UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO Maestría y Doctorado en Ciencias Bioquímicas Las señales de CD43 promueven la activación de vías que favorecen la sobrevida de los linfocitos T TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: Doctor en Ciencias PRESENTA: María Elena Bravo Adame TUTOR PRINCIPAL Dra. Yvonne Jane Rosenstein Azoulay (Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México) MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR Dra. Claudia González Espinosa (Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional) Dr. Federico Sánchez Rodríguez (Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México) Ciudad de México, Noviembre, 2016 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. 2 JURADO DE EXAMEN Dr. Jean Louis Charli Casalonga (Presidente) Dr. Fernando Esquivel Guadarrama (Secretario) Dra. Rosa Victoria Pando Robles (Vocal) Dr. Vianney Ortiz Navarrete (Vocal) Dra. Carmen Beltrán Núñez (Vocal) 3 AGRADECIMIENTOS Este trabajo se desarrolló con fondos provenientes de diferentes proyectos: PAPIIT: IN219307, IN206913, IN212716 CONACYT: 100275, 220990 Asimismo, conté con una beca CONACYT durante el doctorado (Núm. Becario: 172690) y con el apoyo del “Programa de Apoyo a los Estudios de Posgrado (PAEP)” para la asistencia a cursos y congresos. Al Banco de Sangre del Hospital Regional del IMSS y el Centro Regional para la Transfusión Sanguínea en Cuernavaca, Morelos, por contribuir con la materia prima para mis experimentos. A la Unidad de Docencia del IBt por todo su apoyo durante mis estudios de posgrado. A los miembros de mi comité tutoral por sus críticas, sus sugerencias, sus consejos y su entusiasmo. Gracias por la orientación y el apoyo que siempre me brindaron. A los miembros del jurado de examen por las recomendaciones hechas a mi trabajo y por sus palabras cuando nos sentamos a revisar mi tesis. A la Dra. Yvonne Rosenstein por haberme aceptado en el laboratorio, por su confianza, sus consejos, sus críticas y sugerencias. Gracias por abrirme las puertas para entrar en el mundo de la ciencia. Gracias por el apoyo que siempre me brindó, en lo académico y en lo personal, ¡muchas gracias! A la Dra. Rosario Vera y a la Dra. Bronwyn Barkla porque siempre me apoyaron durante esta etapa. Gracias por sus consejos, por sus pláticas, por estar siempre dispuestas a contribuir en todas las maneras posibles. Gracias porque siempre me recibieron con una amable sonrisa para escucharme, aconsejarme y ayudarme cada vez que se los pedí. Al Dr. Omar Pantoja por el entusiasmo que siempre mostró, por toda su ayuda y sus consejos. Al Dr. Gustavo Pedraza, al Dr. Mario Cruz y al Dr. Ismael Secundino por estar siempre abiertos a escuchar y ayudarme a resolver mis dudas, por las preguntas, las críticas y las sugerencias hechas a mi trabajo. ¡Gracias! 4 A todos los miembros del laboratorio: Erika, Monse, Daniela, Álvaro, Steph, Ángel, Víctor, Alicia, Roberto, Constance, Pablo, Brenda, Paulina, Nacho, Citlali y Cecilia. Gracias por siempre animarme y apoyarme, por sus preguntas, sus sugerencias, por todas las cosas que aprendí de ustedes. Gracias por las pláticas tan divertidas, por ser unos excelentes compañeros y amigos. A mis papás, por toda su confianza y por el apoyo que siempre me han dado. Gracias por ayudarme a terminar esta etapa, siempre han sido un ejemplo de éxito personal y profesional y por eso este logro es de ustedes también. Gracias por siempre animarme a salir adelante, por sus consejos, por ser un pilar y un ejemplo tan importante en mi vida. Gracias por todo lo que han hecho para mi formación como profesionista y como persona. Gracias por ser mi guía y un apoyo tan importante para la formación de “mi pequeña familia”. Los adoro!!! A Israel, gracias amor por tu apoyo incondicional, por motivarme a seguir adelante y escucharme siempre. Gracias por ayudarme a cumplir mis sueños, por tu paciencia y por acompañarme a lo largo de todos estos años, este logro también es tuyo ojos. Gracias por compartir conmigo sueños y aspiraciones, por trabajar siempre juntos para lograr nuestras metas personales. ¡Gracias por formar conmigo una hermosa familia, te amo ojos! A Regina, mi princesa, eres nuestra más grande bendición, nuestro orgullo, nuestro motor para superarnos, para unirnos más como familia. Gracias por todas tus sonrisas, tus abrazos y tu amor. Te amo princesa y siempre recuerda que puedes lograr todos tus sueños. Al resto de mi familia, no menciono todos sus nombres, pero saben que les agradezco enormemente su interés, su cariño y el apoyo que siempre me han demostrado. 5 ÍNDICE ABREVIATURAS .................................................................................................................................... 8 RESUMEN ............................................................................................................................................ 9 ABSTRACT .......................................................................................................................................... 10 I. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................................... 11 1.1 La respuesta inmune ......................................................................................................... 12 1.1.1 La respuesta celular ................................................................................................... 14 1.1.2 El receptor para el antígeno: el complejo TCR-CD3 .................................................. 15 1.2 Metabolismo de los linfocitos T ........................................................................................ 17 1.2.1 Flexibilidad en el metabolismo de los linfocitos T .................................................... 18 1.2.2 Las señales co-estimuladoras regulan el metabolismo de los linfocitos T ................ 22 1.2.3 El metabolismo define la viabilidad de los linfocitos T ............................................. 25 1.3 CD43 .................................................................................................................................. 27 1.3.1 El gen ......................................................................................................................... 28 1.3.2 La proteína ................................................................................................................ 29 1.3.3 Regulación de la expresión de CD43 ......................................................................... 31 1.3.4 Los ligandos ............................................................................................................... 32 1.3.5 Las funciones ............................................................................................................. 34 1.3.6 CD43: una molécula accesoria .................................................................................. 36 1.3.7 Participación de CD43 en distintas patologías .......................................................... 38 II. HIPÓTESIS .................................................................................................................................. 42 III. OBJETIVO ................................................................................................................................... 44 IV. RESULTADOS PUBLICADOS ........................................................................................................ 46 V. RESULTADOS NO PUBLICADOS .................................................................................................. 60 5.1 Expresión diferencial de proteínas en respuesta al entrecruzamiento del TCR y CD43 ... 61 5.2 Las señales conjuntas del TCR y de CD43 modulan el metabolismo de glucosa .............. 66 5.3 Las señales de CD43 inducen la expresión del transportador de glucosa Glut-1 de manera dependiente de la vía de PI3K/Akt/mTOR .................................................................................... 68 5.4 La interacción de CD43 con HSA favorece la sobrevida de los linfocitos T ....................... 71 VI. DISCUSIÓN ................................................................................................................................. 74 6 VII. CONCLUSIÓN ............................................................................................................................. 82 VIII. REFERENCIAS ............................................................................................................................. 84 IX. ANEXOS ...................................................................................................................................... 97 Anexo 1. Materiales y Métodos .................................................................................................... 99 Anexo 2. Revisión “CD43” ........................................................................................................... 105 Anexo 3. Lista de proteínas identificadas por spot en el análisis proteómico ............................ 114 Anexo 4. Lista total de proteínas identificadas y número de acceso en Uniprot ....................... 142 Anexo 5. Resultado del análisis bioinformático utilizando la herramienta DAVID para identificar procesos biológicos enriquecidos ............................................................................................... 144 Anexo 6. Resultado del análisis bioinformático utilizando la herramienta STRING para identificar procesos biológicos enriquecidos ............................................................................................... 145 Anexo 7. Resultado del análisis bioinformático utilizando la herramienta STRING para identificar las vías enriquecidas .................................................................................................................... 147 7 ÍNDICE DE FIGURAS Cooperación entre la respuesta inmune innata y la respuesta inmune adaptativa. ........................ 13 El complejo del receptor para el antígeno TCR. ................................................................................ 16 Modelo de activación de linfocitos T dependiente de dos señales. ................................................. 17 Metabolismo de glucosa en linfocitos T. ........................................................................................... 18 Los programas metabólicos de los linfocitos T varían de acuerdo a sus necesidades funcionales. . 19 La regulación del metabolismo de glucosa en células en reposo y activadas. ................................. 20 Programas metabólicos de las diferentes subpoblaciones de linfocitos T. ...................................... 22 La vía de PI-3K/Akt/mTOR. ................................................................................................................ 25 Los linfocitos T requieren señales extracelulares para cubrir sus demandas metabólicas y sobrevivir. .......................................................................................................................................... 27 Estructura de los O-glicanos de CD43. .............................................................................................. 31 Alineamiento múltiple de la región intracelular de CD43. ................................................................ 37 Vías de señalización que se activan en respuesta a las señales generadas por el entrecruzamiento de CD43. ............................................................................................................................................ 38 Activación de linfocitos T CD4+ a través del TCR y CD43. ................................................................. 62 2D-DIGE. ............................................................................................................................................ 63 Procesos biológicos enriquecidos en células co-estimuladas a través del TCR y CD43. ................... 65 Las señales de CD43 inducen moderadamente la producción de lactato y el consumo de glucosa. 67 Las señales de CD43 inducen un aumento en la expresión de Glut-1 en la membrana. .................. 69 La expresión de Glut-1 en la membrana de linfocitos estimulados a través del TCR y CD43 o CD28 se induce a partir de 1 hora de activación. ....................................................................................... 70 La translocación de Glut-1 a la membrana en respuesta a las señales del TCR y CD43 depende de la vía de PI3K y mTOR. .......................................................................................................................... 71 La unión de HSA a CD43 aumenta la viabilidad de los linfocitos T. .................................................. 72 La estimulación a través de CD43 activa la vía de Akt. ..................................................................... 73 Vía de señalización de CD43. ............................................................................................................. 78 8 ABREVIATURAS 2D-DIGE Two-dimensional difference in gel electrophoresis APC Antigen presenting cell Bad Bcl-2 associated death promoter CREB cAMP response element binding protein Glut-1 Glucose transporter 1 HSA Human serum albumin LDH Lactate dehydrogenase MEK5 Mitogen activated protein kinase kinase 5 PEP Phosphoenolpyruvate PKM2 Pyruvate kinase isoform M2 PPP Pentose phosphate pathway Stat3 Signal transducer and activator of transcription 3 TCR T cell receptor 9 RESUMEN CD43 es una de las moléculas co-estimuladoras más abundantes en la superficie de los linfocitos T. En este trabajo nos enfocamos en evaluar por medio de un análisis proteómico la importancia que tienen las señales co-estimuladoras de CD43 en la regulación de la sobrevida de células linfoides. Utilizando citometría de flujo mostramos que las señales de CD43 favorecen la localización del transportador de glucosa Glut-1 en la membrana celular. Aunque los ensayos de actividad enzimática mostraron un incremento ligero en la ingesta y el metabolismo de glucosa, la fosforilación de la enzima glicolítica piruvato cinasa M2 en la Y105 en respuesta al entrecruzamiento del TCR y de CD43, promueve una función alterna de la piruvato cinasa M2 que favorece la sobrevida de las células. Por medio de la co-estimulación de los linfocitos con anticuerpos anti-TCR y anti- CD43 describimos una vía de señalización que no había sido identificada para CD43, donde destaca la participación de la piruvato cinasa M2, PKA, Stat3 y ERK5 como proteínas reguladoras que favorecen la sobrevida al inducir la fosforilación de blancos como CREB y Bad. Asimismo, la incubación de los linfocitos con albúmina sérica humana, uno de los ligandos naturales de CD43, induce la activación de la vía de PI-3K/Akt, la cual junto con mTOR, regula la localización de Glut-1 hacia la membrana. Finalmente, la incubación de los linfocitos T con albúmina sérica humana también favorece la sobrevida, evaluada por la reducción de sales de tetrazolio y por citometría de flujo. En conjunto, nuestros resultados demuestran la activación de nuevas vías de señalización en respuesta a las señales co-estimuladoras del CD43, y resaltan su importancia para promover la viabilidad de los linfocitos T. 10 ABSTRACT CD43 is one of the most abundant co-stimulatory molecules in the T cell surface. Here we used a proteomic approach to evaluate the importance of CD43 co-stimulatory signals in the regulation of cell viability. Our flow cytometry results show that CD43 signals promote the translocation of the glucose transporter Glut-1 to the cell surface. Even though only a mild increase in glucose uptake and metabolism was detected in enzyme activity assays, the tyrosine phosphorylation (Y105) of the glycolytic enzyme pyruvate kinase M2 resulting of TCR and CD43 crosslinking, induces an alternative function for pyruvate kinase M2 that promotes cell survival. Lymphocyte co-stimulation through the TCR and CD43 with specific antibodies allowed us to describe a new signaling pathway for CD43, where pyruvate kinase M2, PKA, Stat3, and ERK5 regulate cell survival through phosphorylation of CREB and Bad. In addition, treatment with human serum albumin, one of the natural ligands of CD43, induces the activation the PI-3K/Akt pathway, which together with the mTOR pathway, regulates Glut-1 translocation to the plasma membrane. Finally, treatment with human serum albumin also favored T cell survival, as measured by the reduction of tetrazolium salts and flow cytometry. Altogether, our results describe the activation of novel signaling pathways for CD43, and underscore a role for this molecule in promoting cell survival. 11 I. INTRODUCCIÓN 12 1.1 La respuesta inmune El sistema inmunológico protege al organismo de sustancias u organismos potencialmente nocivos, distinguiendo entre los antígenos propios del cuerpo y los extraños, para los cuales se produce una respuesta. Las células y moléculas responsables de tal respuesta constituyen el sistema inmunológico. El efecto de reconocimiento y protección contra un antígeno determinado se lleva a cabo a través de dos tipos de respuesta inmune: la respuesta inmune innata y la respuesta inmune adaptativa [1]. La respuesta inmune innata se desarrolla como primera línea de defensa contra patógenos. Entre los mecanismos efectores de la respuesta innata, se encuentran barreras fisicoquímicas como la piel y las mucosas; células, como los macrófagos, neutrófilos, células asesinas naturales (NK) y células cebadas; y moléculas, como el complemento, el interferón γ (IFN-γ) o el factor de necrosis tumoral α (TNF-α). Las células de la respuesta innata reconocen Patrones Moleculares Asociados a Patógenos (PAMPs, por sus siglas en inglés) a través de seis familias de receptores conocidos como Receptores de Reconocimiento de Patrones (PRRs, por sus siglas en inglés), entre los cuales figuran los Receptores tipo Toll (TLRs), Receptores tipo NOD (NLRs), Lectinas tipo C (CTLs), Receptores tipo RIG-I (RLRs), Receptores tipo AIM2 (ALRs), y los Receptores tipo OAS (OLRs) [2]. Al activarse a través de estos receptores, las células del sistema inmune innato aumentan la fagocitosis y la expresión de moléculas co-estimuladoras en la superficie celular, las cuales a su vez son necesarias para la activación de las células del sistema inmune adaptativo durante el reconocimiento del antígeno. Asimismo, las células del sistema inmune innato secretan citocinas y quimiocinas que reclutan a las células del sistema inmune adaptativo hacia los sitios de inflamación. Así, las células de la respuesta innata y la repuesta adaptativa trabajan en conjunto para la eliminación de patógenos (Fig. 1). Originalmente se consideraba que sólo la respuesta inmune adaptativa poseía la capacidad de generar memoria, sin embargo, se ha sugerido que, tras una primera exposición a un antígeno, las células del sistema inmune innato sufren cambios epigenéticos que le permiten montar una respuesta aumentada ante una segunda exposición a diferentes estímulos [3-5]. 13 Fig. 1. Cooperación entre la respuesta inmune innata y la respuesta inmune adaptativa. El reconocimiento de patógenos a través de PRRs induce la activación de células de la respuesta inmune innata que, mediante la secreción de citocinas y la expresión de moléculas co-estimuladoras en su superficie, favorecen la activación de los linfocitos. Tomado de [6]. Los componentes principales de la respuesta inmune adaptativa son los linfocitos T, los linfocitos B y las células dendríticas [1]. Las características principales de la respuesta adaptativa son la habilidad para reconocer de manera específica a diferentes patógenos y la protección mejorada ante una re-infección por el mismo patógeno [7]. La respuesta inmune adaptativa supera las limitaciones de la respuesta inmune innata al permitir el reconocimiento de una diversidad casi infinita de antígenos, de tal forma que la respuesta a cada patógeno es dirigida de manera específica. Esto es posible porque cada linfocito posee un receptor para el antígeno con diferente especificidad. Como se menciona en la Sección 1.1.2, dicha especificidad está determinada por mecanismos genéticos que operan durante el desarrollo de los linfocitos en la médula ósea y en el timo y que generan millones de variantes de los genes que codifican el receptor para el antígeno (TCR). Por lo tanto, dado que un linfocito posee un receptor para el antígeno específico para un solo antígeno, la especificidad de cada linfocito es diferente, lo que asegura que los millones de linfocitos presentes en el organismo conformen un repertorio amplio de especificidades. Sólo los linfocitos que se encuentren con su antígeno serán activados para proliferar y diferenciarse a células efectoras que eliminarán al patógeno. Una subpoblación de los linfocitos que proliferan se diferencian a células de memoria, que responderán rápidamente ante un segundo encuentro con el mismo patógeno [7]. La memoria de la inmunidad adaptativa es específica para un antígeno y tiene una duración prolongada [5]. La respuesta adaptativa se clasifica a su vez en dos tipos: la respuesta humoral, mediada por los linfocitos B, y la respuesta celular, mediada por los linfocitos T. 14 1.1.1 La respuesta celular Los linfocitos T son los componentes esenciales de la respuesta celular específica y se clasifican en dos poblaciones principales: los linfocitos T CD4+ y los linfocitos T CD8+. En humanos, las primeras representan aproximadamente el 65% de las células T, y las segundas corresponden al 35% restante. En conjunto, ambas poblaciones ejercen un papel central en la inmunidad mediada por células y cooperan con los linfocitos B en la generación de anticuerpos [1]. Los linfocitos T CD4+ reconocen al péptido antigénico presentado por moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase II y desempeñan una función crucial en la respuesta inmune, ya que tras reconocer al antígeno a través del receptor para el antígeno (TCR), y con la participación de una serie de moléculas co-estimuladoras, se activan y expanden clonalmente, secretando citocinas clave para la activación de otras células (B, T, macrófagos), motivo por el cual reciben la denominación de linfocitos T cooperadores [1]. Funcionalmente, se han descrito distintos tipos de poblaciones de linfocitos T cooperadores (Th): Th1 que participan en la respuesta a bacterias intracelulares liberando IFN-γ; Th2 que promueven las respuestas humorales y confieren protección contra patógenos extracelulares produciendo IL-4, IL-5, IL-13 e IL-10; Th9 que tienen un papel protector frente a tumores y nemátodos y producen IL-9 e IL-10; Th17, productoras de IL-17, IL-21 e IL-22 para la respuesta a infecciones por bacterias extracelulares y hongos; Th22 que secretan IL-22 y participan en la inmunidad de mucosas; células T foliculares (TFH), productoras de IL-21, involucradas en la respuesta de los centros germinales y en la cooperación con los linfocitos B; y células Treg que regulan la respuesta de los linfocitos T mediante la producción de IL-10 y TGF-β [8-11]. Las vías de diferenciación que originan estos grupos no son definitivas, pues algunas subpoblaciones pueden adquirir la habilidad de producir citocinas específicas de otros linajes [12]. Por otra parte, los linfocitos T CD8+, o linfocitos citotóxicos, reconocen antígenos expuestos en moléculas MHC-I de células propias infectadas con virus o transformadas. Las señales generadas por el reconocimiento del antígeno a través del TCR, y las de las moléculas co- estimuladoras con sus contra-receptores, junto con aquellas proporcionadas por la interacción de las citocinas presentes con sus respectivos receptores, provoca la activación y proliferación de los linfocitos T, culminando con la lisis de células propias enfermas [1]. 15 1.1.2 El receptor para el antígeno: el complejo TCR-CD3 El receptor para el antígeno de los linfocitos T (TCR) es un receptor de membrana formado por heterodímeros de las cadenas αβ ó γδ, cada una de las cuales contiene un dominio variable y uno constante en la región extracelular. Los TCRs funcionales se generan a partir de la recombinación somática de los segmentos V-D-J de la cadena β, y los segmentos V y J de la cadena α. En humanos existen 42 segmentos funcionales Vβ, 2 Dβ, 12 Jβ, 43 Vα y 58 Jα. Durante el desarrollo de los linfocitos T en el timo, los segmentos génicos se recombinan y sufren splicing junto con la región constante (C) para dar lugar a un TCR αβ funcional, de manera que cada linfocito T expresa sólo un tipo de receptor recombinado. Los dominios variables se encuentran en la región amino terminal de las cadenas y presentan secuencias muy diversas que dan lugar a tres regiones hipervariables (CDRs, del inglés Complementarity-Determining Regions). La diversidad de los segmentos Vα y Vβ depende del uso de diferentes regiones CDR, codificadas en distintos segmentos V. Potencialmente, la diversidad del TCR se ubica en un rango de 1012-1015 TCRs diferentes. Sin embargo, después de la selección positiva y negativa en el timo, el número de TCRs αβ en el repertorio de un humano es aproximadamente 2 X 107 [13] (Fig. 2A). En los dominios constantes, la secuencia es altamente conservada y se localiza además una secuencia corta de conexión que permite la formación de un enlace disulfuro entre las dos cadenas del receptor. El dominio intracelular del TCR es corto, formado por solamente 5 a 12 aminoácidos y su región transmembranal contiene cargas positivas que favorecen las interacciones de este receptor con el complejo CD3, el cual es responsable de la transducción de señales en respuesta al reconocimiento del antígeno [3] (Fig. 2 B). El complejo CD3 al cual se asocia el TCR es un complejo macromolecular formado por cinco cadenas polipeptídicas. Las cadenas del complejo CD3 se asocian entre sí para dar lugar a tres dímeros que difieren en la composición de sus cadenas: un heterodímero γε, un heterodímero δε y un homodímero ζζ o un heterodímero ζη. La cadena ζ se caracteriza por tener una región extracelular muy corta, una región transmembranal con cargas negativas que le permiten interactuar con las cargas positivas de la región transmembranal del TCR, y finalmente una cola citoplasmática larga en la que destacan los llamados “Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motifs” (ITAMs). El estado de fosforilación de las tirosinas de los ITAMs regula la interacción de estas cadenas polipeptídicas con cinasas de tirosinas, y participa de manera importante en la transducción de señales. Las cadenas γ, δ y ε contienen un solo ITAM, mientras que las cadenas ζ y η contienen tres [3]. Por lo tanto, el complejo TCR-CD3 consta de cuatro dímeros: el heterodímero αβ ó γδ del TCR que determina la especificidad de la unión al antígeno, y tres dímeros CD3 que se requieren para la expresión del TCR en la membrana, así como para la transducción de señales [3] (Fig. 2 B). 16 Fig. 2. El complejo del receptor para el antígeno TCR. A, Recombinación de los segmentos V-(D)-J del dominio variable de las cadenas α β. B, Estructura del receptor para el antígeno asociado al complejo CD3. Modificado de [13, 14]. A pesar de transducir numerosas señales, las señales intracelulares que se generan a partir del solo reconocimiento del antígeno por el complejo TCR-CD3 no son suficientes para activar a los linfocitos. Se considera que la activación exitosa de los linfocitos T requiere por lo menos de dos tipos de señales: 1) las generadas por la interacción específica del TCR con los péptidos presentados por las moléculas del MHC de las células presentadoras de antígeno (APCs) y 2) las que resultan de la interacción de moléculas co- receptoras en la superficie de las células T con sus contra-receptores en las APCs [1] (Fig. 3). Cuando las moléculas co-estimuladoras entran en contacto con sus ligandos en las APCs, regulan la migración, el reconocimiento, la adhesión, la activación y las múltiples funciones efectoras de los linfocitos. Asimismo, las señales generadas por moléculas co- estimuladoras permiten cubrir los requerimientos metabólicos de las células [15, 16] al mantener la ingesta basal de nutrientes de las células en reposo, así como promoviendo el 17 incremento en la demanda energética y biosintética de las células activadas [17-19]. De esta forma, la modulación de la señalización de células T se da por la contribución de múltiples moléculas co-receptoras, entre las cuales destacan CD2, CD4, CD8, CD28, CD40- L, integrinas y CD43, entre otras. Fig. 3. Modelo de activación de linfocitos T dependiente de dos señales. La señal 1 corresponde al reconocimiento del antígeno a través del TCR y la señal 2 depende de la interacción de moléculas co-estimuladoras en los linfocitos T con sus ligandos en las APCs. Tomado de [20]. 1.2 Metabolismo de los linfocitos T El entrecruzamiento del TCR inicia una respuesta transcripcional y traduccional necesaria para la función efectora [15]. Para poder crecer y dividirse, los linfocitos T, como todas las células en etapa de proliferación, requieren generar precursores de carbono, equivalentes reductores (NADPH) y energía libre (ATP) para la síntesis de biomoléculas [21]. La glucosa es la principal fuente de energía y de precursores biosintéticos [22], por lo que el primer paso limitante en la disponibilidad de nutrientes es la ingesta de glucosa, la cual es transportada a través de la membrana plasmática por el transportador Glut-1. Durante la glicólisis, la hexocinasa fosforila la glucosa y genera glucosa-6-fosfato (G6P), la cual puede seguir por la vía glicolítica generando NADH, ATP y piruvato, o alternativamente puede ser desviada hacia la vía de las pentosas fosfato (PPP), la cual juega un papel importante en la síntesis de ácidos nucleicos, así como en la generación de NADPH para la síntesis de lípidos y en el mantenimiento de la homeostasis del estado redox intracelular. En presencia de oxígeno, el piruvato generalmente entra a la mitocondria y se oxida completamente para producir ATP. Cuando el oxígeno es limitado, el piruvato se convierte en lactato por acción de la lactato deshidrogenasa (LDH) y la glicólisis se convierte en la principal fuente de producción de ATP [23] (Fig. 4). 18 Fig. 4. Metabolismo de glucosa en linfocitos T. Una vez internalizada la glucosa, ésta puede seguir por diferentes rutas metabólicas: a través de la vía glicolítica se genera piruvato, el cual puede convertirse en lactato o continuar su oxidación en el ciclo de Krebs; alternativamente, la glucosa puede desviarse hacía vías colaterales para la síntesis de nucleótidos, lípidos y aminoácidos. Tomado de [24]. 1.2.1 Flexibilidad en el metabolismo de los linfocitos T Las demandas energéticas cambian de acuerdo a las necesidades particulares de cada etapa de la vida de un linfocito T. En el estado de reposo, los linfocitos utilizan preferentemente procesos que llevan a la generación de ATP, mientras que los linfocitos efectores requieren mayor flujo metabólico a través de vías que promueven el crecimiento (Fig. 5). De hecho, las diferentes subpoblaciones de linfocitos T tienen diferentes requerimientos metabólicos y biosintéticos. Las vías que controlan el 19 metabolismo y la función de las células del sistema inmune están estrechamente relacionadas, por lo que el metabolismo celular es actualmente considerado como un regulador maestro de la función y el destino de los linfocitos T. Fig. 5. Los programas metabólicos de los linfocitos T varían de acuerdo a sus necesidades funcionales. Los linfocitos T en reposo oxidan el piruvato, los lípidos y los aminoácidos para producir ATP. Tras la activación, la oxidación de lípidos disminuye y la glicólisis y la oxidación de glutamina aumentan para poder cumplir con la producción de los precursores biosintéticos necesarios para el crecimiento y la proliferación. Al final de la respuesta immune, las células que se convertirán en células de memoria revierten a una oxidación de lípidos. Tomado de [25]. Los linfocitos T en reposo y activados tienen requerimientos metabólicos únicos que se mantienen por medio de las señales generadas a través de receptores para citocinas, receptores para el antígeno, y por moléculas co-estimuladoras [15]. El estado quiescente de los linfocitos es altamente regulado y demanda energía. El ATP que se genera durante la fosforilación oxidativa es usado para suprimir activamente la expresión de proteínas del ciclo celular [26] y proviene de la degradación de glucosa, lípidos y aminoácidos [15]. Los linfocitos T en reposo consumen glucosa y otros nutrientes esenciales a una tasa baja [17, 27, 28], suficiente para mantener las funciones de mantenimiento básico. El metabolismo de los linfocitos en reposo está limitado por la disponibilidad de señales tróficas y no por la disponibilidad de nutrientes, por lo tanto, para mantener la tasa metabólica basal, los linfocitos requieren señales extracelulares [18, 29] (Fig. 6). Estas señales son recibidas por receptores para citocinas, el TCR y por moléculas co-estimuladoras [15]. 20 Fig. 6. La regulación del metabolismo de glucosa en células en reposo y activadas. A, Las células en reposo generan la mayor parte del ATP que requieren a partir de fosforilación oxidativa. Los ácidos grasos y aminoácidos también se degradan para mantener la producción de ATP. B, En células activadas, las señales co-estimuladoras inducen un aumento en la ingesta de glucosa. El metabolismo de glucosa (glicólisis aeróbica, señalada en letras rojas) aumenta para generar ATP. Los ácidos grasos y aminoácidos se dirigen a vías anabólicas para síntesis de membranas y de proteínas, respectivamente. [Adaptada de [15]]. Ante la presencia de un patógeno, los linfocitos cambian de un fenotipo quiescente a uno activo en el transcurso de horas. Las demandas bioenergéticas de los linfocitos aumentan dramáticamente, y aunque los nutrientes como la glucosa, los ácidos grasos y los aminoácidos se mantienen a niveles constantes en la circulación, los linfocitos T carecen de la habilidad de controlar de manera autónoma la ingesta de sustratos metabólicos cruciales para la producción de ATP y síntesis de proteínas y membranas. Los linfocitos deben recibir señales instructivas de su entorno para poder consumir los nutrientes extracelulares. En respuesta a las señales percibidas por el TCR, los receptores para citocinas y las moléculas co-estimuladoras, las células entran al ciclo celular. Durante la proliferación celular, los precursores de lípidos y aminoácidos son desviados hacia la producción de macromoléculas requeridas para el crecimiento. Como resultado, los linfocitos cambian a una dependencia alta en glicólisis, aún en presencia de oxígeno (glicólisis aeróbica), para proveer moléculas de ATP y NADH que son indispensables para 21 sostener el metabolismo [30]. Así, los linfocitos se vuelven aún más dependientes de su habilidad para ingerir glucosa para mantenerse vivos [15]. El aumento en el metabolismo de glucosa provee sustratos para la vía PPP, produciendo azúcares necesarios para la síntesis de ácidos nucleicos y NAD(P)H como poder reductor [31], además de contribuir en la síntesis de lípidos [32] (Fig. 6). Junto con las primeras señales de activación, el microambiente de citocinas promueve la diferenciación de los linfocitos T CD4+ hacia linfocitos T efectores Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, o TFH, o hacia linfocitos T reguladores (Treg), teniendo cada subpoblación funciones distintas en la inmunidad, como se mencionó en la sección 1.1.1. De una manera general, los linfocitos Th1 están involucrados en la inmunidad mediada por células, los linfocitos Th2 y TFH se relacionan con la inmunidad humoral, los linfocitos Th9 con la respuesta contra parásitos extracelulares, los linfocitos Th17 con la inmunidad en mucosas y la inflamación, y los linfocitos Th22 con la inflamación en la piel [11, 33], mientras que los linfocitos Treg limitan la magnitud de la respuesta inmune al suprimir a los linfocitos T efectores [34]. En congruencia con los diferentes roles de los linfocitos T CD4+ en la inmunidad, las necesidades metabólicas de cada subpoblación también difieren. Por un lado, los linfocitos T CD4+ efectores dependen de glucosa para favorecer su rápido crecimiento y proliferación. Sin embargo, los linfocitos Treg dependen principalmente de la oxidación de lípidos para obtener su energía [35, 36]. Asimismo, se ha descrito que los linfocitos T CD8+ también elevan su tasa glicolítica tras la activación, siendo mayor a los niveles observados para los linfocitos T CD4+. Más aún, los linfocitos T CD4+ tienen un metabolismo mitocondrial oxidativo y una capacidad respiratoria mayor que los linfocitos CD8+. Estas diferencias podrían explicar por qué los linfocitos CD8+ crecen y proliferan más rápido que los linfocitos T CD4+ activados [37]. De manera similar a los linfocitos Treg, las células T CD8+ de memoria revierten a un metabolismo oxidativo caracterizado por la oxidación de lípidos [21, 38] (Fig. 7A). Una vez que un linfocito ha recibido todas las señales necesarias para entrar al ciclo celular (reconocimiento específico del antígeno, señales de moléculas co-receptoras, señales tróficas y señales acerca de la disponibilidad de nutrientes), la tasa de proliferación es tan elevada, que la expansión clonal ha llegado a compararse a la de una clona de células tumorales. De hecho, varios de los oncogenes que regulan el metabolismo de las células tumorales también regulan los cambios metabólicos de los linfocitos T, entre estos destacan Myc, el factor inducible por hipoxia 1α (HIF 1α), el receptor relacionado a estrógeno α (ERR α) y la vía de PI3K/mTOR (Fig. 7B) [39]. 22 Fig. 7. Programas metabólicos de las diferentes subpoblaciones de linfocitos T. A, Los diferentes linajes tienen requerimientos metabólicos determinados para mantener sus funciones. B, Las moléculas involucradas en la regulación de los cambios metabólicos durante la activación y la contracción de la respuesta inmune son específicos para cada linaje. Se ha sugerido que los linfocitos Th9 dependen de la vía glicolítica que se induce en respuesta a las señales de mTOR y HIF1α [40], mientras que los linfocitos TFH requieren de bajos niveles de glicólisis y metabolismo mitocondrial para mantener sus funciones [41]. El programa metabólico de los linfocitos Th22 se desconoce. Dado que las subpoblaciones Th9, Th22 y TFH se describieron recientemente, existe poca información respecto a sus requerimientos metabólicos. Adaptado de [25]. 1.2.2 Las señales co-estimuladoras regulan el metabolismo de los linfocitos T Las señales de receptores en la superficie celular son necesarias para que las células puedan ingerir y utilizar nutrientes del medio que las rodea [18]. Las señales proporcionadas por las moléculas co-estimuladoras regulan el metabolismo de manera tal que permite a los linfocitos T activados cubrir sus necesidades energéticas y biosintéticas durante la respuesta efectora [17, 19]. 23 CD28 es la molécula co-estimuladora prototipo de linfocitos T cuyas funciones y vías de señalización han sido ampliamente estudiadas. Las señales de CD28 bajan el umbral de activación de los linfocitos T, complementando las señales del TCR, favoreciendo la proliferación celular incluso a dosis bajas de antígeno. El entrecruzamiento de CD28 induce la activación de las cinasas de la familia de Src, Lck o Fyn, en el complejo TCR/CD3, lo que permite la fosforilación de la Y191 del dominio intracelular de CD28, lo que a su vez favorece el reclutamiento de la cinasa de lípidos PI-3K [42-48]. Como consecuencia de la activación de PI-3K, se genera fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato (PIP3), un sitio de reclutamiento para las cinasas PDK1 y Akt, entre otras. La fosforilación de Akt en la T308 por PDK1 es fundamental para la transducción de señales río abajo, pues entre sus blancos se encuentran la cinasa GSK3, mTOR, CREB, Bad, Bcl-xL, los factores de transcripción FOXO y el inhibidor IκB. De esta forma, las señales de CD28 activan una vía dependiente de PI-3K que puede regular funciones diversas como el ciclo celular, la apoptosis, el metabolismo y la producción de Il-2 [47]. La estimulación a través de CD28 regula el metabolismo de glucosa, lo que permite a las células obtener los requerimientos energéticos asociados con el estado de activación, sugiriendo que el aumento en el metabolismo de los linfocitos T no es una consecuencia de la activación, sino un paso previo que permite a la célula activarse eficientemente [15, 49]. La activación de la vía de PI-3K/Akt/mTOR en respuesta a las señales de CD28 favorece un incremento en la ingesta de glucosa y en la actividad glicolítica, así como un aumento en la expresión del transportador de aminoácidos CD98 y del receptor de transferrina CD71 [16, 17, 50]. La activación de Akt resulta importante porque actúa en varios niveles. Por un lado, la actividad de Akt promueve la transcripción y traducción del transportador de glucosa Glut- 1, favorece su translocación a la membrana celular, previene su internalización y favorece la ingesta de glucosa [51-56]. Akt también aumenta la glicólisis al fosforilar y promover la actividad de enzimas que regulan el flujo glicolítico (hexocinasa y fosfofructocinasa) [17, 22, 57, 58]. El aumento en la ingesta de glucosa promueve la fosforilación inhibitoria de GSK3 [59], impacta positivamente la activación de las células al disminuir la exportación del factor de transcripción NFAT del núcleo hacia el citosol [60] y protegiendo a las células de apoptosis al estabilizar a la proteína anti-apoptótica Mcl-1 [59, 61]. Por otra parte, Akt regula al complejo 1 de la cinasa mTOR (mTORC1) al fosforilar, y por lo tanto inhibir, al factor de represión TSC (del inglés Tuberous Sclerosis Complex), formado por las subunidades TSC1 y TSC2. Este complejo funciona como una proteína activadora de GTPasa que inhibe a la proteína de unión a GTP Rheb. Cuando Rheb se encuentra unido a GTP interactúa con mTOR y favorece su activación. Akt también fosforila a PRAS40 para 24 liberar su inhibición sobre mTORC1. El complejo mTORC1 es un modulador central de la biosíntesis de macromoléculas: regula la síntesis proteica a través de los blancos que fosforila como la cinasa p70-S6 (S6K), un regulador de la función ribosomal, y la proteína de unión al factor de iniciación eucariota 4E (4E-BP), un inhibidor de la traducción [62]. mTORC1 también regula de manera negativa la autofagia, promueve la síntesis de lípidos, la biogénesis mitocondrial, y dirige la expresión de varios transportadores de nutrientes hacia la superficie celular, incluyendo transportadores de aminoácidos, el receptor de lipoproteína de baja densidad y el receptor de transferrina [63, 64]. Por lo tanto, las vías de Akt y mTOR coordinan el transporte de glucosa con la ingesta de otros nutrientes requeridos para el crecimiento celular [65]. Sin embargo, la disminución en el cociente de ATP/ADP puede activar a la cinasa dependiente de AMP (AMPK), la cual inhibe la actividad de mTOR a través de la fosforilación en otros sitios de TSC2 y/o RAPTOR [66]. Finalmente, se ha asociado al complejo 2 de mTOR (mTORC2) con la supervivencia celular y la organización del citoesqueleto. De hecho, Akt es fosforilada en la Ser 473 por mTORC2, lo que implica a ambos complejos de mTOR en un circuito de retroalimentación positiva para favorecer la regulación procesos fisiológicos que promueven el crecimiento celular (Fig. 8). Al iniciar múltiples cascadas de señalización, las señales provenientes de moléculas co- estimuladoras favorecen la activación de los linfocitos por medio de una regulación precisa de los flujos metabólicos que permitirán al linfocito llevar a cabo su función efectora. Como se mencionó, las vías de señalización que regulan el metabolismo comparten entre sí varias moléculas blanco, lo que da lugar a la existencia de circuitos reguladores que permiten al linfocito modular efectivamente su metabolismo en respuesta a una señal de activación. 25 Fig. 8. La vía de PI-3K/Akt/mTOR. La cinasa mTOR funciona a través de dos complejos. mTORC1 controla actividades como la autofagia, la traducción de proteínas y el metabolismo, mientras que mTORC2 regula la organización del citoesqueleto, la sobrevida y el metabolismo. El complejo mTORC1 está formado por cuatro subunidades: la proteína de andamiaje RAPTOR (del inglés Regulatory-Associated protein of mTOR), DEPTOR (del inglés DEP-containing mTOR-interacting protein), Mlst8 (Mammalian Lethal with Sec 13 protein 8) y el sustrato de Akt rico en prolinas (PRAS40). El complejo mTORC2 está formado por RICTOR (Raptor-Independent Comparison of Tor), mSIN1 (Mammalian stress-activated protein kinase), DEPTOR, Mlst8 y PROTOR (proteína observada con RICTOR (PROTOR). La Rapamicina forma un complejo con FKBP12 para inhibir la actividad de cinasa de mTORC1. La inhibición de mTORC2 requiere dosis altas o exposición prolongada de Rapamicina. Tomado de [67, 68]. 1.2.3 El metabolismo define la viabilidad de los linfocitos T La regulación de la homeostasis de los linfocitos es crítica para el desarrollo y formación de respuestas inmunes productivas. Los números celulares deben mantenerse para permitir que haya suficientes linfocitos para combatir patógenos foráneos, pero al mismo tiempo se debe prevenir la acumulación de linfocitos, pues esto pudiera aumentar el riesgo de desarrollar autoinmunidad o cáncer, además del hecho de que el costo energético de la respuesta inmune se cubre a partir de la energía que se requiere para otros procesos fisiológicos indispensables para la vida del individuo. Una vez eliminada la causa de una respuesta inmune, para restaurar la homeostasis, aproximadamente 90% de las células efectoras mueren por apoptosis, asimismo, los niveles de citocinas inflamatorias también disminuyen y la célula recibe menos señales extrínsecas, haciendo imposible mantener el metabolismo de glucosa, aumentando así su susceptibilidad para sufrir apoptosis [18, 69, 70]. Durante esta etapa, el metabolismo de glucosa disminuye y 26 se revierte hacia un metabolismo oxidativo para proveer la generación eficiente de ATP a expensas de precursores biosintéticos. Al terminar la activación, los linfocitos T deben regresar a un estado quiescente y favorecer el establecimiento de células de memoria [71- 73] que responderán vigorosamente al reencontrarse con su antígeno. La vida prolongada de las células de memoria se debe a la expresión del receptor para IL-7 (IL-7R) y del receptor de quimiocinas CCR7, lo que permite a estas células migrar hacia los sitios de producción de IL-7 en los órganos linfoides, asegurando así la expresión de factores anti- apoptóticos en respuesta a las señales de IL-7. Más aún, la sobrevida de las células de memoria se favorece por la expresión del receptor para IL-15 (IL-15R), a través del cual se induce un cambio en el metabolismo que favorece la oxidación de lípidos durante el estado de reposo [74]. El metabolismo de glucosa representa un programa fisiológico critico que no solo provee energía para sostener la proliferación celular, sino que también modula directamente vías de señalización de muerte celular. Los miembros de la familia de proteínas pro- y anti- apoptóticas Bcl-2 (del inglés B-cell lymphoma 2) están regulados por el metabolismo de glucosa. Por una parte, la pérdida de glucosa induce decremento en los niveles de la proteína anti-apoptótica Mcl-1 [59, 75], la inducción de la expresión de las proteínas pro- apoptóticas Noxa y Bim [75] y la activación de Bax [76, 77]. Asimismo, la sobreexpresión de Glut-1 y/o hexocinasa 1 en líneas celulares y células hematopoyéticas estabiliza Mcl-1 y atenúa la muerte celular inducida por la privación de factores de crecimiento. El aumento en el metabolismo de glucosa también protege a las células al activar diferentes isoformas (convencionales y novel) de la cinasa PKC y promover así la inhibición de GSK-3, el cual en su estado activo promueve la degradación de Mcl-1 [59] (Fig. 9). Estos datos confirman la importancia de la regulación del metabolismo de glucosa, pues además de favorecer el aumento de precursores y vías anabólicas que le permiten al linfocito contender con el gasto energético de una respuesta efectora, modula la contracción de la respuesta inmune, donde sólo un número determinado de células debe sobrevivir para favorecer el establecimiento de memoria. Nuevamente, resulta importante el papel de las moléculas co-estimuladoras en la regulación del metabolismo de glucosa, así como en la regulación de las vías de muerte y sobrevida para mantener la homeostasis del sistema inmune. 27 Fig. 9. Los linfocitos T requieren señales extracelulares para cubrir sus demandas metabólicas y sobrevivir. Las señales extrínsecas promueven la translocación de Glut-1 a la membrana por medio de la activación de la vía de Akt, favorecen la ingesta de glucosa y su metabolismo y estabilizan la expresión de proteínas anti-apoptóticas. Tomado de [38]. 1.3 CD43 La participación de moléculas receptoras en el linfocito tales como CD28, receptores para factores de crecimiento, y el propio TCR por ejemplo, es esencial para la regulación del metabolismo y la viabilidad, pues las señales provenientes de éstas regulan la ingesta de nutrientes en linfocitos en reposo, lo que favorece su viabilidad [15, 18]. Como se mencionó anteriormente, los linfocitos en reposo tienen menor demanda por moléculas biosintéticas, requieren una baja, pero no despreciable, tasa de metabolismo energético para mantener funciones de mantenimiento básico como el transporte de iones y la integridad de la membrana [22]. En la ausencia de señales informativas desde el entorno, los linfocitos T en reposo no pueden ingerir nutrientes extracelulares suficientes para mantenerse. La baja bioenergética resultante puede desencadenar la apoptosis y la célula muere por atrofia progresiva y colapso bioenergético [18]. Dada la importancia de las moléculas co-estimuladoras en la modulación del metabolismo de los linfocitos, resulta importante comprender el papel de estos receptores en la regulación de la sobrevida. Como se mencionó anteriormente, CD28 es la molécula co-estimuladora prototipo de los linfocitos T, sin embargo, el ratón deficiente de CD28 no tiene un fenotipo particular. El desarrollo de linfocitos T y B es normal y las respuestas in vivo a diferentes infecciones sugieren que señales de activación pueden surgir a partir de otras moléculas co- 28 estimuladoras. En particular, se ha reportado que en ausencia de CD28 la sialomucina CD43 puede suplir las funciones de esta importante molécula co-receptora [78]. El co-receptor CD43 es una de las glicoproteínas más abundantes que se expresa en la membrana de todas las células hematopoyéticas, excepto en eritrocitos y en células B en reposo [79, 80]. Aunque en un principio se le consideró como una molécula exclusiva del linaje hematopoyético, recientemente se ha descrito su expresión en cerebro, útero y en células de origen epitelial, estas últimas de importancia en un contexto tumoral. CD43 es considerada como una mucina por tener arreglos secuenciales de residuos de serina y treonina en la estructura primaria de la proteína, la mayoría de los cuales está glicosilado en el grupo hidroxilo de la cadena lateral (O-glicosilación) [81, 82]. CD43 tiene también un alto contenido de ácido siálico en los extremos de las cadenas de O-glicanos, lo que le confiere una carga negativa a la molécula, y se ha sugerido que de esta manera podría regular las interacciones entre células [83], aunque como se expone más adelante, CD43 tiene más de una función (Ver Sección 1.3.5). 1.3.1 El gen El gen que codifica para CD43 en humanos está localizado en el cromosoma 16 [83, 84]. La región del promotor no contiene cajas TATA o CAAT, pero es rica en citosinas y guaninas, y tiene secuencias cortas repetidas (GGTG). El gen tiene dos sitios principales para el inicio de la transcripción y un intrón de 378 pares de bases que interrumpe la secuencia que determina la región 5’ no traducida del mRNA [85]. El gen de CD43 consta de dos exones, pero sólo el segundo codifica las regiones extracelulares, transmembranales e intracelulares de la proteína [86], por lo que no ocurren eventos de splicing alternativo. Se ha comprobado que señales alternativas de poliadenilación generan mRNAs de 1.9 y 4.3 kilobases, los cuales difieren en la longitud de sus regiones 3’ no traducidas: una señal de poliadenilación a 2301 pares de bases río abajo del primer sitio de inicio de la transcripción define el extremo 3’ del mRNA de 1.9 kilobases, mientras que cinco señales de poliadenilación que se sobrelapan y comienzan 2290 pares de bases río abajo, determinan el extremo 3’ del mRNA de 4.3 kilobases. La secuencia que se encuentra de -53 a -40 pares de bases del lado 5’ del sitio de inicio de la transcripción también participa en la expresión de CD43. Esta secuencia 5’GGGTGGGTGGACGG3’ representa una secuencia de promotor poco frecuente para otras moléculas expresadas en linfocitos T [86]. La transcripción a partir de esta región del promotor depende del factor de transcripción Sp1, el cual se une a secuencias repetidas GGGTGG de la región 5’ [87]. Asimismo, entre los nucleótidos +18 a +39 del promotor del 29 gen de CD43, existe una secuencia que presenta repeticiones (CCCC) a las cuales se une el factor nuclear PyRo1, favoreciendo la transcripción [88]. En la línea celular K562 (eritroleucemia humana), los niveles de expresión del mRNA de CD43 están regulados por la ribonucleoproteína nuclear heterogénea K (hnRNP-K) y por Purα, que actúan juntos para mediar la represión del promotor de CD43 durante la activación celular [89]. La metilación del DNA juega un papel importante en la regulación de la expresión génica de CD43, ya que la metilación de la región 5’ del DNA reduce la actividad transcripcional in vitro, y la expresión tejido-específica del gen de CD43 puede ser regulada por medio de metilación [87]. 1.3.2 La proteína El co-receptor CD43 está formado por tres dominios: un dominio extracelular de 239 aminoácidos que sale de la membrana plasmática aproximadamente 45 nm y se encuentra altamente glicosilado, un dominio transmembranal de 23 aminoácidos, y un dominio citoplasmático de 123 aminoácidos [90, 91]. La porción polipeptídica de CD43 tiene un peso molecular de 38.5 kDa [92]. El núcleo protéico tiene un contenido bajo de lisinas y un alto contenido de prolinas e hidroxi-aminoácidos (12.5 residuos de serina y 12.5 residuos de treonina por cada 100 aminoácidos) [90]. El dominio transmembranal y el citoplasmático están altamente conservados entre primates, ratón, rata, cerdo, vaca, caballo y perro, lo que sugiere un importante papel regulador de CD43 en las funciones de las células que lo expresan. El dominio extracelular es extendido y rígido y contiene cinco secuencias de 18 aminoácidos que se repiten (Ile-116 a Ser-205) y se encuentran próximos a la membrana; el significado biológico de estos repetidos se desconoce. La región extracelular de CD43 es rica en residuos de prolina, serina y treonina (39% de los aminoácidos del dominio son serinas y treoninas), la mayoría de los cuales están O-glicosilados. CD43 tiene un alto contenido de carbohidratos, siendo la galactosa y la N-acetilgalactosamina (GalNAc) los más abundantes y presentes en cantidades más o menos equimolares (25 y 22 residuos por cada 100 aminoácidos, respectivamente), además de cantidades mucho menores de N-acetilglucosamina, fucosa y manosa. Una de las cadenas de azúcares presenta una unión N-glicosídica, y el resto, aproximadamente 80, tienen uniones O-glicosídicas, constituyendo en su totalidad más de la mitad del peso molecular de la molécula [81-83, 85, 90]. 30 Los patrones de glicosilación post-traduccional de CD43 están altamente regulados y resultan en dos isoformas con pesos moleculares característicos que se expresan en diferentes tipos de células: • Un producto de 115 kDa que está presente en timocitos, linfocitos T CD4+ en reposo y en monocitos. • Un producto de 130 kDa que se expresa en linfocitos CD8+ en reposo, CD4+ activados, neutrófilos, plaquetas, linfocitos B y macrófagos [79, 93]. Las diferencias en el peso molecular se deben a cambios en la estructura de los carbohidratos. Las estructuras de los O-glicanos son características para cada tipo celular y para cada etapa de diferenciación. Los linfocitos T en reposo expresan “core1 O-glicanos” con secuencias Galβ1,3GalNAc, mientras que las células T activadas presentan estructuras más complejas que dan lugar a los “core2 O-glicanos” con secuencias Galβ1,4GalNAc unidas a las ramificaciones de los glicanos core1 mediante un enlace GlcNAcβ1,6GalNAc [94-96] (Fig. 10). Sin embargo, una misma célula puede co-expresar diferentes isoformas de CD43 al mismo tiempo, sugiriendo que las isoformas son funcionalmente distintas. El cambio entre una y otra forma de glicanos que ocurre tras la activación celular se debe a un aumento en la expresión de la enzima β1→6GlcNAc-transferasa, o core 2 GlcNAc transferasa (C2GnT), la cual es responsable de iniciar las ramificaciones en los O-glicanos core 2 favoreciendo el enlace GlcNAcβ1,6GalNAc. La falta de estas enzimas resulta en una disminución de la función de barrera de la mucosa intestinal, acompañado de un aumento en las estructuras core 1[97]. Se ha sugerido que los O-glicanos que se expresan en la superficie celular podrían afectar las interacciones célula-célula regulando la respuesta inmune. Particularmente, los O-glicanos de core 2 constituyen una estructura en la que se forman ligandos para selectinas, lo cual puede contribuir al reclutamiento de linfocitos T CD4+ de memoria hacia los sitios de inflamación [95, 98-102]. De hecho, como se menciona más adelante (Sección 1.3.4), la selectina E ha sido reportada como un ligando de CD43. 31 Fig. 10. Estructura de los O-glicanos de CD43. CD43 presenta aproximadamente 80 uniones O-glicosídicas con estructuras de carbohidratos que pueden ser lineales (core 1) o ramificadas (core 2) [103]. 1.3.3 Regulación de la expresión de CD43 El nivel de expresión de CD43 en la superficie celular es controlado en diferentes células por medio de mecanismos como regulación de la expresión génica [87], proteólisis [80, 104, 105], secreción [106] o segregación [107, 108]. El corte proteolítico constituye un mecanismo para regular la expresión de ciertas moléculas en la superficie celular. La proteólisis de CD43 [109-115] se ha reportado en neutrófilos activados con el factor de necrosis tumoral α (TNFα) [112], el ionóforo de calcio A23187 [113], fMLP, PMA [105, 114, 115], así como en linfocitos estimulados con anticuerpos anti-CD43 [105, 114], los cuales podrían mimetizar la acción de los ligandos naturales de CD43. Se ha demostrado que la activación de los neutrófilos induce el corte de CD43 por la elastasa, generando fragmentos solubles de 52 y 40 kDa [104, 116]. Además, enzimas como la γ-secretasa de líneas celulares de carcinoma de colon (COLO 205) y de leucemia T (Jurkat), son responsables de la proteólisis de CD43 en estas células [117]. Aunque se desconoce la función que tiene la porción soluble de CD43, es posible especular que podría regular las interacciones entre el receptor anclado a la membrana y sus ligandos [105]. De hecho, el corte proteolítico de CD43 ocurre in vivo. Prueba de ello 32 son las altas concentraciones de CD43 soluble (Gal pg) presentes en el suero de individuos sanos [118], aunque no se sabe cuáles son las células que contribuyen en esto. Asimismo, dado que el dominio intracelular de CD43 contiene señales de localización nuclear, se ha descrito que el corte del dominio extracelular de CD43 libera las señales de localización nuclear que promueven la translocación del dominio intracelular al núcleo, donde protege a las células de las señales apoptóticas [110, 111]. El reconocimiento del antígeno por el TCR, induce la exclusión de CD43 del sitio de contacto entre la célula T y la APC, y se ha demostrado que la familia de proteínas adaptadoras del citoesqueleto ezrina-radixina-moesina (ERM) participan en estos eventos, a través de un mecanismo dependiente de PKCθ. Al suceder esto, CD43 migra fuera de la sinapsis inmunológica [107, 108, 119], o al urópodo de las células, donde genera señales intracelulares que modulan de manera positiva o negativa a las del TCR [120-122]. Finalmente, la secreción de moléculas de CD43 intracelulares es otro mecanismo de regulación de la expresión de CD43. En respuesta a un estímulo con LPS, la cantidad de CD43 intracelular en las células epiteliales del intestino aumenta, lo que correlaciona con la secreción de CD43 al lumen intestinal, sugiriendo una función de esta molécula como un mecanismo de defensa ante una infección en el epitelio intestinal [106]. 1.3.4 Los ligandos CD43 es una glicoproteína para la cual se han identificado hasta la fecha siete ligandos naturales, cada uno de los cuales tiene a su vez otros ligandos: ICAM-1, galectina-1, el complejo mayor de histocompatibilidad I (MHC-I), albúmina sérica humana (HSA), E- selectina, sialoadhesina (Siglec-1) y nucleolina [Revisado en [123]. Además, CD43 ha sido reconocido como ligando de varias moléculas de organismos patógenos [124-130], como se menciona en la Sección 1.3.7. Hay muy poca información acerca de las funciones reguladas cuando CD43 interacciona con cada uno de sus ligandos; asimismo, no se sabe si las distintas isoformas de CD43 interaccionan con distintos ligandos, y si de esta manera ejercen diferentes funciones. Al utilizar anticuerpos monoclonales anti-ICAM-1, se demostró que ICAM-1, un marcador de los procesos inflamatorios, es un ligando para CD43. La función principal de ICAM-1 es la adhesión firme, detención y migración transendotelial de los leucocitos, a través de la interacción con sus ligandos, las integrinas LFA-1 (CD11a/CD18) y CR3 (CD11b/CD18) [131, 132]. Estas últimas participan de manera imprescindible en la regulación de la migración y contactos celulares de los linfocitos. Además, las moléculas CR3 son receptores del fragmento C3b del complemento [133]. Por medio de la interacción con ICAM-1, CD43 33 regula la adhesión celular [134], aunque se desconoce cómo la interacción de CD43 con ICAM-1 afecta la interaccion de ICAM-1 con sus otros ligandos. También se reportó que galectina-1, una lectina S, es un ligando para la isoforma de 130 kDa de CD43, así como para CD45, CD7 y CD3. La galectina-1 puede regular la apoptosis de linfocitos T durante su desarrollo en el timo, así como después de ser estimulados en la periferia [135-139]. CD43 regula de manera positiva la muerte de linfocitos T inducida por galectina-1, posiblemente concentrando las moléculas de galectina-1 en la superficie celular y haciéndolas accesibles para su unión con CD7, el cual es indispensable para que ocurra la muerte en respuesta a galectina-1 [103]. Sin embargo, en células dendríticas, CD43 influencia otros procesos celulares como la producción de citocinas, la adhesión y el tráfico celular [140-142]. Diferencias en la glicosilación de CD43 entre células dendríticas inmunogénicas y células dendríticas tolerogénicas son responsables de la regulación diferencial de galectina-1 sobre la migración de estas células a través de la matriz extracelular y a través de células endoteliales [143]. En polimorfonucleares, la interacción de CD43 con galectina-1 parece promover quimiotaxis [144]. Por otra parte, se observó que las moléculas del MHC-I de células presentadoras de antígeno de origen mieloide o linfocitos B tienen la capacidad de interactuar con las moléculas de CD43 de células T en reposo. Esta interacción y el entrecruzamiento de CD43 en los linfocitos T incrementan la adhesividad de CD2 por CD58. A su vez, la unión de CD2 con sus ligandos activa a CD43 y aumenta su afinidad por las moléculas del MHC-I. Se ha sugerido que este sistema podría jugar un papel importante en la activación de las células T y en la mediación de las funciones efectoras [145]. Se reportó que la isoforma de CD43 de 130 kDa que se expresa en neutrófilos se une específicamente con albúmina sérica humana (HSA). A través de interacciones específicas con HSA, CD43 podría controlar la extensión de los neutrófilos sobre el sustrato. Asimismo, se ha propuesto que la interacción entre HSA y CD43 podría proteger a la molécula de ser degradada de la superficie de los neutrófilos por la elastasa, probablemente inhibiendo la función de los neutrófilos [146]. Recientemente, se reportó que la isoforma de 130 kDa de CD43, rica en O-glicanos de core 2, es también reconocida por la selectina E presente en la superficie de células endoteliales. Esta molécula regula el rodamiento de los leucocitos que expresan ligandos para la selectina E, como los neutrófilos y los linfocitos T activados, sugiriendo entonces que CD43 podría participar en la migración de los linfocitos T activados hacia los sitios de inflamación [147]. 34 Asimismo, Siglec-1, un receptor de macrófagos que se une a estructuras de carbohidratos que contienen ácido siálico, tanto core 1 como core 2, se une a CD43. Siglec-1 es mediador en la adhesión de células linfoides y mieloides. Considerando la estructura alargada, así como la longitud de ambas moléculas, es posible que éstas funcionen como mediadores de las interacciones intercelulares a larga distancia, promoviendo los contactos físicos iniciales entre macrófagos y linfocitos T [148]. Por último, la nucleolina que se puede expresar en la superficie de monocitos y macrófagos permite el reconocimiento de células que se encuentran en etapas tempranas de apoptosis mediante su unión a las cadenas de ácido siálico y polilactosaminoglicanos de CD43 de las células apoptóticas. Esta unión es inhibida por anticuerpos anti-nucleolina, así como por anticuerpos anti-CD43, lo cual sugiere un papel importante de CD43 en el reconocimiento y la unión de macrófagos con linfocitos T. Aunque la afinidad de la nucleolina por los carbohidratos es baja, se ha sugerido que la agregación de glicoproteínas que ocurre cuando las células inician apoptosis, favorece un aumento en la avidez de esta unión [149]. En resumen, la multiplicidad de los ligandos, y la gama de funciones que desempeñan, sugiere un rol complejo de CD43 en la regulación de la adhesión y/o la activación celular a través de las interacciones específicas de cada isoforma con sus ligandos. 1.3.5 Las funciones La abundancia de CD43, su estructura altamente glicosilada, su configuración extendida y el alto grado de conservación de los dominios transmembranal e intracelular que se observa entre especies, sugieren que participa en el establecimiento y la regulación de los contactos entre células, así como en los mecanismos de diferenciación y activación de las células linfoides [150]. Aparentemente, CD43 tiene una doble personalidad, pues ejerce efectos reguladores positivos o negativos, dependiendo del momento en que participe durante la respuesta inmune, de la isoforma y probablemente del ligando con el que interactúe. Por su estructura alargada y su alto contenido de ácido siálico, se sugirió que CD43 confiere una fuerte carga negativa a la membrana celular y que constituye una barrera física que previene las interacciones célula-célula. A través de un impedimento estérico, CD43 podría interferir con la interacción de otras moléculas de adhesión con sus ligandos. Los resultados obtenidos con células transfectadas con el gen humano de CD43 o células deficientes en la expresión de CD43 (CD43-/-), apoyan esta idea y sugieren que CD43 35 regula de manera negativa la adhesión de linfocitos T con células blanco o células presentadoras de antígenos [151]. Sin embargo, la teoría de la barrera negativa se contrapone con reportes que demuestran que anticuerpos anti-CD43 inhiben el rodamiento de linfocitos T sobre las células epiteliales de vénulas altas, y tampoco explica por qué numerosos anticuerpos anti-CD43 inducen fenómenos de agregación homotípica, independientes de la participación de las integrinas leucocitarias [152-154]. Si bien el ratón CD43-deficiente no tiene un fenotipo particular en condiciones normales, se ha reportado un defecto en la migración de los leucocitos hacia los órganos linfoides secundarios, en respuesta a un proceso inflamatorio [155-157]. Asimismo, se ha reportado que un anticuerpo monoclonal anti-CD43 retarda significativamente el establecimiento de diabetes e inhibe específicamente el reclutamiento de linfocitos T a los islotes del páncreas, así como a las glándulas salivales y lacrimales, bloqueando los procesos inflamatorios [158]. Estos resultados sugieren que CD43 participa en la migración celular y que anticuerpos anti-CD43 podrían tener usos terapéuticos. Además, los experimentos realizados con líneas de ratones CD43 -/- sugieren también, que la carencia de CD43 se traduce en un retraso en la contracción de la respuesta de los linfocitos CD8+ citotóxicos, lo cual altera la homeostasis de la respuesta inmune y podría favorecer el establecimiento de padecimientos autoinmunes [94]. CD43 se expresa desde etapas muy tempranas durante el desarrollo de las células hematopoyéticas (se expresa junto con CD34 en células madre hematopoyéticas pluripotentes [159, 160]), y como ya se mencionó en la sección anterior, se han reportado funciones apoptóticas y antiapoptóticas para este receptor. Se demostró que el anticuerpo MEM-59 que reconoce a CD43 humano es capaz de inducir apoptosis, lo que sugiere que CD43 podría participar como un regulador negativo en las etapas tempranas de la hematopoyesis [161]. En células Jurkat (leucemia T humana), el ligamiento de CD43 con el anticuerpo monoclonal J393 que reconoce la isoforma de 130 kDa, genera también una señal de apoptosis [162]. Por otra parte, la expresión constitutiva de CD43 en linfocitos B reduce la susceptibilidad de estas células de entrar en arresto en la fase G1 del ciclo celular y retarda los procesos apoptóticos [163-165]. Asimismo, la proliferación descontrolada y el aumento en la sobrevida de los linfocitos B provenientes de linfomas, concuerda con el mal pronóstico de la enfermedad al expresar CD43 en estas células [150]. Además, las señales de CD43 inducen la expresión de los receptores para IFN γ e IL- 4 en linfocitos T en células de recién nacido, demostrando la importancia de CD43 en la preparación de las células para su diferenciación a células efectoras [166]. 36 En conjunto, estos resultados sugieren que CD43, y las señales intracelulares que se generan en el momento en que interacciona con su(s) ligando(s), participan en los procesos de homing y migración celular, en la regulación de las interacciones célula-célula, así como en el mantenimiento de la homeostasis del sistema inmune, y que la regulación de sus funciones podría ser un blanco terapéutico. 1.3.6 CD43: una molécula accesoria CD43 genera señales de manera intrínseca, y la función de CD43 como molécula co- estimuladora es aceptada, y para ello requiere de su región intracelular [167, 168]. La región intracelular está formada por 123 aminoácidos, entre los cuales se encuentran once serinas y seis treoninas potencialmente fosforilables [83, 169]. Asimismo, se han identificado una secuencia rica en prolinas [170] que le permite interactuar con proteínas que contienen dominios SH3, así como dos sitios de unión a las proteínas adaptadoras del citoesqueleto ezrina, radixina y moesina (ERM’s) [171] que empalman con dos secuencias de localización nuclear [83, 107, 108, 119, 123] (Fig. 11). En linfocitos T las señales generadas a partir de CD43 han sido estudiadas con cierto detalle (Fig. 12). El ligamiento de CD43 con diferentes anticuerpos monoclonales induce la generación de diacilglicerol y fosfatos de inositol, movilización de Ca2+ y la activación de PKC [172, 173]. El entrecruzamiento de CD43 en células T humanas, induce la asociación de CD43 con cinasas de la familia Src [170]. La porción intracelular de CD43 se une al dominio SH3 de Fyn y Lck a través de su región rica en prolinas, y posteriormente las señales mediadas por CD43 resultan en la fosforilación de la cadena ζ del complejo CD3 [174], así como en la formación de complejos macromoleculares que comprenden a las moléculas adaptadoras Shc, Grb2, SLP-76 y el factor intercambiador de guanina Vav [175]. Además, las señales específicas de CD43 promueven la activación de ERK, que participa en diferentes fenómenos: regulación del citoesqueleto de actina [154], activación de un loop de retroalimentación positiva sobre las señales de Lck y regulación de la expresión génica [175-177]. Cuando las células reciben las señales de CD43 antes de recibir las del TCR, PKC θ se activa y fosforila a Cbl, disminuyendo así la actividad de E3 ligasa de Cbl y favoreciendo la activación de las células a través de una mayor fosforilación de Zap-70 y de la cadena ζ [178], disminuyendo así el umbral de activación de los linfocitos. El entrecruzamiento de CD43 induce la actividad de unión a DNA de los factores de transcripción AP-1, NF-κB y NF-AT [177], así como la expresión génica de IL-2, sin requerir señales adicionales de otras moléculas receptoras. La activación de AP-1 y NFκB resulta de un pico alto y transitorio de calcio, así como de señales provenientes de la vía de las MAPKs [177, 179]. Como resultado de las señales intracelulares que genera, CD43 37 estimula la expresión de los genes que codifican proteínas necesarias para la función efectora de las células T y para la expansión clonal, por ejemplo: CD69 y CD40L. Asimismo, se ha demostrado que además de inducir la expresión del gen de IL-2, CD43 induce la expresión de una serie de citocinas y quimiocinas, muchas de las cuales son pro- inflamatorias [176, 179]. Fig. 11. Alineamiento múltiple de la región intracelular de CD43. Los dos sitios de unión a proteínas de la familia ERM se muestran en letras azules. Las dos señales de localización nuclear se indican con sombreado amarillo y sobrelapan con los dominios de unión a ERMs. Se muestran sitios potenciales de fosforilación: por cinasas dependientes de cAMP y cGMP (letras rojas), por PKC (letras rosas y sombreado morado), por casein cinasa II (sombreado café). Asimismo, se indican tres sitios potenciales de sumoylación (letras naranjas) y la región rica en prolinas (sombreado verde) que permite la unión de CD43 con proteínas que contienen dominios SH3 [123]. 38 Fig. 12. Vías de señalización que se activan en respuesta a las señales generadas por el entrecruzamiento de CD43 [123]. A través de la activación de múltiples vías de señalización, las señales generadas por el entrecruzamiento de CD43 regulan diferentes procesos biológicos que en conjunto favorecen la respuesta efectora de los linfocitos. Resulta interesante que muchas de las moléculas blanco descritas en las vías de señalización de CD43 pueden ser reguladas también por otras vías, lo que sugiere un papel regulador de CD43 durante la activación de los linfocitos T. 1.3.7 Participación de CD43 en distintas patologías La importancia funcional de CD43 es puesta en evidencia por su asociación con diversas patologías. En algunos casos, funciona como receptor de reconocimiento de patógenos. La expresión alterada de CD43 está asociada con el síndrome Wiskott-Aldrich, una inmunodeficiencia ligada al cromosoma X, que involucra una disfunción severa de plaquetas y linfocitos [180]. El síndrome incluye procesos patológicos crónicos que mejoran con la ablación del bazo [181, 182]. Sin embargo, el síndrome está causado por una mutación en el gen que codifica para la proteína WASP (Wiskott-Aldrich Syndrome 39 Protein), la cual es una molécula adaptadora que participa activamente en los rearreglos del citoesqueleto y en la señalización celular [183]. Sin embargo, hasta el momento se desconoce la relación que existe entre CD43 y WASP en el desarrollo de esta enfermedad. Por otra parte, todos los pacientes con VIH tienen autoanticuerpos anti-CD43 circulantes durante la fase asintomática de la infección. Se demostró que el entrecruzamiento de CD43 estimula la producción del VIH de manera independiente de CD28, y que esto está mediado por los factores de transcripción NF-κB y NFAT [184], los cuales son activados a través de la vía de señalización de CD43 [177]. Esto sugiere que CD43 podría modular la expresión de VIH-1 en los linfocitos T. Cabría preguntarse si, in vivo, los autoanticuerpos anti-CD43 entrecruzan a CD43 y activan así dichas vías de señalización; alternativamente, se podría pensar que los autoanticuerpos anti-CD43 podrían contribuir a la pérdida de células T que se observa en estos pacientes. CD43 funciona también como un receptor para el virus de la influenza A en polimorfonucleares. Por medio de ensayos de immunoprecipitación con la hemaglutinina del virus, se comprobó que la unión es dependiente de ácido siálico y que la hemaglutinina reconoce las dos isoformas de CD43, así como a otras moléculas de la superficie celular ricas en ácido siálico. La unión del virus de la influenza A a los polimorfonucleares estimula la expresión de integrinas y reduce la expresión de CD43, L- selectina y el ligando de P-selectina. Estos resultados sugieren que CD43 puede ser un punto de entrada del virus y/o de desactivación de los neutrófilos, aunque los mismos autores sugieren que existen otros sitios de unión para el virus que también pueden mediar la desactivación de los neutrófilos [126, 127, 185]. Por otro lado, se reportó que la porción extracelular de CD43 es indispensable para la unión de los macrófagos con la chaperona Cpn 60.2 de Mycobacterium tuberculosis y que las señales de CD43 son necesarias para la producción de TNF-α. CD43 podría funcionar como un co-receptor que facilita la unión y la internalización de las micobacterias a los macrófagos [124, 125]. Además, se han asociado polimorfismos en el gen de CD43 con diferencias en la susceptibilidad, las manifestaciones clínicas y el desarrollo de la tuberculosis [186]. Igualmente, la transialidasa de Trypanosoma cruzi se une y co-estimula a los linfocitos T a través de su interacción con CD43 en la superficie de los linfocitos T CD4+, y rescata a las células de la muerte inducida por activación a través de un mecanismo dependiente del entrecruzamiento de CD43 [128]. Asimismo, se ha descrito la interacción de CD43 con la adhesina Hsa de Streptococcus gordonii, el agente causal de la endocarditis [129]. Recientemente se reportó que CD43 también es un sustrato de la metaloproteasa StcE de Escherichia coli enterohemorrágica [130]. En conjunto, esto sugiere que CD43 puede funcionar como un receptor de reconocimiento de patrones que 40 al identificar moléculas microbianas, o patrones moleculares asociados a patógenos, puede inducir vías de señalización que modulan la activación de las células y contribuye así a definir la calidad de la respuesta inflamatoria. Se ha reportado una disminución en la expresión de CD43 en la superficie celular de células polimorfonucleares de líquido sinovial de pacientes con artritis reumatoide [187], así como un aumento en la expresión de esta molécula en los linfocitos T infliltrados en el sinovio de pacientes con osteoartritis [188]. En pacientes con lupus eritematoso sistémico, los anticuerpos anti-CD43 y anti-galectina-1, junto con los niveles altos de galectina-1 soluble correlacionan con el tiempo de evolución de la enfermedad y niveles bajos del complemento [189]. Sin embargo, los mecanismos asociados a la participación de CD43 en la patogénesis de las enfermedades autoinmunes aún se desconoce. Si bien por mucho tiempo se consideró que CD43 era una molécula esencialmente hematopoyética, se ha descrito que su expresión es frecuente no sólo en tumores de origen hematopoyético, sino también en tumores de mama, pulmón, colon, vejiga, cérvix y próstata [150]. De hecho, se ha comenzado a estudiar su papel en el desarrollo del tumor. En humanos, la expresión de CD43 en tumores de linfocitos B es considerado como un mal pronóstico [190]. En un linfoma murino de células B, CD43 confiere a las células un aumento en la viabilidad y proliferación al ser privadas de suero durante el cultivo. Interesantemente, el dominio extracelular de CD43 es necesario para el desarrollo de esta función, sugiriendo que la interacción con sus ligandos favorece la sobrevida de los linfocitos B [165]. Por su parte, los linfocitos T provenientes de linfomas que expresan el protooncogen c-Maf, también expresan CD43 junto con niveles altos de ciclina D1 y D2 [191]. Más aún, ante la falta de los supresores de tumores p53 y ARF, la sobreexpresión de CD43 en una línea de carcinoma humano protege a las células de apoptosis mediada por Fas, favoreciendo así la proliferación celular [192]. Asimismo, la translocación al núcleo del dominio intracelular de CD43 le permite interactuar con beta catenina, lo que resulta en un aumento en la expresión de los genes de c-Myc y ciclina D1 [111]. El silenciamiento dirigido de CD43 en células tumorales de pulmón A549 y en células tumorales de cáncer de mama MCF7, disminuyen la migración transendotelial, aumentan la adhesión homotípica, la susceptibilidad para sufrir apoptosis y la vulnerabilidad a la lisis por células NK. El silenciamiento también disminuye el crecimiento de tumores primarios en ratones desnudos [193, 194]. Finalmente, se ha demostrado que niveles altos de ácido siálico en las moléculas de CD43 de células de leucemia protegen a las células de la lisis mediada por linfocitos T citotóxicos [195]. En conjunto, estos datos demuestran la participación de CD43 en la regulación de la adhesión, movilidad y el control del ciclo celular, favoreciendo así la transformación y la invasividad de las células tumorales. 41 Estos ejemplos, además de poner en evidencia la participación de CD43 en diversas enfermedades, recalcan cuán importante es entender las funciones que desempeña esta molécula en la regulación de la respuesta inmune. En función de esto, nos hemos propuesto estudiar la participación de la molécula co-estimuladora CD43 en la respuesta de los linfocitos T. 42 II. HIPÓTESIS 43 HIPÓTESIS La activación de un linfocito T depende de las señales que éste recibe a través del TCR y de las moléculas accesorias. Debido a que las señales de CD43 tienen la capacidad de regular múltiples funciones en la célula, nos hemos propuesto evaluar la participación de CD43 en la activación de los linfocitos, teniendo como hipótesis: Las señales generadas por CD43 promueven la sobrevida de los linfocitos T por medio de la regulación de vías de señalización que modulan el metabolismo celular. 44 III. OBJETIVO 45 OBJETIVO GENERAL Identificar la participación de CD43 en la regulación del metabolismo y la viabilidad de los linfocitos T. OBJETIVOS PARTICULARES 1. Determinar mediante un análisis proteómico los procesos biológicos regulados por las señales co-estimuladoras de CD43. 2. Validar los resultados del análisis proteómico por medio de ensayos funcionales para verificar la actividad enzimática de las proteínas identificadas. 3. Identificar las moléculas que participan en la vía de señalización que favorecen la sobrevida de los linfocitos T. 4. Evaluar la importancia del dominio intracelular de CD43 en ensayos funcionales para medir la sobrevida. 5. Evaluar las vías de señalización que se activan en respuesta al tratamiento con albúmina sérica humana como ligando de CD43, así como su efecto en la viabilidad de los linfocitos T. 46 IV. RESULTADOS PUBLICADOS An alternative mode of CD43 signal transduction activates pro-survival pathways of T lymphocytes Maria Elena Bravo-Adame,1,2 Rosario Vera-Estrella,3 Bronwyn J. Barkla,4 Cecilia Martınez- Campos,1,2,† Angel Flores-Alcantar,1 Jose Pablo Ocelotl-Oviedo,1 Gustavo Pedraza-Alva1 and Yvonne Rosenstein1 1Departamento de Medicina Molecular y Bioprocesos, Instituto de Biotecnologıa, Universidad Nacional Autonoma de Mexico, Cuernavaca, Morelos, Mexico, 2Posgrado en Ciencias Bioquımicas, UNAM, Universidad Nacional Autonoma de Mexico, Cuernavaca, Morelos, Mexico, 3Departamento de Biologıa Molecular de Plantas, Instituto de Biotec- nologıa, Universidad Nacional Autonoma de Mexico, Cuernavaca, Morelos, Mexico, and 4Southern Cross Plant Science, Southern Cross University, Lismore, NSW, Australia doi:10.1111/imm.12670 Received 29 October 2015; revised 20 August 2016; accepted 31 August 2016. †Present address: Centro de Investigaciones sobre Enfermedades Infecciosas, Instituto Nacional de Salud Publica, Av. Universidad 655, Cuernavaca, Morelos 62100, Mexico. Correspondence: Dr Yvonne Rosenstein, Departamento de Medicina Molecular y Bio- procesos, Instituto de Biotecnologıa, Univer- sidad Nacional Autonoma de Mexico, Apo Postal 510-3, Cuernavaca, Morelos 62250, Mexico. Email: yvonne@ibt.unam.mx Senior author: Yvonne Rosenstein Summary CD43 is one of the most abundant co-stimulatory molecules on a T-cell surface; it transduces activation signals through its cytoplasmic domain, contributing to modulation of the outcome of T-cell responses. The aim of this study was to uncover new signalling pathways regulated by this sialomucin. Analysis of changes in protein abundance allowed us to iden- tify pyruvate kinase isozyme M2 (PKM2), an enzyme of the glycolytic pathway, as an element potentially participating in the signalling cascade resulting from the engagement of CD43 and the T-cell receptor (TCR). We found that the glycolytic activity of this enzyme was not significantly increased in response to TCR+CD43 co-stimulation, but that PKM2 was tyrosine phosphorylated, suggesting that it was performing moonlight functions. We report that phosphorylation of both Y105 of PKM2 and of Y705 of signal transducer and activator of transcription 3 was induced in response to TCR+CD43 co-stimulation, resulting in activation of the mitogen-activated protein kinase kinase 5/extracellular signal-regulated kinase 5 (MEK5/ERK5) pathway. ERK5 and the cAMP response element binding protein (CREB) were activated, and c-Myc and nuclear factor-jB (p65) nuclear localization, as well as Bad phosphorylation, were aug- mented. Consistent with this, expression of human CD43 in a murine T-cell hybridoma favoured cell survival. Altogether, our data highlight novel signalling pathways for the CD43 molecule in T lymphocytes, and underscore a role for CD43 in promoting cell survival through non-glyco- lytic functions of metabolic enzymes. Keywords: CD43; cAMP response element binding protein signalling; extracellular signal-regulated kinase 5; pyruvate kinase isoform M2; T-cell survival. Introduction The outcome of T-cell responses is determined by the sum of positive and negative signalling events. Lympho- cyte activation is considered to follow a two-signal model where both the antigen and co-stimulatory signals are required to induce full T-cell activation. Stimulation through the T-cell receptor (TCR) defines the specificity to a particular antigen; however, this alone does not fully initiate cell activation responses such as proliferation and cytokine release. Instead, stimulation through the TCR without additional signals provided by co-stimulatory molecules leads to an unresponsive state, where negative feedback signalling loops are induced. When they Abbreviations: CREB, cAMP response element binding protein; ERK, extracellular signal-regulated kinase; MEK5, mitogen-acti- vated protein kinase kinase 5; NF-jB, nuclear factor-jB; PEP, phosphoenolpyruvate; PK, pyruvate kinase; PKA, protein kinase A; PKC, protein kinase C; PKM2, pyruvate kinase isoform M2; STAT3, signal transducer and activator of transcription 3; TCR, T-cell receptor ª 2016 John Wiley & Sons Ltd, Immunology 1 IMMUNOLOGY OR IG INAL ART ICLE 47 encounter their cognate ligands on antigen-presenting cells, co-stimulatory molecules initiate diverse signalling pathways that, once integrated, modulate TCR signalling, shaping the activation status of a cell.1,2 Along with this complex decision-making process, activated T cells have unique metabolic demands differentially regulated by sig- nals generated through cytokine, antigen and co-stimula- tory receptors.3 As activation induces cell growth, proliferation and differentiation, the metabolic require- ments of T cells augment considerably. To fulfil these requirements, signals provided by co-stimulatory recep- tors such as CD28 have been shown to lead to higher glu- cose uptake and glycolytic activity, as well as to the up- regulation of molecules involved in nutrient uptake,4,5 underscoring an important role for co-stimulatory mole- cules in coordinating T-cell activation and cell metabo- lism.4 CD43 is one of the most abundant molecules on the T-cell surface.6–10 The expression of wild-type human CD43, but not that of a mutant form that lacks the intra- cellular domain, has been shown to enhance the antigen- specific response of a murine T-cell hybridoma specific for HLA-DR antigens.9 The phosphorylation of S76 of the cytoplasmic domain of CD43 is necessary for T-cell traf- ficking,11 further demonstrating that CD43 requires its highly conserved cytoplasmic tail to perform its co-recep- tor molecule functions. Moreover, data from CD43 knockout mice suggest that it participates in naive T-cell migration to inflammatory sites.12,13 A role for this molecule in the regulation of cell number and homeostasis has also been suggested.14–16 CD43 has been reported to control cell cycle entry and cell migra- tion in lymphoid cells as well as in lymphoid and non- lymphoid tumours.17–20 In T lymphocytes, CD43 ligation results in the association of Src family kinases to the pro- line-rich region of its cytoplasmic domain,21 leading to CD3 f-chain phosphorylation22 and to the formation of macromolecular complexes that comprise Shc, Grb2, SLP- 76 and Vav.23 CD43 signals also promote extracellular sig- nal-regulated kinase 1/2 (ERK 1/2) activation, leading to actin cytoskeleton reorganization24 and to the activation of a positive feedback loop on Lck signalling25 triggered by the inhibition of SHP-1 recruitment.26 Cross-linking CD43 also induces diacylglycerol and inositol phosphate generation, along with calcium mobilization and protein kinase C (PKC) activation.11,27,28 Collectively, CD43- mediated signals result in activation of activator protein-1 (AP-1), nuclear factor-jB (NF-jB) and nuclear factor of activated T cells (NFAT),28–30 coordinating the expression of multiple cytokine genes.25,30 Searching for new signalling pathways and novel func- tions regulated by CD43, we performed a quantitative proteomic analysis to detect changes in protein abun- dance patterns upon co-stimulation of normal human CD4+ T lymphocytes through the TCR+CD43. Interestingly, differences in the expression profile of pyru- vate kinase (PK) were detected; yet, PK glycolytic activity was not significantly augmented in response to TCR+CD43 co-stimulatory signals. In contrast, we found that CD43 signals favoured the protein kinase function of pyruvate kinase isoform M2 (PKM2). Two isoforms of PKM2 have been described: a tetramer that is an active glycolytic enzyme, catalysing the conversion of phospho- enolpyruvate (PEP) to pyruvate by transferring a phos- phate from PEP to ADP, and a dimer that functions both as protein kinase and as a transcriptional co-activator upon post-translational modification.31 Particularly, phos- phorylation of Y105 of the PKM2 isoform triggers its abil- ity to phosphorylate signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3). In agreement with this, phos- phorylation of PKM2 Y105 and that of STAT3 Y705 were augmented in response to TCR+CD43 co-stimulation. Moreover, CD43 signals contributed to the activation of the ERK5 pathway, a STAT3-regulated pathway,32,33 as shown by increased phosphorylation of the ERK5 down- stream targets cAMP response element binding protein (CREB) and Bad, the up-regulation of c-Myc and cyclin D1 expression, and the activation of the NF-jB pathway. In addition to the ERK5 pathway, activation of the pro- tein kinase A (PKA) /adenylate cyclase (AC) pathway led to CREB activation following TCR+CD43 engagement. Overall, our results identified a new signalling pathway for CD43 through the regulation of alternative functions of PKM2, favouring cell survival following activation. Materials and methods Antibodies and reagents Ficoll (Lymphoprep) for blood mononuclear cell isolation was obtained from Axis-Shield PoC AS (Alere Technolo- gies AS, Oslo, Norway). The Human Pan T Cell Isolation Kit was from Miltenyi Biotech (Bergisch Gladbach, Ger- many). The goat anti-mouse IgG magnetic particles used for T-cell purification were from Polysciences, Inc. (Warminster, PA). RPMI (HyClone GE Healthcare Life Sciences, Logan, UT) or Advanced RPMI (A-RPMI) (Gibco/Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) medium were supplemented with the indicated amount of fetal bovine serum (Gibco/Life Technologies), 50 U/ml peni- cillin (Sigma, St Louis, MO, USA), 50 lg/ml strepto- mycin (Sigma), 2 mM glutamine (Gibco/Life Technologies) and 50 lM b-mercaptoethanol (Sigma) (A- RPMI). Anti-human CD3 (OKT3), anti-mouse CD3 (F23.1), anti-human CD8 (OKT8) and anti-c-Myc (9- E10) antibodies were home purified. Anti-CD43 (L10) was home purified or from Caltag (Burlingam, CA, MK) and anti-CD28 (CD282) was from Biolegend (San Diego, CA, USA). Anti-pERK1/2, anti-pERK5 (T218/Y220), anti-p- Akt1, anti-Sp1, anti-cyclin D1, anti-p65, anti-NF-jB, and ª 2016 John Wiley & Sons Ltd, Immunology2 M. E. Bravo-Adame et al. 48 anti-ERK2 primary antibodies were purchased from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA); anti-pSTAT3 (Y705), anti-pCREB (S133), anti-pPKM2 (Y105), anti- PKM2, anti-pBad (S112), and anti-phospho (Ser/Thr) PKA substrates antibodies were from Cell Signaling Tech- nology (Danvers, MA, USA), anti-tubulin antibody was from GeneTex, and anti-histone 3 antibody was from Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY, USA). The anti- rabbit biotinylated antibody was purchased from South- ernBiotech (Birmingham, AL, USA) and the phycoery- thrin-labelled streptavidin was from Molecular Probes (Eugene, OR, USA). The horseradish peroxidase-coupled secondary antibodies were from Santa Cruz Biotechnol- ogy. The Cell Proliferation Dye eFluor 670 was from eBioscience (San Diego, CA, USA). The kinase inhibitor XMD8-92 was from Santa Cruz Biotechnology, and the inhibitors PD98059, H89, G€o6976 and LY294004 were obtained from Calbiochem (Spring Valley, CA, USA). The Src family kinases inhibitor PP2 was from Cayman Laboratories (Ann Arbor, MI, USA). Cells Human T cells were isolated from the peripheral blood of healthy donors. Leucocyte concentrates were provided by the ‘Banco de Sangre del Hospital Regional del IMSS’ and the ‘Centro Regional para la Transfusion Sanguınea’ in Cuernavaca, Morelos, Mexico. Institutional committees approved the acquisition and isolation of human periph- eral blood leucocytes. Peripheral blood mononuclear cells were first isolated by Ficoll gradient centrifugation. T cells were then purified with a Human Pan T-Cell Isolation Kit, as instructed by the manufacturer. Finally, CD4+ T cells were enriched by negative selection by incubating the cells with anti-CD8 antibody (OKT8), followed by incubation with goat anti-mouse IgG-bound magnetic particles. The purity of CD4+ T cells was > 90%, as deter- mined by FACS staining. Before stimulation, cells were arrested overnight in RPMI-1640 medium supplemented with 2% fetal bovine serum. Jurkat and the Lck-deficient Jurkat cells (JCAM-1),34 (see Supplementary material, Fig. S1) were cultured in A-RPMI medium supplemented with 5% fetal bovine serum (5K), and arrested in serum- free RPMI-1640 for 36 hr before stimulation. Stable transfectants of the murine T-cell hybridoma BY155.16 expressing wild-type human CD43 (CD43 WT), a mutant lacking the intracellular domain of CD43 (CD43 DIC),9 or human CD4,35 and control cells (pFneo)9 were cul- tured in A-RPMI 5K. Cell activation CD4+ T lymphocytes (15 9 106), Jurkat, or JCAM-1 cells (5 9 106) were stimulated in 1 ml of serum-free RPMI- 1640 with 2 lg/ml each, of anti-CD3 (OKT3), and/or anti-CD43 (L10), or 1 lg/ml of anti-CD28 (CD28.2) antibodies for 3 min at room temperature, following which primary antibodies were cross-linked with isotype- specific secondary antibodies (anti-IgG1 for L10 and CD28, and anti-IgG2a for OKT3), and incubated at 37°, 5% CO2 for the indicated times. At the end of stimula- tion, cells were spun down at 400 g to remove excess antibodies and pellets were stored at 70° for further analysis. When indicated, before stimulation, cells were pre-incubated for 30 min with the following inhibitors: MEK inhibitor PD98059 (83 lM), ERK5 inhibitor XMD8-92 (5 lM); PKA inhibitor H89 (9 lM), PKC inhi- bitor G€o6976 (4 nM), p38 inhibitor SB203580 (083 lM), phosphoinositide 3-kinase (PI-3K) inhibitor LY294004 (10 or 40 lM), or Src inhibitor PP2 (10 lM). Pyruvate kinase glycolytic activity T lymphocytes stimulated for 48 hr as described under ‘Cell activation’, were lysed in 25 mM HEPES pH 75, 05% Triton X-100, 15 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 02 mM EDTA, with 1 mM PMSF, 10 mM b-glyceropho- sphate, 10 mM NaF, 200 lM NaVO4, 1 lg/ml leupeptin, 50 lg/ml antipain, 10 lg/ml aprotinin, 05 mM DTT. Lysates were spun down at 18 000 g for 15 min at 4° and supernatants were stored at 70°. Pyruvate kinase activity was measured on total lysates according to the coupled method.36 Briefly, 50 lg of cell lysate protein was incu- bated in a total volume of 1 ml with reaction buffer [50 mM Tris–HCl pH 74, 225 mM KCl, 12 mM MgCl2, 06 mM ADP, 43 mM PEP, 06 mM NADH, and 4 IU L- Lactate dehydrogenase]. The initial rate of NADH utiliza- tion was monitored at 340 nm using a Hewlett Packard 8452A Diode-array spectrophotometer (Hewlett Packard, Palo Alto, CA). Immunoblot Pyruvate kinase protein abundance was validated on cells stimulated and lysed as described under ‘Pyruvate kinase glycolytic activity’. One hundred microgrammes of pro- tein were desalted/cleaned with the ReadyPrep 2D Cleanup kit (BioRad, Hercules, CA, USA). The protein pellet was resuspended in rehydration buffer [7 M urea, 2 M thiourea, 5% 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammo- nio]-1-propanesulphonate hydrate (CHAPS), 2% Bio-Lyte ampholytes 3/10]. Ready Strip IPG strips (7 cm, linear pH 3–10, BioRad) were layered gel side down onto sam- ples, covered with 1 ml of mineral oil, and active rehy- dration was performed for 16 hr in a protean IEF Cell (BioRad). Isoelectric focusing was performed with a three-step ramping protocol for a total of 30 000 V-hr at 20° and a maximum current setting of 50 mA per strip. Strips were then equilibrated for 15 min in DTT equili- bration buffer (6 M urea, 0375 M Tris–HCl, pH 88, 2% ª 2016 John Wiley & Sons Ltd, Immunology 3 CD43 signalling promotes T-cell survival 49 SDS, 20% glycerol and 2% DTT), followed by a 15 min incubation in iodoacetamide equilibration buffer (6 M urea, 0375 Tris–HCl, pH 88, 2% SDS, 20% glycerol and 25% iodoacetamide). Finally, IEF gel strips were loaded onto 10% acrylamide gels for SDS–PAGE, at 50 V for 4 hr at 4°. SDS–PAGE-separated proteins were transferred onto nitrocellulose membranes as previously described.37 Following transfer, membranes were blocked with TBS (100 mM Tris–HCl, 150 mM NaCl pH 75) containing 002% (w/v) NaN3 and 5% (w/v) fat-free milk powder for 2 hr at room temperature. Blocked membranes were incubated overnight at 4° with the appropriate primary antibodies, followed by the addition of a 1 : 5000 dilution of secondary antibodies (goat anti-rabbit) conjugated to horseradish peroxidase. Immunodetection was carried out using the chemiluminescent ECL Western blotting analy- sis system (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA). Mean intensity of the immunodetected protein bands was calcu- lated as a relative calibrated measurement of the total band size and intensity using ECL molecular weight markers as loading control standards (Fermentas/Thermo- Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Cytosolic and nuclear extracts were prepared as described previously.38 Lysates were resolved by SDS– PAGE and proteins were transferred onto 022-lm nitro- cellulose membranes (Whatman/GE Healthcare). Mem- branes were blocked with 3% BSA in TBS-T buffer (20 mM Tris–HCl, 015 M NaCl, pH 75, pH 75, 005% Tween-20). Primary antibodies were diluted in 3% BSA and horseradish peroxidase-coupled secondary antibodies were diluted in 5% low-fat milk in TBS-T buffer. Proteins were visualized with Western Lighting Plus-ECL substrate (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) according to the manufacturer’s instructions. Densitometric analysis was performed with the help of a Molecular Imager Gel DocTMXR+ Imaging System (Bio- Rad) and the IMAGE LAB software (BioRad, Version 521). Phosphoflow CD4+ T lymphocytes (3 9 106) were stimulated as described under ‘Cell activation’ for 3 hr. Paraformalde- hyde was immediately added directly to the cells to a final concentration of 15%; cells were then vortexed, incu- bated for 10 min at room temperature, and pelleted by centrifugation at 400 g for 5 min at 4°. The supernatant was decanted and cells, resuspended in the residual vol- ume, were permeabilized by adding 500 ll of cold 100% methanol and stored overnight at 70°. Cells were then labelled (barcoded, so that the identity of each sample is recognized on the flow cytometer on the basis of fluores- cence) with serial dilutions of the cell proliferation dye eFluor 670 (eBioscience) and pooled together before anti- body staining.39 Briefly, cells in methanol were labelled with 20 ll of serial dilutions of the dye eFluor 670 (1, 05, 025, 0125, 00625, or 003125 lM), vortexed and further diluted with 500 ll of ice-cold PBS. Following a 10 min incubation at 37° in the dark, excess dye was washed out by adding 3 ml of staining medium twice (PBS, 001% NaN3, 2% fetal bovine serum) and cen- trifuging for 5 min at 400 g at 4° each time. Barcoded samples were resuspended in 250 ll of staining media and pooled by transferring 200 ll from each tube into an empty FACS tube, and washed once more with staining media before the addition of anti-pCREB and secondary biotinylated anti-rabbit antibodies. Pooled cells were incubated with primary and secondary antibodies for 1 hr; excess antibody was removed and phycoerythrin- labelled streptatividin was added and incubated for 30 min. Finally, cells were washed and resuspended in 300 ll of staining media for analysis on a FACSCanto II flow cytometer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) with the FACSDIVA software (Becton Dickinson). Data were analysed using FLOWJO software.40 Cell viability assays T-cell BY155.16 hybridoma cells (105) expressing CD43 WT, CD43 DIC or CD4, and control cells (pFneo) were stimulated with PMA (50 ng/ml)/ ionomycin (1 lg/ml) for 48 hr at 37°, 5% CO2, in 48-well plates in a final vol- ume of 1 ml; alternatively, cells were stimulated with 4 lg/ml of plate-bound anti-TCR (F23.1). At the end of the incubation period, propidium iodide (400 ng/ml) was added to the cells for 10 min at room temperature, in the dark, before analysis on a FACSCanto II flow cytometer, looking for changes in forward scatter (FSC) and side scatter (SSC) as hallmarks of cell death. Propidium- iodide-negative cells were quantified as live cells. Data were analysed using FLOWJO software.40 Statistical analysis Data shown in the graphs represent the mean  SD. Data were analysed by a paired t-test and Tukey’s method with PRISM software (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA), considered significant at P ≤ 005. Results CD43 co-stimulation does not enhance pyruvate kinase glycolytic activity Cellular signalling efficacy ultimately depends on the inte- gration of internal metabolic cues. Particularly, T-cell activation calls for higher levels of biosynthetic precursors and energy for effector functions. Pyruvate kinase cataly- ses the conversion of PEP to pyruvate by transferring a phosphate group from PEP to ADP, releasing one ATP molecule. As a quantitative proteomic analysis revealed ª 2016 John Wiley & Sons Ltd, Immunology4 M. E. Bravo-Adame et al. 50 that co-stimulation through TCR+CD43 resulted in regu- lation of pyruvate kinase protein levels (unpublished results), we first assessed whether the classical function of PK was activated in response to CD43. Under our experi- mental conditions, TCR+CD43 as well as TCR+CD28 stimulated CD4+ T lymphocytes exhibited a trend to up- regulate PK activity (Table 1), suggesting that TCR+CD43 co-stimulation does not drive the cells into a glycolytic pathway, but rather that PK performed alternative signalling functions. CD43 co-stimulatory signals favour PKM2 tyrosine phosphorylation and activate moonlight functions of PK Since the glycolytic activity of PK was not significantly augmented in response to TCR+CD43 co-stimulation, and given that our quantitative proteomic analysis revealed that co-stimulation through the TCR+CD43 resulted in regulation of PK protein abundance in two different protein spots as determined by differential in gel electrophoresis (unpublished results), we evaluated the possibility that potential post-translational modifications of this enzyme were at the source of these differences. Notably, PKM2 Y105 phosphorylation impairs the forma- tion of the tetramer necessary for the glycolytic function of PKM2 and favours that of a dimer with alternative, non-glycolytic, functions.41 Furthermore, PKM2 is pre- dominant in activated T cells.42 Human T lymphocytes were left unstimulated or activated with the anti-CD43 L10 and the anti-CD3 OKT3 monoclonal antibodies. After a 6-hr stimulation period, PKM2 tyrosine phospho- rylation was evaluated. We found that TCR+CD43 co-sti- mulation significantly increased PKM2 Y105 phosphorylation compared with control cells (Fig. 1a). Phosphorylated PKM2 has a protein kinase activity, potentially leading to phosphorylation of the transcription factor STAT3 and up-regulation of the MEK5/ERK5 path- way.32 TCR+CD43 co-stimulation significantly increased phosphorylation of STAT3 on Y705 (Fig. 1b), as well as that of ERK5 (Fig. 1c). Engaging the TCR+CD28 resulted in PKM2 Y105 phosphorylation, and in STAT3 phosphoryla- tion (Fig. 1b), as previously reported.43 Engagement of CD43 or of the TCR alone did not lead to significant PKM2, STAT3 or ERK5 phosphorylation (Fig. 1b,c), sug- gesting that signals from both receptors cooperate to induce the alternative functions of PKM2. Altogether, these data support that co-stimulating the cells through the TCR+CD43 induces PKM2 tyrosine phosphorylation, favouring the activity of PKM2 protein kinase, as well as STAT3 phosphorylation and activation of the MEK5/ERK5 mitogen-activated protein kinases, two pathways associated with quiescence, cell survival and proliferation.44,45 The moonlighting function of PKM2 induced by TCR+CD43 co-stimulatory signals activates downstream targets of ERK5 To further assess the role of the PKM2/STAT3 pathway in up-regulating MEK5/ERK5 signalling, we evaluated the activation status of downstream targets of ERK5: CREB, Bad, cyclin D1, c-Myc and NF-jB.45 TCR+CD43 co- stimulation of CD4+ T lymphocytes, as well as TCR or CD43 independent stimulation, resulted in a modest but consistent phosphorylation of the transcription factor CREB (Fig. 1d). In contrast, the abundance of cyclin D1 and c-Myc significantly increased in cells stimulated with TCR+CD43 or with TCR only, but not in cells with only CD43 stimulation, suggesting that TCR signalling is accountable for c-Myc and cyclin D1 accumulation in the nucleus (Fig. 1e). Although engagement of CD43 alone induced a modest phosphorylation of the pro-apoptotic protein Bad compared with that resulting from TCR liga- tion, co-stimulating the cells through the TCR+CD43 had a synergistic effect (Fig. 1e), suggesting the activation of anti-apoptotic pathways. As expected,43,46,47 TCR+CD28 stimulation induced the phosphorylation of CREB and Bad, as well as increasing abundance of c-Myc and cyclin D1 (Fig. 1d,e). To determine if the CREB, c-Myc, STAT3, Bad and NF-jB activation we detected following TCR+CD43 co- stimulation was dependent on ERK5 enzymatic activity, we stimulated CD4+ T lymphocytes in the presence of XMD8-92, a specific ERK5 inhibitor.48 As CD43- mediated signals induced Bad and CREB phosphoryla- tion (Fig. 1d,e), but STAT3 phosphorylation, c-Myc and NF-jB activation required signalling through TCR+CD43 (Fig. 1d, e, and see Supplementary material, Fig. S1a), we evaluated the importance of the ERK5 pathway in the activation of the latter proteins in TCR+CD43 co-sti- mulated cells. As a consequence of ERK5 inhibition, Bad phosphorylation, but not that of CREB, was reduced, and the up-regulation of c-Myc protein levels was par- tially abolished in TCR+CD43 co-stimulated cells (Fig. 2a), suggesting the participation of additional path- ways. Likewise, NF-jB activation and STAT3 Table 1. Pyruvate kinase activity Average SD P value Unstimulated 1 0 TCR+CD43 1701 0423 0125 TCR+CD28 1877 0183 0125 CD4+ T lymphocytes (15 9 107) were stimulated for 48 hr through the T-cell receptor (TCR)+CD43, or TCR+CD28, to evaluate pyru- vate kinase glycolytic activity in cell lysates. Enzyme activity was measured using the coupled method, as described in ‘Materials and methods’. The data shown represent four independent experiments. Numbers represent fold change in absorbance values. ª 2016 John Wiley & Sons Ltd, Immunology 5 CD43 signalling promotes T-cell survival 51 phosphorylation were found to be dependent on the ERK5 pathway in response to TCR+CD43 co-stimulation (Fig. 2a). Inhibition of the ERK5 pathway in cells stimu- lated with TCR only or CD43 only had no impact on Bad or CREB phosphorylation (see Supplementary mate- rial, Fig. S1b), further suggesting that co-stimulation through both receptors is necessary for the activation of the ERK5 pathway. CD43-dependent signals activate Src kinases, particularly Fyn and Lck.21,49 Interestingly, PKM250–52 and the MEK5/ ERK5 pathway53,54 have been described as being targets of Src family kinases. To evaluate the role of Src kinases in the activation of the PKM2/ERK5 pathway, CD4+ T lympho- cytes were stimulated in the presence of an Src inhibitor (PP2). We found that the phosphorylation of ERK5 and Bad as a result of TCR+CD43 or TCR+CD28 stimulation was dependent on Src family kinases as both events were abolished in PP2-treated cells (Fig. 2b). Src inhibition in cells stimulated with TCR only or CD43 only did not sig- nificantly reduce ERK5 or Bad phosphorylation (see Sup- plementary material, Fig. S1b). These data suggest that the phosphorylation of ERK5 and Bad resulting from TCR+CD43 co-stimulation is Src-dependent. Additionally, wild-type and Lck-deficient Jurkat cells (JCAM-1) (see Supplementary material, Fig. S2) were stimulated following the same protocol as T lymphocytes. In wild-type Jurkat cells, enhanced phosphorylation of PKM2, Bad and ERK5 was observed following (e) Unstimulated TCR+CD43 IB: anti-PKM2 anti-pPKM2 pCREB CD43 TCR % o f M a x Unstimulated NUCLEUS CYTOPLASM 1·0 2·5 2·2 1·8 1·4 pPKM2 ERK pStat3 Histone 3 1·0 7·2 3·0 0·4 1·9 1·0 2·0 0·3 2·0 pERK5 ERK NUCLEUS CYTOPLASM pBad ERK c-Myc Histone 3 Cyclin D1 1·0 6·8 5·0 2·4 4·6 1·0 11·7 2·9 0·4 3·1 1·0 2·5 1·6 1·5 0·8 100 80 60 40 20 0 F o ld c h a n g e p P K M 2 ** 3 2 1 0 F o ld c h a n g e p P K M 2 * 20 15 10 5 0 F o ld c h a n g e p S ta t3 ** *** * 3 2 1 0 ** *** ** F o ld c h a n g e p C R E B 3 2 1 0 0 F o ld c h a n g e C y c lin D 1 *** ** ** * 30 20 10 * * *** F o ld c h a n g e c M y c 15 10 5 0 *** *** ** * *** F o ld c h a n g e p B a d 2·5 2·0 1·5 1·0 0·5 0·0 F o ld c h a n g e p E R K 5 ** pCREB 0 10 40 20 60 80 100 102 103 104 105 0 10 40 20 60 80 100 102 103 104 105 TCR+CD43 TCR+CD28 % o f M a x Unstimulated (b)(a) (c) (d) U ns tim ul at ed TC R C D 43 TC R +C D 43 TC R +C D 28 U ns tim ul at ed TC R +C D 43 U ns tim ul at ed TC R C D 43 TC R +C D 43 TC R +C D 28 U ns tim ul at ed TC R C D 43 TC R +C D 43 TC R +C D 28 U ns tim ul at ed TC R C D 43 TC R +C D 43 TC R +C D 28 U ns tim ul at ed TC R C D 43 TC R +C D 43 U ns tim ul at ed TC R C D 43 TC R +C D 43 TC R +C D 28 U ns tim ul at ed TC R C D 43 TC R +C D 43U ns tim ul at ed TC R C D 43 TC R +C D 43 TC R +C D 28 Figure 1. CD43 co-stimulatory signals induce pyruvate kinase isoform M2 (PKM2) moonlight functions. (a) Quantitative proteomic analysis results were validated in cell lysates from CD4+ T cells activated for 6 hr as described in the Experimental Procedures. PKM2 and PKM2 Y105 phosphorylation was assessed by immunoblot of two-dimensional gels with samples from three different donors. (b) CD4+ T cells (15 9 107) were left unstimulated or stimulated through the T-cell receptor (TCR), CD43, TCR+CD43, or TCR+CD28 for 3 hr and nuclear and cytosolic extracts were prepared. Phosphorylation of PKM2 on Y105 (pPKM2) and that of signal transducer and activator of transcription (STAT) on Y705 was assessed by immunoblot in cytosolic and nuclear extracts. Total extracellular signal-regulated kinase 2 (ERK2) and histone 3 levels in the cytoplasm and nuclei, respectively, are shown as loading controls. The data shown are representative of three independent experiments. Numbers represent fold increase values. (c) The levels of pERK5 were evaluated in total cell extracts from unstimulated or TCR, CD43 or TCR+CD43 co- stimulated CD4+ T cells for 3 hr. Total tubulin levels are shown as loading control. The data shown are representative of three independent experiments. Numbers represent fold increase values. (d) cAMP response element binding protein (CREB) phosphorylation was assessed by phos- phoflow analysis of T cells co-stimulated for 3 hr with TCR+CD43, TCR+CD28, TCR, or CD43 alone and compared with unstimulated cells. The data shown are representative of three independent experiments. Fold change analysis was based on MFI. (e) The activation of downstream targets of the PKM2/STAT3/ERK5 pathway was assessed after 3 hr stimulation in cytoplasmic or nuclear extracts from unstimulated, TCR, CD43, TCR+CD28, or TCR+CD43 co-stimulated CD4+ T cells, using specific antibodies for phosphorylated Bad (pBad), cyclin D1 and c-Myc; ERK 2 and histone 3 protein levels are shown as loading control for cytoplasmic and nuclear fractions, respectively. The data shown are represen- tative of three independent experiments. Numbers represent fold increase values. Graphs show fold change in protein phosphorylation or abun- dance in three donors. P values were considered significant if P ≤ 005 (*P <0.05, **P <0.01, and ***P <0.001). ª 2016 John Wiley & Sons Ltd, Immunology6 M. E. Bravo-Adame et al. 52 TCR+CD43 co-stimulation. CD43-dependent signals also induced ERK5, PKM2 and Bad phosphorylation in Jurkat cells, whereas, in contrast to CD4+ T lymphocytes, TCR signalling resulted only in a modest increase in PKM2 phosphorylation, but not in that of ERK5 or Bad. Nota- bly, phosphorylation of ERK5 was comparable in Jurkat cells stimulated with CD43 only or TCR+CD43, and PKM2 and Bad phosphorylation was further increased following TCR+CD43 engagement compared with cells stimulated with TCR only or CD43 only, supporting a co-stimulatory role for CD43 in the activation of the PKM2/ERK5 pathway. In JCAM-1 cells, TCR ligation did not induce ERK5, PKM2 or Bad phosphorylation, whereas CD43-mediated signals resulted in modest PKM2 and Bad phosphorylation, and in TCR+CD43- stimulated cells, levels of pPKM2 or pBad were compara- ble to those of cells activated by CD43 only or TCR only, but no ERK5 phosphorylation was detected in either (Fig. 2c). These data suggest that in Jurkat cells, the sig- nalling pathway leading to PKM2, ERK5 and Bad phos- phorylation induced in response to TCR+CD43 engagement is dependent on Lck. Altogether, these results suggest that CD43 co-stimula- tory signals support the activation of the MEK/ERK5 path- way, that up-regulation of c-Myc and NF-jB (p65), and phosphorylation of STAT3 and Bad are dependent on ERK5 activation, and that Src family kinases, namely Lck, participate in PKM2 Y105 phosphorylation in Jurkat cells. CD43 co-stimulatory signals activate PKA to synergize with the PKM2/STAT3/ERK5 pathway CREB is a transcription factor that regulates diverse cellu- lar responses, including proliferation, survival and (a) (c) (b) Src inh – + – + – + pERK 5 pBad 1·0 0·1 2·5 0·3 2·0 1·2 ERK 2 1·0 1·9 7·1 1·0 6·8 1·2 TCR+CD43Unstimulated CD43 TCR pERK 5 Actin pPKM2 1·0 1·0 1·7 0·8 1·8 0·8 0·9 1·0 1·0 1·0 1·7 1·0 3·0 1·4 2·5 1·1 1·0 1·0 2·8 1·0 1·5 1·4 0·5 1·0 pBad Actin NUCLEUSCYTOPLASM 1·0 1·0 8·8 1·6 pBad p65 c-Myc Tubulin 1·0 0·7 3·8 1·7 1·0 1·0 6·3 3·4 1·0 1·0 8·5 2·4 1·0 1·0 1·3 1·2 pStat3 pCREB Histone 3 3 2 1 0 4 F o ld c h a n g e p 6 5 * * 0 10 F o ld c h a n g e p B a d 2 4 6 8 **** ** 1·0 0 0·5 1·5 F o ld c h a n g e p C R E B – + – + XMDO D O D * 10 0 5 15 F o ld c h a n g e p S ta t3 – + – + XMD * * * 6 4 2 0 8 * * * F o ld c h a n g e c M y c 3 2 1 0 *** * F o ld c h a n g e p E R K 5 – + – + – + Src inh 8 6 4 2 0F o ld c h a n g e p B a d h *** * *** Jurkat JCAM-1 0 4 1 2 3 F o ld c h a n g e p P K M 2 * * * **** ** *** 0 4 1 2 3 F o ld c h a n g e p B a d * * * 0 2·5 0·5 1·0 1·5 2·0 F o ld c h a n g e p E R K 5 t M t M t M t M ** *** * ** * U ns tim ul at ed U ns tim ul at ed +X M D TC R +C D 43 +D M SO TC R +C D 43 +X M D U ns tim ul at ed U ns tim ul at ed +X M D TC R +C D 43 +D M SO TC R +C D 43 +X M D U ns tim ul at ed TC R +C D 43 TC R +C D 28 Ju rk at JC AM 1 Ju rk at JC AM 1 Ju rk at JC AM 1 Ju rk at JC AM 1 U ns tim ul at ed TC R +C D 43 TC R +C D 28 U ns tim ul at ed TC R +C D 43 TC R C D 43 U ns tim ul at ed U ns tim ul at ed TC R +C D 43 TC R +C D 43 Figure 2. The T-cell receptor (TCR)+CD43-induced pyruvate kinase isoform M2 (PKM2)/ signal transducer and activator of transcription (STAT3)/extracellular signal-regulated kinase 5 (ERK5) pathway targets Bad, nuclear factor-jB (NF-jB) and c-Myc. (a) Cells were pre-incubated with the ERK5 inhibitor XMD8-92 (5 lM) 30 min before stimulation for 3 hr with TCR+CD43. Phosphorylation levels of pSTAT3, cAMP response element binding protein (pCREB) and pBad, as well as nuclear c-Myc and p65 levels, were evaluated by immunoblot; total tubulin and histone 3 levels are shown as loading controls for cytoplasmic and nuclear fractions, respectively. The data shown are representative of three inde- pendent experiments. Numbers represent fold increase values. (b) CD4+ T lymphocytes were pre-incubated with the Src inhibitor PP2 (10 lM) 30 min before stimulation with TCR+CD43 or TCR+CD28. ERK5 and Bad phosphorylation was evaluated by immunoblot; ERK2 levels are shown as loading control. Numbers represent fold increase values. (c) Jurkat and JCAM-1 cells were stimulated with TCR, CD43, or TCR+CD43, for 3 hr and pPKM2, pBad, and pERK5 phosphorylation levels were evaluated by immunoblot; total actin levels are shown as loading controls. The data shown are representative of three independent experiments. Numbers represent fold increase values. Graphs show fold change in protein phosphorylation or abundance in three donors. P values were considered significant if P ≤ 005 (*P <0.05, **P <0.01, and ***P <0.001). ª 2016 John Wiley & Sons Ltd, Immunology 7 CD43 signalling promotes T-cell survival 53 differentiation.55 Since ERK5 inhibition had no effect on TCR+CD43-induced CREB phosphorylation (Fig. 2a), we searched for other signalling pathways responsible for the regulation of this transcription factor. In Jurkat cells, stimulation through the TCR alone or co-stimulation through TCR+CD43 led to CREB phosphorylation (Fig. 3a). Since CD43 signalling alone did not induce CREB phosphorylation in Jurkat cells, and TCR+CD43- induced CREB phosphorylation was significantly higher than that observed for TCR-stimulated Jurkat cells, we evaluated that signalling pathways that could be responsi- ble for CREB phosphorylation in TCR+CD43 co-stimu- lated cells. We found that in Jurkat cells, CREB phosphorylation is PKA-dependent while MEK 1/2, p38 or PKC inhibition had no effect on the phosphorylation of this transcription factor (Fig. 3b). PKA activation fol- lowing TCR+CD43 signalling was confirmed by immuno- blot using an antibody that recognizes PKA- phosphorylated substrates (see Supplementary material, Fig. S3). As CREB is also a target for Akt,56 a kinase that delivers anti-apoptotic signals through the PI-3K-depen- dent pathway,57 and since the PKA inhibitor (H89) also prevents the activation of Akt,57 we evaluated whether the PI-3K/Akt pathway was involved in TCR+CD43-mediated CREB activation. TCR+CD43 co-stimulation induced Akt phosphorylation in Jurkat cells, and treatment with the PKA inhibitor H89 prevented the activation of this kinase (see Supplementary material, Fig. S4, left panel). Accord- ingly, inhibition of PI-3K with LY904002 led to decreased Akt phosphorylation in TCR+CD43 co-stimulated Jurkat cells, but CREB phosphorylation was not affected (see Supplementary material, Fig. S4, right panel). These data suggest that the phosphorylation of CREB resulting from TCR+CD43 co-stimulation depends on the activation of the PKA pathway, and that this is independent of the PI-3K/Akt pathway. Expression of wild-type CD43 favours cell survival following cell activation The expression of CD43 has been shown to convey a sur- vival advantage for CD4+ and CD8+ splenocytes during apoptosis induction via growth factor withdrawal,58 inde- pendent of antibody-mediated ligation. Based on our results supporting a role for CD43-mediated signals in acti- vating anti-apoptotic and pro-survival molecules, and in view of the fact that T-cell hybridomas can undergo apop- totic cell death when activated through the T-cell receptor complex,59 clones of the By155.16 T-cell hybridoma expressing comparable amounts of the TCR and of human CD43 WT, CD43 DIC or CD4 (Fig. 4a) were evaluated for survival in response to PMA/Ionomycin or F23.1 stimula- tion. Expressing CD43 WT protected the cells from PMA/ Ionomycin-induced cell death, resulting in significantly more live cells (79%), compared with pFneo cells (65%) or BY CD4 cells (61%). On the contrary, expressing a CD43 mutant lacking the intracellular domain (CD43 DIC) ren- dered the cells even more sensitive to PMA/Ionomycin- induced cell death with a survival toll of 46% (Fig 4b). CD43 WT transfected BY155.16 cells significantly survived more with plate-bound anti-TCR monoclonal antibody (F23.1) (96%) compared with BY pFneo (80%) or BY CD4 cells (72%), and expressing CD43 DIC also resulted in a higher susceptibility to TCR-induced cell death (Fig. 4c). (a) (b) 1·0 8·0 14·7 2·3 pCREB CREB – pCREB CREB Sp1 1·0 5·3 6·2 5·4 1·6 6·4 6·0 TCR+CD43 15 10 5 0 20 F o ld c h a n g e p C R E B *** * ** * 15 10 5 0 F o ld c h a n g e p C R E B * *** U ns tim ul at ed TC R +C D 43 TC R C D 43 U ns tim ul at ed PD 98 05 9 SB20 35 80 H 89 D M SO G ö6 97 6 U ns tim ul at ed TC R +C D 43 TC R C D 43 U ns tim ul at ed TC R +C D 43 +D M SO TC R +C D 43 TC R +C D 43 +H 89 Figure 3. T-cell receptor (TCR)+CD43 signals induce protein kinase A (PKA) -dependent cAMP response element binding protein (CREB) activa- tion. (a) Jurkat cells were stimulated with anti- TCR, and/or anti-CD43 antibodies for 10 min and pCREB and total CREB levels were measured in whole cell lysates by immunoblot. The data shown are representative of three independent experiments. (b) Jurkat cells were left untreated or pre-incubated with enzyme inhibitors for MEK 1/2 (PD98059, 83 lM), p38 (SB203580, 083 lM), protein kinase A (PKA; H89, 83 lM), and protein kinase C (PKC; G€o6976, 33 nM) before TCR+CD43 co-stimulation. pCREB levels were evaluated by immunoblot in whole cell lysates after 10 min of stimulation; CREB and Sp1 levels are shown as loading controls. Num- bers represent fold change values. The data shown are representative of two independent experi- ments. (*P <0.05, **P <0.01, and ***P <0.001). ª 2016 John Wiley & Sons Ltd, Immunology8 M. E. Bravo-Adame et al. 54 All unstimulated cells had a viability of > 92% when evalu- ated after a 48-hr incubation. Consistent with previous data showing that the intracellular domain of CD43 is required for the regulation of cell viability,58 these results indicate that CD43 expression protects the cells from apop- totic signals, but also that lacking the CD43 intracellular domain represents a disadvantage for cell survival, Alto- gether, these results suggest that CD43 participates in cell survival in response to TCR- or PMA-dependent signals, potentially contributing to the regulation of T-cell home- ostasis following activation. Discussion Similar to CD28 signalling cascades,60 CD43 engagement activates multiple signalling pathways, ultimately regulating cell fate.61 To further characterize the partici- pation of CD43 in T-cell activation, we carried out a pro- teomic analysis of normal human peripheral blood CD4+ T lymphocytes co-stimulated with TCR+CD43. The bio- logical processes regulated by the proteins found to be modulated in response to TCR+CD43-mediated signals, pointed at the ‘generation of precursor metabolites and energy’ and ‘regulation of apoptosis’ as the most enriched biological processes (23% and 13%, respectively, unpub- lished results), prompting us to explore the participation of CD43 in the regulation of glucose metabolism. Particu- larly, the proteomic data indicated that TCR+CD43 sig- nalling modulated the abundance of PK, which we were able to validate by immunoblot. Out of the four isoforms of PK, PKM2 is expressed in most cells,62 including acti- vated T cells.63 Sp1, HIF-1 and c-Myc activate PKM2 (a) (b) (c) BY pFneo BY CD43 WT BY CD43 ∆ IC BY CD4 % o f M a x % o f M a x % o f M a x % o f M a x % o f M a x % o f M a x % o f M a x % o f M a x % o f M a x % o f M a x Stained Isotype control TCR CD43 CD4 CD43 Actin BY pFneo BY CD43 WT BY CD43 ∆IC BY CD4 % Live cells * * * * * * Unstimulated TCR BY pFneo BY CD43 WT BY CD43 ∆ IC BY CD4 % Live cells * * * * * * * * * PMA/ionoUnstimulated BY p Fne o BY C D 43 W T BY C D 4 BY C D 43 ∆ IC 0 20 40 60 80 1000 20 40 60 80 100 0 0 20 40 60 80 100 102 103 104 105 0 0 20 40 60 80 100 102 103 104 105 0 0 20 40 60 80 100 102 103 104 105 0 0 20 40 60 80 100 102 103 104 105 0 0 20 40 60 80 100 102 103 104 105 0 0 20 40 60 80 100 102 103 104 105 0 0 20 40 60 80 100 102 103 104 105 0 0 20 40 60 80 100 102 103 104 105 0 0 20 40 60 80 100 102 103 104 105 0 0 20 40 60 80 100 102 103 104 105 Figure 4. CD43 expression promotes cell survival of activated cells. (a) The murine T-cell hybridoma BY155.16 was transfected with empty vec- tor (pFneo), full-length human CD43 (CD43 WT), a mutant lacking the intracellular domain (CD43 DIC), or human CD4. The surface expres- sion of each co-stimulatory molecule was evaluated by FACS analysis (left panel). The molecular weight of the full-length CD43 (CD43 WT) and truncated CD43 (CD43 DIC) was determined by immunoblot (right panel) using the L10 anti-CD43 monoclonal antibody. Actin levels are shown as loading control. (b) Cells were left unstimulated (ᴓ) or stimulated with PMA (50 ng/ml)/ionomycin (1 lg/ml) (P/I) for 48 hr, and cell viabil- ity was measured by quantification of propidium-iodide-negative cells. The data shown are representative of four independent experiments. (c) Alternatively, cells were left unstimulated (ᴓ) or stimulated with 4 lg/ml plate-bound anti-TCR monoclonal antibody (F23.1) for 48 hr, and cell viability was measured by quantification of propidium iodide-negative cells. The data shown are representative of three independent experiments. P values were considered significant if P ≤ 0.05, * indicates P values from 0.01 to 0.05. ª 2016 John Wiley & Sons Ltd, Immunology 9 CD43 signalling promotes T-cell survival 55 transcription; in addition, c-Myc also activates the tran- scription of hnRNPA1 and hnRNPA2 (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein), two splicing factors that pro- mote the alternative splicing that generates PKM2 mRNA.64–66 Interestingly, according to our proteomic analysis, the expression level of these factors was also modulated in response to TCR+CD43 signals (unpub- lished data). Pyruvate kinase is a rate-limiting enzyme that catalyses the last step of glycolysis, converting PEP to pyruvate by transferring a phosphate group from PEP to ADP, releas- ing one ATP molecule. Contrary to our expectations, under our experimental conditions, TCR+CD43 co-sti- mulation did not significantly augment PK glycolytic activity, suggesting rather that CD43 co-stimulatory sig- nals favoured the alternative functions of PK. Accord- ingly, we found that co-stimulating CD4+ human T lymphocytes through TCR+CD43 led to phosphorylation of PKM2 on Y105, a protein modification that impairs the tetramer formation necessary for PKM2 to promote oxidative metabolism for energy production,41 and favours the formation of a dimer that leads to the ana- bolic metabolism of glucose, supporting the biosynthesis of macromolecules necessary for cell proliferation.50 Although the accumulation of metabolic intermediates upstream of the glycolytic pathway under our experimen- tal conditions remains to be tested, these data correlate with the fact that CD43 engagement did not lead to increased glycolysis. In addition, we found that STAT3 Y705 was phosphory- lated in response to TCR+CD43 co-stimulation, suggest- ing that the TCR+CD43-mediated activation of PKM2 is responsible for the activation of this transcription factor. This is in line with previous reports showing that phos- phorylation allows PKM2 to function as a co-activator for transcription factors such as HIF-1a, HIF-2a, b-cate- nin, STAT3 and Oct-4, which in turn favour the tran- scription of target genes such as: SLC2A1 (Glut-1), LDHA, PKD1, HK1, VEGFA, CCND1, MYC and MEK5.32,67–69 Whether the phosphorylation of STAT3 is directly mediated by PKM2 still remains to be determined in our system. The MEK5/ERK5 signalling pathway is strongly involved in cell survival and proliferation.45 ERK5 phos- phorylation and higher abundance of several ERK5 tar- gets demonstrated the role of CD43 co-stimulatory signals in activating the MEK/ERK5 pathway. In agree- ment with this, inhibition of ERK5 led to diminished c- Myc, p65 and pSTAT3 abundance, suggesting that in TCR+CD43 co-stimulated cells, the abundance of these molecules was partially dependent on ERK5, but that other signalling pathways participate for their accumula- tion in the nucleus. Likewise, CREB and Bad, two pro- teins involved in apoptosis regulation and potential ERK5 targets70 were phosphorylated in response to TCR+CD43 co-stimulatory signals. Bad and STAT3 phosphorylation were diminished in TCR+CD43 co-sti- mulated cells in the presence of the ERK5 inhibitor and consistent with data showing that CD43 signalling leads to Lck and Fyn activation,21,49 we observed that in TCR+CD43 co-stimulated T cells, ERK5 and Bad phos- phorylation is dependent on Src family kinases. Although CREB can be activated as a result of the MEK5/ERK5 pathway, under our experimental condi- tions, we found that the PKA pathway is the major mechanism responsible for CREB phosphorylation in response to the TCR+CD43 co-stimulatory signals. PKA activation leads also to Bad phosphorylation,71 whether this happens in response to TCR+CD43 stimulation remains to be investigated. Under our experimental con- ditions, TCR+CD43 co-stimulatory signals parallelled the TCR+CD28 co-stimulatory ones, although to a lesser extent, in terms of abundance of c-Myc and cyclin D1 and Bad phosphorylation. Altogether this data further suggest that CD43 co-stimulatory signals promote the non-glycolytic functions of PKM2, and that the MEK5/ ERK5 and the PKA signalling pathways may be simulta- neously activated by CD43, potentially regulating resis- tance to cell death. In neutrophils, mast cells, T cells and granulocytes, CD43 is cleaved by c-secretase following PMA treatment. As a consequence, the extracellular domain of CD43 is shed from the cell surface, and the intracellular domain, which contains two nuclear localization signals, is translo- cated into the nucleus58 where it may interact with b-catenin to promote cell proliferation,72 and with promyelocytic nuclear bodies, to regulate growth factor withdrawal-induced apoptosis.58,73 Inhibition of c-secre- tase impairs nuclear translocation of the cytoplasmic domain of CD43 and prevention of apoptosis.58 Consis- tent with a role for CD43 in cell death protection, target- ing CD43 with small interfering RNA increases the susceptibility of breast and lung cancer cells to apoptosis and vulnerability to lysis by natural killer cells.74,75 Like- wise, in the BY155.16 murine T-cell hybridoma, the expression of wild-type human CD43 protected the cells against apoptosis following TCR engagement or PMA/ ionomycin stimulation; on the contrary, the absence of the intracellular domain rather enhanced cell death toll, suggesting that the CD43 mutant lacking the intracellular domain functioned in a dominant negative fashion. Con- sidering that the BY155.16 hybridoma cells express mur- ine CD43, these data also suggest that murine CD43 could be responsible for the remaining live cells in PMA/ ionomycin or TCR-stimulated cells (40% or 80%, respec- tively), counterbalancing the dominant negative function of CD43 DIC. Furthermore, in addition, to the conserved S72 and S76 shown to participate in regulation of cell movement and proliferation and trafficking, respec- tively,76 the intracellular region of human CD43 has other ª 2016 John Wiley & Sons Ltd, Immunology10 M. E. Bravo-Adame et al. 56 PKC phosphorylation pattern sites that are not present in murine CD43 (residues 59–61 and 91–93 of CD43 cyto- plasmic domain).61 Whether these sites confer additional capacities to human CD43 over murine CD43 in terms of cell death resistance, and whether murine CD43 can potentially overcome the dominant negative effect of the human CD43 DIC favouring the activation on anti-apop- totic pathways, need to be addressed. Collectively, our results provide evidence that by reg- ulating the non-glycolytic functions of PKM2, CD43 co-stimulatory signals promote the activation of the MEK/ERK5 and the PKA pathways, two pathways asso- ciated with cell growth and proliferation.25,30,77 More- over, our data indicate that TCR+CD43 co-stimulation leads to the activation of multiple signalling pathways that share common key targets, such as CREB and Bad, highlighting the importance of regulating these proteins during cell activation to promote cell survival. Cell survival and proliferation are essential for the effector phase of the immune response and the fine- tuning of these processes is critical for the appropriate contraction and memory establishment. Hence, through the activation of pro-survival signalling pathways, CD43 may contribute to the regulation of homeostasis of the immune response. Acknowledgements We thank the blood donors for the generous gift of their lymphocytes. We thank Dr Humberto Vaquera for sup- port with statistical analysis and Erika Melchy for techni- cal support. Work in our laboratories was supported by grants # IN219307, IN206913 and IN212716 from DGAPA/UNAM (Departamento General de Apoyo para el Personal Academico, Universidad Nacional Autonoma de Mexico) and grnats # 100275 and 220990 from CONACyT (Consejo Nacional de Ciencıa y Tecnologıa), Mexico to YR. MEBA and CMC were recipients of schol- arships from CONACyT. Author contributions MEBA designed and performed research, analysed data and wrote the paper; RVE and BJB contributed to experi- mental design, research and paper revision; CMC, AFA and JPOO contributed to research; GPA contributed to experimental design and paper revision; YR contributed to experimental design, data analysis, paper writing and revision, and led the study. Disclosures The authors declare they have no competing interests or other interests that might be perceived to influence the interpretation of results and discussion reported in this paper. References 1 Mueller DL, Jenkins MK, Schwartz RH. Clonal expansion versus functional clonal inac- tivation: a costimulatory signalling pathway determines the outcome of T cell antigen receptor occupancy. Annu Rev Immunol 1989; 7:445–80. 2 Curtsinger JM, Mescher MF. Inflammatory cytokines as a third signal for T cell activa- tion. Curr Opin Immunol 2010; 22:333–40. 3 Fox CJ, Hammerman PS, Thompson CB. Fuel feeds function: energy metabolism and the T-cell response. Nat Rev Immunol 2005; 5:844–52. 4 Frauwirth KA, Riley JL, Harris MH, Parry RV, Rathmell JC, Plas DR et al. The CD28 signaling pathway regulates glucose metabolism. Immunity 2002; 16:769–77. 5 Zheng Y, Delgoffe GM, Meyer CF, Chan W, Powell JD. Anergic T cells are metaboli- cally anergic. 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T-cell receptor (TCR)+CD43 crosslinking induces protein kinase A (PKA) activation. Figure S4. T-cell receptor (TCR)+CD43-induced cAMP response element binding protein (CREB) phosphoryla- tion in Jurkat cells is protein kinase A (PKA) dependent. ª 2016 John Wiley & Sons Ltd, Immunology 13 CD43 signalling promotes T-cell survival 59 60 V. RESULTADOS NO PUBLICADOS 61 5.1 Expresión diferencial de proteínas en respuesta al entrecruzamiento del TCR y CD43 Datos previos del laboratorio mostraron que el orden y la duración de las señales que recibe el linfocito a través del TCR y/o de CD43, define la calidad de la respuesta de las células. Cuando las células eran estimuladas previamente a través de CD43, y posteriormente a través del TCR, los linfocitos mostraron niveles altos de proliferación y producción de citocinas. Por el contrario, la estimulación previa a través del TCR por tiempos mayores a 30 min indujo un estado de anergia. Interesantemente, las señales anergizantes del TCR pueden ser revertidas si las señales de CD43 ocurren dentro de los primeros 30 min posteriores al entrecruzamiento del TCR. Estos resultados recalcan el papel modulador de CD43 durante la respuesta inmune, así como la importancia del orden y la duración de las primeras señales que recibe el linfocito T durante la activación para definir el tipo de respuesta celular [176]. El entrecruzamiento de CD43 induce la activación de vías de señalización que promueven la formación de complejos macromoleculares que culminan en la activación de la vía de las MAPK, PKC y un aumento en los niveles de calcio intracelular que inducen rearreglos del citoesqueleto, expresión génica y entrada al ciclo celular [150]. Para ampliar nuestro conocimiento sobre el papel de CD43 durante las primeras horas de la activación de los linfocitos T, evaluamos los perfiles de expresión de proteínas por medio de un estudio proteómico de células activadas a través del TCR y CD43. Los resultados principales de este esfuerzo se reportan en el artículo adjunto “AN ALTERNATIVE MODE OF CD43 SIGNAL TRANSDUCTION ACTIVATES PRO-SURVIVAL PATHWAYS OF T LYMPHOCYTES”. En esta sección se describen y discuten resultados adicionales que no fueron incluidos en dicha publicación. Los linfocitos T CD4+ de sangre periférica se activaron con anticuerpos anti-CD3 o anti- CD43 por diferentes períodos de tiempo (15 min a 2 h) a 37°C, y posteriormente co- estimulando a las células entrecruzando el TCR o CD43 por 6 horas más (Fig. 13 A). A los 15 minutos de estimulación, se verificó por inmunoblot la fosforilación de ERK 1/2 para corroborar la activación de las células. En la Fig. 13 B se muestra, como se esperaba, una mayor fosforilación de ERK 1/2 en respuesta a las señales de CD43, previas al estímulo con el TCR. Por el contario, en células pre-estimuladas a través del TCR la mayor fosforilación de ERK 1/2 sólo ocurrió a los 15 min de pre-estimulación a través del TCR, y posteriormente fue disminuyendo. Estos resultados concuerdan con datos del laboratorio [176], donde se observó una mayor activación de linfocitos T cuando las señales de CD43 ocurrían dentro de los 30 minutos posteriores a las señales del TCR. Una vez confirmada la activación apropiada de las células de tres donadores independientes, evaluamos las 62 diferencias en la abundancia de proteínas en respuesta a los diferentes estímulos mediante la técnica 2D-DIGE. Fig. 13. Activación de linfocitos T CD4+ a través del TCR y CD43. A, Los linfocitos T CD4+ (15 X 106) se estimularon con anticuerpos anti-CD43 (L10) y/o anti-TCR (OKT3) a 2μg/mL, comparando diferentes tiempos de pre- estimulación. B, La fosforilación de ERK 1/2 se evaluó por immunoblot en lisados celulares de linfocitos T CD4+ activados como se describe en A. Los niveles totales de ERK 2 se muestran como control de carga. Los datos que se muestran son representativos de los resultados obtenidos para cada uno de los tres donadores que se incluyeron en el análisis proteómico. Los lisados celulares de los diferentes estímulos para los tres donadores se distribuyeron en 12 geles, como se muestra en la Fig. 14 A y B. El análisis proteómico se realizó como se describe en “Materiales y Métodos” (Anexo 1). El análisis de los geles nos permitió identificar 22 spots de proteínas que mostraron cambios significativos en su abundancia (Fig. 14 C). Los spots se extrajeron y su análisis por espectrometría de masas (LC-MS/MS) identificó 82 proteínas (Anexo 3) contenidas entre los 22 spots, lo que refleja el grado de complejidad de las muestras. 63 Fig. 14. 2D-DIGE. A y B, Diseño experimental: en A se muestran los estímulos incluidos en el experimento, cada uno por triplicado; en B se describe el marcaje de las muestras y la distribución de las mismas en los 12 geles. C, Imagen representativa de uno de los geles, indicando los spots que presentaron cambios en la abundancia. Para definir el significado biológico de la regulación de la abundancia de dichas proteínas, se hizo un análisis bioinformático que permitiera identificar las funciones en las que participan estas proteínas. Para ello se utilizó la herramienta DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery, http://david.abcc.ncifcrf.gov/), la cual 64 ayuda a extraer un significado biológico de una lista larga de genes o proteínas. El análisis con DAVID se hizo tomando como criterio de clasificación la información de Gene Ontology para los procesos biológicos en los que participan cada una de las proteínas. De esta manera identificamos ocho procesos biológicos enriquecidos (Fig. 15 A). Resulta interesante el enriquecimiento de procesos relacionados con el metabolismo de glucosa y la regulación de apoptosis (23% y 13%, respectivamente). Estos resultados se confirmaron por medio de un análisis para la identificación de interacciones entre proteínas utilizando la herramienta STRING (Search Tool for the Retreival of Interacting Genes/Proteins, http:// http://string-db.org/). En la Fig. 15 B se muestran las asociaciones funcionales entre el conjunto de proteínas y se resalta el grupo de proteínas que participan en procesos metabólicos, el cual representa la vía mayormente enriquecida de acuerdo a la base de datos “Kegg Pathways”, incluída en el análisis con STRING. En conjunto, estos resultados sugieren que, al modular el metabolismo y la apoptosis, las señales de CD43 podrían participar en la regulación de la homeostasis de los linfocitos T. 65 Fig. 15. Procesos biológicos enriquecidos en células co-estimuladas a través del TCR y CD43. A, Las proteínas identificadas se agruparon de acuerdo a su notación en Gene Ontology (Procesos biológicos) utilizando la herramienta “Functional Annotational Clustering” de la base de datos de DAVID. La gráfica muestra los clusters mayormente enriquecidos, así como una lista de proteínas que integran el conjunto de “Generación de metabolitos precursores y energía”. Sólo se incluyeron clusters con valores de enriquecimiento ≥1.3 y valores de p≤0.05. B, La interacción entre las proteínas identificadas se evaluó utilizando la base de datos STRING. En rojo se muestran las proteínas que componen el nodo correspondiente a vías metabólicas. 66 5.2 Las señales conjuntas del TCR y de CD43 modulan el metabolismo de glucosa Como se mencionó anteriormente, la respuesta efectora de los linfocitos T depende de la capacidad de la célula para aumentar su metabolismo. La regulación del metabolismo por las moléculas co-estimuladoras permite a los linfocitos cumplir con las demandas energéticas propias del estado de activación [17, 19]. La regulación del metabolismo es una función que no se ha descrito anteriormente para CD43. Del análisis proteómico y bioinformático resultó interesante la identificación de un papel de CD43 en la modulación de la abundancia de enzimas metabólicas, sugiriendo una relación entre la regulación del metabolismo y la apoptosis. Dado que la “Generación de precursores metabólicos y energía” fue el proceso biológico mayormente enriquecido en respuesta a las señales de CD43, exploramos la participación de CD43 en la regulación del metabolismo de glucosa. El análisis proteómico identificó 11 proteínas agrupadas bajo esta categoría (Fig. 15) entre las cuales la aldolasa, la enolasa, la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y la piruvato cinasa están directamente involucradas en glicólisis. La piruvato cinasa cataliza la conversión irreversible de fosfoenolpiruvato (PEP) a piruvato al transferir un grupo fosfato del PEP al ADP, liberando una molécula de ATP [196]. Tomando en cuenta que la piruvato cinasa constituye la última reacción de la vía glicolítica, consideramos que su actividad podría reflejar alguna participación de CD43 en la regulación del flujo glicolítico. Los datos mostrados en el artículo “AN ALTERNATIVE MODE OF CD43 SIGNAL TRANSDUCTION ACTIVATES PRO-SURVIVAL PATHWAYS OF T LYMPHOCYTES” demuestran que, si bien CD43 no induce un aumento significativo en la actividad glicolítica de la piruvato cinasa, sí promueve un aumento en una de las funciones alternas de esta enzima al ser fosforilada en la Y105 y promover así la activación de la vía de Stat3/ERK5 [197]. Como se describe en el artículo, la fosforilación de la piruvato cinasa (PKM2) en la Y105 disminuye su actividad glicolítica y favorece su función como cinasa de proteínas, lo que finalmente promueve la activación de vías anabólicas. Más aún, los linfocitos activados metabolizan la glucosa por medio de la glicólisis aeróbica, un fenómeno llamado “Efecto Warburg” [198]. Durante la glicólisis aeróbica, en vez de entrar al Ciclo de Krebs, el piruvato es convertido a lactato por la lactato deshidrogenasa (LDH) con la finalidad de generar precursores para biomasa [199]. Debido a que el análisis proteómico identificó cambios en la abundancia de la LDH en respuesta a las señales de CD43, evaluamos la producción de lactato en linfocitos estimulados. En la Fig. 16 A se observa que la estimulación de las células a través del TCR+CD43 indujo un aumento en la producción de lactato (2.4 veces más que las células no estimuladas). En concordancia con la actividad de la piruvato cinasa, las células estimuladas a través del TCR+CD28 tuvieron 67 un mayor aumento en la producción de lactato (6 veces más que las células no estimuladas). El entrecruzamiento del TCR o de CD28 solos resultó en un aumento en la producción de lactato de 2.4 y 2.2 veces, respectivamente, mientras que el entrecruzamiento de CD43 solo indujo un aumento de 1.3 veces. Como medida de la ingesta de glucosa, se cuantificó la cantidad de glucosa remanente en el medio de cultivo 48 horas después de iniciada la estimulación de las células. En la Fig. 16 B se muestra que en los linfocitos estimulados a través del TCR+CD43 hay menos glucosa en el medio (30% menos), en comparación con las células no estimuladas, lo que sugiere que han ingerido glucosa tras la activación. De manera mucho más notoria ocurre en las células estimuladas a través del TCR y CD28 (85% menos glucosa en el medio). De forma similar a los datos obtenidos para la producción de lactato, la ingesta de glucosa fue menor en células estimuladas solamente a través de CD43 (8%) en comparación con células estimuladas a través del TCR o CD28 (40% menos glucosa en el medio). Fig. 16. Las señales de CD43 inducen moderadamente la producción de lactato y el consumo de glucosa. Los linfocitos (15 X 106) fueron co-estimulados durante 48 h a través del TCR y/o CD43 o CD28. La cantidad de lactato (A) y glucosa (B) en el sobrenadante se cuantificó con un analizador enzimático YSI-2700. Los datos se representan como cambios con respecto a las células no estimuladas y corresponden a siete experimentos independientes. El análisis estadístico se hizo con la prueba de T (p≤0.05). Los resultados anteriores sugieren que las señales de CD43, pero más aún las del TCR, regulan el metabolismo de glucosa. Los cambios moderados en la actividad glicolítica sugieren que las señales de CD43 podrían promover el desvío de la glucosa hacía vías anabólicas en vez de catabólicas. En conjunto, estos resultados sugieren que CD43 podría proporcionar a las células “señales tónicas” necesarias para mantener una ingesta y un 68 metabolismo basal de glucosa que permita mantener la homeostasis de los linfocitos en reposo, y a su vez podría regular la activación de las células al dirigir el destino de precursores metabólicos hacia vías de biosíntesis. 5.3 Las señales de CD43 inducen la expresión del transportador de glucosa Glut-1 de manera dependiente de la vía de PI3K/Akt/mTOR En linfocitos, la ingesta de glucosa en linfocitos ocurre principalmente a través de transportadores específicos [200], en particular, el transportador de glucosa Glut-1 [201, 202]. La función de Glut-1 puede ser regulada por varios mecanismos: transcripción génica, expresión de la proteína y translocación a la membrana plasmática para llevar a cabo el transporte de glucosa. Para evaluar si las señales de CD43 podían inducir un aumento en la expresión de Glut-1 como consecuencia de la activación, se estimularon linfocitos T a través del TCR y/o CD43, utilizando diferentes anticuerpos anti-CD43 (DFT1 [203], MEM59 [204] y L10 [205]). En la Fig. 17 A y B se observa que las células estimuladas aumentaron la expresión de Glut-1 en la membrana en respuesta al tratamiento con cualquiera de los tres anticuerpos anti- CD43. Interesantemente, se observó que las señales de CD43 por sí solas inducen un aumento en la expresión de Glut-1 en la membrana (Fig. 17 C y D). Estos datos indican que el entrecruzamiento de CD43, por si solo o en conjunto con el TCR, induce un aumento en la expresión de Glut-1 en la membrana, lo que podría preparar a las células para aumentar el metabolismo de glucosa durante la activación. Con la finalidad de mantener una congruencia con los estímulos utilizados para el estudio de proteómica, y dado que el efecto a nivel de la expresión de Glut-1 es equivalente en células estimuladas solo a través de CD43 o en co-estímulo con el TCR (TCR+CD43), en los siguientes experimentos se evaluó la respuesta de las células estimuladas a través del TCR+CD43. Para estudiar el mecanismo de inducción de Glut-1 en respuesta a las señales de CD43 comenzamos por evaluar la cinética de expresión del transportador en la membrana. En la Fig. 18 A y B se muestra la expresión de Glut-1 en la membrana de linfocitos T después de ser co-estimulados durante diferentes períodos de tiempo a través del TCR+CD43 o TCR+CD28. Ambos receptores inducen un incremento importante en la expresión del transportador de glucosa desde una hora después de haber iniciado la activación. Sin embargo, en el caso de las células estimuladas con CD28, la expresión de Glut-1 en la membrana disminuye a tiempos más largos, mientras que en células estimuladas con CD43, la expresión del transportador se mantiene por encima de la que se observa en respuesta a las señales co-estimuladoras de CD28. Estos datos sugieren que las señales de 69 CD43 favorecen la translocación a la membrana plasmática de moléculas ya existentes de Glut-1 en la célula para regular la ingesta de glucosa. Fig. 17. Las señales de CD43 inducen un aumento en la expresión de Glut-1 en la membrana. Los linfocitos (2 X 106) se activaron durante 24 horas con los estímulos indicados y se evaluó la expresión de Glut-1 por citometría de flujo. A, La activación a través del TCR y el co-estímulo con diferentes anticuerpos anti- CD43 induce un aumento en la expresión de Glut-1. C, Las señales solas de CD43, por el entrecruzamiento con el anticuerpo L10, inducen un aumento en la expresión de Glut-1 en la membrana. B y D, La gráficas muestran los cambios en la intensidad media de fluorescencia (MFI) de tres experimentos con donadores independientes. El análisis estadístico se hizo con la prueba de T (p≤0.05). Con el objetivo de identificar las vías de señalización que participan en la regulación de la translocación de Glut-1 a la membrana, se evaluó la expresión de este transportador en células estimuladas a través de TCR+CD43 en presencia de inhibidores de las vías de PI3K y mTOR, las cuales han sido descritas como vías fundamentales en la regulación del metabolismo de glucosa de los linfocitos T [17, 206]. En la Fig. 19 A y B se muestra que las células estimuladas que fueron pre-incubadas con el inhibidor de PI3K (LY294002) presentan una menor translocación de Glut-1 a la membrana, en comparación con las células estimuladas incubadas sólo con DMSO. Asimismo, las células que fueron incubadas con Rapamicina, un inhibidor de la vía de mTOR, también muestran un impedimento en la 70 expresión de Glut-1 en la membrana. Estos datos demuestran que la regulación de la expresión de Glut-1 en respuesta a las señales de TCR+CD43 depende de la vía de PI3K/Akt/mTOR y confirman un papel modulador de TCR+CD43 en el metabolismo de glucosa, al preparar a la célula para mantener la ingesta basal de glucosa mediante la modulación de la expresión del transportador Glut-1 en la membrana. Fig. 18. La expresión de Glut-1 en la membrana de linfocitos estimulados a través del TCR y CD43 o CD28 se induce a partir de 1 hora de activación. A, Los linfocitos T (2 X 106) se activaron durante diferentes períodos de tiempo y la expresión de Glut-1 en la membrana se evaluó por citometría de flujo. En B se muestran los cambios observados en la intensidad media de fluorescencia (MFI) de tres experimentos independientes. El análisis estadístico se hizo con la prueba de T (p≤0.05). 71 Fig. 19. La translocación de Glut-1 a la membrana en respuesta a las señales del TCR y CD43 depende de la vía de PI3K y mTOR. A, Los linfocitos T (2 X 106) se pre-incubaron por 30 min con LY294002 (10 µM) o Rapamicina (50 nM) y se estimularon a través del TCR y CD43 durante 1 hora. La expresión de Glut-1 se midió por citometría de flujo. B, La gráfica muestra los cambios en la intensidad media de fluorescencia (MFI) de tres experimentos independientes. El análisis estadístico se hizo con la prueba de T (p≤0.05). 5.4 La interacción de CD43 con HSA favorece la sobrevida de los linfocitos T Con el fin de evaluar los efectos de las señales mediadas por CD43 en la sobrevida de los linfocitos T en un contexto similar a las condiciones fisiológicas en las que se encuentran las células, evaluamos la viabilidad de linfocitos T tratados con albúmina sérica humana (HSA), un ligando de CD43 previamente reportado [146] y que se encuentra presente de manera constante en la circulación. Comenzamos por evaluar la interacción de CD43 con HSA en linfocitos T. En la Fig. 20 A se muestra la unión de HSA acoplada al fluoróforo FITC en linfocitos T, así como una reducción en la unión de HSA-FITC cuando las células fueron incubadas simultáneamente con el anticuerpo anti-CD43 L10 (Fig. 20 B), sugiriendo una competencia entre el anticuerpo y la HSA por su unión a CD43. Para medir la viabilidad de las células, y por lo tanto un reflejo de su metabolismo, los linfocitos tratados con HSA fueron incubados con MTT (Fig. 20 C), o con yoduro de propidio (Fig. 20 D) para evaluar el ciclo celular. Se observó un aumento en la viabilidad de los linfocitos desde tiempos cortos de 24 h, hasta 120 h, en comparación con las células no tratadas. La modulación de la viabilidad de linfocitos T activados con PMA/ionomicina en respuesta a la interacción de CD43 con su ligando se evaluó incubando a las células con PMA/ionomicina y HSA de manera simultánea. La unión de HSA favorece un aumento en la viabilidad de las células, aún después de haber recibido el estímulo con PMA/ionomicina (Fig. 20 E). Estos datos sugieren que la unión de HSA con CD43 podría funcionar como una señal tónica que favorece el metabolismo celular y mantiene así la 72 viabilidad de las células, lo que podría contribuir a la homeostasis del sistema inmune al promover el mantenimiento del repertorio de los linfocitos T circulantes. Fig. 20. La unión de HSA a CD43 aumenta la viabilidad de los linfocitos T. A, La unión de HSA se evaluó en linfocitos T (1 X 106) incubados con HSA-FITC (10 mg/mL) durante 2 horas. B, HSA-FITC compite con el anticuerpo anti-CD43 L10 por sitios de unión en linfocitos T. C, La viabilidad de linfocitos incubados con HSA (10 mg/mL) durante diferentes períodos de tiempo se midió con un ensayo de MTT, donde la viabilidad es proporcional a la absorbancia. D, Se evaluó la cantidad de células en la fase Sub G0 del ciclo celular en linfocitos tratados con HSA (10 mg/mL) durante diferentes períodos de tiempo. E, Se estimularon 5 X 104 linfocitos con HSA (10 mg/ml) y/o con PMA (250 ng)/ionomicina (2.5 µM) durante 48 horas y se evaluó la viabilidad por medio de una tinción con Anexina V. Las gráficas de A y C son representativas de tres experimentos y las gráficas de B, D y E son representativas de dos experimentos independientes. El análisis estadístico se hizo con la prueba de T (p≤0.05). Para determinar las vías de señalización responsables del aumento en la viabilidad en respuesta a las señales de CD43, se evaluó la activación de la vía de PI3K/Akt, una vía cuya participación en la regulación del metabolismo y la viabilidad celular ha sido ampliamente descrita [207, 208]. Los linfocitos T se estimularon con el anticuerpo monoclonal anti- CD43 L10 o HSA para evaluar la activación de Akt. Se observó que ambos estímulos indujeron la fosforilación de Akt (Fig. 21 A y B), asimismo, se observó un aumento en la fosforilación de sutratos de Akt en respuesta al tratamiento con HSA (Fig. 21 B). En conjunto, estos resultados, junto con los mostrados en el artículo adjunto, sugieren que las señales de CD43 podrían favorecer la sobrevida de las células al promover la activación de vías de señalización que modulan moléculas pro y anti-apoptóticas. 73 Fig. 21. La estimulación a través de CD43 activa la vía de Akt. A, La fosforilación de Akt en la S473 se evaluó en linfocitos T (5 X 106) estimulados con HSA (10 mg/mL) durante diferentes períodos de tiempo o con el anticuerpo anti-CD43 L10 durante 15 min. B, La gráfica muestra la fosforilación de Akt a los 15 min de estimulación con HSA o L10 en tres experimentos independientes. C, La fosforilación de sustratos de Akt se observó en linfocitos T (5 X 106) estimulados con HSA (10 mg/mL) durante diferentes períodos de tiempo. Los niveles de Akt y de actina se muestran como control de carga. Las imágenes son representativas de tres (A) y dos (B) experimentos. El análisis estadístico se hizo con la prueba de T (p≤0.05). 74 VI. DISCUSIÓN 75 DISCUSIÓN Estudios proteómicos previos han descrito el fosfoproteoma y los perfiles de expresión de proteínas en linfocitos T estimulados a través del TCR y CD28, así como a través del TCR solamente [209-212]. De forma similar a CD28, CD43 activa múltiples vías de señalización que finalmente regulan el destino celular [213]. Para caracterizar con mayor profundidad la participación de CD43 en la activación celular, llevamos a cabo un estudio proteómico en linfocitos T CD4+ humanos de sangre periférica estimulados a través del TCR y de CD43. El análisis por 2D-DIGE reveló cambios significativos en la abundancia de 22 spots de proteínas (Fig. 14). Dentro de dichos spots se identificaron 82 proteínas, confirmando la migración conjunta de más de una proteína hacia el mismo spot, un resultado común en los análisis de 2D-DIGE de muestras complejas de este tipo [214, 215]. La clasificación de las proteínas mostró ocho grupos principales de procesos biológicos enriquecidos, entre los cuales destacan “generación de precursores metabólicos y energía” y “regulación de apoptosis” (Fig. 15), sugiriendo una relación entre estas dos funciones, y en concordancia con el hecho de que ya se ha relacionado a CD43 con la regulación de apoptosis [161-165]. Sin embargo, la regulación metabólica no se ha asociado previamente con las funciones de CD43. Los datos de la proteómica mostraron que las señales co-estimuladoras de CD43 modulan los niveles de expresión de enzimas que participan en diferentes vías del metabolismo de glucosa. Particularmente, se detectaron cambios en piruvato cinasa (PKM2), lactato deshidrogenasa (LDH), ATP sintasa, malato deshidrogenasa, catalasa, aldolasa, enolasa, gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GAPDH) y dihidrolipamida S-succiniltransferasa (Fig. 15). El hecho de que cuatro de las 10 enzimas glicolíticas fueran blanco de las señales co-estimuladoras de CD43, sugirió que las señales de CD43 podrían regular la vía glicolítica. Al evaluar esta posibilidad, observamos que la co-estimulación a través de CD43 solo aumenta moderadamente la actividad glicolítica de la PKM2 [197] y de la lactato deshidrogenasa (Fig. 16), en cambio reportamos la activación de una función alterna de la PKM2 que le confiere propiedades reguladoras de vías de sobrevida [197]. Esta nueva vía de señalización podría activarse de manera simultánea con las vías antes descritas para la molécula CD43 y presenta varios puntos de convergencia con las mismas. El entrecruzamiento de CD43 induce su asociación con las cinasas de la familia de Src: Lck y Fyn, así como la activación de éstas. A través de la activación de estas cinasas, las señales de CD43 promueven, por un lado, la fosforilación en tirosinas de los ITAMs de la cadena CD3 ζ y el ensamblaje de complejos macromoleculares que inducen la activación de las MAPK [Revisado en [123]]. Como consecuencia de la activación de ERK 1/2, Lck se fosforila 76 en serinas, lo cual inhibe su asociación con la fosfatasa SHP-1 y se activa un loop de retroalimentación positiva para las señales de Lck [176]. En el artículo adjunto reportamos que la fosforilación de PKM2 en la Y105 que se induce en respuesta a las señales co- estimuladoras de CD43 es dependiente de Lck, y que podría representar un mecanismo responsable de la formación de dímeros que favorecen el metabolismo anabólico y explica el aumento limitado observado en la vía glicolítica. Asimismo, aunque nosotros aun no lo hemos evaluado, cabe la posibilidad de que ERK 1/2 también fosforile a PKM2 en la S37, lo que promovería la translocación de PKM2 al núcleo, donde podría interactuar con β- catenina para inducir la expresión de Myc y regular la expresión de genes como LDH, hexocinasa, fosfofructocinasa, el transportador de glucosa Glut-1, y las proteínas hnRNP A1/A2, responsables de dirigir el splicing alternativo que favorece la expresión de PKM2 [216-220]. En concordancia con estos reportes, nuestros datos de proteómica muestran que las señales co-estimuladoras de CD43 también regulan la abundancia de hnRNPA2 (Anexo 3). Para determinar si el flujo glicolítico limitado que se observa en las células co- estimuladas a través del TCR y CD43 se debe a que la fosforilación de PKM2 favorece vías anabólicas, será necesario evaluar la posibilidad de que diferentes sustratos de la vía glicolítica sean desviados hacia otras vías como la vía de las pentosas fosfato, la cual puede aumentar por efecto de la activación de Myc, implicando a este factor de transcripción en la producción de NADPH y en la síntesis de biomasa [217]. Una vez fosforilada, PKM2 puede unirse y fosforilar al factor de transcripción Stat3, promoviendo la transcripción de genes como MEK5 [221], lo que favorece un incremento en la actividad de la vía de MEK5/ERK5. Aunque nuestros resultados ponen en evidencia la fosforilación de Stat3 en respuesta a las señales co-estimuladoras de CD43, será necesario estudiar la interacción de PKM2 con Stat3 en nuestras células, así como evaluar la activación de la vía de PKM2/Stat3/ERK5 utilizando mutantes de PKM2 que carecen de actividad de cinasa de proteínas. De esta manera podremos determinar si las señales co- estimuladoras de CD43 que llevan a la activación de la vía de ERK5 dependen de esta función de PKM2. La activación de la vía de ERK5, como la de ERK 1/2, regula múltiples blancos que participan en procesos de sobrevida, proliferación, etc. [Revisado en [222]]. Algunas de las proteínas cuya actividad se modula por ERK5 son ciclina D1, CREB, Bad, c- Myc y NF-κB [Rev. en [213]], quienes a su vez se regulan por otras vías de señalización. De tal forma que el incremento de c-Myc que observamos en linfocitos T co-estimulados a través de TCR+CD43 podría ser una consecuencia tanto de la fosforilación y translocación al núcleo de PKM2 por ERK1/2, así como el resultado de la activación de ERK5 por la vía de ERK1/2 o PKM2/Stat3 como mostramos en este trabajo, e incluso podría ser inducido a través de la vía de Akt, la cual también se activa en respuesta a las señales de CD43. 77 Se sabe que la activación de NF-κB en respuesta al estímulo con CD43 depende de la activación de PKC [173]. En este trabajo demostramos que, adicionalmente, es posible activar a NF-κB por medio de la vía de ERK5 en respuesta al entrecruzamiento de CD43. Cabe la posibilidad de que la activación de PKC favorezca también la activación de ERK5. Asimismo, la activación de PKC y los flujos de calcio inducidos por las señales de CD43, promueven la activación de la adenilato ciclasa (AC), la cual a su vez activa a PKA. A través de la activación de PKA, las señales de CD43 favorecen la actividad del factor de transcripción CREB, el cual al ser fosforilado en la S133, interactúa con sus co-activadores CBP o p300 para activar la transcripción de genes que regulan procesos como proliferación, diferenciación y sobrevida, por mencionar algunos ejemplos [Revisado en [223]]. Más aún, la vía de PKA puede cooperar con la vía de ERK5 para inducir la fosforilación de Bad, una proteína pro-apoptótica que pertenece a la familia de Bcl-2. Cuando Bad se encuentra fosforilado, es secuestrado en el citosol por la proteína 14-3-3, impidiendo su translocación a la mitocondria, donde ejerce su función pro-apoptótica [224]. Aunque no hemos evaluado si las señales de CD43 inducen la asociación de Bad y 14.3.3, datos publicados de nuestro laboratorio [178] indican que las señales de CD43 activan a la proteína 14.3.3. Asimismo, Bad también puede ser fosforilado por Akt [225, 226], de manera que las señales de CD43 podrían regular la supervivencia de las células mediante la activación de tres vías de señalización que comparten blancos importantes como Bad. Mediante la activación de PKC, el entrecruzamiento de CD43 también induce la fosforilación en serinas de Cbl y previene su ubiquitinación. La inhibición de las E3 ubiquitin ligasas de Cbl resulta en una fosforilación prolongada de tirosinas y una degradación retardada de ZAP-70 y de la cadena ζ que promueve un aumento en la activación de MAPK y una respuesta robusta de los linfocitos T [227]. Como consecuencia, al inducir flujos de calcio y mantener activas las vías de PKC y MAPK, se activan factores de transcripción como NFAT, AP-1 y NF-κB, que sumados a los que se activan a través de la vía de PKM2/ERK 5 (Stat3, c-Myc y CREB), inducen la transcripción de genes que promueven la proliferación y sobrevida de las células y de esta manera favorecen la respuesta efectora de los linfocitos T. En conjunto, nuestros resultados sugieren que las señales co-estimuladoras de CD43 promueven la activación de múltiples vías de señalización que favorecen tanto la proliferación como la sobrevida de los linfocitos T, posiblemente contribuyendo al mantenimiento de la homeostasis (Fig. 22). 78 Fig. 22. Vía de señalización de CD43. En color se muestran las vías de señalización que se describen en este trabajo y su integración con las vías de señalización previamente descritas para CD43 (gris). La homeostasis de los linfocitos es un proceso biológico complejo: los precursores se producen continuamente y posteriormente pasan por varias etapas de diferenciación hasta lograr su maduración. Durante este proceso son necesarias señales basales que contribuyan a la sobrevivencia de las células y que permitan mantener el repertorio de linfocitos circulantes. Los linfocitos maduros tienen un tiempo de vida relativamente largo, pero la longevidad de cada clona varía de acuerdo a su habilidad para competir por señales que promuevan su viabilidad. Factores extrínsecos que regulan el metabolismo son esenciales para mantener la sobrevida de las células. Cuando las demandas metabólicas no se satisfacen, las funciones celulares se inhiben y la célula puede entrar en apoptosis. Por el contrario, un exceso metabólico puede prevenir la apoptosis, exacerbar la función celular y potencialmente desencadenar enfermedades inflamatorias. Por lo tanto, el control del metabolismo a través de las señales extrínsecas provenientes del TCR, de receptores para citocinas, o de moléculas co-estimuladoras como CD28, por ejemplo, 79 no sólo promueve la sobrevida de los linfocitos T, sino que también garantiza que las células tengan precursores energéticos y biosintéticos apropiados para mantener la homeostasis y la inmunidad [Revisado en [38]. Los linfocitos en reposo dependen de señales extrínsecas para mantener un estado metabólico quiescente. El metabolismo de los linfocitos en reposo está limitado por el microambiente y la disponibilidad de señales tróficas y no por la disponibilidad de nutrientes [Revisado en [38]. La activación de los linfocitos demanda energía y por lo tanto se acompaña de un incremento en el uso de glucosa, el cual es detectable después de una hora de estimulación [27, 31, 228]. En ocasiones, el aumento en el transporte de glucosa se detecta antes de un aumento en la expresión de Glut-1, lo que sugiere que la regulación de la localización intracelular de Glut-1 podría ser responsables de los cambios tempranos en la ingesta de glucosa [22]. De hecho, nuestros resultados muestran que el entrecruzamiento de CD43 induce la translocación del transportador de glucosa Glut-1 hacia la membrana plasmática desde tiempos cortos (una hora), y se mantiene en niveles por encima de los observados en células no estimuladas o activadas a través del TCR y CD28 (Fig. 17 y 18). En linfocitos estimulados a través de CD43, la ingesta de glucosa mostró un incremento del 8% en comparación con las células no estimuladas (Fig. 16), lo que sugiere que, si bien las señales de CD43 inducen cambios moderados en el metabolismo de glucosa, también mantienen niveles de actividad enzimática y consumo de glucosa ligeramente mayores que aquellos de células no estimuladas, que podrían ser suficientes para mantener la viabilidad y la homeostasis de los linfocitos T. In vivo, los linfocitos T reciben señales extrínsecas que proporcionan a la célula información para la regulación del metabolismo, el estado trófico y la sobrevida. Dichas señales extrínsecas provienen del propio TCR, de receptores para citocinas y quimiocinas, así como de moléculas co-estimuladoras que regulan el metabolismo y la sobrevida mediante la activación de vías de señalización como la de PI3K/AKT/mTOR [Revisado en [38]]. En este trabajo mostramos que la translocación de Glut-1 en respuesta a las señales de CD43 es dependiente de las vías PI3K/Akt/mTOR (Fig. 19). Asimismo, mostramos que estas cinasas se activan en respuesta a las señales de CD43 (Fig. 21), lo que sugiere que CD43 podría jugar un papel importante en coordinar las señales de activación con las demandas metabólicas de los linfocitos T. Será interesante evaluar si el aumento moderado en la ingesta de glucosa observado en células estimuladas a través de CD43 es dependiente de la vía de PI3K/Akt/mTOR y si esta vía regula también la activación de blancos de la vía de ERK5 como c-Myc y Bad, que favorecen la sobrevida. Cuando la célula no recibe señales extrínsecas suficientes para favorecer el metabolismo, la incapacidad de mantener el metabolismo para cumplir con las demandas celulares 80 induce la activación de vías de respuesta a estrés, algunas de las cuales llevan a la activación de las proteínas pro-apoptóticas de la familia de Bcl-2. La proteína pro- apoptótica Bim juega un papel esencial en la eliminación de timocitos y linfocitos B autorreactivos, así como durante la contracción de la respuesta y en la muerte inducida por la escasez de factores de crecimiento. Sin embargo, a pesar de la inducción de Bim, la expresión de Glut-1 puede proteger a las células de sufrir apoptosis por privación de factores de crecimiento [Revisado en [38]. Los datos preliminares que mostramos indican que en presencia de albúmina sérica humana (HSA), uno de los ligandos de CD43, las células tienen mayor viabilidad después de permanecer en cultivo en presencia o ausencia de PMA/ionomicina, comparado con células cultivadas sin HSA (Fig. 20), lo que sugiere que, en la circulación, la estimulación tónica de los linfocitos T a través de la interacción de CD43 con la albúmina de la sangre, podría proveer señales basales de sobrevida para los linfocitos en reposo o activados. En un futuro, será necesario evaluar el balance de proteínas pro y anti-apoptóticas en células estimuladas a través de CD43, ya sea mediante el uso de anticuerpos, o con HSA, en conjunto con un estímulo fuerte como PMA/ionomicina. Ante un estímulo, las señales de CD43 podrían favorecer la viabilidad de las células previniendo la muerte autónoma de células activadas (ACAD, del inglés Activated T Cell Autonomous Death), posiblemente al promover la estabilidad de proteínas anti-apoptóticas de la familia de Bcl-2 como Mcl-1, así como la inactivación de proteínas pro-apoptóticas como Bad [Revisado en [229]]. El incremento en la sobrevida en respuesta a las señales de CD43 cobra importancia no solo durante el desarrollo de una respuesta inmune, donde sería interesante distinguir si las células que sobreviven se diferenciarán en el futuro hacia células de memoria, sino también en el contexto de enfermedades autoinmunes y cáncer. La expresión de CD43 se ha descrito en varios tipos de linfomas [Revisado en [123]], así como en células tumorales de origen no linfoide [Revisado en [150]]. En un linfoma de células B, la expresión de CD43 promovió la sobrevida y la proliferación de las células tumorales [165]. De hecho, dado que la expresión de CD43 en linfocitos B está limitada a etapas tempranas del desarrollo o durante la activación de linfocitos B, la expresión de CD43 en linfomas de células B representa un mal pronóstico para el curso de la enfermedad [230, 231]. Se sabe que la sobreexpresión de CD43 en tumores de origen no hematopoyético que son deficientes de los genes supresores de tumores p53 y ARF protege a las células de muerte inducida por FAS [232]. Resultará interesante evaluar la sobrevida en otras líneas celulares que expresan CD43, así como en líneas en las que esta molécula ha sido silenciada o cuya región intracelular ha sido eliminada. Por lo tanto, comprender los mecanismos de señalización de CD43, y en este caso la activación de funciones alternas de PKM2 en respuesta a las señales de CD43, resultan relevantes para la identificación de blancos terapéuticos en el tratamiento de diferentes tumores. Finalmente, será interesante 81 evaluar los niveles de expresión de CD43 en linfocitos senescentes (CD28 -) que, entre otros aspectos, se caracterizan por aumentar la producción de citocinas pro-inflamatorias [Revisado en [233]], y por lo tanto se han relacionado con la aparición de padecimientos autoinmunes [234-237] y con una resistencia a sufrir apoptosis [238]. Cabe la posibilidad de que la resistencia a apoptosis y la co-estimulación que llevan a estas células a producir citocinas pro-inflamatorias, responsables de propagar el daño en enfermedades autoinmunes, surja como consecuencia de las señales generadas por CD43, la cual se expresa en niveles elevados en linfocitos senescentes [Revisado en [239]]. 82 VII. CONCLUSIÓN 83 CONCLUSIÓN La regulación del metabolismo no sólo modula la activación y la respuesta efectora, sino que también determina el tiempo de vida de los linfocitos. A lo largo de la vida de los linfocitos, la susceptibilidad de estas células para morir por apoptosis varía de acuerdo a su estadio de desarrollo, así como a las señales que reciben a través de receptores en la membrana que funcionan como sensores del medio que las rodea. Entre estas señales destacan las generadas por moléculas co-estimuladoras. En este trabajo mostramos que las señales co-estimuladoras de CD43, en conjunto con las del TCR, regulan la expresión de múltiples proteínas involucradas en diferentes funciones biológicas. El estudio proteómico señaló cambios en la abundancia de proteínas metabólicas en respuesta al entrecruzamiento del TCR y CD43, una función que hasta el momento era desconocida para CD43. Aunque la regulación del metabolismo de glucosa fue moderada, se detectó un aumento en la translocación hacia la superficie celular del transportador de glucosa Glut-1 de manera dependiente de las vías de Akt y mTOR. En congruencia con estos datos, el tratamiento de los linfocitos con HSA, uno de los ligandos naturales de CD43 que se encuentra en altas concentraciones en la sangre, también indujo la activación de la vía de Akt y mTOR, así como un aumento en la viabilidad celular. Asimismo, la sola expresión de CD43 en células del hibridoma murino BY 155.16 redujo el número de células muertas en respuesta a diferentes estímulos de activación, y para ello requiere de la región intracelular. Estos datos sugieren que las señales de CD43 podrían proveer a los linfocitos de un nivel metabólico basal que les permita mantener su viabilidad durante etapas de quiescencia, así como prepararlos para el aumento en la tasa anabólica que surge como consecuencia de la activación. Además de la activación de las vías de Akt y mTOR, en este trabajo también describimos la inducción de nuevas vías de señalización en respuesta a las señales del TCR y CD43. La regulación moderada que se observó en la actividad glicolítica de la PKM2 se debe a que las señales de CD43, en conjunto con las del TCR, promueven una función alterna de esta enzima que le confiere propiedades como cinasa de proteínas cuando es fosforilada en la Y105. En consecuencia, se indujo la activación de Stat3 y de la MAP cinasa ERK5, teniendo como blancos importantes para la regulación de la sobrevida a proteínas como CREB y Bad. En conjunto, nuestros resultados recalcan la importancia de las señales co- estimuladoras de CD43 en la regulación de la sobrevida por medio de la modulación de la actividad de proteínas metabólicas. Este punto cobra mayor importancia en el desarrollo de enfermedades autoinmunes o cáncer, donde modular la respuesta inmune se vuelve un elemento esencial para la elaboración de nuevas drogas y el diseño de nuevos tratamientos. 84 VIII. REFERENCIAS 85 REFERENCIAS 1. Abbas , L.A., Pober JS, Inmunología Celular y Molecular. 4a ed. 2002, España: McGraw-Hill. 2. Thaiss, C.A., et al., Integration of Innate Immune Signaling. Trends Immunol, 2016. 37(2): p. 84-101. 3. Kindt TJ, G.R., Osborne BA, Kuby Immunology. 7th ed. 2007, USA: W. H. Freeman and Company. 4. Medzhitov, R. and C.A. Janeway, Decoding the Patterns of Self and Nonself by the Innate Immune System. Science, 2002. 296(5566): p. 298-300. 5. Netea, M.G., et al., Innate immune memory: a paradigm shift in understanding host defense. Nat Immunol, 2015. 16(7): p. 675-679. 6. Valles, P.G., et al., Acute kidney injury: what part do toll-like receptors play? Int J Nephrol Renovasc Dis, 2014. 7: p. 241-51. 7. 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ANEXOS 98 En esta sección se incluyen documentos que complementan la información referida en esta tesis: Anexo 1. Materiales y Métodos utilizados para los experimentos mostrados en el Capítulo V de Resultados No Publicados. Anexo 2. Revisión de CD43 que fue publicada en 2012 en Encylopedia of Signaling Molecules [123]. Anexo 3. Lista de proteínas identificadas por spot en el análisis proteómico. Anexo 4. Lista total de proteínas identificadas y número de acceso de Uniprot. Anexo 5. Resultados del análisis bioinformático utilizando la herramienta DAVID para identificar procesos biológicos enriquecidos. Anexo 6. Resultados del análisis bioinformático utilizando la herramienta STRING para identificar procesos biológicos enriquecidos. Anexo 7. Resultados del análisis bioinformático utilizando la herramienta STRING para identificar vías enriquecidas. 99 Anexo 1. Materiales y Métodos Reactivos El Ficoll (Lymphoprep) para la separación de células mononucleares se obtuvo de Axis- Shield PoC AS. El kit “Human Pan T Cell Isolation Kit” para la purificación de linfocitos T fue de Miltenyi Biotech. El anticuerpo anti-ratón acoplado a partículas magnéticas fue de Polyosciences, Inc. Los medios de cultivo RPMI (HyClone) o Advanced RPMI (Gibco) se suplementaron con la cantidad indicada de suero fetal bovino (FBS) (Gibco), penicilina (Sigma) 50 U/mL, estreptomicina (Sigma) 50 μg/mL, glutamina (Gibco) 2 mM y beta- mercaptoethanol (Sigma) 50 μM. Los anticuerpos anti-CD3 humano (OKT3) [240], anti-CD3 murino (F23.1) [241] y anti-CD8 humano (OKT8) se purificaron en el laboratorio. El anticuerpo anti-CD43 (L10) [205] se purificó en el laboratorio o se compró de Caltag. El anticuerpo anti-CD28 (CD28.2) [242] fue de Biolegend. Los anticuerpos primarios anti- pERK1/2, -Akt, -ERK2, -Glut1 (H-43), -actina fueron de Santa Cruz Biotechnology; anti- Mcl1, -pAkt, -fosfo sustratos de Akt fueron de Cell Signaling Technology. El anticuerpo biotinilado anti-conejo fue de Southern Biotech y la estreptavidina conjugada con ficoeritrina (PE) fue de Molecular Probes. Los anticuerpos secundarios acoplados a HRP fueron de Santa Cruz Biotechnology. Los inhibidores LY294004 y Rapamicina fueron de Calbiochem. La albúmina sérica humana delipidada (HSA) fue de Sigma. Para el análisis proteómico se utilizaron el kit “ReadyPrep 2D Cleanup Kit”, “Bio-Lyte 3-10 ampholytes”, y las tiras “Ready Strip IPG strips” (17 cm, linear pH 3-10) de BioRad. El Kit “CyDye DIGE Fluor Minimal Labelling Kit” fue de GE Healthcare. Para el análisis metabólico se utilizaron membranas con glucosa oxidasa o L-lactato oxidasa inmobilizadas (YSI Incorporated). Para evaluar el metabolismo/viabilidad celular se utilizó MTT (Sigma). La viabilidad se midió con el “Fixable Viability Dye eFluor 780” de eBioscience, yoduro de propidio (Sigma) o Annexina V acoplada a FITC (Caltag). Células Los linfocitos T humanos de sangre periférica se purificaron a partir de concentrados leucocitarios que fueron donados por el Banco de Sangre del Hospital Regional del IMSS y el Centro Regional para la Transfusión Sanguínea en Cuernavaca, Morelos, México. Las células mononucleares se separaron mediante un gradiente de Ficoll. Posteriormente, los linfocitos T se purificaron por selección negativa utilizando el kit “Human Pan T Cell Isolation Kit”. Finalmente, los linfocitos CD4+ se obtuvieron por selección negativa incubando a las células con un anticuerpo anti-CD8 (OKT8), seguida de una incubación con 100 un anticuerpo anti-ratón unido a partículas magnéticas para capturar las células CD8+. La pureza de las células se determinó por citometría de flujo (≥ 90%). Antes de ser estimuladas, las células se arrestaron durante una noche con RPMI suplementado con 2% de suero fetal bovino (FBS), glutamina 2 mM, penicilina 50 U/mL, estreptomicina 50 µg/mL y beta-mercaptoetanol 50 µM. Los procedimientos fueron aprobados por el comité de Bioética local. Activación celular Las células se activaron con anticuerpos anti-TCR (OKT3), anti-CD43 (L10 [205], MEM59 [204] o DFT1 [203]) o anti-CD28 (CD28.2), y se entrecruzaron con anticuerpos secundarios clase específicos (anti-IgG1 para anti-CD43 y anti-CD28, y anti- IgG2 para anti-TCR). Todos los anticuerpos se usaron a 2µg/mL. Para los ensayos de viabilidad se usó como control positivo la estimulación con PMA/ionomicina en altas concentraciones (250 ng/mL/2.5 µM) para inducir muerte celular. Se utilizó albúmina sérica humana (HSA) delipidada a 10 mg/mL disuelta en PBS. Las activaciones se realizaron durante diferentes períodos de tiempo a 37°C y en los casos indicados, las células se pre-incubaron con inhibidores específicos de PI3K (LY294002, 10 µM) o mTOR (rapamicina, 50 nM) 30 minutos antes de la estimulación con anticuerpos. 2D-DIGE y análisis proteómico Los linfocitos T CD4+ (15 X 106) de sangre periférica se estimularon como se describe en “Activación celular” y se lisaron en Hepes 25 mM pH 7.5, Triton X-100 0.5%, MgCl2 1.5 mM, NaCl 150 mM, EDTA 0.2 mM, con inhibidores de proteasas (PMSF 1 mM, BGP 10 mM, NaF 10 mM, NaVO4 200 μM, leupeptina 1 μg/mL, antipaina 50 μg/mL, aprotinina 10 μg/mL, DTT 0.5 mM). Los lisados se centrifugaron a 18,000 g por 15 min a 4°C y el sobrenadante se congeló a -70°C. Se eliminaron las sales en 75 μg de proteína de cada muestra con el “ReadyPrep 2D Cleanup kit” (BioRad) siguiendo las instrucciones del fabricante y el pellet de proteína se resuspendió en buffer de marcaje (Tris-HCl 30 mM pH 8.5, urea 7M, thiourea 2M, CHAPS 2%, ASB-14 2%) para la preparación de las muestras para 2D-DIGE. Esta técnica permite la comparación de dos muestras diferentes dentro de un mismo gel; mas aún, con el uso de un control interno en cada gel, el cual está formado por cantidades iguales de proteína de todas las muestras que se incluyen en los geles, es posible comparar los mismos spots en geles diferentes [243]. 101 Las muestras de tres experimentos independientes se marcaron con los fluoróforos CyDye (Cy2, Cy3, or Cy5) siguiendo el protocolo para marcaje mínimo proporcionado por el fabricante (GE Healthcare Life Sciences). Posteriormente, a cada reacción se agregaron volúmenes iguales de buffer de rehidratación con DTT 2X y anfolitos (urea 7 M, thiourea 2 M, ASB-14 2%, CHAPS 2%, DTT 100 mM, anfolitos 1% Bio-Lyte 3-10). Las muestras destinadas a cada gel y marcadas con los tres fluoróforos se mezclaron y se llevaron a un volumen final de 300 μL con buffer de rehidratación 1X. Las muestras de proteínas marcadas se colocaron en una celda para isoelectroenfoque Protean IEF (BioRad), las tiras Ready Strip IPG (17 cm, pH linear 3-10) se colocaron sobre las muestras y se cubrieron con 2 ml de aceite mineral para una rehidratación activa a 50V y 20°C durante toda la noche. Al finalizar la rehidratación, el isoelectroenfoque (IEF) se llevó a cabo con un protocolo de rampas en tres pasos para un total de 40,000 volt h a 20°C y una corriente máxima de 50 μA por tira. Después del IEF, las tiras se equilibraron por 15 min en buffer de equilibrio con DTT (urea 6 M, Tris-HCl 0.375 M pH 8.8, SDS 2%, glicerol 20% y DTT 2%), seguido de 15 minutos de incubación en buffer de equilibrio con iodoacetamida (urea 6 M, Tris-HCl 0.375 M pH 8.8, SDS 2%, glicerol 20% y iodoacetamida 2.5%). Las tiras se colocaron sobre geles de poliacrilamida al 10% montados entre placas de cristal de baja fluorescencia. Para la electrophoresis (SDS-PAGE) se utilizó el Sistema Ettan Daltsix (GE Healthcare Life Sciences) a 10 mA/gel por 1 h, seguido de 12 mA/gel para un total de 17-20 h a 25°C. Los geles individuales se escanearon con un Typhoon Variable Mode TM 9410 Imager (GE Healthcare Life Sciences) para obtener las imágenes de cada uno de los fluoróforos. El análisis de las imágenes se realizó con el software DeCyder 2D Software V6.5, siguiendo las instrucciones del fabricante (GE Healthcare Life Sciences). Las proteínas de interés se extrajeron con un robot Ettan Spot Picker (GE Healthcare Life Sciences). La identificación de proteínas se llevó a cabo en la “Proteomics Discovery Platform”, Institut de Recherches Cliniques de Montréal, IRCM, Montréal, Canadá. El software Scaffold 4.2.1 se usó para validar las proteínas identificadas por MS/MS. Se consideraron correctas aquellas identificaciones que cumplieron con los siguientes criterios: 1) tener una probabilidad mayor a 99.0%, 2) contener al menos dos péptidos únicos, y 3) el peso molecular esperado coincide con el peso molecular observado en los geles. Se hizo una base de datos con los números de acceso de UniProt de las proteínas identificadas (Anexo 4). Se hizo un análisis funcional en el sitio NIAID DAVID (david.abcc.ncifcrf.gov) utilizando la herramienta “Functional Annotational Clustering Tool” para agrupar a las proteínas de acuerdo a los términos asignados por Gene Ontology (GO) para proceso biológico. Sólo se consideraron los grupos con un valor de enriquecimiento ≥1.3 (Anexo 5). El análisis de interacción entre proteínas se hizo con la base de datos STRING (http://string-db.org/) utilizando el valor máximo de confidencia 102 para el puntaje de interacción requerido (0.900). Los resultados de los procesos biológicos enriquecidos y las vías enriquecidas (Kegg pathways) se muestran en los Anexos 6 y 7, respectivamente. Evaluación del metabolismo de glucosa Linfocitos T CD4+ de sangre periférica se estimularon durante 48 h en RPMI suplementado con 10% FBS como se describe en “Activación celular”. La concentración de glucosa y lactato en el sobrenadante de las células estimuladas se midió con un analizador enzimático (YSI Lifesciences). El sobrenadante de cultivo pasa a través de una membrana con glucosa oxidasa o L-lactato oxidasa (YSI Incorporated) inmovilizadas entre dos capas, una de policarbonato y la otra de acetato de celulosa. La muestra pasa primero por la capa de policarbonato, la cual limita la difusión del sustrato hacia la membrana con la enzima inmovilizada, donde se oxida y como consecuencia se produce peróxido de hidrógeno. El peróxido atraviesa la capa de acetato de celulosa, la cual sólo permite el paso de moléculas pequeñas y por lo tanto elimina compuestos electroquímicos activos, hacia un electrodo de platino, donde es oxidado. La corriente resultante es proporcional a la concentración del sustrato. Expresión de Glut-1 Linfocitos T CD4+ (2 X 106) se activaron como se describe en “Activación celular”. La expresión de Glut-1 en la membrana se evaluó por citometría de flujo con un anticuerpo anti-Glut-1 (H-43), y un anticuerpo secundario biotinilado y agregando estreptavidina acoplada a ficoeritrina (PE). La intensidad de fluorescencia se evaluó utilizando un citómetro FACSCanto II, la adquisición y el análisis de los datos se hizo con el software FACS Diva o FlowJo. Viabilidad La muerte celular se cuantificó con diferentes métodos que permiten medir los cambios que sufren las células al entrar en procesos de muerte. Para los ensayos de citometría, se utilizó un citómetro FACSCanto II para la adquisición y los datos se analizaron con el software FlowJo. 103 a) El tetrazolio amarillo MTT (bromuro de 3-(4, 5-dimetiltiazolil-2)-2, 5- difeniltetrazolio) es reducido por las células metabólicamente activas, debido a la acción de deshidrogenasas, generando equivalentes como el NADH y el NADPH. Como resultado se obtiene formazan de color morado que puede ser solubilizado y cuantificado midiendo la absorbancia con un espectrofotómetro. De esta manera se considera que la intensidad del color obtenido es proporcional al número de células vivas [244]. Para realizar los ensayos, se utilizaron 5x104 células por condición en 200 μL de RPMI con 10% FBS, por triplicado. Se agregó el estímulo (HSA 10 mg/mL) y se incubaron las células a 37°C durante diferentes períodos de tiempo. Al finalizar el período de incubación se agregaron 20 μL de MTT (5 mg/mL) a los pozos, manteniendo las células a 37°C durante 4 h. Posteriormente, se agregaron 20 μL de SDS al 20% en HCl 0.001 N para solubilizar los cristales de formazan y se incubó 4 horas con agitación, en la oscuridad. Finalmente, se midió la absorbancia utilizando un filtro de 570 nm. b) Se evaluó la integridad del DNA celular al finalizar la activación incubando a las células con 100 μL de una solución hipotónica (30 mg/mL Polietilenglicol 8000, 1 µg/mL PI, 18,000 U RNAse, 10% Tritón X-100, 4 mM citrato de sodio) durante 30 minutos, a 4°C en la oscuridad. Posteriormente se agregaron 100 μL de una solución hipertónica (30 mg/mL Polietilenglicol 8000, 1 µg/mL PI, 10% Tritón X- 100, 400 mM NaCl) para restablecer la isotonicidad a la solución. Finalmente, las células se analizaron por citometría de flujo para evaluar la cantidad de DNA celular como reflejo de la etapa del ciclo celular. Particularmente, se cuantificó la cantidad de células que se encontraron en fase Sub G0, la cual indica que las células han sufrido fragmentación de DNA y sugiere que podría tratarse de células apotóticas. c) Otro método para evaluar la viabilidad celular es la tinción con Anexina V, la cual se une a la fosfatidilserina que es traslocada de la cara intracelular de la membrana a la cara extracelular cuando las células entran en apoptosis [245]. Para estos ensayos, las células activadas (1 X 106 células/mL) se lavaron con PBS pH 7.4 y se resuspendieron en 100 µl de buffer para unión de Anexina (HEPES 10 mM, NaCl 140 mM, CaCl2 2.5 mM). Cada muestra se incubó con 5 μL de Anexina V-FITC durante 15 min. Finalmente se agregaron 400 µL de buffer para unión de Anexina y las muestras se analizaron inmediatamente en un citómetro de flujo. 104 Inmunoblot Las células se lisaron como se describe en “2D-DIGE y análisis proteómico”. Las proteínas fueron separadas por SDS-PAGE y transferidas a membranas de nitrocelulosa de 0.22 µm (Whatman). Las membranas se bloquearon con una solución de 3% BSA en buffer TBS-T (20 mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, pH 7.5, pH 7.5, 0.05% Tween-20). Los anticuerpos primarios se diluyeron en 3% BSA y los anticuerpos secundarios acoplados a HRP se diluyeron en una solución al 5% de leche baja en grasa en buffer TBS-T. Las proteínas se visualizaron con el sustrato Western Lighting Plus-ECL (Perkin Elmer) siguiendo las instrucciones del fabricante. Studies in both mouse and human cells from many laboratories have established that CD40 signaling pathways play a key role in mediating adaptive immune responses and are implicated in the pathogen- esis and progression of many inflammatory and auto- immune diseases, as well as malignancies. A more accurate and detailed understanding of CD40- mediating molecular signaling may offer many new molecular targets for the development of new vaccines and new molecular therapies for the treatment of immune-mediated disorders. However, much remains to be learned, including how CD40 regulates transcrip- tional activation of a variety of genes. Other questions include the specific contributions of each of the known TRAFs and the specific mechanisms mediating their regulatory interactions with CD40. TRAFs can initiate signaling cascade via directly interacting with recep- tors, or alternatively, with intracellular signaling pro- teins to regulate downstream pathways. The activities of the TRAF proteins involved in CD40 signaling are, as yet, only partially defined. It is also quite likely that additional signaling molecules both directly and indi- rectly associate with the CY domain of CD40; CD40- mediated signaling cascades can also interact with other receptors’ signaling pathways. Addressing these questions will elucidate CD40 functions and also pro- vide important principles governing the regulation of signaling by other TRAF-utilizing receptors. References Baccam M, Woo SY, Vinson C, Bishop GA. CD40-mediated transcriptional regulation of the IL-6 gene in B lymphocytes: involvement of NF-kappa B, AP-1, and C/EBP. J Immunol. 2003;170:3099–108. Bishop GA. Themultifaceted roles of TRAFs in the regulation of B-cell function. Nat Rev Immunol. 2004;4:775–86. Bishop GA, editor. The many faces of CD40: multiple roles in normal immunity and disease. Sem Immunol. 2009;21: 255–312. Bishop GA, Hostager BS. Molecular mechanisms of CD40 sig- naling. 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However, recent advances in the field, evidence that CD43 is present in non-lymphoid tissues, particularly tumor cells. Here we reviewed the most important features about this molecule, highlighting the recent advances that have contributed to our understanding of the roles of CD43. Gene Expression and Protein Structure CD43 is a type I cell surface glycoprotein abundantly expressed on almost all hematopoietic cells, except for erythrocytes and resting B cells. Although initially considered an immune cell molecule, recent reports evidence a much broader distribution, as epithelial cells, and a range of tumors of epithelial origin are CD43 positive. Expression of CD43 has also been documented in the normal brain and in the uterus. The gene encoding human CD43 is located in chromo- some 16; it has two transcription initiation sites and it is composed of two exons and a single intron within the untranslated 50 region, although the entire protein is encoded only by the second exon. Alternative polyadenylation signals generate two mRNAs that dif- fer from each other in the length of the 30 untranslated region (Pallant et al. 1989). CD43 is a bulky and extended cell surface mucin that protrudes 45 nm from the cell surface. Its 239 amino acids long extracellular domain comprises five tandem repeats of 18 amino acids each (116Ile–205Ser), rich in serines and threonines modified by O-GalNAc glycosylation. As a result of the timely controlled activity of core 2 b- 1,6-N-acetylglucosaminyltransferase (C2GnT), two isoforms of CD43 that define cell interaction affinities and functional cell states have been characterized. A 115 kDa isoform is expressed preferentially in thymocytes, resting CD4 T lymphocytes and mono- cytes, and a 130 kDa isoform is detected in resting CD8, CD4 activated T lymphocytes, neutrophils, plate- lets, B lymphocytes and macrophages, as well as tumor cells. The lowmolecular isoform contains almost exclu- sively the tetrasaccharide NeuAc(a2-3)-Gal(b1-3) [(NeuAc(a2-6)]GalNAc (Core1) and the high mole- cular isoform exhibits mainly the branched hexasaccharide NeuAc(a2-3)-Gal(b1-3[NeuAc(a2-3) Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)]Gal-NAc (Core2) (Fukuda 2002). The intracellular domain has 123 amino acids with a highly conserved sequence among primates, mouse, and rat; it includes different motifs (Fig. 1) that allow CD43 to participate in different signaling path- ways, supporting a functional role for this molecule. CD43 Expression is Tightly Controlled The levels and relative abundance of CD43 on the cell surface are controlled through several mechanisms: expression regulation, molecular density, or processing, evidencing a regulatory role for CD43 in cell function. Aside from a tissue-specific gene transcription reg- ulation, the relative abundance of CD43 at a specific location of the cell membrane is tightly controlled. As T lymphocytes and neutrophils migrate to inflamma- tory lesions, CD43, together with PSGL-1, ICAM-3 and CD44, moves from the leading edge to the rear end (uropod) of the cell through its association with mem- bers of the ERM family of molecules, while chemokine receptors relocate at the leading edge. Likewise, and through a similar mechanism, during the encounter of an antigen-specific T cell with the appropriate antigen-presenting cell, CD43 is excluded from the immunological synapse (intimate contact zone between the two cells), and relocates partially to the distal pole, where it plays a yet to define role. Interestingly, it is excluded from the inhibitor natural killer (NK) cell synapse, but not from the activating one (Reviewed in Ostberg et al. 1998; Aguilar-Delfı́n et al. 2006). In addition, CD43 expression can be regulated by proteolysis and shedding. Processing of CD43 has been described in human neutrophils, murine T lymphocytes, as well as in human carcinoma cell lines (Lopez et al. 1998; Seo and Ziltener 2009; Andersson et al. 2004). The enzymatic cleavage of CD43 by a g secretase-dependent intramembrane processing mechanism leads to the shedding of the extracellular domain, known as galactoglycoprotein and present in high concentrations in normal serum, and to the translocation of the intracytoplasmic domain to the nucleus, where it has been found to protect cells from apoptotic signals, promoting cell survival (Andersson et al. 2004; Seo and Ziltener 2009). Lastly, CD43 321 C C 106 secretion of intracellularly stored CD43 is yet another mechanism through which CD43 expression levels are regulated: following LPS exposure, the intracellular levels CD43 present in intestinal epithelial cells have been found to augment, and correlate with an impor- tant secretion of CD43 to the intestinal lumen, underscoring a role for this mucin as a defense mech- anism against infection in the intestinal epithelium (Amano et al. 2001). A Multifunctional Protein The abundance of CD43, its elongated structure, and the sequence homology of its intracytoplasmic domain between species indicate that this molecule transduces information from the cell surface to the intracellular milieu in order to modulate the decisions of the cell. In line with the fact that CD43 has been found to partner with a seemingly ever-growing list of membrane CD43, Fig. 1 Multiple alignment of the intracellular region of CD43. Sequences are the reported on NCBI or were obtained by a BLAST analysis and picking the hits with at least 80% identity. The Pan troglodytes, Pongo abelii, Rattus novergicus, Canis familiaris, Callithrix jacchus and Equus caballus sequences are computational predictions. Two binding sites for ERM fam- ily proteins (ezrin, radixin, moesin) are highly conserved between species (blue letters, aminoacids 1–20 and 61–77). Two nuclear localization signals (NLS, yellow-shaded residues), comprising residues 5–19 and 61–75 of the intracellular domain respectively, overlap with the ERM binding domains. Potential phosphorylation sites are also located within the NLS and ERM binding regions. Serine/threonine residues experimentally con- firmed to be phosphorylated in human, and well conserved, are marked with a “#” symbol. Red colored letters represent predicted cAMP- and cGMP-dependent protein kinase phos- phorylation sites (residues 5–8 and 71–74). Pink letters and purple shaded letters tag predicted Protein kinase C phosphory- lation pattern sites (residues 59–61 and 91–93). Between the two ERM binding domains, potential casein kinase II phosphoryla- tion sites are predicted (brown shaded letters, residues 44–47, and 45–48 in Equus caballus). In addition, three potential SUMO modification consensus sequence sites (ψKXE) located close to the C terminus (orange letters) have been identified in the murine CD43 protein (residues 84–87, 92–95, 117–120, as you can see the middle one is well conserved across species). Finally, a proline rich region (green shaded letters, residues 110–115) at the C-terminus allows SH3-domain containing proteins to bind and participate in CD43 signaling pathways (Reviewed in Aguilar-Delfin et al. 2006; Seo and Ziltener 2009) C 322 CD43 107 molecules, multiple, but often opposing functions have been described for CD43. The capacity of CD43 to transduce activation signals that regulate these multiple functions relies on its intracytoplasmic domain. Depending on the cell, and most probably on the ligand it encounters, CD43 must activate different signaling pathways that ultimately fine-tune the decision-making process of the cell, although little is known about this. The net negative charge of CD43, resulting from the elevated glycosylation and sialic acid content, led to first propose that the role of this abundantly expressed cell surface mucin was to provide the cells with a repulsive force to limit cell contacts. Further attempts to under- stand the role of CD43 have been undertaken in vivo, with the CD43/ mice, in different disease models where T lymphocytes are pivotal. In a model of vaccinia virus infection, despite the fact that CD8-dependent cytotoxic response is more robust in the knockout mice, viral clearance is less efficient in these mice as compared to wild-type animals (Manjunath et al. 1995). Likewise, infiltration of naı̈ve CD8+ T cells to the brain following intracranial infection with Lymphocytic Choriomeningitis Virus (LCMV) is impaired in CD43/ mice, resulting in prolonged survival of the animals. In an experimental model of autoimmune encephalomyelitis (EAE), CD43/ mice have a lower incidence rate of the disease and milder symptoms due to a defective migratory capacity of antigen-specific CD4 T cells to the central nervous system. In addition, and consistent with a reduced inflammation, these ani- mals have higher levels of IL-4 rather than of IFNg. The LCMVmodel also provides evidence that, in addition to regulate the migration of T lymphocytes, CD43 partic- ipates in the contraction phase of the response, as anti- gen-specific CD8+ T cells numbers remain higher in the knockout mice, due to enhanced levels of ▶Bcl-2 and hence decreased apoptosis (Onami et al. 2002; Ford et al. 2003). Altogether, these results highlight a positive role of CD43 in regulating the migration of naı̈ve T cells to inflammation sites, and in regulating cell number and homeostasis. This in turn determines the development and the outcome of the disease and corre- lates with the fact that anti-CD43 antibodies prevent the migration of T cells to pancreatic islands, and the devel- opment of diabetes (Johnson et al. 1999). However, all these studies were done in the mixed background BL6.129, and care should be taken in the interpretation of the data, as amixed genetic background can influence the outcome of the experiments. Also, it should be taken into account that these animals are completely deficient for CD43. It will be interesting to valuate the function of this mucin in mice where CD43 deficiency is limited to a specific cell type. In addition to interact with cytoskeletal elements and to participate in directing cell migration, CD43 regulates cell–cell interactions and activation (Fig. 2). In vitro, CD43 engagement has been shown to induce homotypic cell adhesion, dendritic cell maturation, monocyte respiratory burst, increased T and B cell proliferation, and cytokine and chemokine secretion in NK cells, mast cells, dendritic cells, and T cells. CD43 engagement can induce apoptosis of Jurkat T cells and bone marrow cells; however, constitutive expression of CD43 in B cells promotes cell survival. Only expressed on a small proportion of naive B cells, CD43 expression is upregulated upon stimulation through the BCR or pokeweed mitogen and it contrib- utes to cell proliferation; moreover, forced expression of CD43 was shown to inhibit B cell G1 arrest, extending B cell survival. Consistent with the fact that expression of CD43 on B cell lymphomas corre- lates with a bad prognosis, uncontrolled proliferation and enhanced survival capacity, two hallmarks of can- cer cells, are positively regulated by CD43 in B cells (Reviewed in Aguilar-Delfı́n et al. 2006 and Pedraza- Alva and Rosenstein 2007). Multiple Ligands for a Multifunctional Protein The diversity of the physiological ligands identified for CD43 evidences a dynamic role for this cell-surface mucin in regulating intercellular interactions. The fact that ICAM-1 and MHC-1 molecules have been found to act as receptors for CD43 (Reviewed in Pedraza- Alva and Rosenstein 2007), together with the recent finding that CD43 interacts with LFA-1 and CD147 in two distinct complexes (Khunkaewla et al. 2008), indi- cates that CD43 plays a role in cell–cell adhesion, in concert with, and probably regulating, other adhesion molecules. Consistent with this possibility, splenocytes and thymocytes from CD43-deficient mice exhibit enhanced homotypic adhesion to ICAM- 1 and fibronectin (Manjunath et al. 1995). Paradoxi- cally, in contrast with this anti-adhesive function, a number of anti-CD43 mAbs block homotypic cell– cell interactions or lymphoid cell binding to lymph CD43 323 C C 108 nodes and high endothelial venules (Reviewed in Ostberg et al. 1998, and in Aguilar-Delfı́n et al. 2006). Moreover, E-selectin has been found to interact with CD43, favoring neutrophil and B cell leukemia cell lines rolling, further evidencing the participation of CD43 as a pro-adhesive molecule that regulates the infiltrating ability of cells (Matsumoto et al. 2008; Nonomura et al. 2008). CD43 also interacts with Siglec-1 (sialoadhesin), a regulator of lymphoid and myeloid cell adhesion, probably consolidating physi- cal contacts between cells. On the contrary, the puta- tive association of CD43 to human serum albumin inhibits neutrophil function by limiting cell spreading as well as CD43 proteolysis by elastase (Reviewed NUCLEUS NFATAP-1 Gene transcription PKC Ca2+ IP3 ER TCR CD3 CD4 CD8 YYYY ZAP70 P ζ P P P Y Y Y P P P Y Y Y PIP2 DAG Calcineurin ERK P ERK P Ras GDP GTP MEK Cbl SHP-1 CYTOSKELETON Vav Shc Sos Grb2 PLCγ L A T P P ITK SLP76 P P NFAT NFAT P P P Shc Grb2 PLCγ L A T P P ITK SLP76 P P Lck CD43 Fyn Rac GDP GTP PIP2DAG PKC NFkB IKK IkB IkB NFkB JNK P p38 P ERK P Lck CD43 Fyn CD43, Fig. 2 The signaling pathway of CD43 has been best characterized in T cells, where it functions as a co-receptor of the TCR and its co-stimulatory function is independent of CD28 (Sperling et al. 1995). Additional to its role as a costimulatory molecule, CD43 also signals by itself. CD43 engagement in human T cells induces its association to the▶ Src family kinases Lck and Fyn, through the interaction of their SH3 domains and the proline-rich region of CD43. This then leads to the phos- phorylation of the CD3 B chain and the assembly of macromo- lecular complexes that include adaptor proteins such as Shc, Grb2, ▶ SLP-76, and the guanine exchange factor ▶Vav. These signaling complexes promote ERK MAPK activation, leading to regulation of actin cytoskeleton and a positive feed- back loop for Lck signaling as a result of an ERK-dependent serine phosphorylation of Lck, which inhibits its association to the phosphatase SHP-1. CD43 engagement also induces calcium fluxes and Protein kinase C activation, necessary for Cbl serine phosphorylation and its interaction with 14-3-3. Moreover, T cell pre-stimulation by the CD43 co-receptor molecule before TCR engagement inhibits the TCR-dependent c-Cbl tyrosine phosphorylation and interaction with the adapter molecule Crk-L and promotes Cbl-b ubiquitination and degradation in a Protein kinase C y dependent manner. The inhibition of these E3 ubiquitin ligases results in prolonged tyrosine phosphoryla- tion and delayed degradation of ▶ZAP-70 and of the CD3 B chain, leading to enhanced MAPK activation and robust T cell response. These data indicate that CD43-mediated signals lower the threshold for T cell activation by restricting the c-Cbl and Cbl-b inhibitory effects on TCR signaling (Reviewed in Pedraza-Alva and Rosenstein 2007) C 324 CD43 109 in Aguilar-Delfı́n et al. 2006). Altogether, these data support the idea that CD43 triggers signaling pathways that modulate other conventional adhesion mechanisms. In human dendritic cells, galectin-1-CD43 interac- tion primes the cells and results in cytokine production, upregulation of metalloproteases, and increasedmigra- tion, through signaling pathways that depend on cal- cium fluxes as well as on Syk and Protein kinase C activation. However, through its interaction with galectin-1, CD43 promotes T cell apoptosis, possibly by recruiting galectin-1 molecules to the cell surface and making them accessible to CD7, which is directly responsible for galectin-1-induced cell death (Hernandez et al. 2006; Fulcher et al. 2009). Interest- ingly, through the interaction of membrane nucleolin with capped CD43, macrophages recognize apoptotic cells (Miki et al. 2009). The myriad of ligands underscores a regulatory role for CD43, ultimately favoring homeostasis of the immune system. It is clear that, since most of these molecules are also ligands for other receptors, and different functions have been associated to each of them, CD43 participates in the fine-tuning of cell fate. However, information about the cellular responses and the intracellular signals that result from the interaction of CD43 with each of its ligands is very fragmentary, and this is undoubtedly a question that needs to be addressed. CD43 is a Pathogen Recognition Receptor The complex glycosylation pattern of CD43 functions as bait for multiple pathogens. During HIV infection, as a result of increased Core2 enzyme activity, more O-Core2 glycans and lactosamine residues decorate CD43, ultimately leading infected cells to apoptosis, presumably as a result of the interaction of galectin-1 with CD43 and CD45. Moreover, it was suggested that this pathway can contribute to the death of infected as well as noninfected cells, and thus to a decrease in T cell counts (Lanteri et al. 2003). What is more, the combination of CD43 and TCR-▶CD3 complex signals lowers the signaling threshold for HIV LTR- driven gene activity, promoting the activation of NFkB and ▶NFAT, ultimately favoring viral replication (Reviewed in Pedraza-Alva and Rosenstein 2007). In addition, the alternative glycosylation of CD43 promotes the production of autoantibodies against hyposialylated isoforms, although their role in HIV pathogenesis is not understood. Influenza A virus (IAV) was also found to interact with polymorphonuclear leukocytes through the spe- cific interaction of CD43 with the IAV hemagglutinin. In addition to lessen the oxidative burst of these cells, IAV modifies the expression level of adhesion-related molecules: while it reduces that of CD43 and L- and P-selectins, it augments that of integrins CD11b and CD11c, subtly modulating the adhesive interactions of polymorphonuclear cells (Hartshorn and White 1999). It is presently not known if this is the result of the signals transduced by the CD43–hemagglutinin A interaction or if it reflects the activation of additional, CD43-independent pathways. Several pathogenic bacteria also use CD43 as a docking molecule. Recent reports have defined Cpn60.2 (Hsp65, GroEL), a molecular chaperone and an adhesin of the capsule of Mycobacterium tubercu- losis as a ligand for CD43 (Hickey et al. 2010). This is consistent with the fact that, on macrophages, CD43 was previously identified as a receptor forM. tubercu- losis, taking part in bacillus uptake and limiting its intracellular growth through the production of TNF a (Fratazzi et al. 2000). Streptococcus gordonii, the causative agent of infective endocarditis, has also been found to specifically interact with CD43 through Has, another adhesin (Ruhl et al. 2000). More recently, CD43 was reported to be the substrate of StcE, a metalloprotease that cleaves mucin-like glycoproteins, and is secreted by enterohemorrhagic Escherichia coli, the enteric pathogen that causes hemorrhagic colitis. The net balance of this proteolytic activity is the cleav- age of the extracellular domain of CD43 from neutro- phils, increased oxidative burst, but impaired neutrophil motility (Szabady et al. 2009). In addition, CD43 is a counter-receptor for the trans- sialidase of Trypanosome cruzi, the causal agent of Chagas disease. This enzyme transfers sialic acid from b-galactopyranosil donors to b-galactopyranosil accep- tors with a2–3-linkages providing the parasite with a disguise to avoid recognition by the host immune system. Furthermore, it restores the glycosylation status of CD43 to a Core1 glycans expression pattern, similar to that of resting T cells, thus compromising the T cell- dependent response, ensuring parasite replication. Inter- estingly, T. cruzi produces large amounts of an inactive and soluble form of the trans-sialidase that is also CD43 325 C C 110 recognized by CD43, although the biological signifi- cance of this is not understood presently (Freire-de- Lima et al. 2010). On non-lymphoid cells, CD43 retains the capacity to function as a pathogen recognition receptor (PRR). Together with the glycolipid GM1, CD43 has been described as a receptor for the heat-labile enterotoxin of enterotoxigenicE. coli in themicrovilli of enterocytes (Zemelman et al. 1989). Interestingly, in CaCo2 cells differentiated into enterocytes, CD43 is not exposed on the cell surface, but stored in intracellular granules from where it is released and secreted to the extracellular compartment upon exposure of the cells to bacterial lipopolysaccharides (Amano et al. 2001). Altogether, these data suggest that through the path- ogen receptor function of CD43, PAMPS initiate sig- nal transduction pathways that modulate the activation of target cells and the onset of an inflammatory response and inflammation-related diseases. A better knowledge of the specific role of CD43 in the pathogen recognition and the cell-surface association processes will provide a clue to identify key target molecules both on the pathogen and on the host’s cells. CD43 and Noninfectious Diseases: A Poorly Understood Function In addition to function as a PRR, CD43 has been associated to diverse diseases. CD43 was first described as the molecule responsible for the Wiskott-Aldrich Syndrome (WAS), an immunodefi- ciency characterized by frequent infections, skin eczema, decreased platelet numbers, and defective T-cell function (Remold-O’Donnell et al. 1984). How- ever, it was later demonstrated that this X-linked disease was caused by mutations in the gene encoding WASP, a protein involved in signal transduction from cell receptors to the actin cytoskeleton. Yet, the link between WASP and CD43 is still unclear. Although the participation of CD43 in several auto- immune diseases is documented, we are still lacking the full picture regarding the mechanisms of pathogen- esis associated to this. Decreased expression of CD43 on the cell surface of synovial fluid polymorphonu- clear cells of rheumathoid arthritis patients (Humbria et al. 1994) while an enhanced expression on the T cells infiltrating the synovium of osteoarthritis patients (Sakkas et al. 1998) have been reported. In systemic lupus erythematosus (SLE) patients, anti- CD43 and anti-galectin-1 autoantibodies, together with high levels of soluble galectin-1 were found to correlate with the time of disease evolution and low levels of complement (Montiel et al. 2010). A role for CD43 in Type I diabetes has been suggested, as preventing T cell migration and possibly that of other CD43+ cells such as monocytes and dendritic cells from bloodstream to inflammation sites (lymph nodes, pancreas, and salivary glands) with exogenous anti-CD43 antibodies, inhibits the progression of the disease (Johnson et al. 1999). Thus, reflecting the dual nature of CD43, anti-CD43 antibodies could function in two ways: favoring the inflammatory response, exacerbating the disease (SLE and arthritis), or preventing the establishment of the disease (diabetes). CD43: A New “Kid on the Block” in Tumor Development CD43 function has been mostly studied in hematopoi- etic cells and hence in an immunological context. How- ever asmentioned, thismolecule is no longer considered solely as an immune protein. It has been detected in normal and transformed tissues. In addition to hemato- poietic tumors, non-hematopoietic tumor-derived cells from breast, lung, colon, bladder, cervix, and prostate express CD43 (Reviewed in Aguilar-Delfin et al. 2006) pointing to a role for this molecule in cell transforma- tion, raising the question as to whether CD43 could be used as a marker for malignancy and prognosis. The contribution of CD43 to tumor development is slowly emerging. CD43 is expressed in approximately 30% of low-grade B-cell lymphomas and 90% of T-cell lymphomas, B-cell lymphoblastic lymphomas, and of T-cell lymphoblastic lymphomas (Leong et al. 2003). Since CD43 expression inB cells is restricted to early B- cell ontogeny and activation of peripheral B cells, expression of CD43 suggests a state of malignancy. In fact, when expressed in a CD43 murine B-cell lym- phoma, CD43 was found to provide the cells with increased viability and proliferation when cultured under serum deprivation conditions. Interestingly, expression of a CD8/CD43 chimera did not result in cell proliferation, indicating that the intracellular domain of CD43 is not sufficient to protect the cells from apoptosis and to promote cell cycle entry and, that the interaction of the extracellular domain of the C 326 CD43 111 molecule with its ligands generates intracellular signals necessary for cell survival and proliferation (Misawa et al. 1996). Accordingly, T-cell lymphomas that test positive for the expression of the c-Maf protooncogene, also express CD43 together with high levels of cyclins D1 and D2 (Murakami et al. 2007). Moreover and consistent with these findings, in the absence of the tumor suppressors ▶ p53 and/or ARF, overexpression of CD43 in a human carcinoma cell line protects the cells from FAS-mediated apoptosis, ultimately favoring cell proliferation (Kadaja et al. 2004). In addition, it is now clear that the proteolytic cleavage of the CD43 cytoplasmic domain through a regulated intramembrane proteolysis (RIP) process exposes a nuclear localization signal that promotes the translocation of the truncated protein to the nucleus, where it interacts with ▶ beta- catenin, resulting in increased expression of the c-Myc and cyclin D1 genes (Andersson et al. 2004). Further- more, CD43 was recently shown to participate in tumor cell-peritoneum interaction, through a metalloprotease- dependent mechanism activated by the interaction with ICAM-1, one of its putative ligands (Alkhamesi et al. 2007). Altogether, these data demonstrate that CD43 participates in the coordinated regulation of cell adhe- sion and cell motility as well as in the control of cell cycle entry, ultimately favoring cell transformation, tumor formation, and invasiveness. A deeper under- standing of the CD43-mediated signals involved in tumor cell proliferation or survival will be critical for the rational development of drugs aimed to reduce malignancy. Summary CD43 is a mucin that modulates the response of all cells of the immune system as well as that of other cells. Because of its elongated structure and its abundance on the cell surface, it serves as an antenna that senses the environment, and prepares the cells for future actions. CD43 signals help the cell progress toward differentiation and maturation, as it regulates cell migration and cell contact. In addition, through the interaction with its numerous physiological and pathological ligands, CD43 actively participates in the onset of an inflammatory response and of inflammation- related diseases, underscoring the possibility to consider this molecule as a potential therapeutic target. An effort should be undertaken to identify those regions of the extracellular domain that are important for ligand recognition aswell as to understand the rules that dictate selectivity of the different isoforms of CD43 for a given ligand. Unraveling the signals that follow interaction with a given ligand will help to untangle the multiple intracellular signals generated through this molecule. Understanding the role solubleCD43 is also a challenge. A better comprehension of the functions regulated by the interaction of CD43with each of its multiple ligands in different cells in diverse contexts of activation will provide a sharper picture of the roles thismolecule plays in cell physiology in different organs, under normal and pathological scenarios. References Aguilar-Delfin I, Fierro NA, Rosenstein Y. CD43. In: UCSD- nature molecule pages. 2006. doi:0.1038/mp.a000001.01. Alkhamesi NA, Roberts G, Ziprin P, Peck DH. 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Lista de proteínas identificadas por spot en el análisis proteómico Spot # GI # Protein name MW (kDa) # Unique Peptides # Unique Spectra Total Spectra % Coverage Identified Peptides 455 gi|23510338 118 14 15 23 17 (R)LQTSSVLVSGLR(G) (R)LQTSSVLVSGLR(G) (K)LVVADTR(G) (K)DNPGVVTcLDEAR(H) (R)GGIVSQVK(V) (R)GGIVSQVK(V) (K)SLVASLAEPDFVVTDFAK(F) (K)SLVASLAEPDFVVTDFAK(F) (K)SLVASLAEPDFVVTDFAK(F) (R)NEEDAAELVALAQAVNAR(A) (R)NEEDAAELVALAQAVNAR(A) (R)KLAYVAAGDLAPINAFIGGLAAQEVmK(A) (K)LAYVAAGDLAPINAFIGGLAAQEVmK(A) (R)YDGQVAVFGSDLQEK(L) (K)LKSDTAAAAVR(Q) (R)LAGTQPLEVLEAVQR(S) (R)LAGTQPLEVLEAVQR(S) (R)AAVATFLQSVQVPEFTPK(S) (R)AAVATFLQSVQVPEFTPK(S) (R)AENYDIPSADR(H) (R)AENYDIPSADR(H) (R)LDQPMTEIVSR(V) (R)LDQPMTEIVSR(V) 626 gi|10863945 83 7 7 7 12 (K)VITMFVQR(Q) (R)QVFAENKDEIALVLFGTDGTDNPLSGGDQYQNITVHR(H) (R)HIEIFTDLSSR(F) (R)YGSDIVPFSK(V) (K)SQIPLSK(I) (K)TLFPLIEAK(K) (K)ALQEKVEIK(Q) 740 gi|14603253 68 7 8 11 16 (R)LDQETAQWLR(W) (R)LIAEGNKEELRK(C) (R)LIAEGNKEELRK(C) (K)GIVISFDAR(A) (K)GIVISFDAR(A) (R)LAATTFISQGIPVYLFSDITPTPFVPFTVSHLK(L) (R)LAATTFISQGIPVYLFSDITPTPFVPFTVSHLK(L) (K)FVHTSVHGVGHSFVQSAFK(A) (K)NLSLSQQLK(A) (K)NLSLSQQLK(A) (K)YNLQPK(A) 740 gi|167614506 plastin -2 70 5 5 8 13 (K)IGNFSTDIKDSK(A) (K)IGNFSTDIKDSK(A) ubiquitin-like modifier-activating enzyme 1 X-ray repair cross-complementing protein 5 Phosphoglucomutase 2 114 (R)QFVTATDVVR(G) (R)QFVTATDVVR(G) (K)LNLAFIANLFNR(Y) (R)VNHLYSDLSDALVIFQLYEK(I) (K)ISTSLPVLDLIDAIQPGSINYDLLK(T) (K)ISTSLPVLDLIDAIQPGSINYDLLK(T) 740 gi|119580852 65 5 5 7 14 (R)DSLIFLVDASK(A) (R)DSLIFLVDASK(A) (R)ILELDQFKGQQGQK(R) (R)TFNTSTGGLLLPSDTKR(S) (R)SDSFENPVLQQHFR(N) (R)SDSFENPVLQQHFR(N) (R)LGSLVDEFKELVYPPDYNPEGK(V) 800 gi|11493459 serum albumin 57 3 4 7 6.2 (K)YLYEIAR(R) (K)YLYEIAR(R) (K)KVPQVSTPTLVEVSR(N) (K)KVPQVSTPTLVEVSR(N) (K)KVPQVSTPTLVEVSR(N) (K)KVPQVSTPTLVEVSR(N) (K)ccTESLVNR(R) 805 gi|189502784 61 6 6 9 14 (R)TVIIEQSWGSPK(V) (R)GYISPYFINTSK(G) (K)ISSIQSIVPALEIANAHR(K) (K)ISSIQSIVPALEIANAHR(K) (K)VGEVIVTKDDAMLLK(G) (R)VTDALNATR(A) (R)VTDALNATR(A) (R)VTDALNATR(A) (K)NAGVEGSLIVEK(I) 805 gi|11493459 serum albumin 57 5 5 8 10 (K)YLYEIAR(R) (K)YLYEIAR(R) (K)LVTDLTK(V) (K)YIcENQDSISSK(L) (K)KVPQVSTPTLVEVSR(N) (K)KVPQVSTPTLVEVSR(N) (K)ccTESLVNR(R) (K)ccTESLVNR(R) 805 gi|189428 64 4 4 4 11 (R)AISHEHSPSDLEAHFVPLVK(R) (R)LAGGDWFTSR(T) (K)VLAMSGDPNYLHR(M) (K)IGPILDNSTLQSEVKPILEK(L) 823 gi|119598292 60 17 17 26 43 (R)LDIDSPPITAR(N) (R)LDIDSPPITAR(N) (R)LDIDSPPITAR(N) (R)NTGIIcTIGPASR(S) (R)NTGIIcTIGPASR(S) X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 6 (Ku autoantigen, 70kDa) mitochondrial heat shock 60kD protein 1 phosphatase 2A regulatory subunit pyruvate kinase, muscle 115 (R)SVETLKEMIK(S) (R)LNFSHGTHEYHAETIK(N) (R)TATESFASDPILYRPVAVALDTK(G) (R)TATESFASDPILYRPVAVALDTK(G) (R)TATESFASDPILYRPVAVALDTKGPEIR(T) (K)GSGTAEVELKK(G) (K)GSGTAEVELKK(G) (K)GSGTAEVELKK(G) (K)ITLDNAYMEK(C) (K)IYVDDGLISLQVK(Q) (K)IYVDDGLISLQVK(Q) (K)KGVNLPGAAVDLPAVSEKDIQDLK(F) (K)FGVEQDVDmVFASFIR(K) (K)IISKIENHEGVR(R) (R)RFDEILEASDGIMVAR(G) (R)GDLGIEIPAEK(V) (R)GDLGIEIPAEK(V) (K)GDYPLEAVR(M) (K)GDYPLEAVR(M) (R)EAEAAIYHLQLFEELRR(L) (R)LAPITSDPTEATAVGAVEASFK(C) 823 gi|11493459 serum albumin 57 4 4 7 8.6 (K)YLYEIAR(R) (K)YIcENQDSISSK(L) (K)KVPQVSTPTLVEVSR(N) (K)KVPQVSTPTLVEVSR(N) (K)KVPQVSTPTLVEVSR(N) (K)ccTESLVNR(R) (K)ccTESLVNR(R) 832 gi|119598292 60 29 37 74 64 (R)LDIDSPPITAR(N) (R)LDIDSPPITAR(N) (R)LDIDSPPITAR(N) (R)NTGIIcTIGPASR(S) (R)NTGIIcTIGPASR(S) (R)NTGIIcTIGPASR(S) (R)SVETLKEMIK(S) (R)SVETLKEMIK(S) (R)SVETLKEMIK(S) (R)SVETLKEmIK(S) (R)LNFSHGTHEYHAETIK(N) (R)TATESFASDPILYRPVAVALDTK(G) (R)TATESFASDPILYRPVAVALDTK(G) (R)TATESFASDPILYRPVAVALDTK(G) (R)TATESFASDPILYRPVAVALDTKGPEIR(T) (R)TATESFASDPILYRPVAVALDTKGPEIR(T) (R)TATESFASDPILYRPVAVALDTKGPEIR(T) (R)TGLIKGSGTAEVELKK(G) pyruvate kinase, muscle 116 (K)GSGTAEVELK(K) (K)GSGTAEVELK(K) (K)GSGTAEVELK(K) (K)GSGTAEVELKK(G) (K)GSGTAEVELKK(G) (K)GSGTAEVELKK(G) (K)ITLDNAYMEK(C) (K)ITLDNAYMEK(C) (K)IYVDDGLISLQVK(Q) (K)IYVDDGLISLQVK(Q) (K)IYVDDGLISLQVK(Q) (K)KGVNLPGAAVDLPAVSEK(D) (K)KGVNLPGAAVDLPAVSEKDIQDLK(F) (K)KGVNLPGAAVDLPAVSEKDIQDLK(F) (K)KGVNLPGAAVDLPAVSEKDIQDLK(F) (K)KGVNLPGAAVDLPAVSEKDIQDLK(F) (K)GVNLPGAAVDLPAVSEK(D) (K)GVNLPGAAVDLPAVSEKDIQDLK(F) (K)GVNLPGAAVDLPAVSEKDIQDLK(F) (K)GVNLPGAAVDLPAVSEKDIQDLK(F) (K)FGVEQDVDMVFASFIR(K) (K)FGVEQDVDmVFASFIR(K) (K)FGVEQDVDMVFASFIR(K) (K)FGVEQDVDMVFASFIR(K) (K)FGVEQDVDMVFASFIR(K) (K)FGVEQDVDmVFASFIR(K) (K)IISKIENHEGVR(R) (K)IISKIENHEGVR(R) (R)RFDEILEASDGIMVAR(G) (R)RFDEILEASDGIMVAR(G) (R)GDLGIEIPAEK(V) (R)GDLGIEIPAEK(V) (R)GDLGIEIPAEK(V) (R)GDLGIEIPAEKVFLAQK(M) (R)GDLGIEIPAEKVFLAQK(M) (R)AGKPVIcATQMLESMIK(K) (R)AGKPVIcATQMLESMIK(K) (R)AGKPVIcATQMLESMIK(K) (R)AGKPVIcATQmLESmIK(K) (R)AGKPVIcATQmLESMIK(K) (R)AEGSDVANAVLDGADcIMLSGETAKGDYPLEAVR(M) (K)GDYPLEAVR(M) (K)GDYPLEAVR(M) (K)GDYPLEAVR(M) (R)EAEAAIYHLQLFEELRR(L) (R)EAEAAIYHLQLFEELRR(L) 117 (R)LAPITSDPTEATAVGAVEASFK(C) (R)LAPITSDPTEATAVGAVEASFK(C) (R)LAPITSDPTEATAVGAVEASFK(C) (K)ccSGAIIVLTK(S) (K)ccSGAIIVLTK(S) (K)ccSGAIIVLTK(S) (R)GIFPVLcKDPVQEAWAEDVDLR(V) (R)VNFAMNVGK(A) (R)VNFAMNVGK(A) (K)KGDVVIVLTGWRPGSGFTNTmR(V) 832 gi|4557014 catalase 60 20 21 36 50 (K)ADVLTTGAGNPVGDKLNVITVGPR(G) (K)ADVLTTGAGNPVGDKLNVITVGPR(G) (K)ADVLTTGAGNPVGDKLNVITVGPR(G) (R)GPLLVQDVVFTDEMAHFDR(E) (R)GPLLVQDVVFTDEMAHFDR(E) (R)GPLLVQDVVFTDEmAHFDR(E) (R)GPLLVQDVVFTDEMAHFDRER(I) (R)GPLLVQDVVFTDEMAHFDRER(I) (K)GAGAFGYFEVTHDITK(Y) (K)GAGAFGYFEVTHDITK(Y) (R)FSTVAGESGSADTVR(D) (R)FSTVAGESGSADTVRDPR(G) (R)FSTVAGESGSADTVRDPR(G) (K)FHYKTDQGIK(N) (K)NLSVEDAAR(L) (K)NLSVEDAAR(L) (R)LSQEDPDYGIR(D) (R)LSQEDPDYGIR(D) (K)VWPHKDYPLIPVGK(L) (K)VWPHKDYPLIPVGK(L) (R)NPVNYFAEVEQIAFDPSNmPPGIEASPDK(M) (R)LFAYPDTHR(H) (R)LGPNYLHIPVNcPYR(A) (R)LGPNYLHIPVNcPYR(A) (R)RFNTANDDNVTQVR(A) (R)FNTANDDNVTQVR(A) (R)FNTANDDNVTQVR(A) (R)AFYVNVLNEEQR(K) (R)AFYVNVLNEEQR(K) (R)AFYVNVLNEEQR(K) (R)LcENIAGHLK(D) (R)LcENIAGHLKDAQIFIQKK(A) (K)NFTEVHPDYGSHIQALLDKYNAEKPK(N) (K)NAIHTFVQSGSHLAAR(E) (K)NAIHTFVQSGSHLAAR(E) (K)NAIHTFVQSGSHLAAR(E) 118 832 gi|119594345 64 10 10 13 22 (R)VALLSGGGSGHEPAHAGFIGK(G) (K)VAGALAEAGVGLEEIAK(Q) (R)VAPAEPQEAPDSTAAGGSASK(R) (R)VAPAEPQEAPDSTAAGGSASK(R) (R)VAPAEPQEAPDSTAAGGSASKR(M) (K)EGPPPASPAQLLSK(L) (K)LSVLLLEK(M) (K)LSVLLLEK(M) (K)SPGADLLQVLTK(A) (K)SAEAAAEATKNmEAGAGR(A) (R)ASYISSAR(L) (R)LEQPDPGAVAAAAILR(A) (R)LEQPDPGAVAAAAILR(A) 832 gi|20151189 56 5 5 8 12 (-)SEAVADREDDPNFFK(M) (R)YSTDVSVDEVK(A) (R)YSTDVSVDEVK(A) (K)HGGTIPIVPTAEFQDR(I) (K)HGGTIPIVPTAEFQDR(I) (K)YNLGLDLR(T) (K)YNLGLDLR(T) (R)TAAYVNAIEK(V) 832 gi|11493459 serum albumin 57 3 3 5 6.2 (K)YLYEIAR(R) (K)KVPQVSTPTLVEVSR(N) (K)KVPQVSTPTLVEVSR(N) (K)ccTESLVNR(R) (K)ccTESLVNR(R) 832 gi|119594330 CD5 antigen 55 3 3 5 7.5 (R)VLALLcSGFQPK(V) (R)LVGGSSIcEGTVEVR(Q) (R)LVGGSSIcEGTVEVR(Q) (R)VLDAGDPTSR(G) (R)VLDAGDPTSR(G) 832 gi|11527777 64 2 2 3 3.9 (R)VFNVFcLYGNVEK(V) (R)VFNVFcLYGNVEK(V) (K)LcFSTAQHAS(-) 839 gi|119598292 60 30 44 93 61 (R)LDIDSPPITAR(N) (R)LDIDSPPITAR(N) (R)LDIDSPPITAR(N) (R)NTGIIcTIGPASR(S) (R)NTGIIcTIGPASR(S) (R)NTGIIcTIGPASR(S) (R)SVETLKEMIK(S) (R)SVETLKEMIK(S) (R)SVETLKEMIK(S) (R)SVETLKEmIK(S) (R)SVETLKEmIK(S) (R)LNFSHGTHEYHAETIK(N) pyruvate kinase, muscle dihydroxyacetone kinase 2 Glutamate Dehydrogenase heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L 119 (R)LNFSHGTHEYHAETIK(N) (R)TATESFASDPILYRPVAVALDTK(G) (R)TATESFASDPILYRPVAVALDTK(G) (R)TATESFASDPILYRPVAVALDTK(G) (R)TATESFASDPILYRPVAVALDTKGPEIR(T) (R)TATESFASDPILYRPVAVALDTKGPEIR(T) (R)TATESFASDPILYRPVAVALDTKGPEIR(T) (K)GSGTAEVELK(K) (K)GSGTAEVELK(K) (K)GSGTAEVELKK(G) (K)GSGTAEVELKK(G) (K)GSGTAEVELKK(G) (K)ITLDNAYMEK(C) (K)ITLDNAYmEK(C) (K)IYVDDGLISLQVK(Q) (K)IYVDDGLISLQVK(Q) (K)IYVDDGLISLQVK(Q) (K)KGVNLPGAAVDLPAVSEK(D) (K)KGVNLPGAAVDLPAVSEK(D) (K)KGVNLPGAAVDLPAVSEK(D) (K)KGVNLPGAAVDLPAVSEKDIQDLK(F) (K)KGVNLPGAAVDLPAVSEKDIQDLK(F) (K)KGVNLPGAAVDLPAVSEKDIQDLK(F) (K)KGVNLPGAAVDLPAVSEKDIQDLK(F) (K)GVNLPGAAVDLPAVSEK(D) (K)GVNLPGAAVDLPAVSEK(D) (K)GVNLPGAAVDLPAVSEKDIQDLK(F) (K)GVNLPGAAVDLPAVSEKDIQDLK(F) (K)GVNLPGAAVDLPAVSEKDIQDLK(F) (K)FGVEQDVDmVFASFIR(K) (K)FGVEQDVDMVFASFIR(K) (K)FGVEQDVDMVFASFIR(K) (K)FGVEQDVDmVFASFIR(K) (K)FGVEQDVDMVFASFIR(K) (K)FGVEQDVDmVFASFIR(K) (K)FGVEQDVDMVFASFIR(K) (K)FGVEQDVDmVFASFIR(K) (K)FGVEQDVDMVFASFIR(K) (K)FGVEQDVDmVFASFIR(K) (K)FGVEQDVDmVFASFIRK(A) (K)FGVEQDVDMVFASFIRK(A) (K)FGVEQDVDMVFASFIRK(A) (K)IISKIENHEGVR(R) (K)IISKIENHEGVR(R) (R)RFDEILEASDGIMVAR(G) (R)RFDEILEASDGIMVAR(G) 120 (R)RFDEILEASDGIMVAR(G) (R)RFDEILEASDGImVAR(G) (R)RFDEILEASDGIMVAR(G) (R)GDLGIEIPAEK(V) (R)GDLGIEIPAEKVFLAQK(M) (R)GDLGIEIPAEKVFLAQK(M) (R)AGKPVIcATQMLESMIK(K) (R)AGKPVIcATQmLESmIK(K) (R)AGKPVIcATQMLESMIK(K) (R)AGKPVIcATQmLESMIK(K) (R)AGKPVIcATQMLESMIK(K) (R)AGKPVIcATQMLESMIK(K) (R)AEGSDVANAVLDGADcIMLSGETAKGDYPLEAVR(M) (R)AEGSDVANAVLDGADcIMLSGETAKGDYPLEAVR(M) (K)GDYPLEAVR(M) (K)GDYPLEAVR(M) (K)GDYPLEAVR(M) (R)MQHLIAR(E) (R)EAEAAIYHLQLFEELR(R) (R)EAEAAIYHLQLFEELRR(L) (R)EAEAAIYHLQLFEELRR(L) (R)LAPITSDPTEATAVGAVEASFK(C) (R)LAPITSDPTEATAVGAVEASFK(C) (R)LAPITSDPTEATAVGAVEASFK(C) (R)LAPITSDPTEATAVGAVEASFK(C) (R)LAPITSDPTEATAVGAVEASFK(C) (K)ccSGAIIVLTK(S) (K)ccSGAIIVLTK(S) (K)ccSGAIIVLTK(S) (R)VNFAMNVGK(A) (R)VNFAMNVGK(A) (R)VNFAmNVGK(A) (R)VNFAmNVGK(A) (R)VNFAMNVGK(A) (K)KGDVVIVLTGWRPGSGFTNTmR(V) 839 gi|4757810 60 15 15 20 32 (R)ILGADTSVDLEETGR(V) (R)ILGADTSVDLEETGR(V) (R)VLSIGDGIAR(V) (R)VLSIGDGIAR(V) (R)TGAIVDVPVGEELLGR(V) (R)VVDALGNAIDGK(G) (R)VVDALGNAIDGKGPIGSK(T) (K)AVDSLVPIGR(G) (K)AVDSLVPIGR(G) (K)TSIAIDTIINQK(R) (K)TSIAIDTIINQKR(F) ATP synthase subunit alpha, mitochondrial 121 (R)STVAQLVK(R) (K)HALIIYDDLSK(Q) (K)HALIIYDDLSK(Q) (R)QMSLLLR(R) (K)GIRPAINVGLSVSR(V) (R)EVAAFAQFGSDLDAATQQLLSR(G) (K)FENAFLSHVVSQHQALLGTIR(A) (K)LKEIVTNFLAGFEA(-) (K)LKEIVTNFLAGFEA(-) 839 gi|11493459 serum albumin 57 4 4 7 8.6 (K)YLYEIAR(R) (K)YIcENQDSISSK(L) (K)YIcENQDSISSK(L) (K)KVPQVSTPTLVEVSR(N) (K)KVPQVSTPTLVEVSR(N) (K)ccTESLVNR(R) (K)ccTESLVNR(R) 853 gi|4502643 58 12 12 17 30 (R)AQAALAVNISAAR(G) (R)AQAALAVNISAAR(G) (K)DGNVLLHEMQIQHPTASLIAK(V) (K)QADLYISEGLHPR(I) (K)QADLYISEGLHPR(I) (R)IITEGFEAAKEK(A) (R)EMDRETLIDVAR(T) (K)HKSETDTSLIR(G) (R)GLVLDHGAR(H) (R)GLVLDHGAR(H) (R)KVcGDSDKGFVVINQK(G) (K)GIDPFSLDALSK(E) (R)SVTLLIK(G) (R)AQLGVQAFADALLIIPK(V) (R)AQLGVQAFADALLIIPK(V) (K)VLAQNSGFDLQETLVK(I) (K)VLAQNSGFDLQETLVK(I) 853 gi|119598292 60 8 8 9 22 (R)LDIDSPPITAR(N) (R)NTGIIcTIGPASR(S) (R)NTGIIcTIGPASR(S) (R)TATESFASDPILYRPVAVALDTK(G) (R)RFDEILEASDGIMVAR(G) (R)GDLGIEIPAEK(V) (R)EAEAAIYHLQLFEELRR(L) (R)LAPITSDPTEATAVGAVEASFK(C) (K)ccSGAIIVLTK(S) 853 gi|119594330 CD5 antigen 55 3 3 5 7.5 (R)VLALLcSGFQPK(V) (R)LVGGSSIcEGTVEVR(Q) (R)LVGGSSIcEGTVEVR(Q) (R)VLDAGDPTSR(G) T-complex protein 1 subunit zeta pyruvate kinase, muscle 122 (R)VLDAGDPTSR(G) 853 gi|11493459 serum albumin 57 2 2 3 4.8 (K)KVPQVSTPTLVEVSR(N) (K)KVPQVSTPTLVEVSR(N) (K)ccTESLVNR(R) 853 gi|119594723 62 2 2 3 3.6 (R)HLIEQDFPGMR(I) (R)HLIEQDFPGMR(I) (K)IINTPEVVR(V) 853 gi|32483399 58 2 2 2 5.5 (R)LLQTSNITK(L) (R)SVIDPVPAPVGDSHVDGAAK(S) 853 gi|189502784 61 2 2 2 7 (K)ISSIQSIVPALEIANAHR(K) (R)KPLVIIAEDVDGEALSTLVLNR(L) 862 gi|20070125 57 17 20 32 39 (R)KSNFAEALAAHK(Y) (K)LKAEGSEIR(L) (R)LAKVDATEESDLAQQYGVR(G) (K)VDATEESDLAQQYGVR(G) (K)VDATEESDLAQQYGVR(G) (R)EADDIVNWLK(K) (R)TGPAATTLPDGAAAESLVESSEVAVIGFFK(D) (R)TGPAATTLPDGAAAESLVESSEVAVIGFFKDVESDSAK(Q) (K)YQLDKDGVVLFK(K) (K)YQLDKDGVVLFK(K) (K)YQLDKDGVVLFKK(F) (K)YQLDKDGVVLFKK(F) (K)HNQLPLVIEFTEQTAPK(I) (K)HNQLPLVIEFTEQTAPK(I) (K)HNQLPLVIEFTEQTAPK(I) (K)THILLFLPK(S) (K)THILLFLPK(S) (K)ILFIFIDSDHTDNQR(I) (K)ILFIFIDSDHTDNQR(I) (K)ILFIFIDSDHTDNQR(I) (R)LITLEEEMTK(Y) (R)LITLEEEMTK(Y) (R)LITLEEEmTK(Y) (K)YKPESEELTAER(I) (K)YKPESEELTAER(I) (K)YKPESEELTAER(I) (K)YKPESEELTAER(I) (R)ITEFcHR(F) (R)ITEFcHR(F) (K)IKPHLMSQELPEDWDKQPVK(V) (K)IKPHLmSQELPEDWDKQPVK(V) (R)TVIDYNGER(T) 862 gi|220702506 54 6 6 7 15 (-)SDVLELTDDNFESR(I) (-)SDVLELTDDNFESR(I) (R)LAPEYEAAATR(L) EH-domain containing 1 serine/threonine-protein kinase PAK 2 mitochondrial heat shock 60kD protein 1 protein disulfide-isomerase precursor TapasinERP57 HETERODIMER 123 (K)YGVSGYPTLK(I) (K)IFRDGEEAGAYDGPR(T) (R)TADGIVSHLKK(Q) (R)ELSDFISYLQR(E) 862 gi|5902134 coronin-1A 51 4 4 5 10 (K)ADQcYEDVR(V) (K)ADQcYEDVR(V) (K)RGLEVNKcEIAR(F) (R)DAGPLLISLK(D) (R)AAPEASGTPSSDAVSR(L) 862 gi|11493459 serum albumin 57 2 2 4 4.8 (K)KVPQVSTPTLVEVSR(N) (K)KVPQVSTPTLVEVSR(N) (K)ccTESLVNR(R) (K)ccTESLVNR(R) 893 gi|119608775 tubulin, beta 2C 49 20 27 57 47 (R)INVYYNEATGGK(Y) (R)INVYYNEATGGK(Y) (R)INVYYNEATGGK(Y) (R)AVLVDLEPGTMDSVR(S) (R)AVLVDLEPGTMDSVR(S) (R)AVLVDLEPGTMDSVR(S) (R)SGPFGQIFRPDNFVFGQSGAGNNWAK(G) (K)GHYTEGAELVDSVLDVVR(K) (K)GHYTEGAELVDSVLDVVR(K) (K)GHYTEGAELVDSVLDVVR(K) (K)GHYTEGAELVDSVLDVVRK(E) (K)GHYTEGAELVDSVLDVVRK(E) (K)IREEYPDR(I) (R)IMNTFSVVPSPK(V) (R)IMNTFSVVPSPK(V) (R)IMNTFSVVPSPK(V) (R)ImNTFSVVPSPK(V) (R)ImNTFSVVPSPK(V) (R)FPGQLNADLR(K) (R)FPGQLNADLR(K) (R)FPGQLNADLR(K) (R)FPGQLNADLRK(L) (R)FPGQLNADLRK(L) (K)LAVNMVPFPR(L) (K)LAVNMVPFPR(L) (K)LAVNmVPFPR(L) (K)LAVNMVPFPR(L) (K)LAVNmVPFPR(L) (K)LAVNmVPFPR(L) (R)LHFFmPGFAPLTSR(G) (R)LHFFmPGFAPLTSR(G) (R)LHFFmPGFAPLTSR(G) (R)LHFFMPGFAPLTSR(G) 124 (R)LHFFMPGFAPLTSR(G) (R)LHFFmPGFAPLTSR(G) (R)LHFFMPGFAPLTSR(G) (R)YLTVAAVFR(G) (R)YLTVAAVFR(G) (R)YLTVAAVFR(G) (R)MSMKEVDEQMLNVQNK(N) (R)MSMKEVDEQMLNVQNK(N) (K)EVDEQMLNVQNK(N) (K)EVDEQMLNVQNK(N) (K)EVDEQmLNVQNK(N) (K)NSSYFVEWIPNNVK(T) (K)NSSYFVEWIPNNVK(T) (K)TAVcDIPPR(G) (K)TAVcDIPPR(G) (K)TAVcDIPPR(G) (K)TAVcDIPPRGLK(M) (K)MSATFIGNSTAIQELFKR(I) (K)mSATFIGNSTAIQELFKR(I) (R)ISEQFTAMFR(R) (R)ISEQFTAMFR(R) (R)ISEQFTAMFR(R) (R)ISEQFTAmFRR(K) (R)ISEQFTAMFRR(K) 893 gi|18088719 Tubulin, beta 50 3 4 56 43 (R)INVYYNEATGGK(Y) (R)INVYYNEATGGK(Y) (R)INVYYNEATGGK(Y) (R)AVLVDLEPGTMDSVR(S) (R)AVLVDLEPGTMDSVR(S) (R)AVLVDLEPGTMDSVR(S) (R)SGPFGQIFRPDNFVFGQSGAGNNWAK(G) (K)GHYTEGAELVDSVLDVVR(K) (K)GHYTEGAELVDSVLDVVR(K) (K)GHYTEGAELVDSVLDVVR(K) (K)GHYTEGAELVDSVLDVVRK(E) (K)GHYTEGAELVDSVLDVVRK(E) (K)IREEYPDR(I) (R)IMNTFSVVPSPK(V) (R)IMNTFSVVPSPK(V) (R)IMNTFSVVPSPK(V) (R)ImNTFSVVPSPK(V) (R)ImNTFSVVPSPK(V) (R)FPGQLNADLR(K) (R)FPGQLNADLR(K) (R)FPGQLNADLR(K) (R)FPGQLNADLRK(L) 125 (R)FPGQLNADLRK(L) (K)LAVNMVPFPR(L) (K)LAVNMVPFPR(L) (K)LAVNmVPFPR(L) (K)LAVNMVPFPR(L) (K)LAVNmVPFPR(L) (K)LAVNmVPFPR(L) (R)LHFFmPGFAPLTSR(G) (R)LHFFmPGFAPLTSR(G) (R)LHFFmPGFAPLTSR(G) (R)LHFFMPGFAPLTSR(G) (R)LHFFMPGFAPLTSR(G) (R)LHFFmPGFAPLTSR(G) (R)LHFFMPGFAPLTSR(G) (R)YLTVAAVFR(G) (R)YLTVAAVFR(G) (R)YLTVAAVFR(G) (R)MSMKEVDEQMLNVQNK(N) (R)MSMKEVDEQMLNVQNK(N) (K)EVDEQMLNVQNK(N) (K)EVDEQMLNVQNK(N) (K)EVDEQmLNVQNK(N) (K)NSSYFVEWIPNNVK(T) (K)NSSYFVEWIPNNVK(T) (K)TAVcDIPPR(G) (K)TAVcDIPPR(G) (K)TAVcDIPPR(G) (K)TAVcDIPPRGLK(M) (K)MSATFIGNSTAIQELFKR(I) (K)mSATFIGNSTAIQELFKR(I) (R)ISEQFTAMFR(R) (R)ISEQFTAMFR(R) (R)ISEQFTAMFR(R) (R)ISEQFTAmFRR(K) (R)ISEQFTAMFRR(K) 893 gi|119581533 drebrin-like 55 6 6 9 13 (R)NGPALQEAYVR(V) (K)FVLINWTGEGVNDVR(K) (K)FVLINWTGEGVNDVRK(G) (R)FQDVGPQAPVGSVYQK(T) (R)FQDVGPQAPVGSVYQK(T) (K)TNAVSEIKR(V) (K)TNAVSEIKR(V) (R)TWEQQQEVVSR(N) (R)TWEQQQEVVSR(N) 893 gi|167887751 vimentin 50 5 5 5 14 (R)TYSLGSALRPSTSR(S) (R)SLYASSPGGVYATR(S) 126 (R)QDVDNASLAR(L) (K)FADLSEAANR(N) (R)HLREYQDLLNVK(M) 893 gi|220702506 54 4 4 4 10 (-)SDVLELTDDNFESR(I) (R)LAPEYEAAATR(L) (K)YGVSGYPTLK(I) (K)IFRDGEEAGAYDGPR(T) 895 gi|220702506 54 37 46 96 69 (-)SDVLELTDDNFESR(I) (-)SDVLELTDDNFESR(I) (-)SDVLELTDDNFESR(I) (R)LAPEYEAAATR(L) (R)LAPEYEAAATR(L) (R)LAPEYEAAATR(L) (R)LKGIVPLAK(V) (R)LKGIVPLAK(V) (R)LKGIVPLAK(V) (K)YGVSGYPTLK(I) (K)YGVSGYPTLK(I) (K)YGVSGYPTLK(I) (K)IFRDGEEAGAYDGPR(T) (K)IFRDGEEAGAYDGPR(T) (K)IFRDGEEAGAYDGPR(T) (R)DGEEAGAYDGPR(T) (R)DGEEAGAYDGPR(T) (R)TADGIVSHLK(K) (R)TADGIVSHLK(K) (R)TADGIVSHLKK(Q) (R)TADGIVSHLKK(Q) (R)TADGIVSHLKK(Q) (R)TADGIVSHLKK(Q) (K)QAGPASVPLR(T) (K)QAGPASVPLRTEEEFKK(F) (K)QAGPASVPLRTEEEFKK(F) (K)KFISDKDASIVGFFDDSFSEAHSEFLK(A) (K)FISDKDASIVGFFDDSFSEAHSEFLK(A) (K)FISDKDASIVGFFDDSFSEAHSEFLK(A) (K)FISDKDASIVGFFDDSFSEAHSEFLK(A) (K)FISDKDASIVGFFDDSFSEAHSEFLK(A) (K)FISDKDASIVGFFDDSFSEAHSEFLK(A) (K)FISDKDASIVGFFDDSFSEAHSEFLK(A) (K)AASNLRDNYR(F) (K)FEDKTVAYTEQK(M) (K)FEDKTVAYTEQK(M) (K)KFIQENIFGIcPHMTEDNKDLIQGK(D) (K)FIQENIFGIcPHMTEDNKDLIQGK(D) (K)DLLIAYYDVDYEK(N) TapasinERP57 HETERODIMER TapasinERP57 HETERODIMER 127 (K)DLLIAYYDVDYEK(N) (K)DLLIAYYDVDYEK(N) (R)NRVMMVAK(K) (R)NRVMMVAK(K) (K)KFLDAGHKLNFAVASR(K) (K)KFLDAGHKLNFAVASR(K) (K)KFLDAGHKLNFAVASR(K) (K)FLDAGHKLNFAVASR(K) (K)FLDAGHKLNFAVASR(K) (K)FLDAGHKLNFAVASR(K) (K)FLDAGHKLNFAVASR(K) (K)FLDAGHKLNFAVASR(K) (K)FLDAGHKLNFAVASR(K) (K)LNFAVASRK(T) (R)KTFSHELSDFGLESTAGEIPVVAIR(T) (R)KTFSHELSDFGLESTAGEIPVVAIR(T) (R)KTFSHELSDFGLESTAGEIPVVAIR(T) (R)KTFSHELSDFGLESTAGEIPVVAIR(T) (R)KTFSHELSDFGLESTAGEIPVVAIR(T) (K)TFSHELSDFGLESTAGEIPVVAIR(T) (K)TFSHELSDFGLESTAGEIPVVAIR(T) (K)TFSHELSDFGLESTAGEIPVVAIR(T) (K)FVMQEEFSR(D) (K)FVMQEEFSR(D) (K)FVmQEEFSR(D) (K)FVmQEEFSR(D) (K)FVmQEEFSR(D) (K)FVMQEEFSRDGK(A) (K)FVMQEEFSRDGK(A) (R)FLQDYFDGNLK(R) (R)FLQDYFDGNLK(R) (R)FLQDYFDGNLKR(Y) (R)FLQDYFDGNLKR(Y) (R)FLQDYFDGNLKR(Y) (R)FLQDYFDGNLKR(Y) (R)FLQDYFDGNLKR(Y) (R)YLKSEPIPESNDGPVK(V) (R)YLKSEPIPESNDGPVK(V) (K)SEPIPESNDGPVK(V) (K)SEPIPESNDGPVK(V) (K)LSKDPNIVIAK(M) (K)LSKDPNIVIAK(M) (K)LSKDPNIVIAK(M) (K)LSKDPNIVIAK(M) (K)DPNIVIAK(M) (K)DPNIVIAK(M) 128 (K)MDATANDVPSPYEVR(G) (K)MDATANDVPSPYEVR(G) (R)GFPTIYFSPANK(K) (R)GFPTIYFSPANK(K) (R)GFPTIYFSPANK(K) (R)GFPTIYFSPANKK(L) (K)KYEGGRELSDFISYLQR(E) (R)ELSDFISYLQR(E) (R)ELSDFISYLQR(E) (R)ELSDFISYLQR(E) (R)EATNPPVIQEEKPK(K) 895 gi|112491419 Prolidase 55 9 9 16 24 (K)VPLALFALNR(Q) (K)VPLALFALNR(Q) (R)KNPAVQAGSIVVLQGGEETQR(Y) (R)KNPAVQAGSIVVLQGGEETQR(Y) (R)YcTDTGVLFR(Q) (R)YcTDTGVLFR(Q) (K)YAVDDVQYVDEIASVLTSQKPSVLLTLR(G) (K)YAVDDVQYVDEIASVLTSQKPSVLLTLR(G) (K)YAVDDVQYVDEIASVLTSQKPSVLLTLR(G) (R)GVNTDSGSVcR(E) (R)VFKTDMELEVLR(Y) (R)YTNKISSEAHR(E) (R)YTNKISSEAHR(E) (K)AVYEAVLR(S) (K)AVYEAVLR(S) (R)IDEPGLR(S) 895 gi|5902134 coronin-1A 51 8 9 12 25 (K)ADQcYEDVR(V) (K)ADQcYEDVR(V) (K)ILTTGFSR(M) (K)ILTTGFSR(M) (R)YFEITSEAPFLHYLSMFSSK(E) (R)YFEITSEAPFLHYLSmFSSK(E) (K)RGLEVNKcEIAR(F) (R)KSDLFQEDLYPPTAGPDPALTAEEWLGGR(D) (R)DAGPLLISLK(D) (R)DAGPLLISLK(D) (R)AAPEASGTPSSDAVSR(L) (K)RLDRLEETVQAK(-) 895 gi|32709 IFP53 53 6 6 7 18 (K)GIDYDKLIVR(F) (R)ATGQRPHHFLR(R) (K)DLTLDQAYSYAVENAK(D) (R)IGYPKPALLHSTFFPALQGAQTK(M) (K)ALIEVLQPLIAEHQAR(R) (K)ALIEVLQPLIAEHQAR(R) (R)KLSFDFQ(-) 129 895 gi|119583082 51 2 2 2 6.9 (R)ILSISADIETIGEILKK(I) (R)LLIHQSLAGGIIGVK(G) 895 gi|15620780 53 2 2 2 4.4 (K)TGQEIPVNVR(F) (K)TVFGVEPDLTR(E) 920 gi|2134709 52 10 10 19 31 (K)SNLENIDFK(M) (K)SNLENIDFK(M) (K)SNLENIDFK(M) (R)NALDLLLPK(L) (R)NALDLLLPK(L) (R)ASLPTLGFTHFQPAQLTTVGK(R) (R)ASLPTLGFTHFQPAQLTTVGK(R) (R)AFIITGQTYTR(K) (R)AFIITGQTYTR(K) (R)AFIITGQTYTR(K) (R)LLANLKEMEEPFEK(Q) (R)IcLAEAFLTADTILNTLQNISEGLVVYPK(V) (R)VLSQQAASVVK(Q) (R)VLSQQAASVVK(Q) (R)VLSQQAASVVK(Q) (K)QEGGDNDLIER(I) (R)FLEEEVYPLLKPYESVmK(V) (K)VKAELcL(-) (K)VKAELcL(-) 920 gi|4557317 annexin A11 51 11 11 14 27 (R)GTITDAPGFDPLRDAEVLR(K) (R)GTITDAPGFDPLRDAEVLRK(A) (K)TILALMK(T) (K)TPVLFDIYEIK(E) (R)LLISLSQGNRDESTNVDMSLAQR(D) (R)DAQELYAAGENR(L) (R)DAQELYAAGENR(L) (R)DAQELYAAGENR(L) (R)LGTDESKFNAVLcSR(S) (R)LGTDESKFNAVLcSR(S) (R)SRAHLVAVFNEYQR(M) (R)AHLVAVFNEYQR(M) (R)SETDLLDIR(S) (K)SLYHDISGDTSGDYRK(I) 920 gi|203282367 Enolase 1 47 8 9 14 25 (K)KLNVTEQEKIDK(L) (R)IGAEVYHNLK(N) (R)IGAEVYHNLK(N) (R)IGAEVYHNLK(N) (K)AGYTDKVVIGMDVAASEFFR(S) (R)YISPDQLADLYK(S) (R)YISPDQLADLYK(S) (K)ScNcLLLK(V) (K)ScNcLLLK(V) glutamate carboxypeptidase heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K adenylosuccinate lyase 130 (K)VNQIGSVTESLQAcK(L) (K)VNQIGSVTESLQAcK(L) (R)SGETEDTFIADLVVGLcTGQIK(T) (R)IEEELGSK(A) (R)IEEELGSK(A) 920 gi|119607750 49 4 4 6 15 (R)YLAADKDGNVTcER(E) (R)YLAADKDGNVTcER(E) (R)LVARPEPATGYTLEFR(S) (R)LVARPEPATGYTLEFR(S) (R)YLAPSGPSGTLK(A) (K)VGKDELFALEQScAQVVLQAANER(N) 920 gi|197692395 RuvB-like 1 50 4 4 6 11 (K)GLGLDESGLAK(Q) (K)GLGLDESGLAK(Q) (K)QAASGLVGQENAR(E) (R)AVLLAGPPGTGK(T) (R)AVLLAGPPGTGK(T) (R)YSVQLLTPANLLAK(I) 920 gi|119591135 52 3 3 5 7.2 (R)SPSPFHAVAEcR(N) (R)SPSPFHAVAEcR(N) (R)IPHLAIHLQR(N) (R)YASNAVSEALIR(E) (R)YASNAVSEALIR(E) 920 gi|425518 51 3 3 5 8.3 (K)DVLTITLTPK(V) (K)DVLTITLTPK(V) (R)VNSAAFPAPIEK(T) (R)VNSAAFPAPIEK(T) (K)APQVYTIPPPKEQmAK(D) 920 gi|197210452 52 4 4 4 12 (R)AALGPLVTGLYDVQAFK(F) (K)SGLSSPIYIDLR(G) (K)IASWADLVNAHVVPGSGVVK(G) (R)GSDIIIVGR(G) 920 gi|5902134 coronin-1A 51 4 4 4 10 (R)QVALWDTK(H) (K)RGLEVNKcEIAR(F) (R)AAPEASGTPSSDAVSR(L) (K)RLDRLEETVQAK(-) 920 gi|19923748 49 2 2 2 4.6 (K)AKPAEAPAAAAPK(A) (R)GLVVPVIR(N) 1050 gi|119574488 39 14 17 37 50 (K)SATGNSILGR(K) (K)SATGNSILGR(K) (K)SATGNSILGR(K) (R)SSSWKETELVVVDTPGIFDTEVPNAETSKEIIR(C) fascin homolog 1, actin-bundling protein aspartyl aminopeptidase anti-colorectal carcinoma heavy chain uridine monophosphate synthetase dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferase component of 2-oxoglutarate dehydrogenase complex, mitochondrial isoform 1 precursor GTPase, IMAP family member 4 131 (K)ETELVVVDTPGIFDTEVPNAETSKEIIR(C) (R)cILLTSPGPHALLLVVPLGR(Y) (R)cILLTSPGPHALLLVVPLGR(Y) (R)cILLTSPGPHALLLVVPLGR(Y) (R)SFMILIFTR(K) (R)SFMILIFTR(K) (R)SFmILIFTR(K) (R)SFmILIFTR(K) (R)SFMILIFTR(K) (R)SFmILIFTR(K) (R)KDDLGDTNLHDYLR(E) (R)KDDLGDTNLHDYLR(E) (R)KDDLGDTNLHDYLR(E) (R)EAPEDIQDLMDIFGDRYcALNNK(A) (R)EAPEDIQDLMDIFGDRYcALNNK(A) (K)ATGAEQEAQR(A) (R)AQLLGLIQR(V) (R)AQLLGLIQR(V) (R)AQLLGLIQR(V) (K)QTQAMQELHR(V) (R)IREEYEEKIR(K) (R)IREEYEEKIR(K) (R)KLEDKVEQEK(R) (R)KLEDKVEQEK(R) (R)KLEDKVEQEK(R) (R)KLEDKVEQEK(R) (K)KLAEQEAHYAVR(Q) (K)KLAEQEAHYAVR(Q) (K)KLAEQEAHYAVR(Q) (K)LAEQEAHYAVR(Q) (K)LAEQEAHYAVR(Q) (K)LAEQEAHYAVR(Q) (K)LAEQEAHYAVR(Q) 1050 gi|119609192 35 4 5 9 23 (K)LVINGNPITIFQERDPSK(I) (K)IISNAScTTNcLAPLAK(V) (K)IISNAScTTNcLAPLAK(V) (K)VIHDNFGIVEGLmTTVHAITATQK(T) (K)VIHDNFGIVEGLmTTVHAITATQK(T) (K)VIHDNFGIVEGLmTTVHAITATQK(T) (R)GALQNIIPASTGAAK(A) (R)GALQNIIPASTGAAK(A) (R)GALQNIIPASTGAAK(A) 1050 gi|5031601 41 5 5 8 18 (R)NAYVWTLK(G) (R)TWKPTLVILR(I) (R)TWKPTLVILR(I) (R)VAWVSHDSTVcLADADKK(M) glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase actin related protein 2/3 complex subunit 1B 132 (K)ASSEGGTAAGAGLDSLHK(N) (K)ASSEGGTAAGAGLDSLHK(N) (K)NSVSQISVLSGGK(A) (K)NSVSQISVLSGGK(A) 1050 gi|119600342 40 6 6 7 20 (K)GILAADESTGSIAK(R) (R)LQSIGTENTEENRR(F) (K)IGEHTPSALAIMENANVLAR(Y) (K)VLAAVYK(A) (K)VLAAVYK(A) (R)ALQASALK(A) (R)ALANSLAcQGK(Y) 1050 gi|119626277 41 2 2 5 8.2 (K)FGEVVDcTLK(L) (K)FGEVVDcTLKLDPITGR(S) (K)FGEVVDcTLKLDPITGR(S) (K)IFVGGLSPDTPEEK(I) (K)IFVGGLSPDTPEEK(I) 1050 gi|119572233 zyxin 45 3 3 4 10 (R)GPPASSPAPAPK(F) (K)FSPGAPGGSGSQPNQK(L) (K)QHPVPPPAQNQNQVR(S) (K)QHPVPPPAQNQNQVR(S) 1050 gi|18645167 annexin A2 39 4 4 4 16 (K)SALSGHLETVILGLLK(T) (K)TPAQYDASELK(A) (R)TNQELQEINR(V) (K)TDLEKDIISDTSGDFRK(L) 1050 gi|14250401 actin, beta 41 3 3 4 10 (K)AGFAGDDAPR(A) (R)VAPEEHPVLLTEAPLNPK(A) (R)VAPEEHPVLLTEAPLNPK(A) (R)GYSFTTTAER(E) 1050 gi|460771 hnRNP-E1 38 3 3 4 10 (R)INISEGNcPER(I) (R)LVVPATQcGSLIGK(G) (K)IANPVEGSSGR(Q) (K)IANPVEGSSGR(Q) 1050 gi|13786849 37 2 2 2 6.6 (R)VIGSGcNLDSAR(F) (K)VTLTSEEEAR(L) 1098 gi|5453710 30 16 21 44 64 (K)VNcLDKFWHK(A) (K)VNcLDKFWHK(A) (K)AcFHcETcK(M) (K)KPYcNAHYPK(Q) (K)KPYcNAHYPK(Q) (K)QSFTmVADTPENLR(L) (K)QSFTMVADTPENLR(L) (K)QSFTmVADTPENLR(L) (K)QSFTMVADTPENLR(L) (K)QSFTMVADTPENLR(L) (K)QSFTmVADTPENLR(L) (R)LKQQSELQSQVR(Y) L-Lactate Dehydrogenase aldolase A, fructose-bisphosphate heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D LIM and SH3 domain protein 1 133 (R)LKQQSELQSQVR(Y) (R)LKQQSELQSQVR(Y) (R)LKQQSELQSQVR(Y) (K)QQSELQSQVR(Y) (K)QQSELQSQVR(Y) (K)QQSELQSQVR(Y) (R)YKEEFEK(N) (R)YKEEFEK(N) (K)GKGFSVVADTPELQR(I) (K)GKGFSVVADTPELQR(I) (K)GKGFSVVADTPELQR(I) (K)GKGFSVVADTPELQR(I) (K)GFSVVADTPELQR(I) (K)GFSVVADTPELQR(I) (K)GFSVVADTPELQR(I) (K)TQDQISNIK(Y) (K)TQDQISNIK(Y) (K)TQDQISNIK(Y) (K)TQDQISNIKYHEEFEK(S) (K)YHEEFEK(S) (R)mGPSGGEGMEPERR(D) (R)MGPSGGEGMEPERR(D) (R)mGPSGGEGMEPERR(D) (R)mGPSGGEGMEPERR(D) (R)MGPSGGEGmEPERR(D) (R)MGPSGGEGmEPERR(D) (R)RPLEQQQPHHIPTSAPVYQQPQQQPVAQSYGGYKEPAAPVSIQR(S) (R)RPLEQQQPHHIPTSAPVYQQPQQQPVAQSYGGYKEPAAPVSIQR(S) (K)EPAAPVSIQR(S) (R)TGDTGmLPANYVEAI(-) (R)TGDTGMLPANYVEAI(-) (R)TGDTGmLPANYVEAI(-) 1098 gi|13529257 36 14 15 26 56 (K)mPILGLGTWK(S) (K)mPILGLGTWK(S) (K)SPPGQVTEAVK(V) (K)SPPGQVTEAVK(V) (K)SPPGQVTEAVK(V) (K)VAIDVGYR(H) (K)VAIDVGYR(H) (K)VAIDVGYR(H) (R)HIDcAHVYQNENEVGVAIQEK(L) (K)REELFIVSK(L) (K)REELFIVSK(L) (K)LWcTYHEK(G) (K)AIGISNFNHLQVEMILNKPGLK(Y) (K)YKPAVNQIEcHPYLTQEK(L) Aldo-keto reductase family 1, member B1 (aldose reductase) 134 (K)YKPAVNQIEcHPYLTQEK(L) (K)LIQYcQSK(G) (K)LIQYcQSK(G) (K)HNKTTAQVLIR(F) (K)HNKTTAQVLIR(F) (K)TTAQVLIRFPMQR(N) (K)TTAQVLIRFPmQR(N) (K)TTAQVLIRFPMQR(N) (R)NLVVIPK(S) (R)NLVVIPK(S) (K)VFDFELSSQDMTTLLSYNR(N) (R)VcALLScTSHKDYPFHEEF(-) 1098 gi|4506667 34 9 10 18 42 (K)SNYFLK(I) (K)SNYFLK(I) (K)IIQLLDDYPK(C) (K)IIQLLDDYPK(C) (K)IIQLLDDYPK(C) (K)cFIVGADNVGSK(Q) (R)GHLENNPALEK(L) (R)GHLENNPALEK(L) (R)GHLENNPALEK(L) (R)GHLENNPALEK(L) (R)AGAIAPcEVTVPAQNTGLGPEK(T) (K)TSFFQALGITTK(I) (K)TSFFQALGITTK(I) (R)GTIEILSDVQLIK(T) (R)GTIEILSDVQLIK(T) (R)GTIEILSDVQLIK(T) (R)NVASVcLQIGYPTVASVPHSIINGYKR(V) (R)VLALSVETDYTFPLAEKVK(A) 1098 gi|110590506 36 6 6 9 31 (R)AADcEVEQWDSDEPIPAKELER(G) (R)AADcEVEQWDSDEPIPAKELER(G) (R)GVAGAHGLLcLLSDHVDKR(I) (R)ILDAAGANLK(V) (R)ILDAAGANLK(V) (R)RLPEAIEEVK(N) (R)GDVVNQDDLYQALASGK(I) (K)IAAAGLDVTSPEPLPTNHPLLTLK(N) (K)IAAAGLDVTSPEPLPTNHPLLTLK(N) 1098 gi|5803187 transaldolase 37 5 6 9 17 (R)ILDWHVANTDKK(S) (K)SYEPLEDPGVK(S) (K)TIVMGASFR(N) (K)TIVmGASFR(N) (K)ALAGcDFLTISPK(L) (K)ALAGcDFLTISPK(L) (K)LLGELLQDNAK(L) 60S acidic ribosomal protein P0 GlyoxylateHYDROXYPYRUVATE REDUCTASE 135 (K)LLGELLQDNAK(L) (K)LLGELLQDNAK(L) 1098 gi|119620368 32 5 5 8 19 (K)VIVVGNPANTNcLTASK(S) (K)VIVVGNPANTNcLTASK(S) (K)ENFScLTR(L) (K)LGVTANDVK(N) (K)LGVTANDVK(N) (K)LGVTANDVK(N) (K)GEFVTTVQQR(G) (K)FVEGLPINDFSR(E) 1098 gi|14141157 37 4 4 8 13 (R)STGEAFVQFASK(E) (R)STGEAFVQFASK(E) (K)EIAENALGK(H) (K)EIAENALGK(H) (K)EIAENALGK(H) (R)VHIDIGADGR(A) (R)DGMDNQGGYGSVGR(M) (R)DGMDNQGGYGSVGR(M) 1098 gi|10835063 33 3 4 5 12 (K)mSVQPTVSLGGFEITPPVVLR(L) (K)mSVQPTVSLGGFEITPPVVLR(L) (K)GPSSVEDIK(A) (K)FINYVK(N) (K)FINYVK(N) 1098 gi|14043072 37 3 3 4 13 (R)GFGFVTFDDHDPVDKIVLQK(Y) (R)GGNFGFGDSR(G) (R)GGGGNFGPGPGSNFR(G) (R)GGGGNFGPGPGSNFR(G) 1098 gi|119609192 35 2 3 4 12 (K)VIHDNFGIVEGLmTTVHAITATQK(T) (K)VIHDNFGIVEGLMTTVHAITATQK(T) (R)GALQNIIPASTGAAK(A) (R)GALQNIIPASTGAAK(A) 1098 gi|118137847 36 2 2 3 8.9 (R)NcTIVSPDAGGAK(R) (K)IQVIDISmILAEAIRR(T) (K)IQVIDISmILAEAIRR(T) 1098 gi|13786847 37 2 2 3 9.6 (K)IVVVTAGVR(Q) (R)VIGSGcNLDSAR(F) (K)LKDDEVAQLKK(S) 1110 gi|119574954 34 10 12 26 33 (R)DIFNKGFGFGLVK(L) (K)GFGFGLVK(L) (K)ScSGVEFSTSGSSNTDTGK(V) (K)ScSGVEFSTSGSSNTDTGK(V) (K)ScSGVEFSTSGSSNTDTGKVTGTLETK(Y) (K)ScSGVEFSTSGSSNTDTGKVTGTLETK(Y) (K)ScSGVEFSTSGSSNTDTGKVTGTLETK(Y) (K)LTFDTTFSPNTGK(K) (K)LTFDTTFSPNTGK(K) voltage-dependent anion channel 2 malate dehydrogenase 1, NAD (soluble) heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H3 nucleophosmin isoform 1 heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Phosphoribosyl Pyrophosphate Synthetase 1 L-Lactate Dehydrogenase H Chain 136 (K)LTFDTTFSPNTGKK(S) (K)LTFDTTFSPNTGKK(S) (K)LTFDTTFSPNTGKK(S) (K)LTFDTTFSPNTGKK(S) (R)NNFAVGYR(T) (R)NNFAVGYR(T) (R)NNFAVGYR(T) (K)YQLDPTASISAK(V) (K)YQLDPTASISAK(V) (K)YQLDPTASISAK(V) (K)VNNSSLIGVGYTQTLRPGVK(L) (K)VNNSSLIGVGYTQTLRPGVK(L) (K)VNNSSLIGVGYTQTLRPGVK(L) (K)VNNSSLIGVGYTQTLRPGVK(L) (K)LTLSALVDGK(S) (K)LTLSALVDGK(S) (K)LTLSALVDGK(S) 1110 gi|18594498 34 6 6 11 20 (K)SATGNSILGQR(R) (R)LGATSVTR(A) (R)LGATSVTR(A) (R)LGATSVTR(A) (R)FTAQDQQAVR(Q) (R)FTAQDQQAVR(Q) (R)FTAQDQQAVR(Q) (R)ALRELVAEcGGR(V) (R)ELVAEcGGR(V) (R)ELVAEcGGR(V) (R)EQEAQVEQLLGMVEGLVLEHK(G) 1110 gi|119620368 32 5 5 7 20 (K)SQGAALDKYAK(K) (K)VIVVGNPANTNcLTASK(S) (K)VIVVGNPANTNcLTASK(S) (K)ENFScLTR(L) (K)LGVTANDVK(N) (K)LGVTANDVK(N) (K)FVEGLPINDFSR(E) 1110 gi|119589975 calponin 2 32 4 4 4 19 (R)TWIEGLTGLSIGPDFQK(G) (K)GLQSGVDIGVK(Y) (K)AGQcVIGLQMGTNK(C) (K)cASQSGMTAYGTRR(H) 1110 gi|119593674 33 2 2 2 9.6 (R)STPAITLESPDIKYPLR(L) (R)GPSGLLVYQGK(G) 1139 gi|119625664 annexin A5 33 7 7 11 27 (K)GLGTDEESILTLLTSR(S) (K)GLGTDEESILTLLTSR(S) (R)QEISAAFK(T) (R)QEISAAFK(T) (R)LYDAYELK(H) GTPase, IMAP family member 1 malate dehydrogenase 1, NAD (soluble) cytochrome b5 reductase 3 137 (R)LYDAYELK(H) (K)VLTEIIASR(T) (K)VLTEIIASR(T) (R)ETSGNLEQLLLAVVK(S) (R)SIPAYLAETLYYAMK(G) (R)SEIDLFNIR(K) 1139 gi|2343185 27 3 3 4 11 (R)SLTIAEFK(C) (R)LGEYEDVSR(V) (R)LGEYEDVSR(V) (K)YTISQEAYDQR(Q) 1151 gi|15718687 27 8 8 10 40 (K)AELNEFLTR(E) (R)ELAEDGYSGVEVR(V) (R)VTPTRTEIIILATR(T) (R)VTPTRTEIIILATR(T) (R)IRELTAVVQKR(F) (R)FGFPEGSVELYAEK(V) (R)GLcAIAQAESLR(Y) (R)GLcAIAQAESLR(Y) (K)LLGGLAVR(R) (K)GGKPEPPAMPQPVPTA(-) 1151 gi|119568486 31 2 2 2 7.4 (K)NTFSSGSDLNAVK(S) (R)LVEIIGSR(Q) 1154 gi|4826659 31 13 16 26 47 (R)RLPPQQIEK(N) (R)RLPPQQIEK(N) (R)RLPPQQIEK(N) (R)DKVVGKDYLLcDYNR(D) (K)DYLLcDYNR(D) (R)SPWSNKYDPPLEDGAMPSAR(L) (R)SPWSNKYDPPLEDGAmPSAR(L) (R)SPWSNKYDPPLEDGAMPSAR(L) (R)KLEVEANNAFDQYR(D) (R)KLEVEANNAFDQYR(D) (K)LEVEANNAFDQYR(D) (K)SGSGTMNLGGSLTR(Q) (K)SGSGTMNLGGSLTR(Q) (K)SGSGTmNLGGSLTR(Q) (K)SGSGTMNLGGSLTR(Q) (R)QMEKDETVSDcSPHIANIGR(L) (R)LVEDMENKIR(S) (R)LVEDMENKIR(S) (R)STLNEIYFGK(T) (R)STLNEIYFGK(T) (R)STLNEIYFGK(T) (K)TKDIVNGLR(S) (K)TKDIVNGLR(S) tubulin folding cofactor B 40S ribosomal protein S3 enoyl Coenzyme A hydratase domain containing 1 F-actin-capping protein subunit beta 138 (K)DIVNGLR(S) (R)SVQTFADK(S) (R)SVQTFADK(S) 1154 gi|157168362 32 6 7 10 25 (R)LVFGFLNGR(A) (R)FGDRFPAMSDAYDR(T) (R)FGDRFPAMSDAYDR(T) (K)LGADAVGMSTVPEVIVAR(H) (K)LGADAVGMSTVPEVIVAR(H) (K)LGADAVGmSTVPEVIVAR(H) (R)VFGFSLITNK(V) (R)VFGFSLITNK(V) (K)VIMDYESLEK(A) (K)ANHEEVLAAGK(Q) 1154 gi|149243076 27 2 2 2 11 (R)SALALVTGAGSGIGR(A) (K)VGNVGQTNYAASK(A) 1232 gi|2507187 25 9 10 14 62 (K)SGGASHSELIHNLR(K) (K)SGGASHSELIHNLR(K) (K)VFEVMLATDR(S) (K)ALDVGSGSGILTAcFAR(M) (K)ALDVGSGSGILTAcFAR(M) (K)VIGIDHIKELVDDSINNVR(K) (K)ELVDDSINNVR(K) (R)KDDPTLLSSGR(V) (R)VQLVVGDGR(M) (R)VQLVVGDGR(M) (R)VQLVVGDGR(M) (R)mGYAEEAPYDAIHVGAAAPVVPQALIDQLKPGGR(L) (R)LILPVGPAGGNQMLEQYDKLQDGSIK(M) (R)LILPVGPAGGNQmLEQYDKLQDGSIK(M) 1232 gi|15431303 22 4 4 5 25 (K)TILSNQTVDIPENVDITLK(G) (R)TVIVKGPR(G) (R)TVIVKGPR(G) (R)TIcSHVQNMIK(G) (K)FLDGIYVSEK(G) 1232 gi|1174149 23 3 3 3 17 (K)VIILGDSGVGK(T) (K)ATIGADFLTK(E) (K)EAINVEQAFQTIAR(N) 1232 gi|119616745 21 2 2 3 12 (K)TLLGDGPVVTDPK(A) (K)TLLGDGPVVTDPK(A) (K)TLLGDGPVVTDPKAPNVVVTR(L) 1232 gi|7546411 22 2 2 2 18 (K)HHAAYVNNLNVTEEKYQEALAK(G) (K)GDVTAQIALQPALK(F) 1254 gi|392959 LMP-2 21 5 7 15 32 (R)VSAGEAVVNR(V) (R)VSAGEAVVNR(V) (R)VSAGEAVVNR(V) small GTP binding protein Rab7 purine nucleoside phosphorylase Hydroxysteroid Dehydrogenase Type 8, Hsd17b8 Protein-L-isoaspartate(D- aspartate) O-methyltransferase 60S ribosomal protein L9 Rho GDP dissociation inhibitor (GDI) beta Manganese Superoxide Dismutase 139 (R)VFDKLSPLHER(I) (R)VFDKLSPLHER(I) (R)FTTDAIALAMSR(D) (R)FTTDAIALAmSR(D) (R)FTTDAIALAMSR(D) (R)FTTDAIALAmSR(D) (R)DGSSGGVIYLVTITAAGVDHR(V) (R)DGSSGGVIYLVTITAAGVDHR(V) (R)DGSSGGVIYLVTITAAGVDHR(V) (R)VILGNELPK(F) (R)VILGNELPK(F) (R)VILGNELPK(F) 1254 gi|2662291 cytochrome b5 16 3 3 5 40 (K)GQEVETSVTYYR(L) (K)GQEVETSVTYYR(L) (R)NSLKELWLVIHGR(V) (R)FLNEHPGGEEVLLEQAGVDASESFEDVGHSSDAR(E) (R)FLNEHPGGEEVLLEQAGVDASESFEDVGHSSDAR(E) 1254 gi|32189392 peroxiredoxin-2 20 3 3 5 20 (R)KEGGLGPLNIPLLADVTR(R) (K)TDEGIAYR(G) (R)QITVNDLPVGR(S) (R)QITVNDLPVGR(S) (R)QITVNDLPVGR(S) 1254 gi|4502171 20 2 2 2 10 (R)AAIGLLAR(H) (R)IDYIAGLDSR(G) 1276 gi|21624607 16 8 9 13 42 (R)AAYNLVR(D) (R)FTTGDAMSK(R) (R)FTTGDAMSKR(S) (R)FTTGDAMSKR(S) (R)SKFALITWIGENVSGLQR(A) (R)SKFALITWIGENVSGLQR(A) (K)TGTDKTLVKEVVQNFAK(E) (K)TLVKEVVQNFAK(E) (K)EVVQNFAK(E) (K)EVVQNFAK(E) (K)EVVQNFAK(E) (K)EFVISDRK(E) (K)EFVISDRK(E) 1276 gi|4502171 20 6 7 12 36 (R)SFPDFPTPGVVFR(D) (R)DISPVLKDPASFR(A) (R)DISPVLKDPASFR(A) (R)DISPVLKDPASFR(A) (R)AAIGLLAR(H) (R)AAIGLLAR(H) (R)AAIGLLAR(H) (K)ATHGGRIDYIAGLDSR(G) (K)ATHGGRIDYIAGLDSR(G) adenine phosphoribosyltransferase coactosin-like protein adenine phosphoribosyltransferase 140 (R)IDYIAGLDSR(G) (R)IDYIAGLDSR(G) (R)EKLAPVPFFSLLQYE(-) 1276 gi|32189392 peroxiredoxin-2 20 7 7 11 33 (K)ATAVVDGAFKEVK(L) (R)KEGGLGPLNIPLLADVTR(R) (R)KEGGLGPLNIPLLADVTR(R) (R)RLSEDYGVLKTDEGIAYR(G) (R)LSEDYGVLK(T) (R)LSEDYGVLKTDEGIAYR(G) (K)TDEGIAYR(G) (K)TDEGIAYR(G) (R)QITVNDLPVGR(S) (R)QITVNDLPVGR(S) (R)QITVNDLPVGR(S) 1276 gi|238538004 Traf6 17 3 3 4 19 (R)LLAEPVPGIK(A) (R)LLAEPVPGIKAEPDESNAR(Y) (K)TNEAQAIETAR(A) (K)TNEAQAIETAR(A) 1276 gi|19697925 17 2 2 3 15 (R)LVQTAELTK(V) (R)TTDDLTEAWLQEK(L) (R)TTDDLTEAWLQEK(L) 1276 gi|157884034 16 2 3 3 37 (R)HVGDLGNVTADKDGVADVSIEDSVISLSGDHcIIGR(T) (R)HVGDLGNVTADKDGVADVSIEDSVISLSGDHcIIGR(T) (R)TLVVHEKADDLGKGGNEESTK(T) [cu-Zn] Superoxide Dismutase glia maturation factor gamma 141 Anexo 4. Lista total de proteínas identificadas y número de acceso en Uniprot Spot # GI # Protein name Uniprot Accesion # 1098 gi|10835063 nucleophosmin P06748 626 gi|10863945 X-ray repair cross-complementing protein 5 P13010 1098 gi|110590506 GlyoxylateHYDROXYPYRUVATE REDUCTASE Q9UBQ7 895 gi|112491419 Prolidase P12955 800, 805, 823, 832, 839, 853, 862 gi|11493459 Serum albumin P02768 832 gi|11527777 heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L P14866 1232 gi|1174149 small GTP binding protein Rab7 P51149 1098 gi|118137847 Phosphoribosyl Pyrophosphate Synthetase 1 P60891 1151 gi|119568486 enoyl Coenzyme A hydratase domain containing 1 Q96DC8 1050 gi|119572233 zyxin Q15942 1050 gi|119574488 GTPase, IMAP family member 4 Q9NUV9 1110 gi|119574954 voltage-dependent anion channel 2 P45880 740 gi|119580852 X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 6 (Ku autoantigen, 70kDa) P12956 893 gi|119581533 drebrin-like Q9UJU6 895 gi|119583082 heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K P61978 1110 gi|119589975 calponin 2 Q99439 920 gi|119591135 aspartyl aminopeptidase Q9ULA0 1110 gi|119593674 cytochrome b5 reductase 3 P00387 832, 853 gi|119594330 CD5 antigen P06127 832 gi|119594345 dihydroxyacetone kinase 2 Q3LXA3 853 gi|119594723 EH-domain containing 1 Q9H4M9 823, 832, 839, 853 gi|119598292 pyruvate kinase, muscle P14618 1050 gi|119600342 aldolase A, fructose-bisphosphate P04075 920 gi|119607750 fascin homolog 1, actin-bundling protein Q16658 893 gi|119608775 tubulin, beta 2C Q8N6N5 1050, 1098 gi|119609192 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase P04406 1232 gi|119616745 Rho GDP dissociation inhibitor (GDI) beta P52566 1098, 1110 gi|119620368 malate dehydrogenase 1, NAD (soluble) P40925 1139 gi|119625664 annexin A5 P08758 1050 gi|119626277 heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D Q14103 1098 gi|13529257 Aldo-keto reductase family 1, member B1 (aldose reductase) P15121 1098, 1050 gi|13786847 L-Lactate Dehydrogenase P07195 1098 gi|14043072 heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1 isoform B1 P22626 1098 gi|14141157 heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H3 P31942 1050 gi|14250401 actin, beta P60709 740 gi|14603253 Phosphoglucomutase 2 Q96G03 1154 gi|149243076 Hydroxysteroid Dehydrogenase Type 8, Hsd17b8 Q92506 1232 gi|15431303 60S ribosomal protein L9 P32969 895 gi|15620780 glutamate carboxypeptidase Q04609 1154 gi|157168362 purine nucleoside phosphorylase P00491 1151 gi|15718687 40S ribosomal protein S3 P23396 1276 gi|157884034 [cu-Zn] Superoxide Dismutase P00441 740 gi|167614506 plastin -2 P13796 142 893 gi|167887751 vimentin P08670 893 gi|18088719 Tubulin, beta P07437 1110 gi|18594498 GTPase, IMAP family member 1 Q8WWP7 1050 gi|18645167 annexin A2 P07355 805 gi|189428 phosphatase 2A regulatory subunit P30153 805, 853 gi|189502784 mitochondrial heat shock 60kD protein 1 variant 1 P10809 1276 gi|19697925 glia maturation factor gamma O60234 920 gi|197210452 uridine monophosphate synthetase isoform I P11172 920 gi|197692395 RuvB-like 1 Q9Y265 920 gi|19923748 dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferase component of 2-oxoglutarate dehydrogenase complex, mitochondrial P36957 862 gi|20070125 protein disulfide-isomerase precursor P07237 832 gi|20151189 Glutamate Dehydrogenase P00367 920 gi|203282367 Enolase 1 P06733 920 gi|2134709 adenylosuccinate lyase P30566 1276 gi|21624607 coactosin-like protein Q14019 862, 893, 895 gi|220702506 TapasinERP57 HETERODIMER O15533 1139 gi|2343185 tubulin folding cofactor B Q99426 455 gi|23510338 ubiquitin-like modifier-activating enzyme 1 P22314 1276 gi|238538004 Traf6 Q9Y4K3 1232 gi|2507187 Protein-L-isoaspartate(D-aspartate) O-methyltransferase P22061 1254 gi|2662291 cytochrome b5 P00167 1254, 1276 gi|32189392 peroxiredoxin-2 P32119 853 gi|32483399 serine/threonine-protein kinase PAK 2 Q13177 895 gi|32709 IFP53 P23381 1254 gi|392959 LMP-2 P28065 920 gi|425518 anti-colorectal carcinoma heavy chain 1254, 1276 gi|4502171 adenine phosphoribosyltransferase P07741 853 gi|4502643 T-complex protein 1 subunit zeta P40227 1098 gi|4506667 60S acidic ribosomal protein P0 P05388 832 gi|4557014 catalase P04040 920 gi|4557317 annexin A11 isoform 1 P50995 1050 gi|460771 hnRNP-E1 Q15365 839 gi|4757810 ATP synthase subunit alpha, mitochondrial P25705 1154 gi|4826659 F-actin-capping protein subunit beta P47756 1050 gi|5031601 actin related protein 2/3 complex subunit 1B O15143 1098 gi|5453710 LIM and SH3 domain protein 1 Q14847 1098 gi|5803187 transaldolase P37837 862, 895, 920 gi|5902134 coronin-1A P31146 1232 gi|7546411 Manganese Superoxide Dismutase P04179 143 Anexo 5. Resultados del análisis bioinformático utilizando la herramienta DAVID GO term identifier # of Proteins p-Value Cluster Enrichment Score GO:0006091~generation of precursor metabolites and energy 11 1.1 E-5 5 GO:0007010~cytoskeleton organization 12 3.4 E-5 3.62 GO:0006732~coenzyme metabolic process 7 3.1 E-5 3 GO:0042981~regulation of apoptosis 16 4.0 E-5 2.73 GO:0008380~RNA splicing 7 5.5 E-3 2.03 GO:0044271~nitrogen compound biosynthetic process 8 2.5 E-3 2 GO:0050863~regulation of T cell activation 8 4.4 E-6 1.85 GO:0044092~negative regulation of molecular function 6 4.2 E-2 1.58 144 pathway 1D 60:0019674 60:0055114 60:0005996 60:0006734 60:0071822 60:0019320 60:0060249 60:0046364 60:0051186 60:0009117 601901564 60:0006732 60:0006091 600019318 60:0009156 60:0043933 60:0019637 60:0051084 60:0019319 60:0006461 G0:0070271 60:0044764 60:0001894 60:0006950 60:0009168 60:0022607 60:0030029 600042455 60:0044085 60:0061621 601901657 60:0019752 60:0044403 60:0006082 60:0016051 60:0009056 60:0009161 60:0009165 60:0016032 60:00719430 60:0030036 60:0009119 60:0009260 60:0006796 60:0006000 60:0055086 60:0006006 60:0051259 601901575 60:0006163 60:0071451 60:0006094 60:0046129 60:0007015 60:0050870 60:0007010 60:0050863 60:0009060 yoo TT. .u. 7 HR Biological Process (60) pathway deseription NAD metabolic process oxidation-reduction process monosaccharide metabolic process NADH metabolic process protein complex subunit organization hexose catabolic process anatomical structure homeostasis monosaccharide biosynthetic process cofactor metabolic process nucleotide metabolic process organonitrogen compound metabolic process coenzyme metabolic process generation of precursor metabolites and energy hexose metabolic process ribonucleoside monophosphate biosynthetic process macromolecular complex subunit organization organophosphate metabolic process de novo posttranslational protein folding hexose biosynthetic process protein complex assembly protein complex biogenesis multi-organism cellular process tissue homeostasis response to stress purine ribonucleoside monophosphate biosynthetic process cellular component assembly actin filament-based process ribonucleoside biosynthetic process cellular component biogenesis canonical glycolysis glycosyl compound metabolic process carboxylic acid metabolic process symbiosis, encompassing mutualism through parasitism organic acid metabolic process carbohydrate biosynthetic process catabolic process ribonucleoside monophosphate metabolic process nuecleotide biosynthetic process viral process removal of superoxide radicals actin cytoskeleton organization ribonucleoside metabolic process ribonucleotide biosynthetic process phosphate-containing compound metabolic process fructose metabolic process nuecleobase-containing small molecule metabolic process glucose metabolic process protein oligomerization organic substance catabolic process purine nueleotide metabolic process cellular response to superoxide gluconeogenesis purine ribonuecleoside biosynthetic process actin filament organization positive regulation of T cell activation eytoskeleton organization regulation of T cell activation aerobic respiration countin gene sei false discovery rate 8 20 m1 6 22 6 10 6 10 12 21 b l j r o a a o o a o s a 7128-07 2118-06 2.69e-06 6.39e-06 6.39e-06 4158-05 9.378-05 9.39e-05 0.0001726 0.0001 28 0.000134 0.000202 0.000222 0.000255 0.000313 0.000529 0.000595 0.000638 0.000758 0.000852 0.000852 0.001 0.00129 0.00129 0.00129 0.00129 0.00129 0.00129 0.00129 0.00129 0.00129 0.00163 0.00163 0.00176 0.00189 0.00278 0.00278 0.00278 0.00278 0.0029 0.0029 0.00322 0.00322 0.00336 0.00347 0.00361 0.00366 0.00384 0.00441 0.00463 0.00463 0.0046, 0.00508 0.0063 0.0063 0.00646 0.00646 0.00734 Anexo 6. Resultados del análisis bioinformático utilizando la herramienta STRING para identificar procesos biológicos enriquecidos 145 60:0016071 601902589 60:0000302 60:0033554 60:0080135 60:0046128 60:0051262 60:0048871 60:0009167 60:0044712 60:0051704 60:0006897 60:0006090 60:0009152 60:0005975 60:0006457 60:1902175 60:0080134 60:0006167 60:0000398 60:0010035 60:0009259 60:0050878 60:0002376 G0:0072522 60:0042743 60:0043066 60:0015980 60:0044711 60:00301755 60:0008380 60:0034655 60:0043648 60:0051126 60:0044723 60:0006144 60:0072350 60:0044770 60:0047981 60:0072521 60:0006909 60:0075713 60:0034614 60:0006754 60:0032501 60:0044707 60:0046686 60:0001775 60:0051128 60:0051017 60:0007845 60:0045333 60:2007233 mRNA metabolic process single-organism organelle organization response to reactive oxygen species cellular response to stress regulation of cellular response to stress purine ribonucleoside metabolic process protein tetramerization multicellular organismal homeostasis purine ribonucleoside monophosphate metabolic process single-organism catabolic process multi-organism process endocytosis pyruvate metabolic process purine ribonucleotide biosynthetic process carbohydrate metabolic process protein folding regulation of oxidative stress-induced intrinsic apoptotic signaling pathway regulation of response to stress AMP biosynthetic process mRNA splicing, via spliceosome response to inorganic substance ribonucleotide metabolic process regulation of body fluid levels immune system process purine-containing compound biosynthetic process hydrogen peroxide metabolic process negative regulation of apoptotic process energy derivation by oxidation of organic compounds single-organism biosynthetic process regulation of cell adhesion RNA splicing nucleobase-containing compound catabolic process dicarboxylic acid metabolic process negative regulation of actin nucleation single-organism carbohydrate metabolic process purine nucleobase metabolic process tricarboxylic acid metabolic process single-organism metabolic process regulation of apoptotic process purine-containing compound metabolic process phagocytosis establishment of integrated proviral latency cellular response to reactive oxygen species ATP biosynthetic process multicellular organismal process single-multicellular organism process response to cadmium ion cell activation regulation of cellular component organization actin filament bundle assembly phagolysosome assembly cellular respiration regulation of apoptotic signaling pathway v o z a r o m n g a r a r o a d a s mu =k J a n a g w a s a s a 0.00788 0.00792 0.008471 0.00847 0.00875 0.00883 0.00883 0.00897 0.0102 0.0103 0.0103 0.012 0.0129 0.0137 0.016 0.016 0.0167 0.0172 0.0774 0.0197 0.0204 0.0205 0.0206 0.0211 0.0217 0.0231 0.0251 0.0253 0.0253 0.0259 0.0278 0.0286 0.0236 0.0303 0.0324 0.0328 0.0328 0.0338 0.0364 0.0365 0.0375 0.0375 0.0376 0.0393 0.0394 0.0415 0.0415 0.042 0.043 0.0439 0.0449 0.0457 0.0488 146 KEGG Pathways pathway 1D pathway description count in gene set false discovery rate 01100 Metabolic pathways 19 2.29e-05 01200 Carbon metabolism 7 2.29e-05 00620 Pyruvate metabolism 5 4.85e-05 00010 Glycolysis / Gluconeogenesis 5 0.000284 05130 Pathogenic Escherichia coli infection 4 0.00307 00030 Pentose phosphate pathway 3 0.00597 00630 Glyoxylate and dicarboxylate metabolism 3 0.00597 01230 Biosynthesis of amino acids 4 0.00615 04145 Phagosome 5 0.00803 00250 Alanine, aspartate and glutamate metabolism 3 0.0103 00230 Purine metabolism 5 0.0124 03450 Non-homologous end-joining 2 0.0281 (less ...) Anexo 7. Resultados del análisis bioinformático utilizando la herramienta STRING para identificar las vías enriquecidas 147