UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE CIENCIAS DIVERSIDAD GENÉTICA Y DELIMITACIÓN DE ESPECIES DE USNEA (PARMELIACEAE, ASCOMYCETES LIQUENIZADOS) EN BOSQUES TEMPLADOS DE MÉXICO T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: BIÓLOGA P R E S E N T A : SANDRA LORENA AMENT VELÁSQUEZ DIRECTOR DE TESIS: DR. DANIEL IGNACIO PIÑERO DALMAU México, D.F. 2012 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. 1. Datos del alumno Ament Velásquez Sandra Lorena 51 71 51 71 Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Ciencias Biología 407047815 2. Datos del tutor Dr. Daniel Ignacio Piñero Dalmau 3. Datos del sinodal 1 Dra. María de los Ángeles Herrera Campos 4. Datos del sinodal 2 Dra. Hermelinda Margarita Villegas Ríos 5. Datos del sinodal 3 Dr. Luis Enrique Eguiarte Fruns 6. Datos del sinodal 4 Dr. Arturo Carlos II Becerra Bracho 7. Datos del trabajo escrito Diversidad genética y delimitación de especies de Usnea (Parmeliaceae, Ascomycetes liquenizados) en bosques templados de México 197 p. 2012 A Guille Agradecimientos Agradezco en primer lugar a mi papá, mi mamá y mi hermano por su apoyo incondicional, afecto y paciencia. Lo más duro del proceso de hacer la tesis fue no haber podido estar con ustedes. Quiero agradecer con fiesta y pompa a mi tutor, el Dr. Daniel I. Piñero, por ser desde el principio mi principal apoyo, maestro y amigo. Hay que admitir que nadie más me habría permitido elegir mi propio camino y explayarme tan auténticamente como lo hizo Daniel. De igual forma, quiero agradecerle a la Dra. María de los Ángeles Herrera Campos por todo su tiempo, esfuerzo y emoción. Gracias por compartirme tu pasión y cariño. Aunque oficialmente (por razones administrativas) no figuras como mi cotutora, es obvio que lo eres y que esta tesis no habría sido posible sin ti. A la Dra. Alejandra Vázquez Lobo, por su paciencia y dedicación para enseñarme a desenvolverme en el laboratorio y durante la primera parte de mi tesis. Gracias por demostrarme que todo se puede si le piensas lo suficiente. A todas las personas que me ayudaron en las colectas: Daniel, Laura, Eva, Lev, Ale Vázquez, Rodo, Marianita, mi mamá y Guille. También mi más sincero agradecimiento a las autoridades de Santiago Comaltepec, Oaxaca, por permitirme colectar en su territorio. A todas las personas del laboratorio de Genética y Ecología del Instituto de Ecología, que siempre estuvieron dispuestos a auxiliarme en el laboratorio y en los análisis. También por su ocasional opinión, que me resultó muy valiosa. A Laura, que ha estado invariablemente dispuesta a echarle la mano a quien lo necesite (nuestro Kapongo favorito) y que se tomó la molestia de escucharme y apreciarme en momentos críticos. A Lev y Rodo por su entusiasmo. Gracias por explicarme mil cosas. A Eva Eva Eva, mi cómplice taxónoma favorita, con quien encontré consuelo, apoyo y la más honesta empatía. A Juan Jo y a Julia por ayudarme de diferentes maneras. A Coral, a quien considero una hermana más que una amiga. Sin duda, sobreviví a todo esto porque siempre estuviste ahí. ¡Te quiero! A Marisa. Aunque casi no te vi, you’re my best buddy. Contigo descubrí a los hongos y las dos terminamos estudiándolos, a nuestra propia manera particular. A los miembros del Laboratorio de líquenes del Instituto de Biología, en particular a Ricardo y Alejandrina, quienes se tomaron el tiempo para orientarme en el mundo de los líquenes. A los participantes de Lichens connecting people! (http://www.facebook.com/groups/150880938305901/) por disiparme dudas y darme acceso a mucha literatura. A mis sinodales, por ser tan comprensivos, tolerantes y colaborativos. ¡Muchas gracias por leer este ladrillo de tesis y por sus comentarios! Agradezco profundamente a la Universidad Nacional Autónoma de México y a todos mis amigos y personas que participaron de una u otra forma durante mis estudios en la Facultad de Ciencias. Al Instituto de Ecología de la UNAM por financiar el proyecto y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por otorgarme la Beca de Ayudante de Investigador Nacional Nivel III durante el periodo de 2009 a 2012. Y finalmente, con mucha emoción, a Kiyoshi. De entre todas las miles de cosas que hiciste para ayudarme y hacerme feliz, al final lo que más agradezco es que pudiéramos crecer juntos a partir de lo simple y lo ordinario. ¡Miau! i Contenido Resumen....................................................................................................1 Abstract......................................................................................................3 1. Introducción...........................................................................................5 1.1. Delimitación de especies................................................................5 1.1.1. Biodiversidad y especies....................................................5 1.1.2. Implicaciones de los niveles de sexualidad para la delimitación de especies...............................................................................7 1.1.3. ¿Todo está en todas partes?...............................................9 1.1.4. Métodos para delimitar las especies...................................11 1.2. El grupo de estudio y el concepto de par de especies........................13 1.2.1. Líquenes........................................................................13 1.2.1.1. Definición, organización y clasificación...................13 1.2.1.2. Ecología y distribución.........................................14 1.2.1.3. Historia natural de la reproducción de ascomicetes liquenizados............................................................................15 1.2.1.4. Evolución de la sexualidad en Ascomycota.............17 1.2.1.5. Sistemática........................................................18 1.2.1.6. La hipótesis del Par de Especies............................19 1.2.2. El género Usnea Dill. ex Adans..........................................24 1.2.2.1. Ecología y distribución de Usnea...........................26 1.2.2.2. Reproducción en Usnea.......................................27 1.2.2.3. El concepto de especie en Usnea...........................28 2. Antecendentes......................................................................................29 2.1. Marcadores usados en sistemática molecular de hongos....................29 2.1.1. Los genes ribosomales.....................................................29 2.1.2. Los genes codificantes para proteínas: MCM7 y TSR1...........31 2.2. Estudios con datos moleculares en Usnea.......................................32 2.3. Delimitación de especies de Usnea en México..................................35 3. Objetivos..............................................................................................36 3.1. Objetivo general..........................................................................36 3.2. Objetivos particulares..................................................................36 4. Hipótesis...............................................................................................36 5. Materiales y métodos............................................................................37 5.1. Material biológico.........................................................................37 5.2. Caracteres morfológicos y anatómicos............................................38 5.2.1. Morfología......................................................................39 ii 5.2.2. Anatomía.......................................................................43 5.3. Caracteres químicos.....................................................................45 5.4. Extracción de ADN.......................................................................47 5.5. Protocolos de PCR y secuenciación.................................................47 5.6. Alineamiento, particiones y preparación de matrices de datos............50 5.7. Modelos de sustitución nucleotídica y distancias genéticas.................53 5.8. Delimitación de especies...............................................................53 5.8.1. Métodos para delimitar especies........................................53 5.8.2. Inferencia filogenética......................................................55 5.8.3. Redes de haplotipos........................................................56 5.8.4. Estimados de diversidad genética......................................56 5.8.5. Recombinación...............................................................57 5.8.6. Estructura poblacional y diferenciación...............................58 5.8.7. Demografía histórica........................................................59 6. Resultados............................................................................................60 6.1. Material biológico y datos moleculares............................................60 6.2. Alineamiento y matrices de datos..................................................61 6.3. Modelos de sustitución nucleotídica................................................65 6.4. Delimitación de especies...............................................................66 6.4.1. Resultados de análisis filogenéticos....................................66 6.4.2. Inferencia filogenética del género Usnea.............................66 6.4.3. Inferencia filogenética del subgénero Usnea en México y el mundo....................................................................................80 6.4.4. Inferencia filogenética de la sección Usnea.........................84 6.4.4.1. El agregado de Usnea florida en México.................85 6.4.5. Inferencia filogenética de la sección Ceratinae.....................90 6.4.5.1. Usnea ceratina y aliados......................................90 6.4.5.1.1. Estimados de diversidad genética, estructura y demografía histórica de U. ceratina.......................91 6.4.5.2. Usnea rubicunda y aliados...................................98 6.4.5.3. Agregado de Usnea fragilescens............................99 6.4.5.3.1. Estimados de diversidad genética y demografía histórica de U. cornuta s.l. y U. brasiliensis.........................................................102 7. Discusión............................................................................................107 7.1. Delimitación de especies y relaciones filogenéticas.........................107 7.1.1. El intrón tipo I en la inferencia filogenética y delimitación de especies del género Usnea.................................................................107 iii 7.1.2. Papel de los caracteres químicos y morfológicos en la delimitación de especies y relaciones evolutivas dentro del género Usnea.............................................................................................109 7.1.3. Definición de los subgéneros y las secciones dentro del género Usnea.............................................................................................109 7.1.4. Contribución a la delimitación de especies: casos selectos...111 7.1.4.1. Usnea baileyi s.l...............................................111 7.1.4.2. Usnea subfusca y aliados...................................114 7.1.4.3. Usnea subscabrosa y U. subrubicunda.................116 7.1.4.4. Usnea ceratina y aliados....................................120 7.1.4.5. Usnea rubicunda y U. erinacea............................122 7.1.4.6. Agregado de Usnea fragilescens..........................123 7.1.5. El concepto del par de especies en el género Usnea en México............................................................................................130 7.1.6. Diversidad genética y estructura poblacional en especies de Usnea mexicanas.............................................................................131 7.1.7. ¿Todas las usneas están en todas partes?.........................134 7.1.8. Diversidad del género Usnea en México............................135 8. Conclusiones.......................................................................................137 8.1. Conclusiones generales...............................................................107 8.1. Conclusiones taxonómicas...........................................................108 9. Perspectivas........................................................................................140 10. Referencias.......................................................................................141 Apéndice A: Datos de colecta..................................................................163 Apéndice B: Detalles de la alineación de los datos ribosomales usando estructura secundaria.............................................................................171 Apéndice C: Árbol del Intrón...................................................................174 Apéndice D: Ejemplares pertenecientes a especies no identificadas o inusuales................................................................................................176 Apéndice E: Datos de las secuencias de Genbank....................................191 iv Abreviaturas BAR – Barreras de aislamiento reproductivo BS – Bootstrap CGL – Concepto General de Linaje ETS – Espaciador transcrito externo del operón ribosomal (external transcribed spacer) ITS – Espaciador transcrito interno del operón ribosomal (internal transcribed spacer) LSU – Subunidad grande del ribosoma (large subunit of ribosome) MEXU – Herbario Nacional del Instituto de Biología de la Universidad Nacional Autónoma de México ML – Máxima Verosimilitud (maximum likelihood) msnm – Metros sobre el nivel del mar NTS – Espaciador no transcrito del operón ribosomal (nontranscribed spacer) PCR – Reacción en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction) preARN – Precursor de ARN rADN – Genes ribosomales nucleares SSU – Subunidad pequeña del ribosoma (Small subunit of ribosome) TLC – Cromatografía de capa fina (thin layer chromatography) v Índice de figuras Figura 1. Esquema del operón de rARN donde se muestra una unidad y el inicio de otra...............................................................................................29 Figura 2. Sitios de muestreo..............................................................39 Figura 3. Hábito del talo en Usnea.......................................................40 Figura 4. Esquema del corte longitudinal de una rama principal de Usnea y las medidas que constituyen el CMA...............................................................45 Figura 5. Localización de los primers de Schmitt et al. (2009) utilizados y los diseñados en este estudio para Usnea (UMcm7F/R y UTsr1F/R).....................51 Figura 6. Gel de electroforesis que muestra los dos tamaños de banda de un PCR usando los primers ITS1-F y NL6A en Usnea.........................................60 Figura 7. Esquema de la amplificación diferencial del operón rARN en Usnea usando diferentes primers que pretenden recuperar el ITS................................62 Figura 8. Variación de la inserción en el extremo 3’ del intrón en la SSU del género Usnea subgéneros Usnea y Eumitria y del género Everniastrum...............63 Figura 9. Esquema del árbol consenso de mayoría de ML de ITS del mundo.......................................................................................................68 Figura 10. Detalle del árbol de ITS del mundo que muestra los subgéneros Eumitria y Dolichousnea...............................................................................69 Figura 11. Árboles de los genes ITS, MCM7 y TSR1 de especies de Usnea en México................................................................................................73 y 74 Figura 12. Árbol de ML de los loci concatenados para las especies mexicanas...........................................................................................75 y 76 Figura 13. Algunos patrones morfológicos, químicos y ecológicos en el género Usnea..............................................................................................77 Figura 14. Árbol de consenso estricto de los árboles de ITS, MCM7 y TSR1..........................................................................................................78 Figura 15. Árbol de ML de ITS de la sección Usnea en México y en el mundo.......................................................................................................81 Figura 16. Árbol de ITS de ML de la sección Ceratinae....................82 y 83 Figura 17. Detalle del árbol multilocus de la sección Usnea en México señalando el modo reproductivo y la química...................................................87 Figura 18. Relación entre el grosor de la médula y la corteza en los ejemplares colectados pertenecientes al agregado de U. florida..........................87 Figura 19. Árbol de ML no enraizado de los haplotipos de ITS + LSU de Usnea ceratina en México y un resumen de la alineación.................................92 vi Figura 20. Red de haplotipos de ITS de U. ceratina, incluyendo las secuencias de Inglaterra..............................................................................93 Figura 21. Redes de haplotipos de MCM7 y TSR1 de las poblaciones de U. ceratina en México.....................................................................................96 Figura 22. Detalle del árbol de loci concatenados de México y del árbol de ITS de la Sección Ceratinae que muestra a las especies pigmentadas de rojo y su distribución topológica.................................................................................98 Figura 23. Redes de haplotipos de U. cornuta y U. brasiliensis para los tres genes......................................................................................................102 Anexo B Figura B1. Comparación entre la estructura secundaria del ITS2 y la alineación del mismo para las secuencias mexicanas. ....................................172 Anexo C Figura C1. Análisis filogenético de ML del intrón tipo I en las especies mexicanas................................................................................................174 vii Índice de tablas Tabla 1. Posibles escenarios al lidiar con pares de especies putativos......22 Tabla 2. Primers utilizados para obtener las secuencias de ITS, MCM7 y TSR1 de Usnea, Everniastrum y Alectoria........................................................51 Tabla 3. Longitud de la alineación para los grupos de datos principales, el número de sitios variables, de sitios parsimoniosamente informativos (PI), de secuencias y de haplotipos............................................................................64 Tabla 4. Resultados de los análisis de ML usando RAxML........................67 Tabla 5. CMA, asignaciones taxonómicas, estado reproductivo y química de los ejemplares pertenecientes al clado que representa al agregado de U. florida en México.......................................................................................................89 Tabla 6. Estimados de recombinación de U. ceratina para México (los tres loci) e Inglaterra (ITS) ................................................................................94 Tabla 7. Estadísticos descriptivos de variación genética de U. ceratina y pruebas de neutralidad para las poblaciones mexicanas individuales, para todo el país, para Inglaterra y para la especie. .........................................................97 Tabla 8. Estructura poblacional entre Oaxaca, Hidalgo y Michoacán en Usnea ceratina usando los tres loci, y entre Inglaterra o todas las muestras de México, con ITS….......................................................................................95 Tabla 9. Prueba U de Mann-Whitney entre las distancias genéticas interespecíficas (U. cornuta vs. U. brasiliensis) e intraespecíficas (dentro de U. cornuta y dentro de U. brasiliensis). ............................................................104 Tabla 10. Estimados de recombinación para U. cornuta s.l., U. brasiliensis y las dos juntas con o sin el ejemplar 2.26.43..................................................105 Tabla 11. Estadísticos descriptivos de variación genética de U. cornuta y U. brasiliensis (+ U. ramillosa) y pruebas de neutralidad para las poblaciones mexicanas con N > 2..................................................................................106 Tabla 12. Diferencias en el concepto de especies del complejo de U. baileyi relevantes para este estudio y comparación con los ejemplares mexicanos........113 Tabla 13. Comparación entre el CMA y la química de U. subscabrosa y U. subrubicunda, según diferentes autores, con los ejemplares mexicanos.............119 Tabla 14. Quimiotipos de U. cornuta y U. brasiliensis según diversos autores para varias regiones geográficas o países y para los clados monofiléticos rescatados en este estudio..........................................................................................129 Tabla 15. Representatividad del muestreo de este estudio en comparación con estudios taxonómicos de algunas regiones geográficas..............................136 viii Anexo A Tabla A1. Localidades de colecta con estado, localidad, tipo de vegetación, coordenadas y altitud en metros sobre el nivel del mar...................................163 Tabla A2. Datos de cada ejemplar colectado.......................................165 Anexo D Tabla D1. Especies de Usnea (o morfotipos) tratados en este trabajo, el Estado donde se colectaron y los nuevos registros para México y/o para algún Estado......................................................................................................176 Anexo E Tabla E1. Datos de la secuencias de ITS de Usnea obtenidas de Genbank.........191 Resumen Se desconoce aún una enorme fracción de la biodiversidad del planeta, gran parte de la cual se concentra en grupos poco estudiados, donde la delimitación de especies es particularmente problemática. Recientemente se ha optado por hacer uso de diversas evidencias y herramientas analíticas para determinar los límites interespecíficos, conformando la llamada “taxonomía integradora”. Dentro de los organismos más diversos y menos estudiados destacan los hongos liquenizados, que constituyen cerca del 20% de todos los hongos y se caracterizan por grandes distribuciones geográficas, alta plasticidad fenotípica y una dinámica reproductiva complicada. En particular, se ha propuesto que algunos taxa asexuales se derivan de progenitores sexuales, siendo por lo demás idénticos morfológicamente (la hipótesis del “par de especies”). Bajo esta teoría, es práctica común separar en diferentes especies a los individuos sexuados de los que presentan propágulos vegetativos con ambos componentes simbióticos. Por otra parte, rara vez se hace distinción entre organismos fenotípicamente similares de distintos continentes. No obstante, estudios moleculares han revelado una incongruencia frecuente entre la taxonomía clásica y los resultados filogenéticos, por lo que se espera que este grupo de hongos sea considerablemente más diverso de lo que hasta ahora se ha categorizado. El género de hongos liquenizados Usnea es extremadamente rico en especies, conspicuo y taxonómicamente difícil. Forma comunidades diversas, cuyos componentes específicos tienen distribuciones casi cosmopolitas. Asimismo, taxa sexuales, asexuales y con ambas expresiones reproductivas son comunes, incluyendo varios pares de especies sugeridos. En este estudio, se utilizaron datos moleculares de tres loci (ITS, MCM7 y TSR1), en combinación con taxonomía clásica, para delimitar especies del género Usnea de bosques templados mexicanos bajo un marco filogenético. Se reconstruyeron filogenias de máxima verosimilitud tanto del género, como de las secciones Usnea y Ceratinae, lo que permitió corroborar las afinidades entre taxa y evaluar preliminarmente la relación entre poblaciones de diferentes continentes. La amplificación diferencial de un intrón tipo I en el gen nuclear de la subunidad pequeña del ribosoma está fuertemente asociado a los límites interespecíficos y, adicionalmente, apoya la noción de que Usnea es el grupo hermano de los géneros parmelioides. Evaluación del agregado de U. florida en México demostró que U. lecanorica y U. silesiaca son parafiléticas en su concepto tradicional y que el agregado de U. fragilescens es polifilético. Asimismo, pruebas de diferenciación genética y recombinación, morfología, anatomía y química fueron útiles para avanzar en la inferencia de los límites entre 2 las especies más comunes, en particular U. ceratina, U. cornuta s.l. y U. brasiliensis. Se corroboró la existencia de una especie potencialmente críptica (U. entoviolata) dentro de U. ceratina y se rechazaron los cuatro casos putativos de pares de especies: U. ceratina vs. U. cristatula, U. cornuta vs. U. cirrosa, U. brasiliensis vs. U. ramillosa y U. rubicunda vs. U. erinacea. Otras especies, como U. angulata, U. merrillii y U. schadenbergiana se infirieron como monofiléticas. Por otra parte, no hay evidencia de diferenciación poblacional en U. ceratina usando el índice de fijación FST, mientras que pruebas de neutralidad y redes de haplotipos sugieren una posible expansión demográfica antigua. Finalmente, tres nuevos registros de especies en México y otros varios para diferentes estados del país, así como posibles nuevas especies, sugieren que México y especialmente Oaxaca aún esconden mucha diversidad en este grupo. 3 Abstract As of today, a great fraction of the planet’s biodiversity remains undescribed, the majority of which encompasses poorly studied groups, where species delimitation is particularly problematic. Diverse evidences and analytical tools have been recently used to determine interspecific boundaries, constituting the so-called “integrative taxonomy”. Encompassing about 20% of all fungal diversity, lichenized fungi stand out among the more diverse but at the same time less studied organisms. Lichens are characterized by large geographical distributions, high phenotypic plasticity and complicated reproductive dynamics. It has been proposed that some asexual taxa derivate from sexual progenitors, being otherwise morphologically identical (the “species pair” hypothesis). Under this understanding, it is common practice to identify sexual individuals as different species from those who exhibit symbiotic vegetative propagules. On the other hand, phenotypically similar populations on different continents are usually regarded as conspecific. However, molecular studies have revealed a frequent inconsistency between classic taxonomy and phylogenetic results, so that lichenized fungi are expected to be considerably more diverse than they have currently been categorized. The lichenized fungal genus Usnea is extremely species-rich, conspicuous and taxonomically difficult. Some specific components of diverse Usnea communities have nearly cosmopolitan distributions. Taxa which express sexual, asexual or both reproductive strategies are likewise common, including some suggested species pairs. In the present study, classic taxonomy and molecular data from three loci (ITS, MCM7, and TSR1) were employed to delimit Usnea species from Mexican temperate forests under a phylogenetic framework. Maximum likelihood phylogenies were reconstructed for the genus as well as for the Usnea and Ceratinae sections, which allowed to corroborate the affinities between taxa and also to preliminarily evaluate relationships between populations from different continents. The differential amplification of a type I intron in the nuclear ribosomal small-subunit RNA gene is strongly associated with interspecific limits and further supports the notion that Usnea is the sister group of the parmelioid genera. Evaluation of the U. florida aggregate in Mexico showed that U. lecanorica and U. silesiaca are paraphyletic in its traditional concept and that the U. fragilescens aggregate is polyphyletic. Furthermore, genetic differentiation and recombination tests, morphology, anatomy and chemistry were useful to infer the boundaries between the most common species, particularly U. ceratina, U. cornuta s.l. and U. brasiliensis. The existence of a potentially cryptic species (U. entoviolata) within U. 4 ceratina was corroborated and all four putative cases of species pairs were rejected: U. ceratina vs. U. cristatula, U. cornuta vs. U. cirrosa, U. brasiliensis vs. U. ramillosa and U. rubicunda vs. U. erinacea. Other species such as U. angulata, U. merrillii and U. schadenbergiana were inferred as monophyletic. Moreover, there was no evidence of population differentiation in U. ceratina using the fixation index FST, while neutrality tests and haplotype networks both suggest a possible ancient demographic expansion. Finally, three new species records in Mexico and several others for different states of the country, as well as possible new species, suggest that Mexico and especially Oaxaca still hide plenty of Usnea diversity. 5 1. Introducción 1.1. Delimitación de especies 1.1.1. Biodiversidad y especies Considerando diversos estimados del número de especies que habitan la Tierra, es evidente que desconocemos una gran fracción de la biodiversidad. Por ejemplo, en un estudio reciente, Mora et al. (2011) llegaron a la conclusión de que hay aproximadamente 8.7 millones (+ 1.3 millones SE) de especies eucariotas globalmente, de las cuales 86% de las especies terrestres y 91% de las especies marinas no han sido descritas. Como lo expresan las cifras de estos y otros autores, el intervalo de incertidumbre de los estimados de diversidad tiende a ser voluminoso, empeorando conforme menos sabemos del grupo y más diverso es éste (May, 2000). En el caso de los hongos, por ejemplo, se han sugerido la existencia de entre 0.5 y 9.9 millones de especies (Mueller y Schmit, 2007), de los cuales sólo se han descrito c. 100,000 (Blackwell, 2011), es decir, entre el 20 y el 1% del total. Estas cifras son importantes porque la especie, como unidad, constituye nuestra representación natural de la parte taxonómica de la biodiversidad, aún cuando también podemos medirla a nivel genético o ecosistémico (Gaston, 2010; May, 2000). Esto se debe a que cuando nos enfrentamos a la diversidad orgánica del planeta, nuestro primer impulso es dividir la naturaleza en especies. Aunque hay quien sugiere que las especies son simplemente el producto de la tendencia de nuestro cerebro a organizar y/o que sólo son construcciones artificiales (Lawrence y Retchkess, 2010; Mallet, 2007), la mayoría de los biólogos las consideran reales. Un argumento clásico de la realidad de las especies contrasta las coincidencias de los límites específicos que establecemos entre, por ejemplo, diferentes culturas (ver la discusión de Coyne y Orr (2004) sobre la realidad de las especies, y las referencias ahí citadas). De igual forma, si bien es claro que especie tiene una gran diversidad de definiciones, se considera que en general se refieren a la misma entidad subyacente (Agapow et al., 2004; Coyne y Orr, 2004; de Queiroz, 2007). Aún así, se ha visto que varias de estas definiciones pueden llegar a conclusiones distintas. Por ejemplo, el concepto filogenético de especie suele subdividir especies definidas por criterios no filogenéticos, como el morfológico y el biológico (Agapow et al., 2004; Kroken y Taylor, 2001). Esto se hace muy evidente en el estudio de Peterson y Navarro-Sigüenza (1999), en el que el número de aves endémicas de México (y sus correspondientes áreas de endemismo) cambia 6 dramáticamente según si se usa el concepto biológico (101 especies) o el filogenético (249). En vista del “problema de la especie” (the “species problem”; ver Graybeal, 1995), de Queiroz (1998, 2005, 2007) propone un consenso entre las principales categorías de concepto de especie (biológico, ecológico, evolutivo, cohesivo, filogenético, fenético, etc.) llamado el Concepto General de Linaje (CGL). En él, una especie es un segmento de un linaje compuesto de metapoblaciones (población inclusiva hecha de subpoblaciones conectadas) con una relación ancestro- descendiente (de Queiroz, 2007). La palabra “linaje” se aplica aquí para referirse a la metapoblación extendida en el tiempo, no a un clado o grupo monofilético, el cual está compuesto por varios linajes. De acuerdo a de Queiroz (1998, 2005, 2007), el CGL está implícita o explícitamente integrado en la mayoría de los conceptos de especies propuestos. Sin embargo, cada una de las diferentes alternativas del concepto de especie hace énfasis en propiedades distintas de dicho fragmento de linaje, propiedades (llamadas secundarias) que están íntimamente relacionados al proceso de especiación. De esta forma, cuando dos linajes divergen, se vuelven distinguibles fenéticamente; se vuelven diagnosticables por estados de carácter fijos; sus genitales, gametos y sistemas de desarrollo se vuelven incompatibles; sus miembros dejan de reconocerse como posibles parejas; evolucionan distintas características ecológicas y la variación de sus genes pasa por estados polifiléticos, parafiléticos y monofiléticos; todo esto sin un orden general establecido (de Queiroz, 2005). Para este autor, las propiedades secundarias constituyen evidencia de que un grupo dado de organismos forma parte de uno de estos segmentos de linaje y no son por sí mismas necesarias para darles el título de especie. Esto, hablando en un contexto operacional, las reitera como relevantes para la delimitación de especies (de Queiroz, 2007). Así, el conflicto entre conceptos de especies nace del punto en la divergencia en que se encuentren los taxa bajo estudio y en el tipo de especiación, ya sea con o sin flujo génico (i.e. simpátrica/parapátrica o alopátrica/peripátrica). Es relevante también el enorme vacío que tenemos sobre la biología de la mayoría de las especies ya descritas. En muchos casos, la taxonomía aún es deficiente y los muestreos pobres. Es de esperarse entonces que mientras más desconocido sea el grupo, menos concordancia aparente exista entre distintos conceptos de especie, pero conforme más sepamos de su biología, muchos fragmentos de linaje (i.e., especies) serán más o menos claros a la luz de la evidencia que constituyen las propiedades secundarias. 7 1.1.2. Implicaciones de los niveles de sexualidad para la delimitación de especies Un aspecto importante de los límites entre especies es el flujo génico y su frecuencia. Muchas especies eucariotas (p.ej. algunos hongos, protozoarios, plantas e incluso animales) y sobre todo la abrumadora totalidad de especies procariotas, tienen reproducción exclusivamente “asexual” (Cerritos Flores, 2007). Sin embargo, existen diferencias fuertes en las implicaciones de la asexualidad para grupos eucariotas (en especial los multicelulares) y para los procariotas. Para algunos autores, siendo estrictos, es incorrecto denominar a los procariotas como asexuales, ya que presentan transducción, transformación y conjugación (Coyne y Orr, 2004; Lawrence y Retchless, 2010), pero la recombinación que provocan estos fenómenos tienen constricciones y efectos distintos a los provocados por el sexo, en su sentido tradicional (i.e., ligado a la reproducción) (Cohan, 2001). Para estos grupos, hay posiciones muy encontradas sobre los límites de las “especies”. Según Cohan (2001), en ausencia de recombinación, uno puede detectar agregados fenotípicos y ecológicos de bacterias, cuya divergencia genética es alrededor del 1% o menos. De manera similar a lo que sufren los investigadores que trabajan con especies eucariotas sexuales, él dice que “beyond agreeing on the existence of species (...), bacteriologists differ on operational procedures for identifying species most appropriately” (Cohan, 2002 p. 458). No obstante, otros autores consideran que las especies bacterianas son construcciones ambiguas, precisamente por su calidad clonal y la promiscuidad de su intercambio genético a niveles muy altos de divergencia, generando historias evolutivas reticuladas (Lawrence y Retchless, 2010). Dos modelos importantes buscan explicar las dinámicas que podrían formar agregados sugerentes de especies procariotas. El primero es defendido por Cohan (2001, 2002) y consiste en lo siguiente: supongamos una población hipotética de organismos con una ecología particular, que no presenta recombinación intraespecífica. De pronto, aparece una mutación adaptativa que confiere habilitad competitiva superior al resto de los miembros de dicha población. Como no hay recombinación, un genoma entero es llevado a fijación por estar ligado al alelo seleccionado (por hitchhiking o aventón en español). La especie asexual es entonces entendida como un grupo de organismos cuya divergencia está constreñida y es recurrentemente reiniciada por eventos intermitentes de selección periódica (barridos selectivos; Cohan, 2002). De acuerdo con este autor, la especiación ocurre cuando un clona asexual evoluciona hacia un nuevo nicho 8 ecológico (que puede ocurrir por mutaciones o por adquisición de genes heteroespecíficos), de tal forma que ya no es afectado por los barridos selectivos de su población ancestral y es libre de divergir. Cohan (2001) define “ecotipo” como un grupo de cepas usando el mismo nicho o nichos muy similares, donde un mutante adaptativo tiene el potencial de substituir a todas las otras cepas del mismo ecotipo por barridos selectivos. Es decir, en su visión, un ecotipo es equivalente a una especie. En el segundo modelo, los alelos individuales son los que experimentan barridos selectivos al ser transferidos entre cepas por recombinación homóloga (Lawrence y Retchless, 2010). Estas cepas pueden ser parte de ecotipos diferentes, por lo que la frecuencia de los recombinantes estará determinada por selección natural y deriva génica, más que por barridos selectivos. La divergencia ocurrirá si la mutación sobrepasa la tasa de homogeneización por recombinación. En estos casos, cada ecotipo no constituye la unidad evolutiva que se intuye por especie (Cerritos Flores, 2007; Lawrence y Retchless, 2010). Por su parte, los eucariotas de reproducción uniparental tienen sus propias complicaciones en relación a los sexuales. En principio, si concebimos al eucariota como verdaderamente uniparental, podríamos sospechar una dinámica similar al modelo de ecotipo de Cohan (2001, 2002). Asimismo, bajo ciertos escenarios, la divergencia simpátrica por selección sobre rasgos poligénicos puede ocurrir con mayor facilidad en grupos asexuales que en sexuales (Barraclough et al., 2003). Se ha visto además que puede haber diferencias ecológicas entre dichos grupos, lo que podría estar asociado a un potencial adaptativo de la (a)sexualidad. Por ejemplo, los ostrácodos que se reproducen sexualmente son comúnmente marinos, mientras que los asexuales son dulceacuícolas (Bell, 1982 citado en Butlin et al., 1998). Igualmente, de manera muy notoria, parece haber diferentes niveles de dispersión dependiendo de la sexualidad (ver siguiente apartado). De acuerdo a Coyne y Orr (2004), la reproducción totalmente uniparental – asexual – y duradera (en tiempo geológico) en eucariotas es muy rara. Algunos ejemplos clásicos son los rotíferos bdeloideos (Fontaneto et al., 2007), los ostrácodos darwinuloideos (Butlin et al., 1998; Schön et al., 1998) y los hongos que forman micorrizas arbusculares (Glomeromycota) (Pawlowska y Taylor, 2004). Fuera de estos grupos, los linajes asexuales putativos tienden a ser recientes evolutivamente o se ha probado la presencia de algún grado de sexualidad (Judson y Normark, 1996). Finalmente, muchas especies asexuales se originan por hibridización de taxa sexuales y forman poblaciones de reproducción partenogenética (p.ej. escarabajos del genero Calligrapha; Gómez-Zurita et al., 2006). En las plantas, estas 9 situaciones producen los llamados “complejos agámicos” (p.ej. las rosáceas del género Amelanchier; Dibble et al., 1998). Incluso se ha reportado en hongos endófitos (género Neotyphodium; Schardl y Craven, 2003). Los híbridos pueden ser polifiléticos, surgiendo de múltiples eventos de cruza entre especies sexuales y cada clona formada puede ser ecológicamente diferente. En estas circunstancias, decidir qué constituye la especie es difícil: cada clona, grupos de clones ecológicamente similares, o todos los híbridos (Coyne y Orr, 2004). La cualidad intermedia de los híbridos y su ocasional introgresión con las especies parentales hace que la delimitación a partir de propiedades secundarias no sea tan obviamente aplicable, pues las relaciones se vuelven reticuladas y las entidades biológicas dejan de ser reproductiva y morfológicamente discretas (Coyne y Orr, 2004; Horandl et al., 2009). A nivel taxonómico, el desacuerdo entre especialistas puede ser severo. Para ilustrar, May (1990) cita el caso de las moras británicas partenogenéticas (género Rubus), en donde los taxónomos ven desde 20 hasta 200 especies. 1.1.3. ¿Todo está en todas partes? Es posible que la asexualidad juegue un papel importante en la dispersión de muchos grupos, en particular de aquéllos con propágulos o tamaños corporales pequeños. En hongos liquenizados, por ejemplo, se ha visto que las especies asexuales tienen áreas de distribución más amplias que las sexuales (Herrera- Campos et al., 1998; Wirtz et al., 2008). Barraclough et al. (2003) hacen notar que los linajes asexuales antiguos tienden a ser organismos pequeños y de altas capacidades de dispersión. A su vez, los microorganismos parecen exhibir patrones geográficos y de especiación diferentes a los macroorganismos (Finlay, 2002). Al comparar la diversidad de especies animales con diferentes categorías de tamaño corporal, May (1990) propuso una “regla de dedo” en la que, de manera muy gruesa, conforme uno va de animales cuya dimensión linear es de algunos metros, hasta aquéllos de alrededor de 1 cm (un intervalo que abarca varios órdenes de magnitud en peso corporal), por cada reducción de diez veces la longitud (o mil veces el peso) hay 100 veces más especies. Esta relación empírica se rompe por debajo de 1 cm, lo que puede deberse simplemente al registro incompleto de animales terrestres pequeños (May, 1990), o porque los microorganismos tienen números poblacionales y capacidades de dispersión tales que las tasas de extinción y especiación locales se ven limitadas (Finlay y Clarke, 1999). “Everything is everywhere: but the environment selects” es una frase muy famosa que encapsula la concepción sobre la biogeografía de los microorganismos 10 establecida a inicios y mediados del siglo pasado. Según O'Malley (2008), el autor fue el microbiólogo holandés Lourens G. M. Baas Becking (1895-1963). Básicamente sugiere que los microorganismos tienen capacidades de dispersión tan descomunales que rápidamente borran los efectos de eventos evolutivos y ecológicos pasados (Martiny et al., 2006; O'Malley, 2008). La segunda parte de la frase implica que las condiciones ambientales – principalmente las abióticas (temperatura, pH, sales, nutrientes, entre otros) – determinan cuales especies sobreviven dentro de los agregados microbianos (Martiny et al., 2006). Es decir que la distribución está determinada por la localización de hábitats adecuados para las especies, ya que su “banco de semillas” es cosmopolita (Finlay, 2002). Con la introducción de herramientas moleculares y genómicas, se ha revisado ampliamente la clasificación microbiana, así como su filogenia y evolución (O'Malley, 2008). Esto ha disparado el debate sobre las propiedades de la biogeografía de estos organismos, el cual es extensible a los eucariotas con cuerpos, esporas o propágulos pequeños, como hongos, algas, protozoarios, briofitas y helechos (Finlay et al., 2002; O'Malley, 2008; ver volumen 28, número 2 del Journal of Biogeography, 2001). Martiny et al. (2006) proponen cuatro grandes hipótesis alternativas para explicar la distribución de los microorganismos. La primera, que es la hipótesis nula, es que la distribución de los microorganismos es azarosa en el espacio. La segunda, es que la biogeografía refleja la influencia de la variación ambiental contemporánea (hábitats múltiples) dentro de una sola provincia1. Esta es la hipótesis Baas-Becking, donde la provincia abarca todo el mundo. Una tercera es que la variación espacial se debe a efectos remanentes de eventos históricos (provincias múltiples pero sólo un hábitat), lo que provoca divergencia entre agregados microbianos (p.ej. vicarianza). La hipótesis final es que la distribución de los microbios, como la de los macroorganismos, refleja la influencia de ambos: eventos pasados y condiciones ambientales contemporáneas (hábitats múltiples y múltiples provincias; Martiny et al., 2006). Revisando los pocos estudios hasta esa fecha que investigaron la relación entre diferencias ecológicas y la distancia geográfica en microorganismos, Martiny et al. (2006) descartaron la hipótesis nula con facilidad. Hasta la mitad de los estudios encontraron efectos por distancia significativos, indicando cierto grado de provincialismo. De manera relevante, parece ser que la influencia relativa de factores históricos versus ambientales está relacionada a la escala geográfica. Así, en el orden de miles de kilómetros, el impacto de la separación histórica puede 1 Donde una provincia es una región cuya composición biótica refleja el legado de eventos históricos; el término se usa de manera laxa, variando según el taxón o la resolución del enfoque (Martiny et al., 2006). 11 superar los efectos ambientales. En escalas de pocos kilómetros, los efectos del ambiente son mucho más prominentes, tanto que no hay correlación con la distancia. Pero en escalas intermedias (10-3000km), se detectan efectos tanto de la distancia como del ambiente (Martiny et al., 2006). No obstante, la otra mitad de los estudios apoyaron la hipótesis Baas- Becking. En efecto, hay trabajos en los que los microorganismos de hecho resultan ser cosmopolitas (Finaly y Clarke, 1999; Pringle et al., 2005; Slapeta et al., 2006). Finlay (2002) enumera varias evidencias a favor de esto, como un cociente de riqueza local/global mucho más grande para eucariotas microbianos que para animales grandes, y curvas de especie-área más o menos planas. Sin embargo, Martiny et al. (2006) advierten que hay mucha variación entre capacidades de dispersión y tamaños de distribución geográfica, incluso entre microorganismos. Adicionalmente, la aplicación del concepto de especie no es necesariamente consistente entre estudios, por lo que declarar taxa como cosmopolitas usando por ejemplo un concepto morfológico, puede enmascarar patrones biogeográficos de especies filogenéticas (Martiny et al., 2006). 1.1.4. Métodos para delimitar las especies Delimitar especies es el proceso de identificar y delinear distintas entidades organísmicas de la naturaleza (Roe y Sperling, 2007), que bajo el concepto de de Queiroz (1998, 2005, 2007) corresponden a los segmentos de linaje. En línea con el CGL, Sites y Marshall (2003, 2004) revisaron los métodos más utilizados para la detección de las propiedades secundarias (y por tanto de delimitación de especies) que emplean únicamente datos moleculares o en combinación con caracteres de otra naturaleza. Los dividieron en aquéllos basados en árboles (topológicos) y en los que se basan en inferencias indirectas de la presencia o ausencia de flujo génico. En la última categoría figuran por ejemplo, estimar la proporción efectiva de migrantes (Nm) entre especies que hibridizan usando el estadístico FST o el análisis de agregación poblacional, en el que los estados de carácter son establecidos para todos los individuos de una muestra y con ellos se estiman perfiles de dichos estados. Muestras con perfiles poblacionales idénticos son combinadas y consideradas conespecíficas (Davis y Nixon, 1992). Dentro de los métodos topológicos, Baum y Shaw (1995) propusieron el “criterio de exclusividad” que delimita especies usando genealogías de loci no ligados para formar un árbol consenso. Se espera que el límite entre genealogía divergente y reticulada sea equivalente al límite entre especies sexuales; en este punto, los genes no ligados deben tener genealogías concordantes. 12 También destacan los siguientes métodos topológicos: - La agregación cladista de haplotipos (Brower, 1999). En este método los miembros de una especie forman secciones contiguas de una filogenia no enraizada y se separan de las demás especies por una rama en la cual se infiere la fijación de estados de carácter. - El método de Wiens y Penkrot (2002). A partir de una filogenia de haplotipos no recombinantes con localidad y designación taxonómica conocida, éste método considera como especies a los grupos de poblaciones que estén fuertemente soportados, sean exclusivos y sean concordantes con la geografía. Asimismo, dada la filogenia de datos morfológicos o moleculares, ofrece una clave dicotómica de los posibles escenarios topológicos. - El análisis de clados anidados (Templeton, 2001 y referencias ahí citadas). Se construye una red de haplotipos con parsimonia estadística que se divide en una serie de clados anidados de manera jerárquica. Se usa información geográfica para probar la hipótesis nula de que la muestra constituye un solo linaje. Si se rechaza, se evalúa una segunda hipótesis nula: todos los linajes son genética o ecológicamente intercambiables. La desventaja de estos y otros métodos tanto topológicos como no topológicos es que requieren amplios muestreos de individuos y/o loci. Además, muchos fueron diseñados para comparar poblaciones alopátricas o para rescatar especies monofiléticas. Aunque efectivos si se usan en agrupaciones definidas a priori, en general son más útiles para detectar especies crípticas que para reconocer especies en grupos taxonómicamente difíciles (Wirtz et al., 2012). Un método reciente desarrollado por Pons et al. (2006) y Monaghan et al. (2009), busca identificar la transición entre eventos de especiación y eventos coalescentes (intraespecíficos) con el objetivo de delimitar especies en grupos diversos y taxonómicamente difíciles. Dado que su método se basa en el modelo de nacimiento puro, implica tasas de extinción despreciables y tasas de especiación constantes (Yule, 1924). Por tanto es más aplicable a grupos recientes y en principio demanda la inclusión de todas las especies del grupo taxonómico bajo estudio. Asimismo, parece tener fuertes debilidades (generando falsos positivos) por muestreo insuficiente y al enfrentarse a historias demográficas complejas (Lohse, 2009). Por tanto, ya que ningún método es universal a todos los procesos y grupos biológicos, muchos investigadores abogan por la aplicación de una taxonomía integradora (sensu Dayrat, 2005 y Will et al., 2005). Bajo este enfoque, se utiliza una gama variada de caracteres, incluyendo datos moleculares, morfología, comportamiento y geografía, así como diferentes aproximaciones teóricas y 13 metodológicas, para corroborar los límites entre las especies (Dayrat, 2005; Roe y Sperling, 2007; Sites y Marshall, 2003, 2004; Will et al., 2005). La evidencia obtenida de todos los grupos de caracteres es concentrada acumulativamente, las concordancias y discordancias son explicadas desde perspectivas evolutivas, y se toman decisiones con base en la información disponible (Schlick-Steiner et al., 2010; Padial et al., 2010). Consecuentemente, esta aproximación no se adhiere a ninguna propiedad secundaria en especial (Padial et al., 2010), lo que permite flexibilidad al tratar diferentes grupos y niveles de divergencia. 1.2. El grupo de estudio y el concepto de par de especies 1.2.1. Líquenes 1.2.1.1. Definición, organización y clasificación Los líquenes son relaciones simbióticas íntimas y a largo plazo entre un hongo, llamado micobionte, y uno o más organismos fotosintéticos extracelulares, los fotobiontes, que pueden ser algas verdes (Chlorophyta) o cianobacterias (Piercey- Normore y DePriest, 2001; Nash, 2008; Honegger, 1993). Dentro de dicha asociación, puede haber más de dos participantes (“biontes”, Hawksworth, 1988) y las relaciones entre ellos pueden ser muy complejas (Nash, 2008; Hawksworth, 1988). Por ejemplo, la relación entre los biontes puede cambiar en su naturaleza (antagonista, mutualista, comensalista) durante la vida del micobionte (Hawksworth, 1988) y otros organismos pueden incorporarse o ser desplazados, como bacterias (Bates et al., 2011) y hongos parásitos y/o liquenícolas (Lawrey y Diederich, 2003). Algunos autores se refieren a los líquenes como mutualistas (Honegger, 1993), mientras que otros hablan de parasitismo controlado, donde el hongo manipula al alga (Ahmadjian, 1993). El grado de liquenización (la asociación entre los biontes que resulta en una estructura corporal específica) también es variable, desde unas cuantas células del fotobionte asociadas al azar con las hifas de un hongo, hasta un talo complejo, integrado y estratificado, con una capa de fotobionte distintiva bajo tejido cortical fúngico. De igual forma, los miembros de la simbiosis pueden ser simbiontes obligados u ocurrir en vida libre (Nash, 2008). No obstante, parece ser que la mayoría de los hongos que forman líquenes son específicos en su elección del fotobionte (Beck et al. 1998) y no crecen en vida libre (Honegger, 2008). En general, el liquen presenta una morfología y organización distinta a cualquiera de los biontes en solitario (Nash, 2008; Joneson y Lutzoni, 2009), pero el nombre de 14 la especie que identifica al liquen se refiere siempre al micobionte (Honegger, 2008). Aproximadamente el 25% de los hongos que liquenizan forma talos muy complejos, con una estratificación interna donde la población de células de fotobiontes está incorporada en una capa talina de manera similar al parénquima en empalizada de las plantas. Estos talos crecen por sobre el sustrato en tercera dimensión y se les denomina foliosos o fruticosos. Los talos foliosos presentan forma de hojas (Honeggen, 2008) y son separables del sustrato sin destruirlos. Los talos fruticosos son erectos, con una fuerte integración entre el crecimiento fungal y algal (Sanders, 1999). Cerca de 40 géneros de algas y cianobacterias forman líquenes, siendo Trebouxia, Trentepohlia y Nostoc los más frecuentes. Los primeros dos son clorofitas y el último es una cianobacteria. Dentro de los líquenes, las algas verdes (exceptuando al orden Trentepohliales) se reproducen sólo asexualmente. Su identificación a nivel de especie requiere usualmente que sean cultivadas en un medio separado del micobionte (Friedl y Büdel, 2008). La vasta mayoría de los micobiontes son ascomicetos del subphylum Pezizomycota (James et al. 2006), constituyendo cerca del 40% de las aproximadamente 64,000 especies descritas para Ascomycota (Kirk et al. 2008). Se distinguen de otros hongos ascomicetos en la formación de un talo superficial expuesto al aire, una tasa de crecimiento lenta y la longevidad del talo y los ascomas (Sipman y Aptroot, 2001). Considerando también a los micobiontes basidiomicetos, alrededor del 20% de todos los hongos forman líquenes (Blackwell, 2011). 1.2.1.2. Ecología y distribución Como grupo, los líquenes se consideran muy diversos en coloración, formas de crecimiento y tamaño. La duración del ciclo de vida también es muy variable, desde estimaciones por encima de 1,000 años de edad hasta especies anuales. Muy relacionado con esto están las tasas de crecimiento, que van desde imperceptibles hasta varios milímetros al año (Nash, 2008). Ocurren comúnmente como epífitos y dentro o sobre rocas (saxícolas), pero también crecen en suelo, sobre hojas y sobre partes duras de animales. La mayoría son terrestres aunque hay algunas excepciones de agua dulce y de zonas intermareales marinas. Ocurren en la mayoría de los ecosistemas terrestres, sin embargo su contribución en biomasa varía mucho (especialmente porque aportan muy lentamente a la productividad primaria). Por ejemplo, en zonas polares y 15 subpolares, son los autótrofos dominantes. También son muy abundantes en ambientes alpinos, en bosques templados y en taigas (Nash, 2008). En el caso de líquenes que crecen muy rápidamente, éstos pueden tener gran importancia en el reciclado de nutrientes (Knops et al. 1991, 1997). En cuanto a su distribución, algunas especies se localizan en áreas muy restringidas, mientras que otras son cosmopolitas y algunas más tienen distribuciones dentro de estos extremos (Galloway, 2008). 1.2.1.3. Historia natural de la reproducción de ascomicetes liquenizados Cuando dos hongos filamentosos monocariontes (células con núcleos haploides) se encuentran, puede ocurrir anastomosis hifal. Si éstas son vegetativamente compatibles, hay migración de núcleos formando hifas dicarioticas, donde los núcleos de tipos sexuales opuestos se dividen pero no se fusionan (Moore y Novak Frazer, 2002). Una estructura en forma de saco (asca) se forma a partir de la penúltima célula de una hifa dicarionte llamada hifa ascógena en la cual ocurre la cariogamia (fusión de núcleos), la meiosis y la esporulación (Kües y Casselton, 1992). Las ascas, que contienen meiosporas (llamadas ascosporas), pueden estar dentro de un ascoma, que puede ser de una agregación débil o tener una estructura compleja referida como ascocarpo o cuerpo fructífero. En la mayoría de los ascomicetes liquenizados, las ascas se diferencian en una capa plectenquimatosa (es decir, “tejido falso”) llamada himenio. Muy rara vez hay fotobiontes asociados al himenio y éstos pueden ser eyectados con la ascospora, renovando así el talo liquénico (Bungartz, 2002a). Los ascocarpos pueden ser, entre otros, peritecios o apotecios. Los primeros se mantienen cerrados, sin exponer el himenio, mientras que en los segundos el himenio se expone en la madurez (Büdel y Scheidegger, 2008). Alternativamente al sexo, algunos hongos pueden pasar por ciclos de parasexualidad, que también tiene el efecto de generar recombinantes. Esto se da en tres pasos: 1) anastomosis hifal para producir un heterocarionte (ver más adelante); 2) cariogamia que resulta en un diploide somático, el cual se divide mitóticamente junto a los otros núcleos haploides dentro del heterocarionte; y recombinación mitótica intracromosomal seguida de “haploidización”, es decir la pérdida aleatoria de cromosomas produciendo diferentes niveles de aneuploides (Noguchi, 2011; Sidhu, 1983). La heterocariosis (la formación de un talo o tejido compuesto por células con varios núcleos genéticamente diferentes) por sí misma, 16 es fuente de variación adicional que puede traducirse en diferencias ecológicas con respecto al homocarionte, como por ejemplo mayores tasas de crecimiento (James et al., 2008; Sidhu, 1983). En cuanto a reproducción asexual, en ascomicetos una forma común es a través de conidios, esporas no móviles especializadas que pueden tener distintas formas y ser de gran valor taxonómico. La mayoría de los conidios se forman a partir de células conidiógenas. Éstas a su vez nacen de hifas llamadas conidióforos, que pueden estar encerrados en estructuras especializadas llamadas conidiomas. Existen varios tipos de conidiomas, pero el más común es el picnidio (Nash y Gries, 2002). Al germinar, los conidios pueden restablecer la relación simbiótica con un fotobionte libre en el ambiente. También se ha sugerido que los conidos pueden actuar como gametos masculinos (espermacios), que se adhieren a los ascogonios, hifas femeninas especializadas. Éstos presentan una hifa elongada llamada tricógina que recibe al espermacio y entonces ocurre la fertilización (Kües y Casselton, 1992; Nash y Gries, 2002). Los hongos liquenizados han desarrollado una variedad de propágulos vegetativos donde tanto el fotobionte como el micobionte se dispersan en forma conjunta (Büdel y Scheidegger, 2008). Esto es muy ventajoso, ya que si se reproduce solo, el hongo se ve forzado a buscar inmediatamente un fotobionte compatible en el ambiente para renovar la simbiosis y sobrevivir (Ryan et al., 2002). Los isidios y soredios son los propágalos vegetativos más comunes (Büdel y Scheidegger, 2008). Los isidios son pequeñas proyecciones cilíndricas de la superficie del liquen que tienen una organización interna similar a la del talo liquénico. Están cubiertos por tejido cortical y presentan una diferenciación interna en capas (de fotobionte y médula). Es posible que además de servir como propágalos, aumenten la superficie fotosintética del talo (Büdel y Scheidegger, 2008; Ryan et al., 2002). Los soredios son unidades microscópicas de dispersión que contienen algunas células de fotobionte agrupadas y envueltas por hifas; miden c. 25-100 µm de diámetro y siempre carecen de corteza o pseudocorteza (Ryan et al., 2002). Se piensa que los isidios y soredios de líquenes epífitos son dispersados por vectores abióticos y bióticos como viento, gotas de lluvia, aves o artrópodos (Zoller et al., 2000). Adicionalmente, algunos líquenes fruticosos y filamentosos como Bryoria y Ramalina pueden dispersarse por fragmentación del talo (Büdel y Scheidegger, 2008). De hecho, experimentos para medir tasas de crecimiento utilizan fragmentos que cortan de talos maduros (ej. Keon y Muir, 2002). 17 1.2.1.4. Evolución de la sexualidad en Ascomycota En el reino Fungi, el sexo está definido por el locus MAT (del inglés mating type o tipo sexual), que contiene genes codificantes para determinantes de identidad celular (Sun y Heitman, 2011). El término “tipo sexual” se usa para distinguir individuos que son morfológicamente idénticos pero autoincompatibles (Kües y Casselton, 1992). La composición del locus varía dramáticamente entre especies, pero hay dos genes MAT que se encuentran siempre en ascomicetos filamentosos: MAT-1 y MAT-2 (Martin et al., 2011). Estas dos formas alternativas son llamadas idiomorfos en oposición a alelos, dada la alta divergencia entre ellas (Fraser et al., 2007; Kües y Casselton, 1992; Li et al. 2010; Souza et al., 2003; Yun et al., 1999). Se dice que una cepa es homotálica si un individuo puede completar el ciclo sexual por sí mismo o con una cepa compatible. Una cepa heterotálica no puede autofecundarse y requiere de la interacción de dos individuos para completar el ciclo sexual. Los ascomicetos heterotálicos requieren los dos idiomorfos complementarios, MAT-1 y MAT-2, para llevar a cabo la reproducción sexual. Los genes MAT también han sido encontrados en ascomicetos homotálicos, lo que sugiere una función incluso en hongos autocompatibles (Dyer et al., 2003). No obstante, en estos casos, MAT-1 y MAT-2 están fusionados en un solo locus o uno de ellos ha perdido funcionalidad, siendo esto específico de cada especie homotálica (Fraser et al., 2007; Lu et al., 2011; Yun et al., 1999). En algunos casos, como en Saccharomyces cerevisiae, dentro de una misma población existen tanto miembros homotálicos como heterotálicos (Hsueh y Heitman, 2008). De hecho, trabajos en laboratorio sugieren que existe un continuo entre reproducción estrictamente homotálica y estrictamente heterotálica en por lo menos algunos grupos (ver Taylor et al., 1999). Aunque algunos hongos se reproducen sexualmente de manera obligada, la mayoría puede reproducirse sexual y asexualmente. Sólo una minoría se clasifica como exclusivamente asexual (Sun y Heitman, 2011). Sharon et al. (1996) demostraron con cepas transgénicas de Cochliobolus heterostrophus (sexual) y de Bipolaris sacchari (asexual), que la persistencia de la asexualidad de B. sacchari no se debe a la ausencia o a la falta de funcionalidad de los genes MAT, sino que debe adjudicarse a otro gen durante el desarrollo de peritecios. Esto indica que debe haber múltiples formas en que una especie puede volverse asexual. Por otra parte, hongos completamente clonales parecen ser raros (Taylor et al., 1999). Entre grupos de especies cercanamente relacionadas, las especies sexuales suelen estar mezcladas filogenéticamente con las asexuales (Taylor et al., 1999), lo que ha llevado a proponer que la reproducción sexual se pierde durante la 18 evolución (ver apartado 1.2.1.6). Una explicación alternativa es que el sexo no ha sido detectado en los grupos que se creen asexuales (Sun y Heitman, 2011). 1.2.1.5. Sistemática La gran mayoría de especies de líquenes fue descrita durante el siglo XIX y la primera mitad del siglo XX, utilizando caracteres que ahora se saben variables dependiendo del ambiente (Gruben y Kroken, 2000), o que son homoplásicos (Crespo et al. 2007; Printzen, 2010). Esto provocó la acumulación de un gran número de nombres sinónimos. Por otra parte, existen muchos complejos de especies en los que no es claro cuáles caracteres son polimórficos o monomórficos dentro de una especie, en particular caracteres morfológicos, químicos, selección de fotobionte, preferencias ecológicas y estrategias reproductivas (Gruben y Kroken, 2000). Este problema se exacerba cuando las especies son simpátricas (Leavitt et al., 2011a; Gruben y Kroken, 2000). Dentro de los caracteres utilizados en la taxonomía de líquenes los compuestos o metabolitos secundarios son de gran importancia, en especial porque se han detectado correlaciones con morfología y distribución (Culberson y Hale, 1973) y porque persisten incluso en material de herbario muy antiguo (Culberson, 1970). Muchos tienen influencia en la coloración del talo y pueden ser característicos de especies, géneros e incluso familias. Asimismo, se ha demostrado su papel en la regulación de la radiación solar y luz ultravioleta que alcanza al fotobionte (Elix y Stocker-Wörgötter, 2008). Una gran cantidad de estas sustancias es única a la simbiosis liquénica (c. 700), de las cuales las depsidas, las depsidonas, las depsonas y los dibenzofuranos (productos de la vía acetil- polimalonil) son de los más diversos y estudiados (Nash y Elix, 2002). Los llamados quimiosíndromes (Culberson y Culberson, 1976) son juegos de sustancias liquénicas relacionadas que se presentan dentro de una misma especie. De igual manera, las razas químicas dentro de una especie (o dentro de un tipo morfológico esencialmente uniforme) se dan si: a) hay un reemplazo consistente de una sustancia por otra o b) la adición (o eliminación) de una o más sustancias accesorias (Culberson, 1970). Mientras que algunos autores consideran al conjunto de razas químicas o quimiotipos dentro de un solo morfotipo como variación intraespecífica (p.ej. Tehler, 1982), otros pueden darle el grado específico dependiendo del contexto. Un ejemplo muy ilustrativo es Usnea lecanorica. Culberson et al. (1983) encontraron ejemplares del complejo de U. florida en el centro de México que presentaban el ácido lecanórico en la médula, una depsida 19 derivada del orcinol, la cual no está presente en ninguna otra especie del género. Dada la química inusual, los autores elevaron el quimiotipo a especie. En los últimos años, las herramientas moleculares han ganado gran importancia en la sistemática de los líquenes. Esto se debe a que los datos moleculares están libres de muchos problemas asociados al uso de caracteres tradicionales. De hecho, actualmente gran parte de las reconstrucciones filogenéticas moleculares están diseñadas para probar clasificaciones basadas en morfología, lo que ha aportado mucho conocimiento sobre el valor taxonómico de ciertos caracteres (Printzen, 2010). En el caso de los metabolitos secundarios, varios estudios indican que su uso tiene un éxito variable entre grupos, funcionando para distinguir linajes en algunos grupos (p.ej. Lücking et al., 2008), pero sólo parcialmente en otros (p.ej., Fehrer et al., 2008 Leavitt et al., 2011a, 2011b; ver Printzen, 2010). Sin embargo, las reconstrucciones filogenéticas moleculares no están exentas de complicaciones, como por ejemplo: 1) uso de secuencias erróneas por malas identificaciones o parasimbiontes no reconocidos; 2) muestreo incompleto de taxa que afecte hipótesis de monofilia y reconstrucciones filogenéticas; y 3) incongruencia entre genealogías de genes y delimitaciones de especies y problemas al recuperar la filogenia correcta a partir de un grupo de genes limitados (Printzen, 2010). 1.2.1.6. La hipótesis del Par de Especies Al profundizar en la taxonomía de muchos hongos liquenizados, es claro que existen especies que nunca o casi nunca presentan estructuras de reproducción sexual y en su lugar forman propágulos vegetativos que involucran al fotobionte (isidios y/o soralios, entre otros). De igual forma, hay especies que únicamente presentan estructuras sexuales. En algunos casos, individuos asignados a una especie que exclusivamente tiene apotecios son por lo demás extremadamente similares a individuos que sólo tienen soralios y/o isidios y que tienen a su vez otro nombre linneano. En una primera instancia, estos individuos pueden ser conespecíficos, pero dada la profunda historia de asexualidad en los hongos (cf. Fungi imperfecti) y en particular a patrones geográficos distintos de los morfotipos sexuales vs. los asexuales (comúnmente a nivel de continentes), muchos especialistas se han sentido orillados a mantenerlos como especies diferentes. Específicamente, es común que el morfotipo sexual tenga la distribución más reducida (Bowler y Rundel, 1975; Herrera-Campos et al., 1998) y que ambos sean 20 sólo parcialmente simpátricos (Bowler y Rundel, 1975). Esta situación dio lugar a un concepto particular en liquenología llamado “el par de especies”. De acuerdo con Mattsson y Lumbsch (1989) dicho concepto fue formulado inicialmente por Du Rietz (1924), quien señaló que individuos sexuales e individuos sorediados (morfológicamente idénticos a los primeros) a veces tienen ecología diferente. Él usó el término “Artenpaar” para este fenómeno y propuso el reconocimiento de estos morfotipos como especies separadas (Mattsson y Lumbsch, 1989). Hale (1965), en su monografía mundial de Parmelia subgénero Amphigymnia, discutió pares de especies en los trópicos y las denominó “contrapartes”. Poelt (1963) fue de los primeros investigadores en ofrecer una explicación a los patrones biogeográficos de los pares de especies. En particular, argumentó que la recolonización postglacial de Europa Central se llevó a cabo principalmente por poblaciones estériles sorediadas e isidiadas, mientras que las fértiles permanecieron en comunidades relictuales de plantas vasculares. Dicho autor introdujo los términos “primario” y “secundario” para referirse a los morfotipos fértiles y estériles, respectivamente. De hecho, llegó a sugerir que a cada taxón sorediado corresponde uno no-sorediado, implicando que los taxa secundarios siempre se derivan de uno primario (Poelt, 1970). Por su parte, Tehler (1982) notó que los individuos asexuales podrían en teoría originarse muchas veces de manera independiente del taxón sexual (i.e. ser polifiléticos). Por tanto él distinguió dos tipos de “clones”: los generados por un morfotipo sexual aún presente que continúa generando nuevos clones y aquéllos cuyo morfotipo sexual está extinto. En el primer caso él recomienda tratar al taxón sexual parental y a sus clones como una sola especie, donde los diferentes fenotipos clonales pueden ser denominados taxonómicamente como forma, y donde se espera encontrar individuos transicionales (con cuerpos fructíferos y soredios). En el segundo caso, los clones, habiendo perdido toda fertilidad, son considerados una sola especie y de nuevo sus fenotipos son relegados a forma. Aunque los trabajos de Du Rietz (1924), Poelt (1963, 1970), Tehler (1982) y otros han sido muy influyentes en la implementación del concepto en liquenología, su aplicación es especialista-dependiente. Por ejemplo, además de la biogeografía y la ecología, la presencia de los mismos metabolitos secundarios puede o no ser un prerrequisito para considerar a un par de morfotipos sexuales y asexuales, como pares de especies dependiendo del taxónomo (Mattsson y Lumbsch, 1989). Las diferentes posturas están relacionadas a la interpretación evolutiva del concepto de par de especies. 21 Así, hay quienes expresan una noción adaptativa del surgimiento de los taxa sorediados (p.ej. Bowler y Rundel, 1975). Aunque los sistemas que dan lugar a la reproducción sexual y asexual son presumiblemente independientes, parecen interactuar dentro de los individuos, de tal forma que uno de ellos está usualmente suprimido (Buschbom y Barker, 2006). Es posible que expresar ambos sistemas sea energéticamente muy costoso o puede haber una ventaja ecológica de los propágulos vegetativos, simplemente por tener de entrada el fotobionte disponible y por tanto, tener menos exigencias para la germinación (Bowler y Rundel, 1975). Esta última explicación es comúnmente invocada para explicar las diferencias en la distribución entre morfotipos sexuales y asexuales (p.ej., Tehler, 1982). Para Poelt (1970) y Tehler (1982), las especies secundarias constituyen rutas muertas evolutivamente hablando, es decir, linajes efímeros que persisten mientras las condiciones les sean favorables, pero que no diversifican. Mattsson y Lumbsch (1989) se opusieron enérgicamente a esta opinión, en particular porque incluso los primeros estudios moleculares revelaron amplia variación genética dentro de taxa asexuales. Las mutaciones somáticas, argumentan, también pueden contribuir sustancialmente al potencial evolutivo de estas poblaciones, ya que sus efectos se expresan en los individuos haploides (como es el caso de los ascomicetos). Esto incluye la base genética que deriva en los metabolitos secundarios. Por tanto, no todos los ancestros de las especies secundarias deben ser primarias y la misma exacta química no es esencial (Mattsson y Lumbsch, 1989). Mattsson y Lumbsch (1989) detallaron cinco escenarios taxonómicos posibles (Tabla 1): - Los componentes del par tienen distribuciones simpátricas y formas intermedias. En estos casos se trata de variación inducida ambientalmente y los morfotipos son conespecíficos. - Cuando las contrapartes son mayoritariamente alopátricas, pero existen talos intermedios en simpatría, los autores recomiendan el uso de subespecies. - Si el par es simpátrico sin formas intermediarias, quizá no se trate de un verdadero par de especies, sino taxa muy similares con diferencias fenotípicas inexploradas. Por tanto, ellos recomiendan que se les nombre como especies distintas. - Si las contrapartes ocurren alopátricamente sin formas intermediarias, entonces de nuevo son especies diferentes. - Cuando sólo se conoce la especie secundaria (sorediada), se le asigna el estatus de especie. 22 Tabla 1. Posibles escenarios al lidiar con pares de especies putativos (ver texto). Modificada de Mattsson y Lumbsch (1989). Distribución de las contrapartes Formas Simpátricas Alopátricas Sólo estériles intermedias Rango taxonómico X - - X Conespecíficas - X - X Subespecies X - - - Especies - X - - Especies - - X - Especies Con la introducción de herramientas moleculares ha sido posible poner a prueba el concepto de par de especies y sus variantes. Un caso clásico, por ejemplo, es el de Letharia columbiana (apoteciada) distribuida en Norte América y L. vulpina (sorediada) que se encuentra en Norte América y Europa. Kroken y Taylor (2001) probaron con loci multiples y un concepto genealógico de especie que, aunque ambos taxa en efecto son linajes separados, L. vulpina en realidad consta de varios linajes alopátricos (uno europeo y el resto americanos). L. columbiana por su parte consiste de cuatro linajes. Uno de estos es parafilético al linaje europeo de L. vulpina, y el resto son grupos hermanos y basales del linaje americano de L. vulpina. Aunque no fue posible establecer con claridad la raíz de las reconstrucciones filogenéticas (y por tanto el orden en que se pierden o ganan los caracteres reproductivos), es notable que los dos linajes sorediados producen ocasionalmente apotecios (i.e., no son estrictamente clonales) (Kroken y Taylor, 2001). Myllys et al. (2001) analizaron el par Physcia aipolia (sexual) y P. caesia (asexual) y también obtuvieron que los ejemplares de estrategias reproductivas diferentes se mezclaron en los análisis, y como en Letharia, existe la posibilidad de varios linajes crípticos dentro de P. aipolia + P. caesia. De igual forma, Lücking et al. (2008) encontraron que el par de Heterodermia flabellata (sexual) y H. obscurata (asexual) se mezclan en un clado monofilético, aunque sólo utilizaron un locus. Buschbom y Barker (2006) investigaron la evolución de las estrategias reproductivas en el género Porpidia s.l. usando reconstrucciones de estados ancestrales y pruebas de monofilia. Observaron que la tasa de pérdida de propágulos vegetativos es más alta en las especies de Porpidia s.l que la tasa de ganancia. Es decir, es más común que un linaje pierda la capacidad de propagarse vegetativamente por soralios (y que se reproduzca sólo sexualmente), que un linaje exclusivamente fértil vuelva a adquirir los propágulos vegetativos. Este resultado contradice la noción original del concepto de par de especies, en el que es la 23 especie sexual la que generalmente da origen a la asexual2. En cambio, es posible que los linajes sexuales sean en realidad los derivados, ya que son ellos los que pierden los soralios a partir de un linaje ancestral sorediado y apoteciado (Buschbom y Baker, 2006). Buschbom y Barker (2006) sugirieron que la transición entre modos reproductivos representa pérdidas múltiples de complejos sistemas genéticos que muy probablemente controlan el desarrollo de los soralios, o alternativamente, la presencia de un “modificador genético” que active o desactive vías de señalización preexistentes. Buschbom y Muller (2006) se concentraron en un par de especies también del género Porpidia s.l.: P. flavocoerulescens (sexual) y P. melinodes (sorediada). Analizando la distribución de los modos reproductivos en las reconstrucciones filogenéticas de tres loci, encontraron que los individuos sorediados y los apoteciados no forman grupos monofiléticos; tampoco constituyen simplemente una sola poblaciones recombinante. En cambio, como Kroken y Taylor (2001), plantearon que el supuesto par de especies en realidad consta de cuatro a cinco linajes divergentes. No obstante, a diferencia de Kroken y Taylor (2001), Buschbom y Muller (2006) encontraron conflicto significativo entre loci, que se expresó como relaciones reticuladas en redes de haplotipos, en divergencias profundas. Es decir que mientras cada clado (linaje) estaba más o menos bien definido, la relación entre los clados es reticulada (y según los autores, no explicada por sorteo incompleto de linajes). Buschbom y Muller (2006) propusieron su propia hipótesis. Como ya se comentó, la reproducción por soredios es ventajosa por incluir el fotobionte. Supóngase que una combinación dada de micobionte y fotobionte es exitosa, tanto que al propagarse clonalmente (por soredios) aumenta su frecuencia y produce barridos selectivos en las poblaciones (de manera similar a los ecotipos de Cohen, 2001, 2002). En cambio, si la combinación liquénica tiene baja adecuación, la reproducción sexual promueve no sólo recombinación y el proceso mutacional asociado que genera variación, sino también la posibilidad de encontrar un fotobionte cuyo genotipo sea más adecuado para la simbiosis. Por lo tanto, alternar entre estrategias reproductivas puede en principio conservar lo mejor del sexo y la asexualidad. A su vez, cada barrido selectivo actúa como un cuello de botella y genera poblaciones a partir de un sólo genotipo, dando la impresión de un linaje independiente anidado dentro de una especie recombinante (aunque sea rara vez). Estos linajes pueden en algún momento perderse por barrido selectivo de un nuevo genotipo exitoso, o perderse por recombinación (Buschbom y Muller, 2006). 2 Tradicionalmente se asigna a los individuos con apotecios y soralios al taxón reconocido como asexual. Incidentalmente, los resultados de Buschbom y Muller (2006), Buschbom y Baker (2006) y Kroken y Taylor (2001) son consistentes con esta práctica. 24 De acuerdo con Buschbom y Muller (2006), designar los linajes de P. flavocoerulescens y P. melinodes a especies crípticas implicaría múltiples especiaciones simpátricas seguidas de evolución paralela y/o numerosas reversiones. Apegándose a su hipótesis, Buschbom y Muller (2006) concluyeron que P. flavocoerulescens y P. melinodes son conespecíficas. No obstante, los autores no probaron explícitamente su teoría. Más aún, según Crespo y Pérez- Ortega (2009), dicha teoría supone que: 1) los taxa asexuales no especían y 2) que el micobionte no es capaz de cambiar de fotobionte sin reproducción sexual. Sin embargo, ambos supuestos han sido falseados por lo menos en los géneros Lepraria y Cladonia (Crespo y Pérez-Ortega, 2009 y referencias ahí citadas). En conclusión, es claro que se sabe muy poco de la dinámica biológica (en particular genética y poblacional) detrás del fenómeno al que alude el concepto de par de especies en líquenes. Asociado a esto, el conflicto entre la taxonomía tradicional y el concepto filogenético de especie implica que cada caso putativo de pares de especies debe ser evaluado individualmente con herramientas moleculares y morfológicas, anatómicas y químicas. 1.2.2. El género Usnea Dill. ex Adans La palabra Usnea viene del árabe ušna que significa musgo. Fue usada originalmente para un liquen por Dillenius en su Historia Muscorum en 1742 (Modenesi, 2009). Actualmente, el nombre Usnea se usa exclusivamente para un género cosmopolita muy abundante de hongos ascomicetos liquenizados. Se caracterizan por formar un talo fruticoso arbustivo, subpéndulo o péndulo, con ramificaciones color verde amarillento pálido de simetría radial, ácido úsnico en la corteza y un eje central cartilaginoso (Clerc, 1998). Los fotobiontes en Usnea son especies del género Trebouxia, un alga clorofita unicelular del Orden Microthamniales, Clase Trebouxiophyceae (Friedl y Zeltner, 1994), que dentro del talo liquénico se reproduce por formación de aplanosporas (Anglesea et al. 1983). Se ha logrado reproducir esta alga con cultivos axénicos (i.e., puros), en dónde se ha observado la formación de zoosporas (Ahmadjian, 1965), pero su detección en vida libre es debatible (Tschermak-Woess, 1978; Ahmadjian, 1988). El micobionte Usnea es un ascomiceto ubicado en la Clase Lecanoromycetes, dentro del Orden Lecanorales (Lumbsch y Huhndorf, 2007). Su posición a nivel de Familia ha sido discutida por varios autores. Algunos (p.ej. Poelt, 1973; Hale, 1983) lo separan en su propia Familia, Usneaceae, junto con otros géneros 25 morfológicamente similares (“usneoides”3), tales como Evernia, Letharia, Lethariella, Neuropogon y Protousnea. Otros autores (p. ej. Krog, 1982) clasifican a Usnea dentro de Parmeliaceae, una de las familias de líquenes más grandes y mejor estudiadas, que abarca una gran variedad de morfologías y formas de crecimiento (Mattsson y Wedin, 1998; Crespo et al. 2007; Printzen, 2010). Esta última postura ha sido apoyada con caracteres reproductivos (Krog, 1982) y moleculares en los que Usnea y géneros similares aparecen anidados dentro de Parmeliaceae (Mattsson y Wedin, 1998; 1999; Crespo et al. 2007; 2010; Arup et al. 2007). No obstante, las relaciones entre Usnea y otros géneros no son claras. De hecho, en las filogenias de varios estudios, Usnea tiende a aparecer como el grupo hermano de un gran clado compuesto por líquenes foliosos parmelioides (p. ej., Parmelia, Punctelia, Xanthoparmelia, Parmeliopsis, Bulbothrix, Hypotrachyna y Everniastrum, entre otros), sin embargo el soporte nunca es alto (Mattsson y Wedin, 1998; 1999; Wedin et al. 1999). Los géneros usneoides como Evernia y Pseudousnea suelen divergir más tempranamente en las filogenias y no aparecen como cercanos a Usnea, aunque de nuevo el soporte de sus relaciones es bajo (Crespo et al. 2007; 2010). La delimitación del género también ha sido dinámica. Inicialmente, Motyka (1936-1938) agrupó a varios parmeliáceos con cordón central dentro de Usnea, dividiéndolos en subgéneros y secciones. Aunque las secciones cayeron en desuso, los subgéneros (Protousnea, Neuropogon, Lethariella, Chlorea, Eumitria, Euusnea (o Usnea s. str.)) han sido bastante discutidos. Algunos, como Protousnea y Lethariella fueron más tarde elevados a género (Krog, 1976). En el primer estudio filogenético que usó datos moleculares, Ohmura (2001) reconoció sólo a los subgéneros Usnea y Eumitria, a la vez que propuso el subgénero Dolichousnea y las secciones Usnea y Ceratinae dentro del subgénero Usnea. Articus (2004), también con datos moleculares, elevó a Neuropogon, Eumitria y Dolichousnea a géneros. Simultáneamente, Ohmura y Kanda (2004) concluyeron que Neuropogon se anida dentro del subgénero Usnea y lo consideran una sección. Más tarde Wirtz et al. (2006) utilizaron un muestreo más amplio para concluir que Neuropogon es polifilético, con un clado central hermano de la sección Usnea. Por tanto redujeron Neuropogon a sinónimo de Usnea subgénero Usnea. En su denominación actual, Usnea es un género conspicuo y de diversidad excepcional. Sin embargo, la identificación a nivel de especie puede ser extremadamente difícil debido a la alta variabilidad morfológica y química, la 3 Caracterizados por talos fruticosos, corteza para y/o prosoplectenquimatosa, con hifas nunca arregladas de manera periclinal (Crespo et al. 2007). 26 sobreposición fenotípica entre taxa o la existencia de ejemplares con características atípicas (Lendemer y Tavares, 2003; Tõrra y Randlane, 2007; Kelly et al., 2011). De hecho, no hay un claro consenso en cuanto a cuál es el número de especies en el mundo. La monografía mundial de Motyka (1936-1938) contiene 451 especies y numerosas entidades infraespecíficas, de las cuales muchas corresponden a variación ambiental o geográfica (Clerc, 1997, 1998; Halonen et al., 1998). Se mencionan cifras desde 600 o más especies (Wirtz et al. 2006), c. 500 (Culberson et al., 1983), más de 300 (Truong et al., 2011), ó c. 250 (Clerc, 2007). De igual forma, varios autores consideran a Usnea como “(...) one of the taxonomically most difficult of macrolichen genera (...)” (Halonen et al., 1998 p. 43; ver también Clerc, 1998 y Azami et al., 2004). 1.2.2.1. Ecología y distribución de Usnea Usnea (si se incluye a Neuropogon) es un género presente en todo el mundo. Contiene especies cortícolas y saxícolas que se desarrollan principalmente en sitios húmedos, fríos o templados y bien iluminados (Herrera-Campos, 1998; Halonen et al., 1998). Junto con otros géneros fruticosos como Alectoria y Bryoria, constituye el hábitat de muchos invertebrados que a su vez son alimento de numerosas aves paserinas (Pettersson et al., 1995). En general se sabe poco de la biología de Usnea spp., probablemente debido a la dificultad taxonómica que conlleva. Los trabajos ecológicos donde se mencionan a especies de Usnea suelen reportar pocos taxa o se limitan a circunscripciones amplias (“sensu lato”), además de que son casi exclusivamente en ambientes europeos, canadienses o estadounidenses (p.ej. Boudreault et al. 2000; Aragón et al. 2010; Bergamini et al., 2005; pero ver Hauck y Javkhlan, 2009). Sin embargo, es claro que las especies de Usnea persisten comúnmente en los árboles más viejos y grandes (Hilmo, 1994), así como en bosques menos perturbados (Boudreault et al. 2000). Se ha demostrado que varias especies son vulnerables a contaminantes atmosféricos. Por ejemplo, U. amblyocada y U. barbata han resultado útiles en estudios de biomonitoreo en ambientes áridos y urbanos de Argentina (Carreras y Pignata, 2000; Conti et al., 2009). Pruebas con soluciones metálicas indican que el cobre (Cu2+), el plomo (Pb) y el níquel (Ni) son los metales más nocivos para U. amblyocada (Carreras y Pignata, 2006). Bernasconi et al. (2000) notaron que también Usnea densirostra es sensible a estos metales. Adicionalmente, algunas especies están amenazadas, como U. longissima en Europa, principalmente por actividades forestales (Esseen et al. 1981). 27 Bajo la taxonomía moderna, la distribución de muchas especies abarca continentes. Por ejemplo, Usnea ceratina se considera típica de todo el Hemisferio Norte (Articus et al. 2002; Ohmura, 2002; Shen, 2008; Kelly et al. 2011; Herrera- Campos et al. 1998) con reportes de Suramérica (Rodríguez Saavedra et al. 2010). En el otro extremo, hay algunas especies endémicas de regiones geográficas pequeñas, como U. sanctaritae, que está restringida a México (Herrera-Campos et al. 1998). En cuanto a la altitud, en México el género se distribuye desde 1300 m (excepcionalmente 360 m) hasta 4000 m sobre el nivel del mar (msnm), abarcando varios de tipos de vegetación, incluyendo matorral xerófilo, bosque mesófilo de montaña y bosque de coníferas. Algunas especies cubren amplios intervalos de altitud, como U. dasaea que va desde 200m hasta 3000m de altitud. Otras en cambio, habitan en altitudes más restringidas, como U. mexicana que sólo se encuentra entre 1200 y 1850 m altitud (Herrera-Campos et al. 1998; 2001). Finalmente, Herrera-Campos et al. (1998) detectaron patrones geográficos en la composición específica de las comunidades: 1) especies más comunes en la Faja Volcánica Transmexicana; 2) especies que ocurren al norte y sur de la Faja Volcánica Transmexicana; 3) especies que ocurren más hacia el sur; y 4) especies raras o muy poco frecuentes. No obstante, parece ser que la Faja Volcánica Transmexicana contiene la mayor cantidad de especies en el país (Herrera-Campos, comunicación personal). 1.2.2.2. Reproducción en Usnea En el género Usnea es común que haya especies exclusivamente apoteciadas y especies que sólo produzcan soredios/isidios. Cuando apoteciadas, es también frecuente encontrar picnidios asociados. Se piensa que las estructuras de reproducción son perennes, por lo que pueden tomarse como indicativo de actividad reproductiva. De acuerdo con Bowler y Rundel (1975) más del 50% de las especies de Usnea se reproducen por propágulos vegetativos, ya sean isidios, soredios o los dos. De hecho, la norma es que un solo ejemplar tenga ambas estructuras. En otros géneros esto es más bien poco frecuente, especialmente fuera de las familias Parmeliaceae y Lobariaceae (Bowler y Rundel, 1975). Los soredios se producen en rupturas de la corteza llamadas soralios, que pueden o no estar claramente delimitados por un margen cortical. Al desprenderse del talo parental, los soredios se establecen y crecen en pequeñas grietas de la corteza de árboles o de rocas. Por otra parte, se piensa que algunas especies de Usnea son capaces de reproducirse por fragmentación del talo (p.ej. Usnea longissima: Keon y Muir, 2002) y se ha sugerido también que las espínulas (fibrillas 28 muy cortas, ver inciso 5.2) de Usnea probablemente tienen una función similar (Ryan et al., 2002). 1.2.2.3. El concepto de especie en Usnea De acuerdo con Clerc (1998), Motyka (1936-1938) usó una visión tipológica para definir especies de Usnea en su monografía mundial. En ella, las especies son vistas como unidades invariantes basadas en un “tipo perfecto”, de tal forma que un solo estado de carácter basta para definir una nueva especie (Clerc, 1998). Esta práctica llevó a la descripción de numerosas “especies” que probablemente son sinónimos de taxa morfológicamente variables (Clerc, 1998). A partir de los trabajos de Swinscow y Krog (p.ej., 1975, 1979) y de los autores subsecuentes, en general se ha utilizado un concepto poblacional, reconociendo la importancia de la variación intraespecífica (Clerc, 1998). Más aún, la especie en Usnea se definió a partir de una combinación única de caracteres morfológicos, anatómicos y químicos, de los cuales por lo menos dos, que se suponen como independientes, deben estar correlacionados (Herrera-Campos et al., 1998). Por tanto, los quimiotipos no son considerados especies por sí mismos. Según Clerc (1998) en la definición de especies también es necesario que individuos de formas intermedias (llamados a veces híbridos, p.ej. Clerc, 1984; Halonen et al., 1998) estén ausentes u ocurran en muy baja frecuencia. La única excepción a la definición de nuevas especies con un solo carácter es cuando se aplica el concepto de par de especies (Herrera-Campos et al., 1998). Por tanto, Usnea es un género rico en ejemplos de pares, entre los que destacan U. florida y U. subfloridana. En los últimos años, el uso de datos moleculares ha influenciado fuertemente la definición de especies de Usnea, en particular dentro de Neuropogon (p.ej. Wirtz et al., 2011, 2012; ver inciso 2.2). No obstante, aún falta incorporar esta aproximación dentro de la taxonomía de las especies tropicales y templadas, que constituyen el grueso de la diversidad del género. 29 2. Antecedentes 2.1. Marcadores usados en sistemática molecular de hongos La mayoría de los estudios publicados en hongos liquenizados que usan datos moleculares se han basado en genes nucleares ribosomales (rADN) (Grube y Kroken, 2000). Otros marcadores genéticos también han sido propuestos y utilizados (ver adelante), pero lo cierto es que una aplastante mayoría de estudios de sistemática molecular en hongos se han basado en un sólo locus. Este fue el caso de alrededor del 82% de 595 estudios revisados por Lutzoni et al. (2004). 2.1.1. Los genes ribosomales En los eucariotas, los rADN están arreglados en unidades a manera de operón que se transcriben juntas (Fig. 1). Estas unidades están repetidas unas tras otras (en tandem) separadas por un “espaciador” que no se transcribe (nontranscribed spacer; NTS). Cada una contiene, a partir del extremo 5', un espaciador transcrito externo (external transcribed spacer; ETS), seguido de la unidad pequeña del ribosoma (small subunit of ribosome; SSU o 18S), un espaciador transcrito interno (internal transcribed spacer; ITS), la subunidad grande del ribosoma (large subunit of the ribosome; LSU o 28S) y otro ETS en el extremo 3'. Además, dentro del ITS, se encuentra el 5.8S rRNA, y en sus extremos 5' y 3', están el ITS1 e ITS2, respectivamente (van Keulen et al., 1992; Goldman et al., 1983; Hunter et al., 2007). Al conjunto de 5' ETS + NTS + 3' ETS es llamado espaciador intergénico (intergenic spacer; IGS) (Calonje et al., 2009). Figura 1. Esquema del operón de rARN donde se muestra una unidad y el inicio de otra. Las abreviaciones son como en el texto. Las regiones no están a escala. Modificado de Calonje et al. 2009. La ARN polimerasa I es la encargada de transcribir de cada operón un precursor de ARN (preARN), que luego es cortado y procesado, resultando en los rADN maduros que forman parte del ribosoma (Alberts et al., 2007; Venema y 30 Tollervey, 1999). Parte de este proceso incluye la escisión de los espaciadores transcritos por endo y exoribonucleasas (Venema y Tollervey, 1999). En el caso del ITS, parece haber cierta conservación de estructura secundaria, importante para el correcto procesamiento del resto de los genes ribosomales (Liu y Schardl, 1994; Côté y Peculis, 2001; Hunter et al., 2007). No obstante, el tamaño y composición nucleotídica del ITS1 puede variar ampliamente entre eucariotas: desde algunas decenas de pares de bases hasta más de mil, con contenido de GC que puede ir desde el 19% hasta el 95% (Gottschling y Plötner, 2004; Liu y Schardl, 1994). El ITS2 es igualmente variable (Michot et al., 1999; Joseph et al., 1999). En contraste, el 5.8S está altamente conservado, posiblemente por su relevancia en la formación del ribosoma: su pertenencia ancestral a la LSU ha sido sugerida por la homología que presenta con el extremo 5' de la LSU de bacterias (Jacq, 1981). Debido a su tasa mutacional relativamente elevada, el ITS es usado con frecuencia en análisis a nivel de poblacionales, especies y géneros (Grube y Kroken, 2000; Calonje et al., 2009; Kroken y Taylor, 2001; Leavitt et al., 2011a, 2011b), ya que secuencias más divergentes pueden resultar muy difíciles de alinear (Schmitt et al., 2009). De igual forma, el ITS ha sido propuesto oficialmente como región de “código de barras” de hongos (Schoch et al., 2012) y constituye el grueso de las secuencias de Usnea disponibles en bases de datos públicas. Esto último es extensible al resto de los hongos (ver Lutzoni et al., 2004 y Schoch et al., 2012). La SSU y la LSU en cambio, evolucionan más lentamente y se utilizan usualmente para reconstruir relaciones filogenéticas más o menos profundas (Grube y Kroken, 2000; Gargas et al., 1995a; Miadlikowska y Lutzoni, 2004; Wanderlei-Silva et al., 2003). Sin embargo, se ha detectado una gran incidencia de inserciones, en particular intrones tipo I, en ambos genes (Johansen y Vogt, 1994; Gutiérrez et al., 2007). Los intrones tipo I son ribozimas que catalizan su propia escisión a partir el preARN (Cech, 1988) y llegan a medir entre 200 y 1400 pb de largo, aproximadamente (Johansen y Vogt, 1994). Son abundantes en hongos liquenizados, por lo que pueden utilizarse en reconstrucciones filogenéticas cuando su presencia está fija en el grupo (Grube y Kroken, 2000). Más allá de la calidad de la información filogenética que incluyen los rADN, su amplia utilización se basa en la facilidad para amplificarlos por la reacción en cadena de la polimerasa o PCR (Schoch et al., 2012). Esto se debe a que el operón está representado por muchas réplicas en el genoma. Las células de humanos, por ejemplo, contienen alrededor de 200 copias por genoma haploide, repartidas en pequeños grupos en cinco diferentes cromosomas (Alberts et al., 2007), Neurospora crassa tiene aproximadamente 200 repeticiones en el grupo de 31 ligamiento V (Russell y Rodland, 1986), mientras que en Arabidopsis thaliana hay dos grupos con cerca de 1500 copias en diferentes cromosomas (Liao, 1999). Todas estas copias se mantienen iguales gracias a un proceso llamado evolución concertada, es decir, la evolución no independiente de los miembros de una familia de repeticiones (Liao, 1999). Dicha evolución conjunta implica que hay mayor similitud en la secuencia de las repeticiones dentro de una especie que con respecto a las de otra especie (Arnheim et al., 1980). El proceso molecular responsable es llamado “homogeneización” y aunque no está claramente dilucidado, se cree que involucra un cierto número de eventos de recombinación, reparación y mecanismos de replicación, como entrecruzamiento cromosómico asimétrico entre repeticiones y conversión génica (Liao, 1999; Ganley y Kobayashi, 2007). No obstante, en ocasiones la evolución concertada no es completa. Por ejemplo, O'Donnell y Cigelnik (1997) detectaron dos copias no ortólogas de ITS2 en el complejo de hongos fitopatógenos Gibberella fujikuroi, de las cuales una se amplifica con mucha mayor frecuencia con primers conservados. Esto puede llevar a discordancias entre el ITS y otros genes (Grube y Kroken, 2000). 2.1.2. Los genes codificantes para proteínas: MCM7 y TSR1 Además de los datos ribosomales nucleares y sus contrapartes mitocondriales, varios genes que codifican para proteínas han sido usados con regularidad en la sistemática molecular de hongos. De estos destacan la subunidad más grande (RPB1) y segunda más grande de la RNA polimerasa II (RPB2), el factor de transcripción y elongación, la β – tubulina, la actina, la calmodulina y la quitina sintasa (p.ej., Begerow et al., 2004; Buschbom y Muller, 2004; Lutzoni et al., 2004; Matheny, 2005; Peever et al., 2004; Schoch et al., 2009; Zalar et al. 2008). Sin embargo, el uso de estos marcadores (como con los ribosomales) está usualmente asociado a razones prácticas e históricas, por disponibilidad de primers o para permitir la comparación entre estudios. Tratando de promover el uso de loci codificantes por su calidad filogenética per se, Aguileta et al. (2008) analizaron los genomas de Fungi disponibles hasta ese momento en busca de genes adecuados. Específicamente, localizaron genes de copia única constantes en hasta 21 genomas y con ellos generaron una filogenia “genómica”. Luego evaluaron el desempeño de cada gen comparando la topología de las filogenias derivadas de cada loci con la filogenia genómica. Entre sus resultados más relevantes, destaca la identificación de dos genes, MS277 y en especial, MS456, que obtuvieron los mejores puntajes topológicos, es decir, los que reconstruyeron más efectivamente la filogenia genómica. Más aún, los genes más populares en sistemática molecular no figuraron 32 entre los mejores genes, en parte por su propensión a tener parálogos (p.ej., β – tubulina; Ayliffe et al., 2001 o RPB1; Matheny, 2005), pero sobre todo por puntajes topológicos bajos (Aguileta et al. 2008). MS277 corresponde al gen TSR1, una proteína que actúa durante la biogénesis del ribosoma. En particular, interviene tardíamente en la síntesis del 40S (18S más muchas proteínas) y se requiere para la maduración del 43S (40S inmaduro) o para su transporte al citoplasma desde el nucleolo (Gelperin et al., 2001). La eliminación de TSR1 resulta en la acumulación del 20S (un precursor del 18S), de ahí el nombre (Twenty S rRNA accumulation; Gelperin et al., 2001). MS456, por su parte, es el gen MCM7 que codifica para una de las seis proteínas del complejo MCM (minichromosome maintenance proteins; Bochman y Schwacha, 2009). Dicho complejo tiene actividad helicasa, y actúa en la iniciación de la replicación del ADN durante la fase G1 del ciclo celular (Lei y Tye, 2001). Las proteínas MCM se oligomerizan en complejos en forma de anillo, los cuales se adhieren a ATP y lo hidrolizan para manipular su sustrato (el ADN) dentro de su canal central (Bochman y Schwacha, 2009). Como se intuye por sus funciones, la pérdida de MCM7 y de TSR1 es letal para la célula, lo que lleva a que estas proteínas sean relativamente conservadas en eucariotas (Bochman y Schwacha, 2009; Gelperin et al., 2001). Rápidamente Schmitt et al. (2009) diseñaron primers degenerados para amplificar fragmentos de entre 600 y 800 pares de bases (pb) de ambos genes (TSR1 y MCM7) en Pezizomycotina, con posibilidad de extensión a Saccharomycotina y Basidiomycota. Para ello generaron varias secuencias de, entre otros grupos, Lecanoromycetes (incluyendo Usnea). Encontraron suficiente información filogenética como para resolver relaciones más o menos profundas pero también intragenéricas (Schmitt et al., 2009). Adicionalmente, localizaron una región hipervariable en el TSR1 que puede ofrecer información a escalas más finas. Con base en sus resultados, estos autores predijeron gran potencial de estos loci en combinación con otros más típicos para la reconstrucción de relaciones filogenéticas en hongos (Schmitt et al., 2009). 2.2. Estudios con datos moleculares en Usnea En general, los estudios de Usnea que han utilizado datos moleculares han tenido siempre enfoques filogenéticos y/o han intentado delimitar especies. Probablemente la única excepción es también de los primeros estudios explícitamente enfocados en Usnea, si no es que el primero. Se trata de una evaluación de la diversidad genética de poblaciones de Usnea filipendula que 33 reinvadieron zonas previamente muy contaminadas de Alemania (Heibel et al., 1999). Usando RAPDs, los autores interpretaron los resultados como evidencia de múltiples fuentes de invasión. Sin embargo, el análisis de Hiebel et al. (1999) supuso directamente que U. filipendula es en verdad una sola especie. El resto de los estudios han abarcado desde la definición de secciones y exclusión de géneros (ver Apartado 1.2.2) hasta el análisis concienzudo de complejos de especies cercanamente relacionadas. En principio, el género Usnea (ya monofilético) puede incluir a su vez a Dolichousnea, Eumitria y Neuropogon como lo demuestran los trabajos de Ohmura (2001, 2002), Articus (2004), Ohmura y Kanda (2004) y Wirtz et al. (2006). Estas definiciones se basaron en caracteres morfoanatómicos, químicos, en el ITS (Ohmura, 2001; 2002; Ohmura y Kanda, 2004; Articus, 2004; Wirtz et al., 2006) y en la β – tubulina (Articus, 2004). A nivel de especie, Articus et al. (2002) evaluaron un famoso par de especies europeo usando ITS y β – tubulina: U. florida (sexual) y U. subfloridana (predominantemente asexual). Incluyeron diferentes quimiotipos, así como una o dos secuencias de diferentes especies europeas. Se encontró que estos taxa son conespecíficos. No obstante, es posible que existan varias especies filogenéticas en el conjunto U. florida + U. subfloridana (Saag et al., 2011). Similarmente, Ohmura (2008), por su parte, usó el ITS y datos morfológicos y químicos para separar U. rubicunda de U. rubrotincta. Dentro del género entero, las usneas neuropogonoides son las que gozan de mayor escrutinio filogenético, y sobre todo, la mayor cantidad de trabajo en la delimitación de especies usando datos moleculares en combinación con taxonomía clásica. Dichos trabajos han sido efectuados en gran medida por N. Wirtz y colaboradores (ver abajo) y han escalado poco a poco en la complejidad del grupo. Una vez establecido que Neuropogon es polifilético (Wirtz et al. 2006), estos autores se concentraron en tres grandes complejos de especies que aparecen como un grupo central emparentado con la sección Usnea. Primero, Seymour et al. (2007) exploraron morfológica y genéticamente la definición de cinco especies comunes en áreas polares usando ITS y la RPB1. Después, Wirtz et al. (2008) utilizaron datos morfológicos, químicos e ITS, IGS y RPBI para profundizar en la delimitación del llamado complejo de U. perpusilla, una especie fértil. Estos estudios detectaron nuevas especies filogenéticas. Más tarde, Wirtz et al. (2008) usaron el concepto cohesivo de Templeton (2001) que permite trabajar con taxa asexuales distinguibles por su cohesividad demográfica y ecológica (Templeton et al., 2000). Aplicaron análisis filogenéticos, genealógicos, estimaron recombinación, y analizaron la distribución de los caracteres morfológicos y químicos en los linajes detectados. Encontraron que la 34 apoteciada U. perpusilla en realidad consta de tres linajes que los autores reconocieron como especies diferentes, con posibilidad de especiación críptica entre dos de ellos. Asimismo, detectaron dos especies no descritas. De manera llamativa, estos autores encontraron que las especies asexuales tenían distribuciones geográficas más amplias que las sexuales, como ya se ha visto en otras especies de Usnea no neuropogonoides (Herrera-Campos et al., 1998). Lumbsch y Wirtz (2011) ampliaron el muestreo para abarcar la previamente subestimada diversidad de este grupo. Con los mismos marcadores, construyeron una filogenia que aunque no se resolvió completamente, sí permitió rescatar grupos de especies cercanas. Así, localizaron por lo menos 11 especies monofiléticas. Wirtz et al. (2012) expandieron su investigación para reevaluar los grupos de U. aurantiaco-atra y U. sphacelata usando de nuevo el concepto cohesivo. Encontraron que los ejemplares apoteciados y sorediados de U. antarctica (asexual y a veces sexual) y U. aurantiaco-atra (sexual) se mezclan en las reconstrucciones filogenéticas y se separan en tres grupos con cierto grado de estructura geográfica usando el análisis de clados anidados. Reconocieron que U. acromelana es una especie distintiva en Sudamérica y la Península Antártica, pero notan que no están emparentadas con ejemplares de Nueva Zelanda (de donde viene el holotipo), por lo que aunque el taxón está bien definido regionalmente, la distribución global quizá esté mal interpretada. Además, las circunscripciones morfológicas respecto a las estrategias reproductivas no siempre se cumplieron al comparar con los clados formados en el análisis de clados anidados. Por último, estos autores usaron el índice de deferenciación FST para corroborar que la definición de cada especie basada en el concepto cohesivo agrupa organismos genéticamente más uniformes que los conceptos tradicionales. Por su parte, Saag et al. (2011) se enfocaron en las especies europeas con talos sorediados y arbustivos de Usnea sección Usnea usando ITS y β – tubulina y un concepto filogenético. Además incorporaron otras 15 especies de la sección Ceratinae. Encontraron que mientras la bien soportada sección Usnea se caracteriza por ramas cortas (i.e., especies muy cercanas), la pobremente soportada sección Ceratinae presenta ramas largas. Varias especies taxonómicas se recuperaron como monofiléticas, mientras que los miembros del llamado agregado de U. fragilescens no formaron un solo clado. Los autores concluyeron que las circunscripciones morfológicas y químicas coinciden en gran medida con los evidenciados por datos moleculares (Saag et al., 2011), lo que contrasta con la visión de Wirtz et al. (2012) y Lumbsch y Wirtz (2011), en la que las usneas neuropogonoides esconden aún mucha diversidad bajo los nombres tradicionales. Sin embargo, es cierto que las especies europeas han recibido mucha más atención taxonómica. 35 Finalmente, Kelly et al. (2011) evaluaron la efectividad del ITS como código de barras en las especies de Usnea y otros líquenes de Gran Bretaña e Irlanda. En los análisis filogenéticos, algunas de sus secuencias no se agregaron con los clados de su especie putativa y los soportes internos del árbol fueron bajos. Por tanto, el ITS no resultó como un código de barras satisfactorio para Usnea. 2.3. Delimitación de especies de Usnea en México El grueso de los trabajos taxonómicos realizados en México han sido llevados por Herrera-Campos y colaboradores (Clerc, 2007; Clerc y Herrera-Campos, 1997; Herrera-Campos, 1998; Herrera-Campos et al., 1998, 2001). Investigaciones anteriores se limitaron a reportes florísticos, cuyas determinaciones se hicieron sin conocimiento de los metabolitos secundarios, lo que las vuelve cuestionables (ver Herrera-Campos et al., 1998, Montañez Colin, 2000 y referencias ahí citadas). Herrera-Campos (1998) reportó cuarenta y tres especies y cuatro agregados de Usnea en bosques templados de México, utilizando un concepto de especie que implica la combinación única de caracteres morfológicos, anatómicos y químicos. En esta delimitación, las razas químicas no tienen nivel taxonómico. Asimismo, se adoptó el concepto de par de especies, diferenciando entre ejemplares exclusivamente sexuales y los que son asexuales (Herrera-Campos et al., 1998). Clerc y Herrera-Campos (1997) incluyeron a México en su estudio de las especies saxícolas; Herrera-Campos et al. (1998) se concentraron en las especies péndulas de México, diferenciando por lo menos 17 taxa; y Herrera-Campos et al. (2000) trataron extensamente el agregado de U. fragilescens, ampliando el concepto del complejo a especies sexuales. Finalmente, Clerc (2007) proveyó una clave de las especies que ocurren en la Región del Desierto de Sonora. De manera importante, dichos autores incluyeron mapas de distribución de todas las especies y comentarios sobre su ecología. Aunque estas investigaciones han colocado a México dentro de los países cuyas comunidades de Usnea están mejor exploradas, las delimitaciones tradicionales de especie no han sido evaluadas con datos moleculares. Éstos pueden ser especialmente útiles en grupos difíciles, morfológica y químicamente cercanos, y en la exploración del concepto de par de especies, de los cuales México tiene varios ejemplos, como U. ceratina y U. cristatula, U. brasiliensis y U. ramillosa s.s., U. cornuta y U. cirrosa, entre otros. 36 3. Objetivos 3.1. Objetivo general Contribuir a la delimitación de especies del género Usnea en bosques templados de México usando datos moleculares, taxonomía clásica y diferentes métodos analíticos para detectar empíricamente las propiedades secundarias asociadas a los límites entre las especies. 3.2. Objetivos particulares -Establecer un contexto filogenético preliminar del género a partir de datos moleculares. -Detectar especies potenciales dentro de las comunidades mexicanas y evaluar su concordancia con la definición tradicional de taxa en México y el mundo. -Investigar en particular la delimitación de especies de: -La sección Usnea en México. -U. ceratina y aliados. -U. rubicunda y aliados. -El agregado de U. fragilescens. -Explorar la hipótesis del par de especies dentro del género usando casos de taxa mexicanos. -Inferir características de la biología poblacional de especies mexicanas a partir de estimados de diversidad genética y demografía histórica. 4. Hipótesis I) El uso de un criterio filogenético como evidencia de distintas especies en México y el mundo sugerirá más especies de las reconocidas por evidencias morfológicas, anatómicas y químicas, como se ha observado en otros grupos de hongos. Debido a que el objeto de estudio es la comunidad de especies mexicanas, se espera encontrar desde especies muy divergentes hasta altamente emparentadas. II) Se espera que la condición reproductiva para separar especies exhiba éxito variable como carácter taxonómico. III) Se espera que por lo menos algunas especies tengan distribuciones más reducidas de las originalmente postuladas. 37 5. Materiales y Métodos 5.1. Material biológico La colecta fue efectuada en bosques templados de diferentes altitudes y composiciones florísticas, sin conocimiento a priori de la especie colectada (excepto en el caso de U. rubicunda, en el que el pigmento es evidente), sin preferencia particular por talos de algún habito (péndulo, subpéndulo o arbustivo), ni tamaño, más allá del mínimo indispensable para extraer ADN sin destruir el ejemplar. Esta estrategia permitió incorporar material inmaduro o con enfermedades leves que, aunque usualmente es evadido por su dificultad taxonómica (Clerc, 1998), también ofrece información de la variación morfología, química y sobre todo, genética de la especie. A su vez da un indicador cualitativo, aunque muy burdo, de la abundancia de las especies colectadas en las diferentes comunidades. Los sitios de recolecta se ubicaron en los estados de Oaxaca, Hidalgo, Michoacán, Jalisco, Sinaloa, Durango, Veracruz y Querétaro (Fig. 2), que fueron visitados de octubre 2010 a noviembre de 2011. A cada localidad le fue asignado un número propio que va del cero (0) al siete (7). Dicho número es la cifra inicial en la clave de cada ejemplar. La segunda cifra es el número de árbol (el sustrato) dentro de la localidad. La tercera cifra es el número único de cada ejemplar. Así, el ejemplar 4.38.61 fue colectado en la localidad 4 (en Talpa de Allende, Jalisco), en el árbol número 38 y su clave única es el número 61. Estas claves pueden reducirse (como se aprecia en los árboles filogenéticos y las redes) descartando el sustrato, i.e., 4.61. Alternativamente, el primer y segundo número son sustituidos por una abreviatura del estado de la República en cuestión para favorecer la rápida comprensión de la geografía (p.ej. Jal.61). A continuación se enlistan las localidades donde se colectaron los ejemplares de Usnea usados en este estudio. 0. Localidades únicas: En algunos lugares (Oaxaca, Veracruz, Hidalgo y Querétaro) sólo se colectaron uno o dos especímenes, por lo que se agruparon en la “Localidad” 0. De éstos, el ejemplar 0.4.5 se colectó de manera separada en la Sierra Norte de Oaxaca, por lo que, aunque se incluye en la localidad 0, es en realidad parte de la localidad 1. Los ejemplares 0.3.3 y 0.3.4 son un caso especial ya que fueron colectados en los límites de la Sierra Madre Oriental en un matorral xerófilo de Querétaro dominado por Yucca spp. Los nombres alternativos de cada ejemplar son: para los ejemplares 0.1.0 y 0.1.1, Ver.0 y Ver.1; para 0.2.2, Hid0.2; para 0.3.3 y 0.3.4, Que.3 y Que.4; y para 0.4.5, Oax0.5. 38 1. Santiago Comaltepec, Oaxaca: Esta localidad corresponde a los territorios de la comunidad chinanteca Santiago Comaltepec, donde Usnea es abundante y se tiene la denominación general niih4 para estas especies en lengua chinanteca. Forma parte de la Sierra Norte de Oaxaca. Nombre alternativo: Oax1. 2. Parque Nacional del Chico, Hidalgo: Es parte de la Sierra Madre Oriental (Morrone et al., 2002). El género, y en particular Usnea ceratina, son muy abundantes en esta área natural protegida. Nombre alternativo: Hid. 3. Puerto de la Soledad, Oaxaca: Zona de bosque mesófilo de montaña, con perturbaciones severas en algunas áreas. Usnea es más o menos abundante. Se encuentra en el límite de la Sierra Norte de Oaxaca y la Faja Volcánica Transmexicana. Nombre alternativo: Oax2. 4. Talpa de Allende, Jalisco: Bosques templados muy húmedos donde hay encinos, pinos, abetos y elementos de bosque mesófilo de montaña. Usnea spp. es abundante. Forma parte del denominado Bloque Jalisco (Rosas-Elguera et al., 1996) cuyas afinidades biogeográficas no son claras (Salas-Lizana et al., 2011). Nombre alternativo: Jal. 5. Zinapécuaro, Michoacán: En el límite municipal de Zinapécuaro y Ciudad Hidalgo. Usnea no es tan común (predominando U. ceratina). Es una zona muy perturbada donde se explota la madera y la resina de pino. Forma parte de la Faja Volcánica Transmexicana. Nombre alternativo: Mich1. 6. Reserva de la Biosfera de la Mariposa Monarca, Michoacán: localidad de altitud elevada, donde Usnea no es tan conspicua. Los talos se encuentran comúnmente en zonas altas de los troncos o sobre las ramas de abetos. Forma parte de la Faja Volcánica Transmexicana. Nombre alternativo: Mich2. 7. La Concordia, Sinaloa y Puerto Buenos Aires, Durango: Uno de los ejemplares fue colectado en Santa Rita, a 1615 msnm en una zona perturbada donde Usnea no es tan común, en Sinaloa. El resto pertenecen a un bosque de Pino-Encino muy húmedo y conservado donde Usnea es abundante, en los límites de Durango y Sinaloa. Forma parte de la Sierra Madre Occidental. Nombre alternativo: Dur. 5.2. Caracteres morfológicos y anatómicos Cada ejemplar fue asignado preliminarmente a una especie de acuerdo a sus características y posteriormente sometido al análisis filogenético. En caso de incongruencias, los talos fueron reevaluados y designados a los taxa pertinentes. Asimismo, se examinaron ejemplares adicionales previamente identificados del 4 Vocablo obtenido de entrevistas durante el trabajo de campo en la comunidad. 39 Herbario Nacional del Instituto de Biología de la Universidad Nacional Autónoma de México (MEXU), que fueron colectados en diversas localidades de México no muestreadas en este estudio. En este trabajo se utilizó la aproximación taxonómica de Clerc (1998), Clerc y Herrera-Campos (1997), Herrera-Campos et al. (1998, 2001) y Ohmura (2001) para el género Usnea. Los caracteres usados por estos autores son estándar en la identificación y delimitación de especies en el grupo. La descripción detallada de las estructuras y la anatomía pueden encontrarse en dichas referencias pero una breve definición se da a continuación. Figura 2. Sitios de muestreo. Los círculos representan comunidades muestreadas (más de 3 individuos) enumeradas del 1 al 7, y las estrellas representan localidades donde se colectaron sólo uno o dos ejemplares (Localidad “0”). Los puntos de colecta de 0.4.5 y 0.2.2 no se muestran porque prácticamente se traslapan con las localidades 1 y 2, respectivamente. 5.2.1. Morfología Talo El talo es siempre fruticoso con simetría radial. Muchas especies poseen un punto de anclaje al sustrato desde donde se ramifica. Otras especies pueden carecer de dicho punto, colgando o enredándose en las ramas del forofito (el árbol o arbusto sobre el que crecen). El hábito de crecimiento puede ser: 1) erecto, en las que 40 todas las ramas crecen erectas y con ángulos más o menos rectos entre ellas; 2) subpéndulo, en el cual hay ramas tanto erectas como colgantes; y 3) péndulo, en que las ramas son colgantes y paralelas entre sí (Herrera-Campos et al., 1998, 2001; Ohmura, 2001; Fig. 3). Figura 3. Hábito del talo en Usnea. A. Erecto, B. Subpéndulo y C. Péndulo. Editado de Ohmura (2001). El tamaño del talo varía mucho entre especies y entre micrositios, desde algunos centímetros hasta dos metros y medio o más. El color suele ser desde verde oliváceo (atribuido al ácido úsnico), verde amarillento, rojizo o café rojizo. Dichos colores se modifican con el almacenamiento como material de herbario. Algunos pigmentos pueden ser de utilidad taxonómica, pero en general parecen estar sujetos a variabilidad ambiental. La ramificación es dicotómica y puede ser anisotómica (ramificación desigual) o isotómica (ramificaciones iguales) (Ohmura, 2001). La densidad de ramificación cambia mucho la apariencia del talo en general, pero Herrera-Campos et al. (1998) considera que este carácter es variable en las especies mexicanas y no tiene valor taxonómico. Tronco o base Herrera-Campos et al. (1998) lo definen como parte del talo que se extiende desde el punto de anclaje hasta la ramificación principal. Puede ser muy corto e indistinguible o largo (hasta 28 mm). Puede ser concoloro con el resto del talo, más pálido o tener distintas coloraciones de café, negro y naranja-rojizo (Herrera- Campos et al., 1998; Ohmura, 2001). 41 Ramas Se considera que la primera ramificación a partir del tronco da lugar a las ramas principales, que suelen ser las más gruesas. Las siguientes ramificación son secundarias, terciarias, etc. (en conjunto, laterales). Todas suelen estar más o menos segmentadas, pero las características de la segmentación pueden tener valor taxonómico. A lo largo de su longitud, las ramas pueden ser cónicas si se adelgazan lentamente hacia las puntas (en inglés “tapered”), cilíndricas si tienen diámetro constante a lo largo de su longitud y luego decrecen abruptamente hacia los ápices, o irregulares si el diámetro varía a lo largo de la rama (Herrera-Campos et al., 1998). En sección transversal las ramas pueden ser cilíndricas, aplanadas, estriadas (si hay pequeñas estriaciones que no deforman los segmentos), irregulares (cuando los segmentos están deformados), acostilladas y aladas (con proyecciones trapezoidales de la corteza). En sección longitudinal, los segmentos de las ramas pueden a su vez ser cilíndricos, acostillados, trapezoidales o estar constreñidos hacia los extremos (Herrera-Campos et al., 1998) dando en ocasiones la apariencia de estar hinchadas (Ohmura, 2001). Fibrillas Apéndices laterales compuestos de corteza, médula y eje que pueden desprenderse y actuar como propagación vegetativa. Pueden ser cortas (3-5mm) o muy largas (15mm). En el primer caso suelen llamarse espínulas (Clerc, 1984). Algunas especies (p.ej. U. filipendula) presentan fibrillas distribuidas uniformemente a lo largo de la rama de ambos lados, dando la apariencia de vértebras de pez. Al desprenderse, la base de la fibrilla es llamada fibérculo y se diferencian de los tubérculos porque presentan eje central (Clerc y Herrera-Campos, 1997). Ohmura (2001) considera que las fibrillas son estados juveniles de las ramas laterales, distinguiéndolas porque el eje central de la fibrilla no está unido al eje central de la rama. En cuanto se unen, la fibrilla puede crecer y volverse una rama lateral (ver Fig. 5 de Ohmura, 2001). Pseudocifelas Poros que ocurren en la corteza con hifas medulares empaquetadas débilmente en el interior. Son más chicas que las anatómicamente más complejas cifelas (que no existen en Usnea) y, junto con éstas, se piensa que disminuyen la resistencia de la corteza a la difusión de gases (Büdel y Scheidegger, 2008). Adicionalmente, Ohmura (2001) las define como aperturas de la corteza en las ramas que exponen tejido medular y que carecen de cualquier propágulo asexual. 42 Para Usnea, Herrera-Campos et al. (1998) las considera discontinuidades de la corteza delgadas, alongadas y fusiformes que no desarrollan soralios. Ohmura (2001) advierte que pueden confundirse con maculas (secciones de la rama donde la corteza es más delgada y no hay fotobiontes, dando la apariencia de estar deslavado; sí pueden presentar soredios o isidiomorfos), pero las pseudocifelas carecen totalmente de corteza y nunca forman soredios. Adicionalmente, Ohmura (2001) distingue a las pseudocifelas elongadas longitudinal o irregularmente, de las anulares. Estas últimas son similares a las grietas anulares pero el espacio entre segmentos está hinchado y rodeado por mácula. Soralios Porciones decorticadas del talo donde se desarrollan propágalos asexuales (soredios e isidiomorfos). Los soredios pueden ser farinosos o granulares. Son de gran importancia taxónomica (Herrera-Campos et al., 1998), en particular su origen (en la corteza, tubérculos o papilas, fibérculos o grietas en la corteza); situación con respecto a la corteza (superficial, elevado o excavado); superficie (plana, cóncava, convexa o capitada); tamaño relativo al grosor de la rama donde está; forma (punctiforme, circular, longitudinal o transversalmente oblongo, o irregular); densidad (separados, parcialmente confluentes o totalmente confluentes); márgenes (con o sin); y localización (en las ramas principales, secundarias, terminales o en fibrillas). Isidiomorfos Los isidios son proyecciones sobre la corteza o sobre soralios que tienen una organización interna similar a la del talo liquénico, i.e., con capas corticales incluyendo a la capa de fotobionte (Nash y Gries, 2002). Herrera-Campos et al., (1998) consideran que las estructuras en Usnea que cumplen esta descripción no son homólogas a las de otros líquenes, por lo que las llaman isidiomorfos. Para Usnea, Halonen et al. (1988) los define como crecimientos pequeños, corticados, en forma de dedos o raramente ramificados que carecen de eje central, y que sirven como propágulos vegetativos. Truong et al. (2011) propone el nombre de isidiofibrillas a aquellas estructuras similares a isidiomorfos que desarrollan de manera secundaria un eje central una vez que alcanzan cierto tamaño. Se distinguen de las fibrillas porque las isidiofibrillas pueden crecer agrupadas a partir de pseudocifelas o de un soralio, mientras que las fibrillas crecen individualmente de la corteza, no de la médula. Cuando las isidiofibrillas se rompen, no dejan cicatrices estípitadas (fibérculos). 43 Adicionalmente, las isidiofibrillas se mantienen cortas (1mm), delgadas y suaves, nunca rígidas como las fibrillas, y no se desarrollan en ramas (Truong et al., 2011). Apotecios Los ascomas de Usnea son apotecios, con discos comúnmente pruinosos, más o menos grandes (hasta 2cm o más), con colores naranja-rosado, verde-amarillento o rara vez café oscuro (Neuropogon), con fibrillas, picnidios y en raras ocasiones soredios en los márgenes o incluso isidiomorfos en la superficie inferior. Las ascas contienen 8 ascosporas, que consisten cada una de una célula elipsoidal incolora (Halonene et al., 1988). Picnidios Los picnidios en Usnea están inmersos en la corteza pero pueden ser más o menos protuberantes. Son pálidos o pigmentados. Los conidios constan de una célula incolora, baciliforme, comúnmente alargada de un lado (Halonen et al. 1988). 5.2.2. Anatomía Corteza Está compuesta por plecténquima (tejido falso sin un crecimiento meristemático) de hifas orientadas radial o irregularmente, conglutinadas de manera laxa o firme. Dentro de la corteza hay dos clases de hifas: leptodermatosas (hifas con paredes celulares delgadas e inconspicuas, con una luz amplia) y paquidermatosas (hifas con paredes celulares extremadamente gruesas y una luz pequeña). El diámetro de ambos tipos es más o menos más grande que el de hifas medulares. Estas diferencias son importantes para la definición de Secciones de Ohmura (2001), quien distingue cuatro tipos de corteza: florida, merrillii, ceratina y eumitria. Superficialmente, la corteza puede presentar papilas (protuberancias de tejido cortical), tubérculos (protuberancias de tejido cortical y médula) o ambas (Herrera-Campos et al., 1998; Ohmura [2001] las considera sinónimos). También pueden ocurrir depresiones (foveolas) o pliegues longitudinales y transversales que deforman la rama. Algunas especies presentan grietas transversales, que en ocasiones contienen oxalato de calcio (Herrera-Campos et al., 1988). El color de la corteza puede ser amarillo pálido o rojo. El primero se debe a la presencia del ácido úsnico, pero el segundo es de naturaleza desconocida (Ohmura, 2001), no soluble en acetona. La pigmentación rojiza puede ser continua, en parches o en forma de puntos rojos. Puede ser parte de la corteza, o estar justo por debajo de la misma (Truong et al. 2011). 44 Médula La médula es el espacio entre la corteza y el eje central, incluyendo a la capa del fotobionte. Las hifas pueden tener una apariencia laxa (hifas separadas y distinguibles con el estereomicroscopio), densa (hifas visiblemente individuales pero aglutinadas), o compacta (con hifas aglutinadas individuales indistinguibles). Puede presentarse pigmentos rojizos, rosas, amarillos o marrones cerca del eje, cerca de la corteza o a todo lo ancho (Herrera-Campos et al., 1998; 2001). Ohmura (2001) atribuye el color rosado a rojizo de la médula de U. ceratina, U. baileyi y U. mutabilis a la acumulación de bixantonas como eumitrina por fuera de la pared celular de las hifas. Eje El eje es un cordón cartilaginoso que corre a todo lo largo del talo. Se compone de prosoplecténquima (tipo de plecténquima compuesto de hifas alongadas arregladas anticlinalmente; Büdel y Scheidegger, 2008). Hay dos tipos de ejes: fistuloso y sólido. El primero tiene un hueco central o perforaciones más o menos continuas por dentro del eje, y es característico del subgénero Eumitria. El segundo es sólido a lo largo, pero en raras ocasiones puede haber fístulas en partes viejas del talo (Ohmura, 2001). Proporción de corteza, médula y eje (CMA) La proporción entre los tres caracteres anatómicos tiene valor taxonómico (Clerc, 1984, 1998; Clerc y Herrera-Campos, 1997; Herrera-Campos et al., 1998, 2001). De acuerdo a Clerc (1984), la corteza, médula y eje son medidas en la rama primaria más gruesa en su parte más ancha (por encima del tronco). Con ayuda de una navaja se corta unos milímetros en orientación longitudinal hasta la mitad del diámetro de la rama. Se mide el grosor de la corteza, la médula y el eje, y se divide cada uno entre la longitud total de la rama obteniendo así una medida relativa que se usa como porcentaje (Fig. 4). En caso de hacer mediciones en varias ramas, se utiliza la media aritmética de los porcentajes. Clerc (1984) utiliza las siguientes fórmulas para calcular el CMA y así lo reporta en las descripciones de sus subsecuentes trabajos: (c1+c2)/2 = C (m1 + m2)/2 = M A + 2M + 2C = B %C = (C/B) x 100 %M = (M/B) x 100 %A = (A/B) x 100 45 Figura 4. Esquema del corte longitudinal de una rama principal de Usnea y las medidas que constituyen el CMA. Tomado de Clerc (1984). En algunas ocasiones, en este trabajo la proporción de la corteza y la medula se calcularon con respecto al diámetro y no al radio (i.e., sin dividir entre dos: C’M’A) con la finalidad de que la suma de %C', %M' y %A completara el 100%, es decir: c1+c2 = C’ m1 + m2 = M’ A + M + C = B %C’ = (C/B) x 100 %M’ = (M/B) x 100 %A = (A/B) x 100 Para comparaciones directas con la literatura, basta dividir los valores de %C’ y %M’ a la mitad. Esta división tiene una finalidad práctica, pues al identificar un espécimen el investigador tiende a percibir la corteza y la médula sólo de un lado para comparar los grosores. Sin embargo, los resultados cualitativos son los mismos. Truong et al. (2011) comenta que el cociente entre el porcentaje del eje y el de la médula (proporción A/M) es útil para segregar grupos de especies sudaméricas con pigmentación en o por debajo de la corteza. 5.3. Caracteres químicos Para la caracterización química de los ejemplares se empleó la técnica de cromatografía de capa fina (TLC, por sus siglas en inglés). Este método es el más utilizado comúnmente para identificar productos liquénicos y está basado en la estandarización de Culberson y colaboradores (Culberson, 1972; Culberson et al., 1981; Elix y Stocker-Wörgötter, 2008). El procedimiento es el siguiente: Se usan placas comerciales de sílicagel (en este caso, 'BAKER' Si250F TLC Plate-Silica Gel, Reino Unido) con tres o más sistemas de solventes (típicamente los 46 llamados A, B y C) con dos (o más) controles internos (p.ej. atranorina, ácido norestíctico, ácido galbínico, ácido fumarprotocetrárico, ácido protocetrárico y ácido lecanórico). Las sustancias se extraen de un trozo pequeño del talo sumergiéndolo en acetona. Se coloca dicho extracto con un capilar varias veces sobre una línea a un centímetro de la base de la placa de sílicagel y se corre en alguno de los solventes. Tras anotar las características de las manchas obtenidas (en luz visible, luz UV de onda corta ó 254nm y luz UV de onda larga ó 365nm), la placa se rocía con una solución de ácido sulfúrico al 10% y se hornea a 100ºC por 10 a 15min (esto revela muchas sustancias, como terpenos y derivados fenólicos). Se detallan los cambios de coloración de las manchas en luz UV de onda larga. Los ácidos grasos se identifican humedeciendo la placa y observando, mientras la placa se seca, manchas opacas contra una superficie negra. Cada mancha obtenida es asignada dentro de una clase de Rf, determinada por su posición relativa a los controles. Finalmente, dentro de los compuestos en la literatura con dicha clase de Rf, se buscan aquéllos con características similares (color, fluorescencia en luz UV, etc.) a los de la mancha obtenida para identificarla (Culberson, 1972; Elix y Stocker-Wörgötter, 2008). En este estudio se usaron los siguientes solventes (ver Bungartz, 2002b; Culberson et al., 1981; Culberson y Johnson, 1982; Elix y Stocker-Wörgötter, 2008): Solvente C. Tolueno + ácido acético (170:30), solvente general para una gran variedad de compuestos. Solvente B’. Ciclohexano + metil tert-butil eter + ácido fórmico (140:72:18), da buena separación de compuestos que difieren poco debido a la longitud de las cadenas laterales o el número de grupos C-metil. Con especial relevancia para distinguir el ácido protocetrárico del fumarprotocetrárico en el caso de U. subscabrosa y U. subrubicunda. Adicionalmente, se emplearon las llamadas pruebas de tinción, que consisten en aplicar un pequeño volumen de una sustancia química (Pd, K, C) en alguna sección del talo, y dependiendo de la reacción uno puede inferir la presencia de ciertas sustancia liquénicas (ver Bungartz, 2002b). Pd: También conocido como P o PD; es una solución saturada de p- fenilenodiamina en alcohol etílico al 95%, muy poco estable, por lo que se prepara en el momento disolviendo cristales de p-fenilenodiamina en algunas gotas de alcohol. Reacciona amarillo o rojo con depsidos y depsidonas que contienen grupos aldehídos. Se sabe que es irritante para la piel y se ha sugerido que es carcinogénico (Dobson, 2001). 47 K: Solución al 10% de hidróxido de potasio (10g de KOH en 100ml de agua destilada). Es útil para diferenciar entre antraquinonas y derivados de ácido pulvínico. Las antraquinonas naranjas o rojas se vuelven morado oscuro con K. Lo derivados de ácidos pulvínicos no reaccionan (K-) o tienen una reacción rojiza muy débil. El pigmento cortical atranorina (una despida) se vuelve amarillo con K (K+) y el ácido norestíctico (una depsidona) forma cristales naranja rojizo. C: Solución acuosa saturada de hipoclorito de calcio [Ca(OCL)2]. La solución es muy inestable, pero puede sustituirse con el cloro casero. Da un tono rosa rojizo con depsidas y xantonas que contienen dos grupos hidroxilo (-OH) libres en la posición meta. La reacción desaparece rápidamente. Si se aplica K primero y luego C encima, la reacción se intensifica. 5.4. Extracción de ADN Previo a la extracción de ADN total, se obtuvieron entre 8 y 20mg del eje central de los ejemplares de Usnea para evitar contaminación de otros hongos (liquenícolas o parásitos). Para algunos ejemplares muy pequeños y los géneros Alectoria y Everniastrum, se usaron trozos completos sin mayor tratamiento. Se pulverizó el tejido usando nitrógeno líquido, pistilo y mortero. Se utilizó el DNeasy® Plant Mini Kit de QIAGEN (Hilden, Alemania) de acuerdo a las instrucciones del fabricante, excepto por las modificaciones siguientes: El buffer AP1 y la ARNasa A se agregaron sobre el tejido pulverizado aún estando en el mortero y la mezcla se recuperó en un tubo Eppendorf. La incubación a 65°C se prolongó hasta 15 o 18 minutos, mezclando cada 2 a 3 minutos. La dilución final se hizo en agua destilada ultra pura con un volumen de entre 30 y 100μl, dependiendo de la cantidad de tejido utilizado. El resto de los pasos de extracción no se alteraron. 5.5. Protocolos de PCR y secuenciación Se usó la solución de ADN genómico de la extracción sin diluir para todas las reacciones de PCR (15 – 30 ng de ADN/μl). Los primers utilizados, tanto para PCR como para secuenciación, se enlistan en la Tabla 2, junto con sus referencias. Todas las amplificaciones se llevaron a cabo en un termociclador automático (2720, Applied Biosystems). Los productos de PCR se visualizaron en geles de agarosa al 1% teñidos con bromuro de etidio. La secuenciación Sanger se efectuó con los mismos primers usados en la PCR, a través del servicio ofrecido por High Throughput Genomics Center, del Departamento de Ciencias Genómicas de la Universidad de Washington, Seattle, E.U.A.. Algunas secuencias, en especial las de 48 calidad baja, de amplificación mala o con mutaciones inusuales, fueron secuenciadas una segunda o incluso tercera vez para confirmar la información. ITS Se usaron los primers ITS1F y NL6A para amplificar la región del ITS, incluyendo la porción inicial de la LSU. Alternativamente, se emplearon los primers ITS4 e ITS5, amplificando sólo la región del ITS. La mezcla de PCR consistió de 10.8µl de agua ultra pura, 5µl de GoTaq® Flexi Buffer 5x (Promega, Madison), 2.5µl de solución de MgCl2 25mM, 0.25µl de cada dNTP 10mM, 1µl de cada primer 10µM, 0.5µl de albúmina de suero bovino (BSA) o dimetilsulfóxido (DMSO), 0.2 de ADN Polimerasa GoTaq® (5u/µl, Promega, Madison) y 3µl de ADN genómico (para algunos ejemplares cuya amplificación fue insuficiente, se usaron hasta 6µl de ADN). Las amplificaciones se llevaron a cabo con los siguientes parámetros: desnaturalización inicial 94ºC por 8 min; 34 ciclos de 94ºC por 10 seg, 55ºC por 20 seg y 72ºC por 1:11 seg; seguidos por una extensión final de 72ºC por 6min. El programa para MCM7/TSR1 con primers específicos de Usnea (ver adelante en el texto) también resulta útil, especialmente ejemplares cuya amplificación es deficiente. MCM7 Para la obtención de este gen se utilizaron los primers de Schmitt et al. (2009) Mcm7-709for y Mcm7-1348rev, con la siguiente mezcla de PCR (30µl): de 3.6µl de agua ultra pura, 6µl de GoTaq® Flexi Buffer 5x (Promega, Madison), 3.6µl de solución de MgCl2 25mM, 4µl de cada dNTP 10mM, 2µl de cada primer 100µM, 2µl de BSA, 1µl de DMSO, 0.8µl de ADN Polimerasa GoTaq® (5u/µl, Promega, Madison) y 5µl de ADN genómico. Las amplificaciones se llevaron a cabo de acuerdo al programa de Schmitt et al. (2009) con temperatura de alineación entre 45 y 49ºC (dependiendo de la especie). El producto de PCR se visualizó en geles de agarosa al 1.2%. La banda del tamaño correspondiente al reportado por Schmitt et al. (ídem) se escindió con una navaja y se purificó usando el QIAquick® Gel Extraction Kit de QIAGEN (Hilden, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. Con las secuencias obtenidas de 1.4.5B (U. ceratina), 1.29.64 (U. ceratina), 2.1.1 (U. ceratina), 2.2.3 (U. ceratina), 2.7.10 (U. lecanorica), 2.16.23 (U. ceratina) y las secuencias de Schmitt et al. (2009) de Everniopsis trulla (número de ascenso o accession number [AC] en Genbank: GQ272396), Parmeliopsis hyperopta (GQ272426) y Usnea endochrysaea (GQ272417), y de Schmitt et al. (2010) Pertusaria pustulata (GU981002), se diseñaron primers internos para Usnea: UMcm7F y UMcm7R (Tabla 2). 49 Para la amplificación usando los primers UMcm7 se elaboró la siguiente mezcla de PCR: 9.3µl de agua ultra pura, 5µl de GoTaq® Flexi Buffer 5x (Promega, Madison), 2.5µl de solución de MgCl2 25mM, 0.5µl de cada dNTP 10mM, 1µl de cada primer 10µM, 1µl de BSA (ó 0.5µl de DMSO), 0.2 de ADN Polimerasa GoTaq® (5u/µl, Promega, Madison) y 3µl de ADN genómico. El programa de amplificación fue el siguiente: desnaturalización inicial 94ºC por 5 min; 35 ciclos de 94ºC por 1 min, 58ºC por 1:20 min y 72ºC por 1:20 min; seguidos por una extensión final de 72ºC por 5min. TSR1 Con los primers TSR1-1453for y TSR1-2308rev (Schmitt et al, 2009), se elaboraron reacciones de PCR (50µl): 17µl (ó 10 en casos difíciles) de agua ultra pura, 10µl de GoTaq® Flexi Buffer 5x (Promega, Madison), 6µl de solución de MgCl2 25mM, 4µl de cada dNTP 10mM, 2µl de cada primer 10µM, 2µl de BSA, 1µl DMSO, 1µl de ADN Polimerasa GoTaq® (5u/µl, Promega, Madison) y 5µl (ó 12µl) de ADN genómico. El programa de termociclador fue el mismo que el de Schmitt et al. (2009). Alternativamente, se utilizó el siguiente programa de amplificación: desnaturalización inicial 94ºC por 10 min; 20 ciclos de 94ºC por 45seg, 48ºC por 50seg y 72ºC por 1min; 30 ciclos de 94ºC por 45seg, 49ºC por 50seg y 72ºC por 1min; 5 ciclos de 94ºC por 45seg, 50ºC por 50seg y 72ºC por 1min; seguidos por una extensión final de 72ºC por 5min. Con las secuencias obtenidas de 2.1.1 U. ceratina, 1.26.56 U. cornuta s.l., 1.29.64 U. ceratina y las secuencias de Schmitt et al. (2009) de Flavoparmelia marchantii (GQ272463), Bulbothrix apophysata (GQ272434) y Usnea endochrysaea (GQ272461) se elaboraron primers internos para Usnea: UTsr1F y UTsr1R. Para éstos, la mezcla de PCR y el programa de amplificación es igual que para los primers UMcm7. Algunos ejemplares de U. baileyi y de U. mexicana (i.e. del subgénero Eumitria) amplificaron dos a cuatro bandas con los primers UTsr1, por lo que la banda del peso adecuado fue escindida y purificada con el QIAquick® Gel Extraction Kit de QIAGEN (Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La solución purificada se utilizó como ADN plantilla en una reamplificación con temperatura de alineación de 56°C a 59°C. Los ejemplares 4.19.30 (U. cf. mexicana), 4.25.40 (U. cf. mexicana), 4.31.48 (Everniastrum sp.) no amplificaron con los primers UTsr1. Por otra parte, el ejemplar 1.30.67 (Alectoria sp.2) amplificó sólo una banda de alrededor de 400pb (de menor tamaño al esperado) con los primers UTsr1. Por tanto, para estos casos 50 se utilizaron los primers Tsr1-1453for y Tsr1-2308rev (Schmitt et al, 2009) con el programa alternativo (ver arriba) a 48°C de alineación. La banda purificada se reamplificó con los primers UTsr1 (temperatura de alineación entre 52°C y 58°C), que también se usaron en la secuenciación. 5.6. Alineamiento, particiones y preparación de matrices de datos Para cada ejemplar se obtuvieron las secuencias en sentidos forward y reverse, que se alinearon utilizando el programa BioEdit versión 7.0.5.3 (Hall, 1999) y su implementación de Clustal W (Thompson et al., 1994). En caso de conflicto, se verificaron los electroferogramas. Las secuencias de ITS se identificaron con los motivos CATTA- y –GACCT que representan los extremos terminales 3’ y 5’ de la SSU y la LSU adyacentes a las regiones ITS1 e ITS2, respectivamente (Dentiger et al., 2010). Al usar los primers UMcm7 las secuencias se delimitaron a partir del motivo 5’ – GAAATCTTT … ACATCTAGA – 3’ para MCM7 (con ocasionales ligeras modificaciones en las secuencias flanqueantes) que corresponden a las posiciones 775 y 1253 de Aspergillus nidulans (Genbank: XM_658504). De la misma forma, al usar los primers UTsr1 se delimitaron en 5’ – GAAGACCGAG … ACATGTTCTTC – 3’ que en Aspergillus nidulans (XM_658778) son las posiciones 1558 y 2226 (Fig. 5). Para corroborar su identidad, las secuencias fueron sometidas a búsquedas BLAST (Altschul et al., 1990). Adicionalmente, se descargaron 328 secuencias de ITS de Usnea de Genbank, abarcando los estudios de Articus et al. (2002), Articus (2004), Seymour et al. (2007), Shen et al. (2008), Ohmura (2002; 2008), Ohmura y Kanda (2004), Wirtz et al. (2006, 2012), Kelly et al. (2011) y Saag et al. (2011). Cada secuencia fue asignada con un número arbitrario del 0 al 327 para distinguirlas de las muestras mexicanas (Anexo E). Una vez que se obtuvieron los datos moleculares se procedió a alinear las secuencias. En primera estancia, se hicieron cuatro grandes matrices: TSR1, MCM7, datos ribosomales mexicanos y datos ribosomales mexicanos más los de Genbank. Una quinta matriz de ITS correspondió a los ejemplares que amplificaron una inserción en la SSU (ver sección 6. Resultados). Con la matriz de datos ribosomales mexicanos se generaron dos submatrices: ITS e ITS más un fragmento 5’ de la LSU. Adicionalmente, se elaboraron matrices específicas de especie, o especies muy cercanas. Dado que no se detectaron conflictos importantes entre genes (soportes de bootstrap (BS) > 70%) en los análisis filogenéticos (ver sección 6. Resultados), los genes se concatenaron en una matriz multilocus (ITS + MCM7 + TSR1). 51 Tabla 2. Primers utilizados para obtener las secuencias de ITS, MCM7 y TSR1 de Usnea, Everniastrum y Alectoria. La longitud de producto se da por pares de primers utilizados. Figura 5. Localización de los primers de Schmitt et al. (2009) utilizados y los diseñados en este estudio para Usnea (UMcm7F/R y UTsr1F/R). Los números de los primers Tsr1-1453for/Tsr1-2308rev y Mcm7- 709for/Mcm7-1348rev se refieren a la ubicación en la secuencia de Aspergillus nidulans. En comparación, los números junto a las líneas punteadas por debajo de cada gen son los inicios de la secuencia obtenida para Usnea (ver texto). Las flechas horizontales indican la dirección de amplificación. Modificada de Schmitt et al. (2009). Región genómica Primer Dirección Secuencia (5' - 3') Autor Longitud aproximada del producto ITS1-F Forward CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A Gardes y Bruns, 1993 850 (1100) ITS NL6Amun Reverse CAA GTG CTT CCC TTT CAA CA Egger, 1995 ITS5 Forward GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G White et al., 1990 540 ITS4 Reverse TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC White et al., 1990 Mcm7-709for Forward ACI MGI GTI TCV GAY GTH AAR CC Schmitt et al., 2009 640 Mcm7 Mcm7-1348rev Reverse GAY TTD GCI ACI CCI GGR TCW CCC AT Schmitt et al., 2009 UMcm7F Forward CCT GTG ATC GAT GTG GWT SC Este estudio. 550 UMcm7R Reverse GKA GAA GCG CTT TCT TCA CAT C Este estudio. Tsr1-1453for Forward GAR TTC CCI GAY GAR ATY GAR CT Schmitt et al., 2009 750 Tsr1 Tsr1-2308rev Reverse CCI GAY GAR ATY GAR CTI CAY CC Schmitt et al., 2009 UTsr1F Forward TGG GAG ACG AGC GAA GAC CGA Este estudio. 618 UTsr1R Reverse TCT TCC TTG TTG AAG AAC ATG Este estudio. 52 La matriz de datos ribosomales mexicanos más los de Genbank (en adelante llamada “del mundo”) tiene una buena representación de la sección Usnea, de Neuropogon, y un muestreo somero sobre la gran diversidad de la sección Ceratinae. No obstante, por ubicación geográfica, Europa y la Antártida están sobre representados. No hay ningún representante de Australia ni del África y muy pocos de Asia. En total comprende 57 nombres, un “sp.”, dos “aff.” y un “cf.” (i.e., 61 taxa). Las secuencias 203 (FR799115), 204 (FR799116), 211 (FR799117), 225 (FR799114) y 279 (JN086291) de GenBank tienen una gran cantidad de datos faltantes, por lo que se utilizaron para la alineación pero no para los análisis subsecuentes. Esto no afectó el número de taxa finales. Debido a la baja resolución que resulta de descartar las partes ambiguas en la alineación que abarca todas las secuencias (i.e., Alectoria, Everniastrum y Usnea, incluyendo a Eumitria, Dolichousnea y Neuropogon), se elaboraron de manera adicional submatrices de la sección Usnea enraizando con miembros de la sección Ceratinae (elegidos arbitrariamente) y de la sección Ceratinae enraizando con U. subrubicunda y U. cf. cavernosa, que parecen ser basales a la sección Usnea (ver sección 6. Resultados). En las alineaciones de taxa muy cercanamente emparentados (p.ej. U. brasiliensis con U. cornuta s.l.), donde no hay sitios ambiguos, sólo se descartaron los extremos con datos faltantes y ocasionales inserciones de varios pares de bases que sólo se presentaron una vez en todo el muestreo. La alineación se llevó a cabo usando el servidor en línea de MAFFT versión 6 (Katoh et al., 2002; Katoh y Toh, 2008; http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/) con la estrategia Auto para TSR1 (usando las secuencias de aminoácidos y las matrices de sustitución de aminácidos BLOSSUM62 y 80) y MCM7 (nucleótidos), o E-INS-i para los datos ribosomales, la cual es útil cuando hay varios motivos conservados intercalados con zonas difíciles de alinear. El resultado fue revisado y editado “a ojo” en BioEdit. En el caso de rADN, se usó como guía la metodología de Benavides et al. (2007) para alineación manual de intrones, con el fin de mejorar la alineación de MAFFT. Dicha metodología se basa en dos principios: el primero es que los indels (inserciones y deleciones) representan un sólo evento mutacional; el segundo es que el alineamiento es más parsimonioso cuando los indels se ubican de tal forma que preservan bloques de secuencias integrales (i.e., sin indels, con identidad máxima de pares de bases). Como orientación adicional, se utilizó la herramienta de predicción de estructura secundaria de ITS2 de la ITS2 Database (Chen et al., 2010; http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de consultada durante abril 2012) con las opciones preestablecidas. De igual forma, para el ITS1, 53 se comparó la alineación con la secuencia y estructura secundaria de Cladonia merochlorophaea (Beiggi y Piercey-Normore, 2007). Finalmente, se utilizó el programa Gblocks versión 0.91b en línea (Castresana, 2000; Talavera y Castresana, 2007; http://molevol.cmima.csic.es/castresana/Gblocks_server.html) para detectar posiciones ambiguas o pobremente alineadas usando las condiciones rigurosas preestablecidas, o exacerbándolas con la opción de no permitir muchas posiciones continuas no conservadas. Dichas regiones fueron eliminadas de las matrices de datos finales. 5.7. Modelos de sustitución nucleotídica y distancias genéticas Se usó jModelTest versión 0.1.1 (Posada, 2008) para estimar la verosimilitud de cada modelo de sustitución nucleotídica, incluyendo los valores estimados para cada parámetro. Se partió de una búsqueda con 11 esquemas, calculando la frecuencia de las bases (+F), la proporción de sitios invariantes (+I) y la distribución gamma de heterogeneidad (+G) con cuatro categorías. Como base se usó la matriz de cada grupo de datos sin los haplotipos repetidos, que fueron descartados con DAMBE versión 5.2.57 (Xia y Xie, 2001; Xia, 2001). Para elegir entre modelos se usó el Criterio de Información de Akaike corregido (AICc; Akaike, 1973; Sugiura, 1978; Hurvich y Tsai, 1989) y el Criterio de Información Bayesiano (BIC; Schwartz, 1978). Los estimados de distancia se efectuaron usando MEGA versión 5 (Tamura et al., 2011) implementando el modelo y el parámetro de la distribución gamma estimado por JModelTest. Se ha visto que la distribución de las distancias genéticas no necesariamente es normal (Johns y Avise, 1998), por lo que se usó la Prueba U Wilcoxon-Mann-Whitney no paramétrica en comparaciones pareadas de medias. 5.8. Delimitación de especies 5.8.1. Métodos para delimitar especies En una primera instancia, la determinación taxonómica con base en caracteres morfológicos, anatómicos, químicos y reproductivas constituye por sí misma una hipótesis de los límites entre especies. Por tanto, la taxonomía clásica actuó como evidencia de propiedad secundaria por sí misma (i.e., distinción fenotípica y fisiológica). 54 Tres aproximaciones topológicas fueron empleadas para determinar los límites entre especies: 1.-Inferir el árbol de cada gen y compararlos por separado. Esto permite detectar casos obvios de sorteo incompleto de linajes o incongruencias entre la historia de los genes muestreados. 2.-Inferir el árbol usando a los loci concatenados, bajo el supuesto de que en conjunto reflejarán la filogenia de las especies. Esta aproximación es conservadora, ya que favorece las partes de las topologías que son constantes entre genes pero no a aquéllas en donde la historia de cada gen difiere (Wiens, 1998). 3.-Emplear una aproximación de “criterio de exclusividad” (Baum y Shaw, 1995), en la que se genera un árbol de consenso estricto entre los árboles de los tres loci. En el caso de especies con algún grado de sexualidad, los límites entre divergencia y evolución reticulada deben ser evidentes en los nodos más exclusivos y bien soportados. Este método responde al concepto genealógico de especie (Baum y Shaw, 1995). Sin embargo, no es conveniente cuando las especies se encuentran en procesos iniciales de divergencia o cuando son parafiléticas, por lo que puede verse como un método estricto que requiere aislamiento genético y fijación recíproca de todos los loci muestreados dentro de las especies analizadas (Kroken y Taylor, 2001). Se construyeron redes de haplotipos para determinar las relaciones genealógicas y geográficas de los haplotipos, incluyendo poblaciones simpátricas (mexicanas) y alopátricas (en México y en otras partes del mundo a través de las secuencias de Genbank). Asimismo, se emplearon para señalar la distribución de caracteres reproductivos o la posición de individuos peculiares (U. brasiliensis). Como veremos en el Apartado 6.1 de Resultados, algunos taxa presentan un intrón tipo I en la SSU. La presencia o ausencia de un indel en el extremo 3' del intrón se tomó como evidencia adicional para los límites entre especies, suponiendo que el evento mutacional que le dio lugar es inusual y complejo, y por lo tanto menos sujeto a homoplasia. Asimismo, se estimó la diferenciación genética a través de los estadísticos FST y KST/KST* (ver más adelante) y se infirió recombinación en casos donde el tamaño de muestra lo permitió (U. ceratina, U. rubicunda, U. cornuta y U. brasiliensis). Por último, la exploración de la dinámica poblacional en taxa donde se sabe poco o nada de su biología y ecología ofrece herramientas adicionales, en particular en escenarios evolutivos, para interpretar los patrones exhibidos por otros métodos (incluyendo la taxonomía clásica). Por tanto, para U. ceratina, U. cornuta s.l. y U. 55 brasiliensis se estimaron estadísticos descriptivos de diversidad y se efectuaron pruebas de neutralidad en búsqueda de desviaciones explicadas por escenarios tales como expansiones o contracciones poblacionales. 5.8.2. Inferencia filogenética Para estimar las relaciones filogenéticas con máxima verosimilitud (ML) se usó la versión en línea de RAxML BlackBox (Stamatakis et al., 2008; http://phylobench.vital-it.ch/raxml-bb/) con la aproximación CAT para modelar la heterogeneidad de tasas de sustitución (ver adelante) y con proporción de sitios invariantes (si la estimación de JModelTest indicaba que lo ameritaba). La aproximación CAT tiene la ventaja de ser computacionalmente más eficiente que el modelo gamma (Γ) y produce resultados equivalentes (Stamatakis, 2006). RAxML BlackBox emplea la aproximación CAT durante el bootstrapping, pero usa el modelo Γ para estimar la verosimilitud de la mejor topología. En la aproximación CAT se estima la tasa ri de cada sitio dentro de una alineación con m patrones (sitios). Dependiendo de la distribución de las ri, se formulan c categorías con sus propias tasas pj donde j = 0, …, c – 1, con las cuales se calcula la función de verosimilitud. La sobreparametrización se evita manteniendo c << m (Stamatakis, 2006). Por su parte, el modelo Γ discreto utiliza típicamente 4 categorías con sus propias tasas de sustitución relativas r0 a r3. Al estimar las probabilidades de los cuatro nucleótidos (A,T,C,G) de un sitio de la alineación para un nodo ancestral en la filogenia, hace falta estimar estas probabilidades para las cuatro categorías discreta de Γ (Izquierdo-Carrasco et al., 2011). Con la aproximación CAT, en cambio, sólo se utiliza un parámetro (pj), reduciendo el tiempo computación cerca de cuatro veces (Stamatakis, 2006). Alternativamente, se usó la versión en línea del programa PhyML 3.0 (Guindon et al., 2010) usando el modelo de sustitución sugerido por JModelTest o el(los) más simple(s) y cercano(s) disponibles en PhyML, con cuatro categorías para la distribución gamma, un árbol de inicio BIONJ (Gascuel, 1997), 1000 réplicas de BS no paramétrico y algoritmo de búsqueda intercambio del vecino más cercano (nearest neighbor interchange), en conjunto con el podado e injertado de subárbol (subtree pruning and regrafting). Ramas con valores de BS mayores a 70% fueron considerados como soportadas (Van de Peer, 2009; pero ver Hillis y Bull, 1993). Los árboles se visualizaron y manipularon en FigTree versión 1.3.1 (Rambaut, 2009) y Dendroscope versión 3.0.14beta (Hudson et al., 2007). El árbol consenso estricto de los tres loci para los datos mexicanos se calculó con 56 Dendroscope, tratando a los dos ejemplares de E. vexans (4.48 y 4.46) como si fueran el mismo individuo. 5.8.3. Redes de haplotipos Se usó el programa TCS versión 1.21 (Clement et al., 2000) para construir redes de haplotipos usando la aproximación de parsimonia estadística propuesta por Templeton et al. (1992). En ella, las mutaciones compartidas entre haplotipos que surgen por un solo evento mutacional son consideradas parsimoniosas. Los haplotipos son unidos por el número de eventos mutacionales que los separa cuando la probabilidad de que dichos haplotipos (que difieren por j sitios pero comparten m sitios) tengan una relación parsimoniosa es mayor a 0.95 (o algún criterio de significancia dado) (Templeton et al., ídem). Cuando las mutaciones no pueden considerarse parsimoniosas bajo ese nivel de probabilidad, mutaciones tanto parsimoniosas como no parsimoniosas son permitidas entre haplotipos hasta que la probabilidad acumulativa exceda 0.95 (Templeton et al., 1995). Si un conjunto (red) de haplotipos se une a otro conjunto dado con probabilidad menor a 0.95, los autores recomiendan reconocer cuales conjuntos de haplotipos son más propensos a unirse, pero que la ubicación de la conexión entre haplotipos de los dos grupos es incierta. La presencia de loops en las redes de haplotipos pueden deberse a homoplasia en las mutaciones o a recombinación (Templeton et al., 1992). Por tanto, se conservaron los loops para dejar en evidencia estos fenómenos. Los gaps fueron tratados como quinto estado y las redes no fueron enraizadas. 5.8.4. Estimados de diversidad genética Se utilizó el programa DnaSP versión 5.10.01 (Librado y Rozas, 2009) para estimar los estadísticos descriptivos de diversidad y diferenciación genética, así como de recombinación (ver más adelante). Específicamente, se calcularon las siguientes medidas: - Diversidad haplotípica (Hd) y la varianza de la muestra siguiendo las ecuaciones 8.4 y 8.12 (reemplazando 2N por N) de Nei (1987). - Diversidad nucleotídica (π), la proporción de diferencias nucleotídicas entre pares de secuencias ponderadas por la frecuencia de las secuencias (Nei, 1987, ecuación 10.5). La varianza es dada por Nei (1987, ecuación 10.7). 57 - Theta de Watterson (θw) para sitios nucleotídicos, θw = 4Nu, donde N es el tamaño efectivo poblacional y u es la probabilidad por sitio de que una mutación aparezca en un gameto de un locus dado (el 4 se reduce a 2 en organismos haplodides). Bajo un modelo de sitios infinitos, θw puede entenderse como la probabilidad de que dos alelos muestreados al azar de una población en equilibrio deriva-mutación sean homócigos (con alelos idénticos por descendencia; Hamilton, 2009). θw se calculó a partir de los sitios segregantes S y el número de pares de bases L del locus en cuestión con la ecuación 10.3 de Nei (1987). La varianza por sitio nucleotídico de θw se calculó suponiendo (ecuación 8) o no (ecuación 4) recombinación (Tajima, 1993). 5.8.5. Recombinación Se estimó R (el número de eventos de recombinación en la historia de la muestra) a partir de la varianza del promedio del número de diferencias nucleotídicas entre pares de secuencias (Hudson, 1987). R es un estimado de 4Nr, donde N es el tamaño efectivo poblacional y r es la tasa de recombinación por generación entre los sitios más distantes del locus (el 4 se reduce a 2 en organismos haploides). RM es el número mínimo de eventos de recombinación inferidos a partir de la prueba de los cuatro gametos (Hudson y Kaplan, 1985). Asimismo, se efectuaron simulaciones de coalescencia con 10,000 réplicas, usando el número de sitios segregantes, el valor de θs (Watterson, 1975) observado, niveles intermedios de recombinación por locus estimados a partir de R, el RM observado y el número de sitios observados. El resultado se entiende como el RM promedio que 10,000 poblaciones simuladas con los parámetros de las poblaciones reales bajo estudio tendrían en un escenario neutral, apegado al modelo de sitios infinitos. Es posible estimar también el intervalo de confianza del RM promedio simulado y la probabilidad de que sea más pequeño que el RM observado (Hudson y Kaplan, 1985). Debido a que la prueba de los cuatro gametos sólo detecta un evento de recombinación si todas las cuatro posibles combinaciones de alelos de dos sitios son observados en la muestra, es un estimado conservador del número mínimo de eventos de recombinación que han ocurrido en la ausencia de mutaciones recurrentes (Lemey y Posada, 2009). 58 5.8.6. Estructura poblacional y diferenciación Se emplearon los estadísticos KST y KST* de Hudson et al. (1992a) para evaluar la hipótesis nula de diferenciación genética por geografía (para U. ceratina) o por divergencia (en el caso de U. cornuta y U. brasiliensis). Específicamente, KST = 1 – (KS/KT) donde KS es el promedio ponderado por tamaño de muestra de todas las localidades del número de diferencias nucleotídicas entre las secuencias dentro de cada localidad. KT es el número promedio de diferencias entre dos secuencias sin importar de qué localidad provengan. KST* es una versión modificada de KST en donde las comparaciones entre secuencias muy divergentes impactan menos el valor de KS y de KT. Es decir que KST*, como KST, toma en cuenta el número de diferencias nucleotídicas entre dos haplotipos diferentes, pero da menos peso a diferencias muy grandes. Esto es útil si, por ejemplo, una población tiene algunos haplotipos privados muy divergentes que tienden a inflar el promedio de diferencias nucleotídicas intrapoblacionales. Estos valores inflados resultan en valores de KST menores y por tanto, en una diferenciación poblacional aparentemente menor. En cambio, KST* aún podría detectar diferenciación considerable. Estudios con simulaciones indican que KST* puede tener mayor poder estadístico que KST (Hudson et al., 1992a). Para establecer la significancia estadística de un valor observado, se utilizó la prueba HBK (Hudson et al., 1992a), la cual utiliza permutaciones (1000) para generar una distribución de valores posibles de KST. Bajo la hipótesis nula, las muestras de cada localidad se distribuyen equivalentemente a muestras del mismo tamaño tomadas al azar de todo el conjunto de secuencias. El valor de p del valor observado de KST es estimado como la proporción de particiones azarosas que resultan en KST mayores o iguales al valor observado. Esta prueba es conveniente cuando la diversidad haplotípica es bastante alta, y tiene un poder estadístico razonable cuando hay recombinación y tamaños maestrales pequeños a intermedios (entre 10 y 20) en comparación con otros estadísticos (Hudson et al., 1992a). Al establecer la significancia de comparaciones entre poblaciones, se utilizó la corrección de Bonferroni efectuada en línea con las herramientas SISA (http://www.quantitativeskills.com/sisa/calculations/bonfer.htm). La magnitud de la diferenciación se estableció con el índice de fijación FST (Hudson et al., 1992b, ecuación 3), es decir: FST = 1 – HW/Hb donde HW es el 59 número promedio de diferencias entre diferentes secuencias muestreadas de la misma subpoblación y Hb es el número promedio de diferencias entre secuencias muestreadas de las dos subpoblaciones estudiadas. Supone el modelo de sitios infinitos, y por tanto no aplica correcciones por múltiples sustituciones (p.ej. como la corrección de Jukes-Cantor; Hudson et al., 1992b). 5.8.7. Demografía histórica Se empleó el estadístico D de Tajima (1989) para probar la hipótesis de que las mutaciones se comportan de manera neutral con tamaño poblacional constante. Definiendo a k como el promedio del número de diferencias nucleotídicas entre pares de secuencias y θs = 4Nu (similar a θw pero por secuencia, no por sitio), la D de Tajima se basa en el hecho de que, bajo un modelo coalescente estándar donde las mutaciones son neutrales y se mantiene un tamaño poblacional constante, se espera que k y θs sean aproximadamente iguales (D = 0). Desviaciones de la neutralidad pueden ocurrir por expansiones poblacionales o selección direccional negativa (D negativa), o debido a decremento constante en el tamaño poblacional, a cuellos de botella o selección balanceadora (D positiva). D se calcula como la diferencia entre k y θs dividida por la desviación estándar de k - θs (ecuación 38 de Tajima, 1989). El modelo nulo se basa en una tasa mutacional constante (reloj molecular), en el modelo de sitios infinitos, y en un modelo Wright-Fisher con generaciones no sobrepuestas y una población panmíctica bajo equilibrio mutación- deriva (Hamilton, 2009). Con el mismo objetivo, se utilizaron los estadísticos D* y F* de Fu y Li (1993). Ambos se basan en la expectativa de la distribución de las mutaciones (en ramas internas o externas) en la genealogía de la muestra bajo un modelo neutral. En concreto, D* evalúa la diferencia entre el número de mutaciones únicas en la muestra (singletons) y el número total de mutaciones, que bajo un modelo neutral, son ambas proporcionales a θ = 4Nu. F*, por su parte, compara el número de singletons con k. Ambos estadísticos detectan excesos o deficiencias de singletons en las ramas más externas (recientes) de la genealogía (Fu y Li, 1993) y se interpretan como la D de Tajima. 60 6. Resultados 6.1. Material biológico y datos moleculares Se colectaron dos ejemplares de Alectoria, tres de Everniastrum y 162 de Usnea (incluyendo cinco del subgénero Eumitria), dando un total de 167 talos. De éstos se extrajo el ADN y se obtuvieron las secuencias de los tres marcadores (ITS, MCM7 y TSR1), con cuatro excepciones que no se pudieron secuenciar: TSR1 y MCM7 de 4.29.46 (Everniastrum vexans) y TSR1 e ITS de 4.31.48 (E. vexans). Por tanto en este trabajo se obtuvieron 497 secuencias nuevas. El Anexo A contiene datos de todos los ejemplares, incluyendo su ubicación geográfica, altitud y tipo de vegetación. U. ceratina fue la especie más abundante en las colectas, exceptuando la localidad 3 (Oax2), donde se encontraron talos pero no se les extrajo el ADN debido a su mala condición. Como U. ceratina amplificó con mayor facilidad que otras especies para los primers de Schmitt et al. (2009), la mayoría de las secuencias utilizadas en el diseño de los primers internos específicos de Usnea pertenecen a esta especie. Debido a esto, dichos primers fueron menos eficientes para el subgénero Eumitria y los grupos externos (Alectoria y Everniastrum), así como en grupos con extracción deficiente como los especímenes del agregado de U. fragilescens (ver inciso 5.5). Entre los primers utilizados para datos ribosomales, el ITS1-F exhibió irregularidad con el número de pares de bases del producto en la PCR, observándose dos tamaños de bandas en los geles de electroforesis (Fig. 6). ITS1-F fue diseñado para amplificar a partir del final 5’ de la SSU (Gardes y Bruns, 1993), por lo que la secuencia resultante inicia con el motivo CATTA y se ve como una banda de alrededor de 1,000pb. Sin embargo, en 67 de 167 talos (66 Usnea y el Everniastrum 4.28.44), la PCR resultó en un producto de mayor peso, que incluía cerca de 300 pb pertenecientes a un intrón tipo I (Fig. 7) con los motivos reportados por Gutiérrez et al. (2007) para el grupo de Flavoparmelia caperata (posición 1506 en E. coli de Gutell et al., 1994). Figura 6. Gel de electroforesis que muestra los dos tamaños de banda de un PCR usando los primers ITS1-F y NL6A en Usnea. 61 Notablemente, al final de dicho intrón y antes del inicio del ITS (es decir, previo a CATTA), las secuencias son altamente variables en tamaño y composición y se pueden interpretar a su vez como un indel dentro del intrón. Éste va desde 6pb en U. brasiliensis hasta 49pb en U. ceratina y parece ser específico de especie o de grupos cercanamente relacionados. Más aún, el intrón puede que sea ancestral, ya que se detectó en Everniastrum y está distribuido a lo largo de todo el género. Presenta además variación nucleotídica interna (Fig. 8). En ciertos taxa, como U. ceratina y U. cirrosa, algunos ejemplares amplificaron el intrón y otros no. En otros, como U. brasiliensis y U. rubicunda, todos los ejemplares lo presentaron. Algunas secuencias de Genbank incluyen el intrón: 003, 015, 107, 108, 109, 110, 111 y 113 (ver Anexo E). Por lo menos las secuencias a partir de la 107 hasta la 113 fueron amplificadas también usando el primer ITS1-F. 6.2. Alineamiento y matrices de datos En la Tabla 3 se reporta la longitud de cada alineación, el número de sitios variables y el número de sitios parsimoniosamente informativos. De manera detallada, la matriz del gen MCM7 no contuvo indels por lo que la alineación fue directa y sin ambigüedades (166 secuencias). Consistió de 479 caracteres, de lo cuales 184 fueron polimórficos y 158 fueron parsimoniosamente informativos. En el caso del gen TSR1, sólo el ejemplar 4.28.44 (Everniastrum sp.) presentó una deleción de tres aminoácidos con respecto a las secuencias de Usnea y Alectoria, por lo que la alineación no tuvo mayor dificultad. La matriz TSR1 tuvo 536 caracteres, exceptuando la secuencia de 4.28.44 que contiene 527 pb (165 secuencias). La matriz contuvo 300 sitios polimórficos, de los cuales 233 son parsimoniosamente informativos. En ambos casos, la variación está concentrada en gran medida en las terceras posiciones de los codones. Para ilustrar, la tercera posición del MCM7 (159pb) tuvo 151 sitios polimórficos (82.06% de la variación total), con 139 sitios parsimoniosamente informativos (87.34%). Las cifras correspondientes para TSR1 son de 63.33% y 72.53%, respectivamente. La alineación de los datos ribosomales, en cambio, se caracterizó por un gran número de indels y ocasionales inserciones de varios pares de bases. Al comparar la alineación con las estructuras secundarias de ITS1 e ITS2, las zonas ambiguas corresponden ampliamente con los loops, aunque lo inverso no siempre ocurre. En el anexo B se profundiza más sobre la estructura secundaria y la alineación. 62 Figura 7. Esquema de la amplificación diferencial del operón rARN en Usnea usando diferentes primers que pretenden recuperar el ITS. a. Amplificación normal del ITS usando los primers ITS5 y ITS1-F (forward) e ITS4 y NL6A (reverse), en donde los primers forward se asocian al final 3’ de la SSU y el extremo 5’ de LSU. b. Amplificación de la región de ITS y de alrededor de 250-290pb extras que pertenecen a un Intrón tipo I al final de la SSU. En el extremo 3’ del intrón, hay una inserción de tamaño variable que es específica de especie o especies cercanas. Las flechas verticales indican los diferentes puntos de asociación de los primers utilizados y la posición de la inserción al final del intrón tipo I. Las flechas horizontales indican el sentido de amplificación de cada primer. Las regiones no están dibujadas a escala. El motivo CATTA marca el inicio del ITS. 63 Figura 8. Ver siguiente página. 64 Figura 8. (Página anterior) Variación de la inserción en el extremo 3’ del intrón en la SSU del género Usnea subgéneros Usnea y Eumitria y del género Everniastrum. En la figura se muestran ejemplares representativos de los tipos de inserción detectados. Los espacios en blanco entre nucleótidos representan gaps. Aunque la alineación sugerida es cuestionable, es claro que la longitud y patrón de cada inserción es más o menos típico de cada especie o de especies cercanamente relacionadas. Tabla 3. Longitud de la alineación para los principales grupos de datos, incluyendo el número de sitios variables, de sitios parsimoniosamente informativos (PI), de secuencias y de haplotipos. En paréntesis se dan los valores excluyendo el grupo externo (Alectoria y Everniastrum). Para las secciones la selección del grupo externo fue relativamente arbitraria. Matriz No. sitios No. sitios variables No. sitios PI No. secuencias No. haplotipos ITS México 484 193 (175) 144 (124) 166 105 ITS mundo 438 225 (219) 172 (166) 489 261 ITS sección Usnea 477 111 64 130 60 ITS sección Ceratinae 504 223 179 234 129 ITS U. ceratina 492 31 15 54 24 Intron tipo I México 259 115 (106) 85 (83) 67 38 MCM7 479 184 (172) 158 (140) 166 100 TSR1 536 300 (271) 233 (214) 165 100 Concatenado 1499 677(618) 535(478) 166 146 La matriz de ITS y LSU de las muestras mexicanas contuvo 806 pares de bases. En total incluyó 241 sitios polimórficos, de los cuales 178 fueron parsimoniosamente informativos. Sin la región LSU, la alineación de ITS constó de 484 sitios, siendo 193 polimórficos, con 144 parsimoniosamente informativos. La matriz final de ITS del mundo fue de 438 sitios con 225 sitios polimórficos, siendo 172 parsimoniosamente informativos (489 secuencias). Como se ha mencionado previamente (Lutzoni et al., 2000), hay mucha información filogenética representada por indels de alineaciones ambiguas. Por ejemplo, zonas con indels largos en el ITS1 tienden a separar muy bien a los subgéneros de Usnea. Sin embargo, por su posición estructural, que probablemente lleva a altas tasas de mutación, también son zonas muy homoplásicas. Una aproximación a este problema es alinear matrices de secuencias cercanamente emparentadas y generar subárboles para cada grupo (Sánchez Ramírez, 2011). Esto permite conservar zonas informativas que bajo mayor divergencia se vuelven imposibles de alinear. Por tanto se generaron árboles para las secciones Usnea y Ceratinae. En el caso de Neuropogon, ninguna especie mexicana corresponde a 65 este grupo, por lo que no se le dio mayor tratamiento. La ubicación de cada especie dentro de cada sección se estableció a partir de estudios anteriores (ver sección 2. Antecedentes) o con la información obtenida de los tres loci secuenciados en este estudio. En particular, en la matriz de la sección Ceratinae se excluyeron todas las secuencias de usneas neuropogonoides, de Eumitria, Alectoria y Everniastrum, así como las secuencias previamente reportadas para la sección Usnea y las sugeridas aquí (ver más adelante), excepto U. subscabrosa/subrubicunda y U. cf. cavernosa, con quienes se enraizó (en total fueron 235 secuencias, descartando aquéllas con gran cantidad de datos perdidos). El número y amplitud de zonas ambiguas de la alineación decrecieron dramáticamente con respecto a la alineación del mundo. GBlocks detectó únicamente el loop “a”, el sitio inicial del loop “d”, un sitio del loop “f” y el loop “g” en el ITS2 como regiones poco confiables (ver Anexo B). En el ITS1 se detectaron sobre todo inserciones únicas de varios pares de bases en, por ejemplo, los ejemplares 0.1.1 de U. rubicunda y 2.35.54 de U. ceratina, y una región central muy variable. En la alineación de la sección Usnea, GBlocks sólo detectó el loop “g” como ambiguo en el ITS2, y otra vez la región variable del ITS1. Aunque varios estudios (p.ej. Wirtz et al. 2006) indican que el grupo central de Neuropogon está emparentado con la sección Usnea (y por lo tanto sería un buen candidato para enraizar), un análisis preliminar evidenció que las especies neuropogonoides tienden a anidarse dentro de la sección, por lo que se eliminaron de la matriz y se enraizó con U. flavocardia (de la sección Ceratinae: Saag et al., 2011). Esto además, mejoró la calidad de la alineación. 6.3. Modelos de sustitución nucleotídica Para elegir entre los modelos de sustitución más adecuados se emplearon dos criterios de información conceptualmente distintos (AICc y BIC). El AICc se puede interpretar como la cantidad de información que se pierde cuando usamos un modelo dado para aproximar el proceso real (en este caso, la evolución molecular) (Posada y Buckley, 2004). Por su parte, usar el BIC es equivalente a seleccionar el modelo con mayor probabilidad posterior (Posada, 2009). Por el tamaño de muestra en los análisis filogenéticos típicos, BIC tiende a elegir modelos más simples que AIC (Posada, 2009; Posada y Crandall, 2001). En concordancia con esto, el AICc eligió muchas veces modelos más complejos que el BIC, pero en bastantes ocasiones lo que fue mejor para un criterio lo fue también para el otro. Cuando no elegían el mismo modelo, el mejor modelo 66 de un criterio fue usualmente el segundo o tercer mejor del otro. Independientemente de la matriz, se eligió consistentemente el modelo TrN + I + G para el ITS y MCM7, y K80 + G para TSR1. 6.4. Delimitación de especies 6.4.1. Resultados de análisis filogenéticos No hubo diferencias bien soportadas entre la topología de los árboles y los valores de BS (100 replicas) estimados por RAxML y PhyML (500 replicas), por tanto los árboles presentados son los de RAxML. Con respecto a los datos ribosomales, la LSU no resultó informativa debido a su baja variación. De hecho un análisis filogenético de sólo la LSU de México produjo una politomía completa (resultados no mostrados). Por tanto se descartaron para los análisis subsecuentes. La Tabla 4 muestra los resultados del análisis de RAxML para cada matriz de datos. 6.4.2 Inferencia filogenética del género Usnea En el árbol de ITS del mundo, los subgéneros Eumitria, Dolichousnea y Usnea se separaron con alto soporte de BS (Figs. 9 y 10). La sección Usnea y el grupo central de Neuropogon se rescataron sólo con bajo soporte y la sección Ceratina resultó en una gran politomía. Este patrón es similar al obtenido por Ohmura (2002) y Wirtz et al. (2006). No obstante, aunque la resolución fue insuficiente para rescatar las relaciones dentro de cada sección, a menor nivel, las especies reconstruidas como monofiléticas en otros estudios están en general bien soportadas (resultados no mostrados). Las Figs. 11, 12 y 13 corresponden a los árboles de ML para las especies mexicanas del los tres genes por separado, de los tres genes concatenados con detalle sobre la posición de cada especie, y de los tres genes concatenados señalando algunas tendencias morfológicas, químicas y ecológicas, respectivamente. En la Fig. 14 se presenta el árbol de consenso estricto de los árboles de los tres loci. A nivel de subgénero, las especies mexicanas se agregaron en Eumitria (cinco ejemplares de Jalisco) y Usnea (el resto). En Eumitria se ubicaron dos talos pertenecientes al complejo de U. baileyi (4.2.3 y 4.19.31) y tres talos afines a U. mexicana. Dos de éstos últimos (4.19.30 y 4.25.40) tienden a agregarse por separado y se distinguen de la otra U. mexicana por no tener el eje ocráceo. En ninguno de los tres ejemplares se detectaron los compuestos principales típicos 67 (ácidos difractaico, protocetrárico o salazínico), con la excepción del ejemplar de 4.25.40, para el cual se detectó una traza a la altura del ácido salazínico. Tabla 4. Resultados de los análisis de ML usando RAxML. Se muestra la verosimilitud (-Ln) del mejor árbol, la frecuencia de cada base (∏A, C, G, T), las tasas de sustitución (r(AC), r(AG), r(AT), r(CG), r(CT) y r(GT), el parámetro alfa (α) de la distribución gama de heterogeneidad en las tasas de sustitución y, en los casos donde JModelTest lo sugirió, la proporción de sitios invariables (I). Matriz -Ln ∏A ∏C ∏G ∏T r(AC) r(AG) ITS México 3999.4849 0.2139 0.2722 0.2719 0.242 1.0107 5.2705 ITS mundo 6318.6877 0.1956 0.2852 0.2895 0.2298 1.2501 2.7106 ITS sección Usnea 1876.2128 0.2241 0.2789 0.2539 0.2431 1.613 2.1508 ITS sección Ceratinae 5138.9111 0.2181 0.2694 0.2641 0.2483 1.1961 2.3055 ITS U. ceratina 1530.15278 0.243385 0.236917 0.275676 0.244022 0.757174 3.013116 Intrón tipo I México 1681.04956 0.246424 0.247199 0.266806 0.239571 1.343127 5.992825 MCM7 3659.419 0.2936 0.2677 0.1999 0.2388 1.0612 6.9912 TSR1 5544.3962 0.2396 0.3086 0.1995 0.2522 1.0107 5.2705 Multilocus 14536.4371 0.2488 0.2838 0.2228 0.2446 1.2298 4.9365 Tabla 4. Continuación. Matriz r(AT) r(CG) r(CT) r(GT) α I ITS México 0.8093 0.9714 4.2056 1.0000 0.5634 - ITS mundo 0.9546 0.5953 7.9499 1.0000 0.6504 0.2832 ITS sección Usnea 2.1754 0.5825 7.7207 1.0000 0.2715 - ITS sección Ceratinae 1.723 0.8442 8.5096 1.0000 0.3601 - ITS U. ceratina 1.145974 1.036755 11.249859 1.0000 0.225994 - Intrón tipo I México 1.716663 0.687946 10.11421 1.0000 0.636531 0.232565 MCM7 0.7548 0.8155 5.5801 1.0000 1.8053 0.5303 TSR1 0.8093 0.9714 4.2056 1.0000 0.5634 - Multilocus 0.9951 0.9067 6.7844 1.0000 1.0006 0.3924 68 Figura 9. Esquema del árbol consenso de mayoría de ML de ITS del mundo, en el que se destacan con sus valores de soporte (100 réplicas de BS) los subgéneros Eumitria, Dolichousnea y Usnea (señalados con estrellas), así como las secciones Usnea y Ceratinae. Neuropogon es polifilético, como ya lo había notado Wirtz et al. (2006). La sección Usnea y el grupo central de Neuropogon tienen bajo soporte, pero son consistentes con las definiciones previas de Wirtz et al. (2006) y Saag et al. (2011), en donde se usaron más loci además del ITS. La inclusión de U. mexicana en Eumitria es novedosa y nunca había sido sugerida. En efecto, esta especie tiene el eje parcialmente fistuloso, característica propia del subgénero y consistente con los resultados filogenéticos. Por otra parte, Herrera-Campos et al. (1998) sugirieron a U. mexicana como la especie secundaria de U. himantodes (para la cual no hay secuencias disponibles). Esta especie a su vez, fue incluida en Eumitria por Ohmura (2001). No obstante, en la descripción de U. himantodes para Japón y Taiwan, Ohmura (2001) no menciona el pigmento ocráceo característico del eje, además de que la describe como sorediada, en 69 oposición al concepto de Stevens (1990) y de Herrera-Campos et al. (1998). Por otra parte, en la filogenia de ITS del mundo, los ejemplares sin pigmento en el eje se asociaron con las secuencias japonesas de U. pectinata (Fig. 10), una especie muy similar a U. himantodes según el concepto de Ohmura (2001). La relación entre estas especies (U. mexicana, U. himantodes y U. pectinata) requiere más investigación. Figura 10. Detalle del árbol de ITS del mundo que muestra los subgéneros Eumitria y Dolichousnea. Los ejemplares mexicanos se sombrean con gris. Se presentan los soportes de BS mayores o iguales a 60%. Las ramas con 70% se resaltan aumentando su grosor. Los dos ejemplares de U. baileyi s.l. (4.2.3 y 4.19.31, en la Fig. 10 como 4.2 y 4.31, respectivamente; ver inciso 5.1 para nomenclatura) resultaron ser linajes independientes, como demuestran las longitudes de rama en todos los análisis filogenéticos. Más aún, el ejemplar 4.2.3 se asoció claramente con las U. baileyi de Japón, mientras que 4.19.31 se mantuvo separada. Una evaluación química y morfológica ubicó a 4.2.3 en U. baileyi s. str., mientras que 4.19.31 responde a U. 70 perplectata (ver apartado 7.1.4.3 para la asignación del nombre). Esto confirma la presencia de esta última especie en México y constituye un nuevo registro para Jalisco. Por otro lado, 4.19.31 (U. perplectata) es el taxón de divergencia más temprana de todo el subgénero Eumitria muestreado molecularmente hasta ahora (Fig. 10). Dentro del subgénero Usnea, las relaciones de parentesco entre grupos de especies no están completamente resueltas y en el caso particular de México, hay cierto conflicto entre el ITS y los genes codificantes, pero sólo en relaciones no soportadas. Igualmente, si se compara entre loci (ITS, TSR1, MCM7), el límite entre las secciones Usnea y Ceratinae no es claro, pero en el análisis multilocus dichas secciones sí están bien soportadas (Figs. 12 y 13), por lo que se las supuso como correctas. Bajo esta definición, dentro de la sección Usnea entran las especies del agregado morfológico de U. florida, incluyendo aquéllas mencionadas por Halonen et al. (1999) y en el caso de México, a U. silesiaca, U. lecanorica, U. subfusca y un ejemplar afín a U. praetervisa. Asimismo, U. subrubicunda/U. subscabrosa5 y un pequeño clado de ejemplares cercanos a U. setulosa se asocian con el agregado de U. florida en los análisis de cada gen y multilocus, por lo que puede tratarse de especies propias de la sección Usnea cuyas afinidades no habían sido discutidas previamente (ver Fig. 13). El resto de las especies mexicanas entran en la sección Ceratinae, aunque esto es debatible al tratar a U. cf. subeciliata, cuya posición varía según el gen. No obstante, en el análisis multilocus es basal a la sección Ceratinae y, a espera de estudios morfológicos (estructura de la corteza), se la considera temporalmente como propia de esta sección. Al concentrarse en los talos mexicanos, es posible detectar taxa bastante divergentes que no se asocian claramente con ninguna otra especie, como por ejemplo U. angulata y U. merrillii. En el otro extremo, el único ejemplar de U. ramillosa muestreado se anidó sin ambigüedades dentro de U. brasiliensis. Estas dos especies se consideran un par de especies (Herrera-Campos et al., 2001). U. brasiliensis + U. ramillosa y U. cornuta s.l. (excepto el ejemplar 2.42.64, ver apartado 6.4.5.3) a su vez, parecen estar altamente emparentadas entre ellas y con U. schadenbergiana y una especie no identificada (U. sp1). Esto es muy sorprendente, ya que U. brasiliensis, U. ramillosa y U. cornuta s.l. pertenecen al llamado “agregado de U. fragilescens”, el cual está compuesto por especies con corteza brillante, un CMA característico (denominado CMA tipo cornuta; Truong et al., 2011) y ramas constreñidas en la base, además de ser usualmente arbustivos. U. schadenbergiana y U. sp1, en cambio, tienen corteza opaca y ramas cilíndricas. 5 El nombre correcto para este taxón es ambiguo debido a discordancias entre autores (ver apartado 7.1.4.3). 71 Más aún, U. schadenbergiana es una especie típicamente péndula. No obstante, es notable que U. sp1 tiene el mismo compuesto principal (ácido salazínico) que U. cornuta s.l., mientras que U. schandebergiana exhibe el de U. brasiliensis (ácido protocetrárico). Es interesante notar que algunos caracteres importantes en la delimitación de especies de Usnea son altamente homoplásicos. Por ejemplo, la presencia de pigmento cortical rojo ha aparecido por lo menos dos veces: en el clado de U. subrubicunda/U. subscabrosa (pigmento superficial) y en el de U. rubicunda y aliados (pigmento a todo lo ancho de la corteza). En este último caso, al parecer las especies pigmentadas no forman un clado monofilético, pero sí es notorio que están cercanamente relacionadas (ver Figs. 11 y 13). También se pueden notar otras convergencias (Fig. 13). En particular, las ramas constreñidas, la corteza brillante y la médula laxa y ancha, caracteres que, como ya se mencionó, definen al agregado de U. fragilescens, están distribuidas ampliamente a todo lo largo de la sección Ceratinae. También es posible distinguir especies con la médula laxa y ancha (CMA tipo cornuta) pero sin las ramas constreñidas en especies no tan cercanamente emparentadas. De igual forma, especies con pigmento medular rosa y ácido difractaico han aparecido tanto en la sección Ceratinae (U. ceratina y aliados) como en el género Eumitria (U. perplectata). Y el ácido salazínico puede definir grupos no relacionados entre sí (U. setulosa y U. cornuta s.l.). Los ejemplares colectados en matorral xerófilo (señalados con estrellas amarillas en la Fig. 13) se anidaron dentro de la sección Ceratinae. Uno de ellos resultó ser un talo de U. dasaea que, sorprendentemente, exhibe divergencia más bien moderada con sus contrapartes de bosques templados. El otro talo (0.3.3), que se asigna aquí sólo tentativamente a U. parvula, no se agrupa consistentemente con ninguna otra especie en los análisis (amarillo en las Figs. 11 y 12). Al integrar en un árbol de consenso estricto a los árboles de la Fig. 11 (i.e., la metodología de Baum y Shaw, 1995; Fig. 14), los nodos más exclusivos corresponden a clados bien soportados en el análisis de genes concatenados, con tres excepciones: U. brasiliensis + U. ramillosa, U. dasaea y U. rubicunda. U. brasiliensis + U. ramillosa se tratan a detalle en el apartado 6.4.5.3, pero por lo pronto es notable que en la Fig. 14 no se resuelve como monofilética debido a un ejemplar, 2.26.43. En efecto, si se le remueve, este taxón sí es monofilético (Fig. 14b). En el caso de U. dasaea en México, la monofilia se rompe debido a que la posición del ejemplar 2.43.67 no se resuelve completamente con el ITS. Pero su 72 monofilia es indiscutible en los otros dos genes. Por su parte, U. rubicunda, tiene longitudes de ramas pronunciadas y agrupaciones variadas según el gen que se aborde (ver apartado 6.4.5.2). La sección Usnea sugerida se vuelve una politomía en el árbol de consenso estricto debido a que en el árbol de ITS de México U. subscabrosa/U. subrubicunda se ubica con bajo soporte dentro del agregado de U. florida. No obstante, parece claro a partir de los genes codificantes que estos grupos están relacionados pero conforman sus propios subclados. Finalmente, algunas especies poco muestreadas pero bien conocidas morfológicamente se rescataron como linajes independientes y monofiléticos: las péndulas U. angulata, U. merrillii, U. schadenbergiana y U. subscabrosa/subrubicunda y la arbustiva U. cirrosa. En contraste, se detectaron hasta 10 morfotipos distintos que no pudieron ser asignados a ninguna especie, y que en la mayoría de los casos constituyen por sí solos clados o linajes propios. Adicionalmente, se sugiere la asignación de ciertos talos a tres especies: U. cf. parvula, U. cf. subeciliata, y U. cf. meridionalis, siendo las últimas dos posibles registros nuevos para el país y en especial para Oaxaca. Además se reporta un ejemplar de la especie rara U. setulosa (3.22.45, también nuevo registro para Oaxaca) y uno de U. dimorpha (2.30.48, nuevo registro para el país y para Hidalgo). Las descripciones de dichas especies no identificadas o raras se proveen en el Anexo D. Figura 11 (págs. 73 y 74). Árboles de los genes ITS, MCM7 y TSR1 (de izquierda a derecha) de especies estudiadas en México. Los genes codificantes tienen en general altos soportes y relaciones mejor resueltas y más concordes entre sí, que con respecto al ITS. En colores se resaltan la mayoría de las especies para efectos ilustrativos. Se presentan BS mayores o iguales a 60 (100 réplicas). Las ramas con BS mayor o igual a 70 se resaltan con líneas más gruesas. Las estrellas señalan la continuación de la figura en la página siguiente. 73 Figura 11. Ver página anterior. IT5 0.04 I U. subrubicunda/ subscabrosQ .-e " ..... , . 0 I u. cirrosa I ~:;;:~~ '~ -:~:'::_ o 1 U. cf. subeciliata U. merrillii U. brasiliensis + U. ramillosa U. cornuta 5.1. Grupo Externo Eumitria .... """'o"a"'ngu/ata U. florido agg U. lecanorica MCM7 0 .0 7 r,~ ~ " ~ ~ ~ :_:~ 1 U. cirrosa .~~_ ol U. cf. subeciliata ,- I ~ ~ ~,,-"1""" .-... .'::'- I U. subrubicunda/ 5ubscabrosQ ¡r-: u. merrillii - ; ~- I U. schadenbergiona U. brasiliensis + U. rami//osa ,--- .-, _ o ~=~ U. camuta 5.1. , M !::...~" . Cf/statula ° entoVlo ata U. cf. parvula . setulosQ . . me" lona 15 TSRl 0 .04 J ~~~ ~: : I u. subrubicunda/ subscabroso L.... ...... ~ I U. cf. subeciliata r-G.¡¡ ¡;::; ~¡"' I u. cirrosa U. merrillii U. brasiliensis + U. ramillosa bj~~ ~~ ~o .- I U. schadenbergiana U. cornuta 5./. 74 Figura 11. Continuación. IT5 0 .04 .. _,. s , ~ .,.... ,. 2' .... '. 0'_. S_roo 74". •• '"","roo V,,_. 2H_. ''''-'' ,""-- ,. 7.:. •• 2".,.'. -- U. rubicunda U. dasaea U. cera tina MCM7 0 .07 622".... ._. U. rubicunda U. dasaea U. cerotino TSR7 0 .04 U. rubicunda U.dasaea .. ,,,,,.,. :> 37.,.. .. 2.3".,...." , 300." .~. 2 ' '''''''. ,. le . .... 5.'''''''''' ._. :> .'eer • ,_. :> 2'C6<" ,. ' 4.,.." :> 77.,... 5'_ ... 22U-.. . _. e "OO<. 7 .. .,.,..-.. :> 7""",. ,.- 5'_. ,,,_. ,. 7ce •• ,. ,...,.,." ,_. " . 1 7".. •• :> , ...... ._ '6_ ... :> 70.::.'. :> .. . ce ... :> '''''''',,, U. ceratina U. cornuto 5./. U a a U. cr¡stotulo to '0 at U. cf. parvulo U. erinacea 75 Figura 12. Ver la siguiente página. ~-C=' 67A'p, Alectoria - 1.67Asp2 Everniastrum 0.06 , I U. mexicana Eumitria --"'¡'¡---t=~ ~ ;:-: 4 3lperp .. U. perp/ectata i U. bailey¡ U. lecanorica U. florida agg U. leca no rica I U. subrubicunda/ subscabrosa ~~ ~~;,. = U. setu/osa ¡,."......,¡,¡¡¡--~ ""'...,¡,¡¡¡,....c...:.. u~'6"d' I U. cf. subeciliata I U. cirrosa u. cf. meridionalis I U. schadenbergiana U. brasiliensis + U. ramillosa U. cornuta s.l. U. merrillii 76 Figura 12. (Continuación) Árbol de ML de los loci concatenados para las especies mexicanas. La mayoría de las especies morfológicas se rescatan como clados monofiléticos con soportes altos. Colores y simbología de soportes como en la Fig. 11. Sólo se resaltan especies ya descritas o identificadas. El ejemplar 4.27.43 (por encima de U. erinacea) es afín a U. amblyoclada (ver Anexo D) pero es necesario corroborar su identidad muestreando ejemplares saxícolas para los cuales aún no hay secuencias disponibles. El ejemplar 2.42.64 (por encima de U. dimorpha) se asignó a U. cornuta s.l., pero constituye el único ejemplar muestreado sin ácido salazínico y parece no estar emparentado en realidad a este taxón. 77 Figura 13. Ver página 79. Alectoria , ,,/ Secclon Ceratinae 0.06 Everniastrum · • • • • • I Eumitria Sección Usnea Pigmento cortical U. fragilescens agg Pigmento medular ... y ácido difractaico Ácido salazínico ... Matorral Xerófilo 1} 1 57A00t TA _—_— _ _—— 1 ""'; a . -4 70sj>10 Q.'- ~ ..... unw .. O.,"'~ 2 _ ~ ... ',12_ .-,-2.a_ 2.$3/>0"00 2.31_ 3'900>7 2.2_ ,- H'fUtO ,.,,""" . ,87' ...... 2.1 _ .. -3.2sp2 33~0p6 3<52_ U''''''' .-H-.-1 .111oom .-.-,,-,,-.-•. ,!Ioom 211...,..,.-U""" ,,-.-.-1.$1""" ,,- 5.2'.,... 2.52.,.,. S.,'''''' .-2.17"",. '.-.-.-HI,... .-S.lIcero _. . -$ ,1"", • _. $. '-' 2 _ ~. o .$,(MlI .-'.&:e< • . -2.1:loora 5.3<00_ .-22''''''' a.:ze.r. 5 . '~ ' .-2<, ..... 2.3cer. l.7-. 223<00. ,- 21<:er. 8.Il00<. ,,- 2.31011fl1 2.000<. 5.SoN. 5"_, 2_7~ . $ .1)on .-,,- ' .2bfl1 5.10c>t<0 ,_o .-O.5cer. SI'"..,. .2200<. 2. _ .300<. H l itIaO ,- ' . ..o r. ' . OoI, '+- I ,.,. b . - 4 79 Figura 13 (página 77). Algunos patrones morfológicos, químicos y ecológicos en el género Usnea. Se muestra el árbol de la Fig. 12, pero resaltando la evolución de algunos caracteres: 1) El pigmento cortical rojo ha aparecido por lo menos dos veces; 2) La morfología básica del agregado de Usnea fragilescens (ramas constreñidas en la base, CMA tipo cornuta y corteza brillante) está ampliamente distribuida a lo largo de la sección Ceratinae; 3) El CMA tipo cornuta, sin los otros caracteres del agregado, también está presente de manera independiente; 4) La presencia de pigmento medular rosa con ácido difractaico apareció en ambos sugéneros (Usnea y Eumitria); y 5) El ácido salazínico delimita varios clados no emparentados. Adicionalmente, dos ejemplares colectados en matorral xerófilo se anidan dentro de las especies de bosques templados. Figura 14 (página 78). Árbol de consenso estricto de los árboles de ITS, MCM7 y TSR1 (Fig. 11). a. Árbol con los 166 individuos (los ejemplares de Everniastrum vexans se trataron como si fueran el mismo individuo), en el que se rescatan la mayoría de los clados resultantes del árbol de loci concatenados. La excepción son U. rubicunda, U. dasaea y U. brasiliensis. La flecha señala a 2.26.43, un ejemplar con fenotipo de U. brasiliensis que fue excluido del consenso en b. (165 individuos), donde U. brasiliensis sí se rescata como monofilético. Colores como en las Figs. 11, 12 y 13. 80 6.4.3. Inferencia filogenética del subgénero Usnea en México y el mundo Con el fin de contextualizar la definición de las especies mexicanas (como en el caso del subgénero Eumitria), se generaron submatrices y subárboles de la sección Usnea y de la sección Ceratinae con los datos de ITS del mundo (Figs. 15 y 16). De nuevo, las relaciones profundas estuvieron pobremente soportadas, pero hubo resolución suficiente a nivel de especie, lo que permite sacar conclusiones interesantes (ver siguientes apartados). La excepción es (en general) la sección Usnea que, como ya se había reportado (Saag et al., 2011), tiene longitudes de ramas comparativamente menores a la sección Ceratinae y quizá represente una radiación reciente (comparar escalas de Figs. 15 y 16). En particular, hay conflicto entre los clados formados en el árbol de ML de la sección Usnea y las circunscripciones taxonómicas. Dichos conflictos, en su mayoría, ya habían sido observados en los estudios de donde se obtuvieron las secuencias. Los ejemplares mexicanos se asociaron sin soporte con algunas especies europeas y no forman un clado monofilético (ver apartado 6.4.4.1). A continuación se detallan los resultados de cada sección, en particular con respecto a cuatro grandes grupos importantes en las comunidades mexicanas del subgénero Usnea. En primer lugar están los ejemplares morfológicamente cercanos al agregado de U. florida, los cuales se anidan claramente dentro de la sección Usnea en los análisis de ITS del mundo. Figura 15 (página siguiente). Árbol de ML de ITS de la sección Usnea en México (enmarcado con gris) y en el mundo. Se muestran los soportes mayores o iguales a 60% BS (100 réplicas) y las ramas con más de 70% están engrosadas. La flecha señala la única secuencia que se asoció con soporte alto a las secuencias de GenBank (2.27.58). Varias incongruencias taxonómicas son evidentes con respecto a las secuencias de GenBank. Figura 16 (páginas 82 y 83). Árbol de ITS de ML de la sección Ceratinae. Las terminales enmarcadas en gris son las secuencias mexicanas. Se muestran los soportes mayores o iguales a 60% BS (100 réplicas), y las ramas con más de 70% están engrosadas. En algunos casos relevantes, se menciona también el origen geográfico de la secuencia. Las estrellas marcan la continuación entre las dos partes de la figura. 81 Figura 15. Ver página anterior. rt'f-C-'OO:::...¡ ~on"= U. flavocardia 283l1avo { ::::~r=::::::::::::::::~::~~~~ 3 ~ . 4 ~ ~~~~ ...... 'OOiíioj ' .'á.' - 250subll 2.12cfp 7.3subf U. setulosa 78 Sección Usnea 0.02 86 322wasmu 169wasmu 319wasmu 325w8$n'11.1 76 ~~t:~ 263wasmu 258wasmu 253wasmu " ,~8. 252 .r W ~ '~ ,,- " _ 321wasmu ¡28WaSmu 20wasmu 56wasmu 264wIIsmu 254wasmu 260wasmu 255wasmu (Reino Unido, Estonia y Japón) (Reino Unido) U, wasmuthii (Reino Unido y Estonia) 32<\wasmu ~ 257wasmu 262wasmu 97 323wasmu'--,¡,----::::; 2.58sili (Estonia y Suecia) m:r~ U. diplotypus + U. chaetophora 014c1iaet L ..!!:....r.:21"'2·n&]9IIori I '86w.~" U. florida + U. subfloridana + U. wasmuthii g~~n (Reino Unido. Suecia y Japón) r -~;;;;~~;;;;;¡¡¡¡;;;;';" · : 8\ ~ · ~ · :"_IC::::::::::::::::= -;:¡:;¡;;¡- -- L"¡::::::::" ' ~ ' ''' ~ ;~51Sile 5.5sp9 1.73sp8 a~f t-;:=~ 2~ . ;:: 1~:::: (::~~) U. wosmuthií U. lecanorica t --i gg~i~~ ' ~~~ ' -=;:::.,... . I U. rigida + U. barbata + U. arizonica OOOanzo . I U. intermedia (Austria y EUA) 3031nter 304lappo I U I . 3051appo • appomca L ~~ ' : 5 ~~~~=~ 3~ 06 ~lfficf.SUbf 6.3cf.subf 2.2S"sublp" (Canadá y Suecia) (Austria, Suecia y EUA) 1,., 1'..il~2 ~ . 5 ~ 9 ~ ·' ~ " . bfp ~1~f,~~SI I 201litip 276diplo 200111 p 202fil lp 011fihp ~~~~I~1o 1991ihp 196fihp U. substerilis + U. filipendula + U. diplotypus (Reino Unido, Lituania y Estonia) 93 ~ : ~~~ ~nE1 022ftori L _~ 90 :'_.f: ~~ !!::"-- 156subfl 016ftori 021t1ori 326subll 314subll 023subfl 027subll 024subll 2B6~5SUbll 020110ri 2·Hsubll 246subll 248subll 249subll 243subll 315subfl 251subft 157subfl 155subfl 287110fi (Reino Unido) U. subfloridana + U. florida (Suecia, Reino Unido, Finlandia, Noruega, Lituania y Japón) r ~::::::: 2 ~ " ~ ft : ~ : ; :; '"' 132fU~~ 'subfp' ~~~i~~ ,-~ 6 = 2 _i ?~167S~~~b f I U. glabrescens + U. substerilis + U. diplotypus (Reino Unido, Estonia, Espa ña) (Reino Unido, Estonia y Suecia) 29Ofutvo ... __ 9¡9 __ ~ 22 4fll tvo r 269futvo 222fulvo 288flllvo 223fulvo (Reino Unido y Finlandia) (Reino Unido, Finlandia y Estonia) 317subsl 010glabr 74 ~2~~~ 2mlabr 228glabr 292glabr 2."""" 2~labr 29~l a br 297glabr ~~~i~~ 291glabr I U. fulvoreagens u. lecanorica I U. glabrescens u. lecanorica I U. glabrescens 82 Figura 16. Ver página 80. 83 Figura 16. Continuación. I u. esperantiana u. spl U. cf. subeciliata U. flammea U. merrillii (México y Japón) " U. pangiana 134intum L -c::r~=r~~~~~ i~ ~ '33hm" 267artic I U. articulata 266artic U. dimorpha U. sp3 y U. camuta 5.1. 3.355p6. U. sp6 100 U. dasaea (México) U. dasaea (Japón) U. cristatula I u. ceratina (Japón) U. entoviolata (México, con intrón) U. dasaea (México y Portugal) u. ceratina (México e Inglaterra, sin intrón) 0.02 84 En segundo lugar está el grupo de U. ceratina, una de las especies más abundante de México y, por lo mismo, la mejor muestreada en este estudio. Usualmente se la relaciona con U. cristatula, una especie extremadamente similar que difiere únicamente por su estrategia reproductiva. Por tanto, se ha propuesto a U. cristatula como la especie primaria de U. ceratina (Herrera-Campos et al., 1998). El tercer grupo corresponde a los talos con pigmento rojo en todo lo ancho de la corteza que responden principalmente a U. rubicunda, a su contraparte fértil U. erinacea y a dos talos de morfología discordante que se discuten en el Anexo D (U. sp7 y U. sp10). Por último, están las especies incluidas en el “agregado de U. fragilescens”, en particular U. cornuta s.l. y U. brasiliensis. Las secciones dedicadas a cada grupo exponen los resultados de los análisis. Los principales comentarios taxonómicos se presentan en la discusión, pero algunos se expresan aquí para facilitar la comprensión de cada problema. 6.4.4. Inferencia filogenética de la sección Usnea La sección como tal (enraizada con U. flavocardia de la sección Ceratinae), incluyendo a U. setulosa, U. cf. cavernosa, U. sp8 y U. sp9, está altamente soportada (100% BS). Como ya se mencionó, el soporte es bajo dentro de las relaciones internas de la sección, pero la rama que define al agregado de U. florida tiene soporte aceptable (78% BS). Es notorio como se formaron clados bien soportados de varias especies, que, no obstante, presentaron ejemplares contradictorios en alguna otra parte del árbol. El caso más claro es U. wasmuthii, que forma dos linajes bien soportados (uno exclusivamente inglés y otro inglés y estoniano) que a su vez se agrupan sin resolverse con más ejemplares del Reino Unido, Estonia y Japón. Fuera de este clado (soportado por apenas 66% BS) es posible detectar secuencias de Japón que se asocian con, por ejemplo, secuencias de U. florida y U. subfloridana las cuales tampoco se agrupan con sus supuestas conespecíficas (en el árbol de la Fig. 15, por debajo de U. diplotypus + U. chaetophora). Estas secuencias de U. florida y U. subfloridana (012, 019, 026 y 212) fueron colectadas en Escocia y Suecia, por lo que puede tratarse de un linaje ampliamente distribuido (Asia y Europa). Este último linaje ya había sido identificado por Saag et al. (2011), quienes lo llamaron “clado A6”. U. florida + U. subfloridana se separan a su vez en dos clados (uno pequeño inglés y el otro bastante más grande de Finlandia, Suecia, Reino Unido, Lituania, Noruega y Japón) previamente reconocidos también por Saag et al. (2001, clados A8 y A7, respectivamente). Y al igual que en dicho estudio, U. intermedia es 85 parafilética con respecto a U. lapponica. Un conjunto de tres secuencias (identificadas como U. rigida, U. barbata y U. arizonica por sus autores, ver Anexo E) se asocia sin soporte a este clado, siendo las primeras dos europeas y la última americana (de California). De hecho, U. arizonica es considerada un sinónimo de U. intermedia por Clerc (2007), pero es evidente que esta secuencia constituye un linaje independiente. También se notó que U. diplotypus es polifilética, y se rescataron los mismos clados europeos de Saag et al. (2011): A1, A2 y A4. Es notable que todas las secuencias de U. filipendula se anidaron con su clado A2, incluyendo una secuencia de U. substerilis de Canadá. Pero más llamativo aún es la asociación de su clado A4 con una secuencia sueca de U. chaetophora y la secuencia mexicana de 2.37.58 (U. silesiaca). De hecho este es el único clado con soporte alto (97% BS) de todo el árbol que incluye una secuencia de México (señalado con una flecha en la Fig. S1). El resto, se dispersaron por toda la sección. 6.4.4.1. El agregado de Usnea florida en México Este clado de 19 talos resultó altamente soportado en los análisis de especies mexicanas, con longitudes de ramas cortas. Los ejemplares se caracterizan por presentar base negra y la corteza gruesa y opaca. El ácido salazínico es muy común, aunque los ácidos norestíctico (1.11.17, 2.9.12 y 7.4.3), estíctico (7.4.3) y lecanórico (2.7.10, 2.32.50, 2.36.57 y 2.40.62) fueron detectados en algunos casos. El grupo es bastante variable morfológicamente, con miembros arbustivos, subpéndulos y uno péndulo; cinco sólo tienen propágulos vegetativos, 14 tienen apotecios y un caso tiene ambos, apotecios y propágulos. Se colectaron en bosques de pino o abeto y de pino-encino o abeto-encino, entre 2300 y 3100 msnm aproximadamente. En los análisis filogenéticos, los ejemplares tienden a mezclarse si se compara entre los árboles de cada gen, y es notorio que algunos talos apoteciados tienen el mismo haplotipo que algunos exclusivamente sorediados que además son simpátricos (p.ej. 2.37.58 y 2.18.25 en el MCM7 o 1.15.25 y 1.30.65 en el ITS; ver Fig. 11). En el análisis multilocus se forman por lo menos un clado exclusivamente apoteciado de Oaxaca e Hidalgo y otro con ambas estrategias reproductivas de Oaxaca, mientras que no se resuelven las relaciones del resto de los individuos (Fig. 17). Se identificaron tres morfotipos dentro de los especímenes apoteciados que se distinguen principalmente con la razón entre el eje (A) y la médula (M): I) la típica U. subfusca con CMA similar al de U. silesiaca (A/M > 2), II) talos con médula 86 algo más delgada (A/M entre 1 y 2) llamada aquí U. cf. subfusca, y III) talos similares a U. cf. subfusca pero extremadamente papilados en las ramas principales, tanto que la corteza tienen aspecto rugoso. Se les llamó temporalmente U. “subfuscapapilata”. Las U. lecanorica corresponden a este fenotipo. Los talos sorediados corresponden adecuadamente a la descripción de U. silesiaca y U. columbiana: son arbustivos a péndulos; papilados; con fibrillas largas y numerosas; tienen bases con pigmento negro que a veces se extiende a las ramas principales; soralios más o menos planos a distintivamente tuberculados, estipitados y entonces cóncavos, que se mantienen discretos o rara vez confluyen, en especial en ramas terminales; corteza gruesa, opaca, típicamente agrietada en la base de las ramas principales; médula delgada y compacta, no pigmentada; eje grueso y no pigmentado; y ácido salazínico como principal compuesto (Clerc, 2007). Sin embargo, la distinción entre U. columbiana y U. silesiaca es polémica (Clerc, 2006). La diferencia principal radica en el tamaño de los soralios, más grandes y ligeramente excavados en U. silesiaca, y en la densidad de los isidios, siendo más abundantes en U. columbiana (Truong, comunicación personal). No es claro a qué especie pertenecen los ejemplares sorediados de este estudio, ya que parece haber soredios grandes en algunos ejemplares (p.ej. 1.28.61) o son más bien menores a la mitad del diámetro de la rama en otros (p.ej. 1.24.51). De cualquier manera, no se puede distinguir si se trata de individuos adultos o juveniles. Por tanto, se tomó la decisión conservadora de nombrar a todos los ejemplares sorediados como U. silesiaca, ya que este taxón y su sinónimo U. madeirensis, han sido descritos y documentados con mucho mayor detalle (ver Clerc, 1991, 2004; Halonen et al., 1998). Un mayor muestreo, con poblaciones de Sudamérica (de donde se describió a U. columbiana originalmente) y Europa (donde U. silesiaca se distribuye sin ambigüedades) es necesario para clarificar las diferencias (o su ausencia) morfológicas, anatómicas, químicas y genéticas entre estos dos taxa. El único talo sorediado dentro del clado francamente discordante es el 2.9.12, que tiene los soralios puntiformes (mucho más pequeños que las U. silesiaca/U. columbiana), algunos ligeramente elípticos, unos muy planos, a veces ligeramente excavados, pero otros casi estipitados. También confluyen en las ramas terminales. Las ramas son más gruesas. Hay isidios en algunos soralios, en particular los jóvenes. Tiene papilas verrugosas dispersas y algunos fibérculos. El CMA es marcadamente diferente, con una médula más ancha y densa (C/M/A 2.9.12: 21.43%/33.33%/45%). Presenta, además de los ácidos salazínico y úsnico, 87 ácido norestíctico. Se agrupa en particular con el apoteciado 7.4.3. Se le denominó temporalmente como U. cf. praetervisa. Figura 17. Detalle del árbol multilocus de la sección Usnea en México señalando el modo reproductivo y la química (las barras verticales de colores a la derecha). Los individuos cuyos nombres están en gris corresponden al grupo de cuadros grises en la Fig. 18. A: apotecios; S: soredios. Figura 18. Relación entre el grosor de la médula y la corteza en los ejemplares colectados pertenecientes al agregado de U. florida. Los cuadros representan a ejemplares de Oaxaca, mientras que los rombos corresponden a todas las demás localidades. Los colores gris y negro separan a dos grupos con CMA evidentemente distinto. 0 10 20 30 40 50 60 0 20 40 60 Corteza % M é d u la % 88 En conjunto, se detectó cierta variación en los valores de CMA, con dos grupos obvios que se aprecian en la Fig. 18 y en la Tabla 5: un grupo de médula muy delgada y corteza gruesa (cuadros grises) y el resto con médula gruesa y corteza delgada (el cuadro y rombos negros). Los ejemplares del “grupo gris”, forman un clado monofilético (Fig. 17) (excepto por 1.28.61). Estos ejemplares presentan un continuo en los modos reproductivos (asexual -> ambos -> sexual). Por otra parte, los individuos dentro del subclado bien soportado (1.15.25, 1.23.50, 1.24.51 y 1.30.65) fueron los únicos ejemplares que amplificaron el intrón de la SSU (ver Fig. 8). Todos los miembros del grupo gris fueron colectados en Oaxaca, por lo que podría sospecharse un efecto ambiental. No obstante, el ejemplar 1.11.17 (cuadrado negro en la Fig. 18) también fue colectado en Oaxaca, pero pertenece al grupo de médula más ancha; se asocia con las U. lecanorica del otro subclado en la Fig. 17. probablemente U. silesiaca sí constituye una especie por sí misma, pero es paráfilética en su concepto tradicional (contiene individuos apoteciados: ¿U. subfusca s.str.?). Aunque identificado como U. silesiaca, el individuo 2.37.58 no se asoció al subclado de este taxón. Morfológicamente se le distingue por tener la médula algo más gruesa (Tabla 5) y por ser obviamente péndulo (los talos del subclado de U. silesiaca son arbustivos a subpéndulos). Es notable que en el árbol de la sección Usnea de ITS se agregó con secuencias de U. chaetophora (Suecia) y U. diplotypus (Estonia). En efecto, 2.37.58 y lo que se conoce como U. chaetophora comparten el hábito péndulo, la química y la base negra con grietas anulares. No obstante, 2.37.58 está notablemente papilada (de manera similar al morfotipo “subfuscapapilata” de U. subfusca). Halonen et al. (1998) comentan que existen algunos morfotipos muy papilados de U. chaetophora en Columbia Británica. No obstante, U. chaetophora nunca tiene fibrillas abundantes (Halonen et al., 1998), mientras que 2.37.58 está muy fibrillado. Asimismo, 2.37.58 tiene las puntas de los isidios negras, aunque podría ser que esto se deba a una infección ocasionada por otro hongo. Según Clerc (2011a) U. filipendula, U. chaetophora y U. diplotypus son sinónimos de U. dasypoga. No obstante, este grupo de especies se separó en por lo menos dos clados cuya relación no está resuelta. Considerando el conflicto taxonómico, no se las consideró a más profundidad. El subclado de Oaxaca e Hidalgo contiene a todas las U. lecanorica, exceptuando al ejemplar 2.7.10, cuyas relaciones no están resueltas. También abarca dos ejemplares con ácido salazínico (Fig. 17). Esto indica que, mientras no se puede rechazar la posibilidad de que los ejemplares con ácido lecanorico pertenezcan a una sola especie, sí es claro que U. lecanorica en su concepto tradicional, es parafilética a ejemplares con ácido salazínico. 89 Tabla 5. CMA, asignaciones taxonómicas, estado reproductivo y química de los ejemplares pertenecientes al clado que representa al agregado de U. florida en México. Los ejemplares en color gris corresponden al “grupo gris” en la Fig. 18. Sor: soredios; Apo: apotecios; Sal: ácido salazínico; Lec: ácido lecanórico; Nor: ácido norestíctico. Ejemplar Usnea C M A Sor Apo Sal Lec Nor 1.11.17 cf. subfusca 11.63 20.93 34.88 x x x 1.15.25 silesiaca 15.71 5.71 57.14 x x 1.23.50 silesiaca 16.67 6.67 53.33 x x x 1.24.51 silesiaca 22.37 6.58 42.11 x x 1.28.61 silesiaca 18.42 9.21 44.74 x x 1.30.65 subfusca 20.83 8.33 41.67 x x 2.6.9 "subfuscapapilata" 10.00 20.00 40.00 x x 2.7.10 lecanorica 11.11 20.00 37.78 x x 2.9.12 cf. praetervisa 10.71 16.67 45.24 x x x 2.18.25 "subfuscapapilata" 8.93 26.79 28.57 x x 2.32.50 lecanorica 9.80 23.53 33.33 x x 2.33.51 cf. subfusca 10.29 22.06 35.29 x x 2.36.57 lecanorica 8.49 21.70 39.62 x x 2.37.58 silesiaca 11.63 17.44 41.86 x x 2.37.59 "subfuscapapilata" 8.70 22.83 36.96 x x 2.40.62 lecanorica 9.48 24.14 32.76 x x 6.3.3 cf. subfusca 11.36 22.73 31.82 x x 6.8.11 cf. subfusca 11.21 17.24 43.10 x x 7.4.3 subfusca 12.30 13.93 47.54 x x x Por último, cabe mencionar que el ejemplar 3.22.45 mostró anatomía, química y morfología similar al del agregado de U. florida. No obstante, se segrega claramente por su cuenta, asociándose con 1.32.73 (U. sp8) y 5.3.5 (U. sp9). Tras compararlo con ejemplares de MEXU, se concluyó que 3.22.45 pertenece a la especie rara U. setulosa y constituye entonces un nuevo registro para Oaxaca (ver Anexo D para una descripción). 6.4.5. Inferencia filogenética de la sección Ceratinae 6.4.5.1. Usnea ceratina y aliados Herrera-Campos et al. (1998) notaron que U. ceratina es la especie péndula más polimórfica de México. Algunos de sus morfotipos llegan a confundirse con otras especies muy distintas, tanto arbustivas como péndulas. Es por ello que resulta muy interesante que constituya claramente un grupo monofilético en todos los análisis. Asimismo, al hablar de este taxón rara vez se mencionan apotecios, por lo que U. ceratina es percibida como predominantemente asexual. En efecto, de los 90 54 talos colectados, sólo cinco presentaron apotecios además de los propágulos vegetativos (dos de Hidalgo, uno de Jalisco y uno de Michoacán), con tamaños que van desde unos cuantos centímetros (ejemplar 4.40.63) hasta c. 70cm (ejemplar 2.16.23) de longitud. U. cristatula, un taxón mesoamericano (con un reporte reciente de Portugal: Clerc, 2011), presenta la misma variabilidad morfológica de U. ceratina. De hecho, es sólo distinguible por su estrategia reproductiva exclusivamente sexual y por tanto se le ha sugerido como la especie primaria de U. ceratina (Herrera-Campos et al., 1998; Clerc, 2011b). En este estudio se colectaron cuatro ejemplares exclusivamente apoteciados con las características de ambas especies (i.e., U. cristatula). Notablemente, dichos individuos formaron su propio clado cuyo parentesco con U. ceratina no es claro. La excepción fue 4.40.63, que no presenta soralios ni isidiomorfos evidentes, pero sí un apotecio terminal, abundantes pseudocifelas y protuberancias conspicuas de color amarillo pálido en las ramas terminales que podrían ser picnidios o una infección de otro hongo. Este ejemplar, a falta de evidencias moleculares, habría sido asignado a U. cristatula, pero se anida claramente dentro de U. ceratina. Un resultado inesperado fue la agrupación independiente (fuera del clado) de dos ejemplares con las características de U. ceratina, como la química, el hábito y la pigmentación rosa en la médula. El ejemplar 4.35.55 es indistinguible de U. ceratina y parece ser un ejemplar inmaduro; 0.1.0 tiene soralios grandes y excavados, a diferencia de los típicos tuberculados y redondos de U. ceratina. Este fenotipo fue identificado previamente, y asignado al taxón U. entoviolata por Clerc (2004), pero su baja abundancia no ha permitido corroborar la separación de U. ceratina a partir de estudios morfológicos. En el árbol concatenado y parcialmente en los de cada loci, U. cristatula tiene a agregarse con U. entoviolata, aunque con soporte bajo. Sin embargo, la relación de ambas con U. ceratina no es clara (Fig. 12). Más aún, mientras que las U. ceratina inglesas se acomodan con las mexicanas en el árbol de ITS de la sección, las secuencias de Japón se asocian a U. entoviolata (Fig. 16). Esto puede ser un indicio de que las poblaciones japonesas no son conespecíficas con U. ceratina. Si nos concentramos en los rADN, U. ceratina presentó polimorfismo en la amplificación de la inserción en la SSU. Mientras que algunas (32) secuencias sólo amplificaron a partir del motivo CATTA, otras (22 secuencias) incluyeron los 300pb extras pertenecientes al intrón tipo I, junto con un indel de 49pb, el más grande de los taxa muestreados. Ni U. cristatula ni U. entoviolata amplificaron el intrón, aunque esto no descarta que en éstas y otras especies sí exista un intrón homólogo, ya que no es claro por qué sólo algunos ejemplares la amplificaron. 91 Al observar con cuidado las secuencias de rARN con y sin intrón en U. ceratina, es notable que algunas sustituciones no están compartidas entre grupos. Para corroborar esta segregación se corrió un análisis de ML de rRNA (sin el intrón) con el modelo de sustitución TrN+G estimado por JModelTest. El árbol resultante y un resumen con los sitios más ilustrativos de la alineación de ITS + LSU se muestra en la Fig. 19. Las secuencias con intrón se separan de las que sí lo amplificaron. Además, como demuestra el análisis filogenético general, las secuencias de ambos grupos están más relacionadas entre sí que con cualquier otro taxa, es decir que un origen externo por contaminación o por transferencia horizontal es improbable. Los grupos con y sin intrón no aparecen como tales en los otros genes (ver Fig. 11). Esto puede ser evidencia de paralogía en los operones ribosomales de U. ceratina, aunque no se probó aquí si ambas copias están presentes simultáneamente en un mismo genoma. También podría tratarse de polimorfismo ancestral, es decir, individuos con y sin intrón. Notablemente, DnaSP detectó algunos sitios de recombinación entre los grupos (RM = 2; Tabla 6). También dentro del grupo con intrón (RM = 1), pero no dentro del que no lo tiene (RM = 0). Las secuencias 2.28.46 y 4.40.63 son interesantes, ya que posee mutaciones privadas de los dos grupos. De hecho, si se remueven un par de secuencias que tienen una tercera variante (i.e. un sitio que no cumple el modelo de sitios infinitos) en un sitio clave, la detección de recombinación es sensible a la remoción de 2.28.46 (RM = 1, en vez de 2). Al mismo tiempo, el ejemplar 4.40.63 amplificó el intrón, pero presenta por lo menos tres sustituciones típicas del grupo sin intrón. La red de haplotipos de TCS produjo un loop en el grupo con intrón, lo que constituye evidencia adicional de recombinación (Fig. 20). Prácticamente se detectaron secuencias con y sin inserción en todas las localidades. Sin embargo, al incluir las secuencias de Inglaterra, todas se agregan con el grupo sin la inserción (Fig. 20). Interesantemente, cinco de 6 secuencias de Inglaterra tienen el haplotipo que también es el más frecuente en México. Es muy factible que dicho haplotipo sea ancestral. 6.4.5.1.1. Estimados de diversidad genética, estructura y demografía histórica de U. ceratina La prueba de Hudson no mostró evidencia de diferenciación genética entre Mich1 (Zinapécuaro, Michoacán) y Mich2 (Reserva de la Biósfera de la Mariposa Monarca, Michoacán) (KS = 1.43891, KST = -0.01923, p = 0.8620; KS* = 0.71532, KST* = 0.04345, p = 0.1770), por tanto se las combinó en los análisis como una sola población: Mich. 92 Figura 19. Árbol de ML no enraizado de los haplotipos de ITS + LSU de Usnea ceratina en México y un resumen de la alineación (sólo el último sitio pertenece a la LSU). Las secuencias que amplificaron el intrón tipo I en la SSU (enmarcadas) se separan de las que no la amplificaron (por abajo del cuadro) en el análisis filogenético (93.1% BS, 500 réplicas). Sin embargo, parece haber recombinación entre estos dos clados, evidenciada por dos secuencias: Jal.63 (en un cuadrado) y Hgo.46 (en un círculo) (ver texto y Tabla 6). Las cabezas de flecha por encima de la alineación indican los sitios donde se detectan los 4 gametos dentro del grupo con intrón que sugieren recombinación. No hay un patrón geográfico en la distribución de los dos grupos. Comparar con Fig. 20. 93 Figura 20. Red de haplotipos de ITS de U. ceratina, incluyendo las secuencias de Inglaterra. Las secuencias de Japón no se incluyeron porque resultaron ser muy divergentes. El tamaño de los círculos es proporcional al número de haplotipos muestreados. Los puntos negros representan haplotipos no muestreados y los colores corresponden a las localidades. La topología es muy similar a la Fig. 19, y los haplotipos señalados con un cuadro y un óvalo son 4.40.63 y 2.28.46, respectivamente. El loop en la parte superior (i.e. el grupo con el intrón), es un indicio de recombinación intragrupal. 94 Tabla 6. Estimados de recombinación de U. ceratina para México (los tres loci) e Inglaterra (ITS) a partir de las ecuaciones de Hudson (1987) y Hudson y Kaplan (1985) usando DnaSP. Los (posibles) parálogos de los datos ribosomales presentan recombinación entre ellos, pero sólo aquel con el intrón tiene recombinación intragrupal. MCM7 tiene relativamente poca recombinación; TSR1 en cambio tiene mucha, como se aprecia por los estimados de RM y los intervalos de confianza, aunque sus estimados de R son similares. Simulaciones de Coalescencia Gen N pb S Ssi R RM RM prom P (RM < RM observada) Intervalo de confianza ITS México 54 491 30 (31) 29 7.199 2 2.4062 0.5689 1.00, 5.00 ITS México+Inglaterra 61 490 30 (31) 29 4.699 2 1.944 0.739 0.00, 4.00 ITS México (con intrón) 23 491 22 (23) 21 11.1 1 2.1043 0.2836 0.00, 4.00 ITS México (sin intrón) 31 492 9 (9) 9 0.499 0 0.089 0.9123 0.00, 1.00 ITS México (sin intrón) + Inglaterra 39 491 10 (10) 10 0.699 0 0.1532 0.8515 0.00, 1.00 MCM7 54 479 21 (21) 21 8.7989 1 2.1526 0.2635 0.00, 4.00 TSR1 54 618 30 (30) 30 9.999 4 2.9471 0.9062 1.00, 5.00 N: número de secuencias. pb: longitud en pares de bases de la alineación en cuestión. S: número de sitios segregantes y, entre paréntesis, el número total de mutaciones. Ssi: número de sitios que cumplen el modelo de sitios infinitos. R: número de eventos de recombinación en la historia de la muestra. RM: número mínimo de eventos de recombinación detectados con la prueba de los cuatro gametos. RM prom: número promedio de eventos de recombinación en las simulaciones de coalescencia neutrales. P (RM < RM observada): probabilidad de RM sea menor o igual que la RM observada bajo un proceso de coalescencia neutral. Intervalo de confianza: del 95% (límite inferior, límite superior) de RM bajo un proceso de coalescencia neutral. 95 La Tabla 7 detalla en los estimados de diversidad de las poblaciones muestreadas y de la especie en México. Combinar los grupos de ITS con y sin intrón implicaría mezclar historias distintas definidas por la recombinación diferencial entre ellos, además de que podría tratarse de parálogos. Por tanto, dentro del ITS, se eligió para los análisis sólo al grupo sin el intrón, ya que parece ser el homólogo a las secuencias de Inglaterra y gracias a eso es posible la comparación. Es notable que el número de haplotipos tiende a ser similar entre MCM7 y TSR1, exceptuando Michoacán. No obstante, TSR1 presentó siempre más cantidad de sitios segregantes. En general, Hidalgo (los tres loci) y Michoacán (MCM7 y TSR1) son más diversos que Oaxaca, aunque esto puede ser un efecto del muestreo limitado (8 individuos en este Estado). De igual forma, no es posible sacar conclusiones para Jalisco (3 individuos). Las pruebas de neutralidad sólo fueron significativas (y negativas) cuando se usaron todos los datos en conjunto de la especie (México + Inglaterra) con ITS. La significancia ocurrió con p < 0.05 para la D de Tajima, y para la F* de Fu y Li, pero no para la D* de Fu y Li, donde 0.05 < p < 0.10. Sin embargo, si la prueba se aplica con una sola cola, entonces D* sí es significativo (ver Tabla 2 de Fu y Li, 1993). Los valores negativos pueden explicarse con eventos de expansión poblacional o por selección direccional. Entre poblaciones, parece haber poca diferenciación genética, que no es significativa para ninguna comparación tras aplicar la corrección de Bonferroni, ni siquiera entre Inglaterra y México (Tabla 8). Si se considera a Jalisco (3 individuos), la estructura es altamente significativa (KST y KST* p < 0.001; datos no mostrados) pero es necesario confirmar esta posible separación biogeográfica con mayor número de individuos. Tabla 8. Estructura poblacional entre Oaxaca (Oax1), Hidalgo (Hgo) y Michoacán (Mich = Mich1 + Mich2) en Usnea ceratina usando los tres loci, y entre Inglaterra o todas las muestras de México, con ITS. Se muestran los valores de FST (Hudson et al., 1992b) estimados con DnaSP. Si se aplica la corrección de Bonferroni, ninguna comparación es significativa. N: número de individuos; n.a.: no aplica. Locus Población N Oax1 Hgo Mich México Inglaterra MCM7 Oax1 8 - 0.1033 -0.0226 n.a. n.a. Hgo 25 - 0.0511 n.a. n.a. Mich 17 - n.a. n.a. TSR1 Oax1 8 - 0.15598 0.15156 n.a. n.a. Hgo 25 - -0.01273 n.a. n.a. Mich 17 - n.a. n.a. ITS Oax1 6 - 0.02609 -0.02 n.a. -0.05455 Hgo 13 - -0.04255 n.a. -0.03846 Mich 9 - n.a. -0.08696 México 30 - -0.02943 Inglaterra 7 - 96 Las redes de haplotipos de los genes codificantes (Fig. 21) corroboraron la falta de estructura en las poblaciones mexicanas, pues los haplotipos están repartidos entre todas las localidades. La excepción es Jalisco, de donde sólo se recuperaron haplotipos privados. La red de MCM7 exhibió un haplotipo dominante del que derivan muchos haplotipos a un solo paso mutacional, similar al patrón que se observa en la red de ITS (Fig. 20). Esto no es tan claro en la red de TSR1, aunque quizá se deba a la recombinación que parece haber en este locus (Tabla 6) y/o al muestreo incompleto. Figura 21. Redes de haplotipos de MCM7 y TSR1 de las poblaciones de U. ceratina en México. Simbología y colores como en la Fig. 20. Es notable que los haplotipos más frecuentes están en todas las localidades, exceptuando Jalisco. Un haplotipo de Michoacán en TSR1 resultó altamente divergente (se secuenció dos veces para corroborar su autenticidad). No obstante, el mismo individuo mostró haplotipos normales en los otros dos loci. 97 Tabla 7. Estadísticos descriptivos de variación genética de U. ceratina y pruebas de neutralidad para las poblaciones mexicanas individuales, para todo el país, para Inglaterra y para la especie. En el caso del ITS sólo se evaluó el grupo sin el intrón. Los resultados significativos se resaltan con negritas. Población Locus N pb S h Hd SD Hd π SD π θw SDc θw SDs θw D D* F* Oax1 MCM7 8 479 2 3 0.6070 0.1640 0.0014 0.0005 0.0016 0.0011 0.0012 -0.4479 -0.1493 -0.2379 TSR1 8 618 5 3 0.4640 0.2000 0.0029 0.0012 0.0031 0.0014 0.0018 -0.3355 0.1265 0.0214 ITS 6 492 1 2 0.5330 0.1720 0.0011 0.0004 0.0009 0.0009 0.0009 0.8506 1.0525 1.0291 Hgo MCM7 25 479 13 12 0.8670 0.0510 0.0052 0.0007 0.0072 0.0020 0.0020 -0.9545 -1.5708 -1.9158 TSR1 25 618 16 10 0.8770 0.0350 0.0072 0.0007 0.0069 0.0017 0.0027 0.1854 -0.5567 -0.3861 ITS 13 492 4 5 0.5380 0.1610 0.0013 0.0005 0.0026 0.0013 0.0016 -1.7750 -2.1970 -2.3717 Jal MCM7 3 479 7 3 1.0000 0.2720 0.0097 0.0035 0.0097 0.0037 0.0065 - - - TSR1 3 618 2 2 0.6670 0.3140 0.0022 0.0010 0.0022 0.0015 0.0018 - - - ITS 2 492 2 2 1.0000 0.5000 0.0041 0.0020 0.0041 0.0029 0.0035 - - - Mich MCM7 17 479 8 6 0.7430 0.0890 0.0030 0.0007 0.0049 0.0018 0.0024 -1.4267 -1.3366 -1.5675 TSR1 17 618 23 11 0.9340 0.0430 0.0084 0.0008 0.0110 0.0023 0.0034 -0.9569 -1.2707 -1.3660 ITS 9 492 1 2 0.2220 0.1660 0.0005 0.0003 0.0008 0.0008 0.0008 -1.0882 -1.1899 -1.2829 México MCM7 54 479 21 17 0.8050 0.0470 0.0045 0.0006 0.0096 0.0021 0.0033 -1.6910 -1.5708 -1.9158 TSR1 54 618 30 18 0.8860 0.0007 0.0076 0.0008 0.0107 0.0019 0.0034 -0.9340 -1.7311 -1.7202 ITS 31 492 8 7 0.4900 0.1050 0.0016 0.0005 0.0041 0.0014 0.0018 -1.8040 -1.8730 -2.1633 Inglaterra ITS 7 491 2 3 0.5240 0.2090 0.0012 0.0005 0.0017 0.0012 0.0013 -1.2372 -1.2959 -1.3741 Especie ITS 38 491 9 8 0.4870 0.0950 0.0015 0.0005 0.0044 0.0015 0.0019 -1.9117 -2.3511 -2.5955 N: número de individuos. pb: longitud en pares de bases de la alineación en cuestión. S: número de sitios segregantes (número total de mutaciones). h: número de haplotipos. Hd: diversidad haplotídica. SD Hd: desviación estándar de la diversidad haplotídica. π: diversidad nucleotídica. SD π: desviación estándar de la diversidad nucloetídica. θw: Tasa de mutación poblacional por sitio, 4Nu. SDc θw: Desviación estándar de θ permitiendo recombinación. SDs θw: Desviación estándar de θ sin recombinación. D: Prueba de neutralidad de Tajima (1989). D*: Prueba de neutralidad de Fu y Li (1993). F*: Prueba de neutralidad de Fu y L (1993). 98 6.4.5.2. Usnea rubicunda y aliados La principal característica de U. rubicunda (sorediada) y U. erinacea (apoteciada) es la corteza pigmentada de rojo. El sinónimo de U. erinacea, U. sanguinea, ha sido sugerido como la especie primaria de U. rubicunda (Swinscow y Krog, 1979). En este estudio ambos taxa fueron colectados, aunque con un solo representante de U. erinacea y nueve de U. rubicunda. Adicionalmente, se detectaron dos talos pigmentados con diferencias morfológicas y químicas que fueron asignados a U. sp7 y U. sp10 (Anexo D). Las relaciones de los ejemplares mexicanos de U. rubicunda no se resuelven entre sí en los genes codificantes y forman un clado monofilético sólo con bajo soporte con el ITS (Fig. 11). En el árbol multilocus en cambio, U. rubicunda es monofilética y las relaciones internas están fuertemente soportadas (Figs. 12 y 22). Los individuos de U. erinacea, U. sp7 y U. sp10 se posicionaron cerca de U. rubicunda y de algunos miembros del agregado de U. fragilescens, pero siempre con bajo soporte y con posiciones particulares diferentes. A juzgar por las longitudes de ramas, las tres secuencias constituyen linajes separados cada una. Figura 22. Detalle del árbol de loci concatenados de México (izquierda) y del árbol de ITS de la sección Ceratinae (derecha) que muestra a las especies pigmentadas de rojo (U. rubicunda, U. erinacea, U. rubrotincta, U. sp7 y U. sp10) y su distribución topológica. El clado de U. amblyoclada tiende a asociarse a estos taxa sólo con bajo soporte. El ejemplar 2.50.76 se resalta con un círculo gris. 99 Una evidencia adicional de la separación de los cuatro taxa es el indel del extremo 3' del intrón de la SSU. Mientras que U. rubicunda presenta un indel de 20 pb (similar a la de U. cornuta s.l. con ácido salazínico) al final del intrón, U. sp7 no tiene indel y U. sp10 y U. erinacea ni siquiera amplificaron el intrón. Sólo dos secuencias de Genbank tienen el intrón disponible: U. rubicunda 003 (FJ494949.1) y U. rubrotincta 015 (DQ232664). Ambas presentaron el mismo indel de U. rubicunda en México. El intrón de la secuencia 015 U. rubrotincta (antiguo sinónimo de U. rubicunda hasta su resurrección por Ohmura (2001, 2008) para Asia y Oceanía) comparte varias sustituciones con el ejemplar 2.50.76, individuo que es además el más basal en el árbol de loci concatenados. En el análisis de la sección Ceratinae, por lo menos el ejemplar 2.50.76 de U. rubicunda se agrupa con alto soporte con las secuencias de Reino Unido, de donde se describió la especie originalmente (Fig. 22). Otros individuos mexicanos se asocian con soporte a secuencias de EUA, Portugal, Japón y Taiwan. Las secuencias de U. rubrotincta forman dos clados separados cuyas relaciones no están resueltas entre ellos ni con U. rubicunda. Cuando se aplica la prueba de los cuatro gametos para estimar recombinación en U. rubicunda, RM ITS = 7, RM MCM7 = 2, RM TSR1 = 1. No obstante, si se remueve del análisis al individuo más basal (círculo gris en la Fig. 22), es decir, 2.50.76, se obtiene que RM = 0 en todos los genes. Esto sugiere que los cuatro gametos detectados se deben a homoplasia o a una recombinación ancestral y que dentro del clado de U. rubicunda definido por la rama de 98% BS, no hay recombinación detectable. 6.4.5.3. Agregado de Usnea fragilescens Como ya se vio, las especies de este agregado no forman un grupo monofilético (Fig. 13). No se muestreó ningún ejemplar de U. fragilescens s. str en México (ni de U. florida + U. subfloridana, al hablar del agregado de U. florida). En cambio, U. cornuta y U. brasiliensis fueron los taxa más abundantes. El resto de los ejemplares se identificaron bajo los siguientes nombres: U. cirrosa, U. ramillosa, U. dasaea, U. cf. meridionalis, U. dimorpha, un ejemplar con las características de U. amblyoclada (pero ver Anexo D), U. sp3, U. sp4 y U. sp6. En los análisis de datos mexicanos, U. amblyoclada (4.27.43) formó un clado monofilético con U. sp4 (2.15.20 y 2.35.55) y U. sp5 (1.33.74). Esta última es apoteciada (las otras dos son sorediadas) y no tiene las características obvias del agregado. Asimismo, U. sp6 se asoció sin soporte a un subclado formado por U. sp3 y un ejemplar identificado como U. cornuta s.l. (2.42.64; ver más adelante). Estos 100 tres a su vez parecen estar relacionados (con bajo soporte) a los tres ejemplares colectados de U. dasaea en el árbol multilocus y en el de la sección Ceratinae de ITS. Al parecer U. dasaea es monofilética en México (los ejemplares se colectaron en Querétaro, Hidalgo y Oaxaca), pero no se resuelve su relación con los de Portugal y Japón. De hecho, los ejemplares de Portugal (271 y 272) son extremadamente divergentes (nótese la longitud de la rama que los separa). Como se muestra en la sección 7. Discusión, el concepto general de U. cornuta incluye numerosos quimiotipos en muchas partes del mundo. En este estudio sólo se colectaron dos: el dominado por ácido salazínico y el que tiene los ácidos norestíctico y estíctico. Todos los ejemplares excepto uno, tienen ácido salazínico. La excepción fue 2.42.64, que resultó no ser conespecífico y al parecer ni siquiera emparentado con el resto de las U. cornuta s.l. En cambio, los talos con ácido salazínico formaron un clado hermano de otros muy similares identificados bajo el nombre de U. brasiliensis. Clerc (2004) propuso reducir a U. brasiliesis a subespecie de U. cornuta, principalmente por el gran parecido y la ocurrencia de ejemplares “mezclados”: morfología de U. cornuta, pero química de U. brasiliensis (ácido protocetrárico) o al revés. Por otra parte, se han sugerido especies primarias tanto para U. cornuta como para U. brasiliensis: U. cirrosa y U. ramillosa, respectivamente (Clerc, 2007; Herrera-Campos et al., 2001). Por tanto, Clerc (2007) propuso también como subespecie a U. ramillosa (U. cirrosa subsp. ramillosa). El análisis filogenético muestra no sólo que U. cirrosa y U. ramillosa son distintas, sino que U. cirrosa no está emparentada ni con U. ramillosa ni con U. cornuta. Más aún, el ejemplar de U. ramillosa (la especie primaria), se resolvió claramente dentro de U. brasiliensis (la especie secundaria). Adicionalmente, dos ejemplares de U. brasiliensis presentaron apotecios. U. brasiliensis (+ U. ramillosa) es monofilética y fuertemente soportada en los tres loci y en el análisis multilocus, excluyendo a un ejemplar (2.26.43). U. cornuta s.l. en cambio, tiende a formar de dos a tres clados de ejemplares muchas veces genéticamente idénticos (igual genotipo) que, dependiendo del locus, son (MCM7) o no (ITS y TSR1) resueltos como subclados de uno más grande y monofilético. De acuerdo con esto, en el árbol de loci concatenados, U. cornuta s.l. es monofilética, pero se separa en dos subclados: Hidalgo (soportado) y Oaxaca (no soportado). El ya mencionado ejemplar conflictivo de U. brasiliensis, 2.26.43, se comportó de manera variada según el gen: en ITS es basal a ambos clados; en el MCM7, no se resuelve sus relación con ninguna de las dos especies; y en el TSR1, se anida dentro de U. brasiliensis. Adicionalmente, 2.26.43 es de nuevo basal a 101 ambas especies si se hace un análisis filogenético de los intrones (Fig. C1, Anexo C). Y como ya se mencionó en el apartado 6.4.2, al repetir el análisis sin ese ejemplar, U. brasiliensis se rescata como monofilética en el árbol de consenso estricto (Fig. 14b). Al representar la relación entre U. cornuta s.l. y U. brasiliensis (+ U. ramillosa) en una red de haplotipos, el conflicto con 2.26.43 se muestra de nuevo (Fig. 23). En la red de ITS, 2.26.43 parece ser incluso más cercano a U. cornuta que a U. brasiliensis. La Fig. 23 muestra que los haplotipos dentro de las dos especies tienden a ser muy distantes entre sí, tanto que la distancia genética entre taxa y dentro de los taxa podrían ser iguales. Mientras que esto se debe principalmente a submuestreo, se esperaría que dos individuos de una especie tuvieran menor distancia genética entre sí que con los de otra especie. La prueba U de Mann-Whitney demuestra que la distancia intraespecífica (i.e., las comparaciones dentro de cualquiera de las dos especies) es distinta de la distancia interespecífica (comparaciones de individuos de diferentes especies) con p < 0.0001 (Tabla 9). De igual forma, la distancia dentro de U. cornuta s.l. es igual a la de dentro de U. brasiliensi + U. ramillosa para ITS y MCM7, aunque no para TSR1 (p < 0.0016). Notablemente, todos los ejemplares de U. brasiliensis (incluyendo a 2.26.43) presentan un indel particular al final del intrón de la SSU. De igual forma, las U. cornuta s.l. tienen su propio indel, más grande y distinto al de U. brasiliensis (Fig. 8), excepto por cuatro secuencias de Oaxaca (1.28.62, 3.4.7, 3.10.16 y 3.12.18) que amplificaron sólo a partir del motivo CATTA. Si se estima la diferenciación genética entre U. cornuta y U. brasiliensis, los valores son todos muy significativos (p < 0.0001) y altos: FST MCM7: 0.5538; FST TSR1: 0.5393; FST ITS: 0.3731. Si se ignora al ejemplar 2.26.43, los valores de FST aumentan ligeramente en los tres loci: FST MCM7: 0.5832; FST TSR1: 0.5610; FST ITS: 0.42732 (p < 0.0001). Notablemente, si se estima la diferenciación entre las U. cornuta s.l. de Hidalgo y las del clado de Oaxaca sin intrón, la diferenciación es aún más alta: FST MCM7: 0.8173; FST TSR1: 0.4458; FST ITS: 0.5949 (p < 0.001). Por otra parte, la presencia de loops en las redes de haplotipos puede sugerir recombinación (u homoplasia). Una evaluación similar a la que se efectuó con U. ceratina demuestra que hay menos recombinación en U. cornuta s.l. que en U. brasiliensis + U. ramillosa y que al juntar las secuencias de las dos especies, se detectan eventos de recombinación adicionales usando la prueba de los cuatro gametos (RM) (Tabla 10). De hecho, remover al ejemplar conflictivo 2.26.43 disminuye un evento en MCM7. Esto es muy notable, ya que en este locus no se detecta recombinación con RM en ninguna de las dos especies por separado 102 (aunque sus intervalos de confianza son mayores a 0). No obstante, la detección de RM podría deberse a homoplasia. En el árbol de la sección Ceratinae con ITS (Fig. 16), U. brasiliensis y U. cornuta s.l. (incluyendo ejemplares que no son mexicanos) son hermanos, y 2.26.43 es basal a ambos. U. brasiliensis (+ U. ramillosa) es una vez más monofilética. La relación entre las secuencias de U. cornuta s.l. no se resuelve, pero es notable que por lo menos un ejemplar mexicano (2.30.60) se asocia con soporte a las secuencias de Reino Unido (i.e. U. cornuta s. str.) y que las secuencia canadienses de U. fragilescens (040 y 013) se anidan con talos mexicanos. En contraste, las secuencias europeas de U. fragilescens s. str. son basales a la sección Ceratinae, aunque sin soporte (U. cornuta s.l. parece ser derivada). 6.4.5.3.1. Estimados de diversidad genética y demografía histórica de U. cornuta s.l. y U. brasiliensis Al estimar los estadísticos de diversidad (Tabla 11), se consideró a U. cornuta s.l. y a U. brasiliensis + U. ramillosa como especies separadas. Adicionalmente, se estimaron para la población de Hidalgo de U. cornuta s.l. y para la de Oaxaca sin intrón. En el caso de U. brasiliensis se estimó para Hidalgo con y sin el ejemplar 2.26.43 (pero no para Jalisco porque sólo se colectaron dos ejemplares). En todos los casos, excluir a 2.26.43 disminuyó la diversidad de U. brasiliensis. Aún así, es claro que la población de U. brasiliensis de Hidalgo es más diversa que la de U. cornuta s.l., tanto haplotípica (Hd) como nucleotídicamente (π). Aunque se tiene muy bajo tamaño de muestra (cuatro), la población de Oaxaca sin intrón de U. cornuta s.l. es también más diversa que su contraparte en Hidalgo. Finalmente, ninguna prueba de neutralidad resultó significativa, pero es notorio que casi todas las D, D* y F* de U. cornuta s.l. son positivas, mientras que casi todas las de U. brasiliensis son negativas. Figura 23. Redes de haplotipos de U. cornuta y U. brasiliensis para los tres genes. La línea verde separa los haplotipos asignados a cada especie. Los colores corresponden a cada localidad. El asterisco señala al ejemplar de U. ramillosa, mientras que las “A” marcan a los ejemplares con apotecios de U. brasiliensis. También se resalta al ejemplar 2.26.43 (como 2.43). Sólo la red de MCM7 se formó con un límite de conectividad al 95%; para los otros dos genes se disminuyó el umbral a 91% (ITS) y a 16 pasos mutacionales (TSR1). La red de U. brasiliensis individualmente se formó siempre al 95%. 103 Figura 23. Ver página anterior. U. cornuta . Oaxl . Oax2 • Hgo • Jal A U. brasiliensis 104 Tabla 9. Prueba U de Mann-Whitney entre las distancias genéticas interespecíficas (U. cornuta vs. U. brasiliensis) e intraespecíficas (dentro de U. cornuta y dentro de U. brasiliensis) estimadas con MEGA. La distancia intraespecífica de cualquiera de las dos especies es diferente de la interespecífica en los tres genes. En cambio, las distancias intraespecíficas no son significativamente distintas entre sí, excepto para el gen TSR1. Se hicieron 136 comparaciones de U. cornuta vs. U. cornuta, 36 de U. brasiliensis vs. U. brasiliensis y 153 de U. cornuta vs. U. brasiliensis. Comparación ITS + LSU MCM7 TSR1 Cornuta-Cornuta vs. Cornuta-Brasiliensis 93.8 191.1 76.6 86.1 86.1 197.4 UA = 17501 (p < 0.0001) UA = 19709 (p < 0.0001) UA = 2389 (p < 0.0001) Brasiliensis-Brasiliensis vs. Cornuta-Brasiliensis 40.5 107.8 18.5 113 18.5 113 UA = 791 (p < 0.0001) UA = 1 (p < 0.0001) UA = 0 (p < 0.0001) Cornuta-Cornuta vs. Brasiliensis-Brasiliensis 87 84.6 89.5 75.3 92.3 64.8 UA = 2380 (NS) UA = 2046 (NS) UA = 1665.5 (p < 0.0016) 105 Tabla 10. Estimados de recombinación para U. cornuta s.l., U. brasiliensis y las dos juntas con o sin el ejemplar 2.26.43 (sólo secuencias mexicanas). Se asumió que el ejemplar de U. ramillosa forma parte de U. brasiliensis. Resulta claro que U. cornuta s.l. sufre menos recombinación que U. brasiliensis, y que al combinarlas se detectan eventos de recombinación (RM) extras. Si se excluye a 2.26.43, uno de los eventos (RM) desaparece en MCM7. Simbología como en la Tabla 6. Simulaciones de Coalescencia Taxa Gen N pb S Ssi R RM RM prom P (RM < RM observada) Intervalo de confianza U. cornuta s.l. ITS 17 502 33 (35) 31 9.2 1 2.2097 0.2608 0.00, 5.00 MCM7 17 479 18 (18) 18 9.4 0 1.548 0.1074 0.00, 3.00 TSR1 17 562 36 (37) 35 6.1 3 1.8349 0.9403 0.00, 4.00 U. brasiliensis ITS 10 500 43(46) 41 58.7 3 5.7404 0.0829 3.00, 9.00 MCM7 10 479 19(19) 19 99.6 0 4.02 0.0018 1.00, 7.00 TSR1 10 562 30 (30) 30 26.2 2 3.112 0.3344 1.00, 6.00 U. cornuta s.l. + U. brasiliensis ITS 27 499 69 (77) 62 48.9 5 9.1657 0.024 6.00, 13.00 MCM7 27 479 39 (39) 39 34.6 3 5.8563 0.0562 3.00, 9.00 TSR1 27 562 62 (66) 58 25.1 8 6.3828 0.8967 3.00, 10.00 U. cornuta s.l. + U. brasiliensis ITS 26 499 63 (70) 56 41.6 5 7.9995 0.0831 5.00, 12.00 sin 2.26.43 MCM7 26 479 36 (36) 36 29.4 2 5.1528 0.0291 2.00, 8.00 TSR1 26 562 61 (65) 57 22.8 8 6.0014 0.9283 3.00, 9.00 106 Tabla 11. Estadísticos descriptivos de variación genética de U. cornuta y U. brasiliensis (+ U. ramillosa) y pruebas de neutralidad para las poblaciones mexicanas con N > 2. Simbología como en Tabla 7. Ninguna prueba es significativa. Taxa Locus N pb S h Hd SD Hd π SD π θw SDc θw SDs θw D D* F* MCM7 17 479 18 7 0.8380 0.0630 0.0119 0.0016 0.0111 0.0046 0.0026 0.2594 0.1798 0.2337 U. cornuta s.l. TSR1 17 562 36 6 0.7570 0.0910 0.0210 0.0031 0.0190 0.0072 0.0032 0.3199 1.2297 1.1215 ITS 17 502 33 7 0.7720 0.0960 0.0214 0.0023 0.0194 0.0075 0.0034 0.1489 0.0000 0.0494 MCM7 11 479 6 4 0.6730 0.1230 0.0045 0.0043 0.0043 0.0023 0.0018 0.1874 -0.4395 -0.3184 U. cornuta s.l. TSR1 11 562 11 2 0.4360 0.1330 0.0085 0.0026 0.0067 0.0032 0.0020 1.1966 1.4604 1.5763 Hidalgo ITS 11 504 20 3 0.4730 0.1620 0.0138 0.0046 0.0136 0.0060 0.0030 0.0777 0.7255 0.6348 MCM7 6 479 9 3 0.7330 0.1550 0.0093 0.0023 0.0082 0.0046 0.0027 0.7934 0.9321 0.9729 U. cornuta s.l. TSR1 6 562 26 4 0.8670 0.1290 0.0236 0.0036 0.0203 0.0101 0.0040 1.0413 1.3366 1.3908 Oaxaca sin intrón ITS 6 502 18 4 0.8670 0.1290 0.0173 0.0036 0.0157 0.0081 0.0037 0.2588 0.3365 0.3484 MCM7 10 479 19 7 0.8670 0.1070 0.0097 0.0017 0.0140 0.0064 0.0032 -1.4609 -1.7742 -1.9121 U. brasiliensis TSR1 10 562 30 7 0.9110 0.0770 0.0154 0.0026 0.0189 0.0082 0.0035 -0.8876 -0.9773 -1.0776 ITS 10 500 43 9 0.9780 0.054 0.0244 0.0035 0.0304 0.0129 0.0046 -1.2242 -1.0730 -1.2544 MCM7 9 479 14 6 0.8330 0.1270 0.0082 0.0015 0.0108 0.0052 0.0029 -1.1244 -1.3698 -1.4666 U. brasiliensis TSR1 9 562 26 6 0.8890 0.0910 0.0144 0.0029 0.0170 0.0077 0.0033 -0.7583 -0.9223 -0.9898 sin 2.26.43 ITS 9 501 35 8 0.9720 0.0640 0.0209 0.0026 0.0257 0.0114 0.0043 -1.1766 -1.1276 -1.2789 MCM7 8 479 14 5 0.7860 0.1510 0.0087 0.0021 0.0113 0.0055 0.0030 -1.1850 -1.4635 -1.5529 U. brasiliensis TSR1 8 562 20 5 0.8570 0.1080 0.0129 0.0025 0.0137 0.0065 0.0031 -0.3128 -0.3933 -0.4166 Hidalgo ITS 8 500 36 7 0.9640 0.0770 0.0244 0.0041 0.0278 0.0126 0.0046 -0.8899 -0.8042 -0.9189 MCM7 7 479 9 4 0.7140 0.1810 0.0065 0.0017 0.0077 0.0041 0.0026 -0.7677 -0.9711 -1.0135 U. brasiliensis TSR1 7 562 14 4 0.8100 0.1300 0.0110 0.0024 0.0102 0.0052 0.0027 0.4587 0.3977 0.4523 Hidalgo sin 2.26.43 ITS 7 501 25 6 0.9520 0.0960 0.0195 0.0024 0.2037 0.0098 0.0041 -0.4549 -0.3477 -0.4104 107 7. Discusión 7.1. Delimitación de especies y relaciones filogenéticas En muchos casos sólo fue posible utilizar el concepto filogenético de especie en combinación con la taxonomía clásica como evidencia (propiedad secundaria) de un linaje independiente, en particular con aquellas especies representadas por pocos o sólo un ejemplar. En otros, la diferenciación genética (medida con el estadístico FST), la presencia o ausencia del intrón y su indel y los eventos de recombinación (con RM) permitieron reforzar la evidencia ofrecida por la inferencia filogenética. Adicionalmente, fue posible contribuir al conocimiento de la biodiversidad y las relaciones evolutivas entre las especies, las secciones y los subgéneros dentro del género Usnea. 7.1.1. El intrón tipo I en la inferencia filogenética y delimitación de especies del género Usnea Los elementos transponibles han sido utilizados por algunos autores como marcadores para reconstrucciones filogenéticas en hongos y delimitación de especies. Por ejemplo, Myllys et al. (2001) aprovecharon la presencia fija de un intrón en algunas especies del género Physcia para efectuar análisis filogenéticos. De igual forma, Thell (1999) usó un intrón tipo I al analizar las relaciones de algunos géneros cetrarioides. A nivel interespecífico, la presencia y ausencia de elementos transponibles fue utilizada por Giraud et al. (1997) para detectar dos especies dentro del hongo fitopatógeno Botryotinia fuckeliana, que resultaron tener sutiles diferencias ecológicas y morfológicas. Adicionalmente, Leavitt et al. (2011b) notaron que una especie candidata del género Rhizoplaca identificada en su investigación, carece totalmente de un intrón tipo I, en oposición a las especies más cercanamente relacionadas. La presencia de intrones tipo I en la SSU de Usnea ha sido notada múltiples veces, pero es generalmente descartada en los análisis posteriores (p.ej., Kelly et al., 2011; Ohmura, 2002; Saag et al., 2011;). La incidencia de amplificación dentro de Usnea (alrededor del 40% de los individuos) es coherente con la de otros estudios (p.ej., Thell, 1999) y no es claro a qué se debe la variación. Es posible que se trate de un polimorfismo ancestral. También puede que hayan ocurrido múltiples pérdidas o ganancias provenientes de otra parte del genoma (Thell, 1999). Tampoco es descartable que haya algún grado de transferencia horizontal, como ya ha sido detectado entre el fotobionte y otros miembros de la simbiosis liquénica 108 (del Campo et al., 2009). Asimismo, podría existir algún sesgo en la amplificación durante la PCR (O'Donnell y Cigelnik, 1997). No obstante, es notable que la presencia del intrón y su indel en el extremo 3' suele coincidir con los límites entre especies, revelados a partir de la taxonomía clásica y los loci codificantes. Esto es particularmente obvio al comparar U. cornuta s.l. y U. brasiliensis y las especies pigmentadas de rojo. En otros casos permite sospechar discontinuidades dentro de grupos morfológicos difíciles, como el clado oaxaqueño dentro de U. cornuta s.l. y el de U. silesiaca. En el caso de U. ceratina, la amplificación del intrón fue variable, no presentó asociación geográfica y puede deberse a variación intragenómica (i.e. paralogía), lo que constituiría el primer reporte de este tipo para Usnea, o a polimorfismo ancestral (extensible a todo el género) que se mantiene en las poblaciones mexicanas. O'Donnell y Cigelnik (1997) encontraron copias parálogas de ITS2 en Gibberella fujikuroi, de las cuales una es más susceptible a amplificación. El análisis filogenético permite sospechar que los dos linajes de U. ceratina (con y sin intrón) son extensivos a las subunidades del ribosoma y al ITS, y posiblemente al operón entero. Y en efecto, alguna de las dos copias podría estar en más abundancia dentro del genoma, lo que induciría la amplificación preferencial. Si se tratara de copias parálogas, podría ocurrir recombinación no homóloga durante el proceso de homogeneización que procura la evolución concertada, incompleta en este caso. En el otro escenario, sólo algunos individuos presentan el intrón, y en algunas ocasiones hay recombinación homóloga entre los dos linajes. De cualquier forma, cuando presente el intrón, el indel en el extremo 3' es único a U. ceratina y puede ser útil para su identificación. El intrón de Usnea y Everniastrum presentó los motivos conservados del intrón tipo I de Parmeliaceae perteneciente al grupo de Flavoparmelia caperata reportado por Gutiérrez et al. (2007). En su estudio de varios representantes de la familia (aunque no Usnea ni Everniastrum), Gutiérrez et al. (2007) mostraron que este intrón es exclusivo de algunos géneros parmelioides (que no del resto de los parmeliaceos). En las reconstrucciones filogenéticas de Parmeliaceae, Usnea suele ser el grupo hermano del clado de géneros parmelioides, pero la relación nunca está soportada (p.ej. Crespo et al., 2007). Si el intrón tipo I constituye en efecto un polimorfismo ancestral, la presencia en Usnea soporta su parentesco cercano a este clado. Poinar et al. (2000) reportaron un fósil del género Parmelia en ambar dominicano, datado con fechas de 15 a 45 millones de años (m.a). Si los líquenes parmeliodes y Usnea están altamente emparentados, esto implica que la separación del linaje que les dio origen es todavía más antigua. En efecto, otros géneros 109 parmeliaceos probablemente más basales en las filogenias (aunque de nuevo sin soporte: Crespo et al., 2007), tienen representantes fósiles de c. 40 m.a. que son extremadamente similares a sus representantes actuales (p.ej., Anzia: Rikkinen y Poinar, 2002). 7.1.2. Papel de los caracteres químicos y morfológicos en la delimitación de especies y relaciones evolutivas dentro del género Usnea Como se ha demostrado para especies de Heterodermia (Lücking et al., 2008), los metabolitos secundarios pueden ser muy útiles a la hora de separar grupos morfológicamente cercanos, aunque en el caso de Usnea, no necesariamente relacionados. Un ejemplo muy claro son las especies que corresponden al agregado de U. fragilescens, en donde la química llega a ser decisiva para separar en la práctica, por ejemplo, a U. cornuta s.l. de U. dasaea (Clerc y Herrera-Campos, 1997). Asimismo, es posible que diferentes quimiotipos de U. cornuta s.l. en realidad correspondan a linajes separados, como sugiere el ejemplar 2.42.64. La presencia del ácido protocetrárico es decisivo para distinguir entre U. cornuta s.l. y U. brasiliensis, especies que sí están cercanamente emparentadas. Lo mismo ocurre entre los miembros del complejo de U. baileyi. Pero los caracteres químicos no son útiles para distinguir entre especies al tratar con U. ceratina y aliados, donde todas presentan ciertos ácidos. Esto indica que el uso de los caracteres químicos no puede ser establecido a priori dentro de la taxonomía de Usnea, sino que requiere otras evidencias independientes (moleculares, ecológicas, reproductivas) para determinar su valor taxonómico en cada caso. Es claro a partir de las filogenias, que el agregado de U. fragilescens es una agrupación artificial. Las múltiples convergencias de las ramas constreñidas en los extremos y el CMA tipo cornuta sugieren que hay algún valor adaptativo en este fenotipo. De manera similar, el desarrollo de la pigmentación roja en la corteza ha ocurrido por lo menos dos veces en el subgénero Usnea, aunque muchas especies pigmentadas (ver Truong et al. 2011) no fueron incluidas en los análisis y se desconoce sus afinidades. Además, existen también numerosas especies con pigmentación rojiza subcortical (Truong et al. 2011). En todos estos casos, la función de estos pigmentos es desconocida. 7.1.3. Definición de los subgéneros y las secciones dentro del género Usnea La definición de los subgéneros de Usnea propuestos por Ohmura (2001, 2002), elaborada inicialmente con especies asiáticas, parece ser robusta a la adición de 110 taxa de otros continentes. No obstante, el resultado de Ohmura (2002) sugirió, con bajo soporte de BS en una filogenia de neighbor-joining, que Eumitria está más emparentada con el subgénero Usnea que con Dolichousnea. En este estudio, Eumitria y Dolichousnea están más relacionadas entre sí con soporte relativamente alto (86% BS) y juntas constituyen el grupo hermano del subgénero Usnea. Loci adicionales y un muestreo más completo de las especies que componen los subgéneros son necesarios para corroborar esta inferencia. Dentro del subgénero Usnea, Ohmura (2001) definió a la sección Usnea con base en el tipo de corteza plectenquimatosa (tipo florida), con hifas corticales leptodermatosas. La sección Ceratinae, en cambio, tiene hifas corticales paquidermatosas, abarcando al resto de las especies no-neuropogonoides del subgénero. Ohmura (2002) evaluó esta división con ITS y encontró que sólo la sección Usnea tuvo alto soporte de BS en un análisis de neighbor joining. Wirtz et al. (2006) incluyeron más taxa en un marco de inferencia bayesiana, pero no encontraron alto soporte para ninguna de las dos secciones. No obstante, Articus (2004) utilizó la β – tubulina además del ITS, y de nuevo encontró que la sección Usnea es un grupo monofilético bien soportado usando inferencia bayesiana y máxima parsimonia. En el presente estudio se rescataron divisiones similares a las encontradas por estos autores (sección Usnea, el grupo central de Neuropogon y el resto de las Usnea que corresponderían a la sección Ceratinae) con ML, pero con soportes bajos usando exclusivamente ITS y todas las secuencias disponibles. En los análisis multilocus de México, en cambio, la división entre la sección Usnea (pero incluyendo a U. subrubicunda/subscabrosa y el clado de U. setulosa) y la sección Ceratinae está altamente soportada (85% y 92% BS, respectivamente), aunque hace falta evaluar la posición de U. cf. subeciliata, la cual pertenece a una u otra sección dependiendo del gen. En su estudio de las especies europeas, Saag et al. (2011) notaron que la sección Usnea se caracteriza por taxa difíciles de determinar y ramas cortas en los análisis filogenéticos. Sugirieron que podría tratarse de especies de divergencia reciente. Este mismo patrón se rescató con los individuos mexicanos y en el análisis de ITS de la sección en el mundo. Si de hecho el grupo es joven, podría tratarse de una radiación que tuvo lugar en grandes extensiones geográficas (Europa, América y Asia). Se ha sugerido que las radiaciones rápidas pueden ir acompañadas de extenso sorteo incompleto de linajes que limitan las reconstrucciones filogenéticas (Maddison y Knowles, 2006), y de aislamiento reproductivo intrínseco débil, lo que permite hibridación (Wiens et al., 2006). En general, especies jóvenes carecen de 111 varias propiedades secundarias de linaje, lo que complica su diagnosis (Ross et al., 2010; de Queiroz, 2007). Más aún, se piensa que la especiación simpátrica puede ocurrir más rápidamente que la alopátrica (Coyne y Orr, 2004). En grupos compuestos por taxa ampliamente distribuidos (continentes) y con una alta incidencia de asexualidad, como es el caso de Usnea, es posible que la especiación sim/parapátrica ocurra con cierta frecuencia ya que hay más oportunidades para divergencia ecológica (Coyne y Orr, 2004; Barraclough et al., 2003). En dicho escenario, resolver la delimitación de especies dentro de la sección Usnea, y en especial dentro del agregado de U. florida, demanda amplios muestreos geográficos, estudios ecológicos, caracterizaciones morfoanatómicas minuciosas de muchos ejemplares y múltiples loci (Ross et al., 2010; Shaffer y Thomson, 2007). Asimismo, la comparación con los tipos y la literatura es indispensable para tomar decisiones nomenclaturales. Desgraciadamente, más subdivisiones dentro de la sección Ceratinae permanecen poco claras, aunque parece haber cierta cercanía entre U. ceratina y aliados, U. rubicunda y aliados, U. angulata y algunos miembros del agregado de U. fragilescens. El parentesco entre U. cornuta s.l, U. brasiliensis, U. shadenbergiana y U. sp1 también está altamente soportado (98% BS). Considerando lo especioso que es el género, se requiere aún la inclusión de muchos más taxa para definir con claridad otras subdivisiones. El ITS resultó ser, por sí solo, un marcador pobre para resolver las relaciones evolutivas dentro del subgénero Usnea. No obstante, la falta de resolución puede deberse en parte a la remoción de las partes ambiguas del alineamiento. Estrategias para codificar estas regiones, como las usadas por los programas INAASE (Lutzoni et al., 2000) y PICS-Ord (Lücking et al., 2011), probablemente mejorarían la inferencia filogenética del género a la hora de usar datos ribosomales. 7.1.4. Contribución a la delimitación de especies: casos selectos 7.1.4.1. Usnea baileyi s.l. Dentro del subgénero Eumitria existe un grupo de taxa ampliamente distribuido en regiones tropicales y subtropicales, incluyendo Australia, caracterizado por tener el eje fistuloso y la médula pigmentada de color amarillo, rosa a rojizo o incluso óxido oscuro (aunque se han observado ejemplares no pigmentados). Numerosos nombres han sido propuestos para ciertas variaciones morfológicas y químicas, y en general es considerado un complejo de especies cuya identificación recae fuertemente en la química. Al estudiar los ejemplares tipo del complejo, Rogers y 112 Stevens (1988) reportaron que sólo U. baileyi (y varios de sus sinónimos) tiene ácido norestíctico, mientras que U. cristata, U. elata, U. perplectata y U. vainioi presentan todas ácido difractaico. Otros taxa, como U. firmula, tienen ácido protocetrárico. Sin embargo, algunos autores incluyen en su concepto de U. baileyi la posibilidad de presentar tanto ácido norestíctico como difractaico, como es el caso de Swinscow y Krog (1988) para el este de África, o Clerc (2007) para la región del Desierto de Sonora en México (ver Tabla 12 para comparación entre autores y los ejemplares de este estudio). De manera similar, hay un claro desacuerdo sobre si las especies del complejo presentan o no soralios verdaderos. En particular Rogers y Stevens (1988) consideran que se trata de pseudocifelas que desarrollan isidios ocasionalmente, y comentan que sólo U. vainioi presenta soralios verdaderos. No obstante, siguiendo el concepto de Ohmura (2001), las pseudocifelas no forman propágulos asexuales. En ese sentido, uno no puede más que concluir que se trata en efecto de soralios. Herrera-Campos (1998) reportó únicamente a U. baileyi para México, pero comentó que es necesaria una revisión exhaustiva en este grupo, haciendo énfasis en la comparación con U. perplectata y U. vainioi. En los análisis filogenéticos, los dos ejemplares evaluados pertenecientes al complejo no sólo no se agrupan formando un clado propio, sino que además presentan una distancia genética considerable entre ellas como se aprecia en las longitudes de ramas (Figs. 10, 11 y 12). Adicionalmente, en el árbol de ITS del género, sólo el ejemplar 4.2.3 se agrupa consistentemente con las U. baileyi de Japón (obtenidas de Ohmura, 2002). Dichos ejemplares siguen el concepto de Ohmura de U. baileyi que incluye el quimiotipo de ácido norestíctico. Por otra parte, el CMA de 4.2.3 es bastante coherente con los intervalos reportados para esta especie, en especial los de Ohmura (2001). El ejemplar 4.19.31, en cambio, tiene ácido difractaico, y sus valores de CMA tienen diferencias claras, en especial con respecto al grosor de la médula. Otra disparidad evidente entre los talos es la distribución del pigmento en la médula. En el caso de 4.2.3, la médula es muy delgada y completamente pigmentada de rosa rojizo. En contraste, 4.19.31 tiene el pigmento claramente restringido alrededor del eje (periaxial), y el eje mismo está levemente pigmentado de color rosa pálido. El hábito difiere (4.2.3, arbustivo; 4.19.31, péndulo) pero eso puede deberse a variación ambiental, como es típico de otras especies de Usnea (p.ej., U. ceratina). 113 Tabla 12. Diferencias en el concepto de especies del complejo de U. baileyi relevantes para este estudio y comparación con los ejemplares mexicanos. Algunos autores incluyen diferentes quimiotipos en la definición de U. baileyi, en donde el compuesto principal puede ser ácido norestíctico (NOR), difractaico (DIF) o tamnólico (TAM). De igual forma, hay desacuerdo con respecto a ciertas estructuras abundantes en el talo, que pueden ser soralios (Sor) o pseudocifelas (Pse), y ubican de manera distinta los pigmentos de la médula. La química reportada por Rogers y Stevens (1988) corresponde a los ejemplares tipo. Ver texto para la discusión de los valores de Motyka (1938). x: Presencia; -: no hay datos disponibles; ?: la información es confusa. Usnea Autor NOR DIF TAM Sor Pse C % M % A % Distribución del Pigmento baileyi Swinscow y Krog (1988) x x x - - - Rojo, rosa, ocraceo-amarillo u color óxico alrededor del eje. Rogers y Stevens (1988) x x - - Capa de pigmento amarillo, rosa o rojo-café alrededor del eje. Ohmura (2001) x x x 3.3-9.2 3.0-12 58-86 Pigmento rojo cerca de la corteza. Brodo et al. (2001) x x c. 6 5-6 c. 80 Médula roja. Clerc, (2008) x x 2-4 - >80 Pigmento rojo-rosado en el area cerca del eje. Motyka (1938) - - - x ? ? c.80 Médula rosada. cristata Swinscow & Krog (1988) x x - - - No pigmento. elata Swinscow & Krog (1988) x x - - - Pigmento rosa o rojo en la superficie exterior del eje. Rogers y Stevens (1988) x x - - - Pigmento rosa o amarillo alrededor del eje. perplectata Rogers y Stevens (1988) x x - - - - Brodo et al. (2001) x - - - - - - Motyka (1938) - - - x ? ? c. 66 Médula rosada. vainioi Rogers y Stevens (1988) x x - - - - Motyka (1938) CMA c. 7 c. 7 c. 71 Pigmento rojizo en el eje. Motyka (1938) C'M'A - - - x c. 4 c. 4 c. 83 Pigmento rojizo en el eje. 4.2.3B x x 8.3333 3.571 76.19 Pigmento rojo-rosado en toda la médula. 4.19.31 x x 5.3191 15.96 57.45 Pigmento rosado claramente periaxial y eje rosa pálido. 114 Considerando estas características, 4.2.3 parece corresponder a U. baileyi s. str. mientras que 4.19.31 puede pertenecer a U. vainioi, U. perplectata o U. elata (todas descritas originalmente por Motyka, 1938). U. cristata es descartada porque no presenta pigmento y sus ramas son más angulares según Swinscow y Krog (1988). En las descripciones de los ejemplares tipo de U. perplectata y U. vainioi, Motyka (1938) proporciona medidas de la corteza, la médula y/o el eje. Sin embargo, no es claro si toma en cuenta sólo un lado de la rama para medir la corteza y la médula (que equivaldría al valor reportado de CMA detallado por Clerc, 1984) o si suma el grosor total de ambos lados de cada estructura anatómica (equivalente al C’M’A; ver sección 5. Materiales y Métodos). En concreto, Motyka reporta que el tipo de U. perplectata tiene una corteza de c. 90µm y que el eje abarca c. 2/3 de la rama; no da la medida de la médula pero comenta que es delgada, aunque distinguible, y rosada. En U. vainioi, tanto la corteza como la médula miden c. 100µm y el eje es muy grueso, c. de 1mm de diámetro con una cavidad de alrededor de 800µm de diámetro. No menciona pigmento para la médula pero sí para el eje, tendiendo a rojizo. Aunque en este estudio no se tuvo acceso al ejemplar tipo y por tanto se desconoce el CMA, cualitativamente se entiende que la corteza y la médula tienen grosores similares, cosa que no sucede en 4.19.31. Por otra parte, Motyka (1938) establece la distribución de U. perplectata en Florida, México (Veracruz), Brasil, Paraguay, Argentina y la India, sugiriendo que es una especie de afinidades tropicales. A U. vainioi la describe únicamente para Florida y Carolina del Sur (EUA) y a U. elata para África. No obstante, investigaciones recientes en especies de Eumitria en Sudamérica apuntan a que U. elata es un sinónimo de U. perplectata, y que este taxón tiene el pigmento periaxial con intervalos de CMA coherentes con 4.19.31 (Truong & Clerc, 2012). Por tanto, se concluye que 4.19.31 pertenece a U. perplectata. 7.1.4.2. Usnea subfusca y aliados De acuerdo con Halonen et al. (1999), el agregado de U. florida se caracteriza por una ramificación usualmente isotómica-dicótoma, ramas cilíndricas que se adelgazan lentamente hacia las puntas, rara vez foveoladas, con corteza gruesa, médula generalmente densa, base claramente negra y copiosas papilas. Incluye especies típicamente europeas, aunque han sido reportadas en otros continentes (ver por ejemplo Ohmura y Kashiwadani, 2000) como U. subfloridana + U. florida, U. glabrescens, U. fulvoreagens y U. wasmuthii. No obstante, en este estudio el “agregado de U. florida” fue usado de una manera relajada, englobando a otros 115 agregados mencionados en la literatura, tales como el de U. rigida (Halonen et al., 1999) o el de U. arizonica (Herrera-Campos, 1998). En conjunto, todas estas especies características de la sección Usnea parecen constituir un grupo monofilético, diverso y con límites interesepecíficos difusos. La taxonomía de las especies apoteciadas de la sección Usnea aún está muy poco trabajada. Incluso en Europa se puede ver discrepancias entre la definición de especies supuestamente muy conocidas y los resultados de análisis moleculares (Kelly et al., 2011). Es difícil asignar un nombre a las especies del resto del mundo, porque existen numerosos nombres descritos por Motyka y otros, por lo que se requiere revisar el ejemplar tipo y compararlo con material actual. Por otra parte, depender totalmente de la química puede ser peligroso, como se nota con U. lecanorica: en este estudio, se demostró que dicho taxón es parafilético a ejemplares con U. salazínico y por tanto, su concepción está incompleta. Dentro de las comunidades tratadas, U. subfusca, sus morfotipos (ver apartado 6.4.4.1), U. lecanorica y U. silesiaca son las especies taxonómicas más comunes, aún cuando los taxa europeos han sido reportados en México (Herrera- Campos, 1998). No obstante, incluso la noción taxonómica tradicional de estas especies no está totalmente consolidada. En el caso de U. lecanorica, la cual es inmediatamente identificada por sus metabolitos secundarios, la descripción original de Culberson et al. (1983) no permite separarla fácilmente de otras especies usando morfología, en especial de U. arizonica y U. subfusca. U. arizonica, es muy cercana morfológicamente a U. subfusca, pero la médula es más ancha y claramente laxa (ver Fig. 10 de Tavares y Sanders, 1998; Brodo et al. 2001), aunque la química es parecida. Clerc (2007) considera a U. arizonica como un sinónimo de U. intermedia, un taxón europeo. En los análisis, ningún ejemplar mexicano se agrega con las U. intermedia de Austria y EUA. La secuencia de Gaya et al. (2003) identificada como U. arizonica, tampoco se agregó con estas secuencias. Motyka (1936-1938) ofrece una de las pocas descripciones disponibles de U. subfusca, aunque el autor no encontró apotecios. La especie es mencionada en varias publicaciones (Clerc y Herrera-Campos, 1997; Herrera-Campos (1998); Hinds y Hinds, 2007; Tavares y Sanders, 1998) y de ellas se deriva que es una especie con las siguientes características: tiene la base negra, las ramas cilíndricas se mantienen constantes en diámetro a lo largo de la rama, el CMA es similar a U. silesiaca (corteza gruesa y pálida, médula compacta a densa y delgada, y eje grueso), con papilas verrucosas y tubérculos, apotecios terminales a subterminales, y abundantes picnidios (Herrera-Campos, comunicación personal). 116 Resulta confuso que el concepto de U. subfusca parece mezclarse con el de U. florida en Clerc (2007), ya que este autor menciona que U. florida tiene tubérculos y ácido salazínico, mientras que en Europa Clerc (2012) la menciona sin tubérculos y con ácido escuamático, tamnólico y otros, pero nunca con salazínico. No obstante, según Clerc (2007) la única distinción entre U. florida y U. subfusca es que la segunda tiene esporas más pequeñas. El intervalo de tamaño reportado por Clerc (2008: 5-6 x 7-9 μm) se traslapa a su vez, con el dado por Culberson et al. (1983) para U. lecanorica (5-6 x 8-10 μm). Desgraciadamente, no se midieron esporas en este estudio, pero futuros análisis podrían explorar este carácter. El hecho de que exista un continuo reproductivo dentro del “clado gris” (Fig. 17) formado por la mayoría de las U. silesiaca y un ejemplar identificado con U. subfusca, sugiere que la separación entre estos dos taxa es artificial. Este fenómeno ya se había observado en U. florida y U. subfloridana (Articus et al., 2002). Es muy factible que el uso sistemático del concepto de par de especies no sea biológicamente significativo dentro de la sección Usnea. Por tanto, al estudiar la variación morfológica de los miembros de este grupo, no deben separarse inmediatamente los ejemplares apoteciados de los soredidados, sobre todo si se detectan ejemplares intermedios, en apoyo a los argumentos de Mattsson y Lumbsch (1989). La cohesión sólo parcial entre ciertos caracteres (CMA, química, modo reproductivo) y el muestreo limitado no permite llegar a conclusiones sólidas sobre la independencia entre U. silesiaca/U. columbiana, U. subfusca y U. lecanorica. 7.1.4.3. Usnea subscabrosa y U. subrubicunda U. subscabrosa se ha mencionado para el suroeste de Europa, Macaronesia y América del Norte (Clerc, 1992), incluyendo México (Herrera-Campos et al., 1998). Clerc (1997) consideró un sinónimo al taxón brasileño U. santa-annae Motyka, ampliando aún más su distribución geográfica. Aunque es bastante variable en cuanto a hábito, se la conoce como una especie distintiva por sus soralios puntiformes más o menos estipitados que pueden agrandarse e incluso fusionarse, alcanzando la mitad del diámetro de la rama. También es importante su corteza vidriosa y dura, la coloración de su base que es naranja, rojiza oscuro (hasta casi negra) o concolora, y la presencia de ácido protocetrárico en la médula (Fos y Clerc, 2000; Clerc, 1992, 2006, 2007, 2011b; Herrera-Campos et al., 1998). Puede llegar a ser difícil de separar de U. ceratina, a quien Clerc (1992) considera muy cercana morfológicamente. En este caso, el pigmento de la médula de U. ceratina (que puede no estar o ser muy tenue) y la química, son esenciales. U. 117 schadenbergiana también es similar y tiene una distribución muy parecida (Clerc, 1992) pero su corteza y soralios son distintos. Recientemente, Clerc (2011b) describió una nueva especie con material de EUA y Canadá a la que denominó U. subrubicunda, ya que presenta pigmentación rojiza superficial en la corteza que puede llegar a cubrir el talo de tal forma que recuerda a una U. rubicunda típica. La descripción de esta especie es muy cercana a U. subscabrosa, como menciona el autor, con la importante diferencia de que la corteza de U. subrubicunda es mate a brillante (no vidriosa) y siempre tiene ácido protocetrárico y fumarprotocetrárico. U. subscabrosa, según el autor, sólo presenta ácido protocetrárico. Esta afirmación puede resultar confusa, ya que en algunos trabajos se menciona a U. subscabrosa con ácido fumarprotocetrárico como accesorio (p.ej. Clerc, 2007). De hecho, Herrera-Campos et al. (1998) reportó a U. subscabrosa como a la especie péndula más variable químicamente de los bosques templados de México, pues además de ácido protocetrárico, algunos ejemplares estudiados presentaron los ácidos fumarprotocetrárico, hipoprotocetrárico, barbático y hasta un ácido graso desconocido. Incluso el holotipo de U. santa-annae presenta ácido fumarprotocetrárico (Clerc, 1997). Exacerbando la confusión, Truong et al. (2011) encontraron U. subrubicunda en Colombia y Venezuela pero al detallar en su identificación mencionan que esta especie “(...) is characterized by a hard and vitreous cortex in longitudinal section (...)” (Truong et al., 2011; p. 500). De hecho, contrastan a los dos taxa: “Except for the lack of cortex pigmentation and the presence of protocetraric without fumarprotocetraric acid in the medulla, U. subscabrosa Motyka (...) is very similar in its morphology, anatomy and chemistry. In particular the thick, very hard and vitreous cortex is almost identical in both species” (Truong et al., 2011; p. 500 [mis negritas]). No obstante, aunque los valores de CMA no son discutidos por los mencionados autores, los intervalos reportados para ambas especies (incluyendo a los holotipos) de la médula parecen ser ligeramente diferentes (la médula de U. subrubicunda tiende a ser más ancha en promedio; Tabla 13). ¿Qué significa esto entonces? ¿Nos encontramos frente a dos especies independientes pero extremadamente similares, o se trata solamente de plasticidad fenotípica? En el presente estudio se incluyeron cinco ejemplares que empatan con los principales caracteres de ambas, en particular la presencia variable de pigmento superficial en la corteza. Todos presentan ácido protocetrárico y fumarprotocetrárico, lo que según Clerc (2011b) y Truong et al. (2011) corresponde con U. subrubicunda, pero para Herrera-Campos et al. (1998) y Clerc (2007), cae dentro de la variación de U. subscabrosa en México. 118 Aunque U. subrubicunda no ha sido reportada para México, por lo menos dos ejemplares (1.1.1 y, sobre todo, 1.14.23) son muy afines a la descripción (e incluso las fotografías) original de este taxa (ver Clerc, 2011b) incluyendo la corteza brillante. De manera importante, el ejemplar 1.14.23 (el más similar a U. subrubicunda) presenta algunos soralios muy agrandados, algo mayores que la mitad del diámetro de la rama, y llegan a ser excavados. Aunque la descripción de U. subrubicunda no menciona esta característica, los ejemplares siguen siendo compatibles con dicho taxón, en particular porque también están presentes soralios capitados como los que menciona el autor (ver Foto 9G en Clerc, 2011b). Un tercer ejemplar pequeño (c. 4 cm) de Michoacán (5.3.4) carece de pigmento, excepto por pequeñas manchas rojas a manera de pecas. Dicho ejemplar es notoriamente similar a U. ceratina exceptuando los soralios que, de nuevo, llegan a ser grandes y excavados (y por tanto más similar a U. entoviolata, ver apartado 7.1.4.4). Clerc (2011b) menciona que sobre todo ejemplares jóvenes de U. subrubicunda pueden carecer de pigmento. Por otra parte, Herrera-Campos et al. (1998) reporta estas pecas en U. subscabrosa. Por último, los dos ejemplares faltantes son ambos de Jalisco (4.20.33 y 4.26.41) y tienen características más afines a U. subscabrosa, incluyendo soralios puntiformes que pueden alargarse y confluir alcanzando sólo la mitad del diámetro de la rama, y la corteza vidriosa. Adicionalmente, su médula es claramente más estrecha (Tabla 13). Sin embargo, sí llegan a presentar pigmento rojizo en las ramas principales y secundarias, aunque es más o menos tenue. Ambos ejemplares, por otra parte, tiene isidiomorfos que alcanzan a ser espinulosos y agrupados sobre soralios, tal y como lo comenta Clerc para U. subrubicunda (ver Foto 9F en Clerc, 2011b). En los análisis filogenéticos, los cinco ejemplares formaron un clado monofilético con (TSR1 y concatenados) o sin (MCM7 e ITS) soporte, pero tienden a separarse en dos subclados: los de Oaxaca y Michoacán vs. los de Jalisco. Sin contar la química, los subclados corresponden a U. subrubicunda vs. las U. subscabrosas. Morfológicamente, el CMA y posiblemente el tamaño máximo de los soralios las separa. Esto sugiere dos especies muy cercanamente relacionadas. Una explicación alternativa es que se trate de una sola especie polimórfica afectada por la geografía. La localidad de Jalisco forma parte del llamado Bloque Jalisco, una región biogegráfica enigmática e independiente de la Faja Volcánica Transmexicana y la Sierra Madre del Sur (Salas-Lizana et al., 2010), lo que pudo haber facilitado mayor estructura entre las poblaciones provocando la divergencia en los dos subclados. En otras palabras, los miembros de una población tienen mayor probabilidad de ser más cercanos entre ellos que con los de otra población 119 (Andrew et al., 2012). De igual manera, el pigmento, la formación de propágulos e incluso el CMA podrían estar influenciados por el ambiente (el eje de 5.3.4 es hasta cierto punto intermedio). Por ejemplo, las localidades de Oaxaca y Michoacán constan de bosques de pino-encino (2317 m) y pino (2421 m), respectivamente, mientras que la de Jalisco es un bosque de afinidades mesófilas (1745 m). En el otro extremo, esto también podría interpretarse como afinidades ecológicas diferentes de dos especies en divergencia. Tabla 13. Comparación entre el CMA y la química de U. subscabrosa y U. subrubicunda, según diferentes autores (y el holotipo en negritas), con los ejemplares mexicanos. Proto: ácido protocetrárico; Fuma: ácido fumarprotocetrárico; +: compuesto principal; + compuesto accesorio; -: compuesto nunca presente; n.i.: no hay información en la publicación. Usnea Autor C M A Proto Fuma subscabrosa Clerc (1992) 7 - 22 4.5 - 16 38 - 73 + - Holotipo en Clerc (1992) 14 13.5 45 + - Clerc (1997) 13 15.5 44 + + Herrera-Campos et al. (1998) 9 - 24.5 4.5 - 15 21.5 - 55 + + Fos y Clerc (2000) n.i. n.i. n.i. + - Brodo et al. (2001) 18 - 22 6 - 10 40 - 58 + - Clerc (2006) 11 - 17 n.i. n.i. + n.i. Clerc (2008) 11 - 17 Delgada Grueso + + Clerc (2011b) n.i. n.i. n.i. + - Truong et al. (2011) n.i. n.i. n.i. + - subrubicunda Clerc (2011b) 6 - 16.5 12 - 27.5 28-58 + + Holotipo en Clerc (2011b) 11 19.5 39 + + Truong et al. (2011) 11 - 14 16.5 - 18.6 39 - 41.5 + + 1.1.1 14.10 25.64 20.51 + + 1.14.23 12.90 22.58 29.03 + + 4.20.33 13.24 7.35 58.82 + + 4.26.41 14.52 6.45 58.06 + + 5.3.4 8.57 22.86 37.14 + + Desgraciadamente, el pequeño tamaño de muestra no permite distinguir entre estas posibilidades. Un análisis más completo debe incluir ejemplares de diferentes partes de la distribución de U. subscabrosa, incluyendo Europa (actualmente ausentes en Genbank), así como talos mexicanos que tengan únicamente ácido protocetrárico. Pero aún en la carencia, puede sospecharse que: 1) U. subrubicunda de hecho está presente en México, 2) posiblemente sea común (dado el tipo de muestreo de este estudio y colecciones personales de Herrera- Campos en MEXU) y 3) U. santa-annae es en todo caso sinónimo de U. subrubicunda y no de U. subscabrosa, restringiendo su distribución al Hemisferio Norte. 120 7.1.4.4. Usnea ceratina y aliados En las descripciones de U. ceratina se menciona comúnmente que es una especie ampliamente distribuida, particularmente en el Hemisferio Norte (Clerc, 2011a). Fue originalmente descrita para Europa y ha sido frecuentemente reportada en este continente (ver Randlane et al., 2009), pero de acuerdo con Herrera-Campos et al. (1998), se la puede encontrar en todos los continentes, excepto África y la Antártida. De igual forma, entre las especies mexicanas, U. ceratina tiene la distribución geográfica y altitudinal (1,300-3,920 m) más amplia, aunque no se encuentra en Baja California (Herrera-Campos et al., 1998). Por otra parte, su variación morfológica es tan alta que es considerada la más polimórfica de las especies péndulas sorediadas de México (Herrera-Campos et al., 1998). Por ejemplo, varía en hábito; forma de segmentos; grosor de ramas; abundancia de tubérculos y soralios, isidomorfos y fibrillas. La pigmentación de la médula y el eje, su carácter más típico, puede ser de amarilla, rosa hasta roja oscura, aunque en ocasiones el pigmento es tan tenue que no es visible (Clerc, 1992; Herrera-Campos et al., 1998). Algunos morfotipos son tan extremos que resultan difíciles de distinguir de especies tan dispares como U. subscabrosa, U. cornuta y algunas formas de U. chaetophora y U. subfloridana (Herrera-Campos et al., 1998; Halonen et al., 1998). Por su parte, U. cristatula fue descrita para México, de donde se le consideró endémica hasta que Clerc (2011b) encontró una población en Portugal. De acuerdo al estudio morfoanatómico y químico de Herrera-Campos et al. (1988), U. cristatula sólo se distingue de U. ceratina por la ausencia de soralios, y por tanto los autores la consideraron la especie primaria de U. ceratina. A partir de los análisis filogenéticos, es claro que U. ceratina es monofilética y distinta de U. cristatula. El indel particular al final del intrón, la falta de estructura en todas las poblaciones muestreadas, y en menor medida la detección de recombinación, apoyan también la noción de que U. ceratina es una sola especie. No obstante, la existencia de ejemplares como 4.40.63, sin soralios pero sí un apotecio, sugieren que, con el conocimiento taxonómico actual, siempre se corre el riesgo de identificar erróneamente ejemplares de U. ceratina, confundiéndolos con U. cristatula (aunque con baja frecuencia, 1/54 en este estudio). Lo mismo ocurre con el taxón U. entoviolata. Originalmente descrito con ejemplares de Hawái por Motyka (1936-1938), Clerc (2004) puntualizó talos de U. entoviolata en México (Hidalgo y Nayarit), Zimbabwe y Estados Unidos continental, argumentando que la única diferencia con U. ceratina está en el desarrollo y morfología de los soralios. De hecho, el propio 121 Clerc (2004) expresó cierta duda al separarla de U. ceratina, ya que U. entoviolata parece ser rara (o difícil de colectar) y no ha habido suficiente material para asegurar la ausencia de formas intermedias. A pesar de que sólo se colectaron dos ejemplares aquí, se pueden sacar conclusiones importantes. En primera instancia, uno de los ejemplares es indistinguible de U. ceratina, precisamente por la ausencia de soralios completamente desarrollados (i.e., los tiene estipitados y circulares, no grandes y excavados como en la típica U. entoviolata). Esto sugiere que U. entoviolata quizá no es tan infrecuente, sino que no es detectable en ausencia de herramientas moleculares (tan es así que se colectaron dos individuos en un muestreo somero como el realizado aquí). Nuñez-Zapata et al. (2011) descubrieron un caso similar con Parmelina tiliacea, una especie ampliamente distribuida en el sureste de Europa. Su análisis filogenético reveló un pequeño grupo de muestras restringidas a la península Ibérica, ecológica y morfológicamente indistinguibles de P. tiliacea, excepto por sutiles diferencias en los apotecios. No obstante, cuando las estructuras sexuales están ausentes, este grupo es efectivamente críptico, ya que llega a ser simpátrico con el resto de las P. tiliacea. Los autores la consideraron una especie diferente (P. cryptotiliacea). En ese sentido, U. entoviolata puede actuar como especie críptica también. En efecto, según Roe y Sperling (2007), una especie críptica ocurre cuando una o varias fuentes de caracteres bien establecidas (comúnmente morfología) para definir límites entre especies no son informativas o son incongruentes. El hecho de que las muestras de Japón estén más cercanamente relacionadas a U. entoviolata que a U. ceratina es muy notable, pero puede explicarse si se presta atención a la historia taxonómica de U. ceratina. Ohmura (2001), en su estudio de las Usnea de Japón y Taiwán, sinonimizó algunos taxa con U. ceratina, ya que no encontró diferencias ecológicas ni morfoanatómicas. Entre estos sinónimos destaca U. roseola Vainio, la cual fue descrita originalmente para Japón. Swinscow y Krog (1979) colectaron ejemplares que identificaron como U. roseola en el este de África y mencionaron que tiene soralios excavados (comparar Fig. 13 de Swinscow y Krog, 1979 con la Figs. 1-6 de Clerc, 2004). Según Swinscow y Krog (1979) el pigmento de U. roseola tiende a ser periaxial, pero Ohmura (2001) no mencionó esta característica en el ejemplar tipo de U. roseola, a pesar de que es algo al que este autor da importancia (i.e. muy probablemente no es claramente periaxial en el tipo). Por otra parte, Swinscow y Krog (1979) comentan que los caracteres importantes de U. roseola no están bien desarrollados en el tipo. 122 En este contexto, puede que estén ocurriendo dos situaciones: 1) U. entoviolata es en realidad sinónimo de U. roseola (la cual fue descrita primero), ó 2) U. roseola es distinta pero está muy emparentada con U. entoviolata. A su vez, cabe la posibilidad de que las poblaciones africanas sean conespecíficas con cualquiera de las dos, o con ninguna, pero sí están emparentadas con ellas y U. ceratina. Bajo cualquier escenario, hace falta corroborar ahora la presencia de U. ceratina (s. str.) en el este de Asia. Incidentalmente, Ohmura (2001) nombró la sección Ceratinae usando ejemplares que posiblemente pertenezcan a U. roseola, no a U. ceratina. U. cristatula no se resolvió como grupo hermano de U. ceratina. En cambio, hubo una tendencia con bajo soporte a agregarse con U. entoviolata y las poblaciones japonesas. Quizá esta falta de resolución esté relacionada a la ausencia de taxa emparentados y no muestreados. Más concretamente, es posible que lo que se ha considerado típicamente U. ceratina, constituya un complejo de especies mundial (en el que se puede incluir a la propia U. cristatula). Parece poco probable que U. cristatula constituya un par de especies verdadero con U. ceratina. 7.1.4.5. Usnea rubicunda y U. erinacea U. rubicunda s.l. se distribuye en África, Asia, Europa, Oceanía y América (Ohmura, 2008; Clerc, 2006). Como U. ceratina, es una especie muy polimórfica, con numerosos sinónimos que siguen en constante debate (Ohmura, 2001, 2008; Clerc, 2006; Lendemer, 2004; James, 1979). Estudios detallados de Usnea en Sudamérica (Truong et al., 2011) han revelado especies rojas nuevas y numerosos quimiotipos extras de U. rubicunda que sugieren diversidad adicional en áreas tropicales. En efecto, en este estudio, dos linajes detectados en los análisis filogenéticos, con características morfoanatómicas y químicas propias (Anexo D) y diferencias en la amplificación del intrón o en la presencia del indel en su extremo 3', probablemente constituyan especies nuevas (U. sp7 y U. sp10). La propia U. rubicunda parece ser monofilética en México (aunque sólo en el árbol de loci concatenados), con amplificación constante del intrón y su respectivo indel al extremo 3'. Resulta llamativo que las relaciones internas en el árbol de loci concatenados están bien resueltas con alto soporte, lo cual no se espera cuando la especie presenta algún grado de sexualidad (Barraclough et al., 2003). En efecto, excluyendo al individuo más basal, no se detectaron eventos de recombinación con la prueba de los cuatro gametos. De acuerdo con esto, las descripciones taxonómicas de este taxa nunca mencionan apotecios (p.ej. Truong et al., 2011; Ohmura, 2001, 2008; James, 1979). De hecho, según James (1979), sólo se han 123 detectado talos apoteciados en las Azores: U. rubicunda var. primaria Motyka (Clerc, 2006). Esto sugiere que este taxón está compuesto por poblaciones altamente asexuales, susceptibles a divergencia ecológica al estilo de Cohan (2001, 2002) por acumulación de mutaciones (Barraclough et al., 2003), lo que tiene el potencial de explicar la alta variación morfológica y ecológica típica de U. rubicunda s.l. Las secuencias mexicanas se asociaron en el árbol de ITS de la sección Ceratinae con muestras de Europa, Asia y Oceanía (Fig. 22), generalmente con alto soporte. Es posible entonces, que los aislados mexicanos tengan su pariente más cercano en diferentes partes del mundo. En cuanto a U. rubrotincta, Ohmura (2008) reconstruyó una filogenia con ITS y encontró que U. rubrotincta y U. rubicunda son recíprocamente monofiléticas, aunque con relativo bajo soporte. El árbol de la Fig. 22 es similar a su reconstrucción, excepto porque incluye individuos de Europa y México. En este caso, no se forman clados monofiléticos, y U. rubrotincta se separa en dos, uno más divergente con respecto a U. rubicunda que otro. Es claro que el estatus de ambos taxa a nivel mundial aún requiere revisión. De acuerdo con Truong et al. (2011), U. erinacea comparte la misma morfología, ecología y química de U. rubicunda, exceptuando los caracteres relacionados a propágulos vegetativos, y por tanto es considerada la especie primaria de U. rubicunda (Swinscow y Krog, 1988 como U. sanguinea). Desgraciadamente, sólo se colectó un ejemplar de U. erinacea, al cual se le detectaron los ácidos norestíctico y úsnico. Por lo menos este quimiotipo (raza 2 en Truong et al. 2011) puede considerarse un linaje independiente cuyas relaciones no están resueltas en los análisis filogenéticos. Como sucede con U. cristatula, no hay evidencia para suponer que U. erinacea y U. rubicunda están emparentadas al nivel sugerido por la hipótesis del par de especies. 7.1.4.6. Agregado de Usnea fragilescens Clerc (1987a) definió al agregado de Usnea fragilescens como un grupo de especies con talos erectos a subpéndulos, con soralios e isidios, ramas más o menos fusiformes en la base, una corteza delgada, y ácidos norestíctico, estíctico y/o salazínico en la médula. El grupo fue descrito con base en especies europeas, en particular de Escandinavia, e incluye a U. fragilescens (con sus variedades fragilescens y mollis), U. flammea y U. cornuta (Clerc, 1987a). Más tarde, Halonen et al. (1998), en su estudio del género en Columbia Británica, especificaron que en este agregado la corteza es brillante y delgada (C: 3 – 9% de grosor), la médula es usualmente laxa y gruesa (M: 25-40%) y el eje, delgado (A: 12-44%) (i.e., el CMA 124 tipo cornuta). Mencionaron a las especies presentes en Canadá: U. esperantiana, U. glabrata, U. wirthii, U. fragilescens var. mollis y U. cornuta s.l. Herrera-Campos et al. (2001) investigaron el agregado en México, incluyendo por primera vez especies exclusivamente sexuales: U. cirrosa, U. jamaicensis y U. ramillosa s. str. Dentro de las especies sorediadas, encontraron las mismas especies que Halonen et al. (1998), más U. brasiliensis, una especie muy cercana morfológicamente a U. cornuta. De acuerdo a Herrera-Campos et al. (2001), la distinción entre especies es especialmente delicada al tratar con U. brasiliensis, U. cirrosa, U. cornuta s.l., U. glabrata y U. ramillosa s. str. Adicionalmente, U. dasaea puede adoptar fenotipos cercanos al agregado (Herrera- Campos et al., 2001; Clerc y Herrera-Campos, 1997). U. dasaea es un taxón interesante por ser cosmopolita (exceptuando zonas polares; Clerc, 2004) y por poseer una gran cantidad de sinónimos (Clerc y Herrera-Campos, 1997), unificados bajo un talo típicamente espinulado y ácido galbínico en la médula. De acuerdo con Clerc y Herrera-Campos (1997) esta especie no pertenece como tal al agregado de U. fragilescens, pero en ocasiones llega a ser difícil de separar de U. cornuta. A juzgar por el resultado aquí obtenido, U. dasaea es monofilética en México. Un muestreo más amplio quizá permita detectar estructura entre las poblaciones de diferentes localidades, ya que U. dasaea exhibe gran variación ecológica, que se pone en evidencia con los tipos de vegetación muestreados: matorral xerófilo (0.3.4), bosque de encino y abeto (2.43.67) y bosque mesófilo de montaña (3.24.52). Como con U. rubicunda, el ITS no ofreció resolución suficiente para resolver las relaciones entre los ejemplares de México, Portugal, Japón y otras especies, varias de las cuales también tienen ácido galbínico, como U. dimorpha y U. sp6 (ver Anexo D). Asimismo, en las reconstrucciones multilocus hubo una tendencia, aunque no soportada, a agruparse con el ejemplar de U. cornuta s.l. del ácido norestíctico, lo cual explica porque resulta tan difícil separar estos taxa en ausencia de química y ciertos caracteres morfológicos. U. cornuta es una especie que presenta una sorprendente variación química (Tabla 14) y una amplia distribución geográfica (se ha reportado para Europa, Macaronesia, Norte y Sur América, Asia y Oceanía; ver Clerc, 2004 y Feuerer, 2011). La especie se describió originalmente en Europa, y cuando se estudió en América del Norte se optó por utilizar la denominación sensu lato con base principalmente en los soralios: U. cornuta s. str. tiene típicamente soralios planos, pequeños, sin margen y confluentes (Clerc, 1987a), mientras que U. cornuta s.l. puede pasar de soralios típicos hasta aquéllos ligeramente estipitados, con margen y no confluentes, agregados o no (Herrera-Campos et al., 2001; Halonen et al., 125 1998). Por otra parte, puede ser difícil de separar, por ejemplo, de U. fragilescens, sobre todo si los soralios no están bien desarrollados (Halonen et al., 1998), de U. dasaea como ya se mencionó, o de U. ceratina en ciertas circunstancias ambientales (James et al., 2009; Herrera-Campos et al., 1998). Pero entre las especies mexicanas, es con U. brasiliensis que la distinción es más discutible. Al estudiar las especies saxícolas de Norte América, Clerc y Herrera-Campos (1997) incluyeron varios ejemplares de U. cornuta s.l. que exhibían una gran variación química: hasta 6 quimiotipos. Uno de ellos, el que presentaba ácido protocetrárico como principal, y ácido psorómico con accesorio, fue más tarde reconocido como U. brasiliensis por Herrera-Campos et al. (2001). La separación fue sustentada sobre todo con base en el grosor de la médula que tiende a ser mayor en U. brasiliensis de forma estadísticamente significativa, además de algunas diferencias menores o muy variables, como soralios ligeramente más estipitados, corteza más delgada y ramas que suelen ser más infladas (Herrera- Campos et al., 2001; Clerc, 2004). Sin embargo, Clerc (2004) la relegó a subespecie (U. cornuta ssp. brasiliensis), argumentando que existen abundantes intermedios (morfotipos de U. brasiliensis sin ácido protocetrárico o típicas U. cornuta con este ácido). Más aún, en México (y posiblemente en gran parte de América del Sur), las poblaciones de U. brasiliensis y U. cornuta s.l. tienden a ser en su mayoría simpátricas (Herrera-Campos et al., 2001), lo que podría abogar por su conespecificidad. Al parecer, U. cornuta es predominantemente asexual. Ni Halonen et al. (1998) ni Clerc (1987) mencionan apotecios en sus descripciones. Herrera-Campos et al. (2001) reportó algún grado de sexualidad en U. cornuta s.l. en México, aunque las pocas veces que sus ejemplares presentaron apotecios, estos siempre fueron inmaduros. También según Brodo et al. (2001), los apotecios rara vez se han detectado en el resto de Norteamérica. Por su parte, U. brasiliensis es una especie sorediada, que en algunas ocasiones desarrolla apotecios subterminales (Herrera-Campos et al., 2001). En contraste, U. ramillosa s.l., un complejo de especies dentro del agregado, nunca presenta propágulos vegetativos, sólo apotecios (Herrera-Campos et al., 2001). De acuerdo a Herrera-Campos et al. (2001), dicho complejo es muy variable morfológica y químicamente, e incluye en México a U. ramillosa s. str. y a U. cirrosa. La primera, U. ramillosa s. str., está limitada a aquellos ejemplares con ácido protocetrárico sin pigmentos ni picnidios obvios. Según estos autores, este taxa es extremadamente similar a U. brasiliensis, excepto por su estrategia reproductiva. Consecuentemente, U. ramillosa s. str. fue propuesta como la especie primaria de U. brasiliensis (Herrera-Campos et al., 2001). 126 En su discusión de las Usnea de la región del desierto de Sonora, Clerc (2007) denominó a U. cirrosa como la especie primaria de U. cornuta, y declaró que U. ramillosa y U. cirrosa están tan cercanamente emparentadas que quizá sean la misma. Por tanto, también volvió una subespecie a la primaria de U. brasiliensis (U. cirrosa ssp. ramillosa). En este trabajo, se trataron a las cuatro especies, y aún con el bajo tamaño de muestra de las especies apoteciadas, varias conclusiones interesantes salen a la luz. En primera instancia, U. cirrosa es una especie distinta a U. ramillosa s. str. Más aún, U. cirrosa resultó no estar emparentada con U. cornuta, así que es claramente rechazada como la especie primaria de ésta. En segunda instancia, hay bastante evidencia que soporta a U. brasiliensis como una especie distinta de U. cornuta s.l.: monofilia en todos los análisis filogenéticos, los valores relativamente altos de FST, el indel en el extremo 3' del intrón, la química y los análisis morfoanatómicos efectuados por Herrera-Campos et al. (2001). El ejemplar de U. ramillosa s. str. se anidó dentro del clado de U. brasiliensis, y el hecho de que existan ejemplares apoteciados incluso en un muestreo somero sugiere que hay un continuo reproductivo entre estos dos taxa. Más aún, los análisis de Herrera- Campos et al. (2001) demuestran que U. brasiliensis y U. ramillosa s. str. son inseparables química, anatómica y morfológicamente. Por tanto es altamente probable que sean conespecíficas, aunque la secuenciación de más ejemplares de U. ramillosa s. str. sería recomendables para efectuar cambios nomenclaturales. U. cornuta s.l. presenta un escenario más complejo. El quimiotipo de ácido norestíctico es distinto y no emparentando con el de ácido salazínico. Además, el quimiotipo de ácido salazínco es monofilético sólo en el árbol de loci concatenados, y parece haber fuerte estructura geográfica, evidenciada por los subclados formados (Oaxaca vs. Hidalgo), la ausencia de amplificación del intrón en uno de ellos (Oaxaca), y sólo tentativamente (considerando el tamaño de muestra), por los valores de FST entre localidades. Un muestreo más amplio y loci cuyas tasas de mutación sean más rápidas podrían enclarecer la dinámica entre estas y otras poblaciones de U. cornuta s.l. (quimiotipo de ácido salazínico), que es posible que en realidad constituyan un complejo de especies. En el contexto del árbol de ITS del mundo, las secuencias de U. cornuta de Kelly et al. (2011) se agrupan con al menos una secuencia de U. cornuta s.l. (2.38.60). Considerando que se trata de talos colectados en las Islas Británicas, deben tratarse de U. cornuta s. str., lo que confirma el parentesco del taxón americano con el europeo. Sin embargo, tres secuencias de U. fragilescens, 220 (FR799083; Kelly et al., 2011), y 013 y 040 (AJ748104 y AJ748105; Articus, 2004), también se agrupan con las U. cornuta mexicanas. Kelly et al. (2011) en 127 efecto notaron que su secuencia no se agrupó en su análisis con sus “conespecíficas”, sino con sus secuencias de U. cornuta. Los autores interpretaron esto como evidencia de conflictos con el concepto de especie o como posibles especies crípticas en la liquenoflora de las Islas Británicas. También consideraron las complicaciones generadas por la naturaleza multicopia del ITS. Otra posibilidad adicional es que el ejemplar haya sido mal identificado, pues U. fragilescens llega a ser difícil de separar de U. cornuta. Kelly et al. (2011) comentan que la química es consistente con U. fragilescens, pero ambas especies tienen compuestos similares y las diferencias pueden ser sutiles. Por ejemplo, U. cornuta (en su concepto tradicional) tiene ácido norestíctico como el compuesto principal mientras que U. fragilescens lo tiene en muy baja concentración (Clerc, 1987). En el otro extremo, podría tratarse de un híbrido. Las secuencias de Articus (2004), en cambio, son de Canadá. La autora no incluyó secuencias de U. cornuta en su estudio, por lo que no hubo razón para sospechar una mala identificación, ni ninguna relación en particular entre especies. Halonen et al. (1998) incluyó ejemplares con ácido salazínico y accesorios del grupo del ácido estíctico en su concepto de U. fragilescens en Canadá, lo que pudo llevar a Articus a concluir que se trataba de esta especie. En México, en cambio, Herrera- Campos et al. (2001) no encontró ácido salazínico en este taxa. Desgraciadamente, Articus (2004) no detalló la química de los talos en su estudio, sin embargo, es factible que estos ejemplares sean de hecho U. cornuta s.l. El ejemplar 2.26.43 resulta muy llamativo porque presentó fenotipo, química e indel de U. brasiliensis, pero se comportó irregularmente en la filogenia dependiendo del gen, aumentó el número de eventos de recombinación RM en por lo menos el MCM7 al comparar U. brasiliensis y U. cornuta s.l., y disminuyó ligeramente el grado de diferenciación medido con FST entre estos taxa. Aunque esto podría ser explicado por sorteo incompleto de linajes, resulta muy sospechoso que este fenómeno haya ocurrido siempre en el mismo individuo. Por tanto, se propone que quizá se trate de un verdadero híbrido. Por su relativamente baja diversidad y menor número de eventos de recombinación detectados a comparación de U. brasiliensis, es posible que U. cornuta s.l. tenga en efecto menos reproducción sexual. Sin embargo, los reportes de Herrera-Campos et al. (2001) y Brodo et al. (2001) abren la posibilidad de sexualidad infrecuente. Más aún, aunque sus apotecios no se desarrollaran, la producción de picnidios funcionales (que actúan como gametas masculinas) podrían, quizá infrecuentemente, fecundar tricoginas de U. brasiliensis. Alternativamente, podría ocurrir parasexualidad interespecífica, con cariogamia seguida de pérdida azarosa de cromosomas (Schardl y Craven, 2003). Si U. 128 brasiliensis es sexualmente activa, como muestra la producción de apotecios en los ejemplares muestreados, puede que haya incluso más posibilidades de introgresión hacia U. brasiliensis. Esto explicaría el fenotipo del supuesto híbrido (2.26.43) y la gama de individuos intermedios comentados por Clerc (2004, 2007). En efecto, los numerosos intermedios han sido interpretados, a través de estudios morfológicos y químicos, como producto de hibridización entre Cladonia subtenuis y C. uncialis (Anderson y Rudolph, 1956), pero no necesariamente para postular clasificaciones infraespecíficas. Se ha visto que la hibridación es un fenómeno más común de lo que se creía anteriormente en hongos no liquenizados (Schardl y Craven, 2003) y no hay ninguna razón para suponer que es distinto en los liquenizados. Al mismo tiempo, debe haber algún mecanismo de aislamiento intrínseco y/o divergencia ecológica que permita la formación de agregados genéticos y fenotípicos (Coyne y Orr, 2004), los cuales constituyen los incipientes segmentos de linaje (especies) en este grupo de taxa. En apoyo a esto, cierto grado de compatibilidad sexual ya ha sido detectado previamente en especies de hongos fitopatógenos de divergencia temprana, simpátricos y con diferencias ecológicas sutiles (Taylor et al., 1999). Valores de FST usando ITS similares a los reportados aquí para U. cornuta s.l. vs. U. brasiliensis, se han detectado al tratar diferentes poblaciones de individuos saxícolas (sobre rocas) y cortícolas (sobre corteza) del liquen Xanthoria parietina (Lindblom y Ekman, 2006). Estos autores interpretaron sus resultados como adaptación local con aislamiento por habitat de la misma especie, ya que no encontraron diferencias morfológicas ni químicas entre grupos, que a su vez comparten numerosos haplotipos. En el caso de U. cornuta y U. brasiliensis, que no comparten haplotipos, sí hay diferencias fenotípicas (Herrera-Campos et al., 2001) y filogenéticas como para sostener la noción de especies diferentes, aunque en divergencia temprana. Nunca se han efectuado estudios ecológicos detallados de estas especies, pero resultarían muy informativos para corroborar los límites entre taxa. Por otra parte, se ha visto que la estructura poblacional tiende a ser más marcada en líquenes foliosos (como Xanthoria) que en fruticosos (como Usnea), aunque aún no se sabe a qué se debe este patrón o si es biológicamente significativo (Werth, 2010). U. brasiliensis ha sido reportada para Norte América, Sudamérica y las Islas Canarias (Herrera-Campos et al., 2001; Pérez-Vargas et al., 2010; Clerc, 2004). Si la hibridación en verdad está ocurriendo en México, sería muy interesante examinar las poblaciones de Sudamérica. En las Islas Canarias no se han detectado apotecios en U. brasiliensis (Pérez-Vargas et al., 2010), por lo que el origen de esta población, y su dinámica poblacional, también son interesantes. 129 Tabla 14. Quimiotipos de U. cornuta y U. brasiliensis según diversos autores para varias regiones geográficas o países y para los clados monofiléticos rescatados en este estudio. Incluyen los ácidos norestíctico (Nor), criptoestíctico (CrySt), estíctico (St), conestícitico (CSt), menegazziaico (Men), salazínico (Sal), consalazínico (CSal), protocetrárico (Prot), psorómico (Pso), 2'-0-dimetilpsorómico (Cpso), tamnólico (Tam), galbínico (Galb), fumarprotocetrárico (Fum), difractaico (Dif) y grasos desconocidos (Graso). Los quimiotipos que empatan con los clados mexicanos están sombreados de gris. +: ácido principal; +: ácido accesorio; tz: traza; tz: traza accesoria. *Más tarde reconocido como U. brasiliensis por Herrera-Campos et al. (2001). Usnea Autor Raza Quím Nor CrySt St CSt Men Sal Csal Prot Pso CPSO Tam Galb Fum Dif Graso Región o País cornuta Clerc (1987) 1 - - - + - + - + - - - - - - - Europa 2 + + + + + + - + - - - - - - - Europa 3 + + + + + - - - - - - - - - + Europa Lectotipo e isotipos: - - - + - + - + - - - - - - - Alemania cornuta James et al. (2009) 1 - - - + - + - + - - - - - - - Gran Bretaña e Irlanda 2 + - + + + + - - - - - - - - - Gran Bretaña e Irlanda cornuta s.l. Clerc y Herrera-Campos (1997) 1 - - - + - + - + - - - - - - - Norte América 2 - - - - - - - - + - - - - - - Norte América 3 + - + - - + - - - - - - - - - Norte América 4 - - - - - - - + - - + - - - - Norte América 5 - - - - - - - - - - - - - - + Norte América 6* - - - - - - - + + - - - - - - Norte América cornuta s.l. Halonen et al. (1998) 1 + tz + tz tz + - + + tz - - - - tz Canadá cornuta s.l. Herrera-Campos et al. (2001) 1 - - + + - + + - - - - - - - + México cornuta Brodo et al. (2001) 1 - - + - - + - - - - - - - - - Norte América 2 - - - - - - - + - - + - - - - Norte América 3 - - - - - - - - + + - - - - - Norte América confusa Ohmura (2001) 1 - - - + - + - tz - - - - - - - Japón y Taiwan 2 - - - - - - - + - - - - - - - Japón y Taiwan Lectotipo - - - + - + - - - - - - - - - Japón confusa subsp. rubroreagens Lectotipo - - - - - - - + - - - - - - - Japón confusa Stevens (2004) 1 - - - + - + + - - - - - - - - Australia 2 - - - - - + - - - - - + - - - Australia 3 - - - - - + - - - - - - + - - Australia 4 - - - - - + - tz - - - + - - - Australia 5 + - - - - tz - - - - - + - + - Australia cf. cornuta Saag et al. 2001 1 - - - - - - - - - - + - - - - Portugal brasiliensis Herrera-Campos et al. (2001) 1 - - - - - - - + + - - - - - - México Holotipo - - - - - - - + + - - - - - - Brasil Clado Cornuta - - + - - + + - - - - - - - - México Clado Brasiliensis - - - - - - - + - - - - - - - México 130 Finalmente, Clerc (2004) consideró a U. confusa Asahina, un taxa de Australia y el este de Asia, como sinónimo de U. cornuta en su versión europea (s. str.). Notablemente, uno de los quimiotipos detectados por Ohmura (2001) para U. confusa contiene solamente ácido úsnico y protocetrárico, lo que Clerc (2004) interpretó como U. brasiliensis. Si es así, la distribución de U. brasiliensis puede ser casi tan grande como la de U. cornuta s.l. Por tanto, el proceso por el cual han divergido estas especies puede resultar muy informativo con respecto a la especiación en hongos liquenizados, y en particular en especies ampliamente distribuidas y simpátricas. 7.1.5. El concepto del par de especies en el género Usnea en México Al repasar el concepto de par de especies en el apartado 1.2.1.6, quedó claro que cada caso putativo requiere evaluación individual. El género Usnea es rico en pares de especies propuestos por especialistas. El más conocido es el de U. florida y U. subfloridana, ya que fue el primero en estudiarse con herramientas moleculares y sus resultados apuntaron a una realidad biológica distinta: una serie de linajes crípticos con poblaciones reproductivamente polimórficas, no un linaje sexual del que se derivan linajes asexuales hijos. En este estudio se trabajaron cuatro pares propuestos con base en caracteres morfoanatómicos y químicos (Herrera-Campos et al., 1998; Swinscow y Krog, 1988; Herrera-Campos et al., 2001; Clerc, 2007). No obstante, ningún par dio evidencia suficiente para pensar en el fenómeno biológico que subyace a la hipótesis del par de especies. U. ceratina y U. cristatula no se resolvieron como especies hermanas, aunque probablemente sí están emparentadas. Podría argumentarse que U. cristatula es más bien la primaria de U. entoviolata, aunque el soporte de su relación es bajo en las reconstrucciones filogenéticas. De manera similar, no es claro que U. erinacea esté muy cercanamente relacionada a U. rubicunda. En cambio, U. ramillosa probablemente sea conespecífica con U. brasiliensis. Finalmente, U. cirrosa y U. cornuta no están relacionadas en general. Sin embargo, hace falta recalcar que incluso si se comprobara a un par como especies hermanas, esto no demostraría que en efecto una de ellas se derivó de la otra por un evento mutacional (o algo análogo) que suspendiera la reproducción sexual. Un patrón de especies hermanas podría darse por procesos más ortodoxos, por los cuales se explica la especiación en animales y plantas, como vicarianza, divergencia ecológica, etc. Este estudio no estuvo diseñado específicamente para probar la hipótesis de par de especies en estos grupos, pero sí permitió rechazar ciertos casos. 131 7.1.6. Diversidad genética y estructura poblacional en especies de Usnea mexicanas Actualmente existen pocos estudios de genética de poblaciones de líquenes, los cuales han abarcado sólo un número limitado de especies de micobiontes (revisados por Werth, 2010). La mayoría se han basado en técnicas de perfiles genéticos (p.e.j., RAPD, AFLPs) o en secuencias de rADN (Werth, 2010) y sólo hay un caso en el que se han empleado microsatélites (Lobaria pulmonaria, Walser et al., 2004). Asimismo, pocos trabajos han aprovechado métodos de genética de poblaciones para la delimitación de especies (p.ej. Leavitt et al., 2011a, 2011b). Dentro del género Usnea, únicamente las usneas neuropogonoides han sido abordadas con este enfoque (ver sección 2. Antecedentes). En este estudio se exploró superficialmente la diversidad genética y la estructura poblacional de U. ceratina, U. cornuta s.l. y U. brasiliensis. Los tres taxa son comúnmente sorediados, pero exhiben niveles de variación similares a los reportados para otras especies de hongos liquenizados tanto apoteciados como sorediados (Leavitt et al., 2011b; ver Tabla 2 de Werth, 2010). Quizá la comparación más informada se puede efectuar con Xanthoria parietina, ya que se sabe que este hongo liquenizado típicamente apoteciado es homotálico y ha sido investigado extensamente (Honegger et al., 2004; Scherrer et al., 2005; Lindblom y Ekman, 2006, 2007; Itten y Honegger, 2010). De entre estos trabajos, sólo Lindblom y Ekman (2006, 2007) permiten comparaciones directas ya que reportan diversidad haplotídica y nucleotídica para ITS. Es notable que la población de U. cornuta s.l. de Hidalgo tiene menos variación en ambas medidas que las siete localidades en Noruega y la mayoría en Suecia de X. parietina. En el otro extremo, U. cornuta s.l. de Oaxaca y U. brasiliensis tienen diversidad más alta, aunque esto puede deberse a muestreo limitado (n = 6 y n = 9, respectivamente). U. ceratina, por su parte, tiene niveles de diversidad similares o menores a los de X. parietina. Igualmente, al comparar con los valores de π (0.0012-0.0030) y de θw (0.0013-0.0075) del ITS de las Usnea neuropogonoides estudiadas por Wirtz et al. (2012), los de U. ceratina son relativamente bajos (0.0015 y 0.0017). En cambio, los valores de U. cornuta (0.0214 y 0.0194) y U. brasiliensis (0.0244 y 0.0304) son considerablemente más altos, aunque esto podría ser un efecto del muestreo o de especies crípticas. Es importante resaltar que los estimados de diversidad fueron generalmente menores para el ITS que para los loci codificantes en U. ceratina (pero no para U. 132 cornuta s.l. ni U. brasiliensis). Si se hubieran incluido los ejemplares con el intrón en los análisis, la diversidad sería alta (datos no mostrados). No obstante, la ausencia de recombinación en el grupo sin intrón en oposición al grupo con intrón, implica que combinar ambos linajes resultaría en historias mezcladas. Probablemente hay una dinámica celular particular en cuanto a los operones ribosomales de esta especie que hacen difícil interpretar los estadísticos de genética de poblaciones. En cuanto a la diferenciación poblacional, no es trivial comparar diferentes estudios de hongos liquenizados debido al uso de diferentes marcadores, las escalas espaciales trabajadas y las distintas historias de vida de los taxa (Werth, 2010). Sin embargo, dentro de intervalos geográficos más o menos equivalentes, los líquenes fruticosos hasta ahora trabajados tienden a presentar muy poca diferenciación a comparación de los foliosos (Werth, 2010). U. ceratina se une a este patrón, ya que los valores de FST no fueron significativos dentro de las poblaciones mexicanas usando los tres loci, o entre México e Inglaterra usando únicamente ITS. La falta de estructura entre México e Inglaterra, como se aprecia por la gran cantidad de haplotipos compartidos, puede explicarse tanto por dispersión a larga distancia como por retención de haplotipos ancestrales. La medida FST no necesariamente refleja fragmentación (o su ausencia) entre poblaciones porque la ancestría compartida puede confundirse con flujo génico actual (Templeton et al., 1995). El hecho de que los haplotipos compartidos son precisamente los internos y más frecuentes en las redes, sugiere que se trata de polimorfismo ancestral (Schaal y Olsen, 2000). Otro factor es el tamaño de muestra, que no permite recuperar, por ejemplo, los alelos privados y podría estar enmascarando la diferenciación poblacional. Haplotipos compartidos por individuos de diferentes continentes usando ITS no es un fenómeno inusual en hongos. Se han observado, por ejemplo, en basidiomicetos del género Gonoderma (Moncalvo y Buchanan, 2008) lo cual ha sido interpretado en conjunto con NCA para sugerir dispersión a grandes distancias, aunque infrecuente. De igual forma, se ha visto en el hongo liquenizado parmeliaceo Cavernularia hultenii, en donde los haplotipos más comunes aparentan ser ancestrales y ampliamente distribuidos y los haplotipos más derivados están restringidos a ciertas áreas geográficas (Printzen et al., 2003). Incluso se ha observado divergencia tan mínima como una sola mutación entre los haplotipos de individuos de Usnea del Hemisferio Norte y Sur (Wirtz et al., 2012). Con base en estos resultados, se ha sugerido que la deriva génica actúa lentamente en estos grupos (Printzen et al., 2003), o dicho de otra manera, que los tamaños efectivos son muy grandes. 133 Asimismo, estudios de líquenes fósiles preservados en ámbar apoyan la noción de que la tasa de cambio morfológico es lenta en por lo menos Parmeliaceae (Rikkinen y Poinar, 2002; Poinar et al. 2000). Al comentar esta hipótesis, Lindblom y Ekman (2006) mencionan que el cambio morfológico lento puede deberse a situaciones donde hay demandas ecológicas limitadas, en combinación con selección estabilizadora, y posiblemente grandes tamaños poblacionales. Las pruebas de neutralidad empleadas sólo fueron significativas al agrupar todas las secuencias de ITS de U. ceratina, lo cual puede deberse a un sesgo en el muestreo o a una señal auténtica de expansión demográfica o de selección negativa. Cabe resaltar que por lo menos los loci codificantes están sujetos a recombinación (sobre todo TSR1). Las pruebas de neutralidad usadas suponen ausencia de recombinación, y si este supuesto es violado, tienden a ser conservadoras (Fu y Li, 1993). MCM7 sufre menos recombinación, y de acuerdo con esto, los valores de D, D* y F* tienden a ser mayores en magnitud con respecto a los obtenidos para TSR1. De igual forma, la red de haplotipos de MCM7 exhibe parcialmente una topología en forma de estrella similar a la del ITS (sin intrón), que puede ser indicio de expansión poblacional (Slatkin y Hudson, 1991). Por tanto, es posible que la señal sea antigua y que se esté perdiendo por recombinación, mutación, migración y deriva. Si el impacto es genómico, entonces sí se podría sospechar un evento demográfico, pero no se cuenta con información suficiente para profundizar en esta hipótesis. Al tratar con U. cornuta s.l. y U. brasiliensis, de nuevo ninguna prueba fue significativa, pero la dirección de D, D* y F* (positiva en U. cornuta s.l. y negativa en U. brasiliensis) constante en los tres loci también sugiere una huella demográfica débil. Aunque sólo se muestreó un individuo de U. ceratina en Durango, su genotipo incluye haplotipos muy comunes en los tres loci. En contraste, los tres haplotipos de Jalisco resultaron ser siempre derivados. Esto indica que la probabilidad de muestrear alelos potencialmente ancestrales en Jalisco es considerablemente más baja que en el resto de las regiones biogeográficas tratadas. Al estudiar la filogeografía del hongo endófito Lophodermium nitens en México, Salas-Lizana et al. (2012) recuperaron redes de haplotipos con un haplotipo central, muy abundante y ampliamente distribuido, exceptuando a la población del Bloque Jalisco. Asimismo, encontraron valores bajos de diferenciación genética por región biogeográfica, señales de expansión poblacional en la Sierra Madre Occidental y la Faja Volcánica Transmexicana y cierta independencia demográfica del Bloque Jalisco. Las especies de pino hospederos de L. nitens presentan patrones filogeográficos similares (Moreno-Letelier y Piñero, 2009). Siendo U. ceratina epífita de coníferas y encinos, y a juzgar por los resultados prelimiares de 134 este estudio, sería de esperarse que las poblaciones de este liquen mostraran historias demográficas parecidas. 7.1.7. ¿Todas las usneas están en todas partes? Como muchos géneros de hongos liquenizados y no liquenizados, Usnea es rica en taxa cosmopolitas (Galloway, 2008), aunque se conocen especies endémicas de regiones pequeñas (ver Truong et al. 2011; Clerc, 2006; Herrera-Campos et al. 1998). De acuerdo con esto, la composición taxonómica de las comunidades de Usnea que Halonen et al. (1998) describen para Columbia Británica es muy similar a la de los bosques templados mexicanos descritos en los trabajos de Herrera-Campos (1998), Herrera-Campos et al. (1998; 2001) y Clerc y Herrera-Campos (1997). Sucede lo mismo al comparar la liquenoflora de Europa, Asia, África y Oceanía (ver siguiente apartado). Se diría que el cociente entre la riqueza local y la global, el cual se ha empleado como evidencia a favor de la hipótesis Baas-Becking (Finlay, 2002), es grande en este género. La resolución de las secuencias de ADN, no tan fina como la de otros marcadores pero menos sujeta a homoplasia, permite reconocer componentes genéticos compartidos a grandes escalas geográficas, como se ha comentando indirectamente en los párrafos anteriores. Gracias a ello, incluso un sólo locus es informativo sobre la relación de las especies morfológicas en diferentes continentes. A través de las reconstrucciones filogenéticas, fue posible identificar parentescos entre varias especies de Usnea mexicanas y sus contrapartes en Norte América, Europa, Asia y Oceanía. Destaca por ejemplo, U. merrillii, que fue muestreada en Oaxaca, Jalisco y se comparó con una secuencia de Japón. Resulta muy llamativo que la distancia genética (apreciada en la longitud de ramas de las filogenias) entre las tres localidades es extremadamente pequeña. Esta especie rara vez ha sido colectada con apotecios en México (Herrera-Campos et al., 1998) y puede que constituya un taxa muy asexual, cuyas capacidades de dispersión por propágulos vegetativos o fragmentación son notables. Algo fundamentalmente distinto debe estar ocurriendo en las poblaciones de, por ejemplo, U. rubicunda, la cual también es altamente asexual pero exhibe marcadas divergencias. Una posible explicación es que U. merrillii sufrió recientemente una fuerte pérdida de variación (¿un barrido selectivo?) tanto en Norte América como en el este de Asia. 135 Ahora bien, U. ceratina fue protagonista del típico patrón de incongruencia filogenética con el concepto morfológico: aunque las secuencias europeas son consistentes con una sola especie filogenética, las poblaciones japonesas constituyen claramente otro linaje. En el caso de U. cornuta s.l. y U. brasiliensis, de nuevo parecen tener una distribución lo suficientemente grande como para abarcar continentes. Además, resultan ser más o menos simpátricas en gran parte de su distribución y los resultados aquí presentados apuntan a que se trata de especies de divergencia reciente. Con todo, parece ser que en el caso de los micobiontes del género Usnea, sí existen taxa de grandes distribuciones geográficas que deben tener algún mecanismo de cohesión, ya sea ecológico, reproductivo o ambos (Templeton, 2001). No obstante, también hay impedimentos de algún tipo (ecológicos, geográficos, históricos) que faltan por explorar, los cuales impiden total cosmopolitismo en especies claramente exitosas. Por otra parte, el hecho de que las especies sorediadas tengan comúnmente distribuciones más amplias sugiere que hay una relación entre la distribución amplia y las dificultades de mantener la relación simbiótica (Tehler, 1982). Estudios filogeográficos comparativos podrían evaluar esta hipótesis. 7.1.8. Diversidad del género Usnea en México El trabajo más completo hasta ahora publicado de las especies mexicanas es el de Herrera-Campos (1998), en el que se describen 43 especies y cuatro agregados. Investigaciones posteriores (Herrera-Campos, comunicación personal) y el gran número de individuos no identificados en este trabajo sugieren que el conocimiento de la diversidad del género en México aún permanece inacabado. En la Tabla D1 (Anexo D), se muestra un resumen de los nombres tratados, los estados donde se muestrearon y la contribución al conocimiento de la diversidad en el país. Es notable que se detectaron por lo menos tres nuevos registros para México y seis para diferentes estados, de entre los que destaca Oaxaca. Fue en este estado donde se colectaron varios registros novedosos y la mayoría de las especies no identificadas (“sp”). Dado esto, Oaxaca debe considerarse un área prioritaria de investigación y conservación. Por otra parte, ¿cuál es la representatividad del muestreo de este estudio con respecto al género entero? Saber la respuesta es complicado, ya que los estimados del número total de especies de Usnea fluctúan entre cerca de 250 y más de 600. No 136 obstante, es posible tomar como un indicador muy aproximado a la riqueza de especies taxonómicas que se ha reportado en diferentes regiones geográficas ampliamente estudiadas. En particular destacan México (Herrera-Campos, 1998) o una parte de México y Estados Unidos (Clerc, 2007), parte de Canadá (Halonen et al., 1998), Europa en general (Randlane et al., 2009), Japón y Taiwan (Ohmura, 2001) y Australia (Stevens, 2004). Esto permite apreciar el esfuerzo de este estudio en México y en combinación con las investigaciones anteriores que produjeron secuencias de ITS. Sin embargo, hay que tener en mente que todos estos trabajos constituyen límites inferiores de la riqueza real. Tabla 15. Representatividad del muestreo de este estudio en comparación con estudios taxonómicos de algunas regiones geográficas. De las especies taxonómicas reportadas en cada caso (No. Spp), se detalla cuántas se muestrearon en este estudio (México), cuántas ya tenían secuencias de ITS disponibles en Genbank (GB), cuántas han sido secuenciadas (ITS) en total y en porcentaje. En paréntesis se muestran los mismos valores, pero excluyendo a las especies con algún grado de incertidumbre (p.ej. las que son “cf.”, U. silesiaca/U. columbiana o U. subscabrosa/U. subrubicunda). 1 U. hesperina Motyka se trató como sinónimo de U. schadenbergiana Göppert & Stein (Clerc, 2004). 2 Se consideró a los ejemplares colectados de U. subscabrosa/U.subrubicunda como U. subscabrosa Nylander ex Motyka. 3 Se consideró a los ejemplares colectados de U. silesiaca/U.columbiana como U. silesiaca Motyka. Se trató a U. madeirensis Motyka como sinónimo de U. silesiaca (Tavares, 1998; Clerc, 2004). 4 U. confusa Asahina se trató como sinónimo de U. cornuta Körber (Clerc, 2004). 5 U. undulata Stirton se trató como sinónimo de U. dasaea Stirton (Clerc y Herrera-Campos, 1997). U. elata Motyka se trató como sinónimo de U. perplectata Motyka (Truong & Clerc, 2012). Stevens (2004) considera distinta a U. roseola Vainio de U. ceratina Acharius, a diferencia de Ohmura (2001). Es posible que las secuencias de Ohmura (2002) denominadas como U. ceratina pertenezcan a U. roseola (ver apartado 7.1.4.4), así que se la consideró como presente en Genbank. Autores Región No. Spp México GB Secuenciadas Total (ST) ST % Herrera-Campos, 1998 1,2,3 México 52 20 (16) 15 33 (29) 63.46 (55.77) Clerc, 2007 2,3 Desierto Sonora 45 16 (11) 19 30 (25) 66.67 (55.56) Halonen et al., 1998 1,3 Columbia Británica 23 6 (4) 16 19 (17) 82.61 (73.91) Randlane et al., 2009 2,3 Europa 32 7 (3) 25 30 (26) 93.75 (81.25) Ohmura, 2001 1,4 Japón y Taiwán 43 8 (8) 25 27 (27) 62.79 (62.97) Stevens, 20044,5 Australia 37 8 (7) 7(6) 11 (9) 29.73 (24.32) 137 Como se ve en la Tabla 15, Europa ha sido extensamente trabajada molecularmente, aunque al mismo tiempo los autores citados (Randlane et al., 2009) reportan menos especies que en otras partes del mundo, cuyas áreas son considerablemente más pequeñas. De las especies taxonómicas que han sido reportadas para México (Herrera-Campos, 1998), ya existen secuencias de ITS de más del 50%, de las cuales alrededor de la mitad se obtuvieron en este estudio a partir de ejemplares mexicanos. Adicionalmente, hay una serie de taxa (incluyendo posiblemente a varios “sp” y “cf.”) cuyas distribuciones están restringidas a Norte América o al Neotrópico (p.ej. U. cf. meridionalis, U. dimorpha o U. setulosa), muchas de las cuales han sido secuenciadas por primera vez aquí. Finalmente, sólo algunas especies se comparten entre México, Canadá, Europa, el este de Asia y Australia. En otras palabras, hasta el día de hoy las investigaciones con datos moleculares del género han abarcado apenas algo más de la mitad de las especies descritas con rigurosidad taxonómica moderna en áreas relativamente bien conocidas (excepto Australia, con menos del 30%). Aunque estas cifras ya han permitido establecer clasificaciones taxonómicas diseñadas para reflejar procesos evolutivos y constituyen un marco adecuado para la delimitación de especies, es muy factible que existan aún numerosas especies raras de áreas no exploradas o diversos linajes crípticos dentro de taxa definidos tradicionalmente. 8. Conclusiones 8.1. Conclusiones generales 1) El uso de diferentes evidencias y herramientas analíticas (taxonomía integradora) es una aproximación adecuada para la resolución del los límites intraespecíficos del género Usnea, pero aún hace falta trabajo con relación a ciertos grupos de taxa muy emparentados o morfológicamente muy plásticos, en especial los apoteciados. 2) Los datos moleculares, en particular los loci codificantes aquí ensayados, demostraron ser herramientas poderosas para la delimitación de especies y la inferencia de sus relaciones evolutivas. 3) El intrón tipo I en la SSU de Usnea tiene potencial en combinación con otras evidencias de linajes independientes. 4) Los caracteres morfoanatómicos y químicos son altamente homoplásicos en el género. 138 5) Es posible que los subgéneros Eumitria y Dolichousnea estén más emparentados entre sí que con el subgénero Usnea, en oposición a resultados de estudios previos. 6) Análisis filogenéticos multilocus sugieren una separación auténtica entre la sección Usnea, para la cual se sugieren nuevos miembros, y la sección Ceratinae, pero esto requiere la inclusión de especies de otras regiones. 7) El agregado de U. florida, delimitado en un sentido filogenético, puede constituir una radiación reciente de amplia distribución geográfica, mientras que el agregado de U. fragilescens es polifilético. 8) Ninguno de los casos de pares de especies putativas evaluados sugiere que esta hipótesis es adecuada para explicar la especiación en estos taxa. 9) Dentro del agregado de U. florida, la separación sistemática de individuos sorediados de los apoteciados no es recomendable en presencia de intermedios. 10) La exploración de la dinámica poblacional de U. cornuta s.l., U. brasiliensis y U. ceratina arrojó niveles intermedios a altos de variación genética. 11) No se encontró diferenciación poblacional en las poblaciones mexicanas de U. ceratina ni de México con Inglaterra, lo que puede deberse a dispersión a larga distancia, a polimorfismo ancestral o a un efecto del muestreo. 12) Aunque sólo se logró un tamaño de muestra moderado y las pruebas de neutralidad resultaron no significativas, hay indicios que permiten sospechar dinámicas de demografía histórica en U. ceratina similares a otras especies de hongos y plantas de bosques templados de México. 13) En cuanto a su distribución, parece ser que varias especies abarcan varios continentes, pero quizá el cosmopolitismo definitivo esté constreñido por factores históricos o de la historia natural de los taxa. 14) Por lo menos tres nuevos registros para el país y seis registros nuevos para diferentes estados de la República sugieren que la diversidad en México aún requiere más investigación, en particular en el estado de Oaxaca. Lo mismo se puede decir de todo el mundo, a juzgar por los trabajos moleculares y taxonómicos regionales. 8.1. Conclusiones taxonómicas 1) U. perplectata y U. baileyi son especies distintas, con diferencias morfoanatómicas y químicas. 2) U. lecanorica y U. silesiaca (o U. columbiana) son parafiléticas. 3) Existe desacuerdo taxonómico sobre la distinción de U. subscabrosa y U. subrubicunda, pero los ejemplares en México forman un clado monofilético. 139 4) U. santa-annae es en un sinónimo de U. subrubicunda y no de U. subscabrosa, lo que restringe la distribución de esta última al Hemisferio Norte. 5) U. ceratina es una sola especie, distinta de U. cristatula y de U. entoviolata, las cuales parecen estar más relacionadas entre sí. U. entoviolata puede ser críptica en la práctica ya que, en ausencia de soralios desarrollados, es indistinguible de U. ceratina. Las poblaciones japonesas de U. ceratina no son conespecíficas con las mexicanas y europeas, sino que son cercanas a U. entoviolata. 6) U. erinacea (quimiotípo de ácido norestíctico) es una especie separada y no necesariamente hermana de U. rubicunda. Asimismo, existen linajes adicionales de taxa pigmentados de rojo previamente ignorados. 7) Preliminarmente, U. dasaea es monofilética en México. 8) Los quimiotipos de ácido salazínico y norestíctico de U. cornuta s.l. son linajes separados no emparentados. A su vez, el quimiotipo de ácido salazínico puede que incluya linajes no reconocidos. 9) U. cirrosa es distinta y no está emparentada ni con U. ramillosa ni con U. cornuta s.l. 10) U. ramillosa podría ser conespecífica con U. brasiliensis. 11) U. brasiliensis es una especie distinta de U. cornuta s.l., lo cual es apoyado por múltiples evidencias genéticas, morfológicas y anatómicas, aunque existe la posibilidad de hibridización con U. cornuta s.l. e introgresión hacia U. brasiliensis. 12) Otras especies taxonómicas, como U. angulata, U. merrilli y U. schadenbergiana, son monofiléticas. 140 9. Perspectivas Obviamente quedan numerosas especies por corroborar y zonas, en particular tropicales, por explorar. La inclusión de más especies, más ejemplares y más loci (tanto nucleares, como mitocondriales) ayudará a resolver más claramente las relaciones evolutivas dentro del género. Asimismo, es necesario incluir a las especies saxícolas y de zonas áridas. De igual forma, otras aproximaciones, como la inferencia bayesiana, pueden contribuir a enclarecer los resultados. La dinámica poblacional y filogeográfica de U. cornuta s.l. y U. brasiliensis, tanto en México como en otras partes del mundo, puede resultar muy informativa dentro del estudio de la especiación en hongos liquenizados. Especies similares, como U. ceratina y U. cristatula permitirían hacer análisis comparativos con respecto a modos reproductivos y sus efectos en la dinámica poblacional y en la distribución. U. dasaea y U. rubicunda, por su parte, pueden ser modelos de adaptación ecológica. Asimismo, investigar la filogeografía de U. ceratina y otras especies contribuiría al conocimiento de los efectos biogeográficos de las glaciaciones en los bosques de México. Por otra parte, el estudio del (los) fotobionte(s) y otros miembros de la asociación podría contribuir a dilucidar las dinámicas poblacionales de los micobiontes y permitiría explorar formalmente la hipótesis del par de especies. Esto es extensivo también a los hongos parásitos y endoliquénicos que son muy comúnes en el género. 141 10. Referencias Agapow, P.-M., Bininda-Emonds, O.R.P., Crandall, K.A., Gitleman, J.L., Mace, G.M., Marshall, J.C. y Purvis, A. 2004. The impact of species concept on biodiversity studies, The Quaterly Review of Biology 79(2): 161-179. Aguileta, G., Marthey, S., Chiapello, H., Lebrun, M.-H., Rodolphe, F., Fournier, E., Gendrault-Jacquemard, A. y Giraud, T. 2008. Assessing the performance of single-copy genes for recovering robust phylogenies, Systematic Biology 57(4): 613-627. Ahmadjian, V. 1965. Lichens. Annual Review of Microbiology 19: 1-20. Ahmadjian, V. 1988. The lichen alga Trebouxia: does it occur free-living?, Plant Systematics and Evolution 158(2-4): 243-247. Ahmadjian, V. 1993. The Lichen Symbiosis, John Wiley, New York. Akaike H. 1973. 'Information theory and an extension of the maximum likelihood principle' en Second International Symposium on Information Theory, Petrov, B.N., Csaki F., (eds.), Budapest (Hungary): Akademiai Kiado. p. 267–281. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. y Walter, P. 2008. Molecular biology of the cell, 5º edición, Gerland Science, Taylor & Francis Group, USA. Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W., Lipman, D.J., 1990. Basic local alignment search tool, Journal of Molecular Biology 215: 404–410. Anderson, E. y Rudolph, E.D. 1956. An analysis of variation in a variable population of Cladonia, Evolution 10(2): 147-156. Andrew, R.L., Ostevik, K.L., Ebert, D.P. y Rieseberg, L.H. 2012. Adaptation with gene flow across the landscape in a dune sunflower, Molecular Ecology 21(9): 2078-2091. Anglesea, D., Greenhalgh, G.N. y Veltkamp, C.J. 1983. The structure of the thallus tip in Usnea subfloridana, Lichenologist 15(1): 73-80. Aragón, G., Martínez, I., Izquierdo, P., Belinchón, R., y Escudero, A. 2010. Effect of forest management on epiphytic lichen diversity in Mediterranean forests, Applied Vegetation Science 13: 183-194. Arnheim, N., Krystal, M., Schmickel, R., Wilson, G., Ryder, O. y Zimmer, E. 1980. Molecular evidence for genetic exchanges among ribosomal genes on nonhomologous chromosomes in man and apes, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 77(12): 7323-2327. Articus, K., Mattsson, J.-E., Tibell, L., Grube, M. y Wedin, M. 2002. Ribosomal DNA and β-tubulin data do not support the separation of the lichens Usnea florida and U. subfloridana as distinct species, Mycological Research 106(4): 412-418. Articus, K. 2004. Neuropogon and the phylogeny of Usnea s.l. (Parmeliaceae, Lichenized Ascomycetes), Taxon 53(4): 925-934. Arup, U., Ekman, S., Grube, M., Mattsson, J.-E. y Wedin, M. 2007. The sister group relation of Parmeliaceae (Lecanorales, Ascomycota), Mycologia 99(1): 42-49. 142 Ayliffe, M.A., Dodds, P.N. y Lawrence, G.J. 2001. Characterisation of a β-tubulin gene from Melampsora lini and comparison of fungal β-tubulin genes, Mycological Research 105(7): 818-826. Azami, N., Seriñá, E. y Arroyo, R. 2004. The Usnea species of Morocco in R.-G. Werner's Herbarium, The Bryologist 107(2): 180-188. Barraclough, T.G., Birky, C.W. y Burt, A. Jr. 2003. Diversification in Sexual and Asexual Organisms, Evolution 57(9): 2166-2172. Bates, S.T., Cropsey, G.W.G., Caporaso, G., Knight, R. y Fierer, N. 2011. Bacterial Communities Associated with the Lichen Symbiosis, Applied and Environmental Microbiology 77(4): 1309-1314. Baum, D.A. y Shaw, K.L. 1995. 'Genealogical perspectives on the species problem' en Experimental and Molecular Approaches to Plant Biosystematics, Hoch, P.C y Stephenson, A.G. (eds.), Missouri Botanical Garden. Beck, B. y A., Friedl, T., y Rambold, G. 1998. Selectivity of photobiont choice in a defined lichen community: inferences from cultural and molecular studies, New Phytologist 139: 709-720. Begerow, D., Johns, B. y Oberwinkler, F. 2004. Evolutionary relationships among β- tubulin gene sequences of basidiomycetous fungi, Mycological Research 108(11): 1257-1263. Beiggi, S. y Piercey-Normore, M.D. 2007. Evolution of ITS ribosomal RNA secondary structures in fungal and algal symbionts of selected species of Cladonia sect. Cladonia (Cladoniaceae, Ascomycotina), Journal of Molecular Evolution 64: 528-542. Benavides, E., Baum, R., McClellan, D. & Sites, J.W. Jr. 2007. Molecular Phylogenetics of the Lizard Genus Microlophus (Squamata: Tropiduridae): Aligning and Retriving Indel Signal from Nuclear Introns, Systematic Biology 56(5): 776-796. Bergamini, A., Sheidegger, C., Stofer, S., Carvalho, P., Davey, S., Dietrich, M., Dubs, F., Farkas, E., Groner, U., Kärkaäinen, K., Keller, C., Lökos, L., Lommi, S., Máguas, C., Mitchell, R., Pinho, P., Rico, V.J., Aragón, G., Truscott, A.-M., Wolseley, P. y Watt, A. 2005. Performance of Macrolichens and lichen genera as indicators of lichen species richness and composition, Conservation Biology 19(4): 1051-1062. Bernasconi, E.S., De Vito, I.E., Martínez, L.D. y Raba, J. 2000. Liquen Usnea densirostra como bioindicador de metales pesados. Determinación por ICP-AES acoplado con nebulizador ultrasónico, Ars Pharmaceutica 41(3): 249-257. Blackwell, M. 2011. The Fungi: 1, 2, 3 ... 5.1 million species?, American Journal of Botany 98(3): 426-438. Bochman, M.L. y Schwacha, A. 2009. The MCM complex: Unwinding the mechanism of a replicative helicase, Microbiology and Molecular Biology Reviews 73(4): 652-683. Boudreault, C., Gauthier, S. y Bergeron, Y. 2000. Epiphytic lichens and bryophytes on Populus tremuloides along a chronosequence in the Southwestern boreal forest of Québec, Canada, The Bryologist 103(4): 725-738. 143 Bowler, P.A. y Rundel, P.W. 1975. Reproductive strategies in lichens, Botanica Journal of the Linnean Society 70: 325-340. Brodo, I.M., Sharnoff, S.D., Sharnoff, S. 2001. Lichens of North America, Yale University Press, New Haven y London, 795 pp. Brower, A.V.Z. 1999. Delimitation of phylogenetic species with DNA sequences: A critique of Davis and Nixon's Population Aggregation Analysis, Systematic Biology 48(1): 199- 213. Büdel, B. y Scheidegger, C. 2008. 'Thallus morphology and anatomy' en Lichen Biology, Nash III, T.H. (ed.), Cambrige University Press, USA. Bungartz, F. 2002a. 'Morphology and Anatomy of the Fertile Structures' en Lichen Flora of the Greater Sonora Desert Region Vol.1, Nash III, T.H., Ryan, B.D., Gries, C. y Bungartz, F. (eds.), Lichens Unlimited, Arizona State University, EUA. Bungartz, F. 2002b. 'Recipes and other techniques' en Lichen Flora of the Greater Sonora Desert Region Vol.1, Nash III, T.H., Ryan, B.D., Gries, C. y Bungartz, F. (eds.), Lichens Unlimited, Arizona State University, EUA. Buschbom, J. y Barker, D. 2006. Evolutionary history of vegetative reproduction in Porpidia s.l. (lichen-forming Ascomycota), Systematic Biology 55(3): 471-484. Buschbom, J. y Muller, G. 2004. Resolving evolutionary relationships in the lichen- forming genus Porpidia and related allies (Porpidiaceae, Ascomycota), Molecular Phylogenetics and Evolution 32: 66-82. Butlin, R., Schön, I. y Martens, K. 1998. Asexual reproduction in nonmarine ostracods, Heredity 81: 473-480. Calonje, M., Martín-Bravo, S., Dobes, C., Gong, W., Jordon-Thaden, I., Kiefer, C., Kiefer, M., Paule, J., Schmickl, R. y Koch, M.A. 2009. Non-coding nuclear DNA markers in phylogenetic reconstruction, Plant Systematics and Evolution 282: 257-280. Carreras, H.A. y Pignata, M.L. 2000. Comparison among air pollutants, meteorological conditions and some chemical parameters in the transplanted lichen Usnea amblyocada, Environmental Pollution 111: 45-52. Carreras, H.A. y Pignata, M.L. 2006. Effects of the heavy metals Cu2+, Ni2+, Pb2+ and Zn2+ on some physiological parameters of the lichen Usnea amblyocada, Ecotoxicology and Environmental Safety 67: 59-66. Castresana, J. 2000. Selection of conserved blocks from multiple alignments for their use in phylogenetic analysis, Molecular Biology and Evolution 17: 540-552. Cerritos Flores, R. 2007. 'Capítulo 10. La especie como unidad evolutiva: uso de marcadores moleculares para su reconocimiento y delimitación, con especial énfasis en microorganismos' en Ecología Molecular, Eguiarte, L.E., Souza, V. y Aguirre, X. (comp.), Instituto Nacional de Ecología, SEMARNAT, CONABIO, UNAM, México. 144 Chen, S., Yao, H., Han, J., Liu, C., Song, J., Shi, L., Zhu, Y., Ma, X., Gao, T., Pang, X., Lao, K., Li, Y., Li, X., Jia, X., Lin, Y. y Leon, C. 2010. Validation of the ITS2 Region as a Novel DNA Barcote for Identifying Medicinal Plant Species, PLoS ONE 5(1): e8613. Clement, M., Posada, D. y Crandall, K.A. 2000. TCS: a computer program to estimate gene genealogies, Molecular Ecology 9: 1657-1659. Clerc, P. 1984. Contribution à la révision de la systématique des usnées (Ascomycotina, Usnea) d'Europe I. - Usnea florida (L.) Wigg. emend. Clerc, Cryptogamie: Bryologie et Lichenologie 5, 4: 333-360. Clerc, P. 1987a. Systematics of the Usnea fragilescens aggregate and its distribution in Scandinavia, Nordic Journal of Botany 7: 479-495. Clerc, P. 1991. Usnea madeirensis Mot. (ascomycète lichénisé): une espèce méconnue de l'Europe et de l'Amerique du Nord, Candollea 46: 427-238. Clerc, P. 1992. Some new or interesting species of the genus Usnea (licenised Ascomycetes) in the British Isles, Candollea 47(2): 513-526. Clerc, P. 1997. Notes on the Genus Usnea Dill. ex Adanson, Lichenologist 29(3): 209- 215. Clerc, P. 1998. Species Concepts in the Genus Usnea (Lichenized Ascomycetes), Lichenologist 30(4-5): 321-340. Clerc, P. 2004. Notes on the genus Usnea Adanson. II, Bibliotheca Lichenologica 88: 79- 90. Clerc, P. 2006. Synopsis of Usnea (lichenized Ascomycetes) from the Azores with additional information on the species in Macaronesia, The Lichenologist 38(3): 191-212. Clerc, P. 2007. 'Usnea' en Lichen Flora of the Greater Sonoran Desert Region. Volume III (balance of the microlichens, and the lichenicolous fungi), Nash III, T.H., Gries, C. y Bungartz, F. (eds.), Lichens Unlimited, School of Life Sciences, Arizona State University, USA. Clerc, P. 2011a. 'Usnea' en Nordic Lichen Flora Vol.4 Parmeliaceae, Thell, A. & Moberg, R. (eds.), Nordic Lichen Society, Uppsala. Clerc, P. 2011b. Notes on the genus Usnea Adanson (lichenized Ascomycota). III, Bibliotheca Lichenologica 106: 41-51. Clerc, P. y Herrera-Campos, M. A. 1997. Saxicolous Species of Usnea Subgenus Usnea (Lichenized Ascomycetes) in North America, The Bryologist 100(3): 281-301. Cohan, F.M. 2001. Bacterial Species and Speciation, Systematic Biology 50(4): 513- 524. Cohan, F.M. 2002. What are bacterial species?, Annual Review of Microbiology 56: 457- 487. Côté, C.A. y Peculis, B.A. 2001. Role of the ITS2-proximal stem and evidence for indirect recognition of processing sites in pre-rRNA processing in yeast, Nucleic Acids Research 29(10): 2106-2116. Coyne, J.A. y Orr, H.A. 2004. Speciation, Sinauer Associates, Sunderland, MA. 145 Crespo, A. y Pérez-Ortega, S. 2009. Cryptic species and species pairs in lichens: A discussion on the relationships between molecular phylogenies and morphological characters, Anales del Jardín Botanico de Madrid 66S1: 71-81. Crespo, A., Lumbsch, H.T., Mattsson, J.-E., Blanco, O., Divakar, P.K., Articus, K., Wiklund, E., Bawingan, P.A. y Wedin, M. 2007. Testing morphology-based hypothesis of phylogenetic relationships in Parmeliaceae (Ascomycota) using three ribosomal markers and the nuclear RPB1 gene, Molecular Phylogenetics and Evolution 44: 812-824. Crespo, A., Kauff, F., Divakar, P.K., del Prado, R., Pérez-Orteaga, S., Amo de Paz, G. Ferencova, Z., Blanco, O., Roca-Valiente, B., Núnez-Zapata, J., Cubas, P., Argüello, A., Elix, J.A., Esslinger, T.L., Hawksworth, D.L., Millanes, A., Molina, M.C., Wedin, M., Ahti, T., Aptroot, A., Barreno, E., Bungartz, F., Calvelo, S., Candan, M., Cole, M., Ertz, D., Goffinet, B., Lindblom, L., Lücking, R., Lutzoni, F., Mattsson, J.-E., Messuti, M.I., Miadlikowska, J., Piercey-Normore, M., Rico, V.J., Sipman, H.J.M., Schmitt, I., Spribille, T., Thell, A., Thor, G., Upreti, D.K., y Lumbsch, H.T. 2010. Phylogenetic generic classification of parmelioid lichens (Parmeliaceae, Ascomycota) based on molecular, morphological and chemical evidence. Taxon 59(6): 1735-1753. Culberson, W.L. 1970. Chemosystematics and ecology of lichen-forming fungi, Annual Review of Ecology and Systematics 1: 153-170. Culberson, C.F. 1972. Improved conditions and new data for the identification of lichen products by a standardized thin-layer chromatographic method, Journal of Chromatography A 72(1): 113-125. Culberson, C.F. y Culberson, W.L. 1976. Chemosyndromic variation in lichens, Systematic Botany 1(4): 325-339. Culberson, C.F. y Hale Jr., M.E. 1973. Chemical and morphological evolution in Parmelia sect. Hypotrachyna: product of ancient hybridization?, Brittonia 25: 162-173. Culberson, C.F., Culberson, W.L. y Johnson, A. 1981. A standardized TLC analysis of β- Orcinol depsidones, The Bryologist 84(1): 16-29. Culberson, C.F y Johnson, A. 1982. Substitution of methyl tert-butyl ether for diethyl ether in the standardized thin-layer chromatographic method for lichen products, Journal of Chromatography 238: 483-487. Culberson, W.L., Culberson, C.F. y Fiscus, S.A. 1983. A New Lecanoric Acid-Producing Usnea from Mexico, The Bryologist 86(3): 254-256. Culotta, E. 1994. Is Marine Biodiversity at Risk?, Science 263(5149): 918-920. Davis, J.I. y Nixon, K.C. 1992. Populations, genetic variation, and the delimitation of phylogenetic species, Systematic Biology 41(4): 421-435. Dayrat, B. 2005. Towards integrative taxonomy, Biological Journal of the Linnean Society 85: 407-415. de Queiroz, K. 1998. 'The general lineage concept of species, species criteria, and the process of speciation: A conceptual unification and terminological recommendations' en Endless 146 Forms: Species and speciation, Howard, D.J. y Berlocher, S.H. (eds.), Oxford University Press, New York, 57-75 pp. de Queiroz, K. 2005. A unified concept of species and its consequences for the future of taxonomy, Proceedings of the California Academy of Sciences, 56(18): 196-215. de Queiroz, K. 2007. Species Concepts and Species Delimitation, Systematic Biology 56(6): 879-886. del Campo, E.M., Casano, L.M., Gasulla, F. y Barreno, E. 2009. Presence of multiple group I introns closely related to bacteria and fungi in plastid 23S rRNAs of lichen-forming Trebouxia, International Microbiology 12: 59-67. Dibble, A.C., Wright, W.A. y Campbell, C.S. 1998. Quantitative morphology of the Amelanchier agamic complex (Rosaceae) at a Maine site, Systematic Botany 23(1): 31-41. Dobson, F.S. 2001. The problems and danger of using para-phenylenediamine, British Lichen Society Bulletin 88: 56-57. Doyle, J.J. 1995. The irrelevance of allele tree topologies for species delimitation, and a non-topological alternative, Systematic Botany 20(4): 574-588. Du Rietz, E. 1924. Die Soredien und Isidien der Flechten, Svensk Botanisk Tidskrift Utgifven af Svenska Botaniska Foreningen, Stockholm 18: 371-396. Dyer, P.S., Paoletti, M. y Archer, D.B. 2003. Genomics reveals sexual secrets of Aspergillus, Microbiology 149(9): 2301-2303. Egger, K.N. 1995. Molecular analysis of ectomycorrhizal fungal communities, Canadian Journal of Botany 73 (Suppl. 1): S1415-S1422. Elix, J.A. y Stocker-Wörgötter, E. 2008. 'Biochemistry and secondary metabolites' en Lichen Biology, Nash III, T.H. (ed.), Cambrige University Press, USA. Esseen, P.-A., Ericson, L., Lindström, H. y Zackrisson, O. 1981. Occurrence and Ecology of Usnea longissima in Central Sweden, Lichenologist 13(2): 177-190. Fehrer, J., Slavíková-Bayerová, S. y Orange, A. 2008. Large genetic divergence of new, morphologically similar species of sterile lichens from Europe (Lepraria, Stereocaulaceae, Ascomycota): concordance of DNA sequence data with secondary metabolites, Cladistics 24: 443-458. Feuerer, T. (ed.) 2011. 'Biodiversity of lichens and lichenicolous fungi. Versión 1 Agosto 2011', [en línea] consultado el 12 de abril de 2012 en: http://www.checklists.de/ Finlay, B.J. 2002. Global Dispersal of Free-Living Microbial Eukaryote Species, Science 296: 1061-1063. Finlay, B.J. y Clarke, K.J. 1999. Ubiquitous dispersal of microbial species, Nature 400: 828. Finlay, B.J., Monaghan, E.B. y Maberly, S.C. 2002. Hypothesis: The Rate and Scale of Dispersal of Freshwater Diatom Species is a Function of their Global Abundance, Protist 153: 261-273. 147 Fontaneto, D., Herniou, E.A., Boschetti, C., Caprioli, M., Melone, G., Ricci, C. y Barraclough, T.G. 2007. Independently Evolving Species in Asexual Bdelloid Rotifers, PloS Biology 5(4): 914-921. Fos, S. y Clerc, P. 2000. The lichen genus Usnea on Quercus suber in Iberian Cork-Oak forests, Lichenologist 32(1): 67-88. Fraser, J.A., Stajich, J.E., Tarcha, E.J., Cole, G.T., Inglis, D.O., Sil, A. y Heitman, J. 2007. Evolution of the Mating Type Locus: Insights Gained from the Dimorphic Primary Fungal Pathogens Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, and Coccidioides posadasii, Eukaryotic Cell 6(4): 622-629. Friedl, T. y Büdel, B. 2008. 'Photobionts' en Lichen Biology, Nash III, T.H. (ed.), Cambrige University Press, USA. Friedl, T. y Zeltner, C. 1994. Assessing the relationships of some coccoid green lichen algae and the Microthamniales (Chlorophyta) with 18S ribosomal RNA gene sequence comparisons, Journal of Phycology 30: 500-506. Fu, Y.-X. y Li, W.-H. 1993. Statistical test of neutrality of mutations, Genetics 133: 693- 709. Gallogay, D.J. 2008. 'Lichen biogeography' en Lichen Biology, Nash III, T.H. (ed.), Cambrige University Press, USA. Ganley, A.R.D. y Kobayashi, T. 2007. Highly efficient concerted evolution in the ribosomal DNA repeats: Total rDNA repeat variation revealed by whole-genome shotgun sequence data, Genome Research 17: 184-191. Gardes, M. y Bruns, T.D. 1993. ITS primers with enhanced specificity for basidiomycetes – application to the identification of mycorrhizae and rusts, Molecular Ecology 2: 113-118. Gargas, A., DePriest, P.T., Grube, M. y Tehler, A. 1995a. Multiple origins of lichen symbioses in Fungi suggested by SSU rDNA Phylogeny, Science 268: 1492-1495. Gascuel, O. 1997. BIONJ: an improved version of the NJ algorithm based on a simple model of sequence data, Molecular Biology and Evolution 14(7): 685-695. Gaston, K.J. 2010. 'Biodiversity' en Conservation Biology for all, Sodhi, N.S y Ehrlich, P.R. (eds.), Oxford University Press, New York, EUA. Gaya, E., Lutzoni, F., Zoller, S. y Navarro-Rosinés, P. 2003. Phylogenetic study of Fulgensia and allied Caloplaca and Xanthoria species (Teloschistaceae, lichen-forming Ascomycota), American Journal of Botany 90(7): 1095-1103. Gelperin, D., Horton, L., Beckman, J., Hensold, J. y Lemmon, S.K. 2001. Bms1p, a novel GTP-binding protein, and the related Tsr1p are required for distinct steps of 40S ribosome biogenesis in yeast, RNA 7:1268-1283. Giraud, T., Fortini, D., Levis, C., Leroux, P. y Brygoo, Y. 1997. RFLP markers show genetic recombination in Botryotinia fuckeliana (Botrytis cinerea) and transposable elemets reveal two sympatric species, Molecular Biology and Evolution 14(11): 1177-1185. 148 Goldman, W.E., Goldber, G., Bowman, L.H., Steinmetz, D. y Schlessinger, D. 1983. Mouse Rdna: Sequence and Evolutionary Analysis of Spacer and Mature RNA Regions, Molecular and Cellular Biology 3(8): 1488-1500. Gómez-Zurita, J., Funk, D.J. y Vogler, A.P. 2006. The evolution of unisexuality in Calligrapha leaf beetles: molecular and ecological insights on multiple origins via interspecific hybridization, Evolution 60(2): 328-347. Gottschling, M. y Plötner, J. 2004. Secondary structure models of the nuclear internal transcribed spacer regions and 5.8S rRNA in Calciodinelloideae (Peridiniaceae) and other dinoflagellates, Nucleic Acids Research 32(1): 307-315. Graybeal, A. 1995. Naming Species, Systematic Biology 44(2): 237-250. Grube, M. y Kroken, S. 2000. Molecular approaches and the concept of species and species complexes in lichenized fungi, Mycological Research 104(11): 1284-1294. Guindon, S., Dufayard, J.-F., Lefort, V., Anisimova, M., Hordijk, W. y Gascuel, O. 2010. New algorithms and methods to estimate Maximum-Likelihood phylogenies: assessing the performance of PhyML 3.0. Systematic Biology 59(3): 307-321. Gutell, R.R., Larsen, N. y Woese, C.R. 1994. Lessons from an evolving rRNA: 16S and 23S rRNA structures from a comparative perspectiva, Microbiology and Molecular Biology Reviews 58(1): 10-26. Gutiérrez, G., Blanco, O., Divakar, P.K., Lumbsch, T. y Crespo, A. 2007. Patterns of Group I Intron Presence in Nuclear SSU rDNA of the Lichen Family Parmeliaceae, Journal of Molecular Evolution 64: 181-195. Hale, M.E., Jr. 1965. A monograph of Parmelia subgenus Amphigymnia, Contributions from the United States National Herbarium 36(5): 193-358. Hale, M.E., Jr. 1969. How to know the lichens, WM. C. Brown Company Publishers, EUA, pp. 225 Hale, M.E., Jr. 1983. The Biology of Lichens, Edward Arnold, London. Hall, T.A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT, Nucleic Acids Symposium 41: 85.98. Halonen, P., Clerc, P., Goward, T., Brodo, I.M. y Wulff, K. 1998. Synopsis of the genus Usnea (lichenized ascomycetes) in British Columbia, Canada, The Bryologist 101: 36-60. Hamilton, M.B. 2009. Population Genetics, Wiley-Blackwell, Haboken, New Jersey, EUA. Hauck, M. y Javkhlan, S. 2009. Epiphytic lichen diversity and its dependence on bark chemistry in the northern Mongolian dark taiga, Flora 204: 278-288. Hawksworth, D.L. 1988. The variety of fungal-algal symbioses, their evolutionary significance, and the nature of lichens, Botanical Journal of the Linnean Society 96: 3-20. Herrera-Campos, M. A. 1998. Revisión sistemática del género Usnea Hill 1753 en México, Tesis de Doctorado, Universidad Nacional Autónoma de México, México. Herrera-Campos, M. A., Clerc, P. y Nash III, T.H. 1998. Pendulous species of Usnea from the temperate forests in Mexico, The Bryologist 101(2): 303-329. 149 Herrera-Campos, M. A., Nash III, T.H. y Zambrano García, A. 2001. Preliminary study of the Usnea fragilescens aggregate in Mexico, The Bryologist 104(2): 235-259. Hillis, D.M. y Bull, J.J. 1993. An empirical test of bootstrapping as a method for assessing confidence in phylogenetic analysis, Systematic Biology 42(2): 182-192. Hilmo, O. 1994. Distribution and succession of epiphytic lichens on Picea abies branches in a Boreal Forest, Central Norway, Lichenologist 26(2): 149-169. Hinds, J.W. y Hinds, P.L. 2007. The Macrolichens of New England, The New York Botanical Garden Press, 584 pp. Honegger, R. 1993. Developmental biology of lichens, New Phytologist 125(4): 659- 677. Honegger, R. 2008. 'Mycobionts' en Lichen Biology, Nash III, T.H. (ed.), Cambrige University Press, USA. Honegger, R., Zippler, U., Gansner, H. y Scherrer, S. 2004. Mating systems in the genus Xanthoria (lichen-forming ascomycetes), Mycological Research 108(5): 480-488. Hörandl, E., Greilhuber, J., Klímová, K., Paun, O., Temsch, E., Emadzade, K. y Hodálová, I. 2009. Reticulate evolution and taxonomic concepts in the Ranunculus auricomus complex (Ranunculaceae): insights from analysis of morphological, karyological and molecular data, Taxon 58(4): 1194-1216(23). Hsueh, Y.-P. y Heitman, J. 2008. Orchestration of sexual reproduction and virulence by the fungal mating-type locus, Current Opinion in Microbiology 11: 517-524. Hudson, R.R. y Kaplan, N.L. 1985. Statistical properties of the number of recombination events in the history of a simple of DNA sequences, Genetics 111: 147-164. Hudson, R.R., Boos, D.D. y Kaplan, N. L. 1992a. A statistical test for detecting geographic subdivision, Molecular Biology and Evolution 9(1): 138-151. Hudson, R.R., Slatkin, M. y Maddison, W.P. 1992b. Estimation of levels of gene flow from DNA sequence data, Genetics 132: 583-589. Hunter, R.L., LaJeunesse, T.C. y Santos, S.R. 2007. Structure and evolution of the rDNA internal transcribed spacer (ITS) region 2 in the symbiotic dinoflagellates (Symbiodinium, Dinophyta), Journal of Phycology 43: 120-128. Hurvich, C.M. y Tsai, C.-L. 1989. Regression and Time Series Model Selection in Small Samples, Biometrika 76:297-307. Huson, D.H., Richter, D.C., Rausch, C., Dezulian, T., Franz, M. y Rupp, R. 2007. Dendroscope: An interactive viewer for large phylogenetic trees, BMC Bioinformatics 8: 460. Izquierdo-Carrasco, F., Smith, S.A. y Stamatakis, A. 2011. Algorithms, data structures, and numerics for likelihood-based phylogenetic inference of huge trees, BMC Bioinformatics 12: 470-483. Jacq, B. 1981. Sequence homologies between eukaryotic 5.8S rRNA and the 5' end of prokaryotic 23S rRNA: evidence for a common evolutionary origin, Nucleic Acids Research 9(12): 2913-2932. 150 James, P.W. 1979. Notes on Usnea rubiginea and U. rubicunda, The Lichenologist 11: 322-323. James, P., Clerc, P. y Purvis, W. 2009. 'Usnea' en Smith, C.W., Aptroot, A., Coppins, B.J., Fletcher, A., Gilbert, O.L., James, P.W. y Wolseley, P.A. (eds.), The Lichen Flora of Great Britain and Ireland, 2°, Gran Bretaña. James, T.Y, Kauff, F., Schoch, C.L., Matheny, P.B., Hofstetter, V., Cox C. J., Celio, G. Gueidan C., Fraker E., Miadlikowska J., Lumbsch H.T., Rauhut A., Reeb V., Arnold A.E., Amtoft A., Stajich J.E., Hosaka K., Sung G.H., Johnson D., O’Rourke B., Crockett M., Binder M., Curtis J.M., Slot J.C., Wang Z., Wilson A.W., Schüßler A., Longcore J.E., O’Donnell K., Mozley- Standridge S., Porter D., Letcher P.M., Powell M.J., Taylor J.W., White M.M., Griffith G.W., Davies D.R., Humber R.A., Morton J.B., Sugiyama J., Rossman A.Y., Rogers J.D., Pfister D.H., Hewitt D., Hansen K., Hambleton S., Shoemaker R.A., Kohlmeyer J., Volkmann-Kohlmeyer B., Spotts R.A., Serdani M., Crous P.W., Hughes K.W., Matsuura K., Langer E., Langer G., Untereiner W.A., L ¨ ucking R., B¨ udel B., Geiser D.M., Aptroot A., Diederich P., Schmitt I., Schultz M., Yahr R., Hibbett D.S., Lutzoni F., McLaughlin D.J., Spatafora J.W., Vilgalys R. 2006. Reconstructing the early evolution of Fungi using a six-gene phylogeny, Nature 443: 818-822. Johansen, S. y Vogt, V. 1994. An intron in the nuclear ribosomal DNA of Didymium iridis codes for a Group I ribozyme and a Novel Ribozyme that cooperate in self-splicing, Cell 76: 725-734. Johns, G.C. y Avise, J.C. 1998. A comparative summary of genetic distances in the vertebrates from the mitochondial cytochrome b gene, Molecular Biology and Evolution 15(11): 1481-1490. Joneson, S. y Lutzoni, F. 2009. Compatibility and thigmotropism in the lichen symbiosis: A reappraisal, Symbiosis 47: 109-115. Joseph, N., Krauskopf, E., Vera, M.I. y Michot, B. 1999. Ribosomal internal transcribed spacer 2 (ITS2) exhibits a common core of secondary structure in vertebrates and yeast, Nucleic Acids Research 27(23): 4533-4540. Judson, O.P. y Normark, B.B. 1996. Ancient asexual scandals, Trends in Ecology and Evolution 11(2): 41-46. Katoh, K., Misawa, K., Kuma, K. y Miyata, T. 2002. MAFFT: a novel method for rapid multiple sequence alignment based on fast Fourier transform, Nucleic Acids Research 30(14): 3059-3066. Katoh, K. y Toh, H. 2008. Recent Developments in the MAFFT multiple sequence alignment program, Briefings in Bioinformatics 9(4): 286-298. Kelly, L. J., Hollingsworth, P. M., Coppins, B. J., Ellis, C. J., Harrold, P., Tosh, J. y Yahr, R. 2011. DNA barcoding of liquenized fungi demostrates high identification success in a floristic context, New Phytologist 191: 288-300. Keon, D.B. y Muir, P.S. 2002. Growth of Usnea longissima across a variety of habitats in the Oregon Coast Range, The Bryologist 105(2): 233-242. 151 Kirk P.M., Cannon P.F., Minter D.W., Stalpers J.A. 2008. Ainsworth and Bisby’s dictionary of the Fungi, 10° edición CAB International, Wallingford (UK). Knops, J.M.H., Nash III, T.H., Boucher, V.L. y Schlesinger, W.H. 1991. Mineral Cycling and Epiphytic Lichens: Implications at the Ecosystem Level, Lichenologist 23(3): 309-321. Knops, J.M.H., Nash III, T.H. y Schlesinger, W.H. 1997. The Influence of Epiphytic Lichens on the Nutrient Cycling of a Blue Oak Woodland, USDA Forest Service General Technical Reports PSW-GTR-160: 75-82. Krog, H. 1976. Lethariella and Protousnea, two new lichens of the Parmeliaceae, Norwegian Journal of Botany 23: 83-106. Krog, H. 1982. Evolutionary trends in the foliose and fruticose lichens of the Parmeliaceae, Journal of the Hattori Botany Laboratory 52: 303-311. Kroken, S. y Taylor, J.W. 2001. A gene genealogical approach to recognize phylogenetic species boundaries in the lichenized fungus Letharia, Mycologia 93(1): 38-53. Kües, U. y Casselton, L.A. 1992. Fungal mating type genes – regulators of sexual development, Mycological Research 96(12): 993-1006. Lawrence, J.G. y Retchless, A.C. 2010. The myth of bacterial species and speciation, Biology and Philosophy 25: 569-588. Lawrey, J.D. y Diederich, P. 2003. Lichenicolous Fungi: Interactions, Evolution, and Biodiversity, The Bryologist 106(1): 80-120. Leavitt, S.D., Johnson, L. y St.Clair, L.L. 2011a. Species delimitation and evolution in morphologically and chemically diverse communities of the lichen-forming genus Xanthoparmelia (Parmeliaceae, Ascomycota) in western North America, American Journal of Botany 98(2): 175- 188. Leavitt, S.D., Frankhauser, J.D., Leavitt, D.H., Porter, L.D., Johnson, L.A. y St.Clair, L.L. 2011b. Complex patterns of speciation in cosmopolitan “rock posy” lichens – Discovering and delimiting cryptic fungal species in the lichen-forming Rhizoplaca melanophthalma species- complex (Lecanoraceae, Ascomycota), Molecular Phylogenetics and Evolution 59: 587-602. Lemey, P. y Posada, D. 2009. 'Introduction to recombination detection' en The Phylogenetic Handbook: a Practical Approach to Phylogenetic Analysis and Hypothesis Testing, Lemey, P., Salemi, M. y Vandamme, A.-M. (eds.), Cambrige University Press, UK. Lei, M. y Tye, B.K. 2001. Initiating DNA synthesis: from recruiting to activating the MCM complex, Journal of Cell Science 114: 1447-1454. Lendemer, J.C. 2004. Lichens of eastern North America exsiccati. Fascicle II, nos. 51- 100, Opuscula Philolichenum 1: 25-40. Lendemer, J.C. y Tavares, I.I. 2003. Nomenclature and typification in the genus Usnea (liquenized Ascomycetes) – I. Usnea rigida, Proceedings of the Academy of Natural Sciences of Philadelphia 153: 177-180. 152 Li, W., Metin, B., White, T.C. y Heltman, J. 2010. Organization and Evolutionary Trajectory of the Mating Type (MAT) locus in Dermatophyte and Dimorphic Fungal Pathongens, Eukaryotic Cell 9(1): 46-58. Liao, D. 1999. Concerted Evolution: Molecular Mechanism and Biological Implications, The American Journal of Human Genetics 64: 24-30. Librado, P. y Rozas, J. 2009. DnaSP v5: a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data, Bioinformatics 25(11): 1451-1452. Liu, J.-S. Y Schardl, C.L. 1994. A conserved sequence in internal transcribed spacer 1 of plant nuclear rRNA genes, Plant Molecular Biology 26: 775-778. Lohse, K. 2009. Can mtDNA barcodes be used to delimit species? A response to Pons et al. (2006), Systematic Biology 58(4): 439-442. Lu, S.-W., Yun, S.-H., Lee, T. y Turgeon, B.G. 2011. Altering sexual reproductive mode by interspecific exchange of MAT loci, Fungal Genetics and Biology 48: 714-724. Lücking, R., Hodkinson, B.P., Stamatakis, A. y Cartwright, R.A. 2011. PICS-Ord: unlimited coding of ambiguous regions by pairwise identity and cost scores ordination, BMC Bioinformatics 12: 10. Lücking, R., del Prado, R., Lumbsch, H.T., Will-Wolf, S., Aptroot, A., Sipman, H.JM., Umaña, L. y Chaves, J.L. 2008. Phylogenetic patterns of morphological and chemical characters and reproductive mode in the Heterodermia obscurata group in Costa Rica (Ascomycota, Physciaceae), Systematics and Biodiversity 6(1): 31-41. Lumbsch, H.T. y Huhndorf, S.M (eds.) 2007. Outline of Ascomycota – 2007, Myconet 13: 1-58. Lumbsch H.T. y Leavitt, S.D. 2011. Goodbye morphology? A paradigm shift in the delimitation of species in lichenized fungi, Fungal Diversity 50: 59-72. Lumbsch H.T. y Wirtz, N. 2011. Phylogenetic relationships of the neuropogonoid core group in the genus Usnea (Ascomycota: Parmeliaceae), The Lichenologist 43(6): 553-559. Lutzoni, F., Kauff, F., Cox, C.J., McLaughlin, D., Celio, G., Dentinger, B., Padamsee, M., Hibbett, D., James, T.Y., Baloch, E., Grube, M., Reeb, V., Hofstetter, V., Schoch, C., Arnold, A.E., Miadlikowska, J., Spatafora, J., Johnson, D., Hambleton, S., Crockett, M., Shoemaker, R., Sun, G.-H., Lücking, R., Lumbsch, T., O'Donnell, K., Binder, M., Diederich, P., Ertz, D., Gueidan, C., Hansen, K., Harris, R.C., Hosaka, K., Lim, Y.-W., Matheny, B., Nishida, H., Pfister, D., Rogers, J., Rossman, A., Schmitt, I., Sipman, H., Stone, J., Sugiyama, J., Yahr, R. y Vilgalys, R. 2004. Assembling the fungal tree of life: progress, classification, and evolution of subcellular traits, American Journal of Botany 91(10): 1446-1480. Lutzoni, F., Wagner, P., Reeb, V. y Zoller, S. 2000. Integrating ambiguously aligned regions of DNA sequences in phylogenetic analyses without violating positional homology, Systematic Biology 49(4): 628-651. Maddison, W.P. y Knowles, L.L. 2006. Inferring phylogeny despite incomplete lineage sorting, Systematic Biology 55(1): 21-30. 153 Mallet, J. 2007. Species, Concepts Of, en Encyclopedia of Biodiversity, Levin, S. (eds.), Vol. 5. Academic Press, pp. 427-440. Actualización en línea 1, Elsevier, Oxford. Markolf, M., Brameier, M. y Kappeler, P.M. 2011. On species delimitation: Yet another lemus species or just genetic variation?, BMC Evolutionary Biology 11: 216. Martin, S.H., Wingfield, B.D., Wingfield, M.J. y Steenkamp, E.T. 2011. Structure and evolution of the Fusarium mating type locus: New insights from the Gibberella fujikuroi complex, Fungal Genetics and Biology 48: 731-740. Martiny, J.B.H., Bohannan, B.J.M., Brown, J.H., Colwell, R.K., Fuhrman, J.A., Green, J.L., Horner-Devine,M.C., Kane, M., Krumins, J.A., Kuske, C.R., Morin, P.J., Naeem, S., Øvreås, L., Reysenbach, A.-L., Smith, V.H. y Staley, J.T. 2006. Microbial biogeography: putting microorganisms on the map, Nature Reviews Microbiology 4: 102-112. Matheny, P.B. 2005. Improving phylogenentic inference of mushrooms with RPB1 and RPB2 nucleotide sequences (Inocybe; Agaricales), Molecular Phylogenetics and Evolution 35: 1- 20. Mattsson, J.-E. y Lumbsch, T. 1989. The use of the species pair concept in lichen taxonomy, Taxon 38(2): 238-241. Mattsson, J.-E. y Wedin, M. 1998. Phylogeny of the Parmeliaceae – DNA Data versus Morphological Data, Lichenologist 30(4-5): 463-472. Mattsson, J.-E. y Wedin, M. 1999. A Re-Assessment of the Family Alectoriaceae, Lichenologist 31(5): 431-440. May, R.M. 1990. How many species?, Philosophical Transactions: Biological Sciences 330(1257): 293-304. May, R.M. 2000. 'The dimenstions of life on earth' en Nature and Human Society: the Quest for a Sustainable World, Raven, P.H. y Williams, T. (eds.), National Academy Press. May, R.M. 2011. Why worry about how many species and their loss?, PLoS Biology 9(8): e1001130. Miadlikowska, J. y Lutzoni, F. 2004. Phylogenetic classification of Peltigeralean Fungi (Peltigerales, Ascomycota) based on ribosomal RNA small and large subunits, American Journal of Botany 91(3): 449-464. Michot, B., Joseph, N., Mazan, S. y Bachellerie, J.P. 1999. Evolutionarily conserved structural features in the ITS2 of mammalian pre-rRNAs and potential interactions with the snoRNA U8 detected by comparative analysis of new mouse sequences, Nucleic Acids Research 27(11): 2271-2282. Modenesi, P. 2009. Skull lichens: A curious chapter in the history of phytotherapy, Fitoterapia 80: 145-148. Monahan, M.T., Wild, R., Elliot, M., Fujisawa, T., Balke, M., Inward, D.J.G., Lees, D.C., Ranaivosolo, R., Eggleton, P., Barraclough, T.G. y Vogler, A.P. 2009. Accelerated species inventory on Madagascar using coalescent-based models of species delimitation, Systematic Biology 58(3): 298-311. 154 Moncalvo, J.-M. y Buchanan, P.K. 2008. Molecular evidence for long distance dispersal across the Southern Hemisphere in the Ganoderma applanatum-australe species complex (Basidiomycota), Mycological Research 112: 425-436. Montañez Colin, A. L. 2000. Determinación taxonómica de la diversidad liquénica del género Usnea, en el Parque Nacional “El Chico”, Hidalgo, Tesis de Licenciatura, Universidad Nacional Autónoma de México, México. Moore, D. y Novak Frazer, L. 2002. Essential Fungal Genetics, Springer, New York, USA. Mora, C., Tittensor, D.P., Adl, S., Simpson, A.G.B. y Worm, B. 2011. How many species are there on Earth and in the ocean? PLoS Biology 9(8): e1001127. Moreno-Letelier, A. y Piñero, D.I. 2009. Phylogeographic structure of Pinus strobiformis Engelm. across the Chihuahuan Desert filter-barrier, Journal of Biogeography 36: 121-131. Morrone, J.J., Espinosa Organista, D., Llorente Bousquets, J. 2002. Mexican biogeographic provinces: preliminary scheme, general characterizations, and synonymies, Acta Zoológica Mexicana (nueva serie) 85: 83-108. Motyka, J. 1936-1938. Lichenum Generis Usnea. Studium Monographicum. Pars Systematica. 1937. Leopoli Mueller, G.M. y Schmit, J.P. 2007. Fungal biodiversity: what do we know? What can we predict?, Biodiversity and Conservation 16:1-5. Myllys, L., Lohtander, K. y Tehler, A. 2001. β-tubulin, ITS and group I intron sequences challenge the species pair concept in Physcia aipolia and P. caesia, Mycologia 93(2): 335-343. Nash III, T.H. 2008. 'Introduction' en Lichen Biology, Nash III, T.H. (ed.), Cambrige University Press, USA. Nash III, T.H. y Elix J. A. 2002. 'Colors and Chemistry' en Lichen Flora of the Greater Sonora Desert Region Vol.1, Nash III, T.H., Ryan, B.D., Gries, C. y Bungartz, F. (eds.), Lichens Unlimited, Arizona State University, EUA. Nash III, T.H. y Gries, C. 2002. 'Introduction' en Lichen Flora of the Greater Sonora Desert Region Vol.1, Nash III, T.H., Ryan, B.D., Gries, C. y Bungartz, F. (eds.), Lichens Unlimited, Arizona State University, EUA. Nei, M. 1987. Molecular Evolutionary Genetics, Columbia University Press, New York. Noguchi, M.T. 2011. Parasexual recombination in Magnaporthe oryzae, JARQ 45(1): 39- 45. Núñez-Zapata, J., Divakar, P.K., Del-Prado, R., Cubas, P., Hawksworth, D.L. y Crespo, A. 2011. Conundrums in species concepts: the discovery of a new cryptic species segregated from Parmelina tiliacea (Ascomycota: Parmeliaceae), The Lichenologist 43(6): 603-616. Ohmura, Y. 2001. Taxonomic study of the genus Usnea (lichenized Ascomycetes) in Japan and Taiwan, Journal of the Hattori Botanical Laboratory 90: 1-96. Ohmura, Y. 2002. Phylogenetic evaluation of infrageneric groups of the genus Usnea based on ITS regions in rDNA, The Journal of the Hattori Botanical Laboratory 92: 231-243. 155 Ohmura, Y. y Kashiwadani, H. 2000. Usnea subfloridana Stirt. (Parmeliaceae) and its related species in eastern Asia, Journal of Japanese Botany 75(3): 164-177. Ohmura, Y. y Kanda, H. 2004. Taxonomic status of section Neuropogon in the genus Usnea elucidated by morphological comparisons and ITS rDNA sequences, The Lichenologist 36(3y4): 217-225. Ohmura, Y. 2008. Taxonomy and Molecular Phylogeny of Usnea rubicunda and U. rubrotincta (Parmeliaceae, Lichenized Ascomycotina), The Journal of Japanese Botany 83: 347- 355. O'Donnell, K. y Cigelnik, E. 1997. Two divergent intragenomic rDNA ITS2 within a monophyletic lineage of the fungus Fusarium are nonorthologous, Molecular Phylogenetics and Evolution 7(1): 103-116. O'Malley, M.A. 2008. 'Everything is everywhere: but the environment selects': Ubiquitous distribution and ecological determinism in microbial biogeography, Studies in History and Philosophy of Biological an Biomedical Sciences 39: 314-325. Padial, J.M., Miralles, A., De la Riva, I. y Vences, M. 2010. The integrative future of taxonomy, Frontiers in Zoology 7: 16. Pawlowska, T.E. y Taylor, J.W. 2004. Organization of genetic variation in individuals of arbuscular mycorrhizal fungi, Nature 427: 733-737. Peever, T.L., Su, G., Carpenter-Boggs, L. y Timmer, L.W. 2004. Molecular systematics of citrus-associated Alternaria species, Mycologia 96(1): 119-134. Pérez-Vargas, I., Hernández Padrón, C., Arroyo, R. y Seriñá, E. 2010. Usnea brasiliensis (Zahlbr.) Motyka (Parmeliaceae), a new amplhi-Atlantic disjunct lichen species, The Bryologist 113(2): 308-312. Peterson, A.T. y Navarro-Sigüenza, A.G. 1999. Alternative species concepts as bases for determining priority conservation areas, Conservation Biology 13(2): 427-431. Pettersson, R.B., Ball, J.P., Renhorn, K.-E., Esseen, P.-A. y Sjöberg, K. 1995. Invertebrate communities in boreal forest canopies as influenced by forestry and lichens with implications for passerine birds, Biologica Conservation 74: 57-63. Piercey-Normore, M. D. y DePriest, P. T. 2001. Algal Switching among lichen symbioses, American Journal of Botany 88(8): 1490-1498. Poelt, J. 1963. Flechtenflora und Eiszeit in Europa, Phyton (Horn) 10: 206-215. Poelt, J. 1970. Das Konzept der Artenpaare bei den Flechten, Vortraege aus dem Gesamtgebit der Botanik, N.F. 4: 187-198. Poelt, J. 1973. 'Appendix A: Classification' en The Lichens, Ahmadjian, V. y Hale, M. (eds.), Academic Press, New York, pp. 599 – 632. Poinar, G.O. Jr., Peterson, E.B. y Platt, J.L. 2000. Fossil Parmelia in New World amber, Lichenologist 32(3): 263-269. Pons, J., Barraclough, T.G., Gomez-Zurita, J., Cardoso, A., Duran, D.P., Hazell, S., Kamoun, S., Sumlin, W.D. & Vogler, A. 2006. Sequence-based species delimitation for the DNA taxonomy of undescribed insects, Systematic Biology 55(4): 595-609. 156 Posada, D. 2008. jModelTest: phylogenetic model averaging, Molecular Biology and Evolution 25(7): 1253-1256. Posada, D. 2009. 'Selecting models of evolution' en The Phylogenetic Handbook: a Practical Approach to Phylogenetic Analysis and Hypothesis Testing, Lemey, P., Salemi, M. y Vandamme, A.-M. (eds.), Cambrige University Press, UK. Posada, D. y Buckley, T.R. 2004. Model Selection and Model Averaging in Phylogenetics: Advantages of Akaike Information Criterion and Bayesian Approaches Over Likelihood Ratio Tests, Systematic Biology 53(5): 793-808. Posada, D. y Crandall, K.A. 2001. Selecting the best-fit model of nucleotide substitution, Systematic Biology 50(4): 580-601. Pringle, A., Baker, D.M., Platt, J.L., Wares, J.P., Latgé, J.P. y Taylor, J.W. 2005. Cryptic speciation in the cosmopolitan and clonal human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus, Evolution 59(9): 1886-1899. Printzen, C. 2010. Lichen systematics: the role of morphological and molecular data to reconstruct phylogenetic relationships, Progress in Botany 71(4):233-275. Printzen, C., Ekman, S. y Tønsberg, T. 2003. Phylogeography of Cavernularia hultenii: evidence of slow genetic drift in a widely disjunct lichen, Molecular Ecology 12: 1473-1486. Rambaut A. 2009. FigTree: Tree figure drawing tool, version 1.3.1. Disponible en: http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/. Randlane, T., Tõrra, T., Saag, A. y Saag, L. 2009. Key to European Usnea species, Bibliotheca Lichenologica 100: 419-462. Rikkinen, J. y Poinar, G.O. jr 2002. Fossilised Anzia (Lecanorales, lichen-forming Ascomycota) from European Tertiary amber, Mycological Research 106(8): 984-990. Rodríguez Saavedra, P., Flakus, A., Kukwa, M., Lücking, R., Meneses, R.I., Rivas Plata, E., Stanton, D., Truong, C. y Vargas, R. 2010. 'Preliminary cartalogue of lichens and lichenicolous fungi from Bolivia, Lichens and Lichenicolous Fungi of Bolivia', [en línea] consultado el 24 de febrero de 2012 en: http://botan.ib-pan.krakow.pl/lichens- bolivia/en,strona,catalogue,5.html Roe, A.D. y Sperling, F.A. 2007. Population structure and species boundary delimitation of cryptic Dioryctria moths: an integrative approach, Molecular Ecology 16: 3617-3633. Rogers, R.W. y Stevens, G.N. 1988. The Usnea baileyi Complex (Parmeliaceae, Lichenised Ascomycetes) in Australia, Australian Systematic Botany 1: 355-361. Rosas-Elguera, J., Ferrari, L., Garduño-Monroy, V.H. y Urrutia-Fucugauchi, J. 1996. Continental boundaries of the Jalisco block and their influence in the Pliocene-Quaternary kinematics of western Mexico, Geology 24: 921-924. Ross, K.G., Gotzek, D., Ascunce, M.S. y Shoemaker, D.D. 2010. Species delimitation: a case study in a problematic ant taxon, Systematic Biology 59(2): 162-184. Russell, P.J. y Rodland, K.D. 1986. Magnification or rRNA gene number in a Neurospora crassa strain with a partial deletion of the nucleolus organizer, Chromosoma 93(4): 337-340. 157 Ryan, B.D., Bungartz, F. y Nash III, T.H. 2002. 'Morphology and Anatomy of the Lichen Thallus' en Lichen Flora of the Greater Sonora Desert Region Vol.1, Nash III, T.H., Ryan, B.D., Gries, C. y Bungartz, F. (eds.), Lichens Unlimited, Arizona State University, EUA. Saag, L., Tõrra, T., Saag, A., Del-Prado, R. y Randlane, T. 2011. Phylogenetic relations of European shrubby taxa of the genus Usnea, The Lichenologist 43(5): 427-444. Salas-Lizana, R., Santini, N.S., Miranda-Pérez, A. y Piñero, D.I. 2012. The Pleistocene glacial cycles shaped the historical demography and phylogeography of a pine fungal endophyte, Mycological Progress 11(2): 569-581. Sánchez Ramírez, S. 2011. Sistemática molecular de las especies de Amanita sección Caesareae, Tesis de Maestría, Universidad Nacional Autónoma de México, México. Sanders, W.B. 1999. Thallus organization and development in the fruticose lichen Aspicilia californica with comparisons to other taxa, Lichenologist 31(2): 149-162. Schaal, B.A. y Olsen, K.M. 2000. Gene genealogies and population variation in plants, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97(13): 7024- 7029. Schardl, C.L. y Craven, K.D. 2003. Interespecific hybridization in plant-associated fungi and oomycetes: a review, Molecular Ecology 12: 2861-2873. Scherrer, S., Zippler, U. y Honegger, R. 2005. Characterisation of the mating-type locus in the genus Xanthoria (lichen-forming ascomycetes, Lecanoromycetes), Fungal Genetics and Biology 42: 976-988. Schlick-Steiner, B.C., Steiner, F.M., Seifert, B., Stauffer, C., Christian, E. y Crozier, R.H. 2010. Integrative taxonomy: a multisource approach to exploring biodiversity, Annual Review of Entomology 55: 421-38. Schmitt, I., Crespo, A., Divakar, P.K., Fankhauser, J.D., Herman-Sackett, E., Kalb, K., Nelsen, M.P., Nelson, N.A., Rivas-Plata, E., Shimp, A.D., Widhelm, T. y Lumbsch, H.T. 2009. New primers for promising single-copy genes in fungal phylogenetics and systematics, Persoonia 23: 35-40. Schmitt, I., Fankhauser, J.D., Sweeney, K., Spribille, T., Kalb, K. y Lumbsch, T. 2010. Gyalectoid Pertusaria species form a sister-clade to Coccotrema (Ostropomycetidae, Ascomycota) and comprise the new lichen genus Gyalectaria, Mycology 1(1): 75-83. Schoch, C.L., Seifert, K.A., Huhndorf, S., Robert, V., Spouge, J.L., Levesque, C.A., Chen, W. y el Fungal Barcoding Consortium 2012. Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi, Proceedings of the National Academy of Sciences 109(16): 6241-6246. Schoch, C.L., G.-H. Sung, F. López-Giráldez, J. P. Townsend, J. Miadlikowska, V. Hofstetter, B. Robbertse, P. B. Matheny, F. Kauff, Z. Wang, C. Gueidan, R. M. Andrie, K. Trippe, L. M. Ciufetti, A. Wynns, E. Fraker, B. P. Hodkinson, G. Bonito, R. Yahr, J. Z. Groenewald, M. Arzanlou, G. S. de Hoog, P. W. Crous, D. Hewitt, D. H. Pfister, K. Peterson, M. Gryzenhout, M. J. Wingfield, A. Aptroot, S.-O. Suh, M. Blackwell, D. M. Hillis, G. W. Griffith, L. A. Castlebury, A. Y. 158 Rossman, H. T. Lumbsch, R. Lücking, B. Büdel, A. Rauhut, P. Diederich, D. Ertz, D. M. Geiser, K. Hosaka, P. Inderbitzin, J. Kohlmeyer, B. Volkmann-Kohlmeyer, L. Mostert, K. O’Donnell, H. Sipman, J. D. Rogers, R. A. Shoemaker, J. Sugiyama, R. C. Summerbell, W. Untereiner, P. Johnston, S. Stenroos, A. Zuccaro, P. Dyer, P. Crittenden, M. S. Cole, K. Hansen, J. M. Trappe , F. Lutzoni and J. W. Spatafora 2009. The Ascomycota tree of life: A phylum wide phylogeny clarifies the origin and evolution of fundamental reproductive and ecological trait, Systematic Biology 58: 224-239. Schôn, I., Butlin, R.K., Griffiths, H.I. y Martens, K. 1998. Slow molecular evolution in an ancient asexual ostracod, Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences 265: 235-242. Schwartz, G. 1978. Estimating the dimension of a model, The Annals of Statistics 6(2): 461-464. Seymour, F.A., Crittenden, P.D., Nora, W., Øvstedal, D.O., Dyer, P.S. y Lumbsch, H.T., 2007. Phylogenetic and morphological analysis of Antarctic lichen-forming Usnea species in the group Neuropogon, Antarctic Science 19(1): 71-82. Shaffer, B. y Thomson, R.C. 2007. Delimiting species in recent radiations, Systematic Biology 56(6): 896-906. Sharon, A., Yamaguchi, K., Christiansen, S., Horwitz, B.A., Yoder, O.C. y Turgeon, B.G. 1996. An asexual fungus has the potential for sexual development, Molecular and General Genetics 251: 60-68. Shen, Y.-M. 2008. Taxonomy of the Lichen Genus Usnea in Taiwan. National Taiwan University, Tesis de maestría. Sidhu, G.S. 1983. Sexual and parasexual variability in soil Fungi with special reference to Fusarium moniliforme, Phytopathology 73(6): 952-955. Sipman, H.J.M. y Aptroot, A. 2001. Where are the missing lichens?, Mycological Research 105(12): 1433-1439. Sites, J.W., Jr y Marshall, J.C. 2003. Delimiting species: a Renaissance issue in systematic biology, Trends in Ecology and Evolution 18(9): 462-470. Sites, J.W., Jr y Marshall, J.C. 2004. Operational criteria for delimiting species, Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics 35: 199-227. Slapeta, J., López-García, P. y Moreira, D. 2006. Global dispersal and ancient cryptic species in the smallest marine eukaryotes, Molecular Biology and Evolution 23(1): 23-29. Slatikin, M. y Hudson, R.R. 1991. Pairwise comparisons of mitochondrial DNA sequences in stable and exponentially growing populations, Genetics 129: 555-562. Souza, C.A.J., Silva, C.C. y Ferreira, A.V.-B. 2003. Sex in fungi: lessons of gene regulation, Genetics and Molecular Research 2(1): 136-147. Stamatakis, A. 2006. 'Phylogenetic models of rate heterogeneity: A high performance computing perspective' en Proceedings of 20th IEEE/ ACM Internationa Parallel and Distributed Processing Symposium (IPDPS2006), Rhodos, Grecia. 159 Stamatakis, A., Hoover, P. y Rougemont, J. 2008. A Rapid Bootstrap Algorithm for the RAxML Web-Servers, Systematic Biology 75(5): 758-771. Stevens, G.N. 1990. Usnea himantodes Stirton and its synonyms, Lichenologist 22(4): 409-412. Stevens, G.N. 1999. A revision of the lichen family Usneaceae in Australia, Bibliotheca Lichenologica 72: 1-128. Stevens, G.N. 2004. Usneaceae, Flora of Australia 56A (Lichens 4): 78-115. Sugiura, N. 1978. Further Analysis of the Data by Akaike’s Information Criterion and the Finite Corrections, Communications in Statistics, Theory and Methods A7: 13-26. Sun, S. y Heitman, J. 2011. Is sex necessary?, BMC Biology 9: 56. Swinscow, T.D.V. y Krog, H. 1975. The Usnea undulata aggregate in East Africa, Lichenologist 7: 121-138. Swinscow, T.D.V. y Krog, H. 1979. The Fruticose species of Usnea subgenus Usnea in East Africa, Lichenologist 11(3): 207-252. Swinscow, T.D.V. y Krog, H. 1988. Macrolichens of East Africa, British Museum (Natural History), London, 390 pp. Talavera, G. y Castresana, J. 2007. Improvement of phylogenies after removing divergent and ambiguosly aligned blocks from protein sequence alignment, Systematic Biology 56: 564-577. Tamura, K., Peterson, D., Peterson, N., Stecher, G., Nei, M. y Kumar, S. 2011. MEGA 5: Molecular Evolutionary Genetic Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods, Molecular Biology and Evolution 28: 2731-2739. Tehler, A. 1982. The species pair concept in Lichenology, Taxon 31(4): 708-714. Tajima, F. 1989. Statistical method for testing the neutral mutation hypothesis by DNA polymorphism, Genetics 123: 585-595. Tajima, F. 1993. 'Measurement of DNA polymorphism', en Mechanisms of Molecular Evolution, Takahata, N. y Clark, A.G. (eds.), Sinauer Associates. Inc., Sunderland, Massachusetts. Templeton, A.R. 2001. Using phylogeographic analyses of genes trees to test species status and processes, Molecular Ecology 10: 779-791. Templeton, A.R., Crandall, K.A. y Sing, C.F. 1992. A cladistic analysis of phenotypic associations with haplotypes inferred from restriction endonuclease mapping and DNA sequence data. III. Cladogram estimation, Genetics 132: 619-633. Templeton, A.R., Maskas, S.D. y Cruzan, M.B. 2000. Gene Trees: A powerful tool for exploring the evolutionary biology of species and speciation, Plant Species Biology 15: 211-222. Templeton, A.R., Routman, E. y Phillips, C.A. 1995. Separating population structure from population history: a cladistic analysis of the geographical distribution of mitochondrial DNA haplotypes in the Tiger salamander, Ambystoma tigrinum, Genetics 140: 767-782. 160 Tavares, I.I. 1998. Usnea silesiaca and U. subgracilis in California, Bulletin of the California Lichen Society 5(2): 25-27. Tavares, I.I. y Sanders, W.B. 1998. 'Preliminary report on the short, apotheciate taxa of Usnea in the southwestern United States' en Lichenographia Thomsoniana: North American Lichenology in Honor of John W. Thomson, Glenn, N.G., Harris, R.,C., Dirig, R. y Cole, M.S. (eds.), Mycotaxon Ltd., Ithaca, New York. Taylor, J.W., Jacobson, D.J. y Fisher, M.C. 1999. The evolution of asexual fungi: reproduction, speciation and classification, Annual Review of Phytopathology 37: 197-246. Thell, A. 1999. Group I intron versus ITS sequences in phylogeny of cetrarioid lichens, Lichenologist 31(5): 441-449. Thompson, J.D., Higgins, D.G. y Gibson, T.J. 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice, Nucleic Acids Research 22(22): 4673-4680. Tõrra, T. y Randlane, T. 2007. The lichen genus Usnea (liquenized Ascomycetes, Parmeliaceae) in Estonia with a key to the species in the Baltic countries, The Lichenologist 39(5): 415-438. Truong, C. y Clerc, P. 2012. Eumitrioid Usnea species (Parmeliaceae) in South America, sesión de carteles presentada en el 7° Symposium of the Internation Association for Lichenology, (del 9 al 13 de enero), Bangkok, Tailandia. Truong, C., Bungartz, F. y Clerc, P. 2011. The lichen genus Usnea (Parmeliacea) in the tropical Andes and the Galapagos: species with a red-orange cortical or subcortical pigmentation, The Bryologist 114(3): 477-503. Truong, C., Herrera-Campos, M.A. y Clerc, P. 2009. ¿Está Usnea longissima Ach. Realmente presente en América del Sur?, sesión de carteles presentada en el IX Encuentro del Grupo de Liquenólogs Latinoamericanos GLAL9 (del 23 al 30 de noviembre), Campus Deodoro Roca, Corrientes, Argentina. Tschermak-Woess, E. 1978. Myrmecia reticulata as a phycobiont and free-living – free-living Trebouxia – The problem of Stenocybe septata, Lichenologist 10: 69-79. van Keulen, H., Gutell, R.R., Campbell, S.R., Erlandsen, S.L. y Jarroll, E.L. 1992. The Nucleotide Sequence of the Entire Ribosomal DNA Operon and the structure of the Large Subunit Rrna of Giardia muris, Journal of Molecular Evolution 35: 318-328. Walker, F.J. 1985. The lichen genus Usnea subgenus Neuropogon, Bulletin of the British Museum (National History, Botany Series) 13(1): 1-130. Walser, J.C., Gugerli, F., Holderegger, R., Kuonen, D. y Scheidegger, C. 2004. Recombination and clonal propagation in different populations of the lichen Lobaria pulmonaria, Heredity 93: 322-329. Wanderlei-Silva, D., Ramalho Neto, E. y Hanlin, R. 2003. Molecular Systematics of the Phyllachorales (Ascomycota, Fungi) based on 18S ribosomal DNA sequences, Brazilian Archives of Biology and Technology 46(3): 315-322. 161 Watterson, G.A. 1975. On the number of segregating sites in genetical models without recombination, Theoretical Population Biology 7: 256-276. Wedin, M., Döring, H. y Mattsson J.-E. 1999. A multi-gene study of the phylogenetic relationships of the Parmeliaceae, Mycological Research 103(9): 1185-1192. Werth, S. 2010. Population genetics of lichen-forming fungi – a review, The Lichenologist 42(5): 499-519. White T.J., Bruns T., Lee S. and Taylor J. (1990), 'Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics' en PCR Protocols: a guide to methods and applications, Innis, M.A., Gelfand, D.H., Sninsky, J.J. y White, T.J. (eds.), Academic Press, San Diego, pp. 315-322. Wiens, J.J. 1998. Combining data sets with different phylogenetic histories, Systematic Biology 47(4): 568-581. Wiens, J.J., Engstrom, T.N. y Chippindale, P.T. 2006. Rapid diversification, incomplete isolation, and the “speciation clock” in north american salamanders (genus Plethodon): testing the hybrid swarm hypothesis of rapid radiation, Evolution 60(12): 2585-2603. Will, K.W., Mishler, B.D. y Wheeler, Q.D. 2005. The perils of DNA barcoding and the need for integrative taxonomy, Systematic Biology 54(5): 844-851. Wirtz, N., Printzen, C., Sancho, L.G. y Lumbsch, T. 2006. The phylogeny and classification of Neuropogon and Usnea (Parmelieaceae, Ascomycota) revisited, Taxon 55 (2): 367-376. Wirtz, N., Printzen, C. y Lumbsch, T. 2008. The delimitation of Antarctic and bipolar species of neuropogonoid Usnea (Ascomycota, Lecanorales): a cohesion approach of species recognition for the Usnea perpusilla complex, Mycological Research 112: 472-484. Wirtz, N., Printzen, C. y Lumbsch, T. 2012. Using haplotype networks, estimation of gene flow and phenotypic characters to understand species delimitation in fungi of a predominantly Antarctic Usnea group (Ascomycota, Parmeliaceae), Organisms Diversity & Evolution 12: 17-37. Xia, X. 2001. Data analysis in molecular biology and evolution, Kluwer Academic Publishers, Boston. Xia, X. y Xie, Z. 2001. DAMBE: Software package for data analysis in molecular biology and evolution, Journal of Heredity 92: 371-373. Yun, S.-H., Berbee, M.L., Yoder, O.C. y Turgeon, B.G. 1999. Evolution of the fungal self- fertile reproductive life style from self-sterile ancestors, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96: 5592-5597. Yule, G.U. 1924. A mathematical theory of evolution, based on the conclusions of Dr. J.C. Willis, F.R.S., Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B, Containing Papers of a Biological Character 213: 21-87. Zalar, P., Frisvad, J.C., Gunde-Cimerman, N., Varga, J. y Samson, R.A. 2008. Four new species of Emericella from the Mediterranean region of Europe, Mycologia 100(5): 779-795. 162 Zoller, S., Frey, B. y Scheidegger, C. 2000. Juvenil development and diaspore survival in the threatened epiphytic lichen species Sticta fuliginosa, Leptogium saturninum and Menegazzia terebrata: conclusions for in situ conservation, Plant Biology 2: 496-504. 163 Anexo A: Datos de colecta Tabla A1. Localidades de colecta con estado, localidad, tipo de vegetación, coordenadas y altitud en metros sobre el nivel del mar (msnm). No. Estado Localidad Tipo de vegetación Latitud (N) Longitud (W) Altitud (msnm) Veracruz Jardín Botánico Francisco Javier Clavijero, Xalapa Bosque mesófilo de montaña 19°30'41.34" 96°56'38.37" 1280 0 Hidalgo Alfajayucan Bosque de encino 20°1'47.59'' 98°31'35.31'' 2600 Querétaro Vizarrón Matorral xerófilo (dominado por Yucca sp.) 20°47'31.68'' 99°43'22.68'' 2209 Oaxaca Parque La Cumbre Bosque de pino 17°11'27.88'' 96°37'23.40'' 2998 Oaxaca Comaltepec 1 Santiago Comaltepec, Ixtlán Bosque de pino-encino 17º33'18.42'' 96º32'14.34'' 2317 1 Oaxaca Comaltepec 2 Santiago Comaltepec, Ixtlán Bosque de encino-pino 17º33'18.42'' 96º32'14.34'' 2317 Oaxaca Comaltepec 3 Santiago Comaltepec, Ixtlán Bosque de Pinus patula 17º33'48.32'' 96º30'52.08'' 2624 Oaxaca Carretera Federal 175 Oaxaca-Tuxtepec Km 148.4 Bosque de pino-encino 17º21'5.76'' 96º30'53.64'' 2649 Hidalgo El Chico1 afueras del Parque Nacional del Chico Bosque de encino 20º9'1.68'' 98º41'41.1'' 2821 2 Hidalgo Las Ventanas, Parque Nacional Mineral del Chico Bosque de abeto 20º11'12.84'' 98º44'10.44'' 2972 Hidalgo Antes de Los Conejos, Parque Nacional Mineral del Chico Bosque abeto y encino 20º11'35.76'' 98º42'19.38'' 2924 Hidalgo Los Conejos, Parque Nacional Mineral del Chico Bosque de abeto y junipero 20º11'54.42'' 98º42'4.56'' 2940 Oaxaca Antes de Puerto de la Soledad Bosque de pino-encino 18º10'32.1'' 97º0'23.3'' 2207 Oaxaca Puerto de la Soledad Bosque mesófilo de montaña 18º09'38.6'' 96º59'49.5'' 2416 Oaxaca Antes de Huautla Bosque mesófilo de montaña 18º09'19.5' 96º53'53.4'' 1651 3 Oaxaca Entre Huautla y Santa María Teopoxco Bosque mesófilo de montaña 18º09'38.3'' 96º56'41.9'' 2124 Oaxaca Santa María Teopoxco Bosque mesófilo de montaña 18º09'06.6'' 96º58'31.3'' 2198 Oaxaca Cascada entre Teopoxco y Puerto de la Soledad Bosque mesófilo de montaña 18º09'11.9'' 96º59'8.5'' 2243 164 Tabla A1. Continuación. No. Estado Localidad Tipo de vegetación Latitud (N) Longitud (W) Altitud (msnm) Jalisco Talpa Bosque de pino-encino muy húmedo. 20º14'50.5'' 104º46'53.7'' 1323 Jalisco Camino al Bosque de Maples 1 Bosque templado con Pinos, Encinos, Abetos y elementos de mesófilo 20º13'42.1'' 104º46'09.0'' 1582 4 Jalisco Camino al Bosque de Maples 2 Bosque templado con Pinos, Encinos, Abetos y elementos de mesófilo 20º12'42.6'' 104º45'29.4'' 1745 Jalisco Salvia y Tejocote Bosque templado con Pinos, Encinos, Abetos y elementos de mesófilo 20º11'54.2'' 104º43'35.0'' 2098 Jalisco Entre Talpa y Maple 1 Bosque de pino 20°13'36.07" 104°46'29.55" 1490 5 Michoacán Entre Zinapécuaro y Ciudad Hidalgo Bosque de pino 19º44'07.2'' 100º46'31.0'' 2421 6 Michoacán Pasando Angangeo Bosque húmedo de altura 19º39'01.4'' 100º16'01.7 3049 Michoacán Llano de las papas Bosque de abeto 19º39'33'' 100º16'02'' 3114 7 Sinaloa Santa Rita, La Concordia, carretera Mazatlan- Durango Bosque de pino-encino 23°31'31.65'' 105°50'13.81'' 1615 Durango A 1km al Oeste de Puerto Buenos Aires. Bosque de pino-encino 23°39'8.64'' 105°47'8.60'' 2400 165 Tabla A2. Datos de cada ejemplar colectado. Para detalles de las localidades, referirse a la Tabla A1. Clave Género Especie Autor Estado Localidad Sustrato 0.1.0 Usnea entoviolata Motyka Veracruz Jardín Botánico Francisco Javier Clavijero, Xalapa Syagrus coronata 0.1.2 Usnea rubicunda Stirton Veracruz Jardín Botánico Francisco Javier Clavijero, Xalapa Syagrus coronata 0.2.2 Usnea rubicunda Stirton Hidalgo Alfajayucan Cortícola 0.3.3 Usnea cf. parvula Motyka Querétaro Vizarrón Cortícola 0.3.4 Usnea dasaea Stirton Querétaro Vizarrón Cortícola 0.4.5 Usnea ceratina Acharius Oaxaca Parque La Cumbre Cortícola 1.1.0 Usnea cf. subeciliata (Motyka) Swinscow y Krog Oaxaca Comaltepec 1 Santiago Comaltepec, Ixtlán Cortícola 1.1.1 Usnea subrubicunda/ subscabrosa P. Clerc / Nylander ex Motyka Oaxaca Comaltepec 1 Santiago Comaltepec, Ixtlán Cortícola 1.3.3 Usnea ceratina Acharius Oaxaca Comaltepec 1 Santiago Comaltepec, Ixtlán Cortícola 1.4.5 Usnea ceratina Acharius Oaxaca Comaltepec 1 Santiago Comaltepec, Ixtlán Cortícola 1.4.6 Usnea ceratina Acharius Oaxaca Comaltepec 1 Santiago Comaltepec, Ixtlán Cortícola 1.11.16 Usnea erinacea Vainio Oaxaca Comaltepec 1 Santiago Comaltepec, Ixtlán Quercus sp. 1.11.17 Usnea cf. subfusca Stirton Oaxaca Comaltepec 1 Santiago Comaltepec, Ixtlán Quercus sp. 1.12.18 Usnea angulata Acharius Oaxaca Comaltepec 1 Santiago Comaltepec, Ixtlán Quercus sp. 1.13.19 Usnea cristatula Motyka Oaxaca Comaltepec 1 Santiago Comaltepec, Ixtlán Quercus sp. 1.14.23 Usnea subrubicunda/ subscabrosa P. Clerc / Nylander ex Motyka Oaxaca Comaltepec 1 Santiago Comaltepec, Ixtlán Pinus patula 1.15.25 Usnea silesiaca Motyka Oaxaca Comaltepec 1 Santiago Comaltepec, Ixtlán Cortícola 1.17.34' Usnea ceratina Acharius Oaxaca Comaltepec 2 Santiago Comaltepec, Ixtlán Cortícola 1.21.42 Usnea cristatula Motyka Oaxaca Comaltepec 2 Santiago Comaltepec, Ixtlán Cortícola 1.21.43 Usnea angulata Acharius Oaxaca Comaltepec 2 Santiago Comaltepec, Ixtlán Cortícola 1.23.48 Usnea ceratina Acharius Oaxaca Comaltepec 3 Santiago Comaltepec, Ixtlán Quercus sp. 1.23.50 Usnea silesiaca Motyka Oaxaca Comaltepec 3 Santiago Comaltepec, Ixtlán Quercus sp. 1.24.51 Usnea silesiaca Motyka Oaxaca Comaltepec 3 Santiago Comaltepec, Ixtlán Pinus patula 1.26.56 Usnea cornuta s.l. Körber Oaxaca Comaltepec 3 Santiago Comaltepec, Ixtlán Pinus patula 1.26.57 Usnea cornuta s.l. Körber Oaxaca Comaltepec 3 Santiago Comaltepec, Ixtlán Pinus patula 1.28.61 Usnea silesiaca Motyka Oaxaca Comaltepec 3 Santiago Comaltepec, Ixtlán Pinus patula 1.28.62 Usnea cornuta s.l. Körber Oaxaca Comaltepec 3 Santiago Comaltepec, Ixtlán Pinus patula 166 Tabla A2. Continuación. Clave Género Especie Autor Estado Localidad Sustrato 1.29.64 Usnea ceratina Acharius Oaxaca Comaltepec 3 Santiago Comaltepec, Ixtlán Pinus patula 1.30.65 Usnea subfusca Stirton Oaxaca Comaltepec 3 Santiago Comaltepec, Ixtlán Pinus patula 1.30.67 Alectoria sp2 Oaxaca Comaltepec 3 Santiago Comaltepec, Ixtlán Pinus patula 1.30.67' Alectoria sp1 Oaxaca Comaltepec 3 Santiago Comaltepec, Ixtlán Pinus patula 1.32.73 Usnea sp8 Oaxaca Carretera Federal 175 Oaxaca-Tuxtepec Km 148.4 Quercus sp. 1.33.74 Usnea sp5 Oaxaca Carretera Federal 175 Oaxaca-Tuxtepec Km 148.5 Quercus sp. 2.1.0 Usnea ceratina Acharius Hidalgo El Chico1 afueras del Parque Nacional del Chico Quercus sp. 2.1.1 Usnea ceratina Acharius Hidalgo El Chico1 afueras del Parque Nacional del Chico Quercus sp. 2.1.2 Usnea cornuta s.l. Körber Hidalgo El Chico1 afueras del Parque Nacional del Chico Quercus sp. 2.2.3 Usnea ceratina Acharius Hidalgo El Chico1 afueras del Parque Nacional del Chico Quercus sp. 2.2.4 Usnea cornuta s.l. Körber Hidalgo El Chico1 afueras del Parque Nacional del Chico Quercus sp. 2.6.9 Usnea "subfuscapapilata" Stirton Hidalgo El Chico1 afueras del Parque Nacional del Chico Cortícola 2.7.10 Usnea lecanorica W.L. Culberson, C.F. Culberson y Fiscus Hidalgo LasVentanas, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.8.11 Usnea cornuta s.l. Körber Hidalgo LasVentanas, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.9.12 Usnea cf. pratervisa (Asahina) P. Clerc Hidalgo LasVentanas, Parque Nacional Mineral del Chico Cortícola 2.10.13 Usnea ceratina Acharius Hidalgo LasVentanas, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.12.15 Usnea ceratina Acharius Hidalgo LasVentanas, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.13.16 Usnea cornuta s.l. Körber Hidalgo LasVentanas, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.15.18 Usnea brasiliensis (Zahlbruckner) Motyka Hidalgo LasVentanas, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.15.19 Usnea cornuta s.l. Körber Hidalgo LasVentanas, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.15.20 Usnea sp4 Hidalgo LasVentanas, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.15.21 Usnea ceratina Acharius Hidalgo LasVentanas, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.16.22 Usnea ceratina Acharius Hidalgo LasVentanas, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.16.23 Usnea ceratina Acharius Hidalgo LasVentanas, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.17.24 Usnea ceratina Acharius Hidalgo LasVentanas, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.18.25 Usnea "subfuscapapilata" Stirton Hidalgo LasVentanas, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.19.27 Usnea brasiliensis (Zahlbruckner) Motyka Hidalgo LasVentanas, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.22.31 Usnea brasiliensis (Zahlbruckner) Motyka Hidalgo LasVentanas, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.22.32 Usnea brasiliensis (Zahlbruckner) Motyka Hidalgo LasVentanas, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 167 Tabla A2. Continuación. Clave Género Especie Autor Estado Localidad Sustrato 2.22.33 Usnea ceratina Acharius Hidalgo LasVentanas, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.23.35 Usnea cornuta s.l. Körber Hidalgo LasVentanas, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.24.37 Usnea ceratina Acharius Hidalgo LasVentanas, Parque Nacional Mineral del Chico Cortícola 2.25.38 Usnea ceratina Acharius Hidalgo LasVentanas, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.25.41 Usnea ceratina Acharius Hidalgo LasVentanas, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.26.42 Usnea brasiliensis (Zahlbruckner) Motyka Hidalgo LasVentanas, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.26.43 Usnea brasiliensis (Zahlbruckner) Motyka Hidalgo LasVentanas, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.26.44 Usnea cornuta s.l. Körber Hidalgo LasVentanas, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.26.45 Usnea cornuta s.l. Körber Hidalgo LasVentanas, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.28.46 Usnea ceratina Acharius Hidalgo LasVentanas, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.29.47 Usnea brasiliensis (Zahlbruckner) Motyka Hidalgo LasVentanas, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.3.48 Usnea dimorpha (Müller Arg.) Motyka Hidalgo LasVentanas, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.31.49 Usnea sp3 Hidalgo LasVentanas, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.32.50 Usnea lecanorica W.L. Culberson, C.F. Culberson y Fiscus Hidalgo LasVentanas, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.33.51 Usnea subfusca Stirton Hidalgo LasVentanas, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.34.52 Usnea ceratina Acharius Hidalgo LasVentanas, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.35.53 Usnea brasiliensis (Zahlbruckner) Motyka Hidalgo LasVentanas, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.35.54 Usnea ceratina Acharius Hidalgo LasVentanas, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.35.55 Usnea sp4 Hidalgo LasVentanas, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.35.56 Usnea cornuta s.l. Körber Hidalgo LasVentanas, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.36.57 Usnea lecanorica W.L. Culberson, C.F. Culberson y Fiscus Hidalgo LasVentanas, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.37.58 Usnea silesiaca Motyka Hidalgo LasVentanas, Parque Nacional Mineral del Chico Cortícola 2.37.59 Usnea "subfuscapapilata" Stirton Hidalgo LasVentanas, Parque Nacional Mineral del Chico Cortícola 2.38.60 Usnea cornuta s.l. Körber Hidalgo LasVentanas, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.39.61 Usnea ceratina Acharius Hidalgo Antes de Los Conejos, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.40.62 Usnea lecanorica W.L. Culberson, C.F. Culberson y Fiscus Hidalgo Antes de Los Conejos, Parque Nacional Mineral del Chico Cortícola 2.41.63 Usnea cornuta s.l. Körber Hidalgo Antes de Los Conejos, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.42.64 Usnea cornuta s.l. Körber Hidalgo Antes de Los Conejos, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 168 Tabla A2. Continuación. Clave Género Especie Autor Estado Localidad Sustrato 2.42.65 Usnea ceratina Acharius Hidalgo Antes de Los Conejos, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.43.67 Usnea dasaea Stirton Hidalgo Antes de Los Conejos, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.43.68 Usnea ceratina Acharius Hidalgo Antes de Los Conejos, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.45.69 Usnea ceratina Acharius Hidalgo Antes de Los Conejos, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.46.70 Usnea ceratina Acharius Hidalgo Antes de Los Conejos, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.48.73 Usnea ceratina Acharius Hidalgo Antes de Los Conejos, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.49.74 Usnea ceratina Acharius Hidalgo Antes de Los Conejos, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.49.75 Usnea ceratina Acharius Hidalgo Antes de Los Conejos, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.5.76 Usnea rubicunda Stirton Hidalgo Los Conejos, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 2.5.77 Usnea ceratina Acharius Hidalgo Los Conejos, Parque Nacional Mineral del Chico Abies sp. 3.0.1 Usnea sp1 Oaxaca Antes de Puerto de la Soledad Cortícola 3.1.2 Usnea sp2 Oaxaca Antes de Puerto de la Soledad Cortícola 3.2.3 Usnea sp1 Oaxaca Antes de Puerto de la Soledad Cortícola 3.2.4 Usnea sp2 Oaxaca Antes de Puerto de la Soledad Cortícola 3.4.7 Usnea cornuta s.l. Körber Oaxaca Puerto de la Soledad Cortícola 3.6.9 Usnea schadenbergiana Göppert & Stein Oaxaca Puerto de la Soledad Cortícola 3.7.10 Usnea merrillii Motyka Oaxaca Puerto de la Soledad Cortícola 3.7.11 Usnea rubicunda Stirton Oaxaca Puerto de la Soledad Cortícola 3.8.13 Usnea merrillii Motyka Oaxaca Puerto de la Soledad Cortícola 3.10.16 Usnea cornuta s.l. Körber Oaxaca Puerto de la Soledad Cortícola 3.11.17 Usnea merrillii Motyka Oaxaca Puerto de la Soledad Cortícola 3.12.18 Usnea cornuta s.l. Körber Oaxaca Puerto de la Soledad Cortícola 3.18.35 Usnea sp6 Oaxaca Antes de Huautla Cortícola 3.22.45 Usnea setulosa Motyka Oaxaca Antes de Huautla Cortícola 3.22.47 Usnea rubicunda Stirton Oaxaca Antes de Huautla Cortícola 3.22.49 Usnea sp7 Oaxaca Antes de Huautla Cortícola 3.23.51 Usnea cf. meridionalis Zahlbruckner Oaxaca Entre Huautla y Santa María Teopoxco Cortícola 3.24.52 Usnea dasaea Stirton Oaxaca Entre Huautla y Santa María Teopoxco Cortícola 3.31.69 Usnea cf. subeciliata (Motyka) Swinscow y Krog* Oaxaca Santa María Teopoxco Cortícola 3.32.71 Usnea schadenbergiana Göppert & Stein Oaxaca Santa María Teopoxco Cortícola 169 Tabla A2. Continuación. Clave Género Especie Autor Estado Localidad Sustrato 3.42.87 Usnea merrillii Motyka Oaxaca Cascada entre Teopoxco y Puerto de la Soledad Cortícola 4.2.2 Usnea rubicunda Stirton Jalisco La Cuesta Pinus sp. 4.2.3 Usnea baileyi (Stirton) Zahlbruckner Jalisco La Cuesta Pinus sp. 4.7.12 Usnea rubicunda Stirton Jalisco La Cuesta Pinus sp. 4.13.20 Usnea rubicunda Stirton Jalisco La Cuesta Cortícola 4.14.21 Usnea mexicana Vainio Jalisco Camino al Bosque de Maples 1 Pinus sp. 4.18.28 Usnea ceratina Acharius Jalisco Camino al Bosque de Maples 2 Cortícola 4.19.30 Usnea cf. mexicana Vainio Jalisco Camino al Bosque de Maples 2 Pinus sp. 4.19.31 Usnea perplectata Motyka Jalisco Camino al Bosque de Maples 2 Pinus sp. 4.20.32 Usnea merrilli Motyka Jalisco Camino al Bosque de Maples 2 Pinus sp. 4.20.33 Usnea subscabrosa /subrubicunda Nylander ex Motyka / P. Clerc Jalisco Camino al Bosque de Maples 2 Pinus sp. 4.24.39 Usnea merrillii Motyka Jalisco Camino al Bosque de Maples 2 Quercus sp. 4.25.40 Usnea cf. mexicana Vainio Jalisco Camino al Bosque de Maples 2 Pinus sp. 4.26.41 Usnea subscabrosa/ subrubicunda Nylander ex Motyka / P. Clerc Jalisco Camino al Bosque de Maples 2 Pinus sp. 4.27.43 Usnea cf. amblyoclada Müller Arg. Jalisco Camino al Bosque de Maples 2 Pinus sp. 4.28.44 Everniastrum sp. Jalisco Camino al Bosque de Maples 2 Cortícola 4.29.46 Everniastrum vexans (Zahlbruckner ex W.L. Culberson y C.F. Culberson) Hale ex Sipman Jalisco Salvia y Tejocote Cortícola 4.31.48 Everniastrum vexans (Zahlbruckner ex W.L. Culberson y C.F. Culberson) Hale ex Sipman Jalisco Salvia y Tejocote Cortícola 4.33.50 Usnea rubicunda Stirton Jalisco Entre Talpa y Maple Pinus sp. 4.34.55 Usnea cf. entoviolata Motyka Jalisco Entre Talpa y Maple Pinus sp. 4.35.57 Usnea brasiliensis (Zahlbruckner) Motyka Jalisco Entre Talpa y Maple Cortícola 4.37.60 Usnea cristatula Motyka Jalisco Entre Talpa y Maple Quercus sp. 4.38.61 Usnea ceratina Acharius Jalisco Entre Talpa y Maple Cortícola 4.4.63 Usnea ceratina Acharius Jalisco Entre Talpa y Maple Cortícola 170 Tabla A2. Continuación. Clave Género Especie Autor Estado Localidad Sustrato 4.42.67 Usnea ramillosa Motyka Jalisco Entre Talpa y Maple Pinus sp. 5.1.1 Usnea ceratina Acharius Michoacán Zinapécuaro Pinus sp. 5.2.3 Usnea ceratina Acharius Michoacán Zinapécuaro Pinus sp. 5.3.4 Usnea subscabrosa/ subrubicunda P. Clerc / Nylander ex Motyka Michoacán Zinapécuaro Pinus sp. 5.3.5 Usnea sp9 Michoacán Zinapécuaro Pinus sp. 5.4.6 Usnea ceratina Acharius Michoacán Zinapécuaro Pinus sp. 5.4.7 Usnea ceratina Acharius Michoacán Zinapécuaro Pinus sp. 5.6.9 Usnea ceratina Acharius Michoacán Zinapécuaro Pinus sp. 5.6.10 Usnea ceratina Acharius Michoacán Zinapécuaro Pinus sp. 5.7.11 Usnea ceratina Acharius Michoacán Zinapécuaro Pinus sp. 5.7.13 Usnea ceratina Acharius Michoacán Zinapécuaro Pinus sp. 5.8.14 Usnea ceratina Acharius Michoacán Zinapécuaro Pinus sp. 5.8.15 Usnea ceratina Acharius Michoacán Zinapécuaro Pinus sp. 5.10.17 Usnea ceratina Acharius Michoacán Zinapécuaro Pinus sp. 5.12.19 Usnea ceratina Acharius Michoacán Zinapécuaro Pinus sp. 5.14.21 Usnea ceratina Acharius Michoacán Zinapécuaro Pinus sp. 5.14.22 Usnea ceratina Acharius Michoacán Zinapécuaro Pinus sp. 5.15.24 Usnea cirrosa Motyka Michoacán Zinapécuaro Crataegus sp. 5.15.25 Usnea cirrosa Motyka Michoacán Zinapécuaro Crataegus sp. 6.2.2 Usnea ceratina Acharius Michoacán Pasando Angangeo Cortícola 6.3.3 Usnea cf. subfusca Stirton Michoacán Llano de las papas Cortícola 6.5.6 Usnea ceratina Acharius Michoacán Llano de las papas Abies sp. 6.7.9 Usnea ceratina Acharius Michoacán Llano de las papas Abies sp. 6.8.11 Usnea cf. subfusca Stirton Michoacán Llano de las papas Abies sp. 7.1.0 Usnea sp10 Sinaloa Santa Rita, La Concordia, carretera Mazatlan-Durango Crataegus rosei 7.2.1 Usnea cf. cavernosa Tuckerman Durango A 1km al Oeste de Puerto Buenos Aires Psittacanthus sp. en Quercus sp. 7.4.3 Usnea subfusca Stirton Durango A 1km al Oeste de Puerto Buenos Aires Quercus sp. 7.5.4 Usnea ceratina Acharius Durango A 1km al Oeste de Puerto Buenos Aires Quercus sp. 171 Anexo B: Detalles de la alineación de los datos ribosomales usando estructura secundaria La estructura secundaria puede ser útil para alinear regiones con muchos indels en secuencias relativamente muy divergentes entre sí. En la Fig. B1 se muestra la alineación del ITS2 y la estructura secundaria de Usnea subgénero Usnea (1.32.73), sugénero Eumitria (4.19.31) y el género Everniastrum (4.29.46) estimada con los parámetros establecidos en el predictor de la ITS2 Database. Los loops se señalan de la letra “a” hasta la “g”. Como se contrasta en la figura, hay dos grandes tipos de estructuras secundarias que difieren por la forma loops y tamaño del loop central, que en ocasiones absorbe el loop “f”, y por la ausencia o presencia del loop “g” y su stem (tallo) correspondiente. Ambos tipos de estructura están representadas dentro de Usnea subgénero Usnea. Por ejemplo, aunque las Usnea en la figura Z coinciden en el tipo de estructura secundaria, el ejemplar de U. subfloridana 26 de Genbank presenta el tipo de Everniastrum. Alectoria también exhibió estructura similar a Everniastrum. Es notable que la zona “c” del loop central está altamente conservada, quizá por restricciones estructurales, aunque la secuencia 243 (U. subfloridana, FR799082) presenta una inserción de una adenina hacia el final de “c”. Respecto al ITS1, la alineación con la secuencia de Cladonia merochlorophaea (Genbank: AF455227), un hongo liquenizado de otra familia, revela que la homología puede establecerse claramente sólo para la región central del stem más grande, en cuyos loops la alineación se vuelve altamente ambigua (ver Figura 1 de Beiggi y Piercey-Normore, 2007). Los loops IIa y IIb de Cladonia coinciden con zonas ambiguas en la matriz de Usnea, Everniastrum y Alectoria. De acuerdo con esto, Gblocks identificó los loops como zonas pobremente alineadas. Por ejemplo, para el ITS2 detectó el loop “a”, “b”, “d” y pares de bases adyacentes, la columna donde se encuentra el gap en “e” (Figura Z), el final de “f”, “g” y lo inmediato posterior a éste último. Considerando estos resultados, dichas regiones se removieron de la matriz final. De igual forma, las zonas correspondientes a los loops IIa y IIb, así como otras regiones ambiguas del ITS1, fueron eliminadas. 172 Figura B1. Ver página siguiente. 1.32.73 U. sp8 4 . 2 . 3 ~1. 32 .7 3 4.28.44 ~ 4 .1 9 . 31 4 . 14 . 21 ~ 4 . 29 .4 6 1. 30.67 3 .7.10A 1.12 . 18 1.13 . 19 1. 3 . 3 5 .15 . 24 7 . 2.1 5 . 15 . 25 3 . 2 . 4B 4 . 2 . 3 ~ 1.32 . 73 4 . 28 .44 ~ 4 . 19.31 4 . 14.21 ~ 4 . 29 . 46 1.30 . 67 3 . 7.10A 1.12 .18 1.13.19 1. 3.3 5 . 15 . 24 7 . 2 .1 5 .15 . 25 3 . 2 .4B 4.2 . 3 ~ 1.32.73 4 .28. 44 H.1 9 . 31 4.14 . 21 H.29.46 1.30.67 3.7.10A 1.12.18 1.13.19 1. 3.3 5.15.24 7.2 . 1 5.15.25 3.2.4B 4.19.31 U. perplectata a 4.29.46 E. vexans b e 173 Figura B1. Comparación entre la estructura secundaria del ITS2 y la alineación del mismo para las secuencias mexicanas. Las estructuras corresponden a ejemplares de los subgéneros de Usnea (Usnea y Eumitria) y de Everniastrum (de izquierda a derecha; ver texto). En la alineación, dichos ejemplares se señalan con cabezas de flechas a la izquierda. Otras secuencias corresponden a ejemplares representativos de Usnea subgénero Usnea, otro ejemplar de Everniastrum (4.28.44) y a un ejemplar de Alectoria (1.30.67). Los loops principales se nombraron con las letras “a” hasta la “f” de manera arbitraria. En la alineación se señala la zona que abarca cada uno, coincidiendo con las regiones alineadas ambiguamente. Los espacios en blanco entre nucleótidos representan gaps. 174 Anexo C: Árbol del Intrón Figura C1. Ver página siguiente. , ----------- 4.44sp. Everniastrum 79 2.43bras 100 LS6corn 1.57corn 2.6O<:0rn 2.5&orn 2.4