UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMÉDICAS INSTITUTO DE NEUROBIOLOGÍA PARTICIPACIÓN DE LOS RECEPTORES QUE ACTIVAN LA PROLIFERACIÓN DE PEROXISOMAS (PPAR) EN EL EFECTO ANTIPROLIFERATIVO DEL YODO MOLECULAR TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: DOCTOR EN CIENCIAS PRESENTA: C.D. MARIO NAVA VILLALBA DIRECTORA DE TESIS: DRA. CARMEN Y. ACEVES VELASCO INSTITUTO DE NEUROBIOLOGÍA, UNAM COMITÉ TUTOR: DR. EMILIO ROJAS DEL CASTILLO INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS, UNAM DR. MANUEL B. AGUILAR RAMÍREZ INSTITUTO DE NEUROBIOLOGÍA, UNAM JURIQUILLA QUERÉTARO, MARZO 2017 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. Este trabajo se realizó en el Laboratorio de Metabolismo Energético del Instituto de Neurobiología del Campus Juriquilla de la Universidad Nacional Autónoma de México, ubicado en Juriquilla, Querétaro; bajo la dirección de la Dra. Carmen Y. Aceves Velasco. Este trabajo fue financiado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) 176911 y por el Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT) de la UNAM 201516 Mis estudios de doctorado fueron apoyados a través de la beca otorgada por el CONACYT número de registro: 215708 / 254015 (CONACYT / CVU). DEDICATORIAS A la mujer que me dio la vida y quien ha estado a mi lado librando todas mis batallas. Gracias Mamá, gracias Inés A mi hermano Sergio Luis por haberme enseñado a vivir otra vez. Te extraño siempre A ti Silvia por hacer de mi vida un mundo de alegría A mi hermano José Luis por regalarme en mi niñez, su ejemplo A toda la gente honesta de este país que no se dejará vencer por la triste realidad, ni por la miserable actitud de nuestros gobernantes, México es y será grande, estoy convencido AGRADECIMIENTOS A la UNAM y al pueblo de México por darme la educación que ahora tengo y por representar los anhelos más nobles de mi existencia. A la Dra. Tana por confiar en mí, por prepararme y permitirme cumplir el objetivo de formarme como investigador. A los miembros de mi comité tutorial Dr. Emilio Rojas del Castillo y Dr. Manuel Aguilar Ramírez por su apoyo académico y orientación continua. A la Dra. Mercedes Aguilar por regalarme su tiempo tan valioso y ayudarme a entender los métodos que trabajé. Con especial cariño y agradecimiento a Guadalupe Delgado, a pesar de tu ausencia, vives en todos los logros del laboratorio y en hermosos recuerdos de ahora maestros y doctores. A los Técnicos Académicos Jaime Pérez Trevilla, Martha Carranza, Andrés Falcón Alcántara, Adriana González Gallardo y Ángeles Edith Espino Saldaña por su apreciable apoyo técnico, paciencia y toda su amabilidad. A los laboratoristas Felipe Ortíz, Antonio Prado Galán, Juana Cárdenas Luna, por su apreciable apoyo y compañerismo. A mi padre Mario Nava, porque nada me faltó cuando estuviste y por enseñarme a ser fuerte. A Pepe Ávila por enseñarme a desprenderme de lo material y hacer de mi estadía en Querétaro una verdadera etapa de mi vida. A mi amiga Beatriz Aldape por tu guía, tu ejemplo, tu confianza, apoyo y por creer en mi. A mis mentores Dr. Valverde, Dra. Maricela Luna, Dra. Brenda Anguiano y compañeros de laboratorio Elvira Nuñez, Laura Vega, Aura Moreno, Yunúen Alfaro, Evangelina Delgado, Alexander Bontempo, Irasema Mendieta, Lizbeth Trejo, Susana Sosa, Paloma Olvera, Nuri Aranda por compartir aquel tiempo maravilloso. A mis amigos Ismael Gimate y Mariana Hartasánchez, Pepe Zamudio y Daniela Ávila, Miguel Mendoza y Ana Rivera, Néstor Nazario, Francisco Carmona, Ximena Castillo, Benjamín Velarde, Eduardo Sánchez-Mejorada, Angélica Hernández, David Arredondo, Mariana Ramos, Daniel Ríos, Karla Vega, Eduardo Rojas, Daniel Morales por caminar juntos en aquellos tiempos. A mis complices Janett Soriano, Gerardo Meza, Fabián Ocampo y Marco Torres por haber creado durante mis años de doctorado, lo impensable, saben a qué me refiero. A mi familia Cuauhtémoc Jiménez, Maricruz Villalba, Jorge Villalba; Elisa Victoria y Violeta González, Celtzin Nava, a mi familia Arriaga (Omar, Reyna, Samantha y Azul), a Tomás. A mis nuevos amigos Miguel Padilla; Cesar, Claudia y Grecia por todo su cariño y confianza. A Perlita por ser la luz en aquellos días de oscuridad. A mis amigos distantes Edgar, Bety, Santos, Ángel, a los que me faltaron y como no, al Pere también. Cuando volteo, los veo a todos y sé que soy muy afortunado. INDICE RESUMEN ........................................................................................................................................... 1 ABSTRACT ......................................................................................................................................... 2 INTRODUCCIÓN................................................................................................................................. 3 MARCO TEÓRICO .............................................................................................................................. 4 Glándula mamaria ........................................................................................................................... 4 Cáncer mamario .............................................................................................................................. 6 Epidemiología del cáncer mamario en México ............................................................................... 9 Factores de riesgo ........................................................................................................................ 10 Factores de protección (la dieta, ingesta de yodo) ....................................................................... 13 Yodo .............................................................................................................................................. 16 Transformación de ácido araquidónico (AA) a 6-yodolactona (6-IL, 5-hidroxi-6-yodo-8-11-14- eicosatrienoico-δ-lactona) ............................................................................................................. 18 Receptores Activados por Proliferadores de Peroxisomas (PPARs, Peroxisomal Proliferators- Activated Receptors) ..................................................................................................................... 19 Asociación de PPARs y cáncer, participación en neoplasias malignas de mama. ...................... 20 ANTECEDENTES ESPECÍFICOS .................................................................................................... 22 HIPÓTESIS Y OBJETIVOS ............................................................................................................... 22 Hipótesis ....................................................................................................................................... 22 Objetivo general ............................................................................................................................ 22 Objetivos específicos .................................................................................................................... 23 MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................................. 23 Materiales ...................................................................................................................................... 23 Cultivos celulares .......................................................................................................................... 23 Identificación de 6-IL y su sustrato en células normales y tumorales, tratadas o no con I2. ........ 24 Síntesis de 6-IL (5-hidroxi-6-iodo-8-11-14-eicosatrienoico-δ-lactona) ..................................... 24 Extracción de lípidos de cultivos celulares y metanólisis alcalina de extractos lipídicos para la obtención de AA total ................................................................................................................ 26 Identificación de AA por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, High Performance Liquid Chromatography) en fase reversa ................................................................................. 26 Extracción lipídica de células tratadas con I2 para análisis en cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS, Gas Chromatography – Mass Spectrometry) 26 Identificación de 6-IL y 14-IL por GC-MS ................................................................................. 27 Efecto de la 6-IL y la 14-IL sobre la proliferación de células MCF-7. ........................................... 28 Participación de los PPARγ en el efecto antiproliferativo y apoptótico de la 6-IL ........................ 28 Determinación de la proliferación de células MCF-7 tratadas con 6-IL y el antagonista para los PPARγ GW9662 ....................................................................................................................... 28 Determinación de la inducción de apoptosis por citometría de flujo en células MCF-7 tratadas con 6-IL y GW9262 (antagonista de los PPARγ) ..................................................................... 29 Sobreexpresión del isotipo gama de los PPAR a través de la infección de adenovirus recombinantes .......................................................................................................................... 30 Inducción de la expresión de FASN para confirmar la sobreexpresión funcional de los PPARγ .................................................................................................................................................. 34 Determinación de la proliferación celular y apoptosis en células MCF-7 infectadas por AdPPARγ y tratadas con 6-IL y GW9262 ................................................................................. 34 Generación de línea celular estable con silenciamiento de los PPARγ ................................... 36 Determinación de la proliferación celular y apoptosis en células MCF-7 RNAi-PPARγ, Scramble-PPARγ y WT tratadas con 6-IL................................................................................. 39 Efecto de la 6-IL sobre la migración celular. ................................................................................. 41 Evaluación de la participación de la vía extrínseca de la apoptosis en el efecto apoptótico del I2 y la 6-IL. ........................................................................................................................................... 42 Análisis Estadístico. ...................................................................................................................... 42 RESULTADOS .................................................................................................................................. 43 Las células neoplásicas MCF-7 contienen mayor cantidad de AA que las células de fenotipo normal MCF-12F ........................................................................................................................... 43 Síntesis y purificación de yodolactonas ........................................................................................ 45 La 6-IL y la 14-IL inhiben la proliferación de células MCF-7......................................................... 47 El bloqueo de la activación de los PPARγ endógenos por el antagonista GW9662 inhibe los efectos de la 6-IL ........................................................................................................................... 49 La sobreexpresión de los PPARγ exacerba el efecto antiproliferativo y apoptótico de la 6-IL; sin embargo, estos son bloqueados por el GW9662 ......................................................................... 51 El silenciamiento de la expresión de los PPARγ bloquea el efecto antiproliferativo y apoptótico de la 6-IL ............................................................................................................................................ 54 La 6-IL inhibe la migración de células MCF-7, sin embargo, este efecto se ve bloqueado cuando hay silenciamiento de los PPARγ ................................................................................................. 54 La 6-IL no activa la vía extrínseca de la apoptosis ....................................................................... 57 DISCUSIÓN ....................................................................................................................................... 58 CONCLUSIONES .............................................................................................................................. 62 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................................. 63 ANEXO I ............................................................................................................................................ 69 Nava-Villalba M, Aceves C. 6-iodolactone, key mediator of antitumoral properties of iodine. Prostaglandins & Other Lipids Mediators 2014;112:27-33. doi:10.1016/j.prostaglandins.2014.07.001. ANEXO II ........................................................................................................................................... 76 Nava-Villalba M, Nuñez-Anita RE, , Bontempo A, Aceves C. Activation of peroxisome proliferator- activated receptor gamma is crucial for antitumoral effects of 6-iodolactone. Molecular Cancer 2015;14:168. doi:10.1186/s12943-015-0436-8. ANEXO III .......................................................................................................................................... 87 Índice de figuras y tablas. 1 RESUMEN El yodo molecular (I2) tiene efectos antiproliferativos y apoptóticos en modelos de cáncer tanto in vivo como in vitro. Se piensa que estos efectos son mediados por un derivado de la yodación del ácido araquidónico (AA), la 6- yodolactona (6-IL) y uno de los mecanismos propuestos es que la 6-IL activa el isotipo gama de los Receptores Activados por Proliferadores de Peroxisomas (PPARγ). Además de su papel clásico en mantener la homeostasis de lípidos y glucosa, estos receptores han sido implicados en la inhibición de procesos carcinogénicos. El objetivo de este estudio fue determinar si los PPARγ participan en los efectos antiproliferativo y apoptótico del I2 y la 6-IL sobre la línea celular de cáncer de mama MCF-7. Nuestros resultados muestran que las células neoplásicas MCF-7 tienen mayor cantidad de AA que las células epiteliales de fenotipo normal. Los efectos antiproliferativo y apoptótico generados por la 6-IL requieren la activación de los PPARγ. Adicionalmente, los ensayos de cicatrización de herida mostraron que la 6-IL es capaz de inhibir la migración de células MCF-7 y que los PPARγ juega un papel dentro de este fenómeno. Finalmente, los datos obtenidos excluyen la participación de la vía extrínseca en la apoptosis inducida por 6-IL o I2. Estos resultados apoyan el mecanismo previamente planteado en el que los efectos antitumorales del I2 son mediados por la 6-IL y fortalecen la propuesta del uso del I2 como un coadyuvante en el tratamiento del cáncer de mama. Palabras clave: yodo, yodolípidos, yodolactona, yodocompuestos, cáncer 2 ABSTRACT Molecular iodine (I2) exhibits antiproliferative and apoptotic effects on in vivo and in vitro cancer models. These effects are thought to be mediated by an iodinated arachidonic acid (AA) derivative, 6-iodolactone (6-IL), and one of the proposed mechanisms is that the 6-IL activates Peroxisome Proliferator-Activated Receptors type gamma (PPARγ). These receptors have been implicated in the inhibition of carcinogenic processes, in addition to their classical role in maintaining lipid and glucose homeostasis. The aim of this study was to determine whether the PPARγ participates in the I2/6-IL antiproliferative and apoptotic effects on the mammary cancer cell line MCF-7. Our results show that MCF-7 cells have a greater amount of AA than epithelial normal cells. The antiproliferative and pro- apoptotic effects generated by the 6-IL require the activation of the PPARγ. In addition, wound-healing assays show that the 6-IL is able to inhibit MCF-7 cell migration and that the PPARγ plays a role in this phenomenon. Finally, the data exclude the participation of the extrinsic apoptotic pathway in 6-IL- and I2-induced apoptosis. These results support the previously proposed mechanism, in which the I2 effects are mediated by the 6-IL, and they provide further support for the use of the I2 as coadjuvant in breast cancer treatment. Key words: iodine, iodolipids, iodolactone, iodocompounds, cancer 3 INTRODUCCIÓN El yodo molecular (I2) pero no el yoduro (I-) o las hormonas tiroideas exhiben efectos antiinflamatorios, antiproliferativos y apoptóticos en patologías tanto benignas como malignas de las glándulas tiroides, mamaria y prostática. En el cáncer mamario, el efecto apoptótico del I2 se ejerce activando tanto la vía Bax- caspasas como al complejo AIF/PARP-1. Sin embargo los componentes celulares que median dicha respuesta aún se están explorando. Nuestro laboratorio ha propuesto la formación de un yodolípido conocido como 6-yodolactona (6-IL) que se deriva de la yodación del ácido araquidónico (AA). Este yodolípido tiene un potente efecto antineoplásico en diversos tipos celulares normales y cancerosos y se ha detectado su presencia en tumores mamarios de ratas suplementadas crónicamente con I2. También se ha mostrado que la 6-IL se une de manera específica y con gran afinidad a los receptores PPAR. Estos receptores pertenecen a la familia de receptores nucleares y aunque en un principio se relacionaban al metabolismo de lípidos, ahora se conoce que también participan en numerosos procesos tanto fisiológicos como de carcinogénesis. Se han descrito tres isoformas de PPARs: PPAR, PPAR/, y PPAR. Estos receptores son codificados por genes independientes, su expresión en tejidos es diversa y en general se asocia a los PPAR y PPAR/ a procesos de proliferación mientras que a los PPAR a diferenciación y apoptosis. Este trabajo demuestra mediante técnicas de sobreexpresión y silenciamiento, que el efecto antiproliferativo y apoptótico de la 6-IL está mediado por la activación de los receptores PPAR. Estos estudios permiten proponer al yodo molecular como un elemento adyuvante en el tratamiento de cáncer mamario humano. Sus efectos antiproliferativos y diferenciadores sugieren su posible utilidad incluso en procesos cancerosos avanzados. 4 MARCO TEÓRICO Glándula mamaria La glándula mamaria es una glándula exocrina que se presenta de manera exclusiva en los mamíferos, forma parte del aparato reproductor femenino y mediante la síntesis y secreción de distintos elementos, nutre y protege en sus primeras etapas a los neonatos. Morfofuncionalmente está constituida por dos componentes: el parénquima (representado por su epitelio secretor y por el sistema de conductos) y el estroma (constituido por cúmulos de tejido adiposo, septos y ligamentos de tejido conjuntivo, vasos sanguíneos y vasos linfáticos, además de filetes nerviosos que reciben los estímulos periféricos y otros que controlan la inervación autónoma del epitelio). Su componente epitelial proviene embriológicamente del ectodermo, mientras que su estroma se origina del mesodermo, aunque su desarrollo obedece a una inducción recíproca y remodelación conjunta. El desarrollo del tejido mamario es multi-etapas; en su fase embrionaria el tejido epitelial prolifera hacia el mesénquima en forma de un brote, seguidamente se ramifica formando un sistema de conductos rudimentarios el cual detiene su proliferación y se mantiene quiescente a partir del nacimiento. En la pubertad, la proliferación y elongación del árbol ductal se vuelve a activar bajo la inducción de hormonas sexuales, pero no es sino hasta el embarazo y la posterior lactancia, que se diferencia completamente formando estructuras alveolares y transformándose en un órgano lacto-secretor. Es importante resaltar que este órgano tiene la capacidad de regresar a un estado inactivo después de la lactancia y puede ingresar a un ciclo de expansión y regresión durante posteriores embarazos en la vida reproductiva de la mujer. Su función concluye al entrar a un estado de involución en la etapa post-menopáusica (Fig. 1) (Hassiotou & Geddes 2013; Inman et al. 2015). 5 Desde el punto de vista histológico, el parénquima epitelial mamario está dividido en dos poblaciones: el epitelio secretor y el epitelio ductal, ambos están rodeados por una tercera población de células denominadas mioepiteliales. Estas células junto con el músculo liso que rodea a los conductos galactóforos están encargadas de la expulsión de la secreción láctea proveniente de los alvéolos. El mantenimiento del tejido epitelial mamario, su proceso de diferenciación puberal, así como el ingreso a los ciclos de expansión y regresión está controlado por Figura 1. Desarrollo multi-etapas de la glándula mamaria. A. El análogo mamario ya está presente en el nacimiento y permanece quiescente hasta la pubertad. B. Bajo el influjo de hormonas sexuales se activa la proliferación y ramificación del árbol ductal hacia el estroma mamario, guiado por los brotes terminales estratificados (TEB, por sus siglas en ingles). En roedores, los TEBs tienen células “capuchón” que las rodean. C. La glándula mamaria virgen está constituida principalmente por un sistema de conductos con células internas luminales y externas mioepiteliales, así como lobulillos inactivos. D. En el embarazo hay una expansión y diferenciación de células alveolares a partir de las zonas luminales (se ha propuesto que es a partir de células madre progenitoras presentes a intervalos regulares sobre la longitud del árbol ductal), los nuevos alveolos ocupan casi la totalidad de los cojinetes adiposos del estroma. E. Al término de la lactancia se desarrolla un estado de involución y reconfiguración de la matriz extracelular y la glándula mamaria ingresa a un estado de reposo (modificado de Inman et al. 2015). 6 células madre mamarias y sus progenitoras, las cuales al parecer se encuentran insertadas en distintos nichos de todo el sistema alveolo-ductal (Hassiotou & Geddes 2013; Inman et al. 2015). Cáncer mamario El cáncer de mama (CaM) es un término genérico el cual se refiere a un grupo heterogéneo de neoplasias malignas que afectan a la glándula mamaria en su conjunto, tanto a su tejido epitelial como al estroma. De éstas, aquellas que se derivan del epitelio o también denominadas carcinomas mamarios (en realidad, adenocarcinomas por su origen glandular), son las más frecuentes constituyendo alrededor del 95%. Los carcinomas mamarios tienen distintas variantes clínico- patológicas, y actualmente se están reclasificando hacia variantes moleculares (discutidas más adelante) debido a que se ha demostrado que tienen un comportamiento biológico y respuesta diferencial al tratamiento (Kumar et al. 2015). Al igual que en otras zonas anatómicas, la evidencia actual apunta a que existen lesiones predecesoras de las formas invasivas de cáncer mamario. Entre ellas las más importantes son el carcinoma ductal in situ y el carcinoma lobular in situ (DCIS y LCIS respectivamente, por sus siglas en ingles). Es importante mencionarlos ya que gracias a los sistemas de monitoreo por mastografía en los sistemas de salud pública en distintos países, la identificación de estas lesiones se ha mejorado y actualmente representan cerca del 30% de los carcinomas mamarios (EUA y Reino Unido), en México lamentablemente representan menos del 2% (Mohar et al. 2015). Los caracteriza la particularidad histológica de conservar integra la membrana basal del epitelio afectado y su perfil molecular es semejante al de los carcinomas invasivos. Sin embargo, tienen un comportamiento biológico bastante benévolo, su respuesta al tratamiento quirúrgico y por fármacos es bastante exitoso; el restante 70% de las lesiones malignas de mama lo integran los carcinomas invasivos. La clasificación actual de la OMS (Lakhani et al. 2012) considera dos grandes grupos: el carcinoma invasivo de “tipo no especial” (NST, 7 por sus siglas en inglés) y los subtipos especiales. El carcinoma NST es la variante más frecuente de cáncer mamario (~70%), y anteriormente fue conocido como “ductal” o “lobular”, esto fue empleado para intentar establecer subgrupos tanto de carcinomas in situ como invasivos, en base a su aspecto histológico y a partir de su probable origen. Sin embargo, actualmente todo apunta a que todos los carcinomas de mama provienen de la unidad lóbulo-ductal terminal (Kumar et al. 2015). Los subtipos especiales (~30%) son descritos separadamente ya que desde el punto de vista molecular, microscópico y de respuesta al tratamiento difieren de los carcinomas NST y están representados por los tipos lobular, mucinoso, tubular, papilar, micropapilar, apócrino, medular, secretorio e inflamatorio, por mencionar los más característicos y relativamente frecuentes de este subgrupo. Pero lo más relevante hoy en día es que las características moleculares de los carcinomas invasivos, determinan de manera importante los protocolos de tratamiento y el pronóstico de los mismos. Se reconocen en este momento, tres subtipos moleculares (Lakhani et al. 2012; Kumar et al. 2015): 1. Receptor de estrógenos positivo/HER2-negativo (ER+/HER2-). También se le denomina “luminal”, ocupa el 50% - 65% de los canceres mamarios a nivel mundial, en México representa el 58% (Mohar et al. 2015). Éste a su vez se divide en dos subgrupos dependiendo de su índice de proliferación. a. ER+/HER2- de baja proliferación (40% - 55% de los canceres mamarios). Son los más frecuentes en poblaciones adultas mayores, se detectan generalmente en estadios tempranos, tienen baja recurrencia local y son generalmente curados con cirugía. Si dan metástasis lo hacen en períodos mayores a 6 años y generalmente a hueso. Responden bien a terapia hormonal y la sobrevida generalmente es buena (>50% a 5 años). Su firma génica está dominada por genes que responden al receptor de estrógenos. 8 b. ER+/HER2- de alta proliferación (10% de los canceres mamarios). A pesar de que son ER+ su expresión es baja y la positividad para receptor de progesterona es en la mayoría de los casos también baja o incluso ausente. Su huella génica es semejante a los arriba descritos, sin embargo hay una expresión elevada de genes asociados a proliferación. Un 10% de estos canceres tienen una respuesta completa a la quimioterapia. 2. HER2-positivo. Representan cerca del 20% de los canceres mamarios, en México representa el 22% (Mohar et al. 2015), la mitad de ellos pueden ser ER+, aunque su expresión es baja y la positividad para receptor de progesterona suele ser ausente. Este tipo de cáncer mamario se presenta en mujeres jóvenes, pueden dar metástasis cuando tienen un tamaño reducido y lo hacen particularmente a vísceras o cerebro. La terapia actual dirigida contra la actividad de HER2 mediante anticuerpos (p. ej. trastuzumab), ha mejorado de manera sustancial el pronóstico de las mujeres que los padecen; aunque desafortunadamente existe un subgrupo que genera resistencia, los mecanismos por los que lo hace son diversos. 3. ER-negativo/HER2-negativo. También se le conoce como tipo basaloide o “triple negativo”, pues también es negativo a receptor de progesterona, se presenta en cerca del 15% de los casos, en México es alrededor del 17% (Mohar et al. 2015). Tiene una alta proliferación y pueden dar metástasis aun cuando su tamaño sea reducido (vísceras y cerebro). Se observan en mujeres jóvenes pre-menopaúsicas, 30% de los casos responden de manera completa a la quimioterapia, pero aquellas que tienen recurrencia lo hacen dentro de los 5 años después del tratamiento, la sobrevida es baja cuando esto sucede. Desde el punto de vista clínico (y dependiendo de la Institución) a los carcinomas invasivos se les puede asignar un grado histológico denominado “Grado Histológico de Nottingham” (Elston & Ellis 1991; Frkovic-Grazio & Bracko 9 2002; Rakha et al. 2008). Esta “gradación” está basada (de manera subjetiva por la interpretación del patólogo) en la formación de estructuras tubulares, pleomorfismo nuclear y tasa de proliferación mitótica, asignando un valor mínimo de 1 (“bueno”) y máximo de 3 (“malo”) por cada parámetro, resultando una puntuación mínima de 3 y máxima de 9 para el conjunto de los parámetros. Se asignan 3 categorías: - Grado I (bien diferenciado, 3, 4 o 5 puntos). Los carcinomas crecen con un patrón tubular, con un núcleo redondo y pequeño y tienen un bajo índice de proliferación. - Grado II (moderadamente diferenciado, 6 o 7 puntos). Los carcinomas presentan cúmulos de nidos sólidos, algunas estructuras tubulares, así como focos de células individuales infiltrantes; hay un grado mayor de pleomorfismo nuclear y se pueden observar figuras mitóticas. - Grado III (pobremente diferenciado, 8 o 9 puntos). Los carcinomas infiltran en forma de nidos, láminas y células individuales, hay escasa o ausente formación de estructuras tubulares. El pleomorfismo nuclear es franco, el rango de proliferación es alto y es común observar zonas de necrosis. La asignación de este grado histológico, tiene por objeto servir como factor pronóstico o en otras palabras determinar la agresividad del tumor, no determina las decisiones terapéuticas, pero ha demostrado predecir con relativa seguridad el comportamiento del CaM (Frkovic-Grazio & Bracko 2002; Rakha et al. 2008). Epidemiología del cáncer mamario en México Se calcula que la incidencia anual por CaM en México es de 28 mujeres por cada 100,000, sin embargo si lo vemos por grupos de edad la incidencia se dispara a partir de los 45 años (52/100,000) siendo el grupo de 60 – 64 años en el que se concentra la mayor cantidad de casos nuevos (68/100,000) (INEGI 2015). 10 En términos generales anualmente se diagnostican en México alrededor de 16,000 casos nuevos y para el 2020 serán por arriba de 16,500 (Knaul et al. 2009). Las muertes por esta enfermedad son de alrededor de 6,000 casos anuales (1 muerte por cada hora y media), y representan la primer causa de muerte por tumores malignos que afectan a la mujer (Rizo-Ríos et al. 2015), de hecho los tumores malignos ocupan la segunda causa de muerte en México desde el año 2000 (Sosa-Durán & García-Rodríguez 2013; Rizo-Ríos et al. 2015), aunque las cifras oficiales para el año 2015 ubican al CaM en 4° lugar como causa de muerte por tumores malignos en la población general y el 2° en los casos de decesos por tumores malignos en mujeres (INEGI 2015). La tasa de mortalidad (9.4/105) (Rizo-Ríos et al. 2015) se debe en gran medida a que el 70% de los casos de CaM en México, se diagnostican en etapas avanzadas (Mohar et al. 2015). En este sentido, se observa una incidencia conjunta en el grupo de edad de 50 a 74 años, de 535/100,000 mujeres que ingresan a los servicios de salud por motivos relacionados a CaM (INEGI 2015), siendo en muchos de los casos cuando se diagnostica la enfermedad, como se había mencionado anteriormente (grupo de 60-64 años). Sin embargo y aunque parezca contradictorio, la edad promedio al morir se ha mantenido entre los 57-59 años (Knaul et al. 2009; Vara-Salazar et al. 2011), el porqué de este comportamiento en nuestro país, es verdaderamente complejo, pero tiene que ver mucho con acceso a los sistemas de salud, carencias de infraestructura para el tamizaje y por supuesto al tratamiento (Vara-Salazar et al. 2011). El tipo histológico mayormente diagnosticado es el tipo ductal (canalicular o NST) con 84% de los casos, seguido del lobulillar con 9.6%, menos del 2% corresponde a casos de carcinoma in situ y el porcentaje restante está integrado por variantes especiales (Mohar et al. 2015). Factores de riesgo Existen ciertas condiciones intrínsecas y extrínsecas al cuerpo humano que favorecen el desarrollo de cáncer mamario (CaM). Se ha demostrado que algunas 11 de ellas juegan un papel determinante, mientras otras aún son estudiadas para demostrar su probable impacto inductor. A continuación se enlistan los distintos factores de riesgo (Kumar et al. 2015): - Mutaciones en la línea germinal. Del 5 al 10 % de los casos de CaM presentan mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2, a su vez los pacientes afectados tienen un riesgo de desarrollar CaM del 90% a lo largo de su vida. - Familiares de primera línea (madres, hermanas o hijas) afectadas por CaM. Cerca del 15 al 20% de las mujeres afectadas por CaM tienen una familiar de primera línea sufriendo de CaM. Si bien no presentan una mutación genética identificable, es altamente probable que se asocie a genes susceptibles de bajo riesgo y a que comparten factores ambientales inductores. Es importante destacar que este riesgo se atenúa considerablemente cuando la familiar afectada es una mujer postmenopáusica. - Raza/Etnicidad. Las mujeres blancas en Estados Unidos y Europa tienen un alto riesgo de padecer CaM, mientras que las poblaciones denominadas latinas (por ejemplo México) ocupan cerca del tercer lugar. - Edad. La década de vida con mayor incidencia de CaM es la octava (de los 70 a los 79 años de edad) a nivel mundial; sin embargo, en México la prevalencia es en mujeres de alrededor de los 60-64 años de edad (INEGI 2015). - Menarca temprana. Presentar una menarca antes de los 11 años eleva el riesgo de desarrollar CaM en 20% comparado con aquellas mujeres que la presentan después de los 14 años de edad. - Menopausia tardía. Desarrollar menopausia después de los 45 años de edad incrementa el riesgo de desarrollar CaM. 12 - Edad del primer embarazo (nacido vivo). Aquellas mujeres que tienen hijos por debajo de los 20 años disminuyen a la mitad el riesgo de padecer CaM comparado con aquellas mujeres que tienen embarazos a término después de los 35 años. - Enfermedad mamaria benigna. El diagnóstico (por biopsia) de cambios proliferativos o hiperplasia atípica eleva la posibilidad de que haya transformación a neoplasia maligna invasiva. - Exposición a estrógenos. La terapia de sustitución hormonal para pacientes menopáusicas aumenta el riesgo de desarrollar CaM, particularmente cuando se dan por un periodo de años, estrógenos y progestina de manera combinada. En contraste, parece que los anticonceptivos orales no provocan ésta inducción. En este sentido, la reducción de estrógenos endógenos por procedimientos quirúrgicos como la ooforectomía bilateral, reduce el riego de desarrollar cáncer en un 75%. Y de manera similar (aunque aún controversial) el bloqueo de su acción (p.ej. tamoxifeno) o de su síntesis (inhibidores de la aromatasa) también disminuye el riesgo de sufrir CaM ER+ (Kumar et al. 2015). - Densidad mamaria. Se refiere a la densidad (radiopacidad o distintas tonalidades de gris) del patrón radiográfico que se observa en las mastografías. Las mujeres con un patrón de densidad elevado tienen entre 4 y 6 veces más riesgo de presentar CaM, además también se correlaciona con otros factores de riesgo como edad avanzada, primer embarazo, pocos hijos o terapia de sustitución hormonal. - Exposición a fuentes de radiación. Mujeres que son sometidas a radioterapia por linfoma de Hodgkin tienen un 20-30% de más posibilidades de desarrollar CaM dentro de los 30 años subsiguientes (mujeres adultas sometidas a esta modalidad de tratamiento no presentan dicho riesgo), la 13 fuente de radiación incluye accidentes nucleares y mujeres aledañas a los sitios de Hiroshima y Nagasaki. - Carcinoma de mama contralateral o de endometrio. 1% de las mujeres con CaM, desarrollarán CaM del lado contralateral o del revestimiento endometrial, se ha postulado que la exposición prolongada a estrógenos puede ser el factor inductor. - Obesidad. Las mujeres obesas postmenopáusicas presentan un mayor riesgo, el cual se atribuye a la síntesis de estrógenos en los depósitos de grasa. - Tabaquismo. La evidencia actual sugiere que puede existir un potencial efecto causal en las mujeres fumadoras y el CaM, particularmente en aquellas con un hábito intenso, así como con un inicio temprano del mismo (Reynolds 2013). Se ha descrito la capacidad carcinogénica de varios componentes del cigarro en modelos mamarios y estudios recientes evalúan el posible papel modificador de polimorfismos involucrados en el metabolismo del tabaco, como NAT2 (Reynolds 2013) y alteraciones a nivel transcripcional (Pérez-Solis et al. 2016). De todos los arriba mencionados, los factores de riesgo con mayor peso para el desarrollo de CaM son definitivamente las mutaciones en la línea germinal (BRCA1, BRCA2, TP53, PTEN), exposición prolongada a estrógenos (terapia de sustitución hormonal) y los factores endocrino/reproductivos (Aceves et al. 2005; Anguiano & Aceves 2011). Factores de protección (la dieta, ingesta de yodo) Al igual que existen condiciones que elevan la probabilidad de desarrollar CaM, también existen ciertas circunstancias igualmente intrínsecas y extrínsecas que protegen a la mujer de desarrollarlo. Algunas de ellas son antagónicas, como por ejemplo los factores reproductivos, la dieta o el estilo de vida. Entre los 14 factores que se han asociado a protección se encuentran (Kumar et al. 2015; Inumaru et al. 2011): - Obesidad. En las mujeres menores de 40 años, la obesidad provoca ciclos anovulatorios, los cuales disminuyen de manera sustancial la producción de progesterona. - Amamantamiento prolongado. La lactación suprime la ovulación y activa la diferenciación terminal de las células luminales. En países en desarrollo la lactancia es más prolongada (asociada también a la multiparidad) y algunos autores han asociado esta característica con bajas incidencias de CaM. - Multiparidad. Con el fundamento de diferenciación celular por la lactación, ciclos repetidos de diferenciación terminal se cree que pueden proteger a las mujeres de desarrollar CaM. - Estilo de vida. Si bien hay pocos estudios al respecto, se considera que las mujeres físicamente activas tienden a presentar menos CaM. - Dieta. Hemos dejado al final este posible factor protector para dedicarle una mayor contextualización, puesto que el desarrollo de este trabajo está fundamentado en la ingesta y participación bioquímica de un oligoelemento esencial en la dieta humana, el yodo. Ya se abordó de manera muy general las características del CaM, pero es prudente en este momento llamar la atención en cuanto al comportamiento de esta enfermedad en dos tipos de poblaciones, la occidental y la oriental-asiática, particularmente la japonesa. Desde hace tiempo se ha notado que los países occidentales (Europa y Norteamérica) tienen una incidencia alta de CaM comparada con la población oriental, por ejemplo para el año 2012 (los datos disponibles más recientes para el primer trimestre de 2016 comparable entre naciones) EUA tuvo una incidencia (ajustada por edad) de 124.9 mujeres afectadas por 100,000 (Howlader et al. 2015) y el Reino Unido de 129.2/100,0000 (Ferlay 15 et al. 2013), mientras que Japón tuvo 51.5/100,000 o Corea del Sur 52.1/100,000 para el mismo año (Youlden et al. 2014), es importante señalar que los datos son comparables ya que sus registros son confiables de acuerdo a la International Agency for Research on Cancer (Ferlay et al. 2014), en el que EUA tiene una categoría A1, Reino Unido A1, Japón B1 y Corea del Sur A2, categorías dadas de acuerdo al acceso a la información y el registro sistemático de los datos de salud de su población. Aunque la diferencia entre ambas naciones se está modificando (disminuyendo para EUA e incrementándose para Japón) (Saika & Sobue 2009), la diferencia sigue siendo sustancial. Surge por supuesto, el cuestionamiento de que esta diferencia pueda tener un fondo racial, al respecto un estudio hecho por Maskarenic y Noh (Maskarinec & Noh 2004), ha mostrado que la migración de japoneses hacia Hawaii incrementa el riesgo de desarrollar CaM desde la primera generación (Fig. 2) y el riesgo se incrementa en 3 veces para la segunda generación. Este estudio, descarta un fondo racial y apoya la idea de que un componente en el estilo de vida, ya sea su ausencia, su nueva presencia, o una combinación de ambos incrementa la posibilidad de desarrollar CaM, otros estudios han mostrado resultados similares (Ziegler et al. 1993). En este sentido, la dieta asiático-oriental está dominada por alimentos provenientes del mar, entre ellos las algas marinas, esta fuente de alimento contiene altas cantidades de yodo, el cual se encuentra en diversas formas químicas (I, I2, yodato: IO3-), el consumo promedio de yodo en la población japonesa es de 1,200-5,000 μg/día comparado con los 166 o 209 μg/día que consumen las poblaciones del Reino Unido y EUA, respectivamente (Cann et al. 2000; Miller 2006; Teas et al. 2004; Nagataki 2008; Zava & Zava 2011). El posible papel del yodo como factor protector para las poblaciones asiáticas-orientales ha sido planteado apenas a inicios de la década pasada (Cann et al. 2000). Un abordaje más amplio acerca de este bioelemento, sus mecanismos de 16 acción y su papel como posible compuesto terapéutico, será abordado en las siguientes secciones. Yodo Captación. El yodo en forma de yoduro (I-) ingresa a las células a través de la membrana basal gracias a una glicoproteína transportadora conocida como cotransportador de sodio-yoduro (NIS, Na+/I- symporter). Su función la ejerce mediante la traslocación simultánea de dos átomos de Na+ (a favor de su gradiente) y uno de I- (en contra de su gradiente). La fuerza electromotriz que necesita NIS está dada por el gradiente de concentración de Na+, un gradiente dirigido hacia el interior de la célula generado por la ATPasa Na+/K+ (Carrasco 1993). Se ha demostrado su presencia en numerosos tejidos extratiroideos como glándula mamaria lactante, glándulas salivales, plexos coroideos y mucosa Figura 2. Efecto de la migración de poblaciones humanas sobre la incidencia de CaM. Se puede observar en la gráfica el seguimiento por cerca de 40 años de tres poblaciones: japonesas que han migrado a Hawaii, así como sus descendientes (2 generaciones), caucásicas también residentes de Hawaii y japonesas residentes de la ciudad de Miyagi, Japón. Se puede notar que en el primer punto de medición, la incidencia es baja en ambos grupos de japonesas con respecto a las caucásicas, sin embargo la incidencia se incrementa y empieza a comportarse de manera semejante en las japonesas y sus descendientes que han migrado a Hawaii con respecto a la población caucásica residente en Hawaii, mientras que las japonesas residentes en Miyagi continúan presentando incidencias de CaM bajas (tomado de Maskarinec & Noh 2004). 17 gástrica; además de NIS se conoce la existencia de un segundo transportador de yoduro conocido como PDS o Pendrina, se trata de un intercambiador de aniones, su localización es en el dominio apical de los tirocitos, y su función es expulsar el I- hacia el lumen de los folículos tiroideos, su presencia también se ha demostrado en el dominio basal de células cancerosas tanto de tiroides como de mama (Rillema & Hill 2003a; 2003b). Un tercer transportador de reciente descripción es el transportador de yoduro apical humano (hAIT, human apical iodide transporter), el cual se encuentra en el dominio apical de tirocitos y tiene una función similar a la de PDS que es expulsar el I- al lumen folicular tiroideo (Lacroix 2004). Los transportadores antes descritos están involucrados en la internalización del yodo en la forma química de yoduro (I-), sin embargo, el proceso para incorporar yodo molecular (I2) aún no está del todo descrito. Los pocos estudios que analizan la captación de I2 por sistemas vivos son los realizados en algas marinas pardas del género Laminaria. En este estudio mostraron que el I- presente en el agua de mar es oxidado por la exoenzima haloperoxidasa convirtiéndolo a I2 ó ácido hipoyodoso para entonces ser internalizado por un sistema de difusión facilitada (Küpper et al. 1998). Nuestro grupo ha demostrado que el I2 es captado por las células neoplásicas de origen mamario (MCF-7) por medio de un mecanismo de difusión facilitada saturable y dependiente de síntesis de proteínas, pero independiente de NIS, PDS, Na+ y energía sugiriendo la existencia de un transportador similar al de las algas (Arroyo-Helguera et al. 2006). Organificación. El yodo es capaz de incorporarse a proteínas (yodotironinas) y a lípidos (yodolípidos). Cuando está en forma de yoduro debe ser oxidado por una peroxidasa, la cual reduce el yoduro a diversas especies oxidadas del yodo como: yodonio (I+), yodo radical libre (I0), hipoyodito (IO-), ácido hipoyodoso (HIO), y yodo molecular (I2). Aunque no se ha determinado con exactitud qué forma de yodo se une a la tiroglobulina (en el caso de la tiroides) para formar las tironinas y cual a los lípidos, se postula que las formas hidrofóbicas pueden reaccionar primordialmente con los ácidos grasos de cadena larga dando lugar a la formación de lípidos yodados. Este proceso conocido como 18 yodolactonización está restringido a los ácidos carboxílicos insaturados -, - y - de los ácidos araquidónico, eicosapentanoico y docosahexanoico (Ha et al. 2000; Nava-Villalba & Aceves 2014). Transformación de ácido araquidónico (AA) a 6-yodolactona (6-IL, 5- hidroxi-6-yodo-8-11-14-eicosatrienoico-δ-lactona) El ácido araquidónico es un ácido graso poli-insaturado con cuatro dobles enlaces y se localiza en la membrana celular formando parte de los fosfolípidos. Para que éste se encuentre disponible se requiere que su enlace éster, que lo une al residuo de glicerol, sea hidrolizado. Esta acción es realizada principalmente por la fosfolipasa A2, de esta forma con el ácido araquidónico libre, el I2 es capaz de atacar el doble enlace que se encuentra en el C6-C5 y C14-C15 de esta molécula, y generar un cambio esteroespacial con la formación de un anillo lactona (Fig. 3) (Monteagudo et al. 1990; Boeynaems & Hubbard 1980; Turk et al. 1983). Cabe resaltar, que aunque teóricamente la yodación del ácido araquidónico se puede realizar en cualquiera de los cuatro dobles enlaces, los productos más abundantes son la 6-IL y la 14-IL (Turk et al. 1983). Figura 3. Formación de 6-yodolactona y 14-yodolactona. A partir de la oxidación del yodo por una peroxidasa se puede llevar a cabo la lactonización del ácido araquidónico (Monteagudo et al. 1990). Si bien esto también ocurre con yodo molecular. 19 Receptores Activados por Proliferadores de Peroxisomas (PPARs, Peroxisomal Proliferators-Activated Receptors) Los PPARs son factores de transcripción activados por ligando y pertenecen a la familia de receptores nucleares. Fueron descritos en ranas Xenopus y en roedores a inicios de la década de los 90’s como receptores huérfanos, pero eran capaces de ser activados por compuestos que inducen la proliferación de peroxisomas (Issemann & Green 1990; Dreyer et al. 1992). Estos últimos, son organelos citoplasmáticos limitados por una membrana, en su interior contienen una gran variedad de enzimas (oxidasas y catalasas) y entre sus funciones principales está el metabolismo lipídico y la detoxificación de la célula. Actualmente se conocen tres miembros de estos receptores, que son codificados por diferentes genes: PPAR, PPAR/, y PPAR (Kota et al. 2005). Para llevar a cabo su función deben unirse a su ligando, esto permite su heterodimerización con el receptor de ácido retinoico tipo X (RXR) y su translocación al núcleo en donde se unen junto con otros cofactores a elementos de respuesta a PPAR (PPRE) de genes blanco (Fig. 4). También se han descrito activaciones no dependientes del reconocimiento de la secuencia PPRE, donde el complejo PPAR/RXR es capaz de reclutar coactivadores que tienen actividad de acetilación de histonas y esto permite la transcripción de genes que, como se mencionaba, no contienen el PPRE (Berger & Moller 2002). Los ligandos endógenos conocidos para los PPARs son principalmente ácidos grasos de cadena larga. Se sabe que los ácidos grasos poli-insaturados activan a las tres isoformas de PPAR con relativamente baja afinidad, mientras los derivados de estos muestran mayor selectividad en la unión (Krey et al. 1997) por lo que se consideran los verdaderos ligandos endógenos. La distribución de la familia PPAR en tejidos es diferencial, la isoforma alfa se encuentra principalmente en hígado e intestino. La isoforma beta es ubicua y la isoforma gama se localiza principalmente en tejido graso y bazo (Ehrmann et al. 20 2002). Las tres isoformas han sido identificadas en la glándula mamaria de roedores tanto normal como tumoral (Gimble et al. 1998; Roberts-Thomson & Snyderwine 2000; Suchanek et al. 2002), así como en humanos (Suchanek, et al. 2002; Nunez-Anita et al. 2011) y su papel en el CaM se discutirá a continuación. Asociación de PPARs y cáncer, participación en neoplasias malignas de mama Se ha relacionado a los PPARs en el control de la proliferación de diferentes tipos de cáncer (Michalik et al. 2004). En términos generales la isoforma alfa y beta/delta han sido relacionadas con proliferación celular, mientras que ocurre lo contrario con la isoforma gama la cual favorece procesos de diferenciación y apoptosis (Kersten et al. 2000; Wang et al. 2003; Han et al. 2004). En diversas líneas celulares de cáncer mamario como MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-435, BT474, y T47D, se ha demostrado la inducción de apoptosis, arresto celular, y prevención de carcinogénesis por distintos ligandos endógenos o sintéticos de PPAR (Elstner et al. 1998; Mehta et al. 2000; Yin et al. 2001; Maggiora et al. 2004; Bocca et al. 2007). Las vías que regulan dichos efectos Figura 4. Mecanismo de transcripción génica de los PPARs. Los PPARs inactivos están unidos a un complejo represor. Una vez que hay unión con los ligandos exógenos (fármacos) o endógenos (ácidos grasos, prostaglandinas, etc.), los PPAR se heterodimerizan con los RXR y se unen a elementos de respuesta a PPAR (PPRE) iniciando la transcripción o represión de dicho gen (Kota et al. 2005). 21 antiproliferativos están mediadas por la disminución en la expresión de ciclina D1, CDK2, CDK4, CDK6, PCNA, y por un aumento en la expresión de p21 o activación de la vía E-Caderina/β-catenina. Además de estos efectos en la proliferación también se ha observado un efecto angiostático (Xin et al. 1999), permitiendo proponer que podría prevenir de esta manera el desarrollo de metástasis. Los hallazgos sobre la inhibición de la proliferación inducida por ligandos de PPAR en estudios in vitro se ve reforzada por la evidencia obtenida en estudios in vivo. En el caso de tumores inducidos por carcinogénicos como el dimetil- benzantraceno (DMBA) o el N-metil-N-nitrosourea (MNU), el tratamiento con ligandos sintéticos como la troglitazona o el GW845 inhibe el crecimiento tumoral pero no evita su aparición (Pighetti etal. 2001). En otros se ha reportado además de la reducción en el tamaño de la masa tumoral, también el retraso en la aparición de nuevos tumores (Suh et al. 1999; Yin et al. 2005). En otra línea de pensamiento, se ha sugerido que el efecto anticancerígeno de PPAR puede ejercerse a través de la inhibición de COX-2 (Badawi et al. 2004), esta enzima es responsable de la síntesis de prostaglandinas, las cuales se han reportado estar aumentadas en pacientes que presentan metástasis (Rolland et al. 1980a; 1980b). El tratamiento con ligandos de PPAR aunado con el empleo de inhibidores de COX-2 tiene un efecto sinérgico al disminuir la formación de tumores (Badawi et al. 2004; Mustafa & Kruger 2008). Finalmente, se ha demostrado que PPAR puede inducir la re-diferenciación en células de cáncer mamario (Mueller et al. 1998), cambiando su patrón de expresión génica, provocando la acumulación de lípidos y desarrollando un fenotipo celular menos agresivo. Una mayor expresión de los PPARγ medido por inmunohistoquímica en tumores humanos, se correlaciona con un mejor pronóstico en cáncer mamario humano (Papadaki et al. 2005). 22 ANTECEDENTES ESPECÍFICOS Numerosos estudios ha demostrado que el suplemento crónico y moderadamente elevado (miligramos) de yodo molecular ejerce efectos antiinflamatorios, antiproliferativos y apoptóticos tanto en patologías benignas (fibrosis, hiperplasia) como cancerosas en tejidos tiroideo, mamario y prostático (Ghent et al. 1993; Eskin et al. 1995; Kessler 2004; García-Solís et al. 2005; Arroyo-Helguera et al. 2006; Vega-Riveroll et al. 2010; Anguiano & Aceves 2011; Aranda et al. 2013; Olvera-Caltzontzin et al. 2013). Los componentes celulares y moleculares que median dicha respuesta no se conocen a profundidad. Se ha postulado que la molécula efectora, por lo menos en tirocitos, tanto de cerdo como de humano, puede ser la 6-yodolactona, que como ya se había comentado se deriva de la yodación del ácido araquidónico (AA) (Boeynaems & Hubbard 1980; Dugrillon et al. 1990; Dugrillon et al. 1994). Nuestro grupo ha detectado a través de Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC, por sus siglas en inglés) la presencia de esta yodolactona en tumores mamarios de ratas suplementadas crónicamente con I2 (Arroyo-Helguera et al. 2008). Sin embargo la presencia de la 6-IL en las células tumorales y la participación de ésta en la activación o represión de los PPARs no está bien caracterizada. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS Hipótesis El efecto antiproliferativo y apoptótico del I2 está mediado por la generación de 6-IL, la cual activará a los receptores PPAR. Objetivo general Determinar la participación de la 6-IL y los PPAR en el efecto antiproliferativo del I2 en células tumorales mamarias. 23 Objetivos específicos  Identificar la presencia de 6-IL en líneas celulares mamarias normales y tumorales suplementadas con I2.  Caracterizar el efecto fisiológico de la unión de la 6-IL y los PPAR MATERIALES Y MÉTODOS Materiales El medio de cultivo Dulbecco´s modified eagle´s medium (DMEM), el suero fetal bovino (SFB), soluciones de penicilina, estreptomicina y tripsina 0.05%-EDTA 0.2 g/L fueron obtenidas de GIBCO-BRL (Grand Island, NY). El ácido araquidónico (pureza 99%) se obtuvo de Calbiochem (La Jolla, CA, USA). Las distintas sustancias químicas fueron de alto grado de pureza y disponibles comercialmente. Cultivos celulares La línea celular MCF-7 (células epiteliales neoplásicas mamarias) así como la línea celular MCF-12F (células epiteliales ductales de fenotipo normal inmortalizadas) se obtuvieron de ATCC® (HTB-22™ y CRL-10783™, respectivamente). Ambas líneas celulares fueron mantenidas en medio Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) suplementadas con 10% (v/v) de FBS, 100 U/ml penicilina y 100 μg/ml estreptomicina (medio basal). Los cultivos celulares fueron sembrados a una confluencia del 50-70% y mantenidos en una incubadora a 37°C con atmosfera de CO2 al 5%, el medio fue reemplazado cada 2 días o diariamente según el tratamiento. 24 Identificación de 6-IL y su sustrato en células normales y tumorales, tratadas o no con I2 Síntesis de 6-IL (5-hidroxi-6-iodo-8-11-14-eicosatrienoico-δ-lactona) La 6-yodolactona (6-IL) fue sintetizada de la siguiente manera: (Sol. A) 156 mg de yodo elemental se disuelven con 8 ml de acetonitrilo anhidro agitando continuamente bajo atmósfera de N2 en baño con hielo (5-10 min) y protegidos de la luz. Se disuelven 65 microlitros de ácido araquidónico ≥99% (grado GC) (Sigma, USA, A-9673) en 0,8 ml de acetonitrilo (CH3CN) y se agregan a la solución A. Se continúa en baño de hielo 5 minutos más, después se deja agitando protegido de la luz, a temperatura ambiente 4 horas más. Se agrega tiosulfato de sodio para clarificar (cantidad suficiente), volcando el contenido en 20 ml de agua destilada, se extrae 4-5 veces con diclorometano (20 ml) y se reúnen las fases orgánicas, se lava con un vol. de agua, se seca la fase orgánica con sulfato de sodio anhidro, dejando en frío (4 °C) al menos 10 horas, al final de este tiempo se filtra la suspensión, evaporando a sequedad con N2. Se re-disuelve en 5 ml con diclorometano y se evapora hasta 0,5 ml con N2, después se eluye en una columna de silica gel (tamaño de la partícula, 230-400 mesh. 60 Å) con diclorometano (CH2Cl2), se toman 20 fracciones de 5 mL cada una y se siembra una alícuota de 5 μL de cada una en una cromatografía en capa fina (TLC, por sus siglas en inglés), se corre en diclorometano/metanol (97.5:2.5 mL) revelándola con yodo elemental. El “rf” (Fig. 5) de la lactona es 0,82; se juntan las fracciones donde se encuentre la lactona se evaporan, se pesa, se vuelve a reconstituir y se fraccionan, secándose nuevamente para guardarla a -70°C. Modificaciones al trabajo de extracción: el producto crudo fue concentrado a 0.5 ml y separado a través de TLC preparativa, usando el sistema CH2Cl2/MeOH (97.5:2.5), se identifican las bandas que corresponden a cada producto se recuperan por raspado y se concentran con diclorometano (Fig. 6). 25 Figura 6. Esquemas comparativos entre el protocolo tradicional y modificaciones al protocolo. A. el producto crudo es sometido a un proceso de extracción, el cual comprende aclaramiento con tiosulfato de sodio, extracción con diclorometano, deshidratación con sulfato de sodio anhidro, (10 hrs), filtrado y concentración, fraccionamiento a través de cromatografía en columna con silica gel, identificación y recuperación. B. cromatograma de gases mostrando distintos picos (AA, 14-IL, 6-IL y otros compuestos no identificados) obtenidos del proceso de yodación del AA en A. C. el producto crudo es concentrado a 0.5 ml y separado por TLC preparativa usando el sistema eluyente CH2Cl2/MeOH (97.5:2.5). Los estándares de 14-IL y 6-IL fueron visualizados con vapores de yodo, recuperados y concentrados. Figura 5. Fórmula para obtener el factor de retención de un compuesto (rf). Debe registrarse el límite en el que el frente de migración.se detiene, posteriormente se retira el cromatofolio y se deja evaporar el eluyente, posteriormente se revela con vapores de yodo y se realizan las mediciones correspondientes del frente (X) y el compuesto de interés (Y), en este último la medición de ser hecha en el centro de la marca. Distancia que se desplazó la sustancia problema (Y) Distancia alcanzada por la fase móvil (X) rf= 26 Extracción de lípidos de cultivos celulares y metanólisis alcalina de extractos lipídicos para la obtención de AA total Los cultivos celulares fueron recuperados mediante la adición de tripsina y el número de células se determinó empleando la cámara de Neubauer. Se agregó amortiguador de lisis (EDTA 20 mM, Tris-HCl 100 mM pH 8.0, sarcosil 0.8% w/v) incubándose durante 30 minutos, y se realizó la extracción de lípidos a través del método de Bligh-Dyer (Bligh & Dyer 1959). Los extractos fueron sometidos a saponificación añadiendo 2 mL de KOH metanólico e incubados a una temperatura de 80°C durante 60 min. Los ácidos grasos fueron extraídos 3 veces con 1 mL de hexano, evaporados a sequedad y reconstituyéndose en 300 μL de etanol absoluto, almacenándose a -70°C. Identificación de AA por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, High Performance Liquid Chromatography) en fase reversa Se inyectaron 80 μL de cada muestra. La absorción se detectó a 206 nm con un detector ultravioleta y una columna Acclain® 120 DIONEX C18 (4.6 x 250 mm; tamaño de la partícula, 5 m), a través de la cual se hizo pasar una elución isocrática de 1 mL/min, una fase móvil compuesta de la solución A 70% (CH3CN/ácido fórmico al 0.1%), y de la solución B 30% (H2O/ácido fórmico al 0.1%) durante 45 min. La curva estándar se construyó a concentraciones crecientes de AA (2-50 μM, r2=0.9901). Se realizó un análisis de área bajo la curva, los resultados se expresaron como μmolas de AA/número de células. Extracción lipídica de células tratadas con I2 para análisis en cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS, Gas Chromatography – Mass Spectrometry) 20X106 células MCF-7 y MCF-12F fueron sometidas a extracción lipídica como se ha reportado previamente (Dugrillon et al. 1994) con ligeras modificaciones: las células fueron tratadas durante 1 hr con un inhibidor de ciclooxigenasa (COX) inespecífico, ibuprofeno 10 μM (BioMol International, Enzo 27 Life Sciences, NY, EUA) y un inhibidor de lipooxigenasa, ácido dihidroguaiarético (NDGA) 1 μM (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, MA, EUA). Posteriormente fueron tratadas con 200 μM de I2 durante 24 hrs. Las células se desprendieron con tripsina y resuspendieron en 2 ml de PBS (pH 7.4), se dejaron agitándose durante toda la noche con 4 ml de etanol:ácido acético (9:1 v/v). Los extractos fueron centrifugados (3000 rpm/30 min) y los lípidos se extrajeron del sobrenadante al agregar un volumen de cloroformo y un volumen de agua. La fase orgánica (inferior) fue evaporada a sequedad y resuspendida en 10 μL de cloroformo, se inyectaron 2 μL de cada muestra en el GC-MS. Identificación de 6-IL y 14-IL por GC-MS El monitoreo de los iones seleccionados fue realizado en un equipo GC/MS Hewlett Packard series II (Waldbronn, Alemania), la columna utilizada fue de tipo capilar de silica fundida 1% (HP-1, 25 m, 0.2 mm , grosor de revestimiento 0.33 μm). El puerto de inyección se mantuvo a 250°C y la energía aplicada fue 70 eV. Las condiciones para GC fueron: temperatura del inyector 250°C, temperatura de interface 300°C, programa de temperatura del horno 2 min en 100°C, de 100 a 250°C en 30°C cada minuto, de 250 a 300°C en 5°C cada minuto, 5 min en 300°C. El gas eluyente fue helio (rango de flujo, 30 ml/min) y la presión de la columna fue de 5 psi. Para la espectrometría de masas se utilizó un detector selectivo de masa serie 5972 (Waldbronn, Alemania), operado a una energía de 70 eV. Se inyectaron 2 μL de estándar y muestras en modo “splitless” con un tiempo de purga de 5 min. El ion seleccionado para su monitoreo fue 303, debido a la pérdida del yodo (m/z 127) de la 6-IL (m/z 430). La identificación de 6-IL fue realizada al monitorear la presencia del ión 303 como se ha reportado previamente (Boeynaems & Hubbard 1980). El tiempo de retención de la 6-IL en GC fue de 26.59 min, tiempo en el que también se identificó el ion 303 en gran abundancia. El tiempo de retención de la 14-IL en GC fue de 24.36 min, tiempo en el que se identificó el ion 303 en menor abundancia. 28 Efecto de la 6-IL y la 14-IL sobre la proliferación de células MCF-7 Debido a que en la síntesis se detectaron dos compuestos lactona (14-IL y 6-IL) se evalúo el efecto antiproliferativo de la 14-IL en células MCF-7 o la combinación de ambas lactonas sobre estas células y determinar si los cambios eran semejantes al efecto de la 6-IL que previamente se había reportado (Arroyo- Helguera et al. 2008). La proliferación se evalúo mediante el ensayo de exclusión por azul de tripano, que consiste en la exclusión del conteo de células teñidas por el colorante y que evidencia permeabilidad de la membrana plasmática (considerándolas células inviables). 4X104 células fueron sembradas en platos de 24 pozos (Nalge Nunc International, Napenville, IL, USA), después de 24 horas fueron tratadas con concentraciones crecientes (1, 2, 5 y 10 μM) de 14-IL, 6-IL, o una combinación de ambas [50%]/[50%] μM, dichos tratamientos se realizaron cada 24 hrs durante 72 hrs. Al final del tratamiento las células fueron desprendidas con tripsina EDTA (300 μL) y diluidas con PBS (700 μL) y llevadas a un volumen final de 1 mL. De esta solución se tomaron 10 μL y se mezclaron con 10 μL de azul de tripano al 0.4% para ser contadas bajo microscopio invertido (Leica modelo DMIL, Alemania) en campo claro con cámara de Neubauer, 4 repeticiones por muestra. La cantidad de células se obtuvo con la siguiente formula: promedio de 4n/5 (número de campos contados en la cámara) X 10,000 (factor de dilución de la cámara). Los resultados son mostrados como porcentaje de cambio con respecto al control de 72 hrs. Participación de los PPARγ en el efecto antiproliferativo y apoptótico de la 6-IL Determinación de la proliferación de células MCF-7 tratadas con 6-IL y el antagonista para los PPARγ GW9662 4X104 células fueron sembradas en platos de 24 pozos (Nalge Nunc International, Napenville, IL, USA), después de 24 horas fueron tratadas con 6-IL 10 μM, GW9262 0.5 μM o una combinación de ambos (GW9262 0.5 μM durante 2 29 hrs previo al tratamiento de 6-IL 10 μM), dichos tratamientos se realizaron cada 24 hrs durante 72 hrs. Al final del tratamiento la proliferación celular se evalúo como se describió en el apartado anterior. Debido a que se ha reportado que el antagonista para los PPARγ GW9662 tiene efectos antiproliferativos per se e independientes de los PPARγ (Seargent et al. 2004), se decidió hacer una curva dosis respuesta para determinar una concentración apropiada para inhibir la formación del complejo PPARγ/6-IL sin causar efectos antiproliferativos que sesgasen los resultados (Fig. 14A), se decidió emplear una concentración de 0.5 μM para estos experimentos de bloqueo endógeno de los PPARγ. Determinación de la inducción de apoptosis por citometría de flujo en células MCF-7 tratadas con 6-IL y GW9262 (antagonista de los PPARγ) La determinación de apoptosis se evaluó a través de la identificación del fosfolípido fosfatidilserina presente en el lado externo de la membrana celular como un marcador de apoptosis temprana. Su presencia se puede evidenciar a través de su unión con anexina V, una proteína que tiene una alta afinidad por la fosfatidilserina, dicha unión es observable mediante el empleo del fluoróforo Cy5 (que se encuentra biotinilado y se une a anexina V). Se confirma una célula apoptótica al emplear un marcador de células viables como lo es calceína-AM. Este marcador penetra a las células por medio de su grupo acetometil-ester y es atrapado en el interior de las mismas cuando las esterasas endógenas escinden su enlace éster. Ambos marcadores emiten una longitud de onda particular que ubica a la célula en una región específica dentro de una gráfica de puntos, que es interpretada como una población en apoptosis. 2X105 células fueron sembradas en platos de 60 mm de diámetro (Nalge Nunc International, Napenville, IL, USA), después de 24 horas fueron tratadas con 6-IL 10 μM, GW9262 0.5 μM o una combinación de ambos (GW9262 0.5 μM durante 2 hrs previo al tratamiento de 6- IL 10 μM), dichos tratamientos se realizaron cada 24 hrs durante 48 hrs. Al final del tratamiento las células fueron desprendidas con tripsina EDTA (300 μL) y diluidas con DMEM (700 μL) y llevadas a un volumen final de 1 mL. La apoptosis 30 fue evaluada por medio de un bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, después del tratamiento la densidad celular se ajusta a 1X106 por mL en medio basal, se transfieren 200 μL (200 000 células) a un microtubo de 0.5 mL, se centrifugan a 2500 rpm durante 3 min se desecha el sobrenadante y se resuspenden en Binding Buffer 1X (proporcionado por el fabricante), se mezcla gentilmente y se añaden 5 μL de Anexina V. Incubar 5-10 min en obscuridad a temperatura ambiente, centrifugar a 2500 rpm por e min, eliminar sobrenadante, añadir 200 μL de Binding Buffer y agregar 1 μL de Calceína AM y 1 μL de Fluolink Cy5, incubar 5-10 min en obscuridad, centrifugar y desechar el sobrenadante, resuspender en Cell Buffer (proporcionado por el fabricante). Colocar las soluciones provistas en el chip del bioanalizador y las muestras en cada pozo. El número de células apoptóticas se reportaron como porcentaje del número de eventos que confluyen en el área estandarizada por el programa Agilent Cell-Chip software. Sobreexpresión del isotipo gama de PPAR a través de la infección de adenovirus recombinantes Viabilidad de la infección. Para saber si el empleo de adenovirus como un sistema de sobreexpresión era viable, fue necesario explorar si las células MCF-7 eran capaces de ser infectadas y si sobrevivían a dicha infección. Se obtuvieron adenovirus con una construcción para la expresión de proteína verde fluorescente (GFP, por sus siglas en inglés) (AdGFP), los cuales fueron donados amablemente por el Dr. Salomón Hernández (Universidad Panamericana, México). La identificación de la expresión de GFP se realizó con un microscopio confocal FV 1000 Olympus. Objetivo 20X con el canal rojo a una longitud de onda de 260 nm. Y también se determinó por citometría de flujo a través del protocolo de “Expresión de GFP” en el bioanalizador Agilent 2100, siguiendo las instrucciones del fabricante. Se determinó que la infección con 80 MOI (multiplicity of infection) mostró una infección por arriba del 50% (Fig. 7A). Esto confirma la presencia del receptor CCRX en estas células, el cuál es necesario para su adhesión y posterior 31 ingreso a la célula, además de confirmar la factibilidad de emplear este tipo de vector como un sistema de sobreexpresión. Vectores adenovirales. Los adenovirus recombinantes que codifican para el isotipo humano de los PPARγ (AdPPARγ) fueron donados amablemente por el Dr. B. Staels (Instituto Paster de Lille, Francia). Los adenovirus que codifican para la proteína verde fluorescente (AdGFP) fueron tomados como control de infección. Los virus fueron multiplicados en células HEK-293 (donadas por el Dr Ataúlfo Martínez, Instituto de Neurobiología-UNAM, México). La estimación del título de adenovirus fue realizada por una prueba de multiplicidad de infección (MOI por sus siglas en inglés) (AdEasy™ Vector System, application manual version 1.4). Efecto citopático en células MCF-7 infectadas. Debido a que la infección por adenovirus secuestra la maquinaria de síntesis de proteínas de las células anfitrionas y por ende es capaz de llevarlas a la lisis celular, se llevó a cabo una evaluación de la cantidad de partículas virales que provocan un efecto citopático sobre células MCF-7, y se determinó la cantidad de MOI que no interfiriera con los experimentos de proliferación. 4X104 células fueron sembradas en platos de 24 pozos (Nalge Nunc International, Napenville, IL, USA), después de 24 horas fueron infectadas con AdGFP en cantidades crecientes de MOI (~20 a ~400) durante 24 hrs, al término de las 24 hrs se reemplazó el medio con vectores por medio completo y se realizó el recambio cada 24 hrs durante 72 hrs. La viabilidad celular se determinó empleando el ensayo de exclusión por azul de tripano descrito previamente. La cantidad de células se reportó como número de células viables. Se determinó que hasta un MOI de 100 era tolerado por las células antes de comenzar a sufrir efecto citopático (Fig. 7B). 32 Extracción de RNA para la evaluación de la sobreexpresión de los PPARγ mediante retrotranscripción y PCR cuantitativo. La extracción de RNA total se hizo con TRIzol Reagent (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, MA, EUA), siguiendo el protocolo que a continuación se detalla. 5X105 células MCF-7 fueron sembradas en cajas de 60 mm de diámetro (Nalge Nunc International, Napenville, IL, USA) después de 24 hrs fueron infectadas con AdPPARγ a concentraciones crecientes de MOI (~10 a ~80), 24 hrs después se retiró el medio y se añadieron Figura 7. Confirmación del modelo de sobreexpresión de los PPARγ. A. Paneles representativos del ensayo de eficiencia de infección por GFP. 2X105 células MCF-7 fueron infectadas con AdGFP en multiplicidad de infección (MOI) creciente (20 a 80) durante 24 hrs. La expresión de GFP es reportada como porcentaje positivo con respecto al número total de eventos. B. Se evalúo el efecto citopático de la infección por AdPPARγ en MOI creciente (20 a 400) a través del ensayo de exclusión por azul de tripano. Se puede notar que hay diferencia significativa a partir de MOI 200. Un asterisco representa diferencias estadísticamente significativa de P = <0.05 y dos asteriscos de P = <0.01 con respecto al control de 96 hrs. C. Se evalúo la expresión de los PPARγ mediante qPCR en células infectadas con AdPPARγ en MOI creciente (10 a 80), la expresión se normalizó mediante el gen constitutivo β-actina. El asterisco representa diferencias estadísticamente significativa de P = <0.05 con respecto al control. 33 600 μL de TRIzol, cubriendo de manera homogénea la superficie del plato, el cual se colocó inmediatamente en hielo seco, después de 5 minutos, se descongeló y se desprendieron las células de forma mecánica mediante una espátula de plástico, las células se colectaron en un microtubo de 1.5 mL, se añadió 0.12 mL de cloroformo mezclándolo por inversión y se incubaron durante 2-3 min T.A. para posteriormente centrifugarse a 12.000 g, durante 15 min a 4°C. Después de la centrifugación se separó la fase acuosa (superior) y el RNA se precipitó con 0.25 ml de isopropanol, mezclándolo por inversión, después de 3 minutos de incubación a T.A. se centrifugaron a 12.000 g, durante 10 min a 4°C. El botón se lavó con 1 ml de etanol al 70% frio y se centrifugaron a 12.000 g durante 10 min a 4°C. Después de evaporar el etanol el botón de RNA se resuspendió en 50 μL agua estéril. Su cuantificación y determinación de pureza se realizó mediante un espectrofotómetro a través de un cociente de absorbancia 260/280 nm (NanoDrop 2000, Thermo Fischer Scientific, MA, EUA) empleando 2 μL de muestra y la lectura obtenida se reportó en ng/μL. Retrotranscripción y PCR cuantitativo (qPCR). Dos microgramos de RNA fueron sometidos a retrotranscripción utilizando el sistema Superscript II (Invitrogen, ThermoFisher Scientific, MA, EUA) (1μL), en una mezcla de Oligo DT (0.25 μL), cofactor DTT (3 μL), DNTP’s (nucleótidos, 3 μL), RNAase Out (2.5 μL) y el volumen restante ocupado por agua estéril para un volumen final de 20 μL. La mezcla fue incubada en un termociclador (marca) a los siguientes tiempos, 55°C durante 20 min., 94°C durante 40 min y 4°C como temperatura final. La reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR) fue realizada en un sistema de detección Roto-Gene 3000 (Corbett Research, Mortleake, Reino Unido) empleando el sistema SYBR Green como un marcador para la amplificación de DNA. La reacción fue realizada con 1 μL de cDNA como templado y el kit qPCR supermix-UDG (Invitrogen, ThermoFisher Scientific, MA, EUA). Se realizaron 39 ciclos con 3 pasos dentro de la amplificación (94°C por 30 seg, 62°C por 30 seg, 72°C 30 seg) con oligonucleótidos/primers específicos para cada gen (Tabla 1) 34 (Nuñez-Anita et al. 2009). La confirmación del gen producido por la PCR se demostró a través de electroforesis en un gel de agarosa al 2%, teñido con bromuro de etidio en buffer TAE 1X y se visualizó mediante un transiluminador convencional de luz UV. No se observó el producto de la PCR en ausencia de templado. La expresión del gen se calculó utilizando el método “Dcycle threshold” (Dct) y normalizado para actina, como un gen constitutivo o no regulado (housekeeping). Se pudo observar que a partir de un MOI 40 de AdPPARγ había una sobreexpresión significativa de PPARγ comparado con las células no infectadas (Fig. 7C). Inducción de la expresión de FASN para confirmar la sobreexpresión funcional de PPARγ Para determinar si la sobrexpresión del isotipo PPARγ era funcional, se evaluó la expresión de FASN, un gen que responde a dicho receptor (Bogacka et al. 2004; Kadegowda et al. 2009) y se evaluó su activación a través de PCR cuantitativo (qPCR, por sus siglas en inglés). 5X105 células fueron sembradas en platos de plástico de 6 cm de , 24 hrs después fueron tratadas, formando los siguientes grupos: 1) Control (Ctrl) 2) Control de infección sin tratamiento (Ctrl AdPPARγ) 3) Células infectadas tratadas con 6-IL 10 μM (AdPPARγ+6IL), los grupos con infección fueron expuestos durante 24 hrs a AdPPARγ, al término de este tiempo fueron tratados como se mencionó, durante 24 hrs y al final de este tiempo fueron colectadas para extracción de RNA. El cDNA para la qPCR se obtuvo por medio del método de retrotranscripción anteriormente descrito. Las temperaturas de alineación, secuencia sentido/antisentido y referencia de FASN, se mencionan en la Tabla 1. Determinación de la proliferación celular y apoptosis en células MCF-7 infectadas por AdPPARγ y tratadas con 6-IL y GW9262 Proliferación. Células MCF-7 fueron sembradas en platos de 24 pozos a una densidad de 4X104 en medio basal (descrito previamente en la sección de 35 Tabla 1. Secuencias de oligonucleótidos sentido/antisentido y en su caso sondas, de los genes utilizados para evaluar la expresión de los PPARγ, así como su sobreexpresión funcional. Se refieren también la temperatura de alineación y el número de acceso a GenBank. “Cultivos celulares”), 24 hrs después fueron infectadas con MOI ~50 de AdPPARγ y AdGFP como control de infección durante otras 24 hrs. Al término de este tiempo fueron tratadas con 10 μM de 6-IL y GW9262 0.5 μM, o GW9262 0.5 μM durante 2 hrs previas al tratamiento de 10 μM de 6-IL cada 24 hrs durante 72 hrs. Al final del tratamiento la viabilidad celular se determinó por el método de exclusión con azul de tripano, como previamente ha sido descrito. Gen Secuencia (5’ – 3’) Temperatura de alineación (°C) Referencia FASN Sentido GGAATGGGAAGACACCTATGGA 62 GenBank NM_004104.4 Antisentido AGAGAGAGCTCAGATACGTTGAC PPARγ Sentido TCTCTCCGTAATGGAAGACC 62 GenBank L40904.2 Antisentido GCATTATGAGACATCCCCAC β-actina Sentido CCATCATGAAGTGTGACGTTG 62 GenBank NM_001101.3 Antisentido ACAGAGTACTTGCGCTCAGGA PPARγ Sondas de Hidrólisis Sentido GATGTCTCATAATGCCATCAGGTT 60 RTPrimerDB ID: 5471 Antisentido GGATTCAGCTGGTCGATATCACT Sonda CCAACAGCTTCTCCTTCTCGGCCTG β-actina Sondas de Hidrólisis Sentido TCCTTCCTGGGCATGGAG 60 RTPrimerDB ID: 2418 Antisentido AGGAGGAGCAATGATCTTGATCTT Sonda CCTGTGGCATCCACGAAACTACCTTC 36 Apoptosis. La determinación de apoptosis se evaluó a través de la identificación de la fosfatidilserina por citometría de flujo como previamente se describió. Siete grupos de células MCF-7 fueron sembradas en platos de 60 mm de diámetro a una densidad de 2X105 en medio basal, 24 hrs después 4 grupos fueron infectadas con MOI ~50 de AdPPARγ (3 grupos) y AdGFP (1 grupo) como control de infección durante otras 24 hrs. Al término de este tiempo fueron tratadas con 10 μM de 6-IL o con GW9262 0.5 μM, o GW9262 0.5 μM durante 2 hrs previas al tratamiento de 10 μM de 6-IL cada 24 hrs durante 48 hrs, un grupo no fue tratado y fue utilizado como control. Generación de línea celular estable con silenciamiento de los PPARγ Características del vector HuSH™ pGFP-V-RS con el RNA de interferencia para PPARγ. Para confirmar que la vía antiproliferativa y apoptótica es mediada por PPARγ y está activada por la 6-IL, se decidió silenciar al RNA mensajero de éste isotipo del receptor. Para ello se generó una línea celular estable mediante el vector pGFP-V-RS de la serie HuSH™ (OriGene Technologies, Rockville, MD, USA) el cual se basa en un casete de expresión que contiene la secuencia de un RNA de horquilla corta (small hairpin “shRNA” pos sus siglas en inglés), con un promotor de tipo U6. Esta región así como el gen de selección para eucariontes que confiere resistencia a puromicina, se encuentran flanqueados a ambos lados por las repeticiones terminales largas (LTR’s por sus siglas en inglés) 5’ y 3’ del Virus de Leucemia Murina de Moloney (MMLV) lo que provoca que se lleve a cabo una replicación viral deficiente, que asegura una expresión estable. El gen de selección para eucariontes (puromicina) presenta un promotor de tipo SV40. El kit constaba de 4 shRNA con una secuencia específica diferente por cada uno de ellos, de 29 nucleótidos para el gen diana, en este caso PPARγ y también se contó con un vector con una secuencia aleatoria (Scramble) como control de transfección. Inmediatamente después se encuentra un loop u horquilla de 7 nucléotidos y una secuencia reversa complementaria de otros 29 nucléotidos. Finalmente una secuencia de terminación (TTTTTT) es colocada al final de los 37 nucleótidos complementarios (de reversa) para que se complete la transcripción mediante la Polimerasa de RNA tipo III. Es importante mencionar que el vector también cuenta con el gen reportero tGFP, lo que ayuda a reconocer la eficiencia de transfección e identificar las poblaciones que han incorporado de manera estable al vector (Fig. 8A). Estos vectores se amplificaron en bacterias competentes Escherichia coli XLBlue con 10 μg de kanamicina como antibiótico de selección (también incorporado en el constructo del plásmido) por cada mL de medio de Luria y se purificaron mediante kit comercial High pure, Plasmid Isolation Kit (Roche applied science, Penzberg, Upper Bavaria, Germany), obteniéndose alrededor de 100 ng de DNA/μL. Los detalles del mapa del vector se encuentran en la figura 8. Transfección. 1x106 células MCF-7 fueron transfectadas con 5 μg de plásmido, tanto los dirigidos contra los PPARγ, como la secuencia aleatoria, desde ahora denominada: “Scramble”. Para la transfección se empleó el reactivo Xfect™ (Clontech Laboratories, Mountain View, CA, EUA) y se siguieron las instrucciones Figura 8. Características del vector pGFP-V-RS, OriGene. La secuencia del shRNA que contiene la secuencia del RNA de interferencia para los PPARγ no se plasma debido a que pertenece a una patente comercial, sin embargo, se puede observar la localización de su promotor U6 y la presencia de los “cassettes” de expresión para Kanamicina, Puromicina y GFP. 38 del fabricante. Las células fueron mantenidas en estas condiciones durante 48 hrs y al término de este tiempo se inició su selección con 1.0 μg/mL de puromicina durante 2 semanas y se permitió su expansión. Para confirmar la transfección se evaluó la expresión de GFP usando un microscopio Olympus IX50 de luz invertida con sistema de fluorescencia (Olympus Inc., NY, EUA) y también a través de citometría de flujo en el equipo Agilent 2100 bioanalyzer empleando un chip para ensayo celular (Agilent, Technologies, EUA) (Fig. 9A). Después de obtener 5 platos con aproximadamente 5X106 células con expresión positiva para GFP, se continuaron con los ensayos de qPCR con sondas de hidrólisis y Western blot, para la confirmación de silenciamiento de los PPARγ. PCR cuantitativo con sondas de hidrólisis. Se extrajo RNA total de las células transfectadas en las mismas condiciones descritas anteriormente (Págs. 32-34). Y se llevó a cabo una PCR cuantitativa (Pág. 34), sin embargo, se emplearon sondas de hidrólisis tanto para los RNA mensajeros de PPARγ como para los de β-actina. La particularidad de este método es que la cuantificación del número de copias está directamente relacionado con la señal emitida por el consumo de sondas durante la amplificación. La normalización se realizó con el gen de referencia β-actina. La secuencia sentido, antisentido y de la sonda se especifican en la Tabla 1 y los resultados en la figura 9B. Western blot. 3X106 células MCF-7 transfectadas de cada plato (4 para PPARγ y 1 para Scramble) y células no transfectadas fueron lisadas con solución amortiguadora RIPA (50 mM Tris pH 7.4, 0.5% NP-40, 100 mM NaCl) y con una tableta de inhibidores de proteasas libre de EDTA, complete Mini (Roche Diagnostics GmbH, Alemania), seguido de centrifugación a 12,000 rpm por 2 min. a 4°C. Las proteínas extraídas fueron cuantificadas por el método de Bradford (ensayo de proteínas de Bio-Rad, Hercules, CA. EUA). Se prepararon geles de poliacrilamida al 15% (gel separador) y se cargaron 50 μg de proteína por cada pozo/carril. Después de la electroforesis las proteínas fueron electrotransferidas a una membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad, Alemania), la cual fue bloqueada toda la 39 noche con TTBS (100 mM Tris, 2.5 M NaCl pH 7.5, EDTA y 0.05% Tween 20) y leche descremada al 5%. Después de este tiempo las membranas fueron lavadas 3 veces/10 min. con TTBS y posteriormente incubadas con el anticuerpo policlonal anti-PPARγ (sc-7196, 57 kDa, 1:1000 en TBS 5% de leche descremeda, Santa Cruz Biotechnology Inc., EUA) o anti-β-actina (sc-1616, 43 kDa, 1:10,000 en TBS 5% de leche descremeda, Santa Cruz Biotechnology Inc., EUA). Seguido de 3 lavados de 10 min. cada uno con TTBS, para posteriormente incubar con anticuerpos secundarios conjugados con la enzima peroxidasa de rábano (Diluciones de 1:3,000). La señal de la presencia de las proteínas se detectó mediante el sistema quimioluminiscente ECL (Amersham Biosciences, UK). Los valores de la actina fueron utilizados para normalizar los resultados de los PPARγ. El análisis densitométrico de las bandas se realizó con el software Image Lab™ (Bio-Rad Laboratories, CA, EUA) (Fig. 9C). Se escogieron las células con un silenciamiento mayor a 70% demostrado por qPCR y Western blot. A las células resultantes se les denominó de la siguiente manera: células MCF-7 RNAi-PPARγ, aquellas con la expresión estable del RNA de interferencia para PPARγ; células MCF-7 Scramble-PPARγ, aquellas con expresión estable del RNA de interferencia aleatorio, el cual no provoca silenciamiento y células MCF-7 WT (“wild type”), a aquellas que son de tipo parental y que no fueron sometidas a transfección. Determinación de la proliferación celular y apoptosis en células MCF-7 RNAi- PPARγ, Scramble-PPARγ y WT tratadas con 6-IL Proliferación. Células MCF-7 RNAi-PPARγ, Scramble-PPARγ y WT fueron sembradas en platos de 24 pozos a una densidad de 4X104 en medio basal, 24 hrs después fueron tratadas con 10 μM de 6-IL cada 24 hrs durante 96 hrs, también se sembraron sus respectivos controles. La proliferación celular se determinó de igual manera cada 24 hrs hasta concluir el experimento por el método de exclusión con azul de tripano, como previamente se describió (Pág. 30). Se realizaron 3 experimentos independientes por triplicado por cada tiempo y por cada grupo. Los resultados se expresan como porcentaje de cambio con 40 respecto a la hora cero de cada uno de los grupos y también se analizaron diferencias entre tiempos y grupos. El análisis estadístico para este experimento empleo una prueba de ANOVA de dos vías. Figura 9. Confirmación del modelo de silenciamiento de los PPARγ. A. Fotomicrografías representativas de la expresión de GFP (paneles derechos) en las células seleccionadas que presentaron una transfección estable del RNAi de interferencia contra PPARγ (RNAi) y con la secuencia aleatoria (Scramble), las células no transfectadas (WT) no presentan expresión, se muestran las imágenes por contraste de fase para orientación (objetivo 20Χ, barra de escala de 50 μm). B. La expresión de PPARγ en las células establemente transfectadas se evalúo a través de PCR en tiempo real (qPCR) con el sistema de sondas de hidrólisis, los resultados de la expresión de PPARγ se normalizaron con la expresión de β-actina. C. La proporción de proteína PPARγ presente en las células transfectadas de manera estable, se evalúo mediante Western blot y la densitometría de las bandas obtenidas se realizó con el programa de computadora Image Lab™. Los resultados fueron obtenidos de tres experimentos diferentes, las letras distintas representan diferencias estadísticamente significativas de P = <0.05 entre los grupos. 41 Apoptosis. La determinación de apoptosis se evaluó a través de la identificación de fosfatidilserina por citometría de flujo como previamente se describió (Págs. 31-32). Dos grupos de células MCF-7 RNAi-PPARγ, Scramble- PPARγ y WT fueron sembradas en platos de 60 mm de diámetro a una densidad de 2X105 en medio basal, 24 hrs después fueron tratadas con 10 μM de 6-IL cada 24 hrs durante 48 hrs, uno de los grupos no fue tratado y se empleó como control. Se realizaron 3 experimentos independientes por duplicado. Los resultados se expresan como porcentaje de cambio con respecto a su control y también se analizaron diferencias entre grupos. El análisis estadístico para este experimento empleo una prueba de ANOVA de una vía. Efecto de la 6-IL sobre la migración celular Ensayos de cicatrización de herida. Células MCF-7 RNAi-PPARγ, Scramble- PPAR y WT fueron sembradas con medio basal en platos de 60 mm de diámetro (Nalge Nunc International, Napenville, IL, USA), 8X105 células en cada caso. Después de 24 hrs se realizaron 3 heridas paralelas en el fondo del plato con la punta de una pipeta de 1000 μL (337 μm) y las células fueron tratadas con 6-IL 10 μM o vehículo (etanol) por 24 hrs. Al término de este tiempo se realizaron 3 nuevas heridas como control de anchura de herida con el mismo tipo de punta de pipeta, el número de células migrantes se obtuvo contando el número de células dentro de las heridas experimentales guiados por dos líneas trazadas en los bordes de las heridas paralelas entre ellas y con el ancho promedio obtenido en cada experimento. El conteo se realizó con el programa para computadora Leica Application Suite Version 2.8.1 y las imágenes se capturaron con un objetivo de 10Χ empleando un microscopio Leica DM 2500 y una cámara digital DFC 420 (Leica Microsystems, CMS GmbH, Alemania). Al menos 3 campos por plato fueron analizados y cada grupo fue analizado en 3 experimentos independientes. Los resultados se presentan como número de células migrantes. 42 Evaluación de la participación de la vía extrínseca de la apoptosis en el efecto apoptótico del I2 y la 6-IL Evaluación de la actividad de caspasa 8/FLICE. 5X106 células MCF-7 fueron colectadas después de 48 hrs de incubación con I2 o 6-IL y también células no tratadas como control. El botón de células fue lisado con solución amortiguadora RIPA (50 mM Tris pH 7.4, 0.5% NP-40, 100 mM NaCl) y con una tableta de inhibidores de proteasas libre de EDTA, complete Mini (Roche Diagnostics GmbH, Alemania), seguido de centrifugación a 12,000 rpm por 2 min. a 4°C. Las proteínas extraídas fueron cuantificadas por el método de Bradford (ensayo de proteínas de Bio-Rad, Hercules, CA. EUA). Para medir la actividad de caspasa se empleó el kit comercial ApoTarget (Invitrogen Co., CA, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se incubaron alícuotas procedentes de cada grupo, de 200 μg de proteínas con DTT (10 mM) y el substrato colorimétrico IETD-p-nitroanilina (pNA, concentración final de 200 μM) a 37°C por 120 min. en oscuridad. Al final de este tiempo, las muestras fueron leídas a través de un lector de ELISA Bio-Rad 680 (Bio-Rad Laboratories, CA, EUA) a 450 nm. La absorbancia del pNA de los grupos tratados fue comparada con el grupo control para determinar las veces de cambio. Análisis estadístico Se realizaron prueba estadísticas ANOVA de una y dos vías para determinar diferencias estadísticamente significativas entre los grupos y en experimentos determinados, seguidas de una prueba de Tukey para identificar diferencias significativas entre grupos experimentales múltiples. Valores de P <0.05 o por debajo de este valor fueron considerados estadísticamente significativos. En las figuras, un asterisco indica diferencias significativas con respecto al control y letras distintas indican diferencias significativas entre grupos (P <0.05). 43 RESULTADOS Las células neoplásicas MCF-7 contienen mayor cantidad de AA que las células de fenotipo normal MCF-12F Previamente se había reportado la existencia de una concentración 4 veces mayor de AA en tumores mamarios generados por MNU, en comparación con glándulas mamarias normales de rata (Aceves et al. 2009). Para saber si las células epiteliales neoplásicas de origen humano MCF-7 también contenían una mayor concentración de AA (el cual sirve de sustrato para la generación de 6-IL), que células epiteliales humanas normales (MCF-12F) se realizó la extracción de lípidos por medio del método de Bligh-Dyer. El extracto obtenido se sometió a un proceso de metanólisis alcalina para hidrolizar los enlaces éster y obtener el AA presente en los fosfolípidos de membrana y así cuantificar a través de HPLC el AA total. El tiempo de retención del AA fue de 33.08 minutos. El área de pico fue calculada y se realizó una curva estándar de AA de 2-50 μM. El área del pico correspondiente al AA de tres muestras independientes de ambos tipos celulares fueron interpolados a partir de la curva estándar obteniendo una concentración 1.5 veces mayor de AA en células MCF-7 en comparación a la cantidad presente en células MCF-12F (fig. 10). 44 Figura 10. Cuantificación de AA entre células normales y tumorales. A. Cromatograma representativo de los extractos lipídicos de células MCF-7 (negro) y MCF-12F (azul), traslapados con el estándar de ácido araquidónico (rojo) (20 μM, tiempo de retención 33.08 min). B. Curva estándar de ácido araquidónico (r2 = 0.9901), con la cual se realizó la interpolación de los resultados. C. Concentración total de AA en células MCF-7 y MCF-12. Los datos son expresados como media  DS (n=3). La diferencia entre los grupos fue analizada usando una prueba de T de Student. El asterisco indica diferencias significativas entre ambos grupos (P <0.05). 45 Síntesis y purificación de yodolactonas El producto crudo obtenido del trabajo de extracción tradicional del AA yodado, es una mezcla de 6-IL, 14-IL y AA (Fig. 6). Con las modificaciones al método descritas en “Materiales y Métodos fue posible separar ambas yodolactonas sin remanentes de AA contaminante. La inversión en el método es menor (7 hrs) en comparación al método tradicional (48 hrs). El análisis por cromatografía de gases del producto obtenido de la yodación del AA generó dos picos mayoritarios, el primero (A) en 24.37 min, el segundo (B) en 26.59 min (Fig. 11). El espectro de masas de cada pico reveló un ion en m/z 303, sin embargo en el pico B la abundancia de este ion fue mayor que en el pico A. El pico B corresponde a la 6-IL debido a la alta abundancia del ion m/z 303 (Fig. 11C), además del patrón espectrométrico anteriormente reportado por Boeynaems (Boeynaems & Hubbard 1980). La lactona macrocíclica presente en la estructura molecular, probablemente corresponda a la 14-IL (pico A). Este compuesto parece ser muy inestable y susceptible a hidrólisis, debido a ello la presencia del ion m/z 303 en la cámara de ionización es baja (Fig. 11B). La modificación metodológica empleada en este estudio, permitió separar y purificar nuestro compuesto de interés (6-IL) para ser usado como estándar para su identificación en extractos lipídicos de los cultivos celulares MCF-7 y MCF-12F. 46 Figura 11. Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas de productos obtenidos de la yodación del AA. A. La reacción entre AA y I2 en acetonitrilo bajo atmosfera de nitrógeno generó dos productos mayoritarios: 14-IL (24.37) y 6-IL (26.59), la estructura molecular se representa respectivamente. B y C, los espectros de masa de cada compuesto muestran una diferencia en la abundancia del ion m/z 303. La estructura molecular y el patrón de fragmentación de los picos correlacionan con la 14-IL y la 6-IL respectivamente. 47 La 6-IL y la 14-IL inhiben la proliferación de células MCF-7 El efecto inhibitorio sobre el crecimiento celular tiroideo de la 14-IL se ha explorado en modelos in vivo (Chazenbalk et al. 1988; Pisarev et al. 1992a; Pisarev et al. 1994); sin embargo, su acción sobre células de estirpe mamario no se conoce (a diferencia de la 6-IL, el cual ya se ha descrito), por lo que se decidió explorar el impacto que la 14-IL tiene sobre la proliferación y la apoptosis en células MCF-7. Además, dado que teóricamente la 14-IL es un ácido graso yodado que también se puede generar en sistemas in vivo y que se obtiene a la par de la 6-IL en el sistema in vitro que se emplea en el laboratorio, surgió la necesidad de evaluar su papel sobre el modelo de cultivo celular de cáncer mamario. La figura 12 muestra el efecto antiproliferativo de ambas yodolactonas, el cual es dependiente de la concentración. En el caso de la 6-IL su efecto es significativo desde 5 μM (Fig. 12A), mientras que para la 14-IL la concentración parece ser menor (2 μM) (Fig. 12B). De manera interesante, la combinación equimolar de ambas yodolactonas (Fig. 12C) pareciera tener un efecto sinérgico sobre la inhibición de la proliferación en concentraciones de 1 y 2 μM, lo que haría sospechar que activan vías moleculares distintas; sin embargo, en concentraciones mayores (5 y 10 μM) el resultado parece ser simplemente sumativo, orientándonos hacia la posibilidad de que ambos compuestos trabajen sobre la misma ruta, esta opción se refuerza más adelante con los resultados de la figura 15, en el contexto de inducción y bloqueo de apoptosis. En la figura 12D se puede observar que el empleo de 10 μM en el caso de ambos compuestos mantiene un efecto antiproliferativo a lo largo de 96 hrs. Por otro lado, la 14-IL también es capaz de inducir apoptosis de manera muy semejante a la 6-IL, a las mismas concentraciones (Fig. 13). De hecho la imagen muestra que la inducción de apoptosis también es dependiente de la concentración de 14-IL. 48 Figura 12. Efecto de la 6-IL y la 14-IL sobre la viabilidad celular. A-C. 4X104 células MCF-7 fueron tratadas con 6-IL (A) o 14-IL (B) o una combinación de ambas (C) a distintas concentraciones durante 72 hrs, posteriormente fueron desprendidas y contadas utilizando el ensayo de exclusión por azul de tripano. D. Curva tiempo-respuesta con la adición de ambas yodolactonas (10 μM). Los datos son expresados como media  DE (n=3) del porcentaje de cambio con respecto al control. Las letras distintas indican diferencias significativas entre grupos (P <0.05). Un asterisco indica diferencia estadística de P <0.05 y tres asteriscos diferencia estadística de P <0.001 49 El bloqueo de la activación de los PPARγ endógenos por el antagonista GW9662 inhibe los efectos de la 6-IL Proliferación. Para demostrar que el efecto antiproliferativo de la 6-IL es mediado por la activación de los PPARγ, se empleó un antagonista altamente selectivo GW9662, el cual modifica el residuo cisteína285 localizado en el dominio de unión a ligando, inhibiendo la actividad transcripcional de los PPARγ (Leesnitzer et al. 2002). Se puede observar en la figura 14, que el tratamiento con 6-IL ejerce un significativo efecto antiproliferativo. El antagonista GW9662 no tiene efectos sobre la viabilidad celular a 0.5 µM, pero es capaz de bloquear el efecto de la 6-IL cuando se administra previamente (Fig. 14B). Apoptosis. Las mismas condiciones experimentales empleadas arriba, salvo el tiempo (48 hrs), se utilizaron para evaluar el bloqueo del efecto apoptótico de la 6-IL. Dicho efecto se determinó mediante la identificación de fosfatidilserina a través de citometría de flujo, como previamente se describió en la sección de Figura 13. Efecto de la 14-IL y de la 6-IL sobre la inducción de apoptosis. 2X105 células MCF-7 fueron tratadas con 14-IL (5 o 10 μM) o 6-IL (10 μM) durante 48 hrs, posteriormente fueron cosechadas y la presencia de fosfatidilserina extracelular fue evaluada mediante citometría de flujo. Los datos son expresados como media  DE (n=3) del porcentaje de cambio con respecto al control. Las letras distintas indican diferencias significativas entre grupos (P <0.05). 50 “Materiales y Métodos”. Los resultados indican que la 6-IL induce un proceso apoptótico en aproximadamente 2 veces más, comparado con la apoptosis basal de la población control. Sin embargo, el empleo del antagonista GW9662 bloquea el efecto de la 6-IL manteniendo un porcentaje de apoptosis a niveles semejantes al control no tratado (Fig. 14C-D). Figura 14. Bloqueo del efecto antiproliferativo y apoptótico de la 6-IL mediado por los PPARγ. A. Curva dosis respuesta de células MCF-7 tratadas con GW9662 a concentraciones crecientes (0.2 – 10 µM). Se determinó emplear una concentración 0.5 μM (dado que no genera efectos antiproliferativos) para los ensayos posteriores. B. Proliferación de células MCF-7 control y tratadas con 6-IL (10 μM), GW9662 (0.5 μM) y el tratamiento previo de GW9662 (0.5 μM, 2 hrs antes) a la administración de 6-IL. El ensayo fue realizado mediante exclusión por azul de tripano. C. Paneles representativos del ensayo de apoptosis por citometría de flujo en el cual se resalta (recuadro rojo) los eventos apoptóticos en el grupo control, grupo tratado con 6-IL y grupo tratado con GW9662 (0.5 µM) 2 hrs previo a la administración de 6-IL, respectivamente. D. Resultados completos del ensayo de apoptosis. Los resultados son expresados como porcentaje de cambio con respecto al control y se presenta la media  DS (n=4). Los asteriscos indican diferencias significativas con respecto al control (P <0.05). 51 De manera interesante la 14-IL tiene un comportamiento semejante, pues induce apoptosis en el grupo tratado alrededor de 3 veces más y este efecto también se inhibe con GW9662 (Fig. 15). La sobreexpresión de los PPARγ exacerba el efecto antiproliferativo y apoptótico de la 6-IL; sin embargo, estos son bloqueados por el GW9662 Sobreexpresión funcional. Para saber si la sobreexpresión de PPARγ por el vector viral era funcional, se evalúo la expresión del RNA mensajero del gen Sintasa de Ácidos Grasos (FASN), el cual es un gen que responde a los PPARγ (Bogacka et al. 2004; Kadegowda et al. 2009). Se puede observar que la sobreexpresión de PPARγ induce por sí misma una tendencia a aumentar la expresión relativa del RNAm de FASN respecto al control, esta expresión se eleva al doble cuando las células son tratadas con 6-IL (24 hrs) (Fig. 16A). Proliferación. Células MCF-7 fueron infectadas y tratadas con el antagonista de los PPARγ GW9262 (0.5 μM) o con 6-IL (10 μM) durante 72 horas. Además de los respectivos controles se incorporó un grupo con tratamiento previo de 2 hrs de Figura 15. Bloqueo del efecto apoptótico de la 14-IL. Ensayo de apoptosis por citometría de flujo (48 hrs) en el cuál células MCF-7 fueron tratadas con 14-IL (10 μM) y otro grupo fue tratado previamente (2 hrs) con GW9662 (0.5 μM) y posteriormente se administró 14-IL (10 μM). Los resultados son expresados como porcentaje de cambio con respecto al control y se presenta la media  DS (n=4). El asterisco indica diferencias significativas con respecto al control (P <0.05). 52 GW9662 y al término de éste el tratamiento de 6-IL (10 μM), también por 72 hrs. La viabilidad celular se evaluó por el método de exclusión por azul tripano. La figura 15B muestra que no hubo cambios significativos entre las células control sin infectar y las infectadas (AdGFP y AdPPARγ tratadas con GW9662). En contraste el grupo sin infección tratado con 6-IL redujo significativamente el número de células viables y este efecto se intensificó en las células infectadas, sin embargo, cuando las células infectadas fueron tratadas previamente con el antagonista GW9662, el efecto antiproliferativo se revierte, si bien no a niveles comparados con los controles, sí de manera significativa cuando se compara con el grupo infectado y tratado con 6-IL (Fig. 16B). Apoptosis. Con respecto a la apoptosis, el grupo control no infectado (Ctrl) y los grupos control infectados (Ctrl AdGFP y Ctrl AdPPARγ) no muestran cambios entre ellos en cuanto al porcentaje de apoptosis basal. Cuando el grupo experimental no infectado es tratado con 6-IL (10 μM) se induce un aumento significativo de apoptosis, el cual se duplica en las células con sobreexpresión de PPARγ (AdPPARγ+6-IL), estos efectos se previenen cuando los grupos son pre tratados con GW9662 (GW+6-IL y AdPPARγ+GW+6-IL) (Fig. 16C). 53 Figura 16. La sobreexpresión de los PPARγ intensifica los efectos antiproliferativo y apoptótico de la 6-IL, pero éstos se previenen cuando se administra el GW9662. A. Evaluación de la expresión de FASN mediante qPCR en células MCF-7 no infectadas (Ctrl) e infectadas (AdPPARγ) con vectores adenovirales con el inserto de PPARγ (MOI 50, 24 hrs) uno de los grupos fue tratado con 6-IL (10 μM) (AdPPARγ+6IL), la expresión se normalizó mediante el gen constitutivo β-actina. B. Células sin y con sobreexpresión de PPARγ (AdPPARγ) fueron tratadas con 10 μM de 6-IL (6-IL) y se incorporaron 2 grupos de infección control (Ctrl AdGFP y Ctrl AdPPARγ+GW [tratamiento de GW9662 0.5 μM]). También se evalúo un grupo con pretratamiento de GW9662 (AdPPARγ+GW+6-IL) y el respectivo grupo no infectado control para todo el experimento (Ctrl). Se evaluó la proliferación a 72 hrs mediante el ensayo de exclusión por azul de tripano. C. Se evaluó la apoptosis a través de identificación de fosfatidilserina por citometría de flujo. Tres grupos control sin tratar (Ctrl, Ctrl AdGFP y Ctrl AdPPARγ) y cuatro grupos experimentales (6-IL 10 μM y con pretratamiento con GW9662), sin y con sobreexpresión (AdPPARγ) fueron evaluados. Los datos son expresados como media  DS. Letras distintas indican diferencia estadísticamente significativa entre grupos (P<0.05) (n=4). 54 El silenciamiento de la expresión de los PPARγ bloquea el efecto antiproliferativo y apoptótico de la 6-IL Proliferación. Células MCF-7 transfectadas establemente con un plásmido que codifica para un RNA de interferencia dirigido contra los PPARγ (Fig. 9), fueron tratadas con 6-IL (10 μM) durante 96 hrs. La figura 17A muestra que el silenciamiento de los PPARγ inhibe el efecto antiproliferativo de la 6-IL (RNAi 6-IL), en contraste, las células tratadas sin transfectar (WT 6IL) y las células control del RNAi (Scramble 6-IL) si muestran un efecto antiproliferativo de la 6-IL comparado con sus controles (WT Ctrl y Scramble Ctrl respectivamente). Interesantemente, las células con silenciamiento (RNAi Ctrl y RNAi 6-IL) presentan una proliferación mayor que los grupos control (WT Ctrl y Scramble Ctrl). Apoptosis. El silenciamiento de los PPARγ también inhibió el ya descrito efecto apoptótico de la 6-IL (RNAi 6-IL) (Fig. 17B), pero se mantuvo como era de esperarse, en el grupo no transfectado (6-IL) y en el control del RNAi (Scramble 6- IL). La 6-IL inhibe la migración de células MCF-7, sin embargo, este efecto se ve bloqueado cuando hay silenciamiento de los PPARγ Células MCF-7 RNAi-PPARγ, MCF-7 Scramble-PPARγ y MCF-7 WT fueron tratadas durante 24 hrs con 6-IL (10 μM) o su vehículo (etanol) y se evalúo su capacidad de migración a través de ensayos de cierre de herida (Fig. 18). Tanto las células MCF-7 Scramble-PPARγ como las WT tratadas con 6-IL vieron reducida su capacidad de migración en cerca de un 60%, sin embargo, las células MCF-7 RNAi-PPARγ fueron insensibles al efecto de la 6-IL. 55 Figura 17. El silenciamiento de los PPARγ bloquea los efectos de la 6-IL. A. Células MCF-7 transfectadas establemente con un plásmido que codifica para un RNA de interferencia dirigido contra PPARγ (RNAi), su control de transfección (Scramble) y células no transfectadas (WT) fueron tratadas con 6-IL (10 μM) (con su respectivo grupo control) durante 96 hrs, evaluando su proliferación cada 24 hrs mediante el ensayo de azul de tripano. B. Sobre estos mismos grupos tratados igualmente con 6-IL durante 48 hrs, se evaluó la inducción de apoptosis por citometría de flujo. Los resultados son expresados como porcentaje de cambio con respecto al control y se presenta la media  DS (n=3). Letras distintas indican diferencia estadísticamente significativa entre grupos (P<0.05). 56 Figura 18. La 6-IL inhibe la migración de células MCF-7, sin embargo, este fenómeno es revertido por el silenciamiento de los PPARγ. A. Paneles representativos de los ensayos de cierre de herida mediante los cuales se evalúo la migración de células MCF-7 RNAi-PPARγ, MCF-7 Scramble-PPARγ y MCF-7 WT, dichas células fueron tratadas durante 24 hrs con 6-IL o etanol (Ctrl) (contraste de fases, magnificación 10X, barra de escala 200 μm, promedio de la herida 377 μm). B. Gráfica de barras en la que se muestran los resultados completos de los ensayos de cierre de herida. Los datos son expresados como la media del número de células migrantes  DS (n=3). Se realizó una prueba de ANOVA de dos vías y una prueba de Tukey múltiple para la comparación entre grupos. Las letras distintas indican diferencias significativas entre grupos (P <0.05) 57 6-IL no activa la vía extrínseca de la apoptosis Para evaluar si la 6-IL o el I2 eran capaces de activar la vía extrínseca de la apoptosis, se exploró la posible activación de caspasa 8 en células MCF-7 WT tratadas con estos compuestos (10 μM y 200 μM respectivamente). La figura 19 muestra que no hubo cambios entre los grupos tratados y el grupo control. Figura 19. La vía extrínseca de la apoptosis no está involucrada en la inducción de dicho fenómeno ni por la 6-IL, ni por el I2. 5X106 células MCF-7 fueron tratadas con 6-IL (10 μM), I2 (200 μM) o vehículo (etanol + agua desionizada) (Ctrl) durante 48 hrs, al final de este tiempo se evalúo la actividad de caspasa 8 mediante un ensayo colorimétrico, los resultados fueron normalizados por la cantidad de proteína. Los datos son expresados como media  DS (n=3). 58 DISCUSIÓN Existen diversos estudios experimentales (Eskin et al. 1995; Funahashi et al. 1996; García-Solís et al. 2005; Soriano et al. 2011; Alfaro et al. 2013), abordajes epidemiológicos (Cann et al. 2000; Venturi et al. 2000; Venturi 2001) y ensayos clínicos (Ghent et al. 1993; Kessler 2004; Anguiano et al. 2010; Peralta et al. 2011) que muestran que el I2 tiene un efecto inhibidor sobre procesos hiperplásicos, inflamatorios y neoplásicos. La manera en cómo se llevan a cabo estos mecanismos aún se está estudiando, sin embargo, como se mencionó en los antecedentes, nuestro grupo de trabajo ha propuesto la participación de la 6-IL como la molécula intermediaria de una parte importante de dichos efectos. En este proyecto se demostró que las células neoplásicas mamarias MCF-7 contienen 2 veces más cantidad de AA (el cual sirve de sustrato para la formación de 6-IL) que las células normales (MCF-12F). Estos resultados son consistentes con otros reportes que describen altas concentraciones de este ácido graso en varios cánceres incluyendo el de mama (Hilf et al. 1969; Rillema & Mulder 1978; Wicha et al. 1979; Rolland et al. 1980b). La abundancia en AA se ha interpretado como una ventaja para las células neoplásicas, debido a que el AA es un compuesto indispensable para la formación de fosfolípidos y estos a su vez fuente para la biosíntesis de nuevas membranas en células con una alta tasa de replicación (Swinnen et al. 2003; Baron et al. 2004). Además de ello el AA es sustrato para la formación de prostaglandinas, las cuales entre otros efectos, incrementan la proliferación celular e inducen la expresión de metaloproteasas involucradas en procesos de invasión y metástasis (Wicha et al. 1979; Rolland et al. 1980a; 1980b). El incremento en las concentraciones de AA en células neoplásicas nos ha permitido proponer, que la elevada formación de 6-IL es el resultado de la abundante disponibilidad del sustrato y la explicación a la mayor sensibilidad al yodo que presentan las células tumorales versus las normales (Arroyo-Helguera et al. 2008). Por otro lado, se realizaron modificaciones al método tradicional de síntesis de compuestos yodados a partir de AA, con el objetivo de obtener yodolactonas en 59 mayor cantidad y más puras. La modificación metodológica realizada en este trabajo permitió separar ambas yodolactonas mostrando claramente tiempos de retención en cromatografía de gases distintivos para cada pico y su respectivo patrón de fragmentación. Aparentemente el proceso de extracción en el método tradicional causa la pérdida sustancial de 6-IL, lo cual es consistente con lo reportado previamente (Monteagudo et al. 1990). La separación directa del producto crudo por TLC preserva la 6-IL y permite su separación cromatografía de la 14-IL (Fig. 11). Adicionalmente a estos resultados se exploró su efecto sobre células de cáncer mamario, si bien la 14-IL no ha sido identificada in vivo, si ha mostrado tener efectos antiproliferativos tanto in vitro (Pisarev et al. 1992b) como in vivo (Pisarev et al. 1994) sobre tejido tiroideo, por lo cual nos pareció pertinente conocer si era capaz de reproducir los efectos en células mamarias. Nuestros resultados mostraron que la 14-IL también presenta efectos antiproliferativos y apoptóticos en células MCF-7 y que la coadministración de 6-Il y 14IL exhibe un comportamiento aditivo. (Fig. 12C). Además el efecto de la 14-IL se bloquea cuando se emplea el antagonista GW9662 de los PPARγ (Fig. 15), lo que sugiere que podrían utilizar el mismo mecanismo de acción, colocando a la 14-IL como otro compuesto yodado con potencial terapéutico. Resultados previos de nuestro laboratorio han demostrado a través de ensayos de retardo (EMSA) que la 6-IL es capaz de formar complejos con los isotipos de PPAR (Nuñez-Anita et al. 2009) y que esta interacción es capaz de activar el elemento de respuesta de PPARs (mediante ensayos de transactivación con el gen reportero luciferasa), lo que indica que la 6-IL es un ligando funcional. Además, también se mostró que las células MCF-7 acumulan lípidos si son tratadas con 6-IL, de manera semejante a la obtenida a través del tratamiento con roziglitazona, un agonista sintético de alta afinidad para los PPARγ. En este sentido, la activación de la capacidad adipogénica de las células MCF-7 se ha interpretado como un proceso de re-diferenciación (Mueller et al., 1998). En el presente estudio demostramos que el tratamiento con 6-IL en células que sobreexpresan PPARγ provoca un aumento significativo de la expresión de sintasa 60 de ácidos grasos (FASN), un gen que se encuentra regulado por los PPARγ (Bogacka et al. 2004; Kadegowda et al. 2009). Se ha postulado que el compromiso hacia un linaje celular somete a las células a un estado quiescente (von Wagenheim & Peterson 1998; Coffman & Studzinski 1999); así, dicha vía de re- diferenciación podría confluir en el efecto antiproliferativo de la 6-IL. Un aporte sustancial de este trabajo fue la evidencia de que la activación de los PPARγ es crucial para que la 6-IL pueda ejercer sus efectos antiproliferativos y apoptóticos. Esta aseveración se demostró mediante el uso de un antagonista altamente selectivo (GW9662) de PPARγ el cual se empleó para bloquear los receptores endógenos (Fig. 14) y también en un sistema de sobreexpresión de PPARγ por vectores adenovirales (Fig. 16). En ambos casos los efectos antitumorales de la 6-IL sobre células MCF-7 fueron inhibidos con dicho antagonista. Esta observación fue confirmada con la generación de una línea celular con expresión estable de un RNA de interferencia, el cual provocaba el silenciamiento de los PPARγ. En este modelo experimental las células fueron insensibles a los efectos de la 6-IL (Fig. 17). Este hallazgo confirmó la participación de los PPARγ en el efecto antitumoral de la 6-IL. Un dato sobresaliente fue que las células con silenciamiento de PPARγ presentan una proliferación mayor que las células control (WT y Scramble), este comportamiento también ha sido reportado en células de linfomas tipo Burkitt con inmunofenotipo B (Garcia-Bates et al. 2009), indicando que la ausencia de PPARγ permite el escape de las células hacia fenotipos altamente replicantes. Por otro lado, la motilidad es una característica determinante en las células cancerosas y este trabajo demostró por primera vez que la 6-IL disminuye de manera significativa la capacidad de migración de las células neoplásicas MCF-7 (Fig. 18). La inhibición de la migración e invasión por la activación de los PPARγ ha sido reportada en líneas celulares de cáncer de pulmón (Reka et al. 2010), próstata (Qin et al. 2014), glioblastoma y melanoma (Papi et al. 2009) y células de cáncer de mama (Woo et al. 2011). En las células de pulmón se propone a la activación de los PPARγ como generador de un efecto antagónico de la transición 61 epitelio-mesenquima mediada por TGFβ/Smad3. Es decir, mantiene un estado diferenciado de las células (con expresión de moléculas de unión intercelular como E-cadherina), lo que evita que expresen moléculas que participan en la migración (vimentina, N-cadherina y fibronectina). En el caso de las células de próstata se ha propuesto que se debe a una represión dependiente de PPARγ de la expresión del receptor C-X-C para quimocinas tipo 4 (CXCR4), el cual es parte del eje CXCR4/CXCL12 (quimocina C-X-C ligando 12) que a su vez se encuentra involucrado en los procesos de migración, invasión y metástasis al generar una reorganización del citoesqueleto y expresión de proteínas de adhesión célula- matriz de tipo integrinas (Domanska et al. 2013). En el caso de las líneas celulares de glioblastoma, melanoma y de cáncer de mama, no se describe el mecanismo celular, pero se demuestra un efecto inhibidor sobre la migración e invasividad mediada por PPARγ. En nuestro caso, el efecto inhibidor de la 6-IL sobre la migración en las células control (WT y Scramble) es significativo, pues alcanza alrededor de un 60% de inhibición y la participación de los PPARγ es determinante, pues la células con silenciamiento de PPARγ son insensibles al efecto de la 6-IL. Falta abordar si también estarían alterados los mecanismos de invasión, por ejemplo el bloqueo de la activación de metaloproteasas descrito en otros trabajos (Burrage et al. 2008; Reka et al. 2010), o si la activación de PPAR jugaría un papel semejante a los descritos arriba (antagonismo de TGF/Smad3 o represión de CXCR4). Finalmente, se ha descrito que el I2 o la 6-IL inducen apoptosis mediante dos vías: AIF/PARP1 y Bax-Caspasas (Shrivastava et al. 2006; Arroyo-Helguera et al. 2008). Hace algunos años se reportó que los PPARγ eran capaces de activar el promotor del gen de FasL (Bonofiglio et al. 2009) y por lo tanto activar la vía extrínseca de apoptosis en células MCF-7. Esta observación ha sido reforzada recientemente por hallazgos semejantes en células humanas de cáncer colorrectal (Yao et al. 2013). En éste trabajo exploramos si la vía extrínseca de la apoptosis está involucrada en el efecto apoptótico del I2 y la 6-IL; nuestros resultados muestran que la actividad de caspasa-8 no se ve alterada cuando las células son 62 tratadas con alguno de los dos compuestos (Fig. 19), por lo tanto podemos inferir que el efecto apoptótico de éstos compuestos yodados está mediado de manera exclusiva por vías intrínsecas. CONCLUSIONES En este proyecto se demostraron las siguientes aseveraciones: - Las células neoplásicas mamarias MCF-7 contienen mayor cantidad de AA que las células de fenotipo normal (MCF-12). - La 14-IL tiene efecto antiproliferativo y apoptótico de forma semejante a la 6-IL; cuando ambos compuestos son co-administrados sus efectos son aditivos. - La 14-IL podría estar empleando la misma vía que la 6-IL (activación de los PPARγ) para llevar a cabo sus efectos antitumorales, o al menos en la inducción de apoptosis. - La inducción de la expresión de FASN fortalece observaciones previas de que la 6-IL puede ejercer efectos diferenciadores. - La activación de los PPARγ es necesaria para que la 6-IL genere efectos antiproliferativos y apoptóticos - La 6-IL inhibe la migración celular y este fenómeno también podría estar mediado por los PPARγ. - La inducción de apoptosis generada por la 6-IL y/o el I2 se restringe a mecanismos intracelulares. Todos estos resultados refuerzan la noción de que la 6-IL es un intermediario factible de los efectos del I2 y apoyan la propuesta de que este ion puede ser un coadyuvante en el tratamiento de neoplasias de tejidos capaces de captar yodo. 63 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Aceves, C. et al., 2009. Antineoplastic effect of iodine in mammary cancer: participation of 6- iodolactone (6-IL) and peroxisome proliferator-activated receptors (PPAR). Mol Cancer, 8(1), p.33. Aceves, C., Anguiano, B. & Delgado, G., 2005. Is iodine a gatekeeper of the integrity of the mammary gland? J Mammary Gland Biol Neoplasia, 10, pp.189–196. Alfaro, Y. et al., 2013. Iodine and doxorubicin, a good combination for mammary cancer treatment: antineoplastic adjuvancy, chemoresistance inhibition, and cardioprotection. Mol Cancer, 12(1), p.45. Anguiano, B. et al., 2010. Therapeutic effect of iodine on benign human prostatic hyperplasia. En 14th International Thyroid Congress. Paris, Francia, p. P–0051. 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In addition to antiproliferative and apoptotic effects observed in thyrocytes, this iodolipid could also exert similar actions in cells derived from extrathyroidal tissues like mammary gland, pros tate, colon, or the nervous system. In mammary cancer (solid tumors or tumor celllines), 6-IL has been detected after molecular iodine (b) supplement, and is a potent activator ofperoxisome proliferator-activated receptor type gamma (PPAR'Y). These observations led us to propose 12 supplement as a novel coadjutant therapy which, by inducing differentiation mechanisms, decreases tumor progression and prevents chemoresis- tan ce. Sorne kinds oftumoral cells, in contrast to normal cells, contain high concentrations of arachidonic acid, making the b supplement a potential "magic bullet" that enables local, specific production of 6-IL, which then exerts antineoplastic actions with minimal deleterious effects on normal tissues. © 2014 EIsevier Inc. All rights reserved. Contents 1. Introduction.................................... . .... . .. .. .. .... . .... ...... ... .. .. .... .. ... . .... . .... .. ... ... ... . .... .. ... . .... ... .. .. .... .. .... . ..... 27 2. looolactonization............................................................................................................... ....•................. 28 3. Role of iodolipids in thyroid physiology ............................ . ................ . .... . .... . ............... . .... . .... . ............... . ..... . ..... 28 4. Generation and subcellular location ofiodolactones ......... . .... ...... ... ... . .... .. ... . .... ... .. .. ......... . .... . .... .. ... ... ... . .... .. .... .. ..... 30 5. 6-IL effectors......................................................................................................................... ........•........ 30 6. Antitumor properties of 6-IL ....................................... . ...... . .... . .... . .... .. ......... . .... . .... . ......... .. .... . .... . .... . ...... . ..... 30 7. Toward c1inical application............ . .... .. ... . .. .. . .... .. .... .. ... .. .... .. ... ... ... . .... .. ... . .... ... .. .. .... .. ... . .... . .... .. ... ... ... . .......... 31 Authors' contributions................... ..•........ .•........ ....... . . ... .•... ..... ..... ..•... .•....•... ..... ..... ..•... .•... .•... ..... .... ....•.... 32 Conflict of interest................ . ......... . ......... .. .... . .... . ..... . .... .. .... . .... . .... . .... . .......... . .... . .... . .... . .... .. .... . .... . .......... 32 Acknowledgments................................................................................................................... ................. 32 References .....................••.........•.........•.........••..........•....••....•....•....•....•....••....•....•....•....•....••... .•.....•...... 32 1. Introduction Epidemiological studies have shown that moderately high iodine ingestion is a protective factor against mammary and prostate pathologies [1 ,2] .In vivo and in vítro studies have provided evidence that molecular iodine (12 ) rather than iodide (1-) is respon- sible for these antineoplastic effects, and two molecular paths have been proposed: (1) b exerts a direct effect related to the its t Corresponding author at: Instituto de Neurobiología, Universidad Nacional Autónoma de México, Campus Juriquilla, Boulevard Juriquilla 3001, Querétaro, CP 76230, Mexico. Te!.: +52 442 2381067; fax: +52 442 2381067. E-mail addresses: marionava23@unam.mx (M. Nava-Villalba), caracev@unam.mx (c. Aceves). http://dx.doi.org/l0.1016/j·prostaglandins.2014.07.oo1 1098-8823fO 2014 EIsevier Inc. All rights reserved. oxidantjantioxidant properties, which can dissipate the mito- chondrial membrane potential thereby triggering mitochondrion- mediated apoptosis [3], andjor b functions as a scavenger and protective antioxidant neutralizing HO' radical s [4], and (2) b exerts an indirect effect through iodolipid formation and the acti- vation of peroxisome proliferator -activated receptors type gamma (PPAR-y) which, in turn, trigger apoptotic or differentiation path- ways. Here, we review these latter mechanisms that involve the formation of iodo-lactone. Unsaturated fatty acids (UFAs), in addition to being struc- tural components of biomembranes, are metabolized to reactive products and exert a crucial role in several physio- and patholog- ical processes [5] . Many UFA-derivatives, especially the lactones, can act at different cellular levels, functioning as substrates of 70 M. Nava VU/a/ba. c: Acl'V#!S ¡ P,'/lSrug/amlllls &Ollw.r Jillld Melllal.Ol"S I/J. (JfII4p7 13 . " ('z.&Z. II Z.I4Z).U . I I.I~oc"" (M) (IIZ.II Z. I4l¡"~~ I I.I~ocod.._ (6-11.) t'z..u.. I1Z¡..I4-io-l'·,.,....,.._ .... _ ·.....,. (14-11.) Fig. l . Chemic.l l SIrueture o( iodolaclonts. TlIe redel ion involves Ihe fOlIll.ll ion fro lll molo!C14); (2) there is a requirement for free AAwith a carboxyl moiety available to react with iodine (reactive form lOor 1+) to gen- erate the iodolactone; (3) the amount of free AA depends on the PIA2 activity, since themajorityof Mis esterified to phospholipids, and (4) the conversion of AA to eicosanoids by COX and lipoxyge- nases (LOX) decreases its availability as an iodination substrate. An important finding that supports the endogenous generation of iodolactones was made in a patient affected byGrave's di seas e, who was treated with high dos es of iodide (15 mgjday) for 1 O days prior to undergoing surgery. Thyroid tissue from this patient was sub- jected to a lipid extraction process, and the presence of 6-IL was confirmed by GC-MSMS [65 ]. Although only a low amount of 6-IL was generated, the exceptionally high potency exhibited by this iodolipid is known from studies of thyroid growth, in which a 40- to 50-fold lower concentration of6-IL (1.0 J.1M) exerts antiprolifer- ative effects similar to those of 40-50 J.1M iodide [21,65,67] . Regarding its site of synthesis, initial studies show that 6-IL is generated, with the participation of TPO, at the apical membrane in thyrocytes (Fig. 2B); however, radiolabeled iodolipids have also been found in the mitochondrial fraction after 1251_Na administra- tion [66 ]. Another potential region for formation and action ofthis iodocompound could be at the plasma membrane level; studies showthat6-ILsupplementinhibited IP3 generationinduced byEGF, butnot IP3 orcAMP generation induced byTSH, suggestingthat6-IL actions are at the membrane level near phospholipase C [49]. Like 6-1L, other iodinated M derivatives such as 14-IL or I-OH-A could have effects at the membrane level, since glucose and ami no acid transport coupled to Na-K-ATPase activitywere partially inhibited by administration of any of these iodolipids [63 ] (Table 1). 5. 6-IL effectors Paradoxically, the antiproliferative and apoptotic effects of6-IL were not studied in the context of the thyroid, instead most of them have been described in mammarygland [68,69] . Breast cancer cells (MCF-7) are able to take up iodide (through NIS) [70 ] and indepen- dent of NIS, they can internalize molecular iodine (b) [71]. Using high performance liquid chromatography( HPLC), a compound with the same retention time as the 6-ILstandard was recently detected in tumoral mammary gland from a rat supplemented with 12 [72], as well as in 12512-treated MCF-7 cells [71], indicatingthat this com- pound can be generated in neoplastic tissue as it is in thyroid tissue. In MCF-7 cells it has be en shown that 6-ILserves as a ligand for Per- oxisome Proliferator -Activated Receptors (PPARs), particularly the gamma isotype (PPAR1) [69 ]. PPARs are ligand-dependent tran- scription factors that belong to the nuclear receptor superfamily. They are involved in lipid metabolism, energy homeostasis, and differentiation, and recently have be en associated with positive or negative effects on carcinogenesis in various tissues [73,74]. PPAR-y controls glucose metabolism and adipose differentiation, and it is also involved in cellular arrest andjor apoptotic induction [75-79]. In fact, agonistsjantagonists of these receptors are being tested in clinical trials as antineoplastic options. The few results reported to date show contradictions, ranging from no effect to moderately useful responses for sorne cancers. Analysis of these opposing find- ings is still in progress and has been recentlyreviewed by Joshi et al. [80]. Consistent with the effects of PPAR1-ligands, the 6-ILjPPAR cOllljJlex Cdll billu Lo dllU dcLivdLe Lhe PPAR resjJollsive eleIllellL, dS evidenced by electrophoretic mobility shift assays and luciferase transactivation assays, respectively [69]. With regard to cell arrest, 0.5 J.1M 6- IL treatment induces p53 expression with consequent p21 elevation [68 ]. It is well known that p21 participates in cell cycle arrest, inhibiting the Gl-phase progression induced by p53 [81]. Consistentwith this p53-p21 expression, wheneithercancer(MCF- 7) or normal (MCF-12) breast cells are treated with 0.1-0.5J.1M 6-IL, approximately 70% of them remain in Gl-phase [68]. When a moderate concentration of 6-IL (0.5 J.1M) is administered, both caspase-dependent and independent apoptotic effects (increases in Bax-caspase and AIFjPARP-l, respectively) have been described in MCF-7 cells [68]. Moreover, moderate 6-ILsupplementation (1 J.1M) in MCF-7 cells is accompanied by a repression of PPARrr and stim- ulation of PPAR-y expression [69]. PPARrr has been associated with carcinogenesis promotion in mammary cancer [82,83]. It is pos- sible that the 6-ILjPPAR-y activation suppresses the pro-tumoral induction of PPARrr by binding to the PPAR-responsive element present within the PPARrr gene, thereby inhibiting its expression [69,84]. In addition, 6- IL may promote cell differentiation, an action that also involves PPAR-y activation (Fig. 3). In this regard, it has been proposed that PPAR-y activation is antiproliferative since it induces differentiation. Treatmentwith PPAR-y agonists inhibits cancer cell growth by inducing GO-Gl cell-cycle detention, promoting dif- ferentiation, and reverting the epithelial-mesenchymal transition (EMT) [85]. At the molecular level, EMT is characterized by an inter- cellular disruption involving suppression of adhesion molecule expression (e.g., E-cadherin), induction of mesenchymal proteins such as N-cadherin or Vimentin, and acquisition of chemoresis- tance by up-regulation of ATP binding cassette (ABC) transporters and anti-apoptotic markers like Bcl2, Bcl-xl, or Survivin [86]. In functional studies it has been demonstrated that, similar to 5 J.1M rosiglitazone, a highly specific, synthetic PPAR-y ligand, the same concentration of 6-IL is able to generate intracellular lipid accu- mulation in MCF-7 cells as well as decreases in Bcl2 [68,69] ; lipid accumulation is considered a marker ofterminal differentiation in human breast cancer celllines [87]. 6. Antitumor properties of 6-IL Recently, the antitumor potential of 6-IL has be en explored in diverse cancer cell lineages that show differential sensitivity: neuroblastoma, glioblastoma, melanoma, lung, pancreas (5 J.1M) [88 ], colon (10I"M) [89 ], and prostate (1-S0I"M) [90]. These studies also provide evidence about the 6- IL mechanisms that involve intrinsic apoptotic pathways accompanied by the classic 73 M. NilviI ViI/llIhi1. e Ñl!ws j Prostngliludil/S (o"O//ler l.iplll Ml'di!ltQl'S /17. (J.fII4)7.7 n .1 1 Cytoplasm -.......... -1 Chemores istance Fig. l. Gpnprill ion alld inlra<:pUn lar aaions o f G .. 11. in eXl rat hyroid (plls. MoIK:u l.lr iodine SlI llplf!m"m is inmrporat(':(! imo Ihe m"mhranp cpll hy fa<:ility diffusion rran<;pon (1] T) and binds Wifh ar,1chidonic a<:id (AA) molecules 10 generale 6-IL This iodolipid could he a<:1 ar I WQ levels: d irect rea<:h ing milochond r ia me mbrane and acrival ing dpoptot ic mech.anislU J:S rt"'iulled of ROS imb.J.l.a nce; a nd /o rindi rect .. a ion. by 6 ll lig .. nd wilh PPAR)'/RXR ft"Ce pl o~ I ri 1:í!e ril ~cell cyd e .. n ........ d iffefenliillion .. ml .apoplot ic induction. and restr.¡i n Ihe inst"UAlion of chemof('sisIAnce. 1'I'I\R)': p('roxisome prolife rAlor .. AclivAIct! rece pto r. ?.AmmA isolyf)(': KXR: f('(i noid X receptor: L:c; r R: e pidemiAl f-!OWlh fAClor receptor: II'J: inositol 1,'I.s .. triphosphAl e; 1'1.C: phospholi l'iISl' c: ROS: reAClive oxYf-ell Specles. morphological changes of apoptosis (pyknosis. karyorrhexis. ce tl shrinkage, and membrane blebbing) and decreased PCNA expres- sion [89J. [n addition ro rhe wcll-documemed effens induced by 6-IL that inelude apoprosis [68.901 . cell cyele arrest [68[. ditTeren- t iation [691. and antí-ínvasiveness [891. another reactive oxygen species (ROS)-mediated parhway has also been proposed. Evi- dence of increased ROS production and lipopcroxidarion levels afte r 10[.LM 6-IL t reatment [89J. as well as inh ibirion of 6-[L- induced mirochond rial membra ne disruprion by N-aceryl-cysreine supports rhis idea [88[. The wide diversiry in se nsitivity. fu nc- rional etrens. and mechanistic actions reported for rhis iodol ipid suggest that the etTects of 6-I L depend on the cellular or t i$Sue context, and furt her studies should be designed to ana[yze the physiological role oft his iodoli pid in both normal and parhological condirions. 7. Tow.1rd clinicdl dppliulion There are few studies about 6-IL transport and stability il! vivo. Reports of Pisarev's group show that intraperitonea l or oral admin- istrar ion of6-IL 5-1 O ~ govera period of1 O days excrts a significant antigoitrogenic action wirhout detrimental effea s on rhyroidal or general metabolism (no change in urea, acetylcholinesterase activity, cholesterol, total prorein. and total T3 and T4) (58.61 .62[. Similarly, rhe i.p. injecrion of6-IL ( 15 ~gJday for 30 days) reduces the growth of HT-29 cel! xenografts on NIH nude mice (891: how- ever. the pharmacodynamic dist ribution. diffusion mechanisms. and/or the t issues rhat prcferentially take up 6-IL have not been determined. In cont rast. iodine circulat íon and its tissue-spccifi c uptake have bcen well studied at concentrations induding anti- tumoral doses. and no harmful effects on thyroidal or general physio[ogy were observed [9 1- 95[. Moreover. long-term (3-8 monrhs) 5 mglday 12 supplcments. a dose similar to the inrake of the eastern popu lat ions of Japan 11 .96[. have bcen shown to be safe for treatment ofhuman mam mary fi brocysric disease {97.98J . breast ca ncN. 1 or prostare hyperplasia.2 Thus, rhe preferem ia ll y loca l formation of 6-IL in proliferating [65[ or ncoplastic tissues (72J from organs capable of iod ine uptake. together with its lack of da mage to normal tissues allows 12 supplement to be consi dered a good example of the "magíc bullet" concept. Paul Ehrlich inspired this rerm over one hundred yea rs ago for rhe arscnic derivatives used againsr syphilis {99.1001: since then th is notion has inspired generarions of sciem isrs ro devise powerfu l and se[ective molecu- larcancer chemorherapcurics. The prime requiremellts for a 'magic bullet' are rhar ir has high se lectiviry for a rherapeuric target and ir is innocuous toward the patient's normal cells [99. 100[. In searchof these 'magic bullets' a broad range of chemotherapeut ícs has been explored. includi ng antibodies. liposomes. immunoli posomes. and nanomate rials [101 - 1 03J. bur in a ll instances. overcoming the side effects isa hard experimental and clinica l obstade. Thus. the abiliry of certain organs ro take up iodine together wi th high arachidonic acid concentrarion in par hologica[ rissues like ma mmary [104- 1 08J and prostare cancers [109.11OJ makes molecular iodine a magic bullet that acts through the formarian of speci fi c etTector com- pounds like 6-IL , l'erallA G. Tonl.'5 J. \)('lgado G. Domll¡Zuez A \)(' Ob.lkl ..... R. l)u.iu1e L etal lodirK' e;¡lribils dual efJf'dS 011 br-oosl rulKl'r as u w-ITl'IIIrnffiI v.ílh aulhracyrlifws: alllÍ-lw.vvlasdc sYIIl'rgy r/nd mrdioprOfP.Cror. 102nd 1\0nll,11 Meeting of the Ameri- c .. n Associ .. tion (or C .. IICer Rest-a rc ll. Orlando. Florid.¡. Ap ri l 2 6. 201 1: Arnt'r1ciln Associ.J.l ion for Co!.fICer Rt"SeAf(h: I'hil.ldeiphi.l. 1'1\. 201 1 11'osler Nu mber 35O'J1161. 1 Ang lliAJlo n, Lede-zmA O.JUArez M. Nui'K"z 1'. Neves C. Uk'mpell(f(el!eCf oflndlne 011 IH'lIigJ,IlUIIIUII prosfalÍ( I'yperplasia. 14rh Imern.uion.al Thyroid Congress. P,1 r is. l'r"IIet". St"plelJlber 1 1-16. 2010; EU rof)('dll Thyroid AssocÍdlio11. AlllerKdll TIlyroid AssocÍdl ion. As Íd & Ocedni.a Thyroid Associ.alioll. Ltlill AmerK .. n Thyroid Sociely. 2010 ¡I'osler Number 1'-005 11. 74 32 M. Nava-Vil/alba, C. Acevesj Prostaglandins& ocher Lipid Mediators 112 (2014) 27-33 Authors' contributions MNV performed the literature search and wrote the manuscript, CA made substantial contributions to the conceptian and design of the review. 80th authors have read and approved the final manuscript. (oofliet ofinterest The authors declare that no competing fina ncial interests exist Aclmowledgmenls This work was partia lly supported by grants: PAPIIT-UNAM IN200813 and CONACYf 17691 l. Mario Nava-Villalba was a Doc- toral student in the UNAM Biomedicat Science Program and received a fellowship from CO NACYf (No. 215708). The authors are grateful to Leonor Casanova for academic support, Dorothy Pless for proofreading, Francisco Javier Valles for bibliographic assistance and Fernando López-Barrera for assistance with the graphics. References [1 [ Aceves C, Anguiano B, Delgado G. The ex trathyronine actions of iooi ne as antioxidant, apoptotic, and diffe rentiation factor in various tissues . Thyroid 2013;23(8 ):938-46. [2[ Anguiano B, Aceves e lodine in mammary and prostate pathologies . CUIT Chem BioI 2011 ;5(3): 177- 82. 13 [ Shrivas tlVa A, Tiwari M, Sinha RA, et a l. 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Nuñez-Anita', Alexander Bontempo' and Carmen Aceves " Abstract Background: Molecular iodine (1 2) exhibits antiproliferative and apoptotic effects on in vivo and in vitro cancer models. These effects are thought to be mediated by an iodinated arachidonic acid derivative, 6-iodolactone (6IL), and one of the proposed mechanisms is that 61L activates Peroxisome Proliferator-Activated Receptors type gamMa (PPARG). These receptors have been implicated in the inhibition of carcinogenic processes, in addition to their elassical role in maintaining lipid and glucose homeostasis. The aim of this study was to determine whether PPARG participates in the 61L antiproliferative and apoptotic effects on the mammary cancer cellline MCF-7. Methods: The 61UPPARG complex was inhibited by the PPARG antagonist GW9662, in both an endogenous and overexpressed (adenoviral vector infection) context, and stable PPARG-knockdown MCF-7 cells (RNA interference, confirmed with hydrolysis probes and Western blot), were used to corroborate the PPARG participation. 61L effecti on proliferation (measured by T rypan Blue exelusion) and apoptosis (phosphatidylserine identification by fiow cytometer) were evaluated in conditions of chemical inhibition (GW9662) and silencing (RNA interference). A wound-healing assay was conducted on wild-type and stable PPARG-knockdown MCF-7 cells to evaluate the antimigrational effect of 61L. Caspase-S activity was evalua:ed to determine if the extrinsic pathway is involved in the effects of 61L and 12 treatment. Results: Antiproliferative and pro-apoptotic 61L effects require the activation of PPARG. In addition, wound-healing assays show that 61L is able to inhibit MCF-7 cell migration and that PPARG plays a role in this phenomenon. Finally, the data exelude the participation of the extrinsic apoptotic pathway in 61L- and I,-induced apoptosis. Conclusions: These results support the previously proposed mechanism, in which the 12 effects are mediated by 61L, and they provide further support for the use of 12 as coadjuvant in breast cancer treatment. Keywords: lodine, lodocompounds, PPARG, Arachidonic aCid, Mammary cancer, MCF-7, lodolactone Background 6-lodo-5-hydraxy-8,11,14-eicosatrienoic acid, o-lactone (6-iodolactone or 61L) is an iodinated arachidonic acid (AA) derivative and has been praposed to mediate the antitumoral effects of iodine [1-3]. Molecular iodine (12), but not iodide (r), exerts antineoplastic actions on diverse tissues (marnmary, prastate and thyroid glands, and on melanoma, pancreas carcinoma and neurablastoma cell tines), and various studies suggest that these effects can * Cor'espondence: caracev@unam.mx llnstituto de Universidad Nacional Autónoma de Juriquilla 3001, Juriquilla, Querétaro CP 76230, Mexico Full lis! of author information is available at the end ofthe article o BioMed Central involve direct or indirect mechanisms [4-8]. In the direct effect, the oxidant/ antioxidant praperty of 12 can dis- rupt the mitochondrial membrane potential and trigger mitochondrion-mediated apoptosis [6, 9]; on the other hand, the indirect path involves the generation of iodolipid intennediates, and there is evidence that 61L could be one such intermediate. The presence of 61L has been reported in normal and tumoral mammary gland fram rats with continuous 12 supplements in their diet [2]. 61L has also been observed in an in vitro model, in which an iodin- ated lipid co-migrating with the 61L standard was de- tected in 12SlTtreated MCF-7 cells [5]. 77 Nava-Villalba el al, Malecular Canee' (2015) 14:168 At the molecular level, both h as 6lL generate antitu- mor effeds through similar pathways. Both t rigger a p53J p21-mcdiated cell growth arrest, and both induce Bax- caspases and AIF/PARP-l apoptosis [1, 9]. In MCF-7 cells, 61L supplement is aecompan ied by a significant stimulation of peroxisome proliferator-activated re - ceptor type gamma (PPARG) and inhibition of PPAR alpha (PPARA) expression [10] . Moreover, using electro- phoretic mobility shift assays (EMSAs), these authors demonstrated that 61L is a PPAR ligand and can activate the PPAR response clement (PPRE) (as shown by n..'porter gene transactivation assays). PPARs are involved in lipid metabolism, energy homeostasL<; and differentiation, and they have also been associated with positive or negative effeds on cardnogenesis of various neoplasias [l1 - 13J, \Vhile PP ARA has bcen linked to carcinogcnesis promotion [14, 15], PPARG or NRIC3 [16, 17] is proposed to be an antineoplastic agent, since it inhihit'i proliferation, induces apoptosis and promotes differentiation [18- 22]. These opposing effcds of PPARA and PPARG have been docu- mented in normal and tWlloral breast tissue and manunary " " " " " say. e A:xnlosi\ W(!\ (l ila y/ed by 'ow e;¡lolTle! !y (e, d). ~, C5J ts are cxprcsscd as pereen! ch,rgc wit r rcspcct lo the cenl':;!. Data a re cxprCS5CG as mean ± 5D (,~ - 4 -ndcpcndcnt ilSsayS). Jnd t he aster isk nd ieates J sif"nifCJn t u¡f'clc"ce wil h respccl lo l"e co'"tro l Wnres iln l ir lO ferilt ve il nc. ;DOr I01 r effMs OC ( ~ I. ilnd the", p n~ ilnre m p~ts il le pil lliill y :)rpventf'd hy GW9662 {GW;. , a Rcp 'cscn tativc p3rlds cf t l'e infccron-effc"erlc-y <:Issay, MCF-7 cclls wcre -IILxtcc (2¿ ~ ) w iln AdGFP <:It irlCre<:ls ing rn ultipkit ics o' r:.);oll ill _,\JPPAPC- -.. rt.'{J\:.'C u ~ls w as alla 'y¿ed -)y qPCR il llO I)()'mil ' lf'(; lO ACffi eX f)'e'"iort e A r il n g~ o ' MO I ~ Win ;;rMly/!'(j 1(~ df'telrni nf' t ~e opt irllil It:'vp w ,l n "O " f'eCl en :)ro lif"'iltion: iln MO d 50 .~· as sdccted fer subscqJC~ t cXpCrimcnts, d r <:lt ty <:Ic-d synthasc {~IlSM exprcss ion W<:IS <:111(1 yzcd by t ~e d"-':R <:Issay, and t~c results wcre nDr1"hl iZ2d te ACIB exp'ess-Gll. e P'ol -fclat io ll ill HIC prc';CrlCC of -O ~:.,.16 L a" u artel GW pretrcatrncllt ' N ~ al'aly¿c>d ~ thc TIYpCl l1 B uc ex d u~ icll as';(jY, f T"c " pop to tic erre<-t or 61 \NeiS <:I lld ly/ed by nc'N CytGlIlet -y, <;e;J a, pelct'f 11 chclIY,¡e w:th re, ;JKI 10 I lit:' co -· t ro _ Diltel (I'e exprt:',- RNAi Ctrl b e qPCR (hydrolysis probes) ,. it b 11m -to .... :o~ #' ~, ~ " Weslern Blol l i ~ W T Sc,._ RNAi -o · WT6-IL 400 ..t: 300 ,,¡ > ~ 200 < • ~ u 100 '#. -.. Scramble 6-IL -o· RNAi 6-IL Fig. 3 K Il (Y~kJüW Il d PPARS boco in\(; lle sc'¡; td ' OJring 1'1;5 lime WilS oclc " Tlim,'t! {lOx übje,<-l ive, ~cdle ¡)(Ir )((1 ~ITI, dverdge o;c rdl cll w iol" 377 ,,111), a Re:) r e~I'ld r v e lII 'oG phoIGgrd:,h, d wO Jrld-h e¡; I'no:; (l~\;jY'>, b N'. io:;rdl inl,J <.el l\ (lold ri JIToer), [)-JI¡; are exp'Csscc as mean ± SD (n - 3 i n c ex n c:e~t aS5ays;, tWG-way A\IOV,\ and I ukey's mu ir pie cOT1parison tests '.'Jere pcr forllcc; d iffc rent cttcrs i~d i c atc sign'nCilrl t d ifferc " ccs bctw<'''~rl pOJpS (P < O,OS) 81 Nava-Villalba el al, Malecular Canee' (2015) 14:168 The 61L induction of apoptosis is not activated by the extrinsic pathway To evaluatc thc participation of the extrinsic pathway in the 6lL or 12 effects on apoptosis, caspase-S activity \vas evaluated. Neither 10 11M 61L nor 200 11M 12 treatments produced an)' change in caspase-8 activity (Fig. 5). Discussion A significant body of data from in vivo experiments [4, 26-291, dinical trials [30-33], and epidemiological reviews [31- 36J support the notion that molecular iodine has a protective cffect against thc progrcssion of neopla stic diseases and inflammatory/proliferative pathologies. An important fact to consider is that these beneficial effects m:cur onl)' at relatively high iodine concentrations (milligramsJday) and only in those tissues that are able to capture iodine. In the case of mammary and prostate glands, both normal and tlllTIoral ceUs internalize 12 by a sodium/iodine sym- porter (NIS)-independent mechanism [1 , 1, 5, 8, 37] that seems to involve a fadlitated diffusion process (saturable and dependent on protein synthesis) [5]. It has not yet been determined how 12 react'i with cell components, but h is known to bind covalent1y to proteins and lipids [5J. The iodination of fatty acids generates several derivatives, but those from arachidonic ac:id (AA), like 6lL, are espe- cially rclevant since endogenous 6IL has bcen dctected [38, 39], and it generates a range 01' biological effects [3]. Q) Ol e '" .s::: u 99 %) was used to synthesize 61L was from Calbiochem (La JoUa, CA, USA). GW9662 (purity >98 %), a specific PPARG antagonist, was obtained from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). AU other chemicals were of the highest grade of purity commercially available. The breast cancer cellline MCF-7 was obtained from ATCC'''. The cells were maintained in Basal Medium (DMEM Page 7 of " supplemented with 10 % FBS, 100 U/mL penicillin, 100 ~g/mL streptomycin) at 37 oC and 5 % CO2 prior to experiments. Chemical synthesis of 61L 61L was synthesized with a modification of the method of Monteagudo [53]. Briefly, to a solution of AA (65 mg) in acetonitrile (0.8 mL) was added a solution of iodine (156 mg) in acetonitrile (8 mL) at 4 oc. The solution was kept under N2 , stirred for 4 h at room temperature and protected from light. The solution containing crude product was concentrated under low nitrogen flow to 0.5 mI and separated on preparative TLC using the solv- ent system CH2Cl2 /MeOH (97.5:2.5). The reaction prod- ucts, AA (rf: 0.5) and 61L (rf: 0.88) standards were visualized by iodine vapors, and the 61L synthesized was eluted with the same solvent and concentrated under low nitrogen flow. Adenoviral infection Recombinant adenoviruses expressing human PPARG (AdPPARG) were provided by Dr. Steals (Institut Pasteur de Lille, France). Adenovirus expressing GFP (AdGFP), provided by DI. Hernandez-Gutiérrez (Universidad Panamericana, México), was used to confirm infection and as control. Viruses were multiplied in HEK-293 cells (provided by DI. Martínez-Torres, Instituto de Neurobiología UNAM, México). Adenoviral titer was determined by the MOl (multiplicity of infection) test (AdEasy'" Vector System, application manual version 1.4). Prior to treatment with GW9662 and/or 61L, MCF-7 ceUs were infected at an MOl of 50 for 24 h in basal medium. Stable transfection with shRNA against PPARG (RNAi-PPARG) Retroviral silencing plasmid (HuSH"') containing a short, specific hairpin with RNA interference for PPARG, a puromycin resistance gene, a tGFP gene and a U6 pro- moter was obtained from Origen Technologies, Inc. (RockviUe, MD, USA) (RNAi-PPARG ceUs). A similar plasmid but with a scrambled sequence of the short RNAi hairpin against PPARG (Scramble-PPARG ceUs) was used as internal controL MCF-7 cells were trans- fected with 5 ~g of plasmid and Xfecf" Transfection Reagent (Clontech Laboratories, Mountain View, CA, USA) according to the manufacturer's instructions, and they were maintained in culture for 48 h; after this time the transfected cells were selected with 1.0 ~g/mL puro- mycin daily over 2 weeks and expanded. Transfection of the cells was confirmed by tGFP express ion using an IX50 Olympus microscope with inverted reflected light fluorescence system (Olympus Inc., NY, USA), or by an Agilent 2100 bioanalyzer using an On-Chip flow cytometry 83 Nava-Villalba et al. Molecular Cancer (2015) 14:168 system (Agilent Technologies, USA). Knock-down of PP ARG expression was evaluated by quantitative real time PCR (qPCR) with the specific Hydrolysis Probes (Sigma- Aldrich Ca., MO) shown in Table 1 and by Westem Blot. The selected and stably transfected population was main- tained under "light pressure" (0.5 ~g/mL puromycin) over the course of the experiments. Experimental groups The experiments were carried out on AdPPARG-MCF- 7-infected cells, on Scrambled- or RNAi-PPARG-MCF- 7-transfected cells and on wild-type MCF-7 cells. The cells were cultured at a density of 5 x 105 cells in 60-mm culture dishes (Nalge Nunc International, Naperville, IL) for qPCR assays; 4 x 104 cells/well in 24-well culture plates for proliferation assays, 2 x 105 cells in 6O-mm culture dishes for apoptosis experiments, 3 x 106 cells in lOO-mm culture dishes for Western blot assays, 8 x 105 cells in 60-mm culture dishes for wound-healing assays, and 5 x 106 cells in lOO-mm culture dishes for caspase-8 activity assays. All cells were seeded in complete basal medium and incubated for 24 h befare treatment; at the beginning of experiments the medium was changed to low serum (0.5 %)-containing medium. The cells were treated for 24, 48, 72 or 96 h, (depending on the experi- ment) at 37 oC with 10 ~M 6IL, 0.5 ~M GW9662 or ve- hiele (ethanol) diluted befare application in low serum- containing medium. In the GW9662/6IL-treated group, GW-9662 was administered 2 h prior to 61L treatment. Quantitative PCR Total RNA was extracted from cells using TRIzo!" re- agent (Life Technologies, Thermo Fischer Scientific, MA, USA) according to the manufacturer's instructions. Two micrograms of total RNA was reversed transcribed using the Superscript 11 system (Invitrogen, Carlsbad, CA). qPCR was performed on the sequence detector sys- tem Roto-Gene 3000 (Corbett Research, Mortlake, Australia) using SYBR green as a marker for DNA amp- lification. The reaction was performed with 1 ~L cDNA template and the Maxima SYBR Green/ROX qPCR Mas- ter Mix (Thermo Fischer Scientific, MA), using 40 cycles of three-step amplification (94 oC for 30 s, 55-62 oC for 30 s, 72 o C for 30 s) and the gene-specific primers listed in Table 1. PCR generated only the expected specific amplicon, which was demonstrated in each case by the melting temperature profile (dissociation curve) and by electrophoresis of 5 ~L of the PCR product through a 2 % agarose gel in TAE buffer then visualization by eth- idium bromide. No PCR products were observed in the absence of template. Gene expression was calculated using the D cycle threshold method and normalized to the content of ACTB, a non-regulated housekeeping gene. All measurements were performed in triplicate. Page 8 of" Western blot Pellets of whole protein were obtained from lysed cells using RIPA buffer with complete Mini, EDTA-free prote- ase inhibitor cocktail tablets (Rache Diagnostics GmbH, Germany). The extracted proteins were quantified by the Bradford method (Bio-Rad protein assay; Hercules, CA) and analyzed by Western blot. SDS polyacrylamide gel electrophoresis was performed as described [10], using stacking and resolving gels (the latter with 15 % acryl- amide). Samples containing 50 ~g of protein were applied to each lane. After electrophoresis, the proteins were elec- trotransferred to a nitrocellulose membrane (Bio-Rad, Germany), which was then blocked overnight with TBS containing 5 % non-fat dry milk. The membranes were rinsed and treated with polyclonal anti-PPARG antibody (sc-7196, 57 kDa, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology Inc., USA) and anti-ACTB (sc-1616, 43 kDa, 1:10,000, Santa Cruz Biotechnology Inc.) as a protein-Ioading control Protein bands were visualized using a chemiluminescent detection system (ECL, Amersham Biosciences, UK). Densitometry was performed with Image Lab'" software (Bio-Rad Laboratories, CA, USA), and chemiluminescence was normalized to the level of ACTB protein. Proliferation assays The effects on proliferation of 10 ~M 6IL, 0.5 ~M GW9662 and the GW9662/6IL mixture were analyzed using the Trypan Blue dye-exclusion assay. The cells (4 x 104 /well) were cultured in DMEM supplemented with 10 % FBS on 24-well culture plates. Control cells were treated with 0.1 % ethanol (solvent for 6IL). After a 72-h treatment, the cells were harvested with trypsin- EDTA 0.05 % (Life Technologies Brand of Thermo Fischer Scientific, MA, USA). Trypan Blue (0.4 %) was added; those cells that excluded the dye were counted with a hemocytometer under the microscope (Leica Inverted Microscope DMIL model, Germany); prolifera- tion is reported as fold change with respect to control Apoptosis assays Apoptosis was assessed by detecting phosphatidylserine on the external surface of the cell membrane with annexin V conjugated to the Cy5 fluorophore. To mark cells with intact cell membranes, Calcein-AM was used. Apoptosis was assessed by an Agilent Bioanalyzer 2100 and apoptosis kit following the manufacturer's instruc- tions (Agilent Technologies, USA). Briefly, afier treat- ment the cell density was adjusted to 1 x 106 per mL in 200 ~L basal medium, and 200,000 cells were transferred to a 1.5-mL microtube and centrifuged at 2500 rpm for 3 min; the supernatant was discarded. The pellet was re- suspended in 200 ~L of 1X Binding Buffer (provided by the manufacturer), and 1 ~L of Annexin V (Abcam ~ , UK) was added and incubated at room temperature for 84 Nava-Villalba et al. Molecular Cancer (2015) 14:168 10 min; after centrifugation at 2500 rpm for 3 min the supernatant was removed, and 1 ~L each of Calcein-AM and Fluorolink Cy5 in 200 ~L of Binding Buffer were added to the pellet and incubated for 10 mino Finally, the cells were collected by centrifugation and resus- pended in Cell Buffer (provided by the manufacturer). A 10-~L aliquot of cells from each treatment was placed on the cell fluorescence LabChip" together the solutions provided in the kit The apoptotic cells are reported as a percentage of the number of events; this population is delimited in a standardized region by the program Cell- Chip Agilent 2100 Expert software (Agilent Technologies, USA). Wound-healing assay RNAi-PPARG MCF-7 cells, Scramble-PPARG MCF-7 cells and wild-type MCF-7 cells, 8 x 105 in each case, were seeded on 60-mm culture plates and incubated at 37 oC and 5 % CO2 • Afier 24 h, the attached cells were scratched three times in parallel with a 1000-~1 pipette tip (~377 ~m) and treated with 10 ~M 6IL or vehicle (ethanol) for 24 h. Afier this time, three new parallel wounds were performed as width control; the number of migrating cells was obtained by counting the number of cells inside this width controL The count was measured by Leica Application Suite Version 2.8.1., and the images were captured with a 10x objective lens using a Leica DM 2500 microscope and DFC 420 camera (Leica Microsystems, CMS GmbH, Germany). The results are presented as number of migrating cells of treated (6IL) vs. control (Ctrl) groups (mean ± SD). At least three fields were analyzed for each plate, and each group was analyzed in three independent experiments. Caspase-8 activity assay The caspase-8/FLICE activity was measured using a commercial kit (ApoTarget, Invitrogen Ca., CA, USA) according to manufacturer's instructions. Briefly, 5 x 106 MCF-7 cells were collected after a 48-h incubation with h or 6IL. The cell pellet was lysed, and an aliquot con- taining 200 ~g of protein was incubated with DTT (10 mM) and a colorimetric substrate, IETD-p-nitroani- lide; (pNA, final concentration 200 ~M) at 37 OC for 120 min in the dark. The samples were then read in the spectrophotometer at 405 run. The absomance of pNA from a treated sample was compared with an untreated control to determine the fold increase in caspase-8 activity. Statistical analysis One- or two-way ANOVA was performed to determine the significance of differences between groups, followed by Tukey's test for the significance of differences among multiple experimental groups. Data are expressed as mean ± standard deviation (SD), and values with P < 0.05 Page 9 of" were considered statistically significant. In the figures, an asterisk indicates significant differences with respect to the control (P < 0.05), and different letters indicate significant differences between groups (P < 0.05). Competing interests The authors declare that they have no competing interests Authors' contributions MN-V assays and contributed to provded the concept design and scientific directiol\ led scientific discussions and contriooted to editing and drafting ofthe manuscript. AII authors have read and approved tre final manuscript Acknowledgments We thank Felipe Ortíz, M. Juana Cárdenas-Luna and Antonio Prado-Galán for technical assistance; Martha Carranza and A. Edith Emico-",Idom advice and academic assistance; Leorar Casarava academic support; Alberto Lara, Omar GJnzalez, Ramon Martírez ard Sandra Hernández for computer assista rLe ard Dr. Dorothy Pless for special tmnks to Guadalupe Delgado for techni:::al and may she rest in peace Funding information Mario Nava-Villalba was a graduate student of UNAM in the Doctorado en Ciencias Biomédicas, UNAM and from CONACYT This work was partial~ supported by grants 200183 and CONACYT 76911 Received: 4 May 201 S Accepted: 24 August 201 S Published online: 17 Seplember 2015 References tumoral breast cells: evidence that 6-iooolactone mediates apoptotic effects. Endocr Relat CanceL 2008;15:1003-11 m undifferentiated human prostate cancer cell lines. Prostate. 2013;73:31-41 85 Nava-Villalba et al. Molecular Cancer (2015) 14:168 Page 10 of 11 chemoresistance inhibition, and cardioprotection 30 10 32 33 12 13 34 35 14 200J;4:11-7 36 Venturi S. Is there a roldar iodine in breast diseases? Breas!. 2001;10:379-82 37 15 in the breast 38 cancer cell and Carcinog.2002;34:165-71 16 Germain P, Staels B, Dacquet C, Spedding M, Laudet V. Overview of nomenclature of nuclear receptors. Pharrncy:ol Rev. 2006;58:685-704 17 FJ, et al 39 International Unían receptors. Pharmacol 18 Elstner E, Muller C, Koshizuka K, Williamson EA,. Park O, Asou H, et al for peroxisome proliferator-activated 40 ocd 19 et al gamma. Mol 41 Cel!. 1998;1:465-70 20 21 42 22 43 2l 44 24 45 25 46 of PPARgamma