00346 
      
    
  
GRE MEA AE 
¿7 A UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA 
DE MEXICO 
FACULTAD DE CIENCIAS 
DIVISION DE ESTUDIOS DE POSGRADO 
        
  
    
OEM] 
DETECCION DE MUTACIONES EN EL GEN RB1 
EN PACIENTES CON RETINOBLASTOMA 
T E Ss ) S 
QUE PARA OBTENER EL GRADO ACADEMICO DE; 
MAESTRA EN CIENCIAS 
Z (BIOLOGIA CELULAR) 
“Mo POR OE S E N To A 
Q.B.P. MARICELA| RODRIGUEZ CRUZ 
    
  DIRECTOR DE TESIS: DR. FABIO ABDEL SALAMANCA GOMEZ 
CO-DIRECTOR: DR. DIEGO JULIO ARENAS ARANDA 
9.000
 
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EL PRESENTE TRABAJO SE REALIZO EN EL LABORATORIO DE BIOLOGIA 
MOLECULAR DE LA UNIDAD DE INVESTIGACION MEDICA EN GENETICA 
HUMANA, HOSPITAL DE PEDIATRIA, CENTRO MEDICO NACIONAL SIGLO XXI, 
IMSS, BAJO LA DIRECCION DEL DR DIEGO ARENAS A., DR FABIO 
SALAMANCA G, Y DR MAURICIO SALCEDO V
DEDICATORIA A 
DIOS 
HMIMADRE 
ANGELES 
ARIADUA 
VU) ABUELITA 
HUMBERTO
AGRADECIMIENTOS 
Al Dr Fabio A. Salamanca por permitirme pertencer a su grupo y poder realizar el 
trabajo de investigación 
Al Dr. Diego Arenas por su gran calidad humana y disponibilidad para transmitir sus 
conocimientos, gracias por tu AMISTAD. 
A Dr. Mauricio Salcedo por su incondicional apoyo, acertados comentarios y apoyo 
profesional. 
A mis grandes amigos que compartieron conmigo un poco de su vida' Arely, Ana 
Claudia, Samuel, Irma, Selene, Lolita, Juan Carlos. 
A todos mis compañeros de Biologia Molecular por compartir su alegría realmente 
hicieron muy agradable mi estancia en el taboratorio. Rosenda, Paul, Elena, Xochutl, 
Rafael, Tony, Miguel, Carolina. 
A la Dra. del Prado por permitirme robarle “tiempo” al tiempo y poder terminar más 
rápido este trabajo 
A Marma Gonzalez H. por ser tan amable en heredarme algunas de sus muestras y 
por ser una noble persona. 
A la Dra. Georgina del servicio de patología por su amabilidad y proporcionarme los 
tumores de los pacientes 
A la Dra Sara Frías por su valiosa aportación en la revisión de la tesis 
A la M. en C. Marisol! López L, Dra Ma. Eugenia Gonsebatt B., Dr. Mauricio 
Salcedo V., Dra Sara Frias, Dr. Diego Arenas A., Fabio A. Salamanca G y Dr. 
Ramón Coral V., por los acertados comentaros en la revisión del presente trabajo.
ÍNDICE 
RESUMEN 
MNTRODUCCION 
  
A. Transmisión genética del retinoblastoma ..... o cociocooomom. 3 
B. Signos y sintomas del retinoblastoma rr o 
C. Origen genético del retinoblastoma e e e 
D. La citogenética del retinoblastoma mr ob 
E. Mecanismos genéticos que generan pérdida de heterocigosidad «== <= 7 
F Caracterización estructural del gen Rb1 A 
G. Anormalidades genéticas en tumores de retimoblastoma o a. Y 
H Estudios moleculares del gen RB1 rs . o . 12 
l. La proteína pRb producto del gen Rb1-— 14 
J. Familia de proteínas de retinoblastoma —-- <= remmeemencr o 21 
K Genes supresores de tumor en otras enfermedades malignas nee eS 
L Hipótesis molecular para la patogénesis del retinoma y la baja penetrancia de 
la mutación del gen Rb1 en algunas familias remera + - 24 
ILHIPOTESIS ! : o : : 28 
INJUSTIFICACION AN 28 
IV OBJETIVOS 29
Y SUJETOS Y METODOS 
A. Pacientes 
B. Citogenética 
C. Aislamiento del DNA genómico humano a partir de leucocitos de sangre 
periférica 
D Aislamiento de DNA genómico humano a partir de tumor de retinoblastoma 
embebido en bloques de parafina 
E. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de 6 regiones del gen Rb1 _.. 
F. Detección de polimorfismos conformacionales de cadena sencilla (S5C) -- - 
G. Secuenciación del DNA 
H Inmunohistoquímica de la proteína pRb en retinoblastoma : “+ occecu or 
VI. RESULTADOS 
A. Estudio citogenético 
  
B. Estudio molecular 
C. Análisis inmunohistoquímico para la proteina pRb en retinoblastomas 
VII. DISCUSION 
A. Análisis genético y citogenético 
B. Análisis molecular + 0 empre e e
C. Análisis inmunohistoquimico 
Vil. CONCLUSIONES 
IX. BIBLIOGRAFIA 
31 
31 
32 
33 
34 
36 
38 
41 
44 
50 
65 
75 
80 
89 
93 
94
RESUMEN 
El retinoblastoma es una neoplasia embrionaria que se manifiesta en dos formas: la 
forma esporádica (no heredada) y la forma familiar (heredada). En los casos esporádicos, 
el tumor es unilateral y en la forma familiar puede ser tanto bilateral como unilateral. Tiene 
una incidencia de 1 en 13,500- 25,000 nacidos vivos, presentando signos y sintomas que 
incluye leucocoria, estrabismo, midriasis unilateral y heterocromia. El gen que predispone 
al desarrollo de retinoblastoma es Rb1 y se localiza en el cromosoma 13 en la región 
13q14.1. El gen Rb1 está formado por 27 exones que codifican para una fostoproteína 
nuclear que participa de manera importante en la regulación del cicio celular. De acuerdo a 
la hipótesis de Knudson, se deben presentar dos mutaciones en el gen Rb1 para que se 
desarrolle la neoplasia. Las mutaciones puntuales son el tipo de mutaciones más 
frecuentes que se presentan en el gen Rb1 que generan el desarrolo de retinoblastoma. 
En este trabajo se analizó el patrón de distibución de mutaciones en 19 enfermos de 
retinoblastoma unilateral o bilateral, utilizando las técnicas: co-amplificación por PCR 
(amplificación en cadena de la polimerasa) no isotópico, polimorfísmos conformacionales 
de cadena sencilla (SSCP) mediante PCR-isotópico y secuenciación de exones que 
mostraron algún polimorfismo. Además se realizó el estudio citogenético para determinar sí 
existían alteraciones cromosómicas en estos individuos y también se analizó la presencia o 
ausencia de la proteina pRb en tumores de estos pacientes. 
El estudio citogenético mostró alteraciones cromosómicas en uno de los individuos. 
El análisis molecular mediante SSCP-1sotópico, mostró polimorfismo en el DNA de tres 
individuos y al secuenciar estas regiones se identificaron mutaciones puntuales en los tres 
casos. 
En uno de los pacientes se identificaron dos mutaciones una en el exón 8 y otra en 
el exón 20, solo una de éstas generó un codón de paro lo que se traduce en una proteína 
PRb truncada, Esto fue confirmado ya que en el análisis inmunohistoquímico del tumor de 
este paciente no se identificó la proteína pRb. Debido a que este paciente presentó 
retinobiastoma bilateral se puede decir que alguna de las dos mutaciones viene 
segregando por línea germinal (mutación precigótica) o que se generó en las etapas 
tempranas del desarrollo embrionano. 
En el paciente en donde se identificó una mutación de tipo puntual en el exón 18, se 
generó un codón de paro y no fue posible realizar el análisis inmunohistoqúimico debido a
que no hubo enucleación de la pieza ocular. En este caso el paciente presentó 
retinoblastoma unilateral. 
La tercera mutación puntual identificada fue en el exón 20 en el DNA constitucional, 
esta mutación también generó un codón de paro. De acuerdo a esto se puede sugerir que 
el retinoblastoma unilateral que presentó el paciente pertenece a la foma familiar ya que la 
primer mutación constitucional pudo haberse generado durante el desarrollo embrionario o 
segregar por via germinal. 
En todos los tejidos analizados, con excepción del paciente 2-Rb, se observó que la 
proteína pRb estaba presente en el tejido. Esto no indica que la proteína pRb sea 
funcional ya que el anticuerpo que se utilizó para identificar a pRb está dirigido contra el 
carboxilo terminal, de manera que no determina su estado de fosforilación. 
En conclusión, debido a la severidad de esta neoplasia y las consecuencias que ésta 
tiene es importante identificar el tipo de mutaciones que se presentan en los individuos con 
retinoblastoma, de manera que permita hacer un seguimiento en sus familiares en edad 
pediátrica que requieren vigilancia clínica debido al riesgo que tienen de desarrollar esta 
neoplasia.
l. INTRODUCCION 
El cáncer ha sido una enfermedad mortal durante la historia de la humanidad y su 
prevalencia ha cambiado con el avance industrial y tecnológico ya que se ha convertido en una 
enfermedad común afectando uno de cada tres individuos (Wemberg A R, 1996) En México 
desde 1990 los tumores malignos representan la segunda causa de muerte en la población en 
general después de las enfermedades cardiovasculares (Mohar A, 1997) 
Etiología y patogenia del Cáncer 
La carcinogénesis involucra una serie de cambios dentro de las células que generalmente 
ocurren a través del curso de muchos años, que puede ser desde una década o más entre el 
inicio de la carcinogénesis y el diagnóstico de la neoplasia, haciendo dificil puntualizar la causa 
de ésta En muchos casos, las causas de cáncer no están definidas claramente pero se sabe 
que tanto factores; externos (humo de cigarro, alcohol, tipo de dieta, químicos industriales, 
herbicidas, aire, agua contaminada, drogas, infecciones, luz solar, exposición a radiación, etc) 
como internos (defectos en el sistema inmune, factores genéticos) juegan un papel muy 
importante para iniciar y promover la carcinogénesis (Hooper M L, 1999, Wemberg A R, 1998). 
En la actualidad no se tiene información detallada de como la mayoria de las 
exposiciones a los carcinógenos dan origen al cáncer, se cree que éste surge de los efectos de 
dos tipos diferentes de carcinógenos; uno de estos comprende agentes que dañan genes 
involucrados en controlar la migración y proliferación celular. La neoplasia surge cuando una 
sola célula acumula cierto número de mutaciones, generalmente durante muchos años y 
finalmente escapa de los mecanismos que reprimen la proliferación, las mutaciones permiten a 
la célula y sus descendientes desarrollar alteraciones adicionales y acumularlas de manera que 
su número se incrementa favoreciendo la formación del tumor Una teoría que ha permanecido 
por mucho tiempo sostiene que muchos agentes ambientales además de la edad y el tipo de 
vida, juegan un papel importante en el incremento de la producción en el cuerpo de radicales 
libres, éstos reaccionan con el DNA de algunos genes generando mutaciones. El otro tipo de 
carcinógenos incluye agentes que no dañan genes pero en su lugar aumentan selectvamente 
el crecimiento de células de tumor o sus precursores, entre éstos se conocen a los virus, que 
actúan generalmente acelerando la velocidad de la división celular. Los virus y otros agentes 
infecciosos contribuyen en un 5% de todos los casos de cáncer. Por stipuesto, los genes 
heredados de los padres también influyen en el desarrollo del cáncer debido a que algunos 
individuos nacen con las mutaciones que promueven el crecimiento excesivo de ciertas células 
(Truehopoulos D y col 1996)
Debido a la producción de carcinógenos dentro del cuerpo y a los errores genéticos en la 
replicación, se cree que una cuarta parte de todos los cánceres se podrían desarrollar en un 
ambiente libre de influencias externas. En este proceso se presenta la pérdida del control de los 
mecanismos de replicación y reparación del DNA, La alta eficiencia del sistema de reparación 
es una razón de que puedan pasar muchas décadas antes de que se generen las mutaciones 
necesarias para el desarrollo de la neoplasia, aunque las células normales tienen estrategias 
de defensa contra el desarrollo del cáncer, las células tumorales activan diferentes vías de 
escape para favorecer su proliferación (Wemberg A R., 1996) 
El estudio del ciclo celular y su regulación han permitido conocer como se mantiene la 
fidelidad e integridad de la replicación del genoma por las funciones coordinadas en los puntos 
de control y de los sistemas de reparación del DNA, sin embargo el funcionamiento adecuado 
de estos procesos se puede alterar por mutaciones génicas. 
Como ya se mencionó anteriormente la transformación maligna de una célula surge a 
través de la acumulación de mutaciones en clases específicas de genes que proporcionan la 
clave para entender la raíz del proceso del cáncer humano. Existen dos clases de genes, que 
juntos constituyen una pequeña proporción de todo el grupo de éstos que participan de manera 
importante en el desarrollo del cáncer. En su función normal, estos genes regulan el ciclo 
celular, estas dos clases de genes son; 1) los protooncogenes que favorecen el crecimiento 
celular y 2) los genes supresores de tumor, que lo inhiben, de manera que el funcionamiento 
colectivo de estos genes explican mucho de la proliferación celular descontrolada en el cáncer 
Cuando los protooncogenes están mutados, se convierten en oncogenes que dirigen la 
multiplicación celular excesiva, las mutaciones en los protooncogenes pueden generar que se 
aumente la producción de ciertas proteínas estimuladoras del crecimiento celular. En contraste, 
los genes supresores de tumor, contribuyen al cáncer cuando se inactivan por mutaciones y 
como resultado hay pérdida funcional de proteínas supresoras que privan a la célula de frenos 
importantes que evitan el crecimiento descontrolado (Trichopoulos D, y col., 1998). 
Inactivación de los genes supresores de tumor 
Para que una célula normal se convierta en maligna además de sobreestimular su 
maquinaria promotora de crecimiento, también deben tener vías para evadir o ignorar señales 
que detienen el ciclo celular que son emitidas por células normales adyacentes. 
La lista de sindromes de cáncer familiar en los que están incluidos genes supresores de 
tumor esta creciendo, por ejemplo, las formas mutadas del gen supresor de tumor p53 
producen tumores en múltiples siuos además del síndorme de Li-Fraumen, los genes BRCA1 y 
BRCA?2 recientemente aislados están asociados a cancer de mama hereditario, incluyendo el
20% de todos los cánceres de mama premenopáusicos. Otro gen supresor de tumor es Rb1 
cuyas alteraciones conducen al desarrollo de cáncer intraocular conocido como retinoblastoma 
que afecta a niños que más tarde tienen el riesgo de desarrollar osteosarcoma (Trichopoulos D, y 
coJ, 1996) 
RETINOBLASTOMA 
A. Transmisión genética del retinoblastoma 
Desde 1821 se han reportado casos de retinoblastoma dentro de una misma familia, el 
descubrimiento de casos familiares de retinoblastoma originó la hipótesis de que se puede 
heredar la susceptibilidad a la enfermedad (Goodrich D. W, 1993) El retinoblastoma ha servido 
como el ejemplo prototipo de la predisposición al cáncer, éste es un tumor maligno de la retina 
de localización intraocular, que afecta a niños pequeños, con una incidencia de 1 en 13,500 a 
25,000 nacidos vivos. Esta neoplasia ocurre en dos formas la forma espóradica (no heredada) 
y la forma familiar (heredada). En los casos espóradicos, el tumor es unilateral de manera 
unifocal, generalmente se presenta a los 2 años de edad y representa el 60% de todos los 
casos de retinoblastoma Las fomas hereditarias aparecen a una edad muy temprana (en 
ocasiones en recién nacidos), éstos representan el 40% de todos tos casos de retinoblastoma, 
de éstos el 10% (unilaterales o bilaterales) son transmitidos de un padre afectado y el 30% 
restante podrían resultar de una mutación germinal de novo en alguno de los progenitores y se 
presenta de forma unilateral o bilateral. La enfermedad familiar se transmite como una 
enfermedad mendeliana autosómica dominante con penetrancia incompleta y expresividad 
variable (Stahl A y col, 1994: Server Ch y col, 1998) 
La penetrancia del retinoblastoma heredado no es del 100% ya que no se manifiesta en 
todas las generaciones de familias afectadas. El modelo más simple para explicar este patrón 
de herencia es la susceptibilidad del retinoblastoma para segregar como una enfermedad 
autosómica dominante con penetrancia alta (80-95%) pero incompleta. En los casos heredados 
sin antecedentes familiares de la neoplasia, se estma que el 10-12% de casos unilaterales y 
100% de casos bilaterales transmiten la susceptibilidad de desarrollar retinoblastoma a su 
progente, ya que se puede generar por mutación del gen Rb1 en las células germinales de los 
padres Los casos de retinoblastoma espóradico (80%), surge de novo por mutación del gen 
Rb1 en células somáticas durante el desarrollo del ojo (Goodrich OD W, 1993), 
En cuanto a la histogenesis del retinobiastoma, estudios previos han atribuido el origen 
del tumor a células neuronales, gliales o células totipotenciates (stem) de la retina Kyritsis y
col,, (1984) utilizaron una línea celular de retinoblastoma, para identificar un marcador 
específico de células neuronales como la enolasa específica (NSE) y un marcador de 
astrocitos, como la proteína acídica fibrilar de la glia (GFAP), ésta es una glicoproteína asociada 
a mielina para identificar células de Múiller en la retina. Los resultados sugieren que las células 
no diferenciadas contienen ambos marcadores (NSE y GFAP) mientras que las neuronas y las 
células gliales que se están diferenciando pierden gradualmente un marcador y expresan 
selectivamente el marcador que correlaciona con su morfología Estos resultados sugieren que 
el retinoblastoma se origina de una célula neuroectodermal primitiva bipotencial (Kyrtsis y col, 
1984) 
B. Signos y síntomas del retinoblastoma 
En la mayoría de los casos, el primer signo que presentan estos pacientes es el 
característico reflejo ojo de gato, este reflejo pupilar blanco, rosado o amarillo-blanco llamado 
leucocoría resulta del reemplazo del humor vítreo por el tumor o por crecimiento de éste en la 
mácula. Otro sintoma común es el estrabismo, que ocurre cuando pequeños tumores 
maculares interfieren con la visión o pueden estar asociados con leucocoria También se 
presentan otros signos con menos frecuencia como ojos rojos con glaucoma secundario, 
celulitis orbital con visión disminuida, midriasis unilateral y heterocromía (Server Ch. y cof, 1995), 
C. Origen genético del retinoblastoma, 
En 1971 Knudson propuso la hipótesis que postula que dos mutaciones son responsables 
del desarrollo de retinoblastoma para cualquiera de las dos formas de la enfermedad, en la 
forma heredada, la primera mutación es germinal y se encuentra en todas las células del 
individuo, el gen Rbi mutado se hereda de uno de los progenitores o la mutación se genera de 
novo en una célula germinal durante la gametogénesis de uno de los padres. El gen mutado 
localizado en el cromosoma 13q14.1 (Figura 1) es recesivo a nivet molecular, así la primera 
mutación constituye solamente una predisposición para desarrollar la neoplasia La segunda 
mutación siempre es somática y afecta células de la retina que llevan la primer mutación en uno 
de los cromosomas, esto conduce a pérdida o inactivación del alelo normal de aquí la expresión 
frecuente de pérdida de heterocigosidad (LOH). Las células retinianas experimentan 
transformación maligna generando un tumor En la forma espóradica del retinoblastoma, se 
Cree que ambas mutaciones ocurren sucesivamente en una sola célula de la retina de manera 
que es muy raro que existan dos mutaciones idénticas en la misma célula, asi que es poco 
probable que esto ocurra en ambos ojos esto explica porque ta forma espóradica es unilateral 
(Knudson A G. 1971)
D. La citogenética del retinoblastoma. 
Yunis y Ramsay en 1978 demostraron la existencia de una deleción sobre el brazo largo 
del cromosoma 13, una banda localizada en 13q14 1 que frecuentemente se pierde en los 
casos de retinoblastoma Cuando además de ésto, tambien ocurre otra alteración en el gen 
Rb1 del cromosoma homólogo, la deleción da como resultado el crecimiento de clonas de 
células tumorales debido a la pérdida del gen Rb1 que tiene una participación muy importante 
en la regulación del cicio celular. Esta observación fué confirmada ya que el análisis 
citogenético demostró que la deleción de 13q14.1 se observa en el 5% de retinoblastomas, la 
pérdida de material estructural sobre el cromosoma 13 es solamente uno de los mecanismos 
que conducen a pérdida del gen Rb1, ya que las deleciones más pequeñas, no se detectan por 
métodos citogenéticos convencionales. Además el análisis cromosómico demostró que la 
eliminación de 13q14.1 ocurre no solo en células tumorales de la retina sino que también en 
células normales de niños que padecen de retinoblastoma familiar En esas células solo uno de 
los cromosomas 13 muestra la deleción, la cual también se puede encontrar en células de los 
padres. En los casos espóradicos, la deleción solo se observa en las células del tumor (Yums y 
Ramsay 1978, Stahl A y col, 1994)
13 
12 
11.2 
111 
110 
121 
122 
123 
130 
14.1 
142 
143 
211 
212 
Locus del gen Rb1 
e 
213 
22,0 
310 
320 
33.0 
340 
  
Cromosoma 13 
Figura 1. Idiograma del cromosoma 13 en donde se muestra la región 13q14.1 que 
corresponde al locus del gen Rb1. Tomada de Verma R. S. y col., (1995) 
Debido a que la pérdida constitucional de material genético del cromosoma 13q14 1 
predispone a retinoblastoma, varios grupos de investigadores estudiaron los tumores de 
pacientes con cariotipo normal para determinar sí las anormalidades citogenéticas surgen como 
eventos somáticos Aunque algunos reportes iniciales sugirieron que la banda 13q14 estaba 
delecionada en una gran proporción de estos tumores, estudios posteriores demostraron que 
solo el 10% tienen monosomía de la región 13q14. Es importante considerar que en el 
retinoblastoma existen otras anormalidades cromosómicas, las cuales parecen estar asociadas 
con el desarrollo del tumor más que con la iniciación del mismo, por ejemplo como en otros 
tipos de tumor, en retinoblastoma se observan copias extras del cromosoma 1q, isocromosoma 
Bp (1(6p)) que se ha encontrado en el 60% de los casos de Rb que da como resultado cuatro
dosis de todos los genes que se encuentran sobre el brazo corto del cromosma 6 (Gale B L y 
col, 1990; Naumova A, y col, 1994, Scrver Ch y col, 1995) 
E. Mecanismos genéticos que generan pérdida de heterocigosidad (LOH). 
Existen varios eventos genéticos que pueden favorecer la expresión fenotípica del gen 
Rb14 mutado, en la forma familiar, la mutación del gen Rb1 es heredada y se encuentra en uno 
de tos cromosomas 13 de todas las células cualquier evento genético que resulte en LOH, ya 
sea homocigosidad o hemicigosidad conduce a la aparición de una clona tumoral 
Se han propuesto varios mecanismos cromosómicos que pueden conducir a la LOH. 
1) No disyunción mitótica, con pérdida del cromosoma 13 normal, el cromosoma alterado será 
hemicigótico en todos sus genes, permitiendo la expresión del gen Rb1 mutado. 
2) Pérdida del cromosoma 13 normal y no disyunción mitótica con duplicación del cromosoma 
13 que tiene la mutación, dando como resultado homocigosidad para todos los genes. 
3) Recombinación mitótca entre el cromosoma mutado y el normal con la posterior 
segregación, en donde se generan cromosomas que mantienen heterocigosidad en el locus 
próximos al centrómero, pero que muestra hemicigosidad en el resto del brazo largo del 
cromosoma incluyendo locus del gen Rb1. 
4) Mutación det gen Rb1 en el alelo normal. 
5) Se ha descrito otro mecanismo en mujeres afectadas por una translocación X-13, sí el 
cromosoma 13 es translocado en el cromosoma X inactivo, la inactivación se puede continuar al 
segmento autosómico que tiene el gen Rb1 normal, este fenómeno constituye solo una 
predisposición a adquirir retinoblastoma ya que es necesaria la inactivación del alelo restante 
para que aparezca el tumor (Nichols y col, 1980, Stahl A y col.. 1994; Jones C, and cof.. 1997). 
Naumova y Sapienza (1994) propusieron la siguiente hipótesis respecto al fenómeno de 
impronta génica, esta hipótesis se basa en un estudio genético en pacientes con 
retinoblastoma. En este trabajo encontraron una desproporción de sexos, debido a que ésta 
involucra dos cromosomas diferentes (Y y 13 con la mutación en el gen Rb1), que ocurre entre 
la progenie de hombres con retinoblastoma bilateral esporádico, es probable que exista un 
proceso capaz de actuar en trans y dar sensibilidad al origen parental de los alelos, este 
proceso sería la impronta genómica. La hipótesis que proponen sugiere que los hombres con 
retmoblastoma bilateral esporádico, son portadores de un gen defectuoso de impronta en el 
cromosoma X, debido a esto son incapaces de borrar la impronta materna y/o reestablecer la 
impronta paterna en la porción del genoma heredado de sus madres, además tienen alterado el 
gen Rb1 en uno de sus cromosomas La descendencia de estos varones tendrá cuatro 
posibilidades, los dos embriones femeninos no sobrevivirán debido a que el padre afectado
8 
transmite su cromosoma X (el cual tiene el gen defectuoso de impronta). Sólo serán viables 
aquellos que tengan un cromosoma Y y que además tienen un alelo Rb-1 alterado, lo cual se 
ve reflejado en la desproporción de sexos y el desarrollo de retmoblastoma en los varones 
(Naumova y Sapienza 1994) 
F. Caracterización estructural del gen Rb1. 
El locus genético responsable para el desarrollo de retinoblastoma se llamó Rb1, el gen 
Rb1 se localizó por dos evidencias muy importantes. primero, en las deleciones constitucionales 
observadas en el cariotipo o tas translocaciones que predisponian a Rb siempre estaba 
involucrada la banda 13q14 Segundo, el retinoblastoma familiar mostró estrecha relación con 
ta actividad de esterasa D (ESD), la cual es un marcador polimórfico enzimático que se 
encuentra en sangre y su gen se localiza sobre el cromosoma 13414, la proximidad del gen de 
la ESD y el gen Rb1 fue evidente debido a que los niveles sanguíneos de ESD se reducían al 
50% cuando una deleción citogenética originaba retinoblastoma. Motegi y col., (1981 y 1982), 
(citado por Gale 8 L y col, 1990) presentaron datos que mostraban: que un pequeño porcentaje de 
pacientes con retinoblastoma heredado eran mosaico, ya que deleciones pequeñas en el 
cromosoma 13 detectadas con técnicas de bandeo cromosómico de alta resolución solo 
estaban presentes en una pequeña proporción de linfocitos de sangre penférica. Sin embargo 
como Motegi: admitió, las técnicas citogenéticas no pueden ser lo suficientemente confiables 
para distinguir entre deteciones pequeñas y la presencia de artefactos como la compactación 
de bandas (Gale 8, £. y col. 1990), 
La estrategia general empleada por varios grupos para lograr la caractenzación del gen 
Rb4, fue aislar sondas de DNA localizadas en la región 13q14 para caminar sobre el 
cromosoma por tamizaje genético de genotecas de DNA y a intervalos periódicos se tamizaron 
genotecas de cDNA para detectar la expresión de genes. La clona de CDNA aislado se usó 
como sonda para determinar si la expresión del gen afín estaba ausente en el retinoblastoma, 
pero presente en células normales de la retina y en líneas celulares de tumores diferentes a 
retnoblastoma (Lee y col, 1987: Goodrich DW, 1993) La biología molecular permitió ta 
identificación del gen Rb1, su tamaño es de 180,388 pb, con un marco de lectura abierto que 
va del nucleótido 140 del extremo 5'. Sm embargo existen dos codones potenciales de 
iniciación para la traducción, uno en el nucleótido 139 y otro en el nucieótido 475, la proteina 
consta de 928 aminoácidos con un peso molecular de 106 KD. El gen Rb1 consta de 27 
exones, el tamaño de los intrones va de 80pb para el intrón 15 a aproximadamente 70 Kb para 
el intron 17, el intervalo de los exones va de 31 nucleótidos para el exón 24 a 1889 para el exon 
27, que contiene un codón de paro y las señales de pohademlacion El exon 1 contiene el
codón para la primer metionina y la secuencia 5' no traducida, ta longitud del mRNA es de 
4 7Kb (Goodrich y col, 1993) (Figura 2). 
El análisis transcripcional del gen identificó tres sitios potenciales de iniciación en las 
posiciones nucleotídicas +1, +44 y + 51, el análisis de eliminación de la secuencia 5” del gen 
Rb3 indicó que la región entre los nuleótidos -154 y +186 posee función promotora, con una 
subregión crítica de iniciación en los nuleótidos +13 y +183 (Server Ch y col, 1995) 
G. Anormalidades genéticas en tumores de retinoblastoma. 
Los cambios somáticos del cromosoma 13 que no son detectados por análisis 
citogenético en tumores de retinoblastoma, se observaron comparando las isoenzimas ESD 
(esterasa D) en tumores y células constitucionales de pacientes heterocigotos para los alelos 
de la esterasa D. En el 70% de los tumores no se detectó un alelo de la ESD, indicando que 
esa “inactivación somática” ocurrió cerca del gen Rb1 en el cromosoma 13914. La utilización de 
marcadores de DNA para fragmentos de restricción de longitud polimórtica (RFLP) para el 
brazo largo del cromosoma 13 mostró que los cambios genéticos de la ESD se debieron a 
pérdida o rearreglos cromosómicos. El anáñisis de nibridaciones tipo Southern blot con sondas 
para RELP's (Restriction Fragment length polymorphism) en las células constitucionales, 
mostraron pérdida de heterocigosidad (LOH) en extensas regiones del brazo largo del 
cromosoma 13 en células tumorales (Cavenee y col, 1983) Existen varias sondas para detectar 
RFLP's dentro del gen Rbt que pueden usarse para predecir mediante ligamiento, cuales 
miembros de una familia con retinoblastoma heredado tienen mayor probabilidad de heredar el 
cromosoma 13 mutado, sin embargo, solo el 10% de los pacientes tienen una historia familiar 
que permite hacer el Iigamiento de la mutación en el gen Rb1 SI el tumor del retinoblastoma 
está disponible, se puede indentificar el cromosoma mutado por la LOH que ocurre en el 70% 
de los tumores, se pueden utilizar los marcadores informativos RELP para seguir la herencia del 
cromosoma mutado. La frecuencia de LOH (72%) fue la misma en tumores heredados y no 
heredados, posteriormente se confirmó en retnoblastoma famhar que el cromosoma 13 que 
permaneció en el tumor fue el cromosoma heredado del padre afectado, el desarrollo de LOH 
en tumores de retinoblastoma fué especifico para el cromosoma 13, ya que todos los demás 
cromosomas probados mantuvieron la heterocigosidad constitucional (Gale y col, 1990). 
Se ha propuesto que en los casos (30%) restantes que permanecen heterocigotos 
cercano al locus Rb1, se debe a que existen otro tipo de alteraciones como el propuesto por 
Stirzaker C. y col., (1997) en donde menciona que el estado de metilación del promotor del gen 
Rb1 es importante En su trabajo determinaron el estado de metilacion de todos las secuencias
10 
CpGs en la región promotora con la finalidad de determinar, sí los sitios involucrados a la unión 
a factores de transcripción estaban metilados anormalmente, Encontraron hipermetilación a 
través de todas las secuencias CpGs del promotor, por lo que sugieren además que la actividad 
norma! de la metil transferasa (DNA MTasa) está en duda, debido no solo a que metila 
anormalmente el DNA de tumor sino que mantiene anormal el patrón de metilación en el cáncer 
es diferente a la de células normales, por lo que es importante estudiar no solo el patrón de 
metilación anormal sino además relacionarlo con el estudio de actividad de DNA Mtasa en 
tumores (Stirzaker C y col, 1997) Otros mecanismos que podrían contribuwr al desarrollo de 
retinoblastoma se incluyen la expresión anormal de n-myc, (Doz F. y col, 1996), asociación de la 
proteína pRb con oncoprateinas virales, alteración de un gen diferente a Rb1 (Rb2/PRb130), 
alteración de las desacetlasas HDACÍ (Bale A y col, 1998, Brehm A., 1998, Goodrich W D y col, 1993)
10 1112 13 14 2 223 2 
. os 
y 18 16 17 18 19 20 pa oi y vi AS or AA 4 
y 
     
Gen Rb1 
  
UTR 
Exones 1 10 17 18 21 24 27 
MRNA 
Aminoácidos 1 395 579 639 771 876 928 
  
Proteína 
9 Sítios de fosforilación Ml Dominio amino terminal 
Ml Dominio A Región espaciadora 
$8 Dominio B Dominio C 
M nst DEADG 
Figura 2. Representación del gen Rb1. A. Gen Rb1 de 200 Kb, constituido de 27 exones 
representados por las Imeas verticales numeradas en colores y 26 intrones mostrados en color 
azúi B. Estructura del RNAm del gen Rb1 de 4.7 Kb, los números indican ia posición de los 
exones. Los colores indican las regiones que codifican para los diferentes dominios de la 
proteína pRb. C. Proteína pRb en donde se observan los dominios N (ammo), A, región 
espaciadora, B, NLS (señal de localización nuclear), DEADG (sitio consenso que es hidrolizado 
por caspasas-1), (Wang J Y, 1997) C y los sitios de fosforilación, (Taya Y, 1997) esta proteina esta 
formada por 928 ammoacidos
12 
H. Estudios moleculares del gen Rb1. 
El evento que dispara la proliferación maligna en el 70% de retinoblastomas es la pérdida 
de heterocigosidad para la región 13914, asi que el alelo normal del gen del retinoblastoma se 
pierde y el alelo Rb1 ya mutado permanece en el tumor (Zhu y col, 1989) Los mecanismos que se 
han propuesto responsables de la inactivación del gen Rb1 son: 
Mutaciones en el gen RB1 
Se han hecho varios intentos para identificar las mutaciones que originan la inactivación 
del gen Rb1, Mediante estudios previos hechos por Lohmann D, y col., (1992) en pacientes con 
retinoblastoma se detectaron mutaciones en los exones 16, 20 y 23 del gen, en otro estudio 
Lohmann R D. y col., (1994), analizaron 106 pacientes con retinoblastoma hereditario e 
identificaron 20 deleciones pequeñas (de 1 a 18 pb) y siete inserciones distribuidas a lo largo del 
gen Por otro lado Blanquet y col., (1995) analizaron el espectro de mutaciones germinales en el 
gen Rb1 de 232 pacientes con retinobtastoma hereditario y no hereditario, exploraron los 27 
exones y secuencias flanqueantes además del promotor, encontraron que la mayoría de 
mutaciones era de tipo puntual entre otras, duplicaciones, inserciones y deleciones y éstas se 
encuentran distribuidas a lo largo del gen, la población estudiada mostró un mayor número de 
mutaciones en los exones 3, 8, 18 y 19, (Figura 3) Lohmann D. y col., (1996) estudiaron 119 
pacientes con retmoblastoma hereditario, el análisis de hibridación por Southern blot mostró 
mutaciones en 48 pacientes, en los 71 pacientes restantes detectaron mutaciones en 51 (72%) 
aplicando análisis heteroduplex, SSCP no isotópico y secuenciación directa que identificó 
transiciones recurrentes en la mayoría de los 14 codones CGA dentro del gen Rb1, no se 
observó mutación en los exones 25-27, sin embargo esta región contiene 2 codones de CGA, 
esto sugiere que podrian existir otro tipo de mutaciones en estos exones que esten involucrados 
en el desarrollo de retinoblastoma, (Figura 3) De los 119 pacientes con retinoblastoma se 
encontraron mutaciones en 99 de ellos (83%), el espectro de mutaciones comprendió, 15% con 
deleciones grandes en el gen, 26% alteraciones de pequeña longitud y el 42% substitución de 
bases, En otro estudio Cowell y col., (1996) analizaron los 27 exones del gen Rb1 en el DNA 
constitucional de pacientes con retinoblastoma, en donde se una transición de C por T 
convirtiendo un CGA (Arg) por un codon de terminación TGA en el exón 17 y una eliminación de 
8 pb en el exón 20 que originó un codón de terminación río abajo del sitio donde inicia la 
transcripción del gen Rb1 
Blanquet y col., (1993) analizaron 120 pacientes con retinoblastoma, usaron PCR 
combinado con electroforesis en geles con gradiente desnaturalizante (DGGE) para detectar 
mutaciones puntuales, elimimaciones pequeñas o mserciones, Encontraron 10 alteraciones, 5
13 
de éstas afectaron el marco de lectura generando codones de paro que originaron proteinas 
truncadas, otras alteraciones originaron sustitución de aminoácidos o alteración del 
procesamiento de corte y empalme del RNA (Blanquet y col, 1993) 
Kato y col., (1994) detectaron en el gen Rb1 mutaciones constitucionales (dos deleciones 
intragénicas y dos deleciones puntuales) en 4 de 10 pacientes con retinoblastoma hereditario 
Las mutaciones puntuales con sentido equivocado TGT, cisteina > TAT, tirosina se encontraron 
en el codón 706 del exón 21 que corresponde al dominio de la proteína pRb escencial para la 
unión del antígeno grande T del virus de Simio 40 y para la proteína E1A de adenovirus Se ha 
sugendo que la mutación en este codón interfiere con la unión a oncoproteínas in vitro y con la 
fosforilación in vivo (Kato Y M y col, 1994a, Kato V. M. y col, 1994b). 
Anteriormente no se conocía una región preferencial de mutación en el gen Rb1, pero de 
acuerdo a los estudios mencionados, se sugiere que las secuencias CGA son regiones 
susceptibles a mutaciones orginando en su mayoría codones de paro. La metilación de 
secuencias CpGs de DNA exónico favorece el fenómeno de desaminación en las citosinas, 
originando mutaciones puntuales (en la línea germinal) que pueden generar enfermedades 
genéticas, la mayoría de éstas son transiciones C>T. Esto se debe a que la 5 metilcitosima 
(m5C) es altamente mutable por desaminación generando mutaciones transicionales (CT) en 
los CpGs, como consecuencia estas secuencias pueden ser puntos calientes de mutación en 
Una variedad de genes La metilación en el gen Rb1 ha sido estudiada por Mancini D, y col, 
(1997), en su trabajo determinaron que el estado de metilación de CpGs exónicos en el gen Rb1 
contribuye a la hipermutabilidad de estos sitios ya que identificaron mutaciones en la mayoría de 
los 14 codones CGA de este gen con la excepción de los exones 25-27, a pesar de que en 
estas regiones existen CGA y reportan que en 119 pacientes el 69% tenía una sustitución de 
una base en tos codones CGA que condujo a codones de terminación. Los exones involucrados 
con mutaciones recurrentes (reportadas) son 8 y 14, ambos tienen 3 codones CGA y sugieren 
que las regiones hipermetiladas podrian ser puntos calientes para las mutaciones (Hogg y col, 
1993: Mancini D y col, 1997)
14 
Blanquet Y y col, 1995 
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8 2 10 1112 1314 1516 17 18 19 20 21 22 23 24 25 2627 
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Figura 3. Representación de la distibución de mutaciones en el gen Rb1 en pacientes 
    
Lohmamn D. y col., 1996 
con retinoblastoma. En la parte superior las flechas rosas señalan la distribución de las 
mutaciones en la línea germinal, de Blanquet y co!, (1998) En la parte inferior se indica con fiechas 
verdes el espectro de mutaciones en la línea germinal de pacientes con retinoblastoma 
hereditario, datos tomados de Lohmann y col, (1996) Los números indican los exones en 
diferentes colores que representan los dominios de la proteína pRb mostrados en la Figura 2. 
L La proteína pRb producto del gen RB1, 
a). Propiedades de la proteina de retinoblastoma 
El conocimiento acerca de la función de proteínas nuevas algunas veces se puede 
encontrar en la secuencia de aminoácidos o de su DNA. Friend y col., (1986) desarrollaron 
comparaciones de secuencia con el cONA de Rb1 para investigar los dominios funcionales, su 
análisis encontró poca evidencia de una propuesta previa de la existencia de un sitio de unión a 
un metal y concluyeron que el gen Rb1 codifica para una proteina de un tipo no caracterizado 
(Friend y col, 1986) 
El producto del gen Rb1 se identificó con anticuerpos dirigidos contra tres péptidos 
sinteticos, cuya secuencia se dedujo de la secuencia del cDNA del gen Rb1 y contra una
15 
proteina de fusión TrpE-Rb que se expresó en E colí Los anticuerpos polictonales 
inmunoprecipitaron una proteína de 110 kD de células humanas normales, también detectada 
en otras especies de vertebrados. La proteína no se encontró en líneas celulares de 
retinoblastoma, lo que confirmó la pérdida de la función de ésta en retinoblastomas (Goodrich W 
D, y col, 1993) En 1987 Lee y col., prepararon antisueros de conejo contra una proteína de 
fusión y purificaron un anticuerpo anti-pRb que precipitó una proteína de 110 a 114 Kd. Esto dio 
como resultado el conocimiento de varias características importantes de la proteína pRb como: 
Primero, mediante el fraccionamiento subcelular de células marcadas con 35S-metionina 
en fracciones nucleares, citoplásmicas y membranales se demostró que el 85% de la proteína 
de Rb1 permanece en el núcleo, lo cual se confirmó además con tinción inmunohistoquímica 
con el anticuerpo antí-pRb. Segundo, cuando las células se marcaron con ácido fosfórico-32P, el 
anticuerpo anti-pRb inmunoprecipitó una proteína marcada con 32P idéntica a la proteína pRb 
(pp110RB) (Seriver Ch y col., 1995). Por lo anterior se considera que el producto del gen Rb1 es una 
fosfoproteína nuclear de aproximadamente 110 kd (Gale y col, 1990), con 17 sitios potenciales de 
glicosilación (Taya Y 1997) y un cierre de leucina codificado en el exón 20, indicado por la 
presencia de leucinas periódicas cada siete aminoácidos en una alfa helice que se cree 
importante para la dimerización de proteínas Además en la región que contiene los 
aminoácidos 663 a 716 existen 14 prolinas de los 54 que se encuentran en la proteína; esta 
región rica en prolina se ha observado en los oncogenes nucleares como, c-myc, y c-myb 
(Server Ch y col, 1995) 
Una serie de características del producto del gen Rb1 como; 1) la fosfomlación de la 
proteina, 2) la relación entre fosforilación y vida media (la vida media de la proteina no 
fosforilada es de al menos 6-12 horas, mientras que la pRb fosforilada tiene una vida media 
más corta) y su 3) distribución ubicua sugiere que pRb podría ser una proteína que se une al 
DNA en donde ejerce su actividad de supresor de tumor a través de la regulación de la 
transcripción de una variedad de genes celulares (Server Ch, y col, 1995; Goodrich, D.W, 1993). 
b). Caracterización estructural y bioquímica de la proteina pRB 
El dominio de la proteína pRb responsable de supresión de crecimiento celular abarca de 
los aminoácidos 395 al 876 y contiene tres sitios de unión a proteinas denominados dominio A, 
B y C como se muestra en la Figura 2 A estos dominios se pueden unir varias proteinas tanto 
celulares como virales que tengan la secuencia de aminoácidos LXCXE (donde X es cualquier 
aminoácido) La unión de este secuencia (LXCXE) es en los dominioss A y B, el factor de 
transenpción E2F se une a Jos domimos A/B y C; por otro tado C-Abl o Mgm-2 se unen al 
domimo C, La protema pRb también tiene una señal de localización nuclear (NLS) y un sitio
16 
consenso que es hidrolizado por la famiha de proteasas caspasa-3/ICE (entre los aminoácidos 
886 y 887) durante la respuesta a la muerte celular. Este sitio consenso se encuentra fuera del 
dominio de supresor de crecimiento celular, la hidrólisis en este dominio puede comprometer la 
función de protección de pRb contra la muerte celular (Figura 2). La unión de factores de 
transcripción a la proteína pRb probablemente sea la base funcional de ésta para regutar la 
expresión de genes y la proliferación celular. Dado el hecho de que a pRb se unen varios 
factores de transcripción, de esta manera coordina la regulación de algunos genes que son 
relevantes para el control del crecimiento celular (Wang y, 1997) 
Una de las propiedades que se han descubierto mediante la purificación de la proteína 
pPRb fué la capacidad para asociarse con columnas de DNA-celulosa. Usando la proteína de 
fusión trpE-Rb, Wang y col, (1997) demostraron que esta actividad de unión no específica al 
DNA fue intrínseca para la región carboxilo terminal de pRb, las proteínas de fusión que tenen 
los exones 19 al 27 se unen al DNA con alta especificidad mientras que las proteinas que no 
tienen esos exones tienen reducida la capacidad de unirse al DNA (Wang y col,, 1997) 
Otra propiedad bioquímica de la proteína pRb es su capacidad para formar complejos 
específicos con oncoproteínas producidas por algunos virus de DNA transformantes como son; 
el antigeno T (LT) de SV40, la proteína E1A tipo 5 de adenovirus de humano y la proteína E7 
de tipo 16 y 18 del virus de papiloma (Figura 3). Cuando las oncoproteínas se unen a pRb 
alteran sus funciones en el control del ciclo celular. Es importante saber que la oncoproteína LT 
se une específicamente a la forma hipofosforilada de pRb, el complejo LT-pRb solamente se 
puede detectar en fase G1 cuando solo la forma hipofosforilada está presente. Estas 
observaciones favorecieron la hipótesis de que la forma hipofosforilada de pRb inhibe la 
entrada a la fase S y la fosforilación o neutralización por unión a LT permite a la célula entrar 
esta fase (Stahl A y col, 1994) Por otro lado, se conocen los aminoácidos necesarios para la 
unión al antígeno T de SV40 y se ha observado que para la formación del complejo se 
requieren dos regiones distintas que incluyen los aminoácidos 394 al 571 y del 649 al 773. Por 
otro lado se requieren cuatro de ocho cisteinas que están dentro o cerca de esta región para 
una conformación especifica de la proteina para unirse a otra oncoproteina como la E7 del 
virus de papiloma. Estas regiones corresponden a las más frecuentemente mutadas incapaces 
de formar complejos con el antigeno T La estabilidad del complejo entre las proteinas virales y 
PRb varia, ya que se han reportado proteínas virales con capacidad de transformación débil, 
que forman complejos menos estables con la proteina pRb que las asociadas con mayor 
actividad transformante. Es posible que las proteinas virales de DNA inducen la transformación
17 
uniéndose a la forma activa de la proteína pRb, inhibiendo así su función normal de supresión 
(Galiie y col, 1990, Goodrich D VW, 1993) 
    
Conservatign 
DA 
  
Figura 3. Complejo de la proteína de retinoblastoma (pRb) con la oncoproteína viral E7, la 
cual frecuentemente se une a pRb y bloquea su función en este caso en cáncer cervical La 
intensidad del color verde indica la conservación de los aminoácidos en pRb y proteinas 
relacionadas 
El mecanismo de transformación por virus de DNA de tumor es más complejo que la 
simple inactivación de la proteína pRb, varios reportes indican que la unión a la proteína pRb no 
es suficiente para inducir la transformación de algunos virus de DNA, las proteinas 
transformantes además se unen a otras proteinas celulares como p53 que pueden ser 
importantes en el control del ciclo celular (Galte y col., 1990; Goodrich DW, 1993) 
C). Funciones de la proteína pRb 
El proceso de proliferación celular se puede subdividir en las siguientes etapas; latencia 
(GO), preparación para la replicación del DNA (Gú1), duplicación del DNA (S), preparación para 
mitosis (G2) y división celular (M) Existen vanos estudios, como el que se realizó en ratones 
mutados en ambos alelos del gen Rb1 (Rb1”7), que sugieren la existencia de tres funciones 
para la proteina pRb las cuales son 
1 Inhibición a la entrada de la fase S 
2 Supresión de crecimiento celular 
3 Proteccion contra la muerte
13 
1. Intubición a la entrada de la fase S y supresión de crecimiento 
La fase G1 del ciclo celular eucarionte contiene importantes puntos de chequeo 
(“chekpoints”) para continuar o salir de éste Estudios genéticos en levaduras han definido un 
punto control previo a la fase S, llamado “inicio”, en este punto la célula toma la decisión para 
continuar con la siguiente etapa del ciclo celuiar, por lo que el secuestro de factores de 
crecimiento antes del punto de restricción en G1 evita la entrada a la siguiente fase S y la célula 
queda en un estado de latencia, conocido come GO. Se sabe que pRb tiene un papel 
importante en un punto de restricción en la fase G1 ya sea para permitir que salga del ciclo 
celular o para demorar la entrada a la fase S (Goodrich, DW, 1993) 
La función de pRb en la inhibición a la entrada de la fase S, dependiente de E2F, es el 
mecanismo más eficiente; sin embargo la pérdida de esta función como en el caso de la 
mutante pRb-8581W que tiene una mutación puntual en el dominio B y por lo tanto no se une a 
la proteína E2F, no mactiva completamente la actividad de supresión de tumor, Debido a esto 
se propuso que existe otro dominio (C) que también tiene una función importante en la 
regulación del ciclo celular Otra evidencia de que pRb regula la entrada a la fase S es su 
expresión ectópica que induce prolongación de la fase G1 en diferentes tipos celulares Estos 
es apoyado por los reportes de fibroblastos dervados de embriones que tienen el gen Rbt+, 
los cuales tienen Una fase G1 más corta que los embriones Rb1*!*. Existen otras proteínas 
relacionadas a pRb como p107, p130 y la recientemente identificada RbF de Drosophila que 
también regulan a E2F y son capaces de inhibir la entrada a la fase S Además, la 
sobreexpresión desregulada de E2F estimula la entrada a la fase S e induce la transformación 
celular. La función estimuladora de E2F para entrar a la fase S se puede explicar por el hecho 
de que los sitios de unión a E2F están presentes en los promotores de algunos genes 
activados en G1/S, incluyendo la ciclina E y la cichna Á, que son esenciales para la 
estimulación de síntesis del DNA (Wang .., 1997) 
La mejor interacción caracterizada es la asociación de la proteina pRb con el factor de 
transcripción E2£, por lo que el posible papel de pRb está en la regulación de la transcripción 
de estos Originalmente se descubrió a E2F a través de su función en la activación del promotor 
E2 de adenovirus, además de que puede regular otros genes que son importantes para el ciclo 
celular debido a que el sitio de umón a DNA de E2F se encuentra en los promotores de genes 
como DNA polimerasa a, mbonucleótido reductasa, C-Myc, timidilato simtetasa y c-myb El 
complejo pRb/E2F se forma en las fases G1 y S del cicio celular, Hamel y col., (1992), 
demostraron que el adenovirus EllaE, c-myc y los promotores del gen Rol pueden ser 
reprmidos por la sobreexpresión del gen RbY, Para observar la represion, en cada caso se
19 
requiere que en el promotor de estos genes exista una secuencia de unión a E2F, la presencia 
de un sitio E2F en el gen Rb1 sugiere que la pRb puede regular su propia expresión. Estos 
resultados sugieren que la unión al promotor del gen Rbt convierte a E2F de un activador a un 
inhibidor de la transcripción (Hame! y col, 1992) 
Muchos investigadores se han dedicado al estudio de los mecanismos involucrados en la 
regulación de la proliferación celular por la proteína de retinoblastama pRb y han llegado a la 
conclusión de que la proteina tiene una función muy importante dentro del núcleo, en ta 
transducción de señales extracelulares para detener la multiplicación celular. La variación en la 
fosforilación de la proteina pRb durante el ciclo celular, su unión a oncoproteínas virales y 
asociación con proteínas regulatorias del ciclo celular sugieren que pRb puede afectar el 
crecimiento celular mediante el control de la fase S del ciclo cetular (Goodrich D W, 1993) 
Para determinar la función de pRb, se ha estudiado su estado de fosforilación durante el 
ciclo celular (Yen A, y col, 1994) En las fases tempranas de GO y G1, pRb se encuentra 
hipofosforilada (forma activa), la fosforilación de pRb ocurre entre las fases G1 y S y aumenta 
en las fases G2 y M (forma inactiva), cuando la célula termina la mitosis pRb se desfosfonila 
(Goodrich D W. 1992) Los diferentes estados de fosforilación de pRb durante el ciclo celular 
sugieren que pRb es un sustrato de los complejos CDK-cicina, la expresión, fosforilación y 
formación de los complejos CDK-ciclina durante la fase G1 tardía, están asociados a la 
inactivación de pRb, (Zhang K, 1994, Gibson T J y col, 1994), como es el caso de CDK2 que se une 
a pRb y la fosforila en serina o treonima in vivo, (Yamamoto M. y col, 1994) y CDK4-D fosforila a 
PRD in vitro (Hall FL y cof, 1993). Las Ciclinas E y D se acumulan en la fase G1 tardía y se 
expresan para fostorilar a pRb (Gibson T y y cof, 1994), mientras que la expresión de la ciclina A 
ocurre en la fase S temprana y en la fase G2, cuando pRb se encuentra hiperfosforlada, En 
general, las ciclinas D2 y D3 son más estables para formar complejos especificos con pRb que 
las ciclinas A y E (Hall F L ycol, 1993) 
3. Protección contra la muerte celular. 
Las células deficientes en la proteina pRb parecen ser más propensas a la muerte, esto 
se observó primero en embriones de ratón rb1” , en células que expresan oncoproteínas 
virales que alteran la función de pRb y en células que expresan mutantes dominantes negativas 
de pRb La muerte que resulta de la pérdida de pRb se puede bloquear por la eliminación de 
p53, ya que existe relación entre la pérdida de pRb y la activación de p53 a través de E2F-1. La 
sobreproducción de E2F-1, que es capaz de dirigir la entrada a la fase S, también conduce a 
apoptosis dependiente de p53 El complejo E2F-1/DP-1 (DP-1 es un heterodimero de E2F que 
funciona en asociacion con este factor de transcripción) induce la muerte celular y correlaciona
20 
con una acumulación de la proteína p53, sugiriendo que E2F-1 puede activar a p53 para inducir 
la muerte celular Para apoyar estos resultados Field S J., and col., (1996) encontraron 
bloqueo en la muerte de células de timo de ratón deficientes en E2F-1, sugiriendo que E2F-1 
tiene un papel fisiológico en muerte celular programada, la inhibición de E2F-1 puede además 
explicar la actividad anti-apoptótica de pRb (Field $ J and col, 1996) De hecho Kogan y col, 
(1995) demostraron que pRb tiene una nueva función que es la de suprimir la apoptosis, en 
este estudio trabajaron con líneas celulares deficientes en pRb en donde cuantificaron la 
viabilidad celular para demostrar que la radiación ionizante induce menos muerte celular en 
células que expresan pRb. Esta nueva función de la proteína de retinoblastoma tiene 
importantes implicaciones para el desarrollo normal y transformación neoplásica, que además 
requieren un estrecho balance controlado entre la proliferación y la apoptosis (Kogan H A D y col, 
1995, Wang y, 1997). 
La muerte celular programada resulta de la activación de una familia de caspasas (Martins 
L M y cof, 1997) de cisteina, como es el caso de las caspasas-1 (ICE) de mamifero y Ced3 de C. 
elegans, esta familla de proteasas está regulada por mecanismos desconocidos. Se piensa que 
los reguladores transcripcionales como p53, pRb y E2F-1 actúan upstream del gen de las 
caspasas (río arriba) regulando su transcripción. Una vez que se activan las proteasas éstas 
rompen sitios específicos de proteínas para matar a la célula, de manera interesante la proteína 
PRb contiene un sitio consenso de corte Ced3/ICE, DEADG situado en el extremo carboxilo que 
ocasiona que pRb sea degradada en células expuestas a drogas genotóxicas (Wang y. 1997) 
d). Interacciones celulares de la proteína pRb 
La presencia de un cierre de leucina en pRb sugiere que ésta puede interactuar con otras 
proteínas por medio de esta estructura. Varnos grupos de investigadores han observado 
interacciones de las familias de proteínas fos-jun y myc mediadas por el cierre de leucma (Gale 
B.L ycol, 1990) 
La unión de oncoproteinas virales a pRb y su consiguiente liberación sugiere que puede 
haber proteínas celulares que antagonizan la actividad de pRb Esas proteínas podrian ser 
secuestradas por pRb y mantenerse en una forma inactiva hasta que la tosforilación de pRb las 
hace disponibles para realizar su función normal dentro de la célula. Para determinar las 
regiones en el gen Rb1 que codifican para la unión de oncoproteinas virales y otras proteinas 
regulatorias, se generaron una sere de mutaciones con eliminaciones en diferentes regiones 
que codifican para esta proteina Los datos demostraron dos regiones distintas no contiguas en 
pRb necesarias para formar complejos con esas oncoproteinas, además se determinó que se 
requería una región espaciadora entre estos dos bloques para mantener la imtegridad de esta
21 
unión, la comparación de estas regiones de unión con las mutaciones más frecuentes en Rb1 
que ocurren de manera natural reveló una estrecha similitud (Server Ch y col, 1998) 
Se ha observado que la proteina pRb se une a otro tipo de proteínas celulares, como 
es el caso de las oncoproteinas. Los oncogenes que actuan de manera dominante son 
candidatos para ser regulados normalmente por el gen Rb1, por ejemplo, N=myc es un 
protooncogen que se expresa normalmente en etapas tempranas del desarrollo de múltiples 
tejidos, la amplificación genómica del gen N=myc primero ocurre en tumores 
neuroectodermales, incluyendo algunos tumores de retinobiastoma, y está asociado con mal 
pronóstico clínico en neuroblastoma (Gale 8 L y col, 1990) La proteína c-myc parece ser un buen 
candidato como antagonista celular de pRb ya que se localiza en el núcleo, se puede asociar 
físicamente con la pRb in vítro y la sobreexpresión del gen c-myc conduce a la célula a 
pronferación y bloquea la diferenciación. Esta posibilidad se ha confirmado ya que la co- 
Inyección de c-myc inhiben la capacidad de pRb de arrestar el ciclo celular, lo cual no sucede 
cuando pRb se comyecta con EJ-ras, c-fos o c-jun, por otro lado c-myc no mhibe la actividad de 
otros genes supresores de tumor Sí pRb y c-myc funcionan en la misma red regulatoria, 
entonces el fenotipo producido por la activación de c-myc podría ser similiar al fenotipo que 
resulta de la inactivación de la pRb (Goodrich, DW, 1993). 
J. Familia de proteinas de retinoblastoma 
Existe una familia de proteínas de retinoblastoma que están involucradas en el control de 
tres mecanismos del ciclo celular como son; a) proliferación celular, b) diferenciación yc) 
apoptosis. El producto del gen Rb1, la proteina pRb funciona como un transmisor crucial entre 
las señales celulares que controlan la proliferación y la maquinaría de transcripción nuclear Se 
ha reportado la existencia de dos genes celulares relacionados al gen Rb1, estos genes p107 
(RbL1) y PRb2 ó p130 codifican proteinas que son estructural y funcionalmente similares a la 
proteína pRb (Mulligan G, y col, 1998) 
Se sabe además que cada una de las oncoproteinas virales que se unen a pRb también 
interacciona con las proteinas celulares p107 y p130, la interación ocurre en un dominio de 
Unión bipartito (compuesto del dominio A y subdomimios B) que está muy conservado en la 
farmlia de proteinas de retinoblastoma (Mulligan G, y cof. 1998), 
El gen que codifica para la proteina p130 se localiza en el cromosoma 18 en la región 
16q12 2 (Claudio y col,1994), contiene 22 exones que se distribuyen sobre 50 Kb, tiene varias 
secuencias ricas en GC y sitios potenciales de unión a factores de transcripción. Frecuentmente 
la región 16912 2 se ha reportado delecionada o con pérdida de heterocigosidad (LOH) en 
varios tumores humanos de mama, ovario, hepatocelulares y carcinoma prostático (Bald A y col
22 
y carcinoma prostático (Bald A y col, 1996) Por otro lado, no se conoce la localización del gen 
que codifica para la proteína p107 pero se sugiere que podría estar en regiones cromosómicas 
que frecuentemente se encuentran delecionadas en algunos tumores (Jiang y col, 1997) Las 
proteínas p107 y p130 están estrechamente relacionadas ya que tiene una homología de -50% 
en cuanto al tipo de aminoácidos, con respecto a la proteína pRb, cada una tiene 30-35% de 
homología Los dominios A y B de la proteína pRb se encuentran conservados en las proteínas 
de p107 y p130. En contraste, ja mayoría de las secuencias fuera de estos dominios las 
secuencias espaciadoras que están entre los domimios A y B están conservadas entre p107 y 
p130 pero tienen poca similitud con pRb Las secuencias espaciadoras contribuyen a la 
capacidad de p107 y p130 para unirse a las ciclmas A-CDK2 y E-CDK2, aunque la función de 
estas interacciones no es muy clara, la demostración de que p130, p107 y pRb interaccionan 
con distintas proteínas proporciona el primer indicio de que la familia de proteínas de 
retinoblastoma podría tener funciones únicas (Mulligan G y col, 1998). 
Se ha demostrado que las proteínas pRb, p107 y p130 interactúan con otras proteínas 
celulares, pero aún no esta muy claro cuál de esas moléculas son blancos específicos para la 
regulación de la famila de proteínas de retinoblastoma in vivo. Aunque varias de estas 
proteínas se pueden asociar con cada miembro de esta familia, incluyendo MYC, desacetilasa 
de histonas (HDAC1), HBP1 y ciclinas parecen interactuar con un subgrupo específico de la 
familia, como se muestra en la Tabla 1 (Mufiigan G. y col, 1998),
Tabla |. Proteínas que se unen a la familia de proteínas pRb. 
 
 
 
 
 
 
   
Proteína de unión Función putativa pRb p107 p130 | Dominio 
LxCxE 
E2P1-E2F3 R, T. control del crecimiento + - - 
EZF4 R_T. control del crecimiento + + + 
E2FS R_T control del crecimiento - + + 
MYC R_T_control del crecimiento - + - 
Familta BRG Remodelación de la cromatina + + + + 
HDAC1 Remodelación de la cromatina + - ND + 
MDNV2Z inhibidor de p53 (TP53) + - ND 
ABL Tirosin cinasa + ND ND 
TES R_T_RNA Pol III + ND ND 
UBF R_T RNA Pol! + ND ND 
TAF250 R_T. RNA Pal II + ND ND 
Ciclinas A y E Regula actividad de COK - + + 
Ciclinas tipo D Regula actividad de COK + - - + 
HBP1 RT represión + - + + 
ELF1 R_Y iimfoide + ND ND + 
PU. R_T Iimtoide + ND ND 
Familia CIEBP R_T. estirpe especifica + ND ND + 
Miogenina MYOD1 | R T contro! miogénico + + ND 
ATFZ Regula la transoripción + ND ND             
Tabla l. Proteínas celulares que se han detectado asociadas con pRb, p107 y/o p130, 
además tembién se indican sus funciones putativas. La presencia de un dominio LxCxE, simmiar 
al de las oncoproteinas virales también se observa en algunas de estas proteinas Abreviaturas; 
ND= no determinada, Pol= polimerasa, X es cualquier aminoácido, RT= Regulación de la 
transcripción. Tomada de Mulligan G. y col., 1998. 
K. Genes supresores de tumor en otras enfermedades malignas 
a). Pérdida de heterocigosidad (LOH) en otros cánceres. 
El evento de LOH para el cromosoma 13 en retinoblastoma, ha sugerido el estudio de 
otras enfermedades malignas para tratar de localizar otros gemes supresores de tumor 
importantes en tumorogénesis, Cualquier locus génico involucrado comunmente en LOH en un 
tumor específico se debe considerar el posible sitio de un gen supresor de tumor, debido a que 
la LOH ocurre frecuentemente por recombinación mitótica, es posible precisar la localización 
precisa de estos genes El primer tumor que se examinó por LOH fue el tumor de Vilms, un 
tumor embrionario del riñón en donde está involucrado un locus autosómico sobre el 
cromosoma 11 que se le relacionó por deleciones citogenéticas en 11p13 y 11p15 (Stahl A y co! 
1994)
24 
b). Cambios somáticos en el gen Rb1 en otros cánceres. 
Uno de los primeros estudios sobre alteraciones del gen Rb1 en tumores que ho se 
asociaban al desarrollo de retinoblastoma, fue el carcmoma de células pequeñas de pulmón 
(SCLO). Los cambios estructurales en el gen Rb1 (20% de SCLC tienen mutaciones en el gen 
Rb1) y la alteración de expresión de este gen ya sea en la proteína o en el mRNA se 
observaron en líneas celulares de este carcinoma, lo que proporciona la base para concluir que 
la pérdida de la función de pRb es importante en el desarrollo de este tipo de tumor (Hensel Ch y 
col, 1990) En otros estudios realizados en carcinoma de células no pequeñas de pulmón 
(NSCLC) se han obtenido resultados similares en donde no se ha observado expresión de la 
proteína pRb en el 28% de NSCLC estudiados (Xu y y col, 1991) 
El osteosarcoma, el segundo tumor más común en pacientes con retinoblastoma 
hereditario, muestra LOH para el cromosoma 13 en el 70% de los casos en pacientes con o sin 
antecedentes familiares de la neoplasia. Cualquiera que sea el caso; el locus que predispone a 
sarcoma osteogénico está estrechamente relacionado con el desarrollo de retinoblastoma o las 
mutaciones en el gen Rb1 predisponen a otros tumores además de Rb (Gafie £ B, y col., 1990) 
Después de la clonación del gen Rb1, ha sido posible examinar varios tumores con 
anormalidades en éste. Friends y col., (1986) reportaron mutaciones somáticas en Rb1 en el 
20% de osteosarcoma y tumores mesenquimales, en pacientes con o sin predisposición a 
retinoblastoma. Además otros investigadores han encontrado mutaciones en el gen Rb1 en 
otras enfermedades como es el caso de cáncer de mama (Gale L. B y col, 1990) 
Además se han observado mutaciones en el gen Rb1 en otros tipos de tumor como 
sarcomas, carcinoma de células pequeñas del pulmón (Harbour J. W,, y coi, 1988: Hensel Ch y col, 
1990; Xu H. J., y col, 1991), astrocitomas (Tsuzuki T y col, 1998), osteosarcomas (Fnend S. H y col, 1986), 
cáncer de próstata (Bookstein R. y col, 1990) y cáncer de vejiga (Horowitz J M y col, 1990), además de 
leucemias. En estos tipos de cánceres la participación del gen Rb1 es casi siempre la 
consecuencia de mutaciones somáticas y probablemente es parte del proceso complejo que 
involucra varias etapas (Stah! A. y col 1994). 
L. Hipótesis molecular para la patogénesis del retinoma y la baja penetrancia de la 
mutación del gen Rb1 en algunas familias. 
Cuando los padres y parientes sanos de niños con retinoblastoma son examinados 
cuidadosamente, se observa que el 2% de éstos presentan lesiones retinianas estables con 
tres características distintivas; una masa gnsacea translúcida que se extiende de la retma hacia 
el humor vitreo, calcificación tipo “queso cottage" dentro de la masa, un pigmento epitelial y 
anormalidades coroidales. Debido a que estas lesiones, en pacientes que nunca han recibido
25 
ningún tipo de terapia, son muy parecidas a tumores tratados sucesivamente con radiación, 
originalmente fueron llamados como regresión espontánea de retinoblastoma, Esta terminología 
implicó un mecanismo de defensa del hospedero, por el cual un tumor maligno podría ser 
controlado por medios naturales. En 1981 Gallie B. [. y col, proponen el término de retnoma, 
éste y el retinoblastoma están estrechamente relacionados por el hecho de que el 50% de 
retinomas ocurren en individuos que tienen parientes que padecen de retinoblastoma, u ocurre 
en el ojo sano de individuos que padecieron retinoblastoma unilateral. Se pueden proponer al 
menos tres modelos genéticos para explicar la expresión variable del fenotipo de esta neoplasia 
en individuos en una familia en donde todos tienen la misma mutación germinal en el gen Rb1. 
Primero. Solamente los retinoblastos primitivos que tienen capacidad proliferativa son 
susceptibles a la transformación por mutaciones en el gen Rb1, las células retmianas 
completamente diferenciadas con poca o sin ninguna capacidad proliferativa no pueden ser 
transformadas, por lo que las mutaciones en uno de los alelos de Rb1 en retinoblastos no tiene 
efecto que se pueda percibir, ya que los niños con una mutación en Rb1 en la línea germinal 
tienen retinas normales Así los retinoblastos normales se diferencian progresivamente, 
perdiendo el potencial de renovación en cada división celular hasta que no ocurra otra división 
en adulto y la retina se desarrolla completamente. Las células con una mutación germinal M1 
(mutación 1) heredada, se diferencian normalmente, pero sí el otro alelo norma! también se 
pierde debido a una mutación somática M2 (mutación 2), se altera la capacidad de los 
retinobiastos para diferenciarse, de manera que cuando M2 ocurre en un retinoblasto primitivo 
se desarrolla el retinoblastoma (Gale L B, y col, 1990). 
Segundo. Diferentes mutaciones en el gen Rb1 pueden tener diferentes fenotipos, la 
iniciación de la neoplasia requiere pérdida total de la función de la proteína, sí la mutación 
germinal es una mutación con sentido equivocado, la proteína mutada puede conservar alguna 
función, en este caso, la naturaleza de la segunda mutación podría afectar el fenotipo de la 
célula (Galíe L 8, y col, 1990) 
También se puede considerar un tercer modelo, algunas proteinas pRb mutadas pueden 
conservar la capacidad de interaccionar solamente con algunas proteínas celulares Sí la 
proteína mutada tene alterada la capacidad para unirse a regiones regulatonas y por lo tanto 
no funciona, esto podría bloquear parcialmente a acción de la proteina pRb del alelo normal. 
En este caso, no se requiere la pérdida del alelo normal para el desarrollo de retmoma o 
retinoblastoma; esta anormalidad se puede considerar como una mutación “dominante 
negativa”. Debido a lo anterior varios autores han sugerido las siguientes modificaciones del 
modelo onginal de Knudson (1971) (a) las mutaciones en el gen Rb1 son necesanas pero no
26 
suficientes para inducir retinoblastoma, (b) algunas mutaciones en el gen Rb1 pueden conducir 
a penetrancia parcial debido a que las mutaciones no inactivan completamente la proteína pRb 
(Gallie L B. y col., 1990). 
De acuerdo a la mayoría de las estimaciones, el retinoblastoma tiene una penetrancia del 
80-95%, sin embargo existen familias que muestran múltiples recurrencias a través de 
portadores que tenen susceptibilidad de adquiir la neoplasia, estos casos representan más de 
la cuarta parte de las familias estudiadas por Briard- Guillemot y col (1974) (citado por Sthal A y 
col, 1994) Los retinoblastomas, considerados como benignos, podrían corresponder a 
expresividad reducida de la enfermedad en individuos que portan una mutación en el gen Rb1 
en una célula germinal Se han propuesto varias hipótesis para explicar las diferencias en 
penetrancia y expresividad como. la “mutación postergada” propuesta originalmente por 
Auerbach (1958) (citado por Sthal A y col, 1994) para explicar la baja penetrancia de mutaciones en 
el gen Rb1 en algunas familias y la “resistencia del hospedero” (Stah! A y col, 1994) 
a). Mecanismos cromosómicos de variaciones de penetrancia. 
La citogenética puede explicar algunas formas hereditarias de retinoblastoma transmitido 
por individuos no afectados. Strong L. € y col (1981) han descrito casos de inserción 
balanceada de un segmento 13q14 dentro de otro cromosoma, los análisis de las posibles 
combinaciones combinaciones cromosómicas en los gamentos explica que un individuo que 
porta una inserción balanceada produce cuatro tipos de gametos: 1) gametos normales, 2) 
gametos con una inserción 13q14, la cual genera cigotos que portan una trisomia parcial 
13q14, generalmente con un fenotipo normal. 3) gametos con una deleción 13q14 el cual 
conduce a cigotos portadores de una monosomia 13q14 y 4) gametos balanceados con ambos 
inserción y eliminación de 13q14 (Stan! A y col., 1994). 
El análisis de mutaciones en el gen Rbi ha explicado la etiología molecular del 
retinoblastoma con baja penetrancia. Sakai y col., (1991), describieron dos familias con baja 
penetrancia, éstas presentaban una mutación puntual en la región promotora del gen Rb1 que 
redujo la transcripción. Onadim y col., (1992), estudiaron dos familias de baja penetrancia una 
con una mutación germinal con sentido equivocado y otra con una mutación que podria 
interfenr con el empalme del exón 20, Se asume que ambas mutaciones generan una proteina 
PRb incompleta pero con función parcial de oncosupresor Dryja y col. (1993), han propuesto 
que la proteina mutada tiene una escasa función supresora de tumor. Sin embargo contrario a 
lo que propone Auerbach (1958) (citado por Stah! A y col 1994), Dryja y col, (1993), proponen que 
la genética del retinoblastoma de baja penetrancia posiblemente se podria explicar por el tipo
27 
de alteración en gen Rbi más que por resistencia del hospedero o por otros mecanismos 
especulativos, 
M. Origen parental de las mutaciones en el gen Rb1. 
En los casos debido a mutación del gen Rb1 en la célula germinal, las técnicas 
citogenéticas y marcadores polimórficos del DNA han demostrado el origen parental del 
cromosoma 13 mutado Al analizar los polimorfismos del brazo corto del cromosoma 13 (Drya T 
P y col, 1989) y los RFLP intragénicos, se demostró que la mutación germinal es de origen 
paterno Estos resultados fueron confirmados por Zhu X. y col., (1989). Estos estudios 
sugieren que existe una diferencia significativa en el origen parental del cromosoma retenido en 
tumores, debido a esto se concluyó que, primero no hay selección en las células somáticas 
para la retención de los alelos materno o paterno de acuerdo con otros datos de 
retinoblastoma. Segundo, las mutaciones en el gen Rb1 en la línea germinal parece que surge 
más frecuentemente sobre el alelo paterno que sobre el alelo materno. Esto indica que las 
mutaciones ocurren durante la replicación del DNA, debido a que el número de multiplicaciones 
celulares es mucho más alta durante la espermatogénesis que durante la ovogénesis, ya que la 
multiplicación de la ovogonia solamente ocurre durante un período corto del desarrollo fetal del 
ovario, esto es resultado de las diferencias entre la meiosis del espermatozoide y del óvulo. 
Entre las posibles hipótesis, la impronta genómica y exposición ambiental, hace al gen Rb1 
paterno más susceptible a las mutaciones durante el desarrollo (Zhu X y cof, 1989)
23 
IL. HIPOTESIS 
Debido a que sólo en el 5% de individuos con retinoblastoma se observa 
pérdida de material genético en la región 13q14 mediante análisis citogenético Es 
probable, que no se encuentren alteraciones citogenéticas en esta región cromosómica 
en los pacientes estudiados y que ta mayoría de mutaciones que se identifiquen en 
este trabajo sean de tipo puntual Por otro lado ya que la proteína pRb participa en la 
regulación del ciclo celular actuando como proteína supresora de tumor, se espera que 
no este presente en los tumores analizados 
Ill. JUSTIFICACION 
Debido a que en nuestro país, no existen reportes del tipo de mutaciones más 
frecuentes en el gen Rb1 en pacientes con retinoblastoma, es necesario realizar un 
estudio molecular que permita identificar el tipo de alteraciones en éste. La mayoría de 
alteraciones genéticas asociadas con el desarrollo de retinoblastoma son deleciones 
pequeñas o mutaciones puntuales en el gen Rb1, por to que es necesario implementar 
diversas estrategias que nos permitan analizar el tipo de mutaciones en éste, El 
conocimiento de esto permitirá iniciar las bases, para en un futuro proporcionar el 
diagnóstico molecular de retinoblastoma en individuos con susceptibilidad a adquirir la 
neoplasia, apoyando así al médico genetista para un mejoramiento en el 
asesoramiento genético
28 
IL HIPOTESIS 
Debido a que sólo en el 5% de individuos con retmoblastoma se observa 
pérdida de material genético en la región 13q14 mediante análisis citogenético. Es 
probable, que no se encuentren alteraciones citogenéticas en esta región cromosómica 
en los pacientes estudiados y que la mayoría de mutaciones que se identifiquen en 
este trabajo sean de tipo puntual. Por otro lado ya que la proteína pRb participa en la 
regulación del ciclo celular actuando como proteína supresora de tumor, se espera que 
no este presente en los tumores analizados 
IM. JUSTIFICACION 
Debido a que en nuestro país, no existen reportes del tipo de mutaciones más 
frecuentes en el gen Rb1 en pacientes con retmoblastoma, es necesario realizar un 
estudio molecular que permita identificar el tipo de alteraciones en éste. La mayoría de 
alteraciones genéticas asociadas con el desarrollo de retinoblastoma son deleciones 
pequeñas o mutaciones puntuales en el gen Rb1, por lo que es necesario implementar 
diversas estrategias que nos permitan analizar el tipo de mutaciones en éste El 
conotimiento de esto permitirá iniciar las bases, para en un futuro proporcionar el 
diagnóstico molecular de retnoblastoma en individuos con susceptibilidad a adquirir ta 
neoplasia, apoyando así al médico genetista para un mejoramiento en el 
asesoramiento genético.
IV. OBJETIVOS 
Conocer el tipo de alteraciones cromosómicas y de mutaciones en el gen Rb1, 
además de identificar la presencia o ausencia de la proteína pRb en cortes histológicos 
del tumor, en pacientes con retinoblastoma 
OBJETIVOS PARTICULARES 
+ Detectar aberraciones cromosómicas en Imfocitos de sangre periférica en 
pacientes con retinoblastoma 
+ Buscar mutaciones en diferentes regiones del gen Rb1. 
* ldentificar la presencia de la proteína pRb y su localización en cortes 
histológicos de ojos con retinoblastoma, por medio de inmunohistoquímica.
ESTRATEGIA METODOLOGICA 
  
  
OBTENCION DE LAS MUESTRAS 
  
  
30 
 
    
        
    
      
Sangre periférica Sangre periférica Tejido incluido Cortes histológicos 
con heparina con EDTA en parafina de la pieza ocular 
Estudio Extracción Extracción Inmunohistoquimica 
citogenético del DNA del DNA.         
LON ION 
 
  
Interpretaccion 
  del cariotipo   
Amplificación 
por PCR     
PCR-SSCP 
isotópico       
V/ 
  
Secuenciación 
     
  
  
Correlación entre 
1) Cariotipo y alteraciones en el gen Rb1 
2) Alteraciones en el gen RB1 e mmunohistoquímica   
Amplificación 
por PCR 
 
31 
V. SUJETOS Y METODOS 
A. Pacientes. 
Se estudiaron 19 pacientes con diagnóstico clínico de retinoblastoma bilateral o 
unilateral Estos pacientes se captaron a través del servicio de Oftalmología y Patología del 
Hospital de Pediatria del CMN Siglo XXI, IMSS Se contó además de la autorización por 
escrito para el análisis citogenético y molecular mediante una carta consentimiento del 
paciente o en su defecto por la persona responsable de éste. 
Criterios de inclusión 
a). Sujetos diagnosticados con retinoblastoma con o sin antecedentes familiares de la 
enfermedad 
b). Diagnóstico clínico, oftalmológico y patológico que confirme la neoplasia. 
En todos los casos se realizó la historia familiar y se elaboró el árbol genealógico 
correspondiente. 
B. Citogenética. 
a). Obtención de cromosomas en metafase de linfocitos de sangre periférica. 
El cultivo y la cosecha de los cromosomas se realizó mediante el método de Yunis J. 
(1976) con algunas modificaciones realizadas en el laboratorio de citogenética. Con la 
técnica de Viegas-Pequignot y Dutrillaux (Viegas y col, 1978), se obtuvieron cromosomas con 
bandas de alta resolución Los cromosomas de los linfocitos se obtuvieron de la siguiente 
manera. 
1) Se tomaron 2mi de sangre periférica por venipuntura y se les agregó 0.2ml de heparina. 
2) Se sembró por duplicado 1m! de sangre heparinizada en 4 mi de medio de cultivo McCoy 
(Sigma) complementado con 1 0 ml de suero fetal de ternera (Gibco), 0.05ml de antibiótico 
(10 Ul/mi pernellina y 10 ug/mi de estreptommcina), O 4mi de glutamina (Gibco) y 0.3mi de 
fitohemaglutinina (Microtab). Se incubó a 37*C, 
3) A las 48 horas se agregó metrotrexate a una concentración de 40 g/mi y se ncubó a 
37*C, después de 17 horas de incubación se lavó dos veces con 5 mi de medio de cultivo 
McCoy y el botón que se obtuvo se sembró en 5 ml de medio y 50jl de tmidina 1x10 * mM 
Incubando durante 5.30 horas a 37*C 
4) Posteriormente se agregó colchicina como inhibidor del huso mitótico (3011g/1) y se 
incubó a 37“C durante 15 minutos
32 
5) Se centrifugó 10 minutos a 2000 rpm y se descartó el sobrenadante 
6) El botón se resuspendió con 10 ml! de solución hipotónica (Cloruro de potasio 0.075 M) y 
se incubó 20 minutos a 37%C. 
7) Se centrifugó 10 minutos a 2000rpm y se descartó el sobrenadante. 
8) Se resuspendió el botón en solución de Carnoy (metanol:ácido acético 3:1), se hicieron 
varios lavados hasta que se obtuvo un botón blanco. 
9) En el último lavado se decantó hasta dejar de 0.5 a 1 0 ml de solución fijadora y el botón 
se resuspendió. Se dejaron caer vanas gotas del botón en portaobjetos limpios y 
desengrasados, los cuales se dejaron secar al aire y se fijaron a la flama para 
posteriormente teñirlos con Giemsa 
b). Obtención de bandas G en los cromosomas (Seabright 1971) 
1) Las laminilas se sumergieron durante 1 minuto en amortiguador de fosfatos (pH 6.8) 
(Na¿HPO, 0.025 M y KH,POy, 0 025 M) a 37% que contenía tripsina al 0.02%. 
2) Posteriormente las laminillas se enjuagaron en cloruro de sodio al 0.9% 
3) Se procedió a teñir con Giemsa al 2% en amortiguador de fosfatos (pH 6 8) de 4-7 
minutos, se enjuagaron con agua destilada y se dejaron secar al aire. 
4) Los cromosomas se observaron en un microscopio óptico a 100 X y se determinó el 
cariotipo del paciente, poniendo especial interés en el cromosoma 13 (región 13414) 
C. Aislamiento del DNA genómico humano a partir de leucocitos de sangre 
periférica. 
El DNA se obtuvo a partir de leucocitos provenientes de pacientes de retinoblastoma, 
siguiendo un método previamente descrito (Kempter, 1992) excepto que el DNA se punficá con 
extracciones fenólicas. 
1) Se obtuvieron 10 ml de sangre periférica por venipuntura y se mezclaron con 30 pl de 
EDTA 0.5 M (pH 8.5). 
2) Las muestras de sangre se centrifugaron a 3,500 rpm durante 15 minutos 
3) Posteriormente se recuperaron las células blancas de la interfase con una pipeta Pasteur, 
los eritrocitos remanentes que se encontraban en las células blancas se eliminaron a través 
de lavados con amortiguador de lisis de eritrocitos (Tris 10mM pH 7 6 MgCl, 5mM y NaCI 
10mM) y se resuspendió vigorosamente 
4) Se centrifugo a 3,000 rpm durante 10 minutos
33 
5) Posteriormente los leucocitos se lisaron agregando 886 td de NaCi 5mM y 48 ul de SDS al 
10% para lisar a las células. Esta mezcla se agitó vigorosamente durante 5 minutos 
8) Para precipitar las proteínas se adicionaron 308 pl de una solución saturada de NaCl! (493 
pl de NaCI 5 mM, 154 pl de NaC! saturado) y se centrifugó a 15,000 rom durante 30 minutos 
7) Se recuperó el sobrenadante y se le realizaron extracciones fenólicas con fenol 
cloroformo-isoamílico (25.24:1) (Maniatis y col 1989) 
8) El sobrenadante de la última extracción se transfirió a un tubo estéril y se le adicionaron 
dos volumenes de etanol absoluto frío (-20 *C), el DNA se dejó precipitar a -20 *C durante 30 
minutos. 
9) Se separó el DNA y se lavó con etanol al 75%, y se dejó secar a temperatura ambiente. 
10). Posteriormente se resuspendió en un volumen de 500 ul de agua destilada estéril y se 
conservó para su análisis a -20 "C. 
A todas las muestras obtenidas de DNA se les realizó un análisis espectrofotométrico 
mediante lecturas a 260 y 280 nm. La concentración del DNA se calculó con la siguiente 
fórmula: 
[DNA], (19/1l)=(A2gp) (dilución *)(0.05 ug/ul) 
sabiendo que 0.05 9/14 de DNA = 1 D.0 260 
La relación 260/280 indica la pureza del DNA obtenido, se considera que las relaciones 
comprendidas entre 1.8 y 2.0 unidades de D.O.7g) son las óptimas. Para determinar la 
integridad de las muestras se realizaron electroforesis en geles de agarosa al 1% en 
amortiguador de corrida TBE 1x ( Tris Base 54 g, ácido bórico 27.5 g y EDTA 465 g disolver 
y aforar a un litro quedando a una concentración de 10X) y para observar el DNA el gel se 
tiñó con bromuro de etidio (0.5 g/m) 
D. Aislamiento de DNA genómico humano a partir de tumor de retinoblastoma 
embebido en bloques de parafina (Wnght D y col. 1990) 
1) Se prepararon cortes del block con el tedo embebido de 5 a 10 um de grosor y se 
colocaron en tubos eppendorf esteriles de 1 5 mi
2) Se agregaron 200 ul de amortiguador de digestión (Tris HC! 50 mM pH 8.5, EDTA 1 mM, 
Tween 0.5%) y se homogenizó durante 5 minutos. 
3) El tubo se colocó en un baño maria a 55 *C durante 20 minutos para disolver la parafina y 
se centrifugó a 12,000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente 
4) Se retiró el anillo de parafina y se homogenizó, posteriormente se agregó protemnasa K a 
una concentración final de 200 ¡pg/mi y se incubó toda la noche a 42*C, 
5) Se centrifugó a 6,000 rpm durante 5 minutos. 
6) El sobrenadante se transfirió a un tubo estéril y se incubó a 95%C durante 8 minutos para 
inactivar la proteinasa K 
7) Para determinar la integridad del DNA se realizaron electroforesis en geles de agarosa al 
1% en amortiguador de corrida TBE 1x y posternormente el gel se tiño con bromuro de etidio 
(0.5 g/m). 
E. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de 6 regiones del gen Rb1. 
Se hicieron amplificaciones de diferentes regiones del gen Rb1 para determinar si en 
éstas existen mutaciones que involucren más de 20 pb que son lo suficientemente grandes 
para observarse en un gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio, 
Se analizaron los exones 3, 8 y 18 los cuales se han reportado más frecuentemente 
mutados y algunos autores han sugerido que podrían ser puntos calientes dentro del gen 
Rb1. Los exones 19, 20 que corresponden a las regiones codificadoras del dominio B de la 
proteína pRB y el exon 23 que codifica para el dominio carboxilo terminal de pRb además 
tiene dos sitios de fosforilación (Blanquet y col, 1995, Mancim D y col, 1997) 
Los 6 pares de oligonucleótidos utilizados se co-amplificaron de la siguiente manera" 
3/20, 8/18 y 19/ 23 Todas las reacciones de PCR se hicieron bajo las siguientes 
condiciones: DNA genómico 50-100 ng, 0.2 mM de cada uno de los dNTPs, 2.5 U de Taq 
polimerasa (Gibco-BRL), 20 pmoles de cada oligonucleótido, amortiguador de PCR (Tris-HCI 
20 mM pH 8.4, KCI 50 mM) en un volumen final de reacción de 20ul y por último se 
agregaron 40ul de aceite mineral La secuencia de cada oligonucieótido, el tamaño de los 
productos de amplificación y la temperatura de alineamiento se muestran en la Tabla !l.
TABLA ll 
Oligonucleótidos utilizados para la amplificación de las diferentes regiones del 
gen Rb1 
  
  
  
        
Región Secuencia del oligonucleótido Tamaño del producto 
en dirección 5' > 3' amplificado 
(pb) 
Exón 3se | GcG aat tot aac ata Gta toc aGt GiG tG 239 
Exón 3as | GcS aattcG ttt cot tit atG Gca GaG G 
Exón 8se | GcG aattca ttG tio tta tot aat tta cca e 241 
Exón 8as GcG aat tot aca tot asa tot act tta act G 
Exón 18se | GcG aat tca att atG ctt act aat GtG G 216 
Exón 18as | GcG aat toa Gtt iGa 1GG tea aca taa e 
Exón t9se | GcG aat tca act (Ga aat Gaa Gac tit toc 241 
Exón t9as | GcG aat tot aGt tte aGa Gte cat Get a 
Exón 205e | GcG aat toG act aat ttt tot tat tec cac 219 
Exón 20as | GcG aattoS aGG 2Ga Gaa GGt Gaa GtG e 
Exón 23se | GcG aat toa tGt aat GGG tcc acc asa ac 269 
Exón 23as | GcG aat tot tta cta ctt coc taa aGa | 
Secuencia de oligonucleótidos del gen Rb1, utilizados en la amplificación en cadena de 
la polimerasa. Reportadas por Lohmann D.R y col, (1994) se = oligonucleótido sentido, 
as = oligonucleótido antisentido. 
Todas las regiones se amplificaron bajo las mismas condiciones de PCR, las cuales se 
indican a continuación: 
1) Desnaturalización inicial de 94*C durante 5 minutos, 
2) 35 ciclos de desnaturalización (94 “C, 1 minuto), alineamiento (55 *C, 30 segundos) y 
extension (72 *C, 30 segundos).
36 
3) Extensión final 72 *C durante 5 minutos 
4) Los productos de PCR fueron analizados por electroforesis en geles de agarosa al 2% 
con TBE 1X como amortiguador de corrida teñidos con bromuro de etidio (0.5 g/m). 
F. Deteccion de polimorfismo conformacional de cadena sencilla (SSCP). 
Debido a que en nuestros pacientes no se detectaron mutaciones mediante PCR fue 
necesaño implementar otras metodologías que nos permitieran tratar de identificar mutaciones 
en el gen De manera que se procedió a establecer las condiciones necesarias, para realizar la 
detección de polimorfismos conformacionales de cadena sencilla (SSCP) mediante PCR 
isotópica. El empleo de la técnica de SSCP es de gran ayuda para la búsqueda de mutaciones 
debido a que el DNA de cadena sencilla tiende a plegarse y formar estructuras complejas 
estabilizadas por uniones intramoleculares débiles como los puentes de hidrógeno La 
movilidad electroforética de estas estructuras en geles desnaturalizantes depende no 
solamente de la longitud de la cadena, sino también de su conformación, la cual está dada por 
la secuencia nucleotídica (Glavac D y col, 1993) El SSCP es un método muy eficiente para la 
detección de mutaciones puntuales, debido a que tiene una sensiblidad del 80%, cuando son 
optimizados los parámetros que afectan la separación de un fragmento de DNA Glavac D. y 
col,, (1993) estudiaron el efecto de algunos parámetros que alteran la movilidad de las cadenas 
del DNA y como éstos pueden mejorar la eficiencia del método, tales parámetros fueron 
temperatura, adición al gel de agentes desnaturalizantes, compuestos neutros y cambio en el 
tamaño de! poro dado por la concentración de acrilamida (Glavac D, y col, 1993; Hayashi K y col, 
1993), 
En el análisis de POR-SSCP primero se amplifica por PCR una secuencia de DNA, para 
una detección eficiente del producto se incorpora una marca (isotópica o no isotópica) a la 
mezcla de reacción del PCR. El producto de amplificación resultante se desnaturaliza para 
disociar las cadenas y se analiza por electrofóresis en un gel de poliacrilamida (PAGE) (Hayashi 
K. y col., 1993) 
Para la detección de SSCP en este trabajo se realizaron PCR isotópicas bajo las 
mismas condiciones anteriormente mencionadas a excepción de la dCTP fria, la cual se 
agregó a una concentración de 0.02 mM, además también se agregó a la mezcla de 
reacción 2 Ci del isótopo a32P-CTP, Para este análisis también se co-amplificaron de la 
misma manera que para el PCR no isotópico mencionado anteriormente
37 
Procedimiento: 
1) Se preparó un gel de poliacrilamida para cada una de las condiciones electroforéticas 
mostradas en la Tabla Ml. 
2) Una alícuota de cada una de las muestras amplificadas por PCR isotópico se mezcló con 
colorante desnaturalizante (formamida 98%, EDTA 10mM, azul de bromofenol 0.1% y xileno 
ciano! 0.1%) en una proporción de un volumen de muestra por medio volumen de colorante 
3) Las muestras se desnaturalizaron a 100*C durante 10 minutos e inmediatamente se 
sumergieron en agua helada, es muy importante mantenerlas en estas condiciones para 
evitar que las cadenas de DNA se renaturalizen 
4) Se colocaron 5 ul de cada una de las muestras en cada pozo del gel y se sometieron a 
electroforesis utilizando como amortiguador TBE 1x, el tiempo de electroforesis se indica en 
la tabla 11l Es importante resaltar que estas condiciones de electroforesis son adecuadas 
para fragmentos de - 215-270 pb de las regiones en estudio del gen Rb1. 
5) Después de transcurrido el tiempo de electroforesis el gel se secó con vacío a 80%C, 
posteriormente se expuso a una película de rayos X (Kodak Ektascan EM-1) y se guardó a - 
70*C El tiempo de exposición dependió de la actividad del ¡isótopo
TABLA III 
Diferentes condiciones de electroforesis que se implementaron para la 
determinación de los SSCP's, 
  
  
Poliacrilamida Poliacrilamida | Poltacrilamida | Poliacrilamida 
8% 8% + glicerol 5% 6% + glicerol 
10% 10% 
Poliacritamida 40% 10 mi 10 mi 75m 75m 
TBE 5X 19 ml 10 ml 10 mi 10 mi 
Urea 219 219 21g 219 
Glicerol - 5m - 5ml 
Agua 15 ml 10 ml 17 5 mi 125 ml 
Persulfato de amonio 04m 04m 04 mi 04mi 
TEMED 301 30pl 301! 30p1 
Volumen fínal 50 mi 50 mi 50 ml 50 mi 
Watts de corrida 20 30 20 30 
Tiempo de 5 horas 7 horas 5 horas 7 horas 
electroforesis             
TEMED: N, N, N', Ntetrametiletlendiamina 
En todos los casos ta electroforesis se realizó a 4%C. 
G. Secuenciacion del DNA. 
La secuenciación del DNA usando terminadores marcados es un método rápido y 
conveniente para desarrollar las reacciones de extensión enzimática. Los beneficios de este 
método incluyen: 
+ Las reacciones se llevan a cabo en un solo tubo 
+» No se necesita desnaturalización alcalina para DNA de doble cadena. 
+ Seutiliza el mismo protocolo para fragmentos de DNA de cadena sencilla o doble. 
+ Senecesita menos cantidad del templado. 
+ Se obtienen resultados más reproducibles 
En este trabajo se utilizó el Kit BigDye (Perkin Elmer), este kit contiene la enzima 
AmpliTaqw» DNA Polimerasa, FS Esta enzima es una variante de la DNA pollmerasa de 
Thermus aquaticus que contiene una mutación puntual en su sitio activo, esto da como
39 
resultado una menor distinción contra los dideoxinucleótidos. Además esta enzima también 
tiene una segunda mutación en el dominio amino terminal que elimina la actividad de 
exonucieasa de 5' > 3". 
Los Biosistemas PE Applied han desarrollado un grupo de terminadores con una 
marca nueva de alta sensibilidad. Las estructuras de las marcas nuevas contienen una 
marca donadora fluoresceina, por ejemplo, 6-carboxifluoresceina (6-FAM), unida a una 
marca aceptora diclororodamina (dRodamina). El máximo de excitación de cada marca es la 
de la florescema donadora, y el espectro de emisión el del aceptor rodamina. 
La marca donadora está optimizada para absorber ta energía de excitación del ¡ión 
argón del láser en los instrumentos de secuenciación automática de DNA. La unión 
proporciona transferencia extremadamente eficiente de energía (eficiencia quantuma cerca 
del 1.0, p. e., 100%) entre las marcas donadora y aceptora Los terminadores BigDye"* son 2 
a 3 veces más brillantes que los terminadores normales 
Además los termimadores nuevos BigDye también tienen un espectro de emisión más 
estrecho que los terminadores normales, dando un menor sobrelapamiento de espectros y 
menos interferencia La señal más brillante y la disminución de la interferencia generalmente 
mejora la sensibilidad de 4 a 5 veces. 
Procedimiento: 
Se realizó amplificación por PER como se comentó anteriormente en las regiones de 
DNA de pacientes que mostraron alguna variación en la migración electroforética detectada 
por SSCP. 
a). Purificación de los productos de PCR. 
La purificación de los fragmentos se realizó de la siguiente manera: Todo el producto 
de PCR se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio 
(0.5 ug/mi) Posteriormente se corto el pedazo de agarosa que contenia el fragmento de 
DMA, la agarosa se colocó dentro de un microtubo, se sumergió en nitrógeno líquido durante 
10 minutos y se centrifugó 5 minutos a 15,000 rpm Se recuperó el sobrenadante y se le 
hicieron extracciones fenólicas, la última extracción se realizó con cloroformo-isoamilico 
(24:1) y la fase superior se transfirió a otro tubo y se precipitó con etanol absoluto, la pastilla 
se resuspendió en 30 ul de agua destilada. Para determinar la concentración, integridad y 
pureza del fragmento purificado, se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 2% 
teñido con bromuro de etidio (0.5 pg/ml) utilizando TBE 1X como amortiguador de corrida 
(Koenon, M 1989, Mamnants 1982)
40 
b). Extensión de la cadena. 
Para cada reacción se agregaron; 8ul de mezcla de reacción con los terminadores 
(Perkin-Elmer), 30 ng/u! del producto de PCR purificado, 20 pmol del oligonucleótido del 
exón que se analizó y se llevó a un volumen final de reacción de 20! con dH,O. La 
amplificación de la cadena se llevó a cabo en las mismas condiciones anteriormente 
mencionadas en el PCR no isotópico, 
c). Purificación de los productos de extensión. 
Se llevó a cabo usando columnas Centr-Sep (Princeton Separations), La columna 
previamente hidratada 2 horas antes con 0,8 ml de agua grado reactivo se centrifugó 3,000 
rem durante 3 minutos para eliminar el fluido, posteriormente se agregó la mezcla de 
reacción (201 ) BigDye en la parte superior del gel de la columna. La columna se colocó en 
un tubo colector de la muestra y se centrifugó 3,000 rpm durante 3 minutos, la muestra 
purificada se recibió en el tubo colector y se secó en una centrifuga con vacío La muestra 
seca se disolvió en 2 pl de una mezcla que contenía formamida desionizada y un 
amortiguador (EDTA 25 mM, pH 8.0 y azul dextran 50 mg/ml) en una proporción 5:1 Las 
muestras se desnaturalizaron a 90%C durante 5 minutos e inmediatamente se colocaron en 
hielo. 
d). Electroforesis en geles de secuenciación. 
Las muestras se sometieron a electroforesis en un gel de poliacrilamida preparado de 
la siguiente manera. 
1) Para un volumen de 50 ml se agrega lo siguiente; 18 g de urea (Promega), 5625 ml de 
poliacrilamida (acrilamida 40 % + bisacrilamida en una proporción 19:1), 28 ml de agua, 0.5 
mg de ambernlita para desióonizar y se dejó agitando durante 10 minutos. Posteriormente se 
agregaron 5 ml de amortiguador 10X (EDTA, Tris/Acido bórico) previamente filtrado. 
2) Esta mezcla se filtró, se agitó y se desgasificó con bomba de vació para eliminar el 
oxigeno. 
3) Se agregaron 250 yl, de los catalizadores (0 5 mg de persulfato de amonio + 500 ul de 
agua) el cual se preparó en el momento. 
4) Se agitó suavemente y se agregaron 30 ul de TEMED se mezcló suavemente y se 
procedió a llenar la cámara de electroforesis, 
5) Se procedió a colocar las muestras en los pozos y someterlas a electroforesis a 3 W 
durante toda la noche.
+ 
6) Las reacciones de secuenciación se analizaron en un secuenciador ABI PRISM 377 
(Applied Biosystems). 
H. Inmunohistoquímica de la proteína pRb 
a). Obtención de cortes histológicos. 
Las piezas oculares con retinoblastoma enucleadas, se obtuvieron de pacientes que 
acudieron al servicio de Oftalmología del Hospital de Pediatría del CMN $ XXXI. 
La pieza ocular con retinoblastoma se fijó en solución de formaldehído al 10% en 
amortiguador de fosfatos (NaHPOz, 04% y Na, PO¿, 065%), posteriormente las muestras 
se deshidrataron en etanol al 30%, 50%, 70%, 90%, 95%, 100% y se transparentaron con 
xilol para posteriormente incluinas en parafina. Se realizaron cortes histológicos seriados con 
un grosor de 3-5 micras en un microtomo y se montaron en portaobjetos tratados con potli-D- 
Lisina (Gibco-BRL). 
b). Inmunohistoquímica de la pRb en retinoblastoma 
Para asegurar la integridad del tejido, uno de los cortes de la serie se tiñó con 
Hematoxilina-Eosina (HE). La valoración de la expresión de la proteína a estudiar se llevó a 
cabo utilizando el anticuerpo monoclonal Ki-67 específico anti-pRb Para visualizar la 
presencia de la proteína, se utilizó el sistema DAKO-ENVISION, el cual produce una señal 
más Intensa que el sistema peroxidasa-anti-peroxidasa clásico, debido a que este sistema 
utiliza un polimero sintético que contiene más de 4 moléculas de peroxidasa unido a un 
anticuerpo primario. El anticuerpo monoclonal Ki-67 (1:50; DAKO Co.) anti está pRb dirigido 
contra 15 aminoácidos del dominio carboxilo terminal de la proteína pRb, éste se usó como 
un marcador de proliferación celular Este anticuerpo reacciona con células en todas las 
etapas el ciclo celular, excepto las que estan en fase GO La reacción con este anticuerpo 
sirve como Un indicador de la fracción celular en crecimiento, esto es el número de células 
que se están dividiendo El revelado se lleva a cabo por el método enzimático estándar de 
peroxidasa Diammobencidina (DAB), el cual produce un precipitado insoluble de color café 
en el sitio donde se encuentre la proteina 
A continuación se describe brevemente el desarrollo de esta técnica. 
1) Los portabojetos con el tejido embebido en parafina se incubaron a 60%C durante 30 
minutos con la finalidad de eliminar la parafina 
2) Las laminillas conteriendo los cortes se sumergieron en xilol durante 5 minutos (2 veces)
42 
3) Posteriormente se hidrataron pasando el tejido en etanol a diferentes concentraciones 
(100%, 90%, 70% y 30% durante 5 minutos cada uno). 
4) Las laminillas se sumergieron en PBS por 5 minutos 
5) Posteriormente se trataron con H,0, al 3% incubando 30 minutos 
6) Se lavó sumergiendo en PBS durante 5 minutos. 
7) Se agregó suero de burro al 10% para bloquear y se dejó por 30 minutos. 
8) Se elimino el suero y se agregó el anticuerpo primario, se continuó incubando durante 1 
hora en cámara húmeda. 
9) Las laminillas se lavaron en PBS tween 0.025% por 5 minutos. 
10) Posteriormente se lavaron en PBS por 5 minutos. 
11) Se agregó el polímero DAKO ENVISIÓN y se ncubó por 30 minutos en cámara húmeda 
12) La reacción se reveló usando 6 mg de DAB en 10 ml de PBS con 100 ul de HO, al 3% 
13) Se detuvó la reacción sumergiendo las laminillas agua durante 3 minutos 
14) La Contratinción se realizó con Hematoxilina de Harris. 
15) Se deshidrató en etanol a diferentes concentraciones (30%, 70%, 90% y 100%, durante 
5 minutos cada uno). : 
16) Se incubó en xilol 2 minutos posteriormente se agregó una gota de resina sobre el tejido 
y se colocó encima un cubreobjetos. 
Se incluyeron controles para la reacción de especificidad de la proteína pRb, estos se 
usaron como sigue: 1) La línea celular Saos-2 de osteosarcoma que tiene una eliminación 
homocigota del gen Rb1 no expresa la proteína pRb, ésta sirvió como control negativo 
Después de la transfección con el cDNA del gen Rb1 esta misma línea celular se utilizó 
como control positivo 
c). Observación de los cortes 
Los cortes de retinoblastoma se observaron a 10X, para ubicar la distribución del tumor 
en el corte ocular, una vez determinado el tumor se incrementó el aumento a 16X y 40X para 
observar con más detalle las células. Para las observaciones se consideraron los parámetros 
de diferenciación que consistieron en caracterizar al tumor como indiferenciado, si no 
presentaba células tumorales en arreglos particulares; diferenciado, si presentaba arreglos 
celulares del tipo de rosetas o con retina, si tenia porciones de ésta morfológicamente 
normal. El análisis semicuantitativo de la intensidad de la reacción de inmuno-tinción fue 
clasificada de acuerdo a lo reportado previamente por Terpe y cois (1994) y Simon y cols 
(1996) Sólo fue evaluado el epitelio que mostrara lesión patologica - ausencia de tinción
+ 
VI. RESULTADOS 
En las Tablas 4 y 5 se resumen las características generales de los pacientes 
estudiados, así como el resultado del cariotipo que se les realizó. A los pacientes con 
retinoblastoma que tienen antecedentes familiares de esta neoplasia se les elaboró el árbol 
genealógico, mostrados en la Figura 5. 
Mediante el análisis de los árboles genealógicos de las 19 familias con retinoblastoma 
estudiadas, se identificaron 16 sin antecedentes familiares ( de éstas el caso índice en 11 
presentó retinoblastoma unilateral y en 5 fue bilateral), y 3 con antecedentes familiares de la 
neoplasia (de éstas el caso índice en 2 presentó retiblastoma bilatera! y 1 unilateral) De los 
pacientes estudiados 8 corresponden al sexo femenino y 11 al sexo masculino, y la edad al 
diagnóstico de la neoplasia fué en promedio a los 34 meses 
A. Estudio citogenético 
El estudio citogenético se realizó cuando fue posible en los individuos afectados y 
familiares de primer grado, en total se analizaron 10 casos índice y 6 familiares de primer 
grado (Tabla 4). 
Se observaron 20 metafases de cada individuo eligiendo las que presentaban mediana 
o alta resolución, dando mayor importancia a la observación del cromosoma 13 en la región 
13914,2. En ninguno de los casos analizados (Tabla 4 y 5) se presentó alguna alteración 
cromosómica en la región 13q14.2, que pudiera observarse al microscopio óptico, 
En la Figura 6 se muestra el cariotipo de un paciente con retinoblastoma bilateral 
(familia Rb-14), en donde el par de cromosomas 13 no tienen alteraciones estructurales 
evidentes Unicamente el caso índice de la familia Rb-3 (tabla 5) presentó un complemento 
cromosómico anormal además de un polimorfismo en el cromosoma 1, su complemento 
cromosómico fue 47, XXY, var (1)(q12 GTG 44), var (1)(q12 GTG 14)
45 
Tabla 4. Datos generales de los pacientes con antecedentes heredofamiliares de 
  
  
        
la neoplasia. 
Familia Caso Edad al Dx Sexo Tipo de Rb Cariotipo 
años, meses 
Rb-7 Indice 3 6n2 M Bilateral + 
Madre infancia F Bilateral 48,XX 
Rb-13 indice 2 9/12 F Bilateral 46,XX 
Madre Infancia F Unilateral * 
Rb-16 indice 4 M Unilateral 40,XY 
Hermano 4 M Unilatera! 46,XY 
Hermano 3 M Unilateral 46,XY 
Padre Sin Rb M .. 48, XY 
Madre Sin Rb Í F >. 46,XX         
* 
No se dispuso de muestra para realizar el cariotipo 
** No desarrollaron la neoplasia. 
Edad = años 
F = Femenino 
M = Masculino 
Dx = Diagnostico
46 
Tabla 5. Datos generales de los pacientes sin antecedentes heredofamiliares de la 
  
  
  
  
  
neoplasia. 
Familia Caso Edad al Dx Sexo Tipo de Rb Cariotipo 
años, meses 
Rb-1 Indice 6 F Unilateral 48, XX 
Rb-2 indice 2 5112 M Bilateral 46,XY 
Rb3 Indice 9/12 M Bilateral +47 XX 
Rb-4 Indice 2 4112 F Unilateral 46, XX 
Rb-5 Indice 9 M Unilateral 48,XY 
Rb-5 indice 1 6112 F Unnateral 46, XX 
RES Indice 4 6112 F Unilateral + 
Rb-9 indice 1 1/12 M Unilateral : 
Rb-10 Indice 1 M Unulateral : 
Rb-11 Índice 7142 M Bilateral 46,XY 
Rb-12 Indice 2 2112 F Unilateral " 
Rb-14 Indice 2 512 M Bilateral 40,XY 
Rb-15 Indice 1 212 M Bilateral : 
Rb-17 Indice 4 F Unilateral + 
Rb-18 Índice 3 M Unilateral " 
Rb-19 Indice 5 5112 F Unilateral :               
F = Sexo femenino 
M= Sexo masculino 
* No se dispuso de muestra para realizar el cariotipo 
** El paciente Rb-3 presentó un complemento cromosómico 47, XXY, var (1)1(q12 GTG 
44), var (1)(q12 GTG 14). 
Edad = años 
Dx = Diagnóstico
a) Familia Rb-13 
b) Familia Rb-16 
OO 
0% 
O 
“ Es DDPLÉDODO ES 
     
 
  
11. 2.0,3 4. 5.06. 7
48 
c) Familia Rb-7 
Figura 5, Arboles genealógicos de las familias que presentaron antecedentes 
familiares de retinoblastoma. Caso índice 7 Retinoblastoma unilateral O El 
Retinoblastoma bilateral o Individuos que fallecieron por causa diferente a 
retinoblastoma Y KM No se tiene la información del tipo de retinoblastoma que 
padecen (unilateral o bilateral) oc. 2. Sexo no especificado. Y
49 
  
Figura 6. Metafase que representa el complemento cromosómico del caso índice de la 
familia Rb-14 el cual se reporta como 46, XY Al microscopio óptico se observan normales 
los cromosomas 13, la obtención del cariotipo se realizó de acuerdo a lo descrito en Sujetos 
y Métodos Aumento 100X
50 
B. Estudio molecuiar 
a). Búsqueda de mutaciones en el DNA de pacientes con retinoblastoma mediante co- 
amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se realizó la detección de 
mutaciones en el gen Rb1 de 19 pacientes no emparentados con retinoblastoma bilateral o 
unilateral. El DNA de linfocitos y de tumor se analizó mediante co-amplificación por PCR, 
para lo cual se utilizaron pares de oligonucieótidos que amplifican los exones de los 
dominios funcionales B y carboxilo terminal de la proteína como se menciona en Sujetos y 
Métodos (Blanquet V y col, 1995, Mancini D y col, 1997) 
Antes de realizar la amplificación por PCR, se verificó que las muestras de DNA 
cumplieran con los requerimientos necesarios para este estudio. Las concentraciones de 
DNA obtenidas fueron suficientes ya que se obtuvo en promedio de 200 a 400 ng/pl, la 
pureza fué de 1.7 a 2.0 unidades de absorbancia y el DNA que se obtuvo a partr de 
Iinfocitos de sangre periférica no mostró degradación después de la extracción como se 
observó en un gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio como se indica en Sujetos 
y Métodos. Sin embargo, las muestras de DNA extraido a partir del tejido tumoral, mostraron 
Una ligera degradación que se observó en el gel de agarosa, esto no afectó los estudios 
posteriores que se realizaron. 
Inicialmente se probó que cada uno de los oligonucleótidos funcionara de manera 
individual, posteriormente, se hicieron reacciones de PCR combinando varios pares de estos 
para amplificar más de un exón a la vez. Las combinaciones se hicieron tomando en cuenta 
el tamaño de los productos amplificados con la finalidad de distinguir el producto de cada 
reacción. Algunas combinaciones no funcionaron correctamente, ya que se obtuvieron 
bandas especificas O la ausencia de los productos de amplificación esperados. Finalmente 
se eligieron las combinaciones que co-amplificaron los exones 3/20, 8/18 y 19/23, en todas 
los casos se obtuvieron los productos de amplificación esperados, según sus pesos 
moleculares 
En la Figura 7 se observan los productos de la co-amplificación de los exones 
analizados (3/20, 8/18 y 19/23) que fueron sometidos a electroforesis en un gel de agarosa 
teñido con bromuro de etidio. En la Figura 7A se observa la co-amplificación de los exones 3 
y 20 del DNA obtenido a partir de sangre periférica y tumor de 3 pacientes con 
retinoblastoma En la Figura 7B se observa la co-amplificación del DNA obtenido a partir de 
sangre penférica y de tumor de los exones 19 y 23 de 3 pacientes con retinobtastoma y en la 
Figura 7C se observa la co-amplificación de los exones 8 y 18 del DNA obtenido a partir de 
sangre penférica y tumor de 3 pacientes, En cada uno de los casos se incluyó el producto de
31 
amplificación de un individuo sin retinoblastoma (control positivo). Mediante este análisis no 
fue posible detectar algún tipo de mutación en ninguno de los pacientes analizados,
7A 
Rb-2 Rb-4 Rb-11  Rb-12 
  
7B 
Rb-2.— Rb4  Rb-15 
7C 
Rb-2 Rb-4 — Rb-15 
Ex 9 (241) 
Ex. 18 (216) 
33 
Figura 7. Coamplificación por PCR de diferentes exones del gen Rb1, Se muestra la 
coamplificación del DNA de linfocitos y/o tumor de 5 pacientes con retinoblastoma, como se 
describe en Sujetos y Métodos. Una alícuota de 3] del producto coamplificado, se sometió a 
electroforesis en un gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio. En A se muestra la 
co-amplficación de los exones 3/20, en B los exones 19/23 y en C los exones 8/18 En 
todas las reacciones se incluyeron: un control positivo (+) y un marcador de peso molecular 
(M) (escalera de 50pb Gibco-BRL). S = DNA extraído de sangre periferica, Y = DNA extraído 
de tumor, el número corresponde al caso del paciente con retinoblastoma.
b). Detección de polimorfismos mediante SSCP 
Se establecieron las condiciones que permitieron mantener desnaturalizadas durante 
la electroforesis las dos cadenas de DNA amplificadas de los diferentes exones dei gen Rb1 
Para esto se probaron diferentes condiciones de electroforesis descritas en Sujetos y 
Métodos En la Figura 8 se muestra la amplificación del exón 8 del gen Rb4 de un individuo 
no afectado por retinoblastoma, observándose las dos cadenas de DNA separadas Una vez 
establecidas las condiciones de electroforesis para SSCP se procedió a someter las 
muestras de los pacientes a estas condiciones 
Las muestras de DNA de los pacientes (linfocitos y tumor) además se co-amplificaron 
mediante PCR isotópico utilizando 2 yCi del isótopo a32P-CTP 
En los casos índice de las familias Rb-2, Rb-8 y Rb-12 se detectaron polimorfismos 
mediante la técnica de SSCP, (Figura 9). En todos los casos se incluye un control sin 
polimorfismo cuyo patrón de migración sirve de referencia. 
El producto de amplificación del DNA de tumor del paciente Rb-2 mostró un 
polimorfismo en el exón 8 ya que su patrón de migración es diferente al producto de 
amplificación del DNA de un individuo sano (Figura 9A) 
En el paciente Rb-8 la muestra amplificada corresponde a DNA extraido de linfocitos 
de sangre periférica, el producto de amplificación con el polimorfismo correspondió al exón 
20 (Figura 9B). 
En el caso del paciente Rb-12 el DNA se obtuvo del tumor y la región que mostró el 
polimorfismo corresponde el exón 18 (Figura 9C) Es importante mencionar que se logró 
detectar los polimorfismos a diferentes condiciones de electroforesis ya que en algunos 
casos como en el paciente Rb-2 el polimorfismo se observó cuando se llevó a cabo la 
electroforesis en un gel de poliacrilamida al 8% + glicerol al 10% y en las otras condiciones 
mencionadas en la tabla 2 no se detectó éste, como se observa en la Figura 9B en donde 
las muestras se sometieron a electroforesis en un gel de pollacrilamida al 6% con glicerol al 
10% En el paciente Rb-8 se observó el polimorfismo en todas las condiciones probadas y la 
que se muestra en la Figura 8C corresponde a una electroforesis realizada en un gel de 
poliacnilacrilamida al 8% + glicerol 10%, en este caso fue más evidente el polimorfismo 
detectado que en el resto de tas condiciones electroforeticas para el paciente Rb-8. 
El resto de los pacientes analizados mediante esta metodologia no mostró algún 
polimorfismo en las regiones del gen Rb1 que se analizaron (Tabla 6 y 7 )
un
 
9]
 
Exón 8 [241 pb] 
  
FIGURA 8. SSCP isotópico del exón 8. Autorradiografía de un ge! de poliacritamida al 
8% en donde se muestra la amplificación del exón 8 del gen Rb4 de un individuo sano = (+)
36 
   
9A 
Ss e3z 
Exáón 8 , 
(241pb] 
Exón 18 
(216pb] 
9B 
se 
Exún 8 
(241pb) 
£xón 18 ¿ 
(216p] 
Figura 9, Detección de polimorfismos mediante SSCP en individuos con 
retinoblastoma. La extracción de DNA de linfocitos y de tumor se realizó como se describe 
en Sujetos y Métodos. Alícuotas de DNA de cada afectado se coamplificaron y 2ul del 
producto de PCR se sometieron a electroforesis en poliacritamida, como se describe en 
Sujetos y Métodos. En 9A se muestra el análisis de SSCP de los exones 8 y 18 del gen Rb1 
de pacientes con retinoblastoma, la autoradiografía corresponde a un gel de poliacrilamida al 
8% + glicerol al 10%. En 9B se muestra el análisis de SSCP del exón 20 del gen Rb1 de 
pacientes con retinoblastoma, la autorradiografía corresponde a un gel de poliacrilamida al 
8% + glicerol 10% En 9C se muestra el análisis de SSCP de los exones 8 y 18 de pacientes 
con retnoblastoma, la autoradiografía corresponde a un gel de poliacrilamida al 6% + glicerol 
al 10%. (+) = control sin polimorfismos en el gen Rb1, Y = banda polimórfica
Tabla 6. Resultados de SSCP de los pacientes con antecedentes heredofamiliares 
de ta neoplasia. 
  
  
  
Paciente SSCP de los exones: Tejido Tipo de Rb 
3,8, 18, 19,20 y 23 analizado 
Rb-7 NDP Sangre Bilateral 
NDP Sangre 
Rb-13 Bilateral 
NDP Tumor 
Rb-16 NDP Sangre Umlateral           
NDP = No se detectó polimorfismo en el gen Rb1 de los tejidos analizados 
Rb-7...Rb-16 los números indican la familta a la que pertenece el caso índice 
Rb = retinoblastoma
Tabla 7. Resultados de SSCP de los pacientes con retinoblastoma sin 
antecedentes heredofamiliares de la neoplasia. 
  
  
  
  
  
Paciente SSCP de los exones Tejido Tipo de Rb 
3, 8, 18, 19, 20 y 23 analizado 
Rb-1 NDP Sangre Unilateral 
Rb-2 Exón 20 (+) Sangre Bilateral 
Exón 8 (+) Tumor 
Rb-3 NDP Tumor Bilateral 
Rb-4 NDP Sangre Unilateral 
NDP Tumor 
Rb-5 NDP Sangre Unilateral 
NDP Tumor 
Rb-8 NDP Sangre Unilateral 
Rb-8 Exón 20 (+) Sangre Unilateral 
Rb-9 NDP Sangre Unilateral 
Rb-10 NDP Sangre Unilateral 
Rb-11 NDP Sangre Bilateral 
NDP Tumor 
Rb-12 NDP Sangre Untateral 
Exón 18 (+) Tumor 
Rb-14 NDP Sangre Unlateral 
Rb-15 NDP Sangre Bllateral 
NDP Tumor 
Rb-17 NDP Sangre Unmlateral 
Rb-18 NDP Sangre Unilateral 
Rb-19 NOP Sangre Unilateral           
NDP = No se detectó polimorfismo en el gen Rb1 de los tejidos anatizados. Rb-1. Rb-19 los 
números idican la famila que pertenece el caso indice, Rb = Retinoblastoma (+) = Se 
identificó un polimorfismo en el exón indicado.
60 
c). Secuenciación de tos productos de amplificación del gen Rb1 que mostraron 
algún polimorfismo detectado por SSCP. 
Después de analizar las muestras de DNA de 19 pacientes con retinoblastoma 
mediante co-amplificación por PCR no isotópica y SSCP-isotópico, se eligieron para 
secuenciación las muestras de DNA que mostraron algún polimorfismo detectado por SSCP 
Para esto primero se amplificó el exón de la muestra de DNA, el producto se purificó y se 
reamplificó mediante PCR asimétrico utilizando el Kit BigDye (Perkin Elmer), como se 
describe en Sujetos y Métodos 
En la Figura 10A se muestra la secuencia del exón 8 del paciente Rb-2, que presenta 
una mutación puntual que se generó por la inserción de una adenina en el codón 304 del 
CDNA del gen Rb1 (Tabla 8). Esta mutación provocó una cambio de una asparagina por una 
lisina, en el aminoácido 304 de la proteína La adición del nucleótido generó un codón de 
paro en la posición 316 del cONA en el exón 8 En este mismo paciente también se detectó 
otra mutación en el exón 20, el tipo de mutación fue una transversión de una guanina por 
una timina en el codón 704 del cONA del gen en estudio. Esta mutación generó un cambio 
de una alanina por una serina en el aminoácido 704 (Figura 10B). 
La secuenciación del polimorfismo identificado en el exón 20 del individuo Rb-3, se 
muestra en la Figura 10C. Se encontró una eliminación de una timina en la posición 702 del 
CONA, que corrió el marco de lectura generando un codón de paro en la posición 707 del 
CDNA (Tabla 8). La secuenciación del polimorfismo encontrado en el exón 18 del paciente 
Rb-12 se muestra en la Figura 10D. Se encontraron dos mutaciones en esta región, la 
primera es una eliminación de una timina en el codón 613 del cDNA esta mutación generó 
que se corriera el marco de lectura ocasionando el cambio de una serina por una histidina en 
la posición 613 de la proteína pRb, además esta mutación generó un codón de paro en ta 
posición 656 del exón 19. La segunda mutación que se observó fue un polimorfismo, debido 
a que el cambio de una timina por una guanina en el exón 18 generó un codón con sentido 
(Tabla 8)
61 
Tabla 8. Mutaciones identificadas en pacientes con retinoblastoma. 
  
  
              
Paciente Paciente Paciente Paciente Paciente 
2-Rb 2-Rb S8-Rb 12-Rb 12-Rb 
Origen del DNA | Tumor Tumor Sangre Tumor Tumor 
Exón mutado 8 20 20 18 18 
Tipo de | inserción transversión eliminación eliminación transversión 
mutación 
Nucleótido adenina guanma timina tirmina timina 
involucrado 
Codón mutado | aac=aaa,c | geo tec tat > tac tca > cac ott 
Aminoácido Asn -» Lys Ser > Ala Tyr > Tyr Ser > His Leu > Leu 
involucrado 
Posición del | 304 del cONA | 704 del cDNA | 702 del cDNA | 613 del cDNA | 840 del CONA 
codón mutado 
Codón de paro | 318 del cONA | No 707 del cONA | 658 del cONA | No  
10A 
3". GGCGAGGTCAGAACAGGAGT...5* 
Codón 304 
  
  
106 
Exón 20 ñ 
100 
3'TGTATCGGCTAGCCTATC .5' 
ñ Exón 20 
Codón 702 
  
10D 
A Exón 18 
Codon 613 
63
64 
Figura 10, Secuenciación de los exones que mostraron polimorfismo. Las muestras 
que presentaron alguna variación en la migración, con respecto al control durante la 
electroforesis en geles de poliacrlamida con el método de SSCP, se sometieron a 
secuenciación como se describe en Sujetos y Métodos En 10A se observa la secuencia del 
exón 8 del paciente 2-Rb. En 10B se muestra la secuencia del exón 20 del mismo paciente. 
En 10€ secuencia del exón 20 del paciente 8S-Rb En 10D secuencia del exón 18 del 
paciente 12-Rb Los * y fi indica la posición de la mutación. En cada una de las figuras se 
muestra la seuencia normal del exón y se indica la posición de la mutación
65 
C. Análisis inmunohistoquímico para la proteína pRb en retinoblastomas. 
a). Detección de la pRb en retinoblastoma 
La detección inmunohistoquímica de la proteína pRb se realizó en cortes histológicos 
de 8 retinoblastomas, 4 de ellos provinieron de individuos afectados bilateralmente y 4 de 
individuos con retinoblastoma unilateral (Tabla 9). De los tumores estudiados, 3 provenían 
de pacientes femeninos y 6 de pacientes masculinos. Como control positivo se utilizó la línea 
celular Saos-2 transfectadas con el gen Rb1, en la cual se observa tinción positiva para la 
proteína pRb (++++) (Figura 12) y una retina (sin retnoblastoma) de un individuo masculino 
de 4 años de edad (Figura 14). Como control negativo se utilizó la línea celular Saos-2 Rp” 
sin transfectar (Figura 13). 
b). Patrón de tinción de la retina normal 
En la Figura 14 se muestra el corte histológico del ojo normal observándose la retina 
en la cual se realizó la inmunohistoquímica para detectar la proteína pRb. La porción a 
corresponde a los segmentos externos o fotosensibles que son prolongaciones sinápticas de 
células fotorreceptoras, formadas de conos y bastones, esta capa no presenta núcleos por 
lo que no se observó tinción positiva para la proteína pRb. La capa nuclear externa b 
presentó tinción heterogénea de los núcleos de conos y bastones (Tabla 10) los cuales se 
tiñeron en su mayoría con Hematoxilina y por lo tanto fueron negativos para la detección de 
la proteína pRb, además también se observaron algunos núcleos que presentaron mediana 
tinción positiva (++) para pRb con respecto al control positivo (línea celular Saos-2 
transfectadas con el gen Rb1) (Figura 10). En c se observa la capa plexiforme externa que 
no presenta núcleos, es el punto donde hacen sinapsis los fotorreceptores con las dendritas 
de las células bipolares. La capa d corresponde a la nuclear interna que contiene los núcleos 
de las células gliales de Muller y los de neuronas horizontales o amácrinas en donde se 
observan algunos núcleos con tinción negatiwa (-) para la proteína pRb y la mayoría de éstos 
fueron positivos para la misma encontrando desde tinción mediana (++) a intensa (+++). En 
e se observa la capa plexiforme interna anucleada, es la región de contacto o intercambio 
sináptico entre células bipolares, amácrinas y ganglionares. En f se muestra la capa de 
células ganglionares que tiene los núcleos de estas células y vasos retinianos en la cual 
existen, pocos núcleos que en su mayoría mostraron tinción débil (+) para la proteina pRb y 
algunos, mostraron tinción negativa (-)
66 
e). Patrón de tinción en retinoblastomas 
En las Figuras 15 a 18, se observan la inmunotinción de algunos retinoblastomas con 
diferentes grados de diferenciación. 
En la Tabla 9 se observa que en los 8 tejidos tumorales analizados presentaron 
diferentes grados de diferenciación, los cuales fueron: tumor diferenciado en rosetas de 
Flexner Wintersteiner (casos Rb-2, Figura 15 y caso Rb-17, Figura 16), tumor 
medianamente diferenciado (casos Rb-3 y Rb-15) y tumor indiferenciado (casos Rb-4, Rb-5, 
Rb-11 y Rb-18 Figura 18) 
4) Tumores bien diferenciados. 
En el caso índice de la familia Rb-2 que presentó retinoblastoma bilateral se 
identificaron dos mutaciones en el gen Rbí una de elias en el exón 8 y la otra en el 20, 
ambas mutaciones se identificaron en el DNA del tumor. El tumor de este paciente presentó 
rosetas de Flexner Wintersteiner y el patrón de tinción para la proteína fué negativo 
indicando que la proteína no se encuentra en este tumor (Figura 15). El caso índice de la 
familia Rb-17 corresponde a un retinoblastoma unilateral, este caso también presentó 
diferenciación en rosetas de Flexner Winterstener, además no se identficó ninguna 
mutación en los exones analizados, el patrón de tinción para la proteína que va de mediana 
tinción (+++) a tinción intensa (++++) con respecto al control (línea celular Saos-2 
transtectada con el gen Rb1) indica que pRb se encuentra presente en el tumor (Figura 16). 
Este caso (Rb-17) se utilizó como control negativo interno para la inmunotinción el cual se 
muestra en la Figura 17. 
2) Tumores medianamente diferenciados: 
En el caso índice de la familia Rb-3 que presentó retinoblastoma bilateral no había una 
diferenciación total del tumor ya que se observaron células dispersas en el tejido y pocas 
rosetas de Flexner Wintersteiner, en este tumor se observó desde tinción débil (++) hasta 
ausencia de la misma (-) en comparación al control negativo. El caso índice de la familia Rb- 
15 también presentó retinoblastoma bilateral, el tumor no estaba completamente 
diferenciado y solo se observaron algunas células arregladas en rosetas, en la inmunotinción 
se observó tinción mediana (++), débil (+) y células que fueron negativas (-), (figura no 
mostrada). El estudio molecular en este paciente indicó que no existe mutación en los 
exones analizados
67 
3) Tumores indiferenciados: 
Los casos índice de las familias que presentaron este tipo de tumor fueron Rb-4, Rb-5, 
Rb-11 y Rb-18, de estos sólo el caso 11 presentó retinoblastoma bilateral y el resto fue 
unilateral. Los tres primeros presentaron diferentes grados de tinción desde ausencia de 
ésta hasta tinción débil, en el caso 18 se observó mayor tinción (+++,++++) también se 
observaron algunas células negativas (-), en estos tumores se observaron algunas células 
mitóticas (anafase) Figura 18. En este tipo de tumores no se observaron rosetas de Flexner 
Wintersteiner, por lo que las células se observan desorganizadas en el tejido tumoral. En 
ninguno de estos casos se identificó alguna mutación en los exones analizados del gen Rb1.
68 
Tabla 9. Observaciones de la tinción de pRb en los tejidos del tumor de 
retinoblastoma y su correlación con el análisis molecular. 
  
  
  
    
Paciente! | Tipo de ro? Mutación? Grado de | Patrón de 
Exones diferenciación tinción? 
32. 8 18 19 20 23 |deltumorf” 
Control Sin Retina 
Retinoblastoma Segmentos externos - 
Nuclear externa - HA 
Plexiforme externa - 
Nuclear interna TES 
Plexiforme interna - 
Células gangltonares ++ - 
Rb-2 Bilateral - + - - + - | Bien - 
diferenciado 
Rb-3 Bilateral - - - - - - | Medianamente +++ 
diferenciado 
Rb-4 Unilateral - - - - - - | indiferenciado het, + 
Rb-5 Unlareral - - - - - - | Indiferenciado +, - 
Rb-11 Bilateral - - - - - - | Indiferenciado ++ 
Rb-15 Bilateral - - - - - - | Medianamente + > 
diferenciado 
Rb-17 Unilateral - - - - - - | Bien +++ PH 
diferenciado 
Rb-18 Unulateral - " - - - - | Indiferenciado AAA Pob           
1) Rb-2. Rb-18 es la clave que se le asignó al tumor en estudio del caso índice correspondiente. 
2) Tipo de retinoblastoma se refiere a la forma en que se manifiesta la neoplasia unilateral o bilateral, 
3) Mutación identificada en los exones analizados, en este caso solo en el DNA de tumor del paciente 
Rb-2 se encontró una mutación puntual. 
4) Grado de diferenciación en el tumor indica la estructura del tejido que se observó en el tumor 
5) Patrón de tinción se refiere a la intensidad de ésta para la proteina pRb en las células, con respecto al 
control de la linea celutar Saos-2 transfectada con el gen Rb1, en donde el signo - indica que no hubo 
tinción de la proteina, + tinción débil, ++ tinción mediana, +++ tinción intensa. Cuando los simbolos 
están separados por comas quiere decir que la capa tuvo diferentes grados de tinción, ei orden de los 
simbolos presentan decrecientemente la predominancia de los mismos. 
En cl caso indice de la familias Rb-2 se identificaron dos mutaciones; una en el exón 8 y otra en el 
exon 20
69 
  
Figura 12. Control positivo para la inmunotinción en la línea celular Saos-2 Rb1** 
transfectada con el gen Rbi. La metodología se realizó como se indica en Sujetos y 
Métodos Se observan las células positivas para la presencia de la proteína, de manera que 
se le asignaron ++++ para esta intensidad de tinción. Aumento 40X. 
dl 
Figura 13. Control negativo para la inmunotinción en la línea celula Saos-2 RT” sin 
transfectar. La metodología se realizó de acuerdo a lo descrito en Sujetos y Métodos Todas 
las células se observan negativas para la inmunotinción Aumento 40X
70 
  
Figura 14. Inmunohistoquimica de una retina normal. La técnica se realizó como se 
describe en Sujetos y Métodos. Se observan las capas de la retina; a corresponde a los 
segmentos externos o fotosensibles fotorreceptoras, formadas de conos y bastones b Capa 
nuclear externa. En e se observa la capa plexiforme externa que no presenta núcleos La 
Capa d corresponde a la nuclear interna. En e se observa la capa plexiforme interna 
anucleada. En fse muestra la capa de células ganglionares, en donde se observan núcleos 
con diferente grado de tinción mostraron tinción débil (+), mediana (+++), intensa (++++) 
para la proteína pRb y algunos mostraron tinción negativa (-). Aumento 16X.
m 
  
Figura 15. Inmunohistoquímica de un retinoblastoma, Es un tumor negativo para la 
tinción en donde no se observa la proteina pRb. La técnica se realizó de acuerdo a lo 
descrito en Sujetos y Métodos. Este tumor muestra diferenciación en rosetas de Flexner 
Wintersteiner (RWF) con un patrón de tinción negativo para la pRb (-). Aumento 16X
7 
  
  
Figura 16. Inmunohistoquímica de un retinoblastoma diferenciado. Es un tumor que 
presenta tinción positiva para todas las células del tumor, observándose la disposición de las 
células en rosetas de Flexner Wintersteiner (RFW) características en este tipo de tumor, La 
intensidad de la tinción fué mediana tinción (+++) e intensa (++++). La técnica se realizó 
como se describe en material y métodos. Aumento 40X.
  
Figura 17. Control negativo para la inmunohistoquimica en un retinoblastoma. Es el 
mismo tumor que el de ta figura 15, en este caso no se utilizó el anticuerpo dirigido contra la 
proteina pRb, como se detalla en Sujetos y Métodos. Es un tumor diferenciado en Rosetas 
de Flexner Wintersteiner (REW), en las células no se observa la proteína pRb así que éstas 
fueron negativa para la tinción (-). Aumento 40X,
7 
  
Figura 18. Inmunohistoquimica de un tumor indiferenciado. Es un tumor en donde 
predominan las células positivas para la inmunotinción, la técnica se realizó de acuerdo a lo 
descrito en Sujetos y Métodos, Se observan diferentes grados de tinción; células negatvas 
(-), mediana tinción (+++) y tinción intensa (++++), Aumento 40 X.
VII Discusion 
A. Análisis genético y citogenético 
Los resultados obtenidos del análisis genético de los árboles genealógicos en las 19 
familias con retinoblastoma, revelaron que 16 de éstas no tenían antecedentes familiares, la 
neoplasia se presentó de manera unilateral en 11 familias y en las 5 restantes el caso índice 
presentó retinoblastoma bilateral. En las 3 familias que presentaron antecedentes familiares la 
forma bilateral afectó a dos casos índice y un caso se presentó de forma unilateral, es 
importante mencionar que ninguno de los casos índice tienen antecedentes familiares de otro 
tipo de neoplasias. De manera general se observó que el retinoblastoma unilateral se presentó 
en un 63% y el bilateral en un 34% lo cual coincide con lo reportado en otros paises incluyendo 
el nuestro, en donde la forma espóradica (no heredada) es unilateral de manera unifocal y 
representa el 60% de todos los casos de retinoblastoma. En la forma familiar generalmente 
ambos ojos están afectados y en algunos casos puede ser multifocal en cada ojo, además el 
tumor también puede ser tanto unilateral como bilateral, las formas hereditarias se presentan en 
el 40% de los casos ¡Stan! A. y col, 1994, Scriver Ch y col. 1995, Salamanca y col, 1984) 
Mediante el análisis citogenético de los pacientes analizados no se detectó alguna 
deleción en el cromosoma 13 región q14 1, esto correlaciona con los reportes que indican que 
solo en el 5% de los pacientes se puede observar deleción de esta banda por métodos 
citogenéticos, por lo que el tamaño de la población analizada es pequeña para observarse la 
deleción (Janson M. y col, 1994). 
a). Retinoblastoma unilateral. 
1) Familiar, 
De las 19 familias analizadas se encontró que en 12 de éstas el caso índice presentó 
retinoblastoma unilateral, al realizar el estudio genético de los árboles genealógicos de estas 
familias, se encontró que solo en la familia Rb-16 existen antecedentes heredofamiliares de la 
neoplasia (Figura 5). En esta familia el caso índice presentó retinoblastoma unilateral y tiene 
tres hermanos que también padecieron la enfermedad además de familiares con antecedentes 
de la neoplasia por vía paterna. En esta familia el alelo mutado se está heredando de manera 
colateral debido a que no hay transmisión directa del padecimiento de padres a hijos, pero sí 
existen más de dos individuos en la misma generación que la padecen como en el caso de tos 
individuos 1-1, 1-2, 1-9, MI-14; PV-2, IV-3, IV-5 y IV-6 de la famiia Rb-16 (Figura 5). Se puede 
sugerir que en esta familia los progenitores (indwiduos 1-4, li-6, 1-8 y 111-3) transmiten el gen 
anormal, el hecho de no manifestar el padecimiento corresponde a no penetrancia y se debe a
76 
que no se generó la segunda mutación en el gen Rb1, de manera que estos individuos son 
portadores del alelo alterado que viene segregando con la enfermedad, dando como resultado 
un tipo de herencia que se le conoce como “dominancia irregular” (Sorsby A., 1972; Carison E. y col, 
1979) El sujeto 1-2 debe presentar también la mutación ya que tiene descendientes afectados 
con sus dos esposas Como se puede observar en la Tabla 4 el cariotipo del caso índice y de 
sus hermanos con el mismo padecimiento (Figura 5) fue normal así como el de sus padres, por 
lo que se puede sugerir que de existir una alteración en el gen Rb1, ésta no es detectable por 
métodos citogenéticos (Cavenee W. y col, 1985) Solo en una pequeña proporción (5%) se ha 
reportado que tienen alteraciones cromosómicas (translocaciones entre otras) que involucran 
eliminación de la región 13q14,1 del cromosoma 13 que pueden observarse en el cariotipo 
(Janson M y col, 1994). De acuerdo a estos resultados se puede inferir que los individuos IV-2, IV- 
3, IV-4 y IV-6 de la familia Rb-16 tienen una mutación constitucional en el gen Rb1 que viene 
segregando por línea germinal. Es decir de acuerdo a la hipótesis de Knudson la primer 
mutación se dió en células germinales o durante la embriogénesis y la segunda mutación se 
generó en células somáticas de la retina. De esto se puede sugerir que el retinoblastoma 
bilateral se está expresando de manera incompleta debido a que los cuatro afectados lo 
presentaron de manera unilateral (Sorsby A, 1972), por lo tanto estos tienen una probabilidad del 
50% de heredar el alelo mutado a sus descendientes en los cuales puede ocurrir la segunda 
mutación en células de la retina dando como resultado el desarrollo de retinoblastoma (Knudson 
A, 1971) 
2) Esporádico 
Las 11 familias (Rb-1, Rb-4, Rb-5, Rb-S, Rb-8, Rb-9, Rb-10, Rb-12, Rb-17, Rb-18 y Rb- 
19) que también presentaron retinoblastoma unilateral pero sin antecedentes heredofamiliares 
se muestran en la Tabla 5, al no existir antecedentes familiares y presentar retinoblastomas 
esporádicos unilaterales, se puede inferir que estos pacientes desarrollaron la neoplasia por 
cualquiera de las siguientes causas: 
A) Debido a que los dos eventos mutacionales de novo se originaron en células 
somáticas. De ser así no hay nesgo de transmisión a sus descendientes (Sorsby A., 1972), 
B) Debido a una mutación que se dió en el embrión en las primeras etapas del desarrollo 
del afectado, en este caso habría riesgo de transmisión a sus descendientes sí la mutación 
afectó tambien las células gonadales (Carlson E, y col, 1979) 
C) El desarrollo de retmoblastoma pudo originarse por una mutación de novo en alguno 
de los gametos de los progenitores generando una mutación de tipo constitucional como 
consecuencia existe la posibilidad de transmitirla a los descendientes del afectado Este evento
7 
en particular se dá en el 15% de los individuos que presentan retmoblastoma unilateral y 
también se conoce como retinoblastoma bilateral que se está expresando de manera 
incompleta (Sorsby A, 1972, Carlson E. y col., 1979, Gallie B_L y col., 1990). 
D) Existe además otra posibilidad y es el hecho de que la mutación constitucional viene 
segregando por línea germinal en una familia, por lo que ésta se encuentra en alguno de los 
progenitores de manera que la descendencia de los individuos con esta mutación tienen 
predisposición al desarrollo de retinoblastoma. Esto se conoce como no penetrancia por lo que 
la expresión fenotípica del gen estaría reducida y como se mencionó anteriormente es un 
retinoblastoma bilateral que se expresa de manera incompleta. 
E) Se ha hecho menos énfasis en la posibilidad de mosaiscismo para la mutación inicial 
ya sea en el primer individuo afectado en una familia o en uno de los padres. El mosaicismo 
puede ocurrir cuando una mutación inicial en el gen Rb1 no se produce en todas las células 
durante la embriogénesis o no se encuentra en todas las células germinales (Sipel K y col, 1998) 
b). Retinoblastoma bilateral 
1) Familiar. 
Las familias que presentaron retinoblastoma bilateral fueron 7, de las cuales Jas familias 
Rb-7 y Rb-13 presentan antecedentes familiares por vía materna de acuerdo al árbol 
genealógico. En ambos casos el tipo de herencia de la neoplasia es de tipo autosómico 
dominante sin embargo se sabe que a nivel molecular es recesivo (Sorsby A., 1972, Carlson E y col, 
1979, Zhu X y col, 1989), ésta fué heredada por la madre del caso Índice que padeció 
retinobiastoma en su infancia (la madre del caso Rb-7 padeció retinoblastoma bilateral y la del 
caso Rb-13 fué de tipo unilateral). Debido a esto se deduce que el gen Rb1 alterado es 
constitucional, éste se encuentra en los gametos de las madres y viene segregando por línea 
germinal hacía su descendencia de manera que las madres de los casos indice le heredan la 
mutación generando heterocigosidad para este gen (Galie 8 £ y col, 1990, MumerL E y col, 1998) 
2) Esporádica. 
Las familias que presentaron retinoblastoma bilateral sin antecedentes fueron Rb-2, Rb-3, 
Rb-11, Rb-14 y Rb-15 (Tabla 5). Los casos índice Rb-2, Rb-11 y Rb-14 presentaron un 
cariotipo normal 46, XY, el caso indice Rb-3 presentó un cariotipo 47, XXY, var (1)(q12 GTG 
44), var (1)(q12 GTG 14) (Tabla 5). Esta nomeclatura indica que el individuo tiene 47 
cromosomas, el cromosoma extra es el X y su origen se debe a una no disyunción melótica 
paterna o materna, se acepta que en el 40% de los pacientes el cromosoma extra es de origen 
paterno mientras que el 60% su origen es materno En el cariotipo de este paciente se identificó 
además un polimorfismo en el cromosoma 1 en la región q12, GTG indica que se utilizó la
73 
técnica de bandas G por tripsina usando Giemsa. Los números 44 indican tamaño e intensidad 
de la banda polimorfica, para este caso se considera grande e intensa respectivamente. Este 
complemento cromósomico esta asociado al síndrome de Klinefelter descrito por primera vez en 
1942, este síndrome se caracteriza por disgenesia testicular, gonadotrofinas elevadas (FSH) y 
concentraciones disminuidas de 17-cetoesteroides en orina La azoospermia es un hallazgo 
constante en estos pacientes, lo cual explica el que sean estériles, la mayor parte de pacientes 
con este síndrome tienen desarrollo intelectual normal Sin embargo algunos presentan retardo 
mental moderado, el sindrome de Klinefelter se diagnostica generalmente en la pubertad, por lo 
que no es fácil identificar la enfermedad a edades pediátricas tempranas (Salamanca F_ 1990) 
La mayoría de los pacientes que presentan retinoblastoma bilateral no tienen historia 
familiar de la neoplasia por lo que se cree que se debe a mutaciones en células reproductoras 
de alguno de los progemtores o durante el desarrollo temprano del embrión (Zhu X y col, 1989), 
generando heterocigocidad en el gen Rb1, por lo que el individuo desarrolla retinoblastoma 
bilateral si ocurre la segunda mutación en células de la retina de ambos ojos (Knudson A, 1971), 
Además si tanto las células somáticas como gonadales están afectadas, las posibilidades de 
heredar el gen alterado a su descendencia son altas, como ya se ha discutido anteriormente 
(Zhu X y col, 1989, Naumova y Sapienza, 1994), 
En el momento de la concepción, con la excepción de la familia Rb-3 los padres se 
encontraban en una edad reproductiva adecuada lo que descarta que ésta pudiera estar 
influyendo en el desarrollo de retinoblastoma. El caso índice de la Rb-3 presentó retinobiastoma 
bilateral, esto sugiere que la primer mutación se generó en las etapas tempranas del desarrollo 
embrionario, o que se generó de novo en células germinales de uno de los progenitores. 
Existen reportes de algunos autores que sugieren que las mutaciones germinales en el gen 
Rb1 parecen surgir más frecuentemente en el alelo paterno que en el materno, generando 
individuos que llevan una mutación constitucional o heterocigocidad en este gen (en el 85% de 
los casos) (Carison E. y col, 1979; Galhe B. L y col, 1990, Mumer L F y col, 1994, Naumova y Sapienza, 1994, 
Sthal A y col., 1994: Mumier L F y col, 1998). Esto puede imdicar ya sea que la mutación del gen Rb1 
es más común durante la espermatogénesis que durante la ovogénesis, como un resultado de 
las diferencias entre la meiosis femenina y masculina ya que durante la espermatogénesis el 
número de divisiones celulares es mayor que en la ovogénesis Debido a que el genoma de 
espermatozoides, tiene un alto contenido de metilación comparado con el DNA hipometilado de 
los ovocitos, está más expuesto a desaminación espontánea de la 5-metileitosina generando 
mutaciones puntuales (transición) C 3 Ten los dinucleotidos CpG. Además se cree que los 
diferentes estados de metilación del DNA de espermatozoides y de los ovocitos puede persistir
ESTA TESIS M9 DEBE 
SAUR DE ¿A BIBLIOTECA” 
temporalmente en el cigoto y por lo tanto se puede generar una mutación preferencial paterna 
(Zhu X. ycol, 1989, Drye y col, 1989, Gallle L B y col, 1990, Naumova y Sapienza 1994, Kato Y M y col, 1994b, 
Drya T P y col, 1997, Mumier L F y col, 1998). Se debe considerar que las suposiciones con respecto 
al origen parental de las mutaciones que predisponen a retinoblastoma no están bien 
sustentadas ya que aún no se ha comprobado cual es el mecanismo que propicie una mayor 
frecuencia de mutaciones en los gametos masculinos. 
En retinoblastoma hereditario, diferentes estudios indican una transmisión preferencial 
paterna a su progenie del alelo Rb1 mutado, esto sugiere que existe algún mecanismo meiótico 
que favorece este fenómeno Girardet A., y col, trataron de investigar sí la alteración en la 
segregación de las células que portan el alelo mutante ocurre antes de la fertilización, sus 
resultados indican que la alteración en la segregación no ocurre durante la espermatogénesis 
por lo que proponen que después de la eyaculación, pudiera existir algún mecanismo que 
proporcione alguna ventaja a los espermatozoides portadores del alelo alterado, como una 
mejor movilidad que favorece la fertilización tal y como se ha visto en Drosophila (Girardet, A. y 
col, 2000). 
c). Edad de inicio del refinoblastoma 
En este estudio la mayor proporción de pacientes iniciaron el padecimiento desde recién 
nacidos hasta los 5 años de edad, lo cual corresponde a lo que se ha reportado en la literatura. 
De hecho la mayor incidencia reportada es entre recién nacidos y seis años de edad (Ortz 8 y 
col, 1996, Martinez R G y col.), sin embargo el caso índice de la familia Rb-5 manifestó la neoplasia 
a los 9 años (Tabla 5, Rb-5). En este caso el retinoblastoma se considera tardío aunque en 
ocasiones se ha reportado en adultos (Pam V A, y col, 1998, Scriver Ch R y col, 1995). Hasta el 
momento no se han sugerido mecanismos responsables que expliquen el desarrollo tardío de 
retinoblastoma y los estudios acerca de la embriogénesis del retinoblastoma son pocos, por lo 
que no se ha planteado una hipótesis al respecto. 
d). Proporción de sexos. 
En cuanto a la proporción de sexos en los pacientes con retinoblastoma se observó que 
de las 19 familias estudiadas (Tabla 4 y 5), 8 de los casos índice son del sexo femenino y 11 
corresponden al sexo masculino. A pesar de que se observó un ligero aumento en la proporción 
de individuos de sexo masculino que desarrollan retimoblastoma las diferencias no fueron 
estadísticamente significativas. En México existen algunos estudios que se han realizado con 
respecto a la proporción de sexos, Ortiz B. y col., (1996) y Marinez G R. y col. (1995) reportan 
que el retinoblastoma fue más frecuente en el sexo masculino independientemente de la edad, 
habiéndose obtenido una relación M/F de 1.6.1 0 (Ortiz B y col, 1996, Marmoz GR y col 1998)
80 
Para tratar de explicar la distorsión de la segregación en cuanto a la proporción de sexos 
en individuos que padecen retinoblastoma Naumova y Sapienza (1994) propusieron la siguiente 
hipótesis. Debido a que la distorsión de sexo involucra dos cromosomas diferentes (Y y 13 con 
la mutación en el gen Rb1), y ocurre entre la progenie de hombres, es probable que exista un 
proceso capaz de actuar en trans y dar sensibilidad al origen parental de los alelos, este 
proceso sería la impronta genómica. La hipótesis que se propone sugiere que los varones con 
retinoblastoma bilateral esporádico, son portadores de un gen defectuoso de impronta en su 
cromosoma X, debido a esto son incapaces de borrar la impronta materna y/o reestablecer la 
impronta paterna en la porción del genoma heredado de sus madres, además tienen alterado el 
gen Rb1 en uno de sus cromosomas. La descendencia de estos varones tendrá cuatro 
posibilidades; los dos embriones femeninos no sobrevivirán debido a que el padre afectado 
transmite su cromosoma X (el cual tiene ei gen defectuoso de impronta). Sólo serán viables 
aquellos que tengan un cromosoma Y y que además tienen un alelo Rb-1 alterado, lo cual se 
ve reflejado en ta desproporción de sexos y el desarrollo de retinoblastoma en los varones. A 
pesar de los resultados anteriores y de la hipótesis propuesta no existe algún reporte que 
confirme alguna preferencia en donde se vean afectados individuos del sexo masculino. 
B. Análisis molecular 
El retinoblastoma es un tumor embrionario del ojo que afecta a la niñez, es el prototipo de 
neoplasias en donde la predisposisión hereditaria juega un papel principal en la oncogénesis. 
Es causado por dos eventos mutacionales en el locus del gen Rb1. La presencia de mutaciones 
en el gen Rb1 en los afectados por esta enfermedad confirma que la alteración en este gen 
está asociada al desarrollo de retinoblastoma (Knueson 1971). Estas mutaciones constituyen casi 
el espectro completo de alteraciones genéticas, desde eliminaciones grandes hasta cambios en 
una sola base. Las mutaciones muestran una extensa heterogeneidad y se han identificado en 
la mayoría de los 27 exones del gen Rb1, que se distribuyen a lo largo de 183 Kb del DNA 
genómico (Hogg A. y col, 1993; Blanquet V. y col, 1993, Blanquet V. y col, 1994; Lohmann D y col, 1994, 
Blanquet y col, 1995; Lohmann D. y cof., 1998), 
En este trabajo se realizó el análisis molecular en el DNA de 19 pacientes con diagnóstico 
de retinoblastoma unilateral o bilateral. La importancia de conocer el tipo de mutaciones más 
frecuentes en este gen, se debe al hecho de que nos permite identificar la ubicación y 
frecuencia de mutaciones que predisponen a esta neoplasia en nuestra población sobre todo 
en los casos familiares, ya que esto nos permitirá aportar algún beneficio en el asesoramiento 
genético
81 
Con la finalidad de determinar el tipo de mutaciones en el gen Rb1 de los pacientes con 
retinoblastoma, se realizó la co-amplificación de los exones 3, 8, 18, 19, 20 y 23, de los cuales 
el 3, 8 y 18 se han reportado más frecuentemente mutados y algunos autores han sugerido que 
podrían ser puntos caliente dentro del gen Rb1. Los exones 19 y 20 corresponden a las 
regiones codificadoras del dominio B de la proteína pRb y el 23 es uno de los exones que 
codifica para el dominio carboxilo terminal que tiene dos sitios de fosforilación (Slanquet y col, 
1995, Mancni D. y col, 1997) El análisis de los diferentes exones se realizó con oligonucleótidos 
diseñados específicamente para unirse a los extremos de cada exón, permitiendo asi 
determinar la longitud de las eliminaciones genéticas y definir sí el marco de lectura del gen 
Rb1 está en fase o no, 
a). Detección de mutaciones grandes. 
En las muestras de DNA la amplificación por PCR no reveló mutaciones, posiblemente 
porque con la electroforesis en agarosa en donde se analizaron los productos de amplificación 
no se pueden detectar cambios menores de 20 pb. La proporción baja de detección de 
mutaciones mediante este método no es único para el gen Rb1. Esto refleja las dificultades del 
análisis mutacional en este tipo de genes grandes que tienen una extensa heterogeneidad 
mutacional, y que plantea la necesidad de implementar diversas técnicas para determinar las 
mutaciones. Desde la clonación del gen Rb1 en 1986, ta mayoría de las primeras mutaciones 
reportadas incluían alteraciones estructurales gruesas que eran detectadas a través de 
hibridación Southern en el 9-16% de los eventos responsables de la enfermedad (Friends y col, 
1988; Lee y col, 1987). 
Antes de que se realizaran varios estudios para tratar de identificar el tipo de mutaciones 
en el gen Rb1, habia pocos reportes de mutaciones puntuales, elminaciones pequeñas o 
inserciones. En tos casos familiares de la neoplasia, la transmisión de la enfermedad solo se 
podía seguir a través de análisis de ligamiento (RFLPs), sin embargo esta metodología es 
limitada ya que en el 75% de los casos de retinoblastoma las mutaciones son nuevas y los 
pacientes no tienen antecedentes familiares. Debido a esto los casos unilaterales también 
constituyen un problema para el asesoramiento genético ya que el 15% de estos son de hecho 
debido a mutaciones germinales (Janson M y col, 1994, Blanquet y col, 1993) En cuanto a los casos 
espóradicos, la prevención y el asesoramiento no podia plantearse de manera adecuada por la 
falta de conocimiento de las bases moleculares del retinoblastoma Todos los métodos 
previamente usados para la detección de mutaciones puntuales, son demasiado laboriosos 
para analizar un gen grande con una variedad tan alta de mutaciones como sucede en el gen
82 
Rb1, además se ha observado que casi todos los pacientes no relacionados tienen diferentes 
tipos de mutaciones (Blanquet V y col., 1993) 
b). Identificación de mutaciones 
La identificación de la gran variedad de mutaciones a lo largo del gen Rb1 se ha realizado 
con diversas técnicas (SSCP, DGGE y secuenciación directa) Los principales tipos de 
mutaciones que se han identificado en el gen Rb1 son; eliminaciones grandes en un 15%, 
alteraciones de pequeña longitud en un 26% y substitución de bases en el 42% (Lohmann D y 
col, 1996, Blanquet V. y col, 1995; Blanquet V. y cof, 1993; Lohmann D y col, 1994; Hogg A. y col, 1993) 
Se han realizado diversos estudios moleculares que permitieron conocer la frecuencia de 
mutaciones en el gen Rb1, como el realizado en el DNA extraído del tumor de pacientes con 
retinoblastoma en donde identificaron mutaciones del gen Rb1 en el 80% de los tumores. Por 
otro lado el análisis molecular en DNA constitucional en pacientes con esta neoplasia, 
proporcionó información acerca del espectro de mutaciones en este gen, encontrándose 
mutaciones en el 10-30% de los casos de retinoblastoma (Cowell K J y col, 1994, Janson M, y col, 
1994; Blanquet V y col, 1995), Debido a la gran heterogeneidad de mutaciones en el gen Rb1, es 
necesario realizar el análisis mutacional en pacientes con retinoblastoma, ya que nos permitira 
una adecuada predicción del riesgo en pacientes con retinoblastoma arslado. 
De los 19 pacientes analizados solo fué posible identificar polimorfismos en el DNA de los 
pacientes 2T-Rb, 12T-Rb y 85-Rb, las regiones que mostraron un polimorfismo corresponden a 
los exones 8, 18 y 20 respectivamente en el DNA de linfocitos o de tumor. 
El DNA de tumor del paciente 2T-Rb mostró un polimorfismo en el exón 8, esto indica que 
existe una mutación en esta región por lo que procedimos a secuenciarla El análisis de la 
secuencia indicó la adición de una adenina, generando un cambio en el codón normal de AAC 
al codón AAA en la posición 304 del cODNA y como consecuencia la mutación originó una Lys 
en lugar de una Asn. La mutación provocó que el marco de lectura se recorriera formando un 
codón de paro en la posición 316 del cDNA. Existen varios reportes de mutaciones en este 
exón, entre estos se han identificado cambios de Gly por Val en la posición 256 del cDNA, en 
este caso también se corrió el marco de lectura y se generó un codón de paro en la posición 
263. Otra mutación reportada en este exón es el cambio de Ser por Val en la posición 259 del 
CDNA, la alteración recorrió el marco de lectura dando un codón de paro en la posición 263 del 
CDNA (Lohmann D, y col, 1994) Un análisis extenso realizado por Lohmann y col., en 119 
pacientes con retinoblastoma bilateral indicó que la mayoria de las mutaciones identificadas 
conducen a la formación de codones de paro que impiden que se complete la traducción de la 
proteina pRb (Lohmann D- y col. 1998)
83 
Es importante mencionar que el análisis de SSCP en el DNA del paciente 2T-Rb sugería 
la presencia de otro polimorfismo diferente al detectado previamente, sin embargo éste no era 
constante en todos los análisis por lo que se pensó que existen diferentes líneas celulares, 
algunas de ellas con la mutación. Debido a esto se decidió confirmar sí realmente el 
polimorfismo en el exón 20 se debía alguna mutación, por lo que se procedió a secuenciarla. El 
tipo de mutación que se identificó fue una transversión A > T en el codón 704 del cDNA, que 
no generó un codón de paro, este tipo de mutación no se ha reportado en la bibliografía 
Debido a la presencia de dos mutaciones diferentes en este gen se dice que es heterocigoto 
compuesto para el gen Rb1 
El caso índice de la familia 2T-Rb presentó retinoblastoma bilateral sin antecedentes 
familiares, el hecho de ser bilateral indica que existe una mutación germinal que confiere 
predisposición hereditaria al retinoblastoma o que hubo una mutación de novo en el gen Rb1 
durante el desarrollo embrionario. La mutación del gen Rb1 puede ocurrir en una etapa tardía 
de la embriogénesis, dando como resultando una expresión variable de la neoplasia 
dependiendo del tejido afectado. Esto generó mosaicismo lo que evita la detección de la 
anomalía constitucional en Infocitos de sangre periférica (Munier F. L y col, 1998, Zucker J M y col 
1998). En nuestro paciente solo fue posible detectar las mutaciones en el DNA del tumor. De 
acuerdo a estos resultados se puede sugerir lo siguiente, cualquiera de las dos mutaciones 
puede ser de tipo constitucional y el hecho de no identificaria en linfocitos de sangre periférica 
se debe a que pudiera existir un mosaico para alguna de las dos mutaciones en este tipo de 
células, se especula esto porque según el tipo de retinoblastoma que se presenta debe existir 
una mutación constitucional. Se han realizado investigaciones en familias con retinoblastoma 
para detectar mosaicismo Los resultados indican que en -10% de ellas se encontró 
mosaicismo en al menos un miembro de la familia, sin embargo la proporción actual de familias 
con retinoblastoma con un miembro con mosaico es probable que sea más alto (Sippel K C y cof, 
1998), 
En 1979 Cartson y Desnik (1979) propusieron que el mosaicismo mutacional es la 
explicación de la expresión variable en pacientes con Retinoblastoma. De acuerdo a este 
modelo la expresividad reducida en pacientes que son mosaicos para una mutación que 
predispone a retinoblastoma refleja el hecho de que hay pocas células blanco para la segunda 
mutación. La incidencia de mosaicismo debería ser alta en enfermedades como retinoblastoma, 
debido a que una gran proporción de todos los casos representan mutaciones nuevas y el 
mosaicismo somático puede ocurir en un padre con un fenotipo normal, El mosaicismo es una
34 
causa establecida de variación fenotípica en la expresión de otras enfermedades genéticas 
(Sippel K. C y col, 1998). 
La experiencia indica que la frecuencia alta de mosaicismo en pacientes con 
retinoblastoma no se toma en cuenta por muchos consejeros genéticos. Cuando se proporciona 
asesoramiento genético a pacientes y miembros de la familia, frecuentemente no se hace 
énfasis al mosaicismo debido en parte a lo incierto en el riesgo de recurrencia que produce éste 
y en parte a la dificultad de explicar claramente con los principios de los genetistas la 
implicación del padecimiento a los pacientes con retinoblastoma no familiar (Sippel K € y col, 
1998, Siempre que se tenga un caso de retinoblastoma alslado, se debe tener en cuenta la 
posibilidad de mosaicismo para una mutación y así proporcionar un asesoramiento genético 
adecuado. 
Estudios previos que combinan datos de varios casos han encontrado que -45-50% de la 
progenie de pacientes con retinoblastoma bilateral sin antecedentes familiares desarrollaron 
retinoblastoma, estos datos llevan a conciuir que todos los pacientes afectados bilateralmente 
son portadores de la mutación en la línea germinal y que la no penetrancia ocasional de 
portadores explica la proporción insignificante de transmisión de menos del 50%. En estos 
estudios se describieron mosaicos en pacientes afectados bilateralmente que tuvieron una 
mutación inicial, que no se detectó en todos los leucocitos, probablemente en estos individuos 
existe una línea germinal con mosaico en donde hay células libres de la mutación y células 
portadoras de ésta (Sippel K C y col, 1998) También se han reportado pacientes con mosaicismo 
cromosómico, los cuales presentan eliminaciones 13q14.1 que causan el desarrollo de 
retinoblastoma, el porcentaje de linfocitos que tienen anormalidades citogenéticas cambian con 
el tiempo (Motegi y Minoda 1983). 
Otra mutación que se identificó por SSCP y se comprobó mediante secuenciación directa 
se encontró en el exón 18 en el DNA de tumor del paciente 12T-Rb. Este paciente presentó 
retinoblastoma unilateral y no tiene antecedentes familiares de la neoplasia, el tipo de mutación 
que se identificó fue eliminación de una timina en la posición 613 del cDNA, el codón normai 
TCA cambió al codón CAC por lo que hubo una cambio de una Ser por una His. Esta mutación 
corrió el marco de lectura generando un codón de paro en la posición 656 del cDNA, en la 
bibliografía aún no se ha reportado este tipo de mutación. Es importante enfatizar que tampoco 
se encontró mutación en los linfocitos del paciente Resultados similares fueron reportados por 
Lohmann y col (1997), en pacientes con retinoblastoma unifateral sin antecedentes familiares 
de la neoplasia, en donde identificó mutaciones (transiciones y eliminaciones) en el tumor pero
85 
no en tos linfocitos (Lohmann D y col, 1997) De manera que el hecho de no detectar alguna 
mutación en los linfocitos podría deberse a. 
1) La mutación constitucional se encuentra en exones diferentes a los analizados en el 
gen Rb1. 
2) Existe un mosaico para la mutación en los linfocitos del paciente, 
3) Las dos mutaciones se llevaron a cabo en las células de la retina, es decir ambas 
mutaciones son somáticas generando retinoblastoma unilateral esporádico, en este caso no 
existe una mutación constitucional. 
En este individuo (12-Rb) también se identificó otra mutación con sentido, ya que et 
cambio de CTT por CTG no alteró la codificación del aminoácido debido a que ambos codones 
codifican para leucina. 
El análisis de la mutación en pacientes con tumores unilaterales es importante debido a 
que ayuda a reducir de manera significativa el número de famillares en edad pediátrica que 
requieren vigilancia clínica debido al riesgo que presentan para desarrollar retinoblastoma. De 
manera que la investigación molecular en estos pacientes puede identificar portadores de 
mutaciones asociados con penetrancia incompleta y expresividad reducida para mejorar el 
conocimiento de la correlación genotipo-fenotipo (Ktutz M, y col, 1999; Gallie BL, 1997) 
Como ya se mencionó anteriormente, la enfermedad multifocal en pacientes sin una 
mutación en DNA de sangre periférica también puede ser causada por mosaico somático, en 
este caso se podría incluir al paciente 127, Lohmann y col., (1997) mencionan el caso de una 
paciente que fue enucleado a los 2.3 meses, se identificó un nuevo foco del tumor en el otro ojo 
a los 10 meses de edad. Esta paciente recibió, sesiones sucesivas de criocoagulación, para 
sorpresa de los autores, ambas mutaciones identificadas en la muestra del tumor enucleado no 
se detectaron en el DNA costitucional de sangre periférica o en células de origen cefálico. Un 
paciente similar con retinoblastoma bilateral, cuyo DNA de fibroblastos no mostró la mutación 
identificada en el tumor, también fue reportado por Shimizu y col., (1994). Debido a que se ha 
investigado la presencia de mutaciones en pocos tumores, es interesante encontrar 
proporciones altas que no se esperan de casos que sugieren mosaico somático. El mosaico 
puede contribuw a que se detecte en menor proporción mutaciones en DNA constitucional en 
pacientes con retinoblastoma unilateral esporádico, comparado con las mutaciones observadas 
en casos familiares (Lohmann D y col., 1997) 
Es muy importante tomar en cuenta que existe la posibilidad de mosaicismo en un caso 
de retinoblastoma unilateral sin antecedentes familiares, la ausencia de mutación en leucocitos 
no predice de manera confiable que no surgirán en el futuro tumores en el otro ojo, de manera
86 
que los niños con este tipo de retinoblastoma se deben examinar frecuentemente para detectar 
tumores que podrían surgir en el otro ojo. Los casos reportados por Lohmann y col., (1997) 
indican que cuando se identifica una mutación imicial en el tumor del primer ojo y el análisis de 
DNA de leucocitos no detecta la mutación, los niños tendrán el riesgo de desarrollar un tumor 
en el otro ojo, por lo que en base a estos casos, el riesgo estimado para desarrollar un tumor en 
el siguiente ojo es de -5% (Sippel K. € y col., 1998, Lohmann D. y col, 1997). 
El riesgo de que un paciente con retinoblastoma unilateral sin antecedentes familiares 
tenga células germinales mutadas y por lo tanto sea portador de la mutación puede ser mayor 
del 12%, sin embargo algunos de estos pacientes serán mosaicos. Las proporciones calculadas 
de cada tipo (88% no portadores, 12% portadores) se basó en estudios retrospectivos de los 
progenitores de pacientes con este tipo de retinoblastoma, con estos estudios se demostró que 
estos pacientes tienen un riesgo de recurrencia de retinoblastoma de 5-6% (Sippel K. C y col, 
1998) 
Carlson y Col., (1979) usaron el mosaicismo mutacional como un modelo para analizar el 
origen y transmisión del retinoblastoma. Los autores suponen que la variabilidad de penetrancia 
y expresividad en casos familiares, se debe a alelismo múltiple, que es generado por distintas 
mutaciones en familias con retinoblastoma con baja penetrancia. Además también sugieren que 
el mosaicismo mutacional puede explicar la expresividad variable observada en pacientes con 
la enfermedad unilateral esporádica. De acuerdo con este modelo, la expresividad reducida en 
pacientes que son mosaico para las mutaciones que predisponen al desarrollo del tumor, 
refleja que pocas células pueden ser el blanco para una seguna mutación (Lohmann D y col, 
1997). 
Generaimente la mutación en la línea germinal se puede heredar de manera dominante 
por un progenitor afectado ó puede ser transmitida como una mutación precigótica. Se pueden 
sugerir dos pronósticos en los pacientes con retinoblastoma que presentan mosaicismo 
mutacional: (1) el mosaicismo somático puede reducir significativamente la susceptibilidad al 
desarrollo del tumor y (2) el análisis de ligamiento indicara baja penetrancia. Para mejorar el 
asesoramiento genético y comprender los mecanismos fundamentales de expresión y 
penetrancia de retinoblastoma, se debe determinar la incidencia del mosaicismo además de su 
influencia fenotipica en retinoblastoma hereditario (Mumer L F y cof, 1998). 
Debido a la gran variabilidad en cuanto a la sensibilidad (26-83%), de varios métodos 
utilizados para la búsqueda de mutaciones en el gen Rbí, no es sorprendente encontrar 
mutaciones en solo el 33% de los casos como lo reportan Bianquet Y y col., (1995) y Lohmann 
D y col, (1996) En el presente trabajo se identificaron 5 mutaciones puntuales que fueron el
87 
único tipo de alteración que encontramos ya que no se identificó otro tipo de mutaciones que 
involucre más de una base nuleotídica, en todos los casos la mutación generó un codón de 
paro. Una posible explicación al hecho de identificar mutaciones en solo 3 pacientes, podría ser 
que no se detectaron otras mutaciones como polimorfismos (mediante SSCP) o las mutaciones 
se pueden encontrar fuera de los exones analizados del gen Rb1. 
Por otro lado debe tomarse en cuenta que existen otros mecanismos que pudieran estar 
involucrados en el desarrollo del retmoblastoma, como es el caso de una proteína diferente a 
pRb que pertenece a la familia de proteínas de retinoblastoma. Todos los miembros de esta 
familia comparten el dominio funcional que es muy importante para el control de la división 
celular. 
Nuestros resultados sugieren que el mosaicismo puede ser un fenómeno frecuente, 
debido a que interfiere con la expresión y transmisión de retinmoblastoma el mosaicismo 
mutacional somático puede causar expresión atenuada y esto unilateralidad o no penetrancia. 
Del mismo modo, el mosaicimo germinal puede explicar la no penetrancia ya que la mitad de la 
progenie de individuos con este mosaicismo heredan la susceptibilidad de desarrollar 
retinoblastoma. Este hecho se debería tomar en cuenta para calcular el riesgo de recurrencia 
de retinobtastoma, especialmente para fundadores masculinos en familias afectadas 
unilateralmente. De hecho se sabe que existe poca correlación establecida entre el tipo de 
alteración en el gen Rb1 y el desarrollo fenotípico de la enfermedad (Munier L y col., 1998), 
Es importante dar un buen asesoramiento genético, por lo que se debe implementar el 
análisis molecular del gen RB1 de manera rutinaria en todos los pacientes con predisposición a 
retinoblastoma. Sin embargo se debe dar prioridad en primera al diagnóstico clínico temprano 
caracterizado por teucocoria y estrabismo reportado por los padres. Es importante el 
diagnóstico temprano de retinoblastoma para conocer el pronóstico de la visión y la 
sobrevivencia, como consecuencia, son necesarios los exámenes oftalmológicos repetidos en 
familiares pediátricos de niños con retinobtastoma. En el retinoblastoma hereditario el 
conocimiento de una mutación en la linea germinal del individuo permite de manera adecuada 
predecir el riesgo para los familiares, por otro lado es importante iniciar en los pacientes los 
primeros análisis moleculares del gen Rb1 para identificar alteraciones en el mismo. Debido a la 
presencia de mosaicismo en algunos pacientes, es necesario el análisis de DNA de células de 
tumor y de células constitucionales para confirmar o excluir retinoblastoma hereditario en 
pacientes con retinoblastoma unilateral. 
En lo que respecta a las propiedades de la proteina en relación al fenótipo del 
retinoblastoma, Otterson y co!., (1999) estudiaron las propiedades funcionales de una proteina
88 
pRb mutada (712R) en el dominio pocket relacionada con el fenómeno de baja penetrancia 
Observaron que ésta tiene propiedades bioquímicas similares a otras proteínas mutadas (480 y 
661W), incluyendo la capacidad de fosforilación mediada por ciclinas. La identificación de 
alelos Rb1 con este tipo de mutación en la línea germinal de familias con penetrancia 
incompleta de retinoblastoma familiar, es el primer ejemplo de una relación genotipo-fenotipo 
dentro del gen Rb1 que relaciona resultados clínicos con análisis bioquímicos. Desde una 
perspectiva bioquímica, estos resultados enfatizan la importancia en el cuidado del 
asesoramiento genético de pacientes que presenten retinoblastoma unilateral espóradico, ya 
que ellos pueden tener una mutación germinal en el gen RD? (Otterson A G ycol, 1999) 
Para dirigir las bases moleculares hacía la explicación de la baja penetrancia, se han 
estudiado las propiedades bioquímicas de tres alelos de baja penetrancia que corresponden al 
sitio donde hay un cambio en un aminoácido localizado en el dominio pocket de pRb 
especificamente entre los dominios A y B. Los resultados sugieren, que la inactivación parcial 
de mutantes de baja penetrancia pueden reflejar la supresión de tumor de Rb mediada por el 
dominio "pockets” específico de unión a proteínas celulares diferentes al factor de transcripción 
E2F1 que están relacionados con la diferenciación celular (Otterson y col., 19989) 
En el DNA de Hinfocitos del paciente 8S-Rb también se identificó un polimorfismo 
mediante SSCP en el exón 20 que corresponde a una eliminación de una timina que originó el 
cambio del codón TCT por TAC en la posición 702 del cDNA, en este caso el codón mutado 
codificó para el mismo aminoácido, pero se recorrió el marco de lectura y se generó un codón 
de paro en el codón 707. Este paciente padeció retinoblastoma unilateral sin antecedentes 
familiares de esta neoplasia, no fue posible realizar el estudio molecular en el DNA del tumor 
debido a que el paciente respondió favorablemente a la quimioterapia y no se le enucleó el ojo. 
En base a estudios anteriores en este tipo de pacientes que muestran retinoblastoma unilateral 
sin antecedentes familiares se ha estimado que existe la probabilidad de que el 1.7% sean 
portadores de una mutación germinal (Lohmann O. y cof, 1997), No se ha reportado esta mutación 
en el exón 20, pero se han reportado diversos tipos de mutaciones (germinales) con sentido 
como: el cambio de una Val por una Glu en el codon 654 del cDNA, cambio de una Gin por una 
Pro en la posición 685, mutaciones fuera de fase con una duplicación de 5 bases en la posición 
679 del cDNA (Blanquet y col. 1995) Para definir la frecuencia y naturaleza de mutaciones 
constitucionales en retinoblastoma unilateral esporádico, Lohmann y cal, (1997) analizaron el 
DNA de tumores y Iinfocitos de sangre periférica, encontraron mutaciones en el exon 20 que 
comprenden mutaciones puntuales como el cambio de C por T en la posición 1982 del cONA 
generando el cambio de Arg por Trp en la posición 661 del cONA, una insersion de 100 bases
89 
en la posición 2065 del cCODNA que generó un codon de paro en la posición 700 del cDNA, y una 
eliminación de una T en la posición 2084 del cDNA lo que provocó la formación de un codón en 
la posición 704 de cCDNA (Lohmann y col., 1997) 
En el presente trabajo se utilizó SSCP para identificar polimorfismos en 19 individuos que 
padecen de retinoblastoma, las mutaciones se confirmaron mediante secuenciación y tas 
mutaciones puntuales fueron el único tipo de alteración que encontramos, esto coincide con los 
reportes acerca del espectro de mutaciones reportadas en el gen Rb1, la mayoría de las 
alteraciones identificadas son mutaciones puntuales y generan terminación prematura de la 
traducción (Lofmann y col, 1994) 
C. Análisis Inmunohistoquímico. 
En este trabajo se analizaron 8 cortes histológicos de retinoblastomas (tabla 12) en los 
cuales se determinó la presencia o ausencia de la proteína pRb mediante inmunohistoquímica . 
a). Inmunohistoquimica de tejido normal 
En el corte histológico del ojo normal donde se realizó la Inmunohistoquimica (Figura 13) 
se observó heterogeneidad de la tinción para la pRb en las capas nucleadas de la retina. La 
capa nuclear externa que se compone principalmente de núcleos de células fotorreceptoras, 
presentó tinción heterogénea de los núcleos de conos y bastones. La capa nuclear interna que 
incluye núcleos de células ganglionares y amácrinas, mostró aproximadamente el 50% de 
núcleos positivos. Por últmo, la capa de células ganglionares, presentó escasos núcleos, pocos 
de ellos fueron negativos y la mayoría dieron una tinción positiva para la pRb. El patrón de 
tinción observado en la retina normal coincide con el que reporta Cordon-Cardo y Richon en 
donde investigaron la expresión de la proteína pRb en diferentes tejidos normales de humanos 
usando técnicas inmunoquímicas, en los tejidos analizados incluyen la retina, para lo cual 
utilizaron el anticuerpo ant-pRb monoclonal, que reconoce formas hipe o hipofosforiladas de la 
proteina (Cordon-Cardo y col . 1994) 
b). Inmunohistoquimica de retinoblastomas. 
De los ocho tejidos tumorales analizados se encontraron los siguientes grados de 
diferenciación: tumor diferenciado en rosetas de Flexner-Winterstemer, tumor medianamente 
diferenciado y tumor indiferenciado. 
La inmunohistoquímica es la manera más conveniente para estudiar la expresión del gen 
Rb1 en tumores primarios in vivo Se han publicado pocos estudios inmunohistoquímicos sobre 
la expresión de pRb que sean capaces de distinguir en los tumores la presencia de la proteina 
PRb y los que tienen expresión anormal de la misma Entre estos la mayoria de los estudios
90 
han sido sobre tumores embebidos en parafina en donde han utilizado anticuerpos policlonales 
de conejo anti pRb (Geradts y col, 1994) 
Los estudios previos de inmunohistoquímica en retinoblastomas se han encaminado a 
determinar el origen de las células tumorigénicas. Algunos de los marcadores más utilizados 
fueron marcadores específicos de células neuronales como la enolasa específica de neurona 
(NSE) usada como marcador específico de la misma, la proteína acídica fibrilar de ta glía 
(GFAP), usada como marcador de astrocitos; glicoproteína asociada a la mielina para identificar 
células de Múiler en la retina y proteína S-100, encontrada en astrocitos y oligodendrocitos. Con 
estos marcadores se concluyó que el retinoblastoma deriva de célula neuronales y la hipótesis 
más aceptada a la fecha es que estos tumores derivan de una célula precursora llamada 
retinoblasto que es capaz de diferenciarse en más de una dirección (Tso y col, 1970, Molnar y col, 
1984; Yuge y col, 1995) 
En este trabajo, los casos casos 2 y 17 mostraron tumor diferenciado en rosetas, la 
presencia de rosetas en un retinoblastoma se conoce también como neuroepitelioma o 
retinoblastoma neuroepiteliomatoso, esto se ha interpretado como un intento de reproducir el 
epitelio primitivo del tubo neural o las células receptoras visuales más altamente especializadas 
de la retina (Popoff A., 1971). Las células que forman rosetas tienen caracterísitcas morfológicas 
que indican el origen neuronal del retinoblastoma, confirmando que éste proviene de 
retinoblastos con potencial de diferenciación en fotorreceptores y neuronas (Ts'o y col., 1970, Yuge 
y cor, 1995) El caso Rb-2 fue el único con tinción homogénea negativa para la detección 
inmunohistoquímica de pRb, de hecho se esperaba este resultado debido a que en el gen Rb1 
se identificaron dos mutaciones puntuales, una de éstas generó un codón de paro. En el resto 
de los tumores se observó la proteina pRb, en estos tumores predominaron los núcleos 
positivos desde tinción débil a intensa y hubo pocos núcleos negativos. En el estudio molecular 
de estos casos no se identificó ninguna mutación, esto no descarta la posibilidad de que exista 
alguna ya que no se analizaron todos los exones del gen Rb1. De hecho existen evidencias 
reportadas por Geradts y col., (1994), en donde identificó a la proteina pRb con una sustitución 
de un aminoácido, asociado con foforilación alterada y como consecuencia se acumuta en el 
núcleo, Se piensa que la proteina mutada no es funcional, y así la inmunohistoquímica se 
puede considerar como falsa positiva (Geradts y col, 1994). En el caso Rb-8 se identificó una 
mutación constitucional que generó un codón de paro, en este caso no fué posible realizar el 
análisis inmunohistoquimico sin embargo, es probable que la proteína no este presente en el 
tumor En el caso Rb-12 tambien se identificó una mutación que generó un codón de paro, no 
se identifico mutación de los exones analizados en el DNA de linfocitos, esto no descarta que
91 
exista en otras regiones no analizadso. Sin embargo, aunque no se realizó el análisis 
inmunohistoquímico en este tumor se sugiere que la proteína no se encuentre presente en el 
tejido. En ambos casos se sugiere que la proteína no este en el tumor sin embargo no se debe 
descartar que existe la posibilidad de que pRb se encuentre en el tumor considerándose como 
una inmunohistoquímica falsa positiva como lo reporta Geradts y col., (1994). 
El resto de los casos mostraron zonas de tumor indiferenciado con tinciones nucleares 
que van predominantemente de débil a intensa y con escasos núcleos negativos Se 
observaron además algunas figuras mitóticas (anafases y metafases) y la proteína se localizó 
en el citoplasma Geradts y col., (1994) habían observado localización citoplásmica de la 
proteína y sugirieron que esto se debe a que durante la mitosis se pierden las barreras 
nucleares lo que permite que las proteinas nucleares como pRb se distribuyan en el citoplasma 
(Geradts y col, 1994). 
En general en los retinoblastomas se observaron núcleos que sugerían la morfología de 
células en apoptosis, la apariencia de estas células concuerda con los núcleos picnóticos, 
material nuclear fragmentado y densamente compacto. En un trabajo realizado por Kogan H. y 
col (1995) con células de la línea Saos, sugirieron que la proteína pRb puede participar en la 
supresión de apoptosis y que varias proteínas que inducen este proceso tales como ElA, E2F y 
c-myc, lo hacen ai interferir con la función protectora de pRb, por lo cual si la pRb no está 
presente o está mutada, habrá más células que estén en apoptosis (Kogan H y col, 1998). Por otro 
lado Jiang y col, (1997) demuestran que la familia de proteínas de retinoblastoma se expresan 
diferencialmente durante la embriogénesis del ratón. Estos resultados sugieren que los 
miembros de la familia del gen rb1 (ratón) tienen distintas funciones que en algunos casos se 
superponen en la embriogénesis, p107 y pRb posiblemente tienen funciones redundantes en el 
sistema nervioso central e higado Además observan que los embriones rb1” (ratón) tenen 
incrementada la muerte celular durante el desarrollo de la retina (Jiang y cof, 1997). Esto podría 
explicar la presencia de las células compatibles con morfología de apoptosis que se observaron 
en algunos de los retinoblastomas de este trabajo. 
De manera general el hecho de encontrar diferentes grados de tinción para la pRb tanto 
en tumores diferenciados como indiferenciados pudiera tener varias explicaciones: 
1. En los núcleos negativos para la inmunohistoquimica de pRb, en pacientes con 
retinoblastoma se puede sugerr que la ausencia de esta proteína es la responsable del 
desarrollo del tumor, debido a que se pierde la función reguladora del ciclo celular que 
normalmente ejerce pRb en los retinoblastos en vias de proliferación y diferenciación (Gale y col. 
1990, Goodrich LW, 1993 Sorivar Ch y col, 1998, Wong y 1997)
92 
2. En los casos en donde se identificó la proteína pRb, se puede sugerir que la presencia 
de ésta no indica necesariamente que funcione de manera normal, ya que el anticuerpo que se 
utilizó para detectarla está dirigido contra el dominio carbóxilo terminal por lo que no se puede 
diferenciar el estado de fosforitación de la proteína identificándose así a pRb ya sea en su 
forma hiper o hipofosforilada. De manera que pRb podría estar presente en su forma inactiva 
(hipertosforilada) formando complejos con CDK's (Wemberg A R. 1995, Gale y col, 1990, Goodnch W 
D, y col, 1993) 
3. Otra posibilidad es que pRb pudiera estar formando complejos con otras proteínas 
como; proteínas celulares represoras (RBAR1) (Kaneko y cof, 1999), o desacetilasas de histonas 
como HDAC1 (Jaulin L. M y col, 1998; Brehm A. y col, 1998) par lo que la formación de este complejo 
(pRb/oncoproteína ó pRb/proteína celular) inhibe la función normal de pRb 
4. La presencia de la proteína pRb en los retinoblastomas estudiados pudiera deberse a 
una proteína mutada que no se degradó y estaría presente sin ejercer su función o bien tener 
una función incompleta con base en que se han encontrado mutaciones en las cuales se 
predice la alteración que puede sufrir la proteína, desde no estar presente o tener función 
parcial (Drya T. P y col, 1986: Dunn J M y col, 1989, Horowitz J M y col, 1990, Blanquet V y col, 1995, 
Lohamann D y col, 1996) 
Por otro lado se observó que en una misma capa nuclear de la retina, había células 
negativas y positivas con diferente intensidad, este hecho se puede explicar porque las células 
se podrían encontrar en diferentes fases del ciclo celular, tal y como lo propone Cordon y col., 
(1994) en donde menciona que este tipo de estudios han sido cruciales para entender los 
procesos involucrados en el control de la diferenciación celular además del progreso del tumor 
(Cordon-Cardon y col,, 1994) 
En el caso de retinoblastomas, sólo se cuenta con un trabajo (Yuge y col, 1998), en el cual 
se utilizó un anticuerpo monoclonal anti-proteina retinoblastoma y en ninguno de los tumores se 
identificó la proteína pRb, esto no coincide con lo que se obtuvó en este trabajo. Una de las 
consideraciones que se debe hacer al respecto es que no se tiene información hacia donde se 
dirige el anticuerpo usado por Yuge ya que en nuestro caso el anticuerpo estaba dirigido contra 
el carbóxilo terminal, además tampoco se tiene información del estado de fosforilación de la 
PRb que se detectó 
Con la finalidad de extender el conocimiento acerca del tipo de alteraciones moleculares 
en el gen RB1 en pacientes con retinoblastoma de nuestra población, es necesario analizar 
otros exones, que codifican para dominios funcionales de la proteina pRb Es importante
93 
además el análisis de un mayor número de pacientes lo que permitira conocer la frecuencia de 
mutaciones Además es importante hacer un análisis inmunohistoquímico con un anticuerpo 
que nos permita diferenciar entre ambas formas fosforiladas de la proteína pRb. 
Vil. CONCLUSIONES 
1. Los resultados indican que las mutaciones puntulas, son el tipo de alteración más 
frecuente en el gen Rb1 en los pacientes analizados con retinoblastoma, éstas se identificaron 
en 3 de 19 pacientes (15.7%). 
2. Posiblemente en nuestra población podrían existir otros exones más frecuentemente 
alterados, diferentes a los reportados en la bibliografía (como se ha visto en otros genes como 
DMD), ya que sólo se encontró mutación (en los exones 8, 18 y 20) en 3 de 19 pacientes 
analizados. 
3 La presencia de la proteína pRb en los tumores no indica necesariamente que este 
funcionando de manera normal, ya que puede estar presente en su forma inactiva. Además 
debe tenerse en cuenta que la alteración del gen Rb1 no es el único mecanismo que 
predispone al desarrollo de retinoblastoma.
94 
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