UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS Instituto de Ecología ESTRUCTURA Y VARIABILIDAD GENÉTICA DE DOS ESPECIES DE ROEDORES ENDÉMICOS DE LA ISLA COZUMEL, QUINTANA ROO TESIS Que para optar por el grado de: MAESTRA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS (BIOLOGÍA AMBIENTAL) P R E S E N T A SAYRA ROSIO ESPINDOLA BARRIENTOS TUTORA PRINCIPAL: DRA. ELLA VÁZQUEZ DOMÍNGUEZ, Instituto de Ecología, UNAM COMITÉ TUTOR: DR. JUAN PABLO JARAMILLO CORREA, Instituto de Ecología, UNAM DR. DAVID VALENZUELA GALVÁN, Centro de Educación Ambiental e Investigación Sierra Huautla, UAEM MÉXICO, D.F. Abril, 2013 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). 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DAVID VALENZUELA GALVÁN, Centro de Educación Ambiental e Investigación Sierra Huautla, UAEM MÉXICO, D.F. Abril, 2013 COORDINACIÓN Dr. Isidro Ávila Martínez Director General de Administración Escolar, UNAM Presente Me permito informar a usted que en la reunión ordinaria del Comité Académico del Posgrado en Ciencias Biológicas, celebrada el día 21 de enero de 2013, se aprobó el siguiente jurado para el examen de grado de la MAESTRA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS de la alumna ESPINDOLA BARRIENTOS SAYRA ROSIO con número de cuenta 406031068 con la tesis titulada: “Estructura y variabilidad genética de dos especies de roedores endémicos de la ¡isla Cozumel, Quintana Roo”, realizada bajo la dirección de la DRA. ELLA GLORIA VÁZQUEZ DOMÍNGUEZ: Presidente: DR. JORGE EDUARDO CAMPOS CONTRERAS Vocal: DR. JORGE ORTEGA REYES Secretario: DR. JUAN PABLO JARAMILLO CORREA Suplente: DRA. MARÍA DEL CARMEN MANDUJANO SÁNCHEZ Suplente: DR. RODRIGO VEGA BERNAL Sin otro particular, me es grato enviarle un cordial saludo. ATENTAMENTE “POR MI RAZA HABLARA EL ESPIRITU” Cd. Universitaria, D.F., a 01 de abril de 2013. DRA. MARÍA DEL CORO ARIZMENDI ARRIAGA COORDINADORA DEL PROGRAMA c.c.p. Expediente de la interesada. Edif. ¿le Posgrado P. B. (Costado Sur de la Torre II de Humanidades) Ciudad Universitaria C.P. 04510 México, D.F. Tel. 5623-0173 Fax: 5623-0172 http://pcbiol.posgrado.unam.mx UN M ~ POSG DO~ r. i ro vila artí ez ir ctor eneral e dministración scolar, AM r sente RDINACiÓN e r ito n ar t d e ni n r i aria el omité c démico el sgrado i ncias i l gicas, l r da l í 1 ero 13, r bó l i i nte o ra l en r o ESTRA I CIAS I AS l na I OLA RI TOS YRA SIO n ero enta 31068 n is itu a: " str ctura ri bili d nética e s pecies e ores émicos e is ozumel, uint na o", ll a jo i ci n RA. LLA LORIA UEZ MiNGUEZ: Presidente: Vocal: Secretario: Suplente: uplente: R GE ARDO POS NTRERAS R. GE TEGA YES R. N LO AMlllO RREA A. ARíA EL EN DUJANO A CHEZ R. DRI O A RNAl i tr articular, e s r to viarle rdial l do. T ENTE " R I ZA BLARA L PI ITU" d. n iversitaria, .F., bril e 13. ¡J/·cW G ~' RA. ARiA EL RO I ENDI RI GA RDI ADORA EL RAMA -, . .p. xpediente n da. dif. d sgrado . 8. ostado ur e o re n e umanidades) i dad niversitaria c.P. 5 10 éxico, O. F. eL 3-01 73 ax: 3-01 72 tp:/ pcbioLposgrado.ullam. m AGRADECIMIENTOS INSTITUCIONALES Este trabajo se llevó a cabo gracias al apoyo del Posgrado en Ciencias Biológicas, UNAM; a la beca de Maestría y Beca Mixta otorgada por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-245447); al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por el proyecto “Conservación de la Isla Cozumel: diversidad genética de vertebrados, especies introducidas y perturbaciones naturales” (CONACyT- 101861); al Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica por el proyecto PAPIIT-IN217910; y a la asesoría de mi comité tutor Dra. Ella Vázquez, Dr. Juan Pablo Jaramillo y Dr. David Valenzuela. A G R A D E C I M I E N T O S P E R S O N A L E S Muchas son personas a las que quiero agradecer porque de una u otra forma han formado parte en la construcción de esta tesis, y que sin ellas, esta sería otra historia. Gracias a la Doctora Ella, por confiar en mí y darme la oportunidad de hacer mío este proyecto, por permitirme ser parte de su equipo de trabajo, por su asesoría constante y sobre todo por sus enseñanzas y su amistad. Gracias también a mi comité tutor, los doctores Juan Pablo Jaramillo y David Valenzuela, y a los miembros del jurado, los doctores Jorge Campos, Jorge Ortega, Meli Mandujano y Rodrigo Vega, por mejorar y enriquecer este trabajo con sus comentarios. De manera especial agradezco al Doctor Oscar Gaggiotti, por recibirme en su laboratorio y por su asesoría y apoyo en los análisis que realicé durante mi estancia con él. Gracias a la UNAM, al Posgrado en Ciencias Biológicas, al Instituto de Ecología y al CONACyT, por abrirnos las puertas y darnos la oportunidad de crecer y de colaborar con nuestro granito de arena a lo que nosotros los locos llamamos ciencia. A todos mis compañeros de laboratorio por hacer siempre más amenas las horas en el Instituto; y en especial a Marco, Tania Garrido, Susette, Hugo, Tania Gutiérrez y Pablo por acompañarme en campo, compartirme sus experiencias y sufrir un poquito conmigo en esa “horrorosa isla” (nótese la ironía). Gracias también a Cristopher González, al Ing. Juan Bonfil, a Sergio Suárez y a las autoridades de Cozumel, por el apoyo y las facilidades brindadas durante el trabajo de campo. A mi compañeros del LECA, Florian, Marta, Pierre, Céline, Carla, Arthur, Marco, Caroline y Fred, por hacer de mi estancia en Grenoble la experiencia más inolvidable. A mis padres, Rubén y María del Refugio, por su cariño y apoyo incondicional, por estar conmigo siempre, porque gracias a ellos soy lo que soy y estoy en donde estoy. Gracias también a mis amigos, a todos sin excepción, por los ánimos, la compañía, los buenos ratos y las sonrisas que nunca me hicieron falta. A Vicente García, gracias por tu interés, por tus dudas, por escucharme aún cuando entendías poco de lo que estaba hablando y por las distracciones que de vez en cuando también hacían falta. A mis ratones (sí, ¡míos!) también gracias, simplemente porque sin ellos, este trabajo no hubiese sido posible. Por ellos esta tesis, que espero contribuya a su conservación. Gracias finalmente, a quien lea estas letras, porque eso significa que de alguna forma son parte ya de esto. Con cariño, Sayra Espindola Sayra Rosio Espindola Barrientos i Í N D I C E Resumen .................................................................................................................................................................... viii Abstract ....................................................................................................................................................................... ix Capítulo 1: Antecedentes ............................................................................................................................................. 1 Introducción 1. Islas y poblaciones insulares 2. Isla Cozumel, Quintana Roo 3. Los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo O. c. cozumelae R. spectabilis 4. Justificación Capítulo 2. Microsatélites: Caracterización de diez nuevos loci microsatélites para un roedor endémico en peligro de extinción, R. spectabilis ............................................................................................................................. 10 1. Introducción 2. Nota técnica Capítulo 3: Diversidad genética y estructura poblacional de los roedores en Isla Cozumel .................................. 16 Introducción 1. La variación genética dentro y entre las poblaciones 2. Parámetros de diversidad genética 3. Parámetros de estructura genética Hipótesis ............................................................................................................................................................... 21 Objetivos .............................................................................................................................................................. 21 Materiales y Método ............................................................................................................................................ 22 1. Trabajo de campo y obtención de tejido 2. Extracción de ADN 3. Microsatélites y estandarización de PCR 4. Análisis de fragmentos y obtención de genotipos 5. Análisis de datos 1. Presencia de tartamudeos y alelos nulos 2. Definición de subgrupos en la población 3. Diversidad genética 4. Estructura genética 5. Pruebas de parentesco y tamaño efectivo Resultados ............................................................................................................................................................ 29 1. Muestreo y número de individuos 2. Presencia de alelos nulos y tartamudeos 3. Definición de subgrupos y asignación de individuos 4. Equilibrio Hardy-Weinberg 5. Desequilibrio de ligamiento 6. Diversidad genética 7. Distribución de frecuencias alélicas, genotípicas y diferenciación 8. Estructura y diferenciación genética Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo ii 9. Aislamiento por distancia 10. Tamaño efectivo por población y parentesco 11. Flujo génico Discusión ............................................................................................................................................................... 43 Conclusiones ........................................................................................................................................................ 48 Capítulo 4. Consecuencias genético-poblacionales de los huracanes Emily y Wilma en los roedores de Isla Cozumel .................................................................................................................................................. 49 Introducción 1. Huracanes y sus efectos 2. Huracanes Emily y Wilma 3. Cuellos de botella Hipótesis ............................................................................................................................................................... 54 Objetivos .............................................................................................................................................................. 55 Materiales y método ............................................................................................................................................ 56 1. Trabajo de campo y obtención de tejido 2. Trabajo de laboratorio 3. Análisis de datos 1. Análisis de diversidad y estructura genética 2. Cuellos de botella 3. Los efectos del cuello de botella Resultados ............................................................................................................................................................ 59 Oryzomys couesi cozumelae ............................................................................................................................... 59 1. Muestreo y éxito de captura 2. Presencia de alelos nulos 3. Definición de subgrupos 4. Equilibrio Hardy-Weinberg y desequilibrio de ligamiento 5. Diversidad genética 6. Frecuencias alélicas, genotípicas y diferenciación 7. Tamaño efectivo de la población y parentesco 8. Cuellos de botella 9. Efectos del cuello de botella Reithrodontomys spectabilis ............................................................................................................................. 67 1. Muestreo y éxito de captura 2. Presencia de alelos nulos 3. Definición de subgrupos 4. Equilibrio Hardy-Weinberg 5. Desequilibrio de ligamiento 6. Diversidad genética 7. Frecuencias alélicas, genotípicas 8. Diferenciación 9. Tamaño efectivo de la población y parentesco 10. Cuellos de botella 11. Efectos del cuello de botella Discusión ............................................................................................................................................................... 73 El efecto de los huracanes: cada especie tiene su propia historia que contar Sayra Rosio Espindola Barrientos iii Las poblaciones de roedores: ¿se recuperan? Perspectivas Conclusiones ........................................................................................................................................................ 79 Referencias ................................................................................................................................................................ 80 Anexos ........................................................................................................................................................................ 96 Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo iv F I G U R A S Y C U A D R O S Capítulo 1 Figuras Figura 1. Mapa de cobertura vegetal de Isla Cozumel. Figura 2. Fotografía de Oryzomys couesi cozumelae. Figura 3. Fotografía de Reithrodontomys spectabilis. Capítulo 3 Figuras Figura 1. Imagen de la Isla Cozumel con los puntos de muestreo establecidos. Figura 2. Gráfico del porcentaje de asignación para cada localidad de muestreo de R. spectabilis. Figura 3. Árbol filogenético con el método NJ de las localidades muestreadas de R. spectabilis. Figura 4. Modelo lineal de aislamiento por distancia, en el que se observa la correlación entre distancia genética (FST) y geográfica (Km) entre pares de poblaciones de R. spectabilis por localidad de muestreo. Cuadros Cuadro 1. Porcentaje de asignación para cada localidad de muestreo de R. spectabilis. Cuadro 2. Porcentaje de individuos asignados a algún cluster, en relación a la población de muestreo inicial de R. spectabilis. Cuadro 3. Asignación de individuos de R. spectabilis a su población más probable después de detectar migrantes de primera generación. Cuadro 4. Coeficiente de fijación F IS de Weir y Cockerham para cada locus por grupo y para la población en conjunto de R. spectabilis. Cuadro 5. Valores de diversidad genética obtenidos para los cuatro grupos y para la población en conjunto de R. spectabilis. Cuadro 6. Valores de diversidad genética para la población en conjunto de O. c. cozumelae. Cuadro 7. Número total de alelos y genotipos observados para cada locus de R. spectabilis. Cuadro 8. Estadísticos F, GST y DEST para R. spectabilis. Cuadro 9. AMOVA basado en los valores de a) FST y b) RST, tomando como grupos los clusters obtenidos y como poblaciones las localidades muestreadas de R. spectabilis. Cuadro 10. Distancia genética de Nei por locus calculadas entre pares de grupos de R. spectabilis. Sayra Rosio Espindola Barrientos v Cuadro 11. FST locales para cada localidad de muestreo de R. spectabilis. Cuadro 12. Estadísticos de diferenciación genética entre localidades muestreadas de R. spectabilis. Cuadro 13. Tamaño efectivo para los cuatro grupos y la población en conjunto de R. spectabilis. Cuadro 14. Relaciones de parentesco de R. spectabilis para cada grupo y para la población en conjunto. Cuadro 15. Tasas de migración (a) y coeficientes de endogamia (b) de la última generación entre las poblaciones de R. spectabilis. Capítulo 4 Figuras Figura 1. Gráfico obtenido de STRUCTURE en donde se observa la asignación de individuos por población de O. c. cozumelae en tres tiempos, pre-huracán, post-huracán y 2011. Figura 2. Representación gráfica sobre la estimación del tamaño de la población más probable para las poblaciones de O. c. cozumelae. Figura 3. Representación gráfica del aporte genético de las poblaciones pre-huracán a las poblaciones post- huracán de O. c. cozumelae. Figura 4. Representación gráfica de la estimación del tamaño de la población más probable para las poblaciones de R. spectabilis. Cuadros Cuadro 1. Coeficientes de fijación (F Is) de Weir y Crockerham para cada locus de las poblaciones pre-huracán, post-huracán y 2011 de O. c. cozumelae. Cuadro 2. Valores promedio de diversidad genética de la poblaciones pre-huracán, post-huracán y 2011 de O. c. cozumelae. Cuadro 3. Diferenciación alélica y genotípica de las poblaciones de O. c. cozumelae entre las poblaciones pre- huracán, post-huracán y 2011. Cuadro 4. Porcentaje de genotipos homócigos por locus para cada población de O. c. cozumelae. Cuadro 5. Porcentaje de parentesco para las poblaciones pre-huracán, post-huracán y 2011 de O. c. cozumelae. Cuadro 6. Valores de probabilidad de exceso de heterocigosis para las poblaciones pre-huracán, post-huracán y 2011 de O. c. cozumelae. Cuadro 7. Cálculo del tamaño de la población más probable para la estimación de cuellos de botella en las poblaciones de O. c. cozumelae. Cuadro 8. Porcentaje de aporte genético de las poblaciones pre-huracán (por localidad de muestreo) a las poblaciones post-huracán de O. c. cozumelae. Cuadro 9. Coeficiente de fijación F IS de Weir y Cockerham para cada locus de las poblaciones pre-huracán y post-huracán de R. spectabilis. Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo vi Cuadro 10. Valores de probabilidad y desviación estandar obtenidos de la prueba de desequilibrio de ligamiento para todas las combinaciones de loci posible de la población post-huracán de R. spectabilis Cuadro 11. Valores de diversidad genética de R. spectabilis para la población post-huracán. Cuadro 12. Valores de probabilidad de exceso de heterocigosis para las poblaciones de R. spectabilis. Cuadro13. Cálculo del tamaño de la población probable para la estimación de cuellos de botella en las poblaciones de R. spectabilis. Cuadro 14. Composición alélica de la población post-huracán, en relación a los genotipos observados en las poblaciones pre-huracán de R. spectabilis. Sayra Rosio Espindola Barrientos vii R E S U M E N La diversidad biológica única que presentan las islas oceánicas enfrenta serias amenazas, no sólo por el aislamiento en el que se encuentran las poblaciones, sino por las perturbaciones, naturales y antrópicas, a las que se ven sujetas. En Isla Cozumel se conocen al menos 31 taxa de animales endémicos, muchos de ellos considerados amenazados o en peligro de extinción. En particular los roedores de la isla han experimentado reducciones drásticas de tamaño poblacional en los últimos años, sobre todo después de los huracanes Emily y Wilma que impactaron la isla en el año 2005. Los objetivos del presente trabajo fueron determinar la estructura y variabilidad genética de Oryzomys couesi cozumelae y Reithrodontomys spectabilis, dos taxa endémicos de Cozumel, y evaluar el impacto a nivel genético de los huracanes sobre sus poblaciones. En el Capítulo 1 se presenta una breve introducción, haciendo hincapié en los antecedentes de Isla Cozumel y de la información de los roedores con la que se contaba. El capítulo 2 se trata de una nota técnica sobre la caracterización que se realizó de los 10 loci microsatélites de R. spectabilis, publicada en Conservation Genetics Resources en Enero de 2013. La diversidad y estructura genética de ambos roedores se describe en el Capítulo 3. Para O. c. cozumelae utilicé nueve loci microsatélites fluorescentes y obtuve los genotipos de 90 individuos por análisis de fragmentos de los productos amplificados. Para R. spectabilis utilicé 10 loci microsatélites flourescentes, genotipificados de la misma manera en 90 individuos. Se observó una alta diversidad genética y alélica para las dos especies (Ho, He, HNEI>0.7; na>10); aunque R. spectabilis presentó una clara estructura con al menos cuatro subgrupos a lo largo de la isla (FST locales = 0.0377 - 0.124) y un efecto de aislamiento por distancia; mientras que, O. c. cozumelae se comportó como una única población a lo largo de toda la isla, con un elevado intercambio de individuos entre sitios, pues sólo el 8.24% de los individuos fueron asignados correctamente al localidad de muestreo. Es posible que la historia de vida de cada especie esté relacionada con las características genéticas observadas, es decir, mientras que la especificidad de hábitat que presenta R. spectabilis y patrones de conducta como fobia lunar pudieran estar limitando el flujo génico y con ello favoreciendo su estructuración, la capacidad de dispersión y los hábitos generalistas de O. c. cozumelae parecen estar manteniendo su diversidad genética y diluyendo cualquier proceso de diferenciación. La marcada disminución en el éxito de captura fue el efecto más directo que se observó en las poblaciones de roedores después del paso de los huracanes por la isla en el 2005. En el Capítulo 4 se presentan los efectos a nivel genético de dicho disturbio. Para ello se contaba con datos de individuos capturados meses después de los huracanes y se realizaron muestreos durante el 2011, con el fin de dar seguimiento a los cambios que pudieran haberse generado. La vulnerabilidad de R. spectabilis se hizo evidente, pues se detectó un cuello de botella con una reducción de al menos 20% en el tamaño de la población, con probables extinciones locales (pues sólo fue posible obtener muestras de la población localizada al norte de la isla) y la pérdida de alelos, algunos de ellos exclusivos. Desafortunadamente para el 2011, sólo fue posible la captura de un único individuo, que fuera de cualquier análisis genético, pone en evidencia el peligro crítico en el que se encuentra esta especie. Por su parte, O. c. cozumelae parece hacerle frente a los estragos del huracán de una manera más activa: tanto en campo como a nivel genético, se observó un claro desplazamiento del centro de la isla hacia la periferia, movimiento que además podría estar asociado al cambio significativo en la distribución de las frecuencias alélicas que se observó, sin afectar la elevada variación genética que presentaba antes de los huracanes. En cuanto al tamaño de la población, aun cuando se registró un decremento en el tamaño censal, no fue posible detectar alguna huella de la ocurrencia de un cuello de botella, e incluso la población parece Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo viii recuperarse al retomar la distribución de las frecuencias alélicas pre-huracán. Es importante mencionar que otros disturbios como la introducción de especies y la perturbación del hábitat pudieron exacerbar o estar en sinergia con los efectos generados por los huracanes. Los resultados presentados tienen un alto valor de conservación, no solo por las diferencias encontradas entre especies y por la evidencia de efectos genéticos asociados a una reducción en el tamaño de la población, sino también porque manifiestan la capacidad de los organismos para responder a perturbaciones que alteran el hábitat como son los huracanes. El mayor problema que enfrentan las poblaciones en la actualidad es el ritmo acelerado al que avanzan las perturbaciones humanas, que pueden conducir a su extinción antes de lograr su recuperación. Por ello, la necesidad urgente de incorporar planes para la protección del hábitat en Isla Cozumel. Sayra Rosio Espindola Barrientos ix A B S T R A C T The unique biological diversity of oceanic islands faces serious threats, not only because of the isolation at which their populations are subjected, but also due to both natural and anthropogenic disturbances. Cozumel Island has at least 31 endemic animal taxa, many of which are considered threatened or endangered. Rodents, in particular, have experienced drastic population size reductions during the recent years, especially after 2005 when hurricanes Emily and Wilma consecutively hit the island. The objectives of this study were to determine the structure and genetic variability of Oryzomys couesi cozumelae and Reithrodontomys spectabilis, two rodent taxa endemic of Cozumel, and to evaluate the impact of the hurricanes at genetic level. Chapter 1 contains a brief introduction, focused on the history of Cozumel Island and in some information about its rodents. In Chapter 2 we present a technical note describing the 10 microsatellites used for the genotyping of R. spectabilis. This note was published in Conservation Genetics Resources in January 2013. Genetic diversity and population structure of both rodents are described in Chapter 3. Nine fluorescent microsatellite loci were used to genotype 90 individuals of O. c. cozumelae. For R. spectabilis 10 fluorescent microsatellite loci were used to genotype 90 individuals using the same methodology. A high genetic and allelic diversity was observed for both species (Ho, He, HNEI> 0.7, n> 10), although R. spectabilis presented a clear genetic structure, composed by at least four subgroups along the island (local FST = 0.0377 - 0.124) and exhibiting isolation by distance. On the other hand, O. c. cozumelae apparently has a single panmictic population throughout the island. In fact, this species likely maintains a high rate of individuals exchange between sites, with only 8.24% of individuals correctly assigned to their original sampling site. It is possible that the life history of each species is related to the genetic characteristics observed: while habitat specificity and behavior patterns as lunar phobia of R. spectabilis could be limiting its gene flow and promoting population structure, the dispersal ability and generalist habits of O. c. cozumelae seem to be maintaining its genetic diversity and diluting any differentiation process. A sharp decline in capture success was the most direct effect observed in the rodent populations after the 2005 hurricanes. The genetic effects of these disturbances are presented in Chapter 4. In order to track population changes, sampling was conducted twice: a few months after the hurricanes and in 2011. R. spectabilis vulnerability was evident: we detected a bottleneck, with a reduction of at least 20% in the population size, presumable local extinctions (it was only possible to obtain samples in one population at the north of the island) and loss of alleles, some of them private. In 2011 the situation was even worse as it was only possible to capture a single individual, which highlights the critical endangered status of this species. On the other hand, O. c. cozumelae seems to cope with hurricane ravages in a more active way. We observed a clear migration of populations from the center of the island to its periphery, which translated in a significant change in the distribution of allele frequencies. Such a change, however, did not affect the levels of genetic variation that were observed before the hurricanes. On the other hand, we detected a decrease in the census population, which was apparently not strong enough to produce a genetic bottleneck. Indeed, the population seems to be recovering and retaking the distribution of allele frequencies found before the hurricanes. It is noteworthy that other disturbances, such as introduced species and habitat loss, may exacerbate or be in synergy with the effects generated by hurricanes. Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo x Altogether, the results of this study have a high conservation value, not only for the highlighted differences observed between species and the genetic effects associated with population size reductions, but also because they demonstrate the ability of rodents to respond to disturbances that strongly alter their habitat, such as hurricanes. Other than the genetic effects shown herein, the main problems that both species face nowadays are of anthropological origin and can lead them both to extinction before they recover completely from the effects of the hurricanes of 2005. Hence, the establishment of plans for habitat protection in Cozumel Island is urgently needed. 1 CAPÍTULO 1 Antecedentes I N T R O D U C C I Ó N La variedad de paisajes, de ecosistemas y de especies que se distribuyen en el territorio nacional, así como su diversidad cultural, han colocado a México como uno de los países biológica y culturalmente más ricos del mundo. De hecho, México ocupa el quinto lugar mundial de mayor diversidad biológica, por lo que enfrenta un enorme reto en la conservación de esta biodiversidad (CONABIO, 2006). La variabilidad o diversidad genética, en sentido amplio, es el componente más básico de la biodiversidad y se define como las variaciones heredables que ocurren en cada organismo, entre los individuos de una población y entre las poblaciones de una especie, y generalmente se describe con base en polimorfismos, heterocigosidad promedio y diversidad alélica (Frankham et al., 2010). El resto de la biodiversidad se deriva de los procesos evolutivos que operan sobre esas variaciones. De ahí que su conocimiento y comprensión sea de vital importancia, tanto para áreas dedicadas a la conservación y el avance de la genética evolutiva, como para su aplicación en beneficio de los seres humanos (Piñero et al., 2008). Altos niveles de variabilidad son vistos como ‘saludables’, ya que confieren la habilidad para responder a amenazas como enfermedades, parásitos y depredadores, así como a cambios en el ambiente. Por el contrario, bajos niveles de variación se consideran como limitantes en la habilidad de las especies para responder a esas amenazas, tanto a corto como a largo plazo (Frankham, 1996; Amos y Harwood, 1998; Booy et al., 2000). Entre las vertientes en las que este conocimiento puede ser utilizado están los problemas relacionados con la conservación de especies amenazadas o en peligro de extinción. Entre éstas, las especies insulares requieren especial atención ya que son más propensas a la extinción que las poblaciones continentales, debido a factores como baja migración, elevada endogamia (que genera pérdida de variación genética), adaptaciones locales, menor capacidad de dispersión, perturbación del hábitat e introducción de especies, entre otros (Frankham, 1997; 1998; White y Searle, 2007). A lo anterior se suman catástrofes naturales como los huracanes, eventos que generan cambios drásticos en el ecosistema y que afectan las poblaciones naturales exacerbando los problemas que de por sí enfrentan las especies amenazadas (Lugo, 2008). Por lo tanto, el monitoreo del estado genético de las poblaciones de estas especies constituye una pieza indispensable para asegurar su permanencia a largo plazo, mediante su correcta clasificación en la lista de especies con prioridad de conservación, la delimitación de unidades de manejo y la implementación de propuestas para su conservación (Vázquez-Domínguez y Vega, 2006). Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 2 El presente trabajo representa un aporte fundamental al conocimiento de los roedores de la Isla Cozumel, especies que actualmente enfrentan serias amenazas naturales y antrópicas, y que al igual que el resto de las especies vegetales y animales que habitan la isla, requieren acciones urgentes que favorezcan su conservación. Los objetivos principales fueron describir las características genéticas de los roedores Oryzomys couesi cozumelae y Reithrodontomys spectabilis y evaluar los impactos genético-poblacionales que tuvieron los huracanes Emily y Wilma sobre sus poblaciones. 1. Islas y poblaciones insulares Las islas son definidas como fragmentos de tierra rodeados completamente por agua, y según su origen se subdividen en: islas oceánicas (aquellas que nunca han estado conectadas con el continente); fragmentos continentales (que fueron separadas del continente por movimientos de las placas tectónicas); islas localizadas en la plataforma continental (las cuales están o han estado conectadas al continente); e islas dentro de cuerpos de agua como lagos o grandes ríos (Whittaker y Fernández-Palacios, 2007). La biota de estas islas está constituida normalmente por especies que comparten con zonas continentales y otras que se han establecido, adaptado y evolucionado separadas del continente, lo que conforma una biota altamente diversa y, en ocasiones, única en el mundo, por lo que son de importancia crítica para la biodiversidad global (Lara-Lara et al., 2008). Las poblaciones insulares tienen varias características que las distinguen de aquellas localizadas en el continente. En primer lugar son entidades con límites geográficos bien definidos, en las que ocurren los procesos fundamentales de cualquier sistema ecológico (Vitousek et al., 1989). A su vez, las características de poblaciones insulares dependen en gran medida de la naturaleza e historia de la isla en que habitan (Williamson, 1981). Por ejemplo, las poblaciones insulares de roedores presentan, en general, densidades poblacionales más altas y más estables (aunque son menos abundantes), mayor sobrevivencia y masa corporal, reducida agresividad y capacidad de dispersión, así como bajo rendimiento reproductivo y poca estructuración por edades en relación a sus homólogas continentales (Gliwicz, 1980; Alder, 1996; Whittaker y Fernández- Palacios, 2007). Dichas características, producto en gran medida del aislamiento, permiten probar teorías sobre procesos ecológicos y evolutivos (colonización, tasas de extinción, relaciones inter e intraespecíficas, adaptación a los ambientes insulares, etc.). Además, las islas oceánicas presentan altos niveles de endemismo asociados a la marcada diferenciación genética de las poblaciones, resultado de su establecimiento a partir de un reducido número de migrantes (efecto fundador; Grant, 1998); siendo las poblaciones insulares mucho más propensas a la extinción que las poblaciones continentales (Frankham, 1997, 1998). De hecho, la mayoría de las extinciones de mamíferos, aves y reptiles ocurridas desde 1600 han sido especies insulares (Frankham, 1997). Las razones por las que estas poblaciones son altamente susceptibles a la extinción son muy diversas. Se ha propuesto que la extinción en las Sayra Rosio Espindola Barrientos 3 islas se debe a factores estocásticos como el reducido tamaño poblacional, las bajas tasas de migración, la perturbación del hábitat, la introducción de especies exóticas, la reducida habilidad competitiva y la alta susceptibilidad a enfermedades (Vázquez-Domínguez et al., 2004; Lara-Lara et al., 2008). Desde el punto de vista de su capacidad de permanencia a largo plazo, se han descrito tres causas principales que llevan a estas poblaciones a ser poco eficientes: problemas para defenderse de los depredadores, problemas para conseguir alimento (generalistas vs especialistas) y problemas para encontrar pareja; estas pueden agudizarse por las perturbaciones humanas y las catástrofes naturales. Por lo tanto, los organismos isleños generalmente responden a variables como la estacionalidad, el microhábitat, la fase lunar y la temperatura, así como a condiciones bióticas que incluyen la depredación, la competencia y la disponibilidad de alimento (Kelt et al., 2004). Sumado a los factores ecológicos, se han descrito una variedad de factores genéticos que ponen en riesgo a las poblaciones insulares: la pérdida de variación genética, la depresión por endogamia, la acumulación de mutaciones deletéreas y las adaptaciones genéticas a los ambientes insulares (Frankham, 1997). La pérdida de variación genética está determinada en primer lugar por un efecto fundador (ya que la población inicial proviene de un pequeño número de individuos), el cual se puede ver agravado por procesos como la deriva génica y la endogamia, comunes en toda población pequeña y aislada (Frankham 1997, 1998, 2010; Vega et al., 2007). La deriva génica es considerada la principal causa de pérdida de variación genética a largo plazo, mientras que la endogamia es considerada el principal factor que pone en riesgo a las poblaciones en el corto plazo (Booy et al., 2000; Solano et al., 2009). Estos factores, junto con cuellos de botella genéticos, producto de una reducción abrupta del tamaño poblacional, incrementan la probabilidad de extinción gracias a la fijación de alelos deletéreos y a la reducción del potencial adaptativo (Lande, 1994; Vázquez-Domínguez et al., 1999). Sin embargo, estos efectos pueden variar de acuerdo al tamaño de la isla, ya que las islas de mayor tamaño pueden sostener poblacionales más grandes, atenuando la acción de estos factores (Kilpatrick, 1981; Hinten et al., 2003). Igualmente, la historia de vida de cada especie también juega un papel importante, ya que en términos de cómo responden al ambiente y a los cambios ambientales que enfrenten las probabilidades extinción pueden ser mayores o menores. Una gran número de estudios ha evidenciado que la mayoría de las poblaciones insulares (el 82%) presentan niveles más bajos de diversidad alélica que sus contrapartes continentales, mientras que, dentro de las especies insulares, los organismos endémicos muestran proporcionalmente niveles más bajos de variación genética que aquellos no endémicos (Frankham, 1997; Eldridge et al., 1999; Spielman et al., 2004; White y Searle, 2007; Duffie et al., 2009; Echenique-Díaz et al, 2009; Solano et al., 2009); además de que se han observado altos niveles de endogamia en poblaciones insulares (Frankham, 1998; Eldridge et al., 1999). Sin embargo, algunos estudios han encontrado mayor variación genética en poblaciones insulares, en especial cuando se trata de especies con alta capacidad de dispersión, que han efectuado varios procesos de Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 4 colonización e inmigración, o que habitan en islas de gran tamaño (Ryman et al., 1980; Bonhomme et al., 1989; Vega et al., 2007). En particular para México, las islas son ricas en especies endémicas y mantienen una mayor diversidad taxonómica que la parte continental (Ceballos et al., 1998). Sin embargo, varias especies y subespecies de mamíferos endémicas de islas se han extinguido en las últimas décadas y muchas otras están actualmente consideradas como amenazadas o en alguna otra categoría de riesgo (Cuarón et al., 2004; Vázquez-Domínguez et al., 2004), por lo que resulta fundamental realizar estudios que generen información genética sobre estos organismos (Vázquez-Domínguez y Vega, 2006). 2. Isla Cozumel, Quintana Roo Cozumel es la isla más grande del Caribe mexicano con una extensión aproximada de 478 km2. Se localiza a 17.5 km de la costa noreste de la península de Yucatán (20°16’18.2’’- 20°35’32.8’’ N; 86°43’23.3’’- 87°01’31.1’’ W) y está separada del continente por el Canal de Cozumel, que tiene una profundidad aproximada de 400 m. Es una isla oceánica de origen coralino; tiene una altitud máxima cercana a los 10 msnm y no presenta ríos superficiales, pero posee corrientes subterráneas de agua dulce y salobre, así como humedales, aguadas y cenotes. El clima es cálido húmedo con lluvias intensas en verano, una temperatura media anual de 25.5 °C y una precipitación media anual de 1505 mm (Cuarón et al., 2009). No se conoce con certeza el momento de su formación, aunque se sabe con seguridad que la historia biológica de la península de Yucatán comenzó, o al menos se restableció, hace 65 millones de años (Vázquez-Domínguez y Arita, 2010). La vegetación de Cozumel se encuentra entre las más desarrolladas de las islas de la península de Yucatán (Flores, 1992). En general existe un gradiente de vegetación bien definido que inicia a partir de la franja costera este, con vegetación de dunas costeras, seguida por tasistal (islote que se encuentra en marismas y cuya vegetación predominante es el tasiste), manglar, selva baja caducifolia y que culmina con selva mediana subcaducifolia en la porción central de la isla. Ésta se extiende hasta la costa oeste donde también persisten manchones de manglar (Tellez, 1989; Romero-Nájera, 2004). Hay variaciones sobre este patrón general, existiendo diferentes gradientes en la parte norte, sur, occidental y diversas secciones de la costa oriental (CONANP, 2007). Cozumel es un importante centro de endemismos, de hecho es la isla mexicana con mayor número de animales endémicos (especies y subespecies) con al menos 31 taxa (Walton, 2004; Cuarón et al., 2009), muchos de los cuales se encuentran amenazados o en peligro crítico de extinción (SEMARNAT, 2010; IUCN, 2010), y de los cuales se han realizado ya diversos estudios sobre aspectos ecológicos y genéticos relevantes para su conservación (ver, por ejemplo, Engstrom et al., 1989; Macouset y Escalante-Pliego, 2000; Gutiérrez-Granados, 2003; Fortes-Corona, 2004; Vega et al., 2007; Fuentes-Montemayor et al., 2009; García, 2010). Las principales Sayra Rosio Espindola Barrientos 5 amenazas para las especies endémicas de la isla son las especies introducidas (como Boa constrictor, perros y gatos ferales, ratas y ratones domésticos) y la fragmentación del hábitat por la expansión de caminos y construcciones (Cuarón et al., 2009; Vázquez-Domínguez et al., 2012). Hasta el año 2000, se había estimado que aproximadamente el 90% de la isla estaba cubierta por vegetación natural, siendo una de las regiones mejor conservadas del estado de Quintana Roo. Desafortunadamente, el crecimiento de las poblaciones humanas han acelerado la fragmentación, la alteración y la pérdida de hábitats (Walton, 2004; Cuarón et al., 2009). Actualmente existen tres áreas naturales protegidas: el Parque Nacional Arrecifes de Cozumel (11 988 ha), el Refugio Estatal de Flora y Fauna Laguna Colombia (1114 ha) y el Área de Protección de Flora y Fauna Isla de Cozumel (37,829 ha) (Figura 1). Sin embargo, aun cuando existen iniciativas para crear nuevas áreas, la mayor parte de las zonas de importancia para la conservación permanecen sin protección (CONANP, 2007). Los disturbios naturales que afectan continuamente la biota de la isla tienen un efecto sinérgico con las perturbaciones antrópicas, aumentando el riesgo al que están expuestas las poblaciones (García-Aguilar, 2010). Fig. 1. Mapa de cobertura vegetal de Isla Cozumel modificado de Romero-Nájera (2004). Se señalan además los polígonos de las áreas naturales protegidas que existen actualmente. Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 6 Entre los principales disturbios naturales que afectan a Cozumel están los huracanes. Se ha estimado que durante el siglo XX, al menos un huracán de magnitud importante ha pasado por la isla cada década. Los más recientes son Gilberto (1988; categoría 5, según la escala Saffir-Simpson), Roxana (1995; categoría 3) y Emily y Wilma (2005; categorías 4 y 5, respectivamente). 3. Los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo De los animales endémicos que alberga la Isla Cozumel, tres taxa son roedores, Oryzomys couesi cozumelae, Reithrodontomys spectabilis y Peromyscus leucopus cozumelae. Éste último era el roedor más común en la isla a mediados de 1980 (Engstrom et al., 1989); sin embargo, aún con esfuerzos de muestreo intensivo y extensivo no se ha vuelto a encontrar desde 2001, por lo que se presume que está extinto. Es probable que su desaparición esté relacionada a la depredación por especies introducidas como perros y gatos ferales y, especialmente, Boa constrictor (Gutiérrez-Granados, 2003; González-Baca, 2006). Las otras dos especies se encuentran amenazadas según la normatividad mexicana e internacional (SEMARNAT, 2010; IUCN, 2010). Oryzomys couesi cozumelae El género Oryzomys (Familia Muridae, Subfamilia Sigmodontinae; Musser y Carleton, 1993) es uno de los más diversificados dentro de la familia Muridae (Vinicius et al., 2004). Son abundantes en hábitats húmedos y están ampliamente distribuidos tanto en Centroamérica como en México. Oryzomys couesi, conocida como rata arrocera de pantano, es una buena dispersora que puede cruzar amplias extensiones de aguas abiertas (Cook et al., 2001). Es común en marismas y zonas inundables, incluyendo deslaves flotantes en aguas profundas, y menos común en matorrales espinosos, bosques y en los límites de éstos. En ocasiones puede invadir campos de arroz y azúcar. Se ha documentado que si se le molesta, puede sumergirse en el agua y nadar, deteniéndose para descansar a una distancia prudente (Reid, 1997). Se distribuye desde el sur de Texas hasta el noreste de Colombia. En la República Mexicana se distribuye desde Tamaulipas hasta Yucatán por el Golfo de México, y desde Sonora hasta Chiapas por el Pacífico, excluyendo la región centro-norte del altiplano. En Isla Cozumel se reconoce la subespecie O. c. cozumelae (Hall, 1981, Figura 1), que difiere Fig. 2. Fotografía de Oryzomys couesi cozumelae Sayra Rosio Espindola Barrientos 7 significativamente de O. couesi de la Península de Yucatán dado que tiene un tamaño más grande. Su cráneo es ligeramente mayor y menos arqueado en las órbitas, tiene dientes más pesados y nasales más largos, y el color es ligeramente más oscuro (Sánchez-Cordero, 2003). O. c. cozumelae es nocturna, con hábitos terrestres y semiacuáticos, y está clasificada según la normatividad mexicana como amenazada (Loxterman et al., 1998, SEMARNAT, 2010). Es común encontrarla en ambientes inundables como manglares, con enredaderas, hojas de palma, matorrales y hierbas, a lo largo de los bordes de campos abiertos y cerca de las zonas cultivadas. Es omnívoro generalista y se alimenta de semillas, frutos, insectos y partes suculentas de hierbas y arbustos (López y Medellín, 2005). Probablemente se reproduce durante todo el año, dando a luz de 5 a 8 crías, con ciclos de vida corto, y que a su vez son capaces de reproducirse luego de siete semanas (López y Medellín, 2005). Tiene una densidad poblacional de 14.5-16.5 individuos/ha, pero con variaciones estacionales significativas a lo largo del año (Fortes-Corona, 2004). También presenta efectos de borde asociados con una distribución espacial de carácter social (Fuentes-Montemayor et al., 2009). Contrario a lo que se espera para la mayoría de las especies insulares (Frankham, 1998), O. c. cozumelae presenta altos niveles de diversidad genética y alélica (Ho= 0.624; na=10.8), con una leve estructura genética y un posible aislamiento por distancia; teniendo además, un incremento de alelos raros que podría deberse a una expansión poblacional; además se ha observado que la reducción estacional en el tamaño poblacional no ha sido lo suficientemente drástica para que produzcan cuellos de botella o endogamia detectables (Vega et al., 2007). Después del paso de dos huracanes consecutivos en 2005 por la isla, Emily y Wilma, se esperaba que las poblaciones de este roedor presentaran pérdida de diversidad genética (resultado de un cuello de botella) y mayor estructuración, en comparación con los valores observados previamente. Sin embargo, en un estudio con poblaciones de los dos años siguientes (2006-2007), se observó que, aun cuando la población perdió la estructura previamente detectada, no hubo diferencias significativas en la diversidad genética y alélica, mostrando sólo una tendencia a disminuir (García-Aguilar, 2010). Por otro lado, fue claro que los huracanes sí tuvieron un efecto directo en las características demográficas de la especie, ocasionando una disminución del 66% en el tamaño poblacional y una redistribución espacial de los organismos a lo largo de toda la isla (García- Aguilar, 2010). Reithrodontomys spectabilis Los roedores del género Reithrodontomys (Familia Cricetidae, Subfamilia Cricetinae; Jones, 1982) se agrupan en 21 especies divididas en dos subgéneros (Reithrodontomys y Aporodon) y cuatro grupos de especies. Estos son ratones relativamente pequeños, con cola larga y presentan un surco longitudinal en el centro de los dientes incisivos superiores (Carleton, 1980). Los miembros del subgénero Reithrodontomys difieren de las especies asignadas al subgénero Aporodon (consideradas como más derivadas que las primeras) por características Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 8 externas, como la morfología de los dientes molares, de la musculatura zigomasetérica, el número de vértebras caudales y algunos rasgos del epitelio gástrico discoglandular (Howell, 1914; Hooper, 1952; Carleton, 1980). Además, algunas especies muestran altos niveles de divergencia genética (Arellano et al., 2005). Se distribuyen desde el sur de Canadá hasta Colombia y Ecuador (Eisenberg, 1989). En México se encuentra un número considerable de las especies (62% del total; 13 de 21 taxa), distribuidas principalmente en El Eje Neovolcánico Transversal, la Sierra Madre del Sur, la Sierra de Oaxaca y la Sierra Madre de Chiapas (Sánchez, 1993). Las especies menos especializadas morfológicamente y con números diploides variables de 38 hasta 51 cromosomas pertenecen al subgénero Reithrodontomys y se concentran en el norte y centro de la distribución del género, mientras que las especies más especializadas morfológicamente y con números diploides de 50 y 52 cromosomas son del subgénero Aporodon y están distribuidas del centro de la distribución hacia la parte sur de la misma (Sánchez, 1993). R. spectabilis (Jones y Lawlor, 1965, Figura 2), endémico de Isla Cozumel, es un roedor ligeramente más grande que su contraparte continental (R. gracilis); la cola es larga en relación a la cabeza y el cuerpo (hasta 148% en adultos) y tiene algo de pelo. Su pelaje es color ocre en la parte dorsal y blanco- grisáceo en la parte ventral. Es nocturno, semiarborícola y prefiere zonas de bosque denso y con presencia de enredaderas (Jones, 1982) y tiene una estructuración social asociada a efectos de borde (Fuentes-Montemayor et al., 2009). Es extremadamente escaso –presenta una densidad poblacional aproximada de 3.3 individuos/ha–, además de que se ha observado una pérdida del 80% de sus poblaciones en los últimos 10 años. Está ausente en amplias áreas de la isla (Gutiérrez Granados, 2003; Fortes-Corona, 2004). Sus poblaciones muestran una marcada fluctuación temporal, lo cual lo hace altamente vulnerable. La especie ha sido catalogada en Peligro Crítico por la Lista Roja de IUCN (IUCN, 2010) y como Amenazado por la NOM-059-SEMARNAT-2010 (SEMARNAT, 2010). Similar a O. c. cozumelae, parece tener una función ecológica importante en la regeneración de la selva de Cozumel, ya que existe una relación positiva entre su abundancia y la riqueza de especies de plántulas (Gutiérrez Granados, 2003). Pero, a diferencia de O. c. cozumelae, es un ratón mucho más pequeño, no presenta dimorfismo sexual y, como comportamiento anti-depredatorio, no tiene actividad durante las noches con luna llena (Fortes-Corona, 2004). No existen estudios previos sobre su estructura y diversidad genética. De hecho, sólo se sabe, según un Fig. 3. Fotografía de Reithrodontomys spectabilis Sayra Rosio Espindola Barrientos 9 análisis filogenético reciente, que R. spectabilis y R. gracilis están cercanamente relacionadas, donde al parecer R. spectabilis representa una forma derivada relativamente reciente de R. gracilis. R. spectabilis presenta además una novedad morfológica: tamaño corporal grande, probablemente debido a un efecto de aislamiento (Regla de islas: Foster, 1964; Arellano et al., 2005). 4. Justificación del presente trabajo El orden Rodentia es el que alberga el mayor número de especies entre los mamíferos de México y del mundo. Una gran cantidad de éstos son de distribución amplia y se encuentran en una extensa gama de tipos de vegetación, hecho que hace aún más relevante su importancia ecológica (Piñero et al., 2008). Por ejemplo, en las selvas tropicales, los roedores juegan un papel clave en diversas interacciones ecológicas como la dispersión y depredación de semillas y la herbivoría (Janzen, 1981), las cuales afectan la supervivencia y el establecimiento de semillas y plántulas (Gutiérrez-Granados, 2003; Zhang y Zhang, 2008). En consecuencia, tienen un efecto indirecto sobre la estructura de la vegetación y el funcionamiento de los ecosistemas (Sánchez-Rojas et al., 2004; Zhang y Zhang, 2008). Particularmente para los roedores mexicanos se han hecho estudios enfocados a resolver preguntas sobre taxonomía, ecología de poblaciones y comunidades y patrones de diversidad. Con especies insulares, los estudios genéticos han brindado varias respuestas a cuestiones ecológicas y evolutivas sobre mamíferos pequeños: Peromyscus en las islas del Mar de Cortés (Hafner et al., 2001), Peromyscus guardia de la isla Estanque y en el archipiélago Ángel de la Guarda (Mellink et al., 2002; Vázquez-Domínguez et al., 2004), Chaetodipus baileyi fornicatus de la isla Montserrat (Álvarez-Castañeda y Córtes-Calva, 2002), varios roedores en el Golfo de California (Álvarez-Castañeda y Ortega-Rubio, 2003) y trabajos previos con O. c. cozumelae (Gutiérrez-Granados, 2003; Vega et al., 2007; Fuentes-Montemayor et al, 2009; García, 2010) y R. spectabilis (Fuentes-Montemayor et al., 2009). Aunque estos estudios constituyen un avance significativo en el conocimiento de los roedores isleños, todavía falta mucho por estudiar. Debido a la crítica situación de riesgo que ya he descrito para las especies insulares y a la falta de información genética para los roedores del Caribe con alto riesgo de extinción (como O. c. cozumelae y R. spectabilis) es crucial que se sigan desarrollando trabajos de genética de poblaciones con especies de este tipo. La información genética es esencial para conocer su estado actual, su respuesta a perturbaciones naturales y antropogénicas, así como para determinar las potenciales consecuencias evolutivas. Con dicha información será posible contribuir al establecimiento de medidas de protección para asegurar su permanencia a largo plazo, lo que a su vez tendrá repercusiones sobre el ecosistema que habitan. El objetivo general del presente trabajo fue determinar la variabilidad y estructura genética de los roedores endémicos de la Isla Cozumel, así como evaluar el impacto de los huracanes Emily y Wilma (2005) a nivel genético sobre las poblaciones de los roedores en la isla. 10 CAPÍTULO 2 Microsatélites: caracterización de diez nuevos loci microsatélites para un roedor endémico en peligro de extinción, R. spectabilis I N T R O D U C C I Ó N En las últimas décadas, los avances tecnológicos han hecho posible el empleo de técnicas moleculares en estudios de ecología y conservación. Las tecnologías genéticas se emplean para determinar en detalle el estado de varias especies amenazadas o en peligro de extinción, aportando conocimientos importantes que han afectado de manera crítica las decisiones de manejo y han producido beneficios tangibles para las especies estudiadas (Wan et al., 2004; Oliviera et al., 2006). Los marcadores moleculares que se utilizan actualmente en estudios de genética (secuencias de ADN mitocondrial, SNP’s y microsatélites) permiten estimar diferentes parámetros de interés ecológico, como los niveles de diversidad genética, las tasas de migración, el tamaño efectivo de la población y la presencia de cuellos de botella. También, ayudan a determinar relaciones filogenéticas entre especies y poblaciones, así como el posible origen de las mismas. Permiten establecer los efectos del paisaje, reconstruir la historia evolutiva, evaluar el parentesco de los individuos, y ayudan a identificar las poblaciones y especies prioritarias para la conservación (Smith y Wayne, 1996; Avise 2000; Vázquez-Domínguez et al., 2001; Selkoe y Toonen, 2006). Los microsatélites son uno de los marcadores más ampliamente utilizados para el análisis de poblaciones de plantas y animales, tanto en vida silvestre como en cautiverio. Éstos, también conocidos como secuencias repetidas simples (simple sequence repeats: SSR), repeticiones en tándem de número variable (variable number tandem repeats; VNTR) y repeticiones cortas en tándem (short tandem repeats: STR), están ampliamente distribuidos tanto en el ADN nuclear como los genomas citoplasmáticos –como el del cloroplasto o la mitocondria–, en eucariontes y, en menor medida, en procariontes. Son regiones del ADN formadas por secuencias de uno a seis nucleótidos repetidos en tándem (Neff y Gross, 2001; Oliviera et al., 2006; Selkoe y Toonen, 2006; Rentaría, 2007) cuya longitud varía entre cinco y 40 repeticiones, aunque es posible encontrar cadenas más largas. Las repeticiones di-, tri- y tetra-nucleotídicas son las más comúnmente utilizadas para estudios de ecología molecular (Selkoe y Toonen, 2006). Los microsatélites se clasifican de acuerdo al tipo de secuencia repetida como perfectos (la secuencia repetida no es interrumpida por ninguna base a lo largo del motivo repetido), imperfectos, interrumpidos (en los que hay una pequeña secuencia que no encaja con el motivo repetido) y compuestos (donde la secuencia contiene dos secuencias repetidas adyacentes) (Oliviera et al., 2006). Sayra Rosio Espindola Barrientos 11 Se ha estimado que a lo largo de todo el genoma pueden encontrarse entre 104 y 105 microsatélites, generalmente en regiones no codificantes del ADN (es decir, regiones que no son traducidas). También se han encontrado en regiones codificantes, en cuyo caso se cree que podrían desempeñar roles funcionales tales como: facilitar la recombinación, potenciar la expresión de los genes y/o contribuir a la estructura de los cromosomas a través del empaquetado y condensación del ADN (Neff y Gross, 2001; Oliviera et al, 2006). Las regiones nucleares son heredadas de forma mendeliana y son codominantes, por lo que pueden revelar heterocigotos (con dos alelos diferentes en un locus) y homocigotos (con dos copias del mismo alelo en un locus) en cada individuo (Wan et al., 2004). Tienen un alto grado de polimorfismo (con valores superiores al 90%), como consecuencia de la alta tasa de mutación que presentan (Wan et al., 2004; Rentaría, 2007), la cual se ha estimado que varía entre 10-2 y 10-6 mutaciones por locus por generación (en promedio 10-4). Sin embargo, estas no sólo difieren entre tipos de repeticiones (di-, tri- o tetra-nucleótido), las bases que las componen y el tipo de microsatélite (perfecto, compuesto o interrumpido), sino también entre grupos taxonómicos (Balloux y Lugon-Moulin, 2002; Rentaría, 2007). Entre los mecanismos que se han propuesto para explicar el alto polimorfismo en microsatélites están (Li et al., 2002; Oliviera et al., 2006): los errores durante la replicación del ADN (slippage missparing), generando inserciones o deleciones de repeticiones en la secuencia; y la recombinación desigual (unequal crossing-over), que puede causar cambios en la longitud del microsatélite y modificaciones en las regiones flanqueantes. El modelo de mutación más aceptado en estos marcadores respecto a la generación de nuevas variantes es el de paso a paso (Stepwise Mutation Model; Kimura y Otha, 1978), el cual propone que cada mutación crea un nuevo alelo, ya sea mediante la adición o deleción de una repetición. Esto implica que la magnitud de las diferencias en el tamaño de los distintos alelos será proporcional al grado de relación entre ellos. En otras palabras, alelos con diferencias de tamaño grandes están más lejanamente relacionados que aquellos con tamaños similares (Balloux y Lugon-Moulin, 2002), Slatkin (1995) propuso una medida de diferenciación genética (RST) basada en este modelo, útil para el análisis de datos generados por este tipo de marcadores (Oliviera et al., 2006). La presencia de homoplasia, es decir, cuando dos alelos son idénticos por estado pero no por descendencia, puede alterar los resultados de estudios que involucren altas tasas de mutación y grandes tamaños poblacionales, aunque, en general, representa un sesgo mínimo al utilizar este modelo (SMM) en estudios sobre genética de poblaciones (Oliviera et al., 2006; Selkoe y Toonen, 2006). En particular, los microsatélites son útiles en estudios genéticos sobre procesos que actúan a una escala de tiempo ecológica y a una escala espacial fina (Selkoe y Toonen, 2006): variación genética intra e interespecífica, análisis de linajes, para identificar unidades de conservación y tamaños efectivos poblacionales; para investigar las procesos genéticos que se llevan a cabo en las poblaciones, como patrones de flujo génico, estructuración y deriva génica, así como relaciones de parentesco, hibridación y asignación de individuos a su población más Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 12 probable (Loxterman et al., 1998; Vázquez-Domínguez et al., 2001; Mossman y Waser, 2001; Avise, 2000; Vázquez-Domínguez, 2002; Wan et al., 2004; Oliviera et al., 2006; Rentaría, 2007). Otras ventajas de su uso sobre otros marcadores moleculares son que, 1) la obtención de ADN puede hacerse por métodos no invasivos y puede utilizarse poco ADN o de baja calidad; 2) las técnicas utilizadas son relativamente baratas y sencillas y 3) los datos obtenidos son fáciles de interpretar, repetitivos y automatizables (Selkoe y Toonen, 2006; Rentaría, 2007). Algunas desventajas que puede presentar el uso de estos marcadores son que al ser especie-específicos, el aislamiento y diseño de oligonucleótidos cebadores (primers, en inglés) es costoso y lento. No obstante, esto se ha reducido sustancialmente en los últimos años, además de que en ciertos casos es posible utilizar primers desarrollados para otras especies del mismo género e incluso familia (i.e., Galan et al., 2004; Loiseau et al., 2007; Küpper et al., 2008). Otra desventaja es que los mecanismos de mutación de estos marcadores todavía no se conocen del todo, por lo que se dificulta su interpretación en estudios de tipo evolutivo. Asimismo, la diversidad alélica observada puede “ocultarse” por fenómenos como homoplasia y presencia de alelos nulos (aunque se ha reportado muy baja subestimación de diferenciación genética: de 1 a 2%) y algunos microsatélites pueden estar bajo selección. Sin embargo, muchas de las desventajas pueden evitarse si la selección de loci durante el proceso de aislamiento se realiza cuidadosamente y mediante el control de las condiciones de trabajo (Wan et al., 2004; Selkoe y Toonen, 2006; Rentaría, 2007). Para responder las preguntas del presente trabajo se utilizaron estos marcadores moleculares. En el caso de O. c. cozumelae se amplificaron nueve loci desarrollados para la amplificación de microsatélites de O. palustris (Wang et al., 2000), los cuales fueron probados y estandarizados previamente por Vega et al. (2007) y García-Aguilar (2010). Sin embargo, no se habían desarrollado marcadores de microsatélites para ninguna especie del género Reithrodontomys. En las páginas siguientes se presenta una nota técnica sobre la caracterización de 10 loci de microsatélites para R. spectabilis, estandarizados y utilizados en este trabajo (Vázquez-Domínguez y Espindola, 2013). Conservation Genet Resour (2013) 5:251-253 DCI 10.1007/s12686-012-9780-9 TECHNICAL NOTE Characterization of ten new microsatellite loci from the endangered endemic rodent, Reithrodontomys spectabilis Ella Vázquez-Domínguez + Sayra Espindola Received: 5 September 2012 / Accepted: 28 September 2012 / Published online: 9 October 2012 £ Springer Science+Business Media Dordrecht 2012 Abstract Reithrodontomys spectabilis is an endemic rodent inhabiting Cozumel island in the Mexican Carib- bean. This species is categorized as Threatened by Mexican law and as Critically Endangered by the IUCN. We report 10 polymorphic microsatellite loci, which were tested in 30 individuals trapped on the island. Results show a number of alleles ranging from 3 to 14, an observed heterozygosity of 0.200 — 0.967 and expected heterozygosities from 0.396 to 0.899, Two loci showed deviation from Hardy—Weinberg equilibrium. None of the loci showed linkage disequilibrium. These new microsatellite loci for R. spectabilis are vital to investigate different aspects of genetic diversity and help conservation of this endemic, threatened species. Keywords Cozumel harvest mouse - Conservation genetics - Mexico - Island Cozumel Island is the largest island in the Mexican Carib- bean, with an area of ca. 486 km”, located in the Caribbean Sea (20720/N-87*00"W; 20%0'N-8650'"W) and separated from the oriental coast of the Yucatán peninsula by 17.5 km. It harbors a unique biological diversity, including at least 31 endemic animal taxa (Cuarón 2009), one of which is the Cozumel Harvest mouse, Reithrodontomys spectabilis E. Vázquez-Domínguez (6) - S. Espindola Departamento de Ecología de la Biodiversidad, Instituto de Ecología, Universidad Nacional Autónoma de México, Ciudad Universitaria, Ap. Postal 70-275, 04510 Mexico DF, Mexico e-mail: evazquez Oecologia.unam.mx S. Espindola Posgrado en Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Autónoma de México, Torre 11 de Humanidades, Ciudad Universitaria, 04510 Mexico DF, Mexico (Jones and Lawlor, 1965). This rodent is semi-terrestrial, a good tree climber and a lunar phobic. It is extremely scarce on the island as a result of a significant decrease of its pop- ulation numbers in the last decade, with an estimated popu- lation of 3.3 ind/ha (Fortes-Corona 2004; Fuentes- Montemayor et al. 2009). R. spectabilis is currently classified as Threatened by Mexican law (Semarnat 2010) and as Critically Endangered in the global TUCN red list (Cuarón et al. 2008). At present, there are no microsatellite markers developed for this or any species in the genus Reithrodontomys. Here we present 10 polymorphic microsatellites loci developed for R. spectabilis together with population genetics data. We live-trapped rodents throughout the island during several years, as part of an ongoing study on the ecology, evolution, genetics and conservation of the Cozumel biota (e.g., Vega et al. 2007; Martínez-Morales et al. 2009, Vázquez-Domínguez et al. 2012). For each trapped individual we took a tissue sample that was stored in 97 % ethanol for later use. We performed DNA extraction of 30 individuals with the commercial kit Quick Gene DNA Tissue Kit (Fujifilms Life Science), following the manufacturer's instructions. DNA quantity and quality were assessed with 1 % agarose gels stained with 0.5 ug/ml ethidium bromide and visualized with UV light. Microsatellite loci isolation was performed by the commercial company Genetic Marker Services (GMS, United Kingdom), which did the library production, unla- beled primer set design and polymorphism testing. We performed DNA amplification by polymerase chain reaction (PCR) with 10 fluorescent dye-labeled micro- satellite primers (Table 1). Total PCR volume was 5 pl, containing approximately 25 ng template DNA, 0.5 units of Taq DNA polymerase, 1.5-2.0 mM MgCl,, 0.2 mM dNTPs, 0.5-0.9 uM of each primer and 10x reaction PCR buffer (200 mM Tris-HCl pH 8.4, 500 mM KCD. PCR 4) Springer 13 252 ' Genet Resour (2013) 5:251-253 Table 1 Population genetics statistics of 10 microsatellite loci for R. spectabilis from Cozumel Island Loc s Primer sequence 5'-3/ Repeat motif Size (bp) Ta (*C) na H, H. mexR12 F-TTCATCCAAGGCTGCOTCTOT (TO) 233-271 54 14 0.500 0.891 R:GTGAAGACAGCATGGGACAC mexR13 F:GTTTAATCTCCATGCTCTGG (TOD)21 211-245 54 14 0.967 0.899 R:ACATGATGGGAAAAGAATAC mexR16 F:ACCCCAAAAGCAACAATAAGA (TO) 17 172-196 Td 11 0.933 0.887 R:ATGTGOGGOCCACACTCAGG mexR19 F:GTTTCAATCAGCACCCACCT (GD 276-330 Td 12 0.767 0.898 R:GACACACATGAATGCTCTOG mexR20 F:CTGAGCACACAGATGATTCCT (TG) 245-283 Td 12 0.833 0.879 R:CAGTTACAGAAACAAATAGGT AGAC mexR22 F:TGACAGAACACTTCCTGGAGA (ACI: 274-296 Td 11 0.900 0.866 R:GCTTTTGTGGGCOTGTCACTT mexR23 F: GAAAGGATGCAGAGGAGAGG (TO) 119-129 Td 3 0.367 0.396 R:GATTCAATGECCTECTICCAA mexR32 F:TCTAGCAAGTTATCCTTTGACC (CA Jon 170-190 Td 7 0.200 0.701 R:CTECCTTECATCCAGAGCTT mexR33 F:GGGGCTATGCOTGCAAAGTAA (TG)as 170-190 Td 8 0.900 0.797 R:GTACCCACACACATGTCAC mexR34 F:CACCCTCAGGGAAGGATAGT (GT)»3 202-274 Td 9 0.733 0.771 R:GGGTGAGTGTGCATGCATGT Table shows repeat motif, allele size in base pairs, Ta annealing temperature, na number of observed alleles, A, observed heterozygosity and H, expected heterozygosity. Td indicates touch down (see text for temperatures) conditions were as follows (all primers except mexR12 and mexR13): initial 2 min denaturation at 95 *C, 6 cycles consisting of 95 “C denaturing for 1 min, annealing for 1 min at 64 *C (decreasing 1 *C per cycle) and extension at 72 *C for 1 min, followed by 10 cycles consisting of 95 *C denaturing for 1 min, annealing for 1 min at 58 *C and extension at 72 *C for 1 min, 10 cycles of 95 "C denaturing for 1 min, annealing for 1 min at 57 *C and extension at 72 *C for 1 min, with a final extension at 72 *C for 5 min. For mexR12 and mexr13 PCR conditions were: initial 2 min denaturation at 95 *C, followed by 30 cycles consisting of 95 “C denaturing for 1 min, annealing for 1 min at 54 *C and extension at 72 *C for 1 min, with a final extension at 72 *C for 5 min, all with a PTC-100 (M.J. Research) thermocycler. After amplification, micro- satellite products were multiplexed and run on an ABI Prism3730x1 and 3100 Genetic Analyzer (Applied Bio- systems), with ROX-500 as internal size standard, and allele size determined with the software GeneMarker v.1.97 (SoftGenetics). Negative controls were included in all runs and multiple samples were sized at least twice to assure reproducibility and correct readings. We evaluated the presence of null alleles with the program Micro-CHECkKER v.2,2.3 (Van Oosterhout et al. 2004) and also examined possible departures from Hardy—Weiberg equilibrium (HWE) with an exact test and linkage disequilibrium (LD) by a log-likelihood ratio statistic (G-test) using GewEPoP v.4.0 4 Springer (Raymond and Rousset 1995). We assessed genetic variability by estimating the observed (2,,) number of alleles and observed (H,) and expected heterozygosity (He) using Arlequin v.3.1 (Excoffier et al. 2005). The 10 polymorphic loci showed number of alleles ranging from 3 to 14, their observed and expected hetero- zygosities from 0.200 to 0,967 and 0.396 to 0,899, respec- tively. We found evidence for scoring errors due to stuttering and null alleles for the loci mexR19 and mexR32. These same loci showed deviation from HWE (P < 0.005) after Bonferroni correction for multiple comparisons (Rice 1989). No significant LD was detected (P > 0.05). These new microsatellite loci for R. spectabilis are of great value, particularly because of the high conservation risk faced by this species. They are vital for the ongoing research in Cozumel, allowing us to investigate different aspects of genetic diversity and help conservation efforts focusing on population structure, connectivity and the effects of intro- duced species and of recent habitat fragmentation (S. Espindola and E. Vázquez-Domínguez, unpublished data). Acknowledgments We thank the following people for help during field-work: R. Vega, C. González-Baca, E. Fuentes-Montemayor, A.D., Cuarón and other members of the Cozumel Project. E. Vázquez- Domínguez acknowledges financial support from the Instituto de Ecología, UNAM, from Programa de Apoyo a Proyectos de Investi- gación e Innovación Tecnológica (grants 1X238004 and IN219707) and from Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 14 Conservation Genet Resour (2013) 5:251-253 253 (CONACyT grant 101861). S. Espindola acknowledges the scholar- shi and financial support provided by CONACyT (No. 245447), Sci.ntific collector permit to E.V.D.: Semarnat-FAUT-0168. References Cuarón AD (2009) Cozumel. Tn: Gillespie R, Clague DA (eds) Encyclopedia of islands. University of California Press, Berkeley, pp 203-206 Cuarón AD, Vázquez-Domínguez E, de Grammont PC (2008) Reithrodontomys spectabilis. In: IUCN 2012. TUCN Red List of Threatened Species. Version 2012.1. http://www.iucnredlist. org. 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Biol Invasions 14:2101-2116 Vega R, Vázquez-Domínguez E, Mejía-Puente A, Cuarón AD (2007) Unexpected high levels of genetic variability and the population structure of an island endemic rodent (Oryzomys couesi cozumelae). Biol Conserv 137:210-222 Y Springer Sayra Rosio Espindola Barrientos 15 16 CAPÍTULO 3 Diversidad genética y estructura poblacional de los roedores en Isla Cozumel I N T R O D U C C I Ó N La genética de poblaciones es la rama de la genética que se encarga del estudio del origen, los niveles y la distribución de la variación genética presente dentro y entre las poblaciones, así como de los mecanismos que causan cambios en esta variación en tiempo y espacio (Conner y Hartl, 2004; Templeton, 2006). En el presente capítulo se describe la diversidad y estructura genética de O. c. cozumelae y R. spectabilis, los dos roedores endémicos de Isla Cozumel. La información obtenida representa el primer trabajo genético comparativo entre especies insulares en México. Los resultados sugieren que es posible que las características ecológicas de cada roedor (formas de vida, requerimientos de hábitat, comportamiento) estén determinando sus características genéticas. Por lo tanto, es importante considerar la riqueza genética de sus poblaciones y su estructuración dentro de los planes de acción para su conservación a largo plazo. 1. La variación genética dentro y entre las poblaciones Los niveles de variabilidad genética de una especie son explicados en términos de un balance entre procesos de ganancia y pérdida. La diversidad puede ganarse a través de mutación o flujo génico entre poblaciones, mientras que la pérdida puede ocurrir mediante deriva génica y consanguinidad. La selección natural tiene dos vertientes, ya que puede producir pérdida al eliminar todo aquello que se desvíe del genotipo óptimo, o por el contrario conservarla si favorece a los individuos heterocigotos (Futuyma, 2009). El tamaño de la población, la distribución espacial, la endogamia, la habilidad de dispersión y la organización social, así como la heterogeneidad ambiental y la fragmentación del hábitat, son factores que también afectan la diversidad genética y generan estructura entre las poblaciones y especies (Amos y Harwood, 1998; Booy et al., 2000; Conner y Hartl, 2004). La estructura genética es otro factor relevante, ya que la mayoría de las especies se dividen en ‘subpoblaciones’ más pequeñas. Esta subdivisión influye directamente en la probabilidad de que dos individuos escogidos al azar se apareen, lo que a su vez provoca que las frecuencias alélicas entre subpoblaciones sean diferentes y por tanto las poblaciones se diferencien entre sí (Hartl y Clark, 2006; Hamilton, 2009). Cuando una población presenta estructura genética, generalmente la diversidad genética dentro de las subpoblaciones se reduce, debido principalmente a que el flujo génico se ve limitado y a que los apareamientos ocurren predominantemente entre individuos de una misma subpoblación, aumentando el nivel de endogamia (Balloux y Lugo-Moulin, 2002). Sayra Rosio Espindola Barrientos 17 En poblaciones de especies en riesgo, los niveles de diversidad y estructura genética se traducen en términos evolutivos y en su aplicación para su sobrevivencia ya que, a) a corto plazo, la endogamia y la deriva génica disminuyen la adecuación (fitness) de los individuos e incrementan el riesgo de extinción; b) a largo plazo, las poblaciones que pierden variación genética pierden potencial evolutivo –ya que la evolución no puede proceder sin variación genética– por lo que, en un mundo de rápidos cambios ambientales, cualquier población que no sea capaz de adaptarse a las condiciones cambiantes se extinguirá (a menos que presente suficiente plasticidad fenotípica como para sobrevivir a dichos cambios); c) un limitado flujo génico favorece la diferenciación y la pérdida de diversidad y d) cualquier disminución en el tamaño efectivo de la población reduce la variación genética y aumenta la endogamia, generando una reducción en el éxito reproductivo y con ello en la sobrevivencia de las especies (Frankham, 1996; Booy et al., 2000; Höglund, 2009; Frankham et al., 2010). En las islas, la variación genética está fuertemente determinada por procesos como efecto fundador, tamaño efectivo de la población, inmigración, deriva génica y selección, factores que a su vez podrían estar relacionados con el alto riesgo de extinción que las poblaciones insulares enfrentan. En un estudio comparativo, utilizando 202 trabajos que incluían poblaciones insulares y continentales, se concluyó que el 82% de las poblaciones insulares presentan menor variación genética que su contraparte continental, y a su vez, que las especies endémicas presentan una mayor reducción que aquellas que no lo son (Franham, 1997). Cabe mencionar que es tal la relevancia de contar con información genética de poblaciones naturales que actualmente se generan incontables estudios de este tipo. En una búsqueda simple en buscadores como ScienceDirect o Pubmed, utilizando como palabras clave ‘genetic diversity’ y ‘genetic structure’ se obtienen más de 6 000 artículos publicados entre los años 2011 y 2012. 2. Parámetros de diversidad genética Entre los parámetros utilizados para describir la diversidad genética de una especie están: la heterocigosidad observada (Ho), la heterocigosidad esperada (He), la heterocigosidad esperada no sesgada de Nei (HNei), el número observado de alelos (no) y el número efectivo de alelos (ne). La heterocigosidad es una de las medidas de diversidad genética a nivel poblacional más ampliamente utilizada, ya que en especies diploides, los individuos pueden ser caracterizados como homócigos o heterócigos para un locus dado. La heterocigosidad observada (Ho) puede calcularse como: 𝐻𝑜 = 𝑁𝑖𝑁 donde N i es el número de heterócigos observados para un locus dado y N es el total de los individuos muestreados. Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 18 La heterocigosidad esperada (He: 2pq para un locus con dos alelos de frecuencias p y q) es aquella que se esperaría en una población en equilibrio Hardy-Weinberg (H-W) con las mismas frecuencias alélicas observadas en la población real. He puede ser calculada como: 𝐻𝑒 = 1− � 𝑝𝑖2𝑁𝑢𝑚. 𝑑𝑒 𝑎𝑙𝑒𝑙𝑜𝑠 𝑖=1 donde p i es la frecuencia del i-ésimo alelo para un determinado locus en una población. Esta medida es menos sensible al tamaño de muestra que la Ho. Por su parte, Nei (1978) sugirió que cuando se trata de muestras pequeñas debe hacerse una pequeña corrección en la fórmula: 𝐻𝑁𝑒𝑖 = 2𝑁 2𝑁 − 1 �1− � 𝑝𝑖2𝑁𝑢𝑚. 𝑑𝑒 𝑎𝑙𝑒𝑙𝑜𝑠 𝑖=1 � donde N es el tamaño de la muestra y p i es la frecuencia del i-ésimo alelo para un determinado locus en una población (Hedrick, 2005; Frankham et al., 2010). El número observado de alelos (no) se considera una medida complementaria, ya que es más sensible a la pérdida de diversidad genética en poblaciones pequeñas que la heterocigosidad y se encuentra altamente relacionado con el tamaño de la muestra, además de ser una medida importante del potencial evolutivo de las poblaciones (Allendorf, 1986). El número efectivo de alelos (ne) es el número de alelos necesarios para proveer la misma heterocigosidad observada si todos los alelos fueran igualmente frecuentes. Se calcula como: 𝑛𝑒 = 1∑𝑝𝑖2 donde p i es la frecuencia de cada alelo. Esta medida es menos sensible al tamaño de muestra y a la presencia de alelos raros (Hedrick, 2005). 3. Parámetros de estructura genética Uno de los supuestos que debe asumirse para que las frecuencias genotípicas se mantengan en equilibrio de H- W es al apareamiento al azar entre los individuos (Hedrick, 2005). Sin embargo, esta uniformidad es improbable para la mayoría de las especies, ya que generalmente las poblaciones están subdivididas en unidades más pequeñas (ya sea por factores geográficos, ecológicos o de comportamiento). Así, la probabilidad de que dos individuos se apareen depende en gran medida de su ubicación dentro de la población. Esto conduce a lo que se conoce como estructura, o heterogeneidad a lo largo de la población. La cual depende de la probabilidad de que dos individuos escogidos al azar se apareen. El impacto de esta estructura sobre las frecuencias Sayra Rosio Espindola Barrientos 19 genotípicas y alélicas también genera heterogeneidad –o estructura– genética, también conocida como diferenciación entre subpoblaciones (Hedrick, 2005; Hamilton, 2009). El aislamiento por distancia y un limitado flujo génico son los principales factores que generan estructura genética en una población (Hedrick, 2005; Hamilton, 2009). De hecho, sin flujo génico suficiente para mantener los apareamientos aleatorios, la deriva génica, la selección, e incluso la ocurrencia de mutaciones, incrementarían la diferenciación de las subpoblaciones (Hedrick, 2005; Hamilton, 2009). Una forma que se utiliza para cuantificar diferencias entre poblaciones es la distancia genética, una medida de diferenciación dada por las sustituciones alélicas por locus que han ocurrido desde la divergencia de dichas poblaciones. Una de las medidas más empleadas para marcadores acordes al modelo de mutación paso a paso como los microsatélites, es la distancia genética de Nei (DNei), que se define como: 𝐷𝑁𝑒𝑖 = − ln(𝐼𝑁𝑒𝑖) donde INei es el índice de similitud genética de Nei, que se define como: 𝐼𝑁𝑒𝑖 = � (𝑃𝑖𝑥𝑃𝑖𝑦)�(∑ 𝑃𝑖𝑥2𝑚𝑖=1 )�∑ 𝑃𝑖𝑦2𝑚𝑖=1 ��1/2m i=1 donde P ix es la frecuencia del alelo i en la población (o especie) x y P iy es el alelo i en la población (o especie) y; y m es el número de alelos presentes en el locus. Cuando las frecuencias alélicas son similares entre las dos poblaciones (P ix=P iy) la similitud genética se aproxima a 1 y la distancia genética a cero y viceversa (Frankham et al., 2005). El grado de endogamia puede asimismo ser usado como una medida de diferenciación entre las subpoblaciones o fragmentos. Sewall Wright (1951) propuso tres coeficientes para describir la distribución de la diversidad genética dentro y entre poblaciones, los estadísticos F (FST, F IS y F IT). El primero, FST o índice de fijación, es una medida de divergencia entre las frecuencias alélicas de las subpoblaciones. Se define como la probabilidad de que dos alelos tomados al azar en una población sean idénticos por descendencia; su valor siempre es positivo y mantiene una relación inversamente proporcional con el flujo génico entre poblaciones (FST = 0, no hay estructura; FST = 1, completamente diferentes). Existen otros estadísticos homólogos a FST como RST (que toma en cuenta el tamaño de los alelos), GST (equivalente a FST pero útil cuando se cuenta con alelos múltiples en un locus) y DEST (más relacionado con las distancias genéticas entre poblaciones) , útiles en el cálculo de la diferenciación entre subpoblaciones cuanto se utilizan microsatélites como marcador molecular, sobre todo porque son parámetros que consideran las tasas de mutación y los altos niveles de polimorfismos que pueden obtenerse con estos marcadores (Whitlock, 2011). F IS, o el coeficiente de endogamia, es definido como la probabilidad de que dos alelos en un individuo sean idénticos por descendencia y determina el exceso (valor negativo) o deficiencia (valor positivo) de heterocigosidad de los individuos en el interior de las Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 20 subpoblaciones. Finalmente, F IT, o coeficiente de endogamia total de un individuo, mide la reducción de heterocigosis del individuo con respecto a la población en conjunto (Goudet, 1995). Recientemente se ha propuesto que los patrones de estructura genética dentro y entre poblaciones deberían integrarse dentro de una evaluación más compleja, integrando datos ambientales y factores antropogénicos, sobre todo porque dichos factores pueden convertirse en barreras (naturales o no) que limiten el flujo genético y consecuentemente influyan en la diferenciación (estructura) genética (Manel et al., 2003; Radespiel et al., 2008). En México se han incrementado los estudios de diversidad genética en un sin número de especies en los últimos años. Algunas recopilaciones indican que muchas de las especies mexicanas tienen una alta diversidad genética, cuando menos equiparable a la de otras partes del mundo (Piñero et al., 2008). Sin embargo, no es posible hacer una generalización al respecto, ya que los parámetros de genética de poblaciones dependen de la biología, la historia evolutiva y la práctica de manejo del organismo. Como ya se ha mencionado, las islas poseen una diversidad biológica excepcional, cuyas poblaciones poseen generalmente menor diversidad genética (Franham, 1997). En Isla Cozumel, la información genética acerca de los roedores es muy escasa: en 2007, Vega y colaboradores realizaron un estudio sobre la estructura y variación genética de O. c. cozumelae utilizando cinco marcadores microsatélites para evaluar los principales parámetros de diversidad y estructura genética (Equilibrio Hardy-Weinberg, Desequilibrio de Ligamiento, Ho, He, na, ne, estadísticos F, ANOVA, Ne). Respecto a R. spectabilis sólo se sabe que presenta una distancia genética baja (1.27%) respecto a su contraparte continental R. gracilis (Arellano et al., 2005). Este trabajo no sólo complementa la caracterización genética de los roedores que habitan la isla (información completamente nueva en el caso de R. spectabilis), sino que además por primera vez será posible comparar las diferencias que existen entre especies, explicadas en términos de sus requerimientos ecológicos. Es importante mencionar que, para el caso de O. c. cozumelae se incrementará el número de microsatélites utilizados previamente (Vega et al., 2007), lo que dará una mayor precisión y exactitud en los cálculos de los valores genético poblacionales. Sayra Rosio Espindola Barrientos 21 H I P Ó T E S I S Si la variación y estructura genética que presentan los roedores de Isla Cozumel reflejan las diferencias ecológicas entre especies, entonces O. c. cozumelae presentará altos niveles de diversidad genética y poca estructuración, mientras que R. spectabilis, una especie menos abundante y con requerimientos de hábitat más específicos, presentará menor variación genética, alta diferenciación genética y bajos valores de flujo génico, comparado con los valores observados para O. c. cozumelae. O B J E T I V O S 1. Determinar la estructura y variación genética de R. spectabilis y O. c. cozumelae en Isla Cozumel. 2. Evaluar si existen diferencias entre la estructura y variación genética de R. spectabilis y O. c. cozumelae y asociar las características genéticas con las características ecológicas de cada especie. Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 22 M A T E R I A L E S Y M É T O D O 1. Trabajo de campo y obtención de tejido Desde el 2001 y hasta los primeros meses del 2005 se llevaron a cabo muestreos sistemáticos de roedores en Isla Cozumel para otros estudios ecológicos y genéticos. Los sitios estaban ubicados principalmente en la zona centro de la isla, en un área dividida en ejes para la captación y extracción de agua potable, a cargo de la Comisión de Agua Potable y Alcantarillado (CAPA); así como en otras zonas rurales y urbanas al norte, este, sur y noroeste de la isla (Gutiérrez-Granados, 2003; Fortes-Corona, 2004; Vega et al., 2007; Fuentes-Montemayor et al., 2009; García, 2010). Las capturas se realizaron por medio de trampas Sherman cebadas con una mezcla de avena, crema de cacahuate y vainilla. Según el acceso a la zona, las trampas fueron colocadas de tres formas distintas: 1) en gradillas de 4 líneas por 10 trampas separadas entre sí aproximadamente 10 m, 2) gradillas de 7 líneas por 7 trampas separadas entre sí aproximadamente 8.5 m, o bien, 3) transectos lineales con 25 trampas colocadas cada 12 m aproximadamente a lo largo del transecto. De los roedores capturados se obtuvieron muestras de falanges, oreja y/o cola, todas conservadas en etanol al 70%. Además, se tomaron los datos merísticos estándares (medidas de oreja, pata, cuerpo y cola), así como el peso, la edad y el sexo de cada individuo. Finalmente, todos los ejemplares fueron liberados en el mismo lugar de captura. En cada individuo capturado se revisaba la presencia de cortes previos para evitar dobles registros. Las muestras de O. c. cozumelae fueron procesadas para los dos trabajos previos sobre su estructura y diversidad genética (Vega et al., 2007; García, 2010). Para el caso de R. spectabilis todas las muestras fueron conservadas en refrigeración hasta su uso en el presente trabajo. 2. Extracción de ADN Vega y colaboradores (2007) realizaron la extracción de ADN de tejido (falange, oreja o cola) de O. c. cozumelae con el kit comercial AquaPure GEnomic DNA (Biorad, California) siguiendo las instrucciones del proveedor. Para la extracción de ADN de tejido de R. spectabilis se utilizó el kit comercial QuickGene DNA tissue (FUJIFILM Life Sciences®), con algunas modificaciones del protocolo establecido por el proveedor para muestras pequeñas (Anexo 1). La cantidad de ADN obtenido y su pureza (libre de proteínas y RNA) se determinaron empleando un biofotómetro BioPhotometer 6131 (Eppendorf®), que proporciona la concentración de ADN (ng/µl). Además, todas las muestras se observaron en geles de agarosa al 1%, teñidos con bromuro de etidio al 0.5 µg/ml y visualizados con luz UV (Anexo 2). De esta manera, se obtenía un estimado cualitativo de la concentración de ADN (utilizando como referencia el marcador de peso molecular de ADN Lambda (Invitrogen®) a 5, 10 y 25 ng/µl) y su integridad. Sayra Rosio Espindola Barrientos 23 3. Microsatélites y estandarización de PCR Para O. c. cozumelae se utilizaron nueve pares de primers fluorescentes para la amplificación de nueve loci microsatélites, los cuales fueron desarrollados originalmente para O. palustris (Wang et al., 2000), y transferidos y estandarizados previamente para O. c. cozumelae por Vega et. al (2007) y García (2010). Para R. spectabilis se emplearon 10 pares de primers especie-específicos fluorescentes para la amplificación de 10 loci microsatélites, que fueron desarrollados de novo por Genetic Marker Services (Brighton, England; Vázquez-Domínguez y Espindola, 2013). Las condiciones estandarizadas para la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) para cada uno de los primers utilizados se detallan en el Anexo 3. La estandarización consistió básicamente en modificar la concentración de MgCl2 y de los primers, el número de ciclos y la temperatura de hibridación durante la PCR. Se realizaron controles negativos durante la estandarización de cada par de oligonucleótidos para asegurar que no hubiera contaminación durante la amplificación y que las bandas obtenidas fueran propias del microsatélite. Además, se incluyeron controles positivos y negativos al estandarizar la técnica para asegurar que las condiciones de amplificación se mantuvieran entre experimentos. Los productos de PCR se observaron en geles de agarosa al 1.5%, teñidos con bromuro de etidio a 0.5 μg/ml, utilizando como referencia el marcador de peso molecular VC 100pb Plus DNA Ladder (Vivantis®), y visualizados bajo luz UV (Anexo 2). 4. Análisis de fragmentos y obtención de genotipos Todos los productos de la PCR fueron analizados por locus y para las dos especies con el servicio de análisis de fragmentos de la Universidad de Illinois, EUA (UIUC, Core DNA Sequencing Facility), en un secuenciador capilar ABI Prism 3730xl Analyzer (Applied Biosystems®), con la escalera ROX 500 Size Standard (Applied Biosystems®) como marcador de peso molecular. El genotipo de cada locus se obtuvo con los programas GeneMapper V. 4.0 (Applied Biosysistems®) y GeneMarker V 2.2 (SoftGenetics®), que permiten la visualización de los cromatogramas y la lectura del tamaño de cada alelo por medio de la comparación directa del tamaño de dichos alelos con la escalera interna. Cabe destacar que en los casos en los que no se obtenían amplificaciones adecuadas se modificaron las concentraciones de ADN de cada muestra durante la PCR. 5. Análisis de datos Todos los análisis genéticos que se describen a continuación se realizaron por separado para cada especie y se utilizaron pruebas estadísticas descriptivas para comparar los resultados obtenidos entre ellas. Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 24 5.1. Presencia de tartamudeos y alelos nulos Debido a que en los microsatélites puede haber mutaciones en las regiones flanqueantes, los primers pueden no unirse y no amplificar durante la PCR, generando que algunos heterócigos puedan ser considerados como homócigos (lo que se conoce como presencia de alelos nulos). Además, en ocasiones durante la PCR se obtienen fragmentos de un tamaño diferente del alelo real debido a tartamudeos de la polimerasa (llamados stutter bands), que pueden producir errores en la genotipificación. Para evitar interpretaciones erróneas de los datos obtenidos se evaluó la presencia de alelos nulos y tartamudeos con el programa MicroChecker 2.2.3 (Van Oosterhout et al., 2004), con un intervalo de confianza del 95% y 1000 repeticiones, para cada locus por población y para la población en su conjunto. 5.2. Definición de subgrupos en la población En genética de poblaciones, un paso crucial para diversos análisis es definir los grupos o subpoblaciones en las que puede estar dividida la población muestreada (Pritchard et al., 2000). En muchas ocasiones, esta subdivisión resulta subjetiva, basada en criterios arbitrarios del investigador o, típicamente, por los localidades de muestreo en la zona de estudio; lo que puede ocasionar errores graves en el manejo e interpretación de la información. Para evitar esto se hizo un análisis de agrupación de los individuos con el programa STRUCTURE V.2.3 (Pritchard et al., 2000; Hubisz et al., 2009), que permite detectar el número de poblaciones (K) usando datos genotípicos. Este programa utiliza métodos de agrupación permitiendo la asignación de individuos (por probabilidad) a alguna población, o conjuntamente a dos o más poblaciones si los genotipos indican la ocurrencia de mezcla. Además, permite incluir información previa sobre lugar de muestreo mejorando la inferencia de grupos. Para las dos especies se establecieron los siguientes parámetros: 50000 para la longitud de burn-in, 50000 para la longitud de la corrida, Admixture model como modelo ancestral y Correlated allele frequencies model como modelo de frecuencias alélicas. Se pusieron a prueba valores de K entre 1 y 8, con 20 repeticiones cada uno. Se graficó el LnP(K) y se eligió el valor de K que presentó el número más pequeño de LnP(K) Además se hizo la corrección de Evanno et al. (2005) para la obtención de ∆K. Dicha corrida fue utilizada para las estimaciones de porcentajes de asignación por cluster y por individuo. También se realizó un análisis de asignación con el programa GeneClass 2.0 (Piry et al., 2004) debido a que 1) no se contaba con datos precisos referentes al sitio de captura de algunos de los individuos utilizados para este estudio y 2) algunos individuos tuvieron un porcentaje de asignación menor al 70% con el programa STRUCTURE. GeneClass analiza el genotipo de cada individuo para determinar a qué población es más probable que pertenezca según las frecuencias genotípicas que se presenten en las poblaciones de referencia, en este caso, las obtenidas mediante STRUCTURE. Los individuos se asignaron con un umbral de 0.05 y se ocuparon los criterios que el programa trae por defecto (Asignación por individuo, con un umbral del 0.05; criterios de computación por el método Rannala y Mountain; cálculo de probabilidad utilizando el algoritmo de Pakeau, Sayra Rosio Espindola Barrientos 25 1000 individuos simulados y alfa= 0.01). Finalmente los grupos obtenidos por STRUCTURE se utilizaron como ‘poblaciones’ para el resto de los análisis. 5.3. Diversidad genética Equilibrio Hardy-Weinberg y desequilibrio de ligamiento (DL) Una herramienta útil en el análisis de diversidad genética de las poblaciones es el Modelo de Hardy-Weinberg (H-W), un modelo teórico que establece que después de una generación en una población ideal (de tamaño infinito, con apareamientos al azar y en donde no ocurre mutación, migración ni selección), las frecuencias alélicas y genotípicas de un locus permanecen constantes o en equilibrio. Bajo dicho supuesto, los análisis permiten estimar la desviación de este equilibrio, es decir, qué tan semejantes o diferentes son las frecuencias reales de las teóricas. El desequilibrio de ligamiento consiste en la asociación no aleatoria entre alelos de diferentes pares de loci (Hedrick, 2000) y provee información sobre la historia evolutiva y demográfica de las poblaciones, así como de la ubicación espacial de los loci en los cromosomas (Excoffier y Slatkin, 1998). La desviación de las frecuencias observadas con respecto a las esperadas en H-W y la presencia de desequilibrio de ligamiento entre marcadores se determinó con el programa GenePop 4.0.10 (Raymond y Rousset, 1995; Rousset, 2008). Las pruebas de probabilidad se llevaron a cabo mediante dos métodos: Cadenas de Markov para cada locus por población y Método de Fisher para todos los loci por población. En el análisis se obtuvo el coeficiente de endogamia F IS de Weir y Crockerham (1984) para cada una de las poblaciones por locus, con la finalidad de obtener el exceso (valor negativo) o deficiencia (valor positivo) de heterocigotos, así como las frecuencias alélicas, los genotipos observados y las distribuciones alélicas y genotípicas. Para la ocurrencia del desequilibrio de ligamiento se analizaron todas las combinaciones posibles de pares de loci. En todos los análisis se utilizaron los parámetros: 1000 pasos de dememorización, 200 análisis en batch y 1000 iteraciones por batch. Diversidad genética dentro y entre poblaciones Se estimaron los siguientes parámetros de diversidad genética para cada población y para la población en conjunto con los programas GenePop 4.0.10 (Raymond y Rousset, 1995; Rousset, 2008) y GenAlEx v. 6 (Peakall y Smouse, 2006): número observado (no) y efectivo (ne) de alelos, heterocigosidad observada (Ho), esperada (He) y de Nei (HNEI). Asimismo, se calcularon las frecuencias alélicas por locus, por población y la presencia de alelos privados. Para evaluar la diferenciación alélica y genotípica entre poblaciones se realizaron dos pruebas con el programa GenePop: a) la prueba exacta de G (Goudet et al., 1996) para la diferenciación por poblaciones pareadas por locus y b) la prueba de Fisher (Raymond y Rousset, 1995) con todos los loci en su conjunto. 5.4. Estructura genética Se estimaron los estadísticos F por locus (programa FSTAT 2.9.3; Goudet, 1995) y se evaluó la estructura y diferenciación genética dentro y entre poblaciones con el estimador FST (basado en el número de alelos Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 26 diferentes entre las poblaciones) y el de RST (basado en las varianzas de los tamaños de los alelos) (Michalakis y Excoffier, 1996), calculados con el programa Arlequin 3.5.1.3 (Excoffier et al., 2005). Es importante señalar que, aún cuando el índice RST se ha propuesto como el más adecuado para el análisis con microsatélites (Slatkin, 1995), también se ha sugerido que cuando el tamaño de muestra (N<50) y el número de loci analizados (<20) son pequeños, es mejor utilizar el estimador de FST ya con el de RST se pueden obtener datos erróneos (Gaggiotti et al., 1999). Además, para marcadores altamente variables, como los microsatélites, se han propuesto otros estadísticos, como G’ST y DEST, los cuales dependen de la tasa de mutación pero son insensibles a otros factores evolutivos que pudieran estar influenciando la cantidad y los patrones de variación genética (Hedrick, 2005; Whitlock, 2011). El parámetro G’ST está relacionado con la cantidad de variación dentro de las sub-poblaciones y de la población en conjunto (Hedrick, 2005), mientras que DEST indica la proporción de diversidad alélica que se encuentra entre las sub-poblaciones, por lo que aumenta conforme incrementa la divergencia entre éstas (Jost, 2008; Whitlock, 2011). Como ningún parámetro es excluyente, se obtuvieron todas estas medidas de diferenciación utilizando el programa DEMEtics (Gerlach et al., 2010). Se construyó un árbol filogenético por el método Neibour-Joining usando diferentes medias de distancias genéticas y Bootstraps = 10 000 con el programa PopTree2 (Takezaki et al., 2010). Se eligió el árbol con los bootstraps más altos y con el mejor ajuste a los datos de diferenciación. Con el fin de determinar la distribución de la variación genética, se realizó una evaluación de niveles jerárquicos por medio del Análisis de Varianza Molecular (AMOVA; Excoffier et al., 1992) empleando los parámetros FST y RST con 30000 permutaciones. Este análisis utiliza métodos permutacionales no paramétricos para calcular la distribución de la varianza genética entre los diferentes niveles jerárquicos de agrupación (entre individuos, entre poblaciones y entre grupos de poblaciones), mediante la partición de la varianza en componentes de covarianza dados por las diferencias entre poblaciones y entre los individuos de la población. Para evaluar el aislamiento por distancia se utilizó una prueba de Mantel con el programa IBDWS (Jensen et al., 2005), utilizando como distancia genética los valores de FST obtenidos con FSTAT 2.9.3 (Goudet, 1995) y la distancia geográfica lineal entre localidades (en km) para cada una de las poblaciones, obtenidas mediante la herramienta Measure del programa Google Earth (2011). Por su parte, se obtuvo un estimado de migrantes de primera generación entre poblaciones con GeneClass y además, con Arlequin 3.5.1.3, se estimó el número efectivo de migrantes (Nm) a partir de las diferencias en las frecuencias alélicas entre poblaciones (FST y RST) (Allendorf y Luikart, 2007), con el fin de obtener un estimado indirecto de dicho flujo. Con el programa BIMr V.1.0 (Faubet y Gaggiotti, 2008) se calcularon las de tasas de migración reciente entre localidades de muestreo. Este programa permite hacer inferencias de proporciones recientes de genes inmigrantes a través de aproximaciones Bayesianas. Para el análisis se utilizaron todos los parámetros que venían por defecto en el programa (Burnin=10000, Tamaño de la muestra=10000, Thining interval= 50, 3 réplicas). Sayra Rosio Espindola Barrientos 27 Para asociar la ubicación geográfica con la diferenciación genética se utilizó el programa GESTE V.2.0 (Foll y Gaggiotti, 2006), que permite estimar valores locales de FST basados en el localidad de muestreo. Este programa utiliza métodos bayesianos para evaluar el efecto que tienen los factores ambientales en la estructura genética de las poblaciones. El programa utiliza modelos lineales generalizados para relacionar las características genéticas, con los factores ambientales y su interacción. Para una primera estimación se realizó un ensayo utilizando como factor ambiental la distribución espacial de las poblaciones. Los datos genéticos incluyeron 9 loci microsatélites, y como factores se utilizaron las coordenadas geográficas (en grados decimales) de cada localidad de muestreo (Factor 1 = latitud, Factor 2 = longitud) y además se agregó la interacción entre factores, obteniendo cinco modelos probables (M): 1. M1=Constante (Modelo en donde los factores ambientales no tienen efecto sobre la diferenciación genética). 2. M2=Constante, Factor 1 (Modelo en donde la latitud tiene efecto sobre la diferenciación genética). 3. M3=Constante, Factor 2 (Modelo en donde la longitud tiene efecto sobre la diferenciación genética). 4. M4=Constante, Factor 1,Factor 2 (Modelo en donde los dos factores tienen efecto sobre la diferenciación genética). 5. M5=Constante, Factor 1 * Factor 2, Factor 1, Factor 2 (Modelo en donde la interacción de los factores tienen efecto sobre la diferenciación genética). En el segundo ensayo se evaluó la influencia de la conectividad entre localidades de muestreo (medida a partir de distancias geográficas promedio) en el grado de diferenciación (FST local) obtenido. Para este caso se utilizó la conectividad como único factor, donde Factor 1= [Suma de distancias de una población respecto a las demás (km)/número de poblaciones], obteniendo dos modelos probables: M1=Constante (Modelo en donde la conectividad no tiene efecto sobre la diferenciación genética) y M2=Constante, Factor 1 (Modelo en donde la conectividad tiene efecto sobre la diferenciación genética). Ambos análisis se realizaron con los valores que el programa trae por defecto y se repitieron tres veces para confirmar la consistencia de los resultados obtenidos. 5.5. Pruebas de parentesco y tamaño efectivo Otras estimaciones que pueden hacerse a partir de datos genéticos son las relaciones genealógicas entre individuos, representadas como la probabilidad de que los genotipos de los individuos compartan cero, uno o dos alelos idénticos por descendencia (Blouin, 2003); así como el cálculo del tamaño efectivo de las poblaciones. Dichas estimaciones permiten caracterizar el comportamiento demográfico de las poblaciones. Así, se estimaron la relación de parentesco entre individuos con el programa ML-RELATE (Kalinowski et al., 2006). Este programa se basa en pruebas de máxima verosimilitud e incluye alelos nulos, por lo que no es necesario eliminar loci (Wagner et al., 2006), y además ofrece resultados sobre conectividad entre poblaciones Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 28 (identidad por descendencia de alelos) y de relación (clasificando a los individuos en una genealogía por categorías, padre-hijo, hermanos, medios hermanos, etc.). El tamaño efectivo (Ne) se refiere a la porción de individuos en una población que puede reproducirse exitosamente, ya que estos son los que contribuyen a la generación siguiente en términos demográficos y genéticos (Hedrick, 2000). Este valor se determinó con los programas NeEstimator v. 1.3 (Peel et al., 2004; Ovenden et al., 2007) y LDNE v.1.31 (Waples, 2006) a partir de la medida del desequilibrio de ligamiento entre pares de loci en una población, suponiendo un sistema de apareamiento aleatorio. Debido a que el tamaño de las muestras fue pequeño, se evaluó el valor de significancia mediante correcciones de Bonferroni secuencial para todos los análisis mencionados (Rice, 1989). Sayra Rosio Espindola Barrientos 29 R E S U L T A D O S 1. Muestreo y número de individuos Luego de un esfuerzo de captura de aproximadamente 40,000 trampas-noche se obtuvo un éxito por debajo del 3 %. Las trampas se colocaron en los ejes 4 y 5 de CAPA, al noroeste, noreste, este y sur de la isla (Fig. 1). Para este trabajo se eligió aleatoriamente una submuestra de 90 individuos de O. c. cozumelae, de los 228 analizados por Vega y colaboradores (2007). Estos fueron genotipificados para nueve loci microsatélites. Para R. spectabilis se obtuvieron 90 individuos capturados durante los mismos muestreos en siete sitios distintos de la isla (Fig. 1). 2. Presencia de alelos nulos y tartamudeos Sólo se encontró la presencia de alelos nulos y tartamudeos para el locus mexR32 de R. spectabilis. Al analizar la población en su conjunto se obtuvo que los loci mexR16 y mexR19 pudieran presentar alelos nulos; sin embargo, al hacer la corrección no presentan diferencias significativas, de tal manera que se incluyeron para todos los análisis. 3. Definición de subgrupos y asignación de individuos Para O. c. cozumelae se obtuvo un único cluster (LnP(K)= -2471.3, ∆K=0.60), mientras que los individuos de R. spectabilis fueron distribuidos en cuatro grupos (LnP(K)=-3334.6, ∆K=1.74) por el programa STRUCTURE, con un porcentaje de asignación de entre 45.6 y 76.5% (probabilidad de pertenencia) y con el 60% de los individuos asignados a algún grupo (umbral=0.7) (Cuadros 1 y 2 y Fig. 2). El análisis con GENECLASS2 permitió ubicar en SANTA RITA N=1 MANGLAR N=2 N=2 POTABILIZADORA N=3 N=24 MEZCALITOS N=1 N=4 PALMAS N=2 N=32 CAPA N=80 N=27 Fig. 1. Imagen de la Isla Cozumel, Q. Roo, con los puntos de muestreo establecidos y tamaño de muestra; en color amarillo se muestran los puntos con capturas de O. c. cozumelae, y en rojo de R. spectabilis (Mapa obtenido de Google Earth, 2012). CENOTE N=2 10km Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 30 algún grupo el 92% de estos individuos, mientras que el 8% restante se asignó según la población en donde habían sido capturados. Cuadro 1. Porcentajes de pertenencia para cada localidad de muestreo de R. spectabilis, en relación a los cuatro grupos obtenidos con el programa STRUCTURE. Se resaltan en negritas el porcentaje más alto para cada localidad. (N=numero de muestras). Dada la localidad Clusters inferidos (% de asignación) N 1 2 3 4 CAPA 4.4 76 2.8 8.4 12.8 16 CAPA 4.8 7.6 76.5 8.5 7.4 11 MANGLAR 9.7 12.1 16 62.1 2 MEZCALITOS 13 19.4 55.1 12.5 4 PALMAS 17 6 56.2 20.9 32 POTABILIZADORA 14.7 4.6 14.4 66.4 24 SANTA RITA 45.6 8 11.5 34.9 1 Cuadro 2. Porcentaje por localidad de muestreo de los individuos de R. spectabilis que fueron asignados a algún cluster con un porcentaje de probabilidad mayor a 70% Población de origen Porcentaje de individuos i d Cluster asignado CAPA 4.4 81.3% 1 CAPA 4.8 81.8% 2 MANGLAR 50.0% 4 MEZCALITOS 50.0% 3 PALMA 48.4% 3 POTABILIZADORA 56.0% 4 SANTA RITA 0.0% - TOTAL 60.0% - Cuadro 3. Asignación de individuos de R. spectabilis detectados como migrantes de primera generación a su población más probable. Lugar de captura Población probable CAPA 4.4 Palma CAPA 4.8 Mezcalitos CAPA 4.8 Potabilizadora Manglar Palma Manglar Potabilizadora Palma Potabilizadora Potabilizadora Palma Potabilizadora CAPA 4.4 Santa Rita CAPA 4.4 Sayra Rosio Espindola Barrientos 31 Fig 2. a) Representación gráfica del porcentaje de asignación por localidad de muestreo de R. spectabilis, en relación a los cuatro clusters obtenidos con el programa STRUCTURE. Los puntos en rojo señalan la ubicación del localidad de muestreo. Los colores azul, rojo, verde y morado de las gráficas de pastel, permiten visualizar cómo se agrupan los localidades de muestreo en los cuadro grupos inferidos según el mayor porcentaje de asignación. b) Gráfico obtenido de STRUCTURE en donde se observan los cuatro clusters (amarillo, azul, rojo y verde) y un alto contenido de mezcla entre localidades; en el eje “x” están señaladas las poblaciones por localidad de muestreo y el tamaño de muestra (N), el eje “y” representa el porcentaje de pertenencia a algún custer por individuo. a) b) CAPA 4.4 (N=16) MANGLAR (N=2) PALMAS (N=32) CAPA 4.8 (N=11) MEZCALITOS (N=4) POTABILIZADORA (N=24) 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 32 Los resultados que se presentan a partir del siguiente apartado (exceptuando aquellos en donde se mencione explícitamente) estarán dados por los clusters o grupos inferidos por STRUCTURE: grupo 1 = CAPA 4.4 y Santa Rita, grupo 2 = CAPA 4.8, grupo 3 = Mezcalitos y Palmas, grupo 4 = Manglar y Potabilizadora. Además se presentan los resultados de la población en conjunto, es decir, tomando en cuenta a todos los individuos como una única población en toda la isla. 4. Equilibrio Hardy-Weinberg (H-W) Para R. spectabilis los coeficientes de fijación (F IS) según el método de Weir y Cockerham mostraron valores entre 0.2308 y -0.272; sólo el locus mexr19 mostró una deficiencia de heterocigotos significativa para el grupo 2 (Cuadro 4). El locus mexR32 mostró exceso de homocigotos, probablemente debido a la presencia de alelos nulos. Cuadro 4. Coeficiente de fijación (F IS) y valores de probabilidad (P) de Weir y Cockerham para cada locus por grupo y para la población en conjunto de R. spectabilis (* p≤0.05, con corrección de Bonferroni). Se señala en gris el locus que presentó alelos nulos. Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 En conjunto LOCUS F IS p F IS p F IS p F IS p F IS p mexr16 0.03 0.6365 -0.1364 0.3772 0.0754 0.1649 0.165 0.1824 0.0934 0.1438 mexr19 0.0028 0.9646 0.2308 0.0037* 0.0107 0.8317 -0.0323 0.8986 0.1264 0.0146 mexr20 0.0323 0.4374 0.0576 0.3353 -0.0548 0.0467 -0.0601 0.0698 0.0088 0.1696 mexr22 -0.0298 0.5603 -0.2717 0.3785 0.1653 0.0409 0.1228 0.0791 0.0492 0.043 mexr23 -0.1429 1 -0.2727 0.5531 -0.1 1 -0.1364 1 -0.0039 1 mexr12 0.0409 0.7998 -0.0227 0.623 0.0876 0.0889 0.1007 0.1344 0.0653 0.2172 mexr32 0.6949 0* 0.5949 0.1034 0.6811 0* 0.8144 0* 0.72 0* mexr33 -0.021 0.6949 -0.2579 0.4573 -0.2252 0.4318 -0.1201 0.2459 -0.0954 0.5116 mexr34 -0.1021 0.7333 -0.0063 0.0239 -0.0811 0.873 -0.0244 0.9584 -0.0157 0.3326 mexr13 -0.1126 0.7215 -0.2429 0.399 0 0.3018 -0.0668 0.8401 -0.0374 0.7168 Los valores de F IS para O. c. cozumelae se encontraron entre -0.1076 y 0.1001, sin ninguna desviación significativa del equilibrio H-W. 5. Desequilibrio de ligamiento En el caso de R. spectabilis, se encontró desequilibrio de ligamiento (DL) significativo para dos pares de loci (mexr16/mexr34 y mexr19/mexr12) de las 36 combinaciones posibles, ambos al analizar la población en conjunto (Anexo 4). Para O. c. cozumelae sólo el par de loci Ory03/Ory28 presentó un DL significativo (p<0.05 con corrección de Bonferroni). Sayra Rosio Espindola Barrientos 33 6. Diversidad genética Los análisis de diversidad para R. spectabilis por grupo y en la población en conjunto mostraron un rango de 2 (mexr23, grupo 1, 2 y 3) a 18 alelos (mexr13, población en conjunto) y un promedio de 12.5 alelos para toda la población (Cuadro 5). El rango de alelos efectivos varió de 1.2 (mexr23, grupo 3) a 9.7 (mexr19, población en conjunto), con una media de 7.09. Todos los grupos presentaron alelos privados para al menos un locus: el grupo 1 mostró seis alelos exclusivos en cinco loci, el grupo 2 tuvo un alelo exclusivo para mexr12, el grupo 3 presentó tres alelos exclusivos en 3 loci y el grupo 4 13 alelos exclusivos en 8 loci (Cuadro 5). La heterocigosidad observada (Ho) promedio varió entre grupos de 0.768 (grupo 3) a 0.828 (grupo 2), mientras que para la población en conjunto fue de 0.79. Las heterocigosidades esperada (He) y de Nei (HNEI) variaron entre grupos de 0.727-0.757 a 0.773-0.784, respectivamente, mientras que para la población en conjunto éstas fueron de 0.803 y 0.808. Los loci mexr22, mexr33 y mexr13 presentaron los niveles de Ho más altos, mientras que el locus mexr23 el más bajo, con 0.217 para el grupo 3 (Cuadro 5). Cuadro 5. Valores de diversidad genética por locus para los cuatro clusters y para la población en conjunto de R. spectabilis. En negritas se resaltan los valores promedio. (N= tamaño de muestra, na=alelos observados, ne= alelos efectivos, ae= número de alelos privados, Ho= heterocigosidad observada, He= heterocigosidad esperada, HNEI= heterocigocidad esperada de Nei). GRUPO LOCUS N na ne ae Ho He HNEI 1 mexr16 21 10 5.3787 0 0.8095 0.8140 0.8339 mexr19 21 11 6.1946 0 0.8571 0.8385 0.8590 mexr20 21 12 7.3662 2 0.8571 0.8642 0.8853 mexr22 21 9 7.0759 1 0.9047 0.8586 0.8796 mexr23 21 2 1.3247 0 0.2857 0.2451 0.2510 mexr12 21 9 5.6501 1 0.8095 0.8230 0.8430 mexr33 21 6 4.4314 0 0.8095 0.7743 0.7932 mexr34 21 7 3.5616 1 0.8095 0.7192 0.7367 mexr13 21 11 8.3096 1 1 0.8796 0.9011 MEDIA 21 8.56 5.477 0.67 0.7937 0.7574 0.7759 2 mexr16 11 7 4.3196 0 0.9091 0.7685 0.8051 mexr19 11 8 4.5683 0 0.6364 0.7811 0.8183 mexr20 11 8 5.7654 0 0.8182 0.8266 0.8659 mexr22 11 5 4.1783 0 1 0.7607 0.7969 mexr23 11 2 1.9359 0 0.6364 0.4834 0.5065 mexr12 11 7 4.2535 1 0.8182 0.7649 0.8013 mexr33 11 5 3.3114 0 0.9091 0.6980 0.7313 mexr34 11 4 3.224 0 0.7273 0.6898 0.7227 mexr13 11 6 4.4853 0 1 0.7770 0.8141 MEDIA 11 5.78 4.0046 0.11 0.8283 0.7278 0.7624 Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 34 Los valores observados para O. c. cozumelae se muestran en el cuadro 6. Se obtuvo una media de 9.8 alelos observados y 4.2 alelos efectivos. El mayor número de na fue en el locus Ory10 (14 alelos). Los valores de heterocigosidad observada, esperada y de Nei fueron, en promedio de 0.7, 0.68 y 0.69, respectivamente. GRUPO LOCUS N na ne ae Ho He HNEI 3 mexr16 23 9 4.5684 1 0.7391 0.7811 0.7985 mexr19 23 11 5.4468 0 0.8261 0.8164 0.8345 mexr20 23 12 6.577 0 0.9130 0.8480 0.8668 mexr22 23 8 3.4593 0 0.6087 0.7109 0.7267 mexr23 23 2 1.2411 0 0.2174 0.1942 0.1986 mexr12 23 9 6.1417 1 0.8261 0.8372 0.8558 mexr33 23 8 5.0688 1 1 0.8027 0.8206 mexr34 23 7 4.7301 0 0.8696 0.7886 0.8061 mexr13 23 13 9.4011 0 0.9130 0.89363 0.9135 MEDIA 23 8.78 5.1816 0.33 0.7681 0.7414 0.7579 4 mexr16 35 12 7.0973 1 0.7714 0.8591 0.8716 mexr19 35 12 6.5406 0 0.7714 0.8471 0.8594 mexr20 35 14 8.1808 1 0.9143 0.8778 0.8905 mexr22 35 11 8.0425 1 0.8571 0.8757 0.8884 mexr23 35 3 1.3784 1 0.3143 0.2745 0.2785 mexr12 35 10 5.9541 1 0.8857 0.8320 0.8441 mexr33 35 9 4.5557 1 0.8857 0.7805 0.7918 mexr34 35 10 4.9468 4 0.8286 0.7978 0.8094 mexr13 35 13 5.5367 3 0.8858 0.8194 0.8313 MEDIA 35 10.44 5.8036 1.44 0.7905 0.7738 0.7850 CONJUNTO mexr16 90 13 7.3873 - 0.7889 0.8646 0.8695 mexr19 90 13 9.7696 - 0.7889 0.8976 0.9027 mexr20 90 17 9.2334 - 0.8889 0.8917 0.8967 mexr22 90 12 7.1195 - 0.8222 0.8595 0.8643 mexr23 90 3 1.4671 - 0.3222 0.3184 0.3202 mexr12 90 15 8.7841 - 0.8333 0.8862 0.8911 mexr33 90 10 5.4707 - 0.9 0.8172 0.8218 mexr34 90 12 5.1315 - 0.8222 0.8051 0.8096 mexr13 90 18 9.5006 - 0.9333 0.8947 0.8997 MEDIA 90 12.5556 7.096 - 0.7889 0.8039 0.8084 (Continuación cuadro 5) Sayra Rosio Espindola Barrientos 35 Cuadro 6. Valores de diversidad genética por locus para la población de O. c. cozumelae. En negritas se resaltan los valores promedio. (N=tamaño de muestra, na=alelos observados, ne=alelos efectivos, Ho=heterocigosidad observada, He=heterocigosidad esperada, HNEI=heterocigocidad esperada de Nei). 7. Distribución de frecuencias alélicas, genotípicas y diferenciación Cuadro 7. Número total de alelos y genotipos observados para cada locus analizado en R. spectabilis. LOCUS ALELOS GENOTIPOS mexr16 13 42 mexr19 13 49 mexr20 17 50 mexr22 12 38 mexr23 3 4 mexr12 15 44 mexr33 10 25 mexr34 12 26 mexr13 18 52 TODOS 113 330 Para R. spectabilis se obtuvieron un total de 113 alelos entre los nueve loci (Cuadro 7). En conjunto, las frecuencias alélicas por locus varían en su valor máximo entre 0.806 y 0.167 y en su valor mínimo de 0.022 a 0.006 (Ver Anexo 8). Al evaluar la diferenciación alélica entre pares de grupos se encontró para todos los loci una diferenciación altamente significativa (p<0.05 con corrección de Bonferroni) y en la mayoría de los casos cuando se evaluó por locus entre pares de grupos (Anexo 5a). En cuanto a los genotipos para R. spectabilis se obtuvo un total de 330 para los 9 loci, variando de entre cuatro (locus mexr23) y 52 (mexr13) (Cuadro 7). Se observó un gran número de genotipos exclusivos entre grupos (ver anexo). Los genotipos homócigos por locus variaron de siete (mexr12) a dos (mexr23). El mayor Locus N na ne Ho He HNEI Ory03 90 9 3.4402 0.6421 0.7093 0.7131 Ory10 14 6.6594 0.9368 0.8498 0.8543 Ory16 12 4.9368 0.8421 0.7974 0.8017 Ory21 13 6.8831 0.8105 0.8547 0.8592 Ory28 7 3.395 0.6842 0.7055 0.7092 Ory40 8 2.6093 0.6526 0.6168 0.6200 Ory60 10 6.3226 0.9368 0.8418 0.8463 Ory64 9 2.3064 0.5579 0.5664 0.5694 Ory26 7 1.3505 0.2737 0.2596 0.2609 MEDIA 90 9.8889 4.2115 0.7041 0.6890 0.6927 Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 36 número de heterócigos lo presentó el locus mexr13 (94% de los genotipos observados) y el menor el locus mexr23 con 50% (Ver Anexo 9). La diferenciación genotípica entre pares de grupos mostró que los genotipos no se distribuyen homogéneamente tanto al evaluar todos los loci en conjunto como por locus (p<0.05, con corrección de Bonferroni) (Anexo 5b). O. c. cozumelae presentó un total de 89 alelos y 207 genotipos entre los nueve loci evaluados. Con un rango de frecuencias alélicas de entre 0.0053 y 0.850, donde el locus Ory26 fue el que presentó mayor porcentaje de genotipos homocigotos. Al evaluar las poblaciones por localidad de muestreo no se encontró diferenciación alélica ni genotípica (p>0.05 con corrección de Bonferroni), lo que confirma los resultados obtenidos con Structure, en donde se observa una única población (Anexos 6 y 7). 8. Estructura y diferenciación genética Los valores de FST por locus para los grupos de R. spectabilis varían entre 0.026 (mexr20) y 0.177 (mexr23), mientras que en conjunto este valor es de 0.0604 (Cuadro 8). Los valores de DEST y G’ST oscilan entre 0.070 y 0.455; y 0.022 y 0.106, respectivamente. Cuadro 8. Estadísticos F obtenidos según el método de Weir y Cockerham y estadísticos G’ST y DEST por locus para R. spectabilis LOCUS F IS FST F IT G’ST DEST mexr16 0.0577 0.0517 0.1064 0.039 0.250 mexr19 0.0715 0.08 0.1458 0.039 0.322 mexr20 -0.0102 0.026 0.016 0.022 0.189 mexr22 0.0143 0.0484 0.0619 0.045 0.285 mexr23 -0.1601 0.1773 0.0456 0.106 0.070 mexr12 0.0102 0.0755 0.0849 0.058 0.332 mexr33 -0.1394 0.0527 -0.0794 0.037 0.164 mexr34 -0.054 0.0496 -0.0017 0.025 0.103 mexr13 -0.0793 0.053 -0.0221 0.063 0.455 TODOS -0.0208 0.0604 0.0408 0.048 0.241 El AMOVA se realizó utilizando a los sitios muestreados como “poblaciones” y a los clusters obtenidos con STRUCTURE como “grupos”. Los resultados de FST mostraron que la variación se distribuye en mayor porcentaje entre los individuos, seguido de la variación entre grupos y entre poblaciones dentro de los grupos (ambas con valores significativos), mientras que no hay variación entre individuos dentro de cada población. Al repetir el análisis utilizando los valores de RST, se obtuvo nuevamente que el mayor porcentaje de variación esta dado entre individuos y entre poblaciones dentro de los grupos (P=0.036), un pequeño porcentaje entre Sayra Rosio Espindola Barrientos 37 individuos dentro de cada población y no hay variación entre grupos (Cuadro 9). La variación entre grupos y entre poblaciones dentro de los grupos fue estadísticamente significativa. Cuadro 9. AMOVA basado en los valores de a) FST y b) RST, tomando como grupos los clusters de R. spectabilis obtenidos de STRUCTURE y como poblaciones las localidades muestreadas (* p<0.05 con corrección de Bonferroni). Abreviaturas: GL=grados de libertad, SC=suma de cuadrados, CV=coeficiente de variación. a) Fuente de variación GL SC CV % DE VARIACIÓN P Entre grupos 3 35.408 0.1316 3.5620 0.0101* Entre poblaciones dentro de los grupos 3 12.189 0.0756 2.0475 0.0001* Entre individuos dentro de cada población 83 284.197 -0.0630 -1.7046 0.8392 Entre individuos 90 319.5 3.55 96.0951 0.0547 Total 651.294 3.6943 b) Fuente de variación GL SC CV % DE VARIACIÓN P Entre grupos 3 3805.853 -45.6042 -9.30029 0.8836 Entre poblaciones dentro de los grupos 3 3292.787 74.2288 15.1379 0.0369* Entre individuos dentro de cada población 83 39053.316 8.7943 1.7935 0.3918 Entre individuos 90 40764 452.9333 92.3690 0.0905 Total 86915.956 490.3522 Se realizó un segundo análisis utilizando sólo los clusters, el cual mostró que tanto con FST y RST la variación se distribuye mayoritariamente entre individuos (95.92% y 91.9%, respectivamente; p>0.05), seguida por la variación entre poblaciones (6.04% y 5.2%, respectivamente; p<0.001) y finalmente entre individuos dentro de las poblaciones (1.96% [p=0.0412] y 2.9% [p=0.0658], respectivamente) (Datos no mostrados). Otra estimación que se realizó para saber el grado de diferenciación entre grupos fue el cálculo de la distancia genética de Nei (DNEI), obteniendo valores promedio de entre 0.35 (entre los grupos 1 y 4) y 0.64 (entre los pares de grupos [1 y 2] y [2 y 3]) (Cuadro 10). Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 38 Cuadro 10. Distancia genética de Nei calculadas por locus entre pares de grupos de R. spectabilis. Se resaltan en negritas los valores promedio. Los resultados sobre FST locales para cada localidad de muestreo (Fig. 2), mostraron que la población CAPA 4.8 está más diferenciada del resto de las poblaciones (FST local= 0.124); mientras que Palmas y Potabilizadora presentaron los FST locales más bajos (0.03) (Cuadro 11). Cuadro 11. Valores de FST locales obtenidos para cada localidad de muestreo de R. spectabilis FST MEDIA MODA Intervalos de confianza 95% CAPA 4.4 0.0665 0.0634 [0.0369 – 0.0987] CAPA 4.8 0.1240 0.1167 [0.0724 – 0.1787] MANGLAR 0.0544 0.0282 [0.0003 – 0.1303] MEZCALITOS 0.0698 0.0575 [0.0112 – 0.1347] PALMAS 0.0377 0.0360 [0.0206 – 0.0565] POTABILIZADORA 0.0384 0.0365 [0.0203 – 0.0588] SANTA RITA 0.0668 0.063 [0.0367 – 0.099] El análisis sobre los factores geográficos para determinar el modelo más probable que explicara la diferenciación observada mostró, para la primera prueba basada en ubicación geográfica (latitud y longitud), que el modelo más probable fue M1=Constante (63.7%), es decir, que ninguno de los dos factores, ni su interacción, explican la diferenciación entre localidades. La segunda prueba permitió evaluar si la conectividad entre poblaciones (medida en distancias promedio) tenía algún efecto sobre los FST locales, y el modelo más probable fue nuevamente M1=Constante, con una probabilidad del 86.4%, lo que significa que la conectividad entre poblaciones tampoco explica la diferenciación genética que existe. 1 y 2 1 y 3 1 y 4 2 y 3 2 y 4 3 y 4 mexr16 0.8019 0.0831 0.2954 0.9543 0.7470 0.4180 mexr19 0.7259 0.7828 0.5971 2.0278 1.0377 0.6429 mexr20 0.9118 0.6105 0.2713 0.3584 0.4579 0.1565 mexr22 0.7446 0.4276 0.3885 0.4330 0.2127 0.2219 mexr23 0.3615 0.0010 0.0018 0.4084 0.3956 0.0014 mexr12 0.6535 0.6025 0.5818 0.3766 1.2796 0.6988 mexr33 0.2912 0.2876 0.3873 0.5043 0.1942 0.0572 mexr34 0.5797 0.5492 0.1532 0.0600 0.2257 0.2181 mexr13 0.7017 0.4704 0.4882 0.6704 0.2717 0.8391 MEDIA 0.6413 0.42385 0.3516 0.6437 0.5358 0.3615 Sayra Rosio Espindola Barrientos 39 La figura 3 representa un árbol filogenético de las localidades muestreadas. Se observan dos grupos, en donde las localidades Potabilizadora y CAPA 4.8 son las dos más diferenciadas. La diferenciación entre localidades se muestra en el cuadro 12. La mayor diferenciación se observa entre las localidades [CAPA 4.4 y CAPA 4.8] y [CAPA 4.8 y Potabilizadora]. Cuadro 12. Estadísticos de diferenciación genética entre las localidades muestreadas de R. spectabilis LOCALIDADES FST RST G’ST DEST CAPA 4.4 CAPA 4.8 0.0989 0.1277 0.055 0.4202 CAPA 4.4 Manglar 0.0497 0.2073 0.016 0.2965 CAPA 4.4 Mezcalitos 0.0421 0.0756 0.017 0.2359 CAPA 4.4 Palmas 0.0427 0.0035 0.020 0.2191 CAPA 4.4 Potabilizadora 0.0541 0.0005 0.029 0.2612 CAPA 4.8 Manglar 0.0844 0.2498 0.035 0.2646 CAPA 4.8 Mezcalitos 0.0616 0.0618 0.035 0.1695 CAPA 4.8 Palmas 0.0845 0.1004 0.051 0.3305 CAPA 4.8 Potabilizadora 0.0979 0.1424 0.063 0.3455 Manglar Mezcalitos 0.0642 0.3401 0.018 0.2713 Manglar Palmas 0.0246 0.1158 0.006 0.1539 Manglar Potabilizadora 0.0088 0.1383 0.002 0.0419 Mezcalitos Palmas 0.0248 0.0856 0.008 0.1493 Mezcalitos Potabilizadora 0.0499 0.0984 0.021 0.2546 Palmas Potabilizadora 0.0329 0.0196 0.017 0.1742 MANGLAR POTABILIZADORAt CAPA4.4 CAPA4.8 MEZCALITOS PALMAS 73 64 43 0.01 Fig. 3. Árbol filogenético por el método de NJ utilizando FST corregido por el tamaño de muestra para las localidades muestreadas de R. spectabilis. Los números en el árbol representan los valores de soporte por bootstrap. Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 40 9. Aislamiento por distancia Los resultados de aislamiento por distancia entre pares de poblaciones para R. spectabilis (por localidad de muestreo) mostraron un valor de R2 de 0.155 (r=0.3936; p=0.029), lo que indica que existe una ligera, pero significativa, correlación entre la distancia genética y la distancia geográfica (Fig. 4). 10. Tamaño efectivo por población y parentesco Para R. spectabilis se estimó un Ne total de 152.4 individuos, cálculo basado en el desequilibrio de ligamiento en un momento en el tiempo. Al separar por grupos se obtuvo un Ne máximo de 178.7 individuos para el grupo 4 y de tan sólo 11 individuos para el grupo 2 (Cuadro 13). En el caso de O. c. cozumelae, bajo las mismas condiciones de análisis, se estimó un Ne de 133.2 individuos (con intervalos de confianza al 95% de 106.3 a 174.3 individuos). Cuadro 13. Tamaño efectivo (Ne) estimado con el método basado en desequilibrio de ligamiento (DL) y por exceso de Heterocigotos para los 4 grupos y la población en conjunto de R. spectabilis. Población DL Exceso Heterocigotos Ne Intervalo de confianza 95% Ne Grupo 1 70.2 [43.2-165.7] 32.1 Grupo 2 11 [8.2-15.8] 7.9 Grupo 3 84 [50.6-215.3] 28.2 Grupo 4 178.7 [103-573.4] 121.7 Conjunto 152.4 [123.7-195.1] Infinito D is ta n ci a g e n é ti ca ( F S T ) Distancia geográfica (Km) Fig 4. Gráfica de la correlación entre las distancias genéticas (FST) y geográficas (Km) entre pares de localidades de muestreo (círculos en blanco) de R. spectabilis. R 2 = 0.155 Sayra Rosio Espindola Barrientos 41 El análisis de parentesco para R. spectabilis mostró que el 86% de los individuos no tienen una relación cercana de parentesco, que el 11.8% son medios hermanos y que el resto son padres-hijos o hermanos (Cuadro 13). Al evaluar por grupos se encontró que en todos los casos más del 80% de los individuos no presentan un parentesco cercano, entre el 3% y 9.1% son medios hermanos y sólo una pequeña porción corresponde a relaciones padre-hijo o hermanos completos. Sólo en el grupo 2 se observa un mayor porcentaje de parentesco padre-hijo (7.3%) en relación al resto de los grupos (Cuadro 14). Para O. c. cozumelae se estimó que el 80.07% de los individuos no tienen parentesco, mientras que el 15.25% son medios hermanos, el 2.28% son hermanos y el 2.4% tienen una relación padres-hijos. Cuadro 14. Porcentaje de las relaciones de parentesco para cada grupo y para la población en conjunto de R. spectabilis. Parentesco Grupos (%) Conjunto (%) 1 2 3 4 Padres e hijos 1.43 7.27 0.79 0.50 0.40 Hermanos 0.48 7.27 1.19 1.01 0.85 Medios hermanos 6.19 3.64 7.51 9.08 11.76 Sin parentesco cercano 91.90 81.82 90.51 89.41 86.99 11. Flujo génico El análisis para detectar migrantes de primera generación entre localidades de muestreo reveló que nueve individuos de R. spectabilis eran potencialmente migrantes (p<0.01) (Cuadro 3). Una vez asignados todos los individuos a un cluster determinado se observó que el grupo 3 (integrado en su mayoría por individuos provenientes de Palmas) recibe un 36% de individuos provenientes de otros grupos. En el cuadro 3 se enlistan las poblaciones de origen probables en relación al sitio en donde fueron capturados dichos individuos. Se realizó una segunda prueba con GENEPOP, pero ahora utilizando los cuatro grupos definidos por STRUCTURE, con el que se obtuvo un estimado de 3.91 migrantes, lo que puede estar relacionado con los individuos que tuvieron un porcentaje de asignación bajo (Ver asignación de individuos y Cuadro 2). Además se calcularon las tasas de migración para la última generación utilizando el programa BIMr (Cuadro 15), observando valores muy pequeños entre poblaciones. Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 42 Cuadro 15. a) Tasas de migración y b) coeficientes de endogamia de la última generación entre las poblaciones por localidad de muestreo de R. spectabilis obtenidas de BIMr. Abreviaturas: D.E=desviación estándar. a) Tasas de migración De/Para CAPA 4.4 CAPA 4.8 MANGLAR MEZCALITOS PALMAS POTABILIZADORA SANTA RITA CAPA 4.4 1 2.5461E-10 2.6886E-10 2.3705E-10 2.3252E-10 2.5803E-10 3.1999E-10 CAPA 4.8 4.4869E-10 1 4.0156E-10 3.4878E-10 3.6123E-10 3.5173E-10 3.3857E-10 MANGLAR 2.0369E-10 2.7585E-10 1 2.1899E-10 2.0938E-10 2.9517E-10 2.2401E-10 MEZCALITOS 4.0238E-10 3.5423E-10 3.8446E-10 1 3.7436E-10 3.6999E-10 3.6429E-10 PALMAS 2.8841E-10 2.9506E-10 2.3393E-10 2.3229E-10 1 2.3945E-10 2.2958E-10 POTABILIZADORA 3.5717E-10 3.8659E-10 4.2719E-10 3.6756E-10 3.4049E-10 1 3.6272E-10 SANTA RITA 4.0978E-10 3.7750E-10 4.0993E-10 3.9840E-10 3.8561E-10 4.1803E-10 1 b) Coeficientes de endogamia Población Media D.E CAPA 4.4 0.0256 0.0212 CAPA 4.8 0.0216 0.0202 MANGLAR 0.0857 0.0727 MEZCALITOS 0.0685 0.0551 PALMAS 0.0172 0.0145 POTABILIZADORA 0.0189 0.0159 SANTA RITA 0.1018 0.0919 Sayra Rosio Espindola Barrientos 43 D I S C U S I Ó N Este trabajo representa el primer estudio genético comparativo sobre la variación genética de dos roedores insulares y endémicos. Se encontraron diferencias genéticas entre especies, principalmente en la distribución de la variación genética, pues mientras que O. c. cozumelae se comportó como una población panmíctica, R. spectabilis mostró una clara estructuración y limitado flujo génico, probablemente debido a su poca vagilidad, su especificidad de hábitat y el comportamiento antidepredatorio que presenta. Ambos roedores presentan niveles altos de diversidad genética (Ho = 0.70 y 0.78) y alélica (na = 9.88 y 12.56), que se contraponen con lo esperado bajo la teoría de genética de poblaciones en islas, la cual indica que las poblaciones insulares presentan menor variación genética que su contraparte continental (Franham, 1997). Otros estudios en mamíferos pequeños con poblaciones insulares han asociado valores bajos diversidad genética a factores como aislamiento (Bidlack y Cook, 2002), efecto fundador y densidades poblacionales bajas (Jones et al., 2004; Abdelkin et al., 2005), a la presencia de endogamia (Eldridge et al., 1999; Eldridge et al., 2004), e incluso, debido al tamaño pequeño de la isla (Hinten et al., 2003; White y Searle, 2007). Sin embargo se ha observado que especies insulares con elevada capacidad de dispersión, como los murciélagos (Mendoza- Martínez, 2011; Fleming y Murray, 2009; Yoshino et al, 2008; Rossiter et al., 2000), y aquellas que habitan islas de grandes extensiones (Hinten et al., 2003; White y Searle, 2007) mantienen una alta variación genética (0.6 < He<0.8). Esto, probablemente se deba a que islas grandes pueden mantener poblaciones de tamaños mayores y a su vez permite presentar más altas tasas de migración. En este estudio confirmamos la inusual diversidad genética alta de O. c. cozumelae que ya había sido observada por Vega y colaboradores (2007), asociada tal vez con un tamaño de población suficientemente alto como para evitar la endogamia y la deriva génica, y permitiendo así mantener los niveles de diversidad genética y alélica que presenta. Sin embargo, a pesar de que en los últimos años ha habido una importante pérdida de cobertura vegetal en Cozumel y una disminución significativa en las densidades poblacionales de los roedores (ver Capítulo 3), éstas continúan manteniendo altos niveles de diversidad genética, por lo que es posible que a) no haya pasado el tiempo suficiente para ver un efecto significativo o b) otros mecanismos genéticos y ecológicos estén jugando un papel importante. El hecho de que O. c. cozumelae se comporte como una única población dentro de la isla indica que su capacidad de dispersión ha ayudado a mantener la diversidad genética de la especie, aún en presencia de densidades poblacionales bajas, como las que pueden resultar después del paso de huracanes. Diferentes estudios ya han demostrado como la migración, aun a tasas bajas, es altamente benéfica ya que previene la endogamia, aumenta la adecuación y favorece el crecimiento poblacional (Vilà et al., 2003). De hecho, se ha observado que la llegada de un solo migrante puede incrementar la heterocigosidad y la propagación de nuevos alelos en poblaciones genéticamente aisladas (Vilà et al., 2003; Waite et al., 2005; Adams et al., 2011). Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 44 Los requerimientos de hábitat también pueden estar asociados a la distribución de la diversidad genética que caracteriza a cada especie. Se ha observado que la disponibilidad de alimento, la estructura de la vegetación, el tamaño del parche e incluso la posibilidad de dispersión a través de la matriz determinan la abundancia, distribución y el grado de aislamiento de las poblaciones de roedores (Anderson, 2004). O. c. cozumelae, además de ser un roedor generalista, es un buen dispersor a través de grandes extensiones de agua (Cook et al., 2001) y es posible encontrarlo tanto en bosque primario como en zonas perturbadas y no presenta efectos de borde asociados a perturbación (Fuentes-Montemayor, 2009). Además, su abundancia tampoco tiene relación con variables como disponibilidad de refugio, cobertura vegetal del sotobosque, cantidad de semillas o densidad de árboles (Gutiérrez-Granados, 2003); por lo que al parecer no hay factores ecológicos que limiten su dispersión a lo largo y ancho de la isla, lo que permite que el flujo génico diluya los efectos de otros procesos evolutivos que podrían generar diferenciación. Esta característica parece ser común en otros mamíferos; por ejemplo, Estes-Zumpf et al. (2010) observaron que el conejo pigmeo Brachylagus idahoensis conforma un único grupo aún con localidades separadas por más de 14 km y separadas por caminos y arroyos. Además, la diversidad genética reportada aquí para ambos roedores en la isla podría estar favorecida con otros procesos evolutivos como la selección, sobre todo por el ambiente altamente cambiante (estacionalidad y ocurrencia de huracanes) y las fluctuaciones en las densidades poblacionales que se han observado (Gutiérrez-Granados, 2003). Se ha descrito que la selección puede retardar la pérdida de variación genética actuando a favor de los heterocigotos, confiriendo ventajas para adaptarse y “responder” de forma efectiva a ambientes cambiantes (Reed y Frankham, 2003; Bensch et al., 2006); o bien, reteniendo alelos alternos durante periodos de decremento y recuperación de las poblaciones y manteniendo con ello altos niveles de diversidad genética (Pembertón et al., 1996). Sin embargo, dado que para el presente trabajo se utilizaron microsatélites (considerados como marcadores neutros), es necesario realizar estudios posteriores con un mayor número de marcadores, sujetos a selección y que engloben características morfológicas, fisiológicas e historias de vida, así como asociar variables medioambientales, que permitan determinar el papel de la selección sobre la diversidad genética de estas poblaciones (Chapman et al., 2009). El caso de R. spectabilis requiere aún mayor atención, ya que además de mantener una alta diversidad, presenta una clara estructura a lo largo de la isla. El análisis de agrupación permitió definir cuatro subgrupos: uno al norte de la isla, otro al noreste y otros dos al centro. Dicha estructuración, que coincide con un sin número de estudios en poblaciones naturales (por ejemplo, Ehrich et al., 2001; Coulon et al., 2006; Gauffre et al., 2008; Meyer et al., 2009; Mapelli et al., 2012), refleja el aislamiento geográfico y ecológico que presentan las poblaciones de este roedor. En primer lugar la distancia entre poblaciones es una limitante en el intercambio genético entre subgrupos (evidenciado con el efecto de aislamiento por distancia que se observó) que, junto Sayra Rosio Espindola Barrientos 45 con la deriva génica, los tamaños efectivos locales y otros procesos evolutivos, probablemente han generado el grado de diferenciación que actualmente presentan sus poblaciones (FST LOCAL= entre 0.037 y 0.124). En comparación con O. c. cozumelae, parece ser que sí hay factores ecológicos en R. spectabilis que están determinando su estructuración, ya que sus requerimientos de hábitat son mucho más específicos: tiene mayor preferencia por sitios no perturbados, con abundante cobertura vegetal y alejados de los bordes (Fuentes- Montemayor, 2009); además su distribución podría estar delimitada según la estructura de la vegetación debido a sus hábitos semiarborícolas, formando “parches” con poca dispersión entre subpoblaciones y favoreciendo así la diferenciación genética. Sin embargo, existen pocos estudios que evalúen la importancia en la especificidad de hábitat sobre la estructura genética en mamíferos (Fisher y Owens, 2004; Loew et al., 2005). Nuestros resultados sugieren que, aunque los individuos comparten alelos a lo largo de toda la isla, el comportamiento de R. spectabilis tiene profundos efectos en sus características genéticas. En primer lugar la fobia lunar que presenta como comportamiento antidepredatorio (Fortes-Corona, 2004) puede estar determinando que este ratón no se desplace a través de grandes extensiones, favoreciendo, nuevamente, la diferenciación entre las poblaciones de la isla. Otros estudios han relacionado las historias de vida, los procesos demográficos y la conducta con la estructura poblacional. La dispersión basada en algún sexo, el tamaño de la población, el sistema de apareamiento y los tiempos generacionales son los principales atributos involucrados. Por ejemplo, Rosenbaum y colaboradores (2002) encontraron asociaciones entre factores ambientales, éxito reproductivo y estructura genética en la ballena jorobada (Megaptera novaeangliae) y ya en 1995, Palsboll y colaboradores la habían asociado con la conducta migratoria. Vázquez-Domínguez et al. (2002) encontraron que la estructura social de Liomys pictus (filopatría en hembras y dispersión en machos) determina su estructura poblacional. Para el conejo Oryctolagus cuniculus el aspecto social más importante sobre la estructura genética es que los adultos se vuelven sedentarios una vez que se establecen en algún grupo (Daly, 1981). En murciélagos con estructura social, como Cynpterus sphins, la formación de harems también genera una marcada estructura (Storz et al., 2001). Un estudio comparativo entre tres especies simpátricas mostró que en dos de ellas (Antechinus agilis y A. swainsonii) la distribución de su diversidad genética está basada en la dispersión por machos, mientras que la tercera (Rattus fuscipes), que presenta un tamaño corporal más pequeño y es más sensible a la fragmentación de hábitat, presenta un restringido flujo génico y la formación más marcada de “demes” (Kraaijeveld-Smit et al., 2007). Goossens et al. (2001) también atribuyen al comportamiento social de la marmota alpina (Marmota marmota) la diferenciación genética entre sus poblaciones. Por otra parte, resulta relevante la diferenciación tan marcada de los dos subgrupos que se encuentran al centro de la isla, ya que estos tienen, en relación con el resto de los subgrupos, una distancia geográfica lineal relativamente pequeña (3.02 km). A pesar de que no se cuenta con información acerca de algún tipo de comportamiento social, es posible que R. spectabilis forme “grupos” bien definidos, que pudieran ser la causa de la alta diferenciación en esta zona. De hecho, Fuentes-Montemayor (2009) observó que al menos las Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 46 poblaciones de esta zona (CAPA) tienen estructuración en cuanto a su distribución en el parche por sexo y edad y que es más difícil encontrarlos en las zonas más cercanas a los bordes. Justo el grupo más diferenciado (CAPA 4.8) mostró deficiencia de heterocigotos en uno de sus loci (mexr19), lo que podría estar relacionado con cierta endogamia dada por la delimitación de dichos “grupos”. Esta misma diferenciación podría estar asociada además a los altos porcentajes de asignación que se obtuvieron para estos dos grupos. Otra explicación podría estar relacionada con las características de CAPA, ya que es la zona más conservada de la isla, lo que podría proveerles de refugio y alimento suficiente para que no sea necesario el desplazamiento a grandes distancias, contrario a las zonas norte y noreste que presentar cierto grado de perturbación y en donde los individuos pudieran verse forzados a moverse en busca de recursos. De ahí la importancia de las localidades “Palmas” y “Potabilizadora”, ya que son los que reciben la mayor cantidad de migrantes (36%). En los últimos años ha aumentado la perturbación de estos sitios, principalmente por la remoción de selva para el establecimiento de caminos, potreros y zonas de extracción de material calcáreo (obs. pers.), lo que indiscutiblemente se traduce en la fragmentación y disminución del hábitat disponible, aislando a las poblaciones que ya se encuentran diferenciadas y limitando aún más su desplazamiento. Así, es urgente la implementación de medidas que permitan conservar estas importantes áreas para el mantenimiento y conectividad de las poblaciones de roedores en Isla Cozumel. Por ejemplo, la creación de áreas protegidas podría mitigar la destrucción del hábitat; detener la innecesaria construcción de caminos que fragmentan el paisaje y permitir que la conexión entre parches se restablezca y con ello se favorezca el flujo entre poblaciones. Además, es necesario realizar otros estudios que integren características del paisaje (por ejemplo, estructura de la vegetación y fragmentación de hábitat) para determinar si éstas tienen alguna relación con la estructura que presenta R. spectabilis, lo cual permitiría una propuesta más completa sobre los sitios y las conexiones necesarias para lograr su conservación. Los tamaños efectivos estimados en este estudio fueron muy parecidos entre especies (∼150 individuos). Sin embargo, en campo se ha observado que O. c. cozumelae presenta densidades censales mayores que R. spectabilis. Un problema del cálculo basado en el desequilibrio de ligamiento (el método empleado en este estudio) es que es muy sensible al tamaño de muestra, por lo que se puede sub- o sobreestimar el Ne verdadero (England et al., 2005). Utilizando métodos de estimación que involucran tasas de mutación, se ha calculado que el tamaño efectivo poblacional para O. c. cozumelae puede variar entre 720 y 72000 individuos (Vega et al., 2007), lo que además indica que nuestros estimados tienen una gran incertidumbre. El Ne es una medida que está directamente relacionada con la tasa de pérdida de diversidad genética y el incremento de endogamia dentro de una población; la regla general sugiere que los tamaños efectivos mayores a 50 son esenciales para minimizar los efectos de la consanguinidad, o de más de 500 para mantener la variación genética adaptativa (Allendorf y Ryman, 2002). Además, generalmente el Ne es mucho más pequeño que el tamaño censal de la población (N), en el orden del 10% de la población adulta para muchas especies naturales (Frankham, 1995), aunque es afectado por factores como fluctuaciones en el tamaño de la población, varianza en el éxito Sayra Rosio Espindola Barrientos 47 reproductivo y proporción de sexos desigual, entre otros; lo que complica aún más su estimación. Ambos roedores presentan fluctuaciones debido a la estacionalidad en la isla y la proporción de sexos está ligada con un efecto de borde lo que podría estar afectando las estimaciones del tamaño efectivo, el cual podría ser todavía menor al estimado. En cuanto a los valores de parentesco estimados, resulta interesante que para las dos especies, el mayor porcentaje sea de individuos sin alguna relación cercana de parentesco (arriba del 80% en ambos casos), ya que esto puede ser indicativo de que la probabilidad de entrecruza sea baja, un punto a favor en el mantenimiento de su diversidad y para hacer frente a los efectos de consanguinidad. Contar con información del total de individuos que conforman las poblaciones de roedores en la isla podría darnos un estimado mucho más preciso para este tipo de parámetros que conllevan cierto grado de incertidumbre, sin embargo, es posible que no varíe demasiado dada la dinámica poblacional que presentan los roedores, pues se han encontrado individuos reproductivamente activos todo el año (Fortes-Corona, 2004) y al parecer las reducciones poblacionales que se presentan por estacionalidad no son lo suficientemente drásticas como para producir un cuello de botella (Capítulo 4). Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 48 C O N C L U S I O N E S Conservar la riqueza biológica que posee Isla Cozumel es una prioridad urgente, sobre todo actualmente que la isla enfrenta serías amenazas de conservación. Este trabajo constituye una aportación más al conocimiento genético de los vertebrados en la isla, en especial por constituir un estudio comparativo de dos especies endémicas y en peligro de extinción. En primer lugar, los altos niveles de diversidad genética y alélica que poseen ambos roedores ponen de manifiesto que sus poblaciones cuentan aún con las herramientas genéticas necesarias para responder y sobrevivir al ambiente tan cambiante en el que habitan. Parece ser que, además del tamaño de Cozumel, la migración es el principal factor que permite a O. c. cozumelae mantener los niveles de variación genética que presenta, mientras que los cambios en el ambiente y las fluctuaciones en las densidades poblacionales podrían estar involucrados como causa de los altos niveles de variación genética que presenta R. spectabilis. La diferencia más significativa entre especies está en la forma en cómo se distribuye dicha variación. Mientras que O. c. cozumelae se comporta como una única población, R. spectabilis se estructura en cuatro subgrupos repartidos al norte, noreste y centro de la isla. Es posible que su historia de vida y sus requerimientos ecológicos estén determinando estas diferencias. Los hábitos generalistas y la versatilidad para desplazarse por diferentes tipos de hábitat que presenta O. c. cozumelae le permiten su dispersión por toda la isla, favoreciendo que el flujo génico diluya los efectos de otros procesos evolutivos que generan diferenciación, dando como resultado que esta especie se comporte como una población panmíctica. De forma contraria, la especificidad de hábitat de R. spectabilis, así como su comportamiento antidepredatorio y la organización por sexo y edad que presenta, podrían estar determinando su estructuración aún a distancias cortas. La diferenciación que presentan los subgrupos podría explicarse asimismo por su poca capacidad de dispersión, misma que se asocia al aislamiento por distancia que presentan. Aun compartiendo el mismo espacio geográfico, caracterizado además por un efecto de aislamiento, cada especie tiene una historia que define sus características genéticas. Dicha información resulta fundamental, sobre todo en especies como O. c. cozumelae y R. spectabilis que se encuentran en peligro de extinción. De tal forma que es de vital importancia detener la fragmentación y pérdida de hábitat que actualmente ocurre en Isla Cozumel, mediante la creación de nuevas áreas naturales protegidas, principalmente al norte y centro de la isla, en donde se distribuyen en mayor medida los roedores, en especial R. spectabilis, quien presenta un mayor riesgo. 49 CAPÍTULO 4 Consecuencias genético-poblacionales de los huracanes Emily y Wilma en los roedores de Isla Cozumel I N T R O D U C C I Ó N En la literatura existen muy pocos estudios que registren el impacto de huracanes en poblaciones de mamíferos pequeños insulares (Fleming y Murray, 2009; García-Aguilar, 2010). Este trabajo es el primer estudio comparativo para México del impacto, a nivel genético, de los huracanes sobre dos especies de roedores endémicos y con una amenaza crítica de conservación. 1. Huracanes y sus efectos Actualmente, gran parte de los ecosistemas tropicales se encuentran amenazados o deteriorados por las actividades humanas o por la acción de fenómenos naturales (Filip y Moheno, 2007). Entre los impactos ambientales de origen antropogénico están la pérdida de hábitat, el cambio de uso de suelo, la introducción de especies exóticas y el cambio climático. Entre las de origen natural encontramos la estacionalidad y los huracanes (Mimura et al., 2007; Lara-Lara, 2008; GCRP, 2010). Un huracán es un ciclón tropical en el cual los vientos alcanzan una velocidad mayor a 119 km/h. El uso del término huracán está restringido al Océano Atlántico, pues el mismo tipo de tormenta en el Océano Pacífico se denomina tifón (Gannon y Willing, 2009). Los huracanes son clasificados por su intensidad en cinco categorías según el índice de Saffir-Simpson; las categorías —en jerarquía de mínimo (1) a catastrófico (5) —, son definidas según la velocidad de los vientos y el potencial para causar daño (Lugo, 2008; Gannon y Willing, 2009). Los huracanes impactan áreas extensas, tienen una duración de horas a días y una recurrencia que puede ir de uno a miles de años (Wittaker y Fernández-Palacios, 2007; Lugo, 2008). Por la velocidad de los vientos, las inundaciones y demás efectos colaterales —por ejemplo, la pérdida de vegetación—, los huracanes pueden cambiar la estructura y función de las comunidades ecológicas en tan sólo unas horas (Willig y McGinley, 1999; Filip y Moheno, 2007) y tener efectos a escalas temporales amplias (Imbert y Portecop, 2008). Los huracanes son comunes en el Caribe, donde se han reportado aproximadamente 800 huracanes en los últimos cien años, los cuales presentan un amplio rango de variabilidad en frecuencia, tamaño e intensidad tanto espacial como temporal y, por lo tanto, generan diferentes niveles de respuesta en los ecosistemas que afectan (Lugo, 2000, 2008; Fleming y Murray, 2009). Se sugiere que el papel ecológico de los huracanes implica seis efectos principales (Lugo, 2008): 1. Cambian el espacio ecológico disponible para los organismos, 2. Generan que los organismos se muevan, Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 50 3. Aumentan la heterogeneidad del paisaje y la variabilidad en los procesos de los ecosistemas, 4. Rejuvenecen el paisaje y sus ecosistemas, y reorientan las sucesiones, 5. Dan forma a la estructura del bosque, afectan su composición y la diversidad de especies, regulan su función, e, 6. Inducen cambios evolutivos por selección natural y conducen a una larga lista de adaptaciones estructurales y funcionales en los organismos. Dichos efectos se han dividido según la escala temporal en la que ocurren y en relación a los procesos que ocurren dentro de la comunidad que ha sido dañada. Los efectos inmediatos son causados por la intensidad del disturbio: marcada defoliación, remoción de árboles, cambios en el microambiente (intensidad de luz, temperatura, humedad), elevada mortalidad de organismos, disminución del espacio utilizable y en la disponibilidad del alimento (Tanner et al, 1991; Lugo, 2008). A corto plazo (los primeros 5-10 años) continúa la mortalidad y se altera la distribución espacial de los individuos, debido a que origina el movimiento de los organismos hacia hábitats disponibles, se altera la estratificación de la comunidad, se induce plasticidad de alimentación (genera cambios de dieta y reduce la tasa de consumo), disminuye el éxito reproductivo de los organismos y en situaciones más severas pueden ocurrir extinciones locales (Lugo, 2000, 2008). A mediano plazo (después de los 10 años y hasta los 50) continúa la mortalidad, aunque dependiendo de la especie, algunas poblaciones comienzan a recuperarse. Se generan además oportunidades para un cambio en la dirección de sucesiones, ocurre alto recambio y sustitución de especies, aumenta la riqueza por la presencia de especies pioneras, el recambio de biomasa y nutrientes es más rápido y, debido a que hay una menor biomasa aérea, se generan modificaciones en las reservas de carbono (Willig y McGinley, 1999; Lugo, 2000, 2008). Los efectos a largo plazo (después de los 50 años) están pobremente documentados, aunque se relacionan con cambios en la estructura de la comunidad, presión selectiva de organismos y adaptaciones locales (Lugo, 2000, 2008). Las poblaciones pueden responder positiva o negativamente según las alteraciones que hayan ocurrido (Willing y McGinley, 1999). En este sentido, se han propuesto cuatro teorías sobre la respuesta de los organismos a una perturbación de este tipo (Spiller et al., 1998): 1. los organismos grandes podrían ser más resistentes que los pequeños a los impactos inmediatos, 2. las especies pequeñas sobrevivientes podrían recobrarse más rápido debido a su tasa de reproducción, 3. el riesgo de extinción está en función del tamaño de la población, y 4. cuando una población es exterminada por un disturbio catastrófico la recuperación estará determinada por la habilidad de dispersión y recolonización. Sayra Rosio Espindola Barrientos 51 Una conclusión general de los estudios que han evaluado el efecto de los huracanes sobre los vertebrados es que las consecuencias sobre las poblaciones están relacionadas con el tipo de recursos que los organismos utilizan. Por ejemplo, la pérdida de cobertura vegetal da como resultado una disminución de frugívoros y nectarívoros debido a una baja en la producción de los recursos que utilizan estas especies. Por el contrario, la descomposición de las hojas, ramas y otros materiales depositados en el suelo, generan un ambiente adecuado para la recuperación y el desarrollo de insectos y otros vertebrados, de manera que los insectívoros y omnívoros pueden acelerar su recuperación hasta un estado cercano al de pre-huracán (Copa, 2007). Por ejemplo, Klinger (2006) encontró que, después del huracán Iris, la producción de frutos en la Reserva Natural Blanden, en Belice, cesó por dos años, lo que disminuyó la abundancia de dos roedores frugívoros especialistas (Ototylomys phyllotis y Oryzomys rostratus), mientras que otro roedor oportunista (Heteromys desmarestianus) utilizó los frutos disponibles para sobrevivir manteniendo su abundancia en los años posteriores al huracán. Por su parte, un roedor folívoro (Sigmodon hispidus) aumentó su abundancia gracias al incremento de rebrotes y de vegetación herbácea durante los años subsiguientes al huracán. Otros efectos sobre los organismos están relacionados con cambios en la estructura tridimensional de la vegetación, la pérdida de refugios y de áreas de forrajeo, la fragmentación del hábitat, los cambios en las densidades de depredadores y presas, así como de las condiciones de microhábitat (Waide, 1991; Willig y McGinley, 1999). Para mamíferos se han registrado modificaciones en los patrones de movimiento de tipo social y de comportamiento, así como en el esfuerzo reproductivo y la tasa de sobrevivencia (Copa, 2007). Algunos estudios con roedores han puesto en evidencia cómo un huracán podría comprometer la habilidad de las poblaciones a sobrevivir, sobre todo por las tasas de mortalidad, disponibilidad de alimento y refugio (Swilling et al., 1998). Por ejemplo, en el Refugio Bon Secour, en Alabama, se registró que la población de roedores (Peromyscus sp) disminuyó hasta un 30% su tamaño poblacional tras el huracán Opal. Además estos se desplazaron temporalmente hacia las zonas de transición arbustivas, áreas que aparentemente les proveían refugio y recursos, hasta que el bosque recuperó su estado pre-huracán (Swilling et al., 1998). Después del mismo evento, Oli et al. (2001) realizaron un análisis de viabilidad para Peromyscus polionotus, un roedor amenazado, observando que después del huracán la probabilidad de extinción se incrementó al 48%, debido principalmente a la disminución poblacional y a la pérdida de hábitat. Es importante mencionar que se conoce poco sobre las consecuencias genéticas que tiene un huracán en las poblaciones de vertebrados. En un estudio con tres especies de murciélagos en las islas Cayman se observó que a pesar de la significativa disminución del tamaño poblacional ocurrida después del huracán Iván, no se observó disminución en la diversidad alélica ni en la heterocigosidad de 8, 9 o 10 marcadores microsatélites en ninguna población (dependiendo de la especie). Por el contrario, una de las especies (Artibeus jamaicensis), incrementó su diversidad de haplotipos mitocondriales, lo que sugiere que el huracán favoreció la dispersión favorecida por el huracán. Los autores concluyen que es poco probable que la reducción en el tamaño poblacional resulte en pérdidas sustanciales de diversidad genética, a menos que los niveles de la población Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 52 permanezcan muy bajos por un periodo de tiempo prolongado (Fleming y Murray, 2009). Por su parte, Busch et al. (2007) no pudieron detectar ningún cuello de botella genético en poblaciones de la rata canguro (Dipodomys spectabilis) en Arizona, E.U., incluso en muestras tomadas inmediatamente después del huracán. Esto podría deberse a una elevada tasa de mutación, inmigración indetectable y marcadas fluctuaciones demográficas de manera estocástica, confundiendo de alguna manera los análisis para detectar cuellos de botella utilizando microsatélites. Para otros taxa como Pinus elliottii var. densa, un árbol longevo y polinizado por viento, se ha encontrado que los huracanes reducen la estructura genética espacial a escala fina, pero no alteran la diversidad genética (Williams et al., 2007). La importancia de monitorear el estatus genético de las poblaciones después de un huracán resulta entonces evidente. En primer término porque casi no existe información de este tipo que permita documentar el proceso de recuperación de las poblaciones post-huracán, y en segundo porque, dado que los efectos pueden ser diferentes dependiendo de cada especie (reduciendo, manteniendo e incluso favoreciendo la diversidad genética), sería difícil e incorrecto generalizar las consecuencias genéticas que trae consigo el paso de un huracán (Fleming y Murray, 2009). 2. Huracanes Emily y Wilma Emily y Wilma fueron dos de los huracanes más fuertes del año 2005, ambos causaron estragos importantes en el Caribe mexicano. El primero (de categoría 4 según la escala Saffir-Simpson y con un Índice de peligrosidad de "Severo") tocó las costas de la península de Yucatán el 17 de julio con vientos sostenidos de 215 km/h y lapsos de hasta 260 km/h; el ojo del huracán pasó a 5 km de la punta sur de Cozumel con dirección sureste, por lo que la intensidad de los vientos disminuyó hacia el norte de la isla (Hernández y Bravo, 2005a; Álvarez-Filip y Nava- Martínez, 2006). Por su parte Wilma, uno de los huracanes más destructivos de los que se tenga registro, afectó a la isla del 20 al 22 de octubre. Wilma fue el huracán más intenso registrado en el Océano Atlántico (el décimo a nivel global), con la más baja presión atmosférica jamás registrada en el Hemisferio Oeste: 882 millibares a nivel del mar. Este huracán impactó Cozumel con vientos sostenidos de 230 km/h y rachas de hasta 300 km/h, avanzando a una velocidad menor a los 5 km/h con dirección noroeste. El ojo del meteoro, que alcanzó los 63 km de diámetro, pasó casi completamente sobre Cozumel, tiempo en el que estuvo clasificado en los límites entre las categorías 4 y 5, con un Índice de peligrosidad de "Severo" (Hernández y Bravo, 2005b; Álvarez-Filip y Nava-Martínez, 2006). Después del paso de Emily, más del 50% de los individuos muestreados en zonas de selva media perennifolia y de arrecifes no sufrieron daño aparente, lo que podría indicar cierta resistencia a este tipo de eventos. Pero después de Wilma, sólo un pequeño porcentaje de individuos permaneció inalterado (Filip y Moheno, 2007). Sayra Rosio Espindola Barrientos 53 3. Cuellos de botella Uno de los efectos más evidentes de los huracanes sobre las poblaciones naturales es la disminución demográfica drástica, producto de una elevada mortalidad de individuos. Esta reducción abrupta en el tamaño de la población se conoce como cuello de botella, un proceso que puede tener serias repercusiones sobre las poblaciones (Allendorf y Luikart, 2007; Cristescu et al., 2010; Frankham et al., 2010). A nivel genético, un cuello de botella genera pérdida de variación genética, cambios bruscos en las frecuencias alélicas, expone alelos deletéreos e incrementa la endogamia (Ramakrishnan et al., 2005; Hamilton, 2009). Como resultado, la adecuación de las poblaciones se ve comprometida, volviéndose más vulnerables (Weber et al., 2004). De hecho, se ha observado que incluso después de recobrar su tamaño previo, las poblaciones que han sufrido un cuello de botella continúan siendo propensas a la extinción (Bijlsma et al., 2000). El impacto de un cuello de botella en la variación genética depende de dos factores críticos: el tamaño efectivo inicial de la población y el tiempo de duración del mismo, así como de las características genéticas de los sobrevivientes. Además, la historia de vida y el comportamiento reproductivo pueden amplificar el efecto de un cuello de botella (Pertoldi et al., 2001), aunque el impacto puede minimizarse si la recuperación subsecuente es rápida (Miller y Hedrick, 2001). Otros factores que pueden influir en los efectos genéticos de un cuello de botella son el azar, asociado a procesos estocásticos que ocurren en poblaciones pequeñas, y la selección, relacionada con el efecto de purga y la adecuación de las poblaciones remanentes (Bouzat, 2010). A pesar de que en general se esperan repercusiones negativas en las poblaciones después de un cuello de botella, y debido a los múltiples procesos que éste involucra, es posible que los efectos sean especie-específicos. Por una parte, se ha observado en un sinfín de poblaciones de distintos organismos seguidas a un evento de cuello de botella signos de disminución en la diversidad genética y depresión por endogamia (Pertoldi et al., 2001; Hoelzel, 1999; Vilà et al, 2003; Bradshaw et al., 2007; Frankham et al., 2010). En contraparte, otros estudios han sugerido que después de un cuello de botella la variación genética no cambia e incluso puede aumentar, favoreciendo además la adecuación de la población (Miller y Hedrick, 2001; Bouzat, 2010). Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 54 H I P Ó T E S I S En un trabajo anterior, García-Aguilar (2010) observó una tendencia a pérdida de diversidad genética en O. c. cozumelae, luego de 1-2 años del paso de los huracanes. A partir de estos resultados podemos partir de una primera hipótesis en la que esta pérdida se haga evidente: las poblaciones de O. c. cozumelae, luego de 5 años del paso de los huracanes, presentarán pérdida de diversidad genética y mayor estructuración, en comparación con los valores observados en las poblaciones en los 1-18 meses posteriores a los huracanes. Sin embargo, los huracanes son eventos que, como ya se ha descrito, se presentan con cierta frecuencia (aunque variable), generando respuestas en los organismos que se ven afectados. De tal forma que las poblaciones silvestres de Isla Cozumel podría presentar adaptaciones a este tipo de disturbios que les permiten una rápida recuperación o alta capacidad de resiliencia como estrategia de sobrevivencia. Bajo este supuesto, las tendencias hacia la pérdida de diversidad genética que observó García-Aguilar (2010) podrían ser un simple reflejo de la disminución poblacional producto de la mortalidad generada por los huracanes. Por lo anterior, una hipótesis alternativa permite contemplar una posible recuperación genética de las poblaciones: las poblaciones de O.c. cozumelae, luego de 5 años del paso de los huracanes, presentarán una diversidad y estructuración genética similar a las poblaciones pre-huracán, producto de su resiliencia a este tipo de disturbios. Por su parte, y dadas sus condiciones ecológicas asociadas a su historia natural y su baja densidad poblacional (ver capítulo 3), es posible que R. spectabilis se vea más afectada por los huracanes (en comparación con O. c. cozumelae), aumentado el riesgo de extinción que ya de principio enfrenta. Podemos hipotetizar entonces que las poblaciones de R. spectabilis perderán diversidad genética y/o alélica y la diferenciación genética que presentan se verá acentuada en las poblaciones posthuracanes”. Sayra Rosio Espindola Barrientos 55 O B J E T I V O S 1. Evaluar los cambios en los niveles de variación y estructura genética de O. c. cozumelae en poblaciones de años posteriores a los huracanes de 2005. 2. Evaluar los cambios en los niveles de variación y estructura genética de R. spectabilis en poblaciones de años posteriores a los huracanes de 2005. 3. Comparar los efectos de los huracanes Emily y Wilma sobre las características genéticas de los roedores en la isla. 4. Generar información genética de ambas especies que sea útil para su correcta evaluación de conservación nacional (NOM) e internacional (IUCN) y para futuras propuestas de manejo y conservación. Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 56 M A T E R I A L E S Y M É T O D O 1. Trabajo de campo y obtención de tejido Después del paso de los huracanes del 2005, el éxito de captura disminuyó considerablemente, sobre todo en CAPA, por lo que se establecieron otros localidades de muestreo a lo largo de toda la isla, logrando capturas pero en un número bajo. Los muestreos para roedores en la isla se reanudaron en 2011, retomando los sitios de los trabajos anteriores, principalmente en donde se había logrado el mayor número de capturas, y estableciendo nuevos lugares de captura, con la única premisa de ser sitios conservados y/o aptos para los roedores. En cada sitio se colocaron, según el acceso a la zona, tres gradillas separadas aproximadamente por unos 200 m. Cada una contenía 7 x 10 trampas separadas entre sí por una distancia de entre 7 y 10 m; o bien, dispuestas en transectos con unas 200 trampas a izquierda y derecha separadas entre sí por 10 m. Las trampas fueron cebadas con una mezcla de avena, crema de cacahuate y vainilla y se mantuvieron activas en el mismo sitio de 1 a 4 noches consecutivas, con chequeo y recebo diario. De cada individuo capturado se tomó una muestra de tejido (oreja) que se conservó en etanol al 70%. Estas fueron procesadas como se explica en el capítulo 2, incluyendo la extracción de ADN, la amplificación de los microsatélites, el análisis de fragmentos y la genotipificación. 2. Análisis de datos Todos los análisis genéticos que se describen a continuación se realizaron por separado para cada especie. En el caso de O. c. cozumelae, se utilizaron los genotipos que se obtuvieron en el Capítulo 3, a partir de las muestras procesadas por Vega (2006) (que se denominan población “pre-huracán”), los datos del trabajo de García- Aguilar (2010) (población “post-huracán”), y los genotipos de los individuos capturados en 2011, después de 6 años del paso de los huracanes (“población 2011”). Para R. spectabilis sólo se consideraron las poblaciones pre- huracán y post-huracán debido al poco éxito de captura durante los muestreos de 2011. 2.1. Análisis de diversidad y estructura genética Se estimaron nuevamente el número de poblaciones utilizando las muestras de cada población (pre-huracán, post-huracán y 2011) independientemente. Con fines comparativos se realizó un segundo análisis con el programa STRUCTURE utilizando juntas las tres poblaciones (pre-huracán, post-huracán y 2011), bajo la hipótesis de que, de no haber diferencias, el programa detectaría una única población como el número más probable (K). Es importante mencionar que para este caso, las poblaciones no se consideran como sitios de muestreo, si no unidades a través del tiempo, aunque no se hace distinción a priori de los datos. Sayra Rosio Espindola Barrientos 57 En la medida de lo posible, se realizaron de nuevo los análisis de diversidad, estructura genética, parentesco y tamaño efectivo descritos en el capítulo 2, utilizando los datos de todos aquellos individuos capturados después de los huracanes de 2005. También se hicieron pruebas de diferenciación alélica y genotípica entre poblaciones pre y post-huracán con el programa Genepop (Raymond y Rousset, 1995; Rousset, 2008), así como pruebas estadísticas descriptivas para comparar y evaluar diferencias entre los valores de diversidad y estructura genética obtenidos en las poblaciones antes y después de los huracanes. 2.2. Cuellos de botella Es posible que los huracanes que impactaron la isla en 2005 hayan tenido efectos sobre el tamaño poblacional. Las poblaciones que han tenido reducciones drásticas y/o relativamente recientes están sujetas a diversos cambios: se incrementa la probabilidad de identidad por descendencia y el efecto de factores estocásticos como la deriva génica, y hay pérdida significativa de variación genética. En este sentido, dado que los alelos se pierden más rápido (diversidad alélica) que la heterocigosidad, la heterocigosidad tiende a ser mayor que la esperada a partir del número de alelos observados, siempre y cuando exista un equilibrio entre la deriva y la mutación en los loci analizados (Cournet y Luikart, 1997). Para determinar si las poblaciones atravesaron por un cuello de botella se utilizó el programa BOTTLENECK 1.2.02 (Cornuet y Luikart, 1997); la heterocigosidad observada y esperada se basaron en el modelo de mutación de dos fases (TPM), asumiendo que el 90% de las mutaciones seguían un modelo SMM (mutación paso a paso) y un 10% un modelo IAM (alelos infinitos). De igual forma se emplearon los valores que venían por defecto en el programa (70% SMM, 30% IAM y varianza de 10%), ambos con 10000 réplicas. Para determinar si había exceso significativo de heterócigos se utilizó la prueba de Wilcoxon, ya que ésta tiene un mayor poder estadístico cuando hay pocos loci (10 o menos) y es independiente del tamaño de la muestra (Cornuet y Luikart, 1997) Para evaluar la historia demográfica más probable de la población se utilizó el programa MSVAR V.1.3 (Beaumont, 1999; Storz y Beaumont, 2002), el cual se basa en un modelo jerárquico Bayesiano con simulaciones MCMC (Markov chain Monte Carlo) para estimar la distribución a posteriori de parámetros genealógicos y demográficos, mediante un análisis de coalescencia de la variación. Con este análisis se obtiene el tamaño más probable para una población actual (i.e., la población puesta a prueba) y para una población ancestral estimada; comparando dichos estimados es posible deducir si han ocurrido eventos de expansión o reducción poblacional. Además, es posible obtener el tiempo (en relación a las generaciones de cada especie) en que estos eventos han ocurrido. Este análisis se realizó para todas las poblaciones (pre y prost-huracán) de las dos especies, utilizando las frecuencias alélicas por locus (infile), los datos que venían por defecto para el control de las simulaciones (INTFILE) y los valores iniciales sugeridos (init_v_file), a excepción de las líneas de salida (100000) y las interacciones entre líneas de salida (20000) que fueron modificadas debido a la resolución por el tamaño de la muestra. Cada análisis se realizó por duplicado para verificar una buena coalescencia de los datos. Los tamaños estimados para la población actual y la población ancestral y los intervalos de confianza para la Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 58 distribución posterior fueron graficados para determinar el cambio del tamaño poblacional y con ello inferir el cuello de botella. Para estimar la severidad del cuello de botella se obtuvo la proporción de la reducción en el tamaño de la población, mediante NeActual/NeAncestral, reportado como porcentaje. 2.3. Los efectos del cuello de botella Después del paso de los huracanes se observaron dos respuestas demográficas importantes: una reducción poblacional evidente (reflejada en el éxito de captura de individuos) y el aparente movimiento de individuos a diferentes zonas de la isla (García-Aguilar, 2010). De esta forma, se evaluó si existieron eventos de dispersión y colonización a partir de la composición genética de las especies estimando las de tasas de migración reciente entre localidades de muestreo con el programa BIMr V.1.0 (Faubet y Gaggiotti, 2008). Este programa permite hacer inferencias de proporciones recientes de genes inmigrantes a través de aproximaciones Bayesianas. Un primer paso fue estimar la tasa de migración que ocurría antes de los huracanes, y posteriormente obtener la tasa de migración entre las poblaciones después de éstos. Para el análisis se utilizaron todos los parámetros que venían por defecto en el programa (Burn in=10000, Tamaño de la muestra=10000, Thining interval= 50, 3 réplicas). Asimismo, se evaluó la contribución de las poblaciones pre-huracán a la composición genética de las poblaciones post-huracán, dado que pudieron haber ocurrido eventos de colonización (Gaggiotti et al., 2004) y el movimiento o intercambio de individuos de una población a otra ocasionada por el impacto de los vientos extremadamente fuertes de los huracanes. Con el programa HWLER (Pella y Mesuda, 2001) se estimó la composición genética de cada población post-huracán en relación a las poblaciones pre-huracán. El programa utiliza métodos Bayesianos (Gibbs and split-merge Markov chain Monte Carlo sampling) para estimar, en una población dada, la proporción de mezcla a partir de datos genéticos de otras poblaciones de referencia. Además estima si es posible que existan poblaciones “extra” de referencia que no estén representadas en la muestra. Se utilizaron los valores sugeridos para el control del análisis, con un número de muestra final de 65000 (tomando 25000 de estas como Burnin-period), con tres repeticiones para verificar la consistencia de los resultados. Cada población prost-huracán se trabajó independiente como una "población mezcla" (mixture population) y las poblaciones pre-huracán como "posibles poblaciones fuente" (potential source populations) y se permitió que el programa estimara la existencia de poblaciones de referencia sin muestras (extra-baseline populations). Sayra Rosio Espindola Barrientos 59 R E S U L T A D O S Oryzomys couesi cozumelae 1. Muestreo y éxito de captura De septiembre de 2005 a mayo de 2007 se capturaron 85 individuos, de cuales 47 fueron machos, 34 hembras y a cuatro no se les pudo determinar el sexo. Con fines comparativos se retomaron los genotipos obtenidos en el estudio de García- Aguilar (2010) para los análisis del presente trabajo. Durante el muestreo del año 2011, se tuvo un esfuerzo de muestreo total de 4337 trampas/noche, y un éxito de captura del 0.23%, es decir, se capturaron 10 individuos, que conformaron la población “2011”. 2. Presencia de alelos nulos Los análisis mostraron que no hubo errores de lectura, de dominancia corta en los alelos, errores tipográficos, ni alelos nulos para ningún locus en las poblaciones pre-huracán y 2011. Ningún loci mostró valores de F IS significativamente diferentes aun cuando se observaron alelos nulos en el locus Ory64. 3. Definición de subgrupos Como se había ya observado, se obtuvo un único grupo o cluster (LnP(K)= -2471.3) para la población pre- huracán. De la misma manera, también se observó una única población para los individuos post-huracán (LnP(K)= -2650.1) y para los individuos 2011 (LnP(K)= -270). Se realizó un segundo análisis de STRUCTURE para determinar si existían cambios a través del tiempo (pre-huracán, post-huracán y 2011) y se encontraron dos poblaciones (LnP(K)= -5783.3), la primera formada por las poblaciones pre-huracán y 2011 (con el 94.7% y 90% de individuos asignados correctamente) y la segunda por la población post-huracán (con el 89.4% de individuos asignados correctamente) (Fig. 1). Las probabilidades de pertenencia a uno de los dos grupos fueron de 91.6% para la población pre-huracán, 87.8% para la población post-huracán y 89.9% para la población 2011. Esto indica que la composición genética de la población 2011 es más parecida a la de la población pre-huracán, y hubo cambios significativos en la población post-huracán. Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 60 Fig 1. Gráfico de la asignación de individuos para O. c. cozumelae por población en tres tiempos, obtenido de STRUCTURE. En el eje ´x´ se señalan las poblaciones puestas a prueba: población pre-huracán= 1, población post- huracán= 2 y 2011= 3. El eje ´y´ representa el porcentaje de pertenencia y los colores los grupos detectados: verde=cluster 1; rojo=cluster 2. 4. Equilibrio Hardy-Weinberg y desequilibrio de ligamiento Los coeficientes de fijación F IS variaron entre 0.16 (ORY10, 2011) y -0.19 (ORY16, post-huracán). Sólo la población post-huracán presentó un exceso significativo de heterocigotos para dos loci (ORY16 y ORY60), y una deficiencia para otros dos (ORY40 y ORY64; Cuadro 1), incluso después de realizar la corrección de Bonferroni. Al comparar los coeficientes de fijación entre poblaciones no se encontró ninguna diferencia significativa entre ninguna población (P=0.8135; α=0.05). Cuadro 1. Coeficientes de fijación (F is) y valores de probabilidad (P) de Weir y Crockerham para cada locus de O. c. cozumelae, obtenidos con GENEPOP. (Se resaltan en negritas los valores significativos (*p<0.05 con corrección de Bonferroni). Pre-huracán Prost-huracán 2011 LOCUS F IS P F IS P F IS P ORY03 0.1001 0.0752 -0.1611 0.1513 0.0597 0.1005 ORY10 -0.0971 0.2922 -0.0589 0.0554 0.16 0.5099 ORY16 -0.088 0.1201 -0.1954 0.0001* -0.1489 0.4727 ORY21 0.057 0.1262 0.0235 0.0544 -0.125 0.9257 ORY28 0.0354 0.1136 0.048 0.0211 0.0597 0.0906 ORY40 -0.0529 0.6122 0.0835 0.0006* -0.0667 0.8170 ORY60 -0.1076 0.4262 -0.1427 0.0006* 0.0382 0.5050 ORY64 0.0203 0.0378 0.1765 0* -0.2101 0.4212 ORY26 -0.0492 0.009 -0.1339 0.0214 0.0769 0.4808 Sólo el par de loci Ory03/Ory28 presentó desequilibrio de ligamiento significativo (p<0.05 con corrección de Bonferroni) para la población pre-huracán. Sayra Rosio Espindola Barrientos 61 5. Diversidad genética El número de alelos observados fue de entre siete (ORY28 y ORY26) y 14 (ORY10) para la población pre-huracán, entre cinco (ORY03) y 17 (ORY10) para la post-huracán y entre cuatro (ORY26) y ocho (ORY21) para la población 2011. La heterocigosidad observada en promedio varió de 0.700 a 0.770 entre poblaciones, con un rango de 0.27 y 1 entre locus (Cuadro 2 y Anexo 11). Se compararon todos los valores de diversidad obtenidos entre poblaciones con un análisis de varianza (ANOVA) y sólo se observaron diferencias significativas en el número de alelos observados entre la población 2011 con las otras dos poblaciones (P=0.0005). Cuadro 2. Valores promedio de diversidad genética de O. c. cozumelae obtenidos con GENEPOP. (N=tamaño de muestra, na= alelos observados, ne= alelos efectivos, Ho=heterocigosidad observada, He=heterocigosidad esperada, HNEI=heterocigosidad esperada de Nei, D.E.= Desviación estándar) N na ne Ho He HNEI Pre-huracán 95 Media 9.8889 4.2115 0.7041 0.6890 0.6927 D.E. 2.5712 2.0541 0.2098 0.1916 0.1927 Post-huracán 85 Media 10.5556 4.3875 0.7726 0.7417 0.7461 D.E. 3.3953 1.6897 0.1190 0.0944 0.0949 2011 10 Media 5.7778 3.6963 0.7444 0.6939 0.7710 D.E. 1.2019 1.3780 0.1667 0.1228 0.1364 6. Frecuencias alélicas, genotípicas y diferenciación Se obtuvieron un total de 89 alelos para la población pre-huracán, 95 alelos para la población post-huracán y 52 alelos para la población 2011 (Ver Anexo 6). Se observa la presencia de nuevos alelos en la población post- huracán y una marcada reducción en el total de alelos para la población 2011. El análisis de diferenciación alélica mostró que hay cambios en la distribución de las frecuencias entre poblaciones para varios loci (p<0.05 con corrección de Bonferroni); tomando en cuenta todos los loci la distribución de frecuencias no es homogénea entre todos los pares de poblaciones y la diferenciación es altamente significativa (Cuadro 3). Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 62 Cuadro 3. Valores de probabilidad (P) y error estándar (E.E) sobre la diferenciación alélica y genotípica por locus entre las poblaciones pre-huracán, post-huracán y 2011 de O. c. cozumelae. (Se resaltan en negritas los valores significativos (*p<0.05 con corrección de Bonferroni). Diferenciación alélica Locus Comparaciones Pre y Post Pre y 2011 Post y 2011 P E.E P E.E P E.E ORY03 0* 0 0.7145 0.0028 0.003* 0.0002 ORY10 0.0493 0.0020 0.00001* 0.00001 0.0087 0.0007 ORY16 0.007 0.0005 0.5284 0.0035 0.0846 0.0018 ORY21 0.3191 0.0051 0.8031 0.0023 0.8147 0.0021 ORY28 0.0002* 0.0001 0.8412 0.0011 0.2724 0.0029 ORY40 0.0047* 0.0003 0.0366 0.0008 0.0763 0.0013 ORY60 0.3442 0.0039 0.5189 0.0025 0.5296 0.0024 ORY64 0* 0 0.7087 0.0021 0* 0 ORY26 0* 0 0.1484 0.0015 0* 0 Todos los loci <0.0001* 0.0037* <0.0001* Diferenciación genotípica Locus Comparaciones Pre y Post Pre y 2011 Post y 2011 P E.E P E.E P E.E ORY03 0* 0 0.7561 0.0026 0.0016* 0.0001 ORY10 0.0394 0.0013 0.00001* 0.00001 0.0121 0.0007 ORY16 0.0068 0.0005 0.4684 0.0035 0.0798 0.0018 ORY21 0.4452 0.0043 0.8181 0.0027 0.8312 0.0024 ORY28 0.0009* 0.0002 0.8430 0.0019 0.3284 0.0033 ORY40 0.0079 0.0005 0.0381 0.0013 0.1040 0.0020 ORY60 0.3012 0.0041 0.4738 0.0034 0.4708 0.0032 ORY64 0* 0 0.7218 0.0033 0* 0 ORY26 0* 0 0.1412 0.0019 0* 0 Todos los loci <0.0001* 0.003973* <0.0001* Se obtuvieron un total de 304 genotipos, de los cuales 203 se encontraron en la población pre-huracán, 202 en la post-huracán y 61 para la de 2011 (Ver Anexo 7). Cuando se consideraron todos los loci, el número de homócigos varió entre uno (ORY26) y seis (ORY21) para la población pre-huracán, entre dos (ORY03 y ORY26) y seis (ORY21) para la pre-huracán, y entre cero (ORY21) y tres (ORY10) para 2011. En promedio se obtuvo menos del 20% de homócigos de la población en conjunto (Cuadro 4). El análisis de diferenciación genotípica entre pares de poblaciones mostró cambios en la distribución de las frecuencias entre poblaciones (p<0.05 con corrección de Bonferroni). Tomando en cuenta todos los loci, la diferenciación de la población post-huracán fue altamente significativa (Cuadro 3). Sayra Rosio Espindola Barrientos 63 Cuadro 4. Porcentaje de genotipos homócigos por locus para cada población de O. c. cozumelae. 7. Tamaño efectivo de la población y parentesco Para la población pre-huracán se estimó un tamaño efectivo de 133.2 individuos (con un intervalo de confianza al 95% de [106.3-174.3]); para la población post-huracán de 264.2 individuos ([179.7-471.7]) y para la población 2011, 9.9 individuos ([7.4-14.2]), todos con base en el cálculo de desequilibrio de ligamiento. Tomando en cuenta las tres poblaciones y considerando un análisis basado en tiempos generacionales, se obtuvo un Ne de 1165.3 individuos ([43.3- ∞]) para la especie. La prueba de parentesco mostró que la mayoría de los individuos (>80% del total) en cada población no tienen relaciones cercanas de parentesco; además no se encontraron medios hermanos para la población 2011 (Cuadro 5). Pre-huracán Prost-huracán 2011 ORY03 22.22 22.22 16.67 ORY10 6.06 12.12 30 ORY16 12 15.79 16.67 ORY21 15 18.92 0 ORY28 25 28.57 16.67 ORY40 25 20 12.5 ORY60 16.67 12 14.29 ORY64 23.53 24.14 20 ORY26 12.5 12.5 25 Media 17.55 18.47 16.87 Cuadro 5. Porcentaje de parentesco obtenido de ML_RELATE para las poblaciones pre-huracán, prost-huracán y 2011 de O. c. cozumelae. Parentesco Pre-huracán Prost-huracán 2011 Padres e hijos 2.4 1.04 6.67 Hermanos 2.28 2.13 4.44 Medios hermanos 15.25 12.77 0 Sin parentesco cercano 80.07 84.06 88.89 Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 64 8. Cuellos de botella Con el programa Bottleneck sólo se encontró señal de un probable cuello de botella para la población post- huracán (P<0.05) detectado por un exceso de heterocigosis bajo el modelo IAM (Cuadro 6). Cuadro 6. Valores de probabilidad (P) de exceso de heterocigosis para las poblaciones de O. c. cozumelae calculados con BOTTLENECK bajo los diferentes modelos de mutación establecidos. En negritas se resalta el valor significativo (*p<0.05 con corrección de Bonferroni). Abreviaturas: IAM=Modelo de mutación de alelos infinitos, SMM= Modelo de mutación paso a paso, TPM=Modelo de mutación de dos fases. Pre-huracán Post- huracán 2011 Modelo de mutación P P P IAM 0.1797 0.0049* 0.2129 SMM 0.9990 1.0000 0.9815 TPM (70% SMM) 0.8750 0.8496 0.5898 TPM (90% SMM) 0.9932 0.9971 0.8203 Los resultados para determinar el tamaño más probable de las poblaciones, y con ello deducir procesos de expansión o decremento en relación a una población ancestral no mostraron la ocurrencia de cuellos de botella en ninguna población (Fig. 2 y Cuadro 7). Cuadro 7. Cálculo del tamaño de la población más probable con MSVAR para la estimación de cuellos de botella en las poblaciones de O. c. cozumelae. Se compara un estimado del tamaño de la población actual con valores esperados para una población ancestral. (D.E.=desviación estándar). Población Media D.E. Intervalos de confianza Pre-huracán Actual 4.1135 0.6748 [3.0843 - 5.8114] Ancestral 4.385 0.6277 [3.2581 - 5.8089] Prost-huracán Actual 3.9975 0.5242 [3.2814 - 4.6132] Ancestral 4.308 1.1692 [2.3374 - 7.2142] 2011 Actual 4.1025 1.131 [1.8297 - 6.8519] Ancestral 4.4295 1.324 [1.7559 - 7.7501] Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 66 Fig. 3. Representación gráfica del aporte genético entre las poblaciones por localidad de muestreo de las poblaciones pre-huracán a las poblaciones post-huracán de O. c. cozumelae. Las flechas representan el flujo de genes y los círculos de colores los localidades de muestreo de las post-huracán. Sayra Rosio Espindola Barrientos 65 9. Efectos del cuello de botella En campo se observó una marcada reducción en la densidad de la población de este roedor. Lo más evidente fue el éxito de captura casi nulo dentro de los ejes de CAPA y la captura de individuos en nuevos sitios, lo que podría sugerir un movimiento asociado a los estragos que causaron los huracanes. Utilizando el programa Hwler se estimó que los sitos de CAPA, en los ejes 5.3, 5.5, 4.2, 4.6 y 4.8 fueron las que más aportaron genéticamente a las poblaciones post-huracán (Figura 3 y Cuadro 8). Fig. 2. Gráficos de la estimación del tamaño de la población más probable para las poblaciones de O. c. cozumelae. El eje x corresponde a los tamaños de la población estimados y el eje y a la densidad de los datos obtenidos. Se comparan los valores actuales respecto a los tamaños ancestrales. Los modelos incluyen el resultado de dos simulaciones independientes para corroborar los resultados. Sayra Rosio Espindola Barrientos 67 Cuadro 8. Porcentaje de aporte genético de las poblaciones pre-huracán a las poblaciones post-huracán de O. c. cozumelae (por localidad de muestreo). Valores estimados con el programa Hwler; se resaltan en negritas los porcentajes más altos. (D.E.=desviación estándar). Reithrodontomys spectabilis 1. Muestreo y éxito de captura Después de los huracanes del 2005 y con el mismo esfuerzo de captura que para O. c. cozumelae, sólo se capturaron 11 individuos durante el 2006, todos provenientes de un localidad de muestreo: Potabilizadora. Durante el muestreo de 2011 sólo se logró capturar un individuo (hembra) en CAPA. Por lo anterior, se decidió juntar los 12 individuos en una sola población –post-huracán– para los análisis comparativos. Para facilitar estas comparaciones se utilizaron poblaciones equivalentes en tamaño y localización geográfica, así los análisis se realizaron con los 12 individuos post-huracán y con 25 individuos provenientes del sitio Potabilizadora del muestreo pre-huracán (Capítulo 2). 2. Presencia de alelos nulos Igual que lo observado para las poblaciones pre-huracán (Capítulo 2), para la población post-huracán se detectó la presencia de alelos nulos en el locus mexR32, por lo que fue eliminado de los análisis posteriores. Post-huracán Mezcalitos Potabilizadora Palancar Manglar Este Golf Noreste Media % D.E Media % D.E Media % D.E Media % D.E Media % D.E Media % D.E Media % D.E P re -h u ra cá n CAPA 5.3 4.64 0.1541 2.09 0.1156 99.97 0.0098 19.68 0.1665 1.09 0.0675 0.00 0.0030 16.00 0.3181 CAPA 5.5 0.01 0.0049 0.10 0.0195 0.00 0.0001 41.34 0.2908 0.00 0.0001 0.00 0.0014 0.02 0.0059 CAPA 5.7 0.02 0.0060 0.73 0.0219 0.00 0.0037 0.01 0.0027 0.00 0.0008 0.00 0.0005 0.00 0.0017 CAPA 5.9 0.01 0.0032 1.39 0.0332 0.00 0.0009 0.00 0.0005 0.00 0.0015 0.00 0.0005 0.17 0.0267 CAPA 4.2 94.45 0.1750 0.47 0.0482 0.00 0.0006 18.19 0.1653 0.00 0.0020 1.34 0.0968 72.55 0.4296 CAPA 4.4 0.02 0.0057 20.76 0.3077 0.00 0.0006 16.50 0.2811 0.00 0.0003 0.01 0.0053 0.09 0.0146 CAPA 4.6 0.12 0.0189 71.34 0.3362 0.00 0.0027 4.21 0.1112 95.24 0.2060 47.31 0.4795 0.00 0.0018 CAPA 4.8 0.00 0.0014 0.01 0.0020 0.00 0.0002 0.00 0.0007 0.00 0.0006 51.33 0.4778 2.09 0.1094 MANGLAR 0.01 0.0041 0.01 0.0018 0.00 0.0000 0.00 0.0000 0.00 0.0001 0.00 0.0003 0.90 0.0540 MEZCALITOS 0.00 0.0013 0.02 0.0032 0.00 0.0000 0.02 0.0022 0.23 0.0415 0.00 0.0003 2.23 0.1190 EXTRA-POP 0.71 0.0389 3.08 0.0558 0.02 0.0080 0.05 0.0169 3.43 0.1794 0.02 0.0072 5.95 0.2207 Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 68 3. Definición de subgrupos Los análisis de STRUCTURE mostraron una única población en los individuos post-huracán (LnP(K)= -412.6) y en el total de los individuos capturados (pre y post-huracán) (LnP(K)= -929.4). Sugiriendo que no hay cambios en la composición genética a través del tiempo. 4. Equilibrio Hardy-Weinberg Los coeficientes de fijación F IS mostraron valores de entre 0.1239 (mexr22) y -0.0377 (mexr13), sin ningún valor significativamente diferente de lo esperado en equilibrio H-W (Cuadro 9). Al comparar los coeficientes de fijación con la población pre-huracán no se observaron diferencias estadísticamente significativas (t= 0.081, p=0.936, α=0.05). Cuadro 9. Coeficiente de fijación (F IS) y valores de probabilidad (P) de Weir y Cockerham para cada locus de la población post- huracán de R. spectabilis (*p≤0.05 con corrección de Bonferroni). Se resalta en gris el locus con presencia de alelos nulos. Locus F IS P mexr16 0.0435 0.9603 mexr19 -0.1528 0.951 mexr20 0.0598 0.5133 mexr22 0.1239 0.2568 mexr23 -0.0476 1 mexr12 -0.0661 0.8371 mexr32 0.8804 0 mexr33 -0.0577 0.1715 mexr34 -0.1748 0.8968 mexr13 -0.0377 0.8551 5. Desequilibrio de ligamiento (DL) Se observaron cuatro pares de loci en desequilibrio de ligamiento (p<0.05 significativo después de la corrección de Bonferroni): mexr19/mexr20, mexr20/mexr22, mexr20, mexr12 y mexr13/mexr33 (Cuadro 10), los cuales no habían presentado desequilibrio en la población pre-huracán. 6. Diversidad genética Para la población post-huracán el número de alelos (na) fue de entre dos (mexr23) y 10 (mexr20), y con un número efectivo (ne) de entre 1.17 (mexr23) y 6.537 (mexr20). La heterocigosidad observada varió entre 0.1667 Sayra Rosio Espindola Barrientos 69 (mexr23) y 1 (mexr19), mientras que los valores para la He y la HNEI variaron de 0.152 y 0.158, a 0.847 y 0.883, respectivamente (Cuadro 11). Al comparar con la población pre-huracán no se encontró ninguna diferencia significativa para ninguno de los valores de diversidad obtenidos (t=2.02, p>0.05, α=0.05). Cuadro 10. Valores de probabilidad (P) y desviación estándar (D.E.) obtenidos de la prueba de desequilibrio de ligamiento con GENEPOP para todas las combinaciones posibles de loci de la población post-huracán de R. spectabilis (En negritas se resaltan los valores significativos *p<0.05 después de efectuar la corrección de Bonferroni). Pares de loci P D.E. mexr16 mexr19 Sin datos mexr16 mexr20 Sin datos mexr19 mexr20 0.02371* 0.0081 mexr16 mexr22 Sin datos mexr19 mexr22 0.082085 0.0135 mexr20 mexr22 0.027575* 0.0086 mexr16 mexr23 Sin datos mexr19 mexr23 0.9447 0.0025 mexr20 mexr23 0.6903 0.0058 mexr22 mexr23 0.4575 0.0055 mexr16 mexr12 Sin datos mexr19 mexr12 0.0594 0.0112 mexr20 mexr12 0.0276* 0.0083 mexr22 mexr12 0.0686 0.0139 mexr23 mexr12 0.4498 0.0056 mexr16 mexr33 Sin datos mexr19 mexr33 0.2467 0.0175 mexr20 mexr33 0.0864 0.0115 mexr22 mexr33 0.2410 0.0183 mexr23 mexr33 0.1195 0.0026 mexr12 mexr33 0.0105* 0.0025 mexr16 mexr34 Sin datos mexr19 mexr34 0.1098 0.0134 mexr20 mexr34 0.0601 0.0119 mexr22 mexr34 0.1223 0.0168 mexr23 mexr34 0.3276 0.0050 mexr12 mexr34 0.1410 0.0164 mexr33 mexr34 0.4596 0.0186 mexr16 mexr13 Sin datos mexr19 mexr13 0.1086 0.0163 mexr20 mexr13 0.0542 0.0118 mexr22 mexr13 0.0806 0.0140 mexr23 mexr13 0.5397 0.0076 mexr12 mexr13 0.0665 0.0119 mexr33 mexr13 0.3293 0.0207 mexr34 mexr13 0.1343 0.0160 Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 70 Cuadro 11. Valores de diversidad genética de R. spectabilis por locus para la población post-huracán. En negritas se resaltan los valores promedio. (N=tamaño de muestra, na= alelos observados, ne= alelos efectivos, Ho=heterocigosidad observada, He=heterocigosidad esperada, HNEI=heterocigosidad esperada de Nei). Locus N na ne Ho He HNEI mexr16 12 7 6.0210 0.8333 0.8339 0.8702 mexr19 9 6.1266 1 0.8368 0.8732 mexr20 10 6.5371 0.8333 0.8470 0.8839 mexr22 9 5.4282 0.75 0.8158 0.8512 mexr23 2 1.1796 0.1667 0.1522 0.1588 mexr12 7 5.7618 0.9167 0.8264 0.8624 mexr33 6 4.1077 0.8333 0.7566 0.7894 mexr34 8 4.0531 0.9167 0.7533 0.7860 mexr13 7 4.3652 0.8333 0.7709 0.8044 Media 7.22 4.8423 0.7870 0.7325 0.7644 7. Frecuencias alélicas y genotípicas Se obtuvieron un total de 65 alelos entre los nueve loci para la población post-huracán, con un porcentaje de similitud con la población pre-huracan de 78.5%. La riqueza alélica varió entre dos y 10 alelos (Ver Anexo 8). Aun cuando no se observan cambios significativos en las frecuencias alélicas respecto a la población pre-huracán en ningún locus (t=2.77, p>0.05, α=0.05), es importante mencionar que se perdieron algunos alelos y se ganaron otros. Por ejemplo, para el locus mexr19 se perdieron tres alelos y se ganó uno, o en el caso de mexr13 que se perdieron 2 alelos que eran exclusivos pero se ganó uno que no se había observado en la población pre-huracán (ver Anexo 8). En cuanto a los genotipos, se obtuvieron un total de 85 entre los 9 loci. (ver Anexo 9). Se observaron diferencias significativas al comparar los genotipos con la población pre-huracán (t=-2.948, p=0.009, α=0.05), debido a una pérdida en el número de genotipos observados. 8. Diferenciación Al comparar las poblaciones pre y post-huracán con una prueba exacta de G, en relación a la distribución de las frecuencias alélicas y genotípicas, no se encontraron cambios significativos para ningún locus ni para los loci en su conjunto (ver Anexo 10). Sayra Rosio Espindola Barrientos 71 9. Tamaño efectivo de la población y parentesco Se estimó un Ne de 15.8 individuos (con un intervalo de confianza al 95% de [11.8-22.7]) mediante el cálculo por desequilibrio de ligamiento para la población post-huracán, mientras que para la pre-huracán se había estimado un Ne de 190.4 individuos ([87-infinito]). El análisis de parentesco mostró que el 90% de los individuos de la población prost-huracán no están cercanamente relacionados, el 6.7% tienen una relación padre-hijo, el 1.7% son hermanos completos y el resto (1.6%) son medios hermanos. 10. Cuellos de botella Con el programa BOTTLENECK se detectó un exceso de heterocigosis para las poblaciones pre-huracán y post- huracán con el modelo IAM; y para la población pre-huracán con el modelo TPM con un 70% de SMM (Cuadro 12). Cuadro 12. Valores de probabilidad (P) de exceso de heterocigosis para las poblaciones de R. spectabilis calculados con BOTTLENECK bajo los diferentes modelos de mutación establecidos (Se resaltan en negritas los valores significativos *p<0.05 después de la corrección de Bonferroni). Abreviaturas: IAM=Modelo de mutación de alelos infinitos, SMM= Modelo de mutación paso a paso, TPM=Modelo de mutación de dos fases. Con el programa MSVAR 1.3 se estimaron los tamaños poblacionales más probables de la población post- huracán. Se realizó una segunda prueba para evaluar cómo se describían los procesos demográficos para la población pre-huracán. Se encontró un cuello de botella en la población post-huracán, con una reducción del 20.87% en la población actual (Fig. 4 y Cuadro 13). Cuadro13. Cálculo del tamaño más probable de la población con MSVAR para la estimación de cuellos de botella en las poblaciones de R. spectabilis. Se compara un estimado del tamaño de la población actual con valores esperados para una población ancestral. (D.E.=desviación estándar). Pre-huracán Post-huracán Modelo de mutación P P IAM 0.0010* 0.0186* SMM 0.9815 0.7520 TPM (70% SMM) 0.0049* 0.2481 TPM (90% SMM) 0.2852 0.6328 Media D.E. Intervalos de confianza Pre-huracán Actual 4.2825 0.6953 [2.8331 - 5.5959] Ancestral 4.6525 0.5362 [3.8476 - 5.6469] Prost-huracán Actual 3.8775 0.4596 [2.9491 - 4.7145] Ancestral 4.9005 0.7147 [3.6674 - 6.3480] Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 72 11. Efectos del cuello de botella Con el programa HWLER se estimó la composición genética de la población post-huracán, tomando como poblaciones de referencia las siete poblaciones pre-huracán, con el fin de detectar, en caso de presentarse, el aporte de otras poblaciones a la población remanente. El 99% corresponde a la población cuyo localidad de muestreo es ‘Potabilizadora’, mientras que el resto se reparte entre Manglar, Mezcalitos y una probable población extra (Cuadro 14). Cuadro 14. Composición alélica de la población post-huracán, en relación a los genotipos observados en las poblaciones pre-huracán de R. spectabilis. Datos obtenidos de HWLER. En negritas se resalta el mayor porcentaje. (D.E.=Desviación estándar). Localidad Media D.E. CAPA 4.4 0.0000 0.0001 CAPA 4.8 0.0000 0.0005 Manglar 0.0001 0.0083 Mezcalitos 0.0015 0.0111 Palmas 0.0000 0.0019 Potabilizadora 0.9953 0.0331 Pob. Extra 0.0031 0.0248 Fig. 4. Representación gráfica de la estimación del tamaño de la población más probable para las poblaciones de R. spectabilis. Se comparan los tamaños estimados (eje x) entre los valores actuales y los tamaños ancestrales. Sayra Rosio Espindola Barrientos 73 D I S C U S I Ó N La ocurrencia de huracanes en ecosistemas insulares puede causar profundos estragos que pueden reflejarse tanto en el aumento de mortalidad de individuos, como en respuestas fisiológicas y/o de conducta que se generan con el fin de reducir los efectos negativos asociados a la perturbación. En este trabajo, el primero en su tipo, se aborta desde un enfoque genético las consecuencias que tuvieron los huracanes Emily y Wilma sobre las poblaciones de los roedores que habitan Isla Cozumel. El efecto de los huracanes: cada especie tiene su historia que contar En este estudio observamos dos respuestas, completamente distintas, de los roedores de Isla Cozumel, después de los huracanes Emily y Wilma, las cuales podrían estar asociadas a las características genéticas y ecológicas que presentaban previo a los huracanes (Capítulo 3), así como a las variaciones espacio temporales de la disponibilidad de alimento y refugio después de éstos, las cuales ya se ha visto que pueden afectar la dinámica de poblaciones de pequeños mamíferos (Russell y Ruffino, 2012). La evidencia más clara de los estragos de los huracanes sobre los roedores, fue la disminución en el tamaño de las poblaciones, pues el éxito de captura disminuyó notablemente (García-Aguilar, 2010) e incluso el bajo éxito continuó hasta años posteriores (obs. pers.). Se detectó un cuello de botella sólo en las poblaciones de R. spectabilis, con una reducción de la densidad poblacional aproximada del 20%. Además, no hubo cambios en la distribución de las frecuencias alélicas y genotípicas, pero sí se perdieron varios alelos y genotipos (algunos exclusivos); una señal más de la ocurrencia del cuello de botella genético. El problema de estos efectos es que pueden contribuir de manera significativa en el riesgo de extinción de este roedor, ya que disminuye su habilidad para adaptarse a futuros cambios ambientales. Otros estudios han puesto en evidencia que las disminuciones en el tamaño poblacional generan cuellos de botella genéticos, reflejados en la pérdida de alelos raros, reducción de la heterocigosidad y cambios en la distribución de las frecuencias alélicas (Whang et al., 2005; Shama et al., 2011). Otra consecuencia de la presencia de un cuello de botella es la diferenciación genética, sobre todo en aquellas poblaciones que ya de principio presentan estructura genética. En el caso de R. spectabilis, cuyas poblaciones se encontraban estructuradas (Capítulo 3) y en donde se apreciaba un efecto de aislamiento por distancia, es posible que después de los huracanes se observara una mayor diferenciación. Desafortunadamente, la pérdida de individuos fue de tal grado, que después de los huracanes sólo se contó con el registro de la población denominada “Potabilizadora”, en el norte de la isla, por lo que no fue posible comprobar tal supuesto. Se piensa que al disminuir el tamaño de las poblaciones, la deriva génica puede actuar a un ritmo más acelerado. Además, tras extinciones locales se necesita una recolonización rápida y con un elevado número de individuos para poder igualar las frecuencias génicas, o de lo contrario se favorecería la Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 74 diferenciación de nuevos grupos (Shama, et al., 2011); sin embargo, existen pocos estudios que evalúen el efecto de disminución del tamaño poblacional sobre la diferenciación genética. En éstos, la diferenciación genética se hace evidente debido a cambios históricos en los tamaños poblacionales (Alouatta palliata, Milton y Lozier, 2009), reducciones abruptas después de eventos extremos (Allogamus uncatus, Shama, et al., 2011) o por reducciones asociadas a caserías y fragmentación de hábitat (Loxodonta africana africana, Whitehouse y Harley, 2001); y al parecer, una lenta recuperación del tamaño poblacional y la acción de la deriva génica son los principales factores que influyen la diferenciación entre sus poblaciones. La presencia de desequilibrio de ligamiento en algunos pares de loci en R. spectabilis puede ser otra señal del cuello de botella que sufrieron las poblaciones, ya que antes de los huracanes se habían observado dos pares de loci en desequilibrio, número que aumentó a cuatro pares en la población post-huracán. Se sabe que las fluctuaciones estocásticas en poblaciones pequeñas pueden generar asociaciones no aleatorias entre alelos de diferentes loci, debido a la acción de procesos como deriva génica y endogamia en las poblaciones remanentes (Hedrick, 2005; Slatkin, 2008). Esta correlación entre desequilibrio de ligamiento y cuellos de botella se ha observado en otras poblaciones silvestres y domesticadas de perros (Gray et al., 2009) y ratones silvestres (Laurie et al., 2007). Los datos de O. c. cozumelae son contrastantes con los observados para R. spectabilis, pues no es posible detectar la evidencia de cuello de botella aún después de una reducción abrupta en el tamaño de la población. Ninguno de los métodos utilizados en este estudio reveló un cuello de botella relacionado con exceso de heterocigosis o disminución en el Ne en esta especie. Probablemente la alta diversidad genética y su distribución homogénea a lo largo de la isla que presentaba este roedor antes de los huracanes pudieran haber generado que los efectos de los huracanes no fueran evidentes. Existen otros trabajos con roedores en los que no se detectó ninguna señal genética de cuello de botella a pesar de que se habían registrado disminuciones poblacionales y que además tenían altos niveles de diversidad genética antes de dichas disminuciones (e.g. Lemmus lemmus, Ehrich y Jorde 2005; Clethrionomys glareolus, Redeker et al., 2006). Además, se ha observado que factores de historia de vida y el tamaño efectivo pueden borrar dichas señales. Por ejemplo, la rápida expansión poblacional y la capacidad de establecimiento en nuevos sitios favorecieron para que el conejo australiano (Oryctolagus cuniculus) mantuviera su diversidad genética y no muestre señales de cuellos de botella después de una reducción significativa en su Ne debida a eventos de traslocación (Zenger et al., 2003). Por otro lado, la inmigración en ardillas (Spermophilus lateralis) mantuvo la variación genética durante fluctuaciones del tamaño poblacional debido a cuellos de botella demográficos naturales durante un periodo de 10 años (McEachern et al., 2011). Al igual que en O. c. cozumelae, en Dipodomys spectabilis, no se detectó pérdida de diversidad genética ni alélica, incluso inmediatamente después de una reducción poblacional registrada luego de la época de apareamiento, probablemente gracias a su capacidad de dispersión (Busch et al., 2007). Sayra Rosio Espindola Barrientos 75 Por otro lado, es importante mencionar que en este estudio además de la prueba convencional (con el programa BOTTLENECK) se caracterizó la historia demográfica con métodos bayesianos, que tienen mayor probabilidad de detectar cuellos de botella (Peery et al., 2012), ya que las pruebas comunes para detectar cuellos de botella pueden verse limitadas en su poder estadístico como resultado de un tamaño de muestra pequeño o según los valores que se consideren según el modelo de mutación utilizado, por lo que no siempre es posible detectar cuellos de botella genéticos aún cuando exista evidencia clara de disminuciones demográficas (Peery et al., 2012). Lo que sí se observó para O. c. cozumelae fue el movimiento de los individuos, del centro de la isla (en donde se concentraba la mayor densidad poblacional) hacia la periferia (Cuadro 8 y Figura 3), tal vez en busca de refugio y alimento. Probablemente este movimiento haya sido favorecido por su elevada capacidad de dispersión (Capítulo 3), mismo que podría haber facilitado el flujo génico y con ello diluido las huellas de un cuello de botella. El efecto más notorio a nivel genético en la población post-huracán de O. c. cozumelae fue un cambio en la distribución de las frecuencias alélicas, sin que esto afectara los niveles de diversidad genética que se habían observado. Existen varias posibilidades que pudieron generar dicho cambio: variaciones en los alelos con frecuencias bajas debido a la mortalidad de individuos, la acción de la deriva génica sobre la población remanente, o bien, debido al movimiento de individuos que pudo generar un reacomodo de las frecuencias (Luikart et al., 1998; Ramachandra y Ranjini, 2009). Resulta relevante además resaltar la importancia del sitio “Potabilizadora”, ya que por una parte es el único lugar donde se observó una población de R. spectabilis después del paso de los huracanes, y por otra, el mayor porcentaje de los movimientos de O. c. cozumelae fueron hacia esa misma zona. Aun cuando no se cuenta con información que permita definir cuál es su valor ecológico, debe procurarse su conservación, para favorecer el mantenimiento de las poblaciones de roedores. Además, refleja la importancia de proteger otros sitios de la isla y mantenerlos conectados para que los organismos puedan migrar y, de esta forma, se permita la recolonización después de eventos que ocasiones extinciones locales. No hay que olvidar, además, el rol del azar al determinar las consecuencias genéticas de una disminución poblacional, ya que dichas consecuencias dependen en gran medida de la composición genética previa, y que como azar, es posible que cause estragos adversos (pérdida de diversidad genética, disminución de la adecuación) o beneficie a las poblaciones a través de fluctuaciones temporales en las distribuciones de las frecuencias alélicas (Bouzat, 2010). Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 76 Las poblaciones de roedores: ¿se recuperan? Uno de los objetivos del presente trabajo era evaluar el estado de las poblaciones después de cinco años del paso de los huracanes Emily y Wilma. Un cuello de botella, como cualquier otro proceso estocástico, puede 1) conducir a la extinción de las especies, 2) no causar ningún efecto significativo sobre las poblaciones, o bien 3) favorecer su adecuación y con ello su permanencia (Bouzat, 2010). Desafortunadamente, el éxito de captura de roedores en la isla durante el 2011 no fue el suficiente para obtener resultados concretos, por lo que dichas observaciones deben ser tomadas con cautela. Sin embargo, en el caso de O. c. cozumelae la distribución de las frecuencias alélicas se asemeja más a las encontradas en la población pre-huracán, lo que pudiera sugerir que este ratón fue capaz de enfrentar una reducción poblacional y recuperarse hacia un estado previo. En campo, fue posible encontrarlo nuevamente en CAPA, el sitio de mayor éxito de captura antes del paso de los huracanes, indicando que su movimiento entre sitios se mantiene activo, respondiendo probablemente a los cambios en el ambiente. Además, mantiene su diversidad genética y no es posible detectar señal de cuello de botella genético, aún cuando pareciera que a nivel demográfico la disminución de individuos continúa. Así pues, es factible que su dinámica poblacional esté favoreciendo su permanencia en la isla y le permita hacer frente a catástrofes naturales como los huracanes. Este es el primer trabajo en islas en el que se da seguimiento a la variación genética de un roedor después de enfrentar un disturbio natural, que además pone en evidencia la activa respuesta que favorece su permanencia. Algunos estudios ecológicos sobre el impacto de perturbaciones en poblaciones de roedores han mostrado que su recuperación está asociada a su capacidad para explotar los recursos disponibles. En general, roedores oportunistas y/o generalistas (como O. c. cozumelae) tienen una mayor oportunidad de acelerar su recuperación hacia un estado cercano al de pre-huracán (Copa, 2007), al aprovechar el alimento disponible (Klinger, 2006) o desplazarse temporalmente hacia zonas que les proveen refugio y recursos (Swilling et al., 1998). R. spectabilis, como ya se ha mencionado, es una especie mucho más susceptible debido a sus requerimientos de hábitat, su dinámica poblacional y sus bajas densidades poblacionales; de hecho, durante el 2011, sólo fue posible la captura de una hembra, lo que sugiere que se encuentra en un decremento de individuos crítico, lo que además nos impide obtener conclusiones de su estado genético actual. Sin embargo, es importante considerar que la probabilidad de extinción de una población, o bien, de su recuperación, está fuertemente asociada a su tamaño efectivo. Especies que mantienen tamaños efectivos pequeños, como parece ser el caso de R. spectabilis, son más propensas a la extinción, debido a que enfrentan la acción de la deriva génica, depresión por endogamia, acumulación de mutaciones deletéreas, pérdida de variación genética y con ello de su potencial evolutivo (Frankham, 2005). Sayra Rosio Espindola Barrientos 77 Perspectivas Evaluar los efectos que tienen los huracanes sobre las poblaciones naturales es fundamental en proyectos de conservación, sobre todo si se considera que son eventos cíclicos, con un promedio de 4.6 huracanes anuales para el Caribe (Waide, 1992) y con una probabilidad de ocurrencia para la costa de Quintana Roo del 50% por año (Jaúregui et al., 1980). El presente trabajo puso en evidencia que O. c. cozumelae y R. spectabilis responden de manera distinta al paso de un huracán por Isla Cozumel, presentando diferentes consecuencias a nivel genético. Al parecer, O. c. cozumelae se desplazó de un lugar a otros de la isla, lo que generó un reacomodo de sus frecuencias alélicas, manteniendo su diversidad genética y diluyendo la evidencia de un cuello de botella. Además, los datos obtenidos en la población 2011 sugieren que esta especie se recupera, regresando a las condiciones previas al disturbio. Por otro lado, R. spectabilis presentó evidencias de un cuello de botella, con posibles extinciones locales y un decremento excesivo de sus tamaños poblacionales, probablemente asociado a su especificidad de hábitat. Pese a ello, tanto esta especie como O. c. cozumelae conservaron niveles altos de diversidad genética. Es por ello que, ambas respuestas podrían estar asociadas a la periodicidad en la ocurrencia de huracanes e incluso a las fluctuaciones estacionales en la zona. Por medio de selección balanceadora o “purga genética” las poblaciones podrían haberse visto beneficiadas después de atravesar cuellos de botellas anteriores y presentar las condiciones reportadas en el presente trabajo. Para verificarlo, podría realizarse un nuevo trabajo utilizando genes bajo selección, buscar sitios conservados y utilizar otros marcadores como SNP’s y ver qué ocurre con ellos, al menos durante este evento de cuello de botella. Evaluar características de adecuación como éxito reproductivo y fenotipos también podría darnos referencia si los valores de diversidad genética son producto de una “limpieza” genética a lo largo de los años. Los resultados de este estudio tienen un alto valor de conservación, no solo por las diferencias encontradas entre especies y por la evidencia del cuello de botella en R. spectabilis, sino también porque manifiestan la capacidad de los organismos para responder a perturbaciones que alteran el hábitat como son los huracanes. El mayor problema que enfrentan las poblaciones en la actualidad es el ritmo acelerado al que avanzan las perturbaciones humanas, y que puede conducir a su extinción antes de lograr su recuperación. En primer lugar, el problema de introducción de especies exóticas a Isla Cozumel es una severa amenaza que se conoce ya desde hace varios años. La introducción de especies afecta de manera general las interacciones de depredación, competencia, herbivoría, parasitismo, mutualismo y el proceso de transmisión de enfermedades (Coblenz, 1978; Donlan y Wilcox, 2008). El problema se agrava debido a que la mayoría de las especies insulares han evolucionado en ausencia de grandes depredadores o herbívoros, no tienen defensas o no pueden competir eficientemente ante su presencia. De esta forma, los roedores no tienen la capacidad de responder a este tipo de impacto, por lo que se vuelven extremadamente vulnerables con una grave consecuencia: disminución de las densidades poblacionales y finalmente la extinción. En Cozumel, se piensa que las bajas Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 78 densidades de roedores en la isla son el reflejo del impacto de la introducción de Boa constrictor, una especie introducida hace varias décadas a la isla y que incluso se piensa, causó la virtual extinción de Peromyscus leucopus cozumelae, el roedor más abundante hasta antes de la introducción (Gutiérrez-Granados, 2003). En segundo lugar la pérdida de vegetación y la fragmentación de hábitat es una seria amenaza que se ha agravado en los últimos años y que ha puesto en jaque a la flora y fauna de la isla. Un sinfín de estudios sobre fragmentación de hábitat, urbanización y presencia de caminos en mamíferos pequeños han puesto en evidencia cómo este problema aumenta el aislamiento y la diferenciación de las poblaciones, favorece la endogamia, disminuye la sobrevivencia y el éxito de encontrar pareja y se eleva la mortalidad (Bolger et al., 1997; Vucetich et al., 2001; Hopton y Choate, 2002; Rico et al., 2007; Streatfield, 2009; Gomes et al., 2011). Además, la destrucción de vegetación nativa puede favorecer la invasión de especies exóticas como ratas y ratones domésticos y causar el desplazamiento de los roedores endémicos (Umetsu y Pardini, 2007). Incluso especies con alta capacidad de dispersión pueden sufrir, a través del tiempo, los efectos negativos de la fragmentación, posiblemente reduciendo su adecuación y causando extinciones locales (Dixo et al., 2009). Dichas perturbaciones, junto con los procesos demográficos propios de cada especie, podrían estar teniendo efectos genéticos sobre las poblaciones, e incluso, estar en sinergia con los efectos observados que tuvieron los huracanes. Resulta entonces crucial reconocer la interdependencia de los procesos genéticos, demográficos y ecológicos que afectan la viabilidad de las poblaciones. Si bien se ha propuesto que la demografía es de importancia inmediata ya que determina los tamaños viables mínimos para que una población se mantenga (Lande, 1988), tomar en cuenta la conectividad del paisaje para permitir la inmigración (Loew et al., 2005; Mapelli et al., 2012) y considerar la influencia de las fluctuaciones temporales y los catástrofes naturales en las características genéticas de una especie (Lacy, 1997), es parte importante para la implementación de acciones para su protección y planes de conservación. Sin los planes pertinentes, factores genéticos negativos (como endogamia, pérdida de adecuación, entre otros ya descritos) pueden conducir a la extinción de los roedores en la isla, pero aun haciendo frente a ellos, las perturbaciones, principalmente las de origen antrópico, pueden limitar la recuperación de las poblaciones y por lo tanto su mantenimiento. Sayra Rosio Espindola Barrientos 79 C O N C L U S I O N E S La elevada capacidad de dispersión de O. c. cozumelae parece permitirle hacerle frente a los estragos causados por huracanes: a nivel genético, se observa un claro movimiento del centro de la isla hacia la periferia, además se generó un cambio significativo en la distribución de las frecuencias alélicas, pero se conservó gran parte de la elevada variación genética existente antes de los huracanes. En cuanto al tamaño de la población, aun cuando se registró un decremento en el tamaño censal, no se detectó ninguna huella de la ocurrencia de un cuello de botella genético. Incluso se encontraron indicios de que la población parece recuperarse a nivel genético. Por el contrario, la reducción en el tamaño de las poblaciones de R. spectabilis fue tal que se detectó posibles extinciones locales y sólo se encontraron individuos en un sitio hacia el norte de la isla. Evidentemente, se detectó la ocurrencia de un cuello de botella y la pérdida de alelos. La situación más crítica es que, al parecer, continúa el decremento de las densidades poblacionales, ya que para el año 2011, sólo fue posible la captura de un único individuo. Lo que, fuera de cualquier análisis genético, pone en evidencia el peligro crítico en el que se encuentra esta especie. Es importante además, recalcar el papel que juegan otras amenazas como la introducción de especies exóticas y la fragmentación de hábitat, pues podrían exacerbar los efectos negativos que enfrentan los roedores en la isla y que podrían limitar cualquier capacidad de recuperación de la que pudieran echar mano sus poblaciones. Este trabajo, representa una aportación fundamental en el conocimiento de los roedores en Isla Cozumel y enfatiza la necesidad de implementar planes de manejo y conservación que integren factores genéticos, demográficos y ecológicos con el fin de mantener la riqueza biológica que alberga la isla. Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 80 R E F E R E N C I A S Abdelkrim J, Pascal M, Samadi S (2005) Island colonization and founder effects: the invasion of the Guadeloupe islands by ship rats (Rattus rattus). Molecular Ecology, 14, 2923–2931. 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Mezclar con el vortex los tubos por unos segundos 4. Incubar a 55 °C por 6-8 horas (puede ser por toda la noche). Si es posible, vortexear los tubos durante la incubación periódicamente. Al terminar la incubación, vortexear nuevamente los tubos (se puede continuar con los pasos siguientes si quedan restos pardos transparentes de tejidos en los tubos o si el líquido se ve turbio). 5. Centrifugar a 10 000 RPM, durante 3 ó 4 min a temperatura ambiente (la temperatura de la centrífuga puede variar). 6. Transferir el sobrenadante a un tubo eppendorf de 1.5 mL nuevo ya rotulado. Si partes del pellet se vierten con el sobrenadante, centrifugar una vez más por 1 min. 7. Añadir 50 de µl solución de lisis LDT. 8. Mezclar abundantemente en el vórtex durante 15 s. Luego, hacer un breve toque de spín. 9. Incubar en el termoblock a 70 °C por 10 min. Después, hacer un breve toque de spín. 10. Añadir 70 µl de etanol al 96% (v/v) o etanol absoluto. 11. Mezclar abundantemente en el vórtex durante 15 s. Después hacer un breve toque de spin. El lisado se ha obtenido. 12. Para el lavado y la obtención del ADN se colocan las columnas con filtro en un presurizador (una por muestra) y cubetas colectoras para los restos del lavado. 13. Verter cada lisado en una columna diferente (asegurarse de que se ha vertido completamente). Realizar presurización 1. 14. Agregar a cada columna 250 µl de buffer de lavado WDT y realizar presurización 2. 15. Repetir paso 14 dos veces (lavado-presurización 3; lavado-presurización 4). 16. Colocar bajo cada columna en el área de elución un tubo eppendorf de 1.5 mL nuevo y rotulado, en el mismo orden en el que se vertieron los lisados. 17. Agregar a cada columna entre 50 y 100 µl del buffer de elución CDT, esperar ∼90 s y realizar presurización. Este paso puede realizarse dos veces (dependiendo de la cantidad y concentración que se requiera) y es recomendable asegurarse que no ha quedado líquido en la columna, de lo contrario, puede realizarse otra presurización hasta que se haya colectado todo el líquido. 18. Almacenar las muestras del ADN obtenido a 4°C o de -20 a -80 °C si es por un tiempo largo. Sayra Rosio Espindola Barrientos 97 ANEXO 2. Geles de agarosa. Para visualizar productos en geles de agarosa: 1. Agregar agarosa, el buffer TBE al 0.5X y pH 8.0 y calentar hasta que la agarosa se disuelva por completo. 2. Dejar enfriar la mezcla hasta que se tolere tocar el recipiente con la mano y añadir bromuro de etidio al 0.5 µg/ml. 3. Verter la mezcla en la charola y colocar los peines para formar los pozos. Dejar que solidifique. 4. Cargar los geles con 5 μl de muestra (3 μl de loading buffer un frente y 2 μl de muestra). Destinar un pozo de cada fila para cargar el marcador de peso molecular adecuado. 5. Correr el gel en cámaras de electroforesis con buffer TBE a la misma concentración (0.5x y pH 8.0), a 120 V y durante 35-45 minutos. 6. El gel puede entonces visualizarse bajo luz ultravioleta de alta intensidad (480 nm). En este caso se utilizó el transiluminador High Performance Ultraviolet Transilluminator (UVP) y el programa Launch VisionWorks®LS Analysis Software para tomar fotografías y tener el registro. Para visualizar ADN después de su extracción los geles se preparan al 1% de agarosa y se utiliza como marcador lambda de 5, 10 y 25 ng/μl; para productos de PCR se preparan al 1.5% de agarosa y se utiliza marcador de peso molecular VC 100bp Plus DNA Ladder (Vivantis®). Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 98 ANEXO 3. Condiciones de amplificación para cada microsatélite mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). O. c. cozumelae 1. Microsatélites utilizados Locus Motivo Tamaño (pb) Fluorescencia Temp de hibridación (TH) Ory03 (AAT)16 125-143 FAM 55 Ory21 (AAT)16 184-199 HEX Ory28 (AAT)16 70-112 FAM Ory40 (AAT)13 148-175 TAMN Ory10 (AAT)14 124-148 HEX 53 Ory60 (AAT)11 130-181 FAM Ory16 (AAT)11 94-125 HEX 50 Ory26 (AAT)13 97-141 FAM Ory64 (AAT)11 74-95 FAM 2. Condiciones de la reacción 3. Concentraciones Primer ory03, ory 10 y ory64 ory16 y ory26 ory28 ory21 ory40 ory60 Reactivo Concentración final μl Concentración final μl Concentración final μl Concentración final μl Concentración final μl Concentración final μl H2O 1.5 1.45 1.4 1.6 1.05 1 MgCl2 (mM) 3 0.3 3.5 0.35 4 0.4 2 0.2 3.5 0.35 4 0.4 Buffer (X) 1 0.5 1 0.5 1 0.5 1 0.5 1 0.5 1 0.5 dNTP's (mM) 0.2 0.5 0.2 0.5 0.2 0.5 0.2 0.5 0.2 0.5 0.2 0.5 PF (μM) 0.6 0.3 0.6 0.3 0.6 0.3 0.6 0.3 1 0.5 1 0.5 PR (μM) 0.6 0.3 0.6 0.3 0.6 0.3 0.6 0.3 1 0.5 1 0.5 BSA (10 mg/ml) 1 0.5 1 0.5 1 0.5 1 0.5 1 0.5 1 0.5 Taq (U/μl) 5 0.1 5 0.1 5 0.1 5 0.1 5 0.1 5 0.1 TOTAL 5 5 5 5 5 5 Sayra Rosio Espindola Barrientos 99 Reithrodontomys spectabilis 1. Microsatélites utilizados Locus Motivo Tamaño (pb) Fluorescencia Tipo de reacción mexr16 (TG)17 172-196 FAM Touchdown mexr19 (GT)22 276-330 FAM Touchdown mexr20 (TG)25 245-283 FAM Touchdown mexr22 (AC)24 274-296 HEX Touchdown mexr23 (TG)8 119-129 FAM Touchdown mexr12 (TG)22 233-271 HEX Simple, TH= 54°C mexr32 (CA)20 234 HEX Touchdown mexr33 (TG)25 170-190 FAM Touchdown mexr34 (GT)23 202-274 HEX Touchdown mexr13 (TG)21 211-245 HEX Simple, TH= 54°C 2. Condiciones de la reacción Touchdown Simple 3. Concentraciones Primer mexr16, mexr19, mexr20, mexr22, mmexr23, mexr12, mexr33, mexr34, mexr13 mexr32 Reactivo Concentración final μl Concentración final μl H2O 2.25 1.8 MgCl2 (mM) 1.5 0.15 2 0.2 Buffer (X) 1 0.5 1 0.5 dNTP's (mM) 0.2 0.5 0.2 0.5 PF (μM) 0.5 0.25 0.9 0.45 PR (μM) 0.5 0.25 0.9 0.45 Taq (U/μl) 5 0.1 5 0.1 TOTAL 5 5 Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 100 Anexo 4. Valores de p y S.E. obtenidos de la prueba de desequilibrio de ligamiento con GENEPOP para todas las combinaciones de loci posible de R. spectabilis. En negritas se observan los valores de p≤0.05 (*valor significativo después de la corrección de Bonferroni). Clusters CONJUNTO 1 2 3 4 Pares de loci P S.E P S.E P S.E P S.E P S.E mexr16 mexr34 1 0 0.0188 0.0026 1 0 0.1095 0.0201 0* 0 mexr19 mexr12 0.0710 0.0171 1 0 1 0 0.0236 0.0097 0* 0 mexr20 mexr23 0.0996 0.0033 0.7063 0.0066 0.009 0.0008 0.2884 0.0125 0.0030 0.0020 mexr12 mexr13 0.1234 0.0209 0.3585 0.0158 1 0 0.4489 0.0332 0.0119 0.0073 mexr16 mexr33 0.4440 0.0277 0.6142 0.0120 0.8057 0.0187 0.378 0.0299 0.0208 0.0081 mexr12 mexr33 0.2769 0.0248 0.4320 0.0144 0.5842 0.0246 0.1360 0.0208 0.0270 0.0092 mexr22 mexr23 0.4418 0.0063 0.4040 0.0065 0.7877 0.0037 0.1401 0.0083 0.0368 0.0076 mexr20 mexr12 0.0054 0.0050 0.0985 0.0114 1 0 0.3340 0.0317 0.0382 0.0131 mexr12 mexr34 0.5106 0.0267 0.5584 0.0113 0.0618 0.0110 0.5898 0.0304 0.0383 0.0124 mexr19 mexr33 0.1729 0.0226 0.2283 0.0111 0.5064 0.0277 0.3582 0.0292 0.0671 0.0169 mexr22 mexr33 0.3094 0.0266 0.3263 0.0114 0.3749 0.0183 0.1258 0.0201 0.0745 0.0165 mexr22 mexr12 0.1855 0.0244 1 0 0.2995 0.0205 0.2922 0.0298 0.0797 0.0182 mexr20 mexr13 0.1182 0.0203 0.2787 0.0173 0.0081 0.0054 0.3502 0.0324 0.0864 0.0197 mexr19 mexr20 0.0167 0.0070 0.2404 0.0170 1 0 0.5551 0.0333 0.1053 0.0214 mexr19 mexr13 0.0532 0.0142 0.6549 0.0148 1 0 0.5979 0.0322 0.1079 0.0217 mexr33 mexr34 0.3040 0.0199 0.9696 0.0027 0.0142 0.0052 0.1851 0.0227 0.1531 0.0231 mexr19 mexr22 0.1001 0.0198 0.1768 0.0097 0.1668 0.0186 0.6637 0.0311 0.1795 0.0269 mexr16 mexr23 0.3945 0.0070 0.9803 0.0015 0.9171 0.0025 0.7105 0.0120 0.2320 0.0189 mexr16 mexr20 0.1817 0.0250 0.1763 0.0142 0.1171 0.0166 1 0 0.2344 0.0294 mexr23 mexr12 0.1959 0.0048 0.0595 0.0028 0.3005 0.0045 0.8805 0.0065 0.2798 0.0184 mexr34 mexr13 1 0 0.2471 0.0110 1 0 1 0 0.3175 0.0319 mexr23 mexr33 0.7965 0.0037 0.2159 0.0055 0.8784 0.0031 0.5205 0.0106 0.3744 0.0180 mexr16 mexr12 0.2194 0.0263 0.24 0.014 1 0 1 0 0.3800 0.0339 mexr20 mexr33 0.2832 0.0265 0.2996 0.0148 0.7182 0.0222 0.3453 0.0289 0.4087 0.0333 mexr16 mexr13 0.1292 0.0216 0.0835 0.0080 1 0 1 0 0.5083 0.0349 mexr19 mexr23 0.3617 0.0088 0.8928 0.0040 0.4796 0.0079 0.0818 0.0085 0.5286 0.0217 mexr16 mexr19 0.1052 0.0198 0.5091 0.0141 1 0 1 0 0.5528 0.0347 mexr19 mexr34 1 0 0.8993 0.0059 1 0 0.8330 0.0238 0.5925 0.0337 mexr20 mexr22 0.1513 0.0233 1 0 0.8412 0.0153 0.4585 0.0340 0.6745 0.0321 mexr23 mexr13 0.9115 0.0028 0.6342 0.0070 1 0 0.5323 0.0142 0.7630 0.0177 mexr16 mexr22 0.0899 0.0180 1 0 0.8504 0.0137 1 0 0.7901 0.0282 mexr22 mexr13 0.1726 0.0246 0.6924 0.0108 1 0 1 0 0.8183 0.0269 mexr20 mexr34 1 0 0.4217 0.0144 1 0 1 0 0.8706 0.0227 mexr23 mexr34 0.6331 0.0044 0.9299 0.0023 0.8090 0.0046 0.5929 0.0115 0.9147 0.0089 mexr22 mexr34 1 0 0.9385 0.0041 0.1870 0.0164 1 0 0.9279 0.0167 mexr33 mexr13 0.2489 0.0249 0.7376 0.0117 0.466 0.0291 1 0 0.9523 0.0133 Sayra Rosio Espindola Barrientos 101 Anexo 5. Valores de p y D.E. para diferenciación alélica (a) y genotípica (b) entre pares de grupos de R. spectabilis obtenidos con GENEPOP. Se muestran en negritas los valores significativos (p<0.05 con corrección de Bonferroni). a) Par de grupos 1 y 2 1 y 3 2 y 3 1 y 4 2 y 4 3 y 4 LOCUS P S.E. P S.E. P S.E. P S.E. P S.E. P S.E. mexr16 0.0007 0.0002 0.2425 0.0051 0.00004 0.00003 0.1008 0.0036 0.0002 0.0001 0.0002 0.0001 mexr19 0.0061 0.0008 0.00004 0.00004 0 0 0.0010 0.0003 0 0 0.0002 0.0001 mexr20 0.00004 0.00003 0.0001 0.0001 0.0274 0.0018 0.0185 0.0017 0.0169 0.0015 0.4617 0.007 mexr22 0 0 0 0 0.0016 0.0004 0.0003 0.0001 0.0759 0.0031 0.0080 0.0009 mexr23 0.0004 0.0001 0.7507 0.0012 0.00003 0.00002 0.3065 0.0028 0.00002 0.00001 0.3447 0.0024 mexr12 0.0001 0.00004 0 0 0.0066 0.0007 0 0 0 0 0 0 mexr33 0.0015 0.0004 0.0066 0.0008 0.0001 0.0001 0.0007 0.0004 0 0 0.7720 0.0046 mexr34 0 0 0 0 0.3167 0.0045 0.0001 0.0001 0.0318 0.0022 0.0667 0.0038 mexr13 0.0001 0.00004 0.0179 0.0015 0.0006 0.0002 0.0004 0.0002 0.0315 0.0021 0.00001 0 TODOS Highly sign Highly sign Highly sign Highly sign Highly sign Highly sign b) LOCUS Par de grupos 1 y 2 1 y 3 2 y 3 1 y 4 2 y 4 3 y 4 P S.E. P S.E. P S.E. P S.E. P S.E. P S.E. mexr16 0.0012 0.0003 0.3019 0.0055 0.0003 0.0001 0.1270 0.0043 0.0001 0.00004 0.0006 0.0002 mexr19 0.0056 0.0008 0.0001 0.0001 0 0 0.0014 0.0004 0.0002 0.0001 0.0006 0.0003 mexr20 0.0002 0.0008 0.0002 0.0001 0.0349 0.0018 0.0155 0.0013 0.0173 0.0014 0.4199 0.006 mexr22 0 0 0.0002 0.0001 0.0029 0.0004 0.0004 0.0002 0.0687 0.0031 0.0073 0.0008 mexr23 0.0004 0.0001 0.7318 0.0012 0.00003 0.00002 0.2812 0.0023 0.0001 0.00003 0.3191 0.0024 mexr12 0.0004 0.0002 0 0 0.0119 0.001 0 0 0 0 0 0 mexr33 0.0007 0.0002 0.0037 0.0005 0 0 0.0003 0.0002 0 0 0.7196 0.0043 mexr34 0.00004 0.0001 0 0 0.2738 0.0044 0.0002 0.0001 0.0395 0.0019 0.0594 0.0025 mexr13 0.0001 0.0001 0.0151 0.0012 0.0009 0.0002 0.00002 0.00002 0.0198 0.0014 0 0 TODOS Highly sign Highly sign Highly sign Highly sign Highly sign Highly sign Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 102 ANEXO 6. Frecuencias alélicas de las poblaciones de O. c. cozumelae. En amarillo se resaltan alelos exclusivos por población. LOCUS ALELO Pre-huracán Prost- huracán 2011 ORY03 109 0.005 0.000 0.000 112 0.011 0.000 0.050 118 0.084 0.012 0.050 121 0.200 0.129 0.150 124 0.447 0.241 0.450 127 0.205 0.600 0.250 130 0.032 0.018 0.000 133 0.011 0.000 0.050 136 0.005 0.000 0.000 ORY10 130 0.026 0.000 0.000 133 0.137 0.082 0.000 136 0.005 0.018 0.200 145 0.032 0.029 0.000 148 0.005 0.024 0.000 151 0.032 0.041 0.050 157 0.000 0.006 0.000 160 0.005 0.006 0.000 163 0.000 0.012 0.000 166 0.247 0.200 0.150 169 0.168 0.253 0.050 172 0.089 0.147 0.350 175 0.163 0.106 0.150 178 0.063 0.041 0.000 181 0.021 0.012 0.000 184 0.005 0.012 0.000 187 0.000 0.000 0.050 190 0.000 0.006 0.000 196 0.000 0.006 0.000 ORY16 82 0.000 0.029 0.000 85 0.005 0.006 0.000 88 0.174 0.300 0.250 91 0.021 0.006 0.000 94 0.384 0.382 0.350 97 0.063 0.047 0.000 100 0.042 0.012 0.000 103 0.205 0.188 0.200 106 0.053 0.006 0.150 109 0.016 0.006 0.050 LOCUS ALELO Pre-huracán Prost- huracán 2011 112 0.016 0.012 0.000 115 0.016 0.006 0.000 118 0.005 0.000 0.000 ORY21 148 0.037 0.035 0.000 151 0.005 0.000 0.000 160 0.005 0.012 0.000 166 0.068 0.024 0.050 169 0.168 0.147 0.150 172 0.068 0.082 0.100 175 0.063 0.100 0.200 178 0.026 0.071 0.000 181 0.221 0.247 0.200 184 0.216 0.165 0.150 187 0.042 0.041 0.100 190 0.016 0.029 0.000 193 0.063 0.041 0.050 199 0.000 0.006 0.000 ORY28 97 0.000 0.024 0.000 100 0.005 0.000 0.050 103 0.000 0.006 0.000 106 0.074 0.006 0.050 109 0.189 0.141 0.150 112 0.447 0.412 0.450 115 0.226 0.365 0.250 118 0.037 0.035 0.050 121 0.021 0.012 0.000 ORY40 118 0.000 0.006 0.000 127 0.042 0.047 0.000 130 0.074 0.065 0.100 133 0.168 0.118 0.150 136 0.584 0.453 0.450 139 0.053 0.159 0.000 142 0.058 0.082 0.200 145 0.016 0.047 0.000 148 0.005 0.024 0.100 ORY60 127 0.100 0.076 0.100 130 0.079 0.047 0.050 133 0.163 0.188 0.150 LOCUS ALELO Pre-huracán Prost- huracán 2011 136 0.116 0.159 0.050 139 0.268 0.329 0.500 142 0.153 0.094 0.150 145 0.074 0.053 0.000 148 0.011 0.000 0.000 151 0.032 0.041 0.000 154 0.005 0.012 0.000 ORY64 67 0.005 0.000 0.000 70 0.637 0.071 0.550 73 0.026 0.441 0.050 76 0.000 0.035 0.000 79 0.011 0.000 0.000 82 0.026 0.047 0.000 85 0.042 0.082 0.100 88 0.100 0.024 0.200 91 0.116 0.076 0.100 94 0.037 0.100 0.000 97 0.000 0.082 0.000 100 0.000 0.024 0.000 109 0.000 0.018 0.000 ORY26 91 0.000 0.494 0.000 94 0.858 0.182 0.750 97 0.037 0.188 0.150 100 0.000 0.071 0.000 103 0.000 0.024 0.000 106 0.000 0.006 0.000 109 0.000 0.006 0.000 112 0.000 0.006 0.000 115 0.000 0.006 0.000 118 0.005 0.012 0.050 121 0.026 0.006 0.000 124 0.032 0.000 0.050 127 0.037 0.000 0.000 130 0.005 0.000 0.000 (continúa) (continúa) Fr ec ue nc ia Fr ec ue nc ia Fr ec ue nc ia A A A A E A ORYO3 ORY1O ORY16 0.4 0,45 0.35 0.4 0.3 0.35 2 0.25 y ud “G E E 0.25 g 02 y 5 S 02 E 0.15 Eos 0.1 0.1 0.05 0.05 0 0 NI E O E] 109 112 115 121 124 127 — 130 133 136 a Mid 29 0:86 $3 35 5%3 434333 52 35 588 91 94 397 100 103 106 109 112 115 115 Alelo [pk] Alelo (pb) Alelo (pk) ORY21 ORY238 ORY40 0.3 0.5 0.45 18 0.4 0.35 0.2 m mu 03 “3 e E 0.15 30.25 z pa y] £ 0.2 É 0,1 - 0.15 0.05 - ce 0.05 O - 0 145 151 160 166 169 172 175 1/5 181 184 187 190 193 199 97 100 103 106 109 112 115 lis 121 115 127 — 130 133 130 139 142 O Alelo (pb) Alelo (pb) Alelo (pb) ORY6O ORY64 ORY26 0.6 0.5 0,4 m a E E = £ 0.3 z 5 a a y 2 0 2 Le LL 0.1 +7 o — 127 130 133 136 139 142 145 148 151 154 67 70 73 76 79 582 585 5858 391 394 397 100 109 91 94 97 100 103 106 109 112 115 118 121 124 127 130 Alelo [pk] Alelo (pk) Alelo (pb) Poo ol Sayra Rosio Espindola Barrientos 103 Gráficos de las frecuencias alélicas de las poblaciones pre-huracán (azul), post-huracán (rojo) y 2011 (verde) de O. c. cozumelae. Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 104 ANEXO 7. Frecuencias genotípicas de las poblaciones de O. c. cozumelae (Se resaltan en color naranja los genotipos homócigos). LOCUS GENOTIPO Pre-huracán Prost-huracán 2011 ORY03 118 118 3 0 0 118 121 3 1 0 121 121 3 0 0 112 124 2 0 1 118 124 6 0 0 121 124 19 8 0 124 124 22 1 3 109 127 1 0 0 118 127 1 1 1 121 127 9 13 3 124 127 12 30 1 127 127 6 28 0 121 130 1 0 0 124 130 1 1 0 127 130 3 2 0 124 133 0 0 1 127 133 1 0 0 130 133 1 0 0 124 136 1 0 0 ORY10 130 133 2 0 0 133 136 0 1 0 136 136 0 0 1 133 151 2 2 0 133 160 0 1 0 145 163 0 1 0 133 166 9 6 0 136 166 0 1 0 145 166 1 0 0 148 166 1 0 0 151 166 2 1 0 160 166 1 0 0 166 166 3 1 0 133 169 4 1 0 136 169 1 1 0 145 169 1 3 0 148 169 0 3 0 151 169 0 3 0 163 169 0 1 0 166 169 11 10 1 169 169 0 4 0 130 172 1 0 0 133 172 3 3 0 (continúa) Sayra Rosio Espindola Barrientos 105 LOCUS GENOTIPO Pre-huracán Prost-huracán 2011 136 172 0 0 1 145 172 1 1 0 148 172 0 1 0 157 172 0 1 0 166 172 5 4 1 169 172 4 5 0 172 172 0 2 2 130 175 2 0 0 133 175 4 0 0 136 175 0 0 1 145 175 2 0 0 151 175 0 1 1 166 175 7 4 0 169 175 8 7 0 172 175 0 6 1 175 175 3 0 0 133 178 2 0 0 151 178 2 0 0 166 178 3 4 0 169 178 1 1 0 172 178 3 0 0 175 178 1 0 0 178 178 0 1 0 145 181 1 0 0 169 181 2 0 0 175 181 1 0 0 166 184 1 2 0 166 187 0 0 1 181 190 0 1 0 181 196 0 1 0 ORY16 82 82 0 1 0 82 88 0 1 0 85 88 0 1 0 88 88 2 0 0 88 91 0 1 0 82 94 0 2 0 85 94 1 0 0 88 94 17 36 3 91 94 4 0 0 94 94 12 4 1 88 97 0 3 0 94 97 4 4 0 88 100 1 0 0 94 100 1 2 0 (continúa) Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 106 LOCUS GENOTIPO Pre-huracán Prost-huracán 2011 97 100 2 0 0 88 103 8 8 0 94 103 16 10 2 97 103 4 1 0 100 103 3 0 0 103 103 1 6 0 88 106 3 0 2 94 106 2 0 0 103 106 5 1 1 94 109 2 1 0 97 109 1 0 0 103 109 0 0 1 88 112 0 1 0 94 112 1 1 0 100 112 1 0 0 103 112 1 0 0 94 115 1 1 0 97 115 1 0 0 115 118 1 0 0 ORY21 160 160 0 1 0 148 169 2 1 0 151 169 1 0 0 160 169 1 0 0 166 169 1 3 0 169 169 3 2 0 148 172 0 1 0 166 172 4 0 0 169 172 2 0 0 172 172 1 1 0 148 175 1 1 0 166 175 1 0 0 169 175 1 4 2 172 175 0 2 0 175 175 2 1 0 148 178 0 1 0 166 178 2 1 0 169 178 1 1 0 172 178 0 3 0 175 178 1 2 0 148 181 1 0 0 166 181 1 0 0 169 181 10 6 1 172 181 1 3 1 175 181 0 4 1 (continúa) Sayra Rosio Espindola Barrientos 107 LOCUS GENOTIPO Pre-huracán Prost-huracán 2011 178 181 0 3 0 181 181 5 4 0 148 184 3 2 0 166 184 3 0 1 169 184 4 3 0 172 184 2 1 0 175 184 3 2 1 178 184 0 1 0 181 184 10 12 0 184 184 6 2 0 166 187 1 0 0 169 187 0 2 0 172 187 0 0 1 175 187 1 0 0 178 187 1 0 0 181 187 3 2 1 184 187 2 2 0 169 190 1 0 0 172 190 1 1 0 181 190 1 0 0 190 190 0 2 0 169 193 2 1 0 172 193 1 1 0 181 193 5 4 0 184 193 2 0 1 187 193 0 1 0 193 193 1 0 0 184 199 0 1 0 ORY28 97 97 0 2 0 106 106 1 0 0 106 109 3 0 0 109 109 1 2 0 100 112 1 0 1 106 112 6 1 0 109 112 20 9 0 112 112 21 15 3 103 115 0 1 0 106 115 2 0 1 109 115 10 10 3 112 115 12 27 1 115 115 7 11 0 106 118 1 0 0 109 118 0 1 0 112 118 1 2 1 (continúa) Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 108 LOCUS GENOTIPO Pre-huracán Prost-huracán 2011 115 118 5 2 0 109 121 1 0 0 112 121 3 1 0 118 121 0 1 0 ORY40 127 130 1 0 0 130 130 0 1 0 127 133 1 3 0 130 133 1 0 0 133 133 4 0 0 127 136 6 3 0 130 136 12 8 1 133 136 21 14 2 136 136 27 17 2 130 139 0 1 0 133 139 1 1 0 136 139 7 7 0 139 139 1 7 0 130 142 0 0 1 133 142 0 2 0 136 142 8 7 2 142 142 1 2 0 118 145 0 1 0 127 145 0 1 0 136 145 2 4 0 139 145 0 2 0 142 145 1 0 0 127 148 0 1 0 133 148 0 0 1 136 148 1 0 0 139 148 0 2 0 142 148 0 1 1 ORY60 127 127 0 1 0 127 130 1 1 0 130 130 1 0 0 127 133 2 0 1 130 133 2 2 0 133 133 1 0 0 127 136 6 3 0 130 136 3 0 0 133 136 2 3 1 136 136 1 1 0 127 139 5 0 1 130 139 6 3 1 133 139 8 22 0 (continúa) Sayra Rosio Espindola Barrientos 109 LOCUS GENOTIPO Pre-huracán Prost-huracán 2011 136 139 7 12 0 139 139 2 4 3 127 142 4 4 0 130 142 1 1 0 133 142 7 4 1 136 142 2 3 0 139 142 10 4 2 142 142 1 0 0 127 145 1 1 0 133 145 3 1 0 136 145 0 3 0 139 145 8 3 0 142 145 2 0 0 133 148 1 0 0 139 148 1 0 0 127 151 0 2 0 130 151 0 1 0 133 151 3 0 0 136 151 0 1 0 139 151 2 3 0 142 151 1 0 0 133 154 1 0 0 139 154 0 1 0 145 154 0 1 0 ORY64 70 70 38 3 2 70 73 4 0 0 73 73 0 23 0 76 76 0 1 0 70 82 2 0 0 73 82 0 4 0 82 82 1 0 0 70 85 5 0 2 73 85 0 10 0 76 85 0 1 0 79 85 2 0 0 70 88 12 0 4 76 88 0 1 0 82 88 1 0 0 85 88 1 0 0 88 88 2 0 0 70 91 18 3 1 73 91 0 4 1 85 91 0 2 0 88 91 1 1 0 (continúa) Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 110 LOCUS GENOTIPO Pre-huracán Prost-huracán 2011 91 91 1 1 0 67 94 1 0 0 70 94 4 1 0 73 94 1 6 0 76 94 0 1 0 82 94 0 3 0 85 94 0 1 0 91 94 1 0 0 94 94 0 1 0 70 97 0 2 0 73 97 0 5 0 82 97 0 1 0 88 97 0 2 0 91 97 0 1 0 94 97 0 2 0 76 100 0 1 0 94 100 0 1 0 100 100 0 1 0 97 109 0 1 0 109 109 0 1 0 ORY26 91 91 0 17 0 91 94 0 11 0 94 94 69 2 6 91 97 0 27 0 94 97 7 5 2 91 100 0 8 0 94 100 0 4 0 91 103 0 1 0 94 103 0 3 0 94 106 0 1 0 94 109 0 1 0 94 112 0 1 0 91 115 0 1 0 91 118 0 1 0 94 118 1 1 1 91 121 0 1 0 94 121 4 0 0 94 124 6 0 0 97 124 0 0 1 94 127 6 0 0 121 127 1 0 0 94 130 1 0 0 Sayra Rosio Espindola Barrientos 111 ANEXO 8. Frecuencias alélicas de las poblaciones de R. spectabilis (Se resaltan en amarillo los alelos exclusivos para cada cluster, en gris los alelos que se perdieron en la población post-huracán y en verde los alelos nuevos en la población post-huracán). PRE-HURACÁN LOCUS ALELO 1 2 3 4 CONJUNTO mexr16 172 0.048 0 0 0.071 0.039 174 0.048 0 0 0.114 0.056 176 0.048 0 0.087 0.029 0.044 178 0 0 0.022 0 0.006 180 0.357 0.091 0.391 0.157 0.256 182 0.143 0.182 0.13 0.229 0.178 184 0.024 0.045 0.065 0.186 0.1 186 0.119 0.227 0.065 0.057 0.094 188 0.048 0.045 0.174 0.014 0.067 190 0.095 0.045 0.043 0.057 0.061 192 0.071 0 0.022 0.057 0.044 194 0 0.364 0 0.014 0.05 196 0 0 0 0.014 0.006 mexr19 276 0 0 0.022 0.1 0.044 308 0.024 0.091 0 0.014 0.022 310 0.048 0.045 0.043 0.3 0.144 312 0.31 0.045 0.043 0.129 0.139 314 0.143 0 0.283 0.071 0.133 316 0.095 0 0.065 0.029 0.05 318 0.071 0.045 0.022 0.029 0.039 320 0.048 0.136 0.065 0.057 0.067 322 0.048 0 0.065 0.014 0.033 324 0.024 0 0.283 0.129 0.128 326 0.143 0.364 0 0.043 0.094 328 0.048 0.227 0.043 0.086 0.083 330 0 0.045 0.065 0 0.022 mexr20 245 0.024 0 0 0 0.006 247 0.024 0.273 0 0.029 0.05 249 0.119 0.227 0.261 0.171 0.189 251 0.143 0.045 0.065 0.043 0.072 253 0.024 0 0.043 0.029 0.028 255 0 0.045 0.022 0 0.011 257 0 0 0 0.014 0.006 259 0 0 0.043 0.014 0.017 265 0.071 0 0.043 0.043 0.044 269 0.214 0 0.022 0.157 0.117 271 0.19 0.091 0.13 0.143 0.144 273 0 0.136 0.196 0.1 0.106 275 0.024 0.091 0.13 0.171 0.117 277 0.024 0.091 0 0.014 0.022 279 0.048 0 0.022 0.043 0.033 PRE-HURACÁN LOCUS ALELO 1 2 3 4 CONJUNTO 281 0 0 0.022 0.029 0.017 283 0.095 0 0 0 0.022 mexr22 274 0 0 0 0.014 0.006 276 0.071 0 0.022 0.043 0.039 278 0.119 0 0.065 0.029 0.056 280 0.119 0 0 0.043 0.044 282 0 0.182 0.087 0.157 0.106 284 0.119 0.045 0.348 0.171 0.189 286 0.19 0.318 0.391 0.171 0.25 288 0.095 0.227 0.022 0.086 0.089 290 0 0.227 0.043 0.129 0.089 292 0.214 0 0.022 0.071 0.083 294 0.024 0 0 0.086 0.039 296 0.048 0 0 0 0.011 mexr23 119 0.857 0.409 0.891 0.843 0.806 127 0.143 0.591 0.109 0.114 0.178 129 0 0 0 0.043 0.017 mexr12 233 0 0 0.022 0 0.006 235 0.024 0 0 0 0.006 247 0 0 0.087 0 0.022 249 0 0.045 0 0.014 0.011 251 0.238 0 0 0.057 0.078 253 0 0 0 0.129 0.05 255 0 0.045 0 0 0.006 257 0.048 0.091 0.283 0.029 0.106 259 0.262 0.318 0.174 0.043 0.161 261 0.048 0.136 0.087 0.214 0.133 263 0.167 0 0.109 0.257 0.167 265 0.095 0 0.087 0.171 0.111 267 0.024 0.318 0.13 0.029 0.089 269 0 0 0.022 0.057 0.028 271 0.095 0.045 0 0 0.028 mexr33 170 0 0 0.022 0 0.006 172 0 0 0 0.014 0.006 174 0.071 0 0.065 0.043 0.05 176 0.071 0 0.239 0.157 0.139 178 0.262 0.455 0.239 0.257 0.278 180 0.071 0 0.217 0.329 0.2 182 0.31 0.182 0.174 0.129 0.189 184 0.214 0.091 0.022 0.029 0.078 186 0 0.227 0.022 0.014 0.039 PRE-HURACÁN LOCUS ALELO 1 2 3 4 CONJUNTO 190 0 0.045 0 0.029 0.017 mexr34 202 0 0 0 0.014 0.006 204 0.024 0 0.043 0.129 0.067 206 0.048 0.045 0.065 0.071 0.061 208 0.214 0 0.13 0.114 0.128 210 0.452 0.318 0.196 0.357 0.333 212 0 0.364 0.304 0.1 0.161 214 0.071 0.273 0.239 0.171 0.178 216 0.143 0 0.022 0 0.039 218 0.048 0 0 0 0.011 222 0 0 0 0.014 0.006 260 0 0 0 0.014 0.006 274 0 0 0 0.014 0.006 mexr13 211 0.119 0 0.13 0.014 0.067 213 0.048 0.045 0.13 0.029 0.061 215 0 0 0.174 0.029 0.056 217 0.119 0.318 0.087 0.371 0.233 219 0.167 0.091 0.043 0.114 0.106 221 0.024 0.273 0.13 0.014 0.078 223 0.119 0 0.065 0.029 0.056 225 0.143 0.136 0.043 0.1 0.1 227 0 0.136 0 0.043 0.033 229 0 0 0 0.029 0.011 231 0.024 0 0 0 0.006 233 0.024 0 0.022 0 0.011 235 0.071 0 0.065 0 0.033 237 0.143 0 0.065 0.043 0.067 239 0 0 0 0.1 0.039 241 0 0 0.022 0.029 0.017 243 0 0 0 0.029 0.011 245 0 0 0.022 0.029 0.017 (continúa) (continúa) Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 112 POTABILIZADORA LOCUS ALELO PREHURACAN POSTHURACAN mexr16 172 0.1 0.083 174 0.12 0.083 176 0.02 0 180 0.12 0.083 182 0.14 0.125 184 0.24 0.208 186 0.04 0.208 188 0.02 0 190 0.1 0.208 192 0.06 0 194 0.02 0 196 0.02 0 mexr19 276 0.1 0.042 308 0.02 0.042 310 0.3 0.208 312 0.16 0.083 314 0.06 0.042 316 0.02 0 318 0.04 0 320 0.02 0.125 322 0.02 0.042 324 0.16 0.25 326 0.02 0.167 328 0.08 0 mexr20 249 0.18 0.042 253 0.04 0.125 257 0.02 0.125 265 0.06 0 267 0 0.042 269 0.2 0.125 271 0.14 0.083 273 0.1 0.042 POTABILIZADORA LOCUS ALELO PREHURACAN POSTHURACAN 275 0.2 0.292 279 0.04 0.083 281 0.02 0 283 0 0.042 mexr22 274 0 0.042 276 0.04 0.083 278 0.04 0 280 0.02 0.042 282 0.12 0.083 284 0.16 0.25 286 0.24 0.292 288 0.12 0.042 290 0.06 0.042 292 0.08 0.125 294 0.12 0 mexr23 119 0.92 0.917 127 0.02 0.083 129 0.06 0 mexr12 249 0.02 0.083 251 0.06 0.125 253 0.12 0 257 0 0.042 259 0.04 0 261 0.24 0.208 263 0.22 0.25 265 0.16 0.167 267 0.06 0.125 269 0.08 0 mexr33 172 0.02 0 174 0.04 0.042 176 0.12 0.292 178 0.28 0.25 POTABILIZADORA LOCUS ALELO PREHURACAN POSTHURACAN 180 0.34 0.292 182 0.12 0 184 0.02 0.042 0.02 0.083 190 0.04 0 mexr34 204 0.16 0.208 206 0.1 0.042 208 0.12 0.083 210 0.28 0.417 212 0.16 0.125 214 0.12 0.042 216 0.02 0.042 220 0 0.042 260 0.02 0 274 0.02 0 mexr13 211 0.02 0 215 0.02 0.083 217 0.4 0.375 219 0.14 0.208 221 0 0.042 223 0.04 0 225 0.14 0.083 227 0.06 0 229 0.04 0 233 0.02 0 239 0.04 0.042 241 0.02 0 243 0.04 0.167 245 0.02 0 (continúa) (continúa) AA TT TT A A A A AA TA TA —. TP TI mexrl6 mexr19 mexr20 0.3 0.2 0.25 0.15 a 2 02 2 3 E E Z 2 0.15 2 01 5 pa a 5 2 01 y 2 - ” = 0.05 - 0.05 172 174 176 178 180 182 184 186 188 190 192 194 196 276 308 310 312 314 316 318 320 322 324 326 328 330 a 2222I238S5555:33 Alelo (pb) Alelo (pb) Alelo (pb) mexr23 mexrl12 mexr22 1 0.2 0.3 0.38 0.25 a o 0.15 Ma 0.2 2 0.6 2 c y 2 0,1 s 0.15 y 0,4 y uu e Eg 01 0.2 0.05 0.05 o o 0 119 127 129 233235 247 249 251 253255 257 259 261 263 265 267 269 271 274 270 278 2380 282 234 230 288 290 292 294 296 Alelo (pb Alelo (pb elo ([p elo ([p Alelo (pb) mexr33 mexr3d4 13 mexr 0.3 0.35 0.25 0.3 E 02 302 o E £g 02 E uv 0.15 u E S 3 0.15 y E 01 E 01 y + 0,05 0.05 0 0 170 172 174 176 178 180 182 184 186 190 202 204 206 208 210 212 214 216 218 222 260 274 20953 3 q 3 3 2 3 5 8 5 2 339% SS A Alelo (pb) Alelo (pb) Alelo (pb) Sayra Rosio Espindola Barrientos 113 Gráficos de las frecuencias alélicas por locus de la población pre-huracán de R. spectabilis. Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 114 Gráficos de las frecuencias alélicas por locus por cluster de la población pre-huracán de R. spectabilis (Cluster 1, azul, cluster 2, marrón, cluster 3, verde, cluster 4, morado). Sayra Rosio Espindola Barrientos 115 Gráficos de las frecuencias alélicas por locus de la población post-huracán de R. spectabilis. Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 116 Gráficos de la comparación de frecuencias alélicas entre poblaciones de R. spectabilis pre-huracán (en color azul) y post-huracán (en color rojo) por localidad de muestreo ´Potabilizadora´. Sayra Rosio Espindola Barrientos 117 ANEXO 9. Frecuencias genotípicas de las poblaciones de R. spectabilis (Se resalta en color naranja los genotipos homócigos y en amarillo los genotipos exclusivos para cada cluster). PRE-HURACÁN LOCUS GENOTIPO CLUSTER CONJUNTO 1 2 3 4 mexr16 174 174 1 0 0 1 2 172 180 1 0 0 0 1 174 180 0 0 0 2 2 176 180 1 0 0 0 1 178 180 0 0 1 0 1 180 180 3 0 5 1 9 172 182 0 0 0 2 2 174 182 0 0 0 1 1 176 182 0 0 0 1 1 180 182 2 0 2 4 8 182 182 0 0 1 3 4 172 184 0 0 0 1 1 174 184 0 0 0 2 2 180 184 1 0 0 2 3 182 184 0 0 1 1 2 184 184 0 0 0 2 2 172 186 1 0 0 1 2 180 186 3 0 2 0 5 182 186 1 2 0 0 3 186 186 0 0 0 1 1 176 188 0 0 2 0 2 180 188 0 0 2 0 2 182 188 1 0 1 0 2 184 188 0 1 2 0 3 186 188 0 0 1 0 1 172 190 0 0 0 1 1 176 190 1 0 2 1 4 180 190 1 0 0 1 2 182 190 1 1 0 0 2 188 190 0 0 0 1 1 180 192 0 0 1 0 1 182 192 1 0 0 1 2 184 192 0 0 0 2 2 186 192 0 0 0 1 1 188 192 1 0 0 0 1 190 192 1 0 0 0 1 174 194 0 0 0 1 1 PRE-HURACÁN LOCUS GENOTIPO CLUSTER CONJUNTO 1 2 3 4 180 194 0 2 0 0 2 182 194 0 1 0 0 1 186 194 0 3 0 0 3 194 194 0 1 0 0 1 184 196 0 0 0 1 1 mexr19 276 310 0 0 0 1 1 310 310 0 0 0 7 7 310 312 1 0 0 3 4 312 312 3 0 0 0 3 276 314 0 0 0 1 1 308 314 1 0 0 0 1 312 314 1 0 0 3 4 314 314 0 0 2 0 2 276 316 0 0 1 0 1 312 316 1 0 0 0 1 314 316 1 0 0 0 1 314 318 1 0 1 0 2 316 318 1 0 0 0 1 318 318 0 0 0 1 1 310 320 0 0 0 1 1 312 320 1 1 0 1 3 314 320 0 0 2 0 2 312 322 1 0 1 1 3 314 322 1 0 1 0 2 276 324 0 0 0 3 3 308 324 0 0 0 1 1 310 324 0 0 1 1 2 312 324 0 0 1 0 1 314 324 0 0 3 0 3 316 324 0 0 2 2 4 320 324 0 0 1 1 2 322 324 0 0 1 0 1 324 324 0 0 2 0 2 310 326 1 0 0 1 2 312 326 1 0 0 0 1 314 326 1 0 0 0 1 316 326 1 0 0 0 1 PRE-HURACÁN LOCUS GENOTIPO CLUSTER CONJUNTO 1 2 3 4 318 326 1 0 0 0 1 320 326 1 0 0 0 1 324 326 0 0 0 1 1 326 326 0 4 0 0 4 276 328 0 0 0 2 2 308 328 0 1 0 0 1 310 328 0 1 0 0 1 312 328 1 0 0 1 2 314 328 0 0 1 1 2 318 328 0 1 0 0 1 320 328 0 2 0 1 3 324 328 1 0 0 0 1 326 328 0 0 0 1 1 308 330 0 1 0 0 1 310 330 0 0 1 0 1 314 330 0 0 1 0 1 328 330 0 0 1 0 1 mexr20 247 247 0 2 0 0 2 247 249 1 1 0 1 3 249 249 1 0 2 0 3 249 251 0 0 0 1 1 251 253 0 0 1 0 1 247 255 0 1 0 0 1 251 259 0 0 1 0 1 249 265 0 0 0 1 1 251 265 1 0 0 0 1 253 265 0 0 1 0 1 249 269 1 0 1 3 5 251 269 3 0 0 0 3 253 269 1 0 0 0 1 259 269 0 0 0 1 1 269 269 1 0 0 1 2 245 271 1 0 0 0 1 247 271 0 0 0 1 1 249 271 1 1 3 0 5 251 271 1 0 0 0 1 265 271 0 0 0 1 1 (continúa) (continúa) (continúa) Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 118 PRE-HURACÁN LOCUS GENOTIPO CLUSTER CONJUNTO 1 2 3 4 269 271 2 0 0 0 2 271 271 1 0 0 1 2 249 273 0 2 1 3 6 251 273 0 1 0 0 1 255 273 0 0 1 0 1 259 273 0 0 1 0 1 269 273 0 0 0 2 2 271 273 0 0 3 2 5 249 275 0 1 3 2 6 253 275 0 0 0 1 1 257 275 0 0 0 1 1 265 275 0 0 0 1 1 269 275 0 0 0 1 1 271 275 0 0 0 4 4 273 275 0 0 3 0 3 275 275 0 0 0 1 1 251 277 0 0 0 1 1 271 277 0 1 0 0 1 275 277 0 1 0 0 1 249 279 0 0 0 1 1 251 279 1 0 0 1 2 265 279 0 0 1 0 1 269 279 0 0 0 1 1 277 279 1 0 0 0 1 251 281 0 0 1 0 1 253 281 0 0 0 1 1 269 281 0 0 0 1 1 265 283 2 0 0 0 2 271 283 1 0 0 0 1 275 283 1 0 0 0 1 mexr22 276 278 1 0 0 0 1 274 282 0 0 0 1 1 276 282 0 0 0 1 1 278 282 0 0 0 2 2 280 282 0 0 0 1 1 282 282 0 0 0 1 1 276 284 0 0 0 1 1 278 284 0 0 3 0 3 282 284 0 0 0 1 1 284 284 0 0 4 1 5 276 286 2 0 0 0 2 PRE-HURACÁN LOCUS GENOTIPO CLUSTER CONJUNTO 1 2 3 4 280 286 1 0 0 0 1 282 286 0 1 4 2 7 284 286 2 0 3 2 7 286 286 1 0 5 3 9 278 288 1 0 0 0 1 280 288 1 0 0 0 1 282 288 0 2 0 1 3 284 288 1 1 1 1 4 286 288 1 2 0 0 3 276 290 0 0 0 1 1 280 290 0 0 0 2 2 282 290 0 1 0 0 1 284 290 0 0 1 4 5 286 290 0 4 1 0 5 276 292 0 0 1 0 1 278 292 3 0 0 0 3 280 292 2 0 0 0 2 284 292 1 0 0 0 1 288 292 0 0 0 2 2 290 292 0 0 0 2 2 292 292 1 0 0 0 1 284 294 0 0 0 1 1 286 294 0 0 0 2 2 288 294 0 0 0 2 2 292 294 1 0 0 1 2 280 296 1 0 0 0 1 284 296 1 0 0 0 1 mexr23 119 119 15 1 18 24 58 119 127 6 7 5 8 26 127 127 0 3 0 0 3 119 129 0 0 0 3 3 mexr12 251 251 1 0 0 0 1 251 253 0 0 0 1 1 247 257 0 0 3 0 3 253 257 0 0 0 1 1 257 257 0 0 2 0 2 235 259 1 0 0 0 1 251 259 2 0 0 0 2 253 259 0 0 0 1 1 257 259 2 1 0 0 3 259 259 1 2 2 0 5 PRE-HURACÁN LOCUS GENOTIPO CLUSTER CONJUNTO 1 2 3 4 249 261 0 1 0 0 1 253 261 0 0 0 2 2 257 261 0 0 2 0 2 259 261 1 0 0 0 1 261 261 0 0 0 2 2 247 263 0 0 1 0 1 251 263 2 0 0 2 4 253 263 0 0 0 1 1 257 263 0 0 2 1 3 259 263 1 0 2 1 4 261 263 1 0 0 3 4 263 263 1 0 0 2 3 233 265 0 0 1 0 1 249 265 0 0 0 1 1 251 265 3 0 0 1 4 253 265 0 0 0 3 3 257 265 0 0 2 0 2 259 265 1 0 1 0 2 261 265 0 0 0 4 4 263 265 0 0 0 3 3 255 267 0 1 0 0 1 257 267 0 1 0 0 1 259 267 1 2 1 0 4 261 267 0 2 2 0 4 263 267 0 0 0 2 2 267 267 0 0 1 0 1 259 269 0 0 0 1 1 261 269 0 0 0 2 2 263 269 0 0 0 1 1 267 269 0 0 1 0 1 251 271 1 0 0 0 1 263 271 1 0 0 0 1 267 271 0 1 0 0 1 271 271 1 0 0 0 1 mexr33 172 174 0 0 0 1 1 174 176 0 0 0 2 2 176 176 0 0 0 1 1 174 178 2 0 2 0 4 176 178 1 0 5 4 10 178 178 1 1 0 0 2 170 180 0 0 1 0 1 (continua) (continúa) (continúa) (continúa) Sayra Rosio Espindola Barrientos 119 PRE-HURACÁN LOCUS GENOTIPO CLUSTER CONJUNTO 1 2 3 4 174 180 0 0 1 0 1 176 180 0 0 3 2 5 178 180 1 0 1 9 11 180 180 0 0 0 3 3 174 182 1 0 0 0 1 176 182 0 0 3 1 4 178 182 3 3 3 3 12 180 182 0 0 2 4 6 182 182 3 0 0 0 3 176 184 2 0 0 0 2 178 184 2 0 0 0 2 180 184 2 0 1 1 4 182 184 3 1 0 1 5 178 186 0 4 0 1 5 180 186 0 0 1 0 1 184 186 0 1 0 0 1 178 190 0 1 0 1 2 180 190 0 0 0 1 1 mexr34 204 206 0 0 0 2 2 204 208 0 0 0 1 1 206 208 1 0 1 1 3 208 208 1 0 0 0 1 202 210 0 0 0 1 1 204 210 0 0 1 3 4 206 210 1 1 0 2 4 208 210 4 0 1 3 8 210 210 3 0 0 4 7 204 212 0 0 1 1 2 208 212 0 0 3 1 4 210 212 0 1 3 2 6 212 212 0 3 2 1 6 204 214 0 0 0 2 2 206 214 0 0 2 0 2 PRE-HURACÁN LOCUS GENOTIPO CLUSTER CONJUNTO 1 2 3 4 208 214 0 0 1 2 3 210 214 3 5 4 5 17 212 214 0 1 2 1 4 214 214 0 0 1 1 2 208 216 2 0 0 0 2 210 216 4 0 0 0 4 212 216 0 0 1 0 1 204 218 1 0 0 0 1 210 218 1 0 0 0 1 210 222 0 0 0 1 1 260 274 0 0 0 1 1 mexr13 213 213 0 0 1 0 1 211 215 0 0 4 0 4 213 215 0 0 1 1 2 211 217 0 0 1 1 2 213 217 0 0 0 1 1 215 217 0 0 1 0 1 217 217 0 0 0 4 4 211 219 2 0 0 0 2 213 219 1 0 0 0 1 215 219 0 0 1 0 1 217 219 1 0 1 1 3 211 221 1 0 0 0 1 213 221 0 0 1 0 1 217 221 0 4 0 1 5 219 221 0 1 0 0 1 221 221 0 0 1 0 1 211 223 1 0 1 0 2 215 223 0 0 1 0 1 217 223 2 0 0 0 2 219 223 1 0 0 2 3 213 225 0 1 1 0 2 217 225 1 1 0 4 6 PRE-HURACÁN LOCUS GENOTIPO CLUSTER CONJUNTO 1 2 3 4 219 225 2 0 0 1 3 221 225 0 1 1 0 2 217 227 0 2 0 1 3 219 227 0 1 0 1 2 215 229 0 0 0 1 1 217 229 0 0 0 1 1 223 231 1 0 0 0 1 217 233 1 0 0 0 1 217 235 0 0 1 0 1 221 235 0 0 1 0 1 225 235 1 0 0 0 1 233 235 0 0 1 0 1 211 237 1 0 0 0 1 213 237 1 0 0 0 1 217 237 0 0 0 2 2 219 237 0 0 0 1 1 221 237 0 0 1 0 1 223 237 0 0 1 0 1 225 237 2 0 0 0 2 235 237 2 0 0 0 2 217 239 0 0 0 3 3 219 239 0 0 0 2 2 225 239 0 0 0 1 1 225 241 0 0 0 1 1 237 241 0 0 1 0 1 239 241 0 0 0 1 1 217 243 0 0 0 1 1 227 243 0 0 0 1 1 213 245 0 0 1 0 1 217 245 0 0 0 2 2 (continúa) (continúa) Genética de poblaciones de los roedores de Isla Cozumel, Quintana Roo 120 PROST-HURACÁN LOCUS GENOTIPO FRECUENCIA mexr16 172 182 1 172 184 1 174 184 1 180 184 1 182 184 1 180 186 1 184 186 1 186 186 1 174 190 1 182 190 1 186 190 1 190 190 1 mexr19 310 312 1 276 314 1 310 320 1 312 320 1 308 324 1 310 324 1 320 324 1 322 324 1 310 326 2 324 326 2 mexr20 253 257 1 253 269 1 257 269 1 267 273 1 253 275 1 257 275 1 271 275 1 275 275 2 269 279 1 271 279 1 249 283 1 mexr22 280 282 1 284 284 1 274 286 1 276 286 2 284 286 2 286 286 1 282 288 1 284 290 1 PROST-HURACÁN LOCUS GENOTIPO FRECUENCIA 284 292 1 292 292 1 mexr23 119 119 10 119 127 2 mexr12 249 261 1 257 261 1 261 261 1 251 263 2 261 263 1 249 265 1 263 265 2 251 267 1 263 267 1 265 267 1 mexr33 176 176 2 174 178 1 176 180 2 178 180 4 180 184 1 176 186 1 178 186 1 mexr34 204 206 1 204 210 3 208 210 1 210 210 1 204 212 1 210 212 2 208 214 1 210 216 1 210 220 1 mexr13 215 217 1 217 217 1 215 219 1 217 219 1 219 219 1 217 225 1 221 225 1 217 239 1 217 243 3 219 243 1 (continúa) Sayra Rosio Espindola Barrientos 121 Anexo 10. Diferenciación alélica y genotípica obtenida de GENEPOP entre las poblaciones 'Potabilizadora' pre y prost-huracán de R. spectabilis. Anexo 11. Valores de diversidad genética de O. c. cozumelae obtenidos con GENEPOP. Se resaltan en negritas los valores de media y Desviación estándar para cada estadístico. Pre-huracán Locus N na ne Ho He HNEI ORY03 90 9 3.4402 0.6421 0.7093 0.7131 ORY10 14 6.6594 0.9368 0.8498 0.8543 ORY16 12 4.9368 0.8421 0.7974 0.8017 ORY21 13 6.8831 0.8105 0.8547 0.8592 ORY28 7 3.395 0.6842 0.7055 0.7092 ORY40 8 2.6093 0.6526 0.6168 0.62 ORY60 10 6.3226 0.9368 0.8418 0.8463 ORY64 9 2.3064 0.5579 0.5664 0.5694 ORY26 7 1.3505 0.2737 0.2596 0.2609 MEDIA 9.8889 4.2115 0.7041 0.6890 0.6927 DE 2.5712 2.0541 0.2098 0.1916 0.1927 Post-huracán Locus N na ne Ho He HNEI ORY03 85 5 2.2978 0.6588 0.5648 0.5682 ORY10 17 6.699 0.9059 0.8507 0.8558 ORY16 12 3.6392 0.8706 0.7252 0.7295 ORY21 13 7.2573 0.8471 0.8622 0.8673 ORY28 8 3.0782 0.6471 0.6751 0.6791 ORY40 9 3.8403 0.6824 0.7396 0.7440 ORY60 9 5.2543 0.9294 0.8097 0.8145 ORY26 11 3.1403 0.7765 0.6816 0.6856 ORY64 11 4.2798 0.6353 0.7663 0.7709 Media 10.5556 4.3875 0.7725 0.7417 0.7461 3.3953 1.6897 0.1190 0.0944 0.0949 2011 Locus N na ne Ho He HNEI ORY03 10 6 3.3898 0.7 0.705 0.7833 ORY10 7 4.6512 0.7 0.785 0.8722 ORY16 5 4 0.9 0.75 0.8333 ORY21 8 6.6667 1 0.85 0.9444 ORY28 6 3.3898 0.7 0.705 0.7833 ORY40 5 3.5088 0.8 0.715 0.7944 ORY60 6 3.2258 0.7 0.69 0.7667 ORY64 5 2.7397 0.8 0.635 0.7056 ORY26 4 1.6949 0.4 0.41 0.4556 Media 5.7778 3.6963 0.7444 0.6939 0.7710 1.2019 1.3780 0.1667 0.1228 0.1364 D. alélica D. genotípica Locus P SE P SE mexr16 0.6128 0.0062 0.6495 0.0055 mexr19 0.2689 0.0054 0.3442 0.0053 mexr20 0.0534 0.0026 0.0534 0.0023 mexr22 0.1600 0.0035 0.1583 0.0040 mexr23 0.2887 0.0018 0.2799 0.0017 mexr12 0.2155 0.0045 0.1798 0.0042 mexr33 0.3548 0.0053 0.1798 0.0042 mexr34 0.9208 0.0021 0.8713 0.0028 mexr13 0.4181 0.0062 0.3932 0.0054 TODOS 0.2038 0.1880