UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO Facultad de Medicina Instituto de Fisiología Celular Instituto de Investigaciones Biomédicas LA EXPRESIÓN DEL BETAGLICANO (RECEPTOR 111 DEL TGF-~) SE ELEVA A NIVEL TRANSCRIPCIONAL DURANTE LA MIOGÉNESIS ESQUELÉTICA Tesis que para obtener el Título de: LICENCIADO EN INVESTIGACIÓN BIOMÉDICA BÁSICA Presenta: NEFTALÍ YOSHIAKI PÉREZ KATO Director de tesis: Dr. FERNANDO LÓPEZ CASILLAS La presente tesis se realizó con el patrocinio del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, el Howard Hughes Medical Institute y una beca Probetel de Fundación UNAM. México, Distrito Federal, 2005. UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. DEDICATORIAS A la persona que más quiero en este mundo: mi papá Neftalí. Gracias por el amor, el cariño y la paciencia que siempre me has tenido, así como por el apoyo incondicional que me has brindado para todos mis proyectos. Sé que te he quedado mal a veces, y aun así has estado ahí en cada momento dispuesto a perdonarme, a escucharme y a ayudarme. ¡Te quiero mucho papá! A la memoria de mi mamá Alicia, de mi olliichan Hideo, de mi abuelo Agustín y de mi abuela Crescencia: su grato recuerdo estará por siempre en mi corazón. A mi obaachan Kinuyo por todos los magníficos momentos que pasamos juntos en Coatza y por haberme brindado tanto cariño y bondad, cualidades que tu corazón desborda. A mi hermano Naoki. A Sumiko, por tu invaluable apoyo a pesar de que a veces hemos tenido diferencias. A mis tíos Valdés Kato y Jiménez Kato por su cariño. -------------- -------- ; ~ -,~~ ... ~~ < ...... ~. ('t:.; N~~'~' .. " ~"' .... i ~f'.~ ... " ')i~~~~! .. r(:~ .... f. ..... ;: . ~;.t. ...... /~. ~ ..... ~ ..... .. .·.·s·!.- ... .. '. EDI ATORIAS la persona que ás quiero en este undo: i papá eftalí. racias por el a or, el cariño y la paciencia que sie pre e has tenido, así co o por el apoyo incondicional que e has brindado para todos is proyectos. é que te he quedado al a veces, y aun así has estado ahí en cada omento dispuesto a perdonarme, a escuchar e y a ayudarme. ¡Te quiero ucho papá! la emoria de i amá licia, de i olliichan ideo, de i abuelo gustín y de i abuela rescencia: su grato recuerdo estará por sie pre en i corazón. i obaachan inuyo por todos los agníficos omentos que pasamos juntos en oatza y por haber e brindado tanto cariño y bondad, cualidades que tu corazón desborda. i her ano aoki. umiko, por tu invaluable apoyo a pesar de que a veces he os tenido diferencias_ A is tíos Valdés Kato y Ji énez Kato por su cariño_ AGRADECIMIENTOS A la UNAM, por haberme brindado tantas experiencias hermosas a lo largo de mi vida universitaria. A Valentín Mendoza Rodríguez, por la convivencia que hemos tenido en las buenas, pero sobre todo por hacerme el gran favor de escuchar todas las cosas buenas y malas que me suceden y aconsejarme sabiamente, por el grandísimo aliento que me has dado para seguir adelante cuando he estado devastado, incluyendo vida en el laboratorio y fuera de él. Asimismo, por los experimentos que me ayudaste a hacer, sin los cuales, esta tesis simplemente no hubiera salido adelante. A Fernando López Casillas por haberme brindado la oportunidad de desarrollar los experimentos de esta tesis en su laboratorio, por haber confiado en mí, por haberme tenido paciencia y seguido apoyando a pesar de las decepciones que le causé; además, por haberme mandado a realizar una estancia de investigación en la "Católica" de Chile, experiencia que resultó ser sumamente enriquecedora y "abridora de ojos": definitivamente una de las mejores durante mi licenciatura y que además sobrepasó el ámbito académico. A Enrique Brandán Siques de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Pontificia Universidad Católica de Chile en Santiago, por haberme permitido realizar una estancia de investigación en su laboratorio para los experimentos de monitoreo de la actividad del promotor del gen del betaglicano en células C2C12 y por haberme patrocinado, entre muchas otras cosas, unas increíbles clases de esquí en F arellones. A Cecilia Riquelme lIIanes por haber aportado muchos datos para el logro de esta tesis. A todos los integrantes del laboratorio del Dr. Enrique Brandán en Chile por haber sido muy atentos conmigo cuando estuve ahí. A mis cuates por hacer mi vida considerablemente más agradable: Valentín Mendoza Rodríguez, Carmen Cruz Revilla, Javier González Camarillo, Osear Enrique Salinas Santana, Rocío Alcántara Hernández, Dayana Torres Rodríguez, Enrique Espinosa Arciniega, Fabiola Méndez, Yazmín Escobedo, Adam Sonabend, Alejandro García, Takahiro Endo Martínez, Mario Bernal Ladrón de Guevara, Jessica Guzmán, Verónica Jarrín, Susana García, Diana Espinoza, Alejandra González Guadarrama, Italiví Miranda Pérez, Aline García Pérez, Julio César Carrero, Lenin Domínguez, Paulina Cortés, Hara sensei (de Soka Gakkai), José Ignacio Zayas Jaramillo, Isela Mendoza Cervantes, Karla Asúnsolo Vargas, Aldo Gelover Escamilla, Rita Orozco, Ximena Martínez, José Luis García Morales, Annika Alberti, Claudia Escobedo Arriaga, Cynthia Sánchez, Ariadna Islas, Eduardo Martínez, Bernardo Franco, Andrés Bendesky e Ivette (creadores del "Oncoclub"), Luis Ramírez Trejo, Tania Jiménez, Said Pérez Rubio, etc. (disculpas por si se me escapan algunos). A la mamá de Carmen Cruz, por el apoyo que me brindó en momentos de fragilidad emocional y por ayudarme a asimilar sin rencor cosas que pasan en la vida y a despejar algunas de mis dudas existenciales. A mis profesores cuyas clases fueron altamente inspiradoras: Luis Mendoza Sierra, María Elena Álvarez Buylla, Edmundo Lamoyi Velázquez, Leticia Rocha Zavaleta, Fernando López Casillas, Federico Bermúdez Rattoni, Martha Lilia Escobar, Lino Díaz de León, Irma Villalpando Fierro, Alfonso León del Río, Claudia González Espinosa, Luis Padilla Noriega, Marina Macías Silva, Yolanda Caballero Arroyo, Martha Menes Arzate y Julio Morán; Ludivina Herrera Luque, Guadalupe Carrera Dorantes e Irma López Saura; Marco Perilli y Cecilia Méndez Nájera. A mi profesora Esther de las Nieves Paz Pérez Farca por haber abierto mis ojos al fascinante mundo de la biología en quinto de prepa, hecho que considero clave para haber tomado la decisión de estudiar investigación biomédica básica. A la licenciatura en investigación biomédica básica por haberme hecho crecer, por haberme dado una preparación académica sólida, por haberme hecho pasar momentos de éxtasis y por qué no decirlo, también de desilusión en el laboratorio. A mis cuates de generación: Rodolfo García, Paula Licona, IIeana Licona, Naika Rueda y Gabriel por la convivencia durante el inicio de nuestra travesía por "IBB", por haber vivido juntos un sinfín de momentos felices en clase y afuera de ella, y cómo no recordarlo, por nuestras discusiones a muerte, al fin y al cabo estériles, sobre mil aspectos de la ciencia. A mis cuates del lab: Gerardo González Núñez, Dulce Mata Espinosa, Paty Juárez Camacho, Verónica Ponce, Gaby Velasco, Adverqueydi Zúñiga, Pepe Esparza y Male Vilchis, por haber compartido momentos de júbilo y de derrota. A todos los miembros de mi jurado de examen profesional: Marina Macías Silva, Adolfo García Sáinz, Jesús Chimal Monroy, Fernando López Casillas y Alfonso León del Río por haber revisado mi tesis con esmero y haberle corregido errores que creo que yo nunca hubiera notado, sinceramente muchas gracias. A Juan Manuel Barbosa e Ivette Rosas de la Unidad de Cómputo del Instituto de Fisiología Celular por haberme ayudado a darle un buen formato de presentación a esta tesis, hurgando en los misterios (al menos para mí) de Word, de Adobe y de mil programas más. A Edmundo Lamoyi y a Ada Méndez por su eficiente apoyo para los trámites de mi titulación. A Edmundo Lamoyi además por defenderme de una mala persona que quiso perjudicarme abusando de su posición como coordinador de una materia. A mis tíos Valdés Kato y Jiménez Kato por haberme apoyado económicamente, por haberme "arreado" para que me titulara cuando tenía abandonada esa meta y por no haber perdido la esperanza de que algún día lo lograría. A Claudia Dixon y Dimitris Georgellis por haber corregido el resumen en inglés de esta tesis con mucha amabilidad y celeridad. A Benjamín Guerrero, Diego Barona, Ángel Franco, Lenin Reyes, Fernando Ortiz Monasterio y Fernando Molina por fomentar en gran medida mi ego y seguridad. A tantas personas cuyo apoyo ya sea de compañerismo, académico, técnico, o de cualquier otra índole fue valioso para salir adelante en estos años que duró mi licenciatura. íNDICE 1. Resumen 1. en español. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 11. en inglés. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 2 2. Abreviaturas. ......... ...... . ..................................... 3 3. Antecedentes 1. COMUNICACiÓN INTERCELULAR .............................. . .. 6 Principales sistemas de señalización intercelular en vertebrados. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 11. El TGF-p . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 14 El betaglicano . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 21 111. MIOGÉNESIS ESQUELÉTICA ................ .. . . ... ... . .... .... .. 50 IV. ANTECEDENTES INMEDIATOS DEL PRESENTE TRABAJO EXPERIMENTAL .. ..... ... . ... . .. . .......... 58 4. Hipótesis............ .. .................................... . . . ... 59 5. Objetivos l. generales. ....... ... . .............. .. ........... . ............. 59 11. particulares... .... ....... . . ..... ....... ....... .. ..... .. .. . .... . 59 6. Resultados........... . . ... .... . .. ......... ... . ............ . . .. . . . 60 7. Discusión........................... ....... ... . ......... .. ....... 84 8. Conclusiones......... ..... ................ .. .. . .................. 94 9. Perspectivas .................... .. ........ .. ................ ... ... 95 10. Procedimientos experimentales. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 101 11. Referencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 120 Figuras en antecedentes 1. Tipos de señalización y ojo de Drosophila 2. Principales sistemas de comunicación intercelular en vertebrados 3. Estructura cristalográfica del TGF-~2 y de T~RII con TGF-p3 unido 4. Mecanismo de activación de los receptores del TGF-p 5. Estructura modular del proteoglicano del betaglicano 6. Distribución de los exones en el gen del betaglicano murino 7. Funciones a nivel celular del betaglicano 8. Estructura de los Smads 9. Vía integrada de la señalización por TGF-~ de la membrana plasmática al núcleo 10. Regulación molecular de la formación de miotubos a partir de mioblastos Figuras en resultados 1. Durante la miogénesis se incrementa la cantidad del proteoglicano del betaglicano 2. El nivel del ARNm del betaglicano aumenta durante la miogénesis 3. Translocación de una porción del betaglicano a la matriz extracelular en miotubos 4. Patrón de digestión de los BACps e identificación de los fragmentos de digestión en donde se localiza el promotor 5. Clonación del fragmento Hindlll-Hindlll de -6.5 kb 6. Alineamiento de los promotores del betaglicano de ratón y de rata 7. Estructura de la región promotora, del exón 1 y parte del intrón 1 del gen del betaglicano murino, localización de algunos sitios potenciales de regulación en cis y contexto genómico en el que están inmersos 8. Construcciones del promotor del betaglicano -Iuciferasa 9. Actividad del promotor del betaglicano murino en mioblastos LsEg de rata y en fibroblastos Rat-1 de rata 10. Incremento de la actividad del promotor del betaglicano murino en la miogénesis esquelética 11. Modulación de la actividad del promotor del betaglicano por diversos agentes 12. Transactivación del promotor del gen del betaglicano por MyoD pero no por miogenina 13. Presentación de TGF-~ a sus receptores señalizadores a través del betaglicano en mioblastos Figura en procedimientos experimentales 1. Mapa del plásmido B70 -en el vector pBSII-KS(+)-, cuya secuencia ensamblada se denominó Contig 6.5 Tablas l . Reguladores de la expresión o de las propiedades del betaglicano 11. Nombre de los 8ACps 111. Cluster de sitios MEF2-MyoD-Myf5 IV. Ensamble de la secuencia de la clona 870 Anexos 1. Listado completo de los elementos de regulación en cis protenciales hallados con el software "Professional Matlnspector" 11. Reprint del artículo en la revista The Joumal of Biological Chemistry donde quedaron reportados los resultados de esta tesis 1. 1. Resumen en español El término factor transformante del crecimiento p (TGF-P) se refiere a una familia de polipéptidos multifuncionales que controlan la proliferación y la diferenciación celular, entre otras funciones. Existen 3 isoformas de TGF-p que ejercen sus acciones a través de tres receptores de alta afinidad localizados en la superficie celular llamados tipo l (TPRI), tipo 11 (TpRII) Y tipo 111 (TpRIII), conocido este último también como betaglicano. El betaglicano es un proteoglicano de sulfatos de heparano y de condroitina que no posee actividad catalítica -a diferencia de TpRII y TpRI- Y que une las 3 isoformas de TGF-p, modulando ya sea positiva o negativamente la interacción de estos ligandos con TpRl1. Estas funciones del betaglicano contrarias entre sí pueden estar en función de su nivel de glicanación, de su cantidad relativa con respecto a los receptores señalizadores y de su ubicación extra o pericelular. En la presente tesis se reporta que la expresión del proteoglicano del betaglicano aumenta considerablemente durante la diferenciación de mioblastos C2C12 en miotubos, un modelo in vitro de la formación de músculo esquelético. La elevación de la expresión del proteoglicano del betaglicano en los miotubos se correlaciona con una elevación de su ARNm. Con tal de determinar si la subida en la cantidad del ARNm tiene su origen -al menos en parte- en una mayor transcripción del gen del betaglicano, clonamos y secuenciamos la región promotora del gen y observamos que en los miotubos la actividad del promotor aumenta aproximadamente un orden de magnitud con respecto a la que tiene en los mioblastos. Notablemente, observamos que el comportamiento de un gen reportero fusionado con la región promotora mimetiza grosso modo el del ARNm, lo cual sugiere que el segmento que clonamos posee información necesaria para recapitular la actividad del promotor endógeno al menos en las líneas celulares en que fue probado. Asimismo, observamos que en los mioblastos, la región promotora es regulable positivamente por ácido retinoico, un inductor de la miogénesis, y negativamente por TGF-p, un inhibidor de la miogénesis, pero no por bFGF, otro inhibidor de la miogénesis. Encontramos también que MyoD, un factor de transcripción miogénico maestro, capaz de transdiferenciar fibroblastos en mioblastos, incrementa 3 veces la actividad del promotor. El análisis estructural del promotor revela sitios potenciales de regulación por transactivadores importantes durante el desarrollo muscular como MyoD, MEF2, GATA4, NF-ATc y Smad3 y 4. También encontramos que en los miotubos, una parte de la masiva población de las moléculas de betaglicano se transloca a la matriz extracelular, donde podría secuestrar a factores de crecimiento como TGF-p y/o bFGF. Mioblastos transducidos con un adenovirus que expresa al betaglicano silvestre muestran una mayor sensibilidad al TGF-p, lo cual sugiere que en los mioblastos el betaglicano potencia la unión del TGF-p a sus receptores señalizadores y también sugiere que lo hace durante la conversión de estas células en miotubos. 1 1.11. Resumen en inglés The term type ~ transforming growth factor (TGF-~) refers to a family of multifunctional polypeptides that control cell proliferation and differentiation, among other cell functions. There are three TGF-~ isoforms that exert their effects through three high affinity cell surface receptors, types I (T~RI), 11 (T~RII), and 111 (T~RIII); T~RIII is also called betaglycan. Betaglycan is a heparan- and chondroitin-sulphate proteoglycan that has no known signaling motifs, in contrast to T~RII and T~RI. T~RIII is believed to be a co- receptor that either enhances or restrains TGF-~ signaling through modulation of the contact between T~RII and TGF-~. Three aspects of betaglycan could be responsible for its dual function: i) its degree of glycosylation, ii) its ratio with regard to the signaling receptors, and iii) its extra- or pericellular localization. In this thesis, we report that expression of betaglycan increases considerably during differentiation of C2C12 myoblasts into myotubes, a model of skeletal muscle forrnation in vitro. Augmented expression of betaglycan in myotubes is correlated with elevated levels of its mRNA. To determine whether the rise in the betaglycan mRNA is the consequence of transcriptional upregulation, we c10ned the promoter region of the murine betaglycan gene and fused it to the luciferase gene to create a reporter. Using this construct, we demonstrated that the activity of the cloned promoter is about one order of magnitude higher in myotubes than in myoblasts. Furtherrnore, we observed that the behavior of the reporter-fusion mimics approximately that of the actual betaglycan mRNA, suggesting that the stretch of promoter we cloned possesses necessary information to carry out the function of the endogenous gene promoter, at least in the cell lines we tested (LsE9, Rat-1 and C2C12) . In addition, we observed that in myoblasts, the c10ned promoter is regulated positively by retinoic acid, an inducer of myogenesis, and negatively by TGF-~, an inhibitor of myogenesis. It is noteworthy that bFGF, another inhibitor of myogenesis, has no effect on the activity of this promoter. We also found that MyoD, a master myogenic transcription factor capable of trans-differentiating fibroblasts into myoblasts, increased by 3-fold the activity of the betaglycan promoter. Structural analysis of the promoter region revealed several potential DNA targets of trans-acting factors that are important during muscle development such as MyoD, MEF2, GATA4, NF-ATc, and Smads 3 & 4. Moreover, we observed that during myogenesis, sorne betaglycan molecules become translocated into the extracellular matrix, where they could function as a reservo ir of growth factors such as TGF-~ and/or bFGF. This in turn, if true, could provide an additional step for fine-tuning the signaling capability of one or both ligands. Finally, we demonstrate that myoblasts transduced with an adenovirus-encoding betaglycan have an increased sensitivity to TGF-~, suggesting that betaglycan functions as an enhancer of TGF-~ binding to its signaling receptors in proliferating myoblasts. This finding also suggests that betaglycan has the same function when these cells undergo differentiation. 2 2. Abreviaturas 5'-NT 3'-NT [Ca2+]¡ a.a. ActR-IB ADAM ADN ADNc Adv-BG aFGF ANF Ants APC AraC ARN BAC BACgs BACps BAMBI bFGF BG bHLH Blow BMPR-I BMPs Brn-2 BSA c-Ski C/EBP CaMKII Cak CBP CD Cdk Ci CIP CK CMV CPBP CREB CtBP CTGF DEPC Dhh DMEM DMSO dNTPs DPC4 DSS región S' no traducida de un ARNm región 3' no traducida de un ARNm concentración intracelular de calcio aminoácidos receptor lB de activina a disintegrin and metalloprotease ácido desoxirribonucleico ADN complementario adenovirus que expresa al betaglicano silvestre de rata acidic FGF factor natriurético auricular antisocial anaphase promoting complex o ciclosoma ¡3-D-arabino-furanósido de citosina ácido ribonucleico bacterial artificial chromosome BACs que contienen al gen del betaglicano sin incluir al promotor BACs que contienen al promotor y parte del gen del betaglicano BMP, activin, and TGF-p membrane-bound inhibitor basic FGF betaglicano o receptor tipo 111 del TGF-¡3 dominio básico seguido de uno hélice-asa-hélice blown fuse receptor I de BMPs proteínas morfogenéticas óseas brain-2 albúmina de suero bovino cellular transforming protein of the Sloan Kettering Institute virus CCAA T/enhancer-binding protein calciumlcalmodulin-dependent protein kinase 11 cdk activating-kinase complex CREB-binding protein cluster s of differentiation cyclin-dependent kinase curie calf intestinal phosphatase cinasa de creatina citomegalovirus core promoter-binding protein ó ZF9 cAMP-responsive element binding protein C-terminal binding protein connective tissue growth factor dietilpirocarbonato desert hedgehog Dulbecco's modified Eagle's medium dimetilsulfóxido desoxinucleótidos: dATP, dCTP, dGTP y dTTP deleted in pancreatic carcinoma 4, también conocido como Smad4 suberato de disuccinimidilo 3 Duf EDTA EEP ELF e.g. ESTs et al. FCM FGF FGFR FKBP12 FKHR Freac-1 Freac-2 FSH GAGs GFI-1 HAT HBSS HDAC HGF/SF HLH Id i.e. IgG Ihh IFN-y IP IPTG JNK kb Ko A LAP LB Lef1/Tcf LTBP Lux MAPK Mbc MEF2s MEKK1 MH MIP-1a. Miz-1 MMP MOPS MRFs MZF1 N-CAM N-CoR dumbfounded ácido etilendiaminotetraacético extracto de embrión de pollo embryonic liver fodrin exempli gratia expressed sequence tags et a1ii mioblasto competente para la fusión fibroblast growth factor fibroblast growth factor receptor proteína de 12 kDa que bloquea la actividad basal de T¡3RI forkhead in human rhabdomyosarcoma forkhead-related activator 1, también conocido como HFH-8 forkhead-related activator 2, también conocido como LUN ó FoxF2 follicle-stimulating hormone glicosaminoglicanos growth factor independence-1 histone acetyltransferase sales balanceadas de Hanks histone deacetylase hepatocyte growth factor / scatter factor dominio hélice-asa-hélice inhibitor of differentiation id est inmunoglobulina de isotipo G indian hedgehog interferón y inmunoprecipitación isopropil-¡3-D-tiogalactopiranósido c-jun N-terminal kinase kilobases constante de disociación longitud de onda en algunos casos, nombre de un bacteriófago en otros latency-associated polypeptide medio Luria Bertani Iymphoíd enhancer-bíndíng factor 1 / T cell-specífic factor latent TGF-p bíndíng proteín luciferasa mitogen-actívated protein kínase myoblast cíty myocyte-specífíc enhancer-bíndíng factors 2 MAPKlERK kínase kínase 1 mad-homology regíon proteína 10. inflamatoria de macrófagos myc-interacting zínc-finger proteín 1 matrix metalloproteínase ácido 3-(N-morfolino )propanosulfónico muscle regulatory factors myeloíd zínc finger 1 neural cell-adhesíon molecule nuclear receptor co-repressor 4 NF-AT nt PAI-1 pb PBS pCAF PKC PLB PP rpm SARA SBE SC SOS SFB Shh Smad Smurf SNPs Sns Sp1 SRE SRF STAT TAB1 TAK1 TpRI TpRII TpRlI1 TB TGF-p Tm TNF-a TRIP-1 Tris V-CA M v.g. vs. WB Wnt WT-1 X-Gal ZO-1 nuclear factor of activated T-cells nucleótidos plasminogen-activator inhibitor 1 pares de bases phosphate-buffered saline p300/CBP-associated factor proteína cinasa C passive Iysis buffer fosfatasa revoluciones por minuto smad anchor for receptor activation smad-binding element suero de caballo dodecil sulfato de sodio suero de feto bovino sonic hedgehog de sma + mad, factor transcripcional de la vía del TGF-p/activina/BMPs smad ubiquitination-regulatory factors single nucleotide polimorphisms sticks and stones stimulating protein 1, factor transcripcional general elemento de respuesta a suero factor de respuesta a suero signal transducers and activators of transcription TAK-binding protein 1 TGF-f3-activated kinase 1 receptor tipo I del TGF-p receptor tipo 11 del TGF-p receptor tipo 111 del TGF-p o betaglicano terrific broth factor transformante del crecimiento p temperatura de fusión factor de necrosis tumoral a TGF-p receptor interacting protein-1 tris(hidroximetil)aminometano vascular cell-adhesion molecule verbi gratia versus westem blot wingless / íntegratíon regían Wilms' tumors 5-bromo-4-cloro-3-indolil-¡3-0-galactopiranósido zona occludens 1 5 - -_._------ -- - 3. Antecedentes 3. 1. COMUNICACiÓN INTERCELULAR Las células se comunican entre sí a través de señales que liberan o que exhiben en su superficie. Tanto las células eucarióticas como las procarióticas poseen sistemas para dar señales a las demás células en su entorno, además de contar con sistemas para recibirlos; las señales emitidas son indicaciones de la más variada índole: detener la división de una célula, contraerla en caso de que sea de tipo muscular, detonar su diferenciación para modificar sus propiedades funcionales, hacerla secretar sustancias como en el caso de una neurona, etc., que en un contexto global, conducen a que el organismo mantenga su homeostasis, se desarrolle, se reproduzca, escape de situaciones que atentan contra su supervivencia o bienestar, etc. En el caso de las bacterias, se conoce un mecanismo por el cual bacterias de diversas especies se asocian entre sí para formar "biopelículas", cápsulas que se pueden formar en prótesis artificiales dentro del cuerpo humano para evitar ser atacadas por el sistema inmune. Para formar este tipo de agrupaciones, las bacterias liberan señales que por ejemplo, inducen la diferenciación de las células que se quedaron en la capa más externa de la biopelícula para convertirlas en una especie de escudo protector. Las células de los organismos superiores también se comunican entre sí: lo hacen por medio de moléculas de señalización entre las que se incluyen: proteínas, péptidos pequeños, aminoácidos, nucleótidos, esteroides, retinoides, derivados de ácidos grasos e incluso gases disueltos como óxico nítrico, etileno (en el caso de las plantas) y monóxido de carbono. Como ejemplos tenemos: Proteínas: Péptidos pequeños: Derivados de aminoácidos: Nucleósidos: Esteroides: Retinoides: Derivados de ácidos grasos: Factor transformante del crecimiento ~ (TGF-~) , Hedgehogs (Shh, Ihh, Dhh), Wnts Angiotensina 11 Glutamato, serotonina, acetilcolina, dopamina, adrenalina Adenosina Testosterona, progesterona, cortisol, estradiol Ácido retinoico Prostaglandinas, leucotrienos, tromboxanos Las moléculas de señalización pueden ser secretadas mediante exocitosis; liberadas y dispersadas mediante difusión; o simplemente estar embebidas en la membrana celular y afectar sólo a las células vecinas que tienen contacto con estas moléculas. A la célula que emite la señal se le conoce como célula señalizadora. La célula blanco (o célula diana), que es la que captura a la molécula señalizadora, lo hace por medio de una proteína específica llamada receptor, el cual , acto seguido, inicia una serie de eventos adentro de la célula que conducen a que ésta dé una respuesta. En la mayoría de los casos, los receptores son proteínas transmembranales situadas en la superficie de la célula blanco; cuando unen la molécula señalizadora (el ligando) se activan y generan cascadas de señalización intracelular. No obstante, en algunos casos los receptores están dentro de la célula blanco y por ende el ligando debe pasar a través de la membrana celular para activarlos. El receptor y su ligando pueden establecer contacto gracias a que sus respectivas formas se acoplan entre sí; las fuerzas que hacen posibles 6 las interacciones entre sus respectivas superficies son no covalentes y pueden incluir: fuerzas electrostáticas, puentes de hidrógeno, fuerzas hidrofóbicas y fuerzas de van der Waals; la afinidad de la unión del receptor con su ligando es un reflejo de la fuerza con que se acoplan. La actividad, por su parte, se define como la capacidad de la señal para producir un efecto determinado. El efecto que una señal ejerce en una célula blanco depende del tipo de receptores que para esa señal posea y de la maquinaria intracelular a la que se acoplen dichos receptores, de modo que células blanco diferentes entre sí pueden responder de manera diferente ante una misma señal. Por ejemplo, el neurotransmisor acetilcolina induce la contracción de músculo esquelético, pero disminuye la tasa y fuerza de contracción de músculo cardiaco. Esto se debe a que ambos tipos de músculo poseen receptores de acetilcolina diferentes. Más aún, aunque células secretoras poseen el mismo receptor de acetilcolina que las células musculares cardiacas, en ellas el neurotransmisor no induce relajación sino secreción, lo cual refleja diferencias en la maquinaria interna a la que están acoplados dichos receptores. Comúnmente, la señal, luego de unirse a su receptor, hace que éste se active y realice sus funciones, como ya se mencionó, en cuyo caso se conoce a la señal como agonista (de la palabra griega agonistes, que significa campeón, guerrero). Sin embargo, hay veces en que el ligando se pega al receptor pero no permite que éste se active, y por ende, que produzca efectos; es decir, posee afinidad por el receptor pero carece de actividad, en cuyo caso se llama a la señal, antagonista. ¿Por qué el uno sí y el otro no? La diferencia estriba en que el uno induce un cambio tal en la estructura tridimensional del receptor, que lo activa, mientras que el otro, no. El comportamiento de las células en el interior de un organismo animal es regulado por lo general de manera altamente específica por un repertorio inmenso de conjuntos de señales -heterogéneas entre sí- que surgen de la combinación de señales homogéneas -de una variedad comparativamente menor. Los diferentes tipos celulares adentro de un organismo animal requieren de diferentes señales para sobrevivir y por lo tanto están restringidos a ambientes particulares dentro del cuerpo. En los animales operan comúnmente seis sistemas para ejecutar y coordinar dentro del organismo la comunicación intercelular, los cuales se se ilustran en la Figura A 1 Y se describen someramente a continuación: 1. Señalización paracrina Se presenta cuando una célula secreta o libera al medio extracelular señales que captan las células vecinas a la célula emisora. A manera de analogía, es como la señal radiofónica de una emisora local, que se logra captar bien hasta cierta distancia de ésta. Como ejemplo, tenemos un evento que ocurre durante la formación del ojo de Drosophila. El ojo de esta mosquita surge a partir del disco imagal ocular, compuesto por una capa epitelial monoestratificada. Como no hay células inmediatamente arriba o debajo de esta capa, las interacciones quedan restringidas a las células vecinas en dos dimensiones. La región posterior del disco imagal ocular es la primera en experimentar los efectos de una ola de señales secretadas conocida como surco morfogenético que induce los primeros eventos que llevan a la formación de los omatidios, órganos fotorreceptores del ojo compuesto de este insecto (figura A 1). Las células localizadas justo detrás del surco secretan la proteína Hedgehog (Hh), la cual se difunde a las células indiferenciadas localizadas en el surco yen ellas induce la expresión y secreción de la proteína Decapentaplegic (Dpp); ésta se difunde anteriormente abarcando unas cuantas hileras celulares y se une a receptores específicos en las células vírgenes. La señal Dpp induce la morfogénesis y 7 Neurona Célula A • Mensajero jo",''''''''''''''''''. '" Receptor •• Célula blanco 5 , Paracrina b1, Sináptica química b2, Sináptic8 eléctrica Célula de una • glánd.ula Vaso sanguíneo t 1 c, Endocrina d, Autocrina e, Yuxlacrina Neurona ~~,~ t 1 f, Neurosecreción Figura A1. Tipos de señalización. a, paracrina; b1, sináptica química; b2, sináptica eléctrica; c, endocrina; d, autocrina; e, yuxtacrina; f, neurosecreción. E, Fotografía de microscopía electrónica de barrido del ojo compuesto de Drosophila, formado por aproximadamente 800 órganos fotorreceptores idénticos, los omatidios. 8 diferenciación de los omatidios, pero también, la producción y secreción de Hh. Dado que Hh induce a Dpp y éste a su vez a Hh, la ola de señalización se autoinduce y se propaga anteriormente en el disco, dejando una estela de diferenciación a su paso. 2. Señalización sináptica Existen dos modalidades de señalización sináptica: la química y la eléctrica. La química ocurre cuando una neurona envía un impulso eléctrico -conocido como potencial de acción- a lo largo de su axón (un proceso largo), que al llegar al extremo de éste, la terminal nerviosa, produce la descarga de neurotransmisores (e.g., serotonina, glutamato, acetilcolina) al soma o a las dendritas de las células blanco (e.g., otras neuronas, células musculares esqueléticas). Las terminales nerviosas contactan a su célula blanco en uniones celulares especializadas denominadas sinapsis químicas, que poseen un diseño que asegura una llegada rápida y específica del neurotransmisor a la célula blanco. A la transmisión sináptica química también se le conoce como neurotransmisión. El sentido en el que viaja el neurotransmisor es unidireccional, siendo sólo de la célula presináptica (la neurona) a la postsináptica (la célula blanco). Sin embargo, la célula postsináptica puede en algunos casos, una vez que se descargó sobre sí el neurotransmisor y a manera de reacción, señalizar a la presináptica con óxido nítrico, al que se conoce entonces como mensajero retrógrado. La señalización sináptica química suele ser de largo alcance, dado que las neuronas extienden sus axones hasta células blanco lejanas. En el caso de la señalización sináptica eléctrica, las señales (e.g., Ca2 +, AMP cíclico) pasan de una célula a otra a través de gap junctions (estructuras especializadas a modo de túneles que intercomunican citoplasma) y a diferencia de la química, estas señales pueden viajar en cualquier dirección. 3. Señalización endocrina Se lleva a cabo cuando hormonas (e.g., insulina, adrenalina) liberadas por glándulas incretoras o de secreción interna (e.g., hipófisis, glándula pineal, glándulas suprarrenales, glándulas genitales: testículos y ovarios) viajan por el torrente circulatorio para luego establecer contacto con sus células blanco a través de receptores y así transmitirles una señal. Las señalizaciones paracrina y endocrina, a diferencia de la sináptica, son relativamente más lentas y además las células sobre las que inciden sus mensajeros son varias y no una sola. Considerando que la interacción entre los sistemas endocrino y nervioso es muy cercana, ambos sistemas se pueden considerar como el sistema neuroendocrino. 4. Señalización autocrina Se da cuando los mensajes que salen de una célula tienen como destino la misma célula que los emanó, o bien, células idénticas a ella, ya que éstas poseen los receptores adecuados para retenerlos. Como ejemplo tenemos que durante la embriogénesis, una vez que un grupo de células idénticas empieza a atravesar por una etapa de diferenciación, puede secretar señales que actúan sobre el mismo grupo para promover el proceso de diferenciación, de modo que una célula que emite una señal es capaz de recibirla pero también son capaces de recibirla las demás células del grupo. A manera de analogía, es como un equipo de futbolistas que se alientan echándose porras a sí mismos: cualquiera que lance la porra se alienta a sí mismo, pero también lo hacen los demás jugadores que la escuchen. 9 5. Señalización yuxtacrina Acontece cuando dos células establecen comunicación entre sí mediante el contacto físico directo de ambas células. Receptores integrales de membrana (i.e., transmembranales o vinculados a ella a través de enlaces como el de glicosil- fosfatidilinositol) en una célula se unen a ligandos también integrales de membrana de la otra célula, de manera que quedan pegadas en una región, en la cual los planos de las superficies celulares de ambas células quedan paralelos. 6. Señalización por neurosecreción Conocida también como secreción neuroendocrina, sucede cuando neuronas vierten sus hormonas al torrente circulatorio para luego incidir en células blanco. Como ejemplos de hormonas neurosecretadas tenemos a la oxitocina, importante durante el proceso de parto, y a la hormona antidiurética. Cabe mencionar que una sola molécula de señalización puede participar en dos o más de las señalizaciones mencionadas; pero también, una sola célula puede estar sujeta a más de uno de estos tipos de señalización. Principales sistemas de señalización intercelular en vertebrados Las respuestas ante las señales extracelulares en general están determinadas por la naturaleza de la célula diana así como por la naturaleza de la molécula señalizad ora. Aun cuando diferentes tipos de células tengan un receptor idéntico, el conjunto de efectores intracelulares, llámense proteínas y genes regulados por él, es diferente. Esto se debe a que cada tipo de célula posee un conjunto único de proteínas que determina la respuesta que emerge ante la llegada de la señal; cabe hacer notar que para activar la transcripción de un gen eucariote no es suficiente la unión de un solo factor transcripcional (e.g., un receptor intracelular) al promotor del gen, sino que se necesita que cooperen más factores transcripcionales para lograr activarlo, algunos de los cuales son específicos de ciertos tipos celulares. Así, por ejemplo, un receptor intracelular -una vez activado por la unión de su ligando- regulará la transcripción de genes sólo en los tipos celulares que lo expresen, pero el conjunto de genes regulados será un reflejo de las colaboraciones que haya establecido el receptor intracelular con los demás factores transcripcionales que cada tipo celular exprese. Los receptores se pueden clasificar con base en su localización celular en receptores de la superficie celular y en receptores intracelulares. Los receptores de la superficie celular que transmiten señales al interior de la célula lo hacen fungiendo como canales iónicos o como enzimas; o bien, vinculándose a proteínas G ó a enzimas. Se dice que estos receptores actúan como transductores, es decir, capturan extracelularmente un tipo de señal (el ligando), que les da la indicación de transmitir intracelularmente otro tipo de señal(es). Los receptores que funcionan como canales iónicos están involucrados en la señalización sináptica eléctrica, se abren o se cierran momentáneamente ante la llegada de su ligando, un neurotransmisor, con lo cual modifican la permeabilidad iónica de la membrana plasmática y, por lo tanto, la excitabilidad de la célula postsináptica. Los receptores con actividad de canal iónico pertenecen a una familia de proteínas homólogas transmembranales que atraviesan varias veces la membrana. Los receptores que actúan como enzimas son en su mayoría proteínas que atraviesan una sola vez la membrana celular, unen al ligando afuera de la célula y cata liza n 10 reacciones adentro. Constituyen un grupo muy heterogéneo donde la mayoría de sus integrantes son cinasas. Estas cinasas pueden ser de serinas y treoninas, o de tirosinas. Los receptores que se vinculan a proteínas G regulan indirectamente la actividad de otras proteínas integrales de membrana, como enzimas o canales iónicos. Lo hacen a través de mediadores llamados proteínas reguladoras triméricas que unen GTP (proteínas G). Si son enzimas las que resultan reguladas, cambia la concentración de mediadores intracelulares como AMP cíclico ó inositol trifosfato (IP3) y Ca2 +, mientras que sin son canales iónicos se altera la permeabilidad iónica de la membrana celular. Los mediadores intracelulares a su vez promueven o restringen la actividad de otras proteínas en la célula. Todos los receptores vinculados a proteínas G pertenecen a una superfamilia de proteínas homólogas que atraviesan 7 veces la membrana celular. Existe otra variedad de receptores, los que se vinculan a enzimas pero que no lo son per se. Como ejemplo tenemos al receptor de la hormona del crecimiento, que posee asociada una cinasa de tirosina que propaga la señal al interior de la célula. Las señales que son captadas en la superficie celular por receptores con actividad enzimática o por aquéllos vinculados a proteínas G comúnmente llegan hasta el núcleo donde alteran la expresión de genes específicos. Para que estas señales puedan llegar al núcleo, existen sistemas de relevo conformados por proteínas intracelulares. La mayoría de estas proteínas son fosforiladas por proteínas cinasas o forzadas a unir GTP ante la llegada de la señal. En ambos casos, las proteínas de relevo adquieren uno o más grupos fosfato cuando llega la señal, y los pierden cuando se va. Estas proteínas fosforiladas, a su vez, causan la fosforilación de otras proteínas, de modo que se crea una cascada de fosforilaciones cuyo destino final es el núcleo. Como la emergencia de conductas celulares complejas -como sobrevivencia, proliferación o diferenciación- depende de un conjunto de múltiples señales como se mencionó anteriormente, las células cuentan con mecanismos que les permiten integrarlas para luego dar una respuesta global altamente ajustada que resultó de la integración de las señales. Los receptores intracelulares pertenecen a la superfamilia del mismo nombre, dado que están estructuralmente relacionados entre sí. Se localizan en el citosol -el espacio del citoplasma sin contar a los organelos delimitados por membrana- o en el núcleo; una vez activados por su ligando, regulan directamente la transcripción de genes específicos en forma de hetero u homodímeros. Los ligandos de los receptores intracelulares resultan ser hidrofóbicos y pequeños, y dado que son prácticamente insolubles en medios acuosos, deben ser transportados en el torrente sanguíneo y en otros fluidos extracelulares unidos a proteínas acarreadoras, de las que se disocian antes de entrar a la célula blanco. En la Figura A2 se ilustran 16 vías de señalización comunes que emplean diferentes mecanismos bioquímicos. (Referencias de libros: Alberts et al., 1994; García Sáinz, 1998; Gerhart et al., 1998; Guyton y Hall, 2001. Referencias de artículos originales: i. del receptor de Hedgehogs: Denef el al., 2000, Lewis et al., 2001, Taipale et al., 2002, Zhu et al., 2003; ii. del receptor de Wnts: Pinson et al., 2000, Tamai et al., 2000, Wehrli el al., 2000). 11 1. Cinssas trensmembrenales de tirOSÍllIl. Ejemplos deligandos: - Factor de crecimiento epidérmico -Insulina 2. Receptores asociados a cin asas citoplásmicas de tirosins. Ejemplos de ligandos: - H ormon21 del crecimiento - Interleucina 2 3. Cinasas tr2ln,smelTlbr2lnales de serins y treonina. Ejemplos de Jigandos: - TG F-~2 -BMP-7 4. Fosfatasas transmembranales. Ejemplos de ligandos: Se desconocen, pero pueden ser proteínas de la matriz ex!racelular 5. Receptor de Wnts. Ejemplos deligandos: - Proteínas Wnt en vertebrados - Proteína WIO{l1ess en Drosophila 6. Receptores Ton y de IL-1. Ejemplos de (Igandos: - Interleucina 1 - Spiitzle 7. Receptores acoplados a proteínas G, de 7 dominios transmembranales. Ejemplos deligandos: Odorantes y sabores 8. Receptor de Hedgehogs (de · puercos espines"). Ejemplos de '[igamlos: SDnic Hedgehog, Indian HedgehDg • M LprS, Lpr6 DisheveRed ... ) .. uu .. <1- Wnt GSK-3 .... .6-catenina i Hedgehog ::C~ C~ Smads , proteólisis de I ~B activaCión de cinasas .... o Cactus Figura A2. Principales sistemas de comunicación intercelular en vertebrados. En la parte de en medio (de cada fila) se muestra el receptor antes de la llegada de su ligando, mientras que en la parte de la derecha se muestra lo que sucede cuando éste llega. Hedgehog se puede anclar a la membrana por el colesterol que covalentemente se le une en una reacción de autoprocesamiento. Abreviaturas: Cel: celular; GSK-3~: Glycogen synthase-kinase-3j3; Hh: Hedgehog; ON: óxido 12 9. Notch I ~tta. Ligando: Oetta 1 D. Receptores nucleares de hormonas. Ejemplos de ligandos: - Ácido retinoico - Glucocorticoides - Estrbgenos - Tlfoxina 11 . Integrinas. Ejemplos de ügandos: - Otras integrinas - Fibronectina - Laminina 12. Canales catiimicos abiertos por ligando. Ejemplos de ligandos: - Glutamato - Acetilcolina 13. Uniones comun.icantes. 14. Receptor de bxido n~rioo . Ligando: Óxido n~rioo 15. Cadherinss. Ejemplos: - N-Cadherina - L-C8dherina 16. Receptores guannato ciclasa. Ejemplos de ügandos: - Péptid o natriurético auricular - Guanilato ciclasa del esperma de erizo guanilato ciclasa Regulación genética ...... ~CGMPC GTP nítrico; p125FAK : Focal adhesion kinase de 125 kDa; SuH: Suppressor o, Hairless; TGF- ~2: Factor transformante del crecimiento ~2 ; Lpr5 y 6: Low density-lipoprotein receptor related proteins 5 y 6; Wnt: proteínas Wingless-Int (de integrated). 13 3. 11. EL TGF-f3 Descubrimiento del TGF-f3 En 1981, el grupo de Michael Sporn y Anita Roberts en los Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos purificó un polipéptido de plaquetas que al ser aplicado a fibroblastos normales de riñón de rata -cuyo crecimiento era estrictamente dependiente del anclaje al sustrato--, adquirían la capacidad de crecer y formar colonias en agar suave (en presencia del factor de crecimiento epidérmico), i.e., se transformaban temporalmente perdiendo su dependencia al anclaje (Roberts et al., 1981). Así, el factor transformante del crecimiento f3 (TGF-f3) fue descubierto originalmente como un factor secretado que inducía una transformación maligna reversible in vitro. Ahora es reconocido como un miembro prototípico de una superfamilia de polipéptidos horno o heterodiméricos secretados. Estos factores inciden sobre una variedad de procesos biológicos tanto en células transformadas como normales, incluyendo la regulación de la proliferación celular y la diferenciación. Superfamilia del TGF-f3 La superfamilia del TGF-f3 está integrada en humanos por 42 citocinas pleiotrópicas estructuralmente relacionadas entre sí que se clasifican en familias de acuerdo a su homología en secuencia. En función de la vía de señalización que emplean, podemos agrupar por un lado a las familias de TGF-f3, activinas y nodales, y por otra parte, a las familias de BMPs (proteínas morfogenéticas óseas, llamadas así por su capacidad de promover la formación de hueso y también de cartílago), GDFs (growth and differentiation factors) y MIS (sustancia inhibidora de Mueller). La familia del TGF-f3 está integrada a su vez por los miembros TGF-f31, TGF-f32 Y TGF-f33 (Shi y Massagué, 2003); la de activinas por activinas per se e inhibinas. Uno de los primeros miembros de la superfamilia de TGF-f3 en ser descubierto fue Decapentaplegic, originario de Drosophila y nombrado así porque mutaciones en su gen le causan a esta mosquita deficiencias y duplicaciones de estructuras derivadas de sus 15 discos imagales principales (Spencer et al., 1982). Decapentaplegic forma parte de la familia de BMPs, dado que su mayor parecido es con BMP2 y con BMP4. En un artículo de revisión de David Kingsley de 1994 se pueden encontrar clasificados a varios de los miembros de esta superfamilia (Kingsley, 1994). Estructura del TGF-f3 TGF-f31 fue el primer miembro de la familia del TGF-f3 en ser descubierto, habiéndose purificado de placenta (Frolik et al., 1983) y de plaquetas (Assoian et al., 1983). Luego vino la identificación del TGF-f32 y del TGF-f33, y se determinó que las tres isoformas de TGF-f3 que existen en los mamíferos están codificadas por sendos genes. Las tres isoformas de TGF-f3 provienen de precursores: TGF-f31 de uno de 390 aminoácidos (a.a.) y TGF-f32 Y TGF-f33, ambos, de unos de 412 a.a. Cada precursor contiene una señal secretora en el extremo amino, un presegmento llamado "polipéptido asociado con la latencia" (LAP, de latency-associated polypeptide) y un polipéptido de 112 a.a. en el extremo carboxilo que constituye el monómero maduro y bioactivo del TGF-f3. La identidad en estructura primaria de los monómeros maduros de las tres isotormas de TGF-f3 es del 70 al 80% (Derynck et al., 1985; de Martin et al., 1987; Derynck et al., 1988; ten Dijke et al., 1988). Un corte proteolítico hecho en sucesión a un motivo tetra básico (R- H-R-R) libera al monómero del LAP; la proteasa responsable de este corte es furina, una 14 convertasa que hidroliza péptidos secretados en sitios multibásicos (Dubois et al., 1995, 2001). La forma biológicamente activa del TGF-¡3 es un homodímero hidrofóbico cuyos monómeros (segmentos maduros de TGF-¡3) están unidos entre sí por un puente disulfuro, y aunque también se han hallado heterodímeros de TGF-¡31 y TGF-¡32, la relevancia biológica de éstos no se conoce (Assoian et al., 1983; Derynck et al., 1985; Cheifetz et al., 1987). El polipéptido maduro de 112 a.a. de TGF-¡3 cuenta con nueve cisteínas -conservadas entre especies-, ocho de las cuales están apareadas. La estructura tridimensional del homodímero de TGF-¡32 se asemeja a un camastro visto de perfil (Figura A3); revela además que las ocho cisteínas forman puentes disulfuro intramoleculares que en conjunto constituyen un "nudo de cisteínas", mientras que la novena restante forma parte del enlace de cistina intermolecular que media la dimerización. Cada monómero contiene cuatro láminas 13 antiparalelas y una hélice a larga separada (Daopin et al., 1992; Schlunegger y Grütter, 1992). Dadas las semejanzas en secuencia -incluyendo el número y la ubicación de las cisteínas- entre los miembros de la superfamilia del TGF-¡3, es probable que éstos adopten conformaciones estructurales parecidas, como lo ha demostrado la estructura de BMP-7 (Griffith et al., 1996). La secuencia de aminoácidos entre la cisteína cinco y la seis, que es la más divergente entre las isoformas de TGF-¡3 y entre los demás miembros de la superfamilia del TGF-¡3, queda expuesta en la superficie de la molécula y puede tener un papel importante en la determinación de la especificidad del reconocimiento ligando-receptor. Los presegmentos de los precursores de las tres especies de TGF-¡3 tienen algunos elementos estructurales importantes para su actividad y/o plegamiento: a) tres residuos de cisteína, dos de ellos involucrados en la formación de puentes disulfuro intercatenarios; b) dos sitios de N-glicosilación en donde se adiciona manosa-6-fosfato, la cual media la unión del presegmento con el receptor de manosa-6-fosfato; y c) un segmento de aminoácidos hidrofóbicos que sucede al péptido señal que posiblemente participa en el plegamiento del presegmento (Derynck et al., 1988; ten Dijke et al., 1988; Miyazono et al., 1988,1991; Purchio et al., 1988; Kovacina et al., 1989; López et al., 1992). La caracterización bioquímica del TGF-¡3 ha demostrado que éste se secreta normalmente como un complejo proteico constituido por el homodímero maduro del TGF-¡3 y dos presegmentos que interactúan de manera no covalente con el dímero. Los presegmentos impiden que el TGF-¡3 maduro active a sus receptores, por lo que se dice que lo mantienen en un estado inactivo o "latente" (Miyazono et al., 1988; Wakefield et af., 1988). Además, los presegmentos se pueden requerir para la secreción del TGF-¡3 y para el direccionamiento del TGF-¡3 latente (Gray y Mason, 1990; López et al., 1992). Considerando la amplia distribución de los receptores del TGF-¡3 y los potentes efectos biológicos del mismo, es de relevancia fisiológica que el TGF-¡3 se mantenga inactivo hasta que se requiera de su activación en los sitios blanco. Con base en estudios de reconocimiento por anticuerpos, se puede afirmar que es probable que la interacción del TGF-¡3 con los presegmentos -de mucho mayor tamaño- deja poco del TGF-¡3 maduro expuesto en la superficie de este complejo. El complejo de TGF-¡3 aislado de plaquetas incluye un quinto componente denominado proteína de unión al TGF-¡3 latente (LTBP, de latent TGF-/3 binding protein) (Miyazono et al., 1988,1991; Wakefield et al., 1988). LTBP es una proteína de 125-160 kDa que se enlaza -a través de un puente disulfuro- con al 15 cytoplasm Figura A3. Estructura del TGF-B y de sus receptores. Arriba, Estructura del TGF-B3. Los dos monómeros están iluminados de azul y verde, respectivamente. Las cadenas laterales de cisteína y los puentes disulfuro se ilustran con líneas rojas. Abajo, Estructura tridimensional del TBRII con TGF-P3 unido. Se usó la estructura del BMPR-IA para modelar el dominio extracelular de unión al ligando del TBRI. El extremo carboxilo de los receptores se representa con líneas punteadas que atraviesan la membrana plasmática (Hart et al., 2002; figura 4C de Shi y Massagué, 2003). 16 T G F -~3 (homodimer) Figura A3. Estructura del TGF-~ y de sus receptores. Arriba, Estructura del TGF-~3 . Los dos onómeros están ilu inados de azul y verde, respectivamente. Las cadenas laterales de cisteína y los puentes disulfuro se ilustran con líneas rojas. Abajo, Estructura tridimensional del T~RII con TGF-~3 unido. Se usó la estructura del BMPR-IA para odelar el dominio extracelular de unión al ligando del T~RI. El extre o carboxilo de los receptores se representa con líneas punteadas que atraviesan la membrana plasmática (Hart el al., 2002; figura 4C de Shi y Massagué, 2003). 16 menos uno de los segmentos pre-TGF-p en el complejo latente (Kanzaki et al., 1990; Miyazono et al., 1991). Además de LTBP, que ahora se llama LTBP-1, ya se han identificado tres proteínas relacionadas: L TBP-2 (Moren et al., 1994), L TBP-3 (Yin et al., 1995) y LTBP-4 (Saharinen et al., 1998), codificadas por genes distintos. Los LTBPs no se requieren para mantener en estado latente al TGF-p, pero en cambio facilitan la secreción, la localización y la activación del complejo LAP-TGF-p principalmente en la matriz extracelular (Taipale et al., 1994). Ya se han esclarecido algunas de las diferencias en función de estas cuatro L TBPs: mientras que el ratón knock-out de L TBP-3 presenta malformaciones craneofaciales, osteoesclerosis y osteoartritis (Dabovic et al., 2002), el de L TBP-4 presenta enfisema pulmonar, cardiomiopatías y cáncer colorrectal que se correlaciona con un depósito escaso de TGF-p en el espacio extracelular (Sterner- Kock et al., 2002). Las fibrilinas, proteínas relacionadas estructuralmente con los LTBPs, retienen al complejo LTBP-LAP-TGF-p en la matriz celular limitando la activación del TGF- p; en ausencia de fibrilina-1, se activa masivamente el TGF-p en la matriz, lo cual conlleva a una inhibición de la formación de alveolos que eventualmente desemboca en enfisema pulmonar genético, caracterizado por un agrandamiento del espacio aéreo distal (Neptune et al., 2003). El patrón característico e independiente de regulación transcripcional de las tres isoformas de TGF-p está dictado por elementos de control distintos en los promotores de estos genes: mientras que el promotor de TGF-p1 no tiene cajas TATA y está regulado principalmente por sitios AP-1, los promotores de TGF-p2 y de TGF-p3 sí las tienen, además de contar con sitios AP-2 y elementos de respuesta a AMPc. Consistentemente, los ésteres de forbol activan la transcripción TGF-p 1, mientras que la forskolina, un activador de la adenilato ciclasa, activa la de TGF-p2 y TGF-p3. En general, la expresión genética de TGF-p2 está coordinada con la de TGF-p3, en un patrón distinto del de TGF- p1 (revisado en Kim et al., 1990). Además, el tratamiento de fibroblastos y queratinocitos con TGF-p1 o TGF-p2 resulta en cambios diferenciados en la síntesis de las tres isoformas de TGF-p (Bascom et al., 1989). Asimismo, el tratamiento con ácido retinoico resulta en una fuerte inducción de la síntesis de TGF-p2 pero no de TGF-p1 (Glick et al., 1989). Los mensajeros de las tres isoformas de TGF-p varían en tamaño de 1.7 a 6.5 kb, siendo esta divergencia debida a las regiones 5' y 3' no traducidas; sus secuencias 5' no traducidas son muy largas y se encargan de regular la eficiencia con que se traducen (Derynck et al., 1985; Arrick et al., 1991; Kim et al., 1992; Romeo et al., 1993). Los genes humanos de TGF-p1, TGF-p2 Y TGF-p3 poseen 7 exones, habiéndose originado presuntamente de un evento ancestral de duplicación genética. Activación del TGF-p El mecanismo de activación fisiológica del TGF-p latente se estudió al inicio principalmente en cocultivos de células musculares lisas y células endoteliales, en los que la plasmina actúa como la proteasa responsable de la activación del TGF-p 1 (Antonelli- Orlidge et al., 1989; Sato y Rifkin, 1989). No obstante, in vivo, el TGF-p1 latente se activa debido principalmente a la acción de la trombospondina 1 (Crawford et al., 1998) y secundariamente debido a la acción de la integrina {lvPs (el LAP de TGF-p1 es un ligando de esta integrina) (Munger et al., 1997, 1999). Proteasas como la plasmina, las catepsinas y las metaloproteinasas 9 y 2 de matriz (MMP-9 y -2) también participan en el proceso de activación de TGF-p (Lyons et al., 1988, 1990; Harpel et al., 1992; Yu y 17 Stamenkovic, 2000). La trombospondina 1 es una proteína homotrimérica que al aislarla de plaquetas se le encuentra asociada con TGF-f3 (Murphy-Ullrich, et al., 1992); es capaz de activar al TGF-f3 latente mediante un mecanismo que no involucra proteólisis sino una modificación conformacional del LAP (Schultz-Cherry y Murphy-Ullrich, 1993; Schultz- Cherry et al., 1994; Crawford et al., 1998). La plasmina puede activar al TGF-f3 latente de dos maneras: mediante la degradación de los presegmentos y de este modo permitiendo la liberación del dímero de TGF-f3 (Lyons et al., 1990) y mediante la liberación del TGF-f3 latente de la matriz extracelular, un lugar donde se almacena (Taipale et al., 1995). La induccción de activadores del plasminógeno, por ejemplo durante angiogénesis e invasión, resulta en la conversión del plasminógeno en plasmina, que a su vez activa al TGF-f3 latente. Fuentes celulares como células tumorales, macrófagos activados, osteoclastos y osteoblastos liberan TGF-f3 activo (Twardzik et al., 1990; Flaumenhaft et al., 1993a, b; Oursler et al., 1993, 1994). En ellas se requiere la participación de proteasas para activar al TGF-f3, siendo la plasmina en muchos casos la proteasa efectora (Munger et al., 1997). Las metaloproteinasas de matriz MMP-9 (matrix metalloproteinase 9) y MMP-2, ancladas a la superficie celular de queratinocitos a través del receptor de hialuronano CD44, están involucradas en invasión tumoral y angiogénesis y activan al TGF-f3 latente mediante un corte proteolítico (Yu y Stamenkovic, 2000). Es probable que la activación ocurra en la superficie celular, donde se observa que quedan retenidos los presegmentos del TGF-f3 latente unidos a través de sus carbohidratos manosa-6-fosfato con los receptores de manosa-6-fosfato celulares (Dennis y Rifkin, 1991). Hasta ahora se conoce poco sobre cómo TGF-f32 y TGF-f33 se activan. Considerando la naturaleza similar de sus respectivos complejos latentes, es probable que entren en acción mecanismos proteolíticos, pero las extensas diferencias en secuencia de los presegmentos sugieren diferencias mecanísticas, posiblemente incluso en la participación de proteasas diferentes. Una vez liberados de las células, el TGF-f3 latente y el activo interactúan con proteínas en el medio extracelular, especialmente con varios componentes de la matriz extracelular o de la membrana basal. Estas interacciones conducen a otro tipo de mecanismo de control que gobierna la disponibilidad biológica y la actividad del TGF-f3. Una de las proteínas con gran afinidad por el TGF-f3 es la a2-macrogobulina, que se encuentra presente en grandes cantidades en circulación e interactúa con otros factores de crecimiento y citocinas (James, 1990). La interacción del TGF-f3 con la a2-macrogobulina secuestra al TGF-f3 de forma que queda inactivo al no poder unirse a sus receptores. Por lo tanto, la a2-macrogobulina puede funcionar como un "recogedor" (del inglés scavenger) eficiente que une todo el TGF-f3 activo libre, especialmente considerando que casi todo el TGF-f3 en plasma forma este tipo de complejo (O'Connor-McCourt y Wakefield, 1987; Huang et al., 1988). Una vez que llega al hígado, la interacción del complejo con el receptor de a2-macrogobulina conduce a la degradación del TGF-f3 (LaMarre et al., 1991). La heparina (un glicosaminoglicano liberado en la desgranulación de células cebadas activadas) y sulfatos de heparano altamente sulfatados del hígado son capaces de mantener a TGF-f31 -pero no a las otras isoformas- en estado activo por más tiempo al interferir con la unión de la a2-macroglobulina a TGF-f31 (Lyon et al., 1997). Otras proteínas solubles que se encargan de interactuar con alta afinidad con el TGF-f3 son decorina y biglicano, dos proteoglicanos secretados que son parte de la matriz 18 extracelular. La interacción del TGF-j3 con estas proteínas neutraliza en algunos casos la actividad del TGF-j3, y por lo tanto, podrían funcionar como desactivadores fisiológicos del TGF-j3 en la matriz extracelular (Yamaguchi el al., 1990). Asimismo, la fibronectina (Fava y McClure, 1987) y varias colágenas, entre ellas la tipo IV (Paralkar et al., 1991) también son capaces de unir TGF-j3 con gran afinidad. Las interacciones de estos componentes de la matriz extracelular con el TGF-j3 pueden resultar en la retención de TGF-j3 activo en la matriz extracelular, que por tanto puede ser considerada como un lugar de almacenamiento de TGF-j3 (y de otros factores de crecimiento y de diferenciación). Importantemente, las interacciones del TGF-j3 con la trombospondina y la colágena IV mantienen al TGF-j3 en una forma activa (Murphy-Ullrich et al., 1992). El TGF-j3 es capaz de formar complejos con anticuerpos IgG. El TGF-j3 unido a ciertos IgGs tiene una actividad considerablemente mayor (de 50 a 100 veces) que el TGF-j3 libre, lo cual sugiere que esta forma de entrega de TGF-j3 resulta en una presentación eficiente ante sus receptores (Stach y Rowley, 1993; Caver el al., 1996). Cabe aclarar, no obstante, que la mayoría de los demás anticuerpos que se unen al TGF-j3 tienen un efecto distinto: lo neutralizan. Receptores del TGF-j3 Inicialmente se identificaron tres receptores principales del TGF-j3 mediante la técnica de entrecruzamiento químico del TGF-j3 marcado con 1251 a proteínas de la superficie celular. Estos receptores, denominados tipo 1, 11 Y 111, con base en su movilidad electroforética decreciente (Cheifetz et al., 1986, 1987), se observan comúnmente en la mayoría de las células en cultivo y son los receptores mejor caracterizados. Aunque al inicio se supuso que las actividades biológicas del TGF-j3 estaban mediadas por el receptor tipo 111 (Cheifetz et al., 1987, 1988), estudios ulteriores demostraron que los receptores tipo I y 11 median probablemente todas las actividades de señalización del TGF-j3. Estos estudios consistieron en establecer una correlación entre el tipo de receptores de TGF-j3 en la membrana plasmática y la sensibilidad a este factor de crecimiento en las células Mv1 Lu de epitelio pulmonar de visón. Mientras que las células silvestres poseen los 3 tipos de receptores y dejan de proliferar totalmente por acción del TGF-j3, dos clonas mutantes de estas células crecían aun con TGF-j3 presente en su medio de cultivo: por un lado las R, que unían TGF-j3 a través del receptor II pero no del 1, y por otro las DR, que no lo unían a través del 11 ni del I (Laiho el al., 1990b). La complementación entre células R y DR mediante hibridación somática restauró por completo la unión del TGF-j3 al receptor I y la sensibilidad de las células a este factor -reflejada por la inhibición de la síntesis de ADN y la producción de proteínas de matriz extracelular-. Dado que no se detectaba unión de TGF-j3 al receptor I en las células R ni en las DR, su presencia en los híbridos resultó inquietante. Por lo tanto, se concluyó que el receptor I requiere del 11 para que se le una el ligando y que los receptores I y 11 eran requeridos ambos para que las células pudieran responder a TGF-j3; el receptor 111, que seguía uniendo TGF-j3 en las clonas insensibles a TGF-j3, no resultaba tener un papel primordial en este contexto (Laiho et al., 1991; Geiser el al., 1992; Chen, el al., 1993). Además de estos tres tipos de receptores, se han reportado otros con diferentes movilidades electroforéticas o con distintas propiedades (Massagué, 1992). No obstante, estos receptores, llamados tipo IV a IX, no han sido bien caracterizados, y se tiene en algunos casos poca y en otros no se tiene evidencia de que estén involucrados en la señalización por TGF-j3. 19 Receptores 11 Y I (Tf3RII Y Tf3RI) El receptor 11 de TGF-~ es una proteína transmembranal de 567 a.a. de masa molecular de 70 - 85 kDa. (Un et al., 1992). Su dominio intracelular es pequeño y posee actividad constitutiva de cinasa de serinas y treoninas (Wrana et al., 1992). El receptor 11 une por sí mismo TGF-~1 y TGF-~3 con gran afinidad, pero requiere del receptor I ó del 111 para unir TGF-~2 (Un et al., 1992, 1995; López Casillas et al., 1993; Lawler et al., 1994; Rodríguez et al., 1995). La propiedad del receptor 11 de no unir TGF-~2, junto con la observación de que aquél no se produce en sitios de expresión de TGF-~2 durante el desarrollo embrionario, infundió la sospecha de que existían receptores 11 adicionales (Lawler et al., 1994), y esto se confirmó al descubrirse T~RII-B, que sí une TGF-~2 (Rotzer et al. , 2001). El receptor 11 existe como un homodímero constitutivo aún sin tener al ligando unido (Chen y Derynck, 1994; Henis et al., 1994) y se autofosforila constitutivamente (Wrana et al., 1994). In vivo, la autofosforilación ocurre principalmente en cinco serinas: tres en el dominio yuxtamembranal, y dos en la cola carboxilo, debajo del dominio de cinasa (Souchelnytskyi et al., 1996). La autofosforilación de las serinas 213 y 409 es esencial para que el T~RII tenga actividad de cinasa, pero por el contrario, la autofosforilación de la Ser416 inhibe la función de este receptor, dado que una versión S416A del T~RII es hiperactiva. Las serinas 409 y 416 no pueden fosforilarse simultáneamente, y mientras que la autofosforilación de la Ser213 es intramolecular, la de la Ser409 ó 416 puede ser intermolecular, dado que se favorece ante la dimerización del receptor (Luo y Lodish, 1997). El sustrato de la cinasa del receptor 11 es el receptor I T~RI (Wrana et al., 1994). El receptor I de TGF-~ llamado T~RI/ALK-5 (Franzén et al., 1993; ten Dijke et al., 1994), es también un miembro de la familia de receptores transmembranales con actividad de cinasa de serina y treonina. Aunque al principio se sospechó que los receptores tipo I ALK2/Tsk7UActRI (Ebner et al., 1993a, b) y ALK1/TSR-1 (Attisano et al., 1993) transducían señales de TGF-~ y activina debido a que unen ambos, posteriormente se demostró que en realidad transducen señales de BMPs (Armes y Smith, 1997; Macías Silva et al., 1998). La masa molecular del T~RI es de 53 kDa. Su dominio citoplásmico se extiende un poco más allá del dominio de cinasa y su tamaño es relativamente pequeño. Este receptor I de TGF-~ porta una secuencia distintiva: TTSGSGSGLP (el dominio GS) que precede inmediatamente al dominio de cinasa y que tapa el centro catalítico del dominio de cinasa en condiciones basales (Franzén et al., 1993; ten Dijke et al., 1994; Ebner et al., 1993a; Attisano et al., 1993; Huse et al., 1999). El dominio extracelular del receptor I de TGF-~ tiene una similitud discreta con el del receptor 11. El receptor I no une TGF-~ independientemente, require del receptor 11 para poder unir TGF- ~ en la superficie (Ebner et al., 1993a, b). Empero, otros miembros de la superfamilia del TGF-~, concretamente BMP-2, BMP-4 Y BMP-7, se unen a sus receptores I directamente, ALK3/BMP-RIA o ALK6/BMP-RIB, aunque un complejo heteromérico proporciona mayor afinidad para el ligando (Derynck y Zhang, 2003). El receptor 11 también es importante para determinar qué ligando específico se une al receptor 1. Así, ALK2 Y ALK1 unen activina o TGF-~, dependiendo de qué receptor 11 esté coexpresado (Attisano et al., 1993; Ebner et al., 1993a, b), aunque como ya vimos, ambos receptores I no transducen en realidad señales de TGF-~/activinas sino de BMPs. Se sabe que T~RI une TGF-~ con mayor eficiencia que los otros receptores 1, que es frecuentemente el princípal receptor I presente y que media varias de las respuestas a TGF-~ en las células Mv1 Lu (Franzén et al., 1993; Bassing et al., 1994; ten Dijke et al., 1994). 20 A semejanza del receptor 11, el receptor I forma homodímeros independientemente de la presencia del ligando (Gilboa et al., 1998), y está constitutivamente fosforilado por cinasas citoplásmicas (Wrana et al., 1994). Un complejo heterotetramérico que consiste de dos receptores 11 y de dos receptores I es la unidad efectora de la señalización disparada por el ligando (Wrana et al. , 1992; Chen y Derynck, 1994; Yamashita et al. , 1994b; Luo y Lodish, 1996; Weis-García y Massagué, 1996). Los receptores I y 11 se asocian entre sí independientemente de la presencia del ligando (Ventura et al., 1994; Che n y Weinberg, 1995; Chen et al. , 1995a), aun con los niveles endógenos de expresión de los receptores (WU et al., 1996). Por esto, es probable que el receptor I y el 11 tengan una afinidad inherente el uno por el otro, y que la unión del ligando refuerce al heterotetrámero (Figura A3). El receptor I es fosforilado por el receptor 11 en serinas y treoninas al unir ambos el ligando (Wrana et al., 1994) (ver Figura A4). Se han identificado en TI3RI cinco sitios de fosforilación catalizada por TI3RII inducida por el ligando: cuatro en el dominio GS y uno en la región yuxtamembranal (Massagué, 1998; Souchelnitskyi et al., 1996). La fosforilación por el receptor 11 inicia la activación del receptor I y posteriormente el complejo de receptor señaliza (Wrana et al., 1994). El receptor 11 hace que se active el receptor I fosforilándolo, y así, el receptor I empieza a su vez a fosforilar a sustratos encargados de relevar el mensaje del TGF-13 al interior de la célula. No obstante, si se elimina la participación del TI3RII en la señalización por TGF-13 -mediante la sobreexpresión de un TI3RII mutante con actividad dominante negativa-, el efecto antiproliferativo del TGF-13 queda eliminado, pero no la inducción de la síntesis de proteínas de matriz extracelular (Chen et al., 1993). Por lo tanto, aunque el receptor I sí tiene un papel efector corriente abajo del receptor 11, no puede asumirse que el receptor 11 funciona exclusivamente como la cinasa que activa al receptor 1. Una evidencia de señalización directa por un receptor 11 la ha provisto BMPRII: a través de su dominio citoplásmico y ante la estimulación por BMPs, BMPRII regula la actividad de la cinasa LlMK1, cuya función es regular al citoesqueleto (Foletta et al., 2003). Por otra parte, cuando el betaglicano está virtualmente ausente en osteoblastos, el TGF-13 no es capaz de estimular la síntesis de ADN, presuntamente debido a la falta de unión del TGF-13 a TI3RII ; sin embargo, la inducción de la síntesis de proteínas de matriz extracelular como la colágena es muy alta (Centrella et al. , 1995). Por lo tanto, hay efectos del TGF-13 que requieren de TI3RII y TI3RI, pero hay otros que se siguen dando aun en ausencia del betaglicano y/o TI3RII. Receptor 111 (rpRIII) o betaglicano (La descripción del betaglicano se hará con mayor profundidad dado que esta tesis gira alrededor de él). El receptor 111, también llamado betaglicano, está presente en una gran variedad de tipos y líneas celulares, y es el receptor de los miembros de la familia del TGF-13 más abundante, habiendo hasta 200,000 moléculas por célula, aunque en promedio hay 10,000 (Cheifetz et al., 1987). Aunque en un inicio el betaglicano y la endoglina -una glicoproteína no señalizadora homóloga al betaglicano- fueron ambos considerados receptores 111 del TGF-I3, la designación de receptor 111 ha quedado gradualmente destinada al betaglicano, dadas sus funciones más extensas. 21 TGF-f loterte e e er tr tl E TfRI b GAGS | 56 BG Q TGF-P 9) ¡ramnady = 3 1 — = ] = 15 Ñ TÉRI FKBP12 > TAR c BG lb ] E TOR Fxep12 dE Y SARA É U Smad2 ú 3 Figura A4. Mecanismo de activación de los receptores de TGF-f. a, El TGF-f se une por sí mismo al receptor ll (una cinasa constitutiva de serinas y treoninas) e induce el ensamblaje de un complejo de señalización heterotetramérico (cuya formación puede estar auxiliada por el betaglicano, b) que incluye a un dimero de TBRII y a uno de TBRI. c, En este complejo, TBRII transfosforila y consecuentemente activa a TBRI, con lo cual se libera FKBP12 del dominio GS de TBRI, quedando este dominio libre para ser ocupado por los Smads 2 y 3, quienes son empujados a TBRI por SARA y posteriormente fosforilados por TBRI. El betaglicano es fosforilado por TBRII y separado del complejo señalizador una vez que cumplió con su función como presentador de TGF- P a TBRII. 22 a T G F - ~ latente ~=======W==~~F-============================== T¡3R11 b BG ¡3RII FKBP12 T¡3RI e BG ¡3RI FKBP1 2 • ~ Sma d2 Ó 3 Figura 4. ecanismo de activación de los receptores de TGF-p. a, El TGF-p se une por sí is o al receptor 11 (una cinasa constitutiva de serinas y treoninas) e induce el ensamblaje de un complejo de señalización heterotetra érico (cuya for ación puede estar auxiliada por el betaglicano, b) que incluye a un dí ero de pRII y a uno de pRI. e, n este complejo, pRII transfosforila y consecuentemente activa a TpRI, con lo cual se libera F BP12 del dominio S de TpRI , quedando este dominio libre para ser ocupado por los mads 2 y 3, quienes son e pujados a TpRI por ARA y posterior ente fosforilados por T~RI. El betaglicano es fosforilado por TpRII y separado del complejo señalizador una vez que cumplió con su función co o presentador de GF- ~ a T¡3RII. 22 Estructura del proteoglicano De los receptores de TGF-J3 situados en la superficie celular, el betaglicano fue reconocido por ser el de mayor tamaño y mayor heterogeneidad al usar como sonda 1251_ TGF-J3. El betaglicano es una proteína que lleva enlazados covalentemente glicosaminoglicanos ó GAGs (lo que la hace ser un proteoglicano): en uno de sus residuos de serina se polimeriza preferentemente sulfato de heparano, y en otro, de condroitina, lo que le confiere una masa molecular global de 2S0-300 kDa (López-Casillas el al., 1994). El betaglicano fue bautizado con este nombre por tratarse de un proteoglicano que une TGF-bela. La proteína (conocida como core, o "núcleo", haciendo alusión a la proteína per se sin contar a los glicosaminoglicanos) del betaglicano de ratón es una proteína transmembranal de 8S0 aminoácidos y -100 kDa que atraviesa una sola vez la membrana plasmática; posee dos dominios extracelulares, el E, con parecido a endoglina y situado en la mitad amino, y el U, con parecido a uromodulina (proteína de orina) y situado en la mitad carboxilo (Ponce Castañeda el al., 1998). El dominio U, de 260 aminoácidos, tiene además homología con las proteínas de la zona ·pelúcida Zp2 y Zp3 -involucradas en el reconocimiento ovocito-espermatozoide- y con la glicoproteína pancreática Gp2, e incluye 8 cisteínas estrictamente conservadas (Bork y Sander, 1992) (Figura AS). El betaglicano intracelularmente posee un dominio pequeño de 43 aminoácidos, constituido en un 42% por serinas y treoninas y sin motivos de señalización evidentes, lo cual ha conducido a la creencia actual de que este receptor no media directamente ninguna actividad de señalización. Los dominios transmembranal e intracelular del betaglicano son también muy parecidos a los de la endoglina (López Casillas el al., 1991; Wang el al., 1991). Se han detectado formas tanto transmembranales como solubles del betaglicano (Andres el al., 1989). El betaglicano está provisto también de N-glucósidos, que comprenden 10 kDa del peso de la proteína medular y que se añaden en residuos de asparagina. Estructura del ARNm o del ADNc La estructura del ADNc del betaglicano de rata, la primera en conocerse, fue descrita por dos laboratorios en 1991 (López Casillas el al., 1991; Wang el al., 1991). Posteriormente se dio a conocer la estructura del betaglicano de otras especies: humano, cerdo (Moren el al., 1992), pollo (Barnett el al., 1994) y ratón (Ponce Castañeda el al., 1998), y mediante herramientas bioinformáticas, se ha predicho la estructura del de chimpancé, perro, fugu (pez globo), pez cebra y otro pez del género Telraodon (secuencias ensambladas por The Wellcome Trust Sanger Institute, ensembl.org). Es de interés hacer notar que el betaglicano de los mamíferos tiene un patrón particular de distribución de las serinas en las que se añaden glicosaminoglicanos, mientras que el betaglicano de los ovíparos (pollo y peces) en que se ha clonado muestra otro patrón de la distribución de dichas serinas. Los ADNcs de los betaglicanos de diferentes especies muestran una gran similitud en secuencia, evidente sobre todo en la región codificante y en menor grado en las regiones S' y 3' no traducidas. Por otro lado, se han vislumbrado tanto en la literatura como en bancos de ESTs (de expressed sequence tags) transcritos alternos de menor y mayor tamaño, que se expresan junto con la versión más conocida de -6 kb, aunque ninguno de ellos ha sido clonado ni reportado formalmente aún como transcrito alterno del betaglicano. En la literatura, se han detectado transcritos alternos en: cardiocitos auriculares de corazón de pollo del día embrionario 10 (Barnett el al., 1994), células preosteoblásticas de rata (3.7 kb, Centrella el al., 1995), testículo de rata madura sexualmente (3.S-3.7 kb, Le Magueresse-Battistoni el al., 1995; Bernard y Woodruff, 2001), glándulas suprarrenales (Bernard y Woodruff, 2001) e hipófisis y células foliculares de la teca (Sweeney y Johnson, 2004). En las bases de datos de ESTs, se puede apreciar que los transcritos alternos se generan por inclusión de exones novedosos y/o 23 Dominio E (de similitud a endoglina) Dominio U (de similitud a uromodulina) Dominio transmembranal ] Péptido señal Sulfato de heparano Sulfato de condroitina Región yuxtamembranal Dominio citosólico • Cisteínas D Regiones de semejanza a endoglina Figura AS. Estructura modular del proteoglicano del betaglicano. El betaglicano posee en su ectodominio el dominio E, de parecido a endoglina, y el U, de parecido a uromodulina; una región que conecta ambos dominios, 16 cisteínas, dos serinas en el dominio U donde se insertan sendos sulfatos de heparano y de condroitina y una región yuxtamembranal que es sustrato de proteasas que lo cortan generando un ectodominio soluble. Su región transmembranal y citosólica es semejante a la región correspondiente de la endoglina, no poseyendo patrones enzimáticos. 24 exclusión de exones conocidos. Algunos, al parecer, codifican sólo el ectodominio (versiones potencialmente solubles), y otros, versiones transmembranales con una cola citoplásmica diferente o bien, sin cola citoplásmica. En el AONc humano del betaglicano, se han detectado 11 SNPs (single nucleotide polimorphisms) y una inserción de 3 nucleótidos, aunque no se conoce su relevancia (Zippert et al., 2000). Estructura del gen El gen del betaglicano murino se localiza en el cromosoma 5, mientras que el humano se localiza en el 1 en la región 1p32-33 (Johnson et al., 1995). El gen abarca una región de -190 kb Y está compuesto por 17 exones y 16 intrones. En la figura A6 se ilustra esquemáticamente la distribución de exones del gen del betaglicano murino. I~ Figura AS. Distribución de los exones en el gen del betaglicano murino. Se muestra la distribución de los exones en el gen: las líneas verticales representan exones y las inclinadas intrones. El orden de los exones es de derecha a izquierda, de modo que el exón 1 es el de extrema derecha (tomado de ensembl.org). Patrón de expresión espacio-temporal del betaglicano y cambios naturales en él a nivel celular o tisular Grosso modo, la mayoría de los órganos y tejidos expresan betaglicano, entre los que se incluyen: corazón, pulmones, riñones, músculo esquelético, ojos (córnea y retina) (Wang et al., 1991; Barnett et al., 1994; Joyce y Zieske, 1997; Roelen et al., 1998), estómago, intestinos (Stenvers et al., 2003), mama (Chakravarthy et al., 1999; Jeruss et al., 2003), cerebro (motoneuronas, núcleo hipogloso, médula espinal lumbar (Jiang et al., 2000); corteza olfatoria, septum, hipotálamo y tallo cerebral), hipófisis (preferencialmente células gonadotrópicas -del lóbulo anterior y blanco principal de las inhibinas circulantes- y melanotrópicas -del lóbulo intermedio-), testículos (células de Leydig expresan niveles altos; células de Sertoli no lo expresan; ontogénicamente, la expresión del betaglicano se da así: células germinales de etapas tempranas del ciclo epitelial seminífero: niveles altos; espermatogonias: no lo expresan; espermatocitos primarios -en etapa de leptoteno y paquiteno-: niveles moderados; espermátides redondeadas: niveles altos; espermátides elongadas: no lo expresan; espermatozoides: sin determinar), ovarios (ovocitos, células de la granulosa y de la teca de folículos primordiales, primarios, secundarios y de Graaf) (MacConell et al., 2002), glándulas suprarrenales (Bernard y Woodruff, 2001), endometrio uterino (Lewis et al., 2000), encías (Gao et al., 1999; Worapamorn et al., 2000a, b), condrocitos (Grover y Roughley, 1995), megacariocitos (Schick y Jacoby, 1995) y células microvasculares pero no macrovasculares (Morello et al., 1995). Asimismo, linfocitos B y T Y células dendríticas en la lámina propia del intestino delgado de rata postnatal expresan betaglicano sin expresar los receptores I y 11 (Zhang et al., 1999). Muy temprano en el desarrollo murino, a los 7.5 dpc (a los 6.75 dpc comienza la gastrulación), ya es posible detectar intensamente la expresión de betaglicano mediante RT -PCR en ectodermo, mesodermo y endodermo, y de nuevo, no se detectan transcritos de TpRII ni de TpRI en este estadio (Roelen et al., 1994). No se detecta mediante northem blot el ARNm de betaglicano en el hígado adulto normal (Wang et al., 1991; Nishikawa et al., 1998) grosso modo. Al analizar tipos celulares del 25 hígado individualmente, se comprueba que los hepatocitos recién aislados y las células de Kupffer no expresan el ARNm del betaglicano; empero, a los pocos días de estar en cultivo, los hepatocitos empiezan a expresarlo cuantiosamente, dándose un pico a los 3 días (Weiner et al., 1996). En contraste, otro tipo celular presente en el hígado, ellipocito -también llamado célula almacenadora de grasa, estelar hepática o de Ito-, lo sintetiza abundantemente aun apenas aislado (Weiner et al., 1996). Durante la regeneración hepática después de hepatectomizar o de administrar tetracloruro de carbono, se da un disparo transitorio en la expresión del betaglicano por hepatocitos y por lipocitos, respectivamente (Nishikawa et al., 1998; Friedman et al., 1994). Por el contrario, durante la transdiferenciación de lipocitos en miofibroblastos (la fuente principal de matriz extracelular durante el desarrollo de la cirrosis hepática), su expresión baja un orden de magnitud (Weiner et al., 1996). En endotelios microvasculares experimentando angiogénesis in vitro en tres dimensiones, su expresión también baja (Sankar et al., 1996). Durante la fusión entre sí de las placas palatinas, proceso sin el cual se hiende el paladar, el betaglicano se expresa exclusivamente en el mid-edge epithelium (MEE) de aquéllas, lo cual , al parecer, podría concentrar la señalización autocrina por TGF-p3 en dos epitelios contiguos previo a su intercontacto, y con ello permitir que ambos se fusionen a través de la transformación epitelio-mesenquimatosa que induce tal isoforma y así conseguir la fusión palatina (Cui y Shuler, 2000). En tejido de neuroblastoma avanzado, hay una disminución significativa en la expresión del betaglicano tanto a nivel de ARNm como de proteína, a la vez que los niveles de TGF-p 1, TpRI Y rpRl1 resultan ser normales en los neuroblastomas de todos los estadios, lo cual sugiere que la ausencia de betaglicano es un mecanismo para escapar de la inhibición de la proliferación impuesta por TGF-p en estas células (Iolascon et al., 2000). En carcinomas ováricos, también se observa una pérdida en la expresión de betaglicano a nivel de ARNm (Bristow et al., 1999). Regulación de la expresión del betaglicano por agentes particulares En la literatura ya se han reportado hasta el momento algunos casos de regulación transcripcional y postranscripcional del gen del betaglicano, los cuales se enlistan en la tabla 1. En células periodontales, su expresión se incrementa por TGF-p1 pero disminuye por suero (Worapamorn et al., 2001); en monocitos también aumenta por TGF-p1 (Lastres et al., 1996); en osteoblastos se eleva por ácido retinoico (Nakayama et al. , 1994), por glucocorticoides (e.g., cortisol y dexametasona) (Centrella et al., 1991; Nakayama et al., 1994) y por agentes que inducen AMPc, como la hormona paratiroidea (PTH) (Centrella et al., 1988), y se suprime por BMP-2, un potenciador de la diferenciación ósea (Centrella et al., 1995). En la porción ventral de la próstata, su expresión sube después de la castración y es aplacada de nuevo por la administración de andrógenos (Kyprianou e Isaacs, 1988), posiblemente en particular 5a-dihidrotestosterona (Evangelou et al., 2000); de manera similar, el tamoxifeno, un antagonista del receptor de estrógenos, origina una mayor cantidad de betaglicano en la superficie de las células MCF-7, lo cual indica que los estrógenos regulan negativamente su expresión (Koli et al., 1997; Findlay et al., 2001). Asimismo, en células de la corteza suprarrenal, la expresión del proteoglicano del betaglicano aumenta en la superficie celular por acción específica de la adrenocorticotropina (ACTH, hormona trófica principal de tejido adrenocortical in vivo), vía un aumento de AMPc y sin necesidad de síntesis proteica (Cochet et al., 1988). En células humanas HeLa, el betaglicano es regulado positivamente por TNFa presuntamente a través de NF-KB (Zhou et al., 2003), mientras que en células de cáncer mamario MCF-7, es regulado positivamente por la vitamina 03 (Wu et al., 1998). La prostaglandina E2 también incrementa significativamente el ARNm del betaglicano, 26 hoi rr iy rs qe y a a TGF a TBRI y a TBRII y la incrementa a TBRIII (Fine ef al., 1995). Por otra parte, en células MERAKt, su expresión baja a la mitad cuando es activada la cinasa PKB/Akt (Kuhn ef al., 2001). Se sabe también que en células epiteliales de pulmón de visón, la expresión del proteoglicano es suprimida por radiación ultravioleta (Quan ef al., 2001). Molécula del BG estudiada Línea y/o tipo celular y especie Ost pe Pd de LA Regulador Aumento en la superficie celular sin necesidad de síntesis de novo Adrenocorticotropina : (ACTH) Proteoglicano Células adrenocorticales Acortamiento de las DFGF Proteoglicano cadenas de sulfato de Osteoblastos de rata heparano Aumento en expresión y Cortisol Proteoglicano mayor afinidad por TGF- Osteoblastos de rata p1 Aumento MLEC, Mink lung epithelial cells Disminución MERAKt (derivadas de PKB/Akt NIH3T3) Disminución de -2X Tamoxifeno MCF-7 (Células (antagonista del Proteoglicano Aumento humanas de cáncer receptor de estrógenos) mamario) Aumento Aumento de 2.5X HeLa (humanas) Aur nen O BG: betaglicano Funciones a nivel celular Presentación de TGF-Pf a sus receptores señalizadores Este receptor une las tres isoformas de TGF-$ con afinidades semejantes (Xp de 50 a 300 pM), pero la mayor es para con TGF-$2. No obstante, la afinidad del betaglicano por ellas es 3-5 veces menor que la de TBRI y TBRII. Ninguno de los glicosaminoglicanos del betaglicano es necesario para la unión de TGF-f, para su correcto plegamiento ni para su llegada a la superficie celular (Andres ef al., 1991; Cheifetz ef al., 1987, 1988; Cheifetz y 27 posiblemente a nivel transcripcional, además de ue disminuye la unión de TGF-~ T~RI T~RII l i r enta T~RIII ( i e t l., 95). or tra arte, n élulas ERAkt, u xpresión aja l itad ando s cti da l i sa KB/Akt ( uhn t l., 01). e be t bién ue n élulas piteli les e ul ón e i ón, l xpresión el r t ogli no s upri ida or r di ción ltr vi leta ( uan t l., 01). Tabla l. Reguladores de la expresión o de las propiedades del betaglicano egulador olécula el G Efecto st diada Aumento umento en la drenocorticotropina roteoglicano superficie celular sin élulas drenocorticales (ACTH) ecesidad e fntesis Andrógenos Proteoglicano bFGF roteoglicano BMP-2 Cortisol roteoglicano Dexametasona luz ultravioleta Proteoglicano Parathormona u hormona paratiroidea Proteoglicano jPTl:D );o - .' KB/Akt ARNm de novo Disminución umento en xpresión y ayor fi i ad or GF- p1 umento is inución Aumento is inución e - X Epitelio prostático de rata steoblastos e r ta t oblastos e r ta Osteoblastos de rata lEC, ink lung epifhelial cells Osteoblastos de rata ERAkt ( eriv das e NIH3T3) Prostaglandina E2 Aumento Fibroblastos pulmonares _________ 111 _________ ....... _______ ..... de 'ó hu amoxifeno CF-7 ( élulas ( nt gonista el roteoglicano umento anas e áncer r ceptor e str enos) amario) TGF-p1 ARNm Aumento Células gingivales y '-------_-....!~~------....!~ ~~ ~------------~ TNF-a ARNm umento de 2.5X ela (hu anas) ~ ~~~ ~ _________ ~r.~ ~ r ~ ot ~ eo - g ~ li - ca - n - o ---~~ A ~ u w m ~ e ~ nt ~ o ~ _____ ~~ M ~ C ~ E - ~ 7 = E ~ ____________ ~ G: etaglic no unciones ivel elular resentación e TGF-~ us r eptores eñali dores ste r ceptor ne l s tr s i f r as e TGF-~ on fi i des ejantes (KD e 0 0 ), ero l ayor s ara on TGF-~2. o bstante, l fi i ad el etagli no or ll s s -5 eces enor ue l e T~RI T~RII. i guno e l s lic inoglicanos el etagli no s ecesario ara l nión e TGF-~, ara u orrecto l amiento i ara u lle da l uperficie elular ( ndres t l., 91; heifetz t l., 987, 9 8; heifetz Massagué, 1989; López Casillas et al., 1994; Massagué et al., 1994; Segarini et al., 1987; Segarini y Seyedin, 1988). La mayor parte de las moléculas del betaglicano se encuentra en forma de homooligómeros, presumiblemente homodímeros no coval entes , tanto en presencia como en ausencia de TGF-f31 ó 2 (Henis et al., 1994). En presencia de estos ligandos, se forman transitoriamente heterooligómeros de betaglicano-Tf3RII (López Casillas et al., 1993; Moustakas et al., 1993; Yamashita et al., 1994a). La expresión del betaglicano anclado a la membrana incrementa la unión de TGF-f3 a Tf3RII, función conocida como de presentación de TGF-f3 a Tf3RII (Letamendía et al. , 1998; López Casillas et al., 1993). El favorecimiento de la unión del ligando es particularmente significativo para TGF-f32, cuya afinidad por Tf3RII es muy baja. Cuando el betaglicano se coexpresa con el receptor 11, las respuestas celulares a TGF-f32 se incrementan considerablemente, como la inhibición de la proliferación, que aumenta 10 veces en los mioblastos L6E9; así, el betaglicano hace posible que la isoforma TGF-f32, que no posee una afinidad alta por Tf3RII, se una tan eficientemente ante este receptor como lo hacen TGF-f31 y TGF-f33, que despliegan por sí mismos una alta afinidad hacia él (López Casillas et al., 1993; Sankar et al., 1995). Esta situación hace rememorar lo que sucede con el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), cuya presentación al receptor de FGF es propiciada por sulfatos de heparano (Yayo n et al., 1991). El TGF-f3 se une al betaglicano en el dominio E-segmento previo al dominio U (de acuerdo con lo esquematizado en la figura A5) (López Casillas et al., 1994) y además en el dominio U (Pepin et al., 1994) cuando éstos son expresados individualmente, y cada uno es capaz de ocasionar la fosforilación de Smad2 en respuesta a TGF-f32 -al mismo nivel que el betaglicano completo- en mioblastos L6E9, reacción que ante esta isoforma no se da en ausencia del betaglicano (Esparza López et al., 2001). Sin embargo, no sabemos si en la molécula completa del betaglicano ambos dominios están uniendo cada uno por su cuenta TGF-f3, o si entre los dos unen una sola molécula de este factor. En células humanas MCF-7, de cáncer de mama y con baja expresión de betaglicano, un aumento forzado en la expresión de éste restituye la señalización autocrina por TGF-f31, con lo cual disminuye la clonogenicidad de estas células (Chen et al., 1997). La endoglina, otro receptor 111, comparte cierta homología con el betaglicano, y une TGF- f31 Y TGF-f33 pero no TGF-f32 (Gougos y Letarte, 1990; Yamashita et al., 1994a). La expresión de esta glicoproteína transmembranal está restringida principalmente a células endoteliales y hematopoyéticas de varios tipos (Cheifetz et al., 1992). En condrocitos y células vasculares endoteliales, el betaglicano se asocia con la endoglina - independientemente de la presencia de TGF-f3- en complejos que pueden incluir además al receptor 11 y/o al 1, lo cual sugiere que la endoglina puede modificar la señalización por TGF-f3 al interactuar con los Tf3Rs 1, 11 Y 111 (Wong et al., 2000; Parker et al., 2003). Inhibición de la presentación de TGF-f3 a sus receptores señalizadores El betaglicano también puede impedir la presentación de TGF-f3 a Tf3RII. En células humanas MOA-MB-231 de cáncer mamario y con baja expresión de betaglicano, la sobreexpresión artificial de éste detiene la señalización por TGF-f3 (Sun y Chen, 1997). Al parecer, el cambio de papel de presentador a alejador de TGF-f3 a sus receptores depende de la longitud de las cadenas de glicosaminoglicanos que se polimerizan en el betaglicano (Eickelberg et al., 2002). Así, la función presentadora o anti-presentadora del betaglicano puede depender del tipo y estado celular, mismos que reflejarían el nivel de glicanación del betaglicano. Otro mecanismo por el que el betaglicano puede impedir la señalización por TGF-f3 está en función de la tasa que exista de betaglicano/receptores señalizadores -más que de la cantidad absoluta de cada uno, al menos en osteoblastos-; 28 así, mientras mayor sea la proporción de betaglicano con respecto a TpRII y TpRI, especialmente del segundo, la respuesta a TGF-p tenderá a ser menor. Este fenómeno ha recibido el nombre de efecto esponja o efecto tina, dado que la relativamente alta cantidad de betaglicano hace que el TGF-p se "hunda" en éste, no permitiéndole ejercer acciones (Centrella et al., 1995; Ji et al., 1999); así, si se sobreexpresa el TpRI en células preosteoblásticas - Smad2 ú 3 | Smurf Vía vesículas de caveolina E por el E Coactivador o correpresor Fosfatasa A ¿Smurf? » 9 Smadá4 Cofactor de unión al ADN Figura A9. Vía integrada de la señalización por TGF-f de la membrana plasmática al núcleo. Una vez que el BG ha promovido la formación de un complejo de TBRs con TGF-$, TBRII fosforila al BG y éste es excluido del complejo, dejando libre al tetrámero TBRII-TBRI. TBRI fosforila a los Smads 2 y 3, los cuales llegan a él empujados por SARA. Smad2 ó 3 fosforilados se asocian con Smad4 y juntos viajan al núcleo, donde regulan la expresión de centenares de genes con la ayuda de cofactores y coactivadores o correpresores. Tanto Smad4 como los R-Smads activados forman homotrimeros estables. Los Smads son eventualmente desfosforilados y devueltos al citosol para luego ser reaprovechados o ubiquitinados y degradados por el proteosoma. Las flechas de color azul indican activación de la vía, mientras que las de color rojo indican desactivación. Como parte de la desactivación de la vía, el complejo de TBRs-Smad7-Smurfs es dirigido a caveolas, dominios membranales ricos en caveolina, endocitado y puesto en contacto con el proteosoma para su degradación. Como parte de su activación, el complejo de TBRs activados-SARA es endocitado a concavidades recubiertas de clatrina que favorecen la señalización (redibujado de Shi y Massagué, 2003). 40 GAGs BG T~RU T~RI • Smad4 BG T~ R I --en caveolas ~ I-Smad J Smur.f I* ~ ~~=.~. ~~ ---------~ Degradación pDrel proteosoma I igura g. ía integrada de la señalización por T F-J3 de la embrana plas ática al núcleo. na vez que el G ha pro ovido la for ación de un complejo de TJ3Rs con T F-J3, TJ3RII fosforila al G y éste es excluido del complejo, dejando libre al tetrá ero TJ3RII-TJ3RI. TJ3RI fosforila a los mads 2 y 3, los cuales llegan a él e pujados por ARA. mad2 ó 3 fosforilados se asocian con mad4 y juntos viajan al núcleo, donde regulan la expresión de centenares de genes con la ayuda de cofactores y coactivadores o correpresores. anto mad4 co o los - mads activados for an homotrí eros estables. Los mads son eventual ente desfosforilados y devueltos al citosol para luego ser reaprovechados o ubiquitinados y degradados por el proteosoma. Las flechas de color azul indican activación de la vía, ientras que las de color rojo indican desactivación. omo parte de la desactivación de la vía, el complejo de J3Rs-Smad7-Smurfs es dirigido a caveolas, dominios embranales ricos en caveolina, endocitado y puesto en contacto con el proteoso a para su degradación. omo parte de su activación, el complejo de TJ3Rs activados- RA es endocitado a concavidades recubiertas de clatrina que favorecen la señalización (redibujado de hi y assagué, 2003). 40 coo ii A A - ) Y. , ) TGF-8 también conduce a la degradación rápida de SnoN, y en menor grado, a la de o-Ski (Sun et al, 19993, b). El mecanismo de degradación de SnoN es el siguiente: TGF-4 induce el ensamblaje de un complejo de APC (anaphase promoting complex, o ciciosoma) ó de Smurf2 (una ligasa E3 de ubiquitina) con Smad2 ó 3. Smad2, cuya asociación con SnoN se afianza ante la estimulación con TGF-B, remite a SnoN al complejo APC (de 11 subunidades en mamiferos) ó a Smurf2 para que éstos lo ubiquitinen y sea así marcado para su degradación por el proteosoma (Bonni el al., 2001; Stroschein el af, 2001; Want et al, 200%). Empero, TGF-4 induce —a las dos horas de haber sido aplicado— la síntesis de novo de SnoN, dándole fin a la oleada de señalización por TGF-f y regresando a Smad2 y 4 a su estado reprimido (Stroschein et al, 1999). Ski puede formar complejos del que forman parte Smad2, Smad3 y Smad4 en un elemento de respuesta a Smad (SBE) en un promotor y suprimir su potencial transactivador a través del reclutamiento de N-CoR, y posiblemente a través del reclutamiento de su complejo de HDACs asociado. La propiedad de SnoN y de c-Ski de hacer a una célula resistente al efecto inhibidor del crecimiento del TGF-$4 cuando aquéllos son sobreexpresados artificialmente puede ser la responsable de que SnoN y Ski sean protooncoproteínas (Luo ef al, 1999; Xu el af, 2000). TGIF es un correpresor transcripcional activado por la vía Ras-MEK-MAPK que se une a los Smads impidiendo que funcionen; recluta al correpresor HDAC para llevar a cabo esta función (Wotton ef al, 1999a, b, 2001). Hgs, Disabled, axina y ELF (Embryonic liver fodhn, una f-espectrina) son proteínas adaptadoras que asisten la presentación de los Smads2 y 3 a TPBRÍ (Shi y Massagué, 2003). La caveolina 1 es una proteina marcadora de las caveolas, microdominios de la membrana celular ricos en colesterol, que interactúa con TARI un tiempo después de ser éste activado para impedir la fosforilación de Smad2 (Razani et al, 2001). Tanto TBRI como TBRII y Smad2 —no así Smadá— se localizan en caveolas, pero la ubicación en estos microdominios es independiente de la caveolina 1 (Razani ef al, 2001). interacción con otras vías de señalización La señalización por TGF-f se integra con y es modulable por otras vías de señalización como la de Ras/Erk1/2, Jak1/Stat y AKYPKB. Por ejemplo, al ser activada por factores como el factor de crecimiento de hepatocitos (GF) o el factor de crecimiento epidérmico (EGF) —~n"ao,< tm~rf4)-. genes especificos Tt de músculo Comienza la contracción espontánea oeterminaCIónomyf5 miogenina a-actina cadenas de la miosina TGF-I\ ""->TGF-I\ receptor de aceticolina IGF-I "-~ IGF-I cinasa de creatina bFGF AR des mina HGF/SF --1 inhibición .... activación Figura A10. Regulación molecular de la formación de miotubos a partir de mioblastos. Los progenitores mesodérmicos son especificados como mioblastos por el factor transcripcional Pax3 durante la miogénesis embrionaria o por Pax7 durante la miogénesis postnatal. En cualquier caso se induce la expresión de MyoD y/o de Myf5, que especifican a los mioblastos como tales. In vivo, éstos pueden permanecer en un estado silencioso o bien ser activados ante daño muscular, el cual detona su proliferación y posterior diferenciación y fusión entre sí o incorporación a miotubos preexistentes. In vitro, factores de crecimiento como TGF-~, IGF-I, bFGF Y HGF/SF impiden la conversión de mioblastos en miotubos, mientras que factores como el ácido retinoico la promueven. No obstante, tanto el TGF-~ como el IGF-I tienen un rol adicional en este proceso: luego de que se dispara la diferenciación de los mioblastos, dichos ligandos son necesarios para que la miogénesis acontezca normalmente. Durante el proceso de maduración de los miotubos, éstos constituyen miofibras que al ser inervadas, adquieren identidad como de contracción rápida, intermedia o lenta (figura redibujada de Wolpert et al., 1998). 52 (Hepatocyte growth factor / Scatter factor) y su receptor c-Met juegan un papel crucial en la miogénesis, dado que el knock-out de HGF/SF y el de c-Met carecen de músculos en las extremidades. Luego de que se han formado las fibras musculares, viene una segunda ola miogénica en la que comienzan a ser inervadas y que les da identidad como fibras de contracción rápida, intermedia o lenta. Al madurar, las miofibras quedan envueltas en una capa de tejido conectivo por donde atraviesan vasos sanguíneos y nervios. Miogénesis in vitro El estudio del proceso de la diferenciación miogénica se ha llevado a cabo en explantes de somitas y en embriones, pero más comúnmente en cultivos primarios y líneas celulares de mioblastos, pudiendo los mioblastos fusionarse entre sí in vitro para formar miotubos; como dato interesante, tenemos que otros tipos celulares que se fusionan entre sí son los macrófagos para generar osteoclastos, y los gametos para generar cigotos. La conversión in vitro de mioblastos a miotubos se caracteriza morfológicamente por el estiramiento y alineamiento de mioblastos y su posterior fusión entre sí, originando de este modo miotubos, células que al microscopio se aprecian multinucleadas y gigantescas. Mientras que los miotubos son células diferenciadas terminalmente e incapaces de proliferar (aunque se puede forzar su desdiferenciación transfectándoles el AONc del factor de transcripción homeótico msx1, Odelberg et al., 2000), los mioblastos son células no diferenciadas por completo que sí proliferan cuando están expuestos a un medio rico en suero (10-20% de suero de feto bovino). Entre las líneas celulares de mioblastos que se han empleado como modelo de la miogénesis están la C2C12 (proveniente de mioblastos satélite -un tipo de células estaminales miogénicas esenciales para el mantenimiento postnatal del músculo- de músculo esquelético de contracción rápida de la pata de un ratón), la C2 (progenitora de la C2Cd, la 801-8 (proveniente de músculo esquelético de contracción lenta de ratón), la L6E9 (de rata), etc., aunque la más usada actualmente es la C2C12. Los programas genéticos que conducen a la formación de miotubos pueden disociarse entre sí, es decir, por un lado está el programa de detención de la proliferación, por otro el de la diferenciación, y por otro aún, el de la fusión, ejecutándose coordinada y secuencialmente los tres durante el transcurso normal de la miogénesis. Por tal motivo, durante el proceso de diferenciación de mioblastos a miotubos tienen lugar cambios positivos y negativos en el nivel de expresión de centenares de genes, dando por resultado modificaciones en la naturaleza de las proteínas que desde entonces produce la célula muscular, todo lo cual conlleva a cambios en su fisiología, como el hacerla contráctil. Hay proteínas cuya expresión se eleva drásticamente -vía MRFs y MEF2C activando los promotores de sus genes-: a. actina (habiendo habido p y y), cadenas ligera y pesada de la miosina, tropomiosina, troponina (proteínas integrantes del aparato contráctil), receptor de acetilcolina nicotínico, acetilcolinesterasa (presentes en las sinapsis colinérgicas que desencadenan la contracción), desmina (filamento intermedio específico de músculo), transportador de glucosa Glut4, cinasa de creatina específica de músculo, etc. (figura A 10). Cese de la proliferación En los mioblastos, la proteína pRB es hiperfosforilada por el complejo Cdk4-ciclina 01 poco antes de la transición de la fase G 1 a la 8 del ciclo celular, dejándola incapaz de detener el ciclo celular mediante el impedimento de su interacción con factores de transcripción de la familia E2F, necesarios para el progreso del ciclo celular. Cuando la 53 célula se empieza a diferenciar, pRB es mantenida en un estado hipofosforilado, pudiendo así capturar a E2F e inhibir el ciclo celular (Shin et al., 1995; Corbeil et al., 1995). MyoD, en niveles elevados, induce la expresión de p21 C¡P1, un inhibidor de ciertos complejos de Cdks-ciclinas, deteniendo así el ciclo celular (Halevy et al., 1995; Puri et al., 1997). Diferenciación MyoD y miogenina son dos factores de transcripción maestros que se expresan sólo en células musculares esqueléticas. Una hélice a en el término carboxilo de MyoD es importante para iniciar la transcripción de genes normalmente silenciados, mientras que el dominio equivalente de miogenina funciona como transactivador general potenciando el nivel de expresión de genes que ya se expresan, y que por lo tanto, poseen una estructura de cromatina abierta. Aunque la expresión de MyoD y de Myf5 es ya detectable en los mioblastos en división activa, no lo es la de la miogenina: ésta se eleva notablemente sólo al haber diferenciación miogénica (Buckingham, 2001; Davis et al., 1987; Edmondson y Olson, 1989; Weintraub et al., 1989; Wright et al., 1989). En los mioblastos, MyoD y MEF2 ocupan promotores de genes blanco musculares como el de la miogenina, pero al estar asociados con HDACs (histone deacetylases) , reprimen la transcripción de estos genes (Mal y Harter, 2003). Cuando se inicia la diferenciación, se disocian las HDACs de MyoD y de MEF2, siendo sustituidas por p300/CBP y otros coactivadores con actividad de HAT (histone acetyltransferase) como pCAF (P300/CBP- associated tacto!) , conduciendo a la activación transcripcional de las regiones reguladoras de genes musculares. Esta es una explicación potencial de por qué MyoD y MEF2, aunque expresados en niveles bajos en mioblastos, no activan genes blanco en ellos. Al iniciarse la diferenciación miogénica, se incrementa la expresión y la actividad del canal de K+ Kir2.1, el cual eventualmente induce la hiperpolarización de la membrana de -10 a - 70 mV, con la consecuente elevación de la concentración intracelular de Ca2+. El aumento en [Ca2+]¡ modifica la actividad de CaMKII y de la fosfatasa calcineurina, haciendo que se dispare la expresión y la activación de la miogenina y de MEF2C (Konig et al., 2004). la cinasa CaMKII es activada al inicio de la miogénesis como se indicó y fosforila entonces a HDACs, haciéndolas susceptibles al reconocimiento por la chaperona 14-3-3; juntas se translocan del núcleo al citoplasma, dejando a MEF2 libre para asociarse con HATs. Dicha transición de represión a activación transcripcional se sustenta mecanísticamente en que la acetilación de las histonas les resta carga positiva, lo cual conlleva a un debilitamiento de la atracción entre las histonas y los grupos fosfato del ADN cargados negativamente, resultando en una estructura nucleosomal laxa que tolera el ingreso de activadores transcripcionales (McKinsey et al., 2001). Regulación negativa de la miogénesis in vitro los mioblastos en proliferación expresan la proteína Id, un inhibidor de la diferenciación (Benezra et al., 1990). En un medio con un alto nivel de suero, Id impide que MyoD active genes efectores secuestrando a las proteínas HlH E12 Y E47, codificadas por el gen E2A, con quienes MyoD y miogenina se heterodimerizan para unirse al ADN con alta afinidad y llevar a cabo sus funciones transactivadoras (Murre et al., 1989a, b; lassar et al., 1991; Chakraborty et al., 1991). Cuando los mioblastos en cultivo experimentan la transición a un medio bajo en suero, la expresión de Id queda abatida considerablemente (Benezra et al., 1990), lo cual es necesario para que la miogénesis proceda normalmente (Jen et al., 1992). Por su parte, el factor de transcripción homeótico AREB6/ZEB bloquea específicamente la actividad transcripcional de MEF2C uniéndose a cajas E, inhibiendo así la diferenciación muscular (Postigo y Dean, 1999). De forma parecida, la proteína bHlH Twist secuestra a proteínas E impidiendo que MyoD y MEF2 se puedan 54 heterodimerizar con ellas y de esta forma evita que se una al ADN y que transactive, respectivamente (Spiecer et al., 1996). los factores de crecimiento TGF-~, bFGF, aFGF (acidic Fibroblast growth factor) y HGF/SF inhiben la conversión de mioblastos a miotubos, aunque per se no son mitogénicos -a diferencia del suero, que además de suprimir la diferenciación, es mitogénico- (Olson et al., 1986; Spizz et al., 1986). No obstante, tanto el TGF-~ como el suero pierden la capacidad de suprimir la expresión de genes específicos de músculo en miotubos diferenciados terminalmente, concretamente después de la fusión (Massagué et al., 1986; Olson et al. , 1986; Florini et al., 1986). la inhibición de la diferenciación muscular esquelética ejercida por TGF-~ se sustenta mecanísticamente en la represión transcripcional de myoD1 por TGF-~ (Vaidya et al. , 1989) yen que su efector Smad3, pero no Smad2, reprime la actividad de la familia de factores transcripcionales MyoD en mioblastos C2C12: Smad3, mediante interacción física directa con el dominio bHlH de MyoD, impide que este factor miogénico se heterodimerice con proteínas E como E12 y E47, Y así, evita que se unan complejos de MyoD a secuencias "E-box", presentes en enhancers de genes musculares (liu et al., 2001). Además, TGF-~ induce la translocación de MEF2A y MEF2C, pero no de MyoD, miogenina o p21 C ¡P\ al citoplasma de mioblastos C2C12, con lo cual se impide que MEF2A y C formen parte de complejos transcripcionales activos y transactiven genes como el de la miogenina (De Angelis et al., 1998). Asimismo, el TGF-~ inhibe la función de la miogenina (Brennan et al., 1991), y junto con bFGF, induce la síntesis de la ciclina D1 (Rao et al. , 1994). bFGF inhibe la diferenciación muscular esquelética mediante la desactivación funcional de las proteínas miogénicas bHlH como la miogenina. Al activarse ante la estimulación por bFGF, la proteína cinasa C (PKC) fosforila a la miogenina en un sitio conservado en su dominio de unión al ADN, dejándolo inhabilitado (li et al. , 1992). Además, al igual que el TGF-~, el bFGF inhibe transcripcionalmente la expresión de myoD1 (Vaidya et al., 1989). Como se mencionó, los genes específicos de músculo son inmunes ante las acciones represoras del TGF-~ una vez que el mioblasto pasó a ser miotubo. En los miotubos lsE9 , los niveles de receptores de TGF-~ no cambian con respecto a los que había en mioblastos, sin embargo, aun habiendo receptores de TGF-~ en los miotubos lsE9, estas células ya no acatan las órdenes del TGF-~ en el sentido de no reprimir la expresión de genes específicos de músculo, lo cual indica que algunos componentes de la vía de señalización del TGF-~ pueden dejar de operar después de la fusión (Massagué et al., 1986). Tanto bFGF y aFGF como sus receptores ven disminuida su expresión -a nivel transcripcional- durante la diferenciación miogénica de células Sol-8 y ls (Moore et al., 1991), de forma semejante a como sucede con los receptores de TGF-~ en mioblastos C2 (Hu y Olson, 1990). Sin embargo, mioblastos C2 puestos en un medio pobre en suero pero con EGTA, un quelante de Ca2 +, se diferencian bioquímicamente pero nunca se fusionan, dando lugar a miocitos mononucleares, los cuales retienen los receptores de TGF-~ de la superficie celular aún acoplados a las cascadas de señalización que reprimen el fenotipo muscular (Hu y Olson, 1990). Regulación positiva de la miogénesis in vitro El TGF-~, además de tener un papel como modulador negativo de la miogénesis, tiene paradójicamente un papel como modulador positivo: promueve la miogénesis en un medio 55 de cultivo con niveles altos de mitógenos, lo cual logra disminuyendo la expresión de c- myc y retardando el avance a través de la fase G1 del ciclo celular (Zentella y Massagué, 1992); también es capaz de inducir la diferenciación de células estaminales embrionarias (embryonic stem cel/s) hacia un destino primordialmente muscular (Slager et al., 1993). El TGF-p induce los genes de: MyoD, miogenina, cadenas pesada y ligeras de la miosina y troponina T (del programa de diferenciación), pero no afecta la inducción de la cadena a. del receptor de acetilcolina, la caída de Id (del programa de diferenciación) ni la hipofosforilación de pRB (del programa de detención del crecimiento) (Filvaroff et al., 1994). La insulina e IGF-I y 11, producidos por el tubo neural y por las somitas, actúan sinérgicamente con Shh, bFGF y TGF-p1 para promover la miogénesis en cultivos de somitas (Pirskanen et al., 2000). El mecanismo por el cual IGF-II -secretado autocrinamente- promueve la miogénesis en cultivos de mioblastos es mediante la elevación de la expresión del gen de la miogenina (Florini et al., 1991). Es importante mencionar que los IGFs tienen efectos duales opuestos durante la miogénesis al igual que el TGF-p: inicialmente inhiben la expresión del ARNm de miogenina y son exclusivamente mitogénicos, pero subsecuentemente promueven la conversión de mioblastos a miotubos. El mecanismo por el cual promueven mitosis está asociado con una expresión elevada de Cdk4 y de ciclina D1, componentes de una holoenzima que al mantener a pRB en un estado hiperfosforilado -i.e., inactivo-, favorece el avance del ciclo celular (Rosenthal y Cheng, 1995). IGF-II funciona también como un factor de supervivencia para los mioblastos en diferenciación, dado que si se suprime el aumento que experimenta la expresión de IGF-II durante miogénesis mediante un ADNc en contrasentido, en vez de diferenciarse al ser expuestas a un medio bajo en suero, las células se mueren por apoptosis (Stewart y Rotwein, 1996). Fusión de mioblastos Los genes que controlan la fusión de mioblastos actúan de manera secuencial y algunos se identificaron y se siguen identificando inicialmente en Drosophila. Luego de ser disparada la diferenciación en ellos, los mioblastos se atraen entre sí, se alinean en un eje común, yuxtaponen sus membranas, se adhieren, se conectan a través de parches de intercomunicación citoplásmica y se fusionan. La fusión es un proceso estrictamente dependiente de Ca2+: mientras que el quelante de calcio extracelular EGTA bloquea la fusión de los mioblastos, el ionóforo de calcio A23187 provoca su fusión precoz (Bar-Sagi y Prives, 1983). Participan en el proceso de fusión proteínas de la superficie celular como cadherinas, N-CAM, V-CA M (neural y vascular cel/-adhesion molecules, respectivamente), las tetraspaninas CD9 y CD81, ADAMs y receptores de proteínas de matriz extracelular como integrinas ~1 (Schwander et al., 2003; Nishiyama et al., 2004). El factor transcripcional FKHR (Forlchead in human rhabdomyosarcoma) induce la expresión de genes requeridos para la fusión celular como prosaposina, frizzled 4, cadena pesada P de la miosina lenta, además de genes involucrados en la cuantiosa remodelación de la matriz extracelular que se da previamente a la fusión como procolágenas a1 y a2, fibulina 2, tenascina e y anquirina 3 (Bois y Grosveld, 2003). Durante la miogénesis, la actividad de la GTPasa pequeña RhoA y la de su proteína efectora Rock es abatida para que FKHR se pueda translocar al núcleo; si se mantiene artificialmente, se inhibe la fusión sin ser impedida la expresión de marcadores miogénicos tempranos como MyoD y miogenina (Nishiyama et al., 2004). El factor transcripcional NF-ATc2 también es necesario para la fusión: induce la expresión de IL-4, citocina que incide en mioblastos para hacerlos incorporarse a miotubos preexistentes y así hacer que crezca el músculo (Horsley et al., 2003). También, durante la fusión se 56 induce la proteína folistatina, que promueve la fusión al parecer mediante la represión de la actividad de la miostatina (Iezzi et al., 2004). La miostatina es una proteína secretada producida por el músculo esquelético que funciona como un regulador negativo de la masa de las fibras musculares esqueléticas al limitar su crecimiento (Lee, 2004). Drosophila ha constituido un modelo valioso para el estudio de la fusión de los mioblastos, habiéndose logrado clonar inicialmente de ella genes que son críticos para este proceso aun en los mamíferos, no obstante la existencia de diferencias en el modus operandi de la fusión. Revisemos brevemente cómo funcionan algunas de las proteínas involucradas en este proceso en Drosophila. Los progenitores musculares derivados del mesodermo somático proliferan y dan lugar a células conocidas como "fundadoras". Una célula fundadora provee al músculo en desarrollo los genes de identidad muscular; una fundadora individual atrae a otro tipo de célula -también derivada del mesodermo somático- llamada "mioblasto competente para la fusión" (FCM), se fusiona con ella y la hace expresar genes del patrón muscular. Al principio, los precursores musculares están constituidos por dos o tres núcleos, pero al incorporárseles más mioblastos se desarrollan hasta generar miotubos maduros más grandes. La fusión es heteróloga: las fundadoras sólo se fusionan con los FCMs, pero ninguno de los dos tipos celulares se fusiona consigo mismo. Los mioblastos fundadores expresan en su superficie la proteína transmembranal Dumbfounded (Duf), que intracelularmente contacta a las proteínas Antisocial (Ants) y Loner (específicas de fundadoras), mientras que los FCMs expresan en su superficie la proteína transmembranal Sticks and Stones (Sns). Más aún, Ants y Loner se asocian respectivamente con las GTPasas Myoblast City (Mbc) y ARF6-Rac, encargadas de reorganizar el citoesqueleto. Luego de que Duf contacta a Sns (gracias a lo cual Duf funciona como atrayente de FCMs), se da la fusión de manera dependiente de proteínas asociadas a la membrana o citosólicas yuxtapuestas a la membrana como Mbc, Mef2, Blown Fuse (Blow) y Titina, las cuales, a diferencia de Duf y Sns, se localizan en ambos tipos celulares (Taylor, 2002; Chen et al., 2003). Células satélite y homeostasis postnatal del músculo Durante el desarrollo postnatal, las células satélite, una población de células miogénicas estaminales, y otras células estaminales en músculo (CD4S+) (Polesskaya et al., 2003), médula ósea (también CD4S+) (Musaro et al., 2004; Camargo et al., 2003; LaBarge y Blau, 2002) y aorta dorsal (De Angelis et al., 1999), contribuyen al mantenimiento de miotubos. Las células satélite emergen durante la embriogénesis tardía y son altamente activas durante el crecimiento postnatal del músculo, siendo su contribución al músculo adulto significativa; empero, pueden diferenciarse también en adipocitos y en osteocitos. Estas células están intercaladas en fibras musculares adyacentes. El origen ontogénico de las células satélite son las somitas, aunque pueden establecerse en la vasculatura embrionaria, y ser ella quien las provea al músculo maduro. La proteína RhoGAP activada corriente abajo de IGF-I, se encarga de dirigir la diferenciación de precursores mesenquimatosos hacia el linaje miogénico cuando éstos pueden generar aún tanto adipocitos como miocitos. Las células satélite silenciosas comparten un programa de desarrollo con los linajes musculares embrionarios: sus niveles de expresión de MRFs son indetectables, pero ante daño muscular, se activan y empiezan a expresar ya sea MyoD o MyfS antes de entrar al ciclo celular. Sin embargo, en vez de ser Pax3 su factor transcripcional especificador, lo es Pax7, inducido por los Wnts SA, SB, 7A Y 7B. Posteriormente, expresan MRFs corriente abajo como miogenina y MRF4, lo cual está asociado a diferenciación terminal ya fusión a fibras nuevas o preexistentes. Las células satélite se autorrenuevan: luego de ser activadas -proceso en el cual es indispensable la señalización por HGF/c-Met-, se dividen asimétricamente para generar células hijas S7 distintas entre sí: una mantiene constante el número de células satélite y la otra se diferencia. (Referencias generales de la miogénesis esquelética: Anastasi et al., 1997; Bladt et al., 1995; Cossu y Borello, 1999; Edmondson et al., 1992; Heanue et al., 1999; Li et al., 2003; Parker et al., 2003; Ridgeway y Skerjanc, 2001; Sordella et al., 2003). Hipertrofia muscular La hipertrofia muscular es una respuesta adaptativa importante al ejercicio físico. Se sabe que la expresión estable de IGF-I en células C2C12 conduce a la hipertrofia de miotubos diferenciados y a una transición hacia el metabolismo glucolítico. El IGF-I produce un aumento en el calcio intracelular, activa a la fosfatasa calcineurina e induce la translocación al núcleo del factor de transcripción NF-ATc1 (Semsarian et al., 1999). 3. IV. ANTECEDENTES INMEDIATOS DEL PRESENTE TRABAJO EXPERIMENTAL Gracias al modelo in vitro de formación de músculo esquelético a partir de mioblastos C2C12 se han logrado describir las cascadas progresivas de señalización que conllevan a la génesis de músculo -así como la manera en que son reguladas-, ya sea durante el desarrollo embrionario, durante la hipertrofia muscular inducida por ejercicio, o bien, durante la regeneración muscular. Este modelo presenta las siguientes características con respecto a TGF-13 y a bFGF: Tanto TGF-13 como bFGF impiden que los mioblastos se diferencien, manteniéndolos en un estado proliferativo. Aunque el TGF-13 inhibe etapas tempranas de la diferenciación miogénica, si en mioblastos se bloquea su vía de señalización -mediante la sobreexpresión de un receptor 11 con actividad dominante negativa- y luego se induce la diferenciación de los mismos, la formación de miotubos nunca acontece, de lo cual se desprende que la vía de señalización del TGF-I3, una vez disparado el proceso de diferenciación, es indispensable para permitir que los mioblastos pasen a ser miotubos (Filvaroff et al., 1994; Zentella y Massagué, 1992), y por lo tanto, TGF-13 tiene efectos tanto positivos como negativos en este sistema de diferenciación celular (ver las páginas 54-56 para una descripción más a fondo de este papel dual). Durante el proceso de conversión, cambia el nivel de expresión de algunos proteoglicanos; de los que regulan la unión de TGF-I3, aumenta el de decorina -de sulfatos de condroitina y dermatano- (Brandán et al., 1991); mientras que de los que favorecen la señalización por bFGF -de sulfatos de heparano-, disminuye el de sindecano 1 (Larraín et al., 1997a; Larraín et a/. , 1998), el de sindecano 3 (Fuentealba et al., 1999) y el de perlecano (Larraín et al., 1997b), a la vez que aumenta el de glipicano (Brandán et al., 1996). No todos los proteoglicanos sufren cambios en su expresión durante el proceso de conversión, y a manera de ejemplo, tenemos uno de 250-310 kDa de sulfatos de condroitina y dermatano (que no es decorina) (Brandán et al., 1991). Pero, ¿cuál es la relevancia fisiológica de las fluctuaciones en los niveles de estos proteoglicanos? Múltiples observaciones sugieren que estas variaciones modulan tanto el momento preciso 58 en que se dispara la miogénesis como los eventos subsecuentes que conducen a ella, dada su capacidad para regular la señalización por TGF-J3 y bFGF. Al monitorear la expresión de los receptores de TGF-J3 usando como sonda 1251_ TGF-J3 en mioblastos y en miotubos C2 (no C2C12) extensamente diferenciados, se observa que los miotubos pierden la expresión de los receptores de TGF-J3 - incluyendo la del betaglicano- (Hu y Olson, 1990). Durante la miogénesis, aumenta drásticamente la expresión de TGF-J33 y menos notoriamente la de TGF-J32, a la vez que disminuye la de TGF-J31 (Lafyatis et al., 1991). Siendo el betaglicano un correceptor de TGF-J3 (y tal vez también de bFGF, dado que aunque no se ha determinado si el betaglicano favorece la interacción de bFGF con sus receptores de señalización FGFRs, lo une a través de sus glicosaminoglicanos), y considerando que ambos factores de crecimiento son reguladores importantes de la miogénesis -requiriéndose una vía intacta de señalización de TGF-J3 para que la conversión miogénica ocurra-, nos propusimos estudiar la regulación de la expresión del betaglicano y estimar la posible función de éste durante la formación de músculo esquelético in vitro. 4. Hipótesis "En mioblastos esqueléticos experimentando diferenciación terminal a miotubos, fluctúa (se induce o se reprime) la expresión del betaglicano; esta fluctuación comienza a nivel transcripcional y la regulan factores transcripcionales del programa de la miogénesis esquelética." 5. 1. Objetivos generales del trabajo experimental i. Determinar si fluctúa el nivel de expresión de betaglicano a lo largo de la diferenciación miogénica en células C2C12. ii. Conocer la estructura del promotor del betaglicano murino. iii. Determinar reguladores de la expresión del betaglicano. 5. 11. Objetivos particulares del trabajo experimental i. Determinar si en el transcurso de la conversión miogénica de células C2C12 varía la expresión del betaglicano en la superficie celular, teniendo esta variación su origen a nivel transcripcional (para tal fin, medir a distintos tiempos los niveles del proteoglicano, de la proteína, del ARNm y de la actividad del promotor del gen del betaglicano). ii. Clonar la región promotora del betaglicano, conocer su secuencia nucleotídica e identificar sitios probables de regulación en cis. iii. Detectar probables reguladores en tfans del promotor del gen del betaglicano. 59 6. Resultados 1. El nivel del proteoglicano del betaglicano aumenta durante la miogénesis Con el propósito de saber si la expresión del betaglicano fluctúa a lo largo del proceso de la miogénesis, se monitoreó en la superficie celular la expresión de este proteoglicano a los O, 2, 4 Y 6 días de diferenciación miogénica de mioblastos C2C12. Al día O las células son mioblastos propiamente, dado que están en un medio de crecimiento que permite su proliferación e impide su diferenciación. Para disparar la diferenciación a miotubos, el medio de crecimiento se retira y se sustituye con uno que induce la diferenciación, y así, durante los siguientes días, los mioblastos maduran hasta convertirse finalmente en miotubos, pudiéndose observar miotubos desde los 3- 4 días de diferenciación. Las células fueron marcadas por afinidad con 1251-TGF-J32, el cual se une sólo a sus receptores localizados en la membrana celular. Posteriormente, se analizó el extracto proteico total o la fracción inmunoprecipitada - con un anticuerpo específico contra betaglicano- en un gel de acrilamida. Se halló que los mioblastos prácticamente no unen 1251-TGF-J32, pero esta situación cambia drásticamente conforme se van diferenciando (figura R1). Así, al día 2 la unión de TGF-J3 al betaglicano ya es considerablemente mayor con respecto al día O, pero la mayor se tiene al día 4, aunque al día 6 decae, pero no al nivel del día o. Cabe señalar que se observa un retraso en la movilidad del betaglicano del día 4 en relación al 2, lo cual refleja una mayor glicanación del proteoglicano al día 4. La mayor unión de TGF-J32 al betaglicano durante la miogénesis podría deberse a que la cantidad de betaglicano esté aumentando durante la diferenciación muscular; a que otras proteínas que unen TGF-J3 estén dejando de hacerlo (como en el caso de la decorina, el proteoglicano más abundante en la matriz extracelular de músculo y cuya expresión fluctúa durante la miogénesis, tesis doctoral de la Dra. Cecilia Riquelme, Universidad Católica de Chile, 2001), permitiendo que otras proteínas lo hagan, entre ellas el betaglicano; etc. Para ver si opera el primer mecanismo, el lisado celular del día O y del día 4 de diferenciación miogénica fue sometido a un tratamiento con condroitinasa ABC y heparitinasa, fraccionado en un gel de acrilamida, transferido a nitrocelulosa y analizado mediante westem blot con un anticuerpo diferente del que se usó para la inmunoprecipitación. Suponiendo que la digestión con estas glicanasas haya sido completa, la cantidad de proteína desnuda del betaglicano aumenta claramente al día 4. No se hizo inmunoprecipitación y luego western blot porque no se consigue una tasa buena ni uniforme de transferencia de las diferentes especies de betaglicano glicanado del gel a la membrana de nitrocelulosa. En la parte de abajo de la figura R1 se muestra un análisis densitométrico del nivel de expresión del proteoglicano del betaglicano a lo largo de la miogénesis. El nivel relativo de unión de TGF-J3 al proteoglicano del betaglicano es: día O (DO): 1X (valor basal); 02: 16X (dieciséis veces el valor basal); 04: 21X; 06: 10X. Como referencia, se muestra el aumento en expresión que la cinasa de creatina experimenta durante la formación de miotubos. 2. El nivel del ARNm del betaglicano aumenta durante la miogénesis Una vez hallada una mayor expresión del proteoglicano del betaglicano en la superficie celular de los miotubos en formación, se decidió explorar si ésta se correlaciona con un nivel mayor del ARNm de este proteoglicano, dado que, comúnmente, cuando se eleva un ARNm cualquiera, también se eleva la proteína que 60 a o 2 4 6 o 2 4 6 [días] O 4 [kDa] ] BG 194- 120- 120- ~BG desglicanado 87- 64- . Total IP b 16 14 U) as 12 • .-4 ... as ... 10 ..., • .-4 .c ... 8 as U) QJ "O 6 as "O • .-4 c:l 4 ::> 2 O O 2 4 6 Días de diferenciación BG: betaglicano; CK: cinasa de creatina Figura R1. Durante la miogénesis, la unión de TGF-~2 al proteoglicano del betaglicano se incrementa debido al menos en parte a una mayor síntesis del betaglicano. a, Se monitoreó la unión de TGF-~2 a sus receptores de la superficie celular (Total) y al betaglicano (IP, Le., inmunoprecipitado) a los O, 2, 4 Y 6 días de diferenciación mediante marcado por afinidad con 1251_ 61 TGF-p2. También, se halló un aumento en la expresión del betaglicano al día 4 mediante wesfem blof (WB). b, Análisis densitométrico de la intensidad de los barridos del proteoglicano del betaglicano, y como referencia, el nivel de expresión de la enzima cinasa de creatina durante el mismo periodo (las unidades de esta enzima están dadas en [UI/mg ADN]). codifica, aunque el ARNm también podría haber estado teniendo una mayor tasa de traducción. Se extrajo ARN total de las células a los O, 2, 4 Y 6 días de diferenciación, los mismos en los que se monitoreó la expresión del proteoglicano. 10 Jlg de ARN total se fraccionaron electroforéticamente y se transfirieron a una membrana de nailon. Posteriormente la membrana se sondeó con el AONc de betaglicano murino proveniente de la construcción CII-2 (Ponce Castañeda et al., 1998). Como se observa en la figura R2, también el ARNm del betaglicano experimenta un aumento considerable durante miogénesis, aunque como se observa en el análisis densitométrico, no tiene un patrón de expresión correlativo al del proteoglicano. A los días O y 4, la expresión de proteína y ARNm es similar, pero al día 2, hay más proteína que ARNm y al día 6, esta situación se invierte. El nivel relativo de expresión del ARNm del betaglicano es: 00: 1X; 02: 6X; 04: 33X; 06: 24X. Cabe mencionar que una mayor cantidad de la proteína del betaglicano en la superficie celular no necesariamente tiene su origen en una mayor cantidad de su ARNm, debido a que pueden entrar en operación mecanismos adicionales de regulación como la tasa con la que la proteína es retirada de la membrana celular o degradada, e.g., en un momento dado, la proteína puede estar teniendo una menor tasa de recambio en la superficie celular y por eso haber más ahí. 3. En los miotubos, una parte de la población de las moléculas de betaglicano se transloca a la matriz extracelular El betaglicano se presenta de dos formas: una embebida en la membrana celular correspondiente a la forma insoluble y otra presente en el medio extracelular correspondiente a la forma soluble. Con el propósito de averiguar si el betaglicano permanece en la membrana celular una vez que comienza a producirse a gran escala al convertirse los mioblastos en miotubos, se estudió su distribución celular mediante inmunocitoquímica. La localización del betaglicano se infirió al tener como puntos de referencia la ubicación del perlecano, un proteoglicano sabidamente de matriz extracelular, y la de la miosina, una proteína motora que se desliza a través de filamentos de actina. Ambos proteoglicanos fueron sondeados en mioblastos y miotubos (de 6 días) vivos con anticuerpos primarios y éstos a su vez con anticuerpos secundarios acoplados al cromóforo de emisión verde isotiocianato de f1uoresceína (FITC). Las células luego fueron permeabilizadas con Tritón X-100 e incubadas con un anticuerpo contra la miosina, mismo que fue detectado con otro acoplado al cromóforo de emisión roja TRITC. Si la emisión verde proviene de la misma fuente que la roja, la emisión resultante es amarilla. En la figura R3 se muestra el patrón de distribución de las proteínas citadas; las imágenes de la fila de hasta abajo muestran el merge (fusión) de las respectivas dos imágenes de arriba, y como se puede ver, el betaglicano se localiza intensamente tanto en regiones discretas de la superficie de los miotubos (emisión amarilla) como en su matriz extracelular (emisión verde), en contraste con el perlecano, cuya localización prevalece sólo en la matriz extracelular. Sin embargo, algunos de los miotubos emiten únicamente la fluorescencia roja, lo cual 62 a b Q) ~ 12 fIl cQ 10 .... 1-4 ~ cQ 1-4 cQ 8 ..... ~ .... .... ..c fIl 6 1-4 ~ cQ Q) fIl ..... 4 Q) ~ ~ .... cQ 2 ~ .... ~ o ::;¡ o • . • iI ... .. 2 o 4 6 .. NB 2 [ días] <> BG: ",,5800 pb ] 28S: 4712 pb ] 18S: 1869 pb 4 6 Días de diferenciación Figura R2. El nivel del ARNm del betaglicano aumenta durante la miogénesis. a, 5e monitoreó la expresión del ARNm del betaglicano a los 0, 2, 4 Y 6 días de diferenciación mediante northem blot (NB) usando como sonda el ADNc del betaglicano murino. b, Análisis densitométrico de la intensidad de las bandas del ARNm de betaglicano, en conjunción con las del proteoglicano. La longitud precisa del ARNr murino 285 fue averiguada en Hassouna et al., 1988 Y la del 185 en Raynal et al., 1984. 63 Figura R3. Translocación de una porción del betaglicano a la matriz extracelular en miotubos. Se determinó la localización celular del betaglicano en células C2C12 en fase de mioblastos (A , O Y G) o dejadas diferenciar por 6 días (B, C, E, F, H e 1) . Las células sin permeabilizar fueron incubadas con anticuerpos a-betaglicano (O y E) ó a-perieca no (F) . Luego se incubaron con un anticuerpo secundario acoplado a isotiocianato de fluoresceína (FITC) (emisión verde). Las mismas células fueron permeabilizadas e incubadas con anticuerpos a-miosina (G- I) y posteriormente con un anticuerpo secundario acoplado a (TRITC) (emisión roja). Las imágenes de 64 la fila inferior resultan del merge (fusión) de las imágenes de sus respectivas columnas de las dos filas superiores. Así, las imágenes J, K Y L corresponden a la fusión de las imágenes D+G, E+H Y F+/, respectivamente. La emisión amarilla surge de la conjugación de las emisiones roja y verde. El betaglicano se localiza en la superficie de los miotubos y en su matriz extracelular. Los campos fueron fotografiados e impresos bajo condiciones idénticas. Las imágenes de contraste de fases se muestran en la fila superior (A-C). La barra representa una longitud de 50 Ilm. sugiere que no están expresando betaglicano en su superficie. El hecho de haber hallado una mayor expresión del betaglicano en los miotubos que en los mioblastos concuerda con el resultado del westem blot mostrado en la figura 1 a; no obstante, también es cierto que en dicho westem blot no se observó una banda que pudiera corresponder al betaglicano que se ha ido a la matriz extracelular, intuitivamente de menor masa molecular en vista de ser generado presuntamente por un corte proteolítico del betaglicano embebido en la membrana; esto se puede deber a que las correspondientes bandas no se hayan resuelto bien en el gel de acrilamida en el que fueron electroforadas, dado que la diferencia en su movilidad relativa es mínima: 120 kOa del betaglicano transmembranal versus 110 kOa del betaglicano soluble (comunicación personal de la Dra. Gabriela Velasco Loyden en el 2005). 4. Clonación y secuenciación del promotor del gen del betaglicano murino El incremento de la cantidad de ARNm de betaglicano durante la formación de miotubos (figura R2) puede tener su origen en una mayor estabilidad del ARNm (i.e., que se degrade menos) y/o en una mayor transcripción del gen del betaglicano. Para dilucidar si opera el segundo mecanismo -habiendo postulado que sería el más probable-, se decidió clonar la región promotora del gen para el posterior análisis de su actividad durante la miogénesis. Como antecedente, en nuestro laboratorio fue clonado el AONc del betaglicano murino, cuya molécula completa está contenida en la construcción CII-2 (Ponce Castañeda et al., 1998). El AONc completo del betaglicano -de 3977 pb, liberado con EcoRI de dicha construcción- se mandó a la compañía Research Genetics en Huntsville, Alabama, Estados Unidos, para que usado como sonda sirviera para identificar clonas de AON genómico de ratón que posiblemente contuvieran al promotor del betaglicano. Para hallar dichas clonas, se tamizó la biblioteca CT7, compuesta por cromosomas artificiales bacterianos (BACs, de bacterial artificial chromosomes). Éstos, a su vez, están integrados por fragmentos de -130 kb de AON genómico de ratón macho de la cepa CJ7/129Sv, ensamblados en el vector pBeloBAC11 -derivado del factor F de Escherichia coli (E. colt)-. Fueron 8 clonas las que dieron una señal intensa de hibridación. Una vez que recibimos en nuestro laboratorio microtubos (stab cultures) con bacterias E. coli OH10B transformadas con las 8 clonas de BACs, las bacterias fueron estriadas en LB con agar y cloranfenicol a 12.5 J..I.g/mL y de la plétora de colonias se reestriaron 10 de cada clona de BACs. Se hizo una hibridación de las 80 colonias individuales usando como sonda el AONc del betaglicano para comprobar que realmente fueran positivas y para contar con poblaciones clonales, sólo que esta vez se usó la sonda fragmentada en tres partes: un juego de las 8 colonias se sondeó con el tercio 5' del AONc, otro con el tercio medial y otro con el tercio 3' (ver siguiente figura y "procedimientos experimentales") . 65 San EcoRI 5'-NT Pvull Xhol _ ___ ( _______ ~~~i~~ _ ~i ~ ~~~ra Xbal EcoRI 3'-NT i: :: ... ~------------------~ , - -- Tercio 5' Tercio 3' - -- i :: Tercio medial 190 pb ~ : i ~ i :j 808 pb Pe 1 8 ~' " ~ - PL4 Mapa esquemático del ADNc del betaglicano murino. El segmento EcoRI-EcoRI es de 3,977 pb Y corresponde al ADNc completo del betaglicano de ratón, contenido en la construcción CII-2. Se ilustra además el origen de las sondas tercio 5', tercio medial y tercio 3', el de los fragmentos de 190 y 808 pb, así como el de los oligos Pe18 y PL4. La caja representa región codificante, y la barra, regiones no traducidas. De las colonias que dieron señal positiva de hibridación se seleccionó una de cada clona de BACs y con ésa se siguió trabajando en lo subsecuente. Observamos que con cada una de las sondas se obtiene una señal positiva de hibridación, lo cual sugiere que se tiene el gen completo. Para saber si teníamos la región promotora del gen, decidimos fragmentar la sonda del tercio 5'. Para tal fin, se digirió el tercio 5' - que abarca del sitio EcoRI al Xhol- con Sall y Pvull para generar dos segmentos: uno de 190 pb (Sa/l-Pvull , bases 16 a 205 del ADNc -segmento que sólo abarca región no traducida-) y otro de 808 pb (Pvull-Xhol , bases 206 a 1,013 -segmento que abarca una parte de la región no traducida y una de la codificadora-). Ambos segmentos fueron subclonados en el vector pBlueScript 11 KS(+) (pBSII-KS(+), Stratagene) y la identidad de los insertos fue comprobada mediante digestión y secuenciación. Cuando estos fragmentos se usaron para sondear las colonias, observamos que aunque la sonda de 808 pb daba señal de hibridación, la sonda Sa/l- Pvull de 190 pb (región 5' no traducida, 5'-NT) no la daba. Este resultado indicó que ninguna clona de las que nos habían enviado de Research Genetics contenía la región promotora. Por tal motivo, se les mandó ahora la sonda de 190 pb (región 5'-NT) y nos volvieron a enviar 8 nuevas clonas BAC, de la biblioteca murina RP22, construida por Kazutoyo Osoegawa (Osoegawa et al., 2000). Esta biblioteca es de ADN genómico de bazo de ratón hembra de la cepa 129S6/SvEvTac digerido parcialmente con EcoRI y metilasa EcoRI ; está inserta en el vector pBACe3.6 en los sitios EcoRI y su hospedero es la cepa DH10B. Según la información que nos proporcionaron sobre las clonas, su estabilidad es alta y su quimerismo es de no existente a bajo. El tamaño promedio del inserto de cada clona es de 154 kb. En la tabla 11 se indican los nombres asignados por Research Genetics a las clonas nuevas y los nombres que les dimos en el laboratorio para su más fácil identificación, así como la clona aislada -a partir de una población heterogénea- con la que se siguió trabajando (se les designó clonas BACp, la "p" es de promotor). 66 Al igual que con los BACs iniciales -que no contienen la región promotora-, se aseguró la obtención de poblaciones clonales de los BACps, sólo que esta vez se sondearon 12 colonias aisladas (en vez de 10, como en el caso de los BACs iniciales) de cada clona BACp con la región 5' -NT de 190 pb. De las que dieron señal positiva de hibridación, se eligió solamente una colonia de cada BACp para su análisis; sus denominaciones se muestran en la tabla 11. Con la finalidad de encontrar un fragmento -que presuntamente contuviera al promotor- de tamaño adecuado para su clonación y análisis, se hicieron midipreps de las 8 clonas BACp aisladas. Se digirieron con Hindlll o con Xhol 10 J.lL de las midipreps de BACps y los productos digeridos se separaron en un gel de agarosa al 1.2%, se transfirieron a una membrana de nailon y se procedió a hacer la hibridación con el fragmento correspondiente a la región 5'-NT. 3 Bandas fueron las que se hibridaron en la digestión con Hindlll : una de 6,440 pb, otra de 7,460 pb Y otra de 3,870 pb (figura R4). Los productos de digestión que obtuvimos con Xhol son relativamente más difíciles de clonar con respecto a los de Hindlll-debido al mayor tamaño de aquéllos-, por lo que decidimos seguir trabajando con los fragmentos generados por Hindlll. Para caracterizar las bandas más finamente, procedimos a sondearlas con oligos. Se sintetizó el oligo Pe30 (de 30 nucleótidos en contrasentido; bases 126 a 155 del ADNc de betaglicano murino, pertenecientes a la región 5'-NT y diseñado para luego hacer experimentos de primer-extension) y con él se intentó hibridar. La hibridación usando condiciones para sondas de ADN de doble cadena no permitió obtener señal alguna de hibridación. Por este motivo, procedimos a hacer una hibridación usando condiciones para oligos. Esta estrategia también resultó ser infructífera. Al hacer un análisis energético de este oligo, se encontró que su secuencia favorecía la formación de estructuras secundarias y dímeros, pero la razón fundamental por la que este oligo no se hibrida -que después descubrimos-, es que en el ADN genómico, su secuencia complementaria está partida a la mitad por un intrón. A continuación, se hizo una hibridación con el oligo PL4, que está a pocos nucleótidos corriente abajo desde donde inicia la traducción del ADNc (20 bases: 251 a 270 del ADNc). La hibridación con el oligo PL4 marcó las bandas de -7.5 (e.g., BACp1.7) y de -3.9 kb (e.g., BACp7.10), pero no la de -6.5 kb (figura R4). Puede ser que haya un dimorfismo en la región aledaña al exón 2, el del inicio de la traducción, dado que el oligo 32p_PL4 marca la banda de -7.5 kb en algunos BACps y la de -3.9 kb en otros (de los digeridos por Hindlll), a la vez que se hibrida con una banda de -17.3 kb o de -9 kb 67 'U ,S 1: 23,130 9,416 6,557 4,361 2,322 2,027 2,322 2,027 Gel de agarosa al 1.2% Región S'-NT I ! .. 1 ... . '. .-... ;' PL4 • .' . " " ;" ./ • . ~ - Pe18 7,460 6,440 3,870 17,330 15,900 8,990 Figura R4. Patrón de digestión de los BACps e identificación de fragmentos de digestión en donde se localiza el promotor. Las clonas BACp1 a 8 fueron digeridas con Hindlll o con Xhol; los fragmentos generados fueron resueltos en un gel de agarosa al 1.2%, transferidos a una membrana de nailon, y sondeados con la región 5'-NT, el aligo PL4 y el oligo Pe18. En los flancos de los BACs digeridos está el marcador de peso molecular )"-Hindlll, 1 Ilg a la izquierda y -100 ng a la derecha, este último marcado con 32p y señalado arriba del carril con un asterisco. 68 (de los digeridos por Xhol). Posteriormente se diseñó el oligo Pe18 -esta vez usando el programa computacional "Oligo"-, de 18 bases y en contrasentido; la primera base de su extremo 5' se localiza a 127 pb corriente arriba de la adenina del codón de inicio de la traducción. La hibridación con este oligo marcó solamente la banda de -6.5 kb, sin marcar las bandas de -7.5 ó de -3.9 kb (figura R4). De este modo, concluimos que la región 5' no traducida está distribuida en el ADN genómico en dos exones, dado que en el ADNc no hay ningún sitio Hindlll entre las secuencias de Pe18 y PL4. Se eligió al BACp7.10 para clonar de ahí al promotor. La banda Hind III-Hindll I de -6.5 kb se clonó en el sitio Hindlll del vector pBR322pl (provisto por la Dra. Kornelia Polyak del Dana-Farber Cancer I nstitute) , un vector de bajo número de copias que evita pérdidas eventuales de insertos grandes, como el de -6.5 kb. La estrategia para obtener el segmento de 6.5 kb fue ligar todos los fragmentos del BACp7.10 generados por Hindlll en pBR322pl, transformar bacterias y tamizarlas para detectar las que hubieran capturado el segmento de 6.5 kb. En el tamiz se detectó que las colonias que en las membranas ocupaban las posiciones B70, B94, C63, 019 y 029 dieron señal positiva de hibridación (figura R5a) . Para verificar la presencia e integridad del inserto de 6.5 kb en dichas colonias, sus plásmidos se digirieron con Hindlll y luego se corrieron en un gel de agarosa. Como se puede ver en la figura R5b, el inserto de 6.5 kb no venía solo en las construcciones en el vector pBR322pl, sino que durante el proceso de ligación se insertaron segmentos Hindlll-Hindlll intrusos. Los productos de digestión se analizaron por southem blot con el oligo Pe18 y como era de esperarse, la banda de 6.5 kb dio señal positiva de hibridación (figura R5c). Posteriormente, se secuenció el inserto de 6.5 kb con el oligo Pe18 y se encontró que la secuencia de nucleótidos era la esperada dado que se obtuvo la secuencia que hay corriente arriba del oligo en el ADNc. Se eligió trabajar en lo subsecuente con la clona de la posición B70 (figura R5). El inserto de 6.5 kb se transfirió al vector pBSII-KS(+), de mayor número de copias y con más sitios de restricción en su multic/oning site para librarlo de los fragmentos Hindlll-Hindlll invasores; la construcción pBSII-KS(+): :inserto de 6.5 kb también se denominó B70. Con el fin de obtener información sobre la estructura del segmento de 6.5 kb, se decidió obtener fragmentos traslapados de él, secuenciarlos y luego ensamblarlos para conocer su estructura global. Se digirió con las endonucleasas de restricción que cortan al vector una sola vez en el sitio de multiclonación: Apal, BamHI, BstXI , Glal, EcoRI, EcoRV, Hindlll, Kpnl, Pstl, Sacl, Sall, Xbal y Xhol y se observó que no posee sitios de restricción G/al, EcoRV, Sa/l ni Xhol. En el gel en el que se vieron los fragmentos generados, se recuperaron aquéllos con un tamaño mayor de 2961 pb, dado que el vector pBSII-KS tiene 2961 pb; por lo tanto, en cada uno de los distintos carriles, una banda de >2961 pb debía constar de vector más una fracción del inserto de 6.5 kb. Se procedió a autoligar dichos fragmentos y a transformar en Escherichia coli DH5a. los productos de ligación. Algunos fragmentos generaron colonias resistentes a ampicilina y se recuperó el plásmido de 2 colonias de cada reacción de ligación. Los fragmentos así generados sirvieron para secuenciar el inserto con los oligos T3 Y T7, cuyos sitios están presentes en el vector a los flancos del inserto. Con esta estrategia y con el diseño de oligos sintetizados conforme se obtenía más secuencia, se obtuvieron subsecuencias que al final fueron ensambladas para tener la secuencia completa del segmento de 6.5 kb, cuya estructura se ilustra con detalle en la figura PE1 (de procedimientos experimentales en la página 110). 69 [pb] 6,557 -: 894 870 =0. -N b "UN .SM l:a::O...-..rMMO)O) __ al 1'- 1'- O) 10 "'22'''2221 EN ;" , ,,,,, ,,, ,, pGL3-B ex6n 1 luciferasa del BG Figura R8. Construcciones del promotor del betaglicano - luciferasa. El número de bases que se indica debajo de cada construcción hace referencia a la extensión desde el sitio Hindlll, BamHI ó EcoRI hasta el sitio Notl. El vector en el que se insertaron dichos segmentos del promotor del BG es pGL3-Basic (pGL3-B). 6. El promotor del betaglicano tiene un nivel de actividad contrastante en células Rat-1 versus L6Es Endógenamente, los mioblastos de rata L6E9 sintetizan muy poco ARNm de betaglicano, mientras que los fibroblastos de rata Rat-1 sintetizan mucho ARNm de betaglicano (López Casillas et al., 1991). La construcción HN fue la que se usó para los experimentos subsecuentes y es a la que en lo subsecuente se conoce como pBG- Lux. La construcción pBG-Lux se transfectó en ambas líneas celulares y se observó que la expresión de luciferasa era muy baja en las células L6E9 y muy alta en las células Rat-1 (figura R9). Los niveles contrastantes de actividad del promotor en estas dos líneas celulares concuerdan con sus correspondientes niveles de expresión del ARNm de betaglicano. 7. La actividad del promotor del betaglicano aumenta dramáticamente durante la diferenciación de los mioblastos C2C12 a miotubos Como se mencionó anteriormente, observamos que durante la diferenciación miogénica la cantidad de ARNm del betaglicano aumenta notoriamente. Para poner a prueba la hipótesis de que esta elevación se origina al menos en parte a una mayor transcripción del gen del betaglicano, transfectamos mioblastos C2C12 con la construcción pBG-Lux, con la pMygn-Lux (promotor de la miogenina en pGL3-B como control positivo) ó con el vector vacío pGL3-Basic (como control negativo), yen todos los casos con el plásmido pRL-SV40 -para normalizar la eficacia de transfección-. Las células se dejaron diferenciar por O, 2, 4 ó 6 días. En cada punto fueron lisadas las células y se midió la actividad de luciferasa. De este modo encontramos que la actividad del promotor del betaglicano, reflejada en la cantidad de luciferasa, aumenta gradual pero fuertemente durante la miogénesis (figura R10). Los valores de la luciferasa de luciérnaga fueron normalizados con los valores de la luciferasa de Renilla reniformis, cuya expresión está a cargo del promotor SV40. El aumento en la actividad del promotor del betaglicano es drástico al día 4 de diferenciación, siendo prácticamente de un orden de magnitud, mismo que se mantiene al día 6. Como 76 35 30 cu 70 ti) , ~ 60 p.. ....... .3 50 p.. "O 40 '" "O : ~ 30 .... u < 20 10 IX O o 2 4 6 o 2 4 6 Días de diferenciación Días de diferenciación pBG-Lux pMygn-Lux Figura Ri0. Incremento de la actividad del promotor del betaglicano murino en la miogénesis esquelética. Las células C2C12 transfectadas con el plásmido pBG-Lux (que contiene al promotor del betaglicano murino), con el plásmido pMygn-Lux (promotor de la miogenina en el vector pGL3-B) o con el vector vacío pGL3-B se dejaron diferenciar y la actividad de luciferasa se monitoreó en cuatro puntos temporales. La actividad relativa del promotor del betaglicano en cada día del proceso de diferenciación está indicada por los números seguidos de una X encima de las barras. Los valores de la luciferasa de luciérnaga (pLux) fueron normalizados a los de la luciferasa de Renilla (pRL-SV40). La transfección con el vector vacío pGL3-B dio valores promedio de O.59±0.05, 0.71±0.01, 1.32±0.03 y 1.94±0.11 unidades arbitrarias durante los días O, 2, 4 Y 6 de diferenciación, respectivamente. 78 punto de comparación, la actividad del promotor de la miogenina aumenta 40.8 veces al día 6 de diferenciación. Estos resultados sugieren que durante la miogénesis, la subida en los niveles del ARNm del betaglicano se debe al menos en parte a la elevación de la transcripción del gen del betaglicano, si bien es cierto que el ARNm podría también poseer una estabilidad mayor. Cabe mencionar que aunque el incremento de la actividad del promotor de la miogenina es más dramático que el del betaglicano durante la miogénesis, aun el aumento de 40.8X en la actividad del promotor de la miogenina al día 6 de diferenciación no llega a alcanzar en términos de unidades de luciferasa al aumento de 3.5X en la del betaglicano al día 2 de diferenciación. A pesar de que la construcción pBG-Lux despliega una actividad relativamente alta (en comparación con la construcción pMygn-Lux) en los mioblastos, en ellos el ARNm del betaglicano es prácticamente indetectable mediante northern blol, por lo que es posible que a la construcción pBG-Lux le hagan falta elementos represores que abatan el nivel basal de transcripción del gen endógeno en los mioblastos. 8. TGF-j3, ácido retinoico y butirato modulan la actividad del promotor en las células C2C12 La conversión de mioblastos a miotubos está estricta y negativamente regulada por TGF-j3, bFGF, HGF/SF y butirato; por su parte, el ácido retinoico promueve potentemente esta conversión, además de inducir el ARNm de miogenina (Halevy y Lerman, 1993); BMP2, si incide sobre mioblastos C2C12, induce su conversión reversible a osteoblastos (Katagiri el al., 1994), y en éstos, regula negativamente la expresión del betaglicano (Centrella el al., 1995); bFGF inhabilita la capacidad transactivadora de la miogenina (Li el al., 1992) e inhibe transcripcionalmente la expresión de myoD1 (Vaidya el al., 1989), y aunque también se pega a los sulfatos de heparano del betaglicano, no se ha descrito alguna relevancia fisiológica de ello (Andres el al., 1992). Habiendo observado que la inducción del betaglicano es concomitante al avance de la miogénesis, propusimos la hipótesis de que factores de crecimiento extracelulares que regulan el programa miogénico cuentan también con la capacidad de regular al gen del betaglicano. Como sustento a priori de esta hipótesis está el que las isoformas de TGF-j3 tienen como correceptor al betaglicano, en especial TGF-j32, por lo que parecía concebible que estos ligandos pudieran regular la transcripción del gen de su correceptor; además, se probaron las tres isoformas por la posibilidad de que alguna pudiera tener un efecto diferenciado. Aún más, el ácido retinoico aumenta la expresión del ARNm del betaglicano en osteoblastos (Nakayama el al., 1994); el butirato -además de ejercer otros efectos en los mioblastos- inhibe la actividad transactivadora de MyoD y de miogenina, dos factores de transcripción miogénicos maestros (Johnston el al., 1992); así que si lográbamos observar inhibición de la actividad del promotor del betaglicano por el butirato, podríamos sospechar que uno o ambos de los transactivadores maestros ejercían acciones directas o indirectas sobre el promotor del betaglicano. Los tratamientos hormonales se aplicaron a concentraciones ligeramente suprafisiológicas (en el caso de TGF-j3, 40 pM versus 20 pM, la fisiológica) y se dejaron actuar durante 24 horas; los resultados se muestran en la figura R11a. Así determinamos que TGF-j3, ácido retinoico y butirato tienen un efecto sobre la actividad del promotor del betaglicano. No así bFGF, HGF/SF ni BMP2. Como punto de referencia se muestra el efecto que tienen algunos de estos agentes sobre el promotor de la miogenina (figura R11b). 2 1.39X g 1X 1,01X 0,81X eS 0.62X 5 0.43X 04X 0,49% 0.4X S Ac ti vi da d pB G- Lu x/ pR L- SV 40 5 MC — TGF-P1 TGF-P2 TGF-P3 bFGF BMP-2 HGF/SF — AR MD AR — Butirato 6 e d MC MD 5 > Al E =- l. E =0 = Du 3 E 2 ú < 0.03X MC TGF-B1 AR MD AR Butirato 6 e $ MC MD Figura R11. Modulación de la actividad del promotor del betaglicano por diversos agentes. Los mioblastos C¿C+, fueron crecidos en medio de proliferación y transfectados con el promotor del betaglicano fusionado con la luciferasa (pBG-Lux) (a) o con el plásmido pMygn-Lux (b). Posteriormente se les aplicó el agente indicado y se dejó actuar durante 24 horas, para luego lisar las células y medir la actividad de luciferasa. MC: medio de crecimiento; TGF-B1, -B2, -P3: transforming growth factor-81, -P2, -B3;, bFGF: basic fibroblast growth factor, BMP-2: bone morphogenetic protein-2; HGF/SF: hepatocyte growth factor-scatter factor, AR: ácido retinoico; MD: medio de diferenciación. Las 3 barras de la extrema derecha corresponden a células en medio de diferenciación. Concentraciones usadas: TGF-fs: 40 pM (1 ng/mL); bFGF: 3 ng/mL; BMP-2: 1 nM; HGF/SF: 3 ng/mL; AR: 1 uM; butirato: 2 mM. 80 a w,-------------------------------------------------------, 70r-----------------------------------~~~--------------~ ~ 60 r---------------------------------- ~ ~ ~50r_------------ ---- ----------------- i '7 40 r_------------------------:------------ ~ Po. ""30 ~ :E t:l 20 <: 10 e E!l F-In b 1.8 1.6 o ~ 1.4 ~ Po. 1.2 'ª 1.0 ....¡ d 1>0 ~ 0.8 Po. "" oS 0.6 "" .;;: °E 0.4 : 0.2 0.0 TGF - ~2 TGF-~3 F B P-2 F/SF e e F-pl R D al al e R MD R utirato E!l E!l D . R urirare al D i ra 1. odulación e ti i d el otor el t gli no or i rsos entes. s ioblastos 2 12 r n i s edio r li i n ra t os n l otor el t gli o o o n i a -Lux) ) n l l ido ygn-Lux ) . ost ri ente li l ente i o jó t ar r nte ras, ra u o is r l l s edir ti d i sa. C: edio i iento; TGF-~1, -~2, -~3: ra i g r th t r-p1, p2, p3; F: sic ib l st r th t r, P-2: ne orphogenetic r t in-2; F/SF: patocyte r th t r- ca ter t r, : i o t i o; D: edio i ci ción. s rr s t a r cha den l l s edio i ci ción. oncentraci nes adas: TGF-~s: / L); F: / L; P-2: ; F/SF: / L; : ~M; utir to: M. 9. En búsqueda de elementos en trans que regulen al promotor del betaglicano El butirato de sodio inhibe específicamente las funciones transactivadoras de MyoD y de miogenina -no su capacidad para unirse al ADN, siendo necesario su dominio bHLH para ser blanco de tal inhibición-, aunque sus efectos en las células no se restringen a esos dos, sino que también inhibe desacetilasas de histonas, conduciendo a la hiperacetilación de las histonas (Johnston et al., 1992). Habiendo visto que el butirato tiene un efecto inhibidor sobre la actividad del promotor del betaglicano, decidimos explorar si alguno de los transactivadores bloqueados por el butirato -MyoD y miogenina- podía transactivar al promotor del betaglicano. Para tal fin, se cotransfectaron mioblastos C2C12 con los plásmidos pBG-Lux o pMygn-Lux y un plásmido de sobreexpresión solo (pEMSV), con el ADNc de MyoD (Davis et al. , 1987) o con el ADNc de miogenina (Wright et al., 1989). El experimento de cotransfección indicó que MyoD aumenta la actividad del promotor del betaglicano 3 veces y miogenina 1.5X (figura R12). El análisis teórico de los sitios de unión de transactivadores demuestra que hay 2 sitios potenciales de unión de MyoD (figura R7c y anexo 1). Acordemente, al parecer no hay sitios de unión de miogenina en el promotor. Como se puede ver, aunque ambos promotores responden a TGF-~, a ácido retinoico y a butirato en la misma dirección (positiva o negativa), la magnitud del efecto es contrastante: el promotor de la miogenina resulta ser mucho más sensible ante estos agentes. No obstante, la actividad de ambos promotores difiere cuando los mioblastos son puestos en un medio bajo en suero: mientras que la del betaglicano se cae, la de la miogenina sube. Esto sugiere que en los mioblastos, la actividad basal del promotor del betaglicano está sostenida por factores séricos. De nuevo, aunque MyoD sólo aumentó -3X la actividad del promotor del betaglicano, hay que tomar en cuenta que la actividad del promotor en condiciones basales era de por sí alta. Desde un punto de vista personal, me permito hacer la siguiente analogía: el promotor de la miogenina es como un parcela ~ que da 1 zanahoria a la semana, mientras que el promotor del betaglicano es como una parcela y que da 20 por semana. Ante la aplicación de un fertilizante (MyoD) , la parcela ~ que daba 1 zanahoria semanal llega a dar 27 (27 veces de aumento), pero la parcela y que daba 20 llega a dar 60 (3 veces de aumento). Así, aunque las veces que aumenta el rendimiento de la parcela y (betaglicano) sean menos que las de la parcela ~ (miogenina), el rendimiento neto de la parcela y es mayor. Tendríamos una situación semejante si consideramos que el fertilizante es la diferenciación miogénica. 10. En mioblastos, el betaglicano presenta TGF-13 a sus receptores de señalización Para tener una idea de la posible función que el betaglicano desempeña una vez que se empieza a producir abundantemente cuando inicia el proceso de diferenciación miogénica, se transdujeron mioblastos con adenovirus que expresan betaglicano silvestre (Adv-BG) de rata bajo el control del promotor CMV, y como control negativo, el adenovirus solo. Se halló que al estimular con TGF-13 a los mioblastos, aquéllos inducidos a expresar betaglicano tienen una mayor inducción del gen reportero p3TP- Lux -regulado por elementos de respuesta a TGF-~- (figura R 13). Aunque no se hizo el experimento inverso de suprimir la expresión del betaglicano -v.g., mediante ARN de interferencia-, los hallazgos sugieren fuertemente que en los mioblastos el betaglicano funciona como presentador de TGF-~ a T~RII. 81 14 12 o 10 > <1) ~ 8 ¡:,., --3 27.02X ¡:,., 6 'U os 'U '> .¡:: 4 u <: 2 IX O pBG-Lux pMygn-Lux > ¡:: c::l > ¡:: c::l <1) ~ ~ <1) ~ o ::s ::s >- + ::s ::s + ::s ::s , , ~ >-> > <1) <1) <1) ::s ::s ::s ::s + + + + Figura R12. Transactivación del promotor del gen del betaglicano por MyoD pero no por miogenina. Se cotransfectaron la construcción pBG-Lux o pMygn-Lux (como control positivo) y los vectores de sobreexpresión de los factores de transcripción MyoD, miogenina (Mygn), o sin inserto (MSV) en mioblastos C2C12 puestos en medio de crecimiento. 48 horas después de la transfección se lisaron las células para medir la actividad de luciferasa. MyoD aumentó la actividad del promotor del betaglicano -3X y miogenina -1 .5X. 82 a 14 b ~ > 12 el) PFU de Adv-BG / célula , ,....¡ p:: o 50 100 500 j 10 ,....¡ , 8 g: C'I') 116-Po. ~ BG .~ 6 ... tU ~ 4 97 -... •• '" tU '" : ~ 2 ... u < o 0.2 0.4 0.6 0.8 1 TGF-p2 [ng/mLJ Figura R13. Presentación de TGF-~ a sus receptores señalizadores a través del betaglicano en mioblastos. a, Se transdujeron mioblastos C2C12 con 100 unidades formadoras de placas (pfu)/célula de Adv-BG (cuadrados) o del vector vacío (círculos). Luego de 24 horas, los mioblastos fueron transfectados transitoriamente con los plásmidos p3TP-Lux y pRL-SV40. Después de ser transfectadas, las células fueron incubadas en medio de crecimiento por 24 horas y les fue añadido TGF-p2 en diferentes concentraciones; se escogió esta isoforma porque es la que más requiere de betaglicano para señalizar. Después de 24 horas, se lisaron las células y se les midió la actividad de ambas luciferasas. Los resultados muestran la media de dos experimentos independientes con muestras por triplicado. b, Mioblastos C2C12 fueron transducidos con cantidades crecientes de pfus/célula de Adv-BG. Luego de 48 horas se colectaron las células, se trató el extracto celular con heparitinasa y condroitinasa ABC y se determinó la expresión del BG mediante wesfem blof. La flecha indica la posición de la proteína sin GAGs del BG. No sabemos de qué proteína sea la banda que aparece por debajo de la del betaglicano en todos los carriles. 83 7. Discusión Aumento de la expresión del betaglicano durante la diferenciación de mioblastos C2C12 a miotubos Habiendo partido de la hipótesis de que el betaglicano estaría sujeto a regulación durante la conversión de mioblastos C2C12 a miotubos (un modelo in vitro de la formación de músculo esquelético), al igual que lo están otros proteoglicanos de los mioblastos C2C12, decidimos analizar si existían a lo largo de la miogénesis fluctuaciones en varios de los pasos que conducen a la biosíntesis del betaglicano. En el presente trabajo de tesis se describe que durante la diferenciación miogénica aumenta el nivel de expresión del betaglicano en la superficie celular y que una porción considerable de estas moléculas en la superficie celular es desplazada a la matriz extracelular. El incremento del betaglicano en la superficie celular se correlaciona con una mayor cantidad de su ARNm y con una mayor actividad del promotor de su gen, mismo que clonamos. Además, encontramos que también aumenta la unión de TGF-j3 al betaglicano durante la miogénesis. Es necesario aclarar que el aumento en la unión de TGF-j3 al betaglicano conforme avanza la miogénesis no podíamos adjudicarlo a priori a un incremento en la expresión del betaglicano en la superficie celular. En mioblastos C2C12 que no expresan decorina - debido a la transfección estable del ADNc de la decorina en contrasentido-, la unión de 1251_TGF_j3 al betaglicano es patentemente mayor que en los mioblastos silvestres (Tesis doctoral de la Dra. Cecilia Riquelme, Universidad Católica de Chile, 2001); por tal razón, era concebible que la falta de marcado por afinidad del betaglicano al día O de diferenciación se debiera a que la decorina -el proteoglicano más abundante de la matriz extracelular de músculo esquelético- estuviera uniendo un gran porcentaje de 1251_TGF_j3 y que por lo tanto se estuviera ensombreciendo la unión de 1251_TGF_j3 al betaglicano. Conforme transcurre la miogénesis, se modifica la producción de la decorina (Brandán et al., 1991), lo que podría hacer que durante dicho transcurso empiece a elevarse la unión de 1251_TGF_j3 al betaglicano. Así, decidimos simplemente analizar mediante westem blot la expresión de la proteína del betaglicano (habiéndole quitado los GAG s con heparitinasa y condroitinasa ABe) para averiguar si hay más cantidad de proteína del betaglicano en los miotubos y no solamente más unión de 1251_TGF_j3 al mismo en ellos: el resultado nos indicó que además de que los mioblastos producen betaglicano en cantidades bien detectables -lo cual fue sorprendente, dado que el marcado por afinidad había hecho sospechar que casi no se produce-, su cantidad sí es notoriamente mayor en los miotubos. No obstante, no podemos aseverar que la mayor producción de betaglicano en los miotubos sea la única causa de una mayor unión de TGF-j3 al betaglicano. En respaldo de que hay síntesis de betaglicano en los mioblastos está un artículo del laboratorio del Dr. Rik Derynck (Filvaroff el al., 1994), donde se observa en una figura que el betaglicano de mioblastos C2C12 une moderadamente 1251_TGF_j3, es decir, aun cuando no se ha inducido diferenciación. Sin embargo, en dicha figura sí se detecta la expresión de los receptores señalizadores del TGF-j3 Tj3RII Y rj3RI. ¿Cómo explicar esta incongruencia? Una explicación posible es que hayan usado una concentración más alta de 1251_TGF_j3 en el marcado por afinidad de los receptores (no mencionan qué concentración de 1251_TGF_j3 usaron) y/o que los mioblastos que utilizaron hayan estado muy confluentes. Para que la expresión de los genes musculares sea suprimida al máximo en presencia de suero, se requiere que las células estén a baja densidad (a menos del 20% de confluencia); a mayores densidades, los efectos del suero y del TGF-j3 se hacen menos evidentes, y en cultivos altamente densos, se dispara la expresión de 84 - - --------- marcadores de diferenciación miogénica debido a la diferenciación espontánea de una fracción de las células. Esto se debe al rápido consumo de los factores de crecimiento del medio (Lassar et al., 1989). En nuestros cultivos, en cambio, la confluencia de células no pasó del 70%. Como se puede sospechar al ver la figura 2A(-) de Filvaroff et al. de 1994, la medición de los receptores de TGF-p en la superficie la hicieron en cultivos de mioblastos C2C12 confluentes yeso es lo que pudo haber disparado la expresión del betaglicano. Sin embargo, existen dos artículos del laboratorio del Dr. Eric Olson con los cuales nuestro trabajo podría estar en contradicción. En ellos se reporta que la unión de TGF-p a sus receptores de la superficie celular TpRIII, TpRII Y TpRI disminuye una vez que mioblastos C2 (progenitores de los mioblastos C2C12) Ó LsA1 (de rata, parientes de los LsE9) se han diferenciado a miotubos (es interesante mencionar que en estos artículos se detalla que al contrario de lo que sucede en mioblastos, en miotubos la expresión de genes musculares ya es inmune a la inhibición por TGF-p; sin embargo, si se impide sólo la fusión de los mioblastos al añadir EGTA a su medio de diferenciación, la unión de TGF- p a sus receptores no decae y aunque se expresan normalmente genes musculares, siguen siendo blanco fácil de inhibición por TGF-p, de modo que la fusión viene acompañada de un bloqueo permanente de las acciones inhibitorias del TGF-p hacia los genes musculares; Ewton et al., 1988; Hu y Olson, 1990). Según sus hallazgos, la unión de TGF-p al betaglicano con GAGs disminuye un 40%, mientras que al betaglicano sin GAGs un 93%. Acordemente con lo observado en cuanto a TpRII y TpRI, la Dra. Cecilia Riquelme halló que la unión de 1251_TGF_p a estos receptores disminuye durante la miogénesis en mioblastos C2C12, no así la síntesis de TpRl, que muy por el contrario, sube. El Dr. Joan Massagué, por su parte, observó que TpRII y TpRI no pierden la unión de TGF-p en los miocitos LsE9 de rata durante la miogénesis (Massagué et al., 1986). Cabe mencionar que nosotros no pudimos detectar mediante marcado por afinidad a TpRlI1 sin GAG s (i.e., la core protein endógena del betaglicano), a TpRII ni a TpRI en mioblastos ni en miotubos. La disensión es entonces que, según el Dr. Olson, la unión de TGF-p al betaglicano disminuye, y según nosotros, aumenta durante la miogénesis. Estas observaciones discordantes sobre si la unión de TGF-p al betaglicano aumenta o disminuye durante la miogénesis se podrían explicar por diferencias en las condiciones de cultivo y al considerar que Olson empleó mioblastos C2 y nosotros C2C12. ¿Qué sustento se tiene para creer que el comportamiento de los miocitos C2C12 constituye un modelo más confiable de miogénesis que el de los C2? La respuesta estriba en que los mioblastos C2 no poseen propiedades de diferenciación altamente reproducibles, por lo que de ellos se aisló la población clonal C2C12, despojada de este defecto, además de que se diferencia rápidamente y produce extensamente miotubos contráctiles (Yaffe y Saxel, 1977). Por tal motivo, los mioblastos C2C12 son actualmente preferidos no sólo por encima de los C2, sino también de los Ls y Sol-8 para hacer estudios del proceso de miogénesis esquelética. En cuanto a las condiciones de cultivo, el grupo del Dr. Olson usó para sus mioblastos medio con suero de feto bovino al 20% y nosotros al 10% (con extracto de embrión de pollo al 0.5%); las condiciones para detonar la diferenciación también fueron distintas: mientras que su grupo empleó medio con suero de caballo al 10%, nosotros lo empleamos al 5%. Además, detallan haberles puesto medio con suero de feto bovino al 20% (con AraC) a sus cultivos de miotubos para eliminar a los mioblastos sobrevivientes, lo cual nosotros no hicimos. Otro detalle que podría ayudar a explicar las diferencias es que el grupo de Eric Olson midió los sitios de unión de TGF-p en mioblastos y en miotubos "extensamente" diferenciados (sin mencionar cuántos días llevaban en el medio de diferenciación), mas no durante el trance de un estadio al otro. 85 En cambio, nosotros sí determinamos el nivel de unión del TGF-(3 al betaglicano a lo largo del proceso de diferenciación y observamos que este nivel aumenta sin lugar a dudas y se mantiene alto al menos desde el día 2 hasta el 4, aunque al día 6, este nivel cae moderadamente, pero no por debajo del que había en mioblastos, como lo reporta el Dr. Eric Olson. ¿Por qué confiamos en que el aumento durante la miogénesis en la expresión del betaglicano es un evento fisiológico, quizá generalizable a músculo maduro normal y no un mero artificio de la línea celular C2C12? Porque determinamos que el factor de transcripción miogénico maestro MyoD, cuya actividad transactivadora de genes musculares se eleva durante la miogénesis, es capaz de regular positivamente la actividad del promotor del gen del betaglicano, lo cual conduce a elevaciones en su ARNm y proteína y a una mayor unión del TGF-(3 al proteoglicano. Además, en el artículo de Wang et al. de 1991 de la clonación inicial del ADNc del betaglicano, los autores examinan los tejidos de rata donde se sintetiza el ARNm del betaglicano y encuentran que lo hace fuertemente en músculo, lo cual sugiere que las miofibras in vivo sí expresan notablemente betaglicano en la membrana plasmática. Empero, es necesario decir que existe también la posibilidad de que la divergencia genética de los mioblastos C2C12 de los mioblastos silvestres de la pata de un ratón, de donde provienen, sea la responsable de la elevación en la expresión del betaglicano. La magnitud del aumento en los niveles de la actividad del promotor, la cantidad de ARNm y la cantidad de proteoglicano del betaglicano (suponiendo que la unión de 1251_ TGF-(3 al betaglicano refleje fielmente la cantidad de betaglicano en la superficie y en la matriz) no se correlacionan perfectamente a lo largo de la diferenciación miogénica. Esto probablemente se debe a que el ARNm y la proteína del betaglicano estén siendo objeto de mecanismos de regulación postranscripcional. En la literatura podemos ver casos semejantes de expresión dispar del ARNm versus la proteína: en el lóbulo intermedio de la hipófisis no se detecta la expresión del ARNm del betaglicano -intentada medir mediante hibridación in situ-, pero la tinción con el anticuerpo a-betaglicano revela una expresión intensa en el citoplasma de las mismas células (MacConell et al., 2002). Asimismo, aunque se observa que hay ARNm del betaglicano en células germinales testiculares, éstas no muestran inmunorreactividad hacia la proteína (MacConell et al., 2002; Lewis et al., 2000), lo cual podría atribuirse a una traducción lenta del mensajero, a una degradación rápida de la proteína o la liberación de una forma soluble del betaglicano. Una situación semejante se presenta en lipocitos hepáticos: al activarse como parte del proceso de regeneración hepática, expresan altísimas cantidades del proteoglicano del betaglicano con respecto a los hepatocitos quiescentes donde apenas es detectable, y sin embargo, éstos expresan 4 veces más de ARNm de betaglicano que aquéllos (Friedman et al., 1994). Es posible que al día 6 de diferenciación de los miotubos C2C12, donde hay menos ARNm de betaglicano con respecto al día 4, el ARNm esté siendo menos protegido de la degradación y por eso haya una menor cantidad, dado que la actividad del promotor al día 6 es tan alta como al día 4. Estructura y regulación de la actividad del promotor del betaglicano murino. Sitios ya mapeados en el promotor de rata, regulación por agentes y factores de transcripción, sitios potenciales detectados por Matlnspector. ¿Por qué es importante el estudio de un promotor, en general? El promotor de un gen contiene los elementos de control (elementos en "cis") que permiten que la transcripción del gen sea regulada por una plétora de estímulos. Por ejemplo, si observamos que una célula responde ante una hormona incrementando la cantidad del ARNm de cierto gen, 86 podemos inmediatamente sospechar que la hormona causa la llegada de un efector suyo -un factor de transcripción activado, elemento en "trans"- al promotor de dicho gen, lo cual ocasionaría eventualmente una transcripción mayor del gen al estabilizar en el promotor el ensamblaje del aparato basal de transcripción que contiene a la ARN polimerasa 11. Visto de una manera más global, el conjunto de elementos de control en el promotor es el medio que el gen tiene para saber en qué momento y en qué célula debe transcribirse, o bien, modificar su tasa de transcripción, y con ello atender los requerimientos de la célula. El patrón de manchas en las alas de Drosophila es un ejemplo interesantísimo de la importancia de la región promotora: mientras que la especie D. biarmipes tiene manchas -que sirven para atraer pareja-, D. melanogaster no, y la base genética reside en la adición de elementos en cis, incluyendo uno para el transactivador Engrailed, al promotor del gen de pigmentación yellow de D. biarmipes pero no al de D. melanogaster hace millones de años (Gompel et al., 2005). Otro ejemplo es la morfología del pico de diversas especies de pinzones de Darwin: existe la posibilidad de que los elementos de regulación en cis del gen de bmp4, presuntamente diferentes en cada especie de pinzón, sean los responsables de moldear la anatomía sui generis del pico de estas aves y quizá también el de otros géneros de aves (Abzhanov et al., 2004; Wu et al., 2004). El promotor del betaglicano de ratón presenta un alto nivel de homología con su contraparte de rata: globalmente, son idénticos en un 82%. El análisis de la secuencia del promotor basal murino, en gran parte por homología con el promotor de rata (Ji et al., 1999), indica que carece de cajas TATA y de cajas CCAAT, pero contiene dos sitios de unión del factor ubicuo Sp1 cercanos entre sí en una isla CpG. Probablemente también posea varios sitios de inicio de la transcripción, situación asociada con genes que no contienen cajas TATA ni CCAA 1. De forma semejante, los promotores de los genes de T13RI y de T13RII no poseen cajas TATA sino islotes CpG (Bae et al., 1995; Ji et al. , 1996). Los sitios Sp1 vecinos entre sí presumiblemente funcionan de manera cooperativa, formando complejos que inician la transcripción desde varios puntos (referencia 43 de Ji et al., 1999). Ji et al. reportan haber hallado elementos de respuesta a glucocorticoides en el promotor de rata en las posiciones -687 a -495 y -440 a -386, indicados en la figura R6: el primero, un sitio de unión de C/EBP, cuyo gen es estimulado por glucocorticoides, y el segundo, regulado en cooperación con otros transactivadores, dado que no posee sitios consenso de unión de glucocorticoides ni de C/EBP. A pesar de que Ji et al. (1999) no lo mencionan en su discusión, el sitio silenciador descubierto por ellos en el promotor de rata que comapea con una región de regulación negativa por BMP-2, se localiza en una zona donde hay un elemento de unión de Smad4 -dos en el promotor de ratón-. Es muy probable que el sitio de Smad4 sea a donde llegue un complejo efector de BMP-2 compuesto por Smad1, 5 u 8 con Smad4. Es posible que la supresión que nosotros observamos de la actividad del reportero pBG-Lux por TGF-13 -seguramente a través de Smad2 ó 3 con Smad4- conve~a también en este sitio. El análisis de la secuencia del promotor del betaglicano con el software Matlnspector versión profesional (Quandt et al., 1995) reveló que hay múltiples elementos putativos de regulación en cis a lo largo de todo el promotor. Entre éstos, algunos de los elementos en cis relevantes durante la miogénesis son: MyoD, MEF2, Smad3, Smad4 y RAR. Veamos qué agentes probados por nosotros pueden conducir a la regulación en trans de algunos de los elementos reguladores potenciales en el promotor del betaglicano. El ácido retinoico causa una elevación en la actividad del promotor del betaglicano en los mioblastos C2C12• Este hallazgo concuerda con que el ácido retinoico hace lo mismo pero 87 en osteoblastos (Nakayama et al., 1994). Los efectos del ácido retinoico en mioblastos C2C12 están mediados por el receptor X de retinoides (RXR) principalmente y por el receptor de ácido retinoico (RAR) secundariamente, encargándose cada uno al parecer de regular un subconjunto diferente de genes respondientes a ácido retinoico (Alric et al., 1998). El ácido retinoico induce miogénesis sólo en células que expresan MyoD, debido posiblemente a que MyoD y RXR interactúan física y funcionalmente en promotores de genes musculares (Froeschle et al., 1998). El promotor del betaglicano cuenta con sitios potenciales de unión tanto del RAR como del RXR, por lo que será interesante averiguar cuál de ellos regula al gen del betaglicano, si no es que los dos. TGF-J3, por su parte, causa una disminución en la actividad del promotor del betaglicano. Esto se puede explicar al menos en parte considerando que TGF-J3 induce la asociación de Smad3 -pero no de Smad2- con MyoD, impidiendo de esta manera que MyoD forme heterodímeros con E12 y E47 Y active enhancers de genes musculares pegándose a secuencias "E-box" (Liu et al., 2001). Así, es congruente que al recibir el mioblasto señalización por TGF-J3, la actividad de MyoD se inhiba y entonces disminuya la transcripción del gen del betaglicano, dado que MyoD promueve ésta. Asimismo, el TGF-J3 reprime transcripcionalmente a myoD1 (Vaidya et al., 1989), de modo que la inhibición que el TGF-J3 ejerce sobre MyoD es tanto a nivel transcripcional como a nivel postraduccional. Además, existe también la posibilidad de que la represión del promotor por parte de TGF- J3 sea directa. En contraste, en células gingivales humanas, TGF-J31 aumenta la cantidad del ARNm de betaglicano, mientras que el suero de becerro la disminuye (Worapamorn et al., 2001), justo al revés de como sucede en los mioblastos esqueléticos. Estos hechos ilustran cómo el gen del betaglicano responde de manera opuesta ante un mismo estímulo en células diferentes. Los autores recién citados, en concordancia con nuestros hallazgos, tampoco encontraron modulación por bFGF del gen del betaglicano. TGF-J31 incrementa los niveles del ARNm de betaglicano también en monocitos en cultivo (Lastres et al., 1996). Por otro lado, BMP-2 disminuye ligeramente la actividad del promotor, lo cual puede deberse a que este factor inhibe la expresión del ARNm de MyoD y promueve la del ARNm de Id1, un secuestrador de las proteínas E12 y E47, con quienes MyoD se heterodimeriza para transactivar (Katagiri et al., 1994). Nuestros experimentos de cotransfección indican que el factor de transcripción miogénico maestro MyoD aumenta 3 veces la actividad del promotor del betaglicano, mientras que otro factor maestro relacionado, miogenina, sólo es capaz de aumentar su actividad 1.5 veces. Los mioblastos LsEg no expresan MyoD1 (Heino y Massagué, 1990), y la posibilidad de que por esta causa no expresen betaglicano resulta factible. En lo que respecta a MyoD, empero, aún no sabemos si es un regulador en trans del promotor, pero tenemos indicios de que así es por la existencia de secuencias en cis en el promotor que cuadran casi perfectamente con la secuencia consenso de ADN a la que se pega MyoD. De todos modos, considerando que medimos la actividad del reportero 24 horas después de la cotransfección, existe la posibilidad de que MyoD regule a otro gen, ya sea positiva o negativamente, cuyo producto sea el que directamente regule en trans al promotor. Será interesante en un futuro usar versiones sucesivamente más cortas del promotor para determinar si a partir de alguna versión recortada se pierde la regulación positiva por MyoD, y mapear así grosso modo una región del promotor responsable de la estimulación por este regulador miogénico, situada en el segmento que perdió en relación con su antecesora inmediata que aún responde a MyoD. Sin embargo, luego habrá que mapear finamente la región y determinar si es MyoD quien directamente se pega a esa zona - mediante experimentos de retardo de la movilidad electroforética (EMSAs)-, dado que aún cabe la posibilidad de que sea esa región la secuencia efectora de otro factor de 88 transcripción regulado por MyoD. Luego habrá que mutar puntualmente la secuencia regulada por MyoD en el promotor y verificar que se pierda la estimulación que este factor ejerce. Entonces, de pegarse y transactivar al promotor, se podrá afirmar que MyoD es un regulador en trans del gen del betaglicano. En promotores de genes musculares -como el de la cadena ligera de la miosina, la desmina, la miogenina, la cinasa de creatina, etc.- los sitios MEF2 se presentan a una separación precisa de los sitios de miogenina: el residuo que resulta al dividir entre 10.5 (el número de bases en una vuelta de la cadena de ADN en solución) las bases del "centron de una secuencia consenso a la otra es de 3.25±0.25 -en cuyo caso ambos factores de transcripción ven hacia una misma cara- ó de 8.25±0.75 -en cuyo caso ven hacia caras opuestas- (Fickett, 1996). Dado que se parecen -mas no se confunden- las secuencias de ADN reguladoras reconocidas por miogenina, MyoD y Myf5, se determinó si había la coordinación geométrica entre los sitios MEF2-MyoD y MEF2-Myf5 en el promotor del betaglicano según dicho artículo y no se encontró, habiéndose obtenido valores de 4.0 a 5.5. Esto no necesariamente indica que dichos sitios no puedan actuar sinérgicamente, dado que no sabemos si tal coordinación geométrica existe también entre sitios MEF2-MyoD o MEF2-Myf5 -o si se restringe a sitios MEF2-miogenina- (ver tabla 111). Nota: La línea vertical que divide nucleótidos corresponde al "centro" de la secuencia consenso, mientras que los nucleótidos en negritas son de capital importancia para el reconocimiento por transactivadores (Fickett el al., 1996). Con respecto a la miogenina, el promotor del betaglicano cuenta con sitios de unión de bajo potencial ("core similarity" = -0.7) para este factor, por lo que ésta puede ser la causa de que casi no se observe regulación por este factor. Además, la diferencia entre MyoD y miogenina en su capacidad para transactivar al promotor del betaglicano en realidad puede ser más acentuada en vista de que los mioblastos ya expresan MyoD pero no miogenina (Hu y Olson, 1990), de tal suerte que la inducción de -3 veces de la actividad del promotor por MyoD quizá sería mayor en células que no expresaran MyoD. No obstante, la miogenina requiere heterodimerizarse con E12 o con E47 -productos del gen E2A- para funcionar como transactivador (Becker et al., 2001), a diferencia de MyoD, que funciona preferentemente como homodímero (Li et al., 1996). Por lo tanto, dado que no se cotransfectó E12 ó E47, es posible que la cantidad de éstos haya sido limitada y por ende, la miogenina cotransfectada no haya podido establecer suficientes heterodímeros, explicando quizás así la falta de regulación por este factor. Además, el hecho de que el promotor del betaglicano y el de la miogenina (capaz de autoinducir su expresión) muestren un patrón similar de inducción a partir del día 2 de diferenciación apoya la noción de que es posible que la miogenina sí regule al gen del betaglicano. En cuanto a la relevancia de haber hallado regulación del promotor del betaglicano en miogénesis por MyoD (y posiblemente por otros transactivadores miogénicos), es 89 importante mencionar que aunque el ratón con el gen del betaglicano desactivado no presenta al parecer defectos musculares esqueléticos, sí presenta, entre otros, defectos musculares cardiacos. Como algunos de los factores de transcripción que le proveen al músculo esquelético su fenotipo son compartidos por el músculo cardiaco (no así MyoD (Weintraub et al., 1991», es probable que algunos de ellos sean responsables de potenciar la expresión del betaglicano también en músculo cardiaco. Es posible la regulación del promotor del betaglicano por factores de transcripción importantes en la cardiogénesis como NF-ATc, MEF2, Nkx-2.S, SRF (serum response factor) y GA TA-4, todos ellos con sitios potenciales de unión en el promotor del betaglicano, según el programa Matlnspector. Las células endoteliales cardiacas que experimentan la transformación epitelio-mesenquimatosa para convertirse en válvulas y septa membranosos cardiacos expresan betaglicano, a diferencia de las células aledañas que no se sufren esta transformación. Si en este sistema se inhibe la función del betaglicano mediante un antisuero, la formación de las válvulas cardiacas no ocurre (Brown et al., 1999). Asimismo, el fenotipo de los ratones knock-out de NF-ATc consiste en la carencia absoluta y específica de las válvulas aórtica y pulmonar, y en una afectación menos severa de la tricúspide y la mitral, además de defectos en la formación del septum (de la Pompa et al., 1998; Ranger et al., 1998). Dado que los dominios y momentos de expresión de NF-ATc y betaglicano sugieren interacción durante el desarrollo de las válvulas cardiacas, es posible que este factor de transcripción regule en trans la expresión del betaglicano; esta suposición se respalda por la existencia de elementos en cis en el promotor del betaglicano que se asemejan bastante a la secuencia consenso reconocida por NF-ATc (figura R7c y anexo 1) . NF-ATc se activa por desfosforilación: un incremento sostenido en la concentración de calcio intracelular activa a la fosfatasa calcineurina, que entonces desfosforila a NF-ATc. NF-ATc desfosforilado se transloca desde el citoplasma al núcleo y regresa inmediatamente al citoplasma cuando los niveles de Ca2 + intracelular decaen; la proteína cinasa A activada fosforila a NF-ATc, lo cual rubrica a este transactivador para ser objeto de una fosforilación más extensa por la cinasa de la sintasa de glucógeno (GSK-3) (se piensa que la salida rápida desde el núcleo de NF-ATc es un mecanismo por el que las células distinguen las señales de calcio sostenidas de las transitorias (Klemm et al., 1997; Sheridan et al., 2002»; así, es posible que también el Ca2 + sea necesario para elevar los niveles de betaglicano. GA T A-4/S/6 y SRF interactúan físicamente y activan sinérgicamente el promotor de la a- actina uniéndose a un elemento de respuesta a suero (SRE) (Belaguli et al., 2000). Los factores GATA también interactúan física y funcionalmente con factores MEF2 en promotores cardiacos: los MEF2 potencian la capacidad transactivadora de los GATAs luego de ser reclutados por éstos (Morin et al., 2000). Asimismo, GA TA-4/S interactúa con Nkx-2.S en la activación del factor natriurético auricular (ANF) (Durocher et al., 1997). Sitios potencialmente efectores de agentes que sabidamente regulan al betaglicano Hay un sitio del receptor de estrógenos en el promotor, el cual podría ser el responsable de la regulación negativa por estrógenos del betaglicano (Koli et al., 1997; Findlay et al., 2001). Los dos sitios NF-1CB en el promotor posiblemente sean los que medien la modulación positiva del betaglicano por TNF-a en células HeLa (Zhou et al., 2003). El sitio CREB (cAMP-responsive elementbinding protein) puede ser el efector responsable de elevar la cantidad de ARNm de betaglicano en osteoblastos por acción de la parathormona vía un aumento de AMPc (Centrella et al., 1988). En organogénesis, la expresión del gen del betaglicano podría estar regulada por los siguientes elementos en cis inmersos en su promotor: 90 a. en miogénesis esquelética: MyoD, Myf5, NF-AT, MEF2, E47 (E47 forma heterodímeros con MyoD), RAR, Smad3, Smad4, Tcf/Lef1, AREB6/ZEB; b. en desarrollo cardiaco: NF-AT, MEF2, Nkx-2.5, RAR, GATA, Smad3, Smad4, SRF, WT-1; c. en desarrollo hepático: HNF-3 (hepatocyte nuclear factor 3); d. en desarrollo pulmonar: HNF-3, Freac-2, WT-1; e. en desarrollo renal : WT1; f. en desarrollo ocular: Pax6, Freac-2; g. en desarrollo cerebral: Brn-2, Freac-2; h. en desarrollo testicular: WT-1, GFI-1; i. en desarrollo intestinal: Cdx-1, Cdx-2, GKLF (Gut-enriched Krüppel-Iike factor) . Asimismo, los siguientes elementos podrían ser los blancos a donde arriban efectores de vías de señalización particulares: a. vía del TGF-p: Smad3, Smad4, Fast-1; b. vía del bFGF: NF-KB y c-Rel; c. vía del Wnt: Tcf/Lef-1. A continuación se incluye una descripción breve del patrón de expresión y/o función de algunos de los factores de transcripción recién mencionados y del anexo 1: Brn-2, Brain-2, es específico del sistema nervioso central, se requiere para la formación de los núcleos paraventricular y supraóptico del hipotálamo -donde se detecta intensamente el betaglicano (MacConell el al., 2002)-, así como de la hipófisis posterior (Schreiber et al., 1992; Fujii y Hamada, 1993; Schonemann et al., 1995; Nakai et al., 1995). WT-1 (Wilms' tumors): su desactivación en ratones produce malformaciones en riñón, gónadas, mesotelio, pulmones y corazón (Kreidberg et al., 1993). MZF1 (Myeloid zinc finger 1) regula la granulopoyesis y puede tener un papel regulador en la proliferación celular y en cáncer (Peterson y Morris, 2000). Los factores STAT (Signal transducers and activators of transcription) funcionan como transductores de los receptores de citocinas. La expresión del proto-oncogén GFI-1 (Growth factor independence-1) en animales adultos se restringe al timo, al bazo y a los testículos (Zweidler-Mckay et al., 1996). Freac-2, Forkhead-related actívator 2, LUN ó FoxF2 es un factor de transcripción forkhead (cabeza de tenedor o de rastrillo) que se expresa en el mesénquima adyacente al epitelio en los tractos alimentario, respiratorio y urinario, de forma similar a como lo hace Freac- 1/HFH-8), pero también en el sistema nervioso central, ojo, oído y yemas de las extremidades (Aitola et al., 2000). ZF9 ó CPBP (Core promoter-binding protein) es un factor de transcripción con dedos de zinc tipo Krüppel inducido tempranamente en la activación de células estelares hepáticas (también llamadas lipocitos, células almacenadoras de grasa o células de Ito) que tiene lugar durante la regeneración del hígado; transactiva los genes de TGF-p 1, TpRII Y TpRI pegándose a cajas GC en sus respectivos promotores (Kim et al., 1998); en vista de que hay varios sitios ZF9 potenciales en el promotor del betaglicano -en las cercanías del presunto inicio de transcripción-, es posible que este factor también regule al gen del betaglicano. La región promotora de 2,265 pb estudiada en este trabajo parece contener elementos en cis necesarios para mimetizar el comportamiento del promotor endógeno, dado que hay una correlación, si bien no del todo perfecta, entre dicho comportamiento y la cantidad de ARNm de betaglicano, al menos en las tres líneas celulares en las que se averiguó el comportamiento del promotor: fibroblastos de rata Rat-1, mioblastos de rata LsEg Y 91 mioblastos de ratón C2C12 , aunque en estos últimos no se averiguó si los cambios en la actividad del promotor inducidos por diversos agentes son paralelos a cambios en los niveles del ARNm del betaglicano. Función del betaglicano en los mioblastos C2C12 y estimación de su función en los miotubos con respecto a TGF-fJ En mioblastos, el betaglicano favorece la señalización por TGF-p, dado que al transducirlos con un adenovirus que los hace expresar betaglicano y tratarlos con TGF-p, estas células tienen una mayor inducción del reportero p3TP-Lux, respondiente a TGF-p, en relación con las que portan el adenovirus vacío. Pero, ¿cómo conciliar que durante la miogénesis esté aumentando la expresión del betaglicano en la superficie y por ende, que el TGF-p, siendo un potente regulador negativo de la miogénesis, esté siendo presentado más intensamente a sus receptores cuando aparentemente se requeriría de su ausencia para que se lleve a cabo la diferenciación miogénica? Una situación parecida ocurre con la decorina: aunque ésta se encarga de favorecer la presentación de TGF-p a sus receptores señalizadores en mioblastos, su expresión durante la miogénesis aumenta, a pesar de que se podría pensar que su función debería ser mermada. La expresión de la decorina por mioblastos es relevante, dado que si se inhibe su expresión, empiezan a producir el ARNm de la miogenina aun en medio de crecimiento (Riquelme et al., 2001). Al respecto, se sabe, sin embargo, que la señalización por TGF-13 es conditio sine qua non la formación de músculo esquelético no ocurre. Mioblastos C2C12 transfectados establemente con una versión dominante negativa del receptor 11 de TGF-p no se diferencian morfológica ni bioquímicamente, ya que son incapaces de formar eficientemente miotubos, además de que en ellos no se induce la expresión de los marcadores de diferenciación MyoD, miogenina, cadenas ligeras 1, 2 Y 3 Y pesada de la miosina y troponina T ante la incubación en medio bajo en suero; empero, hay algunos marcadores cuya inducción o supresión no se ve afectada, como la de la cadena a del receptor de acetilcolina y la de la proteína Id, respectivamente, lo cual indica que hay varias vías de señalización involucradas en la diferenciación mioblástica, una de las cuales es modulada por TGF-p. La vía de señalización de TGF-13 se requiere no sólo para que pueda subir la expresión de marcadores de diferenciación miogénica, sino también para mantener la expresión basal de MyoD y de miogenina en mioblastos. Además, los mioblastos con TpRII dominante negativo son incapaces de incorporarse a fibras musculares in vivo, lo cual indica que la magnitud del bloqueo en su programa de diferenciación es tal que el ambiente in vivo no alcanza a contrarrestarlo (Filvaroff et al., 1994). De forma semejante, la señalización por FGFs a través del receptor FGFR4 se requiere para que haya diferenciación miogénica in vivo, a pesar de ser bFGF un supresor de este proceso in vitro (Marics et al., 2002). Es posible que las tres isoformas de TGF-13 estén involucradas en el proceso de diferenciación, dado que existe una compleja regulación de la expresión de las mismas durante la miogénesis: mientras que aumenta la expresión del ARNm de TGF-p3 (8.7 veces) y la de TGF-p2, la de TGF-p1, prominente en mioblastos, disminuye un 50% (Lafyatis et al., 1991). El IGF-I, un promotor de la diferenciación miogénica una vez que ésta se ha disparado, baja la expresión de TGF-p1 y de TGF-133 a las 48 horas de haberlo aplicado a mioblastos LsA1 (Bosche et al., 1995). Esta regulación de la expresión de las isoformas de TGF-p probablemente conduce una estimulación autocrina a lo largo de diversos estadios de este proceso de diferenciación celular. 92 Durante la miogénesis, el betaglicano, además de expresarse abundantemente en la membrana celular de miotubos, se transloca abundantemente hacia la matriz extracelular. Es posible que parte del TGF-13 que producen los miotubos quede retenido en la matriz extracelular en parte por el betaglicano y que no necesariamente se active para señalizar, ¿será posible que a medida que los mioblastos se comienzan a diferenciar y que empiezan a expresar betaglicano, éste tenga un papel más bien como ocultador de TGF- 13, a diferencia de la actividad que se encontró en los mioblastos? Otra observación que encontramos interesante es el cambio en la movilidad del proteoglicano del betaglicano al día 6. Aunque no se les ha asignado una función a las cadenas de glicosaminoglicanos del betaglicano, se encuentra un par de artículos que provee pistas sobre las posibles funciones de estas cadenas. En células de cáncer de colon, se observó que el betaglicano pobremente modificado postraduccionalmente se modifica grandemente cuando estas células se transfectan con una versión mutante de Ki-Ras, y además, estas células, que inicialmente eran insensibles a TGF-131, se vuelven sensibles a este factor de crecimiento. Es posible que este betaglicano abundantemente modificado sea el que restaure la sensibilidad de las células de cáncer de colon al TGF-131 (Yan et al., 2001). Aunque los autores especulan sobre la posibilidad de que la naturaleza de estas modificaciones sea glicosilación, no se descarta la posibilidad de que sea glicanación, de acuerdo a lo que se aprecia en la movilidad de las bandas del betaglicano en geles, que no se ve grandemente afectada cuando tratan a las células con glicosilasas. Por otra parte, se observó en células epiteliales de riñón que una forma abundantemente glicanada -aunque no se sabe si de cadenas más largas de sulfato de heparano, de condrotina o de ambos- del betaglicano inhibe, a diferencia de la forma pobremente glicanada, la formación del complejo TI3RII-TI3RI, y por lo tanto bloquea la señalización corriente abajo por TGF-13 (Eickelberg et al., 2002). El betaglicano se presenta altamente glicanado también en células preosteoblásticas de hueso parietal de rata, pero una vez que se diferencian a osteoblastos, la población de moléculas de betaglicano disminuye y vira hacia una forma menos glicanada, todo lo cual, al parecer, es responsable en parte de la sensibilización de los osteoblastos al TGF-13 (Centrella et al., 1995). Por lo tanto, es posible que el cambio en la movilidad del proteoglicano del betaglicano durante la miogénesis tenga un significado fisiológico con relación al TGF-I3. Se cuenta con ejemplos de otros proteoglicanos cuyos glicosaminoglicanos (GAGs) experimentan cambios en su longitud: en células de músculo liso arterial, los GAGs de la decorina-ele sulfatos de condroitina y dermatano- aumentan de tamaño ante la estimulación con ácido linoleico, un ácido graso que circula en grandes cantidades en personas con resistencia a la insulina yen personas con diabetes tipo 2 (Olsson et al., 1999). Durante el desarrollo neuronal, un proteoglicano particular de sulfatos de heparano potencia a FGF-2 mientras se da la proliferación neuronal, pero le concede rápidamente esta potenciación a FGF-1 una vez que comienza la diferenciación neuronal (Brickman et al., 1998). En células endoteliales de córnea, bFGF -específicamente- induce cambios en la estructura de moléculas de sulfato de heparano (Schmidt et al., 1995), mientras que en cartílago articular, TGF-131 e IL-113 modifican el grado de sulfatación de GAG s de condroitina, lo cual sugiere que dichas citocinas interfieren con la actividad o la síntesis de sulfotransferasas involucradas en el recambio de GAGs (Zanni et al., 1995). Por lo tanto, en la miogénesis, cuando se eleva su expresión, el betaglicano podría funcionar como potenciador de la señalización por TGF-132 o TGF-133. No obstante, la presencia en mioblastos C2C12 de TI3RII-B, la isoforma de TI3RII capaz de unir TGF-132 - 93 sin necesidad de betaglicano-, TGF-131 y TGF-133 Y transducir sus señales a través de Smads, complica más el panorama, dado que este receptor generado por empalme alterno también ve elevada su expresión durante la miogénesis (Rotzer et al., 2001), al igual que la ve elevada la decorina, que también potencia la señalización por TGF-13 (Riquelme et al., 2001). Por otro lado, en la miogénesis, el betaglicano podría actuar como represor de la señalización por TGF-131, cuya expresión decae un 50% (Lafyatis et al., 1991), en función de la longitud de las cadenas de glicosaminoglicanos que posee, considerando que si la proteína de TGF-131 se añade a los mioblastos, inhibe su diferenciación bioquímica y su fusión. Sin embargo, es difícil sostener que el betaglicano pueda tener funciones particulares, contrarias entre sí, en función de la isoforma de TGF- 13 que esté uniendo. No obstante, experimentos de saturación por marcado por afinidad y de competencia han arrojado que en células trofoblásticas en cultivo primario hay dos poblaciones de betaglicano: una de capacidad baja y afinidad alta que une TGF-131 y TGF-132, aunque prefiere unir TGF-132, y otra de mayor capacidad y menor afinidad que une solamente TGF-131, en contraste con la población homogénea que existe en células mesenquimatosas de placenta, que despliega capacidad y afinidad similares para ambas isoformas (Mitchell et al., 1992). Se ha hallado que bFGF, un factor de crecimiento que se une a las cadenas de sulfato de heparano del betaglicano, tiene la facultad de acortar, en un periodo de 48 horas, la longitud de estas cadenas en osteoblastos (Andres et al., 1992). En concordancia con estas observaciones, durante la miogénesis, el cese de la señalización por bFGF podría, además de dejar de impedir la diferenciación, ocasionar el alargamiento de las cadenas de sulfato de heparano del betaglicano, con lo cual se podría estar entorpeciendo la señalización por TGF-13, aunque también es cierto que no se sabe aún si son cadenas más largas de sulfato de heparano, de condroitina o de ambas en el betaglicano las que impiden esta señalización. Otra posibilidad es que el betaglicano forme parte de un mecanismo "dosificador" encargado de mantener la señalización por TGF-13 debajo de un umbral, de modo que no llegue a ser tan abrumadora ni tan escasa que en cualquiera de los casos llegue a impedir la diferenciación miogénica. Por lo tanto, aunque el betaglicano esté funcionando como presentador de TGF-13 ante sus receptores de señalización en mioblastos, no podemos extrapolar esta función a miotubos, ya que en ellos no solamente hay más betaglicano transmembranal y con un patrón de glicanación diferente, sino que también hay más betaglicano soluble en la matriz extracelular. En vista de que el knock-out del betaglicano aparentemente no tiene defectos musculares esqueléticos, es probable que la ausencia del betaglicano en dicho tejido esté siendo compensada por otras moléculas, posiblemente otros proteoglicanos, cuya función sea redundante a la del betaglicano. 8. Conclusiones 1. La diferenciación de los mioblastos C2C12 a miotubos está acompañada de una elevación en la expresión de betaglicano en la superficie celular (con un patrón de glicanación mayor) y en la matriz extracelular. 2. Esta elevación es detectable también a nivel de ARNm. 3. Se logró clonar el promotor del betaglicano y conocer su secuencia. 94 4. La elevación en el nivel de ARNm del betaglicano se debe al menos en parte a una actividad incrementada del promotor del gen. 5. Se logró demostrar la actividad del promotor del betaglicano en células Rat-1 y LsEs, habiéndose encontrado un nivel de actividad paralelo al nivel de expresión del ARNm, por lo que es probable que el fragmento promotor de 2.3 kb mimetice el comportamiento del gen endógeno. 6. Se logró demostrar que el TGF-p y el ácido retinoico regulan la actividad del promotor del betaglicano. Consistentemente, mediante el uso del software Matlnspector, se lograron detectar elementos en cis en el promotor que presuntamente unen los factores Smad3, Smad4 y RAR. 7. MyoD incrementa la actividad del promotor, probablemente de manera directa, lo cual puede ser en parte responsable del gran aumento que sufre la expresión del betaglicano durante la miogénesis. 9. Perspectivas Las perspectivas de los resultados del presente trabajo de tesis son: 1. Determinar la función del betaglicano a lo largo de la miogénesis. Esto se puede lograr potenciando o inhibiendo la expresión del betaglicano en mioblastos. Con la potenciación (e.g., con la construcción Adv-BG), se vería cuál es la consecuencia de la expresión abundante y ab origine de betaglicano en mioblastos al diferenciarse. Con la inhibición (v.g., con el uso de una construcción que exprese bajo el control de un promotor regulable por tetraciclina un ARNm en contrasentido de betaglicano), ver si esto altera el proceso de diferenciación de los mioblastos o la viabilidad de los miotubos. 2. Gracias a la clonación del promotor del betaglicano, se facilitaría sobremanera el esclarecimiento de cuestiones como las siguientes. Durante el desarrollo cardiaco murino, la expresión del betaglicano aumenta dramáticamente en el miocardio ventricular del E8.5 al E11.5, concretamente en los cardiomiocitos trabeculantes y no en los miocitos subepicardiacos. Cuando hay ausencia del betaglicano en este tejido, sobrevienen paredes ventriculares patológicamente delgadas y defectos en el tabique interventricular (Stenvers et al., 2003). Por lo tanto, sería interesante ver qué elementos en el promotor del betaglicano causan una elevación drástica en la expresión del betaglicano durante este proceso de desarrollo. 3. El hígado en formación es otro de los órganos en los que súbitamente la expresión del betaglicano se dispara notablemente (Stenvers et al., 2003), pero en animales adultos queda silenciada (salvo contingencias como daño hepático). Por tanto, en este modelo de desarrollo también sería interesante ver qué elementos del promotor se encargan de prender repentina y fuertemente la expresión del betaglicano y luego de apagarla permanentemente. Pero además, a título personal, hay otras perspectivas que no se derivan de los resultados de esta tesis pero que constituyen interrogantes importantes con respecto a la biología de esta molécula affascinante: 95 1. Dado que la evidencia sugiere que no es la vía de TGF-13 ni la de la activina-BMPs- inhibina la que está afectada en el defecto hepático que abruma a los ratones knock-out de betaglicano, sería importante precisar en qué vía de señalización está involucrado de manera crucial el betaglicano. 2. Determinar la función de los evasivos GAGs del betaglicano durante organogénesis. 4. En cuanto a los transcritos alternos misteriosos, ¿cuál es su función?; el de testículo y/o el de hipófisis: ¿podrían ser receptores señalizadores de inhibina sobre los que tanta expectativa se tiene de su existencia (Bernard et al., 2002; Farnworth et al., 2001; Harrison et al., 2001; Matzuk, 2000)? 5. Determinar si el betaglicano es necesario -posteriormente a su papel crítico en hepatogénesis y cardiogénesis- en más eventos de desarrollo. 96 ANEXO 1. Matrix Subsecuencia del promotor y hebra ctctTTGAagtcc- cctAAGTttcttg- 97 PXR n>r-"nlnrl/R)(R Ó sitio del CAR (constitutíve androstane gacAAGTttccag- gtctTTGAaccag+ ctttgaaCCAGacactt+ agaaAGTTgtctt+ 98 tagtTTGAaggat+ acacttcttCCAGgccggg+ 99 gcggtgtgtCCAGgaccgg- agggcgcCAAAccgc- ctctGA T Agggcg- ttgACGCtgag+ Anexo 1. Listado completo de los elementos potenciales de control en cis del promotor del betaglicano predichos por el software "Professional Matlnspector" -de "matrix similarity" ~O.875 y "core similarity" ~O.9-. En la tabla, el término familia se refiere a un conjunto de matrices (secuencias) funcionalmente similares; los nucleótidos en mayúsculas (llamados globalmente eore sequenee) -usualmente 4- corresponden a las posiciones más conservadas de la matriz. 100 10. Procedimientos experimentales Cultivo celular los fibroblastos Rat-1 de rata y los mioblastos LsEg de rata y C2C12 de ratón se compraron a American Type Culture Collection (ATCC). las células Rat-1 y lsEg se cultivaron en una incubadora a 37 oC con 95% de humedad y 5% de CO2 (las C2C12 con CO2 al 8%). Medio de crecimiento para fibroblastos de rata Rat-1 DMEM Suero de feto bovino al 10% descomplementado 30' a 56 oC Mezcla de antibióticos y antimicóticos 1X Medio de crecimiento para mioblastos de rata lsEg DMEM Suero de feto bovino al 20% descomplementado 30' a 56 oC Mezcla de antibióticos y antimicóticos 1X Medio de crecimiento para mioblastos de ratón C2C12 DMEM/F-12 (1:1) Suero de feto bovino al 10% descomplementado 30' a 56 oC Extracto de embrión de pollo filtrado a 60 A al 0.5% Mezcla de antibióticos y antimicóticos 1X El DMEM/F-12 se prepara mezclando 1 sobre de este medio en polvo para 1 len un litro de agua con 1.2 g de NaHC03 y ajustando el pH a 7. luego se esteriliza filtrándolo al vacío a través de un filtro Steritop de poros de 0.22 ¡.un. El medio de crecimiento se les debe reemplazar a las células cada 2 días; se debe vigilar que las células no alcancen una confluencia del 70% o más, ya que si esto sucede una fracción se diferencia a miotubos y la restante queda disminuida en su capacidad para diferenciarse posteriormente. Para tener cultivos de reserva de estos mioblastos, éstos deben ser cultivados a una densidad de 5,000 células/cm 2 en cajas petri de 6 cm de diámetro (21 cm2 de área) con 3 ml de medio o de 10 cm de diámetro (55 cm2 de área) con 6 ml de medio. Dilución de los cultivos de células (split) Cuando se requiera diluir mioblastos cultivados en cajas de 6 cm de diámetro, se deben lavar las células 2X con 5 ml cada vez de HBSS, añadirles 1 ml de tripsina 1X (diluida en HBSS a partir de una solución madre 10X), dejarlas a 37 oC -10 minutos, añadirles 5 ml de medio de crecimiento, pipetearlas para disgregarlas a totalidad y añadir 2 ml de la suspensión de células a otra caja de 6 cm de diámetro en la que ya haya 6 ml de medio de crecimiento. Se esparcen bien las células y se regresan a la incubadora. Si se requiere sembrar células en cantidades específicas, la suspensión de células se transfiere íntegra a un tubo Falcon de 50 ml y se centrifuga a 2,500 rpm 10 minutos. Se aspira el sobrenadante y se añaden 5 ml de medio de crecimiento por cada placa de 21 cm 2 de área de la que provengan los mioblastos. las células se succionan a través de una aguja 21G1% de Plastipak con una jeringa Plastipak de 10 ml y se toma una muestra de 50 Jll para contar las células en la Cámara de Neubauer: se cuentan las células que hay en cada uno de los 4 cuadrantes, se saca un promedio y se multiplica por 10,000 para conocer el número de células por mL. Sembrar 4,000 ó 6,000 célulaslcm 2 para tener un confluencia del 70 al 80% en 3 ó 101 2 días, respectivamente. También se pueden hacer cultivos en cajas de 10 cm de diámetro si se requieren de muchas más células para un experimento. Medio de diferenciación para mioblastos C2C12 DMEM/F-12 Suero de caballo al 5% descomplementado 30' a 56 oC Mezcla de antibióticos y antimicóticos 1X Cuando los mioblastos hayan alcanzado un 60% de confluencia, se les aspira el medio de crecimiento, se enjuagan 3X con DMEM/F-12 y se les añade el medio de diferenciación. El medio de diferenciación se debe cambiar al segundo día de haberlo provisto, añadiendo esta vez AraC (p-D-arabinofuranósido de citosina) a una concentración final de 1 mM (a partir de una solución 100 mM protegida de la luz), y así cada 2 días, añadiendo siempre AraC. El AraC es un análogo de citosina que al incorporarse a una cadena naciente de ADN durante la replicación impide que ésta se extienda, por lo que este compuesto se añade para matar a las células que aun en condiciones de diferenciación sigan proliferando, con el fin de tener en el cultivo una población primordialmente de miotubos y no una mixta. Cabe mencionar que no se consigue obtener miotubos cuando se ponen a diferenciar mioblastos en pozos de la placa de 24 de pozos. Congelación de células Procesar las células como si se fueran a diluir, pero después de centrifugarlas y aspirarles el sobrenadante, adicionarles 3 mL de medio de cultivo por cada placa de 21 cm2 de la que procedan. Disociar las células con jeringa, contarlas y ajustarlas a una densidad de 600-700 mil células/mL. Disociar las células 5 veces de nuevo con jeringa y colocar 1 mL de la suspensión por criovial que se quiera congelar; añadir 100 JlL de DMSO, mezclar por inversión, congelar de 3 a 15 horas en el congelador a -20 oC y luego pasar al tanque de nitrógeno. Medición del proteoglicano, proteína desglicanada y ARNm del betaglicano en células Cl Cll Yodinación del TGF-p por el método de la cloramina T 1 Jlg de TGF-p2 fue disuelto en 5 JlL de acetonitrilo y mezclado con amortiguador fosfato y 500 JlCi de 1251-Na!. La reacción fue iniciada con la adición de 2 JlL de cloramina T; a los 2 minutos se agregaron otros 2 JlL de cloramina T; después de 1.5 minutos se agregaron 2 JlL más y después de 1 minuto se detiene la reacción con un exceso de yoduro de sodio frío. El TGF-p yodinado fue separado del yodo libre mediante una cromatografía de exclusión con Sephadex G-50 (López Casillas et al., 1993; Hunter, 1970). Marcado por afinidad e inmunoprecipitación Para los ensayos de entrecruzamiento fueron plaqueados mioblastos C2C12 a una densidad de 8,000 células/cm2 en placas de 10 cm2 en medio de crecimiento; dos días después, cuando habían alcanzado una confluencia de -70%, se marcaron por afinidad los mioblastos del día O de diferenciación con 1251_ TGF-p2 100 pM Y se indujo la diferenciación de las células de los cultivos de los días 2,4 Y 6 de diferenciación, mismas que en los referidos días se marcaron por afinidad. Las células se incuban en 2 mL del amortiguador KRH 1X (Krebs-Ringer-Hepes; KRH 10X: NaCI128 mM, KCI 5 mM, MgS04 5 mM, CaCI2 1.3 mM y Hepes 50 mM) con BSA al 0.5% a 37 OC por 30 minutos en una 102 plataforma rotatoria. Luego se incuban en 1 mL de KRH 1X con 1251_TGF_p2 100 pM Y BSA al 0.5% a 4 oC por 3 horas en la plataforma rotatoria. Al terminar las incubaciones, las células se enjuagan para quitar el 1251_TGF_p2 libre y la BSA. Se agrega la solución de entrecruzamiento (6 J.!L de DSS a 1 mg/mL) por 15 minutos a 4 oC en la plataforma rotatoria y se detiene la reacción mediante lavados con el amortiguador STE. Las proteínas membranales fueron solubilizadas con el amortiguador Tris-Tritón-EDTA en presencia de un coctel de inhibidores de proteasas por 30 minutos a 4 oC en la plataforma rotatoria. Los lisados celulares fueron centrifugados y los sobrenadantes transferidos a tubos eppendorf para ser inmunoprecipitados o analizados directamente en geles de acrilamida. El anticuerpo policlonal que se utilizó para inmunoprecipitar al betaglicano fue el denominado 822. Cuantificación de proteínas totales Se utilizó el método para cuantificar proteínas con ácido bicinconínico descrito por Smith et al. en 1985. La sal sódica del ácido bicinconínico es un compuesto hidrosoluble capaz de formar un complejo púrpura intenso con el ion cuproso (Cu 1+), mismo que se forma al hacer reaccionar proteínas con Cu2+ en un ambiente alcalino (reacción de Biuret). 10 a 20 J.!L de extractos celulares fueron llevados a 150 J.!L con más amortiguador con Tritón X- 100 (ver sección "Detección de la actividad de la cinasa de creatina") y alicuotados en pozos de 0.32 cm2; luego fueron mezclados con 150 J.!L del reactivo de trabajo (Smith et al., 1985). Después de mezclar agitando suavemente durante 30 segundos, la placa multipozos fue incubada por 2 horas a 37 oC. Se cuantificó la absorbancia a 562 nm de A de cada pozo en un lector de ELlSA 960 Metertech y así se determinó la concentración de proteínas totales sobre la base de una curva estándar elaborada con albúmina de suero bovino en un rango de O a 30 J.!g/mL. Degradación de los glicosaminoglicanos del betaglicano Para degradar las cadenas de sulfatos de heparano y de condroitina del betaglicano, 95 J.!L de extractos de células C2C12 en Tritón X-100 (ver sección "Detección de la actividad de la cinasa de creatina") fueron incubados con 5 mU de heparitinasa (Seikagaku) previamente liofilizada con todo y su amortiguador (Tris HCI 100 mM pH 7.5 Y NaCI 50 mM), condroitinasa ABC (Sigma) a una concentración final de 100 mU/mL y 5 J.!L de CaCI2 20 mM. La digestión se dejó transcurrir por espacio de 12 horas a 37 oC. Electroforesis en geles de poliacrilamida Alícuotas de los extractos celulares (marcados por afinidad o digeridos) se mezclaron con el amortiguador de carga (Tris HCI 125 mM pH 6.8, SOS al 6%, glicerol al 20%, p- mercaptoetanol al 10% y azul de bromofenol al 0.07%), se hirvieron por 5 minutos y se fraccionaron electroforéticamente en un geles de poliacrilamida preparados en vidrios de 20 cm x 14 cm x 1.5 mm al 3% (gel concentrador) y de gradiente 4-12% (gel separador) usando como amortiguador de corrida Tris 25 mM, glicina 192 mM y SOS al 0.1%, aplicándoseles voltajes constantes de 50 V (concentrador) y 150 V (separador). Transferencia de proteínas desde geles de acrilamida a membranas de nitrocelulosa Las proteínas fueron transferidas a una membrana Immobilon (Millipore) luego de ser electroforadas en geles de acrilamida: la membrana y el gel, yuxtapuestos, se colocaron entre cuatro pedazos de papel Whatman 3MM, una esponja y un soporte plástico perforado a cada lado; el ensamble se colocó en una cámara de transferencia con la membrana viendo hacia el polo positivo. Para geles de 20 cm x 14 cm x 1.5 mm la electrotransferencia se llevó a cabo por 2 horas a 70 V en Tris HCI 25 mM pH 8.4 Y glicina 103 ---------- ----- - - _. _- - 192 mM. Como control de transferencia, las proteínas en la membrana se tiñieron con una solución de Rojo Ponceau-S al 0.1 % en ácido acético al 5%. Westem blot Los sitios de unión inespecífica en la membrana de nitrocelulosa ya con las proteínas transferidas fueron bloqueados al incubarla 1 hora a temperatura ambiente en Tris-Blotto- Tween (Tris HCI 20 mM pH 7.4, NaCI 100 mM, leche descremada al 5% y Tween-20 al 1%). Luego se adicionó el suero C6-3 de conejo a-dominio E del betaglicano (codificado por la construcción L110) (1/2000) diluido en Tris-Blotto-Tween y luego de una hora, la membrana se enjuagó 3 veces por 10 minutos cada vez en el mismo amortiguador y se incubó por una hora a temperatura ambiente con el segundo anticuerpo (a-lgG de conejo conjugado a peroxidasa de rábano picante 1/10,000) diludo en Tris-Blotto-Tween. Después de 6 lavados similares a los del primer anticuerpo, el betaglicano se visualizó mediante ECL (enhanced chemiluminescence) (Pierce). Detección de la actividad de la cinasa de creatina Mioblastos y miotubos dejados diferenciar por 2, 4 ó 6 días en placas de 21 cm2 fueron lavados 3 veces por 5 minutos cada vez con PBS (phosphate-buffered saline) 1X, CaCb 0.1 mM y MgCI2 1 mM y lisados mediante incubación con 400 ~L de Tritón X-100 al 0.5%, Tris HCI 50 mM pH 7.4 Y NaCI 150 mM por 10 min sobre hielo. Ellisado se restregó con un raspador, se homogeneizó mediante 20 pasajes por una jeringa de 1 mL (con aguja de calibre 25) y se clarificó mediante centrifugación a 11,000 rpm a 4 oC por 10 minutos. Se utilizó una alícuota de 10 a 1 00 ~L para determinar la actividad de la enzima fosfocinasa de creatina con el kit CK-NAC (Valtek) que cuantifica indirectamente la actividad de esta enzima al detectar la cinética de formación de NADPH en la reacción de fosfocreatina a gluconato-6-fosfato, cuyo primer paso está catalizado por la enzima. Dicha alícuota se mezcló con 750 ~L del amortiguador de ensayo del kit y se medió la absorbancia de la mezcla a 340 nm de t.. en un espectrofotómetro UV-1601PC de Shimadzu, con un tiempo de preincubación de 2 minutos y una cinética de aparición de NADPH de 4 minutos, determinando la absorbancia a intervalos de 1 minuto. La actividad se expresó en UllmL según la siguiente fórmula: UllmL = Pendiente (densidad óptica / minuto) . (Vr /6.22Vm), donde Vr = volumen total de la reacción; Vm = volumen de la muestra; y 6.22 = coeficiente de extinción molar del NADPH a 340 nm de t... El ADN en los extractos celulares se cuantificó con bis-benzimida o reactivo de Hoechst 33258; este reactivo cambia su espectro de emisión de fluorescencia al formar un complejo con el ADN (Labarca y Paigen, 1980). Alícuotas de 20 a 50 ~L de extractos totales fueron mezcladas con 2 mL del amortiguador de ensayo (NaCI2 M, EDTA 10 mM, bis-benzimida 0.1 ~g/mL y PBS 1X) y se midió la emisión de fluorescencia a 458 nm de t.. a una excitación de 365 nm de t.. en un f1uorímetro DyNA Quant200 de Hoefer. Extracción de ARN total Los mioblastos C2C12 fueron plaqueados en medio de crecimiento a una densidad de 6,000 células/cm2 y dos días después fue inducida su diferenciación a miotubos. El ARN fue extraído de células dejadas diferenciar O, 2, 4 Y 6 días. Se utiliza la solución de Trizol para extraerlo siguiendo el protocolo que proporciona Gibco. Se adiciona a los cultivos 1 mL (placas de 21 cm2 ) Ó 2 mL (de 55 cm 2 ) de Trizol , se obtiene un extracto restregando la superficie de la placa con un raspador de células y luego éste se homogeneiza con la micropipeta P-1000 (los extractos que no vayan a ser procesados de inmediato se guardan a -80 oC; cuando vayan a serlo, se descongelan en un baño de agua al tiempo durante unos 10 minutos). Se agregan 200 ~L de cloroformo por cada mililitro de extracto, 104 se agita por inversión 15 segundos y se incuba a 4 oC durante 10 minutos. Después de centrifugar a 11,500 rpm por 10 minutos a 4 oC en microcentrífuga, se transfieren 400-500 IlL de la fase acuosa (la superior) a un nuevo tubo estéril, se adiciona un volumen de isopropanol y se incuba a -20 oC por 2 horas. Se centrifuga en las mismas condiciones, sólo que a 9,500 rpm, y se lava el precipitado resultante con 1 mL de etanol al 75% frío (se invierte el tubo muy suavemente). El precipitado de ARN se seca en el SpeedVac 5 minutos sin calor y luego se redisuelve en un volumen de 20 IlL de formamida, se desnaturaliza incubándolo 10 minutos a 65 oC, se coloca 10 minutos a 4 oC y se cuantifica una alícuota de 2 IlL disuelta en un volumen final de 500 IlL de agua tratada con DEPC midiendo la absorbancia a 260 nm. Electroforesis de ARN en geles de agarosa y transferencia a membranas de Nytran 10 Ilg of ARN total de cada punto temporal de miogénesis fueron electroforados en un gel de agarosa al 1.2% en amortiguador MOPS (ácido mortolinopropanosulfónico 0.04 M pH 7, acetato de sodio 10 mM y EDTA 1 mM) y formaldehído 0.66 M. En un matraz horneado se agregan el agua y la agarosa; se pone el matraz sobre una balanza que se tara a cero, se añade agua (100 mL, compensatoria de la que se evaporará), se derrite la agarosa en el horno de microondas y se evapora agua hasta que el matraz pese cero en la balanza tarada; inmediatamente se añade MOPS 10X y luego el formaldehído (en un ambiente estéril). Se agita suavemente para no formarle burbujas y se vierte en el molde del gel, equilibrado previamente con una "burbuja" libre de ARNasas por haberla tratado con RNAseZap. Antes de cargarle las muestras de ARN, el gel se precorre durante una hora a 70 V en MOPS. El ARN disuelto en formamida se desnaturaliza como se mencionó arriba, se coloca en hielo después, se toman los 10 Ilg Y se mezclan con 15 IlL de amortiguador de carga (750 IlL de formamida desionizada, 150 IlL de MOPS 10X, 240 IlL de formaldehído al 37%, 100 IlL de H20 tratada con DEPC, 100 IlL de glicerol y 80 IlL de una solución de azul de bromofenol al 10%) y 3 IlL de bromuro de etidio 1 mg/mL, todo en hielo. El ARN se carga en los pozos del gel y se corre a un voltaje constante de 70 V (geles de -10 cm de largo) hasta que el frente de azul de bromofenol llegue al final del gel. Se le toma una fotografía al gel y se enjuaga con H20 tratada con DEPC. El ARN se despurina con NaOH 0.05 N (a partir de una solución de NaOH 2 N) Y se transfiere así: el gel y la membrana de Nytran se sumergen por separado en SSC 10X (NaCI 1.5 M, citrato de sodio 0.15 M pH 7) durante 20 minutos con agitación suave (la membrana primero se hidrata con H20). Se arma un dispositivo de transferencia con SSC 10X; el gel se coloca sobre un trozo de papel Whatman 3MM, encima del gel se coloca una membrana de Nytran de Schleicher & Schuell y arriba de ella otro pedazo de papel filtro (ambos de la misma superficie del gel) y hasta arriba pliegos de papel absorbente. La transferencia por capilaridad se deja transcurrir 12 horas, luego de las cuales la membrana se remoja en SSC 6X 5 minutos y se deja secar bien. Luego, el ARN se fija a la membrana con luz ultravioleta haciendo uso de un entrecruzador Stratagene. Norfhern blot Como sonda se utilizaron 100 ng del ADNc entero del betaglicano murino, previamente liberado del plásmido CII-2 con EcoRI, purificado a través de un gel y marcado con 50 IlCi de [a-32P]-dCTP (-3000 Ci/mmol de NEN) durante 20 minutos mediante un kit de marcaje con oligos hexaméricos de secuencia aleatoria de Boehringer Mannheim. La membrana se prehibrida en cilindros de hibridación HybAid durante 20 minutos a 65 oC con el amortiguador de hibridación Rapid-hyb con 0.1 mg/mL de ADN de esperma de salmón previamente desnaturalizado. Luego se agrega la sonda radiactiva (desnaturalizada 10 minutos a 100 oC y enfriada en hielo) y se deja hibridar 1 hora a 65 oC. La membrana se 105 lava una vez con SSC 2X y SOS al 0.1 % durante 30 minutos y dos veces con SSC 0.1 X Y SOS al 0.1 % por 15 minutos cada vez a 65 oC. La imagen se obtuvo mediante autoradiografía en una película de rayos X de Kodak dejada a -80 oC. Inmunofluorescencia indirecta Se cultivaron células C2C12 en cubreobjetos de vidrio. Antes de procesar las células, se les aspiró el medio y se enjuagaron tres veces con PBS y dos veces con TSB (Tris HCI 50 mM pH 7.7, NaCI 0.1 M, BSA al 2%), siendo de 15 minutos cada enjuague. Para tinción de antígenos de la superficie celular, las células vivas fueron incubadas con el suero hiperinmune C6-3 (í.e. , correspondiente a la tercera extracción sanguínea del animal 6) obtenido de conejos inmunizados con la proteína codificada por la construcción ~10 (dominio E) del betaglicano de rata (1/200) o con el anticuerpo de conejo a-perlecano murino (1/1000) diluidos en TSB por 1 h en hielo. Después de retirar esta solución y enjuagar 2 veces con TSB y 3 con PBS, las células fueron fijadas con paraformaldehído al 3% en PBS por media hora a temperatura ambiente; después se retiró el fijador y se enjuagó las células 3 veces con PBS y 3 con TSB. Luego las células fueron permeabilizadas con Triton X-100 al 0.05% e incubadas con un anticuerpo murino a- miosina monoclonal (1/100) (Developmental Studies Hybridoma Bank, University of lowa). Posteriormente, se retiró el anticuerpo no unido enjuagando las células con Blotto (leche descremada al 5% en PBS) y se añadió un anticuerpo IgG secundario de cabra a-Fc de conejo acoplado a FITC (1/100) y otro IgG a-ratón acoplado a TRITC (1/100) (Pierce) diluidos en Blotto. Después de 45 minutos de incubación a temperatura ambiente, los cubreobjetos fueron enjuagados y vistos en un microscopio vertical Diaphot de Nikon de epifluorescencia. Clonación del promotor Sondas del ADNc del betaglicano murino para hibridación de colonias. del tercio 5': EcoRI-Xhol , bases: 2 a 1,013 (1,012 pb) del tercio medial: Xhol-Xbal, bases: 1,014 a 2,421 (1,408 pb) del tercio 3': Xbal-Xbal, bases: 2,422 a 3,948 (1,527 pb) San EcoRI 5'NT .,=' , ....... ... . " .L =~~iOC'_ " .. ,.",."",,(:', 3'-NT ',.1,.1 : = ~! : i~---- 190 pb _!¡; ¡:: 808 pb Tercio 5' Tercio 3' Tercio medial Pe18 _ E F ~- PL4 Clonación de fragmentos de 190 y 808 pb. Xbal EcoRI El fragmento de 190 pb Sa/l-Pvull se insertó en el vector pBS-KSII(+) en los extremos dejados por Sa/1 y EcoRV (Pvull Y EcoRV generan extremos compatibles entre sí). El fragmento de 808 pb Pvull-Xhol se insertó en el mismo vector en los mismos extremos 106 (Xhol y Sall también generan extremos compatibles entre sí). Se verificó la identidad de los insertos mediante su secuenciación con los aligas T3 (17 bases: 5'- att aac cct cac taa ag -3'; T m: 46 OC) Y T7 (22 bases: 5'- gta ata cga ctc act ata ggg c -3'; T m: 64 oC), en sendos flancos del polylinker del vector. Preparación de membranas para hibridación de colonias De una membrana de nailon se recortan círculos que quepan en cajas petri convencionales (la circunferencia de las membranas debe quedar circunscrita al área plana de la cama de LB-agar de estas cajas -en su perímetro se curvea dicha cama-), se les traza con un plumón de tinta indeleble una cuadrícula de 100 cuadritos (válgase la redundancia), se numeran los cuadritos y se esterilizan las membranas. Luego, se vierten 10 mL de LB solo en una caja petri estéril y en este medio se sumerge una membrana a la vez con pinzas esterilizadas al fuego. Se transfiere esta membrana a una caja petri con LB-antibiótico-agar y se retiran las burbujas que le hayan quedado por debajo a la membrana. Con un palillo estéril de madera se toma una colonia de bacterias y se "parcha" (traza) en forma de diagonal en un cuadrito de la membrana y paralelamente en la superficie de LB sólido de una caja petri gemela que por debajo tenga la plantilla de la cuadrícula, la cual se sujeta con cinta adhesiva para que no se mueva. Se repite la operación con todas las colonias y después se incuban a 37 oC. Se deja que las colonias adquieran la forma de costras pequeñas y luego se refrigeran a 4 oC. La membrana de nailon se procesa como se describe en Berent et al., 1985. Midipreps de BACs con kit de Clontech Se hace un precultivo de las bacterias DH10B::BACs en 2 mL de LB con cloranfenicol a 15 J.!g/mL durante 8 horas. Luego se hace el cultivo preparativo en 50 mL del mismo medio en matraces de 1 L durante 16 horas, diluyendo 11500 el precultivo. Se centrifugan las bacterias en frascos de 250 mL a 6,000 rpm durante 15 minutos a 4 oC en el rotor JA- 10 de Beckman. Se resuspende la pastilla en 8 mL del amortiguador S1 frío pipeteando arriba y abajo, tratando de no hacer burbujas. El volumen resultante se transfiere a un tubo de polipropileno de 30 mL. Se añaden 8 mL del amortiguador S2 y se mezcla por inversión 8 veces. Se incuba a temperatura ambiente por 3 minutos y hasta un máximo de 5 (no mezclar en el vórtex). Se añaden 8 mL del amortiguador S3 frío. Se mezcla por inversión 8 veces y se incuba en hielo 5 minutos. Se coloca un filtro predoblado del kit en un embudo, se humedece en su totalidad con 2 mL de H20 ultrapura, se le vierte la suspensión para su filtración y el líquido filtrado se recupera en un tubo de polipropileno de 30 mL. Se distribuyen 1.5 mL de H20 ultrapura en el filtro y se cambia el punto de goteo para drenar lo más posible de líquido. Se equilibra una columna AX100 con 2 mL de amortiguador N2. Tirar el flujo. Verter el líquido donde vienen los BACs a la columna. Si este líquido se ve con material particulado, se puede centrifugar a 13,000 rpm durante 15 minutos a 4 oC en el rotor SS-34 de Sorvall. El cartucho se lava 3 veces con 4 mL del amortiguador N3. El AON se eluye del cartucho con 2 X 2 mL del. amortiguador N5 precalentado a 45 oC. El eluato se reparte así: 1 mL en cada uno de "4 microtubos de 2 mL de capacidad. Añadir a cada microtubo 2 JlL de glucógeno 20 JlglJlL Y 0.7 mL de isopropanol a temperatura ambiente para precipitar el ADN. Invertir los tubos varias veces para mezclar; centrifugar 20 minutos a 14,000 rpm a temperatura ambiente en microcentrífuga. Lavar las pastillas 2 veces con etanol al 70% a temperatura ambiente (1 mL cada vez) . Dar un golpe de microcentrífuga, retirar el EtOH residual y dejar secar la pastilla al aire durante 10 minutos. Disolver las pastillas de una misma preparación en un volumen total de 100 J.!L de Tris HCI 10 mM pH 7.5, EDTA 0.1 mM. Nota: el ADN no se disuelve bien en amortiguadores ácidos. Se digirieron 10 J.!L de la midiprep con 15 unidades de endonucleasa de restricción en un volumen final de 20 JlL; las muestras 107 digeridas se concentraron mediante evaporación a un volumen de -5 J1L para luego ser fraccionadas electroforéticamente en un gel de agarosa al 1.2%. A veces, hubo que teñir el AON luego de haberlo electroforado en el gel con 0.5 I-1g/mL de bromuro de etidio. Luego, se despurinó el AON y se transfirió a una membrana de nailon. Southem blots Las hibridaciones de colonias y las tipo southem se llevaron a cabo en esencia como se describe en Berent et al., 1985. Las hibridaciones fueron realizadas en cilindros de vidrio en un horno Hybaid. Las temperaturas de hibridación fueron de 42 oC para la sonda de 190 pb, de 55 oC para el oligo PL4 y de 61.2 oC para el oligo Pe 18. Se utilizaron 15 mL de solución de hibridación, se hibridó durante 16 horas, se lavó 4X con 200 mL de la solución NET 6X y SOS al 0.5% precalentada a 50 oC (se deben agregar las soluciones concentradas de NET y de SOS a H20 de esta temperatura, dado que conforme esta dilución se enfría, se van precipitando sus componentes). La sonda fue llevada a un volumen de 100 I-1L, desnaturalizada a 94 oC 1 minuto, enfriada en hielo, centrifugada y añadida después de la prehibridación. Para remover una sonda de una membrana y rehibridar, la sonda debe ser retirada tan pronto como sea posible de la membrana y ésta nunca se debe dejar secar. La membrana se debe lavar 2 veces por 20 minutos cada vez en un volumen grande (500 mL) de SSC 0.1X, SOS al 0.5% a 95 oC. Alternativamente, y sólo para hibridaciones de AON, se coloca la membrana con el AON viendo hacia arriba sobre papel filtro empapado de NaOH 0.4 N 5 minutos. Se enjuaga con SSC 2X y se repite la operación . Preparación del marcador de peso molecular A - Hindlll radiactivo Se digiere 1 I-1g del AON del bacteriófago A con Hindlll, se desfosforila en 100 I-1L con 1 unidad de la fosfatasa intestinal de becerro (CIP), se limpia con fenal y cloroformo, se redisuelve en 5 I-1L, se fosforila con [y-32p]_A TP Y 10 unidades de la cinasa de polinucleótidos y se purifica en una columna de Sephadex G50. En el gel, se cargan 250 ng por carril. Ligación de fragmentos Hindlll-Hindlll en el vector pBR322pl Se digieran 20 I-1L (-3.7 I-1g) de la midiprep de BACp7.10 con 30 U de Hindlll en un volumen de 50 1-1L. Luego, los fragmentos resultantes de la digestión fueron precipitados con 60 I-1g de glucógeno, 5.6 I-1L de acetato de sodio 3 M pH 5.2 Y 111.2 I-1L de etanol absoluto. Se incubó a -20 oC 20 minutos, se lavó 2X con 1 mL de etanol al 70% a temperatura ambiente y se centrifugó cada vez 5 minutos. La pastilla se disolvió en 21 I-1L de H20 pH 8 Y se analizaron en un gel de agarosa 3 I-1L para ver el rendimiento de la recuperación. El vector pBR322pl (-3 I-1g) (nota: para hacer maxipreps de este vector, se debe seguir el protocolo para plásmidos de bajo número de copias del kit de Qiagen) se digirió con Hindlll, se desfosforiló en un volumen de 100 I-1L con 1 U de CIP, se limpió meticulosamente con fenol y cloroformo para retirar la CIP, se corrió en un gel para rescatar sólo la población de plásmidos digeridos y descartar la de los no digeridos y se redisolvió en 15 I-1L de H20 pH 8. Antes de mezclar todos los componentes de la ligación, se calentaron sólo el inserto y el vector juntos 1 minuto a 37 oC para despegar los extremos cohesivos adheridos y luego se dejaron enfriar a temperatura ambiente (este paso, si se hace sin NaCl, ocasiona la desnaturalización del AON, así que no se hace por más tiempo ni a más temperatura) . Se incubaron las siguientes reacciones de ligación a 16 oC toda la noche (las unidades son I-1L): 108 Secuenciación Los plásmidos en que están contenidos diferentes segmentos del promotor del betaglicano fueron secuenciados en un secuenciador Abi Prism de la Unidad de Biología Molecular del Instituto de Fisiología Celular. Ensamble de la secuencia del inserto de -6,692 pb de la clona B70 Para ensamblar la secuencia completa del promotor, del primer exón y parte de la del primer intrón (en este orden) de la clona B70 Hindlll-Hindlll, se integraron manualmente las secuencias que se muestran en la tabla IV y que se ilustran en la figura PE1. A esta secuencia se le denominó Contig 6.5. La clona B70, a menos que se especifique lo contrario, hace referencia a la que tiene como vector a pBlueScript. *: secuencias separadas entre sí por -240 nucle6tidos no secuenciados del primer intr6n 0: secuencias separadas entre sí por -480 nucle6tidos no secuenciados del primer intr6n 109 EcoRI Psft BamHI X bal Noft Sacl T7 - - ---- - - -------- - - 1986:Sacl-Sacl 11 i,S:Hindlll-Apal BgpS Bgp4 724¡Ba~HI-BamHI T3 Hindlll . .. 1118 : ~pal-Sacl : ': 7SS:BamHI-BamHI T3 !TtT3, ,1.7 1842:Ba!PHI-BamHI ::: : ... ... : T7 :' 440S:XbaIW,kbal 1 , O~ 4,000 p l I[ I J 11 Smal II LAPal Xbal I L No/1 Sacl Sacl Noft BamHI - Psft ~ BamHI Smal Kpnl Bgp1 "ibS:EcoRI-Hindlll 2323:Xbal-Hindlll 333S:Sacl-Hindlll 1669:Psft-Hinct!.1I S,~O 6,000 :: :6,692 ~ Apal I l- Kpnl EcoRI J T3 Bs/XI Hindlll Figura PE1. Mapa del plásmido B70 -en el vector pBSII-KS(+)-, cuya secuencia ensamblada se denominó Contig 6.5. Las secuencias de los segmentos de restricción y aligas que se muestran por encima de la secuencia completa de 870 se ensamblaron entre sí para obtener ésta. En la barra que está arriba de la secuencia completa, las rayas verticales representan regiones secuenciadas, mientras que las dos porciones coloreadas representan regiones que no lo están. El segmento BamHI-BamHI de 724 pb comprende 30 pb del sitio de multiclonación, de modo que de promotor contiene 694 pb, Análogamente, el segmento Xbal-Xbal de 4405 pb comprende de promotor 4363 pb. Del fragmento Sacl-Sacl de 1986 pb, es la clona #4 la que tiene dicha orientación; del fragmento 724:BamHI-BamHI, la clona #5; los fragmentos 1118:Apal-Sacl, 1842:BamHI-BamHI (clona #2) y 755:BamHI-BamHI quedaron insertados en orientación T3 --> T7 -con respecto al sentido del promotor- en p8SII-KS(+). Nombres alternos: 4405:Xbal-Xbal: banda 2 de Xbal; 3266:Hindlll-Kpnl: banda 1 de Kpnl; 3335: Sacl-Hindll 1: clona L; 724:BamHI- BamHI y 755:BamHI-BamHI: banda 3 de BamHI (estas dos bandas migran en un gel de agarosa a11% como una sola); 1115:Hindlll-Apal : banda 1 de Apal. Bgp1: Bases 452-469 (desde el sitio Hindlll del intrón), o bien, bases -6223-6241 en contrasentido del promotor, 5'- caa atg ctg agt caa acc c -3' (19 nt, T m: 56.63 OC) Bgp4: Bases 3328-3347 en contrasentido del promotor, 5'- tcc cta aaa tta ccc gct ac -3' (20 nt, T m: 56 oC) Bgp5: Bases 1515-1534 en sentido del promotor, 5'- taa gag acc ctg acc aca cc -3' (20 nt, T m: 57.5 OC) Pe18: Bases 88-105 en contrasentido del ADNc, 5'- cga ggt ggg gga gta gcc -3' (18 nt, T m: 66.2 OC); la primera citosina de su extremo 5' se localiza a 127 pb corriente arriba de la adenina del codón de inicio. La secuencia del fragmento Hindlll-Hindlll de 6550 pb está parcialmente armada en el Contig 6.5. Desde el sitio Hindlll del extremo S' del promotor hasta la última G de CACACCGCTTGCGAG, donde termina el primer exón, hay: 2392 pb. El primer exón tiene presuntamente (según el alineamiento con el promotor del betaglicano de rata y con el ADNc del betaglicano de ratón) 251 pb. Construcciones promotor del BG -Iuciferasa Se obtuvieron mediante digestión del plásmido B70(4250:Hindlll-Kpnl) los fragmentos Hindlll-Notl (HN) de 2301 pb, BamHI-Notl (BN) de 1607 pb Y EcoRI-Notl (EN) de 857 pb. Como estos tres fragmentos tienen extremos 5' protuberantes en ambos lados, las hebras sencillas se rellenaron con dNTPs bajo la acción del fragmento Klenow de la ADN 110 polimerasa 1. Estos segmentos con extremos ahora rasos se insertaron en el vector pGL3-Basic de Promega (ilustrado en la última parte de los "procedimientos experimentales") previamente linearizado con Smal (que también genera extremos rasos). Se confirmó el tamaño de los insertos mediante digestión con Kpnl + Hindlll, se definió cuáles tenían la orientación 5'-+3' (i.e., la correcta) con Kpnl + Smal (HN: bandas de 1781 y 5337 pb; BN: bandas de 1087 y 5337 pb; EN: bandas de 337 y 5337 pb), Y se verificó la identidad de los mismos mediante secuenciación con los aligas RV3 (corriente arriba del sitio Kpnl; 20 bases: 5'- cta gca aaa tag gct gtc cc -3'; T m: 52 oC) y GL2 (corriente abajo del sitio Hindlll; 23 bases: 5'- ctt tat gtt ttt ggc gtc ttc ca -3'; Tm: 52 oC). Así, se generaron las construcciones HN-16 (clona 16 Hind 11 I-Notl), BN-4 (clona 4 BamHI-Notl) y EN-2 (clona 2 EcoRI-Notl). Relleno de extremos 5' protuberantes con Klenow para dejarlos rasos Al ADN digerido se le adiciona dATP, dCTP, dGTP y dTTP a concentración final de 200 JlM cada uno y 2 U de la polimerasa Klenow en el amortiguador B 1 X de Boehringer en un volumen de 50 JlL. La reacción se incuba a 37 oC durante 30 minutos. Métodos generales de biología molecular Transformación Bacterias competentes Escherichia coli DH5a (GIBCO BRL) fueron las que se emplearon para ser transformadas con la mayoría de los plásmidos descritos en el presente trabajo para recuperar y obtener éstos en cantidades útiles. El procedimiento de la transformación es el siguiente: se saca un microtubo de bacterias DH5a del congelador de -70 oC, se dejan derretir en hielo, se agitan suavemente, se pone en otro microtubo una alícuota de ellas de 50 JlL Y se le adiciona un volumen de 5 JlL de plásmidos (e.g., de una reacción de ligación). Las bacterias se incuban en hielo media hora y se someten luego a un choque térmico de 42 oC durante 2 minutos. Se transfieren a hielo, se dejan reposar 2 minutos y se les añade 1 mL de medio de cultivo SOC a temperatura ambiente. El microtubo con las bacterias se coloca acostado en una incubadora con agitación a 250 rpm a 37 oC durante 1 hora. Luego, se centrifuga el tubo con las bacterias 5 segundos, se quita el sobrenadante con una pipeta P-1000, se añaden 500 JlL de medio nuevo, se resuspenden las células y se plaquean 100 JlL en una caja petri con LB sólido y 400 JlL en otra (si se sospecha que habrá muchas bacterias transforrnantes y se quiere que sus colonias estén aisladas unas de otras). Este LB sólido contiene 200 Jlg/mL de ampicilina y si se requiere -para discriminación de colonias blancas y azules-, se le añade X-Gal e IPTG antes de echarle las bacterias. Después de plaquear las bacterias, se dejan incubando a 37 oC toda la noche. Minipreps de plásmidos convencionales Se toma una colonia aislada y se inocula en 2 mL de LB o TB líquido con 150 Jlg/mL de ampicilina en un tubo de 50 mL. Se deja crecer durante 8-12 horas a 37 oC con agitación de 250 rpm. Se toman 1.5 mL del cultivo bacteriano y se transfieren a un tubo eppendorf de 1.5 mL; se centrifugan las bacterias a 3,500 rpm durante 3 minutos a temperatura ambiente. Se aspira el sobrenadante y el paquete celular se resuspende en 200 JlL de Sol I con 0.1 mg/mL de ARNasa A (2 JlL de la solución a 10 JlgIJlL), se agita bien en el vórtex. A la mezcla se le añaden 200 JlL de Sol II y se invierte el tubo varias veces. Se añaden ahora 200 JlL de Sol 111 y de nuevo se mezcla por inversión. Centrifugar a 14,000 rpm 5 minutos. (Opcional: Recuperar 0.5 mL de sobrenadante, añadir 200 JlL de fenal 111 (equilibrado a pH 8.0 Y teñido con hidroxiquinolina) y mezclar en el vórtex; añadir 200 IlL de cloroformo, mezclar en el vórtex, centrifugar a 14,000 rpm 3 minutos, recuperar 400 IlL Y precipitar con un volumen igual de isopropanol). Transferir 0.5 mL de sobrenadante a un tubo eppendorf nuevo y precipitar el AON con un volumen igual de isopropanol. Centrifugar de nuevo a 14,000 rpm 10 minutos. Lavar la pastilla de AON (casi no se ve y se queda embarrada en la pared interna del tubo) una vez con 1 mL de etanol al 70%. Secar la pastilla en el SpeedVac aproximadamente 3 minutos y disolverla en 30 IlL de H20 pH -8.0. Usar 5 IlL de la miniprep para analizar por restricción. Sol 1: Tris 50 mM pH 7.5, EOTA 10 mM. Sol 11: NaOH 0.2 M, SOS aI1%. Sol 111: Acetato de potasio 1.32 M pH 5.2 (llevar a este pH con ácido acético). H20 pH -8.0: Tris 100 11M pH 8.0. Oesfosforilaciones La reacción de desfosforilación se lleva a cabo con 1 U de la fosfatasa intestinal de becerro, CIP (no poner más de esta enzima, dado que de poner, por ejemplo, 2 U, se forma una nata muy grande de ella difícil de sortear al extraer con fenol y cloroformo), en un volumen de 100 IlL durante 1 hora. (En caso de vectores digeridos con EcoRI, esta endonucleasa debe ser desactivada previamente a la desfosforilación, dado que en el amortiguador de la fosfatasa alcalina puede presentar actividad de estrella). Extracción de AON con fenol y cloroformo A los 100 IlL de AON (e.g., de la reacción de desfosforilación) se le añaden 100 IlL de fenol-cloroformo 1:1 y se mezcla en el vórtex. Se centrifuga a 14,000 rpm 3 minutos. Se recuperan 80 IlL de fase acuosa. Se añaden 80 IlL de TE (Tris 10 mM, EOTA 1 mM) pH 8 a la fase orgánica. Se mezcla y se centrifuga. Se recuperan 80 IlL de fase acuosa. Se añaden 160 IlL de fenol:cloroformo a la fase acuosa. Se recuperan 140 IlL de ella. Se añaden 140 IlL de TE pH 8 a la fase orgánica. Se recuperan 140 IlL de fase acuosa. Se añaden 280 IlL de cloroformo a la fase acuosa. Se recuperan 260 IlL de fase acuosa. Se añaden 260 IlL de TE pH 8 a la fase orgánica. Se recuperan 260 IlL de fase acuosa. En total se tienen 520 IlL de TE con el AON, los cuales se colocan en un tubo de 2 mL. A éste se le añaden 1 IlL de glucógeno 20 IlgIIlL, 52 IlL de acetato de sodio 3 M pH 5.2 Y 1144 IlL de etanol absoluto (volumen total de 1717 IlL). Se deja precipitando a -20 oC 1 hora, se centrifuga a 4 oC 10 minutos, se lava 2X con 1 mL de etanol al 70% y se residuelve en 30 IlL de Tris 100 11M pH 8. Luego, si se trata de un vector de clonación, el AON desfosforilado y limpio se corre en un gel de agarosa y se recupera su banda, con la finalidad de no acarrear vectores no digeridos. Nota: el fenol debe estar equilibrado a un pH de 8.0 y haber sido teñido con hidroxiquinolina al 0.1 %; el AON se va hacia la fase orgánica si el pH es bajo. Recuperación de bandas de AON electroforadas en geles de agarosa Se utilizó el kit QIAEx 11 Gel extraction de Qiagen para este propósito. No se deben utilizar tubos eppendorf de 2 sino de 1.5 mL para recuperar eficientemente el eluato con el AON (en tubos de 2 mL, la resina no queda bien separada espacialmente del eluato). Marcaje radiactivo de sondas de AON a. AON de cadena doble: Se usó un kit de marcaje de AON con oligos hexaméricos de secuencia aleatoria (Boehringer Mannheim) y [a.-32p]-dCTP, generalmente 10 IlCi (-3000 Ci/mmol) para marcar 100 ng de AON bicatenario. El isótopo no incorporado se removió con columnas de Sephadex Gel-Spin SS50 (Worthington Biochemical Corporation). 112 b. Oligos: Se marcaron generalmente 100 ng de oligos con 10 J.lCi de [y-32p]_dCTP (-3000 Ci/mmol) y 10 unidades de la cinasa de polinucleótidos (PNK, sin actividad de fosfatasa de 3' de Boehringer Mannheim) en un volumen de 20 J.lL. La reacción se incuba a 37 oC 1 hora. El isótopo no incorporado se removió con columnas de Sephadex Gel-Spin SS25 (Worthington Biochemical Corporation). Medición de la actividad del promotor Transfección con CaP04 Las células Rat-1 ó lsEs fueron plaqueadas a una densidad de 20,000 células/cm2 en placas circulares de 100 mm de diámetro y transfectadas un día después con 5 J.lg de ADN siguiendo el protocolo estándar de fosfato de calcio (Ausubel et al., 1996). Otro día después, las células fueron lisadas para medirles la actividad de luciferasa. Transfección con LipofectAMINA-Plus Se sembraron células C2C12 a una densidad de 6,000 células/cm2 en placas de 6 pozos (10 cm2 de área c/pozo; a cada uno se le añaden 2 mL de medio de crecimiento) de la marca Corning -las de la marca Nunc no sirven para generar miotubos, dado que éstos no se adhieren bien al sustratcr en medio de crecimiento. En total, se usaron 4 placas de 6 pozos cada una, la mitad de los pozos de una placa para medir el reportero de betaglicano y la otra para medir el de miogenina, y una placa por día de diferenciación par, hasta el sexto. Dos días después, las células se lavaron 2 veces con 2 mL de OptiMEM I Y se dejaron en 1 mL de este medio para su transfección. Las células de cada pozo se transfectaron con 5 J.lg del plásmido pBG-Lux, pMygn-Lux (que contiene un segmento de 670 pb correspondiente al promotor de la miogenina, bases +55 a -615, y subclonado en pGL3-B, Riquelme et al., 2001) ó vector vacío (pGL3-B), y 10 ng del vector pRL-SV40 (que expresa a la luciferasa de Renilla bajo el control del promotor SV40 y permite normalizar la eficacia de transfección). Cada dueto de plásmidos se mezcló con 125 J.lL de OptiMEM I (por pozo) en un tubo Falcon de 15 mL estéril mediante la formación de un remolino en el interior del tubo; la mezcla resultante se transfirió a una jeringa estéril de la marca Plastipak de 3 mL (una vez que se tomó la mayor cantidad posible de volumen, se puso la jeringa con la aguja viendo hacia arriba y se succionó aire para recuperar la mezcla que quedó en la aguja) y se filtró con un filtro de pirinola Schleicher & Schuell de 0.22 J.lM de tamaño de poro. Cada solución filtrada se virtió en tubos estériles de 15 mL. Luego se añadieron 4 J.lL del reactivo Plus a los >125 J.lL de (OptiMEM I + ADN) / pozo, la mezcla se agitó manualmente sin invertir el tubo y se dejó incubar 15 minutos. Mientras, se preparó la mezcla de LipofectAMINA con OptiMEM 1: se mezclaron 6 J.lL de LipofectAMINA con 125 J.lL de OptiMEM I por pozo a transfectar en un tubo de 15 mL mediante agitación manual. Después de transcurridos los 15 minutos mencionados arriba, se mezclaron en tubos de 15 mL el ADN+Plus con la LipofectAMINA (simplemente se virtió el contenido de un tubo en el otro) y de nuevo se dejó incubar durante 15 minutos. Se añadió lentamente la mezcla de transfección (240 J.lL) al centro de los pozos con agitación manual, circular y suave, y luego se pusieron las células en un ambiente de CO2 al 5%. Transcurridas 5 horas en ese ambiente, se añadieron 139 J.lL de SFB y 7 J.lL de EEP para tenerlos en concentraciones finales de 10 y 0.5%, respectivamente, y se regresaron a un ambiente de CO2 al 8%. Después de -15 horas, las células fueron lavadas 3X2 mL con una solución de sales balanceadas de Hanks; el medio de crecimiento les fue devuelto (2 mL) a las células del día O de diferenciación (estas células se cosechan en realidad al día 1, pero se pueden considerar como del día O de 113 diferenciación dado que permanecen en medio de crecimiento y su confluencia es como del 60-70%), mientras que a las de los días 2, 4 Y 6 se les añadieron 2 mL (por pozo) de medio de diferenciación. Un día después, las células del día O fueron lisadas, mientras que dos días después de haber añadido el medio de diferenciación se lisaron las del día 2, a la vez que se añadió medio nuevo de diferenciación a las de los días 4 y 6, pero esta vez con AraC a una concentración final de 1 mM, y así hasta el día 6. Cabe señalar que no se procede a transfectar miotubos porque no se transfectan bien. Para lisar las células, éstas se deben lavar una vez con 2 mL de PBS a 4 oC. En particular con los miotubos, se debe tener mucho cuidado de no desprender las células de su sustrato cuando se les añade el PBS: éste se debe añadir por la pared del pozo con una pipeta. Luego de haber lavado las células con PBS, se les añaden 200 ~L del passive Iysis buffer (PLB) y se dejan agitando 15 minutos en el aparato "sube y baja", luego de los cuales se aprecia una masa blanca insoluble de consistencia chiclosa. Todo ellisado, incluyendo el "chicle", se pasa a un tubo eppendorf y se almacena a -20 oC hasta su uso. Tratamiento con hormonas Los mioblastos C2C12 se sembraron a una densidad de 6,000 células/cm2 en pozos de placas de 6 de éstos en medio de crecimiento. Dos días después, se transfectaron como se describió en el párrafo anterior con los plásmidos pBG-Lux o pMygn-Lux. Un día después de haberlos transfectado, los mioblastos de cada pozo se lavaron con 2X2 mL de HBSS, se tripsinizaron con 200 ~L de tripsina 1X, se les añadieron 3 mL de medio de crecimiento, se pipetearon varias veces para despegarlos bien de la placa y se colectaron los que se transfectaron con un mismo plásmido en un tubo Falcon de 50 mL, se disgregaron unos de otros pasándolos por una jeringa con aguja 3 veces y se resembraron en placas de 24 pozos con 1 mL de medio de crecimiento en cada pozo (las células de un pozo de la placa de 6 pozos -a una confluencia como del 95%-, alcanzan para 6 pozos de la placa de 24 pozos). Al día siguiente, se aspiró el mililitro de medio de crecimiento de los pozos, se lavaron las células con 3X1 mL de HBSS, se adicionaron 300 ~L de medio de crecimiento o de diferenciación, se aplicaron varios tratamientos hormonales a las células y luego de 24 horas se añadieron 200 ~L de PLB para lisar las células y medir la actividad de luciferasa. Concentraciones finales de las hormonas: ácido retinoico: 1 ~M; TGF-p1, -p2 Y -p3: 40 pM (1 ng/mL); bFGF: 3 ng/mL; vehículo de TGF-p: BSA en HCI; HGF/SF: 3 ng/mL; BMP-2: 1 nM; butirato: 2 mM. Cotransfecciones Los mioblastos C2C12 se sembraron a una densidad de 6,000 células/cm2 en placas de 6 pozos en medio de crecimiento. Dos días después, las células de cada pozo fueron transfectadas con 4 ~g de pBG-Lux o pGL3-Basic; 4 ~g de los plásmidos de expresión dirigida por el promotor MSV pEMSV-MyoD, pEMSV-miogenina o pEMSVa.2-scribe (el vector de los dos insertos anteriores, autoligado después de haberle quitado el inserto de los sitios EcoRI; éstos tres fueron obsequios del Dr. Stephen Konieczny de la Universidad de Purdue); y 10 ng del plásmido pRL-SV40. Después de la transfección, se procedió a manipular las células como se describió antes. Medición de la actividad de luciferasa de luciérnaga y de Renilla La actividad de las luciferasas de luciérnaga y de Renilla se midió con el Dua/-Iuciferase reporter assay kit de Promega. Se colocan en un tubo de vidrio 20 ~L del lisado celular en passive Iysis buffer (PLB) (en caso de que se requiera diluir la muestra, se debe hacer también en PLB 1X) y se les añaden 100 ~L de la solución LARII 0.5X, se mezcla con la micropipeta 7 veces -teniendo el tubo en posición vertical, no inclinada- y se mide en el 114 luminómetro la intensidad de luz durante 10 segundos. Luego, se añaden 100 J.lL del stop & glow buffer (S&G) a una concentración 0.5X, se mezcla en el vórtex 3 segundos y se mide de nuevo la intensidad de luz, sólo que esta vez durante 5 segundos. Tanto el PLB como el S&G son sensibles a la luz, por lo que su manipulación debe hacerse en oscuridad. Para normalizar la actividad de la luciferasa de luciérnaga a la de Renilla se dividió el valor de la primera entre la segunda. Cada experimento se llevó a cabo una sola vez con tres réplicas por condición y en las barras se presenta la desviación estándar de las mediciones. Nota importante: En una muestra, la medición de la actividad de luciferasa debe hacerse cuando aún la totalidad del sustrato presente no ha sido transformada en producto, sino cuando el sustrato está apenas en vías hacia esa conversión total. Dado que el producto generado va aumentando conforme transcurre el tiempo desde el momento en que se mezclan luciferasa y luciferina, una misma muestra daría valores gradualmente mayores de actividad en función del tiempo que uno tarde en meter la muestra al luminómetro. Por eso, la actividad de luciferasa debe medirse inmediatamente después de haber mezclado los componentes de cada reacción, de modo que la lectura sea un reflejo bona fide de la cantidad de luciferasa presente en la muestra. Transducción con adenovirus Se utilizó el adenovirus Adv-BG -que expresa al betaglicano silvestre de rata- generado por el LlBB Gerardo Núñez González. Brevemente, la estrategia para la construcción de este adenovirus fue subclonar un segmento continuo del ADNc de betaglicano de rata que comprende 186 bases de la región 5'-NT, la región codificante completa y 513 bases de la región 3'-NT en los sitios Notl-Hindlll de pAdenoTrack. El vector de transferencia resultante se recombinó con pAdenoEasy1 y el genoma adenoviral recombinante fue transfectado a células 293, de donde se recuperó el virus recombinante (Adv-BG). Los vectores adenovirales y las cepas celulares para ellos fueron obsequios del Dr. Bert Vogelstein (Johns Hopkins University Oncology Center); el método empleado se describe en He et al., 1998. Para transducir mioblastos con el Adv-BG o con el adenovirus vacío, se plaquearon mioblastos a una densidad de 8,000 células/cm2 en botellas de 25 cm2 • Ambos adenovirus expresan además la proteína verde fluorescente (GFP). Después de 24 horas, las células se incubaron con 2X 107 unidades formadoras de placas (pfu) de los genomas adenovirales (100 pfu/célula) en 1.3 mL de DMEM/F-12 con SFB al 2% descomplementado 30' a 56 oC. Los mioblastos se dejaron transduciendo durante 1.5 horas a 37 oC con CO2 al 8% y humedad al 95%, y luego de este tiempo se les agregaron 4 mL de medio de crecimiento a las botellas para finalizar la transducción. Después de 24 horas, se retiró el medio de crecimiento y se añadió nuevo (4 mL). Luego de ser transducidos con los adenovirus Adv-BG o con el adenovirus vacío como control negativo, mioblastos cultivados en pozos de 10 cm2 de área (8,000 células/cm 2 ) fueron transfectados con 2 J.lg de la construcción p3TP-Lux -que contiene parte de la región promotora del gen del inhibidor del activador del plasminógeno I (PAI-I) fusionada con el ADNc de la luciferasa de luciérnaga- y 10 ng de pRL-SV40 por pozo. Marcas de los reactivos El HGF/SF y las isoformas TGF-~1 , TGF-~2 Y TGF-~3 recombinantes fueron obtenidas de R&D Systems (Minneapolis, Minnesota). Las sales balanceadas de Hanks (HBSS), el AraC y el ácido retinoico todo en trans fueron comprados a Sigma (Saint Louis, Missouri). El BMP-2 fue un obsequio del Genetic Institute en Cambridge, Massachusetts. El 115 proveedor del bFGF humano, del DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium), del DMEM/F-12 (1:1) (Dulbecco's modified Eagle's medium: nutrient mixture F-12 (Ham), del OptiMEM 1, del suero de feto bovino (SFB), del suero de caballo (SC), del extracto de embrión de pollo filtrado a 60 A (EEP), de la mezcla de antibióticos y antimicóticos 100X, del Trizol y de la LipofectAMINA-Plus fue Gibco (Grand Island, NuevaYork). En caso de contar con OptiMEM I en polvo, se mezclan 6.8 9 de éste con 1.2 9 de bicarbonato de sodio (NaHC03) en -500 mL de H20 ultrapura, se ajusta el pH a 7.1 y se esteriliza por filtración con vacío. Los vectores pGL3-Basic y pRL-SV40 y el Dual-Iuciferase reporter assay system fueron comprados a Promega (Madison, Wisconsin). 116 pBR322pl 3766 bp Plasmid name: pBR322pl Plasmid size: 3766 bp Constructed by: Kornelia Potyak Construction date: 1/97 Comments/References: Generated from pBR322 by replacing EcoRI-Sall fragment with a -SObp oligo containing MCS. AlI sites in MCS are unique. 117 pBlueScript 11 KS(+): GenBank #52327 ampicíllin pBluescript 11 KS (+/-) Muhiple Cloning Site Region (sequence shown 598-826) Kpn I NoI I B.sH 11 T7 Promofer $oc 1 B.iX I Soc 11 I Eac ~ I X' ''' 1 I I .. I I I I ' I TTGTAAAACGACGGCCAGTGAGCGCGCGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGA .. . M13 -20 primer bindingm! 17 primer binding siie • SK po", .. bcnding .ote._ Hinc li Apa I &plO6 I Acc f Eco01091 S~ 1 Bom.H 1 Sma I Psi 1 Ec.oR 1 EcaR \' Hind 111 CI .. I Sol I )(ha 1 DI'<> fI Kpn I I I I I I I I I I I I I .. . ACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGGGGGGCCCGGTACC •.. . .. SK primer binding ~it~ • KS primer btnding ¡·ae .... __ T.;.;;:J;.;.I'romofe=;;;;· ;r:.,.· __ ..,BssH 11 ,Il-gal o.-fragmenf ..... 11'" I •.• CAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCC • T3 primerbinding silo 'M13 Re-o'Orse primed,;nd i"!l " le 118 SV40 late poly(A) signal (for luc+ reporter) Hpa 11902 1883 BamH I 1631 Xbal Xba 11742 pGl3-8asic Vector (4818bp) pRl-SV40 Vector (3705bp) Synthetic poly(A) signél:l/ transcriptional pause slte ~ for background reduction) Kpnl 5 f1 ori Sac 1 11 Mlu 1 15 Me 1 21 Sma 1 28 Xho 1 32 8g/ll 36 Hind 111 53 BgllI 1 Kpnl58 Nhe 1684 Csp451700 119 11. Referencias Abreu JG, Ketpura NI, Reversade B, De Robertis EM. Connective-tissue growth factor (CTGF) modulates cell signalling by BMP and TGF-p. Nat Cel/ Bio/2002 Aug; 4(8): 599-604. Abzhanov A, Protas M, Grant BR, Grant PR, Tabin CJ. Bmp4 and morphological variation of beaks in Oarwin's finches. Science 2004 Sep 3; 305(5689): 1462-5. Ai X, Do AT, Lozynska 0, Kusche-Gullberg M, Lindahl U, Emerson CP Jr. QSulf1 remodels the 6-0 sulfation states of cell surface heparan sulfate proteoglycans to promote Wnt signaling. J Cel/ Biol 2003 Jul 21; 162(2): 341-51. Aitola M, Carlsson P, Mahlapuu M, Enerback S, Pelto-Huikko M. Forkhead transcription factor FoxF2 is expressed in mesodermal tissues involved in epithelio-mesenchymal interactions. Dev Dyn 2000 May; 218(1): 136-49. Akhurst RJ, Lehnert SA, Faissner A, Ouffie E. TGFp in murine morphogenetic processes: the early embryo and cardiogenesis. Development 1990 Apr; 108(4): 645-56. Alberts, Bruce, Oennis Bray, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and James O. Watson. Molecular Biology of the Cell. 3rd . ed. New York: Garland Publishing, 1994. AIIiston T, Choy L, Oucy P, Karsenty G, Oerynck R. TGF-p-induced repression of CBFA1 by Smad3 decreases cbfa1 and osteocalcin expression and inhibits osteoblast differentiation. EMBO J 2001 May 1; 20(9): 2254-72. Alric S, Froeschle A, Piquemal O, Carnac G, Bonnieu A. Functional specificity of the two retinoic acid receptor RAR and RXR families in myogenesis. Oncogene 1998 Jan 15; 16(2): 273-82. Anastasi S, Giordano S, Sthandier 0, Gambarotta G, Maione R, Comoglio P, Amati P. A natural hepatocyte growth factorlscatter factor autocrine loop in myoblast cells and the effect of the constitutive Met kinase activation on myogenic differentiation. J Cel/ Bio/1997 Jun 2; 137(5): 1057-68. Andres JL, Stanley K, Cheifetz S, Massagué J. Membrane-anchored and soluble forms of betaglycan, a polymorphic proteoglycan that binds transforming growth factor-p. J Cel/ Biol 1989 Oec; 109(6 Pt 1): 3137-45. Andres JL, Ronnstrand L, Cheifetz S, Massagué J. Purification of the transforming growth factor-p (TGF-P) binding proteoglycan betaglycan. J Biol Chem 1991 Oec 5; 266(34): 23282-7. Andres JL, OeFalcis O, Noda M, Massagué J. Binding of two growth factor families to separate domains of the proteoglycan betaglycan. J Biol Chem 1992 Mar 25; 267(9): 5927-30. Antonelli-Orlidge A, Saunders KB, Smith SR, O'Amore PA. An activated form of transforming growth factor p is produced by cocultures of endothelial cells and pericytes. Proc Natl Acad Sci U S A 1989 Jun; 86(12): 4544-8. Armes NA, Smith JC. The ALK-2 and ALK-4 activin receptors transduce distinct mesoderm-inducing signals during early Xenopus development but do not co-operate to establish thresholds. Development 1997 Oct; 124(19): 3797-804. Arrick BA, Lee AL, Grendell RL, Oerynck R. Inhibition of translation of transforming growth factor-p3 mRNA by its 5' untranslated region. Mol Cel/ Bio/1991 Sep; 11 (9): 4306-13. Assoian RK, Komoriya A, Meyers CA, Miller OM, Sporn MB. Transforming growth factor-p in human platelets. Identification of a major storage site, purification, and characterization. J Biol Chem 1983 Jun 10; 258(11): 7155-60. Atchley WR, Fitch WM, Bronner-Fraser M. Molecular evolution of the MyoO family of transcription factors. Proc Natl Acad Sci U S A 1994 Nov 22; 91(24): 11522-6. Atfi A, Buisine M, Mazars A, Gespach C. Induction of apoptosis by OPC4, a transcriptional factor regulated by transforming growth factor-p through stress-activated protein kinase/c-Jun N-terminal kinase (SAPKlJNK) signaling pathway. J Biol Chem 1997 Oct 3; 272(40): 24731-4. Attisano L, Cárcamo J, Ventura F, Weis FM, Massagué J, Wrana JL. Identification of human activin and TGF p type I receptors that form heteromeric kinase complexes with type 11 receptors. Cel/1993 Nov 19; 75(4): 671-80. Attisano L, Tuen Lee-Hoeflich S. The Smads. Genome Bio/2001; 2(8): REVIEWS3010. Ausubel, FA, Brent, R., Kingston, R.E., Moore, 0.0., Seidman, J.G., Smith, J.A., and Struhl, K. (eds.). Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley & Sons, 1996. Bae HW, Geiser AG, Kim OH, Chung MT, Burmester JK, Sporn MB, Roberts AB, Kim SJ. Characterization of the promoter region of the human transforming growth factor-p type 11 receptor gene. J Biol Chem 1995 Oec 8; 270(49): 29460-8. Bakin AV, Tomlinson AK, Bhowmick NA, Moses HL, Arteaga CL. Phosphatidylinositol 3-kinase function is required tor transtorming growth factor p-mediated epithelial to mesenchymal transition and cell migration. J Biol Chem 2000 Nov 24; 275(47): 36803-10. 120 11. Referencias Abreu JG, Ketpura NI, Reversade B, Oe Robertis EM. Connective-tissue growth factor (CTGF) modulates cell signalling by BMP and TGF-p. Nat Cell Bio/2002 Aug; 4(8): 599-604. Abzhanov A, Protas M, Grant BR, Grant PR, Tabin CJ. Bmp4 and morphological variation of beaks in Oarwin's finches. Science 2004 Sep 3; 305(5689): 1462-5. Ai X, 00 AT, Lozynska O, Kusche-Gullberg M, Lindahl U, Emerson CP Jr. QSulf1 remodels the 6-0 sulfation states of cell surface heparan sulfate proteoglycans to promote Wnt signaling. J Cell Bio/2003 Jul 21 ; 162(2): 341-51 . Aitola M, Carlsson P, Mahlapuu M, Enerback S, Pelto-Huikko M. Forkhead transcription factor FoxF2 is expressed in mesodermal tissues involved in epithelio-mesenchymal interactions. Dev Dyn 2000 May; 218(1): 136-49. Akhurst RJ, Lehnert SA, Faissner A, Ouffie E. TGFp in murine morphogenetic processes: the early embryo and cardiogenesis. Development 1990 Apr; 108(4): 645-56. Alberts, Bruce, Oennis Bray, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and James D. Watson. Molecular Biology of the Cell. 3rd . ed. New York: Garland Publishing, 1994. Alliston T, Choy L, Oucy P, Karsenty G, Oerynck R. TGF-p-induced· repression of CBFA1 by Smad3 decreases cbfa1 and osteocalcin expression and inhibits osteoblast differentiation. EMBO J 2001 May 1; 20(9): 2254-72. Alric S, Froeschle A, Piquemal O, Camac G, Bonnieu A. Functional specificity of the two retinoic acid receptor RAR and RXR families in myogenesis. Oncogene 1998 Jan 15; 16(2): 273-82. Anastasi S, Giordano S, Sthandier O, Gambarotta G, Maione R, Comoglio P, Amati P. A natural hepatocyte growth factorlscatter factor autocrine loop in myoblast cells and the effect of the constitutive Met kinase activation on myogenic differentiation. J Cel/ Bio/1997 Jun 2; 137(5): 1057-68. Andres JL, Stanley K, Cheifetz S, Massagué J. Membrane-anchored and soluble forms of betaglycan, a polymorphic proteoglycan that binds transforming growth factor-p. J Cel/ Bio/1989 Oec; 109(6 Pt 1): 3137-45. Andres JL, Ronnstrand L, Cheifetz S, Massagué J. Purification of the transforming growth factor-p (TGF-P) binding proteoglycan betaglycan. J Biol Chem 1991 Oec 5; 266(34): 23282-7. Andres JL, OeFalcis O, Noda M, Massagué J. Binding of two growth factor families to separate domains of the proteoglycan betaglycan. J Biol Chem 1992 Mar 25; 267(9): 5927-30. Antonelli-Orlidge A, Saunders KB, Smith SR, O'Amore PA. An activated form of transforming growth factor p is produced by cocultures of endothelial cells and pericytes. Proc Natl Acad Sci U S A 1989 Jun; 86(12): 4544-8. Armes NA, Smith JC. The ALK-2 and ALK-4 activin receptors transduce distinct mesoderm-inducing signals during early Xenopus development but do not co-operate to establish thresholds. Development 1997 Oct; 124(19): 3797-804. Arrick BA, Lee AL, Grendell RL, Oerynck R. Inhibition of translation of transforming growth factor-p3 mRNA by its 5' untranslated region. Mol Cel/ Bio/1991 Sep; 11(9): 4306-13. Assoian RK, Komoriya A, Meyers CA, Miller OM, Spom MB. Transforming growth factor-p in human platelets. Identification of a major storage site, purification, and characterization. J Biol Chem 1983 Jun 10; 258(11): 7155-60. Atchley WR, Fitch WM, Bronner-Fraser M. Molecular evolution of the MyoO family of transcription factors. Proc Natl Acad Sci U S A 1994 Nov 22; 91 (24): 11522-6. Atfi A, Buisine M, Mazars A, Gespach C. Induction of apoptosis by OPC4, a transcriptional factor regulated by transforming growth factor-p through stress-activated protein kinase/c-Jun N-terminal kinase (SAPKlJNK) signaling pathway. J Biol Chem 1997 Oct 3; 272(40): 24731-4. Attisano L, Cárcamo J, Ventura F, Weis FM, Massagué J, Wrana JL. Identification of human activin and TGF p type I receptors that form heteromeric kinase complexes with type 11 receptors. Cel/1993 Nov 19; 75(4): 671-80. Attisano L, Tuen Lee-Hoeflich S. The Smads. Genome Bio/2001; 2(8): REVIEWS3010. Ausubel, FA, Brent, R., Kingston, R.E., Moore, 0.0 ., Seidman, J.G., Smith, J.A., and Struhl, K. (eds.). Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley & Sons, 1996. Bae HW, Geiser AG, Kim OH, Chung MT, Burmester JK, Spom MB, Roberts AB, Kim SJ. Characterization of the promoter region of the human transforming growth factor-p type 11 receptor gene. J Biol Chem 1995 Oec 8; 270(49): 29460-8. Bakin AV, Tomlinson AK, Bhowmick NA, Moses HL, Arteaga CL. Phosphatidylinositol 3-kinase function is required for transforming growth factor p-mediated epithelial to mesenchymal transition and cell migration. J Biol Chem 2000 Nov 24; 275(47): 36803-10. 121 Brown CB, Boyer AS, Runyan RB, Barnett JV. Requirement of type 111 TGF-p receptor for endocardial cell transformation in the heart. Seienee 1999 Mar 26; 283(5410): 2080-2. Buckingham M. Skeletal muscle formation in vertebrates. Curr Opin Genet Dev 2001 Aug; 11 (4): 440-8. Cadoret A, Ovejero C, Saadi-Kheddouci S, Souil E, Fabre M, Romagnolo B, Kahn A, Perret C. Hepatomegaly in transgenic mice expressing an oncogenic form of p-catenin. Caneer Res 2001 Apr 15; 61 (8): 3245-9. Camargo FD, Green R. Capetanaki Y, Jackson KA, Goodell MA. Single hematopoietic stem cells generate skeletal muscle through myeloid intermediates. Nat Med 2003 Dec; 9(12): 1520-7. Caver TE, O'Sullivan FX, Gold LI, Gresham HD. Intracellular demonstration of active TGFp1 in B cells and plasma cells of autoimmune mice. IgG-bound TGFp1 suppresses neutrophil function and host defense against Staphylococcus aureus infection. J Clin Invest 1996 Dec 1; 98( 11): 2496-506. Centrella M, McCarthy TL, Canalis E. Transforming growth factor p is a bifunctional regulator of replication and collagen synthesis in osteoblast-enriched cell cultures from fetal rat bone. J Biol Chem 1987 Feb 25; 262(6): 2869-74. Centrella M, McCarthy TL, Canalis E. Parathyroid hormone modulates transforming growth factor p activity and binding in osteoblast-enriched cell cultures from fetal rat parietal bone. Proc Natl Aead Sci U S A 1988 Aug; 85(16): 5889-93. Centrella M, McCarthy TL, Canalis E. Glucocorticoid regulation of transforming growth factor p1 activity and binding in osteoblast-enriched cultures from fetal rat bone. Mol Cel/ Bio/1991 Sep; 11 (9): 4490-6. Centrella M, Horowitz MC, Wozney JM, McCarthy TL. Transforming growth factor-p gene family members and bone. Endoer Rev 1994 Feb; 15(1): 27-39. Centrella M, Casinghino S, Kim J, Pham T, Rosen V, Wozney J, McCarthy TL. Independent changes in type I and type 11 receptors for transforming growth factor p induced by bone morphogenetic protein 2 parallel expression of the osteoblast phenotype. Mol Cel/ Bio/1995 Jun; 15(6): 3273-81 . Chakraborty T, Brennan TJ, Li L, Edmondson D, Olson EN. Inefficient homooligomerization contributes to the dependence of myogenin on E2A products for efficient DNA binding. Mol Cel/ Bio/1991 Jul; 11(7): 3633- 41. Chakravarthy D, Green AR, Green VL, Kerin MJ, Speirs V. Expression and secretion of TGF-p isoforms and express ion of TGF-p-receptors 1, 11 and 111 in normal and neoplastic human breast. Int J Onco/1999 Jul; 15(1): 187-94. Chapman SC, Bernard DJ, Jelen J, Woodruff TK. Properties of inhibin binding to betaglycan, InhBP!p120 and the activin type 11 receptors. Mol Cel/ Endocrino/2002 Oct 31 ; 196(1-2): 79-93. Cheifetz S, Like B, Massagué J. Cellular distribution of type I and type 11 receptors for transforming growth factor-p. J Biol Chem 1986 Ju125; 261(21): 9972-8. Cheifetz S, Weatherbee JA, Tsang ML, Anderson JK, Mole JE, Lucas R, Massagué J. The transforming growth factor-p system, a complex pattern of cross-reactive ligands and receptors. Cel/ 1987 Feb 13; 48(3): 409-15. Cheifetz S, Andres JL, Massagué J. The transforming growth factor-p receptor type 111 is a membrane proteoglycan. Domain structure of the receptor. J Biol Chem 1988 Nov 15; 263(32): 16984-91 . Cheifetz S, Massagué J. Transforming growth factor-p (TGF-P) receptor proteoglycan. Cell surface express ion and ligand binding in the absence of glycosaminoglycan chains. J Bio! Chem 1989 Jul 15; 264(20): 12025-8. Cheifetz S, Massagué J. Isoform-specific transforming growth factor-p binding proteins with membrane attachments sensitive to phosphatidylinositol-specific phospholipase C. J Biol Chem 1991 Nov 5; 266(31): 20767-72. Cheifetz S, Bellon T, Cales C, Vera S, Bemabeu C, Massagué J, Letarte M. Endoglin is a component of the transforming growth factor-p receptor system in human endothelial cells. J Biol Chem 1992 Sep 25; 267(27): 19027-30. Chen C, Wang XF, Sun L. Expression of transforming growth factor p (TGFP) type 111 receptor resto res autocrine TGFp1 activity in human breast cancer MCF-7 cells. J Biol Chem 1997 May 9; 272(19): 12862- 7. Chen EH, Pryce BA, Tzeng JA, González GA, Olson EN. Control of myoblast fusion by a guanine nucleotide exchange factor, loner, and its effector ARF6. Cel/2003 Sep 19; 114(6): 751-62. Chen F, Weinberg RA. Biochemical evidence for the autophosphorylation and transphosphorylation of transforming growth factor preceptor kinases. Proc Natl Acad Sci U S A 1995 Feb 28; 92(5): 1565-9. Chen RH, Ebner R. Derynck R. Inactivation of the type 11 receptor reveals two receptor pathways for the diverse TGF-p activities. Seience 1993 May 28; 260(5112): 1335-8. Chen RH, Derynck R. Homomeric interactions between type 11 transforming growth factor-p receptors. J Biol Chem 1994 Sep 9; 269(36): 22868-74. Chen RH, Moses HL, Maruoka EM, Derynck R, Kawabata M. Phosphorylation-dependent interaction of the cytoplasmic domains of the type I and type II transforming growth factor-p receptors. J Biol Chem 1995a May 19; 270(20): 12235-41 . 122 Chen RH, Miettinen PJ, Maruoka EM, Choy L, Derynck R. A WD-domain protein that is associated with and phosphorylated by the type 11 TGF-p receptor. Nature 1995b Oct 12; 377(6549): 548-52. Chen RH, Su YH, Chuang RL, Chang TY. Suppression of transforming growth factor-p-induced apoptosis through a phosphatidylinositoI3-kinase/Akt-dependent pathway. Oncogene 1998 Oct 15; 17(15): 1959-68. Chen S, Guttridge OC, You l, lhang l, Fribley A, Mayo MW, Kitajewski J, Wang CY. Wnt-1 signaling inhibits apoptosis by activating p-cateninlT cell factor-mediated transcription. J Cell Bio/2001 Jan 8; 152(1): 87- 96. Che n W, ten Berge O, Brown J, Ahn S, Hu LA, Miller WE, Caron MG, Barak LS, Nusse R, Lefkowitz RJ. Dishevelled 2 recruits p-arrestin 2 to mediate Wnt5A-stimulated endocytosis of Frizzled 4. Science 2003a Sep 5; 301(5638): 1391-4. Chen W, Kirkbride KC, How T, Nelson CD, Mo J, Frederick JP, Wang XF, Lefkowitz RJ, Blobe GC. p-arrestin 2 mediates endocytosis of type 111 TGF-p receptor and down-regulation of its signaling. Science 2003b Sep 5; 301(5638): 1394-7. Chen X, Rubock MJ, Whitman M. A transcriptional partner for MAD proteins in TGF-p signalling. Nature 1996 Oct 24; 383(6602): 691-6. Erratum in: Nature 1996 Dec 19-26; 384(6610): 648. Chen Y, Li X, Eswarakumar VP, Seger R, Lonai P. Fibroblast growth factor (FGF) signaling through PI 3- kinase and AkVPKB is required for embryoid body differentiation. Oncogene 2000 Aug 3; 19(33): 3750-6. Choy L, Skillington J, Derynck R. Roles of autocrine TGF-p receptor and Smad signaling in adipocyte differentiation. J Cell Bio/2000 May 1; 149(3): 667-82. Choy L, Derynck R. Transforming growth factor-p inhibits adipocyte differentiation by Smad3 interacting with CCAAT/enhancer-binding protein (C/EBP) and repressing C/EBP transactivation function. J Bio/ Chem 2003 Mar 14; 278(11): 9609-19. Christ M, McCartney-Francis NL, Kulkarni AB, Ward JM, Mizel DE, Mackall CL, Gress RE, Hines KL, Tian H, Karlsson S. Immune dysregulation in TGF-p1-deficient mice. J /mmuno/1994 Sep 1; 153(5): 1936-46. Cochet C, Feige JJ, Chambaz EM. Bovine adrenocortical cells exhibit high affinity transforming growth factor- p receptors which are regulated by adrenocorticotropin. J Bio/ Chem 1988 Apr 25; 263(12): 5707-13. Conery AR, Cao Y, Thompson EA, Townsend CM Jr, Ko TC, Luo K. Akt interacts directly with Smad3 to regulate the sensitivity to TGF-p induced apoptosis. Nat Ce" Bio/2004 Apr; 6(4): 366-72. Corbeil HB, Whyte P, Branton PE. Characterization of transcription factor E2F complexes during muscle and neuronal differentiation. Oncogene 1995 Sep 7; 11(5): 909-20. Cossu G, Borello U. Wnt signaling and the activation of myogenesis in mammals. EMBO J 1999 Dec 15; 18(24): 6867-72. Crawford SE, Stellmach V, Murphy-Ullrich JE, Ribeiro SM, Lawler J, Hynes RO, Boivin GP, Bouck N. Thrombospondin-1 is a major activator ofTGF-p1 in vivo. Ce" 1998 Jun 26; 93(7): 1159-70. Cui XM, Shuler CF. The TGF-p type 111 receptor is localized to the medial edge epithelium during palatal fusiono /nt J Dev Bio/2000 Jun; 44(4): 397-402. Czarniecki CW, Chiu HH, Wong GH, McCabe SM, Palladino MA. Transforming growth factor-p1 modulates the expression of class 11 histocompatibility antigens on human cells. J /mmuno/1988 Jun 15; 140(12): 4217-23. Dabovic B, Che n Y, Colarossi C, Obata H, lambuto L, Perle MA, Rifkin DB. Bone abnormalities in /atent TGF- P binding protein (Ltbp)-3-null mice indicate a role for Ltbp-3 in modulating TGF-p bioavailability. J Ce" Bio/2002 Jan 21; 156(2): 227-32. Dang H, Geiser AG, Letterio JJ, Nakabayashi T, Kong L, Fernández G, Talal N. SLE-like autoantibodies and Sjógren's syndrome-like Iymphoproliferation in TGF-p knockout mice. J Immuno/ 1995 Sep 15; 155(6): 3205-12. Daopin S, Piez KA, Ogawa Y, Davies DR. Crystal structure of transforming growth factor-p2: an unusual fold for the superfamily. Science 1992 Ju117; 257(5068): 369-73. Date M, Matsuzaki K, Matsushita M, Sakitani K, Shibano K, Okajima A, Yamamoto C, Ogata N, Okumura T, Seki T, Kubota Y, Kan M, McKeehan WL, Inoue K. Differential expression of transforming growth factor-p and its receptors in hepatocytes and nonparenchymal cells of rat liver after CCI4 administration. J Hepato/ 1998 Apr; 28(4): 572-81 . Datlo MB, Li Y, Panus JF, Howe DJ, Xiong Y, Wang XF. Transforming growth factor p induces the cyclin- dependent kinase inhibitor p21 through a p53-independent mechanism. Proc Natl Acad Sci U S A 1995 Jun 6; 92(12): 5545-9. Davis RL, Weintraub H, Lassar AB. Expression of a single transfected cONA converts fibroblasts to myoblasts. Ce" 1987 Dec 24; 51(6): 987-1000. De Angelis L, Borghi S, Melchionna R, Berghella L, Baccarani-Contri M, Parise F, Ferrari S, Cossu G. Inhibition of myogenesis by transforming growth factor p is density-dependent and related to the translocation of transcription factor MEF2 to the cytoplasm. Proc Natl Acad Sci U S A 1998 Oct 13; 95(21): 12358-63. 123 De Angelis L, Berghella L, Coletta M, Lattanzi L, Zanchi M, Cusella-oe Angelis MG, Ponzetto C, Cossu G. Skeletal myogenic progenitors originating from embryonic dorsal aorta coexpress endothelial and myogenic markers and contribute to postnatal muscle growth and regeneration. J Cel/ Bio/1999 Nov 15; 147(4): 869-78. de La Coste A, Romagnolo B, Billuart P, Renard CA, Buendia MA, Soubrane O, Fabre M, Chelly J, Beldjord C, Kahn A, Perret C. Somatic mutations of the p-catenin gene are frequent in mouse and human hepatocellular carcinomas. Proc Natl Acad Sci U S A 1998 Ju121; 95(15): 8847-51 . de la Pompa JL, Timmerman LA, Takimoto H, Yoshida H, Elia AJ, Samper E, Potter J, Wakeham A, Marengere L, Langille BL, Crabtree GR, Mak TW. Role of the NF-ATc transcription factor in morphogenesis of cardiac valves and septum. Nature 1998 Mar 12; 392(6672): 182-6. de Martin R. Haendler B, Hofer-Warbinek R, Gaugitsch H, Wrann M, Schlusener H, Seifert JM, Bodmer S, Fontana A, Hofer E. Complementary oNA for human glioblastoma-derived T cell suppressor factor, a novel member ofthe transforming growth factor-p gene family. EMBO J 1987 oec 1; 6(12): 3673-7. del Re E, Babitt JL, Pirani A, Schneyer AL, Lín HY. In the absence of type 111 receptor, the transforming growth factor (TGF)-P type II-B receptor requires the type I receptor to bind TGF-p2. J Biol Chem 2004 May 21 ; 279(21): 22765-72. oenef N, Neubuser O, Pérez L, Cohen SM. Hedgehog induces opposite changes in turnover and subcellular localization of patched and smoothened. Cel/2000 Aug 18; 102(4): 521-31 . oeng X, Bellis S, Van Z, Friedman E. oifferential responsiveness to autocrine and exogenous transforming growth factor (TGF) p1 in cells with nonfunctional TGF-p receptor type 111. Cel/ Growth Oiffer 1999 Jan; 10(1): 11-8. oennis PA, Rifkin oB. Cellular activation of latent transforming growth factor p requires binding to the cation- independent mannose 6-phosphate/insulin-like growth factor type 11 receptor. Proc Natl Acad Sci U S A 1991 Jan 15; 88(2): 580-4. oerynck R, Jarrett JA, Che n EY, Eaton OH, Bell JR, Assoian RK, Roberts AB, Sporn MB, Goeddel OVo Human transforming growth factor-p complementary oNA sequence and expression in normal and transformed cells. Nature 1985 Aug 22-28; 316(6030): 701-5. oerynck R. Líndquist PB, Lee A, Wen O, Tamm J, Graycar JL, Rhee L, Mason AJ, Miller DA, Coffey RJ, et al. A new type oftransforming growth factor-p, TGF-p3. EMBO J 1988 oec 1; 7(12): 3737-43. oerynck R, Gelbart WM, Harland RM, Heldin CH, Kern SE, Massagué J, Melton DA, Mlodzik M, Padgett RW, Roberts AB, Smith J, Thomsen GH, Vogelstein B, Wang XF. Nomenclature: vertebrate mediators of TGFp family signals. Cel/1996 Oct 18; 87(2): 173. oerynck R. Akhurst RJ, Balmain A. TGF-p signaling in tumor suppression and cancer progression. Nat Genet 2001 Oct; 29(2): 117-29. Erratum in Nat Genet 2001 Nov; 29(3): 351 . oerynck R. Zhang VE. Smad-dependent and Smad-independent pathways in TGF-p family signalling. Nature 2003 Oct 9; 425(6958): 577-84. ohoot GK, Gustafsson MK, Ai X, Sun W, Standiford oM, Emerson CP Jr. Regulation of Wnt signaling and embryo patterning by an extracellular sulfatase. Science 2001 Aug 31; 293(5535): 1663-6. oickson MC, Martin JS, Cousins FM, Kulkarni AB, Karlsson S, Akhurst RJ. oefective haematopoiesis and vasculogenesis in transforming growth factor-p1 knock out mice. Oevelopment 1995 Jun; 121(6): 1845- 54. oohrmann CE, Belaoussoff M, Raftery LA. oynamic express ion of TSC-22 at sites of epithelial-mesenchymal interactions during mouse development. Mech Oev 1999 Jun; 84(1-2): 147-51 . oubois CM, Laprise MH, Blanchette F, Gentry LE, Leduc R. Processing of transforming growth factor p1 precursor by human furin convertase. J Biol Chem 1995 May 5; 270(18): 10618-24. oubois CM, Blanchette F, Laprise MH, Leduc R. Grondin F, Seidah NG. Evidence that furin is an authentic transforming growth factor-p1-converting enzyme. Am J Patho/2001 Jan; 158(1): 305-16. ourocher O, Charron F, Warren R, Schwartz RJ, Nemer M. The cardiac transcription factors Nkx2-5 and GATA-4 are mutual cofactors. EMBO J 1997 Sep 15; 16(18): 5687-96. oyson S, Gurdon JB. The interpretation of position in a morphogen gradient as revealed by occupancy of activin receptors. Cel/1998 May 15; 93(4): 557-68. Ebner R, Chen RH, Shum L, Lawler S, Zioncheck TF, Lee A, L6pez AR, oerynck R. Cloning of a type I TGF-p receptor and its effect on TGF-p binding to the type 11 receptor. Science 1993a May 28; 260(5112): 1344- 8. Ebner R. Chen RH, Lawler S, Zioncheck T, oerynck R. oetermination of type I receptor specificity by the type 11 receptors forTGF-p or activin. Science 1993b Nov 5; 262(5135): 900-2. Edmondson oG, Olson EN. A gene with homology to the myc similarity region of Myo01 is expressed during myogenesis and is sufficient to activate the muscle differentiation program o Genes Oev 1989 May; 3(5): 628-40. Erratum in Genes Oev 1990 Aug; 4(8): 1450. 124 Edmondson OG, Cheng TC, Cserjesi P, Chakraborty T, Olson EN. Analysis of the myogenin promoter reveals an indirect pathway for positive autoregulation mediated by the muscle-specific enhancer factor MEF-2. Mol Ce" Bio/1992 Sep; 12(9): 3665-77. Eickelberg O, Centrella M, Reiss M, Kashgarian M, Wells RG. Betaglycan inhibits TGF-p signaling by preventing type I-type 11 receptor complex formation. Glycosaminoglycan modifications alter betaglycan function. J Biol Chem 2002 Jan 4; 277(1): 823-9. Engel ME, McOonnell MA, Law BI<, Moses HL. Interdependent SMAO and JNK signaling in transforming growth factor-p-mediated transcription. J Biol Chem 1999 Oec 24; 274(52): 37413-20. Erlebacher A, Oerynck R. Increased expression of TGF-p2 in osteoblasts results in an osteoporosis-like phenotype. J Ce" Bio/1996 Jan; 132(1-2): 195-210. Esparza López J, Montiel JL, Vilchis Landeros MM, Okadome T, Miyazono K, L6pez Casillas F. Ligand binding and functional properties of betaglycan, a co-receptor of the transforming growth factor-p superfamily. Specialized binding regions for transforming growth factor-p and inhibin A. J Biol Chem 2001 May 4; 276(18): 14588-96. Ethier JF, Farnworth PG, Findlay JK, Ooi GT. Transforming growth factor-¡3 modulates inhibin A bioactivity in the L¡3T2 gonadotrope cell line by competing for binding to betaglycan. Mol Endocrinol2002 Oec; 16(12): 2754-63. Evangelou A, Jindal SK, Brown T J, Letarte M. Oown-regulation of transforming growth factor 13 receptors by androgen in ovarian cancer cells. Cancer Res 2000 Feb 15; 60(4): 929-35. Ewen ME, Sluss HK, Whitehouse LL, Livingston OM. TGFp inhibition of Cdk4 synthesis is linked to cell cycle arrest. Ce" 1993 Sep 24; 74(6): 1009-20. Ewton OZ, Spizz G, Olson EN, Florini JR. Oecrease in transforming growth factor-p binding and action during differentiation in muscle cells. J Biol Chem 1988 Mar 15; 263(8): 4029-32. Farnworth PG, Harrison CA, Leembruggen P, Chan KL, Stanton PG, Ooi GT, Rahman NA, Huhtaniemi IT, Findlay JK, Robertson OM. Inhibin binding sites and proteins in pituitary, gonadal, adrenal and bone cells. Mol Ce" Endocrinol2001 Jun 30; 180(1-2): 63-71. Fava RA, McClure OB. Fibronectin-associated transforming growth factor. J Ce" Physio/1987 May; 131(2): 184-9. Feng XH, Lin X, Oerynck R. Smad2, Smad3 and Smad4 cooperate with Sp1 to induce p1S,nk48 transcription in response to TGF-¡3. EMBO J 2000 Oct 2; 19(19): 5178-93. Fickett Jw. Coordinate positioning of MEF2 and myogenin binding sites. Gene 1996 Jun 12; 172(1): GC19- 32. Filvaroff EH, Ebner R, Oerynck R. Inhibition of myogenic differentiation in myoblasts expressing a truncated type 11 TGF-¡3 receptor. Development 1994 May; 120(5): 1085-95. Findlay JK, Orummond AE, Oyson M, Baillie AJ , Robertson OM, Ethier JF. Production and actions of inhibin and activin during folliculogenesis in the rat. Mol Ce" Endocrinol2001 Jun 30; 180(1-2): 139-44. Fine A, Panchenko MP, Smith BO, Yu Q , Goldstein RH. Oiscordant regulation of transforming growth factor-p receptors by prostaglandin E2. Biochim Biophys Acta 1995 Mar 14; 1261(1): 19-24. Fitzpatrick OR, Oenhez F, Kondaiah P, Akhurst RJ. Oifferential expression of TGFp isoforms in murine palatogenesis. Development 1990 Jul; 109(3): 585-95. Flaumenhaft R, Kojima S, Abe M, Rifkin OB. Activation of latent transforming growth factor 13. Adv Pharmacol 1993a; 24: 51-76. Flaumenhaft R, Abe M, Sato Y, Miyazono K, Harpel J, Heldin CH, Rifkin OB. Role of the latent TGF-p binding protein in the activation of latent TGF-¡3 by co-cultures of endothelial and smooth muscle cells. J Ce" Biol 1993b Feb; 120(4): 995-1002. Florini JR, Roberts AB, Ewton OZ, Falen SL, Flanders KC, Sporn MB. Transforming growth factor-p. A very potent inhibitor of myoblast differentiation, identical to the differentiation inhibitor secreted by Buffalo rat Iiver cells. J Biol Chem 1986 Oec 15; 261(35): 16509-13. Florini JR, Magri KA, Ewton OZ, James PL, Grindstaff K, Rotwein PS. "Spontaneous" differentiation of skeletal myoblasts is dependent upon autocrine secretion of insulin-like growth factor-II . J Biol Chem 1991 Aug 25; 266(24): 15917-23. Foletta VC, Lim MA, Soosairajah J, Kelly AP, Stanley EG, Shannon M, He W, Das S, Massagué J, Bernard O, Soosairaiah J. Oirect signaling by the BMP type 11 receptor via the cytoskeletal regulator LlMK1 . J Ce" Bio/2003 Sep 15; 162(6): 1089-98. Franzén P, ten Oijke P, Ichijo H, Yamashita H, Schulz P, Heldin CH, Miyazono K. Cloning of a TGFJ3 type I receptor that forms a heteromeric complex with the TGFJ3 type 11 receptor. Ce" 1993 Nov 19; 75(4): 681- 92. Friedman SL, Yamasaki G, Wong L. Modulation of transforming growth factor p receptors of rat lipocytes during the hepatic wound healing response. Enhanced binding and reduced gene express ion accompany cellular activation in culture and in vivo. J Biol Chem 1994 Apr 8; 269(14): 10551-8. 125 Froeschle A, Alric S, Kitzmann M, Carnac G, Aurade F, Rochette-Egly C, Bonnieu A. Retinoic acid receptors and muscle b-HLH proteins: partners in retinoid-induced myogenesis. Oneogene 1998 Jul 2; 16(26): 3369-78. Erratum in: Oneogene 1998 Oec 10; 17(23): 3071. Frolik CA, Oart LL, Meyers CA, Smith OM, Sporn MB. Purification and initial characterization of a type p transforming growth factor from human placenta. Proe Natl Aead Sei U S A 1983 Jun; 80(12): 3676-80. Fuentealba L, Carey OJ, Brandán E. Antisense inhibition of syndecan-3 express ion during skeletal muscle differentiation accelerates myogenesis through a basic fibroblast growth factor-dependent mechanism. J Biol Chem 1999 Oec 31 ; 274(53): 37876-84. Fujii H, Hamada H. A CNS-specific POU transcription factor, Brn-2, is required for establishing mammalian neural celllineages. Neuron 1993 Oec; 11 (6): 1197-206. Fukuchi M, Imamura T, Chiba T, Ebisawa T, Kawabata M, Tanaka K, Miyazono K. Ligand-dependent degradation of Smad3 by a ubiquitin ligase complex of ROC1 and associated proteins. Mol Biol Ce" 2001 May; 12(5): 1431-43. Fukumoto S, Hsieh CM, Maemura K, Layne MO, Yet SF, Lee KH, Matsui T, Rosenzweig A, TaylorWG, Rubin JS, Perrella MA, Lee ME. Akt participation in the Wnt signaling pathway through Oishevelled. J Biol Chem 2001 May 18; 276(20): 17479-83. Galvin KM, Oonovan MJ, Lynch CA, Meyer RI, Paul RJ , Lorenz JN, Fairchild-Huntress V, Oixon KL, Ounmore JH, Gimbrone MA Jr, Falb O, Huszar O. A role for smad6 in development and homeostasis of the cardiovascular system. Nat Genet 2000 Feb; 24(2): 171-4. Gao J, Symons AL, Bartold PM. Expression of transforming growth factor-p receptors types 11 and 111 within various cells in the rat periodontium. J Periodontal Res 1999 Feb; 34(2): 113-22. García Sáinz, Jesús Adolfo. Hormonas: mensajeros químicos y comunicación celular. 3era. edición. Tomo 28 de la colección "La ciencia para todos". México, D.F. : Fondo de Cultura Económica, 1998. Geiser AG, Burmester JK, Webbink R, Roberts AB, Sporn MB. Inhibition of growth by transforming growth factor-p following fusion of two nonresponsive human carcinoma cell lines. Implication of the type 11 receptor in growth inhibitory responses. J Biol Chem 1992 Feb 5; 267(4): 2588-93. Geng Y, Weinberg RA. Transforming growth factor p effects on expression of G1 cyc1ins and cyc1in-dependent protein kinases. Proe Natl Aead Sei U S A 1993 Nov 1; 90(21): 10315-9. Gerhart, John and Marc Kirschner. Cells, embryos, and evolution. Toward a cellular and developmental understanding of phenotvpic variation and evolutionary adaptabilitv, Malden, Massachusetts: Blackwell Science, 1998. Gilbert, Scott F. Developmental biology. 6th . ed. Massachusetts: Sinauer Associates, 2000. Gilboa L, Wells RG, Lodish HF, Henis Y1. Oligomeric structure of type 1 and type 11 transforming growth factor p receptors: homodimers form in the ER and persist at the plasma membrane. J Ce" Bio/1998 Feb 23; 140(4): 767-77. Glick AB, Flanders KC, Oanielpour O, Yuspa SH, Sporn MB. Retinoic acid induces transforming growth factor- p2 in cultured keratinocytes and mouse epidermis. Ce" Regul1989 Nov; 1(1): 87-97. Gompel N, Prud'homme B, Wittkopp PJ, Kassner VA, Carroll SB. Chance caught on the wing: eis-regulatory evolution and the origin of pigment patterns in Drosophi/a. Nature 2005 Feb 3; 433(7025): 481-7. Gougos A, Letarte M. Primary structure of endoglin, an RGO-containing glycoprotein of human endothelial cells. J Biol Chem 1990 May 25; 265(15): 8361-4. Graff JM, Bansal A, Melton DA. Xenopus Mad proteins transduce distinct subsets of signals for the TGFp superfamily. Ce" 1996 May 17; 85(4): 479-87. Gray AM, Mason AJ. Requirement for activin A and transforming growth factor-p1 pro-regions in homodimer assembly. Seienee 1990 Mar 16; 247(4948): 1328-30. Griffith OL, Keck PC, Sampath TK, Rueger OC, Carlson WO. Three-dimensional structure of recombinant human osteogenic protein 1: structural paradigm for the transforming growth factor p superfamily. Proe Natl Aead Sei U S A 1996 Jan 23; 93(2): 878-83. Griswold-Prenner 1, Kamibayashi C, Maruoka EM, Mumby MC, Oerynck R. Physical and functional interactions between type I transforming growth factor p receptors and Ba, a W0-40 repeat subunit of phosphatase 2A. Mo/ Ce" Bio/1998 Nov; 18(11): 6595-604. Grover J, Roughley PJ. Expression of cell-surface proteoglycan mRNA by human articular chondrocytes. Bioehem J 1995 Aug 1; 309( Pt 3): 963-8. Guyton, Arthur C. y John E. Hall. Tratado de Fisiología Médica. 10ma. edición. México, D.F.: McGraw-Hill, 2001. Halevy O, Lerman O. Retinoic acid induces adult muscle cell differentiation mediated by the retinoic acid receptor-a. J Ce" Physio/1993 Mar; 154(3): 566-72. Halevy O, Novitch BG, Spicer OB, Skapek SX, Rhee J, Hannon GJ, Beach O, Lassar AB. Correlation of terminal cell cycle arrest of skeletal muscle with induction of p21 by MyoO. , Seienee 1995 Feb 17; 267(5200): 1018-21 . Hannon GJ, Beach O. p151NK48 is a potential effector of TGF-p-induced cell cycle arrest. Nature 1994 Sep 15; 371(6494): 257-61 . 126 Harpel JG, Metz CN, Kojima S, Rifkin DB. Control of transforming growth factor-p activity: latency vs. activation. Prog Growth Factor Res 1992; 4(4): 321-35. Harrison CA, Farnworth PG, Chan KL, Stanton PG, Ooi GT, Findlay JK, Robertson DM. Identification of specific inhibin A-binding proteins on mouse Leydig (TM3) and sertoli (TM4) cell lines. Endocrinology 2001 Apr; 142(4): 1393-402. Hart PJ, Deep S, Taylor AB, Shu Z, Hinck CS, Hinck AP. Crystal structure of the human TpR2 ectodomain- TGF-p3 complex. Nat Struct Bio/2002 Mar; 9(3): 203-8. Hassouna N, Michot B, Bachellerie JP. The complete nucleotide sequence of mouse 28S rRNA gene. Implications for the process of size increase of the large subunit rRNA in higher eukaryotes. Nuc/eic Acids Res 1984 Apr 25; 12(8): 3563-83. Hata A, Lagna G, Massagué J, Hemmati-Brivanlou A. Smad6 inhibits BMP/Smad1 signaling by specifically competing with the Smad4 tumor suppressor. Genes Dev 1998a Jan 15; 12(2): 186-97. Hata A, Shi Y, Massagué J. TGF-p signaling and cancer: structural and functional consequences of mutations in Smads. Mol Med Today 1998b Jun; 4(6): 257-62. Hayashi H, Abdollah S, Qiu Y, Cai J, Xu YY, Grinnell BW, Richardson MA, Topper JN, Gimbrone MA Jr, Wrana JL, Falb D. The MAD-related protein Smad7 associates with the TGFp receptor and functions as an antagonist of TGFp signaling. Cel/1997 Jun 27; 89(7): 1165-73. He TC, Zhou S, da Costa L T, Yu J, Kinzler KW, Vogelstein B. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc Natl Acad Sci U S A 1998 Mar 3; 95(5): 2509-14. Heanue TA, Reshef R, Davis RJ, Mardon G, Oliver G, Tomarev S, Lassar AB, Tabin CJ . Synergistic regulation of vertebrate muscle development by Dach2, Eya2, and Six1, homologs of genes required for Drosophila eye formation. Genes Dev 1999 Dec 15; 13(24): 3231-43. Heikinheimo K, Happonen RP, Miettinen PJ, Ritvos O. Transforming growth factor p2 in epithelial differentiation of developing teeth and odontogenic tumors. J Clin Invest 1993 Mar; 91(3): 1019-27. Heimark RL, Twardzik DR, Schwartz SM. Inhibition of endothelial regeneration by type-p transforming growth factor from platelets. Science 1986 Sep 5; 233(4768): 1078-80. Heine U, Munoz EF, Flanders KC, Ellingsworth LR, Lam HY, Thompson NL, Roberts AB, Sporn MB. Role of transforming growth factor-p in the development of the mouse embryo. J Cel/ Bio/1987 Dec; 105(6 Pt 2): 2861-76. Heino J, Massagué J. Cell adhesion to collagen and decreased myogenic gene expression implicated in the control of myogenesis by transforming growth factor p. J Biol Chem 1990 Jun 25; 265(18): 10181-4. Henis YI, Moustakas A, Un HY, Lodish HF. The types 11 and 111 transforming growth factor-p receptors form homo-oligomers. J Cel/ Bio/1994 Jul; 126(1): 139-54. Hoeflich KP, Luo J, Rubie EA, Tsao MS, Jin O, Woodgett JR. Requirement for glycogen synthase kinase-3p in cell survival and NF-KB activation. Nature 2000 Jul 6; 406(6791): 86-90. Horsley V, Jansen KM, Milis ST, Pavlath GK. IL-4 acts as a myoblast recruitment factor during mammalian muscle growth. Cel/2003 May 16; 113(4): 483-94. Hu JS, Olson EN. Functional receptors for transforming growth factor-p are retained by biochemically differentiated C2 myocytes in growth factor-deficient medium containing EGTA but down-regulated during terminal differentiation. J Biol Chem 1990 May 15; 265(14): 7914-9. Huang SS, O'Grady P, Huang JS. Human transforming growth factor p:a2-macroglobulin complex is a latent form of transforming growth factor p. J Biol Chem 1988 Jan 25; 263(3): 1535-41. Hunter R. Standardization of the chloramine-T method of protein iodination. Proc Soc Exp Biol Med 1970 Mar; 133(3): 989-92. Huse M, Chen YG, Massagué J, Kuriyan J. Crystal structure of the cytoplasmic doma in of the type I TGFp receptor in complex with FKBP12. Cel/1999 Feb 5; 96(3): 425-36. lezzi S, Di Padova M, Serra C, Caretti G, Simone C, Maklan E, Minetti G, Zhao P, Hoffman EP, Puri PL, Sartorelli V. Deacetylase inhibitors increase muscle cell size by promoting myoblast recruitment and fusion through induction of follistatin . Dev Cel/2004 May; 6(5): 673-84. Igarashi A, Okochi H, Bradham DM, Grotendorst GR. Regulation of connective tissue growth factor gene expression in human skin fibroblasts and during wound repair. Mol Biol Cel/1993 Jun; 4(6): 637-45. Ignotz RA, Massagué J. Type p transforming growth factor controls the adipogenic differentiation of 3T3 fibroblasts. Proc Natl Acad Sci U S A 1985 Dec; 82(24): 8530-4. Inman GJ, Hill CS. Stoichiometry of active smad-transcription factor complexes on DNA. J Biol Chem 2002 Dec 27; 277(52): 51008-16. Inman GJ, Nicolas FJ, Hill CS. Nucleocytoplasmic shuttling of Smads 2, 3, and 4 permits sensing of TGF-p receptor activity. Mol Cel/2002 Aug; 10(2): 283-94. lolascon A, Giordani L, Borriello A, Carbone R, Izzo A, Tonini GP, Gambini C, Delia Ragione F. Reduced expression of transforming growth factor-p receptor type 111 in high stage neuroblastomas. Br J Cancer 2000 Mar; 82(6): 1171-6. 127 Itoh S, Landstrom M, Hermansson A, Itoh F, Heldin CH, Heldin NE, ten Oijke P. Transforming growth factor 131 induces nuclear export of inhibitory Smad7. J Biol Chem 1998 Oct 30; 273(44): 29195-201 . James K. Interactions between cytokines and a2-macroglobulin. Immunol Today 1990 May; 11(5): 163-6. Jen Y, Weintraub H, Benezra R. Overexpression of Id protein inhibits the muscle differentiation program: in vivo association of Id with E2A proteins. Genes Dev 1992 Aug; 6(8): 1466-79. Jeruss JS, Santiago JY, Woodruff TK. Localization of activin and inhibin subunits, receptors and SMAOs in the mouse mammary gland. Mol Cel/ Endocrino/2003 May 30; 203(1-2): 185-96. Ji C, Casinghino S, McCarthy TL, Centrella M. Cloning, characterization, and express ion of the transforming growth factor-J3 type I receptor promoter in fetal rat bone cells. J Cel/ Biochem 1996 Oec 15; 63(4): 478- 90. Ji C, Chen Y, McCarthy TL, Centrella M. Cloning the promoter for transforming growth factor-J3 type 111 receptor. Basal and conditional expression in fetal rat osteoblasts. J Biol Chem 1999 Oct 22; 274(43): 30487-94. Jiang Y, McLennan IS, Koishi K, Hendry lA. Transforming growth factor-J32 is anterogradely and retrogradely transported in motoneurons and up-regulated after nerve injury. Neuroscience 2000; 97(4): 735-42. Johnson OW, Qumsiyeh M, Benkhalifa M, Marchuk DA. Assignment of human transforming growth factor-J3 type I and type 111 receptor genes (TGFBR1 and TGFBR3) to 9q33-q34 and 1p32-p33, respectively. Genomics 1995 Ju120; 28(2): 356-7. Johnston LA, Tapscott SJ, Eisen H. Sodium butyrate inhibits myogenesis by interfering with the transcriptional activation function of MyoO and myogenin. Mol Cel/ Bio/1992 Nov; 12(11): 5123-30. Joyce ME, Roberts AB, Sporn MB, Bolander ME. Transforming growth factor-J3 and the initiation of chondrogenesis and osteogenesis in the rat femur. J Cell Bio/1990 Jun; 110(6): 2195-207. Joyce NC, Zieske JO. Transforming growth factor-J3 receptor express ion in human cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci 1997 Sep; 38(10): 1922-8. Kaartinen V, Voncken JW, Shuler C, Warburton O, Bu O, Heisterkamp N, Groffen J. Abnormal lung development and cleft palate in mice lacking TGF-J33 indicates defects of epithelial-mesenchymal interaction. Nat Genet 1995 Oec; 11(4): 415-21. Kaname S, Ruoslahti E. Betaglycan has multiple binding sites for transforming growth factor-J31 . Biochem J 1996 May 1; 315( Pt 3): 815-20. Kang Y, Chen CR, Massagué J. A self-enabling TGFJ3 response coupled to stress signaling: Smad engages stress response factor ATF3 for Id1 repression in epithelial cells. Mol Cel/2003 Apr; 11 (4): 915-26. Kanzaki T, Olofsson A, Moren A, Wernstedt C, Hellman U, Miyazono K, Claesson-Welsh L, Heldin CH. TGF- 131 binding protein: a component of the large latent complex of TGF-J31 with multiple repeat sequences. Cel/1990 Jun 15; 61(6): 1051-61. Katagiri T, Yamaguchi A, Komaki M, Abe E, Takahashi N, Ikeda T, Rosen V, Wozney JM, Fujisawa-Sehara A, Suda T. Bone morphogenetic protein-2 converts the differentiation pathway of C2C12 myoblasts into the osteoblast lineage. J Cel/ Bio/1994 Oec; 127(6 Pt 1): 1755-66. Erratum in: J Cel/ Bio/1995 Feb; 128(4): following 713. Kawabata M, Imamura T, Miyazono K, Engel ME, Moses HL. Interaction of the transforming growth factor-J3 type I receptorwith farnesyl-protein transferase-a. J Biol Chem 1995 Oec 15; 270(50): 29628-31 . Keller JR, Mcniece IK, Sill KT, Ellingsworth LR, Quesenberry PJ, Sing GK, Ruscetti FW. Transforming growth factor 13 directly regulates primitive murine hematopoietic cell proliferation. Blood 1990 Feb 1; 75(3): 596- 602. Kim, Seong-Jin, Anita B. Roberts and Michael B. Sporn. Transcriptionl regulabon of TGF-J3s 1, 2 and 3. Cel/ Biology International Reports, Volume 14, Supplement 1, September 1990, page 16. Kim SJ, Park K, Koeller O, Kim KV, Wakefield LM, Spom MB, Roberts AB. Post-transcriptional regulation of the human transforming growth factor-J31 gene. J Biol Chem 1992 Ju15; 267(19): 13702-7. Kim Y, Ratziu V, Choi SG, Lalazar A, Theiss G, Oang Q, Kim SJ, Friedman SL. Transcripbonal activation of transforming growth factor 131 and its receptors by the Kruppel-like factor Zf9/core promoter-binding protein and Sp1 . Potential mechanisms for autocrine fibrogenesis in response to injury. J Biol Chem 1998 Oec 11; 273(50): 33750-8. Kingsley OM. The TGF-J3 superfamily: new members, new receptors, and new genetic tests of function in different organisms. Genes Dev 1994 Jan; 8(2): 133-46. Klemm JO, Beals CR, Crabtree GR. Rapid targeting of nuclear proteins to the cytoplasm. CUff Bio/1997 Sep 1; 7(9): 638-44. Koff A, Ohtsuki M, Polyak K, Roberts JM, Massagué J. Negative regulation of G1 in mammalian cells : inhibition of cyclin E-dependent kinase by TGF-J3. Science 1993 Apr 23; 260(5107): 536-9. Koinuma O, Shinozaki M, Komuro A, Goto K, Saitoh M, Hanyu A, Ebina M, Nukiwa T, Miyazawa K, Imamura T, Miyazono K. Arkadia amplifies TGF-J3 superfamily signalling through degradation of Smad7. EMBO J 2003 Oec 15; 22(24): 6458-70. 128 Koli KM, Ramsey TI, Ko Y, Dugger TC, Bratlain MG, Arteaga CL. Blockade of transforming growth factor-p signaling does not abrogate antiestrogen-induced growth inhibition of human breast carcinoma cells. J Biol Chem 1997 Mar 28; 272(13): 8296-302. Konig S, Hinard V, Arnaudeau S, Holzer N, Potter G, Bader CR, Bernheim L. Membrane hyperpolarization triggers myogenin and myocyte enhancer factor-2 expression during human myoblast differentiation. J Biol Chem 2004 Ju12; 279(27): 28187-96. Kovacina KS, Steele-Perkins G, Purchio AF, Lioubin M, Miyazono K, Heldin CH, Roth RA. Interactions of recombinant and platelet transforming growth factor-p1 precursor with the insulin-like growth factor II/mannose 6-phosphate receptor. Biochem Biophys Res Commun 1989 Apr 14; 160(1): 393-403. Kreidberg JA, Sariola H, Loring JM, Maeda M, Pelletier J, Housman D, Jaenisch R WT-1 is required for early kidney development. CelJ 1993 Aug 27; 74(4): 679-91 . Kretzschmar M, Liu F, Hata A, Doody J, Massagué J. The TGF-p family mediator Smad1 is phosphorylated directly and activated functionally by the BMP receptor kinase. Genes Dev 1997 Apr 15; 11(8): 984-95. Kretzschmar M, Doody J, Timokhina 1, Massagué J. A mechanism of repression of TGFp/Smad signaling by oncogenic Ras. Genes Dev 1999 Apr 1; 13(7): 804-16. Kuhn 1, Bartholdi MF, Salamon H, Feldman RI, Roth RA, Johnson PH. Identification of AKT-regulated genes in inducible MERAkt cells. Physiol Genomics 2001 Dec 21 ; 7(2): 105-14. Kulkarni AB, Huh CG, Becker D, Geiser A, Lyght M, Flanders KC, Roberts AB, Sporn MB, Ward JM, Karlsson S. Transforming growth factor p1 null mutation in mice causes excessive inflammatory response and early death. Proc Natl Acad Sci U S A 1993 Jan 15; 90(2): 770-4. Kyprianou N, Isaacs JT. Identification of a cellular receptor for transforming growth factor-p in rat ventral prostate and its negative regulation byandrogens. Endocrinology 1988 Oct; 123(4):2124-31 . Labarca C, Paigen K. A simple, rapid, and sensitive DNA assay procedure. Anal Biochem 1980 Mar 1; 102(2): 344-52. LaBarge MA, Blau HM. Biological progression from adult bone marrow to mononucleate muscle stem cell to multinucleate muscle fiber in response to injury. Cel/2002 Nov 15; 111 (4): 589-601 . Labbé E, Letamendía A, Attisano L. Association of Smads with Iymphoid enhancer binding factor 1fT cel\- specific factor mediates cooperative signaling by the transforming growth factor-p and wnt pathways. Proc Natl Acad Sci U S A 2000 Ju118; 97(15): 8358-63. Lafyatis R, Lechleider R, Roberts AB, Sporn MB. Secretion and transcriptional regulation of transforming growth factor-p3 during myogenesis. Mol Cel/ Bio/1991 Jul; 11(7): 3795-803. Lagna G, Hata A, Hemmati-Brivanlou A, Massagué J. Partnership between DPC4 and SMAD proteins in TGF- p signalling pathways. Nature 1996 Oct 31; 383(6603): 832-6. Laiho M, DeCaprio JA, Ludlow JW, Livingston DM, Massagué J. Growth inhibition by TGF-p linked to suppression of retinoblastoma protein phosphorylation. CelJ 1990a Ju113; 62(1): 175-85. Laiho M, Weis MB, Massagué J. Concomitant los s of transforming growth factor (TGF)-P receptor types I and 11 in TGF-p-resistant cell mutants implicates both receptor types in signal transduction. J Biol Chem 1990b Oct 25; 265(30): 18518-24. Laiho M, Weis FM, Boyd FT, Ignotz RA, Massagué J. Responsiveness to transforming growth factor-p (TGF- P) resto red by genetic complementation between cells defective in TGF-p receptors I and 11. J Biol Chem 1991 May 15; 266(14): 9108-12. LaMarre J, Hayes MA, Wollenberg GK, Hussaini 1, Hall SW, Gonias SL. An a2-macroglobulin receptor- dependent mechanism for the plasma clearance of transforming growth factor-p1 in mice. J Clin Invest 1991 Jan; 87(1): 39-44. Larraín J, Cizmeci-Smith G, Troncoso V, Stahl RC, Carey DJ , Brandán E. Syndecan-1 express ion is down- regulated during myoblast terminal differentiation. Modulation by growth factors and retinoic acid. J Biol Chem 1997a Ju1 18; 272(29): 18418-24. Larraín J, Álvarez J, Hassell JR, Brandán E. Expression of perlecan, a proteoglycan that binds myogenic inhibitory basic fibroblast groWth factor, is down regulated during skeletal muscle differentiation. Exp Cel/ Res 1997b Aug 1; 234(2): 405-12. Larraín J, Carey DJ, Brandán E. Syndecan-1 express ion inhibits myoblast differentiation through a basic fibroblast growth factor-<:tependent mechanism. J Biol Chem 1998 Nov 27; 273(48): 32288-96. Lassar AB, Davis RL, Wright WE, Kadesch T, Murre C, Voronova A, Baltimore D, Weintraub H. Functional activity of myogenic HLH proteins requires hetero-oligomerization with E12/E47-like proteins in vivo. Cel/ 1991 Ju126; 66(2): 305-15. Lastres P, Letamendía A, Zhang H, Rius C, Almendro N, Raab U, López LA, Langa C, Fabra A, Letarte M, Bernabeu C. Endoglin modulates cellular responses to TGF-p1 . J Cell Bio/1996 Jun; 133(5): 1109-21 . Lawler S, Candia AF, Ebner R, Shum L, López AR, Moses HL, Wright CV, Derynck R The murine type 11 TGF-p receptor has a coincident embryonic expression and binding preference for TGF-p1. Development 1994 Jan; 120(1): 165-75. 129 Le Magueresse-Battistoni B, Morera AM, Goddard 1, Benahmed M. Expression of mRNAs for transforming growth factor-j3 receptors in the rat testis. Endoerinology 1995 Jun; 136(6): 2788-91. Lee SJ. Regulation of muscle mass by myostatin. Annu Rev Cel/ Dev Bio/2004; 20: 61-86. Lehnert SA, Akhurst RJ. Embryonic expression pattern of TGF j3 type-1 RNA suggests both paracrine and autocrine mechanisms of action. Development 1988 Oct; 104(2): 263-73. Leof EB, Proper JA, Goustin AS, Shipley GD, DiCorleto PE, Moses HL. Induction of c-sis mRNA and activity similar to platelet-derived growth factor by transforming growth factor j3: a proposed model for indirect mitogenesis involving autocrine activity. Proe Natl Acad Sei U S A 1986 Apr; 83(8): 2453-7. Letamendía A, Lastres P, Botella LM, Raab U, Langa C, Velasco B, Attisano L, Bernabeu C. Role of endoglin in cellular responses to transforming growth factor-j3. A comparative study with betaglycan. J Biol Chem 1998 Dec 4; 273(49): 33011-9. Lewis KA, Gray PC, Blount AL, MacConell LA, Wiater E, Bilezikjian LM, Vale W. Betaglycan binds inhibin and can mediate functional antagonism of activin signalling. Nature 2000 Mar 23; 404(6776): 411-4. Lewis PM, Dunn MP, McMahon JA, Logan M, Martin JF, St-Jacques B, McMahon AP. Cholesterol modification of sonic hedgehog is required for long-range signaling activity and effective modulation of signaling by Ptc1. Cel/2001 Jun 1; 105(5): 599-612. U FQ, Coonrod A, Horwitz M. Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a Iysosomal protease. J Cel/ Bio/1996 Nov; 135(4): 1043-57. U L, Zhou J, James G, Heller-Harrison R, Czech MP, Olson EN. FGF inactivates myogenic helix-Ioop-helix proteins through phosphorylation of a conserved protein kinase C site in their DNA-binding domains. Cell 1992 Dec 24; 71(7): 1181-94. U X, Oghi KA, Zhang J, Krones A, Bush KT, Glass CK, Nigam SK, Aggarwal AK, Maas R, Rose DW, Rosenfeld MG. Eya protein phosphatase activity regulates Six1-Dach-Eya transcriptional effects in mammalian organogenesis. Nature 2003 Nov 20; 426(6964): 247-54. Un HY, Wang XF, Ng-Eaton E, Weinberg RA, Lodish HF. Expression cloning ofthe TGF-j3 type 11 receptor, a functional transmembrane serine/threonine kinase. Cell1992 Feb 21 ; 68(4): 775-85. Erratum in: Cell 1992 Sep 18; 70(6): following 1068. Un HY, Moustakas A, Knaus P, Wells RG, Henis YI , Lodish HF. The soluble exoplasmic domain of the type 11 transforming growth factor (TGF)-j3 receptor. A heterogeneously glycosylated protein with high affinity and selectivity for TGF-j3 ligands. J Biol Chem 1995 Feb 10; 270(6): 2747-54. Un X, Uang VV, Sun B, Uang M, Shi Y, Brunicardi FC, Shi Y, Feng XH. Smad6 recruits transcription corepressor CtBP to repress bone morphogenetic protein-induced transcription. Mol Cell Bio/2003 Dec; 23(24): 9081-93. Uu D, Black BL, Derynck R. TGF-j3 inhibits muscle differentiation through functional repression of myogenic transcription factors by Smad3. Genes Dev 2001 Nov 15; 15(22): 2950-66. Uu F, Hata A, Baker JC, Doody J, Cárcamo J, Harland RM, Massagué J. A human Mad protein acting as a BMP-regulated transcriptional activator. Nature 1996 Jun 13; 381(6583): 620-3. Lo RS, Massagué J. Ubiquitin-dependent degradation of TGF-j3-activated Smad2. Nat Cell Bio/1999 Dec; 1 (8): 472-8. López AR, Cook J, Deininger PL, Derynck R. Dominant negative mutants of transforming growth factor-j31 inhibit the secretion of different transforming growth factor-j3 isoforms. Mol Cell Biol 1992 Apr; 12(4): 1674-9. López Casillas F, Cheifetz S, Doody J, Andres JL, Lane WS, Massagué J. Structure and expression of the membrane proteoglycan betaglycan, a component of the TGF-j3 receptor system. Cell 1991 Nov 15; 67(4): 785-95. López Casillas F, Wrana JL, Massagué J. Betaglycan presents ligand to the TGFj3 signaling receptor. Cell 1993 Ju12; 73(7): 1435-44. López Casillas F, Payne HM, Andres JL, Massagué J. Betaglycan can act as a dual modulator of TGF-j3 access to signaling receptors: mapping of ligand binding and GAG attachment sites. J Cell Bio/1994 Feb; 124(4): 557-68. Luo K, Lodish HF. Signaling by chimeric erythropoietin-TGF-j3 receptors: homodimerization ofthe cytoplasmic domain of the type I TGF-j3 receptor and heterodimerization with the type 11 receptor are both required for intracellular signal transduction. EMBO J 1996 Sep 2; 15(17): 4485-96. Luo K, Lodish HF. Positive and negative regulation of type 11 TGF-j3 receptor signal transduction by autophosphorylation on multiple serine residues. EMBO J 1997 Apr 15; 16(8): 1970-81. Luo K, Stroschein SL, Wang W, Chen D, Martens E, Zhou S, Zhou Q. The Ski oncoprotein interacts with the Smad proteins to repress TGFj3 signaling. Genes Dev 1999 Sep 1; 13(17): 2196-206. Lyon M, Rushton G, Gallagher JT. The interaction of the transforming growth factor-j3s with heparinlheparan sulfate is isoform-specific. J Biol Chem 1997 Ju118; 272(29): 18000-6. 130 lyons RM, Keski-Oja J, Moses HL. Proteolytic activation of latent transforming growth factor-p from fibroblast- conditioned medium. J Cell Bio/1988 May; 106(5): 1659-65. lyons RM, Gentry lE, Purchio AF, Moses HL. Mechanism of activation of latent recombinant transforming growth factor p1 by plasmin. J Cell Bio/1990 Apr; 110(4): 1361-7. MacCone" LA, leal AM, Vale WN. The distribution of betaglycan protein and mRNA in rat brain, pituitary, and gonads: implications for a role for betaglycan in inhibin-mediated reproductive functions. Endocrinology 2002 Mar; 143(3): 1066-75. Macias Silva M, Abdo"ah S, Hoodless PA, Pirone R, Attisano l, Wrana JL MADR2 is a substrate of the TGFp receptor and its phosphorylation is required for nuclear accumulation and signaling. Cell 1996 Dec 27; 87(7): 1215-24. Macias Silva M, Hoodless PA, Tang SJ, Buchwald M, Wrana JL Specific activation of Smad1 signaling pathways by the BMP7 type I receptor, AlK2. J Biol Chem 1998 Oct 2; 273(40): 25628-36. Mack CP, Owens GK. Regulation of smooth muscle a-actin expression in vivo is dependent on CArG elements within the 5' and first intron promoter regions. Cire Res 1999 Apr 16; 84(7): 852-61 . Mal A, Harter ML. MyoO is functiona"y linked to the silencing of a muscle-specific regulatory gene prior to skeletal myogenesis. Proe Natl Aead Sei U S A 2003 Feb 18; 100(4): 1735-9. Marics 1, Padilla F, Gui"emot JF, Scaal M, Marce"e C. FGFR4 signaling is a necessary step in limb muscle differentiation. Development 2002 Oct; 129(19): 4559-69. Massagué J, Cheifetz S, Endo T, Nadal-Ginard B. Type p transforming growth factor is an inhibitor of myogenic differentiation. Proc Natl Aead Sci U S A 1986 Nov; 83(21): 8206-10. Massagué J. Receptors for the TGF-p family. Celf 1992 Jun 26; 69(7): 1067-70. Massagué J, Attisano l, Wrana JL The TGF-p family and its composite receptors. Trends Cell Biol 1994 May; 4(5): 172-8. Massagué J, Polyak K. Mammalian antiproliferative signals and their targets. Curr Opin Genet Dev 1995 Feb; 5(1): 91-6. Massagué J. TGF-p signal transduction. Annu Rev Bioehem 1998; 67: 753-91 . Massagué J, Chen YG. Controlling TGF-p signaling. Genes Dev 2000 Mar 15; 14(6): 627-44. Massagué J, Wotton D. Transcriptional control by the TGF-p/Smad signaling system. EMBO J 2000 Apr 17; 19(8): 1745-54. Matzuk MM. In search of binding-identification of inhibin receptors. Endocrinology 2000 Jul; 141(7): 2281-4. McA"ister KA, Grogg KM, Johnson DW, Gallione CJ, Baldwin MA, Jackson CE, Helmbold EA, Markel OS, McKinnon WC, Murre" J, et al. Endoglin, a TGF-p binding protein of endothelial ce"s , is the gene for hereditary haemorrhagic telangiectasia type 1. Nat Genet 1994 Dec; 8(4): 345-51 . McKinsey TA, Zhang Cl, Olson EN. Control of muscle development by dueling HATs and HDACs. Curr Opin Genet Dev 2001 Oct; 11 (5): 497-504. Mitche" EJ, Fitz-Gibbon l, O'Connor-McCourt MD. Subtypes of betaglycan and of type I and type 11 transforming growth factor-p (TGF-P) receptors with different affinities for TGF-p1 and TGF-p2 are exhibited by human placental trophoblast ce"s. J Cell Physio/1992 Feb; 150(2): 334-43. Miyazono K, He"man U, Wernstedt C, Heldin CH. latent high molecular weight complex of transforming growth factor p 1. Purification from human platelets and structural characterization. J Biol Chem 1988 May 5; 263(13): 6407-15. Miyazono K, Olofsson A, Colosetti P, Heldin CH. A role of the latent TGF-p1-binding protein in the assembly and secretion ofTGF-p1 . EMBO J 1991 May; 10(5): 1091-101. Mohun T. Muscle differentiation. Curr Opin Cell Bio/1992 Dec; 4(6): 923-8. Moore JW, Oionne C, Jaye M, Swain JL. The mRNAs encoding acidic FGF, basic FGF and FGF receptor are coordinately downregulated during myogenic differentiation. Development 1991 Mar; 111 (3): 741-8. More"o JP, Plamondon J, Meyrick B, Hoover R, O'Connor-McCourt MD. Transforming growth factor-p receptor expression on endothelial ce"s: heterogeneity of type 111 receptor expression. J Cell Physio/1995 Oct; 165(1): 201-11 . Moren A, Ichijo H, Miyazono K. Molecular cloning and characterization of the human and porcine transforming growth factor-p type 111 receptors. Bioehem Biophys Res Commun 1992 Nov 30; 189(1): 356-62. Moren A, Olofsson A, Stenman G, Sahlin P, Kanzaki T, Claesson-Welsh l, ten Dijke P, Miyazono K, Heldin CH. Identification and characterization of l TBP-2, a novel latent transforming growth factor-p-binding protein. J Biol Chem 1994 Dec 23; 269(51): 32469-78. Morin S, Charron F, Robitaille l, Nemer M. GATA-dependent recruitment of MEF2 proteins to target promoters. EMBO J 2000 May 2; 19(9): 2046-55. Moustakas A, lin HY, Henis YI, Plamondon J, O'Connor-McCourt MD, lodish HF. The transforming growth factor p receptors types l. 11. and 111 form hetero-oligomeric complexes in the presence of ligand. J Biol Chem 1993 Oct 25; 268(30): 22215-8. 131 Muller G, Behrens J, Nussbaumer U, Bohlen P, Birchmeier W. Inhibitory action of transforming growth factor p on endothelial cells. Proe Natl Aead Sei U S A 1987 Aug; 84(16): 5600-4. Munger JS, Harpel JG, Gleizes PE, Mazzieri R, Nunes 1, Rifkin OB. Latent transforming growth factor-p: structural features and mechanisms of activation. Kidney Int 1997 May; 51(5): 1376-82. Munger JS, Huang X, Kawakatsu H, Griffiths MJ, Oalton SL, Wu J, Pittet JF, Kaminski N, Garat C, Matthay MA, Rifkin OB, Sheppard O. The integrin avP6 binds and activates latent TGF p1 : a mechanism for regulating pulmonary inflammation and fibrosis. Cel/1999 Feb 5; 96(3): 319-28. Murphy-Ullrich JE, Schultz-Cherry S, Hook M. Transforming growth factor-p complexes with thrombospondin. Mol Biol Cel/ 1992 Feb; 3(2): 181-8. Murre C, McCaw PS, Baltimore O. A new ONA binding and dimerization motif in immunoglobulin enhancer binding, daughterless, MyoO, and myc proteins. Cel/1989a Mar 10; 56(5): 777-83. Murre C, McCaw PS, Vaessin H, Caudy M, Jan L Y, Jan YN, Cabrera CV, Buskin JN, Hauschka SO, Lassar AB, et al. Interactions between heterologous helix-Ioop-helix proteins generate complexes that bind specifically to a common ONA sequence. Cel/ 1989b Aug 11 ; 58(3): 537-44. Musaro A, Giacinti C, Borsellino G, Oobrowolny G, Pelosi L, Cairns L, Ottolenghi S, Cossu G, Bernardi G, Battistini L, Molinaro M, Rosenthal N. Stem cell-mediated muscle regeneration is enhanced by local isoform of insulin-like growth factor 1. Proe Natl Aead Sei U S A 2004 Feb 3; 101(5): 1206-10. Nakai S, Kawano H, Yudate T, Nishi M, Kuno J, Nagata A, Jishage K, Hamada H, Fujii H, Kawamura K, et al. The POU domain transcription factor Brn-2 is required for the determination of specific neuronal lineages in the hypothalamus ofthe mouse. Genes Dev 1995 Oec 15; 9(24): 3109-21. Nakao A, Afrakhte M, Moren A, Nakayama T, Christian JL, Heuchel R, Itoh S, Kawabata M, Heldin NE, Heldin CH, ten Oijke P. Identification of Smad7, a TGFp-inducible antagonist of TGF-p signalling. Nature 1997 Oct 9; 389(6651): 631-5. Nakayama H, Ichikawa F, Andres JL, Massagué J, Noda M. Oexamethasone enhancement of betaglycan (TGF-p type 111 receptor) gene express ion in osteoblast-like cells. Exp Cel/ Res 1994 Apr; 211(2): 301-6. Neptune ER, Frischmeyer PA, Arking DE, Myers L, Bunton TE, Gayraud B, Ramírez F, Sakai LY, Dietz HC. Oysregulation of TGF-p activation contributes to pathogenesis in Marfan syndrome. Nat Genet 2003 Mar; 33(3): 407-11. Nishikawa Y, Wang M, Carr BI. Changes in TGF-p receptors of rat hepatocytes during primary culture and liver regeneration: increased expression of TGF-p receptors associated with increased sensitivity to TGF- p-mediated growth inhibition. J Gel/ Physio/1998 Sep; 176(3): 612-23. Nishita M, Hashimoto MK, Ogata S, Laurent MN, Ueno N, Shibuya H, Cho KW. Interaction between Wnt and TGF-p signalling pathways during formation of Spemann's organizer. Nature 2000 Feb 17; 403(6771): 781-5. Nishiyama T, Kii 1, Kudo A. Inactivation of Rho/ROCK signaling is crucial for the nuclear accumulation of FKHR and myoblast fusion o J Biol Ghem 2004 Nov 5; 279(45): 47311-9. O'Connor-McCourt MO, Wakefield LM. Latent transforming growth factor-p in serum. A specific complex with a2-macroglobulin. J Biol Ghem 1987 Oct 15; 262(29): 14090-9. Odelberg SJ , Kollhoff A, Keating MT. Oedifferentiation of mammalian myotubes induced by msx1 . Cel/ 2000 Oec 22; 103(7): 1099-109. Ogawa Y, Schmidt OK, Dasch JR, Chang RJ, Glaser Cs. Purification and characterization of transforming growth factor-p2.3 and -p1 .2 heterodimers from bovine bone. J Biol Ghem 1992 Feb 5; 267(4): 2325-8. Ohta M, Greenberger JS, Anklesaria P, Bassols A, Massagué J. Two forms of transforming growth factor-p distinguished by multipotential haematopoietic progenitor cells. Nature 1987 Oct 8-14; 329(6139): 539-41. Olson EN, Stemberg E, Hu JS, Spizz G, Wilcox C. Regulation of myogenic differentiation by type p transforming growth factor. J Gell Bio/1986 Nov; 103(5): 1799-805. Olsson U, Bondjers G, Camejo G. Fatty acids modulate the composition of extracellular matrix in cultured human arterial smooth muscle cells by altering the express ion of genes for proteoglycan core proteins. Diabetes 1999 Mar; 48(3): 616-22. Ong SH, Hadari YR, Gotoh N, Guy GR, Schlessinger J, Lax 1. Stimulation of phosphatidylinositol 3-kinase by fibroblast growth factor receptors is mediated by coordinated recruitment of multiple docking proteins. Proc Natl Aead Sei U S A 2001 May 22; 98(11): 6074-9. Onichtchouk O, Chen YG, Oosch R, Gawantka V, Oelius H, Massagué J, Niehrs C. Silencing of TGF-p signalling by the pseudoreceptor BAMBI. Nature 1999 Sep 30; 401(6752): 480-5. Oshima M, Oshima H, Taketo MM. TGF-p receptor type 11 deficiency results in defects of yolk sac hematopoiesis and vasculogenesis. Dev Bio/1996 Oct 10; 179(1): 297-302. Osoegawa K, Tateno M, Woon PY, Frengen E, Mammoser AG, Catanese JJ, Hayashizaki Y, de Jong PJ. Bacterial artificial chromosome libraries for mouse sequencing and functional analysis. Genome Res 2000 Jan; 10(1): 116-28. Ottmann OG, Pelus LM. Oifferential proliferative effects of transforming growth factor-p on human hematopoietic progenitor cells. J Immuno/1988 Apr 15; 140(8): 2661-5. 132 Oursler MJ, Riggs BL, Spelsberg TC. Glucocorticoid-induced activation of latent transforming growth factor-p by normal human osteoblast-like cells. Endocrinology 1993 Nov; 133(5): 2187-96. Oursler MJ. Osteoclast synthesis and secretion and activation of latent transforming growth factor p. J Bone Miner Res 1994 Apr; 9(4): 443-52. Paralkar VM, Vukicevic S, Reddi AH. Transforming growth factor p type 1 binds to collagen IV of basement membrane matrix: implications for development. Dev Bio/1991 Feb; 143(2): 303-8. Pardali K, Kurisaki A, Moren A, ten 0pke P, Kardassis O, Moustakas A. Role of Smad proteins and transcription factor Sp1 in p21waff/ciP regulation by transforming growth factor-p. J Biol Chem 2000 Sep 22; 275(38): 29244-56. Parker MH, Seale P, Rudnicki MA. Looking back to the embryo: defining transcriptional networks in adult myogenesis. Nat Rev Genet 2003 Jul; 4(7): 497-507. Parker WL, Goldring MB, Philip A. Endoglin is expressed on human chondrocytes and forms a heteromeric complex with betaglycan in a ligand and type 11 TGFp receptor independent manner. J Bone Miner Res 2003 Feb; 18(2): 289-302. Pelton RW, Oickinson ME, Moses HL, Hogan BL. In situ hybridization analysis of TGFp3 RNA express ion during mouse development: comparative studies with TG Fp 1 and p2. Development 1990a Oct; 110(2): 609-20. Pelton RW, Hagan BL, Miller DA. Moses HL. Oifferential expression of genes encoding TGFs p1, p2, and p3 during murine palate formation. Dev Bio/1990b Oct; 141(2): 456-60. Pelton RW, Saxena B, Jones M, Moses HL, Gold LI. Immunohistochemicallocalization of TGFp1, TGFp2, and TGFp3 in the mouse embryo: expression pattems suggest multiple roles during embryonic development J Cell Bio/1991 Nov; 115(4): 1091-105. Pepin MC, Beauchemin M, Plamondon J, O'Connor-McCourt MO. Mapping of the ligand binding doma in of the transforming growth factor preceptor type 111 by deletion mutagenesis. Proc Natl Acad Sci U S A 1994 Jul 19; 91(15): 6997-7001 . Perlman R, Schiemann WP, Brooks MW, Lodish HF, Weinberg RA. TGF-p-induced apoptosis is mediated by the adapter protein Oaxx that facilitates JNK activation. Nat Cell Bio/2001 Aug; 3(8): 708-14. Peterson MJ, Morris JF. Human myeloid zinc finger gene MZF produces multiple transcripts and encodes a SCAN box protein. Gene 2000 Aug 22; 254(1-2): 105-18. Petritsch C, Beug H, Balmain A, Oft M. TGF-p inhibits p70 S6 kinase via protein phosphatase 2A to induce G1 arrest. Genes Dev 2000 Oec 15; 14(24): 3093-101 . Pierreux CE, Nicolas FJ, HiII CS. Transforming growth factor p-independent shuttling of Smad4 between the cytoplasm and nucleus. Mol Cell Bio/2000 Oec; 20(23): 9041-54. Pinson KI , Brennan J, Monkley S, Avery BJ, Skarnes WC. An LDL-receptor-related protein mediates Wnt signalling in mice. Nature 2000 Sep 28; 407(6803): 535-8. Pirskanen A, Kiefer JC, Hauschka SO. IGFs, insulin, Shh, bFGF, and TGF-p1 interact synergistically to promote somite myogenesis in vitro. Dev Bio/2000 Aug 15; 224(2): 189-203. Plisov SY, Yoshino K, Oove LF, Higinbotham KG, Rubin JS, Perantoni AO. TGFp2, UF and FGF2 cooperate to induce nephrogenesis. Development2001 Apr; 128(7): 1045-57. Polesskaya A, Seale P, Rudnicki MA. Wnt signaling induces the myogenic specification of resident C045+ adult stem cells during muscle regeneration. Cell2003 Jun 27; 113(7): 841-52. Ponce Castañeda MV, Esparza L6pez J, Vilchis Landeros MM, Mendoza V, L6pez Casillas F. Murine betaglycan primary structure, expression and glycosaminoglycan attachment sites. Biochim Biophys Acta 1998 May 19; 1384(2): 189-96. Postigo AA, Oean OC. Independent repressor domains in ZEB regulate muscle and T -ce 11 differentiation. Mol Cell Bio/1999 Oec; 19(12): 7961-71 . Postlethwaite AE, Keski-Oja J, Moses HL, Kang AH. Stimulation of the chemotactic migration of human fibroblasts by transforming growth factor p. J Exp Med 1987 Jan 1; 165(1): 251-6. Potts JO, Oagle JM, Walder JA, Weeks OL, Runyan RB. Epithelial-mesenchymal transformation of embryonic cardiac endothelial cells is inhibited by a modified antisense oligodeoxynucleotide to transforming growth factor p3. Proc Natl Acad Sci U S A 1991 Feb 15; 88(4): 1516-20. Proetzel G, Pawlowski SA, Wiles MV, Yin M, Boivin GP, Howles PN, Oing J, Ferguson MW, Ooetschman T. Transforming growth factor-p3 is required for secondary palate fusiono Nat Genet 1995 Oec; 11(4): 409- 14. Purchio AF, Cooper JA, Brunner AM, Lioubin MN, Gentry LE, Kovacina KS, Roth RA, Marquardt H. Identification of mannose 6-phosphate in two asparagine-linked sugar chains of recombinant transforming growth factor-p1 precursor. J Biol Chem 1988 Oct 5; 263(28): 14211-5. Puri PL, Avantaggiati ML, Balsano C, Sang N, Graessmann A, Giordano A, Levrero M. p300 is required for MyoO-dependent cell cycle arrest and muscle-specific gene transcription. EMBO J 1997 Jan 15; 16(2): 369-83. 133 Quan T, He T, Voorhees JJ, Fisher GJ. Ultraviolet irradiation blocks cellular responses to transforming growth factor-p by down-regulating its type-II receptor and inducing Smad7. J Biol Chem 2001 Jul 13; 276(28): 26349-56. Quandt K, Frech K, Karas H, Wingender E, Werner T. Matlnd and Matlnspector: new fast and versatile tools for detection of consensus matches in nucleotide sequence data. Nucleic Acids Res 1995 Oec 11; 23(23): 4878-84. FTP disponible: genomatix.de. Página visitada en junio de 2004. Raftery LA, Twombly V, Wharton K, Gelbart WM. Genetic screens to identify elements of the decapentaplegic signaling pathway in Drosophila. Genetics 1995 Jan; 139(1): 241-54. Ranger AM, Grusby MJ, Hodge MR, Gravallese EM, de la Brousse FC, Hoey T, Mickanin C, Baldwin HS, Glimcher LH. The transcription factor NF-ATc is essential for cardiac valve formation. Nature 1998 Mar 12; 392(6672): 186-90. Rao SS, Chu C, Kohtz OS. Ectopic expression of cyclin 01 prevents activation of gene transcription by myogenic basic helix-Ioop-helix regulators. Mol Cel/ Bio/1994 Aug; 14(8): 5259-67. Raynal F, Michot B, Bachellerie JP. Complete nucleotide sequence of mouse 18S rRNA gene: comparison with other available homologs. FEBS Lett 1984 Feb 27; 167(2): 263-8. Razani B, Zhang XL, Bitzer M, von Gersdorff G, Bottinger EP, Usanti MP. Caveolin-1 regulates transforming growth factor (TGF)-ptSMAO signaling through an interaction with the TGF-p type I receptor. J Biol Chem 2001 Mar 2; 276(9): 6727-38. Reddy KB, Karode MC, Harmony AK, Howe PH. Interaction of transforming growth factor p receptors with apolipoprotein J/clusterin. Bioehemistry 1996 Jan 9; 35(1): 309-14. Reynisdottir 1, Polyak K, lavarone A, Massagué J. Kip/Cip and Ink4 Cdk inhibitors cooperate to induce cell cycle arrest in response to TGF-p. Genes Dev 1995 Aug 1; 9(15): 1831-45. Rhodes SJ, Konieczny SF. Identification of MRF4: a new member of the muscle regulatory factor gene family. Genes Dev 1989 Oec; 3(12B): 2050~1. Ridgeway AG, Ske~anc IS. Pax3 is essential for skeletal myogenesis and the expression of Six1 and Eya2. J Biol Chem 2001 Jun 1; 276(22): 19033-9. Ridley AJ, Oavis JB, Stroobant P, Land H. Transforming growth factors-p1 and p2 are mitogens for rat Schwann cells. J Cell Bio/1989 Oec; 109(6 Pt 2): 3419-24. Riedl E, Strobl H, Majdic O, Knapp W. TGF-p1 promotes in vitro generation of dendritic cells by protecting progenitor cells from apoptosis. J Immuno/1997 Feb 15; 158(4): 1591-7. Riquelme C, Larraín J, Schonherr E, Henríquez JP, Kresse H, Brandán E. Antisense inhibition of decorin express ion in myoblasts decreases cell responsiveness to transforming growth factor p and accelerates skeletal muscle differentiation. J Biol Chem 2001 Feb 2; 276(5): 3589-96. Erratum in: J Biol Chem 2001 Mar 23; 276(12): 9580-1 . Riquelme IlIanes, Cecilia Angélica. "Modulación de la diferenciación muscular esquelética por decorina: efecto en la unión de TGF-p a sus receptores". Tesis para obtener el grado de doctora en Ciencias Biológicas por la Facultad de Ciencias Biológicas de la Pontificia Universidad Católica de Chile, 2001 . Director de tesis: Dr. Enrique Brandán Siques. Roberts AB, Anzano MA, Lamb LC, Smith JM, Sporn MB. New class of transforming growth factors potentiated by epidermal growth factor: isolation from non-neoplastic tissues. Proc Natl Aead Sei U S A 1981 Sep; 78(9): 5339-43. Rodríguez C, Chen F, Weinberg RA, Lodish HF. Cooperative binding of transforming growth factor (TGF)-P2 to the types I and 11 TGF-p receptors . J Biol Chem 1995 Ju17; 270(27): 15919-22. Roelen BA, Un HY, Knezevic V, Freund E, Mummery CL. Expression of TGF-ps and their receptors during implantation and organogenesis of the mouse embryo. Dev Bio/1994 Oec; 166(2): 716-28. Roelen BA, Van Eijk MJ, Van Rooijen MA, Bevers MM, Larson JH, Lewin HA, Mummery CL. Molecular cloning, genetic mapping, and developmental expression of a bovine transforming growth factor p (TGF-P) type I receptor. Mol Reprod Dev 1998 Jan; 49(1): 1-9. Romeo OS, Park K, Roberts AB, Sporn MB, Kim SJ . An element of the transforming growth factor-p1 5'- untranslated region represses translation and specifically binds a cytosolic factor. Mol Endocrinol 1993 Jun; 7(6): 759-66. Romero Ávila MT, Flores Jasso CF, García Sáinz JA. u1B-Adrenergic receptor phosphorylation and desensitization induced by transforming growth factor-p. Biochem J 2002 Oec 1; 368(Pt 2): 581-7. Rosenthal SM, Cheng ZQ. Opposing early and late effects of insulin-like growth factor I on differentiation and the cell cycle regulatory retinoblastoma protein in skeletal myoblasts. Proe Natl Acad Sei U S A 1995 Oct 24; 92(22): 10307-11. Rotzer O, Roth M, Lutz M, Undemann O, Sebald W, Knaus P. Type 111 TGF-p receptor-independent signalling of TGF-p2 via TpRII-B, an alternatively spliced TGF-p type 11 receptor. EMBO J 2001 Feb 1; 20(3): 480- 90. Saharinen J, Taipale J, Monni O, Keski-Oja J. Identification and characterization of a new latent transforming growth factor-p-binding protein, L TBP-4. J Biol Chem 1998 Jul 17; 273(29): 18459~9 . 134 Sanford LP, Ormsby 1, Gittenberger-de Groot AC, Sariola H, Friedman R, Boivin GP, Cardell EL, Ooetschman T. TGFp2 knockout mice have multiple developmental defects that are non-overlapping with other TGFp knockout phenotypes. Development 1997 Jul; 124(13}: 2659-70. Sankar S, Mahooti-Brooks N, Centrella M, McCarthy TL, Madri JA. Expression of transforming growth factor type 111 receptor in vascular endothelial cells increases their responsiveness to transforming growth factor p2. J Biol Chem 1995 Jun 2; 270(22}: 13567-72. Sankar S, Mahooti-Brooks N, Bensen L, McCarthy TL, Centrella M, Madri JA. Modulation of transforming growth factor preceptor levels on microvascular endothelial cells during in vitro angiogenesis. J Clin Invest 1996 Mar 15; 97(6}: 1436-46. Sato Y, Rifkin OB. Inhibition of endothelial cell movement by pericytes and smooth muscle cells: activation of a latent transforming growth factor-p1-like molecule by plasmin during co-culture. J Cel/ Biol 1989 Jul; 109(1): 309-15. Savage C, Das P, Finelli AL, Townsend SR, Sun CY, Baird SE, Padgett RW. Caenorhabditis elegans genes sma-2, sma-3, and sma-4 define a conserved family of transforming growth factor p pathway components. Proc Natl Aead Sei U S A 1996 Jan 23; 93(2}: 790-4. Schick BP, Jacoby JA. Serglycin and betaglycan proteoglycans are expressed in the megakaryocytic cellline CHRF 288-11 and normal human megakaryocytes. J Cel/ Physio/1995 Oct; 165(1}: 96-106. Schlunegger MP, Grutter MG. An unusual feature revealed by the crystal structure at 2.2 A resolution of human transforming growth factor-p2 . Nature 1992 Ju130; 358(6385}: 430-4. Schmidt A, Skaletz-Rorowski A, Buddecke E. Basic fibroblast growth factor controls the expression and molecular structure of heparan sulfate in corneal endothelial cells. Eur J Bioehem 1995 Oec 1; 234(2}: 479-84. Schonemann MO, Ryan AK, McEvilly RJ, O'Connell SM, Arias CA, Kalla KA, Li P, Sawchenko PE, Rosenfeld MG. Oevelopment and survival of the endocrine hypothalamus and posterior pituitary gland requires the neuronal POU domain factor Brn-2. Genes Dev 1995 Oec 15; 9(24}: 3122-35. Schreiber E, Himmelmann A, Malipiero U, Tobler A, Stahel R, Fontana A. Human small cell lung cancer expresses the octamer ONA-binding and nervous system-specific transcription factor N-Oct 3 (brain-2). CaneerRes 1992 Nov 1; 52(21}: 6121-4. Schultz-Cherry S, Murphy-Ullrich JE. Thrombospondin causes activation of Jatent transforming growth factor-p secreted by endothelial cells by a novel mechanism. J Cel/ Bio/1993 Aug; 122(4}: 923-32. Erratum in: J Cel/ Bio/1993 Sep; 122(5}: following 1143. Schultz-Cherry S, Ribeiro S, Gentry L, Murphy-Ullrich JE. Thrombospondin binds and activates the small and large forms of latent transforming growth factor-p in a chemically defined system. J Biol Chem 1994 Oct 28; 269(43}: 26775-82. Schwander M, Leu M, Stumm M, Oorchies OM, Ruegg UT, Schittny J, Muller U. p1 integrins regulate myoblast fusion and sarcomere assembly. Dev Cel/2003 May; 4(5}: 673-85. Segarini PR, Roberts AB, Rosen OM, Seyedin SM. Membrane binding characteristics of two forms of transforming growth factor-p. J Biol Chem 1987 Oct 25; 262(30}: 14655-62. Segarini PR, Seyedin SM. The high molecular weight receptor to transforming growth factor-p contains glycosaminoglycan chains. J Biol Chem 1988 Jun 15; 263(17}: 8366-70. Semsarian C, Wu MJ, Ju YK, Marciniec T, Yeoh T, Allen OG, Harvey RP, Graham RM. Skeletal muscle hypertrophy is mediated by a Ca2 + -dependent calcineurin signalling pathway. Nature 1999 Aug 5; 400(6744): 576-81. Seoane J, Pouponnot C, Staller P, Schader M, Eilers M, Massagué J. TGFp influences Myc, Miz-1 and Smad to control the COK inhibitor p15/ NK4b . Nat Cel/ Bio/2001 Apr; 3(4}: 400-8. Serra R, Pelton RW, Moses HL. TGFp1 inhibits branching morphogenesis and N-mye expression in lung bud organ cultures. Development 1994 Aug; 120(8}: 2153-61. Serra R, Johnson M, Filvaroff EH, LaBorde J, Sheehan OM, Oerynck R, Moses HL. Expression of a truncated, kinase-defective TGF-p type 11 receptor in mouse skeletal tissue promotes terminal chondrocyte differentiation and osteoarthritis. J Cel/ Bio/1997 Oct 20; 139(2): 541-52. Sheridan CM, Heist EK, Beals CR, Crabtree GR, Gardner P. Protein kinase A negatively modulates the nuclear accumulation of NF-ATc1 by priming for subsequent phosphorylation by glycogen synthase kinase-3. J Biol Chem 2002 Oec 13; 277(50}: 48664-76. Sherr CJ, Roberts JM. COK inhibitors: positive and negative regulators of G1-phase progression. Genes Dev 1999 Jun 15; 13(12}: 1501-12. Shi W, Sun C, He B, Xiong W, Shi X, Yao O, Cao X. GA0034-PP1c recruited by Smad7 dephosphorylates TGFp type I receptor. J Cel/ Bio/2004 Jan 19; 164(2}: 291-300. Shi Y, Hata A, Lo RS, Massagué J, Pavletich NP. A structural basis for mutational inactivation of the tumour suppressor Smad4. Nature 1997 Ju13; 388(6637}: 87-93. Shi Y, Massagué J. Mechanisms of TGF-p signaling from cell membrane to the nucleus. Cel/2003 Jun 13; 113(6}: 685-700. 135 Shin EK, Shin A, paulding C, Schaffhausen B, Yee AS. Multiple change in E2F function and regulation occur upon muscle differentiation. Mol Cel/ Bio/1995 Apr; 15(4): 2252-62. Shull MM, Ormsby 1, Kier AB, Pawlowski S, Oiebold RJ , Yin M, Allen R, Sidman C, Proetzel G, Calvin O, et al. Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-p1 gene results in multifocal inflammatory disease. Nature 1992 Oct 22; 359(6397): 693-9. Sirard C, Kim S, Mirtsos C, Tadich P, Hoodless PA, Itie A, Maxson R, Wrana JL, Mak TW. Targeted disruption in murine cells reveals variable requirement for Smad4 in transforming growth factor p-related signaling. J Biol Chem 2000 Jan 21 ; 275(3): 2063-70. Slager HG, Van Inzen W, Freund E, Van den Eijnden-Van Raaij AJ , Mummery CL. Transforming growth factor-p in the early mouse embryo: implications for the regulation of muscle formation and implantation. Dev Genet 1993; 14(3): 212-24. Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, Mallia AK, Gartner FH, Provenzano MO, Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ, Klenk OC. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Bioehem 1985 Oct; 150(1): 76-85. Erratum in: Anal Bioehem 1987 May 15; 163(1): 279. Soma Y, Grotendorst GR. TGF-p stimulates primary human skin fibroblast ONA synthesis via an autocrine production of POGF-related peptides. J Cel/ Physio/1989 Aug; 140(2): 246-53. Song K, Cornelius SC, Reiss M, Oanielpour O. Insulin-like growth factor-I inhibits transcriptional responses of transforming growth factor-p by phosphatidylinositol 3-kinase/Akt-dependent suppression of the activation of Smad3 but not Smad2. J Biol Chem 2003 Oct 3; 278(40): 38342-51 . Sordella R, Jiang W, Chen GC, Curto M, Settleman J. Modulation of Rho GTPase signaling regulates a switch between adipogenesis and myogenesis. Cel/2003 Apr 18; 113(2): 147-58. Erratum in Cel/2003 May 16; 113(4): 547. Souchelnytskyi S, ten Oijke P, Miyazono K, Heldin CH. Phosphorylation of Ser165 in TGF-p type I receptor modulates TGF-p1-induced cellular responses. EMBO J 1996 Nov 15; 15(22): 6231-40. Erratum in: EMBO J 1997 Oct 1; 16(19): 6055. Spencer FA, Hoffmann FM, Gelbart WM. Deeapentaplegie: a gene complex affecting morphogenesis in Drosophila melanogaster. Cel/1982 Mar; 28(3): 451-61 . Spicer OB, Rhee J, Cheung WL, Lassar AB. Inhibition of myogenic bHLH and MEF2 transcription factors by the bHLH protein Twist. Seienee 1996 Jun 7; 272(5267): 1476-80. Spizz G, Roman O, Strauss A, Olson EN. Serum and fibroblast growth factor inhibit myogenic differentiation through a mechanism dependent on protein synthesis and independent of cell proliferation. J Biol Chem 1986 Jul 15; 261 (20): 9483-8. Stach RM, Rowley DA. A first or dominant immunization . 11. Induced immunoglobulin carries transforming growth factor p and suppresses cytolytic T cell responses to unrelated alloantigens. J Exp Med 1993 Sep 1; 178(3): 841-52. Staller P, Peukert K, Kiermaier A, Seoane J, Lukas J, Karsunky H, Moroy T, Bartek J, Massagué J, Hanel F, Eilers M. Repression of p1S NK4b express ion by Myc through association with Miz-1. Nat Cel/ Bio/2001 Apr; 3(4): 392-9. Stenvers KL, Tursky ML, Harder KW, Kountouri N, Amatayakul-Chantler S, Grail O, Small C, Weinberg RA, Sizeland AM , Zhu HJ. Heart and liver defects and reduced transforming growth factor p2 sensitivity in transforming growth factor p type 111 receptor-deficient embryos. Mol Cel/ Bio/2003 Jun; 23(12): 4371-85. Sterner-Kock A, Thorey IS, Koli K, Wempe F, Otte J, Bangsow T, Kuhlmeier K, Kirchner T, Jin S, Keski-Oja J, von Melchner H. Oisruption of the gene encoding the latent transforming growth factor-p binding protein 4 (L TBP-4) causes abnormal lung development, cardiomyopathy, and colorectal cancer. Genes Dev 2002 Sep 1; 16(17): 2264-73. Stewart CE, Rotwein P. Insulin-like growth factor-II is an autocrine survival factor for differentiating myoblasts. J Biol Chem 1996 May 10; 271(19): 11330-8. Stroschein SL, Wang W, Zhou S, Zhou Q, Luo K. Negative feedback regulation of TGF-p signaling by the SnoN oncoprotein. Seienee 1999 Oct 22; 286(5440): 771-4. Stroschein SL, Bonni S, Wrana JL, Luo K. Smad3 recruits the anaphase-promoting complex for ubiquitination and degradation of SnoN. Genes Dev 2001 Nov 1; 15(21): 2822-36. Sun L, Chen C. Expression of transforming growth factor p type 111 receptor suppresses tumorigenicity of human breast cancer MOA-MB-231 cells. J Biol Chem 1997 Oct 3; 272(40): 25367-72. Sun Y, Liu X, Eaton EN, Lane WS, Lodish HF, Weinberg RA. Interaction of the Ski oncoprotein with Smad3 regulates TGF-p signaling. Mol Cel/1999a Oct; 4(4): 499-509. Sun Y, Liu X, Ng-Eaton E, Lodish HF, Weinberg RA. SnoN and Ski protooncoproteins are rapidly degraded in response to transforming growth factor p signaling. Proe Natl Aead Sei U S A 1999b Oct 26; 96(22): 12442-7. Sweeney SA, Johnson PA. Messenger RNA and protein express ion analysis of betaglycan in the pituitary and ovary of the domestic heno Biol Reprod 2005 Jan; 72(1): 172-8. Tabibzadeh S. Homeostasis of extracellular matrix by TGF-p and lefty. Front Biosei 2002 May 1; 7: d1231-46. 136 Taipale J, Miyazono K, Heldin CH, Keski-Oja J. Latent transforming growth factor-p1 associates to fibroblast extracellular matrix via latent TGF-p binding protein. J Cel/ Bio/1994 Jan; 124(1-2): 171-81. Taipale J, Lohi J, Saarinen J, Kovanen PT, Keski-Oja J. Human mast cell chymase and leukocyte elastase release latent transforming growth factor-p1 trom the extracellular matrix of cultured human epithelial and endothelial cells. J Biol Chem 1995 Mar 3; 270(9): 4689-96. Taipale J, Cooper MK, Maiti T, Beachy PA. Patched acts catalytically to suppress the activity of Smoothened. Nature 2002 Aug 22; 418(6900): 892-7. Erratum in: Nature 2002 Nov 28; 420(6914): 445. Takeuchi Y, Kodama Y, Matsumoto T. Bone matrix decorin binds transforming growth factor-p and enhances its bioactivity. J Biol Chem 1994 Oec 23; 269(51): 32634-8. Tam BY, Finnson KW, Philip A. Glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins regulate transforming growth factor-p signaling in human keratinocytes. J Biol Chem 2003 Oec 5; 278(49): 49610-7. Tamai K, Semenov M, Kato Y, Spokony R, Liu C, Katsuyama Y, Hess F, Saint-Jeannet JP, He X. LOL- receptor-related proteins in Wnt signal transduction. Nature 2000 Sep 28; 407(6803): 530-5. Taylor MV. Muscle differentiation: how two cells become one. Curr Bio/2002 Mar 19; 12(6): R224-8. ten Oijke P, Hansen P, Iwata KK, Pieler C, Foulkes JG. Identification of another member of the transforming growth factor type p gene family. Proc Natl Acad Sci U S A 1988 Jul; 85(13): 4715-9. ten Oijke P, Yamashita H, Ichijo H, Franzén P, Laiho M, Miyazono K, Heldin CH. Characterization of type I receptors for transforming growth factor-p and activin. Science 1994 Apr 1; 264(5155): 101-4. ten Oijke P, HiII CS. New insights into TGF-p-Smad signalling. Trends Biochem Sci 2004 May; 29(5): 265-73. Tsukazaki T, Chiang TA, Oavison AF, Attisano L, Wrana JL. SARA, a FYVE domain protein that recruits Smad2 to the TGFp receptor. Cel/1998 Oec 11 ; 95(6): 779-91 . Twardzik OR, Mikovits JA, Ranchalis JE, Purchio AF, Ellingsworth L, Ruscetti FW. y-interferon-induced activation of latent transforming growth factor-p by human monocytes. Ann N Y Acad Sci 1990; 593: 276- 84. Ulloa L, Ooody J, Massagué J. Inhibition of transforming growth factor-¡3/SMAO signalling by the interferon- y/STAT pathway. Nature 1999 Feb 25; 397(6721): 710-3. Vaidya TB, Rhodes SJ, Taparowsky EJ, Konieczny SF. Fibroblast growth factor and transforming growth factor p repress transcription of the myogenic regulatory gene Myo01 . Mol Cel/ Bio/1989 Aug; 9(8): 3576- 9. Velasco Loyden G, Arribas J, L6pez Casillas F. The shedding of betaglycan is regulated by pervanadate and mediated by membrane type matrix metalloprotease-1 . J Biol Chem 2004 Feb 27; 279(9): 7721-33. Ventura F, Ooody J, Liu F, Wrana JL, Massagué J. Reconstitution and transphosphorylation ofTGF-p receptor complexes. EMBOJ 1994 Oec 1; 13(23): 5581-9. Wahl SM, Hunt DA, Wakefield LM, McCartney-Francis N, Wahl LM, Roberts AB, Sporn MB. Transforming growth factor type p induces monocyte chemotaxis and growth factor production. Proc Natl Acad Sci U S A 1987 Aug; 84(16): 5788-92. Wakefield LM, Smith OM, Flanders KC, Sporn MB. Latent transforming growth factor-p from human platelets. A high molecular weight complex containing precursor sequences. J Biol Chem 1988 Jun 5; 263(16): 7646-54. Wan M, Cao X, Wu Y, Bai S, Wu L, Shi X, Wang N, Cao X. Jab1 antagonizes TGF-p signaling by inducing Smad4 degradation. EMBO Rep 2002 Feb; 3(2): 171-6. Wan Y, Liu X, Kirschner MW. The anaphase-promoting complex mediates TGF-p signaling by targeting SnoN for destruction. Mol Cel/2001 Nov; 8(5): 1027-39. Wang T, Oonahoe PK, Zervos AS. Specific interaction of type I receptors of the TGF-p family with the immunophilin FKBP-12. Science 1994 Ju129; 265(5172): 674-6. Wang T, Li BY, Oanielson PO, Shah PC, Rockwell S, Lechleider RJ, Martin J, Manganaro T, Oonahoe PK. The immunophilin FKBP12 functions as a common inhibitor of the TGFp family type I receptors. Cel/1996 Aug 9; 86(3): 435-44. Wang XF, Lin HY, Ng-Eaton E, Oownward J, Lodish HF, Weinberg RA. Expression cloning and characterization ofthe TGF-p type 111 receptor. Cel/1991 Nov 15; 67(4): 797-805. Wehrli M, Oougan ST, Caldwell K, O'Keefe L, Schwartz S, Vaizel-Ohayon O, Schejter E, Tomlinson A, OiNardo S. arrowencodes an LOL-receptor-related protein essential for Wingless signalling. Nature 2000 Sep 28; 407(6803): 527-30. Erratum in: Nature 2001 Apr 12; 410(6830): 847. Weinberg RA. The retinoblastoma protein and cell cycle control. Cel/1995 May 5; 81(3): 323-30. Weinberg RA. E2F and cell proliferation: a world turned upside down. Gel/1996 May 17; 85(4): 457-9. Weiner OH, Zoremba M, Gressner AM. Gene expression of syndecans and betaglycan in isolated rat liver cells. Cell Tissue Res 1996 Jul; 285(1): 11-6. Weinstein M, Monga SP, Liu Y, Brodie SG, Tang Y, Li C, Mishra L, Oeng CX. Smad proteins and hepatocyte growth factor control parallel regulatory pathways that converge on p1-integrin to promote normal liver development. Mol Cel/ Bio/2001 Aug; 21(15): 5122-31. 137 Weintraub H, Tapscott SJ, Davis RL, Thayer MJ, Adam MA, Lassar AB, Miller AD. Activation of muscle- specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced express ion of MyoD. Proc Natl Acad Sci U S A 1989 Jul; 86(14): 5434-8. Weintraub H, Davis R, Tapscott S, Thayer M, Krause M, Benezra R, Blackwell TK, Turner O, Rupp R, Hollenberg S. The myoD gene family: nodal point during specification of the muscle celllineage. Science 1991 Feb 15; 251(4995): 761-6. Weis-García F, Massagué J. Complementation between kinase-defective and activation-defective TGF-j3 receptors reveals a novel form of receptor cooperativity essential for signaling. EMBO J 1996 Jan 15; 15(2): 276-89. Whitman M. Smads and early developmental signaling by the TGFj3 superfamily. Genes Dev 1998 Aug 15; 12(16): 2445-62. Wiater E, Vale W. Inhibin is an antagonist of bone morphogenetic protein signaling. J Biol Chem 2003 Mar 7; 278( 1 O): 7934-41 . Wilcox JN, Derynck R. Developmental expression of transforming growth factors a and j3 in mouse fetus. Mol Cel/ Bio/1988 Aug; 8(8): 3415-22. Wilson PA, Lagna G, Suzuki A, Hemmati-Brivanlou A. Concentration-dependent patterning of the Xenopus ectoderm by BMP4 and its signal transducer Smad1 . Development 1997 Aug; 124(16): 3177-84. Wolpert, Lewis, Rosa Beddington, Jeremy Brockes, Thomas Jessell, Peter Lawrence, and Elliot Meyerowitz. Principies of Development. London: Current Biology, 1998. Figura 9.20 de la página 288. Wong SH, Hamel L, Chevalier S, Philip A. Endoglin expression on human microvascular endothelial cells association with betaglycan and formation of higher order complexes with TGF-j3 signalling receptors. Eur J Biochem 2000 Sep; 267(17): 5550-60. Worapamorn W, U H, Pujic Z, Xiao Y, Young WG, Bartold PM. Expression and distribution of cell-surface proteoglycans in the normal Lewis rat molar periodontium. J Periodontal Res 2000a Aug; 35(4): 214-24. Worapamorn W, U H, Haas HR, Pujic Z, Gi~es AA, Bartold PM. Cell surface proteoglycan expression by human periodontal cells. Connect Tissue Res 2000b; 41(1): 57-68. Worapamorn W, Haase HR. U H, Bartold PM. Growth factors and cytokines modulate gene expression of cell- surface proteoglycans in human periodontalligament cells . J Cel/ Physio/2001 Mar; 186(3): 448-56. Wotton O, Lo RS, Lee S, Massagué J. A Smad transcriptional corepressor. Cel/1999a Apr 2; 97(1): 29-39. Wotton O, Lo RS, Swaby LA, Massagué J. Multiple modes of repression by the Smad transcriptional corepressor TGIF. J Biol Chem 1999b Dec 24; 274(52): 37105-10. Wotton O, Knoepfler PS, Laherty CD, Eisenman RN, Massagué J. The Smad transcriptional corepressor TGIF recruits mSin3. Cel/ Growth Differ 2001 Sep; 12(9): 457-63. Wrana JL, Attisano L, Cárcamo J, Zentella A, Doody J, Laiho M, Wang XF, Massagué J. TGFj3 signals through a heteromeric protein kinase receptor complex. Cel/1992 Dec 11 ; 71 (6): 1003-14. Wrana JL, Attisano L, Wieser R, Ventura F, Massagué J. Mechanism of activation of the TGF-j3 receptor. Nature 1994 Aug 4; 370(6488): 341-7. Wright WE, Sassoon DA, Un VK. Myogenin, a factor regulating myogenesis, has a domain homologous to MyoD. Cel/1989 Feb 24; 56(4): 607-17. Wu G, Fan RS, U W, Srinivas V, Brattain MG. Regulation of transforming growth factor-j3 type 11 receptor expression in human breast cancer MCF-7 cells by vitamin 03 and its analogues. J Biol Chem 1998 Mar 27; 273(13): 7749-56. Wu P, Jiang TX, Suksaweang S, Widelitz RB, Chuong CM. Molecular shaping of the beak. Science 2004 Sep 3; 305(5689): 1465-6. Wu X, Robinson CE, Fong HW, Gimble JM. Analysis of the native murine bone morphogenetic protein serine threonine kinase type I receptor (ALK-3). J Cel/ Physio/1996 Aug; 168(2): 453-61 . Xu J, Attisano L. Mutations in the tumor suppressors Smad2 and Smad4 inactivate transforming growth factor j3 signaling by targeting Smads to the ubiquitin-proteasome pathway. Proc Natl Acad Sci U S A 2000 Apr 25; 97(9): 4820-5. Xu L, Kang Y, Col S, Massagué J. Smad2 nucleocytoplasmic shuttling by nucleoporins CAN/Nup214 and Nup153 feeds TGFj3 signaling complexes in the cytoplasm and nucleus. Mol Cel/2002 Aug; 10(2): 271- 82. Xu W, Angelis K, Danielpour O, Haddad MM, Bischof O, Campisi J, Stavnezer E, Medrano EE. Ski acts as a co-repressor with Smad2 and Smad3 to regulate the response to type j3 transforming growth factor. Proc Natl Acad Sci U S A 2000 May 23; 97(11): 5924-9. Yaffe O, Saxel O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature 1977 Dec 22-29; 270(5639): 725-7. Yamaguchi Y, Mann DM, Ruoslahti E. Negative regulation of transforming growth factor-j3 by the proteoglycan decorin. Nature 1990 Ju119; 346(6281): 281-4. Yamashita H, Ichijo H, Grimsby S, Moren A, ten Dijke P, Miyazono K. Endoglin forms a heteromeric complex with the signaling receptors for transforming growth factor-j3. J Biol Chem 1994a Jan 21 ; 269(3): 1995- 2001 . 138 O RA Lago o ap os Ls ir rg grrr CIO. Ll Biol Chem 1994b Aug 5; 269(31): 20172-8. Yan Z, Deng X, Friedman E. Oncogenic Ki-ras confers a more aggressive colon cancer phenotype through modification of transforming growth factor-8 receptor HL. J Biol Chem 2001 Jan 12; 276(2): 1555-63. Yanagisawa K, Osada H, Masuda A, Kondo M, Saito T, Yatabe Y, Takagi K, Takahashi Y, Takahashi T. induction of apoptosis by Smad3 and down-regulation of Smad3 expression in response to TGF-8 in human normal lung epithelial cells. Oncogene 1998 Oct 1; 17(13): 1743-7. Yayon A, Klagsbrun M, Esko JD, Leder P, Ornitz DM. Cell surface, heparin-like molecules are required for binding cf basic fibroblast growth factor to its high afíinity receptor. Cell 1991 Feb 22; 64(4): 841-8. Yin W, Smiley E, Germiller J, Mecham RP, Florer JB, Wenstrup RJ, Bonadio J. Isolation of a novel latent transforming growth factor-f binding protein gene (LTBP-3). J Bio/ Chem 1995 Apr 28; 270(17): 10147- 50 Yoneda A, Asada M, Oda Y, Suzuki M, imamura T. Engineering of an FGF-proteoglycan fusion protein with heparin-independent, mitogenic activity. Nat Biotechnol 2000 Jun; 18(6): 641-4. Yu Q, Stamenkovic 1. Cell surface-localized matrix metalloproteinase-2 proteolytically activates TGP-f and promotes tumor invasion and angiogenesis, Genes Dev 2000 Jan 15; 14(2): 163-76. Zanni M, Tamburro A, Rotilio D. 1L-1B and TGF-8$1 modulate the sulphation grade of chondro-disaccharides in porcine articular cartilage: a capillary electrophoresis study. J Lipid Medist Cell Signal 1995 Jul, 12(1): 29- 44, Zaret KS. Regulatory phases of early liver development: paradigras of organogenesis. Naf Rev Genet 2002 Jul 37): 499-512. Zavadil J, Cermak L, Soto-Nieves N, Bottinger EP. Integration of TGF-S/Smad and Jagged1/Notch signalling in epithelial-to-mesenchymal transition. EMBO J 2004 Mar 10; 23(5): 1155-65. Zeisberg M, Hanai J, Sugimoto H, Mammato T, Charytan D, Strutz F, Kalluri R. BMP-7 counteracts TGF-$1- induced epithelial-to-mesenchymal transition and reverses chronic renal injury. Nat Med 2003 Jul, 37) 964-8. Zeng X, Gray M, Stahiman MT, Whitsett JA. TGF-$1 perturbs vascular development and inhibits epithelial differentiation in fetal lung in vivo. Dev Lyn 2001 Jul, 221(3): 289-301. Zentella A, Massagué J. Transfoming growth factor f induces myoblast differentiation in the presence of mitogens. Proc Nafl Acad Sci U S A 1982 Jun 1; 89(11): 5176-80, Zhang MF, Zola H, Read LC, Pentiila lA. Localization of transforming growth factor-P receptor types !, Il, and tbn the postnatal rat small intestine. Pediatr Res 1999 Dec, 4616): 657-685. Zhang Y, Feng X, We R, Derynck R. Receptor-associated Mad homologues synergize as effectors of the TGF-f response. Nature 1996 Sep 12; 383(6596): 1868-72. Zhao J, Tefí JD, Lee M, Smith S, Warburton D. Abrogation of betaglycan attenuates TGF-f-mediated inhibitien of embryonic murine lung branching morphogenesis in culture. Mech Dev 1998 Jul; 75(1-2): 67- 79. Zhou Á, Scoggin S, Gaynor RB, Williams NS. identification of NF-xB-regulated genes induced by TNFo utilizing expression profiling and RNA interference. Oncogene 2003 Apr 3; 22(13): 2054-84, Zhou L, Dey CR, Wert SE, Whitsett JA. Arrested lung morphogenesis in transgenic mice bearing an SP-C- TGF-81 chimeric gene. Dev Biol 1998 May 1; 17512): 227-38. Zhu Ay, Zheng L, Suyama K, Scott MP. Altered localization of Drosophila Smoothened protein activates Hedgehog signal transduction. Genes Dev 2003 May 15; 17(10y 1240-52. Zipperi R, Bassier A, Holmer SR, Hengstenberg €, Schunkeri H. Eleven single nucleotide polymorphisms and one triple nucleotide insertion of the human TGF-P ll! receptor gene. Y Hum Genet 2000; 45(4): 250-3. Zweidler-Mckay PA, Grimes HL, Flubacher MM, Tsichlis PN. Gf-1 encodes a nuclear zinc finger protein that binds DNA and functions as a transcriptional repressor. Mol Cell Bio! 1996 Aug; 16(8): 4024-34. 139 Yamashita H, ten Oijke P, Franzén P, Miyazono K, Heldin CH. Formation of hetero-oligomeric complexes of type I and type 11 receptors for transforming growth factor-~ . J Biol Chem 1994b Aug 5; 269(31): 20172-8. Van Z, Oeng X, Fried an E. ncogenic Ki-ras confers a ore aggressive colon cancer phenotype through odification of transfor ing growth factor -~ receptor 111. J Biol Chem 2001 Jan 12; 276(2): 1555-63. Yanagisawa K, Osada H, asuda A, Kondo , Saito T, Yatabe Y, Takagi K, Takahashi T, Takahashi T. Induction of apoptosis by S ad3 and down-regulation of Smad3 expression in response to TGF-~ in hu an normallung epithelial cells. Oncogene 1998 Oct 1; 17(13): 1743-7. Yayon A, Klagsbrun , Esko JO, Leder P, rnitz OM. Cell surface, heparin-like olecules are required for binding of basic fibroblast growth factor to its high affinity receptor. Ce/l1991 Feb 22; 64(4): 841-8. Yin , Smiley E, Germiller J, Mecham RP, Florer JB, enstrup RJ, Bonadio J. Isolation of a novel latent transforming growth factor-~ binding protein gene (LTBP-3). J Biol Chem 1995 Apr 28; 270(17): 10147- 60. Yoneda A, Asada , da Y, Suzuki , I amura T. Engineering of an F F-proteoglycan fusion protein with heparin-independent, itogenic activity. Nat Biotechno/2000 Jun; 18(6): 641-4. Yu a, Sta enkovic 1. Cell surface-Iocalized atrix etalloproteinase-9 proteolytically activates TGF-~ and promotes tumor invasion and angiogenesis. Genes Dev 2000 Jan 15; 14(2): 163-76. Zanni , Tamburro A, Rotilio O. IL-1~ and TGF-~1 odulate the sulphation grade of chondro-disaccharides in porcine articular cartilage: a capillary electrophoresis study. J Lipid Mediat Ce/l Signa/1995 Jul; 12(1): 29- 44. Zaret KS. Regulatory phases of early liver development: paradigms of organogenesis. Nat Rev enet 2002 Jul; 3(7): 499-512. Zavadil J, Cermak L, Soto-Nieves N, Bottinger EP. Integration ofTGF-ptSmad and Jagged1/Notch signalling in epithelial-to-mesenchymal transition. E BO J 2004 ar 10; 23(5): 1155-65. Zeisberg , Hanai J, Sugimoto H, a moto T, Charytan O, Strutz F, Kalluri R. BMP-7 counteracts TGF-~1- induced epithelial-to-mesenchymal transition and reverses chronic renal injury. Nat ed 2003 Jul; 9(7): 964-8. Zeng X, Gray M, Stahlman MT, hitsett JA. TGF-~1 perturbs vascular development and inhibits epithelial differentiation in fetallung in vivo. Dev Dyn 2001 Jul; 221(3): 289-301 . Zentella A, assagué J. Transforming growth factor ~ induces yoblast differentiation in the presence of itogens. Proc Na ti Acad Sci U S A 1992 Jun 1; 89(11): 5176-80. Zhang F, Zola H, Read LC, Penttila lA. Localization of transfor ing growth factor-~ receptor types 1, 11, and 111 in the postnatal rat small intestine. Pediatr Res 1999 Oec; 46(6): 657-65. Zhang Y, Feng X, e R, Oerynck R. Receptor-associated ad ho ologues synergize as effectors of the TGF-~ response. Nature 1996 Sep 12; 383(6596): 168-72. Zhao J, Tefft JO, Lee , Smith S, arburton O. Abrogation of betaglycan attenuates TGF-~-mediated inhibition of e bryonic urine lung branching orphogenesis in culture. ech Dev 1998 Jul; 75(1-2): 67- 79. Zhou A, Scoggin S, aynor RB, illia s NS. Identification of NF-KB-regulated genes induced by TNFa utilizing expression profiling and RNA interference. ncogene 2003 Apr 3; 22(13): 2054-64. Zhou L, Oey CR, ert SE, hitsett JA. Arrested lung orphogenesis in transgenic ice bearing an SP-C- TGF-~1 chimeric gene. Dev Bio/1996 May 1; 175(2): 227-38. Zhu AJ, Zheng L, Suyama K, Scott P. Altered localization of Drosophila Smoothened protein activates Hedgehog signal transduction. enes Dev 2003 ay 15; 17(10): 1240-52. Zippert R, Bassler A, olmer SR, engstenberg C, Schunkert . Eleven single nucleotide poly orphisms and one triple nucleotide insertion of the human TGF-~ 111 receptor gene. J Hum Genet 2000; 45(4): 250-3. Zweidler- ckay PA, ri es HL, Flubacher M, Tsichlis PN. fi-1 encodes a nuclear zinc finger protein that binds ONA and functions as a transcriptional repressor. ol Ce/l Bio/1996 Aug; 16(8): 4024-34. 139 THE J OURNAL O, BIOLOGlCAL CHE.\lISTRY e 2003 by Th. American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Ine. Vol. 278, No. 1, Issue of January 3, pp. 382-390, 2003 PrinUd in U.SA Betaglycan Expression Is Transcriptionally Up-regulated during Skeletal Muscle Differentiation CLONING OF MURlNE BETAGLYCAN GENE PROMOTER AND ITS MODULATION BY MyoD, RETINOIC ACm, AND TRANSFORMING GROWTH FACTOR-{3* Received for publication, August 20, 2002, and in revised form, October 8, 2002 Published, JBC Papers in Press, October 23, 2002, DO! 1O.1074/jbc.M208520200 Fernando López-Casillas:j:§, Cecilia Riquelmel1, Yoshiaki Pérez-Kato:j:, M. Verónica Ponce-Castañeda:j:, Nelson Ossesl1, José Esparza-López:j:, Gerardo González-Núñez:j:, Claudio Cabello-Verrugiol1, Valentín Mendoza:j:, Victor Troncosol1, and Enrique Brandan§l1l1 From the Unstituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México, Apartado Postal 70-246, México City, D.F., 04510, México and the l1Centro de Regulación Celular y Patología, Facultad de Ciencias Biológicas, Millenium Institute for Fundamental and Applied Biology, P. Universidad Católica de Chile, Casilla I14-D, Santiago, Chile Betaglycan is a membrane-anchored proteoglycan co- receptor that binds transforming growth factor 13 (TGF -13) via its core protein and basic fibroblast growth factor through its glycosaminoglycan chains. In this study we evaluated the expression of betaglycan during the C2C12 skeletal muscle differentiation. Betaglycan ex- pression, as determined by Northern and Western blot, was up-regulated during the conversion of myoblasts to myotubes. The mouse betaglycan gene promoter was cloned, and its sequence showed putative binding sites for 8Pl, 8mad3, 8mad4, muscle regulatory factor ele- ments such as MyoD and MEF2, and retinoic acid recep- tor. Transcriptional activity of the mouse betaglycan promoter reporter was also up-regulated in differenti- ating C2C12 cells. We found that MyoD, but not myoge- nin, stimulated this transcriptionaI activity even in the presence of high serum. Betaglycan promoter activity was increased by RA and inhibited by the three isoforms of TGF-fJ. On the other hand, basic fibroblast growth factor, BMP-2, and hepatocyte growth factorlscatter fac- tor, which are inhibitors ofmyogenesis, had little effect. In myotubes, up-regulated betaglycan was also detecta- ble by TGF-fJ affinity Iabeling and immunofluorescence microscopy studies. The Iatter indicated that betaglycan was localized both on the cell surface and in the ECM. Forced express ion of betaglycan in CzC12 myoblasts in- creases their responsiveness to TGF-fJ2, suggesting that it pedorms a TGF -13 presentation function in this cell lineage. These results indicate that betaglycan expres- sion is up-regulated during myogenesis and that MyoD and RA modulate its expression by a mechanism that is independent of myogenin. * Tlris work was supported in part by FONDAP-Biomedicine Grant 13980001 (to E. B.). The Millenium Institute for Fundamental and Applied Biology is financed in part by the Ministerio de Planificación y Cooperación (Chile). The costs of publication of this artiele were de- frayed in part by the payment of page charges. This artiele must therefore be hereby marked "advertisement" in accordance with 18 U.S.C. Section 1734 solely to indicate this fact. The nucleotide sequence(s) reported in this paper has been submitted lo the GenBank TM I EBI Data Bank with accession number(s) AF537325. § Supported in part by International Research Scholars grants from the Howard Hughes Medical Institute. H Recipient of a Presidential Chair in Science from the Chilean Gov- ernment. To whom correspondence should be addressed: Dept. de Bio- logía Celular y Molecular, Facultad de Ciencias Biológicas, P. Univer- sidad Católica de Chile, Casilla 114-D, Santiago, Chile. Fax: 56-2-635- 5395; E-mail: ebrandan@genes.bio.puc.cl. Skeletal rnuscle rnyoblasts are the precursors to skeletal rnuscle fibers. During development these cells are rnaintained in a proliferative and undifferentiated state until appropriate signals cause thern to undergo conversion into rnultinucleated rnyotubes. A network of muscle regulatory factors (MRFs), l some of which have been identified and characterized, governs this process. When myogenesis begins, myogenic regulatory genes encoding factors of the MyoD family are activated (rnyogenin, MRF4, and MRF5). These factors bind to specific DNA consen- sus sites called E boxes, which function as transcriptional enhancers of rnuscle differentiation genes (for review see Ref. 1). Factors of the MEF2 farnily are also required to specify rnuscle fate or to direct muscle differentiation (2). The expres- sion and activity of these master regulatory genes are regu- lated by polypeptide growth factors, such as basic fibroblast growth factor (FGF-2) (3), transforming growth factor type f3 (TGF-f3) (4), hepatocyte growth factorlscatter factor (HGF) (5), and insulin-like growth factor (6), as well as by retinoic acid (RA) (7). The onset and progression of the differentiation process are controlled by a complex set of interactions between myoblasts and their environment. The presence of the extracellular ma- trix (ECM) is essential for normal myogenesis (8-11). It has been demonstrated that the activities of FGF-2, HGF, and TGF-f3 can be regulated by binding to proteoglycans (2-6). Cell surface heparan sulfate proteoglycans, in particular, have been suggested to playa role in modulating the activities ofheparin- binding growth factors (7, 8). They modulate terminal myogen- esis probably by acting as low affinity receptors for sorne growth factors such as FGF-2 (5, 9) and HGF (10). We have shown that constitutive expression of syndecan-l, a heparan sulfate proteoglycan whose expression is down-regulated dur- ing skeletal muscle terminal differentiation, inhibits the differ- entiation of myoblasts in culture (5, 11). In contrast, abolish- ment of the expression of syndecan-3, another heparan sulfate proteoglycan synthesized by myoblasts, results in acceleration of skeletal rnuscle differentiation by a rnechanisrn being de- pendent on FGF-2 (9). Decorin is a derrnatan sulfate proteogly- can that has the ability to bind TGF-f3 by its core protein (12, 13). Decorin seerns to be critical in C2C12 cells to repress skel- 1 The abbreviations used are: MRF, musele regulatory factor; FGF-2, basic fibroblast growth factor; HGF, hepatocyte growth factorlscatter factor; ECM, extracellular matrix; TGF-/3, transforming growth factor /3; T/3R, TGF-/3 receptor; RA, retinoic acid; TRITC, tetramethylrhoda- mine isothiocyanate. 382 This paper is available on line al http://www.jbc.org Betaglycan and Skeletal M uscle Differentiation 383 etal muscle differentiation by a TGF-f3-dependent mechanism (14), and its expression is up-regulated during the process (15). Cell interaction with TGF-f3 is mediated by a complex group of proteins that includes the type I and II TGF-f3 receptors, which have signal transducing activity, and the membrane- bound proteoglycan betaglycan (16-18). Betaglycan, a hepa- ran/chondroitin sulfate proteoglycan also known as type III TGF-f3 receptor (Tf3RIID, is present on the ceIl surface of sev- eral celI types (19, 20) and has the ability to bind TGF-f3 through the core protein and FGF-2 through the heparan sul- fate chains (21). Although betaglycan is not directly involved in the intracellular TGF-f3 signaling, it controls its access to the Tf3RII receptor, thereby modulating its actions (6, 22). In this study we show that expression of betaglycan is up-regulated during skeletal muscle differentiation of CZC1Z myoblasts, in- creasing its levels on the cell surface of the myotubes and in the ECM. Our data also indicate that the proximal regíon of the betaglycan gene promoter controls this process in a manner that is dependent of MyoD expression. Although it is not clear at this moment what is the function of betaglycan during the skeletal muscle differentiation process, the fact that its ectopic forced express ion in myoblasts enhances their responsiveness to TGF-f32 suggests a potential regulatory role. EXPERIMENTAL PROCEDURES Cell Culture-The mouse skeletal muscle ceU line C2C12 (ATCC, Manassas, VA) (23) was grown and induced to differentiate as described (15). Briefly, 3 days after plating (80% confluence), the medium was changed to Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 5% horse serum to trigger myoblast differentiation. Two days later 0.1 mM cytosine-f3-D-arabinofuranoside was added to the culture medium. Thereafter the incubation medium was changed daily. Ratl and L6E9 eeUs were routinely cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium containing 10% or 20% fetal bovine serum, respectively, as described (19). RNA lsolatwn and Northern Blot Analysis-Total RNA was isolated from cell cultures at the indicated times using Trizol (Invitrogen). The RNA samples were electrophoresed in l.2% agaroselformaldehyde gels, transferred to Nytran membranes, hybridized with probes for mouse betaglycan (24), and exposed to Kodak x-ray film. Generation of the Adenoviral Vector for the Expresswn of Wild Type Betaglycan (Adv-BG)-The DNA vectors and hosts employed were gen- erous gifts of Bert Vogelstein (Johns Hopkins University Oncology Center), and the method employed has been described by He et al. (25). Briefly, to generate the appropriate transfer vector, a DNA fragment containing the 186 upstream bp of the 5'-untranslated region, the complete open reading frame, and the first 513 bp ofthe 3' -untranslated region ofthe \vild type rat betaglycan cDNA (19) was subcloned at the NotI-HindIll sites of pAdenoTrack. The created transfer vector was recombined with pAdenoEasy-l, and the recombinant adenoviral ge- nome was transfected in 293 cells to recover the recombinant viral particle (Adv-BG). Enrichment and purification of an Adv-BG viral stock was carried out according to standard methods. Cloning of Murine Betaglycan Gene Prorrwter and Construction of Betaglycan Prorrwter Reporter Vector-A bacterial artificial chromo- sorne mouse genomic library (ResearciI Genetics, Huntsville, AL) was screened with the 190 nucleotides (bases 15-205) at the 5' end of the reported mouse betaglycan cDNA (24), and eight positive clones were analyzed by restriction mapping. A 6.5-kilobase pair HindlII fragment that hybridized to bases 88-105 of the cDNA was recovered from bacterial artificial chromosome clone B70. A smaller HindIlI-BamHI fragment containing the 2542 bp located at the 5' end was further isolated and fully sequenced at Instituto de Fisiologia Celular Molecu- lar Biology Core Facility (deposited in the GenBank™ with accession number AF537325). For the construction of betaglycan reporter plas- mid, pBG-Lux, the 2307-bp HindlIl-NotI Klenow-filled-in fragment was subcloned in the SmaI of pGL3-basic (Promega, Madison, WI), and the proper orientation was verified by sequencing (see Fig. 2 for more details). The pMyo-Luc reporter construction was reported previously (14); pRLSV40 was from Promega; and pEMSV, pEMSV-MyoD, and pEMSV-myogenin were gifts from Dr. Stephen F. Konieczny (Purdue University). Transient Transfectwn-The cells were plated at a density of 8,000 ceUslcm' in 6-well plates for 48 h and transfected for 5 h using with 4 ¡LgofpBG-Lux or 4 /Lg ofpMyoLuc and 0.01 /LgofpRLSV40 in each well mixed in Opti-MEM 1 \vith 4 ¡L\ of PLUS reagent and 6 ¡.tI oC-Lipo- fectAMINE (Pro mega). Following transfection, fetal bovine serum and chicken embryo extract were added to restore their complete growth medium concentrations, and the cells were cultured for a further 14 h. The ceUs were then trypsinized and plated in 24-well plates in normal growth medium. Under these conditions, FGF-2 (3 nglml) (Invitrogen), BMP-2 (1 nM) (generous gift from Genetic Institute, Cambridge, MA), HGF (3 nglml) (R & D Systems, Minneapolis, MN), TGF-f3 (1 nglrnl) (R & D Systems), and RA (1 ¡.t.\{) (Sigma) were added at the indicated concentrations. After 24 h , the cells were harvested and assayed for dual luciferase activity (Promega). AlI of the transfections were per- forroed at least three times. lmmunoblot Analysis-For immunoblot analysis aliquots were sub- jected to SDS gel electrophoresis in 4 - 12% polyacrylamide gels, elec- trophoretically transferred to Immobilon membranes (Millipore, Bed- ford, MA), probed with a rabbit antiserum raised against rat betaglycan ectodomain (1:2000) (22), rabbit anti-myogenin (1:500), or rabbit anti- MyoD (1:200) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), and visual- ized by enhanced chemiluminescence (Pierce). For betaglycan core pro- tein analysis, the samples were previously treated with heparitinase and chondroitinase ABC (Seikagaku, Tokyo, Japan) (9, 26). TGF-f3 Affinity Labeling and Immunoprecipitation-TGF-f3 was ra- diolabeled with 1251 using the chloramine T, and affinity labeling and immunoprecipitations were done as described before (22). lmmunofluorescence Microscopy-Cells to be analyzed by immuno- fluorescence microscopy were grown on glass coverslips, as described previously (27) . For cell surface staining the live unfixed cells were incubated in the frrst antibody solution 1:200 anti-betaglycan, 1:1000 anti-perlecan (27) in 50 mM Tris-HCI, pH 7.7, 0.1 1\1 NaCI, 2% bovine serum albumin for 1 h on ice. After removal of this solution, the cells were fixed in 3% parafonnaldehyde and perroeabilized with 0.05% Triton X-lOO and incubated with 1:100 monoclonal anti-myosin anti- body (Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, Iowa City, lA). The bound antibodies were detected by incubating the cells with 1:100 affinity-purified fluorescein isothiocyanate-conjugated anti-rabbit IgG and 1:100 TRITC allti-mouse IgG (Pierce), respectively. After rinsing, the slides were viewed with a Nikon upright microscope equipped for epifluorescence. Analysis of Creatine Kinase Activity-Creatine kinase activity was determined as previously described (9). DNA and Protein Determination-DNA (28) and protein (29) \Vere determined in aliquots of cell extracts as described. RESULTS Skeletal Muscle Myoblasts Up-regulate Betaglycan Expres- sion during Differentiation-To evaluate the expression of be- taglycan during myoblast differentiation, the levels of its mRNA were determined in total RNA isolated from myoblasts and myotubes induced to differentiate for 2, 4, and 6 days. As shown in Fig. lA, betaglycan mRNA was detected after 2 days of induced differentiation with an increase by day 4 and small decrease by day 6. At the same time, the level of celIular betaglycan during skeletal muscle differentiation was deter- mined by Western blot analysis of detergent extracts treated previously with heparitinase and chondroitinase ABC, a pro- cedure that reveals the total content of betaglycan as its core protein. Fig_ lB shows that celIs allowed to differentiate for 4 days increased betaglycan expression significantly compared with the amount synthesized by myoblasts_ Betaglycan has the ability to bind the three isoforms of TGF -f3 through its core protein. To evaluate this property of the betaglycan induced during muscle differentiation, affinity labeling experiments us- ing 1z5I-Iabeled TGF-f32 were performed. Fig. le shows that the up-regulated betaglycan, displaying its characteristic pat- tern of migration in this kind of experiments, bound TGF-f32 and that this binding increased during differentiation when the total extracts were analyzed. The specificity of this result was confirmed when immunoprecipitates from the total celI extract were analyzed using a specific anti-betaglycan antibody (Fig. ID). Fig. lE shows the densitometric analysis for the quanti- tative analyses of the data. As a test of concomitant differen- tiation, the level of creatine kinase activity, a specific skeletal 384 Betaglycan and Skeletal Muscle Differentiation A o 2 4 days B days ., . FIG. 1. Betaglycan expression is up- regulated during myoblasts differen- tiation. A, 15 ¡.tg of total RNA isolated from myoblasts (lane O) and myoblasts induced to differentiate for the indicated days were analyzed by Northern blot with 32P·labeled betaglycan cDNA probe. The arrows indicate ribosomal RNA size, and the arrowhead indicates betaglycan mRNA (BG). B, cell extracts were pre- pared from myoblasts (lane O), and cens were induced to differentiate for 4 days (lane 4) and then treated with hepariti- nase and chondroitinase ABe. The ex- tracts were analyzed by SDS-PAGE. Be- taglycan was visualized by irnmuno- blotting with an antibody specific for be- taglycan. The arrow indicates the core protein of betaglycan. C2C'2 myoblasts were culture under growth conditions for 48 h and switched to differentiate for sev- eral days. At the indicated times of differ- entiation the cens were affinity labeled with 100 pM of ' 25I-labeled TGF-fl2. The total extracts were analyzed by SDS- PAGE (e) or by anti-betaglycan immuno- precipitation (J) . Phosphorimages of the gels are shown indicating the migration of the molecular mass standards (kDa) and ofthe betaglycan-TGF-132 complex (brack· et). E, the graphical representation ofthe phosphorimaging quantitation of the be- taglycan-TGF-fl2 complexo Open bars cor- respond to total extracts, and striped bars correspond to the irnmunoprecipitates. F, cell extracts were prepared from myo- blasts (O), cells were induced to differen- tiate for the indicated days, and creatine kinase activity was determined. For graphical representation, the enzymatic activity values were normalized by DNA contento When indicated the results are the means ::!: S.D. oftwo independent ex- periments performed in triplicate. ~" -.. ~ ; ~ BG +-288 . '.' ~ +-188 ' .. e D o 1 4 6 o 1 4 6 day. BG F <- ~ 0.6 E 30 1 25 • ¡lO .. ;15 .. .; 10 ': 111 S O T U' O BG +- UOkDa TIP TU' 2 4 T U' 6 i ;:> e OA ~ '! < J 0.2 lo: / i u /. o 1 DüI' eraadatiOll days muscle marker, was evaluated (Fig. lF). Together, these re- sults demonstrate that the synthesis of betaglycan increased during skeletal musc1e differentiation. Cloning of Mouse Betaglycan Gene Promoter and Construc- tion of Mouse Betaglycan Gene Reporter-To characterize the mechanism underlying the control of up-regulation of betagly- can mRNA, the murine betaglycan gene promoter was c1oned. For that purpose, a bacterial artificial chromosome library was screened with the most 5' end sequences of the murine beta- glycan cDNA, and the HindIlI-BamHI 2542-nucleotide-Iong fragment (Fig. 2A) containing the most upstream cDNA region was isolated and sequenced (Fig. 2B). This genomic DNA frag- ment had 86% sequen ce identity with the corresponding region of its rat ortholog (1). In addition, it contained a stretch of 127 nuc1eotides (2265-2391) that corresponded to bases 20-141 of the published murine betaglycan cDNA and that was followed by a GT, presumably the splicing donor site of the first intron. Other relevant functional cis-regulatory elements, SP1 and GC boxes, including the putative BMP-2-responsive element, that have been experimentally determined in the rat gene by the Centrella and co-workers (1) were also conserved in the mouse promoter. These similarities strongly suggest that the cloned sequences contain the promoter and first exon of the mouse betaglycan gene. Importantly, the mouse sequences contained several MRFs binding sites: two MyoD- and five MEF2-binding sites, elements that have been shown to be essential for skel- etal muscle differentiation (30). In addition, they also showed the presence of one RA receptor and four Smad4- and one Smad3-binding elements, factors that mediate responses to RA and TGF-¡3, regulators of skeletal muscle differentiation. To determine whether or not the isolated HindllI-BamHI 2542-bp fragment had promoter activity, it was used to con- struct a luciferase reporter plasmid, which was transiently transfected in cell lines capable of expressing the endogenous betaglycan. Fig. 2C shows that, as compared with the empty vector, the cloned HindIII-NotI fragment drove the expression ofluciferase in Ratl fibroblasts. Importantly, transfected L6E9 rat myoblasts, which do not express betaglycan (22), failed to express the reporter gene. Together, these findings confirmed that the cloned region contains the bona fide mouse betaglycan gene promoter. Activity of Betaglycan Reporter lncreases during Myogen- esis-To characterize the mechanisms controlling the up-regu- lation ofbetaglycan during the myogenic differentiation, C2C12 myoblasts were transiently transfected using the betaglycan reporter vector and induced to differentiate for 6 days. As expected from the results described above, Fig. 3 shows that the activity of the pBG-Lux increased 8.4-foid during skeletal Betaglycan and Skeletal Muscle Differentiation A B -24.B l -2,(41 T'C!'TT"lGC1'G GGGCMAcAr Gl"GAAGGAGf' QlT%'l'CC'fQk ~ ~ rAAGGC:Aú-,.c 110 Nf'-AT &41 -2371 ~T 1"C'O.C'I'GMG ~ "TGAGI!GGI\'l'G l'TCTGCTAAA GCAAGCACG'r ~y 180 SaaI - -2301 ~ ATTCTTTGCT AGTGACAGAC ACI':r"1'~'n'G GTCCGCCTl'C CATTOCATAC TTGAaC"fCCA 250 . GATA,-l -2231 TTTG1'('".AGGA C'ITCAAAG'A.G N"'.J4A.1ICACAC CM.GAAACTT AGGTGGCGTC ACACAGTrrC TTGTGGC'M'C 320 -2161 o.1'GCir1\CTCG GGCTGATTGA c.~GTG.I\TG ~ CAGAC'l'CACC 'fGC."!'GAOQ:A ACACCTGTGG 39D SMd4 -2091 ~ CCCGCAGiIlGG ACATAAGGCG TTTGMGGG'T A'J'MGV.AAA C!CCATCCI\C ACTAAt:A.CNi 460 ~ -2021 t'AT'ACC"l'AGG A'!'N1"TD.TA. CAGCl'AGCOO TGTAATGCTG GTCGGT1'1'GG M"tC'l'T'J'GC'r GA1'CTl"CGCT 53D M!:F2 -1951 't'CTCAt"'--'GGG GCJ\TAGCTGA GAGCT'TCTCC TG..\CA'l"TCC'!' G'n'OOTCCCT GC'roC't'GCTG AGGC'fGAGGC 600 -18é1 C'?GGC'lGTTT C'1"GCT"-CGTA GTGCCACCGC 'l'G'l'I'GATTTG TCl'TG1CTA't c::ct:GAC7C'fA C'fGi\AC'l'TCA 670 """'" - 18l! T1.'DtTCTGTG AAG1'GTTTGC GA,G!'QCa.TCC A1t.CTGTCTCr ~ ~ ~ 740 l\AlI -- - 1141 ~ GATGGGAGT't GCrCCMAGA ~ AOGG1"Ct1llC 'l'l'CCCCAD!! CC!'l"'!GIIII 810 EH . HEF2 GUA-¡ -1671 ~ 'fCTGCVilGGGT GG'TGGGCAAC ~ ~A ~TCA 'M'AAAM'1tG 880 lIf-A.'l -1601 GC'I"l"rMAM. C'i"J'AAAATTA CAAAAGTC'lA CC'tGGGCTAC 'tCATTTG'l'GC MAGGTTCCC tGACCATCCA 950 ~ - -1~31 GCAlXr!!II1P\iilCGMA, CI"fG'fC'rT'rG AH:::CAGN::AC TT'CAGTCACt ~ ~ 1020 M)'OO &ad4 NE"-A!' EcoRI ~ -1461 ~ Gt"GAAG'tAAC ~ A~ ~ t'OC'l"GCC".A1IC CCT'GAAGAM 1090 Api'l GA.'tA-l -1]91 ruCAo..."'CAMG M'GGA'lTCTt' CCClCCCTACT TG.\CAAAGGG ~ ~ C'UC'rCtGGC 1160 -¡¡¡¡¡-- "132.1 CJU\.G""~ TCTG.AACTl"G TGATTCnCf CCCC'rACTl'G GT'l'G'l'AtC'rG arGC'fGCNGC t'CMACTCAG 1230 AML-l -l~Sl GOCTCTG'r-GT Al'G'CTGGGCA AA'UCATTPo.C 7ACCGAGC'J'A TAGCCCCMT GGGCAAfTCA. CCTTTTMT~ 1300 -11Bl ~ ~ GCCAZ:A1"TTG 'l'G't'TGG7GNJ ~ GCA1"fCAACT C'M'CCAAAGC 1310 P ... -1111 ACAl'T-QtGC AGOCAGGAC'C C1"Gt'GTGCI'C CICC'!A!'O:I'C !'CT'I'CAGAGC ~ AACCGrIGiA H40 EcoRl GATA-! -1041 AT~ ~ ~ AAt"l"CAGOG CTGGAGAAGa ~ TAGGCTGTAG 1510 - 971 AAAGTAAGAG ACCC'I'GIrICCA S"WP;,(iA. GCA"fAtC'r'ft ~ MC'rGGAGM ~ 15BO NfL-l 1tI('I .. -l GA1'A- l - 90 1 GCGGC.AGAAT GAATGt'GTGC A1'GGGGCTTC GA.TGTGGGAA 'l'GGG'1''M'CTC 1"GIt.GAilí- 'p' 1650 ""1'2 STM -8Jl ~ ~ M1'CCAATAA AACfA%C'r'fC 'fCCtMGGCC C"l'GIGtAG"'M GiUoGGM'CTA 1720 ~f"2 SaNr - 161 c.GG.VtAGGCA GCGAGTCrtC GCHiTGOGCG CCACA'1'OCI:G <»T~ AC't"l'C'ri'CC ~ li90 HP ....... """1 CCI::CACCtGT CAt=J\'ICT CGGGCCGlU\C == CCCACACACA CN:H;N;N;t; == 1860 -62 l 'l'C'''TCcrtA CAGC'i'CCAGC CTTCTC'ICCC C~ ~ 1tIJI:.».GCfc:t c:tAGGCTCAT 1930 -551 CC\T'"..Al;CAG TGGI\GGAroA '== GGCl\GGAGGA GGAGr1"!CTA =.Nr;OOGC !GC!GTC!.T GIlCGC10GTTG 2280 SaeI Notl -201 MCrGCOOC'I' ~ O>QCCCCCTG COCGCGCi'GG GCGCGGGGAC ~ ~ nso _<13 -D1 CCTCGCGTTG ~ CCTGGACACA CCGCT'1'GCGA G9t~t:9'C9 9tt..t99cqee ct.4teaqaqg 2420 et.~gcaeqe t.QCQta9tqc 99Qtec}9tc)c etgctttqcq qgqt.tqccct: ~~cea9 9aeeoeqag9 2no ·_t ctqqqa.cet.q qcttt:qqt:cc cqc.aqqqt:to acqctqageg 9U-~t 00 2St2 e 35010 ~ 3OOtO ;s ..:1 ¿, 1SMO = Q" E lOOOO ~ ¡ < ti 15000 .. e ~ .g 10000 ..:1 5000 o 385 Notl " .c = ~ ... é =: Q, C> L6E9 Ratl FIG. 2. Cloning of murine betaglycan gene promoter. A, schematic representation of mouse betaglycan promoter and first exon. The 2542-bp HindlII-BamHI fragment containing the betaglycan promoter and first exon are shown. Putative boundaries of first exon (box) were established by comparison with rat betaglycan initial exon as experimentally determined by Ji et al. (1) and by alignment to mouse betaglycan cDNA (24). B, nucleotide sequence of mouse betaglycan promoter and first exon. The positive numbers in the right rnargin correspond to the 2542-bp HindIll-BamHI sequence submitted to the GenBank™ (accession number AF537325). For description purposes, the nucleotide sequence of was also numbered taking the A that opens the reading frame in betaglycan cDNA as base + 1 (1U!gative numbers in !he left rnargin). The predicted first exon in the murine betaglycan gene spans from position -341 to -91 (underli1U!d). Thus, the G at position 2391, which corresponds to position -91 and belongs to the 5'-untranslated regíon, is the last base in the putative first exon. The e at position 2195 (asterisk) is ~he first base that aligns with the published cDNA The partial sequence of the putative first intron is shown in lowercase letters. Sequence analyslS of the 2542-bp HindlII-BamID fragment using Professional Matlnspector software identified several potential cis-regulatory elements (consensus sequences higher than 0.9). The subset ofthese elements as well as restriction endonuclease sites that are relevant to the present work are shown in bold type. For clarity, if there is an overlap between two cis-elements, one of them is underlined, and the other is shaded. e, transactivating activity of murine betaglycan promoter. The 2307-bp HindIll-Notl fragment was used for the construction of betaglycan reporter plasmid, pBG-Lux, as described under "Experimental Procedures." Luciferase activity was measured in total celI extracts obtained from LGE9 or Ratl celIs after 48 h of transient transfection with control empty vector (pGL3-b) or pBG-Lux. Luo A A Lu ci fe ra se ac ti vi ty ( p B G - L u x p R L ) Lu ci fe ra se ac ti vi ty (p ¡M yo Lu c/ pR L) Differ entiation days Fic. 3. Activity of betaglycan reporter plasmid increases in differentiating C,C,, myoblasts. Myoblasts C¿C,, were transiently co-transfected with the reporter plasmid for betaglycan expression (pBG-Lux, columns) or myogenin expression (pMyoLuc, solid line) and a plasmid to normalize the transfection (pRLSV40). After transfection the cells were incubated in growth medium for 24 h and then switched to differentiation medium. The cells were harvested at 0, 2, 4, and 6 days after triggering differentiation, and dual luciferase activity was determined. The results show the means + S.D. of two experiments performed in triplicate. muscle differentiation. In parallel, as a control of the differen- tiation process, the increase in expression of myogenin (40-fold) evaluated with pMyo-Luc reporter is shown. Betaglycan Expression Increases during Myogenesis Are MyoD- dependent—As indicated before, betaglycan promoter contain several DNA-binding sites for MyoD and MEF?2 proteins. Upon induction of muscle differentiation, these proteins bind to the regulatory regions and activate the transcription of skeletal muscle genes, such as creatine kinase. Thus, we asked whether or not by forcing the expression of myogenin or MyoD in myo- blasts the transcriptional activity of the betaglycan reporter could be enhanced. For that purpose, myoblasts cells were transiently co-transfected with an expression vector containing the full-length myogenin cDNA (pEMSV-Myog) or with an ex- pression vector containing the full-length MyoD cDNA (pEMSV-MyoD), together with pBG-Lux and pRLSV40. The transfected cells were maintained under proliferating condi- tions, and dual luciferase activity was measured after 24 h. Fig. 4 (open bars) shows that MyoD overexpression produced an important increase of the betaglycan reporter activity. How- ever, no effect on the betaglycan promoter activity was ob- served by myogenin overexpression. The same results were observed when the cells were triggered to differentiate for 24 h (Fig. 4, dark bars). The inset of Fig. 4 shows the protein levels of MyoD or myogenin in the corresponding transfected cells, evaluated by Western blot analyses, and is compared with the induction of those MRFs in myoblasts induced to differentiate. The levels of expression of MyoD or myogenin in the trans- fected cells were comparable with or even bigher than the levels observed during normal differentiation. These results demonstrate that betaglycan expression is under the control of MyoD but not of myogenin activity. Betaglycan Expression Is Inhibited by TGF-B and Stimulated by Retinoic Acid-—The promoter sequence for betaglycan con- tains putative binding sites for Smads, the major transcrip- tional mediators of the TGF-B responses, as well as for RA 10 9H Zo st E 3 a * o A 6 E b 5 E B| o 31 3 3 e 2+ lt 0 pBG-Lu/pEMSY pBG.Luv/pEMSV-myog pBG-Lux/pEMSV-myoD Fic. 4. Betaglycan reporter activity is under the control of MyoD expression. Myoblasts C¿C,, were transiently co-transfected with the reporter plasmid pBG-Lux and expression vectors containing no insert (pEMSV empty vector), the cDNA sequence for myogenin (pEMSV-myog), or MyoD (pEMSV-MyoD). Plasmid pRLSV40 was in- cluded in all the cases to normalize the transfection. Myoblasts were cultured in growth medium for 24 h (open bars) and extracted to measure dual luciferase activity. The other set of myoblasts was cul- tured for 24 h in differentiation media (dark bars) and processed in the same way. Luciferase activity was expressed as arbitrary units of pBG- Lux/pRLSVA40, and the results show the means > S.D. of two independ- ent experiments in triplicate. The inset shows as a control the MRFs expression after transfection. MyoD and myogenin expression was de- termined by Western blot after 0, 1, and 2 days of differentiation of untransfected myoblasts and the levels of both MRFs after 24 h of transfection (lane T) with peEMSV-MyoD or peMSV-myogenin. receptor. Because the induction of myoblast differentiation 1s modulated by removal of diverse growth factors (26) or by the addition of RA to the medium (11), we decided to evaluate their role on the activity of betaglycan promoter. For that purpose, myoblasts were transiently transfected with pBG-Lux and cul- tured in the presence and absence of defined growth factors FGF-2, BMP-2, HGF, and TGF-B and growth medium (10% fetal bovine serum). Fig. 5 shows that treatment of the cells for 24 h with FGF-2, BMP-2, or HGF did not modify luciferase activity compared with growth medium (10% fetal bovine se- rum), whereas treatment with any of the three TGF-8 mam- malian isoforms resulted in a 50% inhibition. These results suggest that growth factors like FGF-2, BMP-2, and HGF are not necessary to maintain the expression of betaglycan, whereas TGF-8 is inhibitory. On the other hand, RA, a vitamin A metabolite that plays a major role in skeletal muscle devel- opment (31) and differentiation, strongly stimulated the tran- scriptional activity of pBG-Lux (Fig. 5). This stimulation is observed under growth or differentiation conditions (data not shown), indicating that RA, an inducer of skeletal muscle dif- ferentiation, stimulates the expression of betaglycan. Betaglycan Enhances TGF-B2 Potency in C¿C ¡¿ Myoblasts— Since the recent paper by Eickelberg et al. (32) reporting that depending on the type and quantity of the glycosaminoglycan attached to betaglycan, it may prevent the access of TGF-8 to the signaling receptors, thereby acting as an inhibitor of the factor, the membrane-bound form of this co-receptor can not be assumed to be an enhancer of TGF-f. Therefore, to determine whether or not betaglycan in the C¿C,2 myoblasts was a TGF-8 enhancer or inhibitor, we analyzed its effect on a prototypical TGF-f assay. For this purpose we forced the expression of 386 Betaglycan and Skeletal Muscle Differentiation 30 8 7 ~ 6 ... .. " ~ e S ~ ,e 4 t- .~ .~ .. 3 ti .. " ~ 1 .. ~ tl!I ...... 15 ...,...... ~ .; .:l 20 él ¡:Q ,e t- 15 :e t: .. ! 10 " ~ " ~ S O O 2 .. 6 iffer .... tiation days FIG. 3. ctivity of betaglycan reporter plas id increases in differentiating C,C '2 yoblasts. yoblasts C2C '2 were transiently co-transfected with the reporter plas id for betaglycan expression (pBG-Lux, columns) or myogenin expression (p yoLuc, solid line) and a plas id to nor alize the transfection (p LSV40). fter transfection the cells ere incubated in growth edium for 24 h and then s itched to differentiation edium. The cells were harvested at O, 2, 4, and 6 days after triggering differentiation, and dual luciferase activity was deter ined. The results show the eans :t S.D. of two experi ents performed in triplicate. uscle differentiation. In parallel, as a control of the differen- tiation process, the increase in expression of yogenin (40-fold) evaluated ith p yo-Luc reporter is shown. BetaglycanExpressionlncreases during yogenesisAre yoD· dependent-As indicated before, betaglycan pro oter contain several NA-binding sites for yoD and EF2 proteins. pon induction of uscle differentiation, these proteins bind to the regulatory regions and activate the transcription of skeletal uscle genes, such as creatine kinase. hus, e asked hether or not by forcing the expression of yogenin or yoD in yo- blasts the transcriptional activity of the betaglycan reporter could be enhanced. For that purpose, yoblasts cells ere transiently co-transfected ith an expression vector containing the full-Iength yogenin c A (pE SV-Myog) or ith an ex- pression vector containing the full-Iength yoD c A (pE SV-MyoD), together with pBG-Lux and pRLSV40. The transfected cells ere aintained under proliferating condi- tions, and dualluciferase activity as easured after 24 h. Fig. 4 (open bars) shows that yoD overexpression produced an i portant increase of the betaglycan reporter activity. ow- ever, no effect on the betaglycan pro oter activity as ob- served by yogenin overexpression. he sa e results ere observed hen the cells ere triggered to differentiate for 24 h (Fig. 4, dark bars). The inset ofFig. 4 shows the protein levels of yoD or yogenin in the corresponding transfected cells, evaluated by estern blot analyses, and is co pared ith the induction of those RFs in yoblasts induced to differentiate. The levels of expression of yoD or yogenin in the trans- fected cells ere co parable ith or even higher than the levels observed during nor al differentiation. These results de onstrate that betaglycan expression is under the control of yoD but not of yogenin activity. Betaglycan Expression ls lnhibited by T F-{3 and Sti ulated by Retinoic cid-The pro oter sequence for betaglycan con- tains putative binding sites for S ads, the ajor transcrip- tional ediators of the TGF-{3 responses, as well as for RA 10 • I 2 T li! 8 B~~ ~ ::1 7 ~~-- ~ ~ ~ 6 =- ~ ~ S ~ 4 .. ! ~ ::1 ~ ,BG.LuI,E SV ,BG.LuI,EMSV._yoC ,BG.LuI,E SV._yoD FIG. 4. etaglycan reporter activity is under the control of yoD expression. yoblasts C2C'2 ere transiently co-transfected with the reporter plas id pBG-Lux and expression vectors containing no insert (pE SV empty vector), the cDNA sequence for myogenin (pE SV-myog), or yoD (pE SV-MyoD). Plasmid pRLSV40 was in- cluded in aU the cases to normalize the transfection. yoblasts were cultured in growth edium for 24 h (open bars) and extracted to easure dual luciferase activity. The other set of yoblasts was cul- tured for 24 h in differentiation edia (dark bars) and processed in the same way. Luciferase activity was e,,:pressed as arbitrary units of pBG- LuxlpRLSV40, and the results show the eans :t S.D. oftwo independ- ent experi ents in triplicate. The inset shows as a control the RFs expression after transfection. yoD and yogenin expression was de- ter ined by estem blot after O, 1, and 2 days of differentiation of untransfected yoblasts and the levels of both RFs after 24 h of transfection (tane TJ ith pEMSV- yoD or pE SV-myogenin. receptor. ecause the induction of yoblast differentiation is odulated by re oval of diverse growth factors (26) or by the addition of A to the edium (11), e decided to evaluate their role on the activity of betaglycan promoter. For that purpose, yoblasts ere transiently transfected ith p G-Lux and cul- tured in the presence and absence of defined growth factors F F-2, P-2, GF, and T F-{3 and growth edium (10 fetal bovine serum). Fig. 5 shows that treat ent ofthe cells for 24 h with FGF-2, B P-2, or HGF did not odify luciferase activity co pared ith growth edium 00 fetal bovine se- ru ), whereas treat ent ith any of the three TGF-t} am- alian isofor s resulted in a 50 inhibition. These results suggest that growth factors like F F-2, BMP-2, and GF are not necessary to aintain the expression of betaglycan, hereas T F-t} is inhibitory. n the other hand, RA, a vita in etabolite that plays a ajor role in skeletal uscle devel- opment (31) and differentiation, strongly sti ulated the tran- scriptional activity of pBG-Lux (Fig. 5). This sti ulation is observed under growth or differentiation conditions (data not shown), indicating that RA, an inducer of skeletal uscle dif- ferentiation, sti ulates the expression of betaglycan. Betaglycan Enhances TGF-{32 Potency in C2C12 yoblasts- Since the recent paper by Eickelberg et al. (32) reporting that depending on the type and quantity of the glycosa inoglycan attached to betaglycan, it ay prevent the access of TGF -{3 to the signaling receptors, thereby acting as an inhibitor of the factor, the embrane-bound for ofthis co-receptor can not be assu ed to be an enhancer ofTGF-t}. Therefore, to deter ine hether or not betaglycan in the C2C12 yoblasts as a T F-{3 enhancer or inhibitor, we analyzed its effect on a prototypical TGF-{3 assay. For this purpose we forced the expression of ÑO Y AO AA III AA a A UU bos. 3 g Lu ci fe ra se ac ti vi ty p B G - L u x v p R L 8 8 3 ys o SFB_ TGF-f1 TGF-$2 TGF-P3 FGF.2 BMP2 HGF RA Fic. 5. Retinoic acid enbances betaglycan reporter activity, whereas TGF-8£ inhibits it. Myoblasts C,C,, were transiently co- transfected with the pBG-Lux and a plasmid to normalize the transfec- tion (pRLSV40). After transfection, the cells were cultured in growth medium for 24 h followed by the addition of FGF-2 (3 ng/ml), TGF-81 (1 ng/ml), TGF-82 (1 ng/ml), TGF-83 (1 ng/ml), BMP2 (1 nm), HGF (3 ng/ml), or RA (1 m1). Control cells were maintained in growth medium (SFB) without additives. Myoblasts were incubated for 24 h with growth factors and extracted to measure dual luciferase activity. The luciferase activity was expressed as arbitrary units of pBG-Lux/ pRLSV40. The results show the means + S,D. of two independent experiments performed in triplicate. betaglycan in C¿C,2 myoblasts using the adenoviral vector Adv-BG, which drives the expression of the wild type receptor. Cells infected with Adv-BG and a control empty vector were then transiently transfected with p3TP-lux, a well known and widely used TGF-8 responsive luciferase reporter (33). After another 24 h of incubation in growth medium, TGF-82 was added to the cells at the concentrations indicated in Fig. 6. The luciferase activity of these cells indicated that both the magni- tude and the sensitivity of the response greatly increased in the Adv-BG infected cells as compared with the control infected cells. Importantly, the presence of betaglycan in the Adv-BG- infected cells was verified by Western blot (Fig. 6B). These results clearly show that betaglycan forced expression in the C2C yz cells enhances TGF-8 function at least in nondifferenti- ated myoblasts. Betaglycan Increases on the Extracellular Matrix and on the Surface of Myotubes during Skeletal Muscle Differentia- tion—To further evaluate the expression and localization of betaglycan during skeletal muscle differentiation, nonperme- abilized cell cultures were stained with anti-betaglycan anti- bodies. Fig. 7D shows that myoblasts express betaglycan that can be detected on the cell surface by immunofluorescent stain- ing. However, cells stained 6 days after initiation of differenti- ation (Fig. 7E) showed a much higher betaglycan immuno- staining on the cell surface and on fibrillar structures characteristic of ECM components (34, 35). Myotubes were revealed by staining using anti-myosin antibodies after perme- abilization (Fig. 7, H and N). The ECM localization of perlecan, a heparan sulfate proteoglycan, is shown in Fig. 7F. Panels K and L of Fig. 7 correspond to the merge of the immunostaining for betaglycan or perlecan, respectively, with the immuno- staining for myosin. These results indicate that up-regulated betaglycan is mainly localized to the myotubes cell surface and associated to the ECM. A 14 l 12 3 10 3 08 E Ss P 06 2 2 a ¿ 3 02 3 4 0 0.2 0.4 0.6 08 1 Concentration of TGF-£ (agimD) B 0 50 1090 500 pfa 116 97 Fic. 6. Betaglycan enhances TGF-82 potency in C,C,, myo- blasts. A, C¿C,, myoblasts (control, closed circle) were infected with 100 plaque-forming units/cell of Adv-BG (closed triangle). After 24 h the myoblasts were transiently transfected with p3TP-Lux and pRL-SV40, an expression vector for Renilla reniformis luciferase, whose activity was used to normalize the transfection (pRL). After trausfection the cells were incubated in growth medium for 24 h, and then increasing concentrations of TGF-82 were added. The cells were harvested after 24 h, and dual luciferase activity was determined. The results show the means of two independent experiments in triplicate. B, C¿C,, myoblasts were infected with the indicated plaque-forming units/cell (pft) of Adv- BG. After 48 h, the cells were harvested, and betaglycan BG was determined by Western blot analyses as done for the experiment in Fig. 18, The arrow indicates the migration position of betaglycan core protein. DISCUSSION The results presented in this paper demonstrate that the expression of betaglycan, a transmembrane heparan/chon- droitin sulfate proteoglycan (19), increases during the differen- tiation of skeletal muscle cells. This conclusion is based on analysis of betaglycan mRNA and protein levels, activity of a reporter construct containing a portion of the mouse betaglycan promoter, analysis of functional betaglycan through binding, presentation of TGF-82 cells, and immunofluorescent staining during differentiation. These observations are of interest in the context of the reg- ulation of the skeletal muscle formation by proteoglycans. Skel- etal muscle cell lines provide a very informative model to study the involvement of proteoglycans and growth factors in this process. Heparin-binding growth factors such as FGFs, HGE, and TGF-8f are among the principal known regulators of skel- etal muscle regeneration and may be normally present in mus- cle tissue and released upon injury or secreted auto- or para- crinally by the cells during the regeneration process (36-38). Quiescent and activated myoblasts express the c-Met receptor as well as FGF receptors (specially FGFR-1 and FGFR-4) (39, Betaglycan and Skeletal Muscle Differentiation 387 ~r--- -------- ------------------------. 10 srB TGF-~I TCF-p TCF-J3 rCF-2 B P2 RGF RA FIG. 5. etinoic acid enhances betaglycan reporter activity, hereas TGF-p inhibits it_ yoblasts C2C'2 ere transiently co- transfected ith the p G-Lux and a plas id to nor alize the transfec- tion (p LSV40). fter transfection, the cells ere cultured in gro th edium for 24 h follo ed by the addition ofF F-2 (3 nglml), T F-J31 (1 ng/mI), TGF-J32 (1 ug/mI), TGF-J33 (1 ng/mI), B P2 (1 nM), HGF (3 ng/mll, or A (1 ¡.tM). ontrol cells ere aintained in growth edium (SFB) ithout additives. yoblasts ere incubated for 24 h ith gro th factors and extracted to easure dual luciferase activity. The luciferase activity as expressed as arbitrary units of pBG-Lux/ p LSV40. The results show the eans ::!: S. . of t o independent experi ents perfor ed in triplicate. betaglycan in 2C12 yoblasts using the adenoviral vector dv-BG, hich drives the expression of the ild type receptor. eBs infected ith dv- G and a control e pty vector ere then transiently transfected ith p3TP-Iux, a ell known and idely used GF -13 responsive luciferase reporter (33). fter another 24 h of incubation in growth edium, F-f32 as added to the cells at the concentrations indicated in Fig. 6. The luciferase activity ofthese ceBs indicated that both the agni- tude and the sensitivity ofthe response greatly increased in the dv- G infected cells as co pared ith the control infected cells. I portantly, the presence of betaglycan in the dv-BG- infected ceBs as verified by estern blot (Fig. 6R). These results c1early show that betaglycan forced expression in the 2 C12 ceBs enhances F-j3 function at least in nondifferenti- ated yoblasts. Betaglycan Increases on the Extracellular atrix and on the Surface of yotubes during Skeletal uscle ifferentia- tion- To further evaluate the expression and localization of betaglycan during skeletal usc1e differentiation, nonperme- abilized cell cultures ere stained ith anti-betaglycan anti- bodies. Fig. 7 sho s that yoblasts express betaglycan that can be detected on the cell surface by i unofluorescent stain- ing_ owever, celIs stained 6 days after initiation of differenti- ation (Fig. 7E) sho ed a uch higher betaglycan i uno- staining on the cell s rfacea d on fibrillar structures characteristic of E M co ponents (34, 35). yotubes ere revealed by staining using anti- yosin antibodies after per e- abilization (Fig. 7, and n. he M localization ofperlecan, a heparan sulfate proteoglycan, is sho n in Fig. 7F. Panels and L ofFig. 7 correspond to the erge ofthe i munostaining for betaglycan or perlecan, respectively, ith the ÍIDmuno- staining for yosin. These results indicate that up-regulated betaglycan is ainly localized to the yotubes cen surface and associated to the E M. lA 1.2 3 ID ~ ~ 11 ..:¡ OJl (!: ... ..eo ~ 0.6 ... ~ DA : • ~ 0.2 ~ .:1 o o 0.2 D.4 D.6 OJI c ..... tntio ... fTGF-jI! (acfool) B O 50 100 SOO pfu 116 ...... BG 97 FlG. 6. etaglycan enhances TGF-p2 potency in e,c,. royo- blasts_ A , C2C'2 yoblasts (control, closed eire/e) ere infected ith 100 plaque-for ing units/cell of dv-BG (closed triangle). fter 24 h the yoblasts were transiently transfected with p3TP-Lux and pRL-SV40, an expression vector for Renilla reniformis luciferase, whose actívíty as used to nor alize the transfection (pRL). fter transfection the cells were incubated in growth edium for 24 h, and then increasing concentrations of TGF-J32 were added. The cells were harvested after 24 h, and dualluciferase activity was determined. The results show the eans oftwo independent experi ents in triplicate. B, C2C'2 yoblasts were infected ith the indicated plaque-for ing units/cell (pfu) of Adv- BG. After 48 h, the celIs were harvested, and betaglycan BG was deter ined by estern blot analyses as done for the experi ent in Fig. lB. The arrow indicates the igration positíon of betaglycan core protein. DISCUSSION The results presented in this paper de onstrate that the expression of betaglycan, a trans e brane heparanlchon- droitin sulfate proteoglycan (19), increases during the differen- tiation of skeletal usele censo This conelusion is based on analysis of betaglycan RNA and protein levels, activity of a reporter construct containing a portion ofthe ouse betaglycan promoter, analysis of functional betaglycan through binding, presentation of TGF -132 celIs, and i munofluorescent staining during differentiation. These observations are of interest in the context of the reg- ulation ofthe skeletal usele for ation by proteoglycans. Skel- etal usele celllines provide a very infor ative odel to study the involve ent of proteoglycans and growth factors in this process. eparin-binding growth factors such as FGFs, GF, and TGF -f3 are a ong the principal known regulators of skel- etal uscle regeneration and ay be nor ally present in us- ele tissue and released upon injury or secreted auto- or para- crinalIy by the cells during the regeneration process (36- 38)_ uiescent and activated yoblasts express the c- et receptor as eU as F F receptors (specially F FR-l and F FR-4) (39, 388 Betaglycan and Skeletal Muscle Differentiation FIG. 7. Betaglycan is Iocated on the surface ol differentiated myotubes and ECM. Betaglycan localization was studied in C2C12 celIs under proliferating conditions CA, D, and G) or after induced to differentiate for 6 days (B, e, E, F, H, and D. Nonpermeabilized cells were processed for indirect immunofluorescent staining with anti·betaglycan (D and E) or anti-perlecan (FJ antibodies and revealed with fluorescein isothiocya- nate-conjugated secondary antibodies (green). The same cells were permeabilized and processed for indirect immunofluorescent staining with anti-myosin antibodies (G-D using TRITC-conjugated secondary antibodies (red). J-L correspond to D plus G, E plus H, and F plus 1 (merged imagesl, respectively. Betaglycan localizes on the surface oí myotubes and in the ECM. The fields were photographed and printed under identical conditions. Phase contrast microscopy is shown CA-Cl. The bar corresponds to 50 p.m. Betaglycan and Skeletal Muscle Differentiation 389 40). Growth factor responsiveness and consequently skeletal myogenesis are regulated by ligands and receptor availability (41), as welI as by the presence of proteoglycans at the celI surface or at the ECM (either presenting 01" sequestering pos- sible ligands). Thus, the expression, processing, and celIular localization of proteoglycans is critical to their modulatory growth factor function. As a matter of fact, we have shown before that perlecan, syndecan-l, and syndecan-3, all ofthem heparan sulfate proteoglycans, are regulated during in uitro skeletal muscle differentiation and play a role in modulating this process (5, 9, 11, 27). In the present work we provide evidence that betaglycan, another important proteoglycan, is modulated during the myo- genic differentiation. Betaglycan is a versatile co-receptor ca- pable ofregulating the effects ofseveral members ofthe TGF-{3 superfamily (42-44). In several celllines, including rat L6E9 myoblasts lacking endogenous betaglycan, it significantly in- creases the affinity ofT{3RII for TGF-{3, thereby enhancing the responses to TGF-{3 (22, 45). It is postulated that this effect eliminates differences in efficacy among the three TGF-{3 iso- forms. TGF-{32, which binds to T{3RI and T{3RII with low affin- ity and has minimal consequence on growth inhibitory effects in the absence of betaglycan, behaves similarly to TGF-{31 in the presence of betaglycan (22, 45). Importantly, it has been shown that betaglycan, in the presence of the type 11 activin receptor, binds inhibin and thereby mediates its well known activin antagonism (42,43,46). Another proposed function of betaglycan derives from the existence of a soluble form of the receptor that is produced by the proteolytic cleavage of its ectodomain (47-49). Soluble betaglycan binds TGF-{3 with the same affinities as its membrane precursor, but contrary to it, this binding sequesters and neutralizes the factor (33, 49). This capacity has been exploited therapeutically to prevent the del- eterious effects of TGF-{3 in the progression of some kind of malignancies (50, 51). Interestingly, a novel and surprising function of betaglycan has been shown recently. Eickelberg et al. (32) demonstrated that membrane betaglycan may inhibit TGF-{3 signaling. This inhibition is not caused by enhanced secretion of soluble betaglycan. It is proposed that in some cell lines, the type and amount of the glycosarninoglycan chains attached to betaglycan core protein, may sterically prevent the access ofTGF-{3 to the T{3RI and T{3RII, thereby preventing its downstream signaling (32). In the present work we show that the expression of betagly- can is regulated during the skeletal muscle differentiation and that this up-reguIation is mainly accounted for at the level of transcription. Cloning of a genomic DNA containing the first exon and the first 2140-bp upstream region of mouse betagly- can gene alIowed us to test its activity during differentiation. Here we show unequivocally that the up-reguIation ofbetagly- can is controlled at least by the expression of the MRF MyoD. In celIs transiently transfected with MyoD, the activity of the betaglycan gene promoter, as measured by our reporter pBG- lux, was up-regulated, even in the presence of high serum condition where muscle differentiation is inhibited (4). Inter- estingly, transient expression of myogenin, another MRF, had no effect on the activation ofbetaglycan transcription. We also found that treatment of myoblasts with any of the TGF-{3 isoforms was inhibitory. On the other hand, treatment of the celIs with RA, an inducer of skeletal musc1e differentiation in uiuo (52) and in uitro (11), increased the activity of the beta- glycan reportero Furthermore, the increase in activity mediated by RA was observed independently of the presence of serum. This effect ofRA is consistent with a report by Nakayama et al. (53), who found that RA increases the levels of betaglycan mRNA in osteoblast-like censo It is particularly interesting that these growth factors and RA, which are known to be expressed in the vicinity of condensing mesenchymal celIs and limb buds during early developmental stages (54- 57), modulate betagly- can expression. Interestingly, it has been described that RA induces differentiation only in MyoD-expressing musc1e cells by the formation of the RA receptor-MyoD complex (58). Other growth factors such as FGF-2, BMP-2, or HGF did not signifi- cantly affect the promoter activity. This lack of BMP-2 effects contrasts with the findings of Ji et al. (1), who, using osteo- blasts, demonstrated that BMP-2 inhibited the rat betaglycan gene promoter and identified a 180-bp region responsible of this silencing. The fact that we did not observe any BMP-2 effect may be explained simply by a difference in the celIline used in our experiments. AdditionalIy, it may be possible that to detect the activity ofthe BMP cis-acting element it has to be removed form the basal promoter to reveal its silencing activity (1). FinalIy, although we have emphasized on the transcrip- tional control ofbetaglycan gene expression, we are aware that other levels of regulation may existo This is particularly possi- ble in view of the fact that our betaglycan reporter remains fulIy active at day 6, even when the levels ofits mRNA and cell surface protein have decreased from their levels at day 4. Additionally, the fact that sorne ofthe up-regulated betaglycan is being localized to the ECM (Fig. 7) makes it very difficult to fulIy account for all of the betaglycan induced during differentiation. The function of betaglycan in skeletal muscle celIs and the consequences of betaglycan up-regulation during differentia- tion are not known and can only be determined experimentally. However, it is reasonable to guess that they will depend on the versatile ability ofbetaglycan as a co-receptor of diverse growth factors. The literature on the role ofTGF-{3 in muscle differen- tiation is abundant but controversia!. TGF -{3 has been shown to be a strong inhibitor of skeletal musc1e differentiation (14, 59, 60) but also to be a promoter of terminal differentiation (61). However, the fact that the expression of a truncated dominant negative T{3RII receptor inhibits the C2C12 differentiation sug- gests the need for an active TGF-{3 pathway for its differenti- ation (62). One c1ue to the role ofbetaglycan in C2C12 differen- tiation can be anticipated from our finding that betaglycan performs a TGF-{3 presentation role in nondifferentiated C2C12 myoblasts (Fig. 6). Reasoning based on these data would lead us to conclude that betaglycan induction may be acting to promote the effects of TGF-{3, and therefore it may act to pro mote the effects of this growth factor on the differentiation process. The regulation ofTGF-{3 activity can be more intricate considering that TGF-{3 also binds to other proteoglycans. In myoblasts that do not express decorin, a proteoglycan with high affinity for TGF-{3 (63), we have observed an inhibition of TGF-{3 signaling (14) together with a significant increase in the binding of TGF-{3 to betaglycan, suggesting a competition be- tween both proteoglycans for TGF-{3.2 On the other hand, although it has not been demonstrated yet, the fact that betaglycan binds FGF -2 via its heparan sul- fate chains makes it a candidate to regulate the association of this growth factor with its kinase receptor and therefore its actions (64). In this regard, the effects ofbetaglycan on muscle celI differentiation may resemble those of the other heparan sulfate proteoglycans that we have studied (5, 9, 11, 27). An- other fact to consider is the localization of the up-regulated betaglycan. It is possible to speculate that betaglycan is shed from the surface and incorporated into the ECM serving there as a TGF-{3 and/or FGF-2 reservoir. TIlUS, betaglycan roles 2 C. Riquelme, C. Cabello-Verrugio, and E. Brandan, manuscript in preparation. 390 Betaglycan and Skeletal Muscle Differentiation during skeletal muscle differentiation are to be determined. Experiments to test the effects of constitutive betaglycan ex- pression and inhibition of endogenous betaglycan expression in CZC12 myoblasts are in progress. In summary, we have found that the expression of betagly- can is up-regulated during skeletal muscle differentiation. This phenomenon is modulated by growth factors and RA and is MyoD-dependent. The regulatory sequences responsible for this modulation are contained within a 2100-bp segment ofthe gene that contains consensus binding sites for severa! tran- scriptions factor such as SPl, Smad3, Smad4, MyoD, MEF2, and RA binding proteins. These results would help to under- stand the complex regulation during development and differ- entiation of this key integral membrane heparanlchondroitin sulfate proteoglycan. Acknowledgments-We are indebted to Dr. Komelia Polyak (Dana- Farber Cancer Institute, Boston, MA) for generous advice and assist- anee in the generation ofreeombinant adenoviruses. Also, we thank Dr. Laura Ongay-Larios for technieal assistanee with the nucleotide sequencing. REFERENCES 1. Ji, C., Chen, Y., McCarthy, T. L., and Centrella, M. (1999)J. Biol. Chem. 274, 30487-30494 2. Ruoslahti. E., and Yamaguchi, Y. (19911 CeU 64, 867-869 3. Rapraeger. A. C., Krufka, A., and Olwin, B. B. (1991) Science 252, 1705-1708 4. Olwin, B. B., and Rapraeger, A. (1992) J. Cell Biol. 118, 631-639 5. Larrain, J. , Carey, D. J ., and Brandan, E. (1998) J . BiDl. Che",. 273, 32288 -32296 6. Esparza-Lopez, J .. Montiel, J . L., Vilchis-Landeros, M. M., Okadome, T., Miyazono, K., and Lopez-Casillas, F . (2001) J . Biol. Chem. 276, 14588-14596 7. Bemfi.ld, M., Hinkes, M. T., and Gallo, R L. (1993 ) Dev Suppl, 205-212 8. Carey, D. J . (1997) Biochem. J . 327, 1-16 9. Fuelltealba, L., Carey, D. J., and Brandan, E. (1999) J . Bio/. Chem. 274, 37876-37884 10. Naka, D., Ishii, T., Shimomura, T., Hishida, T., and Hara, H. (1983) Exp. CeU Res. 209, 317-324 11. Larrain, J ., Cizmeci-Smith, G., Troncoso, V., Stahl, R C., Carey, D. J ., and Brandan, E. (1997) J . BiDl. Chem. 272, 18418-18424 12. Iozzo. R V. (1997) Crit. Reo. Biochem. Mol. Biol. 32, 141-174 13. Isaka, Y., Brees, D. K., lkegaka, K., lmai, E., Noble, N. A., and Border, W. A. (1996 ) Nat. Med. 2, 418-423 14. Riquelme, C., Larrain, J ., Schiinherr, E., Henriquez, J . P .. Kresse, H., and Brandan, E. (2001 ) J . Bio/. Chem. 276,3589-3596 15. Brandan, E., Fuentes, M. E., and Andrade, W. (1991) Eur. J . CeU BiD/. 55, 209-216 16. Cheiretz, S., Andres, J. L., and Massague, J . (1988) J . Biol. Chem. 263, 16984-16991 17. Cheifetz, S., and Massague, J . (1989) J . Biol. Chem. 264, 12025-12028 18. Cheifetz, S., Hernandez, H ., Laiho, M., ten Dijke, P., lwata, K. K., and Massague, J. (1990) J. Biol. Chem. 265, 20533-20538 19. Lopez-Casillas, F., Cheifetz, S., Doody, J., Andres, J. L., Lane, W. S., and Massague, J. (1991) CeU 67, 785-795 20. Andres, J .. Ronnstrand, L., Cheifetz, S., and Massague, J. (1991) J. Biol. Chem. 266, 23282-23287 21. Andres, J ., DeFalcis, D., Noda, M., and Massague, J . (1992 )J . BiDl. Chem. 267, 5927-5930 22. Lopez-Casillas, F ., Wrana, J., and Massague, J . (1993) CeU 73, 1435-1444 23. Yaffe, D., and Suel, O. (1977) Nature 270, 725-727 24. Ponce-Castaneda, M. V., Esparza-Lopez, J ., Vilchis-Landeros, M. M., Mendoza, V., and Lopez-Casillas, F. (1998) Biochim. BiDphys. Acta 1384, 189-196 25 . He, T.-C., Zhou, S., Da Costa, L. T., Yu, J ., Kinzler, K W., and Vogelstein, B. (1998) Proc. Nat/. Acad. Sei. U. S . A. 95, 2509-2514 26. Brandan, E., Carey, D. J., Larrain, J ., Melo, F ., and Campos, A. (1996) Eur. J . CeU BiD/. 71, 170-176 27 . Larrain, J ., Alvarez, J ., Hassel!, J. R .. and Brandan, E. (1997) Exp. CeU Res. 234,405-412 28. Labarca, C., and Paigen, K. (1980) Anal. Biochem. 102,344-352 29. Bradford, M. M. (1976) Anal. Biochem. 72, 248-254 30. Olson, E. N. (1992) Semin. Cell BiDl. 3, 127-136 31. Mocchetti, L, and Wrathall, J. R (1995) J . Neurotrauma 12, 853-870 32. Eickelberg, O. , Centrella, M., Reiss, M., Kashgarian, M., and Wells, R (2002) J . BWl. Chem. 277, 823-829 33. Vilchis-Landeros, M. M., Montiel, J. L., Mendoza, V., Mendoza-Hemandez, G., and Lopez-Casillas, F. (2001) Biochem. J . 355, 215-222 34. Melo, F., Carey, D. J., and Brandan, E. (1996) J . GeU. Biochem. 62,227-239 35. Osses, N., and Brandan, E. (2002) Am. J. PhysiDl. 282, C383-C394 36. Jennische, E., Ekberg, S ., and Matejka, G. (1993) Am. J. PhysiDl. 265, C 12Z-C 128 37. Sakuma, K., Watanabe, K., Sano, M., Kitajima, S., Salcamoto, K., Uramoto, l., and Totsuka, T. (2000) Acta Neuropathol. 99, 177-185 38 . Ta tsumi, R, Anderson, J., Nevoret, e ., Halevy, O., and Allen, R. (1998) Deo. BiDl. 194, 114-128 39. Cornelison, D., and Wold, B. (1997) Dev. BiDl. 191, 270-283 40. Kastner. S., Elias, M. C., Rivera, A. J. , and Yablonka-Reuveni, Z. (2000) J . Histochem. Cytochem. 48, 1079-1096 41. Scata, K. A., Bemard, D. W., Fax, J., and Swain, J. L. (1999)Exp. CeURes. 250, 10-21 42. Bernard, D. J ., Chapman, S. C., and Woodruff, T. K. (2002) Mol. Endocrinol. 16,207-212 43. Gray, P. C., Bilezikjian, L. M., and Vale, W. (2002) Mol. GeU. Endocrirwl. 188, 254-260 44. Massague, J. (1998) Annu. Reo. Biochem. 67,753-791 45. Sankar, S., Mahooti-Brooks, N ., Centrella, M., McCarthy, T. L., and Madri, J . A. (1995) J . Biol. Chem. 270, 13567-13572 46. Lewis, K. A., Gray, P. C., Blount. A L., MacConell. L. A , Wiater, E., Bilezikjian, L. M., and Vale, W. (2000) Nature 404, 411-414 47. Andres, J ., Stanley, K., Cheifetz, S., and Massague, J . (1989) J . CeU BiDl. 109, 3137-3145 48. Arribas, J ., Lopez-Casillas, F., and Massague, J. (1997) J. Bia/. Chem. 272, 17160-17165 49. Lopez-Casillas, F ., Payne, H., Andres, J ., and Massague, J . (1994)J. CeU BiDl. 124, 557-568 50. Bandyopadhyay, A., Zhu, Y., Cibul!, M. L., Bao, L., Chen, C., and Sun, L. (1999) Caneer Res. 59,5041-5046 51. Bandyopadhyay, A., Lopez-easillas, F., Malik, S. N., Montiel, J . L., Mendoza, V., Yang, J ., and Sun, L. Z. (2002) Caneer Res. 62, 4890-4695 52. Momoi, T., Miyagawa-Tomita, S., Nakamura, S., Kimura, l. , and Momoi, M. (1992 ) Biochem. Biophys. Res. Commun. 187, 245-253 53. Nakayama, H., Ichikawa, F., Andres, J. L., Massague, J ., and Noda, M. (1994) Exp. CeU Res. 211,301-306 54. Ralphs, J . R, Wylie, L., and Hill, D. J. (1990) Development 109, 51-58 55. Li, S., and Muneaka, K (1999) Deo. Biol. 211,335-347 56. ltoh, N., Mima, T., and Mikawa, T. (1996) Deoelopment 122,291-300 57. Mollard, R, Viville, S., Ward, S. J., Decimo, D., ehambon, P., and Dalle, P. (2000) Mech. Deu. 94, 223-232 58. Froeschle, A, Alric, S., Kitzmann, M., Camac, G., Aurade, F ., RocheUe-Egly, C., and Bannieu, A. (1998) Oncogene 16, 3369-3378 59. Florini, J . R , Roberts, A B., Ewton, D. Z., Falen, S. L., Flanders, K. e., and Sporn, M. B. (1986) J. BiDl. Chem. 261, 16509 - 16513 60. Massague, J ., Cheifetz, S., Endo, T., and Nadal-Ginard, B. (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 83, 8206-8210 61. Zentella, A., and Massague, J . (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 89, 5176-5180 62. Filvaroff, E. H., Ebner, R., and Derynck, R (1994) Deuelopment 120, 1085-1095 63. Hildebrand, A., Romaris, M., Rasmussen, L. M., Heinegard, D., Twardzik, D. R, Border, W. A., and Ruoslahti, E . (1994) Biochem. J . 302, 527-534