“Inducción de cultivos in vitro de Ligusticum porteri Coulter & Rose (Apiaceae) para la obtención de Z-ligustílida”. TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE MAESTRA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS (BIOLOGÍA EXPERIMENTAL) P R E S E N T A GUITELE DALIA GOLDHABER PASILLAS DIRECTOR DE TESIS: DR. ROBERT BYE BOETTLER MÉXICO, D.F. MAYO, 2008 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS INSTITUTO DE BIOLOGÍA UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. COORDINACIÓN Dr. Isidro Ávila Martínez Director General de Administración Escolar, UNAM Presente Me permito informar a usted que en la reunión ordinaria del Comité Académico del Posgrado en Ciencias Biológicas, celebrada el día 31 de Marzo de 2008, se aprobó el siguiente jurado para el examen de grado de MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS (BIOLOGÍA EXPERIMENTAL) de la alumna GUITELE DALIA GOLDHABER PASILLAS con número de cuenta 99551227 con la tesis titulada “Inducción de cultivos in vitro de Ligusticum porteri Coulter 8, Rose (Apiaceae) para la obtención de Z-ligustílida”, realizada bajo la dirección del DR. ROBERT ARTHUR BYE BOETTLER. Presidente: DRA. RACHEL MATA ESSAYAG DE ESPÍNDOLA Vocal: DR. EDUARDO GUILLERMO DELGADO LAMAS Secretario: DR. ROBERT ARTHUR BYE BOETTLER Suplente: DRA. ANA LUISA ANAYA LANG Suplente: DR. VÍCTOR MANUEL CHÁVEZ ÁVILA Sin otro particular, me es grato enviarle un cordial saludo. Atentamente “POR MI RAZA HABLARA EL ESPIRITU” Cd. Universitaria, D.F. a, 30 de Abril de 2008, AS c.c.p. Expediente de la interesada. Edif. de Posgrado P. B. (Costado Sur de la Torre II de Humanidades) Ciudad Universitaria C.P. 04510 México, D.F. Tel, 5623-0173 Fax: 5623-0172 http://pcbiol.posgrado.unam.mx 
 AGRADECIMIENTOS Agradezco al Posgrado en Ciencias Biológicas la oportunidad de realizar mis estudios de posgrado en el Jardín Botánico del Instituto de Biología de la UNAM. Agradezco al CONACYT por la beca de maestría otorgada. Así como a los proyectos de CONACYT: Estudio comparativo de cinco plantas medicinales de los bosques de pino-encino de Chihuahua: fase 1. Biología reproductiva y radical (U47512-Z), apoyado por SEP-CONACYT, responsable Dr. Robert Bye; y Establecimiento en campo de plántulas de tres especies medicinales sobre explotadas en la Sierra Tarahumara, utilizando métodos de propagación convencionales e in vitro (IN205907-3), apoyado por el Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT) de la Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA, UNAM), responsable Dr. Robert Bye y co- responsable Dr. Víctor Chávez. Agradezco a mi comité tutoral por el tiempo, el apoyo y la atención dedicados a mi trabajo durante los cuatro semestres de mis estudios de posgrado: • Dr. Robert Arthur Bye Boettler • Dra. Rachel Mata Essayag de Espíndola • Dr. Víctor Manuel Chávez Ávila Le quiero dar las gracias al Dr. Bye por permitirme ser parte de este proyecto de investigación que empezó en la Sierra Tarahumara en octubre del 2005, por toda su paciencia, apoyo, tiempo dedicados a mi trabajo, el respeto y la amistad, muchas gracias! A la Dra. Mata le agradezco haberme dejado ser parte de su laboratorio por el tiempo que duró mi trabajo, pero principalmente por ser tan amable y cariñosa con sus alumnos. También agradezco su tiempo, a su equipo de trabajo y todo el apoyo que recibí. Al Dr. Chávez por permitirme ser parte de su laboratorio, por todo lo que aprendí y principalmente la enseñanza sobre la conservación de nuestras plantas y hacernos saber que somos nosotros los que generamos el conocimiento. A mis compañeros de laboratorio Eva, Mariana, Mario, Araceli, Sol, Magda, Lupita, Abraham, Paquito, Claudia, Julio, Minerva, Sandra, Samantha, Iris, Fernando, Isabel, Vicente, Felipe, Jesús, Horacio, Arturo, Guadalupe, Betzy, Rosa, Paulina, Germán, Itzi, Silvio, Alejandro, Gerardo, Octavio, Wendy, Mónica, Miguel, Ariana, Neri, Roberto, Joaquín, Mara, María Luisa, Mabel, Marisela, Laura y a los que olvide, también forman parte de este agradecimiento. Quiero agradecer la amistad que tuve con cada uno de mis compañeros de trabajo, espero que el tiempo no la borre.. Quiero agradecer especialmente a Bárbara, Gina, Rocío, Laura, Isabel, Raúl, Ángel, Hugo, Conchita y Estela por todo el apoyo técnico, la paciencia y la amistad, espero que algún día yo pueda ayudarles en la misma manera en como ustedes me ayudaron, muchísimas gracias!! A mis amigas Cecilia e Iris. Fuimos compañeras de la licenciatura y de la maestría, muchas gracias por el cariño y por todo, estas palabras no son suficientes para expresar mi cariño por ustedes.. A mis muy queridos hermanos Heidi, Liz, Gwendy, Estefi, Jonathan, Nico y Edith, ustedes son mi vida y mi motor para seguir adelante, son mi familia, no hay palabras que expresen este sentir.. muchas gracias.. A mis sobrinos consentidos Maryfer, Regina, Moy, Michelle, Vale y Dani, son un pedacito de mi también… A mis papás Eduardo y Silvia, ustedes han sido un ejemplo para mí, gracias por ser como son… los quiero mucho y los extraño más… A Marisela y René por las tardes en su casa, las comidas tan agradables y las anécdotas que me han compartido. Ustedes forman parte de mi familia y han sido testigos de este proceso, no hay palabras ni manera de darles las gracias.. A mi nena, me has dado muchas alegrías y me has llenado mucho, siempre estás donde yo estoy, me sigues y no te cansas de estar conmigo… eres traviesa, dormilona, curiosa, juguetona y sobre todo, estás conmigo.. Y finalmente a Didier…eres todo… mi amante, mi amigo, mi confidente, mi compañero… sin ti no hubiera llegado a donde estoy ahora, has sido parte de mis tristezas y de mis momentos de felicidad, eres mi incondicional, mi columna vertebral y lo mejor es que te tengo todos los días para decírtelo, sin tu apoyo no sería quien soy, soy una mujer feliz a tu lado!! 
 I Tabla de Contenidos ÍNDICE DE TABLAS IV ÍNDICE DE FIGURAS VI ÍNDICE DE GRÁFICAS VIII ÍNDICE DE CROMATOGRAMAS IX RESUMEN X SUMMARY XI INTRODUCCIÓN 1 ANTECEDENTES 4 México como país megadiverso 4 Domesticación de plantas 7 La familia Apiaceae (Umbelliferae) 9 Problemática en la reproducción de especies de la familia Apiaceae 10 Metabolitos secundarios de la familia Apiaceae 11 Biología de Ligusticum porteri y Petroselinum crispum 13 • El género Ligusticum L. 13 • Descripción botánica del género Ligusticum 14 • Ligusticum porteri Coulter & Rose 16 • Descripción botánica de L. porteri 16 • Distribución geográfica 19 • Etnobotánica 19 • Fitoquímica 22 • Problemática en el aprovechamiento de Ligusticum porteri en México 23 • El género Petroselinum Hill 23 • Descripción botánica del género Petroselinum 24 • Petroselinum crispum (Mill.) Nyman ex A. Hill 26 • Descripción botánica de P. crispum 26 • Etnobotánica 28 • Fitoquímica 29 Metabolitos secundarios 31 Aceites esenciales 32 Terpenoides 33 
 II Fenilpropanoides 34 Acetogeninas 35 Ftálidas 37 Actividad biológica de Z-ligustílida 57 Métodos de investigación 58 Ftálidas en otras familias 59 Cultivo de tejidos vegetales 64 Obtención de metabolitos secundarios in vitro 65 Obtención de metabolitos secundarios a partir de células en suspensión 67 JUSTIFICACIÓN 75 HIPÓTESIS 76 OBJETIVOS 76 • General 76 • Particulares 76 METODOLOGÍA GENERAL 77 MATERIALES Y MÉTODOS 78 • Material biológico 78 • Desinfección de semillas 78 • Germinación in vitro 78 • Germinación ex vitro 79 • Análisis fisicoquímico de suelo 79 • Inducción a callo 79 • Establecimiento de los cultivos de células en suspensión 79 • Cinética de crecimiento 80 • Obtención de los extractos de L. porteri y P. crispum 80 • Cromatografía en columna abierta 82 • Análisis por cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas (CG- EM) 82 • Pruebas preliminares de Ligusticum porteri 83 • Prueba de viabilidad de semillas 83 • Germinación en mezclas de sustratos 84 • Desinfección de explantes 84 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 87 
 III • Material biológico 87 • Desinfección de semillas 87 • Germinación in vitro 89 • Germinación ex vitro 90 • Análisis fisicoquímico de suelo 91 • Inducción a callo 91 • Cultivo de células en suspensión 102 • Cinética de crecimiento 102 • Obtención de extractos 107 • Cromatografía en columna abierta 112 • Análisis de los extractos por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-EM) 112 • Pruebas preliminares de Ligusticum porteri 134 • Viabilidad de semillas 134 • Germinación in vitro 135 • Germinación en suelo 137 • Inducción a callo 140 • Contaminación de explantes 140 • Cultivo de células en suspensión 141 CONCLUSIONES 143 PERSPECTIVAS 146 APÉNDICES 147 • Prueba de viabilidad con TTZ 147 • Cromatogramas 148 BIBLIOGRAFÍA 170 
 Tabla 1 Tabla 2 Tabla 3 Tabla 4 Tabla 5 Tabla 6 Tabla 7 Tabla 8 Tabla 9 Tabla 10 Tabla Tabla No Tabla 13 Tabla 14 Tabla 5 Tabla 6 Tabla 7 Tabla 8 Índice de Tablas Comparación de la riqueza de ecosistemas, hábitats y ecoregiones entre varios países de América Latina Países con mayor riqueza de especies de vertebrados y plantas Familias de plantas vasculares de México con mayor número de géneros Comparación de atributos entre poblaciones naturales y domesticadas Patrón de distribución de metabolitos secundarios en la familia Apiaceae y otras familias botánicas Taxonomía de Ligusticum porteri Taxonomía de Petroselinimn crispum Géneros de la familia Apiaceae que biosintetizan ftálidas Ftálidas extraídas de distintas especies de la familia Aplaceae Actividad biológica de Z-ligustílida Ftálidas identificadas en otros organismos y plantas Algunos metabolitos secundarios de plantas medicinales obtenidos in vitro Cultivos ín vitro de especies de la familia Apiaceae Metabolitos secundarios obtenidos ín vitro de especies de la familia Apiaceae Procedencia del material vegetal analizado Distintos tratamientos de desinfección de explantes y semillas Resultados del análisis de suelo de Chihuahua Efecto de los reguladores de crecimiento en la inducción a callo de explantes de L. porteri. Resultados a los 3 meses del inicio de la inducción de los 41 57 69 7 73 81 86 91 Tabla 19 Tabla 20 Tabla 21 Tabla 22 Tabla 23 Tabla 24 Tabla 25 Tabla 26 Tabla 27 Tabla 28 cultivos Efecto de los reguladores de crecimiento en la inducción a callo de explantes de P. crispum. Resultados a los 3 meses del inicio de la inducción de los cultivos Resultados de presencia o ausencia de Z-ligustílida de acuerdo al análisis por CCF. Material biológico obtenido de plantas adultas silvestres Fraccionamiento del extracto de partes aéreas de L. porteri Componentes de los extractos de callos de £. porteri Componentes del extracto de semillas de L. porteri Componentes de las fracciones del extracto de partes aéreas de £. porteri Componentes del extracto de raíz de L. porteri Componentes del extracto de raíz de P. crispum Distribución de algunos compuestos identificados en L. porteri,en el género Ligusticum, la familia Apiaceae y otras familias botánicas Resultados de inducción a callo con distintos explantes a 50 días del inicio del cultivo 98 107 11 112 115 115 116 116 119 139 Figura | Figura 2 Figura 3 Figura 4 Figura 5 Figura 6 Figura 7 Figura 8 Figura 9 Figura 10 Figura 11 Figura 12 Figura 13 A Figura UD Figura Figura 16 Figura 17 Figura 18 Figura 19 Figura 20 Figura 21 Figura 22 Índice de Figuras Países con mayor biodiversidad Ligusticum porteri Ligusticum porteri Coulter € Rose en Chihuahua, México (Octubre 2005). Distribución geográfica de Ligusticum porteri en México y Estados Unidos Petroselinum crispum (Mill) Nyman ex A.W. Hill Petroselinum crispum Origen biosintético de las acetogeninas Fórmula estructural de una ftálida Posible ruta de biosíntesis de la Z-ligustílida Estructura química de Z-ligustílida Estructuras químicas de algunas ftálidas mencionadas en la Tabla 9 Diagrama evolutivo de la especialización de los Órdenes de las angiospermas Modelo de una curva de crecimiento de un cultivo de células en suspensión relativo al número de células por unidad de volumen de cultivo en cuanto al tiempo de cultivo Larva presente en las semillas de £. porteri Algunas respuestas morfogénicas de Jos explantes de £. porteri con distintas combinaciones de 2,4-D/BA y ANA/BA Algunas respuestas morfogénicas de los explantes de P. crispum con diferentes combinaciones de 2,4-D/BA y ANA/BA Fotomicrografías de los cultivos en células en suspensión de callos de £. porteri Fotomicrografías de los cultivos en suspensión de callos de P. crispuun Análisis por CCE de los extractos obtenidos de partes aéreas y raíces de plantas adultas de L. porteri y P. crispin Análisis por CCF de los extractos de £. portert y P. crispum de plantas cultivadas en invernadero Análisis de los extractos de plántulas germinadas in vitro y plantas germinadas en invernadero de £. porteri y P. crispum Análisis por CCE de extractos de callo de L. porteri 15 18 19 25 27 36 37 39 40 62 68 88 87 98 104 106 107 108 109 110 vi Figura 23 Estructuras químicas de algunos compuestos identificados en extractos de 128 L. porteri y P. crispum Figura 24 Prueba de viabilidad con TTZ 133 Figura 25 Semillas de £. porteri almacenadas un mes en organza 134 Figura26 Plántulas de L. porteri germinadas in vitro en medio MS-100 136 Figura 27 Plántulas de £. porteri germinadas in vitro en suelo de Chihuahua 139 VIH Gráfica ) Gráfica 2 Gráfica 3 Gráfica 4 Gráfica 5 Gráfica 6 Gráfica 7 Gráfica 8 Gráfica 9 Índice de Gráficas Formación de callo en medio de inducción MS-50 a partir de los distintos explantes estudiados de L. porterí. Resultados a los tres meses de inducción de los cultivos Respuestas morfogénicas de cotiledón, hoja, pecíolo, raíz y tallo de £. porteri en medio de inducción MS-50. Resultados a los 3 meses de inducción de los cultivos Formación de callo en medio de inducción MS-50 a partir de los distintos explantes estudiados de P. crispum. Respuestas a los 3 meses de inducción de los cultivos Respuestas morfogénicas de cotiledón, hoja, pecíolo, raíz y tallo de P. crispum en medio de inducción MS-50. Resultados a los 3 meses de inducción de Jos cultivos Cinética de crecimiento de los explantes de raíz, pecíolo y cotiledón de £. porteri Cinética de crecimiento de los explantes de hoja, raíz, tallo y cotiledón de P. crispum Tasa de germinación in vitro de semillas de L. porter: Germinación de semillas de L. porterí en mezclas de suelo Germinación de semillas de £. porterí en suelo de Chihuahua 94 97 99 101 137 138 VI Cromatograma | Cromatograma 2 Cromatograma 3 Cromatograma 4 Cromatograma 5 Cromatograma 6 Cromatograma 7 Cromatograma 8 Cromatograma 9 Cromatograma 10 Cromatograma | | Cromatograma 12 Cromatograma 13 Cromatograma 14 Cromatograma 15 Cromatograma 16 Cromatograma 17 Cromatograma 18 Cromatograma 19 Cromatograma 20 Cromatograma 21 Índice de Cromatogramas Callo de raíz de £. porteri Callo de semillas de L. porteri Callo de cotiledón de £. porteri Callo de hoja de £. porteri Callo de raíz de £. porteri Callo de pecíolo de £. porteri Callo de tallo de £. porteri Callo de pecíolo de £. porteri Callo de raíz de L. porteri Callo de pecíolo de L. porteri Extracto de semillas de L. porteri Fracción | del extracto de partes aéreas de £. porteri Fracción 36 del extracto de partes aéreas de £. porteri Fracción 40 sólida del extracto de partes aéreas de £. porteri Fracción 40 aguas madres del extracto de partes aéreas de £. porteri Fracción 56 del extracto de partes aéreas de L. porteri Fracción 106 del extracto de partes aéreas de L. porteri Fracción 13] del extracto de partes aéreas de £. porteri Fracción 148 del extracto de partes aéreas de £L. porteri Extracto de raíz de £. porteri Extracto de raíz de P. crispum 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 VII! X RESUMEN Ligusticum porteri Coulter & Rose (Apiaceae), “chuchupate”, es una especie silvestre que se distribuye en el centro de las Montañas Rocallosas en E.U. y en el norte de la Sierra Madre Occidental en México. Esta hierba perenne no se cultiva y su raíz es extraída de sus poblaciones naturales para fines comerciales y medicinales. Es altamente apreciada por los Tarahumaras, Zunis, Pauites, Pimas y Mescaleros Apaches para propósitos medicinales y ceremoniales. La infusión de la raíz se consume para aliviar problemas gastrointestinales, como analgésico y remedio contra padecimientos bronco respiratorios, además de que es utilizada como talismán. Uno de los compuestos responsables de esta actividad farmacológica, la ftálida Z-ligustílida, está presente en los aceites esenciales de la raíz. El objetivo fue establecer las condiciones in vitro para inducir la formación de callo y la biosíntesis como parte de una estrategia de conservación ex situ y uso sostenible. Los resultados fueron comparados con los de la especie cultivada Petroselinum crispum, “perejil”. Las semillas de ambas especies fueron germinadas en medio Murashige y Skoog (MS) al 100%, 50% y 25% y 1.5% de sacarosa. Las plántulas se seccionaron en hipocótilo, raíz, cotiledón, pecíolo, tallo y hoja y se indujeron de 30 a 90 días en medio MS al 50% adicionado con 0-4 mg/l de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) ó 0-4 mg/L ácido-alfa-naftalenacético (ANA) con 0-3 mg/L de benziladenina (BA). Los explantes de L. porteri desarrollaron un callo pequeño, poco friable, compacto y amarillo pajizo. En contraste, los explantes de P. crispum, produjeron un callo muy abundante, altamente friable, hialino y verde. A partir de los callos obtenidos en medio MS-50 con 2,4-D (4 mg/L) y ANA/BA (4:1) de ambas especies, se establecieron los cultivos de células en suspensión para iniciar una curva de crecimiento de hoja, raíz, pecíolo, tallo y cotiledón para determinar la cinética de crecimiento y la morfología celular de cada explante en las distintas fases del cultivo. Se analizaron los extractos obtenidos a partir de callos de hoja, semillas, pecíolo, tallo y raíz así como partes aéreas y raíz de plantas adultas de ambas especies por cromatografía en capa fina (CCF) y cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-EM). A partir del extracto de partes aéreas de L. porteri se identificó la ftálida E-butilideneftálida junto con 33 componentes más. Del extracto de raíz de P. crispum se identificaron dos ftálidas no descritas previamente, la 3-n-butilftálida y la 3,6,7,-trimetoxi-isobenzofuran-13(H)-ona. De los extractos de callo de pecíolo y tallo de L. porteri se identificó la ftálida 3-butilideneftálida, así como en el extracto de raíz. Este es el primer trabajo que describe la germinación, el desarrollo in vitro y ex vitro, la morfología celular, describe la composición química de los extractos de L. porteri y explora el potencial biotecnológico de la especie silvestre L. porteri. XI SUMMARY Ligusticum porteri Coulter & Rose (Apiaceae), “chuchupate”, is a wild plant that grows in the central Rocky Mountains and northern Occidental Sierra Madre in Mexico. This perennial plant it’s not cultivated and its roots are extracted from their wild populations and sold as a drug. It’s highly valued for medicinal and religious purposes by Tarahumara, Pima, Zuni, Pauite and Mescalero Apache. The root infusion is consumed to relieve gastrointestinal disorders, as an analgesic and to treat respiratory ailments. It is also used as a talisman to ward off witches and snakes. One of the biologically active compounds, the phthalide Z-ligustilide, is found in the root essential oils. The objective of the present work was to establish the in vitro conditions in order to induce callus formation and the in vitro biosynthesis as a ex situ conservational strategy and sustainable use. Results were compared to that of the cultivated plant Petroselinum crispum, “parsley”. Seeds were germinated in 25%, 50% and 100% Murashige and Skoog (MS) medium with 1.3% sucrose. Plants were excised into hypocotyledon root, cotyledon, petiole, stem and leaf explants and cultured in an induction media supplemented with 0-4 mg/L of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) or 0-4 mg/L of alpha-naphthaleneacetic acid (NAA) with 0-1 mg/L of 6-benzylaminopurine (BAP). L. porteri´s explants developed into a small, poorly friable, compact and yellow callus. In contrast, P. crispum´s explants developed into an abundant, highly friable, hyaline and green callus. Suspension cultures were established from callus cultures of both species in 50% MS medium supplemented with 2,4-D (4 mg/L) and NAA/BA (4:1). Growth kinetics and cell morphology at each culture stage were determined of leaf, root, stem, petiole and cotyledon calli cultures. Calli derived from leaf, seeds, petiole, stem and root, mature aerial parts and roots extracts were analyzed with thin layer chromatography (TLC) and gas chromatography-mass spectrum (GC-MS). E-butylidenephthalide was identified along with other 33 compounds from the mature aerial parts extract of L. porteri. 3- Butylidenephthalide and 3,6,7,-trimethoxy-isobenzofuran-13(H)-one, not previously reported, were identified from the roots of P. crispum. 3-butilidenephthalide was identified from petiole and stem callus as well as in the root extract of L. porteri. This is the first report that describes the germination, the in vitro and ex vitro development, cellular morphology describes the chemical composition of the extracts of L. porteri and explores the biotechnological potential of the wild species L. porteri. 1 INTRODUCCIÓN En el mundo existen más de 170 países, pero sólo 12 de ellos son considerados como megadiversos albergando entre 60 y 70% de la biodiversidad total del planeta (Figura 1). México es uno de estos países, ocupa el cuarto lugar a nivel mundial en riqueza vegetal con una estimación de 30 000 especies pertenecientes a dos reinos florísticos que viven en diez tipos de vegetación (Mittermeier y Goettsch, 1992; Bye, 1998) y de las cuales aproximadamente 9 500 son endémicas (Huerta, 1997). Desde épocas remotas el hombre ha buscado en el mundo animal y vegetal sustancias útiles para aliviar y curar enfermedades (Cordero, 1996). Una parte fundamental de su evolución ha sido haber desarrollado y ampliado el conocimiento de la diversidad biológica a la que se ha enfrentado para poder subsistir (Caballero, 1990). La Organización Mundial de la Salud (OMS) estima que el 80% de la población en países en desarrollo consume plantas medicinales para cuidados básicos de la salud (Farnsworth et al., 1985). En México, el uso de estas plantas alcanza niveles muy altos. Se ha calculado un total aproximado de flora medicinal de 3 352 especies (15% de la flora total), lo que representa el 23% de su flora total de angiospermas (Bye, 1998). Esto refleja la diversidad biológica que es conocida y utilizada por grandes núcleos de la población mexicana y representada en la medicina tradicional (Huerta, 1997). Aproximadamente dos tercios de las 50 000 especies de plantas medicinales utilizadas en el mundo son recolectadas de su hábitat natural y sólo un bajo porcentaje es cultivado. Por esto, hay una creciente preocupación por la disminución de poblaciones naturales de estas plantas, por la pérdida de diversidad genética, extinciones locales y degradación del hábitat. Se calcula que entre 4 000 y 10 000 plantas medicinales están amenazadas (Canter, Thomas y Ernst, 2005). Ante esta situación, cabe recordar que la conservación de los recursos vegetales debe entenderse como el uso racional y sostenido a largo plazo, en particular la conservación de las plantas silvestres no cultivadas que tiene un significado muy grande porque muchas de ellas poseen un valor económico potencial (Caballero, 1990). En México, el número de especies de plantas medicinales con raíces útiles representan el 10% (Navarro y Avendaño, 2002). Plantas como el barbasco (Dioscorea mexicana), la raíz de zacatón (Muhlenbergia spp.), la raíz de memela (Clusia spp.) y la raíz de pingüica (Arctostaphylos spp.), constituyen una importante fuente de ingresos para la población rural de las regiones donde se distribuyen dichas especies, además de que su recolecta está regulada por la norma oficial NOM- 004-RECNAT-1996 (Diario Oficial de la Federación, 1996). Sin embargo, la sobre recolección de raíces de plantas silvestres como la valeriana (Valeriana ceratophylla), la hierba del manso 2 (Iostephane heterophylla) (Sandoval et al., 2005), la cancerina (Hippocratea excelsa), el matarique (Psacalium decompositum) y el chuchupate (Ligusticum porteri), puede llevar a la extinción local de sus poblaciones debido a su demanda tanto en mercados locales como extranjeros (Bye, 1998). En México, las especies de la familia Apiaceae son ecológica y económicamente importantes por ser utilizadas como alimento, condimento, saborizantes, como plantas medicinales, de ornamento, de cultivo y algunas como veneno. Estas especies se caracterizan por ser aromáticas debido a los aceites esenciales presentes en ellas, por lo que muchas son utilizadas como condimentos, pero también como remedios, en los que son utilizadas sus inflorescencias en forma de umbelas y sus raíces de almacenamiento napiformes (Calderón, 2001). En México hay 37 géneros de la familia Apiaceae, utilizados principalmente como remedio, alimento y condimento, entre los que destacan, por su papel ambiental y por sus usos, las especies de los géneros Ligusticum con uso medicinal y Petroselinum con uso medicinal y como condimento. Ligusticum porteri es una especie silvestre que se distribuye en el norte de México en los estados de Chihuahua, Durango y Sonora en la Sierra Madre Occidental y en el suroeste de Estados Unidos en los estados de Colorado, Wyoming, Idaho, Utah, Nuevo México, Nevada y Arizona en las Montañas Rocallosas. Es una planta silvestre que no se cultiva y que se aprovecha como medicinal y cuya raíz es altamente apreciada por los Tarahumaras como talismán, para rituales religiosos y como remedio contra diversos padecimientos (Linares y Bye, 1987); que también es vendida en México y EU como tintura, pastillas y polvo, lo que ha traído como consecuencia un acelerado consumo y colecta de las poblaciones silvestres que se están agotando. Petroselinum crispum es una especie domesticada originaria del este del Mediterráneo, naturalizada en Europa (Gbolade y Lockwood, 1999). En México es cultivada como alimento, condimento, planta medicinal y para el comercio (Martínez et al., 1995). La raíz de L. porteri contiene la ftálida Z-ligustílida como componente mayoritario y a la cual se le atribuye un amplio espectro de actividades biológicas como relajante muscular, neuroprotector, antioxidante, antiesclerótico, antihipertensivo, antiviral, antifúngico y antibacterial, por mencionar algunas y que, además, carece de especificidad y tiene baja potencia sin ser tóxico, lo que lo hace útil y de gran interés para la medicina moderna (Beck y Stermitz, 1995). El hecho de que el compuesto responsable de las actividades biológicas se encuentre en la raíz, enfrenta a esta especie a una fuerte presión de colecta lo que amenaza con extinguir sus poblaciones silvestres ya que su aprovechamiento se basa en la destrucción de la planta para la colecta de la raíz, poniendo en amenaza de extinción a esta especie, sumado a la deforestación de su hábitat, sobrepastoreo, su limitada capacidad reproductiva y la falta de conocimientos sobre su propagación vegetativa y aún sobre la germinación de sus semillas. 3 En virtud de la escasez de L. porteri, la posibilidad de explorar sus respuestas morfogénicas in vitro enfrentan una fuerte limitante por lo que estudios semejantes con una especie domesticada de la misma familia como P. crispum, arrojarían información que permitirá definir y elegir tratamientos a los que podrían responder morfogénica y biosintéticamente de manera positiva los explantes cultivados de L. porteri. Es por esto que el cultivo de tejidos vegetales de especies nativas ofrece una alternativa biotecnológica para su conservación ex situ al reducir la presión de colecta de poblaciones naturales y al ser una fuente alternativa de producción del compuesto, por lo que podrá ser parte de la solución al uso sostenible de L. porteri. 4 ANTECEDENTES México como país megadiverso El concepto de biodiversidad se refiere en general a la variabilidad de la vida; incluye los ecosistemas terrestres y acuáticos, los complejos ecológicos de los que forman parte, así como la diversidad entre las especies y dentro de cada especie. La biodiversidad abarca, por lo tanto, tres niveles de expresión de variabilidad biológica: ecosistemas, especies y genes. En estos niveles se integra una amplia gama de fenómenos, de manera que la biodiversidad de un país se refleja en los diferentes tipos de ecosistemas que contiene, el número de especies que posee, el cambio en la riqueza de especies de una región a otra, el número de endemismos, las subespecies y variedades o razas de una misma especie, entre otros (Neyra y Durand, 1998). En el mundo existen más de 170 países, pero sólo 12 de ellos (Figura 1) son considerados como megadiversos y albergan en conjunto entre 60 y 70% de la biodiversidad total del planeta; México es uno de estos países (Mittermeier y Goettsch, 1992). Figura 1. Países con mayor biodiversidad (Neyra y Durand, 1998). 5 Entre las causas que hacen de México un país de gran diversidad biológica están la topografía, la variedad de climas y una compleja historia tanto geológica y biológica como cultural. Estos factores han contribuido a formar un mosaico de condiciones ambientales y micro ambientales que promueven una gran variedad de hábitats y de formas de vida (Sarukhán et al., 1996). No es casualidad que México sea el cuarto país megadiverso en el mundo al estar presentes dentro de sus límites políticos 5 tipos de ecosistemas, por ejemplo: bosques de coníferas, pastizales, matorrales, formaciones xéricas y manglares; 9 de los 11 tipos de hábitat, por ejemplo: tropical cálido-húmedo, tropical cálido-subhúmedo, templado húmedo, templado subhúmedo, árido y semiárido y 51 de las 191 ecorregiones identificadas, por ejemplo: bosques de pino y encino de la Sierra Madre Occidental, transvolcánicos y Sierra Madre del Sur, humedales del centro de México, chaparrales costeros de Salvia, matorrales de cactus, bosques secos, sabanas de palmas, tundra alpina, matorral xérico (Tabla 1) (Neyra y Durand, 1998). Tabla 1. Comparación de la riqueza de ecosistemas, hábitats y ecorregiones entre varios países de América Latina (Neyra y Durand, 1998). Tipos de ecosistemas México (5/5) Brasil (5/5) Colombia (4/5) Chile (3/5) Argentina (3/5) Costa Rica (3/5) Tipos de hábitats México (9/11) Brasil (8/11) Argentina (6/11) Colombia (6/11) Chile (4/11) Costa Rica (4/11) Ecorregiones México (51/191) Brasil (34/191) Colombia (29/191) Argentina (19/191) Chile (12/191) Costa Rica (8/191) Junto con Brasil, Colombia e Indonesia, México se encuentra en los primeros lugares de las listas de riqueza de especies. Ocupa el primer lugar en el mundo en riqueza de reptiles (707), el segundo en mamíferos (439) y el cuarto en anfibios (282) así como en plantas (26 000), además de tener cerca de 111 especies de aves y 163 especies de peces de agua dulce endémicas (Tabla 2). En términos generales se puede decir que en nuestro país se encuentra al menos 10% de la diversidad terrestre del planeta (Neyra y Durand, 1998). 6 Tabla 2. Países con mayor riqueza de especies de vertebrados y plantas (Neyra y Durand, 1998). Plantas Brasil 55 000 Colombia 45 000 China 30 000 México 26 000 Australia 25 000 Anfibios Brasil 516 Colombia 407 Ecuador 358 México 282 Indonesia 270 Reptiles México 707 Australia 597 Indonesia 529 Brasil 462 India 433 Mamíferos Indonesia 519 México 439 Brasil 421 China 410 Zaire 409 Por toda esta biodiversidad, México es el país con mayor diversidad ecológica de América Latina y el Caribe, y uno de los países en donde hay más especies endémicas en América (Neyra y Durand, 1998). Las plantas vasculares están representadas en México por 2 804 géneros nativos, de los cuales 127 son helechos y plantas afines, 14 gimnospermas, 546 monocotiledóneas y 2 117 dicotiledóneas. Estos géneros se incluyen en 304 familias y a su vez contienen un total de 23 424 especies. Estas cifras no incluyen a las plantas introducidas y naturalizadas, que alcanzan una cifra de 618 especies, repartidas en 355 géneros (Villaseñor, 2004). Las dicotiledóneas (Clase Magnoliopsida) constituyen el grupo más diverso de todas las plantas vasculares, representando 75.5% de la riqueza genérica mexicana (Tabla 3). Le siguen en importancia, en cuanto a número, las monocotiledóneas (Clase Liliopsida) y en menor escala los helechos, briofitas y las gimnospermas (Villaseñor, 2004). 7 Tabla 3. Familias de plantas vasculares de México con mayor número de géneros (Villaseñor, 2004). Familia Número de géneros Asteraceae 362 Poaceae 166 Orchidaceae 157 Fabaceae 92 Rubiaceae 92 Cactaceae 72 Scrophulariaceae 55 Malvaceae 52 Acanthaceae 47 Brassicaceae 47 Euphorbiaceae 44 Apiaceae 37 Bignoniaceae 36 Apocynaceae 34 Mimosaceae 34 Cucurbitaceae 34 Solanaceae 33 Lamiaceae 31 Rosaceae 30 Domesticación de plantas Las investigaciones arqueológicas indican que la agricultura se desarrolló en México alrededor del año 7000 a.C. Las crónicas y documentos que datan de los primeros años de la conquista indican que en esa época ya se habían domesticado plantas de gran importancia alimenticia para el mundo como el maíz (Zea mays), el frijol común (Phaseolus vulgaris), la calabaza (Cucurbita spp.), el camote (Ipomoea batatas), los chiles (Capsicum spp.), el cacao (Theobroma cacao), el tomate (Lycopersicon esculentum), el cacahuate (Arachis hypogaea), la vainilla (Vanilla planifolia) y el amaranto (Amaranthus spp.). Debido a esto, México es uno de los tres centros más importantes de origen de la agricultura en el mundo junto con Medio Oriente y China (Bye, 1998; Neyra y Durand, 1998). Se estima que más de 118 especies de plantas, pertenecientes a 70 géneros y 39 familias, han sido domesticadas en nuestro país (Hernández-Xolocotzi, 1993). Sin embargo, esta cantidad debe ser aún mayor dado que Hernández-Xolocotzi consideró dicho número de especies como una lista de “plantas representativas”. Las plantas domesticadas han sido alteradas genéticamente para su desarrollo hasta el punto de que su sobrevivencia depende de la intervención directa y consciente del hombre, a su vez, éste ha modificado su conducta para adecuarla a la de la planta. Este proceso se relaciona con el entorno ecológico, la flora presente, las formas de uso del material producido y las necesidades y adaptabilidad cultural del hombre (Hernández-Xolocotzi, 1998). En contraste, las poblaciones naturales de las especies silvestres están sujetas a la selección natural para una adaptación altamente 8 específica a su hábitat natural. Éstas han evolucionado en comunidades en relación al suelo y al clima e incluso a otras plantas y animales. Esto significa que en general, las especies silvestres son más difíciles de cultivar que sus congéneres domesticados. En ocasiones, son inapropiadas, improductivas y costosas para su cultivo ex situ (Brown et al., 1997; Hawkes et al., 2000). La Tabla 4 muestra muchos atributos de las plantas silvestres que afectan la facilidad de regeneración de plantas completas en su hábitat comparadas con especies relacionadas que ya están domesticadas. Estos atributos incluyen crecimiento y reproducción junto con aquellos de las fuentes originales. Esta complejidad es debida no solo a los valores generales más altos para cada atributo en plantas silvestres, sino a la variación dentro y entre diferentes especies (Brown et al., 1997). Tabla 4. Comparación de atributos entre poblaciones naturales y domesticadas (Brown et al., 1997). Atributo Especies silvestres en contraste con sus congéneres domesticados Razón Crecimiento Dormancia de la semilla Mayor dormancia y longevidad de la semilla La domesticación selecciona una germinación más homogénea y anticipada Ciclo de vida Ciclo de vida más largo, algunas veces son perennes La domesticación selecciona la madurez temprana Adaptación Altamente específica, más sensibles al fotoperíodo La domesticación selecciona una adaptación más amplia Madurez Más indeterminante La domesticación selecciona la floración y maduración más uniforme Tamaño individual Mayor variación en morfología Reproducción Sistema de cultivo Mayor diversidad y un sistema más abierto de fertilización La domesticación a veces hace un cambio en el manejo de la reproducción Sistema de polinización Vectores más restringidos La domesticación selecciona una menor dependencia de polinizadores específicos Fecundidad de la semilla A veces menos semillas Cultivares seleccionados por alta fecundidad Dispersión de la semilla A veces más amplia La domesticación de cultivares selecciona la retención de la semilla y no la dispersión Fuente Diversidad del hábitat Mayor Especies domesticadas crecen en medios mas uniformes, benignos y controlados Estructura de la población Mayor divergencia local de subpoblaciones La mezcla de cosechas reduce el alcance para retener estructuras locales espaciales Flujo genético interpoblacional Propensas a niveles más altos Sistemas de cultivo más cerrados de especies domesticadas reduce la contaminación de polen y la necesidad de aislamiento 9 La familia Apiaceae (Umbelliferae) La familia Apiaceae ocupa el 12º lugar de 19 familias con mayor número de géneros distribuidos en nuestro país. El género Ligusticum está representado por 40-50 especies, de las cuales L. porteri es la única especie distribuida en México (Pimenov y Lemonov, 1993). La familia Apiaceae está compuesta de 455 géneros y 3751 especies. Es cosmopolita de amplia distribución mundial pero estas plantas están mejor desarrolladas en climas templados a temperaturas de 15 a 18°C y en menor grado en los trópicos, la mayoría de las especies tuvieron su origen en el hemisferio norte. La mayoría son especies herbáceas, algunas arbustivas y pocos árboles. Es una de las familias con inflorescencias más conocidas, las características mas sobresalientes de estas especies son las inflorescencias en forma de umbela, simple o compuesta, una raíz napiforme, frutos esquizocárpicos característicos y su química distintiva, reflejada en su olor, sabor e incluso en la toxicidad de muchos de sus miembros (Cronquist et al., 1997; Huxley et al., 1999). La división de la familia Apiaceae, en tres subfamilias Hydrocotyloideae, Saniculoideae y Apioideae y doce subtribus, se propuso hace un siglo por Drude (1897-1898) en Die Natürlichen Pflanzenfamilien y sigue siendo el sistema de clasificación predominante para la familia. Hydrocotyloideae y Saniculoideae son subfamilias pequeñas con 42 géneros con 490 especies y 9 géneros con 325 especies respectivamente, mientras que Apioideae, la subfamilia más grande y taxonómicamente más compleja, tiene 404 géneros con 2935 especies (Plunkett y Downie, 1999; Pimenov y Lemonov, 1993). El orden Apiales incluye a la familia Apiaceae y a la familia Araliaceae. Tradicionalmente estas dos familias se han estudiado como dos linajes separados que divergieron de un ancestro común, algunas veces llamado como pro-araliad y algunos taxa en Apiales como Myodocarpus, Hydrocotyle, Klotzschia y Mackinlaya han sido propuestos como géneros puente entre estas dos familias, por lo que es de esperarse que ambas familias compartan características fenotípicas, como la morfología de las flores, genotípicas y fitoquímicas, como la presencia de aceites esenciales en canales esquizógenos, poliacetilenos, saponinas triterpénicas y ácidos grasos como el ácido petroselínico en semillas, que además comparten con la familia Asteraceae (Plunkett et al., 1997; Sorensen, 1968; Crowden et al., 1969, Grayer, 1999). Muchas especies de la familia Apiaceae son cultivadas para alimento, como la zanahoria (Daucus carota) o más frecuentemente como especias o condimentos como el apio (Apium graveolens), el cilantro (Coriandrum sativum), el perejil (Petroselinum crispum), el comino (Carum carvi), el anís (Pimpinella anisum), el eneldo (Anethum graveolens) y el hinojo (Foeniculum vulgare) (Calderón de Rzedowski, 2001a). Otras especies poseen alcaloides con efectos letales 10 sobre el sistema nervioso central como la cicuta (Conium maculatum) (Aguilar y Zolla, 1982) y como remedio contra diversos padecimientos como Thapsia garganica utilizada para el tratamiento de cáncer de próstata, reumatismo, catarros y enfermedades pulmonares (Smitt et al., 1996; Makunga et al., 2003), Centella asiatica para el tratamiento de enfermedades de la piel, antipirético, destoxificante y diurético (Solet et al., 1998), Angelica sinensis como estimulante de la circulación, regulador de la menstruación, analgésico, para tratar anemia, dolores de cabeza, hipertensión, bronquitis crónica, asma y reumatismo (Shi-Yu y Kuo-Chang, 1989; Hon et al., 1990) y Ammi majus para tratar el vitiligo, enfermedades de la piel, psoriasis, micosis, pitiriasis, urticaria, alopecia, eczema atípica (Ekiert, 1993) por mencionar algunos ejemplos. Problemática en la reproducción de especies de la familia Apiaceae La familia Apiaceae tiene semillas con un porcentaje muy bajo de germinación debido a la ausencia de embrión que las hace no viables, semillas con embriones rudimentarios que germinan después de un periodo de almacenamiento y semillas con un embrión en estado de dormancia que necesitan estratificación a temperaturas bajas por un periodo de 40 a 95 días (Robinson, 1954) como en el caso de L. porteri y Ferula gummosa (Nadjafi et al., 2006), con temperaturas de 4.4, 20 y 30 °C por periodos de 6 semanas, 12 horas o 12 semanas, respectivamente (Panter et al., 2004) o generalmente acompañadas con el uso de giberelinas para germinar como en Apium graveolens (Bewley y Black, 1994) y en casos como en Chaerophyllum temulum, se requieren bajas temperaturas y el uso de giberelinas (Vandelook et al., 2007). Existen algunos estudios considerados preliminares con L. porteri sobre propagación vegetativa en invernadero a partir de cortes de raíces, semillas adheridas a la umbela y cortes de la corona utilizando las auxinas AIB y ANA, obteniendo resultados con AIB (2 500 y 5 000 ppm) (Sondeno y Panter, 2005) o micorrizas con resultados poco significativos (Sondeno y Panter, 2004). Existe un gran vacío en el conocimiento acerca de la reproducción de la familia y sobre todo de la producción de plantas para su aprovechamiento y comercialización ya que no se han logrado propagar ni por esquejes ni por cultivo de tejidos. Todo esto demuestra la dificultad en el cultivo de especies de esta familia, sobre todo por su reproducción problemática lo que dificulta su propagación y en consecuencia la conservación de estas especies. 11 Metabolitos secundarios de la familia Apiaceae Todas las especies de esta familia son aromáticas. Producen aceites esenciales y resinas las cuales son excretadas en canales esquizógenos en las raíces, tallos, hojas, inflorescencias y algunas veces en los frutos. Los aceites esenciales contienen principalmente monoterpenoides, sesquiterpenoides y fenilpropanoides. Algunos compuestos presentes en los aceites esenciales son sesquiterpenoides de tipo daucano, tipo guaiano y tipo germacrano, ésteres monoterpenoides, aldehídos y ftálidos (Hegnauer, 1971; Heywood, 1971). Los grupos de metabolitos secundarios presentes en esta familia se muestran en la Tabla 5 con algunos ejemplos que han sido reportados en varias especies así como la presencia de estos compuestos en otras familias. Desde el punto de vista quimiotaxonómico, la familia Apiaceae es difícil de estudiarse de manera exhaustiva debido al gran número de géneros y especies; sin embargo los metabolitos secundarios más estudiados han sido las furanocumarinas y otros fenilpropanoides, terpenoides, poliacetilenos y ftálidos. Los fenilpropanoides se han encontrado en más de 300 especies estudiadas pertenecientes a las tres subfamilias: Hydrocotyloideae, Saniculoidae y Apioideae. Sin embargo el resto de los metabolitos tienen una distribución más restringida como el caso de los ftálidos encontrados generalmente en la raíces de los géneros Angelica, Apium, Cnidium, Levisticum, Ligusticum, Lomatium, Meum, Conioselinum y Petroselinum (Crowden et al., 1969; Christensen y Brandt, 2006; Heywood, 1971). Crowden y cols. (1969) hicieron un análisis fitoquímico de 300 especies, que representan el 7.9% de las especies de esta familia. Llegaron a la conclusión de que estas especies pueden ser divididas en dos grupos: aquellas con flavonas, como luteolina, y aquellas con flavonoles como camperol y/o quercetina. Analizaron plantas completas y encontraron que en las semillas de 130 especies, los fenilpropanoides como las furanocumarinas están ampliamente distribuidos en la familia. El análisis de poliacetilenos presentes en raíces tuvo una distribución más restringida, sólo en las tribus Saniculeae, Scandiceae, Smyrnieae, Apieae, Peucedaneae, Laserpitieae y Dauceae se identificaron estos compuestos como el falcarinol, concluyendo que estos compuestos son de poco interés sistemático a nivel de tribu (Crowden et al., 1969). Williams y Harborne (1972) realizaron un estudio de los aceites esenciales presentes en los frutos de 24 especies pertenecientes a la tribu Caucalideae, encontrando en su mayoría monoterpenoides como α y β-pineno y limoneno, comunes a los géneros Daucus y Pseudorlaya, los sesquiterpenoides cariofileno, carotol, daucol, dauceno y caucalol, presentes en los géneros Daucus y Seseli, y otros compuestos como acetato de geranilo y bifenil, presentes sólo en el género 12 Daucus. Estos resultados agrupan a los géneros Daucus, Torilis y Orlaya, siendo Daucus el género más variable con una cantidad y variedad de aceites esenciales tanto en especies silvestres y domesticadas. Tabla 5. Patrón de distribución de metabolitos secundarios en la familia Apiaceae y otras familias botánicas (Heywood, 1971; Crowden et al., 1969; Dewick, 2001). Tipo de compuesto Ejemplos Frecuencia Presencia en otras familias Aceites esenciales Aceite de anís Ubicuos Araliaceae, Asteraceae, Pittosporaceae, Burseraceae, Simaroubaceae, Rutaceae Fenilpropanos Miristicina, elemicina, anetol, estragol, apiol, asarona, dillapiol Frecuentes Myristicaceae, Illiciaceae Ácidos cinámicos Ácido ferúlico, ácido clorogénico, ácido p- cumárico, ácido rosmarínico Frecuentes Rubiaceae, Rosaceae, Asteraceae, Fabaceae, Rutaceae, Bromeliaceae, Poaceae Furanocumarinas Umbeliferona, isoimperatorina, angelicina, atamantina, ostrutina, seselina, farnesiferol A, bergapteno, xantotoxina, psoraleno, isopimpinelina Frecuentes Rutaceae, Pittosporaceae, Fabaceae, Moraceae Piranocumarinas (+/-)-3'-angeloil-4'-acetoxi-cis-kelactona Frecuentes Rutaceae Acetilenos Falcarinona, falcarinol, oenantotoxina, cicutoxina, aetusina, carbinol Frecuentes Araliaceae, Asteraceae, Pittosporaceae, Campanulaceae Sapogeninas triterpénicas tipo urseno y oleaneno Asiaticósido Algunos géneros Araliaceae, Pittosporaceae, Asteraceae, Berberidaceae, Ranunculaceae Flavonoides Quercetina, camperol, luteolina, apigenina, isoramnetina, crisoeriol, diosmetina, acaetina, cianidina, hesperitina, selinona, apiina Algunos géneros Capparaceae, Rosaceae, Theaceae, Alliaceae, Vitaceae, Rutaceae, Brassicaceae, Ranunculaceae, Hamamelidaceae Ácidos grasos Ácido petroselínico Frecuentes Araliaceae, Geraniaceae Oligosacáridos Rafinosa, umbeliferosa, cestosa, centellosa, manitol, ribitol Frecuentes Fabaceae, Brassicaceae, Asparagaceae Ftálidas Z y E-ligustílida, 3-butilideneftálida, senquiunólidas, diligustílida, wallichílida, levistólida A, angelicina, toquinólida A y B Pocos géneros Asteraceae, Gentaniaceae, Typhaceae, Loganiaceae, Rosaceae Terpenoides α y β-pineno, cariofileno, limoneno, humuleno, α y β-felandreno, p-cimeno, timol, espatulenol, α-copaeno, germacreno D, β-bourboneno, β-eudesmol, citronelol Frecuentes Asteraceae, Magnoliaceae, Pinaceae, Piperaceae, Lamiaceae, Poaceae 13 Los compuestos volátiles, que incluyen ftálidas, hasta ahora se han reportado sólo en algunos representantes de la subfamilia Apioideae (Pimenov y Leonov, 1993), en algunos hongos, bacterias y algunas hepáticas (Lin et al., 2005). Estos compuestos se encuentran en aceites esenciales destilados de hojas, tallos y raíces y son los responsables de la actividad antifúngica y actividad relajante sobre el músculo liso, por mencionar algunas. Muchos de estos compuestos están presentes en esencias altamente valoradas en la industria alimenticia y farmacéutica. No existen estudios fitoquímicos de las partes aéreas de L. porteri o alguna otra especie del mismo género, los estudios se han concentrado en los componentes químicos, principalmente ftálidas y fenilpropanoides, presentes en la raíz y la farmacología de éstos. Biología de Ligusticum porteri y Petroselinum crispum El género Ligusticum L. El nombre del género se deriva del latín Ligustikon o Ligystikos y hace referencia a la abundancia de una planta de la familia Apiaceae, probablemente Levisticum sp., que crecía en la región de Liguria, cuyo territorio incluía partes de lo que ahora es el sureste de Francia así como la provincia de Liguria en Italia (Cronquist et al., 1997; Huxley et al., 1999). El género Ligusticum de la familia Apiaceae incluye 25 especies distribuidas en la zona templada del hemisferio norte y oeste, de las cuales 11 especies están distribuidas en Norte América: L. scothicum L., L. tenuifolium S. Watson, L. filicinum S. Wats., L. porteri Coulter & Rose (Figura 2), L. grayi Coulter & Rose, L. hultenii Fernald, L. canadense L., L. californicum Coulter & Rose, L. canbyi Coulter & Rose, L. apiifolium (Nutt.) A. Gray y L. verticillatum (Geyer) Coulter & Rose (Mathias y Constance, 1944; Pimenov y Leonov, 1993; USDA Natural Resources Conservation Service, 2007). En Estados Unidos se recolectan L. filicinum, L. tenuifolium y L. grayi además de L. porteri con propósitos medicinales y son utilizadas y vendidas con el nombre de “osha” en los mercados. Estas especies se distinguen por la estructura y el número de rayos de la umbela (Cronquist et al., 1997), aunque frecuentemente son confundidas con Conioselinum scopulorum (Applequist, 2005). 14 Descripción botánica del género Ligusticum (basada en Cronquist et al., 1997; Mathias y Constance, 1944; observaciones personales) Hierbas monoicas, perennes. Tallos duros o delgados, erectos, escaposos a caulescentes, sencillos o ramificados, glabros o algo puberulentos. Raíz axonomórfica, perenne, con pocas raíces adventicias desde la corona, fibrosas y coronada sobre la raíz principal. Hojas ternadas y ternadas-pinnadas compuestas a disectadas, pecioladas, membranosas a subcoriáceas, basales o caulinas o totalmente basales; con o sin foliolo ancho bien definido, lineales a obovadas o cuneadas, completa o pinnadas lobadas e incisas; pecíolos cubiertos. Inflorescencia de umbelos compuestos; pedúnculos terminales o laterales, o sólo terminales, rayos pocos a numerosos, esparcidos ascendentes, involucro ausente o de brácteas deciduas inconspicuas; involucelo ausente, o de pocas brácteas o bracteletas estrechas inconspicuas lineales o filiformes más cortas que las flores; pedicelos delgados, esparcidos ascendentes. Flores blancas o algunas veces rosadas; dientes del cáliz evidentes a oscuros; pétalos espatulados a obovados con un ápice inflexible estrecho; estambres 5; ovarios 2; estilos cortos, esparcidos; el estilopodio bajo cónico o casi en forma de cojín; carpóforo bífido en la base. Fruto esquizocarpo de 2 mericarpos, oblongo a ovado o suborbicular, subterete o ligeramente comprimido lateralmente, glabro, costillas evidentes, a veces aladas, aceites resinosos 1-6 en los intervalos, 2-10 en la comisura; mericarpo con una semilla aplanada dorsalmente o subterete en sección transversal, normalmente acanaladas bajo los intervalos, la cara plana a profundamente cóncava, con o sin una cresta central longitudinal. n = 11. 15 Figura 2. Ligusticum porteri. Hunt Institute for Botanical Documentation. Carnegie Mellon University, Pittsburgh, Pennsylvania. 16 Ligusticum porteri Coulter & Rose La clasificación taxonómica de L. porteri se muestra en la Tabla 6: Tabla 6. Taxonomía de Ligusticum porteri (Cronquist et al., 1997; Pimenov y Lemonov, 1993). Reino Subreino Superdivisión División Clase Subclase Orden Familia Subfamilia Tribu Género Especie Plantae Tracheobionta Espermatophyta Magnoliophyta Magnoliopsida Rosidae Apiales Apiaceae Apioideae Apieae Ligusticum L. Ligusticum porteri Coulter & Rose Los sinónimos de L. porteri (J.M. Coulter & Rose, Revision of North American Umbelliferae, 86. 1888) son: • Ligusticum goldmani J. M. Coulter & Rose, Proceedings of the Washington Academy of Sciences, 1: 146. 1900. • Ligusticum nelsoni J. M. Coulter & Rose, Proceedings of the Washington Academy of Sciences, 1: 147. 1900. • Ligusticum simulans J. M. Coulter & Rose, Contributions from the U. S. National Herbarium, 7: 135.1900. • Ligusticum affine A. Nelson, Bulletin of the Torrey Botanical Club, 28:223-224. 1901. • Ligusticum madrense Rose, Contributions from the U. S. National Herbarium, 8: 336. 1905. Descripción botánica de L. porteri (basada en Mathias y Constance, 1944; Cronquist et al., 1997; Galaviz et al., 1994; Constance et al., 1976; observaciones personales) (Fig. 2 y 3A-I) Hierba monoica, perenne. Tallo firme, caulescente, ramificado libremente, de 5 a 10 dm de altura (Fig. 3A-B), glabro a través de o la inflorescencia puberulenta. Raíz axonomórfica, perenne, con pocas raíces adventicias desde la corona, fibrosas y coronada sobre la raíz principal (Fig. 3B-C). 17 Hojas ovadas en el contorno general (Fig. 3E), excluyendo los pecíolos 15-28 cm de largo, 12-20 cm de ancho, 1-3 ternadas-pinnadas, foliolos ovados, mayormente distintos, sésiles a peciolados, 2.5-5 cm de largo, 1-3 cm de ancho, regularmente incididos, los lóbulos obtusos o agudos, completamente o dentados; pecíolos 1-3 dm de largo; hojas caulinas como las basales, con divisiones poco lobadas; pedúnculos firmes, alternados y algunas veces verticilados, 6-30 cm de largo, ligeramente hinchados en el ápice; involucro ausente u ocasionalmente solitario en una bráctea decidua; involucelo ausente o en varias bracteletas lineales, 2-7 mm de largo, igualmente o más cortos que las flores y frutos. Inflorescencia de umbelos compuestos (Fig. 3F), los rayos del umbelo principal generalmente 10 o 13-25, 11-24 rayos, ascendentes, desiguales, 2.5-6 cm de largo; pedicelos ascendentes separados preferentemente estrictos, 5-12 mm de largo. Flores blancas (Fig. 3G). Estambres 5. Ovarios 2. Frutos esquizocárpicos oblongos (Fig. 3H), 5-8 mm de largo, 2-4 mm de ancho, teretes, las costillas estrechamente aladas; 4-6 tubos aceitosos en los intervalos, 8-10 en la comisura. Semillas aplanadas dorsalmente en la sección transversal, acanaladas bajo los tubos. n = 11 (Figura 3I). 18 Figura 3. Ligusticum porteri Coulter & Rose en Chihuahua, México (Octubre 2005). A-B. Planta completa (D. Goldhaber), barra: 20 cm, C-D. Raíz (D. Goldhaber), barra: 10 cm, E. Hojas (D. Goldhaber), barra: 10 cm, F. Inflorescencia (R. Bye), barra: 5 cm, G. Flores (R. Bye), barra: 5 cm, H. Frutos (R. Bye), barra: 5 cm, I. Semillas (R. Bye). A D E 19 Distribución geográfica Existen 10 especies en Norte América y Ligusticum porteri es la especie que se encuentra en el límite sur de su distribución geográfica. Es una especie holártica propia de climas templados con poblaciones en bosques de pino-encino en el norte de la Sierra Madre Occidental en los estados de Chihuahua, Durango y Sonora y en el sur de las Montañas Rocallosas en Estados Unidos en los estados de Colorado, Wyoming, sur de Idaho, sur de Utah, Nuevo México, este de Nevada y sur de Arizona (Mathias y Constance, 1944; Cronquist et al., 1997) (Figura 4) con poblaciones muy pequeñas y muy dispersas en un espacio extenso (Walter y Gillet, 1998). Figura 4. Distribución geográfica de Ligusticum porteri en México y Estados Unidos (Modificado de w3 TROPICOS de Missouri Botanical Garden, 2006). Etnobotánica Ligusticum porteri es conocida como “chuchupate”, “chuchupaste” “guarica”, “chuchufate” y “chuchupasto” en Chihuahua y el Distrito Federal; “ha-chi-de”, “ha-chi-di” por los Mescaleros Apaches en Nuevo México; “kwimi dechi” por los Zunis en Nuevo México; “osha” en Colorado, Nuevo México; “pah-net-snap” por los Pauite en Utah; “raíz angélica” en Texas; “raíz de cochino” 20 en Durango; “wadda-e-gopa” por los Puites en Nevada; “wasia” por los Tarahumaras en Chihuahua; “yerba del cochino” en Chihuahua y Durango (Linares y Bye, 1987). En la antigüedad, la raíz estaba recomendada en Guazápares para el dolor precipitado y cólicos; en Guaguachic para limpiar los oídos con señales de piojos; en Chínipas para dolores generales y en San Buenaventura y Nabogame para la flatulencia y otros desórdenes intestinales. “Chuchupastle” era una planta medicinal para los indígenas Névomes de Sonora. “Chuchupasto” fue registrada entre los indígenas Tepehuanes de Chihuahua. “Chuchupate”, un remedio para cólicos y flatulencia en Florilegio Medicinal de Todas las Enfermedades (Esteyneffer, 1978), es probable que se refiera a la L. porteri nativa más que a M. balsamum de Sudamérica, reportado por Anzures y Bolaños (1978) (Linares y Bye, 1987; Bye, 1986). Es utilizada para quitar el dolor del pulmón causado por trabajar mucho o bien por levantar cosas pesadas cuando la persona se empieza a hacer vieja y que se manifiesta por cansancio, se toma una taza del cocimiento de la raíz, por la mañana, a medio día y por la tarde (Argueta et al., 1994). La raíz de L. porteri es gruesa y con un olor fuerte y muy característico. La infusión de la raíz seca o fresca se consume para aliviar dolores de estómago, cólicos, úlceras y diarreas, como analgésico y remedio contra la bronquitis, neumonía, tuberculosis, resfriados y tos. Las infusiones y extractos alcohólicos se consumen para aliviar la garganta irritada, la infusión se utiliza de manera tópica contra dolores del cuerpo y en baños para el tratamiento de fiebres. La infusión se recomienda para tratar diabetes, problemas de circulación y resacas. La raíz pulverizada se aplica de manera tópica en heridas y cortaduras para prevenir infecciones. En el sur de Colorado y la zona adyacente de Nuevo México, se rasura la raíz seca y se mastica como aperitivo y para mantener la juventud del cuerpo, se ha sugerido que es el equivalente mexicano del ginseng. Se cree que al colocar el cataplasma de la raíz en mordidas de insectos y alacranes, saca el veneno y el cataplasma solo o combinado con pino (Pinus edulis) y hojas de “ponche mexicano” (Nicotiana sp.) se aplica en áreas del cuerpo con dolores reumáticos, calambres y huesos rotos. La raíz se utiliza como emético mezclada con sal y agua caliente (Linares y Bye, 1987; Appelt, 1985; Ortiz et al., 2007; Bye, 1985). Las hojas y las raíces pulverizadas de L. porteri son valoradas como condimento para carnes y frijoles. En el Valle de San Luis en Colorado, “oshá del jardín” (Levisticum officinale) es utilizada como sustituto de “oshá” (Linares y Bye, 1987; Bye y Linares, 1986). Las infusiones de L. porteri son utilizadas en ceremonias rituales-curativas por los Tarahumaras y Zunis (Camazine y Bye, 1980). La raíz es utilizada como talismán para alejar a las brujas y serpientes venenosas así como para dar suerte. Para contrarrestar los efectos del “aire”, el cuerpo completo se soba con la tintura. Los Tarahumaras también utilizan la raíz como piscicida 21 (Linares y Bye, 1987). Entre los indígenas Tewa de Nuevo México, la raíz de “osa” era altamente apreciada para tratar diarrea y otros desórdenes gastrointestinales. Robbins y cols. (1916) reportaron que una planta, talvez Angelica grayi, tiene una raíz similar a la de L. porteri pero sin el olor característico. También indicaron que la raíz se utiliza de manera similar por los indígenas Yavapais y otras tribus en el sur de Arizona y que es un artículo de intercambio entre los Tewa y los vendedores ambulantes mexicanos. Entre los indígenas Pauite del sur de Utah, L. porteri (antes identificada como L. apiifolium era un remedio popular para el dolor de estómago (Linares y Bye, 1987). En Sonora, la flora medicinal Pima de Yecora la menciona para “el tratamiento del resfriado, tos, estómago suelto, falta de sueño: se toma una taza de cocimiento de la raíz, en la mañana y en la tarde. Para el tratamiento de las picaduras de alacrán o reumas: se toma un vaso del cocimiento de la raíz, tres veces al día. Para el mal puesto: se reza cuando se está cociendo la raíz y se da una copita a la persona, tres veces al día. También menciona la causa y síntomas de estas enfermedades: el resfriado y la tos se presentan generalmente en tiempos de frío, por el cambio de clima. La falta de sueño puede deberse a que el estómago está muy recargado, porque se ha comido mucho o que la comida tenía mucho chile o grasa. Las reumas se deben a que a la persona le llovió en el campo y se quedó con la ropa mojada y se le secó en el cuerpo, o se acercó al fuego con la ropa mojada. Una persona tiene mal puesto por problemas personales con otras personas, éstas le desean todo mal, si la persona es débil de pensamiento y no tiene fe, se enferma y puede morir. La persona que está tomando la raíz no se debe mojar, si lo hace se le puede hinchar el cuerpo, por lo que se recomienda no coger agua. La raíz se puede colectar en cualquier tiempo, pero en octubre es mejor porque ya está “sazona” (Galaviz et al., 1994). En Durango la infusión de la raíz se bebe para aliviar el dolor de estómago, remedio que también se da a los niños para tratar los cólicos (Argueta et al., 1994). Los indígenas Zuni del oeste-centro de Nuevo México utilizan la raíz pulverizada en agua fresca aplicada en el cuello e ingerido para aliviar la garganta adolorida. La infusión es aplicada tópicamente para aliviar dolores del cuerpo. En ceremonias curativas, la raíz es masticada por el paciente y el curandero para aliviar varios padecimientos (Camazine y Bye, 1980). A través de toda su distribución natural, grupos indígenas hispanos y americanos usan y compran “chuchupate”. Más allá de su distribución en el noreste y centro de México, es considerada una medicina efectiva que exige un alto precio (Linares y Bye, 1987). 22 Fitoquímica En la raíz de L. porteri se han identificado las ftálidas Z-ligustílida, E-ligustílida, (Z)-3- butilideneftálida (Delgado et al., 1992; Cégiéla-Carlioz et al., 2005), riligustílida, (Z,Z′)-rel-(6R, 7R)-6.6′,7.3a′-diligustílida y Z-8.6′,3.7′-diligustílida (Delgado et al., 1988; Reza, 1987), los terpenoides α-pineno, α-felandreno, limoneno, β-felandreno, α-terpineno, p-cimeno (Delgado et al., 1992), α-tujeno, sabineno, β-pineno, mirceno, γ-terpineno, cis-tujona, 1,2-epóxido de α- felandreno, sabinol, α-terpineol, α-barbateno, β-funebreno, widreno, miristicina, β-barbateno, α- chamigreno, α-eudesmol, 1,3,8-mentatrieno, terpinen-4-ol, 2,5-dimetoxi-p-cimeno, kesano, ligulóxido (Cégiéla-Carlioz et al., 2005), los compuestos fenólicos isovainillina, ácido 4-hidroxi-3- metoxicinámico (Delgado et al., 1988; Reza, 1987) elemicina, o-metileugenol y otros compuestos como pentilbenzeno, timil metiléter, carvacril metiléter, isotujil acetato, sabinil acetato, trans- pinocarveil acetato, bornil acetato, 4-vinilguayacol, 4-terpinil acetato, α-terpinil acetato (Cégiéla- Carlioz et al., 2005). De otras especies del género Ligusticum como: L. involucratum, L. elatum, L. multivittatum, L. tenuissimum y L. seguieri se han identificado: bergapteno, psoraleno, anomalina, pterixina, kelactona (Appelt, 1985); ácido ferúlico, tetrametilpirazina, coniferil ferulato (Li et al., 2006); quercetina (3-rutinósida y 3-glucósido), luteolina (Crowden et al., 1969); manitol, trans-kelactona, β-sitosterol (Kapoor et al., 1972), isoimperatorina, isooxipeucedanina, bergapteno (Lemmich et al., 1971), anomalina, pterixina, selinidina, epoxipterixina, cis-kelactona (Gupta et al., 1975), liginvolonas A-D (Shibano et al., 2005), imperatorina, xantotoxina, isopimpinelina, angelicina, umbeliferona, nutalina, cis-kelactona, 3’(R),4’(R)-4’senecioil kelactona, 3’(R),4’(R)-3’,4’- disenecioil kelactona, (+)-octanoilomatina, (+)-decanoilomatina, (+)-dodecanoulomatina, falcarindiol, ácido ferúlico, (+)-peujaponisina y multivitanas A-D (Kondo et al., 2008). Cabe mencionar que estos compuestos también han sido identificados en especies de los géneros Cnidium (Kobayashi et al., 1987), Meum (Kaouadji y Pouget, 1986), Apium (MacLeod y Ames, 1989) y Angelica (Kaul et al., 1996). Los géneros Cnidium, Meum y Apium, que pertenecen a la subfamilia Apioideae y a la tribu Apieae, pueden ser agrupados taxonómicamente desde el punto de vista fitoquímico, y éstos a su vez, agruparse con el género Angelica (tribu Angeliceae), debido a que biosintetizan los mismos tipos de compuestos encontrados en raíces y partes aéreas. 23 Problemática en el aprovechamiento de Ligusticum porteri en México Mientras que su aprovechamiento se mantuvo como remedio contra males de las comunidades locales, las poblaciones de L. porteri se conservaron; sin embargo, ahora han sido y son sumamente afectadas por la acción combinada del aumento de la demanda y la población que han resultado en la colecta indiscriminada de su raíz, además del sobrepastoreo, la pérdida de su hábitat debido a la tala inmoderada de los bosques y su uso se ha extendido a las ciudades del país, lo que ha hecho crecer la presión por la colecta para su comercialización y sobre todo porque su cultivo por métodos agrícolas ha sido muy poco eficiente (CITES, 1999). Esta especie fue propuesta en 1999 por la Universidad de Maryland dentro del Programa de Desarrollo Sustentable y Biología de la Conservación a la Autoridad Científica del Departamento de Pesca y Vida Silvestre de Estados Unidos para ser incluida en el Apéndice II de CITES (Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora) debido a la creciente demanda de la planta y a que la industria no distingue entre especies de Ligusticum, lo que amenaza también al resto de ellas (CITES, 1999). En México, la norma oficial NOM-004- RECNAT-1996 que trata sobre los procedimientos, criterios y especificaciones para realizar el aprovechamiento, transporte y almacenamiento de raíces y rizomas de vegetación forestal no incluye a L. porteri. Además, L. porteri está citada como especie “rara” por la Lista Roja de Plantas Amenazadas de 1997 (Walter y Gillett, 1998). Esto significa que L. porteri tiene una población mundial pequeña que no está en peligro de extinción o es vulnerable, pero está en riesgo de serlo. Las especies designadas como raras tienen un tipo de hábitat específico, una distribución restringida o se le encuentra ampliamente dispersa en un área muy extensa (Walter y Gillett, 1998). El Fondo para la Vida Silvestre Mundial (World Wildlife Fund) clasificó a las poblaciones de L. porteri en declive desde hace 10 años (Robbins, 1999). El género Petroselinum Hill El nombre del género viene del griego Petroselinon, el nombre del perejil común. Es un género con 8 especies: P. crispum (Mill.) Nyman ex A. W. Hill (Figura 5)., P. dissectum Benth, P. hortense Hoffm., P. humile Meisn, P. peregrinum Lag., P. petroselinum (L.) H. Karst., P. sativum Hoffm., y P. vulgare Lag. Es un género nativo de Europa y la región del Mediterráneo. En el Valle de México existe sólo una especie, P. crispum. 24 Descripción botánica del género Petroselinum (basada en Calderón de Rzedowski, 2001; Cronquist et al., 1997; observaciones personales) Hierbas bianuales. Tallo corto. Una raíz principal, pivotante. Hojas basales pinnadas o ternadas- pinnadas; compuestas o decompuestas; pecioladas, con los pecíolos envainantes en la base; láminas una o más veces o pinnadas, o bien, ternado-pinnadas, los últimos segmentos ovados a lineares, dentados o lobados. Inflorescencias en forma de umbelas compuestas; sobre pedúnculos terminales y axilares; involucro constituido por pocas brácteas inconspicuas o ausente; involucelo de varias bracteolas lineares, cortas; radios pocos a numerosos, extendidos y ascendentes. Flores amarillas o verdoso-amarillentas; dientes del cáliz diminutos u obsoletos; pétalos con el ápice angosto e inflexo; estilos cortos, extendidos, estilopodio bajo, cónico; carpóforo partido hasta la mitad o hasta la base. Fruto esquizocárpico de 2 mericarpos (“semillas”) ovoide a oblongo, aplanado lateralmente, glabros, con las costillas prominentes, filiformes, tubos oleíferos solitarios en los espacios intercostales y dos en la cara comisural. n = 11. 25 Figura 5. Petroselinum crispum (Mill.) Nyman ex A.W. Hill. (Cronquist et al., 1997). 26 Petroselinum crispum (Mill.) Nyman ex A. W. Hill La clasificación taxonómica de Petroselinum crispum se muestra en la Tabla 7: Tabla 7. Taxonomía de Petroselinum crispum (Cronquist et al., 1997; Pimenov y Lemonov, 1993). Reino Subreino Superdivisión División Clase Subclase Orden Familia Subfamilia Tribu Género Especie Plantae Tracheobionta Espermatophyta Magnoliophyta Magnoliopsida Rosidae Apiales Apiaceae Apioideae Apieae Petroselinum Hill Petroselinum crispum (Mill.) Nyman ex A. W. Hill Descripción botánica de P. crispum (basada en Calderón de Rzedowski, 2001; Argueta et al., 1994; observaciones personales) (Fig. 5 y 6A-G) Hierba (Fig. 6A) bianual o anual, glabra, erecta, hasta de 1.3 m de alto. Tallo corto (Fig. 6B). Una sola raíz, larga y de color claro (Figura 6C). Hojas basales (Fig. 6D); hojas inferiores sobre pecíolos de 10 a 20 cm de largo, láminas biternadas o bi a tripinnadas, de 4 a 10 cm de largo y de ancho, foliolos peciolulados, ovados a estrechamente lanceolados, enteros, trífidos, dentados o lobulados, de 2 a 5 cm de largo por 0.5 a 4 cm de ancho; las hojas superiores con los pecíolos más cortos (Fig. 6E), totalmente envainantes y con las divisiones más angostas en general. Inflorescencias en umbelas (Figura 6F) numerosas, terminales y axilares, sobre pedúnculos de 3 a 15 cm de largo, involucro ausente o formado por pocas brácteas enteras, inconspicuas, radios 10 a 20, de 1 a 5 cm de largo, involucelo de 4 a 7 bracteolas lineares o lanceoladas. Flores amarillas (Figura 6G), amarillo-verdosas o blanco-verdosas; fruto ovoide-oblongo, de 2 a 4 mm de largo por 1 a 3 mm de ancho; n = 11 (Figura 6H). Originaria de la región del Mediterráneo, está presente en climas cálidos, semisecos, semicálidos y templado desde 200 a 2300 m.s.n.m. Ha sido introducida y cultivada en muchos lugares del mundo; esporádicamente se le encuentra escapada y está adaptada a diferentes condiciones ecológicas. 27 Figura 6. Petroselinum crispum A. Planta completa (D. Goldhaber), B. Tallo (D. Goldhaber), barra: 1.5 cm, C. Raíz (D. Goldhaber), barra: 10 cm, D. Hojas inferiores (D. Goldhaber), barra: 5 cm, E. Hojas superiores (D. Goldhaber), barra: 5 cm, F. Inflorescencia (D. Goldhaber), barra: 10 cm, G. Flores (D. Goldhaber), barra: 5 cm, H. Semillas (D. Goldhaber). 28 Etnobotánica En el siglo XVII, Gregorio López relata que el perejil “abre y desopila hígado y bazo, provoca orina y menstruación, deshace piedra de vejiga y riñones, disminuye la leche en las que crían, resuelve ventosidades y cura apostemas, sana sarna y postillas, es contra tiricia, alegra y refresca la sangre, calienta los miembros al que está frío y helado” (Argueta et al., 1994). A inicios del siglo XVIII, Juan de Esteyneffer señala su uso “contra la hidropesía, males de la pituita, desgano de comer, cólera, destemplanza del hígado, obstrucción hepática, hidropesía, calenturas y morbo gálico”. Para el siglo XX, Alfonso Herrera refiere: su utilidad contra la conjuntivitis, también como diurético, antiperiódico y emenagogo y además su uso como condimento. Posteriormente, Maximino Martínez reporta su empleo como afrodisíaco, antiepiléptico, antipirético, diurético, hemostático, hidropesía y para la nefritis. Finalmente, Luis Cabrera la cita como afrodisíaco, diurético y emenagogo (Argueta et al., 1994). Las hojas frescas del perejil son ampliamente utilizadas como adorno y cortadas, ya sea frescas o secas, para dar un sabor característicamente fuerte a los alimentos en todo el mundo. Todas las partes de la planta son utilizadas en infusiones o tinturas como carminativo, antiespasmódico, diurético (Kreydiyyeh y Usta, 2002), emenagogo, expectorante, antirreumático, antibacterial y antioxidante (Wong y Kitts, 2006; Zhang et al., 2006). Tradicionalmente, se ha usado para dispepsias flatulentas, cistitis cólica, disuria, tos con bronquitis en gente mayor, dismenorrea, amenorrea funcional, mialgia y específicamente para dispepsia flatulenta con cólicos intestinales (Gbolade y Lockwood, 1999). En Michoacán y Puebla el perejil es utilizado para el dolor de muelas, con este propósito se hacen buches con el cocimiento de tallos y hojas. En Guerrero se utiliza como diurético, carminativo y emenagogo. Para obtener estos efectos se toma el cocimiento de la planta completa en la comida o se bebe como caldo. De igual forma, se aconseja usarlo cuando hay calor en el estómago o paño en la cara, aunque en este último caso se puede comer crudo, en ensalada. Por otra parte, para controlar la hemorragia nasal por calor, se emplea la infusión de la planta. Para bajar de peso se toma el jugo de toda la planta. Y como anticonceptivo se bebe el té por tres días seguidos antes de la regla. Además se le utiliza en enfermedades de tipo digestivo como diarrea, cólicos de niños, dolor de estómago, así como para aliviar las postemillas, curar el “espanto” y el “susto”. El perejil, la albahaca y el sauco, se emplean para tratar la “caída de mollera”, con este fin la curandera lava a la criatura con las plantas, después de haberle hecho una “limpia” con romero, sauco y albahaca. En general, esta especie se utiliza para el tratamiento de la bilis, vesícula, bronconeumonía, tosferina, para favorecer la menstruación o retenerla, la “alferecía 29 de niño”, la circulación, el corazón y “hervor de sangre”, “mal de orín”, la diabetes, cólicos, hemorragia nasal, caspa y el “ataque” (Argueta et al., 1994). En Puebla, se utilizan los tallos y las hojas en fresco para el “espanto”, “mal de ojo” y ataques. En Pahuatlán, para el “espanto”, se pone a calentar una hoja de plátano húmeda, se coloca encima la hierba del golpe, perejil, toronjil, estafiate, ruda, Santa María y muicle, se tapa por tres minutos, luego se restriega en una bandeja con medio litro de refino, se le da a tomar al enfermo un vasito y lo demás se frota en el cuerpo (Martínez et al., 1995). El nombre local es perejil, su uso es como especia y medicinal, la parte usada son los tallos y hojas y su distribución en Puebla es en Cuetzalán del Progreso y Pahuatlán, crece en huertos, es de abundancia regular, se cosecha de agosto a septiembre, tiene calidad de planta “caliente” y su vía de administración es oral o local (Martínez et al., 1995). Fitoquímica Del aceite esencial de hojas y pecíolos se han identificado los monoterpenoides α y β-pineno, sabineno, p-xileno, mirceno, α y β-felandreno, terpinoleno, p-mentatrieno (Freeman et al., 1975), timol, p-menta-1,3,8-trieno (Simon y Quinn, 1988), α-tujeno, campfeno, sabineno, α y γ-terpineno, limoneno, cis y trans-β-ocimeno, p-cimeno, α-terpinoleno, α-cubebeno, β y γ-elemeno, α-terpineol, α y β-terpineno; los sesquiterpenoides γ-cadineno, β-bisaboleno, δ-cadinol, β-cariofileno, α- copaeno, sesquitefelandreno, miristicina, apiol, elemicina, criptona (MacLeod et al., 1985) y carotol (Karting et al., 1972); las furanocumarinas psoraleno, bergapteno, xantotoxina, isopimpinelina, isoimperatorina, oxipeucedanina, hidrato de oxipeucedanina, saxalina, graveolona (Beber et al., 1994; Chaudhary et al., 1986); el flavonoide quercetina (Crowden et al., 1969); los alcoholes cis- hex-3-en-1-ol, etanol y metanol (Freeman et al., 1975); los componentes azufrados sulfuro de dimetilo, disulfuro de carbono, disulfuro de dimetilo; los hidrocarburos aromáticos benceno, tolueno, etil benceno, o y p-xileno, 4-isopropenil-1-metilbenceno, cumeno, naftaleno, 4-propan-2- ol-2-il-tolueno (Simon y Quinn, 1988; Karting et al., 1972); los aldehídos fenilacetaldehído, hexanal (MacLeod et al., 1985), trans-2-hexenal, y 2,4-decadienal y el compuesto orgánico benzoato de bencilo (Karting et al., 1972). Del aceite esencial de los frutos son varios los metabolitos que se han identificado: las furanocumarinas oxipeucedanina, isoimperatorina, imperatorina, psoraleno (Ceska et al., 1987). Del aceite esencial de las semillas se han identificado los sesquiterpenos crispano, crispanona (Spraul et 30 al., 1992) y heraclenol (Kato et al., 1978). Del aceite esencial de la raíz se han identificado los alcoholes poliacetilénicos falcarinol y falcarindiol (Nitz et al., 1990); los monoterpenos α y β- pineno y los fenilpropanoides miristicina y apiol (Lamarti et al., 1991); los sesquiterpenoides crispano y crispanona (Spraul et al., 1992) y la furanocumarina oxipeucedanina (Chaudhary et al., 1986) 31 Metabolitos secundarios Las plantas han sido utilizadas durante siglos por diversos grupos humanos para tratar diversos padecimientos ya que representan la principal fuente de productos naturales que producen efectos terapéuticos importantes en el cuerpo humano. Estos productos naturales o metabolitos secundarios representan un recurso para el desarrollo de nuevos fármacos (Rao y Ravishankar, 2002). Las vías metabólicas primarias que dan origen a los compuestos primarios: aminoácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos, ácidos carboxílicos, etc., suministran un número sorprendentemente reducido de moléculas fundamentales, las cuales, a través de las mismas o similares vías de biosíntesis, dan origen a otro tipo de compuestos que por sus características particulares y específicas se denominan metabolitos secundarios. Éstos se caracterizan por la gran heterogeneidad de su estructura química, su distribución restringida, su formación por medio de enzimas codificadas por material genético especial, el control estricto de su biosíntesis, la compartimentación de enzimas, precursores, intermediarios y productos involucrados en su biosíntesis, almacenamiento y desintegración, la expresión de este metabolismo como un aspecto de especialización celular, o bien, de la formación de nuevas células especializadas que se integran en los programas de diferenciación y desarrollo del organismo productor, la importancia relativa para la célula sintetizadora como tal, y la mayor importancia para el organismo como un todo y la falta de continuidad filogenética en muchos de ellos (Anaya, 2003). Sin embargo, algunas de las características anteriores pueden ser aplicables a ciertos compuestos primarios como las proteínas; por ello, en algunos casos, es sumamente difícil establecer una frontera definida entre metabolitos primarios y secundarios, por ejemplo, existen muchos amino ácidos poco comunes, que deben ser considerados como metabolitos secundarios, por el contrario, muchos de los compuestos considerados como secundarios se encuentran presentes en todas las plantas y son esenciales para su sobrevivencia (Anaya, 2003). Respecto a los precursores de los metabolitos secundarios, éstos se pueden derivar del ácido shiquímico, es precursor de muchos compuestos aromáticos, incluyendo los aminoácidos aromáticos, ácidos cinámicos y ciertos polifenoles; los aminoácidos ornitina, alanina, lisina, fenilalanina y triptófano, entre otros compuestos, dan origen a los alcaloides, y el acetato, es precursor de poliacetilenos, polifenoles, flavonoides, naftalenos, antracenos e isoprenoides a través de rutas biosintéticas separadas (Anaya, 2003; Valencia 1995). Los metabolitos secundarios desempeñan un papel ecológicamente importante. Son moléculas que acarrean información del organismo hacia el medio, particularmente hacia otros organismos (Anaya, 2003). En el caso de las plantas, los metabolitos secundarios pueden servir como atrayentes para polinizadores, servir como defensa, protección o químicos de ataque contra microorganismos, insectos y herbívoros e incluso contra otras plantas como herbicidas (Verpoorte et al., 2000). 32 Sin embargo, la disponibilidad de los metabolitos secundarios es un factor limitante debido a dos causas básicas: intrínsecas o endógenas donde intervienen factores inherentes a la genética del organismo vegetal, el estado fisiológico y de desarrollo, y extrínsecas o exógenas, con factores inherentes a las condiciones del medio en que crece la planta como la sobreexplotación, mal manejo de las fuentes naturales, al sobrepastoreo, al continuo cambio en los ecosistemas y sobre todo al rápido crecimiento poblacional humano que han puesto en peligro de extinción o han extinguido ya a muchas especies vegetales (Chrispeels y Sadava, 1994; Valencia, 1995; Oskman-Caldentey e Inze, 2004). Por estas razones la búsqueda de nuevas alternativas para la producción de compuestos útiles de origen vegetal y estudios biotecnológicos, específicamente el cultivo de tejidos vegetales, tienen potencial para darle valor agregado a la agricultura tradicional respecto a la producción de metabolitos bioactivos vegetales, ya que ofrecen la oportunidad de explorar las células, tejidos, órganos o el organismo completo para cultivarlos in vitro y llegar a manipularlos genéticamente para obtener estos compuestos. Además del interés comercial, los cultivos celulares de vegetales son un sistema modelo muy útil para estudiar la biosíntesis de metabolitos secundarios (Verpoorte et al., 2000). Aceites esenciales Los aceites esenciales son comercialmente importantes porque sirven de base en los perfumes naturales y en especias y como saborizantes en la industria alimenticia. Las familias botánicas ricas en aceites esenciales son: Asteraceae, Lamiaceae, Myrtaceae, Pinaceae, Rosaceae, Rutaceae, Brassicaceae, Liliaceae y Apiaceae (Harborne, 1973). Estos compuestos pueden actuar como repelentes de insectos, animales o parásitos, previniendo la destrucción de las flores y hojas, pueden desempeñarse como atrayentes de insectos para la polinización o en algunos casos ejercer el papel de reservas para la planta, para sellar heridas o como protección contra la evaporación excesiva de agua (Tyler et al., 1988; Guenther, 1942). Los constituyentes químicos de los aceites esenciales se pueden dividir en dos clases generales basados en su origen biosintético: (1) derivados de terpenos formados por la ruta acetato-ácido mevalónico y (2) compuestos aromáticos formados por la vía del ácido shiquímico-fenilpropanoide (Tyler et al., 1988). Los terpenos presentes en aceites esenciales pueden dividirse en mono y sesquiterpenos e isoprenoides C10 y C15; y los monoterpenos se pueden dividir a su vez en acíclicos (geraniol), monocíclicos (limoneno) o bicíclicos (α y β-pineno), y dentro de cada grupo, los monoterpenos pueden ser hidrocarbonos insaturados (mentol) o tener grupos funcionales y ser alcoholes (mentol), aldehídos o cetonas (mentona y carvona) (Harborne, 1973). 33 Prácticamente, todos los aceites esenciales consisten de mezclas químicas que generalmente son muy complejas y varían en composición. Casi cualquier tipo de compuesto orgánico puede encontrarse en ellos como hidrocarburos, alcoholes, cetonas, aldehídos, ésteres, óxidos, éteres, entre otros, y sólo algunos aceites esenciales poseen un solo componente en alto porcentaje como el aceite de mostaza (93% de alilisotiocianato) o el aceite de clavo (85% eugenol) y sin embargo, no es difícil encontrar aceites con más de 200 componentes (Tyler et al., 1988). Muchas plantas medicinales son utilizadas por su contenido de aceites esenciales como la manzanilla (Matricaria sp.), la menta (Mentha sp.), el eucalipto (Eucalyptus sp.), el pino (Pinus sp.), aceites de cítricos (Citrus sp.), anís (Pimpinella sp.), comino (Cuminum sp.), eneldo (Anethum sp.) y alcaravea (Carum sp.) (Harborne, 1973). Terpenoides Este grupo de compuestos se producen a partir de acetil-CoA por dos rutas: la ruta del ácido mevalónico o la ruta del metilertitriol fosfato, y están formados por unidades de isopreno (C5H8)n en una cadena linear. Esta cadena puede ciclarse dando origen a una gran variedad de terpenos cíclicos (Anaya, 2003). Los terpenoides se dividen según el número de unidades de isopreno que contenga su molécula. Estos grupos son los siguientes (Anaya, 2003; Romo de Vivar, 1985): 1. Hemiterpenoides (C5), formados por una unidad de isopreno (alcohol dimetilalílico, isopentenol, alcohol isoamílico); 2. Monoterpenoides (C10), formados por dos unidades de isopreno (geraniol, mentol, timol); 3. Sesquiterpenos (C15), formados por tres unidades de isopreno (farnesol, bisabolol, cariofileno, copaeno); 4. Diterpenoides (C20), formados por cuatro unidades de isopreno (ácido abiético, giberelinas) 5. Sesterterpenoides (C25), formados por cinco unidades de isopreno (constituyentes de extractos de lípidos insaponificables); 6. Triterpenoides (C30), formados por seis unidades de isopreno (escualeno, esteroides); 7. Tetraterpenoides (C40), formados por ocho unidades de isopreno (carotenos, xantofilas); 8. Politerpenoides (Cn), formados por más de ocho unidades de isopreno (hule, guatapercha, solanesol, espadicol). En la ruta del ácido mevalónico, a partir de la unión de tres moléculas de acetil-CoA, se forma el ácido mevalónico que se pirofosforila, descarboxila y se deshidrata para dar isopentenil pirofosfato 34 (IPP), que es la molécula a partir de la cual se formarán los terpenos. En la segunda ruta, que opera en cloroplastos y otros plástidos, el IPP puede formarse también a partir de intermediarios de la glicólisis. El gliceraldehído-3-fosfato y dos átomos del piruvato se condensan y forman el 1-desoxi-D-xilulosa-5- fosfato, que después de un rearreglo y una reducción a 2-C-metil-D-eritritol 4-fosfato, es convertido a IPP (Taiz y Zeiger, 2006). El IPP puede combinarse con una unidad de isopreno o dimetilalil difosfato (DMAPP) para dar geranil difosfato (GPP) que da origen a los monoterpenos. El GPP se une a otra molécula de IPP y da lugar al farnesil difosfato (FPP) que da origen a los sesquiterpenos y triterpenos; y la adición de otra molécula de IPP da lugar al geranilgeranil difosfato (GGPP) que es el precursor de los diterpenos; y finalmente, FPP y GGPP se dimerizan para dar origen a los triterpenos y tetraterpenos, respectivamente (Taiz y Zeiger, 2006). Los terpenoides son el grupo de metabolitos secundarios más numeroso y están ampliamente distribuidos en microorganismos, plantas y animales. Muchos de ellos tienen funciones de defensa para la planta como los piretroides, presentes en las hojas y flores de Chrysanthemum, que tienen actividad insecticida, y los limonoides, con actividad antiherbívora, y característicos por su sabor amargo en frutos de cítricos (Taiz y Zeiger, 2006). Fenilpropanoides Estos metabolitos secundarios se derivan de la fenilalanina, que se forma a partir de la ruta del ácido shiquímico, la cual también da origen a los aminoácidos aromáticos tirosina y triptófano. Esta ruta convierte carbohidratos sencillos precursores derivados de la glicólisis y la ruta de las pentosas fosfato en amino ácidos aromáticos (Anaya, 2003; Taiz y Zeiger, 2006). Las estructuras de estos compuestos van desde simples fenilpropanoides como el ácido trans- cinámico, el ácido p-cumárico y sus derivados como el ácido caféico y el ácido vainíllico; fenilpropanoides lactónicos (ésteres cíclicos) como las cumarinas y los derivados del ácido benzóico cómo el ácido gálico. La combinación de la ruta del ácido shikímico con la ruta del acetato da origen a la biosíntesis de, estirilpironas, flavonoides, estilbenos, flavolignanos e isoflavonoides (Taiz y Zeiger, 2006; Dewick, 2001). La desaminación de la fenilalanina es catalizada por la enzima fenilalanina amonio liasa (PAL) y da lugar al ácido cinámico, a partir del cual se derivan los ácidos benzóicos. Esta enzima es el punto de ramificación entre el metabolismo primario y secundario. La actividad de esta enzima aumenta en situaciones de estrés para la planta como niveles bajos de nutrientes, luz e infección fúngica, que estimula la biosíntesis de compuestos fenólicos (Taiz y Zeiger, 2006). 35 A partir del ácido p-cumárico se derivan fenilpropanoides simples, cumarinas y los precursores de la lignina. Con la adición de un acetil-CoA se forma el p-cumaroil-CoA, que da origen a precursores de ligninas. La adición de tres moléculas de malonil-CoA, catalizada por la enzima chalcona sintasa, da lugar a las chalconas, flavanonas, que originan a las flavonas e isoflavonas, y dihidroflavonoles que dan origen a los flavonoles, antocianinas y taninos condensados (Taiz y Zeiger, 2006; Buchanan et al., 2000; Dewick, 2001). Estos compuestos representan el 40% del carbono orgánico que circula en la biosfera. Esta ruta está presente en plantas, hongos y bacterias pero no en animales. Las plantas lograron adaptarse evolutivamente a la vida terrestre en parte por la producción masiva de compuestos fenólicos. Aunque la mayoría de éstos tienen papeles estructurales en la pared celular como la lignina, muchos de ellos tienen papeles de defensa contra herbívoros, insectos y hongos, limitando el crecimiento de otras plantas, dando características a ciertas maderas para conferirles durabilidad, dan el color a las flores y por lo tanto son atrayentes de animales e insectos, protegen de los rayos UV absorbiendo la luz de onda corta y contribuyen a ciertos sabores y olores (Taiz y Zeiger, 2006; Buchanan et al., 2000). Acetogeninas Las acetogeninas comprenden más de 1 000 compuestos cuya biosíntesis es similar a la de las grasas, aunque en las acetogeninas generalmente se alternan un metileno con un carbonilo (-CH2-CO)n (Anaya, 2003). Las acetogeninas o policétidos, provienen de la condensación de varias unidades de acetato. Forman compuestos de cadena abierta que, por posterior aromatización, originan sustancias fenólicas con funciones oxigenadas alternadas (Gros et al., 1985). La unidad acetato es en realidad un ácido acético rico en energía, la acetil coenzima A (CH3CO-SCoA), es decir, el resto acetilo se encuentra unido a la enzima formando un tioéster (Gros et al., 1985). La combinación de unidades de acetato difiere de las conocidas auto condensaciones de la química orgánica, no sólo en la naturaleza de la unidad de acetato, sino en que la dimerización transcurre enzimáticamente debido a una transformación de valor termodinámico: la acetil coenzima A se convierte primero en la malonil coenzima A mediante carboxilación enzimática y luego genera un compuesto con un metileno activo. Esta unidad de tres carbonos se condensa con otra unidad de acetil- CoA, de dos carbonos, en simultánea descarboxilación, lográndose como resultado final la condensación de dos unidades de acetato, se repite el proceso con condensaciones cabeza-cola con otras moléculas de malonil-CoA (Gros et al., 1985) (Figura 7). 36 Policétido Acetoacetil-CoAMalonil-CoA COOH COOH -CO-S-CoAH3-COCH2-COCH2C -CO2 CH3-COOH-COCHCOSCoA CH2COSCoA COOH OO CH3-C-CH2CSCoA CH3COSCoA + CO2 H2C-C-SCoA enzima O CH3-C-S-CoA Figura 7. Origen biosintético de las acetogeninas (Gros et al., 1985). Así se originan sustancias policetometilénicas que forman compuestos no saturados de cadena abierta por reducción total o parcial de los grupos ceto e hidroxilos y deshidratación posterior, o bien se ciclizan. Estas etapas de la aromatización enzimática no se conocen bien, pero como se ha podido comprobar la presencia de policétidos en forma libre se supone que tienen lugar en la enzima sintetasa y permanecen unidos covalentemente a ella hasta que se estabilizan por ciclización (Gros et al., 1985; Anaya 2003). La molécula desprendida de la enzima experimenta enseguida una serie de reacciones: reducción, oxidación, introducción de hidroxilos, O y C metilaciones, O y C glicosidaciones y C prenilaciones (Gros et al., 1985; Anaya 2003). La principal fuente de diversidad de las acetogeninas deriva de lo siguiente (Gros et al., 1985; Anaya 2003): • La posibilidad que tiene la cadena de estos compuestos de ciclizarse de formas distintas, usualmente esta ciclización da origen a un anillo de benceno; • Del número variable de unidades malonil que intervienen en su formación; • De la amplia variedad de transformaciones de los esqueletos básicos. 37 Ftálidas Las ftálidas, comprendidas dentro del grupo de las acetogeninas, son metabolitos secundarios volátiles y constituyentes únicos de las tribus Apieae, Angeliceae, Coriandreae y Peucedaneae. Se han identificado más de 180 ftálidas de origen natural, de las cuales 137 han sido aisladas de plantas. Muchas de ellas son biológicamente activas y tienen un amplio espectro de efectos farmacológicos, que incluyen actividad sobre el sistema nervioso central, anti-angina, prevención de la agregación de plaquetas, antiproliferativos de músculo liso, prevención de trombosis, modulación de la función cardiaca y protección contra isquemia cerebral (Lin et al., 2005). Tienen la estructura general 1(3H)-isobenzofuranona, en la cual el anillo A puede estar parcial o totalmente saturado y con la presencia de sustituyentes. En el anillo lactónico se pueden presentar dos posibilidades: una en la que R1 = H y R2 = alquilo y otra en la que R1 y R2 representen un grupo alquilideno (Figura 8) (Gijbels et al., 1979; Lin et al., 2005). O O R1 R2 R3 R4 R5 R6 A Figura 8. Fórmula estructural de una ftálida. Todas las ftálidas de origen natural son derivadas de 1(3H)-isobenzofuranona. Sus estructuras pueden tener la estructura principal con uno o más grupos en diferentes posiciones o contener una forma reducida, dos dobles enlaces en el anillo A o no tenerlos y varias sustituciones en diferentes posiciones (Lin et al., 2005). A partir del género Ligusticum se han aislado más de 60 ftálidas pertenecientes a 15 especies, por ejemplo, a partir de L. chuanxiong se han aislado 40 y a partir de L. wallichii 27. Del género Angelica se han aislado 38 de 9 especies, una de ellas A. sinensis, de la cual se han aislado 28 y de Levisticum officinale se han aislado 20 (Lin et al., 2005; Beck y Chou, 2007). Algunos ejemplos de éstas y su distribución taxonómica dentro de la familia Apiaceae se muestran en la Tabla 8. 38 Tabla 8. Géneros de la familia Apiaceae que biosintetizan ftálidas. Familia Subfamilia Tribu Especie Referencia Apium graveolens MacLeod et al., 1988; Kitajima et al., 2003; Gijbels et al., 1985 Apium graveolens var. dulce Apium graveolens var. rapaceum MacLeod y Ames, 1989 Cnidium officinale Tsukamoto et al., 2005; Kwon y Ahn, 2002; Gijbels et al., 1981 Conioselinum kamtschaticum Gijbels et al., 1979 Levisticum officinale Santos et al., 2005 Ligusticum acutilobum Ligusticum acutilobum var. sugiyamae Mitsuhashi et al., 1963 Ligusticum chuanxiong Naito et al., 1992ab Ligusticum filicinum Gillespie y Duszynski, 1998 Ligusticum glaucescens Chen y Yang, 2006 Ligusticum hultenii Meepagala et al., 2005 Ligusticum jeholense Ligusticum jeholense var. tenuisectum Yook et al., 1997 Ligusticum mutellina Passreiter et al., 2005 Ligusticum porteri Delgado et al., 1988 Ligusticum sinense Yook et al., 1997 Ligusticum tenuifolium Gillespie y Duszynski, 1998 Ligusticum tenuissimum Ligusticum officinale Yook et al., 1997 Ligusticum wallichii Pushan et al., 1984; Ogawa et al., 1989 Meum athamanticum Palá-Paúl et al., 2004; Tesso et al., 2006 Apieae Petroselinum crispum var. tuberosum Gijbels et al., 1985 Angelica acutiloba Miyazawa et al., 2004; Tsuchida et al., 1987 Angelica acutiloba var. sugiyamae Lin et al., 2005 Angelica anomala var. chinesis Gijbels et al., 1979 Angelica carmichaeli Lin et al., 2005 Angelica dahuricae Lin et al., 2005 Angelica glauca Kaul et al., 1996 Angelica pubescentis Lin et al., 2005 Angelica sinensis Lao et al., 2004; Lin et al., 1998 Angelica tenuissima Angeliceae Angelica teruata Lin et al., 2005 Anethum graveolens var. graveolens Anethum graveolens var. sowa Fischer y Gijbels, 1987 Capnophyllum peregrinum Gijbels et al., 1984 Lomatium californicum Meepagala et al., 2005 Lomatium dasycarpum Asuming et al., 2005 Lomatium dissectum var. dissectum Bairamian et al., 2004 Lomatium lucidum Lomatium macrocarpum Asuming et al., 2005 Lomatium rigidum Beauchamp et al., 2004 Lomatium utriculatum Asuming et al., 2005 Opopanax chironium Gijbels et al., 1983 Peucedaneae Peucedanum ostruthium Gijbels et al., 1984 Apiaceae Apioideae Coriandreae Bifora testiculata Gijbels et al., 1985 39 La mayoría de las ftálidas se oxidan rápidamente por la influencia del aire y tienden a formar polímeros fácilmente, además, como estas sustancias tienen diferencias estructurales muy pequeñas resulta difícil separar una mezcla de las mismas (Reza, 1987). Estos compuestos son análogos estructurales del anhídrido ftálico, de ahí su nombre. El olor característico de las plantas de la familia Apiaceae se debe a los derivados de estos compuestos (Miyazawa et al., 2004). En cuanto a la ruta de biosíntesis de las ftálidas, sólo se conoce la del Z-ligustílida, sin embargo aún no se conoce con detalle y la información que se tiene está basada en estudios hechos con Levisticum officinale a partir del ácido acético a través de unión cabeza-cola ilustrado en la Figura 9 (Reza, 1987; Figueroa, 1997). Esta afirmación parece confirmarse dado que los compuestos fenólicos como el ácido ferúlico han sido aislados junto con ftálidas (Kobayashi y Mitsuhashi, 1987). Figura 9. Posible ruta de biosíntesis del Z-ligustílida. Z-ligustílida es un componente líquido volátil e inestable que puede cambiar su estructura a otras ftálidas por oxidación, isomerización, dimerización o rápida descomposición a altas temperaturas por su estructura de dihidrobenzeno (Zhang et al., 2003). De acuerdo a Kaouadji y Pouget (1986) es probable que Cnidium officinale, Ligusticum wallichii y Meum athamanticum produzcan ftálidas por la misma ruta biosintética, probablemente a partir de Z-ligustílida (Figura 10), la ftálida con mayor acumulación en plantas de la familia Apiaceae. 40 Figura 10. Estructura química de Z-ligustílida. Z-ligustílida es el metabolito secundario más abundante de la raíz de L. porteri, L. wallichii, L. chuanxiong, Angelica sinensis, Cnidium officinale y Levisticum officinale (Lin et al., 1998; Crowden et al., 1969). En el caso de Angelica sinensis la raíz contiene aproximadamente 0.2% a 0.65% de aceite esencial del cual aproximadamente 45% a 60% corresponde a Z-ligustílida, por lo que es la ftálida mayoritaria (American Herbal Pharmacopoeia and Therapeutic Compendium, 2003). Además de la Z-ligustílida, se han encontrado otras ftálidas que se han extraído de partes aéreas, raíces y semillas de diferentes especies con solventes de diferente polaridad. Se aislaron 37 ftálidas a partir de raíces, 14 de tallos, 10 de hojas, 9 de frutos, 6 de partes aéreas, 3 de semillas, 2 de flores y 1 de raíces transformadas y tubérculos (Tabla 9). Las estructuras químicas de algunas de ellas se muestran en la Figura 11. Las especies que biosintetizan Z-ligustílida son: Angelica acutiloba, A. sinensis, Apium graveolens, Cnidium officinale, Ligusticum chuanxiong, L. porteri, L. mutellina, Levisticum officinale, Lomatium californicum, L. dasycarpum, L. lucidum, L. macrocarpum, L. utriculatum y Meum athamanticum representadas en las tres tribus mencionadas y se ha obtenido en extractos polares como metanol y agua y de mediana polaridad como cloroformo principalmente de raíces aunque también se ha obtenido de semillas y partes aéreas. En los casos de Angelica, Cnidium y Ligusticum el compuesto se aisló de la raíz con solventes como metanol y cloroformo y en los casos de Apium y Meum el compuesto se aisló de partes aéreas con solventes como metilbutano. Esto sugiere, que dependiendo de la parte de la planta, el compuesto es extraído con solventes de diferente polaridad debido a la estructura de Z-ligustílida que tiene una parte lipofílica y otra soluble en agua. De lo anterior se desprende que Z-ligustílida es soluble en diferentes solventes y los distintos autores han utilizado diferentes solventes para extraerlo. 41 Tabla 9. Ftálidas extraídas de distintas especies de la familia Apiaceae. Especie Parte de la planta Ftálida obtenida Referencia Anethum graveolens var. graveolens n.e. • cis-Neocnidilida Anethum graveolens var. sowa n.e. • cis-Neocnidilida Fischer y Gijbels, 1987 • Z-3-butilideneftálida • Z-ligustílida Miyazawa et al., 2004 Angelica acutiloba Raíz • Levistólida A • Senquiunólida E, F, H, I • Toquinólida A, B • Angeloilsenquiunólida F Tsuchida et al., 1987 • 3-n-Butilftálida • 3-Butilideneftálida • Z-ligustílida • E-ligustílida Piao et al., 2007 Angelica gigas Raíz • 3-Butilideneftálida • Butilidenedihidroftálida Cho et al., 2007 • Z-ligustílida • Z-3-butilideneftálida • E-3-butilideneftálida • E-ligustílida • Z-ligustílida + 3-valeriftálida • 3-Hexil-4,5-dihidroftálida • 6,7-Dihidroxi-6,7-dihidroligustílida Kaul et al., 1996 Angelica glauca Raíz • Z-3-butilideneftálida • E-3-butilideneftálida • Z-ligustílida • E-ligustílida Thappa et al., 2005 42 Especie Parte de la planta Ftálida obtenida Referencia • Senquiunólida I, H, F, E, D, B, C, G, K • Riligustílida • Sedanenólida • Neocnidilida • 3-n-Butilftálida • E-ligustílida • Z-ligustílida • Z-3-butildeneftálida • Z,Z′-6.8′.7-3′-diligustílida • Angelicina • Levistólida A • Dímero E-232 de Z-ligustílida • Z,Z′-3.3′,8.8′-diligustílida • Z-6-hidroxi-7-metoxi-dihidroligustílida • E-6,7-dihidroxidihidroligustílida • Z-6,7-epoxiligustílida Lin et al., 1998 • Gelispirólida • Riligustílida Deng et al., 2006 • Dímero E-232 de Z-ligustílida Hon et al., 1990 • 3-Butilideneftálida Song et al., 2004 • 3-n-Butilftálida • Z-butilideneftálida • 3-butiliden-4-hidroxiftálida • E-butilideneftálida • Senquiunólida A, F, H, I • Z-ligustílida • E-ligustílida • 6,7-Epoxiligustílida • 6,7-Dihidroxiligustílida Lao et al., 2004 • 10-Angeloilbutilftálida • Sinaspirólida • Anaspirólida • Z-ligustílida • Z-butilideneftálida • Senquiunólida I • Z-6-hidroxi-1-metoxidihidroligustílida Deng et al., 2006 Angelica sinensis Raíz • Senquiunólida A Yi et al., 2005 43 Especie Parte de la planta Ftálida obtenida Referencia • 3-n-Butilftálida • Sedanólida • Sedanenólida MacLeod et al., 1988 Tallos • Sedanólida • Sedanenólida • trans-Butilideneftálida • cis-Butilideneftálida • 3-n-Butilftálida Uhlig et al., 1987 • Sedanólida • Senquiunólida N y J Momin y Nair, 2001 • Celeftálida A, B, C • 3S-3′-hidroxi-3-3-n-butilftálida Kitajima et al., 2003 Semillas • 3-n-Butilftálida • Sedanenólida Bjeldanes y Kim, 1977 Hojas y tallos • 3-n-Butilftálida • Sedanenólida • trans-Sedanólida • cis-Sedanólida Kurobayashi et al., 2006 • Neocnidilida • Senquiunólida Saleh et al., 1985 Partes aéreas • Cnidilida • Z-ligustílida • Senquiunólida • 3-n-Butilftálida • Neocnidilida Gijbles et al., 1985 • 3-n-Butilftálida • Neocnidilida Mitsuhashi et al., 1963 Apium graveolens Raíz • 3,3α-cis-Neocnidilida Fischer y Gijbels, 1987 Apium graveolens var. dulce Tallos • 3-n-Butilftálida • E-3-butilideneftálida • Z-3-butilideneftálida • Sedanenólida • cis-Sedanólida • E-ligustílida • Z-ligustílida • trans-Sedanólida • Metil sedanonato • 3-Butilhexahidroftálida MacLeod y Ames, 1989 Apium graveolens var. graveolens Fruto, flores, hojas, tallos, raíz • 3-n-Butilftálida • 3-Butilideneftálida • Z-ligustílida • 3a,4-Dihidroisobutilideneftálida Fehr, 1979 44 Especie Parte de la planta Ftálida obtenida Referencia • Z-3-butilideneftálida • E-3-butilideneftálida • Z-ligustílida • E-ligustílida • Neocnidilida • Senquiunólida • 3-n-Butilftálida • E-3-butilideneftálida • Z-3-butilideneftálida • Sedanenólida • cis-Sedanólida • trans-Sedanólida • Metil sedanonato • 3-Butilhexahidroftálida Gijbles et al., 1985; MacLeod y Ames, 1989 Raíz • cis-Neocnidilida Fischer y Gijbels, 1987 Fruto, hojas, tallos, tubérculo y raíz • 3-n-Butilftálida • 3-Butilideneftálida • Z-ligustílida • 3a,4-Dihidroisobutilideneftálida Fehr, 1981 Apium graveolens var. rapaceum Tallos • Sedanólida • Sedanenólida • trans-Butilideneftálida • cis-Butilideneftálida • 3-n-Butilftálida Uhlig et al., 1987 Apium graveolens var. secalinum Partes aéreas • Sedanólida • Neocnidilida • 3-Isobutilideneftálida • 3-n-Butilftálida • Z-ligustílida • 3-Isobutilidene-3α,4-dihidroftálida Saleh et al., 1985 Bifora testiculata Raíz • Z-ligustílida • Senquiunólida • Neocnidilida Gijbles et al., 1985 Capnophyllum peregrinum Raíz • Z-ligustílida Gijbels et al., 1984 Conioselinum kamtschaticum n.e. • 3-Butilideneftálida • Z-ligustílida Gijbels et al., 1979 45 Especie Parte de la planta Ftálida obtenida Referencia • 3-Butilideneftálida Kwon y Ahn, 2002 • Cnidilida • Z-ligustílida • 3S-3-n-butilftálida • Neocnidilida Tsukamoto et al., 2005 • Senquiunólida B, C, E, F, G, H, I, J • Z-ligustílida Kobayashi et al., 1987 • 3-Butilideneftálida • Z-ligustílida • 3-n-Butilftálida • Cnidilida • Neocnidilida Mitsuhashi et al., 1963 • Cnidilida • Neocnidilida Bohrmann et al., 1967 • 3-Butilideneftálida • Z-ligustílida • 3-n-Butilftálida • Cnidilida • Senquiunólida • Neocnidilida Gijbels et al., 1981 Raíz • Z-ligustílida • E-ligustílida Gijbels et al., 1982 Cnidium officinale n.e. • cis-Butilideneftálida • cis-3-Isobutilideneftálida • 3-n-Butilftálida • Z-ligustílida • 3-Butildihidroftálida Choi et al., 2002 Glaucosciadium cordifolium Partes aéreas • E-3-butilideneftálida • Z-ligustílida • Z-3-butilideneftálida Baser et al., 2000 46 Especie Parte de la planta Ftálida obtenida Referencia Raíces transformadas • Z-3-butilideneftálida • E-3-butilideneftálida • Z-ligustílida • E-ligustílida • 3-Validen-4,5-dihidroftálida Santos et al., 2005 • Z-ligustílida Segebrecht y Schilcher, 1989 • Z-ligustílida • E-ligustílida • Z-butilideneftálida • E-butilideneftálida • Senquiunólida • 3-Validen-4,5-dihidroftálida • Propilideneftálida • Isosenquiunólida Gijbels et al., 1982 Raíz • 3-Butilideneftálida • Z-ligustílida Mitsuhashi et al., 1963 Tallos • trans-Butilideneftálida • cis-Butilideneftálida • 3-n-Butilftálida Uhlig et al., 1987 Levisticum officinale Hojas, tallos, semillas y flores • 3-n-Butilftálida • Z-3-butilideneftálida • E-3-butilideneftálida • Z-ligustílida • E-ligustílida • 3-Validen-4,5-dihidroftálida Bylaite et al., 1998 • 3-Butilideneftálida • Z-ligustílida • 3-n-Butilftálida • Ácido sedanónico Mitsuhashi et al., 1963 Ligusticum acutilobum Raíz • Z-ligustílida • 3-Butilideneftálida Mitsuhashi et al., 1960 • 3-Butilideneftálida • Z-ligustílida • 3-n-Butilftálida • Cnidilida • Ácido sedanónico • Neocnidilida Mitsuhashi et al., 1963 Ligusticum acutilobum var. sugiyamae Raíz • 3-Butilideneftálida • Z-ligustílida Mitsuhashi et al., 1960 47 Especie Parte de la planta Ftálida obtenida Referencia • E-Senquiunólida E • Senquiunólida H, N, J, B, C, D, E, F, G, I, L • Z-3-butiliden-7-hidroxiftálida • (3S)-3-butil-4-hidroxiftálida • Z-ligustílida • 3-Butilideneftálida • 3-n-Butilftálida • Cnidilida • Neocnidilida Naito et al., 1992(a) • Senquiunólida J, I, H • Sedanenólida • E-6,7-dihidroxidihidroligustílida • 3-n-Butilftálida • Riligustílida • Z-ligustílida • E-ligustílida Zhang et al., 2003 • Senquiunólida Q, M • Senquiunona Naito et al., 1992(b) • Senquiunólida R, S Naito et al., 1996 • 3,8-Dihidro-diligustílida • 4,5-Dehidro-diligustílida • Levistólida A • Toquinólida B • Riligustílida • 3-n-Butilftálida Lim et al., 2006 • Senquiunólida A • 3-n-Butilftálida • Neocnidilida • Z-ligustílida Zschocke et al., 2005 • Chuanxiongnólida A, B • 3-n-Butilftálida • Condilida • Z-ligustílida • Toquinólida B • Levistólida A • Riligustílida • 7-Hidroxi-3-butilideneftálida • 4-Hidroxi-3-3-n-butilftálida • Senquiunólida H, I • 3-Hidroxi-4,5,6,7-tetrahidro-6,7-dihidroxi-3-butilftálida Li et al., 2006 • Z-ligustílida Shi et al., 2006 Ligusticum chuanxiong Raíz • Senquiunólida I, H, A • Z-ligustílida • Neocnidilida • 3-Butilideneftálida • Levistólida A, 48 Especie Parte de la planta Ftálida obtenida Referencia • Riligustílida Yan et al., 2005 Ligusticum filicinum Raíz • Z-ligustílida Gillespie y Duszynski, 1998 Ligusticum glaucescens Raíz • Z-ligustílida • Levistólida A Chen y Yang, 2006 Ligusticum jeholense Raíz • Z-ligustílida • Cnidilida Yook et al., 1997 Ligusticum jeholense var. tenuisectum Raíz • Z-ligustílida • Cnidilida Yook et al., 1997 Ligusticum officinale Raíz • Z-ligustílida • Cnidilida Yook et al., 1997 • Z-ligustílida • Riligustílida • Z-6.6′,7.3a'-diligustílida Delgado et al., 1988 • 3-Butilideneftálida • Z-ligustílida • E-ligustílida Delgado et al., 1992 • Toquinólida B • Diligustílida • Senquiunólida I Vázquez, 1996 • Diligustílida • Wallichílida • Demetilwallichílida Ríos et al., 1998 • Diligustílida • Demetilwallichílida Quiroz-García et al., 2004 • Z-ligustílida • Ligulóxido • (Z)-3-butilideneftálida • E-ligustílida Cégiéla-Carlioz et al., 2005 • Diligustílida • Toquinólida A, B • Riligustílida • endo-Z,Z’-(3.3’,8.8’)-diligustílida Quiroz-García et al., 2005 Ligusticum porteri Raíz • Z-ligustílida Gillespie y Duszynski, 1998 Ligusticum mutellina Raíz • Z-ligustílida Passreiter et al., 2005 Ligusticum sinense Raíz • Z-ligustílida • Cnidilida Yook et al., 1997; Gijbels et al., 1979 Ligusticum tenuifolium Raíz • Z-ligustílida • E-ligustílida Gillespie y Duszynski, 1998 49 Especie Parte de la planta Ftálida obtenida Referencia Ligusticum tenuissimum Raíz • Z-ligustílida • Cnidilida • 3-Butilideneftálida • 3-Butiliden-4,5-dihidroftálida Yook et al., 1997 • 3-Butiliden-7-hidroxiftálida • cis-6,7-Dihidroligustílida • trans-6,7-Dihidroligustílida • Wallichílida • 3-Butil-4,5-dihidro-3-hidroxiftálida Pushan et al., 1984 • Senquiunólida K, L, M Kobayashi y Mitsuhashi, 1987 • Z-6.8′,7.3′diligustílida • Z′-3,8-dihidro-6.6′,7.3′a-diligustílida • Z-6,7-epoxiligustílida Kaouadji et al., 1986 • Z,Z-diligustílida Kaouadji et al., 1983(a) • Z-ligustilidiol Kaouadji et al., 1983(b) Ligusticum wallichii Raíz • Z-3-butil-4-hidroxiftálida Ogawa et al., 1989 Lomatium californicum Semillas • Z-ligustílida Meepagala et al., 2005 Frutos, tallos, hojas y raíz • 3-n-Butilftálida • Senquiunólida Raíz • Z-3-butilideneftálida • Cnidilida • E-3-butilideneftálida • Neocnidilida • Z-ligustílida Lomatium dasycarpum Tallos y hojas • Z-ligustílida Asuming et al., 2005 Lomatium dissectum var. dissectum Frutos • Z-ligustílida Bairamian et al., 2004 Lomatium foeniculaceum sp. fimbriatu Frutos • 3-n-Butilftálida • Z-3-butilideneftálida • Cnidilida • E-3-butilideneftálida • Senquiunólida • Neocnidilida • Z-ligustílida • E-ligustílida Beauchamp et al., 2006 Lomatium grayi Partes aéreas • 3-n-Butilftálida • Z-3-butilideneftálida • E-3-butilideneftálida • Senquiunólida • Neocnidilida • Z-ligustílida • E-ligustílida Dev et al., 2007 50 Especie Parte de la planta Ftálida obtenida Referencia Lomatium lucidum Frutos, raíz, tallos y hojas • Z-3-butilideneftálida • Z-ligustílida • Cnidilida • Senquiunólida Asuming et al., 2005 Lomatium macrocarpum Raíz • 3-n-Butilftálida • Senquiunólida • Z-ligustílida Asuming et al., 2005 Lomatium rigidum Frutos, tallos, hojas y raíz • Senquiunólida • Neocnidilida • Z-ligustílida Beauchamp et al., 2004 Frutos, tallos, hojas y raíz • 3-n-Butilftálida • Z-3-butilideneftálida • E-3-butilideneftálida • Senquiunólida • Z-ligustílida • E-ligustílida Lomatium utriculatum Raíz • Cnidilida Asuming et al., 2005 Hojas y tallos • Z-3-butilideneftálida • Z-ligustílida • E-ligustílida Palá-Paúl et al., 2004 Parteas aéreas y frutos • 3-n-Butilftálida • 3-Butiltetrahidroftálida • Z-ligustílida Stahl y Bohrmann, 1967 • 7-Hidroxi-3-butilideneftálida Raíz • 4-Hidroxi-3-butilideneftálida • 5-Hidroxi-3-butilideneftálida • 3-(2-Hidroxibutilidene)-ftálida • 9-Hidroxiligustílida • cis-6,7-Dihidroxiligustílida • trans-6,7-Dihidroxiligustílida Kaouadji y Pouget, 1986 Meum athamanticum Partes aéreas • (3Z), (2’E)-3-but-2’-eniliden-4,5,6,7-tetrahidroftálida • Z-ligustílida • Z-butiliden-4,5,6,7-tetrahidroftálida Tesso et al., 2006 Opopanax chironium Raíz • Z-ligustílida • Z-3-butilideneftálida • Senquiunólida • 3-n-Butilftálida • Cnidilida Gijbels et al., 1983 Peucedanum ostruthium Raíz • Z-ligustílida • Cnidilida • Senquiunólida Gijbels et al., 1984 51 Especie Parte de la planta Ftálida obtenida Referencia Petroselinum crispum Células en suspensión • 5-Hidroxibutilideneftálida • 7-Hidroxibutilideneftálida • 7-Hidroxibutilideneftálida 7-O-glucósido • 7-Hidroxibutilideneftálida 7-O-(6′-malonilglucósido) Hagemeier et al., 1999 Petroselinum crispum var. tuberosum Raíz • Z-ligustílida • Senquiunólida • 3-n-Butilftálida • Z-3-butilideneftálida Gijbles et al., 1985 n.e.: no especificado 52 3-n-Butilftálida E-6,7-dihidroxidihidroligustílida Ligustidiol E-ligustílida Sedanenólida Senquiunólida A Senquiunólida B Senquiunólida C Senquiunólida D Senquiunólida E Senquiunólida F Senquiunólida G Figura 11. Estructuras químicas de algunas ftálidas mencionadas en la Tabla 9. 53 Senquiunólida H Senquiunólida I Senquiunólida J Senquiunólida K Senquiunólida L Senquiunólida M Senquiunólida N Senquiunólida Q Senquiunólida R Senquiunólida S E-Senquiunólida E Z-3-butilideneftálida Figura 11. Continuación 54 Chuanxiongnólida A Chuanxiongnólida B Dímero E-232 trans-Neocnidilida Cnidilida cis-Neocnidilida E-butilideneftálida Z-6,7-epoxiligustílida trans-6,7-Dihidroxiligustílida cis-6,7-Dihidroxiligustílida Figura 11. Continuación 55 Gelispirólida Riligustílida Wallichílida Angelicina Toquinólida A Toquinólida B Figura 11. Continuación 56 Diligustílida Levistólida A Celeftálida A Celeftálida B Celeftálida C 3’R,8’-dihidrodiligustílida Figura 11. Continuación 57 Actividad biológica de Z-ligustílida La actividad biológica y farmacológica de Z-ligustílida es muy amplia. Los estudios han sido realizados en diversos organismos como algas, virus, bacterias, artrópodos, ratas y ratones, probando ser biológicamente activa con distintas propiedades benéficas, ya que tiene efectos sobre el músculo liso como relajante, antiinflamatorio y analgésico, así como antiviral, antibacteriana, antioxidante, entre otras (Tabla 10). Tabla 10. Actividad biológica de Z-ligustílida. Actividad biológica Sobre Referencia Inhibición del crecimiento (Magnoliophyta) (Chlorophyta) Lemna paucicostata (I50= 600 µM) Selenastrum capricornutum (LCIC = 53 µM) Tóxica (Cyanophyta) Oscillatoria perornata (LCIC = 53 µM) Meepagala et al., 2005 Isquemia cerebral del procencéfalo transitoria en ratones Kuang et al., 2006 Daño permanente por isquemia focal en ratas Peng et al., 2007 Neuroprotector (Chordata) Isquemia del procencéfalo permanente en ratas Déficit cognitivo crónico Kuang et al., 2007 Línea celular de feocromocitoma adrenal de rata (PC12) Yu et al., 2008 Sueño inducido por pentobarbitales en ratón (20 mg/Kg.) Matsumoto et al., 1998 Antioxidante y antiapoptótico (Chordata) Isquemia cerebral del procencéfalo transitoria en ratones Kuang et al., 2006 Antiviral (Vira) Citomegalovirus (I = 23%) Rinovirus tipo II (0.3 µM) Heimbegner, et al., 2004 Artemia salina (DL50=10.3 ppm) Heimbegner et al., 2004 Tóxico (Arthropoda) Artemia salina (LC50= 20.1 ppm) Figueroa, 1997 Contracciones uterinas en rata (EC50 = 4.4 µg/ml) Atenuación de PGF2α Contracciones inducidas por Ach Du et al., 2006(a) Contracciones inducidas en aorta de ratas (IC50= 64 µg/ml) por fenilefrina Du et al., 2006(b) Contracciones inducidas por ácido acético y formalina Du et al., 2007 Vasoconstricción in vitro de segmentos de aorta abdominal de rata Liang et al., 2005 Relajante muscular (Chordata) Vasorrelajante de aorta aislada de rata Chan, et al., 2007 Vasodilatador de arteria mesentérica de rata (10 µM) Cao et al., 2006 Antiasmático Tao et al., 1984 Insecticida (Arthropoda) Larvas de Drosophila melanogaster (2.54 µmol/ml) Miyazawa et al., 2004; Tsukamoto et al., 2005 Antiesclerótico y antihipertensivo Proliferación y migración de células vasculares del músculo liso de aorta torácica de ratas Antioxidante (Chordata) Suprime la producción de especies reactivas de oxígeno Lu et al., 2006 Antibacterial (Proteobacteria) (Bacteria) Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Mycobacterium smegmatis, Proteus mirabilis, Streptococcus feacalis y Shigella sonnei Figueroa, 1997 Antifúngico (Ascomycota) Trichoderma viride, Aspergillus niger y Candida albicans Figueroa, 1997 Células vasculares de músculo liso de rata inducidas por bFG Liang y He, 2006 Antiproliferativo (Chordata) Células de músculo liso de aorta de ratón Kobayashi et al., 1993 58 La mayoría de los trabajos se han realizado con extractos de raíces o de plantas completas de especies de los géneros Angelica, Cnidium y Ligusticum, principalmente. Estas especies al igual que L. porteri, no se cultivan y son colectadas de su hábitat natural para ser aprovechadas en China y Japón, principalmente, como plantas medicinales. Estos extractos han demostrado tener una actividad biológica similar a la observada con el compuesto puro (Hou et al., 2005). Es posible que los aceites esenciales presentes en la raíz de estas especies, que poseen un alto porcentaje de ftálidas, tengan una acción sinérgica entre ellos, dando como resultado la actividad biológica por la que son conocidas y utilizadas estas especies. Sin embargo, algunos compuestos, como la diligustílida, no pueden ser utilizados de manera pura, pues presentan una actividad altamente tóxica sobre Artemia salina (Vázquez, 1996). Las raíces de L. porteri y P. crispum contienen la ftálida Z-ligustílida como componente mayoritario y al cual se le atribuye un amplio espectro de actividad biológica que carece de especificidad y baja potencia sin ser tóxico lo que lo hace útil y de gran interés para la medicina moderna (Beck y Stermitz, 1995). Métodos de investigación Los métodos de investigación utilizados sobre ftálidas para su extracción, aislamiento y análisis por medio de técnicas analíticas han sido muy diversos. Para la obtención de estos compuestos se han utilizado tanto disolventes polares como no polares, generalmente se extraen de raíces. Los métodos de aislamiento y caracterización incluyen la cromatografía líquida de alta resolución (CLAR), cromatografía de gases (CG) o CG acoplada a espectrometría de masas (CG- EM), cromatografía de capa fina (CCF), cromatografía de columna (CC), resonancia magnética nuclear (RMN H1 y C13), espectroscopía en rayos infrarrojos (IR), rayos ultravioleta (UV) y cristalografía de rayos X (Beck y Chou, 2007). En los comienzos de los estudios químicos de las ftálidas, se identificaban por métodos espectroscópicos tales como rayos X, IR, UV y CG-EM (MacLeod et al., 1988; Pushan et al., 1984). En años más recientes, estos compuestos han sido detectados por CLAR acoplada a técnicas espectroscópicas como UV, EM y RMN de dos dimensiones. Una de las técnicas que siguen vigente es la CG-EM Con la ayuda de estas técnicas, los constituyentes principales han sido caracterizados e identificados simultáneamente, haciendo el análisis de estos compuestos, sencillo, sensible y rápido (Zschocke et al., 2005; Li et al., 2002; Zschocke et al., 1998: Beck y Chou, 2007). 59 Ftálidas en otras familias Se han encontrado ftálidas en hongos, hepáticas y en plantas pertenecientes a las familias Gentianaceae, Typhaceae, Loganiaceae, Rosaceae, Rhamnaceae, Nymphaceae, Orchidaceae y Asteraceae entre otras. En la Tabla 11 se muestra la distribución botánica de estas ftálidas. Tabla 11. Ftálidas identificadas en distintas familias botánicas. Nombre Obtenido a partir de Ftálida Referencia Akebia quinata (Lardizabalaceae) Frutos y tallos • Z-ligustílida • (3Z)-butilideneftálida Kawata et al., 2007 • Porritoxinol Suemitsu et al., 1994 Alternaria porri (Pleosporaceae) Cultivo líquido • Zinnimidina • 5-(3’,3’-dimetilaliloxi)-7-metoxi-6-metilftálida Suemitsu et al., 1995 Anaphalis araneosa (Asteraceae) Partes aéreas • Ftalidacromeno • Araneoftálida • Aranocromanoftálida Jakupovic et al., 1987 Anthocleista djalonensis A. vogelli (Loganiaceae) Corteza • Djalonensina Okorie, 1976 Asarum canadense (Aristolochiaceae) Raíz • 3-n-Butilftálida • Sedanólida Motto y Secord, 1985 Banisteriopsis caapi (Malpighiaceae) n.e. • Shihunina • Dihidroshihunina Kawanishi et al., 1982 Corollospora maritima (Halosphaeriaceae) Medio de cultivo • Corolosporina Liberra et al., 1998 Corydalis sempervirens (Fumariaceae) Toda la planta • Feruloil-octopamina Majak et al., 2003 C. stewartii Toda la planta • (+)-Adlumidina • (+)-Domesticina Hussain et al., 1988 Dendrobium lohohense D. pierardii (Orchidaceae) Toda la planta • Shihunina • Dihidroshihunina Murakoshi et al., 1964; Kawanishi et al., 1982 Fumaria agraria (Fumariaceae) n.e. • Adlumiceína • Adlumidiceína Bentley, 1999 F. bastardii n.e. • Bububulina • Corlumina • β-Hidrastina Bentley, 1999 F. capreolata, F. muralis F. officinalis n.e. • Adlumiceína • Adlumidiceína Bentley, 1999 F. densiflora n.e. • (-)-Adlumina • (+)-Bicuculina • Fumaflorina Bentley, 1998 F. macrosepala n.e • (+)-Bicuculina • Adlumina Suau et al., 2002 F. parviflora n.e. • Adlumiceína • Adlumidiceína • Corledina • Corlumidina • α-Hidrastina Bentley, 1999 60 Nombre Obtenido a partir de Ftálida Referencia F. vaillantii Toda la planta • (+)-Bicuculina • (-)-Capnoidina • (-)-Adlumina • N-Metilhidrasteína • Z-fumaramina • Adlumiceína Sener et al., 1983 • Pedicelosina (deglucosilpedicelósida) • 6”-O-glucosilpedicelósida Mpondo et al., 1987 • Pedicelósido Chulia et al., 1984 Gentiana pedicellata (Gentianaceae) Hojas • Pedirutinósido • n-Propanoxi-3-ftálida • Pedirutinósido Chulia et al., 1986 G. pyrenaica Partes aéreas • Pediglucósido 6’-vanilloilpediglucósido García et al., 1989 Geum montanum (Rosaceae) Raíz • Z-ligustílida • E-ligustílida • 3-Butilideneftálida • Isómero de 3-butilideneftálida • Isómero de butilidenedihidroftálida Vollmann y Schultze, 1995 Helichrysum arenarium (Asteraceae) Raíz • Arenoftálida A Vrkoc et al., 1975; Vrkoc et al., 1973 H. platypterum Raíz • Platipteroftálida Jakupovic et al., 1987 Myrsine africana (Myrsinaceae) Raíz • 5-Metoxi-7-hidroxiftálida Li y McLaughlin, 1989 Nuphar pumilum (Nymphaceae) Rizoma • Z-ligustílida Myazawa et al., 2005 Papaver fugax (Papaveraceae) Cápsulas • (-)-α-Narcotina • Narceína Phillipson, 1973 P. pseudo-orientale Partes aéreas • (-)-α-Narcotina • Narceína Sariyar y Asma, 1986 P. triniifolium Cápsulas • (-)-α-Narcotina • Narceína Sari y Sanyer, 1997 Plagiochila killarniensis (Plagiochilaceae) Espécimen completo • Kilarninsólida Rycroft et al., 1999 Polygonum multiflorum (Polygonaceae) Tubérculos • cis-E-3-butiliden-4,5,6,7-tetrahidro-6,7- dihidroxi-1(3H)-isobenzofuranona • trans- E-3-butiliden-4,5,6,7-tetrahidro-6,7- dihidroxi-1(3H)-isobenzofuranona Grech et al., 1994 Quillaja saponaria molina (Rosaceae) Corteza • 4-Metil-7-hidroxiftálida glucósido Steinbeck et al., 1995 Rhamnus wightii (Rhamnaceae) Corteza • 7-Hidroxi-5-metoxiftálida • Naftálida Pepalla et al., 1991 Scorzonera hispanica (Asteraceae) Toda la planta • cis-Sedanólida • trans-Sedanólida MacLeod y Ames, 1991 Sporotrichum laxum (Corticiaceae) Medio de cultivo • Esporotrical • 6-Hidroxisporotrical Bava et al., 2006 Trifolium pratense T. repens (Fabaceae) Flores • 3-n-Butilftálida Buchbauer et al., 1996 Typha capensis (Typhaceae) Rizoma • Tifaftálida Shode et al., 2002 n.e.: no especificado 61 Las familias Fumariaceae y Papaveraceae están cercanamente relacionadas debido a que ambas biosintetizan alcaloides, particularmente del tipo ftálidaisoquinolinas (Suau et al., 2002). Además ambas familias pertenecen al orden Papaverales, por lo que podría explicarse la presencia de estos compuestos en estas familias. La presencia de algunas de las ftálidas identificadas en la Tabla 11 ha sido reportada en especies de los géneros Ligusticum, Levisticum, Meum y Cnidium, denotando la relación quimiotaxonómica entre éstos y ésta misma con otras familias tan distantes como la Orchidaceae y organismos como hongos microscópicos patógenos y marinos así como hepáticas. Es de gran interés notar que Z-ligustílida se identificó en las raíces de Nuphar pumilum y Geum montanum y en los frutos y semillas de Akebia quinata. Estas especies, excepto G. montanum, pertenecen a la subclase Magnoliidae y están en el orden Ranunculales y Nympheales, respectivamente. La familia Apiaceae y G. montanum pertenecen a la subclase Rosidae dentro del orden Umbelales y Rosales, respectivamente (Figura 12). Estas tres especies pertenecen al grupo Magnoliopsida y crecen en hábitats montañosos y en suelos ácidos, característica que comparten con las especies de Apiaceae que biosintetizan ftálidas. Por lo tanto, Z-ligustílida podría ser un carácter taxonómico que agrupe a estas familias. La presencia de ftálidas no isoquinolinas se identificó en los órdenes Rhamnales, Ericales, Fabales, Polygonales y Aristolochiales. Éstos están más alejados taxonómicamente entre sí, ya que pertenecen a tres distintas subclases, Rosidae, Dilleniidae y Caryophylliidae. 62 Figura 12. Diagrama evolutivo de la especialización de los órdenes de las angiospermas (Stebbins, 1974). En los recuadros negros se indican los órdenes Umbelales, Rosales, Ranunculales y Nympheales. En los recuadros grises se indican los órdenes Rhamnales, Fabales, Ericales, Polygonales y Asistolochiales. 63 La ausencia o presencia de metabolitos secundarios puede ser un indicativo de un ancestro común. Sin embargo, la expresión de estructuras químicas similares de éstos en familias distantes ocurre en el reino vegetal. La co-ocurrencia de una clase estructural puede ser un indicativo de una relación monofilética. Esto puede ser debido a una evolución convergente o a una expresión diferencial de genes, es posible que en algunos casos los genes que codifican para las enzimas para la biosíntesis de un metabolito secundario hayan tenido una evolución temprana. Estos genes no se pierden durante la filogenia pero pueden estar “apagados”. De igual manera, estos genes pueden “encenderse” en otro momento evolutivo (Wink, 2003). 64 Cultivo de tejidos vegetales El cultivo de células, tejidos y órganos vegetales es un conjunto de técnicas diseñadas para el crecimiento y multiplicación de células bajo condiciones asépticas en un medio de composición químicamente definido y condiciones ambientales controladas (Roca y Mroginski, 1993). La base teórica para el cultivo de tejidos fue propuesta por Haberlandt en 1902 cuando estableció claramente el concepto de totipotencialidad indicando más tarde que la técnica de cultivo de células vegetales aisladas en una solución nutritiva permitirá el estudio de problemas importantes desde un nuevo acercamiento experimental (Thorpe, 2007; Loyola-Vargas y Vázquez-Flota, 2006). Las aplicaciones de esta técnica son: modelos de estudio para aspectos fundamentales de la fisiología vegetal, genética y bioquímica; el incremento de la variabilidad genética; la generación de individuos fértiles modificados genéticamente; la obtención de plantas libres de patógenos; la micropropagación de plantas; la conservación de germoplasma de especies amenazadas; la manipulación de rutas metabólicas de metabolitos secundarios y la bioconversión y producción de metabolitos secundarios (Loyola-Vargas y Vázquez-Flota, 2006). Sin embargo, se deben tener en cuenta varias consideraciones para el éxito del cultivo de tejidos. La primera de ellas es la elección del explante que está determinada por el objetivo perseguido y la especie vegetal estudiada así como el estado fisiológico del mismo. La segunda es la asepsia, evitar contaminación con microorganismos es un aspecto básico que se debe tener en cuenta para el éxito del establecimiento del cultivo, para su incubación y para su manipulación. Si bien es cierto que en el cultivo de plantas, es más común la contaminación por hongos y virus y en menor grado por bacterias, es necesario sobrepasar este factor ya que puede ser el paso limitante para el establecimiento del cultivo. La tercera es la elección del medio y de los reguladores de crecimiento y por último las condiciones de incubación (Roca y Mroginski, 1993; Steward et al., 1970; Hurtado y Merino, 1987). Esta técnica explora las condiciones que promueven la división celular y la reprogramación genética en condiciones in vitro. Esto se logra al manipular las concentraciones exógenas y endógenas de reguladores de crecimiento vegetal. Los reguladores de crecimiento más utilizados para ello son las auxinas y las citocininas y se utilizan para la inducción de callos y morfogénesis (Parr, 1989). También influencian la diferenciación de las células vegetales: una alta concentración de citocininas y baja de auxinas promueven la formación de brotes, las auxinas inician el crecimiento de raíces y una cantidad equimolar de citocininas y auxinas promueven la proliferación de callo (Buchanan et al., 2000). Las auxinas regulan la elongación celular, la dominancia apical, el desarrollo de frutos, la elongación de brotes, la inducción de la división celular en el cambium, la iniciación de la raíz 65 principal y raíces adventicias, la embriogénesis, la diferenciación de tejidos vasculares, previenen la abscisión y están involucradas en tropismos. La principal auxina presente en la mayoría de las plantas es el ácido indol-3-acético (AIA), es derivada del L-triptófano y es sintetizada en tejidos jóvenes aéreos y en la punta de la raíz. También existen auxinas sintéticas como el ácido 2,4- diclorofenoxiacético (2,4-D) y el ácido naftalen-1-acético (ANA). Su papel en la elongación celular es acidificar la pared celular para provocar un debilitamiento temporal cambiando la presión osmótica estimulando ATPasas de H+ que permiten la entrada de agua lo que provoca la elongación de la célula. Se transportan de manera unidireccional, es decir, de manera polar desde la parte apical hacia la parte basal (basipétala). También se pueden transportar por el floema hacia las raíces, es decir, de manera acropétala (Taiz y Zeiger, 2006; Buchanan et al., 2000). Las citocininas regulan la división y proliferación celular, la dominancia apical, la formación y la actividad de los meristemos apicales, el desarrollo floral, retardan la senescencia de las hojas, promueven la movilización de nutrientes, el desarrollo y diferenciación de cloroplastos, el metabolismo autotrófico, la expansión de hojas y cotiledones y la interrupción de la dormancia de yemas. La citocinina más abundante en la mayoría de las plantas es la trans-zeatina y en menor cantidad la cis-zeatina y la dihidrozeatina. También existen citocininas sintéticas como la benziladenina (BA), orto y meta-topolinas. Son derivados estructurales de la adenina con cadenas laterales de tipo isoprenoides y aromáticas. Su biosíntesis está regulada espacial y temporalmente, hay altos niveles en las semillas inmaduras, en las puntas de raíces y en el meristemo apical. Se biosintetizan en la punta de la raíz principalmente. Se transportan por difusión a las células blanco y/o sistemas de transporte selectivo (Taiz y Zeiger, 2006; Buchanan et al., 2000). Su papel en la división celular es inducir la expresión de los genes cdc2, cdk4 y cdk6, ciclinas dependientes de cinasa que se asocian con ciclinas tipo B seguido por una fosforilación para la transición de la fase G2 a la fase M y activan la expresión de ciclinas tipo D y del gen cd4 para la transición de la fase G1 a la fase S (D’Agostino y Kieber, 1999). Obtención de metabolitos secundarios in vitro Las plantas son la fuente de muchas medicinas modernas. Se estima que una cuarta parte del número total de las medicinas contienen extractos vegetales de ingredientes activos obtenidos de sustancias vegetales o modeladas a partir de ellas. Como ejemplo el analgésico más común, la aspirina, es derivada de especies de Salix y Spiraea y los productos anticancerígenos más valiosos como el paclitaxel y la vinblastina son derivados de fuentes vegetales (Tripathi y Tripathi, 2003). 66 Muchas plantas que sintetizan productos de alto valor son difíciles de cultivar y están siendo o están alcanzando el estatus de amenazadas por la sobrecolecta, lo cual es muy preocupante, además de que la síntesis de compuestos derivados de plantas no es factible económicamente, en algunas ocasiones debido a la gran complejidad de sus estructuras y sus requerimientos estereoespecíficos (Oksman-Caldentey e Inze, 2004). Los sistemas de cultivos celulares pueden ser utilizados a gran escala para cultivar células vegetales de las cuales se pueden extraer metabolitos secundarios. Una de las ventajas de estos métodos es que puede proveer productos naturales de manera continua y de una fuente confiable. La biosíntesis de estos compuestos ocurre a una velocidad similar o superior a la de las plantas intactas. Algunos metabolitos secundarios localizados en tejidos u órganos morfológicamente especializados de plantas nativas se han producido en estos sistemas no sólo induciendo cultivos organizados específicos, sino desdiferenciando los cultivos celulares como los cultivos de callos (Mulabagal et al., 2004). Las ventajas de un sistema de cultivo celular sobre el cultivo tradicional de plantas completas son: • Los compuestos de interés pueden producirse bajo condiciones controladas independientes de cambios climáticos, estaciones del año o condiciones del suelo, • Las células cultivadas están libres de bacterias, hongos, virus e insectos, • Las células de cualquier planta pueden ser manipuladas para obtener sus metabolitos específicos, • El control automatizado del crecimiento celular y la regulación de los procesos metabólicos pueden reducir los costos de labor y mejorar la productividad y • En algunas ocasiones las sustancias orgánicas son excretadas al medio nutritivo de donde son fácilmente extraídas. Una de las principales dificultades en el uso de cultivos in vitro de células vegetales para producir metabolitos secundarios a nivel industrial es la lentitud de crecimiento de éstas, por lo que el tiempo aumenta significativamente para la producción de biomasa. La biosíntesis de metabolitos secundarios tiene lugar cuando las células vegetales han dejado de crecer y reproducirse, esto es, en la fase estacionaria (Roca y Mroginski, 1993). Las estrategias biotecnológicas utilizadas para incrementar la producción de metabolitos secundarios en cultivos celulares vegetales están basadas en aquellas utilizadas en cultivos de bacterias y hongos. Algunas de éstas son las siguientes (Collin, 2001; Mulabagal y Tsay, 2004): • Selección y mejora de líneas celulares altamente productoras, 67 • Variación del medio de cultivo (nutrientes, reguladores de crecimiento, factores físicos y químicos, adición de precursores) • Uso de técnicas especializadas (elicitación, inmovilización, permeabilización, escalamiento, transformación genética, biotransformación de precursores, ingeniería metabólica de rutas biosintéticas). Obtención de metabolitos secundarios a partir de cultivo de células en suspensión El cultivo de células en suspensión está basado en la metodología utilizada en microorganismos. Consiste en un conjunto de células aisladas distribuidas en un medio de cultivo líquido en constante movimiento. Éste puede iniciarse al transferir un fragmento de callo friable al medio líquido. Al dividirse, las células se liberan del inóculo debido a la acción mecánica y posteriormente el cultivo estará compuesto por células aisladas. La capacidad de separación o friabilidad de las células en cultivo de células en suspensión se puede promover con una mayor concentración de auxinas que de citocininas (Loyola-Vargas y Vázquez-Flota, 2006). Un callo se puede definir como una masa celular amorfa en activa división celular obtenida por medio del aislamiento de órganos o tejidos diferenciados, los cuales son llevados a una desdiferenciación celular, y presentan una proliferación continua, acelerada y de apariencia desorganizada, dando lugar a una masa amorfa de tejido. Desde el punto de vista biosintético, la característica más importante del callo es la totipotencialidad de sus células, lo que significa que cada célula en cultivo mantiene la información genética completa y por lo tanto es capaz de producir una amplia gama de metabolitos secundarios encontrados en la planta madre. Para iniciar un cultivo de callo de una planta medicinal, se puede partir de cualquier explante y no necesariamente del órgano productor del metabolito de interés; éste se pone en contacto con un medio de cultivo que induzca este desarrollo con una activa proliferación. Éstas células al entrar en una fase de desdiferenciación celular, son capaces de biosintetizar este metabolito, independientemente del explante utilizado para el cultivo. Si este callo derivado de un explante produce el compuesto de interés, se espera que cualquier otro lo hará. Este hecho puede implicar que todos los callos derivados de una planta tendrán finalmente las mismas características cuantitativas y cualitativas independientemente de los estados iniciales de los explantes (Berlin, 1988; Hurtado y Merino, 1987; Rao y Ravishankar, 2002). Al iniciarse el cultivo de células en suspensión, el comportamiento que presentan las células en crecimiento es típicamente sigmoide (Figura 13). Durante la fase de reposo o lag el inóculo no 68 presenta ninguna señal de división celular, está adaptándose a las condiciones de cultivo para iniciar e incrementar la velocidad de la división celular durante la fase exponencial y lineal. La velocidad de división va disminuyendo gradualmente hasta dar inicio a la fase estacionaria, que es el momento en que se han agotado los nutrientes o alguno de ellos. Durante esta fase las células han alcanzado su máxima densidad celular, permaneciendo viables pero sin división (Hurtado y Merino, 1987). Figura 13. Modelo de una curva de crecimiento de un cultivo de células en suspensión relativo al número de células por unidad de volumen de cultivo en cuanto al tiempo de cultivo. Al seleccionar una línea celular productora de metabolitos secundarios, ésta se mantiene en un cultivo en suspensión óptimo para así incrementar la biomasa y por consiguiente las concentraciones del metabolito. Estos cultivos pueden mantenerse por períodos largos en suspensión siendo éstos una fuente continua, confiable y estable tanto de células productoras como de metabolitos secundarios (Hurtado y Merino, 1987; Bajaj et al., 1988, Heinstein, 1985). Algunos ejemplos de metabolitos secundarios obtenidos in vitro se muestran en la Tabla 12. 69 Tabla 12. Algunos metabolitos secundarios de plantas medicinales obtenidos in vitro. Especie vegetal Compuesto Tipo de cultivo Referencia Atropa belladonna Atropina Raíces transformadas Kamada et al., 1986 Escopolamina, Hiosciamina Raíces transformadas Bensaddek et al., 2001 Camellia sinensis Catequina Suspensión Shibasaki-Kitakawa et al., 2003 Teamina Suspensión Orihara y Furuya, 1990 Capsicum annuum Capsaicina Suspensión Johnson et al., 1990 Catharanthus roseus Catarantina, Akuammicina, Vindolina, Ajmalicina, Estrictosidina Suspensión Scout et al., 1980 Vindolina Suspensión Hernández-Domínguez et al., 2004 Chrysanthemum cinerariifolium Piretrinas Callo Rajasekaran et al., 1991 Cinchona ledgeriana Quinidina Cultivo de raíz Anderson et al., 1982 Quinina Cultivo de raíz Anderson et al., 1982 Quinolina Suspensión Robins et al., 1986 Coffea arabica Cafeína Callo Waller et al., 1983 Coleus blumei Ácido rosmarínico Suspensión Zenk et al., 1977 Coptis japonica Berberina Callo Furuya et al., 1972 Datura innoxia Digitalis lanata Hiosciamina, Escopolamina Digitoxina Callo Suspensión Hiraoka et al., 1973 Ohlsson et al., 1983 D. lanata Dioscorea deltoidea Digoxina Diosgenina Escopolamina Suspensión Suspensión Cultivo de raíz Ohlsson et al., 1983 Tal et al., 1983; Heble y Staba, 1980 Endo y Yamada, 1985 Duboisia leichhardtii Hiosciamina Callo Endo y Yamada, 1985; Yamada y Endo, 1984 Ephedra spp. Efedrina Suspensión O’Dowd et al., 1993 Fabiana imbricada Acido oleanóico, Rutina, Ácido clorogénico y Escopoletina Callo y suspensión Schmeda-Hirschmann et al., 2004 Ginkgo biloba Ginkólida A Suspensión Carrier et al., 1991 Helianthus annuus α-tocoferol Suspensión Gala et al., 2005 Hypericum perforatum Hipericina, Pseudohipericina Ápices de brotes Kornfeld et al., 2007 Linum usitatissimum Neolignano Suspensión Attoumbre et al., 2006 Lithospermum erythrorhizon Siconina Suspensión Fujita et al., 1981 Morinda citrifolia Antraquinonas Suspensión Inoue et al., 1981 Mucuna pruriens L-DOPA Callo Brain, 1976 Nicotiana tabacum Nicotina Suspensión Mantell et al., 1983 Papaver bracteatum Sanguinarina Suspensión Cline y Coscia, 1988 P. somniferum Codeína, Morfina Suspensión Heinstein, 1985 P. somniferum P. bracteatum Morfina, Tebaína Callo Alkhimova et al., 2001 Passiflora quadrangularis Orientina, Isoorientina, Vitexina, Isovitexina Callo Antognoni et al., 2007 Pilocarpus pennatifolius Pilocarpina Callo y suspensión De Andrade et al., 2005 70 Especie vegetal Compuesto Tipo de cultivo Referencia Podophyllum hexandrum Podofilotoxina Suspensión Uden et al., 1989 Plumbago zeylanica Plumbagina Raíces transformadas Verma et al., 2002 Rauwolfia serpentina Reserpina Suspensión Yamamoto y Yamada, 1986 Solanum laciniatum Solasodina Suspensión Chandler y Dodds, 1983 S. lyratum Solanina, Solanidina, Solasodina Suspensión Meng-Hsin et al., 2007 Swainsona galegifolia Swainsonina Raíces y raíces transformadas Ermayanti et al., 1994 Taxus brevifolia Taxol Callo y suspensión Gibson et al., 1993 Theobroma cacao Cafeína, Teobromina, Teofilina Callo y suspensión Gurney et al., 1992 Trigonella foenum-graecum Diosgenina Callo Oncina et al., 2000 Uncaria tomentosa Ácido ursólico, Ácido oleanólico Suspensión Flores-Sánchez et al., 2002 Valeriana wallichii Valepotriatos Raíces transformadas Banerjee et al., 1998 Actualmente se han realizado estudios sobre la regeneración in vitro de varias especies de la familia Apiaceae a partir de distintos tipos de explantes (Tabla 13). Mediante este método, se han logrado propagar especies con el mismo genotipo y fenotipo libres de patógenos de manera masiva y que están amenazadas por la sobrecolecta o porque su reproducción por semilla no es posible, como Cnidium officinale (Pant et al., 1996). También existen trabajos sobre la obtención de metabolitos secundarios de especies de la familia Apiaceae ejemplificados en la Tabla 14. Dichos estudios experimentales han demostrado la factibilidad de esta alternativa biotecnológica para conservar las poblaciones naturales al obtener el compuesto deseado in vitro. Sin embargo, no existen trabajos enfocados a la obtención in vitro de Z- ligustílida o alguna otra ftálida. 71 Tabla 13. Cultivos in vitro de especies de la familia Apiaceae. Especie Explante Condiciones de cultivo Resultado de regeneración Referencia Anethum graveolens Yema axilar MS + BA (0.5 mg/L) y AIB (0.1 mg/L) Plántulas Sharma et al., 2004 Angelica acutiloba Callo de brote apical LS + 2,4-D (10-6M) + Kn (10-6M) Embriones somáticos y plántulas Miura et al., 1988 Angelica sinensis Embriones inmaduros MS + 2,4-D (0.5-1 mg/L) Embriones somáticos Tsay y Huang, 1998 MS + 2,4-D (0.5 mg/L) y Kn (0.6mg/L) Williams y Collin, 1976(a) Pecíolo MS + AIA (0.5 mg/L) y Kn (0.6 mg/L) Embriones somáticos y plántulas Williams y Collin, 1976(b) Apium graveolens Hipocótilo MS + 2,4-D (10-5 M) Embriones somáticos Up-Dong et al., 1999 Bupleurum falcatum Callo de hipocótilo MS + 2,4-D (9 µM), BA (4.4 µM) y Kn (4.6 µM) Embriones somáticos y plántulas Bang et al., 1999 Bupleurum kaoi Segmentos nodales MS + BA (0, 0.25, 0.5, 1, 2 mg/L) + Kn (0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8 mg/L) Plántulas Chen et al., 2006 Segmento nodal MS + BA (22.2 µM) y ANA (2.68 µM) Plántulas Tiwari et al., 2000 Callo de pecíolo, lámina y entrenudo MS + 2,4-D (4.52 µM) o ANA (5.37 µM) + Kn (2.32 µM) Embriones somáticos y plántulas Martin, 2004 Callo de hoja MS + Kn (9.29 µM) y 2,4-D 2.26 µM) Embriones somáticos y plántulas Paramageetham et al., 2004 Centella asiatica Brote apical MS + BA (4 mg/L), ANA (1 mg/L) y Kn (1-4 mg/L) y AIB (0-3 mg/L) y ANA (0-1 mg/L) Plántulas Nath y Buragohain, 2003 Cnidium officinale Brote apical MS + BA (10-6M) y MS + ANA (10-7M) + BA (10-7M) Plántulas Pant et al., 1996 Cuminum cyminum Callo de hipocótilo y cotiledones MS + 2,4-D (4 µM) + Kn (2 ó 4 µM) Plántulas Tawfik y Noga, 2002 Embriones B5 + BA (0 y 0.1 mg/L) + ANA (0, 0.2, 0.4, 0.6 mg/L) + AIA (0, 0.2, 0.4 mg/L) Plántulas Ebrahimie et al., 2007 Brote apical MS + AAB (10-4M) Embriones somáticos y plántulas Nishiwaki et al., 2000 Daucus carota Callo de hipocótilo B5 + 2,4-D (1 µM) Embriones somáticos Li y Kurata, 2005 Pecíolo y nudo de inflorescencia MS + ANA (0.5 µM) y TDZ (0.9, 1.8, 4.5 y 9 µM) Plántulas Mohamed-Yasseen, 2002 Hoja, disco de tallo y raíz MS + ANA (5.37-10.74 µM) + Kn (2.32 o 4.65 µM) Plántulas Martin, 2004 Eryngium foetidum Hojas LS + 2,4-D (1 mg/L) y BA (1 mg/L), MS + 2,4-D (0.1 mg/L), BA (2 mg/L) y/o GA3 (1 mg/L) BA (0.1 mg/L) Embriones somáticos y plántulas Ignacimuthu et al., 1999 Foeniculum vulgare Callo de hipocótilo y tallo MS + ANA (2 .6 µM) y Kn (2.3 µM) Embriones somáticos Bennici et al., 2004 72 Especie Explante Condiciones de cultivo Resultado de Referencia regeneración Heracleum candicans Pecíolo MS + 2,4-D (0.5 mg/L) + BA (0.5 mg/L) Embriones somáticos Wakhlu y Sharma, 1998 Ligusticum chuanxiong Yema axilar MS + BA (0.5 mg/L) + ANA (0.5 mg/L) y MS + AIA (1 mg/L) + ANA (0.5 mg/L) Plántulas Pen, 2002 Ligusticum wallichii Protoplastos de hipocótilo MS + 2,4-D (1 mg/L) + BA (0.5 mg/L) y MS + 2,4-D (0.5 mg/L) y BA (0.5 mg/L) Callo y plántulas Zhong-Yi y Hui- Min, 1986 Petroselinum crispum Yema axilar MS + BA (0, 2.5, 5 µM), ANA (0, 2.5, 5 µM), AIB (2.5 µM), Kn (0.5, 2.5, 5µM), Thidiazuron (0.1, 1µM) Plántulas Vandermoortele et al., 1996 Petroselinum hortense Callo de pecíolo MS + AIA (1, 2.5, 5, 10 mg/L), MS + Kn (0.04 mg/L) y MS + sulfato de adenina (2.5, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 mg/L) Plántulas Vasil y Hildebrandt, 1966 Pimpinella tirupatiensis Hipocótilo MS + TDZ (1 mg/L) + ANA (0.5 mg/L) Embriones somáticos Prakash et al., 2001 Callo de pecíolo y hoja MS + ANA (0.5 mg/L) y BA (1.5 mg/L) Plántulas Makunga et al., 2003 Hojas MS + ANA, AIA, 2,4-D y BA (0-2 mg/L) Plántulas Makunga et al., 2005 Pecíolo y hoja MS + ANA (0.5 mg/L) y BA (1.5 mg/L) Plántulas Makunga et al., 2006 Thapsia garganica Hojas B5 + 2,4-D (1 mg/L), ANA (1 mg/L) y BA (1 mg/L) Embriones somáticos Jager et al., 1993 Trachyspermum ammi Hipocótilo MS + 2,4-D (9 µM) y Kn (2.3 µM) Embriones somáticos y plántulas Jasrai et al., 1992 1 µM = 10-6 M (10-6 g), 1 mg = 10-3 g 73 Tabla 14. Metabolitos secundarios obtenidos in vitro de especies de la familia Apiaceae. Especie Usos Compuesto obtenido Tipo de cultivo Referencia Ammi majus A. visnaga Vitiligo, psoriasis, micosis, eczemas atípicas, pitiriasis liquenoides, urticaria pigmentosa y alopecia. Psoralenos Umbeliferona, isopimpinelina, (S)- marmesina, (R)-amirina, umbeliferona-[3´-metil-buta-1t.3- dien-1´-il]-éter y umbeliferona-[3´- hidroximetil-1t.-buten-1t.-buten- 1´-il]éter Visnagina Callo (LS) Células en suspensión de hipocótilo (B5) Células en suspensión (MS) Ekiert, 1993 Hamerski et al., 1990 Kaul y Staba, 1965 Anethum graveolens Condimento, indigestión, cólicos y gases Quercetina 3-O-D-glucurónida Células en suspensión Mohle et al., 1985 Angelica dahurica var. formosana Dolor de cabeza y psoriasis Imperatorina Células en suspensión (MS) Mulabagal y Tsay, 2004 A. sinensis Estimulan la circulación, lumbago, constipación, úlceras, reumatismo, parálisis, amenorrea, sangrados uterinos Compuestos fenólicos, ftálidas Callo (B5, KU, MS, NT) Shi-Yu y Kuo-Chang, 1989 Células en suspensión (MS) Watts et al., 1984; Watts et al., 1985 Apium graveolens Condimento, alimento, carminativo, diurético, emenagogo, galactogogo, estimulante, tónico, analgésico, antiinflamatorio, diurético y vermífugo Terpenoides y ftálidas Callo (MS) Al-Abta et al., 1979 Bupleurum falcatum Antipirético, analgésico y antiinflamatorio Saikosaponinas Callo (LS) Hiraoka, 1989 Saponinas triterpénicas Callo y células en suspensión (MS) Solet et al., 1998 Asiáticosidos Callo y células en suspensión (MS) Nath y Buragohain, 2005 Centella asiatica Lepra, padecimientos de la piel, antipirética, destoxificante, diurético, revitalizante y alimento en curris y ensaladas. Asiaticósido y madecacósido Estolones y callo de pecíolo y hoja (MS) Aziz et al., 2007 Cianidin 3-O-latirósido, cianidin 3- O-(2”-O-β-D-xilopiranosil-6”-O-β- D-glucopiranosil-β-D- galactopiranósido) acilado con ácido 4-cumárico, ácido ferúlico, ácido 4-hidroxibenzóico o ácido sinápico Células en suspensión Gläbgen et al., 1992 Daucus carota Contra lombrices intestinales, trastornos estomacales, diarrea, tos, afecciones del pecho, hidropesía, vista cansada. Alimento. Antocianinas Células en suspensión (SH y Nitsch & Nitsch) Kinnersley y Dougall, 1980; Dougall et al., 1980; Noé et al., 1980; Yoon et al., 1992 74 Especie Usos Compuesto obtenido Tipo de cultivo Referencia Glehnia littoralis Analgésico, antipirético, diaforético y expectorante Furanocumarinas Células en suspensión elicitados Kitamura et al., 1998 Levisticum officinale Diaforética, emenagogo, expectorante, estomático y estimulante. Perfume, alimento, bebida. Aceites esenciales, terpenoides y ftálidas Raíces transformadas (SH, B5 y MS) Santos et al., 2005 Marmesina, bergapteno, ftálidas y ftálidas glicosiladas Cultivos elicitados Hagemeier et al., 2004 β-elemeno, miristicina y apiol Callo (B5) Gbolade y Lockwood, 1990 Petroselinum crispum Condimento, diurético, antihipertensivo, emenagogo α-pineno, β-pineno, β-mirceno, β- felandreno, γ-terpineno, 4- isopropenil-1-metilbenzeno, p- menta-1,3,8-trieno, β-elemeno, miristicina y apiol Callo (B5) Gbolade y Lockwood, 1991 Aceites esenciales y fenilpropanoides Callo (MS y B5) Ernst, 1989 Pimpinella anisum Especia aromática, carminativo, espasmolítico y expectorante Pseudoisogenol Células en suspensión (MS) Reichling et al., 1995 Thapsia garganica Enfermedades pulmonares, catarros y dolores reumáticos. Tapsigarginas Callo (MS) Smitt et al., 1996 75 JUSTIFICACIÓN Ligusticum porteri es una planta de gran importancia ecológica, etnobotánica, medicinal, económica y cultural para los Tarahumaras de la Sierra Tarahumara en Chihuahua en México por el valor medicinal y religioso ceremonial que le dan a esta planta. Ligusticum porteri se distribuye en los bosques de pino-encino desde las Montañas Rocallosas en Estados Unidos con su límite de distribución sur en la Sierra Madre Occidental en México. Por esta situación, las poblaciones tienen una distribución restringida, a veces aislada, reduciendo el flujo de intercambio genético entre éstas y haciéndolas más vulnerables a cambios en el ambiente. Aunado a la sobrecolecta para su comercialización, al sobrepastoreo, a la deforestación, en general a la destrucción de su hábitat, sus poblaciones están desapareciendo rápidamente. Su situación se agrava debido al gran desconocimiento que existe de la especie, no se cuenta con un procedimiento de propagación ni siquiera a través de la germinación de sus semillas ni de cultivo. En México y Estados Unidos se venden productos hechos a base de tinturas, polvo y cápsulas de la raíz así como la raíz completa. Estos preparados tienen un amplio espectro de bioactividad como bactericida, fungicida, antiviral, antiespasmódico, insecticida, analgésico y antidepresivo por mencionar algunas. Estas propiedades se atribuyen a la presencia de Z-ligustilido que por presentar una baja toxicidad en su estado puro, es un producto muy interesante para su posible aplicación en la medicina moderna y tradicional. En este último caso se emplean los extractos crudos de la droga con un alto contenido de Z-ligustilido. Actualmente no existe ninguna norma nacional ni internacional en cuanto al manejo y/o conservación de L. porteri por lo que este proyecto ofrece tratar de desarrollar una fuente alternativa del principio activo que pueda hacer frente a su demanda a corto plazo y que de esta manera disminuya la presión sobre las plantas de poblaciones naturales además de integrar la producción in vitro y ex situ con convenios entre la UNAM y las comunidades rurales para el beneficio de éstas y de las poblaciones naturales de L. porteri. Es por esto que una alternativa biotecnológica como el cultivo de tejidos es una alternativa viable para explorar la germinación de L. porteri así como el potencial morfogénico de estructuras somáticas que hagan posible la formación de callo para evaluar la presencia de metabolitos secundarios de interés. Se pretende también que esta estrategia experimental sirva de base para poder ser aplicada a la conservación ex situ de esta especie. Debido a la falta de información, se compararon las respuestas morfogénicas y la biosíntesis in vitro con las de una especie cultivada, como P. crispum, de la misma familia y que también biosintetiza Z-ligustílida. 76 HIPÓTESIS • Se ha demostrado que bajo ciertas condiciones experimentales el callo de distintos cultivos in vitro de algunas plantas expresan la capacidad biosintética que permite la formación de metabolitos secundarios, es probable que Ligusticum porteri y Petroselinum crispum produzcan el compuesto Z-ligustílida a partir del cultivo de callo y/o de células en suspensión de varios explantes. OBJETIVOS General: 1. Establecer condiciones in vitro para inducir la morfogénesis y la biosíntesis in vitro a partir de distintos explantes de Ligusticum porteri y Petroselinum crispum. Particulares: 1. Determinar las condiciones para la germinación in vitro y en suelo de las semillas de Ligusticum porteri y Petroselinum crispum. 2. Establecer cultivos de callo y de células en suspensión de segmentos de tallo, raíz, cotiledón, hoja y pecíolo de ambas especies. 3. Evaluar el efecto de los reguladores de crecimiento en las combinaciones ANA/BA y 2,4-D/BA en la formación de callo y en cultivos en suspensión de ambas especies. 4. Establecer una curva de crecimiento a partir de cultivos de células en suspensión de todos los explantes de ambas especies. 5. Determinar la cinética de crecimiento de las células en suspensión de los explantes de ambas especies. 6. Determinar la presencia de Z-ligustílida en los distintos explantes estudiados de ambas especies utilizando técnicas cromatográficas. 77 METODOLOGÍA GENERAL Recolección de semillas y partes aéreas Estratificación (1°C/40-60 d) Germinación in vitro MS 50% de sales Germinación en mezclas de sustratos Inducción de callos con 2,4-D/BA y ANA/BA de hojas, cotiledones, pecíolos y raíces Determinación cinética de crecimiento Establecimiento de cultivos de células en suspensión Establecimiento de curva de crecimiento Obtención de semillas de P. crispum Desinfección Identificación por comparación con estándares ó bancos de datos (CG- EM) 78 MATERIALES Y MÉTODOS Material biológico Las semillas de L. porteri (técnicamente mericarpos) fueron recolectadas en el Municipio de Guachochi en la localidad de Basigochi a 2433 m.s.n.m. (Latitud Norte 27° 12′ 53″, Longitud Oeste 107° 23′ 22″) en el Estado de Chihuahua en México del 8 al 22 de octubre del 2005 (Bye 34467). Las partes aéreas de plantas de aproximadamente 3 años de edad se recolectaron en el Municipio de Guachochi en la localidad de Simuchichi a 2261 m.s.n.m (Latitud Norte 27° 14′ 38″ Longitud Oeste 107° 05′ 42″) en el Estado de Chihuahua, México el 18 octubre del 2006 (Bye 34820). Las semillas de P. crispum se adquirieron en un mercado local en la Ciudad de México de la marca comercial “Semillas Vita” (Rancho Los Molinos S. P. R. de R. L. Morelos, México). Desinfección de semillas La germinación de semillas de L. porteri y P. crispum se realizó en condiciones asépticas. Las semillas de L. porteri se hidrataron previamente por 1 h en agua destilada y se escarificaron con pinzas. La desinfección superficial se realizó en agitación de la siguiente manera: (1) solución de detergente por 20 min, (2) solución de peróxido de hidrógeno (7% v/v) por 7 min, (3) solución de terramicina (200 mg/100 ml) por 10 minutos, (4) solución de cuprimicin (300 mg/100 ml) por 10 minutos, (5) solución de hipoclorito de sodio (blanqueador doméstico) 10% v/v por 10 min y (6) solución de PPM (Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology, Inc.) (1 ml/49 ml) por 2 h. Después de cada solución, las semillas se enjuagaron dos veces con agua destilada excepto después de la solución de PPM. Germinación in vitro Para la germinación de ambas especies se utilizó el medio nutritivo de Murashige-Skoog (1962) al 50% de sales y 1.5% de sacarosa (MS-50). El pH del medio se ajustó a 5.7 y se solidificó con 4 g/L de phytagel. El medio se repartió (25 ml) en frascos de vidrio de 100 ml y fue esterilizado en 79 autoclave a 120°C y 1.5 Kg/cm2 por 17 min. Se sembraron 4 semillas por frasco. Los cultivos se mantuvieron a 21°C en oscuridad hasta la germinación, después de esto, las plántulas se expusieron a un fotoperíodo de 16 h luz (fluorescente 1000 – 2000 luxes) y 8 h de oscuridad. Germinación ex vitro Se sembraron 30 semillas de L. porteri en charolas (30 x 30 cm) con diferentes mezclas de sustratos: (a) Sphagnum y suelo de Chihuahua (1:1), (b) agrolita, (c) hojarasca y agrolita (1:1) y (d) suelo de Chihuahua a una profundidad de 1.5 cm y se mantuvieron en un invernadero. Análisis fisicoquímico de suelo Se analizó una muestra de 180 g de suelo colectado en Chihuahua en un bosque de pino-encino en el Municipio de Guachochi en la localidad de Piedras Blancas en Chihuahua, México donde crece L. porteri. La muestra fue tamizada en una malla de 2 mm para obtener los siguientes datos fisicoquímicos: pH, contenido de P y cationes intercambiables para analizar la riqueza de minerales. Inducción a callo De plántulas de L. porteri y P. crispum de 3 a 5 meses de edad germinadas in vitro, se obtuvieron explantes de tallo (2 cm de longitud), raíz (primaria y secundaria), pecíolo (3-8 cm de longitud), cotiledones (separados) y hoja (lámina completa) y se cultivaron en medio de inducción MS-50 adicionado con 2,4-D (0, 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4 mg/L) con BA (0, 0.5, 1, 2, 3 mg/L) y ANA (0, 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4 mg/L) con BA (0, 0.5, 1, 2, 3 mg/L) a 21°C durante un mínimo de 30 días. En cada frasco de cultivo se sembró un explante. Se hicieron 5 repeticiones por tratamiento. Establecimiento de los cultivos de células en suspensión Los explantes con callo se seccionaron en fragmentos de 5 mm3 y se transfirieron a medio MS-50 con la misma combinación hormonal de su medio de inducción. Se sembró un fragmento de callo 80 por frasco (100 ml) en 25 ml de cultivo. Se colocaron en una plataforma de agitación orbital a 90 r.p.m. y se incubaron en luz en las condiciones ya mencionadas. Se hicieron subcultivos cada 4 semanas. Cinética de crecimiento Para determinar la cinética de crecimiento de los cultivos de células en suspensión, debido a la poca biomasa, se tomaron todos los explantes de callos de cultivos de raíz, hoja, cotiledón y pecíolo de L. porteri (2,4-D, 4 mg/L) y pecíolo, hoja, raíz (ANA/BA 4:1) y cotiledón (2,4-D/BA 4:1) de P. crispum. El material vegetal se repartió en 20 frascos de 100 ml con 25 ml de medio MS-50 líquido con la misma combinación de reguladores de procedencia. Los frascos se mantuvieron en una plataforma de agitación orbital a 90 r.p.m., se incubaron en luz en las condiciones ya mencionadas y se dejaron de 30 a 60 días para su establecimiento en medio líquido. Se tomaron las lecturas cada 8 días. Por cada punto (20 en total) en la curva de crecimiento, se tomaron tres alícuotas de 1 ml cada una, considerándose tres repeticiones por punto. Las muestras se colocaron en tubos Eppendorf estériles de 1.5 ml de volumen. Cada muestra se centrifugó en una centrífuga Eppendorf 5415D a 2 600 r.p.m. por 3 min y posteriormente se pesó el tubo en una balanza analítica para determinar el volumen del paquete celular. Las muestras fueron almacenadas a 1°C. Se analizaron distintas etapas de todos los cultivos de ambas especies con un fotomicroscopio Axoskop C. Zeiss en campo claro (cc) y contraste de fases (cf). Este trabajo fue realizado en el Laboratorio de Anatomía e Histología del Jardín Botánico del Instituto de Biología, UNAM. Obtención de los extractos de L. porteri y P. crispum Para determinar la presencia o ausencia de Z-ligustílida, se analizaron los siguientes extractos de ambas especies (Tabla 15): 81 Tabla 15. Procedencia del material vegetal analizado. L. porteri P. crispum Partes aéreas (pecíolos y hojas) 3 años de edad (Chihuahua) Partes aéreas 8 meses de edad (invernadero) Raíz 8 meses de edad (invernadero) Partes aéreas 3 meses de edad (in vitro) Raíces 3 meses de edad (in vitro) Semillas (Chihuahua) Callos raíz y cotiledón (MS-50 2,4-D/BA 2:1) Callo pecíolo (MS-50 2,4-D/BA 4:0.5) Callo semillas (GA3 2:0) Callo raíz (MS-50 ANA/BA 1:1) Callo hoja (MS-50 2,4-D/BA 4:1) Callo cotiledón (MS-50 2,4-D 0.5:0) Callo tallo (MS-50 2,4-D/BA 4:2) Callo tallo (MS-50 2,4-D/BA 0.1:3) Callo pecíolo (MS-50 2,4-D/BA 0.1:1) Callo raíz (MS-50 2,4-D/BA 0.1:1) Callo raíz (MS-50 2,4-D/BA 0.1:3) Callo raíz (MS-50 ANA/BA 4:2) Callo hoja (MS-50 2,4-D/BA 1:1) Callo pecíolo (MS-50 2,4-D/BA 1:1) Callo raíz (MS-50 BA 3:0) Callo hoja (MS-50 ANA/BA 4:2) Callo cotiledón (MS-50 2,4-D/BA 0.1:0.5) Callo pecíolo (MS-50 2,4-D/BA 0.1:3) Callo raíz (MS-50 ANA/BA 3:1) Callo raíz (MS-50 ANA/BA 1:1) Callo pecíolo (MS-50 ANA/BA 4:1) Callo cotiledón (MS-50 2,4-D/BA 1:1) Callo tallo (MS-50 2,4D/BA 0.1:3) Callo pecíolo (MS-50 2,4-D/BA 0.1:1) Callo raíz (MS-50 ANA/BA 4:2) Callo pecíolo (MS-50 2,4-D/BA 0.1:3) Partes aéreas (pecíolos y hojas) 6 meses de edad (invernadero) Partes aéreas 3 meses de edad (in vitro) Raíces 3 meses de edad (in vitro) Raíz 6 meses de edad (invernadero) Callo cotiledón (MS-50 ANA/BA 3:0.5) Callo hoja (MS-50 ANA/BA 4:1) Callo tallo (MS-50 ANA/BA 2:1) Los extractos preparados por maceración con CH2Cl2-MeOH 1:1 se analizaron por CCF utilizando placas de aluminio recubiertas con gel de sílice y como sistema de elución, mezclas compuestas de hexano, acetato de etilo, tolueno, ácido acético glacial y cloroformo en diversas proporciones. Para revelar las placas se utilizó como reactivo visualizador una solución de sulfato cérico. En todos los casos las placas se observaron previamente con luz UV y se utilizó una solución estándar de Z-ligustílida para detectar la presencia o ausencia en sus extractos. 82 Cromatografía en columna abierta El extracto de partes aéreas (10 g) se preabsorbió en 31 g de gel de sílice (Merck 60). Se empacó una columna de vidrio con 250 g de gel de sílice (tamaño de la partícula 0.063-0.200 mm Merck 60) como fase estacionaria y se eluyó con mezclas de hexano y acetato de etilo, como fase móvil, aumentando gradualmente la polaridad. Se colectaron alícuotas de 50 ml, se destilaron a 60°C en un rotaevaporador a presión reducida y se analizaron por CCF. Este trabajo fue realizado en el Laboratorio 124 del Departamento de Farmacia, Conjunto E, Edificio A de la Facultad de Química de la UNAM. Análisis por cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas (CG-EM) Para la caracterización de los componentes presentes en las muestras a partir del análisis de los espectros de masas en su modalidad impacto electrónico se utilizó un cromatógrafo de gases (Agilent Technologies 6890N) con inyector split (relación split 1/50) acoplado a un espectrómetro de masas (LECO Pegasus 4D) con un analizador másico TOF (tiempo de vuelo) a baja resolución. Se utilizó una columna capilar de sílice fundida semipolar DB-5MS (5% fenil 95% metilpolisiloxanos) de 10 m de longitud x 0.18 mm de diámetro interno x 0.18 µm de grosor de película. Se empleó helio como gas acarreador a flujo constante de 1 ml/min. La temperatura del inyector fue de 300°C. La temperatura de la línea de transferencia fue de 250°C y la de la fuente de ionización de 200°C. Los análisis se realizaron a 70 eV, utilizando el modo de barrido total del espectro de 45 a 800 m/z para la identificación de iones para la caracterización. Las muestras se compararon con la biblioteca de espectros de masas NIST (NIST Mass Spectral Search ver. 2.0) en conjunto con datos de la literatura y con estándares de referencia. Este trabajo fue realizado en la Sección de Espectrometría de Masas de la Unidad de Servicios de Apoyo a la Investigación (USAI) en el Edificio B de la Facultad de Química de la UNAM. 83 Pruebas preliminares de Ligusticum porteri Prueba de viabilidad de semillas La determinación de la viabilidad de los embriones se evaluó con la técnica de tinción con tetrazolio (cloruro de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazolio, TTZ) de acuerdo a Schmidt (2000) (Apéndice I). Se utilizaron 10 semillas por cada lote de muestras. A cada semilla se le hizo una perforación (1-2 mm) con pinzas para permitir que el TTZ penetrara la semilla. Las semillas se mantuvieron en oscuridad a 21 °C por 24 h. Después de transcurrido este tiempo se analizaron las semillas bajo el microscopio estereoscópico. Se hicieron 5 lotes de semillas de acuerdo al tiempo de horas frío (estratificación) a diferentes temperaturas: 1. Semillas de 7 años de edad mantenidas a -10°C 2. Semillas de 8 meses de edad mantenidas a 10°C por 7 meses 3. Semillas de 8 meses de edad mantenidas a 10°C por 2.5 meses 4. Semillas de 8 meses de edad mantenidas a 10°C por 2 meses 5. Semillas de 8 meses de edad mantenidas a 10°C por 1 mes Con la técnica del TTZ se puede evaluar la actividad bioquímica de la semilla determinando si ésta es viable o no. El principio del TTZ, desarrollado por Lakon (1949), indica la actividad del grupo de las deshidrogenasas, las cuales son responsables de los procesos reductores en los tejidos vivos. En la penetración en las células vivas, el TTZ es reducido a formazán, un compuesto rojizo, estable y no soluble. La reacción ocurre dentro de o cerca de las células vivas que están liberando hidrógeno en el proceso de la respiración. Los tejidos sanos producen un color rojo normal. Tales tejidos resisten la velocidad de penetración de TTZ. La proporción de liberación de hidrógeno en tejidos sanos es lenta comparado con aquella en tejidos parcialmente debilitados. Los tejidos vivos débiles producen un color anormal. Tales tejidos han perdido algo de la resistencia inicial a la penetración de TTZ. La respiración se acelera y el formazán se produce rápidamente. Durante las fases tempranas de deterioro, estos tejidos se ponen rojo oscuro más rápidamente que los tejidos sanos, saludables. Los tejidos muertos no se tiñen y permanecen normalmente blancos (tejido viejo) debido a la pérdida de respiración que previene la producción del formazán por los tejidos embrionarios (Roberts, 1972). 84 Germinación en mezclas de sustratos Debido a la falta de información sobre la germinación de las semillas de L. porteri, se ensayaron diferentes mezclas de sustratos en distintas proporciones, temperaturas de incubación, luz, lotes de semillas y contenedores. 1. Se colocaron 100 g de semillas sin previa hidratación y sin estratificación en una bolsa de organza y se colocaron en un recipiente con suelo de Chihuahua por un mes a 25°C para estimular la germinación (Orozco, com. pers.). 2. Se ensayaron dos mezclas de sustrato de 500 g, una con Sphagnum, tierra negra y agrolita (1:1:1) y otra con Sphagnum y agrolita (1:1). Se esterilizó el material en autoclave (40 min a 1.5 Kg/cm2 a 121°C) y en 80 frascos de vidrio con 25 g de la mezcla se sembraron 2 semillas desinfectadas por frasco. Se mantuvieron a 21°C en un fotoperíodo de 16 h luz y 8 h de oscuridad. 3. En charolas de plástico (30 x 30 cm) se colocaron 500 g de las mezclas mencionadas y mezclas de tierra negra y tierra de hoja (1:1) sin desinfectar, se sembraron 20 semillas desinfectadas por charola. Las semillas se incubaron a temperatura ambiente en invernadero y se regaron cada 7 días. 4. Adicionalmente, se utilizó suelo recolectado en el Municipio de Guachochi en la localidad de Piedras Blancas en Chihuahua en donde habían poblaciones de L. porteri. Se hicieron tres tratamientos: (1) suelo y semillas sin desinfectar; (2) suelo sin desinfectar y semillas desinfectadas y (3) suelo y semillas desinfectadas. En los dos primeros tratamientos se sembraron 20 frascos con 3 semillas cada uno y en el último se sembraron 40 frascos con 3 semillas cada uno. Se mantuvieron a 21°C en un fotoperíodo de 16 h luz y 8 h de oscuridad hasta su germinación. Desinfección de explantes Se ensayaron varios métodos de desinfección conforme se fueron generando resultados. En la Tabla 16 se muestran los diferentes tratamientos utilizados para la desinfección de los distintos explantes. Las concentraciones utilizadas de cada antibiótico y fungicida de cada tratamiento fueron las siguientes: Benomilo 1 g/500 ml, Gentamicina 20 mg/1 ml (ampolleta), Amoxicilina 500 mg/500 ml (cápsula), Terramicina 200 mg/100 ml, Cuprimicin 300 mg/100 ml, PPM 3 ml/L y Tecto 60 85 1g/500 ml a menos que se indique otra concentración. La solución de agua oxigenada fue de 10% (v/v) y la de hipoclorito de sodio de 10 ml/20 ml a menos que se indique otra concentración. 86 Tabla 16. Distintos tratamientos de desinfección de explantes y semillas. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 AD 10-15 min AD 10-15 min AC 5 min AC 5 min AC 5 min AC 5 min AC 5 min AC 5 min AC 5 min AC 5 min AC 5 min AC 5 min AC 5 min AC 1 h SD 5 min SD 5 min Cl 1 min ADE Bn (50mg/100ml*15min) con y sin enjuague en ADE Cl 1 min ADE Cl 1 min ADE Cl 1 min ADE Cl 1 min ADE Cl 1 min ADE Cl 1 min ADE Cl 1 min ADE Cl 1 min ADE Cl 1 min ADE ESC AO 10% 7 y 3.5 min AO 10% 7 y 3.5 min MS 50% T60 (1g/100ml*15min) con y sin enjuague en ADE MS 50% Bn 15 min, Gm 30min y Am (100mg/100ml*30min) MS 50% PPM, Bn, Gm y Am MS 50% PPM MS 50% Gm y Am MS 50% Bn y T60 MS 50% Gm, Am, Bn y T60 MS 50% Gm, Am y PPM MS 50% Bn, T60 y PPM MS 50% Gm, Am, Bn, T60 y PPM SD 20 min Terr 10 min Terr 10 min MS 50% MS 50% T60 (1g/100ml*15min), Gm 30min y Am (100mg/100ml*30min) AO 10% 7 min Cp 10 min Cp 10 min Terr (200 mg/100 ml* min) Cl 10% 10 y 5 min Cl 10% 10 y 5 min Cp (300 mg/100 ml* min) PPM 2 h PPM 3 y 20 h Cl 10% 10 min MS 50% PPM (1ml/L) MS 50% PPM (1 ml/49 ml*2 h sin enjuague Abreviaturas: ADE: agua destilada esterilizada, AD: agua destilada, AC: agua corriente, SD: solución de detergente, AO: agua oxigenada, Terr: terramicina, Bn: benomilo, T60: tecto 60, Cp: cuprimicin, Am: amoxicilina, Gm: gentamicina, Cl: solución de hipoclorito de sodio, PPM: plant preservative mixture, ESC: escarificación. 86 Tabla 16. Distintos tratamientos de desinfección de explantes y semillas. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 AD 10-15 min AD 10-15 min AC 5 min AC 5 min AC 5 min AC 5 min AC 5 min AC 5 min AC 5 min AC 5 min AC 5 min AC 5 min AC 5 min AC 1 h SD 5 min SD 5 min Cl 1 min ADE Bn (50mg/100ml*15min) con y sin enjuague en ADE Cl 1 min ADE Cl 1 min ADE Cl 1 min ADE Cl 1 min ADE Cl 1 min ADE Cl 1 min ADE Cl 1 min ADE Cl 1 min ADE Cl 1 min ADE ESC AO 10% 7 y 3.5 min AO 10% 7 y 3.5 min MS 50% T60 (1g/100ml*15min) con y sin enjuague en ADE MS 50% Bn 15 min, Gm 30min y Am (100mg/100ml*30min) MS 50% PPM, Bn, Gm y Am MS 50% PPM MS 50% Gm y Am MS 50% Bn y T60 MS 50% Gm, Am, Bn y T60 MS 50% Gm, Am y PPM MS 50% Bn, T60 y PPM MS 50% Gm, Am, Bn, T60 y PPM SD 20 min Terr 10 min Terr 10 min MS 50% MS 50% T60 (1g/100ml*15min), Gm 30min y Am (100mg/100ml*30min) AO 10% 7 min Cp 10 min Cp 10 min Terr (200 mg/100 ml* min) Cl 10% 10 y 5 min Cl 10% 10 y 5 min Cp (300 mg/100 ml* min) PPM 2 h PPM 3 y 20 h Cl 10% 10 min MS 50% PPM (1ml/L) MS 50% PPM (1 ml/49 ml*2 h sin enjuague Abreviaturas: ADE: agua destilada esterilizada, AD: agua destilada, AC: agua corriente, SD: solución de detergente, AO: agua oxigenada, Terr: terramicina, Bn: benomilo, T60: tecto 60, Cp: cuprimicin, Am: amoxicilina, Gm: gentamicina, Cl: solución de hipoclorito de sodio, PPM: plant preservative mixture, ESC: escarificación. 87 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Material biológico Una muestra de aproximadamente 1000 semillas de L. porteri se sometió a estratificación a 1°C por 40 días para inducir la germinación, de acuerdo a Robinson (1954) y los resultados obtenidos en las pruebas preliminares de L. porteri. El resto de las semillas permanecieron en estratificación. En la gran mayoría de las especies no tropicales, la dormancia fisiológica de sus semillas es interrumpida cuando éstas son sometidas a temperaturas que van desde 1 a 10°C. En la naturaleza esto ocurre para prevenir la germinación de las semillas hasta que haya pasado el invierno. La temperatura baja actúa reduciendo la tasa de reacciones enzimáticas que tienen lugar en las semillas, retardando así algunos de los procesos metabólicos de la germinación (Bewley y Black, 1994). En el caso de las semillas de L. porteri, al caer al suelo en otoño, pasan el invierno cubiertas de nieve aproximadamente hasta primavera, explicando así la necesidad de estratificar sus semillas para lograr su germinación ex situ. Esta información concuerda con los resultados obtenidos por Vandelook y cols. (2007), quienes estratificaron las semillas de Chaerophyllum temulum (Apiaceae) a 5°C por 20 semanas, logrando el 80% de germinación, aún en semillas tratadas posteriormente con temperaturas más altas (23°C) y con GA3 (10, 100, 1000 mg/L). Llegando a la conclusión de que GA3 no sustituye el tiempo frío necesario para la germinación de las semillas de esta especie. Desinfección de semillas Una fuerte limitante para el desarrollo de la investigación fue el hecho de que los distintos lotes de semillas presentaron contaminación por microorganismos tanto en condiciones in vitro como ex vitro. Por ello, para resolver esta situación se desarrolló un tratamiento de desinfección (Tabla 16), de los cuales el método 14 fue el más efectivo, lo que hizo posible la obtención de plántulas a través de la germinación aséptica de las semillas. La diferencia sustancial fue la inclusión de PPM (1 ml/ 49 ml de agua destilada) en el procedimiento de esterilización superficial. El PPM es un biocida y fungicida de amplio espectro utilizado para el cultivo de tejidos vegetales ya que previene la germinación de esporas y en concentraciones mayores elimina contaminantes endógenos de explantes. El PPM tiene como blanco enzimas esenciales en el ciclo de Krebs y de la cadena de transporte de electrones (www.ppm4plant-tc.com). Naill y Roberts (2005) lograron obtener suspensiones celulares de Taxus cuspidata libres de patógenos con la adición de PPM (0.2% v/v) al medio de cultivo (MS) sin mostrar efectos negativos sobre el crecimiento o viabilidad de éstas, contrastando con la penicilina y estreptomicina, ésta última disminuyendo el crecimiento celular y ambas, en combinación, mostrando el mismo resultado. Li y cols. (2000) lograron la germinación aséptica de semillas de Scutellaria baicalensis en medio MS adicionado con PPM (4 ml/L). La inclusión del PPM en el tratamiento de desinfección eliminó toda contaminación microbiana en el establecimiento de las plántulas de P. crispum, no obstante, para L. porteri, una especie silvestre cuyas semillas fueron recolectadas de sus poblaciones naturales, sus semillas presentaron 17.5% de contaminación, principalmente fúngica. Este fue uno de los resultados que mostró una gran diferencia entre ambas especies y principalmente entre especies silvestres y domesticadas. En el proceso de la desinfección superficial de las semillas de L. porteri, al ser sumergidas en agua corriente, el 20% de ellas flotaban en la superficie y éstas al ser vistas bajo el microscopio estereoscópico, presentaron en su interior larvas de color blanco a amarillento de aproximadamente 3.5 mm de longitud pertenecientes al grupo Hymenoptera y la familia Chalcididae (García, 2008) (Figura 14). Esta familia de insectos parasitan semillas de manzanas y otras frutas (Peterson, 1962). Figura 14. Larva presente en las semillas de L. porteri. 89 White (1988) reporta que las larvas de Euleia heraclei (grupo Diptera, familia Tephritidae) se alimentan de las hojas de L. scoticum y la larva de este insecto ha sido asociada a un gran número de especies de la familia Apiaceae como Ammi, Angelica, Apium, Berula, Bupleurum, Conium, Daucus, Heracleum, Levisticum, Petroselinum, Pimpinella y Tordylium entre otros. Robinson (1954) y Flemion (1949) mencionan a Lygus oblineatus (grupo Heteroptera, familia Miridae) como el causante de que las semillas de eneldo, zanahoria, apio, cilantro, hinojo, perejil y pastinaca carezcan de embrión, reduciendo en un rango del 33 al 85% la viabilidad de estas semillas. Sin embargo, el grupo Hymenoptera no había sido reportado como parásitos de especies de la familia Apiaceae ni específicamente de L. porteri, por lo que se suma a la problemática en la conservación de esta especie al disminuir el número de semillas viables. Germinación in vitro Por definición, la germinación comienza con la absorción de agua por la semilla (imbibición) y termina con la elongación del eje embrionario, generalmente la radícula. El signo visible de que la germinación está completa es generalmente la penetración de la radícula a las estructuras que rodean al embrión (Bewley y Black, 1994; Bentsink y Koornneef, 2002). La emergencia de la radícula fue el parámetro que se tomó en cuenta para determinar si las semillas habían germinado o no. Las semillas de P. crispum germinaron entre la tercera y quinta semana de incubación de manera sincrónica, mientras que las de L. porteri germinaron a partir de la tercera semana de incubación de manera asincrónica (Tabla 4). A diferencia de las semillas de L. porteri, las de P. crispum no necesitaron estratificación, ni escarificación y no presentaron contaminación bacteriana o fúngica después de la desinfección de semillas. Una semilla puede permanecer viable o viva pero ser incapaz de germinar o crecer por varias razones. Éstas pueden ser por condiciones internas o externas. Una situación interna puede ser que el embrión no ha alcanzado la madurez morfológica para germinar. La germinación de semillas de plantas silvestres a menudo está limitada internamente de una u otra forma, pero las semillas de muchas plantas domesticadas están limitadas únicamente por la falta de humedad y/o falta de calor. A partir de estas dos situaciones se pueden diferenciar la quiescencia que es el estado de una semilla cuando su incapacidad para germinar solo se debe a que no se dan las condiciones externas adecuadas, como el caso de P. crispum, y la latencia que es el estado de una semilla cuando su incapacidad para germinar se debe a condiciones internas, aunque las condiciones externas (temperatura, humedad y atmósfera) sean adecuadas, como el caso de L. porteri (Salisbury y Ross, 1992). Esta fue otra de las diferencias notables 90 entre L. porteri y P. crispum, la germinación diferencial bajo las mismas condiciones de incubación entre ambas especies (Tabla 4). Las plántulas de L. porteri tuvieron, en general, un crecimiento muy lento en comparación con las plántulas de P. crispum que tuvieron un crecimiento más rápido, es decir, después de una semana de germinación, emergió una hoja color verde claro y dos semanas después emergieron más pecíolos con hojas, ambos verde claro. De las plántulas de L. porteri que lograron germinar, la hoja emergió después de los tres meses a partir de la germinación. Las hojas y pecíolos, en la mayoría de las ocasiones se tornaron rojizos, lo que es común en plantas adultas en su hábitat natural. El 30% de las plántulas que germinaron, murieron después de dos semanas, se tornaron café oscuro o pajizo, posiblemente por las condiciones de luz y temperatura en las que fueron incubadas. Las raíces de L. porteri tuvieron una elongación muy escasa (1-5 cm) y no hubo desarrollo de raíces secundarias. El color de las raíces fue de color café muy claro. En plántulas de dos meses de edad se distinguió el olor característico de la raíz. Si el micrópilo de las semillas no estaba en contacto con el medio, la radícula emergía sin tropismo negativo y moría en poco tiempo, a menos que se invirtiera su posición, aunque no siempre con éxito. Las raíces de P. crispum emergieron sin importar la posición del micrópilo y desarrollaron raíces hialinas muy largas y delgadas e incluso raíces secundarias. En general, las plántulas se desarrollaron de manera normal comparadas con las plántulas germinadas ex vitro, las cuales también presentaban una raíz principal y secundarias de color amarillo muy claro, sin embargo sus raíces presentaban un engrosamiento no observado en plántulas germinadas in vitro. Las plántulas de P. crispum tuvieron un mejor crecimiento y desarrollo en las condiciones ensayadas, tanto in vitro como ex vitro. Lo cual concuerda con los atributos (Tabla 4) descritos para especies cultivadas. L. porteri demostró ser una especie de alta especificidad para las condiciones de su hábitat. Germinación ex vitro Las semillas de ambas especies que fueron sembradas en tierra de hoja y tierra negra (1:1) y suelo de Chihuahua, germinaron más rápido, aproximadamente en menos de dos semanas, que las plántulas germinadas in vitro, con un 80% de germinación y 90% de sobrevivencia para L. porteri y 100% en ambos casos para P. crispum. Las plántulas de L. porteri tuvieron un desarrollo más regular, es decir, las raíces se elongaron más en comparación con las germinadas in vitro, se observó el mismo color café muy claro, un engrosamiento, hubo desarrollo de raíces secundarias y se distinguió el olor característico de 91 éstas. Las hojas y pecíolos no se tornaron rojizos, se elongaron más en comparación con las plántulas germinadas in vitro. Análisis fisicoquímico de suelo En una malla de 2mm se tamizó una muestra de suelo colectado en Chihuahua, obteniendo 181 g. El resultado del análisis fisicoquímico se ilustra en la Tabla 17. Tabla 17. Resultados del análisis de suelo de Chihuahua. Cationes intercambiables cmol/kg pH agua 1:2.5 pH KCl 1:2.5 P mg/kg Ca2+ Mg2+ K+ Na+ 6.09 5.30 30.9 37.18 4.82 5.65 0.13 6.05 5.31 33.4 39.17 4.72 5.84 0.18 X = 6.07 5.31 32.15 38.18 4.77 5.75 0.16 De acuerdo a este análisis, las cantidades de Ca2+ >20, de Mg2+ >6.5 y K+ >1.5 son indicadoras de un suelo muy rico, por lo que esos datos indican un suelo muy fértil, de regiones frías con alta precipitación y lenta descomposición de la materia orgánica. Por lo que podrían no ser las condiciones del suelo las que están limitando la germinación, el crecimiento y establecimiento de las plántulas de L. porteri en su hábitat natural. Inducción a callo Debido a la baja sobrevivencia de las plántulas de L. porteri germinadas in vitro, el número de explantes a cultivar fue muy escaso y por ello fue un reto difícil explorar la respuesta a diferentes reguladores de crecimiento. El 80% de los explantes cultivados en medio de inducción MS-50, derivaron en un callo pajizo, compacto, poco friable, pequeño y de lento crecimiento en un período aproximado de 2 a 3 meses de inducción. Se observó un crecimiento limitado, que en algunos casos se debió a una oxidación basal, en contacto con el medio de cultivo, que progresó al resto del tejido. Se observó que al aumentar las concentraciones de ambas auxinas, el 90% de los explantes de L. porteri se oxidaron y murieron, lo cual contrastó con el 90% de los explantes de P. crispum que dieron lugar a un callo verde, hialino, altamente friable, de gran volumen y de rápido crecimiento sin importar la concentración de auxinas. 92 Después de 30 a 40 días de inducción; de los explantes de L. porteri y P. crispum que dieron lugar a callo, éstos fueron seccionados en piezas de 5 mm2 y transferidos a 25 ml de medio MS-100 líquido en agitación a 90 r.p.m., con la misma concentración de reguladores. Después de dos semanas, el 90% de los explantes de L. porteri se oxidaron y murieron o presentaron contaminación fúngica. En la Tabla 18 se muestran los resultados obtenidos de inducción a callo de los explantes de L. porteri con los reguladores de crecimiento 2,4-D, ANA y BA. Tabla 18. Efecto de los reguladores de crecimiento en la inducción a callo de explantes de plántulas germinadas in vitro de L. porteri. Resultados a los 3 meses del inicio de la inducción de los cultivos. Regulador de crecimiento BA 0 mg/L BA 0.5 mg/L BA 1 mg/L BA 2 mg/L BA 3 mg/L 2,4-D 0 mg/L R, C, P R R R R 2,4-D 0.1 mg/L P C, H, P, T H, P, R, T P, H, R C, H, P, R, T 2,4-D 0.5 mg/L C, P, R - - - - 2,4-D 1 mg/L R - C, H, P, R - - 2,4-D 2 mg/L - - C, H, R - - 2,4-D 3 mg/L - - C, H, P - - 2,4-D 4 mg/L C, H, P, R, H, P, R, T C, H, P, R T - ANA 0 mg/L R, C, P R R R R ANA 0.1 mg/L - T, C H, T T T, H ANA 1 mg/L - - C, P, H, R - - ANA 0.5 mg/L P - H - -- ANA 2 mg/L - - H, R - - ANA 3 mg/L - - C, R, P - - ANA 4 mg/L C, P, R H - C, H, P, R H, R, T - C: cotiledón, H: Hoja, P: Pecíolo, T: Tallo, R: Raíz (-): sin explorar o sin respuesta Al término de 30 días de inducción, los cultivos que presentaron los mejores resultados para L. porteri, es decir que dieron lugar a la formación de callo en todos los explantes, fueron las combinaciones de 2,4-D 1, 2, 3, 4 mg/L con BA 1 mg/L (Figura 15A-D), sin embargo, muchos de estos explantes no sobrevivieron la transferencia a medio MS líquido, debido a que sufrieron contaminación fúngica, no obstante que derivaron de plántulas germinadas en condiciones asépticas. Los callos de raíces de todos los tratamientos, siempre dieron origen a un pecíolo con hoja, sin importar si la raíz dio lugar a callo o no. Esto se debió a que el corte de la raíz incluía al tallo, el cual es una zona comprimida entre el pecíolo y la raíz en esta especie, y que posiblemente una parte de él quedó incluida en el explante considerado como “raíz”. Los cotiledones y los pecíolos dieron lugar a un callo de poco tamaño, de color pajizo, compacto y poco friable. En términos de formación de callo con las combinaciones de ANA/BA y 2,4-D/BA se tuvo una inducción homogénea, frecuente y abundante, es decir, los 5 tipos de explantes estudiados dieron lugar a 93 callo (Gráfica 1). En la Figura 15 se ilustran algunas respuestas morfogénicas de los cinco explantes estudiados de L. porteri. Figura 15. . Algunas respuestas morfogénicas de los explantes de L. porteri con distintas combinaciones de 2,4-D/BA y ANA/BA. A. Cotiledón ANA/BA (3:1), B. Raíz y tallo ANA/BA (3:1), C. Hoja ANA-BA (3:1), D. Tallo 2,4-D/BA (0.1:1), E. Hoja 2,4-D/BA (4:1), F. Raíz y tallo 2,4-D/BA (1:1), G. Tallo 2,4-D/BA (4:2), H. Cotiledón 2,4-D (0.5:0), I. Pecíolo ANA (4:0), J. Pecíolos 2,4-D/BA (0.1:1), K. Pecíolo 2,4-D/BA (3:1), L. Cotiledón 2,4-D/BA (0.1:0.5), M. Hoja ANA/BA (0.1:3). Barra: 1.5 cm. Los callos de L. porteri fueron escasos (2–5 cm2), de poca biomasa, de color amarillo pajizo a café oscuro, en pocos casos fue verde (Figura 15J), poco friables, compactos, de apariencia granulada y de lento crecimiento. Los explantes de raíz que incluían el tallo, dieron lugar a la formación de una hoja (Figura 15F), lo que también demuestra que el tallo tiene la capacidad de regeneración, aún cuando la raíz haya desarrollado callo. En la Gráfica 1 se muestran las respuestas morfogénicas de todos los explantes de L. porteri demostrando cuantos explantes tuvieron respuesta a la inducción de callo. El único tratamiento donde se presentó callo en los 5 tipos de explantes fue 2,4-D/BA (0.1:3). Sin embargo, los tratamientos con 2,4- D/BA (4:1), 2,4-D/BA (1:1) y 2,4-D (4 mg/L) y las combinaciones de ANA/BA (1:1), ANA/BA (4:1) también presentaron la formación de callo. 94 Es notable que distintas concentraciones de 2,4-D, desde 0.1 mg/L hasta 4 mg/L, en combinación con BA (1 mg/L) tuvieron un efecto en la formación de callo a pesar de que se hizo una amplia exploración en cuanto a combinaciones de reguladores de crecimiento (35 en total; 7 de 2,4-D, 6 de ANA y 5 de BA), lo que sugirió que esta especie se mostró recalcitrante a otras combinaciones. La combinación 2,4-D/BA es la más utilizada para la inducción de callo, en concentraciones altas de auxina y bajas de citocinina. Éstas interaccionan al regular la división celular, donde la auxina ejerce su efecto en la replicación de ADN mientras que la citocinina lo ejerce sobre algunos eventos que llevan a la mitosis (George, 1993; George y Sherrington, 1984). Las altas concentraciones de 2,4-D son recomendadas para el inicio de la formación de callo ya que suprimen la morfogénesis y dan como resultado la rápida proliferación de éste y las bajas concentraciones de citocininas para mantener su crecimiento (Hurtado y Merino, 1987). También fue notorio que los tratamientos con los explantes de raíz, a pesar de que se formó callo, los explantes conservaron en gran medida su integridad morfológica (Figura 15B, C, E, F, J, L, M). Lo que parece indicar que los tratamientos inductores de callo fueron efectivos para ciertas poblaciones celulares en determinadas condiciones y en un tiempo pero no para otras que mantuvieron la condición original del explante (Figura 15C). Gráfica 1. Formación de callo en medio de inducción MS-50 a partir de los distintos explantes estudiados de L. porteri. Respuesta a los tres meses de inducción de los cultivos. 95 Así mismo, en la Gráfica 2 se muestran los resultados para cada explante, indicando cual de ellos tuvo mayor respuesta morfogénica (callo) en cada combinación de regulador de crecimiento. Para la hoja, los mejores tratamientos, en cuanto al número de explantes que formaron callo, fueron ANA-BA (4:1) y 2,4-D/BA (4:0.5); para el cotiledón fue 2,4-D (4 mg/L) y 2,4-D/BA (2:1), aunque en el control se presentó la formación de callo, sugiriendo que esta estructura fue independiente de la adición de reguladores de crecimiento para la formación de callo. La combinación en la que el pecíolo tuvo una mejor respuesta fue 2,4-D/BA (4:0.5) y para la raíz fue ANA/BA (1:1) seguido de ANA/BA (3:1). El tallo fue el explante que menor respuesta a inducción mostró, formando callo en sólo 5 combinaciones, siendo 2,4-D/BA (4:0.5) donde se presentó el mayor número de callos. Sin embargo, los únicos explantes que no fueron dependientes de la presencia de reguladores de crecimiento fueron cotiledón, pecíolo y raíz, ya que hubo formación de callo en los tratamientos control. Esto evidencia el potencial de estas estructuras para la manipulación in vitro sin la necesidad de adicionar reguladores de crecimiento al medio de cultivo. El explante de raíz fue el que mayor número de respuestas a callo presentó. Esto indica que la raíz de L. porteri tiene un alto potencial regenerativo, posiblemente debido a la estructura napiforme de este órgano que le permite el almacenamiento de sustancias de reserva y la sobrevivencia en situaciones ambientales desfavorables, así como a la posible presencia de áreas meristemáticas y meristemos axilares del tallo, ya que este es muy compacto y muy difícil de delimitar de la raíz. Estos resultados hacen evidente que la fisiología de cada órgano aún de un mismo individuo es diferente. Además, el cultivo de tejidos permitió generar información valiosa de esta especie sobre su comportamiento in vitro a la inducción a callo y a distintos tratamientos de reguladores de crecimiento, ya que desafortunadamente, no existen estudios de morfogénesis de especies del género Ligusticum con los cuales se puedan comparar estos resultados. 96 97 Gráfica 2. Respuestas morfogénicas de cotiledón, hoja, pecíolo, raíz y tallo de L. porteri en medio de inducción MS-50. Resultados a los 3 meses de inducción de los cultivos. En la Tabla 19 se muestran los resultados obtenidos de los explantes inducidos de P. crispum. En general ambas auxinas en combinación con BA (1 mg/L) dieron lugar a callo en los 5 tipos de explantes estudiados (Figura 14A-M). Estos explantes al ser transferidos a medio MS líquido sobrevivieron, proliferaron rápidamente, en menos de dos semanas, de manera abundante y presentaron una contaminación fúngica muy escasa. 98 Tabla 19. Efecto de los reguladores de crecimiento en la inducción a callo de explantes de plántulas germinadas in vitro de P. crispum. Resultados a los 3 meses del inicio de la inducción de los cultivos. Regulador de crecimiento BA 0 mg/L BA 0.5 mg/L BA 1 mg/L BA 2 mg/L BA 3 mg/L 2,4-D 0 mg/L C, P, R R, T C, H, P, R H, P, R, T R, T, H, P 2,4-D 0.1 mg/L C, H, P, R C, H, P, R, T C, P, R, T C, H, P, R, T C, H, R, T, P 2,4-D 0.5 mg/L C, H, P, R - - - - 2,4-D 1 mg/L - - C, H, P, R, T - - 2,4-D 2 mg/L C, H, P, R - C, H, P, R - - 2,4-D 3 mg/L C, H, P, R C, H, P, R C, H, P, R, T - - 2,4-D 4 mg/L C, H, P, R C, H, P, R C, H, P, R C, H, P, R, T ANA 0 mg/L P, R R, T C, H, R, P H, P, R, T R, T, H, P ANA 0.1 mg/L C, H, R, P C, H, P, R, T C, H, R, P, T C, H, R, P, T C, H, T, P, R ANA 0.5 mg/L C, H, P, R - - - - ANA 1 mg/L C, H, T, P, R - C, H, P, R - - ANA 2 mg/L - - C, H, P, R, T - - ANA 3 mg/L C, H, P, R, T C, H, P, R C, H, P, R, T - - ANA 4 mg/L C, H, P, R, T C, H, P, R C, H, P, R, T C, H, P, R, T - C: cotiledón, H: Hoja, P: Pecíolo, T: Tallo, R: Raíz (-): sin explorar o sin respuesta Figura 16. Algunas respuestas morfogénicas de los explantes de P. crispum con diferentes combinaciones de 2,4-D/BA y ANA/BA. A. Hoja ANA/BA (4:1), B. Raíz 2,4-D/BA (1:1), C. Raíz y tallo ANA (4:0), D. Pecíolo (ANA/BA 3:0.5), E. Cotiledón ANA/BA (4:0.5), F. Hoja ANA/BA (0.1:0.5), G. Raíz ANA/BA (4:1), H. Pecíolo 2,4-D/BA (0.1:1), I. Cotiledón 2,4-D (2:0), J. Hoja BA (1:0), K. Hoja 2,4-D/BA (2:1), L. Tallo ANA/BA (2:1), M. Hoja ANA (4:0). Barra: 1.5 cm. 99 Gráfica 3. Formación de callo en medio de inducción MS-50 a partir de los distintos explantes estudiados de P. crispum. Respuestas a los 3 meses de inducción de los cultivos. En contraste con L. porteri, las respuestas de inducción a callo de los explantes de P. crispum tuvieron un comportamiento más homogéneo, es decir los cinco explantes dieron lugar a la formación de callo en todos los tratamientos explorados incluyendo los controles. Sin embargo, la combinación de reguladores donde hubo mayor frecuencia de respuestas morfogénicas fue con ANA y BA (4:1) y 2,4- D/BA (4:1) (Gráfica 3). Los explantes de P. crispum dieron lugar a un callo abundante, altamente friable, de color hialino y verde claro brillante, de rápido crecimiento y de aspecto húmedo. En los explantes de hoja y raíz con combinaciones de auxinas altas como ANA (3 mg/L y 4 mg/L) o bajas como ANA/BA (0.1:3), hubo la formación de muchas raíces secundarias (Figura 16G) hialinas, delgadas y largas. Los explantes de raíz que probablemente contenían alguna fracción de tallo, también dieron lugar a la formación de muchas hojas verdes con pecíolos verdes o hialinos. Esto sugiere también, que estas dos estructuras son propicios para la regeneración de plantas completas. En el caso de P. crispum, también se observó que en la mayoría de los explantes, éstos conservaron su identidad morfológica. Sólo algunas zonas lograron la formación de callo (Figura 16K, M). Por ello, estos resultados morfogénicos son muy importantes, pues los tratamientos en que ocurrieron evidenciaron que estas condiciones fueron inductoras de estructuras organizadas y que se desarrollaron vía organogénesis indirecta, y en algunos casos directa. No obstante que no se logró la regeneración de plantas completas, éstos son los primeros y únicos resultados sobre la morfogénesis in vitro de P. crispum. 100 101 Gráfica 4. Respuestas morfogénicas de cotiledón, hoja, pecíolo, raíz y tallo de P. crispum en medio de inducción MS-50. Resultados a los tres meses de inducción de los cultivos. Los mejores tratamientos en cuanto al número de explantes que formaron callo fueron: para la hoja, los mejores tratamientos con igual número de explantes que formaron callo fueron 2,4-D/BA y ANA/BA (4:1); para el cotiledón fue 2,4-D/BA (3:1) seguido de 2,4-D/BA y ANA/BA (1:1), 2,4-D (2 mg/L) y 2,4-D/BA (4:1); para el pecíolo fue ANA (4 mg/L) y ANA/BA (3:1), siguiendo 2,4-D/BA (3:1) y ANA (0.5 mg/L) y para la raíz fueron ANA/BA (2:1), 2,4-D/BA (3:0.5) y ANA (4 mg/L), siguiendo 2,4- D (0.1 y 0.5 mg/L), ANA (0.5 mg/L), BA (0.5 mg/L), 2,4-D/BA (1:1 y 3:1) y ANA/BA (4:1) y para el tallo las combinaciones con mayor número de formación de callo fueron 2,4-D/BA y ANA/BA (4:2) (Gráfica 4). 102 Estos resultados sugieren que el cotiledón, el pecíolo y la raíz tienen comportamientos y frecuencias de respuestas a callo similares, contrastando con la hoja y tallo, donde se observó una baja respuesta a la formación de callo. Cultivo de células en suspensión Los ensayos para explorar el establecimiento de cultivos de células en suspensión de L. porteri, se iniciaron a partir de callo de los 5 explantes que observaron activo crecimiento (división celular) y mayor biomasa. Se disectaron fragmentos de 5 mm3 y se sembró un fragmento en cada frasco de cultivo (100ml) con 25 ml de medio de cultivo líquido MS-50 con la misma formulación de reguladores de crecimiento de su procedencia en medio sólido. Los cultivos de los explantes de L. porteri que presentaron mayor proliferación en medio MS-50 líquido, fueron con 2,4-D (4 mg/L), aunque fue lenta, de 2 a 3 meses, éstos cultivos se han mantenido asépticos y con un crecimiento constante desde hace 15 meses. Todos estos cultivos tuvieron un color café oscuro, con células totalmente disgregadas y en algunos casos, como los cultivos de raíz, con agregados celulares, y de rápido crecimiento. El fragmento inicial de todos los callos de L. porteri no se disgregó y por el contrario, adquirió una condición compacta. El medio de cultivo adquirió un color café oscuro en el caso del cultivo de raíz, al ser expuesto al flujo de aire, posiblemente por la oxidación de los metabolitos secundarios presentes en ella. Los cultivos de los explantes de P. crispum que mostraron una proliferación abundante tuvieron la combinación de ANA (4 mg/L) con BA (1 mg/L) y para el cotiledón con la combinación de 2,4-D con BA en las mismas concentraciones. Estos cultivos tuvieron un color amarillo claro con células totalmente disgregadas y el medio de cultivo se mantuvo incoloro. Cinética de crecimiento La curva de crecimiento de L. porteri tuvo un comportamiento sigmoide (Gráfica 5). La fase lag o de reposo, tuvo una duración de 4 semanas en todos los explantes (Figura 15A-D). En esta fase, el inóculo no presenta ninguna señal de división celular, ya que únicamente se está adaptando a las nuevas condiciones nutricionales (Hurtado y Merino, 1987; Street, 1977; Dodds y Roberts, 1982), al estado líquido y a la agitación del medio de cultivo. Las células de los cuatro explantes, en esta fase, tuvieron una morfología alargada en su mayoría, y algunas redondas. Se observaron agregados celulares de 1-2 mm de diámetro, algunas células aisladas con una pared celular delgada. En la Figura 15B y C, se observa 103 el citoplasma que adoptó la morfología de la célula llenándola por completo. Esta morfología pudo deberse a la agitación mecánica del cultivo en la plataforma de agitación orbital. Gráfica 5. Cinética de crecimiento de los explantes de raíz, hoja, pecíolo y cotiledón de L. porteri. En la cuarta semana, tuvo lugar la fase exponencial, y entre la cuarta y la quinta semana de cultivo, tuvo lugar la fase lineal, en las cuales hubo un incremento en la división celular y la turbidez del medio de cultivo en todos los casos (Figura 17F-H). En el cultivo de cotiledón se registró una lectura de biomasa de 1.26 g, dato visiblemente superior al resto de los explantes. En esta fase se observaron agregados celulares pero de mayor diámetro (5-8 mm). Algunas células aisladas fueron alargadas y otras redondas a semiesféricas. Por contraste de fases se pudo observar un citoplasma comprimido y una gran cantidad de contenidos celulares de aspecto granular. Entre la quinta y sexta semana se observó una disminución progresiva de biomasa y a partir de la sexta semana hasta la onceava, tuvo lugar la fase estacionaria. Esta fase tuvo una duración de 5 semanas y la biomasa en todos los casos se mantuvo en aproximadamente 1.12 g. En esta fase las células han 104 cesado de crecer y dividirse, posiblemente por el agotamiento de alguno de los nutrientes en el medio (Street, 1977; Dodds y Roberts, 1982) o la acumulación de sustancias de desecho en el medio de cultivo que pueden ser tóxicas para las células. Las células han alcanzado su máxima densidad celular y permanecen viables. A partir de la doceava semana y hasta la catorceava semana, disminuyó drásticamente la biomasa y se mantuvo la turbidez del medio de cultivo. Se observaron células alargadas, con el citoplasma comprimido con gran cantidad de contenidos celulares de aspecto granular (Figura 17I- K) y en algunos casos se logró observar el núcleo (Figura 17L). Es posible que los contenidos celulares hayan sido metabolitos secundarios o algunos aceites característicos de esta especie. Figura 17. Fotomicrografías de los cultivos en células en suspensión de callos de L. porteri. A. Cotiledón x1000 cc, B. Hoja x2000 cc, C. Pecíolo x100 cc, D. Raíz x100 cc, E. Cotiledón x100 cc, F. Hoja x200 cc, G. Pecíolo x400 cf, H. Raíz x200 cc, I. Cotiledón x400 cf, J. Hoja x400 cf, K. Pecíolo x400 cf, L. Raíz x1000 cf. n: núcleo. cc: citoplasma contraído. Es interesante notar que los cultivos de raíz sufrieron una rápida oxidación al estar en contacto con el aire, se tornaron a un color café muy oscuro. Es posible que alguno de los metabolitos secundarios, como las ftálidas que se oxidan rápidamente por el aire, hayan sido una de las causas de este proceso. La curva de crecimiento de los explantes de P. crispum también presentó un comportamiento sigmoide (Gráfica 6). La fase lag tuvo lugar en las primeras dos semanas de cultivo, con una ligera 105 disminución en la biomasa, excepto en la raíz, donde no hubo fase lag ni disminución en la biomasa. En el caso de P. crispum, las fases lineal y exponencial ocurrieron al mismo tiempo, entre la segunda y la tercera semana. En esta etapa se observaron células aisladas de morfología alargada y algunos agregados celulares de morfología semiesférica (Figura 16A-D). A partir de la tercera semana y hasta la quinta, la fase estacionaria no fue constante como en el caso de L. porteri, sino que comenzó a disminuir la biomasa de la quinta a la sexta semana de cultivo en todos los casos. Se observaron células aisladas de morfología alargada con contenidos celulares de aspecto granular, con el citoplasma contraído y con una pared celular delgada (Figura 18E-H). Después de la sexta semana y hasta la octava semana, volvió a incrementar la biomasa, pudiéndose considerar como una segunda fase exponencial, excepto en el caso del tallo. Esto pudo deberse a que en el mismo cultivo habían distintas poblaciones celulares con distinto estado fisiológico y por consiguiente con distintos tiempos de división celular, por lo tanto algunas poblaciones celulares no se reprodujeron en la primera etapa exponencial y lo hicieron en la segunda etapa exponencial. A partir de la octava semana y hasta la décima, la fase exponencial, tampoco se mantuvo y en los cuatro casos, la turbidez y la biomasa celulares disminuyeron considerablemente hasta llegar a la doceava semana, donde la lectura final fue la misma que la del inóculo inicial, en la primera semana (1.06 g). En esta fase, se observaron células de morfología muy alargada, característica de cultivos viejos, con el citoplasma contraído y contenidos celulares de aspecto granular (Figura 18I-L). Entra la tercera y décima semana, el valor aproximado de biomasa fue de 1.12 g, al igual que en los cultivos de L. porteri. 106 Gráfica 6. Cinética de crecimiento de los explantes de hoja, raíz, tallo y cotiledón de P. crispum. Figura 18. Fotomicrografías de los cultivos de células en suspensión de callos de P. crispum. A. Cotiledón x100 cc, B. Hoja x200 cc, C. Raíz x200 cc, D. Tallo x200 cc, E. Cotiledón x400 cf, F. Hoja x400 cf, G. Raíz x200 cf, H. Tallo x400 cf, I. Cotiledón x400 cf, J. Hoja x400 cc, K. Raíz x400 cf, L. Tallo x200 cf. cn: contenido celular, cc: citoplasma contraído. 107 Es posible que la condiciones de cultivo ensayadas de los explantes de P. crispum no hayan sido adecuadas para éstos, ya que hubieron repetidos descensos en la cuantificación de biomasa y la fase estacionaria no fue lineal. Esto pudo deberse a varios factores como el frasco utilizado, la falta de intercambio gaseoso en la atmósfera del frasco, el rápido agotamiento de alguno o varios de los nutrientes o incluso el estado fisiológico del inóculo inicial. Obtención de extractos El material vegetal procedente de plantas adultas de L. porteri: partes aéreas (126 g), semillas (9.81 g), raíz (1.52 g) y raíz de P. crispum (4.30 g) se dejaron secar una semana a temperatura ambiente, se molieron hasta obtener un polvo fino y se pesó en una balanza analítica. Este material se extrajo durante siete días con una mezcla de CH2-Cl2-MeOH 1:1 en un matraz de 2 L (con 1800 ml de disolvente), para las parteas aéreas, y 500 ml (con 250 ml de disolvente) en el resto de los casos, en oscuridad para evitar al descomposición de las ftálidas por efecto de la luz o el aire. Posteriormente los extractos resultantes se concentraron por destilación en un rotaevaporador a una temperatura de 60°C al vacío. Al cabo de estos experimentos se obtuvieron 11.3719 g de extracto de hojas, 3 g de extracto de semillas, 0.17 g de raíz de L. porteri y 0.38 g de raíz de P. crispum. Los extractos se analizaron mediante CCF para determinar la presencia o ausencia de Z- ligustílida. El compuesto no se detectó en el extracto de semillas ni en el de partes aéreas (Figura 19A-B). De manera conjunta se utilizó una referencia pura de diligustílida para determinar su presencia o ausencia observándose que el mismo compuesto está presente en la raíz pero no en semillas y partes aéreas (Tabla 20). La fase móvil se hizo de acuerdo al trabajo de Zschocke y cols. (1998). Adicionalmente se prepararon extractos de partes aéreas y raíz de L. porteri y P. crispum cultivadas en invernadero como una placa de CCF de referencia (Figura 20). Tabla 20. Resultados de presencia o ausencia de Z-ligustílida de acuerdo al análisis por CCF. Material biológico obtenido de plantas adultas silvestres. Parte de la planta Presencia de Z-ligustílida Semillas No Partes aéreas No Raíz Sí 108 Figura 19. Análisis por CCF de los extractos obtenidos de partes aéreas y raíces de plantas adultas de L. porteri y P. crispum. La fase móvil utilizada fue Tolueno-AcOEt-Ácido acético glacial 90:10:1. A. CCF vista a 365+254 nm. B. CCF vista a 254 nm (UV). A-B. Carril 1: extracto de hojas, Carril 2: extracto de raíz, Carril 3: extracto de semillas, Carril 4: fase de CH2Cl2 del extracto de hojas, Carril 5: fase acuosa del extracto de hojas, Carril 6: fase hexánica del extracto de hojas. Figura 20. Análisis por CCF de los extractos de L. porteri y P. crispum de plantas cultivadas en invernadero. Resultados a los 8 y 6 meses de edad, respectivamente. La fase móvil utilizada fue Tolueno-AcOEt-Ác. acético glacial 90:10:1. A. CCF vista a 254 nm + 365 nm B. CCF vista con 254 nm. RL: raíz de L. porteri, AL: partes aéreas de L. porteri, RP: raíz de P. crispum, AP: partes aéreas de P. crispum, DIL: Diligustílida, Z: Z-ligustílida. B 1 2 3 4 5 6 A B RL AL RP AP DIL Z RL AL RP AP DIL Z 1 2 3 4 5 6 A 109 A partir de los extractos obtenidos de raíz y partes aéreas de plántulas germinadas in vitro de L. porteri y P. crispum de tres meses, se hizo una placa comparativa en CCF para establecer si la presencia o ausencia de Z-ligustílida es dependiente de la edad de la planta y/o su estado fisiológico. En la Figura 21 se muestra que en plántulas de tres meses de edad si está presente la Z-ligustílida en el extracto de raíces (RLJ). Este material se extrajo durante siete días en frascos viales de vidrio de 15 ml con una mezcla de CH2-Cl2-MeOH 1:1 (10 ml) en oscuridad. Posteriormente los extractos resultantes se concentraron por destilación en un rotaevaporador a una temperatura de 60°C al vacío. Al cabo de estos experimentos se obtuvieron: 1.6974 g del extracto de partes aéreas de P. crispum; 0.3809 g del extracto de raíz de P. crispum; 0.2658 g de extracto de partes aéreas de L. porteri y 0.1717 g de extracto de raíz de L. porteri. Estos 4 extractos se obtuvieron de plantas germinadas en invernadero. 110 Figura 21. Análisis de los extractos de plántulas germinadas in vitro y plantas germinadas en invernadero de L. porteri y P. crispum. A. CCF vista a 254 + 365 nm. B. CCF vista a 254 nm. ALJ: partes aéreas de L. porteri jóvenes; RLJ: raíz de L. porteri jóvenes; APJ: partes aéreas de P. crispum jóvenes; RPJ: raíz de P. crispum jóvenes; AL: partes aéreas de L. porteri; RL: raíz de L. porteri; AP: partes aéreas de P. crispum; RP: raíz de P. crispum; Z: Z-ligustílida. El análisis por CCF de los 24 callos obtenidos a partir de distintos explantes de L. porteri reveló que la Z-ligustílida no estuvo presente en ellos. Sin embargo, en algunos de ellos se encontró la presencia de 4-vinilguayacol. Es posible que las condiciones in vitro y el estado fisiológico del callo no hayan sido los adecuados para inducir la biosíntesis de Z-ligustílida. Stahl-Biskup y Wichtmann (1991) mencionan que la ausencia de ftálidas en Levisticum officinale se debe a que la raíz de esta planta necesita tener A B ALJ RLJ APJ RPJ AL RL AP RP Z ALJ RLJ APJ RPJ AL RL AP RP Z 111 ductos resiníferos desarrollados para su producción, y debido a la falta de diferenciación de los callos, no se exprese la biosíntesis de Z-ligustílida. Adicional a este reporte, es posible suponer que algún factor ambiental pudiera tener efecto en la estimulación de a biosíntesis de Z-ligustílida. En la Figura 22 se muestra el análisis por CCF de algunos extractos de callos de L. porteri. Figura 22. Análisis por CCF de extractos de callo de L. porteri. A. CCF vista a 254 nm. B. CCF vista a 254 + 365 nm. A: Tallo. B: Tallo. C: Pecíolo. F: Raíz. L: Pecíolo. P: Cotiledón. Z: Z-ligustílida. Dil: Diligustílida. A B C F L P Z DIL A B C F L P Z DIL A B B 112 Cromatografía en columna abierta En la literatura no existen estudios fitoquímicos sobre las partes aéreas de L. porteri o alguna otra especie del mismo género, por lo que es de gran interés determinar la presencia o ausencia de Z-ligustílida o alguna otra ftálida en esta parte de la planta. De la separación del extracto de partes aéreas recolectadas en campo, se obtuvieron 219 alícuotas (Tabla 21) y un total de 30 fracciones que se verificaron en CCF. Se analizaron las siguientes fracciones por CG-EM: 1, 36, 40 (sólida y aguas madres), 56, 106, 131, 148 y 172. Tabla 21. Fraccionamiento del extracto de partes aéreas de L. porteri. Eluyente Proporción (100%) Alícuotas recolectadas Fracciones combinadas Hexano 100 1-26 1 2 3 4 5 6 7-35 Hexano – AcOEt 90:10 27-65 36-39 40-53 54-55 56-73 Hexano – AcOEt 80:20 66-95 74-81 82-94 95-105 Hexano – AcOEt 70:30 96-134 Hexano – AcOEt 60:40 135-149 106-130 131-147 Hexano – AcOEt 50:50 150-172 148-160 161-171 172-182 Hexano – AcOEt 75:25 173-185 183-190 AcOEt 100 186-218 191-199 200-208 209-210 211-212 213-216 217 218 MeOH 100 219 219 Análisis de los extractos por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG- EM) Se analizaron los extractos de callos de raíz (32 mg, 2,4-D/BA, 3:1 ), callo de cotiledón (28 mg, 2,4- D/BA, 3:1 ), callo de semillas (7 mg, GA3, 10 mg/L), callo de hoja (228.5 mg, 2,4-D/BA, 4:1), callo de 113 raíz (50.2 mg, ANA/BA, 1:1), callo de pecíolo (270.5 mg, 2,4-D/BA 4:0.5), callo de tallo (49 mg, 2,4- D/BA 0.1:3), callo de pecíolo (136 mg, 2,4-D/BA 0.1:1), callo de raíz (53 mg, ANA/BA 4:2), callo de pecíolo (52 mg, 2,4-D/BA 0.1:3), el extracto de semillas, partes aéreas y raíz de L. porteri y el extracto de raíz de P. crispum por CG-EM. En la Tabla 22 se muestran los componentes encontrados en los callos de L. porteri, en la Tabla 23 los componentes encontrados en el extracto de semillas de L. porteri, en la Tabla 24 los componentes encontrados en las fracciones de las partes aéreas de L. porteri, en la Tabla 25 los componentes encontrados en la raíz de L. porteri y en la Tabla 26 los componentes encontrados en la raíz de P. crispum. Todos éstos fueron analizados por CG-EM y en el Apéndice II se incluyen los cromatogramas. Tabla 22. Componentes de los extractos de callos de L. porteri. Componente T.R. (seg.) % No. Espectro Raíz Z-2-Heptenal 197.84 16.08 1 4-Vinilguayacol 390.44 3.90 2 β-Hidroxipropiovanillona 497.04 2.12 3 Ácido n-hexadecanóico 614.49 55.87 4 Octadecanoato de metilo 652.94 0.82 5 2,3-dihidroxi-hexadecanoato de propilo 753.24 13.91 6 Semillas Benzotiazol 357.44 0.74 7 (3-Hidroxi-2,4,4-trimetil-pentil) 2-metilpropanoato 410.69 8.52 8 Hexadecanol 583.54 8.00 9 Ácido n-hexadecanóico 612.74 45.88 10 Octadecanoato de metilo 653.14 2.64 11 Ácido 9-hexadecanóico 661.74 34.19 12 Cotiledón 4-Metoxicinamato 708.09 100 13 Hoja Cefalotaxina 123.25 11.48 14 Acetovanillona 324.25 2.65 15 Ácido 2-(2-etilhexoxicarbonil) benzóico 636.45 22.50 16 Neurosporaxanthina 814.55 3.15 17 Raíz 5-Metil-2-furancarboxialdehído 107.14 8.57 18 5-Hidroximetil-2-furancarboxialdehído 226.84 85.04 19 7-Acetiloxi-15,16-epoxi-,metil éster- ácido kauran-18-óico 286.04 0.43 20 Acetovanillona 324.94 3.17 21 Ácido n-hexadecanóico 484.04 2.10 22 4,4a,5,6,7,8-Hexahidro-1-metoxi-2(3H)-naftalenona 500.54 0.65 23 Pecíolo 4-Vinilguayacol 292.25 46.92 24 Ácido n-hexadecanóico 523.85 45.38 25 Escalol 619.85 7.69 26 Tallo 5-Acetoximetil-pirrolidona 162.34 3.10 27 Timol 192.84 0.06 28 (E, E)-2,4-decadienal 193.64 3.65 29 4-Vinilguayacol 199.04 1.90 30 Apiol 279.04 0.53 31 3-Butilideneftálida 292.74 0.82 32 Metil 3,5-dioxo-2,6,7,8-tetrahidro-1H-pirrolizina-2-carboxilato 295.15 1.10 33 2-(2-Metilprop-2-enil)-ciclohex-2-en-1-ona 305.84 1.86 34 2-Metoxiprop-2-enilbenceno 306.34 7.84 35 Ácido n-hexadecanóico 353.24 10.65 36 14,15-epoxi-3,11-dihidroxi-bufa-20,22-dienólida 358.24 0.18 37 Falcarinol 369.34 11.56 38 114 Componente T.R. (seg.) % No. Espectro (11E, 13Z)-octadeca-1,11,13-trieno 387.04 9.25 39 Dodeca-5,7-diín-1,12-diol 400.44 39.39 40 Ácido 6-etenil-2,4,5,6,7,7a-hexahidro-7a-hidroxi-3,6-dimetil-metilen- 2-Oxo-5-benzofuranacético 415.34 3.77 41 Ácido 2-(2-etilhexoxicarbonil) benzóico 456.44 2.75 42 Estigmasterol 582.24 0.39 43 22,23-Dihidro-estigmasterol 598.04 1.21 44 Pecíolo (E, E)-2,4-heptadienal 103.44 0.41 45 4-Vinilguayacol 198.94 0.17 46 (E, E)-2,4-decadienal 200.44 4.82 47 2-Hidroxi-3-metilbenzaldehído 236.84 0.29 48 Apiol 279.34 21.05 49 3-Butilideneftálida 292.54 0.99 50 Hexadecanal 300.34 0.29 51 2-(2-metilprop-2-enil)-ciclohex-2-en-1-ona 305.84 0.74 52 Alcohol metil-cinámico 306.24 1.29 53 Eicosano 318.54 0.43 54 trans-Fitol 326.54 3.50 55 Metil tridecanoato 345.24 0.95 56 Ácido nonanóico 355.14 8.54 57 Ácido n-hexadecanóico 355.74 5.35 58 Palmitato de isopropilo 364.94 1.98 59 Falcarinol 369.24 3.01 60 trans-9-Hexadecen-1-ol 377.44 2.14 61 Fitol 382.14 0.08 62 Ácido 9-octadecinóico 389.34 11.43 63 9,12,15-Octadecatrienal 390.24 1.17 64 Ácido octadecanóico 393.54 3.47 65 Dodeca-5,7-diín-1,12-diol 400.54 7.67 66 1,3-Dihidroxipropan-2-il-hexadecanoato 453.94 6.44 67 Estigmasterol 582.74 10.64 68 22,23-Dihidro-estigmaterol 600.74 3.06 69 Raíz 4-Hidroxi-3-metilacetofenona 199.24 8.81 70 (E, E)-2,4-decadienal 200.74 5.40 71 (5-Etenil-1-oxido-1-azoniobiciclo[2.2.2]oct-7-il)-(6-metoxi-1-oxido- quinolin-4-il)metanol 237.54 0.91 72 Dihexil-bencen-1,2-dicarboxilato 352.54 13.45 73 Falcarinol 369.34 0.10 74 1,E-11,Z-13-octadecatrieno 386.74 20.60 75 Dodeca-5,7-diín-1,12,diol 400.24 9.39 76 Ácido 2-(2-etilhexoxicarbonil) benzóico 456.34 3.88 77 β-Sitosterol 598.14 8.41 78 Pecíolo (E, E)-2,4-decadienal 200.64 0.88 79 Apiol 279.04 5.60 80 3-Butilideneftálida 292.64 0.26 81 Alcohol metil-cinámico 306.44 9.62 82 trans-9-Hexadecen-1-ol 336.64 0.03 83 Metil tridecanoato 345.44 0.27 84 Ácido n-hexadecanóico 353.94 11.65 85 9-endo-hidroxi-9-exo-vinilbiciclo(4,2,1)-nona-2,4-dieno 358.24 0.61 86 Falcarinol 369.44 12.91 87 trans-9-Hexadecen-1-ol 377.64 1.30 88 Metil-(9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dienoato 379.04 0.24 89 7-Hidroxi-3-metil-2,3-dihidroinden-1-ona 383.54 0.38 90 9,12-Octadecadienal 387.94 13.60 91 Ácido octadecanóico 392.54 0.41 92 Dodeca-5,7-diín-1,12,diol 400.74 27.01 93 1,3-Dihidroxipropan-2-il-hexadecanoato 453.74 1.25 94 Estigmasterol 582.54 4.57 95 22,23-Dihidro-estigmasterol 598.94 9.33 96 115 En los extractos de callos se detectaron fenilpropanoides como el 4-vinilguayacol, terpenoides como el α-espatulenol, ácidos grasos como el estigmasterol, aldehídos como el Z-2-heptenal, poliacetilenos como el falcarinol, el alcaloide cefalotaxina y el carotenoide neurosporaxantina. En los callos de tallo y pecíolo se detectó la presencia de la ftálida 3-butilideneftálida en los callos de pecíolo y tallo, ambos inducidos con la combinación 2,-4D/BA (0.1:3), pero no la Z-ligustílida. Aunque la diferenciación fisiológica y estructural de los callos fue nula, la biosíntesis de las ftálidas sí se expresó, y el hecho de que Z-ligustílida no se haya biosintetizado pudo deberse a la cantidad de muestra analizada o a la falta de algún inductor, ya que este compuesto se almacenan y se produce en canales o ductos resiníferos presentes en toda la planta. Estos resultados concuerdan parcialmente con los obtenidos por Smitt y cols. (1996) en cuyos trabajos con callos, células en suspensión, elicitación de cotiledones y raíces y transformación de raíces de Thapsia garganica no lograron obtener ni inducir la biosíntesis in vitro de tapsigarginas, sugiriendo que es necesaria la diferenciación celular para su producción. La 3-butilideneftálida tiene actividad acaricida contra larvas de Dermatophagoides farinae (6.77 µg/cm2) y adultos de D. pteronyssinus (6.46 µg/cm2) (Kwon y Ahn, 2002) e insecticida contra larvas de Drosophila melanogaster (0.94 µmol/ml) con una DL50 = 0.84 µg/adulto, siendo la ftálida más activa en comparación a Z-ligustílida y las furanocumarinas xantotoxina e isopimpinelina (Miyazawa et al., 2004). Estos resultados hacen a 3-butilideneftálida un compuesto insecticida de origen natural, biodegradable, no tóxico y que actúa a bajas concentraciones. Al-Abta y cols. (1979) obtuvieron a partir de callos diferenciados, con estructuras embrionarias en las fases globular y acorazonada, y de plantas intactas de Apium graveolens var. Lathom Blanching las ftálidas 3-isobutilidene-3a,4,5,6-tetrahidroftálida y 3-isobutilidene-3a,4-dihidroftálida identificadas por CG-EM. Este cultivo fue obtenido en medio MS sólido adicionado con 2,4-D (5 mg/L) y transferido a medio MS líquido sin reguladores de crecimiento, donde en este último se lograron obtener cantidades similares de las ftálidas a las de la planta intacta en la fase embrionaria de torpedo. Concluyeron que en esta etapa embrionaria y en etapas más avanzadas, los tejidos podrían tener una mayor capacidad para acumular o aumentar la capacidad bioquímica dada la diferenciación de tipos celulares específicos. Watts y cols. (1984) obtuvieron a partir de células en suspensión de Apium graveolens cultivadas en medio MS líquido adicionado con 2,4-D (0.5 mg/L) y Kn (0.6 mg/L), las ftálidas 3-n-butilftálida y sedanenólida. Observaron que al sustituir 2,4-D con 3,5-D, en cultivos iluminados y agregados se lograba una mayor síntesis de estos compuestos al igual que algunos terpenoides como el limoneno. Una de las hipótesis es que la producción de metabolitos secundarios en cultivos celulares no diferenciados puede lograrse modificando el patrón de crecimiento de éstos, por lo que Watts y cols. (1985) compararon la relación entre la diferenciación celular, la producción de metabolitos secundarios y el color verde de los cultivos en suspensión de Apium graveolens. Reportaron que la producción de las mismas ftálidas disminuyó cuando aumentaba la agregación celular y el color verde pero aumentaba la 116 del limoneno. A pesar de la agregación y el color verde, no observaron la formación de cloroplastos o diferenciación celular explicando el resultado por la transferencia del cultivo de 2,4-D a 3,5-D. Tabla 23. Componentes del extracto de semillas de L. porteri. Componente T.R. (seg.) % No. Espectro β-Cariofileno 420.05 34.59 97 Germacreno D 443.65 65.40 98 Tabla 24. Componentes de las fracciones del extracto de partes aéreas de L. porteri. Fracción Componente T.R. (seg.) % No. Espectro Timol 221.34 13.79 99 α-Copaeno 254.74 0.93 100 α-Bourboneno 256.64 0.96 101 Germacreno D 271.14 19.94 102 β-Bisaboleno 275.24 33.80 103 α-Calacoreno 282.24 5.94 104 Cadala-1(10),3,8-trieno 300.74 2.04 105 1 3-(4,8,12-trimetiltridecil) furano 335.14 22.56 106 Miristicina 460.64 12.76 107 36 Apiol 496.34 87.23 108 Elemicina 282.84 32.16 109 3-Hidroxi-7,8-dihidro-α-ionol 284.24 7.819 110 α-Espatulenol 288.24 48.88 111 α-Cadinol 298.74 7.67 112 6-Isopropenil-4,8a-dimetil-1,2,3,5,6,7,8,8a-octahidro-naftalen-2-ol 303.84 1.83 113 2-Butenal-2-metil-4-(2,6,6-trimetil-1-ciclohexen-1-il) 324.74 1.42 114 40 (sólido) 5,7,8-Trimetil-dihidrocumarina 330.14 0.20 115 α-Asarona 281.94 1.42 116 α-Espatulenol 289.64 7.73 117 Apiol 293.64 57.23 118 E-Butilideneftálida 302.14 6.35 119 (7R*8R)-biciclo(5,3,1)undec-1-en-8-ol,7-metil-4-(1-metiletilideno) 303.64 22.46 120 40 (aguas madres) 5,7,8-Trimetil-dihidrocumarina 329.84 1.61 121 Timol 144.05 53.48 122 Dihidroactinidiólida 246.65 2.38 123 2,5-Octadecadiinoato de metilo 260.05 31.99 124 56 Fitona 296.85 12.13 125 5-(2-Hidroxipropan-2-il)-2-metilciclohex-2-en-1,4-diol 106.45 0.99 126 2-Metil-5-hexen-3-ol 207.45 11.03 127 6-Metil-ciclohex-2-en-1-ol 261.65 3.14 128 6-Metoxi-4-(2-metoxipropan-2-il)-1-metil-ciclohexen 434.25 82.15 129 4,5-Dimetil-5-(2-metilprop-1-enil)-oxolan-2-ona 453.65 1.64 130 106 Oplopanona 538.45 1.024 131 131 Escoparona 326.05 100 132 α-Espatulenol 281.64 60.02 133 148 Fitol 302.24 39.97 134 117 Tabla 25. Componentes del extracto de raíz de L. porteri. Componente T.R. (seg.) % No. Espectro p-Cimeno 112.64 0.32 135 Sabineno 114.64 0.12 136 E-2-nonenal 154.04 1.47 137 4-Vinilguayacol 199.64 0.43 138 Anhídrido ftálico 201.34 7.47 139 4,7-Dihidroisobenzofuran-1,3-diona 211.34 22.02 140 Ácido 3-hidroxi-4-metoximandélico 224.24 0.16 141 2-Hidroxi-6-metil-benzaldehído 238.44 0.26 142 Carveol 257.84 1.61 143 Apiol 279.44 0.41 144 1,4-Benzenedicarboxaldehído 287.64 0.09 145 Cedran-8,13-diol 292.14 0.60 146 3-Butilideneftálida 293.94 20.85 147 trans-Bisaboleno 295.14 1.47 148 2-Metoxiprop-2-enilbenceno 305.74 3.58 149 Alcohol metil-cinámico 307.64 3.29 150 5,7,8-Trimetildihidrocumarina 310.14 6.73 151 3-Etilidenisobenzofuranona 315.14 0.61 152 β-Copaeno 315.14 0.97 153 Alcohol metil-cinámico 321.54 1.26 154 4-Hidroxi-2-metil-3-fenil-ciclopent-2-en-1-ona 322.04 0.23 155 Ácido ferúlico 341.24 1.67 156 7-Nitrotetralin-1-ona 341.74 0.65 157 Ácido n-hexadecanóico 355.04 8.10 158 1,E-11, Z-13-octadecatrieno 388.64 3.69 159 (7Z, 10Z, 13Z)-hexadeca-7,10,13-trienal 390.14 0.27 160 Bufogenina 396.94 3.39 161 Ácido 9-octadeciinóico 400.64 1.86 162 Dodeca-5,7-diín-1,12,diol 401.04 5.88 163 Estigmasterol 582.74 0.38 164 Tabla 26. Componentes del extracto de raíz de P. crispum. Componente T.R. (seg.) % No. Espectro 4-Vinilguayacol 292.04 1.16 165 Vanillina 328.24 0.002 166 cis-Bisaboleno 365.04 4.42 167 β-Sesquifelandreno 379.04 9.38 168 Elemicina 388.04 1.78 169 3-n-Butilftálida 423.64 0.72 170 Apiol 429.54 3.23 171 Apiol 434.44 23.51 172 Alcohol metil-cinámico 449.64 3.57 173 Coniferol 452.24 0.99 174 Psoraleno 478.94 2.62 175 Ácido dodecanóico 521.64 0.01 176 Ácido n-hexadecanóico 526.34 0.77 177 Falcarinol 545.74 17.56 178 3,6,7-Trimetoxi-isobenzofuran-13(H)-ona 553.84 4.99 179 Ácido octadecanóico 581.74 0.42 180 1,3-Dihidroxipropan-2-il-hexadecanoato 667.44 1.79 181 Ácido tetracosanóico 727.34 2.74 182 Escualeno 735.24 0.81 183 Estigmasterol 818.44 11.65 184 β-Sitosterol 829.94 7.78 185 118 El timol, el apiol, el α-espatulenol y la 5,7,8-trimetil-dihidrocumarina fueron los compuestos que se identificaron en distintas fracciones de las partes aéreas de L. porteri, por lo que se puede decir que éstas tienen una alta concentración de ellos. Estos compuestos, a su vez, tienen una distribución muy amplia en la familia Apiaceae así como en otras familias, al igual que el copaeno, el cariofileno, el germacreno D y el α-cadinol (Tabla 27). Éstos, son componentes típicos de los aceites esenciales con actividades biológicas muy amplias como biocidas, analgésicos, antiinflamatorios, antiespasmódicos, entre otras (Sedy y Koschier, 2003; Alali y Al-Lafi, 2003; Beer et al., 2007). El resto de compuestos incluyen ácidos grasos, aldehídos, monoterpenoides, sesquiterpenoides y fenilpropanoides, que también son compuestos característicos de aceites esenciales de algunas familias botánicas y la mayoría de ellos no han sido reportados para alguna especie de Ligusticum o alguna especie de la familia Apiaceae. La estructura de algunos de ellos se muestra en la Figura 23. Los compuestos identificados en los extractos de callos son muy distintos a los hallados en las partes aéreas de una planta adulta, excepto el 4-vinilguayacol. Aunque el estado fisiológico tiene consecuencias en cuanto a la biosíntesis de productos del metabolismo secundario, este compuesto es la evidencia de que sí se está expresando la ruta biosintética de este compuesto, a pesar de la nula diferenciación de los callos. El 4-vinilguayacol es un fenilpropanoide, los cuales tienen funciones de defensa en plantas y tienen un amplio espectro de actividad antimicrobiana (Dixon et al., 2002). También tienen potencial biotecnológico para la industria alimenticia como saborizantes (Tsujiyama y Ueno, 2008). El apiol y el 4-vinilguayacol se identificaron en la raíz de L. porteri y P. crispum. El apiol es un fenilpropanoide identificado principalmente en especies de la familia Apiaceae. Tiene actividad fitotóxica contra Lemna paucicostata (I50 = 80 µM) (Meepagala et al., 2005) y antifúngica contra Aspergillus parasiticus (IC50 = 0.24 µM) (Razzaghi-Abyaneh et al., 2007). En el extracto de raíz de P. crispum se identificaron compuestos que ya habían sido reportados como componentes de partes aéreas como el psoraleno (Beber et al., 1994), el β-felandreno (Karting et al., 1972) y de la raíz como el apiol (Lamarti et al., 1991) y el falcarinol (Nitz et al., 1990). Sin embargo, se detectaron dos ftálidas que no habían sido previamente reportadas, el 3-n-butilftálida y una ftálida desconocida, la 3,6,7-trimetoxi-isobenzofuran-13(H)-ona (Figura 19). La variación en los contenidos de aceites esenciales entre especies cultivadas y silvestres pertenecientes a la misma familia es muy notable. Aún siendo la misma especie, estas diferencias son visibles, como en el trabajo de Staniszewska y cols. (2005) donde analizaron el aceite esencial de Daucus carota sp. carota, una especie silvestre y Daucus carota sp. sativus, una especie cultivada. Encontraron una variación en los monoterpenoides y sesquiterpenoides de ambas plantas. En la especie silvestre hubo mayor presencia de monoterpenoides, pero no se detectaron los sesquiterpenos carotol, daucol y dauceno, componentes típicos en la composición química del aceite esencial obtenido de la especie cultivada. Por 119 el contrario, en el aceite esencial de la especie cultivada se identificaron altas concentraciones de sesquiterpenoides, siendo el carotol el componente mayoritario, y una baja concentración en monoterpenoides. Se observó una variación similar en la composición química de la raíz de L. porteri y P. crispum. Aunque se evidenció la presencia de compuestos en común como el apiol, el bisaboleno y el 4- vinilguayacol, en la raíz de L. porteri se identificaron 30 componentes distintos a diferencia de los 21 componentes encontrados en la raíz de P. crispum. Aunque estas dos especies no pertenezcan al mismo género, es evidente que L. porteri posee una composición química más compleja y numerosa de metabolitos secundarios. Es posible que por el hecho de ser una especie silvestre y estar adaptada a un solo hábitat, el cual es altamente específico, la composición química sea tan grande. Estos compuestos tienen actividad biológica contra diversos microorganismos y herbívoros, los cuales forman parte de su entorno, por lo que éstos podría decirse que, forman parte de su sistema de defensa. La composición química del extracto de raíz de P. crispum fue menos compleja y numerosa, ya que esta especie cultivada presenta un proceso de domesticación, que no ha tenido L. porteri. P. crispum está adaptada a un hábitat más uniforme, benigno y controlado. Es probable que la composición química de L. porteri cambie al volverse una especie cultivada, aunque la presencia de algunos compuestos en una especie y su ausencia en la otra especie, la presencia de ftálidas sigue siendo un factor común entre ellas que no ha sido alterado en ambas especies. Este es el primer trabajo que estudia la composición química de los metabolitos secundarios presentes en los extractos de L. porteri y el potencial biotecnológico de esta especie, por lo que hacen que L. porteri cobre un alto valor no sólo ecológico, sino cultural, social y económico. 120 Tabla 27. Distribución de algunos compuestos identificados en L. porteri en el género Ligusticum, la familia Apiaceae y otras familias botánicas. Componente Ligusticum Apiaceae Otras familias Referencia Z-2-heptenal - - Asteraceae, Fabaceae, Orchidaceae, Magnoliaceae, Pedaliaceae, Lamiaceae, Aquifoliaceae, Oleaceae, Araliaceae, Rosaceae, Liliaceae, Anacardiaceae Flamini et al., 2003; Han et al., 2006; Yuan et al., 2006; Han et al., 2006; Chen y Wang, 2005; Flamini et al., 2005; Yang et al., 2002; Campeol et al., 2003; Meng et al., 2001; Lee et al., 2000; Umano et al., 1999; Kurucu et al., 1993; Takeoka et al., 1990 4-Vinilguayacol L. porteri, L. chuanxiong Coriandrum sativum, C. sativum var. microcarpum, Angelica sinensis, A. gigas, A. acutiloba, A. pubescens, A. dahurica, Lomatium foeniculaceum spp. fimbriatum, L. nevadense, Cnidium officinale, Ferula asafoetida, Glehnia littoralis Solanaceae, Lamiaceae, Tiliaceae, Rutaceae, Ranunculaceae, Elaeagnaceae, Liliaceae, Aquifoliaceae, Liliaceae, Asteraceae, Geraniaceae, Elaeagnaceae Cégiéla-Carlioz et al., 2005; Zhang et al., 2007; Li et al., 2005; Senatore et al., 2007; Bi et al., 2007; Kumazawa et al., 2007; Zeng et al., 2007; Lu, 2007; Zhang et al., 2006; Lu et al., 2007; Lozano et al., 2007; Beauchamp et al., 2006; Kim et al., 2006; Choi et al., 2002; Takeoka, 2007; Kameoka et al., 1991; Li et al., 2007; Rosselli et al., 2007; Cho et al., 2007; Senatore et al., 2007; Bi et al., 2007; Dev et al., 2007; Beauchamp et al., 2007; Lu et al., 2007; Pyun y Shin, 2006; Huang et al., 2006; Senatore et al., 2007; Barra et al., 2006; Senatore et al., 2005; Zeng et al., 2007; Umano et al., 1999; Lu, 2007; Telci et al., 2006 β-Hidroxipropiovanillona - - Rubiaceae, Pinaceae Potterat y Hamburger, 2007; Andersson y Lundgren, 1988; Pawlus et al., 2005; Karonen et al., 2004 2,3-dihidroxi-hexadecanoato de propilo - - Theaceae Cao et al., 2007 Benzotiazol - - Fabaceae, Liliaceae, Vitaceae, Polypodiaceae, Arecaceae, Aquifoliaceae, Rosaceae, Theaceae Lane et al., 2004; Pyun y Shin, 2006; Karagiannis et al., 2000; Okuno et al., 1993; Meekijjaroenroj et al., 2007; Yang et al., 2002; Lee et al., 2000; Watanabe et al., 1988; Cao et al., 2007 Hexadecanol - - Ephedraceae, Araceae, Liliaceae, Araliaceae, Rosaceae, Asteraceae, Fabaceae, Theaceae, Apocynaceae, Rhamnaceae Kobaisy et al., 2005; Radusiene et al., 2007; Pyun y Shin, 2006; Tsukasa y Okutu, 1993; Kovzacevic y Ristic, 2007; Judzentiene, 2007; Tava et al., 2007; Cao et al., 2007; Lopes et al., 2005; Ghannadi et al., 2003 121 Compuesto Ligusticum Apiaceae Otras familias Referencia Octadecanoato de metilo - - Lamiaceae, Musaceae, Simaroubaceae, Cactaceae Gören et al., 2003; Meechaona et al., 2007; Tzakou et al., 2006; Zhao et al., 2003 Ácido 9-hexadecanóico - - Lamiaceae, Plumbaginaceae Gören et al., 2003; Wei et al., 2007 4-Metoxicinamato - - Rutaceae Ivanova et al., 2004 β-Cariofileno L. chuanxiong, L. scoticum, L. mutellina Apium graveolens, Lomatium dasycarpum, L. lucidum, L. macrocarpum, L. utriculatum, L. grayi, L. nevadense, L. dissectum var. dissectum, L. dissectum var. multifidum, L. grayi var. grayi, L. grayi var. depauperatum, L. grayi, L. foeniculaceum spp. fimbriatu, L. rigidum, Meum athamanticum, Petroselinum crispum, Cuminum cyminum, Pimpinella rupicola, P. anagodendron, P. acuminata, P. aurea, P. corymbosa, P. peregrina, P. puberula, P. cappadocica var. cappadocica, P. flabellifolia, Angelica archangelica, A. glauca, Anethum graveolens, Rhabdosciadium strausii, R. oligocarpum, R. petiolare, Pituranthos chloranthus spp. cossonianus, P. scoparius, Centella asiatica, Foeniculum vulgare, Tordylium trachycarpum, T. hasselquistiae, Ferulago angulata, Prangos turcica, Carum nigrum, Diplotaenia cachrydifolia, Daucus gingidium spp. gingidium, D. carota ssp. carota, D. carota ssp. sativus, Ferula szowitsiana, Artedia squamata, Kardenia dubia, Oenanthe crocata, Heracleum candolleanum, Seseli rigidum var. rigidum, S. buchtormense, Kitagawia baicalensis, Eryngium foetidum Rutaceae, Caryophyllaceae, Asteraceae, Lamiaceae, Araceae, Fabaceae, Zingiberaceae, Myrtaceae, Clusiaceae, Pinaceae, Burseraceae, Convolvulaceae, Pittosporaceae, Lauraceae, Cupressaceae, Boraginaceae, Valerianaceae, Piperaceae, Ebenaceae, Liliaceae, Arecaceae, Aquifoliaceae, Geraniaceae, Nymphaeaceae, Ranunculaceae, Oleaceae, Anacardiaceae, Lardizabalaceae, Apocynaceae, Rhamnaceae Fehr, 1981; Asuming et al., 2005; Tesso et al., 2006; MacLeod et al., 1985; Karting et al., 1972; Palá-Paúl et al., 2004; Wang et al., 2006; Velasco-Negueruela et al., 2005; Nivinskiene et al., 2007; Tapa et al., 2005; Dev et al., 2007; Beauchamp et al., 2006; Jirovetz et al., 2003; Tabanca et al., 2005; Tabanca et al., 2006; Yayli et al., 2006; Guo et al., 2006; Peng y Yang, 2005; Deng et al., 2004; Ogunwande et al., 2006; Guo et al., 2004; Sabulal et al., 2006; Fakhari et al., 2005; Wenqiang et al., 2007; Rosselli et al., 2007; Senatore et al., 2007; Dev et al., 2007; Zhang et al., 2007; Beauchamp et al., 2007; Dahia et al., 2007; Wu et al., 2006; Chowdhury et al., 2006; Mojab et al., 2007; He et al., 2007; Tian et al., 2006; Wang et al., 2008; Karim et al., 2007; Ozek et al., 2007; Matasyoh et al., 2007; Ashnagar et al., 2007; Kurkcuoglu et al., 2007; Brophy et al., 2007; Loizzo et al., 2007; Reza et al., 2007; Fellah et al., 2006; Yu y Guo, 2007; Chowdhury et al., 2005; Ozek et al., 2006; Baser et al., 2006; Dermirci et al., 2006; Sylvestre et al., 2007; Marie et al., 2007; John et al., 2007; Tabanca et al., 2007; Kovacevic et al., 2007; Nogueira et al., 2008; Butkiene et al., 2007; de Oliveira et al., 2007; Pavlovic et al., 2007; Melkani et al., 2006; Bozin et al., 2006; Singh et al., 2006; Bazgir et al., 2005; Bertoli et al., 2004; Pino et al., 2004; Orav et al., 2003; Díaz-Maroto et al., 2002; Hethelyi y Galambosi, 2002; Rao et al., 2000; Vernin et al., 1999; Brandt y Schultze, 1995; Radusiene et al., 2007; Flamini et al., 2007; Ren et al., 2002; Viswanathan et al., 2002; Pyun y Shin, 2006; Meekijjaroenroj et al., 2007; Araujo et al., 2007; Barra et al., 2006; Habibi et al., 2006; Javidnia et al., 2006; Myazawa et al., 2005; Bairamian et al., 2004; Beauchamp et al., 2004; Zeng et al., 2007; Campeol et al., 2003; Kurucu et al., 1993; Kawata et al., 2007; Tkachev et al., 2005; Bonsignore et al., 2004; John et al., 2007; Savikin-Fodulovic et al., 2006; Tkachev et al., 2006; Letchamo et al., 2005(c); Staniszewska et al., 2005; Cardozo et al., 2004; Lopes et al., 2005; Ghannadi et al., 2003 122 Compuesto Ligusticum Apiaceae Otras familias Referencia Timol - Hydrocotyle maritima, Centella asiatica, Glaucosciadium cordifolium, Petroselinum crispum, Meum athamanticum, Lomatium grayi, Apium graveolens var. secalium, Foeniculum vulgare, Ferulago angulata, Prangos turcica, Carum nigrum, Coriandrum sativum, Pituranthos scoparius, Daucus gingidium sp. gingidium Lamiaceae, Asteraceae, Ephedraceae, Salvadoraceae, Burseraceae, Myrtaceae, Rutaceae, Cupressaceae, Euphorbiaceae, Valerianaceae, Fabaceae, Arecaceae, Geraniaceae, Liliaceae Hudaib y Aburjai, 2007; Bendahou et al., 2008; Asakawa et al., 1982; Baser et al., 2000; Simon y Quinn, 1988; MacLeod et al., 1985; Palá-Paúl et al., 2004; Dev et al., 2007; Saleh et al., 1985, Guo et al., 2006; Kobaisy et al., 2005; Touafek et al., 2004; Alali y Al-Lafi, 2003; Rosselli et al., 2007; Senatore et al., 2007; Dev et al., 2007; Mojab et al., 2007; Suárez et al., 2007; Tian et al., 2006; Wang et al., 2008; Kurkcuoglu et al., 2007; Reza et al., 2007; Vagionas et al., 2007; Ozek et al., 2006; Dermirci et al., 2006; Tabanca et al., 2007; Butkiene et al., 2007; Simionatto et al., 2007; Pavlovic et al., 2007; Bozin et al., 2006; Singh et al., 2006; Lo Cantore et al., 2004; Bertoli et al., 2004; Vernin et al., 1999; Flamini et al., 2007; Meekijjaroenroj et al., 2007; Barra et al., 2006; Javidnia et al., 2006; Umano et al., 1999 α-Copaeno - Angelica glauca, A. archangelica, Cnidium officinale, Lomatium macrocarpum, L. utriculatum, L. nevadense, L. grayi var. depauperatum, L. foeniculaceum spp. fimbriatu, Petroselinum crispum, Cuminum cyminum, Pimpinella junoniae, P. rupicola, P. anagodendron, P. acuminata, P. aurea, P. corymbosa, P. peregrina, P. puberula, P. cappadocica var. cappadocica, P. isaurica, Rhabdosciadium strausii, R. oligocarpum, R. petiolare, Pituranthos chloranthus spp. cossonianus, P. scoparius, Foeniculum vulgare, Nigella sativa, Tordylium trachycarpum, T. hasselquistiae, Ferulago angulata, Prangos uloptera, P. turcica, Diplotaenia cachrydifolia, Daucus gingidium spp. gingidium, Ferula szowitsiana, Artedia squamata, Heracleum candolleanum, Seseli peucedanoides, S. rigidum var. rigidum, S. buchtormense, Eryngium bourgatii, Peucedanum zenkeri Rutaceae, Araceae, Fabaceae, Asteraceae, Lauraceae, Solanaceae, Zingiberaceae, Myrtaceae, Piperaceae, Magnoliaceae, Lamiaceae, Burseraceae, Clusiaceae, Pinaceae, Convolvulaceae, Pittosporaceae, Anacardiaceae, Cupressaceae, Vitaceae, Euphorbiaceae, Boraginaceae, Valerianaceae, Liliaceae, Arecaceae, Aquifoliaceae, Oleaceae, Lardizabalaceae Apocynaceae Kaul et al., 1996; Choi et al., 2002; Asuming et al., 2005; MacLeod et al., 1985; Karting et al., 1972; Wang et al., 2006; Wang et al., 2006; Velasco- Negueruela et al., 2003; Velasco-Negueruela et al., 2005; Nivinskiene et al., 2007; Dev et al., 2007; Beauchamp et al., 2006; Palá-Paúl et al., 2005; Tabanca et al., 2005; Tabanca et al., 2006; Deng et al., 2004; Ogunwande et al., 2006; Guo et al., 2004, Sanhaji et al., 2006; Huang et al., 2006; Sabulal et al., 2006; Fakhari et al., 2005; Wenqiang et al., 2007; Cardeal et al., 2006; Deng et al., 2003; Li et al., 2007; Rosselli et al., 2007; Dev et al., 2007; Beauchamp et al., 2007; Dahia et al., 2007; Mojab et al., 2007; Suárez et al., 2007; Jalali-Heravi et al., 2007; Tian et al., 2006; Karim et al., 2007; Ozek et al., 2007; Wang et al., 2008; Khin et al., 2007; Brophy et al., 2007; Loizzo et al., 2007; Reza et al., 2007; Nazemiyeh et al., 2007; Vagionas et al., 2007; Ozek et al., 2006; Baser et al., 2006; Dermirci et al., 2006; Sylvestre et al., 2007; Marie et al., 2007; John et al., 2007; Gardeli et al., 2008; Kovacevic et al., 2007; Nogueira et al., 2008; Butkiene et al., 2007; Ruberto et al., 2008; Simionatto et al., 2007; de Oliveira et al., 2007; Pavlovic et al., 2007; Melkani et al., 2006; Bozin et al., 2006; Bazgir et al., 2005; Raina et al., 2004; Bertoli et al., 2004; Díaz-Maroto et al., 2002; Vernin et al., 1999; Flamini et al., 2007; Pino et al., 2006; Pyun y Shin, 2006; Meekijjaroenroj et al., 2007; Huang et al., 2006; Liu et al., 2006; Araujo et al., 2007; Habibi et al., 2006; Javidnia et al., 2006; Campeol et al., 2003; Kawata et al., 2007; John et al., 2007; Bulatovic et al., 2006; Savikin-Fodulovic et al., 123 2006; Tkachev et al., 2006; Lopes et al., 2005; Menut et al., 1995 Compuesto Ligusticum Apiaceae Otras familias Referencia α-Bourboneno - Angelica glauca, Pimpinella aurea, P. corymbosa, P. peregrina, P. puberula, Lomatium nevadense, Nigella sativa, Cuminum cyminum, Tordylium trachycarpum, T. hasselquistiae, Prangos turcica, Rhabdosciadium microcalycinum, Smyrnium perfoliatum Piperaceae, Clusiaceae, Lamiaceae, Rutaceae Kaul et al., 1996; Tabanca et al., 2005; Cardeal et al., 2006; Beauchamp et al., 2007; Jalali-Heravi et al., 2007; Karim et al., 2007; Ozek et al., 2007; Kurkcuoglu et al., 2007; Brophy et al., 2007; Fellah et al., 2006; Yu y Guo, 2007; Chowdhury et al., 2005; Ozek et al., 2006; Baser et al., 2006; Dermirci et al., 2006; Molleken et al., 1998(a) Germacreno D L. chuanxiong, L. mutellina Angelica glauca, A. archangelica, A. glauca, Cnidium officinale, Meum athamanticum, Lomatium lucidum, L. macrocarpum, L. utriculatum, L. grayi, L. nevadense, L. grayi var. grayi, L. grayi var. depauperatum, L. grayi, L. foeniculaceum spp. fimbriatu, L. rigidum, Eryngium bourgatii, Pimpinella rupicola, P. anagodendron, P. aurea, P. corymbosa, P. peregrina, P. puberula, P. anisetum, P. cappadocica var. cappadocica, P. isaurica, Ferulago carduchorum, Rhabdosciadium strausii, Pituranthos chloranthus spp. cossonianus, P. scoparius, Centella asiatica, , Nigella sativa, Cuminum cyminum, Tordylium trachycarpum, T. hasselquistiae, Ferulago angulata, F. carduchorum, Prangos uloptera, P. turcica, Rhabdosciadium oligocarpum, R. petiolare, Carum nigrum, Diplotaenia cachrydifolia, Anethum graveolens, Apium graveolens, Petroselinum crispum, Daucus gingidium spp. gingidium, D. carota, D. carota spp. carota, D. carota spp. sativus, Ferula szowitsiana, Artedia squamata, Kadenia dubia, Seseli peucedanoides, S. rigidum var. rigidum, S. buchtormense, Chaerophyllum prescottii, Kitagawia baicalensis, Peucedanum zenkeri Rutaceae, Caryophyllaceae, Araceae, Fabaceae, Asteraceae, Lamiaceae, Piperaceae, Clusiaceae, Oleaceae, Pinaceae, Burseraceae, Convolvulaceae, Pittosporaceae, Anacardiaceae, Cupressaceae, Vitaceae, Boraginaceae, Valerianaceae, Lauraceae, Arecaceae, Geraniaceae, Apocynaceae, Rhamnaceae Kaul et al., 1996; Choi et al., 2002; Asuming et al., 2005; Wang et al., 2006; Velasco-Negueruela et al., 2005; Nivinskiene et al., 2007; Tapa et al., 2005; Dev et al., 2007; Beauchamp et al., 2006; Palá-Paúl et al., 2005; Tabanca et al., 2005; Tabanca et al., 2006; Yayli et al., 2006; Samiee et al., 2006; Deng et al., 2004; Ogunwande et al., 2006; Guo et al., 2004; Fakhari et al., 2005; Touafek et al., 2004; Cardeal et al., 2006; Dev et al., 2007; Zhang et al., 2007; Beauchamp et al., 2007; Dahia et al., 2007; Chowdhury et al., 2006; Jalali-Heravi et al., 2007; Karim et al., 2007; Ozek et al., 2007; Matasyoh et al., 2007; Yu y Fu, 2007; Brophy et al., 2007; Loizzo et al., 2007; Reza et al., 2007; Nazemiyeh et al., 2007; Fellah et al., 2006; Yu y Guo, 2007; Vagionas et al., 2007; Chowdhury et al., 2005; Ozek et al., 2006; Nik y Mirza, 2006; Baser et al., 2006; Zriria et al., 2007; Dermirci et al., 2006; Sylvestre et al., 2007; Marie et al., 2007; John et al., 2007; Gardeli et al., 2008; Tabanca et al., 2007; Nogueira et al., 2008; Butkiene et al., 2007; Ruberto et al., 2008; de Oliveira et al., 2007; Pavlovic et al., 2007; Bozin et al., 2006; Singh et al., 2006; Bazgir et al., 2005; Pino et al., 2004; Orav et al., 2003; Vernin et al., 1999; Brandt y Schultze, 1995; Radusiene et al., 2007; Flamini et al., 2007: Barra et al., 2006; Pino et al., 2006; Meekijjaroenroj et al., 2007; Andrade et al., 2006; Rossi et al., 2007; Habibi et al., 2006; Javidnia et al., 2006; Samiee et al., 2006; Beauchamp et al., 2004; Tkachev et al., 2005; Bulatovic et al., 2006; Savikin- Fodulovic et al., 2006, Tkachev et al., 2006; Letchamo et al., 2005(a); Letchamo et al., 2005(b); Staniszewska et al., 2005; Lopes et al., 2005; Ghannadi et al., 2003; Menut et al., 1995 124 Compuesto Ligusticum Apiaceae Otras familias Referencia β-Bisaboleno L. mutellina Angelica glauca, Pimpinella aurea, P. corymbosa, P. peregrina, P. puberula, Rhabdosciadium strausii, Lomatium nevadense, L. dissectum var. dissectum, L. dissectum var. multifidum, Prangos uloptera, Eryngium corniculatum, Carum nigrum, Anethum graveolens, Apium graveolens, Petroselinum crispum, Daucus carota, D. carota sp. carota, D. carota sp. sativus, Seseli buchtormense, Kitagawia baicalensis, Molopospermum peloponnesiacum Zingiberaceae, Piperaceae, Lamiaceae, Clusiaceae, Cupressaceae, Ebenaceae, Araceae, Nymphaeaceae, Anacardiaceae, Solanaceae, Rosaceae Kaul et al., 1996; Tabanca et al., 2005; Sabulal et al., 2006; Cardeal et al., 2006; Rui-Zhen et al., 2007; Beauchamp et al., 2007; Karim et al., 2007; Nazemiyeh et al., 2007; Pala-Paul et al., 2007; Butkiene et al., 2007; Bozin et al., 2006; Singh et al., 2006; Orav et al., 2003; Díaz-Maroto et al., 2002; Brandt y Schultze, 1995; Viswanathan et al., 2002; Raina et al., 2003; Rossi et al., 2007; Myazawa et al., 2005; Bairamian et al., 2004; Kurucu et al., 1993; Cardeal et al., 2006; Tkachev et al., 2006; Letchamo et al., 2005(b); Staniszewska et al., 2005; Vollmann y Schultze, 1995; Kubeczka y Ullmann, 1981 α-Calacoreno - Eryngium bourgatii, E. corniculatum Pimpinella corymbosa, P. cappadocica var. cappadocica, Rhabdosciadium oligocarpum, R. petiolare, Pituranthos scoparius, Lomatium rigidum Ephedraceae, Asteraceae, Lamiaceae, Clusiaceae, Cupressaceae, Vitaceae, Euphorbiaceae, Boraginaceae, Valerianaceae, Araceae, Lauraceae, Liliaceae, Arecaceae, Nymphaeaceae, Lardizabalaceae, Solanaceae Palá-Paúl et al., 2005; Tabanca et al., 2005; Tabanca et al., 2006; Kobaisy et al., 2005; Vagionas et al., 2007; Baser et al., 2006; Dermirci et al., 2006; Pala- Paul et al., 2007; Nogueira et al., 2008; Butkiene et al., 2007; Ruberto et al., 2008; Simionatto et al., 2007; de Oliveira et al., 2007; Pavlovic et al., 2007; Vernin et al., 1999; Radusiene et al., 2007; Pino et al., 2006; Raina et al., 2003; Pyun y Shin, 2006; Meekijjaroenroj et al., 2007; Facey et al., 2006; Liu et al., 2006; Senatore et al., 2005; Habibi et al., 2006; Myazawa et al., 2005; Beauchamp et al., 2004; Kawata et al., 2007; Cardeal et al., 2006 Cadala-1(10),3,8-trieno - Angelica pubescens Lauraceae, Solanaceae, Arecaceae, Lamiaceae, Araceae, Cupressaceae Song et al., 2004; Sanhaji et al., 2006; Huang et al., 2006; Meekijjaroenroj et al., 2007; Facey et al., 2006; Zhang et al., 2007; Huang et al., 2006; Liu et al., 2006 3-(4,8,12-trimetiltridecil) furano - - Rubiaceae Huang et al., 2007 Miristicina L. porteri, L. mutellina, L. scoticum Petroselinum crispum, Apium graveolens, Apium graveolens var. secalium, Pituranthos chloranthus spp. cossonianus, P. scoparius, Centella asiatica, Foeniculum vulgare, Nigella sativa, Cuminum cyminum, Pimpinella acuminata, Carum nigrum, C. carvi, Anethum graveolens, Sium latifolium, Coriandrum sativum var. vulgare, C. sativum var. microcarpum, Chaerophyllum prescottii, Peucedanum zenkeri, Pastinaca sativa Aristolochiaceae, Lamiaceae, Piperaceae, Ranunculaceae Cégiéla-Carlioz et al., 2005; MacLeod et al., 1985; Karting et al., 1972; MacLeod et al., 1988; Passreiter et al., 2005; Saleh et al., 1985; Nguyen et al., 2007, Dahia et al., 2007; Chowdhury et al., 2006; Mojab et al., 2007; Jalali-Heravi et al., 2007; Melkani et al., 2006; Bozin et al., 2006; Singh et al., 2006; Tewari y Mathela, 2003; Pino et al., 2004; Orav et al., 2003; Díaz-Maroto et al., 2002; Hethelyi y Galambosi, 2002; Vernin et al., 1999; Brandt y Schultze, 1995; Saiki et al., 1967; Zeng et al., 2007; Letchamo et al., 2005(a); Telci et al., 2006; Letchamo et al., 2005(b); Menut et al., 1995; Zangerl et al., 1997 125 Compuesto Ligusticum Apiaceae Otras familias Referencia Apiol L. hultenii, L. scoticum, L. mutellina Petroselinum crispum, Apium graveolens var. secalium, A. graveolens, Pituranthos chloranthus spp. cossonianus, P. scoparius, Centella asiatica, Foeniculum vulgare, Nigella sativa, Cuminum cyminum, Prangos turcica, Rhabdosciadium microcalycinum, Pimpinella acuminata, Carum nigrum, C. carvi, C. bulbocastanum, Diplotaenia cachrydifolia, Coriandrum sativum, Peucedanum decursivum, Anethum graveolens Ephedraceae, Aristolochiaceae, Lamiaceae, Burseraceae, Fabaceae, Piperaceae, Ranunculaceae MacLeod et al., 1985; Karting et al., 1972; Saleh et al., 1985; Kobaisy et al., 2005; Meepagala et al., 2005; Nguyen et al., 2007, Dahia et al., 2007; Wu et al., 2006; Chowdhury et al., 2006; Mojab et al., 2007; Suárez et al., 2007; Jalali-Heravi et al., 2007; Ozek et al., 2006; Baser et al., 2006; Melkani et al., 2006; Bozin et al., 2006; Singh et al., 2006; Bazgir et al., 2005; Raina et al., 2004; Lo Cantore et al., 2004; Lan et al., 2004; Tewari y Mathela, 2003; Bertoli et al., 2004; Pino et al., 2004; Orav et al., 2003; Díaz- Maroto et al., 2002; Rao et al., 2000; Vernin et al., 1999; Brandt y Schultze, 1995: Yang et al., 2005 Elemicina L. porteri, L. scoticum, L. mutellina Petroselinum crispum, Apium graveolens var. secalium, A. graveolens, Pimpinella isaurica, Pituranthos chloranthus spp. cossonianus, P. scoparius, Nigella sativa, Cuminum cyminum, Diplotaenia cachrydifolia, Carum carvi, C. bulbocastanum, Anethum graveolens, Daucus gingidium spp. gingidium, D. carota, Peucedanum officinale, Smyrnium olusatrum Burseraceae, Lauraceae, Piperaceae, Clusiaceae, Aristolochiaceae, Araceae, Asteraceae, Rutaceae, Ranunculaceae Cégiéla-Carlioz et al., 2005; MacLeod et al., ; Tabanca et al., 2006; Dahia et al., 2007; Suárez et al., 2007; Jalali-Heravi et al., 2007; Kovacevic et al., 2007; Bazgir et al., 2005; Tewari y Mathela, 2003; Pino et al., 2004; Orav et al., 2003; Hethelyi y Galambosi, 2002; Vernin et al., 1999; Brandt y Schultze, 1995; Karim et al., 2007; Flamini et al., 2007; Saiki et al., 1967; Raina et al., 2003; Kowalski et al., 2007; Andrade et al., 2006; Rossi et al., 2007; Jaimand et al., 2006; Merle et al., 2006; Ramanoelina et al., 2006; Zeng et al., 2007; Molleken et al., 1998(b) α-Cadinol L. marginatum Meum athamanticum, Angelica archangelica, Lomatium foeniculaceum spp. fimbriatu, L. nevadense, L. rigidum, Pimpinella corymbosa, P. cappadocica var. cappadocica, Rhabdosciadium strausii, Pituranthos chloranthus spp. cossonianus, P. scoparius, Centella asiatica, Prangos turcica, Rhabdosciadium oligocarpum, Carum carvi, C. bulbocastanum, Peucedanum officinale, P. zenkeri, Ferulago angulata, Seseli buchtormense, Smyrnium perfoliatum Asteraceae, Zingiberaceae, Lamiaceae, Lauraceae, Clusiaceae, Oleaceae, Rutaceae, Burseraceae, Convolvulaceae, Pittosporaceae, Anacardiaceae, Cupressaceae, Boraginaceae, Valerianaceae, Fabaceae, Piperaceae, Araceae, Nymphaeaceae, Ranunculaceae, Lardizabalaceae Tesso et al., 2006; Nivinskiene et al., 2007; Beauchamp et al., 2006; Tabanca et al., 2005; Tabanca et al., 2006; Guo et al., 2004; Sabulal et al., 2006; Fakhari et al., 2005; Rosselli et al., 2007; Beauchamp et al., 2007; Dahia et al., 2007; Chowdhury et al., 2006; Khin et al., 2007; Karim et al., 2007; Matasyoh et al., 2007; Yu y Fu, 2007; Kurkcuoglu et al., 2007; Brophy et al., 2007; Yu y Guo, 2007; Vagionas et al., 2007; Ozek et al., 2006; Nik y Mirza, 2006; Baser et al., 2006; Okoh et al., 2007; Zriria et al., 2007; Sylvestre et al., 2007; Marie et al., 2007; John et al., 2007; Gardeli et al., 2008; Tabanca et al., 2007; Kovacevic et al., 2007; Nogueira et al., 2008; Butkiene et al., 2007; de Oliveira et al., 2007; Pavlovic et al., 2007; Tewari y Mathela, 2003; Bertoli et al., 2004; Pino et al., 2004; Vernin et al., 1999; Radusiene et al., 2007; Pino et al., 2006; Raina et al., 2003; Facey et al., 2006; Liu et al., 2006; Andrade et al., 2006; Jaimand et al., 2006; Javidnia et al., 2006; Myazawa et al., 2005; Beauchamp et al., 2004; Zeng et al., 2007; Kawata et al., 2007; Tkachev et al., 2006; Thakuri et al., 2007; Menut et al., 1995; Molleken et al., 1998(a) 5,7,8-Trimetil-dihidrocumarina - Angelica sinensis - Ming-Jiang et al., 2005 126 Compuesto Ligusticum Apiaceae Otras familias Referencia Asarona L. mutellina Daucus gingidium spp. gingidium, D. carota Araceae, Ephedraceae, Lamiaceae, Clusiaceae, Rutaceae, Amaranthaceae, Tiliaceae, Ranunculaceae. Lauraceae, Aristolochiaceae, Polygonaceae, Ebenaceae, Rutaceae, Asteraceae, Nymphaeaceae Deng et al., 2004; Kobaisy et al., 2005; Lee et al., 2004; Li et al., 2007; Karim et al., 2007; Brandt y Schultze, 1995; Khan et al., 2007; Wei et al., 2005; Rashmi, 2007; Radusiene et al., 2007; Flamini et al., 2007; Fang et al., 2006: Yang et al., 2005: Pino et al., 2006; Saiki et al., 1967; Gao et al., 2002; Ren et al., 2002; Viswanathan et al., 2002; Wijaya et al., 2002; Raina et al., 2003; Kowalski et al., 2007; Rossi et al., 2007; Myazawa et al., 2005 E-butilideneftálida L. chuanxiong, L. mutellina Angelica sinensis, A. glauca, A. acutiloba, A. acutiloba var. sugiyamae, A. carmichaeli, Apium graveolens, A. graveolens var. rapaceum, Levisticum officinale, Lomatium dasycarpum, L. utriculatum, L. torreyi, Cnidium officinale, Meum athamanticum, Petroselinum crispum, P. crispum var. tuberosum, Glaucosciadium cordifolium - Yi et al., 2006; Lu et al., 2004; Lao et al., 2004; Kaul et al., 1996; Gijbels et al., 1985; Santos et al., 2005; Gijbels et al., 1982; Asuming et al., 2005; Lin et al., 2005 Dihidroactinidiólida - - Cyperaceae, Theaceae, Actinidiaceae, Asteraceae, Aquifoliaceae, Primulaceae, Rosaceae, Ranunculaceae, Lamiaceae, Geraniaceae, Orchidaceae, Hydrocharitaceae, Olacaceae, Tiliaceae, Verbenaceae Stevens y Merrill, 1981; Seigo et al., 1969; Zhao et al., 2006; Senatore et al., 2007; Araujo et al., 2007; Yuan y Yuan, 2007; Gong et al., 2006; Rosselli et al., 2007; Formisano et al., 2007; Barra et al., 2006; Formisano et al., 2007; Han et al., 2006; Bureau et al., 2006; Guan et al., 2006; Xian et al., 2006; Mevy et al., 2006; Wang y Tian, 2006; Al-Amier et al., 2005; Senatore et al., 2005 Oplopanona - Meum athamanticum, Peucedanum officinale, Lomatium rigidum Ephedraceae, Araliaceae; Zingiberaceae, Asteraceae, Cupressaceae Palá-Paúl et al., 2004; Kobaisy et al., 2005; Takeda et al., 1965; Tchuendem et al., 1999; Gutiérrez et al., 2001; Butkiene et al., 2007; Jaimand et al., 2006; Céspedes et al., 2006; 127 Compuesto Ligusticum Apiaceae Otras familias Referencia Escoparona - - Gentaniaceae, Ranunculaceae, Rutaceae, Malvaceae, Calycanthaceae, Asteraceae, Ulmaceae, Euphorbiaceae, Araliaceae, Orchidaceae Randrianarivelojosia et al., 2006; Beauchamp et al., 2004; Zheng et al., 2006; Shi et al., 2006; Silva et al., 2006; Xiao et al., 2005; Zhang y Kong, 2006; Céspedes et al., 2006; Wang et al., 2004; Huang et al., 2004; Lin et al., 2004; Wu et al., 2005; Lee et al., 2002; Triana et al., 2001; Canelon et al., 2005; Fan et al., 2001 α-Espatulenol L. chuanxiong Lomatium dasycarpum, L. lucidum, L. utriculatum, L. nevadense, L. foeniculaceum spp. fimbriatu, L. rigidum, Angelica archangelica, A. glauca, A. sinensis, Meum athamanticum, Eryngium bourgatii, E, glaciale, Pimpinella junoniae, P. aurea, P. corymbosa, P. cappadocica var. cappadocica, P. flabellifolia, P. isaurica, Rhabdosciadium strausii, R. petiolare, R. oligocarpum, Pituranthos chloranthus spp. cossonianus, P. scoparius, Nigella sativa, Cuminum cyminum, Tordylium trachycarpum, T. hasselquistiae, Ferulago angulata, Prangos uloptera, P. turcica, Carum nigrum, Daucus gingidium spp. gingidium, D. carota spp. carota, D. carota spp. sativus, Peucedanum officinale, Ferula szowitsiana, Seseli peucedanoides, S. rigidum var. rigidum, Smyrnium perfoliatum Rutaceae, Asteraceae, Fabaceae, Lauraceae, Piperaceae, Lamiaceae, Burseraceae, Myrtaceae, Apocynaceae, Clusiaceae, Anacardiaceae, Cupressaceae, Euphorbiaceae, Boraginaceae, Valerianaceae, Amaranthaceae, Araceae, Arecaceae, Geraniaceae, Nymphaeaceae, Apocynaceae, Rhamnaceae, Rosaceae Asuming et al., 2005; Velasco-Negueruela et al., 2003; Nivinskiene et al., 2007; Palá-Paúl et al., 2004; Tapa et al., 2005; Delazar et al., 2006; Wang et al., 2006; Beauchamp et al., 2006; Palá-Paúl et al., 2005(a); Paúl et al., 2005(b); Tabanca et al., 2006; Guo et al., 2006; Ogunwande et al., 2006; Song et al., 2004; Suárez et al., 2007; Senhaji et al., 2006; Fakhari et al., 2005; Cardeal et al., 2006; Li et al., 2007; Zhang et al., 2007; Beauchamp et al., 2007; Dahia et al., 2007; Jalali-Heravi et al., 2007; Tian et al., 2006; Chen et al., 2006; Khin et al., 2007; Karim et al., 2007; Ozek et al., 2007; Ashnagar et al., 2007; Kurkcuoglu et al., 2007; Brophy et al., 2007; Reza et al., 2007; Nazemiyeh et al., 2007; Vagionas et al., 2007; Ozek et al., 2006; Nik y Mirza, 2006; Baser et al., 2006; Gardeli et al., 2008; Radusiene et al., 2007; Tabanca et al., 2007; Kovacevic et al., 2007; Nogueira et al., 2008; Butkiene et al., 2007; Simionatto et al., 2007; de Oliveira et al., 2007; Pavlovic et al., 2007; Bozin et al., 2006; Singh et al., 2006; Bertoli et al., 2004; Vernin et al., 1999; Rashmi, 2007; Flamini et al., 2007; Ren et al., 2002; Raina et al., 2003; Meekijjaroenroj et al., 2007; Barra et al., 2006; Andrade et al., 2006; Jaimand et l., 2006; Habibi et al., 2006; Javidnia et al., 2006; Myazawa et al., 2005; Beauchamp et al., 2004; Bulatovic et al., 2006; Savikin-Fodulovic et al., 2006; Staniszewska et al., 2005; Lopes et al., 2005; Ghannadi et al., 2003; Vollmann y Schultze, 1995; Molleken et al., 1998(a) 128 Compuesto Ligusticum Apiaceae Otras familias Referencia Fitol - Tordylium trachycarpum, T. hasselquistiae, Smyrnium olusatrum Tiliaceae, Lauraceae, Lamiaceae, Solanaceae, Primulaceae, Ranunculaceae, Orchidaceae, Asteraceae, Verbenaceae, Aquifoliaceae, Fabaceae Fang et al., 2006; Pino et al., 2006; Ren et al., 2002; Huang et al., 2006; Yuan y Yuan, 2007; Senatore et al., 2007; Rosselli et al., 2007; Han et al., 2006; Guan et al., 2006; Al-Amier et al., 2005; Senatore et al., 2005; Yang et al., 2002; Tava et l., 2007; Ozek et al., 2007; Molleken et al., 1998(b) Acetovanillona - - Orchidaceae, Solanaceae, Rosaceae Pérez-Silva et al., 2006; Miguel y Barroso, 1994; Kokubun y Harborne, 1995 129 Z-2-heptenal 4-Vinilguayacol Timol 6-Isopropenil-4,8a-dimetil-1,2,3,5,6,7,8,8a-octahidro-naftalen-2-ol (7R*8R)-Biciclo(5,3,1)undec-1-en-8-ol,7-metil-4-(1-metiletilideno) Apiol Ácido n-hexadecanóico Figura 23. Estructuras químicas de algunos compuestos identificados en extractos de L. porteri y P. crispum. 130 β-Bisaboleno Asarona Benzotiazol α-Bourboneno Cadala-1(10),3,8-trieno α-Cadinol α-Calacoreno Copaeno Dihidroactinidiólida 5,7,8-Trimetil-dihidrocumarina E-butilideneftálida Elemicina Figura 23. Continuación. 131 Germacreno D Escoparona α-Espatulenol Cariofileno β-Hidroxipropiovanillona Miristicina Oplopanona 3-(4,8,12-Trimetiltridecil) furano Ácido tetracosanóico Falcarinol Figura 23. Continuación. 132 Coniferol Vanillina β-Felandreno Estigmasterol β-Sitosterol Psoraleno 4-Metoxicinamato 3,6,7-trimetoxi-isobenzofuran-13(H)-ona Figura 23. Continuación. 133 Acetovanillona Escalol 2-Metil-5-hexen-3-ol 3-Butilideneftálida Ácido ferúlico Alcohol metil cinámico Carveol p-Cimeno Figura 23. Continuación. 134 Pruebas preliminares de Ligusticum porteri Viabilidad de semillas La técnica de tinción con tetrazolio (TTZ) reveló que sólo el 50% de las semillas de los lotes 1 y 2 eran viables. En el lote 3 hubo 80% de viabilidad, en el lote 4 solo 60% y en el lote 5 un 100% de viabilidad. En el caso de las semillas no viables, las semillas no tenían embrión o el embrión no estaba teñido y el endospermo si lo estaba o ninguno de los dos estaba teñido (Figura 24). Figura 24. Prueba de viabilidad con TTZ. A. Embrión no viable. B. Embrión viable. C. Embrión ausente. D. Embrión viable. E. Embrión no viable. Barra: 0.1 mm. Las semillas colocadas en una bolsa de organza en suelo de Chihuahua por un mes se contaminaron por hongos quedando inservibles (Figura 25). El crecimiento de hongos degradó por completo a las semillas, por lo que este método para inducir la germinación quedó descartado. A B D C E 135 Figura 25. Semillas de L. porteri almacenadas un mes en organza. Germinación in vitro Las semillas del lote 1 germinadas in vitro en medio MS-50 suplementado con GA3 (2 mg/L) tuvieron un porcentaje menor al 5%, por lo que este lote quedó descartado para experimentos posteriores. El porcentaje de germinación (MS-50 GA3 2 mg/L) del lote 2 fue de 5.5%, de un total de 181 semillas sembradas, solo 10 germinaron a las 6 semanas de incubación. En la siguiente semana germinaron 3 semillas; al término de la semana 9 habían germinado 9 semillas; en la semana 10 germinaron 6 semillas y en la semana 13 germinaron 8 semillas más (Gráfica 7). Estos resultados se correlacionan con el bajo porcentaje de viabilidad de las semillas obtenido con la tinción con TTZ. Al subcultivar las plántulas de los frascos de 9.5 cm de altura a frascos de 13 cm de altura con medio MS-50 sin GA3 comenzaron a elongarse rápidamente. Esto pudo deberse al cambio de la atmósfera dentro del frasco (Figura 26). Cuando algún cultivo está sometido a algún tipo de estrés, la tasa de biosíntesis del etileno aumenta y se acumula en el ambiente (George, 1993), por lo que es posible que ésta sea la causa de que las plántulas tenga un desarrollo lento y alterado. Las semillas del lote 2 del tratamiento de imbibición por 24 h en GA3 (5 mg/L) dieron resultados muy bajos, sólo germinó un 2% de las semillas. El resto de los tratamientos de imbibición por 24 h y 48 h en GA3 (10 mg/L) para inducir la germinación no dieron resultados. Cabe mencionar, que el 0.5% de las semillas sometidas a estos tratamientos dieron lugar a callo en lugar de una radícula. 136 Gráfica 7. Tasa de germinación in vitro de semillas de L. porteri. 137 Figura 26. Plántulas de L. porteri germinadas in vitro en medio MS-100. A. Plántulas de 5 semanas de edad de 6 cm de altura a partir del tallo con cotiledones largos de color verde oscuro y pecíolo color amarillo y algunas con hoja de color verde oscuro sin expandir. B. Plántulas de 5 semanas de edad de 6-8 cm de altura a partir del tallo con cotiledones de color verde oscuro y café claro, hoja verde sin expandir y pecíolo de 4 cm de largo de color café oscuro. C. Plántulas de 5 semanas de edad de 8-10 cm de altura con cotiledones de 8 cm de largo, de color verde oscuro, pecíolo de 6 cm de largo de color café oscuro y con hoja expandida. Barra: 2 cm. Germinación en suelo La germinación de los lotes de semillas 1 y 2 en las mezclas de suelo fue muy baja. En la Gráfica 8 se muestran los resultados donde se muestra que las semillas del lote 1 no germinaron. Sin embargo, las semillas del lote 2 germinaron a las 4 semanas y en 2 semanas comenzaron a secarse y posteriormente murieron. Se descartó el uso de estos dos lotes para experimentos posteriores. La germinación de semillas del lote 1 sembradas en tierra negra y tierra de hoja fue muy rápida, 7 días, sin embargo las plántulas de las mezclas de suelo se secaron y murieron. A B C Cotiledones Pecíolo Hipocótilo Raíz Cotiledón Testa Hoja Hojas Hoja Raíz 138 Gráfica 8. Germinación de semillas de L. porteri en mezclas de suelo. La germinación de semillas en suelo de Chihuahua fue más rápida, 4 semanas, sin necesidad de utilizar GA3 y sin estratificación para estimular la germinación (Figura 27). Los resultados mostrados en la Gráfica 9 corresponden a las 4 y 7 semanas de incubación. Los resultados de los tratamientos con semillas desinfectadas y suelo desinfectado demostraron mejores resultados de germinación en comparación al resto de los tratamientos por lo que en el resto de la investigación se siguió utilizando este tratamiento para la germinación en suelo. Entre las causas que propiciaron las bajas tasas de germinación estuvieron la falta de estratificación de las semillas, la edad de éstas, las condiciones de almacenamiento y principalmente la alta variabilidad fisiológica y genética de esta especie. 139 Gráfica 9. Germinación de semillas de L. porteri en suelo de Chihuahua. Figura 27. Plántulas de L. porteri germinadas in vitro en suelo de Chihuahua. A. Plántula de 4 semanas de edad de 6- 8 cm de altura a partir del tallo con cotiledones de 4-5 cm de largo de color verde claro u oscuro y pecíolo color verde claro, sin hoja. B. Plántula de 4 semanas de edad de 3 cm de altura a partir del tallo, los cotiledones aún sin separarse y de color verde claro a oscuro. C. Plántulas de 4 semanas de edad de 6-8 cm de alto a partir del tallo, los cotiledones de 4-5 cm de largo y de color verde claro. Algunas plántulas con hoja expandida. Barra en A y B = 0.5 cm; C = 1 cm. A B C Cotiledones Pecíolo 140 Inducción a callo Para evaluar la inducción a callo, de manera preliminar se utilizaron explantes de hoja, raíz-tallo y pecíolos de plántulas de L. porteri de 5 meses de edad. El tratamiento con ANA (2 mg/L) y BA (1 mg/L) no indujo callo en ninguno de los explantes estudiados. Sin embargo, el tratamiento con 2,4-D (2 mg/L) con BA (1 mg/L) con explantes de hoja dio lugar al aumento de volumen, callos y también necrosis del tejido. El explante de raíz-tallo dio lugar a la formación de una hoja. Estas respuestas se observaron a las dos semanas de inducción. El resto de los explantes no fueron inducidos a callo con esta combinación hormonal (Tabla 28). Tabla 28. Resultados de inducción a callo con distintos explantes a 50 días del inicio del cultivo. Explante ANA (2mg/L) y BA (1 mg/L) 2,4-D (2mg/L) y BA (1mg/L) Hojas - Aumento de volumen Formación de callo Necrosis Tallos - - Raíz - Formación de hoja (-) no hubo inducción Contaminación de explantes De un total de 289 frascos con un explante cada uno, se contaminaron 161 frascos, lo que corresponde a 55.7% de explantes contaminados, en su mayoría por hongos, por lo que se utilizaron fungicidas y bactericidas específicos para cultivos vegetales. De acuerdo a los resultados obtenidos por Hauptmann y cols (1985) y Shields y cols. (1984), utilizaron Benomilo (6.25-50 mg/L) para inhibir el crecimiento de Penicillium spp. en cultivos celulares en suspensión y protoplastos de Nicotiana tabacum, Datura innoxia, Daucus carota, Glycine canescens y Solanum tuberosum, utilizaron este fungicida de amplio espectro en la desinfección de explantes y como ingrediente en el medio sólido al igual que los antibióticos Gentamicina (20-40 mg/L) y Amoxicilina (100-500 mg/L) (Tabla 16) también reportados por Salehi y Khosh-Khui (1997) para la desinfección de Rosa chinensis. El Benomilo y el Tiabendazol (Tecto 60) pertenecen al grupo de los bencimidazoles y son fungicidas de amplio espectro sistémicos, esto es, que son traslocados por el sistema vascular de la 141 planta desde el punto de penetración a áreas de alta transpiración como hojas en desarrollo. El movimiento acropétalo tiende a concentrar el fungicida en las puntas y márgenes de las hojas, sitios de mayor susceptibilidad por el ataque de los hongos. Inhibe la mitosis al unirse a la tubulina, de esta manera impide la división celular evitando el crecimiento y desarrollo del hongo. Es un fungicida de amplio espectro para el control de Ascomicetos, Deuteromicetos y Basidiomicetos (McCarroll et al., 2002). La amoxicilina es un antibiótico semisintético derivado de la penicilina. Se trata de una amino penicilina. Actúa contra un amplio espectro de microorganismos, tanto Gram-positivos como Gram-negativos. Como las demás penicilinas, la amoxicilina impide en las bacterias la correcta formación de las paredes celulares. Concretamente inhibe la conexión entre las cadenas lineales de peptidoglicanos que forman la mayor parte de las paredes de los microorganismos Gram-positivos. Al impedir que la pared celular se construya correctamente, la amoxicilina ocasiona, en último término, la lisis de la bacteria y su muerte (Madigan et al., 2004). La gentamicina es un bactericida de espectro limitado a Gram-negativos. Debe alcanzar el citoplasma bacteriano para poder ejercer su acción a nivel ribosomal. Pasa la membrana externa a través de porinas por un proceso pasivo y no dependiente de energía. Se une a la subunidad 30S a nivel de las proteínas S12, S3, S4, S5, bloqueando el inicio de la síntesis proteica al fijar el complejo 30S-50S al codón de inicio del ARN mensajero acumulándose como complejos de inicio anormales impidiendo la elongación ocasiona la terminación prematura e induce la síntesis de proteínas anormales en la bacteria. Las proteínas anormales se insertan en la membrana alterando la permeabilidad y favoreciendo el ingreso de más antibiótico (Barranco, 1998; Madigan et al., 2004). Además de incluir estos antimicrobianos en el medio de cultivo, se observó que la desinfección previa de los explantes con NaOCl (10 ml/20 ml ADE) logró mejores resultados que los procedimientos con éstos antes de la siembra. El mejor tratamiento fue el 13, que incluye bactericidas, fungicidas y PPM, en el cual no hubo ningún tipo de contaminación, seguido por el 9 que incluye a los fungicidas (Tabla 16). Sin embargo, fueron muy agresivos con los explantes, se oxidaron rápidamente y murieron. Cultivo de células en suspensión Se seleccionaron los cultivos con callo de mayor volumen celular y que sobrevivieron a la contaminación por hongos y bacterias. En total fueron 15 callos y se sembraron en medio MS líquido al 100% de sales y sacarosa suplementado con 2,4-D (2mg/L) y BA (1mg/L). Sin embargo, estos 142 explantes murieron al ser transferidos al medio líquido, posiblemente por las concentraciones de sales y sacarosa, que fueron muy altas para los tejidos, por la falta de oxígeno o el cambio de un medio sólido a uno líquido de inmersión total e inclusive la agitación pudieron ser uno de los factores que tuvieron un efecto negativo sobre los cultivos celulares ensayados en este trabajo. 143 CONCLUSIONES • Las mejores condiciones para la germinación de semillas de L. porteri, en el presente estudio, fueron un tiempo de estratificación a 1°C de 45 a 90 días, su cultivo in vitro en medio MS sólido al 100%, 1.5% de sacarosa, sin reguladores de crecimiento y en oscuridad, así como en una mezcla de agrolita y tierra negra (1:1). • La adición de GA3 en el medio MS sólido no sustituyó la falta de estratificación de las semillas de L. porteri. • La germinación de las semillas de L. porteri fue asincrónica, muy heterogénea y altamente sensible al fotoperíodo e intensidad de luz. • Las semillas de P. crispum no requirieron estratificación para lograr su germinación. • La germinación de las semillas de P. crispum fue sincrónica, homogénea, insensible al fotoperíodo e intensidad de luz. • Las semillas de L. porteri presentaron una contaminación fúngica muy frecuente. • El método 14 (Tabla 16) demostró ser el mejor sistema de desinfección superficial para las semillas de L. porteri. • El método 12 (Tabla 16) demostró ser el mejor sistema de desinfección superficial de los explantes de plántulas germinadas en maceta de L. porteri. • Las semillas y explantes de P. crispum no sufrieron contaminación fúngica en ninguna etapa del cultivo. • Los explantes de raíz, cotiledón, hoja, tallo y pecíolo de L. porteri y P. crispum mostraron un alto potencial para la inducción a callo bajo las condiciones de cultivo ensayadas. • La combinación de reguladores de crecimiento donde se presentó el mayor número de explantes que dieron lugar a callo para L. porteri fue ANA/BA (1:1). • El tipo de explante que mostró un mayor número de respuestas de inducción a callo fue la raíz de L. porteri. • La combinación de reguladores de crecimiento donde se presentó el mayor número de explantes que dieron lugar a callo para P. crispum fueron ANA/BA (4:1) y 2,4-D/BA (4:1). • Los explantes que presentaron un mayor número de respuestas de inducción a callo fueron la hoja y pecíolo de P. crispum. 144 • El cultivo de células en suspensión de L. porteri que logró aumentar la biomasa fue con medio MS líquido adicionado con 2,4-D (4 mg/L). Los explantes que mayor proliferación tuvieron fueron la hoja y la raíz. • Los cultivos de células en suspensión de P. crispum con mayor proliferación fueron la raíz> hoja> cotiledón> y pecíolo en medio MS líquido adicionado con ANA/BA (4:1). • L. porteri requirió de altas concentraciones de reguladores de crecimiento para lograr la formación de callo, a diferencia de P. crispum, que requirió menores concentraciones. • Se logró establecer la cinética de crecimiento de los cultivos de células en suspensión de callos de los explantes de raíz, cotiledón hoja, tallo y pecíolo de L. porteri y P. crispum. • Se lograron establecer plantas en invernadero de L. porteri y P. Crispum a partir de semillas. • No se detectó la presencia de Z-ligustílida por CCF y CG-EM en los extractos de partes aéreas y semillas; ni en extractos de callos de raíz, semillas, cotiledón, hoja ni pecíolo de L. porteri. • Se detectó la presencia de la ftálida E-butilideneftálida en el extracto de partes aéreas de L. porteri. Este es el primer reporte de su presencia en plantas recolectadas de sus poblaciones naturales. • En el fraccionamiento del extracto de partes aéreas de L. porteri se identificaron por CG- EM 33 metabolitos secundarios, los cuales, no habían sido reportados para esta especie. • En el extracto de raíz de P. crispum se identificaron por CG-EM 19 metabolitos secundarios, entre ellos, dos ftálidas que no habían sido reportadas para esta especie: la 3- n-butilftálida y 3,6,7-trimetoxi-isobenzofuran-13(H)-ona. • En el extracto de callo de raíz de L. porteri se identificaron 6 componentes, dos de ellos, los fenilpropanoides 4-vinilguayacol y β-hidroxipropiovanillona. Esto indica el potencial de biosíntesis in vitro de esta estructura. • En el extracto de callo de semillas de L. porteri se identificaron 6 componentes distintos, en su mayoría ácidos grasos. • En el extracto de callo de cotiledón de L. porteri se identificó como componente único, el 4-metoxicinamato. Esto indica el potencial de biosíntesis in vitro de esta estructura. • En el extracto de callo de hoja de L. porteri se identificaron 4 componentes distintos, uno de ellos el alcaloide cefalotaxina y el caroteno neurosporaxantina. Este es el primer reporte de la presencia de estos compuestos en L. porteri. 145 • En el extracto de callo de pecíolo de L. porteri se identificaron 3 componentes distintos, uno de ellos el vinilguayacol. Esto indica el potencial de biosíntesis in vitro de esta estructura. • En los extractos de tallo y pecíolo de L. porteri se identificó la ftálida 3-butilideneftálida. Este es el primer reporte de su presencia en callos de esta especie. • Los callos de L. porteri demostraron un potencial de biosíntesis in vitro de metabolitos secundarios. • En el extracto de raíz de L. porteri, cultivada en invernadero, se identificó la ftálida 3- butilideneftálida. Este es el primer reporte de su presencia en la raíz de esta especie. • Se detectó por CCF la presencia de Z-ligustílida en la raíz de plántulas de 3 meses de edad germinadas in vitro de L. porteri. • Datos bibliográficos revelaron la presencia de Z-ligustílida en las raíces de Akebia quinata, Geum montanum y Nuphar pumilum, plantas filogenéticamente alejadas de la familia Apiaceae. • L. porteri y P. crispum representaron un buen modelo experimental para la comparación de resultados morfogénicos y fitoquímicos entre especies silvestres y cultivadas. • L. porteri demostró ser una especie silvestre altamente específica a su hábitat. En las mejores condiciones in vitro fue difícil mantenerla viva y en crecimiento. • P. crispum, por el contrario, demostró ser una especie con una adaptación más amplia, indicando su condición de planta cultivada. 146 PERSPECTIVAS Ligusticum porteri es una especie silvestre, que debido a que crece en el límite sur de su distribución geográfica en la Sierra Tarahumara en Chihuahua en México, tiene una producción alta de semillas pero la maduración de embriones es asincrónica e incluso algunos no maduran con tratamiento por frío. Si a esta situación se le añade el calentamiento global, el retraso de las lluvias en la Sierra Tarahumara, su sobrecolecta, el sobrepastoreo, la deforestación de su hábitat y el poco conocimiento que hay de esta especie, es posible que su estatus de riesgo deje de ser rara y se vuelva una especie amenazada o en peligro de extinción. Es urgente incluir a esta especie en alguna norma oficial mexicana que regule su recolecta como la NOM-004-RECNAT-1996 en conjunto con autoridades oficiales y científicas en México y Estados Unidos, que permitan su conservación con un uso sostenible de ésta. El uso sostenible de esta especie puede lograrse con su cultivo en invernaderos con la información generada en este trabajo, como la estratificación de las semillas, haciendo recolectas periódicas o tal vez destructivas de este material. También es necesario mantener cultivos in vitro de esta especie como banco de germoplasma y como recurso alternativo para la extracción del material vegetal. Ligusticum porteri demostró ser una especie con un alto potencial biotecnológico para la producción in vitro de metabolitos secundarios de interés comercial y farmacológico, por lo que es necesario establecer protocolos de germinación in vitro como ex vitro, la exploración de condiciones de cultivo con otros reguladores de crecimiento en distintas combinaciones, el establecimiento de cultivos en suspensión de células diferenciadas y callos y el monitoreo de los principales metabolitos secundarios en distintas etapas de crecimiento. Debido a la falta de conocimiento sobre la biología y ecología de esta especie silvestre, es urgente realizar estudios de: el ciclo de vida de L. porteri, polinizadores, plagas, el papel ecológico que juega en su hábitat, dinámica de poblaciones, genéticos, biología molecular, transformación genética, sobre la germinación de sus semillas, fitoquímicos en sus distintas etapas de crecimiento, sobre la ruta de biosíntesis de las ftálidas, hasta ahora desconocida, taxonomía bioquímica y farmacológicos. Esta especie medicinal es candidata para la elaboración de una monografía oficial donde se reconozca su uso en prescripciones médicas y el uso potencial de alguno de sus componentes en la medicina actual. 147 APÉNDICE I Prueba de viabilidad con TTZ de acuerdo a Schmidt (2000) El cloruro o bromuro de tetrazolio es una sal que se disuelve en agua antes de usarse. La sal así como la solución son sensibles a la luz por lo que deben guardarse en frascos ámbar o en oscuridad. Las soluciones deben guardarse en frío y no son reutilizables. El pH de la solución debe de estar entre 6.5 y 7.5. Se prepara una solución buffer con KH2PO4 y Na2HPO4. • En la solución 1 se disuelven 9.078 g de KH2PO4 en un litro de agua. • En la solución 2 se disuelven 9.472 g de Na2HPO4 o 11.876 g de Na2HPO4 x 2H2O en un litro de agua. Se mezclan dos partes de la solución 1 con tres partes de la solución 2. Si la solución no es clara se añaden unas gotas de alcohol. Para la mayoría de las especies se utiliza el 1% de la solución. Esta proporción se logra disolviendo 1 g de tetrazolio en un litro de agua. El procedimiento para evaluar la viabilidad de semillas es el siguiente: 1. Las semillas deben estar escarificadas o pinchadas para que la solución pueda penetrar el tejido. 2. Las semillas deben estar previamente humedecidas a 20°C de 3 a 48 h. 3. Las semillas deben estar completamente cubiertas de la solución. 4. Las semillas se incuban en la solución en oscuridad de 30 a 35°C de 1 a 24 h. 5. Después de transcurrido ese tiempo, las semillas se enjuagan con agua destilada y deben estar húmedas para su evaluación. 6. Se evalúa el teñido bajo el microscopio. 148 APÉNDICE II CROMATOGRAMAS 149 Cromatograma 1. Callo de raíz de L. porteri. 1 2 3 4 5 6 150 Cromatograma 2. Callo de semillas de L. porteri. 7 8 10 9 11 12 151 Cromatograma 3. Callo de cotiledón de L. porteri. 13 152 Cromatograma 4. Callo de hoja de L. porteri. 14 15 16 17 153 Cromatograma 5. Callo de raíz de L. porteri. 18 19 20 21 22 23 154 Cromatograma 6. Callo de pecíolo de L. porteri. 24 25 26 155 Cromatograma 7. Callo de tallo de L. porteri. 27 28 29 30 31 34 36 32 33 35 37 38 39 40 41 42 43 44 156 Cromatograma 8. Callo de pecíolo de L. porteri. 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 157 Cromatograma 9. Callo de raíz de L. porteri. 70 71 72 73 74 75 76 77 78 158 Cromatograma 10. Callo de pecíolo de L. porteri. 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 159 Cromatograma 11. Extracto de semillas de L. porteri. 98 97 160 Cromatograma 12. Fracción 1 del extracto de partes aéreas de L. porteri. 99 100 101 102 103 104 105 106 161 Cromatograma 13. Fracción 36 del extracto de partes aéreas de L. porteri. 107 108 162 Cromatograma 14. Fracción 40 sólida del extracto de partes aéreas de L. porteri. 109 111 112 113 114 115 110 163 Cromatograma 15. Fracción 40 aguas madres del extracto de partes aéreas de L. porteri. 116 117 118 119 120 121 164 Cromatograma 16. Fracción 56 del extracto de partes aéreas de L. porteri. 122 123 124 125 165 Cromatograma 17. Fracción 106 del extracto de partes aéreas de L. porteri. 126 127 128 129 130 131 166 Cromatograma 18. Fracción 131 del extracto de partes aéreas de L. porteri. 132 167 Cromatograma 19. Fracción 148 del extracto de partes aéreas de L. porteri. 133 134 168 Cromatograma 20. Extracto de raíz de L. porteri. 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 158 159 163 162 164 161 160 157- 156 154-155 169 Cromatograma 21. Extracto de raíz de P. crispum. 165 166 167 168 169 170 171 172 173 184 178 179 180 181 183 182 174 175 176-177 185 170 BIBLIOGRAFÍA  Agnihotri VK, Thappa RK, Meena B, Kapahi BK, Saxena RK, Qazi GN and Agarwal SG. 2004. Essential oil composition of aerial parts of Angelica glauca growing wild in North-West Himalaya (India). Phytochemistry 65: 2411-24113.  Aguilar A y Zolla C. 1982. Plantas tóxicas de México. IMSS. México. [Conium: pp 60-61].  Al-Abta S, Galpin IJ and Collin HA. 1979. Flavour compounds in tissue cultures of celery. Plant Science Letters 16: 129-134.  Alali F and Al-Lafi T. 2003. GC-MS analysis and bioactivity testing of the volatile oil from the leaves of the toothbrush tree Salvadora persica L. Natural Product Letters 17(3): 189-194  Al-Amier H, El-Hela AA, Al-Khadrawy FM and Craker LE. 2005. 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