Mmco FACULTAD DE OUIMICA PATOLOGIA, DIAGNOSTICO Y IPIDIMIOLOGIA DE LAS GASTROENTERITIS DEBIDAS A !!!!!!_o parahaemolyticas TRABAJO MONOGRAFICO Oae para obtener el Título de OUIMICO fARMACIUTICO BIOLOGO presenta GALO GERARDO ORTIZ GARCIA 1 9 8 7 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis está protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. INDICE I. INTRODUCCION II • .ANTECEDENTES HIS!l'ORICOS III.GENERALIDADES ACERCA DEL AGENTE ETIOU>GICO l.. Taxonomia 2. Ul.traeatru.ctura 3. Caracteri•tic- m:l.croecdpic- 4. Prop:1eda4ee 4• Cul.tivo 4.1 Caracterfaticae ~ieioldg:l.cas relac:l.onedae 1 2 10 12 J.6 con au a1al11111ieato 7 cultivo en el laboratorio 21 4.2 CUl.t:l.w y mor~ol.ogfa macroacdpica 25 4.2.l. Cal.dos de enriquecimiento 26 4.2.2 Medios en placa 27 4.3 Cultivo ele c4l.ul.- en eatr4a 32 5. Caracter!eticae bioqufmicaa 6. ~:l.pificacidn 7. m'todoe de deteccidn y recuento J:V. l'ATOGEHICIDAD Y PATOU>GIA A. Relacidn entre l.ae hemol.iainas de Vibrio ¡arahaemolyticue 7 su patogenicidad A.l .Antecedentes A. 2 La prueba de JCana&uva A.3 Hemol.isinaa detectadas en Vibrio parahaemol,yticu~ 39 43 47 51 54 55 60 c-..- Purificación A0.4.2 Propiedades fisicoquímicas A.4.3 Efecto Arrhenius 4.4.4 Propiedades biológicas a. b. Ce da. e. f. E- h. Actividad hemolítica - Citotoxicidad Enterotoxicidad Toxicidad letal Respuestas en piel de animales Cardiotoxicidad ! Receptores de membrana Signos clínicos y su relación con la TDH A.4.5 Métodos de detección B. Pactores asociados a la infección B.1 Inoculación en ratones B.2 Inoculación en conejos B.3 Adherencia de Víbrio parahsemolyticus B.4 Invesividad de Vibrio parahsemolyticus Co. Patología Ve. DIAGNOSTICO l. Aislamiento 2. Identificación VI. TRATAMIENTO 63 65 66 69 71 72 74 76 AT 82 85 88 91 93 95 100 110 116 119 122 124 A.4 I.a hemo11s1na te:nnoeetab1• directa A 4.1 Pur1~1cacidn .2 r piedades ~1siooqu1m1cae .4.3 B~ecto rhenius A.4.4 r piedades 1o1dgicae . oti i.de4 o11tioa . Oit t 1cida4 c. Bnterotoxicida4 . ~oxicidll4 1 ta1 •. espuestas i l. e iaa1ee ~. Oard1otoxic1da4 g. eceptor•• e embrana . is os .1n1coe 1' e 1 1dn COD 1a !D>H A.4~5 •'to os e t ccidn . actores ciados 1• in~eooidn .1 1aci6D es s. l.acldn e3oe .3 dherencia e ibrio e a ol.;yticue .4 lnV118ividad e ibrio a ol.yticus c. l' t .og1a • Dl.&GMOS~ICO 1. isl.amiento . ntifi cidn I. ~AMIB?nO 3 5 6 9 1 2 4 6 77 2 5 8 1 3 5 0 0 6 9 2 V1l.BPIDEMIOLOGIA l. Aspectos ecoldgicoe 1.1 Dietribuci6n geogr~fica 1.2 Variaci6n estacional 1.3 Correlac16n con par6metros ambienta.1ee 1.4 Ocurrencia en mar abierto 1.5 Asociaci6n con orea.nismoa superiores 1.6 Relaci6n con bacteri6faeos 2. Pen6menos epidem1ol6gicos VIII .D.ISCUSION IX. CONCLUSIONES X. ANEXOS X.I. .BIBLIOGRAFIA 130 131 135 138 140 141 145 152 153 157 168 I. INTRODUCCION Vibrio parahaemolxticus es un microorganismo ha16filo que dese~ pena funciones im!)Ortantes en la ecología de los estuarios 7 c~ ya posición tazon6micano est4 mbi bien definida. Actual.mente, ae 1e ha venido relacionando con :frecuentes brotas epid4micos de gastroenteritis en todo el mundo sin haberse esclarecido del todo loa mecanismos mediante los cuales provoca 1ae alteracionee. Bn pa!eea or1entalee tales como Jap6n, es responsable de aproxi- madamente el 70~ de loa caeoe de gastroenteritie registrada• anualmente 7 en otros como Estados Unidos, ocupa un lugar entre los principales patógenos ent•ricos. Sin embargo, en M4xico no se ha establecido su verdlld.era :frecuencia del)ido a que no se le ha estudiado en la forma apropiada: a pesar de que loa m6todos microbiol6gicos que detectan confiablemente a este microorganis- mo no requieren el empleo de t6cnicas sofisticadae, su inveetig~ ' cidn ·no se lleva a cabo en forma rutinaria, ya que err6neamente, eigue sin consider6rsele como patógeno importante. B1 propósito de este trabajo es dar a conocer esta bacteria, subr~ando Sil relevancia en diferentes aspectos, con la finalidad de dirigir la atencidn de los bacteriólogos hacia 10 que ella re- presenta en lo que se refiere a1 mantenimiento del equilibrio de ciertos ecosistemas 7, principal.lllente, a la incidencia de loe pa- decimientoa intestinales. Cabe mencionar que en nuestro p~e, un elevado porcentaje de enfermedades entéricas sigue quedando ain diagndstico, debido al desconocimiento de varios agentes etioló- gicos 7 de las t6cnicas para detectarlos. Sea esta una invitacidn para que los infect6logos y la gente re- lacionada con el campo de la salud consideren en sus estudios a este microorganismo, el cual. puede sienificarse como un importan- te agente causal de gastroenteritis en México. ,. Il. AiiTEC.E.DEN1'ES HISTORICOS La historia de Yibrio parahaemolyticus se remonta al. 21 de octubre de 1950, cuwido en 1oe suburbios situadoe al. sur de Oeaka, JapcSn tuvo lugar un brote de envenenf&llliento al.imentario, que provoc6 la muerte a 20 de las 272 personas que desarrollaron gastroenteritis aauda; en esa oceeidn, la causa del envenena- miento fue una pequei'l.a sardina, llamada "shiraeu" en japonls (Engraulis japon!g Houttuyn), la cual se hierve en egua con sal y es costumbre comer1a cuando se encuentra parcialmente seca (43,93). El 23 de octubre siguiente, el Prof. T. Omura, investigador de Medicina Forense, public6 los principales síntomas clínicos de la enfermedad y sus hallazgos patoldgicoa en ocho caeos de autopsia; de los períodos de incubaci6n que observd, el mAs corto fue de una hora, pero en le mayoría de los caco• dicho tiempo fluctu6 entre dos y seis horas; respecto a los signos que detectd en todos los pacientes, el primero era un intenso dolor abdominal. del cual la meyor!a de los enfermos se refería a "una seneaci6n ardiente en e1 est6mago", el segundo era vdmito y, el tercero, diarrea de frecuencia variable: muchoe pacientes excretaba.a. heces acuosas 7 en algunos c11110• eangu.ino1entae; en ocasiones, se detectd la aparicidn de fiebre y, loe caeos m'8 severos manifestaron disnea, taqUicardia y cianosis. los principales hallazgos patoldgicos comunes en los ocho c&sos de autopsia, fueron los siguientes: lesi6n catarral del estdma- go, hiperemia del mesenterio, erosidn de yeyuno e íleon, corlf:e~ tidn de varios drganos incluyendo las clAndulas suprarrenales y hemorragia interlobal en los pulmones (69). rio, se iniciaron de inmediato los trabajos encarninados a deter minar el agente causal, destacando el Dr. Tesunesaburo Pujino entre los investigadores més activos; su sede: el Instituto de Investigación para Enfermedades Microbianes en la Universidad de Osaka (69). áunque el "shirasu” utilizado durante sus investigaciones bac- teriológicas había sido mantenido en una caja de hielo, se en- contraba ya descompuesto y desprendía un fuerte olor a amoníaco; la observación de las muestras al microscopio reveló que so encontraba intensamente contaminado con bacterias (69,93). Para excluir la posible etiología de microorganismos filtrables (PPIO) y venenos químicos, homogeneizó el "shirasu” en solución salina fisiológica y filtró el homogeneizado a través de dos filtros Berkefelád N. Entonces, inyectó intraperitonealmente en aobayos los filtrados 1 y 2s el animal inoculado con el filtre- do 1 murió de peritonitis purulenta, mientras que el segundo no desarrolló síntoma alguno. Las características de la peritonitis observada en el primer cuyo fueron idénticas a las encontradas en ratones inyectados intraperitonealmente con "shirasmu” y resulteron muy similares a las menifestadas por humanos. Sin embargo, al hacer las revi- siones pertinentes, encontró que el filtro No. 1 estaba roto y, por ello, había permitido que el agente causal formara parte del filtrado correspondiente. Esto sugería que el pequeño número de bacterias presentes en el filtrado claro era lo suficientemente virulento pera matar al cobeyo durante la noche (69). Con el fin de prevenir nuevoa brotes de envenenamiento aliment~ , i r n e ediato s ajos cami ados dete~ inar l ente sa1, st ndo l r. su buro 'lljino tre a sti adores 4a ti os; es l stit to e esti acidn ara nfer edades icrobianas niversidad e ska 9). AWlque l i s.au" t 1 lldo rante s sti ciones ao- ioldgica11 bfa o antenido a Ja e ielo, - ntraba a puesto s rendfa n t erta lor onfaco: servacidn e ea uestras l icroscopio eld e e contraba ente t inado n acterias ,93). ara cluir sible l gfa e icr organis os tra 1es ID) enos f icos, ogeneizd l ir au" l cidn li a d ica d l ogeneizado &s e os s erkefeld . ntonces, i~ectd ri ealaent• ~ob~C).s .os l. t oa r l i al ulado n l a- do urid e eritonitis rulenta, ientras e l ndo o sa ro ld a no. as racter!sticas e 1a eritonitis servada l. ri er C\Q'O r n &nticas 1aa contradas es ctados ra to l ente n iraau" ltaron uy ilares .ae anifestadas or anos. in bargo• l. acer a vi- es erti entes, contrd e l o. l t ba to , or llo, bfa r itido e l. ente usal ara arte el r o rr s ondiente. sto gerfa e l. efto d ero e acterias r sentes l r o l ro ra .o ente i 1ento era atar l bqo rante che ). 3 Para efectuar los estudios bacterioldgicos centrii'Ugd un extras. "to de "shirasu" e inoculd el sobrenadante en varios medios de cul.tivo, los que incubd posteriormen"te a 37oc, tanto en condi- cione• aerobias como en anaerobias. No ai•ld microorganismoe de 1oe g•neroe Salmonella, Clostridium o Pro"teua pero desarrol1aron colonias de 1o que en un principio •• penad que ser:(an Lactoba- cillue 7 stapbylOCOCCUS y, 114em6a, bacilo• Gram-negativoa; 4•toa produo!an colonias blanquecina• y opacas que microacdpi- c-ente semejaban a Escherichia; sin embargo, wa t'rotia de una colonia, manit'eatd 1a presencia de a1gunas bacterias Grara-negat!, vas con loa bordes awaentadoa y grue•o• entre loa numerosos bacilos GrS111-negativoa. Los intentos por aeparar ambos tipos de bac"teria• Gram-negativaa presente• en la mie:na colonia mediante au transferencia a placas de llB&r fresco fueron infructuosoa. Por esta razdn, formuld la . 'hip6tesia de que una de las dos cepae era patdgena y, por tanto, inhibir:(a el crcci~iento de la otra !!! ~; por ello, crecería m6s r6pido si se le inacu1aba .en anima1es. A•!, utilizando ratones, inyect6 intraperitonealmente una sus- pensidn de colonias que contenían los dos tipos de bacterias Gram-negativas y varias horas despu4s, cuttndo se manifestaron loa síntomas, tomcS muestras de~ l!quido de ascitis y laa inoculd intraperitonealmente en otros. Repiti6 este procedimiento una vez m4s y pudo constatar que, en un lapso de entre 2.5 y 3 horas, loe ratones manifestaron síntomas t!picos. Entonces, inoculd el líquiio de ascitis de este dltimo grupo de ratones en placas de agar sangre que se incubaron po•teriormente a 3700 dura11te diez horaa y, una vez transcurrido este tie1npo, aparecieron dos tipos de coloniass uno de no hemolíticas cons- ti tu!das por bacilos delgados Gram-negativos que, al someterse 4 a pruebas bioquímicaa mani.festaban la produccidn de ilcido y gas en medio• con glucosa pero que no hidrolizaban la gelatina y otra.a que desarrollaban halo de hemdliaia, integradas por baci- los grueooa Gram-negativoa que ae tefiían fuertemente en aua extremoa, producían 4cido pero no gaa en medios con gl.ucoaa, licuaban la gelatina y eran extremadamente virulentos para loa ratone a. Pronto identificd al primer microorganismo como Proteua aorcanii, pero no pudo relacionar al segundo con alguna bacteria patdgena daacrita con anterioridad. Bata dltima era activamente mdvil por medio de un flagelo polar simple y aua movimiantoa recorda- ban a loa de V1br1o cholerae; ain embargo, no reaccionaba con al auero anti-Vibrio cho1erae y au eje longitudinal no era curvo, por lo cual ae concl~6 que no podía pertenecer al glnero Vibrio (69,93). Recurriendo tanto al Manual Bergey de Bactar1olog1a Determinati- va, 6a. adicidn, como al artículo de Skermens "Clava llec4nica para la Identificacidn ~en,rica de Bacterias", el investigador clasificd al microorganismo dentro del glnero Paateurel.la y como sus csracter!sticas ~ostraban semejanza con laa de Paateure- ~ hemolytica, decidid darle el nombra de Paeteurella parahae- mo!ytioa. Posteriormente aisló a la mi.ama bacteria del contenido intestinal de una v!ctima de envenenamiento alimentario y, entonces, junto con sus colaboradores, Okuno, Nalcada, Aoyama, Pl.llcai, MWcai y Ueho, anunció el descubrimiento de un nuevo patdgeno durante el 25° Encuentro Anual de la ~eociacidn Japonesa de Enfermedades Infecciosas, cel.ebrado en 1951 (69). 5 En el. otoño de l.955, el. Dr. Takikmva intercwnbi6 impresiones con e1 Dr. Fl.ljino y l.e habl.6 de l.os reaul.tedos de loe estudios bacteriol.6gicoa realizados en el Hoapita1 Yokohama con motivo de un brote de envenenamiento alimentario que invo1ucr6 a 120 pacientes, de los cua1ea ninguno muri6. Había aislado en placas de agar con NaCl cl. 4:.i' (general.mente empl.eadn.s para aiel.ar esta~ilococoe), un bacilo Gram-negativo dotado de un flagelo polar simple. Sus características eran similares a las de Paateurella parahaemolytica, pero era haldfilo, lo cual. no se babia analizado con anterioridad para l.a especie mencionada (43,69). Bl al.imento implicado en el. incidente del. hoepita1 era un pepino en sal.muera y se especulaba que el agente cauoal hab{a sido un microorganismo ha16filo preaente en un pezs 1a caba11a, que había contaminado los pepinos (69,43,93). , .. En su primera publ.icacidn sobre la bacteria, el. Dr. Takikawa reportcS que su cepa era una "bacteria ha16fil.a" y más tarde l.e di6 el. nombre de Pseudomonaa enteritis, no obstante que recono- ci6 que sus características eran idlnticas a l.as de Pasteurel.l.a parahaemol.ytica (93). Bl Dr. Xawakita, miembro del. Comit6 Internaciona1 sobre Nomen- cl.atura de Bacterias, se comuniccS con el. Dr. Tekikawa, manif'ea- t6ndol.e que, ai en realidad pensaba que su microorganismo era idéntico a Pasteurel.l.a Rarahaemol.ytica, debería respetar el. C6digo de Nomencl.atura de Bacterias y, por el.l.o, retener su nombre eepec!fico; por tanto, ten!a que denominar a su bacteria Pseudomonaa parahaemol.ytica. A partir de entonces, en Japón, e1 microorganismo se designcS "bacteria hal.of'!l.ica pat6gena" y se investigaron casos subsecuentes de envenenamiento alimentario caaaados por áete en el. consumo de Ika (calB111ar) y Aji (cabal.l.a). 6' ás tarde, es realizó un estudio en el que Kosuga y Yameji compararon la cepa EB101 aislada por Fujino con la "bacteria halofílica gatógena" de Takikawa, llegando a la conclusión de gue ambas pertenecían a la misma especie, aún cuendo existían pequeñas Variaciones entre ellas, destacendo la producción de ácido a partir de arabinosa. Se les detectó un antígeno común, uno cepa-específico y otros termolábiles y termoestables (69). Un poco después, VYiyamoto declaró que el microoyganisme debería colocarsé en el género Aeromonas debido a que fermentaba la glucosa y así propuso un nuevo génore para las bacteriss fer- mentativas halófilas: Ocsanomonsa. De esta menera suririS que, tento los aislunmientos clfnicos de Fujino, como los de Takikawa y loa suyos» fueran incluídos dentro del nuevo género como O. parahaemolytica, OU. enteritidis y C, alsinoirtica, respecti- vamente (69,43,93). En 1960, el rinisterio Japonés de Salud y Bienestar organizó un comité especial para investigar a la "bactería halofílica patéó- gena"”. De este modo, el grupo de Riichi Sekazaki realizó exten- sos estudios: examinó 21,072 cepas de bacilos cortos Gram-negati- vos, los cuales resultaron móviles y exhibían como característi- cas la producción de indol, reducción de nitratos, licuefacción de la gelatina, reacción positiva de citocromo-oxidasa y fermen tación de la glucoga. Observó que estos halófilos patógenos "formaban dos grupos (a los que denominaron biotipos 1 y 2), encontrando que la cepa EBiO1 gislada por Fujino y la 14 da Takcikawa eran idénticas; entonces sugirió que ambas deberían ser clasificadas dentro del género Vibrio y propuso el nombre de Vibrio parahaemolyticus para la "bacteria helofílica patógena"” (69,138). ~As e, se l.iz6 n t dio l e osuga amaji pararon 1a pa lOl i l a or ujino n acteria l f!1ica p t6 ena" e 1'akikawa. le do .a cl si.Sn e q e wnbas rt ecisn is a ecie, d.n ando istían ueBae v ri i nes tre llas, &ndo u cidn e Acido artir e inosa. e s tect6 n ti no dn, o a-espec!fico tr s o1ábi1es oestables 9). n co spu4s, M oto clar6 e l icr organis e bería l carse l &nero e 111onas bido e :fer entaba l cosa s! r puso n evo l ere ara s acterias :fer- entativas hal.6filaea ceanomonas. e sta anera e girid e, t~to s á lllllientoa lí i os e .P'Ujino, o s e akik8"a s ,yoa, ran l i os ntro el evo &nero o o. earah olytica, . teritidis O. gi olytica, ecti- ente , 3,93). n l.960, l 1anisterio n4s e a1ud ienestar r anizd n comit~ ecial ara estigar acteria alof!lica at6- eena ... e ste odo, l. r po e 1ich1 akazaki li d ten- s t dios: llÚ.nd l., 2 pas e acilos rtos ram-neeati- oe, s a1es lt r n dvil.ea hib!an o racterísti- s u cidn e ol, ccidn e it tos, 1 :fa ci6n e l.atina, cidn sitiva e :l.tocr o-oxid-a 'T e,e 16n e l cosa. bserv6 e t s 16filos t6eenos fo aban os r pos • e deno~inaron i ti os ), ontrando e pa lOl ai l a or ujino .a 4 e ak a n &nticas; t nces girid e bas berían r i das ntro el 4nero ibrio r puso l bre e 'li rio r ae olyticus ara .a acteria al f'!lica at6gena" , l.38). 7 Bt1 1963, Vibrio parahaemolyticus fue aubdividid• en dos biotipoa, dee1gn4ndose oficialmente como "Chohen Vibrio" al biotipe l (QU• en japonls significa vibrio que causa gaatreenteritia). Ese aiamo ai'lo, se ley4 durante una reunidn en Japdn un artículo publicado por Sakazaki, :Iwanami y PUkumi y, en dicha ecasidn, Pl.ljino decler& estar de acuerde en que el microorganismo se asemejaba a Vibrio (69). :Independientemente del trabaje que realizaba el grupo del Dr. Sakazaki, Pujino habfa iniciad• un estudio taxon&mice de Paateurella parahaemoJ,ytica: compar6 lea aislamientos original••• cepaa .EBlOl y BB102 con variaa otra• de loa g&neres Vibrio, Aeromonas y Peeudemonaa y siguiendo la descripci&n de Davi• a Park l.l.ep taJDbi&a a la conclusi4n de qge el microorganismo de- berfa ser incluido dentre del gt§nere Vibrio, depositando las cepaa BBlOl y BB102 en el ATCC, el 5 de maye de 1965. Bll este aepecte ea interesante señalar el hecho de que fue hasta 1974 cuando, en forma conjunta, l'l.ljino, Sakazaki y Taiaura prepu- sieren a la cepa EBlOl (clasificada con el ndmero ATCC17802), como la cepa tipo de Vibrio parahaemolyticus (70). En 1965, Zen-Yoji realiz6 un estudio de taxonomía numfrica sobre Vibrio parahaemolyticus, concluyende que. el biotipe 2 deberfa ser aeparado de la especie; adem4a, mostrd que la frecuencia de eu aislB11iente en paciente• era extremadamente baja comparada con su alta incidencia en peces, 2e.riscoa y equipe usade en cocina para su preparac16n. Sakazaki lleg6 a lae mismas conclusiones que Zen-Yoji despu&e de llevar a cabo un estudio de taxonomía numfrica en cepas de Vibrio incluyende algunas de PhotobacteriWll y otras ne identificadas de origen marino • 8 De esta manera, en ese mismo año, Sakazeki nombr6 al biotino 2 coMo Vibrio a1ginolyticus y reconoci6 s61o e.1 biotipo l como Vibri• pereheemolyticue. Si bien esta distinci4n de especies se acept4 desde ese mismo aí'l• (1965), el Subcomitf de Taxonomía de Vibries del Cemit4 Znter11acional de Bacteri•log!a Sistemática la admiti6 hasta 1974 (85) y, el Manual. Bergey de Bactt'riolog!a Sistem6.tica, la reconoci& hasta 1984 (13). 9 III. GENERALIDAI>ES ACERCA DEL AGENTB ETIOU>GICO l. TAXONCMIA Las agrupaciones taxon6micas representan asociecienes naturales de 111icroorganis111os en virtud de un origen o herencia connSn; ~r tanto, los indivi.duos de un mismo conjunte demuestran uniformi- dad gen•tica. As!, se ha reconocid• la necesidad de complementar Ul1a clasificaci&n fenotípica con una genotípica y a este tipe de combinaci4n de dos clasificaciones se le ha designedes taxonom!a polifásica. Bn taxonom!a bacteriana ae han utilizado des mltodoa de an'1.isis del genotipo bacterianos la determinaciln de la compeaici4n en beses del. ~cid• desoxirribonucl.eic• (~ de GC) y las hibridaciene• !!! vi.tr. entre 4cides nucleicos (AI>N/ADN • Al>N/ARN) de bacterias que pertenecen a especies • g4nerea taxen6micamente cercan••· Charga:ff (1955) y Lee (1956) demostraron que, en tedaa las c•lu- las, el. ADN contiene cantidades símil.are• de bases pdricas y pi- rim!dicas, pero la rel.aci4n 1 G+C/A+T+G+C, ea constante en el seno de una misma especie y varia de una a otra (22). En coneecuencia,·exiete una re1aci&n entre el va1er ~de GC de una bacteria y au. pesiciln taxondlllica. Tomando en cuenta eete criterie, •e han observado diferencias entre Vibrio parehaemo1Yticus y la especie tipo del g4nero, Vibrio cholerae: si bien sus valeres ~ de GC son cercanos (46 ~ l. y 48 ·~ 1, respectivé:lllente), su ••mejanza en estudio• de taxonomía numérica es del 66 a1 75:.' que ne ea alta y puede considerarae come un nivel. marginal., apenas aceptable, para co1ecer ambas es- pecies dentro del mismo g•ner• (37,46). 10 aderás, se ha ebservade un alto grado de similitud entre bacterias luminosas y Vibrio parahaemolyticuse, sugiriéndose que las primeras son representativas de alguna especie nuy relacienada con esta última (44,132) y, per otre lado, el carácter haléfile de Vibrie parahaenelyticus, sugiere una línea de evolución diferente de la des Vibrie cholerae (44). Cen base en le anterior y teniendo en cuenta el tipe de fla- geleción de Vibrie parahaemolyticus (flagelo pelar siuple en medie líquido y flagelación peritrica en medio sólido), así cone su valer % de GC, Baumann le incluyó en 01 génere Beneckea (Lucibacterium), descrite per Campbell en 1954. Aunque en un principie muches investigadores aceptaren esta sugerencia, el hecho de que ne hubiese en existencia un cultive de. Beneckea labra, especie tipo de este género, impidió efectuar les análiris cerrespendientes. Este, sumade a que el valer _£ de GC del género Beneckea (Lucibacterium) es de 45 a 48% y quedaba incluíde en el de Vibrie (38 a 51%), prevocé que esta posición perdiera fuerza y, al final, diche género (Beneckea) fuera descartado (21,22,13). En un estudio epidemiológico, Cheterjes (51) realizó algunes sislamientes de le que 61 deneminé "bietipeos de Vibrie parahas- molyticus”, los cuales cumplían con la definicién de la fanilia Brucellacease y cuyas cerszcterísticas manifestaban una pesición internmedía entre les géneres Pasteurella y Yersinia. En censecuencia, sugería una revisión adicienal sebre la taxeno mía de este zicroorganisme, con la creación de un nueve género en la familia Brucellaceas. 12 ~dem6a, a eervade wi lt e o e ei ilit d tre cteriaa l.wainesa. ibrio r h emolyticue, iri, ose e l • ri eras n r sentativas e l na ecie muy l i ada n sta dlti a ( ,l.32) , or tre l o, l r4cter al4fil• e ibri• r aemelyticue, giere a lí a e oluciln i rente e e ibri• elerae 4). con ase le EAnterior t i do enta l ti.pe e fl.a- laciln e ibri• &rahaemolYticus l.agel• elar eimple edie lí i o :fl celacidn eritrica edie •ll.ide), s! •• e aler 1' e e, wllllftll • l yl ol ' er. eneckea (IA.lcibacteriwa), ecr:i.t• or a pbell 54. unque UA ri cipie uchea eti aderea eptar•• sta e gerencia, l cho e e e bie e ist ncia n lti e 'I e ,Beneokea l ra, a eoie ti o e ste l ere, i pidil :fectuar • '1ieie endientea. Bate, ado e l aler , f. e O el l ere eneckea I. cibacteriwa) •• e 5 :' edaba l fde l e ibrie 8 51~), r vocl e sta aici6n rdiera t rza , l i al, i o l ere ( eneckea) :fuera scartad• ( , 2,13). n UA at dio 1 e 1o1d€ice, hater3ee 1) 11z4 l.6UB9• a ale111ientea e wt • 1n4 ietipe• e ibri• arehae- o1Yticua", l.oa al.e• pl:lan n f1 i 14n e , :f819111a n.acellaceae y- ra fati ae ani:feataban a eaiciln i t rmedia tre l a l erea asteurella ersinia. BD aaecuencia, m erfa a i.eiln i ional a bre taxen~ fa e ate a nia e, n aciln e n eve • ero .a &lllilia .Br\lcellaceae. 1 Peae a tede, la "bacteria hal.ef!lica pat,gena" aparece en la dltima edici'n del Manual. Berge7 de Bacteriolegfa Siatem4tica (1984) en la Secci'n 5s Bacilea Gram-negativea .Allaerebiea Pacultativea, Pamilia: Vibrienaceae, Glnere: Vibrie, Especies Vibrie parahaemolyticua (13). 2. ULTRAESTRUCTURAs ESTUDIOS SOBRB SU CCrl'OSICION QUIMICA La pared celular de lea microergazn-•e Gram-negatiwa tiene uaa eatructura tr11 .... 1nar que •at& compueata de pretera- 7 lipepeli•ac~ido• (LPS); a 8U vez, esta dl'tima eet' coDBti-tu! da per un pel!mere de azdcar•• unides cevalentemente, f'e•f'at•• 7 lipid••· Bl LPS ee di vide en doe f'raccioaeas una cadena la- teral de pol.iaac&ridoe sol.ubl.ee •• agua que ti ene actividad anti8'nica O 7 el. lfpido A. Bn loe microorgaai-oe ent•ricos, es'taa doe aubunidadea ae encuentran unidaa por medio de un eDl.ac• 2-ceto-3-deeozioctana'to (KDO). Por eu parte, l.a e.Sena l.ateral pol.ieacúida ae eubdiñde en l.a estructura antiglnica O y.el pol.ieac~ido central, el cual. contiene glucoaa, galac- toea, beptoea 7 gl.ucosB!llina. Bl. lfpido A eet4 f'ormedo por glucoa1111ina, 4cidoe sraeoe eaterif'iclldoe, 6cidoa graaoa hidrox!, ladoa, snipoe O-acetilo 7 f'oaf'ato ( 61). Oontraatando coa la estructura clúica del LPS, •• ha encontrado que el per'teneciente a una bacteria marina, Vibrio aarinue cepa PS-207, ea similar a una mutante entlrica R, en la cua1 no ee encuentran presentee la eatructura antiglnica O ni el polisac~ido central. Aa!, la naturaleza lipof':Clica de la cubierta cel.1.11.ar de laa bacteriaa marinas puede tener un signi- ficado ecoldgico al favorecer su adheaidn a l.oa exudados pre- sentea en la superf'icie de l.os peces o permitiendo la formaci~n 12 de auesados en el. 88U& de mar (61). El inter&a suscitado por establecer 1as dif'erenc:l.ae bioqufmicaa Y' :f"iaioldgicas entre laa bacterias Gram-negat:l.vaa mariaaa y no marinas, ha conducido a estudiar la cubierta celul.ar de Vibrio parahaemolyticua, ya ~ue este microorgeni .. o ee afala predolli.nantemente del a111b:l.ente estuariao 7, por el.lo, se le considera como "intermedio" entre lae :f"o:nae.9 111~nae y las terrestres (61). Denek• y Colwe11 (61) estudiaron la cubierta celu1ar de Vibrio parahaemopticua encontrando que su LPS era dif'erente tanto de 1 .. mutante• ent&ricas R como del de la cepa de V:l.br:l.o marinua PS-207, dado que 1 Poaee una eetructura antiglnica O Su cadena lateral. polisac~ida tiene un peao mol.ecul.ar mayor - Bl LPS puede extraer•• con f'enol. al. 45~ =a vez de la mezcla f'enol-clorof'o:nao-lter de petrcSleo utilizada en el. caso de Vi brio aarinue loa azdcaree que constitUTen al pol:l.eac~do central. son di:f"erentea %.a cantidad de l.!pido A, ea re1acida al. LPS total., •• encuen- tra en el ranso del. de loe microorganismo• Gr--negativoe no marino e. Por otro 1ado, estos investigad.orea encontraron que el. :LPS de Vibrio parah-mol.yticus era aimi.lar al. de Vibrio marinua, ea el aentido de que anabaa cep- poseen bajas cant:l.dad•• de 6cidoe g-o• hidrox11adoe y, adem'8, una alta proporcicSa molar de f'oa~atos coa reepecto a 1oa &laiaoazdcaree presente• en el lfp! do A; todo fato, en contraste con 1aa bacteriaa no marinas. 13 Estos reeu1tadoe parecen reforzar la hip6tesia de que Vibrio parahaemo1y:ticua ocupa una poeici6n intermedia entre las f'or- aae bacterianas marinas y terrestres. 3D un trabajo si,ilar, Rietechel (146) eetudi6 1oe 6cidoe gra- 90s presentes en e1 LPS de Vibrio parahaemol.zticue, encontrando &cido mir!etico, pa.l.lll!tico y 3-hidroxi11.u.rico en cantidades ei- llli lares, adem'8 de un Acido ia.eaturado que ident:lf'iccS tentati- vamente como 6cido pal.mitoleico. Asimismo, este investigador obeervcS cpe el principal. componea.te del total de 6ci4oe graeoe ea e1 3-hidroximirfetico, cpe ee encuentra ua.iclo por medio de enlac•• amiela. Por au parte Beuchat (20) cletectcS, adem'8, '°idos dodecsnoico, ., tetradecanoico, hexa4ecanoico, hexadecenoico, octadecanoico, octmdeoea.oico 7, ea csnticladee mea.ores, dodeceaoico, peatlldec~ aoico, heptadecanoioo, octadecadieaoico 7 eicocenoico. De igual 1U1Dera, obeervcS cierta re1aci6a entre 1a compoe'1.cida de 6cido• grasos 7 la resistencia al calor del microorganieao. Se ha ~eto que la temperatura ele crecimiento 7 el medio de cu1tivo af'ectan 1a oompoaioida ele loe 6cidoe gr-o• en lae bSS, teriae Grana-negativas 7, del mismo modo, que la compoeicida de Acidoe gr-o• y 1a temperatura ele crecimiento ia.f'1~ea sobre la estabilidad tlrm:l.oa de l.a baoter:l.a (20). Por tanto, cambio• ea el. medio de crecimiento, eoa. reepoaeabl.ee a.o sdlo de dif'erea- ciae cuantitativae, eino que, en al.gua.os cuoe, de oualitatiirae en el. eepeotro de 6cido11 graao• en lae cllulae Gram-aegat:l.vaa • .&11!, Beuohat (20) obeervcS un aumento ea. loa niveles de Ac:lc!o tetradeoanoico en o•l.ulae deearrol.l.adae en r.5B coa NaCl. al 7. 5", ea comparaci6a con el exhibido por las que habfaa crecido en concentraciones menores de este compuesto; tambi6a detectd que 14 - lis minución en el hexadecencoico conforme se elevaba la tenperatu- ra. Estos cambios se asociaban con una mayor resistencia al calor, es decir, mayor resistencia, mientras más grande fuera. la relación ác. saturados/ác. insaturados. Por otro lado, se ha demostrado que las proporciones de ácidos grasos saturados e insaturados afectan la fluidez y pernmeabilí dad de las membranas celularea y que, cuanto mayor es esta re- lación, menor es la pernesabilidad. Sin embargo, la influencia . que pueda ejercer esta relación sobre la resistencia al calor, estará sujeta a condiciones de ensayo tales como la temperctu ra de crecimiento y la concentración de los compuestos del medio de cultivo (20). En otras investigaciones, Daily (58) detectó una superóxidodis- muitesa (SOD) en Vibrio parahaemolyticus cuya actividad se en- cúuentra en bajos niveles cuando el microorganismo crece en con- diciones de mnaerobiosis y se eleva como respuesta a tensiones altes de oxígeno. Este proceso inductivo puede ser de ayuda para el microorganismo cuano se establece en tejidos asrobios, ya que le permite transforaer los radicales superóxido en peróxido (transformado posteriormente en agua por nedio de la catalasa), aumentando el E, y creando así focos de infección. Por su parte, Collins y Knowles (93) reportaron la existencia áe un citocromo tiro C en la fracción soluble de extractos li- bres de células de V. parahbaemolyticus que tiene la capacidad áe unir monóxido de carbono; su función es desconocida. 13 ua awaento en el Acido bexadecanoico, ee acompai'iaba de uaa di~ a cidn l b xadecenoico f'orae ee -.aba mperatu- . etoe C818bio• ee .. ciaban n aa lllEQ'or eiat ncia l 1or, a ecir, 111a,yor i t ncia, ientras 6e r de era oidn 6.c. e e/6.c. e t radoe. or tro o, •• ba ostrado e 1- r orcionee e Ac1doe r eoe e t r doe • a t rados •Ot8a i i es 7 r eabil.! ad e s e bran&B lular•• 7 ue, anto qor s eta - 1.dn, enor s e aeabilidad. 1n bargo, :tl encia e 1&eda j rcer sta ida bre ai t ncia l lor, estar~ e jeta dicione• .d• a.,-o l e o tem~erat!! e i iento 7 centracidn e a puesto• el edio e lti o 0). BA'otraa ati acionea, Dai~ 8) tectd a a erdxidodi•- u.taea D) l.brio ahae11101Yticus lqa t .dad ee - u atra ajos i ele• ndo l lli.cr gania1110 ce n- i i ne• e a aerobiosi• 7 ee l a llO a gesta ei nea ltaa e fgeno. Beta r ceso uctivo ede r e .;r da para l lllicr or llllis o ano at bl•c• os er bio•, 7a cpe • rlllite rana:t rmar e icales erdxido rdxido trans:tol"lllado st ri ente q a or medio e tala a), auaent&Ddo l ~ 7 do ef ' coe e llf'e cidn. or arte, o line 7 Jtnowlea 3)·reportaron l.stencia ae n o o po e :traccidn l ble e tractos - res e 6lulaa e v. r h olyticue e e acidad óe nir a dxido e r ono; :f"unci6n s sconocida. 5 3. CARACTERISTICAS MICROSCOPICAS A. Morfol.ogía Investigado al. microscopio de l.uz, v. parahaemolyticus aparece como un bacil.o recto, en oce.l!iones curvo y pl.eomdrfico que, en general., no presenta agrupacidn (aunque ocasional.mente llega a forau.r cadenas). Con cierta frecuencia produce esferoplaetoe, no forma endoepo- ras Di microquietee, es Gram-negativo y, eventualmente, puede manifestar una concentracidn del colorante en l.os extremos de c6lul.as ~6venes en proceso de divisidn. Posee un fl.agelo polar simple envainado cuando crece en medio l.iquido y, bajo ciertas condiciones de cultivo, puede sintetizar flagel.os peritricoe no envainados (l.3, 93, 37). B. Plagelaci6n Bn. general, el. arregl.o de flagelos en una c6l.uia bacteriana es constante dentro de una misma especie¡ en consecuencia, se le utiliza como una caracterietica tazondmica. La variaci6n en la organizaci6n flagelar se ha reportado en un ndmero limitado de bac~eriass en 1943, Johneon observd flagelación mixta (flagelo polar y peritricos en l.a mi.smb c6lula) en dos bacterias lumi- nosas, Photobacterium sepiae y Photobacterium barveyi (actual- mente Vibrio harveyi); en 1950, Houwink observó el. mismo fenó- meno en una bacteria no identificada; en 1953, Leifeon consta- td este hecho en algunas cepas de Aeromonae; en l.956, Leifson y Sneath demostraron este tipo de fl.agel.aci6n en Chromobacterium ~-; en 1958, Buttiaux y Voisin advirtieron este srreel.o para 16 una bacteria ba1dfil.a, supuestamente del elnero Beneckea; en 1963, Leif'son aisl6 una bacteria marina con fiagelaci6n mixta perteneciente al g6nero Pseudomones y finalmente, en 197lt ~aWDann descubrid este tipo de flagelaci6n ea v. parahaemolYticus y v. al51nol.yticua (27, 26, 15). Baumann repon6 que el 95" de las cepas de Vi.brio parabaemol:yticue anal.izadas por ,n • presentaban una f'lagelaci6n peri trica. ad.eml.e del flagelo polar, cuando erecta en un ••41o s6lido. Yabuuobi (202) con1'irmd l.os ha1lazgos de B&WDBDD, conolUTendo que la :r1- gelacidn de este mj,.croorgan1smo es m:l.xtas poler-peritrica; ad.em'8, encontr6 diferencias entre amboa tipos de f'legeloe, entre las que destacaba la lozicitud de oDdas para el polaZ' era ele 2. 53 p., mentrae que para J.os peri tr:icos era de l. 72 p.. Betae obeer"f'a- oi.onee eoa muy eim11sree a las e:f'ectu.ad- en fiagel.011 de bacte- rias marinas 1'eraentat1 v- aiellldae del 1nte11t:l.no de anima1ee ~aoa. Otra diferencia observada entre loe dos tipos de f'lageloe :tUe que el po1ar, a diferencia de los peritricos. ee encuentra en- "Yaillado. Beta cubierta es continuacicSn de la meabrana externa de la pared celular. A•iai.&90, Yabuucbl obeervcS que los 1'l&&eloe peritricoe son 1'6- cllae.a.te eliminados del cuerpo bacteriano por mecU.o de ag1 ta- cionee aec'81cae suaves, desintesrándose poeterlormente eD e1 ••ello y, por otro lado. que l.a acidi1'icac16n del •edio debida a la :f'ermeDtacicSn de carbobidratos, tambiln deat""1'e a loe fia- geloa peritricos. Betaa observaciones Eugieren que eatos fl98e- loa son m'8 :fr-'gilee que l.os polares. BZ1 dos estudios 1nasunoldg1cos, Shinoda (162, 163) detect6 di- 17 ferencias antig,nices exietentes entre los dos tipos de flage- lo• de Y. parahaemo1Yticus; en e1 primero de ellos, 1ogrd pu- rit'icar lae fl.qelinae por aed:lo de electro:f'oresie en un copo- lfmero de cloruro de polivinil.o y acetato del •iemo compuesto (Pevikon C-870) como medio de eoporte y, una vez puriCicedae, 1- aplicd a una colwuaa de Sepha4ex G-200 en :forma eeparada, obteniendo cromatogramaa similares; cuando se ap1icaban ;tuntaa ae manifestaba un solo pico, lo oua1 indicaba que su peso mo- lecular era eemeja11te. As{, por oomparacidn con l.as posiciones de elucidn de l.a al.bdmina ••rica bovina 7 de l.a ovoaJ.bdmina, se determind que su peso ao1ecul.ar era de 40,000 daJ.tona. Aeiaismo, determind algunas propiedadee fisicoqufmicas de estas aubetaaciaa &1.11 co~o su compoeicidn de aminoAcidoa, con lo cual eatabl.ecid di:f'erencias &Atig•ntcae entre los :f'l.ageloa. Bn baee a el.l.o, pUdo expU.car el hecho de que l.a :f'l.agel.ina peritrica p.adiera ser el.u1da con amortiguador de fos:f'atoa a1 0.03•, mien- tras que la pol.ar l.o era a una concentracidn de 0.12•. Bl1 el trabaJo subsecuente, Sbinoda corrobor6 l.as observaciones a11teriores y pu.do demostrar en forma evidente l.a di:f'erencia antis'tüca entre 1ae dos flagel.:lnas por medio de microscopía el.eotrdnica; para el.lo, utili1:d anticuerpos conJugadoe con t'erritina, dirigi.doe contra cada tipo de :f'l.agel.ina 7 obtuvo como reeultlldo l.a observaoidn de flagelos ":forrado•" con :f'erri- tina 1"6cil.lllente distinguibles en cada uno de loa casoe (162). Cabe ee¡'¡alar que, a1 comparar la.a longi.tudes de onda de 1011 fl.aceloe, se encuentran diferenc:laa entre loa datoe proporcio- na4oss para el fiage1o polar, Bauman.n reporta 1.3 a 1.4 p y 1.0 p para loa peri.tricos, Ogasawara 7 Jtuno 1.9 .,». para el :f'la- 18 gel.o polar y DeBoer de 1.5p (27). Betos datos, aunque presen- tan semejanza entre a!, difieren de los publicadoe por Yabuuchi (202). BD 1975, De Boer (26) realizcS un eetwU.o coaparat:l'VO eatr• v, parabaemo17H.cue 7 Y. a1gino1Yticue 1nveetigando la int'1ue.e cia de f'actor•• qu!mico• .,bre la f'l.agel.ac:l.da 7 el desarrollo en f'ol'llla de en;t .. bre (ewllZ'llling) d.e eetae eepec1••• encontrlllldo qu alsuna• qeAtoe• teneo-actiw• como l .. •al•• biliar•• 7 el ~eepol, 1:ah1ben l.a f'oraac16a 4• f'lllcelo• l.ateral•• 7, en con•!. cuenci.a, el ewarim.ng. Bl1 197?, Shinod.a (164) ef'ec'tud una 1nveeUgacida. sobre la tor- a.cidn 7 1'unc16a de loe f'lageloa per1tricoe T obeerv6 que a 25º0 •• mani.f'•a'taban tanto microecdpi.ca como inaunoldgic-•n'te; en cambio, cuando el mioroorganlemo •• cul.'tiYab& a 3700, el ndaero idxi.mo 4• ••t• tipo 4• fiqeloa se alcaasaba basta 2 .. 6 borae pero, una noche deepule, ao •• lee detectaba por••- di.o del lli.croeoopio • iaaunoldsicaaen't• sdlo •• ..tvertf en pe- quel'l- cantidad••· Betoe reeul.1oa4oe eugie:ren que l.oe n-.selo• la'teral••• a teaperatur .. auperioree a las 4•1 ••41.o Utbiente (l?ºC en 9delao.te), llegan a 4esprel14er .. eepon't._e .. eat• 4e 1 .. cllul. .. 7 •• 4eeoomponen en el ••41o. A ea'te reapecto, De Boer (2?) reporta ballasao• eimilaree. Aaimi__. • Shiaod.a (164) obee~ que la dateeie de f'l.ageloe lateral•• •• 1:ah1be 111m•41atamente cuando •• trmief'1ere el aicroorg81li.-o d.e ••dio a6114o a lfquido 7 que, 9demú, esto• oraaaelo• no •• forman a bajae concentracionee de ..-r en e1 ••di.o (O.J~). en 1 .. cual••• poseyendo un f'la&elo polar, loe ai.oroorgezüsmoe •• mueven f'6cilmente. As{, parece que la for- •aci.6a de flagelo• peritricoe es una eepecie de adaptac16n d• 19 1ae c4lul.ae a su meciio a:nbiente. A pe.rtir de mueetrae clfnicae se han aislado mutentee que poseen fl.agelo polar pero no peri- tricoe 7 este.e cepae no desarrollan ewarmias en medio edlido; con e1lo puede concluir•• que el f'laaelo pol.ar •• un 6rgano de l.OCOllOCidD 9XClUBiYD para medio l.1quido. 611 l.979 0 Kiaaura (102) l.levd a cabo un eetudio eobre el. efecto del pH de1 medio eobre l.a flegelacidn de V.pa:rehaemo1Tticue 7 obeervd que, l.a mayoría de l.ae cepae anal.izada•, euependia l.a formacidn de flisgel.oe peritricoe a pH 8.5 7, en todoe l.oe ca•oe, a pH 9.0. Por tanto, puede establ.eceree que 1a flsgela- cidn peritrica •• conserTa en condicionee 6cid .. o neutraa, mientrae que la polar no ee Te afect....Sa a Dingdn val.or de pH. En l.982, Belae y Oo1well (15) observaron el. ewarming de Vibrio parab-•o1Tticue por medio ele microscopia e1eotr6Dica de barrA do, encontrando que el flagelo polar tiene un di6metro ele 24 '• 30 na 7 eet4 conetitufelo por un "corudn" ele 14 a 16 na cubierto por una Taina, mientr- que 1oe lateral.e• no •• en- cuentrmi envainadoe 7 tienen un eli"8etro de 14 a 15 -· B1 -arming depende de un gran ndmero de factoree, tal•• collO l.a temperatura, •l pR, l.a concentracicSn de ec.z- 7 la concentr.e cidn ele 1'.01 en el -elio. Por otro llldo, ednñieron que en 1a zona ele ewa:rmiq, eetae bacteriae aparecen de vario• tillllaftoe que van eleeele 1. 5 p. haeta ciAoo o ••1• vece• ••• aae;aituel 7, ademú, que la producci6n de fl9&910e lateral•• •• mqor •n 1- bacteriu preeentee en 1a soaa ele ewar:ning que en las que ee encuentren en l.o• límite• de la zoaa. Bl aonmiento a traris del. agar puede dar como r•- eul:tado la P'rdiela de l.oe fla&elos lateralee po:r ":raeuraci.Sn", lo cual podrfa explicar eu ausencia en loe microorganismos en- 20 contradoa f"uera de la zona de awarming. Sin embargo, ae ha •.!! gerido que al awarmiag ea inducido por productos metab6licoa da deaacho originado• por la bacteria durante au crecimiento en el acar. Ea poeibl• que uno de aatoa producto• induzca la f'ormacicSn de f'lageloa lateral.ea en l.a •aa• de anj .. bra de 1.- bactariaa, pero una vez que •ataa •• alej.n de l.a perit'eria del awarming, loa f"lageloe latera1ea no puedan ••r reempl.azadoa Tª que la concentracicSn del i.nductor aetab6l.ico ha caldo por debajo del. nive1 aeceeario para estimular au producci6n. 4. PHOPIBJ>ADBS DB CULTIVO 4.1 Caractarfaticaa Piaiol6g1caa Relaci.onc .. con 1n& Aialudanto 7 Cultivo en el Laboratorio UDO da loa principal.ea raagoa t'iaioldgicoa da Vibrio paralla•- 1101Yticua ea, un duda, eu. car6ctar balof'fli.co, catal.og6adoaala en aeta aentido como haldt'ilo modar..So (93), T• epa praa•nta crecimiento cuando laa concentraci.onaa da lf.Cl en el medio van da O.UI a aprox:Lalld•ent• i.211. ai.eado la 6pt:i.aa de 0.5K. Si.n embarp. ai ae aplicara la claaificacicSn de I.araen (111), aeta bacteria quedarfa co•prendida entre loa microorganiaaoa leveaenta bal.cSt'iloa cv,yo nivel cSptillO da N.Ol en el medio ea da 2 a "'• Ta qua aeta autor considera como haldf"i.l.oa modera- do• a aqu•lloa que preaentan m6ximo daaarrollo a concantracio- nea de 5 a 20" de lfaOl 7 como hal.&t'iloa extramoa a loa que muút'ieatan wa mejor crecimiento en ranD>a de 20 a 3°" de BaC1. Aat puaa, ad.A cuenclo v. parallaamolyticua exhi.ba cierta halotg, lerancia (b-ta un 8"), se ha determinado que au concentracidn 21 dptima de NaCl. es 0.5il, es decir, 4• 34' (150,1.89,126), aunque :PQede reducirse considerablemente al emplearse otros cationee tal•• como el :Li.+ y el E+. Por ejemplo, Rotti.Di (150) encontrd que al. utilizarse Jt+ 0.10311 y r.t.+ 0.1711, lo• requerimien"toe de Na+ dieminuian hasta 0.00711. Bn un trabajo aimil.ar, Morishita (l.26) obtuvo resul.tado• aem•- jantea; observcS que el. requerimiento m!nimo de Na+ era de scSlo 0.00311 si en el. me4io se encontraba presente t.i+, el. cual. .... nifiesta una accidn preventiva en la l.isi• de bact•ri- mari- nae, ya que p:ropo:rciona tuerza idnica 7 repl.aci6n osm6tioa adeouadae; estoe reeul.tados eugieren que el L:L+ pue4e pro"teger la eetructura celul.ar 7, bajo esu condicione a, - presencia puede eer impor"tan't;e en la incorporacidn de aaiaof.cidoe a l.a c4l.ul.a, proceeo en el. que ae :requiere en. :torsaa ••~ecf:tica 16n eo4io. A4em'8, este dl.timo parece indispensabl.e en l.a s!nteaie proteica 7a que se ha demos'trada que lata se auapencle a1 cul.- ti varse a1 microorganismo en medio• que ao l.o contienen, a4n cuando poaean aaentea oaadticoe. Bn un ee"tudio en el que •• i.Dveetip el papel clel. aodio •n 1a :tisiologfa bacteriana, Sakai y Sakai (93) encoDtraron que un grupo ele bacterias mari.nas, al que deno111inaron 'l'H (bald:tiloa terrestres) 7 en el Clll• •• incl.ufa a v. parahaemol.Vicus, pr~ aen'taba aemejllllSaa con otro establ.ecido por ell.oa, al que 4•- eignaro.a llH (ba1cSfilos marinos) 7 que cumplia con l.a siguiente deaoripcicSn1 Lu bac't•ri- clel tipo llH requieren 1tg++ para e:f'ec't;uar la ozidacidn 4• subatra't;os; e1n embargo, es"t;e catidn no puede 81.tbstituir a1 Na+ en otroe procesos :tieiol.dgiooa. De hecho, el Ha+ previ.ene la lisia cel.ul.e.r y acelera a la citocromo oxidas&, l.a cadena de transporte de electrones y la ~ormac16n 22 —— APP en la fosforilación oxidativa. Por otra parte, cumple también una función relevante en el traneporte activo de nutrimentos dependiente de Na? y K*, al interior de la célula; por su parte, el K” es necesario sólo de manera accesoria y siempre en presencia de Na?. Consecuentemente, €l tino MH requiere, en forma indispensable, al Na? como único catión para su crecimiento. Además, este grupo pertenece a las bac- terias psicrófilas, ya que pierde su capacidad de crecimiento al alcanzarse temperaturas de 37%C. Las características que diferencian al tipo MH del TH, pueden resunirse así; en el tipo TH el requerimiento de Na* es menor que para el MH en la prevención de la lisis, la oxidación de substratos, 01 sistema de transporte de aelectrones, la citocro mo oxidasa y el desarrollo. Además, el tipo TH es capaz de cre- cer bien a 3700 y, por tanto, pertenece a las bucterias mesó- filas. Larsen (111) agrupW3 a los microorganismos halófilos en tres categoríass el grupo 1 está constituído por bacterias que tie nen requerimientos especificos de Na” y C1”, el 2 por los que tienen requerimientos específicos de Na? poro no del anión y, por último, el grupo 3, cuyos miembros no muestran requerimien tos específicos para el catión ni para el anión. Por tanto, en base a los datos obtenidos por varios investigadores, Vibrio pasrahaemo lyticus podría incluírse en el grupo 2 de Larsen. Sin embargo, en 1981, Palesuntheram (140) realizó un estudio en el que observó que V. parahaemolyticus podía mantener su ocrscimniento en presencia de otros cationes tales como K* y Mg**, si bien lo realizaba en forma lenta y, en base a sus resultados, sugirió que este microorganismo debería ser incluído en el grupo 3 de Larsen y no en el 2. 23 de A~ ' af'orilaci6n idativa. or tra arte. CWl ple B111bi.6n a 'wicidn leVl:illte l sporte ti o e tr ento• endiente e a• Jt+. 1 t rior e fl las or arte. l et' • cesario e61o e anera ceeoria pre r sencia e a+. oneec e t 111ent•• el i!>O ll uiere. ' l'dla i eneabl•• l Ha+ o d ico tidn ara i iento. dem6e. ste s o rt ece e ac- rias i cSf'ilaa. a e i rde a acidad e i iento l alcan~ar•e peraturas e 00. e r ct r.!eticae e i 'erencian l o JIH el 1'H. edeB mirse !1 l Po !r l. eri iento e a+ e enor e ara l 1111 encidn e •i•• i acidn e e batrato•• e a e sport• e elec ••• tocl'S!, a :l.da a 7 l sa rollo. de Aa. l o l' e pas 4• re- er i n oc 7• or to. rt ece e acteri- a ed- 1'il-. areen 11) l'Llpd e i rU.amoe .c5f':Lloe ne t rf'aas l r po l at4 aati td o Por acteri- e s en eri iento• e .!f'icoe e wa+ 7 01-. l or a e en eri iento• ec!f'icoe e s + ero ao el 11nidn 7• or ilt:l.lllO• 1 r po . ;roa llliembroa o 111Uestran eri ie5 1;oe • c!f'iooe ara l ti6n i .ra l idra. or 't n'to. - e cla'toa t icloa or U'io• ati adore•• ibrio a .. ll011t:icue dr!a l !r e l r po ele u-eeA. in a arao. 81. alaaunther- 0) : cS n et clio a l e • :rvd e . r e olltt.cua dfa antener a rac.l 1 tio ra r aencia e tr s tt.oaea l s o 1e+ 7 11g++. ai i n l ba :tor a ta 7 • ue a a aul tadoe • •U6irid e ete i gllft lllllO berla aer l i o l r po e Wlr en T o l . Bn cuanto a la variacidn de respueata que puede presentar un •icroorganismo hacia la sal., en cantidad o calidad, Laraan aconae~a prec&Jlcidn extrema para aaegurarse de que 1a cepa que reaponde en forma diatinta, ••a •n verdad la deacendient• de la bacteria que originalmente :tue pu.esta a prueba. Eatab1.!. ce que hll,J' una gran poeibilich1d de que una aparente 84aptacicSn aea, en realidad, la ae1eccicSn de un microorganiamo dit'erente (111.). Otra caracterlatica importante en la t'ieiologfa de Vibrio PFabaemobtioua •• eu temperatura de crecimiento, e ate mora · or•aniemo crece en el ranco de temperatura t!pica de lo• m••! t'11oa con Wl& id:maa entre 9 7 10°c, una aú:Laa ele 44º0 7 UD& dpt:laa de 35 a 3700 (88,189). La int•racoidD con~unta de pB, temperatura 7 conoentrac:l.dn de aal, da ooao resultado UD& ligera al.teracidn ea. la temperatura l:tmte para orec:Lmientor Beuchat (18) report6 un crecimiento moderado a 500 cuando el medio ae •ncon'traba a pH alcalino 7 Covert (50) observd una temperatura aúima de deaar:rollo a 48ºC, cuando e1aedio poae!a concentJPaeion•• eleva4aa de •ae1. l'or otro lado, el. rango de pH para el crecimiento de Yibl'io par!hMlllOl.YUoua •• mq aapl:Lo, 7• que desarrolla 4eade pH 5 laaata 11, aieD4o 1na dptiao entre 7.5 7 8.o (189,18). r.a oapac:Lded ele eat• al.oroorganiamo para crecer a pR •l•Ylllllo •• ba aproveoh•o en el d:Laeilo de medio• ae1ec'ti'90• para au 11:1.al.ai•nto. Otro rasgo t'iaioldgico caracter:latico de Vibrio paraba•molz!;ioua ea au tiempo de generacicSn, el cual. ea extremadamente corto. JCatob (93) reporte$ valorea de 8 a 9 minutos; por au parte, Ulitzur (191), en un estudio que incluy6 30 cepaa de eata ea- 24 pecte, detectd la existencia 4• doe grupo• bae&idoee en •1 tiempo de ••n•racidna el primero exbibfa uno corto, de 12 a 14 minu'toe, mi-ti"- que el eegwado mani.:teataba un tiempo •&- ;yor, de 20 a 25 iaimawe. No oba'tan'te, 10• 'ti••JIO• m'8 colldn- .. nte ob••r•lldo• v.a de 9 a 11 minu'to• (166). 4.2 CU1t:l~ 7 mor:tolo~a Macroecdp1ca Yibrio parallaemol.Yticue ha capturlldo el in'ter4e el• loe ld.crobi! loco• en mucho• c-poa, en'tr• loe que 4eetao.n •1 mldico, •1 alimeeltar:lo ;y el ecoldg1.co 7 1 coao raeultlldo ele ello, •• ba deeUTOl.l.So un ez'811 adaero de al'to4oa eepec1:ticoa para 1ocrar au aialami.ento, enriquecimiento ;y r.ouen'to (193). J.a aqorfa 4• 1- tfcn:l.c- coaprenden la 1nocu1ao1dn directa e!• 1.. m,¡eatr.. en aedioa que con1:1enen agar o •1 enr.l.quaoilli•nto ~c1a1 en caldo, ••sui4o de 1a eiembra por ••trfa para ob't•n•r el coneeouent• aialaaiento en loe ••41oa llCSlidoa lld.ecuadoa. llD 1a aqor1a ele loa oaaoa, la aieabra 41rec'ta ea au:ficiente plll'a 1 .. aueetraa :teoa1••, pero l.u da alimento• ~ 1u colect,e d .. del ae4:lo ambiente con frecuencia (no eiempre) requieren UD enri.queciúanto previo. Algl.IAOa prooe4iaientoe oonte•plao :Lncubacionea eapeoiale• a 't .. pera'turu el.e..ulu (42 a 4300) o b~o ooadicioAea •-rob1 .. , con al. :t1n de pro•eer un-. ••l•o- 'ti Yicl.S edicioaal.. Una ves a1el...S .. , 1- ooloni- tlpic- de Yib!jo perabaemoJ.rtioua ee ••cogen ;y ezmninml util.iz~doe• una aerie de prueb .. b1oqu1mio .. , :tiaioldgic .. 7 eeroJ.dgio ... lila loe caaoe en loe que no ••• poeib1e e:tec'tu11r el procesamiento :iaaadi.a'to de 1.. mueetraa, 4ataa puecla11 congelar••, pero debe 'tollAl'aa en cuanta al riesgo de eetrfe o 1nclueo de la ~uert• de l.ae c•lulaa. Por ello, se recomienda el. empleo de medio• de tran.!! porte tal.•• como el de Cary-Blair o el descrito por LeCla1r (93). 25 4.2.1. C&l.eloa el• Bnr1quec11111ento Laa contr1buc1onea inicia1ea a la metodología deatinacla a1 aia- 1-iento 7 recuento de v. perabaemolYticua, 1aa •1'ectuaron 1n- vaet1gll4orea ;Japoneaea, qui.enea d1aeftaron med1oa de enriquec1- m1ento empl.eaado mgentea t&l.ea como •1 '••po1 (detergente neu- tro), laa aalea bi1ierea, col.ormat••• altaa concentracionea ele •al. 7 p&•a al.cali.DOa. 8a.tre ell.oa, cleeteca el. cal.do gluco•-•al-T••pol. (GS,B), el. oua1 cont1ene, ed•-'- 4al. 4eteraent•, violeta ele .. ti.lo 7 poaee un pB 1'1na1 ele 9.4. Bate aed1o f'ue mo411'io.So poater1ormenta, aubatituylncloae •1 !eepol por. l.aur11 aul.1'ato (12). Si.a eabargo, •1 o&l.clo da Horie, con arabinoaa, Y1o1eta ele etilo 7 pH da 8.6, proporc1ond val.orea 41•• vecea •'8 elavalloa en la t•cn1ca del lfdaero •6a Probable, cuando •• le compar6 con el GS'B~(93). Poateriormente, •1 aeclio ele Horie rue aocl11'ica4o por Kaper (99), quien 11Ubat1 twd la arabinoaa por galactoaa. Otro• calcloa ele •nr1queo1miento aon el aecl1o SWYS 4• Kmaeko 7 Co1w•ll (98) 7 al. aal.-coliatina ele Saku:ak1 (153). K-p•laaoher (93) propuso uno a baae de sa1-Polilllixina B (SPB) que poaterior- aente f'ue mocl11'1clldo por Saka&ak1 (153); ltriatenaen (107) ut;111- zd con lx1to un caldo de carne con 1'.C1 al ?fe 7 aul1'onato da al.qu11 benceno al. O.)fe, al CUal M:i.Ciond alaiddD 7 quitina. ~mpaon 7 Treahola (93) emplearon el oal.clo aul1'ito ele biamuto- -ro;Jo 1'eaol. (BSPB), el. cual. contiene ademú aacaroaa, 1'.C1 -, •anitol. Vandersant 7 1'ickelaon (193) util1•aron calcio 'ript1caae So7a ( !SB) auplement;allo con 1'.C1 al 7- con una 1ncubacidn ele 8 a 12 horaa, pero posteriormente reaembraron en ~· peptonacla al- cal.ina salina como un ae~clo enriquecimiento; con ••• mi.amo ob- ;Jetivo, Sakasaki (153) ut11izd el caldo ele Moneur (telurito-•al- -b1lia). 26 Un e11tud:Lo llevuo a cabo en molu11co11 de 1- co11t- holaa4e•-· :Lnclu.1'6 la comparac:L6n de cinco caldo11 de enriquecimiento, 11,S gú4011e a la conclu11i6n de que el caldo de cU'De con 1'.Cl al "' d111ei'184o por ~pelmacber, incubado a 37oc, proporcionaba loe aejor•• reeultlldo• (33). Otro eetwl:Lo real:L&lldo por 1'akma:L11h:L 'I 11ur-e (130), demoatr6 que el SPB proporciona 1011 ••jor•• fnd:Lcea d• deteccidn cuamlo •• :Lnve11t:Lgan mae11tr- de peacado cl"Wlo. l'ara el mi.-o 1':LD, Ohun report6 un ••d:Lo 11:1.aple que contiene !'••pol 'I lf.Cl al 3" en un .aortigull4or de 1'011t'ato11 (93) 'I Beuchat (16) ha ut:Ll:Lzado con b:Lto •1 cal.do azul agu.,_ .. ar:Lllo ali.zarina 11upl-entlldo con !'eepol. Una gran var:Ledad de aed:l.011 en placa, mucho• de lo• cual•• 11e 4eearro11.ron originalmente para •l ai•l1D:Lento de V:Lbrio cholerae •• bma empleado coll •x1 to en la illveat:Lgac:Ldn de Vi.br:Lo parah-- aoJ.Tticua. Indwlableaente, el m'8 oomdnmeAte uelldo •• el medi.o t:Loault'ato- -citrato-bi.l:l-eaoaro11a (TOBS) • de11arrolle40 por Kobqa11h:L (153) ¡ ••t• inh:Lbe a un gren ndmero de e11pec:Lee bacteriaa.- (principal- aeAte de la t'lora 1'ecal) • deb:Ldo a la pre11encia de •al•• bil:Lare11 'I citrato 4• eod:Lo :¡ a que poeee un pH alcal:Lno de 8.6. Ad.emú, aporta una bueD& dit'•renciaci6n prelimiDar de laa eepeci•• de Vibr:Lo en bue a la reacci6A de :t'ermeAtac:L.Sn de la eacaro11a, 7a que v. cholera• :¡ v. alginolyticu11 fermentan e11te azdcar 7 produ- cen coloDi .. -ar111 .. :¡, en general, V:Lbrio parüaemolyt:Lcu11 no utiliza este carbohidrato, por tal motivo, aua coloniaa aon azu- l•• o azul verdoe ... 27 y alta y, por ello, no siempre impide el crecimiento de otros microorganismos tales como Proteus spp., Aeromonas spp. O Staphylococcus Bpp- Para investigar su efectividad, lotz (116) llevó a cabo un estu- dio en el qe empleó 188 cepas diferentes pertenecientes a 31 especies bacterimas aisladas de muestras clínicas y anrinas, así como a algunas de colección, obteniendo los siguientes re- sultadoss 177 cepas crecieron en él medio, nueve especies pro- dujeron las típicas colonias amarillas propias de V. cholerae y otras nueve, colonias verdes que senejaban a V. parmhaenmo lyti- or 'tro .ado, o a pre •• .ogra .a f' 11Cida tre . .. •• eci•• td enae e ibrio 7 tr .. P r en'te r cterizad .. contrlld- •1 biente Atic·o. Por ••t- s n••• •• han 'ect ado odif'icacion•• 1 .. dio ~BS, .ea o .a .evacidn l. "t;enido el• .Cl. 7) , edicidn e a l 'onato e .quil. ceno (107) e nos r1vmoa e 1 .. a l.ea i .iarea 5), "t;enilndo e a lt oe 11ati11f'ac"t;or1011. ü parara• 1etint .. arcae ercial.ea el ie o edio, •• a eervado ue, a'te i el, iate biln a Tariacidn eip t'!, 't1•a .a e . "t;ividll4 3). e an 4 ea ro lmo "t;roa -d s e "t;ivoa, ario• e e al.ea ti n t' .r en"t;acidn e a aro a o ractedetica it'- acial. a!, or ;templo, l edio ul e oti ol- eepol. "t;-biln ocido o ar e . Jci7ama J), llQ'• 1 t r,sente o "t;e "t;orios akazaki odif'iod aubati"t;~endo l Teepol por hept.iecil sulf'ato de eodio (Tersitol 7), hacifndolo mú ••l.ect:ivo. 'l-bifn •• ha observado que el Teepol pu.ede e•r r•-plazado por l~l aulf'ato (107). •1 .. ar poli•ixi-1'7loeiD-eel-•acaro•a (P'ISS) proporciona una dif'erenoiacicSn acep'table de i.. eepeciee de Vibrio median'te la l'ermen'tacidn de la eacaroea 7 :tund.amen't& eu eelecti"ñ.d-1 - •l empleo de antibidtico• en lusar de lo• detergent•• (93). Sil el acar azul ._ua-uarillo elis.rina (WA) •• incorporma lo• color&11t•• azul aaua 7 .. arillo alizarina en un medio adecuado para di•'tincm,r entre V. Pl!Z'all•-ol.yticue 7 v. al.g!pel:f1:icuu ade-'a de lo• indicador.•, ••t• medio contiene extracto de cer- ne d• r••• peptona, lfaCl, T••pol 7 •ao11rO••· J'.a f'ermen'tacidn de eeta dl.:t;ima por pu-te de V, alg:inol.zticue, da collO reeultado un.a reduocicSn en el pH del ••dio, provocmaclo que •l agar -1quiera un -ti• azul debido al ñra3e del coloran'te azul 8&'1&• Por otro lado, la elcalinizaoidn del. aed:io por pu-te de v. parahaemol.yti- cue da como coneecuencia un color -arillo naran3a, cmae.io por la accidn del pH eobre el. .-arillo eli•arina (93). Horie (83) empled un carbohidrato fermentable diet:into de la •a- caroea 7 d:ieeftd el medio arabinoea-eulf'ato de .. onto-colato (.AAC) el cual contiene cola1:o de •odio 7 po••e un pH de 8.6. De•af'Ort!! n.s .. en'te, lo• r••ul'tadoe de ••te no eon cSptimo•, 7a que la l'er- aentacida de la u-&binoea ea una caracter1:etica variable en la eepeoie. Por IN parte, Watld.ne (200) dieei'ld mu ••dio ut:lli•ando cola1:o 4e •odio para :inhibir el crecimiento de microorsani .. o• Gram-poeiti:, voe, salactoea como carbohidrato f'ermentable y eulf'ato de cobre con el fin de impedir el deearrol.lo de v. alginolyticue, e•pecie que •• encuentra estrechamente relacionada con v. parahaemol.Yti- 29 cus y que en el medio ambiente existe en mayor núnero que este último. Baross y Liston (6) crearon un medio no selectivo, empleando la hidrólisis del alwidón como característica diferencial; no con- tiene agentes inhibidores, el pH se ajusta a 7.5 y las placas inoculadas se incuban en una jarra de anasrobiosis a 37%C, du- rente 36 a 48 horas; las muestras que contienen cantidades gran des de Bacillus app. deben tratarse previamente con penicilina (20 U/ml1), con el fin de lograr un mejor desarrollo de Vibrio spp. fwedt y Novelli (193) llevaron a cabo un estudio sistemático de los medios propuestos para el aislamiento de Y, parshasmolyticus así como de sus componentes; de esta manera, se comprobó que la penicilina incorporada a los medios con pH alcalino era más útil Que un buen número de los agentes selectivos sugeridos con an- terioridad, entre los que se cuentan el telurito de potasio, . Aesoxicolato de sodio, Teepol y NaCl al 6%. Así, desarrollaron un medio que utilizaba la hidrólisis del al- midón como característica diferencial y cuya formlación incluía peptona al 2%, extracto de levadura al 0.2%, almidón de maíz al 0.5%, Nacl1 al 3%, penicilina (2 U/ml) y agar sl 1.5%, ajustándo se su pÍÑ a 8.0. Subsecuentemente, Vanderzant y Nickelson (193) realizaron un estudio comparativo, analizando los siguientes medios de culti- vos Staphylococcus 110 con penicilina (5 U/m1), egar Infusión Cerebro Corazón con NaCl al 5%, agar BHI con tetrametil-p-feni- lendiamina al 0.1%, agar sulfito de bismuto, agar verde brillan te-sulfadiazina, azar telurito-polimixina-yema de huevo, medio de Baross y Liston, medio de Twedt y Novelli con NaCl al 5% y sales biliares al 0.2%, medio de Twedt y Novelli con cristal 30 ~ 7 e l edio biente iate tQ"or daero ue ••t• di o. aro•• 7 ietoa ) ellZ"On n ed:lo o e l t:lvo ... i. clo 1a i r6lia:l• 4•1 ll:l cSn ao racterfetica i ' r cial.1 o n- e ..rente• i idor••• •1 •• j sta T.5 7 1 .. 1ac .. 1114- •• :lncuban • na rra e - io•i• Tº • u- a te 6 8 llor-1 1 .. ueatrae e nti nen cant:ldlld•• P"ll!! e• e aoil.1Uf .!!J!I!• ben t ra• r• :l-ente n enicilina 0 /al.). n •1 4• 1 grar n a jor •arro1lo e Y:l.brio .all2• '!Wedt 7 Bove11i 3) 1l•TIU'On bo n at clio e e e &tico e 1o• a :loa .eetoe ara •.1 a .-:1.•nto e v. rü-mol.rt:l.cue uf o ele llU8 aponent••; e a'ta a11nera. •• pr cS ue .a c:l.1:1.na :l corporll4a 1 e edio• n l li o ra '8 dtil. que n en daero e .oe ..rentea a l cti oa e &eridoe n . - 't r1oridll4, tre e e ae entan l l rito • t a:l.o, ., d a x:lco1ato e e dio, !! epol 7 aCl. 1 "· ef. aarr ll.aron n edio e t:lli 'ba 1drdl.1a1• el. &1- a dcSn o r cter!a'tica 4:1.f'erenc: al 7 C'IQ'a 'OW' lnll.ac:ldn :lnclufa t D& l 1'. tracto e • lldura l. o. 21', i cSn ele a lz 1 . ", B.C1 l "' :lcil:l a / l) 7 ar a1 l .5", atÚ 2, •• 8U H a.o. 'b ecuenteaent•• Ya 1111t 7 ickeleon 3) :lsaron UD •• 41o a ara'ti-vo, l.ismido a a :lentee •dioa e lt:l.- 1 t JlhTloco cua 0 n enicilina /ml), -. r 1'Ua:ldn erebro orazdn n aca 1 '"• ar HI n tetr-•t:l.1-~f'em­ ell :l.amina 1 . ", llBllZ" e l.fito • 'b:lamuto, -.er erde :l.1111!! a ' d:lasina, 8gar lur:lto-polilld. i &-7e a e evo, edio e u-o•• 7 :laton, eclio • ~edt 7 ovell:I. n .Cl l. '" 7 • l.•• :lliar•• 1 . ", ed:lo e 1' eclt ovell:I. n ristal 2001%) , medio de Twedt y Novelli con almidón de maíz al 14, NaCl al 7% y penicilina (10 U/ml) y, por último, el me- dio de Twedt y Novelli con alwidón de maíz al 1% y NaCl al 7%, pero sin penicilina. Tras efectuar el análisis de los resultados, llegaron a la con- clusión de que el medio de Twedt y Novelli con ligeras modifica ciones (almidón de maíz al 1% y Nacl1 al 7%), era el más apto para el aislamiento selectivo de Y, parshaemolyticus; en 461, el microorganismo desarrolló colonias circulares, planas, de color blanco cremoso y manifiesta una reacción amilasa positiva. Debido al alto costo y gran dificultad de obtener el agar TCBS en algunos países como la Indía (actualmente también México), varios investigadores han diseñado medios de cultivo más sinm- ples y, por lo mismo, menos caros. Así, S. P. De (93) reporta que el agar VP de Kaper (99) con tasmrocolato de sodío y lauril sulfato de sodio, poses propiedades similares al PCBS; del mis- mo modo, Chaterjee (52) publicó sus resultados con el agar sacarosa-Toepol-telurito (3ST?), el cual contiene peptona, ex- . tracto de carne de res, Teepol, telurito de potasio, sacarosa, azul de bromotimol y agar. En los Estados Unidos no es difícil obtener el TCBS pero no to- dos los laboratorios, especialuente los clínico», lo trabajan de rutina. Algunos investigadores teles cono Carruthers (41), reportan re- sultados satisfactorios usando medios más comunes como el manj.- tol-sal-egar y Roland (149) recomienda el xilosa-lisina-desoxíico lato (XLD) suplenentado con NaCl al 1.5% y almidón al 0.5%, como adecuado para el aislamiento del microorganismo. 31 vio1•1'• (0.0001~), •• io e e4t T ovel1:1 n . i4dn 4• • f• l. 1~, .01 l " 7 1.c111 a 0 V/ l) Tt or d 1'1mo, 1 ••- 410 e e41' 1' ove 11 n ll14da 4• afs 1 " 7 .01 l. 1", ero eiD :l :11:Uaa. orr- 1'ectuar •1 11D'1.: eta 4• 1 a 9'l1"t-4oa, 11 car a. 1a n- ei6n • e •1 edio e ed1; T ovelli n 1:1.gerae a 11'1o§ a.•• a1 icl6D e a fa l. " 1' lf.01 l "), ra •l 1168 1'o ara l 1•1-1ea.1;o ••leo1'1'ft» 4• v. u-üauiolz1'j,cuar f , 1 aioroor.-nuio 4 ear.ro1ld oolom- llll'••• 1.-, 4• 1or .111100 oso 7 anirt.ee1;a a caida .. il ..a •11'1Y&. ebido 1 lt sto 7 CJ"llD·d.11'1cu11;114 e 'btea.er •1 .. r '1'CBS •D l.pno• af••• ao dia 1aente 't• :iln •lzi o), Yario• Dve•'ttc..ior•• ll i• a 4o •• ios e a 1t1'90 a'8 eia- P1•• T• or .o •i- , •• o• ro•. •t, s. . e 3) ona e l. llCal" P ele ltaper 9) n 1i111rocolato 4• dio 7 mar11 e 11'ato e • .1o, ••• r piedad•• • ll1lar•• l ~BSt 4•1 •i•- o a 4o, Ohater,1 e 2) l cS e a a li:edoa n •1 ecar • e.-Te 1-t l 11;o SH), l al tt.eae ptona, - to e rne e e, eepol, 1 r1to e t-:1.o, aecaro a, u l. 4• otiao1 7 1141ar. Bn .o• atedoa nid.os a.o •• 411'1ci1 Men•r 1 '1'088 ero o - o• • oratorio•, a o:ialmente • 11a:l.ooa, 1o 't ,1an 4e "tilla. l.guno• DYee1'1 adorea 'tale• mo ar.ru'th•r• 1), onan •- e 11;a4oa a 1•:t' 1'ol"ioa e lldo a dioa •'- aune• ao l a&Di- l • l agar T oland 9) ienda •1 11 e .... lia1n .. deaoxic~ 'to D) a 1ementa4o n M.01 l . " 7 lll14dn 1 º·'"• o 4 ou.So ara l a iento el a1o oorgani111DO. Teniendo en cuenta la limitad.a selectividad 7 cupaci4ad dire- rencilJ. del acar TCSS, Kour~ (104) disefld 1Ul medio para el aislamiento e identificacidn de v. parahaemolYticus, conside- rando que la contin1ML presencia de v. aJ.gino1Jticue en lae mue~ trae, pu.ede ocultar su crecimiento. Este medio (TSAT) lleva, por cada litro de acua destilada, 40 g de egar soya tripticaae, 25 g de N&Cl, 20 g de eacaroea, 0.5 g de sa1es biliar•• 7 3 ml de una solucidn de clor\al'O de trifeniltetrazolio al l~, ajust4ndoee au pH a 7.1; la direrenciacidn se baaa en el color 7 tamaí'lo de las coloniaea lae del primero son rojo brillantes, mientras que lee del segundo son blancaa • mb pequeflae 7 ocaeionalmente, preeen- tmi un pequeflo centro roelldo. Una deeventaja de este medio •• que Proteue .!.1!2• desarrolla coloniaa indistinguible• de l .. de V:l.brio parah .. mol,yticue. Pee• a todo, Sekuald. recomenda la t4ctica empleada por Balean! ehi, lluraae y Teramoto en el aislamiento e identif:l.oacidn de esta bacteria, coneietente en una comb:l.nacidn del caldo eal-pol,i m:l.xilla.7 el acar de ~EIS, 7a que ae1 ao llq necee:l.dlld de ident:l.- r:1.oar bJ.oqu1m:l.c-ente 1 .. coloniu obtenidas en el -car; sin -bargo, eetL opc:l.dn no ee recomienda pera aqu•11oe º1.11'ª expe- riencia con v. parall-•o1zt:l.cue no eea -plia (153). Loe m:l.crob:l.dlogoe de alimentos han ex-ill84o detallad-ente loa probl-- relacionado• con el dafio cauelldo a Vibrio parallaemob- ti.cus por la accidn del frl.o y el calor; este aspecto ea :l.nt•r- ewite debido a que loe a11mentoe de origen marino eon preserTa- do• mediEt.Dte refri.geraci.dn o congelacidn 7, la m~or!a, se cue- cen bien o por lo menoe ae calientan antes de ser coneWDidoa. 32 Un hecho empll-ente comproba4o es que V. parahaemol.rticue •• aensible al frio cuendo se encuentra presente en loa ali•entoa T el aaua (50,115,30); vario• eetudioa ben de110atrado qu.e •i bien un cierto porcentaje de los vibrioa que ee encuentr.n en alimentos refrigerado• o congela4oa pierden viabilidad, una gran cantid"4 de los sobrevivientea sufren un dafto subleta1 T ae maeatran altamente eeneiblea a loe medio• que contienen agentes tenao-acti.vos. En ta1ee condiciones, 1011 microorganis- mos daftados general.mente no pueden replOZ'llZ" su lillOmal!a y •• ma- Difieet8D oo•o no viables pues, cabe aubr~ar, loe m•todoa co- aúnmente util.i&adoe para la datacci.dn da eata bacteria recomien- dan el eapl.eo de varios medios eel.ectiTOs que contienen agentea teneo-activos, los oualea evidentemente, est&i diseftados para el. cultivo de 0•1ui- norlDli.l.ee pero no para aqu,ll.a• qu.e •• en- cuentran deftadas subletalmente (1~6). Ya que Vibr:io parah-mol.Yticua es un ld.croorganiemo ba1.6filo, concentracionea 6ptimaa de sal pueden incrementar su reeistencia a lae condiciones desfavorables. T•llllllYO (50) eatudid en Jal)dn la prevencidn de l.os brotes de envenenamiento alimentario cau.- eados por esta bacteria ~· observ6 que el RaCl, en una ooncentra- c:idn de 5 a 7~. pod!a aumentar eu eobrevivencia en extractos al.:imenticios durante su almacenamiento a -18ºc por per~odos cor- tos (4 d!-) • .Aeakawa ( 50) reportd untt disminuc:icSn de cons:iclerllble en l.a can- tidad de v. paz:ahaemolyticus a -10°c que a -20°0 en medios de ou1ti:vo de li-al..aiaa e:Lnt:e1;-a, bloqueendo por 't:alll1'o, 1• incorporac:ldll ee1ec1o:lva 4e J>-al.an:Lna en •1 p6pt:l.do,glic'-' 4• 1• pezoe4 celular. Se pudo ob••:rvlll' que o1;ro de 1o• proce•o• involucr114o• 4uran1;e 1oa prillero• 90 lli.aui;oa de la recupe1'9CicSn e• la alnte•i• pro- 'te:lca. Bll'to se coaprobcS al u1;:1.U.zar eu1:tat:o 4e Jl:anaaic:Lna, eub,!! i;anc:la que iald):le ee'te p:roce80 a1 aotuezo •obre la aubwd.4114 30 S 7& -• 4ur11111;a n 1Dic1aoicSa. e1oagacidn o 'teraia.c:lcSn. U .,contiauo •f'eo'to iab.ibito:rio de la rif'-piciaa 7 1• aotiao•i- cina J>, obeer1rado por He:i..Di.e, indica que 1a efnteei• ele. Alllfa ea neoeear:La en e1 per:Codo 4e reouperacida, eobre 'todo en lo• priaero• 30 •inu'toa de•JNI• 4el dafto. D\u'an1;e el. tratamien1'o 1oarmioo •• dafla en :torma cone:lderab1e 1a capa po11aao6r:Lda de la c4lu1a, que .aoraalaeate p:ro1'ege a la capa lipopro'teica de 1• aeabrmia contra 1a .cc:ldn 1ftioa 4e1 1mar:l.1 8111.:tato 7 4e1 deeox:l.col.a'to ele aodio • .Al. igual. que Ma-Un (117), Reint.e obeervd que e1 M,g++ eet .. f\aert-•nte 1aplioll4o ea 1oe aeoani•o• de reparacidn. 7• que eete idn .ao edl.o ao abmidozaa a 1a c41ula 4ur9111;e e1 trat.m:len'to t4:rmico, eino que 114emú, 1u c6lulae aef dailll4- requ.ieren ni- Ye1ea elevado• del a:l.emo durante 11\l p:rooeeo de reparac:l.dnr por otro lado, e•'te requerimiento ee inmediato (dentro de loe pri- mero• 30 miautoa). Bato llevd a Heini• a eugerir la ut:i.1ida4 37 de adicionar JIB++ a lo• medio• wsado• para la recuperacidn de Vibrio parahaeaol,yticus en alimento• proceeadoe (79). Si bien Heini• (7.9) utiliza como ••dio de recuperacidn al 1'SB con lf.Cl al 3", Vanderzant (196) recoaieDc!a el 1'SB con lf.Cl al 7" (para lo• homogeneizado• re:f'rigeradoe), junto con el agar aodi:f'icado d• ~edt 7 Novell.i. Sin embargo, en un eatudio comparatiw, :S.uchat (19) lldY:lrticS que esto• medioa, al igual que el GS1'B, eon ••no• e:f'icientea que el.. caldo arabinoaa-v:Lol.eta de etil.o (HABB) 7 el caldo azul. aaua--arillo ali.zarina (WA) para recobrar c•J.u1aa dafladas por :f'r!o o calor. loa recuperacicSn de Vibrio parllhaemolz1¡icue a per1;ir de homog- neiz&dos de ostidn con varios medio• de enriquec1m:i.ento •• ve l.imit&da no sdlo por :ractores tal.ea como agente• teneo-actiwa, pB F sal•• illorgúic .. , eino t-bi4n por l.a micronora natural preeente a l.a hora del 11nilisia. Se ha Y.Lato, por ejemplo, que ciert .. especie• de Peeudomon- a:Lsl.114- de ostiones, repri•- •l deearrol.lo de Vibrio parabeemol.Yticue (l.17). P••• a todo, 1a omi•idn de llg++ o de .. 3+, o de -bo•, en 1o• ••dios de enriquecimiento, puede conducir a una aubeatimacidn del. grado de contaminacicSn por este a:i.croorgani..o en l.o• al.1- aento• de origen marino, re:f'rigerados o congel.adoa. 38 5. CARACTERISTXCAS BIOQUIMXCAS Varios investigadores he.n proporcionado gran int'ormacidn acer- ca de 1- características bioqmmic- de v. parahaemolV;icus. B•te microorganismo es un :tacultati vo que po•ee -bo• aetabo- 1.i.aaoea reepiratorio 7 :termentativo; produce una oatal .. a 7 una citocromo oxid .. a, t'ermenta la glucoea en :toraa anseros•n:1.- ca y, no produce aceto!na, ea decir, ea negativo para la prueba de Voge•-Proekauer¡ t-biú :termenta gal.actoea, levuloea, •al- toea, aanitol, mano••• ri.bo•a 7. trellalo ... Bn contr .. te, no :termenta adonitol, dulcitol, eritritol, ino•itol, 111eto••• me- lizito••• ra:tinoea, ramnoea, •alicina, •orbo•a, •orbitol, •aca- roea 7 xiloea. r.a vari11eic5n da cepa puede ob•ervarae enali&anclo la f'ermenta- cidn de arabiaoea, oelobioea 7 melibioea. Vibrio parahaemoly1;ioue ea positivo para la produccidn de :l.ndol, posee descarboxilasaa para lisina 7 ornitina, reduce loe nitra- to• a nitritos 7 degrada gelatina, quitina, almiddn, oasefna, eeculina 7 leoitina. Generalmente, es negativo para la actiVi- dad de arginina dihidro1 .. a, la produocidn da l.cido •ul:thidrioo, ure .. a, :tenilalenina deamminua 7 lumin:l.soenc:l.a. Oominllente aeta bacteria utiliza loe aiguiente• compueeto• como f'uentee dnicaa de oarb61u J>-gluoonato, acetato, citrato, propi,2 nato, DL-malato, piruvato, f'umarato, lactato, euccinato, ceto- glutarato, etanol, propanol, L-aer:l.na, L-leucina, L-glut-ato, L-arginina, -L-prolina, L-tirosina, L-alanina y L-hietidina. De igual manera, es incapaz de utilizar :f'enol, cateool, malon- to, oxalato, glutarato, tartrato, p-hidroxibenzoato, butanol, benzoato. r-alanina, orni tina, L-ci trul.ina 7 eepermina (70). 39 I.ae carr.cterieticae indiVidualee no deben tomaree con demaeiada rigidez para la identi:ficacidn, ya que es comdn la variabilidad de cepa. Si un aislamiento obtenido del medio ambiente cuaple con todos los criterio• antee mencionados, Pllede requerir•• una caracterizacidn bioquímica adicional, inclueo hibridacionea de DKA, par.a e:fect.uer una completa separacidn • identi~icacidn. Uaa caracterizacidn de este tipo diferenciar' ocasional.mente entre V. parahaemoly1;icua y otra bacteria marina similar, pero pobremente caracterizada. Hugh 7 Sakazaki (45) propusieron una 'tabla de oaracterfs'ticu a1n:L.mae para efectuar l.a identif'icacidn de v. parahaemolJrticue. S:ln embargo, deben seilalaree 1aa excepciones a. dicha tabl.a. Por ejemplo, l.a ausencia de ~ermentacidn de sacarosa •• una caracteriatica diferencial pr~maria y conetit~e el criterio búico empl.eado en la ma,yor!a de loe mftodo• de ai.sl.llllliento recomendados para Vibrio parahaemol.yticus; no obstante, •• ha reportado que un gran ndmero de cepae ex-inadae son sacaroea-112 aitivae. Colwel.1 (44) encontr6 que el 6~ de las cepae que ex~­ nd eran eacaroea-positivaa, Joaeph (92) detectd este mismo ~e~ ••DO en un al'lio porcentaje de lae cepas que aisld, 11\a;lino (70) obeervd que el. 2" de sus aiel-ientoe marinos eran tambiln 11acaro11a-poeitivoe, qree y Barrow (4) reportaron que, de 1- 1.,484 cepas obtenidaa de laa llc!Uall costeras brit4nicae, el. 6.9" eran aacaroea-poaitivaa y .ICampel.macher (95) publicd reeultadol!I eim:ll.area. Oabe mencionar que la deteccidn del Acido producido durante la ~ermentacidn de l.a sacarosa puede variar de acuerdo al medio y a la concentracidn del carbohidrato; por ello, Baroes (93) re- comienda el uso del medio basal OP con una concentracidn :final de o. 57' de sacarosa. 40 (identificación de Vibrio parmhaemolyticua Bacilo Gram-negativo no esporulado Indofenol oxidasa Glucosa, ácido bajo un sello de petróleo Úlucosa, gas | o D-manitol, ácido Securosa, ácido ácotilametilcarbinol H23 L-lisina descarborilasa L-erginina dihidrolasa L-ornitins descarboxilasa Crecimiento en caldo triptona al 1% | Crec. en caldo triptona al 1% con NaCl el 8% Crec. en caláo triptona al 1% con NaCl al 10% Crecimiento a 42%C Cuadro propuesto por Hugh y Sakazaki (45) | 41 Caracter!eticae KiAi.aae para Bf'ectuar la Identi~1cac16n e ibrio a 110lzticua f'enol xid-a luco•a, 6 i o ajo n ••ll e t 61eo Gll.lco••• •- -ll11Dito1, 6 i o w:aro a, '° o Acetila lc .nol B28 J.-lieina ecarboxilaea J.-ar i.nina b:l.drolaea J.- :l.t:l.na acarboxila a reci iento l o a 1 l" reo. l o 1ir:l.ptona 1 l" n ff.Cl a1 ª" ree. ldo 1iri 1iona l " n lfaCl l " r :l.mieniio a 00 Clledro r puesto or ugh 'T akazaki 5) + + + .• + • • • Generelmente, 1- deacarboxilaea11 para liaina y ornit:lna eet6n presentes en v. parahaemolyticue, aunque existen muchas excap.. cione11. Pl.lj:lno (70) reportcS que el 4 a 5" da las cap- probmd- eran negativ- para ornitina y/o liaina deacarboxil-•· Po:r otro lado, se aaba qua 11610 al 78" da 1- colectad- an Tokio ea han reportado como poeiti'Yaa para la ornitina da11carboxil-• (151.). La produccidn de 4cido aulf'h1drico ae investiga leyendo la reas, cidn qua ea l.l.eva a cabo en al. extremo da un tubo con agar da Kl.igl.er (KIA), agar Tripl.e Azdcar (~I) o en loa medio• SIM o LIA. Sall:uüi (93) reportcS qua ninsuna de l.aa 1,072 c•p- ex .. :Lnad- en au estudio 1\leron positivas para la produccidn da H2s util.izando loa medios da SD o ~I. Sin embargo, Colwell (44) encontrd que casi todas las cep- de v. choleraa y v. para- haemo1Jticua que axamind f'ueron B2S-poaiti._ al utilizar un medio con acetato de plomo, lo cual comprobd Twedt (189) pos- teriormente. Por tanto, se ha sugerido analizar la produccidn de 6c:ldo eul.1"h1drico en el. agar de acetato de plomo, cuando ae requiera e~ectuar la identi~icacidn de esta especie. Otras dos caracteristicaa que no están :lnc~uidaa en el conjunto de carac1;eraa minimoa de Hugh y Sakazaki, paro que aon dignas de macionarae, son el indol y la u:reaaa. Aunque la produccidn de indol general.manta es positiva, un sran ndmero de cepas indol.-negativaa han estado implicadas en brotes de envenenamie!! to al.:lmentario an la ciudad de Tokio (151). Del mismo modo, V. parah-mogticua estl. considerado como u:reaea-negativo, aunque varios :1nveetigadore11 han encontrado cepaa ureaaa-poei1;i- vaas Coltlrell. (44) observíS que el 97:.' de las cepas exand.nadas en su inveetigacidn eran u:reaaa-poeitivae, Sakazaki (93) reportcS 42 un 4- 7 Kaper encontrd 13 cepaa ureaaa-positivas de lae 19 aisladas de camardn. Bl aislandento de cepas ureasa-positivas en infecci.onee hwaanae •e ha mencionado en los reportes de Lam y Yeo (110) 7 en lo• de Oberhof'er 7 Podgore ( 135). Curiosamente, en ambos caao•, 1- cepas obtenidas, ademAs de ser ureasa-poeitivae, eran negati- vaa para la prueba de ro~o de metilo, hecho que adn no tiene expl.icaci6a. 6. ~IPIPICACIOll La claaif'icacidn serol6gica ·de v. parahaemol.yticue ae baea ea la inveetigacida de doa eetructuru antig,11icaas el. mntfgeno eomAtico o 7 el pol.ieacArido capsular E (153,93,24)s lo• antf- geaos tl.&Belarea B eon ipalee en todaa las cepas 7 • por ello, ·i ao •e utilizan ea l.a •erotipificaci6n. Lo• antígenos K son termol.Abiles, ya que resultan suaceptiblea a calentamientos de lOOºC durante l a 2 horas, mientru que l.011 O aon termoestablea, pues soportan durante el. mismo tiempo, te5 peraturaa de hasta 121°c (153,93). Bl. eequeaa mitig,nico de v. perahaemolyticua fue sugerido por Sllkasaki deapu•e de estudiar 2,720 cepas obtenidas 4e pacientes con gaatroenteritia. Su investigaci6n demostr6 que eete microo.1: gaaieao es aerol.6gicamente diferente de otroa vibrio• (93). La especificidad de l.os antfgenoa f'ue tema de an61.ie1.s profun- do; ~erada (93) encontr6 que v. pBZ1ahaemo¡yticus, V. alcino¡yti- S!!§ 7 v. BDfS!!il.l.arwn muestran id,nticos antfgenos H To por otro l.ado, Pishbein (66) obaervd que V. parahaemol.Yticus y v. al.gino- lyticus comparten algunos antígenos O y K. 43 :.¡ Si bien existen 12 antígenos O dentro de l.os cua1es ee claei- f'ican 59 antígenos IC, Twedt (190) ha demostrado que algunas cepas de v. parahaemolyticus producen reacciones poco eapecí- f'icaa debido quiz4 a la presencia de otroe antigenoe E o a 1a reaccidn cru~ada con otros sueros anti-O. Aunque mucho• aie1amientoe ambienta1es ~ al.gunoa c1fnicoa son atfpicoa para e1 antígeno E, 1a mayor!a de 1ae cepas c1fnic .. pueden ser cl.aeif'icadas de acuerdo al. tipo o. ESQUBllA ANTIGENICO DB V. parahaemo].yticus (66,93,153,190) - .&ntís¡enoe O Antígeno a E 1 1,25,26,32,38,41,56,58 2 3,28 3 4,5,6,7,29,30,31,33,37,43,45,48,54,57,59 4 4,8,9,10,11,12,13,34,42,49,53,55 5 15,17,30,47 6 l.8,40 7 19 8 20,21,22,39 9 23,44 10 24 l.l. 36,40,50,51 12 52 44 Bn l.968, Sakazalc:I. habla propuea'to un eaqu-• que reconoc:!a a&l.o 11 grupo• o 7 41 ant!genoa lt; posterio:naen't•, loa .n1:1ge- noa lt 2,14,16 9 27 7 35 a• excl'Q'eron del esquema. 7a que a• •n- con1:r6 que eren id•nticoe a otros reconocido• con .n'terioridad. Ac1:ualaente 9 Sakazaki 7 otro• :l.n•eet:l.gadorae japone•••• "al•• como 1'okoro 9 Y-ad• 7 Yokota, reconocen 61 ant:(genoe lt, colo- cando lo• an't:!genoa 60 7 61 en el grupo 05 (153). lirl esqu-• llll'tig,nico propuesto por Sekasek:I. •• bua en cepu aielad- de pac:l.ent•• hWD!ftO• 7 no aberoa l.u del. medio -bien- te 9 l.u cual•• trecuen'temente eon at1p:l.c .. (66 9 153). Aeim:l.amo, •1 Comit' de Serotip:l.a de Y:l.br:l.o parllh .. mobticua ha adoptado l.a poeic:l.dn 4• mgraadar •1 ••quema adl.o con 1a inclueidn 4• ••ro'tipoe humano• (93). llUohoe in•••tig&doree h1111 moetrado in'ter•s por 4:1.luci4ar l.a •- 1:ruc1:ura qu1mica 4• l.o• principal•• antígenos 4• v. pu-aha••o- J,yt&cue. Aunque 1'era4a 7 Zen-Yoj:I. han deacr:l.to la obtencidn 4•1 antfgeno E9 :fue Omor:I. quien J.ogrd eu parif:l.c.cida a partir ele l.a cepa A55 (051Kl.5). La substancia era c.racter1•t:l.camente l.cida por con'tener cantidad.e• coneiderabl.ee 4• hezoe8111ina 7 grupoe ace'tilo. Poeteriormente, ltudoh deecubrid l.a preeenc:l.a de alswioa ar;dcarea 'Jf !l'orii encontró que ••"• antígeno, •1 EJ.5, poeefa dOB l.c:l.40BI el llaftOB-inurdniOO 7 el. glUCOB-illlU'd- DiCOo Cabe aeftalar que este tipo de l.cidoe (l.os hezoa .. imardni- coa) • se han aiel.ado collO ent!genoa protector•• en otrae eep•- cies bacterianae (183). !l'ori:I. (182), al. realizar estwiios inmunoqu1micoa en material cel.ul.ar extra1do por el ••todo de reno1-agua 9 encontrd que l.oe ant!genos O son pol.isac6ridoa que contienen glucoa~ galactosa, gl.ucosamina, heptoaa, f&sforo, lateree de 4c:l.4oa graeoe y 45 compue•toe Ditrogenlldoe. Ademáe detect6 galactoeamina en 5 aueetr-. i..e especificidad•• aerol6gic.. de loe ant!genoe de 33 cep .. inveetiga4u por ae4io de la t'cnica de dihe:L6n en -car, coincidieron con 1as de 1a aglutinac:L6n o. Aeimiemo, Simouchi reportcS la preeencia de arab:l.nosa, maaosa.. ramnosa 7' xi.losa en algunoa aa.t!genoe O de eete microorganismo (182). Por otro 1ado, i .. eero-•ariedadee de V. parahaemollti.C\U pueden determinare• por aglutinaci.611 en pi.ca ••diente lo• eueroe d:la&ndaticoa anti-O 7' anti-E de loe laboratorio• 1'oehiba ICaBalcU Xogyu Co., Ltd. • 1'olqo, que ee encuentrma dieponible• en f'o:rma comercial. PILZ!IL la aglutinac:Ldn o, ee eligen coloni.- tranelllcid- de cult:Lvaa de una noche que ee cosechan en eolu- cidn ealina 7' ee someten a 100°0 durante una llora. n paquete cel.ular ee 1a'ftl dos •ecee oon soluc:Ldn •ali.Da a1 l~ 7' con esto •• inoremea:ta la eB1ut:Lnabi.l.:Ldad O del cultiYO. Si no h81' .. l!! t:LnecidD con ningdn euero anti-O d:l.eponible, ee deben probar coloniaa b.ri1lantes o 'traneldcidaa 4• cu1'ti"IOe en ager nutri- t:L va. La -.glut:l.naci6n o puede ocurnr 'tambim deepule d• que loe cultivos •• han tra't..So •n autocla'Ye a 121°0 durante doe horae. Par.a la 4eterminacidn 4e1 anttgeno s:, •• eligen coloniaa opaca• 7 euavee, pero no mucoidea (109), que •• eubcultiven en qar nutritivo. Para e:fectuar 1a prueba ee uti11za una suapeneidn densa de microorganiemoa Vivoe en eolucidn salina al 1-, la cual. ae aplica en una placa ;junto con el euero para real:l.zar Ulla aclutinacidn directa. Bn el ca110 de iae coloniaa mucoidee, Lam y Monteiro (109) rec2 miendan el tratamiento de 1- c41ula8 con HCl o. 2N durante 46 30 minutos, 1av6ndose 4 vecea 7 reauapendienclo en eolucidn eal.ina al. 3"· Betoe mi-o• invee'tigadoree (109) determinaron 1a natural.esa de 1a eubstancia viecoea que proporciona la textura -.acoide de eete tipo de coloni-, mediante un ••todo de co11glutinacidn de c6lul- t'ormal.iniz..S- de Staph:rlococcue aureue, reveetid- de anticuerpo• anti-K. Encontraron que eeta eubetancia Yiecoea era antig,nioamente •illlilar al. ant:(geao capeular de la •iema cepa. No ae ba encontr..So explioecidn a ••t• t'end•eao, adn cuando en •1 o-o de otr- eepeoie• bacterian .. , alguno• autor•• han eefta1ado la infiuenoia ele cier11oa co•pueeto• en e1 ••dio de cU1ti-.o, ta1e• como carbohidrato• ., t'oet'ato• • .AUD.que 1- eerovariededee de la •a:roria de 1- ce~ a1•1e4- de hecee diarreiciaa pued- dete&'ldnarae con 1oe muero• anti-O 7 anti-E exietentee, mucho• aieleaiento• obtenidoe de fuente• •&rin- ao p&eden identit'icaree con elloe ., quiz'-• posterior- mente, ee incl~an otroe eerotipo• en e1 eaqueaa antiglnico de Vibrio parahaemo].zticut• 7. ME!L'ODOS I>B .DB'l'BOC.ION Y RBCUE~ Loe doe altodo• m6e utilizado• para et'actuar el recuento de eete microorganiamo,~to en alimento• como en muestrea de egua, eona •l ndmero mú probable (1'11P} ., 1a t'iltracidn por meabrana (Jll)s -bo• ¡naden emplear•• para eu &1•1-iento aunque ee t'actible apl.icar el p1aqueo directo cuando el ndmero de cllul- en la mueatra es relativ-ente elevado. La inmovili&acidn en agua deetil8illa propueeta por Cbeeter (55), •• una prueba presuntiva que puede aplicare• al inicio de una 47 caracterizaci6n; este investigador obaerv6 que loa primoaiala- mientoa de v. alginolyticua 7 v. parahaemolyticus obteni.doe en -.ar aaDBZ"• al. "'• eran activamente m6vil•• en t'SB pero perd:f:ma dicha propiedad al colocar•• en a,gua deetilad.a; lllientrae tmato, 44 especies de b.cilo• Gr .. -ne .. tiYO• ooneerveron su moyj,l:ld-4 en •bo• t'lu:l:doa. Conclu¡rd entone•• que un bllOilo Gr--negatiYO, oz:ldaaa poeitiYO, lldyj,l en t'SB pero inmcSrtl en &«U& destilada, p11ede :ldentit'icarae presuntivamente como Vibrio. La t4cnica de t'iltr11Cidn de •••brana que se e11plea con t'recuee cía para el recuento de cierto• grupoa tazon6m:lco• (oolit'ormea, enterococo•, etc.), t .. b1•n pUede aplicara• p.ra et'ectuar •1 de lo• mioroorganillllO• del Bfnero Yibrio (93)1 en ••t• dltimo oaao, dupuls de t'iltrara• la auestra, •• depolll.ta l.a •-brana en el aed:lo .AAC (arabiaoea-sult'ato de aaonio-colato) con pll de 8.6 7 se incuba a 420C Ct•cntca de Horie)¡ el creci•iento a eata tea- peratura es una caracter1a'tica di:f'erenc:lal. importante de Vibrio parahaemoly:ticus, 1111••'-• otra propiedad que sugiere la preeen- oia de eeta b.cteria ea l.a colorac:l6n -ar:lll.a de 1- colon:laa t'eraentadoras de arabinosa, pero COllO ae ha establecido con anterior:ldad., la t'ermentac:l6n d• eete carbohidrato •• una c&rll!t terf•tica variable en la especie (44,153). Jluchoe de lo• aed:los en placa descritos anteriormente han •ido a4apt84o• para lo• filtros de membrana; entre loa a'8 empleado• deetaca el TCBS. Sin embargo, Watkin• (200) disefld un ••dio b.- •6n4oee en la capacidad de v. parahaemol;yticua para crecer en - presencia de NaCl al 3"• a un pH de 8.6 'JI a una temperatura 4• 4lºC; en late, el autor utiliza col.ato de aodio como 11&9nte :lnh,! bidor del crecimiento de 111.icroorgan:lemoe Gram-positivos, galact2 ea como carbohidrato t'ermentable y sult'ato de cobre para impedir el desarrollo de v. alginolyticua. Por otro ledo, realizd varios 48 intento• para lograr una rápida identificacidn de este microor- ganismos tr&neferfa loa filtroe en loa que apreci&ba deearrollo a medios de fermentacidn para galactosa y sacarosa 7, como pa•o 1'inal1 realizaba la prueba de oxid-a. Segdn .u publicacidn, este procedimiento requiere de 30 hor .. y proporciona un 95" de confiabilid-4 en la identificacidn. ltaper (99) desarrolld un medio, el VP, tendiente a lograr una r6pida identi1'1cacicSn preeÜntiva de v. perü-mol,yticua. Bn late, 1 .. fermentacione• de aanitol, •aceroaa y lactosa, la activid..S de la arpnina clihidrolaea, 1a producoidn de indol, e- 7 H2S1 pueden regiatraree en un solo tubo. Lea ooloni- eoepecho• .. de eer v. parllhaeaolY'ticue pueden ele- girse direot-ente de 1- placae de aielemiento o de loe 1'iltro• ele membrana e inocu111re• por picadura 'T deect!Z'gando el -a en la parte incl.inada. Lo• cultivo• •• incuban a 35ºc durante 18 a 24 horas, cleepula de laa cuales •• efectdlln 1- lecturae. Para detectar la produccicSn de indol •• egregan 3-4 gotaa del reac- ti-vo ele KoYaca. Lae reaccionee del medio VI' •• basan en loa principio• de loe 114rare• hierro-triple azdcar (ftlI) 'T hierro-liaina (LI.A). La dnioa combinacidn de reaccione• que produce una inclinacidn alcalina (pdrpura) sobre una base 4cida (amarilla), la dan laa prueb- de manitol (+), eacaroea (-), laotoaa (-) 7 arginina (-), ~o cual •• tfpico de V. parahaemol;rticue que ademú ea anaeros•- nico, H2S (-) '• indol (+). No obstante, •e recomienda la conf'ir- macidn, que puede incluir pruebas adicionalea tales como la ozidaea, crecimiento en O- de N&Cl, desarrollo a 43oc 7 produc- cidn de lisina deacerboxilaaa. Una de 1- limitaciones del medio VP radica en au incapacidad para manifestar la ferment6.Cidn del manitol cua.ndo ocurren ade- 49 llo roo o confiable en la detección de Vibrio parahaemolyticus (99). Reacciones de Bacterias Gram-negativas en VP Comparadas con Pruebas Convencionales Medio VP Pruebas Convencionales Especie Incl. Base H2S Gas Sac Lac Manitol Arg Y. parahaemolyticus K Á - - - - + - Y. elginolyticus O - - V. choleras A A == to = o. + N - | Ve. llarum AGK AÓX —- = Vo . ls . + | Eo A. hydrophila K6A KÓA - == Vo vo eo + Pseudomonas spp. Lv Escherichia coli E Vo + v z. pneumoniae A A - 0» » » e v S. £ imurium K A + + - - . + V. natriegens A A -. - . - + - Vibrio Grupo Pp Á Á - v + - » + A ' reacción alcalina (púrpura) reacción ácida (amarilla) variable < > C N mú l• ·hid 611eie de la arginina o la.e t'er111entacionee de lact2 ea o sacarosa; ein embargo, ofrece una a1ternati •• r6pida y con~iable t 16n e ibrio ol1t 11 9). ea ciones e acteriae ra -negativae P omp r d- n r ebae onvencional•• edio P r ebae onvencional•• Bepecie ·Inol. a e 2S ae ac ac •11111 tol rg v. parmhaemol~icue A v. al¡ino~ticue A A + + v. l ra• + v. angut .l 6 d X: V +. ·+ . !!zdrol!!!ila 1C6A 6A V V + + e onae e p. J( K y echerichia .2,2!! A A + + + V .i:. e wnoni- + + + + V s. tzl!!!imurium J( + v. atri•s•n• + ibrio rupo p A A V • + K= 16n 1cal.ina drpura) A• cidn 6 1da niarilla) V• ariable 50 IV. l'ATOGBNICIJ>AD Y PATOU>GIA Vibrio parahaemolyticue se considera un importante agente etiol~ gico de gaetroenteritie en humanoe, a rafa del brote epid,mico que provoc6 en Oeaka, Jap6n durante el afto de 1950; no obetante, tambi•n se 1e ha asociado con af'eccionee extrainteetinalee (24). Loe principa1ee eintomaa de 1• inf'ecci6n gastrointeetina1 por V:ibr:io parehaamol.Yticua eon la diarrea y e1 do1or abdominal (172) y, coao se ha eetablecido, e1 padecimiento ee re1aciona eeencial- aente con 1a :ingeet:i6n de al:iaentoe pro-..nientee del •ar• eete a:icroorgan:iuo babi.ta noraa1mente esi aguae de baja ealinidad ta- 1ee como loe eetuarioe, deeeapeilendo un papel prepon4erente en 1a eepecia1 ecologfa de 1oe ambiente• aariao• coetero• (98). Aunque no ee 1e coneidera un aicroorganiemo al.tmaente inf'eccioeo, ~ ao, ex:iste duda de eu capacide4 para ca1&ear enf'eraedadee eeriae. Bn genera1, 1ae d:iarreae de origen bacteriano •• deben a al.guno de 1oa tree aecaniemoe eiguientees 1. La producci6n de enterotoxinae prote:icae 1:1.beradae por aicroorganiamo• no invaaiiroe que originan 1a 11CU111Uleci6n de f'luidoe en el :inteet:ino; ta1 ea e1 caso de Vibrio cho1erae, Becbe:rich:ia 221! enterotox1s•n1ca y Cloetr:idium perf':r:ingena. 2. La inv .. 16n de 1o• tejidos del hu••Ped por bacteria• tal.•• como Shigel1a y B. coli entero:inv .. 1va, 1a cual. ee mani- f'ieeta por 1a aparic:i6n de f'en6menoe citot6xicoe que inte~ f'ieren con lea f'uncionee hieto16gicae no:r9al.ee. 3. La combinaci6n de ambos efectoe mencionados. 51 Si.n -bargo • por l.a extensa •ari•dad d• s:l:nto•- detectado• en 1aa pereonae af'ectadaa de gastroenteritis debida a Vibrio parahaemol,yticua y l.os contradictorios datos patol.cSgicoa pabl.! cado•• no se ba determinado el.ar-ente l!i l.a enf'e:raedad es ªº!! secuencia de l.oe e:tectoe ele una enterotoxiaa. •i ee debe a que •1 acent• caaaaal. invade el. inteatino • o bien. •i ea producto d.e 1a accicSn de componen1;es 1;c$xicos originado• s6l.o por aJ.gunae cep- de eata especie (167). Conaiderando l.a natural.•&• del. pa4ecilliento. l.o •'- l.6gico ea penalll' que uaa exo"t;oxina ••a 1a eubatancia reaponaab1e. 1'o ob- ~ante. el becho de que 1a en:termedad acSl.o ae preaente cuando ae S.ntroduc• por ~a oral. al. lli~roorgani-o 'YiTO• sugiere que lste requiere desarro11ar al. menos cierto grado de inT-ividad en el. 1.nteatiao para que s• deaencadene el. proceso l.esivo 7, al. aia- •o 1;iempo • descarta l.a posibilidad de que sea una toxina pre:tor- :} llllllla eli loa al.imentos l.a que genera la enf'enaeda4 (154.1.85.141.). Otra evidencia en :tavor de 1a irn·aei vi.dad se apo7a en el. hecho de que •• requiere un a!niao de 105 microorgani-oa para que el. padecimiento ocurra; cabe aaftal.ar que en 1os estados apdos de 1a enf'ermeda4 pueden aisl.aree entre 106 7 108 microorgani .. os por lli.11litro de heces (53). Por otro lado. desde bace tiempo se ha asociado l.a patogenici4a4 ele eate microor.-U,emo con eu capacidad para causar h-cSli•i• en 1lll .. ar eapecial.• debido a que dicha caracter:l:stica se ha obeer- ~o en el. 96.5~ de l.o• aial.miaientoe cl!nicos y scSl.o en el. l.~ de 1o• obtenidos del. medio ambiente (153,122). Consecuentemente, •arios inveatigadores ae han dado a l.a tarea de ai•l.ar y anal.i- •ar a 1os :tactor .. hemoliticos para definir su papel. en la pat~ genicidad de esta especie. Asf, se han determinado sue propie- 52 ··'"'' dad•• fieicoquimi.cae 7 biol6gicae 7 la poeibl• relacidn entre alguno de ello• y la virulencia de la bacteria. Bn reeumen, haet1& el momento eon doe lo• aepectoa c¡ue ee han considerado para explicar la patogenicicla4 de Vibrio parahaemo- lyticues A. La r•lacidn entre lae hemolieinae de eete microorganiemo 7 eu patogea.icicl-4. B. La presencia de ~actor•• aeocia4oe a la 1nfeccidn. 53 _ ENTRE IAS HEMOLISINAS DE Vibrio parahaemolyticus Y SU PATOGENICIDAD. . A.1l Antecedentes Desde la primera vez que fue caracterizado (Pujino, 1950), Vibrio parahaemolyticus manifestó una clara actividad hemolítica en placas de agar sangre (43,69); posteriormente en 1965, las investigaciones realizadas por Kato en el Laboratorio de Salud Pública de Kanagawa, dezostraron que mientras las cepas aisladas de las heces de los pacientes causaban hemólisis, las obtenidas de diferentes fuentes de contegio para el hombre, no lo hacían (153,172). Años más tarde, en 1968, Wagatsuma modificó el medio utilizado por Kato buscando mejorar la visualización de la he- mólisis (agar de Wegatsuza); en ese nismo año, durente e1 419 Encuentro General de la Sociedad Bacteriológica Japonesa, Pujino, el descubridor originsl de V. parashaemolyticus, propuso asignar el nombre de "Penómeno de Kanegawa” a la peculiar hemólisis mos—- trada por este microorganismo en el agar de Wagateuma, debido a que había sido detectado por el grupo de estudiosos de la pre- fectura del mismo nombre. Desde aquel entonces, muchos autores consideran que existe una estrecha relación entre la enteropato- genicidad del microorganismo y la positividad de la prueba, misma que se caracteriza por la aparición de una clara zona de ' hemólisis completa (beta), debajo y/o alrededor de las colonias del bacilo (122). 54 A. RBLAOIOlf BN~RB L S BllOLISI AS B Yibrio u-llh- obtioue GBMIOIDAD. .l .Antecedente• eade r era Y9& e 1\le 1:erizado (~jiDO• 50), Yibrio ar olYticue a11Di1'est6 a l ra 11etiVidad .. lftica l.ac- e er e gre ,69); st r ente l.965, 1- st ci nea l.i•ad- or ICato l aboratorio e 1ud 4bl.ica e 1C1111-c-ra. moatraron e ientr- .- pu .114- e 1 .. cea e .oe ciente• . aban eadlieia,·J.- tenidu e i 'erentea 1\lente• e ntegio ara l. abre • o acf- .J.72) • .&flo• aú u- e. 68, agueu a a 4i1'icd l. edio 'til slldo or ICato a llDdo a j ru- Vi8U . 11acicSD e e- acSli•i• ar e agatauaa); ae milllllO fio, raa.te l. ° JIDcuentro eneral. e ied8111 acterioldgica one a. 1\ajino, 1 e bri4o:r r i al. e v. ra olnicue. 110 e1par l ab:re e daeno 4e ICllDagawa" .a culiar dl.ieie oe- a or ete i :roo:rganie o l q r e qateu a, 14o e bfa ei o t ct do :r l po e et 4i eoe e :re- ' ct :ra l. a e o bre. eede uel t e ea, a ohoe . t r•• sideran e iste a t ha l. cSn tre .a t r pato- nici ad l. uc: organi..o 7 .a eiti i ad 4e 1e r eba, •i•- e ee racteri•a or ic:l.cSn e a e .ara s na e dl.ieie pleta eta)• bajo T/O .r dedor e 1 .. loniu el acilo 2). A.2 La l'rv.eba de ICanqawa Tradicionalmente, para inve•tigar la actividad bemol!tica de Vibrio parllhaemo1Yticus, •• e:f'ectd.a 1a prueba de Jtanagawa en el qar de W11&at.umai •ate •e prepara de la siguiente maneras el medi.o baaa1 (extracto de le•adura, peptona, •an:ltol, -.rar, crista1 violeta y N.Cl a1 7") •in eateriliztir es di'Yi.de en do• porcionea igual•• que se mantienen a 50º0; en eeguida, •• 9gr.!, ga a una de ellu uaa ewapenaidn el• eri trooi to• !mm.no• :f're•co• 7 lavll4oa al 20", en wia proporcidn de1 1°" V/V y, a la •egunda, •• 1• adiciona •l miamo volumen de otra, con la lli.-• ooncentr,s cicSa, d.a slcSbu1oe rojo• de cabal.lo. Por dltimo, 1- clit'eren't•• •••el .. a• dia'tri~en en caj .. de Pe'tri. Para realizar la prueba, 11• descarga una -ad• ele un cultivo líquido incubado durante una nocbe en una placa de agar con eritroc:ltoe .bumeno• 'T otra •n una caja de agar con bematfea de caballos 1011 resu1tlldoe ae leen una vez que tranecu.rre un perío- do de incub.c:idn de 18 a 24 .bor .. a 37°c. Una reaccidn •e considera ICanagawa positiva (U+) , cuando apar~ ce una zona clara de .bemdliai• beta alrededor del crecimiento d• Vibrio parabaemol!'ticue en la placa de agar que contiene lo• glf. bulo• rojoe hum1111oe 7 dicho t'encSmeno eet4 aueente en la zona que ci.rcuncla e1 cl•earrollo de eete microorganismo en la caja de llB&r con eritrocito• de caballo; eeto •e debe a que otro• vibl"io• •arillo• mon capacee de liear loa hematfee de eete .nimal. Consecuentemente, la prueba debe leerse como negativa, cuando la bem611.•i• en el primer medio ••• de tipo a1:f'a, o bien cuando mnbos medioe mani:f'ieeten heai6liaia (153). 55 En 1.968, Sakazak:L aplicd la prueba a 3,370 cultivo• 4• V:Lbr:Lo parahaemo!yt:Lcua procedente• tanto de pac:Lent•• af•cte4o• como 4• f'uentee ambienta1ee ., obeervd que, m:Lentr .. •l 96.5- 4• 1oe provenientes 4e huaeno• eran Kanec-a poe:Lt:L-.oe (U+), e1 99" 4• 1o• de or:Lpn .. b:Lental reeul.taban U- (153,172)1 - ••twU.o e:Lmi1ar 11.evado a cabo por •:Lyamoto en 1.969 proporo:Lolad 1.a 111- aa inf'ormacidn (122). Bn 1910, 'lwe4t real:l.zd un ee'tudio compera't:l.'VO o~o• ha11azgo• perecieron :torta1ecer 1- obaervacion•• 4• Sakazaki ., •i-,.-oto, pero que di:terlmi en la frecuencia d• ai.•1..t.ento• KP+ a partir de t\&ente• Ulbi•ntal••• dmdo. que ••"ta reeult6 aqor que la r•- portmda por lo• inve•t:l.gadore• ;tapone e•• ( 187) • ..'to ditimo :fue posteriormente apo;rado por Chwl, quien 11ev6 a cabo una eeri• 4• eetwlio• en loe que apl.ic6 1.a prueba 4• Kaneg.,a a 478 cep .. de v. perab .. aol.yticue obten14u del aar (sedimento, -cua. peces, aerieco•, etc.) y eu• r•111&l'tadoe eetabl.ec:Leron que •1 39.7~ de di.ch .. aep_, erui poaitiv .. (57). Bn 1ae •i-u :tecbu, 'ftlomeon, en un eetu4io rea1:Lza4o en Caa46, encontrd que •1 7~ de lo• ai.•1-ientoe o'bteni.doe en la costa de1 A't16nt:Loo era llP+, a1 :l.gua1 que •l. 10- de loe proveni.ent•• de la costa 4e1 Pacf:tico (178). Como puede cone'tataree, estos dltimos 4atoe difieren coneidera- bl.emente de lo• 4• Sllkuaki, c~oe eetwlios 'tieden a con:t:Lrmar la !U.p6teeis 4• que 1a poe:Lt:Lvi.dad en la prueba 4• ICaag-a, •• encuentra rel.ac:Lona4a con 1a enteropatogenic:l.4a4 para el. bwaano1 ein embargo, P••• a lo exteneo de eu trabajo y a la gran acepta- ci6n que exi•t• de su pl.ante8111iento, otros :1.nveat:l.gadore• •• niegan a aceptar a 1a prueba de ICanagawa como parúietro para c1~ eif:Lcar a lae cepae como hum1111as o ambientales y a coneiderarl.a 56 como medida pera acreditar patogentcided a ac¡u611 .. que 1a manifiesten poaitiva. Por ejemplo, ~homeon (178) comenta que aunque e1 porcentaje ele cepae ICP+ obtenid .. del medio marino ea eapecialmea~e e1evllllo en Oanllll&, 1a incidencia de 1a enfermedll4 en eete pmi• ea extre aa4 ... nte baja. Por otro ledo, oeda vez. sal.en a la luz. ¡n1'bl.ioa m'8 reportee de caaoa de envenenamiento aliaenterio, cu;r .. ce- pu responsable• son U-, coao pueden conetatarlo 1o• eatu4io• ele !feraao"to en Japdn 7 loe de •olen4a en lo• ••tedo• Unido• (124). :itor lo que re•pecta a la confiabilieled ele 1a prueba, 4•'ta ea cueationable, ya que eon muchos lo• inveetigedorea que. eatab1~ cen variacionea en loe reeu11'e4oe cle 1a •i-a. Por 'tal ao'ti"YO, "tmto la prueba de Jr::anag-a coao e1 q.r de Wagatl!IUlla •e han eoaetielo a numeroso• ea"tudio•. Obull compard la ac'tividad heaol:ltica tan"to de cep .. Jr::P+ como de KP- en funcidn del "tiempo de incubacidn 7 obeervd que mientraa l.u primeraa moet:raban una hem61.isie evidente en 16 a 20 horae, laa eeguadae desarrollaban una reaccidn cleramen"te poeitiva a l .. 48 hor... Bete reeul.tedo eugiere que 1ae cep&8 JCP- 1'•b:L4n 'tienen capacida4 hemol:ltica, minque "tardía, compareda con lae KP+ (57). Por o'tro lado, ae ha detect..So que la natural.e za de 1oe carbo- hidrato• f'ermen'tabl.ee contenido• en el. medio de cu1.t:Lvo, cone- tit~e un factor importante en 1.a aparicidn de la hem61:Ls1e en el asar de Wa&a'tawaa, ya que ee obtienen resul.tados diferentes al. variaar loa azdcarea involucrados. 57 Aei, Chun obse:Mr6 cepaa que, habiendo res"1l.tado KP- en el medio origina1, llegaban a manif"eetarae como Ja'+ a1 cambiarse el manitol por manoaa. Asim111110, encontrd que cuando se empleaban carbohidratos DO utilizables por v. parah-•olrticus, tales coao la lactosa y la sacarosa, loe microorgmdsmos supueat .. •n- t• KP+ no desarrollaban hemdlisi11. Bato t.mbiln sucedfa en pr~ sencia de galacto11a o arabino11a (56). Otro hecho que ha atrddo l.a atenciéSn de a2guno11 in'99etigador••• •• l.a variac:l.dn de los reeul.tado• por infiuenc:l.a de los c-bio• en el. pH del medio de W-.rataumas Chun obaer'Yd que •• presentaba una notable diamimlcidn en el pH del. medio durante 1- pri••r- 18 hor- de incubacidn que 9uizA •• debfa a la degl"edaoidn de loe carbohidrato11; entoDC•s eug:l.r:l.d que esta condicidn &cicla podia f"avorecer la aparicidn de halos de hem6liei11, toda ve• que 4sta •• detecta normalaente cuanclo •l pH del. aedio ee encue~ tra •n valoree cercano• a 6 o mú ba3011 7 no ee presenta en au- sencia de carbch:l.dratos f"ermentabl•• por el. microorganismo (56). La concentracidn d• NaCl. es otro parúetro que origina v.riacidn en los resultlld.os de la pn¡eba; la hemdlisis de K1111a.gawa se ha deaostrado claramente en •l agar de Wagatswaa 7 en otro• medio• con sangre que contienen lf.Cl al 7"' pero no en aqullloe cuy- concentracionee eon menor••• Chun ob11ervd que cuando ae edicio- naba este compueato al. "'• l.a zona de hemdliai11 DO preaentaba tan clara definicidn como. la que aparecfa en presencia del 7" y, ad-4a, cuando ... dieminuia al. 3", 1- eupueet- zona• de hemdlisia eran tan pobrea, pequeftae 7 sin m6rgenes distintivos, que no podian considerarse como reacciones positivas (56). 58 o. o ando las zonas de hemóliecis comien- zan a distinguirse en forma clara (193). Otro factor que tiene gran influencia en el resultado de la prueba es el tipo de eritrocitos presentes en el medio de Wagatsuma: Vandertant observó que si bien los hematíes de conejo eran fácilmente hemolizados por V, parmhaemolyticus, al utilizar se otro tipo de glóbulos rojos como los de cordero y, sobre todo, los humanos, la lisis era dependiente de la concentración de NeCc1 (193). Otra posibilidad es que la hemólisis de Kanegara dependa de la cantidad de hemolisina producida por V. paraheemolyticus bajo distintas condiciones, pues tanto las cepas KP+ como las KP- producen esta substancia, si bien las primeras lo hacen en mayor z proporción; por lo anterior y por el hecho de que está relacio- nada con el tipo de sangre empleado, la concentración de NaCl, el pH y la fuente de carbono disponible, la prueba aún no puede considerarse como un indice confiable de patogenicidad (56,57, 124,193). 59 En un estudio eimi1er, Vanderzant determind que •• ;Suet-ente a l.a concentracidn de 5~, cuan o 1ae nas e e dli•i• ien- n i.ati guir e ' r a l ra 93). tro 'actor e e ran 'l encia •l e 1te4o 4• r eba s l o e i cito• r sentes l edio e wec BWDas anderzant eerv6 e ei i n e atfee e ;So n 'l.cil ente o1izedoe or v. e a o1Yticue, 1 t iZllE tro o e ld uloe ;Soa o e e rdero 7, e bre o, e w anoe, 1• ei• ra eacliente e ent cSn e lf.Cl 3) • tra sibili ad s e 61 •i• e l:anec-• enda e 1a ti ad e olieina r ducida or v. r ae o1yticus ;So ieti tae ndicionea, es to 1- ae D o s u- ucen sta e betmicia, ei i n 1- ri_r_ cen qor ~ . · r poroidn; or terior 7 or l cho e e et' l cio- eda n l o e gre pleado, centracidn e aCl, l 7 nte e no i nibl.e, prueba· a:dn o ed'9 nsiderar • o n ice nf'iable e t enicida4 ,57, 4,193). A.3 Hemoliain1111 detectadae en Vibrio parahaemolyticua Bl 1Dter4a suscitado por la supuesta re1acidn entre el 1'en6meno ICaDaBawa y la patogenicidad de v. parahaemol;rticua para •1 hu- mano, motivd cpe michos invectigadorea ••prendieran 1a tarea de aia1ar a1 factor o factoree reeponaab1ea de dicha reacción. Aaf, en el afio de 1966, ICato purificd parcial.mente una heao1i- sina con car4cter termoeetabl.e que aosvaba 1•ta1idad parara- tone•; af.e tarde, en 1968, Yanas-• reportd que la bemolialAa principal. del microorganismo era una 1ecitinaea deaignada como foafolipaea A; wa do deepu6e, PV.;jino IJUllO de mani:tiea1;o una hemo1iaina que, a diferencia de la ena'lizll4a por J:ato, reeu1ta- ba termol6bi1. Debido a la di veraidad de 1oa bal1a&goe pu.blicadoe, otro a inves 't~ado~a decidieron continuar el •1.-o traba~o y, de eee aodo, Obara en 1971 aie16 una hemo1iaina tenaoeatabl• a partir de fi,! 'tradoa de culti-.oa de cepaa U+ 'T eugirid que esta eubetancia podr:!a ser la responsab1e de1 f'endmeno J:mas-• (172); ••• mi.- mo efto, Zen-Yo;ji comprob6 eu exi.stenc:1a aial6ndo1a a part:1r del filtrado d• un cultivo l.!quido de una cepa inductora del fen6m~ no JC!nas-• (203). ai 19731 Sakurai obaerv6 que 1a acti.vi.da4 bemo1:!ti.ca de 1a h•lll.2 lielAa termoestable producida por cepas KP+ ~ era ao1'i.Yada por 1a adicidn de lec:1tina y propuso denominar1a "bemo1iaina termoe.1. tab1e directa"; cabe señalar que a diferencia de 1aa hemoliainaa direotae, las indirectaa requieren 1a e4ici6n de :toa:tol!pi.doa tales como la 1ecitina, para originar zonae de hem61i.eia m4.a grandes y mejor definidas (156). Dentro de este dltimo grupo se c1asif'ioa a l.a f'osf'o1ipasa A reportada por Yana.gasa (203). 60 . - - - - pre cipitación de los filtrados con ácido acéticos uno de ellos rrovenía de una cepa KP+ y el otro de una KP-, posteriormente comparó algunas de sus características, y encontré lo siguiente: - Que el suero dirigido contra la hemolisina directa termesta- ble inhbibía la actividad hemolítica del primero y no del se- gundo (en medios. que no contenían alta concentración de Nac1). - Que mientras el producto que procedía de la cepa KP+ origina- ba henólisis en el agar de Wagatsuma, el proveniente de la KP- no lo hacía. - Que mientras el primero conservaba su actividad hemolítica después de ser sometido a 1000 durante 10 minutos, el segun- do la perdía desde su exposición a los 60%C, - Que el suero antihemolisina directa termoestable, evitaba la aparición de hemólisis beta en el agar de Vagatsuma. Con todo ello, Sakurai demostróá que la hemolisina directa termoes table es la responsable del fenómeno Kanagawa, que sólo la produ- cen las cepas KP» y que antigénicamente es distinta de la hemoli- sina termol16bil detectada tanto en cepas KP- como en algunas KP+. En base a sus resultados, 3akurai sugiere la posibilidad de efec tuar la identificación de cepas KP» de Y. parahaemolyticus, uti- lizando un suero contra la hemolisina directa termoestable pu- Frificada (157). En 1978, alentados por los hallazgos obtenidos por otros investi gadores en microorganismos tales como Escherichia coli y -- Penicillium notatum, Xisaki y Matsumoto decidieron investigar la presencia de otro factor hemolíÍtico (una lisofosfolipasa) 61 AJ. milo sieuiente, 1974, Sakul'ai obtu'VO dos produc'toa de 1a pr~ i it idn e 1 a f'~ltradoa n 6 1do lti oa o e ll • en!a e na pa P+ 7 l tro e na U-, st ri ente pard l nae e s o racterfeticaa, 7 contrd l e1 u1en'tes ue l ero i i o ntra 1a ol1s1na ir cta l'90eeta- le . i fa ti i ad olftica el ri .. ro 7 o el ••- ndo n e4ioe. ue o nten!an lta centracidn e .C1). l¡e lli "t;raa l r ducto ue r cedfa e pa U ri ina- a b mdli•i• n l ar 4• aga'8uaa, l r :i "t;e 4• P- o aofa. ll• i•n•raa •l r ero servaba llU eo"t;ivide4 b olftica epule e eer etido lOOºC "t;e 0 inu'toe, l ••s n- o er4fa sde 1111 poaicidn a º0• ue l ero "t;ibemolieina ire "t;a t l'llOestable, i't;aba ilricidn e dlisie eta n l ar e Waga"t;euma. on 't do llo, akurai os"t;rd ue .. lieina ir cta o•• 't;abl• a on-ble el 1' c5meno lln g-a, ue ac51o r du- n a pae JlPt. 7 ue t • ente •• a"t;in'ta e -011- •i o1Abi2. t ctada to n pae u- o n w a• JCP+. Jrn ase a e lt dos, Sakurai giere e1b1lide4 e •1'•.!!. 'tu.r ti 'i aoidn e epu P+ e V. b o1;rticws, "t;i- 2.izando n ero ntra 1a aoliaina 4i e "t;a oeatable u- r11'1oa4a 57). n 78, .ente .oe or • ll go• tenido• or tro• eet!, i rea n i.croorgania oa le• o scberichia !!!!.!! enic1 li t t , Ki aki ateumoto cidieron estigar i.a r sencia e tro tor bemolftico na lisof' ef'ol1pasa) L »wahasnolyticus; la búsqueda resultó exitosa y, una vez purificada, encontraron que esta enzima hidrolizaba substra tos tales como la 1-acil-glicerofosforilcolina, la l-acil y la 2-ecil-glicerofosforiletanolemina y la lisocardiolipina; sin embargo, no actuaba sobre el monoacilglicerol1, el triacilglice rol ni la fosfatidilcolina; además comprobaron que su actividad no requería la presencia de cationes divalentes (119). En conclusión, a la fecha se han descrito por lo menos cuatro constituyentes hemolÍíticos producidos por V. parshaemo icus: _1a fosfolipasa A (203), una lisofosfolipasa (119), una hemolisi ne directa termolábil (157,120) y la hemolisina directa ternoes table (84,123,157,156,172,203). La relación de las tres primeras “ con la patogenicidad del microorganismo no se ha estudiado ex- tensamente, por tanto, su papel en la patogenia (si es que lo tienen) no ha podido aclararse. En cuanto e la termoestable, algunos autores la señalan como la responsable de los procesos lesivos, además de que origina el fenómeno Kanegewa y se manifiesta como inmunogénica en víctimas de envenenamiento alimentario; esto último ha motivado un gran número de investigaciones tendientes a dilucidar su función en la patología (123). 62 en Vibrio 2areha•~o11ticua; 1a dequeda a 1t6 it sa 7, na ez ri 'i lllla, contraron ue ata zi a i r 1izaba e batr• e .e• o 1a l a l-glicerof' ef r11colina• 11 7 a 1 cerof' af'ori1et no1 .. i a 1 e ar4io1ipina1 ain barao, o t aba e bre 1 onoacilg11cerol, l triacilglic~ l i 'oaf'atidilcolinas 8deaú probaron ue . ti i ad o ueria r sencia e ti nes i alente• 19). Bn nclusidn, ha •• an escrito or 1o enoa atro conati~ente• emolitico• r ucidos or v. para aolZ'ti ua: 1a ' af 11pasa 03), na 11aofoafol:lpa a 19), UDa a 11•:!. a ir cta o1lbil 0 120) 7 -o11aina ir cta 1iermo•.9 le , , 57,156.172,203). a 1aci6n e a a riaer .. n t enici llll e1 icr r mú.a o o • a et iedo z- uente, or to, pe1 n 1a t genia •i •• ue 1o en) o a dido 1ararae. :In anto a 1a oeetab1e, .gunoe mator•• a fla1an o ao 1a nsable e a r ceeoa 1 .'VO•• emú e ue ri ina l d eno ICanag-a 7 •• anifieata o ao a unos•ntoa n idcti•- e enenamiento 1i en1iario; a1io d1ti o a oti'Yado n ran d ero e et .cionee iente• 4i1ucidar ' ncidn n t 1ogia 23). estable Directa A.4.1. Purificación de la Hemolisina Termoesstable Directa De las substancias hemolíticas producidas por V, parahaemolyti- c£us, la hemolisina directa termoestable (TDH) ha sido la más es tudiada; y tento su aislamiento como su purificación se han efectuado a partir de sobrenadantes de cultivos líquidos de mi- croorgenismos que previamente han manifestado reacciones KP+ (84,156,123,120,203,204). Uno de los métodos más efectivos para la purificación de la TDH, es el desarrollado por Honda (84)s una cepa KP+ se inocula en un medio que contiene NaCl, peptona, fosfato dibásico de sodio y glucosa con un pH final de 7.6 a 7.8. Después de incubar en agitación durante 15 horas a 379C, se recoge .el sobrenadante previa centrifugación y, de éste, se obtiene un precipitado al adicionársele eulfato de amonio al 35.1% que se disuelve en amortiguador de fosfatos y se dializa toda la noche contra el mismo». El producto obtenido en este paso se denomina "hemolisi na cruda” y se aplica a una columna de intercambio iónico, DBAE-celulosa, que contiene grupos cargados positivamente a pH de 7.0 (112). En seguida, las fracciones obtenidas que poseen actividad hemo- lítica se aplican a una columna de hidroxiapatita (una forma de fosfato de calcio cristalino), a la cual se le considera como el adsorbente más efectivo en purificación de proteínas; los grupos cargados negativamente se unen a los iones Ca?*? presen- tes (112). 63 A.4 La Hemo1isina ~el'lllOeetable irecta .4.1. urifi acidn e emolisina er oestab1e irecta e 1ae stanciae ol1ticaa r ucidae or v. r ae olYti- .2!!!!• olisina ir cta oeetable (~DH) a ei o 1a •'• .1 iada; a to e iento o e ri:t'icacidn •• an t .So artir e e ren8dantes e 1ti'90s f i oe e •i- o rgan.:i.smo• e revi• nte an anifestado ci nes D , , 23,120,203,204). no e .oa lt dos •'- :r i"WO• ara .a p¡rif'icaoi~n e '1'DH, a l. .l.edo JIOr onda ) 1 na pa U ae u1a n n edio e ~ontieae ,lfaDl, ptona, :ros:t'ato i bioo e a dio l co a n un ll al e .6 .8. eepala e bar n it cidn rante 5 or- oc, cop , l a renadante r i.a t ' gacidn , e late, •• ti ne n r cipit do l i i a6rsele 1f'ato e omo l .1" ue ae ie •1ve .a ador e :t'os:t'atoa 7 i liza a che ntra l ismo. B1 r ducto t nido ste BllO ae ina o1is1 a wla" 7 lica a l ana e bio d ico, llAB-ce1u1oea, e ntiene r po• o r a4o• a ti•11111ente e .0 ll ). Bn a uicla, 1ae i nes tenidas e seen iv.l.dall o- f a a• l .can na 1 na e i r xiapatita a ' r a e :t'oa:t'ato e 1cio ri t li o), 1a al nsidera o •1 -4 rbente '8 cti o ri:t'icacidn e r te!naa; a r pos r ados ati ente ae en 1 a ea c ++ r aen- a 2). De aquf. laa fracciones reeult1mtes que auestr•n actividlld hemolftica ee aplican a una col.wana de Sephade.x 0-200. donde •• lleva a cabo una cromatograf'!a d.e excluaicSn mol.ecul.ar (tamb14n conocida como :f'il.traoicSo en gel). a partir de la cual.. la eeparaci&n de protefnas •• logra en bue al. t-aiio de 1- - mi-- (l.l.2). Real.i&ado lo anterior. las fraccionea hemo1ft1cae •• coacentr-.n 7 col.ectan. ex-1n"1do•• au homogene:14a4 por electro:f'oreeia diec. tanto ea gel. de J>ol.iacrilamida co•o en «•1 de pol.iacnlami.da-8Dll .. ! como por ultracentrifu&ac:idll anal.!ti.ca. Cuando en ~boa tt.- poe de electro:f'oreeie diac l~ preparaci&n Jll"•••nta una dn:ioa 'baada que paede eer teflt.da con uul. ele Oooa-ie 7 en la u1tr.,_ oentritugacicSn .nal.!tica eediaenta ooao Ull pico eiaple 7 e:ia6- trioo. queda demoat:re4• 1a al.ta paresa del producto. ••diente la apl.icacicSn d.e eeta aetodo1oda. Hollda obtu"WO T.4 -.r 4e 1'JJll a partir de 415 11tro• 4• aobrene411nte de oulti-..,e lfquj.- doe; ••to eigni:f':ica que eu rendimiento •• del 15.5~ 7 ae oal.cu- 1.a que l.a t•cnica logra puri:f'icar esta subatmac:ia 540 vece• partiendo del aobrenedante. Otroa inveatig.torea han extrafdo TDH por dinraoe mftodo•• ob- teniendo reaultedoa 41:f'erentea. Por ejemplo Zen-Yo~i .. plecS do• proce41mientoes en uno de ello• (204) obtuvo do• tipo• de ~ que di:f'erf en en cuento a aovilid..S el.eotro:f'orltioa en gel de pol.iacril.am:lda; eeto no l.o ha reportado niaadn otro anal.iata. Bi1 el. otro. l.osrcS una al.ta depuracicSn 7 ain embargo. el produc- to :final ao reeultcS paro. Sakurai (1.56), -p1ean4o otra t6cni.ca, obwvo rea4imi•ntoe •4• bajo•; el.producto obtenido por Miwatlllli (1.20) preeentd dife- rencias importante• comparedo con e1 de Hoa4a y el. de •17emoto (i23) manifeetd una def'iciente purif'icacidn. A.4.2 Propiedad.e• Pieicoqu!mic .. La TDH purificada no presenta carbohidratoe, 1.!pidoe ni co•Plle.!! toe 1'oet'ori1edoe (84,1.56,1.72,1.74,203); eu espectro de abeorcidD en e1 u1travi.o1eta correeponde a1 de una prote:lna tfpica, con un akimo a 277 na 7 un m:lnimo a 250 na (172), 1o cua1 ee conf'iJ: ma por el. hecho de que BU activided heao1ftica desaparece a1 ser expuesta a 1a accidn hidrol.!tica de 1a pepsina y 1.a a11'a-qu! aotripeina, aunque no por 1a tripsina (172). :ID cuanto a BU IN!l _, to ieoel.•otrioo, ee 11.an pabl.ioa4o Tario• 4atoes Sllkurü. (156) 7 Mi7emoto (123) mencionan va1oree de 4.93, Zen-Toji (204) 4e 5.02 7 Honda (84), uti1izando e1 siet-a de e1ectroenfoque con un grediente de pH de 3 a 5, estab1eoe val.oree de 4.2. Acerca de BU peeo mol.ecu1ar, ee han report;a4o diferente• val.oree, depencUen4o de1 eiet .. a o mftodo empl.ea4oe1 Ronda (84) 7 •i;,"amoto (123) 1o ca1cu1aron en 42 0 000 da1tone aediante el. m6todo de f'i1- _tracidn en ge1 (84, 123) 7 Talceda (174) examind eu estructura ao- 1eou1ar por e1ectrof'oreeie diec en ge1 de po1iacr11-1da.-SDS 7 en !!riton X-100, obteniendo reeul.tadoe dif'erentee en cada una de 1 .. tfcnicaa1 mediante 1a primera, determinó que BU peeo era de 21.,000 dal.tone 7 con 1a segunda, en 1.a cua1 interviene el. Triton lt-1.00 que ea un detergente no idnico l" por e1lo no diso- cia 1ae prote!nae, el re11ul.tado obtenido t'ue de 42,000. 65 Para comp1ementar e1 estudio, trat6 1a hemo1isina con g1utara1- deh:!do para que 11e f'ormara un en1ace cruzado en su• unidades (en e1 c-o de que eetuviera conetitu!da por mú de una) 7 po- teriormente 1a eoaeti6 a e1ectroforesi• diec en ge1 de po1iacri,! -id~SDS¡ -:r, obtuvo bancl- con pesos mo1ecu1aree d:lf'erentees 21,000, 41,000, 63,000, 87,000, 108,000 7 130,000; eeto11 datos permitieron conc1u:lr que 1a BB eetA compuesta por doa 11Ubun:ld5 dea 4• aproximad-ente 21,000 dal.tona cada una. Zen-Yo ji (203), Honda (84) 7 11i7UM>to (123) describieron llU coapoeic:lcSn de -1noAcidoa (coneul.ter tab1a). A pr:lncip:loe de 11is1o se obaervd que 1a hemo1ia1na al.f'a de1 eat5 f'i1ococo se comportaba de una manera ~ peculiars al. cal.entaree a 70°0 perd:!a BU act1vi4a4, pero cu11nc!o posteriormente 11• 1e so- metía a un ca1ent-1ento de 100°0, 1a recobraba. A ••te compor- t-1.ento •• 1e denomincS •uecto Arrhen:lua•, debido a que e11te :ln-..etiglldor 1Ue e1 primero en 4escr:lb1r1o en e1 ano 4e 1907 (121,112,173). Para e:xp11car 1a ca•• de1 Bf'ecto .Arrhen:lu. en 1a hemolieina al.f'a de1 ••taf':l.1ococo, :r.ndateiner, Von Rachenb1oh1er, 'rac•r 7 •mhonar propu11ieroa. 1a ex:lstencia 4• al.guna .ubetancia que interutuaba con e11a a 6000. Por eu parte, Cooper 7 Arbuthnott obe•Z"Yeron que 1a al.f'a hemo1ieia.a formaba un agregado :l.neo1ub1e no td:xico cuando •e al.canzaban 1oe 60°c, pero a temperatur- mú al.t- ee red1eo1v:!a, recuperando BUB propiedad•• tdxic- (173). 66 b TERMOESTABIE DIRECTA Aminoácido Residuos de Aminoácidos (X) Lys 6,1% 5.7% 6.1* His 2.2 2.6 2.5 AE 1,9 2.0 1.5 Asp 12.1 12,5 12.2 Thr 6.2 6.3 6.6 Ser 8.9 10.8 10.7 Glu 9.4 10.2 10.2 Pro 4.6 5.1 5.1 Gly 5.5 6.3 5.1 ála 4.7 5.1 4.6 Cys | 3.1 0.9 2.0 Val 12.0 10.8 11.7 Met 1,9 2.0 2.0 Ile . 3.1 3.1 3.0 Lou , : 3.9 3.7 3.6 Tyr 6.2 5.i 5.6 Phe 6.6 6.3 T.1 Trp 1.6 1,4 0.5 + El total de residuos de aminoácidos individua- les, se toma como 100%, a Datos de Honda, 1976 (84). b Datos de Zen-Yojid, 1975 (172). c Datos de Miysmoto, 1980 (123). NHE2-Phe-0lu-Leu-Pro-Ser-Val-Pro-Phe-Pro-4la-Pro-Gly-([ )- -Asp-Glu-Ile-leu-Phe-Val-Val=( )-Gly-Pro-Val-Phe-( )-Pro- -( )-Ala-Pro-Val-( )-Val-( )-Val-( )-Val-( )-Glu-Phe- + Secuencia de aminoácidos N-terminal de la TDH. + Datos de Zen-Yoji, 1975 (172). co•POSIC.101' DB AllINOAC.IDOS DB u Hae>LXSINA ~BRllOBS!'A.Bl& IBBO!l'A Ami.no6cido eeiduoa e llino6c1doa ") lo'• .1ª . b . º ie .2 .6 .5 Z'g .9 .0 .5 Aap 12.1 .5 .2 t'br .2 .3 .6 er .9 .8 .7 CJlu 9.4 .2 .2 Pro .6 .1 .1 J.7 .5 .3 .1 Ala .7 .1 .6 07• .3.1 .9 .0 al .0 .8 .7 ••t .9 .0 .0 J:le .1 .1 .0 eu .9 .7 .6 ~ .2 .4 .6 n .6 .3 7.1 t'rp .6 .4 .5 Bl tal e ei oa e ino.,idoa i ñ .- a, •• a o 0-. a ato• e onda, 76 4). ato• e en-Yoji, 75 2). e ato• e :L7-.oto, 80 23). IOl2-Ph-Glu-Le\l-Pro-Ser-V'a1-Pro-Ph-Pro-ila.-Pro-G~-( - 8P-Glu-I1-L u-l'h 'al-V'al-( )-G~-Pro-V'al-Ph-( ro- ( l .-Pro-Ya1-( 'al-( al-( al-( 1u-Ph- ecuencia 4• ino6cidoa -t r ina1 e ~B. D to• e en-Yoji, 75 ). 67 Bn 1969, M1watan1 (121) 4etectcS que 1a !'1>11 mostraba •1 B:tecto Arrberú.ua y junto con !l'ake4a (173), en 1975, 4ec:l.4:1.cS :ln"ftatl- gar el mecan:La.o 4•1 :ten6meno en la hemol:le:l.na cruda 4e Y:lbrlo parehaemol.Yticua¡ para el1o,_ anali•aroa la :ln:tluenc:l.a 4•1 calor aobre la acti"l'i.dlld hemolft:Lca de preparacionea con di:terente grado de pure&a y encontraron que el grado 4• iaact:I. YaeicSn •• 1a hemolie:l.na (al calentarla entre 60 y 700C), d:l.-:1.mda oon:torae awaentaba eu pureza. IASgic .. ente, ••toa reaultado• 1•• aug:l.rie- ron que 1- preparacionee de h-ol:l.a:l.aa cruda contenian algda :t11etor que :Lnactivaba au e:teoto hemolft:l.oo. Jloeterlor111ente, apl.:lcando el. aobrene4ante del. cult:l.'90 de Yibr:l.o parehaemol.Yticua a una croaatogra:tfa en colwima de DU.-oelulo-, ~ü:eda (173) logrd alelar un :taotor que :lnact:l.-..ba la 11eo:LcSn he- aolft:loa 4• la Z>B, pero ecSlo bajo ciert; .. oondio:l.on•• ezperiaea tal••• el :tactor ee •••clcS con BB pur:l.:tioada y la coabinac:lcSn · '••· ·eoa•ticS a calentamiento a var:1.- temperatur-. Lo• reeultado• f'lleron lo• eigu:lent••• mientraa que a 50-6000 4uran'te 10 ainuto• •• provocaba una p'rdida eign:L:ticat:l.va 4e la capac:l.dad heao1ft:l- oa, a 80-9000 durante e1 a:l..-o tl .. po, la acti"l'i.dad era 6ptiaa. lo anterior demoetrd que e1 :tactor re•ponaable 4e1 S:tecto .&rrh- lliua era termo16bi1 ~. en e•• mi-o traba~o, •e enableo:l.cS que era 4e natural••• proteica. Cabe aefla111r que t-bim •e ha r•JIO!: 't..to el ai•land.ento 4e un :taotor inaot:lvuate para 1a ezotozina A ele 1'aew!omo0 e• aerugtnoea, la cual a au n•, presenta el B:teoto Arrheniua (172). 68 La hemol.ieiaa termoeetabl.e directa purificada poeee variae acti- Yicla4•• b:lo1dgi.c .. s ee hemolítica y citotdx:Lca 7• para ratone• 7 rat-. reeul.ta 1eta1. a. ActiVida4 Hemol.itica Bn cuanto a IN actinclad hemo1itica. · Zen-Yo3:l (203) eatw!icS •1 efecto qu.e producfa sobre 1o• g1dlna1oe ro3oe de -.rariaa eepeci•• 11Diaa1••• encontranclo que/aqu61l.a decrece en el. ei- guient• ordena rata. perro. ratcSa.. mono. hoabr•• cone30 7 cobqo¡ -iaillllO obeervd_ que la eubetencia in'99etica4• DO ezbitda acti.Yi.4114 a2cua.a. ubre l.oe eritrocito• 4• oaba11o. Por eu pert•• SekUrai. (172) ~a1i.z6 eu mecaniBlllO 4• acc:ldn con poco fx:ltof ec51o encontrd que 1a activ:lcla4 en cueet:ldn "l'U'f& en f'unc:lcSn de 1a temperatura• cuando ••ta •• ba3• (O a 4ºC) • 1a h-61:1.•:l• correepond:lente no •• pro~ce. llUllClU• ocurre 1a unidn ele la DH a 1oe er:ltrocitoe hwnano•i di.cho enlace antecede a l.a 1:1.eie cel.ul.ar 7 eetl. mediado por cati.o- n•• cli.valent•• ta1•• como ca++, 11n++ ., .. ++. lloti.Tado por el. hallazgo anterior, S&Jturai. inveeti.gd poete- ri.ormente l.& cin6ti.oa que mostraba la i.ahi.bicicSn ele 1• hemd- 11.eie con 1111 euero ant:leepec:le boadl.ogo y ed1o pudo cono1ui.r que el. efecto hemol.ft:lco •• l.leYa a cabo en do• p-0•1· en el. primero •• e1'ectda l.& uni.cSD ele l.a ne a l.o• h-atfee • pero el. eegl.Ulllo e• toclavfa incierto; adn •• 4eeconoce ei. el. papel. l.ft:lco ee consecuencia de a1guna acc:ldn enzim&t:Lca ubre 1- membranas ci. top1'8mi.c.. ele 1 .. c•1u1- •bJ.anco•. 69 .Acii:l 9i.4ae• Hemol.fii:lc- 4e l.a 'IJ>H ., .. Britroc:lto• 4• v~- Bapeci•• Pl¡ezaiie 4• llr:ltrociiio• ªª"ª Perro Ratda •oao Ro abre Cone;lo Cobqo Pol.l.o Ove;la Cabal.l.o aecfproco del. ~ftuJ.o 4• Doe:l• Bemol.11i:lca Mfn:laa l.0,240 5,l.20 2,560 2,560 l.,280 640 640 l.60 30 o + Do•:l• Bemol.11iica •:!n:laa1 4:1.luc:ldn al.e al.1ia que da una helldl.ie:le compl.eiia. + Dato• 4• Zen-Yo;li, l.971 (203). 70 b. Citotox1cidll4 Referente a l.a c1totox1c1da4 de la ~. •e ha demoetra4o que •ata manifteeta dicha acti vj.da4 en 911Z'io• t1Po• de c•1ui .. oUlti'ftld-. tal•• COllO laa H•IA (154). 1- r. (154), 1 .. PL (155), i- de neurobl-toaa (172), 1- de •iocU'd:lo 7 meluo .. de ratdn (76) 7 1- COL-6 der1Ya4- del 1Dt••t1- DO h--.0 (172). ~ 1976, Sllkur.U. (155) eatu41d con detalle el erecto de e•t• h4lll011•1Da aobre c•1ulaa •z. d•r:l~aa de •••brana 8ml:ldt1ca humaaa 7 obaeJ"fd que, owmao •• iacubllb- 6.6 z 105 c•1uiu por .mililitro con ena INb•tanc:La ua concentracio••• de 5 ,.u&/ml a 'temperatur- de 37°C, 1& muerte de 1- c•1ui .. ocurña ua 20 m:l.nuto•r la .uperv.l.Yencia de latae •• 1111aliz5 ba por ae41o de tincione• Vital•• con asul. de tripano o de- tectando 1• liberacicSn de ro•rat .. a alcalina, J"ª que ••t• enato •• ~elo a la muerte celulmr. A81m1emo. encoatrd que 1 .. m1cro-1lo•ida4ea de i.. of1ui .. eut'r1ma c-bio• morroldgico• ent•• de que ocurriese la 1111ert•r aplicanclo la microecop!a electrdnioa 4• barrido 4eao•trd que, de•pu•• de 5 minu'to• de iDCubeoicSn, •l ndaero de 81cro,,..11o•1d84e• de l.a auperf'ici• celular d18minlqe J" la morrolosfa de l.. que m5n peraietea, var!a ooneiderablemente; en 10 a:lllllto•• al- sun- cflul .. mueren, pero caai tod .. 1 .. a1orovelloe1d84•• de•apareoea 7, por 41.t:iao, transcurrido• 60 .uauto• de ia- cubaoidn, ... 4e1 95" de l .. cflulaa mueren, a&llireatando una marcada deseneracidn de la auperftcie celular. 71 Por 1o que se refiere a 1a morfol.ogfa intracelular. detec- td que a loe 5 minuto• no •• observan grandes c-bioe en e1 citopl--. de l.a c'lu1a; ein embargo. en 30 millutoe l.- microvel.loaidad.ee desaparecen. el. citopl.aema aueetra cam- bios 7 el mlcleo eet'- deaintegrad.o 7• p-ad.o• 60 minutos. ae manitieata una degeneracidn completa del citoplaama 7 Diasdn ndcl.eo aobrevive. B8 importente aubrqar que •• ob- servan tambiln trastorno• mortoldgicoa en laa microvello•! dad.•• culllldo 1- cllu1- correapondi-te• •• trai¡an con cantidad•• eubl.etalea de hemoliaina. c. Bnterotoxicidlld. ~ambi•n exiaten reportea intereaant•• aobre la enterotoxici- da4 de l.a ft>Hs Zen-Yoji (204) inTestigd a la DH eometi•D4o- 1a a la prueba del. asa inteat:inal. l.iga4a de conejo 7 obtuft 1011 siguientes resultad.o•• la i127eccidn de 100 pg de 1a h•Jll2 l.iaina no caued acumulacicSn de fl.u1do• • ain embargo al apli- car•• 500 pg, •• provocd la acumulacicSn de un f'l.u!do turbio 7 sanguinolento 7 el examen h:istopatolcSgico mostr6 leaion•• eros:iv- ., deacemacicSn necrdtica de la mucoaa, acompmflad.a por una marcad.a intiltracidn de neutrdfiloa en 1a pared int••ti- nal.. Comparada con •1 co1er6geno (J>B50 • 2 pg) • 1a cantidad. de ft>H requerida para dar una reaccidn positiva en esta prue- ba ea demasiado alta (84); por tanto, •• PQede inferir que loa cambio• observado• en 1011 tejidos "blanco• •• deben a loe ya mencionado• ef'ectoa citotdxicoa de la TI>H• m'• que a au capacidad enterotdxica. 72 Por su parte, Obara (134) y Miyamoto (123) analizaron lo• CBl!lbios histopatol6gicos ocurridos en el intestino delgado de ratones lactantes de 5 a 6 dfa• de nac:ldoa culllldo lato• ae inoculaban por via ora1 con 'J!DH (mediante la uti 1.izacida de un tubo e11tomaca1) 'JI observaron que la adminiatracidn de 50 pe provocaba diarrea, preV:la a la muerte de la tota1:ldll4 de 1.011 anilllalea _util:lzadoa; en cmnbio, con doais de 2.0 a 12.5 pg, 11610 algunos de el.loe muri•ron 7, 1011 11obrevivien- te11, aunque aufrieron transitoriamente de di.arrea, 11• recu- peraron pos"ter:lormente. Mientr- l.a mucosa intestinal. de lo• llDimales con diarrea pro'VOcada con do•i• rela"ti van1-te pequ.! ft- no deno"td cambios deetruc"tivos, el ex-en al. microacopio de lu• moa'trd que la 14mina propia se "tornaba edeaa"toea. Bn disecciones ultradelgad- se observd que las unionea intercelulares en laa interdigitaciones se habf .. perdido 7 '1011 espacios resultan~ea entre laa cllulaa se encontrabmi enonaemente elongadoe; esto sugería una 11CW11Ul.acidn de fluf- doe. Al apl.icarse grande• doaie, se apreciaron camb:l.011 deatructi- voe en d:lferentee par"tee de la mucoaa in"teetinal, justo antes de la muerte de loe animales. Secciones ul"trafinaa de laa V11- llo11idadea del intestino delgado de un animal al que admin:l•- 'traron 25 pg de la 'l!DH, manifestaron disturbio• es"tructurale• en el re"tfcul.o endopl6.amico 7 mitocondriaa hinchadaa con crestas indis"tineuiblea; en •l citoplasma •e detectaron num_t roeaa vacuol.as de va.rioa t-ai'los 'Jf 1011 microvelloa se encon- traron desordenados o degenerados; en algunaa c6lul. .. epi'te- liales el m1cleo había llegado a ser menos denso a loe el.ec- trones, mostrando ademAs c-bios degenerativos. 73 d. A A O o ao —- cada, puede ser un factor importante en las gastroenteritis humanas debidas a Vibrio paruhaemolyticus. Toxicidad Letal Desde su aislamiento, se reportaron aspectos acerca de la toxicidad letal de V. parabaemolyticus para ratones y cuyos; por ello, son varios los investigadores que han intentado aislar una toxina letal. Kuriyama, Akehashi y Yoneda reportaron la existencia de una substancia tóxica en las células de este microorganismo; pos teriormente, Ueyama publicó el aislamiento de una toxina le- tal para ratones, a partir de filtrados de cultivos del mi- croorganismo y reportó que aquélla estaba libre de azúcares y ácidos nucleicos y que presentaba propiedades de proteína (84,172). Por su parte, Zen-Yoji (204) y Obara (134) demostraron que la hemolisinma directa termoestable purificada tenía toxici- dad letal para animales pequeños de experimentación; Honda (84) purificó cuidadosamente la toxina letal a purtir de filtrados de cultivos líquidos de Y. parahuemolyticus y encontró que era idéntica a la TDH en cuanto a sus propieda- des fisicoquímicas y biológicas; empleando sulfato de amonio, obtuvo varios precipitados a partir de los sobrenaedentes de los cultivos de una cepa KP+, los cuales purificó posterior- mente mediánte cromatografías sucesivas en columa de DEAB-celulosa, hidroxiapatita y Sephadex G-200. 74 De eetoe reau1tado•• tanto Obara (134) como Miyeaoto (123) conc1uyer n que 1a hemo1ieina directa termoeetab1e puri~­ da, ede aer n tor portente 1- atr enterit:le anas bidae ibrio ra ae o1yticue. . !foxicidad etal. esde e e .mniento, •• rtaron ecto• erca e 1a i i ad 1 tal. e v. er ha- .;rticue era aee -, Cu:J'O•; or 11o, llOll ario• 1 e n•t1 e4ore• e aa :latentedo el.er aa 't xina 1 'tal.. Jturiy-a. kehaehi -, one4a rteron .a ie'tenc1a e a e e'tancia 6 ica a 1- •1ui- 4e ete i.croorgeni.emo; .1, "teri :r en'tee 97 na bl.ic6 •1 .sl.amieato 4• a ina 1•- l. ara t •••• ertir e :ti1tr-4o• 4• 1ti"f0• e1 •i- r anieao ., ort6 e e u,11a . a 1i re e dcere• 6cidoe c1eicos -, e r sentaba r pieded•• e r teina , 72). or e arte, 3:1. 4) 7 bera 4) ostraron e 1a .bemolie:L a ir cta oeetabl.e ri:ticada ía ici- ad 1 ta1 ara i a1e• i'loe e eri entacida; onda 4) ri:tic6 en'te 1a i. a 1 ta1 art1r e 1'11tradoe e 1ti oe .i uido• e v. a o1zticue -, on'trd e ra f 'tica 1a ~DH anto 11W1 ropied- •• e1 i icae -, 1ol.6gicaa; pl.ema4o e 11'ato e oaio, t vo erioe 't .oe artir e 1 a e brena antee e .oa 1tivo• e a pa P+, 1 e a1ee ri:ficd sterior- ente a diinte atograf'íaa cesi vae 1 na e BA.B-cel.u1osa, i r xiapatita hadex IJ-2 0. Cacta t'racc16n ee eomet16 a an6l.ie1e para inveetigar tanto llU actiñ4a4 hemol:!"tic& como eua prop1e4adee 1eta1•• en ra"to••• 1' loe re11Ulta4oe aoetraroa que ntacuna 4• _._ carac1:er:lat1cae •• per4:la durante el proceeo de parinc- c16D, lo cua1 11ipifica c¡ue 1ae 1n&pueetae 4oa eubatanci- •OD UD& a1 ... 1 4ea4e que la preparac16a f'inal. aparecid ho119. gáea tanto en electrof'oreei• diao practicada en gel de poliacr11ami4a coao la e:rectua4a en •el 4• poliacrilamida- -SDB. •• coaprobcS que la hemol.ie:ina directa termoeatable era, en e:l mi ... , la toxina 1eta1 producida - loe eobraDe.- daatea 4e loe cu.1t1-.oe de Vibrio pareh-molyticue. ~tempo deepu•e, coa el objeto 4• probar la tox1ci4a4 1eta1 4e l.a ~DH, ~o• iaveatigad.orea realizaroa eatud:ioe -. ratone as Zen-Yo ;11 4e"termi.a6 eu doeie a!a:iaa letal. ~•c"6a- 4o1a por vfa in1iraper1tonea1 1' ob'tu~ un va1or 111• o.62 .p.g de Ditrdceno por ratda (203). Ho114a eetablacicS que la i~•o­ cidn iatravenoea de 1a toxi.na mataba a loa ratonae mq r•p1- damente, paea 5 .)Jg de la !rl>H mataban a1 enima1 (de eeia ••- manu 4e edllll) en un minu'to, • 1nclua1Te que UAa 4oe1• 4• 1 )IS lo hac:la, aunque - 20 iünuto•. Rincdn ratdn auri.6 durante loa tree d:!ae aiguientae a l.a ~ecc16a 4• o. 5 JlC 4a toxi.na. Aeilli.emo • obaez-W que loe an1ma1ea inJ'ecta4oe coa l.a toxina llegaban a quedar 1111116v11ee, moetrando en oeae:io- aee ca1ambre• (84). :8D 1980, 11i7amoto ca1eu1d el. valor 4e 1a l>L5o para animal.ea 4eaaf'iadoa tmi'to por v:!a intravenoea como por vfa oral. 7 encontr6 que el vlll.or correspondiente para la primera era 4• 1.4 )&g, mientr- que la segunda reault6 de 30 .USI por otro l.1140, deacubr16 que la a4min1atrac16n ora1 4e 6 p.g produci:a 75 _ SOX de ratones lactantes (123). Aparte, Zen-Yoji investigó también la toxicidad letal de la YTDH en monos observando que los que se inyectaban directa- mente en el duodeno con 5 y 10 mg de la toxina, desarrolla- ban diarrea acuosa y lesión catarral acompañádas por la acu mulación de un exudado mucoide en el yeyuno; mientras tanto, cuendo se aplicaban 25 mg, los monos moríam 5 a 10 horas después de la inyección. Asimismo, observó que en el huma- no se manifiesta un notable adelgazamiento así como una marcada disminución en el tono de la pared del intestino delgado con gran abundancia de exudado mucoide sanguinolen- to. Tales efectos pudieron detectarse al practicar autopsias a individuos que habían fallecido a causa de la infección por Vibrio parahssmolyticus (204). Respuestas en Piel de Animales La aplicación intradérmica de la TDH en animales, desarrolla una respuesta característica que presenta una cinética dife- rente a la del colerégeno. Histopatológicamente, existen edema, eritema e induración, alcanzándose el máximo 8 horas después de la inoculación. La dosis mínima que provoca respuesta cutánea en los cobayos es de 2.5 mg (204), mientras que el colerágeno presenta su punto máximo hasta las 24 horas y, en ocasiones después, pero con tan sólo 10 ng (123). Miyamoto, Ohashi y Shimada, empleando conejos, analizaron la actividad de la TDH sobre la permeabilidad carilar. Dicha característica se investigó tifriendo lesiones originadas por 76 diarrea a1 50~ e es lac~antea 23). parte, en-Yoji i estigd -b l t i i ad l t l. e D ono• s rYando e 1 s e ct ban irect- en'te l deno n 7 0 q e :lna, cleaarl"011a- an i rrea osa 7 1 cSn 'tar:ra1 paíl d- or .!! ulacidn 4• n dado ucoide l 7 ;yuno; ientr- Bllto, lllldo ae 1icab- 5 g, • ono• llO:r1- 0 ora• apu4s e icSn. si ismo, eervd e l um- o anif'iea'ta n t b1e l a iento -f o na arcllda :l• inucicSa 1 o e .a r cl el 'tino l ado n &11 adanc:la e 4114o aco:lde •mip:lnolen- . ~alee 1'ec'to• dieron de~ect11ree 1 t 11r t pai .. i i.duo• e bfaa 1'a1lecido a e ll:te icSa or ibrio 11rabaemol.Tticua 04). e. espuea't.. iel e .Animal•• a .i :lcSn n' :r cHr :ioa e .a '1' H a.i al.ea, ae: ro1la a ueata r 'ter1etioa e r senta na i l'tioa :lf'e- te 4e1 l.e:r'8eno. iet 't lcSgicamente, :le'ten e a, a cluracicSn, 1canzú oae 1 ú o :rae apula e n 1 :lcSn. a eia flli a e r voca e ueata outé a 1 e bqoa a e .5 ..J1C 04), • nt:r- e 1 l :rqeno r eenta a nto á o aeta ea 4 rae 7, oaaionea apu••• ero n cSlo 0 g 23). •:l a oto, haahi 7 i ada, pleando nejoa, ali aron 'Vidad e 'f e bre r eabilidad pilar. :lcha t fe't:lca eatigd :lñe o 1 ai nea ri i adas or la aplicaci6n intrad•rmica de la toxilla 7 midiendo el di6- me'tro deearrollado por la di:f'usidn del colorant;e (Asul. Cielo Pont;amina 6B); la doeie m!niaa reeultant;e en el co- n• ,:lo :tue de o. 3 .uc 7 '•'ta provocd \U1 diúet;ro 4• 10 x 10 - a 1- 3 horaa 4• haber•• e:tec"tuado la inoculacidn. Cabe •- flalar que est;a dosle •• JOO ,,..cee aqor que la que •• requl~ re de coler6geno para ocaeionar el 111980 e:tec"to (123). :t. Car41ot;oxlci4&4 de la ~ I& heaollelna direc"ta t;ermo•e'table man:i:tiee'ta capacidad l•'tal. en aniiaal.•• de experimen't110idn 'tal•• collO ratone•, ratae 7 coba.To•, loe que mueren r6pidement• al eerlea e4ai- nietra4a ·en pequefl- dosie. aitre lae mue~ toxinas bacterianae repor"ta4- huta ahora. la estreptoli•:LDa O, la tetanoli•ina 7 la hemolleina de Li.eter:La monocTtogen•• eon lae que han caueado 1- muen•• m'8 r6pidae despule de eer aa!Jú.n:Letra4u por da intra•eno- ea. r.oe eet;ud:Loe real:Lzado• deepu•e de e:tect;ua4a eu. :L~eccidn intr~venoea en animalee 7 que :Ln'VOluormi pruebae elec'troear- d:LogrUicae 7 el an6li•:L• de eu.11 e:teoto• en oor-onee ai.•l~ do• perf'und:Ldoe, han comprobado eu cerút;er c111'41o"tdx:lco 7, al :Lgual. que ••fl- toxin .. , la hemolle:laa directa termoeet;~ bl!e ha man:L:teet;ado card:Lotoxic:ldad med:Lan.'te la• m:Leaae pna~ b- (81,172). Bond.a (8l.), ~ectd intra,,.noeamen"te una rat;a de 445 g con 15JIC del.a ~J>H, reg:Letr.ndo 11imult;'2leamen"t• el electroeoce:talograma 7 el el.ectrocU'Cl:Logreaa correepon- d:L ent ... B1 prilllero no man:L:tee"td c ... bios e:Lgni:ticat:L'VOe; e:Ln embargo, el electrocardiograma mos'trd un :Lncrementlo de YOl't,!! 7T e. ==.> =e => ---> y -1 corazón dejó latir a los 33.5 segundos. Los electrocardiogramas practicados a una rata de 448 q inyectada intravenosamente con 7.5 ug de toxina, manifesta- ron que 15 segundos después de la inyección, la onda P se hacía más ancha y más alta que la normal; ello sugería la aparición de cambios en la conducción de impulsos intra- -Aatriales. En ese nismo tiempo, el voltaje de QRS se incre- mentó y el de 57-T se alteró; de ésto se desprende que exis ten cambios en la conducción de impulaos intraventriculares de activación eléctrica. Después de 17 a 18 segundos, los intervalos PQ se hicieron más largos: de ello puede -con- cluirse la posibilidad de una inhibición de la conducción atrio-ventricular. Después de 41 segundos, los pptrones mos traroa un cambio del foco de excitación en. el ventrículo y la velocidad del corazón disminuyó debido a la reducida es- timulación del músculo cardíaco. 4 los 50 segundos se desarro 11 una palpitación ventricular acelerada, dejando de latir el corazón a los 148 segundos. De lo anterior se puede concluir que la reducción existente en le excitación intra-atrial y en la intraventricular, es el efecto més notable en el animal, dando como resultado una enorme alteración tanto en la velocidad como en el ritmo cardíacos. Luego entonces, puede establecerse que la inyec- ción intravenosa. de la TDH de V. parahasmolyticus, afecta primariamente el corazón y, como consecuencia, unos cuantos minutos después los animales mueren. 78 je a 1oa 13 segundos ~ • r z6n ej6 tir 1 a 3.5 undos. oa tr cardiogr-ae "tic..Soa na ta e 8 g e cta4a 1.ntr a en"te n . 5 ,ua e ina, ll&ni.f'e•t- n e 5 .do• apu•e e 1a ft1'• ci&n, da ee acfa ú cha 7 ú "ta e 1a r a11 llo e ger!a 1a arici6n e bios n du cidn e pulsos tra- atria1ea. 811 se miBIDO e po, l -voltaje e RS ae re- ent6 7 1 e s~-~ ae lt rd; e 6ato •• aprende ue i.! n o l:>ioa n ucc16n e 1a u1aoa rav 1:ricu1area e t cidn l ·uea •a 4• 7 8 e 8'1114oa, 1 a n1i l'Y&l.oa ae i i ron ú oas e 11o e4e-o n- 1uirae j>oaibi1i4a4 e na n 11:>ici6n e du cidn entricular. eapufa e 1 e undoa, 1 a ¡a ea llO~ 1:raron n bio el ' co e i cSn n l ntr!culo 7 l cidad el cSn l!llllinUTd bido ucida a- im l cSn el dsculo r !aco. A a 0 e ndoa ae 4••&r'l'2 6 na 1 1 t oicSn -ntrio lar o l.er&4a, jarido e tir l cSn a 8 a nlloa. e .o terior ae ede ncluir e ci&n ia 1:e n a cit o16n tr- 1 n entricu1er, a l 'eoto 4a table n 1 i a1, do ao a 1tado na r e 1t r oi6n to n l cidad o n l i1i o o rdfacoa. l go t nces, ede at lecerse ue eo- o cSn 't o a.. e mi e v. parabaem l t:Lcua, "ecta 1 a .:Lamente l. r zdn , o aecuencia, o• 1:oa 1nu.toa apula e i ales ueren. La cardiotoxicidad de la hemolisina 4irecta teraoeetable ae ha demostrado tambi'n en cultivo• de c•lulae de corazdn de ratdn (81). Si el corazdn f'etal. •• dieoc1a en na c•1u1- componente• (mediante la aplicacidn d• tri.peina) 7 ••t.. •• cultivan en el medio eaencial. alniao de Bec1e eup1eaent .. o con euero :tetal boViao al. 10"• a 36ºC• ba;lo waa atada:tera de co2 a1 5" 7 air• al 95"• laa c•lulaa en cueaUdn laten reg1.1larmente en :t'oraa espont6nea 7• al. ser •••bradaa 911 ca- ~aa Petri recubiertaa con gelatia& • 1Doubadaa durante 1 dfa a 36ºC• ae obtienen c•1uiaa de mi.ocardio aialadu 7 aepar ... du por coapleto de otru •in que iapal.ao alpao •• tranaaj,- ta entre ellaaa -1, cllda uaa la'tie iadependien'tieaente 7 a d1f'eren1i•• velocidadee, que generalmen'tie van de 10 a 260 latidos por ainu'tio (proaed1o1 '70 lati4oa/m1nu1;o). Poeter1o..,_ mente, cuan4o en dich .. ca~•• •• aieabran 1 a 1.5 a 106 c•lulae, se obtiene una acloaeracidn celular con UD diúetro de 2 a 4 -· que contiene aú de 105 c•1u1aa al t•rms.no ele un d1a de incubacidn. ~daa lae c•lulae de dicho• grupoe celular•• laten regulB1"111ente 7 en :torma eincrdnica. loe e:tectoe que la mH pur1f'1cll4a moetrd aobr.e un grupo ele eetae c•1uiae de miocardio, ae pue4en reeuair de la aiguien- te maneras la adicid~ de 0.05 pe/a1 de heaolieina al ••di.o, incrementa liger11111en1ie el latido pero fate vuelve a la no..,_ malidad en 10 minutoe. Al acregarae 0.1 pg/ml, el 1a1i1do •• eetimula r6pidamente en un principio. pero ee detiene sdbi- tamente en 1 minuto 7, 5 minutoa deepu•a, el latido •• r••- tablece a la velocidad normal. permaneciendo ein cambio. An'1.ogamente, al adicionaree o. 2 )18/al de la hemolie:lna, :lnicialmen'tie el latido ee incrementa, luego •• detiene 7, posteriormente, se restablece; sin embargo. el intervalo '79 ter a o o o g/l. Al aplicarse 1 mg/ml o més, nuevamente el latido se incrementa a1 princi pio, a continuación se detiene abruptamente pero, por Últi- m0, se desintegra rápidamente casi la totalidad de las cólu las. Sin embargo, en este último caso, extrañamente, una nueva adición de hemolisina antes de la mencionada desinte- gración, esta vez de 0.1 a 0.2 Jue/ml da como resultado que el latido se restablezca en unos cuantos minutos. Con respecto a las células aisladas de miocardio, los resul tados obtenidos son similares a los observados sobre grupos celulares y, teniendo en cuenta que las cólulas cultivadas están libres de nervios, tejido conectivo y vasos sanguíneos, puede establecerse que la TDH ejerce su acción cardiotóxica directamente sobre las cólulas del miocardio (81). : Goshima (76) estudió el mecanismo de la degeneración celular causada por la TDE y, mediante sus experimentos, encontró que la TDH provoca cambios morfológicos en las cólulas culti vedas de miocardio y de melanoma de ratón (cepa B-16C0W1), en presencia de Ca** extracelular. las características de dichas transformaciones son: - Degeneración de la forma celular (aparición de vesículas y posterior conversión en globo) en ambos tipos celulares. - Contracción total de las células miocárdicas. - Reducción o desaparición de los cables de actina y las redes de tubulina en las células de melanoma. - Condensación del nucléolo en ambos tipos celulares. 80 existente entre la detencidn y el restablecimiento es m6e largo que cuando se adicionan 0.1 ~ml. l li ar e ~g/ml. ú. a ente l t o ae enta l. ri c! io, t:Lnuacidn ee ti ne rupt- nte ero. or dlti- o, ae eintesra 6pid- nte -i t l ad e .- • :!! 1-. in bargo. ste dl o .o, trllil-•nt•• a eva icidn e olieina tea e encionada einte- s idn. aeta wz e .1 o. 2 , g/ l ela o e ltedo e l t o ae a 2.ezca os "tos :lnu"to•. on e ecto s •1ui- :laledae e iocarclio, .o• eu! e o• t nido• a n e:l i.1aree e servado• e bre r poe l lar•• 7, i do enta e 1- •1u1- 1ti•e4- •t'-1 .i rea e 'Yi.oe. j o ect 'ft> T Yaeoe emnguíneoe, ele t lecerse e H j rce 11\l cidn o cl:l.otdxlca irect- te e bre .- •1ui .. l. iocarclio 1). Goahima 6) at di6 l ecani-o ele a er cSn lular wiada or H 7 • ediante &WI eri ento e• contrd e l>H oca - l a morf'olcSgicoe 1aa •lul.- 1t! e4- e iocardio e el o a e cSn pa - l:) • a :La 4• c ++ tracelular. t.ae r cter1aticas e :lchaa rane:t r acionee a n1 J>epneracidn e .a :t r a lular :Lcidn e a1cu1- Y sterior vereidn l bo) -b • s l larea. ontr!Ccidn t l. e 1aa 61ulae iocA!-dicae. edu cidn a ari cSn e a blea ele t:lna 1- ea e lllina 1ae 6lulaa e elanoma. ondeneacidn el cléolo -b • s l 1area. eo A1gunas observaciones sugieren que la degeneracidn de la f'orma celular depende de una ingestidn excesiva de ca++ extracelular por p2rte de 1- c•1u1-• .Bn sua eatudioa, Goehima utili&d el iondf'oro A2Jl8? como modelo coaparati-wos como •• aabe, los ion61'oros son compuesto• 4• paeo molecular moderado (entre 200 y 2000 daltone) que f'oraan comp1e3o• de aolubilida4 lipídica con cationea polar••• de loe cual•• el Je+, el Na+, el ca++ 7 el llg++ ae:! como J.ae -1~ biog6nicas, son los •'• importante• desde el punto de ~eta bioldgico. Inicialmente se les considerd como metabolito• de microorCA ni.-o•, pero en la actualidad existen mucho• ion6f'oro• ein- t•tico•. Bl. i.nter•s de algunoe de eeto• coapueeto• reaide en au capacidad para transportar ion•• "clave'" a travla 4e •-- bren- bioldgic_, aumentando la permeabil.idad de ••t- ha- cia alguno de elloe; en el caeo del A2Jl8?, •• trata del idn ca•• (142,l.44). Re•ulta intereeante obeervar que la toxina de Vibrio ~­ haeniolyticus muestra la misma accidn que el 1ondf'oro A2318? en la degeneracidn de la f'orma celulars 1- cllulas trata- d.. con la hemolisina toman en exceeo el ca++ extracelular mientrae que lae cllulas de miocardio de pol.lo empleadas como control, no preeenten degeneracidn en la f'o:rma celular y t-poco manif'iestan una ingeetidn excee1Y& de ca••. Bato demueatra que la TDH incrementa la permeabilidad de lae ••!! branas celular•• hacia el idn ca++ y que cuando eete catidn extraoelular estA presente en una concentracidn euf'iciente- mente alta (igua1 o ma,yor a 10-6 •>, f'l\11'• al interior de lae cllulae de acuerdo a 11U gradiente electroquímico, 7a que la concentracidn de la f'orma libre intracelular es del orden de 10-7 11. 81 Un cambio morf'ol6gico caracter!etico en laa c61u1ae de miocardio de rat6n •• la contracci6n total de 1ae miotibri- llae • .Be bien eabido que lae miof'ibri1lae card.lac .. •• en- cuentran re1aja4ae en el citop1a-•, donde eziñ• ca•• en concentracionee menor•• a 10-7 • 7 •• contr .. D total.llente cuando •1 citop18.lllla contiene ca++ a •'- de 10-6 •· Ael, la degeneraoidn de la f'or11a ce1u1ar, tanto de c•1u1 .. aioc'-rct! e- como de 1 .. de melanoma de ratdn, inducida por 1a RH, podr!a deber•• probablemente a un exceeo de ingeeti6n de ca++ extracelu1ar. g. Receptor•• 4• Meabrana para la GR Uao 4• loe ••todo• utilisadoe para eetudiar lo• receptor•• 4e membrmna para toxiDall bacterienae, coneiete en ex .. inar 1a inhibicidn 4e lae actindades bioldgi.c .. 4e 1ae corree- pondientee tozinas por ae4io de ganglideido• (172); ••toe eon glicol!pidoe constitu!doe por UD& parte 4• ce:rami4a 7 otra de cu-bobi.drato 7 1a coapoe:icicSn 4• la porcidn oligos~ c6rida de 1a mol~cula ea la que distingue a loe principal•• tipo• 7 1a responeabl• 4• su especif'icidll4 para alguna tox! na (128). lo• receptores 4e membrmna de la toxina tetúica, 1a enterotoxina termo1'bil de B. 001:1 7 la enterotoxina co1•rica ee ben determinado por eete m6to401 a1 4eterminaree que •1 gang116sido GJ.1 inhib!a las actividad•• bioldgicae de la enterotoxina termolAbil de B. coli 7 de la enterotoxina colfrica (175), se establecid que aqufl era su receptor correspondiente. 82 Loa primero• intento• en 1oe que ae emplearon gang116aidoe para determinar loe recpetoree de m-brana para la 'fDH, fueron realiz&doe por Takeda, quien al utilizar una eezcla de.•etoe auplementada con coler'6eno, pudo deectlZ't&r al a..1 como reaponeabl• en 1a inhibicidn de lae actiYida4•• bioldgicae de eeta hemoli•ina (175). Posteriormente, mediante ••tudio• m4e ••lectivoe, Take4a obeervd que cuando la hemolieina ee incubaba con el gangli! •ido G~ 1 o •1 Gi>ia au activicled hemolitica ee per4{a, lo cua1 no ocurrfa cuando •e u1;ilizaba el Clill. o el GJi2 (176). Lo• gangli6eido• a,1 y ~l.a eon eeneiblee a la accidn de la neurem:Lnidaea 7 experillentoe compl .. en"t;ario• moetl'&l'on que, al ••r tratado• con dicha enz1-. •• euprim.ian loe efecto• inhibitorio• de aqu•11oe eobr• la actiYid..S 11 .. 01{- tica de la~. Bae4ndoee en el hecho de que la 1'DR ceuea h-611•1• de loe eritrocitos humano• pero no de loe de caballo (203), Tekecla efectu6 un estudio comparativos utilizd mezclae ele ganglid- eido• obteiU.dae de membranae de glcSbuloe rojo• humanoe 'V de caballo 7 1.. eoaetid a cromatogra1'1a en capa finas lo• re- eul "ta4oe moetraron que 1 .. membranas.de loe de origen eqUino no conten!an. lo• ganglideidoe Gt1 7 ia mueetra efecto• inhibitorio• ailllilarea, ••toa eon menoa ev1.dentee. Por o~ 1ado, 1a preincubacidn de la hemoliaina con loa gaa- glidaido• CJari y G•2 no a1'ectd 11\l acti'ñ.dad 1etal. l'or au parte, en 1978, Goahiaa (7f5) repor\cS que el gengll! eido GT1 bloquea lo• efecto• anterio:naente deecritoe de 1a hemoliaina sobre lae c•1u1 .. de aiocanlio de ratcSn. De lo• fendaenoa deacrito•, puede eetablecerae que 1o• re- ceptor•• de aeabrana para la hemo11eina directa teZ"llOe•'*a- ble de Vibrio parahaemol.yt;ioua, eon 1oe ganglidaido• •Ti 'T Gn1a• ..uaque e1 priaero ee e1 de iu;ror a1'1nida4 ., cionai,e tencia. h. , Signo• Cl!nico• T eu Relacidn con 1a 'fDH :r.a aintomatoloci:a de la infecci6n debida a Vibrio pareh._ molyticua incluye loa aigi.iientea aisno•s diarrea, dolor abdomina1, dolor de cabeza, vdmito, fiebre, laaitud general., eacalo1'rfo•, tene•mo y n"1aeae. De loe anteriorea, loe mú comWimente observado• aon la diarrea y el dolor abdominal 7, por lo general, la primera ae pre•enta con una 1'recuencia menor de 10 vecea al dfa, aunque en ocaeionea puede lleger a preaent.-.ree en m4a de 21¡ genera.1Jllente au apariencia ea acuosa, aunque eventualmente se preaentan deacargae de moco y sangre¡ ademú, •• ha observado que la duracidn de la diarrea o de heces de consiatencia blanda ea de 4 a 7 df&8 o mú. 85 Aunque no existe evidencia comprobada de que la hemolie:lna directa termoestable sea la reeponsabl• 4• la diarrea obs•J: vada en la inf'ecci6n por V. parahae110btieue, 'ftlrioa Jaal.18!! co• eugieren que ee, por lo aesioa, w. •• 1ae ~1118:1...,iee cau• .. de dicba aanif'••t-i6.. Loe e:!nto•ae cardiovucul-•• ao •• 11.- eeftal .. o con :frecuee cia como complicacidn dura11te la inf'eccidn por Vibrio para- baemol.Yticue; sin embargo, existen 'Wal':lo• repon•• que ind,&. can al.teracionee a este nivel To como •• ha 4eaoe•l'll4o ea animal••• la UH puede IUDit'•••N" actiYicled oardio•dx:lca. ~alcik-a, al adainietrar c•lul- Viv- 4• v. parabaemolJti- S!!R a un voluntario, obeez'Yd un c-bio eipif'icati vo en l.a preeidn •ancu!neaa la •ietdlica 4:1.eminuf.a 11. . ta 77 - He en el priaer 4!a de la int'ecoidn T resreeaba a 136 .. Hs 4eepu•• die 4 dfae; por mu parte, Salto obeer...S W. di-in!! cidn eigni.f'icati-.. de la preeidn aancufnea en paciente• vfctiJllae de envenenamiento al.imentario caueado por ee'te microorgani8lll0 0 durante loe dos primero• d:!ae de la enf'ermJt dad (l.72). Bn otro experimento tendiente a inveetigar eignoe oardioYaJ! cularee, Honda compard electrocardiogr-ae practicado• a lo• pacien'te• durante 1& taee acuda de gaetroenteritie debicla a Vibrio par&haemollrticue -,, 4••P"'• de su recuperac:lcb:a, ob- eervcS que l.a onda ~. que indica la rela~ac:ldn ventricul.r, era signif'icatiYBmente m'8 ba3a durante la enf'erme4a4 que la exhibida por el :l.ndiViduo al recuperarse. llientr- tanto, la onda ~. que repreeenta la propagacidn de un impul•o del nddulo einoatrial. sobre la euperf'icie de los dos atrios, 86 11•sd a ser mú amp1ia y a1ta durante 1a ent'e:naeda4, pero ee norma11zd a1 recobrarse e1 paciente (172). JU.watani, ex-iaando 1o• tftu1oe de anticuerpo• contra 1a hemo1i•ina directa termoeetab1e, encontrd un incremento en e1 tftu1o d• antihemo1i•ina en un 33,C de 1o• paciente•• durante el. d:Ca de admieidll a1 hospital. 1o• tftu1o• er1111 ~ bajo•, ya que BU incremento comienza 5 d:C- d••~• de1 ill- greeo y al.canzan su múillO de•pul• de 10 a l.5 d:C- (172). IU.7amoto reportd obeervacione• similar•• (123). De lo• datos anterior•• puede concluir•• que la h .. ol.ieiaa directa terao••tab1e producida por Vibrio parallaemo]yticue en 1a cañ4114 intestinal., •• absorbida 4ur1111t• la ent'era- 4114 y circula por 1a corriente e&DB'lfnea originando 1- al.teracionee e1ectrocardiogr6t'icae. \, · DW-ante 1oa dltJ.moe 20 afio•, •• hall reportado en lapdn 74 OIUloe de muerte -por envenenamiento al.imentario debido a eete mioroor...U.emo; este dato repre•enta e1 32.3,C de todo• l.oe caeo• de defunciones debidas a envenenamiento al.iaentario bacteriano. Blll mucho• c-o•, 1oe deceeoe •• deben a ineuft- ciencia cardfaca, pero coao no exietell eetudioe h1etopato1~ gicoe acerca de 1oe et'ectoe de 1a hemo11•ina directa termoea table en tejido• carcUacoe, e• dit'fci1 conc1uir que dicha toxina ••a la reeponeabl.e. Sin embargo, ee mq probabl.e que la cardiotoxicidad de l.a hemol.ieina directa termoeetable estl relacionada de alsdn modo con la morta1ida4 derivMCla de la int'eccidn originada por Vibrio parahaemo1Yticue (172). 87 A.4.5 •'todo• de DeteccicSn La deteccicSn de la bemolisina de Ean&Bawa (termoeatabl.e direc- ta), ae efect11a generalmente en el medio diaeftado por Wagatauma desde 1968; si.n -bargo, eate inveati.gador modi.ficd posterior- mente au coapoaicidn con el fin de faci1itar la vi.aualizacidn de 1a hemdl.isi.a producida por l.aa cepas KP+ s elevcS la concen- tracicSn de eritrocitos de 2 a "' y, actualmente, a eate aedio ae l.• conoce como acar modificado de Wacatauma (122). Otros medios en loa que ae ha logrado detectar la produccicSn de l.a hemo1ia:Lna !!! ~. so1u BHI, caldo nutriti.'VD, l:arunaeagar (l.01) 7 C:hezwonogrodzky (54). Si.n -bu-go, boy en dfa ae cuenta con lll•todoa serol.cS~coa mediante l.oa cual.ea puede determinarse si una cepa ea o no productora de hemoliaina termoeatab1• directa (KP+) 7 •atoa · aon tan eenai. bles que pueden empleara e, inc luei. ve• para real,! BU' l.a cuanti.ficacidn de 1a aubstanci.a en cueatidn 7 eaclare- cer caeos eapor'4icoe debidos aupuest11111ente a cepae ICP-. Bntre loa mú confiables, se cuenta el de la h-aglutinaci.dn pasiva di•eaado por Ohaahi en 1978 (136); en ••te, el autor adaorbicS anticuerpoa anti-TDH a gl.dbul.oa rojoa humano• 7 po•- teriormente loa enf'rentcS a filtrados de cultivo• 11qui.doa 4• Y. parah-mol.Y!icuas cuando laa cepaa en cueatidn producfan la 11.aina correspondiente, ae originaba la 116lutinacidn eap_t c1fica de loa eritrocitos. Bfectuando un anél.isia retroapectivo de cepas presumiblemente Ja>-, tanto de ori.gen humano como provenientes de alimento• del aar, este investigador encontrcS que l.a hemolisina podfa ser detectada en cantidades tan pequeftae como de 1 ng/ml, a di.fe- 88 rencia de la t•cnica de Kanacawa que requiere cuando menoe, de 1 pg/m1; ello se ref'lejd en su trabajo experimental dado que demostrd que tanto cepaa dudoeas lCP+ como algunas pre1N- miblemente JCI>-, daban reaccione• positivae. Con la miema finalidad, Honda disef'ld posteriormente otroe doe mtStodoas una prueba de Blek modif'icada 'T otra de inmun.2, halo (83). La primera ee emplea genera1mente para llevar a cabe la deteccidn de cepas toxig,nicae en lae eepecie• CorYnebacteri!UD diehteriae y StapbY1ococcue aureu11; normalmea te se reali.za empleando un medio edlido en "Una ca.ja de Petri, en la cual se han colocado. ti.rae eet4rile• de papel f'i ltro impregnedaa con antitoxina 7, una vez solidif'icado el agar, se siembra por e11tria recta un 1ndculo del cultivo bajo eetu- dio en f'orma perpendicular a lae ti.rae de papel; ef'ectuado lo anterior, 11e incuban 1u placas durante 24 horae y ei 1011 m1- croorgeniemo11 inveetigado11 eon toxig4n:icoe, ee ob11ervan bandaa de preci.pitacidn debidae a la reaccidn antfgeno-enticuerpo en lae zonae en que lae concentracione11 de ambce reactantee eon eqUivalentee (58).· Bn el e~ de la modalidad de11arrolla4a por Honda, lu tirae de papel ee eubeti tuyen por poso• que •• practican en el agar deepu•• de haberse obtenido el crecimiento bacteriano (a 5 .. de ••te); en di.cho• pozoe ee aftade el euero anti.hemolieina. La placa ee mantiene a temperatura ambiente durante toda una noche 7, al cabo de este periodo, ee examina para obeervar la f'ormacidn de una 11nea de precipitacidn cuando el microorgani• IDO produce la hemolieina en cueeti.dn. 89 l'or eu parte, 1a prueba 4•1 i.nmunoha1o ae rea1i.20. i.nocu1ando a la bacteri.a en un medio con aear a1 que preVi.smente ae 1e ha incorporado e1 suero antihemoli.sina o bien 1a XgG corres- pondiente. La p1aca se incuba a 37ºC durante toda la noche y, a1 t4rmino de 'sta, se observa un ha1o de precipitacidn en el. cnso de que laa co1oni.as resulten productoras de hemo- li.sina directa termoeatabl.e (60). Si bien esta metodol.og1a ea anaU.oga a la de RXD, no puede re~ 1izarse en f'orma cuantitativa, pu.ea no es posible estandarizar e1 in6cu1o, debido a que dentro de la misma especie bacteriana se han detectado grandes di.f'erenciaa en los tiempos da genera... ci6n (191). •unqua 1a sensibili.dad de loe dos ál.timoa mftodoa descritos no as t..n el.evada como 1a mostrada en la hemaglutinacidn paeiva, ambos se consideran reproducibles 7 m6e fácil.ea de efectuErahaemol;rti- ~ es un factor de virulencia, ya que l.as cepas que no lo po- seen muestran una adherencia negativa o débil; sin embargo, el flagel.o L, por s! mismo, no es el factor adheeivo pue~to que algunas cepas que lo poseen, no ee adhieren a l.~s c6lulas epit~ lial.es. Por tanto, estas cepas deben carecer de ale;án otro f~c­ tor adhesivo y, en consecuencia, es posib1e que el. flagelo L sea edlo un accesorio en l.a adhesión (87). En 1983, Reyes (145) estudió la hemngl.utinación y l.a adhesividad de cepas de V. parahaemol.yticus epidemiológicamente distintas, empl.eando cél.ul.as del. epitel.io de la mucosa bucal.¡ éstas se vi~ nen util.izando mucho recientemente para investigar l.a adherencia en patógenos ent~ricos, ya que faci1itan el estudio de loe pri- meros eventos de este fen6meno. Se trata de cél.ul.as mucosas de origen humano, fácil.mente accesibles, que comparten al.gunas si- militudes con el epitel.io mucoso gastrointestinal.. La concluei6n de que existe una gran rel.ación entre el sistema c·elul.ar bucal. y el. eaetrointestinal., proviene de 1a evidencia clínica de que 1a col.onización de la cavidad oral puede ocurrir en forma simu1 tánea con l.a gastrointestinal. durante el proceso inrcctivo nat~ ra1 ocasionado por pat6genos ent~ricos; también se ha ob~ervado cierta asociaci6n entre estos estudios y ciertos ~atrones de hemaglutino.ci6n (HA), en l.a que pari;ici pan eritrocitos humanos 108 procesos adhesivos de un gran número de enterobacterias (145, 1237). En el trabajo de Reyes se hizo manifiesto que, en la meyoría de los Casos, la Há era menose-=resistente (no se innibía por la adición de este carboriárato), con excepción de la que se veri- ficaba con hematíes de conejo, le cual resultó menosa-sensible, en el caso de cepas KE+. la diferenciución percial entre cepas KE+ y KP- efectuada por medio de la reacción manosa-sensible en glóbulos rojos de conejo, puede resultar de particular interés con base en el modelo largamente usado para discriminar entre cepas patógenas (KP+) y no patógenas (KP-)s el asa ligada de conejo. En consecuencia, el autor propone revisar empliamente los peránetros de la Há con eritrocitos de conejo, pera optimi 2er la técnica y, con ello, su confiabilided como criterio de selección entre las diferentes cepas de este microorgenismo. Este mismo investigador encontró que todas las cepas probadas se adherían a les célules epiteliales de la mucosa bucal, tanto en presencia como en ausencia de menosa, si bien el grado de adhesión variaba. Sin embargo, no pudo establecer una correla- ción entre los d«tos obtenidos, aún cuando comelementó su estu-= dio protendo las cepas en el modelo del esa ligada de conejo. En este sentido, explica que ésto puede deberse a que las célu- las escogidas tenían un inacecuado arreglo de sitios "blanco" y concluye que le ednerencia exhitisa por Y. perehaemolyticus para las células del evitelio bucal numano, no puede tomarse como un mejo de predicción de petogeniciczsdo. 109 y de otrns especies animo.les, t<'-'1.to cn ryresenciu come en e.usen cia. de L-m<.U1osa; como se recordará, la D-:n. n l ajo e rreyes i o :nanifiesto ue, ayoría e .os c sos, .ii. ra a.nosa-resistente o hibia or ici n e ste r ohidrato), n epción e e eri- a n atíes e nejo, a al ultó anosa-sensible, l so e pas la'+. La i ciación arcial tre pas la'+ F- t ada or edio e ción anosa-sensible l ulos j s e nejo, ede sultar e arti ular t rés n ase l odal.o ente do ara i r inar tre pas t genas F+) o t genas P-)s l. sa .i ada e nejo. n secuencia, l tor one isar runpliamente .os o.rá;netroe e .a A n i citos e nejo, ara ti i _1zar .a ica , n .l.o, nfiabili ad o rit rio e l ción tre s i r ntes pas e ste icr orgcnis o. ste is o esti ador contró e as s pas adas herían as l l.as it li l.es e .a ucosa cal., to r sencia o sencia e anosa, i i n l. r do e esión ariaba. in bargo, o r o t lecer a rrela- i n tre s 1.tos tenidos, n ndo ¡:il.ementó stu- io bi;:ndo s pas l odelo e1 asa li~ada e nejo. n ste tido, l.ica e sto ede berse e .as lu- 1as gidas ían n d uado glo e s l co" cl.uye e a a herencia ibicia or V. nc.rah'1.erno1:t~ ara .as c~l.ul.os l. pit l.io cal. h ano, o ede arse o n edio e r icci6n e at g.:n ic.ad. Ios datos aportados por los estudios hasta a.hora realizados, no establecen una posible relaci6n entre el proceso de adhesi6n y el :fenómeno oe Kanagawa; sin embargo, la hip6tesis formulada por Hackney (78) sobre el espectro de estados de virulencia den tro de esta especie bacteriana, podría explicar a1eunos puntos discordantes entre los trabajos publicados, sobre todo si se consideran loe hal.l.azgos de Chaehi (136) mediante su m6todo de hemaglutinaci6n pasiva. Por otro lado, puede suponerse que las l:!ne- celul.a.res empleadae no son las m4a apropiadas para exa- minar la adherencia o tal. vez que no se est6n considerando al- gunos otros :factores, como la variaci6n entre cepa y cepa, que son determinantes en los sistemas de ens~o utilizados. B.4 :Invasividad de Vibrio parahaemolyticus Bn 1967, Yahagi reportd la localizaci6n de una cepa de Vibrio paraha-ol.Yticus ICI'+ tanto en el tejido epitelia.1 como en la lámina propia de asas ligadae de conejo; el método utilizado para su deteccidn t"u.e la inmunofl.uorescencia, mediante la cual •• encontrd que dicha cepa ni aumentaba en n11mero ni se exten- dfa a tejidos m4s prof'undos del intestino (29). Posteriormente, analizando el mecanismo de patogenicidad de V. parahaemolyticus, Ghosh encontrd que a1gunae secciones de lae asas ligad.e.:;: de conejo que manif'estaron una reaccicSn posi- tiva con microorganismos viables, mostraban una notable pérdida de cflul.as epitelia1es y una marcada inf'iltracidn de linf'ocitos y c6lulae mononucleares en la lámina propia. Todos estos datos suger!an una capacidad invasiva por parte de este microorganismo, por tanto, para complementar su estudio, 110 el autor 11ev6 a cabo 1a prueba de Sereny, que se uti1iza para ¡x>ner de meníf'iesto 1as propiedades invasivas de bacterias tales como Shiee11a y a1gunae cepas de E. co1i; se basa en la a9ari- cidn de queratoeonjuntivitis, 18 a 72 horas despu6s de haber insti1ado una euspensidn de 1 x 108 c6lu1as en 0.05 ml, en e1 saco conjuntiva1 de cobqos adu1tos. La prueba, en e1 caso de v. parahaemo1Ytícue, resu1t6 negativa; en consecuencia, este i~ vestigador conc1uycS que aunque este microorganiemo no es invas!_ ~, si •• capaz de cau•ar daf'lo celu1ar (71). Bn 1975, con 1os mismos f'ines, Ca1ia uti1iz6 uno de 1oe modelos experimenta1es máe ampliamente uti1izadoss el deeaf'ío oral en conejo 1actante. En 6ste, se utiliaan conejos lactantes blancos Nueva Ze1anda de 46 a 173 g, los cua1es se tienen en ayuno 24 horas antes de1 experimento; transcurrido ese tiempo, se anee- ' ~eeian ievemente con metof'ano y en seguida, se 1es inserta en e1 est6mago un cat6ter de polieti1eno a trav6s de 1a boca por el. cua1 se inyectan 2 m1 de un cul.tivo obtenido en el lapso de una noche; rea1izado 1o anterior, e1 tubo se retira y 1os anim~ 1es se mantienen separa4oa. Siete horaa deepu6s de1 desafío, 1os .anima1es se sacrifican con c1orof'ormo, se pesan y sus paredes torúica y abdomina1 se tr~ tan con etano1 al. 70"; 1a pared abdomina1 ee abre para obtener bazo e h1ga4o en condiciones de esterilidad y cada drgano ee co1oca en una c~ja de Petri, donde se disgrega con tijeras es- t6ri1es. Aparte, una porcicSn de tejido de cada 6rgano se cu1tí- va en un ce.1do apropiado. l.l.1 Una vez retirados el higado y e1 bazo, se separa el intestir10 desde e1 piloro hasta el recto y se peeas el peso del intesti- no, dividido entre el del resto del cuerpo, se considera como un indice de la cantidad relativa de fluido en el lumen intea- tinal. l'osteriorn1ente se practica una puncicSn trenstor6.xica para obt~ ner 1 ml de sangre cardíaca, que se siembra en 10 ml de un ca]. do de cultivo id4ntico a aquél del que procede el microorgeni~ mo de prueba, con el fin de investigar si hubo diseminacicSn h~ matdgena. Ca1ia (36) aplicando este mode1o, tratd sin &xito de poner de manifiesto a1guna actividad enterot6xica por parte de Vibrio parahaemolyt:icue y, en un intento por detectar invasidn, anal! ' z6 cultivos de sangre, hígado y bazo, comprobando que sdlo 1as oepea KP+ de este microorgmüsmo producían bacteremia a los conejo e. Betos hal1azgos sue;ieren que Vibrio parahaemolyticus, a1 igua1 que Sa1monella y Shige1la, es capaz·de penetrar el epitelio in- testina1 del conejo lactante; la posibilidad de que la disemin~ oicSn hemat6gena del microorganismo se deba a trauma.a provocados por la sonda gástrica es improbable debido a que 1ae cep&.11 bac- terianaa uti1:izadaa como control nunca se recobraron mediante hemocultivoe. P~r otro lado, tampoco 1a dosis empleada parece ser un factor de confusi6n, ya que la utilizada en el estudio cae dentro del rango de la establecida para otros microorganis- aoe. No obs~ante, no ee pudo determinar el sitio exacto de pen.!! traci6n. 112 .Bn 1978, a diferencia de lo que Calia establecid para una cepa lCl'+, Joseph (93) encontrd que un aislamiento humano KP- inyec- tado directamente en el !leon externalizado de conejos lactan- tes anestesiados, provocaba diarrea y bacteremia a las 5 horas de la inoculacidn. Bl. examen correspondiente efectuado mediante microscop!a electrdnica, tanto de transmisidn como de barrido, reveló una necrosis focal observándose adhesidn de vibrios sdlo en 4reas dañadas. Este hallazgo condujo a formular la hipótesis de que el tejido dañado, la adherencia y la invasividad se en- cuentran interrelacionados con la toxicidad. Bl1 1979, Boutin (29) llevó a cabo un estudio sobre la posible interaccidn entre v. perahaemol,yticus y el drgano hu,sped, em- pleando un mftodo de inmunofluorescencia; se utilizó el modelo del asa ligada de conejo y, transcurrido el tiempo de prueba, las asas se colocaron en bandejas con amortiguador helado de fosfatos. Bl tejido helado se cortd en secciones de l x 1 cm, las cuales se congelaron al ponerse en un baño de hielo seco- -acetonaa por medio de un criostato, de estae dltimas se obtu- vieron nuevas secciones de 4p. que se fijaron en portaobjetos y tifleron con anticuerpoa marcado& con isotiocianato de fluore.!! ce!na, dirigidos contra la cepa aplicada. Realizado lo anterior, ae procedió a efectuar el examen microecdpico. Por otro lado, se investigd la diseminación de v. parehaemolyti- .2!!!. por v!a hematdgena al cultivar muestras de bazo, h!gado, p6ncreas, corazón y sangre cardíaca. Todas las cepas probadae, tanto KP+ como KP-, penetraron la l4mina propia y la muscular externa, aunque a diferencia de las primeras, las segundas no provocaron la acU!JIUlacidn de fluídos 1.13 nayorím de les cepas se aislaron mediante cultivos de los diferentes órganos, hubo uno de ellos del que se obtuvieron todas las cepas: el bazo, ya que éste es un órgano secuestrante de macrófagos. Esto sugiere que la propagación de V. parahaemolyticus puede ser por el sis tema circulatorio; sin embargo, la ruta exacta de disemineción, a partir del tracto intestinal, todavía no se ha determinado. La contaminación del peritoneo por un error quirúrgico es una posibilidad que no puede descarterse totalmente y, en ese caso, las cepas inveasivas infectarían todas las vísceras abdominales; no obstante, no se encontró tal patrón de infección. Además, ninguna cepa se aisló de los órganos de aquellos animales que no mostraron alguna evidencia de invasión por medio de micros- copía de fluorescencia. Por otra parte, las asas hinchadas y sanguinolentas inoculadas con cepas KP+, exhibían un aspecto comparable al manifestado en severas gastroenteritis humanas. la enfermedad producida por Vibrio parahaemolyticus se asoció durante mucho tiempo con la producción de hemolisina termoesta ble directa, aún cuando un buen número de cepes KP- se han ais- lado de personas clínicamente enfermas. Ahora bien, los hallaz- gos obtenidos que muestran que todas las cepas probadas pueden penetrar la mucosa ileal y multiplicarse ampliamente en la 1lá- mina propia y en la muscular externa, sugieren que, junto con la capacidad de producir hemolisina, debe considerarse la capa cided invasiva de este microorganismo; edemás, debe tenerse en cuenta que en la petogénesis de la vibriosis puede desarrollar- se el establecimiento de una infección generalizada del Íleon que, como consecuencia, puede extenderse por vía hematórsena hacia hígado, bazo y páncreas. 114 en las asas intestina.1es. Si bien la mayorf~ e a.a pas r n ediante 1tivos e s i r ntes 6 anoe, bo o e ll s el e t vieron as s pas: l azo, a e f te s n 6 ano estrante e acr6fae;os. sto giere e 1a agaci6n e v. r ae olyticus ede r ~or l si~ a latorio; i bargo, ta acta e i inaci6n, artir el to t sti a1, avía o a t inado. a t inaci6n el ri eo or n rror i i1rgico s a sibili ad e o ede scartarse al. ente , se so, a pas i as ctarían as s í eras ominales; o stante, o contr6 l tr6n e ci6n. dem4s, i una pa i ló e e 6 anoa e e1los i ales e o ostraron 1 una Videncia e aei6n or edio e icros- pía e r scencia. or tra arte, s eas i adas e D&Uinolentas uladae n pas P+, hibían n ecto parable l anifestado eras stroenteritis anas. La edad ucida or ibrio r ae olyticus ci6 rante ucho ie po n u cidn e olisina termoest~ le ir cta, dn ndo n en d.mero e .e P- an is- o e rs nas f ente 1'ermas. hora ien, s a laz- s t nidos e uestran e as s ae adas eden netrar ucosa al ultiplicarse plia ente 4- ina r pia uscular terna, ieren ue, to n acidad e r ducir olisina, be nsiderarse 1a cap~ ad asiva e ste icr organis o; a ás, be erse enta e at 4nesie e i rioeis ede sa rollar- ªª l l i iento e a cidn neralizada el ! n e, o secuencia, ede t derse or ía at6eena acia í ado, zo ncreas. Pese a todo, el autor sugiere que la invasidn es un evento raro en el hu,eped humano saludable. Si el vibrio puede sobreviVir lo suficiente como para multiplicarse en el in- testino y producir cantidades sienificativas de hemolisina o algdn otro factor desconocido que cause gastroenteritis y, al miamo tiempo, el hu,sped sano puede resistir la inv~ aidn tisular (como lo demuestra el hecho de que existen po.!: tadores sanos), entonces la penetracicSn por parte del microo.!: ganismo puede no estar relacionada con la enfermedad result&!! te; por el contrario, cuando la hemoliaina ca.rdiotrcSpica y citotdxioa puede causar la muerte a una persona comprometida, meno• resistente, entonces la invasicSn y la infeocidn pueden llegar a significarse como -pectos importantes en el cuadro total de la enfermedad. 115 C • PA'lOWGIA B1 mecanismo exacto por el. cual Vibrio perahaemolyticus ejerce su papel patog6nico, no se ha. aclarado. Sin embargo, se han realizado numerosae observaciones de l.a sintomalog!a exhibida por 1ae victimas de 1a infeccidn. LB.e manifestaciones clíni.cae incluyen diarrea (98~), dolor abdominal. (82~), nilu.eea. (71~), vdmito (52~), cef~lea (42~), fiebre (35~), escalofrío (24~) y teneemo (17~) (24,93,172). Bl. fluido diarreico presenta un color caf'6 característico y un aspecto de "heces en arroz"; pero, en caeos severos, exhibe adem'8 descargas de moco y sangre (24,86,147,68,72,89,181). Bn baae al espectro de manifestaciones cl.!nicae que presentan loe at'ectados por este microarganiemo, Ohosh (71) estableci6 doe glMlpos de enf'ermoe: el primero, conetitu!do por aquello• indi.vi.duoe que man.if'iestan una "forma mediana de cdlera" pues eXhiben s6lo una fuerte diarrea acuoea y, el aegundo, integr~ clo por aqu6l.lo• en los que se advierte un cuadro similar al. de 1• sbigel.osie. Ya que 1• manif'estacidn observada m4e frecuentemente en la enfermedad es la diarrea acuosa, se ha pensado que Vibrio e;z=aha!mo:Lyticua plldiera producir una toxina con accidn simi- lar al coler'ceno. Eeta, es una enterotoxina típica que activa la adenilato ciclase originando, de esta manera, un aumento en la eecreci6n de f'luidoe a nivel de intestino delgado (64a, 82, l.01a,128,161a). Ahora bien, la adicidn de monofosfato de dibu- tiril. adenosina. c!cl.ica a c6l.ul.as de ovario de hámeter chino 11.6 (CHO). provoca cambios en su morfología. En coneecuencia. estos camb:l.os se han utilizado para ensayar le. actividad de enterotoxi.DBll (82). Honda (82) aisl6 un factor que provoca cambios morfoldgicos en 1as CHO. a partir de un fi.1trado de un cultivo de v. parahae- mol.yti.cue y J.o compar6 con el co1er4geno. observando efectos eimi.1aree, si bien los de este dltimo resultaban méa intensos. Honda eugi.r:l.6 que este factor podría ser el responsable de 1a diarrea acuosa en el humano. Por otro 1ado, 1a di.arrea con descargas de moco y sangre, su- giere una .i.nvaei.6n tisu1ar. En algunos cB11os se han observado gran cantidad de eritrocitos y c6lu1as polimorfonuc1eares en este tipo de heces. Bn ciertas ocasi.onee el examen con ei.gmo:l.- doscopi.o ha reve1ado m:ucosae h.i.per6mi.c- que muestran de 6 a B ul.ceraciones por cm2 7 man.i.fieetan puntos eangrantea en 1a regi.6n del. rectos1~oi.des¡ en tales pacientes se han detectado hematocri.to• de 30 a 40" y le:ucocitos:l.e de hasta 34.900 (86,24). Allem .. , existen al.gunos eatud:l.oe i.n"teresantes en loa que, cur:l..2, semente, l.o• pac:l.entes af'ectados en forma severa por 1a en:fer- meda4. no excretan co1:l.formes. tal. como si hub:l.esen si.do "1aVJ!: do•"• en d:l.chos c-os se han obten:l.do cu1tivos puros de vi.bríos; este hecho permanece ein exp1icacidn (166). Vibr:l.o parahaemo1yt:l.cua se ha encontrado tambi6n ocasionando inf'ecc:l.onea extraintestinales. Rol.and (J.48) report6 un caso de una pierna gangrenada donde se aisl6 V. parahaemoJ.yticus; el arteriograma revel6 obliteraci6n en la porcidn media de la tibia y el examen patoldg:l.co mo@tr6 117 una inflamaci.cSn eupurativa con necrosis masiva de tejido adi- poso y muscul.ar as1 como 1.nfl.ame.ci.cSn necrosante de erandes V!, ne.e y arteria• del espacio poeterior de la tibia. Se procedicS a la amputacicSn del miembro. ~acket (171) detectcS un caso de panoftalmitis por V. parahae- mo],yticue como resultado de 1a contaminacicSn de una herida con ag11a de estanque. 01.sen (139) aisl.cS v. parahaemolyticus a partir de una descarga del. oido de una persona que hab!a estado expUesta al aeua de mer. Porree (24) obtuvo al. microorganiemo del. l.!quido sinovial. de un paciente con sinovitis que hab!a sufrido una herida en la rodi.11a. Aeimiemo, ee reportcS un caso de septicemia (181). Con todo ello, el. mecanismo patog6nico de Vibrio perahaemol.yti.- 2!!!! contim1a sin el.ucidarse y se sigu.en requiriendo estudios mi.e completos encaminados a expl.icar tanto las diferentes man!, ~estaciones c11nicas exhibidae por numerosoe pacientee, como 1- extrailae observacionee registradas en tan scSl.o algunos de ello•• 11.8 V. DIAGNOSTICO l. AislB.'lliento El diagn6stico de la gastroenteritis debida a Vibrio parahae- mo1Yticua, requiere el aislamiento del microorganismo a partir de muestras de heces o v6mito de pacientes, así como de alime~ tos sospechosos de contenerlo. La detecci6n de Vibrio R&rahaemolyticus pÜede resultar difícil en el caso de muestras de heces obtenid- durante las dltimas etapas de la diarrea ya que el ndmero de vibrios disminuye r4pidamente conforme el paciente se recupera del padecimiento. Laa muestrae pueden estar consti tuídas por heces evacuadas recientemente o, en su defecto, obtenerse por medio de hisopos rectal.ea. En ambos casos, deben cultivarse una vez que haya finalizado su recoleccidn. Si el cultivo no ha de real.izarse en forma inmediatá~ las muestraa deber"1 colocarse en un medio de transporte como el de Cary-Blair, el cual, sin NaCl adicio- nal., ha resultado adecuado en la preservacidn de este tipo de muestras. Asimismo, el 88UB. peptonada alcalina es otro medio que ha demostrado ser dtil en la conservaci6n de tales especímenes, cuando fetos han de cultivarse dentro de las primeras 8 horas de au obtencidn. Por otro lado, en el caso de loe alimentos que han de someterse a 1a investigecidn de este, microorganismo, las muestras colec- tadas de peces deben obtenerse a partir de la superficie del cuerpo, del intestino y de las branquias; si se trata de mariscos, latos se homogeneizar4n en un mezclador que no forme aerosoles. 119 Vibrio parahaemolyticus crece en un buen nd.mero de medios emp1eados en forma rutinaria, si se encuentran suplementados con KaCl al 2-5~; incluso, puede desarrollar en manito1-sal- -agar, utilizado originalmente para el aislamiento de eetafi- 1ococoa. Sin embargo, e1 agar TCBS facilita e1 eie1emiento de 1os vibrios. Las colonias de ~ parahaemo1yticus en el agar TCBS, deepuls de una incubaci6n de 18-24 horas a 37ºC, presentan una forma redonda, aspecto hlhnedo, con un diámetro de 2-3 mm y centros verdes o azu1ee, originados por 1a ingesti6n de azu1 de bromotimo1 a1calino. Por su parte, 1as de Vibrio alginolytiaus son de mayor tamailo y exhiben u.na coloraci6n amari1la debida a 1a fermentaci6n de la sacarosa. A1gu.nae bacterias que no se encuentran habitualmente en las hece• humanas pueden dar lugar a la formaci6n de colonias -.rí1las y en ocasiones azuiee, si bien la mayorfa de 188 veces, este medio inhibe su crecimiento. Cuando 1as muestras de heces pueden cultivarse en seguida de haberse colectado, laa t6cnicas de enriquecimiento no son necesarias; sin embargo, son recomendables en el caso de heces provenientes de pacientes conval.ecientes. A este respecto, cabe mencionar a1 medio de Monsu.r, as! como al agua peptonada al.calina, como medios adecuados para el enriquecimiento se1e~ tívo de Vibrío parahaemol.yticus. Del milllllo modo, se ha obeer- v..So que es dtil aplicar un eegundo enriquecimiento en el caeo de pacientes que han recibido un tratamiento antimicrobiano. 120 Por otro lado, cuando el aislamiento ha de realizarse a partir de alimentos o de fuentes ambient&les, es esencial la aplica- ci6n de un enriqu~cimiento selectivo, encaminado a inhibir el crecimiento de otros microorganismos marinos presentes en la muestra. Para tal fin, uno de los medios más ampliamente utilizados es el caldo Sal-Polimixina, que inhibe no s6lo a enterobacterias, pseudomonas y microorganismos Gram-positivos, sino tambi6n a vibrioa marinos que guardan una estrecha relaci6n con Vibrio parahaemo],yticua. Cuando este medio se emplea en el cultivo de especímenes ma- rinos, generalmente se obtienen cultivos casi puros de Vibrio panahaemolyticus, ya que otros vibrios, incluyendo a Vibrio al.ginolyticus, no desarrollan en 61 dentro de las 8 horas de incubaci6n recomendadas, a 3700. Una vez realizado el enriquecimiento selectivo, es necesario subcultivar la muestra en un medio apropiado. En este caso, el medio que me3ores resultados ha mostrado es el TC!IS, ya que al. Ellllplear otro• medios aenoa selectivos, las colonias resultantes pueden ser difíciles de identificar. Varios investigadores han establecido que Vibrio parahaemoly- l!S!!!! puede ser detectado ~6.cilmente en &l.imentoa, empleando para ello la combinac:LcSn del caldo Sal-Polimixina y el ag&r 1'C!IS, ya que de esta manera, no hay necesidad de identificar bioquímicamente las colon:Lae resultantes, a:L bien, no reco- miendan esta t6.ctica para aqu6llos c~a experiencia en Vibrio parahaemo]..yticus no sea. amplia. 121 2. Identificacidn De loa bacilos fermentativos Gram-negativos presentes en las heces humanas, sdlo Vibrio parahaemolyticua produce colonias verdes o azulea en el agar TCBS. Lae colonias que exhiban este patrdn de crecimiento pueden considerarse como sospechosas de aer Vibrio parahaemolYticue y someterse a pruebas diferenciales. Bate tipo de col.oniaa se eubcultivan en el. agar de Hierro- -~iple AZdcar (TSI) y en el caldo MR-VP, los cuales deben estar suplementados con NBCl al 2~. El TSI se incuba toda la noche a 37ºC y •l llR-VP a 25-JOºC durante 15-18 horas. Un cultivo de Vibrio parahaemolYticua en el agar de TSI, exldbe un plano inclinado alcalino y una base 11.cida; no produce gas y no preeenta ennegrecimiento. Por otra parte, produce una reaccidn negativa en la prueba de Vogee-Proskauer. Asimismo, l.a prueba de oxidaea puede real.izarse sobre el crecimiento obtenido en el ~l.ano incl~ ruido del agar TSI. Bn el caso de aislamientos obtenidos en medios diferentes del TCJE, seril. indispensable llevar a cabo pruebas adicion_e. 1•• talea como la lisiD& deecarboxilaaa. y el crecimiento en aedioa con N.Cl a1 º" y al. ª"· Cabe ••i'1a1ar que de las prueb- establecidas para 2a ident! ~ic.cidn de Vibrio parahaemol,,yticua, aquel.las como son el iadol, las deacarboxilasaa de aminoil.cidoa y las fermentaci~ nea de azdcarea, se 12ev1111 a cabo en loa miamos medio• em- pleados en el caso de enterobacteriaa pero aupl-entadoa con NaOl. al. 2"· 122 Las pruebas para h&.l.ofilismo, tolerancia a la ea1 y capacidad de crecimiento a 42°c, son indispensables en la di:ferenciaci6n de Vibrio parahaem~l.yticue cuando se trata de distinguirlo de otros microorganismos marinos simil.ares a 'l.. .Est- pruebas deber6n realizarse con cuidado extremo para evitar confusiones. Prueba para Ha1o:filiamo y Tolerancia a la Sal. Una asada de un cultivo liquido de una noche, ae siembra en una serie de tres tubos de caldo nutritivo, conteniendo NaCl. a1 o~. ª" y l°" respectivamente. Se incuban durante l.2-18 horas a 37°C. Bl. carActer ha1of"!l.ico de Vibrio parahaemolyticus se pone de manifiesto al no desarrol.l.ar en el tubo sin sal; por otro lado, su halotol.erGncia no rebasa el. ª"· Prueba para Capacidad de Crecimiento a 42°c. Una asada de un cultivo l.!quido de u.na noche, se inocula en caldo nutritivo con NaCl. al. 2" y ae :Lncuba en un bailo con agitacidn a 42ºC durante 24 horas. La aparicidn de un creci- miento escaso se considera negativo. Bl criterio utilizado para la di:ferenciaci6n de Vibrio parahae- mo],yticue con Vibrio aJe1.no],yticus, se basa en la hal.otol.eran- ci•, la 1'ermentaci6n de l.a sacarosa y la prueba de Voges-Pro,! kauer, ya que el segundo resiste NaCl. al. l°"• util.iza el. az'1- car mencionado y produce acetofna. Por su parte, Vibrio .!E• biovar 6330 puede confundirse :frecuen temente con Vibrio parah~~mol.yticua al. emplear procedimiento• de rutina y& que muchaa cepas de este vibrio ·sin nombre, no fermentan la aacarosa ni producen aceto:!na y, ademú, reaccio- nan positivamente en las prueb&& de descu-boxilasas. Sin embll:!: go, no desarrollan en agua peptonada con NaCl al ª"· Su ocurren ciase circunscribe a los ambientes marinos (l.53). 123 Si bien la diarrea aaociata. a Vibrio parahaemolyticus en much .. ocasione• resulta &lltolimitante. existe un buen n11mero de caeos en los que el padecimiento es tan severo, que es pr~ ciao establecer una terapia con antibidticos. Por tanto, una vez que se ha efectuado el diagndstico micro- bioldgico, existe la necesidad de determinar el antibidtico que debe utilizarse para eliminar al microorganismo que _est' provocando l.a enfermedad. A!3!• el. primer paso a seSl.lir es· ia veetigar J.a susceptibilidlllf de l.a bacteria .!!! vitro, ya que el.lo ser& de gran ~da para establecer l.a teraplutica ade- cuada. Varios investigadores han realizado diferentes estudios tendientes a anal.izar l.a sensibilidad de Vibrio parahaemolyti- ~ a diverBDa agentes antimicrobianoa. Los dos m&todos que m&e se han utilizado para este fin sons J.a di:f'uei6n en gel. a partir de discos impregnados y- el. de dil.ucionea seriadal!I en tubo. BoDSDB (28) determind l.as concentraciones mínimas inhibitorias (CllI) de cinco antibidticoe segdn el. m4todo de dil.ucidn seri.a- 4& en tubo, empl.eando medio de peptona con NaCl al 3"; l.as CllI ~eron 1.as aigu.ienteas josamicina 50-200pg/ml.• eritro- micina 1.2.5-50 }J&/ml., bactrim 0.78-25 .PS/ml, tetracicl:lna 0.1.95-6.25 pe/ml. y doxicicl.ina 0.098-1..56 pe/ml. Ea interesll!! te sei'lalar que sue resultados son similares a loa obtenidos anteriormente por Saka&aki y Hale qui.enea utilizaron discos 4e papel. 124 o o . . a £todo de discos de papel sobre medio Mueller-Hinton (con NaCl al 3%), observó que Vibrio parahaemolyticus era sensible a cloramfenicol, furadantina, gentamicina, É£cido nalidíxico y tetraciclina; en cambio era resistente a ampicilina, kanamicina, neomicina, novobiocina, polimixina B y estreptomicina. Posteriormente, Joseph (94) determinó las CMI de algunos antibióticom aplicando el método de dilución seriada: en tubo y utilizando medio BHI con NaCl al 3%, la CMI obtenida para cloramfenicol fue de 3.1 pag/ml, al igual que en el caso de tetraciclina; sin embargo, la gentamicina exhibió una CMI muy superior a los niveles séricos permisibles que no correspondía con los valores obtenidos al emplearse discos de papel filtro. Probablemente esto se deba a que la actividad de la gentamici na disminuye conforme aumenta la concentración de Na?. En el mismo trabajo, se ensayó la producción de p- lactamasa me- diante un método yodométrico, encontrándose una buena correla ción entre la actividad de esta enzima y la resistencia a empicilina. Por otro lado, Beuchat (17) llevó a cabo un estudio compara- tivo entre las actividades anti-Vibrio de ésterus de ácidos grasos y dos sales preservadoras de alimentoss sorbato de potasio y benzoato de sodio, utilizando una cepa de Vibrio parahaemolyticus como microorganismo de ensayo. Observó que a un pH de 6.7, la monolaurina, la monocaprina y el moncaprila to de sacarosa, exhibían una actividad similar a la mostrada por el sorbato de potasio y superaban el grado de acción del benzoato de sodio a concentraciones semejantes. 125 Por su parte, Joseph (92), aplicando el m~todo e i os e el. bre edio lluel1er- inton n KllCl 1 J~), aerv6 e ibrio parahaem ].ytiaua ra sib1• fenicol, r r. antina, ta icina, A i o 1idfxico i 1ina; bio ra i t nte picilina, .. icina, micina, vobiocins, li ixina t t icina. steri r ente, seph ( 4) t r in6 l a I e l nos ti idtico• l do l •todo e i idn riad• o til.is do edio I n &Cl l J., lll tenida ara . r f'enicol. \&e e J.l. .c l., l. al. e 1 so e iclina; i bargo, t icina hibid na llI uy a eri.or 1 a i e1e• •l s ll'lllisibl•• e o r e ondfa n s alores t nidos l. plear•• i os e pel. 1tro. r able ente sto a• ba e 1a ti i ad e 1a i J:. a i-inUl'e f r e enta ent cSn e a+. I l 1 mi~ ajo, ens~6 1a u cidn e ~- a ta e.Sa e- i nte n •todo domftrico, tll'lindose na ena rr• .!: i6n tre 1a t . o sta zi a .a i t cia aapicilina. l'or tro o, eu.chat 7) 1l.evd bo n t dio para- o tre 1aa t i ades ti ibrio e •at rua e 4 i oa s ao• os l.ea prea~oraa e ento•• e rbato e taaio nsoato e dio, t z do na P! e ibria Rarahaemolyticua o icr or ania o e ens~o. bservd e n e .7, 1.a onolaurina, onocaprina l oncapril.!: e arosa, hibían na ti i ad i1ar ostrada or 1 e rbato e t ai.o eraban l r do e cidn l. nzoato e dio centraciones ejantes. No obstante, cabe mencionar que existe contJ·overeia sobre el uso de antimicrobianoe en los padecimientos diarreicoa, pues QOn frecuencia conducen a iatrogenia y alteraci6n de loe ec2 sistemas bacterianos. No existen, por otra parte, suficientes estudios clínicos con pacientes teetigoa que apoyen la efica- cia de estoa f6rmacos. Por otro lado, el padeéimiento diarreico es una enfermedad "aist,mica" en la cual la diarrea es un e!ntoma fundamenta1. Bl. trastorno b6sico del padecimiento diarreico ea J.a deshidr~ taci6n, que correaponde a un balance hídrico negativo condiCi,2. nado tanto por laa p4rdid- por apara.to digeeti vo como por la falta de aporte hídrico para llenar los requerimientos m!nimoa del aujeto correspondientes a p'rdidaa insenaiblea y a excre- ci6n urinaria. Aunque l.a natural.esa exacta de laa alteraciones bioquimic- en cada paciente en pirticular dependen de la in- tensida4 y característica de 1- p4rdidas por las evacuaciones, del aporte líquido por vía oral y parenteral, del fUncionamien- to renal y de laa condicione• nutricionales, en todos loa casos hrq p4rdida de agua. y de determinados iones como sodio, cloro, potasio, macz¡esio, fosfato y calcio. B1 d'ficit hídrico es tanto intracelular como extracelular, pero en la deshidrataci6n leve o moderllda la disminucidn ea sobre todo a partir del compartimiento extracelul.ar, mientras que en la deshi~rataci6n grave abarca tanto el intra col!o el extracelular. Batas alteraciones originan modificaciones en los voldmenes circulatorios (hipovolemia); modific.aciones en la osmolaridad de loa líquidos intracelulares (generalmente hiperosmolaridad); alteraciones de loa iones específicos en los comoartimientoe 126 intra y extracelul.ar (deaplaza:niento de r '!)Or ffa+. incapaci- dad de la cllula para retener ca••); modificaciones en el equilibrio 4cido bAaico (acidosis metab6lica) :fundamentalmente por p~rdida de Na+ y Je+ en las evacuacionea, por acdmulo de producto• &cidoa del aetabolismo debidos a deshidr~taci6n e insuf'ici~encia renal; por cetoaia debida al a,yuno, por incap.!: cidad para metabolizar ciertos 4cidoa (16ctico) y por trans- ferencia de las basea hacia el interior de la cllula. Bl desequilibrio hidroi6nico repercute en el f'uncionamiento de diveraoa 6rganos como gl6ndulaa suprarrenales, hígado, cerebro 7, de muy eapecial manera, sobre riff6n cuya :funci6n tiende a mantener un volumen aangu!neo normal y una preai6n oam6tica apropiada, conservando agua y sodio a tra~s de una reabaorci6n tubular aumentada, e intenta asimismo corregir la acidoaia por la aecreci6n de orina 6cida. La deahidrataci6n y el ac11mu1o de diversos productos metab6licoa tiende a reducir la habilidad renal.:.para cumplir eataa f'unciones, abatiendo la filtraci6n glomerular 7 1a reabaorci6n tubular de agua. Cualquier programa terap,utico deber4 tender a la reparaci6n del desequilibrio h!drico, mejorando autom4ticamente la hipo- volemia y la oamolarid,..S alteradas; a. la reparaci6n de loa d4ficits idnicoss hiponatrelllia, hipocloremia, hipopot-emia e hipocalcemia; y lograr la mejor!a del f'uncionamiento renal. Be eVidente que la form~ de tratamiento podr4 variar aegdn el grado de la &fecci6n; as! en loa casos de deshidratacidn lig.!. ra en loa cuales la plrdida de peso ha sido in~erior al 5~, en que no ha.y signos importantes de deehidrataci6n y en que la excreción urinaria ea buena, el tratamiento podr4 hacerse en el hogar a travla de la ad.ministr.acicSn de l!quidos por v!a oral. 127 Si 1a deshidratación es mod•.rada con p4::'dida ele peso de1 5 a1 1°"• con oliguria y dificu1tad para retener l!quidos por 1aa vías normales, el lugar de tratamiento deber& ser de pre- ferencia •1 hospita1, recurriendo a 1a ingestión ora1 si se contro1a e1 v6mito, o en caso contrario o de pe1igro m~or, a 1a endovenosa. Pina1mente en la deshidratación grave, con p&rdida de peso de m&s de 10", con o1ip,uria marcada o adn anuria, con p4rdidaa anormales continuas y con intolerancia g'8trica completa, 1a hospita1izacidn es obligatoria y 1a forma de tratamiento debe ser el empleo de soluciones endove- nos-. Loa resultado• que se buscan en 1a terap4utica de1 desequili- brio h!drico y e1ectro1!tico son de dos órdeness e1 inmediato, .que ae impone con urgencia y es e1 de corregir, mejorar o evitar, e1 estado de choque y facilitar la fUnción renal a tra"'8 del restablecimiento de un volumen circu1atorio adecu.!! do y e1 de recuperación gradua1 bioqu!mica, que se consigue en el transcureo de d:!as o semanu. Deade el punto de vista práctico en la terap4utica se distin- guen dos etapaas e1 tratamiento reparador en el que se corri- gen 1os d'ficits preexistentes y en e1 que seo 11eva e1 orga- nismo a un estado de equilibrio y, e1 tratamiento subsecuente, con el que ae trata de evitar que el paciente caip nuevamente en desequ11ibrio hidroe1ectrol!tico, manteniendo 11>ra el1o 1os requerimientos normales y reemplazando 1ae. p'rdidas ano~ ma1ea. La reparación compensa loa d4ficita de ae;ua y de ciertos ele,2_ trolitoa y es el primer paao de 1a terap4utica. se lleva a cabo 128 par la administraci6n, en un lapso de 30 a 60 minutos, de solucidn glucosada al. 5- y soluci6n fisiol6gica de cloruro de sodio, a partea igual.es, en cantidad equivalente al 5- del peso corporal., siendo e eguida de la a9licaci6n de 10 ml por kilogramo y por hora de la misma soluci6n hasta J.ograr que el paciente orine m'8 de una vez y que la orina tenga una gravedad específica de 1,010 o menos. ~an pronto como la excreci6n urinaria es satisfactoria, se procede al tratamiento de mantenimiento y de reemplazamiento. Bl mantenimiento llena los re~uerimientos normales de agua de ciertos electrolitos y proporciona suficientes cerbohidratos pazia evitar la cetosis y reducir al mínimo la ruptura de las protetnas dJel propio organismo. El reemplazamiento ea la cor:recci6n de 1- p'rdid- anormales que han tenido lugar por v1- normal.e•· Ahora bien, en muchos casos, aunado a la terapia dietltica, es necesario el establecimiento de un tratamiento con agentes antimicrobianos en donde el. antibi6tico de elecci6n es la tetraciclina, adn cuando su acci6n no ha sido cabalmente evaluada e J.8Ja) • 129 VII. BE'IDZ:IOU>l°iIA l. ASPECTOS BCOU>GICOS 1.1 Di•tr:lbu.cidn Geocr61'ica ~anto la distribucidn como 1a frecuencia de Vibrio parahaemo- J,yticu. pueden coneiderarse eleva4aes reconocido inicialmente en Japdn (43,69,166,153), ee 1e ha encontrado poeterioraente en otro• pafeee -iAU.cos ta1ee como Corea ( 57), 'J!ai1and:la ( 3), Indonea:la (28,92), Vietnam (177), llal.aeia (89), Ohiaa (93,24), Iad:la (51,24,159,158) e Ir.,,_ (93). Aeimiemo ee le ha detectado en Auetrali.a (170), 1a Unidn SoV16tica (114) y en vario• pdee• del continente europeo entre lo• que cuentan Holanda (75, 95), Gran Bl"etda (10), Dinamarca (107,139), A1emania (113), Yuso•- laYia (129), Ita1ia (150), Bacocia (93) y Bspafta (1); de 1a millllla manera, ee le ha puesto de mBllif'iesto en el •ar Negro, el llar .B61.tico, el llar de1 Norte y e1 •ar •ed:lterr6neo (113). I.os reportee de Ah'ica :lnc1~en aial-1entoe en 'J!ogo (25), lladacucar (93) y K:eD:la (23) 7, en cuanto al hemief'er:lo occi- dental, ee'ta bacter:la •e ha aia1a4o en Canacil. (178), 1o• Bet~ 4oe Unicloe (24,5,12,6,43,47,48,44,67,74,91,93,98,96,100,115, 124,141,169,166,160), •6xico (131,125,5), Argen'tina (42), Bl'U:ll (68) .., l'anaaf. (105,5). Bate microorgan:lemo ee ba aiela4o f'recuen'temente a lo largo de todo el ambiente estuarino a partir ele eedimento, ecua, partf- culae auspendidae, plancton, pecee 7 mariecoe. Loe principales factora• que inf'l~en sobre su exia'tencia son la ealinidad, la 130 variaci6n eetaciona1 y au aeociaci6n con organi11111oa auperior••· Vibrio parllhaemo],yticu1 ea un habitante coadn de 101 estuario• y •• poco :frecuente encontrarlo en agua dulce o ea nar abierto. su incidencia es dependiente de 1.a temperatura y, por eDde, del ciclo estaciona1, encontr6ndoa1 eu ocurrencia 111ú alta en loe meees m'8 c6lidos del vereno (43,98,96). 1.2 Variaoi6n Betaciona1 Bn la mtQ'oria de las 6reae geogr4f'icae donde este microorgani~ mo habita, eu incidencia sigile un detel'lllinado ciclo estacional, regiatr'-'4ose lae cuentas mú altae en el verano y en el otofto y, laa mú bajae, durante el invierno. Miyamoto (93) detect6 por vez primera este fenómeno en Jap6n y, posteriormente, otro• investigadores como Niahio y Shin (93) 10 confirmaron. Consecuentemente, se ha registrado ta1 inf'lueg et.a eatacional en otros pa!eee como Auetra11a (170), varios da1 continente europeo (113) y loe Bata.dos Unidos (12,98,6,67). Sin embargo, es interesante aefta1ar el hecho de que Thompaon y Vanderzant (180) no pudieron detectar dicho fenómeno en el Oolf'o de .Ulxico, pero observaron que 1 .. temperaturae en este lugar fueron mú a1tae durante. todo el afto (la mú baja f'ue de adlo 11.6ºC) que lae de otros ambientes estudiadoa. Aunque en l.a bahia de Cheaapeake y 4reae aledaftae 11 111icroorg- niamo eet4 ausente de J.a columna de BBUª durante loa meses de 1.nvierno, ee l.e pUede aislar del sedimento durante todo este tiempo (98). En otros ambientes permanece 8ll dicha columna pero en ndmeroe 111\Q' reducido• (4). 131. ·4 En pai••• tropical••• •1 ciclo eetacional de Yibrio paruaemo- 1.Yt;iou• tiene corre1ao.1c5A coA lu temporada• de lluviu 7 ••- c-; en Yietn- (133), loa nl1aero• aú alto• •• obtienen en lo• ••••• de 1luv1u (•arso 7 Abril) 7 lo• 11168 bajo• en la teaporada de eecu (J>icieabre a Pebrero). Ourioa-ente, un rend-no contrario ae obeervcS en 'l'ogo (25) 7 en Xndoneaia (92), 4oa4• 1- cuentu 1168 a1t;- ae obtuTieron al rinal. de la tem~ rada 4• aec .. (.Abril) 7 1- mú baJ- en la t;eaporada de llu- vt. .. (Junio). Lo• •alo:rea de eal.1111484, no r•Bi•tradoe en lo• eetwlioa de Yietll88 • XndoJMaia, r-ron toaello• en cuenta en 1- in-•tigaoion•• de Togo, ea 1- que se obaerv6 que la coa- oen'trao.1c5n de •al era mú alta en 1a •poca de ••cu (mú de1 12 por ai11ar), periodo en e1 que las cuen"tu de1 •1croorgan1J! ao tueron 't-b1•a a6a •1••84-. J>uran't• 1a •poca de lluv1 .. ae r•Bi•trd una aa11mdad de 1.6 a 4.2 por ail.lar, l.a cual •• aenor c¡ue l.a 6pt1- para v. paru-mol.,yticua; por el.lo, •• 1o- gr~n poooe aielam.en"toa en eaae recbae (25). Si bien l.a aal11d.dll4 parece aer l.a causa de l.os datos ob"ten.14o• en 'J!ogo 7 en Indoneaia, no sucede u! en e1 c .. o de Vietnem, donde no ex.tete adn exp1icacidn para diobo rea6meno. üelde 4• 1a tempera-tura 7 la ealinided, 1a Tariaoidn eatacio- Dal de eete microorganiamo •s'tA inr1uencia4a por interaooion•• con e1 p111DOton 7 orgmniaaos auperi.oree. Eaneko 7 Oo1well (98,96), a1 es"tudiar el ciclo es"tmcional de ••"ta bacteria en l.a belda de Oheaapeue, observaron que duran- -te loe aesee de verano au .incidencia era me;vor en lae mueatrae de plano-ton que en laa de agua o ••d.lmento mar.1Doe. 132 Vibrio parabaemo1fticue y otroe vibrio• eatrechemente relacio- nedo• eoa quitiaoclúticoe 7 ea un becbo -pli ... nt• comprobado que exiat• una acSli4a aaociaci.dn de eate tipo 4• becteriaa con •1 sooplenoton. 8n el r!o Bhode, la flora bacter:L8Da .. robia beterdtrota uocia- da con plancton reaultd eepecltica, predominando Vibrio .!.l!.2· en la cuenta viable total; a la mitad del Terano, Vibrio .!l!J!· oom- prendid el 100" correepondiendo el 9.5" a v. par•haemolYticue. l.a aaociec:Ldn de ~~ !22· al plaa.oton, eug:Ler• que eetoe mi- oroorganilAIO• ~uegan un papel importante en el ciclo de elemento• 4•1 .. bient• marino, probablemente en la mineralisacidn del oo~podo. Verlo• :Lnveatigadore• han demostrado que la flora bacteriana del ' pÍáncton no ea la lld.11111& que la del ambiente donde generalmente •e tolUID l .. aueatraa. Sb~4u. (98) reportd que mú 4•1 70'/. de 1- bacteri- heter6tro- t .. aialell .. 4•1. plancton eran Vibrio 7 Aeromon-; pero, por otro l.e4o, encontrd una flora eepec!tica localisllda en •1 interior del pl.aaotoa. Liia aupert:Lciee del plancton eat6n reveetidaa con un exudado vi.!! coao al que •• ..Sbieren 1- bacteri- 7 del cual toman oompueetoa que u.tilismn como f'uentee diepon:Lbl•• de alimento 7 energla. Ademle, cu9Ddo lo• microor•ani•mo• aeoc:La4o• con el plancton aon qu:Ltinoclúticoe, eer6n capacea. de deaoomponerlo 7 reciclar au aater:La orgWoa. De hecho, lu c6lul- libree 4• !:. parahaemo- lzt¡icua que •• encuentran en la columna de agua, provienen del plancton, del que se liberan dur•t• el proceeo de mineraliza- 133 cldn; 1ia1 •• el caeo de l.- que •• de1iec1ian en l.a col.umna duran1i• lo• prlaeroe diae de junio (96,48). Vlbrio parüumol.Yticws •obrevi- en el. invierno -oc18do a aari•oo• 7 pee•• propio• del. t'ondo, lo cual. no •• 4•1. "todo eor- preDden1i• •i •• coneldera que loe animal.ea b•ntlco• eet"1 eiem- pre en con1iacto con la t'l.ora m:i.crobiana ele ee"ta reg:Lc5n. Ad••'-• l.o• aariecoe •e a1imen1ian por f'1ltracic5n 7, por ello, conoen1iran mcroorganiemoe. Se ha vie't;o que el ndmero de bac'te- ri. .. encon"tredo en lo• mari•co•, •• correlaciona con la 1iemper5 'tura -blen'te; ui, •• ha oomprobmo que en invierno, lu cuen- 't- de v. parüaemoll''ticu• •on ba.ju, pu.ea eobrevi,,. a ba.ju 'teapera"turu en el eedimen1io aarino, el cual., de al8UD• manera dn iadeter.mineda, lo protege. Amü.,a (98) obH~ que v. parebaemoJ.zticue 11obrev1Te en tubo• de qua pep't;oneda con KllCl a1 3" oolocadoe en eediaeato aunque ee pre•ente• c-bio• embien"tal•• extremoe. Sin eabargo, eu •ea- •ib1l.i4al depende de la edal del cul'tiTO ~ de otro• t'actoree, 'tal•• coao la coacen"tracidn de aa't;eria o~ca e inorg6n1ca en el medio. CoD1'orae la temperatura ae i.Dcre-n't;a, lo• Tibrio• proliferan 7 Vibrio parabaemol.z1¡icue pu.ede aielaree t'6cilmente de la oolU11Da ele qua. Otra interaccidn interesante en la que participa Vibrio parllhae- aob!iou• ea la que man1iiene con Bdellovibrio, pu-a el cual •17.-o't;o 7 ll\aro4a (197) sug:Leren un papel importan"te en el ciclo ee't;eiciollal 4el primero. B•toe innetigadoree encon'treron que Bdellovibrio puede li•ar a v. parllhaemol.Yticue en una proporcidn 2 a 3 vece• m~or que a otro• vibrio• mar:l.Doe, cuando lae tempe- ra'turae eon de 5ºC pero no a temperatur .. mú al"tu (35º0). 134 rajas y Bdellovibrio lisa activamente al huésped, V, parshasmolyticus no prolifera fácilmente. Esto fenómeno se hs detectado tanto en la bahía de Osaka (197) como en la de Chesapeake (201). Por tanto, el ciclo estacional de Vibrio parahaemolyticus puede estar influenciado por una gran variedad de factores, entre los que destacan la temperatura, la salinidad, el plancton, etc. 1.3 Correlación con Parámetros Ambientales La relación existente entre la incidencia de V. parahasmolyticus y el medio ambiente, cuando éste presenta determinados índices de polución, no está del todo clara. Algunos investigalores han reportado mayores concentraciones de este microorseniamo en aguas contaminadas que en las que no lo están (6,199). En cambio, Thompson y Vanderzant (180), Kaneko y Colwell2 (98), 3utton (170) y Jonas (91) no encontraron una relación significativa entre las cuentas de Vibrio parahasmolyticus y los Índices de contaminación represmitados por cuentas de coliformes totales o de E. coli. Así, por ejemplo, Oshiro (98) detectó entre 10 y 20 células de V. parashaesolyticus por ml de agua en un área densamente conta- minada del mar interior de Seto, Japón. Por eu parte, Horie (98) reportó la existencia de 20 a 100 UPC por ml de agua en la bahía de Tokio y cuentas mayores en la boca del río que allí converge; asimismo, Baross y Liston (6) encontraron de 10 a 5,000 células por ml en la sonda de Puget. Sin embargo, Kaneko y Colwell (98) reportaron cuentas relativamente bajas que promediaban menos de 10 por ml y sin correlación alguna con las cuentas de E. coli. 135 A•:!• dur.ate lo• ..... de otofto • invi.erao. cuando l .. 1;eaper- turae •on ba~ .. de l vi l"io ea Y ente l Ul•p•d• Y. e abu l.Yticua o r li 'era 1'6ci1-nte • .... ' 6aeno •• ba 'lledo 1111to abia • •alca 97) COllO • b•••P•ake 1). or 1;o, l i lo al. e Yi l"io B1"91l .. ao),zticue ede •tar l'l nciedo or l&ll& Cl"llll ri ad e tor••• 1;re • e •t can -p• t ra, • l i m• •1 l cton, tc. .3 o relacidn con rAae1;ro• mbiental•• I.a :raleo éSn zietente tre i encia e v. 91laemolztioue 7 •1 •• io .. ient•• ando •~• r eenta er1111u14o• 1a4io•• de l iéSn, o et6 el 1;odo l ra. ilgl&ao• •t doree an rtlldo lllq'ol"•• centracionee e e1;e llior organi-o q e t.ai ll4 .. e e e o etm . 99). 111 - i , ft a eon 7 Yander mat 0) • Eaneko 7 o1we11 8) • Su ton 0) 7 ODall 1) o contraron a idn e e if'icativa 1;re e 1; ... 4• Yibrio e oJ.Ttioue 7 • i ice• e tlllU.naoidn l"eaen1;adoe or 1; .. e f' l'tlle• 1;al•• e B. ooli. ••1• por ;jeaplo. ehil"O 8) tectd 1;re 10 7 0 f l&lu e . .rab w z e or al e 8Cll• n 6rea e en'te o nta- 111nada del. 1181" t rior e eto. dn. or a . l"t•• orie 8) ond iet noia e 0 0 PO or a1 e cua ab1a e ~okio 7 ent .. ayoree ca el ! e li nverge: ei inio. aroea 7 ~eto'1 ) contraron e 0 .ooo •1ulae or l. • e n4a e ug9t. in bargo, JC.ieko 7 olwell 8) rtaron ent .. iv ente ;jae e ediaban enoe e 0 por 111. 7 ei rrel cidn na n 1 .. cuent .. e B. ooli. ••ti- Yar1ac1oaee pue4•D expl:i.car•• a1 tlomal'lle en cuenta otlro• t'aatore• aeociado• con la conti-inac:i.cSn tlal•• como la concentra- cicSn 4e matlrien'te• 7 par1;icul.- •u•peDdid- '7 no mdlo lu cuent- 4• colit'ora••· Loa !nd:i.cea 4e colif'o:r.e• generalaen'te correlaci2 nea bien con la preeencia 4e patdgenoe bacteriano• aldctonoa tale• como Salaonella .!J!2• • pero no con la 4e bacteriae autcScto- naa potencial.mente pa'tctgenaa oollO V:i.brio par.itaeao].ytioue (49). Watlkina '7 Oabelli (199) ob•erT&ron que la 114aoraicSn 4• V1br1o par•h•-olz!;io- a par'tfoul- w•pen414- ea aqor en epa8 4e ba3a aalin14114 7• por o'tro 11140. Sllg:ieren que 1- ouent- 4e ea'te aioroor•eDillllO po4r!llD ee'tar relaciond- con l.a con't-ina- c:i.cSn. 4eb14o a que 6a'ta, a eu Ye•, lo eetil. con el ndaero de par- 't!cul.u. A4••'-• comprobaron que en 1a b.iiia de Obeeapeake, adD ouelMlo la incidencia 4• ee'te aicroora-n:l..-o mo•'tr6 una correla- cidn poai'tiva con la cuen'ta de colit'orme• en el Aziea que rodea 'ai ¡Üer'to de Bal'ti.more • la oan't14a4 de'tec'tda no t'lle 'tan eleTada como la e:dL:i.bida por Salaonella .!J!E· Bn un ••'tud:i.o eubeecuen'te que cubr16 el 6rea en'tera de la babia 4• Oheeapeake, loa 4a'to• reYelaron que la •alin:14a4 7 la concen- 'tracicSn de oxigeno 41eue11oo ee encontrabllD mú eetrechamen'te re- laciondoa con la inc14enc1a de Yibri.o par.itaemol.y1;1cue. I.a f'reouenc:i.a, ea 4ec1r, 1oa ndaeroa 'to'talee de ea'te aicroorga- D:i.aao, ee incremen'tabaa a1 auaen'tar la eal1n14a4 '7 41B1Dinuir la concen'tracicSn 4• oxigeno dieuel'to, lo cual ret'le3a un Jll'Obable auaen'to en la concen'tracidD de nu'trien't•• en 1- Ar•- eu'trcSt'icae de la b.iiia (100). 136 Vibrio p!Eaba••olz!icue •• ha ai•lado de -.gua du1c• en di•tia- •- k•-· Josepb (92), ea ua •••wlio realiii:edo en Iadoa••ia, encon•rcS que en mucho• o-o• el acua po'f¡abl• obtellida de po•o• con'f¡ell!a a ••ta bacteria. Bn 1a balda de C:heeap•ak•, ICaper ( 100) ai•l.d al. lli.oroorglllli•mo en la regicSn mú alta de la beh!a, -f 0080 en lo• nivele• auperior•• de lo• rfo• J .... 7 Potomac. Al. examillar la mi-a 4rea, SQ"ler (160) obtu'IO vario• &1•1-19!! to•, uno ele lo• cua1•• t'u• ele ••di••nto •uependido, donde la te•peratura del -aua era de 4. JºC y la •alimelad •• hallaba por deb~o de loa lfait•• de'f¡eotabl•• por •l. aalilldme'f¡ro. n truusporte de v. pa:reha•molYticue por la aarea, ;tuep •in duela un papel. imponui•• Bll la ocurrencia de e•t• mcroorgalli- ao rfo arriba de loe eetuarioe. ~·• 7 Barrow (4) obaervU'On aqor•e oollCentracione• de eate moroorcalli .. o en ••dilBBDto lodoao que en eediaento ele grava o arenar ••t• hecho refl.•3• la in~uencia que tiene la aateria orgtrUca en l.a ocurrencia y eobreVivencia de eeta eapeci• bac- teriana. Bn C&lcuta, Zndia, v. parahaemolYticue •• ha ai.elmo el• pece• 7 aueetr .. de -cua dul.c• 'f¡oaadae del rfo HoogJ.7, aproximadamente 50 ml.l... rfo arriba de la balda de Bengala. Bate aicroorgania- 80 •• encuentra -pl.iamente di•triblddo en elicba 4rea, al. gredo que •• le encuentr~ en un 4°" de l.a• aueetrae de ag.aa el• eétan- que que "pr6cticamente no tienen •al" por provellir de 11gUa el• l.luVia, principal.mente. BD ••ta aetrdpoli el consumo de alimen- to• marino• •• ba;lo 7a que la poblaoidn l.ocal pre~ier• e11peoi•11 de 11gua dulce. 137 Ya que Vibrio parahaemolyticue •• encuentra entre loa Vibrioe ... dep•ndientee de la ea1, podrfa eeper••• que eobr•Viviera adlo por un corto periodo en -bientea de qua dulce. No obetae te, la adaorcicSn al plancton qUizl. pueda prolongar au auperVi- venci.a coDl'iri.,ndol• aip tipo de proteccicSn.. BD eate contexto, cabe .. ncionar que en •l e-o d• v. cholerae, la -ociaci6n con qui.tina l•. otorga reeiatencia a1 pR l.cido. •ueatreo• aubaecuentee en otru Ar•- han aoatrado una ba3• t-• de aialami.•ntoa de ••t• microorgani•mo tanto de acua como de aedi•en1lo. Batoa da1loa no apo;rua la idea de un ciclo de ea1la bae, 1leria en loa Di.cho• he1lercS1lro:f'oa de qua dulce, ta1 como aucede en 1- apaa eatuarin- :r coat•r-. Aparentemente, v. parehaemo- 1;r1;icue no :f'oraa parte de la micro:f'lora autcSctona de loa ecoai4 •-- de aaua dulce, ain embargo, la aobrevivencia de 1- c•1u- 1- i.ntroducid- en eiatem- de agua dulce por humanos i.n:f'ecta- _. doa, parece prolonsaree por au -ociacicSn con el. pl-cton •xi- tente. Bata podrfa aer la razcSn de la diaeminaci.dn de ••ta i.A1'eccic5n en Ca1cuta (159). ai reaumen, la -ocisci.c5n de Vibrio parahaemolytioua al plancton de ..su& dulce, adn en n-daeroa ba:Joa, con:f'iere o1lra dimeneicSn a 1a di.atribuci.6n de ••t• microorgeniemo. 1.4 Ocurrenci.a en Mar Abi.erto Coao rara vez •• ha aislado a Vibrio pareh-molzticue de regi.on•• pel.'81.c_, parecerfa que eatl. limi.tado a l.- acu- coat•r- :r ••- tuari.naes ain embargo, Aoki. reportcS eu aial.amiento del. mar abier- to de Japdn, adn cuando Di Hori• ni Mi7amoto pudieron reproducir •1 :f'encSmeno en l.- miamaa 4reae (93). l.38 pelágicas se ha reportado también en Canadá y el Continente Africano (25). Baross y liston (6) notaron que la incidencia de este microorgenismo en. el agua de mar decrecía conforme aunen taba la profundidad en la costa de Washington; no obstante, en- contraron números muy bajos de esta bacteria en sedimentos más profundos. Kaneko y Colwell (97) colectaron muestras a lo largo de cuatro recorridos fuera de la saliente continental del suroes te de los Estados Unidos y no ajslaron a esta bacteria de ningu- na de las muestras de agua, sedimento o plancton; sín embargo, obtuvieron un buen número de vibrios muy similares a ella. La ausencia de V. parahasmo icus en el océano es probablemente el resultado de la baja temperatura del agua, la alta salinidad y la baja concentración de nutrientes, ya que este microorganis- BO, A diferencia de otras bacterias marinas, es sensible al frío y Etneralmente no sobrevive en aguas con baja centidad de nutrien tes. Otro factor importante que debe considerarse al examinar la in- cidencia de V. parahasmolyticus en el océano, es la presión hi- drostática. Su efecto ha sido estudiado por Schwarz y Colwell (161) quienes reportaron que esta bacteria es incapaz de crecer a cualquier presión que siuule el ambiente del océano profundo, es decir, entre 200 y 1000 atm. De esta manera, la incapacidad de Vibrio parahuemolyticus para tolerar una presión hidrostáti- ca elevada, mantiene la conclusión de que las aguas estuarinas constituyen su hábitat natural. 139 Beta incapacidlld para alelar a Y. parahaemolyticue en zon- pel.~c- 11• a ortuo a b:l•n anadl. l ontinente 1'ricmao 5). a:roee 7 Lieton ) taron e i encia e ete • cro a ie o n l eaua e ar crecía f r e wn•!! a ' ndi ad. .a ata e aehington; o stante, - ntraron daeroe 'lq ajoe e eta acteria i entoe ú fwldoe. JCaneko ol.well 7) l ctaron uestras so • atro rrido• era e li nte ntinental el suroe~ e e :astados nidos 7 o i r n sta acteria e i gu- a e .- ueet 11 e eua, e• l'lento l.anctoa; •i barso, t vieron n en d ero e o11 ~ ilar•• lla. ?.a - ia e v. para -m :J,zti us l llano e abl ente l e lt do e 1a 3a peratura el 9&'1a, lta l i ad 7 1a aja centracidn e a tri ntea, 7a e ate a rganie- ll • a i r ncia e trae cteriae arinas, a e eible l f 7 pn eate a i'Ye p e a aja a t:lda4 e tri•!! e. tro tor portante e be nsiderara• l inar - ncia e v. parahae ol.zticue l o•ano, e r eidn i- r et6.tica. u oto a ei o e :lado or arz 7 olwell 2) ien•• rtaron e ata acteria e paz e cer alquier r eidn e e mule •1 .. iente el •eao :t'undo, e ecir, tre 0 7 00 ta. »• eta anera, acidad e ibrio ahK ol,y1;ioua ara l rar a r eidn 1droat4ti- a ada, aDtiene clueidn e e .- uae t ari ae conatit~en e f.bitat atural. 1.5 Aeociacida con Organiemoe Superior•• Be bien conocido el hecho de q1&e v. parllhaemolyticus ee encuen- tra .. ociado con una gran VIOZ'iedad de organiemoe superiores, incl~endo plaActoa, pece• 7 •arieco•, tanto en el ambiente aal'ino coao ea el eetuarino. Piehbein (67) ba reportado eu aislamiento de 30 di~erentee eepe- ci•• marinaa, incl~endo almej&B, oet1one•, 11111so•tae, vanera•, •ardiaaa, oaaaroaee, cal.amare•, cangrejo•, anguil&B 7 otra•~ De 1969 a 1972, eacoatrd que el 86~ de lae aue•trae de alimento• aariaoa ex .. iaadoa por la Pood and. Drug Adminietratioa, reeulta- ron po•itivae para v. Parahaemol.Yticue, ei biea la 11181'0rfa de l&B aueetraa ee colectaron durante brote• colectivos de en~erme­ dade• entilrlcae. Otro• estudio• igualmen'te ex'tenaoe, reportan la presencia de eate microorganiamo en alaej&B, mejlllone• 7 o•tloaee (95,12,179,33,6,170,25,178,180,131). L&B cuea'tae de v. parahaemoJ.3rtlcu• en oetion•• pueden ascender basta 1,300 por gramo de tejido, aunque lo• valoree •'- ~ecue!! 'tea BOD de 10 por gramo (64). Yarloe iDveetigadoree como Co1wel1 (50), Krant& (106), Piehbein (65) T Barrow 7 Mi11er (11), han repor'tado el aislamiento de eate microorgani..a a1 anali&ar cangrejoa, encontrando ooncentr!! cioaea 'tan altaa como de 103 por sr-o de carne (106). Otros, collO Vanderzan't (194) y Joeeph (93), lo han :recuperado del cuia- rdn. Vibrio parahaemolz1¡icue no •e ha aialado tan ~recueatemente de pece8 como lo ha •ido de invertebrado• que •• alimeatan por ~il­ 'tracidn (6). Sin embargo, ee ha demoatrado eu existencia en una 140 gran 'YU'ie4ad de peces tanto marinos como de &BU• du1ce, entre 1o• que •• cuentan e1 atdn, robal.o, pez azu1, pez gato, angui1a, 1enpuo, macare1a, mujol, perca, p6mpano, pargo, eardina, espe!: 18llO, aer1usa, cabal1a, bagre, etc. (95,31,130,67). Ad•-'- de 1a aaocir.cidn comensal o aimbi6tica de esta bacteria coa or.-iamoa superior••• t-bi'n ea poaib1e la antag6Dica. ICr11Dts (106) aial6 a este microorganismo de cangrejos let6rgi- co• 7 moribundo•; Brinkle7 (31) observ6 la relaci6n de esta bacteria coa una enfermedad de'lae 1aagostas 7, Tubiaah (184) 1a ha reportado presente en moluacoa bivaJ.vos. Vandersant 7 lf:l.ckelaon (195) pub1icaron 1a muen• de camaroaes en mar1c~u1tura, debida a iDfeccidn por Vibrio parahaemol,yticua. :In eete:eentido, 1ae propiedadea patog6nicaa de v. parahaemoly- ticu. podrfan aer tan importante• en 1a maricultura del camar6n u otro• invenebrados, como ae ha demostrado que v. anftillarum 1o •• en viireroe de pecee. 1.6 Belacida con Bacterid~agos B1 priaer ais1amiento de bacteri6fagos eepecfficoe para Vibrio parllhaemogticus f'ue reportado en 1966 por Rakaniehi quien, en ••• ocaei6n, describid 3 diferente• fagoe obteaidoe de aeua de mar, hecea 7 una cepa 1ieog6nica, respectivamente (103). Bn 1973, Sk1arow (165) aisl6 un bacteri6~ago especifico para v. parahaemolYticue del sedimento de la costa de1 AtlAntico, •1 cual. preaentaba forma de icoaahe4ro. Poeteriormente, Barosa, Liston y Morita llevaron a cabo una serie de estudios sobre fagos de Vibrio parahaemolyticue (7,8,9). 141 Se pienea que la f'uncida primaria de loe bacteriófagos en la naturaleza ee liear coa el objeto de diemi.nuir lae poblacionee de determinadaa bacteriaa. Generalmente, loe tagoe eon eepec!- ticoe de eepecie o cepa 7 ae cree que tienen eu origen en cepas lieog6nic .. de la aieaa especie. Lae cepae lieog6ni.c .. son b••- taate comunee en la aatural.eza T ea loe experimento• donde ee baa mezclado ~ego• con lae cepaa aueceptiblee, eventual.mente b.n -ergido cepu reeietentee a tal.•• f&BO•• En coneecuencia, puede euPoD•r•• que loe bacteridfagoe de Vibrio eet6n eaocilldoe de al.gdn modo a la ae,vor!a 4e laa eepeciea de este gfnero que ee encuentr.n en el -biente marino. l.a incidencia eetacional de loe bacteriófagos de v. parahaemo].z- ~ en aar:l.ecoa, ha moetrlll!o estar relacionada en ~oJ'lla inver- eamente proporcional con la frecuencia de vibrio• meeótilos. Se han detectedo nivel•• elevado• de f'aso• de v. parahaemoll'ticue en mueatrae de mariscoe que no albergaban niveles detectable• de vibrioe mesófilos To edem'8, ee han aislado frecuentemente de cruetAceoe tales como el cangrejo Re7 y el cangrejo de Ni.eve, que habitllD en aeuaa permanentemente f'r!ae (menos de 5ºC); este hal.lazgo supere fuer1'emente que el orie;en de estoe ~egos capa.- cea de li.ear a v. parahsemolyticue, no est& en cepae liaog6nicaa natural•• de eeta eepecie. Bato es contrario a la creencia gene- rali.zll4a de que el principal requisito para el ai.slEaiento de un bacteriófago, es la preeenci.a del hu•eped eepec!f:l.co. Obvi-ente, el origen de estos bacteridf'e.goe seguir4 siendo obecuro. en tanto el conocimiento sobre el tipo• ndmero y actiYidad de los vibrioa mari.noe y su aeociaci6n con &ni.malee de estos ambientes. no ee establezca con claridad. 142 A la :techa, sólo existe in:forinación confiable, tanto de tipo taxonómico como fisiológico, sobre lea especies patógenae para el hombre y loe pecee, tales coao v. parahaemol;rticus, ~algi­ nolyticue y v. !lDflllillarum. De latae, sólo la• dos primeras se encuentran relacionadaa en forma significativa, a un gr~do tal que pudieran compartir algunos :tagos. Sin embargo, no ee ha detectado ningán faso de v. slginol;rticue a partir de muestras aarin_, ni ee ha encontrado alguna cepa que albergara pro:fagoe capacee de lisar a v. parahaemo!yticus. Por otro lado, el hecho de que alsunoe :tagoe de V. parahaemoly- !ll!!!!. puedan Usar a un amplio gru.po de Vibrioe degradadorea de acar y viceverea, puede cona:lderaree como evidencia de que alS!! nos de dichos :t&BO• pudieran haberse orietnado 4• un Vibrio re- motemente relacionado con v. parahaemo].yticua, por •3emplo, al- guna especie paicro:tflica. Aef, puede mencionare• el caso de loa :tagoa P4A, P4B y 4-TC cuyo hu•aped original es el vi.brio peicro- :t1lico TC11 B2A que es degradador de agar; lo interesante del caso ea que estos ff180• tambi'n liaan cepas de v. parahaemolTti- S!!e• pero solmnente a temperaturas inferiores a loe 30°c. De esta manera, el hecho de que loa ostiones conteag.n a una srmi población de bacterió:tagoa que 11..ean tanto a Vibrio parahae- mo1zticus como a una gran variedad de vibrios degradadoree de qar, augii.ere una relación ecológica entre estos dos grupos de Vibrioa. Las especies 4e Vibrio• comprendidas dentro de laa poblaciones peicro:tflica y mesófila encontrlldaa en ostiones, no ae encuen- tran determinadaa con exactitud. Por e3emplo, existe un coneid~ rable nW!lero de vibri.os peicrof!licoe y de1P"adadoree de agar 143 que ao •• han identificado. debido a la gran variaci.dn fenot!- pica que exhiben; en esta eituacidn. loe bacteridfagoe pueden repr••entar el factor defini.ti.vo. Aef, ee ha llegado a sugeri.r que la eepecificacidn dentro de este grupo de vi.brioe •arinoe •• pr6ctic111Dente iapoei.ble. pudiendo existi.r un espectro emplio e ini.nterrwapido de organi.emo• relaci.onado• gen6ticEo111ente (7.8,9). Por 1111 parte Koga (l.03), •n 1982. ll•VIS a cabo un eetudio eobre 1- Yari•dad•• aort'olcSgi.c- 7 lo• rango• de bu6•ped•• de fago• de Y. parmhaemo],yticue. Del agua de •ar obtuvo 18 bacteridfago• l.ftiooe para Y. parabaemo],yticue. a. l.o• que claaificd en 4 gru- poe de acuerdo a eu morfologia. Bl grupo I estaba constituido por f'acoe con cabeza hexagonal. 7 una cola con Taina contrl.ctil. Lo• f'ago• el• lo• clemú grupoe poee!1111 una cola no contrl.ctil, relativamente larga. pre•entando dit'erenciaa en eue cabezaa. 1 . Bl grupo II presentaba una cabeza hexagonal; el III exhib!a una cabeza polih6drica 7• en el grupo IV ee observaba una cabeza hexagonal con proyeccione• en forma de perilla. Ro ee advi.rtid correlacicSn alguna entre lo• eerotipo• O y K 7 •1 e•pectro l!tico de l.oe 1'-SO• 7 •e encontrcS que el grupo I era mú •en•ibl• al calor que loe otros grupo•• pue• ae inacti vaba totalmente al. exponerlo durante 30 minutoa a 55°0; loa dem6a lo haofan haeta loa 60°c. 144 a 'MIOLOGICOS frecuencia y distribución de los brotes epidémicos de la enfermedad causada por Vibrio parshaemolyticus correlacionan perfectamente con su ecología. Su incidencia se acentúa en los meses más cálidos del año, disminuyendo en los de invierno; este hecho exhibe un paralelismo total con la variación estacional del microorganismo (5). Sin embargo, aunque ésta establezca un ritmo determinado en Japón y los países occidentales, en otros como la India, dicho esquema no se presenta: ocurren durante todo el año tanto brotes epidémicos como casos esporádicos (51). Por otro lado, gtneralmente se ha asociado la infección por Vibrio parahaermolyticus al consumo de alimentos crudos de origen marino tal como sucede en Japón; no obstante, en países como la India, rara ves se acostumbra ésto y además se prefieren las es- pecies de agua dulce. En Calcuta se ha reportado que el 33.3% de los pacientes que sufren de infección por esta bacteria, no presentan en su historia clínica el consuso de peces en los 7 días previos a la manifestación de la enfermedad. En este sentido se había sugerido que la presencia de V. parahasmolyticus en esta región se debía a la marea, empero, Sarkar (159) descartó esta posibilidad debido a que estas áreas, en las cuales las muestras de plancton contienen a este nicroorganismo, no tienen confluen- cia con aguas marinas y son entidades independientes con fuentes de agus subterráneas. Puede pensarse que la introducción del patógeno en tales cuerpos cerrados de agua, se deba a casos am- bulantes o a portadores, ya que estas aguas se usan constantemen te para propósitos domésticos y ablucionarios; además, no se descarta la posibilidad de un reservorio extrahumano (51,159). 145 2. PBHOllBltOS Bl'IDBlllIOU> I S I.a ~ecuencia 7 ie ib .cidn e e rote• i 6 icoa 4• :terae4ad . ae4a or ibrio rahaeaolñi.cua r l i.on.n r:tect ente n a logf a. u i encia ee ntlla e ••••• 111'8 61i.doe •1 ilo, e i.niqendo e ele ierno; ete cbo hibe n r l l e o tal n Tal'iacidn et i Dal e1 a . r rcmai.aao ). in •• erp, .Dq\le 6eta at 1esca n .tllO t ina4o pcSD 7 a ai •• cidental••• D tr a o 1a dia, i llo equ-a o •• F••• tar u ren rante o •1 ilo to rot•• iel6aico• ao eoe •• r'4ico• 1). or tro o, pn ente a e ciado :teccidD or i.br:io araha- kt:i ue l suao ele l a nto• do• 4• ri en • aerillo l ao e cede cSn; o etante, ai••• ao :lndi.a, ra -• •• etwabra 6eto 7 e4emü •• r f'ieren s s- ecie• e ua lce. Bn alcuta •• b.a rt84o e 1 . 3" 4• a ciente• e •~•n e 'eccidn or ••ta acteria, DO r aentan e ist ria olt i.ca l llUlllO e aces • :f- rerio• &Dif'eatacidn 4• 'er eda4. Bn •et• e tielo •• abla erido e r aeacia e v. e e olz!i.cus eta :repdn •• ebia area, pero, arkar 9) eleecertd •eta eibili ad bido e •ñ- ~e-, 1ae o a1e• 1- 111&e tr- e ls oton nti nen ••t• mi.croor e :t.amo, DO e D f'luen- oi.a n 11&"88 mari~ 7 e n ti ad•• 4 endientee n :ruentee e ua a bterr6neae. uede near e e 1a . t cci.dn el td eno l•• :rpoe rr do• ele ua, •• ba - • - lantee rtu :ree, 7a e ••t- 8811- •• ean et e.e ara r pdeitoe deticoe 7 l cionarioe; em'8, o ee eca:rta si il .da4 ele n e rvorio a ano , 59). Ae:l.miamo, ee ha obaervado que en la :India, 1a enf'ermeclad a1'ecta tanto a grupos eetrict-ente veptar:lanoe como a 1oa no veget- r:l.ano•; '•to cueet:l.onar~a la teorfa de que la :l.npet16n de al:l.- •ento• ID&Z':Lnoe crudo• ee 1a causa pri.nc:lpa1 de gaetroenter:l tia por v. parahaemolYticu.. Por otra parte, e1 padecimiento a1'ecta pri.nci.pa1mente a 1a pob1ac:l.dn aoc:loecondmi.c1111ente m'8 pobre, que no parcia wenoa h6.bitoa de h:l.giene (51). Oon todo el1o, Barker (5) propuso que aon 3 loa aot:l."WO• med:l.ante loe cua1ea 1oa a1:l.mentoa contaaindoe pueden 1legar a adqui.rir ndmeroa auf':l.c:l.entemente a1toa de1 a:l.croorgan:lamo como para cauaar enf'enaedad en el humanos 1) QUe •• de3en a:l.n ref'r:l.gerar durante un largo perio4o antea 4e eu cocc:l.dn o :l.nceetidn. 2) QUe no ee cuezan 1o euf'ic:l.ente, 3) QUe ae recontaminen 4eepu6e de baberee coc:l.4o. 1 Con reepeoto a la f'a1ta de retrigeracidn, Bradahmr (30) real:l.zd un eatud:lo aobre laa te•peratur- de loe ref'r:lgeradorea r 1a auperv:l~no:la 4e v. pfEaha•mo1.yt:l.cll81 encontrd que en lo• ref'r:l- pradorea 4om6at:lco• 7 comero:la1ee 1a t-peratura f'luctda entre 4.4 7 12.sºo en un perio4o de 12 horaa permi.t:l.enc!o, en lllllohoa caaoa, no ad1o la auperv:lvencia del mioroorcant.emo a:l.no ~ncluao au aulti.p1icac:l.dn. Por otra parte, Vanderzant r N1cke1eon (194) obeerv9Z"on que cuando v. parabaemol;rt:l.cua •• encuentra presente en loe a11mentoa, puede aoportar temperaturaa de haeta 80º0; de ahf la :l.mportancia de coc:l.nar 1011 al:lmentoa durante el tiempo auf'ic:l.ente. 146 Otro factor que Barker (5) anal.iz6 fue •1 tiempo de generacidn de V. parahaemolzticu11 (9 a 1.1 minutoa); un in6cu1o inicia1 de 101. aicroor•aniemoa puede 11.egar a aer 4• 106 en un periodo de 3 a 4 bor-. A ••t• reepecto, Smith (166) reporta e1 c-o de1 •auabi" ;tapon'• (enaalada típica 4• arroz -, peecado), 1a cual ai •• iagiere •D el reetau.rant rara vez provoca la enferae4a4, pero ei •• ordena por tei•tono para que ••• entregmdo a domici- 1io 1a 4 .. ora pgede reeu1tar aur1ciente coao para alcanzar la doeia a!Diaa ~ectiva. BD baile a 1o materior, •• procedid a realizar una inveatigacidn con 1oa cocinero• que preparaban el "auehi" en la que a• obaer'Wd que 4• Abri1 a Octubre -'a de1 15'' •• "infectaben en foraa -in- to .. tica", eapero, dicha "infecci6n", deaaparecia durante 1oa ••••• de invierno. BD •et• c_o, SaU;h (166) acufl6 •1 t•naiao •eitcretor oont-1Da4o" , -,a que aunque eetoa portador•• no aani- fieatan eintoa_, excretan constantemente al microorpniemo. B1 conocimiento de 1a exiatencia de1 eat.ao aeintoa6tico de 1oa oocineroa ., otroa portador•• que pueden hacer 1aa vecea de foco infeccioao para 1a tranaaiaidn de 1oa microorgani-oa, ba origi- nado el eatableoimiento de encueataa epidem1o16gicae en vario• paf••• (166) incl~•ndo el nueetro. BD la ciwta4 de Puebla, ••xtco, el. grupo de eetudio encabeza4o por llolina Garcfa (125) determinó l.a frecuencia de anticuerpo• anti-Vibrio parahaemoly:ticue en div•r•- poblacionee de au;tetoa aeintom6ticoa que tueron ee1ecciona4oa 4e acuerdo a au ocupacidns de 100 peraonaa encarga4aa de expender alimento• a1 pdblico, lT aoetraban anticuerpoe ••r1coe contra el aicroorgui1amo. Ademú, entre loa diez iadividuoa que teniui m~or contacto con pro4uc- 147 to• derivado• del mar, c:Lnco manit'eetlll'On presencia de anticuer- po•: -imi•ao, en la poblac:l.dn general ee encontrd una hecuencia del 16.5"· Bato• dato• eusi,eren que en eete pafe 1 .. in~eccione• por v. parahaemolrticue .on aú f'recuentee de lo que co!lldnmente •• piensa. Por .u p~e, Kava Pern6ndes (131) realizd un estudio en la Ci11- dll4 de ••x:Lco; anal:l.zd 200 au.eetr- de ost:l.onee obtenid- en el pr:l.ao:l.pal aerollllo de peacll4o• 7 aari•Co• de la ciU4114 7 de 10 de elJ.- (5") a:l.•26 a v. par8h-mo17ticua. Cabe aenci.onar que en eeta c.iud&d no •• han reportado c-o• d• s-troenter.it:l.a d- b:l.d .. a ••t• a.icroorganieao, e:l.n eabargo, exieten auch .. poeibi- 1i411d•• de que eeto •• deba a que no •e coneidera, coao debiera aer, que v. parahaemobtic11t1 ea un iaportuate qente causal de ••ta en1'eraecl&d 7, por ello, DO •• le bu•que en 1- au.eetr- de mater:l.a t'ecal.. S:I. 114-ú •• toma en cuenta el hecho de que eata eepeo:I.• DO deaarrolla en ••dio• tal•• coao el Bndo 7 el JmB 7 lo hace pobremente en el McC0Dllce7 (62, 166), loa cual•• •• emplean para realizar loe coprocult:l."VO•, puede explicare• el mot:l.vo por el cual DO •• detecta 1a Tel'd.lldera incidencia de eete m.1croorga- m880, m. ad.a cuando cause brotes ep:l.dúicoe; ademú 1a antib:l.6- 'ticoterapi.a pre•cri ta en eu e-o •• 1a ai-a que ·~ emplea en aalmonelo•i•, eh:l.ge1oa:l.e 7 gaetroentel'i.ti• por E. éou enteropa- tdgena • .Antes de 1o•·acontecim:l.ento• de 1950 en Oellka, JapSn, DO •• con- sideraba que una bacteri.a eetuarina o aar1Aa pudiera ••r un im- portante llC•nte caueal de ..-troenteriti•: e:l.n embargo, en cuanto ae :Lnveatigd au preeencia, v. parahaemo1zticua ha 11e&*fo a colo- car•• grmualJllente como el principal ..-nte cau•al de este pade- cimi.ento en varios palees (J,138,108). 148 JCu4ob (108) realizcS wi exteneo traba;lo en JapcSn BObre la f'recuen cia de loe diBtinto• aerotipoe 7 eu relacidn con brotes epid6m1- coa •in encontrar aaociacidn alguna, Bet• becbo ae ba corrobora- do en otro• pala•• (24). Allimi.-o, Aaakalfa (2), al in'nstiaar la preaencia de Vibrio para- baemol.zticue en alimento• marino• que •• expenden en mercado•, reataurantea 7 botelea, encontrcS que el •icroorgani .. o eobreYive 7 prolif'era en tal•• ambientee, ei bien no pudo detectar una sola cepa U+. Oon reapecto a loa alimento• cont-inadoe, Süazald. (152) establ!. ce que para controlar la inf'ecoicSn en bumanoe, ba8ta aplicar al- gunaa medid- bipfnic- que eYitan la aultiplicacicSn del vibrio en loa alimento• 7 pre'Vi.enen cont-inacionea eecUDllarl-. J:su.al- mente datermiDcS el l!aite pera aceptacicSn del peacll401 1 z 104 ,mioroorganiaaoe por cada 100 e de carne; •in embargo, eate i!mit• no incllqe a mariecoe, en l.oe cual•• requiere ear determinado. A4em'8, ancontrcS una ee1irecba relacicSn entre l.- cuentae vi.abl•• de v. paraba-01.zticue 7 v. alpnolzticu11 por clllla l.00 cflul- del aegund.o exiaten 10 del primero; de eete dato ae deaprende que del recuen1io de v. al.pnclñioue puede eet1meree el grado de cont.ain11eicSn de l.o• alim•ntoe por v. parehaemol.zticua. Por otro l.ado, la reaccidn al f'encSmeno de ICmiac-• eipe eiendo uao de l.oe aepectoa mú enip,tiooe de Y1brio parüaemobticue (153,172,122). OriSinalaente ee bab!a poetulado que l.ae oepae JCP-, lae cual.e• ae encuentran generalmente en loe ali-ntoe, ee tranef'ormaban en U+ al puar por el tracto inteetinal humano. Sin mebargo, 149 loe exper:l.mentoe rea1izadoa para probar esta hipdteeia, tanto en an:l.•&i•• como en voluntar:l.oa hWDanoa, reeul taron :l.n1'ructuo- eo e1 •• adm:l.n:l.atraron cep- IQI- por ~a oral 'T en nin&dn caeo •• recobraron cepae trmieformad.ae a partir de laa hecee (5,77). Poeterio:naente, ae aoapechd que la preaenc:l.a de p1'8midoa en las ce11aa KP+ podrían explicar eeta eituac:l.dn. S:l.n embargo, en loa eatud:l.oa real:l.zadoe por Guerr,v (77) 'T Twedt (186) adlo se dete~ 'taron plúmidoe en a1gun- de laa cepam KP+ 'T nunca en laa KP-, pUdi.endo comprobare• ademú, que la curac:l.c5n de loa a:l.amoa, no mt'ectaba en 1'orma eiSDi1':1.cat:l.Ya la producc:l.dn de hemoliaina (77) n:I. la reacti~dad en el modelo del aaa 1:1.gada de conejo (186). Otro 1'endmeno :l.ntereaant• 1'ue el d•t•c'tado por Bllret'Tft (35): 61 comprobd que unaa cepaa mutante• eepontdn•aa auxotrdf:l.c- para C7a- 7 Az'g- de una cepa orig:l.nalaente JCP+, se man:l.1'eataron U- 7 la poater:l.or r•Tera:l.c5n a la prototrofia no •• acompllfld del retorao a1 1'enot:l.po orig:l.nal KP+. A eat• reapecto, •• ba augerido que alguno•· •l-entoa de :l.neercic5n en eecuenc:l.a (IS), como loa obeer...adoa en: algunaa mutac:l.onea de loe operonea gal. 7 lac en B. col:I., pud:l.aran eatar :l.nvolucradoe en la producc:l.dn de la h•- mol:l.a:l.na, actulmdo como 1'actorea de control o como parte del gene eet1'QCtura1. Zn ••t• ••nt:l.do, loa ••tfmuloa del medio embiente podrían :1.D1'lu:l.r en evento• de :l.naerc1c51V'•zc:l.a1dn de algdn elem•!! 'to IS que aobernara la expraa:l.dn del gene de la hemol:l.aina. Coao auoed• en alguno• a:l.atemae biol6g:l.coa, exiaten tranepoaonea que 1'on11m parte integral en 1a regulao:l.c5n d• un gene normal y c~o movim:l.ento depende de eati111Uloe ezternoa para que el microo,E gan:l.amo •• adapte a cembioa en el -biente. S:I. un mecaniamo aimi- lar ex:l.etiera en v. parü-mo1Yt:l.cua y gobernara la produccidn de hemolieina, podría peD8arae que a1 menos a1gunaa cepas KP- llev~ 150 r!an cr!ptic-•nte 1a 1n1'ol'lllaci6n gen6tica pera la produccidn de la he11011eina (35). Si. bien el t'endaeno JCanag.,a permenece sin exp11caci6n, cabe aeflal.ar un t'endmeao eiai.ler exhibido por otro grupo de Yibrioes 1oe no aglutinab1ea (NAG). Br1 •atoa, ee obeerYa 1o 11isW.ente1 aque11os aielemientoe obtenido• del medi.o aabiente preaent11n 'UD& reactivi.ded negativa a la prueba del ua 1igada de cone;to, ai.entru loe obtenido• a partir de hecea de paciente• 1a muestran poaiti."Wa (158a). Otra ob11erY11Cidn intereaente con reepecto al. t'endaeao K1111ac .. a ae deeprende de 1a admi.Diet:racidn del. ai.croorganiemo a aniaal.ea. Oluan ( 57) no encontrd di.fe:rencia alguna entre cep- ICP+ .,- D- en lo que ae ret'i.ere a aparici.dn de eintoaae .,- exc:reci.dn de1 ld.croorcmu.-o en hecea, al. 11.evar a cabo pruebae con perro• y gatoa. Del ai.-o aodo, .Aleo no pudo di:terenciar 1- cepae patd- genu de lae no pat6gen- en B1l8 experimentoe. Po:r otro ledo, ae ha obaervado que algun- cepae que reeu1tan patdgenae en el huaeno, llO muestren efecto alguno en el enimal. 7 viceversa ( 57) • 151 VJ::ll. DISCUSIOR Vibrio parahaemo1zticua exhibe una maplia diatribucidn en el orbe lo Óua1 ba pro-wocado que •• 1• dale en 4i:t,! rente• cl.iau, 4••4• ll&U- trop:l.oa1•• h-ta cuerpo• de ll&Ua :trla (pe•• a •u a1ta •en•ib1114-4 a 1- ba;lae tem- peraturu) • Bate hecho podr!a ezp1icllr8• en baB• a 1111 gran oapmc14-4 4• -4aptacicSD pu•• 1111-ú, au aeoci.aicSn con otro• ••r•• coao el plancton aef como con organi-o• .uperior-, ~·ciado 1ugar a que •e le obtenga incluao en agua 4ul.ce, eienclo UD aicroorguii.ao bal.6:tilo. SiD -bargo, 4icba capac14e4 4• e4aptaci6n puede eer el re.ultll4o 4e1 a:lelamdento ele eepecie• atlpic .. eetrech~ aente -pe.rente4.. con •1 'T que aon pr'°ticament• incli,! tiD&Ui.bl•• por ••tocio• convencioD81e•. Aef, eerla :tacti- b1e tener 'W'ari.88 eepecie• mgl'llpllll .. ba;lo una eo1a, dando ••ta dn:l.ca eepecie, 1& apariencia de ubicuidad. QQi•' eata ~ama eituaoidn sea responsable en cierta me- 4i4a 4• 1& ~i•4a4 ele efntomaa regietra4oe en di:terente• P"'IPo• 4• paciente• ademú del aecaniemo por el cua1 de••!! o.Sena 1a BD1'enae484 pu••• en -bo• o-o•, no •• ha llega- do a UD& ezp11cacidn eat:l.ef'actoria como t-poco lo ha e14o •1 :tendaeno ICanaB-a. 152 IX. CONOWSIONBS Con reepeoto a 1o• aapeotoe c•nerale• de v. pazollhaemol.rt;iouas 1. Be un aioroorganiaao al que ao •• 1e preata 1• debida ate.e cidn en 11•xioo, no obet11nte que en un aignit'ic..tivo ndmero de aexioeno• ae han pue•to de manifte•to anticuerpo• ••ri- co• 'T de que .. 1• ha detectado en 1.. ._u.. de nueatroe meree 7 en 1o• aliaento• que de e11 .. obteneaoe. 2. .. un habitante tfp~co de 1oe ••tuario• en ou,ya eco1ogfa d••-pefla una :tuncicSn ralevante, aunque t;-bi4n puede de- tectara• en otroa ambientea acu&ticoa. 3 ... una bacteria ar--neptiYa, haldt'i1a 'T •••dt'i1a (aunque deearro11a a temperaturaa que ~ dead.e loa 9 beata 1o• 44º0) 'T 01VO pR cSptiao ea de 7.5 a 8 (-pero, puede repl'2, duo:iree an un ranao de 5 a 11) J preaenta t1apbci6n •ixta 7 au ti-po de generacidn var1a coadiment• entre 9 7 11 llimlto•. Por 10 que ae ret'iere al di-cndetico de 1ae gaatroenteriti• d•bid.. a Vibrio parahaemolz!icuas 1. Para et'ectuar e1 a1•1-iento de1 m:lcroorgan:Leao a partir de mueetr .. de materia t'ecal, 1o• medio• d~ enriquecimiento dptimo eon e1 8BQ& peptonllda •alina alcalina, e1 caldo de •onll\U', e1 medio de Jrriatenaen, e1 medio de JC-p•lmacher 7 e1 ftB adicionado de 71' de NaOl t aai111iamo, loa medio a 153 eelectiwoe en placa m6s adecuado• llOD el 1'0JIS adiciona4o de NllC1, el WA, •l AA.O y el de hed1; 7 No-lli con 7" de N.01 1' l" 4• alai.tdn de mda. 2. aa cuanto • 1u pru•b- bioqu!mic- que •• empleen para la i4ent11't.caci6n 4•1 microor.-ntBllO, 4•b• con•14eraree •1 cu84ro propaeeto por Hup ., Süuald., para reducir coño• p ti-po •in que •• d1••1n'IJil'& la con:fiabilidll4 dw lo• r•- aul.tll4o•. Por lo que toca • la patogenicic!ad del microorgani•o, lo• dnico• f'ac1iore• detectado• a 1• :techa eon la h..Olieina ter- moeatabl• directa (re•poaeabl• del t'encSmeao 4• ltanagmra) ., au capacida4 4• adherencia, la cual •• 4etermin11Dte para eu inTaai'Yi4a4. Sin -bareo, ao debe 4e11cart;&r8e 1• poei'biU.4e4 d• que produzca a1auzaa otra toxina ., de que 1a clApeula tenca propiedad•• 1111ti:t-cocitar1u. Sobre eu. pa'tologf as 1. La enf'e:rae4a4 principal con 1• que 11e relaciona •• la s-- troenteri ti•, la cual origina eíntomae divereoe dependiendo de 1a cepa, la ree:l.•'&encia del. hu•eped 7 el ndmero de microoz Bani•llO• :l.nger14oa. 2. loe diterent•• grado• de Yirulencia ob11ervado• entre la• di_e tint.. oepaa aiel-4- ele pac:Len1;ea ., 1- variacionee en el ten6me110 de IC9Dag-a, perecen re:torzar la hipdteeia de qu.e ex:l.ete todo un e11pectro de vibrioe marino• lllUlr' relacionado• capacee de causar enf'ermeda4 en el humano. 154 3. loe •isaoe mAe frecuentee en la gaetroenteritie eon la diarrea, el dolor abdominal, l .. n6ueeae 7 el vdmito. 4. No obetente que en la ·~rfa de lae Yecee 1.. leaionee e618 ~eotllll a1 tracto intestinal, exieten e'ñ.denciu de que en 18• caeoe •68 eeveroe otro• 6rS11DO• 7 11e;t1doe, in- C11Q'endo el corazdn, pUeden vera• 1nvolucradoe. 5. .Aunque con m.Q" ba~a 1'recuenc1a, ee ba encon'tredo que puede prowoer peaoftalmi 'tie, oti ti• 7 sencrena • .&ceroa de eu ep1demiol.ogfa1 l • .Aunque la •qor 1'recuencia de enYenea.mtentoe alimentario• •• ba preeen'tad.o en el Japdn, en doDll!e mAe ee aooetuabra oonllUllir peeclldo cru4o, 7a e• han 4etec'tado o-o• :L•port119 tea en todo el mundo; de hecho, 7a •• reconoce que Vibrio p!raha•mol.Tt;1cue ea uno de lo• principal•• agelltee etiold- gi.co• de gaetroenter1tie en to4o el.orbe. 2. La mAe ele'VWla 1Dc14eacia de petroenteriti• debidae a eete m:Lcroorpni.-o •• preean'ta en loe •••e• ~n que lae temper.,_ turae eon aú altu; ein .. bargo, en ciertae regionee exiate UD p-en ndaero de o .. oe durante todo el ailo. 3. loe portador•• ae1n'to•6ticoe 4ee .. peflan un papel impor'tan't• en la tran-1e:L6n 4•1 microorganiemo1 no obetante, la ent'eJ: me4ad ee ad.qui.ere mú 1'recuentemen't• por la ingeetidn de ali.mento• 4e1 mar que no han e14o re1'rigeradoe 7/0 coc1doe dptim-ente. 155 Refir1•ndoe• a lae ••didae que deben tomare• en nueetro pafe, •• 1aport1mt• deetaclll" la neceeiclad de incorporlll" loe ••todo• mi.crob1ol6g1coe t•Ddientee a detectar la preeencia de Vibrio parllbae110lz!icua tanto en loe alimento• ooao en 1- aa• et:r- cl:IDio-1 -iaiemo, •• con-Diente eetabl•c•r enou••t- ep1- 48111ol6sic- 1o eu1'1c1entement• repreeentati,,... Bl.lo condu- oi:r:la a deteraiaar 1a •erdllllera inciclencia de ••t• aicroor~ nillmO 7 a 1Det1tuir la te:rap•utica lllleoulllla. 156 X. A JI 8 X O S Pep1;ona ll.C1 10 " 10. 1000 •1 8.6 - 9.0 n medio ae diatri.b\qe en cantidades 4• 10 al 7 •• esteriliza a 121°c du- rante 15 minutos. llt1 e1 medio •• inocula una muestra de 0.5 g ó 0.5 - 1 ml 4• heces 7 •• incuba a 35 - 37°C durante 6 a 8 hf observando eate tiempo de incubacidn •• previene el aobredeaarro11o de o11rae bact•ri.- de la nora t'ecal. (153). 157 CALDO DB llONSUR Cloruro de Sodio Taurocolato de Sodio carbonato 4• Sodio pH 10 " 10 " 5 " l g 1000 •l D••pu6e de ••terilizar el ••dio en 1mtoolave a l2lºc durmite l.5 minuto•, •• asr•sa tel.urito de potaeio a una concentraci6n ~i­ nal. de 11100,000 (153). 158 Bxtrac1;o de l.evadura 3 g Peptona 10 g 1'.Cl. 20 g Polimixina B 250 J1B H20 l.000 ml. pH 8.6-9.0 Bl. -d:l.o ae dia1;ribU7• en cantidades de 10 ml 7 ae eateriliza en 81.ltocla'Ve a i21°c durante 15 m:l.nutoa. Cada tubo ae inocul.a con. 1 g d 1 al. de muestra 7 ae incuba a 35-31°0 durante 8-12 h (153). l.59 e.u.no AZUL AGUA - AllARILU> ALIZARINA Pep'tona Sacaroea Cloruro de Sodio AZ\11 Agua Amarillo A11zar1na Teepol. pH 10. 10. 30 • 0.02 • 0.02 g 2.0 ml 1000 ml Bl. medio ee d1str1bu7• en can'ti- dadee de 10 ml 7 •• ester1l.1za a 121°c durante 15 minu'tos (19). 160 CALDO l>& HOIU& l'•ptoaa 5 g 8xtracw de carne 3 g 01oruro 4• Sodio 30 g Asul. 4• Bromo~imo1 0.03 g V1o1eta 4• ~ilo 0.001 g Arabinoea 5 g Agua 1000 a1 pH 9.0 I.a eo1ucidA de arabinoea •• ••t•ri.- 1i.ca por ~11tracidn 7 •• agrega .. 6P- ticemente a1 medio 'b&Bal. •1 cual. PI".! Yi.-ente •• ha •ñ•r111zado en auto- c1a•• (117). 161 .&O.AR 1' C B S Bztraoto el• LeYlldura :Peptona Sao aro ea 1'io1111l.:tato el• Soelio Citrato ele s·oelio Col.ato de Soelio Billa el• bue;y Cloruro ele Sodio Citrato Hrl'ico A8ul. ele Timol. A&u1 ele Bro.atimol .&car .&&ua cleat1l.a4a pH 5 g 1.0 • 20 B 1.0 • 1.0 • 3. ,. 10 g l.g o.o4 • 0.04 • 15 B 1000 •l 8.6 B1 .. elio •• calienta haata diaolYer 1oe ingredientee, •• en1'rfa a 45ºC ;y •• 4i.!! tri~• en ca~- el• PetriJ no cleb• ••t.! riUzaree en autoclave (l.53). 162 AG.All DB WAGATSUllA Bxtracto 4• levadura 3 s llactopeptona 10 g · Cloruro d• Sodio 70 g IC~4 5 g Aca:r 15 g R~ 1000 .•1 Deepu6e de disolver loe ingredientee (debe evitare• la eeter111zac1dn en autoclaTe), •• 114P"ega manJ.tol a una concen'trmci.dn ftnal d• 1", aef como crie'tal viole'ta en eolucidn al.cobdlica (al O.l") a una concentraci.cSn de 0.1". De 1.SQal modo •• adi.ciona eansre de- :t:l.br1Da4a de cone30 o de hWllano (o una llWl- peneidn eal.ina de hemat!ee) al "' (122). 163 Bxtrecto 4e Carne 5 • Peptona 10 • Sacaroaa 10 • Cloruro 4• Sodio 20. ~eepol 2.0 •1 AZul. de Bromotimol o.os • Agar 15 • Agua 1000 •1 pH 7.8 B1 medio ee e•teriliza en au1;oc1ave a 121°c durante 15 llinu.to•. En mucho• e-o• •e ha •Ubati tu:(c!o •1 THpo1 por Ter~tol 7 (0.1 m1) debido a eu gran eetab111da4 (153). 164 AGAR DB KOURANY Tripticaee Soya Agar Cloruro de Sodio Sacaro11a Sa1e• 811.iare• So1uc16n de Cloruro de Trifeniltetrazolio al 1~ pR 40 g 25 g 20 g 0.5 g 3 m1 1000 a1 7.1 Bl med.io •• ••teriliza en autoclave a 121ª0 durante 15 minuto• (104). 165 AGAR ft~!reepo1 MODI PJ:CAJX> Extracto de carne Peptona R.C1 Ra2BP04 •12 H20 SacU"Oea G1uco•a ~eepo1 Agar Noble Acu1 de Bromotimol Hz-pura de Bromooreeo1 .Antihemolie:i.na Agua pH 5 g JO g 40 g JO g 20 g 4 g 2 al 15 g o.os g 0.01 g 50 m1 1000 ml e.o Para la prueba de :l.aaunohalo, el euero antihemolie:i.na (con un t1tulo de ls J2), ee mezcla con el medio eeteril:i.zado en aitoc1ave, cuando este áltimo ee ha.Y• en:trtado a 50º0 (8J). 166 AGAR DB ~BR Peptona Extracto de l.e..-.dura 'lrtpt.ona Cl.oruro de So4to sacaroea Lacto•• •.m.tol. Cl.orbi.dra'to 4e Arpnina Ci. trato de ._,Di.o P4rrtco '11.oeul.~ato 4e Sodi.o Pdrpura 4e Bromocreeol. AC&r Agua pH 5 g 3 g 10. 30. 20. 20 • 1 • 5 g 0.5 g 0.3 g 0.02 g 13.5 • 1000 m1 6.7 .i .. c110 •• 41.strt~e en can'ttdades 4e 5 al. ~ se es'teri.l.tza en au'toc1ave • 12100 durante 12 miau.to•. Ioe tuboe •• de~an •~ri.ar en poei.ci.dn tnc1tneda ~. una •ez que ee han tnocul.a4o, se tncuban a 35ºC d.urante 18-24 hor- (99). 167 XI. BIBLIOGRAFIA l.. Arcos, J .ll., Del. Moral., A. and Reparaz, J. s "The pre sene e of hal.ophilic vibrios in watere of Navarra (Spain), very dietant from the sea". Int. Symp. on Vibrio parahaemolyti- ~· Pujino, Sakaguchi, Sakazeki, Takeda, Bds., Saikon Publ.. Co., Tokyo, 77-81, 1974. 2. Asakawa, Y., Akahane, s. and Noguchi, JII. s "Quantite.tive studiee on Pol.l.ution with !!!!!'.!2. parahaemol,yticus, during distribution of Pieh". Int. Symp. on Vibrio parahaemolyti- cue, Pujino, SakBB11Chi, Sakazaki, Talceda, Ede., Saikon PUbl.. Co., Tokyo, 97-103, 1.974. 3. Atthaeampuna, P.1 "Vibrio parehaemol.yticus food poisoning in Tbail.and". Int. 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