UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO PROGRAMA DE DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMÉDICAS FACULTAD DE MEDICINA EL POST-ACONDICIONAMIENTO CONTRA EL DAÑO POR REPERFUSIÓN EN CORAZONES SOMETIDOS A HIPERTROFIA CARDIACA T E S I S QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: DOCTOR EN CIENCIAS BIOMÉDICAS PRESENTA: SAURI HERNÁNDEZ RESÉNDIZ DIRECTOR DE TESIS: DRA. CECILIA ZAZUETA MENDIZÁBAL INSTITUTO NACIONAL DE CARDIOLOGÍA. IGNACIO-CHÁVEZ MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR: DRA. NORMA ARACELI BOBADILLA SANDOVAL INTITUTO NACIONAL DE CIENCIAS MÉDICAS Y NUTRICIÓN. SALVADOR ZUBIRÁN DR. RAMÓN MAURICIO CORAL VAZQUEZ ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA, INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL MÉXICO, D. F, 26 DE OCTUBRE DEL 2015 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). 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Eventos metabólicos y funcionales del daño por reperfusión 11 a. Estrés oxidante 13 b. Sobrecarga de Ca2+ 14 c. Apertura del poro de la transición de la permeabilidad mitocondrial (mPTP) 15 d. Inflamación 15 7. Consecuencias del daño por reperfusión 17 a. No-reflujo 17 b. Incremento del tamaño del infarto (IS) 18 c. Remodelación 18 8. Cardioprotección 20 9. Post-acondicionamiento (PostC) 20 10. Efectos cardioprotectores otorgados por el post-acondicionamiento (PostC) 21 a. Efecto del pH 21 b. Homeostasis iónica 21 c. Síntesis de ATP 22 d. Sistema antioxidante 22 e. Reducción de la apoptosis 22 11. Transducción de señales en la cardioprotección del PostC: Vía de cinasas de salvamento contra el daño por reperfusión (RISK) 22 a. Vía PI3K/Akt 22 b. Vía MEK/ERK1/2 23 c. Óxido Nítrico (NOŸ) 23 12. Factores implicados en la pérdida de la cardioprotección por PostC 26 a. Hipertrofia cardiaca (CH) 26 b. Cardiomiopatía dilatada (DCM) 26   III. ANTECEDENTES 28 IV. JUSTIFICACIÓN 29 V. HIPÓTESIS 30 VI. OBJETIVOS 30 a. Objetivo general 30 b. Objetivos particulares 30 VII. MATERIAL Y MÉTODOS 31 1. Modelo experimental hipertrofia cardiaca (CH) y cardiomiopatía dilatada (DCM) 31 2. Marcadores de remodelación cardiaca 31 a. Análisis por Ecocardiografía 31 b. Análisis histológico con hematoxilina y eosina (H&E) 31 c. Evaluación por tomografía computarizada de emisión monofotónica (SPECT) 32 3. Preparación de corazón aislado:Langendorff 32 a. Protocolos experimentales: isquemia/reperfusión y PostC 32 4. Modelo de corazón in vivo 33 a. Protocolo experimental 33 5. Determinación del tamaño del infarto (IS) 33 6. Preparación de homogenados tisulares 34 7. Evaluación de ERK1/2 y PHO-ERK1/2 34 a. Activación de ERK1/2 34 b. Efecto de U0126 en el PostC 34 c. Niveles de ERK1/2 y PHO-ERK1/2 en fracciones mitocondriales 34 8. Aislamiento y purificación de mitocondrias 34 9. Determinación del potencial de membrana mitocondrial 34 10. Transporte de Ca2+ mitocondrial 35 11. Oxidación de proteínas mitocondriales 35 12. Determinación de fosforilación de proteína mitocondrial 35 13. Determinación de la translocación de ERK1/2 a la mitocondria 35 14. Análisis estadístico 36 VIII. RESULTADOS 39 1. Modelo de Hipertrofia Cardiaca (CH) y Cardiomiopatía dilatada (DCM): Marcadores de Remodelación cardiaca 39 a. SPECT 39 b. Ecocardiografía 39 c. Péptido natriurético atrial (ANP) y metaloproteinasa de   matriz-2 (MMP-2) 39 2. Niveles basales de PHO-PI3K, PHO-Akt, PHO-MEK, PHO-ERK1/2 en ventrículos de corazones CH y DCM 40 3. Efecto del post-acondicionamiento sobre la función cardiaca en corazones Sham, CH y DCM 40 Corazón aislado: Sistema de Langendorff: a. Efecto del PostC sobre el tamaño del infarto en corazones CH y DCM 40 b. Efecto del PostC sobre la activación de ERK 1/2 en corazones CH y DCM 40 4. Efecto de la inhibición de ERK1/2 y PI3K en la cardioprotección por PostC en corazones CH y DCM 40 a. Efecto del compuesto U0126 (U) y LY294002 (LY) sobre la activación de ERK1/2 y PI3K en corazones CH y DCM 40 b. Efecto de U y LY sobre el tamaño del infarto en corazones Sham, CH y DCM 41 c. Efecto de U y LY sobre la activación de ERK1/2 41 d. Efecto de U y LY sobre la activación de PI3K/Akt 41 5. Cinética de activación de ERK1/2 en corazones DCM 41 6. Cinética de activación de Akt en corazones DCM 42 7. Efecto de Akt sobre la activación de GSK3β en corazones DCM 42 8. Modelo in vivo en corazones DCM: Efecto del PostC sobre la función cardiaca, tamaño del infarto y la activación de ERK1/2 42 9. Activación de ERK1/2 e incremento en la fosforilación de la proteína mitocondrial de corazones DCM 42 10. Asociación entre la apertura del mPTP y la actividad de ERK1/2 en corazones DCM 43 11. Correlación entre la inhibición de ERK1/2 y los niveles de oxidación de la proteína mitocondrial 43 12. Translocación de ERK1/2 del citosol a la membrana externa mitocondrial a través de complejos moleculares de señalización enriquecida con caveolina-3 43 IX. DISCUSIÓN 59 X. CONCLUSIONES 63 XI. PERSPECTIVAS 65 XII. REFERENCIAS 66   XIII. PUBLICACIONES DERIVADAS DE ESTA TESIS 79 1. Hernández-Reséndiz S, Palma-Flores C, De los Santos S, Anguiano-Román NG, Flores M, de la Peña A, Flores PL, Fernández-G JM, Coral-Vázquez RM, Zazueta C (2015) Reduction of no-reflow and reperfusion injury with the synthetic 17β-aminoestrogen compound Prolame is associated with PI3K/Akt/eNOS signaling cascade. Basic Res Cardiol 110:1 2. Hernández-Reséndiz S, Zazueta C (2014) PHO-ERK1/2 interaction with mitochondria regulates the permeability transition pore in cardioprotective signaling. Life Sciences 108:13-21 3. Hernández-Reséndiz S, Roldán FJ, Correa F, Martínez-Abundis E, Osorio-Valencia G, Ruíz-de-Jesús O, Alexánderson-Rosas E, Vigueras RM, Franco M, Zazueta C (2013) Postconditioning protects against reperfusion injury in hypertensive dilated cardiomyopathy by activating MEK/ERK1/2 signaling. J Card Fail 19(2):135-46.     1   i. RESUMEN La mortalidad por infarto agudo al miocardio ha disminuido debido al tratamiento de reperfusión, ya sea a través de la administración de agentes trombolíticos o por medio de la angioplastía primaria. Sin embargo, a pesar de los beneficios de la terapia de reperfusión, las complicaciones, incluyendo la muerte, en pacientes con infarto agudo persisten. El proceso de reperfusión es un procedimiento que paradójicamente puede inducir la extensión del daño o muerte asociado a una respuesta inflamatoria exagerada; condición conocida como “daño por reperfusión”. Los factores de comorbilidad estan asociados con alteraciones moleculares fundamentales que inciden sobre el éxito de las terapias de reperfusión. Una de estas estrategias es el post- acondicionamiento (PostC), que consiste en la aplicación de ciclos de reperfusión y reoclusión coronaria después del evento isquémico y que tras la activación de la vía de señalización MEK/ERK1/2 reduce el daño por reperfusión. En este trabajo estudiamos el efecto del PostC bajo condiciones de comorbilidad. Usamos un modelo de hipertrofia (CH) cardiaca y un modelo de cardiomiopatía dilatada (DCM). En estos modelos determinamos los efectos estructurales, funcionales y de señalización tras un infarto agudo y en consecuencia directa el efecto de la aplicación del PostC. Adicionalmente, determinamos el impacto de la vía de señalización MEK/ERK1/2 sobre la regulación de la función mitocondrial. Se administró angiotensina-II a ratas Wistar hasta que se desarrollaron las enfermedades cardiovasculares. Posteriormente, los corazones aislados se sometieron a isquemia, seguida por el tratamiento de post-acondicionamiento y de reperfusión. El PostC mantuvo el doble producto de todos los grupos. El PostC redujo el tamaño del infarto de 36.16 ± 3% a 9.8 ± 2.2% en el grupo Sham, de 37.5 ± 2.4% a 12 ± 3% en el grupo CH y de 40 ± 2.4% a 11.55 ± 3% en el grupo DCM. La inhibición de la vía MEK/ERK1/2 (proteína cinasa de la cinasa activada por mitógenos) tuvo diferentes efectos en la cardioprotección conferida por el PostC en los grupos evaluados. Interesantemente, aunque la activación de la fosfatidilinositol 3-cinasa fue insignificante en corazones DCM durante el PostC, observamos activación de la cinasa Akt. Utilizando el modelo de DCM, determinamos el impacto de la señalización de ERK1/2 en mitocondrias y evaluamos su efecto sobre el poro de la transición de la permeabilidad. Observamos que bajo condiciones de cardioprotección, una subpoblación de ERK1/2 se activa y se dirige a las membranas mitocondriales a través de tráfico vesicular, en correlación con el incremento en la fosforilación de proteínas mitocondriales y la inhibición de la apertura del poro de la transición de la permeabilidad mitocondrial. Nuestros resultados sugieren que las vesículas enriquecidas con caveolina-3 forman complejos de señalización que translocan a ERK1/2, GSK3β y Akt hacia la mitocondria. En conclusión el PostC confiere cardioprotección a través de vías alternativas de supervivencia en corazones normales y corazones con CH, mientras que la recuperación de los corazones DCM depende de la vía MEK/ERK1/2. En estos corazones, la pérdida en la actividad de PI3K no afecta la cardioprotección, ya que MEK/ERK1/2 es capaz de activar a Akt, fortaleciendo la vía de señalización cascada abajo. Los complejos de señalización, que incluyen a PHO-ERK1/2, PHO- Akt, PHO-eNOS y caveolina-3 contribuyen a inducir cardioprotección a través de la inhibición de la apertura del poro de la transición de la permeabilidad mitocondrial.   2   ii. ABSTRACT Acute myocardial infarction mortality has diminished due to reperfusion therapy by using thrombolytic agents or primary angioplasty. Despite the benefits of reperfusion therapy, complications that include death, persist in patients with acute myocardial infarction. Reperfusion is the definitive treatment for acute coronary syndromes, especially acute myocardial infarction; however, reperfusion has the potential to exacerbate lethal tissue injury, a process termed “reperfusion injury”. Comorbidity factors are associated with fundamental molecular alterations that can potentially affect the development of ischemia and reperfusion injury per se and responses to cardioprotective interventions, like that conferred by Post-conditioning (PostC), which consist in applying cycles of coronary reperfusion and reocclusion n after the ischemic event. This strategy led to activation of the signaling pathway MEK/ERK1/2 that participates in reducing reperfusion injury. In this work, we founded that PostC’s protection does not depend of MEK/ERK1/2 activation in hearts of animals with cardiac hypertrophy, however, is essential for animals with dilated cardiomyophaty (DCM). Wistar rats were subjected to angiotensin-II administration until development of cardiovascular diseases. Then, isolated hearts underwent ischemia followed by PostC and reperfusion. PostC maintained the double product in all groups. PostC reduced infarct size from 36.16 ± 3% to 9.8 ± 2.2% in Sham, from 37.5 ± 2.4% to 12 ± 3% in CH, and from 40 ± 2.4% to 11.55 ± 3% in DCM. Inhibition of the mitogen activated protein kinase MEK/ERK1/2 pathway had different effects on PostC-conferred cardioprotection in the evaluated groups. Interestingly, although phosphatidylinositol-3-kinase activation was negligible in PostC DCM hearts, we observed Akt activation. Using the model of DCM, we determined ERK1/2 signaling at the level of mitochondria and evaluated its effect on the permeability transition pore. The most important finding is that, under cardioprotective conditions, a subpopulation of activated ERK1/2 was directed to the mitochondrial membranes through vesicular trafficking, concurring with increased phosphorylation of mitochondrial proteins and inhibition of the mitochondrial permeability transition pore opening. In addition, our results suggest that vesicles enriched with caveolin-3 could form structures that may drive ERK1/2, GSK3β and Akt to mitochondria. In conclusion, PostC confers cardioprotection through alternative survival pathways in normal and CH hearts, whereas cardiac function recovery in DCM relies mainly on MEK/ERK1/2 cascade. Down regulation of phosphatidylinositide 3-kinase does not affect the cardioprotective response in DCM, because MEK/ERK1/2 cascade may convey direct Akt activation, strengthening downstream signaling. Signaling complexes including PHO- ERK, PHO-Akt, PHO-eNOS and caveolin-3 contribute to cardioprotection by directly targeting the mitochondrial proteome and regulating the opening of the permeability transition pore in this model.   3   iii. LISTA DE ABREVIATURAS ACC: Colegio Americano de Cardiología ADP: Adenosina difosfato AHA: Asociación Americana del Corazón Akt: Proteína Cinasa B AMP: Adenosina monofosfato AMPK: Cinasa activada por adenosina monofosfato Ang-II: Angiotensina-II ANP: Péptido natriurético atrial ANT: Translocasa de nucleótidos de adenina ATP: Adenosina trifosfato AVISA: Años de vida saludable BH4: Tetrahidrobiopterina CCCP: m-clorocarbonilcianuro fenilhidrazona CH: Hipertrofia cardiaca CPT-1: Carnitina palmitoil transferasa-1 CsA: Ciclosporina A Cyp-D: Ciclofilina-D Cyt-c: Citocromo-c DCM: Cardiomiopatía dilatada DNA: Ácido desoxirribonucleico ECVs: Enfermedades cardiovasculares EF: Fracción de eyección eNOS: Sintasa de óxido nítrico endotelial ERK1/2: Cinasa regulada extracelularmente 1 y 2 ESC: Sociedad Europea de Cardiología ETC: Cadena transportadora de electrones FAT: Transportador de ácidos grasos libres FS: Fracción de acortamiento G6PDH: Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa GC: Guanilato ciclasa GLUT: Transportador de glucosa cGMP: Guanosín monofosfato cíclico GPCR: Receptores acoplados a proteínas G GSH: Glutatión GSK3β: Cinasa glucógeno sintasa 3β GSSG: Disulfuro de glutatión GST: Glutatión s- transferasa H&E: Hematoxilina y eosina HW/BW: Cociente peso corporal/peso corazón IL-6: Interleucina-6 IL-8: Interleucina-8 IS: Tamaño del infarto IVS: Septo intraventricular LVDd: Dimensión del ventrículo izquierdo al final de la diástole LVSd: Dimensión del ventrículo izquierdo en telesístole LW/BW: Cociente peso corporal/peso pulmón MAPK: Proteína cinasa activada por mitógeno MAPKKs: Proteína cinasa de cinasa activada por mitógeno mCAU: Uniportador de Ca2+ mitocondrial   4   MEK1/2: Proteína cinasa activada por mitógenos ERK1/2 mK+ ATP: Canales mitocondriales de potasio sensibles a ATP MMP-2: Metaloproteinasa de matriz-2 mPTP: Poro de la transición de la permeabilidad mitocondrial MTC-1: Transportador de monocarboxilatos-1 NADPH: Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato NOŸ: Óxido nítrico NR: No-reflujo OMS: Organización Mundial de la Salud OxPhos: Fosforilación oxidativa p70S6K: Proteína cinasa ribosomal S6 de 70kDa PCI: Intervención coronaria percutánea PDK1: Cinasa dependiente de 3’-inositolfosfato tipo 1 PFK: Fosfofructocinasa Pi: Fosfato inorgánico PI3K: Fosfoinositol 3-cinasa PiC: Acarreador de fosfatos PIP2: Fosfatidilinositol-4, 5-bifosfato PIP3: Fosfatidilinositol-3, 4, 5-trifosfato PKC: Proteína cinasa C PKCε1: Proteína cinasa C épsilon 1 PKCε2: Proteína cinasa C épsilon 2 PKG: Proteína cinasa G PostC: Post-acondicionamiento RISK: Cinasas de salvamento ante el daño por reperfusión ROS: Especies reactivas de oxígeno RTK: Receptor tipo tirosina cinasa Ru360: Rutenio 360 RyR: Receptor de rianodina Ser: Serina SERCA2a: ATPasa de Ca2+ tipo 2a del retículo sarcoplásmico SOD: Superóxido dismutasa SPECT: Tomografía computarizada de emisión monofotónica SR: Retículo sarcoplásmico TAG: Triacilglicerol Thr: Treonina TNFα: Factor de necrosis tumoral α TTC: Cloruro de trifeniltetrazolio TTP+: tetrafenilfosfonio Tyr: Tirosina VDAC: Canal aniónico dependiente de voltaje γ-GCS: γ-glutamil-cisteína-sintetasa ΔΨm: Potencial eléctrico mitocondrial   5   iv. LISTA DE FIGURAS página Figura 1: Principales eventos metabólicos que se desarrollan durante la isquemia. 10 Figura 2: Reperfusión temprana. 12 Figura 3: Daño por reperfusión. 16 Figura 4: Tamaño del infarto (IS) en función de la duración de la isquemia y del tiempo de reperfusión. 19 Figura 5: Protocolo convencional de Isquemia/Reperfusión y post-acondicionamiento (PostC). 21 Figura 6: Transducción de señales en el PostC. 24 Figura 7: Posible mecanismo de protección mitocondrial por efecto del PostC. 25 Figura 8: Hipertrofia y Cardiomiopatía dilatada. 27 Figura 9: Esquema simplificado del sistema de Langendorff y del modelo de corazón in vivo. 37 Figura 10: Protocolo experimental. 38 Figura 11: Niveles de MMP-2 y ANP en corazones Sham, CH y DCM. 45 Figura 12: Morfología y perfusión cardiaca en corazones CH y DCM. 46 Figura 13: Imágenes de ecocardiografía y contenido basal de las cinasas de su- pervivencia de la vía de RISK. 47 Figura 14: Función cardiaca en corazones post-acondicionados. 48 Figura 15: Efecto de U0126 y LY294002 sobre el doble producto de corazones a) Sham, b) CH y c) DCM post-acondicionados. 48 Figura 16: Tamaño del infarto (IS) y niveles de PHO-ERK1/2 en corazones post- acondicionados CH y DCM. 49 Figura 17: Efecto de U0126 y LY294002 sobre el tamaño del infarto de corazones post-acondicionados. 50 Figura 18: Efecto del inhibidor U0126 sobre la vía canónica MEK/ERK1/2 en corazones DCM post-acondicionados. 51 Figura 19: Efecto de U0126 y LY294002 sobre la activación de ERK1/2 en Corazones post-acondicionados. 51 Figura 20: Efecto de U0126 y LY294002 sobre la activación de PI3K/Akt en corazones DCM post-acondicionados. 52 Figura 21: Cinética de activación de ERK1/2 en corazones DCM con protocolo I/R y PostC. 52 Figura 22: Cinética de activación de Akt en corazones DCM post-acondicionados. 53 Figura 23: Efecto de U0126 y LY294002 sobre la activación de GSK3β en corazones DCM. 55 Figura 24: U0126 inhibe la fosforilación de ERK1/2 y GSK3β mitocondrial. 55 Figura 25: U0126 disminuye la fosforilación de proteínas mitocondriales e induce la apertura del poro de la transición de la permeabilidad mitocondrial en corazones DCM post-acondicionados. 56 Figura 26: La inhibición de PHO-ERK1/2 incrementa los niveles de carbonilación en mitocondrias de corazones DCM. 57 Figura 27: Contenido de diferentes cinasas en fracciones citosólicas y mitocondriales del ventrículo izquierdo de corazones DCM. 57 Figura 28: Contenido de PHO-ERK1/2, PHO-Akt, PHO-eNOS y caveolina-3 en fracciones citosólicas, mitocondriales y SM en corazones DCM. 58 Figura 29: Cardioprotección en corazones DCM. 64   6   I. INTRODUCCIÓN Las enfermedades cardiovasculares (ECVs) son la primera causa de muerte y de discapacidad a nivel mundial. De acuerdo con el Anuario de Estadística Sanitaria 2014 publicado por la Organización Mundial de la Salud, anualmente 3.8 millones de hombres y 3.4 millones de mujeres mueren a causa de las ECVs. Se estima que para el 2020 la carga global de las enfermedades del corazón aumentará los años de vida saludable perdidos, tanto por muerte como por discapacidad (de 47 millones a 82 millones de habitantes) [OMS, 2014]. En México acontecieron 140,595 defunciones por enfermedades cardiovasculares, lo que se traduce en una tasa de 122 defunciones por cada 100 mil habitantes en 2011. En esta agrupación se encuentran las defunciones por enfermedades isquémicas del corazón (50.5%) y las enfermedades cerebrovasculares (22.2%), que representan la segunda y cuarta causas a nivel nacional. De las personas que fallecieron por ECVs, 51.4% fueron hombres y 48.6% mujeres; ocho de cada 10 (82.2%) personas que fallecieron por esta causa tenían 60 años y más [INEGI, 2011]. La principal complicación postoperatoria de los pacientes con enfermedad cardiovascular, como lo son los pacientes con infarto agudo al miocardio con elevación del segmento ST, surge de los efectos perjudiciales del daño por reperfusión. Después de la aparición de la isquemia miocárdica aguda en estos pacientes, la reperfusión oportuna con terapia trombolítica o con intervención coronaria percutánea primaria es esencial para salvar el tejido cardiaco viable. Sin embargo, paradójicamente la reperfusión del tejido isquémico puede acompañarse de daño y muerte celular adicional generando arritmias ventriculares, alteraciones en la función contráctil del corazón y obstrucción microvascular (daño por reperfusión). A pesar de que la reperfusión es práctica habitual en el ámbito clínico, no existe actualmente ninguna estrategia establecida para proteger el corazón contra la pérdida de la función miocárdica postoperatoria [Husenloy et al., 2013]. El tratamiento contra el daño por reperfusión requiere medidas más allá de la reperfusión oportuna. En este sentido, el post-condicionamiento (PostC) es una terapia mecánica que induce una respuesta adaptativa del corazón para mejorar la capacidad de resistencia a la reperfusión. Sin embargo, el éxito de esta terapia es aún un desafío en la práctica clínica debido a que la mayoría de las enfermedades isquémicas se desarrollan como consecuencia de un gran número de etiologías que coexisten con estados patológicos. Poco se sabe acerca de la manera en que el miocardio responde a esta terapia cuando existen factores de riesgo cardiovascular. Por tal motivo, el objetivo de este trabajo fue evaluar la efectividad del post-acondicionamiento en un modelo animal de remodelación miocárdica patológica.   7   II. MARCO TEÓRICO 1. Isquemia La isquemia (del griego ἴσχειν, ísjein, detener, y αἷµα, aíma, sangre) es la pérdida transitoria o permanente del flujo sanguíneo de un tejido. En 1957, la oclusión aguda de la arteria circunfleja en un modelo canino de infarto experimental, permitió al Dr. Jennings describir por primera vez las consecuencias deletéreas de la ausencia del flujo coronario cardiaco [Jennings y Wartman, 1957] y con especial énfasis señaló el efecto de la isquemia sobre la producción y utilización de los fosfatos de alta energía, el daño mitocondrial y el daño a las membranas celulares [Jennings et al., 1957; Gettes et al., 1991]. El daño tisular derivado de la isquemia depende del tiempo y del grado de disminución del flujo sanguíneo colateral. Se estima que si la obstrucción del flujo sanguíneo dura menos de 15 minutos con perfusión colateral de ≥0.3 mL/min por gramo de peso húmedo, los cambios metabólicos establecidos por la isquemia sobre el corazón son completamente reversibles [Fleet et al., 1985]; sin embargo, si la isquemia dura más de 20 minutos con una perfusión colateral de 0.01 a 0.09 mL/min por gramo de peso húmedo, habrá infarto agudo [Kloner et al., 1976; Reimer et al., 1977]. 2. Infarto agudo El infarto agudo es una de las enfermedades más frecuentes en la consulta de urgencias del Instituto Nacional de Cardiología Ignacio Chávez. El 64.2% de los pacientes que acuden a urgencias tienen algún tipo de cardiopatía isquémica, y de éstos el 38.5% corresponden a pacientes con infarto agudo con elevación del segmento ST. [González-Pacheco et al., 2007] El infarto agudo agudo del miocardio está estrechamente relacionado con la duración de la isquemia y con el flujo sanguíneo colateral. El infarto agudo comienza en las capas internas del miocardio y se extiende transmural y lateralmente en forma de onda del subendocardio al subepicardio. Al igual que en los seres humanos, este patrón de infarto subendocárdico se ha observado en perros, cerdos y primates; mientras que en roedores el infarto ocurre preferentemente en las capas externas del corazón, en el subepicardio. En estos animales, el infarto agudo ocurre a los 30-60 minutos de isquemia, mientras que los primates exhiben una sorprendente resistencia a desarrollarlo [Schaper et al., 1988]. En el hombre, caninos y cerdos el infarto agudo se establece a partir de los 40 minutos de isquemia y puede desarrollarse entre 8 y 12 horas [Schömig et al., 2005]. El índice de mortalidad y morbilidad por infarto agudo depende de las características del paciente incluyendo los factores de comorbilidad y el tiempo en que se restablece el flujo sanguíneo. Se estima que los pacientes con infarto agudo que pierden el 15% de masa ventricular, tienen riesgo de morir durante los 5 años posteriores al evento isquémico [Ndrepepa et al., 2010].   8   3. Eventos metabólicos que se desarrollan durante la isquemia Durante la isquemia severa, en condiciones de baja concentración de O2, disminuye la síntesis de ATP proveniente de la fosforilación oxidativa (de 25-27 µmoles/g de peso seco a < 2.0 µmoles/g de peso seco por una hora de isquemia) [Rouslin et al., 1986]. Sesenta segundos sin flujo sanguíneo en el miocardio son suficientes para agotar las reservas de fosfatos de alta energía en forma de creatina fosfato; el aumento en la concentración de AMP durante la isquemia induce la fosforilación de la cinasa activada por AMP (AMPK), que estimula la producción de ATP a través de la vía anaerobia [Dyck et al., 2006; Carvajal y Moreno-Sánchez., 2003; Carvajal et al., 2007]. En la fase temprana de la isquemia, la glucólisis anaerobia se acelera veinte veces. El ATP producido a través de esta vía es utilizado principalmente para mantener la función de los canales iónicos de la membrana plasmática [Kubler te al., 1970; Weiss et al., 1985]. El lactato como producto de la glucólisis anaerobia es eliminado de la célula a través del transportador de monocarboxilatos (MCT-1) si el flujo coronario es >20%; sin embargo, si el flujo es menor durante la isquemia, la pérdida de la perfusión arterial favorece la acumulación del metabolito (~0.8mmol/L) en tan solo 15 minutos de isquemia, contribuyendo a la acidificación del citoplasma celular (pH ~6.6) que puede disminuir hasta pH 5.8 después de los 50 minutos de isquemia [Steenbergen et al., 1978; Gettes et al., 1991; An et al., 2001]. La acumulación de lactato y de protones (H+) favorecen la disminución de la actividad de la fosfofructocinasa (PFK1), una enzima limitante en la vía de la glucólisis [Rovetto et al., 1973]. La isquemia severa trae como consecuencia la pérdida del funcionamiento de bombas y canales iónicos membranales. El incremento intracelular de protones H+ activa al intercambiador Na+/H+ que expulsa protones de la célula a costa de incrementar los niveles de Na+ intracelular. Este mecanismo y la inactivación de la Na+/K+ ATPasa (dependiente de ATP) exacerban la carga de sodio citoplasmático. En respuesta a la sobrecarga de Na+, el intercambiador Na+/Ca2+ funciona en reversa expulsando sodio a costa de introducir Ca2+ a la célula [Imahashi et al., 2005]. Además, durante la fase de isquemia también disminuye la actividad de la ATPasa de Ca2+ tipo 2a (SERCA2a) y por lo tanto la capacidad de recaptura de Ca2+ hacia el retículo sarcoplásmico (SR). El calcio del SR se reduce progresivamente lo que favorece a la disminución de la activación del receptor de rianodina (RyR), un componente clave en el acoplamiento excitación-contracción [Fauconnier et al., 2013] (Figura 1). A nivel subcelular, a pesar de los procesos de daño generados por la ausencia de oxígeno y nutrientes, el pH ácido de la célula mantiene cerrado el poro de la transición de la permeabilidad mitocondrial (mPTP), un canal no específico de alta conductancia dependiente de voltaje localizado en las mitocondrias, cuya apertura se asocia con muerte por necrosis y apoptosis (Figura 1) [Bernardi et al., 1992; Monassier, 2008].   9   4. Reperfusión La restauración oportuna del flujo coronario en la arteria ocluida es requisito indispensable para salvar el miocardio del infarto agudo ya que permite corregir los cambios metabólicos ocurridos durante la isquemia [Boersman et al., 2006]. La guía clínica de intervención coronaria publicada por el ACC/AHA/ESC (American College of Cardiology/American Heart Association and European Society of Cardiology) recomienda el uso de anticoagulantes durante la intervención coronaria percutánea primaria para restablecer el flujo sanguíneo del paciente con infarto agudo [Jacobs et al., 2008]. A nivel celular, la reperfusión temprana restablece el pH extracelular debido al lavado de H+ y ácido láctico; este evento favorece la actividad del intercambiador Na+/H+ y por lo tanto la entrada de Na+. Tras la reperfusión en el miocardio isquémico con lesión reversible, la función contráctil se recupera una vez restaurados los niveles de ATP. En presencia de oxígeno se reactiva la fosforilación oxidativa; la activación de la AMPK y la consecuente acumulación de ácidos grasos favorece la síntesis de ATP [Dick y Lopaschuk, 2006]. El sodio citosólico comienza a ser regulado por la Na+/K+ ATPasa o por el intercambiador Na+/Ca2+ [Piper et al., 2003] y la función de canales iónicos como SERCA y del receptor de rianodina se restauran (Figura 2) [Fauconnier et al., 2013]. 5. Daño por reperfusión: Definición El concepto de daño por reperfusión surgió hace más de 55 años cuando en un modelo canino de infarto experimental fueron detectadas zonas de necrosis independientes a las generadas por el evento isquémico [Jennings et al., 1960]. Actualmente, el daño por reperfusión hace referencia a aquellos cambios metabólicos y estructurales deletéreos que potencialmente pueden producir muerte celular y que se producen como consecuencia directa de la reapertura del segmento epicárdico de la arteria relacionada con el infarto [Rosenkranz et al., 1983; Yellon y Hausenloy, 2007]. Experimentalmente, las tinciones histológicas pueden marcar con precisión el daño por reperfusión y evidenciar que al final del periodo isquémico una gran porción del miocardio infartado es aún viable y que pierde su función durante los primeros minutos de la reperfusión [Heusch, 2013].   10   CD oclusión (ateroma) t .1 . ácidos -.- grasos Citoplasma Mitocondria , O/hipoxia) 'flujo . coronario « 70%) glucógeno ~ ~G6-P PF~ ( PFK'l t Ca2+ G I u c~ "'"-==-r'"" F- ~ r Piruvato Q\M@ 0 t + t H+ Lactato ~ ~i~~ ii~ ~ i a~ ~ celular Na+ « « (( Miofibrillas @ tNa+ - @ tCa 2+ )"\ Y.t- sobra~arga ~--- J calcio ( Calpaina ) SERCA2a   11   6. Eventos metabólicos y funcionales del daño por reperfusión La entrada de oxígeno y nutrientes en la arteria previamente ocluida permite el restablecimiento del metabolismo aeróbico. Sin embargo, en muchos casos el aumento en la disponibilidad de ATP y la restauración del pH intracelular favorecen al desarrollo de procesos celulares deletéreos. Si la isquemia es severa (prolongada y con poca perfusión colateral), se genera un gradiente de pH enorme entre los compartimentos intra y extracelular durante la reperfusión, lo que origina un aumento en la concentración de Na+ derivado de la actividad del intercambiador Na+/H+, que no es eficientemente eliminado por la Na+/K+ ATPasa. En consecuencia se produce un incremento de Ca2+ intracelular mediado por el intercambio de Na+/Ca2+, que aumenta aún más, cuando el pH celular se restablece. Además del Ca2+, se acumulan otros mediadores como la trombina, el factor de activación plaquetario, radicales libres y la angiotensina-II; todos ellos asociados a extrasístoles ventriculares, taquicardias ventriculares y ritmo idioventricular acelerado, consecuencias clínicas que favorecen al daño y la muerte celular (Figura 3) [Monassier et al., 1992; Hausenloy et al., 2013]. Durante la reperfusión se producen cuatro procesos celulares principales que favorecen al desarrollo del daño por reperfusión: a) Estrés oxidante, b) sobrecarga de Ca2+, c) apertura del poro de la transición de la permeabilidad mitocondrial y d) inflamación (Figura 3) [Piper et al., 2003]. flujo "coronario ácidos grasos   12   Reperfusión ~ -k t j c---c--r coronario Glucosa °2 (normoxia) ~ } ~ G1-P r-F-t--------,.." CPT1"'/ / '--- Glucó!isi r Al s...---- aerobla : p _~ r- ----¡-y Piruvato ----¡ = ===---==----< 'H+ +, Lactato ---=-_--' ~ Contracción ~ (DL ~ »-- A 1 Na+ ,/ .1 acidosis e -.- celular ~~.Q2-~~/ .. ~ ----..., ~~ Ca2+   13   a. Estrés oxidante La reentrada de sangre oxigenada al tejido isquémico resulta en la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). En 1987, Zweier y colaboradores demostraron por primera vez con mediciones de resonancia paramagnética electrónica que las ROS se producen desde la isquemia (6.1 ± 0.4 µM vs 4.7 ± 0.5 µM en controles) y que se elevan y rebasan al sistema antioxidante durante la reperfusión (11.4 ± 0.6 µM) [Zweier et al., 1987]. Debido a su naturaleza altamente reactiva, las ROS pueden modificar por oxidación cualquier tipo de biomolécula. El estrés oxidante produce la pérdida de la función del tejido cardiaco vía peroxidación lipídica de membranas, oxidación del DNA, activación de metaloproteinasas de matriz, activación de calpaínas, promueve el no-reflujo y causa la apertura del mPTP [Chen y Zweier, 2014]. El Dr. Roberto Bolli, pionero en el estudio del efecto de las ROS sobre el aparato contráctil de los miocitos, demostró que las ROS son responsables del aturdimiento miocárdico, un daño completamente reversible en presencia de antioxidantes [Bolli et al., 1989; Bolli et al., 1990]. Durante la reperfusión, las ROS son producidas por diferentes enzimas incluyendo la ciclooxigenasa, el citocromo p450, la monoaminooxidasa, la NADPH oxidasa, la xantina oxidasa y los complejos mitocondriales pertenecientes a la cadena transportadora de electrones. Además, se ha demostrado que bajo condiciones de agotamiento de arginina o de tetrahidrobiopterina la óxido nítrico sintasa (NOS) se desacopla y también produce ROS. El estrés oxidante producido durante la reperfusión es generado por células endoteliales a través de la oxidación mitocondrial por la xantina oxidasa; por neutrófilos a través de la NADPH oxidasa y por los miocitos a través de la cadena transportadora de electrones [Zweier and Talukder, 2006]. Las mitocondrias de los miocitos comprenden entre el 30 y 40% del volumen total y generan el ≈90% de ATP con alta demanda de O2; por lo tanto, no es difícil pensar en este organelo como la principal fuente productora de ROS en el sistema cardiovascular. Bajo condiciones fisiológicas el transporte de electrones al O2 está acoplado a la fosforilación oxidativa para la síntesis de ATP. Este   14   mecanismo depende de un gradiente electroquímico que representa la fuente de generación de ROS mitocondrial. Durante la reperfusión, la disminución de la tasa de fosforilación mitocondrial aumenta la fuga de electrones de los complejos de la cadena transportadora de electrones incrementando la producción de anión superóxido (O2 Ÿ-) [Chen y Zweier, 2014]. Bajo condiciones fisiológicas, el O2 Ÿ- es un radical que dismuta a peróxido de hidrógeno (H2O2) espontáneamente o a través de una reacción que se lleva a cabo 1000 veces más rápidamente por la superóxido dismutasa (SOD), para luego ser inactivado por la catalasa y producir H2O y O2. Las proteínas mitocondriales son ricas en cofactores metálicos como los grupo hemo (en los complejos II, III y IV) y centros hierro azufre (complejo I, II y III) por lo que en un medio altamente oxidante y en presencia de metales de transición, el peróxido de hidrógeno puede oxidarse al altamente reactivo radical hidroxilo (•OH) por la reacción de Fenton [Pauslen y Carroll 2010]. Se reporta que el pico máximo en la formación de ŸOH aparece entre los 30 y 90 segundos de haber iniciado la reperfusión [Takemura et al., 1992]. Además, la exposición aguda de las membranas a los radicales altamente reactivos producen la oxidación de la cardiolipina promoviendo alteraciones sobre el ensamble y la actividad de los complejos mitocondriales. Estas modificaciones estructurales contribuye a la fuga de electrones alimentando la producción de ROS y generando un circulo vicioso donde las ROS producen más ROS [Zweier y Talukder, 2006]. b. Sobrecarga de Ca2+ Al final de la isquemia, el citosol está cargado de Na+, Ca2+ y H+, y el resultado de la reperfusión tras una isquemia severa es la sobrecarga de Ca2+. Como se describió anteriormente, la normalización del pH extracelular durante la reperfusión crea inicialmente un gradiente de protones a través de la membrana celular promoviendo el intercambio de iones Na+/H+. Este gradiente no fisiológico induce la acción pasiva inversa del intercambiador Na+/Ca2+, contribuyendo al aumento de calcio intracelular. La activación de la bomba dependiente de ATP del retículo sarcoplásmico o SERCA, temporalmente puede secuestrar y almacenar el exceso de calcio intracelular; sin embargo, si la cantidad de Ca2+ citosólico rebasa la capacidad del retículo sarcoplásmico, inicia un ciclo de liberación y receptación de este ión causando oscilaciones que se propagan como ondas y que se cree facilitan su entrada a la mitocondria; además de favorecer un estado de contracción permanente de las miofibrillas (hipercontractura) [Ndrepepa et al., 2010; Ruiz-Mena et al., 2009]. La alta concentración de iones calcio en el citosol favorece su entrada a la mitocondria a través del uniportador de Ca2+ mitocondrial (mCaU), en respuesta al potencial electroquímico mitocondrial (ΔΨm) negativo [Contreras et al., 2010]. La sobrecarga de Ca2+ mitocondrial resulta en la despolarización de la membrana interna, la producción de ROS y la apertura del mPTP [Dixon et al., 1990]. Al atenuar la sobrecarga de Ca2+ mitocondrial con el bloqueador del uniportador de calcio Ru360, se logra reducir el daño por reperfusión en un modelo in vivo [García-Rivas et al., 2006].   15   c. Apertura del poro de la transición de la permeabilidad mitocondrial (mPTP) Haworth y Hunter a finales de los 70s describieron por primera vez el poro de la transición de la permeabilidad mitocondrial, un canal no específico que se forma en los sitios de contacto entre la membrana interna y la membrana externa de la mitocondria y cuya apertura se asocia a necrosis y apoptosis [Hunter et al., 1976]. La composición del mPTP sigue siendo controversial, sin embargo, se reconocen tres componentes principales, el translocador de adenin nucleótidos (ANT), el acarreador de fosfatos (PiC) y la ciclofilina-D (Cyp-D). Hallazgos experimentales más recientes también han demostrado la participación del canal aniónico dependiente de voltaje (VDAC) y de la ATP sintasa o complejo V mitocondrial [Ong et al., 2015]. El mPTP permanece cerrado durante la isquemia debido a las condiciones ácidas; sin embargo, la normalización del pH, la sobrecarga de Ca2+, el exceso de ROS, la concentración creciente de fosfato inorgánico (Pi) y el agotamiento de ADP generado durante la reperfusión favorecen su apertura [Yellon et al., 2007]. La apertura del mPTP representa el flujo no selectivo de solutos de ≤1.5 kDa a través de la membrana y por lo tanto el colapso del Δψm. Con esto se crea un gradiente osmótico que favorece la entrada de agua a la mitocondria provocando su hinchamiento y bajo condiciones de daño severo, la ruptura de la membrana mitocondrial. Como tal, la inhibición de la apertura del mPTP forma parte de las estrategias terapéuticas contra el daño por reperfusión; ya que el uso de ciclosporina A (CsA) reduce la sensibilidad de la activación del poro durante la reperfusión [Nazareth et al., 1991]. d. Inflamación La respuesta inflamatoria en la reperfusión es similar a la que se produce en la sepsis, la insuficiencia cardiaca crónica y en el bypass cardiopulmonar [Meldrum et al., 1998, Levine te al., 1990]. Al inicio de la reperfusión diferentes tipos celulares del tejido cardiaco incluyendo células endoteliales, miocitos y macrófagos liberan factores pro inflamatorios como el TNFα, IL-6 e IL-8 que activan y reclutan neutrófilos [Meldrum et al., 1998]. Durante las primeras 6 horas de la reperfusión, los neutrófilos son reclutados en el espacio intravascular del área de riesgo y durante las 24 horas subsiguientes migrarán a través del endotelio hacia la zona del subendocardio dañado [Smith et al., 1998; Chatelain et al., 1987; Zhao et al., 2000]. Una vez activados e infiltrados, los neutrófilos producen grandes cantidades de ROS [Kvietys et al., 2012] y liberan más de 20 diferentes enzimas proteolíticas incluyendo hidrolasas ácidas, proteasas de serina, metaloproteinasas, gelatinasas y colagenasas con actividad catalítica específicas y tiempo de vida media larga para degradar proteínas estructurales del endotelio. Estas enzimas proteolíticas tienen como blanco principal a las enzimas de la matriz extracelular como la elastina, el colágeno, proteoglicanos y glicoproteínas; su degradación trae como consecuencia la pérdida de la vasodilatación endotelial y el desarrollo del fenómeno de no-reflujo [Vinten-Johansen, 2004]. En A TNFa (normoxia) Glucólisis == aerobia a ; : Trombina Miofibrillas Hipercontractura. Aléquetas o A y Ne Dm A)   16   CD ~NO· Endot ~ e ~ lio ~ ====~~~-- Moléculas ~1.5 kDa Fa G 6-P.J I SERCA2a SR @) Neutrófilos Tro bina Plaquetas Wí Ang-II   17   7. Consecuencias del daño por reperfusión Actualmente se reconocen dos consecuencias reversibles y dos irreversibles del daño por reperfusión. Son reversibles las arritmias y el aturdimiento miocárdico, condición que se refiere a la pérdida temporal de la función de las células cardiacas. Las condiciones irreversibles son la obstrucción vascular o la incapacidad para perfundir al miocardio a nivel vascular que se manifiesta como “no-reflujo” coronario; y el daño letal por reperfusión, el cual se refiere a la muerte adicional de los miocitos viables al final de la isquemia y que puede contribuir hasta con un 50% del tamaño del infarto (IS) [Jennings, 2013; Monassier et al., 1992; Komamura et al., 1994]. a. No-reflujo El fenómeno de no-reflujo (NR) se define como la pérdida de la perfusión de un segmento coronario sin evidencia angiográfica de obstrucción coronaria epicárdica [Kloner et al., 1974, Galasso te al., 2014]. El NR se considera una complicación en la práctica habitual de la intervención coronaria percutánea primaria cuya incidencia favorece la remodelación miocárdica y la reincidencia de infarto [Resnic et al., 2003]. La zona de no-reflujo se identifica por la presencia de hinchamiento intramural de la vasculatura, adhesión e infiltración de neutrófilos, formación de vesículas pinocíticas, presencia de potentes vasoconstrictores (angiotensina y endotelina), obstrucción microvascular por embolización, coagulación y disminución de óxido nítrico (NOŸ) [Heusch et al., 2013; Niccoli et al., 2009]. Se ha determinado que 20 minutos de reperfusión son suficientes para producir daño en más del 40% de los capilares [Kloner et al ., 1974]. El tratamiento del NR durante la intervención coronaria primaria favorece el flujo colateral y permite que los diferentes tratamientos coadyuvantes contra el infarto agudo lleguen a su blanco tisular. La tromectomía mecánica aplicada en el momento del cateterismo es una terapia contra el no-reflujo, sin embargo, la administración de antiplaquetarios y agentes que aumentan los niveles de NOŸ en el   18   corazón reperfundido como la adenosina [Desmet et al., 2011] y el prolame [Hernández-Reséndiz et al., 2015] han mostrado efectos benéficos en el sistema cardiovascular. b. Incremento en el tamaño del infarto (IS) El tamaño del infarto (IS) resultante de la isquemia y de la reperfusión es el determinante más importante del pronóstico en pacientes que han sobrevivido al evento de infarto agudo al miocardio [Heusch, 2013, Ovize et al., 2010]. La duración de la isquemia, la zona de riesgo y el flujo coronario residual determinan el tamaño del infarto y por lo tanto la posibilidad de reducir el IS con estrategias de protección. En roedores con 60 minutos de isquemia, la posibilidad de reducir el IS con estrategias protectoras es casi nula; en contraste, si la isquemia dura entre 30-40 minutos y se aplica el mismo protocolo de protección, el IS se reduce considerablemente [Skyschally et al., 2009]. La Figura 4 muestra la contribución individual sobre el IS generado por la isquemia, la reperfusión y el daño por reperfusión (expresada en unidades arbitrarias). En el ámbito clínico, el IS puede detectarse con biomarcadores de circulación y técnicas de imagen [Roberts y Sobel, 1987]. Bajo entornos experimentales, el tamaño del infarto se mide con precisión usando el marcador estándar de oro el cloruro de trifeniltetrazolium [Heusch, 2013]. c. Remodelación La remodelación miocárdica tras la reperfusión esta íntimamente relacionada con los índices de morbilidad y mortalidad post-operatoria en los pacientes con infarto agudo. Independientemente de los factores relacionados con la remodelación, las consecuencias patológicas que la favorecen dependen del tamaño del infarto [Heusch et al., 2014]. La remodelación miocárdica es una respuesta celular del endotelio, los miocitos, el músculo liso, las células intersticiales y de matriz a cambios hemodinámicos, metabólicos e inflamatorios de carácter nocivo. La remodelación del endotelio vascular contribuye al desarrollo de enfermedades crónicas degenerativas post-operatorias comunes como la ateroesclerosis y la hipertensión [Libby et al., 2011]. Además, durante el proceso de remodelación se llevan a cabo cambios importantes a nivel metabólico que favorecen el establecimiento de enfermedades como la hipertrofia y la falla cardiaca [Heusch et al., 2014].   19   / 15 en ausencia de reperfusión ••• ~ Miocardio rescatado ••••• por la reperfusión •• / - 15 después de / la reperfusión ---. /:·:<1-----------· 15 debido al daño ./ ••••• po reperfusión : .+ .. •••••••••••••••••••••••••• - 15 si se previene el daño por reperfusión f------- 15 por isquemia isquemia Reperfusión A. sin reperfusión 1575% Tiempo B. reperfusión 1554% c. cardioprotección 1525% Figura 4. Tamaño del infarto (IS) en función de la duración de la isquemia y el tiempo de reperfusión. En ausencia de la reperfusión, la isquemia causa la muerte progresiva de la totalidad del tejido cardiaco (línea roja punteada). A pesar de que la reperfusión detiene el proceso de muerte celular por isquemia, también puede producir lesión (línea negra punteada). El resultado neto es el tejido reperfundido con menos muerte celular que la que se produciría en el tejido isquémico sin reperfusión. Terapias de protección cardiaca aplicadas al inicio de la reperfusión limitan el alcance de la lesión por reperfusión e incrementa el efecto de salvamento de la reper- fusión (línea azul punteada) . El panel inferior muestra imágenes representativas de corazones de rata teñidos con TTC que muestran el porcentaje del tamaño del infarto (zona amarilla) bajo las tres condiciones A) tras una isquemia de 60 minutos y sin reperfusión, B) tras una isquemia de 30 minutos y 60 minutos de reperfuisón y C) tras 30 minutos de isquemia, post-acondicionamiento y 60 minutos de reperfusión. Modificado de García -Dorado [García-Dorado y Piper, 2006].   20   8. Cardioprotección La cardioprotección es un término que se refiere a las estrategias de origen mecánico o farmacológico dirigidos a reducir o eliminar el daño por reperfusión. Estudios experimentales han identificado en el tejido cardiaco un programa de autoprotección endógeno que al ser activado reduce el tamaño del infarto. Este sistema de protección es sensible a fármacos y a breves ciclos de hipoxia y reoxigenación antes o después de que ocurra la isquemia; incluso, actualmente este programa de cardioprotección mecánica puede ser activado a distancia (acondicionamiento remoto) [Kerendi et al., 2005]. 9. Post-acondicionamiento (PostC) El concepto de post-acondicionamiento (PostC: postconditioning) fue introducido por el grupo de Vinten-Johansen quienes con el antecedente de los efectos benéficos del pre-acondicionamiento reportados por Charles Murry, propusieron la aplicación de la misma estrategia mecánica pero al inicio de la reperfusión. Encontraron que tres ciclos de 30 segundos de reperfusión y 30 segundos de reoclusión coronaria después del evento isquémico reducen el IS (Figura 5) [Zhao et al., 2003]. El PostC surgió de la necesidad de proporcionar una estrategia aplicable en la práctica clínica y aunque no se ha definido un protocolo óptimo (el número de episodios y la duración de la intermitencia de reperfusión y reoclusión) el éxito generalizado en el medio experimental consolidó la idea de llevarlo a la práctica clínica. La apertura de la arteria coronaria ocluida por angioplastia percutánea transmural es equivalente a remover la ligadura alrededor de la arteria coronaria en los animales experimentales. Para los pacientes con infarto agudo tratados con angioplastia primaria, el PostC se logra con inflaciones repetidas del globo [Ovize et al., 2010].   21   10. Efectos del PostC sobre la función celular en el corazón reperfundido a. Efecto del pH. La reperfusión ácida inhibe la apertura del mPTP. Se ha reportado que el PostC preserva el pH ácido durante los primeros 3 minutos de la reperfusión [Inserte et al., 2008] y que la reperfusión ácida de 6.4 no tiene efecto benéfico si dura menos de 2 minutos [Rodriguez-Sinovas et al., 2009] o, si supera los 3 minutos [Cohen et al., 2008]. Esto indica que al retrasar la restauración del pH intracelular, se evita la sobrecarga de Na+ y se restauran los niveles de ATP; a este fenómeno se suma el hecho de que la actividad de proteasas como las calpainas es baja a pH 6.5 [Zhao et al., 1998]. b. Homeostasis iónica. El PostC restablece la homeostasis iónica debido a que previene la entrada adicional de Ca2+ vía intercambiador Na+/Ca2+ en su modo inverso durante los primeros 4 minutos de la reperfusión [Inserte et al.,2008], éste efecto puede estar relacionado con la regulación del pH y por lo tanto con la disminución de la concentración de Na+ intracelular. c. Síntesis de ATP. El post-acondicionamiento preserva los niveles de ATP a través de la glucólisis aerobia y la β -oxidación. Incrementa la hidrólisis de triacilglicerol (TAG),   22   incrementa la actividad de la AMPK, la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH) y provee de equivalentes reductores en forma de NADPH [Prendes et al., 2011]. d. Sistema antioxidante. El PostC mantiene la relación de glutatión reducido/oxidado (GSH/GSSG) [Arreguín et al., 2012; Prendes et al., 2011] y promueve la activación de Nrf- 2 que induce la transcripción de enzimas antioxidantes como la γ-glutamil-cisteína-sintetasa (γ-GCS), glutatión-S-transferasa (GST) y la superóxido dismutasa cobre/zinc (SOD Cu/Zn) [Buelna-Chontal et al., 2014]. e. Reducción de la apoptosis. El post-acondicionamiento genera resistencia a apoptosis por efecto de la inhibición de la caspasa-3 y -9; además, mantiene la relación Bcl-2/Bax que favorecen un estado antiapoptótico [Sun et al., 2006]. 11. Transducción de señales en la cardioprotección del PostC: Vía de cinasas de salvamento contra el daño por reperfusión (RISK) La protección que deriva del PostC es resultado de la activación de dos principales vías de señalización, la vía de PI3K/Akt y la vía de MEK/ERK1/2. Colectivamente esta señalización es conocida como la vía RISK (RISK: Reperfusion Injury Salvage Kinase) [Hausenloy e Yellon, 2004]. Los elementos de RISK incluyen también a la p70S6 cinasa, PKC, PKG, la sintasa de óxido nítrico endotelial (eNOS: endothelial nitric oxide synthase) y GSK3β (GSK3β: glycogen synthase kinase-3β) [Hausenloy e Yellon, 2006]. Se ha demostrado en diversos estudios que la activación tanto de Akt como de ERK1/2 durante la reperfusión es necesaria para inducir cardioprotección (Figura 6) [Shulman et al., 2002; Tsang et al., 2004]. a. Vía PI3K/Akt PI3K: PI3K pertenece a una familia de cinasas que se clasifica en tres clases dependiendo de sus características estructurales. PI3K Clase I posee una subunidad catalítica denominada p110γ, la cual genera fosfatidilinositol-3, 4, 5-trifosfato (PI3,4,5P) que interacciona con múltiples moléculas de señalización. Además, p110γ es activada directamente por receptores acoplados a proteínas-G (GPCRs) a través de la interacción con la subunidad trimérica Gαβγ [Chang et al., 2007]. Akt/protein kinase B (PKB): Akt es una cinasa efectora que se activa por dos eventos de fosforilación; uno en el dominio de activación, en el residuo de Thr-308 (conformación conocida como AKT1) y otro en la Ser-473 del carboxilo terminal, en el motivo hidrofóbico [Sarbassov et al., 2005]. Se ha demostrado que la activación de la vía canónica PI3K/Akt durante los primeros 15 minutos de reperfusión reduce el IS [Tsang et al., 2004]. También se ha aceptado la participación de la vía PI3K/Akt/mTOR en la cardioprotección, ambas vías confieren protección mitocondrial e inhiben la apoptosis [Zhang et al., 2014]. Además, la fosforilación de Akt favorece la síntesis de NOŸ y la regulación de los canales de potasio mitocondriales sensibles a ATP (mK+ ATP). El tratamiento con inhibidores de PI3K bloquea los efectos benéficos del PostC en animales sanos (Figura 6) [Yang et al., 2005].   23   b. Vía MEK/ERK1/2 MEK: MEK es una cinasa perteneciente al grupo evolutivamente conservado de las MAPKKs. MEK se activa principalmente por la fosforilación de sus dos residuos de serina y su único substrato fisiológico es ERK1/2 [Rose et al., 2010]. ERK1/2: ERK1 de 44kDa (p44) y ERK2 de 42kDa (p42) son MAP cinasas 83% idénticas y por consecuencia son conocidas como ERK1/2. Estas MAP cinasas son activadas por la doble fosforilación de sus residuos de treonina y tirosina (ERK1: Thr-202 y Tyr-204; ERK2: Thr-183 y Tyr-185). ERK 1/2 fosforila más de 100 posibles sustratos celulares y está implicada en la transmisión de las señales extracelulares en vías que inducen diferenciación, desarrollo y apoptosis [Shaul et al., 2007; Ebisuya et al., 2005; Canagarajah et al., 1997]. La fosforilación de ERK1/2 durante los primeros minutos de la reperfusión reduce los procesos de apoptosis y preserva la integridad mitocondrial. La activación de ERK1/2 está asociada con la reducción del 40-50% del IS. La interacción ligando-receptor entre autacoides (adenosina, bradicinina y opioides) y GPCRs promueve la fosforilación de ERK1/2 en sus residuos de treonina y tirosina; esta fosforilación conlleva a la activación de proteínas anti-apoptóticas río abajo como p70S6K. Además, se ha reportado que PHO-ERK1/2 reduce la liberación de citocromo-c (Cyt-c) de la mitocondria, inhibe la apertura del mPTP y mejora el metabolismo energético del miocito a través de la fosforilación de eNOS y GSK3β en animales sanos [Rahman et al., 2011] como lo muestra la figura 6 y 7. c. Óxido Nítrico (NOŸ) El óxido nítrico (NOŸ) es un radical libre que induce cardioprotección a través de la guanilato ciclasa (GC) y la activación de PKG y PKC [Yang et al., 2005]. Ambas cinasas activadas por cGMP tienen la capacidad de modular los canales mK+ ATP e inhibir la apertura del mPTP. Además, diversas investigaciones han demostrado que el NOŸ puede modificar directamente residuos de cisteínas por s-nitrosilación, una modificación postranscripcional que comienza a asociarse fuertemente con cardioprotección (Figura 6) [Sun et al., 2015].   24   adenosina bradicinina opioides enzimas a ntioxida ntes (;§¡x;; , Figura 6. Transducción de señales en el poste. La imagen muestra la activación de los dos principales componentes de la vía de RISK: PI3K1Akt y MEKlERK1I2. Diversos autacoides (adenosina, bradicini- na y opioides) son liberados durante la etapa temprana de la reperfusión; la interacción de estos ligando s con sus receptores tipo GPCR promueven la activación de Ras y RAF, Y río abajo la fosforilación de p70S6K, eNOS, PKG y GSK3~. La activación de los componentes de la vía de RISK resulta en la inhibición de la apertura del mPTP vía GSK3~. La vía PKG/PKC induce protección mitocondrial a través de la apertura intermitente de los canales mK+ ATP (mostrado a detalle en la Figura 7). Las abre- viaturas se encuentran en en el apartado iii.   25   \- "~ ... , \ ROS :' \, ~.c.!.- ...... \ , ... ... 0,- 2 ~ , " Mitocondria eNOS "é'J) ~ ~ ~ (itosol Figura 7. Posible mecanismo de protección mitocondrial por efecto del Poste. La producción de GMPc y la subsecuente activación de PKG inhiben la apertura del mPTP a través de la activación de una población de PKCd ubicada en espacio intermembrnal de la mitocondria. La activación de esta cinasa hipotética induce la apertura de los canales mK+ ATP e incrementa ligeramente los niveles de ROS. Se piensa que la aper- tura intermitente de los canales mK\TP induce la activación de la PKCE2 que inhibe directamente la apertura del mPTP. Simultaneamente, los niveles de ROS producidos durante el PostC también promueven la activi- dad de los canales de potasio y de PKCE2. Potencial transmembranal mitocondrial ~ 'Pm; I, lI, lII, IV, com- plejos respiratorios; Cyt-c, citocromo-c. La abreviaturas se encuentran en el apartado iii. Modificado de Costa [Costa y Garlid, 2008].   26   12. Factores implicados en la pérdida de la cardioprotección por PostC Condiciones patológicas como la diabetes [Sasaki et al., 2007], la obesidad [Katakam et al., 2007] y la hipertensión [Ebrahim et al.,2007] alteran los beneficios del acondicionamiento mecánico. Los posibles mecanismos implicados en la pérdida de la protección han sido poco estudiados; sin embargo, es razonable predecir que las principales vías de señalización implicadas en inducir supervivencia como lo es la vía de RISK podrían estar alteradas en estos estados patológicos, así como en la hipertrofia cardiaca y la cardiomiopatía dilatada, donde prevalece el estrés oxidante y predominan los cambios en el metabolismo energético (Figura 8). a. Hipertrofia Cardiaca (CH) La hipertensión está fuertemente asociada al desarrollo de remodelación hipertrófica ventricular vía sobrecarga de presión. El estrés sobre la pared ventricular izquierda estimula la activación del sistema renina-angiotensina promoviendo el aumento de tamaño de los miocitos, la remodelación intersticial y la activación de metaloproteinasas de matríz [Patel y Mehta, 2012]. En adición, durante la hipertrofia disminuyen los niveles de mRNA de SERCA, RyR y fosfolamban; hay modificaciones en el manejo de Ca2+ predisponiendo al desarrollo de patologías valvulares y cardiomiopatía dilatada hipertensiva [Hill, 2003]. b. Cardiomiopatía dilatada (DCM) La cardiomiopatía dilatada (DCM) es una enfermedad del miocardio asociada al deterioro ventricular. La DCM se define como el acortamiento fraccional del ventrículo izquierdo sistólico (fracción de acortamiento de <25% ó fracción de eyección de 45%) asociada a la dilatación del ventrículo izquierdo (diámetro tele diastólico ventricular izquierdo >117% del valor predicho por la fórmula de Henry) [Destrona et al., 1999; Henry et al., 1980]. La dilatación ventricular generalmente es secundaria a la hipertrofia y manifiesta pérdida del metabolismo oxidativo y de la función de los canales mK+ ATP [Meyer et al., 2013].   27   Hipertrofia y Cardiomiopatía dilatada (DCM) Sobrecarga de presión ~ Hipertensión j Estímulo patológico Respuesta neurohormonal ) Ang-II endotelina noradrenalina ( MAPK ( Genes fetales Corazón Estrés hemodinámico Hipertrofia ventricular -Incremento de la masa de los miocitos - Metabolismo glucolítico - Expresión de genes fetales - Fibrosis AMI Infarto agudo al miocardio Cardiomiopatía dilatada (DCM) - Muerte celular - Fibrosis - Metabolismo glucolítico - Disfunción mitocondrial - Estrés oxidante Figura 8. Hipertrofia y Cardiomiopatía dilatada. La ilustración muestra la remodelación miocárdica por efecto de la sobrecarga de presión sobre la pared ventricular. Si el estrés hemodinámico persiste, cambios deletereos producirán la pérdida del tejido contractil provocando la dilatación ventricular. LV, ventrículo izqui- erdo; Ang-Il, angiotensina-Il; GPCR, receptor acoplado a proteínas G.   28   III. ANTECEDENTES El beneficio generalizado derivado de la aplicación del PostC en modelos experimentales apoya su utilización en el esquema general de cardioprotección en pacientes con infarto agudo. Sin embargo, las enfermedades isquémicas se desarrollan como consecuencia de un gran número de etiologías que coexisten con estados patológicos como por ejemplo la hipertensión arterial sistémica asociada a la hipertrofia del ventrículo izquierdo, la aterosclerosis, la diabetes, la falla cardiaca y el envejecimiento, que potencialmente pueden modificar el efecto benéfico de la terapia de cardioprotección [Peart y Headrick, 2009; Lecour et al., 2014]. Se sabe que bajo condiciones de co-morbilidad, la expresión y actividad de los componentes de la vía de RISK está alterada [Lecour et al.,2014]. En este sentido, se ha demostrado que en el envejecimiento PKC está presente pero su capacidad de translocación está reducida [Takayama et al., 2001]. Además, en un modelo de ratas con resistencia a la insulina se ha observado que la cantidad de canales mK+ ATP es similar a la de animales sanos, sin embargo, el estrés oxidante que persiste en la diabetes reduce la función del canal [Katakam et al., 2007]. Ratas con síndrome metabólico (WOKW: Wistar-Ottawa-Karlsburg W) pierden por completo la capacidad de protección por PostC debido a la incapacidad de activar a ERK1/2 [Wagner et al., 2008]; de hecho, se han identificado alteraciones en la activación de esta cinasa en el miocardio diabético y envejecido [Pryzklenk et al., 2008]. Adicionalmente, en un modelo de obesidad (ratones mutantes ob/ob, deficientes de leptina), la pérdida de la función de ERK1/2 se atribuye a la alta actividad de fosfatasas [Bouhidel et al., 2008]. En contraste, animales con hipertrofia o hipertensión mantienen la protección a través de la vía RISK, mientras que ratas diabeticas (New Zealand genetically hypertensive rats) con post-acondicionamiento no recuperan la función ni los niveles de PHO- ERK1/2 [Przyklenk et al., 2011]. A pesar de las posibles alteraciones sobre la actividad de los componentes de la vía señalización de RISK, las cinasas también pueden amplificar la señal a través de una gran variedad de interacciones con componentes alternos a su vía canónica. Al respecto, se sabe que la activación en paralelo de PI3K/Akt y MEK/ERK1/2 durante el PostC converge sobre blancos río abajo comunes. En este sentido, se ha propuesto que la ausencia en la actividad de alguno de los componentes de la vía de RISK, potencialmente pueden generar puntos de convergencia entre ambas vías para conservar el efecto de cardioprotección. De hecho, Hausenloy y Yellon demostraron que p70S6K es un punto de convergencia entre PI3K/Akt y MEK/ERK1/2 y que estas dos vías interactúan de tal manera que inhibir cualquiera de ellas estimula la actividad de la otra vía en respuesta compensatoria, asegurando que la señal sea ejecutada [Hausenloy et al., 2004]. Es claro que la tolerancia al daño por reperfusión y los efectos del post-acondicionamiento se modifican en presencia de factores de riesgo cardiovascular. Para determinar los cambios relacionados con la remodelación del miocardio, las vías PI3K/Akt y MEK/ERK1/2 fueron analizadas en este trabajo.   29   IV. JUSTIFICACIÓN El beneficio generalizado del PostC en el ámbito experimental consolidó la idea de llevarlo a la práctica clínica; sin embargo, los resultados obtenidos hasta la fecha son inconclusos y poco alentadores. De acuerdo con la Sociedad Europea de Cardiología (European Society of Cardiology (ESC) Working Group (WG) Cellular Biology of the Heart Position Paper 2014) los factores de riesgo cardiovascular o comorbilidades afectan la eficacia de las terapias contra el daño por reperfusión. Por lo tanto, debido al potencial terapéutico que tiene el PostC es de interés evaluar si esta estrategia preserva los efectos benéficos de protección en corazones con hipertrofia ventricular y con cardiomiopatía dilatada hipertensiva. Tomando como base lo antes mencionado y con el fin de contribuir al estudio de la integración de señales intracelulares que confieren protección miocárdica contra el daño por reperfusión, planteamos investigar primero si el PostC confiere cardioprotección en un modelo de hipertrofia experimental y que deriva en cardiomiopatía dilatada; segundo, si hay cambios en la activación de las vías canónicas de señalización de PI3K/Akt y MEK/ERK1/2 y finalmente cuál es el papel de estas cinasas sobre la función mitocondrial, particularmente sobre el mPTP, que es el efector final de muerte celular en el daño por reperfusión.   30   V. HIPÓTESIS Si la intervención del post-acondicionamiento (PostC) activa la vía de señalización RISK para evitar el daño por reperfusión en corazones con infarto agudo al miocardio, entonces la presencia y activación de MEK/ERK1/2 en corazones con hipertrofia estable y en aquellos corazones que hayan evolucionado a cardiomiopatía dilatada hipertensiva, garantizará la efectividad de la maniobra del PostC cuando los corazones con remodelación severa se encuentren ante un evento de isquemia aguda. VI. OBJETIVOS 1. Objetivo general Evaluar el efecto del post-acondicionamiento y el papel de MEK/ERK1/2 en dos estados de remodelación miocárdica patológica por efecto de la hipertensión: en hipertrofia cardiaca (CH) y en corazones con cardiomiopatía dilatada (DCM). 2. Objetivos particulares En modelo aislado Langendorff: a. Determinar los niveles basales de ERK1/2 y de las principales cinasas involucradas en la cardioprotección en corazones CH y DCM b. Evaluar el efecto del PostC en corazones CH y DCM c. Determinar la importancia de la vía de ERK1/2 en corazones CH y DCM d. Obtener la cinética de activación de ERK1/2 en corazones DCM e. Analizar la posible asociación de ERK1/2 con proteínas blanco para inducir cardioprotección en corazones DCM En corazones DCM en modelo in vivo: a. Determinar el papel de ERK1/2 en la señalización de cardioprotección del PostC b. Determinar la posible asociación de ERK1/2 con blancos mitocondriales para inducir cardioprotección   31   VII. MATERIAL Y MÉTODOS Esta investigación se llevó a cabo conforme la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio publicado por el Instituto Nacional de Salud de Estados Unidos (US-NIH: United States National Institutes of Health) (NIH publication 85-23,1985) y fue aprobado por el comité de ética del Instituto Nacional de Cardiología I. Ch. El trabajo experimental ha seguido las normas de la Norma Oficial Mexicana para el uso y cuidado de los animales de laboratorio (NOM-062-ZOO- 1999) y para la eliminación de los residuos biológicos (NOM-087-ECOL-1995). 1. Modelo experimental CH y DCM Bombas osmóticas (Alzet Osmotic pumps, Durect Corporation, Cupertino Palo Alto, CA) con angiotensina-II (Ang-II) humana (Sigma-Aldrich, St. Louis OM) fueron implantadas quirúrgicamente en el área escapular de ratas Wistar macho de 400-450g. Grupo hipertrofia cardiaca (CH): se perfundieron 320 ng • kg-1• min-1 de Ang-II durante 7 días. Grupo cardiomiopatía dilatada (DCM): la perfusión de Ang-II fue de 435 ng•kg-1•min-1 durante 14 días. Los grupos Sham- CH y Sham-DCM se refieren a los animales experimentales que cursaron por el mismo procedimiento quirúrgico pero sin perfusión de Ang-II. 2. Marcadores de remodelación cardiaca La presión sistólica (SP) se evaluó diariamente mediante un método no invasivo, conectando el transductor de pulso a la cola del roedor (Narco Biosystems, Austin Texas). Al final del tratamiento los corazones y pulmones de todos los grupos experimentales se pesaron y se estableció la relación entre peso del corazón/peso corporal (HW/BW) y peso del pulmón/ peso corporal (LW/BW). Se realizaron análisis histológicos utilizando la técnica de hematoxilina-eosina (H&E) y se determinaron los niveles de metaloproteinasa de matriz tipo 2 (MMP-2). Adicionalmente, se realizaron mediciones de ecocardiografía y análisis de perfusión por SPECT (SPECT). a. Análisis por Ecocardiografía Para el análisis de estructura y función ventricular se obtuvieron imágenes de ecocardiografía mediante un ecocardiografo Sonos 55000 (Koninlijke Philips Electronics, Eindhoven, The Netherlands) y un transductor de 12-MHZ. Las imágenes fueron obtenidas en el eje largo y corto paraesternal de ratas anestesiadas. Se realizó ecocardiografía bidimensional en modo-M guiada y las determinaciones se realizaron al menos en 3 latidos por cada rata. Las medidas de la cavidad y el grosor de la pared del ventrículo izquierdo fueron obtenidas para determinar la fracción de eyección (EF) y la fracción de acortamiento (FS) de acuerdo a las siguientes fórmulas: %EF=[(EDV-ESV/EDV) X 100] y %FS=[(LVDd-LVSd/LVDd) X 100] [Wandt et al., 1999] b. Análisis histológico H&E El corazón se cortó en segmentos de 0.25cm de ancho que fueron fijados por inmersión en una solución de paraformaldehído al 4%, deshidratados y embebidos en parafina. Secciones delgadas de tejido de 2µm fueron teñidas con hematoxilina y eosina (H&E) y analizadas con un microscopio de luz Leica (Cambridge, UK). En los cortes de corazón, se analizaron   32   los perfiles histológicos de nueve campos 10X seleccionados al azar por corazón de rata (n=6 por grupo) y se registró el tamaño de la pared del ventrículo izquierdo. c. Evaluación por SPECT La perfusión miocárdica de animales CH y DCM se determinó por tomografía computarizada de emisión de monofotones, SPECT. Las ratas fueron anestesiadas con pentobarbital sódico vía intraperitoneal (60mg/kg-1) y recibieron un dosis de 201Tl (150µCi) vía intravenosa. Después de 15 minutos de estabilización se adquirieron 32 proyecciones de 128X128 pixeles con una gamma-cámara equipada con 36 tubos fotomultiplicadores dispuestos para una visión de campo de 370 X 370 mm (Milenio MPR/MPS gamma- camera; General Electric). La distribución en la fase de reposo fue adquirida durante 54 minutos. Las proyecciones se transfirieron y almacenaron en formato DICOM en una estación de procesamiento (Xeleris 2.1753; GE Healthcare) y las imágenes fueron procesadas con el software SPECT Quantitative Gated SPECT/Quantitative Perfusion SPECT. El algoritmo de reconstrucción iterativa fue OSEM (Ordered Subsets Expectation Maximization) y el filtro Butterworth fue utilizado para el filtrado de los cortes. La resolución espacial de las imágenes fue de 3X3mm. 3. Preparación de corazón aislado: Langendorff Los animales CH y DCM fueron anestesiados vía intraperitoneal con 40mg/kg de pentobarbital sódico en presencia de heparina sódica (10 U/kg). Minutos después se ingresó a la pared abdominal y se seccionó por la línea del tórax hasta el cartílago xifoides. Posteriormente, se realizó una toracotomía aislando el segmento proximal de la aorta para retirar el corazón del animal. En seguida, los corazones fueron montados y perfundidos de manera retrograda vía aorta en el aparato de perfusión de Langendorff [Langendorff, 1895] con un flujo constante de 12 ml/min con medio Krebs-Henseleit (4.3 mM de glucosa a una atmósfera de 95% de O2 y 5% de CO2 a 37 0C) [Krebs et al., 1932]. El trabajo cardiaco (TC) de los corazones experimentales aislados fue monitoreado introduciendo un balón de látex en el ventrículo izquierdo al que se conectó un transductor de presión (Figura 9A). a. Protocolos experimentales: isquemia/reperfusión y PostC. Los grupos experimentales CH y DCM se dividieron en 7 subgrupos de 12 ratas cada uno para evaluar los siguientes protocolos: perfusión (P), isquemia/reperfusión (I/R), post-acondicionamiento (PostC), post-acondicionamiento más inhibidor U0126 (PostC+U), post-acondicionamiento más inhibidor LY294002 (PostC+LY), perfusión más U0126 (P+U), perfusión más LY294002 (P+LY). Adicionalmente, nueve subgrupos fueron formados con el objeto de evaluar la cinética de activación de ERK1/2: estabilización (S20), a los 5 minutos de isquemia (I5), a los 20 minutos de isquemia (I20) y a los 5, 10 y 60 minutos después de la reperfusión con y sin PostC (I/R5, I/R10, I/R60, PostC5, PostC10 y PostC60 respectivamente). Todos los protocolos probados en el sistema de Langendorff se resumen en la figura 9A.   33   Isquemia: Se produjo isquemia total con duración de 30 minutos, cerrando la perilla del flujo que alimenta con medio Krebs-Henseleit al corazón en el sistema de Langendorff. PostC: La maniobra de post-acondicionamiento consistió en la aplicación de 5 ciclos de reperfusión y reoclusión con 30 segundos de duración cada uno. Después de la aplicación de los ciclos, el corazón se reperfundió durante 60 minutos. Además, el tiempo de estabilización se utilizó alternativamente para inhibir a la cinasa ERK 1/2 con 500 nM del compuesto U0126 o a PI3K con 500 nM de LY294002 (Figura 9A). 4. Modelo de corazón in vivo Treinta y dos ratas DCM fueron intervenidas con una incisión en la línea media cervical para realizar una traqueotomía. Los roedores fueron ventilados mecánicamente a una tasa de 60 respiraciones por minuto con volumen de 1ml/100g de peso corporal. Después de la traqueotomía, se midieron parámetros hemodinámicos con un catéter de presión-volumen SPR-869 Mikro-Tip (Millar Instruments, Houston, TX). Los registros de electrocardiograma fueron obtenidos usando los tres electrodos estándar (Figura 9B). a. Protocolo experimental Los animales DCM fueron divididos en 4 subgrupos para la evaluación de los protocolos: perfundidos (P), isquemia/reperfusión (I/R), post-acondicionamiento (PostC) y post- acondicionamiento más U0126 (PostC+U). Isquemia: Se realizó una oclusión en la arteria coronaria descendente izquierda (CAO) con una sutura de nylon 6-0. La oclusión genera la isquemia localizada del ventrículo izquierdo y se logró apretando el nylon alrededor de la arteria durante 5 minutos (Figura 10). PostC: El post-acondicionamiento consistió en la aplicación de tres ciclos de reperfusión de 30 segundos y 30 segundos de reoclusión inmediatamente después del evento isquémico (Figura 10). 5. Determinación del tamaño del infarto (IS) Corazones de los diferentes grupos experimentales se congelaron a -30°C y se cortaron en rebanadas de aproximadamente 3mm. Las rebanadas se incubaron en una solución de cloruro de trifeniltetrazolio (TTC) al 1% (w/v) con buffer de fosfatos pH 7.4 durante 25 minutos a 37oC. Al finalizar la incubación, los cortes del corazón se montaron entre dos placas de vidrio para hacer el análisis de la tinción diferencial entre las zonas sanas y las zonas de infarto en el corazón.   34   6. Preparación de homogenados tisulares El ventrículo izquierdo fue extraído y congelado a -70ºC. El tejido se homogenizó con un politrón Brinkmann Modelo PT 2000 (Westbury, NY, USA) en una solución amortiguadora RIPA pH8.0 (NaCl 150mM, TRIS-HCl 50mM, IGEPAL 0.5%, EGTA 5mM, NP-40 1%, MgCl2 1mM, cocktail anti-proteasa). Los homogenados se centrifugaron a 3,000g y se conservó la fracción del sobrenadante. En los sobrenadantes se determinaron diferentes proteínas de interés para esta investigación (MMP-2, MEK1/2, ERK1/2, PHO-ERK1/2, PI3K, PHO-PI3K, Akt, PHO-Akt, GSKβ, caveolina, eNOS, etc). La concentración de proteína de los homogenados se determinó de acuerdo al método descrito por Lowry et al (1951). 7. Evaluación de ERK1/2 y PHO-ERK1/2 a. Activación de ERK1/2 Cantidades equivalentes de proteína del ventrículo izquierdo (100µg) fueron separadas por SDS-PAGE y transferidas a membranas de floruro de polivinilideno. La cinética de activación de ERK1/2 fue obtenida a partir de muestras tomadas a diferentes tiempos de la reperfusión (Figura 10A). b. Efecto de U0126 en el PostC Los corazones de los grupos PostC+U recibieron la perfusión de 0.5 mM del inhibidor U0126 (Cell Signalling Technology) un inhibidor específico de la cinasa MEK. U0126 fue perfundido durante la maniobra del PostC y durante toda la reperfusión. Al final del experimento, los corazones fueron congelados rápidamente para determinar la relación ERK1/2/PHO-ERK1/2 por la técnica de electrotransferencia tipo western blot. c. Niveles de ERK1/2 y PHO-ERK1/2 en fracciones mitocondriales Cantidades equivalentes de proteína mitocondrial (100µg) fueron separadas por SDS-PAGE para analizar por técnica de electrotransferencia tipo Western Blot la presencia de PHO- ERK1/2 en las fracciones mitocondriales. 8. Aislamiento y purificación de mitocondrias Al término del periodo de isquemia/reperfusión, los corazones fueron desmontados para obtener las mitocondrias en solución Sacarosa-Tris-EGTA helada (sacarosa 250 mM, Tris-Na 10 mM, EGTA 1mM) pH 7.3 en presencia de subtisilina A. Posteriormente, se obtuvieron las fracciones mitocondriales por centrifugación diferencial como lo reportaron Chávez et al. (1989). La concentración de proteína fue cuantificada por el método de Biuret. 9. Determinación del potencial de membrana mitocondrial La determinación cuantitativa se hizo mediante la distribución de tetrafenilfosfonio [H3] TPP+. Se resuspendieron 2mg de proteína en 0.5 ml de medio KME (K2HPO4 5mM, succinato 10mM, rotenona 1µM y [H3] TPP+ 0.8µm) y se incubaron durante 4 minutos. Se adicionó ADP 10mM al   35   medio e inmediatamente se centrifugó a 14000 rpm por 10 min a 4°C en una microcentrífuga. Al término se tomaron 150µl del sobrenadante y se resuspendió el botón en el mismo volumen de una solución de SDS al 0.5%. [Rottenberg, 1984]. El potencial transmembranal se calculó de acuerdo a la ecuación de Nernst, considerando los coeficientes de partición reportados para el TPP+ [Rottenberg, 1984] ΔΨ = RT/ZF ln (RCVO - KO) / (Vi+Ki) a 30°C es igual a ΔΨ = 60mV log (RCVO - KO) / (Vi+Ki) donde RC = La relación entre el contenido del catión en las mitocondrias y en el medio. VO = volumen del medio externo Vi = volumen de la matriz mitocondrial (1µl • mg de proteína) KO = Coeficiente de partición interno del TPP+ (7.9 µl • mg de proteína) Ki = Coeficiente de partición externo del TPP+ (14.3 µl • mg de proteína) 10. Transporte de Ca2+ mitocondrial Los cambios en la permeabilidad de las mitocondrias se evaluaron mediante la medición de la dinámica del Ca2+ mitocondrial. La retención y liberación de calcio mitocondrial se evaluó mediante espectrofotometría en un espectro doble haz a 675-685 nm utilizando el colorante metalocrómico arsenazo III (50µM). Se utilizaron 2.8mL de un medio con 125 mM de KCl, 10mM de Hepes y 3mM de fosfato inorgánico (Pi) pH7.3, complementado con 200µM de ADP, 2µM de rotenona y 100µM de CaCl2. La reacción se inició mediante la adición de 2mg de mitocondrias íntegras [Kendrick, 1976]. 11. Oxidación de proteínas mitocondriales La oxidación de proteínas mitocondriales se determinó mediante OxyBlotTM (OxyBlot Kit; CHEMICON, Temecula, CA). Los residuos carbonilo de las proteínas modificados por oxidación son derivatizados a 2,4-dinitrofenilhidrazona (DNP-hydrazone) por la reacción con DNPH. Las membranas PVDF se incubaron durante 24 horas a 4ºC con anticuerpos específicos que identifican a las proteínas con la fracción DNP. 12. Determinación de fosforilación de proteína mitocondrial Las proteínas fosforiladas fueron detectadas directamente en geles usando un kit de tinción (GelCode® phosphoprotein staining Kit, Pierce Chemical, Rockford, IL). 13. Determinación de la translocación de ERK1/2 a la mitocondria Para determinar la translocación de ERK1/2 citosólica hacia las membranas mitocondriales utilizamos la estrategia experimental de Quinlan et al. (2008) empleada para purificar complejos multimoleculares de señalización con modificaciones menores. Brevemente, las mitocondrias se purificaron en gradientes de 40-60% de Percoll y se obtuvieron dos fracciones, una fracción de alta densidad que contiene mitocondrias purificadas y una fracción de baja densidad que se reporta contiene moléculas de señalización. El grado de purificación de las moléculas señal (SM) se evaluó   36   mediante la medición del enriquecimiento de caveolina y la disminución del translocador ANT. En las moléculas señal y en las fracciones citosólicas se determinó el contenido de ERK1/2 y PHO- ERK1/2. 14. Análisis estadístico Todos los datos se expresan como la media ± SD. Los datos de los valores hemodinámicos y de otras determinaciones dependientes del tiempo fueron comparadas por mediciones repetidas ANOVA seguidas por análisis post hoc. Los análisis de una sola variable como el IS fueron comparados por ANOVA de una sola vía seguida por la prueba de Duncan. P<0.05 fue considerado estadísticamente diferente.   37   A Recipiente con medio de perfusión intercambiador de calor B ••• Figura 9. Esquema simplificado del sistema de Langendorffy del modelo de corazón in vivo. A) Muestra el sistema de Langendorff a presión y flujo constante. El corazón es canulado vía aorta y perfundido en forma retrógada dentro de un compartimento que lo mantiene a 37°C. La presión del ventrículo izquierdo (LV) se obtiene a través de la inserción del transductor de presión dentro de la cavidad ventricular. La bomba peristáltica administra el medio de perfusión a flujo y presión constante (12mIlmin). Todo el sistema de tubería y cámaras estan contenidos dentro de una cobertura para mantener el medio de perfusión a 37 oc. B) En el sistema de corazón in vivo, los animales son ventilados mecánicamente y los parámetros hemodinami- cos son obtenidos a través de un catéter de presión-volumen SPR-869 Mikro-Tip. El electrocardiograma (ECG) es obtenido con los electrodos para roedores ADinstruments.   38   A B Tiempo(min) 1 1 1 1 o 20 30 110 P I/R PostC 11111 PostC+ U PostC+LY P+ U P+LY Cinética de activación de ERK1 /2 Tiempo (min) 1 1 1 O 20 30 110 5'0 c=::J Is .: :::: ::: :::: ::: :::: ::: :::: ::: :::: ::: :::: ::: ::~ 1 20 I/Rs I/R lO I/R 60 PostCs PostC,o PostC 60 c=:...-_ -_ -_ -_ -_ -_ -_ -_ -_ -_ -_ -_ -_ -_ -_ -_ -_ -_ -_ -_ -_ -_ -_ -_ -_ -_ -_ -_ -_ -_ -_ -_ -_ -_ -_ -_ -_ -_-_ C=:J ____ lIllllIIIDI==::::JI.~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ c=:J ____ lIllllIIIDI=====:Ji ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 11111 Tiempo (min) 1-1 --+1 ----+1 -----------l O 10 15 30 P ~I ______________ ~ CAa. I/R IC==-___ ========::::J CAa • PostC [1 ==-___ mIlDI========:J CAa U • • PostC + U [1 ==-___ DIIIII========::JI P+U I~--------------~ c=J estabilización _ isquemia c=J reperfusión mm PostC c=J U0126 c=J LY294002 c=J estabilización _ isquemia c=J reperfusión [[(1] PostC c=J U0126 Figura 10. Protocolo experimental. A) Protocolo experimental empleado para el modelo de corazón aislado en el sistema de Langendorff. B) Protocolo probado en el modelo de corazón in vivo. P, perfusión; I/R, isque- mia/reperfusión; PostC, post-acondicionamiento; PostC+U, post-acondicionamineto + 500nM de U0126; Post- C+LY, post-acondicionamiento + 500nM de LY294002; P+U, perfusión + 500nM de U0126; P+LY, perfusión + 500nM de LY294002; CAO, oclusión de la arteria coronaria izquierda; S, estabilización; 1, isquemia.   39   VIII. RESULTADOS 1. Modelo de Hipertrofia Cardiaca (CH) y Cardiomiopatía dilatada (DCM): Marcadores de Remodelación cardiaca Al final del tratamiento con angiotensina-II, el análisis histológico de los corazones del grupo CH reveló engrosamiento de la pared ventricular izquierda y reducción del radio de la cavidad ventricular; además las miofibrillas fueron de mayor tamaño en el grupo CH que las miofibrillas del grupo Sham (Figura 12A). El grupo de hipertrofia cardiaca incrementó la presión sistólica (168 ± 9 mmHg en el grupo CH vs. 109 ± 10 mmHg en el grupo Sham). La relación HW/BW fue estadísticamente mayor que la del grupo Sham (2.8 ± 0.4 g/kg vs. 4.6 ±0.2 g/kg) mientras que la relación LW/BW no mostró cambios (Tabla1). En el grupo DCM aumentó la presión arterial sistólica de 109 ± 10 mmHg a 219 ± 14 mmHg. El grupo DCM perdió peso corporal (445 ± 13.2 vs. 221 ± 13 g en el grupo Sham) durante los 14 días de tratamiento, así como masa ventricular (Figura 12A). El peso del corazón (HW/BW) incrementó y en la relación LW/BW se observó una tendencia a incrementar, sin embargo no hubo cambios significativos (Tabla1). a. SPECT El análisis por SPECT de los valores obtenidos por la retención de cloruro de talio-201 (201Tl), reveló alteraciones en la perfusión ventricular de los animales con DCM mientras que el grupo Sham y CH no se mostraron cambios en la perfusión ventricular (Figura 12B). b. Ecocardiografía Las imágenes obtenidas por ecocardiografía mostraron cambios importantes en los corazones con hipertrofia cardiaca así como en el grupo DCM. En el grupo CH, el grosor del septo interventricular (IVS), el LVDd y LVSd presentaron una tendencia a aumentar, sin embargo no hubo cambios importantes en la fracción de eyección (EF) ni en la fracción de acortamiento (FS) con respecto al grupo Sham. El grupo DCM perdió función sistólica con un incremento del 28% en LVSd y la reducción del 25% en la fracción de eyección en comparación con el grupo Sham (67±14% vs 88± 12%; P<0.05; Tabla1, Figura 13A). c. Péptido natriurético atrial (ANP) y metaloproteinasa de matriz-2 (MMP-2) Diversos estudios han demostrado que durante la hipertrofia cardiaca y la cardiomiopatía dilatada incrementan los niveles de metaloproteinasas [Zhang et al., 2015]. En particular niveles elevados de MMP-2 han sido asociados con cardiomiopatía dilatada. En el grupo CH y DCM incrementaron los niveles de MMP-2 (Figura 11A). Adicionalmente, los niveles de péptido natriurético atrial (ANP), un marcador positivo de falla cardiaca se observó en el grupo DCM (Figura 11B). En general, el análisis en conjunto de los datos sugieren que la administración de Ang-II a las dosis empleadas generan hipertensión, hipertrofia del ventrículo izquierdo (grupo CH) y que su progresión produce pérdida de la función sistólica (grupo DCM).   40   2. Niveles basales de PHO-PI3K, PHO-Akt, PHO-MEK, PHO-ERK1/2 en ventrículos de corazones CH y DCM El contenido basal de proteína total de PI3K, Akt, MEK y ERK1/2 no cambió entre los grupos. PHO-Akt, PHO-MEK y PHO-ERK1/2 mantuvieron niveles similares en el grupo CH y DCM con respecto al grupo Sham; sin embargo, el grupo DCM mostró una reducción significativa en el contenido de PHO-PI3K con respecto al grupo Sham y CH (P<0.001; Figura 13B). 3. Efecto del post-acondicionamiento sobre la función cardiaca en corazones Sham, CH y DCM Corazón aislado: Sistema de Langendorff El análisis de la función cardiaca de corazones CH durante 110 minutos de perfusión mostró un incremento significativo en el doble producto al inicio y durante el experimento (32,914 ± 1,705 mmHg x latidos x min-1) comparado con los corazones Sham (21,711 ± 186 mmHg x latidos x min- 1). Ambos grupos, Sham y CH perdieron progresivamente el doble producto durante en el protocolo de I/R; mientras que bajo el protocolo de PosC la función cardiaca se mantuvo tras la isquemia y la reperfusión (Figura 14 A y B). En las preparaciones DCM, se observó una pérdida del 52% del doble producto en el protocolo de perfusión (de 32, 101 ± 3, 890 mmHg x latidos x min-1 a 16, 604 ± 1, 847 mmHg x latidos x min-1) revelando la sensibilidad del tejido y por lo tanto mayor susceptibilidad al daño por reperfusión. Sin embargo, el PostC preservó la función cardiaca durante los 60 minutos de reperfusión (Figura 14A). a. Efecto del PostC sobre el tamaño del infarto en corazones CH y DCM: De acuerdo con los datos obtenidos del análisis de los corazones con TTC, el IS después de la isquemia y la reperfusión (I/R) fue de 36 ± 3% en el grupo Sham, 38 ± 2.4% en el grupo CH y 40 ± 2.4 % en el grupo DCM. El PostC redujo significativamente el tamaño del infarto (73% en Sham, 69% en CH y 71% en corazones DCM; Figura 16 A, B, C). b. Efecto del PostC sobre la activación de ERK 1/2 en corazones CH y DCM: El contenido de ERK1/2 y PHO-ERK1/2 en los corazones CH no mostró cambios relevantes entre los protocolos I/R y PostC (Figura 16E); mientras que en el grupo DCM, en el protocolo de I/R disminuyeron los niveles de PHO-ERK1/2 y se mantuvieron en el protocolo PostC (Figura 16F). 4. Efecto de la inhibición de ERK1/2 y PI3K en la cardioprotección por PostC en corazones CH y DCM a. Efecto del compuesto U0126 y LY294002 sobre la activación de ERK1/2 y PI3K en corazones CH y DCM: Para evaluar el papel de la vía de MEK/ERK1/2 y la vía de PI3K/Akt, empleamos inhibidores específicos de ambas vías. El inhibidor específico de MEK1/2, el compuesto U0126 (U) fue administrado durante el protocolo del PostC y durante toda la reperfusión; para determinar la importancia de la vía de PI3K, se perfundió el compuesto LY294002 (LY) de la misma forma. La cardioprotección se   41   mantuvo sin modificación en corazones Sham tratados con U o con LY (Figura 15B). El doble producto de los corazones CH disminuyó parcialmente tras la administración de U y LY (16,036 ± 4, 331 mmHg x latidos x min-1 en corazones PostC+U y 19, 017 ± 1, 605 mmHg x latidos x min-1 en corazones PostC+LY después de 60 minutos de reperfusión; Figura 15B). En el grupo DCM, el protocolo PostC+U produjo cambios deletéreos en la función cardiaca similares a los observados bajo el protocolo de I/R (3, 813 ± 2, 128 mmHg x latidos x min-1 vs 1, 056 ± 744 mmHg x latidos x min-1; Figura 15B). b. Efecto de U y LY sobre el tamaño del infarto en corazones Sham, CH y DCM: Ninguno de los inhibidores revirtió la disminución en el tamaño del infarto en corazones Sham o CH post-acondicionados. Sin embargo, la administración de U0126 en el grupo DCM con PostC incrementó el tamaño del infarto (34 ± 3% en PostC+U vs 12 ± 3% en PostC; Figura 17C). c. Efecto de U y LY sobre la activación de ERK1/2: Después de haber observado la pérdida progresiva del doble producto en los corazones DCM post-acondicionados así como el incremento del IS en los corazones tratados con U0126, determinamos por western blot los posibles cambios en los componentes de la vía canónica de MEK/ERK1/2 (Figura 18A). No observamos cambios en la actividad de las proteínas río debajo de MEK1/2, incluyendo a p70S6K (Figura 18B). Después relacionamos el efecto funcional (doble producto) con el nivel de fosforilación de la cinasa ERK1/2. Observamos una clara disminución en los niveles de fosforilación de la cinasa en los corazones DCM bajo el protocolo PostC+U. La función cardiaca de los corazones DCM correlacionó con los niveles de PHO-ERK1/2. También confirmamos que el inhibidor de PI3K no disminuye el contenido de PHO-ERK1/2 (Figura 19). d. Efecto de U y LY sobre la activación de PI3K/Akt: Aunque ya habíamos observado que los niveles basales de PHO-PI3K eran bajos en corazones DCM (Figura 13B) y que la inhibición de su inhibidor no evitaba el efecto protector del PostC (Figura 15C), decidimos confirmar si efectivamente se estaba disminuyendo la fosforilación de PI3K en estas condiciones. Los western blot fueron sobreexpuestos y así logramos observa que los niveles de PI3K permanecen sin cambios en los grupos P, I/R, PostC y PostC+U; sin embargo, PHO-PI3K fue sensible a la administración de LY (Figura 20A). También analizamos el contenido y la activación del sustrato de PI3K: Akt y PHO-Akt. Interesantemente, observamos aumento en la activación de Akt en corazones PostC, que disminuyó notablemente tanto en presencia de LY, como del inhibidor de MEK1/2 (Figura 20B). 5. Cinética de activación de ERK1/2 en corazones DCM Para determinar el tiempo de activación de ERK1/2 en corazones DCM post-acondicionados, se obtuvieron muestras de los corazones I/R y PostC a los 5 y 20 minutos de isquemia, y a los 5, 10 y 60 minutos de la reperfusión. Los niveles de PHO-ERK1/2 se conservaron constantes durante el periodo de estabilización y durante el inicio de la isquemia. A los 20 minutos de isquemia, los niveles de ERK1/2 fosforilada drásticamente disminuyeron y permanecen reducidos durante toda la reperfusión (Figura 21A). En los corazones DCM bajo el protocolo de PostC, la reactivación de   42   ERK1/2 se observó a los 10 minutos de reperfusión y se mantuvo así durante los 60 minutos (Figura 21B). 6. Cinética de activación de Akt en corazones DCM Debido a que Akt mostró actividad independiente de la fosforilación de PI3K, decidimos determinar el tiempo de activación de Akt bajo los mismos tiempos a los que se determinó ERK1/2. Observamos que la fosforilación de Akt bajo el protocolo I/R disminuye desde el minuto veinte de la isquemia y que permanece a niveles reducidos durante los 60 minutos de reperfusión (Figura 22A). Bajo el protocolo de PostC, la cinasa fosforilada se reduce desde el minuto 20 de la isquemia, pero se reactiva al minuto 10 de la reperfusión y permanece activa durante los 60 minutos de reperfusión (Figura 22B), siguiendo una cinética de activación muy similar a la de ERK1/2. 7. Efecto de Akt sobre la activación de GSK3β en corazones DCM GSK3β al ser fosforilada se inhibe y puede regular procesos de apoptosis. Ya que esta cinasa es blanco de Akt, determinamos los niveles de PHO-GSK3β en corazones DCM bajo los diferentes protocolos. Como los muestra la figura 23, los niveles de PHO-GSK3β aumentan significativamente bajo el protocolo PostC y dicho incremento es sensible al tratamiento con ambos inhibidores (U y LY; Figura 23). 8. Modelo in vivo en corazones DCM: Efecto del PostC sobre la función cardiaca, tamaño del infarto y la activación de ERK1/2 Aunque el modelo de corazón aislado nos permitió observar importantes diferencias entre las dos vías de protección activadas por el PostC, particularmente la estrecha relación entre la actividad de ERK1/2 y la protección de los corazones DCM, reconocemos que podría no reproducir muchos de los aspectos relevantes en la hipertrofia y en la cardiomiopatía dilatada que podrían ocurrir in vivo, como la regulación neurohormonal, la inflamación y otros mecanismos de compensación. El PostC evitó el daño por reperfusión en los animales DCM también en el modelo in vivo. Los corazones DCM post-acondicionados recuperaron el ritmo sinusal y la protección del PostC mostró sensibilidad al tratamiento con U0126. Observamos que la aplicación de los 3 ciclos de hipoxia y reoxigenación reducen el 60% del IS en comparación con los corazones que únicamente son reperfundidos (I/R) o que recibieron una dosis del inhibidor U0126. 9. Activación de ERK1/2 y el incremento en la fosforilación de la proteína mitocondrial de corazones DCM in vivo Comprobamos también en el modelo in vivo, conocido como “open chest” que la fosforilación de ERK1/2 es indispensable para inducir protección en animales con DCM [Hernández-Reséndiz et al., 2014]. Preparamos fracciones mitocondriales del ventrículo izquierdo de los corazones DCM sujetos a los diferentes protocolos experimentales y determinamos que existe una subpoblación de PHO-ERK1/2 asociada a mitocondrias que tiene como sustrato río abajo a GSK3β en corazones DCM in vivo (Figura 24A y 24B).   43   10. Asociación entre la apertura del mPTP y la actividad de ERK1/2 en corazones DCM Adicionalmente, nos interesó determinar si existía una correlación entre la actividad de ERK1/2 con el estado de fosforilación de otras proteínas mitocondriales. Observamos un claro incremento en los niveles de fosforilación en la fracción mitocondrial de corazones PostC, que disminuyó en presencia del inhibidor de ERK1/2 (Figura 25A). Ya que el estado de activación del poro de la transición de la permeabilidad mitocondrial determina los procesos de muerte celular durante la reperfusión, decidimos medir si su apertura podría ser modulada por la actividad de esta cinasa, para lo cual medimos parámetros que son indicativos de su apertura, como el transporte de calcio y el potencial transmembranal mitocondrial (Δψm). Lo que observamos fue que las mitocondrias de corazones DCM perfundidos fueron capaces de retener el calcio hasta que el potencial transmembranal se disipó por la adición del desacoplante CCCP. Por el contrario, las mitocondrias de los corazones bajo el protocolo I/R no fueron capaces de retener el calcio como consecuencia de la apertura del mPTP. Además, las mitocondrias I/R perdieron su Δψm (-79±10 mV vs. -156±13mV en corazones perfundidos). Interesantemente, los corazones PostC retuvieron el Ca2+ y preservaron el potencial transmembranal mitocondrial de -142 ± 11mV. El tratamiento con el inhibidor de ERK1/2 (PostC+U) revertió la condición protectora conferida por el PostC (Figura 25B y 25C). 11. Correlación entre la inhibición de ERK1/2 y los niveles de oxidación de la proteína mitocondrial Dado que las mitocondrias son la principal fuente generadora de especies reactivas de oxígeno en miocitos, determinamos el nivel de oxidación del contenido proteico mitocondrial. Utilizamos FeCl2 y H2O2 como control positivo y todas las muestras obtenidas de los protocolos de la Figura 10B fueron comparados contra este grupo. La proteína mitocondrial de corazones DCM mostró el 21% de carbonilación en corazones bajo el protocolo de perfusión, 78% en corazones reperfundidos y el 36% en corazones PostC (Figura 26). 12. Translocación de ERK1/2 del citosol a la membrana externa mitocondrial a través de complejos moleculares de señalización enriquecidas con caveolina-3 Finalmente evaluamos si el PostC induce la movilización de PHO-ERK1/2 del citosol hacia las mitocondrias o si en estos organelos existe una subpoblación que responde al estímulo del PostC. En la figura 27, se muestra que tanto PHO-Akt, como PHO-ERK1/2 y PHO- GSK3β se localizan preferentemente en el citosol en condiciones de perfusión; durante la reperfusión, la activación disminuye en ambos compartimentos, aunque la ubicación de la cinasas predomina en la fracción citosólica. Interesantemente, la determinación de PHO-ERK1/2, PHO-Akt y PHO- GSK3β en corazones DCM, nos mostró que los niveles de estas cinasas incrementan significativamente en la fracción mitocondrial cuando se aplica el post-acondicionamiento. Estos resultados nos sugieren que las cinasas son translocadas hacia la mitocondria aunque PHO-GSK3β también aumenta en la fracción citosólica en comparación con los niveles observados en el grupo I/R (Figura 28). El hecho de que la inhibición de ERK1/2 disminuyera la fosforilación de GSK3β en la mitocondria (Figura 24), nos sugiere que esta cinasa podría ser fosforilada tanto en la fracción citosólica como en la fracción mitocondrial. Finalmente, exploramos la posibilidad de que “moléculas señal” constituidas por caveolina-3 estuvieran involucradas en la interacción de PHO-ERK1/2, PHO-Akt y de otros   44   elementos de la vía de RISK (eNOS y GSK3β) con la mitocondria. Realizamos algunas modificaciones al protocolo descrito por Quinlan et al (1998), para obtener las moléculas señal y determinamos los niveles de las cinasas antes mencionadas bajo el protocolo de PostC. Una vez que las fracciones fueron separadas (mitocondrial y SM), observamos que la señal de PHO-ERK1/2, PHO-Akt, PHO-eNOS, PHO-GSK3β y caveolina-3 disminuye en la fracción mitocondrial y permanece en la fracción SM de los corazones PostC, lo que sugiere que estas estructuras favorecen el transporte de cinasas a la mitocondria. Interesantemente, la inhibición de la fosforilación de ERK1/2 no solo reduce la actividad de Akt y eNOS, también reduce el contenido de caveolina-3 sugiriendo que las moléculas de señalización son reclutadas preferentemente en su forma activa (Figura 28).   45   Tabla 1. Parámetros estructurales y funcionales de los grupos CH y DCM. Parametros Sham CH DCM Peso corporal (g) 445±13.2 370 ±1 O 221 ±13a Peso corazón (g) 1.3 ± 0.2 1.5 ±0.6 0.9 ±O.3 ab HW /BW (g/kg) 2.8 ± 004 4.6 ±0.2a 6.9 ±O.3 ab Peso pulmón (g) 2.5 ± 0.6 1.9 ±0.7a 2.1±0.2 LW /BW (g/kg) 5.3 ± 004 5.0 ±OA 604 ±0.3 IVS (mm) 0.6 ±0.04 2.2 ±0.3a 1.1 ±0.06a LVDd (mm) 5.1 ±1.2 4.1 ±0.5 4.6 ±0.9 LVSd (mm) 2.5 ±OA 1.9 ±0.2 3.2 ±0.2a EF (%) 88 ±12 92 ±10 67±14ab FS(%) 51 ±6 57 ±12 31.2±lOa b Parámetros funcionales HR (Iatidos/min) 410±12 270 ±14a 246 ±13 a Presión sistólica (mmHg) 109 ±10 168 ± 9a 219±14a b CH, hipertrofia cardiaca; DCM, cardiomiopatía dilatada; HW/BW, cociente peso corpo- ral/peso corazón; LW/BW, cociente peso corporal/peso pulmón; EF, fracción de eyección; FS, fracción de acortamiento; IVS, septo intraventricular; LVDd, dimensión del ventrículo izquierdo al final de la diástole; LVSd, dimensión del ventrículo izquierdo en telesístole de almenas 9 animales por grupo experimental y 6 animales por parámetro. ap-1 ------<1 I I I I >-1 -------< ERK1/2 F4i~B PHO-ERK1/2 (Thr202 ITyr 204) ~==========~ ==~~ ============~ 1 ~44 kD ~ ________________ ~.~42kD 6~ -----------------------------------' N -...... ;¿ o::: L.U 4 -...... N -...... ;¿ o::: Ll¡l 2 O I o... o a P I/R PostC PostC+U PostC+LY Figura 19. Efecto de U0126 y LY294002 sobre la activación de ERK1/2 en corazones post-acondicio- nados. La imagen muestra el westem blot representativo del contenido de ERK1I2 y PHO-ERK1I2 de seis preparaciones independientes de corazones DCM bajo diferentes protocolos. Las barras muestran la media ± SD de la relación PHO-ERK1I2 y ERK1I2 de seis experimentos. ap PHO-G5K3 E======3 (Thr 202/Tyr 204) == qa nn ERK112 | — GSK3p E 3 3 ab E N 1 Y L o a T T S a ma P VR PostC PostC+U P UR PostC PostC+U PH O- ER K1 /2 / E RK 1/ 2 po l PH O- GS K3 f / G SK 3f o e Figura 24. U0126 inhibe la fosforilación de ERK1/2 y GSK3f mitocondrial. Las imágenes muestran el western blot representativos con los niveles de A) PHO-ERK1/2, ERK1/2 y B) PHO-GSK3f, GSK3P de corazones DCM bajo el protocolo de perfusión (P), isquemia/reperfusión (1/R), post-acondiciona- miento (PostC) y PostC con inhibidor U0O126 (PostC+U). Las barras indican la media + SD de 6 experi- mentos independientes. *P< 0.05 vs. P, ”P< 0.001 PostC vs. PostC+U.   55   DCM P I/R PostC PostC+U PostC+LY GSK3~1 ____ -- I PHO-GSK3~ I ( er9) -1 3 C!:l. ("1') ~2 !,.9 ........ C!:l. ("1') ~ V) ~ 1 I o... O I/ ostC st U st LY i ura 3. fecto e 0126 294 02 bre t ción e SK3p r zones M. l nel uestra agen r sentativa e estern lot e uestra s i eles e GSK3~ PHO-GSK3~ r zones M jetos a s i r ntes t colos eri entales i ura lO ) as a ras uestran edia ± e i n PHO-GSK3~ GSK3~ e is eri entos i rentes. ap 0.05 s. st . A r cci n it condrial B r cci n it condrial P I/R PostC PostC +U P I/ ost t U Thr ~~~Ey~~~2) '1 ==------:::::---==-----,1 PHO-GSK3 13 1_ - - - -- - - - 1 (Ser 9) K /2 1 1 SK3p 1--- - - --1 N ........ 3 3 -,-----------------, ~ c::: L.J..J2 ........ N ........ ~ ffi 1 Ó I o... ab a I/ ost ost U C!:l. ("1') ~ V) !,.9 2 ........ C!:l. ("1') ~ t9 1 Ó I o... I/ ost PostC i ura 4. 0126 i i e l f ril i n e K1I2 SK3p itocondrial. as i ágenes uestran l estern lot r sentati os n l s i eles e ) -ERK1I2, K1I2 ) PHO- GSK3~, GSK3~ e r ones M ajo l t colo e rf sión ), is ia/reperfusión I/ ) , st ndiciona- iento st ) st n i i or 0 6 st +U). as a ras i an edia ± e peri- entos in endientes. ap . 5 s. , b . 1 st s. st +U. o S H a DD S a 3 y (p ix el es x 10 00 ) Nm = y Un id ad es ar bi tr ar ia o B 0.700 PostC+U R PostC P á 3 Y o E 2 0.400 3 CccP 5 2 3 z 0.100 o 0.0 999 1998 Tiempo (segundos) 1% O ADP ] 0 ADP+CCCP E] Ó 37 b b ] > o S 14 3d 254 P VR PostC PostC+U Figura 25. U0126 disminuye la fosforilación de proteínas mitocondriales e induce la apertura del poro de transición de la permeabilidad mitocondrial en corazones DCM post-acondicionados. A) El panel muestra los patrones de fosforilación de la proteína mitocondrial tras el protocolo de perfusión (P), isquemia/reperfusión (1R), post-acondicionamiento (PostC) y PostC en presencia del inhibidor U0126 (PostC+U). C(+) indica el control positivo (fosvitina) y C(-) muestra el control negativo (inhibidor de la tripsina de soya). También se muestra el contenido de ANT como control de carga de la proteína mitocon- drial. Los datos representan valores promedio + SD de seis experimentos independientes, *P<0.05. B) Trazos representativos de la retención de calcio mitocondrial. C) Valores de potencial transmembranal (A''m) en mitocondrias aisladas de ventrículo izquierdo en presencia de ADP y ADP+CCCP. La retención de Ca” se evaluó en 6 experimentos, mientras que los datos de AY'm representan la media + SD de 12 experimentos diferentes. "P<0.001.   56   A 100 Vl .~ ~80 roO ..... 0 .~ O ..D .- 60 ro x Vl (íJ ~ Qj 40 T ro x -o .- .- Q. :3 '-' 20 O P B . 0 Vl ..D 0 00 - E 7_