3 
2e 
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO 
Cuernavaca, Morelos 1992 
Instituto de Biotecnología 
Caracterización, manipulación y posible papel en la Naturaleza 
del gene pac y su producto, la enzima penicilino acilasa de 
Escherichia culi. 
TESIS 
Que para obtener el grado de 
Doctor en Biotecnología 
presenta 
Enrique Merino Pérez 
     TESIS CON 
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Contenido 
Capítulo I. Prólogo y Objetivos 
Capítulo II. Antecedentes y Justificaciones 
Antibíoticos 13-lactámicos, naturales y semisintéticos 
11.2. Importancia de la enzima penicilino acilasa (PA) 
11.2.1. Aspecto tecnológico. 
11.2.2. Estado actual del conocimiento sobre el gene pac y de su producto, 
Capitulo III. Mecanismos y elementos involucrados en la 
de la actividad de penicilino acilasa. 
111.1. Introducción 
1111.1. Estructura del gene pac de E. coli y de sus regiones de regulación 
111.1.2. Estructura de la enzima PA de E. 
1112. Resultados y Discución 
111.2.1. Estudios sobre la regulación transcripcional del gene pac. 
111.2.1.1. Estudios de fusión de los genes pac-lacZ. 
111.2.1.2. Cuantificación del mRNA específico del gene pac. 
111.2.1.4. Análisis de la región 5' de egulación del gene pac. 
111.2.1.5. Presencia del gene pac en cepas de E. coli. 
111.2.2. Estudios de la regulación post-transcripcional de la actividad de PA 
111.2.2.1. Determinación de la actividad específica de PA en extractos 
111.2.2.2. Estudio de proteínas híbridas de PA. 
111.3. Conclusiones particulares 
la enzima PA, 
regulación 
5' y 3'. 
celulares. 
2 
Capítulo IV. Incremento de la actividad de la enzima penicilino 
acilasa mediante técnicas de Ingeniería Genética 
IVA.. Introducción 
IV.2. Resultados y Discusión 
1V,2.1 Construcción de vehículos moleculares para lograr la sobre-expresión del gene pac 
1V.2.2. Estudios de procesos fermentativos de cepas con actividad de PA, 
1V.2.2.1. Efecto de la concentración y del tiempo de adición de inductor del 
sistema en la actividad de PA. 
IV.2.22, Efecto del fondo genético sobre la actividad de PA. 
IV.3. Conclusiones particulares 
Capítulo V. Posible papel de la enzima penicilino acilasa 
en la Naturaleza 
V.1. Introducción 
V.1.1. Distribución, propiedades y mecanismo de acción de la enzima PA. 
V.1.2. Vía de utilización del ácido fenilacético en Psettdornonas y E. coli. 
V.2. Resultados y Discusión 
V.2.1. Crecimiento de cepas de E. coli en presencia de compuestos fenilados, 
V.2.2. Posible papel fisiológico de la enzima PA, 
V.3. Conclusiones particulares 
Capítulo VI. Conclusiones generales y perspectivas 
Capitulo VIL Otros estudios realizados durante el Doctorado 
- Origen y evolución de la transmisión de la información genética 
- Estudio de genes sobrelapados y sus implicaciones evolutivas 
3 
Bibliografía 
Indice de Tablas y Figuras 
Nomenclatura 
Apéndice I.- Artículos en los que se incluyen elementos de esta Tesis 
- The role of penicillin amidases in Nature and in industry. 
Trends in Biochemical Sciences. 
- Carbon regulation and the role in Nature of the E. coli penicillin acylase (pa gene. 
Molecular Microbiology, 
- A general, PCR-based method for single or combinatoria]. oligonucleotide-directed 
mutagenesis on pUC/M13 vectors. 
BioTechnics. 
• Recovery of DNA from agarose gels stained with Methylene Blue, 
BioTechnics. 
Apéndice 	Otros artículos elaborados durante el período Doctoral 
- New insights on the Comma-less theory. 
Origens of Life. 
- Are overlapping open reading frames remants of a primaeval genetic code system? 
Manuscrito en preparación. 
4 
Capítulo 1. Prólogo y Objetivos 
La enzima penicilino acilasa (PA) (E.C. 15.1.11) es la enzima industrialmente usada para 
hidrolizar a la penicilina G (PenG) en ácido fenilacético (AFA) y ácido 6-amino 
penicilánico (6-APA). Este último es un intermediario en la producción de penicilinas 
semisintéticas, que son en nuestros días, el tipo de antibiótico más importante para el 
tratamiento de enfermedades infecciosas. La enzima PA presenta características únicas 
dentro de las enzimas de origen procarionte; la forma activa de la enzima corresponde a la 
de un heterodímero, producto del procesamiento de un precursor común. 
Paralelo a la importancia de esta enzima, el estudio del gene que la codifica, pac, 
representa un excelente modelo para conocer, a nivel molecular, algunos de los mecanismos 
y elementos involucrados en la expresión genética, ya que se encuentra modulado a través 
de diferentes sistemas de regulación. Por otro lado, el comprender la organización y la 
regulación de este gene, es un aspecto importante para lograr la obtención de cepas 
microbianas, modificadas genéticamente, que permitan sobreproducir la actividad de PA. 
Por estas razones, el gene pac y su enzima PA, representan un modelo de estudio de gran 
importancia, tanto en el campo básico como en el tecnológico. 
En base a lo mencionado, la presente Tesis de Doctorado ha tenido como Objetivo 
General el obtener información sobre los mecanismos y elementos involucrados en la 
regulación de la enzima PA, y de como este conocimiento a través de la manipulación de 
su gene estructural pac, permita obtener cepas bacterianas sobreproductoras de la actividad 
de PA. Así mismo es también parte del Objetivo General de esta Tesis, el elucidar el 
posible papel fisiológico de la enzima PA en la Naturaleza. 
Así mismo, los objetivos particulares de esta Tesis son: 
- Integrar la información publicada más relevante en torno de las enzimas PA y de los 
genes estructurales que las codifican en diferentes organismos y especialmente en 
E. coli. 
- Estudiar algunos de los mecanismos y elementos más importantes involucrados en la 
regulación de la actividad de PA: a) Organización y regulación del 
gene pac. b) Estructura de la PA y de su regulación post-transcripcional. 
- Obtener cepas de E. coli, sobreproductoras de la actividad de PA. 
- Proponer el posible papel de la enzima PA en la Naturaleza. 
5 
El contenido de esta Tesis esta organizado en capítulos, y en cada uno de ellos se trata 
en forma particular, los objetivos planteados. 
Finalmente, se incluyen en el Apéndice I, los artículos elaborados durante el período 
Doctoral: Los dos primeros artículos están directamente relacionados con la Tesis Doctoral. 
Los dos segundos artículos son referentes a innovaciones metodologías, desarrolladas para 
facilitar parte del estudio experimental de la Tesis. Los dos últimos artículos fueron 
realizados paralelamente a esta Tesis, y están integrados en otra línea de investigación de 
nuestro laboratorio que tiene como objetivo estudiar el origen y la evolución de los 
primeros mecanismos de transmisión de la información genética. 
6 
Capitulo II. Antecedentes y Justificación 
. Antibióticos Blactámicos, naturales y semisintéticos. 
El descubrimiento de los agentes antimicrobianos marcó el advenimiento de una nueva 
era en la práctica médica. Desde entonces, el control de enfermedades infecciosas se ha 
basado en la elección de un gran número de compuestos inhibitorios del crecimiento 
bacteriano a los que se les ha asignado el nombre genérico de antibióticos. Desde el 
descubrimiento de la penicilina por Fleming en 1929, cientos de antibióticos han sido 
descubiertos o generados por vías semisintéticas. Así, para 1981, se habían desarrollado 
cerca de 20,000 penicilinas, 4,000 cefalosporinas, 1,000 rifampicinas, 500 cloranfenicoles, 
500 kanamicinas y 250 tetraciclinas. En ese mismo año, la producción de antibíoticos 
alcanzó aproximadamente las 25,000 toneladas, de las cuales cerca de 12,000 
correspondieron a penicilinas, 5,000 a tetraciclinas, 1,200 de cefalosporinas y 800 de 
eritromicinas."'" Del anterior grupo de antibióticos, los B-Iactámicos (penicilinas y 
cefalosporinas), se caracterizan por poseer un anillo B-Iactámico en su molécula (Fig. 1). La 
diversidad de este tipo de compuestos se da a partir de la modificación de su núcleo básico 
(Fig. 2). Este grupo confiere al antibiótico la capacidad para interactuar covalentemente con 
proteínas periplásmicas (PBPs) involucradas en la síntesis de pared celular bacteriana en sus 
etapas terminales." 
Las cepas usadas industrialmente para incrementar los niveles de producción de estos 
antibióticos han sido obtenidas a partir de programas de desarrollo a gran escala. Por 
ejemplo, durante 40 años, la compañía Gist-Brocades (líder actual en la producción de 
penicilinas), ha mejorado la productividad de su proceso en 1,000 veces." Sin embargo, 
después de la década de los 60s, el uso desmedido de los antibióticos B-lactárnicos en la 
terapia clínica así como su aplicación en otras áreas tales como la preservación de 
alimentos y la nutrición animal, propiciarán la selección de microorganismos resistentes a 
los mismos. 
El mecanismo más común de resistencia bacteriana a estos antibióticos, es su in.activación 
mediante la ruptura del enlace amídico del anillo B-lactámico por las enzimas 
lactamasas.' Actualmente, estas enzimas constituyen uno de los más serios problemas de la 
terapia clínica, ya que se presentan en una gran variedad de bacterias patógenas. 
7 
nuá . 
CH3  
CH3  
CO2  
a 
R 
R 	
(1)1 
COOH 	
SO 3 
b 	 c 
Figura 1. Estructura general de un antibiótico B-lactóinico. 
a) penicilinas, b) cefalosporinas, c) monobactamas. El grupo 13-lactámico se indica con las 
líneas gruesas. 
El problema ha sido parcialmente resuelto con el uso de nuevos antibióticos B-lactámicos 
semisintéticos con estructuras modificadas, que son substratos pobres para estas enzimas, a 
comparación de los antibióticos naturales. Sin embargo, se ha encontrado que cambios 
puntuales en los genes de las 13-lactarnasas, pueden modificar el espectro de su 
especificidad, por lo que es claro que ningún antibiótico B-lactámico podrá permanecer en 
el mercado por tiempo indefinido.88"53,89,74 
Las penicilinas producidas por vía semisintética, son en la actualidad los antibióticos que 
dominan el mercado por ser, no tan solo los más baratos, sino también los menos tóxicos. 
Paralelamente a lo anterior, es importante mencionar que el empleo en la clínica de un 
nuevo y potente inhibidor de 13-lactamasas, el ácido clavulánico, combinado con las 
penicilinas semisintéticas existentes, permite rescatar en muchos casos, el uso de varias de 
ellas." 
R Nombreg  R Nombre 
HO 
Carbenicilina 
COOH 
C001-1 o 
Figura 2. Estructura química de algunas penicilinas semisintéticas, En la parte superior 
de la figura se muestra la estructura general de las penicilinas semisintéticas. En la parte 
inferior se muestra los diferentes tipos de radicales, que dan origen a las correspondientes 
penicilinas semisintéticas. 
• 
9 
0-C1-1-• 
c, H$ P7opc%t•ilipa 
OCH3  
C>1.,. 	14eticilina 
OC H3 
CH-•• 	Ampicilina 
Amoxicilina 
NH3  
o H Oxacilina 
Ciox2cilina 
Dicloxacilina 
Flucloxacilina 
CoMa—CHa—COOH 
ACIDO FENILACETICO 
11.2. Importancia de la enzima penicilino acilasa. 
11.2.1. Aspecto tecnológico. 
El primer reporte de la obtención del 6-APA de un proceso fermentativo data del ¿lío de 
1959, cuando Batchelor y colaboradores lograron obtenerlo utilizando una cepa de 
Penicillum chrysogenum.6 A partir de entonces, fue posible la elaboración de penicilinas 
semisintéticas, y con ello se logró una gran revolución en la práctica terapéutica. 
Difícilmente se puede pensar en ejemplos similares, en donde la utilización de una enzima 
sea responsable de una contribución de tal importancia en el campo de la medicina. 
Pese al su gran éxito, la baja producción y los complejos mecanismos involucrados en el 
aislamiento del 6-APA, hizo del proceso desarrollado por Batchelor y colaboradores, un 
proceso poco rentable en aquel momento. Hoy en día, el 6-APA es producido por hidrólisis 
química o enzimática de las penicilinas G y y. Actualmente, la producción vía enzimática 
del 6-APA es preferida sobre la realizada mediante procedimientos químicos, ya que 
además de resultar más barata, las sustancias utilizadas en el proceso químico son 
altamente contaminantes, y por lo tanto de uso cada vez más restringido.` 
El proceso enzimático para la obtención de 6-APA se basa, como ya se ha mencionado, 
en la hidrólisis de la PenG utilizando a la enzima PA. Los productos de esta reacción son 
el AFA y 6-APA (Fig. 3). Este último al ser reacilado en el cc-amino de la posición 6 con 
una cadena lateral particular, permite producir una gran variedad de compuestos 13- 
lactámicos" (Fig. 2 y 3). 
Sitio de hidrcliish 
O1 H 
II 	1 
C4H5— C He— C N 
ACIDO 6-AMINO PENICILANICO 
• 
Figura 3. Esquema de la acción de la enzima penicilino acilasa sobre la molécula de 
penicilina G. En la figura se muestra el sitio de hidrólisis de la PenG por la enzima PA, 
así como los productos de esta hidrólisis, AFA y 6-APA. 
lo 
CH3 
CH3 
C 00H 
PENICILINA G 
PS 	Alfa 	PC 	 Beta 
4 
Alfa 	 Beta 
_ 
Aunado a lo anterior, el desarrollo de la tecnología de i111110Vill1.11Ción de enzimas ha 
permitido la elaboración de biocatalizadores en los que la enzima en cuestión puede ser 
reusada en varias ocasiones, La producción industrial de 6-APA a traves de la 
inmovilización de la enzima PA, ha sido uno de los primeros éxitos en la aplicación 
comercial de esta tecnología." 
11.2.2 Estado actual del conocimiento sobre el gene pac y de su producto, la enzima PA 
En E. coli, la forma activa de esta enzima consiste de dos subunidades heterólogas 
producto del procesamiento proteolítico de un precursor comün8.9.7' (Fig. 4). Esta forma de 
activación es similar a la qu ese realiza en algunas hormonas de tipo eucariote, como la 
insulina, o en algunos zimógenos como el fibrinógeno o el tripsinógeno; sin embargo, se 
puede considerar que entre los organismos procariotes, este tipo de procesamiento de las 
enzimas capaces de deacilar penicilinas o cefalosporinas, como son los casos de la PenG 
acilasa de E. coli,"'", Arthrobacter viscosus,', Bacillus megaterium,", Proteus 
rettgeri,11.1241'' Kluyvera citrophila,5A" y las enzima GK16 glutaril 7-ACA acilasa," y la 
enzima SE83 cefalosporina C acilasa" de Pseudomonds melanogetum, es poco frecuente. 
PS 	Alfa 	PC 	 Beta 
Precursor proteico de 
	
'•••••• ••• ••Éjilij 	 1 
la enzima PA 
	
li 
Corte proteolítico del 
péptido señal (PS) y del 
péptido conector (PC) 
Generación de las dos 
subunidades a y 13 que 
conforman la enzima 
PA activa 
Figura 4. Ruta del procesamiento del precursor proteico de PA. Alfa y Beta representan 
a las subunidades proteicicas de 24 y 62 kDa respectivamente. PC representa al péptido 
conector y PS al péptido señal. La forma activa de la enzima PA corresponde a las 
subunidades alfa y beta correctamente asociadas. Ninguno de los intermediarios del 
procesamiento presenta actividad de PA," 
11 
Ligado a lo anterior, es importante señalar que la expresión del gene pac, es un 
excelente modelo para conocer, a nivel molecular, algunos de los elementos involucrados 
en la expresión genética de este gene y finalmente de su producto proteico. La actividad de 
PA se encuentra modulada por diversos elementos, siendo los más importantes la inducción 
por AFA, regulación por fuente de carbono y temperatura de crecimiento. 
Inducción por ácido fenilacético: El AFA es uno de los dos productos de la hidrólisis 
de la PenG por la enzima PA (Fig. 3). Se ha reportado que la actividad de PA en células 
crecidas en AFA (0.1 a 0.3% p/v), es aproximadamente 8 a 10 veces mayor que la que se 
obtiene al crecer en ausencia de este compuesto." Esta inducción es altamente específica 
del AFA, ya que muchos compuestos estructural y químicamente relacionados al mismo, no 
producen ningún efecto.' Se ha reportado que la actividad de PA, tanto en Proteus 
rettgeri,21.' como en Kluyvera citrophila,29 no es inducida por AFA. No obstante, cuando el 
gene pac de K. citrophila es donado en E. coli, el efecto de inducción por este compuesto 
puede ser observado." Es importante mencionar también que el AFA es un inhibidor del 
crecimiento celular y que concentraciones superiores a 0.3%, son tóxicas para las 
bacterias." 
Un estudio más detallado de esta regulación, así como las contribuciones en este 
respecto, realizadas durante la presente Tesis, se incluyen en el artículo "Carbon regulation 
and the role in Nature of the Escherichia coli penicillin acylase (pac) gene", que se anexa 
en Apéndice 1. 
Regulación por fuente de carbono: Se ha reportado que la expresión del gene pac de 
E. culi se encuentra bajo el control de represión catabólica por diferentes fuentes de 
carbono, tales como glucosa, lactosa, fructuosa y glicerol."'" Esta represión puede ser 
totalmente liberada mediante la adición exógena de AMPc' Hasta el momento de iniciar la 
presente Tesis, no había sido demostrado si el efecto de represión catabólica se ejercía 
directamente sobre el inicio de transcripción del gene pac, o bien de una manera indirecta, 
mediante la regulación de otros genes cuyos productos estuvieran relacionados con el 
transporte del inductor AFA, o el transporte y/o procesamiento del precursor de PA." El 
efecto, directo o indirecto, de la represión catabólica por glucosa sobre la actividad de PA 
en células crecidas en un medio que contiene glucosa y AFA es de aproximadamente 30% 
con respecto a aquellas células crecidas en ausencia de glucosa." 
Es interesante mencionar que la actividad de PA en P. rettgeri es activada por glucosa y 
reprimida por succinato, fumarato y malato,' y que cuando el gene pac de este organismo 
12 
  
es transformado en cepas de E. coli, no se observa ningún efecto de inhibición por 
succinato, fumarato o malato pero si se presenta una aparente inhibición catabólica por 
glucosa." 
En el Apéndice 1, se anexa el artículo "Carbon regulation and the role in Nature of the 
Escherichia coli penicillin acylase (pac) gene", en donde se analiza en detalle este tipo de 
regulación, incluyendo las contribuciones realizadas durante la presente Tesis. 
Termoregulación: La temperatura de crecimiento es un factor determinante en la 
actividad final de PA. Se ha reportado que la temperatura óptima de crecimiento de E. coli 
para obtener la actividad máxima de PA es 28 °C. A temperaturas mayores de crecimiento, 
la actividad de PA decrece, de tal manera que, en células crecidas a 37 °C, la actividad de 
PA es casi nula."' Esta pérdida de actividad de PA sin embargo, no es debida a la 
inactivación de la enzima por calor, ya que la temperatura óptima de reacción de esta 
enzima es de 42 °C.' Oh et al., han demostrado que cepas crecidas a 42 °C transformadas 
con plásmidos multicopia que contienen al gene pac bajo el control del promotor PL del 
bacteriofago lambda, acumulan al precursor de PA no procesado.' A partir de este 
resultado, estos autores concluyen que la termoregulación de la actividad de PA esta 
mediada a nivel del transporte, y/o procesamiento del precursor de PA. Sin embargo, es 
necesario tener en cuenta que estas determinaciones fueron realizadas con un promotor 
diferente del nativo y de que de los experimentos realizados, no es posible inferir si tal 
acumulación es debida a un efecto de saturación del mecanismo de transporte y/o 
procesamiento originada por la sobre-expresión del precursor de PA, o bien por otro tipo 
de regulación. 
Valle E ha demostrado que la termoregulación de la actividad de PA es independiente 
del locus envY", cuyo producto esta involucrado en la termoregulación de genes de porinas 
ompF, ompC y lamB.' 
García y Buesa,29 han reportado que el gene pac de K. citrophila, se termoregula de la 
misma manera que lo hace el gene pac de E. coli, no obstante el decremento de la 
actividad de la primera es tan solo de aproximadamente un 50% cuando es crecida a 37°C. 
La magnitud de esta regulación es independiente de que el gene pac de K. citrophila se 
encuentre en K. citrophila, o haya sido donado en E. coli. Es interesante mencionar que 
Daumy et al. han reportado que la actividad de PA de P. rettgeri solo existe a 28 °C, ya 
que este organismo no es capaz de crecer a 37 °C.
24 
13 
BgIII HpoI 
•••• Hind111 
CRP 	—35 —10 RBS ATG 
S <X C 
5' 
••• 
••• 
CRP 
t 
1 HpaI 
Capítulo III. Mecanismos y elementos involucrados en la regulación 
de la actividad de penicilino acilasa. 
HM. Introducción 
TRU. Estructura del gene pac de E. coli y de sus regiones de regulación S' y 3'. 
El gene estructural pac de E. coli ATCC1105 consta de 2,532 pb. En nuestro laboratorio 
liemos identificado, mediante experimentos de extensión de primero, que el inicio la 
transcripción del RNA mensajero se encuentra a 30 pb hacia arriba dei primer codón 
MG." El análisis de la secuencia nucleotídica de la región 5' de regulación, ha permitido 
determinar mediante criterios de secuencia consenso, dos posibles sitios de unión para el 
complejo CRP-AMPc, tres secuencias palindrómicas que pudieran estar involucradas en la 
regulación transcripcional del gene, así como un promotor funcional 34 pb hacia arriba del 
gene estructurar' (Fig. 5). 
Figura 5. Organización física del gene pac de E. coli. En la figura se esquematiza al 
gene estructural pac, así como los elementos de regulación localizados en los extremos 5' 
y 3' terminales, estos son: dos sitios propuestos para el reconocimiento por el complejo 
CRP-AMPc (CRP), un promotor funcional (cajas -35 y -10), regiones palindrómicas 
imperfectas, posiblemente involucradas en la regulación de la expresión (flecha de dos 
• 
cabezas), un sitio de unión a ribosoma (RBS) y el codón de inicio de la traducción (ATG). 
La estructura de tallo y asa (t) ubicada en el extremo 3', representa un posible terminador 
de la transcripción rho-dependiente". 
14 
La determinación del inicio de la transcripción del gene pac (Valle et Os.), fue realizada 
en condiciones de máxima inducción (AFA 0.1% como única fuente de carbono). Es 
importante mencionar que se han reportado evidencias en favor de la existencia de un 
segundo promotor ubicado en la región de DNA delimitada por el sitio de restricción 
Hindi)) inmediato anterior al gene estructural.' En la sección de resultados del presente 
capitulo, así como en el artículo anexo: "Carbon regulation and the role in Nature of the 
Escherichia coli penicillin acylase (pac) gene", se realiza un análisis de la región de control 
5' y se evalúa la existencia de este segundo promotor. 
111.1.2. Estructura de la enzima PA 
Como se ha mencionado en el capítulo II, la forma activa de la enzima PA se localiza 
en el espacio periplásmico y está constituida por las subunidades a (24 kDa) y 13 (62 kDa), 
en proporciones equimolares.8'9 Estas subunidades son el producto del procesamiento del 
precursor PA, cuyo peso original es de 94 kDa, Durante el proceso de translocación a 
través de la membrana interna, es removido el péptido lider de la región amino terminal 
del precursor. Una vez en el periplasma, se efectúa un segundo y tercer corte proteolítico 
con lo que se exinde el péptido conector ubicado entre las subunidades" (Fig. 4). Ninguno 
de los intermediarios del procesamiento presentan actividad de amidohidrolasa.9 
En base a resultados de experimentos de reasociación in vitro, Lindsay y Pain39 han 
propuesto que la forma activa de la enzima PA, es adquirida a través del plegamiento 
secuencia) de las dos subunidades. La subunidad a puede plegarse independiente en una 
estructura globular compacta. Por el contrario, el plegamiento de la subunidad 13 es 
dependiente de la conformación previamente adquirida por la subunidad a.18 La función del 
péptido conector es la de favorecer la adecuada interacción entre las dos subunidades, que 
posteriormente permanecerán unidas por interacciones que son principalmente de tipo 
hidrofóbicas." 
Aún no han sido identificadas las enzimas involucradas en el procesamiento de la enzima' 
PA. Se ha propuesto que la propia enzima PA pudiera tener propiedades proteolíticas que 
le permitieran autoprocesarse.12." Sin embargo, se ha reportado que son necesarias ciertas 
proteasas del periplasma para obtener la forma madura de PA.' Muy probablemente, estas 
proteasas están involucradas en el procesamiento de otras proteínas distintas a PA, ya que 
cepas de E. coll carentes de la actividad nativa de PA, al ser transformadas con el gene 
15 
E. culi 	K. citropliila Microorganismo P. rettgeri 	A. viscosas 
93.5 	80-90 Precursor (kDa) 	 95 
Precursor (a.a.) 846 	844 
24.5 	24 24 	 23 Subunidad a (kDa) 
65 	60 65 	 62 Subunidad a (kDa) 
85 	89.5 81 Enzima madura (kDa) 	89 
26 	 26 Póptido señal (a.a.) 
Sitio de corto PS ALA 1 EQ 	ALA 1 AS 
54 	54 Péptido conector (a.a.) 
TA 1 AL 
Tr I SN 
Sitio de corte PC TA 1 AL 
Ti' 1 SN 
	
1 SN 
PenG 
Cefalexina 
Cefalotina 
PenG PenG 
Cefalexina 
Cefaloridina 
Substrato 	 PenG 
KM 20 mM 	1.4 mM 	 0.42mM 
pac de otros organismos (Arthobacter viscosus," 	Bacillus megateriurn," Kluyvera 
citrophila29 y Proteus rettger?4), fueron capaces de sintetizar, y procesar correctamente a la 
enzima PA. 
Mediante mutagénesis generalizada sobre el gene pac, se ha identificado que la 
especificidad de la enzima hacia grupos fenilo radica en la subunidad ct,n mientras que la 
subunidad B contiene un residuo de serina reactivo que puede ser inactivado por PMFS,"  
Aunado a lo anterior, se ha pensado que un estudio comparativo entre las enzimas PA de 
diversos organismos, constituye una fuente importante de información para entender algunas 
de sus propiedades estructurales, cinéticas y regulatorias. En la Tabla 1 se compilan algunas 
de ellas. 
	IMS,~1.1~...131 11.a• 
VidlIX 62µM 
pH óptimo de reacción 8.1 	73 	 6 - 7.5 
Tcmp. óptima de reacción 55 °C 	 45 - 50 *C 
APA 4 mM 
6-APA 1 mM 
Inhibición por APA 200 mM 
6-APA 1 mM 
Periplastna 	Intracelular 	Extracelular Pcriplasma Localización 
Succinato 
malato 
fumarato 
Glucosa 	Glucosa Represión por 
30 °C 	30 °C Tcmp. crecimiento 28 °C 28 °C 
Tabla 1. Propiedades estructurales, cinéticas y regulatorias de la enzima PA de 
diferentes microorganismos. 
16 
111.2. Resultados y Discusión 
111.2.1. Estudio sobre la regulación transcripcional del gene pac 
Como se mencionó anteriormente, debido a que la enzima PA requiere ser transportada y 
procesada en el espacio periplásmico para obtener su forma activa, la biosíntesis del 
precursor de la enzima PA, no necesariamente es un reflejo de la actividad final de la 
enzima. Con el objeto de discernir en que medida esta actividad es modulada a nivel del 
inicio de la transcripción del gene pac, se realizaron los siguientes estudios: 
a) Regulación por fuente de carbono: En el artículo "Carbon regulation and the role in 
Nature of the Escherichia culi penicillin acylase (pac) gene", se describe en forma detallada 
los elementos relacionados a este tipo de regulación. En dicho estudio se analizaron 
condiciones de exceso (11mM glucosa) y limitación (22mM glicerol) de carbono. 
b) Inducción por AFA: Los elementos relacionados a este tipo de regulación se 
describen en forma detallada en el artículo antes mencionado. Los experimentos realizados 
en el estudio fueron llevados a cabo, tanto en presencia (AFA 0.1%), como en ausencia del 
inductor. 
c) Termoregulación: El estudio de la termoregulación se efectuó al crecer las cepas a 28 
y 37 °C, en condiciones de máxima inducción (AFA 0.1% como única fuente de carbono). 
Temperatura 
28 °C 	37 °C 
Glucosa 
11 mM 
A 	 Sin AFA 
B 	 AFA 0.1% 
=D. 	 
Fuente de 
carbono 	Glicerol 22mM 
y energía 22mM D 
Sin AFA 
Inductor 
AFA 0.1% 
E 	F 	AFA 0.1% 
Tabla 11. Condiciones analizadas en el estudio de la regulación transcripcional del gene 
pac. 
17 
En la Tabla II se muestran las distintas condiciones de crecimiento utilizadas en los 
estudios anteriores. Para cada uno de las condiciones anteriores de estudio se realizaron las 
siguientes determinaciones: 
111.11,1. Estudios de fusión de los genes pac-lacZ. 
En este estudio se realizó la fusión de la región de regulación del extremo 5' terminal 
del gene pac con el gene reportero lacZ, que codifica para la enzima I3-galactosidasa. Del 
plásmido pPA25' se aisló un fragmento de DNA que contiene la región de regulación del 
extremo 5' terminal del gene pac de E. coli, así como la parte del gene estructural 
correspondiente al péptido señal y a los primeros 75 aminoácidos de la subunidad a de la 
enzima. Este fragmento fue donado en fase, al gene que codifica para la enzima 
13-galactosidasa en el plásmido pMC1403.15 El plásmido producto de esta donación fue 
designado como pPA50. Las cepas de E. coli ATCC11101, así como la cepa HB101 
transformada con los plásmidos pPA4,65 pPA25' y pPA50 (Fig. 6), fueron crecidas hasta 
fase exponencial tardía en medio mínimo NN suplementado con 15mM NH4C1 como fuente 
de nitrógeno y glucosa 11mM, glicerol 22mM o AFA 0.1%, como fuente de carbono y 
energía, de acuerdo a las condiciones descritas en la Tabla II. La actividad de PA se 
determinó mediante el método reportado por Balasingham et al., en donde la formación de 
la base de Shifft colorida formada entre el p-dimetil aminobenzaldehido y el grupo amida 
del 6-APA, es una medida indirecta de la hidrólisis de la Pena' La actividad de 
13-galactosidasa fue determinada de acuerdo al método descrito por Miller, en base a la tasa 
de hidrólisis del ONPG54. 
111.2.1.2. Cuantificación del mRNA específico del gene pac. 
El RNA total de la cepa ATCC11105 crecida en las diferentes condiciones anteriormente 
descritas, fue extraído de acuerdo al protocolo descrito por Young y Furano." La integridad 
del RNA y el tamaño del mRNA de pac, fueron verificados en geles desnaturalizantes de 
acrilamida 5%, urea 8M, y la pureza del mismo mediante estudios de tipo Northem8° en 
geles de agarosa 1%, formaldehido 2.2M. La cuantificación del mRNA específico del gene 
pac fue realizada por hibridización en punto. La radioactividad de cada punto fue 
determinada en un contador de centelleo. 
18 
h'suZ + DNA ligese 
Hpc I 
, Eco RV sino' 	Nindn 	H Srnai 	+DNA patyn-,erase 
DNA ligcse 	 /DNA lígose 
ii
E 
f 
Figura 6. Construcción de vehículos moleculares para el estudio de la transcripción del 
gene pac. Los plásmidos pPA2, pPA4, pPA25, pPA25 y pBR339 han sido previamente 
descritos por Oliver et al.' El plásmido pMC1403 fue construido por Casadaban a al.," y 
contiene al gene reportero de lacZ. Eñ plásmido pPA50, el gene lacZ ha sido fusionado a 
la región de regulación 5' del gene pac. La línea gruesa del plásmido pPA2 representa el 
fragmento cromosoma! que contiene al gene pac de la cepa de E. coli ATCC11105. 
19 
o. 
15 • 60 
— ¥¥40 
20 
100 
o - 
- 
• 
%
 A
c
t i
v
id
a
d
 d
e
  P
A
 
100 
80 - 
60 
40 - 
20 - 
B 101i p1,1 G 25 — 
Glu 011 Glu Gli AFA AFA 
+AFA +AFA 	37 C 
Gu Gli Glu Gli AFA AFA 
+AFA +AFA 	37 C 
A
c
ti
v
id
a
d
 d
e
  P
A
 
Glu Glu 	Gli Glu Gil AFA AFA 
+AFA *AFA 	37 C 
Gli Glu Gil AFA AFA 
+AFA +AFA 	37 C 
%
 A
c
ti
v
id
a
d
  
HE1101/p1,1 G25 
liBl 01 /13MG 1 0 
Gfu Gil Glu Gil AFA AFA 
+AFA *AFA 	37 C 
Figura 7. Determinación de las actividades de PA, 11-galactosidasa y pac mRNA. Las 
cepas de E. con ATCC11105 y HB101, transformadas con los plásmidos indicados, fueron 
crecidas en medio mínimo NN y cosechadas en la fase exponencial tardía. Seis condiciones 
fueron analizadas: Glu: glucosa 11 mM, 28 °C, Gly: glicerol 22 mM, 28 °C, Glu+AFA: 
glucosa 11 mM + ácido fenilacético 0.1%, 28 °C, Gly+AFA: glicerol 22 mM + ácido 
fenilacético 0.1%, 28 °C, AFA: ácido fenilacético 0.1%, 28 °C, 37 °C: ácido fenilacético 
0.1%, 37 'C. Con el objeto de poder realizar un análisis comparativo, los resultados son 
expresados en términos relativos al máximo valor obtenido (100%) de cada conjunto de 
determinaciones. El detalle y su discusión, de estos resultados se presentan en el artículo 
"Carbon regulation and the role in Nature of the E. coli penicillin acylase (pac) gene". 
20 
• 
Los resultados correspondientes a la fuente de carbono e inducción por AFA, son 
descritos y analizados en forma detallada en el artículo: "Carbon regulation and the role in 
Nature of the Escherichia coli penicillin acylase (pac) gene", y se resumen en la Fig. 7. 
Estos resultados muestran claramente que la regulación por represión catabólica, así como 
la inducción por AFA, es llevada a cabo a nivel del inicio de transcripción. Lo anterior 
está de acuerdo el reporte de Valle et al," en donde se propone la existencia de sitios para 
la unión al complejo CRP-AMPc en la región de control 5' de este gene. 
Un elemento relevante de estos estudios, lo constituye los resultados de cuantificación de 
B-galactosidasa y del mRNA específico del gene pac en cultivos crecidos a diferentes 
temperaturas (Fig. 7). Estos resultados indican que la termoregulación de la actividad 
intracelular de PA, es esencialmente postranscripcional. 
Es importante notar que el sistema de regulación por temperatura de la actividad de PA 
en E. coli, es diferente de los anteriormente descritos en la literatura: Regulación mediada 
por el producto de envY, que regula transcripcionalmente a los genes de ciertas porinas 
como OmpF, OmpB y LamB;8") al sistema de ternioregúlación por proteólisis mediado por 
el producto de orripT;8G'7 a o al sistema global de regulación conocido con el nombre de 
"Heat shock"." Tomando en cuenta esta regulación postranscripcional de PA, y 
considerando que la enzima activa de PA no es labil a 37 °C, es posible pensar que entre 
los elementos que pudieran estar involucrados en esta termoregulación de PA se encuentran 
entre otros: 
a) El transporte del precursor de PA al periplasma, b) El procesamiento del precursor 
de PA, c) La vida media de la enzima PA. 
111.2.1.4. Análisis de la región 5' de regulación del gene pac. 
Como se mencionó en la Introducción del presente capítulo, en nuestro grupo se ha 
identificado un promotor funcional del gene pac, 34 pb hacia arriba del primer ATO del 
gene estructural" (Fig. 5). Sin embargo, existe controversia en torno a la existencia de un 
segundo promotor funcional.6° Con el objeto de evaluar la factibilidad de estos promotores, 
se desarrolló un programa para computadora basado en el algoritmo estadístico de Mulligan 
et al.," con el que fueron analizados los 160 nucléotidos anteriores al gene estructural de 
pac. El número de posibles promotores identificados en esta región, depende del valor filtro 
usado en el análisis. Los resultados del estudio se muestran en el histograma de la Fig. 8, 
21 
en donde se puede observar que el promotor propuesto por nuestro grupo (B), posee el 
valor más alto de filtro, y por tanto es estadísticamente el más probable dentro de esta 
región, mientras que por otro lado, el segundo promotor, propuesto por Oh et a1.60 (A), 
tiene un valor de filtro tan bajo, que con él también se pueden encontrar adicionalmente 
otros 13 posibles promotores. En el artículo "Carbon regulation and the role in Nature of 
the E, coli penicillin acylase (pac) gene", se presenta una descripción detallada de estos 
resultados y del algoritmo matemático empleado. 
30 
N° de 
Promotores 
20 
10- 
j1 	t 
37 38 39 40 41 42 4 46 33 34 
Valor del filtro 
Figura 8. Análisis de los posibles promotores en la región 5' de regulación del gene 
pac. El histograma mostrado, representa el número de promotores 03° identificados, dentro 
de los 160 nucleótidos anteriores al codón de inicio ATO, empleando el algoritmo 
estadístico propuesto por Mulligan et al." 	Las flechas indican el valor del filtro 
correspondiente al promotor propuesto por Valle et al." (B) y Oh et alnA). 
22 
23130 — 
9416 -- 
6557 -- 
4361 -- 
2322 — 
2025 — 
Figura 9. Detección del gene pac en cepas de E. col!. El DNA de las cepas de cepas de 
E. col! ATCC11105, 1-1B101, JM101, W3110 (carriles 1, 2, 3 y 4, respectivamente), fueron 
digeridos con la enzima EcoRI y separados por electroforesis en gel de agarosa 1%, 
transferidos a una membrana de nitrocelulosa e hibridizados con el fragmento interno lipal- 
Hpal del gene pac. El carril de la extrema izquierda corresponde a marcadores de peso 
molecular. 
11L2.1.5. Presencica del gene pae en cepas de E. coli 
Los estudios de inducción transcripcional del gene pac por AFA, revelaron que esta 
regulación puede estar presente en cepas de E. col! que originalmente carecían de actividad 
de PA. Este hecho puede implicar que: a) La regulación por AFA es común a otros genes 
presentes en E. coli, o b) El gene pac es un gene críptico en las cepas sin actividad de 
PA, pero la regulación por AFA en estas cepas es debida a que aún se encuentran 
presentes los elementos que anteriormente lo regulaban. 
Con el objeto de discernir entre estas dos posibilidades, se realizaron experimentos tipo 
Southern" usando DNA cromosomal de cepas de E. coli que poseen (ATCC11105) o no 
(HB101, JM101, W3110) actividad de PA. La sonda usada en estos experimentos de 
hibridización, fue el fragmento interno del gene pac de 1.7 kb Hpal-Hpal. Como puede 
observarse en la Fig. 9, solo el DNA cromosomal de la cepa ATCC11105 presenta 
hibridización con el detector. Este resultado implica que el sistema que interviene en la 
regulación del gene pac por AFA en ciertas cepas de E. col!, es común a otros genes por 
lo que puede considerarse que el gene pac pudiera ser parte de un regulón modulado por 
AFA 
23 
111.2.2. Estudios de la regulación post.transcripcional de la actividad de PA. 
111.2.2.1. Determinación de la actividad especific de PA en extractos celulares. 
Corno se demostró anteriormente, la actividad de PA se encuentra termoregulada 
esencialmente a un nivel post-transcripcional. Los mecanismos de regulación que se 
analizan en esta sección, se basan en la hipótesis de que la actividad de PA en células 
crecidas a 37 °C es nula debido a que a esa temperatura: 
a) No se produce la enzima responsable del procesamiento del precursor de PA. 
b) Se produce una proteasa(s) que degrada e inactiva a la enzima PA. 
Con el objeto de analizar las anteriores alternativas, y en base a los resultados de 
Schumacher et al.,72 que demuestran que el precursor de PA acumulado en el citoplasma 
puede ser procesado después del rompimiento celular, se realizó el siguiente experimento: 
La cepa de E. coli HB101 (pac-) fue transformada con el plásmido pPA2. Posteriormente, 
ambas cepas fueron crecidas a 28 y a 37 °C, en condiciones de máxima inducción (AFA 
1% como única fuente de carbono), cosechadas en fase logarítmica tardía, y resuspendidas 
en buffer fosfatos 0.1M, pH 7.5. Finalmente se determinó la actividad de PA a estos 
cultivos, así como al producto de la mezcla de ellos, tal y como se indica en la Tabla III. 
Las condiciones 1 al 10, son controles del estudio en los que se observa que: 
a) La cepa de E. oil HB101 carece de actividad de PA, a menos que esta sea 
transformada con un plásinido que contenga al gene pac, 
b) La actividad de PA es casi nula en cepas de E. coli crecidas a 37 °C. 
c) El efecto de la ruptura celular mediante sonicado, no afecta la actividad de PA. 
d) La actividad específica de PA de la mezcla por partes iguales de un cultivo con 
actividad de PA con otro que no la tiene, es aproximadamente la mitad de la primera. 
El resultado de la condición N°11 muestra que la disminución de la actividad de PA de 
las cepas crecidas a 37 °C, no es debida a que la endopetidasa(s) responsable del 
procesamiento del precursor de PA, sea sintetizada exclusivamente a 28 'C. 
El resultado de la condición N°12 muestra que la termoregulación de la actividad de PA, 
no es debida a la inactivación de la enzima activa de PA, por proteasas que pudieran 
sintetizarse preferencialmente a 37 °C. 
24 
Cepa 
	
Tratamiento 
	
Actividad 
del cultivo relativa 
1) 1-1B101 	37 °C 
	
no sonicada 
	
0% 
2 ) FIB101/pPA2 	37 °C no sonicada 4% 
3 ) 1-113101 	28 °C 
	
no sonicada 
	
0% 
4 ) FIB101/pPA2 	28 °C 110 sonicada 94% 
5 ) HI3101 	37 °C 
	
sonicado 
	
0% 
6 ) HB101/pPA2 	37 °C sonicado 6% 
7 ) 1-113101 	28 °C 
	
sonicado 
	
0% 
8 ) 11B101/pPA2 	28 °C sonicado 100% 
9 ) FIB101 37 °C + HB101/pPA2 37 °C sonicadas e incubadas 
	
3% 
10) HB101 28 °C + HB101/pPA2 28 °C sonicadas e incubadas 49% 
11) HB101 28 °C + HB101/pPA2 37 °C sonicadas e incubadas 
	
2% 
12) HB101 37 °C + HB101/pPA2 28 °C sonicadas e incubadas 48% 
Tabla 111. Estudio del mecanismo de termoregulación de la actividad de PA. Con el 
objeto de poder realizar un análisis comparativo de los resultados, la actividad de PA se 
expresa en términos porcentuales respecto al máximo valor obtenido (100%). 
111.2.2.2. Estudio de proteínas híbridas de PA. 
Como se comentó anteriormente, el estudio comparativo del gene pac de diferentes 
organismos, puede brindar información relevante sobre la estructura y función de la enzima 
PA. En la presente Tesis se decidió realizar el estudio comparativo entre los genes pac de 
E. col! y K. citrophila. Pese a la gran homología a nivel de secuencia primaria entre estos 
dos genes (80%)5 (Fig. 10), su regulación, así como algunas propiedades enzimáticas de sus 
productos polipeptidicos presentan ciertas diferencias2'mP7.16, siendo las más importantes las 
que presentan en su regulación por AFA y temperatura. 
Con el propósito de correlacionar regiones específicas de la enzima PA, con algunas de 
las propiedades cinéticas o regulatorias de la misma, se decidió construir genes híbridos 
formados a partir de los genes pac nativos de E. coli y K. citrophila. El gene pac de E. 
coli utilizado en este estudio, había sido anteriormente aislado en nuestro laboratorio.' Con 
el objeto de aislar el gene pac de K. citrophila, el DNA cromosomal de este organismo fue 
25 
digerido con la endonucleasa de restricción HindIII y ligado con el plásmido pGBS19s2 
previamente digerido, desfosforilado y purificado de un gel de agarosa 1%. En el Apéndice 
1 se incluye el artículo "Recovery of DNA from agarose gels stained with Methylen Blue", 
en donde se describe el protocolo empleado en la purificación del fragmento de DNA 
correspondiente al vehículo linearizado. El producto de esta reacción de ligasa, fue usado 
para transformar la cepa de E. coli 1-1B101 	pro'). La selección positiva de las donas 
portadoras del gene pac, estuvo basada en la propiedad de la enzima PA para hidrolizar 
diferentes compuestos que poseen un grupo fenilo, como la fenil-prolina y la fenil-glicina, 
de tal manera que la liberación del aminoácido de su correspondiente complejo, permitió 
complementar las auxotrofías de la cepa.»  
Dado que la forma activa de la enzima activa PA consta de las subunidades a y 13, y 
que se ha identificado que la especificidad de la enzima hacia grupos fenilo radica en la 
subunidad a,22 mientras que la subunidad 13 contiene un residuo de serina reactivo'', se 
pensó construir un primer conjunto de genes híbridos mediante el intercambio de estas 
subunidades. Para delimitar y manipular estas dos regiones estructuralmente relevantes, en 
las regiones de DNA que codifican para los péptidos conectores de las enzimas, se crearon 
mediante mutagénesis dirigida sitios de restricción de la endonucleasa Kpnl. Así mismo, en 
esta mutagénesis fueron creados los sitios de restricción EcoRI y HindlII para delimitar a 
los genes pac en sus extremos 5' y 3', respectivamente (Fig. 11). Las mutagénesis 
realizadas fueron efectuadas mediante un protocolo modificado al propuesto por Melson y 
Long,' mismas que son reportadas en el artículo "A general, PCR-based method for single 
or combinatorial oligonucleotide-directed mutagenesis on pUC/M13 vectors", incluido en el 
Apéndice 1. Los fragmentos resultantes de la mutagénesis por PCR fueron digeridos con las 
endunucleasa de restricción EcoRI-HindIII, y donados en el polilinker del plásmido 
pGBS19", dando origen a los plásmidos pPACEC y pPACKC (Fig. 12). A partir de estos 
plásmidos, y haciendo uso del sitio de restricción de 44 fueron purificados los 
fragmentos de DNA correspondientes a la subunidad a y 13 de los genes pac de E. coli y 
K. citrophila. Estos fragmentos adecuadamente combinados y ligados al plásmido pGBS19, 
dieron origen a los plásmidos paECBEC, paECBKC, pocKCI3KC y paKCBKC (Fig. 12), 
26 
360 780 
• 
420  	 840 
Figura 10. Alineamiento de las secuencias de las enzimas PA de E. coli y K. citrophila. 
En la figura se esquematiza el alineamiento mediante barras (aminoácidos diferentes en las 
proteinas alineadas) y espacios (aminoácidos idénticos en las dos proteinas). PS significa 
péptido señal, Alfa la subunidad ligera de PA, PC al péptido conector y Beta a la 
subunidad pesada del precursor de PA. 
27 
o 
480 
540 
600 
Beta 
660 
720 
PS 
240 	 
60 
120 
Alfa 
180 
PC 
300 
( EcoRI 
a' 	4 
A (co R 
HInd111 
imar-1 
mago 	
Eco R I 	  / 4 
	Xpn I 
	
frpn I 
	
4 
m=nop o 
o 
Hpnl 
Irpnl 
n d 111 
Figura 11. Estrategia de mutagénesis dirigida para la creación de sitios de restricción. 
En la figura a y 13 representan a la regiones del gene pac que codifican para las 
subunidades ligera y pesada de la enzima PA, respectivamente. EcoRI, KpnI y HindlIl 
representa a los oligonucleótidos usados en la reacción de amplificación con polimerisa 
termoestable (PCR). Estos oligonucleótidos introducen en el fragmento de DNA 
amplificado, los sitios de restricción empleados en la donación de genes híbridos. Las 
porciones vacías de los oligonucleótidos, representan regiones de DNA diferentes a las 
nativas, mientras que las obscuras representan regiones idénticas a las originales. 
28 
Eco R 
\mal- Eco R I 
=MEI 	 
+le" 
KpnI 
HindIII 
EC 
KpnI 
izEC 
EcoRI 
EcoRI 
Kpn1 
HindIU 
KpnI 
clKC 
EcoRI 
EcoRI 
Kpn I 
+ 
HindlII 
elial1~11~11151111+ 	 ElE~II=722Zai24 	 if2222ZUZ=1~~11~1> 
ceEcAEc 	 Jiu/51<c anne 
Lec Z 
EcoRI 
HindM 
DNA ligas 
HIndfE 
EcoRI 
SD 
—10 
—35 
Figura 12, Construcción de genes híbridos de pac. En la figura la flecha obscura 
representa al gene pae de E. coli, mientras que la flecha rayada al gene pac de K. 
citophila. La región correspondiente al péptido conector se representa por la región abierta 
de las flechas. 
29 
aKC/3 KC 
Como puede observarse en la Fig. 10, las proteínas PA de E. coli y K. citrophila, 
presentan una gran homología. Aún y cuando las diferencias de residuos entre estas dos 
proteínas están ubicados a lo largo de las mismas, pueden observarse regiones muy 
conservadas (i.e. residuos 280-380, 98% idénticos) y regiones menos conservadas (i.e. 
residuos 10-35, 40% idénticos, 556-606, 54% idénticos). Es interesante observar que una de 
las regiones menos conservadas comprende a la región del péptido señal y la parte amino 
de la subunidad a. El intercambio de lal péptido señal de PA por el de otras proteínas, 
permitirá elucidar si esta región de la proteina posee un papel en la regulación de la 
actividad de PA a través del transporte del su precursor. 
Es claro que la construcción de proteínas híbridas a partir del intercambio de dominios 
funcionales permitirá ampliar el horizonte de posibilidades dentro del área de Ingeniería de 
Proteínas. Actualmente los plásmidos con genes híbridos pac, descritos en esta sección, 
están siendo utilizados para determinar algunas de las propiedades cinéticas y de 
especificidad a substratos de las proteínas híbridas de PA, así corno el patrón de 
termoregulación de las mismas. 
111.3 Conclusiones particulares 
- La determinación de la actividad de PA, los estudios de fusión con el gene lacZ, y la 
cuantificación del mRNA del gene pac, han demostrado que, la regulación por represión 
catabólica así como la inducción por AFA del gene pac, son llevadas a cabo a nivel 
transcripcional. 
- El análisis estadístico de la región 5' de regulación del gene pac, indica que el 
promotor más probable en esta región corresponde al propuesto por Valle et al." 
La termoregulación de la actividad intracelular de PA que se efectúa post- 
transcripcionalmente. Esta termoregulación no es mediada por inactivación proteolítica a 
37 °C, o por procesamiento selectivo a 28 °C. 
30 
Capítulo IV.- Incremento de la la actividad de 
penicilino acilasa mediante técnicas de Ingeniería Genética 
IV.!. Introducción 
Como se mencionó en capítulos anteriores, la enzima PA es de gran importancia en la 
industria farmacéutica. Con el objeto de obtener una cepa sobreproductora de la actividad 
de PA, se han realizado una gran variedad de estudios que pueden ser primordialmente 
agrupados dentro de tres áreas: 
a) Ingeniería bioquímica. En ésta se encuentran los estudios tendientes a definir las 
condiciones de crecimiento óptimas para la obtención de cultivos con alta actividad de PA 
(fuente de carbono, temperatura, aereación, inductores de la actividad, etc.). La cepa de E. 
cola' ATCC11105 ha sido usada preferencialmente en procesos comerciales," siendo algunos 
de los parámetros utilizados comúnmente: temperatura de crecimiento entre 24 y 30 °C, 
concentración de oxígeno disuelto menor al 2%, inducción por adición de AFA en una 
concentración de 0.2% y una fuente de carbono diferente a glucosa." 
b) Genética clásica. En esta área se han utilizado técnicas de rnutagénesis generalizada 
con agentes químicos o físicos. Dentro de los primeros, los más utilizados han sido el 
MNNG y el EMS." Usando estos compuestos, y a partir de cepas que poseen una sola 
copia del gene pac en su cromosoma, se han obtenido organismos sobreproductores de la 
actividad de PA. En la Tabla IV se compilan algunos ejemplos de este tipo de estudio. Es 
importante mencionar que el incremento en la actividad de PA reportado en dicha Tabla, es 
un valor relativo a la actividad inicial de la cepa antes de mutagenizar, mismo que 
comúnmente no se especifica. Por tal motivo, es difícil evaluar la actividad final de PA de 
dichas mutantes y en consecuencia es conveniente tomar con reserva tales valores de 
incremento de actividad de PA. 
c) Ingeniería genética. La tecnología del rDNA ha hecho posible aislar al gene pac, 
clonarlo en plásmidos multicopia, determinar su secuencia nucleotídica, modificar sus 
señales de regulación, e incluso sustituirlas por las de otros genes. No obstante, las 
actividades obtenidas con estas modificaciones no han sido tan altas como las esperadas 
debido a factores como, inestabilidad del plásmido recombinante, saturación de los 
mecanismos de transporte y procesamiento del precursor. 
31 
La inestabilidad de plásmidos es un fenómeno comúnmente observado en sistemas de alta 
expresión:14' En particular para el caso de PA, Deretic e: al, han reportado que la 
inestabilidad estructural de plásmidos que portan al gene pac es muy alta.' En cuanto a los 
sistemas de transporte, se sabe que hay un número determinado de canales de secreción por 
organismo, y para el caso de E. coll se describen cerca de 20,000. Estos canales son 
compartidos con otros precursores distintos al de PA, por lo que puede existir competencia 
entre ellos por ser transportados en un sistema saturado". 
Existen pocos reportes en donde un esfuerzo conjunto en estas tres áreas haya sido 
aplicado en forma integral. 
Como se mencionó en el capítulo II, un factor importante en la producción de 6-APA, 
producto de la hidrólisis enzimática de PenG, es el empleo de biocatalizadores enzimáticos. 
En la actualidad, la mayoría de los biocatalizadores empleados en la producción de 6-APA, 
utilizan a la enzima PA parcialmente enriquecida e inmovilizada. El costo de este tipo de 
biocatalizadores es comúnmente muy elevado debido a que su elaboración involucra la 
purificación de la enzima, sin embargo, la actividad específica de este tipo de 
biocatalizadores es muy alta. En contraparte, en la literatura existen pocos reportes de 
biocatalizadores de células inmovilizadas. Su empleo podría ser de gran importancia dado 
su bajo costo. López-Munguía et al.," han evaluado el costo de producción de 6-APA en 
términos de la actividad específica del biocatalizador y del número de veces que este puede 
ser reusado. Del análisis realizado en este estudio, es posible concluir que para elaborar un 
biocatalizador de células inmovilizadas, es requisito contar con cepas que presenten muy 
alta actividad específica de PA, mismas que podrían ser obtenidas mediante técnicas de 
Ingeniería Genética. 
32 
Cepa original 	Cepa mutagenizada Agente 
mutagénico 
o vector 
Incremento 
en la activ. 
de PA 
Mutante 
resultante 
Ref. 
som.1 
E. co1i9637 	E. colé cepa5 Nutricional 120.0 Constitutivo 77 
E. co119637 E. colé M-1 ND' 7.0 ND 16 
tnegaierhn1494B. megaterhunKFCC UV 4.0 Constitutivo 79 
E. coli 	E. coli MNNG 2.2 Inducible 42 
E. co/i1F013500 	E. coliAS2 MNNG 6.0 Inducible 56 
B. spaericus B. subtilis pOI-1 38 1.7 Constitutivo 30 
E. colé 	E. coliKFCC-84-3 ND 2.0 Constitutivo 17 
K. citophila21285 E. colé ND 30.0 ND 29 
13. megaterhun 	B. megaterium pPL608 1.2 ND 48, 49 
E. co11194 E. colipMLV7 pACY184 10.6 Constitutivo 96 
E. coli11105 	E. coli5K/pHM6 pBR322 4.6 Constitutivo 46, 81 
E. coli5K/pHM6 E. colé UV 1.8 Constitutivo 46, 81 
P. rettgeri31052 	P. rettgeriCYC1 Nutricional 150.0 Constitutivo 23, 24 
P. rettgeriCYC1 E. colLIW358 pACYC184 1.0 Constitutivo 23, 24 
Tabla IV. Cepas obtenidas por mutagénesis y recombinación genética para la 
sobreproducción de la actividad de PA." 
Información no disponible. 
IV.2. Resultados y Discusión 
IV.2.1. Construcción de vehículos moleculares para la sobre-expresión del gene pac. 
Uno de los primeros requisitos para obtener una cepa con alta actividad de PA, es de 
que en ella exista una considerable tasa de biosíntesis del precursor de PA. La donación 
del gene pac en plásmidos multicopia, es sin duda una de las formas más directas para 
lograrlo. En nuestro laboratorio se ha aislado un fragmento cromosoma) de 
aproximadamente 7.5 Kb que contiene el gene pac de E. coli, así como sus regiones de 
control 5' y 3'.65 Este fragmento fue donado en el plásmido pBR339 dando origen al 
plásmido pPA2. La expresión del gene pac en esta primera construcción, esta regulada por 
el control de las señales nativas de regulación, por lo que se está sujeto a represión 
catabólica e inducción por AFA. Debido a lo anterior, para lograr una máxima inducción 
del gene pac usando este plásmido, es necesario crecer al organismo transformado en un 
medio de cultivo con fuentes pobres de carbono y altas concentraciones de AFA, que como 
se mencionó anteriormente, es un inhibidor del crecimiento celular. Estos dos requisitos son 
33 
un impedimento para obtener biomasas altas durante la fermentación, y por tanto se reduce 
considerablemente el rendimiento del proceso. Con el objeto de contender con este 
problema, fue construido el plásmido pPA101 a partir de la subclonación del gene pac en 
el polilinker del plásmido pGBS19" (Fig. 13). En este plásmido, la transcripción del gene 
pac se encuentra bajo el control del promotor del gene lacZ y puede ser inducido si se 
utiliza lactosa como fuente de carbono o bien con el inductor gratuito 
isopropil-tiogalactopiranósido (IPTG), Debido a que en la construcción anterior, la región 
amino terminal del gene lacZ quedó en la misma fase de traducción del gene pac, el sitio 
de restricción HindlII, ubicado entre estos dos genes, fue digerido, polimerizado y ligado 
sobre sí mismo. Estas modificaciones adicionan cuatro pares de bases que evitan la 
formación del producto de fusión (Fig. 14), El plásmido que tiene estas modificaciones fue 
designado como pPA102 (Fig. 13), 
IV.2.2. Estudio del proceso fermentativo de cepas con actividad de PA. 
Con el objeto de caracterizar el sistema de sobre-expresión basado en el plásmido 
pPA102, este plásmido fue transformado en las cepa de E. col! JM101. Las células así 
transformadas fueron crecidas en fermentador de 2 lt a 28 °C, en un medio Bauer" 
modificado, que contenía: KFI2PO4 3%, Na2HPO4 3%, MgSO4 3%, (NH4. 14--- -4 HP0 17%. El -
fermentador fue inoculado con 10% (v/v) de un cultivo crecido en condiciones similares a 
las antes mencionadas. El pH de la fermentación se mantuvo constante mediante la adición 
de NaOH. Las condiciones de aereación permitieron mantener al cultivo a una 
concentración de oxigeno disuelto superior al 15%. La presión de selección de células con 
plásmido se realizó mediante la adición de Kanamicina (Km), en una concentración de 
3511M. La velocidad específica de crecimiento II, fue pre-seleccionada a un valor de 0.2, y 
fue modulada por limitación de fuente de carbono. Esta se adicionó de una solución 
alimentadora que contenía glucosa 40% y extracto de levadura 3%, en base al rendimiento 
de la cepa para convertir glucosa en biomasa, y tomando en cuenta las siguientes 
relaciones: 
Ln(BiomasamAjBiomasamcm) = u. 8t, por lo que: BiomasaFINAL = BiomasknefAL ( e 
34 
Figura 13. Construcción de vehículos moleculares para la sobre-expresión del gene pac. 
El plásmido pPA101 fue construido al donar el fragmento HindIll-Smal del plásmido 
pPA2" en los correspondientes sitios del polilinker del plásmido pGBS19". Con el objeto 
de evitar la fusión traduccional entre la región amino de LacZ y PA, el sitio !finen 
presente en el plásmido pPA101 fue digerido, polimerizado y ligado, dando origen al 
plásmido pPA1O2. En este plásmido, .1a transcripción del gene pac se encuentra bajo el 
control del promotor del gene lacZ. 
35 
Sala' 
Loe z 	EcoRI 
SmaI 
Hindla 
SD 
-35 
Poc 
SD 
-35 10•
¡nal 
Hindi + Sma 	 Hincillt+Smai 
PA 
SmaI 
Loc z 
SD 
¥
-35 
-10 1 
pLA CZ 
Pac 
HindiU 
DNA polirnerosa 
DNA.ligaso 
rSmOI 
SDpac 
Locz 
SD Luc z 
El inductor IPTG se agregó al inicio de la fermentación en una concentración de 
100 µM/ml. Las células fueron cosechadas en fase logarítmica tardía, y posteriormente se 
analizaron los siguientes elementos: 
a) La actividad de PA, se determinó usando el método de Balasingham et al.,3 descrito 
en el capítulo III, en donde una unidad de actividad de PA se define como la cantidad de 
enzima necesaria para formar 1 !Imola de 6-APA por minuto a 37 °C. El valor de 
actividad específica de PA presentó una variación de aproximadamente un 20% entre cada 
fermentación, y un valor promedio de 0,25. 
b) El análisis de proteínas totales se realizó mediante la electroforesis en geles de 
poliacrilamida al 15%. Este reveló que en las células del cultivo existía una gran 
acumulación del precursor de PA no procesado equivalente a más del 10% de la proteína 
celular total (Fig. 15), 
c) La estabilidad de plásmido se verificó mediante el análisis de "cuentas viables y por 
cuantificación directa del "número de plásmidos promedio'''. Ambos resultados demostraron 
que la pérdida de plásmido al final de la fermentación fue de aproximadamente un 15%. 
d) La biomasa obtenida al final de la fermentación resultó ser de aproximadamente 
10 gr/It peso seco. 
IV.2.2.1. Efecto de la concentración y tiempo de adición del inductor del sistema, 
IPTG, en la actividad de PA. 
El análisis de proteínas totales de las fermentaciones anteriores, reveló que gran parte de 
la enzima PA se acumulaba en forma de precursor, y que por lo tanto los pasos limitantes 
para la sobre-producción de la enzima activa consistían principalmente en el transporte y/o 
el procesamiento del precursor. 
Dado que la biosíntesis del precursor de PA en estas fermentaciones era mayor al que 
podría procesarse, y tomando en cuenta de que tales cantidades de precursor podrían tener 
un efecto negativo, en términos de costo energético celular y saturación de los puntos de 
transporte a periplasrna,"." se decidió determinar la concentración óptima del inductor para 
obtener una mayor actividad de PA. Para ello se realizó una fermentación en condiciones 
similares a las anteriormente descritas, en donde el inductor IPTG fue adicionado a la 
solución de glucosa y extracto de levadura, de tal manera que la cinética de adición del 
inductor al fermentador fue de tipo exponencial, tal y como se muestra en la Fig. 16. 
36 
—35 —10 
	
D 
La concentración del inductor a la cual se encontró la máxima actividad de PA 
correspondió a 15-2511154/m1, Es interesante observar que a diferencia de muchos sistemas 
de sobre-expresión, la condiciones óptimas para una mayor síntesis de la enzima activa, 
pueden diferir de las condiciones para obtener la mayor actividad del sistema. 
"; 
a) Plásmido pPA1O1 
Hindlii 	 SDpacr 
METThrbistileThrProSerPheileAlaMetileAseSerLeuIlellelliaLeuProTyrAspThr T 
••• 3 .10, S D 	ATGaccatgattacgccaagottcgttgetagtatcaattcgotaattatacacetgccagaggatacdATGI 
TACtggtaataatgeggttagaageaacgatcatagttaagegattaatatgtggacggtetectatgtTAC: 
b) Plásmido pPA102 
Mei 	 SDpac 
METThrmatileThrProser 
I 
ATGaccuttgattacgacaagoTA.GcttegttgctagtatoaattegctaattatacaoctgocagaggatactaATG 
TACtggtaataatgeggttcgATCgaagcaacgatcatagttaagegattaatatgtggaeggtctactatgtTAC 
Codón de 
término 
Figura 14. Regiones de regulación involucradas en la expresión del gene pac en los 
plásmidos pPA101 y pPA102. (a) Fusión entre la región 3' del gene lacZ y la región de 
control 5' del gene pac. Debido a que estas dos regiones de DNA quedaron en la misma 
fase de traducción, el producto peptídico proveniente de ellas carece de actividad biológica. 
Para evitar esta fusión, el sitio de HindIII ubicado entre estos dos genes (marcado con 
letras obscuras), fue digerido, polimerizado y ligado. (b) En el plásmido pPA102 estas 
modificaciones adicionan cuatro pares de bases con las que se origina un movimiento entre 
los de los marcos de lectura de estos dos genes. Aunado a lo anterior, con estas 
modificaciones se creó un sitio de restricción para la enzima Nhel, que permitió confirmar 
que dichos cambios fueron producidos correctamente (marcado con letras obscuras). El 
• 
codón de término TAG, generado con las anteriores modificaciones, se indica con letras 
mayúsculas. También se muestra el sitio de reconocimiento por el ribosoma, SD pac, así . 
como el codón de inicio de la traducción (ATG) del gene pac, 
37 
.111~44.. 01101111~1. 
••• 
1 3 5 6 
4.• 
• '"'" 	db.. • I 
4.5k3 	.;2.4 '04 
WilánlMonliMs~ 
egoo~' 80 000 
67 000 
. • 	'; .5.19  
1J I 
, 
43 
30 
000 
000 
-15 000 
Figura 15. Análisis de proteínas de células sobreproductoras de la actividad de PA. En 
la figura se muestra el patrón electroforético de geles de acrilamida 15%, de las proteínas 
totales de las cepas de E. coli: 1: JM101, 2: JM101+IPTG, 3: JM101[pGBS19], 4: 
JM101[pGBS19]+LPTG, 5: .1M101[pPA102], 6:JM101[pPA102H-LPTG. El carril de la 
extrema derecha son marcadores de peso molecular. 
Una vez determinada la concentración óptima del IPTG, se realizaron 	diferentes 
fermentaciones utilizando las condiciones anteriormente descritas, a excepción de que la 
concentración del inductor que fue de 25111\4/ml. En cada una de ellas, el inductor fue 
adicionado en diferente tiempo. Los perfiles de actividad de PA y crecimiento de estas 
cepas, se muestran en la Fig. 17. 
Como puede observarse en esta figura, la condición de máxima actividad corresponde a 
tiempos de inducción temprana. En este sentido el sistema de sobre-expresión de actividad 
de PA, difiere de los sistemas comúnmente empleados, en donde la inducción se efectúa 
una vez que en el cultivo ha llegado a obtener una alta biomasa. 
38 
0,4 80 
60 
-40 
0,1 
T 
20 
	
30 
- 20 
o 
40 
—o— Aci, Fsp. 
IPT G 
0,0 -1 	 
o 
0,3 - 
0,2 
E 
0 
o. 
Tiempo 
Figura 16. Efecto de la concentración de inductor en la actividad de PA. La cepa de E. 
coli JM101 fue transformada con el plásmido pPA102 y crecida a 28 °C en medio Bauer 
modificado. La cinética de adición del inductor 1PTG al medio, fue de tipo exponencial. El 
la figura se muestra la concentración final del mismo a lo largo de la fermentación. 
Los resultados mostrados en esta sección, son acordes a los obtenidos por Panbangred et 
en donde se demuestra que la actividad máxima de PA es obtenida al inducir su 
sistema de expresión bajo la regulación del promotor tac, en densidades de cultivo bajas. 
39 
30 
o 
o. 20 
o 
10 
	
0,3 	30 
o. 
vo u) 
0.2 	d20 
4 o 
,t 	10 
0,0 
10 	20 	30 	40 
Tiempo (Hrs) 
10 	20 	30 
Tiempo (Hrs) 
40 
0,4 	C)4o 
0,3 	30 
a 
ID 
0,2.: 	20 
d 
u O 
0,1 	10 
0,0 . 	 0,0 
10 	20 	30 40 
Tiempo (Hrs) 
IV.2.2.3. Efecto del fondo genético en la actividad de PA. 
Es importante considerar que el genotipo de la cepa de E. coli ATCC1105, de donde se 
aisló al gene pac, es muy diferente al de las cepas de E, coli K-12, comúnmente usadas en 
el laboratorio, y en particular a la cepa JM101 empleada para realizar los experimentos de 
fermentación.° Aunado a lo anterior, es necesario mencionar que los resultados de los 
experimentos de tipo Southern presentados en el capítulo III, demuestran que diversas cepas 
de E. coli, entre ellas la cepa JM101, carecen de la región del DNA croinosomal que 
contiene al gene pac. Debido a lo anterior, se pensó que pudieran existir elementos 
específicos en la cepa de E. con ATCC1105, que favorecieran el transporte y/o el 
procesamiento del precursor de PA. Por estas razones, la cepa de E, coli ATCC1105 fue 
transformada con el plásmido pPA102, y crecida en fermentador bajo las condiciones 
empleadas con la cepa JM1O[pPA102]. El perfil de actividad de PA y crecimiento celular 
obtenido en este estudio, es el que se muestra en la Fig. 18. 
Figura 17. Efecto del tiempo de inducción en la actividad de PA. La cepa de E. coli 
JM101 fue transformada con el plásmido pPA1O2 y crecida a 28 °C en medio Bauer 
modificado. La concentración final del inductor IPTG en el medio fue de 2511M/ml. Este 
fue adicionado en una etapa temprana (a), intermedia (b) o tardía (c), del crecimiento del 
cultivo celular, 	D.0.560 
Act. Esp. 
40 
30 0,14 
u 
- 0,08 < 
ci 
10 
+IPTG 
	 D.O. 560 
—e 	 MI Esp. 
- 0,12 
20 
- 0,10 	d.  
- 0,06 
0,04 
o 
r 
100 	20 	30 	40 	 60 
Tiempo (Hrs) 
Figura 18. Efecto del fondo genético en la actividad de PA, La cepa de E. coli 
ATCC11105 fue transformada con el plásmido pPA102 y crecida a 28 °C en medio Bauer 
modificado. El inductor IPTG fue adicionado en una etapa temprana de la fermentación en 
una concentración final de 25µM/ml, 
Como puede observarse en la Fig. 18, la actividad de PA disminuye significativamente a 
partir de la hora 26. Las determinaciones de Cuentas viables y Número de copias de 
plásmidos en las células del cultivo, indicaron que no existía una pérdida considerable de 
plásmidos en la población celular. Cabe mencionar que, pese a que el número de colonias 
resistentes al antibiótico permanecía constante a lo largo de la fermentación, a partir de la 
hora 14 y en proporción directa a la pérdida de actividad de PA, se observó que dentro de 
las colonias estriadas, una población de las mismas presentaba un fenotipo diferente. Este 
nuevo tipo de colonias no presentó actividad de PA. Los patrones de digestión del 
plásmido aislado de estas células fue diferente al obtenido del plásmido original pPA102. 
Estos resultados permiten explicar la pérdida de actividad de PA por inestabilidad 
estructural del plásmido en la cepa de E. coli ATCC1105. Posiblemente tal diferencia de 
estabilidad en las dos cepas estudiadas sea debida al locus recA presente solo en la cepa 
ATCC11105. El producto peptídico 2de este locus esta involucrado en el proceso de 
recombinación y posiblemente favoreció rearreglos en el pásmido pPA102 durante el 
proceso fermentativo. 
41 
50 
IV.3. Conclusiones particulares 
- Se desarrolló un proceso para la obtención de cepas de E. coli sobreproductoras de la 
actividad de PA basado en células transformadas con plásmidos que tienen al gene pac 
bajo el promotor de lacZ. 
- La máxima actividad de PA obtenida en el proceso fermentativo correspondió a 
cultivos inducidos en una etapa temprana de la fermentación con una concentración final 
del inductor IPTG de 15-2511114/ml. 
- Las modificaciones realizadas para sustituir a las señales nativas de regulación del gene 
pac, por las del gene lacZ, permitió obtener un sistema de expresión cuya inducción es 
independiente del AFA, que es un inhibidor del crecimiento celular. La biomasa obtenida al 
final del proceso desarrollado en esta Tesis, es aproximadamente tres veses mayor a la 
obtenida con el primer sistema de espresión. 
- La actividad específica del sistema fue en promedio de 0.25 y la producción 
volumétrica lograda de 1,250 Unt. De acuerdo al modelo de factibilidad económica de 
López-Munguía et al.,» y considerando la misma estabilidad a la antes obtenida, será 
necesario triplicar la actividad específica de PA en el proceso obtenido, a fin de poder 
elaborar un biocatalizador con células inmovilizadas. 
- La síntesis del precursor de PA obtenida en el sistema de expresión desarrollado, 
equivale a más del 10% de la proteína celular total, 
- Pese a la alta síntesis del precursor, el incremento de la actividad celular de PA no fue 
el esperado. El transporte y/o el procesamiento del precursor de PA constituyen los 
elementos limitantes para el incremento de la actividad de PA en el proceso fermentativo. 
42 
43 
PrIV 01,71 t7. 
tl 
Capítulo V. Posible papel de la enzima penicilino acilasa 
en la Naturaleza 
V.1. Introducción 
V.I.1. Distribución, propiedades y mecanismo de acción de la enzima PA. 
La actividad de PA está presente en una amplia variedad de microorganismos, tales como 
bacterias (gram positivas y negativas), hongos y levaduras. Ejemplo de microorganismos 
con esta actividad son entre otros: Kluyvera citrophila, Streptomyces levandulae, Proteus 
rettgeri, Actinoplanes sp., Fusarim sp., Bovista plumbea, Pseudomonas melanogenum, 
Mycoplana, Poraminobacter, Aeromonas, Xantomonas y Acetobacter. 
Las enzimas penicilino acilasas se dividen en tres tipos, de acuerdo a la especificidad de 
sus substratos y a su fuente de origen: 
Tipo I. Son todas aquellas enzimas de hongos y de bacterias que hidrolizan 
preferencialmente la PenV (fenoximetilpenicilina). 
Tipo II. Son enzimas básicamente encontradas en bacterias, y están caracterizadas por su 
alta especificidad por la PenG (benzilpenicilina). 
Tipo IR Son específicas para hidrolizar ampicilina (D-aminobenzilpenicilina) y 
cefalosporina, como la que poseen Pseudomonas melanogetum y K. citrophila. 
En general las acilasas de tipo II son inhibidas por los productos de la hidrólisis de la 
PenG, el AFA actúa como un inhibidor competitivo y el 6-APA que inhibe de un modo no 
competitivo. 
La enzima PA de E. coli (tipo II), es una de la enzimas más ampliamente usadas en la 
producción de penicilinas semisintéticas. El 6-APA puede obtenerse también usando PenV, 
substrato de las PA tipo 
El mecanismo de acción de la enzima PA es semejante al de las enzimas serin-proteasas. 
Se ha propuesto que la hidrólisis de PenG por la enzima PA se realiza a través de un 
intermediario acil-enzima de tal manera que, el grupo acilo donador (Le. AFA, o un 
derivado de él) reacciona con la enzima para formar un intermediario que en cambio, 
transfiere el radical acilo a una amina (Le. 6-APA), agua o alcohol?' 
La enzima no es específica para penicilinas, ya que también hidroliza ciertas 
cefalosporinas de tipo N y C, aminoácidos, amidas y ésteres. Su especificidad reside en la 
estructura del grupo acilo y ésto la hace diferente de otras enzimas (como las peptidasas), 
de tal manera que incluso algunos substratos pueden ser hidrolizados más rápidamente que 
la PenG, tales como: fenilacetamida (110%), N-fenilacetilglicina (182%) y 
N-fenilacetil-l-alfa aminofenilacético (139%). Un ejemplo de los valores de la constante Km 
para ciertos substratos hidrolizados por la enzima PA, son los mostrados en la Tabla V. 
V.1.2. Vía de utilización del ácido fenilacético en Pseudomonas y E. culi. 
La mayor parte de la información sobre la degradación biológica de compuestos 
aromáticos proviene de estudios en Pseudomonas. Estos organismos son capaces de 
metabolizar una amplia gama de compuestos aromáticos'. No obstante, existen pocos 
estudios sobre la capacidad de E. coli para crecer en compuestos fenilados. Burlingame y 
Chapman' han demostrado que E. coli es capaz de metabolizar, en forma muy específica, 
ciertos compuestos aromáticos y utilizarlos como fuente de carbono. Algunos de los 
resultados de dichos autores se presentan en la Tabla VI. 
Substrato 	 Km (M) 
Bencilpenicilina (PenG) 	 4.6 . 10' 
Acido 7-aminodesacetoxicefalosporanico 	1.0 , 10' 
Cefalotina 	 4.2 . 10' 
Etil-fenilacetato 	 4.5 . 10' 
p-nitrofenil-fenilacetato 	 3.1 . 104  
Fenilacetato p-nitroanilida 9.7 . 10' 
Fenilacetilglicina 	 8.0 . 10' 
Ce faloridina 	 LO . 
Ampicilina 5.2 . 10' 
Acido Bencilpeniciloico 	 2.0 . 10' 
Cefalexina 	 2.1 10' 
Acido D-(-)-a-arninofenilacetico p-nitroanilida 	3.2 . 
Tabla V. Perfil de especificidad de la enzima PA de E. coli. Los valores de Km fueron 
calculados a pH 7.5 a 25 OC"` 
44 
Cepa de 	No. de 	Acidos aromáticos utilizados para crecer 
E. coli casos AFA 3-1IFA 4-F FA 	3-FP 3-31-1FP 3-1-1C 
B 	1 	 + 	+ 	+ 	+ 	+ 
C 1 - 	+ + + + + 
W 2 + + + + + + 
K-12 	2 	+ 	- 	- 	+ 	+ 	+ 
NCTC5928 1 + - + + + 
	
Aislados 19 	- 	- 	 - 
clínicos 	5 + - - 
2 	- 	- 	- 	- 
8 - .. - + 	+ 	+ 
1 	- 	+ 	+ 	- 
2 + + + - 
3 	+ 	_ 	_ 
27 + + + 	+ 	+ 
Tabla VI. Crecimiento de E. coli en compuestos fenilados. + Se observó crecimiento. 
- No se observó crecimiento. AFA: ácido fenilacético. 	3-hidoxifenilacético. 
4-11FA: 4-hidroxifenilacético. 3-FP: 3-fenilpropiónico. 3-3 FIFP: 3,3-hidroxifenilpropiónico. 
ácido-3-hidroxicinámico13 . 
Es interesante comentar que en E. coli y Pseudomonas, las vías para la utilización del 
fenil-propiónico, 3-hidroxifenilacético y 4-hidroxifenilacético, están muy conservadas, y por 
el número de elementos que involucran, son de las vías más complejas descritas en E, 
coli.' 
Independientemente de la vía para la utilización del fenil-propiónico, algunas cepas de E. 
coli y Pseudornonas cuentan con la vía para la asimilación del fenilacético. Esta vía ha 
sido mapeada cerca del, minuto 30 del cromosoma de E, coli K-12.'9 Se ha descrito que en 
esta región del cromosoma se localizan un gran número de genes dispensables para el 
crecimiento en el laboratorio del organismo, de tal manera que pareciera ser una región 
silenciosa desde el punto de vista de identificación de mutantes, y por tanto ha sido difícil 
su caracterización.' Hasta el momento solo se sabe que esta vía es inducible por AFA y 
que existe una proteína encargada del transporte del mismo. 
45 
V.2. Resultados y Discusión 
IV.2.1. Crecimiento de cepas de E. coli en presencia de compuestos fenilados. 
Con base en los resultados de crecimiento de E. coli en compuestos fenilados presentados 
en la Tabla VI, y tomando en cuenta los obtenidos del experimento de "Southern" 
mostrado en el capítulo III, queda claro que existen cepas de E. colé capaces de crecer 
usando AFA como fuente de carbono, pero que carecen del gene pac. En la Tabla antes 
mencionada, se considera exclusivamente si ciertas cepas de E. coli son (+) o no (-) 
capaces de crecer a expensas de estos compuestos. Con el objeto de observar diferencias 
cuantitativas en este crecimiento, las cepas de E. colé ATCC11105, HB101, JM101 y 
W3110, fueron crecidas a 28 °C, en medio NN suplementado con AFA 0.1%, corno única 
fuente de carbono (Fig. 19a). Es interesante observar que la cepa que presentó un mayor 
crecimiento (ATCC11105), es la única que posee al gene pac. No obstante, esta diferencia 
de crecimiento no está asociada directamente a la actividad de PA, ya que se obtienen 
patrones de crecimiento similares cuando estas cepas son transformadas con el plásmido 
pMG25 (pac+) (Fig. 19b). Estos resultados están de acuerdo a los obtenidos en el análisis 
de la regulación del gene pac, y soportan la idea de que este gene pudiera pertenecer a un 
regulón involucrado en la utilización de compuestos aromáticos. 
IV.2.2. Posible papel fisiológico de la enzima PA. 
Una de los puntos más importantes del presente proyecto, ha sido el tratar de 
comprender la función de esta enzima en el organismo. Dado que la enzima PA no 
confiere resistencia a PenG, queda claro que su función difiere al de las enzimas 13-
lactamasas, de tal manera que los diferentes nombres que se le da a esta enzima: penicilino 
acilasa, penicilino amidasa, penicilino amidohidrolasa, etc., solo reflejan el interés del 
investigador por su aplicación.» Por otro lado, con base a las propiedades cinéticas de esta 
enzima, su perfil de especificidad por substrato, anteriormente citado," y considerando el 
patrón de regulación por fuente de carbono, en el artículo "The role of penicillin amidases 
in Nature and in industry" (Anexo I), se propone que un posible papel fisiológico de la 
enzima PA, es el de liberar el grupo fenilo de ciertos compuestos fenilados no 
metabolizables, para que una vez separado, éste sea utilizado como fuente de carbono. 
46 
200 
• U
n
id
a
d
e
s
  
M
e
t  
300 	 300 
—a-- ATCC 
1113101 
JM101 
—o-- W3110 
U
n
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a
d
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s
  
M
e
t  
100 
"MI .1 .11i 	 iTi i 	; 	trrrrTTT 
on11fJWN.WM0*-NO~ONWM0.--NM.1WMONMMW  
ATCC/pPA25 
HB101/pPA25 
JM101/pPA25 
W3110/pPA25 
T1'171'1'4'1'1' TrPT 	1'1'1'1 I 1 1 	1 	1 I 	r 
0.4.OWNWOC.-NMIIWWN.W 010,-.NOn1 WMON T~M 
...... NNNNNNNMOMMO 
Con el propósito de verificar la hipótesis anterior, y considerando que la actividad de PA 
se presenta comúnmente en organismos con actividad de B-lactamasa,' se decidió examinar 
si una cepa de E. coli con estas dos actividades, es capaz de crecer utilizando a la PenG 
como fuente de carbono. Para ello, la cepa de E. coli HB101 fue transformada con el 
plásinido pMMB222 (B-lactamasa+), o simultaneamente con los plásmidos pMMB22 y 
pPA2565 (pac+). Posteriormente, estas cepas fueron crecidas a 28 °C en medio mínimo NN 
complementado con casaminoácidos 0.02% y PenG 0.05%, como únicas fuentes de carbono 
y energía. Las curvas de crecimiento obtenidas de este experimento, se muestran en la 
Fig. 20. Como puede observarse en dicha figura, el crecimiento de la cepa transformada 
con el gene pac, es al menos del doble con respecto de la que no la tiene, lo cual 
constituye una evidencia en favor de la hipótesis anteriormente planteada. En el artículo 
"Carbon regulation and the role in Nature of the Escherichia coli penicillin acylase (pac) 
gene", se analiza de manera más detallada los resultados aquí mostrados (Apéndice 1). 
a) b) 
Tiempo (Hm) 
	
Tiempo (Hrs) 
Figura 19. Crecimiento de E. Mi empleando AFA como fuente de carbono. a) Las 
cepas de E. coli ATCC11105, HB101, JM101 y W3110, fueron crecidas a 28 °C, en medio 
NN suplementado con AFA 0.1%, como única fuente de carbono. b) Las cepas de E. coli 
ATCC11105[pPA25], HB101pPA25}, JM101[pPA25] y W3110[pPA25], crecidas en las 
mismas condiciones del inciso a. 
47 
O 10 20 
0.2 
o 
LO 
co 
0.1 
»1101 (pMMB22) 
	-C3 
1 
0.3 
JM101(pMMB22, pPA25) 
  
30 
Figura 20. Crecimiento de cepas de E. coli empleando PenG corno fuente de carbono. 
Las cepa de E. coli HB101[pMMB22] (13-lactamasa+) y HB101[pMMB22,pPA25] (13- 
lactamasa+, paeg son crecidas a 28 °C en medio mínimo NN, casaminoácidos 0.02% y 
PenG 0.05% como únicas fuentes de carbono y energía. 
V.3. Conclusiones 
La actividad de PA puede conferir a cepas de E. coli la capacidad de crecer empleando a 
la PenG como fuente de carbono y energía. En base a este resultado y a los obtenidos en 
el estudio de regulación de la actividad de PA, y considerandando las propiedades cinéticas 
y el perfil de especificidad de la enzima PA, se propone que un posible papel fisiológico 
de esta enzima, es el de liberar el' grupo fenilo de ciertos compuestos fenilados no 
metabolizables, para que una vez separado, éste sea utilizado corno fuente de carbono. 
48 
Capítulo VI.- Conclusiones generales y perspectivas 
Dada la importancia que presenta la enzima penicilino acilasa, tanto en el campo básico, 
como en el tecnológico, en la presente Tesis se ha tratando de integrar y generar 
conocimiento relativo a esta enzima utilizando diferentes elementos metodológicos y 
conceptuales, con un enfoque multidiciplinario. 
La determinación de la actividad de PA, los estudios de fusión con el gene lacZ, y la 
cuantificación del mRNA del gene pac, han demostrado que, la regulación por represión 
catabólica así como la inducción por AFA del gene pac, son llevadas a cabo a nivel 
transcripcional. Estos resultados son acordes a los elementos de regulación anteriormente 
propuestos por nuestro grupo", y junto con el resultado del análisis estadístico empleado en 
la determinación de posibles promotores'', constituyen una evidencia en favor del promotor 
originalmente propuesto por Valle et al.," como el más pausible. 
De manera diferente, la termoregulación de la actividad intracelular de PA se ha 
demostrado que se efectúa a nivel post-transcripcional aunque aún se desconoce el 
mecanismo molecular de tal regulación. Los resultados aquí presentados indican que es 
poco probable que esta termoregulación sea mediada por inactivación proteolítica a 37 °C, 
o por procesamiento selectivo a 28 °C. Será necesario identificar el evento molecular que 
determina tal regulación. Mediante experimentos de tipo Western", podría ser identificada 
la forma (precursor no procesado o subunidades independientes) y la ubicación 
(periplásmico o citoplásmico) de la enzima PA de células crecidas a diferentes 
temperaturas. Estos resultados serían clave en la caracterización de este novedoso sistema 
de regulación. 
Como se ha mencionado anteriormente, aún no se han identificado la(s) proteasa(s) 
involucradas en el proceso de maduración del precursor de PA. Dado que estas proteasas 
aparentemente están involucradas en el procesamiento de otras proteínas, sería interesante 
estudiar la relación que pudiera existir entre estas enzimas y la enzima PA. La obtención 
de mutantes deficientes en el procesamiento del precursor de PA, podría conseguirse 
mediante mutagénesis química generalizada en cepas transformadas con el gene pac en 
multicopia, de tal manera que se pueda evitar que la perdida de actividad de PA de dichas 
mutantes sea por inactivación directa del gene pac, 
49 
Por otro lado, y con el objetivo de sobreproducir la actividad de PA, se construyeron 
cepas de E, coli en las que se logró un sistema de expresión basado en células 
transformadas con plásmidos que tienen al gene pac bajo el promotor de lacZ. Las 
modificaciones introducidas en la región 5' de control del gene pac, permiten que el 
sistema de expresión sea inducido sin la necesidad del empleo del AFA, que es un 
inhibidor del crecimiento celular. Por este motivo, la biomasa obtenida al final del cultivo 
inducido con IPTG resultó ser aproximadamente tres veces mayor a la obtenida empleando 
AFA como inductor. 
Aunado a este incremento en la biomasa, el sistema desarrollado permitió obtener una 
actividad específica de PA 0.25 y una productividad volumétrica de 1,250 U/It. Aún y 
cuando estos valores son superiores a los obtenidos anteriormente, está claro que sería 
necesario incrementar estos valores en cuando menos tres veces, a fin de poder elaborar de 
manera rentable, un biocatalizador de células inmovilizadas. 
El análisis electroforético de proteínas de las cepas transformadas, demostró que en el 
cultivo inducido con IPTG, el precursor de PA constituye más del 10% de la proteína 
celular, y que los pasos limitantes para la sobre-expresión de la actividad de PA, son el 
transporte y/o el procesamiento del precursor de PA. Aún y cuando el precursor de PA no 
procesado no incide en la actividad final de PA del sistema fermentativo actual, éste 
es suceptible de ser convertido en su forma activa mediante futuras implementaciones al 
sistema de expresión desarrollado. Dichas implementaciones podrían estar basadas en los 
siguientes enfoques metodológicos: 
a) En los estudios de sobre-expresión de la actividad de PA, las únicas cepas de E, coli 
usadas como hospederas del plásmido pPA102, fueron la cepas ATCC111O5 y JM101. La 
búsqueda de nuevas cepas de E. coli que pudieran servir como receptoras de este plásmido 
para el proceso fermentativo, sería una forma sencilla y probablemente eficaz para obtener 
un mejor sistema de expresión. 
b) Como una extensión de la propuesta anterior, podrían ser empleados otros organismos 
como hospederos del plásmido pPA1O2 (o derivados del mismo). En particular• sería 
importante utilizar para tal fin a organismos que presentan un eficiente sistema de 
procesamiento, como son los casos de Bacillus, Streptomyces o Aspergillus. 
50 
c) En dado caso que los estudios de regulación demostraran que el transporte del 
precursor de PA sea un paso limitante en la sobre-expresión de la actividad de PA, sería 
conveniente realizar, mediante técnicas de Ingeniería Genética, el intercambio del péptido 
señal de la enzima PA, por el de otras proteínas cuyo transporte sea muy eficiente, como 
lo es el de la porina OmpA. Este enfoque ha sido empleado exitosamente para secretar 
otras proteínas como la interleucina 1f3 y las enzimas B-lactamasa y subtilisina.84 
d) Paralelamente a lo mencionado, se ha descrito que las enzimas chaperonas SecB y 
GroEL, ayudan a mantener la conformación de diversos precursores en un estado 
conformacional compatible con su transiocación a txavéz de la membrana." Posiblemente la 
sobre-expresión conjunta de estas chaperonas junto con la de laenxima PA pudiera redituar 
en una mayor actividad de PA. 
Finalmente, en lo que se refiere al papel de la enzima PA dentro de la fisiología celular, 
en el presente trabajo se han aportado evidencias que soportan la hipótesis de que el gene 
pac de E. coli forma parte de un regulón involucrado en la utilización de compuestos 
aromáticos, y que particularmente permite liberar a grupos fenilos de ciertos compuestos 
que originalmente no eran metabolizables. Así mismo, la capacidad que le confiere el gene 
pac al organismo de hidrolizar a la PenG y crecer a partir del AFA liberado, podría ser 
empleada como elemento de selección en ensayos de actividad de PA. La construcción de 
cepas derivadas de la E. coli ATCC11105 modificadas para obtener el fenotipo pac-, 
podrían ser un hospedero adecuado en dicho ensayo. 
51 
Capítulo VII,- Otros estudios realizados durante el Doctorado 
- Origen y evolución de la transmisión de la información genética 
Simultáneamente al proyecto de investigación "Aislamiento y caracterización del gene de 
la enzima penicilino acilasa (pac) de Escherichia coli", se realizó un estudio por 
computadora referente al origen y evolución de los primeros mecanismos de transmisión de 
la información genética. Los resultados obtenidos en la primera parte del estudio 
demuestran que, la existencia del patrón RNY (purina- cualquier nucléotido pirimidina), 
presente en regiones codificantes del genoma, son independientes del bias originado por la 
composición de aminoácidos de las proteínas. El resultado encontrado apoya el modelo 
originalmente propuesta por Crick et al.,' en el que se propone que solo los codones del 
tipo RNY eran usados por el primer aparato traductor, por lo que era posible identificar la 
fase correcta del mensaje. Una discusión más amplia de este estudio se presenta en el 
articulo "New insights on the Comma-less theory" , incluido en el Apéndice L 
- Estudio de genes sobrelapados y sus implicaciones evolutivas 
En este estudio se realizó un análisis estadístico de la distribución y tamaño de los 
marcos abiertos de lectura (ORFs) de la cadena no codificante. El resultado de dicho 
estudio reveló la existencia de una amplia familia de genes que presentan ORFs 
sobrelapados en un 100%. Este resultado se interpreta en términos de la posible evolución 
del sistema información genética de los primeros "organismos vivos" en el manuscrito 
"Are overlapping open reading frames remants of a primaeval genetic code system?" 
incluido en el Apéndice L 
 
52 
 
  
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59 
fi 
Indice de Figuras y Tablas 
Figura: 
1, Estructura general de un antibiótico B-lactámico. 
2. Estructura química de algunas penicilinas semisintéticas. 
3. Esquema de la acción de la enzima penicilino acilasa sobre la molécula de penicilina G. 
4, Ruta del procesamiento del precursor de PA. 
5. Organización física del gene pac de E. coli. 
6. Construcción de vehículos moleculares para el estudio de la transcripción del gene pac. 
7. Determinación de las actividades de PA, B-galactosidasa y pac mRNA. 
8. Análisis de los posibles promotores en la región 5' del gene pac. 
9. Detección del gene pac en cepas de E. coli. 
10. Alineamiento de las secuenciad de las enzimas PA de E. coli y K. citrophila, 
11. Estrategia de mutagénesis dirigida para la creación de sitios de restricción. 
12. Construcción de genes híbridos de pac. 
13. Construcción de vehículos moleculares para la sobre-expresión del gene pac. 
14. Regiones de regulación involucradas en la expresión del gene pac en los plásmidos 
pPA101 y pPA102. 
15. Análisis de proteínas de células sobreproductoras de la actividad de PA. 
16. Efecto de la concentración de inductor en la actividad de PA. 
17. Efecto del tiempo de inducción en la actividad de PA. 
18. Efecto del fondo genético en la actividad de PA. 
19. Crecimiento de E. coli empleando AFA como fuente de carbono. 
20. Crecimiento de E. coli empleando PenG como fuente de carbono. 
Tablas 
1. Propiedades estructurales, cinéticas y regulatorias de enzimas PA. 
II. Condiciones analizadas en el estudio de la regulación transcripcional del gene pac. 
Estudio del mecanismo de termoregulación de la actividad de PA. 
IV. Cepas obtenidas por mutagénesis y recombinación genética para la sobreproducción de 
la actividad de PA. 
V. Perfil de especificidad de la enzima PA de E. coli. 
VI. Crecimiento de E. coli en compuestos fenilados. 
60 
Nomenclatura 
6-APA 	Acido 6-aminopenicilánico. 
AFA Acido fenilacético. 
ATCC 	American Type Culture Collection. 
CRP Proteína de represión catabólica. 
DNA 	Acido desoxiribonucléico. 
EMS Etil metano sulfonato. 
IPTG 	 Isopropil-tiogalactopiranósido. 
kDa Kilo Daltons. 
Km 	 Kanamicina. 
MNNG N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina. 
ONPG 	Orotidina 5'-monotosfato. 
PA Penicilino acilasa. 
pb 	 Pares de bases. 
PCR Reacción de amplificación con polimerisa termoestable. 
PMFS 	Flururo de fenil-metil-sulfonato. 
rDNA DNA recombinante. 
RNA 	 Acido ribonucléico. 
mRNA RNA mensajero. 
UV 	 Luz ultravioleta. 
1-t 	 Velocidad específica de crecimiento. 
61 
k 	11 
The role of penicillin aniidasés in 
, 
 
na ure aúd in industry 
eriyoiandm, 
Francisco Bolivar 
Fernando Valle, Paulinal0,014  
Penicillin amidase (PA) is the enzyme used commercially for the produc-
tion of semisynthetic penicillins. During the past decade, a detailed pic-
ture of the structure and regulation of the gene encoding this enzyme has 
emerged, revealing a variety of interesting features that are unique among 
microorganisms, Ciues to the biological role of this enzyme have been 
provided, as well as new strategies for the commercial production and util-
ization of PA. 
PERHAPS NO ENZYME has had such 
an impact in human health as penicillin 
amidase (PA, EC 3.5.1.11). lts use has 
made possible a simple procedure for 
the massive production of a large group 
of [3-lactam semisynthetic antibiotics 
for the control of bacterial infectious 
diseases. This enzyme is used to hydro-
lyse either benzyl-penicillin (penicillin 
(3) or phenoxymethylpenicillin (peni-
cillin V) to produce 6-aminopenicillanic 
acid (6-APA), the starting compound for 
the production of semisynthetic peni-
cillins (Fig. 1), 
The semisynthetic penicillin deriva-
tives not only exhiba better properties 
than penicillin G or penicillin V, such as 
increased stability, easter absorption 
and fewer side-effects, but represent a 
practical solution to the problem of 
adaptive microbial resistance to anti-
biotics. The most common mechanism 
of microbial resistance to Prlactam anti- 
F. Valle, P. Balbás, E. Merino and F. Bolivar 
are at the Centro de Investigación sobre 
Ingeniería Genética y Biotecnología, 
Universidad Nacional Autónoma de México, 
Apdo. Postal 510.3, Cuernavaca, Mor. CP. 
62271, Mexico. 
36  
blotics is based on a group of enzymes 
that hydrolyse the 0-lactam ring of peni-
cillin, known as plactamases. This type 
of resistance spreads rapidly in bac-
terial populations by transfer of genetic 
information among populations and 
natural selection. Consequently, the 
massive use of antibiotics soon renders 
them inefficient, and new antibiotics 
need to be prepared in order to over-
come resistant forms. Cephalosporins, 
another important group of plactam  
antibiotics, have been increasingly used 
in preference to penicillin derivatives. 
However, the recent introduction oí 
certain Plactamase inhibitors (clavam 
compounds) in 13-1 acta in antibiotic 
preparations has rekindled interest in 
the use of semisynthetic penicillin 
derivatives in medicine'. With its stra-
tegic value restored, PA continues to play 
a key role in the production of useful 
plactam antibiotics for the control of 
infectious bacteria! diseases. 
0376- S067/91402.00 © 1991, Elsevier Science Publishers Ltd, (UK) 
o 
Benzylpeniciliin 
(Pen G) 
S 	CH3 
+ H20 
COOH 
Peniciilin 
amidase CH3 
CH3 
COOH 
CH2—COOH + 
O 
Phenylacetic Acid 6-Aminopenicillanic acid 
5' 	 
• 
• 
CRP CRP 
< 	 
S cX C 
ammizeu-- 3  
Bg111 	HpaI Hpo1  
ti 
Hindill 
—35 —10 RBS ATO 
	1  
L, 
Figure 2 
Structure of the E. col! PA gene and its 5' and 3' flanking regulatory regions. The 5' regulat• 
ory regio') contains two putative CRP-binding sites. Also indicated are the promoter (-35 
and -10 hexamers) imperfect palindromic sequences (opon arrows), the ribosome-binding 
sito (RBS), and the transiation initiation colon (ATG). The hairpin structure at the end of 
the PA structural gene (t) is a putative rho-dependent terminator. A few relevant restriction 
sites are marked and the polypeptide processing units are shows; S, signa! peptide; C, 
connecting peptide; a, small subunit; a, large subunit. 
TI BS 16 -JANUARY1991 
Figure 1 
Hydrolysis of penicillin G by PA. The plactam ring is indicated with heavy lines. 
Penicillin amidase activity is present 
in a variety of organisms, such as Gram-
negative and -positive bacteria, {llamen-
tous fungi and yeast. A classification of 
PAs has been suggested that is based 
upon the preferential activity of the 
enzyme over a particular substrate2. 
Type 1 enzymes preferentially hydrolyse 
phenoxymethylpenicillin (penicillin V); 
type 11 enzymes are prirnarilS, active 
against benzylpenicillin (penicillin G), 
although they exhibit a broader range 
of specificities; and finally, type 111 
enzymes 	(n-a-aminobenzylpenicillin) 
are most active using ampicillin as a 
substrato, Industrially, the most com-
monly used enzyme to date is the type 
11 enzyme isolated from E. coli strains 
ATCC 9637 and ATCC 11105 (for reviews 
see Reís 2-6). 
Penlcillin amidase is found in a range 
of organisms, but its role in vivo 
remains unclear. In fact, the designation 
of this enzyme as PA reflects its indus-
trial application for the production of 
6-APA. A detailed analysis of the gene and 
protein structures and regulatory mech-
anisms of cloned and sequenced PA 
genes has revealed interesting aspects 
about gene organization, expression 
and protein processing. This infor-
mation has led to a hypothesis on the 
possible biological role of PAs. A better 
understanding of these elements may 
be heipful for the design of novel strat-
egies to accornplish overproduction of 
PA. 
An unusual form of protein processing In 
bacteria 
PA from E. coll is a periplasmic 
enzyme that ras composed of a- and 13-
subunits of 23.8 and 62.24 kDa, respect-
ively, as deterinined by the amino acid 
sequence inferred from the nucleotide 
sequence of the gene'. However, some 
heterogeneity In the size of the small 
subunit becomes apparents when the 
enzyme Is denatured by SDS—PAGE, 
The most striking feature of this 
enzyme is that the two heterologous 
subunits that comprise the active 
molecule are produced from a common 
polypeptide precursor of approximately 
95 kDa. At Ieast three different proteo-
lytic cleavages are necessary to gener-
ate the functional enzyme, and none of 
the processing intermediates exhibits 
amidohydrolase activity. The first mod-
ification of the precursor molecule is the 
excision of a 26 amino acid leader pep-
tide. This leader permits the transport 
and translocation of the molecule into 
the bacteria! periplasm9. 'NO sub-
sequent proteolytic cleavages excise a 54 
amino acid connecting peptide to pro-
duce the separate a- and P-subunits. 
Amino acid sequence analysis of the 
purified enzyme has shownt 	that the 
eight amino acid residues are also 
removed from the carboxyl terminus of 
the smallest of the species of the u-sub-
unit7. (See Fig. 2 for the linear arrange-
ment of the various fragments,)  
Whether the proteolytic modifications 
take place during the export process or 
within the periplasmic space is not 
known9. Multistep proteolysis mech-
anisms exist for many eukaryotic 
polypeptide hormones, such as insulin, 
but they are not common in prokaryotic 
organisms, and thus this complex 
processing system in E. coli is quite 
noteworthy. The connecting peptides 
probably serve to direct the correct 
folding of protein subunits finto an 
active conforrnation. In the case of PA, 
this hypothesis is supported by the fact 
that alter denaturation oí the active 
enzyme, regeneration of enzymatic ac-
tivity is only partially accomplished'°. 
Kinetic and biochemical studies have 
revealed that the highest specificity of 
the PA enzyme is for the phenylacetyl 
side chain, and also that the specificity 
for the penicillin lateral chain Is located 
in the small subunit, while the large 
subunit possesses a phenylmethane-
sulfonyl fluoride (PMSF)-sensitive serine 
37 
o 
ii 
0/./ 	t4{..---CH2-0—C — CH3  
COOH 
COCH 	O H 
1 n 	1 
CH—(CH.2)3C—N 
CH3 
Figure 3 
Chemical structure of cephalosporin C. The 7•ACA moiety is enbold- 
ened. 
TIBS 16 — JAA'Whq Y.1991 
residue that plays a key role in the cata-
lytic activity of the enzyme'a." PA is 
capable of transferring acyl groups 
from esters, amides or acids to accep-
tor molecules such as alcohols, animes 
or water. The reaction mechanism thus 
resembles that of serme proteases in Its 
abillty to form acyl-enzyme inter-
mediate compounds. Phenylacetic acid 
acts as a competitive inhibitor, whlle 
6-APA is a non-competitive inhibitor. 
such a difference is a consequence oí 
the two-step mechanism of the enzyme: 
the molecules that donate the acyl 
group compete for the active site of PA, 
while those that accept the acyl group 
compete for the acyl-enzyme Inter-
mediatell. 
A complex regulatory network 
There are three majar mechanisms 
regulating PA levels in E. col!: cyclic 
AMP-receptor protein (CRP or CAP). 
phenylacetic acid12 and thermoregu-
I ation3. 
The 5' flanking region oí the E. culi PA 
gene contains severa' DNA sequences 
that may be involved In the regulation 
of gene expression (see Fig. 2). Primer 
extension experiments have suggested 
that transcription of the PA gene is 
directed from a single promoter, which 
exhiblts slmilarity to the E. cola 	con- 
sensus prornoter'3. However, promoter 
fusion experiments have identified 
another promoter". In this promoter, 
the first ribonucleotide from the mRNA 
Is located two nucleotides before the 
ribosome-binding site, which is an 
unusual position in E. coli genes. More 
experiments are required to clarify this 
point. 
Two putative CRP-binding sites have 
been round around the promoter 
reglan, at a position typical of pro-
moters regulated by the CRP mechan-
ism. The 5' regulatory DNA sequence 
also contains three imperfect palin-
dromic sequences that could be involved 
In a negative control mechanism'3, 
Thls array of putative CRMinding 
sites, promoter and palindromic 
al • 
sequences resembles 
that of other genes 
and operons that 
are subject to carbon 
regulation. Most of 
the 	physiological 
data available sug-
gest that regulation 
of the PA gene of E. 
cali is similar to that 
of genes involved in 
carbon assimilation. 
Catabolite repression of the PA gene is 
observed on a variety of carbon 
sources such as glycerol, lactase, fruc-
tose and glucose. This effect may be 
partially overcome by the addition of 
cAMP, which exerts its effect at the 
transcriptional leve'. As yet, however, 
there is no evidence that catabolite 
repression acts directly at the tran-
scription initiation step, and the 
observed effect could be mediated by 
an indirect mechanIsm, such as the 
activation of other genes or aitered 
transport of molecules12. In addition, 
transcription of the PA gene is induced 
by the presence of phenylacetic acid as 
the sale carbon sourceu.15, thus sup-
porting the hypothesis that PA ex-
pression is modulated by carbon sources. 
Another interesting feature of PA is 
its temperature-dependent regulation, 
Thermoregulation of protein synthesís 
and protein activity is a poorly studied 
global regulatory system that is distinct 
from the heat-shock response". In 
E. col!, the optimal temperature for PA 
activity ranges from 24 to 30T, and no 
activity is detectable at 37'C or more3.5. 
This dramatic effect is not due to heat 
inactivation of the enzyme, since the 
optimal temperature for its activity is 
45'C (Ref. 3). In E. con there are at least 
two genetic loci, ena and ompT, 
responsIble for the thermoregulation of 
a variety of genes. However, neither of 
them is in` olved in the thermoregu-
lation of the PA gene (E. Merino, E 
Bolívar and F. Valle, unpublished). 
The physiological basis for the ther-
moregulation of PA and other enzymes 
in E. col! is not understood. Never-
theless, an interesting hypothesis 
favors the interpretation that E. col! rec-
ognizes its parasitic or nonparasitic 
habitats by sensing the temperature: 
that is, higher temperatures under para-
sitie growth and lower temperatures in 
a nonparasitic environment". This com-
plex regulatory network would ensure 
that the PA gene was expressed at low 
temperatures, with phenylacetic acid as 
the sale source of carbon. 
The PA gene from Kluyvera citrophila 
has been cloned and sequenced and is 
87% identical to the E. col( enzyme at 
the amino acid leve117. The PA gene from 
K citrophila, which is not inducible by 
phenylacetic acid in this organism, may 
be induced by this compound when 
transferred to E, col!. This PA gene 
is also thermoregulated in both organ-
isms, although at different levels". 
The expression of PA enzymes in 
Pseudomonos rettgeri and Arrobacter 
viscosus is regulated in different ways, 
In P. mugen' the gene is not inducible by 
phenylacetic acid and not repressed by 
glucose, but it Is repressed by some tri-
carboxylic acid cycle intermediatesi°, 
while in .4. ciscosus PA actMty is 
inducible by phenylacetic acide, 
Is PA from E. coll a scavenger for 
phenylacetylated compounds? 
Several groups have addressed the 
question of the physiological role of PA. 
The enzyme will recognize preferentlal 
enzyrnatic activity and cleave other 
phenylacetic acid derivatives in 
addition to penicillins; some examples 
of these substrates are presented In 
Table 1. Together wlth the regulatory 
mechanisms of phenylacetic acíd In-
duction and catabolite repression, 
these data suggest that the PA gene is 
related to pathways involved in the 
assimilation of aromatic compounds as 
carbon sources, 
.khhough E. cali has been the subject 
of a variety of blochemical and physio-
logical studies, its ability to grow 
on aromatic compounds has not been 
thoroughly Investlgated. That E. coli is 
able to catabolize such molecules 
should ,not be surprising, given the 
number of aromatic derivatives that are 
products of the metabolismo of a variety 
of compounds that are present in its 
intestinal/fecal habitat, Furthermore, an 
inducible catabolic pathway for the utíl-
ization of phenylacetic acid in E. col! 
has been described, and at least N.o 
genetic locl have been Identified. One of 
them participates in the transport of 
phenylacetic acid alter its modification 
to 2-hydroxyphenylacetic acid. How-
ever, the cells are incapable of taking 
2-hydroxyphenylacetic acid from the 
environment, It is noteworthy that the 
genes for this pathway have been 
mapped to 30.4 minutes on the bac-
teria! chromosome. This reglan appar-
ently does not carry essential genes for 
laboratory growth because 60 kDa of 
DNA from this area may be deleted 
without generating a different pheno- 
Benzylpeniciiiin (Pen G) 4.6 
7•Aminodesacetoxycephalosporanic a:id 10 
Cephalothin 42 
Elhyl phenyiacetate 
p-NitrophenyI pheny!aceta:e 51 
Pnenylacetate pnitroaninde 97 
Pnenyta:etygrycine 53 
Cepha!oritine :D3 
Ampicillin 	• 233 
Sencylpenicnic a:id 2030 
Cepha!exin 2:00 
r..-(-)-(a•Am:nopheny:antic a:id pnitroanilide 520 
AH K, vaLes were calcu!ated at pH 7.5 and at 
ÍTU6strate 
temperature range 
24-30:C; dissolved 
oxvgen concentra-
tion below 2%; in-
ducer concentration 
0.2%; and a carbon 
source other than 
glucose3.5.u.". 
Conventional 
genetic techniques 
have been fruitlay 
exploited to in-
crease the produc- 
tivity 	of 	strains 
carrying the PA 
gene. Mutant strains 
Tabie 1, Substrato specificities of penicillIn arnidase from E. col' type. It has been suggested that this 
Isilent' region may contain unusual or 
exotic genes". 
The aboye evidente suggests that PA 
•• an amidase involved in the degra- 
Jtion of phenylacetylated compounds 
for the generation of phenylacetic acid, 
which may be used as a carbon source 
and could act as an inducer of the 
degradative pathway. However, this 
pathway seems to be useless when 
E. coli is living as a parasite, because 
richer carbon sources are usually In 
abundante, However, when E. coli moves 
to a free-living state, the utilization of 
alternative carbon sources becornes 
obligatory. Phenylacetic acid deriva-
tives are abundant In the nonparasitic 
environment. For example, they are 
formed by the action of microflora on 
plant constituents; these include phe-
nolic and caffeic acids, the flavonoids 
cathechin, myrecetin and hesperetin, 
and the amino acids phenylalanine and 
tyrosine, as well as some oí their 
metabolites2). 	 • 
The hypothesis that PA is an enzyrne 
involved in the degradation of phenyl-
acetylated compounds is further sup-
ported by the thermoregulation of PA 
gene expression. As mentioned before, 
•A•hen E. coli abandons its Intestinal 
habitat, the ability to use the great var-
lety of phenolic compounds available as 
carbon sources would be an adaptative 
advantage. Lower temperatures might 
act as a signal for the detection of the 
new environment and, In conjunction 
with the phenylacetylated compounds, 
the synthesis of PA would then be 
induced. In the light of this hypothesis, 
PA should not be an essential enzyme 
for the parasitic growth of E. coli, since 
al 37:C its enzymatic activity is practi-
cally negligible. 
CommercIal production of PA 
A variety of strategies have been 
designed to increase the commercial 
production of PA. There have been 
three mejor successful approaches to 
obtain higher PA yields: improvement 
of the bioengineering process, strain 
development by conventional microbial 
genetics, and the use of recornbinant 
DNA methodologies. 
The numerous bioenglneering 
proaches have resulted in the optl-
mization of growth conditions for maxi-
mal enzymatic activity in large-scale 
fermentors. For the E. coli strain ATCC 
11105, which is preferentially used in 
commercial processes, the optimized 
parameters for PA production are: 
• 
from ATCC 11105 have 
been isolated on the 
basis of selection for penicinin G hyper-
sensithity; the test strains exhibited an 
eightfold higher activity than the 
parental strain=3, Another approach has 
been the isolation of mutants (using 
continuous culture techniques) in the 
presence of amides as the only source 
of nitrogen. In addition, glucose has 
been used in the culture medium to 
generate mutants that are resistant to 
catabolite repression; these are fully 
resistant to repression by glucose, and 
produce 8-20 times higher PA levels 
than the parental strains. 
The use of genetic engineering tech-
niques has also yielded rewarding 
results in the development of PA over-
producing strains. Recombinant DNA 
technology has made it possible to alter 
in a precise, directed manner those 
specific sequences that regulate gene 
expression. The most straightforward 
strategy has been the cloning of the PA 
genes In multicopy plasmid vectors in 
orden to increase gene dosage from one 
chromosornal cor.v to more than 20 
(Reís 7,9,15,17). Furthermore, knowl-
edge about the DNA regions, and the 
molecular mechanisms that modulate 
PA expression, has made it possible to 
replace the native regulatory regions 
for more convenlent ones7.1s. Although 
increases of several fold have been 
• obtained in the synthesis of PA pre-
cursor, the absolute values in terms of 
PA activity are not as high as expected. 
Plasmid instability and saturation of the 
exporting mechanism are two possible 
explanations for this result. 
Plasmid instability in high-level 
expression systems is a commonly 
observed phenomenon. It is affected by 
several variables in which the host cell 
genetic background, the induction 
method, the toxicity of the product and 
the stability of the expression próducts  
(mRNA and protein) play key roles. An 
extensive review of these issues has 
been presented elsewhere". Structural 
and segregational Instabilities have 
been reported for plasmids carrying the 
PA genes25.26. To oyercome this problem, 
stable derivatives may be constructed 
or isolated using rDNA or conventional 
genetic techniques”. 
Saturation of the secretion mechan-
ism may also be a problem In the over-
production of mature PA. The number 
of secreting channeis is thought to be 
about 20 000 in E. col!. If these are 
shared by several proteins that are 
secreted finto the periplasmic space, 
transportation of a feeder pepticle-con-
taining enzyme may become a limiting 
step. This hypothesis has not been test-
cd experimentally28. 
Other strategies for achieving higher 
PA yields using recombinant DNA have 
been the use of mutagenesis and strain 
selection. The mutagenesis schemes 
have produced mutants with approxl-
mately threefold higher activity than 
the parental strain by modification of 
the 5' regulatory reglan, which led to 
the constitutiva synthesis of PA27. The 
strain selection approach resulted in á 
more than 50-fold increase In the ac-
tivity of PA29. 
Are cephalosporin-C acetylhydrolases 
related to penicillin emitieses? 
As mentioned earller, cephalosporIns 
are another important group of P-lac-
tem antiblotics, Cephalosporin C, pro-
duced by Cephalosporium acremonium. 
is the starting material for most of the 
currently marketed cephalosporins 
(Fig. 3). Chemical cleavage produces 
7-aminocephalosporanic acid (7-ACA) 
from which the semisynthetic cephalo-
sporins are derived. However, this pro- 
cess• is very delicate and expensive. 
39 
T1BS 16 —JAAVARYI 991 
Consequently, many pharmaceutical 
companies and research laboratories 
have endeavored to develop an enzy-
matic method for the preparation of 
semisynthetic cephalosporIns anal-
ogous to the process deyeloped to pro-
duce semisynthetic penicillins. None-
theless, the search for a commerclaily 
useful enzyme has been largely futile. 
Some strains carrying cephaiosporin-
C acetylhydrolases have been reported 
but none of these activities can ef-
ficiently hydrolyse cephalosporin C, and 
it remalns to be seen whether these 
acetylhydrolases are active on peni-
cillin G or Y. The cloning and se-
quencing of a gene from Pseudomoros 
species, coding for an acetylhydrolase 
that has activity on 73-(4-carbox-y-
butanamido) cephaJosporanic acid as a 
substrate (glutary1-7ACA acetylhydro-
lase), revealed some slmilarity with the 
E. coli PA enzyme. Both enzymes con-
sist of two nonhomologous subunits 
processed from a common 'precursor, 
suggesting that they share a common 
origin".3°. 
Another Pseudomonas species, strain 
5E83, produces two distinct glutary1-
7ACA acetylhydrolases". Again, both 
are componed of two different subunits 
that apparently originated from a com-
mon precursor. The structural genes for 
these two enzymes, acyl and n'II, have 
been sequenced31. Studies on substrate 
specificity disclosed a significant dif-
ference between them. Nevertheless, 
the acyll enzyme, which has a broad 
substrate specificity, is capable of 
hydrolysing cephalosporin C to 7-ACA 
and aminoadipic acid, although at a 
very low rate. 
There are significant hornologles 
between the amino acid sequences of 
cephalosporin-C acetylhydrolase 11 and 
PA from E. colim. The penicillin ami-
dases from E. coli, K, citrophila, .4. 
viscosus", and those enzymes described 
so lar as glutary1-7ACA acetylhydro-
lases from Pseudc,monas strain GM16 
and acyll from Pseudomoncs strain  
SES3, could share a common origin but 
have evolved along separate pathways, 
generating enzymes with different 
substrate specificity. 
Aithough the cephalosporin-C acetyl-
hydrolases described aboye do not 
have an industrially important activity 
on cephalosporin C as a substrate, they 
bear a partial resemblance to PA. This 
similarity with PA is noteworthy, 
because if PA is redy a scavenger for 
"phenylacetylated compounds, then a 
good cephalosporin-C acetylhydrolase 
should not be similar to PA, mainly 
because cephalosporin C does not con-
tain any phenylacetylated groups. 
Furthermore, this hypothesis suggests 
that all the cephalosporin-C acetyl-
hydrolases thus lar reported, which 
exhibit very poor activity on cephalo-
sporin C but share similarities with PA, 
could be modified penicillin amidases 
that diverged from a common pre-
cursor gene. This hypothesis is further 
supported by the fact that PA from 
E. coli is also capable of hydrolysIng 
certain semisynthetic cephalosporins 
at a very low rate (Table D. With all 
these elements In mirad, it Is possibie 
that protein engineering of penicillin 
amidases, vía site-specific mutagenesis, 
could be an interesting alternative 
for the isolation of an efficient 
cephalosporin-C acetylhydrolase. 
• 
Acknowiedgements 
We are grateful to P, Lizardi for his 
critical review of the manuscript. This 
work was partially supported by a grant 
awarded by Dirección General de 
Asuntos de Personal Académico, 
UNA.M. 
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A n 
  
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r-trirt i J I rinr UNU I L L. 	14 	I .4 	 Z.0 
   
molecular 
micro oblogy 
Dr, G,K. Schoolník 
Division, Geograpllic Medicino 
Bcckman Center 241A 
Stamford University School of Medicine 
Staniord, CA 94305.5425, USA 
(415) 723.8158 
(415) 723.1399 FAX 
April 16, 1992 
Dr. Francisco Bolivar 
Department° de Biología Molecular 
Instituto de Biotecnologia 
Universidad Nacional Autonoma de Mexico 
APDO 	• 
Postal 510-3 
Cuernavaca, Morelos 62271, Mexico 
Dear Dr. Bolívar: 
Your revised manuscript entitled "Carbon regulation and the role in Nature 
of the Esch%erichia coli penicillin acylase (pac) gene" has been read by Dr. 
Edmundo Calva and myself. 1 am pleased to inform you that it has been 
accepted for publication in Molecular Microbiolosy. 
All futuro correspondence about this papen should be with Ms. Helen Ure, the 
Journal's Executive Editor.. Her phóne number is 011-44-31-226-7232 and her .  
FAX number is 011-44-31-226-3803. Please expect to receive your page proofs 
in approximately eight weeks. 
Thank you for your attention to the Reviewers' comments and for having 
allowed us to consider this worthwhile contribution. 
Sincerely, 	
• 
ry K. Schoolnik 
Editor 
GKS/er 
MS EC9203 
Edilors 	Dr. C.F. Higgins 
Dr. G.K. Schoolnik 
• 
Floviews Editor Dr. A.P. Pugsiey 
Carbon regulation and the role in Nature of the Escherichia coli 
penicillin acylase (pac} gene. 
Enrique MeIino, Paulina Balbás, Felix Recillas, Balt2.zar Becerril, Fernando Valle and 
Francisco Bolivar. 
Departmento de Biología Molecular, Instituto de Biotecnología, 
Universidad Nacional Autónoma de México. 
Apdo. Postal 510-3, Cuernavaca, Mor. CP 62271, México. 
Tel.(5273) 17 23 99; Fax: (5273) 17 23 88. 
For correspondence: Dr. Francisco Bolívar. 
Running title: Carbon regulation and role in Nature of the pac gene. 
1 
9 
Summary 
Quantitative analysis of specific pac mRNA and a lacZ fusion to the 5' terminal 
region of the pac gene demonstrated that both, phenylacetic acid (PAA) induction and 
catabolite repression by glucose are involved, at the transcriptional level, in the regulation 
of the pac gene. The. studies presented here suggest that this regulation is also present in 
E. coli transformed strains in which the pac gene was not originaliy present. Analysis of 
the nucleotide sequence of the 5' terminal region of this gene, with a statistical algorithm, 
confums that the putative promoter previously proposed by our group (Valle, et al., 1986), 
is the most feasible within this region. We demonstrate that the PA activity can confer E. 
coli the ability to use penicillin G (PenG) as a metabolic substrate, by detaching the 
phenylacetic group which can be used as a carbon source. Based on this data, the 
regulation properties of the pac gene studied in this work and considering the specificity 
prof le of the penicillin acylase enzyme (PA), (Balasingham et al., 1972; ivlargolin et 
1980), we suggest its role in E. coll as a scavenger enzyme for phenylacetylated 
compounds. 
• 
Introduction 
N i 
Penicillin acylase (PA) is an enzyme used for the commercial production of 
semisynthetic penicillins. Several studies have been made to overproduce this enzyme (for a 
review see Vandame, 1980; Mahajan, 1984; Savidge, 1984; Valle et al., 1991). Despite the 
fact that PA and its gene have some unique features, many basic aspects on its expression 
and role in cell metabolism still remain unclear. For example,.in E. coli ATCC11105, PA 
is produced as a cytoplasrnic precursor that, in order to become catalytically active, has to 
be transponed to the periplasmic space and proteolytically processed (Bóck et al., 1983). 
None of the processing intermediates have PA activity (Schumacher et al., 1986). 
Interestdngly, an internal peptide, located between the two subunits in the PA precursor, is 
removed in the maturation process to conform the matare enzyme. Another interesting 
aspect of the enzyme and its gene is that intracellular PA activity is under several 
regulatory controls, such as temperature, oxygen level, catabolic repression and PAA , 
induction (Kaufman and Bauer, 1964; Szentinnai, 1964, Vojtisek and Slezák 1975a .1975b). 
Because of the complex pathway required to render the active form of this enzyme, these 
regulatory elements may act at different levels, including among others: pac transcription, 
PA transpon and PA maturation. Nevertheless, there is no reponed data about how this 
regulation takes place at the molecular level. 
Our group has previously published the nucleotide sequence of the 5' regulatory region 
of the E. coli pac gene and established lis transcription startpoint 30 bp upstream to the 
first ATG codon (Oliver et al., 1985, Valle et al., 1986). Analysis of this region has led us 
to identify two putative CRP-cAMP binding sites, three palindromic sequences that might 
be involved in transcriptional regulation, and a previously proposed functional promoter 34 
bp upstrearn of the structural gene (Valle et al., 1986). However, Oh et al., (1987) have 
proposed a different promoter for this gene. 
In this report we extend our analysis of the pac gene regulatory reglen. To study 
catabolite repression and induction by PAA, we performed quantitadve analysis of specific 
pac mRNA and pac-lacZ fusion studies. Our results suggest that both PAA induction and 
catabolite repression by glucose, are involved in the regulation of the pac gene at the 
transcriptional ievel. Statistical analysis of the 5' terminal region of the pac gene centraras 
that the putative promoter proposed by our group, is the most feasible, one in this reglen. 
Finally, the regulatory features of the pac gene, as well as the specificity profile of 
PA, has let us to propase that the role of this enzyme in Nature might be to scavenge for 
phenylacetylated compounds. In arder to test this hypothesis, we perforrned experiments in 
which we demonstrate that PA activity can confer E. coli the ability to use the phenylacetic 
g,roup of PenG, as a carbon source, when this bacteria also cardes a 11-lactamase gene. 
Results 
PAA induction and. glucose repression are mediated at the transcriptional level 
To analyZe how the pac gene is regulated by glucose and PAA, we performed 
quandtative studies of pac mRNA and a pac,lacZ fusion, Two different strains viere used: 
E. coli ATCC1105, which presents the native PA activity, and E. coll HB1Ó1 in which the 
PA activity was not originally present but it was acquired by transformation with plasmid 
pPA25. In this plasmid, the pac gene carnes its native 5' regulatory regions (Fig. 1). 
4 
Five different conditions ` ¥ere analyzed, and the patterns of PA activity, expression of 
the PA-LacZ transladonal fusion, as well as intracellular amounts of pac mRNA for tested 
condition were measured and are depicted in Fig. 2. To make a comparative analysis of 
these results, the values are expressed in relative terms with respect to the maximum value 
(100%) of each case. From these results, it can be seen that: 
- PA activity is minimal when glucose is used as carbon source. 
An energetically inferior carbon source, such as glycerol, increases PA activity. 
- PA activity is maximal when PAA is used as the only carbon source. 
- PAA can induce the PA activity even when glucose or glycerol are added to the 
media, thus indicating that glucose and PAA can simultaneously regulate PA activity. 
- These profiles were similar even if the pac gene was present in mono or muldcopy 
number. 
- In all the aboye conditions, the PA acdvities (Fig. 2a) conelate with the amounts of 
specific pac mRNA (Fig. 2d) and PA-ágalactosida.se determinations (Fig. 2c). 
The 5' regulatory elements of the pac gene 
In arder to study the effects of the putative regulatory elements of the pac 5' terminal 
region, we transformed E. con HB101 cells with plasmid pPA4. In this plasmid, the 5' 
region upstream of the -10 promoter box of the pac gene has been removed (Valle et al., 
1986,. 	Figs. 1 and 3b). From Fig. 2e, it can be seen that in cells carrying this plasmid, PA 
activity is no longer affected by glucose repression, PAA does not induce PA activity and 
a constitutiva. profile of PA activity is observed in all of the tested conditions. 
5 
aada A PM 	LA 	a á 	Otil i.1 .J boalA 
Computer analysis of the pac promoter 
In order to identify and evaluare putative o" promoters within the 5' control region of 
the pac gene, we developed a computer program based on the statistical .algorithm proposed 
by Mulligan et al. (1984). Using this program, a maximum value of 60 is obtained when 
a11 the bases match the consensus promoter and the -35 and -10 boxes are separated by 17 
bp (see Experimental.procedures). When a cutoff value of 45 was used, the prograrn 
identified 4 putative promoters within the first 150 bp upstream the structural gene. One of 
these promoters corresponds to the one previously proposed by our group to be functional, 
under maximal pac induction, and is located 34 bp upstream the first ATG coding codon. 
It is important to note that using this algorithm, this promoter obtained the maximum score 
found in the analysis (Fig. 3a). The putative pac promoter proposed by Oh et al., (1986) 
was found when the cutoff value was set down to 37. Using this cutoff value, 14 putative 
promoters were also found in the analysis. 
The pac gene is part of a regulon 
The results presented in this paper showed that the pac* gene is regulated in a similar 
manner in both ATCC11105 and HB101[pPA25] strains. These results indicate that the 
regulatory elements responsible for PAA induction are present in E. con strains that do not 
originally have PA activity. This suggests that the pac gene shares regulatory elements with 
other genes present in severa' E. coli strains or that pac could be a cryptic gene in sorne 
of theme In order to differentiate between these two alternatives, we performed Southem 
blof hybridization studies using chromosomal DNA isolated from strains that either have 
(ATCC11105) or do not have (H13101, IM101, W3110) PA activity. The probe used for 
this experiment was a 1.7 kb Hpal-Hpal internal fragment of the pac gene. As can be seen 
in Fig. 4, only the chromosomal DNA from the ATCC11105 strain hybridized, indicating 
that the pac gene is present only in this strain. Furtherrnore, even when non-stringent 
washirig condition or when a 7.5 kb DNA fragment carrying the entire pac gene and 
chromosomal flanking regions was used as a probe, the same results were obtained (data 
not shown). 
Finally, the size .of the pac mRNA, determined from the Northern blot studies, was 
approximately of 3.2 kb (not shown), suggesting that the pac gene is transcribed as a 
mono-cistronic unit. 
The PA enzyme confers E. coli the ability to groja using the phenylacetic group of 
PenG, as a carbon source 
We have previously proposed that a possible role in Nature of the PA enzyme is to 
transfonn non-metabolizable phenylacetylated compounds into ones that can be metabolized 
(Valle e: al., 1991). Taldng into account that the coexistente of PA and 13-lactamase 
activities have been observed in severa]. organisms (Hamilton-Miller, 1966), we decided to 
test if E. coli strains with both activities could use PenG as a carbon source. To do so, 
strain JM101 was transformed with either plasmid pMMB22 (13-lactamase+), or with both 
plasmids, pMMB22 and pPA25, simultaneously (see Fig. 2). These strains were grown in 
NN minimal media supplemented with casaminoacids and PenG as the only carbon and 
energy sources. The growth curves obtained are shown in Fig. 5. From this figure it can be 
seen that the growth cate of cells carrying the pac gene was at Ieast twice with respect to 
the ones without it. 
r. 
Discussion 
It has been previously reported that in E. coli the PA activity is under several 
regulatory controls, including catabolite repression and phenylacetic acid (PAA) induction 
(Kaufman and Bauer, 1964; Szentirmai, 1964; Voltisek and Sezlák, 1975a, 1975b). 
Furtherrnore, it is knówn that exogenous addition of cAMP paitially overcomes catabolite 
repression by glucose (Gang and Shaikh, 1976) and that maximal PA activity is obtained 
when PAA is the only carbon source (Voltisek and Sezlak, 1975a). Nevertheless, as far as 
we Lmow, in all of these studies, it was assurned that the regulation of the pac gene 
directly influenced the intracellular PA activity at the transcriptional level. Although the 
regulation by glucose of most of the carbon utilization genes is mediated at the 
transcriptional level, due to the complex pathway needed to get the active form of PA, an 
extensive analysis was required in order to confirm this. At least there are two ways by 
which the pac gene can be regulated by glucose: a) directly, regulating PA activity by 
modulating pac gene transcription, or b) indirectly, by affecting the expression andior 
activity of some other gene(s) involved in the transpon or maturation of the PA precursor. 
In order to find out which one of these two possibilities was the most plausible, we 
studied a pac-lacZ transcriptional fusion, performed specific pac mRNA quantitative 
analysis and PA activity determinations, in E. coli cultures grown under different carbon 
sources and induction conditions. 
Our results indicate that PA and B-galactosidase activities, as well as the amount of 
specific pac mRNA in E. coli ATCC11105, are minimal when glucose is used as the only 
carbon and energy source. This negative effect is partially overcome when a different 
8 
carbon source is used, such as glycerol, or when PAA is present in the media. Maximal 
PA activity was found when PAA was the only carbon source. Interestingly, when the pac 
gene was present in a multicopy plasmid, the same results were observed, suggesting that, 
at least in the tested conditions, there is no titration effect on a putative regulatory protein 
(Figs, 2a and 2b). It is also important to mention that the data obtained from the PA-B-
galactosidase fusion, and from specific pac mRNA studies, are in accordance with these 
results (Figs. 2c and 2d). However, when rnost of the original pac 5' terminal region was 
deleted, no regulation effect by glucose or the PAA was observed (Fig. 2e). From these 
results it can be established that the glucose effect and PAA induction act directly by 
modulating the transcriptional level of the pac gene, and not by an indirect effect on the 
regulation of oler factor(s) involved in the transpon or maturation of the PA precursor. 
Although this was previously assumed, no demonstration of either the transcriptional 
regulation by glucose or of the effects of PAA induction had been presented before. 
A superficial analysis of PA regulation might conduce to inaccurate conclusions. For 
example, Deretié et al. (1984) proposed a correlation between the stability of a plasmid 
carrying the pac gene and the degree of trancriptional activation of pac. Nevertheless, the 
repressed condition used in their study corresponded to a temperature growth of 37 °C, 
where no PA activity is detected. PA-Bgalactosidase translationál fusion and specific pac 
mRNA quandtations performed in our laboratory, have demonstrated that even when no PA 
activity is detected, as in cells grown at 37 °C, the pac gene is transcribed and PA enzyme 
is synthesized (data not shown), so there should be another explanation for the stability 
results obtained by Deretié et al. 
The results presented in this paper are in agreement with physiological data reponed 
previously (Kaufrnan and Bauer, 1964; Szentirmai, 1964, Vojtisek and Slezák 1975a, 
1975b) and also support the model in which CRP regulates the pac gene by interacting 
with sites located upstream of its promoter (Valle et al., 1986). However, based on the 
identification of a different promoter, a slightly different model for the pac gene regulatory 
region has been suggested (Oh et al., 1987). This alternative promoter is located six bp 
downstream of the one proposed by us. Further analysis of this 5' regulatory sequence, 
using the statistical algorithm develope.d by Mulligan et al. (1984), confirmed that the 
prometer identified by us is more likely than the ene suggested later. Furthermore, the 
probable mRNA start of the prometer reponed by Oh et al. is located two nucleotides 
before the riboson-ie binding site, which is in an unusual position for E. coli genes. 
Another interesting result is the fact that similar PA activity profiles were obtained 
with two different E. coli strains: ene with a ñative PA activity .(ATCC11105) and another 
one that did not have the pac gene originally (HB101), but was later acquired by 
transforrnation. These results indicate that both strains are able to respond in the same way 
to PAA induction. Two main possibilities may explain the fact that the PAA regulatory 
elements were present in a strain lacking PA activity. The first ene is that the HB101 
strain once might have had a functional and regulatable pac gene, which later became 
cryptic. The second possibility is that the regulatory elements responsible for pac gene 
activation by PAA• are common to other loci of the H13101 strain. To test these hypothesis, 
we performed a Southern biot hybridization study, in which cromosomal DNA from several 
E. coli strains, able to regulate the pac gene present in plasmid pPA25, failed to hybridize 
when the pac gene was used as a probe. These results support the hypothesis of common 
10 
11.;¿.3ij 
regulatory protein(s) involved in PAA regulador!. Interestingly, the Kluyvera citrophila pac 
gene is regulated in the same fashion when it is transformed into E. coli strains, but 
presents a constitutive expression respect to PAA in K. citrophila (García and Buesa, 
1986). 
Despite many studies on PA and its gene, its role in the cell metabolism is unknown. 
The results obtained jn our studies confirrn that the E. coli pac gene possesses some 
regulatory features common to many carbon utilization genes and, considering the ability of 
the PA enzyme to hydrolyze some other phenylacetylated compounds other than PenG 
(Margolin et al., 1980), we have proposed that the role of this enzyme in Nature is to 
transform non-metabolizable phenylacetylated compounds into metabolizable ones (Valle et 
al., 1991). The results presented in Fig. 5, where a higher cell density is reached by a 
J14101[pMMB22, pPA25] culture, when compared to a JM101[p11,25922] culture, in a 
minimal media containing PenG as carbon source, are in accordance with this hypothesis. 
It is important to mention that PAA is one of the producs of PenG hydrolysis by the 
PA enzyme and that the metabolic degradation of PAA, and aromatic compounds closely 
related to it (3- and 4-hydroxyphenylacetic acid and phenylpropionic acid), have been 
previously reported to occur in E. coli (Burlingame and Chapman, 1983; Cooper and 
Skinner, 1980; Cooper et al., 1985). Taking these data into account, we propose that the 
role of the PA enzyme in E. coli is to transform phenylacetylated compounds into 
metabolizable ones by detaching the phenyl group, which is further used as carbon source: 
We think that this catabolic role of the E. coli PA enzyme may be similar in other 
organisms, although the metabolic pathway(s) used to assimilate the phenyl group may be 
different. For example, in Proteus rettgeri ATTC31052, PA is not induced by PAA and is 
11 
not subject to catabolite repression by glucose, but is repressed by the C4-dicarboxylic acids 
of the tricarboxilic ácid cycle, such as succinate, fumarate and malate (Dautny et al., 1982). 
Also, in some fungi, PAA produced by PenG hydrolysis seems to be catabolized to 
cysteine, acetone and glycine (Shimi et al., 1966). All these data support the broad use of 
PA enzymes in Nature as scavengers. Further studies shall reveal the relationships of PA 
enzymes with severa', catabolic pathways. 
Experimental procedures 
a) Plasmids 
Plasmids pPA4 and pPA25 carrying the E. coli pac gene have been previously 
described (Oliver et al., 1985; Valle et al,, 1986). Plasmid pMMB22 carrying a 13-lactamase 
gene was constructed by Bagdasarian et al (1983), Chis plasmid cardes an origin of 
replication compatible with ColE1 replicons. 
b) Assays for penicalin acylase and B-galactosidase activities 
PA activity was determined by the initial rates of 6-aminopenicilanic acid (6-APA) 
forrnation using the colorimetric rnethod described by Balashingharn et al. (1972). 13- 
galactosidase activity was determined according to Miller (1972). Protein deterrninations 
were done as reponed by Lowry (1951). Specific activities are expressed in relative terms 
in order to simplify the analysis. 
c) Quantitative analysis of penicillin acylase rnRNA 
E. col! ATCC11105 and HB101, transformed with plasmid pPA25, were grown to late 
exponential phase in NN minimal medium supplemented with 15nrtM NH4C1 as nitrogen 
12 
.1M 
source. The carbon and energy source used were: a) 0.1% (w/v) of PAA. b) 11 mM 
glucose c) 22mM glycerol. Total RNA. was isolated (Young and Furano, 1981), and loaded 
orno nitrocellulose membranes using a dot blot camera. Prehybridization was performed at 
42 °C for 4 h in a buffer containing 5 X SSC, 50% formamide, 1mM EDTA, 10 mM Tris 
pH 8, 10 X Denhardt's solution (Denhardt, 1966) and 150 	of calf thymus DNA. The 
internal fragment Hpal-Hpal of the pac gene (Fig. 1) was nick-translated according to 
Rigby et al. (1977) and used as a "P-labeld probe. Hybridization was carried out for 12 h 
at 42 °C using the prehybridization buffer mixed with the probe. Filters were subsequently 
washed for 10 min with: 2X SSC, 0.1% SDS at room temperature; 0.1 X SSC, 0,1% SDS 
at 48 °C; and 0.1X SSC at 64 °C. The radioactivity in each dot was detennined by 
scintillation counting, 
d) Northern blot hybridization 
The mRNA isolated in the dot blot analysis was electrophoresed on a 1% agarose- 
2.2M formaldehyde gel for 10 h at 30 Y (Lehrach et al., 1977) and then transferred onto 
nitrocellulose membranes (Southern, 1975). The prehybridization, hybridization and washing 
procedures were the same as the ones used in the dot biot analysis. In order to determine 
the position of the 235 and 16S rRNA, filters were stained with methylene blue, 
e) Southern biot hybridization 
Total DNA from E. coli ATCC11105, HB101, TM101 and W3110 strains was 
extracted and digested with EcoRI tnzyme. The resulting fragments were resolved by 
electrophoresis through a 1% agarose gel and blotted onto nitrocellulose membranes 
(Southern, 1975). The subsequent steps of prehybridization, hybridization and washing 
procedures were the same as the ones used in the Northern study. 
13 
Growth of coli with of PenG as carbon source 
E. coli JM101 strain was transformed with plasmid pMMB22 or cotransformed with 
plasmids pM1vLB22 and pPA25. The transformed strains were grown at 28 °C on NN 
minimal media supplemented with 0.02% casaminoacids and 0.05% PenG as solo carbon 
and energy sources. 
g) Computer program to identify a" promoters 
The program developed to search for a7° promoters is based on the statistical algorithm 
proposed by Mulligan et al. (1984) and was written in Turbo C language for IBMpc 
computers. In Chis algoritlun, each base of the -35 and -10 boxes as well as the ones 
nearby them, are weighted accordingly to a score matrix. This score matrix was built up 
based on the frequency of occurrence of each base on a list of E. coli and phages a" 
promoters. The space between the -35 and -10 regions contributes in geometrical terms to 
the final score. A cutoff value is used to select only the best promoters within a DNA 
region. 
Acknowledgments 
We thank Gloria Soberón for fruitful and gratifying discussions and Noemf Flores and 
Mercedes Enzaldo for technical support. This work was partially supported by a grant 
awarded by the Dirección General de Asuntos del Personal Académico, UNAM. ) 
14 
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"i 
18 
Fig. 1. Strategies for construction of the pac derivative plasmids. Plasmids pPA2, pPA4 
and pPA25 have been previously described (Oliver et al,, 1985). The thick line in plasmid 
pPA2 represent the E. coli ATCC11105 DNA fragment that carnes the pac gene. The open 
boxes represents the -35 and -10 regions of the pac gene. Plasmid pPA50 is a pPMC1403 
(Casadaban et al., 1980) derivative in which the lacZ gene has been fusioned to the 5' 
regulatory region of pac gene. Only the relevant restriction sises are indicated. 
Fig. 2. Profiles of PA, 13-galactosidase and pac mRNA. E. coll ATCC11105 and. HB101, 
transformed with the indicated plasmids, were grown in NN minimal media at 28 °C and 
harvested at late exponencial phase. Five different induction condition were studied: Glu: 
11 mM glucose, Gly: 22 mM glycerol, Glu+PAA: 11 mM glucose + 0.1% phenyl acetic 
acid, Gly+PAA: 22 mM glycerol + 0.1% PAA and PAA: 0.1% PAA. In order to have a 
comparadve analysis of these results, the values are expressed in relative terms respect to 
the maximum value (100%) of each case. 
19 	-UTA ItSIS MI DEBE 
RIIIR • E 1k 
9.14•Iii 	• 
Fig. 3. Putative promoters in the 5' region of the pac gene. a) 1-listogram of the putative 
promoters found within the first 160 nucleotides upstrearn the initiation ATG codon, The 
statistical algorithm used in this study was the one developed by Mulligan et al. (1984). 
Arrows indicate the cutoff value for where the putative promoters proposed by Oh et al. 
(1987) (A), or Valle et al, (1986) (B) are located; the maximum score obtained within this 
region, corresponds to the latter promoter. b) The 80 bp preceding the initiation ATO 
codon of the pac gene are presented, where the transcriptional startpoint (+1 at open arrow) 
and the putative ribosome-binding site (RB) are indicated. The -35 and -10 regions of the 
promoter proposed by Valle et al. (1986), are indicated by rectangles. 
Fig. 4. Southern blot analysis for detection of the chromosomal pac gene. Total DNA from 
E. coli strains ATCC11105, HB101, JM101, W3110 (lanes 1, 2, 3 and 4, respectively), 
were digested with EcoRI enzyme, separated by electrophoresis through a 1% agarose gel, 
transfered to a nitrocellulose rnembrane and hybridized with a 32P-labelled pac DNA 
internal fragment (see Experimental procedures). Sizes of phage lambda DNA markers are 
shown in bp. 
Fig. 5. Growth of E. coli on PenG as carbon source. E. coli strain IM101, carrying either 
plasmid pMMB22 or plasmids pMMB22 and pPA25, was grown at 28 °C on NN minimal 
media, supplemented with 0.02% casaminoacids and 0.05% of PenG as sole carbon and 
energy sources. Cell density is expressed as 0.D.560 
20 
Hpa I 
4sull Eco RV L mo±  
SMal 	+DNA polymerase 
DNA ligase 
i• 
Eco R 1 	Smol 
Asult+ DNA ligase 
Hinc/111' 
• 
60— 
HB101/pPA4 
e)  loo 
80 
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40 
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 P
A
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v
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2 
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 P
A
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ATCC11105 
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Glu Gly 
HB101/pPA50 
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Deleted in plasmid pPA4 
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10 
44 i 45 i 46 
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•+. 
1 	2 	3 	4 
23130 - 
9416 - 
6557 - 
4361 - 
2322 - 
2025 
1 
f-91111 	• 
"1101(pMMB221pPA25)  
JM101 (pMMB22) 
 
0.3 
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• 
• 
l'he journal uf Laboratory Technology for Bio-research 
BioT c ni ues 
January 9, 1992 
Francisco Bolivar, Ph.D. 
Universidad Nacional Autonoma de Mexico 
Molecular Biology, Instituto de Biotechnologia 
Adpo. Postal 510-3 
Cuernavaca 
Morelos CP 622271 
MEXICO 
RE: MS n BT91-360 
Dear Professor Bolivar: 
1 am pleased to inform you that your paper entitled 
"Recovery of DNA from agarose gels..." has been accepted for 
publication. Based strictly on the date of acceptance, your 
paper would be scheduled tentatively for the August 1992 
issue. Other factors, such as priority recommendations made 
by reviewers, subject matter appropriate for a particular 
issue, or the number of papers that can be published in each 
issue, will determine whether or not your paper can be 
published•earlier. You will be informed as soon as a more 
definitive publication date has been set. 
Enclosed is a form that you are asked to return, within 
two weeks, if you do not want your paper to be made available 
through BioTechNet prior to actual publication in 
BioTechniques. BioTechNet is our international computer 
network for research biologists. Most papers accepted for 
publication are listed in the network database as articles "in 
press" and are available for a nominal fee as copies of the 
accepted manuscript or copyedited galley proofs. 
Thank you for this fine submission and for your interest 
in our journal. 
Sincerely, 
Thomas J. Stevens 
Assistant Editor 
EATON PUBLISHING • 154 E. CENTRAL STREET • NATICK, MA 01760 • (508) 655.8282 • FAX (508) 655-9910 
 
	 EECIrre=n7R-Tars ERY CA_REFULLV 
Annons ASSU:5£E 	r4.ESPONTBILM FOR CORRECTIONJ4 
APFROITS AS IS n WF-91 	 rysERTED O 
A.UTHOR'S LNITIALS: 	  
 
 
• 
  
    
       
A method for oligonucleolide-
directed, site-spedfic mutagenesis is 
reported that represents an extension of 
rnetbods based on PCR. The scheme 
affords the following advantaees: ñrst, 
it raes on a "universal" set of primers, 
complementary to tbe arcas that flank 
the cloning reglen of pUCilvl 13 veo-
tors, thus requiring only ene additional 
oligonucleotide per target site: and 
second, it is suitable for generating 
simultaneous, noncontiguous muta-
tions on the same molecule with bIgh 
efficiency. Tbe method is simple and 
robust, and uniquely suited for the 
generation of combinatorial libraries of 
nonadjacentmutations. 
Recent literature shows a nurnber of 
experimental approacbes for oligo-
nucleotide (oligo)-disected, site-speci-
fic mutagenesis employing ?CR (2-4, 
6,7,9). Some important advantages of 
these approacbes are high yield of 
mutant recovery, with concomitant 
overali speed of the procedure, and 
easy applicability on double-stre.nded 
templates. Unfortunately, many of the 
procedures proposed to date require the 
syntbesis of several eliges for each -r% 
mutagenesis experiment. In this report, h. 
,;ey we describe a set of eliges that havel 	Figure 1. Niutagenesis procedure, Plastrtid N113mpl9PHEco was used for mutagenesis. This plasmid 
• 
been suecessfully utilized CO perforrd\f is a derivative of MI 3mp19, in which a Pa•Hindill fragment of the gene encoding endonuelease EcokI 
.;. • mutagenesis experiments, in a mannee.1 (10) was cloned. Mutagcnesis was dasigned to introduce two nonadjacent restriction sites in the same 
1'7 	 to that described by Nelson and' I molecvle. Five oligos were used. A-E. °ligo A (GGAATAGCCGATCGAGATCrAG. 
N. )1.1 
, IsOn° (6) but applied to DNA frad- 
	
	GAAACAGCTATGACCATG), Oligo B (GG.4.ATAGCCGATCGAGATCTAGGA) and oligo C 
(GTTGTAAAACGACGGCCAGT)arc based en sequences adjacent lo the M13mp and pUC series of 
*- Tri¿nts cloned in M13 and pUC Niectors, 1 vectors (theyateactuafly extensions of "universal" and "reverse" M13 sequencing primera designed to 
4. f.1,1 	In ouropinion, this approach is an atz I have similar,,Trru)and should be able tia (unction with any DNA cloned on them. Oligos ID (GCCAT- 
\./ %)/ tractive alternative to other schem¿s-  TTAGATCTIGXTCTCCTC) andl (TTAACAACGCGTCCATCTGGTC) incorporate 11s111 and 3f/u1 
alees, respectively (altered bases, with re-spect to the original gene sequenw, ,are boldfaced). A 100111 11, N, t. that also call for subcloning of the frag-y 
1'
. 	
ment to be muta,genized (1,10,11). Vtrá (.1.11y 
Y . 	consider the method particularly suited 
for random, targeted mutagenesis be-
cause of the capability of the PCR to 
procced with eliges complementary te 
the tem piale only at their 3' cnds. Fur-
tbermore, as we sbow in this report, it 
is also possible to use (bis rnetbod in a 
, serial manner to perform combinatorial 
A General, PCR-Based 
Method for Single or 
Combinatorial 
Oligonucleotide-Directed 
Mutagenesis on 
pUCTM1.3 Vectors 
reaction was set up with 1 ng of M13DNA (digested with Pvult to allow for heteroduplex formation), 
combine with 10 pino! eaa of the oligos A and ID and subjected to PCR with the followies co nditions: 
30 cveles of 1 rrjn at 93eC, 1 min at 55cC and 1 min at 70`C, followed by a final reaction of 15 mía 
at 70'C (reaction 1). ?CR product I wad gel-pu:U-red and 10 ng of it were used next, in a 90111 reaction, 
tose:he( with 10 ng of template (Null-digested M13 done) perforrning 5 cycics of 1 mio at 93`C, 1 
rnin at 50`C and 1 min at 70eC (reaction 2). The resulting extension produot was amplified by adding 
pmol each of alisos B and E to the. same tubo, bringing the total volume to 103 pi and pa-forrning 
27 additional cycles, identical to the first Sive (reaction 3). Note that oligo B is not complernentary to 
the M13 template and, therefere, should only amplify DNA dmived from the primer extension of 
product 1, once the complementary sumad is afforded by primer E. The resulting PCR product II was 
used :acata in exactly the same conditioas as the previcus reaction, with the primer extenúo° voduct 
amplified by oligos B and C, 
inutagensis over scveral, noncontigu-
ous sitos. Tbe use of the additional 
"rail" (oligo A, Figure 1) that is not 
complementary te tbe original template 
sequenceallows cornbining eacb PCR 
mutant prct with the mutation en- 
ceded by a successive d 	- w igo ith 
avoidance of nonmutant sequences. 
Tbe explosive growth in the genera-
don of new metbods based on the PCR 
suggest caution in calling a method 
"novel" or "unique." Approacbes such 
as those proposed by Sarkar and Som-
eter (9) or Higuchi et al. (3) share 
several features with the method de-
scribed bere, and tbey may be simpler 
te perforen in some cases. 	te the 
) 
1 IVY\ 
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1 G1' 
/1( 
Aziliorg are respondble 
fr:r eorreet referencee. 
Tiaey 1,7411 not 	checke
at 
 
the pes'' h' cOce. 
• 
best our k-nowledge (derived from care-
ful monitoring of the directed-muta-
genesis literature), the approach de-
scribed here is general, simple and less 
costly than previously reported enes. It 
is also uniquely suited for the introdtic-
don of several noncontiguous muta-
tions in the same molecule. 
The mutagenesis procedure is de-
scribed in the Figure 1 legend. Tbe 
progress of the PCRs was monitored by 
running samples of tbem en 7.5% poly-
acrylamide gel electropboresis. As 
shown in Figure 2, products of the ex-
pected length were the major species at 
eacb stage. Tbe final PCR product was 
digested with Psti and 	ligated 
• 
Vol. 12, No. 4 (1992) BioTeehniques 8 
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Figure 2. Electrophoretk anaiyas of the PCR 
products. A, size Markers: B, C and D, PCR 
products 1, II and 111 (see Figure 1), respec-tively. 
Antlors 	re.2ponsible for correel. referenceR. 
They 	
not be c.b'ecked 
a t the pv.5113Z-2:7,f5 oillc 
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may contad the autho< at the 	Le, sea 
Wo'rechNet E•Mail bddress below. 	El  
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BioFeedback (Quebecor- place stats bere) 
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to M13mp19 digested with the same 
two enzymes and transfonned into E. 
col! DH5o."4. 
Twenty-four ilidepende.nt white 
w___Qrpflked'and verified for the 
of :gil and Afluí sites by re-
/ strictson analysts. Twenty-three clones 
had both sites incorporated (the other 
I 
	
	done usas lacking an insert). We also 
deterrnined the nucleotide sequence of 
one of the clones and confirmed that it 
corresponded to what was expected, 
Yi 	with the predictecl ¿hanges at the target, 
sites forlsonigEdesis ancl•dcrótEa'al- 
> 	terations. 
We. have repeatedly used oligos A, 
B and C to perforen other mutagenesis 
experiments and also oligo B as a com-
panion to similar scheines on different 
templates (that is, using a correspond-
ing oligo, analogoui to A). We have 
found the approach fast and reliable, 
and the only viable alternlive to per-
foren combinatorial mudteenesis on 
nonadjacent sites. We hay so 
tended Chis procedure ID general Eire 
nonadjacent point mutations, encom-
passing over 1000 bases, with satisfac-
tory results (data not shown). 
Additional mutations, not encoded 
by the mutagenic °lisos, bave been ob-
served in our laboratory, at cates con-
sistent with previous reports (3). To 
keep chis drawback at a minirnum, we 
suggest using gene fragments as short 
as possible and trying new, less error-
prone, thermally stable polymerases as 
Lb ey 	=Hable. • 
7 
..• 
REFERENCES 
1. Carter, P., H. BednuIle and G. Winter. 1985. 
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nucle.otide-direc-ted mutagenesis: • A simple 
method using two oligonucleotide primers and 
a sin gle-stranded DNA templatz. DNA 3:479-
488. 
We are srateful ro Paul Gaytdn for 
olisonucteotide syn:hesis and to Sonia 
Caro for secretaria) assistance. ,This work 
was supported by a srant from DGSCA, 
Nacional University of Mear o. Address 
correspondence lo X. Soberdn. 
Enrique Merino, J'ad Osuna, 
Francisco Bolívar and Xavier 
Soberón 
CL1GB, UNAM 
Apdo. Postal 410-3 
62271 Col, Miraval 
Cuernavaca, Morelos, Mexico 
9 BioTechn;ques 	 Vol. 12, No. 4 (1992) 
1 
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BioTechnies 
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February 13, 1992 
Xavier Soberon, Ph.D. 
Universidad Nacional,Autonona de Nexico 
UNAM; Adpo, Postal 510-3 
Cononia Miraval 62271 
Curenavaca, Morelos 
MXIc0 
RE: MS # BT91-202 
Dear Doctor Soberon: 
• 
Enclosed is the galley proof of your article entitled "A 
general, PCR-based method for single or conbinatorial..,". 
Please read the galley proof VERY CAREFULLY. Indicate if 
you disagree with any editing changes, making any necessary 
corrections directly on the galley proof. Our copy editor may 
have :nade certain changes in wording, sentence structure anca 
terminology where it was felt that readability could be 
improved without changing the technical meaning. 
Please indicate your approval of the galley proof without 
further correction3 ("as is") or "with corrections inserted" and 
return the corrected galley proof to me by Pebruary 21, 1992 so 
that we may include your papen in the upcoming April 1992 
issue. We will need the original hard copy of the galley with 
a cover letter explaining any corrections. Should you need to 
FAX the galley to us, pisase send the hardcopy and cover letter 
by mail. When FAXing, do not use a highlighting pen nor write 
in any of the margins as these details will not be transmitted. 
Be sure to program your FAX to its finest setting. 
am also enclosing information concerning reprints, which 
may be ordered at your oonvenience. Prepayment is required ©n 
all orders to be shipped outside of the U.S. Please call for 
shipping charges. All payments must be in U.S, funds, drawn on 
a U.S. bank. 
Thank you again for your fine submission, 
Sincerely, 
Thomas J. Stevens 
Assistant Editor 
EATON PLBL]SHING • 154 E. CENTRAL STREET • NATICK, 11A 01760 • (508) 655-8282 • FAX (508) 655.9910 
RECOVERY OF DNA FROM AGAROSE GELS 
• 
STAINED WITH METHYLENE BLUE. 
Address co:respondence to E. Merino 
• 
Noerni Flores, Fernando Valle, Francisco Bolivar and Enrique Merino. 
Deparnent of Mofecular Biology, Instituto de Biotecnología, 
Universidad Nacional Autónoma de México. 
Apdo. Postal 510-3, Cuernavaca Mor. CP 62271, México. 
Tel. (52)(73)17-2399. FAX (52)(73)17-2388. 
RECOVERY OF DNA FROM AGAROSE GELS 
STAIN9 WITH METHYLENE BLUE. 
Numerous rnethods have been publishefl for isoladng and purifying 'DNA from 
agarose gels. However, most of them 	ethidium bromide (EtBr) staining and IN light 
for DNA visualization. This rnethod has some disadvantages due to the carcinogenic effects 
of EtBr, complicating handling and disposal of this chemical and stained gels. Furthermore, 
radiation also induces mutations that might affect integity of the isolated DNA. In this 
communicadon ve report the appiication of rnethylene blue (MB) staining to visualize 
DNA in aearosé gels, This DNA can be. easily isolated and used for ligation and 
cansformadon. 
To test the sensidvity of our staining rnethod, 4 1.te of pKX2.23-3 plasraid were 
digested vlith EccRI accordingly to the supplier (Boehringer Mannheim). Serial diludons of 
this DNA va. ing from 1 jig to 65 ng were loaded in nvo 1% agarose-TBF, gels (5 rnm 
thick with 2x6 mm wells). One gel was stained with EtBr using a standard protocol (2). 
The other gel vas stained for 15 minu:es with a 0.02% MB soludon in disdlled water. 
Aftet-wards, the gel wa.s de.-stained with disdlled water for 15 minutes. 
The ET3r-stained gel was photographed using a Uy trarisilluminator and the lvf.B-stained gel 
was photographed using a white light box. The results are presented in figrze 1. As can be 
seen, using MB-staining, 62,5 ng. of DNA can be visuaiized easily (see fig. 1B). However, 
EtBr is four dmes more sensitive tha.n 	therefore the MB staining proce4dure is mainly 
applicabie when high asnounts of DNA are loaded, i.e. preparadve gels. It is imr.tortan: to 
mention that longer de-staining times does not increase resoluzion. 
/ 
In order to compare the transformadon  efficiency of MB with Effir-sta.i.ned DNA, 4 110 
of M13 mp8 DNA phage digested with EcoRl were loaded into two gels. They were 
elecrrophoresed and stained 'With EtBr or !dB respectively. Afterwards, the DNA bands 
were iisua_lized with the appropriate 1i2ht source, cut out with a razor blade and placed 
into microcentrifuge . tubes. Two different rnethods were used to purify the DNA from 
agarose. The phenol-freeze method (1) and NaI-glass method (accordingly to the suppliers 
of the. GeneClean kit, Bio 101, La Jolla, C.A.). 0.1 p...q of DNA isolated by these two 
methods, were ligated and transforrned into calcium-chioride competent E. culi IM101 
The nurnber of plaques were scored and the results are presented Ln Table 1. The aboye 
procedure was perfon-ned three times from •,,Yhich reproducible results were obtained. 
The number of plaques obtained with MB stained-DNA was t'Atice of EtBr-stained 
DNA and did not depend on the purification method. Based on these results, we believe 
that the MB staining procedure offers a 9.00d and safe alternadve to obtain z highly 
clonable DNA, even that, when it is compeled with EtBr, is less sensidve. 
REFERENCES 
1. Benson, S.A. 1984. A rapid proc.'eduré for Isolation. of DNA Fragments from Aearose 
Gels. BioTechniques. 2:66-67. 
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2. Sambrook4., E.F.Fritsch and Tjvlaniatis. 1989. Molecular Clonine: A laboratory 
Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, Coid Sprins. Harbor, NY. 
Table 1. 
Staining`and 	No. of plagues 
isolation procedures 	x10 -3 
MB/Nal-glass 	 3`.0 
EtBr/Nal-glass 	1.4 
MB/Phenol-freeze 	3.2 
EtBr/Phenol-freeze 	1.7 
• 
Table 1. Number of plagues obtained alter transforrning E. coli with DNA isolated frorn 
agarose gels stained with N1B or EtBr. M13 rnp18 DNA was digested with EcoRl and 
electophoresed into a 1% agarose-TBE gel, Different lames were stained with either MB or 
EtBr. Alter purification using either Nar-glass or phenol-freeze rnethods, 0.1 tg of these 
DNAs were ligated and used to trnsform E. coli .T.N4101 cells. The number of plagues 
obtained with each one of the DNAs are indicated. 
Figure 1. DNA stained with 1\1B or EtBr. Serial dilutions of M13 mpS linear DNA: 1000, 
500. 250, 125, 62.5, 31.25 and 16.25 ng Manes 1-7, respectively), were loaded and 
elecu-ophoresed into a 1' agarose-TBE gel and stained with either EtBr (A) or MB (B). 
• 
1 
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A) 	 • 
2 3 4 5 6 7 8 
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2 3 4 5 6 
yV 	f.141-0 	v'• • ' I. • 
1 
ORIGINE OF LIFE 
AND EVOLUTION OF THE BIOSPHERE 
The Journal of the International Society for the Study of the Origin of Life 
Editor: JAMES P. FERRIS 
Department of Chemistry 
Rensselaer Polytechnic instituir 
Troy, NY 12180-3590 
U.S.A. 
 
Telephone: (518) 276-8493 
Telex: 6716050 RPI T'ROU 
BITNET:..1FerrisaRPITSMTS 
Fax: (518) 276-4045 
  
October 11, 1991 
Dr. Francisco Bolivar 
Dept. of Molecular Biology 
Universidad Nacional Autonoma 
Apdo. Postal 510-3 
Cuernavaca 
Mor. CP 62271, MEXICO 
Dear Dr. Bolivar: 
Re: Ms. #475 - New Insights on the Comma-Less Theory (2nd Revision) 
Thank you for providing an additional clarification of your manuscript. 
I have accepted it for publication and forwarded it to the publisher. You will 
receive page proofs in about two months. 
Thank you for your contribution to the Journal. 
Sincerely yours, 
James P. Ferris 
  
Editor 
  
   
PUBLISHER: KLUWER ACADEMIC PUBL1SHERS, P.O. BOX 322, 3300 AA DORDRECHT, HOLLAND; AND 
P.O. BOX 358, ACCORD STATION, HINGHAM, MA 02018-035S, U.S.A. 
; 
NEW INSIGHTS ON THE COMMA-LESS THEORY 
Enrique Merino, Paulina Balbás and Francisco Bolivar 
Department of Molecular Biology, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional 
Autónoma de México, 
Apdo. Postal 510-3, Cuernavaca, Mor. CP 62271, México. Tel. 
(5273) 17 23 99. 
Offprint requests to: Dr. Francisco Bolivar 
Key words: Genetic code, Comma-less theory, Sequence analysis. 
Summary 
The cometa-less hypothesis represents a theoretical effort to describe one of the steps in 
the early evolution of the translation apparatus. This hypothesis emphasizes the advantages 
that a RNY coding pattern would have provided in a primitive RNA adaptor-catalyst system. 
This theory has been debated for years, both in conceptual and statistical tercos, and no 
consensus about lis validity has been ascertained. In this work, a statistical model refuting this 
theory was reconsidered. This new approach eliminates the bias due to the absence of stop 
codons in the open reading frame, and to the amino acid composition of bacteria! genes. The 
results obtained support the biological significance of the RNY coding pattern. 
Introduction 
One of the major questions in molecular biology has been the origin and early evolution 
of the genetic code. The comma-less theory states that in a primeval stage in the evolution 
of the txanslation apparatus, only codons of the form RNY were used, thus providing a 
primitive message in which translatable codons could only be found in one of the three 
possible reading frames. This theory emphasizes the positional conelations between purines 
(R) and pyrimidines (Y), and for years much debate and further elaboration of the concept 
has been carried out (Crick et al. 1957, 1976; Eigen and Shuster 1978; Shepherd 1981, 1984, 
1990; Staden 1984; Wong and Cedergren 1986). With the advent of powerful DNA sequencing 
techniques and the use of computers to perform searches for reiterative patterns of bases in 
long stretches of DNA, a prebiotic genetic coding system proposed to be RNY has been 
supported (Shepherd 1984), although the possibility of the repeating RNY pattern being the 
outcome of natural selection has not been ruled out (Wong and Cedergren 1986). 
Remnants of such RNY-rich messages can still be detected almost everywhere in coding 
regions. Computer programs have taken into account this property to discern the actual reading 
frame in newly determined DNA sequences (Shepherd 1981, 1984, 1990). Briefly, in these 
programs a sequence is scanned so that a test window length of DNA is taken and moved 
along the sequence in steps. In the test length, 	mutations away from the. RNY pattern 
in the first and third positions are counted in each reading frame, and the RNY codons are 
considered to be in the frame with the least such mutations. 
A hypothesis refuting this notion has been presented by Staden (1984). He claims that 
although this method does indeed generally indicate the correct reading frame, the biological 
significante about the RNY code being a relic from a primeval comma-less genetic code is 
inaccurate. To demonstrate this position, Staden generated very long random amino acid 
sequences without codon preferences but exhibiting exactly Dayhoff's protein sequence 
database average amino acid composition. A hypothetical gene was then derived from the 
amino acid sequence, using the triplets that code for each amino acid in an evenly probable 
way. He observed that in this gene it was possible to predict the real reading frame with 
Shepherd's method (1981). From this study Staden concluded that the average amino acid 
composition and the absence of stop codons in the coding frame, rather than codon 
preferences, are sufficient to explain how Shepherd's method will choose correctly (Staden 
1984). However, this fact alone might not be sufficient to invalidate the comma-less theory 
because when the information contained in DNA sequences of coding genes is considered, a 
different outcome is observed. 
Materials and Methods 
All the programs used in chis study were written in C language and ran under a UNIX 
operating system on a DECstation 3100. The information recorded in the Genbank release 
62 was screened prior to the analysis in order to remove redundant gene sequences. The 
codon values were calculated according to equation 1 and the results are depicted in Table 
L The coefficient YRNy/V„,,,RNy was estimated independently for every gene and these results 
were averaged to obtain the ratio preferente. 
Results and Discussion 
To prove that the information contained in the actual DNA sequences is relevant to the 
evolutionary theory sustained by the RNY code pattern, we repeated the experiment devised 
by Staden (1984), using a new approach. Instead of considering the deviations away from 
the RNY pattern in absolute terms, a numeri-cal value was given to each codon accordingly 
to the probability of choice between RNY (P(RNY) } versus non-RNY (P(non-RNY)) codons 
for every amino acid of the randomly generated protein, according to the following equations: 
(1) Voy = 1 - P (RNY) or Vnon.my = 1 P (non-RNY) 
2 
Therefore, the value (V) for those codons where no choice is possible between RNY or 
non-RNY equals zero (ie., the stop codons that are YNR), whereas the value for those codons 
where a choice is possible, depends on the number of triplets that code for the given amino 
acid. The value (Y) for each codon is presented in Table L 
Following the experimental design by Staden, very long amino acid sequences exhibiting 
exactly Dayhoff's protein sequence average amino acid composition, were generated at random. 
From these amino acid sequences, the corresponding nucleotide sequences were also randomly 
generated and the numerical values for EVRNy and EV,,„„.1,Ny were calculated. These values were 
identical therefore the coefficient EV„Ny/EV„„„.„Ny equaled 1. However, when this analysis was 
performed on a gene by gene basis, utilizing all the prokaryotic sequences reported in the 
Genbank, the average coefficient obtained was 1.6. This result implies that even when no bias 
is introduced due to the presence of stop codons (V=0) or to the amino acid composition per 
se (V,<N y equals Vnon.RNY  for every amino acid), a predilection for codons with the RNY forrn 
is present, 
Most of the statistical analisis concerning RNY pattern on DNA squences have 
considered exclusively the RNY frequency of appearence in absolute terms (Staden 1984, 
Nussimat 1984, Wong and Cedergren 1986). Our probabilistical approach differs from the 
previous ones in that the contribution of the RNY pattern is consider relative to its probability 
of selection and so different outcomes can be seen. The 1.6 coefficient obtained indicated that 
there is a strong bias in favour of the choice of RNY triplets in present day genes. However, 
it is not clear whether this fact represents the residue of a primitive gene structure (Shepherd 
1984) or the effect of a natural selection process (Wong and Cedergren 1986), or both. Strong 
argumentation against the view of a primitive genetic coding system has been presented by 
Wong and Cedergren (1986) based on the analysis of mutational rates of a variety of genes. 
However, it is important to mention that the theory of the coevolution of the amino acids and 
the genetic code also developed by Wong (1981), states that the prebiotic amino acids used 
for primaeval protein synthesis were encoded exclusively by RNY triplets (except Asn). This 
proposal supports the view that a RNY coding system existed long before life as it is known 
today. The results obtained in this work taken by their own might not offer sufficient evidence 
to clear this debated issue. Neverthelees, we consider that our new approach to analize the 
data, might help to consider new points of view and is conclusive about the preferente to the 
RNY pattern in present day genes. 
Acknowledgments 
We thank Dr. Antonio Lazcano and Dr, Xavier Soberón for fruitful discussions and critical 
review of the manuscript. 
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Table 1. Numerical values 	(V) for the genetic code. 
the form RNY are presented in bold face. 
U 	 A 
Triplets of 
G 
Phe UUU 0.00 Ser UCU 0.33 Tyr UAU 0.00 Cys UGU 0.00 
Phe UUC 0.00 Ser UCC 0.33 Tyr UAC 0.00 Cys UGC 0.00 
Leu UUA 0.00 Ser UCA 0.33 End UAA 0.00 End UGA 0.00 
Leu UUG 0.00 Ser UCG 0.33 End UAG 0.00 Trp UGG 0.00 
Leu CUU 0.00 Pro CCU 0.00 His CAU 0.00 Arg CGU 0.00 
C Leu CUC 0.00 Pro CCC 0.00 His CAC 0.00 Arg CGC 0.00 
Leu CUA 0.00 Pro CCA 0.00 Gin CAA 0.00 Arg CGA 0.00 
Leu CUG 0.00 Pro CCG 0.00 Gln CAG 0.00 Arg CGG 0.00 
Ile AUU 0.33 Thr ACU 0.50 Asn AAU 0.00 Ser AGU 0.66 
A Ile AUC 0.33 Thr ACC 0.50 Asn AAC 0.00 Ser AGC 0.66 
Ile AUA 0.66 Thr ACA 0.50 Lys AAA 0.00 Arg AGA 0.00 
Met AUG 0.00 Thr ACG 0.50 Lys AAG 0.00 Arg AGG 0.00 
Val GUU 0.50 Ala GCU 0.50 Asp GAU 0.00 Gly GGU 0.50 
Val GUC 0.50 Ala GCC 0.50 Asp GAC 0.00 Gly GGC 0.50 
Val GUA 0.50 Ala GCA 0.50 Glu GAA 0.00 Gly GGA 0.50 
Val GUG 0.50 Ala GCG 0.50 Glu GAG 0.00 Gly GGG 0.50 
   
   
   
  
5 
   
   
   
Enrique Merino, Paulina Balbás, José Luis Puente and Francisco Bolivar. 
Departamento de Biología Molecular, Instituto de Biotecnología, 
Universidad Nacional Autónoma de México. Apdo. Postal 510-3, 
Cuernavaca, Mor. CP 62271, México. Tel. (5273) 17-23-99. 
Offpfint requests to Dr. Francisco Bolivar. 
Key words: Genetic code, open reading frames, comma-less theory, 
double stranded coding. 
1 
Are overlapping reading frames a remanent of the early coding system? 
SUMMARY 
We address the cuestion whether the overlapping open reading frames (ORFs) are 
determined by natural selection or is a relic of the earliest stages in the evolution of the 
coding system. We performed an extensive search in the Genbank release 63 and identified 
a large group of genes with totally ORFs in the anti-sense complementary DNA strand, 
This is a frequent, nonrandom phenomenon which is highly prevalent in bacteria although 
it is also present in a wide variety of species. The analysis of these bacteria' genes with 
100% overlapping ORFs contain a higher proportion of triplets in the RNY form (purine 
-any nucleotide- pyrimidine) as well as higher GC content than the average value obtained 
for all the genes in the database. The sequences of gene families as well as homologous 
proteins in different species were studied, but no DNA sequence patterns were observed. 
The evolutionary implications of these data are discussed in the light of the theoretical 
capacity of overlapping DNA strands to code for proteins in an early stage of life. 
INTRODUCTION 
Modern biochemistry provides evidence that metabolism was once based on processes 
mediated by messenger-catalyst RNA molecules. RNA structures are proposed to have 
functioned as organizing centers that coordinated the arder and nature of biochemical 
reactions using base-pairing interactions (Tyagi 1981; Gibson and Lamond 1990). There is 
theoretical and statistical evidence supporting the view that codons of the form RNY 
(purine - any nucleotide 	pyrimidine) were preferentially used in this initial stage, thus 
providing a primitive message in which translatable codons could mainly be found in one 
of the three possible reading frames. This could have represented a considerable advantage 
for a primitive translation system in that a start signal would not be required to indicate 
the correct reading frame and no blockages of translation would occur due to primaeval 
RNA adaptar molecules attaching themselves in the wrong frame of the message. This is 
the basic statement of the Cometa-less theory (Crick 1957; Eigen and Shuster 1978; Tyagi 
1981; Shepherd 1984, 1990). This theory has been debated both in conceptual and 
statistical terms, and no consensos about its validity has been ascertained. However, recent 
2 
reconsideration of a statistical model strongly refuting the comma-less theory (Staden 
1984), has led to new insights that support that the theory might be correct (Merino et. 
a/.,1991, in press). 
Most importantly, in a relatively later stage in evolution, when this RNY code was 
imprinted into double-stranded DNA, these molecules would exhibit the same overlapped, 
in-phase RNY code pattern in the 5'---> 3' direction, which meant that both strands could 
have directed the synthesis of different proteins by acting either directly as messengers, or 
indirectly as templates for RNA synthesis. The discovery of present-day genes with the 
capacity to code for mRNAs in overlapping strands supports this hypothesis (Rak 1982; 
Inouye 1988; Simons 88; Henikoff et. al., 1986; Adelman 1987; Spencer et. al,, 1986). 
There are also some reports where large ORFs (Open Reading Frames) have been detected 
in the antisense strand of a number of genes, but no expression of such putative proteins 
has been ascertained in most of the cases (Shepherd 1984; Goldstein and Brutlag 1989; 
Kumamoto and Nault 1989). Moreover, some discussions are available about the theoretical 
coding capacity of both DNA strands, and the properties that should be exhibited by the 
proteins coded by both strands (Casino et. al., 1981; Alff-Steinberg 1981; Tramontano 
1984; Sharp 1985; Zull and Smith 1990; Miyajima et. al., 1990; Blalock 1990; Brentani 
1990; Sloostra and Roubos 1990). 
Based on these observations, we decided to conduct a computer analysis of the 
antisense DNA strands of all the bacterial nucleotide sequences present in the Genbank to 
evaluate the frequency of occurrence and some properties of these ORFs. Our search 
detected a prominent group of bacterial genes containing unusually large overlapping ORFs 
in the antisense DNA strand. A statistical analysis confirined that the length of these ORFs 
was far from random (Tramontano 1984) but unexpectedly, a considerable group of genes 
was identified where the ORF overlapped entirely with the cocling gene of the sense strand 
or even extended further. This phenomenon appears to be prevalent in bacterial organisms 
for they represent 12% of the total bacterial gene entries in the database, although it is not 
absent in other species. The genes with totally overlapping ORFs contain a higher 
preference of triplets in the RNY fonn, when a choice of RNY versus non-RNY codons is 
possible (ile, thr, ser, gly, val, ala) than the average value, this suggesting that the 
tendency for using RNY codons and the theoretical capacity of coding in both strands may 
be related. There is also a positive correlation between the GC content of the DNA 
3 
1,4,11,f 
sequences analyzed and the overlapping percentage, but this fact alone does not account 
exclusively for this observation. Some of these genes have been identified as highly 
expressed and presents an important codon usage bias. We propose a hypothesis which 
correlates the theoretical two-strand coding capacity to the evolutionary process of the 
genetic coding system. 
MATERIALS AND METHODS 
All the programs developed for this study were written in C language and ran under a 
UNIX operating system on a DECstation 3100. The only source of information used in this 
study was the one recorded in Genbank release 63. This information was screened prior to 
the analysis in order to remove redundant nucleotide sequences. Eukaryotic sequences were 
edited to remove introns. We define an overlapping antisense ORF of a gene as the largest 
reading frame between two in-phase termination codons TGA, TAG or TAA in the 5'--->3' 
direction of the antisense DNA strand, When the antisense ORFs extend beyond the 
inidation or termination triplets of the gene sequence, the length is limited by the coding 
region of the sense strand. The codon usage for bacterial genes was calculated directly 
from the information recorded in the database. The GC content of genes was also 
calculated from the DNA sequences, therefore the values may differ from those obtained 
experimentally. The RNY index was previously described (Merino el., al., 1991). 
RESULTS 
Size distribution of antisense ORFs Bacterial sequences of protein encoding genes 
present in Genbank were used to generate the complementary DNA strand in order to 
identify the ORFs in every antisense strand in the 5'--->3' direction (antisense ORF). The 
largest antisense ORF present within each gene was selected to carry out a statistical 
analysis from which a modal distribution was obtained as it can be seen in Fig. la, Most 
of the antisense ORFs found are distributed in a Gaussian fashion, where the media and 
the standard deviation are 1059 bp and 701 bp respectively. However, there is a 
conspicuous group óf genes that show a statistically significant antisense ORF length, 
4 
which is by different criteria far beyond random. 
A control analysis was designed to verify whether the results obtained were significant 
or an effect of preferential codon usage and amino acid composition. The amino acid 
sequences of each bacteria]. protein in the Genbank were used to generate two different 
hypothetical nucleotide sequence databases, where the corresponding coded proteins are 
identical to the real ones in order to avoid any bias due to amino acid composition and 
gene length. The first hypothetical database contained randomly chosen codons for every 
amino acid (Fig, 1b), whereas the choice of triplets in the second database •was generated 
according to the codon usage exhibited by the actual DNA sequences present in the 
Genbank (Fig. 1c). The differences between Figs. lb and lc are a consequence of codon 
usage that affect the frequency of the codons TTA, CTA and TCA (stop codons in the 
antisense strand). However, the difference observed when comparing the hypothetical gene 
distribution in Fig. lc with the real gene distribution depicted in Fig, la, indicate that the 
length of these antisense ORFs is not an exclusive consequence neither of codon usage, nor 
of amino acid composition. 
Overlapping percentage of the antisense ORFs The overlapping percentage of every 
coding gene in the sense strand with its largest antisense ORF was also analyzed, and the 
results are shown in Fig. 2a. The observed trend matches the one previously observed in 
Fig. la, in that a normal distribution is found for the majority of the genes, while a 
considerable group of genes have a totally overlapping antisense ORF. In many cases, the 
antisense ORF extends beyond the initiation or termination codon of the sense strand, and 
this fact accounts for the size of the peak observed. It is important to note that the lengths 
of the genes with totally overlapping ORFs are not considerably biased towards smaller 
sizes (see the irisen in Fig. 2a), which supports the view that this is not exclusively a 
size-dependent phenomenon. 
An analogous control analysis was also carried out to verify that this distribution was 
not fortuitous, Fig. 2b shows the distribution obtained for a hypothetical nucleotide 
sequence database generated on a gene by gene basis with randomly chosen triplets, as it 
can be seen, a smaller peak corresponding to randomly generated 100 % overlapping 
antisense ORFs is observed. The coinciding peak present in Fig. 2c indicates that codon 
usage imprints a considerable bias in the appearance of overlapping ORFs. Nevertheless, 
comparison of the peaks in the three graphs in Fig. 2 supports the view that the totally 
   
 
   
overlapping antisense ORFs are definitely nonrandom, and are not an exclusive effect of 
codon usage, amino acid composition or gene size, so therefore they might possess 
biological significance. 
Analysis of the nucleotide sequences of the genes with totally overlapping antisense 
ORFs. The positional correlation of purines and pyrimidines and the GC content were two 
parameters evaluated in order to assess the significance of the 100% overlapping antisense 
ORFs phenomenon. Computer programs were devised to scan for the positional correlations 
between purines and pyrimidines, and to determine whether or not triplets with the pattern 
RNY were preferentially used in the genes with 100 % overlapping ORFs. The algorithm 
has been described in detall elsewhere (Merino et. al., 1991). Suffice it to say that a 
coefficient indicating the preferencial usage of RNY codons versus non-RNY codons 
whenever a choice is possible (ile, thr, ser, gly, val, ala) was obtained. The bias due to the 
absence of stop codons in the reading frame and to the average amino acid composition of 
proteins were eliminated. Absence of codon preference results in a value of 1, so 
deviations from this figure indícate bias by codon preference. When this analysis was 
performed on a gene by gene basis in the database, the average coefficient obtained was 
1.6, indicating the existente of a predilection for codons with the RNY form. However, 
when the genes with totally overlapping ORFs were tested in identical conditions, a higher 
coefficient of 2.2 was obtained. Some of these genes have been identified as highly 
expressed and are known also to be present in the earliest living organisms. 
Higher CC content might result in lower abundance of stop codons in the antisense 
strand, which could be partially responsible for the prominent peak in Fig. 2a. The oyeran. 
GC content of the bacterial genes was determined to be 51%. Nevertheless, the genes with 
totally overlapping ORFs in bacteria contain an average value of 62% GC. 
Correlation study of the RNY and GC contents to overlapping percentage of 
different species. A detailed study of individual organisms was designed in order to 
determine the correlation between RNY codons and overlapping percentage of . individual 
species. A positive correlation with a value of 0.57 was obtained and the results are 
presentad in Fig. 4. 
Deterrnination of the correlation between GC content and overlapping percentage of all the 
genes reported for those species was also obtained. The average values for both parameters 
were calculated and plotted in Fig. 3, where a positive correlation of 0.87 can be observed. 
  
  
  
DISCUSSION 
It is a well established phenomenon that a nonrandom coding capacity exists in the 
complementary DNA strand of some protein encoding genes (Casino 1981; Tramontano 
1984; Alff-Steinberger 1984; Sharp 1985).This capacity is given by large overlapping 
ORFs, and their frequency in bacterial genel is depicted in Fig. la, The data presented 
thereafter extend these observations by calculating the overlapping percentage of these 
ORFs, by analyzing the coding pattern exhibited by these genes, and by correlating this 
capacity to the evolutionary implications of this phenomenon. 
It has been argued that long antisense ORFs are a consequence of the low usage of 
codons PITA, CTA and TCA, which are the triplets opposite to the stop codons in the 
5'--->3' direction (Staden 1984). This tendency is observed when comparing Figs, 2b (no 
codon bias present) and 2c (bias inflicted by bacterial codon usage). However, the fact that 
such a large number of genes contain a 100 % overlapping single ORF (Fig. 2a), suggests 
that the function of the antisense DNA strand in a previous evolutionary stage was not 
solely restricted to serve as a necessary conduit for double stranded semiconservative DNA 
replication. In this context, we would like to propose that the double strand coding capacity 
of DNA rnolecules may have been advantageous in the injtial stage to assay a higher 
number of potendal.coding sequences in order to obtain more proteins capable of biological 
function. Once function was obtained, the DNA coding sequence became "frozen" and 
entered a process of natural selection in order to become improved, while the antisense 
ORF remained as a relic of this stage. 
Examination of the coding pattem of the bacterial genes in the database showed two 
important facts. The first is that no marked global preference of GC over AT (51% GC) is 
present in the bacteria' database. Nevertheless, when the analysis was done with the genes 
containing totally overlapping ORFs, a value of 62% GC was obtained. This bias was also 
observed when genes from individual species were studied. A positive correlation of 0.87 
between GC content and overlapping percentage was observed (Fig. 3). 
The second fact observed is the existence of a preferential usage of the RNY codons for 
those amino acids where a choice between RNY and non-RNY triplets is possible (ile, thr, 
ser, gly, val, ala). There is a considerable bias towards the use of RNY codons in the 
bacteria' database, described by the 1.6 coefficient value observed. However, the genes 
containing totally overlapping ORFs have an enlarged coefficient of 2.2, indicating that 
  
  
  
1,1 
these codons are largely preferred. The bias due to preferential usage of RNY codons is 
also observed when genes from individual species were studied. In this case, a positive 
correlation of 0.57 between RNY and overlapping percentage was obtained (Fig. 4). The 
importance of both findings is supported by the observation that measurements of the 
stability and lifetime of GC and AT pairs imply that in the early phase of primitive 
translation, GC-rich sequences liad the advantage over AT-rich sequences (Kuppers 1984). 
This is in agreement with the idea that the genes with totally overlapping ORFs retain 
some properties of the earliest genes, therefore their RNY preferente and GC content is 
expected to be higher, 
As it was previously mentioned, the RNY pattern on the sense strand, generates also a 
RNY pattern on the antisense strand in the 	direction. The eminent predilection of 
codons in the form of RNY might provide a device for selection pressure because of the 
symmetry granted to both DNA strands. The overlapped, in-phase RNY triplets in both 
strands might then be a reflection of a primitive structure, not only of the genetic code but 
of the translation process as well because both strands could act as templates. This does 
not imply that both strands should be today simultaneously transcribed, but rather supports 
our hypothesis that DNAs with the capacity to code for the highest possible number of 
proteins may have had a selective advantage in an earlier stage of molecular evolution. 
This conjecture is supported by two independent fines of evidente. The first is the 
theory of the coevolution of the genetic code and amino acid biosynthesis developed by 
Wang (1975, 1981). According to this author, not all the 20 amino acids were originally 
present in the primaeval genetic code, but were accommodated in a series of stages until 
the actual genetic code was established. Remarkably, the earliest amino acids were those 
which nowadays retain prevalently the form RNY, and none of them produces a stop codon 
in the antisense strand. Wong questions the value of the comma-less theory as opposed to 
natural selection. Based on calculated mutation cates of present-day genes, this author 
discards the possibility of RNY as relics of an ancient pattern of genetic coding (Wong 
1986).. However, in the light of the "frozen stages" hypothesis in the evolution of the 
genetic code presented aboye, the results of this study indicate that both, a primitive gene 
structure and natural selection are Hable for the widely spread phenomenon of overlapping 
antisense ORFs. In accordance with this notion is the fact that the RNY message is 
particularly well preserved in genes which have been required to be heavily expressed 
8 
throughout their evolutionary history. The ribosomal proteins and the translation-related 
protein factors studied in detall reveal that in fact, the RNY pattern in these proteins is 
highly preserved. Although it is prevalent in bacterial species, it may still be identified in 
phylogenetically distant species as well. 
The second supporting line of evidente is offered by the observations that interacting 
sises in eukaryotic hormone-receptor proteins are componed of complementary amino acid 
sequences that might have originated from a single DNA molecule (Goldstein and Brutlag 
1989; Zull and Smith 1990; Blalock 1990; Sloostra and Roubos 1990, Brentani 1990). Thig 
molecular recognition theory claims that overlapping ORFs•for certain eukaryotic hormones 
have the capacity to code for putative proteins with complementar)/ hydropathy that might 
dfrect the hormone-receptor interaction. Further development and experimental verification 
of this theory are necessary before its validity can be ascertained, but if this mechanism is 
indeed present in such an evolved protein interaction system, it is suggestive that it might 
also be present in other species. 
In conclusion, the nature of the molecular features now described and the fact that 
these are so prevalent in bacteria, strongly suggest that this gene organization offered an 
evolutionary advantage, which may relate to genetic translation and to the coding capacity 
of double stranded molecules. The information provided here also supports the view that 
the RNY coding pattern was once used in earlier life systems, and prevails in present day 
genes, although it is not certain whether they are a relic from a previous stage in the 
organization and evolution of the genetic code and the translation process or a result of 
natural selection. Owing to the lack of evidente of these primitive stages, every hypothesis 
must remain under constant survey so that the extense gap in our empirical knowledge is 
closed by theory. 
Figure 1. Length distribution of the bacterial overlapping ORFs. (a) Actual bacterial gene 
sequences. (b) Control analysis using a putative database generated with randomly chosen 
codons for every amino acid. (c) Control analysis with a putative database generated using 
the codon usage of the actual bacterial Genbank sequences. 
Figure 2. Overlapping percentage distribution of the bacterial overlapping ORFs. (a) Actual 
bacterial gene sequences. The insert shows the size distribution of genes with totally 
overlapping ORFs. (b) Control analysis tising the putative database containing randomly 
chosen codons for every amino acid. (c) Control analysis using the putative database 
generated with the codon usage of the actual bacterial Genbank sequences. 
Figure 3. Correlation between the overlapping percentage of the ORFs and the (3C content 
of individual species. The GC content was theoretically calculated using the DNA 
sequences reponed. Fig. 4. Correlation between the overlapping percentage of the ORFs 
and the RNY index of individual species. 
10 
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