UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO FACULTAD DE CIENCIAS "CARACTERIZACION HISTOLOGICA DE LA FLOR DE MA.NI'I' A Chiranthodendron pentadactylon LARR (STERCULIACEAE) USADA EN MEDICINA TRADICIONAL'' T E s 1 s QUE PARA OBTENER EL TITULO DE B I o L o G A p R E s E N T A : JUANA EDITH ZARATE RODRIGUEZ DIRECTOR DE TESIS: DR. GUILLERMO,LAGUNA HERNANDEZ -··-R--· 2002 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. 'hllVll{'il),\JJ>J,v·Ji 1,.1,;(. /1.1.l'h"l"MA l·I ·"'' n· DRA. MARÍA DE LOURDES ESTEVA PERALTA Jefa de la División de Estudios Profesionales de la Facultad de Ciencias Presente Comunicamos a usted que hemos revisado el trabajo c:Scrito: "Caractcrización histológica de la f'lor de manita Chiranthodendron pentadactylon Larr. (Stercul iaceae) usada en· medicina tradic1onal" realizado por Juana Edi th Zárate Rodr'iguez con número de cuenta 9210750-0 , quien cubrió los créditos de la carrera de: Biología Dicho trabajo cuenta con nuestro voto aprobat~rió. · Director de Tesis Propietario Propietario Propietario Suplente Suplente A.ten ta rri en t ~ . ~~~ Dr. Guillermo. Laguna Hernández. , - --- ::·- ~ Ora. Al i<:'iá EnriqÜ~ta ;Brechú Franco. ~¿..:.,L~~ M. en C. Rosenda Marg~rita Ponce Salazar.,J?'~;Í":r•-/;;,~( o::'J.,.i,.-,r. )h. l' {/ Ora. Ma r'ia Cristina Pérez-Amador y Barrón. ~1-~.f=- M. en C. Armando Gómez Campos. Consejo Departamental de Biología ~ACULTAD DE CIE!!CI;i u.¡;.;, .t.J. DF.PA P.T .\ l\IE!'\TO DE BIOLOGIA A ~í. &1bt.<.elí.t&1, qt.<.le"" ~ 11&1 cleclí.c&1clo St.<. &11'\.1.0r-,. co~pi;-ell\Sí.ó"'-, p&1cle"'-Cí.&1 !::I cuí.clt1clos [j &1 qule"" clebo ~t.<.cl1o ele lo qt.<.e so1::1. 1 AGRADECIMIENTOS N Dr. Guillermo Laguna Hemández por la dirección de la presente tesis y por su amistad. A mis sinodales Dra. Nicia Brechú Franco, a la M. en C. Margarita Ponce Salazar, a la Dra. Ma. Cristina Pérez-Amador y Barrón y al M. en C. Armando Gómez Campos por sus valiosas correcciones y aportaciones para mejorar el presente manuscrito. N Dr. Xavier lozoya Legorreta, del Instituto Mexicano del Seguro Social, por el apoyo otorgado durante la realización de esta tesis. A todos Jos miembros del laboratorio MDesarrollo en plantas", donde se realizó este trabajo, porque enriquecen y amenizan el trabajo en él. Particularmente a la Dra. Margarita Collazo Ortega por su cariño y buena disposición y ánimo para ayudar. N M. en C. José Gonzalo Ricardo Wong por las observaciones que hizo en el contenido del trabajo. A la Q. A Verónica Muñoz Ocotero por su amistad y la asesoría en la parte fitoquímica del trabajo. N Biól. Alfredo Gamboa Romero por su paciencia e interés en la toma de las fotografias que ilustran este trabajo. A la M. en C. Silvia Espinosa Matías por las facilidades otorgadas en la toma de fotografías de MEB. N M. en C. Erick Estrada lugo por ser un gran amigo, por encaminarme en el estudio de I~ plantas medicinales y por compartir conmigo su visión cosmogónica de la vida. A mis compañeros de la generación y anexos, Oaus, Joss, Carlitas, Normita, José, Angélica, Pancho, Oaudia, Benis, Chucho y Lalo, por su apoyo y amistad. A ~ b,0J1 por sus insistentes ánimos, especialmente a Uu y Uli por el cariño que se tienen y transmiten, a Kary por su amistad, a Go por su buen sentido del humor, a Ric por su bigotona presencia, a Flo y Bibi por su sudaméricana forma de ser, y a Guille por su contagioso dinamismo. A Alejandro Ramos porque siempre ha confiado en mi, a Xavier Valencia por ser el mejor "bichito" del planeta, a Rodolfo Zamudio por su cariño. A mi mamá, mis tíos Lourdes, Lucio y Chóforo, porque siempre han estado conmigo. A mi hermana Martha y a mis sobrinos, por sus risas y alegria. Ati •.• II CONTENIDO .Pág. RESUMEN............................................................................................... 1 INTRODUCCIÓN ............................•.•.................•..•.. ;» ••••••••••• ;................. · 3 ANTECEDENTES ........................................•....•....•........ ::.:..................... 7 o Taxonomfa .......................•. : ....•.... '.....•.•.. : •.• L.: .. ~ .. :•::: ... ~'. ... :..... 7 o Descripción de la familia Sterculliac:eaeL'.~:~.';}.;.L::·:::: ....•. :;;... 7 ¿ Características de Chirantodf!ndron·pehta~áctYlon La~r; .. '.'. ... •· 1 ~ OBJETl~~~=:.~~:~~'.'.:'.'..'.'.:~_é(;~j~~f '.{~W~)}).:'i~~~~;~i~f~if:!~t; .. · :: MÉTODO ...................................... ::.:~.LJ~), .. '.if(.:;i~.E:''.:2/,'. .. Ji_jJ.;:1f~.i::t: .. ~:.:,. ·. 27 ·. RESUL TADOS .........•............ :.:~.~::: .... '.j:_.'f!::.:~:.:•.:::: ... \.LJ:J~(f~{;f~'.x:.W.5:'t;. ?'.33: ·.: ~:---. ~.--V ·(.c . • .- o Caracterización histológicá de los sépalos ..... ;.:,::.;.;; .. :::~ .. :;.:• .. 33 · Sépalos no herborizados ..........•..•••.... ;, .. :,;:'. .•. ;:;.;;,;. • 33 Sépalos herborizados ....•....•....• :; .... ,·:;.:;;·'..:.:·:~.:.•:.~.·:~.:··· 57 · o Identificación de los sacáridos de las cavidades de los•· • • _-.· .• · sépalos .........................•.................•........... ~". •... :_. ...•... ·:•:.:.~, .. :... 67 DISCUSIÓN ..........................................................•••..................•..•.. ;....... 71 CONCLUSIONES .............................................•.•.......•........ ; ... :;;............. 81 LITERATURA CITADA .............•......................•.........••... ; .•.....•... ;............ 83 III RESUMEN La herbolaria es un recurso muy utilizado en los sistemas de s~lud que están creciendo rápidamente y de gran importancia económica. La farmacognosia tiene como objetivo estudiar las sustancias medicamentosas de origen natural. Uno de los aspectos que contempla es el histológico vegetal, donde la importancia de realizar la caracterización del fitofármaco, es con la finalidad de regular la calidad de los medicamentos herbarios. La identificación de las drogas vegetales depende de la plena identificación de las plantas productoras, lo cual es posible gracias a que existen estructuras celulares que son características de una especie vegetal y que son reconocibles en cortes histológicos o en polvos de la droga. Chiranthodendron pentadacty/on es un árbol medicinal, cuyas flores son utilizadas por su efecto cardiotónico. Los estudios realizados en la especie no han abordado el aspecto anatómico vegetal, por lo que el presente estudio aporta características histológicas distintivas de la especie. Los resultados obtenidos muestran que los sépalos están constituidos por una epidermis uniestratificada en ambas caras, pero la adaxial es más gruesa. La cara abaxial presenta abundantes tricomas estelados y la adaxial solo en los márgenes. En el tejido nectarffero, se encontraron tricomas glandulares pluricelulares y bicelulares. Éstos últimos no hablan sido descritos para la familia. En esta región, el parénquima secretor se caracterizó por los materiales que almacena y la distribución de los mismos. El parénquima estructural contiene canales grandes y abundantes que muestran aspecto diferente en su interior por acción de las distintas técnicas de inclusión y de tinción utilizadas, y que además contienen azúcares y pectina. Por cromatografía bidimensional, se determinó que las cavidades almacenan una sustancia viscosa que contiene fructuosa y sacarosa en la base del sépalo y, en menor cantidad, glucosa en el resto del sépalo. No presenta azúcares caracterlsticos un mucilago. Por lo anterior, se sugiere que la sustancia viscosa podría estar relacionada con el néctar de la flor. INTRODUCCIÓN En México, existe una gran diversidad vegetal, determinada por su situación geográfica y por la heterogeneidad de condiciones fisiográficas, geológicas y climáticas que en sus múltiples combinaciones la originan. Además de estas caracterlsticas, en el pals se distribuyen 56 grupos étnicos en todos los biomas y cada uno en su medio aprovecha los recursos naturales disponibles para satisfacer sus necesidades (Estrada, 1985}. Tal es el caso de las plantas medicinales, utilizadas desde la aparición del hombre y cuyo conocimiento práctico de su uso ha sido transmitido de generación en generación por diversos medios. La herbolaria, como se conoce a la práctica terapéutica que utiliza plantas medicinales, continúa vigente y tiene gran arraigo en nuestro pals. Las plantas medicinales aún constituyen el recurso más conocido y accesible para grandes núcleos de la población mexicana. La Organización Mundial de la Salud (OMS} reconoce el valor de esta práctica terapéutica y le otorga gran importancia en los esquemas o sistemas públicos para la salud en los paises en desarrollo (OMS, 1996}. El número estimado de plantas medicinales en México, lo ubican en el quinto lugar a nivel mundial, con 3352 especies distribuidas en 1214 géneros y 166 familias de plantas vasculares (Bye, et al., 1992), de las cuales no se ha estudiado ni siquiera el 10% desde el punto de vista qulmico, farmacológicamente son menos del 5% y agronómicamente ni siquiera el 1 % (Estrada, 1995). El gran incremento en el uso de plantas con fines medicinales, ha provocado un renovado interés por el conocimiento de sus caracterlsticas y las drogas que de ellas se extraen. El desarrollo tecnológico ha dado paso a nuevas metodologlas y procedimientos que han modificado sustancialmente el estudio de la herbolaria y la obtención de los nuevos medicamentos preparados a base de plantas, los fitofármacos, como una opción en la medicina del nuevo siglo. Estos productos recuerdan a los medicamentos galénicos, pues vuelven a presentarse en forma de extractos, pomadas, mezclas de plantas molidas y encapsuladas o tabletas que contienen múltiples compuestos naturales, pero se distinguen de ellos porque el conocimiento cientlfico sobre la acción de sus componentes está mejor fundamentado (Lozoya, 1998). El valor de las plantas medicinales está dado por sus constituyentes quimicos, principalmente por los metabolitos secundarios que producen efectos fisiológicos. Los alcaloides, terpenoides, glucósidos y flavonoides son algunas de las mayores categorlas de dichos compuestos con actividades farmacológicas ya conocidas. Estas sustancias constituyen la 3 razón por la que las plantas medicinales se han seleccionado y usado en la medicina tradicional, asl como en la industria farmacéutica y son la base para su aprovechamiento a gran escala en las sociedades industriales (Balandarin, et al. 1985). La farmacognosia es la aplicación simultánea de diversas disciplinas cientlficas con el objeto de estudiar las drogas y sustancias medicamentosas de origen natural en todos sus aspectos posibles (Tyler, et al., 1979; Kuklinski, 2000). Entre dichas disciplinas se encuentra la biologla, que mediante la histología vegetal, establece una linea de investigación en la identificación de la droga vegetal que ayuda a la elaboración de los fitofármacos. La determinación morfológica macro y microscópica de la droga vegetal es requerida por el Sector Salud Institucional en los reglamentos para la evaluación de la calidad, la inocuidad y la eficacia de los medicamentos herbarios (WHO, 1992; NOM- Reglamento de insumos para la salud, 1998; OMS, 2000). El análisis morfológico debe ser aplicado en este caso, para evitar adulteraciones de la materia prima con especies botánicas parecidas, para detectar la presencia de contaminantes de otras plantas indeseables o para la identificación de compuestos importantes a nivel celular. Estos estudios permiten la caracterización de los tejidos y, con ello, la elaboración de las pautas morfológicas que definen el género y la especie botánica en particular (Rivera, et al., 2000). La información farmacognósica se reúne en monografías para la publicación de las farmacopeas, que consignan los métodos generales de análisis y los requisitos sobre identidad, pureza y calidad de los fármacos, aditivos, medicamentos y productos biológicos (NOM-001-SSA-1993), sin embargo, aún faltan muchas especies medicinales por ser estudiadas. Una de estas especies, poco estudiadas histoJógicamente, es Chirantodendron pentadactylon Larr., miembro de la familia Sterculiaceae (Cronquist, 1981). Es un árbol conocido comúnmente como "Flor de manita", "Palo de yaco• o "Macpalxóchitl" en náhuatl, que quiere decir "flor de palma de mano". Este nombre se debe a que los filamentos de los estambres semejan una mano, siendo el sexto dedo el estilo (Bye, 1987). Esta planta ha sido apreciada en México desde la época prehispánica, como lo demuestran las fuentes históricas por medio de sus dibujos y manuscritos, que suponen además una importancia ritual. Actualmente, ras flores son utilizadas en infusión frecuentemente combinadas con otras plantas como remedio para enfermedades del corazón, presión arta y sedante para los nervios. En los últimos anos, el cambio de uso del suelo para la introducción de la ganadería y agricultura ha ocasionado la destrucción de los hábitats naturales de este árbol, bosque de pino-encino y bosque mesófilo de montaña, dando como resultado que las poblaciones de estos árboles 4 disminuyan al punto de tener catalogada a esta especie como amenazada (NOM-059-ECOL-2001 ). A pesar de Ja importancia farmacológica, fitoqulmica, económica y cultural de Chiranthodendron pentadactylon, las investigaciones realizadas no han abordado el aspecto histológico, por lo tanto, el presente estudio pretende obtener información detallada sobre la histologla de la flor con la finalidad de proporcionar una referencia que apoye su correcta identificación como parte del control de calidad de los herborizados comerciales, asl como para identificar y ubicar algunos metabolitos biológicamente activos en sus tejidos. 5 ANTECEDENTES TAXONOMÍA Cronquist (1981), agrupa a las familias Sterculiaceae, Elaeocarpaceae, Tiliaceae, Bombacaceae y Malvaceae en el orden Malvales. Sin embargo, autores como Alverson y colaboradores (1999) no aceptan este arreglo taxonómico, y proponen la formación del ciado Malvatheca que incluye a toda la familia Malvaceae y la mayoría de los géneros de Bombacaceae, más los géneros Fremonthodendron y Chiranthodendron, los cuales eran tratados habitualmente como esterculiáceas, esto a partir de sus trabajos de secuenciación y comparación de bases en el gen ndhF de cloroplasto. Por su parte, Nyffeler (1999) apoya la idea de agrupar a las familias Sterculiaceae, Tiliaceae, Bombacaceae y Malvaceae en un solo orden mo:1ofilético (Malvales), dentro de todo un nuevo sistema de clasificación en donde se reconocen 40 ordenes basados en estudios de filogenia molecular, utilizando secuenciaciones del gen lbcL. Este último autor señala que su propuesta de clasificación puede cambiar en anos venideros, especialmente a nivel de ordenes. Por lo anterior, para los fines de este trabajo, se recurre a la clasificación tradicional de Cronquist (op. cit.). DESCRIPCIÓN DE LA FAMILIA STERCULIACEAE Esta familia agrupa a árboles, arbustos o hierbas incluidos en 68 géneros y 700 especies que están caracterizados por la presencia de tricomas estelados o peltados. Comúnmente presentan células taninlferas, células mucilaginosas, cavidades o canales lisógenos o esquizógenos, que se encuentran de manera caracterlstica en el tejido parenquimatoso; grupos de cristales de oxalato de calcio o cristales solitarios; los elementos de vaso presentan placas perforadas simples; los elementos traqueales tienen punteaduras rebordeadas inconspicuas o punteaduras simples. Las hojas son alternadas, simples y frecuentemente palmatilobuladas, con venación que va de pinnada a palmaticompuesta; estípulas presentes pero éstas caen tempranamente; los estomas son en su mayorla anomoclticos; el sistema vascular es con frecuencia sifonostélico. Las flores se agrupan en varios tipos de inflorescencias y rara vez son solitarias, son actinomórficas o raramente zigomórficas, bisexuales pero cumúnmente son funcionalmente unisexuales. El perianto es comúnmente uniseriado y está 7 constituido por tres a cinco pétalos valvados, los sépalos están basalmente connados pero usualmente está presente un número igual de pétalos; los nectarios están constituidos por cúmulos de tricomas glandulares que se encuentran en la base de los sépalos. El androceo frecuentemente consta de dos series de cinco estambres cada uno, estos están unidos por sus filamentos formando un tubo que rodea al ovario y que comúnmente se asienta sobre un androginóforo; las anteras son tetrasporangiadas y bitecadas; los sacos de polen son paralelos y adyacentes o algunas veces son divergentes y separados, abren por Hneas de dehiscencia longitudinales y rara vez por poros apicales; los granos de polen son binucleados, se encuentran desde tricolporados lisos o reticulados hasta pentacolporados y espinulosos. Gineceo de uno a 60 carpelos, pero en la mayoría de las especies son cinco, estos generalmente están unidos para formar un ovario compuesto por tantos lóculos como carpelos y con los estilos connados formando un único pistilo, el ovario es súpero con uno, dos o varios óvulos por cada carpelo, estos óvulos muestran placentación axilar, marginal o parietal, pudiendo ser anátropos o hemianátropos. Las semillas son bitégmicas, crasinucelares, comunmente con su micrópilo en zig-zag; el endospermo es abundante y de desarrollo nuclear, rico en aceite o almidón; el embrión es recto o curvado y con los cotiledones expandidos. El fruto es variable, va de carnoso a correoso e incluso llega a ser lei'loso, son tanto dehiscentes como indehiscentes. En la mayoría de las especies el número cromosómico es de X= 20. Theobroma cacao, Cola nftida y C. acuminata son especies de gran importancia económica. Las esterculfaceas aparecen en el registro fósil a partir del Cretácico tardlo y el polen caracterlstico de la familia aparece a partir del Paleoceno. (Cronquist, 1981 ). CARACTERÍSTICAS DE Chiranthodendron pentadactylon Larr. • DESCRIPCIÓN DE LA ESPECIE Son árboles de 1 O y hasta 30 m de altura; su madera es frágil; las ramas, especialmente cerca de las hojas están revestidas de tomento compuesto de tricomas estrellados, que en conjunto presentan un color ferruginoso; la corteza del tronco es lisa y de color café. Las hojas son anchas y ovadas, con tres a cinco lóbulos profundos o superficiales, palmatinervados, su base es notoriamente cordada, el ápice agudo o acuminado, son ligeramente crenadas, envés ferruglneo y haz casi glabro; tienen peciolos de 8 a 11 cm y están provistas de pequeñas estipulas foliáceas, caedizas o persistentes. Dichas hojas son verdes y están cubiertas especialmente las jóvenes, de tomento en ambas caras; las adultas lo llevan solamente en la cara inferior. 8 Las flores son hermafroditas y zigomórficas, solitarias, axilares; los pedúnculos son opuestos a las hojas, con tres bractéofas; cáliz campanulado, cinco lóbulos lanceolados de color rojo en el interior y tomentoso café rojizo en el exterior, imbricados, connados; apétalas; Jos estambres son exertos, se presentan en número de cinco, están unidos por Ja base formando un tubo cilíndrico que se ensancha hacia abajo por donde se une con el perianto; son de color rojo brillante y se extienden en la parte superior, arqueándose ligeramente hacia adentro, dando el aspecto de una mano; anteras largas, con dos tecas y dehisencia longitudinal; el polen tiene forma triédrica y es de color amarillo; el ovario se encuentra escondido en la base del tubo estaminaf, sincárpico, cinco carpelos con óvulos numerosos en cada fóculo; el estilo asciende en medio del mismo tubo y deja salir una pequeña punta amarillenta formada por cinco surcos que forman el estigma. El fruto es una cápsula leñosa pentavafvada, profundamente acanalado y mide unos 12 cm es dehiscente de la parte media hacia el extremo superior; fas semiffas son ovoides y de color negro, briffantes miden 5 mm de largo por 3 mm de ancho, con una carúncula granulosa de color amariffo a naranja, endospermo carnoso y cotiledón circular, plano (Azuara, 1990; Vázquez, 1998). + DISTRIBUCIÓN El género consta de una sola especie, la cual es de distribución restringida en México, localizándose principalmente en forma silvestre, en los estados de Guerrero, Oaxaca, Chiapas y hasta Guatemala, y en forma cultivada en el Estado de México y Distrito Federal. Habita en bosques de pino-encino y bosque mesófifo de montaña en altitudes de 2000 a 3000 msnm (Azuara, 1990; Bye, 1987). • Usos El atractivo principal de Ch. pentadacty/on son sus flores, por Jo que es muy codiciada como planta de ornato en Jardines Botánicos, en Estados Unidos y Europa (Vázquez, 1998). Esta planta ha sido importante en México desde Ja época prehispánica, los nahuas usaban Jos cocimientos de las flores para fas inflamaciones de Jos ojos y para aminorar los dolores de las hemorroides. Después de la conquista se Je atribuyó acción cardiotónica y contra Ja epilepsia (Lara y Márquez, 1996). La corteza del árbol se ha utilizado para elaborar correas, las hojas flexibles se han usado para cubrir comida en los mercados de Oaxaca y como emolientes (Martlnez, 1936). Actualmente, en el mercado de Sonora se recomienda para los nervios y el 9 corazón, combinada con yololxóchitl (Talauma mexicana), magnolia (Magnolia sp.), los tres toronjiles, el blanco y el morado (Agastache mexicana) y el azul o chino (Dracocephalum moldavica), asl como flores de azahar (Citrus spp.) todo esto tomado como té cuando sea necesario (Lináres et al. 1988). En Carrizal de Bravo, Municipio de Leonardo Bravo, Gro., existe una gran actividad de recolección de flores secas durante el periodo de floración comprendido entre febrero y abril, que involucra principalmente a mujeres y niflos, que aunque no conozcan el uso terapéutico que se le da a la flor, si saben del valor comercial de la misma. Esto representa un ingreso económico muy importante, lo que permite la conservación del bosque de esa región en las zonas de crecimiento de los árboles de "flor de manita" (Osuna, et al., 1998). Presencia de la flor fresca Presencia de la flor seca Ausencia de la flor Gráfica 1. Presencia de la "flor de manita• en el mercado de Sonora a lo largo del ano (Tomado de Linares. et al .• 1988). La comercialización de la "flor de manita", en un 90% se lleva a cabo en el mercado de Sonora, en la Ciudad de México (Gráfica 1 ). El principal abastecedor de la flor fresca es el municipio de Texcoco (especialmente San Miguel Tlaixpa), donde existen alrededor de 30 árboles que florecen de noviembre a abril. Otra manera de vender la flor es en forma seca, cuya procedencia es de los estados de Oaxaca y Guerrero, y su llegada a la Ciudad de México es después de que termina la temporada de flor fresca, entre los meses de julio a septiembre (Vázquez, 1998). 10 'TE ,-..,.e r-:-, ~.~--1 U!u ,.;t._;.;..\ FALLA DE ORIGEN • INVESTIGACIONES REALIZADAS Existen pocos trabajos farmacológicos y fitoqulmicos realizados en esta especie. En 1948, Sodi y Martlnez caracterizaron al pigmento de macpalxóchitl, como una aglicona más tres moléculas de glucosa y tres de ácido gálico (precursor de taninos), que llamaron Trigalogluxi-5,7,4'-cloro-1- Benzopiroxona. Por su parte, Domlnguez y colaboradores (1969), obtuvieron a partir de extractos con flores secas los compuestos octacoseno (C28H58), dacosanol ll-1 (C22H4sO), l}-sitosterol (C29HsoO) y un material rojo insoluble, glucosa y sacarosa. Domlnguez y Gutiérrez, en 1972, aislaron octacoseno, dacosanol P-1, acetato sitosterol y un flavonoide rojo muy insoluble del extracto, que dio reacción negativa a alcaloides y glucósidos cardiacos. En 1995, Perusquia y colaboradores comprobaron el efecto farmacológico del extracto acuoso de las flores que inhibió la contracción muscular en aorta de rata previamente estimulada con noradrenalina. Más recientemente, Lara y Márquez (1996), hicieron una recopilación de los compuestos aislados de la flor de Ch. pentadactylon (Cuadro 1 ). Cuadro 1. Compuestos encontrados en flores de Ch. pentadacty/on (Modificado de Lara y Márquez, 1996). NOMBRE Octacoseno Éster alifático Glucosa Sacarosa J3-sitosterol Dacosanol ll-1 3-glucósido de cianidina Leucocianidina ?-glucósido de luteolina 7-glucurónido de luteolina 3-glucósido de quercetina Gosipertina 3-glucorónido de gosipetina ácido gálico Tri lucósido de a i enina . TIPO DE COMPUESTO Alqueno Éster Carbohidrato Carbohidrato Esterol Flavonoide rojo Alcohol Glucósido de antocianina Antocianina Flavonoide Glucorónido flavonoide Glucósido flavonoide Glucorónido Glucorónido A cid o Glucósido flavonoide Katzung (1986) mencionó que los glucósidos cardiacos involucran a un grupo de compuestos esteroides que tienen efectos primarios complejos sobre las funciones mecánicas y eléctricas del corazón. También actúan sobre el músculo liso y sobre otros tejidos. Su principal efecto terapéutico 11 consiste en aumentar la contractilidad cardiaca en la insuficiencia cardiaca congestiva, es decir, cuando el gasto cardiaco es inadecuado para proporcionar el oxigeno necesario al organismo. Los glucósidos cardiacos se dividen en dos grupos principales, los cardenólidos y los bufadienólidos. Los primeros son los más abundantes y ampliamente distribuidos en las plantas, mientras que los segundos sólo han sido aislados en algunos géneros de plantas (Silla y Hel/eborus). Los cardenólidos son bien conocidos por su uso medicinal como estimulantes cardiacos, pero también presentan una importancia ecológica, ya que pueden inducir el vómito y afectar el Sistema Nervioso Central de animales, desalentando asl a los herblvoros potenciales. Además, diversos herblvoros, especialmente insectos son capaces de neutralizar y almacenar dichos cardenólidos y de esta forma pueden adquirir una efectiva defensa contra sus posibles depredadores. Respecto a estudios fisiológicos y ecológicos, se encuentran los trabajos de Larreategui (1975) que investigó la reproducción sexual mediante la autopolinización y polinización cruzada. En el mismo ano, describió la polinización de esta especie por aves de hábitos nectarlvoros que requieren estar perchadas para obtener su alimento (Toledo, 1975). Algunas caracterlsticas morfológicas del fruto y semillas fueron estudiadas por Estrada (1987), asimismo, se analizaron los resultados obtenidos de pruebas con polinización manual. García y Perales (1990), evaluaron la viabilidad de las semillas realizando pruebas de germinación bajo condiciones de almacenamiento y dan pautas a la propagación e introducción de la especie. Recientemente, Osuna y colaboradores (1997), realizaron pruebas de germinación en respuesta a la escarificación, temperatura y luz y observaron la presencia de una cubierta impermeable al agua en la exotesta y la endotesta de las semillas. En cuanto a estudios etnobotánicos, Bye y Linares (1987), realizaron un estudio de siete plantas medicinales encontradas en los mercados mexicanos haciendo hincapié en sus usos actuales y en tuentes históricas (Códice de la Cruz- Badiano, Códice Florentino e Historia Natural de ta Nueva Espana), y encontraron que la información antigua de Ch. pentadactylon fue censurada por atribuirle una importancia ritual (Fig. 1 ), y que a partir del siglo XX se emplea en infusión para enfermedades del corazón, los nervios, epilepsia y síntomas de convulsiones. Asimismo, anaden que la planta es cultivada y recolectada, la vla de administración es oral y local, además de las flores se ha ocupado las hojas y la corteza. Por otro lado, Osuna y colaboradores (1998), presentaron una propuesta para la comercialización de las flores en el Municipio de Miahuatlán, Oax., a partir de la experiencia anterior en el municipio de Leonardo de Bravo, Gro., donde la planta es una importante fUente de ingresos durante su floración 12 para los pobladores recolectores, pese a que desconocen su uso medicinal. Figura 1. Macpalxóehitl. La manera de Ilustrar las llores en fonna de garra le atribuyen una importancia ritual (Tomado de Hernández. 1959). SÉPALOS Los sépalos son los componentes individuales del cáliz, es decir, el verticilo más externo de fa flor. Por fo común son verdes, pero pueden ser petaloides o de colores (Janes, 1988). Su estructura histológica al ser semejante a fas hojas se describe de igual forma. Constan de un parénquima fundamental, a menudo llamado mesófifo, un sistema vascular que atraviesa el parénquima fundamental, y capas epidérmicas sobre los lados adaxiaf y abaxial. En el tejido fundamental o en asociación con los elementos vasculares puede haber células con cristales como idiobfastos y faticfferos. El mesófilo esta raramente diferenciado en parénquima en empalizada y esponjoso, pero puede contener grandes cantidades de clorénquima. 13 Generalmente es de estructura simple y consta de células aproximadamente isodiamétricas flojamente dispuestas en un tejido lagunoso. La epidermis de los sépalos presenta una aposición de cutina y desarrollo de estomas y tricomas similares a los de fas hojas. El sistema vascular recuerda el de las hojas, pero es menos complejo (Esau, 1985). Algunas estructuras secretoras como tricomas glandulares o cavidades, que son comunes en fas hojas, también se presentan en los sépalos. En algunas especies los sépalos son de colores brillantes, parecidos a los pétalos, y pueden producir fragancias y néctar. En estas flores los sépalos cumplen una doble función, como protección de fas partes más internas de fa flor y como atrayente para los pofinizadores (Maushet, 1988). La anatomfa de fa flor ha sido estudiada principalmente para explicar alguno de los complejos detalles estructurales de las flores, para obtener datos adicionales de la clasificación de las angiospermas, embriologfa y mecanismos de polinización. NÉCTAR Y NECTARIOS Bahadur y colaboradores (1998) afirman que el néctar es el mayor atrayente y la mejor recompensa que dan fas flores a sus polinizadores. Esta secreción resulta de diferentes y complejos procesos fisiológicos de glándulas especializadas llamadas nectarios. La secreción y concentración del néctar está relacionada con el estado fisiológico y nutricional de la planta y sus ritmos autónomos. El néctar puede estar constituido por azúcares, aminoácidos, lfpidos, alcaloides, glucósidos, sustancias tóxicas, fenofes, proteínas, ácidos orgánicos, vitaminas, compuestos inorgánicos, resinas, ácido ascórbico, polisacáridos mucilaginosos, etc. De todos, los azúcares son los principales componentes (Bahadur, et al. 1998). El efecto de estos compuestos químicos para los visitantes de fas flores es diverso. Los azúcares los proveen de energía de manera instantánea y los aminoácidos, Hpidos y proteínas son valiosos en su nutrición. De igual forma, se ha propuesto que el néctar podrfa servir como senuelo para los depredadores, como en el caso de fas hormigas ( Rao y Ramayya, 1998). Los estudios de fa composición del néctar establecen que los azúcares comunes que se presentan en fas flores son hexosas monosacáridas, glucosa y fructuosa y un disacárido, sacarosa. Estos tres azúcares se encuentran combinados o separados. Baker y Baker (1982) hicieron un resumen de fa frecuencia de estos tres azúcares en 765 especies (Cuadro 2). Existen además, otros tipos de azúcares en los nectarios, sin embargo son menos frecuentes y se les encuentra en menor cantidad. Estos 14 azúcares son mono-, di-, tri-, y tetrasacáridos (Cuadro 3). Entre los monosacáridos es frecuente encontrar a la arabinosa y la galactosa y raramente la manosa. A los disacáridos se les encuentra ocasionalmente, mientras que a los trisactlridos es mtls frecuente encontrarlos (Baker y Baker, 1981). Cuadro 2. Número de especies para cada combinación de azúcares en su néctar (Modificado de Baker y Baker, 1982). Azucares componentes del néctar No.de Porcentaje de esoecies esoecies Sacarosa 7 0.91 Glucosa 2 0.26 Fructuosa o 0.00 Sacarosa + i:ilucosa 29 3.79 Saearosa + fructuosa o 0.00 Glucosa + fructuosa 78 10.20 Sacarosa + alucosa + fructuosa 649 84.84 Total 765 100.00 -· Cuadro 3. Azúcares menos frecuentes reportados en el néctar de más de 1000 especies distintas (Tomado de Baker y Baker, 1981 ). Monosacáridos: Arabinosa Galactosa Manosa Disacáridos: Gentobiosa Lactosa Maltosa Melobiosa Trehalosa Trisacáridos: Melecitosa Rafinosa Tetrasacáridos: Estaquiosa El término tejido nectarlfero se refiere al tejido que forma el nectario, constituido por una epidermis con o sin tricomas y un parénquima especializado. El parénquima estti compuesto por células relativamente pequeñas con citoplasma granular denso y un núcleo relativamente grande (Fahn, 1998). 15 El néctar que se secreta tiene origen en la savia del floema. El pre-néctar se mueve a lo largo de los elementos cribosos hacia las células del tejido nectarffero, donde utiliza la vla de los plasmodesmos. La composición del pre-néctar se modifica en el tejido nectarffero por actividad enzimática y por procesos de reabsorción. El néctar es exudado desde el nectario mediante: células epiderrnales, tricomas, células del parénquima nectarffero, estomas modificados o cavidades lisógenas (Fahn, 1998). Entre las caracterlsticas moñológicas de las plantas, los nectarios no solo tienen importancia histológica, sino también filogenética. Rao y Ramayya (1998) realizaron un estudio que evalúa la importancia moñológica y filogenética de los nectarios florales para 32 géneros y 64 especies de las Malvales, de las cuales, 11 especies pertenecen a la familia Sterculiaceae. Ellos encontraron que dentro de la familia Sterculiaceae, donde el cáliz es usualmente gamosépalo, el nectario se encuentra en la base de éste, de modo que el néctar no gotea hacia afuera y asl se halla disponible para los polinizadores. Los nectarios se forman como una capa interna continua de tricomas en forma de clava uniseriados, filiformes o piriformes. Asimismo, una sola especie presentó tricomas uniseriados piriformes en la base abaxlal del sépalo. Además, indican la ausencia de nectarios extraflorales, excepto en algunos miembros de la familia Malvaceae, los cuales carecen de tricomas glandulares. Finalmente concluyeron que los nectarios extraflorales son un carácter más avanzado que los nectarios florales, dentro de la historia evolutiva de las Malvales. FARMACOGNOSIA La palabra farmacognosia proviene de los vocablos griegos pharmacon que significa venenos o medicamentos y gnosis que significa conocimiento, lo que se interpreta como conocimiento de los venenos o medicamentos. Sin embargo, la farmacognosia limita su campo de investigación a las drogas y sustancias medicamentosas exclusivamente de origen natural: vegetal, animal o microbiano (hongos, bacterias). Estudia tanto sustancias con propiedades terapéuticas como sustancias tóxicas, excipientes u otras sustancias de interés farmacéutico, aunque su uso sea básicamente tecnológico y no terapéutico. Se considera una rama de la farmacologla, ciencia descriptiva que estudia la acción y el efecto de las sustancias qulmicas, de diversa naturaleza y origen, sobre la materia viva (Tyler, et al., 1979; Bruneton, 1999; Kuklinski, 2000). Para la farmacognosia, estudiar una planta es definir su identidad, esto es: establecer las caracterlsticas moñoanatómicas, tanto macroscópicas como microscópicas, y las organolépticas, que permitan la caracterización de la droga; investigar los métodos óptimos de producción; establecer 16 cuantitativa y cualitativamente sus principios activos; controlar la calidad de las drogas; establecer sus propiedades farmacológicas; e investigar nuevos principios activos que puedan constituir un punto de partida para el diseno de nuevos fármacos en el futuro (Trease y Evans, 1988; Bruneton, 1999; Kuklinski, 2000). Para valorar una droga, es decir, para identificar la calidad y pureza de la misma, se realizan diversos ensayos que se pueden clasificar en: organolépticos, botánicos (macroscópico y microscópico), fisicoqulmicos y farmacodinámicos y biológicos (Tyler, et al., 1979; Kuklinski, 2000). Los ensayos botánicos que se practican para la valoración microscópica de la droga vegetal, están dirigidos para controlar caracterfsticas histológicas y/o histoqulmicas específicas, debido a que las drogas se pueden emplear no pulverizadas, es decir, enteras o fragmentadas, y pulverizadas. De entre las diversas clasificaciones que existen para el estudio de éstas caracterlsticas, para el presente estudio se considera la adoptada por Trease y Evans (1988) y Kukfinski (2000), en fa que sugieren dividir en dos grupos: drogas organizadas o estructuras celulares cuando se realizan observaciones en el tejido conservado, y no organizadas o contenidos celulares cuando el tejido está disociado y se realizan interpretaciones a partir de los contenidos celulares ergásticos (Cuadro 4). Para identificar y determinar fa calidad y pureza de un fitofármaco que solicita fa aprobación del Sector Salud Institucional, se debe comparar la muestra desconocida con muestras de drogas auténticas o con la descripción que se hace de ellas en las farmacopeas y otras publicaciones autorizadas, cuya caracterización se debe de realizar a partir de ejemplares enteros, y que idóneamente cuenten con las normas de calidad y sanidad en cuanto a cultivo, recolección, etc. (Tyler, et al., 1979). La identificación de las drogas vegetales es posible gracias a que existen algunos elementos celulares o del tejido que son propios o característicos de cada droga que se determinan al estudiarla al microscopio, pulverizada o micronizada (Cuadro 4). la identificación se puede producir tanto por la presencia como por la ausencia de dichos elementos, lo que también permite la detección de adulteraciones (Kuklinski, 2000). La determinación de la calidad de la droga está dada, principalmente, por la cantidad de principios activos que contiene, aunque también suelen incluirse otros compuestos como: carbohidratos, glucósidos, esteroides, alcaloides, vitaminas o algunas protefnas. En cambio, el grado de pureza se determina por la presencia de materia extraña, es decir, otras partes de la planta que no constituyen la droga vegetal u otras especies que no son las declaradas y que se les ha añadido de forma voluntaria o involuntaria. De igual forma se puede determinar si el estado de conservación es deficiente, debido a la presencia de hongos o bacterias. En el primer caso, 17 a las drogas se les denomina drogas falsificadas y en el segundo drogas alteradas (Tyler, et al., 1979; Kuklinski, 2000). Cuadro 4. Principales elementos celulares que deben ser estudiados para la caractertzaclón histológica de las drogas vegetales (Trease y Evans, 1988; Kuklinski. 2000). DROGAS ORGANIZADAS O ESTRUCTURAS CELULARES Elementos largos Fibras Traque idas Vasos leflosos Radios Tubos cribosos Conductos o cavidades secretoras Tubos laticlferos Elementos cortos Células del parénquima Células de súber Células pétreas o esclereidas Células epidérmicas Recubrimiento de cutícula Estomas Pelos o tricomas Glándulas de secreción DROGAS NO ORGANIZADAS O CONTENIDOS CELULARES Almidón Aceites y grasas lnulina Granos de aleurona Inclusiones salinas Carbonato cálcico (CaC03) Oxalato cálcico (CaC204) Silice (Si02) Taninos Gomas y mucflago Látex + DROGAS ORGANIZADAS O ESTRUCTURAS CELULARES Las brácteas, cáliz y en menor proporción, la corola, poseen estructura de hoja y dan lugar a elementos de epidermis con estomas, pelos glandulares o lectores, células del mesófilo, glándulas de esencia y cristales. La forma, tamaño y estructura de las células epidérmicas; forma, distribución y relación de los estomas respecto a las células epidérmicas; forma, distribución y abundancia de los pelos epidérmicos, son de importancia diagnóstica (Trease y Evans, 1988). + DROGAS NO ORGANIZADAS O CONTENIDOS CELULARES En las drogas pulverizadas debido a que las células se encuentran rotas, los contenidos celulares ergásticos son muy importantes para la 18 identificación. Los más importantes en farmacognosia son aquellos que pueden ser identificados en drogas vegetales mediante el examen microscópico o por pruebas físicas o químicas. Estos contenidos celulares son tanto productos de reserva como productos del metabolismo secundario y comprenden carbohidratos, protelnas, aceites fijos y grasas, alcaloides y purinas, glucósidos, aceites esenciales, gomas y mucílagos, resinas, taninos, oxalato cálcico, carbonato cálcico y sllice. En la droga pulverizada pueden distinguirse con frecuencia fragmentos delicadamente coloreados de la corola (Trease y Evans, 1988). Taninos Los taninos en el más amplio sentido de la palabra, son un grupo heterogéneo, derivados del fenol comúnmente relacionados con los glucósidos. Son sustancias amorfas, amarillas, rojas o pardas que se conservan muy claramente en las preparaciones. Se presentan como masas granulares más o menos finas, o como corpúsculos de diversos tamaños (Esau, 1985). Los taninos están ampliamente distribuidos en el reino vegetal. Son comunes en gimnospermas y angiospermas, entre las angiospermas son más frecuentes en las dicotiledóneas que en las monocotiledóneas. En lá planta se localizan en la corteza, madera, hojas, frutos y ralz (López, 1989; Scalbert, 1991). Pueden hallarse en las vacuolas de células aisladas o bien en formaciones especiales denominadas sacos tanlferos, en el protoplasto y también puede hallarse impregnando las paredes celulares secundarias, como sucede en el tejido suberoso. Dentro del protoplasto los taninos aparecen frecuentemente en las vacuolas, o también en el citoplasma en forma de pequet'las gotitas que eventualmente pueden fusionarse (Esau, 1985). Si se desea estudiar la distribución de los taninos en la planta, los cortes histológicos deben realizarse en seco, pues los taninos son solubles en agua y en alcohol (Trease y Evans. 1988). En cuanto a sus características químicas, los taninos se disuelven en agua formando disoluciones coloidales, pero su solubilidad varia según el grado de polimerización (disminuye conforme ésta aumenta). Son solubles en alcoholes y en acetona. Las disoluciones acuosas poseen una estabilidad variable según su estructura, generalmente moderada. Asl, durante la decocción, un tanino como la geranifna se descompone en 30 minutos en ácido gálico, ácido elágico y corilagina. Como todos los fenoles, los taninos reaccionan con cloruro férrico. Sus disoluciones acuosas precipitan con sales de metales pesados y con gelatinas (Bruneton, 1999). En los vegetales superiores se distinguen, generalmente, dos grupos diferentes de taninos, tanto por su estructura como por su origen biogenético: taninos hidrolizables y taninos condensados (Bruneton, 1999). 19 la clasificación de los taninos, sus caracterlsticas y los métodos de identificación se muestran en el cuadro 6. Cuadro 5. Clasificación, caracter!stlcas y métodos de identlflcaciOn para los taninos {Tyler, 1979; Bruneton, 1999). CARACTERISTICAS Son oligo- o poliésteres de un azúcar (o de un polio! relacionado) y de un número variable de moléculas de ácido fenol. El azúcar generalmente es la 13-D-glucosa. El ácido fenol es o bien ácido gálico en el caso de los taninos gálicos, o el ácido hexahidroxidifénico y sus derivados de oxidación, en el caso de Jos taninos clásicamente (aunque de manera impropia), denominados taninos elágicos. Los taninos condensados o proantocianidoles son poli meros flavánicos. Están constituidos por unidades de flavan-3-oles ligadas entre si por enlaces carbono-carbono generalmente 4~ 6 4--.5, resultante de un acoplamiento entre el C-4 electrofilico de un flavanilo que proviene de un flavan4'>1 o de un flavan-3,4-diol y una posición nucleófila de otra unidad. METODOS DE /DENT1FICACIÓN Los taninos gálicos y elágicos con sales férricas dan coloraciones azul- negro, producidas por el ión férrico. Los taninos gálicos dan coloración rosa con yoduro potásico (el ácido gálico libre se colorea de naranja con este reactivo). Los taninos elágicos se colorean con ácido nitroso en medio acético (primero rosa, después vira a púrpura y a azul). Azul de Prusia con cloruro férrico y ferricianuro de potasio da color azul. Con sales férricas, el ión férrico produce un color verde marrón verdoso. Los taninos condensados se colorean especlficamente en rojo con vainillina clorhldrica. Respecto a su función biológica, los taninos se consideran como sustancias que protegen al protoplasto contra la desecación, putrefacción y destrucción por animales; como sustancias de reserva relacionadas de manera no determinada con el almidón; como sustancias asociadas a la formación y transporte de azúcares; como antioxidantes; y como protector de la homogeneidad del citoplasma (Esau, 1985). Históricamente, la importancia de las drogas con taninos está ligada a sus propiedades curtientes, ya que tienen la capacidad de fomlar enlaces cruzados muy estables con macromoléculas como la celulosa, pectinas y protefnas ya que pueden precipitarlas. Cuando los taninos precipitan a las 20 proteínas en solución y se combinan con ellas, haciéndolas resistentes a las enzimas proteollticas, se establece una acción conocida como astringente y constituye la base para Ja acción terapéutica de /os mismos. Muchas de fas drogas vegetales que contienen taninos, se emplean en medicina como astringentes del tracto gastrointestinal y de las excoriaciones de la piel. En el tratamiento de /as quemaduras, fas proteínas de fas tejidos expuestos precipitan y forman una capa protectora antiséptica bajo fa cual tiene Jugar Ja regeneración de /os tejidos (Tyfer, 1979; López, 1989; Bruneton, 1999). Mucilago Las gomas, las pectinas y los mucilagos son macromolécuJas osídicas que al contacto con el agua forman disoluciones coloidales o geles. la tendencia actual es abandonar estos términos y utilizar el de hidrocoloides vegetales que es más general o incluso, más globalmente el que refiere a polisacáridos vegetales. Aunque el término polisacárido parece falto de especificidad, la dificultad que a veces existe para delimitar histológica y químicamente las nociones de gomas y mucilagos e incluso de pectinas obliga a dar preferencia, siempre que sea posible, a un criterio químico- estructural para clasificar estos polímeros (Bruneton, 1999). la clasificación se basa principalmente sobre aquellas secuencias de residuos de azúcar en los polisacáridos que forman las cadenas interiores y una variedad de residuos de iguales o distintos azúcares puede estar unida formando cadenas laterales (Aspinall, 1970). Se han establecido una serie de criterios para diferenciar gomas y mucilagos. Las gomas son moléculas complejas, siempre heterogéneas y ramificadas, que contienen ácidos urónicos. Fluyen al exterior del vegetal y en general se considera que resultan de un traumatismo. Solidifican por desecación, son insolubles en disolventes orgánicos, lo que las diferencia de las resinas (Bruneton, 1999). En cuanto a los mucilagos se considera que son constituyentes celulares normales, preexisten en formaciones histológicas especializadas (células o canales} frecuentes en el endospermo de las semillas. Son pollmeros heterogéneos con carácter neutro o ácido, lo que permite su clasificación. Están ampliamente distribuidos siendo comunes en las Malváceas (mucilagos ácidos} y en Fabales (mucilagos neutros del endospermo}. Son agentes de retención hídrica, que poseen un papel activo en la germinación (Bruneton, 1999; Kuklinski, 2000). Siguiendo la clasificación de Bruneton (1999), Jos mucllagos neutros están compuestos principalmente por una cadena lineal de D-manosa unidas en '3-(1-->4), son estrictamente insolubles en agua. Los polisacáridos más 21 frecuentes que contienen manosa son: Glucomananos. En estos pollmeros del 20 al 50% de las unidades de 0-manosa de la cadena se encuentran reemplazadas por 0- glucosas. Las uniones interosldicas siguen siendo 13-(1-.4); pueden tener varias manosas contiguas pero las glucosas permanecen aisladas. Son más abundantes en las Gimnospermas que en las Angiospermas, frecuentes en los órganos subterráneos de diversas monocotiledóneas. Galactomananos. En estas moléculas se sustituye el grupo hidroximetllico en C-5 de determinados residuos de 0-manosa de una cadena polimanosfdica por un resto 0-galactosllico unido en a. El porcentaje de sustituciones varia del 30 a cerca del 100%, según la especie vegetal. Se encuentra en diversas semillas {Annonaceae, Convolvulaceae, Palmae), constituyen un depósito extracelular en el endospermo de ras semillas de las Fabales en los que se pueden representar hasta un 40% de la masa. Galactoglucomananos. La cadena central es del tipo de los glucomananos y un número variable de unidades de manosa de estas moléculas se sustituyen en C-6 por un resto de o-0- galactosllico unido en a. Son componentes frecuentes de las hemicelulosas, se acumulan a veces en las semillas. Aspinall {1970) considera un subgrupo más para los mucilagos neutros: Arabinoxilanos. Son solubles en agua y comunes en el endospermo de las leguminosas. Están constituidos por cadenas lineales de 0- glucanos unidas en j3{1->3) y 13(1--l-4) y altamente ramificado por L- arabino-D-xylanos. Algunas veces se presentan residuos de a-L- arabinofuranosas unidas en {1->4) a las cadenas de 13-0-xilanos. Esta forma de mucilago es común en plantas superiores. Teniendo en cuenta las dificultades encontradas para clasificar químicamente la estructura de los mucilagos ácidos, y basándose en el origen botánico y analogías estructurales, Bruneton {1999) incluye dentro de los mucilagos ácidos a las drogas que concuerdan en clasificar asi la mayorla de los autores. En cambio, Aspinall {1970) incluye a los polisacáridos compuestos por cadenas de ácido-0-galacturónlco y residuos de L-ramnosa. Por su parte Kuklinski (2000) únicamente determina que se encuentran principalmente en tres familias de vegetales: Plantagináceas. Lináceas y Malváceas, aunque no son exclusivos de ellas y que los diferentes tipos de mucílagos ácidos presentan numerosas propiedades que determinan su uso terapéutico: 22 Emolientes y antiinflamatorios. Antitusigenos. Protectores de la mucosa del tracto digestivo. Mucilagos con propiedades hipoglucemiante e inmunoestimulantes de tipo inespecífico. Existen distintos mucllagos ácidos representativos de la familia Sterculiaceae, de los cuales la goma karaya o goma esterculia es el más . importante. Es el exudado viscoso natural del árbol Sterculia urens Roxb., que se cultiva principalmente en la India, y que se obtiene mediante incisiones o quemadura de la madera. Se trata de un heteropolisacárido ramificado acetilado que tiene un alto componente de residuos de L- ramnosa, O-galactosa, ácido D-galacturónico y ácido 0-glucorónico. La goma de buena calidad es incolora y translúcida, pero puede contener algunas impurezas pigmentadas. Es una de las gomas vegetales menos solubles que al contacto con el agua se hincha formando una suspensión de elevada viscosidad (Kirk-Othmer, 1980; Trease y Evans, 1988; Bruneton, 1999). Se usa como laxante mecánico. La goma pulverizada es un agente para formar emulsiones, suspensiones, pastillas, pastas y polvos para fijación de dentaduras. En soluciones para fijar el cabello y en lociones para la piel (Tyler et al., 1979; Trease y Evans, 1988; Bruneton, 1999). Diversas reacciones pueden asegurar su identidad (Trease y Evans, 1988; Bruneton, 1999): Por técnicas fitoqulmicas se permite su caracterización, por cromatografía en capa fina, de galactosa y de ramnosa en un hidrolizado sulfúrico de la goma. Histoqulmicamente, se tiñe de rojo con la solución de rojo de 1"4tenio. Otras especies de la familia Sterculiaceae productoras de goma son S. tomenrosa Guill. & Perr. y S. tragacantha, las cuales producen una goma denominada "goma M'Bep" o "goma de tragacanto" (Bruneton, 1999). 23 1----------------· ----· -·- -- --· --------~---- OBJETIVOS GENERAL: o Caracterizar histológicamente los sépalos de Chlrantodendron pentadactylon. ESPECIFICOS: o Describir y comparar la estructura histológica de sépalos herborizados y no herborizados de la flor de Ch. pentadactylon. o Analizar las reacciones histoqufmicas de los sépalos herborizados y no herborizados. o Determinar los azúcares presentes en las cavidades de los sépalos herborizados y no herborizados. 25 MÉTODO SITIO DE ESTUDIO Las recolectas se efectuaron en Carrizal de Bravo, Municipio de Leonardo Bravo que se localiza al oeste de Chifpancingo, fonnando parte de la región centro del estado de Guerrero. Carrizal de Bravo está ubicado en los paralelos 17°33'17" de latitud norte y 99°50'17" de longitud oeste y su altitud es de 2400 rnsnm. la región presenta un clima templado subhúmedo (C(w)) con temperatura media anual de 15ºC y una precipitación pluvial de 1 253 mm. La época de lluvias se presenta de junio a septiembre, siendo agosto el mes más lluvioso (INEGI, 1988). Carrizal de Bravo se encuentra en medio de un bosque mesófifo de montaña, que se caracteriza por presentar tanto árboles perennifolios como caducifolios, siendo un bosque denso con una altura hasta de 35 m. Incluye además, varios estratos arbóreos, el arbustivo y el herbáceo, pudiéndose encontrar trepadoras leñosas. Entre los géneros más frecuentes se mencionan a: Archibacharis, Celastrus, Smi/ax, Vitis, etc, las epffitas están bien representadas como líquenes, musgos y pteridofitas, se han registrado helechos arborescentes, asl como géneros de árboles como Magnolia, Saurauia, Synardisia, Weinmannia, etc. (Rzedowski, 1978). • COLECTA Se recolectaron flores en antesis, en el mes de marzo del 2001 para obtener ejemplares frescos (no herborizados). Las flores herborizadas (ya disponibles en el laboratorio) se colectaron en el mes de abril de 1999. TECNICAS HISTOLÓGICAS • FIJACIÓN Y DESHIDRATACIÓN Se obtuvieron pequeños fragmentos de las flores herborizadas y no herborizadas a estudiar. parte media y basal de los sépalos (Fig. 2), después de lo cual se fijaron en FAA (Formaldehldo-Acido acético-Alcohol etllico al 96% y agua, 1:0.5:5:3.5). 27 Flg. 2. Secciones en las que se dividió los sépalos (A=apical, M=media y B=basal). Algunas de las flores fueron conservadas en fresco, mediante refrigeración, para la aplicación de técnicas histoqu!micas. Las flores herborizadas antes de la fijación, se rehidrataron hirviéndolas en agua por un lapso de una hora, dejando enfriar por 24 horas y repitiendo la operación nuevamente (Diego, com. pers.). Después de 24 horas, el material fijado (flores herborizadas y no herborizadas) se lavó en agua corriente por 2 horas para luego deshidratarlo en una serie gradual de alcohol etllico (30%, 50%, 70%, 85%, 96%, 100% y 100%) permaneciendo 24 horas en cada solución. • INCLUSIÓN Y CORTES Para la inclusión en parafina (paraplast), después del alcohol absoluto se cambió a xilol puro durante 10 minutos y luego a xilol:paraplast (1:1) por 24 horas y por último en paraplast puro durante 2-3 semanas a 56°C. Dicha inclusión se realizó en moldes de papel, para la obtención de cortes mediante el uso de un micrótomo de rotación (American Optical) calibrado a 6-8 µm. Los cortes se realizaron utilizando navajas desechables de acero. También se efectuó la inclusión en LR-White, seguido del último cambio de alcohol, se pasó a otra serie graduada de LR-White y alcohol absoluto (1:3, 1:1y3:1) por 24 horas en cada uno a 4ºC. Ulteriormente, se efectuaron dos cambios de LR-White puro de 24 horas cada uno. La polimerización de la resina se llevó a cabo a 55°C en ausencia de 0 2 , dentro de cápsulas de gelatina. Los cortes se obtuvieron en un ultramicrótomo (MT2-B) con cuchillas de vidrio y calibrado a un grosor de 1 µm. 28 TESIS CON FALLA DE ORIGEN ,______ + TINCIÓN Los cortes se desparafinaron en la estufa a 56ºC por 1 hora, después se pasaron por tres cambios de xilol; uno de alcohol al 100% y otro al 96% por tres minutos cada uno. Los cortes se tifleron con una tinción doble de safranina-verde rápido en metilcelosolve (López, et al.. 1998) y con la tinción cuádruple de .Johansen ( .Johansen, 1940). Los cortes en resina se tit'ieron con azul de toluidina (López, et al. 1998). + HISTOQUIMICA Para el análisis histoquímico se aplicaron las siguientes pruebas en cortes desparafinados: Ácido Peryódico-Reactivo de Shift {APS): Tine polisacáridos Insolubles en magenta {.Johansen, 1940). APS I Azul negro de naftol: Tinción doble para evidenciar polisacáridos insolubles en magenta y proteínas en azul {Engleman, com. pers.). Azul negro de naftol: Tifle las protelnas en azul { López et al., 1998) Cloruro férrico: Se tiflen los taninos hidrolizables en color azul- verdoso {.Johansen, 1940). Floroglucina-ácido clorhídrico: Tiñe la lignina de color rojo violáceo {Curtís, 1986). Lugol: Tiñe las reservas de almidón de azul intenso a morado {López, et a/., 1998). Rojo de rutenio: Tiñe pectinas en tonalidad de rosa a rojo {O'Brien y Me Cully, 1981). Tiñe mucllago en rojo {Trease y Evans, 1988; Bruneton, 1999). Rojo "O" de aceite: Til'ie la cutícula y reservas lipídicas de rojo {López, et al., 1998). Vainillina-ácido clorhídrico: Tifle taninos condensados de color rosa a rojo (Johansen, 1940). Para los sépalos no herborizados las técnicas histoqulmicas de APS, rojo "O" de aceite, floroglucina y cloruro férrico, se realizaron en corte de material en fresco, obtenidos manualmente con navaja de rasurar. En el caso de los sépalos hernorizados no se realizó la prueba de APS. + MORFOMETR(A Se efectuaron medidas de la longitud y número de células de los tricomas y del grosor de la epidermis adaxial y abaxial de los sépalos, para esto se 29 dividió en distintas zonas la parte media del sépalo (Fig. 3). Las mediciones fueron realizadas en tres cortes distintos de sépalos de tres flores diferentes. El número de mediciones fue de: 360 para el grosor de la epidermis; 173 para la longitud de los tricomas; y 61 para el número de células. Las mediciones se realizaron utilizando el programa lmage Zeiss y fueron analizadas mediante análisis de varianza de una vla (Tukey) en el programa STATISTICS 98 para encontrar si habla diferencias significativas. ADC ADM2 ADMA ABC ABM ASMA 1 Flg. 3. Zonas en las que se dividió la parte media del sépalo en cortes transversales. Para la cara abaxial: abaxial centro (ABC), abaxlal media (ABM) y abaxial margen (ABMA). Para la cara adaxial: adaxial centro (ADC), adaxial media dos (ADM2), adaxial media uno (ADM1) y adaxial media margen (ADMA). + MICROSCOPIA ELECTRÓNICA DE BARRIDO (MEB) Se tomaron pequeños fragmentos de los sépalos de la flor no herborizada, tanto de la parte basal como de la parte media, que se encontraban fijados. Posteriormente se deshidrataron en etanoles graduales (30%, 50%, 70%, 85%, 96% , 100% y 100%), durante dos horas en cada uno. Las muestras se procesaron en una desecadora de punto critico con C02 marca Bal-Tec, y se colocaron en porta muestras metálicos para ser cubiertas con una fina capa de oro con una ionizadora CPD 030. Las observaciones se realizaron en el microscopio electrónico de barrido JEOL 5310 LV, donde se tomaron placas fotográficas del material y se capturaron fotomicrograffas. 30 DETERMINACIÓN DE LOS AZÚCARES CONTENIDOS EN LAS CAVIDADES DE LOS SÉPALOS + DETERMINACIÓN DE LOS SACARIDOS EN FLORES FRESCAS Se efectuó una cromatografla bidimensional del contenido de las cavidades de las flores en fresco, tanto para la parte basal como para la parte media. Con una navaja de rasurar se realizó un corte transversal en la base de los sépalos, y con ayuda de un tubo capilar se obtuvo una muestra de la sustancia viscosa que se aplicó directamente en la placa cromatográfica de gel de sflice (60 F254 , Merck), que se corrió con una mezcla de Propano!: Etanol: Agua (7: 1: 1 ). Posteriormente, se aplicaron soluciones en agua destilada (12mg/ml) de los nueve azúcares estándares (Merck) D(+)manosa, 0(-)arabinosa, ribosa, D(+)glucosa, sacarosa, 0(-) fructuosa, D(+)galactosa, xilosa y ramnosa, y se corrió en una mezcla de Acetonitrilo: Propano!: Acetato de etilo: Agua (85:20:20:15). + AISLAMIENTO Y DETERMINACIÓN DE LOS SACARIDOS DE LA SUSTANCIA VISCOSA DE LAS FLORES HERBORIZADAS Extracción de la sustancia viscosa Se molieron 84.65g de flores secas de Ch. pentadacty/on en molino mecánico hasta obtener un triturado muy fino para su posterior extracción selectiva por la técnica de Soxhlet: se produce un goteo que moja completamente el cartucho que contiene la harina de la flor, efectuándose entonces la extracción de la sustancia afín con el disolvente empleado; los solutos disueltos se van concentrando en el matraz de fondo redondo que contiene el disolvente, el cual se recicla a través del sistema. Se efectuó una primera extracción con hexano (500ml/3 veces/8h), para eliminar las grasas y compuestos polares, y una segunda extracción con etanol (500ml/4 veces/8h), con el objeto de separar otras substancias de mayor polaridad. Se dejó secar el material molido luego de ser sometido a ras extracciones anteriores. registrando un peso de 72.8 g. Se colocó en un cristalizador y se le agregó ácido acético en agua al 1 % en cantidad suficiente para que el material se suspendiera y se agitó durante 5h con un agitador mecánico. A continuación la mezcla se vació en embudos con papel filtro plegado, el filtrado se colectó en matraces Erlenmeyer de 500 mi, y permaneció asl hasta que el escurrimiento de la sustancia mucilaginosa fuera completo. Inmediatamente se le agregó etanol para provocar la precipitación del compuesto, el cual se filtró, se lavó con etanol y se colocó en un desecador 31 al vaclo para que se secara totalmente. La cantidad final del extracto fue de 167 mg. • Hidrólisis Al precipitado seco se le anadió H2S04 2N para su ulterior ebullición durante 18h. El jarabe que se obtuvo de la hidrólisis se neutralizó a pH 6 con BaC03 , luego se filtró y se concentró al vaclo mediante rotaevaporización. Posteriormente se congeló en nitrógeno liquido y se liofilizó. Identificación de los azúcares Con el producto de la hidrólisis previamente disuelto en agua se realizó una cromatografía bidimensional en placa fina con gel de sllice (60 F254, Merck). En la primera dimensión se corrió el producto, siendo el eluyente empleado Propano!: Etanol: Agua (7:1:1). La segunda dimensión se corrió con Acetonitrilo: Propano!: Acetato de etilo: Agua (85:20:20:15), con soluciones acuosas de azúcares estándares (Merck) disueltos en agua destilada (12mg/ml} como referencia. Los azúcares empleados fueron: D(+)manosa, 0(-) arabinosa, ribosa, D(+)glucosa, sacarosa, D(-)fructuosa, D(+)galactosa, xllosa y ramnosa. 32 RESULTADOS CARACTERIZACIÓN HISTOLÓGICA DE LOS SÉPALOS SÉPALOS NO HERBORIZADOS MORFOLOGÍA EXTERNA La flor de Ch. pentadactylon es gamosépala y sus cinco sépalos son carnosos. Su cara externa está revestida pcr abundantes tricomas, que a simple vista, dan el aspecto de una fina capa de polvo café-rojizo. En esta cara, la base de cada sépalo es convexa, y se aprecia una continuidad de una protuberancia en forma de costilla que llega hasta el ápice (Fig. 4). La parte libre del sépalo en el centro de su cara adaxial presenta una zona lisa, brillante y roja, sin embargo, hacia los márgenes del mismo se torna opaca. Asimismo, en la base se forma una concavidad de color verde que corresponde a una región secretora, que forma el nectario (Fig. 5). Al momento de efectuar la disección del sépalo, se observa que el tejido presenta oquedades de las que emerge una sustancia incolora, transparente y de consistencia viscosa (Fig. 6). Al microscopio electrónico de barrido (MEB), se confirmó que la cara abaxial de los sépalos está cubierta en su totalidad por abundantes tricomas estelados, por lo que no se puede ver la epidermis (Fig. 7). Por otro lado, en la cara adaxial de la base del sépalo que corresponde al tejido secretor, muestra numerosos tricomas glandulares pluricelulares y tricomas bicelulares de gran tamaño, por lo que no es posible observar la epidermis. Al recorrer este tejido hacia el ápice, poco antes de que el nectario termine, se nota la ausencia de los tricomas bicelulares, después, la superficie cambia por una epidermis lisa, sin tricomas y sin estomas (Fig. Sa y Sb). 33 Flor de manita fresca. Protuberancia (flecha). Cara adaxlal del sépalo. Nectario (N). TESIS CON FALLA DE ORIGEN 1 Sección de nectario. Sustancia mucilaginosa (flecha). 35 36 Tricomas estelados en la cara abaxial. MEB X200. Secciones del nectario. La ausencia de tricomas indica el término del tejido secretor. Izquierda: Zona basal del nectario. Tricomas pluricelulares glandulares (Tg) y trlcomas bicelulares (flecha). Derecha: Zona apical del nectario. Tricomas pluricelulares glandulares (Tg). Epidermis adaxial sin lricomas (Ead). MEB X150. MORFOLOGÍA INTERNA • PARTE APICAL Y MEDIA DE LOS SÉPALOS Debido a que no se encontraron diferencias hlstológicas e histoqulmicas en estas dos secciones de los sépalos, en lo siguiente se considera a toda la parte libre de los sépalos como una sola: parte media. En corte transversal, de manera general, se observó una epidermis abaxial con abundantes tricomas estelados, un parénquima estructural que contiene numerosas cavidades y una epidermis adaxial más gruesa que la abaxial y sin tricomas (Fig. 9). La epidermis abaxial es uniestratificada, cuyo grosor es muy homogéneo (Tabla 1). Las células que la forman son de cúbicas a irregulares y, comúnmente, presentan una base más delgada (cara interna) que el ápice (cara externa), lo que produce que la epidermis presente ondulaciones a todo lo largo de la misma (Fig. 10). Con la tinción de safranina-verde rápido, se observa que el citoplasma de dichas células es hialino y un núcleo teñido en rosa intenso (Fig. 10 y 12). Los tricornas estelados están formados por grupos de células alargadas no unidas en la base, que se encuentran distribuidos en la epidermis (Fig. 11 ). En dichas células es frecuente observar los núcleos. y en el citoplasma se aprecian grandes vacuolas que se tiñen rosa intenso con safranina-verde rápido. Hacia los márgenes del sépalo, es común encontrar, algunos tricomas sobre elevaciones de la epidermis debidas a grupos de 3 a 5 células del parénquima (Fig. 12). En el margen de los sépalos, los tricomas esterados están formados por células de menor tamaño y menor número de ellas (Fig. 13) (Tabla 2 y 3). En esta zona, las células epidérmicas son en su rnayorla irregulares y la epidermis no está muy bien definida (Fig. 13). El parénquima está formado por células esféricas e irregulares en su rnayorla, cuyas paredes celulares van de rectas a sinuosas (Fig. 14). El tamaño de las mismas aumenta al alejarse de la epidermis, pero vuelve a disminuir alrededor de los haces vasculares y de las cavidades, donde generalmente son alargadas. Con la tinción de safranina-verde rápido se observa que la pared de las células parenquimatosas se til'ie verde al igual que su citoplasma hialino (Fig. 15), mientras que en los márgenes en algunas células, su contenido se tiñe de rosa (Fig. 16). En el interior de las células parenquimatosas, principalmente en las que se encuentran en el estrato subsiguiente de la epidermis, y asl como las que rodean a los haces vasculares, es frecuente encontrar drusas solitarias de diversos tarnanos, pero tan grandes en algunas ocasiones que ocupan casi todo el citoplasma de las células (Fig. 17). Con luz polarizada se aprecia la 37 considerable cantidad de ellas (Fig. 18). En los cortes transversales de sépalos, se observan elementos traqueales helicoidales (Fig. 19). Los haces vasculares están rodeados de células parenquimatosas esféricas y pequenas, algunas de las cuales contienen un material que se tine de rojo brillante con safranina- verde rápido. Por la distribución del floema con respecto al xilema, son de tipo colateral, y se encuentran en grupos formando un semicírculo, con la parte abierta dispuesta hacia la cara adaxial (Fig. 20). La posición de la vena media corresponde al centro de la costilla del sépalo, y un poco más hacia los extremos se observan dos venas de tamano mediano, siguiendo la misma dirección y hasta llegar a los márgenes de los sépalos, se pueden contar hasta seis venas medianas y en ocasiones, otras tantas muy pequetias, formadas por un solo par de haces vasculares, sin embargo, la disposición del floema y el xilema se mantienen. Se observó que las cavidades que se encuentran en el parénquima son, en general, grandes y numerosas. Las cavidades son lisógenas ya que están delimitadas únicamente por la pared de las células parenquimatosas inmediatas que las rodean. En ocasiones se encuentran varias cavidades juntas, tan solo separadas por una pared celulósica (Fig. 21). En cortes observados en MB se determinó que las cavidades forman canales, que en corte transversal se observan de forma circular u ovalada y la profundidad (Fig. 22a), mientras que el tamar'lo y la trayectoria de los mismos se aprecia mejor en corte longitudinal (Fig. 22b). El aspecto del contenido de las cavidades se observa de manera distinta dependiendo de la técnica que se emplea para su inclusión, así como la técnica de tinción. En cortes en paraplast, el contenido de las cavidades tiene un aspecto reticular y que se aprecia muy poco en tono verde con la tinción de safranina-verde rápido (Fig. 21) y que evidencia mejor de púrpura con la tinción cuádruple de Jonhansen (Fig 23a), en tanto que en cortes del material incluido en LR- White el contenido se encuentra formando estratos, los cuales pueden ser concéntricos o en filas (Fig. 23b). En la cara adaxial de los sépalos, la epidermis es uniestratificada y ligeramente ondulada. En corte transversal de sépalo se observa que la forma de las células epidérmicas y el grosor de las mismas cambia a lo largo de la cara adaxial, y disminuyendo de manera gradual del centro de los sépalos hacia el margen. Además su grosor es mayor que el de la cara abaxial (Tabla 1) (Fig. 24a y 24b). En el centro de los sépalos, la epidermis está formada por células rectangulares con su eje mayor en sentido anticlinal, y algunas otras son esféricas o irregulares (Fig. 24a) en cambio la forma rectangular periclinal es mas frecuente en los márgenes (Fig. 24b). En cortes más finos se puede observar las células irregulares de la epidermis (Fig. 25). 38 De la zona ADM1 hacia el margen, la epidermis comienza a presentar tricomas estelados, pero son escasos, de menor tamaño y de menor número de células que los localizados en la cara abaxial (Tabla 2 y 3)(Fig. 26a y 26b). • PARTE BASAL DE LOS SÉPALOS la cara abaxial mantiene las mismas características de la parte media de los sépalos, estando compuesta por una epidermis uniestratificada que sostiene abundantes tricomas estelados (Fig. 27a y 27b). En la base adaxial de los sépalos se encuentra el tejido secretor. En cortes longitudinales se observa el inicio, del ápice hacia la base del sépalo, ya que la epidermis, que al principio carecía de tricomas, muestra una depresión acompañada por la presencia de tricomas glandulares (Fig. 27a), y más hacia la base del sépalo, se observan también, numerosos tricomas bicelulares y de gran tamaño, por lo que solo pueden ser observados completos en MEB (Fig. 27b y 28). Los tricomas glandulares están unidos a la epidermis por un pie constituido por una o dos células y un cuerpo pluricelular (Fig. 29). El promedio del largo de los tricomas es de 86.618 ± 7.047 µm. Con la tinción de safranina- verde rápido, se tiñen de rosa intenso las células basales de los tricomas glandulares y los núcleos de las células que forman el cuerpo de los tricomas, que contrastan con el citoplasma verde (Fig. 30). Es frecuente encontrar que las células más exteriores que forman el cuerpo del tricoma, se desprenden o se colapsan (Fig. 30 y 31). La epidermis continúa siendo uniestratificada con células de tamaño y forma similares a la de la parte media (Fig. 30), sin embargo, el parénquima que se encuentra debajo de ella es característico al de un tejido nectarlfero, el cual está compuesto por células mucho más pequeñas. de formas poliédricas, esféricas e irregulares. Los primeros dos o tres estratos de las células parenquimatosas están bien delimitados de manera paralela a la epidermis, sin embargo, los estratos siguientes no cumplen con esta continuidad y se desarreglan. En sentido perpendicular a la epidermis se pueden contar, aproximadamente, doce estratos de células, antes de encontrar las cavidades (Fig. 32). Con la tinción cuádruple de Jonhansen se puede observar un cordón de células que se tiñen de rojo intenso, las cuales probablemente sean canales laticíferos (Fig. 32). En el interior de las células del parénquima es frecuente observar grandes núcleos (Fig. 30) y un citoplasma granular, el cual es más denso y constante en las células que se encuentran hacia la base de los sépalos (Fig. 33a y 33b). 39 Corte transversal de sépalo. Epidermis abaxial (Eab) con tricomas (flechas). Parénquima estructural (P) con cavidades (C). Epidermis adaxial sin tricomas. X1 O. L'll':::'.l~~~----""'~~.-L-.-=_1..~ .... !""'.:~ .... ~ Epidermis abaxial uniestratificada y sinuosa. Presenta abundantes tricomas estelados. X40. Las células que conforman al tricoma no están unidas en la base. MEB X750. Tricoma estelado sobre elevación de la epidermis abaxial. Vacuola (V}. Núcleo (N) X100. 41 42 Tricomas estelados en el margen del sépalo. La epidermis no está bien definida. X40. Las células parénquimatosas son Irregulares y algunas esféricas. Las paredes van de rectas a sinuosas. X1 OO. Células del parénquima. Pequeñas (cp) bajo la epidermis y rodeando a los haces vasculares (Hv). Alargadas (ca) rodeando las cavidades (C). El citoplasma es hialino. X20. ,--------·----------------- Corte transversal del margen de sépalo. Las células parenquimatosas almacenan un contenido que se tiñe de rojo (flechas). X10. Drusas cercanas a Ja epidermis abaxiaJ (flecha). Azul negro de naftol. X40. Distribución de las drusas en el sépalo (flechas). Luz polarizada X10. Elemento traqueal helicoidal (flecha) . X40. TESIS CON .FALLA DE ORIGEN Haz vascular central. Algunas céJulas que rodean a los haces almacenan un contenido que se tiñe en rojo (flecha). X50. 43 44 Las cavidades fomian canales. Izquierda: Corte transversal que muestra la profundidad de las cavidades. MEB X350. Derecha: Corte longitudinal en la que se observa el tamaño y la trayectoria de los canales. MEB X50. El grosor de Ja epidermis adaxial disminuye del centro del sépalo hacia los márgenes. Izquierda: Sección central del sépalo. Las células son rectangulares anticlinales (flecha) o esféricas. X40. Derecha: Sección marginal del sépalo. Las células son rectangulares perlclinales (flecha) o esféricas. X40. -·-~-------------¡-- Células irregulares en la epidermis adaxial (flecha). X60. Trlcomas estelados en la epidermis adaxial del margen de los sépalos. Derecha: los tricomas son escasos que dejan ver la epidermis adaxial (Ead). MEB X500. Izquierda: Las células que conforman a los trlcomas son pocas y en cortes transversales aparecen solitarias (flecha). X100. 45 46 Cortes longitudinales de la base del sépalo. La epidermis abaxial (Eab) sigue presentando los tricomas estelados (Te). Izquierda: La epidermis adaxial sin tricomas, posterior a una elevación, presenta tricomas glandulares pluricelulares (Tg). El parénquima estructural (P) cambia por un parénquima de secreción (Ps) formado por células que almacenan gránulos que se tiñen de rojo (g) con la técnica cuádruple de Jonhansen. X10. Derecha: En una reglón más basal y por MEB se puede observar a los tricomas glandulares (Tg) acompañados de tricomas biceluiares (Tb). X75. Tricomas glandulares y bicelulares. Los tricomas bicelulares son grandes y numerosos. MEB X200. Tricomas glandulares. La base (B) está formada por dos células y el cuerpo (Cu) es pluricelular. la flecha negra señala un resto de trlcoma bicelular. X60.5. Epidermis adaxial (Ead) uniestratlficada. Los tricomas gránulos que se tiñen de rojo brillante (g). Los trlcomas en el ápice presentan células nucleadas con citoplasma hialino (en). Las células externas del cuerpo del tricoma se desprenden o se crenan (d). Núcleos de células parenquimatosas (N). Safranlna- verde rápido. X1 OO. Trlcomas glandulares y bicelulares. Las células eX1emas del cuerpo del tricoma se desprenden o se crenan (flecha). MEB. X500. 47 48 Parénquima del nectario. Presenta células pequenas y que contienen gránulos (flecha) afines a la safranina. Los dos primeros estratos del parénquima son paralelos a la epidermis (ep), los demás se desarreglan. Cavidad (C). Cordón de células (ce). Cuádruple de Jonhansen. X40. ~--------------·------ 1 ·!'~ \!~.): !~ ''.~~~~ ~-·& ~"·n.·~,'C~·· m~~ u.;;·\ .. _.,,_;.~~··- ..... cortes longitudinales de nectario. Izquierda: Al inicio del nectario (zona apical), el parénquima secretor (Ps) presenta pocas células que contienen gránulos rojos (g). Cuádruple de Jonhansen. X20. Derecha: Zona basal del nectario. El contenido granular es más denso y frecuente (g). Las células parenquimatosas tienen núcleos prominentes (N). Fragmentos de tricomas bicelulares (f). Safranina-verde rápido. X25. + PRUEBAS HISTOOUIMICAS APS La Unción con APS para polisacáridos insolubles, tiñe las paredes y el contenido de Jos tricomas esterados en color magenta, además de las paredes de las células parenquimatosas (Fig. 34). El contenido de las cavidades se til'ie de magenta intenso (Fig. 35). Asimismo, en cortes de sépalos frescos se observa que en las cavidades de los sépalos hay gran cantidad de azúcares reductores, Jos cuales forman estratos concéntricos en el interior de ellas (Fig. 36). APS / Azul negro de naftol Se tiñen las paredes de fas células parenquimatosas de magenta con tonalidades moradas y fas cavidades contrastan en el tejido ya que se til'ien de magenta, lo que indica que el material que contienen es un tipo de azúcar (Fig. 37a y 37b). En el tejido secretor, las cavidades más cercanas a los tricomas glandulares, se tit'len de magenta muy intenso (Fig. 37b). En un acercamiento se observa que los tricomas bicefulares se tiñen de magenta, mientras que el citoplasma de algunas células del parénquima se til'ien de púrpura (Fig. 38). Azul negro de naftol En el tejido nectarlfero hay reacción positiva para protefnas en el ápice de los tricomas, asf como de manera particular, se tiñe el segundo estrato celular subsiguiente a la epidermis, resaltando también los núcleos celulares (Fig. 39). Del mismo modo, se evidencian las paredes de las células que componen al xilema de los haces vasculares (Fig. 40). Cloruro férrico La tinción para detectar taninos hidrolizables fue negativa. Floroqfucina-ácido clorhfdrico En la parte media de los sépalos con esta prueba se tiñó la cara exterior de Ja epidermis adaxial (Fig. 41a), indicando Ja presencia de compuestos lignificados. Además se obtuvo una reacción positiva en los elementos traqueales helicoidales (Fig. 41b). Luqol La tinción para detectar almidón fue negativa. Rojo de rutenio La tinción presentó reacción positiva en el contenido de las cavidades, dando un aspecto reticular o concéntrico (Fig. 42). En el tejido secretor el citoplasma de las células del parénquima y de los tricomas también 49 presentaron una reacción positiva al colorante en distintas tonalidades de rosa a rojo, que demuestra la presencia de pectinas o compuestos mucilaginosos (Fig. 43). Rojo ·o· de aceite Ambas epidermis de los sépalos están recubiertas por una cutrcula que se tir'ló de rojo con esta prueba, siendo ligeramente mayor la reacción en la cara abaxial, pero sin recubrir a los tricomas (Fig. 44a y 44b). Sin embargo, la cutícula de la cara adaxial se engruesa en el nectario y cubre también a los tricomas glandulares, aunque ésta es delgada (Fig. 45a y 45b). No se observaron rupturas en la cutícula. Vainillina-ácido clorhídrico En el nectario se observa, en color rojo, los taninos condensados de algunas células del tejido nectarlfero (Fig. 46a). La base de los tricomas glandulares dan reacción positiva a esta técnica. (Fig. 46b). Asimismo, los tricomas estelados contienen taninos condensados en su interior. so Las paredes (pa) de las células del parénquima y las vacuolas (V) de los tricomas estelados se tiñen con APS. xao. Parte media del sépalo. El contenido de las cavidades (C) se tiñe de magenta intenso y tiene aspecto reticular. APS X1 O. Corte en fresco. El contenido de las cavidades forma círculos concéntricos (flecha). APS. X100. 51 52 Cortes transversales de sépalo. APS-azul negro de naftol. Las paredes de las células del parénquima (P) se tillen en morado. El contenido de las cavidades (C) se tille de magenta. Izquierda: Parte media. X10. Derecha: Parte basal. Las cavidades orientadas hacia la luz del nectario se tillen de magenta intenso (flehas). X10. ~----------------------- Nectario. El citoplasma de las células del ápice de los tricomas glandulares (Tg) y del estrato subepidénnico se tiñen de azul (Sep), así como los núcleos (N). Azul negro de nafta!. X100. Las paredes del xilema (flecha) dan reacción positiva al azul negro de naftol. X50. Cortes en fresco de sépalo. Floroglucina-ácfdo clorhfdrico. Izquierda: La cara exterior de la epidermis adaxial presentó reacción positiva (flecha). X100. Derecha: Elementos traqueales helicoidales. X40. El contenido de las cavidades se arregla en estratos concéntricos (ec) y de manera reticular (r). Rojo de rutenio. X60. Nectario. El citoplasma (flechas) de las células del parénquima y de los tricomas glandulares se Uñen con rojo de rutenio. X60. 53 54 ---Cuticula (flechas) en cortes en fresco. Rojo ·o· de aceite. Izquierda: La epidermis abaxial presenta una cuticula que no recubre a los tricomas. X100. Derecha: Cutlcula en la epidermis adaxlal. X100. Cutlcula en el nectario. Rojo ·o· de aceite. Izquierda: La cutlcula se engruesa en el nectario (flecha). X65. Derecha: La cutlcula que envuelve a los tricomas glandulares es delgada (flecha). X100. L_~~~~~~~-'..._.,,,¡-:....,"-=~~~~-"'-_::==:__J Cortes transversales de nectario. Vainillina-ácido clorhídrico. Izquierda: Se evidenciaron taninos condensados (flechas) en el citoplasma del parénquima (Ps). X20. Derecha: Taninos en la base de los tricornes glandulares (flecha). X80. TESIS CON FALLA DE OHIGEI~ • MORFOMETRIA Grosor de la epidermis Se encontraron diferencias significativas (Fc6,353¡= 188.1111; p<0.001) respecto al grosor de la epidermis, mediante análisis de varianza de una vla, en las siete zonas que se midieron (ABC, ABM, ASMA, ADMA, ADM1, ADM2 y ADC). Se encontró que el grosor de la epidermis para la cara abaxial es homogéneo para las tres zonas en que se dividió (ABC, ABM, ASMA) y el promedio del mismo es de 16.691 ± 2.926 µm. Por otro lado, para la cara adaxial sólo es uniforme para las zonas ADC y ADM2, cuyo promedio es de 32.252 ± 3.408 µm, y luego disminuye en la zona ADM1a27.67±4.677 µm y en la zona ADMA es de 21.923 ± 3.67 µm (Tabla 1). Tabla 1. Prueba de Tukey para el grosor de la epidermis. Alpha=0.05. PROMEDIO Desviación ZONA N Cuml estándar (uml SIMILITUD ABMA 75 15.39 2.4 X ABC 26 16.38 3.0 X ABM 53 17.50 2.9 X ADMA 75 21.92 3.7 X ADM1 67 27.67 4.7 X ADM2 53 31.81 2.2 X ADC 59 32.64 4.2 X 1 Total 360 24.67 7.3 • Longitud y número de células de los tricomas De la misma forma, se establecieron diferencias significativas en la longitud de ras células que forman a los tricomas estelados (Fc4,168¡= 5.7482; p= 0.000232). La longitud de los tricomas en la cara abaxial aumenta de la zona ABC a la ABM, para volver a disminuir en la ABMA. En la cara adaxial, el tamaño de los tricomas es homogéneo. La longitud en el margen de los sépalos (zonas ADMA y ABMA) es similar en ambas caras. (Tabla 2). En el sépalo los tricomas más largos están en la parte media de la cara abaxial (zona ABM). 55 Tabla 2. Prueba de Tukey para la longitud de los tricomas estelados. Alpha=0.05. ZONA N PROMEDIO Desviación SIMILITUD m están da m ADMA 18 55.14 16.1 X ABMA 29 57.42 13.0 X ABC 58 65.64 16.1 X X ADM1 22 68.16 23.6 X X ABM 46 74.99 22.8 X Total 173 65.98 19.7 Con respecto al número de células en los tricomas estelados (F<4 .se1= 23.0675; P<0.0000001 ), se determinó que es similar para la cara adaxial (zonas ADM1 y ADMA), mientras que en la cara abaxlal, el nllmero de células aumenta del centro hacia la parte media de los sépalos, para volver a disminuir en el margen (Tabla 3). Tabla 3. Prueba de Tukey para el número de células que componen a los trlcomas estelados. Alpha=0.05. ZONA N PROMEDIO Desviación SIMILITUD (µm) estándar (µm) ADMA 11 1.63 1.2 X ADM1 10 2.50 0.9 X X ABMA 10 4.60 0.9 X X ABC 18 6.22 2.4 X X ABM 12 7.83 2.2 X )Total 61 4.83 2.8 56 SÉPALOS HERBORIZADOS MORFOLOGIA EXTERNA La morfologfa externa de la flor cambia notablemente con respecto a los sépalos no herborizados. El tamal'lo de los sépalos se reduce y cambian de carnosos a coriáceos y la superficie es rugosa debida a la pérdida de agua. El conjunto de tricomas estelados le dan a la cara exterior un color ferruginoso y en la cara interior se observa que carece de brillo (Fig. 48). Durante la disección no se observó la presencia de una sustancia de aspecto viscoso. MORFOLOGIA INTERNA • PARTE MEDIA DE LOS SEPALOS En general, los tejidos se encuentran modificados y destruidos, especialmente hacia los márgenes de los sépalos. Sin embargo, las cavidades se ven conservadas (Fig. 49). Por lo anterior, muchas de las estructuras celulares no pueden observarse, por ejemplo, núcleos, vacuolas, forma de las paredes, etc. No es posible obtener características detalladas de la epidermis abaxial, ya que las células de la misma están comprimidas y desarregladas. En observaciones generales, los tricomas estelados conservan el tamaño de células que los forman pero están frecuentemente rotos (Fig. 50a). Debido a que la superficie del tejido se contrae por la desecación, la epidermis da el aspecto de contener mayor cantidad de tricomas. Las elevaciones de la epidermis son más pronunciadas (foto 50b). El parénquima estructural se encuentra muy reducido. Las células del parénquima se ven muy irregulares, desarregladas y comprimidas. En los puntos que rodean a las cavidades se observa solo la pared de las células parenquimatosas y no as! su citoplasma (Fig. 51 ). Las cavidades mantienen su forma, es decir, no se observan comprimidas y ocupan una gran parte del parénquima (Fig. 51 ). Con la tinción cuádruple de Jonhansen se observa que el aspecto interno de las cavidades en forma de red se mantiene (Fig. 52). El tejido localizado entre los haces vasculares se compacta y se observan las bandas de xilema unidas (Fig. 53). Los elementos traqueales helicoidales se mantienen sin cambios (Fig. 54). 57 La epidermis abaxial constantemente se fragmenta, por lo que no es posible observar la continuidad de la misma. La forma de las células se mantiene constante y con la tinción de safranina-verde rápido se unen ambos lados de la epidermis en color rojo (Fig. 54). • PARTE BASAL DE LOS SÉPALOS El tejido nectarífero presenta diferencias con respecto al nectario no herborizado. El parénquima que se encuentra bajo los tricomas glandulares no tienen un citoplasma granular (Fig. 55 y 56). En cortes longitudinales se observa que el contenido de los canales es más denso que en la parte media del sépalo (Fig. 55). La epidermis adaxial presenta tricomas glandulares pluricelulares que se observan desarreglados. El citoplasma de las células que componen a los tricomas glandulares se tine de rojo brillante con la tinción de safranina- verde rápido (Fig. 56). En esta sección del sépalo, en la cara abaxial, se observa que el tejido parenquimatoso, almacena un contenido que se evidencia de rojo brillante con la tinción de safranina-verde rápido (Fig. 57). 58 Flor herborizada. La cara Interna de los sépalos carece de brillo. Corte transversal del margen del sépalo herborizado. Los tejidos están muy dañados. Las estructuras mejor conservadas son las cavidades (C).X10. 59 60 Tricomas estelados en la epidermis abaxial. Izquierda: Los tricomas mantienen su tamaila. X40. Derecha: La epidennls está reducida, la que da el aspecto de sostener más tricomas. Las elevaciones de la epidermis son frecuentes (flechas). X30. Corte transversal del sépalo herborizado. El parénquima estructural (P) está muy reducido. Las estructuras mejor conservadas son las cavidades (C). X10. El aspecto reticular (Hechas) del interior de las cavidades se mantiene. Cuádruple de Jonhansen. X20. Haz vascular central. Las bandas de xilema se encuentran unidas (flecha). X15. Epidermis adaxlal. Ambas caras de la epidermis se tiilen en rojo (flechas), al igual que los elementos traqueales (Et). X40. 61 62 Corte longitudinal de nectario. El parénquima (Ps) del tejido nectarífero no muestra contenido granular. El contenida de las cavidades se ve más intenso. X25. La epidermis adaxial está desarreglada (Ead). Los tricomas glandulares almacenan una sustancia que los tiile completamente de rojo (Tg). Parénquima secretor (P). Cavidades (C). X40. Parte basal del sépalo. La epidermis abaxial está desarreglada (Hecha negra). El parénquima presenta células que almacenan una sustancia que se tille de rojo (Hechas azules). X40. • PRUEBAS HISTOQUfMICAS Las pruebas histoqulmicas de APS, APS-Azul negro de naftol y azul negro de naftol presentaron la misma reacción positiva que para los sépalos no herborizados. De igual forma, las técnicas de cloruro férrico y lugol fueron negativas. Por fo anterior solo se muestran los resultados donde se encontraron diferencias de tinción. Floroglucina-ácido clorhídrico En la parte media de los sépalos con esta prueba se indica la presencia de compuestos lignificados al tei'iirse en rojo principalmente en las paredes periclinales de fas células de la epidermis adaxial (Fig. 58). Rojo de rutenio El contenido de las cavidades presenta reacción positiva con esta tinción. El aspecto interno es de red. No se observaron depósitos en circules concéntricos (Fig. 59). Rojo "O" de aceite Ambas epidermis están totalmente cubiertas por una cutlcula, que se evidenció de rojo al aplicar esta prueba, sobre todo la zona del nectario. Las reacciones fueron más marcadas que para los sépalos frescos (Fig. 60). Vainillina-ácido clorhídrico En el nectario se observa, en color rojo, que el ápice de los tricomas glandulares contienen taninos condensados (Fig. 61 a). En la cara abaxial del nectario, se evidencia que el contenido de las células parénquimatosas también se tii'ien de rojo (Fig. 62b). 63 Las células epidérmicas presentan paredes muy lignificadas (flecha). sobre todo en Ja cara interna y externa. Floroglucina-acido clorhídrico. X1 OO. El contenido de las cavidades forma redes (flecha). Rojo de rulenlo. X40. 'TESIS CON FALLA DE ORIGEN 65 66 Cortes transversales de nectario. Vainillina-ácido clorhídrico. Izquierda: Los tricomas contienen taninos condensados (flecha). No hay reacción positiva en el parénquima. X100. Derecha: Cara abaxial del nectario. El parénquima contiene taninos condensados (flecha). X40. IDENTIFICACIÓN DE LOS SAcARIDOS DE LAS CAVIDADES DE LOS SÉPALOS FLOR FRESCA PARTE MEDIA DE LOS SÉPALOS La cromatografla bidimensional muestra una mancha que corresponde con la fructosa, y otra muy tenue que se corresponde con la glucosa (Fig. 62) . • •• • • • • 1 1 1 1 1 f2D Sv1 Sv2 A Ga S F GI 10 Flg. 62. Cromatografía bidimensional de la sustancia viscosa de la parte media de los sépalos. Las manchas encontradas corresponden a la fructosa (Sv1) y a la glucosa (Sv2). A= arabinosa, F= fructosa, Ga= galactosa, GI= glucosa, S= sacarosa. 67 PARTE BASAL DE LOS SÉPALOS Después de un perfil cromatográfico preliminar para descartar algunos azúcares estándares (ribosa y D(+)manosa), se realizó una placa cromatográfica bidimesional empleando únicamente los azúcares estándares más parecidos a la sustancia viscosa de los sépalos: D(-) arabinosa, D(+)glucosa, D(-)fructuosa, sacarosa y D(+)galactosa. En la cromatografla bidimensional la sustancia viscosa presentó dos manchas, que se encuentran rango de los sacáridos. Dichas manchas revelan, que la sustancia viscosa está compuesta de un monosacárido, la fructuosa y de un disacárido, la sacarosa (Fig 63) . • •• Sv1 Sv2 Flg. 63. CromatografJa bidimensional de Ja sustancia viscosa de Ja parte basal de Jos sépalos. 68 La mancha menos polar (Sv1 ), corresponde a la fructosa (F) y Ja más polar (Sv2), a Ja sacarosa (S). A= arabinosa, Ga= galactosa, GJ= glucosa. FLOR SECA En la extracción de las flores secas, no se observó la presencia de un precipitado abundante de consistencia viscosa (167mg, 0.23%). En el perfil cromatográfico del hidrolizado se presentan dos manchas, que se corresponden con los monómeros de fructuosa y glucosa . • • • • • • • • • • • Sv1 Sv2 MARGIS FGa Ra X .f20 -•n Flg. 64. Cromatografla bidimensional del hidrollzado obtenido de las flores secas. Sv1 corresponde a la fructosa (F) y Sv2 a la glucosa (GI). A= arabinosa. Ga= galactosa, M= manosa, Ra= ramnosa, R= ribosa, S= sacarosa, X= xilosa 69 1~---...,,-----------------··-----··---·--·--· DISCUSIÓN H/STOLOGfA DE LOS SÉPALOS SÉPALOS De las caracterlsticas anatómicas distintivas para la familia Sterculiaceae (Cronquist, 1982}, en Ch. pentadactyton se observaron las células taninlferas, los tricomas esterados, los canales lisógenos, ros cristales solitarios de oxalato de calcio y los tricomas glandulares en los nectarios, todas ellas de valor farmacognósico. La descripción de los tricomas es de importancia taxonómica para la familia (Hussin y Sani, 1998). De los tricomas descritos como característicos en las esterculiáceas, en los sépalos de la "flor de manita" se observaron los estelados y los glandulares pluricelulares, en cambio, los tricomas peltados no se observaron. Además, se encontraron tricomas bicelulares que no hablan sido reportados en la familia. + EPIDERMIS Los sépalos de esta especie están delimitados por una epidermis uniestratificada y cubiertos por una cutícula. En los márgenes de los sépalos la epidermis está desarreglada. En los sépalos no herborizados, la epidermis adaxial es más gruesa que la abaxial y únicamente en los márgenes contiene tricomas estelados. Sin embargo, dichos tricomas son más grandes, numerosos y están formados por más células que los de la cara adaxial. En cortes de sépalos herborizados la longitud de los tricomas estelados, en las células que se mantienen completas, no presenta diferencias notables bajo el microscopio de luz. Sin embargo, el número de células que los forman no pueden ser medidos por lo desarreglado del tejido. Por otro lado, las paredes de las células de la epidermis adaxial están muy lignificadas. De las pruebas histoqufmicas que se aplicaron, para los sépalos herborizados y no herborizados, solo la tinción sencilla y la doble con APS reaccionaron de manera positiva en el interior de los tricomas esterados, demostrando que la vacuola contiene polisacáridos insolubles y taninos. La morfometrfa de los tricomas estelados indica que en el centro de los sépalos las células son de mayor longitud y más numerosas, y disminuyen 71 en tamaño y número de células de manera gradual hacia los márgenes. Los tricomas en la cara adaxial están formados por número y longitud de células homogéneo. Sin embargo, el número de células que forman los tricomas estelados no es el real, ya que en MEB se puede notar que el número de estas células es mayor al que se puede contar en cortes en paraplast, debido a que el corte rompe a los tricomas, lo que provoca pérdidas en el número de células que componen a cada uno de ellos. No obstante, es un buen indicativo de las caracterlsticas de los tricomas esterados. Los estudios que se han realizado para describir a los tricomas en la familia han sido, principalmente, en hojas y ralees y para fines taxonómicos. En un estudio realizado por Hussin y Sani (1998), en donde comparan la estructura anatómica de las hojas de doce especies distintas de la familia, pero todos pertenecientes al género Sterculia, ninguno de los tricomas estelados tenla las caracterlsticas de los encontrados en Ch. pentadactylon. • PARÉNQUIMA La forma y el tamaño de las células del parénquima estructural observados en los sépalos de Ch. pentadactylon no herborizados, no presenta caracterlsticas distintivas que permitan su identificación, aún con la aplicación de las técnicas histoqulmicas no se revela un contenido especifico para este tejido. En los sépalos herborizados el parénquima está muy reducido y sólo se encontraron cambios en el parénquima cercano a la epidermis abaxial en la parte basal de los sépalos, donde las células parenquimatosas contienen taninos condensados evidenciados con la prueba de vainillina-ácido clorhldrico. Algunas células parenquimatosas contienen drusas solitarias, y no en grupos, que pueden observarse en detalle con luz polarizada que permite resaltar los cristales. Estos cristales son de oxalato cálcico. No se encontró otro tipo de inclusión salina. En observaciones realizadas con luz polarizada se pudo notar que la distribución de las drusas en el tejido es amplia, siendo mayor en las cercanlas de ambas epidermis y entre los haces vasculares. En un estudio histológico realizado en ralees de Sterculia bidwilli, se reporta que los cristales de oxalato cálcico son tan abundantes en el interior de los tejidos parenquimatosos que obligan a una selección rigurosa de las muestras para que pueda ser cortado el material (Bouchet y Deysson, 1974). Debido a que la cantidad de los cristales de oxalato de calcio es similar en 72 --- -··--···~--~------------------- los sépalos herborizados y no herborizados, la iluminación con luz polañzada resulta útil para la caracteñzación e identificación de este tejido, por la presencia de dichos cristales. Las cavidades mucilaginosas (estructuras isodiamétricas) y los canales mucilaginosos (estructuras alargadas). son comunes en miembros de la familia Malvaceae, Tiliaceae y Sterculiaceae (Metcalfe, 1950). Por otra parte, Van Tieghem (1885a) afirma que los canales mucilaginosos son distintivas de las esterculiáceas, ya que la mayorla de los miembros de esta familia presentan canales de mucilago, a diferencia de otras malvales, en donde son más frecuentes las cavidades y células mucilaginosas. En cortes transversales se observó que la "flor de manita" presenta grandes y numerosas cavidades en el parénquima, y por cortes longitudinales se determinó que forman largos canales de trayectoña sinuosa. Histológicamente, estos canales son muy importantes, debido a que ocupan un volumen significativo en los sépalos y porque son las estructuras mejor conservadas después de la desecación de la flor, ya que la forma y el volumen se ven poco afectados. Algunos autores refieren a los canales que presentan otras especies de la familia Sterculiaceae como canales mucilaginosos o canales de goma (Van Tieghem, 1885a; Van Tieghem, 1885b; Bouchet y Deysson, 1974; Shah y Setia, 1976; Fahn 1979). Sin embargo, en este estudio, no se les llama asl por considerar que la goma es una sustancia que se produce únicamente en condiciones traumáticas o de infección de la planta, y porque no se encontraron azúcares componentes de un mucllago típico en la hidrólisis realizada al líquido viscoso de esta especie. Antiguamente se pensaba que las cavidades o canales de las estérculiaceas eran todos ezquisógenos (Van Tieghem, 1885b), pero Cronquist (1981) sel'lala que las cavidades o canales en la familia pueden ser ezquisógenos o lisógenos. Los canales en Ch. pentadactylon, tienen un lumen delimitado por restos de células y por paredes de células parenquimatosas pequel'las y aplanadas, por lo que los canales son lisógenos. Sin embargo, un estudio sobre el desarrollo de los canales serla más determinante. Los canales lisógenos han sido descritos para otras especies de la familia Sterculiaceae, sin embargo, los estudios realizados han sido principalmente en órganos como ralz y tallo, y algunos en hoja y peciolo, y escasos en flor. En los tallos, hojas y rarz de S. urens, por técnicas histoquímicas se determinó que los canales lisógenos contienen una sustancia gomosa, granos de almidón y pequenos cuerpos lipldicos, mientras que la forma de los canales es recta (Shah y Setia, 1976). En un estudio en tallo de S. 73 bidwilli, se detalla la formación de los canales lisógenos a partir de células del parénquima y además se reporta la presencia de almidón en ellos (Bouchet y Deysson, 1974). Las pruebas histoqufmicas hechas en ros sépalos de Ch. pentadactylon, revelan que el único componente de la sustancia viscosa son azúcares. El aspecto del contenido .de los canales se ve de manera distinta según la técnica de inclusión y tinción empleadas. Debido a que esta información está relacionada con la naturaleza qulmica de la sustancia viscosa, se discute más adelante. NECTARIO El tejido nectarffero es muy evidente por sus diferencias histológicas con respecto al resto del sépalo (Fahn, 1998). En Ch. pentadactylon, la presencia de los tricomas glandulares pluricelulares y bicelulares, y las caracterlsticas morfológicas del parénquima secretor, distinguen al tejido nectarlfero en la cara adaxial, desde la parte basal del sépalo y hasta la mitad del mesófilo. Los tricomas bicelulares, por su gran tamano, sólo pueden ser vistos completos por MEB, ya que en cortes histológicos solo aparecen fragmentos de ellos. Las pruebas histoqufmicas evidencian que la naturaleza qulmica de los tricomas bicelulares es similar a la de los tricomas esterados, es decir, presenta una vacuola prominente con la tinción de APS, APS-azul negro de naftol y vainillina-ácido clorhldrico, y resulta negativa para las demás. Las presencia de los tricomas simples en el nectario está relacionada funcionalmente como defensa contra los herblvoros, como gula para el camino de los polinizadores o para evitar la pérdida de agua (Rudramuniyappa y Manure, 1998). En cuanto a los tricomas glandulares pluricelulares en esta especie, el tamai'lo de ellos es de importancia farmacognósica, por lo que se reporta el promedio del largo de los mismos. En tanto que las pruebas histoqulmicas realizadas indican que el contenido en las células de la base de los tricomas glandulares son taninos y mientras que en el ápice las células almacenan proteínas. Además, tanto la epidermis que sostiene a los tricomas, como los mismos tricomas glandulares, están cubiertos por una cutlcula que es más gruesa en esta región de la epidermis adaxial. En Kigelia pinnata, miembro de la familia Bignoniaceae, se ha observado que los tricomas glandulares pluricelulares almacenan en el ápice 74 polisacáridos insolubles, evidenciados con APS, además la reacción para llpidos es moderada en la epidermis que sostiene a los tricomas glandulares y mayor en la que envuelve a estos últimos (Rudramuniyappa y Manure, 1998). La forma de las células que componen al tejido secretor no presentan características distintivas que permitan su diferenciación con otras especies. Pero debido a que la composición química del tejido nectarrfero varia en algunos casos, con la edad de la flor, sexo, estación y localización, y mayormente entre las especies distintas (Baker y Baker, 1979; Rudramuniyappa y Manure, 1998), se analizan únicamente las reacciones histoquímicas que resultaron positivas en el tejido. En el parénquima secretor de Ch. pentadactyton, sus células almacenan únicamente proteínas en el segundo estrato paralelo a la epidermis, mientras que el resto alternan entre proteínas, taninos y sustancia viscosa, como lo demuestran las tinciones con azul negro de naftol, vainillina-ácido clorhídrico y rojo de rutenio, respectivamente. La prueba de rojo ·o· de aceite sólo evidenció la presencia de una cutlcula recubriendo a los tricomas y epidermis del nectario, sin embargo, no reveló la presencia de cuerpos oleosos. La concentración de la sustancia viscosa es mayor en las cavidades del tejido nectarífero, como lo manifiesta la tinción doble de APS- Azul negro de naftol. En contraste con el tejido de los sépalos herborizados, las proteínas y los taninos son prácticamente nulos en el parénquima secretor, y solo se encuentra la sustancia viscosa. Además, la cutlcula esta notablemente engrosada. Las técnicas histoquímicas para taninos hidrolizables, lignina y almidón, resultaron negativas. La ausencia de lignina en las paredes del nectario coincide con lo reportado en la literatura para los nectarios (Fahn, 1979). Es común encontrar protelnas en el néctar:,_ (Fahn, 1979), que en su mayoría son enzimáticas en su función (Baker y Baker, 1982). Las proteínas comúnes son invertasa, transglusidasa, fosfatasa, oxidasa, tirosinasa, etc. Se ha reportado la presencia de esterasa y maltasa- deshidrogenasa en el néctar de Fremonfia sp., perteneciente a la familia Sterculiaceae (Bahadur, et al., 1998). Respecto a su función dentro de la planta, los taninos se consideran como sustancias asociadas a la formación y transporte de azúcares; como antioxidantes; y como protector de la homogeneidad del citoplasma (Esau, 1985). Además se les ha asignado una función contra la deshidratación ya que las uniones con proteínas forman una capa muy estable (lópez, 1989). Por lo anterior, en el tejido nectarífero, podrlan estar involucradas en el proceso de secreción del néctar, asociadas a proteínas y protegiendo contra la deshidratación. 75 Los lfpidos y ácidos grasos tienen ventajas sobre el néctar azucarado, ya que contienen más energla por unidad que el azúcar (aceites 9cal/g; azúcar 4cal/g). Estos compuestos son nutricionalmente más sustanciales para los polinizadores (Bahadur, et al., 1998) como los colibrles. Lo anterior concuerda con la ausencia de compuestos lipídicos en el interior del tejido secretor, ya que Ch. pentadactyfon es polinizada por aves paseriformes (Toledo, 1975). La presencia y posible función de los azúcares en las cavidades en discutida en el siguente apartado. El estudio del tejido nectarlfero, en general y particular, revela que los nectarios son un sistema complejo y dinámico. Su localización parece ser importante para la polinización (Yung et al., 1984). La producción del néctar está controlada por factores externos e internos de la planta. Los cambios en la composición del néctar, pueden tener importancia sobre los polinizadores, porque las flores son explotadas normalmente tan pronto como el néctar esté disponible (Baker y Baker, 1982; Yung et al .• 1984; Bahadur, et al., 1998). La localización de los nectarios, la calidad del néctar, Ja importancia ecológica de Jos nectarios podrla ser discutida en posteriores estudios. 76 SUSTANCIA VISCOSA El aspecto de la sustancia viscosa depositada en los canales de Ch. pentadacty/on, se ve de manera distinta según la técnica de inclusión y tinción empleadas. As!, en cortes en fresco tenidos con APS y en cortes en LR-White tenidos con azul de toluidina, se observa un depósito en círculos concéntricos y también formando estratos en filas con ésta última técnica. En tanto que en cortes con paraplast, tenidos con rojo de rutenio, además del depósito en círculos concéntricos, se observa también que la sustancia viscosa fonna una trama reticular. Asimismo, en cortes con paraplast teflidos con la técnica cuádruple de Jonhansen y con las técnicas de APS y la doble de APS-azul negro de naftol, se observa la forma reticular. Bouchet y Deysson (1971), describieron por medio de cortes semifinos, incluidos en resina (Epon), que la forma del depósito del mucilago en las células mucilaginosas de meristemos radiculares de Althea rosea (Malvaceae), es en forma de estratos concéntricos, a partir de las paredes pecto-celulósicas de las mismas. Los mismos autores, posteriormente, realizaron un estudio ultraestructural de la formación de los canales lisógenos en el tallo de Stercu/ia bidwilli, donde además detallan la síntesis de la sustancia mucilaginosa que forma una trama, a partir de la paredes pecto-celulósicas que se localizaban en el lumen del canal previo a su formación, y no por las células circundantes al canal lisógeno (Bouchet y Deysson,1974). El aspecto del depósito de la sustancia viscosa en los canales de Ch. pentadactylon es similar al establecido para A. rosea, por lo que se sugiere que ar momento de la formación de los canales, las células antes de lisarse, pudieran dejar su secreción en forma de estratos concéntricos, los cuales son visibles en cortes en fresco teflidos con APS, o ser un efecto de las técnicas utilizadas. Sin embargo, al momento de procesar el material para su inclusión, éste se modifica, especialmente por el método de inclusión en paraplast, lo que explicarla que aún se pudiera ver esta formación del depósito en el material incluido en LR-White y además, quizás, porque los cortes son más delgados. Por otro lado, solo la prueba de rojo de rutenio alcanza a distinguir un poco los estratos concéntricos, posiblemente porque tif\e pectinas, y estarla marcando entonces, las distintas fases del depósito de la sustancia viscosa, o quizá está evidenciando los restos de las láminas medias de la lisis de las células. La tinción cuádruple de .Jonhansen indica que el compuesto tiene azúcares reductores. Sin embargo, la prueba de lugol resultó negativa, por lo que se descarta la presencia de almidón en los canales. Las pruebas 77 histoqufmicas empleadas que resultaron positivas, APS en sus dos modalidades y rojo de rutenio, son más especfficas para azúcares reductores y para pectinas y mucílago, respectivamente (Jonhansen, 1940; O'Brien y Me Cully, 1981; Trease y Evans, 1988; Bruneton, 1999). De éstas, ambas resultaron positivas y coinciden en que son azúcares los que forman a la sustancia viscosa. No obstante, no pueden determinar si el compuesto es químicamente un mucilago, ya que la prueba de rojo de rutenio no es concluyente (Trease y Evans, 1988). Las técnicas histoqufmicas restantes, azul negro de naftol, cloruro férrico, floroglucina- ácido clorhldrico, rojo "O" de aceite y vainillina-ácido clorhldrico, resultaron negativas para estas estructuras. El análisis del perfil cromatográfico bidimensional en las flores frescas de Ch. pentadactylon, deja ver que los azúcares que se encuentran en los sépalos son la fructosa, en la parte media, y la sacarosa y fructuosa, en la parte basal. En tanto que la cromatografla del hidrolizado revela la presencia de glucosa y fructuosa, componentes de la sacarosa, en las flores herborizadas. Sin embargo, estas pruebas indican que los azúcares no son los únicos componentes de la sustancia viscosa, ya que en todas las cromatograflas se manifestó también la presencia de, por lo menos, una sustancia muy poco polar y que se encuentra en mayor concentración, cuya naturaleza es desconocida. El aspecto de la sustancia viscosa coincide con las características reportadas por Martlnez (1936) para el néctar que secreta la "flor de manita", quien lo describe como un llquido ligeramente viscoso y transparente destilado por las fosetas nectarlferas. Por lo anterior, y debido a que la cromatografla bidimensional para la parte basal, donde se encuentra el nectario, muestra la presencia de sacarosa y fructuosa, que son dos de los tres azúcares reportados como constituyentes principales del néctar, aunque no en esa combinación (Baker y Baker, 1982), se propone que la sustancia viscosa que se encuentra en los canales, esté relacionada con la producción, almacenaje y/o secreción del néctar. Bahadur et al., (1986) reportan en el néctar de Tecomaria capensis, la presencia únicamente de éstos dos azúcares. Además, en la cromatografla bidimensional de la parte media de los sépalos, se revela la presencia de glucosa, aunque en muy poca cantidad, que también podrla estar relacionada con el néctar, ya que es el tercer azúcar más común en el néctar. La proporción de los azúcares anteriores es diferente para cada especie, y está muy relacionada con su polinizador (Baker y Baker, 1982; Yung et al .. 1984; Bahadur, et al., 1998). Ch. pentadactylon, es una flor polinizada por aves percharas (Toledo, 78 1975). Además, en el perfil cromatográfico de la sustancia viscosa, en la parte basal de los sépalos, se observa que la mancha de sacarosa está en menor concentración que la de fructuosa. Lo anterior coincide con lo descrito en la literatura, donde se registra que la concentración baja de sacarosa es característica de plantas polinizadas por aves paseriformes (Yung eta/., 1984; Rudramuniyappa y Manure, 1998). Asimismo, los cortes histológicos transversales del nectario de Ch. pentadactylon, teflidos con la tinción doble de APS-azul negro de naftol, revelan una mayor concentración de azúcares reductores en las cavidades orientadas hacia la feseta nectarlfera, lo que reafirma la anterior propuesta, ya que esto indica una relación entre el contenido de las cavidades y su posición al interior de los sépalos. Sin embargo, la comprobación de esta sugerencia puede ser parte de otro estudio en la especie. La cromatografía bidimensional del producto de la hidrólisis del extracto de las flores secas, no revelan la presencia de azúcares que sean componentes característicos, de un mucílago, por lo que se descarta la presencia de mucilago en Ch. pentadactylon, y se sugiere que la consistencia viscosa de la sustancia que se estudió, se debe únicamente a la concentración de azúcares y de las sustancias pecticas que se evidenciaron con la prueba hístoqulmica de APS, en sus dos modalidades y la de rojo de rutenio, respectivamente. CONCLUSIONES • La caracterización histológica de Ch. pentadacty/on está dada por el conjunto de estructuras celulares que permiten la distinción farmacognósica de la especie. • Las estructuras de mayor valor farmacognósico para los sépalos son: A. Los diferentes tipos de tricomas que se encontraron en ambas caras de los sépalos. Los tricomas estelados se pueden identificar, en flores no herborizadas, por el número de células que los forman y el largo de las mismas. En sépalos herborizados solo debe considerarse el largo de las células. Se observaron tricomas bicelulares en el tejido nectarlfero que no hablan sido descritos para la familia Sterculiaceae. El largo de los tricomas glandulares y bicelulares son importantes en la identificación. B. Los canales, que son las estructuras mejor conservadas después de la desecación. Para el reconocimiento de los canales se debe considerar la forma y trayectoria de los mismos, asl como el aspecto de la sustancia viscosa que contienen, a través de las distintas técnicas de inclusión y de tinción. C. La composición qulmica de la sustancia viscosa, ya que al ser un material ergástico es útil en la identificación de drogas pulverizadas. La presencia y concentración de los azúcares, fructosa, sacarosa y glucosa, son determinantes en cuanto a la identificación de la sustancia viscosa en los sépalos frescos. + Las pruebas histoqulmicas aplicadas en este estudio, revelan la distribución y el tipo de componentes celulares que se almacenan en los tejidos, lo que ayuda a la caracterización, principalmente, del tejido nectarlfero. + La sustancia viscosa puede estar relacionada con la producción o almacenaje del néctar. + La sustancia viscosa extralda de las flores herborizadas no es un mucílago. 81 LITERATURA CITADA Alverson, W. S.; B. A. Whitlock; R. Nyffeler; C. Bayer y D. A. Baum. 1999. Phylogeny of the core Malvales: evidence from ndhF sequence data. Amer. J. Bot., 86 (10): 1474- 1486. Aspinall, G. O. 1970. Pectins, Plant gums, and other plant polysaccharides. En: Pigman W. and D. Horton (eds.). The Carbohydrates. Academic Press. USA. 515-535. Azuara, G. B. 1990. Contribución al estudio genérico de la Fam. 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