, , UNIVERSIDAD NACIONALAUTONOMA DE MEXICO POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS INSTITUTO DE BIOLOGÍA SISTEMÁTICA Y ClTOGENÉTICADEL COMPLEJO Phaseolus pedicellatus BENTH, (PHASEOLINAE:FABACEAE) T E S 1 S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE DOCTOR EN CIENCIAS PRESENTA PEDRO MERCADO RUARO DIRECTOR DE TESIS: DR ALFONSO O. DELGADO SALINAS MÉXICO O.F. OCTUBRE, 2006 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. Se agradece a la Dirección General de Asuntos del Personal Académico de la UNAM, que a través del Programa de Apoyos para la Superación del Personal Académico de la UNAM, otorgó una beca complementaria para la realización del doctorado. También se agradece a la Dirección General de Estudios de Posgrado, Subdirección de Programas Institucionales de Apoyo al Posgrado, PAEP, el apoyo económico brindado para realizar el trabajo de laboratorio en secuenciación molecular. Clave del proyecto 201319. Comité Tutoral: Dr. Alfonso Octavio Delgado Salinas Dra. Sandra Luz Gómez Arroyo Dr. Fernando Chiang Cabrera DEDICATORIA A SARA y ALEX por su amor siempre presente. Lo mejor de mi vida. A mi madre………..Gracias, donde quiera que te encuentres. AGRADECIMIENTOS De manera muy especial agradezco al Dr. Alfonso O. Delgado Salinas por la dirección y constante asesoría en el desarrollo de la presente tesis. Por su comprensión y apoyo en situaciones personales difíciles. A la Dra. Sandra Luz Gómez Arroyo y Dr. Fernando Chiang Cabrera, integrantes del Comité Tutoral, por las enriquecedoras observaciones y sugerencias durante el desarrollo y etapa final de la presente investigación. A la Dra. Judith Márquez Guzmán, Dra. Alda Rocío Ortiz Muñiz, Dra. Mercedes Isolda Luna Vega y Dra. Helga Ochoterena Booth, por aceptar ser parte del jurado revisor; sus observaciones y acertadas sugerencias enriquecieron notablemente el manuscrito final. Al Instituto de Biología de la UNAM por todas las facilidades brindadas para la realización de los estudios de doctorado. Al Dr. Héctor Hernández y Dra. Tila María Pérez Ortiz por su apoyo como directores del IBUNAM. Al Dr. Miguel Ulloa y Claudio Delgadillo por las facilidades otorgadas como jefes del Departamento de Botánica del IBUNAM. A la Biól. Maria del Rosario García Peña por la ayuda brindada en la obtención de ejemplares herborizados en préstamo de herbarios extranjeros. A la M. en C. Laura Márquez, responsable del Laboratorio de biología molecular del IBUNAM por la ayuda y orientación brindada en la secuenciación de los ITS. Al Dr. Fernando Chiang C. por sus observaciones críticas, pero sobre todo, por la amistad brindada. Al Biól. Alfredo Wong León y al Lic. en Diseño Gráfico Julio Cesar Montero por todo el apoyo brindado en la parte de cómputo. Al Biól. Alberto Reyes, M. en C. Fernando Tapia, Biól. Gabriel Flores, M. en C. Norma Oropeza y Biól. Pedro Tenorio por su compañía y apoyo en la colecta de material durante las salidas al campo. Al M. en C. Rafael Torres por compartir material biológico importante para el presente trabajo. Finalmente, gracias a todas aquellas personas que no son mencionadas por olvido involuntario, pero que intervinieron en la culminación de la presente tesis. CONTENIDO RESUMEN ..................................................................................................... VIII ABSTRACT ..................................................................................................... X CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN ........................................................................... 1 ANTECEDENTES ................................................................................... 2 OBJETIVO GENERAL ............................................................................. 11 OBJETIVOS PARTICULARES ................................................................... 11 HIPÓTESIS ........................................................................................... 12 CAPÍTULO II. ANÁLISIS MORFOLÓGICO............................................................. 14 MATERIALES Y MÉTODOS...................................................................... 15 ANÁLISIS FENÉTICO .............................................................................. 16 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................... 23 CONCLUSIONES ................................................................................... 39 ANEXO II.1........................................................................................... 44 ANEXO II.2........................................................................................... 52 CAPÍTULO III. ESTUDIOS CITOGENÉTICOS ........................................................ 54 ESTUDIOS CROMOSÓMICOS EN Phaseolus ........................................... 54 ESTUDIOS DE CONTENIDO DE ADN NUCLEAR EN Phaseolus.................. 57 MATERIALES Y MÉTODOS...................................................................... 60 CROMOSOMAS ..................................................................................... 60 CONTENIDO DE ADN............................................................................ 63 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................... 64 CROMOSOMAS ..................................................................................... 64 CONTENIDO DE ADN............................................................................ 74 CONCLUSIONES ................................................................................... 79 ANEXO III.1.......................................................................................... 85 CAPÍTULO IV. FILOGENIA MOLECULAR............................................................. 88 ESPACIADORES INTERNOS TRANSCRITOS (ITS) ..................................... 88 MATERIALES Y MÉTODOS...................................................................... 93 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................... 101 ANÁLISIS DE SECUENCIAS..................................................................... 101 ANÁLISIS FILOGENÉTICO ....................................................................... 110 CONCLUSIONES ................................................................................... 118 ANEXO IV.1 ......................................................................................... 119 CAPÍTULO V. REUBICACIÓN DE Phaseolus dasycarpus ................................ 126 CAPÍTULO VI. CONCLUSIONES GENERALES ..................................................... 143 REFERENCIAS................................................................................................ 146 RESUMEN El género Phaseolus L. (Fabaceae) tiene una distribución actual en el neotrópico y consiste de aproximadamente 75 especies distribuidas en 15 secciones; no obstante que contiene cinco especies con importancia económica, son pocos los estudios de las especies silvestres, la mayoría están concentrados en las cultivadas, principalmente en P. vulgaris, olvidando el valor que tiene el material silvestre como portador de variabilidad genética y de características deseables que pueden ser introducidas a las especies cultivadas, como ya se ha realizado en algunos casos. Aun cuando en 2002 se realizó una revisión del género, el número de especies y las relaciones entre ellas aún no se resuelve. Al complejo Phaseolus pedicellatus a partir de la última revisión se le otorgó la categoría taxonómica de sección – sect. Pedicellati- constituida por 11 especies: P. pedicellatus Benth., P. laxiflorus Piper, P. purpusii Brandegee, P. esperanzae Seaton, P. oaxacanus Rose, P. grayanus Wooton & Standl., P. palmeri Piper, P. polymorphus S. Watson, P. scabrellus Benth. ex S. Watson, P. teulensis Freytag y P. pyramidalis Freytag. Excluyendo a las últimas dos especies, las nueve restantes habían sido consideradas como coespecíficas con P. pedicellatus o variedades de ella. i En este trabajo se realizaron estudios morfológicos, cromosómicos y de secuenciación de ADN nuclear de los espaciadores internos transcritos (ITS) en el complejo Phaseolus pedicellatus, con el objetivo principal de determinar el número de especies que la integran y sus relaciones. Se encontró que todas las especies analizadas cariotípicamente tienen números cromosómicos de 2n= 22, con predominancia de cromosomas metacéntricos y submetacéntricos y una segregación meiótica normal. El análisis filogenético mostró que P. oaxacanus no es parte de la sección y que P. glabellus junto con P. neglectus, utilizadas como especies del grupo externo, se anidan en el clado correspondiente a la sección Pedicellati. Con la información generada en el presente estudio no se resuelve la sistemática de la sección Pedicellati, pero se establece que la sección no es monofilética. ii ABSTRACT Phaseolus L. (Fabaceae) is a Neotropical genus of approximately 75 species distributed in 15 sections, five of these species being of great economic importance. Most studies in the genus deal with the economically important cultivated species, particularly with P. vulgaris, overlooking the potential value of wild species as bearers of genetic variability and valuable characteristics that could be incorporated into the cultivated species, as it has been done in some cases. A revision of the genus was undertaken in 2002; however, the number of species and the interspecific relationships are still unresolved. In that revision, the Phaseolus pedicellatus complex was accorded sectional status, i.e., section Pedicellati, with 11 species, namely P. pedicellatus Benth., P. laxiflorus Piper, P. purpusii Brandegee, P. esperanzae Seaton, P. oaxacanus Rose, P. grayanus Wooton & Standl., P. palmeri Piper, P. polymorphus S. Watson, P. scabrellus Benth. ex S. Watson, P. teulensis Freytag and P. pyramidalis Freytag. With the exception of the last two, the other nine species had been considered as conspecific with or varieties of P. pedicellatus. In the present work several studies were undertaken, including morphologic, chromosomal, and of nuclear DNA sequencing of the internal transcribed spacers (ITS) in the P. pedicellatus complex, with the aim of determining the number of species that make up the complex, as well as their relationships. It was found that all the species analyzed for karyotype have 2n = 22 chromosomes, with a prevalence of metacentric and submetacentric chromosomes, and normal meiotic segregation. The phylogenetic analysis showed that P. oaxacanus does not form part of the section Pedicellati; it also showed that P. glabellus and P. neglectus, both iii employed as outgroup species, are nested in the clade corresponding to section Pedicellati. The information generated in this study does not solve the systematics of section Pedicellati; however, it proves that the section is not monophyletic. iv INTRODUCCIÓN El género Phaseolus L. tiene una distribución actual en el neotrópico y pertenece a la subtribu Phaseolinae, una de las más notables por el número de géneros con importancia económica dentro de la familia Fabaceae o Leguminosae. Phaseolus tiene cinco especies cultivadas: P. vulgaris L. (frijol común), P. coccineus L. (frijol ayocote o escarlata), P. dumosus Macfad. (=P. polyanthus Greenm.) (frijol gordo o anual), P. acutifolius A. Gray (frijol escumite o tépari) y P. lunatus L. (frijol comba o lima), y desde tiempos previos al descubrimiento de América, se distinguió por ser un alimento básico de las civilizaciones americanas, situación que actualmente se extiende en prácticamente todo el mundo. Es tan grande la importancia del frijol en la dieta mundial, que un grupo de científicos, en el que participan varios mexicanos, formaron un consorcio internacional denominado Phaseomics (Broughton et al., 2003), cuyo objetivo principal es generar nuevas variedades, que no sólo sean adecuadas, sino también aceptadas por los agricultores y las comunidades consumidoras, a través de la formación de una red de conocimiento y materiales cuyos resultados serán la generación de frijoles de alto rendimiento, resistentes a enfermedades, tolerantes al estrés abiótico (edáfico e hídrico) y de alta calidad en proteínas. No obstante la importancia de Phaseolus, el número de especies y las relaciones entre ellas están lejos de ser entendidas (Debouck, 1991, 2000; Freytag y Debouck, 2002); es un grupo que ha sufrido una serie de 5 cambios, tanto en la cantidad de secciones, como en el número de especies que deben ser consideradas; una relación condensada sobre tales cambios es presentada por Delgado-Salinas (1985) y Freytag y Debouck (2002). Contrariamente a lo que se podría pensar, y a pesar de su importancia, Phaseolus, en comparación con otros géneros cultivados, es menos conocido en lo referente al número de especies y las relaciones entre ellas. 6 CAPITULO I ANTECEDENTES Conocida más comúnmente como Leguminosae, la familia Fabaceae es un grupo importante y diverso dentro de las angiospermas. Es la tercera familia más numerosa dentro de las plantas superiores, con 650 géneros y aproximadamente 18 000 especies (Lavin et al., 2005; Polhill, 1994; Polhill et al., 1981), en cuanto a su importancia en la agricultura, son superadas únicamente por las poáceas, siendo fijadoras de enormes cantidades de nitrógeno atmosférico por su asociación simbiótica con bacterias del género Rhizobium, además de ser una fuente importante de proteína vegetal en la dieta humana y en alimento de ganado. Se calcula que las fabáceas proporcionan del 25 al 35% de las proteínas consumidas a nivel mundial (Broughton et al., 2003). A nivel mundial, la familia ocupa el tercer lugar en el número de especies (National Academy of Sciences (NAS), 1979; Polhill et al., 1981), en la República Mexicana se ubica en segundo lugar, con 139 géneros y 1850 especies (Sousa et al., 2004), superada únicamente por la familia Asteraceae. Aunque las fabáceas están distribuidas en todo el país, hay más especies en las regiones tropicales (Sousa y Delgado, 1993), siendo los estados de Oaxaca y Chiapas los más ricos, resultado del traslapo de varias provincias florísticas en los límites entre ambos estados (Sousa, 1986). Las Fabaceae se distribuyen en todos los hábitats terrestres, desde el ecuador hasta las orillas de los desiertos fríos y secos; sin embargo, existe una mayor diversidad en áreas de topografía variada y con climas estacionales (Polhill et al., 1981). La familia Fabaceae está integrada por las subfamilias Caesalpinioideae, Mimosoideae y Papilionoideae aunque, para algunos autores, entre ellos Cronquist (1981), cada una de ellas debería ser considerada como familia independiente. De acuerdo con Lavin et al. (2005), la aparición de las primeras fabáceas ocurrió hace aproximadamente 60 millones de años, y que el registro fósil más antiguo corresponde a restos de frutos similares a los de Diplotropis y Bowdichia, ambos de las papilionoidéas. Estudios moleculares indican que las mimosoideas y papilionoideas son monofiléticas, mientras que las caesalpinioideas aparecen como parafiléticas (Doyle et al., 1997; Kajita et al., 2001). Integrante de la subfamilia Papilionoideae se encuentra la tribu Phaseoleae, una de las económicamente más importantes con aproximadamente 84 géneros y 1500 especies, que incluye a los géneros Phaseolus, Vigna y Glycine, conocidos popularmente como frijoles; también se encuentran otros 14 géneros que pueden tener importancia como alimento, forraje o de tipo ornamental (Lackey, 1981). Phaseolus y Vigna, géneros estrechamente relacionados, pertenecen a la subtribu Phaseolinae. En el caso particular del género Phaseolus, aproximadamente 75 especies lo conforman (Freytag y Debouck, 2002), de las cinco cultivadas, P. vulgaris es la que más se consume y por lo tanto la especie más ampliamente cultivada. Después de las revisiones taxonómicas de Verdcourt (1970) y Maréchal et al. (1978), quedaron claros los límites del género y su restricción al continente americano, principalmente en las regiones montañosas de México (Sousa y Delgado, 1993; Debouck, 2000) y Centroamérica, en regiones tropicales y subtropicales entre los 370 de latitud norte y 280 de latitud sur (Debouck, 2000). Las principales áreas de diversificación del género son las partes altas del centro (Estado de México a Jalisco) y sur de México (Chiapas), (Freytag y Debouck, 2002). A nivel mundial, la importancia económica del cultivo de frijol radica en su consumo humano directo, con una producción que excede los 23 millones de toneladas métricas, de las cuales, siete son producidas en América Latina y África. En México, se estima que el consumo promedio per capita es mayor a 16 kg al año (Broughton et al., 2003). Del frijol se puede consumir la semilla madura (lo más común) o inmadura, hojas, vainas y flores. La posición taxonómica de Phaseolus es la siguiente: Familia: Fabaceae Subfamilia: Papilionoideae Tribu: Phaseoleae DC. Subtribu: Phaseolinae Benth. Género: Phaseolus L. La falta de claridad en la delimitación de las especies señalada por Debouck (1991) y Freytag y Debouck (2002) ha propiciado el origen de complejos o grupos taxonómicos aún sin una definición clara, sobre todo en la sección anteriormente denominada Phaseolus y que recientemente Freytag y Debouck (2002), en un estudio taxonómico del género, han fragmentado en varias secciones, una de ellas es la sección Pedicellati Freytag, en donde la mayoría de las especies que la integran habían sido consideradas por Delgado-Salinas (1985) como variedades o sinonimias de la macroespecie P. pedicellatus, con excepción de P. pyramidalis Freytag y P. teulensis Freytag, que son nuevas descripciones realizadas por Freytag y Debouck (2002). Delgado-Salinas (1985) consideró 36 taxones en América del Norte y Central distribuidas en las secciones Chiapasana A. Delgado, Phaseolus DC., Minkelersia (Mart. & Gal.) Maréchal et al. y Xanthotricha A. Delgado, mientras que Debouck (1991), estimó 52 especies las integrantes del género, mencionando que la cantidad de especies podría incrementarse cuando se realizara un mayor número de exploraciones. Debouck (2000) reconoce 56 especies y organiza a la sección Phaseolus, integrada por 40 especies arregladas en phyla (series de formas): phylum del frijol común; phylum del frijol escarlata; phylum del frijol tepari; phylum del frijol Lima; phylum de frijoles silvestres con testa rugosa; phylum de P. pedicellatus; phylum de P. microcarpus; phylum de P. neglectus, phylum con 2n=2x= 20 y 7 phyla aislados monotípicos. Recientemente Freytag y Debouck (2002), realizarón una revisión del género para América del Norte, México y América Central, estableciendo que el número de especies es de 75, distribuidas en 15 secciones: Acutifolii Freytag, Phaseolus acutifolius A. Gray y P. parvifolius Freytag. Phaseoli Freytag, Phaseolus vulgaris L., P. costaricensis Freytag & Debouck, P. dumosus Macfad. y P. albescens McVaugh ex R. Ramírez & A. Delgado. Coccinei Freytag, Phaseolus coccineus L. (P. glabellus Piper, un caso especial, no tiene una posición definida en sección alguna, pero los autores la colocan cercana a P. coccineus). Paniculati Freytag, Subsección Volubili Freytag, Phaseolus lunatus L., P. polystachyus (L.) Britt., Sterns & Pogg, P. salicifolius Piper, P.maculatifolius Freytag & Debouck, P. dasycarpus Freytag & Debouck y P. longiplacentifer Freytag. Subsección Lignosi Freytag, Phaseolus jaliscanus Piper, P. scrobiculatifolius Freytag, P. nodosus Freytag & Debouck, P. albinervus Freytag & Debouck, P. marechalii A. Delgado, P. rotundatus Freytag & Debouck, P. acinaciformis Freytag & Debouck, P. xolocotzii A. Delgado, P. sonorensis Standl. y P. juquilensis A. Delgado. Bracteati Freytag, Phaseolus macrolepis Piper y P. talamancensis Debouck & Torres. Minkelersia (Mart. & Gal.) Maréchal, Mascherpa & Stainier, Phaseolus pluriflorus Maréchal, Mascherpa & Stainier, P. nelsonii Maréchal, Mascherpa & Stainier, P. perplexus A. Delgado, P. plagiocylix Harms, P. amblyosepalus (Piper) Morton, P. tenellus Piper, P. parvulus Greene, P. anisophyllus (Piper) Freytag & Debouck, P. amabilis Standl. y P. pauciflorus Sessé & Mociño ex G. Don. Xanthotricha A. Delgado, Phaseolus xanthotrichus Piper, P. hintonii A. Delgado, P. zimapanensis A. Delgado, P. gladiolatus Freytag & Debouck, P. magnilobatus Freytag & Debouck y P. esquincensis Freytag. Revoluti Freytag, Phaseolus leptophyllus G. Don. Digitati Freytag, Phaseolus neglectus Hermann, P. albiflorus Freytag & Debouck, P. albiviolaceus Freytag & Debouck, P. trifidus Freytag y P. altimontanus Freytag & Debouck. Rugosi Freytag, Phaseolus filiformis Benth., P. angustissimus A. Gray, P. carterae Freytag & Debouck y P.microcarpus Mart. (P. microcarpus es otro caso particular, Freytag y Debouck (2002) la colocan cercana a la sección Rugosi, no obstante que molecularmente se encuentra alejada de ella, además de que la testa no es rugosa como en el resto de los integrantes de la sección, señalan que presenta otras características morfológicas que la acercan a la sección). Falcati Freytag, Phaseolus micranthus Hook. & Arn., P. leptostachyus Benth., P. opacus Piper, P. persistentus Freytag & Debouck y P. macvaughii A. Delgado. Brevilegumeni Freytag, Phaseolus oligospermus Piper, P. campanulatus Freytag & Debouck y P. tuerckheimii Donnell-Smith. Pedicellati Freytag, Phaseolus pedicellatus Benth., P. oaxacanus Rose, P. esperanzae Seaton, P. polymorphus S. Wats., P. palmeri Piper, P. purpusii Brandegee, P. grayanus Woot. & Standl., P. scabrellus Benth. ex S. Wats., P. teulensis Freytag, P. pyramidalis Freytag y P. laxiflorus Piper. Chiapasana A. Delgado. Phaseolus chiapasanus Piper. Coriacei Freytag, Phaseolus maculatus Scheele, P. venosus Piper y P. reticulatus Freytag & Debouck, y ahora P. novoleonensis Debouck (Salcedo et al. 2006). La integración de las secciones corresponde, en lo general, a la forma en que habían sido ordenadas las especies en phyla (series) por Debouck (2000). Si se compara el trabajo de Delgado-Salinas (1985) con el de Freytag y Debouck (2002), es evidente que los cambios realizados por los últimos dos autores se encuentran básicamente en la sección anteriormente llamada Phaseolus, grupo en donde se observa el mayor incremento de nuevas descripciones y de nuevas secciones, probablemente por lo grande que era en comparación con el resto de ellas. La sección Chiapasana permanece sin cambios, mientras que Minkelersia y Xanthotricha incrementan el número de especies. En el cuadro I.1 se presentan los distintos taxones que han sido reconocidos por diversos autores en lo que se conoció como complejo o macroespecie Pedicellatus y que, actualmente, de acuerdo con Freytag y Debouck (2002) corresponde a la sección Pedicellati. Phaseolus pedicellatus var. grayanus es reconocida por Isely (1998) como un taxón válido en su tratamiento de las leguminosas nativas y naturalizadas de los Estados Unidos: P. pedicellatus Benth. var grayanus (Wooton & Standley) Delgado ex Isely. El reconocimiento de Isely de la existencia de variedades en P. pedicellatus implica un apoyo implícito a lo planteado por Delgado-Salinas (1985) para la especie P. pedicellatus, en el sentido de que se trata de un complejo taxonómico. Lo intrincado del complejo Pedicellatus se refleja en los cambios que ha sufrido a lo largo del tiempo, pero además también en el punto de vista de algunos autores que puede cambiar, tal es el caso de Debouck (1991) quien considera especies válidas a Phaseolus foliaceus, P. floribundus y P. schaffneri, y posteriormente en Freytag y Debouck (2002) las consideran sinónimos de P. pedicellatus. Aun con la importancia mencionada de Phaseolus, son pocos los estudios de cualquier disciplina que han incluido a las especies silvestres, la mayoría se enfocan principalmente a las cultivadas, olvidando así la investigación de las especies progenitoras de las cultivadas, así como de taxones relacionados, que pueden ampliar las fuentes de mejoramiento genético en los cultivos (Hucl y Scoles, 1985). Bayuelo-Jiménez et al. (2002a; 2002b) encuentran, por ejemplo, que Phaseolus micranthus, P. macvaughii y P. lunatus (silvestre) son tolerantes a la salinidad, característica que puede ser transferida y aprovechada en cultivos que se desarrollan en regiones con alta salinidad. En virtud de la problemática planteada para el género Phaseolus, en particular en P. pedicellatus, se plantean los siguientes objetivos en el complejo Phaseolus pedicellatus, actualmente sección Pedicellati. OBJETIVO GENERAL -Realizar estudios citogenéticos, morfológicos y moleculares en la sección Pedicellati que ayuden a determinar el número de especies que la integran y sus relaciones. OBJETIVOS PARTICULARES: -Realizar estudios mitóticos que incluyan la determinación del número cromosómico y elaboración del cariotipo en varias poblaciones de la sección Pedicellati, con la finalidad de detectar posibles diferencias en el número cromosómico, longitud total de los cromosomas, fórmula cariotípica e índice de simetría TF%. -Realizar estudios meióticos, que contemplen el análisis del comportamiento cromosómico para determinar si existen anormalidades cromosómicas: presencia de univalentes, multivalentes, puentes cromosómicos, cromosomas retardados o micronúcleos. -Análisis morfológico utilizando técnicas fenéticas que permita determinar como se relacionan morfológicamente los taxones integrantes de la sección Pedicellati. -Realizar el análisis filogenético empleando la secuenciación de ITS y establecer las relaciones entre los distintos taxa de la sección Pedicellati. HIPÓTESIS Si el complejo Pedicellatus está integrado por las especies que Freytag y Debouck (2002) incluyen en la sección Pedicellati, entonces los estudios morfológicos, moleculares y cromosómicos, como técnicas individuales o en su conjunto, permitirán la identificación de cada uno de los taxa. Cuadro I.1. Cuadro comparativo que muestra la forma que diversos autores han considerado a las especies del complejo o sección Pedicellati. Piper (1926)1 Delgado-Salinas (1985) Debouck (1991) Freytag y Debouck (2002) P. foliaceus (P. pedicellatus y sus aliados) Sinónimo de P. pedicellatus var. grayanus Sección Phaseolus P. foliaceus Sección Phaseolus Sinónimo de P. grayanus Sección Pedicellati P. floribundus (P. pedicellatus y sus aliados) Sinónimo de P. pedicellatus var. pedicellatus Sección Phaseolus P. floribundus Sección Phaseolus Sinónimo de P. pedicellatus Sección Pedicellati P. schaffneri (P. pedicellatus y sus aliados) Sinónimo de P. pedicellatus var. polymorphus Sección Phaseolus P. schaffneri Sección Phaseolus Sinónimo de P. polymorphus Sección Pedicellati P. oaxacanus (P. pedicellatus y sus aliados) P. pedicellatus var. oaxacanus Sección Phaseolus P. oaxacanus Sección Phaseolus P. oaxacanus Sección Pedicellati P. pedicellatus (P. pedicellatus y sus aliados) P. pedicellatus var. pedicellatus Sección Phaseolus P. pedicellatus Sección Phaseolus P. pedicellatus Sección Pedicellati P. polymorphus (P. pedicellatus y sus aliados) P. pedicellatus var. polymorphus Sección Phaseolus P. polymorphus Sección Phaseolus P. polymorphus Sección Pedicellati P. palmeri (P. pedicellatus y sus aliados) Sinónimo de P. pedicellatus var. grayanus Sección Phaseolus P. palmeri Sección Phaseolus P. palmeri Sección Pedicellati P. scabrellus (P. pedicellatus y sus aliados) Sinónimo de P. pedicellatus var. pedicellatus Sección Phaseolus P. scabrellus Sección Phaseolus P. scabrellus Sección Pedicellati P. grayanus (P. pedicellatus y sus aliados) P. pedicellatus var. grayanus Sección Phaseolus P. grayanus Sección Phaseolus P. grayanus Sección Pedicellati P. esperanzae (P. pedicellatus y sus aliados) Sinónimo de P. pedicellatus var. pedicellatus Sección Phaseolus P. esperanzae Sección Phaseolus P. esperanzae Sección Pedicellati P. salicifolius (P. pedicellatus y sus aliados) P. salicifolius Sección Phaseolus (fuera del complejo Pedicellatus) P. salicifolius Sección Phaseolus P. salicifolius Sección Paniculati subsec. Volubili P. laxiflorus (P. pedicellatus y sus aliados) Sinónimo de P. pedicellalltus var. pedicellatus Sección Phaseolus P. laxiflorus Sección Phaseolus P. laxiflorus Sección Pedicellati P. purpusii, sinónimo de P. polymorphus P. pedicellatus var. purpusii Sección Phaseolus P. purpusii Sección Phaseolus P. purpusii Sección Pedicellati P. pyramidalis Sección Pedicellati P. teulensis Sección Pedicellati 1Piper incluye dentro del grupo Pedicellatus a especies que actualmente se consideran notoriamente fuera del grupo: Phaseolus acutifolius, P. bolivianus, P. falciformis, P. lunatus, P. mollis, P. rosei, P. salicifolius y P. viridis (Freytag y Debouck, 2002), y que por lo mismo no fueron tomadas en cuenta. CAPÍTULO II ANÁLISIS MORFOLÓGICO La taxonomía numérica es definida como el agrupamiento por métodos numéricos de unidades taxonómicas sobre las bases de sus estados de caracteres (Sneath y Sokal, 1973). El análisis fenético permite conocer la semejanza morfológica entre los taxones o ejemplares examinados y de ninguna manera refleja filogenia alguna. La semejanza entre dos unidades taxonómicas operativas (OTU’s por sus siglas en inglés) es estimada generalmente por medio de un coeficiente de similitud, el cual es una cuantificación del parecido entre los elementos en las dos columnas de la matriz de datos, representando los estados de carácter de los dos OTUS’s en cuestión. Existen varios coeficientes de similitud para evaluar la semejanza morfológica entre taxones: coeficientes de distancia, de asociación, de correlación y de similitud probabilística. El coeficiente de correlación es el utilizado con mayor frecuencia en taxonomía numérica. Dicho coeficiente ha sido usado en datos donde la mayoría de los caracteres, si no es que todos, están presentes en más de dos estados. MATERIALES Y MÉTODOS Para el análisis morfológico, se examinaron ejemplares depositados en el Herbario Nacional del Instituto de Biología, UNAM (MEXU) y también se solicitaron en préstamo ejemplares a los siguientes herbarios del extranjero: (GH) Harvard University, Cambridge, Massachusetts. USA, (ARIZ) University of Arizona, Tucson, Arizona. USA, (F) Field Museum of Natural History, Chicago, Illinois. USA, (MICH) University of Michigan, Ann Arbor, Michigan. USA, (MO) Missouri Botanical Garden, Saint Louis, Missouri. USA, (NMC) New Mexico State University, Las Cruces. USA, (NY) New York Botanical Garden, Bronx, New York. USA, (TX) University of Texas at Austin, Austin, Texas. USA y (US) Smithsonian Institution, Washington, District of Columbia, USA. Con relación a los folíolos la literatura revisada indicó que han sido utilizados para la delimitación de las especies; sin embargo, se encontró que es un carácter muy variable: aun dentro de una misma planta se pueden encontrar distintos grados de lobulación, dependiendo de si la observación es realizada en la parte basal, intermedia o apical de la planta, se pueden encontrar folíolos no lobulados, ligeramente lobulados o claramente lobulados. Con base en lo anterior se seleccionaron caracteres que incluyeran estructuras florales y de fruto, sin dejar de considerar a los folíolos. Después de la revisión del material de herbario del MEXU y del solicitado en préstamo, se eligieron los ejemplares más completos en cuanto a características vegetativas, florales y de fruto y con ellos se realizó un análisis fenético. Los taxones que no fueron incluidos no presentaban todas las características mencionadas, y que tampoco fue posible obtener durante las salidas de campo que se realizaron para la recolección de material. La revisión de material de herbario se hizo, además, con la intención de conocer la distribución y fenología del grupo y de esta forma planear salidas al campo para colectar material vivo que apoyara las observaciones del material herborizado, así como para colectar semillas y/o botones florales para ser utilizados en los estudios cariológicos. La colecta de nuevo material incluyó a los estados de Puebla, Oaxaca, Hidalgo, Morelos, San Luis Potosí, Querétaro, Estado de México, Veracruz, Michoacán, Durango y Aguascalientes. ANÁLISIS FENÉTICO Se realizó con la finalidad de determinar si un análisis morfológico es suficiente para delimitar con claridad a Phaseolus esperanzae, P. grayanus, P. laxiflorus, P. oaxacanus, P. pedicellatus, P. polymorphus y P. purpusii, especies que Freytag y Debouck (2002) señalan como integrantes de la sección Pedicellati, taxones que Delgado-Salinas (1985) considera variedades de P. pedicellatus. Phaseolus dasycarpus, especie que, de acuerdo con Freytag y Debouck (2002), no pertenece a la sección Pedicellati, fue incluido porque, en el transcurso del trabajo de campo, se colectó como una población con características típicas de la sección Pedicellati, pero con estandarte en forma de capucha, carácter que no se ha visto en los demás integrantes de la sección Pedicellati Los 86 ejemplares seleccionados que resultaron de la revisión de herbario y de las colectas realizadas en el transcurso de la presente investigación, reflejan la variación morfológica del grupo en estudio. Además se incluyeron tres ejemplares de Phaseolus glabellus y cinco de P. neglectus, especies que en estudios moleculares realizados por Delgado- Salinas et al. (1999), mostraron una cercanía con la sección Pedicellati. En total, la matriz incluyó 94 ejemplares. Para el análisis fenético, cada ejemplar se constituyó en una unidad taxonómica operativa. Se analizaron 39 caracteres obtenidos de hoja, inflorescencia, flor y fruto, de los cuales, 30 fueron cuantitativos y 9 cualitativos. Phaseolus palmeri, P. scabrellus y P. teulensis, especies consideradas en la sección Pedicellati, no fueron incluidos en el estudio morfológico, por la carencia de ejemplares que presentaran todas las características consideradas en el análisis. Los caracteres muestreados son los siguientes: 1 Lobulación de los folíolos laterales: 0) sin lobulación; 1) ligeramente lobulados o lobulados; 2) lobulados y angulosos; 3) bilobulados o trilobulados. Fig. II.1.A-D. 2 Longitud de pecíolo de la hoja que sustenta a una inflorescencia. Fig.II.1. J. 3 Longitud del raquis del folíolo. 4 Largo de las estípulas. 5 Ancho de las estípulas. 6 Largo de las estipelas. 7 Ancho de las estipelas. 8 Número de nervaduras de estípulas: 0) 5-7; 1) 3-4. 9 Número de nervaduras de estipelas:0) 1; 1) 2; 2) 3. 10 Acúmenes en el lóbulo derecho del folíolo lateral: 0) ausencia; 1) presencia. 11 Lobulación del folíolo central: 0) sin lobulación; 1) ligeramente lobulados o lóbulos bien definidos. 12 Número de nudos en raquis de la inflorescencia en el intervalo de 2 cm, del primer nudo floral al ápice de la inflorescencia: 0) 0-1; 1) 2-3; 2) 4 o más. Fig. II.1. J. 13 Longitud de la inflorescencia. 14 Longitud del pedúnculo. 15 Longitud del raquis de la inflorescencia. 16 Longitud de la bráctea. 17 Ancho de la bráctea. 18 Longitud del pedicelo. 19 Longitud de la bractéola. 20 Ancho de la bractéola. 21 Número de nervaduras en bráctea: 0) 0-1; 1) 2-3; 2) 4-5 al ápice. 22 Número de nervaduras en bractéola: 0) 0; 1) 1. 23 Presencia de brácteas trífidas: 0) ausencia; 1) presencia. 24 Grosor del pedicelo en flor. 25 Largo del cáliz. 26 Ancho del cáliz. 27 Largo del diente ventral medio del cáliz. 28 Largo del estandarte. 29 Ancho del estandarte. 30 Largo del ala derecha. 31 Ancho del ala derecha. 32 Longitud del ovario. 33 Número de vueltas en la quilla: 0) 1.25; 1) 1.5; 2) 1.75. 34 Número de óvulos: 0) 2-3; 1) 4-5; 2) 6 ó más. 35 Color de la flor: 0) azul o violeta; 1) blanco; 2) rojo. 36 Estandarte en su parte distal en antesis: 0) forma extendida; 1) forma de capucha. Fig. II.1. E, F. 37 Pubescencia fruto inmaduro: 0) notablemente pubescente; 1) glabro o ligeramente pubescente. 38 Rostro del fruto inmaduro: 0) sin rostro o pequeño; 1) rostro pronunciado. 39 Textura de las valvas del fruto maduro: 0) no coriáceo; 1) coríáceo. De los 39 caracteres enlistados anteriormente, el fruto inmaduro fue considerado por presentar con mayor claridad diferencias en cuanto a pubescencia y longitud del rostro, además de que son caracteres que se conservan en los ejemplares de herbario. El número de nudos en raquis floral en 2 cm, a partir del primer nudo basal, fue considerado para establecer qué tan separados se encuentran los nudos florales en una longitud determinada y de esta forma establecer si existen diferencias que indiquen qué tan laxa es la presentación de las flores en la inflorescencia; el color de la flor se agregó porque se introdujo en el análisis, como ya se mencionó, a Phaseolus glabellus que tiene la flor de color rojo, mientras que las pertenecientes a la sección Pedicellati o Paniculati presentan una coloración violeta o blanca; las vueltas de la quilla se incluyeron al observarse que no todas presentaban el mismo grado de enrollamiento. La matriz de datos que se generó es mostrada en el anexo II.1. El análisis de los datos se realizó empleando el programa NTSYSpc2.1. Los caracteres se estandarizaron para dar igual peso a todos ellos. Por incluirse caracteres con más de dos estados, se utilizó el coeficiente de correlación y el método de agrupamiento UPGMA en la obtención del fenograma que representa la asociación morfológica del grupo en estudio. Figura II.1.- Distintos grados de lobulación de los folíolos, forma del estandarte e inflorescencia, A=0; B=1; C=2; D=3. E= estandarte en forma de capucha; F= estandarte en forma extendida; J= inflorescencia en donde se muestra la posición de hoja e inflorescencia que se consideró para la obtención de datos, así como la determinación del número de nudos en 2 cm de la inflorescencia. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Aun cuando fueron analizados numerosos ejemplares de herbario, la matriz que se generó está constituida por 94 ejemplares (OTU’s), que fueron los que presentaban todos los caracteres incluidos en la misma matriz, el resto carecía de estructuras florales o fruto y en muchos casos, la forma como estaba prensado el ejemplar no permitía realizar las mediciones correspondientes. Del análisis de la matriz con NTSYSpc, se generó el fenograma que se muestra en la figura II. 2. También utilizando el programa NTSYSpc, se corrió un análisis de componentes principales, encontrándose que los caracteres que definen el fenograma son el largo y ancho del estandarte en el primer componente, mientras que, en el segundo, es el tipo de lobulación de los folíolos junto con el ancho del cáliz y, en el tercer componente, es el ancho de la bráctea y el número de nervaduras de la bractéola (Anexo II.2). Es interesante observar que, en el fenograma, los OTUS se distribuyen en dos grandes grupos; el agrupamiento superior incluye a Phaseolus dasycarpus, P. esperanzae, P. glabellus, P. laxiflorus, P. pedicellatus, P. oaxacanus y dos colectas de P. grayanus provenientes del estado de Durango y de San Luis Potosí. La mayoría de los ejemplares que se congregan en el grupo superior, presentan folíolos lobulados o ligeramente lobulados, similares a los de Phaseolus pedicellatus. En el grupo inferior se encuentra el material identificado como P. grayanus, P. polymorphus, P. purpusii, P. neglectus y dos colectas de P. pedicellatus de Sinaloa y Nuevo León, respectivamente. La cercanía de Phaseolus glabellus y de P. neglectus con especies del grupo Pedicellati ya había sido detectada en reportes previos de secuenciación de ITS (Delgado-Salinas et al. 1999; Gaitán et al. 2000), razón por la que se incluyeron en el estudio. Los resultados observados en el presente análisis muestran que morfológicamente también presentan semejanza. Al analizar el fenograma de la figura II.2 se desprenden las siguientes observaciones: Phaseolus pedicellatus muestra una menor cohesión ya que se relaciona con varios taxones, tanto del grupo superior como en el inferior, indicando que puede ser la especie más polimórfica, portadora de características morfológicas que comparte con el resto de los taxones, razón por la que queda incluida en varios agrupamientos del fenograma. Phaseolus esperanzae, no obstante que se encuentra relacionado con ejemplares de P. pedicellatus, se muestra como un subgrupo definido ya que todos los ejemplares permanecen juntos. El color negro y la forma casi esférica de la semilla, así como la textura, forma y pubescencia del fruto son los caracteres que permiten en el campo una rápida identificación de la especie (Fig. II.3); con excepción de la textura del fruto maduro, el resto de las características no fueron consideradas en la elaboración de la matriz debido a que muy pocos ejemplares las presentaban. De haberse considerado, el número de OTU’s sería muy bajo; sin embargo, en el fenograma P. esperanzae se agrupa aun sin la inclusión de los caracteres mencionados. La distribución de P. esperanzae incluye los estados de México, Puebla, Hidalgo y Distrito Federal; en la revisión de herbario no se encontraron ejemplares en el estado de Michoacán,como reportan Freytag y Debouck (2002); en cambio, sí los hubo en el Distrito Federal, entidad que no fue incluida por dichos autores. Figura II.2.- Fenograma generado con 94 OTU’s y 39 caracteres. dasy= Phaseolus dasycarpus; esp= P. esperanzae; gla= P. glabellus; gra= P. grayanus; laxi= P. laxiflorus; neg= P. neglectus; oax= P. oaxacanus; ped= P. pedicellatus; poly= P. polymorphus; pur= P. purpusii. Figura II.3. Semillas y fruto de Phaseolus esperanzae mostrando forma y color característicos de la semilla, así como la textura y apariencia del fruto seco (P. Mercado et al. 23). Phaseolus oaxacanus, aun cuando no presenta caracteres tan evidentes como pueden ser los de P. esperanzae, también es un taxón en el que todos los ejemplares forman un grupo compacto. Una de las características morfológicas que lo distinguen y que permiten una fácil identificación de P. oaxacanus en el campo o en el herbario, es la presencia de brácteas trífidas y su distribución geográfica restringida a los alrededores montañosos de la Ciudad de Oaxaca, que corresponde a la Sierra de Juárez, Oaxaca. Otra característica que se apreció con las colectas realizadas es la poca o nula lobulación de los folíolos, como se muestra en la figura II.4. Es oportuno mencionar que la presencia de brácteas trífidas no es exclusivo de esta especie; dicha característica también ha sido encontrada en ejemplares de P. pedicellatus provenientes del estado de Durango, que tampoco fueron incluidos en la matriz por las razones ya mencionadas al inicio del presente capítulo. Freytag y Debouck (2002) señalan que las brácteas trífidas se encuentran en algunos ejemplares de P. grayanus; sin embargo, durante la revisión de material de herbario o las colectas realizadas, no se observó la presencia de brácteas trífidas en esta especie. Fig. II.4 Phaseolus oaxacanus (P. Mercado y F. Tapia 88). Folíolos con poca lobulación o carentes de ella; la imagen muestra también la inflorescencia. Phaseolus laxiflorus al igual que P. pedicellatus no forma un grupo compacto y las colectas de estas dos especies se mezclan en el fenograma. Una de las características que presenta este taxón es la presencia de raíces adventicias y que no se introdujo en la matriz de datos porque los ejemplares de herbario carecen de dicha información; sin embargo debe mencionarse que, de las colectas que se realizaron y en donde se pudo observar raíces, P. laxiflorus fue la única que las presentó (figura II.5). Otras características que permiten identificar a P. laxiflorus es la delgadez de sus folíolos, así como la separación que se aprecia entre los nudos florales, que es mayor en comparación con la mayoría de los integrantes de la sección Pedicellati; esta última característica también se presenta en algunos ejemplares de P. pedicellatus, razón que impide su separación. Figura II.5. Phaseolus laxiflorus (P. Mercado et al. 133), se aprecia la producción de raíces adventicias, características de la especie; en las primeras etapas se presentan filiformes, pero las más antiguas son más gruesas, sin alterar en mucho la longitud que aquí se muestra. Phaseolus dasycarpus, como se mencionó anteriormente, es una especie recientemente descrita por Freytag y Debouck (2002) y colocada por ellos dentro de la sección Paniculati. Durante el desarrollo de la presente investigación se colectó material que se consideró pertenecía a la sección Pedicellati pero que, por la presencia de un estandarte en forma de capucha (Fig. II.6) y los folíolos más gruesos que en el resto de las especies, la hacían candidata a nueva especie. Sin embargo, en estudio taxonómico de Freytag y Debouck (2002), se le encontró ya descrita, pero fuera de la sección Pedicellati. Revisiones de herbario permitieron establecer que P. dasycarpus fue inicialmente identificada como P. pedicellatus y que el material consultado por los autores mencionados y, de acuerdo con la ilustración mostrada en la monografía, consistía de una sola colecta carente de flores que permitieran observar las características del estandarte; no obstante, Freytag y Deboluck (2002) ofrecen una descripción de la flor, probablemente basada en las estructuras de un botón floral. El fruto inmaduro pubescente con rostro pronunciado y el número de óvulos fueron las características que Freytag y Debouck (2002) consideraron para ubicarla dentro de la sección Paniculati. Es conveniente mencionar que, antes de conocer que la especie ya había sido descrita en otra sección, el material colectado en el presente trabajo fue considerado como nueva especie, ubicada en la sección Pedicellati. La apreciación de pertenencia a la sección Pedicellati fue apoyada por su ubicación dentro del fenograma que se generó durante el desarrollo de este estudio. Con la revisión de ejemplares de herbario se ampliaron también los datos de distribución, encontrándose la especie en los estados de Veracruz e Hidalgo. Por lo antes mencionado, Phaseolus dasycarpus es analizada en un capítulo aparte de esta tesis. Figura II.6. Phaseolus dasycarpus (P. Mercado et al. 131) Flor en donde se observa la característica que más distingue a la especie, estandarte en forma de capucha, formándose un engrosamiento en la parte superior de dicha estructura Nótese también la coloración lila que presenta el cáliz. En el grupo inferior del fenograma se ubican Phaseolus grayanus, P. polymorphus, P. purpusii y dos colectas de P. pedicellatus; en este grupo también se integró P. neglectus, de la sección Digitati. La característica más notable de los taxones que integran el grupo inferior, con excepción de P. pedicellatus y de P. neglectus, es la forma de los folíolos, en donde los lóbulos dejan de ser redondeados y se encuentran angulosos con la presencia de acúmenes y, en otros casos, bilobulados o tetralobulados con o sin acumen. La forma en que se agrupan P. polymorphus y P. purpusii entre los ejemplares de P. grayanus sugiere que se trata de la misma entidad taxonómica con variaciones intraespecíficas. Phaseolus neglectus, aun cuando se relaciona con el grupo que incluye a P. grayanus, P. polymorphus y P. purpusii, todas las colectas que se consideraron de esta especie integran un subgrupo. La dificultad para separar con claridad morfológicamente a los distintos taxones de la sección Pedicellati también fue enfrentada en la revisión taxonómica de Freytag y Debouck (2002), pues se presentan las siguientes inconsistencias en su monografía: las colectas Chiang et al. 9250, March 1935 y Standford et al. 563 son ubicadas tanto en P. polymorphus como en P. grayanus (pag. 239 y 244). La colecta de McVaugh16760 en la página 239 es considerada P. polymorphus del estado de Jalisco, mientras que en la página 244 la ubican como P. grayanus pero del estado de Aguascalientes. Lo anterior pone de manifiesto la dificultad para separar ambos taxones desde el punto de vista morfológico y las confusiones taxonómicas que ello puede generar. La identificación de P. polymorphus se basó en la presencia de folíolos grandes bilobulados y sin acúmenes. En lo que respecta a Phaseolus grayanus, también se observan inconsistencias en la monografía de Freytag y Debouck (2002); la colecta de Le Sueur 713 en la página 242 se identifica como P. grayanus, pero páginas más adelante se considera como el ejemplar tipo de P. pyramidalis. Esta es una nueva especie de Freytag (Freytag y Debouck, 2002), en la que la forma piramidal que presenta la inflorescencia joven es el carácter distintivo del nuevo taxón. Sin embargo, durante la revisión de herbario se apreció que la forma piramidal en las inflorescencias jóvenes también se presenta en poblaciones de P. pedicellatus y de P. grayanus (Fig. II.7), en localidades bastante distantes de donde se encuentra P. pyramidalis, y ello hace suponer que no se trata de una verdadera especie y que dicho ejemplar debe permanecer como P. grayanus. Figura II.7. Inflorescencia joven de Phaseolus pedicellatus (P. Mercado et al. 114, Michoacán). Se aprecia la forma piramidal de la inflorescencia. En el caso de Phaseolus purpusii, los ejemplares de herbario que fueron consultados son muy distintos morfológicamente en los folíolos al resto de las especies de la sección Pedicellati, y son la característica morfológica para su identificación; sin embargo, como ya se mencionó con anterioridad, no fueron incluidos en la matriz de datos, ya que no presentaban todos los caracteres seleccionados. La colecta de R. Torres 15438 de la Mina la Fabucita de San Luis Potosí, identificada como Phaseolus purpusii, aun cuando no mostró todos los caracteres, el ejemplar estaba acompañado de un par de semillas. Una de las semillas fue inducida a germinar y se obtuvo una plántula que fue llevada hasta la etapa de fructificación en condiciones de invernadero; se elaboró un ejemplar de herbario, el cual se consideró en la elaboración de la matriz de datos. Al colocar la plántula de Phaseolus purpusii en condiciones de invernadero junto con plántulas de P. grayanus o de P. polymorphus, P. purpusii perdió la forma distintiva de sus folíolos y presentó un desarrollo muy semejante a lo que se consideraría un P. grayanus (Fig. II.8 y II.9). También el ejemplar de P. purpusii portó una flor más grande, y con un diente ventral medio del cáliz en forma de espolón que la distinguió de P. grayanus o de P. polymorphus (Fig. II.10). La modificación de los folíolos de P. purpusii en condiciones de invernadero explica por qué se agrupa con P. grayanus y P. polymorphus en el fenograma y no forma un grupo separado. Con base en las observaciones de la germinación y conservación de los ejemplares en invernadero en el caso específico de P. purpusii, la forma de sus folíolos es el resultado de su carga genética en combinación con las condiciones edáficas en que se localiza, ya que las colectas realizadas corresponden a suelos yesosos. Figura II.8. Phaseolus purpusii (R. Torres 5438), los folíolos de la izquierda son los obtenidos de la germinación de semillas en invernadero, los de la derecha corresponden al ejemplar colectado en el campo y del que provienen las semillas germinadas. Figura II.9. Folíolos de Phaseolus grayanus (P. Mercado et al. 60) desarrollándose en invernadero a partir de raíz proveniente de Presa El Peaje en San Luis Potosí; nótese la similitud de los folíolos con los de P. purpusii creciendo también en invernadero. Diente medio ventral del cáliz en forma de espolón Figura II.10. Flor de P. purpusii mostrando el lóbulo ventral medio del cáliz en forma de espolón que, junto con la diferencia en el tamaño de la flor, la distingue de P. grayanus. Una primera imagen que muestra el fenograma es la presencia de dos grupos principales, que en forma general podría estar mostrando la separación de Phaseolus pedicellatus en el agrupamiento superior, mientras que en el inferior se encuentra P. grayanus; no abstante en cada uno de los grupos se introducen OTU’s que corresponden al otro. Una observación más detallada nos permite apreciar que en ambos agrupamientos se presenta lo que Sneath y Sokal (1973) llaman fenones y que se refiere a grupos que se aproximan a taxones naturales. Si se traza una línea vertical en el valor de 0.39 del fenograma, en el grupo superior los fenones que surgen son P. esperanzae, P. dasycarpus, P. oaxacanus, P. glabellus y de manera menos clara a P. laxiflorus, mientras que P. pedicellatus se encuentra disgregado entre los taxones mencionados. En el grupo inferior se encuentra P. neglectus y, de manera muy difusa, P. grayanus, P. polymorphus y P. purpusii; de acuerdo con lo anterior, parece ser que los últimos tres taxones mencionados integran un solo taxón. En el caso particular de Phaseolus purpusii, las características que ayudan a su identificación en condiciones de invernadero son el tamaño de la flor -que es más grande que en P. grayanus o P. polymorphus- y el diente medio ventral del cáliz en forma de espolón; sin embargo, dichas características no permitieron su separación en el fenograma. Los fenones indican que los ejemplares incluidos en el análisis fenético representan 8 especies: Phaseolus dasycarpus, P. esperanzae, P. glabellus, P. grayanus, P. laxiflorus, P. neglectus, P. oaxacanus, y P. pedicellatus. Es interesante también la agrupación de Phaseolus glabellus con las especies que se caracterizan por sus folíolos ligera o marcadamente lobulados, mientras que P. neglectus se agrupó con P. grayanus, P. polymorphus y P. purpusii, especies con lóbulos de los folíolos muy marcados, angulosos y con acúmenes. Phaseolus glabellus y P. neglectus, por estar ubicados cercanamente a la sección Coccinei y sección Paniculati respectivamente, se esperaba que se mostraran separados de las especies pertenecientes a la sección Pedicellati. Los resultados morfológicos que se obtuvieron en el presente estudio con ambas especies apoyan lo encontrado por Delgado-Salinas et al. (1999) y Gaitán et al. (2000), pero con análisis moleculares. Es importante resaltar que los ejemplares o especies con folíolos ligera o marcadamente lobulados y sin acúmenes se distribuyen básicamente en lo que corresponde a la parte sur del país, región que resulta al considerar al Eje Neovolcánico como línea divisoria, mientras que los que tienen los lóbulos de los folíolos multilobulados y con acúmenes, se distribuyen básicamente en la porción norte que, en comparación con la parte sur, es más seca y fría. La presencia de algún taxón en una región que no le corresponde podría significar el cruce de dicha barrera (Eje Neovolcánico) o que, bajo ciertas condiciones ecogeográficas en que se encuentran las poblaciones, su fenotipo se modifica, ejemplo claro es el de P. purpusii, que ya fue mencionado previamente en este texto (pág. 34). CONCLUSIONES Con base en el fenograma que se generó con el análisis fenético, los fenones que se distinguen son Phaseolus dasycarpus, P. esperanzae, P. grayanus, P. laxiflorus, P. oaxacanus y P. pedicellatus. La forma de los folíolos en Phaseolus purpusii es resultado de las condiciones ambientales en que se localiza la especie, en combinación con su carga genética. Phaseolus pyramidalis no fue reconocido como especie en el presente estudio, porque la forma piramidal de la inflorescencia también se observa en poblaciones de P. grayanus y P. pedicellatus. Phaseolus glabellus y P. neglectus se agrupan dentro de la sección Pedicellati, apoyando lo encontrado por Delgado-Salinas et al. (1999) y Gaitán et al. (2000) con estudios moleculares de secuenciación. EJEMPLARES CONSULTADOS PARA EL ANÁLISIS MORFOLÓGICO: Phaseolus dasycarpus HIDALGO: Zacualtipan, Camino de terracería a Tlahuelompa, 24 Sep 1995, Alcántara 2405 (MEXU); Acaxochitlán, 8 km del occidente de Acaxochitlán, 2300 m, 7 Sep 1980, Hernández 4940 (MEXU); Pasando Zacualtipán, km 91.5 de la carretera Mex. 105 Huejutla de Reyes a Pachuca, 2200 m, 28 Ene 2001, Mercado et al. 131 (MEXU). Phaseolus esperanzae, DISTRITO FEDERAL: Xochimilco, Rancho El Conejo, 2350 m, 17 Oct 1976, Ventura 2319 (MEXU); ESTADO DE MÉXICO: Temascaltepec, Cajones, 2480 m, 8 nov 1932, Hinton 2375 (MEXU); 5 km al NE de Amecameca, 2650 m, 22 Sep 1968, Pineda 570; PUEBLA: Autopista México – Puebla km 74.5, 1440 m, 3 Dic 1998, Mercado et al. 23 (MEXU); Esperanza, 1 Aug 1907, Purpus 3639 (MEXU). Phaseolus glabellus PUEBLA: Mpio. de Orizaba, Cerro San Cristóbal al SE de Orizaba (al SE de la autopista), 1400 m 29 Aug 1985, Lorente 4857 (MEXU); Opio. Zacapoactla, San Carlos a orilla de la carretera Zacapoactla – Apulco, 12 Sep 1996, Delgado-Salinas et al. 1582, (MEXU, F, NY); km 9 camino Huahuaxtla Tetela de Ocampo, 1575 m, 17 Sep 1988, Basurto 573 (TX, MEXU). VERACRUZ: Paxtepec, Municipio de Coacoatzintla, 400m, 27 Sep 1974, Ventura 10601 (MEXU); Cerro de Macuiltépetl, Municipio Xalapa, Veracruz, 1480 m, 7 sep 1976, Zola 702 (MEXU). Phaseolus grayanus MÉXICO, CHIHUAHUA: northwest of Cd. Chihuahua, on road to cumbres de Macalca, 14.1 miles west of Hwy 16, 20 Sep 1984, Lavin & Sundberg 4904 (MEXU); Santa Clara Canyon, 17 Aug 1936, LeSueur 731 (CA, GH, F, US). Coahuila: High western ridges of Sierra del Jardín E of Rancho El Caballo, 29° 03’ N 102° 37’ W, 2250-2450 16 Sep 1972, Chiang et al. 9350 (MEXU, TEX); High western ridges of Sierra del Jardín E of Rancho El Caballo, 29° 03’ N 102° 37’ W, 2250-2450 16 Sep 1972, Chiang et al. 9342 (AC); Western side of Potrero de La Mula, about 20 km NW of Ocampo on the escarpment near the mines, 18 Sep 1941, Johnston 9235 (GH); Cañón de San Enrique, eastern side of Sierra de La Encantada, 5 km west of Rancho Buena Vista, 4 Sept 1941, Stewart 1389 (GH, TX); Cañon Desiderio (N-draining): in E Fork, 1.0 mi below (n of) upper woodcutters Camp, 0.9 mi above jct. with W fork, along lumber road; 9.8 mi by road W from Rancho Cerro de la Madera. 27° 07’ 25’’ N 102° 31’ 45’’ W, 2280 m, 29 Sep 1976, Wendt et al. 1836 (ARIZ, TX). Durango: Canyon Cantero, Sierra Gamon, ± 2000 m, 21 Sept 1948, Gentry 8376 (MICH, GH, MEXU, UC, US); Along Mexico Highway 40, about 98 miles east of Mazatlán and 104 miles west of Durango, at El Espinazo del Diablo, 3.3 miles west of Los Bancos and 20.8 miles east of El Palmito, 14.3 miles west of La Ciudad, Sierra Madre Occidental, 27 Sep 1973, Reveal 3565 (NY). SONORA: Cananea, Sonora, Mex, 20 Aug – 1 Sep 1914, Murdoch s/n (F); Las Tierritas de El Temblor, Sierra de el Tigre, 18 – 24 Aug 1940, White 3438 (MEXU, MICH). San Luis Potosí: Charcas, S. L. P. Jul – Aug 1934, Lundell 5317 (MICH, US). E.U.A. ARIZONA: Chiricahua Montains, Barfoot Park, 8000 – 8200 ft, 1 Sep 1906, Blumer 1347 (GH, NMC, NY) Cochise, Onion Saddle in Chiricahua mtns, 7600 ft, 29 Aug 1966, Cazier 679 (ARIZ); Chiricahua Mountains, Coronado Nacional fores, south Fork Campground of Cave Creek, 1/8 mi S of CG reside Cave Cr. Trail (USFT-243), 4 air mi SW of Portal, Az., 5600 ft, 7 Sept 1986, Darrel 86 – 007 (NY, NMC); Cochise Country, Chiricahua Wilderness Area, Chiricahua Mountains, 8310 ft, 29 Jul 1975, Leithliter 175 (ARIZ). NUEVO MEXICO: Hidalgo Co., NESW sec.8, T32S, R19W, Animas Mountains on Gray Ranch, 6200 ft, 21 Aug 1993, McIntosh 2877 (NMC); Nuevo Mexico, 1851 m, Wright 932 (NY, GH). Phaseolus laxiflorus Guerrero: 32-40 km by road west of Chilpancingo, 2100-2325 m, 4 Dec 1966, Anderson & Laskowski 4377 (MEXU). Hidalgo: Acaxochitlán, cerro 4 km E de la Presa El Tejocotal, 98°08’ W 20° 09’ N, 2180 m, 7 Nov 1987, Debouck & Muruaga 2380 (MICH); Molango, a 5 km al N de Molango, 1700 m, 13 Nov 1975, Delgado-Salinas 71 (MEXU). Phaseolus neglectus NUEVO LEÓN: 15 miles up Cola de Caballo, south of Monterrey. 27 Aug 1984, Lavin et al. 4889 (MEXU, TX); Montemorelos. Canyon Los Positos on the road to La Trinidad, 25° 14’ 30’’ N 100° 09’ 20’’ W, 9 Sep 1992, Patterson et al. 7145 (TX);El Chipinque, aprox. 6 km al sur de Monterrey, camino a la meseta 25° 35’ N y 100° 19’ W, 400 m, 7 Oct 1998, Villarreal & Carranza 8687 (TX).TAMAULIPAS: Puerto Purificación, Mpio. Hidalgo, 1545 m, 24 Aug 1994, Hinton 24657 (MEXU, TEX); Mun. Hidalgo 3 km al SE de Puerto Purificación, en el camino a Conrado Castillo, 1300 m, 10 Oct 1989, Medrano et al 17171 (MEXU). Phaseolus oaxacanus Oaxaca: Tlacolula, Villa Díaz Ordaz, 14 km N de V. Díaz Ordaz hacia Cuajilomoyas, 96° 24’ W 17° 04’ N, 2250 m, 24 Oct 1987, Debouck & Muruaga 2335 ( MICH); Sierra de San Felipe, 3048 m, 1 Jun 1894, Pringle 5661 (MEXU); Camino Díaz Ordaz a Cuajilomoya ± 12 km, 2620 m, 9 Sep 2000, Mercado y Tapia 90 (MEXU); Sierra de Clavellinas, 2740 m, Oct 1894, Smith 566 (F, MEXU). Phaseolus pedicellatus Nuevo León: Galeana, loma cerca de Las Placetas, 7.0 km N de 18 de Marzo, camino a San Rafael, 2140 m, 14 Sep 1985, Debouck et al. 1516 (MICH); General Ignacio Zaragoza, 6.0 km N de La Siberia, 2 km desviación a La Joya de San Diego, 99° 49’ W 23° 50’ N, 2550 m, 6 jul 1986, Debouck et al. 1512 (MICH); Galeana, Cerro el Potosí, 3050 m, 21 Aug 1969, Hinton 17245 (MEXU, TEX, US); Cerro del Viejo, 20 Aug 1948, Meyer & Royers 3029 (MEXU, MO); About 1.5 miles below the microwave station on Cerro Potosí, 1 Sep 1970, Norris 17688 (MEXU, US). Guerrero: Tlacotepec, Cerro Tlacotepec, 2650m, 4 Dec 1963, Dieterle 3236 (AS, MEXU, MICH, NY). Distrito Federal: Dinamo de Contreras, 3000 m, 29 Oct 1950, , Matuda 18641, (MEXU); Base de Sierra de Ajusco, 2438 m, 23 Oct 1896, Pringle 8616 (MEXU); Cerca de Contreras, 17 Sep 1930, Russell & Souviron 182 (MEXU). Michoacán: Paracho, Cerro al N de Ahuirán, 2300 m, 13 Dec 1990, Garcia& Pérez3579 (MEXU); Zitácuaro, Zona 7, 19° 23’ 50’’ N 100°19’ 7’’ W 2340 m, 4 Mar 1979, Ibarra388 (MEXU); Zinapécuaro, Cerro Monterrey, cerca de los ojos de agua22 Feb 1986, Santos 1198 (MEXU). Morelos: Valle del Tepeite, norte, Mlos., Lyonnet 876 (MEXU, US); Valle del Tepeite (Mor), 1990 m, Nov 1933, Lyonnet 2988 (US); Dic 1932, Mountain wood above Cuernavaca, 2438 m, 19 Nov 1902, Pringle 9769 (MEXU); Carretera México-Cuernavaca, 2300 m, 13 Oct 1975, Sousa & Delgado 5121 (MEXU). Estado de México; Chiltepec, 4 km N de Chiltepec, 99° 52’ W 18° 55’ N, 2470 m, 1 Nov 1987, Debouck & Muruaga 2368 (MICH); Al NE de Temazcaltepec, 2800 m, 15 Jan 1989, Campos 2793 (MEXU); 1 km al E de Santo Tomás Atzingo, municipio de Tlalmanalco, 2450 m, 28 Oct 1981, Ramos 260 (GH, MEXU); Amecameca, 1 km al E de San Antonio, 2500 m, 31 Oct 1968, Rzedowski 26451 (MEXU, MICH, MO). San Luis Potosí: Zaragoza, 0.2 km al N. de Alvarez, 2400 m, 3 Nov 1986, Debouck 2051 (MEXU). Durango: Along Mexico Highway 40, 27 Sep 1973, Reveal 3565 (MEXU). Phaseolus polymorphus Hidalgo: Ixmiquilpan, 1 Aug 1905, Purpus 1365 (MEXU). Querétaro: Near Cadereyta, 21 Aug 1905, Rose 9723 (MEXU). Phaseolus purpusii San Luis Potosí: La Fabucita, 3 km entronque carretera Matehuala por entrada a microondas Nuñez, junto a la mina “Yeso único”, Mpio. Guadalcazar, 22° 41’ 21’’ N, 100° 30’ 20’’ W, 1600 m, 6 Nov 1999, R. Torres 15438 (MEXU). Anexo 11.1. Matriz básica de datos. Se consideraron 94 0tus y 39 caracteres, 30 de ellos fueron cuantitativos y 9 cualitativos. La matriz fue analizada con el programa NTSYSpc2.1 1 39 94 0.999 Caracteres ped1N.L. laxi2Gro gra3Ariz gra6Coa ped9Mor ped12DF esp13Mex gra14SL Acúmenes lóbulo derecho 0 0 0 1 0 0 0 0 Ancho ala derecha 5.52 4.35 5.87 4.89 4.94 6.1 5.66 8.04 Ancho bráctea 1.2 1.3 1.2 1.4 1.7 1 1.3 1.1 Ancho bractéola 0.8 0.6 0.15 0.7 0.6 0.6 0.5 0.6 Ancho de estípulas 1.1 1.6 1.3 1 1.8 1.8 1.6 1.3 Ancho del cáliz 5.81 5.06 3.9 4.32 5.64 4.39 5.21 5.07 Ancho estandarte 8.34 8.33 8.6 7.78 9.37 8.72 8.23 9.24 Ancho estipelas 0.3 0.5 0.5 0.7 0.5 0.5 0.9 0.6 Bráctea trífida 0 0 0 0 0 0 0 0 Color de flor 0 0 0 0 0 0 0 0 Estandarte con capucha 0 0 0 0 0 0 0 0 Fruto coriáceo 0 0 0 0 0 0 1 0 Fruto inmaduro pubescente 1 1 1 1 1 0 1 0 Grueso del pedicelo 0.35 0.23 0.4 0.3 0.25 0.25 0.3 0.35 Largo del cáliz 4.18 4.85 3.68 3.67 4.45 4.11 3.66 4.12 Largo estandarte 8.33 9.22 6.62 6.34 7.69 8.18 6.25 8.29 Largo estipelas 1.2 2.1 1.3 1.4 1.3 1.4 1.5 1.5 Largo estípulas 2.2 2.7 3.5 2.85 4.5 4.5 3.5 3 Largo diente med. ventral de cáliz 1.54 1.33 1.16 1.08 1.31 1.49 1.29 1.45 Largo ala derecha 9.62 7.9 12.27 9.04 10.48 10.47 8.77 12.46 Lobulación del folíolo central 1 0 1 1 0 0 0 1 Lobulación folíolos 1 1 3 2 1 1 1 2 Long. bráctea 2.5 2.5 2.2 3 4.3 3.8 2.8 2.2 Long. bractéola 2 1.5 0.7 1.2 1.2 1 0.8 1.3 Long. inflorescencia 68 155 155 175 80 110 103 75 Long. pedicelo 10 8.5 5 6 7 6.5 4.5 9.5 Long. pedúnculo 52 95 80 100 42 57 48 20 Long. raquis ¡nflorescencia 16 60 75 75 38 63 55 55 Long.ovario 3.87 5.12 4.52 5.61 4.19 3.88 4.83 5.43 Núm. de nervaduras estípulas 0 0 0 0 0 0 0 0 Núm. de nervaduras bráctea 1 1 1 2 2 1 1 1 Núm. de nervaduras bractéola 1 1 0 1 0 1 0 1 Núm. de nervaduras estipelas 0 0 0 0 0 0 0 0 Núm. de nudos en raquis 2 cm 1 0 0 0 0 0 0 1 Núm. de óvulos 0 0 1 1 1 1 1 1 Núm. de vueltas en quilla 1 1 1 2 1 1 2 2 Pecíolo en hoja de nudo floral 33 32 25 33 80 18.5 22 16.5 Raquis folíolo 10.9 9 8 13 17.5 6.47 7.3 7 Rostro en fruto inmaduro 0 1 0 1 0 0 0 1 gra15Son poly17Qro gra27Ariz gra31Son ped32N.L. gra34NMex ped42Mich ped43Mex ped47Mex ped48DF dasy50Hgo 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3.57 4.06 4.59 6.47 6.29 5.54 3.93 5.58 5.64 4.27 4.17 1.1 0.75 1 1.5 1.3 1.1 1.5 1 1.4 0.9 0.5 0.2 0.3 0.2 0.2 0.9 0.3 0.75 0.5 0.4 0.5 0.3 1.6 1.4 1 1.5 1.2 1.2 1.3 2.2 1.5 0.9 1 3.2 4.32 3.5 3.7 5 3.7 5.15 5.07 5.13 4.06 4.17 7.37 8.52 7.51 9.43 8.88 8.25 6.57 8.56 7.7 8.31 8.85 0.5 0.45 0.4 0.5 0.7 0.4 0.6 0.6 0.7 0.4 0.45 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0.35 0.35 0.4 0.4 0.2 0.3 0.3 0.4 0.35 0.3 0.2 3.73 4.55 3.86 5.27 5.26 4.66 4.15 3.69 4.34 3.46 4.66 6.1 6.59 7.6 8.11 8.45 9.03 7.82 9.21 8.97 7.34 8.09 1.8 1.8 1.2 1.5 2 1.6 1.6 2.2 1.8 1.4 1.5 5.2 3.5 2.5 3.2 4 3.2 3 3.7 3.8 2.5 2.5 1.49 1.53 0.64 2.26 1.46 1 1.34 0.98 1.4 1.32 1.05 7.93 7.37 12.51 13.07 12.72 13.2 7.73 9.81 10.73 6.53 7.15 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 2 2 3 2 1 3 1 1 1 1 1 2.8 4 3 3.3 5 2.8 2.7 2.3 3.3 2.5 2 0.9 1.8 0.8 1.1 2 0.6 1.3 1.1 1 1 0.7 150 55 125 570 140 195 100 170 145 60 250 4 4.5 5 10 6.5 7 7 6.7 4 8.5 6.5 100 30 80 280 75 115 65 90 60 35 75 50 25 45 290 65 80 35 80 85 25 175 4.38 4.11 8.18 6.32 7.91 5.83 6.04 4.95 4.58 4.3 4.45 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 2 1 2 1 2 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 2 2 1 1 2 2 1 1 1 0 1 27.5 9.26 17.37 42.32 25.23 37.89 14.59 63.4 22.62 12.6 34.99 9.2 3.77 7.94 12.64 8.24 11.81 5.03 13.62 8.97 5.16 12 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 gra51Ariz ped52DF ped53N.L. gra54Coa gra56Dur esp58Mex esp59DF ped61SLP ped62Mex ped63Hgo pedi64Mex 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6.03 4.14 5.92 5.34 5.37 5.27 6.05 5.75 5.51 6.07 9.32 0.5 1.2 0.95 0.5 0.75 0.9 0.75 1 0.9 1.5 0.9 0.25 0.6 0.55 0.3 0.25 0.5 0.4 0.5 0.5 0.35 0.4 0.9 1.5 1.3 1 1 1.8 0.8 1 1.4 1.5 2 4.75 5.96 4.4 3.64 3.63 5.01 4.87 5.36 4.19 5.52 5.92 9.55 7.64 8.71 7.93 8.16 8.01 8.31 8.21 8.22 8.99 8.19 0.5 0.7 0.7 0.5 0.5 0.4 0.35 0.35 0.7 0.3 0.5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 0.2 0.4 0.2 0.25 0.4 0.4 0.3 0.25 0.2 0.3 0.35 3.99 3.97 3.78 2.28 3.12 4.17 5.56 4.27 3.86 3.79 4.43 9.44 8.52 9.14 8.12 6.88 6.67 8.57 7.63 6.96 7.08 9.6 1.1 1.7 1.4 1.4 1.1 1.5 1.4 1.9 1.5 1.7 1.5 2.8 4.5 2.7 2.2 2 5 2.5 3.3 3.7 2.5 3.5 1.13 1.26 1.2 0.56 1.51 1.77 1.77 0.95 1.41 1.47 1.42 11.54 7.77 9.57 8.28 7.15 10.28 12.49 11.34 9.9 10.11 13.92 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 3 1 1 2 3 1 1 0 1 1 1 2 3.2 2.5 2.3 1.9 4 3.5 3.5 3 3.5 2.5 1 1 1.3 0.75 0.8 1.2 1.2 1.15 0.9 1.2 0.9 275 230 80 55 120 140 55 140 70 120 100 8.3 5.5 5.5 3 6 6 7.5 7 5.5 7 9 190 140 50 18 50 55 40 30 40 70 45 85 90 30 37 70 85 15 110 30 50 55 4.59 5.23 4.25 4 4.11 5.03 5.65 6.19 4.75 4.41 5.23 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1 2 1 0 1 1 1 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 2 2 1 1 1 2 1 1 1 2 1 36.03 19.06 21.55 12.48 21.92 26.09 47.52 16.18 20.89 18.51 50.96 12.39 6.73 8.89 5.19 11.91 9.02 11.52 7.77 7.69 4.97 15.89 0 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 gra66Chi poly67Qro gra68Dgo laxi69Ver ped70Mor ped71Mor ped73Mor laxi76Gro ped77Sin gra78Ariz 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3.96 4.68 4.97 5.93 5.97 4.62 4.84 4.67 6.73 7.72 1.6 0.8 0.9 1 1 1 0.9 1.2 0.6 1 0.25 0.45 0.4 0.4 0.4 0.5 0.4 0.6 0.5 0.25 1.5 1 0.8 1.6 1.7 0.9 1.3 1.6 1.2 1.6 3.68 4.82 4.4 5.6 5.02 4.07 4.33 4.8 3.9 4.45 7.58 8.21 8.11 9.66 9.32 7.64 9.13 7.75 8.47 8.85 0.5 0.5 0.4 0.8 0.6 0.5 0.4 0.8 0.5 0.5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 0 1 0.3 0.28 0.3 0.2 0.3 0.25 0.22 0.25 0.25 0.25 2.63 3.56 3.76 5.45 3.55 2.92 4.1 4.82 3.51 4.35 6.35 8 4.4 9.35 7.78 7.15 6.15 7.95 6.55 7.88 2 1.8 0.9 2.3 1.1 1.2 1.5 2.5 1.5 1.4 4 3 2.8 4.2 3.3 2.5 3.5 3.8 2.5 2.8 1.17 1.46 1.32 1.6 1.02 1.05 1.15 1.46 1 1.78 8.44 8.84 8.18 10.37 9.43 8.03 11.77 8.1 9.1 11.7 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 3 2 1 0 1 0 1 1 3 3 2.5 3.5 3.3 3.2 3 2.5 3 2 2.2 0.7 1 0.9 1 1 1 1 1.2 1.3 0.7 235 150 95 130 115 100 60 100 230 120 3 4.2 8 7 6.5 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gra109NMex oax110Oax oax111Oax oax113Oax esp114Pue esp115Mex gla120Ver 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 6.36 7.05 6.05 8.84 4.5 4.98 3.47 5.43 4.9 6.65 3.53 0.9 0.65 0.8 0.8 1.7 1.5 2.8 2.2 1.4 1 0.9 0.4 0.35 0.4 0.35 0.4 0.45 0.35 0.35 0.5 0.4 0.6 1.1 1 1.5 0.8 1.5 1.2 2.5 1.5 1.7 2.2 1.3 4.86 3.91 4.91 5.72 4.98 5.16 4.57 5.7 5.12 4.79 5.35 7.92 9.14 7.27 11.01 6.84 7.29 8.17 8.47 8.52 8.72 12.29 0.7 0.5 0.5 0.45 0.65 0.45 0.6 0.6 0.7 0.9 0.9 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0.6 0.45 0.4 0.45 0.45 0.6 0.23 0.25 0.23 0.53 4.16 2.67 3.14 4.97 4.89 4.19 3.96 5.59 4.51 3.88 3.12 8.63 9.07 6.78 10.93 8.22 7.43 8.02 9.88 8.81 8.64 11.49 1.5 1.2 1.3 1.5 1.8 1 1.3 1.7 2 2 1.8 3.5 2.5 3.7 2.3 3 2.3 3.5 4 3.5 3.5 2.5 1.46 0.93 0.94 1.19 2.72 0.92 0.73 1.61 1.08 1.09 0.94 10.29 12.61 10.12 12.86 8.05 8.2 7.7 9.09 7.8 9.31 8.92 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 3 1 2 3 0 0 0 1 1 0 3.5 2.2 2.3 2.5 4 2 3.5 3.8 3.7 2.8 2.8 1 0.9 0.7 0.8 1 0.85 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8.78 0.4 0.85 0.59 0.65 0.36 0.6 0.5 0.48 0.43 0.53 0.7 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0.3 0.21 0.29 0.31 0.22 0.23 0.28 0.27 0.21 0.27 0.22 4.59 4.14 3.56 5.18 3.21 5.05 5.57 5.24 4.85 4.68 4.02 7.71 8.58 7.07 9.5 8.78 8.16 8.04 10.14 9.67 10.24 7.55 1 2.1 1.17 1.75 1.4 1.65 1.24 1.41 1.6 1.27 1.6 3.1 3.56 3.67 4.71 2.63 5.4 4.46 2.82 3.4 2.89 3.36 1.91 1.4 1.36 1.38 1.1 1.83 1.76 2.07 1.41 1.5 1.21 7.59 8.98 7.24 10.37 11.43 9.47 9.36 11.94 12.33 11.53 8.78 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 2.65 2.7 3.3 3.01 2.7 4.38 2.9 3.91 3.04 2.19 2.61 1 1.27 0.96 1.2 1.34 1.76 0.95 0.76 1.26 1.05 1.08 190 100 60 105 75 80 100 190 135 90 95 4.67 12.5 6.68 7.55 7.02 6.52 7.9 8.6 7.07 6.2 6.58 110 45 30 60 43 55 42 110 49 60 45 80 55 30 45 32 25 58 80 86 30 50 4.6 5.23 5.85 6.37 5.24 5.51 6.31 5.35 4.33 5.26 4.47 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 2 1 1 1 1 3 2 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 2 2 1 1 1 1 1 2 2 1 26.64 40.35 16.66 27.61 21.03 22.5 24.9 52.3 38.55 17 30.74 11.48 12.5 6.5 8.54 7.41 7 9.6 19.76 12.95 5 9.95 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 pedi 227 Edo. Mex. gra 228 Dgo gra 229 Dgo. pur 230 Inv.(SLP) dasyP.M131 neg 489NvoLeón neg 8687NvoLeón neg 7145NvoLeón neg 24657Tamp neg 17171Tamp 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5.46 5.61 3.56 7.75 4.56 9.05 5.65 7.84 9.91 6.46 1.02 1.34 1.17 0.77 1.2 0.8 0.45 1.2 1 0.5 0.44 0.35 0.2 0.45 0.29 0.3 0.3 0.4 0.6 0.35 1.35 2.11 1.36 1 1.23 1.5 0.8 1 1.5 1 4.24 4.22 4.2 4.61 4.65 5.14 4.4 4.84 5.24 4.24 9.41 8.44 7.22 11.01 9.1 13.78 11.6 12.45 13.62 12.68 0.5 0.77 0.79 0.42 0.47 0.5 0.6 0.6 0.7 0.5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 2 2 2 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0.22 0.33 0.25 0.29 0.25 0.3 0.35 0.4 0.3 0.4 3.84 4.16 3.42 6.37 5.5 3.89 4.07 3.56 4.55 4.74 8.72 7.85 7.83 9.2 9.2 15.78 16.67 13.82 19.6 16.58 1.45 1.64 1.8 1.36 2.48 1.7 1.4 2 2 1.5 2.58 4.1 3.06 3.06 4.05 4 3 3.5 3.5 2.5 1.23 1.44 0.77 2.69 1.54 1.27 0.9 1.02 0.78 1.19 9.67 8.14 6.57 12.87 9.04 15.57 13.38 14.37 18.83 16.53 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 3 3 2 1 1 1 1 0 0 2.65 2.43 2.43 2.2 4.3 3.2 2.5 4.5 2.5 2.2 0.96 0.84 0.76 1.34 0.91 0.6 0.6 0.7 1.1 0.7 105 190 230 223.33 63 270 200 260 250 325 6.61 4 7.66 12.04 7.29 5.5 6.3 5 11 7.5 50 85 70 183.33 31 190 65 155 140 140 55 105 160 40 32 80 135 105 90 185 4.1 4.07 4.4 5.69 5.7 5.18 5.2 5.31 7.89 8.56 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 2 1 1 1 1 1 2 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 2 1 35 17.91 26.54 36.5 22.2 40.8 46 43.58 38.62 52.16 12.44 9.33 9.76 13.45 10.5 10.1 13.3 12.44 11.98 27.04 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 Anexo II.2. Análisis de componentes principales. Los caracteres resaltados en negritas son los que definen el fenograma. Output: NTSYSpc 2.11V, (C) 2000-2004, Applied Biostatistics Inc. Date & time: 23/01/2006 01:34:50 p.m. ---------------------------- Input parameters: Read input from file: E:\MBD(enero23-06) 940TUSconCapucha(45)Sinmed.folioEVE. NTS Format: width=9 decimals=4 Page width: 80 Field width: 9 Decimal places: 4 Page width: 80 Comments: STAND: input=E: \MBD (nov4-05) 940TUSconCapucha(45)Sinmed.folioN tsys.NTS, divide=STD, subts=YBAR, direction=Row SIMINT: input=E: \MBD (nov4-05) 940TUSconCapucha(45)Sinmed.folioS td.NTS, coeff=CORR, direction=Rows EIGEN: input=E:\MBD(Dic9-05) 940TUSconCapucha(45)Sinmed.folioC orr.NTS, k=4 vectors, length=SQRT(LAMBDA) Matrix type = 1, size = 39 by 4, missing value code = "none" (rectangular) C1 C2 C3 C4 ------------------------------------ Lobulación de folíolos lat 0.2363 0.7003 0.3014 0.1075 Fruto inmaduro pubesc. -0.0027 -0.0562 0.4596 0.2120 Rostro en fruto inmad. -0.3356 -0.2633 -0.3084 -0.3654 Fruto coriáceo 0.1983 -0.2623 0.1881 0.3852 Peciolo de hoja de inflo. -0.5660 -0.2795 0.0921 -0.1840 Longitud raquis foliólo -0.6244 -0.1584 0.1274 -0.2513 largoestípulas 0.1329 -0.4255 0.4019 0.2115 Ancho de estípulas 0.1765 -0.4084 0.3032 -0.1086 Largo estipelas -0.1939 -0.4636 0.1013 0.1527 Ancho estipelas -0.1661 -0.3401 -0.0524 -0.1359 Longitud de inflo. -0.6420 0.3562 0.3705 -0.0507 Longitud de pedúnculo -0.6342 0.2567 0.3078 -0.0558 Longitud deraquis inflo. -0.4707 0.3738 0.3421 -0.0365 Longitud de la bráctea -0.0114 -0.5790 0.3336 0.1223 Ancho de la bráctea 0.2228 -0.4905 0.5611 -0.4603 Longitud del pedicelo -0.4421 -0.4058 -0.1834 0.1020 Longitud de la bractéola 0.0888 -0.4351 -0.1619 0.4525 Ancho de la bractéola -0.0163 -0.5220 -0.2936 0.1870 Largo del cáliz -0.1774 -0.4042 0.4783 0.4691 Ancho del cáliz -0.2263 -0.6422 -0.0096 0.0742 Largo diente ventral cáli 0.0819 -0.1708 0.4831 0.4132 Largo del estandarte -0.8726 -0.0902 -0.0323 0.0208 Ancho del estandarte -0.8313 -0.0432 -0.1684 0.1047 Largo del ala derecha -0.6931 0.1082 0.1608 0.2424 Ancho del ala derecha -0.4515 0.1009 0.0648 0.2473 Longitud del ovario -0.5114 -0.1607 0.1115 0.2064 # de nerv. estípulas -0.1380 0.3526 -0.0101 0.2391 # de nerv. estipelas -0.3893 -0.2797 -0.3740 -0.2294 Acúmenes en folíolo lat. 0.0162 0.1311 0.2852 -0.0382 # de nudos en raq. inflo. -0.0274 -0.3777 -0.3564 0.0572 # de nerv. bráctea 0.0752 -0.3468 0.3855 -0.5458 # de nerv. bractéola -0.1433 -0.0903 -0.5416 0.1446 # de vueltas en quilla 0.1923 0.0945 0.2536 0.2094 # de óvulos -0.5854 0.1359 0.1100 0.0498 Bráctea trífida 0.0885 -0.2711 0.4522 -0.5513 Color de flor -0.8068 0.0440 -0.0511 -0.0816 Grueso del pedicelo -0.1922 0.1304 -0.0050 -0.4196 Lobulación folíolo central -0.2000 0.7472 0.1801 0.0301 Forma del estandarte 0.0113 0.0396 0.0352 0.1375 Ending date & time: 23/01/2006 01:34:50 p.m. CAPÍTULO III ESTUDIOS CITOGENÉTICOS ESTUDIOS CROMOSÓMICOS EN PHASEOLUS No obstante que los estudios cromosómicos pueden ser utilizados como una herramienta importante en la resolución de problemas taxonómicos (Almeda y Chuang, 1992; Green et al., 1980; Thomas, 1973), la mayoría de ellos se han realizado en especies cultivadas y pocos han involucrado a las silvestres. Goldblatt (1981) propuso que el número cromosómico básico para las Fabaceae es x= 7, ese número solo se presenta en Cercis (Caesalpinioideae). A partir de x= 7 se dio una poliploidía temprana acompañada de aneuploidías con pérdida o ganancia de uno o varios cromosomas, originando con ello desviaciones del poliploide n= 14 y dando como resultado toda una serie de números cromosómicos básicos en los diferentes géneros de las fabáceas. Poliploidías posteriores se han presentado en grupos como Leucaena, en el que en algunas especies se ha registrado un número diploide (2n) por arriba de los 100 cromosomas (Kumari y Bir, 1985; Palomino et al., 2000). Federov (1974) presenta como primer reporte de número cromosómico en el género Phaseolus el de Kleinmann en 1923 para P. multiflorus con 2n= 24, registro que parece erróneo, sobre todo por la técnica utilizada en esa época para las determinaciones cromosómicas, que consistía en la inclusión del tejido en parafina y la realización de los cortes correspondientes. Senn (1938) por su parte, en su trabajo sobre los números cromosómicos en las fabáceas, señala que Karpenchenko determinó un 2n= 22 en P. lunatus, P. vulgaris, P. multiflorus (=P. coccineus) y P. acutifolius. El género se caracteriza por la constancia intraespecífica en el número cromosómico. Las especies que han sido reportadas como poliploides, se han inducido. Goldblatt (1981), Lackey (1979) y Mercado-Ruaro y Delgado-Salinas (1996) propusieron, con base en los reportes disponibles que, al igual que en la tribu Phaseoleae, el número cromosómico básico en el género es x= 11, existiendo un número haploide de n=10 en tres especies: P. leptostachyus, P. micranthus y P. macvaughii (Mercado-Ruaro y Delgado- Salinas, 1998), surgiendo así un número básico secundario de x= 10. El número cromosómico de estas tres especies, junto con información morfológica, hicieron que Debouck (2000) las considerara parte de un grupo distinto y Freytag y Debouck (2002) las integraron en la sección Falcati, junto con otras dos nuevas especies, de las que se desconoce su número cromosómico. El porcentaje de especies a las que se les ha determinado el número cromosómico es de 43%, y disminuye notablemente a 14% al considerar las analizadas cariotípicamente. No obstante, con la información disponible es posible sugerir que el cariotipo de las especies de Phaseolus es simétrico por la predominancia de cromosomas metacéntricos y submetacéntricos. P. chiapasanus es la única especie registrada con cromosomas subtelocéntricos (Mercado-Ruaro y Delgado-Salinas, 1998, 2000). Algunos autores (Sarbhoy, 1977, 1980; Sinha y Roy, 1979a, 1979b) señalan que, en la evolución cariotípica del grupo, han estado involucradas principalmente las inversiones pericéntricas y paracéntricas, translocaciones y pérdida o ganancia de cromatina. También proponen que el cariotipo de Phaseolus ha evolucionado hacia una asimetría, con una disminución en el contenido total de la cromatina. Mercado-Ruaro y Delgado-Salinas (1998) señalan, de las 10 especies que analizaron cariotípicamente, a P. filiformis como la más primitiva cariotípicamente, por presentar todos sus cromosomas metacéntricos y una baja longitud cromosómica, ambas características señaladas como primitivas por Stebbins (1971); también Mercado-Ruaro y Delgado-Salinas (1998, 2000) encuentran que la aneuploidía, contrariamente a lo que se consideraba, sí ha participado en la evolución del cariotipo, al encontrar tres especies aneuploides con 2n= 20. El trabajo de Mercado-Ruaro y Delgado-Salinas (1998) proporciona un análisis cromosómico en 10 especies silvestres donde se observan diferencias en los cariotipos. La falta de estudios cariológicos se atribuye a la pequeña talla que presentan los cromosomas en este grupo y a la dificultad que esto conlleva (Hucl y Scoles, 1985; Zheng et al., 1991). ESTUDIOS DE CONTENIDO DE ADN NUCLEAR EN EL GÉNERO Phaseolus L. Una vez que se reconoció al ADN como el principal material genético en la mayoría de los organismos, y al tenerse mayor conocimiento de los mecanismos por los cuales la información genética se codifica, rápidamente se convirtió en uno de los principales focos de investigación biológica. Uno de los objetivos de investigación, fue conocer el tamaño del genoma nuclear en diferentes organismos (Bennett y Leitch, 1995), es así que Ohri (1998) considera que el estudio del ADN nuclear es crucial para un entendimiento global del genoma de un organismo. Bennett y Leitch (1997) señalan que el conocimiento del contenido de ADN nuclear puede tener aplicaciones en diferentes campos de la biología como es el caso de sistemática y evolución, ecología, biología celular y molecular, fisiología y paleontología. De acuerdo con Greilhuber (1998), el tamaño del genoma es un carácter más, y como tal, tiene significado taxonómico como cualquier otro, o tal vez más, ya que su diversificación depende de cientos e inclusive miles de pasos mutacionales. El contenido de ADN en las angiospermas varía aproximadamente en valores 1C de 0.1 a 127.4 picogramos, en donde 1C es la cantidad nuclear de ADN no replicado en los gametos de un organismo (Fay et al., 2005). El contenido de ADN se modifica por mecanismos que pueden tener poco impacto, como son las inserciones o deleciones (INDEL), o por otras vías, como la poliploidía y los transposones en donde el efecto es mayor (Bennetzen et al., 2005, San Miguel et al., 1996). Se ha establecido que variaciones en el contenido del ADN tienen incidencia en el fenotipo celular (Bennett, 1972). Algunas de las consecuencias mencionadas por Knight et al. (2005) en especies que tienen un alto contenido de ADN, es un bajo promedio de diversificación y un alto riesgo de extinción y, que dichos organismos no se encuentran en ambientes extremos, nunca tienen semillas pequeñas y se caracterizan por bajos niveles fotosintéticos. Se menciona con frecuencia, la existencia de una correlación negativa entre latitud y altitud con el contenido de ADN, aunque, resultados de Bennett (1987), Bennett et al. (1982), Levin y Funderburg (1979) y Rayburn (1990), sugieren que la verdadera relación entre el tamaño del genoma con la altitud y latitud, se encuentra representada más adecuadamente por una distribución unimodal, en donde las especies con bajo contenido de ADN pueden existir en cualquier elevación o latitud, como ocurre con Phaseolus microcarpus; especies con elevados contenidos de ADN pueden encontrarse excluidos de los extremos. Greilhuber (1998) señala que mucha de la variación intraespecífica que se reporta en las especies vegetales puede ser relacionarse con un error metodológico ocasionado por la especie que se utiliza de referencia, recomendando emplear una que muestre valores cercanos a la o las especies que se pretendan analizar. Gregory (2005) y Greilhuber (2005) mencionan varios factores que afectan una adecuada determinación del ADN nuclear y que pueden dar la impresión de variaciones intraespecíficas que en realidad son artefactos causados por una inadecuada aplicación de la técnica o al contenido celular que interfiere con la tinción del ADN. En el caso particular de Phaseolus, al igual que en los estudios cromosómicos, en los realizados sobre contenido de ADN nuclear hay especies que son referidas como pertenecientes a Phaseolus, cuando actualmente están ubicados en géneros cercanos (Mercado-Ruaro y Delgado-Salinas, 1998); por ejemplo, P. angularis (Willd.) Wight reportada por Ayonoadu (1974) con un valor 2C de 2.8 picogramos, actualmente es Vigna angularis (Willd.) Ohwi & Ohashi, mientras que P. geophyllus Burk. (2C= 2.6 pg) y P. lathyroides L. (2C= 2.3 pg), ambas especies también reportadas por Ayonoadu (1974), pertenecen al género Macroptilium (Benth.) Urban. Una revisión condensada sobre los estudios citogenéticos que se han realizado en Phaseolus se presenta en el trabajo de Mercado-Ruaro y Delgado-Salinas (2000). La revisión fue resultado de una actividad complementaria desarrollada por el primer autor durante la presente investigación (Anexo III.1). MATERIALES Y MÉTODOS CROMOSOMAS El material utilizado fue el que se obtuvo de las salidas al campo; las especies estudiadas y su procedencia se enlistan en la Cuadro III.1. Todos los ejemplares de respaldo están depositados en el Herbario Nacional de México (MEXU). Cuadro III.1. Especies del género Phaseolus que fueron analizadas cromosómicamente. Especie Colector Procedencia P. dasycarpus P. Mercado et al. 131 Hidalgo P. esperanzae P. Mercado et al. 23 Puebla P. esperanzae P. Mercado y A. Reyes 98 Puebla P. glabellus P. Mercado s/n Puebla P. grayanus P. Mercado et al. 60 San Luis Potosí P. grayanus P. Mercado et al. 145 Aguascalientes P. laxiflorus P. Mercado y A. Reyes 102 Veracruz P. neglectus P. Mercado et al. 49 San Luis Potosí P. oaxacanus P. Mercado y F. Tapia 91 Oaxaca P. pedicellatus G. Ibarra 403 Michoacán P. pedicellatus P. Mercado 70 Morelos P. pedicellatus P. Mercado et al. 127 San Luis Potosí P. pedicellatus P. Mercado 181 Morelos P. pedicellatus P. Mercado y G. Flores 40 Puebla P. pedicellatus P. Mercado et al. 114 Edo. de México P. purpusii R. Torres 15438 San Luis Potosí El resto de las especies no fueron consideradas por carecer de material biológico ya que no fue posible obtener ejemplares durante las salidas al campo. Así, que de las 11 especies reconocidas por Freytag y Debouck (2002) en la sección Pedicellati, sólo fue posible analizar a seis de ellas, aunque hay que agregar a P. dasycarpus, especie que de acuerdo, con el capítulo anterior, pertenece a dicha sección. Como se mencionó en el capítulo anterior, por ser especies cercanas a las de la sección Pedicellati, y a manera de comparación, P. glabellus y P. neglectus también fueron incluidas en el análisis citogenético. Los cromosomas mitóticos fueron observados y analizados en células meristemáticas de punta de raíz, obtenidas de la germinación de semillas en cajas de petri con algodón y papel filtro humedecidos a temperatura de 300C en oscuridad. Se cortaron las raíces con una longitud de 1 – 2 cm y se pretrataron con 8 hidroxiquinoleína 0.002 M por 5 horas a temperatura ambiente, posteriormente se fijaron en solución farmer (alcohol etílico absoluto-ácido acético 3:1) durante 24 horas como mínimo; las raíces fueron lavadas con agua destilada e hidrolizadas en HCl 1N a 600C durante 12 minutos, posteriormente se tiñeron con solución Feulgen por espacio de una hora en oscuridad. El aplastamiento de la punta de raíz teñida se realizó con una gota de acetorceína al 1%; las preparaciones permanentes se obtuvieron siguiendo el método de hielo seco de Conger y Fairchild (1953) y se encuentran en la colección de preparaciones cromosómicas del Laboratorio de Fanerogamia del Instituto de Biología de la UNAM. Para las fotografías se utilizó un fotomicroscopio Carl Zeiss Axioskop. Las mediciones se realizaron en fotografías de células metafásicas; se utilizaron por lo menos 5 células por especie. En la clasificación de los cromosomas se siguió a Levan et al. (1964). El número fundamental y simetría del cariotipo se calcularon de acuerdo a Matthey (1945) y Huziwara (1962), respectivamente. Los cromosomas meióticos fueron observados en células madres del polen obtenidas de botones florales colectados entre las 8:00 A.M. y 15:00 P.M. y fijados en solución farmer. Las anteras fueron separadas y abiertas en un portaobjetos, se les agregó una gota de acetocarmín al 2% y otra de solución de Hoyer, se mezcló de manera homogénea con la ayuda de una varilla de vidrio y posteriormente se colocó un cubreobjetos y se aplastó de manera suave, la preparación fue revisada en el microscopio para observar si contenía células madres del polen en división meiótica. Si la preparación contenía células en división, se presionaba con mayor fuerza con el dedo pulgar para lograr una mayor separación de los cromosomas. Los mejores campos fueron fotografiados y analizados para determinar el comportamiento cromosómico en la primera división meiótica. CONTENIDO DE ADN La cuantificación de ADN se llevó a cabo en los Royal Botanic Gardens de Kew, Inglaterra, en una estancia realizada con la Dra. Ann Kenton ( ). Las mediciones fueron realizadas en células meristemáticas de ápice radicular, la técnica utilizada fue la descrita por Bennett y Smith (1976): Vigna radiata (L.) Wilczek con cantidad de ADN conocida de 4C de 2.1 picogramos (pg) se utilizó como referencia (estándard). Raíces en división celular activa de cada especie a analizar se colectaron y colocaron en fijador alcohol etílico-ácido acético (3:1). Al mismo tiempo también se fijaron raíces de la planta estándard en un recipiente aparte; se introdujeron en fijador fresco ambos grupos de raíces después de 30 min. Las raíces pudieron ser utilizadas después de 24 horas de fijación, pero no en un lapso mayor de 15 días, ya que un tiempo prolongado en el fijador puede afectar la tinción. Las raíces se hidrolizaron en HCl 1N durante 12 minutos a 60oC, se extrajeron y se tiñeron en solución de feulgen hecho a base de pararosanilina por 2 h a 23oC; se realizaron tres lavados con agua sulfatada de 10 minutos cada uno, las raíces fueron colocadas en agua destilada antes de hacer las preparaciones. Se aplastaron los meristemos radiculares en una gota de ácido acético al 45% y se sellaron las preparaciones para su posterior observación, la cual no debió exceder las 7 horas. En total se analizaron tres preparaciones con buenos campos en interfase o metafase de la especie problema y del estándar; se midieron 10 núcleos interfásicos por preparación con 3 valores integrados por núcleo. Las mediciones se realizaron en un microdensitómetro Vickers M85a con longitud de onda de 560 nm. La cantidad de ADN se calculó del valor medio de cada núcleo de los tres valores integrados, el valor medio para cada preparación de los 10 núcleos medidos y el valor medio y error estándar entre las tres preparaciones. Las cantidades obtenidas son unidades arbitrarias y se transforman a picogramos utilizando la siguiente fórmula: pg= Unidades arbitrarias de la sp. problema x cantidad de ADN de la especie referencia Unidades arbitrarias de la especie referencia RESULTADOS Y DISCUSIÓN CROMOSOMAS Se obtuvieron los cromosomas mitóticos de P. dasycarpus, P. glabellus, P. grayanus, P. esperanzae, P. laxiflorus, P. pedicellatus, P. neglectus y P. purpusii; algunas especies fueron analizadas de varias poblaciones. Se observaron cromosomas meióticos en P. dasycarpus, P. glabellus, P. grayanus, P. laxiflorus, P. oaxacanus y P. pedicellatus. Con la información disponible y la obtenida en el presente estudio, siguiendo la clasificación de Freytag y Debouck (2002), se conoce del género Phaseolus el número cromosómico de 32 especies (43%) y 1 variedad (Phaseolus maculatus var. ritensis); 29 especies, junto con la variedad presentan un número cromosómico de 2n= 22, las tres especies restantes tienen 2n= 20. Las figuras III.1 y III.2 muestran algunas de las células mitóticas obtenidas en el presente estudio, todas ellas con 2n= 22. De las especies a las que se les determinó el número cromosómico diploide, únicamente en Phaseolus purpusii no fue posible la obtención de cromosomas con una buena contracción que permitieran determinar su fórmula cariotípica y solo fue posible la cuantificación del número cromosómico. La fórmula cariotípica de las otras especies se caracteriza por la predominancia de cromosomas metacéntricos y submetacéntricos, como ya anteriormente habían establecido Mercado-Ruaro y Delgado Salinas (1998). Se observaron cromosomas del tipo subtelocéntrico en Phaseolus grayanus procedente de Aguascalientes y en P. glabellus de Puebla, con ello se incrementó la cantidad de especies que presentan dichos cromosomas, dejando de ser exclusivos de P. chiapasanus como habían reportado Mercado-Ruaro y Delgado-Salinas (1998) (Cuadro III.2). Se confirma el número cromosómico básico x=11 propuesto por Goldblatt (1981) y Mercado-Ruaro y Delgado-Salinas (1998), y un número secundario de x= 10 en tres especies (sección Falcati). P. glabellus y P. neglectus que también fueron analizadas mostraron número cromosómico diploide de 2n= 22 (Fig. III.2. A-B y III.4.C). De los 10 taxa analizados, nueve presentaron un par de cromosomas con constricción secundaria, mientras que, en Phaseolus pedicellatus proveniente de Veracruz no se observó dicha característica. Esto puede deberse a que las células analizadas presentan los cromosomas muy condensados o a que la separación entre el satélite y el resto del cromosoma sea muy pequeña, impidiendo que pueda observarse al microscopio la constricción secundaria. La longitud de la cromatina por complemento diploide varió de 21.51 µm en P. esperanzae a 39.16 µm en P. pedicellatus del estado de Morelos. El tamaño de los cromosomas varió ampliamente: el más pequeño lo presentó P. pedicellatus de Veracruz (0.72 µm), mientras que el más grande correspondió a P. pedicellatus de Morelos (2.31 µm). El menor índice de simetría y que indica un cariotipo más asimétrico correspondió a P. pedicellatus de Michoacán, con un valor TF% de 37.91, mientras que el índice mayor corresponde a P. pedicellatus de Morelos con un TF% de 42.28. En lo referente al número fundamental (número de brazos cromosómicos en complementos cromosómicos haploides, 2 para cromosomas metacéntricos y submetacéntricos y 1 para los subtelocéntricos, telocéntricos y acrocéntricos), en la mayoría fue de 22 y únicamente en las dos poblaciones que presentaron cromosomas subtelocéntricos se redujo a 21. Los cromosomas fueron pequeños como era de esperarse por reportes previos (Hucl y Scoles, 1985; Mercado-Ruaro y Delgado-Salinas, 1998). Phaseolus esperanzae presentó una longitud total de los cromosomas menor al resto de las especies con 21.51 µm, mientras que P. pedicellatus de Veracruz mostró mayor longitud total con 39.14 µm. En los datos del Cuadro III.2., puede apreciarse que existe variación intraespecífica en la longitud total de la cromatina: P. pedicellatus presenta una variación intraespecífica de 26. 14 µm a 39.14 µm, mientras que en P. grayanus es de 29.8 µm a 33.58 µm. La variación intraespecífica observada en las poblaciones analizadas puede ser real, como se ha encontrado en Milium effusum L. (Bennett y Bennett, 1992) y Dactylis glomerata L. (Reeves et al., 1998) por citar algunos ejemplos, y en donde dichas variaciones se han correlacionado con distintas condiciones ecogeográficas en que se localizan las poblaciones; sin embargo, no se descarta que las variaciones observadas en la longitud total de los cromosomas sean resultado de diferencias en la condensación de los cromosomas durante el ciclo mitótico, tal y como se ha observado en poblaciones de Crotalaria incana L. (Tapia-Pastrana et al., 2005). Otra explicación para las variaciones en el tamaño del genoma puede ser resultado de la presencia de ADN repetitivo, compuesto en su mayoría por transposones (Knight et al., 2005), principalmente del tipo Retrotransposones-LTR (Long Terminal Repeat- Retrotransposons) que pueden encontrarse en distintas cantidades y que se asocian a grandes regiones heterocromáticas que se localizan a los lados de los centrómeros (Bennetzen et al., 2005). Respecto al análisis meiótico, con excepción de Phaseolus laxiflorus de Maltrata, Ver. y P. pedicellatus proveniente del estado de Morelos, la segregación cromosómica en las poblaciones analizadas fue normal, con formación de 11 bivalentes. En el caso de P. pedicellatus del estado de Morelos, se observó la presencia de puentes cromosómicos durante la primera división meiótica (Fig. III.3.A), probablemente como resultado de una separación tardía de los cromosomas después de la sinapsis correspondiente, mientras que en P. laxiflorus, se observó la formación de cromosomas multivalentes, pero no en la primera división meiótica, que sería lo normal si se tratara de una especie autopoliploide; dichas formaciones fueron observadas en la segunda metafase meiótica (Fig. III.4. A). Esta agrupación de varios cromosomas puede considerarse como aglutinación cromosómica la cual, de acuerdo con Beadle (1932), es una clase de “pegajosidad” cromosómica de naturaleza desconocida, que produce una apariencia picnótica o aglutinada de los cromosomas; las aglutinaciones se producen por ciertas mutaciones génicas, y se pueden inducir mediante la aplicación de una gran variedad de agentes físicos y químicos, durante el estado condensado de los cromosomas, en mitosis y meiosis; sin embargo, al final del proceso meiótico, todas las células observadas tenían 11 cromosomas, indicando una segregación normal (Fig. III.4. B). En el caso particular de Phaseolus dasycarpus, especie ubicada por Freytag y Debouck (2002) en la sección Paniculati, a diferencia de los resultados obtenidos en el presente estudio, que la colocan en la sección Pedicellati, tuvo una formación de 11 bivalentes y segregación normal, como se aprecia en la Fig. III.2. C. Cuadro III.2. Análisis cariotípico de 10 poblaciones de especies de la sección Pedicellati, junto con Phaseolus glabellus y P. neglectus. Especie Localidad y colector n 2n Fórmula cariotípica (haploide) Constricciones secundarias Longitud total de la cromatina (µm) Intervalo de longitud de los cromosomas (µm) Índice de simetría (TF%) Número fundamental P. dasycarpus Hidalgo, P. Mercado et al. 131 11 22 9m + 2sm 1sm 30.37 1.12 – 1.69 41.16 22 P. esperanzae Puebla, P. Mercado et al. 23 22 7m + 4sm 1sm 21.51 0.77 – 1.21 39.05 22 P. grayanus La Congoja, Ags., P. Mercado et al. 145 ND 22 6m + 4sm + 1st 1m 29.8 0.95 – 1.69 38.15 21 P. grayanus El Peaje, S. L. P., P. Mercado et al. 60 11 22 10m + 1sm 1m 33.58 1.18 – 1.81 41.05 22 P. laxiflorus Maltrata, Veracruz, P. Mercado y A. Reyes. 102 11 ND ND P. oaxacanus Oaxaca, P. Mercado y F. Tapia 91 11 ND ND P. pedicellatus Michoacán, G. Ibarra 403 11 22 6m + 5sm 1sm 26.14 0.86 – 1.6 37.91 22 P. pedicellatus Morelos, P. Mercado 181 11 22 8m + 3sm 1m 39.16 1.35 – 2.31 42.28 22 P. pedicellatus Río Verde, S. L. P., P. Mercado et al. 127 ND 22 8m + 3sm 1sm 31.23 1.02 – 1.79 39.19 22 P. pedicellatus Veracruz P. Mercado y A. Reyes 106 ND 22 6m + 5sm No se observaron 39.14 0.72 – 1.31 39.14 22 P. purpusii San Luis Potosí, R. Torres 5438 ND 22 ND P. glablellus Puebla, P. Mercado s/n 11 22 7m + 3sm + 1st 1st 25.31 0.91 – 1.54 38.95 21 P. neglectus Nuevo León, A. Delgado 1015 22 10m + 1sm 1sm 28.04 1.09 – 1.45 45.15 22 m= metacéntrico, sm= submetacéntrico, st= subtelocéntrico; TF% = Long. total de brazos cortos/ Long. total de los cromosomas X 100; ND= no determinado Figura III.1. Células en metafase durante la división mitótica, A) Phaseolus dasycarpus, Hidalgo; B) P. esperanzae, Puebla; C) P. grayanus, La Congoja, Ags.; D) P. grayanus, El Peaje San Luis Potosí. La escala equivale a 10 µm. Figura III.2. A) Phaseolus glabellus, Zacapoaxtla, Pue. Cromosomas mitóticos 2n= 22; B) P. neglectus, San Luis Potosí. Cromosomas mitóticos 2n= 22; C) P. dasycarpus, Hidalgo, Meiosis, metafase II D) P. grayanus, El Peaje, S. L. P. Meiosis, metafase I; E) P. pedicellatus, Morelos. Meiosis, metafase II. La escala corresponde a 10 µm. Figura III.3. A) Phaseolus pedicellatus Morelos. Meiosis, metafase II; B) P. pedicellatus Morelos.Meiosis, anafase-telofase I; C) P. pedicellatus, Aputzio, Michoacán. Meiosis, Profase I; D) P. pedicellatus, Morelos. Meiosis, anafase I; E) P. pedicellatus, Zinapécuaro, Michoacán. Meiosis, metafase I. La escala equivale a 10 µm. Figura III.4. A) Phaseolus laxiflorus, Maltrata, Veracruz. Meiosis, Anafase-telofase I.; B) P. laxiflorus, Maltrata. Meiosis, metafase II; C) P. glabellus, Nauzontla, Pue. Meiosis, metafase II La escala equivale a 10 µm. CONTENIDO DE ADN Los resultados sobre contenido nuclear se obtuvieron durante una estancia que realicé en el Jodrell Laboratory de Kew Gardens, Inglaterra, en el área de citogenética con la fallecida Dra. Ann Kenton y que por comunicación personal fueron publicados en Bennett y Leitch (1995); no obstante, un análisis sobre el particular no se ha realizado. En el Cuadro III.3., se enlistan las especies de Phaseolus a las que se les determinó el contenido de ADN nuclear, junto con una revisión sobre las especies que han sido reportadas con anterioridad por otros autores. De las referencias consultadas se eliminaron las especies que, de acuerdo con Verdcourt (1970) y Maréchal et al. (1978), entre otros autores, no pertenecen al género. Así, a 30 especies se les ha cuantificado el contenido nuclear, representando el 40% del total de ellas (sensu Freytag y Debouck, 2002). También se aprecia que son pocos los estudios realizados en el género, de no ser por los análisis de Nagl y Treviranus (1995) y los de Mercado-Ruaro y Kenton (1995); la información al respecto estaría concentrada en P. acutifolius, P. coccineus, P. lunatus y P. vulgaris, todas especies cultivadas. Los valores 2C dentro del género oscilan de 0.9 pg en Phaseolus macvaughii a 3.7 pg en P. vulgaris; del análisis del Cuadro III.3., se aprecia que existen diferencias en los valores que se han obtenido para una misma especie, los valores reportados por Ayonoadu (1974) y Castagnaro et al. (1990) son aproximadamente el doble de los generados por los otros autores para las mismas especies; la diferencia puede ser ocasionada porque la especie Allium cepa L. fue utilizada como referencia con 2C= 33.55 pg, mientras que Nagl y Treviranus (1995) incluyeron a Petunia hibrida cv. PxPc6 (INRA, Dijon) con 2C= 2.85 pg y Mercado-Ruaro y Kenton (Bennett y Leitch, 1995) recurrieron a a Vigna radiata (L.) Wilczek cuyo contenido 2C es de 1.05 pg. Gregory (2005) destaca la importancia de la especie tomada como referencia, indicando que debe ser una que tenga valores cercanos a las especies que se pretendan analizar. Greilhuber (2005) por su parte, señala varios elementos metodológicos que pueden provocar errores en la cuantificación, algunos de ellos es el tipo de fijador utilizado, contenido celular, tiempo de fijación, etc., e igualmente la especie de referencia (Greilhuber, 1998). Otra causa en la discrepancia en los resultados obtenidos es la técnica empleada, Ayonoadu (1974); Castagnaro et al. (1990) y Mercado-Ruaro y Kenton utilizaron microcitofotometría, mientras que la citometría de flujo fue aplicada por Nagl y Treviranus (1995) en sus cuantificaciones. Si se ignoran los datos de Ayonoadu (1974), suponiendo que sean incorrectos por la especie usada de referencia, y por ello los valores son más discrepantes del resto de las determinaciones, se observa entonces que la variación dentro del género es de 0.9 a 2.18 pg (2C) en Phaseolus macvaughii y P. pluriflorus, respectivamente, una diferencia de aproximadamente 2.25 veces. También las conclusiones vertidas por Ayonoadu (1974) deben ser vistas con cautela, ya que están basadas en especies que actualmente pertenecen a distintos géneros y por lo tanto no pueden aplicarse en lo particular al género Phaseolus; los agrupamientos taxonómicos sugeridos por dichos autores, tomando como referencia las diferencias en el contenido nuclear ya no son válidos por combinar varios géneros dentro de su análisis. En el Cuadro III.3., se observa que los registros más bajos se presentan en Phaseolus microcarpus, P. micranthus y P. leptostachyus, mientras que los valores intermedios se encuentran de manera general en las formas cultivadas de P. lunatus y P. vulgaris y los valores más altos en P. grayanus, P. neglectus, P. glabellus y P. pluriflorus. Nagl y Treviranus (1995) determinan que algunas poblaciones silvestres presentan un contenido mayor de ADN nuclear en comparación con las poblaciones cultivadas. Bennett y Bennett (1992) observan especies donde las formas cultivadas son las portadoras de un mayor contenido de ADN nuclear, en el caso particular de Phaseolus, no se aprecia un incremento en el contenido de ADN como respuesta a la domesticación. Los valores obtenidos por Mercado-Ruaro y Kenton (en Bennett y Leitch, 1995) son menores a los de Nagl y Treviranus (1995); no obstante, hay coincidencia en que Phaseolus micranthus, P. leptostachyus y P. microcarpus son especies en las que se observan bajos valores en el tamaño del genoma, aunque P. macvaughii presenta el valor más pequeño (2C= 0.9 pg). Lo anterior es interesante desde el punto de vista de evolución del cariotipo y por lo tanto del tamaño del genoma; esta especie, junto con P. micranthus y P. leptostachyus presentan un número diploide de 2n= 20, apoyando así la propuesta de Mercado-Ruaro y Delgado-Salinas (1998) de que la reducción del número cromosómico estuvo acompañada de pérdida de material genético a través de translocaciones, seguido de la eliminación de un par de cromosomas carentes de información genética importante después de las translocaciones. Aun cuando existen diferencias en los valores obtenidos por Nagl y Treviranus (1995) y Mercado-Ruaro y Kenton (en Bennett y Leitch, 1995), en general ambos presentan la misma tendencia en estas especies analizadas. Cuando se relaciona la información que existe sobre el contenido de ADN nuclear con los grupos (subclados) que resultan del análisis filogenético de especies silvestres y cultivadas de Phaseolus que realizaron Delgado-Salinas et al. (1999), P. microcarpus es el grupo que resulta basal respecto al resto de las especies del género y coincidentemente es una de las especies que muestran, tanto en los datos de Nagl y Treviranus (1995), como en los de Mercado-Ruaro y Kenton (en Bennett y Leitch, 1995) uno de los valores más bajos en su ADN nuclear (1-1.2 pg); lo anterior implicaría que la evolución del genoma en el género se inicia con un valor bajo y la tendencia entonces es hacia un incremento en el contenido nuclear. Un grupo que presenta valores bajos en el contenido de ADN nuclear (0.9-1.2 pg) es el denominado P. leptostachyus por Delgado-Salinas et al. (1999) o sección Falcati de acuerdo con Freytag y Debouck (2002) y que incluye a todas las especies con número cromosómico haploide de 2n= 20 (Mercado- Ruaro y Delgado-Salinas (1998). El bajo contenido de ADN nuclear puede ser atribuido a la pérdida de un par cromosómico. El resto de los grupos incluyen especies que presentan bajos o altos valores en el contenido de ADN nuclear, estableciendo así que se trata de un carácter independiente de las relaciones interespecíficas dentro del género. En el caso particular de la sección Pedicellati, se cuantificó el ADN nuclear a Phaseolus esperanzae, P. grayanus y P. pedicellatus en donde los valores oscilaron de 1.2 pg a 1.9 pg. El valor más alto corresponde a P. grayanus con 1.9 pg y fue determinado por Nagl y Treviranus (1995); lamentablemente, no se menciona el sitio de colecta del material y únicamente se sabe que proviene de México. Para esta misma especie, Mercado-Ruaro y Kenton encontraron 1.1 pg, valor más cercano a las otras dos especies de la sección Pedicellati (1.1-1.5pg). Independientemente del 1.9 pg de P. grayanus, los valores encontrados en especies de la sección Pedicellati son bajos y muy cercanos al valor mínimo de 0.9 pg registrado para P. macvaughii. CONCLUSIONES La sección Pedicellati (sensu Freytag y Debouck, 2002) presenta un número básico de 2n= 22 y segregación cromosómica normal. Los cariotipos presentan principalmente cromosomas metacéntricos y submetacéntricos, considerandose simétricos. No se observaron diferencias que permitan utilizar el cariotipo como un elemento en la delimitación de las especies. Las tres especies de la sección Pedicellati a las que se les determinó el contenido de DNA nuclear se caracterizaron por presentar bajos valores (1.1 – 1.9 pg). El contenido de ADN nuclear en el género Phaseolus es pequeño, oscilando de 0.9 picogramos en Phaseolus macvaughii a 3.7 en la forma silvestre de P. vulgaris. No existe una evidencia clara de que haya un incremento en el contenido de ADN como resultado de la domesticación. Las diferencias que se observan en el contenido de ADN nuclear en una misma especie pueden ser variaciones intraespecíficas, como ocurre con otras especies, aunque no se descarta la posibilidad de que las diferencias se deban a la técnica utilizada en su determinación. Cuadro III.3. Contenido de ADN en especies silvestres y cultivadas en el género Phaseolus. Las marcadas en negritas señalan las especies analizadas por el autor. Se respetó la nomenclatura utilizada en la fuente orignal. Taxón 2C ADN (pg) Autor 2n P. acutifolius var. acutifolius A. Gray 1.76 Nagl y Treviranus (1995) 22 P. acutifolius var. latifolius G. Freeman 1.62 1.5 Nagl y Treviranus (1995) Mercado-Ruaro y Kenton (1995)* 22 P. acutifolius var. tenuifolius (Wooton & Standl.) A. Gray 1.63 Nagl y Treviranus (1995) 22 P. angustissimus A. Gray 1.32 Nagl y Treviranus (1995) 22 P. augusti Harms 1.1 Mercado-Ruaro y Kenton (1995)* 22 P. coccineus L. 1.6 1.3 1.98 3.5 Nagl y Treviranus (1995) Mercado-Ruaro y Kenton (1995)* Castagnaro et al. 1990 Ayonoadu (1974) 22 P. coccineus subsp. coccineus 1.63 Nagl y Treviranus (1995) 22 P. coccineus subsp coccineus cv. Hammond’s Dwarf Scarlet 1.62 Nagl y Treviranus (1995) 22 P. coccineus subsp. coccineus cv. Desirée 1.63 Nagl y Treviranus (1995) 22 P. coccineus subsp. coccineus cv. Preisgewinner 1.65 Nagl y Treviranus (1995) 22 P. coccineus subsp. coccineus cv. Weißer Riese 1.65 Nagl y Treviranus (1995) 22 P. coccineus subsp. purpurascens 1.62 Nagl y Treviranus (1995) 22 P. esperanzae Seaton 1.2 Mercado-Ruaro y Kenton (1995)* 22 P. filiformis Benth. 1.41 1.1 Nagl y Treviranus (1995) Mercado-Ruaro y Kenton (1995)* 22 P. glabellus Piper 2.09 Nagl y Treviranus (1995) 22 1.8 Mercado-Ruaro y Kenton (1995)* P. grayanus Wooton & Standl. 1.9 1.1 Nagl y Treviranus (1995) Mercado-Ruaro y Kenton (1995)* 22 P. hintonii A. Delgado 1.46 1.4 Nagl y Treviranus (1995) Mercado-Ruaro y Kenton (1995)* 22 P. jaliscanus Piper 1.4 Mercado-Ruaro y Kenton (1995)* 22 P. leptostachyus Benth. 1.25 1.1 Nagl y Treviranus (1995) Mercado-Ruaro y Kenton (1995)* 20 P. lunatus var. lunatus cvgr. Big Lima 1.43 Nagl y Treviranus (1995) 22 P. lunatus var. lunatus cvrg. Potato 1.4 Nagl y Treviranus (1995) 22 P. lunatus var. lunatus cvrg. Sieva 1.41 Nagl y Treviranus (1995) 22 P. lunatus var. lunatus cv. Early Thorogreen 1.41 Nagl y Treviranus (1995) 22 P. lunatus var. lunatus cv. Henderson Bush 1.43 Nagl y Treviranus (1995) 22 P. lunatus var. lunatus cv.Jackson Wonder 1.42 Nagl y Treviranus (1995) 22 P. lunatus var. silvester Baudet 1.42 1.4 2.5 Nagl y Treviranus (1995) Mercado-Ruaro y Kenton (1995)* Ayonoadu (1974) 22 P. macrolepis Piper 1.3 Mercado-Ruaro y Kenton (1995)* 22 P. maculatus Scheele 1.3 Mercado-Ruaro y Kenton (1995)* 22 P. macvaughii A. Delgado 0.9 Mercado-Ruaro y Kenton (1995)* 20 P. marechalii A. Delgado 1.6 1.4 Nagl y Treviranus (1995) Mercado-Ruaro y Kenton (1995)* 22 P. micranthus Hook. & Arn. 1.2 Nagl y Treviranus (1995) Mercado-Ruaro y Kenton 20 1.0 (1995) P. microcarpus Mart. 1.03 Nagl y Treviranus (1995) 22 P. neglectus Herman 1.92 1.4 Nagl y Treviranus (1995) Mercado-Ruaro y Kenton (1995)* 22 P. campanulatus Piper 1.0 Mercado-Ruaro y Kenton (1995)* 22 P. pachyrhizoides Harms 1.3 Mercado-Ruaro y Kenton (1995)* 22 P. parviflorus G. Freytag 1.3 Nagl y Treviranus (1995) 22 P. pauciflorus Sessé & Mociño ex G. Don 1.4 Mercado-Ruaro y Kenton (1995)* 22 P. pedicellatus Benth. 1.5 Mercado-Ruaro y Kenton (1995)* 22 P. pluriflorus Maréchal et al. 2.18 1.9 Nagl y Treviranus (1995) Mercado-Ruaro y Kenton (1995)* 22 P. polyanthus Greenm. 1.63 1.4 Nagl y Treviranus (1995) Mercado-Ruaro y Kenton (1995)* 22 P. sonorensis Standl. 1.2 Mercado-Ruaro y Kenton (1995)* 22 P. vulgaris forma silvestre 1.43 1.3 1.2 3.7 Nagl y Treviranus (1995) Mercado-Ruaro y Kenton (1995)* Mercado-Ruaro y Kenton (1995)* Ayonoadu (1974) 22 P. vulgaris cv. Alubia Cerrillo 1.79 Castagnaro et al. (1990) P. vulgaris cv. Exp. 113 1.69 Castagnaro et al. (1990) P. vulgaris cv. Dor 41 1.63 Castagnaro et al. (1990) P. vulgaris cv. Dor 157 1.56 Castagnaro et al. (1990) P. vulgaris cv. Nuna 1.41 Nagl y Treviranus (1995) P. vulgaris cv. Admires 1.48 Nagl y Treviranus (1995) P. vulgaris cv. Bertina 1.45 Nagl y Treviranus (1995) P. vulgaris cv. Blauhilde 1.44 Nagl y Treviranus (1995) P. vulgaris cv. Canadian Wonder (Kidney) 1.43 Nagl y Treviranus (1995) P. vulgaris cv. Contender 1.45 Nagl y Treviranus (1995) P. vulgaris cv. Facta 1.44 Nagl y Treviranus (1995) P. vulgaris c. Hild’s Marona 1.43 Nagl y Treviranus (1995) P. vulgaris cv. Hilda 1.45 Nagl y Treviranus (1995) P. vulgaris cv. Kentucky Wonder 1.4 Nagl y Treviranus (1995) P. vulgaris. cv. Neckargold 1.46 Nagl y Treviranus (1995) P. vulgaris cv. Neckarkönigin 1.44 Nagl y Treviranus (1995) P. vulgaris cv. Sanilac 1.53 Nagl y Treviranus (1995) P. vulgaris cv. Saxa 1.43 Nagl y Treviranus (1995) P. vulgaris cv. Tendergreen 1.45 Nagl y Treviranus (1995) P. vulgaris forma escapada 1.44 Nagl y Treviranus (1995) P. vulgaris var. aborigeneus (Burk.) Baudet 1.47 1.71 Nagl y Treviranus (1995) Castagnaro et al. (1990) P. vulgaris var. mexicanus 1.5 Nagl y Treviranus (1995) P. xanthotrichus Piper 1.73 1.2 Nagl y Treviranus (1995) Mercado-Ruaro y Kenton (1995)* 22 var. xanthotrichus 1.35 Nagl y Treviranus (1995) 22 P. xolocotzii A. Delgado 1.3 Mercado-Ruaro y Kenton (1995)* 22 *Datos obtenidos por Pedro Mercado-Ruaro y Ann Kenton en el Jodrell Laboratory de Kew en 1992, no publicados, pero comunicados a Bennett y Leitch (1995). Se utilizó un espectofotómetro para la obtención de contenido del DNA nuclear. Anexo III.1. Publicación en donde de forma condensada se muestran los distintos estudios citogenéticos que se han realizado en el género Phaseolus. Genelics tm d Molecular Biolog )', 23, 4, 985-987 (2000) Cytogenetic studies in Phaseolus L. (Fabaceae) Pedro M ercado-Ruaro and Alfonso Delgado-Salinas / Ils liluto de Biología, Uni versidad Nacional Autó noma de M ¿xico, A. P. 70 -233, De legación Co)'oacán . 04510 M ü ico, D.F., México. S end corresp ondence 10 P.M. -R . AbslraCI A rev iew of the cytogenetic studies canied out on Phaseolus as well as the different pro posa ls that have been s uggested ro ex - plain the chromosomal chan ges in the group a re presented. The importance of including w ild species in cytogenetic studies and the collaboration between taxonomists and cytogene tic ists in or- der lO draw be tter conclu s io ns are e mphas ized. INTRODUCTION The family Fabaceae (Leguminosae) contains the sub-family Papilionoideae of wh ich the tribe Phaseoleae is one of the most important groups because it contains genera such as Glycine (soybean), Phaseolus (American bean s) and Vigna (Asiatic beans), which are econo mically important due to their role in human nutrition and their use as cattle forage and ornamental (Lackey, 198 1). The genus Phaseolus is mainly found in the Mexican mountains (Sousa and Delgado, 1993), and contains approxi- m ate ly 50 species , w ith four (Delgado-Salinas, 1985) or fi ve (Debo uck, 1991) c ulti vated ones: P vulgaris, P coc- cineus, P acutifolius, P lunalus and P. p o lyanchus (= P coccineus subsp. darwinian.us). In hi s original description of Phaseolus, Linnaeus (1753) inc luded eleven species, but with time the number grew LO 200, distributed both in the Old and the New World. In 1970, Verdcourt redefined Phaseolus , considering it exclus ively of New World o rigins, with approximately 50 species whose characteristics are similar to those of P. vul- garis (generitype). This redefinition was confirmed as valid and refined by a series of studies by other researchers (Maréchal ec a!. , 1978 and Lackey, 1981 , 1983). The last revision ofthe genus was m ade by Delgado- Salinas ( 1985), w ho recog ni zed only 36 species in North and Central Ameri ca. Despite the taxonomic s tudies car- ried o ut o n the genus th at have led to its clear de limitation , neither the number oftaxa o f which the genus is composed nor the genetic relati o nship between spec ies has been well establi shed (Debouck, 199 1). Delgado-Salinas (I985) es- timates that the genu s contains 36 spec ies, in North and Central America, sorne o fthe m w ith subspec ific divisions, w hile D e bo uck (1991) includes 52 e s pec ies, without sub- specifi c dj visions. Although the importance of cytoge ne tic studies have been noted by several a uthors (Thomas, 1973; Green e C al., 1980; Al meda a nd C huang, 1992), Olost studies have dealt with economicaJly important s pecies, ig noring the poten- tial of w ild spec ies and relating o nly to c ultivated spec ies such as Phaseolus. CHROMOSOMAL STUDIES The [irst reports o n chromosome numbers in Pha- seolus go back to 1925, when Karpe tschenko obtained 2n = 22 for P. acutifo lius A. Gray, P. coccine u s L. , P. lunacus L. and P vulga ris L. From the n on, a large number of cyto - genetic studies have focused mainl y o n the detenninatio n of c hromosome numbers, establi shing x = 11 as the basic number. Prior to 1996, of the approximately 50 species rec- ogn ized in the gen us Phaseolus, only 9 spec ies and 4 sub- species had bee n c hro m osomally counted. Mercado-Ruaro a nd Delgado Salinas ( 1996, 1998) increased the numbe r of taxa a nalyzed to 3 l . Based on the published literature Lackey ( 1979), Goldblatt ( 1981) and Mercado -Ruaro and D e lgado Salinas ( 1996, 1998) propose that, as in the tribe Phaseo- leae , the basic c hromosome numbe r in the genus is x = 11 , with a haploid number of n = 10 in three spec ies (P leplOslachyus Benth., P micranchus Hook. & Arn. , and P macvaughii A. Delgado, ined. (Mercado-Ruaro and D elgado- Sa linas, 1998» . The number of species tha t have been ana- Iyzed is very low, and the anal yses have been restricted m ainly to cu lti vated species (Sarbhoy, 1977 ; Joseph a nd Bouwkamp, 1978; Sinha and Roy, 1979a; Z heng eC al. , 1991 ) . Mercado-Ruaro and Delgado-Salinas (1998) re- ported the karyotypic a nalysis of 10 wi ld s pecies, that rep- resent on average 20% ofthose compris ing the genus. The lack of karyologic studies in the gen us has been attributed to the reduce d s ize o f the c hromosomes, which makes the a na lysis difficult (Hucl and Scoles, 1985; Zheng el al. , 199 1). Nonetheless, the availabl e info rmation has shown that there is a predo minance of metacentric and submeta- ce ntric c hromosomes, w hjc h trans lates into very synunelTi- cal karyotypes . Sorne authors (Sarbhoy_ 1977, 1980; Sinha and Roy, I 979a,b) have pointed o ut that the Ola in fac tors involved in the ka ryotypic evolution of the genus are pericentric and paracentric inve rs ions, translocations and the loss o r gain of c hromatin . They have also proposed that the karyotype 986 Mercado-Ruaro and Delgado-Salinas of Phaseolus has evolved towards an asymmetry, with a decrease in the total chromatin content. Mercado-Ruaro and Delgado-Salinas (1998), after encountering three aneuploid species with 2n = 20, have pointed out that aneuploidy has al so played a role in the evolution ofthe karyotype. GENOMIC HYBRIDIZATION Studies of Phaseolus vulgaris by Frediani el al. (1993) using in silu hybridization have shown the position ofthe genes that code for polygalacturonase-inhibiting pro- tein (POIP) and stablished that the coding sequen ces are located in the heterochromatic pericentromeric regian of metacentric chromosome 10, while Schumann el al. ( 1990) and Nenno el al. (1993) ha ve documented the position of the phaseolin gene. In P coccine"s Avanzi et al. (1972) have located the ribosomal cistrons in the nucleolar and satel- lite regions of chromosomal pairs [ and V usi ng tritium- labelled rRNA. These studies, all employi ng polytene chro- mosomes, show the potential of in situ hybridization for chromosome mapping. The application of genomic in situ hybridi zation to taxonorny and the e lucidatían of genetic relationships are exemplified by the studies ofMercado-Ruaro on the Pha- seo/us vulgaris-P. coccineus complex, which investigated the possible hybrid origin 01' P coccineus subsp. darwi- nianus Hernández X. & Miranda C. (= P polyanthus Greenm.) as well as the genetic relationships between the species and subspecies that make up the complex. The re- sults of this study have shown the high degree of genetic homology between Ihe members oflhis group, and because of this it was not possible to establish whether or not P coccineus subsp. darwinianus is the result of a cross be- tween P coccineus and P. vulgaris, although it was pos- sible to establish that P glabellus is a taxon only di stantl y related to other members of the complex . STUDIES OF NUCLEAR DNA CONTENT There is much variation in the reported DNA content ofthe Phaseolus species studied by different authors. The DNA content of cultivated P vulgaris has been reported as being 1.56, 1.63, 1.69, 1.79 pg by Castagnaro el al. (1990), 2.7 pg by Bennett (1982) and 3.7 pg by Ayonoadu ( 1974), while that ofthe wild-type P vulgaris varo aborigineus has been reported to be 1.71 pg by Castagnaro el al. (1990). These di fferences may be attributable to Ihe source of the material, the type of control used or to errors inherent in the technique. Other species studied for their DN A content in- c1ude P coccineus, containing 3.5 pg accarding toAyonoadu (1974) and 1.98 pg according to Castagnaro el al. (1 990) ; P lunalus with 2.5 pg (Ayonoadu, 1974); P dumosus with 3.8 pg, and P leucanlhus with 3.3 pg (Ayonoadu, 1974). The lalter two species are probably P coccineus subsp. daJwinianus, since both names have al ways been nomen- c1aturally associated with thi s subspecies. As is the case in cytogenetic studies, there are reports of species referred as Phaseolus when they actually be- long to other genera, for instance, P angularis is really Vigna angularis, with a DNA content of2.8 pg, while both species P geophillls (2.6 pg) and P lathyroides (2.3 pg) be long to genus Macroptilium. Ayonoadu (1974) found a positive correlation between the nuclearDNA content and the nuclear volume, nucleolar and nuclear dry mass and total dry mass, i.e., high DNA con- tent indicates high values for volume and dry mass param- eters. Castagnaro el al. (1990), studying P coccinells and several cultivars of P vulgaris , along with P vulgaris varo aborigineus, al so found a positive correlation between seed weight and DNA content, with the exception of P vulgaris varo aborigineus, which presented a negative correlation. Even so Ihose authors concl ude that varieties wilh a high DNA content are better adapted to cold or temperate re- gions, whi le those varieties with a lower DNA content are adapted to hot, dry environments. We are now in the process ofanalyzing the ONAcon- tent of wild species of Phaseolus to determine if there is any relationship between DNA content and taxonomic rela- tionships between the species anel/ar karyotype. ACKNOWLEDGMENTS We lhank Fernando Chiang for reviewing lhe manuscripl. REFERENCES Almeda, F. and Chuang, T.L (1992) . Chromosome numbers and their sys- tematic significance in some Mexican Meiastomataccae. Syst. Bot. 17: 583-593. Avanzi, S., Durante, M., Cionini, P.G. and D' Amato, F. ( 1972). Cytological loca li zation of ribosoma! cislrons in polytene chromosomcs of Pha- seo/lis coccillells . Chromosoma 39: 191-203. Ayonoadu, U.W.U. (1974). Nuclear DNA variation in Phaseolus . Chromo- soma 48: 41-49. Bcnnctt, M.O., Smith, J.B. and Heslop-Harrison,J.8. (1982). 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Las regiones de los ITS están flanqueadas por secuencias conservadas, razón por la que pueden ser amplificadas por iniciadores (primers) universales, y posteriormente secuenciadas (Goel et al., 2002). Comparados con los espaciadores intergénicos y las regiones de los espaciadores externos transcritos de ADN ribosómico nuclear, los ITS son relativamente conservados, aunque divergen más que las subunidades 26S, 5S y 18S del nrADN, lo que permite la elaboración de reconstrucciones filogenéticas (Baldwin et al., 1995). El principal reto al usar nucleótidos como caracteres en estudios filogenéticos, en niveles taxonómicos bajos, es la identificación de regiones de ADN de fácil amplificación, con cambios relativamente rápidos, pero que se puedan alinear sin ambigüedad, y que proporcionen variación suficiente y adecuada dentro de un segmento de secuencia corta. Los ITS de la región 18S – 26S del nrADN cumplen con las características anteriormente mencionadas. Baldwin (1992) menciona cuatro características que deben poseer las regiones nucleares para su utilización en estudios filogenéticos: 1) evolutivamente conservadas, que se desarrollen principalmente por mutaciones puntuales, 2) que puedan ser interpretadas filogenéticamente, desarrollándose de un modo tal que permitan discernir los eventos de especiación, 3) que puedan ser fácilmente examinadas en el laboratorio y 4) sean lo suficientemente largas para ofrecer suficientes caracteres potencialmente útiles en la reconstrucción filogenética. La organización de los ITS se mostra en la figura IV.1. Figura IV.1. Organización de los ITS, tomada de Baldwin (1992). Separando a los ITS se encuentra la subunidad 5.8, secuencia altamente conservada. La región de los ITS es parte de la unidad transcripcional del nrADN, pero los espaciadores no son incorporados en los ribosomas maduros, por lo que la función de los ITS, al menos en parte, es intervenir en la maduración del ARN ribosómico nuclear (nrRNA). Las secuencias de los ITS han divergido más en el nivel de nucleótidos que las subunidades del nrADN. La longitud conservada y la alta variabilidad en la secuencia de nucleótidos en estos espaciadores permiten la alineación de taxones cercanamente relacionados, siendo lo suficientemente variables para permitir la solución de preguntas filogenéticas en niveles taxonómicos bajos (Baldwin et al., 1995). La región de los ITS está sumamente repetida en el genoma nuclear de las plantas Toda la región del nrADN está presente en varios miles de copias dispuestas una tras de otra, en una región cromosómica o en multiples loci, lo anterior promueve la detección, amplificación, clonación y secuenciación del nrADN, además de que la familia de genes sufre lo que se conoce como una rápida evolución concertada, a través de entrecruzamiento desigual y conversión génica. La evolución concertada promueve la uniformidad del nrADN dentro de poblaciones con entrecruzamiento, minimizando así la importancia del muestreo intrapoblacional en estudios filogenéticos. El tamaño pequeño de la región de los ITS (menor a 700 bases en angiospermas) y la presencia de secuencias altamente conservadas a los lados de cada uno de los espaciadores, la hacen una región fácil de amplificar a partir de material fresco o de ejemplares de herbario. En estudios de filogenia molecular en plantas, en niveles taxonómicos altos y a nivel de familia, se ha utilizado ampliamente la secuenciación del ADN nuclear ribosómico 18-26S. El análisis con enzimas de restricción de las mismas secuencias se ha empleado en estudios de géneros o especies estrechamente relacionados. La estructura repetida una tras de otra (tandem) y el alto número de copias de estas secuencias, las hace fácilmente detectables, además de que se ha visto que este grupo de genes sufre una rápida evolución concertada dentro y entre los loci, lo que promueve su uso para reconstrucciones filogenéticas. Las variaciones en el nrADN 18-26S entre especies estrechamente relacionadas se han descubierto principalmente en las regiones de los espaciadores intergénicos (IGS) y los espaciadores internos transcritos (ITS). La principal desventaja que presentan los IGS en estudios filogenéticos en el análisis de secuencias con enzimas de restricción es que gran parte del espaciador intergénico muestra una estructura parcialmente repetida, haciéndola susceptible de mutaciones en longitud, variando extensamente entre especies, a nivel de población y a nivel de individuo. Por otro lado, los ITS son regiones que han mostrado ser evolutivamente conservadas en longitud, aunque en plantas son demasiado pequeños, por lo que son pocos los sitios de restricción que se encuentran en ellos. No obstante que se han realizado estudios moleculares de diversa índole en el género Phaseolus (Blair et al., 2003; Caicedo et al., 1999; Delgado-Salinas et al., 1993, 1999; Fofana et al., 1997, 1999; Fukuda et al., 2005; Gaitán et al. (2000); Goel et al., 2002, McClean et al., 2004; Pedrosa et al., 2003; Ramamonjisoa et al., 1998; Vallejos et al, 1992; Vekemans et al., 2002; Wojciechowski et al., 2004), la mayoría de ellos han sido enfocados a las especies cultivadas. Únicamente Delgado-Salinas et al. (1999), Gaitán et al. (2000) y Goel et al. (2002) realizarón análisis filogenéticos utilizando los ITS, además de que incluyen en sus estudios especies silvestres y cultivadas. Delgado-Salinas et al. (1999) reportan en un análisis combinado con datos morfológicos y moleculares, la formación de nueve grupos; uno de ellos es el grupo Pedicellatus, que resultó pobremente sostenido por los análisis bootstrap y de sensibilidad, integrado por P. pedicellatus, P. neglectus, P. grayanus, P. oaxacanus y P. glabellus. Phaseolus oaxacanus se presenta como una especie separada del conjunto que integran el mencionado grupo. Phaseolus microcarpus resultó ser la especie basal de todo el género. La longitud del ITS1 en el grupo Pedicellatus, junto con P. microcarpus, es de las más cortas, encontrando que la secuencia ITS1 es más conservada en longitud con una variación en las especies estudiadas de 221 a 242 bases. Al igual que Delgado-Salinas et al. (1999), Goel et al. (2002) en su análisis filogenético muestran que las especies de Phaseolus se separan claramente del género Vigna. Aun cuando Broughton et al. (2003) señalan que existe una limitada investigación molecular en Phaseolus, consideran que las familias de genes en este grupo taxonómico tienden a ser pequeñas. MATERIALES Y MÉTODOS El material biológico utilizado en la secuenciación y posterior análisis filogenético del ITS1 e ITS2, se presenta en el Cuadro IV. 1, las secuencias marcadas con asterisco fueron obtenidas del GenBank. Las especies externas a la sección Pedicellati fueron seleccionadas después de revisar la publicación de Delgado-Salinas et al. (1999), con el fin de incluir especies cercanas y lejanas filogenéticamente de la sección Pedicellati que aparecen en dicho estudio y observar su comportamiento en el presente análisis. SECUENCIACIÓN DE LOS ITS 1 Y 2 Y DEL FRAGMENTO 5.8S La secuenciación de ADN implica varios pasos: a) Extracción y purificación de ADN; b) Confirmación de la extracción; c) PCR (reacción en cadena de la polimerasa) y d) Secuenciación. Extracción de ADN Se eligió la técnica descrita por Wilkie (1997), llamada Microaislamiento de ADN por el Método del CTAB, que consiste en lo siguiente: - Machacar en un mortero aproximadamente 1-2 cm de hoja joven en 400 µl de –CTAB frío. - Agregar 500 µl de amortiguador (buffer) +CTAB precalentado a 650C (antes de calentarse, se añaden 100 µl de mercaptoetanol por cada 5 ml de CTAB). - Mezclar e incubar a 650C por 90 min con inversiones ocasionales. - Enfriar a temperatura ambiente. - Agregar 450 µl de cloroformo-alcohol isoamílico. Mezclar invirtiendo el tubo, sin agitar. - Centrifugar por 2 min a 13000 rpm. Remover la fase acuosa a un tubo Eppendorf limpio. - Agregar 7 µl de RNAsa (200 unidades). - Incubar a temperatura ambiente por 30 min. - Agregar 600 µl de 2-propanol y mezclar invirtiendo el tubo. - Centrifugar por 10 min. Eliminar el sobrenadante. - Agregar 800 µl de acetato de sodio frío 0.2M en alcohol al 70%. Dejar reposar por 5 min. - Centrifugar por 2 min a 13000 rpm. Eliminar el sobrenadante. - Agregar 100 µl de alcohol al 70% frío y dejar reposar por 5 min. - Centrifugar por 2 min, eliminar el sobrenadante. - Desechar el resto del alcohol en un concentrador Eppendorf al vacio por 5 min. - Resuspender en 50 µl de agua bidestilada y guardar a –200C. Confirmación de la extracción Para comprobar la extracción del ADN se corre un gel de electroforesis de agar al 3%, en donde las muestras que se colocan en las pozas del gel contienen: 5 µl de agua bidestilada, 1 µl de colorante “blue juice” y 3 µl de la muestra del ADN obtenida de la extracción. Como parte comparativa se colocan en la primera o última poza 2 µl de ADN ladder de 1 kb. La corriente de la fuente de poder debe ser de 100- 110 miliamperes y se deja correr por espacio de 15 ó 20 min. PCR Los Primers (iniciadores) que se emplearon para amplificar los ITS fueron los utilizados por Delgado-Salinas et al. (1999), siendo el Primer frontal a la subunidad 18S 5’-GTC CAC TGA ACC TTA TCA TTT AGA GG- 3’ y el Primer opuesto a la subunidad 26S es 5’-GCC GTT ACT AAG GGA ATC CTT GTT AG-3’ y fue solicitada su elaboración a Life Technologies. Para la reacción en cadena de la polimerasa se prepara la siguiente mezcla: A cada tubo Eppendorf de 0.5 ml marcado previamente por muestra de ADN purificado se le agrega 1µl del Primer 1, 1µl del Primer 2 (en ambos casos 10 picomolas por µl), dNTP 2.5 µl, amortiguador 2.5 µl, Mg Cl2 0.8 µl, 0.4 µl de Taq y 1 µl del ADN purificado (pueden ser 2 µl dependiendo de cómo se vea la intensidad de la banda cuando se realiza la electrofóresis para verificar la extracción), al final se agregan 16 µl de agua bidestilada para dar un volumen final de 25 µl. Después de haber colocado las cantidades señaladas, se mezcla con vortex y se centrifuga de 15-30 seg máxima revolución y se introducen en la PCR El programa para las temperaturas en la PCR y llevar a cabo la amplificación de los ITS fue el descrito por Kaas y Wink (1997): desnaturalización inicial de 940C por 2 min, después de ello, 30 ciclos de 30 seg a 940C, 30 seg a 450C y 60 seg a 720C, después de los 30 ciclos, la temperatura se mantiene a 720C por 4 minutos, para posteriormente de manera automática mantener a 40C. Una vez que se realizó la PCR, las muestras con el ADN amplificado se mantienen a –200C. Para verificar que efectivamente hubo amplificación de los segmentos deseados, se lleva a cabo otra electrofóresis, para lo cual se toman 2 µl de la muestra del ADN amplificado que se mezclan con 1 µl de colorante marcador y se coloca en la poza del gel. Purificación del ADN El ADN resultante de la electroforesis anterior y que queda atrapado en el gel, es el que se purifica para para ser utilizado en la PCR, para ello se lleva a cabo lo siguiente: Se utilizan los productos químicos y columnas incluidos en un Kit de purificación llamado “quick PCR purification kit (250)”. Se corta el pedazo de gel que contiene el ADN (se hace en la lámpara de UV y rápidamente para cada muestra), se procura que tenga la menor cantidad de gel sin ADN. Cada trozo de gel con el ADN se coloca en un tubo Eppendorf de 1.5 ml previamente marcado, se pesa un tubo Eppendorf vacío para después pesar cada tubo que contiene gel. El tubo con gel que pesa más se toma como referencia para multiplicarlo por 3000 y la cantidad resultante es la cantidad de µl de amortiguador QG que se agrega a cada tubo con gel. Los tubos se colocan en baño maría previamente calentado a 50 grados y se dejan en incubación por espacio de 10 min. Se le agrega a cada tubo el peso del gel más elevado multiplicado por 1000 de isopropanol y se mezcla con vortex, la mezcla se vacía en una columna de separación incluida en el kit. Centrifugar 2 min a 13000 rpm y desechar el líquido. Añadir 500 µl de amortiguador QG a la columna y centrifugar 1 min. Desechar el líquido. Añadir 750 µl de amortiguador PE. Esperar 5 min y centrifugar 1 min. Desechar el líquido. Centrifugar otro minuto y desechar el líquido. Cambiar la columna a un tubo Eppendorf limpio rotulado de 1.5 m. (no incluido en el kit) y añadir 30 µl de agua bidestilada al centro de la columna. Dejar reposar 1 min y centrifugar. Guardar a –20 grados el líquido resultante y que contiene el ADN amplificado. Para conocer que efectivamente se ha realizado la purificación y al mismo tiempo determinar el peso del segmento, se corre otro gel de electrofóresis, teniendo como referencia a un segmento de peso conocido. Una vez que se ha realizado la purificación de los segmentos amplificados de ITS, se procede a una nueva reacción de PCR para llevar a cabo la secuenciación, aún cuando es prácticamente lo mismo ya escrito, la principal diferencia es que el ADN resultante es marcado con un fluorocromo, de tal suerte que las bases nitrogenadas puedan ser reconocidas por el secuenciador. Otro cambio importante es que en esta fase que fue efectuada en el Laboratorio de Molecular del Instituto de Biología, UNAM, se utiliza un Kit llamado Remix, el cual es vendido con todo lo necesario para realizar la amplificación, con la excepción de los Primers, y por supuesto, el ADN a ser amplificado. Para la PCR para secuenciación se agregaron las siguientes cantidades por muestra: 4 µl de Remix, 5 µl de ADN y 1 µl de Primer. Se prepararon dos tubos por cada tipo de ADN ya que a diferencia de la otra PCR, en este caso únicamente se obtuvo una secuencia por muestra (una por cada primer utilizado). Una vez realizado lo anterior se mezcla con vortex, se centrifugan de 15 a 30 seg máxima velocidad y se colocan en la PCR con los siguientes cambios de temperatura: 5 min a 960C como inicial, para después efectuar 25 ciclos de 10 seg a 960C y 4 min a 600C, para posteriormente mantenerse a 40C. Después de la PCR para secuenciación se procede a la purificación de los ITS obtenidos, lo cual es completamente distinto a lo que se llevó a cabo en la primera PCR. Para ejecutar lo anterior se emplean microcolumnas de sefadex hidratado. Previo a su colocación en la columna, a cada secuencia de ITS se le agrega 10 µl de agua desionizada y doblemente estéril para dar un volumen total por muestra de 20 µl, los cuales se agregan en las columnas previamente introducidas en tubos Eppendorf de 1.5 ml, teniendo cuidado de que la gota sea colocada en el centro de la columna. Se centrifuga por 2 min a 3000 rpm, el líquido colectado se concentra con la utilización de un concentrador por espacio de 23 min. Se resuspende la muestra en 15 µl de un reactivo llamado “template suppression reagent”, se mezcla con vortex y se centrifuga 30 seg a 0.7 rcf. Se calienta a 950C por espacio de 3 minutos y se mantienen en hielo por 10 min, se mezcla con vortex, se centrifuga 10-15 seg para y se introducen los tubos en el secuenciador, aparato que se encarga de determinar el orden en que se encuentran las bases nitrogenadas que constituyen los segmentos amplificados y aislados, los resultados se obtienen de forma impresa. La determinación del inicio y fin de cada secuencia, así como el de cada ITS y del segmento 5.8S, se basó en las secuencias proporcionadas por Goel et al. (2002). No se consideraron las de Delgado-Salinas et al. (1999), porque contenían residuos de las secuencias adjuntas. Para llevar a cabo la alineación de las distintas secuencias, se utilizó el programa Bioedit (Hall, 1999); para realizar lo anterior fue necesario la inclusión de espacios y de esta forma hacerlas coincidir. Los indel (inserciones-deleciones) fueron codificados y tratados como caracteres separados de codificación simple, siguiendo a Simmons y Ochotorena (2000). Se determinó el porcentaje de bases que se presentó en cada una de las secuencias, también con la ayuda del programa Bioedit. Algunas de las secuencias, principalmente las empleadas como grupo externo, fueron las reportadas por Delgado et al. (1999) y tomadas del GenBank, que se alinearon con las obtenidas en el presente estudio. En el análisis filogenético se recurrió al programa WinClada (versión 0.0.99.unam21 (Beta), K. Nixon) para generar la matríz en Nona (Goloboff, 1993); se ejecutó un análisis heurístico con 30 replicaciones, 100 árboles iniciales y 4000 árboles máximo retenidos con una estrategia de búsqueda múltiple TBR. Se realizó un análisis Bootstrap para determinar los niveles de apoyo de las ramas. El análisis se realizó con 1000 réplicas y 10 árboles salvados por réplica. Phaseolus microcarpus de la sección Rugosi se utilizó para enraizar el cladograma. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ANÁLISIS DE LAS SECUENCIAS Las secuencias completas que se obtuvieron en el presente estudio junto con las que se tomaron del Genbank, son mostradas en el anexo IV.1. El anexo incluye las especies de la sección Pedicellati y aquellas que fueron incluidas como externas. En el Cuadro IV.2 se incluyen las principales características de las secuencias para cada una de las especies. La longitud total de los ITS varió de 609 a 646 bases. La menor longitud se observó en Phaseolus grayanus de San Luis Potosí, mientras que P. polystachyus y P. salicifolius fueron las portadores de las secuencias con mayor longitud, la diferencia entre ambas es de 37 bases nitrogenadas y es ocasionada por la presencia de inserciones y deleciones. Las longitudes obtenidas están dentro del intervalo de los valores reportados previamente en angiospermas (Baldwin et al., 1995). El espaciador ITS1 fue en la mayoría de los taxones menor que el espaciador ITS2, aunque existen valores de empalme en ambas regiones. Las secuencias en Phaseolus fueron mayores (208 – 252 ITS1 y 221 – 237 ITS2) a las que se reportan para varias especies de Vigna (196 – 207 ITS1 y 210 – 215 ITS2), género cercano (Goel et al., 2002). Si se excluye a las especies externas al grupo y únicamente se considera a las integrantes de la sección Pedicellati, entonces la variación en la secuencia completa fue de 609 a 641 bases en Phaseolus grayanus de San Luis Potosí y en P. laxiflorus de Veracruz, respectivamente. Con excepción de P. laxiflorus y P. oaxacanus, la mayor parte de las especies de la sección Pedicellati se caracterizó por una longitud total de la secuencia que osciló de 609 a 614 bases nitrogenadas. P. laxiflorus presenta una longitud de 636 a 641, mientras que P. oaxacanus tiene una longitud de 631 y 632 bases, valores en ambas especies más cercanos a la longitud de las especies que fueron utilizadas como grupo externo y que se caracterizan por tener los valores más altos en la longitud total de las secuencias de los ITS (Tabla IV.2.). La diferencia que se observa en las distintas colectas de una misma especie, indica que existe variación intraespecífica. En el segmento 5.8S la longitud fue constante en todas las especies con 168 bases, mientras que en los segmentos ITS1 e ITS2 se presentaron variaciones en las distintas especies. En el ITS1 se aprecia una diferencia de 44 bases nitrogenadas; Phaseolus esperanzae, junto con las tres colectas de P. grayanus y las colectas de P. pedicellatus de Durango, Michoacán y Morelos presentaron el valor más pequeño con una longitud de 208 bases, mientras que la secuencia más grande en este segmento correspondió a las dos colectas de P. lunatus con 252 bases. La longitud del fragmento ITS1 en las especies de la sección Pedicellati osciló de 208 a 236 bases nitrogenadas, el valor más pequeño se presentó en P. esperanzae, P. grayanus y en las colectas de P. pedicellatus de Durango, Michoacán y Morelos, mientras que la longitud mayor se encontró en las cuatro colectas de P. laxiflorus. En el caso de la región de la ITS2, el intervalo de variación entre las especies de la sección Pedicellati y de las externas fue de 221 a 237 bases nitrogenadas, la secuencia más pequeña correspondió a P. lunatus de Veracruz, mientras que el fragmento de 237 bases lo mostraron las colectas de P. glabellus y P. laxiflorus de Veracruz. Al considerar únicamente a la sección Pedicellati, la secuencia con menor longitud pertenece a P. laxiflorus de Honey, Pue. (231 bases), mientras que P. laxiflorus de Cumbres de Maltrata, Ver., junto con tres colectas de P. pedicellatus de Veracruz, Puebla e Hidalgo presentaron el ITS2 con mayor longitud (237 bases). Con base en los resultados anteriores, se aprecia que existe una mayor variación en la longitud del ITS1 que en el ITS2. En el cuadro IV.2. también se muestra el porcentaje de las bases Guanina + Citosina (G + C) en cada una de las secuencias. La variación en el porcentaje de contenido de G + C fue de 56.65 a 59.03% indicando que las secuencias son ricas en G-C. P. oaxacanus (R.Torres 12380) aún cuando presentó un porcentaje de 51.90% en el contenido de G +C no fue considerada en el análisis de dicho porcentaje ya que la secuencia reportada por Delgado-Salinas et al. (1999), contiene un fragmento grande de la secuencia con indefinición de las bases (Anexo IV.1.). Del análisis anterior destaca Phaseolus oaxacanus (P. Mercado y F. Tapia 90) por presentar un total de 24 substituciones a lo largo de toda la secuencia, junto con dos inserciones de 3 y 22 bases en lo que corresponde a la región del ITS1. P. laxiflorus es quien porta la inserción más grande que va de 29 a 31 bases, dependiendo de la población, el mayor fragmento de inserción se ubica en la posición 93-123. La inserción de bases tan grande que poseen estas especies, se refleja en que son las que presentan una mayor longitud en la secuencia de sus ITS (Cuadro IV.2.). Cuadro IV.1. Especies utilizadas en el análisis filogenetico molecular con ITS 1 y 2. Las secuencias de las especies señaladas con asterisco, fueron obtenidas del Genbank y son las reportadas por Delgado-Salinas et al. (1999) con claves de entrada: AF115175, AF115244, AF115171, AF115209, AF115236, AF115242, AF115232, AF115240, AF115196 y AF115182. Especie Localidad Datos de procedencia 1.-P. microcarpus* Durango, México A. Delgado 1025 (MEXU) 2.-P. dasycarpus Hidalgo, México P. Mercado et al. 131 (MEXU) 3.-P. esperanzae Puebla, México P. Mercado et al. 23 (MEXU) 4.- P. glabellus* Puebla, México F. Basurto 791 (MEXU) 5.-P. glabellus Puebla, México P. Mercado s/n (MEXU) 6.-P. grayanus Aguascalientes, México P. Mercado et al. 145 (MEXU) 7.-P. grayanus San Luis Potosí, México P. Mercado et al. 60 (MEXU) 8.-P. grayanus San Luis Potosí, México P. Mercado et al. 130 (MEXU) 9.-P. laxiflorus Puebla, México P. Mercado y A. Reyes 109 (MEXU) 10.-P. laxiflorus Puebla, México P. Mercado et al. 133 (MEXU) 11.-P. laxiflorus Veracruz, México P. Mercado y A. Reyes 102 (MEXU) 12.-P. laxiflorus Hidalgo, México P. Mercado et al. 132 (MEXU) 13.-P. lunatus* Magdalena, Colombia CIAT G-26309 14.-P. lunatus* Veracruz, México A. Delgado 901 (MEXU) 15.-P. neglectus * Tamaulipas, México F. G. Medrano16937 (MEXU) 16.-P. oaxacanus Oaxaca, México P. Mercado y F. Tapia 90 (MEXU) 17.-.P. oaxacanus* Oaxaca, México R. Torres 12384 (MEXU) 18.-P. campanulatus* Jalisco, México A. S. Magallanes 1961 (MEXU) 19.-P. pedicellatus Nuevo León, México M. Lavin 4810 (MEXU) 20.-P. pedicellatus Veracruz, México R. Hernández y C. Trigos 886 (MEXU) 21.-P. pedicellatus Hidalgo, México P. Mercado et al. 123 (MEXU) 22.-P. pedicellatus Durango, México R. Hernández 7903 (MEXU) 23.-P. pedicellatus Michoacán, México P. Mercado et al. 139 (MEXU) 24.-P. pedicellatus Morelos, México P. Mercado 138 (MEXU) 25.-P. polymorphus Querétaro, México P. Mercado y G. Flores 66 (MEXU) 26.-P. polymorphus* Querétaro, México S. Zamudio 3470 (MEXU) 27.-P. polystachyus* Missouri, U.S.A. B. Summers 4680 (MO) 28.-P. purpusii San Luis Potosí, México R. Torres 15438 (MEXU) 29.-P. salicifolius* Sinaloa, México A. C. Sanders 4419 (MEXU) Cuadro IV.2. Longitud de las regiones ITS1, ITS2 y 5.8S, junto con el contenido porcentual de Guanina + Citosina (G+C) en especies de la sección Pedicellati, Coccinei, Paniculati, Digitati y Rugosi. Las cantidades en negritas indican los valores mínimos y máximos. Los asteriscos indican que la información se obtuvo del Genbank: AF115175, AF115171, AF115244, AF115209, AF115236, AF115242, AF115232, AF115240, AF115196 y AF115182. Especie Localidad long secuencia %G-C long ITS1 Long ITS2 Long 5.8S 1.-P. microcarpus A. D. 1025 Dgo.* 645 58.14 235 242 168 2.-P. dasycarpus P. M. 131 Hgo. 613 57.42 211 234 168 3.-P. esperanzae P. M. 23 Pue. 610 57.38 208 234 168 4.-P. glabellus Basurto 791 Pue*. 642 59.03 237 237 168 5.-P. glabellus P. M. s/n Pue. 644 58.70 239 237 168 6.-P. grayanus P. M. 130 S.L.P. 610 56.89 208 234 168 7.-P. grayanus P. M. 60 S.L.P. 609 56.65 208 233 168 8.-P. grayanus P. M. 145 Ags. 610 57.21 208 234 168 9.-P. laxiflorus P. M. 102 Ver. 641 58.81 236 237 168 10.-P. laxiflorus P. M. 109 Pue. 636 58.49 236 232 168 11.-P. laxiflorus P. M. 132 Hgo. 639 58.53 236 235 168 12.-P. laxiflorus P. M. 133 Pue. 638 58.31 236 234 168 13.-P. lunatus A. Delgado 901 Ver.* 641 58.97 252 221 168 14.-P. lunatus CIAT G-26308 Colombia* 645 58.76 252 225 168 15.-P. neglectus F. Medrano 16937 Tamps.* 614 57.82 209 237 168 16.-P. oaxacanus P. M. 90 Oax. 631 58.32 229 234 168 17.-P. oaxacanus R. Torres 12380 Oax.* 632 51.90 230 234 168 18.-P. campanulatus Magallanes 1961 Jal.* 631 58.32 229 234 168 19.-P. pedicellatus Hdez-Trigos 886 Ver. 614 57.00 209 237 168 20.-P. pedicellatus Lavin 4810 Nvo. León 611 57.28 209 234 168 21.-P. pedicellatus P. M. 138 Mor. 611 57.45 208 235 168 22.-P. pedicellatus P. M. 139 Mich. 611 57.28 208 235 168 23.-23.-P. pedicellatus P. M. 123 Hgo. 614 56.84 209 237 168 24..-P. pedicellatus R. Hdez. 7903 Dgo. 610 57.54 208 234 168 25.-P. polymorphus Zamudio 34 70 Qro.* 612 57.03 209 235 168 26.-P. polymorphus P. M. 66 Qro 614 56.84 209 237 168 27.-P. polystachyus Summers 4680 EUA* 646 57.59 246 232 168 28.-P. purpusii R. Torres 15438 S.L.P. 611 57.12 209 234 168 29.-P. salicifolius Sanders 4419 Sin.* 646 57.59 246 232 168 Cuadro IV.3. Relación de sustituciones, inserciones y deleciones en las secuencias de los ITS en distintas especies del género Phaseolus; la posición de la base es considerando la alineación mostrada en el anexo IV.1. SUBSTITUCIONES Especie Posición de la base Cambio Posición de la base Cambio P. pedicellatus Trigos y Hernández 886 Veracruz 10 46 55 77 C → A A → G C → G C → G 86 157 579 582 G → T C → T C → A T → C P. oaxacanus R. Torres 13280; P. Mercado 90 14 36 70 71 72 86 164 165 223 234 386 445 C → A A → C T → G G → C T → G G → T T → A G → C T → C C → A T → C T → C 491 523 532 536 554 572 582 606 635 638 647 G → C G → A T → C C → A G → A A → G T → C T → C C → A G → C C → G P. laxiflorus P. M. 102 40 86 228 426 T → A G → T T → C C → T 536 563 595 604 C → T C → T C → A T → C P. laxiflorus P. M. 109 40 86 228 536 T → A G → T T → C C → T 595 604 619 C → A T → C C → T P. laxiflorus P. M. 132 40 86 228 536 T → A G → T T → C C → T 563 579 595 604 T → C C → A C → A T → C P. laxiflorus P. M. 133 40 86 228 536 T → A G → T T → C C → T 595 604 619 C → A T → C C → T P. pedicellatus P. M. 123 Hgo. 46 55 62 86 165 A → G C → G T → C G → T G → C 495 579 582 617 T → A C → A T → C C → A P. polymorphus Zamudio 34 70 Qro.; P. Mercado 66 Qro. 46 55 71 86 A → G C → G G → T G → T 165 448 579 582 G → C A → G C → A T → C P. polymorphus P. Mercado 66 Qro. 234 C → T 617 C → T P. purpusii R. Torres 15438 S. L. P. 46 55 71 86 165 A → G C → G G → T G → T G → C 448 579 582 591 A → G C → A T → C G → T P. dasycarpus P. Mercado 131 400 C → G Hgo. P. grayanus P. Mercado 130 S. L. P. 48 430 C → T C → T 582 T → C P. grayanus P. Mercado 60 S. L. P. 48 274 C → T C → T 430 582 C → T T → C P. grayanus P. Mercado 145 Ags. 164 579 T → A C → A 582 T → C P. pedicellatus M. Lavin 4810 Nvo. León 55 608 C → G G → C 634 C → T P. pedicellatus R. Hernández 7903 Dgo. 164 316 G → C T → G 474 A → G P. pedicellatus P. Mercado 139 Mich. 223 T → A 526 G → A P. polymorphus Zamudio 34 70 Qro.; P. Mercado 66 Qro. 123 G 245-247 TAT INSERCIONES P. purpusii R. Torres 15438 S. L. P. 123 G 245-247 TAT P. dasycarpus P. Mercado 131 Hgo. 114-116 CGA P. pedicellatus M. Lavin 4810 Nvo. León 123 G P. pedicellatus P. Mercado 138 Mor. 428 C P. pedicellatus P. Mercado 139 Mich. 428 C P. pedicellatus Trigos y Hernández 886 Veracruz. 123 C 245-247 TAT P. oaxacanus R. Torres 13280; P. Mercado 90 67-69 CGT 92-123 31 Bases P. laxiflorus P. M 102 Ver. 92-123 31 Bases 428 C P. laxiflorus P. M 109 Ver. 92-123 31 Bases P. laxiflorus P. M 132 Hgo. 92-123 31 Bases 428 G P. laxiflorus P. M 133 Pue. 92-123 31 Bases DELECIONES P. polymorphus Zamudio 34 70 Qro 545 C 598 C P. purpusii R. Torres 15438 S. L. P. 510-512 GAA P. grayanus P. Mercado 60 S. L. P. 625 C P. oaxacanus R. Torres 13280; P. Mercado 90 78-80 GTC P. laxiflorus P. M 102 Ver. 147 A P. laxiflorus P. M 109 Ver. 147 A 645-646 AT P. laxiflorus P. M 132 Hgo. 147 A P. laxiflorus P. M 133 Pue. 147 A ANÁLISIS FILOGENÉTICO Cuando las secuencias fueron vaciadas en una matriz de datos y analizadas con el programa WinClada, el número de caracteres originales (bases) que consistió de 609 – 646, se redujo a 105 caracteres informativos, el resto fueron no informativos. Al codificar los espacios (“gaps”) obtenidos por la alineación de las distintas secuencias, se generó una matriz que consistió de 66 caracteres, 28 de ellos resultaron no informativos al analizarlos con WinClada, por lo que únicamente se consideraron los 38 restantes que fueron informativos para el análisis. Se fusionaron las dos matrices, generando una nueva que consta de 143 caracteres informativos. El análisis heurístico de la nueva matriz generó 6 árboles más parsimoniosos (menor número de pasos), cada uno de los árboles consistió de 315 pasos, con un índice de consistencia (CI)= 74 y un índice de retención (RI)= 85. Los árboles generados son los que se muestran en la figura IV.2. a-f . El número que aparece en paréntesis delante del nombre de la especie, corresponde al del Cuadro IV.2. y fue colocado para conocer la procedencia de cada uno de los taxones en el cladograma. Figura IV.2. 1-6 árboles más parsimoniosos generados de un análisis heurístico, L=315, Ci=74 y Ri=85; 7 árbol de consenso estricto, L=318, Ci=73 y Ri= 84. P mJcl'OCalpUs (1) r--i= P poIyslachYU$ (27) P. sa/K;ifoIius (29) P. lun9/U$ (13) P. lun9/U! (14) P. c9mp6nul6/us (18) P. o.lrllCSIWS (16) P Oftlr9C9flU! (17) P. ptK1iceNs/us (20) P. m1gh!clus (15) P. pediceNa/us (19) P. pedicel/atus (23) P. purpusii (28) P. poIymorphu! (25) P. poIymcxphus (26) P glsbeUus (4) P. gl6beNus (5) P. /6Xif/oroS (10) P. /6xif!orus (12) P. 16lriflorus (9) P. /alriflorus (11) P. dUycarpus (2) P. esperanza. (3) P gfIlyslWs(6) P. gfIlysnU$ (7) P. pedicel/It/u! (21) P. pedicalla/us (22) P. gfIlY6nus (8) P. pedicel/aws (24) P. m;clOC9rpus (1) r---C: P poIys/tlchyus (27) P. sa/icifoJlus (29) P. /una/us (13) P. /tina/u! (14) P campanul9/U! (18) ,-L~ P o.xlIC8nu! (16) • P. Oll)(/JCenus (17) P. g/abel/u! (4) P. g/abellu! (5) P /axiflol\Js (10) P. /iuiflMJ! (12) P. lalriflorus (9) P. /IUiIJorus (11) P d9sycarpus (2) P. 6speranla9 (3) P. gray9nus (6) P. grayanus (7) P. pedicel/atus (21) P. ptKIiceI/a/us (22) P. grayanus (8) P. pediceIIa/us (24) P. pedicella/us (20) P. n(JfllfICtus (15) P. pedic8l1a/us (19) P. pedicells/us (23) P purpuSH (28) P poIyfflOqlhus (25) P. potymorphu! (26) P mÍClOCarpus (tI r--i= r poIy31~YU3 (27) P. salicifolius (29) P. luna/us (13) P. mÍClOCarpus (1) P. luna/us (14) P. c8mpanula/us (18) P. OftlrllCllflU$ (16) P. o.lracanu! (17) P g/abellus (4) P g/abe/lus (5) P. pedice//atus (20) P. neg/ectus (15) P. pedice/la/us (19) P . pedicel/atus (23) P putpUsii (28) P poIymorphus (25) P poiymcxphus (28) P. /alriflOft.ls (10) P. laxiflOft.lS (12) P. /axiflorus (9) P. /sllifIOrus (11) P. dasycarpus (2) P. esparanzae (3) P grayalWs (6) P. graY6nus (7) P. pedicellatus (21) P. psdicel/alus (22) P. Qray6nus (8) P. ped/C8//Blus (24) r--i= P. poJy:¡IQchYU3 (27) P. salicifo/ius (29) P. luna/us (13) P /unlJtus (14) P. camp3nu1a/us (18) P. 08I1BCanus (16) P. 08XBCltnuS (17) P. g/BlJellus (4) P. g/alJellus (5) P IBlliflorus (fO) P. /BlliflOft.IS (12) P I9l1i1/orus (9) P I9xiIforus (11) P. pedicella/us (20) P. negh!clus (15) P. pedicella/us (19) P. pedicell9tus (23) P. purpu$ii (28) --.~- p poIymofphus (25) P. poIymcxphus (26) P dssycsrpus (2) P. 6spsranlS9 (3) P. grayanus (6) P. grayanus (7) P. pedal/a/us (21) P. pt1dKXfllalus (22) P. gray.nus (8) P. pediceIIalus (24) Figura IV.2. Continuación. P. microcarpu, (1) r--C P. poIystachyus (27) P. salícifolius (29) P. lunatus (13) P. lunlltus (f4) P. Cllmpllnulatus (18) P OIIlfllCanus (16) P. OIUIICllnus (17) P. r¡llIbellus (4) P glsbellus (5) P /IIlfifforos (10) P /IIlfifforos (12) P. I'lfif/orr.JS (9) P IlIlflflorus (11) P. pedicllllll/US (20) P. fIII1}lIICIus (15) P. f)IIdicel/s/us (19) P. psdícellatus (23) P. purpus;; (28) -LJ- P. poIymorphus (25) P. poIymorp/lus (2~) P. dllsyellrpus (2) P. mícrocarpu.! (1) P. esp6rPnla6 (3) P. grayanus (6) P. OrPylllWs (7) P. pedic#JII./us (21) P . pediceIIa/us (22) P. gfPytmuS (8) P. f)IIdicell./US (24) r-- C P. poIysl.Chyus (27) P. '1Ilícifolius (29) P. lunlllus (13) P. lunll/us (14) P. campanulalus (f8) P oalf8C.IWS (16) P. OIIlfllC8fNJs(17) P. dll'yea!pUs (2) P. glsbtlllus (4) P gllIbllllu.! (5) P. /IIlflflorus (lO) P. IlIlfif/orr.JS (12) P. 1,,,,ifIoruf; (O) P. /lIlfiflorus(fI) P. 1I~l"IIn18tl (3) P. gnlyanus (6) P. oraY/lnus (7) P. psdioollatus (21) P. f)IIdicellatus (22) P. grPy.nus (8) P. f)IIdic8llatus (24) P. pediCellatus (20) P neglectus (15) P. pediceIIII/us (19) P. pediceIIIIlus (23) P. purpusii (28) P. poIymotphus (25) P. poIymorp/lus (26) P mlCl'OC.rpus(l) r--C P. poIy,lechyu, (27) P. salíclfot/us (29) P./un./u, (13) P. luna/us (14) P. camp.nullllu' (18) P. 08XlICllnus (16) P. 08xscanus (17) P. rPllbeIIUS (4) P. glII/JeIItJS (5) P. /lIxi/JoIuS (fO) P. /llxifforos (12) P. /lIxiIIorus (9) P . IIIxillcJrw (11) P . desycarpus (2) • P. e~nlnlae (3) P. {JrPy.nus (6) P. {JrPy.nus (7) P. psdicellatus (21) P. p8d;cella/us (22) P. gnlyllnus (8) P. ped/Cf1/lalus (24) P. pediclllllltus (20) P. fIII1}l6ctus (15) P. pedlCfJlllllus (19) P pedicelllltuS (23) P. purpusii (28) P. poIymorphus (25) P. poIymotphus (26) Del análisis de los árboles puede apreciarse que Phaseolus oaxacanus siempre se mantiene como un taxón fuera del clado que incluye a las especies que integran a la sección Pedicellati; es conveniente recordar que del análisis de las secuencias, P. oaxacanus presentó un mayor número de substituciones, además de ser junto con P. laxiflorus, la especie con las inserciones más grandes en el ITS1 (22 bases). Phaseolus dasycarpus, P. glabellus y P. neglectus, especies que Freytag y Debouck (2002) no incluyen en la sección Pedicellati, claramente quedan incluidas en la misma. Resultados similares para P. glabellus, P. neglectus y P. oaxacanus fueron obtenidos por Delgado-Salinas et al. (1999) y Gaitán et al. (2000). Cuando se realizó el análisis de Bootstrap para conocer el soporte de cada uno de los clados, se generó otro cladograma (Fig. IV.3), en el que nuevamente se aprecia que la topología es muy similar a la presentada por los árboles de consenso y a los más parsimoniosos. En el árbol con valores de Bootstrap se observa que el soporte para el clado que incluye a la mayoría de las especies de la sección Pedicellati es de 60, valor relativamente bajo, indicando que las relaciones que se muestran en el cladograma entre los distintos taxones incluidos en el estudio son débiles. Figura IV.3. Análisis bootstrap mostrando el soporte de los distintos clados L= 321, Ci= 73 y Ri= 84. El número en paréntesis corresponde a la numeración dada en la tabla IV.1. Las especies Phaseolus microcarpus, P. campanulatus, P. polystachyus, P. lunatus y P. salicifolius, se ubicaron claramente como era de esperarse, por ser especies utilizadas como grupo externo, en un clado separado. Con base en los resultados del presente estudio y los realizados por Delgado-Salinas et al. (1999), se confirma que Phaseolus oaxacanus debe ser excluida de la sección Pedicellati; en el análisis aquí efectuado se ubica más cercana a P. campanulatus de la sección Brevilegumeni. Sin embargo, es necesario incrementar el número de especies y de colectas de cada sección para determinar si se mantiene la cercanía que se observa en esta investigación, o se agrupa con especies de otra sección. Phaseolus dasycarpus queda incluido con las especies de la sección Pedicellati, ya que los estudios morfológicos y moleculares apoyan fuertemente la reubicación de dicho taxón; más detalles y argumentos sobre su exclusión de la sección Paniculati y reubicación, se encuentran en el manuscrito “Taxonomic re-assessment of Phaseolus dasycarpus (Leguminosae): Systematic position, chromosome studies and re- description” generado con los resultados obtenidos en el presente estudio y se presenta en un capítulo aparte. Phaseolus laxiflorus, a diferencia de lo observado en el capítulo del análisis morfológico, forma un subclado muy definido, indicando que puede ser considerado como un taxón válido. Phaseolus polymorphus y P. purpusii en todos los árboles se agrupan en un subclado, sugiriendo que ambos corresponden a la misma entidad taxonómica; la agrupación que presentan en el cladograma apoya lo que ya se mencionó en la parte morfológica, con relación a que las características de lobulación de los folíolos que se observan en P. purpusii y que sirvieron para su diferenciación específica, en realidad son una respuesta a las condiciones edáficas en que se encuentra dicha población y que este tipo de lobulación es el resultado de la interacción de la información genética y el medio ambiente. Phaseolus purpusii ya había sido reconocida como sinónimo de P. polymorphus por Piper (1926) y los resultados aquí obtenidos lo apoyan. Phaseolus esperanzae, P. grayanus y P. pedicellatus, especies que morfológicamente es posible distinguir en algunos casos con cierta dificultad, en el cladograma se mezclan unas con otras no permitiendo una separación clara entre ellas, indicando que los cambios de inserción, seleción o substitución en los ITS no han sido suficientes como para generar diferencias que permitan una individualización específica dentro de este grupo de especies. Por lo anterior, se sugiere realizar otros estudios moleculares con otros marcadores para poder asegurar que molecularmente no pueden ser distinguidas. En concordancia con Delgado-Salinas et al. (1999), se encontró que P. glabellus (cercana a la sección Coccinei) y P. neglectus (sección Digitati), se agruparon en el clado correspondiente a la sección Pedicellati. En lo que corresponde a P. glabellus, Freytag y Debouck (2002) proporcionan una serie de argumentos basados en estudios de análisis de proteínas (Pueyo y Delgado-Salinas, 1997; Schmit y Debouck, 1990; Schmit et al., 1992, 1996), ADN de cloroplastos (Gepts, 1996; Llaca et al., 1994; Schmit et al., 1993), secuenciación de ITS (Delgado-Salinas et al., 1999), que apoyan su cercanía con la sección Pedicellati, no obstante dichos autores consideran que por algunas similitudes, como son el color rojo de la flor, forma del estigma y otras partes florales, P. glabellus debe mantenerse cercana a la sección Coccinei. Los resultados obtenidos por Delgado et al. (1999), Gaitán et al. (2000) y los del presente estudio la colocan dentro de la sección Pedicellati, independientemente del color de la flor o las otras características mencionadas. Phaseolus neglectus se encuentra relacionado con P. polymorphus, P. purpusii y P. pedicellatus de Hidalgo (P. Mercado 123) y Veracruz (Hernández-Trigos 886); la razón de dicha relación es que comparten al menos 5 substituciones y dos inserciones. CONCLUSIONES El análisis filogenético con secuencias de ITS muestra que Phaseolus dasycarpus, P. pedicellatus, P. glabellus, P. laxiflorus, P. neglectus, P. polymorphus, P. esperanzae y P. grayanus se agrupan en un clado, nominado aquí sección Pedicellati. Se confirma que Phaseolus oaxacanus queda excluida del clado que agrupa a las especies de la sección Pedicellati. Se puede considerar a Phaseolus purpusii como co-específico de P. polymorphus, como fue sugerido por Piper en 1926. La sección Pedicellati (sensu Freytag y Debouck) no es monofilética. Con los resultados morfológicos, citogenéticos y filogenéticos obtenidos en el presente estudio, las especies que se reconocen en la sección Pedicellati son: Phaseolus dasycarpus, P. esperanzae, P. grayanus, P. laxiflorus, P. pedicellatus y P. polymorphus. Phaseolus glabellus y P. neglectus requieren de estudios filogenéticos adicionales, en los que se incluyan mayor número de especies de varias secciones para confirmar si su inclusión en la sección Pedicellati se mantiene. Finalmente; es necesario obtener material de Phaseolus palmeri, P. scabrellus y P. teulensis, para secuenciar sus ITS e incluirlas en el análisis filogenético. Anexo IV.1. Secuencias de ITS 1, 5.8S y ITS 2, las especies resaltadas en negritas fueron de las obtenidas por Delgado-Salinas et al. (1999) y tomadas del GenBank. Se incluyen especies de la sección Pedicellati, así como especies consideradas externas a dicha sección. ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 5 15 25 35 45 55 P. dasycar TCGATGCCTC AACCAG---- TTCGACCCGC GAATCTGTAA TCATCCACA- AACGCAC-AA P. esperan P. glabell TCGATGCCTC AACCAG---- TTCGACCCGC GAATCTGTAA TCATCCACA- AACGCAC-AA TCGATGCCTC AACCAG---- TTCGACCCGC GAATCTGTAA TCATCCACA- AACGCAC-AA P. glabell TCGATGCCTC AACCAG---- TTCGACCCGC GAATCTGTAA TCATCCACA- AACGCAC-AA P. grayanu TCGATGCCTC AACCAG---- TTCGACCCGC GAATCTGTAA TCATCCACA- AATGCAC-AA P. grayanu TCGATGCCTC AACCAG---- TTCGACCCGC GAATCTGTAA TCATCCACA- AATGCAC-AA P. grayanu TCGATGCCTC AACCAG---- TTCGACCCGC GAATCTGTAA TCATCCACA- AACGCAC-AA P. laxiflo TCGATGCCTC AACCAG---- TTCGACCCGC GAATCTGTAA TCAACCACA- AACGCAC-AA P. laxiflo TCGATGCCTC AACCAG---- TTCGACCCGC GAATCTGTAA TCAACCACA- AACGCAC-AA P. laxiflo TCGATGCCTC AACCAG---- TTCGACCCGC GAATCTGTAA TCAACCACA- AACGCAC-AA P. laxiflo P. lunatus TCGATGCCTC AACCAACCAG TTCGACCCGC GAATCCGT-A TCAAACACAC AACGCAC-AA TCGATGCCTC AACCAG---- TTCGACCCGC GAATCTGTAA TCAACCACA- AACGCAC-AA P. lunatus TCGATGCCTC AACCAACCAG TTCGACCCGC GAATCCGT-A TCAAACACAC AACGCAC-AA P. microca TCGATGCCTC AACAAG---- TTCGACCCGC GAATCTGTAC TCATCCACA- AACGCACAAA P. neglect TCGATGCCTC AACCAG---- TTCGACCCGC GAATCTGTAA TCATCCACAG A-CGCAC--A P. oaxacan TCGATGCCTC AACAAG---- TTCGACCCGC GAATCTGTAC TCATCCACA- AACGCAC-AA P. oaxacan TCGATGCCTC AACAAG---- TTCGACCCGC GAATCTGTAC TCATCCACA- AACGCAC-AA P. campanu TCGATGCCTC AACAAG---- TTCGACCCGC GAATCTGTAC TCATCCACA- AACGCAC-AA P. pedicel TCGATGCCTG AACCAG---- TTCGACCCGC GAATCTGTAA TCATCCACA- GACGCAC-AA P. pedicel TCGATGCCTC AACCAG---- TTCGACCCGC GAATCTGTAA TCATCCACA- AACGCAC-AA P. pedicel TCGATGCCTC AACCAG---- TTCGACCCGC GAATCTGTAA TCATCCACA- AACGCAC-AA P. pedicel TCGATGCCTC AACCAG---- TTCGACCCGC GAATCTGTAA TCATCCACA- AACGCAC-AA P. pedicel TCGATGCCTC AACCAG---- TTCGACCCGC GAATCTGTAA TCATCCACA- GACGCAC-AA P. pedicel TCGATGCCTC AACCAG---- TTCGACCCGC GAATCTGTAA TCATCCACA- AACGCAC-AA P. polymor TCGATGCCTC AACCAG---- TTCGACCCGC GAATCTGTAA TCATCCACA- GACGCAC-AA P. polymor P. polysta TCGATGCCTC AACCAACCAG TTCGACCCGC GAATCCG--- T---AT-GA- AATCCAC-AA TCGATGCCTC AACCAG---- TTCGACCCGC GAATCTGTAA TCATCCACA- GACGCAC-AA P. purpusi TCGATGCCTC AACCAG---- TTCGACCCGC GAATCTGTAA TCATCCACA- GACGCAC-AA P. salicif TCGATGCCTC AACCAACCAG TTCGACCCGC GAATCCG--- T---AT-GA- AATCCAC-AA ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 65 75 85 95 105 115 P. dasycar C------GG- --GT--CCTC CCC---TGTG CGTCGTCGAG A--GTGCGGG C--------- P. esperan C------GG- --GT--CCTC CCC---TGTG CGTCGTCGAG A--GTGCGGG C--------- P. glabell C------GG- --GC--CCTC CCC---TGTG CGTCGTCGAG A--GGGCGGC C-GGCCGGCC P. glabell C------GG- --GC--CCTC CCC---TGTG CGTCGTCGAG A--GGGCGGG CGGGC-GGC- P. grayanu C------GG- --GT--CCTC CCC---TGTG CGTCGTCGAG A--GTGCGGG C--------- P. grayanu C------GG- --GT--CCTC CCC---TGTG CGTCGTCGAG A--GTGCGGG C--------- P. grayanu C------GG- --GT--CCTC CCC---TGTG CGTCGTCGAG A--GTGCGGG C--------- P. laxiflo C------GG- --GT--CCTC CCC---TGTG CGTCGTCGAG A--GGGCGGG CCGGCCGG-- P. laxiflo C------GG- --GT--CCTC CCC---TGTG CGTCGTCGAG A--GGGCGGG CCGGCCGG-- P. laxiflo C------GG- --GT--CCTC CCC---TGTG CGTCGTCGAG A--GGGCGGG CCGGCCGG-- P. laxiflo C------GG- --GT--CCTC CCC---TGTG CGTCGTCGAG A--GGGCGGG CCGGCCGG-- P. lunatus CGGCTGGGGC TCGTCCCCTC CCGTGT---G CGTCGTCGAG A--GGGCGGG CGGGCGAC-- P. lunatus CGGCTGGGGC TCGTCCCCTC CCG---TGTG CGTCGTCGAG A--GGGCGGG CGGGCGAC-- P. microca -------GG- --GT--CCTC CTGCGT---G CGTCGTCGTG A------GTA CGGGCG-CTG P. neglect C-----GGG- --GT--CCTC CCC---TGTG CGTCGTCGAG A--GGGCGGG C--------- P. oaxacan C------GG- --GT--CCTC CCCC-TGCGT CGTC---GAG A--GGGCGGG CGGGC-GGCC P. oaxacan C------GG- --GT--CCTC CCCCGTGCGT CGTC---GAG A--GGGCGGG CGGGC-GGCC P. campanu C------GG- --GT--CCTC CCCC-TGCGT CGTCG---AG A--GGGCGGG CGGGC-GGCC P. pedicel ------GGG- --GT--CCTC CCC---TGTG CGTGGTCGAG A--GGGCGGG C--------- P. pedicel ------GGG- --GT--CCTC CCC---TGTG CGTCGTCGAG A--GTGCGGG C--------- P. pedicel C------GG- --GT--CCTC CCC---TGTG CGTCGTCGAG A--GTGCGGG C--------- P. pedicel C------GG- --GT--CCTC CCC---TGTG CGTCGTCGAG A--GTGCGGG C--------- P. pedicel ------GGG- --GT--CCCC CCC---TGTG CGTCGTCGAG A--GGGCGGG C--------- P. pedicel C------GG- --GT--CCTC CCC---TGTG CGTCGTCGAG A--GTGCGGG C--------- P. polymor ------GGG- --GT--CCTC CCC---TTTG CGTCGTCGAG A--GGGCGGG C--------- P. polymor ------GGG- --GT--CCTC CCC---TTTG CGTCGTCGAG A--GGGCGGG C--------- P. polysta C-GC-GCGGC CNGT--CCGA CGTTGTGT-G CCAAGTCGAG AGAGGGCGGG CAGGCG---- P. purpusi ------GGG- --GT--CCTC CCC---TTTG CGTCGTCGAG A--GGGCGGG C--------- P. salicif C-GC-GCGGC CCGT--CCGA CGTTGTGT-G CCAAGTCGAG AGAGGGCGGG CAGGCG---- ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 125 135 145 155 165 175 P. dasycar ---------- --GCA----- ---GCAAGCC CGTGT----- ---------- -------CTC P. esperan ---------- ---------- ---GCAAGCC CGTGT----- ---------- -------CTC P. glabell -C-GATGCCG TGCGCATCCG ACCGCAAGCC CGTGT----- ---------- -------CTC P. glabell TCCGATGCCG TGCGCATCCG ACCGCAAGCC CGTGT----- ---------- -------CTC P. grayanu ---------- ---------- ---GCAAGCC CGTGT----- ---------- -------CTC P. grayanu ---------- ---------- ---GCAAGCC CGTGT----- ---------- -------CTC P. grayanu ---------- ---------- ---GCAAGCC CGTGT----- ---------- -------CTC P. laxiflo TC-GATGCCG TGCGCATTGG GCCGCAAGCC CGTGT----- ---------- -------CTC P. laxiflo TC-GATGCCG TGCGCATTCG GCCGCAAGCC CGTGT----- ---------- -------CTC P. laxiflo TC-GATGCCG TGCGCATTCG GCCGCAAGCC CGTGT----- ---------- -------CTC P. laxiflo TC-GATGCCG TGCGCATTCG GCCGCAAGCC CGTGT----- ---------- -------CTC P. lunatus TCGG-T---- ---------- -------GCC CC-GTGCATG CGGTCGCAAG CCCGTGTCTC P. lunatus TCGG-T---- ---------- -------GCC CC-GTGCATG CGGTCGCAAG CCCGTGTCTC P. microca TGCG-TCG-- ---------- -------TCG TGAGTACGGG CGCTCGC--G CCTGTGTCTC P. neglect ---------- ---------- --CGCAAGCC CGTGT----- ---------- -------CTC P. oaxacan -C-GAT---- ---GCATTCG GCCGCAAGCC CGTGT----- ---------- -------CTC P. oaxacan -C-GAT---- ---GCATTCG GCCGCAAGCC CGTGT----- ---------- -------CTC P. campanu -C-GAT---- ---GCATTCG GCCGCAAGCC CGTGT----- ---------- -------CTC P. pedicel ---------- ---------- --CGCAAGCC CGTGT----- ---------- -------CTC P. pedicel ---------- ---------- --CGCAAGCC CGTGT----- ---------- -------CTC P. pedicel ---------- ---------- ---GCAAGCC CGTGT----- ---------- -------CTC P. pedicel ---------- ---------- ---GCAAGCC CGTGT----- ---------- -------CTC P. pedicel ---------- ---------- --CGCAAGCC CGTGT----- ---------- -------CTC P. pedicel ---------- ---------- ---GCAAGCC CGTGT----- ---------- -------CTC P. polymor ---------- ---------- --CGCAAGCC CGTGT----- ---------- -------CTC P. polymor ---------- ---------- --CGCAAGCC CGTGT----- ---------- -------CTC P. polysta TC-----CCG -----AT--- -------GCC CCCGTGCACC CGGTCGCACG CCCGCGTCTC P. purpusi ---------- ---------- --CGCAAGCC CGTGT----- ---------- -------CTC P. salicif TC-------- ---------- --CCGAAGCC CCCGTGCATC CGGTCGCACG CCCGCGTCTC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 185 195 205 215 225 235 P. dasycar CCGACAAAAC ACTAACCCCG GCGCTTGACG C-GCCAAGGA ATACGAAGCT GTTAGGTGAG P. esperan CCGACAAAAC ACTAACCCCG GCGCTTGACG C-GCCAAGGA ATACGAAGCT GTTAGGTGAG P. glabell CCGACAAAAC ACTAACCCCG GCGCTTGACG C-GCCAAGGA ATACGAAGCT GTTAGGTGAG P. glabell CCGACAAAAC ACTAACCCCG GCGCTTGACG CTGCCAAGGA ATACGAAGCT GTTAGGTGAG P. grayanu CCGACAAAAC ACTAACCCCG GCGCTTGACG C-GCCAAGGA ATACGAAGCT GTTAGGTGAG P. grayanu CCGACAAAAC ACTAACCCCG GCGCTTGACG C-GCCAAGGA ATACGAAGCT GTTAGGTGAG P. grayanu CCGACAAAAC ACTAACCCCG GCGCTCGACG C-GCCAAGGA ATACGAAGCT GTTAGGTGAG P. laxiflo CCGACAAA-C ACTAACCCCG GCGCTTGACG C-GCCAAGGA ATACGAAGCT GTTAGGTGAG P. laxiflo CCGACAAA-C ACTAACCCCG GCGCTTGACG C-GCCAAGGA ATACGAAGCT GTTAGGTGAG P. laxiflo CCGACAAA-C ACTAACCCCG GCGCTTGACG C-GCCAAGGA ATACGAAGCT GTTAGGTGAG P. laxiflo CCGACAAA-C ACTAACCCCG GCGCTTGACG C-GCCAAGGA ATACGAAGCT GTTAGGTGAG P. lunatus CCGACAAAAC ACTAACCCCG GCGCTTCATG C-GCCAAGGA ATACGAAGCT GTTAGGTGAG P. lunatus CCGACAAAAC ACTAACCCCG GCGCTTCATG C-GCCAAGGA ATACGAAGCT GTTAGGTGAG P. microca CCGACAAAAC ACTAACCCCG GCGCTTCACG C-GCCAAGGA ACACGAAGCT GTTAGGTGAG P. neglect CCGACAAAAC ACTAACCCCG GCGCTTGACG C-GCCAAGGA ATACGAAGCT GTTAGGTGAG P. oaxacan CCGACAAAAC ACTAACCCCG GCGCTACACG C-GCCAAGGA ATACGAAGCT GTTAGGTGAG P. oaxacan CCGACAAAAC ACTAACCCCG GCGCTACACG C-GCCAAGGA ATACGAAGCT GTTAGGTGAG P. campanu CCGACAAAAC ACTAACCCCG GCGCTACACG C-GCCAAGGA ATACGAAGCT GTTAGGTGAG P. pedicel CCGACAAAAC ACTAACCCTG GCGCTTGACG C-GCCAAGGA ATACGAAGCT GTTAGGTGAG P. pedicel CCGACAAAAC ACTAACCCCG GCGCTTGACG C-GCCAAGGA ATACGAAGCT GTTAGGTGAG P. pedicel CCGACAAAAC ACTAACCCCG GCGCTTGACG C-GCCAAGGA ATACGAAGCT GTTAGGTGAG P. pedicel CCGACAAAAC ACTAACCCCG GCGCTTGACG C-GCCAAGGA ATACGAAGCT GTTAGGTGAG P. pedicel CCGACAAAAC ACTAACCCCG GCGCTTCACG C-GCCAAGGA ATACGAAGCT GTTAGGTGAG P. pedicel CCGACAAAAC ACTAACCCCG GCGCTCGACG C-GCCAAGGA ATACGAAGCT GTTAGGTGAG P. polymor CCGACAAAAC ACTAACCCCG GCGCTTCACG C-GCCAAGGA ATACGAAGCT GTTAGGTGAG P. polymor CCGACAAAAC ACTAACCCCG GCGCTTCACG C-GCCAAGGA ATACGAAGCT GTTAGGTGAG P. polysta CCGGCAAAAC ACTAACCCCG GCGCTTGATG C-GCCAAGGA ATACGAAGCT GTTAGGTGAG P. purpusi CCGACAAAAC ACTAACCCCG GCGCTTCACG C-GCCAAGGA ATACGAAGCT GTTAGGTGAG P. salicif CCGGCAAAAC ACTAACCCCG GCGCTTCATG C-GCCAAGGA ATACGAAGCT GTTAGGTGAG ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 245 255 265 275 285 295 P. dasycar GCAACCGAGG GACGTGTCCC GCGGGTGTCG TCACGACGAC ATGTTAT--- GTAAAATGAC P. esperan GCAACCGAGG GACGTGTCCC GCGGGTGTCG TCACGACGAC ATGTTAT--- GTAAAATGAC P. glabell GCAACCGAGG GACGTGTCCC GCGGGTGCCG TCACGACGAC ATGTTAT--- GTAAAATGAC P. glabell GCAACCGAGG GACGTGTCCC GCGGGTGCCG TWACGACGAC ATGTTAT--- GTAAAATGAC P. grayanu GCAACCGAGG GACGTGTCCC GCGGGTGTCG TCACGACGAC ATGTTAT--- GTAAAATGAC P. grayanu GCAACCGAGG GACGTGTCCC GCGGGTGTCG TCACGACGAC ATGTTAT--- GTAAAATGAC P. grayanu GCAACCGAGG GACGTGTCCC GCGGGTGTCG TCACGACGAC ATGTTAT--- GTAAAATGAC P. laxiflo GCAACCGAGG GACGTGTCCC GCGGGTGTCG CCACGACGAC ATGTTAT--- GTAAAATGAC P. laxiflo GCAACCGAGG GACGTGTCCC GCGGGTGTCG CCACGACGAC ATGTTAT--- GTAAAATGAC P. laxiflo GCAACCGAGG GACGTGTCCC GCGGGTGTCG CCACGACGAC ATGTTAT--- GTAAAATGAC P. laxiflo GCAACCGAGG GACGTGTCCC GCGGGTGTCG CCACGACGAC ATGTTAT--- GTAAAATGAC P. lunatus GCAGCCGAGG GACGTGTCCC GCGGGTGCCT TCACGACGAC ATGTTAT--- GTAAAATGAC P. lunatus GCAGCCGAGG GACGTGTCCC GCGGGTGCCT TCACGACGAC ATGTTAT--- GTAAAATGAC P. microca GCAACCGGGG GACGTGTCCC GCGGGTGTCG TCACGACAAC ATGTCAT--- GTAAAATGAC P. neglect GCAACCGAGG GACGTGTCCC GCGGGTGTCG TCACGACGAC ATGTTATTAT GTAAAATGAC P. oaxacan GCAACCGAGG GACGTGTCCC GCGGGCGTCG TCACGAAGAC ATGTTAT--- GTAAAATGAC P. oaxacan GCAACCGAGG GACGTGTCCC GCGGGCGTCG TCACGAAGAC ATGTTAT--- GTAAAATGAC P. campanu GCAACCGAGG GACGTGTCCC GCGGGCGTCG TCACGAAGAC ATGTTAT--- GTAAAATGAC P. pedicel GCAACCGAGG GACGTGTCCC GCGGGTGTCG TCACGACGAC ATGTTATTAT GTAAAATGAC P. pedicel GCAACCGAGG GACGTGTCCC GCGGGTGTCG TCACGACGAC ATGTTAT--- GTAAAATGAC P. pedicel GCAACCGAGG GACGTGTCCC GCGGGTGTCG TCACGACGAC ATGTTAT--- GTAAAATGAC P. pedicel GCAACCGAGG GACGTGTCCC GCGGGAGTCG TCACGACGAC ATGTTAT--- GTAAAATGAC P. pedicel GCAACCGAGG GACGTGTCCC NCGGGTGTCG TCACGACGAC ATGTTATTAT GTAAAATGAC P. pedicel GCAACCGAGG GACGTGTCCC GCGGGTGTCG TCACGACGAC ATGTTAT--- GTAAAATGAC P. polymor GCAACCGAGG GACGTGTCCC GCGGGTGTCG TCACGACGAC ATGTTATTAT GTAAAATGAC P. polymor GCAACCGAGG GACGTGTCCC GCGGGTGTCG TCACGATGAC ATGTTATTAT GTAAAATGAC P. polysta GCAACCGAGG GACGTGTCCC ACGGGTGCCT TCACGACAAC ATGTTAT--- GTAAAATGAC P. purpusi GCAACCGAGG GACGTGTCCC GCGGGTGTCG TCACGACGAC ATGTTATTAT GTAAAATGAC P. salicif GCAACCGAGG GACGTGTCCC ACGGGCGCCT TCACGACAAC ATGTTAT--- GTAAAATGAC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 305 315 325 335 345 355 P. dasycar TCTCGGCAAC GGATATCTCG GCTCTTGCAT CGATGAAGAA CGTAGCGAAA TGCGATACTT P. esperan TCTCGGCAAC GGATATCTCG GCTCTTGCAT CGATGAAGAA CGTAGCGAAA TGCGATACTT P. glabell TCTCGGCAAC GGATATCTCG GCTCTTGCAT CGATGAAGAA CGTAGCGAAA TGCGATACTT P. glabell TCTCGGCAAC GGATATCTCG GCTCTTGCAT CGATGAAGAA CGTAGCGAAA TGCGATACTT P. grayanu TCTCGGCAAC GGATATCTCG GCTCTTGCAT CGATGAAGAA CGTAGCGAAA TGCGATACTT P. grayanu TCTCGGCAAC GGATATTTCG GCTCTTGCAT CGATGAAGAA CGTAGCGAAA TGCGATACTT P. grayanu TCTCGGCAAC GGATATCTCG GCTCTTGCAT CGATGAAGAA CGTAGCGAAA TGCGATACTT P. laxiflo TCTCGGCAAC GGATATCTCG GCTCTTGCAT CGATGAAGAA CGTAGCGAAA TGCGATACTT P. laxiflo TCTCGGCAAC GGATATCTCG GCTCTTGCAT CGATGAAGAA CGTAGCGAAA TGCGATACTT P. laxiflo TCTCGGCAAC GGATATCTCG GCTCTTGCAT CGATGAAGAA CGTAGCGAAA TGCGATACTT P. laxiflo TCTCGGCAAC GGATATCTCG GCTCTTGCAT CGATGAAGAA CGTAGCGAAA TGCGATACTT P. lunatus TCTCGGCAAC GGATATCTCG GCTCTTGCAT CGATGAAGAA CGTAGCGAAA TGCGATACTT P. lunatus TCTCGGCAAC GGATATCTCG GCTCTTGCAT CGATGAAGAA CGTAGCGAAA TGCGATACTT P. microca TCTCGGCAAC GGATATCTCG GCTCTTGCAT CGATGAAGAA CGTAGCGAAA TGCGATACTT P. neglect TCTCGGCAAC GGATATCTCG GCTCTTGCAT CGATGAAGAA CGTAGCGAAA TGCGATACTT P. oaxacan TCTCGGCAAC GGATATCTCG GCTCTTGCAT CGATGAAGAA CGTARCGAAA TGCGATACTT P. oaxacan TCTCGGCAAC GGATATCTCG GCTCTTGCAT CGATGAAGAA CGTAGCGAAA TGCGATACTT P. campanu TCTCGGCAAC GGATATCTCG GCTCTTGCAT CGATGAAGAA CGTARCGAAA TGCGATACTT P. pedicel TCTCGGCAAC GGATATCTCG GCTCTTGCAT CGATGAAGAA CGTAGCGAAA TGCGATACTT P. pedicel TCTCGGCAAC GGATATCTCG GCTCTTGCAT CGATGAAGAA CGTAGCGAAA TGCGATACTT P. pedicel TCTCGGCAAC GGATATCTCG GCTCTTGCAT CGATGAAGAA CGTAGCGAAA TGCGATACTT P. pedicel TCTCGGCAAC GGATATCTCG GCTCTTGCAT CGATGAAGAA CGTAGCGAAA TGCGATACTT P. pedicel TCTCGGCAAC GGATATCTCG GCTCTTGCAT CGATGAAGAA CGTAGCGAAA TGCGATACTT P. pedicel TCTCGGCAAC GGATATCTCG GCTCTTGCAT CGATGAAGAA CGTAGCGAAA TGCGATACGT P. polymor TCTCGGCAAC GGATATCTCG GCTCTTGCAT CGATGAAGAA CGTAGCGAAA TGCGATACTT P. polymor TCTCGGCAAC GGATATCTCG GCTCTTGCAT CGATGAAGAA CGTAGCGAAA TGCGATACTT P. polysta TCTCGGCAAC GGATATCTCG GCTCTTGCAT CGATGAAGAA CGTAGCGAAA TGCGATACTT P. purpusi TCTCGGCAAC GGATATCTCG GCTCTTGCAT CGATGAAGAA CGTAGCGAAA TGCGATACTT P. salicif TCTCGGCAAC GGATATCTCG GCTCTTGCAT CGATGAAGAA CGTAGCGAAA TGCGATACTT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 365 375 385 395 405 415 P. dasycar GGTGTGAATT GCAGAATCCC GTGAACCATC GAGTCTTTGA ACGCAAGTTG CGCCCAAAGC P. esperan GGTGTGAATT GCAGAATCCC GTGAACCATC GAGTCTTTGA ACGCAAGTTG CGCCCAAAGC P. glabell GGTGTGAATT GCAGAATCCC GTGAACCATC GAGTCTTTGA ACGCAAGTTG CGCCCAAAGC P. glabell GGTGTGAATT GCAGAATCCC GTGAACCATC GAGTCTTTGA ACGCAAGTTG CGCCCAAAGC P. grayanu GGTGTGAATT GCAGAATCCC GTGAACCATC GAGTCTTTGA ACGCAAGTTG CGCCCAAAGC P. grayanu GGTGTGAATT GCAGAATCCC GTGAACCATC GAGTCTTTGA ACGCAAGTTG CGCCCAAAGC P. grayanu GGTGTGAATT GCAGAATCCC GTGAACCATC GAGTCTTTGA ACGCAAGTTG CGCCCAAAGC P. laxiflo GGTGTGAATT GCAGAATCCC GTGAACCATC GAGTCTTTGA ACGCAAGTTG CGCCCAAAGC P. laxiflo GGTGTGAATT GCAGAATCCC GTGAACCATC GAGTCTTTGA ACGCAAGTTG CGCCCAAAGC P. laxiflo GGTGTGAATT GCAGAATCCC GTGAACCATC GAGTCTTTGA ACGCAAGTTG CGCCCAAAGC P. laxiflo GGTGTGAATT GCAGAATCCC GTGAACCATC GAGTCTTTGA ACGCAAGTTG CGCCCAAAGC P. lunatus GGTGTGAATT GCAGAATCCC GTGAACCATC GAGTCTTTGA ACGCAAGTTG CGCCCAAAGC P. lunatus GGTGTGAATT GCAGAATCCC GTGAACCATC GAGTCTTTGA ACGCAAGTTG CGCCCAAAGC P. microca GGTGTGAATT GCAGAATCCC GTGAACCATC GAGTCTTTGA ACGCAAGTTG CGCCCAAAGC P. neglect GGTGTGAATT GCAGAATCCC GTGAACCATC GAGTCTTTGA ACGCAAGTTG CGCCCAAAGC P. oaxacan GGTGTGAATT GCAGAATCCC GTGAACCATC GAGTCTTTGA ACGCAAGTTG CGCCCAAAGC P. oaxacan GGTGTGAATT GCAGAATCCC GTGAACCATC GAGTNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN P. campanu GGTGTGAATT GCAGAATCCC GTGAACCATC GAGTCTTTGA ACGCAAGTTG CGCCCAAAGC P. pedicel GGTGTGAATT GCAGAATCCC GTGAACCATC GAGTCTTTGA ACGCAAGTTG CGCCCAAAGC P. pedicel GGTGTGAATT GCAGAATCCC GTGAACCATC GAGTCTTTGA ACGCAAGTTG CGCCCAAAGC P. pedicel GGTGTGAATT GCAGAATCCC GTGAACCATC GAGTCTTTGA ACGCAAGTTG CGCCCAAAGC P. pedicel GGTGTGAATT GCAGAATCCC GTGAACCATC GAGTCTTTGA ACGCAAGTTG CGCCCAAAGC P. pedicel GGTGTGAATT GCAGAATCCC GTGAACCATC GAGTCTTTGA ACGCAAGTTG CGCCCAAAGC P. pedicel GGTGTGAATT GCAGAATCCC GTGAACCATC GAGTCTTTGA ACGCAAGTTG CGCCCAAAGC P. polymor GGTGTGAATT GCAGAATCCC GTGAACCATC GAGTCTTTGA ACGCAAGTTG CGCCCAAAGC P. polymor GGTGTGAATT GCAGAATCCC GTGAACCATC GAGTCTTTGA ACGCAAGTTG CGCCCAAAGC P. polysta GGTGTGAATT GCAGAATCCC GTGAACCATC GAGTCTTTGA ACGCAAGTTG CGCCCAAAGC P. purpusi GGTGTGAATT GCAGAATCCC GTGAACCATC GAGTCTTTGA ACGCAAGTTG CGCCCAAAGC P. salicif GGTGTGAATT GCAGAATCCC GTGAACCATC GAGTCTTTGA ACGCAAGTTG CGCCCAAAGC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 425 435 445 455 465 475 P. dasycar CATTAGGCTG AGGGCACGCC TGGCTGGGTG TCACACATCG TCACCCCCCC -GCCCGCCAC P. esperan CATTAGGCTG AGGGCACGCC TGCCTGGGTG TCACACATCG TCACCCCCCC -GCCCGCCAC P. glabell CATTAGGCTG AGGGCACGCC TGCCTGGGTG TCACACATCG TCACCCCCCC -GCCCGCCAC P. glabell CATTAGGCTG AGGGCACGCC TGCCTGGGTG TCACACATCG TCACCCCCCC -GCCCGCCAC P. grayanu CATTAGGCTG AGGGCACGCC TGCCTGGGTG TCACACATCG TCACCCCCCC -GTCCGCCAC P. grayanu CATTAGGCTG AGGGCACGCC TGCCTGGGTG TCACACATCG TCACCCCCCC -GTCCGCCAC P. grayanu CATTAGGCTG AGGGCACGCC TGCCTGGGTG TCACACATCG TCACCCCCCC -GCCCGCCAC P. laxiflo CATTAGGCTG AGGGCACGCC TGCCTGGGTG TCACACATCG TCACCCCCTC CGCCCGCCAC P. laxiflo CATTAGGCTG AGGGCACGCC TGCCTGGGTG TCACACATCG TCACCCCCCC -GCCCGCCAC P. laxiflo CATTAGGCTG AGGGCACGCC TGCCTGGGTG TCACACATCG TCACCCCCCC CGCCCGCCAC P. laxiflo CATTAGGCTG AGGGCACGCC TGCCTGGGTG TCACACATCG TCACCCCCCC -GCCCGCCAC P. lunatus CATTAGGCTG AGGGCACGCC TGCCTGGGTG TCACACATCG TCCCCCCCC- TGCCCGCCAC P. lunatus CATTAGGCTG AGGGCACGCC TGCCTGGGTG TCACACATCG TCCCCCCCC- TGCCCGCCAC P. microca CATTAGGCTG AGGGCACGCC TGCCTGGGTG TCACACATCG TCACCCCCC- -GCCCGCCAC P. neglect CATTAGGCTG AGGGCACGCC TGCCTGGGTG TCACACATCG TCACCCCCCC -GCCCGCCAC P. oaxacan CATTAGGCCG AGGGCACGCC TGCCTGGGTG TCACACATCG YCACCCCCCC -GCCCGCCAC P. oaxacan NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNCCCCCCC -GCCCGCCAC P. campanu CATTAGGCCG AGGGCACGCC TGCCTGGGTG TCACACATCG YCACCCCCCC -GCCCGCCAC P. pedicel CATTAGGCTG AGGGCACGCC TGCCTGGGTG TCACACATCG TCACCCCCCC -GCCCGCCAC P. pedicel CATTAGGCTG AGGGCACGCC TGCCTGGGTG TCACACATCG TCACCCCCCC -GCCCGCCAC P. pedicel CATTAGGCTG AGGGCACGCC TGCCTGGGTG TCACACATCG TCACCCCCCC CGCCCGCCAC P. pedicel CATTAGGCTG AGGGCACGCC TGCCTGGGTG TCACACATCG TCACCCCCCC CGCCCGCCAC P. pedicel CATTAGGCTG AGGGCACGCC TGCCTGGGTG TCACACATNG TCACCCCCCC -GCCCGCCAC P. pedicel CATTAGGCTG AGGGCACGCC TGCCTGGGTG TCACACATCG TCACCCCCCC -GCCCGCCAC P. polymor CATTAGGCTG AGGGCACGCC TGCCTGGGTG TCACACATCG TCACCCCCCC -GCCCGCCAC P. polymor CATTAGGCTG AGGGCACGCC TGCCTGGGTG TCACACATCG TCACCCCCCC -GCCCGCCAC P. polysta CATTAGGCTG AGGGCACGCC TGCCTGGGTG TCACACATCG TCACCCCCCC -GCCCGCCAC P. purpusi CATTAGGCTG AGGGCACGCC TGCCTGGGTG TCACACATCG TCACCCCCCC -GCCCGCCAC P. salicif CATTAGGCTG AGGGCACGCC TGCCTGGGTG TCACACATCG TCACCCCCC- TGCCCGCCAC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 485 495 505 515 525 535 P. dasycar ACTTAACT-A AATAAATGTG CAGCAGGGGG --TGA---AA GATGACCTCC CGCGAGCGAG P. esperan ACTTAACT-A AATAAATGTG CAGCAGGGGG --TGA---AA GATGACCTCC CGCGAGCGAG P. glabell ACTTAGCT-A AATAAATGTG CAGCAGGGGG --TGA---AA GATGACCTCC CGCGAGCGAG P. glabell ACTTAGCT-A AATAAATGTG CAGCAGGGGG --TGA---AA GATGACCTCC CGCGAGCGAG P. grayanu ACTTAACT-A AATAAATGTG CAGCAGGGGG --TGA---AA GATGACCTCC CGCGAGCGAG P. grayanu ACTTAACT-A AATAAATGTG CAGCAGGGGG --TGA---AA GATGACCTCC CGCGAGCGAG P. grayanu ACTTAACT-A AATAAATGTG CAGCAGGGGG --TGA---AA GATGACCTCC CGCGAGCGAG P. laxiflo ACTTAACT-A AATAAATGTG CAGCAGGGGG GGTGA---AA GATGACCTCC CGCGAGCGAG P. laxiflo ACTTAACT-A AATAAATGTG CAGCAGGGGG --TGA---AA GATGACCTCC CGCGAGCGAG P. laxiflo ACTTAACT-A AATAAATGTG CAGCAGGGGG --TGA---AA GATGACCTCC CGCGAGCGAG P. laxiflo ACTTAACT-A AATAAATGTG CAGCAGGGGG --TGA---AA GATGACCTCC CGCGAGCGAG P. lunatus ACTTAACT-A ATTAAATGTG CAGCAGGGGG --TGGTGGAA GTTGACCTCC CGCGAG--AC P. lunatus ACTTAACT-A ATTAAATGTG CAGCAGGGGG --TGGTGGAA GTTGACCTCC CGCGAG--AC P. microca ACTTATC-CA AATAAGGGTG CGGCA--GGG ---GGTGAAA GATGACCTCC CACGAGCGAG P. neglect ACTTAACT-A AATAAATGTG CAGCAGGGGG --TGA---AA GATGACCTCC CGCGAGCGAG P. oaxacan ACTTAACC-A AATAAATGTG CAGCAGGGGG --TGA---AA GATGACCTCC CGCGAGCCAG P. oaxacan ACTTAACC-A AATAAATGTG CAGCAGGGGG --TGA---AA GATGACCTCC CGCGAGCCAG P. campanu ACTTAACC-A AATAAATGTG CAGCAGGGGG --TGA---AA GATGACCTCC CGCGAGCCAG P. pedicel ACTTAACT-A AATAAATGTG CAGCAGGGGG --TGA---AA GATGACCTCC CGCGAGCGAG P. pedicel ACTTAACT-A AATAAATGTG CAGCAGGGGG --TGA---AA GATGACCTCC CGCGAGCGAG P. pedicel ACTTAACT-A AATAAATGTG CAGCAGGGGG --TGA---AA GATGACCTCC CGCGAGCGAG P. pedicel ACTTAACT-A AATAAATGTG CAGCAGGGGG --TGA---AA GATGACCTCC CGCGAGCGAG P. pedicel ACTTAACT-A AATAAATGTG CAGCAGGGGG --TGA---AA GATGACCTCC CGCGAGCGAG P. pedicel ACTTAACT-A AATAAATGTG CAGCAGGGGG --TGA---AA AATGACCTCC CGCGAGCGAG P. polymor ACTTAACT-A AGTAAATGTG CAGCAGGGGG --TGA---AA GATGACCTCC CGCGAGCGAG P. polymor ACTTAACT-A AGTAAATGTG CAGCAGGGGG --TGA---AA GATGACCTCC CGCGAGCGAG P. polysta ACCTAACT-A AATAGGTGTG CAGCAGGGGG --TGCA---A GATGACCTCC CGCGAG--AC P. purpusi ACTTAACT-A AGTAAATGTG CAGCAGGGGG --TGA---AA GATGACCTCC CGCGAGCGAG P. salicif ACTTAACT-A AATAGGTGTG CAGCAGGGGG --TGCA---A GATGACCTCC CGCGAG--AC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 545 555 565 575 585 595 P. dasycar TTCCTCGTGG TTGGTTGAAA AGCAAGTTCG GGGCGGAGTC CCCCACGATA ACGGTGGATG P. esperan TTCCTCGTGG TTGGTTGAAA AGCAAGTTCG GGGCGGAGTC CCCCACGATA ACGGTGGATG P. glabell CTCCTCGTGG TTGGTTGAAA AGCAAGTTCG GGGCGGAGTC CCTCACGATA ACGGTGGATG P. glabell CTCCTCGTGG TTGGTTGAAA AGCAAGTTCG GGGCGGAGTC CCTCACGATA ACGGTGGATG P. grayanu TTCCTCGTGG TTGGTTGAAA AGCAAGTTCG GGGCGGAGTC CCCCACGATA ACGGTGGATG P. grayanu TTCCTCGTGG TTGGTTGAAA AGCAAGTTCG GGGCGGAGTC CCCCACGATA ACGGTGGATG P. grayanu TTCCTCGTGG TTGGTTGAAA AGCAAGTTCG GGGCGGAGTC CCCCACGATA ACGGTGGATG P. laxiflo TTCCTCGTGG TTGGTTGAAA AGCAAGTTCG GGGCGGAGTC CCTCACGATA ACGGTGGATG P. laxiflo TTCCTCGTGG TTGGTTGAAA AGCAAGTTCG GGGCGGAGTC CCTCACGATA ACGGTGGATG P. laxiflo TTCCTCGTGG TTGGTTGAAA AGCAAGTTCG GGGCGGAGTC CCTCACGATA ACGGTGGATG P. laxiflo TTCCTCGTGG TTGGTTGAAA AGCAAGTTCG GGGCGGAGTC CCTCACGATA ACGGTGGATG P. lunatus CTCCTCGTGG TTGGTTGAAA AGCAAGTTCG GGACGGAGTC TCCCGCGATA TCGGTGGATG P. lunatus CTCCTCGTGG TTGGTTGAAA AGCAAGTTCG GGAAGGAGTC TCCCGCGATA TCGGTGGATG P. microca TCCCTCGTGG TTGGTTGAAA AGCAAGTTCG GGGCGGAGTC CCCCACGATA ACGGTGGATG P. neglect TTCCTCGTGG TTGGTTGAAA AGCAAGTTCG GGGCGGAGTC CCCCGCGATA ACGGTGGATG P. oaxacan TTCCTCGTGG TTGGTTGAAA AGCAAGTTCA GGGCGGAGCC CCACACGATA ACGGTGGATG P. oaxacan TTCCTCGTGG TTGGTTGAAA AGCAAGTTCA GGGCGGAGCC CCACACGATA ACGGTGGATG P. campanu TTCCTCGTGG TTGGTTGAAA AGCAAGTTCA GGGCGGAGCC CCACACGATA ACGGTGGATG P. pedicel TTCCTCGTGG TTGGTTGAAA AGCAAGTTCG GGGCGGAGTC CCCCACGATA ACGGTGGATG P. pedicel TTCCTCGTGG TTGGTTGAAA AGCAAGTTCG GGGCGGAGTC CCCCACGATA ACGGTGGATG P. pedicel TTCCTCGTGG TTGGTTGAAA AGCAAGTTCG GGGCGGAGTC CCCCACGATA ACGGTGGATG P. pedicel TTCCTCGTGG TTGGTTGAAA AGCAAGTTCG GGACGGAGTC CCCCACGATA ACGGTGGATG P. pedicel TACCTCGTGG TTGGTTGAAA AGCAAGTTCG GGGCGGAGTC CCCCACGATA ACGGTGGATG P. pedicel TTCCTCGTGG TTGGTTGAAA AGCAAGTTCG GGGCGGAGTC CCCCACGATA ACGGTGGATG P. polymor TTCCTCGTGG TTGGTTGAAA AGCAAGTTCG GGGCGGAGTC CCCCACGATA A-GGTGGATG P. polymor TTCCTCGTGG TTGGTTGAAA AGCAAGTTCG GGGCGGAGTC CCCCACGATA ACGGTGGATG P. polysta TTCTTCGTGG TTGGTTGAAA AACAAGTTCG GGGCGGAGTC TCCCACGATA ACGGTGGATG P. purpusi TTCCTCGTGG TTGGTT---A AGCAAGTTCG GGGCGGAGTC CCCCACGATA ACGGTGGATG P. salicif TTCCTCGTGG TTGGTTGAAA AACAAGTTCG GGGCGGAGTC TCCCACGATA ACGGTGGATG ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 605 615 625 635 645 655 P. dasycar GGCCAACGCT C--G----AG ACCAATCGTG CCTGCGCGAC TCCG-ACACA ACGGACTTAT P. esperan GGCCAACGCT C--G----AG ACCAATCGTG CCTGCGCGAC TCCG-ACACA ACGGACTTAT P. glabell GGCCAACGCT C--G----AG ACCAGTCGTG GCTGTGCGAC TCCG-ACACA ACGGACTTAT P. glabell GGCCAACGCT C--G----AG ACCAGTCGTG CCTGTGCGAC TCCG-ACACA ACGGACTTAT P. grayanu GGCCAACGCT C--G----AG ACCAATCGTG CCTGTGCGAC TCCG-ACACA ACGGACTTAT P. grayanu GGCCAACGCT C--G----AG ACCAATCGTG CCTGTGCGAC TCCG-ACACA ACGGACTTAT P. grayanu GGCCAACGCT C--G----AG ACCAATCGTG CATGYGCGAC TCCG-ACACA ACGGACTTAT P. laxiflo GGCCAACGCC C--G----AG ACCAATCGTG CCTGCGCGAC TCCG-ACAAA ACGGACTCAT P. laxiflo GGCCAACGCT C--G----AG ACCAATCGTG CCTGCGCGAC TCCG-ACAAA ACGGACTCAT P. laxiflo GGCCAACGCC C--G----AG ACCAATCGTG CATGCGCGAC TCCG-ACAAA ACGGACTCAT P. laxiflo GGCCAACGCT C--G----AG ACCAATCGTG CCTGCGCGAC TCCG-ACAAA ACGGACTCAT P. lunatus AGCCCACGCT C--G----AG ACCAATCGTG GCTGTGGGAC TCCGGACGTA ATGGACTTAC P. lunatus AGCCCACGCT C--G----AG ACCAATCGTG GCTGTGGGAC TCCGGACGTA ATGGACTTAC P. microca AGCCAACGCT CGAGACCAAG ACCAATCGTG CCTGCGCGAC TCC-GACGTA ACGGACTTAC P. neglect GGCCAACGCT C--G----AG ACCAATCGTG CCTGCGCGAC TCCG-ACACA ACGGACTTAT P. oaxacan AGCCAACGCT C--G----AG ACCAGTCGTG CCTGTGCGAC TCCG-ACACA ACGGACTTAC P. oaxacan AGCCAACGCT C--G----AG ACCAGTCGTG CCTGTGCGAC TCCG-ACACA ANGGACTTAC P. campanu AGCCAACGCT C--G----AG ACCAGTCGTG CCTGTGCGAC TCCG-ACACA ACGGACTTAC P. pedicel GGCCAACGCT C--G----AG ACCAATCGTG CATGTGCGAC TCCG-ACACA ACGGACTTAT P. pedicel GGCCAACGCT C--G----AG ACCAATCGTG CCTGCGCGAC TCCG-ACACA ACGGACTTAT P. pedicel GGCCAACGCT C--G----AG ACCAATCGTG CCTGCGCGAC TCCG-ACACA ACGGACTTAT P. pedicel GGCCAACGCT C--G----AG ACCAATCGTG CCTGCGCGAC TCCG-ACACA ACGGACTTAT P. pedicel GGCCAACGCT C--G----AG ACCAATCGTG CATGTGCGAC TCCG-ACACA ACGGACTTAT P. pedicel GGCCAACGCT C--G----AG ACCAATCGTG CCTGCGCGAC TCCG-ACACA ACGGACTTAT P. polymor GGCCAACGCT C--G----AG ACCAATCGTG CATGTGCGAC TCCG-ACACA A-GGACTTAT P. polymor GGCCAACGCT C--G----AG ACCAATCGTG CATGTGCGAC TCCG-ACACA ACGGACTTAT P. polysta AGCCCACGCT C--G----AG ACCAATCGTG CTTGTAAGAC TCCG-ACGTG ATGGACTTAT P. purpusi GGCCAACGCT C--G----AG ACCAATCGTG CATGTGCGAC TCCT-ACACA ACGGACTTAT P. salicif AGCCCACGCT C--G----AG ACCAATCGTG CTTGTAAGAC TCCG-ACGTG ATGGACTTAT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|... 665 675 685 695 705 P. dasycar CGACCCCACA CGCGCCC-TC T-GTGAAAAC CGAGTGCGCC --ATCTAC P. esperan CGACCCCACA CGCGCCC-TC T-GTGAAAAC CGAGTGCGCC --ATCTAC P. glabell CGACCCCACA CGCGCCCCTC T-GTGAAAAT CGAGTGCGCG CCATCTAC P. glabell CGACCCCACA CGCGCCCCTC T-GTGAAAAT CGAGTGCGCG CCATCTAC P. grayanu CGACCCCACA CGCGCCC-TC T-GTGAAAAC CGAGTGCGCC --ATCTAC P. grayanu CGACCCCACA CGCGCCC-T- T-GTGAAAAC CGAGTGCGCC --ATCTAC P. grayanu CGACCCCACA CGCGCCC-TC T-GTGAAAAC CGAGTGCGCC --ATCTAC P. laxiflo CGACCCCACA CGCGCCC-TC T-GTGAAAAC CGGGTGCGCC --ATCTAC P. laxiflo CGACCCCACA CGTGCCC-TC T-GTGAAAAC CGAGTGCGCC ----CTAC P. laxiflo CGACCCCACA CGCGCCC-TC T-GTGAAAAC CGAGTGCGCC --ATCTAC P. laxiflo CGACCCCACA CGTGCCC-TC T-GTGAAAAC CGAGTGCGCC --ATCTAC P. lunatus TGACCCCACA CGCGCCC-TC ---------- CG-CT----- --ATCCAC P. lunatus TGACCCCACA CGCGCCC-TC T-GTG----- ------CGC- -TATCCAC P. microca CGACCCCACG CGCGCCACTC A-GTGAAAAC TTAGTGCGTG CCATCTAC P. neglect CGACCCCACA CGCGCCC-TC T-GTGAAAAC CGAGTGCGCC --ATCTAC P. oaxacan CGACCCCACG CGCGCCC-TC T-GTGAAAAC AGACTGCGCC --ATGTAC P. oaxacan CGACCCCACG CGCGCCC-TC T-GTGAAAAC AGACTGCGCC --ATGTAC P. campanu CGACCCCACG CGCGCCC-TC T-GTGAAAAC AGACTGCGCC --ATGTAC P. pedicel CGACCCCACA CGCGCCC-TC T-GTGAAAAC CGAGTGCGCC --ATCTAC P. pedicel CCACCCCACA CGCGCCC-TC T-GTGAAAAT CGAGTGCGCC --ATCTAC P. pedicel CGACCCCACA CGCGCCC-TC T-GTGAAAAC CGAGTGCGCC --ATCTAC P. pedicel CGACCCCACA CGCGCCC-TC T-GTGAAAAC CGAGTGCGCC --ATCTAC P. pedicel CGACCCCACA AGCGCCC-TC T-GTGAAAAC CGAGTGCGCC --ATCTAC P. pedicel CGACCCCACA CGCGCCC-TC T-GTGAAAAC CGAGTGCGCC --ATCTAC P. polymor CGACCCCACA CGCGCCC-TC T-GTGAAAAC CGAGTGCGCC --ATCTAC P. polymor CGACCCCACA TGCGCCC-TC T-GTGAAAAC CGAGTGCGCC --ATCTAC P. polysta TGACCCCACG TGCGCCC-TC T-GTGAAAAC CGAGTGTGC- -TATCCAC P. purpusi CGACCCCACA CGCGCCC-TC T-GTGAAAAC CGAGTGCGCC --ATCTAC P. salicif TGACCCCACG TGCGCCC-TC T-GTGAAAAC CGAGTGTGC- -TATCCAC CAPÍTULO V REUBICACIÓN DE Phaseolus dasycarpus En este capítulo se presenta el manuscrito en que se analiza la situación de Phaseolus dasycarpus y que fue enviado a la revista Brittonia para su publicación. Taxonomic re-assessment of Phaseolus dasycarpus (Leguminosae): Systematic position, chromosome studies and re-description. PEDRO MERCADO-RUARO, ALFONSO DELGADO-SALINAS AND FERNANDO CHIANG Mercado-Ruaro, P.*, A. Delgado-Salinas, and F. Chiang (Departamento de Botánica, Instituto de Biología, UNAM. Apartado Postal 70-233. C.P. 04510, México, D.F., México. *e-mail: mruaro@ibiologia.unam.mx). Taxonomic re- assessment of Phaseolus dasycarpus (Fabaceae): Systematic position, chromosome studies and re-description. Brittonia 00: 000–000. 200X. Based on new information of floral structures, seedling, fruit, seed, root, and leaflets, Phaseolus dasycarpus is re-described and illustrated. The species is transferred to sect. Pedicellati, based upon the results of phylogenetic analysis of ITS sequences. Its chromosome number was determined as 2n = 22, with metacentric and submetacentric chromosomes, and karyotype formula of 9m + 2sm. The limits of sect. Pedicellati are questioned. Key words: Chromosomes, ITS, Paniculati, Pedicellati, Phaseolus. Taxonomic re-assessment of Phaseolus dasycarpus (Fabaceae): Systematic position, chromosome studies and re-description. Con nueva información de estructuras florales, plántulas, frutos, semillas, raíz y folíolos, se redescribe e ilustra a Phaseolus dasycarpus. Además, se reubica a esta especie en la sección Pedicellati, con base en los resultados del análisis filogenético de secuencias de ITS. Se determina el número cromosómico 2n= 22, con cromosomas metacéntricos y submetacéntricos y fórmula cariotípica = 9m + 2sm. Se cuestionan los límites de la sección Pedicellati. The genus Phaseolus L. (Fabaceae) comprises approximately 70 species that are distributed in tropical and temperate regions of the New World, from southeastern Canada to northern Argentina. More than 90% of the species occur in Mexico, from sea level to 3000 m. Five species were domesticated and at least one, Phaseolus vulgaris L., with hundreds of cultivars, is extensively grown for its edible pods and seeds. Phaseolus species are predominately perennials, and most are trailing or climbing herbaceous vines, with indument of small uncinate hairs, and flowers with a distally coiled keel. The taxonomic history of Phaseolus reflects recurring taxonomic confusion mainly with the genus Vigna Savi (Delgado-Salinas, 1985). For Phaseolus of North and Central America, Delgado-Salinas (1985) enumerated 36 species in four sections; in contrast, Freytag and Debouck (2002) recognized 75 species arranged in 15 sections. Section Pedicellati Freytag & Debouck, comprises 11 species: P. pedicellatus Benth., P. laxiflorus Piper, P. purpusii Brandegee, P. esperanzae Seaton, P. oaxacanus Rose, P. grayanus Wooton & Standl., P. palmeri Piper, P. polymorphus S. Watson, P. scabrellus Benth. ex Watson, P. teulensis Freytag, and P. pyramidalis Freytag. Except for the last two, which were new species described by Freytag, the rest had been considered by Delgado-Salinas (1985) as conspecific with or varieties of P. pedicellatus. Phaseolus dasycarpus Freytag & Debouck (2002) was placed in section Paniculati Freytag subsect. Volubili Freytag. The material upon which the authors based their description consists of a single collection, Hernández & Trigos 872 (holotype and one isotype); therefore, their information was necessarily limited. In the present study, live specimens were collected in the field and grown in the greenhouse until they bloomed and set fruits. Flowers and fruits were dissected for study, and seeds were germinated to obtain root- tips for chromosome studies and to observe the seedlings. Chromosome counts were also obtained from pollen mother cells. We present herein a re- description with new information such as root and seedling type, characters of the standard petal and pollen grains, variation in leaflet form and texture, and chromosome number. In addition, we reconstruct the phylogeny of this species using nrDNA sequences. Materials and Methods MORPHOLOGY AND CHROMOSOME STUDIES. Description was based on herbarium specimens from the National Herbarium in Mexico City (MEXU) and the Instituto de Ecología, A.C. Herbarium in Xalapa (XAL), and on living material. Phaseolus dasycarpus was collected in the state of Hidalgo, México in the winter of 2001. Seeds were germinated for morphological and chromosomal studies. Seedlings were grown in greenhouse conditions until they bloomed and set fruit. Observations and measurements were made on living and herbarium materials. For observations of external pollen features, non-acetolized pollen grains were mounted on stubs, sputter coated with gold in an EMITECH K 550, and studied under a Hitachi S-2460N at 15 KV, scanning electron microscope (SEM). Pollen terminology follows Delgado-Salinas (1985). Mitotic chromosomes were studied in meristematic cells of root tips obtained from germinated seeds on Petri dishes with moist filter paper and cotton at 30°C and following the method described in Mercado-Ruaro and Delgado-Salinas (1988), while meiotic chromosomes were studied in pollen mother cells from immature anthers according to Tapia-Pastrana and Mercado- Ruaro´s (2001) method. PHYLOGENETIC ANALYSIS. Due to morphological similarity of Phaseolus dasycarpus of section Paniculati to members of section Pedicellati, a pylogenetic analysis using nrDNA ITS1 and ITS2 sequences from several populations was performed to assess if this morphological similarity was congruent or not with the sectional placement of this species. Within the ingroup taxones, in addition to Phaseolus dasycarpus and four species of section Paniculati, seven out of eleven species belonging to section Pedicellati were sampled. Samples were chosen to reflect as much of the morphological variation in section Pedicellati as possible. Efforts were made to include all species of this section, but P. palmeri, P. scabrellus, P. teulensis, and P. pyramidalis were not included in the study, since no populations of these species could be located. Four species from different related sections chosen among previously proposed sister groups of the Pedicellatus group (Delgado-Salinas et al., 1999) were included as outgroup members. Overall, fourteen species of Phaseolus were included in the analysis, representing species of the two main clades established in a recent phylogenetic study by Delgado-Salinas et al. (in prep.). Voucher information along with GenBank accession numbers are detailed in Table 1. DNA extraction, was carried out by DNA micro isolation by the CTAB method, followed Wilkie (1997). The primers for amplifying the ITS were those used by Delgado-Salinas et al. (1999). The parameters employed in the PCR for amplifying the ITS were those described by Kass and Wink (1997). The matrix includes several sequences reported by Delgado-Salinas et al. (1999) and from the GenBank. WinClada (version 0.0.unam21 [Beta], K. Nixon) was used to spawn the matrix into Nona (Goloboff, 1993). Heuristic searches included TBR branch swapping on 100 initial trees, holding 20 trees on each, and retaining a maximum 4000 trees. Bootstrap analysis was conducted with 1000 replications, 100 random taxones entry sequences per replication, and 10 trees saved per replication. Results TAXONOMIC TREATMENT Phaseolus dasycarpus Freytag & Debouck, emend. & ampl., Mercado-Ruaro. Sida, Botanical Miscellany 23: 120. 2002. TYPE: MEXICO. Veracruz: Municipio Huayacocotla, El Paraje, Huayacocotla (20°30’N, 98°30’W), 1950 m, 24 Oct 1970, Hernández & Trigos 872 (HOLOTYPE: F; ISOTYPE: MEXU). (Fig. 1) Herbaceous, twining or trailing, perennial vines, to 2 m long. Root thick and fleshy, 10-15 cm long. Stem cylindrical, purple to green, 1-1.25 mm diam., striate, with internodes 8-8.5 cm long, sparsely strigose, with retrorse hairs of two sizes, the long ones 0.4-0.45 mm, the short ones 0.1-0.15 mm; stipules deltoid, 2-2.5 mm X 1 mm at the base, 3-(occasionally 4-) nerved, adaxially covered by hairs 0.3-0.35 mm long. Leaves pinnately trifoliolate, 10-12 cm long, membranaceous to papyraceous, deep to light green, with prominent purple- red (in living material) veins in upper side, or with white veins not prominent in either upper or lower side; petiole 3-3.5 cm long, terete, sparsely covered with long and short hairs, canaliculate; rachis 1-1.5 cm long, canaliculate; lateral pulvinuli 3-3.5 mm long, the central one 2-2.5 mm, adaxially covered by straight long hairs; stipels oblong, 1-nerved, 1.5 mm long; central leaflet very variable in shape, either elongated and thin, 0.8-1.2 cm wide with two lobes at the base, or triangular sublobed, or triangular with or without two lobes at the base, 5-6.5 cm X 3-4 cm, apex acuminate, slightly apiculate, the upper and lower surfaces sparsely strigose, the margins ciliate; lateral leaflets with unequal base, ovate, or with a lateral lobe above the base, or triangular with unequal basal lobes. Inflorescence a pseudo-raceme or a scarcely developed panicle; peduncle 0.7 mm diam., striate, 30-40 cm long, puberulent; rachis 15-22 cm, with uncinate hairs 0.5 mm long, with 4-10 nodes, each node bearing 2-4 flowers; primary bract lanceolate, 3-3.5 mm X 0.65 mm, with 2-3 (occasionally 5) green veins, lustrous, abaxially pubescent, persistent; pedicel 0.6-0.9 cm at anthesis, 1.0-1.2 cm in fruit, adaxially green, abaxially purple, with uncinate hairs 0.05 mm long; bracteole ovate to lanceolate, 1-nerved or nerveless, 0.75 mm long, ciliate, purple or green, persistent. Flowers purple to lavender, fading to yellow-brown; calyx campanulate, 5.6-6.2 mm X 4.3-5.6 mm, inner surface of tube strigillose, outer surface covered with short hairs, abundantly so on lower lobe, upper lobes connate, emarginate, the three lower lobes deltoid, unequal, lower lobe 1.7-3 mm long; standard usually wider than long, recurved at anthesis, with the upper part hood-like, thickened at point of folding up, margins of blade rolled backwards, auriculate at base with quadrate flap-like appendages, 0.9-1 cm high, 0.9-1.1 cm wide; wings convex, slightly unequal, 0.9-1.0 cm X 5-6 mm, 2-3 mm at the narrowest part that adheres to the keel, claws 3.5-4.5 mm long; keel incurved and rotated laterally above the curve, ca. 1 cm long, distally coiled with 1.5 spirals; androecium diadelphous, vexillar stamen with a gibbous appendage, 1-1.5 mm broad, 0.6-0.7 mm from the base; stamens connate into a tube 0.9-1 cm, with two lobe-like appendices 1 mm from the base; anthers oblong, 0.65-0.75 mm X 0.25-0.35 mm; pollen tricolporate, exine sculpturing narrowly reticulate, operculum hemispheric, surface regulate (Fig. 2); gynoecium surrounded at base by a cylindrical nectary, less than 1 mm long; ovary densely strigose, 5.3-6 mm X 1.2-1.55, 4-5-ovuled; style distally thickened, with a pollen brush; stigma subapical, introrse. Fruit linear-falcate, densely strigose (immature) to hirsute, valves elastically dehiscent along both sutures and curling, 3.5-4.5 cm X 7.5-8 mm, with a straight, 5-6 mm beak. Seeds 2-4, brown, rounded and flattened, 4.2-5 mm long, 3.5-4.3 mm wide, 2.5- 3.2 mm thick, hilum ovate 1.23-1.45 mm X 0.75-0.9 mm. Seedling with hypogeal germination, eophylls simple and opposite, ovate and acute at the tip, petiolate. Distribution and ecology.- Phaseolus dasycarpus occurs in the states of Hidalgo and Veracruz, Mexico, between 20°31’ and 20°39’ long. N, and between 98°29’ and 98°39’ lat. W, at 1950 – 2250 m, in cloud and pine-oak forests on rocky volcanic soil. Phenology.- Flowering and fruiting takes place from July through November. Additional specimens examined: MEXICO. HIDALGO: Municipio Zacualtipán, gravel road to Tlahuelompa, 24 Sept 1995 and 15 Nov 1995, Alcántara 2045, 2721 (MEXU); pine woods on trail to Nonoalco below Tepeoco, about 4 mi from Zacualtipán near Tianguistengo road, 18 Oct 1949, Moore Jr. 5359 (MEXU); altered oak forest, with Pinus, Clethra, and Rubus, Km 91.5 of Highway 105, from Huejutla de Reyes to Pachuca, 28 Jan 2001, Mercado et al. 131 (MEXU). VERACRUZ: 3 km SW of Huayacocotla along road to Palo Bendito, Jul 22 1982, Nee & Diggs 25183 (MEXU, XAL). MORPHOLOGICAL FEATURES The hood-like standard (Fig. 1; D-F) and the pubescent fruit with a conspicuous thin beak (Fig. 1; A) allow for quick identification of this species in the field or in the herbarium. Freytag and Debouck (2002) stated that P. dasycarpus is 1 to 1.5 m tall, while field and greenhouse observations allowed us to determine its size actually up to 2 m. The number of ovules, 4 to 5, was obtained after dissecting 10 flowers, and it differs from the number of 6 that was reported in the original description. CHROMOSOME STUDIES The mitotic chromosome number was 2n = 22 (Fig. 3), which agrees with most of the species in the genus (Mercado-Ruaro and Delgado-Salinas, 1996, 1998), thus confirming the base chromosome number of x = 11 for Phaseolus (Goldblatt, 1981; Mercado-Ruaro and Delgado-Salinas, 1996). Meiotic division was normal, with formation of 11 bivalents and segregation of 11 chromosomes to each of the poles. The karyotype formula of the chromosomes of P. dasycarpus is composed of 9 metacentrics + 2 submetacentrics, a pair of the latter bearing a secondary constriction; the average chromosome size is 1.38 µm, ranging from 1.125 to 1.69 µm; the chromosome total diploid length is 30.37 µm, with a symmetry index TF% of 41.16 ([sum total of short arms / sum total of chromosome length] x 100). All the results of the karyotype analysis fall within the range of chromosome measurements of 10 wild Phaseolus species studied by Mercado-Ruaro and Delgado-Salinas (1998). PHYLOGENETIC ANALYSIS The ITS phylogenetic tree (Fig. 4) resolves P. dasycarpus nested in the clade corresponding to sect. Pedicellati. This contrasts with Freytag and Debouck’s (2002) placement of P. dasycarpus in sect. Paniculati. Members of sections Brevilegumeni, Paniculati and Rugosi, such as P. lunatus, P. polystachyus, P. salicifolius, P. oligospermus and P. microcarpus, together with P. oaxacanus, form a well supported clade apart from the group of species forming sect. Pedicellati. Phaseolus oaxacanus is excluded from sect. Pedicellati (sensu Freytag & Debouck, 2002), in agreement with Delgado-Salinas et al. (1999) and Delgado- Salinas et al. (in prep.). Phaseolus neglectus of sect. Digitati (Freytag & Debouck 2002) is resolved within the Pedicellati clade, also in agreement with other phylogenetic analyses of Phaseolus (Delgado-Salinas et al., 1999 and Delgado-Salinas et al., in prep.). Such agreement among different phylogenetic analyses that utilize different combinations of data (although always with ITS sequences) bolsters our conclusion that P. dasycarpus is part of the Pedicellati clade. These molecular results, in addition to the new morphological information, compel us to transfer P. dasycarpus to sect. Pedicellati. This transfer does not alter the morphological integrity of the section, since the characteristics that define it are shared with P. dasycarpus. However, this arrangement plus the inclusion of P. neglectus and exclusion of P. oaxacanus questions the monophyly of section Pedicellati, and makes it necessary to be re-defined (Mercado-Ruaro, in prep.). Acknowledgments We thank Maria del Rosario García Peña for her help in obtaining the loans of specimens used in writing this paper; Albino Luna for drawing the beautiful illustration; Helga Ochoterena, L. Kelly, and M. Lavin made useful suggestions to improve the manuscript; Norma Oropeza, Alberto Reyes, Gabriel Flores and Fernando Tapia for their assistance in the field; Virginia León Règagnon and Laura Márquez Valdelamar for the facilities and their support in the molecular studies; Berenit Mendoza for preparing the SEM photo of the pollen, and Alfredo Wong for providing computer support. The Dirección General de Apoyo al Personal Académico (DGAPA-UNAM) awarded a graduate studies scholarship to the first author. Literature Cited Delgado-Salinas, A. 1985. Systematics of the genus Phaseolus (Leguminosae) in North and Central America. Ph. D. dissertation, University of Texas, Austin, U. S. A. ——————, T. Turley, A. Richman & M. Lavin. 1999. Phylogenetic analysis of the cultivated and wild species of Phaseolus (Fabaceae). Systematic Botany 24: 438 – 460. Freytag, G. F. & D. G. Debouck. 2002. Taxonomy, distribution, and ecology of the genus Phaseolus (Leguminosae-Papilionoideae) in North America, Mexico and Central America. Sida, Botanical Miscellany 23: 1-300. Gepts, P. 1996. Origin and evolution of cultivated Phaseolus species. Pages 65 – 74. In: B. Pickersgill & J. M. Lock, editors. Advances in legume systematics. Part 8. Legumes of Economic Importance. Royal Botanic Gardens, Kew, UK. Goldblatt, P. 1981. Cytology and the phylogeny of Leguminosae. Pages 427 – 463. In: R. M. Polhill & P. H. Raven, editors. Advances in legume systematics. Part 2. Royal Botanic Gardens, Kew, UK. Goloboff, P. 1993. Nona. Software and documentation by the author, Tucumán, Argentina. Kass, E. & M. Wink. 1997. Phylogenetic relationships in the Papilionoideae (Family Leguminosae) based on nucleotide sequences of cpDNA (rbcL) and ncDNA (ITS 1 and 2). Molecular Phylogenetics and Evolution 8: 65- 88. Mercado-Ruaro, P. & A. Delgado-Salinas. 1996. Karyological studies in several Mexican species of Phaseolus L. and Vigna Savi (Phasolinae: Fabaceae). Pages 83-87. In: B. Pickersgill & J. M. Lock, editors. Advances in legume systematics. Part 8. Legumes of Economic Importance. Royal Botanic Gardens, Kew, UK. —————— & ——————. 1998. Karyotypic studies on species of Phaseolus (Fabaceae: Phaseolinae). American Journal of Botany 85(1): 1 - 9. Tapia-Pastrana, F. & P. Mercado-Ruaro. 2001. A combination of the “squash” and “splash” techniques to obtain the karyotype and assess meiotic behavior of Prosopis laevigata L. (Fabaceae: Mimosoideae). Cytologia 66: 11 – 17. Wilkie, S. 1997. Genomic DNA isolation, southern blotting and hybridization. Pages 3-14. In: M. S. Clark, editor. Plant Molecular Biology. A Laboratory Manual. Springer-Verlag, Berlin, Germany. FIGURE LEGENDS Figure 1. Phaseolus dasycarpus Freytag & Debouck. A. Habit, inflorescences, flowers, and fruits. B. Stem node showing stipules, petiole and basal part of peduncle. C. Floral node with flower bud. D. Flower, frontal view. E. Flower, lateral view. F. Standard petal, showing the upper part hood-like. G. Keel, lateral view, showing distal part coiled with 1.5 spirals. H. Wing petal, showing auricle at base and claw. I. Gynoecium, showing ovary with cylindrical nectary at base, style with pollen brush, and introrse stigma. J. Diadelphous androecium with vexillary stamen, showing appendix at base. K. Seed, frontal and lateral view, showing hilum. L. Seedling of three-weeks old. (Drawn from P. Mercado et al. 131 by Albino Luna). Figure 2. Scanning electron micrograph of non-acetolyzed pollen grain, equatorial view, showing the operculum with rugulate surface (P. Mercado et al. 131). Figure 3. Mitotic chromosomes of Phaseolus dasycarpus from root meristem, 2n= 22. Figure 4. Strict consensus tree of a heuristic analysis, based on ITS1 + ITS2 sequences (length= 297, CI= 77, RI= 86). Numbers above branches indicate parsimony bootstrap values greater than 50 %. Note that the Pedicellati clade includes species of sections Paniculati (P. dasycarpus) and Digitati (P. neglectus). Numbers after species correspond to ones used in Table 1. Table 1. Phaseolus species included in the present nrDNA ITS phylogenetic analysis. Nomenclature follows Freytag and Debouck (2002). All specimens are deposited in MEXU, except for P. lunatus (CIAT G-26309), and P. polystachyus (B. Summers 4680). Asterisks after species indicate that ITS sequence information is from GenBank and accession numbers are the following: AF115175, AF115171, AF115209, AF115236, AF115242, AF115232, AF115240, AF115196 and AF115182. Figure 1 E '