UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO PROGRAMA DE MAESTRÍA Y DOCTORADO EN CIENCIAS QUÍMICAS ESTUDIO DE LA FORMACIÓN DE COMPLEJOS DE INCLUSIÓN DEL FÁRMACO ANTIINFLAMATORIO INDOMETACINA CON CICLODEXTRINAS Y SU INTERACCIÓN CON Cu(II) Y Zn(II) EN SOLUCIÓN. TESIS PARA OPTAR POR EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS PRESENTA M. en C. ADRIÁN RICARDO HIPÓLITO NÁJERA DRA. MARÍA DEL ROSARIO MOYA HERNÁNDEZ FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN MAYO 2020 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO PROGRAMA DE MAESTRÍA Y DOCTORADO EN CIENCIAS QUÍMICAS ESTUDIO DE LA FORMACIÓN DE COMPLEJOS DE INCLUSIÓN DEL FÁRMACO ANTIINFLAMATORIO INDOMETACINA CON CICLODEXTRINAS Y SU INTERACCIÓN CON Cu(II) Y Zn(II) EN SOLUCIÓN T E S I S PARA OPTAR POR EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS P R E S E N T A M. en C. ADRIÁN RICARDO HIPÓLITO NÁJERA DRA. MARÍA DEL ROSARIO MOYA HERNÁNDEZ FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN Ciudad de México, Mayo del 2020…. A. Ricardo Hipólito N. Agradecimientos. Agradezco infinitamente a mi madre María del Carmen Nájera Baños por todo los esfuerzos realizados, el apoyo y la paciencia que me ha brindado para alcanzar estas metas. Aún faltan muchas alegrías y demasiados retos, los cuales no dudo que seguiremos compartiendo. ¡Te amo! Muchas gracias a mi abuela Alicia Baños Ortiz y a mis primos Irene y Gilberto, ya que su compañía y su manera de ver la vida, me ayudado a darle forma a la mía. No puedo dejar pasar de agradecer especialmente a la pequeña Aranza, que en tan poco tiempo ya ha nos ha traído mucha felicidad. Gracias a la Dra. María del Rosario Moya Hernández, por todo el soporte, la guía, los conocimientos y herramientas que me brindó para desarrollarme en mi carrera profesional, como en la vida en el día a día. Es una tutora ejemplar. Agradecimientos al Dr. Rodolfo Gómez Balderas por el apoyo profesional, las guías de escritura y las aventuras académicas en las que hemos compartido bastante. Agradezco a todos mis amigos que estuvieron presentes en este proceso largo de formación: A Martha E. García, Cecilia Yáñez, Fernanda Velázquez, Brenda Cruz, Janet Suárez y muchos más, que gracias a ustedes la vida es más divertida; a mis amigos derivado de la música, Rogelio Sotelo, Dorian Medrano, Ernesto Reyes, Juan Bautista, Emmanuel Manriquez y muchos más, con los cuales se viven experiencias nuevas ha cada momento. Muchas Gracias al comité jurado por hacer la revisión de esta tesis al brindarme sus correcciones y comentarios: Dra. Lena Ruiz, Dr. Miguel Costas, Dra. Teresa Ramírez, Dra. Patricia Guadarrama, Dra. Yareli Rojas, en tiempos de contingencia por el COVID-19. A la Coordinación del Programa de Maestría y Doctorado En Ciencias Químicas. A los profesores que semestre con semestre me compartieron todos sus conocimientos. A los proyectos PAPIIT IN211881 “Complejos de Cu(II) y Zn(II) con fármacos antiinflamatorios” y al proyecto PIAPI 1846: “Complejos de inclusión de ciclodextrinas con moléculas orgánicas de interés biológico” Agradecimientos al CONACYT por la beca otorgada para estudios de doctorado con número de becario: 300687. A la UNAM por brindarme, durante todo este tiempo, todo lo necesario para mi formación como profesional. Al deberle tanto a esta institución, prometo dar todo lo necesario, para lograr ser un digno representante de todo el conocimiento almacenado en la mejor universidad de América Latina. A. Ricardo Hipólito N. Este trabajo fue realizado en el laboratorio 10 Fisicoquímica Analítica de la Unidad de Investigación Multidisciplinaria, Campo 4, de la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán, UNAM. A. Ricardo Hipólito N. Algunas secciones de este trabajo fueron presentadas en los siguientes congresos: - Determinación de las constantes de inclusión de complejos M(II)-Indometacina con ciclodextrinas en medio acuoso. XXXII Congreso Nacional de Química Analítica en Universidad Autónoma de San Luis Potosí, S.LP. Cartel profesional. 10-14 de Junio de 2019. - Inclusión de complejos M(II)-Indometacina con ciclodextrinas en medio acuoso. 5º Congreso de Ciencia, Educación y Tecnología en FES Cuautitlán, UNAM, CDMX. Presentación Oral. 17-21 de Junio de 2019. - Estudio del complejo de inclusión Cu2Indo4(H2O)2-Ciclodextrina. QuimiUNAM 2018 en Facultad de Química, UNAM, CDMX. Cartel. 7 Agosto de 2018. - Estudio de la interacción ciclodextrina con cobre (II) en disolución acuosa. XXXI Congreso Nacional de Química Analítica en Universidad Autónoma de Hidalgo, Pachuca, Hidalgo. Presentación oral. 11-15 de Junio de 2018. - Speciation of indomethacin-cyclodextrins inclusion complex in water. 19th International Cyclodextrin Simposium en Sophia University, Tokio, Japón. Cartel Estudiante. 27-30 de Abril de 2018. - Estudio de la formación de complejos de inclusión de indometacina con b-CD y 2-HP-b-CD por espectroscopía UV-Vis e ITC en solución acuosa. XXX Congreso Nacional de Química Analítica en Universidad de Guanajuato, León Guanajuato. Cartel Estudiante. 11-15 de Junio de 2017. Los artículos científicos derivados de esta contribución son los siguientes: - Hipólito-Nájera, A. R., Rojas-Hernández, A., Rodríguez-Laguna Norma, Reyes-García, L. I. Gómez-Vidales, V., Gómez-Balderas, R., Moya-Hernández, M. R., (2020). Thermodynamics of inclusion of M(II)Indomethacin complexes (M(II): Cu(II) o Zn(II) within cyclodextrins in aqueous solution. En revisión. - Hipólito-Nájera, A. R., Moya-Hernández, M. R., Rojas-Hernández, A., & Gómez-Balderas, R. (2019). Interaction of indomethacin–cyclodextrins in water by UV–Vis and ITC. Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry, 95(1–2), 55–62. https://doi.org/10.1007/s10847-019-00915-9 Estos artículos pueden consultarse en la sección Artículos publicados (pág. 119). A. Ricardo Hipólito N. Contenido 1.- Resumen. ..................................................................................................................... 1 2. Introducción. ................................................................................................................. 4 2.1. Los primeros antiinflamatorios. ......................................................................................... 5 2.2. De la aparición de los antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) hasta la actualidad. ....... 6 2.3. Indometacina (IMC). ........................................................................................................ 11 2.4. Farmacocinética humana de la indometacina. ................................................................. 13 2.5. Mecanismo de acción de los AINES. ................................................................................ 13 2.6. Mecanismo de acción de la indometacina. ....................................................................... 16 2.7. AINEs y su complejación con Cu(II) y Zn(II). MAINEs. ................................................. 16 2.8. Complejos metal-indometacina (MIMC; M = Cu(II) ó Zn(II))......................................... 19 2.9. Mecanismo de acción de los complejos MAINEs y MIMC. .............................................. 21 2.10. Historia de las ciclodextrinas.......................................................................................... 23 2.10.1. Primera Etapa (1891-1935). Descubrimiento de las ciclodextrinas. Periodo de duda...............23 2.10.2. Segunda Etapa (1935-1970). ...................................................................................................24 2.10.3. Tercera Etapa. Periodo de aplicación. (1970- a la actualidad). ...............................................27 2.11. Características y propiedades de las ciclodextrinas. ....................................................... 30 2.11.1. Nomenclatura. ........................................................................................................................30 2.11.2. Propiedades físicas y químicas. ..............................................................................................31 2.11.3. Ciclodextrinas sustituidas. ......................................................................................................35 2.11.4. Usos. ......................................................................................................................................36 2.11.5. Farmacología. ........................................................................................................................38 3. Hipótesis y Objetivos. .................................................................................................. 40 3.1. Hipótesis. .......................................................................................................................... 41 3.2. Objetivo General............................................................................................................... 41 Objetivos particulares. .......................................................................................................................41 4. Equipos, Reactivos y Metodologías. ............................................................................ 43 4.1. Materiales y Equipos. ....................................................................................................... 44 4.2. Reactivos y Soluciones...................................................................................................... 44 4.3. Metodologías. ................................................................................................................... 46 4.3.1. Síntesis y caracterización de reactivos utilizados. .....................................................................46 4.3.2. Estudios de estabilidad de IMC a pH 5 y 7. ...............................................................................47 4.3.3. Determinación del pKa de la IMC por UV-Vis. ..........................................................................47 4.3.4. Determinación de los parámetros termodinámicos de la interacción IMC con CDs por ultravioleta visible (UV-Vis) y calorimetría de titulación isotérmica (ITC). .........................................48 4.3.5. Determinación de las propiedades termodinámicas de la inclusión IMC con CDs por Calorimetría de Titulación Isotérmica (ITC) a pH 7, a diferente temperatura. Determinación de ΔCp. Estudio de la compensación entálpica-entrópica. ...............................................................................49 4.3.6. Estudios de la interacción de los complejos M(IMC)2(H2O)2 en presencia de CDs. ....................50 A. Ricardo Hipólito N. 5. Resultados y Discusión. ............................................................................................... 53 5.1. Síntesis y caracterización de NaIMC. ............................................................................... 54 5.2. Síntesis y caracterización de los complejos MIMC. .......................................................... 57 5.3. Estudios de estabilidad de IMC a pH 5 y 7. ...................................................................... 60 5.4. Determinación del pKa de la IMC por UV-Vis. ................................................................. 65 5.5. Estudio de la interacción IMC con CDs. .......................................................................... 69 5.5.1. Análisis estructural de la interacción IMC con CDs. .................................................................69 5.5.2. Determinación de las constantes de inclusión IMC con CDs por UV-Vis a pH 5 y 7...................72 5.5.3. Determinación de las propiedades termodinámicas de la inclusión IMC con CDs por Calorimetría de Titulación Isotérmica (ITC) a pH 7. ..........................................................................77 5.5.4. Determinación de las propiedades termodinámicas de la inclusión IMC con CDs por Calorimetría de Titulación Isotérmica (ITC) a pH 7, a diferente temperatura. ....................................85 Determinación de ΔCp. .......................................................................................................................85 Estudio de la compensación entálpica-entrópica. ...............................................................................96 5.6. Estudios de la interacción de los complejos M(IMC)2(H2O)2 en presencia de CDs. ........ 101 5.6.1. Diagramas de solubilidad de fases de los complejos M(IMC)2 en presencia de CDs. ............... 101 5.6.2. Estudios de EPR de especies solubles de CuIMC2 con CDs. .................................................... 103 5.6.3. Estudio por calorimetría de titulación isotérmica (ITC) de la interacción M(IMC)2 con CDs. .. 104 6. Conclusiones. .............................................................................................................115 Artículos publicados. ......................................................................................................119 Anexos. ..........................................................................................................................125 A1. Técnica de espectrofotometría Ultravioleta-visible (UV-Vis) .......................................... 157 A2. Técnica de espectrofotometría de Infrarojo (IR). ............................................................ 158 A3. Calorimetría de titulación isotérmica (ITC) .................................................................... 161 A4. Técnica de resonancia paramagnética electrónica (EPR) .............................................. 164 A5. Programas computacionales utilizados. .......................................................................... 167 A6. Método de relaciones molares (RM). .............................................................................. 171 A7. Gráficos de absorbancia corregida a 229 nm contra el pCD, de la interacción IMC con CDs porUV-Vis a pH 5 y 7. ................................................................................................... 173 A8. Información obtenida por cada técnica. ......................................................................... 178 Referencias. ...................................................................................................................179 A. Ricardo Hipólito N. Índice de siglas y abreviaturas. DCp: capacidad calorífica a presión constante. A∥: Acoplamiento paralelo AINEs: Antiinflamatorios no esteroideos. Arg: Arginina B. macerans: Bacillus macerans BCS: Biopharmaceutical Classification System CCP: Cromatografía en capa fina. CD: Ciclodextrina. CG: cromatografia de gases. CGT: ciclodextrin glucanotransferasa. CLAR: Cromatografía líquida de alta resolución COX: ciclooxigenasa Cu(IMC)2: Complejo mononuclear de indometacina, Cu(IMC)2(H2O)2, en solución acuosa. Cu(IMC)2(H2O)2: Especie mononuclear del complejo de indometacina con Cu(II) en relación 1:2 con dos moléculas de agua en su esfera de coordinación. Cu(IMC)2CD: Complejo de inclusión con una molécula de ciclodextrina, del complejo mononuclear de indometacina, Cu(IMC)2(H2O)2. Cu(IMC)2CD2: Complejo de inclusión con dos moléculas de ciclodextrina complejo mononuclear de indometacina, Cu(IMC)2(H2O)2. CuAINE: Complejo de un fármaco antiinflamatorio no esteroideo con Cu(I) ó Cu(II) CuIMC: Complejo sólido de indometacina con el ión Cu(II) en relación 1:2. DMA: Dimetlacetamida DMF: Dimetilformamida DTGS: TGS deuterado ECZ: Electroforesis capilar de zona. EPR: Resonancia paramagnética Nuclear. FDA: Food and Drug Administration FIR: Infrarojo lejano g∥: valor g paralelo. g⊥: valor g perpendicular GI: Gastrointestinal. GRAS: Generally Recognized As Safe HCl: ácido clorhídrico HIMC: Indometacina protonada HP: 2-hidroxipropil- IFN: Interferón IL: interleucinas IMC: Especie generalizada de las especies indometacina desprotonada e indometacina protonada. IMC-: Indometacina desprotonada IMCCD: Complejo de inclusión de indometacina con ciclodextrina. IR: Infrarojo ITC: Calorimetría de titulación isotérmica. M(IMC)2: Metalocomplejo mononuclear de indometacina MIMC2(H2O)2, donde M puede ser Cu(II) ó Zn(II), en solución acuosa. M(IMC)2(H2O)2: Especie mononuclear del complejo de indometacina, donde M es Cu(II) ó Zn(II) en relación 1:2 con dos moléculas de agua en su esfera de coordinación. M(IMC)2CD: Complejo de inclusión, con una molécula de ciclodextrina, del complejo mononuclear de indometacina, M(IMC)2(H2O)2, donde M puede ser Cu(II) ó Zn(II), en solución acuosa. M(IMC)2CD2: Complejo de inclusión, con dos moléculas de ciclodextrina, del complejo mononuclear de indometacina M(IMC)2(H2O)2, donde M puede ser Cu(II) ó Zn(II), en solución acuosa. MAINE: Complejo de un fármaco antiinflamatorio no esteroideo con Cu(I), Cu(II) ó Zn(II). MEDUSA:Representación de diagramas de equilibrio usando algoritmos sofisticados (por sus siglas en inglés, Making Equilibrium Diagrams Using Sophisticated Algorithms) MIMC: Complejo sólido de indometacina en relación estequiométrica 1:2, donde M puede ser Cu(II) ó Zn(II). MIR: Infrarojo medio NADPH: nicotinamida adenina dinucleótido fosfato. NaIMC: Sal trihidratada de IMC (NaIMC NaIMC·3H2O) NaOH: Hidróxido de sodio. NIR: Infrarojo cercano NMP: N-metil-2-pirrolidona NO: Óxido nítrico NSAIDs: non-steroidal anti-inflammatory drugs. PGES: Prostanglandina endoperóxido sintasa PGs: Prostaglandinas PMNL: Leucocitos polimorfo nucleares RM: Relación molar o relaciones molares. RMN: Resonancia Magnética Nuclear. rpm: revoluciones por minuto A. Ricardo Hipólito N. Ser: Serina SOD: superóxido dismutasa SQUAD: Coeficientes de estabilidad de datos de absorbancias (por su siglas en inglés Stability Quotients from Absorbance Data). TGS: Sulfato de triglicina TNF: Factor de necrosis tumoral TSP: ácido 3-(trimetilsilil)propanoico Tyr: tirosina U: suma de cuadrados de los residuales para SQUAD. UV-Vis: Ultravioleta visible Val: Valina VD: volumen de distribución. XRD: Difracción de rayos X. XRPD: Difractograma o difracción de rayos X de polvos. Zn(IMC)2: Complejo mononuclear de indometacina, Zn(IMC)2(H2O)2, en solución acuosa. Zn(IMC)2(H2O)2: Especie mononuclear del complejo de indometacina con Zn(II), en relación 1:2, con dos moléculas de agua en su esfera de coordinación. Zn(IMC)2CD: Complejo de inclusión, con una molécula de ciclodextrina, del complejo mononuclear de indometacina, Zn(IMC)2(H2O)2. Zn(IMC)2CD2: Complejo de inclusión, con dos moléculas de ciclodextrina, del complejo mononuclear de indometacina Zn(IMC)2(H2O)2. ZnAINE: Complejo de un fármaco antiinflamatorio no esteroideo con Zn(II) ZnIMC: Complejo sólido de indometacina con el ión Cu(II) en relación 1:2. 1 A. Ricardo Hipólito N. 1.- Resumen. 2 A. Ricardo Hipólito N. From ancient times, non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) studies, to avoid their adverse effects, enhance their effects, and understand their modes of action, do not stop and continue to this day. To improve its effectiveness and avoid adverse effects of NSAIDs (including indomethacin (IMC)), various approaches have been used. One of these approaches, used with IMC, is the formation of complexes with metal ions, MIMC, being M: Cu (II) or Zn (II). However, the low water solubility of the MIMC complexes makes their study, preparation and administration for human use difficult. In this work, it is proposed to increase the solubility of IMC metal complexes ((M(IMC)2(H2O)2)) with the use of cyclodextrins (CDs). CDs are molecules capable of conferring solubility, due to their polar exterior, by allowing other nonpolar molecules to be included in their nonpolar cavity. In this work, it is hypothesized that it will be possible to understand the thermodynamic profile of the formation of inclusion complexes, between IMC and its metallic complexes with Cu (II) and Zn (II) with CDs, through its study by different techniques, for a future development of more effective and less toxic drugs. This contribution experimentally describes studies of IMC, from its basic properties such as stability with pH and acidity constant, to the ability to convert it into its corresponding salt. Subsequently, the synthesis and solid characterization of the MIMC metal complexes (where M: is Cu (II) or Zn (II)) are described, to determine if the complex is mononuclear or dinuclear, in addition to its corresponding structure in order to figure out his study in aqueous solution. Understanding that the structure and solubility of the complexes in solid, MIMC, depends largely on the IMCs attached to the metal center, the thermodynamics of the interaction of the inclusion complexes of BMI with CDs (IMCCDs) was studied, using 5 different CDs (a-, b-, g-, HP-b- y HP-g-CD). In addition, the development of the methodologies to study the inclusion complexes of MIMC in CDs is shown. The thermodynamics of the inclusion of MIMC complexes with CDs is now known. The solubility of the MIMC complexes was raised with CDs, to propose for the first time the existence of the mononuclear species Cu(IMC)2CD, Cu(IMC)2CD2, Zn(IMC)2CD y Zn(IMC)2CD2in aqueous solution. 3 A. Ricardo Hipólito N. Desde la antigüedad, los estudios sobre los antiinflamatorios no esteroideos (AINEs), para evitar sus efectos adversos, potenciar sus efectos, y entender sus modos de acción, no se detienen, por lo que continúan hasta nuestros días. Para mejorar su efectividad y evitar efectos adversos de los AINES (entre ellos la indometacina (IMC)), se han usado diversos enfoques. Uno de estos enfoques, usado con IMC, es la formación de complejos con iones metálicos, MIMC, siendo M: Cu(II) ó Zn(II). Sin embargo, la baja solubilidad en agua, de los complejos MIMC, hace que su estudio, preparación y su administración para uso humano, se dificulte. En este trabajo, se propone aumentar la solubilidad de los metalocomplejos de IMC (M(IMC)2(H2O)2) con el uso de ciclodextrinas (CDs). Las CDs son moléculas capaces de conferir solubilidad gracias a su exterior polar, al permitir incluir otras moléculas no polares en su cavidad no polar. En este trabajo, se plantea la hipótesis de que será posible entender el perfil termodinámico de la formación de los complejos de inclusión entre IMC y sus complejos metálicos con Cu(II) y Zn(II) con CDs, a través de su estudio por diferentes técnicas, para un futuro desarrollo de fármacos más efectivos y menos tóxicos. Esta contribución describe experimentalmente los estudios de la IMC, desde sus propiedades básicas como estabilidad a diferente pH y constante de acidez, hasta la capacidad de convertirla en su sal correspondiente. Posteriormente, se describe la síntesis y caracterización en sólido de los complejos metálicos MIMC (donde M: es Cu(II) ó Zn(II)), para determinar si el complejo es mononuclear o dinuclear, además de su correspondiente estructura para poder abordar mejor su estudio en solución acuosa. Al entender que la estructura y solubilidad de los complejos en sólido, MIMC, depende en gran manera de las IMCs unidas al centro metálico, se estudió la termodinámica de la interacción de los complejos de inclusión de la IMC con CDs (IMCCDs), usando 5 diferentes CDs (a-, b-, g-, HP-b- y HP- g-CD). Con lo anterior se demostraron las mejores condiciones y por primera vez las propiedades termodinámicas para la formación de los complejos IMCCDs. Además, se muestra el desarrollo de las metodologías para estudiar los complejos de inclusión de MIMC en CDs. La termodinámica de la inclusión de los complejos MIMC con CDs es ahora conocida. Las solubilidad de los complejos MIMC se elevó con CDs, para proponer por primera vez, la existencia de las especies mononucleares Cu(IMC)2CD, Cu(IMC)2CD2, Zn(IMC)2CD y Zn(IMC)2CD2 en solución acuosa. 4 A. Ricardo Hipólito N. 2. Introducción. 5 A. Ricardo Hipólito N. 2.1. Los primeros antiinflamatorios. El hallazgo de ciertas plantas y sus extractos se dio por serendipia desde la antigüedad y su aplicación contra el dolor, fiebre e inflamación, sigue hasta nuestros días. Los beneficios de la cinchona (Cinchona officinalis) y del sauce blanco (Salix Alba) son conocidos desde el comienzo de las civilizaciones en todo el mundo [Rainsford, 2007]. No fue hasta el año 1633 que comenzó el estudio formal de los analgésicos, antipiréticos y antiinflamatorios derivados de plantas, cuando un monje agustino en Perú, divulgó que el polvo de cinchona curaba la fiebre y cuando Edward Stone en 1763, reportó que la corteza del sauce blanco tenía éxito contra la fiebre de la malaria [Grosser, 2012]. En el siglo XIX, la quinina (Fig. 2.1) se aisló de la cinchona, pero su escases y alto costo llevó a la búsqueda de nuevos compuestos con mejores efectos [Lucas, 2016]. En el año de 1828, el alemán Johann Andreas Buchner extrajo el principio activo del sauce blanco, llamándole salicina (Fig. 2.2), nombre derivado del latín Salix que significa sauce [Fischer, 2010]. La salicina se usaba como agente antipirético, sin embargo, es poco palatable por su sabor amargo, por lo que se buscaron alternativas. En 1839, Raffaele Michele Rocco Piria obtuvo el ácido salicílico (Fig. 2.3), Hermann Kolbe en 1859, facilita su producción a escala industrial [Mahmud, 2019], por lo cual pudo ser introducido como antirreumático analgésico en Berlín. Es hasta 1876, que Thomas Maclagan encuentra que la salicina y el ácido salicílico eran igualmente eficaces. A pesar de sus beneficios, el ácido salicílico o su sal de sodio, tiene varios efectos secundarios en dosis altas, como la irritación gástrica. En 1897, Arthur Eichengrün y Felix Hoffmann descubrieron el ácido acetilsalicílico (Fig. 2.4), el cual era tan efectivo como el ácido salicílico, pero mejor tolerado [Jeffreys, 2004]. En 1899, Bayer lo comercializó como aspirina, el nombre aspirina no tiene un origen claro, se dice que la “a” viene de acetil y “spirina” viene de Spiraea, la familia de plantas usadas como materia prima [Mahmud, 2019]. En 1919, después de que Alemania perdiera la primera guerra mundial, Bayer fue forzada a renunciar a la marca, como parte del tratado de Versalles [Mann, 1991]. La aspirina es usada y conocida mundialmente hasta nuestros días [Fischer, 2010]. Otro analgésico exitoso para esta época es la fenazona (Fig. 2.5), descubierta por Emil Fischer en 1883, siendo más efectiva y económica que la quinina, con la desventaja de causar 6 A. Ricardo Hipólito N. agranulocitosis, dejando a los pacientes vulnerables a infecciones [Mahmud, 2019]. La acetanilida (Fig. 2.6), el primer derivado de la anilina con actividad antipirética, descubierta por accidente, fue sintetizada en 1886 por Adolf Kussmaul en la universidad de Strassburg. Se comercializó con el nombre de Antifebrin, sin embargo, en las formulaciones que se utilizaba producía daños al hígado y al riñón. Fue reemplazada por la fenacetina (Fig. 2.7), sintetizada en 1887, con las ventajas de la fenazona y de la acetanilida y sin ninguna desventaja aparente (hasta 1960 hay evidencia de causar falla renal) [Mahmud, 2019]. Debe notarse que en esta época las regulaciones farmacéuticas y farmacológicas no tenían un rol importante, un ejemplo es el hecho de que se basaban en modelos de aletas de pescado para comparar el daño en la mucosa intestinal producido por fármacos [Brune, 2004]. Más adelante, Bayer siguió trabajando con la tolerabilidad de Fenacetin, desarrollando acetaminofen (paracetamol) (Fig. 2.8), pero se creyó que debido a sus impurezas podría causar metahemoglobinemia (condición en la que la hemoglobina anormal presenta iones Fe(III) [Mansouri, 1993]). Sin embargo, Sterling en el Reino Unido, encontró que el acetaminofen no inducía tal enfermedad y comercializó el producto como Panadol (ahora propiedad de GlaxoSmithKline) [Brune, 2004]. Hoechst, adicionando más grupos amino a la estructura de la fenazona, logró sintetizar aminofenazona (Fig. 2.9), melubrin (Fig. 2.10) y dipirona (Fig. 2.11), ésta última fue útil como inyectable. Por otro lado, Hoffman substituyó un grupo isopropilo del grupo amino de la 4-amino-dietil fenazona, resultando en propifenazona (Fig. 2.12). Después de la segunda guerra mundial, tratando de disminuir los efectos adversos de la aminofenazona, H. Stenzl sintetizó la fenilbutazona (Fig. 2.13), la cual fue muy activa en dolor reumático. A pesar del arduo trabajo de los científicos y empresas de esos tiempos para sintetizar nuevos fármacos más potentes y menos dañinos, muchas otras empresas lo único que realizaban eran mezclas aspirina, paracetamol, cafeína y una variedad de ingredientes extras que a pesar de que satisfacían al consumidor, no tenían beneficio médico y sólo llevaban a abusos y diversas toxicidades [Dubach, 1983]. 2.2. De la aparición de los antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) hasta la actualidad. Para 1941, Hans Selye dio la primera descripción científica de un corticoesteroide. En 1949, se presenta por primera vez un tratamiento con corticoesteroides para el tratamiento de artritis 7 A. Ricardo Hipólito N. reumatoide y el primer fármaco antirreumático con propiedades modificadoras de la enfermedad [Buer, 2014]. Estos fármacos parecían muy prometedores, durante la década de 1950, muchos fármacos derivados de los esteroides fueron introducidos, y sus descubridores fueron galardonados con el premio nobel. Sin embargo, sus efectos secundarios, severos e irreversibles hicieron que los tratamientos con corticoesteroides fueran rechazados por completo por la comunidad especializada en reumatología [Rainsford, 2007; Buer, 2014]. Por lo anterior, en esta década también comenzaron a llevarse a cabo medidas regulatorias para conocer el efecto de los antiinflamatorios existentes hasta entonces. Al tratar de distinguir entre salicilatos, nuevos antiinflamatorios y los esteroides; una nueva categorización nació por la necesidad de señalar cuales no eran esteroides para no asociarlos con sus efectos adversos [Buer, 2014]. Por lo anterior, probablemente la primera vez que el término non-steroid anti-inflammatory (antinflamatorio no esteroideo) apareció en un artículo fue en 1960 [Whitehouse, 1960], y por primera vez en un título de un artículo en 1963. Durante esta década los fármacos fueron llamados non-steroidal anti-inflammatory drugs (fármacos anti-inflamatorios no esteroideos). Después de 10 años las siglas NSAIDs (AINEs, por sus siglas en español, donde la sigla F de fármaco no suele incluirse) comenzaron a utilizarse con mayor frecuencia [Buer, 2014]. En esta misma década, además de varios análogos de la fenilbutazona, se desarrollaron nuevos fármacos, ahora ya categorizados como antiinflamatorios no esteroideos o AINEs, desarrollados a partir de modelos de inflamación usados para definir su actividad. De estos modelos Merck, Sharp and Dohme identificaron agentes antiinflamatorios indólicos, de entre 350 compuestos, reportaron que el más exitoso era la indometacina (IMC) (Tabla 2.1) [Shen, 1963]. A su vez la compañía Boots, comercializó ibuprofeno (Fig. 2.14) en 1969 y flurbiprofeno (Fig. 2.15) en 1977, que son derivados del ácido propiónico. Más adelante, el ácido flufenámico (Fig. 2.16), fue el primero de los derivados del ácido fenámico, aunque por su toxicidad en el sistema nervioso central, estos compuestos fueron abandonados. 8 A. Ricardo Hipólito N. Fig. 2.1.Quinina Fig. 2.2. Salicina. Fig. 2.4.Ácido acetilsalicílico Fig. 2.5. Fenazona. Fig. 2.6. Acetanilida. Fig. 2.7. Fenacetina. Fig. 2.8.Acetaminofen (paracetamol). Fig. 2.3. Ácido Salicílico. 9 A. Ricardo Hipólito N. Fig. 2.9. Aminofenazona. Fig. 2.10. Melubrin Fig. 2.11. Dipirona. Fig. 2.12. Propifenazona. Fig. 2.13. Fenilbutazona. Fig. 2.14. Ibuprofeno. Fig. 2.15. Flurbiprofeno. Fig. 2.16. Ácido flufenámico. Fig. 2.17. Ketoprofeno. Fig. 2.18. Diclofenaco NH 10 A. Ricardo Hipólito N. Fig. 2.19. Piroxicam. Fig. 2.20.Tenoxicam. Fig. 2.21. Meloxicam. Fig. 2.22. Celecoxib. Fig. 2.23. Valdecoxib. Fig. 2.24. Rofecoxib. Fig. 2.25. Etoricoxib. 11 A. Ricardo Hipólito N. Por el contrario, los derivados del ácido acético tuvieron éxito, por ejemplo, se pueden nombrar al ketoprofeno (Fig. 2.17), comercializado en 1973 y al diclofenaco (Fig. 2.18), comercializado en Japón en 1974. Pfizer desarrolló piroxicam (Fig. 2.19), más tarde el tenoxicam (Fig. 2.20) apareció gracias a Hoffmann-La Roche y meloxicam (Fig. 2.21) por Boehringer Ingelheim, todos estos ejemplos de ácidos cetoenólicos [Brune, 2004]. Gracias al descubrimiento de las ciclooxigenasas (COXs), y a la elucidación del mecanismo de acción, es posible conocer que la mayoría de AINEs actúan sobre COX-1 y COX-2. Lo anterior abrió una nueva dimensión de selectividad, ya que permitió entender el porqué los fármacos tendrían que inhibir principalmente a la COX-2 para evitar los efectos adversos que provoca inhibir la COX-1. Se encontró que el diclofenaco era muy selectivo a COX-2 por lo cual se volvió muy exitoso, sin embargo, aún inhibía a la COX-1. En épocas recientes una nueva gama de fármacos altamente selectivos a COX-2 se han venido desarrollando, ejemplos de estos fármacos derivados de sulfonamidas se encuentran celecoxib (Fig. 2.22) y valdecoxib (Fig. 2.23), y derivados de metilsulfonas son rofecoxib (Fig. 2.24) y etoricoxib (Fig. 2.25). Aunque pareciera que estos nuevos fármacos son resultados de nuevos modelos de inflamación o una revolución química, son compuestos muy parecidos a compuestos ya conocidos como la fenazona. Además, debido que inhiben a la COX-2, no dejan de tener efectos secundarios, por lo que pueden llegar a impactar a los riñones, afectar la presión arterial y presentar efectos cardiovasculares adversos [Brune, 2004]. Desde la antigüedad, y a casi más de 130 años del descubrimiento de la aspirina y de un desarrollo más metodológico, los esfuerzos para desarrollar fármacos antiinflamatorios con mayores ventajas no se detienen y siguen hasta nuestros días. 2.3. Indometacina (IMC). El AINE llamado ácido [1-(4-clorobenzoil)-5-metoxi-2-metil-1H-indol-3-il]-acético con nombre común indometacina (IMC) (Tabla. 2.1), es un antiinflamatorio analgésico y antipirético, descubierto en 1963 por Merck & Co, Rahway, NJ, USA, y aprobado en 1965 por la FDA (Food and Drug Administration por sus siglas en inglés) [Shen, 1963; Andrade 2015; Rainsford, 2007]. Se clasifica como un AINE del grupo de los índol-acéticos. Sintetizado como antagonista de la serotonina (Ser)[Fini, 2001]. Es de los AINES más fuertes. 12 A. Ricardo Hipólito N. Su potencial farmacocinético y sus diferencias biomecánicas con otros AINEs, lo hacen de gran interés clínico y de investigación. La especie protonada de la IMC (HIMC), en solución, actúa principalmente como ácido de Lewis (debido a sus grupos –OH), con el fin de establecer puentes de hidrógeno con grupos funcionales aceptores de protones que tienen los disolventes (átomos de oxígeno en grupos –OH y –O–), aunque también puede actuar como compuesto aceptor de protón por medio de sus grupos carboxilo, metoxilo e hidroxilo. [Cantillo, 2013]. Es muy poco soluble en agua alcanzando una concentración de 5.16 × 10-5 M. Tiene un pKa de 4.5 (Tabla 2.1). A pesar de su baja solubilidad en agua, la IMC se clasifica como un fármaco de clase II en el BCS (Biopharmaceutical Classification System, por sus siglas en inglés) debido a su alta permeabilidad a través de la membrana intestinal [Karmwar, 2012; Andrade, 2015]. Es electroactiva [Sataraddi, 2014], y se ha reportado que puede reducirse y descomponerse en el electrodo de gota de mercurio [Fini, 2001]. Se receta para: artritis reumatoide, osteoartritis, espondilitis anquilosante, artritis gotosa aguda, bursitis, tendonitis, cierre persistente de ductos arteriosos, edema macular cistoide, quemadura de sol, dismenorrea, profilaxis de la migraña, cefalea histamínica y polihidramnios [Valentovic (2007)]. Tabla 2.1. Indometacina y sus propiedades. Indometacina (IMC) Especie protonada: HIMC. Especie desprotonada: IMC- Estructura Química (HIMC) Clasificación Química como AINE Ácidos carboxílicos. Indol/indeno acetatoa Clasificación BCS Clase IIb Fórmula Química C19H16ClNO4 Peso Molecular (g/mol) 357.79 Solubilidad Soluble en etanol, éter, acetona y aceite de castor. Prácticamente insoluble en agua (0.937 µg/ml a 298.15K)c 5.16×10-5 Mol/ld. Estable en medios neutros y ácidos; se descompone por medios fuertemente alcalinos. Constante de ionización (pKa) 4.5e Propiedades físicas Cristales blancos, exhibe polimorfismo (4 formas polimórficas diferentes, γ ó I (Triclínica, pf: 157.9ºC), α ó II (monoclínica, pf: 151ºC), β ó III y δ ó IV (pf: 130.6ºC)f a. Rainsford (2007); b. Andrade (2015); c. Yalkowsky, (1992); d.Ruidiaz (2010); e. Budavari, (1989); f. Dubbini (2014). 13 A. Ricardo Hipólito N. La IMC se preescribe por cápsulas, formulaciones de liberación controlada, supositorios rectales y suspensiones para uso oral, así como en múltiples formas genéricas [Nalamachu, 2014]. Se han propuesto aplicaciones tópicas de la IMC para disminuir los efectos adversos, al disminuir la concentración de fármaco en circulación sanguínea, ya que estudios demuestran que esta formulación demostró eficacia similar a IMC oral. Hasta ahora, el diclofenaco es de los únicos fármacos en usarse tópicamente [Nalamachu, 2014]. 2.4. Farmacocinética humana de la indometacina. El comienzo de la acción de la IMC, después de administración oral continua, es de aproximadamente 30 minutos, para un efecto analgésico, y 7 días para la actividad antiinflamatoria completa. Por ejemplo, el pico de acción en el tratamiento de gota es de 24- 36 horas con disminución gradual del hinchamiento de 3 a 5 días. La duración de acción de la IMC es aproximadamente de 4 a 6 horas para efecto analgésico y de 1 a 2 semanas como un agente antiinflamatorio. Para el tratamiento de artritis, la dosis diaria máxima es de 150- 200 mg, mientras que, para bursitis y tendonitis se trata con 75-150 mg/día. Para el alivio del dolor de artritis gotosa aguda se utiliza una dosis de 50 mg/Kg. Se metaboliza en el hígado y se excreta en la orina y las heces. Aproximadamente 90% de indometacina se une a la proteína del plasma. Presenta un reciclado enterohepático significativo. [Valentovic, 2007]. 2.5. Mecanismo de acción de los AINES. En 1971, se demostró que los fármacos AINEs actúan mediante la inhibición de la biosíntesis de las prostaglandinas (PGs) a partir del ácido araquidónico (Fig. 2.26) [Vane, 1971; Ferreira, 1971; Vane 1998). En esta ruta, los AINES actúan principalmente sobre la enzima PG endoperóxido sintasa (PGES) o también llamada ciclooxigenasa (COX) [Piper, 1969; Fitzpatrick, 2004]. Hay dos isoformas identificadas de la COX: la COX-1 que está universalmente presente en la mayoría del tejido humano y está involucrada en la síntesis de prostanglandinas y tromboxano A2, además de ser responsable de algunas funciones del cuerpo, como agregación plaquetaria, protección gástrica y función renal; y la COX-2 la cual se expresa en respuesta a lesión, inflamación (tal como endotoxinas, factor de necrosis tumoral (TNF)-α, interferón (IFN)-γ, interleucinas (IL-1α, IL-1β), y factores de crecimiento) y mutágenos en algunas células, incluyendo macrófagos y células sinoviales [Lucas, 2016; 14 A. Ricardo Hipólito N. Dillon, 2004]. La COX-1 fue estudiada y purificada en la década de 1970 y la COX-2 fue descubierta hasta 1991 [Marnett, 1999a; Marnett, 1999b]. Las COXs presentan 2 sitios activos (Fig. 2.27), el primer sitio transforma al ácido araquidónico, ciclándolo y agregandole un grupo 15-hidroxiperóxido (Fig. 2.26) para formar un endoperóxido llamado PGG2. El segundo sitio reduce el grupo hidroxiperóxido de la PGG2 y lo transforma en un grupo hidroxilo de la PGH2, otro endoperóxido [Vane 1997], el PGH2 es transformado, a su vez, por isomerasas específicas en PGs, prostaciclinas (PGI2) y tromboxano A2. Las estructuras en tercera dimensión de las COX-1 y -2 han sido elucidadas Fosfolípidos Ácido araquidónico fosfolipasas lipocortina prednisolona dexametasona aspirina indomethacina COX-1 ó COX-2 COX-1 ó COX-2 TXA sintasa PGE isomerasa PGF sintasa PGD sintasa PGI sintasa PGI 2 (prostaciclina) Fig. 2.26. Cascada del ácido araquidónico. Imagen tomada de Vane, J.R. de 1996. 15 A. Ricardo Hipólito N. y han permitido tener evidencia suficiente para proponer un mecanismo de inhibición del proceso de síntesis de PGs [Hart, 1963; Vane, 1997; Wong, 1997]. Los sitios activos están conformados por un canal hidrofóbico, en el cual la tirosina (Tyr) 385 y la serina (Ser) 530 (Fig. 2.27) se sitúan en la parte más externa del sitio activo, la Tyr 385 forma un radical tirosilo, extrayendo un hidrógeno del carbono 13 del ácido araquidónico, creando un radical activado araquidonilo que experimenta la reacción de ciclación/oxigenación, la cual resulta en la formación de los endoperóxidos PGG2 y PGH2 [Botting, 2010]. Los AINES generalmente actúan en competencia con el ácido araquidónico por el sitio activo de la COX. Una de las teorías de inhibición, para los fármacos parecidos a la Aspirina, es la promoción de acetilación del grupo hidroxilo de la serina en la posición 530 (Ser 530, Fig. 2.27) en la COX-1 y en la posición análoga de la Ser 516 en la COX-2, dejando intacta su actividad como peroxidasa, ya que se impide el acceso al ácido araquidónico por impedimento estérico [Vane, 1997; Nijkamp, 2005]. Otra teoría de inhibición, postula que el residuo salicilato de la aspirina o ácido salicílico se une débilmente a un segundo espacio por debajo de la Ser 530 (COX-1), el ácido carboxílico de la aspirina se une inicialmente a la Arg 120 (COX-1), que se sitúa cerca de la apertura del sitio catalítico, seguido por un enlace covalente del grupo acetilo a la Ser 530 [Botting, 2010]. A) COX-2 B) COX-1 Fig. 2.27. Los sitios activos de la a) COX-1 y COX-2 estan representados con los residuo importantes delineados. El residuo de tirosina (Tyr 385) en ambas isoformas está localizado debajo del grupo heme de la enzima y en la parte más externa del sitio activo, y el residuo Arg 120 está presente en la “boca” del canal en el cual el ácido araquidónico entra (varias regiones de la enzima han sido removidas por claridad). Los puntos azules representan las regiones de solvente accesibles dentro de los dos sitios activos. Ile 523 de la COX-1 actúa como residuo clave para comprimir un área del sitio activo de la COX-1, mientras que la Val 509 y Arg 499 de la COX-2 resulta en una superficie más grande y accesible, sugiriendo un sitio activo más grande y mayor sitio de inhibición. 16 A. Ricardo Hipólito N. Aunque los sitios de acción de la COX-1 y de la COX-2 son muy parecidos, hay diferencias en la posición 523, la COX-1 tiene a la isoleucina (Ile 523) y la COX-2 a la valina (Val 509). Esta posición permite que COX-2 tenga una proximidad con la Arg 499 y tenga más probabilidad de que se produzcan puentes de hidrógeno cuando se acerque un inhibidor, formando una cavidad lateral, por lo tanto el sitio activo incrementa su tamaño por la creación de un espacio extra. Los sitios importantes Tyr 385 y Arg 120 se mantienen igual en ambas COXs [Vane, 1997; Nijkamp, 2005, Botting, 2010]. 2.6. Mecanismo de acción de la indometacina. La IMC permite el incremento de la producción de interleucina-1 (IL-1 o factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), este efecto ha sido considerado importante para el desarrollo de úlceras gastrointestinales (GI) y asma [Rainsford (2007)]. La IMC ha demostrado también la inhibición de la liberación de histamina [König W, 1987] y la potenciación de la ruta de lipooxigenasa, en contraste con otros fármacos antiinflamatorios no esteroideos (su efecto con respecto a la vasoconstricción cerebral sigue en debate) [Docherty, 1987; Mosca, 1997]. La acción terapéutica y adversa de la IMC depende de la disminución en la producción de PGs. Actúa como inhibidor potente no selectivo de la biosíntesis de prostanoides (e.g., PGE2, PG12) mediada por COX, a partir del ácido araquidónico, en los sitios de inflamación con actividad antiinflamatoria (Sección 2.5) [Hart, 1963]. La IMC, a diferencia de la aspirina que, por ejemplo, inhibe a las COXs por competencia con el ácido araquidónico por el sitio activo (Vane, 1996). La IMC no actúa de la misma manera con la COX-1 que con la COX-2, ya que se ha demostrado inhibir de manera irreversible a la COX-1 y de manera reversible a la COX- 2 [Valentovic, 2007]. Se ha demostrado que la IMC y otros AINEs son capaces de inhibir algunas respuestas quimiotácticas de neutrófilos, por ejemplo, quimiotaxis y liberación de enzimas lisosomales [Shen, 1982]. 2.7. AINEs y su complejación con Cu(II) y Zn(II). MAINEs. Es bien conocido que durante la inflamación de tejidos, se encuentran concentraciones altas de iones zinc y cobre [Fini, 2001]. A partir de esto, se creó un gran interés sobre el rol antiinflamatorio de estos iones metálicos, así como su acción sinérgica cuando se complejan 17 A. Ricardo Hipólito N. con AINEs comunes. Esta asociación con iones metálicos (especialmente Cu(II)), ha demostrado ser más activa que el fármaco, aún en su forma farmacológicamente inactiva [Fini, 2001]. Esto podría indicar que el agente activo no es el fármaco sólo, más bien se está llevando a cabo un efecto sinérgico que lleva a la inhibición de la actividad de alguna metal- enzima involucrada en la inflamación [Fini, 2001]. La necesidad de desarrollar fármacos más potentes y menos dañinos, de los que ya son usados en humanos y en veterinaria, ha llevado a la preparación, caracterización y estudio de los complejos metal-AINEs (MAINEs). La relación mononuclear/dinuclear de los complejos MAINE parece tener un efecto en su actividad biológica [Dillon, 2004]. En particular, para complejos MAINE, donde el metal es Cu(II) ó Zn(II) y los AINES son carboxilados. Se ha encontrado evidencia de complejos carboxilato monodentados y bidentados monoméricos, aunque también existen las formas dinucleares de puente carboxilato. Los factores que propician que una especie predomine por encima de otra, no son totalmente conocidos, se cree que la existencia de alguna especie en particular no depende sólo del ligante principal, parece ser que la naturaleza del disolvente, el cual puede actuar también como ligante, también es un factor determinante [Dillon, 2004]. Las diferencias en la química de coordinación de Cu(II) y Zn(II) se debe entender en término de sus propiedades electrónicas. Los complejos Cu(II) d9, en el caso de complejos dinucleares, donan un electrón para formar un enlace Cu(II)-Cu(II) significativo, lo cual mantiene los dos iones a una misma distancia (~2.6 Å). Los complejos CuAINE de ácidos carboxílicos, existen como especies mononucleares o dinucleares, pero hay una preferencia hacia la forma dinuclear en forma de rueda de paletas parecida a la estructura del Cu(II)-acetato (Cu2(AcO)4) [Dillon, 2004] en estado sólido. Por otro lado, Zn(II) tiene una subcapa electrónica d llena y la falta de fuerza metal-metal requiere que la estructura dinuclear se estabilice, lo que resulta en distancias variables Zn(II)···Zn(II) generalmente ≥ 2.9 Å, para evitar las fuerzas repulsivas Zn(II)···Zn(II). Además de que hay un incremento en los ángulos Zn(II)-O-C, (O: oxígeno y C: es el carbono del carboxilato puente) comparados a los complejos de Cu(II), para acomodar la separación tan grande [Dillon, 2004; Zhou, 2000]. La mayoría de las especies mononucleares, unidas a carboxilato, existen en una configuración trans con el enlace unidentado bis(carboxilato), el número de coordinación va de 4 a 6 alrededor del átomo de Cu(II). La coordinación dependerá del disolvente utilizado, 18 A. Ricardo Hipólito N. formando en ocasiones pseudo-octahedros o cuadrados planos. Se ha reportado que para favorecer la formación de complejos mononucleares sobre los dinucleares de Cu(II) se debe incrementar la fuerza ácida de los grupos carboxilato, por ejemplo, halogenación del grupo alquilo e incrementando basicidad, por ejemplo piridina e imidazol de otros ligandos coordinados [Weder, 2002]. Las especies dinucleares CuAINE, como se mencionó antes, presentan una estructura de rueda de paletas, con el disolvente de síntesis unido en la posición trans al enlace Cu(II)‒Cu(II). La distancia Cu(II)‒Cu(II) en estas especies generalmente se incrementa con la acidez del ligante, y al mismo tiempo hay movimiento del átomo de carbono fuera del plano basal de su poliedro de pirámide cuadrada. Un ejemplo es la diferencia en distancia del enlace Cu(II)‒Cu(II) y el Cu basal en los siguientes complejos: Para [Cu2(CH3COO)4(H2O)2] 2.616(1) y 0.32 Å (pKa = 4.756); para [Cu2Dic4] 2.6265(8) y 0.203 Å (pKa = 3.94), y para [Cu2(CF3COO)4(quinoline)2] 2.886(2) y 0.19 Å.(pKa = 0.52) [Dillon C. T, 2004]. Es claro que con la quinolina (pKa = 0.52) la distancia es mayor. De acuerdo a estos valores, para la IMC (pKa = 4.5), pueden esperarse separaciones Cu(II)‒Cu(II) mayores de 2.6 Å. A diferencia de los complejos CuAINE, los complejos ZnAINE tienden a ser dominados por especies mononucleares, aunque hay evidencia de que los complejos dinucleares, se pueden presentar. Dentro de las especies dinucleares, se ha reportado que dentro una estructura de puentes tetracarboxilato, las distancias Zn(II)···Zn(II) pueden llegar a ser de hasta 3.452 Å [Zhou, 2000]. Existen muchos ejemplos con diversas y variadas estructuras en donde es posible observar la especie cis-[Zn(IMC)2(L)2] en donde el AINE actúa como un quelato, también pueden existir estructuras hexa o penta coordinadas mononucleares en donde el AINE puede actuar como quelato o ligando monodentado y complejos tetrahédricos con ligando carboxilato monodentados. La diversidad de las estructuras observadas para los complejos de Zn(II) son un reflejo de la configuración electrónica 3d10 en donde los factores electrónicos ya no son importantes en direccionar tipos estructurales, en contraste a Cu(II) [Dillon, 2004; Zhou, 2000]. 19 A. Ricardo Hipólito N. 2.8. Complejos metal-indometacina (MIMC; M = Cu(II) ó Zn(II)). La necesidad de encontrar nuevos fármacos antiinflamatorios menos dañinos y más efectivos para su uso en humanos como en animales ha llevado a la preparación de sales de iones metálicos tanto de Cu(II) como Zn(II) con IMC [Morgan, 2001]. Estos complejos han demostrado ser un poco más potentes que la IMC libre y mucho menos dañina [Dillon, 2003]. Las constantes de formación y de solubilidad obtenidas por Fini en 2001 son: Cu(II) con IMC tiene un valor de [Kf = 7.0 (± 1.0) × 109] y [Kps=3.0 (± 0.3) × 10‒10], en el caso del Zn(II) [Kf = 3 (± 1) × 103] y [Kps = 1.8 (± 0.1) × 10‒11] [Fini, 2001] En ambos caso los complejos tiene una baja solubilidad como IMC. Se ha demostrado que los complejos Cu(II) con IMC (CuIMC) se absorben bien en intestinos de ratas [Weder, 2002]. A pesar de que los complejos dinucleares CuIMC tienen baja solubilidad, se observan niveles en sangre comparables a IMC y penetración rápida de CuIMC a través de la membrana celular intestinal, esto es una pista de una posible diferencia en la manera de absorberse, comparada con IMC, no debida a la complejación en sí, más bien debido a coeficientes de partición que favorecen al complejo al atravesar la célula intestinal [Weder, 2002]. Mientras que el porcentaje de CuIMC absorbida, a través del lumen intestinal, es incierto, se sabe aún menos sobre la disposición sistémica [Weder, 2002]. Las observaciones al administrar, en perros, el complejo dimérico [Cu2(IMC)4(DMF)2] dónde la IMC libre sería fatal, muestran que el complejo es estable en el estómago y tal vez absorbido por el plasma. Estudios in vitro no han demostrado lo observado in vivo [Weder, 2002]. La potencia que han demostrado los complejos CuIMC en comparación con la HIMC libre, son muy parecidos en ensayos de edema inducidos por caragenina [Weder, 2002]. El método de administración del complejo es crucial para su eficacia y toxicidad [Dillon, 2003], además de la importancia de las especies mononucleares o dinucleares formadas. Se ha demostrado que el Zn(II) incrementa la velocidad de curación de las úlceras gástricas, y los complejos Zn(II) con IMC (ZnIMC) también se han identificado como fármacos antiinflamatorios [Singla, 1995], debido a efectos, en algunos casos, hasta 3 veces mayores a la IMC libre, muy probablemente a que hay mejor solubilidad y velocidad de disolución. [Singla, 1995; Abou-Mohamed, 1995]. Hasta el momento, los reportes estructurales de las 20 A. Ricardo Hipólito N. especies de ZnIMC [Zhou, 2000] han demostrado que para los complejos sólidos de ZnIMC con DMA (Dimetilacetaamida), Piridina y NMP (N-metil-2-pirrolidona), los complejos son principalmente especies dinucleares, con la IMC arreglada en forma de rueda de paletas (Fig. 2.28) sobre el eje Zn(II)···Zn(II). Cada catión Zn(II) tiene una geometría de pirámide cuadrada, con una molécula de solvente en la punta de la pirámide. La separación Zn(II)···Zn(II) es de 2.9686, 2.969, 2.934 Å para [Zn2(IMC)4(DMA)2], [Zn2(IMC)4(Piridina)2] y [Zn2(IMC)4(NMP)2], respectivamente; lo cual indica que son menores al máximo que se puede encontrar para los complejos de este tipo, pero mayores que los complejos dinucleares de [Cu2(IMC)4(DMF)2] de distancia Cu(II)‒Cu(II) 2.630 Å [Weder, 1999]. Fig. 2.28. Posibles estructuras de los complejos MIMC, siendo M: Cu(II) ó Zn(II); R: IMC). En el estudio de Zhou del 2000, se describe estructuralmente a los complejos de ZnIMC con etanol, metanol y agua, describiéndolos principalmente como mononucleares. Una de las diferencias que las especies mononucleares presentan con los dinucleares es en la disminución del ángulo O‒C‒O, siendo de ~119° para los mononucleares y de ~126° para los dinucleares, siendo estos ángulos muy parecidos a los ya observados para otros mononucleares y dinucleares de los dihidratos Zinc-acetato [Ishioka, 1997] y de dinuclear (chelate) mononuclear cis isomer (chelate) mononuclear trans isomer (chelate) mononuclear tetrahedral isomer mononuclear cis square planar isomer mononuclear trans square planar isomer dinuclear (quelato) isómero mononuclear trans (quelato) isómero mononuclear cis (quelato) isómero mononuclear tetrahédrico (quelato) isómero mononuclear cuadrado plano trans (quelato) isómero mononuclear cuadrado plano cis 21 A. Ricardo Hipólito N. [Cu2(IMC)4(DMF)2]. Es probable que los ligantes que sean bases de Lewis, relativamente débiles, como el etanol, metanol o agua; no soporten un centro metálico con un número de coordinación menor de 6 en los complejos ZnIMC, por lo que esta puede ser una razón determinante para la estabilidad de las especies dinucleares [Zhou, 2000]. No hay duda de que los complejos dinucleares son preferibles para complejos de CuIMC en comparación con ZnIMC. Además de que las pruebas realizadas de los complejos de [Cu2(IMC)4(DMF)2] han demostrado tener una menor toxicidad en el estómago y en el intestino delgado, mientras que [Zn2(IMC)4(DMA)2] es poco tóxico en el intestino delgado pero tóxico en el estómago [Zhou, 2000], por lo que, la toxicidad de los diversos complejos dependerá de la estabilidad relativa de los complejos dinucleares. Pocos fármacos MIMC están presentes en el mercado, por ejemplo; el fármaco CuAlgesic es distribuido principalmente en Australia, para el tratamiento en perros y caballos en enfermedades inflamatorias [Dillon, 2003]. Esta presentación comercial ha demostrado tener menos efectos secundarios GI y del sistema nervioso central en comparación a la HIMC libre [Dillon, 2003]. 2.9. Mecanismo de acción de los complejos MAINEs y MIMC. Entre los modos de acción que se han propuesto, para los complejos de CuAINE, además del mismo mecanismo para los AINES (Sección 2.5), se encuentran: la regulación baja y estabilización de leucocitos polimorfo nucleares (PMNL, por sus siglas en inglés), que son parte del sistema inmunológico y ejercen actividad fagocítica (incluyendo inhibición de O2 ‒• sintetizado por PMNLs); baja regulación de fosfolipasas A2 (las cuales activan/liberan el enlace de membrana del ácido araquidónico antes de su conversión a COXs y lipooxigenasas, para su posterior transformación a prostanglandinas y leucotrienos, respectivamente); inhibición de peroxidación lipídica y oxidación microsomal nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH, por su siglas en inglés) y modulación de actividad del óxido nítrico sintetasa [Weder, 2002]. Cualquiera que sea el mecanismo de acción de los complejos CuAINE, exhiben una actividad mimética-SOD (superóxido dismutasa) marcada y esto se propone comúnmente para su 22 A. Ricardo Hipólito N. actividad antiinflamatoria. La SOD compite con el óxido nítrico (NO) por la expulsión de O2 ‒•. NO es reconocido como un mediador crítico de la mucosa GI [Weder, 2002] por el cual puede tomarse en cuenta para el efecto de preservación GI del complejo CuAINE ya que al parecer NO ayuda a que se forme la asociación COX hierro heme en el estado Fe(III), que lleva a la formación de PG protectoras [Weder, 2002]. Los complejos de CuIMC han sido considerados como complejos de cobre análogos a SOD y usados como ejemplos de SOD apróticos [Weser, 1980]. Por lo tanto, el modo de acción de los complejos MIMC es impactado por la actividad de la SOD, ya que los complejos no son transportados intactos al sitio de la inflamación, ya que los complejos MIMC al parecer pueden formarse in vivo y reducir la inflamación, no importando la manera de administración, HIMC, CuIMC ó ZnIMC [Dillon, 2003]. Se ha documentado que la SOD existe en la mucosa del tracto GI, y se cree que es una enzima clave en el mecanismo protector de la mucosa gástrica y duodenal contra especies dañinas. El incremento de toxicidad de los complejos MIMC sugiere ser por la hidrólisis ácida, que puede darse en el estómago, y por lo tanto liberar HIMC. Pero debido a su naturaleza lipofílica, los complejos MIMC tienen la tendencia a mantenerse en micelas y mantenerse intactos hasta su absorción [Dillon, 2003]. Se ha demostrado que los complejos MIMC presentan toxicidad GI más bajas que la IMC libre [Dillon, 2003]. Se piensa que el modo de acción de los complejos MIMC es igual a la IMC libre, la cual a su vez sigue el mecanismo general de los AINES. Los complejos son es muy grandes para acomodarse en los espacios que se generan en las COX. Por lo tanto, los residuos IMC entrarán en contacto con las COXs, así que tampoco funcionan como inhibidores selectivos a COX-2 [Dillon, 2003]. Debido a la baja solubilidad de los complejos MIMC sólidos, su estudio se vuelve dificil tanto in vitro como in vivo, por lo que su estudio en solución acuosa es poco explorado (Rodríguez-Laguna, 2016). El conocer las especies, ya sean nucleares o dinucleares de los complejos MIMC en solución, sería de gran ayuda, para entender de mejor manera, el modo de acción en los sitios activos de las enzimas encargadas en las diversas afecciones 23 A. Ricardo Hipólito N. inflamatorias. Además de facilitar la preparación de formulaciones menos tóxicas y más efectivas. 2.10. Historia de las ciclodextrinas. 2.10.1. Primera Etapa (1891-1935). Descubrimiento de las ciclodextrinas. Periodo de duda. El inicio de la era de las celulosinas comenzó con una observación fortuita por Antoine Villiers, un investigador curioso francés en la última parte del siglo XIX, exactamente en el año de 1891 [Szejtli, 1998]. Villiers se encontró con cristales en desechos de alcohol, dejados por la producción de productos de degradación de almidón con un cultivo bacteriano de Bacillus amylobacter (Clostridium butyricum) e impurezas posibles de Bacillus macerans [Szejtli, 1998]. A estos cristales les llamo celulosinas, por la resistencia de la hidrólisis ácida y su falta de azúcares reductores, que son propiedades parecidas a las de la celulosa. En ese tiempo Villiers observó que se formaban dos celulosinas cristalinas distintas, las representó como múltiplos de la fórmula [(C6H10O5)2 + 3H2O] [Szejtli, 1998]. Franz Schradinger en 1904, aisló un nuevo microorganismo al cual llamó Rottebazillus I, varios meses después, decidió cambiarlo al nombre en latin: Bacillus macerans. Los rendimientos obtenidos de celulosinas por Schardinger usando sólo Bacillus macerans fueron 10 veces mayores a los de Villiers [Szejtli, 1998; Crini, 2014]. A Schardinger se le conoce como el precursor o iniciador de la química de las celulosinas [Kurkov, 2013; Crini, 2014]. Entre 1905 y 1911, Schardinger dio los primeros detalles de la preparación, separación y purificación de las primeras celulosinas; por lo anterior, en este periodo a las celulosinas se les llamó dextrinas de Schardinger. En 1911, Hans Pringsheim y su equipo de trabajo fueron los líderes en la investigación de las dextrinas de Schardinger, se les reconoce como los descubridores de que las dextrinas de Schardinger cristalinas y sus acetatos, tengan la tendencia de formar complejos con varios compuestos orgánicos, además de clasificarlas como poliamilosas [Szejtli, 1998]. En este periodo se determina la estructura del almidón [Crini, 2014]. En este mismo periodo, Max Ulmann observa que el huésped, en un complejo de inclusión, pude formar diferentes estructuras cristalinas con las mismas dextrinas de Schardinger. Mientras, Zacherov, J. P., describía las características del Bacillus macerans. 24 A. Ricardo Hipólito N. Una de las principales confusiones durante este periodo inicial, fue la toxicidad de las dextrinas de Schardinger [Freudenberg, 1935]. Otras confusiones surgieron de la variedad de terminologías de los compuestos y la falta de certeza en la estructura de las dextrinas. 2.10.2. Segunda Etapa (1935-1970). De 1935 a 1950 fue el periodo de madurez de las dextrinas de Schardinger, gracias a dos grupos de trabajo, el de Karl Johann Freudenberg y el de Dexter French. Estos grupos aceleraron el desarrollo científico de las dextrinas de Schardinger [Crini, 2014]. En 1935, Freudenberg describió un método para las síntesis de dextrinas de Schardinger de alta pureza. Usando un método crioscópico, para la determinación del peso molecular, reportó (erróneamente) el número de unidades de glucosa que las dextrinas de Schardinger contenían: cinco para α-dextrina de Schardinger y seis para β-dextrina de Schardinger [Crini, 2014; Freudenberg, 1935]. En el año de 1936, postula la estructura cíclica de estas dextrinas de Schardinger [Freudenberg, 1936a; Freudenberg, 1936b; Freudenberg, 1943; Freudenberg, 1948; Crini, 2014; Szejtli, 1998] junto a sus colaboradores, llega a la conclusión de que las dextrinas de Schardinger se forman de unidades de maltosa y contienen sólo enlaces α-(1®4)-glicosídicos. Al final de la década de 1930, Freudenberg sugirió por primera vez la hidrofobicidad de la superficie interna de las dextrinas de Schardinger. Notó como tenían la habilidad de incluir moléculas en su cavidad, y años más tarde fue también el primero en mostrar la participación de las fuerzas hidrofóbicas en la formación de complejos. En 1939, Freudenberg propone el primer mecanismo en el que las dextrinas de Schardinger son preformadas, dentro de las macromoléculas de almidón [Freudenberg, 1938; Freudenberg, 1939]. Él mismo, rechaza este mecanismo, así que propone un segundo mecanismo basándose en el trabajo de Charles Samuel Hanes de la Escuela de Botánica de Cambridge y su modelo helicoidal de la estructura del almidón y la naturaleza α-D de las unidades de glucosa, años más tarde el mecanismo lo confirma French, usando cromatografía, y también Takeo y Kuge, usando cristalografía [French, 1954; Takeo, 1969; Takeo, 1972; Kainuma, 1984]. Para 1942, French y Rundle usando difracción de rayos X (XRD), y medidas de densidad cristalina, determinaron los pesos moleculares de la α- y β-dextrinas de Schardinger descubriendo 25 A. Ricardo Hipólito N. también el número exacto de unidades de glucosa por dextrina, siendo seis y siete, respectivamente. A las dextrinas de Schardinger, French les llamó cicloamilosas [Crini, 2014]. En este mismo año Tilden y Hudson aíslan, del Bacillus macerans, la enzima responsable de la conversión de almidón a cicloamilosas, a la cual se le llamó cicloamilosa glucanotransferasa [Tilden, 1939, 1942a, 1942b; Crini, 2014]. En 1948, se confirma la estructura cíclica de las cicloamilosas por rayos X. Además, en el periodo de 1948 a 1950 Freudenberg y su equipo de trabajo descubrieron la γ-cicloamilosa, elucidando su estructura [Freudenberg, 1948; Freudenberg, 1950]. Freudenberg también propuso las posibles existencias de cicloamilosas con 9 o 10 unidades de glucosa [Crini, 2014; Szejtli, 1998]. French en 1949 describe los protocolos para preparar las tres cicloamilosas nativas. [French, 1949a; French, 1949b; Crini, 2014]. A finales del periodo de madurez, los resultados presentaban varias contradicciones, debido a la confusión en nomenclatura, pureza de las cicloamilosas y las diferencias en los protocolos de purificación. Eran aún muy costosas y disponibles en pequeñas cantidades [Crini, 2014]. Periodo de exploración (1950-1970). A finales de la década de 1940, los grupos de trabajo que encabezaban las investigaciones de cicloamilosas eran los de French y Friedrich Cramer, comenzando a trabajar en su producción enzimática, fraccionándolas a componentes puros y caracterizando sus propiedades químicas y físicas verdaderas. Cramer se enfocaba también en las propiedades de los complejos de inclusión de las cicloamilosas ó ciclodextrinas (CDs) como él les llamó [French, 1957; Robyt, 1998; Szejtli, 1998]. En 1951, Hale y Rawlins publican la purificación de la enzima CGT [Hale, 1951]. Freudenberg, Cramer y Plieninger obtuvieron una patente en 1953 [Freudenberg, 1953], demostrando la protección de sustancias fácilmente oxidables contra oxidación atmosférica, la reducción de pérdidas de sustancias altamente volátiles, etc., al complejarse con CDs [Szejtli, 1998]. Además, Cramer daba las bases para la catálisis supramolecular que involucraba a las CDs. En este mismo año Broser y Lautsch usaron ensayos espectrofotométricos para determinar que las CDs y moléculas de colorantes se combinan en 26 A. Ricardo Hipólito N. una relación 1:1 [Broser, 1953; Crini, 2014]. Para 1956, Cramer introduce la noción de complejo de inclusión [Cramer, 1956; Cramer, 1957]. Un término similar alemán es: einschlussverbindungen (literalmente, complejo de inclusión) que fue creado por W. Schlenk en 1950 [Schlenk, 1950; Schlenk, 1952]. En 1957, French descubrió CDs más grandes (δ y ε aunque no tenía claro si verdaderamente eran anillos con número de glucosas de 9, 10 unidades, ó CDs glucosil-, maltosil- o diglucosil-ramificadas). A finales de 1950, French y colaboradores habían establecido, el peso molecular, la estructura química exacta, las dimensiones y los tipos de enlaces de la α-, β- y γ-CD [Pulley, 1961]. En 1959, estudios de XRD mostraron que las moléculas pequeñas, tales como el yodo, eran capaces de interactuar con la cavidad de las CDs, confirmando los estudios de Freudenberg y Cramer [James, 1959]. A finales de 1960, ya se conocían los métodos de preparación a escala de laboratorio, sus estructuras, sus propiedades químicas y físicas, así como sus propiedades de formación de complejos de inclusión [Szejtli, 1998]. Después de que se publicaron estudios de toxicología adecuados, en dónde se demostró que no había una toxicidad inherente de las CDs, las publicaciones sobre CDs incrementaron significativamente [Szejtli, 1998]. En 1961, Pulley y French indicaban la existencia de CDs que tenían más de 8 unidades de glucosa, confirmando lo supuesto por Freudenberg y su alumno Cramer en 1948 [Pulley, 1961; Crini, 2014]. Para 1965, French reportaba la estructura y las dimensiones, no sólo de la δ- y ε- dextrina, si no de la ζ-CD y η-CD, aunque el descubrimiento, de estas dos últimas CDs, se le atribuye a Thoma y Stewart [Crini, 2014]. En 1965, Hybl y colaboradores fueron los primeros en determinar la estructura de los complejos entre α-CD y acetato de potasio, usando datos de XRD en tres dimensiones, resultados que demostraron que las cavidades de las CDs tenían una forma ligeramente de V [Hybl, 1965; Crini, 2014]. A mediados de esta década, varios estudios demostraron que las impurezas atrapadas pueden hacer a las CDs tóxicas [Crini, 2014]. En 1967, Cramer es capaz de detallar el mecanismo de formación de un complejo de inclusión, dando la primera explicación científica [Cramer, 1967; Crini 2014]. En este periodo se reconoce a Cramer por su trabajo con los complejos de inclusión, en solución y en estado sólido. [Crini, 2014]. 27 A. Ricardo Hipólito N. Llegando al final del periodo de exploración, las estructuras, las propiedades fisicoquímicas y su preparación habían sido bien definidas y explicadas, además se perfeccionó el mecanismo de acción del B. macerans, así como los protocolos de purificación [Crini, 2014]. 2.10.3. Tercera Etapa. Periodo de aplicación. (1970- a la actualidad). En la década de 1970, la no toxicidad de los CDs se va aceptando más y varios fabricantes comienzan a producirlas y comercializarlas [Crini, 2014]. En 1970, se proponen modelos moleculares Corey-Pauling-Kultun para explicar las características de las CDs [Crini, 2014]. Y en este año Breslow, en la universidad de Columbia en 1970, sintetiza una enzima artificial (una CD modificada con una coenzima) que imita la reacción bioquímica catalizada por transaminasas de origen natural [Breslow, 1980-a; Breslow, 1980-b; Breslow, 1982]. Un año después, este mismo laboratorio, logra catalizar una cicloadición de Diels–Alder, la cual ni una enzima natural ni un catalizador común podía hacerlo, usando una CD modificada [Crini, 2014]. Thakkar y Demarco, en 1971, fueron los primeros en demostrar la formación de complejos de inclusión entre varias sustancias orgánicas y β-CD, usando RMN en D2O [Thakkar, 1971; Crini, 2014]. En 1972, Manor y Saenger demostraron que la fórmula [(C6H10O5)6 – H2O] era el hexahidrato-α-CD, la misma fórmula que se propuso para describir una celulosina de Villiers en 1891 [Manor, 1972; Szejtli, 1998]. A mediados de esta década, comenzaron a aparecer las aplicaciones farmacéuticas, ganando terreno rápidamente, principalmente en el aumento de solubilidad de fármacos evitando el uso de sustancias como solventes orgánicos y surfactantes no iónicos, que causan irritación [Crini, 2014]. Ono Pharmaceutical Co., una empresa japonesa, produce el primer fármaco basado en CD. Un fármaco basado en un complejo de prostanglandina E2 con CD, llamado Prostarmonen, en 1976, año en el cual Japón también autoriza el uso de α- y β-CD como aditivo alimenticio (mientras que en Hungría se autoriza en 1983 y en Alemania en 2000) [Crini, 2014]. En 1977; Saenger, usando 1H RMN y simulación por computadora, mostró (i) que las seis unidades glucosa tenían conformaciones idénticas, (ii) que las moléculas α-CD tenían simetría hexagonal, y (iii) la presencia de puentes de hidrógeno intramoleculares en CDs, 28 A. Ricardo Hipólito N. [Wood, 1977; Crini, 2014] confirmando las conclusiones previas de Hybl, y Cramer [Casu, 1966; Hennrich, 1965]. Para 1979, la producción industrial de CDs comenzó, gracias a los avances de ingeniería genética y la confección de CGTasas para incrementar actividad, selectividad y especificidad hacía diferentes CDs, que condujeron a productos de alta pureza, adecuados para usos farmacéuticos y alimentarios [Crini, 2014). Entre 1978 y 1982, Lindner y Saenger mostraron, con estudios cristalográficos, que la β-CD se asocia con 12 moléculas de agua (dodecahidrato) [Lindner, 1982; Lindner, 1978]. En la década de 1980, una serie de CDs más grandes fueron aisladas y estudiadas, por ejemplo la δ-CD de 9 miembros que presenta mayor solubilidad en agua que la β-CD, pero menor que la α y γ-CD [Miyazawa, 1995; Endo, 1997; Larsen, 1997; Szejtli, 1998; Taira, 2006; Crini, 2014]. En esta década, también comienzan las primeras aplicaciones cromatográficas, espectrofotométricas y colorimétricas, comenzando un desarrollo espectacular [Crini, 2014]. En 1981, Szejtli organizó el primer simposio internacional sobre las ciclodextrinas, en Budapest y un año después, escribió el primer libro sobre las CDs. En este año, se desarrolló un nuevo derivado de CD llamado HP-β-CD, un potente solubilizador comercializado como Encapsin o Cavitron por Josef Pitha [Szejtli, 1981; Szejtli, 1982; Crini, 2014]. En 1982, Szejtli explicó la ganancia en entalpía por la llegada espontánea del huésped, desplazando moléculas de agua activas retenidas en la cavidad no polar de la CD en solución acuosa (Budapest, 1982. Szejtli, 1988; Crini, 2014). En 1983, se autoriza el uso de la α- y β-CD en la industria farmacéutica en Japón (Crini, 2014). En este mismo año, Fujiwara y colaboradores demuestran la existencia de un nuevo solvato, para el cual 11 moléculas de agua se asocian a cada molécula de β-CD (Fujiwara, 1990; Pande, 1995; Crini, 2014). En 1984, las CDs bajan de precio considerablemente, y se comercializan las columnas cromatográficas a base de CDs con el nombre CYCLOBOND, usadas para separaciones quirales [Crini, 2014]. En 1987, en Francia se autoriza el uso de CD en alimentos como vehículo para saborizantes [Crini, 2014]. Buvari y Barcza, en 1988, demostraron que la deslocalización de la carga de resonancia incrementa la densidad electrónica y la polarizabilidad del sustrato, incrementando las fuerzas de London y por lo tanto la estabilidad del complejo, siendo esta la razón por la cual el p-nitrofenolato de sodio forma un complejo 29 A. Ricardo Hipólito N. más estable con β-CD que el p-nitrofenol [Buvari, 1988; Crini, 2014]. En el mismo año, Palepu y Reinsborough reportaron que la conductividad de las soluciones de surfactantes iónicos esta fuertemente afectada por la formación de los complejos de inclusión con CDs, adjudicándole este resultado a la anfifilicidad del huésped, la cual lleva a especies fuertemente asociadas [Palepu, 1988; Crini, 2014]. Además, en este mismo año, Europa tiene su primer fármaco desarrollado por la compañía Italiana Chiesi Farmaceutici, un fármaco de piroxicam y β-CD, llamado Brexin [Crini, 2014]. En la década de 1990, Japón se vuelve el principal consumidor de CD en el mundo, para su uso en la industria de: alimentos (~60%), cosméticos (~10%), farmacéutico (~5%) y agricultura (~5%, pesticidas) [Crini, 2014]. A principios de esta década, Valentino J. Stella de la universidad de Kansas, KS, registra dos patentes de la síntesis de la sulfobutiléter- ciclodextrina (SBE-CD) por el proceso llamado Captisol (CYDEX Co., USA) [Stella, 1996; Stella, 1999; Crini, 2014]. En 1991, Nishijo y colaboradores mostraron que la fluorescencia también provee datos interesantes, para caracterizar la formación del complejo de inclusión de 6-p-toluidinilnaftaleno-2-sulfonato y β-CD, usando la geometría del sustrato y las diversas interacciones [Nishijo, 1991; Nishijo, 1992; Crini, 2014]. Para 1992, Susuki mostró que las interacciones dipolo-dipolo pueden llevar a la formación de complejos inesperados, por ejemplo, en colorantes azo, que a pesar de su gran masa, la parte sulfonada se inserta en la cavidad, destacando la importancia de fuerzas de van der Waals para producir esto [Suzuki, 1992; Crini, 2014]. Durante esta década, las CDs se propusieron para la síntesis de nuevas moléculas supramoleculares y materiales tales como catenanos o rotoxanos [Harada, 2004; Harada, 2009; Crini, 2014]. El primer caso de un catenano basado en CD, fue reportado por Stoddart (Universidad de California) en 1993 [Nepogodiev, 1998; Crini, 2014]. El precio de 1 kg de β-CD para 1970, rondaba los $2000 US, y estaba disponible solo como un químico fino poco común. Después de 25 años, varias compañías estaban produciendo CDs y el precio del producto clave, β-CD, era de varios dólares por kilogramo, dependiendo de la calidad y cantidad. Las α-CD y γ-CD, así como varios derivados de las CD, ya se producían industrialmente [Szejtli, 1998]. Hasta 1997, aproximadamente, 100 derivados de diferentes CDs estaban comercialmente disponibles como químicos finos, principalmente para el uso en cromatografía, en 30 A. Ricardo Hipólito N. diagnósticos y como intermediarios de síntesis adicionales [Szejtli, 1998]. En este año, Hamai y Satoh reportaron la preponderancia de las interacciones dipolo-dipolo electrostáticas durante la complejación de los sustratos con fuertes momentos dipolares (por ejemplo fenoles) [Hamai, 1997; Crini, 2014]. Además de que en este año, se aprueba y se lanza al mercado, en E. U., la primer formulación en solución oral de HP-β-CD-itraconazol [Crini, 2014]. En esta década (1990), existía un acuerdo general, en el cual, durante la formación de un complejo de inclusión, un set completo de interacciones intermoleculares están involucradas (puentes de hidrógeno, fuerzas de vander Waals, interacciones hidrofóbicas, interacciones estéricas, etc.) y cada una tiene su propio rol en el proceso general [Crini, 2014]. La primer evidencia de agregados de complejos de inclusión con huéspedes lipofílicos fue en 1998 [Mele, 1998; Kurkov, 2013]. El estatus regulatorio y normativo de las CDs, para su uso en alimentos y medicamentos, a evolucionado desde 1970 hasta nuestros días (Kurkov, 2013). En la década del 2000, se demuestra finalmente la reacción de transglicosilación catalizada por la CGTasa [Crini, 2014]. Para 2004, Szejtli estimó que existían más de 15000 derivados de CD, los cuales han sido estudiados y pueden mencionarse en la literatura [Crini, 2014]. Las CDs, hoy en día, son moléculas de interés en cosméticos, biotecnología y están probando ser atractivas en nuevos campos, tales como el medio ambiente (tratamiento de contaminantes). Los estudios también se están dirigiendo hacia la síntesis de materiales innovadores para el sector biomédico (prótesis, agentes terapéuticos, etc.) y para textiles (materiales inteligentes, cosmetotextiles) (Szejtli, 1998, Kurkov, 2013; Crini, 2014). 2.11. Características y propiedades de las ciclodextrinas. 2.11.1. Nomenclatura. Una de las nomenclaturas más completa y unánimes, es la propuesta por Lichtenthaler e Immel, recomendada para las CD menores o cualquier oligosacárido cíclico, ésta sugiere que una CD de 5 unidades glucopiranosa sea llamada ciclo-α(1→4)-glucopentósido [Szejtli, 1998]. Sin embargo, el uso de esta nomenclatura no ha sido ampliamente usada y otras nomenclaturas aún son utilizadas [Crini, 2014]. En este trabajo, por practicidad, se utilizará 31 A. Ricardo Hipólito N. el término ciclodextrina (CD), que se ha usado desde finales de la década de 1940 en esta área, llamándoles, por lo tanto, a las CDs más sencillas o nativas: α-, β-, y γ-CDs (Fig. 2.29). 2.11.2. Propiedades físicas y químicas. La degradación enzimática del almidón, generalmente resulta en la producción de glucosa, maltosa, maltriosa, etc.; en otras palabras, una serie de malto-oligómeros de cadenas lineales o ramificadas, llamadas dextrinas. Las dextrinas son sustancias heterogéneas, amorfas e higroscópicas producidas en grandes cantidades para la industria alimentaria, textil, papelera, entre otras. Son consumidas sin aislamiento previo, en productos como cerveza y pan. Este tipo de degradación del almidón, es un proceso hidrolítico, ya que el producto primario del rompimiento de la unión glicosídica reacciona con agua [Szejtli, 1988]. Pero, si el almidón es degradado por la enzima ciclodextrin glucanotransferasa (CGT), el producto primario del rompimiento de la cadena, sufre una reacción intramolecular sin la participación de moléculas de agua. Los productos cíclicos de unidades α-D-glucopiranosa con uniones α-(1→4) resultantes (Fig. 2.30) (también conocida como conformación 4C1), son llamadas ciclodextrinas (CDs) (Fig. 2.29) [Loftsson, 1996; Kurkov, 2013]. Las tres CDs consideradas nativas son la α-CD, que es un ciclo que cuenta con 6 monosacáridos; la β-CD que cuenta con 7 monosacáridos y la γ-CD que tiene 8 (Fig. 2.29); el monosácarido para todas es la D-glucosa. Existen reportes de CDs más grandes como la δ-, ε-, ζ- y la η-CD [French, 1957-b; Pulley, 1961], las CDs con menos de 6 miembros de glucosa no son estables por efectos estéricos, confirmados por mapas de energía de conformación [Sundararajan, a-CD b-CD g-CD Fig. 2.29. Estructuras de las CDs nativas. 32 A. Ricardo Hipólito N. 1970]. Se ha comprobado que los residuos de CD están en la conformación de silla 4C1 y que la cavidad adquiere una forma de V, lo que le da una estructura toroidal a todas las CDs. Fig. 2.30. Diagrama esquemático de dos unidades glucopiranosa de una molécula de ciclodextrina ilustrando los detalles de la unión a-(1®4) y la numeración usada para describir los anillos de glucopiranosa (Bender, 1978). La estructura de las CDs requiere acomodos especiales de grupos funcionales, que resultan en una variedad de características importantes: (i) como consecuencia de la conformación 4C1 de las unidades glucopiranosas, todos los grupos hidroxilos secundarios se localizan en el lado del toroide más abierto, al estar en la cadena relativamente más rígida no pueden girar. Mientras que todos los grupos hidroxilo primarios se localizan en el lado opuesto (la parte más cerrada), estos hidroxilos pueden rotar de tal manera que pueden llegar a bloquear la entrada a la cavidad; (ii) el interior del toroide consiste sólo de un anillo de grupos C‒H, un anillo de oxígenos glucosídicos y otro anillo de grupos C‒H y (iii) el interior de la cavidad es relativamente apolar, comparada con agua, esta característica estructural es responsable del uso de CDs como solubilizantes de moléculas poco solubles en agua [Hybl, 1965; Crini, 2014; Kurkov, 2013]. Los grupos hidroxilo, de los C-2 y el C-3, de las unidades glucopiranosa forman enlaces de hidrógeno, los cuales estabilizan la forma de las moléculas y al mismo tiempo influencian significativamente su solubilidad en agua [Bender, 1978; Szejtli, 1998; Crini, 2014]. Los pares de electrones de no enlace, de los puentes de oxígeno glicosídico, están dirigidos hacia el interior de la cavidad, produciendo una densidad electrónica alta en esta zona y brindándole características de base de Lewis [Szejtli, 1998]. El grupo C-2-OH, de una unidad glucopiranósido, puede formar un puente de hidrógeno con el grupo C-3-OH, de la unidad de glucopiranosa adyacente, por lo que, en la molécula de CD se forma un cinturón secundario, debido a estos puentes de hidrógeno. La formación de estos puentes de hidrógeno produce una estructura rígida en la β-CD y probablemente son también 33 A. Ricardo Hipólito N. la explicación del porqué, la β-CD, tiene una solubilidad más baja en agua que todas las CDs [Szejtli, 1998]. Los puentes de hidrógeno son incompletos en la α-CD, debido a que una unidad glucopiranosa está en una posición distorsionada y sólo 4 puentes de hidrógeno se forman completamente, la γ-CD es una estructura no coplanar y más flexible, por lo tanto es la más soluble de las tres CDs [Szejtli, 1998]. Los puentes de hidrógeno de la β-CD son tan fuertes como los de la α-CD, pero con la temperatura se debilitan [Crini, 2014]. Las solubilidad en agua de las CDs son: α-CD 14.5 g/100 mL (145 g/L), β-CD 1.8 g/100 mL (18 g/L) y γ-CD 23.2 g/100 mL (232 g/L) [French, 1950; Crini, 2014]. Esta solubilidad aumenta con la temperatura. Tienen un máximo de solubilidad en soluciones etanólicas al 20-30%, no son fermentables, resisten el ácido y pueden ser convertidas en éteres bajo la acción de cloruros. [Villiers, 1891a; Villiers, 1891b; Crini, 2014]. Además de ser cristalinas, homogéneas y no higroscópicas [Crini, 2014; Szejtli, 1998]. Las CDs nativas no son iónicas, pero las interacciones electrostáticas con los huéspedes, son posibles debido a que las CDs tienen un momento dipolar. Sin embargo, a pesar de los numerosos resultados publicados, mostrando que un set completo de interacciones están involucrados, sigue habiendo un debate sobre la medida en que cada fuerza puede contribuir a la formación de los complejos [Crini, 2014]. Dependiendo de las condiciones, las CDs tienen diferentes formas cristalinas: la α-CD tiene tres formas diferentes: α-CD·6H2O, forma I; α-CD·6H2O, forma II, y α-CD·7.57 H2O, forma III. La β-CD tiene 2 formas cristalinas en su forma hidratada: β-CD·12 H2O y β-CD·11 H2O, las diferencias estructurales dependen de la distribución o desorden de las moléculas de agua en la cavidad de la β-CD. En la β-CD·11 H2O, las 11 moléculas de agua están distribuidas sobre 16 posiciones, ocho en la cavidad (6.12 moléculas de agua ) y ocho en los intersticios (4.88 moléculas de agua) [Szejtli, 1988; Fujiwara, 1990; Pande, 1995; Crini, 2014]. En la β- CD·12 H2O, la cavidad está ocupada por 6.5 moléculas de agua, distribuidas sobre ocho posiciones y las otras 5.5 moléculas están localizadas en los intersticios. Las moléculas de la cavidad muestran movimiento térmico intenso [Saenger, 1982; Szejtli, 1988; Crini, 2014]. La γ-CD sólo tiene una estructura cristalina: la γ-CD·13.3 H2O que incluye 5.3 moléculas de agua, las cuales ocupan los 13 sitios disponibles [Szejtli, 1988]. 34 A. Ricardo Hipólito N. Las CDs no tienen puntos de fusión definidos, pero se descomponen alrededor de 200 °C. Las propiedades termoanalíticas dependen del contenido de agua, la estructura cristalina, y velocidad de calentamiento [Szejtli, 1988]. En solución acuosa, las CDs no pueden considerarse como espacios vacíos. El volumen de la cavidad de 1 g de α-CD es de cerca de 0.1 mL. La energía requerida para mantener esta cavidad vacía es de cerca de 271 kJ/mol, el valor es tan grande que no puede concebirse como vacía. Con otras CDs, que tienen diámetros más grandes, esta energía es aún más grande. Si la cavidad estuviera vacía, entonces los volúmenes parciales específicos de las CDs deberían ser más grandes que la glucosa o maltosa: cosa que no se ha observado [Szejtli, 1988]. El efecto de la hidratación, sobre el diámetro del anillo y su forma, no es conocida todavía, aunque experimentos realizados, han mostrado que la distorsión del anillo en solución no es significativo [Szejtli, 1988]. La viscosidad de una solución, 9.5 × 10-4 M de α-CD es de 8.99 mP y de una solución de β-CD 9.98 × 10-3 M 9.436 mP. La del agua pura es de 8.93 mP. Al ser productos de degradación del almidón, poseen muchas de las características químicas y biológicas similares a las dextrinas lineales solubles en agua. Aunque las reacciones de hidrólisis ácida y las reacciones de oxidación de peryodato, para romper las unidades de glucosa de las CDs, no producen ni ácido fórmico ni formaldehido, permitiendo demostrar una estructura cíclica [French, 1942; French, 1950]. Por lo tanto, la estructura cíclica de las CDs les proporciona de 3 a 5 veces más resistencia a la hidrólisis no enzimática, comparada con dextrinas lineales [Kurkov, 2013]. La degradación no enzimática de las CDs en solución acuosa, sigue una hidrólisis específica catalizada por ácidos de los enlaces α-(1®4) para formar glucosa, maltosa y oligosacáridos no cíclicos, que contienen tantas unidades de glucosa como las CDs originales [Kurkov, 2013]. En solución acuosa, la vida media (t1/2) para la apertura del anillo de β-CD es de aproximadamente 15 h a 70°C y pH de 1.1 [Kurkov, 2013]. En estado sólido, las CD son tan estables como la sucrosa o el almidón, y pueden ser guardadas por varios años a temperatura ambiente sin degradación detectable [Kurkov, 2013]. Las CDs son resistentes a la β-amilasa, que hidroliza el almidón de su extremo no reductor, pero son lentamente hidrolizadas por la α-amilasa, que al almidón lo hidroliza desde el 35 A. Ricardo Hipólito N. interior de la cadena del carbohidrato. La velocidad hidrolítica depende del tamaño del anillo y la fracción libre de CD. El mecanismo por el cual la CD resiste la hidrólisis, se debe a que todos los puentes de oxigeno se ocultan dentro de la cavidad central [Kurkov, 2013]. Por lo tanto, las CD libres se hidrolizan más rápido que aquellas CD ligadas en un complejo de inclusión y con un aumento en la velocidad de hidrólisis cuando se incrementa el tamaño de la cavidad. Por ejemplo, la α-CD y la β-CD son esencialmente estables frente a la α-amilasa en la saliva, mientras que la γ-CD, es rápidamente digerida por amilasa pancreática o salival [Kurkov, 2013]. La reacción de yoduro sirve para identificar al menos 2 CDs, con α-CD, el yoduro da un color amarillo-verdoso y la reacción yoduro con β-CD, da un color café-rojizo [Pringsheim, 1924-a; Pringsheim, 1924-b; Szejtli, 1998]. La α-CD es aproximadamente 1.5 veces más estable y la γ-CD es aproximadamente 1.5 veces menos estable que la β-CD. Sin embargo, la formación de complejos de inclusión aumenta significativamente la estabilidad química de la CDs. En comparación, su velocidad de hidrólisis se incrementa en el orden de αCD < βCD < γCD [Szejtli, 1998]. Se ha observado que las CDs pueden formar agregados entre sí, a concentraciones muy por debajo de su solubilidad intrínseca, debido a puentes de hidrógeno. Estos agregados pueden tener diferentes formas: esféricas, partículas alargadas, así como fibras o tubos anormalmente unidos y extensas hojas a microescala [Kurkov, 2013]. Las CDs tienen poco efecto en disminuir la biodisponibilidad de fármacos de Clase I (clasificación BCS). Frecuentemente, aumentan la biodisponibilidad de los fármacos de Clase II y clase IV, sin embargo tienen un efecto despreciable frente a los fármacos de Clase III [Kurkov, 2013]. 2.11.3. Ciclodextrinas sustituidas. La β-CD al igual que la α-CD y la γ-CD, pueden modificarse químicamente a través de los grupos hidroxilo en las posiciones C-2, C-3 y C-6 (Fig. 2.30) [Crini, 2014]. La diferencia de reactividad entre los hidroxilos primarios y secundarios es relativamente pequeña (con las funciones primarias ligeramente más reactivas), por lo que la sustitución selectiva no es sencilla. Los derivados disponibles comercialmente, son de hecho mezclas de sustancias. El sistema se puede complicar si el radical insertado tiene su propia función reactiva. Debido a 36 A. Ricardo Hipólito N. la alta reactividad de los hidroxilos, varias reacciones se han estudiado: alquilación, hidroxialquilación, adición de sulfatos, acetilación, aminación, esterificación, eterificación etc. Las tres CDs nativas tienen 18 (α-CD), 21 (β-CD) y 24 (γ-CD) grupos hidroxilo que podrían ser sustituibles, el posible número de derivados es prácticamente ilimitado. La mayoría de estos derivados nunca encontrarán aplicaciones, especialmente por razones de costos de producción, síntesis larga y difícil, a excepción de la hidroxipropil-β-ciclodextrina (HP-β- CD) y la sulfobutiléter-β-ciclodextrina (SBE-β-CD) [Crini, 2014]. Estos dos últimos derivados de CDs, abrieron la posibilidad de nuevas aplicaciones, particularmente en la formulación de fármacos y en la producción de separadores quirales (electroforesis capilar). Actualmente, estos derivados sirven como excipientes solubilizadores en productos medicinales [Crini, 2014]. El incremento de solubilidad, puede mejorar la estabilidad, biodisponibilidad y propiedades farmacocinéticas, por lo tanto incrementar la eficiencia del fármaco [Crini, 2014]. El área de modificación química y enzimática de las CD es intensiva. Los derivados se pueden clasificar según su propósito: transportadores (solubilizadores, estabilizadores) para sustancias biológicamente activas; enzimas modelo; agentes separadores (para cromatografía o procesos por lotes); además de catálisis y aditivos (como detergentes, modificadores de la viscosidad, etc.) [Szejtli, 1998]. 2.11.4. Usos. Las CDs son moleculas altamente versátiles, que se prestan a ser modificadas y usadas tanto en forma disuelta como sólida. Esto significa, que las diferentes formas físicas o químicas que pueden tomar se pueden incluir en partículas (agregados, microesferas), polimeros solubles e insolubles, polimeros con CDs injertadas, geles e hidrogeles, materiales basado en CD (sílica modificada o resinas orgánicas, etc.) o membranas, superestructuras moleculares (polirotoxanos, etc.), o nanopartículas. Estas formas solubles e insolubles, son muy útiles cuando se consideran aplicaciones farmacéuticas o biomédicas [Crini, 2014]. Las diversas aplicaciones, se deben principalmente a las posibles consecuencias de la encapsulación de los huéspedes dentro de las CDs. Se pueden asumir 5 puntos: (i) la modificación de 37 A. Ricardo Hipólito N. propiedades fisicoquímicas de los huéspedes; aumento de solubilidad en sustancias poco solubles; eliminación de sabores, alteración de colores de ciertas sustancias que puede cambiar las propiedades espectrales, etc.; (ii) la modificación de la actividad química del huésped; (iii) estabilización de sustancias sensibles a la luz y el oxígeno; (iv) la absorción de sustancias volátiles, almacenamiento y manejo de ciertas sustancias tóxicas, ahorro de sustancias requeridas debido a evaporación reducida, etc.; y (v) la complejación, extracción y transporte de contaminantes [Crini, 2014]. Las tres principales CDs u oligosacáridos cíclicos menores o nativos, α-, β- y γ-CD, son las que se producen en mayor cantidad a nivel industrial [Szejtli, 1998; Crini, 2014). Tienen diversas aplicaciones en la industria farmacéutica (antiinflamatorios, antibióticos, antifúngicos y en vasodilatadores, para la producción del complejo de Piroxicam/β-CD, conocido como Brexin, el cual es comercializado en muchos paises en el mundo, es necesario de 40-50 toneladas/año de β-CD [Szejtli, 1998]), alimentaria; (se usan muchas toneladas de β-CD para la producción de la mantequilla baja en colesterol, donde la β-CD se usa para remover específicamente el colesterol de la grasa de la leche [Szejtli, 1998]), cosmética y artículos de tocador (como en reductores de irritación ocular de champús, para estabilizar los sabores y el color de la pasta dental, para proteger cremas contra fotodegradación, para atrapar olores, o para incrementar la duración de los perfumes, en estos días es el mercado más grande para las CDs) [Kurkov, 2013; Crini, 2014], catálisis, agricultura, textil (en fragancias de tejidos para su uso sólo en lavanderias donde la cantidad necesaria de β-CD es de cientos de toneladas [Szejtli, 1998], análisis químicos, biotecnología (antídoto o anestésico a base de γ-CD modificada, que forman complejos inactivos en el plasma y eliminados en la orina), química supramolecular, química computacional y se espera que se comiencen a utilizar en protección ambiental [Szejtli, 1998; Crini, 2014]. La investigación sobre las CD es muy activa en campos como la formulación de detergentes, pegamentos y adhesivos, el sector de los plásticos y en la industria de fibras y papel además de la arquitectura supramolecular, Química “Clic” [Crini, 2014]. El uso analítico de la β-CD, se da principalmente en cromatografía de gases (CG), cromatografía líquida de alta resolución (CLAR o HPLC por sus siglas en inglés), en electroforesis capilar de zona (ECZ), cromatografia de capa fina (CCF), para la mejora de la 38 A. Ricardo Hipólito N. absorción UV-vis, luminiscencia/fosforescencia por CDs y para incrementar la sensibilidad de los métodos analíticos relacionados [Szejtli, 1998]. 2.11.5. Farmacología. Un aspecto importante, que recae en la naturaleza de sacárido de las CD, es su toxicidad nula hacia humanos. Aunque no todas las CDs, o derivados de CDs, pueden ser administradas a humanos, parcialmente debido a aquellas CDs que tienen afinidad hacia los componentes lipídicos de las membranas celulares del organismo, que dependendiendo de las concentraciones, puede resultar en hemólisis [Szejtli, 1998]. A pesar de esto, las CD son atractivas por su versatilidad, siendo adecuadas para administración oral, parenteral, rectal, cutánea o sublingual [Crini, 2014]. La digestión de dextrinas lineales, así como del almidón, después de administración oral se da por una serie de hidrólisis enzimáticas produciendo glucosa. La enzima α-amilasa de la saliva hidroliza rápidamente a las dextrinas (productos de degradación del almidón), pero administradas oralmente, las dextrinas pasan inmediatamente al estómago donde la enzima se inactiva. Algunas hidrólisis ácidas específicas, no enzimáticas, de las dextrinas, se llevan a cabo en el estómago, pero la formación de complejos de lípidos con alimentos, puede retardar la hidrólisis. Después del estomago, las dextrinas siguen a un ambiente neutral en el intestino delgado, donde se libera fluido pancreático que contiene α-amilasa, continuando así, la hidrólisis de la dextrina. El sustrato de dextrina no digerido por la α-amilasa, sufre digestión bacterial en las secciones más bajas del sistema digestivo. Las dextrinas lineales y otros polímeros solubles en agua, se usan comúnmente en soluciones parenterales [Kurkov, 2013]. Todas las CD naturales son susceptibles a digestión bacterial. Después de administración oral, la γ-CD se digiere casi completamente en el tracto GI, mientras que la α-CD y β-CD, son predominantemente digeridas por las bacterias en el colon. La α-CD se digiere más lentamente que la β-CD [Kurkov, 2013]. Cualquier residuo o remanente de CD se elimina por otras rutas, como metabolismo del hígado ó excreción biliar vía tracto GI. La farmacocinética de las tres CDs son muy similares entre sí y entre las dextrinas lineales de pesos moleculares comparables. El intervalo de t1/2 de la fase de eliminación es de aproximadamente 1.4 a 2 h, y el VD (volumen de distribución) es de aproximadamente 0.2 39 A. Ricardo Hipólito N. L/Kg para las tres CDs nativas. Los estudios farmacocinéticos muestran que alrededor del 90% de CD administrada parenteralmente, se eliminan del cuerpo dentro de 6 h, el 99.9% dentro de las 24 h por via orina por filtración glomerular. Por lo tanto, no se verá CD acumulada en individuos con función normal del riñón, inclusive a altas dosis. En los pacientes con insuficiencia renal severa, se observará acumulación de CD [Kurkov, 2013]. Las CDs y derivados de CDs que se encuentran en más de 35 productos farmacéuticos comercializados, son en general oligosacáridos hidrofílicos con peso molecular entre 973 y 2163 Da. con muy bajos coeficientes de partición octanol-agua (log KO/W aproximadamente de ‒8 y ‒12) y numerosos puentes de hidrógeno donadores y aceptores, todas las anteriores, son características de moléculas que no son fácilmente permeables en membranas por la vía de difusión pasiva [Kurkov, 2013]. No hay reportes, hasta 2013, de permeación mediada por transportador de CD a través de membranas biológicas, y en general, la biodisponibilidad de la CD es más bien baja, del orden del 4%. Solo algunas CD metiladas aleatoriamente, tienen gran biodisponibilidad oral (hasta 12%) en ratas. La administración parenteral de la α-CD, β-CD ó β-CDs metiladas pueden resultar en toxicidad renal [Kurkov, 2013]. En los Estados Unidos, la α-, β- y γ-CD han sido Reconocidas Generalmente Como Seguras (Generally Recognized As Safe, GRAS por su siglas en inglés) por la Administración de Fármacos y Alimentos (Food and Drug Administration, FDA por su siglas en inglés) [Kurkov, 2013]. En resumen, las CD son una herramienta importante en formulación farmacéutica, lo que se ha observado en los más de 40 productos que se encuentran en el mercado. La principales ventajas que tienen las CDs, frente a fármacos poco solubles en agua, es el aumento de solubilidad aparente, velocidad de disolución y estabilidad química. Presentando un metabolismo y farmacocinética muy parecido a sus contrapartes lineales [Kurkov, 2013]. 40 A. Ricardo Hipólito N. 3. Hipótesis y Objetivos. 41 A. Ricardo Hipólito N. 3.1. Hipótesis. Será posible entender el perfil termodinámico de la formación de los complejos de inclusión entre indometacina, y sus complejos metálicos (de Cu(II) y Zn(II)), con ciclodextrinas. A través, de su estudio por diversas técnicas, para la identificación de las especies de los complejos metálicos existentes en solución acuosa que permita, en un futuro, entender su química en agua, entender su rol biológico, así como desarrollar formulaciones más efectivas y menos tóxicas, de las que existen actualmente. 3.2. Objetivo General. Estudiar la indometacina (IMC), y sus complejos de Cu(II) y Zn(II) (MIMC), para su inclusión en ciclodextrinas; con el fin de facilitar su estudio en medio acuoso, obtener los perfiles termodinámicos de las inclusiones, incrementar la solubilidad de los complejos insolubles y la identificación de las especies solubles resultantes, en solución acuosa. Objetivos particulares. - Sintetizar y caracterizar la sal de IMC, así como los complejos CuIMC2(H2O)2 y ZnIMC2(H2O)2 - Determinar la estabilidad de IMC a pH 5 y 7. - Calcular el valor de pKa de la IMC. - Determinar las propiedades termodinámicas de inclusión por espectrofotometría ultravioleta-visible (UV-Vis) y calorimetría de titulación isotérmica (ITC) de los complejos IMC con CDs, siendo CD: α-, β-, γ-, HP-β- y HP-γ-CD a pH de 5 y 7 a 25°C. - Determinar las propiedades termodinámicas por calorimetría de titulación isotérmica de los complejos de inclusión IMC con CD, siendo CD: α-, β-, γ-, HP-β- y HP-γ-CD a diferente temperatura (20, 25, 30 y 35 °C) a pH de 7. - Determinar la capacidad calorífica (DCp) de la formación de los complejos IMC con CDs. - Entender por medio del análisis entálpico-entrópico las interacciones de la formación de los complejos IMC con CDs. 42 A. Ricardo Hipólito N. - Aumentar la solubilidad de los complejos Cu(IMC)2(H2O)2 y Zn(IMC)2(H2O)2 con ciclodextrinas en agua. - Determinar las propiedades termodinámicas, por calorimetría de titulación isotérmica (ITC), de los complejos Cu(IMC)2(H2O)2 y Zn(IMC)2(H2O)2 con ciclodextrinas en agua. - Establecer el modelo de inclusión Cu(IMC)2(H2O)2 y Zn(IMC)2(H2O)2 con ciclodextrinas. - Caracterizar los complejos de inclusión, presentes en solución, de los complejos CuIMC2(H2O)2 con ciclodextrinas en agua. 43 A. Ricardo Hipólito N. 4. Equipos, Reactivos y Metodologías. 44 A. Ricardo Hipólito N. 4.1. Materiales y Equipos. Parrilla de agitación StableTemp. Cole-Parmer. Balanza Analítica. Pioneer Ohaus ±0.0002 g. Electrodo de pH. Sension 5014T. HACH. Material de vidrio: vasos de precipitados desde 5-250 mL, matraces aforados de 5-250 mL Pyrex, embudos. Micropipetas Finpippete de 1-10µL, 10-100µL, 100-1000µL y de 500-5000µL, con errores de volumenes no mayores al 3.5%. Espectrofotometro de UV-Vis. Lambda 35. Perkin Elmer. ±0.003 en valor de absorbancia. Calorímetro para Titulación Isotérmica. VP-ITC. General Electric. < 0.005 µcal/s Espectrofotómetro de Infrarojo (IR). Frontier FT-IR. Perkin Elmer. Espectrómetro de Resonancia Paramagnética Nuclear (EPR, por sus siglas en inglés) JES- TE300, Jeol. Difractómetro de rayos-X de polvos D5000, Siemens. Espectrómetro de Resonancia Magnética Nuclear (RMN), AVANCE DMX500, Bruker. 4.2. Reactivos y Soluciones. Hidróxido de Sodio (perlas) ≥ 98.6% PM 40.4 g/mol. Mallinckrodt AR. Fosfato de sodio dibásico ≥ 99.7% PM 141.96 g/mol. Fermont. ZnCl2 (granular USP) 99% J.T. Baker. CuCl2·2H2O 99% J.T. Baker. Alcohol etílico absoluto 99.1% J.T. Baker. Metanol anhidro 99.99% Merck. Indometacina (HIMC) ≥ 0.99 (TLC) PM 357.79 g/mol. Sigma-Aldrich. α-CD ≥ 98% (HPLC) PM 972.86. Fluka. β-CD ≥ 97% PM 1134.98 g/mol. Sigma-Aldrich. γ-CD PM 1297.1 g/mol. Sigma-Aldrich. 2-HP-β-CD MS 0.6 PM 1541.54 g/mol. Sigma-Aldrich. 45 A. Ricardo Hipólito N. 2-HP- γ-CD MS 0.6 PM 1761.8 g/mol. Sigma-Aldrich. Agua Desionizada 18 MΩ. Soluciones. NaOH 0.1 M. Se pesan 0.04 g de NaOH, se disuelve con agua desionizada y se lleva a un aforo a 10 mL con agua desionizada. Soluciones amortiguadoras de fosfatos 0.1 M. Se pesan 3.56 g de fosfato de sodio dibásico, se disuelve en agua desionizada, se ajusta el pH (4.5, 5, 7 y 11) con HCl concentrado (debido a que no se utilizó su par congujado ácido fosfórico) o hidróxido de sodio, según sea el caso y se lleva a un aforo de 250 mL con agua desionizada. Solución de IMC 5.5 × 10-4 M. Se pesan 0.010 g de HIMC en un vaso de precipitados y se adicionan 600 µL de solución de NaOH 0.1 M (1.2× 10-3 M en 50 mL, cantidad suficiente de NaOH para lograr desprotonar de inmediato a la HIMC por una relación estequiométrica mayor que la HIMC, y se solubilice), se agita hasta tener una solución homogénea. Se adiciona, lo más rápido posible, solución amortiguadora de fosfatos al pH deseado, hasta el aforo de 50 mL. Solución de IMC 5.5 × 10-5 M. De la solución de IMC 5.5 × 10-4 M se toman 1 mL y se aforan con buffer deseado a 10 mL. Esta solución fue utilizada para los estudios de estabilidad y los estudios de interacción IMC con CDs por UV-Vis. Una solución de 5.5 × 10-5 M de IMC, se eligió por tener absorbancias cercanas a 1 y los cambios de las absorbancias se observen con claridad. Solución de NaIMC 5.5 × 10-4 M. Se pesan 0.012 g de NaIMC en un vaso de precipitados, se disuelve y se lleva al aforo de 50 mL con solución amortiguadora de fosfatos 0.1M a pH 7. Solución de CDs 1.7× 10-2 M. Para el estudio de la interacción IMC con CDs por UV-Vis. Se pesa la cantidad necesaria de la CD deseada, se adicionan 30 µL de solución de NaOH 0.1 M y se disuelve con solución amortiguadora de fosfatos al pH deseado hasta el aforo de 25 mL. La adición de NaOH, es para tener lo más parecido el ambiente de la solución de CD al de la solución de IMC con la que se estudiará la interacción IMC con CDs por UV-Vis. Para el estudio de la interacción IMC con CDs por calorimetría de titulación isotérmica (ITC). Se pesa la cantidad necesaria de CD deseada, se adicionan 300 µL de solución de NaOH 0.1 46 A. Ricardo Hipólito N. M y se disuelve con solución amortiguadora de fosfatos a pH 7 hasta el aforo de 25 mL. La adición de NaOH, es para tener una solución de CD parecida a la solución de IMC con la que se estudiará la interacción IMC con CDs por ITC. Para la determinación de DCp y equilibrio entálpico-entrópico. Se pesa la cantidad necesaria de la CD deseada (no se adiciona NaOH 0.1 M) y se disuelve con solución amortiguadora de fosfatos a pH 7 hasta el aforo de 25 mL. 4.3. Metodologías. 4.3.1. Síntesis y caracterización de reactivos utilizados. Síntesis y caracterización de NaIMC. Para la síntesis de la sal de IMC trihidratada (NaIMC·3H2O ó NaIMC) se realiza lo siguiente. Se pesa la cantidad de 3.04 g de HIMC (0.008 moles), se disuelve en 50 ml de metanol calentando hasta 50°C. Una vez a esta temperatura, se adicionan 8.6 mL de H2O desionizada con 0.7002 g de NaHCO3 (0.008 moles) disueltos. Se deja en reflujo por 2h. El metanol es evaporado a presión reducida, y un precipitado amarillo pardoso en forma de hojuelas comienza a aparecer. El precipitado es lavado con dietil éter. El precipitado obtenido, fue analizado por potenciometria para cuantificar el contenido de NaIMC, usando ácido clorhídrico 0.1 M estandarizado de acuerdo a Kulkarni, 2011. El precipitado obtenido es caracterizado por Infrarojo (IR, obteniendo un espectro en un intervalo de 4000-400cm-1), Rayos X de polvos (XRPD, los difractogramas fueron obtenidos a 35 kV y 20 mA, con longitud de onda de 1.544 Å las muestras fueron escaneadas desde 4° hasta 50° para 2θ a temperatura ambiente)) y Resonancia Magnética Nuclear (RMN) en agua deuterada con TSP como referencia. Síntesis y caracterización de complejos MIMC. Los complejos en sólido CuIMC2(H2O)2 y ZnIMC2(H2O)2, fueron sintetizados de acuerdo a Weder, 1999. Con la diferencia del uso de NaIMC, evitando el uso de NaOH para disolver a la HIMC, además de que sólo se utilizó agua para sintetizar estos complejos. CuIMC2(H2O)2: Se pesa la cantidad correspondiente a 0.04 mol de NaIMC y se disuelve en agua y se calienta hasta 50°C. Una vez a esta temperatura, se adiciona un volumen de CuCl2 (0.02 mol) disuelto en agua. Al momento de adicionar, un precipitado verde oscuro comienza a aparecer. La mezcla se filtra y el polvo verde se lava exhaustivamente con agua y etanol. ZnIMC2(H2O)2: Se pesa la cantidad correspondiente a 0.04 mol de NaIMC y se disuelve en agua y se calienta hasta 50°C. Una vez a esta temperatura se adiciona un volumen de ZnCl2 (0.02 mol) disuelto en agua. Al momento de adicionar, un precipitado blanco comienza a aparecer. La mezcla se filtra y el polvo blanco se lava exhaustivamente con agua y etanol. 47 A. Ricardo Hipólito N. Los precipitados obtenidos se caracterizaron por IR (obteniendo un espectro en un intervalo de 4000-400cm-1), XRPD (los difractogramas de XRDP fueron obtenidos a 35 kV y 20 mA, con longitud de onda de 1.544 Å las muestras fueron escaneadas desde 4° hasta 50° para 2θ a temperatura ambiente) y Resonancia Paramagnética Nuclear (EPR, por sus siglas en inglés. Las medidas de EPR fueron realizadas en un tubo de cuarzo a temperatura de 25 °C con un espectrómetro JEOL JES-TE300 operando en banda X con una frecuencia de 100KHz de modulación de campo (cerca de 9.4 GHz), con una cavidad cilíndrica (modo TE011). La medición externa del campo magnético externo se realizó con un gaussmetro JEOL ES-FC5). 4.3.2. Estudios de estabilidad de IMC a pH 5 y 7. El estudio contemplaba estudiar la estabilidad a pH ácido, neutro y básico, sin embargo, a pH por debajo de 4.5, a la concentración elegida, la IMC precipita. Por lo que se determina su estabilidad a lo más ácido posible en solución. Por lo anterior, se sigue la siguiente metodología Se preparan 10 mL de una solución de 5.5 × 10-5 M de IMC a pH 4.5, se toman 3 muestras de máximo 3 mL, para realizar el estudio por triplicado. Se realizan mediciones a las 0, 2, 4, 6, 24 y 168 h por UV-Vis (ANEXO A1). Se preparan 10 mL de una solución de 5.5 × 10-5 M de IMC a pH 7, se toman 3 muestras de máximo 3 mL, para realizar el estudio por triplicado. Se realizan mediciones a las 0, 2, 4, 6, 24 y 168 h por UV-Vis. Se preparan 10mL de una solución de 5.5 × 10-5 M de IMC a pH 11, se toman 3 muestras de máximo 3 mL, para realizar el estudio por triplicado. Se realizan mediciones a las 0, 2, 4, 6, 24 y 168 h por UV-Vis. Se grafican los máximos del espectro de IMC en función del tiempo. 4.3.3. Determinación del pKa de la IMC por UV-Vis. Se pesan 0.01 g de HIMC en un vaso de precipitados y se adicionan 600 µL de solución de NaOH 0.1 M, (cantidad suficienta para disolver de inmediato a la HIMC), se agita hasta tener una solución homogénea, se adiciona inmediatamente agua desionizada y se afora a 50 mL. De esta solución se toma 1 mL y se lleva a un aforo de 10 mL con agua desionizada para tener una concentración aproximada de IMC 5.5 × 10-5 M, conservando un pH cercano a 10. A esta misma alícuota, con una micropipeta, se comienzan a adicionar volumenes de 50 µL de HCl de concentración 1 × 10-3 M, midiendo en cada adición el pH y el espectro de UV- Vis, correspondiente. Los espectros obtenidos se analizan por SQUAD [Leggett, 1985] (ANEXO A5) para refinar el valor de pKa. 48 A. Ricardo Hipólito N. El valor de pKa obtenido se utiliza para alimentar MEDUSA (ANEXO A5) y obtener el diagrama de distribución de especies. 4.3.4. Determinación de los parámetros termodinámicos de la interacción IMC con CDs por ultravioleta visible (UV-Vis) y calorimetría de titulación isotérmica (ITC). Metodologías para el estudio de la interacción IMC con CDs. Gaussian 16. Se utilizó gaussian 16 para calcular las medidas de enlace y separación de los átomos de la IMC. Determinación de las constantes de inclusión IMC con CDs por UV-Vis a pH 5 y 7. Se toma una alícuota de 5 mL de solución de 5.5 × 10-5 M de IMC (IMC disuelta con NaOH 0.1 M en buffer fosfatos 0.1 M pH 5 ó 7), se toma el espectro inicial y posteriormente, se van adicionando volúmenes de solución de 1.7 × 10-2 M de CD (con NaOH 0.1 M en buffer de fosfatos 0.1 M pH 5 ó 7), para llevar a cabo el método de relaciones molares (CD/IMC) (ANEXO A6). Las relaciones molares se llevan desde la 0 hasta la 200, aproximadamente (debido a que se está estudiando un equilibrio con un logb ó logK1:1 menor de 3, ANEXO, A6. y A7). En cada adición de CD, se toma el espectro UV-Vis. Los espectros obtenidos se analizaron (usando los espectros de las relación molar 0-30) con el programa SQUAD [Leggett, 1985] ajustando a un modelo de estequiometría 1:1. Esta metodología se realiza para cada CD . Determinación de las propiedades termodinámicas de la inclusión IMC con CDs por Calorimetría de Titulación Isotérmica (ITC) a pH 7. Para el funcionamiento de la Calorimetría de Titulación Isotérmica (ITC) se recomienda ver el ANEXO A3. Experimento de Titulación. De la solución de IMC 5.5 × 10-4 M (IMC disuelta con NaOH 0.1 M en buffer fosfatos 0.1 M pH 7) se vierten 1.4 mL en la celda de reacción. La solución de CD 1.7 × 10-2 M (con NaOH 0.1 M en buffer de fosfatos 0.1 M pH 7) se coloca en la jeringa de aproximadamente 280 µL. El experimento de titulación se realiza programando 70 adiciones de la solución de CD a 25 °C. Se hacen adiciones de 4 µL por 8 s con un tiempo de equilibrio entre adición de 450 s, con velocidad de agitación de 305 rpm. A lo largo del experimento, el equipo de ITC mide la potencia necesaria en todo momento, para mantener la celda de reacción a temperatura constante. La celda de referencia se llena sólo con agua desionizada. Experimento de Dilución. El experimento de dilución es idéntico al experimento de titulación, pero sin tener uno de los analitos a interaccionar en la celda de reacción. Por lo 49 A. Ricardo Hipólito N. tanto, para tener la misma solución que en el experimento de titulación sin IMC, se prepara la siguiente solución. Se toman 30 µL de la solución de NaOH 0.1 M y se llevan a un aforo de 25 mL con el buffer de fosfatos 0.1 M a pH 7. De esta solución se vierten 1.4 mL en la celda de reacción. La solución de CD 1.7 × 10-2 M (con NaOH 0.1 M en el mismo buffer de fosfatos 0.1 M pH 7 que la solución de la celda de reacción) se coloca en la jeringa de aproximadamente 280 µL. El experimento de dilución se realiza programando 70 adiciones de la solución de CD a 25 °C. Se hacen adiciones de 4 µL por 8 s, con un tiempo de equilibrio entre adición de 450 s, con velocidad de agitación de 305 rpm. A lo largo del experimento, el equipo de ITC mide la potencia necesaria en todo momento, para mantener la celda de reacción a temperatura constante. La celda de referencia se llena sólo con agua desionizada. La potencia obtenida en función del tiempo, se integra, para obtener un gráfico del calor por inyección en función de la relación molar CD/IMC. La respuesta de dilución debe restarse de la respuesta de titulación, para descartar el efecto provocado por la dilución de la CD en la solución de IMC. Manteniendo sólo el efecto provocado por la interacción IMCCD. La respuesta de titulación (ahora sin el efecto de dilución) se ajusta a un modelo 1:1 para la determinación de los parámetros termodinámicos, esto se realiza con la ayuda del programa Affinimeter (Ver ANEXO A5). Los experimentos de titulación y dilución se repiten cambiando la solución de CD, por la CD respectiva. 4.3.5. Determinación de las propiedades termodinámicas de la inclusión IMC con CDs por Calorimetría de Titulación Isotérmica (ITC) a pH 7, a diferente temperatura. Determinación de ΔCp. Estudio de la compensación entálpica-entrópica. Metodología por ITC. Experimento de Titulación. De la solución de NaIMC 5.5 × 10-4 M, en buffer de fosfatos 0.1 M pH 7, se vierten 1.4 mL en la celda de reacción. La solución de CD 1.7 × 10-2 M en buffer pH 7 se coloca en la jeringa de aproximadamente 280 µL. El experimento de titulación se realiza programando 35 adiciones de la solución de CD a la temperatura indicada. Se hacen adiciones de 8 µL por 16 s con un tiempo de equilibrio entre adición de 360 s, con velocidad de agitación de 351 rpm. A lo largo del experimento, el equipo de ITC mide la potencia necesaria en todo momento, para mantener la celda de reacción a temperatura constante. La celda de referencia se llena sólo de agua desionizada. Experimento de Dilución. El experimento de dilución es idéntico al experimento de titulación, pero sin tener uno de los analitos a interaccionar en la celda de reacción. Por lo que, de una solución de buffer de fosfatos 0.1 M a pH 7 se vierten 1.4 mL en la celda de reacción. La solución de CD 1.7 × 10-2 M se coloca en la jeringa de aproximadamente 280 µL. El experimento de dilución se realiza programando 35 adiciones de la solución de CD a la temperatura indicada. Se hacen adiciones de 8 µL por 16 s, con un tiempo de equilibrio 50 A. Ricardo Hipólito N. entre adición de 360 s, con velocidad de agitación de 351 rpm. A lo largo del experimento, el equipo de ITC mide la potencia necesaria en todo momento para mantener las celdas a temperatura constante. La celda de referencia se llena sólo de agua desionizada. La potencia obtenida en función del tiempo, se integra, para obtener un gráfico del calor por inyección en función de la relación molar CD/IMC. La respuesta de dilución debe restarse de la respuesta de titulación, para descartar el efecto provocado por la dilución de la CD en la solución de IMC. Manteniendo sólo el efecto provocado por la interacción IMCCD. La respuesta de titulación (ahora sin el efecto de dilución) se ajusta a un modelo 1:1 para la determinación de los parámetros termodinámicos, esto se realiza con la ayuda del programa Affinimeter (Ver ANEXO A5). Los experimentos de titulación y dilución se repiten a 20, 25, 30 y 35 °C. Esta metodología se realiza para cada CD. Una vez que se obtienen los valores termodinámicos se estudia la relación de DH con la temperatura y la relación de DH con -TDS. 4.3.6. Estudios de la interacción de los complejos M(IMC)2(H2O)2 en presencia de CDs. Diagramas de solubilidad de fase de los complejos M(IMC)2 en presencia de CDs. Se prepara un conjunto de soluciones acuosas, que contienen una misma cantidad insoluble de muestra de complejo MIMC2(H2O)2 (M: Cu(II) ó Zn(II)), a pH = 6-7, en los cuales se les adiciona diferente cantidad de CD (0-0.08 M). Estas soluciones se dejan en agitación por 3 días, para lograr que el equilibrio de inclusión se estabilice. Después de éste tiempo, las muestras se filtran, y al filtrado obtenido se le cuantifica la cantidad de Cu(II) por una metodología, seguida por espectrofotometría UV-Vis, de EDTA en buffer NH3/NH4 + 1.0 M (pH = 8.5, estas condiciones se eligen para aumentar la cuantitatividad de la reacción entre Cu(II) y EDTA, y todo el Cu(II) presente en solución se forme como complejo, (Yessica, 2011)) y el contenido de Zn(II) por una metodología, seguida por espectrofotometría UV- Vis, de PAR en buffer de fosfatos 0.1 M (pH = 7) que se ha demostrado ser efectiva para cuantificar al Zn (II) (Aguirre, 2016), respectivamente. El contenido de ion metálico cuantificado e incluido en la CD, se relaciona con la cantidad de M(IMC)2 soluble. Los diagramas de solubilidad de fase se construyen relacionando la cantidad de M(IMC)2 que se logró disolver en función de la CD adicionada. Estudios de EPR de los complejos solubles de Cu(IMC)2 con CDs. Un conjunto de viales, que contienen muestra de Cu(IMC)2(H2O)2 insoluble en agua (pH=6- 7) con CD (‒log[β-CD] = 1.77, para las demás CD ‒log[CD] = 1.10), se mantuvieron en agitación por 3 días, para lograr que el equilibrio de inclusión se estabilice. Después de este 51 A. Ricardo Hipólito N. tiempo, las muestras fueron filtradas y el filtrado obtenido se utilizó para realizar mediciones por la técnica de EPR. El espectrofotómetro EPR fue operado en la banda X, a una modulación de frecuencia de 100 kHz, con una cavidad cilíndrica (modo TE011). Las muestras fueron colocadas en una celda de cuarzo (cuarzo sintético, Wilmad Glass Company) con un paso de 0.2 mm. La calibración externa del campo magnético se realizó usando un gaussmetro JEOL ES-FC5. Las mediciones fueron realizadas a una temperatura de 77 K. Estudio por calorimetría de titulación Isotérmica (ITC) de la interacción M(IMC)2 con CDs. Una muestra sobresaturada en agua de complejo de Cu(IMC)2(H2O)2 ó Zn(IMC)2(H2O)2 insoluble, se deja en agitación por 3 días. Después de este tiempo, la muestra se filtra, un parte se utiliza para los experimentos de ITC y otra parte se usó para cuantificar la cantidad de Cu(II) por una metodología, seguida por espectrofotometría UV-Vis, de EDTA en buffer NH3/NH4 + 1.0 M (pH = 8.5, estas condiciones se eligen para aumentar la cuantitatividad de la reacción entre Cu(II) y EDTA, y todo el Cu(II) presente en solución se forme como complejo, (Yessica, 2011)) y el contenido de Zn(II) por una metodología, seguida por espectrofotometría UV-Vis, de PAR en buffer de fosfatos 0.1 M (pH = 7) que se ha demostrado ser efectiva para cuantificar al Zn (II) (Aguirre, 2016), respectivamente. La cantidad de metal cuantificado se relaciona con la cantidad de complejo en solución M(IMC)2. Experimento de Titulación. De la parte de la solución acuosa filtrada, con M(IMC)2 soluble, ya sea Cu(IMC)2 (concentración promedio 2.28 ´ 10-5 M) ó Zn(IMC)2 (concentración promedio 4.25 ´ 10-5 M), se vierten 1.4 mL en la celda de reacción. Se coloca una solución de CD 1.7 × 10-2 M disuelta en agua desionizada en la jeringa de aproximadamente 280 µL. El experimento de titulación se realiza programando 28 adiciones de la solución de CD a 25 °C. Se hacen adiciones de 10 µL por 20 s con un tiempo de equilibrio entre adición de 360 s, con velocidad de agitación de 351 rpm. A lo largo del experimento, el equipo de ITC mide la potencia necesaria en todo momento para mantener la celda de reacción a temperatura constante (ANEXO A3). La celda de referencia se llena sólo de agua desionizada. Experimento de Dilución. El experimento de dilución es idéntico al experimento de titulación, pero sin tener uno de los analitos a reaccionar en la celda de reacción. Por lo que, se vierten 1.4 mL de agua desionizada en la celda de reacción. La solución de CD 1.7 × 10-2 M se coloca en la jeringa de aproximadamente 280 µL. El experimento de dilución se realiza programando 28 adiciones de la solución de CD a 25 °C. Se hacen adiciones de 10 µL por 20 s, con un tiempo de equilibrio entre adición de 360 s, con velocidad de agitación de 351 rpm. A lo largo del experimento, el equipo de ITC mide la potencia necesaria en todo 52 A. Ricardo Hipólito N. momento, para mantener las celdas a temperatura constante. La celda de referencia se llena con agua desionizada. Los datos experimentales fueron ajustados a un modelo de sitios sucesivos independientes e iguales, usando el software Affinimeter [https://www.affinimeter.com/site/]. Con las constantes obtenidas del modelo propuesto se construyó un diagrama de distribución de especies usando MEDUSA [Puigdomenech, 2004]. 53 A. Ricardo Hipólito N. 5. Resultados y Discusión. 54 A. Ricardo Hipólito N. 5.1. Síntesis y caracterización de NaIMC. Después de seguir la metodología descrita para la obtención de la sal de indometacina trihidratada NaIMC·3H2O (NaIMC) [Kulkarni, 2011] y obtener un precipitado en hojuelas amarillo pardoso, se prosiguió con su identificación por diferentes técnicas; infrarojo (IR) (ANEXO A1), rayos X de polvos (XRPD, por sus siglas en inglés), resonancia magnética nuclear (RMN) y por último titulación por potenciometría. En la Fig. 5.1 se muestran los espectros de IR de la a) HIMC y b) NaIMC. Como se puede observar, la HIMC (reactivo de partida) muestra señales características a 1717 y 1692 cm-1, siendo la primera absorción asignada a la vibración del dímero del ácido carboxílico, característico de la HIMC en su isoforma g. Fig. 5.1. Espectros de IR de la a)HIMC y de b) NaIMC. La absorción a 1692 cm-1 se asigna a la banda de vibración del carbonilo de la amida (namida). Las bandas que se observan en el gráfico de la NaIMC son: 1557 cm-1, la cual se asigna a la señal del estiramiento asimétrico del carboxilato (nasim). Debido a un nuevo ambiente químico, la banda de absorción de la amida se desplaza hacia 1674 cm-1. Otras bandas características se encuentran a 3647 y 3538 cm-1, las cuales son típicas para un hidrato [Tong, 2001; Chen, X., 2005; Kulkarni, 2011]. Como se puede observar, los gráficos de IR cambiaron drásticamente desde la isoforma de la HIMC hacia señales caracteristicas de un hidrato. 4000 3500 3000 1600 1400 1200 b Wavenumber (cm -1 ) a %T 1717 1692 1557 1674 3647 3538 Número de onda (c -1) 55 A. Ricardo Hipólito N. La Fig. 5.2 muestra el XRPD de NaIMC. Este difractograma fue comparado con los espectros de NaIMC·3H2O de los trabajos realizados por Chen, 2005 y Dubbini, 2014, los cuales tienen mucha similitud con el obtenido en esta contribución. Fig.5.2. XRPD de NaIMC. Adicionalmente un análisis de 1H RMN se realizó para confirmar la estructura de la NaIMC, éste espectro se muestra en la Fig. 5.3. Fig. 5.3. Espectro de RMN de la NaIMC, en D2O, usando TSP. Como puede observarse, en el espectro de 1H RMN de la Fig. 5.3, se caracterizan los desplazamientos químicos de los protones de la molécula de la NaIMC. Los desplazamientos obtenidos se asignan para cada protón de la molécula, por lo cual el protón numerado con el no. 1 presenta una señal singulete con desplazamiento de 2.14 ppm, que integra para 3H; el no. 2, presenta un singulete a 3.42 ppm que integra para 2H; el no. 3 presenta un singulete en 3.59 ppm que integra para 3H), el no. 4 presenta un doblete en 6.16 ppm con J = 9.0, 2.6 Hz, 5 10 15 20 25 30 2θ 1 2 3 4 5 6 D2O TSP 1H INDOMETHACIN Solvent: D2O+TSP Temperature: 298 K AVANCE-III 500 78 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 ppm 1 2 3 4 5 6 7 7 8 8 56 A. Ricardo Hipólito N. que integra para 1H; para el no. 6, se tiene un doblete a 6.34 ppm con J = 9.0 que integra para 1H; el no. 5 presenta un singulete a 6.88 ppm con J = 2.5 Hz, que integra para 1H; el no.7 presenta un multiplete entre 7.09–7.03 ppm que integra para 2H; y finalmente el no. 8 que presenta un multiplete entre 7.29–7.23 ppm integra para 2H. Para finalizar la caracterización, se realizó una titulación de una solución de NaIMC por potenciometría, usando HCl 0.09M (estandarizado). Al pesar 0.0405g de precipitado de NaIMC y disolverlo en 10 mL agua, y al realizar la titulación por triplicado (Fig. 5.4), se obtiene que el volumen de punto de equivalencia se alcanza a los 0.99 mL de HCl y neutralizando a la NaIMC después de éste punto. Lo anterior indicaría que la cantidad de NaIMC en molaridad en los 10 mL de solución es de 0.0091 M, y relacionando la concentración con la cantidad pesada inicialmente, se puede concluir que el peso molecular de la sal de IMC trihidratada es de 433.83±0.63 g/mol con una pureza del 97.4±0.13%. Fig. 5.4. Valoración de la sal de indometacina. En conclusión, fue posible confirmar la identidad de la sal sódica trihidratada de IMC, con la evidencia espectroscópica, difractográfica y potenciométrica. -50 0 50 100 150 200 250 300 350 0 0.5 1 1.5 2 E ( m V ) Volumen (mL) Valoración de 10 ml de solución de NaIMC con una solución 0.09 M HCl 1aRep 2aRep 3aRep 0.87 1.75 2.63 3.50 4.38 hj 5.25 6.13 7 7.88 p H 1aRep 2aRep 3aRep 57 A. Ricardo Hipólito N. 5.2. Síntesis y caracterización de los complejos MIMC. Después de sintetizar los complejos CuIMC2(H2O)2 y ZnIMC2(H2O)2 de acuerdo a Weder de 1999, se prosiguió a identificarlos por IR, Resonancia Paramagnética Electrónica (EPR, por sus siglas en inglés) en el caso del complejo con Cu(II) y XRPD en el caso de Zn(II). La Fig. 5.5 muestra los espectros obtenidos por IR, en dónde se muestra a los complejos de a) CuIMC2(H2O)2 y b) ZnIMC2(H2O)2; los cuales presentan señales caracteristicas de la vibración del carboxilo de la amida en namida = 1673 y 1679 cm-1, respectivamente. El espectro de c) NaIMC de la Fig. 5.5, presenta namida = 1674 cm-1 por lo que al comparar con los obtenidos con CuIMC2(H2O)2 y ZnIMC2(H2O)2 se puede inferir que el nitrógeno de la amida no participa en la esfera de coordinación del ion metálico. En contraste, las vibraciones asimétricas que corresponden al carboxilo de la IMC van desde νasym = 1557 cm-1 en NaIMC a νasym = 1589 cm-1 y 1567 cm-1 para CuIMC2(H2O)2 y b) ZnIMC2(H2O)2, respectivamente; haciendo evidente la complejación de M(II) por IMC [Dillon, 2004, Singla, 1995]. Fig. 5.5. Espectros IR de a) CuIMC2(H2O)2 b) ZnIMC2(H2O)2 y c)NaIMC,. Se señalan las vibraciones respectivas de los carboxilatos presentes.namide es la vibración de la amida. nasym es la vibración asimétrica del carboxilo unido al metal y nsym es la vibración simétrica del carboxilo unido al metal. Por otra parte, el estiramiento simétrico del carboxilo νsym a 1400 y 1440 cm-1 ha sido usado para diferenciar especies mononucleares de dinucleares de complejos metal-carboxilato [Zhou, 2000, 2003; Dillon, 2004]. La ausencia de la banda a 1400 cm-1 está asociada con las especies puente dinucleares [Zhou, 2000; Morgan, 2001]. En el caso de complejos sólidos c b%T a 1700 1600 1500 1400 1300 1200 Wavenumber (cm -1 ) !asym!amide !sym !asym !amide !sym !amide Número de Onda (cm-1) 58 A. Ricardo Hipólito N. sintetizados en este trabajo, νsym se observa en 1420 y 1437 cm-1 para CuIMC2(H2O)2 y a 1400 y 1435 cm-1 para ZnIMC2(H2O)2. La separación (D) entre νasym y νsym es también indicativo de puente simétrico dinuclear cuando el valor de D > 200 cm-1, mientras que un valor D < 200 cm-1 es típico para especies monómerícas quelatadas [Zhou, 2000; Jabali, 2016; Jenniefer, 2013; Deacon, 1980]. En este trabajo D es 169 cm-1 y 167 cm-1 para CuIMC2(H2O)2 y ZnIMC2(H2O)2, respectivamente, sugiriendo que la geometría es de un quelato monomérico cuando los complejos se encuentran en sólido. Para llevar a cabo un análisis comparativo, los espectros en sólido de EPR de a) dinuclear Cu2(AcO)4 y CuIMC2(H2O)2 a 25ºC, se muestran en la Fig. 5.6. El espectro de Cu2(AcO)4 (Fig. 5.6a) tiene respuestas típicas para dos átomos de Cu(II), derivadas de un estado triplete (S = 1) [Dillon, 2004]. El espectro de CuIMC2(H2O)2 (Fig. 5.6b) tiene una respuesta para una especie mononuclear, con un momento magnético S = ½, a 330 mT con un valor de g = 2.0786 (ANEXO A4); no se observa acoplamiento debido a su forma sólida. Debido a señales caracteristicas de una especie mononuclear por EPR y a la evidencia por IR, el complejo sólido CuIMC2(H2O)2 tiene la estequiometría esperada. Fig. 5.6. Espectro de EPR de a) Cu2(AcO)4 y b) Cu2IMC4(H2O)2. Además, se observa una señal débil a 470 mT, derivada de un estado triplete (S = 1), el cual podría surgir de impurezas de la especie [Cu2IMC4(H2O)2][Weder, 1999]. Estos resultados señalan que la especie mononuclear [CuIMC2(H2O)2] predomina en estado sólido. Parece ser que la síntesis de los complejos de CuIMC2(H2O)2 al usar NaIMC ayuda al predominio de especies mononucleares, además del uso de agua como solvente. El espectro de XRPD para zinc (Fig. 5.7a), presenta similitudes con el difractograma reportado por Zhou, 2003, especificamente para la especie mononuclear [Zn(IMC)2(MeOH)2] 0 300 600 Magnetic Field (mT) a b C mpo Magnético ( T) 59 A. Ricardo Hipólito N. (Fig. 5.7b), sugiriendo isoestructuralidad con el complejo sintetizado en este trabajo y una posible estructura [Zn(IMC)2(H2O)2]. El difractograma en el caso de CuIMC2(H2O)2 no fue obtenido debido a una baja cristalinidad. Zhou en 2003 y Jabali en 2016 han establecido, por evidencia de IR, XRPD y XAFS, que la síntesis en solventes polares (MetOH, EtOH y H2O) producen especies mononucleares. Fig. 5.7. XRPD de a) ZnIMC2(H2O)2 (Este trabajo) b) ZnIMC2(MetOH)2 (Zhou, 2003). Zhou, et al. también concluyen que el mejor modelo de ajuste para sus datos de XAFS, en muestras de polvos, se obtiene para un complejo tetraédrico mononuclear monodentado con dos IMC complejadas. Dada la similitud entre el XRPD de ZnIMC2(H2O)2 aquí reportado y el reportado por Zhou, 2003, una especie tetraédrica de [ZnIMC2(H2O)2] se propone exista mayoritariamente en la forma sólida. Estos resultados concuerdan con lo esperado con los complejos de Zn(II), ya que su capa llena d no le da una estabilización de campo cristalino, por lo que el tamaño del ión y los requerimientos estéricos del ligante, serán los que determinen el número de coordinación y estereoquímica. Los complejos esperados para Zn(II) son regularmente mononucleares, regularmente como quelatos o monodentados [Burgess, 2011] y a pesar de que existen los complejos carboxilatos como puentes estos generalmente no se estabilizan. 5 10 15 20 25 30 2θ b a 60 A. Ricardo Hipólito N. 5.3. Estudios de estabilidad de IMC a pH 5 y 7. Después de someter una solución de IMC 5.64 ´ 10-5 M a pH 5 y 7 con buffer de fosfatos 0.1 M, su espectro UV-Vis cambia de la siguiente manera: pH 4.5 La Fig. 5.8 muestra los espectros de la IMC al paso del tiempo; en cada uno de ellos se observan los máximos característicos a 225, 270 y 320 nm. Fig. 5.8. Espectros de la IMC, en función del tiempo, a pH de 4.5. El cambio de los máximos, en función del tiempo, con respecto a la señal a 0 h, tomada como 100 %, se observa en la Fig. 5.9; los máximos sufren cambios prácticamente despreciables. Los cambios perceptibles podrían adjudicarse a interacciones leves entre IMC-–-HIMC. La IMC parece ser muy estable a pH 4.5, parece ser que la especie HIMC en solución no se descompone y es más estable con el tiempo, sin embargo, al disminuir más el pH de la solución, por debajo de 4.5, la IMC precipita, y no permite el estudio en solución. 220 240 260 280 300 320 340 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 pH 4.5 Tiempo (h) A b so rb an ci a Longitud de Onda (nm) 0.00 0.96 1.90 3.98 6.00 23.98 49.36 167.20 61 A. Ricardo Hipólito N. Fig. 5.9. Porcentaje de modificación de los máximos de IMC a a) 225, b) 270 y c) 320 nm, con respecto al valor a 0h, a pH 4.5, en función del tiempo. pH 7 A pH 7, la IMC presenta más cambios perceptibles, en comparación a pH 4.5, como se observan en la Fig. 5.10 y 5.11. Se puede observar que todos los máximos aumentan y ninguno disminuye; además, después de las 48 h los gráficos comienzan a tener menos modificaciones; indicativo de que la descomposición se vuelve mas lenta. Estos aumentos se pueden asumir debido a formación de dímeros de IMC-– con HIMC ya que se encuentran presentes ambas especies en solución y en los cuales se ha observado asociación por los grupos carbonilo en solución (Fig. 5.12) [Tong, 2001]. Fig. 5.10. Espectros de la IMC en función del tiempo a pH de 7. 100 110 120 130 140 150 0 2 4 6 8 (A b s/ A b si n i) * 1 0 0 ( % ) Tiempo (días) 225 nm 0 20 40 60 80 100 0 2 4 6 8 (A b s/ A b si n i) * 1 0 0 ( % ) Tiempo (días) 270 nm 0 20 40 60 80 100 0 2 4 6 8 (A b s/ A b si n i) * 1 0 0 ( % ) Tiempo (días) 320 nm 220 240 260 280 300 320 340 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 pH 7 Tiempo (h) A b so rb an ci a Longitud de Onda (nm) 0.00 1.00 1.95 4.00 6.00 23.98 49.31 167.82 a) b) c) 62 A. Ricardo Hipólito N. Fig. 5.11. Porcentaje de modificación de los máximos de IMC a a) 225, b) 270 y c) 320 nm, con respecto al valor a 0h, a pH 7 en función del tiempo. Fig. 5.12. Formación de dímeros de IMC por el grupo carboxilato. pH 11 A pH 11, es dónde se observan cambios considerables en los espectros Fig. 5.13 y 5.14. Es muy notorio el hipercromismo de la señal entre 225 y 230 nm convirtiendo el hombro a máximo, así como hipocromismo de la señal a 270 nm la cual presenta una disminución y un cambio batocrómico, indicación de cambios en la estructura de la molécula considerables, de igual manera la señal a 320 nm prácticamente desaparece, la banda que crece alrededor de 290-300 nm hace que la banda que se mueve a 270 nm se vea muy ancha, lo cual es indicativo de formación de al menos 2 diferentes productos con máximos muy próximos, lo cual hace difícil diferenciarlos. Para todas las señales, después de 48 h el cambio deja de ser tan drástico. 100 110 120 130 140 150 0 2 4 6 8 (A b s/ a b si n i) * 1 0 0 ( % ) Tiempo (días) 225 nm 0 20 40 60 80 100 0 2 4 6 8 (A b s/ a b si n i) * 1 0 0 ( % ) Tiempo (días) 270 nm 0 20 40 60 80 100 0 2 4 6 8 (A b s/ A b si n i) * 1 0 0 ( % ) Tiempo (días) 320 nma) b) c) 63 A. Ricardo Hipólito N. Fig. 5.13. . Espectros de la IMC en función del tiempo a pH de 11. Fig. 5.14. Porcentaje de modificación de los máximos de IMC a a) 225, b) 270 y c) 320 nm, con respecto al valor a 0h, a pH 11, en función del tiempo. Es posible asignar las nuevas señales a la formación de productos de degradación de la IMC por hidrólisis básica que ya se han reportado, los cuales son: el ácido 2-(5-metoxi-2-metil- 1H-indol-3-il) acético y el ácido p-clorobenzoíco (Fig. 5.15) [Comer, 2014. Fadhil , 2015]. 220 240 260 280 300 320 340 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 A b so rb an ci a Longitud de Onda (nm) 0.00 0.96 1.96 3.81 5.86 23.91 49.48 168.43 Tiempo (h) pH 11 100 110 120 130 140 150 0 2 4 6 8 (A b s/ A b si n i) * 1 0 0 ( % ) Tiempo (días) 225nm 0 20 40 60 80 100 0 2 4 6 8 (A b s/ A b si n i) * 1 0 0 ( % ) Tiempo (días) 320 nm 0 20 40 60 80 100 0 2 4 6 8 (A b s/ A b si n i) * 1 0 0 ( % ) Tiempo (días) 270nma) b) c) 64 A. Ricardo Hipólito N. Fig. 5.15. La indometacina y sus productos de degradación a pH básico (Comer, 2014; Fadhil, 2015). Por lo tanto; es posible observar que no sería favorable estudiar a la IMC a pH mayor a 7 debido a la descomposición rápida de la IMC. Por lo tanto las mejores condiciones para estudiar a la IMC en solución sin presentar descomposición considerable; es entre pH 7 y pH 4.5 a una concentración de 5.64 ´ 10-5 M. 65 A. Ricardo Hipólito N. 5.4. Determinación del pKa de la IMC por UV-Vis. En la Fig. 5.16 se observa el cambio de absorbancia de una solución inicial de IMC 5.83 ´ 10-5 M a pH 9.45, a medida que se realizan adiciones de HCl 0.09 M. El cambio de pH modifica el intervalo entre 280 y 220 nm, observándose un punto isosbéstico, indicación de que al menos se esta llevando a cabo un equilibrio, esto se explicaría debido a la protonación de la IMC- para la formación de HIMC. Fig.5.16. Espectros obtenidos de la titulación de 10 mL de IMC 5.53´10-5 M con HCl 0.09. el gráfico completo se observa en el gráfico reducido, mientras que el acercamiento de 220-280 nm se muestra en primer plano. El hombro observado a 230 nm tiene una disminución de absorbancia (cambio hipocrómico) [Husain, 2017], hasta el punto de desaparecer al final de la titulación y el máximo cercano a 270 tiene un ligero desplazamiento hasta 267 nm (cambio hipsocrómico), el valle que se forma entre 250-260 nm aumenta en aborbancia (cambio hipercrómico). Los efectos que se pueden estar observando, son debidos principalmente al cambio de ambiente que sufre la 220 240 260 280 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 A b so rb an ci a Longitud de Onda (nm) 9.45 9.06 7.58 6.93 6.56 6.26 5.93 5.36 5.06 4.84 4.69 4.56 4.42 4.32 pH 240 280 320 0.0 0.8 1.6 2.4 A b so rb an ci a Longitud de Onda (nm) Titulación de una solución de 10 mL de IMC 5.53×10 -5 M con HCl 0.09 M 66 A. Ricardo Hipólito N. parte indol de la molécula, ya que los máximos reportados para indol (216, 271 y 278 nm) se encuentran entre 220 y 280 nm, que tiene relación a los máximos de 220 y 270 nm de la indometacina (los máximos de la molécula de ácido p-clorobenzoico son 202 y 234 nm) [Hirayama, K. (1967)], además de que los desplazamientos no son tan marcados, por lo que la aportación del carboxilo a la resonancia del grupo indol, no es tan significativo [Chakraborty, 2010]. Por lo tanto, es de esperarse que las transiciones que más predominan y las que mayores modificaciones presentarán en este sistema sean las π‒ π* [Kalsi, 2006]. Los espectros de la Fig. 5.16 fueron alimentados en SQUAD, proponiendo el siguiente equilibrio: Ec. 5.1 Lo anterior para poder elucidar la constante de acidez (-log Ka = pKa). Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 5.1. Tabla 5.1. Valor de pKa para la IMC refinado por SQUAD. pKa σ U 4.52 ± 0.06 5.81 × 10-3 9.68 ×10-3 El valor de pKa obtenido, concuerda con los valores reportados en Valentovic, 2007; Salústio, 2009 y Lucas, S., 2016. Mientras que los valores de σ (desviación estándar) y U (suma de cuadrados de los residuales, Anexo A5) indican una diferencia mínima del modelo propuesto, con los obtenidos experimentalmente. Adicionalmente, para comprobar gráficamente el modelo propuesto con los datos experimentales, se construyó un diagrama de distribución de especies con el dato de pKa obtenido por SQUAD (Fig. 5.17). En donde se puede observar que a pH < 4.5 la especie que predominará será la HIMC y a pH > 4.5, predominará la especie IMC-. Con este gráfico es posible saber la fracción de la especie a un pH definido y gracias a los valores de absortividad calculados por SQUAD es posible reproducir el experimento de manera teórica (ajuste). 67 A. Ricardo Hipólito N. Fig.5.17. Diagrama de distribución de especies de HIMC en función del pH. Se pueden observar los valores de pH donde predominará la especie protonada y desprotonada de la HIMC. Fig. 5.18. Comparación gráfica entre los espectros obtenidos experimentalmente con los gráficos teóricos (ajuste). 0 1 2 3 4 5 6 7 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 F ra cc ió n pH IMC HIMC 220 240 260 280 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 Comparación de espectros experimentales y ajustados A b so rb an ci a Longitud de Onda (nm) pH 5.93 pH 5.93 Ajuste pH 4.84 pH 4.84 Ajuste pH 4.32 pH 4.32 Ajuste 240 280 320 0.0 0.8 1.6 2.4 A b s o rb a n c ia Longitud de Onda (nm) 68 A. Ricardo Hipólito N. En la Fig. 5.18 se puede observar el gráfico en el que se comparan algunos espectros experimentales, con sus respectivos teóricos (ajuste), cuando se encuentra en mayor medida la especie IMC (pH = 5.93), cuando se está cerca del punto de equivalencia (pH = 4.82) y cuando se encuentra en mayor proporción la especie HIMC (pH = 4.32). Se observa gran correspondencia entre el teórico (ajustado) y el experimental, por lo cual se puede confirmar que el modelo propuesto (Ec. 5.1) explica el comportamiento de los datos obtenidos experimentalmente. 69 A. Ricardo Hipólito N. 5.5. Estudio de la interacción IMC con CDs. 5.5.1. Análisis estructural de la interacción IMC con CDs. Se realizó un analisis estructural con las medidas de las moléculas involucradas para proponer una manera en que las CDs incluyen a la IMC. Las medidas y el volumen de la IMC, así como los volumenes del indol, como del grupo p-clorobenzoílofueron calculados con el programa Gaussian [Frisch, 2016] (Fig. 5.19). Fig. 5.19. Tamaños calculados para la molécula de IMC, así como para la molécula metoxiindol y el ácido p- clorobenzoíco. Las medidas de las CDs se tomaron de Frömming de 1994 (Fig. 5.20). Aquí se presentan tanto a la IMC como a las CDs como moléculas rígidas, sin embargo esto en la realidad no sucede, todas las moleculas tendran libertad conformacional y en el caso de la CDs este movimiento tendrá efecto en la apertura de la cavidad y su disponibilidad para tener contacto con el huésped, en este caso la IMC. La a-CD, al ser la CD más pequeña, va a interaccionar por las secciones hidrófobas que permitan un mejor contacto con la molécula de IMC, los dos sitios posibles son los que se presentan en la Fig. 5.21. Es posible la entrada de la IMC en la cavidad, sin embargo la entrada no sería completa ya que la cavidad se vuelve más pequeña con la profundidad, V=151 Å3V=228 Å3 70 A. Ricardo Hipólito N. además de que el volumen de los residuos disponibles, se encuentran en los límites o sobrepasan el volumen de la a-CD. Fig. 5.20. Dimensiones de la CDs nativas. Fig. 5.21. Interacción propuesta para la a-CD con IMC. En el caso de la b-CD (Fig. 5.22), los residuos pueden interaccionar con la molécula de IMC por los mismos lugares que se plantearon antes con la a-CD, sin embargo la entrada sería un poco más libre debido a un volumen mayor de la cavidad de la b-CD. Por lo tanto permitiría una mayor inclusión de la molécula. Sería posible proponer 2 sitios disponibles para que la CD interactúe. Debe notarse que los grupos o las zonas más polares no interaccionarán con la IMC. α-CD β-CD γ-CD α-CD 71 A. Ricardo Hipólito N. Fig. 5.22. Interacción propuesta para la b-CD con IMC. En el caso de la g-CD (Fig. 5.23), es posible que incluya a la IMC. pero con una libertad aún mayor que con a- y b-CD, además de mayores movimientos conformacionales, la inclusión podría ser por los dos sitios anteriormente planteados con a- y b-CD (Fig. 5.23a); aunque, el volumen de la g-CD podría incluir a la IMC completa, debido al volumen tan grande, aunque los efectos estéricos podrían comenzar a tener impactos desfavorables (Fig. 5.23b). Fig. 5.23. Interacción propuesta para la g-CD con IMC. a) con dos moléculas de CD, y con b) una molécula de CD. Es posible observar que con todas las CDs la IMC puede interaccionar ya que tiene grupos disponibles hidrofóbicos que son candidatos para que se lleva a cabo la inlcusión. Los tamaños relativos de las CDs sustituidas como HP-b- ó HP-g-CD, no tendran cambios significativos en sus dimensiones debido a los grupos hidroxipropilos. Existen estudios de modelado molecular sobre la interacción de la IMC con CDs y muestran la preferencia que tiene el grupo p-clorobenzoilo para incluirse en la cavidad, además de que un gran número de contribuciones se elige la relación 1:1, lo cual indicaría que sólo una β-CD β-CD γ-CD γ-CD γ-CD a) b) 72 A. Ricardo Hipólito N. molécula de CD interaccionará con una molécula de IMC [Backensfeld, 1990; Rudrangi, 2015; Hamada, 1975, Backensfeld, 1991; Casella, 1998; Jambhekar, 2004; Zhang, 2006; Iohara, 2008; Salústio, 2009; Alsarra, 2010; Rudrangi, 2015]. 5.5.2. Determinación de las constantes de inclusión IMC con CDs por UV-Vis a pH 5 y 7. Diversos estudios de interacción IMC con CDs se han reportado anteriormente por UV-Vis, usando el método de Higuchi-Connors [Higuchi-Connors, 1965] para determinación de constantes aparentes de inclusión [Hamada, 1975, Backensfeld, 1991; Casella, 1998; Jambhekar, 2004; Zhang, 2006; Iohara, 2008; Salústio, 2009; Alsarra, 2010; Rudrangi, 2015]. Sin embargo, este método límita su estudio a sólo pocos puntos y al uso de sólo una longitud de onda, además de una cuantificación del analito de interés ya incluido en la CD. En los experimentos propuestos en este trabajo, se toman al menos 24 espectros con 40 puntos, desde 220 hasta 340 nm, por cada espectro; además de que no es necesaria una cuantificación adicional de la cantidad del analito huésped. Es bien sabido que los complejos de inclusión CD-huésped presentan valores de constantes de complejación (log K1:1) menores de 3 [Szejtli, 1998], por lo tanto, al proponer un equilibrio como el de la Ec. 5.2, y al realizar adiciones en exceso de CD, podremos asegurar la formación del complejo. Por lo tanto, en cada experimento presentado, un exceso de CD de hasta 200 veces por arriba de la concentración de IMC fue agregado. Esta forma de experimentación fue seleccionada para desplazar el equilibrio hacia la formación de productos y poder estudiar el efecto de las CDs sobre la IMC. El experimento inverso, adicionar exceso de IMC a una solución de CD, es también factible, sin embargo por practicidad en las señales por UV-vis debido a un mayor coeficiente de absortividad de la IMC, se eligió dejar constante la IMC y variar las CDs, que tienen bajo coeficientes de absortividad. Debe notarse que los experimentos fueron realizados a pH de 7 y de 5 debido a la estabilidad que se ha descrito en la sección 5.3 para la IMC, en donde es relativamente estable y no precipita. IMC + CD ⇆ IMCCD Ec. 5.2 De los experimentos de RM realizados, se seleccionaron los espectros de las RM de 0-30 para alimentar en SQUAD (ANEXO A5, A6 y A7) y refinar los valores de log K1:1. En las 73 A. Ricardo Hipólito N. Figs. 5.24 y 5.25 se muestran, algunos de los espectros experimentos obtenidos por UV-Vis (a pH 5 y 7) para las CDs nativas y para las CDs sustituidas, respectivamente. El uso de marcadores indican los puntos experimentales, mientras que las líneas contínuas señalan los ajustes teóricos del modelo 1:1 Ec. 5.2. construidos usando SQUAD y MEDUSA. Las ligeras modificaciones en los espectros y los valores de log K1:1 refinados por SQUAD (Tabla 5.2), indican que existe interacción entre la IMC y las CDs y que efectivamente las interacciones son débiles, muy probablemente del tipo de van der Waals y puentes de hidrógeno [Szejtli, 1998] En el ANEXO A7, se muestran los gráficos del pCD contra la absorbancia corregida. Los valores de log K1:1 son diferentes para cada CD y a cada pH. Los valores de s y de U (suma de cuadrados), fueron de los más bajos, indicación de un buen ajuste al modelo propuesto, debe mencionarse que otros modelos fueron evaluados, pero el modelo 1:1 Ec. 5.2 presentó mejores ajustes y menores valores de s y de U. En el caso de a-CD (Fig. 5.24), los espectros de la IMC tanto a pH 5 como 7, presentan un efecto hipercrómico a relaciones molares bajas, el efecto es poco preceptible y tiende a mezclarse con efectos de dilución. Una vez alimentando y refinando las constantes por SQUAD, las constantes (logK1:1); en comparación al conjunto de constantes obtenidas, son de las más bajas siendo de 2.22 ± 0.05 y 2.32 ± 0.05 a pH 5 y 7, respectivamente. Al ser diferentes, indicarían que la inclusión es distinta, teniendo una mejora de inclusión al aumentar el pH. Este valor pareciera estar relacionado al porcentaje de especies presentes de IMC y HIMC en solución. Al aumentar el pH, habrá más porcentaje de IMC desprotonada en solución (Sección 5.3). Esto indicaría que la a-CD tiene más afinidad con la IMC-. En el caso de la b-CD (Fig 5.24), un efecto hipercrómico similar al de a-CD se observa al iniciar las adiciones de CD, sin embargo, después de la relación 6 este efecto se pierde por dilución surgiendo un efecto hipocrómico, sin embargo puede notarse que en los máximo a 225 y 270 nm el efecto hipocrómico es más marcado, pero en el máximo a 320 nm y en el intervalo de 240 a 250 nm, no parece que el efecto hipocrómico presente mucho efecto, ya que se esperaría que el efecto de dilución afecte a todo el espectro en iguales proporciones, como sucede en el caso de la a-CD. Esto confirma la inclusión de la IMC en la b-CD, además de que indicaría que una sección de la IMC es la que entrará en la CD. 74 A. Ricardo Hipólito N. Se puede observar que los valores de logK1:1 son 2.86 ± 0.01 y 2.80 ± 0.04 a pH 5 y 7, respectivamente; son muy similares, ligeramente más grandes a pH 5, lo que indicaría que la HIMC podría estar incluyendo de una mejor manera, esto es claro debido a la cavidad hidrofoba que atraería a la molécula también hidrófoba y al acomodo que pudiera tener dentro de la cavidad, situación que cambió con respecto a la a-CD, esto puede ser indicio del cambio de polaridad de a-CD y la b-CD al interaccionar con IMC. α-CD pH 5 α-CD pH7 β-CD pH 5 β-CD pH 7 γ-CD pH 5 γ-CD pH 7 220 240 260 280 300 320 340 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 A b so rb an ci a Longitud de Onda (nm) IMC 1.27 4.56 6.46 10.27 29.28 220 240 260 280 300 320 340 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 A b so rb an ci a Longitud de Onda (nm) IMC 1.21 6.03 10.86 18.10 28.95 220 240 260 280 300 320 340 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 A b so rb an ci a Longitud de Onda (nm) 0 1.56 11.41 14.53 20.76 27.00 IMC 220 240 260 280 300 320 340 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 A b so rb an ci a Longitud de Onda (nm) IMC 1.24 2.36 7.58 17.51 28.69 220 240 260 280 300 320 340 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 A b so rb an ci a Longitud de Onda (nm) Indo 1.26 5.05 10.10 15.15 25.25 220 240 260 280 300 320 340 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 A b so rb an ci a Longitud de Onda (nm) 0 2.59 4.66 7.56 13.78 24.13 MC IMC Fig. 5.24. Gráficos de la interacción IMC con las CD nativas (a-, b- y g-CD) por UV vis a pH 5 y 7. Las líneas continuas indican el ajuste realizado por SQUAD. 75 A. Ricardo Hipólito N. Tabla 5.2. Tabla de resultados de la interacción IMC con CDs por UV-Vis a pH 5 y 7. CD pH logK1:1 σ U α 5 2.22 ± 0.05 2.56 × 10-3 4.58 × 10-3 α 7 2.32 ± 0.05 3.67 × 10-3 7.18 × 10-3 β 5 2.86 ± 0.01 2.67 × 10-3 3.69 × 10-3 β 7 2.80 ± 0.04 1.72 × 10-3 1.59 × 10-3 γ 5 2.31 ± 0.03 3.82 × 10-3 7.79 × 10-3 γ 7 2.13 ± 0.02 4.09 × 10-3 9.51 × 10-3 HP-β 5 2.57 ± 0.04 4.25 × 10-3 7.92 × 10-3 HP-β 7 3.00 ± 0.04 3.24 × 10-3 6.02 × 10-3 HP-γ 5 2.43 ± 0.06 6.11 × 10-3 1.99 × 10-2 HP- γ 7 2.00 ± 0.05 4.30 × 10-3 9.83 × 10-3 HP-β-CD pH 5 HP-β-CD pH 7 HP-γ-CD pH 5 HP-γ-CD pH 7 220 240 260 280 300 320 340 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 A b so rb an ci a Longitud de Onda (nm) IMC 1.00 3.99 9.98 13.98 19.97 220 240 260 280 300 320 340 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 A b so rb an ci a Longitud de Onda (nm) IMC 1.85 4.02 14.86 21.24 34.00 220 240 260 280 300 320 340 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 A b so rb an ci a Longitud de Onda (nm) IMC 1.23 4.93 9.86 14.80 22.20 220 240 260 280 300 320 340 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 A b so rb an ci a Longitud de Onda (nm) IMC 1.36 5.36 11.82 15.04 27.96 Fig. 5.25. Gráficos de la interacción IMC con CD sustituidas (HP-b y HP-g-CD) por UV-vis a pH 5 y 7. Los recuadros indican la relación molar a la que se llegó. Las líneas continuas indican el ajuste realizado por SQUAD. 76 A. Ricardo Hipólito N. Los valores son mayores que los de la a-CD, indicación de una mayor cavidad mejora la inclusión. El pH no prece tener un efecto tan considerable como con a-CD. Con g-CD (Fig. 5.24), los espectros de la IMC presentan el efecto hipercrómico-hipocrómico antes mencionado al realizar las adiciones. El efecto es perceptible en el máximo a 225 nm. Al ser evaluados los espectros experimentales, se tienen valores de logK1:1 de 2.31 ± 0.03 y 2.13 ± 0.02 a pH 5 y 7, respectivamente; los cuales, en comparación a las demás CD no sustituidas, son bajas pero a pH 7 es de las más bajas de todas las constantes calculadas. Lo anterior indicaría que la HIMC tiene preferencia por la g-CD, al igual que como sucede con b-CD, esto posiblemente al ambiente dentro de la CD; sin embargo el tamaño de la CD, contrario a lo que se pensaría no hace mejorar la inclusión. Los gráficos de la interacción IMC con HP-b-CD (Fig. 5.25), muestran a pH 5, un incremento de absorbancia al adicionar la CD en el intervalo de 220-280nm, este aumento comienza a disminuir por dilución después de la relación 3.99. A pH 7 este cambio es diferente, se puede observar que las modificaciones de absorbancia sólo se dan en los máximos cerca de 230 y 275nm. Los resultados de la IMC con HP-b-CD Tabla 5.2 presenta valores de logK1:1, 2.57 ± 0.04 y 3.00 ± 0.04 a pH 5 y 7, respectivamente; indicación de que la HP-b-CD tiene más afinidad por la IMC que por la HIMC, en comparación con la b-CD, es más evidente la diferencia de afinidad, la cavidad de la HP-b-CD es del mismo tamaño que la b-CD siendo los residuos 2-hidroxipropilo los que mejoran la preferencia por IMC. En el trabajo de Backensfeld de 1991, usando HP-b-CD M.S. 0.39 la afinidad es mejor por HIMC (logK1:1 = 3.20 y 2.28, a pH 5 y 7, respectivamente) de igual manera que b-CD. En este trabajo la modificación de M.S. 0.6 mejora la afinidad por IMC. Con la HP-g-CD (Fig. 5.25) los valores de logK1:1 son 2.43 ± 0.06 y 2.00 ± 0.05 a pH 5 y 7 (Tabla 5.2 ). Al igual que la g-CD, la afinidad por HIMC es mayor que por IMC, la sustitución por 2-hidroxipropil mejora aún más la preferencia por HIMC que por IMC. En comparación con HP-b-CD, la preferencia por IMC disminuye drásticamente, y la preferencia por HIMC disminuye ligeramente. Esto indicaría que la cavidad afecta desfavorablemente la inclusión y que la sustitución por hidroxipropilos en HP-g-CD y HP-b-CD, tiene efectos distintos al interaccionar con las especies de IMC. 77 A. Ricardo Hipólito N. En general se observa una mayor afinidad por las CDs que tienen 7 residuos glucopiranosa. Las diferencias entre pHs de los valores de logK1:1 de las CDs nativas son mas cercanas, lo cual cambia con los valores de las CDs sustituidas que presentan una mayor diferencia entre un pH y otro, aunque el tamaño será el que dictamine la afinidad, con 6 y 8 residuos glucopiranosa la IMC disminuye su afinidad; esto debido a la posible existencia de efectos estéricos en el caso de la a-CD y con la probable deficiencia de interacciones con la g-CD debido a un mayor tamaño. Sin embargo, el estudio de UV-Vis no nos brinda mayor información sobre la manera en que las CDs incluyen a la IMC, otras técnicas tendrán que ser utilizadas. 5.5.3. Determinación de las propiedades termodinámicas de la inclusión IMC con CDs por Calorimetría de Titulación Isotérmica (ITC) a pH 7. La técnica de calorimetría de titulación isotérmica (ITC, por sus siglas en inglés: isothermal titration calorimetry) es una herramienta muy útil y versatil para el estudio de interacciones moleculares. Durante un experimento de calorimetría de titulación isotérmica, se mide el calor generado o absorbido durante la reacción de interés. En nuestro caso, una solución de CD (titulante) es adicionada a una solución de IMC (titulado) por un tiempo determinado usando una o más adiciones individuales (inyecciones). El calor en el caso de un VP-ITC, que fue utilizado para este trabajo, es medido como el cambio de potencia necesaria para mantener la celda de muestra y la celda de referencia a la misma temperatura. El calor producido durante cada inyección es proporcional a la cantidad de complejo formado (ANEXO A3). El cambio en calor durante el experimento, permite la evaluación de la estequiometría de interacción, la constante de afinidad (K) y la entalpía de interacción (DH), de las cuales se puede derivar el valor de energía libre de Gibbs (DG) y el valor de entropía (DS) [Duchêne, D. 2011; Gaisford, 2006; Costas, 2015]. En este trabalo, los experimentos sólo se realizaron a pH 7 debido a que a pH 5, a las concentraciones de trabajo, la IMC precipita, además de que se usó solución NaOH 0.01M para disolver a la HIMC. Los gráficos de las Fig. 5.26, 5.27 y 5.28, muestran para cada experimento de interacción IMC con CD, un termograma o potenciograma (potencia en función del tiempo) de dilución; 78 A. Ricardo Hipólito N. en dónde se realizan adiciones de CD al buffer de fosfatos en los que fueron preparadas las soluciones, enseguida se muestra el termograma de la titulación de una solución de CD en una solución de IMC. Por último, se muestran los isotermas (calor por inyección en función de la relación molar) de dilución (círculos negros) y titulación (círculos rojos). A la isoterma de titulación ya se le ha realizado la resta del efecto debido a la dilución y además se compara con el ajuste del modelo realizado (línea azul). El ajuste fue realizado usando el modelo de la Ec. 5.2, con la ayuda del software Affinimeter. Los ajustes fueron seleccionados en función del valor más bajo de chi-cuadrada (c2) obtenido (otros modelos fueron probados sin embargo, los mejores resultados se obtuvieron para modelos 1:1) [Bouchemal, 2012]. Las respuestas obtenidas en los termogramas presentan, en su mayoría, señales caracteristicas de liberación de energía hacia el entorno del sistema. Las señales de dilución (Fig. 5.26a, 5.27 a,d y 5.28a,d) siempre son más bajas que las señales de titulación (Fig. 5.26b, 5.27b,e y 5.28b,e). Al hacer el ajuste al modelo, el efecto de dilución se resta del experimento de titulación para sólo considerar a la interacción IMCCD. En los isotermas de enlace (titulación), la gráfica de titulación no presenta una forma característica de sigmoide, esto debido a que la interacción es débil (Fig. 5.26b, 5.27 c,f y 5.28c,f). En la mayoría de los casos la curva tiende a cero, indicación del grado de saturación de los sitios en donde la CD puede interaccionar, pero a pesar de llegar a relaciones mayores a 1 nunca se llega a saturación, una posible razón de esto es la baja cuantitatividad de la reacción de formación del complejo de inclusión, además de un valor de 1/K1:1 menor de 10 [Jelesarov,1999]. Para cada CD, las particularidades al interaccionar con la IMC se muestran en la Tabla 5.3 y se describen a continuación. Los valores obtenidos por ITC (Tabla 5.3), para la interacción α-CD con IMC a pH 7, señalan que la interacción es débil y poco espontánea por los valores de logK1:1 y DG. Es de las interacciones más exotérmicas y con un DS negativo. Esto indicaría que la contribución entálpica es mayor, en comparación al resto de las CDs. La contribución entálpica tiene muchas fuentes, sin embargo en el caso de las CDs los efectos de enlaces no polares son los que mayoritariamente se espera que afecten los valores de entalpía [Jelesarov, 1999]. Además de que los grados de libertad disminuyen, indicación de un sistema más ordenado. La interacción es impulsada por la contribución entálpica. 79 A. Ricardo Hipólito N. IMCα-CD. [IMC]=5.53×10-4M; [α-CD]=1.73×10-2M Fig. 5.26. Experimento obtenidas por ITC para la interacción de IMC con a-CD a) Potenciograma de dilución, b) potenciograma de titulación y c) isotermas de dilución y titulación con ajuste al modelo 1:1. 0 100 200 300 400 500 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 P o te n ci a (µ W ) Tiempo (min) a-CD@7.0 0 100 200 300 400 500 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 P o te n ci a (µ W ) Tiempo (min) a-CD@7.0 0 1 2 3 4 5 6 7 -2.4 -2.0 -1.6 -1.2 -0.8 -0.4 0.0 a-CD@7.0 C al o r p o r In y ec ci ó n CD/IMC Dilución Titulación Ajuste a) b) c) 80 A. Ricardo Hipólito N. IMCβ-CD [IMC]=5.53×10-4M; [β-CD]=1.73×10-2M IMCHP-β-CD [IMC]=5.53×10-4M; [HP-β-CD]=1.74×10-2M 0 100 200 300 400 500 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 P o te n ci a (µ W ) Time (min) b-CD@7.0 0 100 200 300 400 500 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 P o te n ci a (µ W ) Tiempo (min) b-CD@7.0 0 1 2 3 4 5 6 7 -2.4 -2.0 -1.6 -1.2 -0.8 -0.4 0.0 Dilución Titulación AjusteC al o r p o r in y ec ci ó n CD/IMC b-CD@7.0 0 100 200 300 400 500 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 P o te n ci a (µ W ) Tiempo (min) HP-b-CD@7.0 0 100 200 300 400 500 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 P o te n ci a (µ W ) Tiempo (min) HP-b-CD@7.0 0 1 2 3 4 5 6 7 -2.5 -2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 HP-b-CD@7.0 C al o r p o r In y ec ci ó n CD/IMC Dilución Titulación Ajuste a) d) b) e) c) f) Fig. 5.27. Experimento obtenidas por ITC para la interacción de IMC con: b-CD a) Potenciograma de dilución, b) potenciograma de titulación y c) isotermas de dilución y titulación con ajuste al modelo 1:1 y HP-b-CD d) potenciograma de dilución, e) potenciograma de titulación y f) isotermas de dilución y titulación con ajuste al modelo 1:1. 81 A. Ricardo Hipólito N. IMCγ-CD [IMC]=5.53×10-4M; [γ-CD]=1.72×10-2M IMCHP- γ -CD [IMC]=5.81×10-4M; [HP-γ-CD]=1.78×10-2M 0 100 200 300 400 500 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 P o te n ci a (µ W ) Tiempo (min) g-CD@7.0 0 100 200 300 400 500 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 P o te n ci a (µ W ) Tiempo (min) g-CD @7.0 0 1 2 3 4 5 6 7 -0.6 -0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0.0 C al o r p o r In y ec ci ó n Tiempo (min) Dilución Titulación Ajuste g-CD@7.0 0 100 200 300 400 500 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 P o te n ci a (µ W ) Tiempo (min) HP-g-CD@7.0 0 100 200 300 400 500 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 P o te n ci a (µ W ) Tiempo (min) HP-g-CD@7.0 0 1 2 3 4 5 6 7 -0.6 -0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0.0 HP-g-CD@7.0 C al o r p o r In y ec ci ó n CD/IMC Dilución Titulación Ajuste a) d) b) e) c) f) Fig. 5.28. Experimento obtenidas por ITC para la interacción de IMC con: g-CD a) Potenciograma de dilución, b) potenciograma de titulación y c) isotermas de dilución y titulación con ajuste al modelo 1:1 y HP-g-CD d) potenciograma de dilución, e) potenciograma de titulación y f) isotermas de dilución y titulación con ajuste al modelo 1:1 82 A. Ricardo Hipólito N. Tabla 5.3. Resultados de ITC para la interacción IMC con CDs. CD log K1:1 ∆G (kJ/mol) ∆H (kJ/mol) ‒T∆S (kJ/mol) ∆S (J/molK) α-CD 2.10 ± 4.62´10-4 ‒11.99 ± 4.62´10-4 ‒25.50 ± 0.02 13.51 ± 0.05 ‒45.32 ± 0.06 β-CD 2.749 ± 0.002 ‒16.11 ± 2.97´10-4 ‒10.97 ± 0.01 ‒5.15 ± 0.02 17.26 ± 0.05 γ-CD 2.666 ± 0.002 ‒15.22 ± 6.96´10-4 ‒0.493 ± 0.001 ‒14.72 ± 0.05 49.38 ± 0.01 HP-β-CD 2.98 ± 4.02´10-4 ‒17.00 ± 1.35´10-4 ‒9.79 ± 0.01 ‒7.21 ± 0.02 24.19 ± 0.02 HP-γ-CD 2.258 ± 0.002 ‒12.885 ± 0.001 ‒2.14 ± 0.01 ‒10.74 ± 0.04 36.03 ± 0.03 En el caso de β-CD con IMC, se puede decir que la interacción es espontánea, exotérmica y con un valor positivo entrópico, la reacción es impulsada por la contribución entálpica. En comparación con la α-CD; ambas CDs producen una interacción espontánea, exotérmica e impulsada entálpicamente. Sin embargo, los valores entrópicos para la β-CD son positivos, esto indicaría que los grados de libertad o que el desorden del sistema está aumentando, esta diferencia se puede explicar por la entrada de la IMC a la cavidad de la CD, pero a diferencia de la α-CD, existe otro factor adicional que favorece a un valor entrópico positivo. Se ha reportado que este efecto adicional es debido a efectos de hidratación; los cuales pueden ser asignados la expulsión de moléculas de agua de la interface del complejo o a la salida de moléculas de agua de la cavidad de las CDs [Jelesarov, 1999, Liu, 2008]. Al parecer un mayor número de moleculas de agua son desplazadas fuera de la cavidad en el caso de la β-CD a diferencia de la α-CD. Además debe resaltarse que los valores de ΔH, son más bajos que α- CD, indicación de una menor interacción, debido muy probablemente al incremento de tamaño de la cavidad de la CD. Al tener contacto la g-CD y la IMC, se puede notar que las señales de calor experimentales son muy bajas (Fig. 5.28a), aun así, es posible distinguir una diferencia entre la interacción de CD con IMC, que de la interacción CD con buffer. Los valores termodinámicos obtenidos demuestran una interacción espontánea, exotérmica y entrópica, siendo el valor entrópico el que impulsa la interacción. En comparación con las otras CDs nativas, la interacción es más espontánea que la a-CD, pero menor que la b-CD. Los valores de entalpía parecen tener una tendencia a disminuir con el tamaño de la CD, indicación de menos interacciones IMCCD. En contraste, el valor de entropía aumenta con el tamaño de la CD, indicación de mayor 83 A. Ricardo Hipólito N. desorden, evidencia de una mayor salida de moléculas de agua de la cavidad al ser sustituidas por la IMC. Hasta el momento, se puede decir que la mejor CD para incluir a la IMC es la b-CD, por presentar mayor espontaneidad derivada del equilibrio entálpico-entrópico, en comparación con el resto de CDs nativas. En el caso de la a-CD, la inclusión no es tan espontánea, muy probablemente por su tamaño, lo que provoca dificultad para que la IMC se incluya a una profundidad considerable, y que el desplazamiento de moléculas de agua de la cavidad a la solución no sea un efecto considerable, lo que explicaría, en este caso; que el valor entrópico o sólo las interacciones sean las que impulsen la inclusión. En el caso de la g-CD, la inclusión no es efectiva por la cavidad de gran tamaño que evita a la IMC mantener las interacciones que permitan que la IMC permanezca en la cavidad, de tal manera que no estabiliza al complejo de inclusión. Los efectos entrópico y entálpicos parecen ser los que determinan la espontaneidad o estabilidad de los complejos de inclusión, los cuales parecen ser determinados por las caracteristicas de la cavidad y la manera de interacción. Cuando la b-CD presenta grupos 2-hidroxipropilo en su estructura y está presente la IMC, la interacción es espontánea, exotérmica y con valores entrópicos positivos. La interacción está impulsada por el valor entálpico. Los valores entre b- y HP-b-CD son muy parecidos, aunque la b-CD tiende a ser más espontánea, menos exotérmica y más entrópica, lo cual indica que los grupos 2-hidroxipropilo favorecen una mayor liberación de moléculas de agua de la cavidad, por una posible inclusión más profunda dentro de la cavidad por una posible mayor afinidad por IMC. En el caso de la HP-g-CD la interacción con IMC se da de manera espontánea, exotérmica y entrópica; siendo esta última contribución la que impulse la interacción. Esto indicaría que la IMC entraría en la cavidad y a su vez saldrían moléculas de agua, sin embargo, la poca interacción con la CD no estabilizaría al complejo de inclusión. Con la g-CD sucede algo parecido, sin embargo los grupos 2-hidroxilpropilo, hacen que la interacción sea mayor con la CD, pero no permiten que la IMC reemplace más moléculas de agua dentro de la cavidad, provocando que la interacción IMCHP-g-CD presente valores de logK1:1 mucho más pequeños que todas las CDs estudiadas en este trabajo. 84 A. Ricardo Hipólito N. Se sabe que los residuos HP (M. S. 0.6), aumentan el efecto estérico y modifican bloqueando la cavidad, alterando también la rigidez y estructura de las CDs [Schönbeck, 2010; Costas, 1994]. Estos efectos alterarían de manera menos favorable el valor de entalpía en el caso de HP-b-CD y lo contrario sucede con HP-g-CD en dónde el valor de entalpía es mayor; con respecto a sus CDs no sustituidas. De igual manera el valor de entropía se ve afectada por los sustituyentes HP. Un aumento de entropía es observable en el caso de IMCHP-b-CD con respecto a IMCb-CD, que indicaría una mayor salida de moléculas de agua. Pero en el caso de IMCHP-g-CD; el valor disminuye con respecto a IMCg-CD. La explicación de estos comportamientos es el tamaño de CD y a la facilidad o dificultad de deshidratar la cavidad debido a la entrada de la IMC. En el caso de HP-b-CD, las interacciones no son tan cercanas lo que permitiría mayores movimientos y mayor salida de agua en comparación con b-CD. Por otra parte, lo que pareciera suceder con la HP-g-CD es que hay una menor entrada de la IMC en la cavidad, lo que evita la salida de moléculas de agua (por el valor positivo de ΔS) debido a un efecto estérico (debido a un valor más alto de entalpía), en comparación con g- CD, lo cual impactaría al valor de logK1:1 y al valor de DG. El valor de logK1:1 para HP-g-CD es consistente con el obtenido por UV-Vis, por lo cual el efecto hidrofóbico planteado en el capítulo anterior debido a los grupos HP se debe en mayor medida a efectos estéricos que derivan en mayor hidrofobicidad, que hacen que la IMC con carga negativa sea repelida en este caso. En el caso de CDs sustituidas, se observa que un mayor tamaño no necesariamente ayudará a que el complejo se vea tan favorecido, esto debido a las interacciones con IMC ya que es posible observar que el valor entrópico es mayor con HP-g-CD que con HP-b-CD. Este efecto entrópico mayor, no es suficientemente grande para estabilizar al complejo de inclusión. El tamaño de la CD será el que dictamine la inclusión por permitir el acomodo de la IMC y que las interacciones se den de tal manera que los complejos de inclusión puedan estabilizarse. La sustitución de las CDs por grupos HP ayudará a tener mayores valores entálpicos y/o entrópicos dependiendo de la CD y harán que el ambiente químico sea favorable para la inclusión o sea impactada por efectos estéricos. 85 A. Ricardo Hipólito N. Los valores obtenidos por ITC tienen tendencias y valores parecidos a los obtenidos por UV- Vis a pH 7, confirmando que la reacción de inclusión puede ser seguida por medición de la cantidad de luz absorbida o la cantidad de calor que producen los complejos de inclusión o productos formados. 5.5.4. Determinación de las propiedades termodinámicas de la inclusión IMC con CDs por Calorimetría de Titulación Isotérmica (ITC) a pH 7, a diferente temperatura. Determinación de ΔCp. Para la determinación de DCp de la interacción IMC con CD fue necesario determinar los valores termodinámicos DG, DH y -TDS (o DS) [Weber, 1995] a diferentes temperaturas (293.15, 298.15, 303.15 y 308.15 K) los gráficos de la isoterma de dilución y de titulación con su ajuste se observan en las Figs. 5.29-5.33. Los resultados de los mejores ajustes se muestran en las Tablas 5.4-5.8. Se puede observar que los valores de logK1:1 y de DG disminuyen en la mayoría de los casos, indicación de que la estabilidad y la espontaneidad de la reacción disminuye al aumentar la temperatura. En el caso de IMCa-CD, el valor de DH aumenta con el paso de la temperatura (el incremento de 5 K en temperatura hace más exotérmico el sistema por 2.27 kJ/mol, en promedio), haciendo que la interacción sea más exotérmica, resultado de posibles mayores interacciones [Rekharsky, 1994, Rekharsky, 2006]. Además de que el valor de -TDS incrementa (el incremento de 5 K en temperatura hace menos entrópico al sistema por 2.51 kJ/mol, en promedio), indicación de que el desorden de la reacción disminuye (disminución de libertad conformacional) con la temperatura. En todas las temperaturas, la reacción es impulsada por el valor de DH, por lo que se espera que para el complejo IMCa-CD exista más contribución a la estabilidad debido a las interacciones. A pesar de que las contribuciones tanto entálpica como entrópica aumentan en valor con la temperatura, la relación entre ambas no hace que la espontaneidad de la reacción de inclusión aumente. Esto puede deberse a que, en comparación con el DH; el valor de DS tiene un incremento mayor con la temperatura. Lo que sugiere que las contribuciones que hacen aumentar al DH no aumentan tanto como lo hacen las contribuciones que modifican al DS, por lo tanto el complejo no se estabiliza. La mejor 86 A. Ricardo Hipólito N. temperatura para incluir a la IMC con a-CD será a 293.15 K ya que habrá una mayor espontaneidad para que el complejo se forme. Fig. 5.29. Isotermas de enlace y de dilución de la interacción IMCa-CD a pH 7 y diferente temperatura. La isoterma de enlace ya incluye la resta de la dilución. Tabla 5.4. Resultados de ITC obtenidos para la interacción de IMC con a-CD a pH 7 y diferente temperatura. T (K) logK1:1 ∆G (kJ/mol) ∆H (kJ/mol) ‒T∆S (kJ/mol) ∆S (J/molK) 293.15 2.20 ± (5.71×10-4) ‒12.36 ± (2.59×10-4) ‒20.95 ± 0.02 8.58 ± 0.03 ‒29.28 ± 0.06 298.15 2.17 ± 0.002 ‒12.02 ± (7.66×10-4) ‒23.31 ± 0.06 11.29 ± 0.04 ‒37.86 ± 0.21 303.15 2.081 ± 0.001 ‒12.08 ± (4.96×10-4) ‒25.44 ± 0.04 13.37 ± 0.04 ‒44.09 ± 0.14 308.15 1.978 ± 0.001 ‒11.67 ± (6.42×10-4) ‒27.78 ± 0.06 16.11 ± 0.05 ‒52.29 ± 0.19 El valor de DCp (Tabla 5.9) en el caso de la interacción IMCa-CD es de ‒452.75 ± 27.25 J/molK, es de los valores más altos negativos, los valores de DCp que reporta Inoue de 1998 para la interacción huésped-a-CD en comparación con otras CDs, suele ser más alto. Este valor indica un gran contacto del ambiente hidrófobo de la CD con la parte más apolar de la IMC [McPhail, 1997; Cooper, 2001], ya que se sabe que entre mayor y negativo sea el valor de DCp habrá una mayor transferencia de grupos hidrófobos a un ámbiente ápolar. Se sabe que al incrementar la temperatura, los puentes de hidrógeno se vuelven menos estables y las interacciones hidrofóbicas se mantienen practicamente sin cambios 0 1 2 3 4 5 6 7 -5 -4 -3 -2 -1 0 C al o r p o r In y ec ci ó n a-CD/IMC 293 K ajuste 1:1 dilución 298 K ajuste 1:1 dilución 303 K ajuste 1:1 dilución 308 K ajuste 1:1 dilución 87 A. Ricardo Hipólito N. [Rekharsky, 1998], lo que podría estar sucediendo en éste caso y por lo tanto, los puentes de hidrógeno se ven afectados entre la a-CD y la IMC, mientras que las interacciones hidrófobas no cambian, por lo que los valores de DH no son lo suficientemente grandes para contrarrestar el efecto del incremento del orden del sistema o del DS, cuando la interacción se lleva hasta temperaturas de 308.15 K. Como puede observarse en la Tabla 5.5 los valores termodinámicos de los experimentos de la Fig. 5.30 se modifican con la temperatura al interaccionar la IMC con la b-CD. Fig. 5.30. Isotermas de enlace y de dilución de la interacción IMCb-CD a pH 7 y diferente temperatura. La isoterma de enlace ya incluye la resta de la dilución. Tabla 5.5. Resultados de ITC obtenidos para la interacción de IMC con b-CD a pH 7 y diferente temperatura. T (K) logK1:1 ∆G (kJ/mol) ∆H (kJ/mol) ‒T∆S (kJ/mol) ∆S (J/molK) 293.15 2.79 ± (3.24×10-4) ‒15.67 ± (1.22×10-4) ‒13.767 ± 0.005 ‒1.899 ± 0.006 6.48 ± 0.02 298.15 2.78 ± (8.72×10-4) ‒15.88 ± (3.13×10-4) ‒14.93 ± 0.01 ‒0.947 ± 0.003 3.18 ± 0.05 303.15 2.74 ± (5.84×10-4) ‒15.88 ± (2.13×10-4) ‒16.411 ± 0.007 0.528 ± 0.002 ‒1.74 ± 0.02 308.15 2.70 ± (5.61×10-4) ‒15.93 ± (2.08×10-4) ‒17.459 ± 0.009 1.527 ± 0.005 ‒4.95 ± 0.03 Se puede observar que el valor de logK1:1 disminuye y el valor de DG de la interacción aumenta, debido al efecto de la temperatura, por lo tanto; la interacción se vuelve menos estable y más espontánea, respectivamente. 0 1 2 3 4 5 6 7 -5 -4 -3 -2 -1 0 C al o r p o r in y ec ci ó n b-CD/IMC 293 K ajuste 1:1 dilución 298 K ajuste 11 dilución 303 K ajuste 1:1 dilución 308 ajuste 1:1 dilución 88 A. Ricardo Hipólito N. Como se puede observar, el valor de DH incrementa por cada 5 K en promedio en 1.23 kJ/mol, como a-CD, el valor se hace más exotérmico, pero el incremento es menor. El valor de -TDS disminuye 1.13 kJ/mol por cada 5 K de aumento en temperatura. Además, debe notarse que los valores de -TDS son muy cercanos a cero, se observa un cambio de signo del valor del -TDS cuando la temperatura es mayor o igual a 303.15 K. La relación DH-DS hace que los valores de DG sean ligeramente más espontáneos que con la a-CD. La mejor temperatura para incluir a la IMC con la β-CD será a 298.15 K, debido a que será más estable y más espontánea. En comparación; los valores de b-CD para DH son menores (menos exotérmicos) y los valores de -TDS son menores (más entrópicos) que la a-CD. La posible razón de que los valores de DH sean menores es debido al tamaño de la cavidad y a la menor interacción que presentan con el residuo de IMC que está incluyendose. La posible razón del valor de -TDS es el fenómeno de desplazamiento de moléculas de agua de la cavidad por la introducción de la IMC, el cual es más marcado con b-CD que con a-CD, ya que es posible que se relacione a la cantidad de moléculas de agua presentes en la cavidad, pues se sabe que a-CD puede almacenar menos moléculas de agua que b-CD y por lo tanto la interacción de IMC con a- CD tenga valores poco entrópicos o valores de -TDS > 0. El valor obtenido para DCp es de ‒251.06 ± 48.22, el cual indica que la IMC interacciona con el ambiénte no polar de la b-CD, el valor es menor que con la a-CD, lo que indicaría menos interacciones de IMC con b-CD y que el tamaño de la CD tiene mucha reelevancia. La a- CD es más pequeña y por lo tanto se puede pensar que tiene más contacto con la IMC al momento de incluirse, mientras que con la b-CD, el contacto se lleva a cabo pero no es en tal grado como con una CD más pequeña, esto podría confirmar los valores tan grandes de DH con a-CD. En el caso de la g-CD, se puede resaltar que la interacción con IMC presenta calores por inyección relativamente bajos, en comparación con las CD anteriores (Fig. 5.31). Aún así, fue posible ajustar los resultados experimentales a un modelo 1:1. Los resultados se muestran en la Tabla 5.6. 89 A. Ricardo Hipólito N. Fig. 5.31. Isotermas de enlace y de dilución de la interacción IMCg-CD a pH 7 y diferente temperatura. La isoterma de enlace ya incluye la resta de la dilución. Tabla 5.6. Resultados de ITC obtenidos para la interacción de IMC con g-CD a pH 7 y diferente temperatura. T (K) logK1:1 ∆G (kJ/mol) ∆H (kJ/mol) ‒T∆S (kJ/mol) ∆S (J/molK) 293.15 2.108 ± 0.001 ‒11.83 ± (6.27×10-4) ‒4.04 ± 0.01 ‒7.79 ± 0.03 26.57 ± 0.03 298.15 2.171 ± 0.001 ‒12.39 ± (6.86×10-4) ‒4.13 ± 0.01 ‒8.26 ± 0.03 27.70 ± 0.04 303.15 2.205 ± 0.002 ‒12.80 ± (1.10×10-3) ‒4.23 ± 0.02 ‒8.57 ± 0.03 28.26 ± 0.06 308.15 2.133 ± 0.004 ‒12.58 ± (1.85×10-3) ‒4.30 ± 0.03 ‒8.28 ± 0.03 26.87 ± 0.10 Como puede observarse los valores de logK1:1 y DG tienen un aumento al incrementar la temperatura, sin embargo, al llegar a la temperatura de 308.15 K el valor disminuye. Hasta ahora, esta es la única CD con la que se presenta este efecto con la temperatura. Este comportamiento puede atribuirse a las contribuciones de DH y DS que se modifican con la temperatura. Los valores de DH se incrementan con el valor de la temperatura. En promedio, por cada 5 K de incremento en temperatura hay un incremento de 0.086 kJ/mol. Además el valor de -TDS es más negativo a medida que la temperatura lo hace, aunque a valores de 308.15 K este comportamiento parece revertirse, en promedio el cambio por cada 0 1 2 3 4 5 6 7 -5 -4 -3 -2 -1 0 293 K ajuste 1:1 dilución 298 K ajuste 1:1 dilución 303 K ajuste 1:1 dilución 308 K ajuste 1:1 diluciónC al o r p o r In y ec ci ó n g-CD/IMC 90 A. Ricardo Hipólito N. 5 K es de 0.16 kJ/mol. Los valores de -TDS son los que dirigen la inclusión en todas las temperaturas, además de que presenta el mismo comportamiento que log K1:1 y de DG. La mejor temperatura para incluir a la IMC con g-CD será a 303.15 K debido a una mayor estabilidad y mayor espontaneidad. El valor obtenido de DCp para la interacción g-CD es de ‒17.68 ± 3.61 J/Kmol, el cual es el valor más bajo hasta ahora. Esto indica que con g-CD, la temperatura no impacta o impacta muy poco a la entalpía. El tamaño parece ser el principal factor para que el valor de DCp sea tan bajo. En comparación con las CD anteriores; se observa que los valores de DH son los más bajos que los de a- y b-CD, es posible pensar que la g-CD no tiene un buen contacto con la IMC. Los valores de -TDS son de los más positivos, indicativo de una mayor cantidad de desorden en el sistema, derivado muy probablemente a la exclusión de moléculas de agua por la entrada de la IMC, además de mayor movimiento conformacional y por lo tanto, de un mayor grado de libertad que el estado inicial, en donde no se ha llevado a cabo la inclusión. Los valores de logK1:1 y de DG son relativamente parecidos a los obtenidos con a-CD, con la diferencia de que con a-CD, la entálpia dirige la inclusión en todas las temperaturas y con g-CD, el valor entrópico es el que la dirige en todas las temperaturas. El balance entrópico- entálpico es lo único que explica estas similitudes pues hace que las contribuciones relativas se cancelen entre sí, provocando por tanto que debe existir un balance adecuado para que la inclusión mejore. Este balance adecuado parece presentarse hasta el momento sólo con la b-CD, ya que los valores entálpicos y entrópicos, se relacionan entre sí para lograr la mejor inclusión, por lo que en el caso de la inclusión de la IMC con b-CD, el balance entre las interacciones hidrofóbicas (puentes de hidrógeno, fuerzas de van der wals etc.) y el desplazamiento de las moléculas de agua serán las que hagan que la interacción mejore. En resumen hasta ahora, se puede confirmar que el valor de DCp en el caso de la interacción IMCCD con CD nativas (o no sustituidas) está relacionado con el desplazamiento de la IMC del ambiente acuoso de la solución, al ambiente hidrofóbico de la cavida de la CD. Es posible 91 A. Ricardo Hipólito N. observar que en todos los casos la temperatura incrementa el valor de DH, debido al incremento de la IMC con las CDs nativas. El tamaño de la cavidad será el determinante de que las interacciones sean mayores o menores. En el caso de la HP-b-CD (Fig. 5.32 y Tabla 5.7) los valores de logK1:1 y DG disminuyen con la temperatura, lo que indica una menor estabilidad y mayor espontaneidad, respectivamente. Los valores de DH aumentan 5.08 kJ/mol (por cada 5 K hay un incremento de 1.93kJ/mol), mientras que los valores de -TDS cambian por 5.09 kJ/mol (por cada 5 K hay un incremento de 2.77 kJ/mol) hacia un mayor orden en el sistema cuando se eleva la temperatura desde 293 a 308 K. En todas las temperaturas, los equilibrios se rigen por su valor de DH. En comparación con la b-CD, se puede observar que los valores de logK1:1 son muy parecidos entre sí, aunque con HP-b-CD los valores numéricos son ligeramente mayores. Al igual que con la b-CD; con la HP-b-CD la inclusión también incrementa en espontaneidad con la temperatura, aunque los complejos de inclusión IMCHP-b-CD, serán más espontáneos. Los valores de DH con la HP-b-CD son muy parecidos a los de b-CD, pero los incrementos de DH son mayores para la HP-b-CD cuando se aumenta la temperatura. Los valores de -TDS son más entrópicos en el caso de HP-b-CD, aunque al aumentar la temperatura a 308.15 K se alcanzan valores parecidos a la b-CD, indicación de que con ambas CDs, la contribución de -TDS disminuye y el orden aumenta. Por lo tanto, es posible observar que el sustituir a la CD con grupos HP, los valores de log K1:1 y DG en general aumentan, indicación de que el balance entálpico-entrópico mejora. Este balance parece ser mejorado por los valores mayores de -TDS cuando la temperatura es baja. Cuando la temperatura es alta, la contribución entálpica será la que mejore la inclusión ya que los valores de -TDS para b-CD y HP-b-CD son práctimente iguales. 92 A. Ricardo Hipólito N. Fig. 5.32. Isotermas de enlace y de dilución de la interacción IMCHP-b-CD a pH 7 y diferente temperatura. La isoterma de enlace ya incluye la resta de la dilución. Tabla 5.7. Resultados de ITC obtenidos para la interacción de IMC con HP-b-CD a pH 7 y diferente temperatura T (K) logK1:1 ∆G (kJ/mol) ∆H (kJ/mol) ‒T∆S (kJ/mol) ∆S (J/molK) 293.15 2.82 ± (1.41×10-3) ‒15.84 ± (4.99×10-4) ‒12.26 ± 0.02 ‒3.57 ± 0.01 12.19 ± 0.06 298.15 2.78 ± (6.11×10-4) ‒15.88 ± (2.19×10-4) ‒14.29 ± 0.01 ‒1.59 ± 0.01 5.34 ± 0.02 303.15 2.84 ± (4.70×10-4) ‒16.47 ± (1.65×10-4) ‒16.07 ± 0.01 ‒0.400 ± 0.001 1.32 ± 0.02 308.15 2.80 ± (5.76×10-4) ‒16.54 ± (2.05×10-4) ‒18.06 ± 0.01 1.52 ± 0.01 ‒4.93 ± 0.03 El valor obtenido de DCp para la interacción de IMC con HP-b-CD es de ‒383.44 ± 28.84 J/molK, este valor al igual que con las demás CDs indica que hay un desplazamiento e interacción hidrofóbica de la parte hidrófoba de la IMC con la CD. El valor obtenido con HP- b-CD es más grande que con b-CD, pero no tan grande que con α-CD. Esto indica que los residuos HP ayudan a mejorar las interacciones hidrófobas por una mayor y mejor penetración en la cavidad de la IMC. Se puede notar que en la Fig. 5.33 los valores de calor por inyección de la interacción IMCHP-g-CD son bajos, en comparación con los demás experimentos con CDs, aún así; fue posible ajustar un modelo 1:1. 0 1 2 3 4 5 6 7 -5 -4 -3 -2 -1 0 293 K ajuste 1:1 dilución 298 K ajuste 1:1 dilución 303 K ajuste 1:1 dilución 308 K ajuste 1:1 diluciónC al o r p o r in y ec ci ó n HP-b-CD/IMC 93 A. Ricardo Hipólito N. Fig.5.33. Isotermas de enlace y de dilución de la interacción IMCHP-g-CD a pH 7 y diferente temperatura. La isoterma de enlace ya incluye la resta de la dilución. Tabla 5.8. Resultados de ITC obtenidos para la interacción de IMC con HP-g-CD a pH 7 y diferente temperatura T (K) logK1:1 ∆G (kJ/mol) ∆H (kJ/mol) ‒T∆S (kJ/mol) ∆S (J/Kmol) 293.15 2.439 ± 0.005 ‒13.69 ± (2.22×10-3) ‒1.49 ± 0.01 ‒12.20 ± 0.04 41.61 ± 0.05 298.15 2.439 ± 0.002 ‒13.92 ± (6.36×10-4) ‒3.30 ± 0.01 ‒10.62 ± 0.04 35.61 ± 0.03 303.15 2.292 ± 0.001 ‒13.30 ± (4.55×10-4) ‒5.36 ± 0.01 ‒7.94 ± 0.03 26.18 ± 0.03 308.15 2.239 ± 0.001 ‒13.21 ± (4.55×10-4) ‒7.13 ± 0.01 ‒6.08 ± 0.02 19.74 ± 0.04 Los valores termodinámicos derivados del modelo 1:1 para la interacción IMCHP-g-CD en función de la temperatura, se muestran en la Tabla 5.8. Se puede observar que los valores de log K1:1 disminuyen con el aumento de la temperatura, indicación de disminución de la estabilidad del complejo de inclusión. Los valores de DG tambien disminuyen indicando que la interacción es menos espontánea con la temperatura. Los valores de DH incrementan con la temperatura indicación de una mayor interacción IMCHP-g-CD, mientras que los valores de DS disminuyen con la temperatura indicación de una disminución en el orden del sistema, esta contribución es la que tiene mayor impacto en la espontaneidad. 0 1 2 3 4 5 6 7 -5 -4 -3 -2 -1 0 293 K ajuste 1:1 dilución 298 K ajuste 1:1 dilución 303 K ajuste 1:1 dilución 308 K ajuste dilución C al o r p o r In y ec ci ó n HP-g-CD/IMC 94 A. Ricardo Hipólito N. El valor de DCp obtenido para interacción de IMCHP-g-CD es de ‒379.76 ± 33.92 J/molK, indicación de que la IMC tiene un desplazamiento hacia las zonas hidrófobas de la HP-g-CD. Este valor en comparación con g-CD es mucho mayor, indicativo de que los grupos HP mejoran las interacciones hidrófobas de manera positiva. En comparación con el valor de HP-b-CD, el valor es ligeramente menor, debido al parecer, al tamaño de la CD, aunque parece ser notorio que los residuos HP, tienen una mejor interaccion con la IMC cuando la temperatura se incrementa. En comparación con la g-CD, la HP-g-CD presenta valores más grandes logK1:1 así como en los valores de DG, siendo los residuos HP las principales razones para el aumento de estos valores. Así como la comparación entre b-CD y HP-b-CD, el balance de las contribuciones entálpicas-entrópicas serán las que hagan que incremente la estabilidad y la espontaneidad. Los valores de DH debido a las interacciones IMCHP-g-CD en comparación con las interacción de IMCg-CD son menores a temperaturas bajas, pero a temperaturas altas los residuos HP mejoran la interacción, esto posiblemente debido a mayor movimiento con la temperatura. En los valores de DS, los residuos de HP parecen producir valores muy grandes a bajas temperaturas, pero al incrementar la temperatura los valores llegan a parecerse entre g-CD y HP-g-CD, indicación de una posible similitud de grados de libertad. Al igual que con b-CD y HP-b-CD, los grupos HP, mejoran los valores de -TDS a temperaturas bajas para mejorar el balance entrópico-entalpico y a temperaturas altas será el valor de DH el que mejore el balance. Como se pudo observar, un incremento en la temperatura hace mejorar al complejo de inclusión en el caso de la b-CD, g-CD y HP-b-CD. Mientras que para a-CD y HP-g-CD la temperatura tuvo un efecto contrario. La temperatura parece tener un efecto mayor en las CDs en donde son importantes las interacciones, esto confirma que la temperatura debilita a las interacciones, mas directamente, a los puentes de hidrógeno. Para concluir, el análisis de DCp de acuerdo a los datos de la Fig. 5.34 y la Tabla 5.9; de las interacciones IMCCDs, nos permitió observar el efecto que el tamaño de la CD tiene, además de que las interacciones hidrofóbicas no se darán de la misma manera para todas las CDs. En 95 A. Ricardo Hipólito N. la Fig. 5.34 se observan claramente las zonas en las que los valores de DH se encuentran, de acuerdo al tamaño; mientras mayor el tamaño menor valor de entropía, además de que mientras mayor el tamaño, menos será el incremento del desplazamiento e interacción del residuo hidrofobo de la IMC con las partes hidrófobas de la CD. Se ha hablado sobre la relación de la cantidad de la deshidratación de las partes hidrófobas de la IMC y de las CDs con un valor negativo de DCp, este fenómeno es observado para todas las CDs parece ser que a mayor contacto más negativo será el valor de DCp. La temperatura hace que los equilibrios de formación de complejo de inclusión IMCCD sean más exotérmicos y menos entrópicos. Fig. 5.34. Curvas de la relación del DH en función de la temperatura para la determinación del DCp la línea continua señala el ajuste de mínimos cuadrados. Tabla 5.9. Resultados del DCp obtenidos a partir de las curvas de la Fig. 5.34. CD DCp (J/molK) α ‒452.75 ± 27.25 β ‒251.06 ± 48.22 γ ‒17.68 ± 3.61 HP-β ‒383.44 ± 28.84 HP-γ ‒379.76 ± 33.92 295 300 305 310 -30 -25 -20 -15 -10 -5 0 D H ( k J/ m o l) Temperatura (K) a-CD b-CD g-CD HP-b-CD HP-g-CD 96 A. Ricardo Hipólito N. La relación entre las contribuciones DH y DS serán las que determinen la espontaneidad y la estabilidad, por el equilibrio de fuerzas que estén presentes e involucradas en la interacción. Estudio de la compensación entálpica-entrópica. Como se ha hablado anteriormente, las contribuciones termodinámicas DH y DS por sí mismas dan indicios de cómo es que la inclusión IMCCD se lleva a cabo. Aunque, es posible señalar que una contribución en partícular es la que lleva, dirige o gobierna la interacción; al final el balance será el que determine si una inclusión es espontánea o no. Por lo tanto, vale la pena analizar más profundamente este balance para entender mejor las fuerzas que están involucradas en la interacción y entender mejor el fenómeno de inclusión. Un efecto entrópico-entálpico debido al cambio de temperatura, es consecuencia de efectos de DCp finitos [Cooper, 1995; 1999]. Cuando hay una compensación entropíca-entalpíca se observa una correlación lineal [McPhail, 1997]. Es una consecuencia inevitable de perturbación de cualquier sistema en donde existen multiples fuerzas intermoleculares débiles. Cuando existen rompimientos de enlace, en cualquier sistema [incluyendo el solvente], el sistema será endotérmico DH > 0, pero será compensado por una entropía DS > 0 que resulta de un incremento en flexibilidad molecular [Cooper, 1999]. La relación lineal de DH y DS observada experimentalmente lleva a la Ec. 5.3. Donde el coeficiente proporcional b tiene dimensiones de temperatura. De una combinación de la Ec. 5.3 y de la diferencial de la forma de Gibbs-Helmholtz Ec. 5.4 se obtiene 5.5. ∆𝐻 = 𝛽∆∆𝑆 (Ec. 5.3) ∆𝐺 = ∆∆𝐻 − 𝑇∆∆𝑆 (Ec. 5.4) ∆𝐺 = 21 − 4 b 5 ∆∆𝐻 (Ec. 5.5) La ecuación 5.5 indica un punto crítico llamado temperatura isocinética o de isoequilibrio (b). La velocidad o constante de equilibrio es totalmente independiente del cambio de entalpía causado por cualquier alteración en sustituyente, solvente, etc. Este fenómeno se ha observado para muchas reacciones y equilibrios [Rekharsky, 1998]. 97 A. Ricardo Hipólito N. De la relación compensatoria dónde el valor de TDS se relaciona linealmente con el valor de DH se obtiene la Ec. 5.6, que al integrarse se obtiene la Ec. 5.7 y la subsecuente combinación con 5.4 se obtiene la Ec. 5.8. 𝑇∆∆𝑆 = 𝛼∆∆𝐻 (Ec. 5.6) 𝑇∆𝑆 = 𝛼∆𝐻 + 𝑇∆𝑆7 (Ec. 5.7) ∆∆𝐺 = (1 − 𝛼)∆∆𝐻 (Ec. 5.8) Por lo tanto, la pendiente (a) de la curva TDS contra DH (Ec. 5.7) indica cuanto de la ganancia entálpica DDH es cancelada por la pérdida entrópica. Es decir, sólo una fracción (1-a) de la ganacia entálpica puede contribuir a la mejora de la estabilidad del complejo. Por otro lado, la intersección (TDS) representa la estabilidad del complejo inherente (DG) obtenida cuando DH = 0, lo cual significa que el complejo se estabiliza inclusive en ausencia de ganancia entálpica, cuando el término TDS0 es positivo. Usando los valores de a y TDS0 como medidas cuantitativas de los cambios conformacionales y desolvatación tanto del anfitrión como el huésped, diversos sistemas químicos y biológicos supramoleculares pueden ser analizados consistentemente, a pesar de las diferencias en interacciones débiles en cada sistema supramolecular [Rekharsky, 1999; 2006]. En la Fig. 5.35 es posible observar como la interacción de la IMC con las diferentes CDs tienen valores caracteristicos. Con la mayoría de las CDs se tiene una compensación lineal de DH y de TDS, sólo con g-CD no es lineal. El comportamiento de menor valor de DH y TDS parece ser debido a una interacción más rígida [Dunitz, 1995]. Es claro que los valores obtenidos tanto de DH y de TDS dependen principalmente al tamaño de la cavidad de la CD. Cómo se puede observar en la Tabla 5.10 de resultados, los valores de pendiente (a) van desde 0.86-1.11 los cuales son grandes pero concuerdan con los obtenidos para diferentes experimentos con CDs [Rekharsky, 1998]. Los valores de ordenada o TDS0 son muy cercanos entre sí teniendo un valor entre 14 y 14.85, los cuales son comparables a los reportados para CDs y otros huéspedes de (TDS0 = 13 kJ/mol), y de los valores de éteres corona (TDS0 = 12 kJ/mol), éstos valores confirman que la liberación de moléculas de agua que originalmente 98 A. Ricardo Hipólito N. residían dentro de la cavidad y la deshidratación inducida de los grupos hidroxilos periféricos de la CD y de la IMC; son conjuntamente responsables de una ganancia entrópica grande. Fig. 5.35. Curvas de la compensación entálpca-entrópca para la interacción IMCCDs, los diferentes puntos se obtuvieron a 295.15, 298.15, 303.15 y 308.15 K Tabla 5.10. Resultados del análisis de mínimos cuadrados de la compensación entálpica-entrópica para la interacción IMCCDs CD Pendiente (a) Ordenada TDS0 (kJ/mol) α 1.09 ± 0.11 14.24 ± 2.71 β 0.94 ± 0.11 14.85 ± 1.75 γ ‒‒‒ ‒‒‒ HP-β 0.86 ± 0.18 14.07 ± 2.71 HP-γ 1.11 ± 0.24 14.00 ± 1.17 El valor obtenido para IMCa-CD de la pendiente o valor a es igual a 1.09±0.11 y de TDS0 = 14.24±2.71. El valor tan grande de pendiente se puede atribuir a un incremento de cambios conformacionales, esto quiere decir que las componentes entrópicas no son completamente compensadas por las componentes entálpicas, esto concuerda debido a que el tamaño más pequeño y por lo tanto a una interacción más apretada, lo que haría que la IMC tuviera una disminución de movimiento conformacional pero las interacciones no llegan a compensar. -30 -25 -20 -15 -10 -5 0 -20 -15 -10 -5 0 5 10 15 a-CD b-CD g-CD HP-b-CD HP-g-CD T D S ( k J/ m o l) DH (kJ/mol) 99 A. Ricardo Hipólito N. Por otro lado, el valor de TDS0 señala la suposición de tener un valor de DH = 0, lo que supodría que no hay interacciones presentes; lo que confirmaría que la desolvatación o incremento de grados de libertad cuando se da el contacto, será lo que ayuda a que el complejo sea estable cuando no existan interacciones presentes [Schönbeck, 2010]. Para la interacción IMCb-CD, el valor de pendiente es de 0.94±0.11, el cual indica que sólo el 6% de la pérdida o ganancia de entalpía (DDH) inducida por las alteraciones del sistema se refleja en el incremento neto de la estabilidad del complejo (DDG). Este es un resultado del efecto entrópico (DDS) cancelador que lo acompaña. Esto quiere decir que el valor entálpico se cancela mas por el mayor efecto entrópico que se presenta. Es más pequeño que el valor obtenido para la interacción IMCa-CD. Por otra parte, el valor de TDS0 = 14.85 ± 2.71, es un poco mayor que la interacción IMCa-CD indicativo de que será un complejo más estable cuando DH = 0, además de una mayor penetración a a la cavidad [Schönbeck, 2010]. Este resultado confirma como la salida de aguas de la cavidad tienen tal impacto como para poder estabilizar el complejo de inclusión. En el caso de la g-CD no fue posible obtener los valores de pendiente ni de ordenada, debido a que no presentan un comportamiento lineal, es posible que debido a su gran tamaño las interacciones con la IMC no llegan a compensarse de manera directamente proporcional. Se observa que los valores de DH parecen ser ligeramente mayores y que las interacciones se debilitan [Cooper, 1999], pero al igual que todas las CDs el valor de TDS disminuye, lo que indica una tendencia a la disminución de grados de libertad. Cuando la IMC interacciona con HP-b-CD, el valor de pendiente es de 0.86±0.18, el cual indica que sólo el 14% de la pérdida o ganancia de entalpía (DDH), inducida por las alteraciones del sistema, se refleja en el incremento neto de la estabilidad del complejo (DDG). Este es un resultado del efecto entrópico (DDS) cancelador que lo acompaña. Esto quiere decir que el valor entálpico ganado se cancela aún más por el mayor efecto entrópico comparado con b-CD, por lo tanto el valor es más pequeño que el valor obtenido para la interacción IMCa-CD y que IMCb-CD. Por otra parte, el valor de TDS0 = 14.07±2.71, es menor que la interacción IMCa-CD y que IMCb-CD indicativo de que será un complejo 100 A. Ricardo Hipólito N. menos estable cuando DH = 0, en comparación a las CDs nativas. Este resultado confirma que en este caso, el contacto es esencial para poder estabilizar el complejo de inclusión. La interacción IMCHPg-CD presenta valores de pendiente de 1.11 ± 0.24; es de los valores más grandes obtenidos, esto quiere decir que las componentes entrópicas no son completamente compensadas por las componentes entálpicas. Con el valor de TDS0 = 14.00 ± 1.17, es posible observar que al considerar un DH = 0 el complejo presenta una estabilidad parecida a HP-b-CD. Al parecer las interacciones en este caso también son relevantes para estabilizar al complejo. Para este punto es muy notorio el agrupamiento de las curvas cuando se tienen cavidades similares, así pues se observa, que los valores para estructuras con b-CD, se encuentran a valores de DH entre -20 y -10 kJ/mol y TDS muy cercanos a 0 kJ/mol. Para estructuras con g-CD los valores de DH se encuentran entre -7 y 0 kJ/mol y a TDS mayores a 5 kJ/mol. Para la a-CD se encuentra en valores de DH entre -30 y -20 kJ/mol y a TDS menores a 5 kJ/mol. Este efecto de agrupamiento no se observa para diferentes moléculas huéspedes [McPhail, 1997; Schönbeck, 2010]. No se observan cambios en la pendiente que puedan asignarse al tamaño de las CDs, a pesar de que se ha reportado que el valor de pendiente tiende a aumentar cuando la cavidad aumenta [Rekharsky, 1999]. Se observan cambios relacionados a los grupos HP en los valores de TDS0 siendo considerablemente más pequeños cuando las CDs están sustituidas. La compensación entrópica-entálpica nos permitió analizar el efecto de las contribuciones termodinámicas y asociarlas directamente a un efecto determinante para la inclusión. Es posible confirmar: la importancia tan considerable de la cavidad para los valores relativos de DH y TDS, así como el aumento en las interacciones debido a la temperatura para observar al complejo más rigido o con menos grados de libertad. Además de confirmar la importancia de la desolvatación de ámbos analítos (IMC y CDs) para la formación de los complejos de inclusión. Parece ser una pendiente o valor (a) mayor a 1 no ayuda a la inclusión de la IMC, mientras que un valor menor a 1 mejora la inclusión. Además se puede observar que un aumento o disminución en la cavidad las fuerzas que estabilizan al complejo serán diferentes, por lo tanto se confirma que debe existir un equilibrio entre las fuerzas y un tamaño intermedio de cavidad (entre CDs nativas) para que la IMC se incluye efectivamente. 101 A. Ricardo Hipólito N. 5.6. Estudios de la interacción de los complejos M(IMC)2(H2O)2 en presencia de CDs. 5.6.1. Diagramas de solubilidad de fases de los complejos M(IMC)2 en presencia de CDs. Para diferenciar las especies en solución de las especies sólidas se utilizará: M(IMC)2(H2O)2 para las especies sólidas y M(IMC)2 (Cu(IMC)2 y Zn(IMC)2) para las especies en solución. De la evidencia experimental presentada anteriormente, se propone que los complejos Cu(IMC)2 y Zn(IMC)2, en solución acuosa, son especies mononucleares con dos moléculas de IMC enlazadas al metal central. Los complejos CuIMC2(H2O)2 y ZnIMC2(H2O)2 son sólidos insolubles en agua, es bien conocido que las CDs incrementan la solubilidad de moléculas poco solubles. El efecto de las CDs sobre la solubilidad de los complejos Cu(IMC)2(H2O)2 y Zn(IMC)2(H2O)2 preparados en la sección 5.2, se muestra a continuación. La Fig. 5.36 muestra que la cantidad de los complejos M(IMC)2 en solución es proporcional a la concentración de CD, todas las curvas son lineales con pendientes positivas (Higuchi, 1965). La Tabla 5.11 compila la pendiente, el coeficiente de correlación (de un ajuste de mínimos cuadrados) y el porcentaje de incremento de solubilidad. Asumiendo que sólo existen especies mononucleares presentes en solución la solubilidad de Cu(IMC)2 y Zn(IMC)2 es S0 = (3.14 ± 2.35) × 10-5 and S0 = (2.49 ± 1.90) × 10-5 M, respectivamente. Estos valores concuerdan con los reportados por Dillon de 2004 y Fini de 2001. Fig. 5.36. Diagramas de solubilidad de fases para a)Cu(IMC)2 y Zn(IMC)2 en presencia de CDs 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.0 2.0x10 -4 4.0x10 -4 6.0x10 -4 8.0x10 -4 1.0x10 -3 [C u IM C 2 ] (M ) a-CD b-CD g-CD HP-b-CD HP-g-CD [CD] (M) 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.0 2.0x10 -4 4.0x10 -4 6.0x10 -4 8.0x10 -4 1.0x10 -3 [CD] (M) [Z n IM C 2 ] (M ) a-CD b-CD g-CD HP-b-CD HP-g-CD a) b ) [ C u( IM C ) 2 ] (M ) [Z n( IM C ) 2 ] (M ) 102 A. Ricardo Hipólito N. En el caso de Cu(IMC)2 (Fig. 5.36a), el incremento más grande se produce con β-CD; desafortunadamente, esta CD tiene la solubilidad más baja en agua, limitando el incremento de solubilidad de Cu(IMC)2. La HP-β-CD tiene mejor solubilidad que la β-CD, favoreciendo grandes cantidades de Cu(IMC)2 en solución más que con β-CD. Además de la solubilidad de la CD, parece que existen otros factores que afectan la velocidad del incremento o el aumento de la solubilidad de los complejos M(IMC)2(H2O)2 en solución. Tabla 5.11. Pendiente, coeficiente de correlación y porcentaje de incremento de solubilidad de Cu(IMC)2 and Zn(IMC)2 en presencia de CDs. Cu(IMC)2 (S0=(3.14±2.35)×10-5M) CD pendiente % aumento solubilidad R2 Solubilidad de CDs (g/100 mL water) HP-β (6.60 ± 0.95)×10-3 1624.37 ± 74.75 0.99 >120.0 α (4.50 ± 2.10)×10-3 1146.62 ± 76.33 0.98 14.5 β (16.10 ± 1.80)×10-3 780.34 ± 78.33 0.99 1.85 γ (5.20 ± 0.90)×10-3 633.82 ± 74.87 0.99 23.2 HP-γ (1.90 ± 0.50)×10-3 423.61 ± 75.86 0.99 80.0 Zn(IMC)2 (S0=(2.49±1.90)×10-5M) CD pendiente % aumento solubilidad R2 Solubilidad de CDs (g/100 mL water) HP-β (16.80 ± 0.54) ×10-3 3474.07 ± 76.92 0.99 >120.0 α (4.70 ± 0.50)×10-3 1608.36 ± 77.31 0.99 14.5 HP-γ (4.30 ± 0.50) ×10-3 1419.38 ± 76.62 0.99 80.0 β (19.80 ± 2.30) ×10-3 1190.19 ± 76.59 0.99 1.85 γ (2.50 ± 0.20)×10-3 655.41 ± 82.24 0.99 23.2 Por ejemplo, los residuos HP en la HP-β-CD reducen la tasa de incremento de la solubilidad de Cu(IMC)2 comparada con β-CD. Un efecto similar sucede con HP-γ-CD comparada con γ-CD. Adicionalmente, aunque a-CD y g-CD tengan una solubilidad más grande que β-CD, la taza de incremento en la concentración en solución de M(IMC)2 es pequeña en 103 A. Ricardo Hipólito N. comparación a la CD adicionada. Por otra parte, para Zn(IMC)2 (Fig. 5.36b) el mejor resultado en aumentar su solubilidad se tiene con β-CD y HP-β-CD. Las otras CD muestran capacidades solubilizantes parecidas entre ellas, con pendientes muy cercanas (Tabla 5.11). A diferencia de Cu(IMC)2, parece ser que los residuos HP de las CDs no tienen un efecto sobre la solubilidad de Zn(IMC)2; este hecho parece estar relacionado con la estructura del complejo. Como ya se ha establecido, el incremento de solubilidad está relacionado con la cantidad de CD en solución, por lo tanto, el orden de incremento de solubilidad de los complejos es el siguiente: HP-β-CD > α-CD > β-CD > γ-CD. Este orden es diferente a la solubilidad de las CDs el cual presenta el siguiente orden HP-β-CD > HP-γ-CD > γ-CD > α-CD > β-CD (Saokham, 2018). El tamaño de la cavidad parece tener cierto impacto en incluir a la IMC ya que al comparar la α-CD con β-CD y HP-β-CD la HP-β-CD presenta una mayor pendiente que α-CD, tanto para Cu(IMC)2 y Zn(IMC)2, sin embargo para γ-CD o HP-γ-CD la pendiente es de las más bajas. 5.6.2. Estudios de EPR de especies solubles de CuIMC2 con CDs. Debido al incremento de solubilidad de los complejos M(IMC)2 en agua, la técnica de resonancia paramagnética electrónica (EPR, por sus siglas en inglés, ANEXO A4) se usó para identificar las especies mononucleares o dinucleares de las especies solubles de Cu(IMC)2 en un exceso de CD. Las concentraciones altas de CD (como se observa en la Fig. 5.36) ayudan a alcanzar concentraciones en solución de [Cu(IMC)2] ≈ 1 × 10-4 M at pH = 6- 7 una concentración que cae dentro de los intervalos de concentración de la técnica de EPR. Los resultados de EPR de la Fig. 5.37 y Tabla 5.12. confirman la presencia de una especie mononuclear de cobre, en solución congelada, en presencia de CDs, los espectros exhiben evidencia de una señale típica cerca de 330 mT para el ion Cu(II) S=½. Algunas señales de acoplamiento hiperfino (A∥) se pueden observar para Fig. 5.37b) α-CD y Fig. 5.37e) HP-β- CD. Adicionlmente una mezcla de CuCl2 y NaIMC en relación 1:2 en etanol (EtOH) para tener [Cu(II)]total=10-4M, fue preparada para detectar [Cu(IMC)2(EtOH)2], sus parámetros se observan en la tabla 5.12. Para todos los espectros se calculó g⊥, para b) y e) se realizó una simulación para calcular los valores de g∥ y A∥, estos resultados se observan en Tabla 5.12. 104 A. Ricardo Hipólito N. Los valores sugieren una estructura elongada octaédrica con estado basal 𝑑;<=>< en donde 2 IMCs quelatan al Cu(II) en posición trans (Fig. 2.28) y 2 moléculas de H2O se coordinan en posción axial. Se poropone una estequiometría [Cu(IMC)2H2O]. Fig.5.37. EPR espectra of CuIMC2 in a)H2O, b)α-CD, c)β-CD, d)γ-CD, e)HP-β-CD, f)HP-γ-CD Tabla 5.12. Valores de A//, g// y g⊥, obtenidos por la simulación de los gráficos de EPR de la Fig. 5.37. CD A// (mT) g// g⊥ α 13.5 2.3880 2.0770 β — — 2.0775 γ — — 2.0784 HP-β 12.5 2.3880 2.0770 HP-γ — — 2.0676 [CuIMC2(EtOH)2] 12.5 2.3655 2.0740 5.6.3. Estudio por calorimetría de titulación isotérmica (ITC) de la interacción M(IMC)2 con CDs. Cuando los complejos M(IMC)2 interactúan con las CD (consideradas como ligantes) pueden interactuar independientemente con cualquiera de los residuos IMC disponibles en el complejo metálico mononuclear (Fig. 2.28). Por lo tanto, para describir el fenómeno de inclusión y los datos experimentales de ITC (Figs. 5.38-5.42) se propone un modelo de ajuste de dos sitios sucesivos independientes y equivalentes, como se presentan en la Ec. 5.9 y Ec. 5.10 [Bouchemal, 2012]. Los parámetros termodinámicos: logK1 ΔG1, ΔH1, and ΔS1 para el primer sitio y logK2, ΔG2, ΔH2, y ΔS2 para el segundo sitio, así como los parámetros globales de la inclusión; β1, ΔGg, ΔHg and ΔSg, (Ec. 5.11) se reportan en la Tabla 5.13 for Cu(IMC2 and ZnIMC2. De los 0 300 600 f e d c b Magnetic Field (mT) a a b c d e f Campo Magnético (mT) 105 A. Ricardo Hipólito N. resultados de la Tabla 5.13 se puede observar que la inclusión de M(IMC)2 en CDs es un proceso espontáneo independientemente del sitio (ΔG1 < 0 y ΔG2 < 0). (Ec. 5.9) (Ec. 5.10) (Ec. 5.11) Comparando α-CD con β-CD y HP-β-CD, la inclusión global de la primer CD es ligeramente menos espontáneo (este comportamiento es apreciable en la Tabla 5.13). En general, ΔG1 < ΔG2 excepto para Cu(IMC)2HP-β-CD. Ahora, comparando entre los centros metálicos, Cu(IMC)2 en β-CD es más espontáneo que en HP-β-CD; Zn(IMC)2 se comporta de una manera opuesta, siendo la interacción con HP-β-CD más espontánea que con β-CD. El fenómeno de inclusión regularmente se discute en términos de contribuciones entálpicas y entrópicas para la energía de Gibbs [Bouchemal, 2012; Rekharsky, 1998, 2006, 2002; Crini, 2014; Cooper, 1999, 2001]. Que una reacción sea impulsada entrópicamente (|DH| < |TDS|) significa que los grados de libertad se incrementan en la interacción. Dos efectos competitivos son notorios: la reducción de entropía por el efecto del cambio conformacional de M(IMC)2 después de la inclusión; y el incremento de entropía debido a la liberación de moléculas de agua de la cavidad para contener al complejo M(IMC)2 (Todorova, 2007). Las interacciones hidrofóbicas son impulsadas entrópicamente, donde la entropía (DS) de la interacción es grande y positiva y la entalpía es una contribución baja. (Bouchemal, 2012). El incremento de la entropía debido a la liberación de moléculas de agua incrementa con el tamaño de la cavidad de las CDs. Cuando una reacción se impulsa por contribuciones entálpicas (|DH| > |TDS|) , quiere decir que los interacciones de van der Waals tendrán mayor contribución que las entropías por interacción (Bouchemal, 2012). Los complejos M(IMC)2 poseen importantes fragmentos hidrofóbicos, los residuos aromáticos de los ligantes IMC, que son estabilizados por las cavidades de CDs liberan energía. Además, las moléculas de agua dentro de la cavidad son moléculas con estados energéticos más grandes comparados con las moléculas de agua en el seno de la solución, esta energía también se libera durante la inclusión de M(IMC)2. M(IMC) 2 CD M(IMC) 2 M(IMC) 2 M(IMC) 2 CD 2 M(IMC) 2 CD 2 M(IMC) 2 CD 106 A. Ricardo Hipólito N. Tabla 5.13. Resultados de ITC de la interacción de los complejos M(IMC)2 con CDs CuIMC2 CD(1st site) logK1 ΔG1 (kJ/mol) ΔH1 (kJ/mol) ‒TΔS1 (kJ/mol) ΔS1 (J/molK) α 3.35 ± 0.02 ‒19.093 ± 0.005 ‒24.41 ± 0.41 5.31 ± 0.41 ‒17.82 ± 1.38 β 3.27 ± 0.25 ‒18.67 ± 0.08 ‒4.40 ± 0.94 ‒14.26 ± 1.02 47.84 ± 3.42 HP-β 2.85 ± 0.01 ‒16.260 ± 0.004 ‒19.89 ± 0.45 3.63 ± 0.45 ‒12.18 ± 1.52 CD (2nd site) logK2 ΔG2 (kJ/mol) ΔH2 (kJ/mol) ‒TΔS2 (kJ/mol) ΔS2 (J/molK) α 2.11 ± 0.02 ‒12.07 ± 0.01 ‒152.32 ± 4.65 140.25 ± 4.66 ‒470.41 ± 15.62 β 2.70 ± 0.47 ‒15.40 ± 0.17 ‒5.10 ± 0.95 ‒10.30 ± 1.12 34.55 ± 3.77 HP-β 3.11 ± 0.03 ‒17.72 ± 0.01 9.47 ± 0.47 ‒27.19 ± 0.48 91.21 ± 1.60 CD (global) logβ ΔGg (kJ/mol) ΔHg (kJ/mol) ‒TΔSg (kJ/mol) ΔSg (J/molK) α 5.46 ± 0.03 ‒31.16 ± 0.01 ‒176.73 ± 5.06 145.57 ± 17.00 ‒488.23 ± 17.00 β 5.97 ± 0.72 ‒34.06 ± 0.25 ‒9.50 ± 1.89 ‒24.57 ± 2.14 82.39 ± 7.18 HP-β 5.95 ± 0.04 ‒33.98 ± 0.01 ‒10.42 ± 0.92 ‒23.56 ± 0.93 79.03 ± 3.12 ZnIMC2 CD(1st site) log K1 ΔG1 (kJ/mol) ΔH1 (kJ/mol) ‒TΔS1 (kJ/mol) ΔS1 (J/molK) α 3.41 ± 0.13 ‒19.44 ± 0.04 ‒3.67 ± 0.54 ‒15.77 ± 0.58 52.90 ± 1.96 β 2.99 ± 0.02 ‒17.09 ± 0.01 ‒26.22 ± 1.16 9.13 ± 1.17 ‒30.63 ± 3.92 HP-β 3.39 ± 0.01 ‒19.371 ± 0.002 ‒10.44 ± 0.68 ‒8.93 ± 0.69 29.94 ± 2.30 CD(2nd site) logK2 ΔG2 (kJ/mol) ΔH2 (kJ/mol) ‒TΔS2 (kJ/mol) ΔS2 (J/molK) α 2.02 ± 0.19 ‒11.55 ± 0.10 ‒62.86 ± 0.88 51.31 ± 0.98 ‒172.09 ± 3.29 β 2.46 ± 0.06 ‒14.05 ± 0.02 ‒7.02 ± 1.20 ‒7.03 ± 1.22 23.59 ± 4.09 HP-β 2.39 ± 0.01 ‒13.645 ± 0.003 ‒38.16 ± 3.48 24.52 ± 3.49 ‒82.24 ± 11.69 CD (global) logβ ΔGg (kJ/mol) ΔHg (kJ/mol) ‒TΔSg (kJ/mol) ΔSg (J/molK) α 5.43 ± 0.32 ‒30.99 ± 0.13 ‒66.53 ± 1.43 35.54 ± 1.56 ‒119.19 ± 5.24 β 5.46 ± 0.08 ‒31.14 ± 0.03 ‒33.24 ± 2.36 2.10 ± 0.69 ‒7.04 ± 4.67 HP-β 5.78 ± 0.01 ‒33.64 ± 0.01 ‒48.61 ± 4.17 15.59 ± 4.17 ‒52.29 ± 13.99 107 A. Ricardo Hipólito N. Al analizar las contribuciones entálpicas y entrópicas para ΔGg se puede observar que la inclusión Cu(IMC)2 en α-CD es impulsada entálpicamente, en contraste, inclusión en β-CD y HP-β-CD es controlada entrópicamente. Parece ser que las moléculas de agua liberadas de la cavidad son determinantes en la inclusión en β-CD y HP-β-CD en comparación con α-CD, lo cual concuerda con el contenido en la cavidad de la CD antes de la inclusión. Para Zn(IMC)2, la entalpía guía la inclusión para las 3 CDs. Se espera que para la α-CD al ser una cavidad pequeña, las interacciones débiles sean mayores o más numerosas, explicando la entalpía tan grande y por lo tanto en comparación con β-CD y HP-β-CD, al tener un mayor tamaño en la cavidad son propensas a tener pocas interacciones (Wenz, 2008, Danil de Namor, 1990, Bouchemal, 2012, Rekharsky, 2002). La interacción de la CDs con el primer sitio de M(IMC)2 es un proceso más exotérmico que la interacción con el segundo sitio, excepto para Cu(IMC)2HP-β-CD, donde el segundo sitio es más exotérmico que el primero, lo anterior puede explicarse por una posible disminución en interacciones. En cualquier caso esta evidencia nos indica que los sitios no son equivalentes. Respecto a la contribución exotérmica, la interacción de Cu(IMC)2 con α-CD es más exotérmica que con Zn(IMC)2. En contraste, la interacción de Zn(IMC)2 es más exotérmica que Cu(IMC)2 con β-CD y HP-β-CD. Esto indica que el complejo con Cu(IMC)2 presenta mayores interacciones con α-CD, por otra parte; Zn(IMC)2 presenta mejores interacciones con β-CD y HP-β-CD. Lo anterior puede estar relacionado con diferencias estructurales entre Cu(IMC)2 y Zn(IMC)2. La contribución entrópica de Zn(IMC)2 es negativa para las tres CDs. Los complejos de cobre presentan un comportamiento diferente, el cambio de entropía es negativo para α-CD, pero positivo para β-CD y HP-β-CD. Además, la inclusión de Zn(IMC)2 en α-CD resulta en un ΔSg menos negativo que con Cu(IMC)2. Ahora, para β-CD y HP-β-CD, ΔSg para Zn(IMC)2 es negativo mientras que para Cu(IMC)2 es positivo. Como se ha discutido, el cambio entrópico debido a la inclusión de Cu(IMC)2 y Zn(IMC)2 puede ser analizado en términos de dos contribuciones competitivas: la disminución de entropía asociada con la reducción de libertad conformacional del complejo en la inclusión y el aumento de entropía debido a la salida de moléculas de agua de la cavidad, conforme la parte hidrofóbica del complejo ocupa la cavidad de la CD. 108 A. Ricardo Hipólito N. Por lo tanto, la entropía positiva para la inclusión de Cu(IMC)2 puede indicar que la reducción en los grados de libertad conformacional de Cu(IMC)2 es insuficiente para superar la entropía generada por la salida de moléculas de agua. Por otra parte, la entropía negativa, asociada con la inclusión de Zn(IMC)2 podría explicarse si la disminución en los grados de libertad conformacional del Zn(IMC)2 excede el incremento en entropía debido a la deshidratación Fig. 5.38. Los gráficos a) y b) muestran los potenciogramas del experimento de dilución; los gráficos c) y d) muestran los potenciogramas de la titulación de α-CD con Cu(IMC)2 y Zn(IMC)2 respectivamente. Los gráficos e) y f) muestran los isotermas de enlace obtenidos para la dilución, la titulación y el ajuste al modelo de dos sitios sequenciales independientes.. 0 20 40 60 80 -1.2 -1.0 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0.0 ZnIMC 2 a-CD Dilución Titulación AjusteC al o r p o r in y ec ci ó n Relación Molar 0 20 40 60 80 100 120 140 160 -5.0 -4.0 -3.0 -2.0 -1.0 0.0 P o te n ci a (µ W ) Tiempo (min) a-CD (Dilución) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 -5.0 -4.0 -3.0 -2.0 -1.0 0.0 P o te n ci a (µ W ) Tiempo (min) a-CD (Titulación) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 -5.0 -4.0 -3.0 -2.0 -1.0 0.0 P o te n ci a (µ W ) Tiempo (min) a-CD (Titulación) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 -5.0 -4.0 -3.0 -2.0 -1.0 0.0 P o te n ci a (µ W ) Tiempo (min) a-CD (Dilución) 0 100 200 300 400 500 600 -1.2 -1.0 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0.0 CuIMC 2 a-CD Dilución Titulación AjusteC al o r p o r In y ec ci ó n Relación Molar Cu(IMC)2 /𝛂-CD Zn(IMC)2 /𝛂-CD a) b) c) d) e) f) 109 A. Ricardo Hipólito N. de la cavidad. Por lo tanto, los resultados en Tabla 5.13 señalaría que la molécula de Cu(IMC)2 tendría una estructura más rígida que el complejo de Zn(IMC)2. En general, las CDs interactúan con M(IMC)2 espontáneamente, la manera en que las CDs interactúan con los sitos es de manera independiente y no equivalentes. Se llegó a esta conclusión gracias a la elección de un modelo adecuado para explicar los datos experimentales. La relación entre DH y DS determina tendencia de formar un complejo de inclusión. Es apreciable que la cavidad de la CD es importante para determinar los valores relativos de DH y DS, pero también lo es la molécula huésped, la cantidad de interacciones y la libertad conformacional al momento de darse la inclusión. De los valores obtenidos de logK1 and logK2 por ITC (Tabla 5.13), es posible construir diagramas de distribución de especies (Fig. 5.43) para la inclusión de M(IMC)2 (en sus concentraciones de solubilidad, S0 en Tabla 5.11) en función de la cantidad de CD adicionada, expresada como pCDTotal (‒log[CD]Total). Es notorio que en todos los diagramas la primer especie. M(IMC)2CD, no alcanza el 100% de formación, su predominio se encuentra alrededor de pCDTotal ≈ 3. El predominio de M(IMC)2(CD)2 sucede cuando pCDTotal < 2. Algunas diferencias entre Cu(IMC)2 y Zn(IMC)2 se pueden observar. En el caso de los diagramas con α-CD los complejos no muestran muchas diferencias. Para obtener un complejo M(IMC)2 completamente incluido, menor cantidad de β-CD se necesita con Cu(IMC)2 que con Zn(IMC)2. En el caso de HP-β-CD; el complejo Zn(IMC)2HP-β-CD predominara en un ligero mayor porcentaje que Cu(IMC)2HP-β-CD. Al comparar la CDs se puede observar que el complejo Cu(IMC)2α-CD presentará un mayor porcentaje de predominio que los demás complejos Cu(IMC)2CD. Será necesario adicionar menor β-CD y HP-β-CD para alcanzar la formación del 100% (fracción = 1) del complejo Cu(IMC)2(CD)2. No se observan diferencias considerables en el caso de β-CD y HP-β-CD con el complejo de CuIMC2. El complejo Zn(IMC)2α-CD al igual que Cu(IMC)2α-CD tendrá el mayor porcentaje de predominio que sus similares Zn(IMC)2CD. Aunque la CDs que necesitará menor cantidad de CD para formar el complejo M(IMC)2(CD)2 con Zn(IMC)2 serán la β-CD y HP-β-CD. Esto explicaría una mayor solubilidad de los complejos sólidos con estas CDs. 110 A. Ricardo Hipólito N. Fig.5.39. Los gráficos a) y b) muestran lospotenciogramas del experimento de dilución; los gráficos c) y d) muestran los potenciogramas de la titulación de β-CD con Cu(IMC)2 y Zn(IMC)2 respectivamente. Los gráficos e) y f) muestran los isotermas de enlace obtenidos para la dilución, la titulación y el ajuste al modelo de dos sitios sequenciales independientes. 0 50 100 150 200 250 300 -1.2 -1.0 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0.0 CuIMC 2 b-CD Dilución Titulación AjusteC al o r p o r In y ec ci ó n Molar Ratio 0 20 40 60 80 100 120 140 160 -5.0 -4.0 -3.0 -2.0 -1.0 0.0 P o te n ci a (µ W ) Tiempo (min) b-CD (Titulación) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 -5.0 -4.0 -3.0 -2.0 -1.0 0.0 P o te n ci a (µ W ) Tiempo (min) b-CD (Dilución) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 -1.2 -1.0 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0.0 ZnIMC 2 b-CD Dilución Experimental AjusteC al o r p o r In y ec ci ó n Relación Molar 0 20 40 60 80 100 120 140 160 -5.0 -4.0 -3.0 -2.0 -1.0 0.0 P o te n ci a (µ W ) Time (min) b-CD (Titulación) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 -5.0 -4.0 -3.0 -2.0 -1.0 0.0 P o te n ci a (µ W ) Tiempo (min) b-CD (Dilución) a) b) c) d) e) f) Cu(IMC)2 /𝛃-CD Zn(IMC)2 /𝛃-CD 111 A. Ricardo Hipólito N. Fig.5.40. Los gráficos a) y b) muestran los termograma de los experimento de dilución; los gráficos c) y d) muestran los termogramas de la titulación de γ-CD con Cu(IMC)2 y Zn(IMC)2, respectivamente. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 -5.0 -4.0 -3.0 -2.0 -1.0 0.0 P o te n ci a (µ W ) Tiempo (min) g-CD (Dilución) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 -5.0 -4.0 -3.0 -2.0 -1.0 0.0 P o te n ci a (µ W ) Tiempo (min) g-CD (Titulación) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 -5.0 -4.0 -3.0 -2.0 -1.0 0.0 P o te n ci as ( µ W ) Tiempo (min) g-CD (Dilución) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 -5.0 -4.0 -3.0 -2.0 -1.0 0.0 P o te n ci a (µ W ) Tiempo (min) g-CD (Titulación) a) b) c) d) Cu(IMC)2/𝛄-CD Zn(IMC)2/𝛄-CD 112 A. Ricardo Hipólito N. Fig.5.41. Los gráficos a) y b) muestran los termograma del experimento de dilución; los gráficos c) y d) muestran los termogramas de la titulación de HP-β-CD con Cu(IMC)2 y Zn(IMC)2 respectivamente. Los gráficos e) y f) muestran los isotermas de enlace obtenidos para la dilución, la titulación y el ajuste al modelo de dos sitios sequenciales independientes y no equivalentes. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 -1.2 -1.0 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0.0 CuIMC 2 HP-b-CD Dilución Titulación AjusteC al o r p o r In y ec ci ó n Relación Molar 0 20 40 60 80 100 120 140 160 -5.0 -4.0 -3.0 -2.0 -1.0 0.0 P o te n ci a (µ W ) Tiempo (min) HP-b-CD (Titulación) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 -5.0 -4.0 -3.0 -2.0 -1.0 0.0 P o te n ci a (µ W ) Tiempo (min) HP-b-CD (Dilución) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 -1.2 -1.0 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0.0 ZnIMC 2 HP-b-CD Dilución Experimental AjusteC al o r P o r In y ec ci ó n Relación Molar 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 -5.0 -4.0 -3.0 -2.0 -1.0 0.0 P o te n ci a (µ W ) Tiempo (min) HP-b-CD (Titulación) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 -5.0 -4.0 -3.0 -2.0 -1.0 0.0 P o te n ci a (µ W ) Tiempo (min) HP-b-CD (Dilución) a) b) c) d) e) f) Cu(IMC)2 /HP-𝛃-CD Zn(IMC)2/ 𝛃 113 A. Ricardo Hipólito N. Fig.5.42. Los gráficos a) y b) muestran el termograma del experimento de dilución, los gráficos c) y d) muestran los termogramas de la titulación de HP-γ-CD con Cu(IMC)2 y Zn(IMC)2 respectivamente. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 -5.0 -4.0 -3.0 -2.0 -1.0 0.0 P o te n ci a (µ W ) Tiempo (min) HP-g-CD (Dilución) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 -5.0 -4.0 -3.0 -2.0 -1.0 0.0 P o te n ci a (µ W ) Tiempo (min) HP-g-CD (Titulación) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 -5.0 -4.0 -3.0 -2.0 -1.0 0.0 P o te n ci a (µ W ) Tiempo (min) HP-g-CD (Titulación) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 -5.0 -4.0 -3.0 -2.0 -1.0 0.0 P o te n ci a (µ W ) Tiempo (min) HP-g-CD (Dilución) a) b) c) d) Cu(IMC)2/HP-𝛄-CD Cu(IMC)2/HP-𝛄-CD 114 A. Ricardo Hipólito N. . Fig.5.43.Diagramas de distribución de especies de los complejos M(IMC)2 en CDs F ra cc ió n F ra cc ió n F ra cc ió n F ra cc ió n F ra cc ió n F ra cc ió n Cu(IMC)2 Cu(IMC)2𝛃-CD Cu(IMC)2(𝛃-CD)2 Cu(IMC)2 Cu(IMC)2𝛂CD Cu(IMC)2(𝛂-CD)2 Zn(IMC)2 Zn(IMC)2𝛂CD Zn(IMC)2(𝛂-CD)2 Zn(IMC)2 Zn(IMC)2𝛃-CD Zn(IMC)2(𝛃-CD)2 Zn(IMC)2 Zn(IMC)2HP-𝛃-CD Zn(IMC)2(HP-𝛃-CD)2 Cu(IMC)2 Cu(IMC)2HP-𝛃-CD Cu(IMC)2(HP-𝛃-CD)2 115 A. Ricardo Hipólito N. 6. Conclusiones. 116 A. Ricardo Hipólito N. Se logró sintetizar a la sal de IMC (NaIMC·3H2O) y se caracterizó como un precipitado en hojuelas amarillo pardo, además; con IR, XRPD y RMN se confirmó la formación de un hidrato y la estructura de la IMC–. Se logró determinar el peso y pureza de la sal NaIMC·3H2O como 433.83±0.63 g/mol y 97.4±0.13%, respectivamente. Se determinó que la IMC es estable en solución a pH < 7. Por UV-Vis, Se observan señales de posible formación de dímeros de IMC que pueden asociarse pero no llegan a precipitar, aunque a pH por debajo de 4.5 la precipitación no permite el estudio de IMC en solución. Se determinó, que la IMC es poco estable a valores de pH básicos, observando cambios en los máximos de absorbancia y por lo tanto, una descomposición de la molécula considerable, debido al rompimiento de la amida presente en la molécula. Se confirmó, por UV-Vis el pKa de la IMC, refinando un valor de pKa de 4.52 ± 0.06. La especie HIMC predominará antes del pH 4.5 y la especie IMC- predominará pH mayor de 4.5. Fue posible determinar las propiedades termodinámicas de la inclusión IMC con CDs con 5 CDs diferentes, por UV-Vis e ITC, con lo cual se puede concluir lo siguiente: La IMC se incluye con una sola molécula de CD muy probablemente por el residuo p-clorobenzoilo de la IMC. La IMC tiene mayor preferencia por la β- y HP-β-CD; mientras que con el resto de las CDs la afinidad es menor. El tamaño de las CDs tiene un impacto en la afinidad por la IMC. El tamaño de la cavidad tiene un efecto favorable al pasar de la α-CD a la β-CD, pero al pasar de la β-CD a la γ-CD la afinidad no mejora. El cambio de pH de 5 a 7 hace que la inclusión mejore sólo con α-CD y HP-β-CD, en los demás casos la inclusión se ve afectada, lo que indica que la afinidad por IMC‒ es mejor para α-CD y HP-β-CD. En las demás CDs, la afinidad es mayor por HIMC. A partir de los valores de ΔH y ΔS, obtenidos por ITC, se logró entender que la inclusión dependerá de dos razones principalmente; las interacciones no polares que pueden llevarse a cabo y el cambio de libertad conformacional debido a las moléculas de agua desplazadas del centro de la cavidad. El equilibrio de las fuerzas moleculares anteriores, serán las que faciliten la inclusión. Por lo anterior, la fuerza que mayor impacto tiene en el caso de la IMC 117 A. Ricardo Hipólito N. con CDs es el contacto y formación de interacciones no polares y puentes de hidrógeno. El efecto de salida de moléculas de agua de la cavidad comienza a ser considerable al aumentar el tamaño de las CDs, aunque las interacciones se ven afectadas. El mejor equilibrio de fuerzas se logra con la β-CD y la HP- β-CD. Se estudió el efecto que tiene la temperatura en las propiedades termodinámicas, determinadas por ITC, en la inclusión IMC con CDs, en general los valores de logK1:1 ó ΔG, disminuyen haciendo que los complejos sean menos estables y menos espontáneos, se observa que el fenómeno es más exotérmico y con menos grados de libertad para todas las CDs. Se logró determinar el valor de ΔCp, obtenido por ITC a diferente temperatura,para las interacciones IMC con CDs, observando que en todos los casos el valor es negativo indicación de que para todas las CDs la IMC presenta una interacción mayoritaria con las zonas hidrófobas de la CD además de una desolvatación de los grupos en donde se lleva a cabo la interacción. El valor más grande se obtiene con α-CD (‒452.75 ± 27.25 J/molK) y el menor con γ-CD (‒17.68 ± 3.61 J/molK). El sustituir a las CDs ayuda a que los valores de ΔCp se incrementen en comparación a las CDs no sustituidas. Los complejos en sólido M(IMC)2(H2O)2 se sintetizaron a partir de la sal de indometacina. La caracterización, de los sólidos preparados, por IR brindó señales de especies CuIMC y ZnIMC quelato o puente, donde la IMC enlaza el metal a través del grupo carboxilato. Los estudios de EPR para CuIMC y de XRPD para ZnIMC, respectivamente, permitieron identificar especies mononucleares. Las especies puente se pueden descartar, por lo tanto, las especies propuestas para este trabajo son [Cu(IMC)2(H2O)2] y [Zn(IMC)2(H2O)2] en estado sólido. Se determinó la solubilidad de los complejos para Cu(IMC)2(H2O)2 y Zn(IMC)2(H2O)2 , por UV-Vis, las cuales fueron (3.14 ± 2.35) × 10-5 y (2.49 ± 1.90) × 10-5 M, respectivamente. Se demostró que la solubilidad de los complejos de Cu(II) se incrementa ≈ 500% con HP-γ-CD y hasta ≈ 1700% con HP-β-CD, mientras que la solubilidad de los de Zn(II) aumenta ≈ 700% con γ-CD y hasta ≈ 3500% con HP-β-CD; la CD que mejor solubilizó a los complejos M(IMC)2(H2O)2 fue la HP-β-CD, siendo mayor el efecto para Zn(IMC)2(H2O)2 que para 118 A. Ricardo Hipólito N. Cu(IMC)2(H2O)2. El orden de poder solubilizante de los complejos M(IMC)2(H2O)2 con CDs es: HP-β-CD > α-CD > β-CD > γ-CD. El aumento de solubilidad, permitió estudiar las especies presentes en solución del complejo de cobre por EPR, se confirmó la presencia de una especie mononuclear de cobre, donde 2 moléculas de IMC forman un complejo quelato de posible estequiometría Cu(IMC)2(H2O)2. En analogía con este complejo de Cu, se propone que el complejo de Zn tenga la estequiometría Zn(IMC)2(H2O)2. Con las posibles estequiometrías en solución, se estudió la termodinámica de la interacción de los complejos M(IMC)2 con CDs por ITC. Se propuso un modelo de dos sitios de enlace secuencial, con el cual se determinaron los valores de DG, DH, DS para cada sitio y el valor global. La termodinámica con el modelo propuesto indica que los sitios de enlace de los complejos M(IMC)2 son independientes y no equivalentes, con valores distintos entre ellos. La interacción de los complejos M(IMC)2 con CDs es espontánea. El primer sitio siempre es más espontáneo que el segundo sitio. El aumento en la cavidad entre a-CD y b-CD, mejora la espontaneidad. Los valores de espontaneidad dependerán del equilibrio entálpico entrópico que se genere debido a todas las fuerzas inter e intra moleculares que intervienen en la inclusión. De esta manera se observa que para a-CD la contribución entálpica será la que predomine para ambos complejos, esto debido a una inclusión más justa. En el caso de b-CD y HP-b-CD con Cu(IMC)2, la contribución entrópica será la que dicte la manera de inclusión, por otra parte la interacción de b-CD y HP-b-CD con Zn(IMC)2 es dirigida por la contribución entálpica. El comportamiento anterior sugiere una diferencia estructural entre los complejos de M(IMC)2, en donde el complejo de Zn(IMC)2 presenta más libertad conformacional. Los diagramas de distribución de especies confirman la necesidad de usar cantidades muy altas de CD (pCDTotal bajas) para el predominio de un complejo completamente incluido (M(IMC)2(CD)2). 119 A. Ricardo Hipólito N. Artículos publicados. 120 A. Ricardo Hipólito N. 121 A. Ricardo Hipólito N. 122 A. Ricardo Hipólito N. 123 A. Ricardo Hipólito N. 124 A. Ricardo Hipólito N. Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry (2019) 95:55-62 60 Time (min) 0 50 100 150 200 04 T T T T ma puma ad Ds E ¡se E 12) mE -167 —— B-CDO7.0 0. S ) E Bo > 8 uh ? o a , 33! $-CDA7.0 o O Dilution LK O. Experimental 4 4 One-site fitting 0 l 2 3 4 5 6 7 Molar Ratio Time (min) 0 50 100 150 200 OST r : : S 3% ua pra Ds E 118 En, E -164 —— 2-HP-$-CDO7.0 04 sg O . + o -17 «> e] . Eu 727 o a 33. 2-HP-$-CD07.0 HE O Dilution O Experimental 4 7 ——- One-site fitting 0 l 2 3 4 5 6 7 Molar Ratio Fig. 5 ITC thermograms in top panels, bottom panels show the one-site fitting isotherms after withdrawing the CD dilution effect are consistent with those reported by Todorova et al., for the interaction of $-CD with nabumetone and flurbiprofen of 11.7 and 16.5 kJ/mol, respectively [32]. Furthermore, in Table 2 the values of inclusion constants agree with those already calculated from the UV—Vis experiments at pH 7. Negative Gibbs energies denote that inclusion is a spontane- ous event under experimental conditions; — TAS, indicates that inclusion of IMC in the CDs is accompanied of dis- placement of solvent molecules from the CD cavity. On the other hand, comparatively it has been observed that smaller — TAS terms are associated with larger CD cavities [32], which is reproduced in our experiments, as can be seen in Table 2. Once the inclusion constants have been obtained, we employed the MEDUSA program [33-35] to create dia- grams of distribution for the species in solution. Figure 6 displays these diagrams, the molar fraction of the species IMC and the inclusion complex are plotted in terms of the concentrations of IMC and CD, the latter expressed as p[CD]=-—1log[CD]; in the construction of such diagrams we employed the logK;., obtained by means of ITC. It is convenient to explore the fraction of species formed in the CD solubility limit, which would be a realistic limit A Springer when preparing pharmaceutical formulations. In water, B-CD solubility is reported to be around - 2% (w/v), equiva- lent to 20 mg/mL or 1.63 x 107? M [36] that corresponds to p[P-CD]= 1.77; whereas solubility of 2-HP-P-CD is -45% (w/v) [14], equivalent to 450 mg/mL or 0.35 M, p[2-HP- P-CD]=0.48. For an IMC concentration of 107*5 M and B-CD in its solubility limit, the fraction of the formed inclusion complex is 0.91. In contrast, when in the solu- tion 2-HP-P-CD is set to its solubility limit, the fraction of the inclusion complex would be 0.99. Thus, 2-HP-f$-CD performs better because it includes a higher quantity of the IMC molecule than f$-CD. This higher amount of the formed inclusion complex is a consequence of the larger stability constant but also of the higher water solubility of 2-HP-f$-CD. Concluding remarks The interaction between IMC and CD occurs in the stoichio- metric ratio 1:1, with weak interaction. UV—Vis results in logK;., of 2.86 and 2.57 for P-CD and 2-HP-f-CD, respec- tively at pH 5. At pH 7, while by UV—Vis logK;.;, are 2.80 a A O oo 125 A. Ricardo Hipólito N. Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry (2019) 95:55-62 61 OR da un ES ha .Q A a 0.8, 0.91 y O E E , 0.6- ' 3 oO S 0.4- a E O s . pu, % od 4 3 02), " al sx 0.0? Cr 0 1.772 CD 4 p[$- Moa: 0.99 Indo - * IMC-2-HP-$-CD Fr ac ti on of s pe ci es 29 or óHP-8-CD] total Fig. 6 Species distribution diagrams for the systems IMC-CD, pH 7, [IMC]=107** M. Inclusion constants were those obtained from the ITC experiments and 2.99, by ITC logK;., are 2.81 and 2.85 for $-CD and 2-HP-f-CD, respectively. ITC results indicates that inclu- sion phenomenon of IMC in CDs is spontaneous, exothermic and entropically driven by the exclusion of water molecules from the CD cavity. As a consequence of the small inclu- sion constant, formation of the IMC-CD inclusion complex will be favored at high CD/IMC molar ratios. In the CDs solubility limit, 2-HP-P$-CD performs better for inclusion of IMC than f-CD. Acknowledgements The authors are grateful to PAPUT DGAPA- UNAM Grant No. IN218118, FESC-UNAM PIAPI 1846, A.R. H.-N. thanks to CONACYT for his Ph.D. Scholarship No. 300687. Author contributions The manuscript was written through contribu- tions of all authors. All authors have given approval to the final version of the manuscript. Compliance with ethical standards Conflict of interests The authors declare that there is no conflict of interests regarding the publication of this paper. References 1. Valentovic, M.: Indomethacin. In: xPharm: The Comprehensive Pharmacology Reference, pp. 1-5. Elsevier, Amsterdam (2007) 2. Lucas, S.: The pharmacology of indomethacin. Headache J. Head Face Pain 56(2), 436-446 (2016) 3. 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Wu, C.-Y., Benet, L.Z.: Predicting drug disposition via application of BCS: transport/absorption/elimination interplay and develop- ment of a biopharmaceutics drug disposition classification system. Pharm. Res. 22(1), 11-23 (2005) . Rudrangi, S.R.S., Bhomia, R., Trivedi, V., Vine, G.J., Mitchell, J.C., Alexander, B.D., Wicks, S.R.: Influence of the preparation method on the physicochemical properties of indomethacin and methyl-P-cyclodextrin complexes. Int. J. Pharm. 479(2), 381-390 (2015) . Kurkov, S.V., Loftsson, T.: Cyclodextrins. Int. J. Pharm. 453(1), 167-180 (2013) . Li,J., Zhang, X.: Preparation and characterization of the inclusion complex of ofloxacin with P-CD and HP-$-CD. J. Incl. Phenom. Macrocycl. Chem. 69(1-2), 173-179 (2011) Ol'khovich, M.V., Sharapova, A.V., Blokhina, S.V., Skachilova, S.Y., Kesarev, O.G., Perlovich, G.L.: Physicochemical character- istics of the inclusion complexes of biologically active compounds with 2-hydroxypropyl-P-cyclodextrin. Thermochim. 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Méx., México 3Instituto de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, Circuito exterior, Ciudad Universitaria, 04510 Coyoacán, D.F., México. *To whom correspondence should be addressed Adrián Ricardo Hipólito-Nájera ORCID: 0000-0002-9053-5011 Alberto Rojas-Hernández ORCID: 0000-0001-9716-4762 Norma Rodríguez-Laguna ORCID: 0000-0003-1340-3303 Luis I. Reyes-García ORCID: 0000-0002-0705-1340 Virginia Gómez-Vidales ORCID: 0000-0003-3070-7085 *Rodolfo Gómez-Balderas ORCID: 0000-0002-3293-1841 rodolfo.gomez(Yunam.mx *Rosario Moya-Hernández ORCID: 0000-0001-8064-1008 rosariomoya(Ygmail.com Tel.: (+5255) 5623 2014 KEYWORDS: Non-steroidal anti-inflammatory drugs, Cu(ID)-Indomethacin-Cyclodextrin ternary complexes, Zn(ID)-Indomethacin-Cyclodextrin ternary complexes, stability constants, Isothermal Titration Calorimetry. 128 A. Ricardo Hipólito N. 26 pa] 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 qe 45 46 47 Abstract Metallocomplexes of indomethacin M(IMC)(H20) (M = Cu(ID, Zn(IT)) are recognized as potential anti-inflammatory drugs; but their low solubility in water difficult their bioavailability, participation in drug formulation and identification of therapeutically active species. On the other side, cyclodextrins (CDs) are recognize for their capability to increase the amount in solution of different guests by forming inclusion complexes. This contribution presents a study of the thermodynamics of the interaction between water soluble MIMC2 species with various CDs. The synthesis of initial and main M(IMC)2(H20) compounds are presented, as well as their structural characterization by means of IR, XRPD and EPR, which allows to discuss the existence of mononuclear species in the solid form of the M(IMCO)(H20)2 complexes. Moreover, a UV-Vis study was performed, in order to confirm that CDs assists the metallocomplex solubility in water. Once the increasing of solubility was established, an EPR study on the Cu(II) systems demonstrates that mononuclear soluble species of the type Cu(IMC)2(H20 ) is included in CDs, in water solution. Then, isothermal titration calorimetry was performed to follow the M(IMC)2(H20 » inclusion within various CDs. The obtained heat response during titration was fit to a sequential independent binding site model, besides the AH, AS and AG thermodynamic parameters, the inclusion constants of MIMC with CDs are here reported for the first time. Main results show that inclusion is exothermic, spontaneous and, depending on the metal center of the metallocomplex, will be driven either by enthalpic or entropic contributions. 129 A. Ricardo Hipólito N. 48 49 S0 51 32 53 54 7 56 Y 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 q 13 74 qa 76 1. Introduction The worldwide use of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) arises for its anti- inflammatory, analgesic and antipyretic properties [Rainsford, 2007]. The NSAID Indomethacin (IMC) of chemical name C19H16CINO4 2-[1-(4-chlorobenzoy]l)-5-methoxy-2- methylindol-3-yl1] acetic acid is classified as a member of the family of the arylalkanoic acids (Fig. 1); it is prescribed for a great variety of sickness with possible anticancer activity [Valentovic, 2007; Jain, 2008, Zhang, 2006; Maity, 2015]. IMC is a no selective inhibitor of cyclooxygenase COX1 and COX2, that stops the prostaglandin synthesis, which are responsible of the inflammatory response and the gastrointestinal (G. 1.) covering. The last explain the principal side effects produced by IMC: ulceration and G. I. bleeding [Valentovic, 2007; Jain, 2008; Williams, 2005; McNally, 2001; Vane, 1997; Moncada, 1979; Marnett, 1999; Weder, 2002; Zhou, 2000]. UD N Y O OH O Fig. 1. HIMC structure A strategy to avoid G. I. adverse effects is the complexation of IMC with metal ions of the d block, such as Cu(II) and Zn(II) [Zhou, 2000]. In spite of having the same mechanism of action of AINES, some MNSAIDs complexes (M=Cu(II) or Zn(I1)) improve the therapeutic effect of the drug and decrease side effects [Sorenson, 1989; Tagliati, 1999; Dillon, 2004]. It is known that in inflamed tissues there are high levels of copper and zinc ¡ons [Fini, 2001]. The copper ion plays a role in the gastrointestinal damage prevention with NSAIDs [Morgan, 2001]. CulIMC complexes are important in veterinary medicine and marketed formulations are already available [Weder, 2001]. On the other hand, zinc (II) ion has shown an improvement in the ulceration heal rate and the complexes ZnNSAIDS are less irritating to the gastric mucosa [Tagliati, 1999]. Complexes [Zn-(IMC)»L2] and cis-[Zn(IMCpL2] (L: solvent) has been identified as anti-inflammatory drugs and 3 times more potent that IMC [Dillon, 2003]. It is well known that the effectivity of MIMC complexes depends on species formed in solution, and interaction with the site of action. 130 A. Ricardo Hipólito N. Ll 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 2 Lay A o M———0 O [> ¡A La / y R >> NJ ze eo L mononuclear trans isomer O (chelate) R dinuclear mononuclear cis isomer (chelate) (chelate) L M O > AS Sa L > d o e Y R tr O R R > a O mononuclear mononuclear mononuclear O . . , trans square planar isomer cis square planar isomer tetrahedral isomer Fig. 2. Structures of MIMC with carboxylic acids ligands. R=IMC. Molecular structures of complexes CuNSAID have been identified to exist as mononuclear or dinuclear species with carboxylic acids ligands (Fig. 2) [Baes, 1976; Dillon, 2004]. Most carboxylato-bound Cu(II) mononuclear exist in a configuration with unidentate o chelate carboxylate binding, with a coordination number ranging from four to six [Dillon, 2004]. Meanwhile, CUNSAID dinuclear species appear to have a preference towards the paddle wheel copper acetate structure [Dillon, 2004]. In the same manner, carboxylate-bound to Zn(I) could occur in a mononuclear and dinuclear species too [Dillon, 2004]. There is evidence that MNSAID form mononuclear or polynuclear depending on the solvent used (acting like ligand) [Zhou, 20003], as well as the metal-ligand molar ratio in solution [Rodríguez-Laguna, 2016]. Many reports of the solid MIMC complexes, crystallized from diverse solvents, have been published [Weder, 1999]; however, few of them report speciation in aqueous solution. A critical parameter in the copper and zinc complexes with IMC is their poor water solubility, originating unsatisfactory identification of mononuclear or polinuclear soluble species in vivo and in vitro, hinders MIMC study on the enzymatic sites of action, diminishes bioavailability and makes difficult preparation of pharmaceutics (Zhou, 2000; Fini, 2001; Olvera, 2017; Sanches, 2019). It is well known that cyclodextrins are molecules used as excipient for the improvement of bioavailability in a great variety of drugs [Rekharsky, 1998]. The cyclodextrins (CDs) are rings of glucopyranose units with a toroidal shape, a hydrophobic cavity and a hydrophilic 4 E O o 131 A. Ricardo Hipólito N. 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 surface (Fig. 3). The hydrophobic cavity can include or encapsulate a great number of organic molecules [Rekharsky, 1998; Jambhekar, 2016]. This encapsulating property assists or modifies the physical, chemical and/or biological characteristics of the included guest (Crini, 2014; Loftsson, 1996). Cyclodextrins names are related to the number of glucopyranose units in their ring structure: a-cyclodextrin (a-CD) has 6 glucopyranose units, P-cyclodextrin (P- CD) has 7 units and y-cyclodextrins (y-CD) has 8 units, and so on [Crini(2014); Szejtli(1997); Szejtli(1998)]. Encapsulating potential and solubility of the CDs depends on the size of the cavity and OH residues. OH groups have the potential to be replaced for different functional groups and customize the CDs properties. A common group used to increase B-CD solubility is 2-hydroxypropyl (HP-) to give HP-$-CD when OH- groups are substituted [Gould, 2005]. In the case of any substituted CD the substitution could be incomplete, and the degree of substitution is given by the molar substitution (M.S.). OH OR HO o 0 RO o O, pas pa or Ro HO H H O O O O OH E — OR HO O RO R=-H or o OH OR DH 'OH OR a b Fig. 3.a) B-Cyclodextrin and b) HP- B-Cyclodextrin structure OH OR The interaction CD-guest is weak, attributed to van der Waals forces, hydrogen bonds and the interchange between solvent molecules inside the cavity for the guest molecule. [Crini, 2014]; however, the detailed picture of inclusion continues in discussion. The interaction between IMC and CDs has been broad studied [Hamada, 1975; Backensfeld, 1990; Casella, 1998; Jambhekar, 2004; Hipólito-Nájera, 2019); an interesting approach of ternary metal- NSAID-CD system is the study by Hamdan in 2016 where Diclofenac with HP-$-CD and Zn(II) interactions are researched. However, as far as we know, neither the MIMC water soluble species with CDs nor the thermodynamics of the MIMCCD inclusion complexes have been known or studied yet. This contribution aims to study the thermodynamics of the interaction between MIMC with various CDs. Consequently, MIMC (M: Cu(ID) or Zn(ID)) were prepared in their solid form in aqueous solutions. Characterization, performed by XRPD, IR and EPR technics, permitted to determine some key structural features and the stoichiometry of the solid complexes. Then, 5 E O o 132 A. Ricardo Hipólito N. 130 131 132 133 134 135 136 different CDs were employed to increase MIMC solubility in aqueous solution, by forming the corresponding inclusion complexes. This enhancement of solubility allowed to identify the CulIMC species included within the CDs. The increment of solubility of MIMC was evaluated quantifying the total amount of metals in solution, by UV-Vis spectroscopy. In order to identify the CulIMC2 soluble species electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy was applied. Finally, the thermodynamics of the MIMC water-soluble species with CDs were follow by isothermal titration calorimetry (ITC). E O o 133 A. Ricardo Hipólito N. 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 2. Methodology 2.1. Reagents. Indomethacin (HIMO), a-CD, B-CD, y-CD, 2-HP-$-CD (M.S.: 0.6), 2-HP-y-CD (M.S.: 0.6) and Cu(CH3COO) (Cu(OAc)) were purchased at Sigma Aldrich. NaOH (98%) was purchased at Mallinckrodt. ZnCl (granular USP), CuCLh:2H20 (99%), ethyl alcohol absolute (99.91%) and methanol anhydrous (99.99%) was purchased at J. T. Baker and Merck, respectively. Deionized water 18.2 MQ was used to prepare all solutions. 2.2. Instrumental. Lambda 35 UV-Vis spectrophotometer, Perkin Elmer. Frontier FT-IR, Perkin Elmer. VP- ITC, General Electric. EPR spectrometer JES-TE300, Jeol. X-ray powder diffractometer, D8 Advance, Bruker. RMN espectrometer, AVANCE DMXS500, Bruker. Stirring hot plate, Cole Parmer stabletemp. Filter paper +42, Whatman. Common glassware. 2.3. Experimental 2.3.1. CulIMC and ZnIMC synthesis and characterization Prior to MIMC synthesis, indomethacin sodium salt NalMC-3H20 (NalIMC) was prepared from HIMC and characterized by IR according Kulkarni, 2011 and ¡H NMR (in D20 and trimethylsilylpropanoic acid as reference). The solid forms of CuIMC2(H20 » (CuIMC)) and ZnIMC4(H20) (ZnIMC)) were prepared with NaIMC and CuCL:2H20 in water according Weder, 1999, products were confirmed by IR, XRPD and EPR. 2.3.2. Phase Solubility Diagrams A set of vials containing a same amount of the solid form of the MIMC complex in water (pH = 6-7) with different concentrations of CD (0-0.08 M) were stirred for 3 days. After this time, the samples were filtrated and analyzed for quantification of Cu(II) and Zn(II) with EDTA and PAR, respectively, by UV-Vis [Ringbom, A., Montuenga, C., 1979, (Aguirre, 2016)]. 2.3.3. EPR studies of CulMC soluble species A set of vials containing a sample of the non-soluble CulIMC complex in water (pH = 6-7) with CD Clog[fP$-CD] = 1.77, otherwise —log[CD] = 1.10) remained in stirring for 3 days. After this time, samples were filtered, and filtrates were used for EPR spectra. EPR spectrometer, operated in the X-Band mode at a modulation frequency of 100 KHz, with a cylindrical cavity (TE011 mode). The individual samples were placed in a quartz flat cell (synthetic quartz, Wilmad Glass Company) with a path length of 0.2 mm. The external calibration of the magnetic field was carried out using a JEOL ES-FCS precision gaussmeter. E O o 134 A. Ricardo Hipólito N. 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 EPR measurements were made in a quartz tube at room temperature with a JEOL JES-TE300 spectrometer operating at X-band frequency (near 9.4 GHz) at 100 KHz field modulation, with a cylindrical cavity (TEo11 mode). The external measurement of the static magnetic field was made with a precision JEOL ES-FC5 gaussmeter. The low-temperature measurements were made at 77 K using quartz tube (synthetic quartz, Wilmad Glass Company) of 5 mm 1.d. Spectral acquisition and manipulations were performed using the program ES-PRITS/TE. 2.3.4. Isothermal Titration Calorimetry A set of vials with water were saturated with MIMC complexes, after stirring 3 days, samples were filtrated, and the filtrate was used to quantify the soluble MIMC fraction by UV-Vis. For the ITC experiments, the sample cell was filled with filtrate of CulIMC2 or ZnIMC», average concentrations of 2.28x10.5 M and 4.25x10-5M, the syringe was filled with a concentrated solution of CD of 1.45x10-2 M, for titration experiments. For controls or dilution experiments, the reaction cell was filled with water and CD solution was injected from the syringe. Both experiments were programmed to make 28 additions of 10 uL each 20 s, followed by 360 s between additions, at 25 *C. Experimental data were fitted to the binding model using Affinimeter software [AFFINImeter- The software for molecular interactions [WWW Document], n.d. URL https://www.affinimeter.com/site/ (accessed 1.21.20).]. From the determined inclusion constants distribution species diagrams were constructed applying MEDUSA program [I. Puigdomenech, MEDUSA (Making equilibrium diagrams using sophisticated algorithms), Royal Institute of Technology, Stockholm, Sweden]. 135 A. Ricardo Hipólito N. 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 3. Results and Discussion 3.1. CulMC and ZnIMC solid complexes, synthesis and characterization In Fig. 4 the IR of a) HIMC and b) NalIMC-3H20 are shown. NalMC can be differentiated from the HIMC reagent (y-isoform) because the salt has characteristic signals of a hydrate at 3646 and 3535 cm-1[Kulkarni, 2011; Chen, 2005]. ¡:H NMR (500 MHz, D20, TSP) (Fig. 4c) $ 7.29-7.23 (m, 2H), 7.09—7.03 (m, 2H), 6.88 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 6.34 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 6.16 (dd, J= 9.0, 2.6 Hz, 1H), 3.59 (s, 3H), 3.42 (s, 2H), 2.14 (s, 3H). In addition, the XRPD diffractogram of NaIMC in Fig. 4d shows agreement with the XRPD pattern of Chen, 2005, confirming the formation of the hydrate of IMC sodium salt. Finally, NalIMC shows better solubility in water and methanol than HIMC. b | E 2 E y 3 1% dr 200 4 N 8 e AS as 344 | $ LL | 1 3535 %T 87 2 A Hd | 4 7.5 7.0 6,5 6.0 s.5 s.0 45 40 3,5 3.0 2.5 2.0 LS 10 0.5 00 ppm | d 1692 h nal ' 4000 3500 3000 1600 1400 1200 3 10 15 20 25 30 Wavenumber (cm) 20 Fig. 4. IR spectra of a) HIMC, b) NalMC, c) XRPD y d) RMN of NalMC. IR spectra of the prepared solid complexes are displayed in Fig. 5 a) CulIMC and b) ZnIMC present the characteristic signals of the amida carbonyl vibration at vamide = 1673 cm-1 and Vamide = 1679 cm.-1, respectively; as in NaIMC vamide = 1674 cm.-1 (Fig. 5c), this fact shows that the N-amide does not participate in the metal ion coordination sphere. In constrast, the asymmetric vibration signal that corresponds to the IMC carbonyl goes from vasym = 1557 cm-1 in NalMC to vasym = 1589 cm-1 and vasym = 1567 cm-1 for CuIMC and ZnIMC, respectively, making evident the binding of M(II) with IMC through the carbonyl moiety [Dillon, 2004; Singla 1995]. On the other hand, symmetric carboxy] stretching vsym at 1400 and 1440 cm.1 have been used to differentiate mononuclear from dinuclear carboxylato metal species (Zhou, 2000, 2003; Dillon, 2004); the absence of the 1400 cm-1 band is associated with bridging dinuclear species (Zhou, 2000; Morgan, 2001). In the case of the complexes synthetized in this work, vsym bands appear at 1420 and 1437 cm-1 for CuIMC and at 1400 and 1435 cm-1 for ZnIMC. The separation (A) between vasym and vsym is also indicative of dinuclear symmetrical bridging: 9 136 A. Ricardo Hipólito N. 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 values of A > 200 cm-1, while values of A < 200 cm.-: are typical for chelation in monomeric species (Zhou, 2000). In this work A is 169 cm-1 and 167 cm-1 for CuIMC and ZnIMC, respectively, suggesting that chelating geometry of mononuclear species prevails as solid. C VAINA + t + a. Vamide asym Voym 4 4 Vamide asym Y 1700 1600 1500 1400 1300 1200 Wavenumber (e) Fig. 5. IR spectra of a) CulIMC b) ZnIMC y c)NalMC. To carry out a comparative analysis, the EPR spectra of a) dinuclear CuAcO and b) CulIMC at 298 K, both in solid state, are shown in Fig. 7. The a) spectrum has a typical answer for two near Cu(II) atoms giving a well resolved triplet state (S = 1) with axial symmetry (D+0 y E=0), Hz1 = 49.88 mT, Hz2 = 572.53 mT and H ;2= 436.4 mT (Dillon, 2004; Olguin, 2009). In the spectrum b a central field signal in axial symmetry was observed, corresponding to S = 1/2, assigned to mononuclear species and characterized by gi = 2.35 and g: = 2.0786, no hyperfine coupling was detected, the [CuIMC2(H20 )] species might be responsible of those signals. Additionally, a weak signal was detected at 470 mT, which may correspond to the signal H ¡2 in axial symmetry (D+0 y E=0), from the complex [Cu2IMC4(H20)2] in triplet state (S = 1) found as impurity. These results point out the predominance of the mononuclear specie of [CulIMC2(H20)2] in solid state. It seems that synthesis of CuIMC complexes using NalMC assists the predominance of mononuclear species, if water is used as solvent. b A AN 0 300 600 Magnetic Field (mT) Fig. 6. a) CUACcO, b) CulIMC 10 137 A. Ricardo Hipólito N. 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 231 252 233 254 255 256 257 258 259 260 261 262 263 264 265 266 267 268 269 270 ZE 272 The determined XRPD of ZnIMC (Fig. 7a) has strong similarities with the XRPD reported by Zhou, 2003 specifically for mononuclear [Zn(IMC)(MeOH)2] (Fig. 7b), suggesting isoestructurality and a possible structure [Zn(IMC)2(H20)2]. CulIMC diffractogram was not obtained because low crystallinity. Zhou et al. 2003 have stablished, from XRD evidence, that synthesis of ZnIMC in polar solvents (MetOH and EtOH) produce mononuclear species. They also concluded that the best model that adjust to their XAFS data in powder samples is obtained for a tetrahedral mononuclear complex with two monodentade IMC (Zhou, 2003). Given the similarity between XRD of ZnIMC here reported, and that of Zhou et al.; a [ZnIMC2(H20)2] tetrahedral species is proposed to exist in solid form. ' b l MUI ria MN 5 10 15 20 25 30 20 Fig. 7. XRPD. a) ZnIMC>2(H20)» (This work) b) ZnIMC>(MetOH), (Zhou, 2003) 3.2. Solubility Studies CuIMC and ZnIMC are solids scarcely soluble in water, it is well known that CDs increase the solubility of many poor soluble molecules. Here, the effect of CDs on increasing the solubility of the prepared complexes is demonstrated. To differentiate the species in solution from their solids, the MIMC2 (CuIMC2 and ZnIMC2) notation is defined. Figure 8 shows that the amount of MIMC2 complexes in solution is proportional to the CDs concentration, all the curves have positive slopes (Higuchi, 1965). Table 1 compiles the slope and the percentage increase of solubility; correlation coefficients (R2) are also report. By assuming solely mononuclear species present in solution, the solubility of CuIMC2 and ZnIMC are So =(3.14 + 2.35) x 10-5 and So = (2.49 + 1.90) x 10.5 M, respectively. These values are in concordance with those reported by Dillon in 2004 and Fini in 2001. In the case of CulIMC» (Fig. 8a), the highest solubility increment is produced by P-CD; unfortunately, this CD has the lowest solubility in water limiting the increase of solubility of CuIMC2. HP-$-CD has better water solubility than $-CD, favoring greater amounts of MIMC in solution than B-CD. Besides CDs solubility there exist other factors that affect the rate of increment of MIMC concentration in solution. For instance, the HP residues in HP- P-CD reduce the rate of increment of CulIMC2 solubility compared to $-CD; a similar effect of the HP residues in HP-y-CD compared to y-CD is observed. Additionally, although a-CD and y-CD have higher solubility than B-CD, the rate of increasing of MIMC concentration in solution is small as CD is added. 11 138 A. Ricardo Hipólito N. 273 274 275 276 277 278 279 280 281 282 283 284 285 286 287 288 On the other hand, for ZnIMC2 the P-CD and HP-$-CD perform the best in solubilizing the solid complex. The other CDs shown similar solubilizing capacity, among them, with alike straight slopes (Fig. 8b). In contrast to CulIMC», it seems the HP residues of the CDs have no effect on the solubility of ZnIMC2; this fact might be related with differences on the molecular structure of the complexes in solution. As it has been stablished, the increase of solubility of the complexes is related to the amount of CD in solution. Table 1 shows that increase of solubility for both complexes follows the order HP-$-CD > a-CD > fB-CD > y-CD. Interestingly, this order is different to the CD solubility order (HP-$-CD > HP-y-CD > y-CD > a-CD > fB-CD [Saokham, 2018]), reveling that apart from the CD solubility other factors influence the complexes and CDs in solution. il. FR 1.0x107 - : % PCD : e 4 | A y-CD 4] 2 8.0x10 + HP-g-CD S 8.0x10 Ss 6.0x10'4 ” HP=CD —, 6.0x1077 y 340x107 2 4.0x107- S E 2.0x107 - —= 2,.0x10” 0.0- 0.0. 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.00 [CD] (M) 0.02 0.04 0.06 0.08 [CD] (M) Fig. 8. Phase solubility diagrams for CulMC, and ZnIMC, in presence of CDs Table 1. Slope, correlation coefficients (R?) and percentage increase of solubility of CulMC and ZnIMC, in presence of CDs. CulMC (So=(3.14+2.35)x10-sM) CD Slope % solubility increase R2 ( ION RED HP-$ (6.60 + 0.95)x10.3 1624.37 + 74.75 0.99 >120.0 a (4.50 + 2.10)x10-3 1146.62 + 76.33 0.98 14.5 B (16.10 + 1.80)x10-3 780.34 + 78.33 0.99 1.85 Y (5.20 + 0.90)x10-3 633.82 + 74.87 0.99 23.2 HP-y (1.90 + 0.50)x10.3 423.61 + 75.86 0.99 80.0 ZnIMC: (So=(2.49+1.90)x10.sM) CD Slope % solubility increase R2 ( aladas HP-P (16.80 + 0.54) x10.-3 3474.07 +76.92 0.99 >120.0 a (4.70 + 0.50)x10.3 1608.36 + 77.31 0.99 14.5 HP-y (4.30 + 0.50) x10-3 1419.38 + 76.62 0.99 80.0 B (19.80 + 2.30) x10.-3 1190.19+76.59 0.99 1.85 Y (2.50 + 0.20)x10-3 655.41 + 82.24 0.99 23.2 12 E O o 139 A. Ricardo Hipólito N. 289 290 291 292 293 294 295 296 297 298 299 300 301 302 303 304 305 306 307 308 309 310 311 312 319 314 313 3.3. EPR studies of CulMC soluble species As CDs assisted the increase of MIMC2 solubility in water, electronic paramagnetic resonance becomes a powerful technic to identify either mononuclear or polynuclear soluble CuIMC species. Consequently, an EPR study was performed to elucidate the predominance of the mononuclear or dinuclear specie of copper in solution in presence of high concentration of CDs, this high concentration helps to reach concentrations of [CulMC2] = 1x10-4M at pH =6-7 the results are shown in Fig. 9 and Table 2. The spectra obtained shows the typical central field absorption corresponding to Cu(II) S = 1/2, indicating the presence of the monomer in the frozen solution. In all cases an axial spectrum was determined showing the dependence gi > g : > ge which is diagnostic for a dx2- y? ground state for Cu(II), in the case of b) a-CD and e) HP-$-CD was possible to determine the value of the hyperfine coupling constant (A1) resulting from the interaction between delocalized p electrons and the nuclear spin Icu = 3/2, Ar coupling was not distinguish in the other spectra due loss of base line principally by the solvent and the low solubility of the metallocomplex. Table 3 shows the spectroscopic parameters (g:, g, and Au) for this series of compounds, which were corrected by simulation. Additionally a mixture of CuCl and NalMC in a molar ratio 1:2 in ethanol to get a [Cu(ID) Jtotal = 10.4 M, was prepared to obtain the EPR spectra in frozen solution, a mononuclear specie assigned to [CulIMC2(EtOH)2] was detected whose spectroscopic parameters are gi = 2.3655 and g, = 2.0740 shown an axial symmetry Fig. 10. The average g values for the complexes studied are in good agreement with another Cu(II) carboxylates complexes where gi = 2.3 and g, = 2.08 (Dillon, 2004). These values suggest an octahedral elongated structure with a ground state d,2_,2. With these results is possible to propose a complex in aqueous solution, where carboxylates of IMC chelate copper ion in trans position lying on the x and y axes with two H20 molecules coordinating along the z axe, which stoichiometry should be [CulIMC2(H20 )]. Table 2. EPR data obtained by the simulation of spectra of Fig. 9 y 10. CD As (mT) 7) gl a 13.5 2.3880 2.0770 B — — 2.0775 Y — —= 2.0784 HP-$ 12.5 2.3880 2.0770 HP-y — — 2.0676 [CuIMC2(EtOH)2] 12.5 2.3655 2.0740 13 140 A. Ricardo Hipólito N. 316 317 318 319 320 Fig. 9. EPR espectra of CulMC) in a)H20, b)a-CD, c)6-CD, d)y-CD, e)HP-6-CD, f)HP-y-CD Magnetic Field (mT Fig. 10. EPR spectra of a) solution CuCl, and NalMC in relation 1:2 with a [Cu]rota=10*M. b) simulation. 14 141 A. Ricardo Hipólito N. 321 322 323 324 325 326 327 328 329 330 331 332 333 334 335 336 337 338 339 340 341 342 343 344 345 346 347 348 349 350 351 3.4. Isothermal Titration Calorimetry From the experimental evidence presented in section 3.1, this work proposes that the complexes of CuIMC2 and ZnIMC>, in aqueous solution, are mononuclear species with two IMC molecules binding the metal center. When MIMC2 complexes interact with CDs entities (considered as ligands), CDs have the possibility to interact independently with any of the two equivalent IMC residues available in the metal complex. Hence, to describe the inclusion phenomena, a two successive independent sites model is proposed for fitting ITC experimental data (Fig. 11), as in Eq. 1 and Eq. 2 [Bouchemal, 2012]. The thermodynamic parameters logK1 AG1, AH, and AS1 for a first site, and logK2, AG2, AH2, and AS2 for a second site, as well as the global parameters (Eq. 3) of the inclusion f, AGz, AHz and AS, are reported in Table 3 for CulIMC» and ZnIMC2 interaction with CDs (the results of interaction IMC2 with y-CD and HP-y-CD are not evaluated for low heat signal in ITC). MIMC, + CD=== MIMC,CD K;,,AG;, AH, AS; (Eq. 1) MIMC,CD a CD o MIMC)>CD, K, AG», AH», AS, (Eg. 2) MIMC, + 2CD==== MIMC,CD, f, AG,, AH,, AS, (Eq. 3) 15 142 A. Ricardo Hipólito N. 32 333 354 399 356 357 358 359 360 361 362 363 364 365 366 367 368 369 370 3 372 373 374 375 376 377 378 379 380 0.0 coccion rUL nr... .. nn. ...e.r.... s TN , O -0.24 o E Dos 0 sg “0.67 2 Aa 08. CulMC,_a-CD E e Control Q -1.0) o Binding Tí Seg. Binding Sites Fitting -1.2 7 7 7 7 7 1 0 100 200 300 400 500 600 Molar Ratio 0.0- co... .ecnn..... e... pc LoC—e.o Ss O -0.27 8 O 0.4. > E 067 En] o dl 8 ,,] CulMC $-CD E e Control O -1.04 o Binding Tí Seq. Binding Sites Fitting -1.2 7 7 7 1 7 7 0 50 100 150 200 250 300 Molar Ratio 0.04 ; > a 0000000. v60000000000000 O -0.27 E Y -0.4? 2 .= -0.63 e o —B— 8) CulMC_HP-$-CD * e Control Ú -1.04 o Binding T Seq. Binding Sites Fitting -1.2 7 7 7 7 7 1 7 1 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Molar Ratio He at pe r in ye ct io n He at pe r in ye ct io n He at pe r in ye ct io n 0.04 0.24 -0.4- -0.6 + -0.8 4 -1.04 ZnIMC a-CD e Control o Binding Seq. Binding Sites Fitting 0.07 0.2 4 0.44 0.6 y 0.8 7 -1.04 Y Y T 20 40 60 80 Molar Ratio 4000VOOLOLLILILLIOLILLLLILIIIAA ZnIMC,p-CD e Control O Binding Seq. Binding Sites Fitting T T T T T T 1 30 40 50 60 70 80 Molar Ratio ZnIMC_HP-$-CD e Control O Binding Seg. Binding Sites Fitting 10 20 30 40 50 60 70 80 Molar Ratio Fig. 11. Binding ( O experimental) and control ( dilution) isotherms of MIMC inclusion within CDs, fitting considered a two sequential independent binding sites [ — ). Binding isotherms take into account the control contribution. 16 a A O oo 143 A. Ricardo Hipólito N. 381 382 383 384 385 386 387 388 389 390 391 Table 3. CulMC ITC results, AH, AG and TAS in kJ/mol; AS in J/molK. Subscripts 1, 2, refer to binding the sequential independent sites 1 and 2; g indicates the values of the global inclusion process. CuIMC2 CD(s site) logK1 AG1 AH: —TAS1 AS1 a 3.35+0.02 -—19.093+0.005 -—2441+041 5.31+0.41 -17.82 + 1.38 B 3.227+0.25 -18,67+0.08 —4.40%+0.9 -14.26+ 1.02 47.84 + 3.42 HP-$ 2.85+0.01 -16.260+0.004 -19.89+0.45 3.63+0.45 -12.18 + 1.52 CD (Qna site) logK2 AG2 AH2 —TAS2 AS2 a 2.11+0.02 -12.07%+0.01 -152.32+4.65 140.25+4.66 -470.41 + 15.62 B 2.70+0.47 -1540+0.17 -—S5.10+0.95 -10.30+1.12 34.55 + 3.77 HP-$ 3.11+0.03 -17.72%0.01 947+0.47 —27.19+0.48 91.21 +1.60 CD (global) logf AGg AHgz —TASy¿ ASg a 5.46+0.03 -—31.16+0.01 -176.73+5.06 145.57+17.00 488.23 + 17.00 B 5.97+0.72 -34.06x+0.25 -9.50+1.89 -24.57+2.14 82.39+7.18 HP-B 5.95+0.04 -3398+0.01 -10.42+0.92 -23.56+0.93 79.03 + 3.12 ZnIMC2 CD (1st site) logK1 AG1 AH: —TAS 1 AS1 a 341+0.13 -1944+0.04 -—3.67%+0.54 -15.77+0.58 52.90 + 1.96 B 2.99+0.02 -17.09%+0.01 -26.22+1.16 9.13%+1.17 30.63 + 3.92 HP-$ 3.39+0.01 -19.371+0.002 -10.44+0.68 -8.93+0.69 29.94 + 2.30 CD (2na site) logK2 AG2 AH2 —TAS 2 AS2 a 2.02+0.19 -11.55+0.10 -62.86+0.88 51.31+0.98 -172.09+3.29 B 2.46+0.06 -14.05+0.02 -—7.02+1.20 -—7.03+1.22 23.59 + 4.09 HP-$ 2.39+0.01 -13.645+0.003 -38.16+3.48 24.52+3.49 -82.24+11.69 CD (global) logf AG AHgz —TAS ¿ ASg a 5.43+0.32 -—30.99+0.13 -66.53+1.43 35.54+1.56 -119.19%5.24 B 5.46+0.08 31.140.003 -33.24+2.36 2.10+0.69 —7.04 + 4.67 HP-B 5.778+0.01 -33.64%+0.01 -—48.61+4.17 15.59+4.17 -52.29+13.99 From results in Table 3, it can be seen that inclusion of MICM into the CDs are spontaneous processes regardless the site (AG1 < 0 and AG2 < 0). Comparing a-CD with P-CD and HP-f- CD, the global inclusion for the former CD is slightly less spontaneous (this behavior is appreciable in Fig. 11). In general, AG: < AG» except for CuIMC2HP-$-CD. Now, comparing between metallic center, CuIMC2 inclusion in B-CD is more spontaneous than in HP-$-CD; ZnIMC behaves in opposite way, being interaction with HP-$-CD more spontaneous than f-CD. 17 a A O oo 144 A. Ricardo Hipólito N. 392 393 394 395 396 397 398 399 400 401 402 403 404 405 406 407 408 409 410 411 412 413 414 415 416 417 418 419 420 421 422 423 424 425 426 427 428 429 430 431 Inclusion phenomena are regularly discussed in terms of enthalpic and entropic contributions to Gibbs energy [Bouchemal, 2012; Rekharsky, 1994, 1998, 2002, 2006; Liu, 2005; Crini, 2014; Cooper, 1999, 2001]. Entropic driven (|AH| < [TAS|]) means that degrees of freedom are increased in the interaction. Two competitive effects are notorious: the reduction of entropy by effect of the restriction in MIMC2 conformational changes after inclusion and the increase of entropy due to release water from the cavity to contain the MIMC2 complex [Todorova, 2007]. Hydrophobic interactions are entropy-driven, where the entropy (AS) of the interaction is large and positive and enthalpy is a low contribution [Bouchemal, 2012]. Increasing of entropy due to water release is higher as the cavity size grows. Enthalpic driven means (|AH| > [TAS|) that Van der Waals interactions with unfavorable entropies of interaction. MIMC complexes possess important hydrophobic fragments, the aromatic residue of the IMC ligand, which are stabilized in the CD cavities realizing energy. Furthermore, water molecules within the cavity are in higher energy states compared with water molecules in the bulk, this energy is also released during MIMC inclusion. By analyzing the enthalpic and entropic contributions to AGg, it is observed that CulMC2 inclusion in a-CD is enthalpically driven, in contrast, inclusion in B-CD and HP-$-CD is entropically controlled. It seems that water release from cavity is determinant on inclusion of CulIMC in f$-CD and HP-$-CD vs a-CD, which would agree with water content in the CDs cavity before inclusion. For ZnIMCz, enthalpy guides inclusion for the three CDs. Exothermicity favors inclusion in a-CD, sum of (more numerous) weak interactions in the a.- CD smaller cavity might explain larger enthalpy change (Brocos, 2011), compared with f- CD and HP-f-CD, which having more spacious cavity are prone to present fewer interactions [Wenz, 2008; Danil de Namor, 1990;; Bouchemal, 2012; Rekharsky, 2002]. Interactions of CDs with the first MIMC site are more exothermic processes than interactions with the second MIMC site, except for CuIMC2HP-f-CD, where the second site is more exothermic that the first one. In both cases is clear that the two sites are no equivalent. Regarding global exothermicity, interaction of CuIMC2 with a-CD is more exothermic than ZnIMC.. In contrast, interaction of ZnIMC2 is more exothermic than CuIMC2 with P-CD and HP-$-CD. This may be due to a-CD display a closer contact with the CulIMC2 complex, improving interactions as complex approaches the cavity; on the other hand, the ZnIMC2 complex better interaction with a $-CD could be related to its structural features. For ZnIMC entropic contribution is negative for the tree CDs. Copper complex present a differentiate behavior, entropy change is negative for a-CD but positive for P-CD and HP-f- CD. Moreover, inclusion of ZnIMC2 in a-CD results in a ASz less negative than CulMC». Now, for B-CD and HP-$-CD, ASz of ZnIMC are negative while it is positive for CuIMC2. As it has been discussed, the entropic change due to the inclusion of CulIMC2 and ZnIMC2 can be rationalized in terms of two competitive contributions: the decrease of entropy associated with the reduction of conformational freedom of the complex upon inclusion; and the rise of entropy due to the exit of water from the cavity, as the hydrophobic part of the complex occupies the CD cavity. Thus, the positive entropy for the inclusion of CuIMC2 18 145 A. Ricardo Hipólito N. 432 433 434 435 436 437 438 439 440 441 442 443 might indicate that the reduction in the degrees of conformational freedom of CuIMC2 is insufficient to overcome the entropy generated by the exit of water molecules. On the other hand, the negative entropy, associated with the inclusion of ZnIMC2, could be explained if the decrease in the degrees of conformational freedom of ZnIMC>2 exceeds the increase in entropy due to dehydration of the cavity. Therefore, results in Table 3 would point out that CuIMC2 display a more rigid molecular structure than ZnIMC2 complexes. In general, CDs interact with MIMC2 spontaneously, the way that CDs interact with the sites are independently and no equal, indication that an election of a correct model helped to explain the experimental data. The relationship between AH y AS determine the feasibility of form and inclusion complex. It is appreciable that CD size cavity it is important for the relative values of AH y AS, but the guest molecule, and the number of released molecules of water from the CD cavity, also will contributes to the MIMC 2 interaction with CDs. 19 146 A. Ricardo Hipólito N. 444 — From obtained values of log Ki and log K2 by ITC (Table 3), it is possible to construct 445 diagrams of predominance (Fig. 12) for the inclusion of MIMC2 (at their solubility 446 concentration, So in Table 1) in function of the added CD, expressed as pCDrTotal (- 447 — log[CD]rotai). It is noticeable that in all the diagrams the first species, MIMC2CD, does not 448 reach the 100% of formation, its highest predominance is found around pCDTota = 3. The 449 predominance of the MIMC2CD2 occurs when pCDrTota < 1. Some differences between 450 CuIMC2 and ZnIMC-2 can be pointed out. In case of a-CD there is no perceptible differences. 451 To get a MIMC2 complex fully included, slightly less amount of B-CD and HP-f$-CD is 452 necessary for CulIMC2 than for ZnIMC. In the case of HP-f$-CD; ZnIMCHP-f$-CD 453 — predominate higher than CuIMCHP-$-CD. 454 When CDs are comparated, it is notorious that CulIMC2a-CD predominate in a higher 455 percentage than other CulIMC2CD. In contrast, less amount of Bf-CD y HP-$-CD is necessary 456 to reach 100% of formation of CuIMC2(CD)2. There is no differences between P-CD y HP- 457 — P-CD with CulIMC2 complex. The ZnIMC2a-CD acts as CulIMC20-CD and it has a higher 458 predominance than other ZnIMC2CD complex. Less amount of fP-CD y HP-f-CD is 459 necessary to reach 100% of formation of ZnIMC2(CD) than a-CD. 1.07 1.07 E 0.84 ¿e Z 0.67 ——CulMC> 3 0.6 ZnIMC> oO —— CulMC:a-CD —— ZnIMCia-CD 0.2 0.24 0.0 s : 0.0 - 2 0 2 4 6 2 0 2 A 6 1.04 POD o 1.0 POD o 0.8 0.84 S S E 0.6 ——CulMC: E 0.6 ZnIMC: ——CulMC:f-C Q ——Zn1MC:B-C E 04 CO es AMOO) 0.2 0.24 0.0 7 " r T 0.0 7 dl 7 7 2 0 2 4 6 2 0 2 4 6 1.07 PO o 1.07 PO o E 0.8 E 0.8 E 0.6 —— CulMC> E 0.6 —— ZniIMC: 3 04 —— CulMC:HP-$-CD 3 04) —— ZnIMC:HP-$-CD ea > —— Cul MCAHP-P-CD) e . — ZnIMCA(HP-$-CDp 0.2 0.2 0.0 Y 0.0 -2 0 2 4 6 2 0 2 4 6 460 POD posa POD oa 461 Fig. 12. Distribution species diagrams of MIMC, into CDs. 462 463 20 _ mm o o a == 147 A. Ricardo Hipólito N. 464 465 466 467 468 469 470 471 472 473 474 475 476 477 478 479 480 481 482 483 484 485 486 487 488 489 490 491 492 493 494 495 496 497 498 4. Concluding remarks It was possible to synthesize the solid complexes of MIMC, from the indomethacin salt. The characterization by IR, of the prepared solids, provided signals of CuIMC and ZnIMC mononuclear species, where the IMC coordinates the metal center through its carbonyl group. The studies of CuIMC by EPR and ZnIMC by XRPD, allowed to identify the stoichiometers [Cu(IMC)2(H20)2] and [Zn(IMC)2(H20)2]. The solubility of the complexes for CulIMC and ZnIMC were determined which were (3.14 + 2.35) x 10-5 and (2.49 + 1.90) x 10-5 M, respectively. This solubility is very low and does not allow the study of these complexes in water. It was shown that the solubility of the Cu complexes increases = 500% with HP-y-CD and up to = 1700% with HP-P-CD, while the solubility of those of Zn increases = 700% with y-CD and up to = 3500% with HP-f-CD; The CD that best solubilized the MIMC complexes was the HP-$-CD, the effect being greater for ZnIMC than for CuIMC. The order of solubilizing power of MIMC complexes with CDs is: HP-$-CD> a-CD> fB-CD> y-CD. The increase in solubility allowed to study the species present in solution of the copper complex by EPR, confirming the presence of a mononuclear copper species, where 2 molecules of IMC form a stoichiometry chelate complex Cu(IMC)(H20». In analogy with this Cu complex, it is proposed that the Zn complex has the stoichiometry Zn(IMC)(H20 ),, although the presence of a chelate complex is debatable. With the stoichiometry in solution confirmed, it was possible to study the thermodynamics of the interaction of MIMC2 complexes with CDs by ITC. A model of two sequential binding sites was proposed, with which the values of AG, AH, AS were determined for each site and also the global value. Thermodynamics with the proposed model indicates that the binding sites of the MIMC2 complexes are independent and not equivalent, with different values between them. The interaction of MIMC2 complexes with CDs is spontaneous. The first site is always more spontaneous than the second site. The increase in the cavity between a-CD and fB-CD improves spontaneity. The spontaneity values will depend on the enthalpy-entropic balance that is generated due to all the molecular driving forces in the inclusion. In this way it is observed that for a-CD the enthalpy contribution will be the predominant one for both complexes, this due to a tighter inclusion. In the case of P-CD and HP-$-CD with CulIMC,, the entropic contribution will be the one that dictates the way of inclusion, on the other hand the interaction of B-CD and HP- B-CD with ZnIMC is directed by the enthalpy contribution. The above behavior suggests a structural difference between the MIMC2 complexes, where the ZnIMC2 complex presents more conformational freedom. Species distribution diagrams confirm the need to use very high amounts of CD (low total pCDrota!) for the predominance of a completely included complex (MIMC2CD»).. 21 148 A. Ricardo Hipólito N. 499 500 501 502 503 504 S05 506 507 508 509 510 511 512 S13 514 SS 516 917 518 519 520 Author Contributions The manuscript was written through contributions of all authors. All authors have given approval to the final version of the manuscript. Adrián Ricardo Hipólito-Nájera, Alberto Rojas-Hernández, Norma Rodríguez-Laguna, Luis I. Reyes-García, Virginia Gómez-Vidales, Rodolfo Gómez-Balderas, María del Rosario Moya-Hernández. Declaration of Interest The authors declare that they have no known competing financial interests or personal relationships that could have appeared to influence the work reported in this paper. Financial Resources This work was supported by: UNAM-PAPIIT IN218118 “Complejos de Cu(II) y Zn(II) con fármacos antiinflamatorios”. UNAM-FESC-PIAPI 1846: “Complejos de inclusión de ciclodextrinas con moléculas orgánicas de interés biológico”. LANCAD-UNAM-DGTIC-058: “Complejación de fármacos antiinflamatorios no esteroidales con iones Cu(II) y Zn(M)”. Acknowledgments To CONACYT for the scholarship with registration number 300687. To the A.R. H-N thanks to Dr. Miguel Costas Basin for providing y-CD and the support with ITC Data. To Dr. Atilano Gutiérrez Carrillo for RMN support. To Dra. Katya Frank for the comments and suggestions for this publication. 22 149 A. Ricardo Hipólito N. 521 522 23 524 3Z3 526 327 528 529 530 531 532 533 534 139) 536 537 538 539 540 541 542 543 544 545 546 547 548 549 550 551 552 553 554 References. AFFINImeter- The software for molecular interactions https://www.affinimeter.com/site/ (accessed Jan 21, 2020). Aguirre, C.; Goto, Y.; Costas, M. Thermal and Chemical Unfolding Pathways of PaSdsAl Sulfatase, a Homo-Dimer with Topologically Interlinked Chains. FEBS Lett. 2016, 3590 (2), 202-214. https://do1.org/10.1002/1873-3468.12041. Backensfeld, T.; Miller, B. W.; Wiese, M.; Seydel, J. K. Effect of Cyclodextrin Derivatives on Indomethacin Stability in Aqueous Solution. Pharm. Res. An Off. J. Am. Assoc. 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Ricardo Hipólito N. 109 556 337 558 559 560 S61 562 563 564 565 566 567 568 569 570 571 572 573 574 373 576 377 578 579 580 581 582 583 584 585 586 587 588 589 Corona-A vendaño, S.; Alarcón-Angeles, G.; Rosquete-Pina, G. a; Rojas-Hernández, A.; Gutierrez, A.; Ramírez-Silva, M. T.; Romero-Romo, M.; Palomar-Pardavé, M. New Insights on the Nature of the Chemical Species Involved during the Process of Dopamine Deprotonation in Aqueous Solution: Theoretical and Experimental Study. J. Phys. Chem. B 2007, 111 (7), 1640-1647. https://doi.org/10.1021/p0637227. Crini, G. Review: A History of Cyclodextrins. Chem. Rev. 2014, 114 (21), 10940-10975. https://doi.org/10.1021/cr500081p. Danil de Namor, A. F.; Traboulssi, R.; Lewis, D. F. V. Host Properties of Cyclodextrins toward Anion Constituents of Antigenic Determinants. A Thermodynamic Study in Water and in N, N-Dimethylformamide. J. Am. Chem. Soc. 1990, 112 (23), 8442— 8447. https://doi.org/10.1021/ja001794031. Dillon, C. T.; Hambley, T. 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Ricardo Hipólito N. 659 660 661 662 663 664 665 666 667 668 669 670 671 672 673 674 675 676 677 678 679 680 681 682 683 684 685 686 687 688 689 690 691 692 Sanches, B. M. A.; Ferreira, E. I. Is Prodrug Design an Approach to Increase Water Solubility? Ínt. XK Pharm. 2019, 568 (May), 118498. https://doi.org/10.1016/3.ijpharm.2019.118498. Saokham, P.; Muankaew, C.; Jansook, P.; Loftsson, T. Solubility of Cyclodextrins and Drug/Cyclodextrin Complexes. Molecules. MDPI AG 2018. https://doi.org/10.3390/molecules23051161. Singla, A. Zinc-Indomethacin Complex: Synthesis, Physicochemical and Biological Evaluation in the Rat. nt J. Pharm. 1995, 120 (2), 145-155. https://doi.org/10.1016/0378-5173(94)00370-K. Sorenson, J. R. J. Copper Complexes Offer a Physiological Approach to Treatment of Chronic Diseases. In Progress in Medicinal Chemistry; Ellis, Szejtli, J. Introduction and General Overview of Cyclodextrin Chemistry. Chem. Rev. 1998, 98 (5), 1743-1754. https://doi.org/10.1021/cr970022c. 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Lámpara de filamento de tungsteno (380-2500nm) 2. Monocromador. El encargado de seleccionar la longitud de onda que se requiera. 3. Compartimiento de muestra. La muestra se coloca en bases adaptadas para la colocación de celdas de cuarzo, generalmente de 1 cm de paso óptico. 4. Detector. Es el que recibe la energía transmitida por la muestra y la convierte en una señal eléctrica. Fig. A1.1 Partes de un espectrofotómetro UV-vis de doble haz. En la Fig. A1.1, es posible observar un espectrofotómetro de doble haz (Harris, 2007). Ley de Lambert-Beer-Bouguer Cuando se hace incidir radiación UV-Vis a una muestra, la energía de la radiación absorbida por los electrones de valencia, los cuales sufren una transición de un de estado menor energía (estado basal) a un estado de mayor energía (estado excitado). Cada molécula presenta estados excitados característicos. La emisión de radiación sucede cuando el electrón libera energía, ya sea en su forma de radiación electromagnética o calor, para pasar de un estado excitado a un estado de menor energía. Una muestra, con especies capaces de absorber radiación, se le hace incidir una haz de luz, con una potencia inicial (P0), tendrá la capacidad de cambiar la potencia del haz cuando atraviese la muestra, a una potencia menor (P), debido a que la solución absorbió radiación del haz original (Fig. A1.2). Fig. A1.2 Fenómeno de absorción de radiación por una muestra 158 A. Ricardo Hipólito N. La transmitancia, T, es la fracción de potencia o radiación del haz de luz después de atraveaar una muestra, a una longitud de onda específica: 𝑇 = F FG ó %𝑇 = F FG × 100 (Ec. A1.1) Experimentalmente, se puede medir la absorbancia con un espectrofotómetro UV-Vis. La absorbancia se define como: 𝐴 = − logP7 F FG = logP7 FGF (Ec. A1.2) La absorbancia es directamente proporcional a la concentración del analito absorbente en la solución: 𝐴Q = 𝜀Q𝑏𝐶 (Ec. A1.3) donde; b es la longitud de paso óptico C es la concentración de la especie absorbente y ∈Q es el coeficiente de absortividad la cual es específica para cada molécula e indica la intensidad con la cual una sustancia absorbe radiación a cierta longitud de onda. Cuando C está dado en molaridad, 𝜀Q se denomina coeficiente de absortividad molar y sus unidades serán L cm-1mol-1. Esta ecuación es conocida como la Ley de lambert-Beer-Bouguer o simplemente Ley de Beer. La ley de Beer se cumple para soluciones diluidad, ya que, en soluciones concentradas, las mléculas de analito están muy próximas entre sí generando una mayr interacción entre éstas y así modificando la absortividad de las especies absorbentes. Cuando en una solución se tiene más de una especie química que absorve luz a la misma longitud de onda, la absorbancia queda definida por la suma de las absorbancias de cada una de las especies. A esto se le conoce como ley de las aditividades. 𝐴Q = ∑ 𝐴WQW = ∑ 𝜀WQ𝑏𝐶WW (Ec. A1.4) Debido a que el coeficiente de absortividad molar es específico para cierta longitud de onda, la absorbancia será dependiente, de la concentración de las especies absorbentes, de la longitud del paso óptico y también de la longitud de onda (Cedillo, 2017). A2. Técnica de espectrofotometría de Infrarojo (IR). Un espectrofotómetro de IR (Fig. A2.1), tiene la siguiente instrumentación: 1. Fuente de radiación. Cuerpo negro que produce una radiación continua, en IR medio suele utilizarse una lámpara de filamento de tungsteno. 2. Interferómetro. En la mayoría de IR de transformada de Fourier comerciales, se utiliza un interferómetro de Michelson (Fig. A2.2), que incluye un divisor de haz, espejos, láser y en algunos casos apertura. 3. Accesorio para muestra. Dependiendo de la muestra puede ser para medir transmisión y absorción (discos de haluro de alcali, suspensiones y películas), reflectancia total atenuada (ATR, por sus siglas en ingles), reflectancia difusa, reflectancia especular. 159 A. Ricardo Hipólito N. 4. Detector. Se pueden encontrar: a. Térmicos. Termopares, termopilas, etc. b. Piroeléctricos. TGS (sulfato de triglicina) y DTGS (TGS deuterado) c. Cuánticos. In(Ga)As, InSb y HgCdTe. Fig. A2.1. Esquema del interior de una Espectrofotómetro de IR con transformada de Fourier y interferómetro de Michelson Fig. A2.2, Ejemplo de una interferómetro de Michelson. 160 A. Ricardo Hipólito N. Un espectrofotómetro de IR de emisión de banda ancha, emite todas las frecuencias de interés simultáneamente donde la región del IR cercano (NIR, por sus siglas en inglés) es de 14000- 400 cm-1, el IR medio (MIR, por sus siglas en inglés) es de 4000-400cm-1, y el IR lejano (FIR, por sus siglas en inglés) es de 400-10 cm-1. La absorción del IR al igual que en UV-Vis está gobernada por la ley de Beer, que antes se ha descrito. El espectro de IR se obtiene al graficae la intensidad (absorbancia o transmitancia) contra el número de onda, el cual es proporcional a las diferencias de energía entre el estado basal y el excitado (Larkin, 2011). Dos componentes importantes en la absorción de IR son: la frecuencia de la radiación y el momento dipolar molecular. La interacción de la radiación con las moléculas puede describirse en términos de una condición de resonancia donde la frecuncia de radiación oscilante específica coincide con la frecuencia natural de una modo particular de vibración. Para que la energía se transmita del fotón IR a la molécula por absorción, la vibración molecular debe causar un cambio en el momento dipolar de la molécula. Esta es la regla de selección para espectrofotometría IR. La Fig. A2.3, muestra un ejemplo de una molécula diatómica heteronuclear “IR activa”. Este momento dipolar de la molécula cambia conforme lo hace el enlace. Por comparación un ejemplo de una molécula “IR inactiva” es una molécula diatómica mononuclear debido a que su momento dipolar es cero sin importar que tan largo sea el enlace (Stuart, 2005). Las vibraciones pueden ser cualquier cambio, en la longitud del enlace (estiramiento) o de de ángulo de enlace (flexión) (Fig. A2.4) Algunos enlaces pueden estirarse en fase (estiramiento simétrico) o fuera de fase estiramiento asimétrico (Fig. A2.5). Fig. A2.3. Cambio en el momento dipolar de una molécula diatómica heteronuclear (imagen tomada de Stuart, 2005). Fig. A2.4. Vibraciones de estiramiento y de flexión (imagen tomada de Stuart, 2005). Estiramiento Flexión Estiramiento 161 A. Ricardo Hipólito N. Fig. A2.5. Vibraciones simétricas y asimétricas(imagen tomada de Stuart, 2005). Un espectro típico de IR es obtenido de 4000 a 400cm-1. Dentro de este intervalo es posible diferenciar zonas en las que se pueden identificar grupos funcionales de moléculas orgánicas. 4000-2500cm-1: Absorción de enlaces simples de Hidrógeno (C-H, O-H ó N-H) 2500-2000 cm-1: Absorción de triples enlaces (CºC y CºN) 2000-1500 cm-1: Absorción de dobles enlaces (C=C, C=O) 1500-400cm-1: Huella digital. Absorción debida a otras deformaciones del enlace. Rotación, tijeras y algunas flexiones. A3. Calorimetría de titulación isotérmica (ITC) La calorimetría de titulación isotérmicas (ITC, por sus siglas en inglés) es una técnica basada en la medición del calor generado o absorbido cuando interaccionan dos moléculas. Los datos de ITC se usan en muchas áreas, desde química hasta biología celular. ITC es de las técnicas más sensibles para la determinación de la estequiometría de la interacción (N), la constante de afinidad (K) (también llamada estabilidad, constante de asociación o constante de inclusión) y el cambio de entelpía, el cual es el reflejo del calor ganado o pérdido durante la interacción. Además la entropía (DS) y la energía libre de Gibbs del proceso puede calcularse con los datos obtenidos por ITC. Un modelo adecuado debe de aplicarse para el ajuste de las curvas de titulación y los resultados obtenidos por ITC deben ser interpretados cuidadosamente. El experimento de ITC consiste en adiciones del ligante (L), que es colocado en la jeringa de inyección, al metal o macromolécula (M), que está contenido en la celda de reacción, la celda de referencia se llena con agua (Fig. A3.1). Las celdas de reacción y referencia, idénticas en forma y volumen, están colocadas en escudos de aislamiento térmico y son equilibradas a la temperatura deseada antes de comenzar el experimento. Estiramiento simétrico Estiramiento asimétrico 162 A. Ricardo Hipólito N. Las adiciones de L pueden ser continuas o por incremento. La adición continua del L se usa solamente para reacciones rápidas y las reacciones lentas pueden ser llevadas a cabo por ambas adiciones. La ventaja que tiene la inyección continua sobre la inyección por incremento es que con la primera se obtiene un número mayor de datos y la curva de valoración que se obtiene suele ser más definida, sobre todo cerca del punto de equivalencia. (Hansen, 2011). Cada inyección representa una reacción independiente que tiende al equilibrio bajo condiciones isobáricas, cuando la temperatura de ambas celdas se mantiene constante. El equipo detecta los cambios de temperatura en cada adición de valorante y compensa la ganancia o pérdida de calor, aplicando o sustrayendo potencia. Cuando una perturbación de la señal de potencia es considerable, por el cambio del ambiente, debido a una inyección, el sistema compensa la potencia hasta que las celdas vuelven a permanecer en equilibrio a la misma temperatura, este proceso gráficamente se observa como un pico, seguido de una línea base estable. Se obtiene un gráfico de la diferencia de calor asociada a la reacción química en función del tiempo (termograma) (Fig. A3.2a). Fig. A3.1. a)Fotografía del equipo VP-ITC del laboratorio 10 de fisicoquímica analítica de FES Cuautitlán. B)Representación esquemática del interior de un VP-ITC (imagen tomada del instructivo del equipo [GE Healthcare]). 1 y 2 sensores, 3 escudo interior, 4 celda de referencia, 5 husillo, 6 inyector, 7 émbolo, agitación, 9 jeringa, 10 escudo exterior, 11 celda de muestra. a) b) 163 A. Ricardo Hipólito N. Fig. A3.2. Gráficos obtenidos por la técnica de ITC. En donde se muestra el termograma y la isoterma de la interacción en una interacción en donde N = 1. A partir del termograma, los datos se integran para obtener una isoterma de enlace (Fig. A3.2b), que es la representación gráfica del calor asociado a la reacción en función de la relación molar entre M y L. En el punto de inflexión de la isoterma de enlace corresponde a la relación estquiométrica de la reacción, la diferencia de calor total corresponde a la entalpía de reacción (DH) y la pendiente a la constante de equilibrio (K). Esto se cumple si sólo se forma un solo complejo de estequiometría sencilla ó 1:1. [Martínez, 2015; Cedillo, 2019]. Una vez recolectados los datos por ITC se debe elegir un modelo químico que describa el sistema. Los modelos de interacción dependerán del sistema con el que se está trabajando. Pendiente: K N C a lo r p o r in y e cc ió n P o te n ci a ( µ W ) Tiempo (min) Relación Molar Termograma Isoterma a) b) 164 A. Ricardo Hipólito N. A4. Técnica de resonancia paramagnética electrónica (EPR) La espectroscopía de resonancia paramagnética electrónica (EPR, por sus siglas en inglés) es una herramienta poderosa en el estudio de las estructuras y el entorno de las especies que contienen electrones desapareados, tales como iones metálicos de transición, radicales libres orgánicos y estados electronicamente excitados. EPR es una técnica muy útil para inferir detalles sobre la estructura de complejos formados por iones metálicos paramagnéticos [Garribba, 2006]. Los electrones tienen momentos dipolares magnéticos debido a su momento angular intrínseco (o espin). Para un momento angular de espin, S, el momento magnético asociado (µe) es: 𝜇Y = −𝑔Y𝜇[𝑆 donde g es una cantidad adimensional llamada el factor g del electrón, 𝜇[ es el magnetón de Bohr y es igual a eh/4pmc = 9.2731 ´ 10-24 J/T (e y m son la carga y masa del electrón, respectivamente, h es la constante de Planck y c es la velocidad de la luz) (Basu, 2001). La interacción de una campo magnético aplicado B0 (usualmente a lo largo del eje z) con el momento magnético de un electrón, se puede describir por un Hamiltoniano, ℋ=𝑔Y𝜇[𝑩7ℓ donde 𝓵 es el operador de momento angular. Para el momento de espin angular S, los estados de energía no degenerados 2S+1, se pueden obtener con Ms = -1/2 y Ms = +1/2. Esta pérdida de degeneración en la aplicación del momento magnético es llamado el efecto Zeeman (Fig. A4.1). Fig. A4.1. Diagramas de niveles de energía para el efecto zeeman de un espin desapareado y transiciones de EPR). En la espectroscopía EPR, una transición es inducida entre los dos niveles Ms por la aplicación de radiación electromagnética adecuada n (10-1000 J/mol en la región de microondas) que satisface la condición de resonancia hn=gµBB0 (Fig. A4.1). Para electrones libres g es 2.0023; sin embargo, en moleculas cuyo electrón desapareado no está libre, su valor varía considerablemente. El movimiento orbital, introducido como resultado del acoplamiento espin orbital lleva a una salida desde el valor g del orbital libre. Esto es particularmente importante para iones de transición metálicos. La energía debida a acoplamientos espin-orbital es comparativamente pequeña que la interacción del campo de 165 A. Ricardo Hipólito N. electrones. Por lo tanto, para metales de transición, el efecto del acoplamiento espin-orbital altera el valor de g del electrón libre. Los núcleos que poseen momento angular de espin exhiben división debido al efecto nuclear Zeeman. Por lo tanto, un espin nuclear I, cuando interacciona con el espin electrónico, perturba la energía del sistema de tal manera que cada estado electrónico se divide en subniveles 2I+1. Debido a que el magneton nuclear es cerca de 1000 veces más pequeño que el magnetón de Bohr, las interacciones magnéticas nucleares son débiles, por lo que la separación de la energía entre los subniveles es pequeña. Las transiciones que involucran estos estados dan lugar a división hiperfina en un espectro bien resuelto y se designa como A. Estructura de un espectrómetro EPR. En la Fig. A4.2, se muestra un espectrómetro de onda continua convencional. El espectrometro está compuesto de cuatro grupos: los componentes de la fuente, el sistema del magneto, el sistema de detección, y el sistema de modulación. La función del primer grupo, la fuente, es producir la radiación electromagnética y mantener la muestra en las ondas incidentes. Fig.A4.2. Diagrama de una espectrómetro de EPR de banda X empleando 100kHz de fase sensible de detección. (1) Control de frecuencia automático. (2) Suministro de energía para la fuente de Microondas. (3)Fuente de microondas (klystron o pistola de diodo). (4) Aislador. (5)Contador de frecuencia. (6) Atenuador. (7) Carga final. (8) Oscilloscope. (9) Cristal detector. (10) Amplificador de señal de 100 kHz. (11) detector de señal de 100 kHz. (12) Computadora. (13) Soporte circular o híbrido. (14) Cavidad del sistema. (15) Bobinas de mudulación de 100kHz. (16) Amplificador de potencia de 100kHz. (17) oscilator de 100kHz. (18) Cavidad de resonancia. (19) Suministro de energía del magneto. (20) Unidad de escaneo de campo. La región de la fuente también controla y dirige las microondas incidentes. El sistema del magneto ayuda a proveer el campo magnético necesario para dividir los niveles de energía; 166 A. Ricardo Hipólito N. el campo debe ser homogeneo y estable sobre el intervalo deseado. Los sistemas de modulación y detección actúan para amplificar la señal recibida y registrarla (Maghraby, 2019). Espectros de EPR del ión Cu(II). En situaciones regulares (Fig A4.3), cuando el estado basal es el orbital 𝑑;<=>< ó 𝑑`< , el espectro EPR es axial, con ejes y y x equivalentes y dos valores g// (gz) y g⊥ (gx = gy). Cuando la geometría es un octaédro elongado, una pirámide cuadrada o cuadrado plano, el estado basal es el orbital 𝑑;<=><: 𝑔// = 𝑔` = 2.0023 ± fQ g2hi = 2.0023 ± mQ g2hi g⊥ > 2.0023 (espectro normal). En los situaciones inversas (Fig. A4.4), el estado basal es el orbital 𝑑`< y las componentes perpendiculares y paralelas del tensor g pueden describirse por las siguientes ecuaciones: 𝑔// = 𝑔` = 2.0023 (Ec. A4.3) 𝑔l = 𝑔; = 𝑔> = 2.0023 ± oQ gphn g// = 2.0023. En situaciones intermedias (Fig. A4.5), un espectro “rómbico” se puede esperar observándose 3 valores de g. Para estos complejos el parámetro R puede indicar el predominio del orbital 𝑑`< ó 𝑑;<=>< en el estado basal. 𝑅 = sk=sn si=sk (Ec. A4.5) con gx > gy > gz. Si R > 1, la contribución es más grande por el estado basal que surge del orbital 𝑑`<; si R < 1, la contribución mayor se da por el estado basal 𝑑;<=>< (Garribba, 2006). Fig. A4.3. Espectro de [Cu(etilendiamina)2(ClO)4]2. Situación Regular. 167 A. Ricardo Hipólito N. Fig. A4.4. Espectro de [Cu(fenantrolina)2Cl]ClO4. Situación Inversa. Fig. A4.5. Espectro de [Cu(fenantrolina)2(H2O)](NO3)2. Situación intermedia. A5. Programas computacionales utilizados. SQUAD Para el análisis de los experimentos de relaciones molares por UV-Vis, se utilizó el programa que calcula los cocientes de estabilidad a partir de datos de absorbancia (SQUAD, por sus siglas en inglés, Stability Quotients from Absorbance Data). SQUAD es un programa escrito en lenguaje FORTRAN (por sus siglas en inglés, Formula translation). Está diseñado para refinar constantes de equilibrio de un modelo químico propuesto, a partir de datos de absorbancia obtenidos a diferentes longitudes de onda y a diferente composición, empleando un enfoque no lineal de mínimos cuadrados. El programa tiene la capacidad de refinar constantes de equilibrio de complejos del tipo MmMl’HjLnLq’, donde m, l, n, q ³ 0 y j es positivo (protones), negativo (iones hidróxido) o cero. También es útil para equilibrios ácido- base, además de protonados ó hidroxo complejos. Para el refinamiento de las constantes de equilibrio, el algoritmo se basa en la ley de aditividades y la ley de beer, para calcular los coeficientes de absortividad (𝜀). El programa trata datos de absorbancia, para un cierto número de longitudes de onda y un cierto número de soluciones. Para cada valor de absorbancia Ai,k se puede definir la siguiente ecuación: 168 A. Ricardo Hipólito N. 𝐴W,v = ∑ [𝑠𝑝𝑒𝑐𝑖𝑒𝑠]W,~ × 𝜀~,v P (Ec. A5.1) donde; la concentración de la j-ésima especie en la iésima solución (espectro) y 𝜀~,v es la absortividad molar de la j-ésima especies en la k-ésima longitud de onda. SQUAD computa los valores de la(s) constante(s) general(es) de formación las cuales minimizan la suma de los cuadrados residuales entre los valores observados y los calculados: 𝑈 = ∑ ∑ p𝐴W,v‚ƒ − 𝐴W,v„…†„q m‡ P ˆ P (Ec. A5.2) Los cálculos más básicos de SQUAD se basan en varíar los parámetros a dos niveles. En el cual en un nivel superior, se varían las constantes de equilibrio para la formación de varias especies y para cada set de constantes de equilibrio, SQUAD calcula, para cada longitud de onda separadamente, los valores de las absortividades molares que minimizan las contribuciones de U. Además del ajuste a dos niveles, SQUAD usa otras subrutinas de cálculo, que controlan el refinamiento y el cálculo numérico, usando enfoques clásicos como Gauss-Newton o Newton-Raphson. Los calculos se repiten (iteración) hasta tener diferencias entre las constantes calculadas menores del 0.1%, en este punto, se considera que el programa convergió. Los siguientes parámetros estadísticos, que arroja SQUAD, ayudan a determinar si el modelo químico propuesto explica la información experimental (Martínez, 2015; Morales, 1993) • Parámetro de correlación (matriz): determina la asociación entre las variables, su valor va de cero a uno, es una medida de la dependencia lineal entre las variables. • La desviación estándar sobre los datos de absorbancia (s): es un indicativo de la validez del modelo químico propuesto. • La desviación estándar sobre las constantes: valores del 1 % son aceptables. • La desviación estándar por espectro y desviación estándar sobre los coeficientes de absortividad molar: dependen de las desviaciones estándar en los datos de absorbancia y de las constantes calculadas. • Valores de U menores de 10-2 MEDUSA Otro programa utilizado, fue MEDUSA (Make Equilibrium Diagrams Using Sophisticated Algoritms), el cual es un software con el que es posible crear diversas representaciones gráficas del sistema químico estudiado, a partir de los valores refinados de las constantes de equilibrio. Se pueden crear diagramas de distribución de especies, logarítmicos y de zonas de predominio. Para la construcción de dichos diagramas se tiene el apoyo de una base de datos llamada HYDRA (Hydrochemical Equilibrium Data Base), que contiene valores de constantes de formación a 25 °C, utiliza los datos de constantes de equilibrio desarrollada por el Department of Inorganic Chemistry, Royal Institute of Technology (KTH) en Estocolmo Suiza. Algunos de los elementos que constituyen el archivo de entrada son: el número de componentes del sistema, número de complejos formados y especies sólidas, tanto de complejos como de componentes, la estequiometría de cada uno de los complejos y los valores de sus constantes de equilibrio, la concentración de trabajo, la fuerza iónica y la 169 A. Ricardo Hipólito N. temperatura [Bernabé-Pineda, 2009; Gómez-Zaleta, 2006; Puigdomenech https://www.kth.se/en/che/medusa]. AFFINIMETER. El programa utilizado para determinar la constante de inclusión y los parámetros termodinámicos, es Affinimeter, la versión utilizada fue la versión en linea. Este software se usa para el análisis de eventos enlazantes de medidas experimentales de diferentes orígenes. Affinimeter puede analizar datos, principalmente, de calorimetría de titulación isotérmica (ITC) y resonancia magnética nuclear (RMN), pero también espectroscópicos. Para ITC, durante un experimento típico, se obtiene la señal de la potencia aplicada en función del tiempo (Fig. A3.2a). Las señales de potencia aplicada se perturba debido a los pequeños cambios del sistema, que pueden ser debidas a la agitación o cambios de temperatura en el ámbiente y también debido a perturbaciones grandes debido a inyecciones. La señal del periodo de inyección-recuperación se registra como un pico de potencia contra tiempo. La colección de los picos para una titulación completa debe ser integrada. Para esto Affinimeter genera una línea base para cada inyección, que se resta de la señal obtenida. Esto lo realiza usando funciones ortogonales de cominación lineal (polinomiales de Legendre de primero, segundo y tercer grado). Una vez que los picos se han integrado, se genera la isoterma de equilibrio o de enlace (Fig. A3.2b). La integral de cada pico representa el calor liberado o absorbido debido a la reacción de enlace que se llevó a cabo en la celda de reacción. Existen diversos programas para el análisis de interacciones intermoleculares, como Origin ó PEAQ para ITC. Generalmente, estos programas computacionales pueden clasificarse como software que sólo ofrece una lista de modelos predeterminados o software que permite la implementación de nuevos modelos. La generación y validación de nuevos modelos no es algo sencillo debido a que no hay resultados de referencia disponibles, además de que se necesita experiencia y herramientas avanzadas. Affinimeter ha resuelto este problema al adoptar diferentes estrategias -el uso de equaciones generalizadas para las dos familias principales de modelos de enlace, llamados equilibrios estequiométricos (SE, por sus siglas en inglés) y sitios independiente (IS, por su ssiglas en inglés). Debido a que las ecuaciones son generalizados, la cantidad de modelos disponibles para cada familia son virtualmente ilimitados. Los modelos SE se basan en constantes de equilibrio estequimétrico (o macroscópico) y son típicamente aplicadas a interacciones de baja estequiometría, donde los diferentes sitios de enlace pueden acoplarse entre sí. Los modelos IS, se basan en constantes de equilibrio para sitios específicos (o microscópicos) donde los diferentes sitios de enlace no interactúan entre sí, aunque se pueden agrupar en conjuntos, donde los sitios tienen afinidades idénticas y entalpías de interacción con las especies involucradas. Para los modelos SE se considera la interacción entre 3 componentes M, L y Z, formando complejos de cualquier estequiometría. Para escribir las ecuaciones es conveniente escribir las ecuaciones en términos de constantes de equilibrio globales: 𝑥𝑀 + 𝑦𝐿 + 𝑧𝑍 ↔ 𝑀;𝐿>𝑍` (Ec. A5.3) 𝛽†> = ‘’i“k”n• ([’]–∙[“]i∙[”]˜) (Ec. A5.4) 170 A. Ricardo Hipólito N. La ecuación usada por affinimeter para el análisis de datos de ITC bajo el esquema estequiométrico SE es: Δ𝑄W = ›=œkž,Ÿ (œŸ¡¢=œŸ) œ£¤žž,Ÿ ∆¥¦Ÿ§∙p‘“kž•=[“]¨,Ÿq œ¦©ª p‘“kž•∙«Ÿ¬­,Ÿq (Ec. A5.5) donde; Δ𝑄W es el calor absorbido o emitido por mol de L adicionado durante la inyección i. La presencia de M y Z es opcional en cualquier experimento. 𝑄ƒ>®,W es el calor total requerido para formar todas las especies químicas presentes en el volumen inyectado (𝑣W°~,W). 𝑄W es el calor requerido para formar todas las especies químicas presentes en la celda. 𝑄„®®,W es la contribución de calor asociado con la muestra que esta siendo desplazada (que no está en contacto con la sección de la celda en donde el sensor de temperatura) durante la inyección. . ‘𝐿ƒ>®• es la concentración de la jeringa, [𝐿]4,W es la concentración en la celda de reacción después de cada adición. 𝑄h‚ es una corrección por el desplazamiento de línea base debido a fenómenos físicos. Bajo el esquema estequiométrico IS la ecuación utilizada es: Δ𝑄W = ›(œŸ¡¢=œŸ) œ£¤žž,Ÿ ∆¥¦Ÿ§∙p‘“kž•=[“]¨,Ÿq œ¦©ª p‘“kž•∙«Ÿ¬­,Ÿq (Ec. A5.6) El término 𝑄ƒ>®,W se remueve debido a que la macromolécula ó (M) no pueden estar en la jeringa. Para los datos de ITC, los ajustes de los parámetros para cada modelo están numéricamente determinados por la minimización de la función objetivo: 𝜒m = P ²∑ p∆œŸ ³i´=∆œŸq < µ¢< ² P (Ec. A5.7) donde p es el número total de puntos, ∆𝑄WY;² son los valores de la isoterma de equilibrio experimental, ∆𝑄W está dado por las ecuaciones XXXX, y si es la incertidumbre de cada punto. Para optimizar la convergencia, se usan los algoritmos de cristalización simulada (simulated annealing) y Levenberg-Marquardt, de manera secuencial. Además, durante el proceso iterativo se usó el algoritmo Newton-Raphson usando la regla de Armijo para obtener las concentraciones de las especies libres M, L y Z. Lo que se busca en un experimento es obtener los valores c2 más pequeños posibles, para asignarlo a un mejor ajuste. Idealmente, para una combinación de medidas experimentales razonablemente buenas, los valores de c2 deben acercarse a la unidad, lo que significa que la diferencia entre ∆𝑄WY;² y ∆𝑄W se explica esencialmente por las incertidumbres si. En práctica, los valores de c2 puede ser difícil para asignarlo a medidas informativas de la calidad del ajuste que guía al usuario en la selección del modelo correcto para analizar los datos. En general el valor cercano a la unidad corresponde a buen ajuste, pero el valor absoluto de este parámetro depende mucho de las incertidumbres de los puntos y su valor no está limitado, por lo que es dificil decir si un valor de c2 de 5, 10 ó 20 es aceptable.Affinimeter espera mejorar estos problemas en versiones más recientes (Piñeiro, 2019). 171 A. Ricardo Hipólito N. A6. Método de relaciones molares (RM). Considerando la reacción: 𝑥𝑀 + 𝑦𝐿 ⇄ 𝑀;𝐿𝑦 (Ec. A6.1) Cuya constante de formación está dada por: 𝛽 = ‘’i“k• [’]i[“]k (Ec. A6.2) Es posible determinar la estequiometria para una reacción de complejación en el que está involucrada una macromolécula o un metal (M) con un ligante (L). En el método de relaciones molares (RM), se mantiene fija la concentración de alguno de los reactivos y la concentración del otro reactivo se varía. A cada cambio de concentración, del reactivo que se varía, se determina alguna propiedad fisicoquímica o respuesta (R) que esté relacionada con la concentración, ya se de alguno de los reactivos (M ó L), del complejo formado (MxLy) o ambos. Si sólo el complejo, MxLy, es el responsable de la propiedad fisicoquímica a medir, entonces R puede definirse como: 𝑅 = 𝑘’i“k‘𝑀;𝐿>• (Ec. A6.3) donde 𝑘’i“k es el factor de respuesta. La representación gráfica, de R en función de la RM, para reacciones cuantitativas, se obtiene una trayectoria recta y un cambio de pendiente, el cual corresponde a la RM estequiométrica. En la Fig. A6.1a, se pesenta el gráfico típico de RM para una reacción cuantitativa en donde sólo el complejo formado da lugar a la respuesta. Otra ventaja de emplear el método de RM es que se pueden estudiar la formación de complejos sucesivos, siempre y cuando los valores de las constantes de formación sean considerablemente distintas y los factores de respuesta no sean iguales. (Fig. A6.1b). Fig. A6.1. Espectros típicos para experimento de RM de reacciones cuantitativas donde se observan los cambios de pendiente para a) complejos de relación 1:1 y b) complejos de la forma MLn. a) b) 172 A. Ricardo Hipólito N. Para reacciones poco cuantitativas, es decir, que la constante de formación del complejo es menor de 103, es el que se presenta en la gráfica como puede observarse en la Fig. A6.2. Para reacciones poco cuantitativas no puede determinarse la relación estequimétrica entre ambos reactivos. Lo que si nos proporciona información es la representación gráfica de las respuestas en función del logaritmo negativo de la concentración del analito que varía en el método de relaciones molares o a la partícula (P) (pP=-log[P]). A partir de la Fig. A6.3, se puede estimar el valor de la constante de formación en donde se presenta un cambio pronunciado en la pendiente de la curva que se obtiene. Fig. A6.2. Representación gráfica de R contra la relación molar ([L]/[M)) para la formación de un complejo MxLy, con un log b < 3. Fig. A6.3. Respuesta en función del pP R 173 A. Ricardo Hipólito N. A7. Gráficos de absorbancia corregida a 229 nm contra el pCD, de la interacción IMC con CDs porUV-Vis a pH 5 y 7. Fig. A7.1. Gráfico de Absorbancia corregida a 229 nm contra el pCD del experimento de interacción de IMC con a-CD a pH 5. Fig. A7.2. Gráfico de Absorbancia corregida a 229 nm contra el pCD del experimento de interacción de IMC con a-CD a pH 7. 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 1.38 1.40 1.42 1.44 1.46 229nm A b so rb an ci a paCD 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 1.26 1.28 1.30 1.32 1.34 1.36 1.38 1.40 pa-CD 229 A b so rb an ci a 174 A. Ricardo Hipólito N. Fig. A7.3. Gráfico de Absorbancia corregida a 229 nm contra el pCD del experimento de interacción de IMC con b-CD a pH 5. Fig. A7.4. Gráfico de Absorbancia corregida a 229 nm contra el pCD del experimento de interacción de IMC con b-CD a pH 7. 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 1.28 1.30 1.32 1.34 1.36 229nm A b so rb an ci a co rr eg id a pb-CD 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 1.32 1.34 229nm A b so rb an ci a C o rr eg id a pb-CD 175 A. Ricardo Hipólito N. Fig. A7.5. Gráfico de Absorbancia corregida a 229 nm contra el pCD del experimento de interacción de IMC con g-CD a pH 5. Fig. A7.6. Gráfico de Absorbancia corregida a 229 nm contra el pCD del experimento de interacción de IMC con g-CD a pH 7. 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 1.2 1.4 1.6 1.8 229 nm A b so rb an ci a co rr eg id a pg-CD 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 229 nm A b so rb an ci a co rr eg id a pg-CD 176 A. Ricardo Hipólito N. Fig. A7.7. Gráfico de Absorbancia corregida a 229 nm contra el pCD del experimento de interacción de IMC con HP-b- CD a pH 5. Fig. A7.8. Gráfico de Absorbancia corregida a 229 nm contra el pCD del experimento de interacción de IMC con HP-b- CD a pH 7. 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 1.65 1.70 1.75 1.80 1.85 229 nm A b so rb an ci a co rr eg id a pHP-b-CD 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 1.44 1.45 1.46 1.47 1.48 1.49 1.50 1.51 1.52 229nm A b so rb an ci a C o rr eg id a pHP-b-CD 177 A. Ricardo Hipólito N. Fig. A7.9. Gráfico de Absorbancia corregida a 229 nm contra el pCD del experimento de interacción de IMC con HP-g- CD a pH 5. Fig. A7.10. Gráfico de Absorbancia corregida a 229 nm contra el pCD del experimento de interacción de IMC con HP-g- CD a pH 7. 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 1.30 1.35 1.40 1.45 1.50 1.55 1.60 229 nm A b so rb an ci a co rr eg id a pHP-g-CD 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 1.35 1.40 1.45 1.50 229 nm A b so rb an ci a co rr eg id a pHPg-CD 178 A. Ricardo Hipólito N. A8. Información obtenida por cada técnica. Técnica Información obtenida. Uso de información. UV-Vis Información del espectro de UV-Vis de la IMC. Para determinar los máximos y como varían los mismos en función del pH y en función a la inclusión con CD. Determinación de pKa de la IMC y logK1:1. Cuantificación de Cu(II) y Zn(II) en solución. Se supo qué cantidad de iones estaban disueltos en solución acuosa cuando fueron incluidos en CDs. IR Espectro IR de la IMC. Permitió observar las vibraciones asimétricas y simétricas del carboxilato de la IMC y diferenciarlo de la HIMC y la materia prima para su obtención. Información del espectro complejos Cu(IMC)2(H2O)2 y Zn(IMC)2(H2O)2. Se logró proponer la manera del enlace del ión metálico con IMC. Siendo las especies quelato o puente, las posibles estructuras en los sólidos Cu(IMC)2(H2O)2 y Zn(IMC)2(H2O)2. ITC Información de los parámetros termodinámicos de interacción entre IMC con las diferentes CDs. Ayudó a determinar las fuerzas moleculares, que se llevan a cabo, para que la IMC interaccione con la CD de tal manera que explique la inclusión. Proponiendo un modelo de enlace 1:1 de inclusión. Información de los parámetros termodinámicos de la interacción entre M(IMC)2 con las diferentes CDs Ayudó a determinar las fuerzas moleculares, que se llevan a cabo, para que los complejos M(IMC)2 interaccionen con CDs de tal manera que se lleva a cabo la inclusión. Proponiendo un modelo de enlace de inclusión inependiente y sucesivo. EPR Un gráfico de los sólido de CuIMC. El sólido presento señales típicas para un complejo mononuclear, con ligeras impurezas de complejo dinuclear. Un gráfico de los complejos Cu(IMC)2CD2 con las diferentes CDs en solución acuosa Ayudó a determinar que las especies mononucleares de los complejos Cu(IMC)2CD2 son especies mononucleares, con posible estructura octaédrica elongada o cuadrada plana. XRPD Difractogramas de la sal de IMC Ayudó a identificar la sal de IMC y observar que era una especie distinta a la HIMC Complejo en sólido de Zn(IMC)2(H2O)2 Permitió comparar las señales con las comparadas con la literatura para identificar al complejo mononuclear Zn(IMC)2(H2O)2 RMN Espectro de RMN de protón en agua deuterada de la sal de IMC. Las respuestas de los protones de la molécula permitieron constatar la estructura de la sal de IMC. 179 A. Ricardo Hipólito N. Referencias. 180 A. Ricardo Hipólito N. Abou-Mohamed, G., El-Kashef, H. A., Salem, H. A., & Elmazaf, M. M. (1995). Effect of Zinc on the Anti-Inflammatory and Ulcerogenic Activities of Indometacin and Diclofenac. Pharmacology, 50(4), 266–272. https://doi.org/10.1159/000139292 AFFINImeter- The software for molecular interactions [WWW Document], n.d. URL https://www.affinimeter.com/site/ (accessed 1.21.20). Aguirre, C., Goto, Y., Costas, M., 2016. 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