UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO Programa de Doctorado en Ciencias de la Producción Animal y de la Salud Animal FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA “Uso de un modelo en ratón para evaluar el efecto activador de la respuesta inmune de un lisado múltiple polivalente de bacterias para el tratamiento y control de infecciones crónicas de las vías urinarias.” TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE Doctor en Ciencias de la Producción y de la Salud Animal PRESENTA Salvador Eduardo Acevedo Monroy TUTOR Dr. Carlos Alberto Eslava Campos Facultad de Medicina UNAM COMITÉ TUTOR Dr. Ulises Hernández Chiñas Facultad de Medicina UNAM Dr. Daniel Martínez Gómez Universidad Autónoma Metropolitana-Xoch ACADÉMICO INVITADO Dr. Francisco Javier Basurto Alcántara Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, UNAM Ciudad de México Febrero 2025 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. 2 3 In the warrior's code There's no surrender Though his body says stop His spirit cries, never Deep in our soul A quiet ember Knows it's you against you It's the paradox That drives us on It's a battle of wills In the heat of attack It's the passion that kills The victory is yours alone In the burning heart…. Frank Sullivan Burning Heart Cuando pierda todas las partidas Cuando duerma con la soledad Cuando se me cierren las salidas Y la noche no me deje en paz Cuando sienta miedo del silencio Cuando cueste mantenerse en pie Cuando se rebelen los recuerdos Y me pongan contra la pared Resistiré Erguido frente a todo Me volveré de hierro para endurecer la piel Y aunque los vientos de la vida soplen fuerte Soy como el junco que se dobla Pero siempre sigue en pie Resistiré Para seguir viviendo Soportaré los golpes y jamás me rendiré Y aunque los sueños se me rompan en pedazos Resistiré… Cuando el mundo pierda toda magia Cuando mi enemigo sea yo Cuando me apuñale la nostalgia Y no reconozca ni mi voz Hay una gran maldad en el mundo y viene de los hombres, los otros elil hacen lo que hacen para vivir, para alimentarse, pero los hombres no descansarán hasta que arruinen la tierra y eliminen a los animales Richard Adams Watership Down Mi corazón se une a los mil, por mi amigo qué hoy dejó de correr Hazel -Por qué los humanos hacen eso? Acebo - No lo sé. – Todo lo qué sé es que donde hay humanos, hay muerte, debemos alejarnos de ellos a cualquier costo Richard Adams Watership Down 4 Dedicatoria Este trabajo lo concluí por las siguientes causas: Mi necedad, que muchos llaman resiliencia, herencia de mamá. El ejemplo a mis hijas y a mis alumnos, si he podido yo, ustedes lo harán mejor… Y lo dedico: A mamá que sé que podría dar su vida por nosotros. A mi mamá porque todo su apoyo es reflejo de éste trabajo. A mis hermanos que han mostrado su gran apoyo, ejemplo y amor siempre. A mis motores y el ejemplo de lo mejor que me ha pasado en esta vida Ile y Lani, siempre busquen ser mejores aunque ya lo sean, Merecen lo que sueñan. A mis estudiantes sin ustedes no me obligaría a ser mejor cada día, como académico y como persona A cada uno de los animales que han brindado saber y conocimiento a la humanidad porque siempre el éxito se lo atribuyen a los investigadores sin embargo el éxito de la ciencia es gracias a esas hermosas almas sin voz, que sufieron y padecieron, no solamente al egocentrismo científico: Laika, Felicity, Balto, Togo Y cada uno de los animales que han dado bienestar y salud a la humanidad. A las ratonas que dieron su vida para que este proyecto se efectuara En nombre de los "túnicas blancas" PERDÓN y MUCHAS GRACIAS. A Julio Manuel Méndez Alemán por que soy el resultado de todo el conocimiento que posee y ha sido el único maestro que ha sabido enseñarme tanto de laboratorio como de la vida. A Jorge Alfredo De La Garza García quien me hizo pensar de la microbiología más que una materia es una pasión y un arte. A mi mejor amigo y hermano Mauro Daniel Fonseca Ortíz quién se quedó dormido en la espera de la cura de las enfermedades infecciosas, no sabes cuánta falta me has hecho, mi alma está rota desde que te fuiste. A Isaac Del Real Piña y a Carlos Alberto Vilchis Malvaez que han sido mis amigos, hermanos y compañeros de vida han demostrado estar conmigo entero y en pedazos Gracias . A Leonardo DVM, Itzel GS, Frida ERC y Wendy AH, mis alumnos, aprendí y sigo aprendiendo más yo de ustedes,que ustedes de mi.... A Sombrita, Kimba, Goose, Misha, Bichardo, Taquion, Shadow, Tomy, Odín, Perlita, Sharlyn, Minah, Silvestre, Benji, Loba, Ollin, Galleta, Teporingo, La Familia Suavecitos, Canela, Tambor, Shadow, Lluvia, Trompa I, Trompa II, Jorgito, Malvavisco, Sully, Tulipan, Fantasma y a cada uno de los animales que han sido mis amados compañeros de vida o mis pacientes, porque ustedes han dado sentido a todo esto. 5 Agradecimientos Al CONACYT por el apoyo para la realización de este trabajo Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologías (CONAHCYT), que otorgó la beca no. 759975 para poder llevar a cabo este proyecto. A la UNAM, mi alma mater por siempre. A la FMVZ por ofrecerme todas las herramientas profesionales y de vida. A la Al Dr. Carlos Eslava por todo el apoyo otorgado, la confianza y la ayuda que me ha dado, por ofrecerme esta oportunidad. Al Dr. Ulises Hernández Chiñas por el apoyo. A la Dra. Alejandra Quiñones, gracias por todo tu apoyo y amistad, confiar en mi. Al Dr. Óscar Medina que me ofreció su apoyo aún sin ser su estudiante y sin nada a cambio Al Dr. Raul Castro y Leonel Martínez que me han apoyado tanto en el proceso de trabajo con los animales de laboratorio Al Dr. Antonio Verdugo, que por tantos años me ha otorgado mucha confianza, apoyo y herramientas para mi desarrollo, no solo profesional también personal, un padre acádemico para mi. Al Dr. Daniel Martínez de la UAM-XOCH el gran aporte a este trabajo A la Dra. Ana Belén Tirado por su ayuda durante el proceso de inclusión de tejidos animales Al Dr. José Ramírez Lezama por su contribución con los estudios de histopatología en la primera etapa del trabajo. Al Dr. Osvaldo López por su contribución con los estudios de histopatología en la segunda etapa del trabajo. A Julio Méndez que a pesar de no figurar como mi tutor, su opinión y orientación ha sido fundamental para muchas decisiones en mi trabajo y vida profesional. A mis compañeros del laboratorio Yolanda, Maribel, Cristina, Berenice, Cristopher, Scarlett, Tania, Agustín, Francine y Pedro (Los potosinos). A mi amigo Leonel Chávez cuyo interés en la investigación ha empatado con el mío A la Dr.a LuzMa Rocha por la asesoría en las primeras etapas del trabajo A mi jurado; Dr. José Alberto Cano Buendía, Dr. Jose Luis Puente García, Dr. Francisco Javier Basurto Alcántara; cuyas observaciones enriquecieron este trabajo por todas las observaciones valiosas a este trabajo. A la Dra. María Antonieta Mójica que siempre me ha prestado apoyo incondicional como madre y consejera. Al Dr. Raymundo Iturbe por sus consejos de trabajo, vida y apoyo personal 6 Índice Índice ............................................................................................................................ 6 Índice de figuras ......................................................................................................... 8 Índice de cuadros ....................................................................................................... 9 Abreviaturas .............................................................................................................. 10 Resumen .................................................................................................................... 11 Abstract ...................................................................................................................... 12 Introducción .............................................................................................................. 13 Etiología de las ITUs. ........................................................................................................ 14 Infecciones Recurrentes del Tracto Urinario (IRTU). .................................................. 16 Tratamiento y control de las infecciones del tracto urinario ..................................... 17 Antimicrobianos ................................................................................................................................. 17 Antecedentes sobre la resistencia a los antimicrobianos en ITU ......................................... 18 Tratamientos alternativos para el control de las Infecciones crónicas del tracto urinario (ICTU) .................................................................................................................................................... 20 Justificación .............................................................................................................. 22 Hipótesis .................................................................................................................... 23 Objetivo general ........................................................................................................ 24 Objetivos específicos .............................................................................................. 24 Material y métodos ................................................................................................... 26 Caracterización serológica de E. coli ............................................................................ 27 Caracterización genotípica de Escherichia coli ........................................................... 27 Obtención del lisado bacteriano polivalente ................................................................ 28 Curvas de crecimiento de bacterias seleccionadas ........................................................................ 28 Componentes del lisado polivalente .................................................................................................. 30 Inmunogenicidad de los lisados ..................................................................................... 31 Actividad citotóxica de los lisados en células en cultivo. .......................................... 32 Citotoxicidad in vitro evaluada con MTT y XTT. .......................................................... 32 Ensayos in vitro para conocer la actividad inmunogénica de los lisados UNAM- HIMFG y monovalentes. ................................................................................................... 33 Ensayos en modelo animal (ratones) ............................................................................ 34 Inocuidad del lisado UNAM-HIMFG en ratón. .................................................................................. 35 Selección de la cepa de ratón para la Infección con E. coli uropatógena ................................... 35 Microbiota cultivable de orina y heces de los ratones en estudio ................................................. 35 Inóculo para la infección de los ratones ............................................................................................ 36 Infección del tracto urinario ................................................................................................................. 37 Efecto protector del lisado UNAM-HIMFG ........................................................................................ 38 7 Activación de la expresión de citocinas en el modelo con animal inducida por el lisado UNAM-HIMFG ..................................................................................... 39 Estudio histológico de tejidos del tracto digestivo ........................................................................... 40 Actividad protectora del lisado UNAM-HIMFG en la colonización de tejidos por Escherichia coli uropatógena UPEC ....................................................................................................................... 40 Análisis estadístico ........................................................................................................... 41 Resultados ................................................................................................................. 43 Bacterias seleccionadas para elaborar el lisado polivalente (UNAM-HIMFG) ......... 43 Composición de los lisados ............................................................................................ 43 Antigenicidad de los lisados monovalentes y polivalente. ........................................ 44 Detección de proteínas en los lisados ........................................................................... 47 Actividad citotóxica de los lisados ................................................................................ 48 Actividad tóxica del lisado UNAM-HIMFG In vivo ........................................................ 50 Actividad inmuno-estimulante de los lisados en modelo celular. ............................ 51 Estudio de la microbiota cultivable a partir de ratones .............................................. 53 Infección inducida en el tracto urinario de ratones ..................................................... 53 UNAM-HIMFG protege contra la colonización por UPEC CFT073 ............................. 54 Efecto inmunoestimulante del lisado UNAM-HIMFG. .................................................. 55 Lisado UNAM-HIMFG protege contra la colonización en tejidos .............................. 56 Discusión ................................................................................................................... 59 Prospectiva ................................................................................................................ 71 Referencias: ............................................................................................................... 72 Anexo 1. Cuadros Material y métodos .................................................................. 96 Anexo 2. Cuadros Resultados ................................................................................ 99 Anexo 3. Medios de Cultivo .................................................................................. 102 Anexo 4. Soluciones .............................................................................................. 108 Anexo 5. Publicaciones producto de este trabajo ............................................ 112 8 Índice de figuras Figura 1. SDS-PAGE de componentes de lisados polivalente y monovalentes…....………...37 Figura 2. Inmunotransferencia de lisados polivalente (UNAM-HIMFG) y monovalentes...................…....………....………….....………....………....…………..38 Figura 3. Inmunotransferencia de lisados polivalente (UNAM-HIMFG) y monovalentes....……… ....……… ....……….....……… ....….….............................. 39 Figura 4. Inmunotrasnferencia de diferentes preparaciones del lisado polivalente UNAM- HIMFG…...............………....………….....………....………….....………....…………..40 Figura 5. Gráfica de promedios de porcentaje de sobrevivencia obtenidos en ensayos de proliferación celular.................………....…………......………....…………….............41 Figura 6. Evaluación histológica de los tejidos de ratones tratados.…...................................42 Figura 7. Secreción de TNF-a en macrófagos murinos J774 A.1 con diferentes concentraciones de los lisados….........………....………….....………....………........43 Figura 8. Activación de macrófagos de humano inducida por los lisados…...........................44 Figura 9. Infección urinaria inducida con cepas UPEC en ratones …....................................46 Figura 10. E. coli CFT073 recuperadas de muestras de orina en ratones…............................47 Figura 11. Expresión de TNF-α (A) e IL-10…...........................................................................48 Figura 12. Análisis histológico de la vejiga de ratones BALB/c.................................................50 9 Índice de cuadros Cuadro 1. Análisis de la composición de macromoléculas de diferentes lisados…..........36 10 Abreviaturas °C Grados Celsius g Gravedades h Hora kg Kilogramo µg Microgramo L Litro M Molar mM Milimolar µM Micromolar mg Miligramo mL Mililitro mm Milimetro µL Microlitro min Minuto ng Nanogramo nm Nanometro pb Par de bases pg Picogramo pM Picomolar pH Potencial de Hidrógeno rpm Revoluciones por minuto s Segundo U Unidades v/v Volumen/volumen w/v Peso/volumen V Volt % Porcentaje 11 Resumen El uso excesivo de antimicrobianos ha contribuido al aumento de bacterias multirresistentes, problemática que dificulta el tratamiento de las enfermedades infecciosas causadas por estos microorganismos, el caso de las infecciones del tracto urinario (ITU) no son la excepción y representan un problema de salud pública mundial, ya que para su tratamiento se hace uso de moléculas antimicrobianas, a las cuales se ha reportado frecuentemente resistencia a los antibióticos, bajo esta premisa surge la necesidad de buscar alternativas para su control y tratamiento, una de estas alternativas han sido los lisados bacterianos autólogos, de los cuales, estudios previos han demostrado su utilidad para el tratamiento de las ITU, sin embargo, una limitación es el alto costo de producción de inmunógenos individuales. La etiología de las ITUs puede estar asociada a bacterias como E. coli, Klebsiella spp., Enterococcus spp., entre otras. Incluso Escherichia coli, el principal agente causal, está compuesto por diversas variantes antigénicas. Ante la dificultad de contar con antimicrobianos efectivos, para el control de las ITUs se requieren alternativas que contribuyan a mejorar las condiciones clínicas del paciente. En este trabajo se desarrolló un lisado bacteriano llamado UNAM-HIMFG compuesto por diez serotipos de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella aerogenes, Enterococcus faecalis, Proteus mirabilis, Citrobacter freundii y Staphylococcus haemolyticus. Se evaluó la seguridad del compuesto en células y en un modelo animal, así como su capacidad inmunogénica desafiando in vitro macrófagos humanos y murinos de la línea J774 A1. Los resultados demostraron que UNAM-HIMFG no causó daños a las células, ni alteraciones fisiológicas, histológicas o de comportamiento en el modelo animal utilizado. El ensayo de actividad inmunogénica mostró que activa secreción de TNF-α e IL-6, en macrófagos humanos y de TNF-α en células J7741.A. Para definir el potencial empleo en tratamiento de ITUs del lisado. Se infectaron ratones BALB/c por vía uretral con E. coli CFT073, se colectaron muestras de orina antes del desafío y posteriormente cada semana hasta completar 60 días. A las 96 horas del desafío se inició la administración semanal de UNAM-HIMFG por vía sublingual durante 60 días, se evaluó el estado clínico y la evolución de los animales analizando su comportamiento. El cultivo de las muestras de orina en de los ratones tratados con UNAM-HIMFG mostró presencia de bacterias únicamente hasta la tercera semana de tratamiento y los animales no tratados persistieron las bacterias hasta concluir los 60 días de seguimiento. Al terminar el ensayo se obtuvo la vejiga, en las muestras de vejiga de los animales sin tratamiento mostraron inflamación crónica y bacterias en submucosa, por otro lado, los tejidos de los ratones tratados con UNAM-HIMFG no presentaron alteraciones. Finalmente, la actividad inmuno estimulante del compuesto sobre los animales se analizó por qPCR a partir del bazo; en este se cuantificó la expresión de TNFα e IL-10. Los resultados obtenidos sugieren que la activación de la respuesta inmune inhibe el desarrollo de las bacterias inoculadas y de manera consecuente, evita la inflamación crónica que contribuye en forma importante en el daño de los tejidos. Por lo que el lisado UNAM- HIMFG tiene potencial como tratamiento ante las ITUs. Palabras clave Infecciones del tracto urinario; lisados bacterianos; Tratamiento de las Infecciones del tracto urinario. 12 Abstract The excessive use of antimicrobials has contributed to the increase of multiresistant bacteria, a problem that hinders the treatment of infectious diseases caused by these microorganisms, the case of urinary tract infections (UTI) are no exception and represent a global public health problem, since their treatment antimicrobial molecules are used, One of these alternatives has been autologous bacterial lysates, of which previous studies have demonstrated their usefulness for the treatment of UTI, however, one limitation is the high cost of production of individual immunogens. The etiology of UTIs may be associated with bacteria such as Escherichia coli, Klebsiella spp. and Enterococcus spp. among others. Even E. coli, the main causative agent, is composed of several antigenic variants. Given the difficulty of finding effective antimicrobials, alternatives are required for the control of UTIs that contribute to improving the patient's clinical conditions. In this work, a bacterial lysate called UNAM-HIMFG was developed, composed of ten serotypes of Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella aerogenes, Enterococcus faecalis, Proteus mirabilis, Citrobacter freundii and Staphylococcus haemolyticus. The safety of the compound was evaluated in cells and in an animal model, as well as its immunogenic capacity by challenging in vitro human and murine macrophages of the J774 A1 line. The results showed that UNAM-HIMFG did not cause cell damage, or physiological, histological or behavioral alterations in the animal model used. The immunogenic activity assay showed that it activated secretion of TNF-α and IL-6, in human macrophages and TNF-α in J7741.A cells. To determine the potential use of the lysate in the treatment of UTIs. BALB/c mice were infected urethrally with E. coli CFT073, urine samples were collected before the challenge and then every week until 60 days were completed. At 96 hours after the challenge, weekly administration of UNAM-HIMFG was started sublingually for 60 days, and the clinical status and evolution of the animals were evaluated by analyzing their behavior. The culture of urine samples from mice treated with UNAM-HIMFG showed the presence of bacteria only until the third week of treatment and the untreated animals persisted with bacteria until the end of the 60-day follow-up. At the end of the assay, bladder samples from untreated animals showed chronic inflammation and bacteria in the submucosa; on the other hand, tissues from mice treated with UNAM-HIMFG showed no alterations. Finally, the immunostimulatory activity of the compound on the animals was analyzed by qPCR from the spleen; the expression of TNFα and IL-10 was quantified in the spleen. The results obtained suggest that the activation of the immune response inhibits the development of the inoculated bacteria and consequently avoids the chronic inflammation that contributes significantly to tissue damage. Therefore, the UNAM-HIMFG lysate has potential as a treatment for UTIs. Key words Urinary tract infections; bacterial lysates; Urinary tract infections Treatment. 13 Introducción Las infecciones del tracto o vías urinarias (ITUs), representan un importante problema de salud pública ya que anualmente a nivel mundial se informan aproximadamente 150 millones de casos (Mlugu et al. 2023). Otros aspectos relevantes es mayor frecuencia en mujeres (70%) y que aproximadamente 25% de las mujeres afectadas pueden presentar una reinfección en un periodo de seis a doce meses que puede evolucionar a cuadros recurrentes (Jacobsen et al., 2008). En México, de acuerdo con el Anuario de Morbilidad 1984 –2020 (DGE 2022), este padecimiento ocupa el 3er lugar entre las 20 principales causas de enfermedad. La información reportada entre 2017-2020 en este documento, refiere en promedio 4,254,968 casos de ITUs por año, con frecuencia de 3443.5 casos. El padecimiento, aunque, se presenta en diferentes etapas de la vida, afecta principalmente a mujeres jóvenes entre los 14 y 40 años. Las ITUs pueden ser agudas de presentación ocasional, o crónicas (ICTU) cuando existe la presencia de por lo menos tres cuadros de ITU en el periodo de un año. (Medina & Castillo-Pino 2019) Por su ubicación anatómica, el tracto urinario de las mujeres es una región que puede contaminarse con bacterias debido a su cercanía con la región perianal, además de una higiene inadecuada, a consecuencia podría haber una posterior infección. Los estudios sobre la patogénesis de las ITU refieren que se inician como infección de la vejiga ocasionada por las bacterias que se encuentran en el perineo, de ahí contaminan la uretra para finalmente ascender la vejiga. En los casos en los que la cistitis no se trata de forma adecuada, las bacterias que colonizan la vejiga pueden ascender por uréteres y ocasionar pielonefritis, que a la postre puede llegar incluso al daño renal permanente. En los casos severos de pielonefritis, las bacterias pueden afectar el epitelio y endotelio en el riñón y si el problema continúa, la bacteria puede pasar al torrente sanguíneo y causar sepsis (urosepsis) que podría complicarse hasta la muerte o secuelas (Beetz et al. 2002, Lin et al., 2003; Hooton 2012, Flores et al. 2015, Wagenlehner 2020, Ambite et al. 2021). Dependiendo de las características del proceso infeccioso y del sitio afectado, las ITUs se clasifican en: 14 Infección del tracto urinario inferior llamada cistitis, que consiste en invasión de la vejiga. Infección tracto urinario superior con afección directa en los riñones que pueden ser no complicadas sin pielonefritis o complicada con pielonefritis (Flores et al. 2015). Además, se pueden presentar las consideradas formas especiales como la prostatitis, epididimitis y orquitis. En relación con el tiempo de evolución se consideran como agudas y crónicas, y por las manifestaciones clínicas en sintomáticas y asintomáticas (Beetz et al. 2002, Wagenlehner 2020, Ambite et al. 2021). El diagnóstico de las ITU se establece con datos clínicos y se confirma a través del examen general de orina; en este se busca la presencia de esterasa leucocitaria, reducción de nitratos a nitritos, cuenta de células inflamatorias (más de 10 células/ campo), eritrocitos y presencia de bacterias, lo anterior en conjunto. Esta prueba tiene una sensibilidad de 75 al 90% y una especificidad de 70 al 82%. El cultivo de orina es el complemento para establecer correctamente la identidad del patógeno responsable del cuadro clínico, aunque, tiene la limitante de que al colectar la muestra debe tenerse cuidado de evitar la contaminación externa. El número de unidades formadoras de colonias (UFC) necesarias para establecer el diagnóstico de ITU está en función del tipo de muestra que se obtiene, sin embargo, se considera que debe ser igual o mayor a 105 UFC/mL. En el diagnóstico además se pueden emplear procedimientos como la urografía excretora con cistograma miccional y el ultrasonido (Wilson y Gaido, 2004). Etiología de las ITUs. La etiología del padecimiento se relaciona con bacterias, parásitos, hongos y virus. las bacterias son responsables del 90% de los casos y de estas, las Enterobacterias (Gram negativas) son las que con mayor frecuencia se asocian al padecimiento, aunque, bacterias Gram positivas también son asociadas con ITUs (Flores-Mireles et al. 2015). 15 Diversos géneros bacterianos en los que se incluyen: Proteus spp., Enterococcus spp., Klebsiella spp. y Staphylococcus spp. (Jacobsen et al. 2008, Flores et al. 2015, Wagenlehner 2020), están relacionadas con ITU, sin embargo, Escherichia coli es el principal patógeno asociado con ITUs. Esta bacteria participa en forma importante tanto en las infecciones de la comunidad (70%-80%), como en las intrahospitalarias (60%) (Foxman 2014, Zhou et al. 2023, Regasa Dadi et al. 2018). El proceso evolutivo de esta bacteria, ha propiciado el surgimiento de diferentes grupos clonales que en la actualidad se clasifica; comensales (aquellos que forman parte del microbiota intestinal de los animales), patógenos intestinales o E. coli diarrogénica (DEC) asociados a diferentes cuadros de diarrea y patógenos extraintestinales (ExPEC) (Kaper et al., 2004, Croxen y Finlay 2010). Aunque el grupo ExPEC, ha conservado la capacidad para mantenerse en la mucosa del intestino sin ocasionar trastornos al hospedero, además, tiene la habilidad de diseminarse y colonizar otros órganos y de manera consecuente ocasionar infecciones extraintestinales como la meningitis neonatal, sepsis, neumonía intrahospitalaria, osteomielitis, infecciones de heridas e infecciones del tracto urinario. Las cepas de Escherichia coli asociadas a ITU se incluyen en el patotipo UPEC o uropatógena (Russo y Johnson. 2000, Croxen y Finlay 2010). Previo a los avances en los métodos moleculares, el empleo de pruebas serológicas era de gran importancia para la diferenciación de los grupos patógenos de E. coli (Orskov & Orskov 1992, Nataro & Kaper 1998). En estas pruebas se analizan diferentes antígenos, uno de los más utilizados es el antígeno somático (O) que forma parte de la membrana externa de la bacteria. En la actualidad se conocen 187 variedades y se emplea para definir el serogrupo. En las cepas UPEC, además se pueden buscar los antígenos capsulares K1, K2 y flagelares (56 variedades). Entre los serogrupos de E.coli se han identificado algunos que con mayor frecuencia se relacionan con la etiología de las ITU (O1, O2, O4, O6, O7, O15, O18, O25, O75, O83 y O175), por lo que se denominan UPEC clásicos (Kõljalg et al. 2009, Ahumada et al. 2020, Hernández et al. 2021). 16 Las cepas UPEC al igual que las pertenecientes a otros tipos patógenos de E. coli presentan lo que se ha definido como factores o componentes de virulencia identificados en plásmidos e islas de patogenicidad (Naderi et al. 2016). La expresión de estos le confiere a la cepa que los porta propiedades como la capacidad para adherirse a las células del epitelio uretral por medio de fimbrias (P, S, tipo I, curli), o adhesinas afimbriales (Afa) y por acción de proteínas de membrana externa (Omp). Otros genes que presentan algunas de las cepas UPEC se son de alfa-hemolisina (HlyA), el factor citotóxico necrotizante (Cnf) o proteínas autotransportadas como las serinas proteasas Pic y Sat, también presentan sistemas para captación de hierro (aerobactinas, salmoquelinas y yersibactinas) y enzimas para su metabolismo, componentes que contribuyen para que la bacteria pueda colonizar áreas estériles del hospedante (Ejrnæs 2011, Flores et al. 2015). Infecciones Recurrentes del Tracto Urinario (IRTU). En algunos casos después de tres a seis meses de presentar un cuadro inicial de ITU, los pacientes pueden sufrir una nueva infección. La recurrencia de este padecimiento se relaciona con la edad y el número de episodios infecciosos previos, Se ha identificado que cuando existe el antecedente de un episodio previo, la tasa de recurrencia en el primer año es del 25% y esta se incrementa hasta el 75% cuando son más de dos en el mismo año (Conway 2007). Las consecuencias importantes de las IRTU son alteraciones de la función renal; al respecto Hoberman et al. (2003) y Lin et al. (2003), refieren que el primer cuadro de pielonefritis aguda puede ser causa de daño renal en el 10% y en 57% de los casos de reinfecciones. Existen diferentes factores de riesgo para que se presenten IRTU, en los niños el reflujo urinario con o sin micción disfuncional es uno de ellos (Beetz et al. 2002, Zorc et al. 2005). Es necesario señalar que cuando se presentan cuadros recurrentes es importante definir si es el mismo microorganismo (bacteria con las mismas características) el responsable de la IRTU, si es el caso se define como infección persistente, por el contrario, si se trata de un microorganismo diferente se considera como reinfección 17 (Pigrau 2005, Minardi et al. 2008, Naber et al. 2010, Malik et al. 2018, Hérnandez- Chiñas et al. 2023). Estudios histológicos en modelos y en pacientes han mostrado la presencia de reservorios de bacterias intracelulares que persisten por semanas y meses en el epitelio uretral, asimismo, se han identificado en células de mujeres con cistitis la presencia de bacterias en estructuras semejantes a biopelículas. Estas observaciones confirman que algunas variantes de UPEC invaden el urotelio y conforman reservorios de bacterias y a partir de estos ocasionan las Infecciones Persistentes del Trato Urinario (Anderson et al. 2003, Kerrn et al. 2005, Rosen et al. 2007). La capacidad de adhesión a los epitelios y la formación de biopelículas, son funciones de la bacteria que evitan su eliminación del tejido que coloniza e incluso interfieren con el efecto de los antimicrobianos. (Mulvey et al. 2001, Mysorekar et al. 2006, Hunstad et al. 2010, Flores et al. 2015). Tratamiento y control de las infecciones del tracto urinario Antimicrobianos Es primordial emplear un tratamiento con un antimicrobiano efectivo que permita controlar las ITU’s para garantizar la erradicación del microorganismo responsable. Actualmente se prescribe el antibiótico de mayor espectro durante un corto período de tiempo (Jancel & Dudas 2002, Kang et al. 2018). La selección del antimicrobiano dependerá del patógeno involucrado, los patrones de sensibilidad a este producto identificado, en la comunidad o en el medio hospitalario, así como de las características del paciente (edad, género, embarazo, localización anatómica de la infección y condiciones de comorbilidad). Por tal situación es que debe considerarse que, para el empleo de cualquier antimicrobiano, se requiere conocer su farmacodinamia, perfil de efectos adversos y facilidad en la administración (Van et al., 2007). La terapia de las ITU con antimicrobianos permite resolver la mayoría de los casos sintomáticos, es bajo esta premisa que existe un esquema de tratamiento con 18 antibióticos (Jancel & Dudas 2002, Kang et al. 2018). Los que con mayor frecuencia se utilizan son: trimetoprima sola o con sulfametoxazol, fluoroquinolonas, nitrofurantoína, amoxicilina con o sin ácido clavulánico, cefalosporinas de segunda y tercera generación y aminoglucósidos. Antes del surgimiento de la resistencia múltiple a los antimicrobianos, en la mayoría de los pacientes las ITUs se controlaban con facilidad, sin embargo, el manejo poco adecuado de éstos medicamentos como lo es administrarlos sin justificación, posología inadecuada, abandono del tratamiento voluntario; por efectos secundarios o intolerancia al medicamento, así como su empleo exagerado en la agroindustria entre otros, son situaciones que han contribuido a la selección de mutantes resistentes que participan en las fallas en el manejo y tratamiento de la mayoría de las enfermedades infecciosas incluidas las ITU (Woolhouse et al. 2015, Lee et al. 2018, Gil-Gil et al. 2019, Esposito et al. 2022 ). Antecedentes sobre la resistencia a los antimicrobianos en ITU Un estudio clínico de ITU realizado en los Estados Unidos de América en 2001, reportó que, en aislados de 10,161 urocultivos, la resistencia a trimetroprima con sulfametoxazol (antibiótico de primera elección) estaba presente en 17% E. coli, Proteus mirabilis, 11% K. pneumoniae y 3% S. saprophyticus (Sahm et al. 2001). En nuestro país en un estudio realizado en el Hospital Infantil de México “Federico Gómez” (HIMFG), en el que se evaluaron 179 cepas de E. coli aisladas de muestras de orina con diagnóstico de ITU, se documentó resistencia a ampicilina en 79% de los aislados, 39.8% a amoxicilina con ácido clavulánico, 85% al ácido nalidíxico, 50% a trimetropima con sulfametoxazol, 69% a ciprofloxacina, 42% a ceftriaxona y 35% a la gentamicina (Hernández Morales 2015). En otro estudio del HIMFG en el que se analizaron 500 aislados de E. coli de pacientes con ITU, se identificó que 16.40% de las bacterias fueron multi-drogo resistentes y 4.20% extremo drogo resistente. Ambos grupos de bacterias se obtuvieron de pacientes con ITUs complicadas de los servicios de Nefrología, Urología, Unidad de Cuidados Intensivos y Oncología (Ochoa et al. 2016). Lo referido muestra que la resistencia a 19 los antimicrobianos empleados para el tratamiento de las ITU se mantiene con frecuencia elevada y en algunos casos es superior a lo informado en otras partes del mundo. El proyecto designado como Plan Universitario de Control de la Resistencia Antimicrobiana (PUCRA) de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM); da conocer que los niveles de resistencia a ciprofloxacino y cefalosporinas son del 63% y 49% respectivamente. Siendo muy elevados en casos de E. coli involucrada en infecciones del tracto urinario; en el informe también se mostró que más del 80 % de las cepas aisladas a partir de ITUs en hospitales, poseen resistencia a betalactámicos (PUCRA-UNAM 2018). Un estudio más reciente para definir los serogrupos a través de métodos moleculares y la resistencia a antimicrobianos por ensayos in vitro de cepas aisladas de adultos, se identificó que más del 70% de las cepas de E. coli evaluadas presentaban multirresistencia y el 6% de las cepas analizadas mostró extremo-drogorresistencia a dieciocho antimicrobianos evaluados (Hernández-Chiñas et al. 2021). Para conocer la información sobre la resistencia a los antimicrobianos publicada en la República Mexicana relacionada con las ITUs durante el periodo 2007-2021, Ahumada-Cota et al. (2022) mostraron que E. coli, principal agente etiológico de ITUs, presentaba resistencia a todos los grupos de antibióticos utilizados en los diferentes estudios. En la revisión se identificó mayor resistencia hacia las penicilinas (79.1%), seguida por el grupo de las quinolonas y fluoroquinolonas (58.5%). Aunque, en los estudios revisados, también se reportó sensibilidad a carbapenémicos (1.7%) y nitrofuranos (8.7%). Actualmente las bacterias resistentes se categorizan como: Multidrogo-resistente (MDR), las bacterias que se incluyen en este grupo no son sensibles a un agente en tres o más categorías de antimicrobianos; extremodrogo-resistente (XDR), estas bacterias no muestran sensibilidad a un agente en todas las categorías excepto en dos o menos; Pandrogo-resistente (PDR), incluye a las baterías que no son sensibles a alguno de los agentes de todas las categorías de antibióticos (Rozwadowski et al. 2022, WHO 2017). 20 Lo anteriormente referido muestra que la resistencia de las bacterias a los antimicrobianos, representa ya en la actualidad un importante problema de salud pública difícil de controlar (Patangia et al. 2022). Cálculos realizados por la OMS señalan que para el año 2050, una pandemia de proporciones catastróficas será ocasionada por diversas enfermedades infecciosas (WHO 2015, 2024, de Kraker 2016). Ante la dificultad para realizar un control adecuado de las ITU y de otros padecimientos infecciosos, la OMS en 2014 planteó la necesidad de buscar alternativas que ayuden al control y tratamiento de este grupo de padecimientos. En el caso específico de las ITU se han explorado diversas posibilidades para lograr su control, entre ellas el uso de extractos de productos naturales como el arándano y el empleo de mezclas de bacterias entre otros (WHO 2015, Schmidhammer et al. 2002, Hopkins et al. 2007, Brumbaugh and Mobley 2012, Lorenzo-Gómez et al. 2013). Tratamientos alternativos para el control de las Infecciones crónicas del tracto urinario (ICTU) Está demostrado que las vacunas representan uno de los principales procedimientos para el control de algunas enfermedades infecciosas, sin embargo, la gran diversidad antigénica que las bacterias presentan complica la elaboración de una vacuna universal (Brown et al. 1994, Servín-Blanco et al. 2016, Zhaoet al. 2022). Para el caso de las ITUs la dificultad se acrecienta no solo por la participación de diferentes microorganismos, también es el hecho que no se requiere realizar inmunización universal, ya que no toda la población es susceptible (Ambite et al. 2021). Es por lo que el enfoque en el caso particular de las ITUs más que profiláctico, debe tener una directriz terapéutica. En este sentido es que se han desarrollado vacunas dirigidas al reconocimiento de diferentes antígenos de las cepas UPEC. Las vacunas multivalentes generadas con diversos componentes de la superficie de la bacteria son consideradas biomoléculas funcionales por su capacidad inmunogénica (Westcott et al. 2024). Los lisados de bacterias descritos en el siglo pasado son compuestos con estas características (Giedrys-Kalemba et al. 2018, Suárez et al. 2020), que, además tienen la ventaja de que se pueden 21 administrar por diferentes vías incluidas intranasal, intravaginal, oral o sublingual, todas ellas de gran relevancia ya que activan el sistema inmunitario de las mucosas del paciente (Brown et al. 1994, Kozlowski et al. 2002, Brandtzaeg 2009, Sánchez Ramón et al. 2020). Lisados de bacterias En un estudio con 25 niños de entre 3-12 años que ITU recurrente, se administró el compuesto denominado OM-89 (un lisado obtenido a partir de 18 cepas de E. coli) en combinación con un antibiótico, mientras que en otros 13 niños solo se administró el antibiótico. Al analizar los resultados, se identificó que la tasa de pacientes con ITU (33%) fue similar en ambos grupos; sin embargo, en los 3 meses siguientes que ya no se administró tratamiento, solo 16% del grupo al que se le proporcionó OM- 89 presentó IRTU en comparación con 54% del grupo testigo que recibió antibiótico (Lorenzo-Gómez et al. 2013). Autovacunas El empleo de autovacunas basadas en bacterias inactivadas por calor para el tratamiento de diferentes enfermedades infecciosas se remonta a la década de 1930, siendo Sir Almroth Edward Wright, pionero en su desarrollo, quien obtuvo excelentes resultados (Gómez-Lus y López 2006). Fue así como, antes del inicio de la terapia con antimicrobianos que se implementó el empleo de las autovacunas o vacunas autógenas como tratamiento alternativo de algunas enfermedades infecciosas, principalmente aquellas ocasionadas por microorganismos difíciles de eliminar. Estos compuestos se elaboran a partir de los microorganismos responsables del padecimiento, se definen como un medicamento biológico capaz de producir una inmunización activa protectora (Agut et al. 1996). Aunque, el mayor número de publicaciones sobre autovacunas con lisados de bacterias se generó en dicha época, existen reportes recientes sobre estudios en niños y adultos (Bauer et al. 2005, Aziminia et al. 2019, Ahumada-Cota et al. 2020, Hernández-Chiñas et al. 2021). 22 La ventaja de las autovacunas sobre otro tipo de productos es que son inocuas y que mejoran la situación clínica del paciente, y no interfieren con el empleo de otras terapéuticas como los antimicrobianos, y el aspecto más relevante de estos compuestos es que mejoran la situación clínica del paciente (Gallego et al. 2011, Lorenzo et al. 2013). Las ITUs al ser un problema importante de salud pública tanto, por las complicaciones a las que pueden conducir, como por la dificultad que actualmente existe para su tratamiento y control, requieren del desarrollo de alternativas para el mejor manejo de pacientes con ICTU. Ahumada-Cota et al. (2020) evaluaron el efecto de lisados de bacterias autólogas aisladas de pacientes adultos con ICTU administradas por vía oral, con la intención de estimular el tejido linfoide asociado a mucosas. Los resultados mostraron que a partir del segundo mes de administrar el lisado de bacterias hubo control de la infección y se observó ausencia de reinfecciones entre 7 meses y más de un año. El mismo diseño de estudio, pero en niños de diferentes edades (≤18 años) con ICTU, mostró resultados similares (Hernández-Chiñas et al. 2021). En ambos trabajos, aunque se aislaron diferentes bacterias, la que se aisló con mayor frecuencia fue E. coli (78.7%). En ambos estudios se realizó la caracterización antigénica de la bacteria definiendo el serotipo, analizando la sensibilidad a los antimicrobianos y evaluando la presencia de genes de virulencia y los correspondientes para conocer el filogrupo al que pertenecían. Los datos referentes a la sensibilidad a los antimicrobianos mostraron que más del 80% de las cepas de E.coli estudiadas eran multirresistentes y que antes del empleo de la autovacuna la respuesta al tratamiento con quimioterapéuticos antimicrobianos era limitada presentando cuadros de recurrencia con alta frecuencia. Justificación El anuario de epidemiología de la Dirección General de Epidemiología muestra que las ITU se ubican en el tercer lugar entre las 20 principales causas de enfermedad en México, padecimiento cuyo tratamiento es cada vez es más difícil de llevar a cabo debido a la gran incidencia de cepas resistentes. Por otro lado, al ser un 23 problema que puede hacerse crónico, con frecuencia es causa de complicaciones graves que pueden concluir con la incapacidad de los pacientes e incluso ser causa de muerte. Ante tal panorama, se requiere la búsqueda de alternativas para su tratamiento y control, situación que ha sido planteada por la OMS. Ante la falta de antimicrobianos nuevos contra los que no se seleccionen cepas resistentes en poco tiempo, se requiere de alternativas viables que no sean costosas. Las vacunas multivalentes generadas con diversos componentes de la superficie de la bacteria son consideradas biomoléculas funcionales por su capacidad inmunogénica, los lisados de bacterias son compuestos con estas características que, al ser administrados por vía intranasal, intravaginal, oral o sublingual, activan el sistema inmunitario de las mucosas del paciente. Los lisados bacterianos autólogos o autovacunas, son compuestos que han mostrado ser efectivos para el tratamiento y control de las ITU; sin embargo, por ser productos personalizados tienen un costo elevado, lo que dificulta su uso rutinario. Ante ello una alternativa es el desarrollo de un inmunógeno múltiple polivalente, que pueda ser de utilidad en la mayoría de los pacientes con ICTU. Trabajo desarrollado en dos proyectos previos en el laboratorio de Patogenicidad Bacteriana (Facultad de Medicina UNAM/Hospital Infantil de México Federico Gómez), en los que se realizó el seguimiento de pacientes con ICTU durante un año, se identificaron en niños y adultos las cepas de bacterias más comunes relacionadas con el padecimiento. La información recabada permitió definir qué cepas de diferentes géneros pudieran ser utilizadas para elaborar un inmunógeno múltiple polivalente. Previo a ello para evaluar su eficiencia e inocuidad es necesario seguir la dinámica para el desarrollo de un producto de uso médico, que pueda ser utilizado sin contraindicaciones para su uso en humanos. Ante esta situación, y como parte de un estudio preclínico en este trabajo se propuso implementar ensayos primero, in vitro y posteriormente en un modelo animal, que permitan evaluar el uso potencial, eficiencia, inocuidad y actividad protectora de un inmunógeno polivalente útil para el control y tratamiento de ITU crónicas. Hipótesis Un inmunógeno compuesto por una mezcla de lisados obtenidos mediante lisis térmica de cepas de E. coli uropatógena de diferentes grupos antigénicos, Klebsiella 24 spp., Citrobacter freundii, Enterococcus faecalis y Staphylococcus spp., aisladas en México, administrado por vía oral, controlará y eliminará la infección en ratones infectados por vía uretral con cepas uropatógenas, sin provocar efectos colaterales. Objetivo general Diseñar y evaluar un inmunógeno múltiple-polivalente para tratamiento y control de infecciones del tracto urinario empleando un modelo murino. Objetivos específicos - Seleccionar las cepas de alta incidencia en México, con perfiles de multirresistencia, genes asociados a virulencia e involucradas en ITU. - Estandarizar los procedimientos para preparar los lisados de bacterias (inmunógeno) a partir de las cepas seleccionadas. - Caracterizar la concentración de los componentes (proteínas, azúcares, LPS) de los lisados bacterianos - Evaluar la respuesta inmune inducida por el lisado de bacterias (monovalente y múltiple polivalente) en un modelo in vitro por medio de cultivo primario de monocitos humanos. - Evaluar la respuesta inmune inducida por el lisado de bacterias (monovalente y múltiple polivalente) en un modelo in vitro en la línea celular J774.1A. - Desafiar por infección inducida a diferentes líneas de ratones con cepas uropatógenas de Escherichia coli (UPEC) empleando condiciones reportadas en la literatura. - Analizar la respuesta a la infección inducida evaluando el cultivo bacteriano de orina de los ratones desafiados antes y después de la administración oral del lisado de bacterias. - Analizar la respuesta inmune innata y específica. - Evaluar el daño en los tejidos de los diferentes grupos de ratones evaluados. 25 Los animales no son como humanos, si tenemos que pelear, peleamos, si tenemos que matar, matamos. No usamos el ingenio para buscar formas de hacer sufrir a otras criaturas… Richard Adams Watership Down 26 Material y métodos Bacterias. Las cepas utilizadas se obtuvieron del cepario del Laboratorio de Patogenicidad Bacteriana (Facultad de Medicina UNAM/Hospital Infantil de México Federico Gómez), se seleccionaron 10 cepas de E. coli, siete de serogrupos clásicos y tres considerados endémicos. Además, se incluyeron una cepa de cada una de las siguientes especies: Klebsiella pneumoniae, Klebsiella aerogenes, Citrobacter freundii, Proteus mirabilis, Staphylococcus haemolyticus y Enterococcus faecalis. Las bacterias seleccionadas fueron las que se aislaron con mayor frecuencia de las muestras de orina de pacientes evaluados en dos estudios prospectivos previos de ICTU (Ahumada-Cota et al. 2020, Hernández-Chiñas et al. 2021). Las cepas seleccionadas, cuyo almacenamiento era en medio de preservación, se recuperaron en agar Luria-Bertani (LB) y medio MacConkey (McC) (Bioxon, Cuatitlán Izcalli, Edo. Mex., México) en el caso de las (enterobacterias) o agar Manitol con Sal (Bioxon, Cuatitlán Izcalli, Edo. Mex., México) para (Staphylococcus spp.) y medio agar Bilis con esculina y azida de sodio (Merk, MA, USA) para (Enterococcus spp). La identidad de las bacterias se confirmó por su perfil bioquímico (Jang 1986, Barrow et al. 1987). Sensibilidad a los antimicrobianos La sensibilidad a los antimicrobianos se realizó por difusión en agar Müeller- Hinton (Bioxon, Cuatitlán Izcalli, Edo. Mex., México) (Bauer et al. 1966) con sensidiscos (Oxoid, Sigma-Aldrich, Louis, MO, USA) impregnados con los siguientes antimicrobianos: ampicilina (10 µg), mecilinam (10 µg), amoxicilina con ácido clavulánico (20 µg/10 µg), piperacilina con tazobactam (100 µg/10 µg), cefozolina (30 µg), cefamandol (30 µg), cefepime (30 µg), cefoperazona (75 µg), cefoxitina (30 µg), ceftriaxona (30 µg), ceftazidima (30 µg), cefuroxima (30 µg), meropenem (10 µg), nitrofurantoína (300 µg), aztreonam (30 µg) (excepto en Gram positivos), gentamicina (10 µg), amikacina (30 µg), kanamicina (30 µg), trobramicina 27 (10 µg), estreptomicina (10 µg), tetraciclina (30 µg), ofloxacino (5 µg), ciprofloxacina (5 µg), norfloxacina 10 (µg), ácido nalidixico (30 µg), trimetroprima con sulfametoxazol (1.25 µg/23.75 µg), sulfonamidas (250 µg), trimetroprima (5 µg), cloranfenicol (30 µg) y fosfomicina (200 µg), además de vancomicina (30 µg) en el caso de los Gram positivos de uso en infecciones del tracto urinario de acuerdo con lo recomendado por el CLSI (CLSI 2021). La interpretación de los antibiogramas se realizó midiendo los halos de inhibición de acuerdo a las especificaciones del manual M100 CLSI (CLSI 2021). Caracterización serológica de E. coli La identificación del serotipo de las cepas de E. coli se realizó en el laboratorio de bacteriología en la Facultad de Medicina de la UNAM, empleando sueros de conejo (SERUNAM) preparados contra 186 antígenos somáticos (O) y 56 para los flagelares (H) a través de aglutinación (Orskov & Orskov 1992). Caracterización genotípica de Escherichia coli El perfil de genes asociados al patotipo UPEC presentes en las cepas de E. coli seleccionadas se definió por ensayos de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Previo al ensayo se realizó la extracción de ADN por el procedimiento de tiocianato de guanidina descrito por Pitcher et al. (1989), con modificaciones hechas por Acevedo-Monroy et al. 2022. El DNA obtenido se reconstituyó con 50 μL de agua MiliQ (Milipore, MA, USA) y se almacenó a -20°C hasta su uso; la concentración del ADN se ajustó a 100 ng/μL. El ensayo de PCR para genes de virulencia se realizó con los iniciadores empleados en dos estudios previos (Anexo 1, Cuadro 1) (Hernández-Chiñas et al. 2021, Hernández-Chiñas et al. 2023) y otros utilizados como complemento con el objetivo de caracterizar el pérfil patógenico de E. coli (Johnson et al. 2000, Rodriguez-Siek et al. 2005, Boisen et al. 2009) empleando los iniciadores específicos para cada gen (Anexo 1 Cuadro 1). Para los ensayos de PCR Se utilizó PCR Master Mix (2X) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) con 0.2 nM de cada primer. Para los filogrupos se utilizó el 28 procedimiento de PCR múltiple reportado por Clermont et al. (2000). A todas las reacciones se les agregó 200 ng de ADN. Cada tubo con su mezcla se colocó en la placa se amplificaron con el termociclador (Techne 3Prime, Thermo Scientific Fisher, Waltham, MA, USA USA; MiniAmp Thermal Cycler, Applied Biosystems, Thermo Scientific Fisher, Waltham, MA, USA siguiendo las condiciones para la amplificación indicadas en el Anexo 1 Cuadro 2. Los amplificados se analizaron en geles de agarosa al (1.5%), realizando electroforesis en amortiguador de borato sódico (SB) a 60 o 100 v durante (60 o 30 minutos respectivamente). En estos ensayos las cepas de referencia fueron: E. coli UPEC CFT073 (ATCC 700928), E. coli K12 HB101 (ATCC 33694), E. coli (ATCC 25922), E. coli de aves APEC 1331 y APEC 1336 colección del laboratorio. Obtención del lisado bacteriano polivalente Curvas de crecimiento de bacterias seleccionadas Se analizaron los perfiles de crecimiento de los diferentes microorganismos que integraran el inmunógeno seleccionados para elaborar el lisado polivalente al que se denominó UNAM-HIMFG, para ello, las bacterias en forma individual se cultivaron en agar LB que se incubó 24 h a 35 °C ± 2 ºC, a partir del desarrollo del cultivo se seleccionaron cinco colonias que se inocularon en 7.5 mL de caldo LB incubando a 37 ºC ± 2ºC por 16 h en agitación (200 rpm). De los cultivos de las bacterias preparados se tomaron 2 µL para inocularlos en 200 µL de caldo LB colocados asépticamente en una placa de 96 pozos (Costar Corning, Corning, Austin, TX, USA), la placa fue incubada 37 ºC sin agitación y se realizaron lecturas (O.D. 600 nm) durante 8 h cada hora en espectrofotómetro (Epoch BioTeK, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Como blanco se utilizó medio de cultivo sin inocular. Los datos de crecimiento bacteriano fueron empleados para elaborar el lisado polivalente utilizando el procedimiento descrito por Ahumada et al. (2020) con modificaciones. Brevemente: con cada bacteria (E. coli, K. pneumoniae, K. aerogenes, P. mirabilis, S. haemolyticus, E. faecalis) se preparó un pre-inóculo a 29 partir de 5 colonias en 7.5 mL de caldo LB para optimizar la adaptación del microorganismo al medio líquido, el cual se incubó 37 ºC durante 16 h, posteriormente se transfirieron a 200 µL del cultivo a 200 mL de LB incubando (37 ºC ± 2ºC) en agitación constante a (200 rpm) hasta alcanzar la fase exponencial de crecimiento (3.5 -4 h en el caso de las bacterias Gram negativas, 6 – 8 h en el caso de los Gram positivos). La masa bacteriana se obtuvo por El cultivo se centrifugó (4000 g/ 60 min), el sobrenadante fue desechado para posteriormente realizar tres lavados suspendiendo el paquete de bacterias cada ocasión en 30 mL de solución salina fisiológica (SSF)(Pisa, CdMx, México). Una vez eliminado el sobrenadante del tercer lavado, la pastilla de bacterias se reconstituyó con 25 mL de SSF y la suspensión de bacterias se ajustó a un valor de 0.582 con en una densidad óptica (O.D.) a 600 nm, equivalente a aproximadamente (9 X 108 UFC/mL) (Murray 1999). El procedimiento se realizó a todas las bacterias seleccionadas. Con la concentración definida de cada microorganismo, estos se mezclaron en 200 mL de SSF. Para la inactivación de las bacterias se colocó el frasco con la mezcla bacteriana en un volumen de 250 mL en una autoclave hasta obtener vapor saturado (110 ºC) durante una hora manteniendo la presión a 6.4 psi (0.45 kg/cm2) (Felisa). Una vez inactivada la mezcla de bacterias se atemperó a 20 ºC para centrifugar (4000 g/1 h) y obtener el sobrenadante, para corroborar el proceso de inactivación se realizaron pruebas de de pureza biológica, colocando 100 µL de los lisados en agar sangre, caldo tioglicolato y agar Sabourad dextrosa (Bioxon, Cuatitlán Izcalli, Edo. Mex., México) (Parveen et al. 2011). Una vez que las pruebas de esterilidad fueron satisfactorias el sobrenadante se filtró con membranas de (nitrocelulosa o fluoruro de polivinilideno) [PVDF] de 0.22 µm diámetro (Merk Millipore, Darmstadt, Germany). En forma paralela se prepararon lisados monovalentes de E. coli de los serogrupos O25 y O20, K. pneumoniae y E. faecalis (de los cultivos previamente seleccionados), siguiendo la metodología descrita. Cada uno de los lisados esterilizados se envasó en gabinete de bioseguridad II, dispensando en frascos viales de 5 mL, previamente horneados (170 ºC/2 h.) y esterilizados en autoclave. Los frascos con los lisados se sometieron a pruebas de de pureza biológica (Parveen et al. 2011). Después fueron almacenados a 4 ºC hasta su uso. 30 Componentes del lisado polivalente Para conocer la concentración de proteína de los lisados preparados (UNAM- HIMFG), polivalentes y monovalentes se utilizó el método colorimétrico de Bradford (Bio-Rad Protein Assay, Hercules, CA, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las proteínas de los compuestos se precipitaron con ácido tricloroacético (TCA) de acuerdo con lo descrito por Link et al. (2011) realizando algunas modificaciones: a 500 µL de lisado de bacterias se le añadió un volumen de TCA al 20 % y se incubó en hielo por 20 min, se centrifugó a 13,000 g/20 min para retirar el sobrenadante y la pastilla con proteína se lavó con 3 volúmenes de acetona fría, nuevamente se centrifugó (11,000 g/5 min), el sobrenadante se decantó y el botón se secó en incubadora (37 ºC/10 min) y se reconstituyó con 500 µL de solución salina fisiológica con 0.01 N de NaOH. La concentración de proteínas se evaluó con el ensayo colorimétrico referido realizando las lecturas a una longitud de onda de 595 nm y tomando como patrón de referencia una curva de concentración de albúmina sérica bovina. El pH de los inmunógenos se definió con tiras reactivas (Hydrion) colocando 10 µL del producto en la tira. La concentración de peptidoglicano y lipopolisacárido de los lisados se analizó por inmunoensayo enzimático con el kit de ELISA (Abbexa LCC; Houston, Tx USA), considerando las instrucciones del fabricante. Para la concentración de carbohidratos se empleó el método colorimétrico fenol-ácido sulfúrico (Dubois et al. 1956). Muestras de los lisados (polivalente y monovalente) se ajustaron a 200 μg de proteína, a estas se les adicionaron 5 μL de fenol al 80 % y 500 μL de H2SO4. Se incubaron durante 20 min a 30°C. Posteriormente, se leyó a una absorbancia de 490 nm (Dubois et al. 1956). Todos los ensayos se realizaron tres veces por duplicado. El perfil proteico de los lisados preparados (monovalentes y polivalente) se analizaron por electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida al 12 % con duodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE). Para ello en cada pozo del gel se colocó 31 una concentración aproximada de 20 µg/mL de proteína, los perfiles proteicos obtenidos en los geles se analizaron realizando tinción con nitrato de plata de acuerdo con lo descrito previamente (Chevallet et al. 2006, Laemmli et al. 1970). Inmunogenicidad de los lisados Con la intención de conocer si el suero de pacientes inmunizados con lisados autólogos monovalentes (Ahumada-Cota et al. 2020, Hernández-Chiñas et al. 2021), reconocían alguna de las fracciones de proteína del lisado UNAM-HIMFG, se realizaron ensayos de SDS-PAGE y Western-blot. Para esto se elaboraron geles de poliacrilamida al 12 % y las fracciones separadas fueron trasferidas a membranas de nitrocelulosa (Amersham Protran), con buffer de transferencia (Tris base 25 mM, Glicina 192 mM y SDS 0.1%) a 100 volts durante de 60 min a 4 ºC. Concluida la transferencia se realizó la saturación de los espacios libres con leche descremada al 5% incubando 30 minutos a temperatura ambiente en agitación constante, posteriormente las membranas se lavaron con solución amortiguadora de fosfatos (PBS) + Tween 20 (0.05 %). Para identificar si había reconocimiento se añadió una mezcla de anticuerpos obtenidos de un paciente tratado con inmunógeno autólogo preparado con E. coli O25 (1:50). Como control negativo se utilizó suero de individuos con ITU crónica pero no tratados con inmunógeno (1:50), para visualizar la reacción se empleó un anticuerpo secundario anti-humano obtenido en conejo marcado con peroxidasa de rábano picante (1:1500), después se reveló la reacción a través de peróxido de hidrógeno. Como complemento para evaluar si el procedimiento de elaboración del lisado UNAM-HIMFG era reproducible, se analizó por SDS-PAGE y Western-blot la presencia de OmpA en tres lotes del lisado utilizando anticuerpos de conejo anti-OmpA (1:250), como anticuerpo secundario se usó IgG anti-conejo derivada de cabra, marcado con peroxidasa de rábano picante (1:1500) (Ahumada-Cota et al. 2020). 32 Actividad citotóxica de los lisados en células en cultivo. Para este ensayo se utilizaron las líneas de cultivo celular J774A.1 (ATCC TIB-67) de macrófagos de origen murino, 293 [HEK-293] (ATCC CRL-1573), células epiteliales de riñón de origen humano, células Caco-2 (ATCC HTB-37) células epiteliales de colon humano, cultivadas en medio RPMI (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,USA) suplementado con suero fetal bovino 10 %, glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1mM, penicilina-estreptomicina-gentamicina-anfotericina B (100 UI / 100 μg / 100 μg / 2 μg /mL) incubadas a 37º C con 5 % de CO2. Aproximadamente 3x105 células de cada línea se colocaron en placas de 24 pozos, a cada pozo se añadieron 100 ng/mL de proteína del lisado polivalente UNAM-HIMFG y de los monovalentes de E. coli O25, K. pneumoniae, E. faecalis (Pfister et al. 1992, Rocha-Ramírez et al. 2016). De manera individual, además, se inocularon células con Lipopolisacárido de Salmonella Enteritidis (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,USA) a concentraciones de 100 ng/mL y 1 µg/mL, como control positivo se utilizó sulfóxido de dimetilo (DMSO) a 1.5 M y como control negativo medio RPMI. Las placas se incubaron a 37°C por 24 horas con 5 % de CO2, concluido el tiempo de incubación las células se evaluó analizando el efecto citopático (vacuolización, formación de sincitios), despues las células fueron disgregadas con PBS-EDTA 4 mM o Tripsina EDTA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,USA) por 10 min a 37 º C con 5 % de CO2. Las células disgregadas se tiñeron con Azul tripano al 0,4 % (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,USA) y posteriormente se observaron y cuantificaron en cámara de Neubauer, y se determinó muerte a través del conteo de células viables (Strober et al. 2001), el ensayo se evaluó por tres diferentes observadores y se asignó el siguiente puntaje en cuanto a sobrevivencia o daño observado 0: 85 - 100% (sin daño), 1: 26 - 84 % (daño), 2: 11 - 25 %, 3: 0 - 10 % (citotóxico). Citotoxicidad in vitro evaluada con MTT y XTT. Un cultivo de tres pases con células HEK-293 fue llevado a una confluencia en crecimiento de 85 – 95 %, las células fueron disgregadas de la botella de cultivo 33 empleando PBS y Tripsina 4 mM + EDTA (0.25%) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,USA) por 5 min, fueron recogidas y centrifugadas a 300 g por 5 min a 25 ºC. Aproximadamente 50,000 células/mL por pozo fueron colocadas en placas de 96 pozos e incubadas por 96 h a 37 ºC con 5% de CO2. En cada pozo se colocaron 100 ng/mL del lisado usando como referencia la concentración de proteína, siguiendo la secuencia referida en los ensayos de actividad citotóxica, incluyendo además un control positivo adicional con Tritón X-100 (0.01% v/v). Al igual que en el ensayo previo, las células se incubaron 24 h a 37 ºC con 5% de CO2, al concluir el tiempo de incubación las células se lavaron dos veces con SSF (37 ºC). El ensayo de MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) (Roche, Basel, Switzerland) y XTT (2,3-bis-(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazolio-5- carboxanilida) (Roche, Basel, Switzerland) se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante. La incubación con los reactivos se realizó durante 24 h, al concluir el tiempo se realizaron las lecturas a densidad óptica de 500 nm y 600 nm, para MTT y XTT, respectivamente, tomando como referencia la absorbancia de las células sin estímulo como el 100 % de viabilidad. El ensayo se realizó 3 veces por duplicado (Lagha et al. 2012). Ensayos in vitro para conocer la actividad inmunogénica de los lisados UNAM- HIMFG y monovalentes. Se utilizaron monocitos de humano y macrófagos de origen murino J7741.A (ATCC TIB-67). Los monocitos se obtuvieron por el procedimiento descrito por Rocha- Ramírez et al. (2016). Los monocitos purificados (1x105 monocitos/mL) se diferenciaron en macrófagos mediante el cultivo de las células durante 72 horas en placas de 24 pozos (Costar, Corning, Corning, Austin, TX, USA). Los macrófagos murinos J7741.A (ATCC TIB-67) se cultivaron en medio RPMI (Sigma-Aldrich) suplementado con 10 % de suero fetal bovino, glutamina 2mM, piruvato de sodio 1mM, penicilina-estreptomicina-gentamicina-anfotericina B (100 UI /100 μg /100 μg / 2 μg / mL) hasta obtener confluencia de 85 - 95%, la monocapa de células se disgregó con solución amortiguadora de fosfatos (PBS) pH 7.0 - 7.2 con 4 mM de EDTA. 34 Las placas con los macrófagos humanos y murinos se desafiaron con concentraciones decrecientes con respecto a proteína de 100 ng/mL, 10 ng/mL y 1 ng/mL de los lisados; UNAM-HIMFG, E. coli O25:H4 y E. faecalis. Como controles se colocaron lipopolisacárido de Salmonella Enteritidis (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA) 100 ng/mL, Polimixina B y los lisados tratados con polimixina B (Sigma-Aldrich St. Louis, MI, USA) (100 ng/mL de estímulo + 100 ng/mL Polimixina B). Una vez que las células fueron estimuladas con los extractos, se incubaron 24 h a 37 ºC con atmósfera de 5% de CO2. Concluida la estimulación, el sobrenadante fue cosechado y conservado a -70 ºC hasta su uso. Se evaluaron las citocinas; TNFα, IL6 e IL10 presentes en los sobrenadantes con los Kits comerciales ELISA Ready-SET-Go! (Thermo Scientific Fisher, Waltham, MA, USA) y HUMAN ELISA Set (Becton-Dickinson, East Rutherford, NJ, USA), siguiendo las instrucciones del fabricante. La concentración de las citocinas en los sobrenadantes se definió extrapolando los datos obtenidos en curvas estándar de cada citocina, los ensayos se realizaron por duplicado. Ensayos en modelo animal (ratones) Acuerdos de ética Todos los ensayos con animales fueron realizados de acuerdo con las técnicas específicas para la producción, cuidado y uso de animales de laboratorio descritos en la NOM-062-ZOO-1999 (DOF 2001). Previo al inicio del estudio los proyectos fueron evaluados y aprobados por: Subcomité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de Experimentación (SICUAE) [SICUAE.DC2020/3-1]; Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, UNAM. Comité Interno para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio (CICUAL) [CICUAL 002-CIC.2021]. Facultad de Medicina UNAM y los Comités de Ética de la División de Investigación de la Facultad de Medicina UNAM [FM/Dl/013/2021], e Investigación, Ética y Bioseguridad del Hospital Infantil de México Federico Gómez [HIM-2023-008]. 35 Inocuidad del lisado UNAM-HIMFG en ratón. Para el ensayo se emplearon seis ratones hembra de seis a ocho semanas de edad de la cepa BALB/c. Los animales fueron criados y alojados en la unidad de bioterio del Hospital Infantil de México Federico Gómez (HIMFG), mantenidos en esterilidad en cajas de policarbonato colocadas en un rack con 20 cambios de flujo de aire por hora, humedad relativa de 45 a 65 % a una temperatura de 18 - 22 ºC. A cada grupo de animales, se le administró por vía oral 200 µL del lisado polivalente (UNAM- HIMFG) o SSF, con sonda gástrica rígida de acero inoxidable de calibre 22G en condiciones de esterilidad, semanalmente. Los animales se mantuvieron durante 60 días y al concluir el periodo se les practicó eutanasia (previa anestesia con xilacina en asociación a ketamina 100 mg/kg y 5 mg/kg respectivamente), por dislocación cervical de acuerdo con la NOM- 062 - ZOO- 1999 (DOF 2001). Selección de la cepa de ratón para la Infección con E. coli uropatógena Se evaluaron ratones hembra de seis a ocho semanas de edad de las cepas BALB/c, C57BL/6, y la línea CD-1. Los animales fueron mantenidos bajo las condiciones referidas. Microbiota cultivable de orina y heces de los ratones en estudio Previo a realizar los ensayos en animales, se analizó la microbiota cultivable de heces y orina de los ratones siguiendo los procedimientos reportados para la identificación de bacterias (Jang 1986, Barrow et al. 1987). Para el aislamiento, muestras de orina y heces se colectaron en tubos de 0.6 mL estériles (Axygen), las heces se suspendieron en SSF estéril, se cultivaron inmediatamente en Agar para anaerobios con Vancomicina y Agar para Anaerobios con ácido Nalidíxico y se colocaron en bolsas GENbag (Biomérieux, Marsella., France) con un generador de atmósfera anaeróbica GENbag anaer (Biomérieux, Marsella., France). Al mismo tiempo se realizó siembra en Agar Sangre y MacConkey en condiciones de aerobiosis. Las muestras inoculadas se incubaron a 35 ºC / 24 - 48 h. Las colonias 36 aisladas que fueron incubadas en anaerobiosis se transfirieron a caldo tioglicolato e incubaron 35 ºC / 24 - 48h. La identificación se realizó por VITEK MS (Biomérieux, Marsella., France), de los cultivos incubados en aerobiosis se tomaron 10 colonias de McC y de AS, se colectaron colonias con diferente morfología para realizar su identificación (Jang 1986, Barrow et al. 1987). Inóculo para la infección de los ratones La preparación del inóculo se realizó considerando lo reportado previamente (Hannan et al. 2010, Reis et al. 2011, Carey et al. 2016, Zychlinsky et al. 2017). Brevemente: Para la preparación de los inóculos en medio líquido estático se realizó para las cepas CFT073 y O25:H4. Las cepas se cultivaron por separado en medio sólido (AS) incubado 24 h a 37 °C; de cada caja se tomaron 5 colonias que se inocularon en tubos con 7.5 mL de LB, los tubos se incubaron sin agitación a 37 ºC por 16 h. De cada uno de los cultivos se transfirieron 300 µL a dos tubos cónicos (Costar, Corning, Austin, TX, USA) que tenían 30 mL de LB fresco, para incubar nuevamente a 37 ºC durante 24 h. Concluida la incubación, los cultivos se centrifugaron a 5000 rpm (Dynamica) 10 min a 4 ºC, el sobrenadante se eliminó y cada paquete de bacterias se suspendió en 30 mL de PSS estéril agitando hasta disolver y realizar un nuevo ciclo de centrifugado. Los sobrenadantes se desecharon y las pastillas de bacterias se suspendieron en 10 mL de SSF estéril, las suspensiones de bacterias (CFT073 y O25:H4) se ajustaron a una O.D (600 nm) entre 0.080 y 0.100 nm que corresponde aproximadamente a 1–2 x 108 UFC/mL. Al mismo tiempo, las cepas CFT073 y O25:H4 se sembraron por separado por estría cerrada en AS, se incubaron a 37 º C por 24 h. Al concluir la incubación estos cultivos se suspendieron en 20 mL de SSF estéril, para realizar dos lavados y posteriormente el ajuste de inóculos como previamente fue descrito. Para la mezcla de ambos cultivos se tomó 1 mL de cada uno se centrifugaron a 5000 rpm/10 min a temperatura ambiente, los sobrenadantes se eliminaron cuidadosamente y ambos reconstituyeron en 25 µL de SSF estéril. Se ha reportado que antes de realizar la infección los cultivos se incuban 25 ºC por 20 minutos con el propósito de estimular la expresión de la adhesina F9 (Wurpel et al. 2014). La cantidad de bacterias 37 presentes en el inóculo se determinó por conteo de UFC/mL (Unidades Formadoras de Colonias por mL) por el método de Miles y Misra (Ndemueda et al. 2020). Infección del tracto urinario Seis ratones hembra BALB/c, C57BL/6, y CD-1 de cada grupo de 6 a 8 semanas de edad se desafiaron con la cepa UPEC CFT073, para evaluar cuál variedad manifestaba una infección crónica, en la que se mantuviera bacteriuria durante todo el periodo de estudio. Los animales fueron anestesiados por vía intraperitoneal con Xilacina HCl (Xilazina, Aranda, Edo. Mex., México) al 2 % y Ketamina (Ketamin Pet, Aranda, Mex.,Mex.) al 10 % a dosis de; 5 mg/kg y 60 mg/kg respectivamente. El procedimiento se realizó en gabinete de seguridad clase II. Para evitar la desecación de los ojos de los animales durante el procedimiento éstos se protegieron con aceite mineral (Duralágrima, Chinoin, Mex., Mex). Confirmado el plano quirúrgico los ratones se infectaron con 25 µL del cultivo estandarizado utilizando catéteres nuevos y estériles, (para administración intravenosa) calibre 24G (Punzocat Vizcarra, Edo. Mex., México). La introducción se realizó por uretra hasta llegar a la vejiga (aproximadamente 3 mm posterior al meato urinario), a los animales testigo se les administró SSF con la misma maniobra (Hannan et al. 2010, Reis et al. 2011, Carey et al. 2016, Zychlinsky et al. 2017). El seguimiento de los animales se realizó durante 60 días tomando muestras de heces y orina semanalmente hasta concluir el experimento (Kurien et al. 2004). Las muestras de heces y orina se sembraron en agar McC o CLED y AS, para realizar la identificación de microorganismos, para ello se realizó una dilución 1/5 de la orina y se sembró usando una varilla de vidrio, en el caso de las heces se suspendieron en 1 mL de SSF y se diluyó 1 /100. Finalmente se estimó el número de microorganismos presentes en la muestra, después, de cada medio se tomaron 10 colonias y a las identificadas como E. coli se les realizó extracción de ADN y ensayo de PCR para conocer la identidad de los antígenos somático (O) y flagelar (H) (Banjo et al. 2018). Para este ensayo se emplearon iniciadores para amplificar fragmentos de los genes wzy correspondiente al serogrupo O6 y fliC H1 correspondiente al antígeno 1 del flagelo, así como el wzy 38 correspondiente al serogrupo O25 y fliC H4 correspondiente al antígeno 4 del flagelo (Hernández-Chiñas et al. 2019, Banjo et al. 2018). Efecto protector del lisado UNAM-HIMFG Con los resultados obtenidos previamente, se seleccionó la línea BALB/c para los ensayos de infección con UPEC CFT073 y de protección con el lisado UNAM- HIMFG. Siguiendo los procedimientos referidos previamente (secciones Inóculo para la infección de los ratones e Infección del tracto urinario), se integraron los siguientes grupos (N=10/grupo): Grupo 1) [CFT073+UNAM-HIMFG]; 2) [CFT073+SSF], 3) [NI+UNAM-HIMFG]; 4) [NI+SSF], los inóculos para el desafío y el procedimiento para la infección se realizaron como fue mencionado previamente (ver: Infección del tracto urinario). Muestras de orina se colectaron antes y después de la infección y durante el tratamiento. La orina se colecto en tubos de 0.6 mL (Axygen), estériles cada semana hasta completar los 60 días de duración del estudio. Para realizar la cuenta y el aislamiento de bacterias 5 µL de orina se diluyeron (1/5) obteniendo un volumen final de 50 µL para inocular placas de BA (Bioxon, Cuatitlán Izcalli, Edo. Mex., México) y CLED (Oxoid, Basingstoke, Ham.,England). Las placas se incubaron 24 h a 35 ºC y se realizó la cuenta de UFC/mL. Una vez confirmada la infección la identificación de las bacterias se realizó de acuerdo con lo descrito anteriormente. El lisado UNAM-HIMFG se administró a las 168 h post-infección por vía sublingual (Liu et al. 2020). En acuerdo con la anotomía del ratón se introdujo cánula esofágica metálica recta (estéril) de 1.0 pulgada de longitud, calibre 22 G con punta roma conectada a una jeringa estéril de plástico de 1 mL. Inmovilizado el ratón (manualmente), la cánula se pasó a través del diastema y la punta se colocó debajo de la lengua, el lisado se administró en intervalos de 20 a 30 segundos hasta completar un volumen de 0.2 mL (Bosch et al. 1988, Berdanier 2004). El tratamiento se realizó dos veces por semana durante 8 semanas. 39 Activación de la expresión de citocinas en el modelo con animal inducida por el lisado UNAM-HIMFG A los 60 días del ensayo de tratamiento con el lisado se practicó eutanasia de los ratones por dislocación cervical de acuerdo con la NOM-062-ZOO-1999 (DOF 2001), (previa anestesia con xilacina en asociación a ketamina). De los animales se colectaron los bazos en tubos de 0.6 mL estériles (Axygen, Union City.,CA), se almacenaron a -70 ºC hasta su procesamiento. Cada bazo se maceró colocándolo en un filtro celular nuevo (CELLTREAT, Scientific Products, Pepperell MA, USA), después se añadió un volumen de 600 µL de SSF y con un émbolo de jeringa de 5 mL se disgregó el tejido sobre una caja de Petri estéril. El procedimiento se realizó en condiciones asépticas, el macerado se colectó en tubos de 1 mL estériles (Axygen, Union City.,CA) y se procedió a la extracción de mRNA con el Kit PureLink RNA Mini Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante. El mRNA obtenido se cuantificó por espectrofotometría (NanoDrop, Thermo Fisher Scientific, Asheville., NC,USA). El mRNA se trató con DNAsa I de acuerdo con el siguiente protocolo: en tubos de 600 µL se colocaron 10 µg de mRNA, 2 µL de amortiguador para DNase I y 2 U de DNasa I (Thermo Scientific, Vilnius, Vilnius, Lituania), la mezcla se incubó 10 min a 25 ºC en termociclador, después se agregó 2 mM de EDTA y se incubó a 65 ºC durante 15 min para la inactivar la DNasa I. El mRNA tratado se procesó mediante retro-transcripción con QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen, Hilden, North Rhine-Westphalia, Germany) siguiendo las instrucciones del fabricante. Con el cDNA obtenido se realizó la qPCR con el kit SoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) y los iniciadores respectivos (Anexo 1, Cuadro 2). Los niveles de expresión de los genes de TNF-α e IL-10 se midieron empleando como gen constitutivo un fragmento de la secuencia del gen de gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (Gorressen et al. 2015, Devarapu et al. 2017, Suretteet al. 2021, ). Las reacciones se llevaron a cabo en el termociclador AriaMx Real-time 40 PCR System (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), los resultados obtenidos fueron analizados por medio del método de ∆∆CT (Rao et al. 2013). Estudio histológico de tejidos del tracto digestivo Para el análisis histológico del efecto del inmunógeno polivalente en la mucosa gastrointestinal, se colectaron estómago, intestinos delgado y grueso. Para la colecta de los tejidos se realizó una ligadura con hilo de algodón en la porción cardial del estómago y en la porción rectal. Posteriormente se introdujo formaldehído amortiguado a pH 7.0 al lumen digestivo empleando una jeringa de 10 mL con aguja de 24 G, una vez fijado el interior se colocaron los órganos en formalina amortiguada a pH 7.0 para los estudios de histopatología. Los tejidos fijados se fraccionaron e incluyeron en parafina para realizar los cortes y las tinciones de Hematoxilina y Eosina (H y E) (McInnes et al. 2014). Actividad protectora del lisado UNAM-HIMFG en la colonización de tejidos por Escherichia coli uropatógena UPEC Se analizó el efecto protector de UNAM-HIMFG en el establecimiento de bacterias en muestras de vejiga y riñón de los ratones estudiados, por lo que esto órganos se colectaron asépticamente de cada animal. Uno de los riñones y una porción de la vejiga fraccionada de forma medial fueron colocaron en microtubos de 1 mL (Axygen, Union City., CA, USA) y se fijaron con formaldehído (J.T. Baker, Xalostoc, Edo. Méx. Méx) amortiguado al 10% con pH 7.0 – 7.4. Los tejidos se incluyeron en parafina para realizar cortes y tinciones con hematoxilina y eosina (H y E) (McInnes et al. 2014), y con tinción de Sandiford (Leaver et al. 1975) para evaluar alteraciones en los tejidos y la presencia de bacterias, respectivamente. Los riñones y la porción de vejiga que no se trataron con formaldehído se maceraron con el mismo procedimiento referido para el bazo (ver: Activación de la expresión de citocinas en el modelo con animal inducida por el lisado UNAM-HIMFG), se realizaron diluciones en SSF y muestras de éstas se inocularon en AS y CLED, para determinar UFC/mL. 41 Análisis estadístico Se realizaron pruebas de ANOVA con poshoc de Tukey, para ello se empleó la plataforma de R studio versión 8.1. así como GraphPad Prism v10.1.1. 42 ¿Por qué hacen esto? No soy un mal perro. Sean lo que sean los Batas Blancas no son amos. He tenido uno y sé que ellos no lo son… Richard Adams The Plague Dogs 43 Resultados Bacterias seleccionadas para elaborar el lisado polivalente (UNAM-HIMFG) El lisado polivalente UNAM-HIMFG se elaboró con 10 cepas de E. coli, siete de serogrupos clásicos (O25, O75, O6, O8, O1, O16, O7) y tres considerados endémicos (O9, O17 y O20) y con cepas de Klebsiella pneumoniae, Klebsiella aerogenes, Citrobacter freundii, Proteus mirabilis, Staphylococcus haemolyticus y Enterococcus faecalis, que fueron las bacterias aisladas con mayor frecuencia entre los pacientes de dos estudios previos (Ahumada-Cota et al. 2020, Hernández- Chiñas et al. 2021). El ensayo para conocer el perfil de susceptibilidad a los antimicrobianos mostró en todos los microorganismos seleccionados patrones de multirresistencia (Anexo 2 Cuadros 1 y 2). En las cepas de E. coli se evaluó la presencia de genes para definir su filogrupo, encontrando que cinco de las cepas pertenecen al filogrupo B2 (serogrupos: O1, O6, O16, O25 y O75), dos al A (O9, O20), dos D (O7 y O17) y una al B1 (O8). La presencia de genes asociados a virulencia analizada por PCR mostró que las cepas del filogrupo B2 poseen entre 11 y 23 genes siendo los más frecuentes fimH, feoB, sitA, chuA, y ompA mientras que las cepas de los filogrupos A, B1 y D contienen de 2 a 13 genes (Anexo 2 Cuadro 3) . Composición de los lisados Mediante el análisis de las cinéticas de crecimiento de las bacterias seleccionadas, se determinó que las enterobacterias se encuentran en fase exponencial entre las 3.5 y 4 horas post-inoculación. Por su parte, de las bacterias Gram positivas S. haemolyticus mostró crecimiento exponencial a las 8 horas y E. faecalis a las 6 horas. Para contar con parámetros homogéneos al ajustar los inóculos de los lisados en estudio, se analizó la concentración de algunos de sus componentes; proteínas, carbohidratos, LPS y PG (Cuadro 1). En el lisado UNAM-HIMFG la concentración de proteínas fue de 578.22 μg/mL, peptidoglucano 0.2599 ng/mL, lipopolisacárido 173.97 ng/mL, carbohidratos 8656.79 μg/mL. Al comparar la concentración de los mismos compuestos en los lisados monovalentes se observó 44 que el lisado polivalente presentaba concentraciones hasta cinco veces mayores que las obtenidas en los monovalentes, el pH en ambos tipos de lisados fue ácido. Antigenicidad de los lisados monovalentes y polivalente. Estimular la inmunidad innata es un evento primordial para activar la respuesta inmune después de la exposición a cualquier antígeno. Por ello era importante conocer en los lisados (UNAM-HIMFG y algunos monovalentes) la diversidad de sus componentes proteícos empleando SDS-PAGE y la inmunogenicidad de los mismos por Western-Blot (WB). La tinción con plata reveló que los lisados analizados tienen una composición diferente, incluyendo componentes predominantes de los que se pudo estimar su peso molecular aparente (Figs. 1 A y B). La antigenicidad de los componentes presentes en los lisados se analizó utilizando el suero de un paciente tratado con un lisado monovalente preparado con una cepa de E. coli O25:H4 (Ahumada-Cota et al. 2020). El resultado mostró reacción intensa del suero contra el LPS de los lisados; polivalente (UNAM-HIMFG) Cuadro 1. Análisis de la Concentración de macromoléculas de diferentes lisados. Lisado pH Proteína (μg/mL) Peptidoglucano (ng/mL) Lipopolisacárido (ng/mL) Carbohidratos (Hexosas) (μg/mL) Carbohidratos (Pentosas) (μg/mL) UNAM-HIMFG 4 578.22 0.2599 173.97 7822.5 8656.79 Escherichia coli O25:H4 4 25.82 0.0096 1.19 500.08 569.39 Escherichia coli O20:H9 4 33.76 ND ND ND ND Klebsiella pneumoniae 4 23.03 0.0334 1.39 1035.91 835.44 Citrobacter freundii 4 37.27 ND ND ND ND Proteus mirabilis 4 38.04 ND ND ND ND Enterococcus faecalis 4 33.09 0.0171 0 409.06 377.44 Stahpylococcus haemolyticus 4 20.81 0.0788 ND ND ND Abreviaciones: ND, No Determinado; Los valores corresponden a los promedios de experimentos realizados en diferentes momentos 45 y el monovalente de E.coli O25:H4 (incluida en el lisado polivalente), y escaso reconocimiento de una fracción del lisado de E. coli O20:H9 (también incluida en el lisado polivalente) (Fig. 2 A). Sin embargo, no se observó respuesta en el lisado de una cepa de Citrobacter freundii que también forma parte del lisado polivalente (Fig. 2 A). El resultado obtenido muestra que el lisado administrado a un paciente con ITU crónica, activó la respuesta inmune mostrando alta especificidad hacia el LPS presente en el lisado de E. coli O25:H4 utilizado para tratar al paciente de donde se obtuvo el suero, el cual es parte del lisado polivalente UNAM-HIMFG. Sin embargo, el suero de pacientes con ITU pero que no recibieron inmunógeno no reaccionó con ninguno de los lisados (Fig 3 A y B). Figura 1. SDS-PAGE de componentes de lisados polivalente y monovalentes teñido con nitrato de plata. A): Carriles 1) Lisado Polivalente UNAM-HIMFG, 2) E. coli O25, 3) E. coli O20, 4) Citrobacter, B): Carriles 1) Klebsiella, 2) Enterococcus, 3) Staphylococcus, 4) Proteus. MPM: PageRuler Preistained Protein Ladder (ThermoScientific) 46 Figura 2. Inmunotransferencia de lisados polivalente (UNAM-HIMFG) y monovalentes. Los lisados se desafiaron con una muestra de suero obtenida de un paciente previamente tratado con un lisado preparado con E. coli O25. A): Carriles 1) Lisado Polivalente UNAM-HIMFG, 2) E. coli O25, 3) E. coli O20, 4) Citrobacter, B): Carriles 1) Klebsiella, 2) Enterococcus, 3) Staphylococcus, 4) Proteus. MPM: PageRuler Preistained Protein Ladder (ThermoScientific) 47 Detección de proteínas en los lisados En el ensayo de WB se identificó la reactividad del suero empleado con el LPS de los lisados UNAM-HIMFG y monovalente de la cepa E. coli O25. Para conocer si alguno de los componentes presentes en el lisado polivalente correspondía a alguna proteína descrita previamente (Ahumada et al. 2020), se utilizó un anticuerpo policlonal dirigido contra la proteína OmpA de E. coli, demostrando que esta proteína está presente (Fig.4), lo que sugiere que el lisado posee diferentes proteínas potencialmente inmunogénicas. En el este ensayo además se analizaron Figura 3. Inmunotransferencia de lisados polivalente (UNAM-HIMFG) y monovalentes. Los lisados se desafiaron con una muestra de suero obtenida de un paciente sin tratamiento. A): Carriles 1) Lisado Polivalente UNAM-HIMFG, 2) E. coli O25, 3) E. coli O20, 4) Citrobacter, B): Carriles 1) Klebsiella, 2) Enterococcus, 3) Staphylococcus, 4) Proteus. MPM: PageRuler Preistained Protein Ladder 48 tres diferentes lotes del lisado UNAM-HIMFG que presentaron un perfil de reconocimiento similar, corroborando la reproducibilidad del proceso de obtención del lisado. Actividad citotóxica de los lisados Para conocer la inocuidad del lisado UNAM-HIMFG y de algunos monovalentes, se analizó su efecto sobre tres líneas de células en cultivo, una de macrófagos murinos (J774.A1) y otras de epiteliales humanas (Caco-2 y HEK293). El resultado obtenido por medio de la tinción de azul de tripano en las tres líneas de células mostró que ninguno de los lisados bacterianos les ocasionó daño, efecto diferente al inducido por Tritón X-100 o DMSO empleados como controles de efecto citotóxico. Para confirmar la inocuidad de los lisados, se realizaron ensayos de toxicidad con MTT y XTT en la línea HEK293. Los resultados mostraron que los lisados no alteraban la viabilidad de las células como se observó en el control sin tratamiento, situación diferente a lo observado en las células tratadas con Tritón X-100 y DMSO en donde el daño a las células fue total (p< 0.005) (Figs 5 A y B). MPM 1 2 3 Figura 4. Western blot de diferentes preparaciones del lisado polivalente UNAM-HIMFG. La identificación se realizó con anticuerpos polivalentes de conejo obtenidos contra OmpA. Lines: 1, 2 and 3, muestras de diferentes preparaciones de lisado polivalente. (Flecha indica OmpA 35 kDa) MPM: Page Ruler Plus Prestained Protein Ladder. kDa 250 130 100 70 55 35 25 15 10 49 Figura 5. Evaluación de la citotoxicidad de los diferentes lisados en céulas HEK293. Gráfica de promedios de porcentaje de sobrevivencia obtenidos en ensayos de proliferación celular A) XTT se observa un efecto citotóxico completo en DMSO y Tritón, no así en los inmunógenos, comparable con las células con medio RPMI, B) MTT se observa un efecto citotóxico total en DMSO y Tritón, no así en los inmunógenos, comparable con las células con medio RPMI. P <0.005 A B x -20 0 20 40 60 80 100 120 % d e S o b r e v iv e n c ia d e c é lu la s Ensayo de proliferación celular XTT con diferentes inmunógenos, en línea celular HEK293 RPMI UNAM-HIM E. coli O25 K. pneumoniae E. faecalis LPS SE 100 ng LPS SE 1 μg DMSO 1.5 M Tritón X-100 0.01% -20 0 20 40 60 80 100 120 % d e S o b r e v iv e n c ia d e c é lu la s Ensayo de proliferación celular MTT con diferentes inmunógenos, en línea celular HEK293 RPMI UNAM-HIM E. coli O25 K. pneumoniae E. faecalis LPS SE 100 ng LPS SE 1 μg DMSO 1.5 M Tritón X-100 0.01% A B 50 Actividad tóxica del lisado UNAM-HIMFG In vivo Para conocer si el lisado polivalente causa daño a los tejidos del tracto digestivo al administrarlo por vía oral, se utilizó el modelo de infección en ratón. Para este propósito, semanalmente se administraron 200 μL del lisado por vía oral por 60 días. Durante el tiempo de administración del lisado no se observaron alteraciones clínicas (pérdida de peso, cambio en el comportamiento, signos de alteración gastrointestinal, u otras), que sugirieran daño ocasionado por el producto administrado. A los 60 días los animales fueron sacrificados y a los tejidos seleccionados se les realizó estudio histológico. El análisis de los cortes de estómago e intestino confirmó la ausencia de inflamación o lesiones tanto en los animales tratados con el lisado como en los controles a los que se les administró solución salina fisiológica (Fig. 6 A -D). Solución salina fisiológica UNAM-HIMFG D C B A Figura 6. Evaluación histológica de los tejidos de ratones tratados con solución salina fisiológica o con el lisado bacteriano polivalente. A y B) Epitelio estomacal, C y D) Epitelio intestinal. Las muestras se tiñeron con eosina y hematoxilina y se observaron a x400. 51 Actividad inmuno-estimulante de los lisados en modelo celular. La capacidad estimulante de los lisados UNAM-HIMFG y monovalentes de E. coli O25:H4 y O20:H9, K. pneumoniae y E. faecalis sobre la respuesta inmune innata, se probó en la línea celular J774.A1. Estos ensayos muestran que todos los lisados, a excepción del correspondiente de E. faecalis, activan la producción de TNFα con efecto dosis dependiente (Figs. 7 A - D). Para conocer si el efecto estaba dado por LPS, se realizó la neutralización con polimixina B en la que se observó una disminución del 38% en la secreción de TNFα en células tratadas con el lisado UNAM-HIMFG, 45 % con el lisado de E. coli O25:H4, 26% con E. coli O20:H9 y 11% con K. pneumoniae, comparado con la muestra sin tratamiento (Figs. 7 A - D). También se evaluó la producción de IL-10 con resultado negativo para todos los lisados a las 24 h de incubación (p< 0.005) (Dato no mostrado). D E A B C Figura 7. Secreción de TNF-a en macrófagos murinos J774 A.1 con diferentes concentraciones de los lisados. A) UNAM-HIMFG, B) E. coli O 25:H4 y C) E. coli O20:H, D) K. pneumoniae y E) E. faecalis. Los resultados son el promedio de tres ensayos realizados por duplicado. p£ 0.005. SFF: Solución salina fisiológica; PMB: polimixina B 100 µg/µL; LPS: Lipopolisacárido 100 ng/µL. 52 La actividad de los lisados UNAM-HIMFG, E coli O25:H4 y E. faecalis se analizó además sobre macrófagos humanos. En este ensayo se identificó que ambos activan la secreción de TNFα, sin efecto dosis dependiente (Fig. 8 A y B), pero no el lisado de E. faecalis (Fig. 8 C). En el ensayo se evaluó el efecto de la polimixina B sobre la activación de macrófagos, el cual se inhibió en 100 % con el lisado UNAM-HIMFG y 22% en el lisado de E. coli O25:H4 (Fig.8 A y B). En el ensayo, además, se determinó que la producción de IL-6, el efecto de ambos lisados (UNAM-HIMFG y E. coli O25) fue positivo en la secreción de la citocina (Fig. 8 D y E). Al igual que en lo antes referido, la actividad estimulante disminuyo entre el 50 y 60% (Fig. 8 D) posterior al tratamiento con polimixina B. Al igual que en los ensayos previos el lisado de E. faecalis no mostró actividad estimulante (p< 0.005) en la secreción de IL-6 (Fig. 8 F). Figura 8. Activación de macrófagos de humano inducida por los lisados UNAM-HIMFG, E. coli O 25:H4 y E. faecalis para la secreción de TNF-a e IL-6 respectivamente. UNAM-HIMFG (A y D), E. coli O 25:H4 (B y E), y E. faecalis. (C y F). Los resultados son el promedio de tres ensayos realizados por duplicado. p£ 0.005. SFF (Solución salina fisiológica), PMB (polimixina B 100 µg/µL); LPS (Lipopolisacárido 100 ng/µL). A B C D E F 53 Estudio de la microbiota cultivable a partir de ratones Previo a realizar los ensayos de infección experimental, se analizó la microbiota urinaria e intestinal de ratones de las variedades BALB/c, C57BL/6 y CD-1 contemplados para el modelo animal a desarrollar. El cultivo de las muestras de orina en los ratones BALB/c reveló la presencia de Staphylococcus xylosus, Staphylococcus cohnii subesp. urealyticum, Micrococcus luteus y Lactobacillus acidophilus. En las muestras de las variedades C57BL/6 y CD-1 se identificaron Micrococcus luteus y Lactobacillus acidophilus. Con respecto a las muestras de heces en BALB/c se identificaron: Micrococcus luteus, Enterococcus gallinarum, Listeria seeligeri y E. coli, y en C57BL/6 y CD-1 Micrococcus luteus, Enterococcus gallinarum y E. coli. Los aislados de E. coli presentes en heces son serotipo O178:H7, diferente de los serotipos O6:H1 y O25:H4 seleccionados para el experimento. Infección inducida en el tracto urinario de ratones Para determinar la estirpe de ratones que permanece colonizada por más tiempo, ratones C57BL/6, CD-1 y BALB/c fueron infectados con la cepa de UPEC CFT073 (O6:H1). En los ratones C57BL/6 no se observó presencia de bacterias en orina en las primeras cuatro semanas posteriores a la infección; sin embargo, entre la quinta y sexta semana la cuenta de bacterias se incrementó a 1X102 UFC/mL y 8.3 x103 UFC/mL, para bajar a 60 UFC/mL en la semana siete y volver a subir en la semana ocho a 8.3 x103 UFC/mL, lo que sugiere un proceso de infección recurrente (Fig. 9). En ratones CD1 se identificó bacteriuria hasta la semana cuatro post-infección obteniendo cuentas en cada semana de 8.3 x103 UFC/mL. En ratones BALB/c se observó de manera permanente la presencia de bacterias con cuentas de 8.0 x 104 en la primera semana post desafío y, aunque con disminuciones en las semanas subsecuentes, en la semana siete se presentó un incremento similar que al inicio (5x104 UFC/mL). Dado que CFT073 es un aislado obtenido de sepsis asociada a pielonefritis, se consideró conveniente analizar el comportamiento en los ratones BALB/c de un aislado clínico (UPEC O25:H4); sin embargo, con esta cepa los 54 ratones desafiados no se colonizaron. Al finalizar el tiempo de estudio (60 días), los animales se sacrificaron para obtener riñones y vejiga y analizar la presencia de bacterias en ambos tejidos. Los ratones BALB/c y C57BL/6 infectados con la cepa CFT073 presentaron crecimiento de la bacteria solo en vejiga 1.5 x103. El mismo ensayo en los ratones desafiados con O25:H4 no mostró la presencia de la bacteria en riñones o vejiga. UNAM-HIMFG protege contra la colonización por UPEC CFT073 Establecidas las condiciones de infección en ratones BALB/c, se procedió a evaluar el efecto protector del lisado polivalente UNAM-HIMFG. La administración semanal del lisado UNAM-HIMFG o de Solución Salina fisiológica (SSF) como control, se inició a las 96 horas después de la infección. En las muestras de orina de los ratones desafiados con E. coli CFT073 tratados con UNAM-HIMFG se observó la disminución sostenida de UFC/mL durante las primeras cuatro semanas post- tratamiento, y a partir de la semana cinco no se recuperaron bacterias (Fig. 10). Con respecto a los animales a los que se administró SSF las cuentas de UFC/mL se Figura 9. Infección urinaria inducida con cepas UPEC en ratones BALB/c, C57BL/6 y CD-1. El estudio se realizó durante ocho semanas, analizando la presencia de bacterias en orina 55 mantuvieron en diversos periodos hasta arriba de 104 con diferencias significativas (p <0.005) en todas las muestras hasta la conclusión del estudio (Fig. 10). El análisis clínico de los animales de los diferentes grupos no reportó alteraciones en el comportamiento o signos clínicos (diarrea, melena, hematoquexia, anorexia, hiporexia, pirexia, pérdida de peso) que pudieran sugerir la presencia de enfermedad. Efecto inmunoestimulante del lisado UNAM-HIMFG. La expresión de los genes de TNF-α e IL-10 del bazo de los animales desafiados y tratados o no con el lisado UNAM-HIMFG se analizó por qPCR. Los animales que recibieron el lisado UNAM-HIMFG después de haberse infectado con UPEC CFT073 mostraron incremento en la expresión de TNF-α en contraste con lo observado en el grupo control sin desafío ni tratamiento (Fig. 11 A). Los niveles de expresión de TNF-α no presentaron diferencia estadísticamente significativa entre los grupos CFT073+SSF y CFT073+UNAM-HIMFG; sin embargo, si se presentó con los animales que no fueron desafiados y recibieron UNAM-HIMFG (p< 0.005). Figura 10. Permanencia de E. coli CFT073 en orina de ratones BALB/c tratados con el lisado UNAM-HIMFG o con SSF. Abreviaturas: (CFT073+SSF) Infectado con E. coli CFT073 y tratado con SSF; (CFT073 + UNAM- HIMFG) Infectado con E. coli CFT073 y tratado con lisado UNAM-HIMFG. 56 En el mismo ensayo se evaluó la expresión de IL-10 (Fig. 11 B), el resultado mostró que los animales tratados con UNAM-HIMFG desafiados y sin infección (NI), mostraron aumento en la expresión de la citocina sin diferencia estadísticamente significativa entre ambos, pero si (p< 0.005) con los animales desafiados tratados con SSF o UI (CFT073+SSF y NI+SSF). Lisado UNAM-HIMFG protege contra la colonización en tejidos El efecto protector del lisado UNAM-HIMFG fue también evaluado mediante un estudio histopatológico de tejido de vejiga y riñón de animales infectados y tratados (CFT073+UNAM-HIMFG) y a los que se administró solución salina (CFT073+SSF). En los animales infectados y tratados con UNAM-HIMFG y los controles sin desafío y sin recibir el lisado bacteriano, no se observaron cambios histológicos aparentes en vejiga (Fig 12 A y B). El mismo análisis histológico en las muestras de los animales desafiados con CFT073 que no recibieron UNAM-HIMFG mostró en las muestras de la vejiga infiltrado leucocitario, inflamación granulomatosa leve y Figura 11. Expresión de TNF-α (A) e IL-10 (B) en el bazo de ratones de los grupos de animales NI+SSF, CFT073+SSF; CFT073 +UNAM-HIMFG; y UI+UNAM-HIMFG. RT-PCR a partir de ARNm obtenido del bazo. 57 presencia de bacterias Gram negativas de forma localizada en submucosa formando agregados de bacterias (Fig. 12 C - F). Además, se evaluó la presencia de CFT073 en la vejiga y riñón de los animales desafiados con y sin tratamiento, en las muestras de vejiga de los animales no tratados se aislaron más de 1.5x103 UFC/mL con características correspondientes a CFT073. En el estudio histológico del riñón, no se observaron alteraciones y en el cultivo de las muestras no se aislaron bacterias lo que sugiere que no hubo infección en este órgano. 58 Figura 12. Análisis histológico de la vejiga de ratones BALB/c. (A) NI+SSF; (B) CFT073+UNAM- HIMFG; (C a F) CFT073+SSF. (C) La flecha indica inflamación granulomatosa; (D) La flecha muestra zonas de inflamación leve e infiltración leucocitaria; (E y F) Las flechas muestran bacilos Gram-nega tivos formando comunidades similares a colonias. Aumento: 400X (A a D) y 1000X (E y F). Tinción de hematoxilina/eosina (A a D); tinción de Sandiford (E y F). 59 Discusión Las enfermedades infecciosas son un problema cada vez más complejo de abordar clínicamente debido a la amenaza en el aumento de la resistencia a los antimicrobianos (RAM). La búsqueda de alternativas para el control de las infecciones bacterianas es de la mayor importancia (Abe et al. 2008, Baquero 2021). Una de estas alternativas, con potencial para la prevención y tratamiento de infecciones, es la vacunación, ya que ha contribuido de manera directa en la salud humana y en otras especies animales, por lo que se considera el método más efectivo para limitar y erradicar las enfermedades infecciosas (Henriques-Normark et al. 2014, Li et al. 2014). Sin embargo, las diversas variantes antigénicas de los patógenos limita el desarrollo de vacunas, esto se debe a la complejidad de cada microorganismo que aún, siendo de la misma especie presentan modificaciones en su estructura, lo cual implica una falla en la cobertura y dificulta desarrollar inmunógenos. (Stenutz et al. 2006, Rodríguez-Muñoz et al. 2020). En lo que respecta a las infecciones del tracto urinario (ITUs) esta problemática está presente además de tanto el surgimiento de bacterias con resistencia a los antimicrobianos, como la dificultad para la elaboración de vacunas profilácticas o terapéuticas (Henriques-Normark et al. 2014, Aziminia et al. 2019, Miranda-Novales et al. 2022, Hernández-Chiñas et al. 2023). En este trabajo se desarrolló un lisado múltiple polivalente para ello se identificaron los patógenos bacterianos más comunes y sus variantes antigénicas. En este caso E. coli fue la bacteria con mayor frecuencia de aislamiento; hasta de un 80 %, además se dio a conocer las variantes antigénicas más comunes en la región mexicana siendo O25, O75, O1, O6, O8 los serogrupos más frecuentes, además de catalogados como clásicos, también se encontraron los serogrupos O20, O11, O17 cuya clasificación se denominan endémicos (Ahumada-Cota et al. 2020, Hernández-Chiñas et al. 2021). Entre otras bacterias aisladas de forma constante se encuentran Klebsiella pneumoniae, Klebsiella aerogenes, Citrobacter freundii, Proteus mirabilis, Staphylococcus haemolyticus y Enterococcus faecalis. Durante el proceso de selección de cepas para formular el lisado, tomó interés una de las cepas de E.coli seleccionadas; perteneciente al serotipo O6:H1el cuál ha sido 60 reportado con frecuencia a nivel mundial (Luo et al. 2009), otro aspecto de interés con este serotipo es que la cepa de referencia UPEC CFT073 presenta el mismo serotipo al igual que la cepa del inmunógeno propuesto pertenece al filogrupo (B2) (Luo et al. 2009; Mobley et al. 1990). No obstante que ambas cepas poseen la misma serovariedad, tienen diferencias en los genes asociados a virulencia; al respecto CF073 posee 27 genes entre toxinas, captadores de hierro, adhesinas fimbriales y afimbriales, cápsula etc., mientras que el aislado clínico O6:H1 presenta 19 de los 27 identificados en la cepa de referencia (Ver anexo 2.), y algunos otros como el gen codificante del factor citotóxico necrotizante (cnf-1) y producción de cápsula (kpsMT (K1)) que no posee CFT073. Estas diferencias relacionadas con la plasticidad genética de E. coli (Kaper et al. 2004) pudieran ser aspectos importantes, relacionados con el tipo de cuadro clínico que ocasionan. Como resultado de la selección de cepas bacterianas y su posterior procesamiento, se obtuvo el lisado denominado UNAM-HIMFG, a partir del cual se realizaron diversos ensayos para determinar su composición de proteínas, azúcares, peptidoglucano y lipopolisacárido (Cuadro 1.), dichas moléculas se han reconocido como inductoras y mediadoras en los procesos de respuesta inmunitaria (Woolverton et al. 2009, Li et al. 2014, Stenutz et al. 2016, Verdiguel-Fernández et al. 2017, Westcott et al. 2024). Respecto a las proteínas, el lisado UNAM-HIMFG mostró poseer una amplia variedad de proteínas (Fig. 1) algunas de ellas han sido caracterizadas y estudiadas con potencial inmunogénico (Ahumada-Cota et al. 2020). Al llevar a cabo un ensayo para la detección inmunogénica de alguna de estas proteínas por parte de anticuerpos, provenientes de pacientes tratados con lisados autólogos preparados con E. coli O25:H, se observó gran avidez hacía el LPS tanto en el lisado monovalente preparado con O25:H4 así como en el lisado UNAM-HIMFG; el cual tiene en su composición este serotipo de E. coli (Fig. 2), demuostrando la capacidad de restimulación que tienen los lisados en pacientes con ITUs y tratados con lisados autólogos, ya que en el suero de los mismos pacientes sin tratamiento con lisados no se observó reconocimiento alguno. Los LPS son moléculas relevantes en el lisado, pues se ha descrito su capacidad como inmunomodulador, llevando a cabo la inducción de citocinas y anticuerpos en 61 ratones (Aguiniga et al. 2016). Además de LPS en el lisado UNAM-HIMFG se encuentran PG y azúcares, los cuales podrían jugar un papel relevante en el reconocimiento por parte del sistema inmunitario lo cual ha sido también informado (Woolverton et al. 2009). Con la finalidad de identificar alguna fracción proteica que pudiera ser reconocida en el lisado, se realizó un ensayo de inmunotrasnferencia en el que se emplearon anticuerpos policlonales de conejo dirigidos contra OmpA (Ahumada-Cota et al. 2020); los cuales pudieron reconocer una fracción de aproximadamente 35 kDa probablemente correspondiente a OmpA de E. coli, además de otras fracciones proteicas no identificadas (Fig. 4). Este resultado concuerda con lo reportado con lisados monovalentes por Ahumada-Cota et al. en (2020), además en dicho trabajo reportaron reconocimiento a otras proteínas como OmpC, NmpC, Udp, Gpma, FimH, BamB y BamC, en los lisados, los cuales también forman parte de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs por sus siglas en inglés) los cuales son relevantes en el reconocimiento inmunitario (Sivick et al. 2010). Una vez que se caracterizó la composición del lisado y su potencial reconocimiento por parte del sistema inmune, se evaluó la capacidad citotóxica, por lo que se dio tratamiento a células epiteliales para conocer el efecto de los lisados múltiple y diversos monovalentes, en los ensayos realizados se observó que los lisados carecen de potencial efecto citotóxico. La asociación al potencial tóxico de extractos bacterianos se ha asociado a la presencia del LPS, en cuya composición se encuentra el lípido A responsable de la actividad tóxica (Wang et al. 2010). Está reportado que dosis de 10-15 μg/kg en torrente sanguíneo inducen choque tóxico en humanos, no así el caso de los ratones cuyo umbral de choque aumenta a 10 mg/kg (Zschaler et al. 2014), sin embargo, este efecto tóxico no se ha observado a través de la vía de administración oral (Schryvers et al. 1987). además, se ha dado a conocer que el lípido A purificado no tiene la capacidad de atravesar la barrera intestinal; únicamente cuando el epitelio sufre alguna solución de continuidad puede observarse el efecto tóxico (Benoit et al. 1998), asimismo, en 2011 Harper y col. demostraron que 1 millón de unidades de endotoxina (UE) no fueron suficientes para inducir la muerte a ratones, en equivalencia 1 millón de UE aproximadamente 62 representan 200 μg de LPS (Perdomo Morales 2004). en el caso del lisado que tiene cantidades inferiores a este valor era esperado no observar daño. Cualquier molécula administrada a través de ruta oral sufrirá alteraciones dadas por los componentes anatómicos del tracto digestivo, como la saliva y el pH gástrico, en este caso el LPS no es la excepción (Hua 2020). una de las modificaciones más relevantes es el cambio de pH en el tracto digestivo cuyo efecto sobre el LPS, es la disminución de su capacidad tóxica pero conserva sus propiedades imunoestimulantes (Amano & Fukushi 1984) , lo anterior explicaría la inocuidad del lisado UNAM-HIMFG para cultivos celulares. Con los datos de inocuidad en células fue posible llevar a cabo ensayos para conocer la capacidad inmunoestimulante del lisado in vitro. En esta etapa se emplearon macrófagos de ratón (J774.1A y humanos, los cuales fueron estimulados con diferentes concentraciones del lisado UNAM-HIMFG además de monovalentes de E. coli O25:H4, O20:H9, y K. pneumoniae. A excepción del lisado preparado con E. faecalis, Los lisados bacterianos tuvieron la capacidad de estimular la producción de TNF-α en ambas variantes celulares (Figs. 7 y 8). Este resultado podría deberse al efecto del LPS, se ha estudiado también el efecto de sinergia entre el LPS y ADN bacteriano para inducir la producción de TNF-α en macrófagos de ratón (Gao et al. 2001, Wang et al. 2000, Gupta et al. 1995), otra molécula con capacidad de inducción de esta citocina es el PG y los ácidos lipoteicoicos, estructuras propias de las bacterias Gram positivas, en un trabajó se dio a conocer la capacidad estimulante de los ácidos teicoicos y el PG de Staphylococcus sobre lifocitos T y monocitos humanos, cuyo efecto fue la secreción de TNF-α además de otras citocinas proinflamatorias (Wang et al. 2000), adicionalmente en otra investigación se demostró el mismo efecto en macrófagos murinos (Xu et al. 2001). En este trabajó se observó el efecto mencionado en macrófagos derivados de monocitos de sangre periférica, pero no en macrófagos murinos con el lisado monovalente de Enterococcus. Esto podría sugerir que el efecto del lisado podría estar dirigido principalmente por el LPS bacteriano. En este estudio se observó además un posible efecto dosis dependiente del lisado en la secreción de TNF- α por parte de los macrófagos murinos no así en los 63 macrófagos humanos, lo cual abre la necesidad de definir perfiles de dosificación, asimismo, no hubo diferencias entre los lisados preparados con serovariedades de E. coli diferentes, que pudieran sugerir que la diferencia en cadenas laterales del LPS pudieran impactar en la respuesta. El mismo efecto se observó en el lisado de Klebsiella pneumoniae, pero no en el lisado de E. faecalis el cual carece de LPS. Otra molécula que el lisado presenta de forma preponderante es la flagelina, que en conjunto al LPS se ha estudiado su capacidad inductora de TNF-α (Ciacci-Woolwine et al. 1998). Es necesario destacar que la mayoría de las cepas de E. coli que conforman el lisado UNAM-HIMFG poseen el antígeno flagelar (H). A pesar de que el lisado de E. faecalis no mostró aparentemente capacidad estimulante hacia las células, puesto que ninguna de las citocinas evaluadas aumentó su concentración, sin embargo, no se descarta su participación como inmunomodulador debido a la presencia de peptidoglucano el cual ha sido estudiado también como un adyuvante (Sun et al. 2015, Bastos et al. 2021). La intención de cuantificar la producción de de TNF-α se debe a su papel durante las infecciones del tracto urinario descrito en diversos reportes, en uno de ellos se ha dado a conocer su importancia en pacientes con artritis reumatoide tratados con inhibidores directos de de esta citocina (Puntis et al. 2013). La capacidad inductora de TNF-α por parte de los lisados podría sugerir efecto de activación celular, ya que se ha descrito durante los cuadros de cistitis bacteriana ocurre liberación de TNF-α por parte de macrófagos que residen en la vejiga, esto a su vez estimula la expresión del ligando 2 de la quimioquina [motivo C-X-C] (CXCL2), además de la activación de neutrófilos los cuales expresan metaloproteinasa de matriz-9, que por consiguiente aumenta su capacidad de permear el epitelio para llevar a cabo eliminacion bacteriana en la vejiga (Mysorekar et al. 2002, Schiwon et al. 2014). Otra célula capaz de secretar TNF-α son los mastocitos, los cuales se ha descrito que tiene el papel de reclutar células dendríticas al sitio de infección (Shelburne et al. 2009). Esto demuestra la importancia del TNF-α durante los cuadros de ITUs, asimismo, su estimulación por parte del lisado UNAM-HIMFG durante esta patología sugiere una adecuado inmunoestimulante para el control de las ITUs. Otro aspecto a considerar con el TNF-α algunos de los potenciales efectos sobre el tracto urinario en el entorno de una ITU, se ha descrito que otra fuente de TNF-α en las ITUs son 64 las células naturales asesinas (NK) sin embargo, el papel de estas células en las ITUs aún no es claro (Gur et al. 2013). Como se ha referido una de las moléculas que posee el lisado cuyo efecto más prominente podría ser el LPS el cual es reconocido por el receptor tipo toll-4 (TLR 4 por sus sigas en inglés) que desencadena una cascada de señalización en la que participan diversos adaptadores y cinasas como; MyD88, IRAK, TRAF6, que a su vez estimulan la cinasa IκB la que se encarga de inducir la acción de NF-κB encargado de regular la transcripción de genes asociados a moléculas pro-infamatorias como TNF-α (Liu et al. 2017), lo cual sugiere al LPS como una molécula adyuvante durante el proceso del reconocimiento que podría mejorar la respuesta durante la infección (Byrne et al. 2002, Inagawa et al. 2011). Otra de las citocinas evaluadas en este trabajo fue IL-10 en células de ratón, sin embargo, no se observó respuesta activadora por parte de ninguno de los estímulos, esto podría deberse a la falta de más señales coestimulantes. Algunos rabajos han evidenciado la necesidad de neutrófilos en estado apoptótico y de células epiteliales urinarias para inducir la secreción de IL-10 (Byrne & Reen 2002, Duell et al. 2013, Vega-Hernández et al. 2021), lo que podría explicar el resultado obtenido respecto a la ausencia de señal por parte de las células hacía el estímulo. Con base en este resultado y lo descrito en la literatura, no se hizo la búsqueda de IL-10 en macrófagos humanos bajo el estímulo de los lisados. Lo anterior sugiere la necesidad de estudios en sistema de co-cultivo para determinar el potencial efecto del lisado en un sistema celular complejo de estimulación. El papel de esta interleucina se ha referido como una pieza fundamental durante los procesos de ITU, puesto que al ser una citocina con efecto antiinflamatorio, es capaz de suprimir respuesta por parte de linfocitos T y macrófagos de tal manera que protege al organismo de una respuesta inflamatoria exhacerbada, durante los eventos de ITUs se ha descrito que los mastocitos pueden liberar IL-10 para evitar comprometer el tejido de la vejiga (O'Brien et al. 2015, Carlin et al. 2023) En el presente estudio se determinó también, la secreción de IL-6 por parte de macófagos humanos, los cuales fueron estimulados con el lisado UNAM-HIMFG y 65 el lisado de E. coli O25:H4 pero no por parte del lisado de E. faecalis. Estudios han reportado la participación de diferentes constituyentes de UPEC como la fimbria tipo 1, curli y flagelo en sistemas de co-cultivo cuyo resultado es la secreción de IL-6 (Vega-Hernández et al. 2021). El resultado anterior sugiere una respuesta pro- inflamatoria, similar a lo observado en macrófagos murinos, en los que se ha descrito su estimulación con componentes bacterianos a las 18 horas de incubación (Martin & Dorf 1990, Arenas et al. 2010, Hirano et al. 2017). El papel de IL-6 durante diversos procesos inmunes, por lo que se considera pleiotópica, secretada como resultado de un daño tisular y durante infecciones, diversas células son capaces de producirla como; mastocitos, macrófagos, células dendríticas y células T y B, una de las funciones de esta citocina es la diferenciación de monocitos a macrófagos a través de la regulación de la expresión del factor estimulante de colonias de macrófagos, asimismo, tiene un efecto negativo en la regulación de la maduración de las células dendríticas, adicionalmente tiene un efecto polarizante en el cambio de respuesta inmune de un tipo Th1 hacia Th2 (Velazquez-Salinas et al. 2019), en el contexto de las ITUs se ha descrito como un indicador de serveridad en cuadros de cistitis, sin embargo la ausencia de esta citocina es factor relvante para la progesión de una ITU hacía pielonefritis, efecto descrito en ratones através de la evaluación de la vía Stat-3 (Ching et al. 2018). La activación de esta citocina se ha observado en presencia de LPS. En el presente trabajo se demostró la secreción de IL-6 y TNF-α por parte de macrófagos humanos a través de ELISA, asimismo en macrófagos de ratón se demostró la inducción en la secreción de TNF-α, por lo que los resultados obtenidos aquí sugieren que los lisados inducen una respuesta pro-inflamatoria predominante, sin embargo se requiere una evaluación que abarque otras citocinas para la comprensión del entorno inmunológico en el que los lisados podrían estar actuando. Después de conocer la nula capacidad citotóxica del lisado y su potencial activador de la respuesta inmune se realizaron ensayos de inocuidad en modelo animal, en el que no se observó algún potencial efecto tóxico (Fig.6). Como se describió arriba, en diversos estudios se ha demostrado que altas dosis de LPS no inducen daño a 66 través de la vía oral, así como su potencial capacidad estimulante (Amano & Fukushi 1984, Schryvers et al. 1987, Benoit et al, 1998, Harper et al. 2011, Hua 2020); los resultados obtenidos aquí demuestran la seguridad de los lisados ya que carecen de efecto adverso en células y animales. Para conocer el posible efecto terapéutico de UNAM-HIMFG se implementó un modelo animal con el objetivo de dar seguimiento a la bacteriuria con y sin tratamiento con los lisados, se diseñó además una estrategia con diferentes líneas animales, variaciones de cepas UPEC, así como distintos tipos de cultivo. Previo a los ensayos de infección se caracterizó la microbiota cultivable de los animales a emplear en el experimento, en dicho ensayo se pudieron recuperar diferentes microorganismos los cuales también corresponden a miembros propios de la microbiota humana, específicamente del tracto urinario como fue el caso de Lactobacillus spp. (Falagas et al. 2006, Barrons & Tassone et al. 2008, Hilt et al. 2014, Gupta et al. 2017). Posterior a la obtención de los datos sobre la microbiota de los ratones, se estandarizó un método de infección uretral en ratones de la cepa BALB/c tomando como referencia los datos existentes en la literatura con algunas modificaciones entre las que se incluyen las condiciones de crecimiento de las bacterias que se inocularon. Lo reportado al respecto en E. coli refiere la importancia de emplear medios de cultivo líquidos o sólidos, pH, atmósfera y otros factores que influyen en la expresión de diversos factores de patogenicidad como las adhesinas fimbriales, estructuras cruciales para el tropismo de los patógenos en superficies bióticas o abióticas por esta razón se mezclaron dos tipos de cultivo de cada patógeno a desafiar; a partir de medios líquidos y la bacteria creciendo en superficie de medios sólidos. En un estudio llevado por Kikuchi et al. (2005) se dio a conocer el desarrollo abundante de la fimbria Csg también conocida como Curli en medios de cultivo con agar a diferencia de los medios líquidos, en dicho estudio además se reportó la relevancia de esta estructura para la adhesión de las bacterias en células epiteliales urinarias. Previamente en (2003) Ferrières demostró el papel del sensor de quinasa RcsC 67 durante el desarrollo en medios sólidos, este como regulador para la formación de biopelículas bacterianas por lo que en este estudio se procuró que los cultivos para desafío pudieran cubrir los requerimientos de la bacteria para lograr una infección eficaz. Por tal motivo se incluyeron cultivos en caldo y en agar procedimiento llamado enriquecimiento de fimbrias (Carey et al. 2016). En E. coli CFT073 han descrito el favorecimiento de la expresión de la fimbria tipo 1 durante el crecimiento in vitro en medios líquidos (Olsen et al. 1994, Snyder et al. 2005), además se ha reportado que en una superficie de agar se inhibe la expresión de la fimbria tipo 1, pero se favorece la expresión de la fimbria tipo P (Gunther et al. 2001, Snyder et al. 2005). Esto se sustenta además en lo descrito por Melican y colaboradores (2011) quienes demostraron que ambas fimbrias tipo 1 y P tienen sinergia para la colonización del hospedero. En el ensayo de infección en animales algo destacable fue la evolución de la infección por parte de la cepa C57BL/6 puesto que en este trabajo se realizó seguimiento durante 61 días de una infección inducida en la cual se mostró que, si bien a partir de la segunda semana aparentemente se solucionó la infección en los animales monitoreando a través de urocultivos, pero, en la semana siete volvían la bacteriuria, posteriormente la bacteria desaparecía aparentemente a la semana ocho. Sin embargo, al momento del sacrificio se colecto orina, en la cual el desarrollo bacteriano se hizo evidente nuevamente. Lo anterior difiere con lo reportado en la literatura (Hannan et al. 2010, Carey 2016), pues se ha mencionado que esta cepa de ratones es capaz de resolver la colonización bacteriana a los 15 días post-infección. Por otra parte, en el grupo de ratones infectados con el aislado clínico O25:H4, en los que la infección desaparece a la segunda semana, otro hallazgo relevante durante el experimento fue el aislar a la bacteria en la materia fecal de los animales, diferente a lo observado en los demás grupos de animales, lo que podría sugiere la integración de la bacteria a la microbiota intestinal, sin embargo, es necesario realizar más estudios al respecto. Por otra parte en los ratones CD-1 aparentemente permanecieron infectados hasta la semana seis; este es el primer trabajo en donde se realiza un seguimiento de CD- 1 en una infección crónica, puesto que uno de los pocos estudios en donde se 68 incluye el empleo de la estirpe CD-1 con una cepa de UPEC fue el de You et al. (2009), sin embargo en dicho estudio la infección solo se requirió para determinar la eficacia de dos antibióticos y el periodo de infección solo fue de 72 horas antes del sacrificio, por lo tanto no hay datos de infecciones crónicas en una línea exogámica. Los resultados de este estudio concuerdan con la literatura en la cual los ratones a los siete días post-infección continúan con bacteriuria (Zunino et al. 2000). Lo descrito demuestra que la línea BALB/c, infectados con CFT073 son un modelo adecuado para conocer y caracterizar escenarios de infecciones crónicas de las vías urinarias, asimismo, la cepa O25:H4 no deja de ser objeto de estudio para futuros trabajos. Los resultados obtenidos en los ensayos de inocuidad de UNAM-HIMFG en ratones, así como la obtención del modelo más ad hoc para conducir una infección urinaria dieron la pauta para estudiar el potencial efecto curativo del lisado múltiple. En el ensayo se administró a por vía sub-lingual el lisado UNAM-HIMFG a ratones infectados con UPEC CFT073 observando mejoría a partir de la segunda semana posterior a la administración del lisado (Fig. 10), continuando el efecto hasta la semana cuatro en la que la bacteriuria desaparece; en contraste a los animales tratados con SSF, este resultado demuestra el efecto terapéutico del lisado en los animales que recibieron el tratamiento frente al grupo control. El motivo por el que se optó por la administración sub-lingual se fundamenta en diversos estudios que refieren una absorción más pronta. En el caso de tratamientos ambulatorios resulta ser más económica y sencilla, asimismo, se evade de alguna manera el tratamiento enzimático y los cambios de pH propios del sistema digestivo, así como las rutas de degradación hepática (Zhang et al. 2009, Vela Ramirez et al. 2017, Trincado et al. 2021). Otra ventaja en la administración a través de la ruta sub-lingual es el estímulo que recibe el sistema inmunitario, puesto que se ha demostrado que aproximadamente el 50 % de los linfocitos residen en el tejido linfoide asociado a mucosas (MALT por sus siglas en inglés) (Trincado et al. 2021), aunado también a la activación de la inmunidad local y sistémica por la distribución del MALT en la nasofaringe y que comunica con el resto de sus porciones en intestino, bronquios y tracto urogenital (Trincado et al. 2021). Esta comunicación es indispensable para la protección de las diferentes mucosas ya que en el sistema inmune común de las 69 mucosas (SICM) los linfocitos pueden migrar como células efectoras a sitios distintos y llevar a cabo la protección contra un mismo antígeno (McGhee & Fujihashi 2012). Por otra lado, se ha reportado que en el MALT se encuentran también células M, capaces de reconocer algunos PAMPs como el LPS, la fimbria tipo 1 y el peptidoglucano, evento importante para el reconocimiento de patógenos e indispensable durante el desarrollo de inmunógenos y vacunas (Mabbott et al. 2013, Wang et al. 2014). Con el objeto de analizar el potencial estimulante del lisado en el modelo animal, al finalizar el experimento in vivo, se obtuvo el bazo de los animales infectados y sin infectar tratados con UNAM-HIMFG, en los animales tratados con el lisado se observó un aumento significativo de TNF-α, no así con la expresión de IL-10 (Fig. 11), lo que es comparable con los resultados obtenidos en los ensayos con cultivos celulares. La expresión de TNF-α aunado a los resultados en la clarificación de la orina de los animales infectados y lo observado también en el estudio de histopatología en el que la vejiga no mostró tener signos de colonización o inflamación en aquellos animales tratados con el lisado a diferencia de los tratados con SSF (Fig. 12), demuestran el efecto terapéutico de UNAM-HIMFG. En este trabajo se observó el incremento en la expresión del gen asociado a TNF-α en aquellos animales tratados con UNAM-HIMFG respecto a los no tratados, lo cual podría explicarse con la ruta de administración del lisado la cual se ha discutido anteriormente y la probable inducción de respuesta sistémica, eso propone realizar estudios acerca de la comunicación celular durante los eventos de infección y en el tratamiento con los lisados. En lo que refiere a IL-10 sus niveles reducidos de expresión podrían explicarse por su naturaleza antinflamatoria, además que debe regular dicho proceso (Duell et al. 2012), en este ensayo en los animales infectados no tratados, no se detectó esta citocina lo que es concordante con lo reportado en los estudios de histopatología en los que se observan, reacción inflamatoria que sugiere un proceso crónico. Aunque en los animales infectados y tratados no se reportó tampoco la expresión del gen asociado a IL-10, los estudios de histología mostraron tejidos sanos, comparables con el grupo control sin infección, esto podría explicarse debido a que la busqueda 70 de esta citocina se llevó a cabo hasta finalizar el experimento, por lo que la secreción de IL-10 podría haberse llevado a cabo por efecto del lisado en etapas temoranas del tratamientom esto sugiere estudios que aboren una cinética de citocinas durante la infección y tratamiento en el modelo animal. Debido a las limitaciones técnicas, en este trabajo no se realizó la búsqueda de inmunoglobulinas en mucosas, como IgA, sin embargo no se descarta su presencia y de otras citocinas durante el tratamiento, esta aseveración se basa en la presencia de estos anticuerpos en los sueros de pacientes con infección y tratados con lisados autólogos (Ahumada-Cota et al. 2020), los cuales fueron capaces de reconocer porciones del lisado UNAM-HIMFG, se ha reportado además la capacidad de la inducción de este anticuerpo a través del estímulo sub-lingual (Sánchez Ramón et al. 2020). Es importante destacar que aunque en este trabajo no se realizó una re- infección en los animales que se recuperaron de la infección, en trabajos previos con lisados monovalentes se ha observado efecto de protección en pacientes que han recibido los lisados y se ha podido obtener IgG a partir del suero (Ahumada- cota et al. 2020, Hernández-Chiñas et al. 2021), esta directriz es de interés para investigación ya que se ha reportado la capacidad de diferentes patógenos para evadir la respuesta inducida en mucosas y consolidad una infección (Laprise et al. 2024), lo que propone trabajos acerca de la memoria inmunológica de mucosas, primordial en las ITUs para evitar procesos de reinfección. El lisado UNAM-HIMFG requiere mayor investigación en cuanto a su capacidad estimulante de la inmunidad de mucosas. 71 Conclusiones - Se diseñó un inmunógeno polivalente (UNAM-HIMFG) basado en datos de prevalencia e incidencia de cepas uropatógenas en México - Se estableció un modelo de infección urinaria en ratones BALB/c desafiados con UPEC CFT073 cultivada en dos diferentes condiciones - Se comprobó la inmunogenicidad del lisado UNAM-HIMFG en modelos in vitro e in vivo - Se comprobó la inocuidad del lisado UNAM-HIMFG en modelos in vitro e in vivo - El lisado UNAM-HIMFG mostró ser capaz de eliminar la infección urinaria inducida en ratones Prospectiva - Realizar la caracterización de los componentes del lisado como; lípidos y ácidos nucleicos. - Definir la ruta de señalización que sigue el lisado al entrar en contacto con otras células del sistema inmune como, macrófagos, células dendríticas y linfocitos B. - Conocer la eficacia del lisado en modelos animales utilizando otros uropatógenos - Probar lisados en modelos animales inmunocomprometidos o con neoplasias - Iniciar ensayos clínicos con el lisado en humanos 72 Referencias: 1. 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Gen blanco Iniciadores Longitud (pb) Testigo Referencia Filogrupo ChuA (Adquisición de hierro) TGCCGCCAGTACCAAAGACA 279 UPEC CFT073 Clermont et al. 2000 GACGAACCAACGGTCAGGAT YjaA TGAAGTGTCAGGAGA 211 UPEC CFT073 Clermont et al. 2000 ATGGAGAATGCGTTCCTCAAC TspE4.C2 GAGTAATGTCGGGGCATTCA 152 UPEC CFT073 Clermont et al. 2000 CGCGCCAACAAAGTATTACG Adhesinas fimbriales y afimbriales papA ATGGCAGTGGTGTCTTTTGG 721 - 736 UPEC CFT073 Johnson and Stell 2000 CGTCCCACCATACGTGTTCTTC papC ATATCCTTTCTGCAGGGATGCAATA 203 UPEC CFT073 Johnson and Stell 2000 GTGGCAGTATGAGTAATGACCGTTA afa GGCAGAGGGCCGGCAACAGGC 593 UPEC AKD(U) 1-1 Johnson and Stell 2000 CCCGTAACGCGCCAGCATCTC CTCCGGAGAACTGGGTGCATCTTAC UPEC CFT073 sfa CGGAGGAGTAATTACAAACCTGGCA papG alelo II GGGATGAGCGGGCCTTTGAT 190 UPEC CFT073 Johnson and Stell 2000 CGGGCCCCCAAGTAACTCG papG alelo III GGCCTGCAATGGATTTACCTGG 258 E.coli 25922 Johnson and Stell 2000 CCACCAAATGACCATGCCAGAC fimH TCGAGAACGGATAAGCCGTGG 506 UPEC CFT073 Johnson and Stell 2000 GCAGTCACCTGCCCTCCGGTA focG CAGCACAGGCAGTGGATACGA 362 UPEC CFT073 Johnson and Stell 2000 GAATGTCGCCTGCCCATTGCT iha CTGGCGGAGGCTCTGAGATCA 827 UPEC CFT073 Paniagua et al. 2017 TCCTTAAGCTCCCGCGGCTGA tsh GGATGCCCCTGCAGCGT 302 APEC 1331, APEC 1336 Boisen et al. 2009 CCGTACACAAATACGACGG Adquisición de hierro fyuA TGATTAACCCCGCGA 785 UPEC CFT073 Johnson and Stell 2000 CGCAGTAGGCACGATGTTGTA ireA GATGACTCAGCCACGGGTAA 260 UPEC CFT073 Ewers et al. 2007 CCAGGACTCACCTCACGAAT ironD AAGTCAAAGCAGGGGTTGCCCG 668 UPEC CFT073 Ewers et al. 2007 GACGCCGACATTAAGACGCAG feoB AATTGGCGTGCATGAAGATAA 469 UPEC CFT073 Rodríguez et al. 2005 AGCTGGCGACCTGATAGAACA iutA CGTCGGGAACGGGTAGAA 302 UPEC CFT073 Johnson and Stell 2000 GGCTGGACATCATGGGAAC 97 sit TACCGGGCCGTTTTCTGTGC 606 UPEC CFT073 Rodríguez et al. 2005 AGGGGGCACAACTGATTCTCG irp2 AAGGATTCGCTGTTACCGGAC 413 UPEC CFT073 Ewers et al. 2007 AACTCCTGATACAGGTGGC iucD CCTGATCCAGATGATGCTC 711 UPEC CFT073, APEC 1331, APEC 1336 Johnson and Stell 2000 ACAAAAAGTTCTATCGCTTCC Toxinas cnf-1 GCAGAACGACGTTCTTCATAAGTATC 972 UPEC HIM- XV/RMR(U3)02 Rodríguez et al. 2005 ATCTTATACTGGATGGGATCATCTTGG sat CCATTATCACCAGTAAAACGCACC 931 UPEC CFT073 Ewers et al. 2007 TCAGAAGCTCAGCGAATCATTG hylD CTCCGGTACGTGAAAAGGAC 904 UPEC CFT073 Rodríguez et al. 2005 GCCCTGATTACTGAAGCCTG vat AACGGTTGGTGGCAACAATCC 421 UPEC CFT073 Boisen et al. 2009 AGCCCTGTAGAATGGCGAGTA Protectinas e invasinas ompT CCCGGGTCATAGTGTTCAT 556 UPEC CFT073 Johnson and Stell 2000 ATCTAGCCGAAGAAGGAGGC ompA GGTGTTGCCAGTAACCGG 931 UPEC CFT073 Ewers et al. 2007 AGCTATCGCGATTGCAGTG iss CAGCGGAGTATAAATGCCT 309 APEC 1331, APEC 1336 Paniagua et al. 2017 ATCACATAGGATTCTGCCG kpsMT (K1) TAGCAAACGTTCTATTGGTGC 151 APEC 1336 Johnson and Stell 2000 CATCCAGACGATAAGCATGAGCA ibeA AGGCAGGTGTGCGCCGCGTAC 170 APEC 1331, APEC 1336 Johnson and Stell 2000 TGGTGCTCCGGCAAACCATGC traT GGTGTGGTGCGATGAGCACAG 288 APEC 1331, APEC 1336 Rodríguez et al. 2005 CACGGTTCAGCCATCCCTGAG Reguladores, serinas y micelaneos set1A TCACGCTACCATCAAGGA 309 UPEC CFT073 Vargas et al. 1999 TATCCCCCTTTGGCGGTA pic GACTTAATGTCACTGTTCAG 567 UPEC CFT073 Ewers et al. 2007 ACTGGATCTTAAGGCTCAGGAT maIX (PAI) TCGCCACCAATCACAGCCGAAC 922 UPEC CFT073 Rodríguez et al. 2005 GGACATCCTGTTACAGCGCGCA Formación de biopelículas fluB (ag43) AGGCAGGAGGAACTGCCAGT 440 UPEC CFT073 Tek et al. 2015 TAAATGAGGGTGTCCCGTGCC fluA (ag43) CAGCCGGATCTGCGGCACT 340 UPEC CFT073 Tek et al. 2015 ACTCTGGTGTTTCTGGCTGTT 98 Cuadro 2. Condiciones empleadas para la detección de genes asociados a virulencia y filogrupo en cepas UPEC 1 ciclo 30 ciclos 1 ciclo Desnaturalización inicial Desnaturalización Alineamiento 30 s Objetivo Extensión Extensión final 96 ºC 2 min 95 ºC 30 s 50 ºC iucD vat iss 72 30 s 72 ºC 5 min 51 ºC pic 52 ºC ompT iutA fyuA feoB 53 ºC irp2 hylD cnf1 ompA sit 54 ºC papA papC ireA 56 ºC focG 57 ºC ibeA kpsMT1 papG iha traT fluA 58 ºC ironD tsh 59 ºC maiIX PAI 61 ºC fluB 63 ºC fimH Cuadro 3. Primers utilizados para la cuantificación de los genes TNF, IL-10 y GAPDH Gen Iniciador Secuencia 5'-3' Size (pb) Mus musculus gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (Gapdh) gapdh F TGGCAAAGTGGAGATTGTTGCC 156 gapdh R AAGATGGTGATGGGCTTCCCG Mus musculus mRNA for tumor necrosis factor ligand 1f TNFa F GGTGCCTATGTCTCAGCCTCTT 139 TNFa R GCCATAGAACTGATGAGAGGGAG Mus musculus interleukin 10 (Il10), mRNA IL-10 F CGGGAAGACAATAACTGCACCC 130 IL-10 R CGGTTAGCAGTATGTTGTCCAGC 99 Anexo 2. Cuadros Resultados E. coli AMP PRL MEL AMC TZP KZ MA FEP CFP FOX CRO CAZ CXM MEM F ATM CN KA K TOB S TE OF CIP NOR NA SXT S3 W C FOS O 25 R R R R R R R R R S R R R R R R R R R R R R R R R R S R S S R O 75 R R R R S R R S S S S S R R S S S S R S R R R R R R R R R S S O 9 R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R S R R R R R R R R S O 17 R R R S S R R S R S R S R S S R S S S S S S S S S S S R S S S O 20 R R R R R R R R R R R R R R R S S R R R R R R R R R R R R R R O 6 R S R S S R S R S R R R R S R S S R R S R R R S S S S R S S R O 8 R S S R S R S S S S R S R S S S S S S S S S S S S S S R S S S O 1 R S R R S R S S S S S S R S S S S R R S R S S S S S S R S S S O 16 R R R R R R R R R S R R R S S R S S S R R R S R S R R R R S S O 7 R S R S R R S R S S R R R R S S S S S R R S S S S R S R S S R S u sc e p ti b il it y a n d r e si st a n ce p ro fi le o f th e U P E C s tr a in s th a t m a k e u p t h e U N A M -H IM F G l y sa te (A M P ) am p ic il in , (P R L ) p ip er ac il in , (M E L ) m ec il in am , (A M C ) am ox ic il li n w it h cl av u la n ic ac id , (T Z P ) p ip er ac il li n w it h ta zo b ac ta m , ce fo zo li n , ce fa m an d ol e, ce fe p im e, (K Z ) ce fo zo li n a, (M A ) ce fa m an d ol e, (F E P ) ce fe p im e, (C F P ) ce fo p er az on e, (F O X ) ce fo xi ti n , (C R O ) ce ft ri ax on e, (C A Z ) ce ft az id im e, (C X M ) ce fu ro xi m e, (M E M ) m er op en em , (F ) n it ro fu ra n to in , (A T M ) az tr eo n am , (C N ) g en ta m ic in , (K A ) am ik ac in , (K ) k an am y ci n , (T O B ) tr ob ra m y ci n , (S ) st re p to m y ci n , (T E ) te tr ac ic ly n e, (O F ) of lo xa ci n , (C IP ) ci p ro fl ox ac in , (N O R ) n or fl ox ac in , (N A ) n al id ix ic ac id , (S T X ) tr im et h op ri m w it h su lf am et h ox az ol e, (S 3) su lf on am id es , (W ) tr im et h op ri m , (C ) ch lo ra m p h en ic ol , (F O S) fo sf om y ci n . (R ) R es is ta n t (S ) Su sc ep ti b le , (I ) In te rm ed ia te , (D D S) d os e- d ep en d en t su sc ep ti b il it y . E s c h e r ic h ia c o li se ro g ro u p s Cuadro 1. Perfil de susceptibilidad de las diferentes variedades de E. coli que componen el lisado UNAM-HIMFG. 100 B A C AMP PRL MEL AMC TZP KZ MA FEP CFP FOX CRO CAZ CXM MEM NF ATM CN AK K TOB S TE OF CIP NOR NA SXT S3 W C FOS VA N D R R N D R N D R R R N D R R N D R R R S S R S R S R R S R R R R R R N D N D R R S R R S S S R R R R R R S S S R S R S S R S R R R S R R N D S S R S S N D N D N D N D N D N D N D N D R S N D N D N D N D N D N D R R R S N D N D N D N D R S S R R R S R R R R R S R R R S R N D S S S S S R S S S N D R R R R R N D N D R R N D R N D R R S N D R R R R R S S R R R R R S S R R S R R S R N D S S R S S R R R S R R R R R N D R S R R S R N D S S S R R R R R R N D E F S H K A P M (A M P ) am p ic ili n ,( P R L ) p ip er ac ili n ,( M E L ) m ec ili n am ,( A M C ) am ox ic ill in w it h cl av u la n ic ac id ,( T Z P ) p ip er ac ill in w it h ta zo ba ct am ,c ef oz ol in , ce fa m an d ol e, ce fe p im e, (K Z ) ce fo zo lin a, (M A ) ce fa m an d ol e, (F E P ) ce fe p im e, (C FP ) ce fo p er az on e, (F O X ) ce fo xi ti n , (C R O ) ce ft ri ax on e, (C A Z ) ce ft az id im e, (C X M ) ce fu ro xi m e, (M E M ) m er op en em , (N F) n it ro fu ra n to in , (A T M ) az tr eo n am , (C N ) ge n ta m ic in ,( A K ) am ik ac in ,( K ) ka n am yc in ,( T O B ) tr ob ra m yc in , (S ) st re p to m yc in , (T E ) te tr ac ic ly n e, (O F) of lo xa ci n , (C IP ) ci p ro fl ox ac in , (N O R ) n or fl ox ac in , (N A ) n al id ix ic ac id , (S T X ) tr im et h op ri m w it h su lf am et h ox az ol e, (S 3) su lf on am id es , (W ) tr im et h op ri m , (C ) ch lo ra m p h en ic ol , (F O S) fo sf om yc in . (V A ) v an co m yc in . (R ) R es is ta n t (S ) Su sc ep ti bl e, (I ) In te rm ed ia te , (D D S) d os e- d ep en d en t su sc ep ti bi lit y. , (N D ) N ot d et er m in ed by th e p re se n ce of in tr in si c re si st an ce .A bb re v ia ti on s: B A C : B ac te ri a; C F: C it ro b a ct er f re u n d ii ; K P : K le b si el la p n eu m o n ia e ; E F: E n te ro co cc u s fa ec a li s ; S H : S ta h p y lo co cc u s h a em o ly ti cu s ; P M : P ro te u s m ir a b il is S u sc e p ti b il it y a n d r e si st a n ce o f o th e r u ro p a th o g e n s th a t m a k e u p t h e U N A M -H IM F G l y sa te C F K P Cuadro 2. Perfil de susceptibilidad de las diferentes uropatógenos que componen el lisado UNAM-HIMFG 101 Filogrupo chuA yjaA tspE4.c2 iroN iss iucD iutA set1 sitA traT tsh afa fimH iha papA papC papG allelo II papG allelo III focG feoB fyuA ireA irp-2 kpsMT (K1) cnf-1 hlyD vat pic sat ibeA ompA ompT ag43a ag43b malX (PAI) B a c te ri a S e ro ti p o C e p a C a n ti d a d d e g e n e s E s c h e r ic h ia c o li O 2 5 :H 4 H IM -X V /R M R (U 3 )0 2 B 2 1 1 1 N N 1 1 N 1 1 N N 1 1 1 1 N N N 1 1 N 1 N 1 1 N N 1 N 1 N 1 N 1 2 0 E s c h e r ic h ia c o li O 7 5 :H - C M H 0 2 -5 B 2 1 1 1 N N 1 1 N 1 N N N N N N N N N N 1 N N 1 1 N N 1 N 1 N 1 N N N N 1 2 E s c h e r ic h ia c o li O 9 :H - K M B (U 5 )0 2 A N N N N N N N N N N N N N N N N N N N 1 N N 1 N N N N N N N N N N N N 2 E s c h e r ic h ia c o li O 1 1 :H 2 5 H IM -X X V /S C (U 1 )0 2 D 1 N N N N N 1 N N N N N N N N N N N N 1 N N N N N N N N N N N N N N N 3 E s c h e r ic h ia c o li O 1 7 :H 1 8 N B A (U )2 2 -1 D 1 N N N N N N N 1 N N N 1 N N N N N N 1 N N N 1 N N N N N N 1 N N N N 6 E s c h e r ic h ia c o li O 2 0 :H 9 H IM -X II I- 1 /M R C ( U 1 ) A N 1 N N N 1 1 N 1 N N N 1 N N N N N N 1 1 N 1 N N 1 N N N N 1 N N N N 1 0 E s c h e r ic h ia c o li O 1 0 2 :H 6 F M H (U 2 )0 2 D 1 N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N 1 E s c h e r ic h ia c o li O 2 8 a b :H - H IM X X II /R A V (U 1 )0 2 A N 1 N N N N 1 N N N N N N N N N N N N 1 N N N N N N N N N N N N N N N 3 E s c h e r ic h ia c o li B o y 8 :H 8 V M S (U ) 1 -1 B 1 N N 1 N N N N N N N N N 1 N N N N N N 1 N N 1 N N N N N N N 1 N N N N 5 E s c h e r ic h ia c o li O 6 :H 1 T C J (U 2 ) 1 B 2 1 1 1 1 N N N 1 1 1 N N 1 N N N N N 1 1 1 N 1 1 1 1 1 1 N N 1 N N 1 N 1 9 E s c h e r ic h ia c o li O 8 :H 1 9 E C (U ) 1 3 -1 B 1 N N 1 N N N N N N N N N 1 N N N N N N 1 N N N N N N N N N N 1 N N N 1 5 E s c h e r ic h ia c o li O 1 :H 7 JL A (U ) 4 -5 B 2 1 1 1 1 N 1 1 N 1 1 N N 1 N 1 1 1 N N 1 1 1 1 1 N 1 1 N 1 N 1 1 N N 1 2 3 E s c h e r ic h ia c o li O 1 :H ? /H - H IM -I -1 /A Z R ( U 1 )0 1 A N 1 N N N 1 1 N 1 1 N N N N N N N N N 1 1 N 1 N N N N N N N 1 N N N 1 1 0 E s c h e r ic h ia c o li O 1 6 :H 5 A K D (U ) 1 -1 B 2 1 1 1 N N N N N 1 1 N 1 1 N N N N N N 1 N N 1 N N N N N N N 1 1 N N N 1 1 E s c h e r ic h ia c o li O 7 :H - L A C (U )1 -2 D 1 N N N N 1 N N 1 N N N 1 N N 1 1 N N 1 1 N 1 1 N N N N 1 N 1 1 N N N 1 3 Cuadro 3. Perfil de virulencia de las diferentes variedades de E. coli que componen el lisado UNAM-HIMFG. 102 Anexo 3. Medios de Cultivo Medios de cultivo en caja de Petri Caldo Luria Bertani (LB) Cloruro de Sodio (JT Baker®) 10 g Peptona de caseína (Difco®/MCDLab®) 10 g Extracto de levadura (Bioxon®) 5 g Agua destilada 1000 mL Disolver los componentes y esterilizar en autoclave durante 15 min, 15 lb de presión a 121 °C. Agar LB Al preparar caldo LB agregar 15 g de agar-bacteriológico (Difco®/ MCDLab®) para 1 L. Disolver los componentes y esterilizar en autoclave durante 15 min, 15 lb de presión a 121 °C. Agar sangre Corazón de res, infusión 500 g Peptona de caseína 10 g Cloruro sódico 5 g Agar 15 g Agua destilada 1000 mL Disolver los componentes en 900 mL de agua destilada y esterilizar en autoclave durante 15 min, 15 lb de presión a 121 °C. Al enfriarse el medio a 45ºC agregar 100 mL de sangre de ovino o bovino o caballo desfibrinada atemperada asépticamente. Agar para Anaerobios con Vancomicina Digerido pancreático de caseína 10 g Digerido péptico de tejido animal 10 g Glucosa 1 g Piruvato de sodio 1 g Extracto de levadura 2 g Cloruro de sodio 5 g Bisulfito sódico 0.1 g Tioglicolato de sodio 0.4 g L cistína 0.4 g Vitamina K 0.01 g Vancomicina 0.075g Agar 15 g Agua destilada 1000 mL Disolver los componentes en 900 mL de agua destilada y esterilizar en autoclave durante 15 min, 15 lb de presión a 121 °C. Al enfriarse el medio a 45ºC agregar 100 mL de sangre de ovino o bovino o caballo desfibrinada atemperada asépticamente. 103 Agar para Anaerobios con Ácido Nalídixico Digerido pancreático de caseína 10 g Digerido péptico de tejido animal 10 g Glucosa 1 g Piruvato de sodio 1 g Extracto de levadura 2 g Cloruro de sodio 5 g Bisulfito sódico 0.1 g Tioglicolato de sodio 0.4 g L cistína 0.4 g Vitamina K 0.01 g Ácido nalidíxico 0.01 g Agar 15 g Agua destilada 1000 mL Disolver los componentes en 900 mL de agua destilada y esterilizar en autoclave durante 15 min, 15 lb de presión a 121 °C. Al enfriarse el medio a 45ºC agregar 100 mL de sangre de ovino o bovino o caballo desfibrinada atemperada asépticamente. Medios de cultivo en tubo Caldo tioglicolato Extracto de levadura 5 g Cloruro sódico 2.5 g Digerido pancreático de caseína 15 g Tioglicolato sódico 0.5 g Dextrosa (anhidra) 5 g Azul de metileno 0.001 g L-cistina 0.5 g Agar 0.75 g Disolver los componentes en 100 mL de agua, hervir hasta que el medio tome un aspecto ópalo y dispensar en volúmenes requeridos, esterilizar en autoclave durante 15 min, 15 lb de presión a 121 °C. el medio se mantiene reducido hasta 3 meses, después deberá hervirse para reducirlo. Agar triple azúcar hierro (TSI) Digerido pancreático de caseína 10 g Digerido péptico de tejido animal 10 g Cloruro sódico 5 g Lactosa 10 g Sacarosa 10 g Glucosa 1 g Sulfato ferroso de amonio 0.2 g Tiosulfato sódico 0.2 g Rojo fenol 0.025 g Agar 13 g Agua destilada 1000 mL 104 Disolver los componentes, calentar hasta ebullición, no sobrecalentar, y dispensar en tubos, esterilizar en autoclave durante 15 min, 15 lb de presión a 121 °C. Enfriar posicionando el tubo de manera que el agar quede en forma inclinada en el tubo. Medio SIM Extracto de carne 3 g Hidrolizado pancreático de gelatina 30 g Sulfato ferroso amónico 0.2 g Tiosulfato sódico 0.025 g Agar 3 g Agua destilada 1000 mL Disolver los componentes calentando hasta ebullición y dispensar en tubos, esterilizar en autoclave durante 15 min, 15 lb de presión a 121 °C. Agar citrato de Simmons Fosfato de amonio dihidrogenado 1 g Fosfato dipotásico 1g Cloruro sódico 5 g Citrato sódico 2 g Sulfato magnésico 0.2 g Agar 15 g Azul de bromotimol 0.08 g Agua destilada 1000 mL Disolver los componentes, calentar hasta ebullición, no sobrecalentar, y dispensar en tubos, esterilizar en autoclave durante 15 min, 15 lb de presión a 121 °C. Enfriar posicionando el tubo de manera que el agar quede en forma inclinada en el tubo. Agar urea de Christesen Hidrolizado pancreático de gelatina 1 g Dextrosa 1 g Cloruro sódico 5 g Fosfato potásico 2 g Urea 20 g Rojo Fenol 0.012 g Agar 15 g Disolver el agar en 950 mL de agua, calentar hasta ebullición, no sobrecalentar, esterilizar en autoclave durante 15 min, 15 lb de presión a 121 °C. Atemperar el agar a 45ºC, los demás componentes disueltos en 50 mL de agua destilada, esterilizar por filtración incorporándolos al agar, dispensar en tubos. Enfriar posicionando el tubo de manera que el agar quede en forma inclinada en el tubo. Agar fenilalanina DL-Fenilalanina 2 g Extracto de levadura 3 g Cloruro sódico 5 g 105 Fosfato sódico 1g Agar 12 g Agua destilada 1000 mL Disolver los componentes, calentar hasta ebullición, no sobrecalentar, y dispensar en tubos, esterilizar en autoclave durante 15 min, 15 lb de presión a 121 °C. Enfriar posicionando el tubo de manera que el agar quede en forma inclinada en el tubo. Caldo lisina Clorhidrato de L-lisina 5 g Extracto de levadura 3 g Glucosa 1 g Púrpura de bromocresol 0.015 g Agua destilada 1000 mL Disolver los componentes y dispensar en tubos, esterilizar en autoclave durante 15 min, 15 lb de presión a 121 °C. Caldo MR-VP Mezcla de Peptonas 7 g Fosfato dipotásico 5 g Dextrosa 5 g Agua destilada 1000 mL Disolver los componentes y dispensar en tubos, esterilizar en autoclave durante 15 min, 15 lb de presión a 121 °C. Reactivos para identificación e interpretación de bioquímicas Reactivo de Kovac (para detección de indol) Alcohol isoamílico 150 mL p-dimetilaminobenzaldehído 10 g HCl 50 mL Disolver el p-dimetilaminobenzaldehído en el alcohol isoamílico (amílico o butílico), una vez incorporado se agrega el HCl, almacenar en frasco ámbar en refrigeración. Reactivo de Barrits A (Prueba de Voges-Proskauer) 1-naftol 5 g H2O 100 mL Disolver cuidadosamente el 1-naftol en el agua, almacenar en frasco ámbar en refrigeración. Reactivo de Barrits B (Prueba de Voges-Proskauer) KOH 40 g H2O 100 mL Disolver cuidadosamente el KOH en el agua, realizar el procedimiento con cuidado ya que el KOH es altamente corrosivo y al mezclarse con el agua se produce una 106 reacción exotérmica, por lo cual el frasco se calentará, una vez que se haya enfriado, almacenar en frasco ámbar en refrigeración. Rojo de metilo (Prueba de rojo de metilo) Rojo de metilo 0.1 g Etanol 300 mL Agua destilada 200 mL Disolver el rojo de metilo en el etanol y agregar el agua, almacenar en frasco ámbar en refrigeración. Prueba de oxidasa N, n, n, n-tetrametil-p-fenilendiamina Impregnar una porción de papel filtro (7 cm de diámetro) con 3 gotas de solución acuosa al 1 % del reactivo, secar a temperatura ambiente (no secar por completo) y congelar -20 ºC. Cloruro férrico (prueba de fenilalanina) FeCl3 10 g H2O destilada 100 mL Disolver cuidadosamente el FeCl3 en el agua destilada. Almacenar en frasco ámbar en refrigeración. Aceite mineral (sellado de bioquímicas) Aceite mineral sin esencia Esterilizar por autoclave 121ºC 15 lb 15 min, almacenar a temperatura ambiente. Tinción de Gram Colorante primario: Cristal Violeta 2.5 g H2O destilada 1000 ml Almacenar en frasco ámabar. Sensibilizante: NaHCO3 (Bicarbonato de sodio) 12.5 g H2O destilada 1000 ml Almacenar en frasco ámabar. Mordente: Iodo 20 g KI2 40 H2O destilada 900 ml Almacenar en frasco ámabar. Decolorante: Alcohol Etílico 96 % 50 ml 107 Acetona 50 ml Almacenar en frasco ámabar. Colorante de contraste: Fucsina Básica, solución saturada en alcohol de 95% 100 ml H2O destilada 900 ml Almacenar en frasco ámabar. Reactivo de Gregensen (corroborar tinción de Gram) KOH 3 g H2O destilada 100 mL Disolver cuidadosamente el hidróxido en el agua ya que es corrosivo, almacenar en frasco ámbar en refrigeración. 108 Anexo 4. Soluciones Solución amortiguada de fosfatos (PBS) NaCl (JT Baker®) 8 g KCl (JT Baker®) 0.2 g KH2PO4 (JT Baker®) 0.2 g Na2HPO4 (JT Baker®) 1.15 g Ajustar pH 7.4, aforar a 1000 mL con agua destilada, esterilizar por autoclave 121ºC 15 min 15 lb. Soluciones para electroforesis Solución TRIS-ácido acetico-EDTA (TAE) 50X Trisaminometano base (Affymetrix USB®) 242 g Ácido acético glacial (JT Baker®) 57.1 mL Ácido Etilen Diamino Tetracético - EDTA (JT Baker®) 37.2 g o 50 mL a 0.5 M pH 8.0 Aforar a 1 L de agua destilada. Esterilizar por autoclave 121ºC 15 min 15 lb Solución de trabajo 1X. Solución borato de sodio (SB) 25X NaOH (JT Baker®) 25 mM disolver en agua destilada y ajustar pH con ácido bórico (JT Baker®) a 8.0 - 8.5 de pH. Esterilizar por autoclave 121ºC 15 min 15 lb Solución de trabajo 1X. Amortiguador de carga para ADN Glicerol o Sacarosa (Sigma-Aldrich®) 30-40 % (w/v) Ciano de xileno (Sigma-Aldrich®) 0.25 % (w/v) Azul de bromocresol (Sigma-Aldrich®) 0.25 % (w/v) Naranja G (Sigma-Aldrich®) 0.50-0.75 % (w/v) Agua destilada Esterilizar por autoclave 121°C 15 min 15 lb Solución de trabajo 1 X (Realizar Dilución con solución TAE o SB según sea el caso). Agarosa con SB 1.5 % Agarosa grado biología molecular (Invitrogen®) 1.5 g Solución SB 1x 100mL Calentar hasta ebullición y disolución de la agarosa y enfriar hasta 50 ºC y vaciar. Agarosa con TAE 0.8 % Agarosa grado biología molecular (Invitrogen®) 1.5 g Solución TAE 1x 100 mL Calentar hasta ebullición y disolución de la agarosa y enfriar hasta 50 ºC y vaciar. 109 Soluciones para extracción de ADN Solución de lisis 1.66 M tiocianato de guanidina (Sigma-aldrich®) N-Sarcosyl (Sigma-Aldrich®) 0.16% EDTA Na (JT Baker) pH 8.0 a 0.5M Disolver todos los reactivos en agua Mili Q y aforar a 150 mL Esterilizar por autoclave 121°C 15 min 15 lb, almacenar en frasco ámbar a temperatura ambiente. Acetato de amonio 7.4 M 7.4 M Acetato de amonio (JT Baker®) 100 mL Esterilizar por autoclave 121°C 15 min 15 lb Almacenar a -20 ºC. Fenol-cloroformo Fenol (Sigma-Aldrich) 25 mL Cloroformo (JT Baker®) 25 mL Almacenar en frasco ámbar en refrigeración 4°C. Fenol-cloroformo-alcohol isoamílico Fenol (Sigma-Aldrich) 25 mL Cloroformo (JT Baker®) 24 mL Alcohol isoamílico (JT Baker®) 1 mL Almacenar en frasco ámbar en refrigeración 4°C. Etanol 100% Alcohol etílico absoluto (JT Baker®) 100 mL Almacenar a -20°C. Etanol 70% Alcohol etílico absoluto (JT Baker®) 70 mL H2O libre de nucleasas 30 mL Almacenar a -20°C. SOLUCIONES PARA GELES DESNATURALIZANTES DE POLIACRILAMIDA- SDS 1.5 Tris-HCl pH 8.8 Tris base 18.17 g Agua destilada 50 ml Se ajusta pH a 8.8 con HCl, se afora a 100 ml con agua destilada y se esteriliza a 121 ºC, 121 lb, 15 min. Se almacena a 4 ºC. 0.5 Tris-HCl pH 6.8 Tris base 6.0 g Agua destilada 50 ml 110 Se ajusta pH a 6.8 con HCl, se afora a 100 ml con agua destilada y se esteriliza a 121 ºC, 121 lb, 15 min. Se almacena a 4 ºC. Acrilamida Acrilamida 30.0 g Bisacrilamida 0.8 g Se afora a 100 ml con agua destilada y se almacena en frasco ámbar a 4 ºC. Persulfato de amonio Persulfato de amonio 100 mg Agua destilada 1 ml Se utiliza al momento o se hacen alicuotas de 100 µl y se congelan a -20 ºC. Amortiguador de muestra 0.5 M Tris-HCl pH 6.8 1.0 ml Glicerol 0.8 ml SDS al 10% 1.6 ml 2-mercaptoetanol 0.4 ml Agua destilada 0.4 ml Azul de bromofenol cristales Se almacena en recipiente ámbar a temperatura ambiente. Amortiguador de corrida Tris base 25 mM 3.03 g Glicina 192 Mm 14.4 g SDS 0.1% 1 g Se afora a 1000 ml con agua destilada. Gel separador, la preparación consta de los siguientes elementos: Agua destilada 3.35 ml 1.5 m TRIS- HCL Ph 8.8 2.5 ml SDS 10% 100 µl Acrilamida 4.0 ml Persulfato de amonio 10% 60 µl TEMED 7 µl Gel concentrador, la preparación consta de los siguientes elementos: Agua destilada 6.1 ml 1.5 m TRIS- HCL Ph 6.8 2.5 ml SDS 10% 100 µl Acrilamida 1.3 ml Persulfato de amonio 10% 60 µl TEMED 10 µl 111 TINCIONES Tinción de Coomassie Etanol 40 % Ácido acético 10 % Azul brillante de Coomassie 0.05% w/v Agua destilada 50% Tinción de plata Nitrato de plata 2.5 g Formaldehido 108 µl (0.04 % concentración final) Agua destilada 100 mL Proteger de la luz Solución aclaradora Tiosulfato de sodio 0.6 g Ferrocianuro de potasio 0.3 g Na2CO3 0.1 g Agua destilada 200 mL Proteger de la luz Solución desteñidora para tinción de Coomassie Etanol 40 % Ácido acético 10 % Agua destilada 60% SOLUCIONES DE INMUNOTRANSFERENCIA Solución de Towbin SDS 0.037% 0.36 g Tris base 25 mM 3.03 g Glicina 192 M 14.4 g Metanol 20% 200 ml Se afora a 1000 ml con agua destilada. 112 Anexo 5. Publicaciones producto de este trabajo Citation: Acevedo-Monroy, S.E.; Rocha-Ramírez, L.M.; Martínez Gómez, D.; Basurto-Alcántara, F.J.; Medina-Contreras, Ó.; Hernández-Chiñas, U.; Quiñones-Peña, M.A.; García-Sosa, D.I.; Ramírez-Lezama, J.; Rodríguez-García, J.A.; et al. Polyvalent Bacterial Lysate with Potential Use to Treatment and Control of Recurrent Urinary Tract Infections. Int. J. Mol. Sci. 2024, 25, 6157. https://doi.org/10.3390/ ijms25116157 Academic Editor: Jochen Mattner Received: 1 May 2024 Revised: 21 May 2024 Accepted: 23 May 2024 Published: 3 June 2024 Copyright: © 2024 by the authors. Licensee MDPI, Basel, Switzerland. This article is an open access article distributed under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution (CC BY) license (https:// creativecommons.org/licenses/by/ 4.0/). International Journal of Molecular Sciences Article Polyvalent Bacterial Lysate with Potential Use to Treatment and Control of Recurrent Urinary Tract Infections Salvador Eduardo Acevedo-Monroy 1,2 , Luz María Rocha-Ramírez 3 , Daniel Martínez Gómez 4, Francisco Javier Basurto-Alcántara 5, Óscar Medina-Contreras 6 , Ulises Hernández-Chiñas 1,7 , María Alejandra Quiñones-Peña 1,8 , Daniela Itzel García-Sosa 1, José Ramírez-Lezama 9, José Alejandro Rodríguez-García 1, Edgar González-Villalobos 10, Raúl Castro-Luna 11, Leonel Martínez-Cristóbal 11 and Carlos Alberto Eslava-Campos 1,7,* 1 Laboratorio de Patogenicidad Bacteriana, Unidad de Hemato-Oncología e Investigación, Hospital Infantil de México Federico Gómez/Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México, Dr. Márquez No. 162, Col Doctores, Alcaldía Cuauhtémoc, Ciudad de México 06720, Mexico; salcevedom@fmvz.unam.mx or salcevedom@gmail.com (S.E.A.-M.); ulisesh@unam.mx (U.H.-C.); maria.quinones@utrgv.edu (M.A.Q.-P.); danielaitzelgs@hotmail.com (D.I.G.-S.); alej.rodriguez42@gmail.com (J.A.R.-G.) 2 Laboratorio de Microbiología Molecular Departamento de Microbiología e Inmunología, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México, Av. Universidad #3000, Colonia, C.U., Coyoacán, Ciudad de México 04510, Mexico 3 Unidad de Investigación en Enfermedades Infecciosas, Hospital Infantil de México Federico Gómez. Secretaría de Salud, Dr. Márquez No. 162, Col Doctores, Alcaldía Cuauhtémoc, Ciudad de México 06720, Mexico; luzmrr7@yahoo.com.mx 4 Departamento de Producción Agrícola y Animal, Laboratorio de Microbiología Agropecuaria, Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco, Calzada del Hueso 1100, Colonia Villa Quietud, Alcaldía Coyoacán, C.P., Ciudad de México 04960, Mexico; dmartinez@correo.xoc.uam.mx 5 Laboratorio de Vacunología y Constatación, Departamento de Microbiología e Inmunología, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México, Av. Universidad #3000, Colonia, C.U., Coyoacán, Ciudad de México 04510, Mexico; basurto@unam.mx 6 Unidad de Investigación Epidemiológica en Endocrinología y Nutrición, Hospital Infantil de México Federico Gómez, Dr. Márquez No. 162, Col. Doctores, Alcaldía Cuauhtémoc, Ciudad de México 06720, Mexico; omedina@himfg.edu.mx 7 Unidad Periférica de Investigación Básica y Clínica en Enfermedades Infecciosas; Departamento de Salud Pública, División de Investigación Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México, Dr. Márquez No. 162, Col Doctores, Alcaldía Cuauhtémoc, Ciudad de México 06720, Mexico 8 Department of Health & Biomedical Science College of Health Professions, Biomedical Science, The University of Texas Rio Grande Valley, Edinburg, TX 78539, USA 9 Departamento de Patología, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México, Ciudad de México 04510, Mexico; pepeton_60@yahoo.com.mx 10 Laboratorio de Epidemiología Molecular, Departamento de Salud Pública División de Investigación Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México, Av. Universidad #3000, Colonia, C.U., Coyoacán, Ciudad de México 04510, Mexico; edgar.villalobos@comunidad.unam.mx 11 Bioterio, Hospital Infantil de México Federico Gómez, Dr. Márquez No. 162, Col Doctores, Alcaldía Cuauhtémoc, Ciudad de México 06720, Mexico; raulcaslu@yahoo.com.mx (R.C.-L.); martinezcristobal@yahoo.com.mx (L.M.-C.) * Correspondence: carlos_01eslava@yahoo.com.mx or eslava@unam.mx; Tel.: +52-555-228-9917 Abstract: Overuse of antimicrobials has greatly contributed to the increase in the emergence of multidrug-resistant bacteria, a situation that hinders the control and treatment of infectious diseases. This is the case with urinary tract infections (UTIs), which represent a substantial percentage of worldwide public health problems, thus the need to look for alternatives for their control and treatment. Previous studies have shown the usefulness of autologous bacterial lysates as an alternative for the treatment and control of UTIs. However, a limitation is the high cost of producing individual immunogens. At the same time, an important aspect of vaccines is their immunogenic amplitude, which is the reason why they must be constituted of diverse antigenic components. In the case of UTIs, the etiology of the disease is associated with different bacteria, and even Escherichia coli, the main causal agent of the disease, is made up of several antigenic variants. In this work, we present results on the study of a bacterial lysate composed of 10 serotypes of Escherichia coli and by Int. J. Mol. Sci. 2024, 25, 6157. https://doi.org/10.3390/ijms25116157 https://www.mdpi.com/journal/ijms Int. J. Mol. Sci. 2024, 25, 6157 2 of 19 Klebsiella pneumoniae, Klebsiella aerogenes, Enterococcus faecalis, Proteus mirabilis, Citrobacter freundii, and Staphylococcus haemolyticus. The safety of the compound was tested on cells in culture and in an animal model, and its immunogenic capacity by analysing in vitro human and murine macrophages (cell line J774 A1). The results show that the polyvalent lysate did not cause damage to the cells in culture or alterations in the animal model used. The immunostimulatory activity assay showed that it activates the secretion of TNF-α and IL-6 in human macrophages and TNF-α in murine cells. The obtained results suggest that the polyvalent lysate evaluated can be an alternative for the treatment and control of chronic urinary tract infections, which will reduce the use of antimicrobials. Keywords: urinary tract infections; bacterial lysates; animal model; in vitro assays; immunostimulant; culture cells 1. Introduction Recently, the increase in antimicrobial multiresistant bacteria has come to pose a serious problem for the treatment and control of infectious diseases. It is estimated that before the middle of the 21st century, millions of people will die because of infectious diseases, or their complications caused by multiresistant bacteria [1]. In this situation, there is a need to look for alternatives that can contribute to the treatment and control of some infectious diseases which, because of the exaggerated and misdirected use of antimicrobials, are becoming more and more difficult to treat. Among these, urinary tract infections (UTIs) have acquired great relevance, both in the number of cases that have increased worldwide and with the different organic and social complications that are associated with this disease [2]. The treatment of UTIs, like that of other infectious diseases, is carried out with antimicrobials; however, the resistance of bacteria to most of the products routinely used for their treatment has limited the options for their control [3–5]. Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) is the most frequently associated bacteria with the pathogenesis of UTIs. However, other bacteria including Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecalis, Proteus mirabilis, and Staphylococcus spp, are microorganisms also associated with UTIs, showing high resistance to commonly used antimicrobials for the treatment of this condition [6–10]. Failures in antimicrobial treatment are not the only problem related to the management of UTIs; the use of antimicrobials for long periods can cause alterations in the microbiota and damage to host organs with consequent repercussions such as diabetes, immune response alterations, or inflammatory colitis, among other illnesses [11–17]. In this situation, it is necessary to implement effective alternative therapies to reduce the use of antimicrobials. During two prospective studies of children and adults with chronic urinary tract infection (UTI), lysates of bacteria isolated from the same patient (autovaccines) were used as an alternative treatment; these were inactivated by heat treatment and sterilized by filtration [18,19]. Both groups of patients were followed for seven months to a year, with urine samples collected every month. The results of both studies showed a favorable response, controlling the infection in almost 70% of both groups of patients, with in some cases, reinfections occurring between six months and one year after administering the bacterial lysate. The use of complete microorganisms related to the etiopathogenesis of a condition such as UTI has the advantage of providing diverse immunogenic compounds that can induce an effective polyvalent response [20]. The purpose of the present study was to evaluate the immunostimulatory activity and safety of a polyvalent lysate prepared with previously isolated bacteria [18,19], to have a product with different antigenic components that allows the treatment and control of recurrent urinary tract infections, that is reliable and accessible to the population that requires it and can be used as an alternative to reduce the use of antimicrobials in cases of UTI. Int. J. Mol. Sci. 2024, 25, 6157 3 of 19 2. Results 2.1. Selected Bacteria to Elaborate UNAM-HIMFG Lysate The UNAM-HIMFG polyvalent lysate was elaborated with 10 strains of E. coli, 7 of classical serogroups (O25, O75, O6, O8, O1, O16, and O7), and 3 considered as endemic (O9, O17, and O20), and with strains of Klebsiella pneumoniae, Klebsiella aerogenes, Citrobacter freundii, Proteus mirabilis, Staphylococcus haemolyticus, and Enterococcus faecalis, all bacteria isolated most frequently among patients of two previous studies [18,19]. The antimicrobial susceptibility profile assay of these strains reported multidrug-resistant patterns in all the microorganisms (Tables S3 and S4). The phylogroups and virulence genes of the E. coli strains were also analyzed in these assays, five strains were found to belong to the B2 group (O1, O6, O16, O25, and O75 serogroups), two to A (O9, O20), two to D (O7 and O17) and one to the B1phylogroup (O8). The presence of genes involved in virulence analyzed by PCR showed that strains from phylogroup B2 presented between 11 and 23 genes, the most frequent being fimH, feoB, sitA, chuA, and ompA, among others, while the strains from phylogroups A, B1, and D presented between 2 and 13 genes (Table S5). 2.2. Procedures for Preparing Lysates To determine the time in which the selected bacteria reached the exponential phase, growth kinetics were performed, in which it was identified that the enterobacteria report exponential growth between 3.5 and 4 h post-inoculation. In the case of Gram-positive bacteria, the exponential growth of S. haemolyticus starts at 8 h and E. faecalis 6 h post- inoculation. To have homogeneous parameters when adjusting the samples of the lysates under study, the concentrations of some of its components were analyzed. In the UNAM- HIMFG lysate, the concentration of proteins was 578 µg/mL, peptidoglycan 0.26 ng/mL, lipopolysaccharide 174 ng/mL, and carbohydrates 8657 µg/mL. When comparing the concentration of the same compounds in the monovalent lysates evaluated, it was observed that the UNAM-HIMFG polyvalent had concentrations up to five times higher than those obtained in the monovalent lysates (Table 1). Table 1. Analysis of macromolecules composing the different lysates. Lysate Protein Concentration (µg/mL) Peptidoglycan Concentration (ng/mL) Lipopolysaccharide Concentration (ng/mL) Carbohydrate Concentration (Hexoses) (µg/mL) Carbohydrate Concentration (Pentoses) (µg/mL) UNAM-HIMFG 578 0.26 174 7823 8657 Escherichia coli O25:H4 25.8 0.01 1.2 500 569 Escherichia coli O20:H9 33.8 ND ND ND ND Klebsiella pneumoniae 23 0.033 1.4 1036 835 Citrobacter freundii 37.3 ND ND ND ND Proteus mirabilis 38 ND ND ND ND Enterococcus faecalis 33.1 0.017 0 409 377 Staphylococcus haemolyticus 20.8 0.08 ND ND ND Abbreviation: ND, No Determinated. Values shown are averages obtained from at least two assays at different times; The pH in both monovalent and polyvalent lysates was 4. 2.3. Antigenicity of UNAM-HIMFG and Monovalent Lysates To confirm if the components of the UNAM-HIMFG lysate and some monovalent were immunogenic, SDS-PAGE and Western blot (WB) tests were performed. In the SDS-PAGE, the presence of fractions with different migration profiles was observed (Figure 1A,B). The antigenicity of the fractions obtained in the lysates was analyzed, using serum from a patient with CUTI who was treated with a monovalent lysate (autovaccine) prepared with an E. coli O25:H4 strain [18]. An intense serum reaction against the LPS of UNAM- Int. J. Mol. Sci. 2024, 25, 6157 4 of 19 HIMFG and monovalent E. coli O25:H4 lysates was observed, alongside poor recognition of the E. coli O20:H9 and Citrobacter freundii lysates (Figure 2). The result obtained shows that the autovaccine administered to a patient with CUTI activated the immune response, showing high specificity towards the LPS present in both lysates UNAM-HIMFG and O25:H4. Conversely, serum from patients with CUTI but who did not receive autovaccine did not react with either lysate. ff Figure 1. SDS PAGE of polyvalent and monovalent lysate components Silver stained. (A): Lines: (1) Polyvalent lysate (UNAM-HIMFG), (2) E.coli O25, (3) E.coli O20, (4) Citrobacter, (B): Lines: (1) Klebsiella, (2) Enterococcus, (3) Staphylococcus, and (4) Proteus. MW Molecular Weight: PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (ThermoScientific). Int. J. Mol. Sci. 2024, 25, 6157 5 of 19 ff ff ff ff ff Figure 2. Western blot of polyvalent (UNAM-HIMFG) and monovalent lysates. The lysates were challenged with a serum sample obtained from a patient previously treated with a lysate prepared with an O25 E. coli strain. Lines: (1) UNAM-HIMFG; (2) E.coli O25; (3) E.coli O20; and (4) Citrobacter. MW Molecular Weight: PageRuler Plus Prestained Protein Ladder. 2.4. Protein Detection The SDS-PAGE performed shows fractions of different molecular weights (Figure 1), rabbit antibodies against OmpA previously obtained [18] were used in a WB assay. An intense reaction was observed on a 35 kDa (which corresponds to OmpA) and with less intensity against other fractions of different molecular weights (Figure 3). The result indicates that the UNAM-HIMFG lysate contains immunogenic protein fractions. In the assay analyzed, three different batches of the UNAM-HIMFG lysate showed a similar recognition profile. ff ff ff ff ff Figure 3. Western blot of different preparations of the UNAM-HIMFG polyvalent lysate. The WB was developed with polyvalent rabbit antibodies obtained against OmpA. Lines: 1, 2, and 3, samples of different preparations of polyvalent lysate. (Arrow indicates OmpA 35 kDa) MW Molecular Weight: Page Ruler Plus Protein Ladder pre-dye. Int. J. Mol. Sci. 2024, 25, 6157 6 of 19 2.5. Cytotoxic Activity of Lysates The safety of the UNAM-HIMFG lysate and some monovalent lysates was analyzed on murine macrophages J774.A1 and the human epithelial cells Caco-2 and HEK293. The result of the three cell lines evaluated by trypan blue staining showed that none of the bacterial lysates caused damage to the challenged cells—an effect different from that induced by Triton X-100 and DMSO used as controls for cytotoxic effect. To confirm the safety of the lysates, MTT and XTT assays were performed on the HEK293 line. In this assay, it was observed that the lysates did not alter the viability of the cells as was observed in the untreated control; however, opposite results were observed in the cells treated with Triton X-100 and DMSO, where the cell damage was total (p ≤ 0.005). 2.6. Effect of UNAM-HIMFG Lysate on a Mouse Model A mouse model was used to determine whether the polyvalent lysate could cause damage to digestive tract tissues when administered orally at a level of 200 µL weekly for 60 days. The animals, during the time that the lysate was administered, did not show clinical alterations (weight loss, behavioral changes, signs of gastrointestinal alterations, or other alterations), suggestive of alterations or damage caused by the administered product. After 60 days, the animals were sacrificed and in the analysis of the stomach and intestinal sections, no alterations were identified, a situation similar to what was observed in the animals used as controls inoculated with physiological saline solution (Figure 4). ff ff ff ≤ ff α ff ff α Figure 4. Histological evaluation of mice tissues treated with physiological saline solution (left) or the polyvalent bacterial lysate (right). (A,B) Stomach epithelium, (C,D) Intestinal epithelium. Samples were stained with Eosin and Hematoxylin and observed to ×400. Int. J. Mol. Sci. 2024, 25, 6157 7 of 19 2.7. Immunostimulatory Activity of Lysates The stimulatory capacity of UNAM-HIMFG and monovalent lysates of E. coli O25:H4 and O20:H9, K. pneumoniae, and E. faecalis was analyzed on the murine macrophage cell line J774.A1. The assays showed that all lysates except that of E. faecalis activated the production of TNF-α with a dose-dependent effect (Figure 5A–E). To find out whether the effect was due to LPS, polymyxin B neutralization was performed; in this test, a 38% decrease in TNF-α secretion was observed in the UNAM-HIMFG lysate, 45% in E. coli O25:H4, 26% in E. coli O20:H9, and 11% in the correspondent of K. pneumoniae, compared with the untreated samples (Figure 5A–E). In these cells, IL-10 production was also evaluated with negative results in all lysates at 24 h of incubation (p ≤ 0.005). ≤ α ff α ff ff ff ≤ α ffFigure 5. Secretion of TNF-α in J774 A.1 murine macrophages with different concentrations of the lysates. (A) UNAM-HIMFG, (B) E. coli O 25:H4, (C) E. coli O20:H9, (D) K. pneumoniae, and (E) E. faecalis. Results are the average of three tests performed in duplicate p ≤ 0.005. SSF: Physiological saline solution; PMB: polymyxin B 100 µg/µL; LPS: Lipopolysaccharide 100 ng/µL. The activities of UNAM-HIMFG, E. coli O25:H4, and E. faecalis lysates were also ana- lyzed on human macrophages. In this assay, it was identified that both UNAM-HIMFG and E. coli O25:H4 lysates activate TNF-α secretion, with no dose-dependent effect (Figure 6A,B), and again, E. faecalis lysate did not activate TNF-α secretion (Figure 6C). In this assay, the effect of polymyxin B on macrophage activation was also evaluated, this effect was 100% inhibited with UNAM-HIMFG lysate and 22% with E. coli O25:H4 lysate (Figure 6A,B). IL-6 production was also analyzed; the effect of both UNAM-HIMFG and E. coli O25:H4 was positive for the secretion of the cytokine (Figure 6D,E). As was previously observed, the stimulatory activity decreased by 50–60%, respectively (Figure 6D), after polymyxin B treatment. In a new finding, E. faecalis lysate showed no stimulatory activity (p ≤ 0.005) on IL-6 secretion (Figure 6F). Int. J. Mol. Sci. 2024, 25, 6157 8 of 19 α ffi ff ffi ff ff ff ff ʺ ʺ Figure 6. TNF- and IL-6 production of human macrophages activated by UNAM-HIMFG, E. coli O 25:H4, and E. faecalis lysates. UNAM-HIMFG (A,D), E. coli O 25:H4 (B,E), y E. faecalis. (C,F). Results are the average of three tests performed in duplicate. p ≤ 0.005. SSF: Physiological saline solution; PMB: polymyxin B 100 µg/µL; LPS: Lipopolysaccharide 100 ng/µL. 3. Discussion The search for alternatives for the control of bacterial infections is of utmost importance considering the increasing number of multiresistant bacteria to antibiotics [1,5,6]. UTIs are infectious processes that have acquired great relevance, mainly because of the current difficulty in their effective treatment with antimicrobials [9,10,21]. Although the use of vaccines to prevent diseases is an alternative of great relevance, in many infectious diseases, the complexity of the pathogen or causal pathogens is a limiting factor that makes it difficult to obtain the optimal immunogen [22,23]. At the same time, since UTIs do not affect the entire population, the use of a prophylactic method to prevent its occurrence is complicated. Although UTIs are a condition of great clinical and epidemiological importance, it is not possible to practice generalized immunization [2,3]. This is why alternatives should be sought that contribute to the treatment and control of UTIs [24,25]. The use of bacteria lysed by different procedures complies with the above goals. Alrmroth E. Wright (1930) developed the first autovaccine when he considered that dead microorganisms, besides helping to prevent infections, could also contribute to their treatment [26]. In two previous studies, the effect of monovalent lysates was evaluated (autovaccines) in the treatment and control of recurrent urinary tract infections [18,19]. In the previously mentioned studies, E. coli of different serogroups was observed to be the most frequently isolated pathogen. With this information, the development of a polyvalent immunogen (bacterial lysate) was considered, including serogroups defined as “classic” uropathogenic E. coli (O25, O75, O1, O6, O8), mainly related to persistent infections, and other (O20, O11, O17), antigenic, variants that could be considered endemic, mainly associated with cases of reinfections. The immunogen also included Klebsiella pneumoniae, Klebsiella aerogenes, Citrobacter freundii, Proteus mirabilis, Staphylococcus haemolyticus, and Enterococcus faecalis bacteria, which, although less frequently, were also isolated from the studied patients. The polyvalent lysate UNAM-HIMFG, due to its composition, includes several molecules (Table 1) with immunogenic properties capable of activating the immune system [21,24,27–29]. This was confirmed by SDS-PAGE and WB analysis of the lysate. Int. J. Mol. Sci. 2024, 25, 6157 9 of 19 The composition (Figure 1) includes a great diversity of components of different molecular weights that are recognized by antibodies from patients with persistent UTIs treated with a monovalent lysate prepared with a UPEC strain of serogroup O25:H4. In this assay (Figure 2), LPS recognition was observed and found to have high specificity towards the homologous LPS (O25), but only in patients previously treated with the monovalent lysate [18,19], since serum from untreated patients did not induce a response. The content and diversity of peptidoglycan and sugars, together with the LPS of the UNAM-HIMFG lysate (Table 1), support its broad immunostimulant capacity. There are studies that point out the participation of LPS in UTIs as a mediator in colonization events and the formation of intracellular reservoirs, as well as an immunomodulator in the response to these infections [30]. The immunomodulatory activity of LPS has been analyzed by making modifications in the molecule and evaluating the effect of the changes on the response of mice in the expression of cytokines and antibodies [30]. The UNAM- HIMFG lysate, in addition to having a high LPS content (Table 1), is diverse due to the different strains of enterobacteria that were selected for its composition, which confers greater complexity without making modifications to the molecule. As with LPS, the ability of different doses of bacterial polysaccharides and peptidoglycan to stimulate the systemic immune response in mice free of specific pathogens has been demonstrated [28]. It is important to note that outer membrane proteins are considered important epitopes for the development of diagnostic systems and mainly vaccines, because of their ability to stimulate the immune response [29,31–33]. The protein composition of the UNAM-HIMFG lysate is very diverse (Figure 1A,B); to know if some of these proteins were immunogenic, their reactivity was evaluated by WB assays. Since there are no antibodies against the lysate, rabbit polyclonal antibodies directed against OmpA obtained previously were used [18]. As mentioned above, the antibodies recognized a fraction of approximately 35 kD corresponding to OmpA (Figure 3), as well as other (unidentified) protein fractions. This result was like that obtained previously when analyzing different monovalent lysates prepared with E. coli strains of serogroups O25, O75, O8, and O6 [18]. It is important to mention that in the previous study, in addition to OmpA, OmpC, NmpC, Udp, Gpma, FimH, BamB, and BamC were identified. The presence of the referred protein fractions is probably part of the pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), which participate in the immune stimulation of the host against uropathogens [25,34–36]. The prepared bacterial lysate was obtained by heat treatment with saturated steam and then subjected to filtration, so it is a compound free of whole bacterial cells but retains most of the soluble components including those present in the periplasmic space, which may have different properties. NlpD is a protein associated with bacterial cell division that activates the peptidoglycan hydrolase; previous studies state that this protein phosphorylates host RNA polymerase II and by transcriptional regulation, decreases the inflammatory response secondary to UPEC infection so that a severe acute infection is reversed and becomes asymptomatic bacteriuria [37–39]. Although to date, the presence of this protein in UNAM-HIMFG lysate has not been identified, in previous studies in which autologous lysates were administered, some patients reported clinical improvement, although bacteriuria persisted [18,19]. The safety of a compound must be evaluated to avoid adverse effects on the individual to whom it is intended to be administered. As previously mentioned, UNAM-HIMFG lysate contains LPS in high concentrations; this compound has different effects that are concentration- and host-dependent. It is known that at doses of 10–15 µg/kg, it induces toxic shock in humans but not in mice, which tolerate several times this dose (10 mg/kg). In some studies, an adverse effect has not been demonstrated at doses of 20 µg/mL orally administrated for 10 consecutive days [40,41]. In this regard, it has been shown that the pure toxic fraction of LPS does not have the ability to cross the intestinal barrier and can only cause toxic effects when the mucosa undergoes a continuity solution [42]. LPS as well as any drug administered orally will present modifications during its passage through the digestive tract, from its entry through the mouth until its arrival in the intestine [43]. In this Int. J. Mol. Sci. 2024, 25, 6157 10 of 19 regard, it is known that treating LPS with acid reduces its toxic capacity, although it retains its stimulant properties [44]. In vitro and in vivo assays (Figure 4) to evaluate whether the UNAM-HIMFG lysate was innocuous showed that it is a non-toxic and safe compound despite its high content of LPS and peptidoglycan. The results obtained in the safety assays of the UNAM-HIMFG lysate provided a guideline to evaluating its effect on cells associated with the immune response. The assay to evaluate the immunostimulatory activity of the lysates was performed on murine cells (J774A.1) in culture and on human macrophages [45–47]. UNAM-HIMFG as well as some of the monovalent lysate tested (E. coli O25H:4, E. coli O20:H9, and Klebsiella pneumoniae), activated the innate immune response in mouse and/or human macrophages by stimulating TNF-α production (Figure 5A,B). The results confirm that LPS is a key molecule for the activation of the innate immune response. The synergistic effect between LPS and bacterial DNA to induce TNF-α production in mouse macrophages has been described [48–51]. PG and lipoteichoic acids in human monocytes also have been stated to induce the secretion of this cytokine [50]. Although the monovalent lysate of E. faecalis did not show a stimulatory effect on either of the two cell types used, the result confirms that bacterial structures vary between genera and species [52,53], which supports the relevance of using immunogens with epitopes expressed by the different microorganisms [24,30,32]. In addition, with regard to LPS, it has been reported that in conjunction with bacterial flagellin, it induces TNF-α production [54]. It is important to note that the presence of flagellin in the UNAM- HIMFG lysate was because the E. coli strains used had flagellar antigens [10]. The role of TNF-α in urinary tract infections is of great relevance, in this respect, it has been observed in patients with rheumatoid arthritis treated with specific TNF-α inhibitors that the risk of suffering UTIs is notably increased [55]. The ability of the lysates (polyvalent and monovalent) to induce the expression of TNF-α suggests their participation in cell training to activate the immune response against pathogens responsible for UTIs [10,18,19]. In different studies in which cystitis images were evaluated, the participation of resident macrophages in the bladder that release TNF-α and induce the expression of chemokine [C-X-C motif] ligand 2 (CXCL2) was observed, as well as the activation of neutrophils that stimulates the expression of matrix metalloproteinase-9, which increases its capacity to cross the epithelium favorably modifying cystitis problems [56,57]. Finally, the resident mast cells of the bladder by secreting TNF-α generate the recruitment of dendritic cells [58]. The above shows the relevance of TNF-α in recurrent UTIs and how its activation by the effect of a polyvalent immunogen can participate in the treatment and control of UTIs by limiting the use of antimicrobials. The study shows the ability of monovalent and polyvalent lysates to induce in mouse cells and human macrophages the production of TNF-α, but not IL-10. Studies with human peripheral blood monocytes indicate that the presence of neutrophils in an apoptotic state and urinary epithelial cells is required for IL-10 release. What was observed in this study could be explained by the fact that the information was obtained from a cell line [J774.A1] and cultured human macrophages [59–61]. The study analyzed the presence of different genes related to E. coli virulence; the result was important because of the number of genes presented by the selected strains (Table S5), some of which were related to the expression of toxins, fimbriae, and other structures relevant to E. coli virulence. The study also showed that UNAM-HIM lysates and monovalent E. coli O25.H4 activated IL-6 production (Figure 6A,B). It has been found that the different components of UPEC strains (type 1 fimbriae, curli, and flagellum) in co-culture systems participate in the activation of IL-6 production [61]. The activation of TNF-α and IL-6 production suggests that the response activated by the components of the lysates is mainly pro-inflammatory and directed towards cell capacitation and migration. However, it is important to note that the lysates were evaluated only with macrophages, so the immunological context of how the lysates act on other cytokines and different cell signaling pathways needs to be further understood. Int. J. Mol. Sci. 2024, 25, 6157 11 of 19 In animal models, it has been demonstrated that the capacity of LPS administered orally and intranasally to conduct a humoral response mainly by IgA, the immunoglob- ulin is important in the response for the neutralization of urinary pathogens during infection [62–64]. This work shows the immune recognition of LPS by systemic antibod- ies and the activation of pro-inflammatory cytokines, which shows the relevance of this molecule with great structural diversity to the different strains of E. coli that have the UNAM-HIMFG lysate, which, as has been reported, is relevant to the modulatory response of the host infection [22,30,48,52,63]. There are different commercial formulations prepared from bacterial lysates, in which some components’ presence needs to be analyzed in the UNAM-HIMFG lysate [65,66]. 4. Materials and Methods 4.1. Ethics Agreements All experiments were conducted in accordance with the specific techniques for the production, care, and use of laboratory animals described in NOM-062-ZOO-1999 [67] and have been approved by the Institutional Subcommittee for the Care and Use of Experimental Animals (SICUAE) of the Faculty of Veterinary Medicine and Zootechnics of the National Autonomous University of Mexico (FMVZ-UNAM) [Protocol No. SICUAE.DC2020/3-1], the Internal Committee for the Care and Use of Laboratory Animals (CICUAL) of the Faculty of Medicine of the National Autonomous University of Mexico (FacMed-UNAM) [Protocol No. CICUAL 002-CIC.2021], and the Research, Research Ethics, and Biosafety Committees of the Hospital Infantil de México Federico Gómez [HIM-2023-008]. 4.2. Microorganisms The UNAM-HIMFG lysate was prepared with 10 strains of E. coli of different serotypes and one bacterial strain each of Klebsiella pneumoniae, Klebsiella aerogenes, Citrobacter freundii, Proteus mirabilis, Staphylococcus haemolyticus, and Enterococcus faecalis isolated in two previous studies [10,18]. The selected preserved strains were recovered by culture on Luria-Bertani (LB), MacConkey (McC) agar (Bioxon) for enterobacteria, Mannitol agar with Salt (Mcdlab) for Staphylococcus, and Bilis agar with esculin and sodium azide (Merk) for Enterococcus. The identities of the strains were confirmed by verifying their biochemical profile [68,69]. The recovered strains were preserved in skim milk (15%) and glycerol (20%) and in LB broth with glycerol (20%), and maintained at −70 ◦C until use. Once their identities were confirmed by metabolic tests, the E. coli strains were serotyped using 186 anti-O and 56 anti-H sera (SERUNAM, Mexico) obtained from rabbits immunized with the respective antigens (somatic [O] and flagellar [H]); the microplate agglutination procedure (Orskov) was used for this assay [70]. 4.2.1. Virulence Genes and Phylogroups of Escherichia coli To confirm the UPEC gene profile of the selected Escherichia coli strains, Polymerase Chain Reaction (PCR) assays were performed. DNA extraction was performed by the guani- dine thiocyanate procedure described by Pitcher et al. [71], with some modifications [72]. Briefly: The obtained DNA was reconstituted with 50 µL of MiliQ water (Millipore) and stored at −20 ◦C until use, and DNA concentration was adjusted to 100 ng/µL. PCR as- say for virulence genes was performed with the gene-specific primers used in previous studies [10,18,19] and others used as a complement (Table S1) [73–75]. Assays were per- formed with PCR Master Mix (2×) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) with 0.2 nM of each primer and 200 ng of DNA; for phylogroups, the procedure reported by Clermont [76] was used. Each tube with its mixture was placed on the plate of a thermal cycler (Techne 3Prime, Thermo Scientific Fisher, Waltham, MA, USA; MiniAmp Thermal Cycler, Applied Biosystems, Thermo Scientific Fisher, Waltham, MA, USA) following the conditions referred to in Table S2. The amplified genes were analyzed in 1.5% agarose gel, performing electrophoresis in sodium borate (SB) buffer at 60 volts for 60 min or 100 volts for 30 min [72]. The following were used as reference strains: E. coli UPEC CFT073 (ATCC Int. J. Mol. Sci. 2024, 25, 6157 12 of 19 700928), E. coli K12 HB101 (ATCC 33694), and poultry E. coli APEC 1331 and APEC 1336 (Table S1). 4.2.2. Antimicrobial Sensitivity All the microorganisms used to elaborate the UNAM.HIMFG, were tested for antimi- crobial sensitivity by diffusion on Müeller–Hinton agar (BD Bioxon, Ciudad de México, Mexico) with sensidiscs (Oxoid, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) impregnated with the following antimicrobials: ampicillin (10 µg), mecilinam (10 µg), amoxicillin with clavu- lanic acid (20 µg/10 µg), piperacillin with tazobactam (100 µg/10 µg), cefozolin (30 µg), cefamandole (30 µg), cefepime (30 µg), cefoperazone (75 µg), cefoxitin (30 µg), ceftriax- one (30 µg), ceftazidime (30 µg), cefuroxime (30 µg), meropenem (10 µg), nitrofurantoin (300 µg), aztreonam (30 µg) (except Gram-positive), gentamicin (10 µg), amikacin (30 µg), kanamycin (30 µg), trobramycin (10 µg), streptomycin (10 µg), tetracycline (30 µg), ofloxacin (5 µg), ciprofloxacin (5 µ), norfloxacin 10 (µg), nalidixic acid (30 µg), trimethoprim with sulfamethoxazole (1.25 µg/23.75 µg), sulfonamides (250 µg), trimethoprim (5 µg), chloram- phenicol (30 µg), and fosfomycin (200 µg); in addition to vancomycin (30 µg) in the case of Gram-positive for use in urinary tract infections as recommended by CLSI [77]. E. coli strain ATCC 25,922 was used as a control for the assay. 4.3. UNAM-HIMFG Lysate Growth Curves of Selected Bacteria To obtain the growth profiles of the different microorganisms that would integrate the immunogen, bacterial growth kinetics were performed. Bacteria were individually cultured on LB agar incubated 24 h at 37 ◦C ± 2 ◦C. From the development of the culture, 5 colonies were selected and inoculated in 7.5 mL of LB broth incubating at 37 ◦C ± 2 ◦C for 16 h under agitation (200 rpm). From these cultures, 2 µL were taken and inoculated in 200 µL of LB broth placed in a 96-well plate (Costar, Corning, Austin, TX, USA) to analyze the growth kinetics for 8 h incubating the plate at 37 ◦C without agitation with readings (O.D. 600 nm) every hour in a spectrophotometer (Epoch BioTeK, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Uninoculated culture medium was used as a blank performing the same procedure. With the growth curve data of the selected bacteria, the polyvalent lysate was prepared using the procedure previously described [18], with some modifications. Briefly: with each bacterium, a pre-inoculum was prepared from 5 colonies in 7.5 mL of LB broth to optimize the adaptation of the bacteria to the liquid medium; then, they were transferred to 200 mL of LB incubating 37 ◦C ± 2 ◦C in constant agitation at 200 rpm in constant agitation at 200 rpm until reaching the exponential phase of growth. The bacterial mass was obtained by centrifugation at 4000× g for 60 min and the supernatant was discarded to subsequently perform three washes suspending the bacteria package each time in 30 mL of physiological saline solution (PSS) (Pisa, CdMx, Ciudad de México, Mexico). Once the supernatant of the third wash was eliminated, the pellet was reconstituted with 25 mL of SSF, and the bacterial suspension was adjusted to a value of 0.582 at an optical density (O.D.) of 600 nm, equivalent to approximately 9 × 108 CFU/mL. The referred procedure was performed for all the selected bacteria, with the defined concentration, and the microorganisms were mixed in 100 mL of SSF. To inactivate the bacteria, the flask with the mixture was placed under saturated steam (110 ◦C) for one hour maintaining the pressure at 6.4 psi (0.45 kg/cm2). Once the bacterial mixture was inactivated, the flask was centrifuged (4000 g/1 h) to obtain the supernatant, which was subsequently filtered with nitrocellulose or polyvinylidene fluoride (PVDF) membranes of 0.22 µm diameter (Merk Millipore Darmstadt, Germany). In parallel, monovalent lysates of E. coli serogroups O25:H4 and O20:H9, K. pneumoniae, and E. faecalis were prepared with the same procedure as previously mentioned. Each of the sterile lysates was packaged under aseptic conditions in 5 mL vials, previously baked (170 ◦C/2 h.) and autoclaved. The vials with the lysates were subjected to sterility tests and finally stored at 4 ◦C until use. Int. J. Mol. Sci. 2024, 25, 6157 13 of 19 4.4. Polyvalent Lysate Components The concentration of some of the components of the UNAM-HIMFG lysate and the monovalent E. coli serogroups O25:H4 and O20:H9, K. pneumoniae, and E. faecalis were evaluated. Proteins of the compounds were precipitated with trichloroacetic acid (TCA) following the indications previously described [78] with the following modifications: to 500 L of bacterial lysate was added one volume of 20% TCA; this was incubated on ice for 20 min, centrifuged at 13,000× g/20 min to remove the supernatant, and then the pellet with protein was washed with 3 volumes of cold acetone, again centrifuged (11,000× g/5 min); then, the supernatant was decanted and the pellet was dried (37 ◦C/10 min); and this was then reconstituted with 500 µL of physiological saline with 0.01 N NaOH. Protein concentration was evaluated by the Bradford colorimetric method (Bio-Rad Protein Assay) following the manufacturer′s instructions, taking readings at a wavelength of 595 nm. The pH of the immunogens was evaluated with test strips (Hydrion) by placing 10 µL of the product on the strip. The peptidoglycan and lipopolysaccharide concentration of the lysates was analyzed by enzyme immunoassay with ELISA kit (Abbexa LCC; Houston, TX, USA), considering the manufacturer′s instructions. For carbohydrate concentration, the phenol- sulfuric acid colorimetric method [79] was used; for this purpose, the lysates samples were adjusted to 200 µg and 5 µL of 80% phenol and 500 µL of pure H2SO4 were (carefully) added. Samples were incubated for 20 min at 30 ◦C, followed by spectrophotometer readings at an absorbance of 490 nm [80]. All assays were performed three times in duplicate. Lysates SDS-PAGE Analysis The presence of the components of the lysates (UNAM-HIMFG and monovalent) was analyzed by electrophoresis in 12% polyacrylamide denaturing gels with sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE) using 25 mM Tris base, 192 mM glycine, and 0.1% SDS as running buffer; 100 volts were applied to the samples [80]. In each well of the gel, a volume with an approximate concentration of 20 µg/mL of protein was placed; the protein profiles of the gel were analyzed by staining with silver nitrate as previously described [81]. 4.5. Lysates Immunogenicity To determine whether the serum of patients immunized with monovalent autovac- cine [10,18] recognized any of the protein fractions of the lysate observed in SDS-PAGE, a Western blot assay was performed. For this, new 15% polyacrylamide gels were prepared, and the separated fractions were transferred to nitrocellulose membranes (Amersham Protran). The membrane was saturated with 5% skim milk and incubated for 30 min, then the membranes were washed with phosphate buffer solution (PBS) + Tween. Serum (1:50) from a patient treated with autologous immunogen prepared with an E. coli O25 strain was added to each membrane. Serum from individuals with UTIs but not treated with immuno- gen was used as a negative control, and rabbit anti-human IgG (1:1500) labeled with rabbit peroxidase was used as a secondary antibody. To determine whether the UNAM-HIMFG lysate contained OmpA, SDS-PAGE and Western blot were performed on three batches of the lysate; rabbit antibodies (1:250) immunostained with a partially purified fraction of OmpA were used to identify the protein; goat anti-rabbit IgG (1:1500), labeled with horseradish peroxidase as previously described [18] was used as a secondary antibody to visualize the reaction. 4.6. Cytotoxic Activity of Lysates Evaluated with Trypan Blue For this assay, murine-derived macrophage lines J774A.1 ATCC TIB-67, kidney ep- ithelial cells of human origin [HEK-293 ATCC CRL-1573], and human colon epithelial cells [Caco-2 ATCC HTB-37] cultured in RPMI medium (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) supplemented with 10% fetal bovine serum, 2 mM glutamine, 1 mM sodium pyru- vate, penicillin- streptomycin-gentamycin-amphotericin B (100UI/100 µg/100/2 µg/mL), incubated at 37 ◦C with 5% CO2. Approximately 3 × 105 cells of each line were plated in 24-well plates, and to each well, 100 ng/mL protein lysate (UNAM-HIMFG, E. coli Int. J. Mol. Sci. 2024, 25, 6157 14 of 19 O25, K. pneumoniae, E. faecalis) was added. In addition, the effect of Salmonella Enteritidis Lipopolysaccharide (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA) was evaluated at concentrations of 100 ng/mL and 1 µg/mL; dimethyl sulfoxide (DMSO) [1.5 M] was used as a positive control and RPMI medium as a negative control. The plates were incubated at 37 ◦C for 24 h with 5% CO2. At the end of the incubation time, the cells were disaggregated with 4 mM PBS-EDTA or Trypsin EDTA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA) for 10 min at 37 ◦C with 5% CO2. The disaggregated cells were stained with 0.4% Trypan Blue (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA) and subsequently observed and quantified in a Neubauer chamber by analyzing the cytopathic effect (vacuolization, syncytia formation), or death by viable cell count [82]. The assay was evaluated by three different observers and the following score was assigned in terms of survival or damage observed 0: 85–100% (no damage), 1: 26–84% (damage), 2: 11–25%, and 3: 0–10% (cytotoxic). Cytotoxicity Activity Evaluated with MTT and XTT A three-passage culture with HEK-293 cells was brought to 85–95% growth confluence and then the cells were detached from the culture bottle using PBS and Trypsin + EDTA (0.25%) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA) for 5 min, collected and centrifuged at 300× g for 5 min at 25 ◦C. Approximately 50,000 cells × mL per well were plated in 96-well plates and incubated for 96 h at 37 ◦C with 5% CO2. In each well, 100 ng/mL of protein from each of the lysates was independently spotted following the sequence referred to previously (4.6) including an additional positive control with Triton 100× (0.01% v/v). As in the previous assay, the cells were incubated 24 h at 37 ◦C with 5% CO2, and at the end of the incubation time, the cells were washed twice with SSF (37 ◦C). The MTT (3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) (Roche, Basel, Switzerland) and XTT (2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide) (Roche, Basel, Switzerland) assay was performed following the manufacturer′s instructions; the incubation with the reagents was performed for 24 h. At the end of the process, readings were taken at optical densities of 500 nm and 600 nm for MTT and XTT, respectively. Taking as reference the absorbance of the cells without stimulus as 100% of viability, the assay was performed 3 times in duplicate [83]. 4.7. In Vivo Effect of UNAM-HIMFG Lysate Six female mice from six to eight weeks old of the Balb/c strain, bred and housed in the biotherium unit of the Hospital Infantil de México Federico Gómez (HIMFG), were used. The animals were maintained in sterile rack conditions with 20 airflow changes per hour at a relative humidity of 45 to 65% and a temperature of 18–22 ◦C. Each group of animals was orally administered 200 µL of UNAM-HIMFG or SSF lysate every week with a 22G stainless steel rigid gastric tube. The animals were kept for 60 days and at the end of the period, were euthanized (after anesthesia with xylazine in association with ketamine 100 mg/kg and 5 mg/kg, respectively) by cervical dislocation according to NOM-062—ZOO-1999, [67]. Stomach and small and large intestines were collected for histological evaluation of potential damage induced by the immunogen in the gastrointestinal mucosa. For tissue collection, the cardial portion of the stomach and the rectal portion were ligated with cotton thread and then buffered with formaldehyde at pH 7.0 introduced into the digestive lumen using a 10 mL syringe with a 24 G needle. Once the tissues were fixed, the organs were placed in a flask with buffered formalin at pH 7.0 for histopathology studies [84]. The fixed tissues were fractionated and embedded in kerosene for sections and Hematoxylin and Eosin (H and E) staining. 4.8. Stimulatory Activity of UNAM-HIMFG and Monovalent Lysates in Mouse Macrophage Cell Lines and Primary Human Macrophage Cultures The murine macrophage cell line J774A.1 and monocytes obtained from human periph- eral blood leukocytes were used [85]. Human mononuclear cells were obtained from bags of leukocyte concentrates from samples from four donors following the approval guidelines Int. J. Mol. Sci. 2024, 25, 6157 15 of 19 established by the Bioethics Committee of the blood bank of the HIMFG. The mononuclear cell fraction was obtained by Lymphopred gradient centrifugation (Nycomed AS, Oslo, Norway). Once the cells were separated, they were washed three times with physiological saline and the obtained monocytes were purified by the negative selection method using a mixture of anti-CD3, CD7, CD19, CD45RA, CD56, and anti-IgE antibodies (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany). Purified monocytes (1 × 105 monocytes/mL) were differentiated into macrophages by culturing the cells for 7 days in 24-well plates (Costar, Corning, Austin, TX, USA). Murine macrophages J774A.1 were cultured in RPMI medium (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA) supplemented with 10% fetal bovine serum, 2 mM glutamine, 1 mM sodium pyruvate, and penicillin-streptomycin-gentamicin-amphotericin B (100UI/100 µg/ 100/2 µg/mL) until 85–95% confluence was obtained. The cell monolayer was disaggre- gated with phosphate buffered solution (PBS) pH 7.0–7.2 with 4 mM diethylene aminote- traacetic acid (EDTA) and 2 × 105 cells/mL was used for stimulation. Plates with human and murine J7741.A macrophages were challenged with decreasing protein concentrations of 100 ng/mL, 10 ng/mL, and 1 ng/mL of the lysates; UNAM-HIMFG, E. coli O25:H4, E. coli O20:H9, and E. faecalis, Salmonella Enteritidis Lipopolysaccharide (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 100 ng/mL, Polymyxin B and polymyxin B (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)-treated stimuli [100 ng/mL stimulus + 100 ng/mL Polymyxin B] were used as controls. Plates were maintained for 1 h at room temperature. Once the cells were stim- ulated with the extracts, they were incubated for 24 h at 37 ◦C with 5% CO atmosphere2, after stimulation the supernatant was harvested and stored at −70 ◦C until use. The expression of TNF-α, IL6, and IL10 was performed by enzyme immunoassay with the commercial ELISA Ready-SET-Go Kits (Thermo Scientific Fisher, Waltham, MA, USA) and HUMAN ELISA Set (Becton-Dickinson, East Rutherford, NJ, USA), following the manufacturer′s instructions an extrapolation of cytokine concentrations was performed according to a recombinant cytokine standard curve for each of the samples evaluated in duplicate. 4.9. Statistical Analysis ANOVA tests with Tukey′s post hoc were performed using the R studio platform version 8.1 and GraphPad Prism v10.1.1. 5. Conclusions The UNAM-HIMFG lysate is composed of bacterial strains isolated more frequently in two prospective studies of recurrent UTIs. The antigenic diversity of the lysate favors its immunogenic activity and likely its positive effect in the treatment and control of CUTI. The effect it induces is likely associated with that reported for NlpD, which inhibits the host’s RNA polymerase II (Pol II), which inhibits the expression of pro-inflammatory genes, favoring the reduction of symptoms. However, to confirm the above, it is necessary to identify the presence of NlpD in the lysate and to evaluate the effect of the UNAM-HIMFG lysate in an animal model. Although the use of bacterial lysates is an alternative for controlling UTIs without the use of antimicrobials, there are other alternatives that are being explored. Among these are the development of recombinant vaccines, the use of phage therapy, probiotics, postbiotics, and even the search for new antimicrobials or the use of natural products; all with the purpose of treating and controlling UTIs and avoiding their consequences, as well as reducing the use of antimicrobials as much as possible. Supplementary Materials: The following supporting information can be downloaded at: https: //www.mdpi.com/article/10.3390/ijms25116157/s1. Author Contributions: Conceptualization, S.E.A.-M., C.A.E.-C. and U.H.-C.; data curation, S.E.A.-M., M.A.Q.-P., E.G.-V., J.A.R.-G. and C.A.E.-C.; formal analysis, S.E.A.-M., M.A.Q.-P., E.G.-V., J.A.R.-G. and D.I.G.-S.; funding acquisition, C.A.E.-C. and U.H.-C.; investigation, S.E.A.-M.; methodology, S.E.A.-M., D.I.G.-S., J.A.R.-G., J.R.-L. and E.G.-V.; supervision, U.H.-C., Ó.M.-C., L.M.R.-R., R.C.-L., Int. J. Mol. Sci. 2024, 25, 6157 16 of 19 L.M.-C., D.M.G., F.J.B.-A. and C.A.E.-C.; writing—original draft, S.E.A.-M., M.A.Q.-P., E.G.-V., J.A.R.-G. and C.A.E.-C.; writing—review and editing, S.E.A.-M., M.A.Q.-P., E.G.-V., J.A.R.-G. and C.A.E.-C. All authors have read and agreed to the published version of the manuscript. Funding: This work has been funded by PAPIIT IN221318 Stage 29 “Prospective follow-up study of patients with urinary tract infections, phenotypic, genotypic characterization and assay of an- timicrobial activity of natural and synthetic compounds in isolated uropathogenic Escherichia coli strains”; PAPIIT IN205322 “Animal model (Mouse) to evaluate the utility of lysates of uropathogenic Escherichia coli (UPEC) and other urinary pathogens, for the control and treatment of chronic urinary tract infections”; and HIM-2023-008 ”Animal model (Mouse) to evaluate the usefulness of lysates of uropathogenic Escherichia coli (UPEC) and other urinary pathogens for the control and treatment of chronic urinary tract infections”. Institutional Review Board Statement: Hospital Infantil de México Federico Gómez [HIM-2023-008]. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional Autónoma de México [No. de Protocolo SICUAE.DC2020/3-1]. Facultad de Medicina [Registro CICUAL 002-CIC.2021]. Informed Consent Statement: Not applicable. Data Availability Statement: Not applicable. All data regarding this research are available in the present manuscript and no data was included in any database elsewhere. Acknowledgments: The authors would like to acknowledge Ana Belén Tirado-Rodríguez of the Unidad de Investigación en Enfermedades Oncológicas, Hospital Infantil de México Federico Gómez, Mexico City, Mexico, for the support provided for the performance of the MTT and XTT assays; Ricardo E. Ahumada Cota from the Bacterial pathogenicity Laboratory, Hospital Infantil de México Federico Gómez, Mexico City, Mexico, for the support provided in the translation of the manuscript; and Yolanda Perez-Del Mazo and Maribel Alvarado-Cabello for the technical support within the laboratory. We would also like to thank the María de los Ángeles Sánchez Jiménez from the HIMFG Central Laboratory, Bacteriology Section, for her support in the confirmation of the strains through mass spectrometry. We also acknowledge Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologías (CONAHCYT), which awarded S.E.A.-M. grant no. 759975. Conflicts of Interest: The authors declare no conflicts of interest. References 1. De Kraker, M.E.A.; Stewardson, A.J.; Harbarth, S. Will 10 Million People Die a Year Due to Antimicrobial Resistance by 2050? PLoS Med. 2016, 13, e1002184. [CrossRef] [PubMed] 2. Wagenlehner, F.M.E.; Bjerklund Johansen, T.E.; Cai, T.; Koves, B.; Kranz, J.; Pilatz, A.; Tandogdu, Z. Epidemiology, Definition and Treatment of Complicated Urinary Tract Infections. Nat. Rev. Urol. 2020, 17, 586–600. [CrossRef] [PubMed] 3. Foxman, B. The Epidemiology of Urinary Tract Infection. Nat. Rev. Urol. 2010, 7, 653–660. [CrossRef] 4. 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[CrossRef] Disclaimer/Publisher’s Note: The statements, opinions and data contained in all publications are solely those of the individual author(s) and contributor(s) and not of MDPI and/or the editor(s). MDPI and/or the editor(s) disclaim responsibility for any injury to people or property resulting from any ideas, methods, instructions or products referred to in the content. Citation: Acevedo-Monroy, S.E.; Hernández-Chiñas, U.; Rocha-Ramírez, L.M.; Medina-Contreras, O.; López-Díaz, O.; Ahumada-Cota, R.E.; Martínez-Gómez, D.; Huerta-Yepez, S.; Tirado-Rodríguez, A.B.; Molina-López, J.; et al.. UNAM-HIMFG Bacterial Lysate Activates the Immune Response and Inhibits Colonization of Bladder of Balb/c Mice Infected with the Uropathogenic CFT073 Escherichia coli Strain. Int. J. Mol. Sci. 2024, 25, 9876. https://doi.org/10.3390/ ijms25189876 Academic Editor: Giuseppe Murdaca Received: 26 July 2024 Revised: 4 September 2024 Accepted: 8 September 2024 Published: 12 September 2024 Copyright: © 2024 by the authors. Licensee MDPI, Basel, Switzerland. This article is an open access article distributed under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution (CC BY) license (https:// creativecommons.org/licenses/by/ 4.0/). International Journal of Molecular Sciences Article UNAM-HIMFG Bacterial Lysate Activates the Immune Response and Inhibits Colonization of Bladder of Balb/c Mice Infected with the Uropathogenic CFT073 Escherichia coli Strain Salvador Eduardo Acevedo-Monroy 1,2 , Ulises Hernández-Chiñas 1,3,* , Luz María Rocha-Ramírez 4 , Oscar Medina-Contreras 5 , Osvaldo López-Díaz 6 , Ricardo Ernesto Ahumada-Cota 1 , Daniel Martínez-Gómez 7 , Sara Huerta-Yepez 8, Ana Belén Tirado-Rodríguez 8 , José Molina-López 1,3, Raúl Castro-Luna 9, Leonel Martínez-Cristóbal 9, Frida Elena Rojas-Castro 1, María Elena Chávez-Berrocal 1,3, Antonio Verdugo-Rodríguez 2 and Carlos Alberto Eslava-Campos 1,3,* 1 Laboratorio de Patogenicidad Bacteriana, Unidad de Hemato-Oncología e Investigación, Hospital Infantil de México Federico Gómez, Dr. Márquez No. 162, Col Doctores, Alcaldía Cuauhtémoc, Ciudad de México 06720, Mexico; salcevedom@gmail.com or salcevedom@fmvz.unam.mx (S.E.A.-M.); ricardoeahumada@gmail.com (R.E.A.-C.); joseml@unam.mx (J.M.-L.); frirojc784@gmail.com (F.E.R.-C.); malenachavezb@yahoo.com.mx (M.E.C.-B.) 2 Laboratorio de Microbiología Molecular, Departamento de Microbiología e Inmunología, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México, Av. Universidad #3000, Colonia, C.U., Coyoacán, Ciudad de México 04510, Mexico; antoverduro@hotmail.com 3 Unidad Periférica de Investigación Básica y Clínica en Enfermedades Infecciosas, Departamento de Salud Pública, División de Investigación Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México, Dr. Márquez No. 162, Col Doctores, Alcaldía Cuauhtémoc, Ciudad de México 06720, Mexico 4 Unidad de Investigación en Enfermedades Infecciosas, Hospital Infantil de México Federico Gómez, Secretaría de Salud, Dr. Márquez No. 162, Col Doctores, Alcaldía Cuauhtémoc, Ciudad de México 06720, Mexico; luzmrr7@yahoo.com.mx 5 Unidad de Investigación Epidemiológica en Endocrinología y Nutrición, Hospital Infantil de México Federico Gómez, Dr. Márquez No. 162, Col. Doctores, Alcaldía Cuauhtémoc, Ciudad de México 06720, Mexico; omedina@himfg.edu.mx 6 Laboratorio de Histopatología Veterinaria, Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco, Calzada del Hueso 1100, Col. Villa Quietud, Alcaldía Coyoacán, Ciudad de México 04960, Mexico; olopez@correo.xoc.uam.mx 7 Departamento de Producción Agrícola y Animal, Laboratorio de Microbiología Agropecuaria, Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco, Calzada del Hueso 1100, Col. Villa Quietud, Alcaldía Coyoacán, Ciudad de México 04960, Mexico; dmartinez@correo.xoc.uam.mx 8 Unidad de Investigación en Enfermedades Oncológicas, Hospital Infantil de México Federico Gómez, Secretaría de Salud, Dr. Márquez No. 162, Col Doctores, Alcaldía Cuauhtémoc, Ciudad de México 06720, Mexico; shuertay@gmail.com (S.H.-Y.); bely_16@hotmail.com (A.B.T.-R.) 9 Bioterio, Hospital Infantil de México Federico Gómez, Dr. Márquez No. 162, Col Doctores, Alcaldía Cuauhtémoc, Ciudad de México 06720, Mexico; raulcaslu@yahoo.com.mx (R.C.-L.); martinezcristobal@yahoo.com.mx (L.M.-C.) * Correspondence: ulisesh@unam.mx (U.H.-C.); carlos_01eslava@yahoo.com.mx or eslava@unam.mx (C.A.E.-C.); Tel.: +52-5552289917 (ext. 6000) (U.H.-C.); +52-5537225446 (C.A.E.-C.) Abstract: Urinary tract infections (UTIs) represent a clinical and epidemiological problem of world- wide impact that affects the economy and the emotional state of the patient. Control of the condition is complicated due to multidrug resistance of pathogens associated with the disease. Considering the difficulty in carrying out effective treatment with antimicrobials, it is necessary to propose alternatives that improve the clinical status of the patients. With this purpose, in a previous study, the safety and immunostimulant capacity of a polyvalent lysate designated UNAM-HIMFG prepared with different bacteria isolated during a prospective study of chronic urinary tract infection (CUTI) was evaluated. In this work, using an animal model, results are presented on the immunostimulant and protective activity of the polyvalent UNAM-HIMFG lysate to define its potential use in the control and treatment of CUTI. Female Balb/c mice were infected through the urethra with Escherichia coli CFT073 (UPEC O6:K2:H1) strain; urine samples were collected before the infection and every week for up to 60 days. Once the animals were colonized, sublingual doses of UNAM-HIMFG lysate were Int. J. Mol. Sci. 2024, 25, 9876. https://doi.org/10.3390/ijms25189876 https://www.mdpi.com/journal/ijms Int. J. Mol. Sci. 2024, 25, 9876 2 of 14 administrated. The colonization of the bladder and kidneys was evaluated by culture, and their alterations were assessed using histopathological analysis. On the other hand, the immunostimulant activity of the compound was analyzed by qPCR of spleen mRNA. Uninfected animals receiving UNAM-HIMFG lysate and infected animals administered with the physiological saline solution were used as controls. During this study, the clinical status and evolution of the animals were evaluated. At ninety-six hours after infection, the presence of CFT073 was identified in the urine of infected animals, and then, sublingual administration of UNAM-HIMFG lysate was started every week for 60 days. The urine culture of mice treated with UNAM-HIMFG lysate showed the presence of bacteria for three weeks post-treatment; in contrast, in the untreated animals, positive cultures were observed until the 60th day of this study. The histological analysis of bladder samples from untreated animals showed the presence of chronic inflammation and bacteria in the submucosa, while tissues from mice treated with UNAM-HIMFG lysate did not show alterations. The same analysis of kidney samples of the two groups (treated and untreated) did not present alterations. Immunostimulant activity assays of UNAM-HIMFG lysate showed overexpression of TNF-α and IL-10. Results suggest that the lysate activates the expression of cytokines that inhibit the growth of inoculated bacteria and control the inflammation responsible for tissue damage. In conclusion, UNAM-HIMFG lysate is effective for the treatment and control of CUTIs without the use of antimicrobials. Keywords: urinary tract infections; bacterial lysate; animal model; UTI treatment 1. Introduction The increase in antimicrobial resistance is due, among other things, to its inappropriate use in both humans and animals, which has favored the emergence of multidrug-resistant bacteria (MDR) [1]. That is the reason infectious diseases currently represent a major public health problem, which is due to the increasing difficulty in the treatment and control of these [2]. WHO proposed that by the year 2050, a pandemic of catastrophic proportions will be caused by various infectious diseases, for which the institution suggests the development of alternative methods for their treatment and control [3–5]. Urinary tract infections (UTIs) are an example of the general impact that infections have acquired in recent years. UTI incidence has increased, affecting populations of different ages, and in many situations, UTIs are associated with other diseases [6,7]. Bacteria are the microorganisms more frequently involved in the pathogenesis of UTIs, and Escherichia coli is the main pathogen in both community (70–80%) and hospital acquired infections (60%) [8–10]. Strains associated with UTI are known as uropathogenic E. coli (UPEC), and they host genes present in plasmids and pathogenicity islands, whose expression contributes to the survival of the bacterium in infected tissues, as well as in the antimicrobial resistance and damage that generates in the host [11,12]. Treatment, in general (preventive and curative), is carried out with antimicrobials, which, in recent years, have decreased their usefulness due to bacterial antibiotic resistance [13–16]. Resistant bacteria are currently defined as multidrug- resistant (MDR), extremely drug-resistant (XDR) and pandrog-resistant (PDR) [17]. E. coli belongs to a bacterial XDR group; thus, WHO included this bacteria in the group of priority microorganisms for the search for alternatives for its control and treatment [4,18]. Vaccines represent one of the main procedures for the control of infectious diseases; however, the great antigenic diversity of bacteria complicates the development of a universal vaccine [19,20]. In UTIs, the participation of different microorganisms complicates the development of a universal vaccine, and, on the other hand, a preventive vaccine is not required since not all of the population is affected [19]. Therefore, the approach to vaccines for UTIs should consider both a prophylactic and a therapeutic treatment [21,22]. Multivalent vaccines manufactured with various bacterial surface components are considered functional biomolecules due to their immunogenic capacity [19,23]. Bacterial lysates described in the last century are compounds with these characteristics [24,25]. In two previous studies, the usefulness of autologous bacterial lysates for the control and treatment of chronic urinary tract infections Int. J. Mol. Sci. 2024, 25, 9876 3 of 14 (CUTI) was evaluated with good results [26,27]. The information obtained on the isolated microorganisms in both studies was used to manufacture a polyvalent bacterial lysate (UNAM-HIMFG). Assays in vitro showed that the compound was both harmless and immunostimulant to culture cells [28]. In this work, the protective effect of UNAM-HIMFG lysate administered sublingually to female Balb/c mice infected with the UPEC CFT073 strain was evaluated. The results strongly suggested that the treated animals with UNAM- HIMFG controlled the infection and the bacterial colonization of the bladder and kidney, stimulating the mice’s immune responses. 2. Results 2.1. Cultivable Bacterial Microbiota of Mice The microbiota analysis of Balb/c urine samples showed the presence of Staphylococcus xylosus and Staphylococcus cohnii subsp. Urealyticum and Micrococcus luteus, Enterococcus gallinarum, Listeria seeligeri, and Escherichia coli were found in the feces samples. In C57BL/6 and CD-1, Micrococcus luteus and Lactobacillus acidophilus were identified in urine samples, and Micrococcus luteus, Enterococcus gallinarum and E. coli in feces. The characterization of E. coli isolated from feces did not correspond to the O6:H1 or O25:H4 serotypes, strains used in the infection assays. 2.2. Urinary Tract Infection Balb/c, C57BL/6 mice strains, and CD-1 line were selected for infection assays with UPEC CFT073 (O6:H1) strain. The transurethral infection of C57BL/6 showed the presence of bacteria in urine after the first week of inoculation (5 × 105 CFU/mL); however, from 2 to 5 weeks, a minimal presence of bacteria was observed. Fluctuations in bacterial counts in the following three weeks suggested a recurrent infection process (Figure 1). In CD1 mice, the presence of bacteria (8.3 × 103 CFU/mL) was observed only from the first to four-week post-infection. For Balb/c mice, the presence of bacteria was observed from the first post-challenge week with bacterial counts of 8.0 × 104 CFU/mL, decreasing the two following weeks and increasing to approximately 1.0 × 105 CFU/mL at the end of this study (Figure 1). Considering that CFT073 was a strain isolated from a clinical case of sepsis associated with pyelonephritis, it was decided to evaluate whether the UPEC O25:H4 strain isolated from CUTI could be considered for the infection trial of Balb/c mice. The challenge with this strain only showed the presence of bacteria in the first week (Figure 1). The bladder and kidney of Balb/c and C57BL/6 colonization by CFT703 were evaluated at the end of this study; the presence of bacteria was observed only in the bladder with bacterial counts of 1.5 × 103 CFU/mL. ff Figure 1. Urinary tract infection induced with UPEC strains in Balb/c, C57BL/6, and CD-1 mice. This study was conducted over eight weeks, analyzing the presence of bacteria in urine. 2.3. UNAM-HIMFG Lysate Protects Balb/c Mice against UPEC CFT073 Colonization Once the conditions of the mice infection and the strain (Balb/c) were established, the protective effect of the polyvalent UNAM-HIMFG lysate was evaluated. The urethral infection assay was performed in different batches of mice with E. coli strain CFT073. At Int. J. Mol. Sci. 2024, 25, 9876 4 of 14 96 h after infection, weekly administration of UNAM-HIMFG lysate or Physiological Saline Solution (PSS) was initiated. The groups of animals challenged with E. coli CFT073 treated with UNAM-HIMFG showed a decrease in CFU in urine from one to four weeks, after which no bacteria were recovered (Figure 2). Regarding the animals treated with PSS, the bacterial count remained >104 CFU/mL in all urine samples until the conclusion of this study, with significant differences (p ≤ 0.005) compared with animals treated with UNAM-HIMFG lysate (Figure 2). ff ff ff ≤ ff α α α ff α ff Figure 2. E. coli CFT073 recovered from urine samples in Balb/c mice to which it was administered UNAM-HIMFG lysate or PSS. Abbreviations: (CFT073 + PSS) E. coli CFT073 infected and PSS administered; (CFT073 + UNAM-HIMFG) E. coli CFT073 infected and UNAM-HIMFG lysate treated. 2.4. Immunostimulatory Effect of UNAM-HIMFG Lysate TNF-α and IL-10 gene expressions (mRNA) of infected and uninfected (UI) mice treated or not with UNAM-HIMFG lysate were analyzed in the spleen of the animals. The groups CFT073 + UNAM-HIMFG, UI + UNAM-HIMFG, and CFT073 + PSS showed increased TNF-α expression levels when compared to the negative control group (UI + PSS) (p < 0.05). TNF-α expression levels did not show significant statistical differences when groups CFT073 + UNAM-HIMFG, UI + UNAM-HIMFG, and CFT073 + PSS were compared against each other. Remarkably, the UI + UNAM-HIMFG animal group expressed higher TNF-α levels (p < 0.0001) (Figure 3A). With respect to IL-10, only the UI + UNAM-HIMFG group showed significant statistical differences when compared to the UI + PSS group (p < 0.05). However, an increase in IL-10 expression was observed in all groups (Figure 3B). α – Figure 3. Expression of TNF-α (A) and IL-10 (B) in mice spleen mRNA of UI + PSS, CFT073 + PSS, CFT073 +UNAM-HIMFG, and UI + UNAM-HIMFG animal groups. Int. J. Mol. Sci. 2024, 25, 9876 5 of 14 2.5. UNAM-HIMFG Lysate Protects against Tissue Colonization Histopathological study of the bladder from the control group (UI + PSS) and infected and treated animals (CFT073 + UNAM-HIMFG) did not show histological alterations in the bladder tissue (Figure 4A,B). The same analysis in bladder samples for the CFT073 + PSS group showed leukocytic infiltrate, mild granulomatous inflammation, and the presence of Gram- negative bacteria localized in the submucosa, forming bacterial aggregates (Figure 4C–F). The presence of CFT073 (1.5 × 103 CFU/mL) was only detected in the bladder samples from the CFT073 + PSS group. CFT073 identity was confirmed by culture and PCR detection of lipopolysaccharide and flagellum genes (wzyO6 and fliCH1). No alterations were observed in the histological study of the kidney (data did not show), and bacteria were not isolated in the samples, suggesting no infection in this tissue. ff tt tt ffi Figure 4. Histological analysis of bladder from Balb/c mice. (A) UI + PSS; (B) CFT073 + UNAM- HIMFG; (C–F) CFT073 + PSS; (C) The arrow indicates Granulomatous inflammation; (D) Arrow shows areas of mild inflammation and leukocytic infiltration; (E,F) Arrows show Gram-negative bacilli forming colony-like communities. Magnification: 400× (A–D) and 1000× (E,F). Hematoxylin/Eosin stain (A–D); Sandiford stain (E,F). Int. J. Mol. Sci. 2024, 25, 9876 6 of 14 3. Discussion The clinical and epidemiological importance of UTI has increased significantly in recent years, and the MDR is one of the most relevant aspects [1,2,16,29]. A side effect of MDR is that it favors the persistence and chronicity of UTIs, a situation that has begun to attract attention due to the relationship that apparently exists between CUTI, chronic inflammatory diseases, and cancer [30,31]. This has led to the search for alternatives to re- duce the use of antimicrobials [32,33], where vaccine development has been considered for the clinical efficacy that they have shown [21,22,34,35]. Multivalent vaccines manufactured with various bacterial surface components are considered functional biomolecules due to their immunogenic capacity [19,23,36], and bacterial lysates described in the last century are compounds with such characteristics [24,25]. In two previous prospective studies of CUTI, the usefulness and efficacy of autologous bacterial lysates for the control and treatment of UTIs were evaluated with satisfactory results [26,27]. Based on these studies, the genera and species of the bacteria that were more frequently identified were selected for the manufacture of the polyvalent lysate UNAM-HIMFG. Assays on cultured cells showed that the compound was harmless and an immunostimulant. [28]. In this work, the proper- ties of UNAM-HIMFG lysate were analyzed using a previously reported mouse infection model [37,38]. The mice infection was carried out with UPEC strains CFT073 and O25:H4; the results showed that UPEC CFT073 and female mice of the Balb/c strain were the most suitable for the proposed study. Additionally, it was observed that UNAM-HIMFG lysate administrated sublingually decreased bladder colonization of CFT073 in Balb/c bladder from the second until the fourth week post-treatment when the presence of bacteria in urine was no longer observed. Unlike what was observed in animals administered with PSS, where the presence of bacteria in urine was identified throughout the sixty days (eight weeks) when the monitoring of the animals was completed (Figure 2). The sublingual UNAM-HIMFG administration route provided good results because it was a route that favored drug absorption, maintained the stability of its components, and eluded entero- hepatic circulation [39,40]. It is also known that the administration of antigens through the mucosa activates local and systemic immunity since mucosa-associated lymphoid tissue (MALT) is widely distributed in the nasopharynx (NALT) [nasopharynx-associated lymphoid tissue], intestine (GALT) [gut-associated lymphoid tissue], bronchus (BALT) [bronchus-associated lymphoid tissue], and urogenital tract [41]. On the other hand, in the mucosal immune system, M cells found in the epithelium belonging to GALT and NALT have an important role in immunization since they recognize bacterial structures as lipopolysaccharide (LPS), FimH, and peptidoglycan [42,43]. The characterization of UNAM-HIMFG lysate carried out previously showed that LPS, peptidoglycan, and various protein components were found in high concentrations in the lysate [28]. Therefore, the route of administration used and the composition of UNAM-HIMFG favor the local and systemic immune response [41]. It is known that MALT has different locations, which are connected by the common mucosal immune system (CMIS) through the migration of lymphocytes induced by a specific antigen in one site of the mucosa as effector cells to different organs and protect the tissue against infection [44]. The secretion of TNF-α in human macrophages and murine cell cultures induced by UNAM-HIMFG previously reported [28] was confirmed in the present study in the animal model (Figure 3A). TNF-α has been shown to act as an innate helper factor produced by Ly6C macrophages+, whose function is to favor chemokines secretion (CXC motif) ligand 2 (CXCL2), responsible for the increase in the inflammatory response and neutrophile migration to the infection site [45–47]. The LPS, both for its concentration and diversity, is an important component in the UNAM-HIMFG lysate [28]; functionally, this molecule acts as an adjuvant during immune recognition, which, in turn, stimulates IκB kinase, responsible for eliminating factors that inhibit the expression of NF-κB, a mediator that favors the transcription of genes associated with proinflammatory molecules such as TNF-α [48–51]. The above suggests that the high LPS content of UNAM-HIMFG lysate favors the TNF-α gene expression, which is higher in treated animals (Figure 3A). The IL-10 expression (Figure 3B) was observed in both treated and untreated animals that have been Int. J. Mol. Sci. 2024, 25, 9876 7 of 14 administered with UNAM-HIMFG lysate; this interleukin, due to its anti-inflammatory effect, is produced to regulate the microenvironment of an infectious process such as UTIs [52–54]. The anti-inflammatory effect induced by UNAM-HIMFG associated with IL-10 expression was confirmed in the histological study of not treated UNAM-HIMFG animals (Figure 4C,D), in which an intense inflammatory reaction was observed, sugges- tive of a chronic process [30,31]. In contrast, the inflammatory reaction did not occur in the control animals and in those that received the lysate (Figure 4A,B). This observation suggests that, although the animals were colonized by CFT073, the inflammatory event associated with the infection was probably controlled by IL-10 gene activation induced by the UNAM-HIMFG lysate. As mentioned above, the control and treatment of CUTI with antimicrobials is be- coming more difficult every day due to the emergence of resistant mutants that influence changes in sensitivity profiles, among other factors. An example of the above is the recent reports by Bologna et al. [15] and Cai et al. [16], who observed an increase in fosfomycin re- sistance in strains producing extended spectrum beta lactamases and the existence of strains of the Enterobacteriaceae family that are carbapenem-resistant, respectively. On the other hand, the recurrence and chronicity of UTIs associated with the difficulty that already exists for their control and treatment lead to considering a proposal that has existed for more than 40 years regarding the association between CUTI and bladder cancer [55]. In this sense, recent studies propose that urinary infections participate in bladder carcinogenesis. In this regard, it is suggested that prolonged inflammation contributes to tumor development and that proinflammatory cytokines play an important role with TNF-α as the possible molecu- lar link between chronic inflammation and cancer [56]. T Hannan TJ et al. [30] observed that at the beginning of the infection, the innate immune response activates a cascade of proinflammatory cytokines that triggers a severe acute inflammatory response, which causes significant tissue damage. In the present work, it was also observed that infection of mice with a UPEC strain activated the expression of TNF-α; however, the administration of a polyvalent bacterial lysate (UNAM-HIMFG) controlled both colonization and inflam- mation (activating the expression of IL-10) of the tissues. Although new infection assays with longer follow-ups of the animals are required, it can be suggested that lysate prevents the occurrence of a chronic inflammation event and could be evaluated for the control of bladder cancer. Another aspect with equal relevance to those previously mentioned is the specific function of the urinary tract microbiota and the action of antimicrobials causing dysbiosis and how both can participate in the control or development of bladder cancer [31,56]. 4. Materials and Methods 4.1. Ethics Statement for Animal Protocols All experiments were conducted according to the specific techniques for the pro- duction, care, and use of laboratory animals described in NOM-062-ZOO-1999 [57] and approved by the Institutional Subcommittee for the Care and Use of Experimental Ani- mals (SICUAE) [SICUAE.DC2020/3-1], the Faculty of Veterinary Medicine and Animal Husbandry UNAM, the Internal Committee for the Care and Use of Laboratory Animals (CICUAL) [CICUAL 002-CIC.2021] of the Faculty of Medicine UNAM, the Ethics Commit- tees: Research Division, Faculty of Medicine UNAM [FM/Dl/013/2021], and Research, Ethics and Biosafety, Hospital Infantil de México Federico Gómez [HIM-2023-008]. 4.2. Bacterial Strains and Culture Conditions UPEC O25:K2:H4, a clinical isolate from a patient with chronic UTI; UPEC E. coli CFT073 (ATCC 700928) (O6:K2:H1). Culture media: blood agar [BA] Bioxon, Cuatitlán Iz-calli, Edo. Mex., México), MacConkey agar [McC] (Bioxon, Cuatitlán Izcalli, Edo. Mex., México); Cystine Lactose Electrolyte Deficient [CLED] agar (Oxoid, Basingstoke, Ham., England); Thioglycollate broth with dextrose and indicator (Bioxon, Cuatitlán Izcalli, Edo. Mex., México), Luria broth [LB] (Dibico, Cuatitlán Izcalli, Edo. Mex., México). Anaerobic Int. J. Mol. Sci. 2024, 25, 9876 8 of 14 agar [AN]; Brucella agar (BD Difco, Cuatitlán Izcalli, Edo. Mex., México) with 5% defib- rinated ram blood; 1 g/L sodium pyruvate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA); 10 mg/L vitamin K, 400 mg/L sodium thioglycolate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA.); 400 mg/L L-cystine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). In addition, for the selective isolation of Gram-negative anaerobic bacteria, 7.5 mg/L vancomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) was added [ANV]. For the selective isolation of Gram-positive anaerobic bacteria, 10 mg/L nalidixic acid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) was added [ANN]. 4.3. Laboratory Animals Balb/c and C57BL/6 mice strains and CD-1 line were provided by the bioterium Unit of the Hospital Infantil de México Federico Gómez. The animals were housed in the same unit under sterile conditions in a rack with airflow of 20 changes per hour, relative humidity of 45 to 65% at a temperature between 18 and 22 ◦C, and wooden substrate bedding; they were hydrated and fed with sterile water and food. 4.4. Cultivable Microbiota of the Mice Prior to animal infection, urine and fecal cultures were performed [58]. Samples were collected in sterile tubes (Axygen, Union City, CA, USA); feces were suspended in sterile Physiological Saline Solution (PSS). The urine was collected directly in sterile tubes (Axy-gen, Union City, CA, USA), and both samples were cultured in ANV and ANN and placed in GENbag anaerobic bags (Biomérieux, Marsella, France) to anaerobic bacteria; BA and McC were used for aerobic cultures. Isolated anaerobic colonies were transferred to thio-glycollate broth for identification in VITEK MS (Biomérieux, Marsella, France); aerobic colonies were identified by metabolic tests [59]. 4.5. Inoculum Preparation and Conditions Inoculum preparation of CFT073 and O25:H4 UPEC strains was performed using two culture conditions: (1) static liquid medium (LB) and (2) BA, as previously reported (37). Colony Forming Units (CFU) present in the inoculum were determined by plate counting (CFU/mL) using the drop-seeded technique on BA plates. To stimulate the expression of F9 adhesin, the inoculum was incubated at 25 ◦C for 20 min, as previously suggested [60]. 4.6. Urinary Tract Infection in Murine Model Six female (6 to 8 weeks age) Balb/c, C57BL/6, and CD-1 mice strains from each group were challenged with UPEC strain CFT073 to evaluate which mice strain responded better to infection. The animals were anesthetized intraperitoneally with 2% Xylazine HCl (Xylazine, Aranda, Edo. Mex., México) and 10% Ketamine (Ketamin Pet, Aranda, Mex., México) at 5 mg/kg and 60 mg/kg doses, respectively. Once the surgical plane was confirmed, the mice were infected with 25 µL of the standardized culture (1 × 108 CFU/mL) using sterile catheters (for intravenous administration) 24G caliber (Punzocat Vizcarra, Edo. Mex., México). The catheter introduction was made through the urethra until reaching the bladder (approximately 3 mm posterior to the urinary meatus); control animals were administered PSS with the same maneuver [38,61]. The animals were observed for 60 days, with urine samples being taken weekly until the conclusion of this experiment [58]. Urine samples were plated on McC or CLED and BA; the bacteria identified as E. coli were subjected to DNA extraction and PCR assays, using primers to amplify fragments of wzy and fliC genes (Table 1), O6 and O25, and H 1 and H4 somatic and flagellar antigens, respectively [62,63]. Int. J. Mol. Sci. 2024, 25, 9876 9 of 14 Table 1. Specific primers to determine somatic and flagellar antigens of O6:K2:H1 and O25:H4 E. coli strains. Targeted Gene Sequence (5′-3′) Size (bp) UPEC Strains References wzy O6 F GGATGACGATGTGATTTTGGCTAAC 783 CFT073 [63] wzy O6 R TCTGGGTTTGCTGTGTATGAGGC FliC H1 F ATGCGCTGACTGCATCAAAG 774 CFT073 [62] FliC H1 R CCTTGCCGTTGTTAGCATCG wzy O25 F GTTCTGGATACCTAACGCAATACCC 229 RMR(U3)02 [63] wzy O25 R AGAGATCCGTCTTTTATTTGTTCGC FliC H4 F GATTTCAGCGCGGCGAAACT 150 RMR(U3)02 [62] FliC H4 R GGTTGCAGAATCAACGACCG 4.7. Protective Effect of UNAM-HIMFG Lysate Four groups with Balb/c mice strains were integrated (n = 10) using UPEC CFT073 for infection and UNAM-HIMFG for protection: (1) CFT073 + UNAM-HIMFG; (2) CFT073 + PSS, (3) UI + UNAM-HIMFG; (4) UI + PSS. Urine samples were collected before and weekly after infection until completing 60 days [38,58]. For counting and isolation of bacteria, 5 µL of urine was diluted to obtain a final volume of 50 µL to inoculate culture plates of BA and CLED. Once the infection was confirmed, the identification of bacteria was performed, as described above (Section 4.6). UNAM-HIMFG lysate was prepared, as previously described [28], and administered sublingually with 1.0 inch long 22 G-gauge blunt-tipped straight metal esophageal cannula (sterile) connected to a sterile 1 mL plastic syringe [39,41]. The cannula was passed through the diastema, and the tip was placed under the tongue; the lysate administration was at 20 to 30 s intervals until a volume of 0.2 mL was collected; this treatment was performed twice each week for 60 days [40,64,65]. 4.8. Cytokines Detection On the 60th day, mice were anesthetized with xylazine with ketamine (as was described in Section 4.6) and euthanized by cervical dislocation according to NOM-062-ZOO-1999 [57]. Spleens were collected from the animals in sterile 0.6 mL tubes (Axygen, Union City, CA, USA) and stored in an ultra-freezer (Revco, Thermo Fisher Scientific, Ashevie, NC, USA) at −70 ◦C until processing. Each spleen was macerated by placing it on a cell strainer (CELLTREAT, Scientific Products, Pepperell, MA, USA); then, a volume of 600 µL of PSS was added, and with a 5 mL syringe plunger, the tissue was disaggregated on Petri dish. The macerate tissue was collected in sterile conditions in 1 mL tubes (Axygen, Union City, CA, USA), and mRNA extraction was performed using the PureLink RNA Mini Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) following the manufacturer’s instructions. The mRNA was quantified by spectrophotometry (NanoDrop, Thermo Fisher Scientific, Asheville, NC, USA), and then 10 µg of mRNA was treated with 2 U DNase (Thermo Scientific, Vilnius, Vilnius county, Lituania). The mixture was incubated for 10 min at 25 ◦C in a thermocycler (MiniAmp Thermal Cycler, Applied Biosystems, Thermo Scientific Fisher, Waltham, MA, USA); then, 2 mM EDTA to inactivate DNase I (65 ◦C for 15 min) was added. The mRNA was processed by retro-transcription with QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen, Hilden, North Rhine-Westphalia, Germany) following the manufacturer’s instructions. With the cDNA, the qPCR was performed with the SoAdvanced Universal SYBR Green Supermix kit (Bio- Rad, Hercules, CA, USA) and the respective primers (Table 2). The expression levels of TNF-α and IL-10 genes were measured using a fragment of the glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene sequence as a constitutive gene [47,66,67]. The reactions were carried out on the AriaMx real-time PCR System thermal cycler (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), and the results were analyzed by means of the 2−∆∆CT method [68]. Int. J. Mol. Sci. 2024, 25, 9876 10 of 14 Table 2. Primers utilized for quantification of TNF-α, IL-10, and GAPDH gene expression. Gene Primer Sequence (5′-3′) Size (bp) References gpdh, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase [Mus musculus (house mouse)] gapdh F TGGCAAAGTGGAGATTGTTGCC 156 [67] gapdh R AAGATGGTGATGGGCTTCCCG Tnf-α, tumor necrosis factor [Mus musculus (house mouse)] TNF-a g GGTGCCTATGTCTCAGCCTCTT 139 [47] TNF-a R GCCATAGAACTGATGAGAGGGAG IL-10 [Mus musculus (house mouse)] IL-10 F CGGGAAGACAATAACTGCACCC 130 [67] IL-10 R CGGTTAGCAGTATGTTGTCCAGC 4.9. Effect of UNAM-HIMFG Lysate on Tissue Colonization by Bacteria The protective effect of UNAM-HIMFG lysate on the establishment of bacteria in bladder and kidney samples from the mice studied was analyzed. Kidneys and bladder were collected aseptically; one kidney from each animal and a portion of their bladder were placed in sterile microtubes (Axygen, Union City, CA, USA) and fixed with 10% formalde- hyde (J.T. Baker, Xalostoc, Edo. Méx. México) buffered to pH 7.0–7.4. To evaluate tissue alterations, these were embedded in kerosene, sectioned, and stained with Hematoxylin and Eosin [69] and Sandiford’s stain [70]. Kidneys and the bladder portions that were not fixed were macerated, as was previously mentioned (Section 4.8); dilutions were performed in PSS, and samples of these were inoculated in BA and CLED to determine CFU/mL. 4.10. Statistical Analysis Statistical analysis was performed using GraphPad Prism version 10 software (Graph- Pad Software, San Diego, CA, USA). UPEC CFT073 prevalence in Balb/c mice was com- pared by Fisher’s exact test. TNF-α and IL-10 expression between groups were compared by performing a Student’s t-test. For all analyses, a value of p < 0.05 was considered statistically significant. 5. Conclusions Results showed that the CFT073 UPEC strain colonized the bladder of Balb/c mice for a reasonable time for a CUTI study. With respect to the UNAM-HIMFG lysate, it was observed that it had a protective effect on bacterial proliferation, eliminating them, avoiding tissue lesions, and controlling the chronicity of the clinical manifestations. It was confirmed that the sublingual administration of UNAM-HIMFG is a suitable route for immunization through MALT and that, as previously observed [28], it activates the production of TNF-α, which apparently contributes significantly to the resolution of the infectious process. UNAM-HIMFG lysate has a curative effect on CUTI without the need for antimicrobials. This work describes phase two of a pre-clinical study, which gives the guideline to proceed to phase three in individuals with CUTI. Author Contributions: Conceptualization S.E.A.-M., C.A.E.-C. and U.H.-C.; data curation, S.E.A.-M., U.H.-C. and C.A.E.-C.; formal analysis S.E.A.-M., C.A.E.-C. and U.H.-C., funding acquisition C.A.E.- C., J.M.-L. and U.H.-C.; investigation, S.E.A.-M., M.E.C.-B., U.H.-C. and C.A.E.-C.; methodology S.E.A.-M., O.M.-C., O.L.-D., S.H.-Y., A.B.T.-R., D.M.-G., F.E.R.-C., L.M.R.-R. and C.A.E.-C.; supervision; U.H.-C., O.M.-C., O.L.-D., L.M.-C., R.C.-L., J.M.-L., D.M.-G., A.V.-R. and C.A.E.-C.; writing—original draft, S.E.A.-M., U.H.-C., L.M.R.-R. and C.A.E.-C., writing—review and editing, S.E.A.-M., U.H.-C., R.E.A.-C. and C.A.E.-C. All authors have read and agreed to the published version of the manuscript. Funding: This work was funded by National Autonomous University of Mexico, funding numbers PAPIIT IN221318 Stage 29 and PAPIIT IN205322, project titles “Prospective follow-up study of pa- tients with urinary tract infections, phenotypic, genotypic characterization and assay of antimicrobial activity of natural and synthetic compounds in isolated uropathogenic Escherichia coli strains” and, “Animal model (Mouse) to evaluate the usefulness of lysates of uropathogenic Escherichia coli (UPEC) and other urinary pathogens for the control and treatment of chronic urinary tract infections” respec- tively, Hospital Infantil de México Federico Gómez, funding number HIM-2023-008 “Animal model Int. J. Mol. Sci. 2024, 25, 9876 11 of 14 (Mouse) to evaluate the utility of lysates of uropathogenic Escherichia coli (UPEC) and other urinary pathogens for the control and treatment of chronic urinary tract infections”. Institutional Review Board Statement: Hospital Infantil de México Federico Gómez [HIM-2023- 008]. Faculty of Veterinary Medicine and Animal Husbandry of the National Autonomous University of Mexico [Protocol No. SICUAE.DC2020/3-1]. Faculty of Medicine [Registration CICUAL 002- CIC.2021]. Informed Consent Statement: Not applicable. Data Availability Statement: The original contributions presented in the study are included in the article, further inquiries can be directed to the corresponding authors. Acknowledgments: The authors would like to acknowledge Raymundo Iturbe Ramírez of the Laboratorio de Virología, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Mexico City, Mexico, for the support provided for the performance challenge to mice. We would also like to thank Maribel Alvarado Cabello and Yolanda Perez de Mazo for their technical support in this work. We also thank María de los Ángeles Sánchez Jiménez from the HIMFG Central Laboratory, Bacteriology Section, for her support in the confirmation of the strains through mass spectrometry. hGrant no. 759975. Conflicts of Interest: The authors declare no conflicts of interest. References 1. Bell, B.G.; Schellevis, F.; Stobberingh, E.; Goossens, H.; Pringle, M. A systematic review and meta-analysis of the effects of antibiotic consumption on antibiotic resistance. BMC Infect Dis. 2014, 14, 13. [CrossRef] [PubMed] 2. Michael, C.A.; Dominey-Howes, D.; Labbate, M. The antimicrobial resistance crisis: Causes, consequences, and management. Front. Public Health 2014, 2, 145. [CrossRef] [PubMed] 3. World Health Organization. Global Action Plan on Antimicrobial Resistance; World Health Organization: Geneva, Switzerland, 2015; Available online: https://iris.who.int/handle/10665/193736 (accessed on 3 June 2024). 4. World Health Organization. Bacterial Priority Pathogens List. 2024. 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