DOCTORADO  EN  CIENCIAS  BIOMÉDICAS   INSTITUTO  DE  NEUROBIOLOGÍA   PAPEL  DE  LOS  CANALES  DE  K+  SENSIBLES  A  ATP  EN  LAS   ALTERACIONES  DE  LA  COGNICIÓN,  DE  LA  ACTIVIDAD  ELÉCTRICA   HIPOCAMPAL  Y  DE  LA  PLASTICIDAD  SINÁPTICA  PRODUCIDAS  POR  EL   PÉPTIDO  BETA  AMILOIDE   TESIS   QUE  PARA  OPTAR  EL  GRADO  DE:   DOCTOR  EN  CIENCIAS     PRESENTA   LBT.  KARLA  GEORGINA  SALGADO  PUGA   TUTOR  PRINCIPAL   DR.  JOSÉ  FERNANDO  PEÑA  ORTEGA   INSTITUTO  DE  NEUROBIOLOGÍA   COMITÉ  TUTOR   DRA.  MARTHA  L.  ESCOBAR  RODRÍGUEZ   FACULTAD  DE  PSICOLOGÍA   DR.  ROBERTO  A.  PRADO  ALCALÁ   INSTITUTO  DE  NEUROBIOLOGÍA   QUERÉTARO,  QRO.,  OCTUBRE  2017 UNIVERSIDAD  NACIONAL  AUTÓNOMA  DE  MÉXICO UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor.   UNIVERSIDAD  NACIONAL  AUTO7 NOMA  DE  ME7XICO   DOCTORADO  EN  CIENCIAS  BIOMÉDICAS   INSTITUTO  DE  NEUROBIOLOGÍA   PAPEL  DE  LOS  CANALES  DE  K+  SENSIBLES  A  ATP  EN  LAS  ALTERACIONES  DE  LA  COGNICIÓN,  DE  LA   ACTIVIDAD  ELÉCTRICA  HIPOCAMPAL  Y  DE  LA  PLASTICIDAD  SINÁPTICA  PRODUCIDAS  POR  EL   PÉPTIDO  BETA  AMILOIDE   TESIS   QUE  PARA  OBTENER  EL  GRADO  DE   DOCTOR  EN  CIENCIAS     PRESENTA   LBT.  KARLA  GEORGINA  SALGADO  PUGA   TUTOR  PRINCIPAL   DR.  JOSÉ  FERNANDO  PEÑA  ORTEGA   SINODALES   DRA.  GOHAR  GEVORGYAN                                                                                                                                    __________________________________   PRESIDENTE   DR.  JOSÉ  FERNANDO  PEÑA  ORTEGA                                                                                            __________________________________   SECRETARIO   DR.  JOSÉ  GERARDO  ROJAS  PILONI                                                                                                      __________________________________   VOCAL   DRA.  CLAUDIA  GÓMEZ  ACEVEDO                                                                                                        __________________________________   VOCAL   DR.  LUIS  BERNARDO  TOVAR  Y  ROMO                                                                                        __________________________________   VOCAL
 AGRADECIMIENTOS   Deseo  expresar  mi  agradecimiento  de  manera  especial  por  el  apoyo  de  las  siguientes  personas:     Ing.  José  Adán  Hernández  Bolaños   Dr.  Benito  Ordaz   cDra.  Martha  Estela  Albino  Sánchez     Dra.  Mónica  Andrea  López  Hidalgo     Dra.  Andrea  Cristina  Medina  Fragoso     Dra.  Deisy  Gasca  Martínez   M.V.Z.  Martín  García  Servín     Sra.  Alejandra  Castilla  León   Sr.  Rigoberto  Hernández  Calderón   A  los  miembros  de  mi  comité  académico  por  su  apoyo  y  contribución  al  proyecto:   Dr.  Roberto  Agustín  Prado  Alcalá   Dra.  Martha  Lilia  Escobar  Rodríguez   A  los  sinodales  por  la  revisión  y  sus  valiosos  comentarios:     Dra.  Gohar  Gevorgyan  Markosian,  IIB   Dr.  José  Gerardo  Rojas  Piloni,  INB   Dra.  Claudia  Gómez  Acevedo,  FM   Dr.  Luis  Bernardo  Tovar  y  Romo,  IFC   A  mi  tutor:   Dr.  José  Fernando  Peña  Ortega   Asimismo,   agradezco   el   apoyo   de   las   siguientes   instituciones   para   la   realización   del   presente   trabajo:     Laboratorio   de   Circuitos   Neuronales,   Departamento   de   Neurobiología   del   Desarrollo   y   Neuroeisiología,  Instituto  de  Neurobiología,  Campus  Juriquilla,  UNAM.     Laboratorio   de   Aprendizaje   y   Memoria,   Departamento   de   Neurobiología   Conductual   y   Cognitiva,  Instituto  de  Neurobiología,  Campus  Juriquilla,  UNAM.     Unidad  de  Análisis  Conductual,  Instituto  de  Neurobiología,  Campus  Juriquilla,  UNAM.   Unidad  de  Microscopía,  Instituto  de  Neurobiología,  Campus  Juriquilla,  UNAM.   Bioterio,  Instituto  de  Neurobiología,  Campus  Juriquilla,  UNAM.     Programa  de  Doctorado  en  Ciencias  Biomédicas,  UNAM   Consejo  Nacional  de  Ciencia  y  Tecnología  (CONACyT),  No.  de  Becario:  270263   La  realización  de  esta  tesis  fue  einanciada  por:     CONACyT  (117,  237570,  235789,  246888  y  181323)   Fundación  Marcos  Moshinsky   Dirección  General  de  Asuntos  del  Personal  Académico  (DGAPA-­‐UNAM,  IN200715  y  IN201415)   RESUMEN   Además  de   acoplar   el  metabolismo   con   la   excitabilidad   celular,   los   canales  de  K+   sensibles   a  ATP   (KATP)   están   involucrados   en   la   función   y   plasticidad   neuronal,   así   como   en   la   formación   de   la   memoria.  De  manera  interesante,  existen  alteraciones  en  la  actividad  y  la  expresión  de  los  canales   KATP  en  la  enfermedad  de  Alzheimer  (EA)  así  como  en  la  patología  tipo  EA  inducida  por  el  péptido  β   amiloide  (Aβ).  El  objetivo  de  esta   tesis   fue  evaluar  el  efecto  de   la  modulación   farmacológica  de   la   actividad   de   los   canales   KATP   sobre   las   alteraciones   inducidas   por   el   Aβ   en   la   conducta   típica   de   burrowing  (deeinida  como  la  acción  de  construir  una  madriguera),  la  memoria,  la  actividad  eléctrica   hipocampal   y   la   plasticidad   sináptica.   Los   resultados   mostraron   que   el   tratamiento   crónico   con   dosis   subclínicas   de   la   tolbutamida   (antagonista   del   canal   KATP)   o   diazoxida   (activador   del   canal   KATP)  previenen  el  incremento  de  la  conducta  de  burrowing,  el  deterioro  en  la  memoria  de  contexto,   la   reducción   de   la   actividad   eléctrica   espontánea   hipocampal   y   el   desequilibrio   en   la   plasticidad   sináptica  (inhibición  de  la  potenciación  de  largo  plazo  -­‐LTP-­‐  y  facilitación  de  la  depresión  de  largo   plazo   -­‐LTD-­‐)   inducidas   por   el   Aβ.   El   efecto   protector   de   la   tolbutamida   sobre   el   deterioro   en   la   memoria  de  contexto  correlacionó  signieicativamente  con  la  restauración  de  la  LTP  y  el  bloqueo  de   la  LTD.  En  contraste,  la  diazoxida  tuvo  un  efecto  protector  moderado  sobre  la  memoria,  comparado   con  el  efecto  de  la  tolbutamida,  el  cual  no  estuvo  relacionado  al  balance  de  la  plasticidad  sináptica.   El   tratamiento   con   ambos  moduladores   de   los   canales  KATP   evitaron   la   inhibición   de   la   actividad   eléctrica  espontánea  hipocampal  inducida  por  el  Aβ  in  vitro.  Estos  hallazgos  indican  que  los  canales   están   involucrados   en   la   patología   inducida  por   el  Aβ,   lo   que  muestra   el   potencial   del   canal  KATP   como  posible  blanco  terapéutico  para  la  EA.     i SUMMARY   In  addition  to  coupling  cell  metabolism  and  excitability,  ATP-­‐sensitive  potassium  channels  (KATP)  are   involved   in   neural   function,   plasticity,   and   memory.   Moreover,   alterations   in   KATP   activity   and   expression   have   been   observed   in   Alzheimer’s   disease   (AD)   and   during   amyloid-­‐β   (Aβ)-­‐induced   pathology.  Thus,  we   tested  whether  KATP  modulators  can   ineluence  Aβ-­‐induced  deleterious  effects   on   typical   rodent   behavior   (burrowing),   contextual   memory,   hippocampal   network   activity,   and   plasticity.   We   found   that   treating   animals   with   subclinical   doses   (those   that   did   not   change   glycemia)  of  a  KATP  blocker  (tolbutamide)  or  a  KATP  opener  (diazoxide)  differentially  restrained  Aβ-­‐ induced   burrowing   increase,  memory   deeicit,   hippocampal   network   activity   inhibition,   and   long-­‐ term   synaptic   plasticity   unbalance   (long-­‐term   potentiation   -­‐LTP-­‐   inhibition   and   long-­‐term   depression  -­‐LTD-­‐  induction).  We  found  that  the  protective  effect  of  tolbutamide  against  Aβ-­‐induced   memory  deeicit  correlated  with  LTP  induction  and  LTD  inhibition.  In  contrast,  diazoxide  treatment   produced  a  mild  protection  against  Aβ-­‐induced  memory  deeicit,  which  was  not  related  to  a  synaptic   plasticity   recovery.   Interestingly,   treatment  with   both   KATP   modulators   renders   the   hippocampus   resistant  to  Aβ-­‐induced  inhibition  of  hippocampal  network  activity  in  vitro.  These  eindings  indicate   that  KATP  are  involved  in  Aβ-­‐induced  pathology  and  show  the  potential  role  of  KATP  modulation  as  a   plausible  therapeutic  strategy  against  AD.   ii ÍNDICE  GENERAL   iii Contenido Pág. RESUMEN                                                                                                                                                                                                                                                                                       i SUMMARY                                                                                                                                                                                                                                                                                                                              ii Índice  General                                                                                                                                                                                                                                                                                     iii Abreviaturas                                                                                                                                                                                                                                                                                       v INTRODUCCIÓN                                                                                                                                                                                                                                                               1 ANTECEDENTES                                                                                                                                                                                                                                                             3 Enfermedad  de  Alzheimer 3 Péptido  beta  amiloide  (Aβ) 4 Efectos  del  Aβ  sobre  la  conducta  y  la  memoria  dependiente  de  hipocampo 6 Efectos  del  Aβ  sobre  la  actividad  oscilatoria  hipocampal 9 Efectos  del  Aβ  sobre  la  plasticidad  sináptica  hipocampal 12 Canales  de  potasio  sensibles  a  ATP  (KATP) 17 Estructura 18 Localización 20 Regulación  eisiológica  de  la  actividad  del  canal  KATP 22 Regulación  farmacológica  del  canal  KATP 25 • Antagonistas  de  los  canales  KATP:  Sulfonilureas 25 •        Agonistas  de  los  canales  KATP:  KCOs 28 Funciones  de  los  canales  KATP   30 • Función  de  los  canales  KATP  en  el  hipocampo 32 Relación  de  los  canales  KATP  con  la  enfermedad  de  Alzheimer  y  el  Aβ 33 RELEVANCIA 37 HIPÓTESIS 38 OBJETIVOS 39 General 39 EspecíFicos 39 MÉTODOS 40 Sujetos 40 iv Oligomerización  del  Aβ1-­‐42 40 Cirugía  estereotáxica 41 Manipulación 42 Administración  de  los  fármacos   42 Pruebas  conductuales 43 Campo  abierto 43 Conducta  típica:  Burrowing 43 Evitación  inhibitoria 44 •      Sesión  de  entrenamiento 45 •      Sesión  de  prueba 46 Prueba  actividad  motora 46 Ganancia/pérdida  de  peso  corporal 46 Análisis  de  glucosa  en  sangre 46 Obtención  de  rebanadas  de  hipocampo  dorsal 47 Registros  electroFisiológicos 47 Actividad  espontánea  hipocampal 47 Potenciación  de  largo  plazo  (LTP) 48 Depresión  de  largo  plazo  (LTD) 49 Histología 50 Análisis  estadístico 51 RESULTADOS 55 DISCUSIÓN 88 CONCLUSIONES 107 REFERENCIAS 108 ABREVIATURAS   ABC Superfamilia  de  proteínas  con  cassettes  de  eijación  de  ATP  (por  sus  siglas  en  inglés) ADPi Adenosín  difosfato  intracelular Akt Proteína  cinasa  B AMPA Ácido  α-­‐amino-­‐3-­‐hidroxi-­‐5-­‐metil-­‐4-­‐isoxazol  propiónico  (por  sus  siglas  en  inglés) APP Proteína  precursora  amiloide  (por  sus  siglas  en  inglés) ATPi Adenosín  trifosfato  intracelular Aβ Péptido  β  amiloide  (por  sus  siglas  en  inglés) BACE Enzima  1  de  unión  al  sitio  β  de  la  APP  (por  sus  siglas  en  inglés) Ca2+ Calcio CaCl2 Cloruro  de  Ca2+ CaMKII Calcio  calmodulina  cinasa  II  (por  sus  siglas  en  inglés) cAMP Adenosín  monofosfato  cíclico  (por  sus  siglas  en  inglés) Cdk5 Cinasa  dependiente  de  ciclina  5  (por  sus  siglas  en  inglés) ClCd2 Cloruro  de  Cadmio CO2 Dióxido  de  carbono CREB Proteína  de  unión  a  elementos  de  respuesta  al  cAMP  (por  sus  siglas  en  inglés) DMSO Dimetilsulfóxido Dzx Diazoxida EA Enfermedad  de  Alzheimer EC50 Concentración  efectiva  50  (por  sus  siglas  en  inglés) EK Potencial  de  equilibrio  del  K+  (por  sus  siglas  en  inglés) FAK Cinasa  de  adherencia  focal  (por  sus  siglas  en  inglés) fEPSP Potenciales  postsinápticos  excitatorios  (por  sus  siglas  en  inglés) Fyn Cinasa  tipo  Src GABA Ácido  γ-­‐aminobutírico  (por  sus  siglas  en  inglés) GSK-­‐3β Glucógeno  sintetasa  cinasa  3-­‐beta  (por  sus  siglas  en  inglés) HFIP 1,1,1,3,3,3-­‐hexaeluoro-­‐2-­‐propanol HFS Estimulación  de  alta  frecuencia  (por  sus  siglas  en  inglés) i.c. Intracerebral v i.c.v. Intracerebroventricular i.h. Intrahipocampal i.p. Intraperitoneal IC50 Concentración  inhibidora  50  (por  sus  siglas  en  inglés) IL-­‐β Interleucina  1  beta  (por  sus  siglas  en  inglés) K+ Potasio KATP Canales  de  K+  sensibles  a  ATP   KCl Cloruro  de  K+ KCOs Activadores  de  canales  de  K+  (por  sus  siglas  en  inglés) KIR Canales  rectieicadores  entrantes  de  K+  (por  sus  siglas  en  inglés) LCRA Líquido  cefalorraquídeo  artieicial LCRAm Líquido  cefalorraquídeo  artieicial  modieicado LFS Estimulación  de  baja  frecuencia  (por  sus  siglas  en  inglés) LTD Depresión  de  largo  plazo  (por  sus  siglas  en  inglés) LTM Memoria  de  largo  plazo  (por  sus  siglas  en  inglés) LTP Potenciación  de  largo  plazo  (por  sus  siglas  en  inglés) MF12 Medio  F12 Mg2+ Magnesio MgCl2 Cloruro  de  Mg2+ Na+ Sodio NaCl Cloruro  de  Na+ NaHCO3 Bicarbonato  de  Na+ NBDs Dominios  de  unión  a  nucleótidos  (por  sus  siglas  en  inglés) NFκB Factor  nuclear  de  las  cadenas  ligeras  kappa  de  las  células  B  activadas  (por  sus  siglas   en  inglés) NMDA N-­‐metil-­‐D-­‐aspartato O2 Oxígeno p.o. Per  os  (vía  oral) PI3K Fosfoinositol  3-­‐cinasa  (por  sus  siglas  en  inglés) PIP2 Fosfatidilinositol,-­‐4,5-­‐bifosfato  (por  sus  siglas  en  inglés) PKA Proteína  cinasa  A  (por  sus  siglas  en  inglés) vi PKC Proteína  cinasa  C  (por  sus  siglas  en  inglés) PPR Proporción  pulsos  pareados  (por  sus  siglas  en  inglés) PS Espigas  poblacionales  (por  sus  siglas  en  inglés) PS1/2 Presenilina  1/2 ROS Especies  reactivas  de  oxígeno  (por  sus  siglas  en  inglés) s.c. subcutáneo sAPPα Fragmento  soluble  α  de  la  APP  (por  sus  siglas  en  inglés) sAPPβ   Fragmento  soluble  β  de  la  APP  (por  sus  siglas  en  inglés) SDS-­‐PAGE Electroforesis  en  gel  de  poliacrilamida  con  dodecilsulfato  sódico  (por  sus  siglas  en   inglés) SNC Sistema  nervioso  central SUR Receptores  a  sulfonilureas  (por  sus  siglas  en  inglés) TMD Dominio  transmembranal  (por  sus  siglas  en  inglés) TMS Segmento  transmembranal  (por  sus  siglas  en  inglés) TNF-­‐α Factor  de  necrosis  tumoral  alfa  (por  sus  siglas  en  inglés) Tol Tolbutamida VDCCs Canales  de  Ca2+  dependientes  de  voltaje  (por  sus  siglas  en  inglés) Vm Voltaje  de  membrana Zn2+ Zinc vii INTRODUCCIÓN   La  enfermedad  de  Alzheimer  (EA)  se  caracteriza  por  la  deeiciencia  cognoscitiva  temprana  (Caselli  et   al.,   2006)  y   la  pérdida  progresiva  de   la  memoria  (Jacobs  et   al.,   1995).  El  deterioro   cognoscitivo  y   mnémico  han   sido   asociados   con   alteraciones   funcionales   como  el   elentecimiento  de   la   actividad   electroencefalográeica  (Coben  et  al.,  1983;  Kowalski  et  al.,  2001)  y  alteraciones  morfológicas,  como   la   presencia   de   agregados   extracelulares   del   péptido   beta   amiloide   (Aβ)   eibrilar,   llamados   placas   amiloides  o  placas  seniles  (Glenner  &  Wong,  1984;  Cummings  et  al.,  1995).   Recientemente,  se  ha  demostrado  que  el  Aβ  pre-­‐eibrilar  (péptido  no  agregado  en  placas  amiloides,   también  llamado  “Aβ  soluble”)  afecta  las  funciones  cognoscitivas  (Cleary  et  al.,  2005)  y  la  actividad   eléctrica  neuronal  (Peña-­‐Ortega  F,  2013).  En  particular,  se  ha  demostrado  que  la  aplicación  del  Aβ   soluble   en   el   hipocampo   (estructura   asociada   al   aprendizaje   y   la   memoria)   altera   diversas   conductas   consideradas   “típicas”   (Deacon   et   al.,   2008;   Nobakht,   2011;   Morales-­‐Corraliza   et   al.,   2013),   produce   un   efecto   amnésico   y   disminuye   la   actividad   eléctrica   poblacional   (Sun  &   Alkon,   2002;  Villette  et  al.,  2010;  Roberson  et  al.,  2011).  De   igual  manera,  el  Aβ  afecta  diversos   tipos  de   plasticidad  sináptica  que  están  asociados  a  los  procesos  de  memoria,  como  la  potenciación  de  largo   plazo  (LTP,  por  sus  siglas  en  inglés;  Whitlock  et  al.,  2006)  y  la  depresión  de  largo  plazo  (LTD,  por  sus   siglas   en   inglés;   Goh   et   al.,   2013).   También,   se   ha   demostrado   que   la   aplicación   del   Aβ   en   el   hipocampo  puede  inhibir  la  LTP  (Itoh  et  al.,  1999)  y,  en  contraste,  puede  inducir  la  LTD  (Kim  et  al.,   2001).   El  conjunto  de  estas  evidencias  ha  promovido  la  investigación  de  los  mecanismos  moleculares  por   los  cuales  el  Aβ  induce  dichas  alteraciones  y  su  relación  con  el  deterioro  cognoscitivo  (Salgado-­‐Puga   &  Peña-­‐Ortega,  2015).  Nuestro  grupo  de  trabajo  ha  descrito  una  vía  transduccional  activada  por  el   Aβ  que,  a  través  de  la  activación  de  la  glucógeno  sintetasa  cinasa-­‐3  beta  (GSK-­‐3β,  por  sus  siglas  en   inglés),   promueve   la   activación  de   los   canales  de  K+   sensibles   a  ATP   (KATP;   Balleza-­‐Tapia  &  Peña-­‐ Ortega,   2009;   Rodríguez-­‐Colorado   J,   2013).   La   actividad   de   estos   canales,   en   el   sistema   nervioso   1 central   (SNC),   regula   la  neurotransmisión   (Hibino  et  al.,  2010),   la  excitabilidad  neuronal   (Allen  &   Brown,  2004)  y  participa  en  diversos   tipos  de  memoria   (Zarrindast   et   al.,   2004a  y  b;  Ryan  et   al.,   2006;   Betourne   et   al.,   2009).   De   manera   interesante,   diversos   trabajos   han   mostrado   que   la   actividad  y  densidad  de  los  canales  KATP  pueden  ser  moduladas  por  el  Aβ  (Ma  et  al.,  2008;  Ma  et  al.,   2009;  Tan  et  al.,  2012;  Macaluey  et  al.,  2015),  y  que  además  están  alteradas  en  pacientes  con  la  EA   (Ikeda  et  al.,  1993a  y  b).     Por   lo   anterior,   se  han   comenzado  a   evaluar   las  propiedades   terapéuticas  de  moduladores  de   los   canales  KATP  en  la  EA.  En  este  sentido,  diversos  estudios  han  mostrado  que  antagonistas  especíeicos   de  estos  canales,  como   la   tolbutamida  o   la  glibenclamida  (Baraka  &  ElGhotny,  2010;  Caesar  et  al.,   2015),  así  como  agonistas  especíeicos  como  la  diazoxida  (Liu  et  al.,  2010),  reducen  los  niveles  del  Aβ   y  mejoran  la  memoria  espacial  en  modelos  animales  de  la  EA.  Estos  hallazgos  abren  la  posibilidad   de   que   los   canales   KATP   estén   involucrados   en   los   efectos   causados   por   el   Aβ   sobre   la   actividad   eléctrica  hipocampal  y  los  procesos  mnémicos.  Es  por  ello  que  el  presente  trabajo  pretende  analizar   los   efectos   de   la  modulación  de   los   canales  KATP   en   las   alteraciones   inducidas   por   el   Aβ   sobre   la   actividad   eléctrica,   la   conducta   típica   de   burrowing   (deeinida   como   la   acción   de   construir   una   madriguera),   la  memoria  y   la  plasticidad  sináptica  (en  especíeico   la  LTP  y   la  LTD)  hipocampal.  Lo   anterior,   a   través   de   la   inhibición   especíeica   de   los   canales   KATP   con   tolbutamida   y   su   activación   especíeica  con  diazoxida.   2 ANTECEDENTES   Enfermedad  de  Alzheimer  (EA)     La  demencia  se  deeine  como  un  síndrome  en  donde  la  cognición,  la  memoria,  la  conducta  y  la   habilidad  de  ejecutar  actividades  de  la  vida  diaria  se  deterioran  de  manera  irreversible  (Prince  et   al.,  2015).  La  forma  más  común  de  demencia  es  la  EA,  la  cual  tiene  una  incidencia  global  del  17.1%   en  personas  mayores  de  65  años  de  edad  (Alzheimer's  Association,  2014;  Prince  et  al.,  2015).  En   particular,  la  EA  presenta  un  nivel  de  incidencia  de  8.5%  en  Latinoamérica  (Wimo  &  Prince,  2010;   Prince  et  al.,  2015),  y  de  7.6%  en  México  en   las  personas  mayores  de  60  años  (Zúñiga-­‐Herrera  &   García,  2008;  González  et  al.,  2010).     La  EA  se  caracteriza  por  el  deterioro  temprano  y  progresivo  de  la  memoria  (Cummings  et  al.,  1995;   Cummings   et   al.,   2002).   Asimismo,   cursa   con   la   neurodegeneración   progresiva   e   irreversible,   particularmente,  del  lóbulo  temporal  medial  y  de  estructuras  neocorticales  (De-­‐Paula  et  al.,  2012),   que   incluyen  al  hipocampo   y   la  corteza  entorrinal,   cuya   función  está  ampliamente  asociada  con  el   aprendizaje   y   la   memoria   (Kandel   ER,   2013).   La   neurodegeneración   en   la   EA   se   asocia   a   la   presencia  de  agregados  de  la  proteína  Tau  y  del  Aβ  (Glenner  y  Wong,  1984),  los  cuales  forman  las   marañas  neuroeibrilares  y  las  placas  amiloides  (también  llamadas  placas  seniles),  respectivamente   (Lue  et  al.,  1999;  Figura  1).   A B                                           Fig.  1.  Micrograeías  de  secciones  del  hipocampo  proveniente  de   la  autopsia  de  un  paciente  de   90  años  de  edad  con  la  EA  donde  se  muestran  las  marañas  eibrilares  marcadas  con  anticuerpos   para   la   proteína   Tau   (A)   y   las   placas   amiloides   marcadas   con   anticuerpos   para   el   Aβ   (B;   Modieicado  de  Marcus  &  Jacobson,  2003).   3 Las  placas  amiloides  han  sido  ampliamente  asociadas  con  el  desarrollo  de  la  EA  (Cummings  et  al.,   1995).   Actualmente,   existe   una   gran   cantidad   de   evidencia  mostrando   que   el   incremento   en   los   niveles  del  Aβ  no  agregado  en  placas   (“Aβ  soluble”),  principalmente  en  el  hipocampo  y   la   corteza   entorrinal,  correlacionan  con  el  incremento  en  el  deterioro  de  la  demencia  en  etapas  tempranas  de   la  EA  (Lue  et  al.,  1999;  McLean  et  al.,  1999;  Näslund  et  al.,  2000).  Asimismo,  se  ha  caracterizado  que   mutaciones  genéticas  en   las  proteínas  asociadas  a   la  generación  del  Aβ   (por  ejemplo:   la  proteína   precursora   amiloide   -­‐APP,   por   sus   siglas   en   inglés-­‐   y   las   presenilinas   1   y   2   -­‐PS1/2-­‐),   las   cuales   inducen  un   incremento  en   la  concentración  del  Aβ  soluble   (Tomiyama  et  al.,  2010;  Lalonde  et  al.,   2012),   están   asociadas   con   la   pérdida   de  memoria   y   el   desarrollo   de   la   EA   familiar   (Parvathy  &   BuxBaum,   2002).   Debido   a   lo   anterior,   el   estudio   de   los   efectos   del   Aβ   soluble   es   de   gran   importancia  para  desarrollar  estrategias  terapéuticas  para  la  prevención  del  desarrollo  de  la  EA.   Péptido  beta  amiloide  (Aβ)     El   Aβ   es   un   péptido   de   39-­‐49   aminoácidos   producto   del   proceso   proteolítico   de   la   APP   (Turner  et  al.,  2003).  La  APP  es  una  glucoproteína  integral  de  membrana  de  695-­‐770  aminoácidos   cuya  función  se  ha  asociado  con  diversos  procesos  celulares  como  el  transporte  axonal,  la  adhesión   celular,  el  metabolismo  y  la  transcripción  génica  (Turner  et  al.,  2003).  El  procesamiento  proteolítico   de   la  APP  es   secuencialmente   realizado  por   el   grupo  de   enzimas  α/β  y   γ-­‐secretasas.   El   complejo   enzimático   con  actividad  α-­‐secretasa  hidroliza  a   la  APP  en  el   carboxilo   terminal   (posición  83),   lo   que  produce  un  fragmento  N-­‐terminal  que  es  secretado  al  medio  extracelular,  el  fragmento  soluble   α   de   la   APP   (sAPPα,   por   sus   siglas   en   inglés;   Figura   2).   La   producción   de   este   fragmento   ocurre   dentro  de  la  región  de  aminoácidos  que  conforman  el  Aβ,  de  modo  que  este  corte  de  la  APP  evita   que   se   genere   el   Aβ   (Figura   2).   Debido   a   esto,   esta   vía   también   es   conocida   como   “vía   no-­‐ amiloidogénica”  (Kojro  &  Fahrenholz,  2005;  LaFerla  et  al.,  2007).     Por  el  contrario,   la   “vía  amiloidogénica”,  es  decir   la  vía  por   la  que  se  produce  el   fragmento  Aβ,  se   4 lleva  a  cabo  por  las  enzimas  con  actividad  β-­‐secretasa  (como  la  Enzima  1  de  unión  al  sitio  β  de  la   APP  -­‐BACE1-­‐,  por  sus  siglas  en   inglés).  La  enzima  BACE1  hidroliza  a   la  APP  en   la  posición  99  del   carboxilo   terminal,   lo   cual   produce   el   fragmento   soluble   β   de   la   APP   (sAPPβ,   por   sus   siglas   en   inglés).   El   fragmento   restante   de   la   APP   que   queda   en   la   membrana   celular   es   posteriormente   cortado  por  el   complejo  enzimático   con  actividad  γ-­‐secretasa   (entre  ellas   la  PS1  y  PS2)  entre   los   residuos  38  y  43,  produciendo  el   fragmento  Aβ  (Figura  2).  En  condiciones  eisiológicas,   la  variante   del   Aβ  más   producida   en   el   SNC   es   el   Aβ1-­‐40   (Randall   et   al.,   2010),   mientras   que   el   Aβ1-­‐42  es   la   variante  menos  abundante,  siendo  aproximadamente  un  10%  del  Aβ  total  producido  (Randall  et  al.,   2010).  En  condiciones  eisiopatológicas,  hay  un  mayor  incremento  del  Aβ1-­‐42  comparado  con  el  Aβ1-­‐40   (Cirrito  et  al,  2003;  Kuperstein  et  al.,  2010;  Dolev  et  al.,  2013).     Fig.  2.   Conformación  de   la  APP  y  del  Aβ.  A,   posición  del  Aβ  en   la   conformación  de   la  APP.  B,   sitios   en   los   que   se   corta   la   APP   por   la   α/β   secretasa   y   la   γ-­‐secretasa   para   dar   lugar   a   los   fragmentos   sAPPα   en   la   vía   no-­‐amiloidogénica   y   en   la   vía   amiloidogénica   que   deriva   en   la   producción  del  Aβ  (Modieicado  de  Chen  &  Schubert,  2002).   La   diferencia   en   la   longitud   de   la   cadena   de   aminoácidos   que   conforman   el   Aβ   modieica   las   propiedades  eísicas  y  funcionales  del  péptido  (Innocent  et  al.,  2010).  Por  ejemplo,  la  variante  Aβ1-­‐42   presenta  una  mayor  hidrofobicidad,  lo  que  promueve  la  adquisición  de  una  estructura  beta-­‐plegada   y  la  agregación  del  péptido.  Por  lo  mismo,  la  Aβ1-­‐42  es  la  variante  más  encontrada  en  los  agregados   de   las   placas   amiloides   (Jarrett   &   Lansbury,   1993;   Younkin   SG,   1998).   Debido   a   lo   anterior,   los   b 1 100 200 300 400 500 600 770 KPI NSO4SO4 O Cytoplasm N PO4 Signal Residue CO2H ISEVKM DAEF RHDSGYEVHHQKL VF F A EDVGSNKGAI I GL MVGGVVI A TVIV VI T L ML β α γ40 γ42 700 Membrane Aβ Aβ a APP CH2O CH2O CH2O O CH2O 5 estudios  relacionados  al  desarrollo  de  la  EA  se  han  enfocado  en  los  efectos  de  esta  variante  del  Aβ   (Salgado-­‐Puga  &  Peña-­‐Ortega,  2015).   De   manera   eisiológica   los   agregados   solubles   del   Aβ   están   involucrados   en   la   modulación   de   la   probabilidad  de   liberación  de  neurotransmisores   (Abramov  et  al.,  2009),   la   transmisión  sináptica   (Cirrito   et   al.,   2005),   la   plasticidad   sináptica   (Kamenetz   et   al.,   2003;   Puzzo   et   al.,   2008)   y   en   la   formación  de   la  memoria   (García-­‐Osta   y  Alberini,   2009;   Puzzo   et   al.,   2012).   En   la   patología,   esta   función  se  ve  alterada  cuando  los  niveles  de  la  Aβ  rebasan  concentraciones  picomolares  (Puzzo  et   al.,  2008)  y  llegan  a  concentraciones  nanomolares  e  incluso  micromolares  (Pettit  et  al.,  2001;  Puzzo   et  al.,  2008;  Kurudenkankandy  et  al.,  2014).  Además  de  la  concentración,  los  efectos  patológicos  del   Aβ   sobre   la   conducta,   la   memoria   y   los   mecanismos   celulares   que   las   subyacen,   dependen   del   estado   de   agregación   (Townsend   et   al.,   2006;   Wang   et   al.,   2009;   Kuperstein   et   al.,   2010;   Kurundenkandy  et  al.;  2014;  Charkhkar  et  al.,  2015)  y  del  tiempo  de  exposición  (Görtz  et  al.,  2009;   Liu   et   al.,   2013a;   Zussy   et   al.,   2011;   2013;   Charkhkar   et   al.,   2015)   al   Aβ.   En   este   sentido,   los   agregados  solubles  del  Aβ1-­‐42,  que  incluyen  dímeros,  trímeros  y  oligómeros,  son  los  que  más  se  han   utilizado   in   vitro   e   in   vivo   para   caracterizar   los   efectos   del   Aβ   asociados   a   la   neurodegeneración   observada  en  la  EA  (Salgado-­‐Puga  &  Peña-­‐Ortega,  2015).  Asimismo,  la  administración  intracerebral   (i.c.)  de  oligómeros  del  Aβ,  así  como  la  sobre-­‐expresión  del  Aβ  en  roedores  a  los  que  se  incorpora  la   APP  con  una  o  varias  mutaciones  genéticas  asociadas  a  la  EA  familiar  (modelos  transgénicos  de  la   EA),   son   los  métodos  más   utilizados   para   caracterizar   los   efectos   sobre   los   procesos   eisiológicos   anteriormente  mencionados.   Efectos  del  Aβ  sobre  la  conducta  y  la  memoria  dependiente  de  hipocampo     El  hipocampo  es  importante  para  el  aprendizaje  y  la  memoria  (Kandel  ER,  2013).  Asimismo,   su   función   se   ha   relacionado   con   el   estado   emocional   de   los   organismos   y   con   la   expresión   de   conductas  innatas  y  aprendidas  que  le  sirven  al  organismo  para  interactuar  con  su  entorno  (Neil  C,   6 2010).   Se   ha   demostrado   que   un   daño   selectivo   en   el   hipocampo   o   en   áreas   con   las   que   el   hipocampo   se   conecta   (e.g.   corteza   entorrinal),   impide   la   expresión   de   ciertas   conductas   innatas   (Deacon   et   al.,   2002)   y   produce   una   pérdida   de   memoria   o   la   formación   de   nuevas   memorias   (Kandel  ER,  2013).   Los  estudios  sobre  los  efectos  del  Aβ  en  la  conducta  se  han  enfocado  principalmente  en  “conductas   típicas   de   la   especie”   asociadas   a   la   función   hipocampal   en   modelos   murinos   de   la   EA.   Las   “conductas  típicas  de  la  especie”  son  conductas   innatas  consideradas  actividades  de  la  vida  diaria   para   los   roedores   (Deacon  et   al.,   2002).  Entre   estas   conductas   se   encuentran  el  nesting   (deeinida   como  la  acción  de  construir  un  nido),  la  alternación  espontánea  (deeinida  como  la  preferencia  típica   del   roedor   a   explorar   zonas   nuevas   de   su   entorno)   y   el   burrowing   (deeinida   como   la   acción   de   construir  una  madriguera;  Neil  C,  2010).  Debido  a  que  estas  conductas  dependen  de  la  integridad   de  la  función  hipocampal  (Deacon  et  al.,  2002),  las  alteraciones  observadas  en  estas  conductas,  en   los  modelos  murinos  de   la  EA,  han  sido  consideradas  como  el  correlato  de   las  alteraciones  en   las   actividades  diarias   (e.g.  vestirse,   tender   la  cama,  usar  cubiertos,  etc.)  observadas  en   los  pacientes   con   la  EA   (Deacon  RMJ,  2014).  De  manera   interesante,   animales   transgénicos  de   la  EA  presentan   una  disminución  en  la  conducta  de  nesting  (Deacon  et  al.,  2008;  Wesson  &  Wilson,  2011;  Min  et  al.,   2013;   Morales-­‐Corraliza   et   al.,   2013),   en   alternancia   espontánea   (Lalonde   et   al.,   2012)   y   el   burrowing  (Deacon  et  al.,  2008;  2009b;  Sagare  et  al.,  2013;  Janus  et  al.,  2015).  De  manera  similar,  la   administración   i.c.   del   Aβ   reduce   la   conducta   de   alternancia   espontánea   (Bagheri   et   al.,   2011;   Nobakht  et  al.,  2011).  Sin  embargo,  aún  no  se  ha  descrito  de  manera  directa,  los  efectos  del  Aβ  sobre   conductas  como  el  nesting  y  el  burrowing.     Por  otro  lado,  los  efectos  del  Aβ  sobre  la  memoria  dependiente  del  hipocampo  están  ampliamente   descritos   (para   una   revisión   ver   Salgado-­‐Puga   &   Peña-­‐Ortega,   2015).   Diversos   estudios   han   demostrado  que   la  administración  de  oligómeros  del  Aβ,  ya  sean  sintéticos  (Balducci  et  al.,  2010;   Bagheri   et   al.,   2011;   Nobakht   et   al.,   2011;   Reed   et   al.,   2011)   o   extraídos   de   pacientes   con   la   EA   7 (Cleary  et  al.,  2005;  Lesné  et  al.,  2008;  Reed  et  al.,  2011;  Borlikova  et  al.,  2013),   intereieren  con  la   formación   de   la   memoria.   La   administración   de   los   oligómeros   del   Aβ   se   ha   realizado   más   frecuentemente  de  manera  intracerebroventricular  (i.c.v.,  Cleary  et  al.,  2005;  Mizoguchi  et  al;  2009;   Balducci  et  al.,  2010;  Reed  et  al.,  2011;  Borlikova  et  al.,  2013)  o  i.c.  (Giovannelli  et  al.,  1995;  Bagheri   et  al.,  2011;  Nobakht  et  al.,  2011;  Villette  et  al.,  2010).  Esta  última  vía  de  administración  implica  la   inyección  del  Aβ  en  una  variedad  de  estructuras  cerebrales  como,  en  el  hipocampo  (Villette  et  al.,   2010;  Bagheri  et  al.,  2011;  Nobakht  et  al.,  2011).  A  pesar  de  la  variedad  de  sitios  de  administración,   se  ha  demostrado  que  la  inyección  del  Aβ  afecta  la  formación  de  la  memoria  espacial,  la  memoria  de   contexto  y  la  memoria  de  trabajo  en  diferentes  paradigmas  conductuales  como  el  laberinto  acuático   de  Morris  (Sun  y  Alkon,  2002;  Geng  et  al.,  2010:  Li  et  al.,  2010),  el  laberinto  radial  (Stéphan  et  al.,   2001;  Srivareerat  et  al.,  2009;  2011),  el  laberinto  en  “Y”  (Kim  et  al.,  2016),  el  condicionamiento  de   miedo  al  contexto  (Dineley  et  al.,  2010;  Granic  et  al.,  2010),  la  evitación  inhibitoria  (McDonald  et  al.,   1994;  Borlikova  et  al.,  2013;  Nobakht  et  al.,  2011;  Zare  et  al.,  2015),  y  el  reconocimiento  de  objetos   (Mizoguchi   et   al.,   2009;   Villette   et   al.,   2010).   Además,   los   efectos   del   Aβ   sobre   la   memoria   dependiente  del  hipocampo  también  han  sido  descritos  en  diversos  modelos  transgénicos  de  la  EA   en   los  que  el  Aβ  está   sobre-­‐producido   (Saura  et  al.  2005;  Dineley  et  al.,  2007;  Lesné  et  al.,  2008;   Bryan  et  al.,  2009;  Puzzo  et  al.,  2009;  Ma  et  al.,  2012).   De  manera  convencional,   se  acepta  que   la   formación  de   la  memoria   requiere  de   tres  procesos:  el   aprendizaje   (deeinido   como   la   adquisición   de   información),   la   consolidación   (deeinido   como   la   codieicación   y   almacenaje   de   la   información),   y   la   evocación   (deeinido   como   la   extracción   de   información   almacenada;   Bliss   &   Collingridge,   1993).   En   este   sentido,   se   ha   descrito   que   el   Aβ   afecta   diferencialmente   estos   procesos   dependiendo   de   la   concentración,   del   momento   de   su   administración,  o  del  modelo  transgénico  utilizado  (Puzzo  et  al.,  2008;  Salgado-­‐Puga  &  Peña-­‐Ortega,   2015).  La  mayoría  de  los  estudios  muestran  que  la  administración  del  Aβ,  así  como  varios  modelos   transgénicos  de  la  EA,  afecta  el  proceso  de  consolidación  de  la  memoria  (Yamada  et  al.,  1999a  y  b;   8 Nakamura  et  al.,  2001;  Saura  et  al.,  2005;  Li  et  al.,  2010;  Borlikova  et  al.,  2013;  Tucci  et  al.,  2014;   Zare   et   al.,   2015;   Beglopoulos   et   al.,   2016).   Sin   embargo,   algunos   estudios   muestran   que   la   administración  del  Aβ,  y  algunos  modelos  transgénicos,  tienen  un  deterioro  en  el  aprendizaje  (Sun  y   Alkon,  2002;  Geng  et  al.,  2010;  Mitchell  et  al.,  2009;  Srivareerat  et  al.,  2009;  2011;  Ma  et  al.,  2012;   Tong  et  al.,  2012).  Por  otro  lado,  debido  a  la  dieicultad  para  disociar  el  proceso  de  consolidación  y  de   evocación,   hay  muy   pocos   estudios   en   los   que   se   ha   demostrado   que   el   Aβ   también   afecta   este   proceso  cognitivo  (Tucci  et  al.,  2014;  Roy  et  al.,  2016;  Ryan  &  Tonegawa,  2016).     Los  mecanismos  moleculares  por  los  cuales  el  Aβ  afecta  la  formación  de  la  memoria  aún  no  están   del   todo   descritos.   Los   estudios   para   dilucidarlos   se   han   enfocado   en   mecanismos   celulares   considerados   esenciales   para   la   formación   de   la  memoria,   como   son:   la   actividad   oscilatoria   y   la   plasticidad  sináptica  (particularmente  la  LTP  y  la  LTD;  Hasselmo  &  Stern,  2014).  A  continuación,  se   discutirán  con  más  detalle   los  efectos  del  Aβ  sobre  estos  mecanismos  celulares  y   los  mecanismos   moleculares   propuestos   como   posibles   vías   por   las   que   el   Aβ   deteriora   la   memoria   y   altera   la   conducta.     Efectos  del  Aβ  sobre  la  actividad  oscilatoria  hipocampal   Las  propiedades  intrínsecas  de  las  neuronas  y  su  conectividad  dan  lugar  a  oscilaciones  de  la   actividad   neuronal   de   manera   espontánea   (Treviño   &   Gutiérrez,   2007).   La   actividad   oscilatoria   espontánea  de  una  red  neuronal  representa  el  estado  basal  de  la  red,  la  cual  cambia  cuando  la  red   neuronal  es  requerida  para  una  función  especíeica  (Treviño  &  Gutiérrez,  2007;  Buzsáki  et  al.,  2012).   En  particular,   la   formación  de   la  memoria  y   su   evocación,   requieren  de   la   coordinación   temporal   precisa  de  la  actividad  de  redes  neuronales  locales  (dentro  de  una  misma  estructura  cerebral)  y  las   redes  neuronales  entre  regiones  cerebrales  distantes  (Ainsworth  et  al.,  2012;  Peña-­‐Ortega  F,  2013;   Hasselmo  &  Stern,  2014).  Para  que  dicha  coordinación  exista,  las  células  que  conforman  estas  redes   neuronales   sincronizan   su   actividad   en   patrones   de   actividad   oscilatoria   especíeicos   que   van   de   9 rangos  de   frecuencias   lentas   a   frecuencias   rápidas   (Ainsworth   et   al.,   2012;  Peña-­‐Ortega  F,   2013).   Los  rangos  de  frecuencia  con  las  que  se  han  categorizado  los  patrones  de  la  actividad  oscilatoria  en   los  roedores  son:  delta  (δ,  0.5-­‐3  Hz),  theta  (θ,  4-­‐12  Hz),  beta  (β,  13-­‐35  Hz),  y  gamma  (γ,  36-­‐80  Hz;   Buzsáki   et   al.,   2012).   Las   actividades   oscilatorias   neuronales   en   rangos   de   frecuencias   θ   y   γ   del   hipocampo,   son   principalmente   las   que   han   sido   asociadas   con   el   aprendizaje   y   la   memoria   (McNaughton  et  al.,  2006;  Cornwell  et  al.,  2008;  Kirov  et  al.,  2009;  Tort  et  al.,  2009).  En  la  patología   de   la   EA,   las   deeiciencias   en   la   memoria   cursan   con   alteraciones   en   los   patrones   oscilatorios   cerebrales.  En  especíeico,  se  observa  una  reducción  de  las  oscilaciones  con  frecuencias  θ  y  γ  (4-­‐80   Hz)  y  un   incremento  en  oscilaciones  δ   (1-­‐3  Hz)   (Coben  et  al.,  1983;  Schreiter-­‐Gasser  et  al.,  1994;   Kowalski   et   al.,   2001).   De   manera   similar,   los   modelos   transgénicos   de   la   EA   muestran   una   reducción  en   las  oscilaciones  θ   (Wang  et  al.,  2002;  Akay  et  al.,  2009;  Scott  et  al.,  2012;  Busche  &   Konnerth,  2016)  y  γ  (Palop  et  al.,  2007;  Rubio  et  al.,  2012;  Verret  et  al.,  2012),  lo  que  correlaciona   con  deeiciencias  en  la  memoria  (Platt  et  al.,  2011;  Cramer  et  al.,  2012;  Verret  et  al.,  2012;  Schneider   et   al.,   2014).   Considerando   lo   anterior,   se   ha   sugerido   que   la   sobre-­‐expresión   del   Aβ   afecta   la   formación  de   la  memoria   a   través  de   alteraciones   en   los  patrones  oscilatorios  necesarios  para   la   misma.   En   este   sentido,   varios   estudios   han  mostrado   que   la   aplicación   directa   del   Aβ   altera   la   actividad  oscilatoria  del  circuito  hipocampal  in  vitro  e  in  vivo  (Salgado-­‐Puga  &  Peña-­‐Ortega,  2015).   Al   igual  que  en   los  estudios  de   la  memoria,  dependiendo  de   la  concentración   (Puzzo  et  al.,  2008;   Wang  et  al.,  2009;  Kuperstein  et  al.,  2010),  del  estado  de  agregación  (Charkhkar  et  al.,  2015),  del   tiempo   de   exposición   (Görtz   et   al.,   2009;   Liu   et   al.,   2013a;   Charkhkar   et   al.,   2015)   y   del  modelo   murino  utilizado  (Peña-­‐Ortega  F,  2013),  el  Aβ  tiene  efectos  diferentes  sobre  la  actividad  oscilatoria.   El  efecto  más  reportado  es  una  disminución  de  la  actividad  espontánea  (Balleza-­‐Tapia  et  al.,  2010;   Kuperstein   et   al.,   2010;   Peña   et   al.,   2010;   Varghese   et   al.,   2010;   Charkhkar   et   al.,   2015),   y   en   la   actividad  oscilatoria  en  frecuencias  θ  (Sun  y  Alkon,  2002;  Xu  et  al.,  2004;  Villette  et  al.,  2010;  Peña-­‐ Ortega   &   Bernal-­‐Pedraza,   2012;   Rubio   et   al.,   2012;   Gutiérrez-­‐Lerma   et   al.,   2013),   β   (Adaya-­‐ 10 Villanueva  et  al.,  2010;  Peña-­‐Ortega  et  al.,  2012)  y  γ  (Driver  et  al.,  2007;  Peña-­‐Ortega  et  al.,  2012;   Rubio  et  al.,  2012;  Verret  et  al.,  2012;  Kurudenkandy  et  al.,  2014).  Por  otro  lado,  recientemente  se  ha   incrementado   el   número  de   reportes  que  muestran  que   el  Aβ   incrementa   la   actividad  oscilatoria   (Colom  et  al.,  2010;  Kuperstein  et  al.,  2010;  Cuevas  et  al,  2011;  Busche  et  al.,  2008;2012;  Wang  et  al.,   2016)  e  induce  un  estado  de  hiperexcitabilidad  (Palop  et  al.,  2007;  Cuevas  et  al,  2011;  Verret  et  al.,   2012).   A   pesar   de   mostrar   efectos   opuestos,   se   ha   propuesto   que   mediante   la   alteración   de   la   actividad   espontánea   de   las   redes   neuronales   (ya   sea   disminuyendo   o   incrementando   la   excitabilidad  celular),   la  capacidad  de   las  redes  neuronales  para  sincronizar  su  actividad  y  oscilar   en  un  patrón  con  una  frecuencia  especíeica  está  afectada  en  presencia  del  Aβ  (Verret  et  al.,  2012;  Liu   et  al.,  2013a;  Busche  &  Konnerth,  2016;  Palop  et  al.,  2016),  de  tal  manera  que  el  Aβ  intereiere  con  la   capacidad  de  la  red  para  cumplir  con  su  función.     De  una  manera  más  precisa,  se  ha  propuesto  que  el  mecanismo  por  el  cual  el  Aβ  afecta  la  actividad   oscilatoria,   y   en   consecuencia,   la   formación   de   la   memoria,   es   a   través   de   la   modulación   de   la   excitabilidad  celular  y  de  la  transmisión  sináptica  (Figura  3;  Salgado-­‐Puga  &  Peña-­‐Ortega,  2015).  En   este  sentido,  el  Aβ  puede  modieicar  la  excitabilidad  celular  a  través  de  la  modulación  de  la  actividad   de  diversos  canales  iónicos  (e.g.  canales  de  Ca2+  y  de  K+)  y  de  varios  receptores  de  membrana  (e.g.  el   receptor  nicotínico  α7;  Peña  et  al.,  2006;  Salgado-­‐Puga  &  Peña-­‐Ortega,  2015).  Además,  el  Aβ  puede   inducir   la   activación   de   cinasas   asociadas   a   la   modulación   de   canales   iónicos   y   la   transmisión   sináptica  como   la  cinasa  de  serinas/treoninas  glucógeno  sintetasa  cinasa-­‐3  beta  (GSK-­‐3β,  por  sus   siglas   en   inglés;   Zhu   et   al.,   2010;  Wildburger   et   al.,   2012).   Se   ha   referido   que   la   actividad   de   la   GSK-­‐3β  participa  de  manera  determinante  en  la  eisiopatología  de  la  EA  (Pei  et  al.,  1997;  Blalock  et   al.,   2004;   Leroy   et   al.,   2007).   Principalmente,   se   ha   descrito   que   la   activación   de   la   GSK-­‐3β   promueve  la  producción  del  Aβ  (Ly  et  al.,  2012;  Qu  et  al.,  2014),  y  que  esta  cinasa  está  involucrada   en   el   deterioro   de   la   memoria   (Fiorentini   et   al.,   2010;   Zhao   et   al.,   2014)   y   en   la   alteración   la   actividad  de  los  circuitos  neuronales  (Peña-­‐Ortega  et  al.,  2012;  Isla  et  al.,  2016)  inducidos  por  el  Aβ.   11 Además,  la  participación  de  la  GSK-­‐3β  en  los  efectos  del  Aβ  se  ha  visto  corroborada  con  hallazgos  in   vitro  en  donde  el  tratamiento  con  litio  (inhibidor  inespecíeico  de  la  GSK-­‐3β,  Quiroz  et  al.,  2004)  o  el   inhibidor  especíeico  de   la  GSK-­‐3β,  VIII   (Bhat  et  al.,  2003;  Vasdev  et  al.,  2005),  previene   la  muerte   neuronal   producida   por   el   Aβ   (Alvarez   et   al.,   1999;   Koh   et   al.,   2008).   Coincidentemente,   el   tratamiento   con   litio   evita   el   deterioro   en   la   actividad   oscilatoria   hipocampal  mediada   por   el   Aβ   (Balleza-­‐Tapia  et  al.,  2010;  Peña-­‐Ortega  et  al.,  2012;  Islas  et  al.,  2016).     Fig.   3.   Mecanismos   moleculares   involucrados   en   las   alteraciones   de   la   actividad   oscilatoria   inducidas   por   el   Aβ.   Se   muestran   algunas   de   las   alteraciones   moleculares   que   induce   el   Aβ   sobre   las   células   excitadoras   (ej.   células   piramidales   -­‐negro-­‐)   y   las   células   inhibidoras   (ej.   interneuronas   -­‐naranja-­‐)  mediante   las  cuales  afecta   la  actividad  y   la  dinámica  de   los  circuitos   neuronales,   lo   que   intereiere   con   la   inducción   de   la   actividad   oscilatoria   necesaria   para   la   formación  de  la  memoria.  Las  elechas  indican  el  efecto  que  induce  el  Aβ  sobre  dicho  elemento.   Aβ   (péptido   β   amiloide),   GSK-­‐3   (Glucógeno   Sintetasa   Cinasa-­‐3),   nAChRs   (Receptores   de   acetilcolina  tipo  nicotínicos,  por  sus  siglas  en  inglés),  VDCCs  (canales  de  Ca2+  dependientes  de   voltaje,   por   sus   siglas   en   inglés)   de   los   tipos  N/P/Q/L,   LTM   (memoria   de   lago  plazo,   por   sus   siglas  en  inglés).  La  eigura  fue  modieicada  de  Salgado-­‐Puga  &  Peña-­‐Ortega,  2015.   Efectos  del  Aβ  sobre  la  plasticidad  sináptica  hipocampal   Como  se  mencionó  en  el  apartado  anterior,  la  formación  y  evocación  de  la  memoria  requieren   de   la   coordinación   temporal   de  múltiples   redes   neuronales.   Sin   embargo,   antes   de   que   ocurra   la   coordinación  temporal  de  múltiples  redes  neuronales,  se  deben  reforzar  las  redes  neuronales  que   especíeicamente  van  a  estar  involucradas  en  la  representación  de  la  información  adquirida,  para  así   posteriormente,  poder  evocarla  (Zhang  y  Linden,  2003;  Josselyn  et  al.,  2015).  Este  proceso  ocurre   12 mediante  cambios  en  la  función  y  eeiciencia  sináptica  de  las  células  que  van  a  formar  parte  de  los   ensambles  neuronales  asociados  a  la  formación  de  la  memoria  (Rogerson  et  al.,  2014).  Los  cambios,   de  duración  variable,  en  la   función  sináptica  se  deeinen  como  plasticidad  sináptica  (Cooke  y  Bliss,   2006).  Los  eventos  plásticos,  que  requieren  diversos  procesos  moleculares,  pueden  incluir  cambios   en   el   número   de   canales   y/o   receptores   de   membrana,   así   como   cambios   en   la   estructura,   distribución  y  número  de  sinapsis  (Bear  MA,  1996;  Collingridge  et  al.,  2004).  Dentro  de  los  procesos   de   plasticidad   sináptica   se   incluyen:   la   habituación,   la   deshabituación,   la   sensibilización,   la   facilitación,  la  potenciación  de  largo  plazo  (LTP,  por  sus  siglas  en  inglés),  la  depresión  de  largo  plazo   (LTD,  por  sus  siglas  en   inglés),  entre  otros  (Kandel  E,  2013).  En  particular,   la  LTP  y   la  LTD  se  han   observado   en   el   hipocampo   durante   los   procesos   de   aprendizaje   y   memoria   de   una   tarea   en   modelos  animales   (Borroni   et   al.,   2000;  Braunewell   y  Manahan-­‐Vaughan,  2001;  Taubenfeld  et   al.,   2001;   Aboulkassim   et   al.,   2011)   y   se   consideran   esenciales   para   la   formación   de   memoria   en   humanos  (Cooke  &  Bliss,  2006;  Lazzaro  et  al.,  2009;  Suppa  et  al.,  2015).  La  LTP  se  caracteriza  por  un   incremento  en  la  fuerza  sináptica,  mientras  que  la  LTD  se  caracteriza  por  una  reducción  en  la  fuerza   sináptica.   Ambos   procesos   pueden   mantenerse   por   horas,   días,   incluso   meses   (Abraham   et   al.,   2002;  Neves  et  al.,  2008).  Ambos  procesos,  a  través  de  vías  moleculares  diferentes,  inducen  cambios   en  la  estructura  sináptica  (por  ejemplo:  redistribución  de  receptores,  remodelación  de  conexiones   sinápticas,   etc.)   que   permiten   el   almacenamiento   de   la   memoria   y   su   evocación   (Cooke   &   Bliss,   2006;  Massey  &  Bashir,  2007).  Consecuentemente,  la  alteración  en  la  expresión  de  la  LTP  y/o  la  LTD   han  sido  asociados  con  deeiciencias  en  la  formación  de  la  memoria  (Escobar  &  Derrick,  2007).     Considerando  lo  anterior,  ha  habido  gran  interés  de  estudiar  los  efectos  del  Aβ  sobre  la  plasticidad   sináptica,   en   particular   sobre   los   procesos   de   la   LTP   y   la   LTD,   y   su   posible   correlación   con   el   deterioro  cognoscitivo  observado  en   la  EA.  En  este  sentido,  existe  una  gran  cantidad  de  evidencia   que  muestra  que  la  aplicación  de  Aβ  in  vitro  (Freir  et  al.,  2003;  Townsend  et  al.,  2006;  Li  et  al.,  2011;   Lei   et   al.,   2016)   e   in   vivo   (Walsh   et   al.,   2002;   Klyublin   et   al.,   2005;2008;   Puzzo   et   al.,   2009;   13 Srivareerat  et  al.,  2009;2011)  inhibe  la  LTP  en  el  hipocampo.  El  Aβ  afecta  tanto  la  fase  de  inducción   (Dineley  et  al.,  2010),  como  la  fase  de  mantenimiento  (Ma  et  al.,  2012)  de  la  LTP.  Por  el  contrario,   varios  estudios  han  mostrado  que  la  aplicación  del  Aβ  facilita  (Cheng  et  al.,  2009;  Cavallucci  et  al.,   2013;  Chen  et  al.,  2013;  Hu  et  al.,  2014)  e  induce  (Kim  et  al.,  2001;  Wang  et  al.,  2002;  Shankar  et  al.,   2008;  Li  et  al.,  2009)  LTD  en  el  hipocampo.  Ambos  efectos  inducidos  por  el  Aβ  sobre  la  plasticidad   sináptica   han   sido   correlacionados   con   la   alteración   de   la   memoria   dependiente   del   hipocampo   (Shankar  et  al.,  2008;  Srivareerat  et  al.,  2009;2011;  Ma  et  al.,  2012).  La  alteración  de  la  transmisión   sináptica  de  largo  plazo  también  ha  sido  correlacionada  con  deeiciencias  en  la  memoria  en  modelos   transgénicos  de  la  EA  (Chapman  et  al.,  1999;  Oddo  et  al.,  2003;  Cleary  et  al.,  2005;  Liu  et  al.,  2008;   Mitchell  et  al.,  2009;  Moreno-­‐Castilla  et  al.,  2016).  De  manera  interesante,  este  fenómeno  también  se   ha   observado   en   un   modelo   de   la   EA   espontánea,   el   roedor Octodon   degus.   En   este   modelo   la   memoria  de   contexto   está  deteriorada  de  manera   correlacionada   con   la   inhibición  de   la   LTP  y   la   facilitación  de  la  LTD  (Ardiles  et  al.,  2012).   Debido  a  que  la  capacidad  de  almacenamiento  de  información  en  un  circuito  se  basa  en  el  balance   entre   la   potenciación   y   la   depresión   de   la   transmisión   sináptica   (Muller   et   al.,   1995;   Daodal   y   Debanne,   2003),   se   ha   propuesto   que   el   Aβ   promueve   la   activación   de   las   vías   moleculares   involucradas  en  la  inducción  de  la  LTD  e  inhibe  las  vías  moleculares  requeridas  para  la  inducción  de   la   LTP,   de   tal   manera   que   induce   un   desequilibrio   en   los   mecanismos   moleculares   que   son   necesarios  para   la   formación  de   la  memoria  (Figura  4;  Salgado-­‐Puga  &  Peña-­‐Ortega,  2015).  Es  así   que,  el  Aβ  modieica  la  conductancia  (Parameshwaran  et  al.,  2007;  Alberdi  et  al.,  2010;  Texidó  et  al.,   2011)   de   los   receptores   AMPA   (ácido   α-­‐amino-­‐3-­‐hidroxi-­‐5-­‐metil-­‐4-­‐isoxazolpropiónico,   por   sus   siglas  en   inglés)  y  NMDA  (N-­‐metil-­‐D-­‐aspartato,  por  sus  siglas  en   inglés),  así  como   la  presencia  de   estos   receptores-­‐canal   en   la  membrana   celular   (Snyder   et   al.,   2005;  Origlia   et   al.,   2010;  Miñano-­‐ Molina  et  al.,  2011),  los  cuales  están  involucrados  en  la  inducción  de  la  LTP  y  la  LTD  (Malenka  RC,   1994).  La  modulación  de  la  actividad  de  estos  receptores  producida  por  la  presencia  del  Aβ  altera  la   14 entrada  de  Ca2+  a  las  neuronas,   ineluyendo  así  en  la  inducción  de  la  LTP  y  la  LTD  (Neveu  &  Zucker,   1996).  Está  ampliamente  caracterizado  que  los  eventos  moleculares  requeridos  para  inducir  la  LTP   son  la  entrada  de  Ca2+  súbita  y  masiva  (Neveu  &  Zucker,  1996),  la  activación  de  la  CaMKII  (Calcio-­‐ Calmodulín  Cinasa  II,  por  sus  siglas  en   inglés).  Para  el  mantenimiento  de   largo  plazo  de   la  LTP  es   necesaria   la   inserción  de  receptores  AMPA  en  la  membrana  celular  (Raymond  et  al.,  2007).  Por  el   contrario,  para  la  inducción  de  la  LTD  se  requiere  de  una  entrada  lenta  y  prolongada  de  Ca2+  (Neveu   y   Zucker,   1996),   mediada   por   la   activación   de   receptores   NMDA   extrasinápticos   (Massey   et   al.,   2004)  y  la  activación  de  la  fosfatasa  calcineurina  (Collingridge  et  al.,  2010).  A  diferencia  de  la  LTP,   para  el  mantenimiento  de  largo  plazo  de  la  LTD  se  requiere  de  la  internalización  de  los  receptores   AMPA   (Collingridge   et   al.,   2004).   Se   ha   reportado   que   el   Aβ   puede   inducir   la   activación   de   los   receptores  NMDA  extrasinápticos  (Talantova  et  al.,  2013)  y la  activación  de  la  calcineurina  (Li  et  al.,   2011;   Knobloch   et   al.,   2007),   lo   que   facilita   la   inducción   de   la   LTD   (Li   et   al.,   2009)   e   inhibe   la   inducción  de   la  LTP  (Chen  et  al.,  2002;  Zhao  et  al.,  2004;  Knobloch  et  al.,  2007).  De  esta   forma,   la   suma  de  estos  fenómenos  afecta  la  memoria  (Dineley  et  al.,  2010). Adicionalmente,  la  activación  de   la   calcineurina  por  el  Aβ,  puede   inhibir   la  activación  de   la  CaMKII   (Zhao  et  al.,  2004)  y  activar   la   cinasa   GSK-­‐3β   (Alvarez   et   al.,   1999).   La   activación   de   la   GSK-­‐3β   inducida   por   el   Aβ,   evita   la   formación  de  la  memoria  (Rockenstein  et  al.,  2007;  Dewatcher  et  al.,  2009;  Fiorentini  et  al.,  2010;   Onishi  et  al.,  2011),  facilita  la  LTD  e  inhibe  la  LTP  (Dewatcher  et  al.,  2009;  Jo  et  al.,  2011;  Shipton  et   al.,  2011)  mediante  la  inhibición  de  la  liberación  de  glutamato  (Zhu  et  al.,  2007)  y  la  internalización   de  los  receptores  AMPA  (Miñano-­‐Molina  et  al.,  2011).  Alternativamente,  se  han  descrito  otras  vías   transduccionales  por  las  que  el  Aβ  promueve  la  activación  de  la  GSK-­‐3β,  inhibe  la  LTP  y  deteriora  la   memoria  (Wang  et  al.,  2008;  Balleza-­‐Tapia  &  Peña,  2009;  Yang  et  al.,  2011).  La  unión  del  Aβ  a   las   integrinas   (glicoproteínas   de  membrana)   inhibe   el   LTP   (Wang   et   al.,   2008).   La   activación   de   las   integrinas  por  el  Aβ,  a  su  vez,  activa  a   las  cinasas  FAK  (siglas  en   inglés  para  cinasa  de  adherencia   focal;  Grace  y  Busciglio,  2003;  Frasca  et  al.,  2008)  y  Fyn  (Frasca  et  al.,  2008;  Williamson  et  al.,  2002)   15 las  cuales  terminan  por  activar  la  GSK-­‐3β  (Sayas  et  al.,  2002;  Geschwind  et  al.,  2003).     Fig.   4.   Mecanismos   moleculares   involucrados   en   las   alteraciones   de   la   plasticidad   sináptica   inducidas   por   el   Aβ.   Las   vías   moleculares   activadas   (negro)   e   inhibidas   (gris)   por   el   Aβ   involucran   cambios   en   la   entrada   de   Ca2+,   la   liberación   de   neurotransmisores   y   la   internalización  de  receptores.  En  conjunto,  estos  cambios  promueven  la  inducción  de  la  LTD  y  la   inhibición   de   la   LTP.   Estas   alteraciones   en   la   plasticidad   sináptica   afectan   la   formación   de   la   memoria.   Aβ   (péptido   β   amiloide),   AMPARs   (receptores   ácido   α ︎-­‐amino-­‐3-­‐hidroxi-­‐5-­‐ metilisoxazol-­‐4-­‐propiónico,   por   sus   siglas   en   inglés),   NMDARs   (receptores   N-­‐metil-­‐D-­‐ aspartato),  nAChRs  (receptores  de  acetilcolina  tipo  nicotínicos,  por  sus  siglas  en  inglés),  VDCCs   (canales  de  Ca2+  dependientes  de  voltaje,  por  sus  siglas  en  inglés),  CaMKII  (calcio  calmodulina   cinasa   II,  por  sus  siglas  en   inglés),  Fyn  (cinasa   tipo  Src),   cAMP  (adenosín  monofosfato  cíclico,   por  sus  siglas  en   inglés),  PKA  (proteína  cinasa  A,  por  sus  siglas  en   inglés),  CREB  (proteína  de   unión  a  elementos  de  respuesta  al  cAMP,  por  sus  siglas  en  inglés),  GSK-­‐3  (Glucógeno  Sintetasa   Cinasa-­‐3,  por  sus  siglas  en  inglés),  LTD  (Depresión  de  largo  plazo,  por  sus  siglas  en  inglés),  LTP   (Potenciación  de   largo  plazo,  por   sus   siglas  en   inglés),  LTM  (Memoria  de   largo  plazo,  por   sus   siglas  en  inglés;  modieicado  de  Salgado-­‐Puga  &  Peña-­‐Ortega,  2015).   16 Canales  de  Potasio  sensibles  a  ATP  (KATP)     Los  canales  de  potasio  sensibles  a  ATP  (KATP)  pertenecen  a  la  sexta  subfamilia  de  los  canales   rectiFicadores  entrantes  de  K+  (KIR,  por  sus  siglas  en  inglés).  La  característica  principal  de  los  canales   KATP   es   que   su   actividad   está   modulada   por   la   proporción   de   la   concentración   intracelular   de   Adenosín  Trifosfato  y  Adenosín  Difosfato  (ATPi/ADPi,  respectivamente).  Generalmente,  los  estados   cerrados  del  canal  son  favorecidos  por  el  ATP,  mientras  que  los  estados  abiertos  son  favorecidos  por   el  ADP.  De  esta  manera,  los  cambios  en  las  concentraciones  de  ATPi/ADPi  modieican  el  elujo  de  K+  a   través   de   la  membrana   celular,   impactando   directamente   el   potencial   de  membrana   celular   y   su   excitabilidad  (Seino  S,  1999;  Lu  Z,  2004).  En  este  sentido,  se  considera  que  la  función  principal  de   los  canales  KATP   es   la  asociación  de  eventos  metabólicos  con   la  excitabilidad  celular   (Babenko  AP,   2005;  Hibino  et  al.,  2010).     Fig.   5.   Constitución   del   canal   KATP.   En   la   parte   superior,   se   muestran   las   subunidades   que   componen  el  poro  del  canal  (KIR  6.x)  y  las  subunidades  auxiliares  (SURx).  A  su  vez,  se  muestran   los   dominios   transmembranales   (TMDs,   por   sus   siglas   en   inglés)   y   los   dominios   de   unión   a   nucleótidos  (NBD  1  y  2,  por  sus  siglas  en  inglés)  de  las  subunidades  SUR.  En  la  parte  inferior  se   muestra   un   modelo   tridimensional   de   cómo   4   subunidades   KIR   (amarillo-­‐rojo)   están   ensambladas  con  4  subunidades  SUR  (azules)  para  formar  un  canal  KATP  funcional  (Modieicado   de  Moreau  et  al.,  2005).   17 Estructura   Los   canales   KATP   están   compuestos   de   4   subunidades   que   conforman   el   poro   del   canal   de   potasio   (subunidades   KIR   6.x)   y   cuatro   proteínas   reguladoras:   los   receptores   a   sulfonilureas   (subunidades   SURx;   Figura   5).   Las   subunidades   KIR   comprenden   las   variantes   KIR   6.1   y   KIR   6.2,   mientras  que   las  subunidades  de   los  receptores  a  sulfonilureas  comprenden   las  variantes  SUR1  y   SUR2.  Ésta  última,  comprende  las  variantes  SUR2A  y  SUR2B.  Los  genes  de  las  subunidades  KIR  6.2  y   SUR1   se   encuentran   en   el   cromosoma   11   en   la   posición   11p   15.1,   mientras   que   los   genes   que   codieican  para  las  subunidades  KIR  6.1  y  SUR2  se  encuentran  en  el  cromosoma  12  (Aguilar-­‐Bryan  y   Bryan,  1999;  Campbell  et  al.,  2003).         Fig.   6.   Topología   de   las   subunidades   KIR   6.1   (A)   y   KIR   6.2   (B).   Se   muestran   los   segmentos   transmembranales   (TMS1,   TMS2),   la   región   H5   en   la   que   se   encuentra   la   secuencia   de   selectividad   por   los   iones   de   K+   y,   el   amino   (NH3+)   y   carboxilo   (COO−)   terminal   de   cada   subunidad.   Los   sitios   de   fosforilación   por   PKA   y   PKC   están   indicados   por   círculos   rellenos   y   abiertos,  respectivamente  (Modieicado  de  Seino  S,  1999).   Las  subunidades  KIR  6.x  presentan  dos  segmentos  transmembranales  (TMS1  y  2,  por  sus  siglas  en   inglés)   unidos   por   una   región   extracelular   que   forma   el   poro   (H5),   un   amino   citoplásmico   y   un   carboxilo  terminal  (Figura  6).  La  región  H5,  que  contiene  la  secuencia  que  determina  la  selectividad   del  poro  para   los   iones  de  K+   y   la   cual   es   conservada  en   los   canales  de  K+   (MacKinnon  R,  1991),   contiene  un  aminoácido  extra,  el  aminoácido  fenilalanina,  por  lo  que  la  secuencia  de  selectividad  es   Treonina-­‐X-­‐Glicina-­‐Tirosina-­‐Fenilalanina-­‐Glicina   (T-­‐X-­‐G-­‐Y-­‐(F)-­‐G;   Seino   S,   1999).   Arregladas   en   tetrámeros,   las   subunidades  KIR   6.x   forman   el   poro  del   canal   de  ∼7-­‐15Å  de  diámetro   y  ∼90Å  de   18 largo   (Kuo   et   al.,   2003),   que   puede   presentar   una   conductancia   de   canal   único   de   20-­‐100   pS   (dependiendo  de  cual  sea  la  conformación  del  canal;  Pelletier  et  al.,  2000;  Tanner  et  al.,  2011).  En   comparación  con  otros  canales  KIR,  que  presentan  ácido  aspártico  en  el  segmento  TMS2  (que  es  un   factor   determinante   para   la   capacidad   de   rectieicación   del   canal),   el   canal   formado   por   las   subunidades  KIR   6.x  presenta  asparagina   (Ho  et   al.,   1993).  Además,   las   subunidades  KIR   6.1  y  6.2   presentan  sitios  intracelulares  en  los  que  puede  unirse  el  ATP/ADP  (Tucker  et  al.,  1997;1998;  Li  et   al.,  2000),  así  como  varios  sitios  de  fosforilación  (Babenko  AP,  2005).  La  subunidad  KIR  6.1  presenta   dos  sitios  que  pueden  ser  fosforilados  por  la  proteína  cinasa  A  (PKA,  por  sus  siglas  en  inglés)  y  siete   sitios   que   pueden   ser   fosforilados   por   la   proteína   cinasa   C   (PKC,   por   sus   siglas   en   inglés).   La   subunidad   KIR   6.2   también   tiene   dos   sitios   que   pueden   ser   fosforilados   por   la   PKA   y   cinco   que   pueden  ser  fosforilados  por  la  PKC  (Seino  S,  1999).     Por  otro  lado,  las  subunidades  SUR  pertenecen  a  la  superfamilia  de  proteínas  con  cassettes  de  Fijación   de  ATP   (ABC,  por  sus  siglas  en   inglés;  Ashcroft  &  Ashcroft,  1992).  Todas   las  proteínas  ABC  tienen   cinco   dominios   estructurales:   un   dominio   carboxilo-­‐terminal   de   5   segmentos   transmembranales   (TMD0),  2  dominios  transmembranales  (TMD  1  y  2)  con  6  segmentos  transmembranales  cada  uno,   y  2  sitios  intracelulares  citoplasmáticos  llamados  dominios  de  unión  a  nucleótidos  1  y  2  (NBDs  1  y  2,   por   sus   siglas   en   inglés)   los   cuales   son   pliegues   de   eijación   a   nucleótidos   (Figura   5;   Higgins   CF,   2001).   Cada   NBD   contiene   un  motivo  Walker   A,  Walker   B,   también   llamados   “P-­‐Loops”,   que   son   motivos  con  bucles  de  unión  a  fosfatos,  y  una  secuencia  motivo  de  unión  L-­‐S-­‐G-­‐G-­‐Q  conocida  como   la  secuencia  característica  de  las  proteínas  ABC  (Figura  7).  Todos  estos  motivos  están  implicados  en   la  unión  e  hidrólisis  de  nucleótidos,  como  el  ATP  y  el  ADP,  así  como  en  los  efectos  de  estos  sobre  la   actividad   del   canal   (Campbell   et   al.,   2003).   Cuando   los   sitios   NBD   1   y   2   están   expuestos   a   nucleótidos  forman  dímeros  en  los  que  se  encapsula  el  ATP/ADP  y  genera  el  sitio  catalítico  para  su   hidrólisis  (Figura  7).  Tanto  el  ATP  como  el  ADP  presentan  una  mayor  aeinidad  de  unión  por  el  sitio   NBD   1   (Matsuo   et   al.,   2000).   Se   ha   propuesto   que   la   dimerización   de   los   NBDs   induce   la   19 reconeiguración  del  canal  de  modo  que  se  abra  o  se  cierre  el  poro  de  canal  (Yamada  et  al.,  2004).  Por   ultimo,  al  igual  que  las  subunidades  KIR,  las  subunidades  SUR  tienen  al  menos  dos  sitios  que  pueden   ser   fosforilados  por   la  PKA  y   la  PKC  (Figura  7;  Tusnády  et  al.,  1997).  En  un  canal   funcional,   las  4   subunidades  Kir  6.x  están  unidas  con  4  subunidades  SURx  y,  dependiendo  del  tipo  de  la  subunidad   SUR  expresada  en  combinación  con  el  tipo  de  la  subunidad  KIR  que  el  canal  posea,  las  características   eléctricas  y  moleculares  de  los  canales  KATP  pueden  variar  (Liss  et  al.,  1999).   A B ! ! Fig.   7.  Modelo   de   los   dominios   NBDs   que   presenta   cada   subunidad   SUR.   A,   se   muestra   el   modelo   estructural   del   dominio   NBD1   (azul)   y   el   dominio   NBD   2   (morado)   los   cuales   se   dimerizan   atrapando   el   ATP   en   dos   sitios   de   unión.   Además,   se   muestran   los   sitios   de   los   motivos  Walker  A   (amarillo),  Walker  B   (naranja)  y   la  secuencia  característica  de   las  proteínas   ABC  (verde),  los  cuales  están  involucrados  en  la  unión  de  nucleótidos  a  los  NBDs.  B,  se  muestra   un  acercamiento  a  uno  de  los  sitios  de  unión  en  los  NBDs  donde  el  ATP  (verde)  está  asociado  a   una  molécula  de  Mg2+  (café),  la  cual  puede  determinar  la  dinámica  de  cierre  o  apertura  del  canal   (Modieicado  de  Campbell  et  al.,  2003).     Localización Los  canales  KATP   fueron  descubiertos  por  primera  vez  en   los  miocitos  cardiacos  por  Akinori   Noma  (Noma  A,  1983;  Trube  G  &  Hescheler  J,  1984).  Posteriormente,  fueron  descritos  en  otros  tipos   celulares  como  las  células  β  pancreáticas  (Ashcroft  et  al.,  1984;  Cook  D  &  Hales  C,  1984),  las  células   del  músculo   esquelético   (Spruce   et   al.,   1985),   las   células   del  músculo   liso   (Standen   et   al.,   1989;   Beech  et  al.,  1993)  y,   einalmente,  en   las  neuronas  (Ashford  et  al.,  1988;1990).  La  expresión  de   los   canales   KATP   en   estos   tejidos   es   combinación-­‐especíeica   (tipo   de   subunidad   KIR   6.x   y   SURx   que   ATP NDB1 NDB2 ATP Site 1 Site 2 1 20 expresan;  Ashcroft  &  Gribble,  1998;  Shi  et  al.,  2005).  Por  ejemplo,   la  combinación  KIR6.2/SUR1  es   expresada   mayoritariamente   por   las   células   pancreáticas.   La   combinación   KIR6.2/SUR2A   es   mayormente   expresada   por   las   células   cardiacas   y   del   músculo   esquelético.   En   contraste,   la   combinación  KIR6.1/SUR2B   se   encuentra   expresado  más   en   células  del  músculo   liso   (Ashcroft  &   Gribble,  1998).   En  general,  todas  las  células  del  SNC  expresan  los  canales  KATP,  y  su  expresión  dentro  de  los  tipos   celulares  y  las  estructuras  cerebrales  no  son  tan  especíeicas  como  en  otros  tejidos  (Karschin  et  al.,   1997;  Zhou  et  al.,  1999;  2012).  En  el  hipocampo,  las  células  expresan  en  su  mayoría  la  combinación   KIR  6.2/SUR1  (Karschin  et  al.,  1997;  Moriguchi  et  al.,  2016),  aunque  también  se  ha  encontrado,  en   menor  medida,   las   combinaciones  KIR   6.1/SUR2A/B   (Wu   et   al.,   2006;  Moriguchi   et   al.,   2016).  De   manera  más  detallada,  Zawar  et  al.   (1999)  demostraron  que  el  26%  de   las  células  piramidales,  el   89%  de  las  interneuronas  y  el  100%  de  las  células  gliales  de  la  región  CA1  del  hipocampo  expresan   canales   KATP.   Entre   las   células   piramidales   que   expresan   canales   KATP,   sólo   un   17%   expresa   la   combinación  KIR  6.2/SUR1.  De  igual  manera,  del  89%  de  interneuronas  que  expresan  canales  KATP,   el  58%  de  las  interneuronas  expresa  la  combinación  KIR  6.2/SUR1  (Zawar  et  al.,  1999).  El  resto  de   las   células,   sean   piramidales   o   interneuronas,   que   expresan   los   canales   KATP,   expresan   combinaciones  KIR  6.1/SUR1/2A/B.     A  nivel  celular,  los  canales  de  KATP  están  localizados  en  la  membrana  plasmática  (KATP  plasmáticos)  y   en   la  membrana   interna  mitocondrial   (canales   KATP  mitocondriales;   Inoue   et   al.,   1991;   Hu   et   al.,   1999;  Foster  et  al.,  2012).  A  pesar  de  que  no  se  ha  descrito   la   identidad  molecular  de   los  canales   KATP  mitocondriales   (mito-­‐KATP;   Inoue   et   al.,   1991;   Liu   et   al.,   1998)   y   no   se   sabe   si   existe   alguna   diferencia  estructural  o  bioeísica  comparados  con   los  canales  KATP  plasmáticos,  si  se  han  sugerido   diferencias  en  la  contribución  de  estos  canales  con  respecto  a  la  funcionalidad  celular.  Por  ejemplo,   los   canales   KATP   plasmáticos   se   han   asociado   más   con   cambios   en   la   excitabilidad   celular   y   liberación  de  sustancias  (Seino  S,  1999),  mientras  que  los  mito-­‐KATP  pueden  regular  el  potencial  de   21 membrana   mitocondrial   y   su   volumen,   de   tal   manera   que   afecta   la   producción   de   ATP   y   la   de   especies  reactivas  de  oxígeno  (ROS,  por  sus  siglas  en  inglés;  Light  et  al.,  2001;  Malinska  et  al.,  2010).   En   este   sentido,   la   localización   celular   de   los   canales  KATP   es   esencial   para   la   asociación   entre   el   consumo  de  ATP/ADP  y  el  estado  energético  (balance  ATPi/ADPi)  en  el  que  se  encuentre  la  célula,   así  como  para  la  capacidad  de  dicha  célula  para  responder  a  un  estímulo  químico  o  eléctrico.       Regulación  de  la  actividad  del  canal  KATP   El   canal   KATP,   como   miembro   de   la   familia   de   los   canales   KIR,   tiene   una   actividad   que   se   caracteriza  por  conducir  preferentemente  corrientes  entrantes  de  K+  a  voltajes  de  membrana  (Vm)   negativos  que  tienden  al  potencial  de  equilibrio  del  K+  (EK=  -­‐75  mV).  Por  el  contrario,  conduce  en   menor  medida  corrientes  salientes  de  K+  a  voltajes  positivos  que  se  alejan  del  EK  (Figura  8A).  Esta   propiedad  de  conducción  se  deeine  como  rectiFicación  entrante  (Katz  B,  1949;  Hagiwara  et  al.,  1974;   1976).  La  propiedad  de  rectieicación  es  dependiente  del  Vm,  dependiente  del  EK,  e  independiente  de   la  concentración  intracelular  de  K+  (Lu  Z,  2004).  La  dependencia  del  Vm  se  ve  reelejada  en  el  bloqueo   del  poro  del  canal  por  iones  de  Mg2+  y  por  poliaminas  (por  ejemplo,  la  espermina  y  esperimidina;   Figura  8A).  La  capacidad  de  rectieicar,  también  depende  del  arreglo  de  aminoácidos  dentro  del  poro   del   canal.   Por   ejemplo,   los   canales  KIR   clásicos   (KIR   2.x)   que  presentan  una   rectieicación   entrante   fuerte,  tienen  ácido  aspártico  en  el  residuo  172  del  segundo  segmento  transmembranal  (Ho  et  al.,   1993).  Por  el  contrario,  en  los  canales  KATP  las  subunidades  KIR  6.1  y  6.2  presentan  asparangina  en   la   posición   correspondiente   (residuos   170   y   160,   respectivamente).   La   sustitución   de   ácido   aspártico   por   asparangina   reduce   la   capacidad   de   rectieicación,   por   lo   que   los   canales   KATP   son   considerados  rectieicadores  débiles  (Ho  et  al.,  1993).  La  denominación  fuerte  o  débil  es  un  indicador   de   la   cantidad   de   corriente   que   el   canal   puede   conducir   hacia   afuera   cuando   el   potencial   de   membrana   es   mayor   que   el   EK.   En   este   caso,   un   rectieicador   débil,   como   el   canal   KATP,   conduce   mayor  corriente  saliente  (Hibino  et  al.,  2010).  Además  de  la  modulación  por  cationes,  poliaminas,  y   22 la  conformación  intrínseca  del  canal,  la  actividad  del  canal  KATP  está  regulada  por  la  unión  del  ATP/ ADP  al  amino  terminal  y  al  carboxilo  terminal  (en  los  cuales  5  residuos  conforman  el  sitio  de  unión   al  ATP/ADP)  de  las  subunidades  KIR  6.x  (Markworth  et  al.,  2000).  La  unión  de  alta  aeinidad  del  ATP   (Figuras  8B  y  C)  en  este  sitio  induce  el  cierre  del  canal  sin  depender  de  la  presencia  de  Mg2+,  el  cual   si  esta  unido  al  ATP,  puede  modieicar  el  efecto  del  ATP  sobre   la  actividad  del  canal   (Tucker  et  al.,   1997;  Gribble  et  al.,  1998;  Ribalet  et  al.,  2003).     Fig.  8.  Características  eléctricas  y  farmacológicas  de  los  canales  KATP.  A,  curva  corriente  (I)  vs.   voltaje  (V)  de  canal  único  del  canal  KIR  6.2/SUR1  donde  se  muestra  que  la  rectieicación  entrante   del   canal   KATP   requiere   de   la   presencia   de   Mg2+   (modieicado   de   Aguilar-­‐Bryan,   1998).   B,   registros  de  canal  único  del  canal  KIR  6.2/SUR1  donde  se  muestra  que  la  aplicación  de  ADP  en   presencia  de  Mg2+  promueve  la  apertura  del  canal,  mientras  que  la  aplicación  de  ATP  sin  Mg2+   induce  el  cierre  del  canal  (modieicado  de  Aguilar-­‐Bryan  &  Bryan,  1999).  C,  se  muestra  la  curva   de  inhibición  por  ATP  de  los  canales  KIR  6.2/SUR1.  La  concentración  inhibidora  50  (IC50)  varía   de  10  -­‐  50  µM  dependiendo  del  tejido  en  el  que  este  expresado  el  canal  (modieicado  de  Aguilar-­‐ Bryan,  1998).  D,  se  muestra  la  curva  de  activación  por  ADP-­‐Mg2+  de  los  canales  KIR  6.2/SUR1.  La   concentración   efectiva   50   (EC50)   varía   de   10   -­‐   100   µM   (Campbell   et   al.,   2003).   Nótese   que   concentraciones   muy   altas   de   ADP-­‐Mg2+   (∼   10   mM)   también   inducen   el   cierre   del   canal   (modieicado  de  Proks  et  al.,  2014).   23 Considerando   lo  anterior,  el  papel  de   las  subunidades  SUR  sobre   la  actividad  del  canal  KATP   es  de   modulación.  La  unión  de  los  nucleótidos  en  las  subunidades  SURx  modula  y  estabiliza  los  estados   abiertos  o  cerrados  del  canal.  De  esta  manera,  la  inhibición  del  canal  se  produce  por  la  unión  de  ATP   a  la  subunidad  KIR  6.x,  la  cual  es  amplieicada  por  la  unión  de  ATP  (sin  estar  unido  a  iones  de  Mg2+)  a   la   subunidad   SURx   (Figuras  8B  y  C;  Tucker   et   al.,   1997;  Gribble   et   al.,   1998).   Por   el   contrario,   la   unión  de  ATP/ADP  +  Mg2+   a   la   subunidad  SURx   induce  y  estabiliza   los  estados  abiertos  del   canal   (Figuras  8B  y  D).  Esto  puede  ocurrir  por   la  unión  directa  del  ADP-­‐Mg2+  a   los  NBDs  o  mediante   la   hidrólisis  del  ATP-­‐Mg2+  que  ocurre  en  el  dominio  NBD2  de  la  subunidad  SURx  (Tucker  et  al.,  1997;   Gribble  et  al.,  1998;  Campbell  et  al.,  2003;  Craig  et  al.,  2008).  Dependiendo  del  estado  energético  en   el  que  se  encuentre  la  célula,  la  unión  de  ADP-­‐Mg2+  puede  sobrepasar  la  inhibición  producida  por  el   ATP   en   las   subunidades  KIR   6.x,   lo   que   permite   la   apertura   del   canal   (Alejandro   et   al.,   2009).   La   unión   de   ADP-­‐Mg2+   o   ATP-­‐Mg2+   en   los   dominios   NBD   1   y   2   de   las   subunidades   SUR   inducen   su   dimerización,  de  tal  manera  que  cambian  la  conformación  estructural  del  canal  para  abrir  el  poro,   bloquear  el  sitio  de  unión  de  ATP  en  las  subunidades  KIR  y,  así,  estabilizar  el  estado  abierto  del  canal   (Proks  et  al.,  2010;  Vedovato  et  al.,  2015).   Además  de   la  unión  de  nucleótidos  (unidas  o  no  a   iones  de  Mg2+)  a   las  subunidades  SUR,  existen   otros  factores  que  también  ineluyen  en  la  apertura  del  canal.  En  este  sentido,  se  ha  mostrado  que  los   iones  de  zinc  (Zn2+),  además  de  los  iones  de  Mg2+,  inducen  la  activación  de  los  canales  KATP  ya  sea  de   manera  extracelular  o  intracelular  (Prost  et  al.,  2004;  Matias  et  al.,  2010).  Por  otro  lado,  fosfolípidos   como   el   fosfatidilinositol,-­‐4,5-­‐bifosfato   (PIP2,   por   sus   siglas   en   inglés),   favorecen   y   estabilizan   el   estado  abierto  del  canal  sin  afectar  la  amplitud  de  su  conductancia  (Fan  &  Makielski,  1997;  Shyng  et   al.,  2000).  En  presencia  de  PIP2  el  efecto  inhibidor  del  ATP  disminuye  y  se  promueve  la  apertura  del   canal  (Shyng  et  al.,  1998).  Además,  se  ha  mostrado  que  la  fosforilación  de  las  subunidades  KIR  6.x  y   SURx   por   la   cinasa   PKA   modula   la   activación   del   canal   (Béguin   et   al.,   1999),   mientras   que   la   fosforilación  por   la   cinasa  PKC  puede   inducir   la   apertura  o   cierre  de   los   canales  KATP   (Aziz   et   al.,   24 2012),  y  la  desfosforilación  por  fosfatasas  como  la  calcineurina  reducen  su  conductancia  (Orie  et  al.,   2009).  Por  último,  se  han  descrito  que  otras  proteínas  intracelulares  como  la  actina  pueden  cambiar   la  coneiguración  estructural  del  canal  modulando  su  conductancia  (Brady  et  al.,  1996;  Hibino  et  al.,   2010).   Regulación  farmacológica  del  canal  KATP   Para  caracterizar  la  función  de  los  canales  KATP,  se  ha  utilizado  una  variedad  de  fármacos  que   se   unen   a   las   subunidades   SURx.   Debido   a   la   amplia   distribución   de   los   canales   en   los   tejidos   celulares,  los  efectos  de  estos  fármacos  se  han  extendido  a  varios  usos  clínicos.  De  manera  general,   los   agentes   inhibidores   de   la   actividad   de   los   canales   KATP   mayormente   utilizados,   son   las   sulfonilureas   (Edwards   &   Weston,   1993).   El   principal   efecto   sistémico   de   estos   fármacos   es   la   reducción  de  la  glucosa  en  sangre,  por  lo  que  estos  fármacos  son  utilizados  para  el  tratamiento  de  la   diabetes   tipo   2   (Doyle   &   Egan,   2003;   Krentz   &   Bailey,   2005).   Por   otro   lado,   también   existen   fármacos  conocidos  como  activadores  de  canales  de  K+  (KCOs,  por  sus  siglas  en  inglés;  Terzic  et  al.,   1995;  Ashcroft  &  Gribble,  2000)  que  pueden  promover  la  actividad  de  los  canales  KATP.  El  principal   efecto  sistémico  de  estos  fármacos  es  la  vasodilatación  y  el  incremento  de  la  glucosa  en  sangre,  por   lo   que   estos   fármacos   han   sido   utilizados   para   el   tratamiento   de   la   hipertensión   (Hamby   et   al.,   1968)   y   la   hiperinsulinemia   (Welters   et   al.,   2015),   respectivamente.   A   continuación,   se   va   a   describir  con  más  detalle  cuáles  son  los  fármacos  más  utilizados  para  modular   la  actividad  de   los   canales  KATP  y  su  mecanismo  de  acción.   • Antagonistas  de  los  canales  KATP:  Sulfonilureas   Las   sulfonilureas   son   fármacos   con   arilsulfonilureas   sustituidas.   Dieieren   entre   ellas   por   sustituciones  en  el  anillo  benceno  y  en  el  residuo  de  nitrógeno  de  la  mitad  de  urea  (Figura  9).  Estas   sustituciones  son  las  responsables  de  la  variación  de  la  potencia,  eeicacia,  vida  media,  y  reacciones   25 adversas  entre  los  tipos  de  sulfonilureas  (Brunton  et  al.,  2005).   Las   sulfonilureas   disponibles   se   dividen   en   dos   generaciones   de   los   fármacos.   La   primera   generación   de   sulfonilureas   incluye   a   la   tolbutamida   (Tol)   y   a   la   clorpropamida.   La   segunda   generación   de   sulfonilureas   incluye   a   la   glibenclamida,   a   la   glipizida,   a   la   gliclazida,   y   a   la   glimepirida.  Esta  última  generación  tiene  una  mayor  potencia  y  mayor  eeiciencia  para  controlar  la   hiperglucemia  (Brunton  et  al.,  2005;  Tran  et  al.,  2015).     A B   Fig.   9.   Estructura   química   característica   de   las   sulfonilureas   (A)   y,   especíeicamente,   de   la   tolbutamida  (B).  Modieicado  de  Aguilar-­‐Bryan  &  Bryan,  1999. El   efecto   de   las   sulfonilureas   sobre   los   canales   KATP   fue   descrito   primeramente   en   las   células   β   pancreáticas  (Ashcroft  &  Ashcroft,  1992).  Cuando  las  sulfonilureas  interactúan  con  las  subunidades   SURx  de  los  canales  KATP  membranales  de  las  células  β  pancreáticas,  promueven  el  cierre  del  canal.   Por   consiguiente,   disminuye   el   potencial   de   membrana.   La   despolarización   de   las   células   β   pancreáticas  abre  canales  de  calcio  dependientes  de  voltaje,  que  resulta  en  la  entrada  de  Ca2+  a  la   célula  y   la  activación  de  proteínas  dependientes  de  Ca2+  que  inducen  la   liberación  de  vesículas  de   insulina   adyacentes   a   la   membrana   celular   (Ashcroft   &   Ashcroft,   1992).   De   este   modo,   las   sulfonilureas  imitan  la  acción  de  secretagogos  eisiológicos  como  la  glucosa,  que  modula  la  actividad   de  los  canales  KATP  e  induce  la  liberación  de  insulina  (Cook  et  al.,  1988). Posterior   a   este   descubrimiento,   se   encontraron   dos   sitios   de   unión   de   las   sulfonilureas   en   los   canales   KATP.   El   primer   sitio   de   “alta   aeinidad”   se   encuentra   en   el   loop   entre   los   segmentos   transmembranales   TMS15   y   TMS16.   El   segundo   sitio   “de   baja   aeinidad”   se   encuentra   entre   los   26 segmentos  transmembranales  TMS5  y  TMS6  (Asheield  et  al.,  1999;  Mikhailov  et  al.,  2001).  Además   de   la   interacción  con   las   subunidades  SURx,   las   sulfonilureas   también  pueden   interactuar  con   las   subunidades  KIR  6.x,  la  cuales  poseen  un  sitio  de  baja  aeinidad  que  se  ha  propuesto  involucra  varios   residuos  en  el  extremo  N-­‐terminal  (Gribble  et  al.,  1997;  Gros  et  al.,  1999). Los  efectos  de  las  sulfonilureas  en  el  cerebro  no  son  muy  diferentes  a  los  observados  en  las  células  β   pancreáticas.  Diversos  trabajos  han  demostrado  que  la  aplicación  de  sulfonilureas  in  vivo  e  in  vitro   induce   la   despolarización   celular   en   varias   estructuras   cerebrales,   incluyendo   el   hipocampo   (Pelletier  et  al.,  2000;  Stefan  &  Gold,  2001;  Allen  &  Brown,  2004;  Steinkamp  et  al.,  2007;  Zhang  et  al.,   2010;  Patel  et  al.,  2011;  Tanner  et  al.,  2011;  Schiemann  et  al.,  2012).  Asimismo,  se  ha  reportado  que   la   aplicación   de   sulfonilureas   induce   la   liberación   de   neurotransmisores   como:   la   acetilcolina   (Stefan  &  Gold,  2001),  el  ácido  γ-­‐aminobutírico  (GABA;  Amoroso  et  al.,  1990;  Margaill  et  al.,  1992;   Chan   et   al.,   2007),   el   glutamato   (Soundarapandian   et   al.,   2007),   la   dopamina   (Patel   et   al.,   2011;   Schiemann  et  al.,  2012),  la  noradrenalina  (Eckhardt  et  al.,  2003),  entre  otros.   Además  de  las  sulfonilureas,  se  han  descrito  otros  dos  grupos  de  antagonistas  de  los  canales  KATP.   Uno   de   estos   grupos   son   fármacos   derivados   del   ácido   benzoico,   que   incluye   la   meglitinida,   repaglinida,  nateglinida,  y  mitiglinida  (Dabrowski  et  al.,  2001;  Hibino  et  al.,  2010).  Estos  fármacos   también   son  utilizados  para   el   tratamiento  de   la   diabetes   tipo  2   (Blicklé   JF,   2006).  Otro  de   estos   grupos  son  compuestos  derivados  de  la  cianoguanidina,  que  incluye  los  compuestos  PNU-­‐37883A,   PNU-­‐89692,   PNU-­‐97025E,   y   PNU-­‐99963.   Estos   últimos   son   utilizados   en   la   regulación   de   alteraciones   cardiovasculares   (Khan   et   al.,   1997).   Recientemente,   se   ha   descubierto   que   la   memantina,   fármaco   utilizado   generalmente   para   bloquear   la   actividad   de   los   receptores   NMDA,   tiene  mayor  especieicidad  como  bloqueador  de  los  canales  KATP  (Giustizieri  et  al.,  2007;  Moriguchi  et   al.,  2016).     27 • Agonistas  de  los  canales  KATP:  KCOs   Los   KCOs   son   un   grupo   de   fármacos   que   incluyen   a   la   diazoxida   (Dzx),   el   nicorandil,   el   minoxidil,   el   pinacidilo,   y   el   cromakalim,   los   cuales   estimulan   la   activación   de   los   canales   KATP   (Figura  10;  Robertson  &  Steinberg,  1990).  Debido  a  que  la  apertura  de  los  canales  KATP  aumenta  el   potencial   de   membrana   celular   y   reduce   su   excitabilidad,   estos   fármacos   son   utilizados   para   el   tratamiento   de   varias   enfermedades   como   la   hipertensión,   las   isquemias   aguda   y   crónica,   la   insueiciencia  cardíaca  congestiva,  el  asma  bronquial,   la   incontinencia  urinaria  y  algunas  miopatías   del  músculo  esquelético  (Alejandro  et  al.,  2009;  Rubaiy  H,  2016).     La  especieicidad  de  estimulación  de  la  actividad  de  los  canales  KATP  inducida  por  los  KCOs  depende   de  la  combinación  de  las  subunidades  KIR  6.x  y  SURx  que  exprese  el  canal,  y  el  tejido  en  el  que  éste   se  encuentre  expresado.  El  pinacidilo  y  el  cromakalim  estimulan  los  canales  KIR6.2/SUR2A  y  KIR6.2/ SUR2B,  los  cuales  no  son  estimulados  por  la  Dzx  (Rubaiy  H,  2016)  y  se  expresan  mayormente  en  el   músculo   cardiaco   (Shyng   et   al.,   1997).   En   contraste,   la   Dzx   estimula   los   canales   KIR6.2/SUR1   encontrados   en   las   células   pancreáticas   y   los   cuales   no   son   estimulados   por   el   pinacidilo   o   el   cromakalim  (Rubaiy  H,  2016).     A B   Fig.  10.  Estructura  química  de   la  diazoxida   (A)  y  del   cromakalim  (B).  Modieicado  de  Aguilar-­‐ Bryan  &  Bryan,  1999. La  estimulación  de  los  canales  KATP  por  los  KCOs  requiere  de  la  presencia  de  ATP-­‐Mg2+  y  ADP-­‐Mg2+,   por  lo  que  se  ha  sugerido  que  los  nucleótidos  participan  en  la  unión  y  acción  de  los  KCOs  (Shyng  et   al.,  1997).  La  acción  de  los  KCOs  sobre  los  canales  KATP  involucra  su  unión  a  las  subunidades  SURx.   28 Los  sitios  de  unión  de   los  KCOs  cromakalim,  nicorandil,   y  pinacidilo  en   las   subunidades  SUR2A  y   SUR2B,   están   localizados   en   el   loop   entre   los   segmentos   transmembranales   TMS13   y   TMS14,   la   región  que  comprende  los  TMS16  y  TMS17  del  TMD2,  y  un  segmento  del  dominio  NBD  2  (Hibino  et   al.,   2010).   En   la   subunidad  SUR1,   la   unión  de   la  Dzx  ocurre   en   los   segmentos   transmembranales   TMS6  al  TMS11.  En  este  proceso  participan  residuos  de  la  secuencia  característica  de  las  proteínas   ABC  y  el  motivo  Walker  B  del  dominio  NBD  2,  pero  no  del  dominio  NBD  1  (Shyng  et  al.,  1997).  No   obstante,  se  ha  reportado  que  alteraciones  en  el  dominio  NBD1  afecta   la  cinética  de  activación  de   los  canales  KATP  por   la  Dzx  (Shyng  et  al.,  1997).  Además,  se  ha  descrito  que  en   la  unión  de   la  Dzx   están   involucrados   los   últimos   42   aminoácidos   del   carboxilo   terminal   de   la   subunidad   SUR1,   segmento  que  dieiere  con  respecto  al  de  las  subunidades  SUR2A/B  (Babenko  AP,  2005).   Al   igual   que   los   antagonistas   de   los   canales   KATP,   el   efecto   de   los   KCOs   sobre   los   canales   KATP   también   fue  descrito,  por  primera  vez,   en   las   células  β  pancreáticas   (Henquin  &  Meissner,  1982).   Contrario  a  las  sulfonilureas,  los  KCOs  abren  los  canales  KATP  lo  que  produce  una  hiperpolarización   de   las   células  β  pancreáticas.   Esta  hiperpolarización   reduce   la   entrada  de  Ca2+   a   la   célula,   lo   que   inhibe  la   liberación  de  insulina  (Henquin  &  Meissner,  1982).  De  esta  manera,   los  KCOs  activan  los   canales  KATP   de  manera   similar   a   activadores   eisiológicos   como   el   ADP-­‐Mg2+   (Shyng   et   al.,   1997).   Este  efecto   también  se  ha  descrito  en  otros   tipos  celulares,  principalmente  en  células  de  músculo   liso   y   cardiomiocitos,   en   los   que   la   reducción   de   la   excitabilidad   celular   producida   por   los   KCOs   genera   un   efecto   inotrópico   negativo   en   los   cardiomiocitos   y   una   vasodilatación   de   los   vasos   sanguíneos   (Edwards  &  Weston,   1990;  Weston  et   al.,   1990).   En   el   cerebro,   particularmente   en   el   hipocampo,  la  aplicación  de  los  KCOs  in  vivo  e  in  vitro  también  induce  la  hiperpolarización  celular,   reduce   la   excitabilidad   celular   (Pelletier   et   al.,   2000;  Allen  &  Brown,   2004;   Zhang   et   al.,   2010),   e   inhibe  la  liberación  de  neurotransmisores  (Avshalumov  &  Rice,  2003;  Chan  et  al.,  2007;  Steinkamp   et  al.,  2007;  Patel  et  al.,  2011;  Schiemann  et  al.,  2012).   29 Funciones  de  los  canales  KATP   La   función   comúnmente   asociada   con   los   canales  KATP   es   la  modulación   de   la   liberación   de   insulina   en   las   células   β   pancreáticas.   En   condiciones   eisiológicas,   el   incremento   de   glucosa   (>   3   mM)  en  sangre,   inducen  el   incremento  en   la  concentración  de  ATP   intracelular,   lo  que  produce  el   cierre  de  los  canales  KATP,  promoviendo  la  despolarización  de  la  célula  β  pancreática  e  induciendo  la   liberación  vesicular  de  insulina  (Aguilar-­‐Bryan  y  Bryan,  1999;  Levin  et  al.,  1999;  Miki  et  al.,  2001).   De  esta  manera,   los  canales  KATP   son  esenciales  para   la  detección  y  regulación  de   la  glucosa  en   la   periferia.   Además   de   la   detección   de   glucosa   y   la   liberación   de   insulina,   los   canales   KATP   están   involucrados   en   la   liberación   de   otras   hormonas   como   el   glucagón,   secretado   por   las   células   α   pancreáticas  (Göpel  et  al.,  2000)  y  el  péptido  similar  al  glucagón  tipo  1,  secretado  por  las  células  L   del  intestino  (Gribble  et  al.,  2003).     En   el   corazón,   los   canales   KATP   están   involucrados   la   respuesta   cardiaca   al   estrés   y   a   la   hipoxia,   alteraciones  en  los  niveles  de  glucosa,  en  la  inhibición  de  la  glucólisis  y  en  el  precondicionamiento   isquémico  (Yokoshiki  et  al.,  1998;  Suzuki  et  al.,  2002;  Gumina  et  al.,  2003).  En  el  músculo  liso,   los   canales   KATP   están   involucrados   en   la   modulación   del   elujo   sanguíneo   a   través   del   cambio   en   el   diámetro  vascular   (Brayden   J,  2002;  Hay  et  al.,  2017).  En  el  músculo  esquelético,   los  canales  KATP   también  modulan  la  captura  de  glucosa  (Bryan  &  Bryan,  2004)  y  se  ha  sugerido  que  participan  en  la   recuperación  del  músculo  ante  un  evento  de  fatiga  (Gong  et  al.,  2000).     En  el  SNC,  la  actividad  de  estos  canales  ha  sido  ampliamente  asociada  con  efectos  neuroprotectores   en   respuesta   al   estrés  metabólico   (Liss   &   Roeper,   2001),   a   la   hipoxia   (Yamada   &   Inagaki,   2002;   Ballanyi  K,   2004),   a   la   isquemia   cerebral   (Abdallah   et   al.,   2011;  Ortega   et   al.,   2012;  Ortega   et   al.,   2013)  y  a  la  actividad  epiléptica  (Hernández-­‐Sánchez  et  al.,  2001;  Yamada  et  al.,  2001;  Gooshe  et  al.,   2017).   Además,   al   igual   que   en   las   células   β   pancreáticas,   los   canales   KATP   neuronales,   particularmente  en  el  hipotálamo,  están  involucrados  en  la  detección  de  glucosa  y  en  la  homeostasis   de  los  niveles  de  la  misma  (Miki  et  al.,  2001).  Recientemente,  Molnár  et  al.  (2014)  mostraron  que  el   30 incremento  de  glucosa  extracelular  o  la  aplicación  de  glibenclamida  induce  la  liberación  de  insulina,   dependiente  de  los  canales  KATP,  en  interneuronas  neurogliformes  en  la  corteza  cerebral  (Molnár  et   al.,   2014).   Asimismo,   se   ha   descrito   que   la   actividad   de   los   canales   KATP   está   involucrada   en   la   respuesta   hormonal   y   en   la   liberación   de   péptidos   en   las   neuronas   del   hipotálamo   (Zhang   et   al.,   2007;  2010),  así  como  en  la  señalización  asociada  al  consumo  de  comida  (Plum  et  al.,  2006).     De  manera   general,   en   el   cerebro,   la   actividad  de   los   canales  KATP   en   respuesta   a   cambios   en   las   concentraciones  de  ATPi/ADPi  modulan   la   función  glial   (Granda   et   al.,   1998;  Velasco   et   al.,   2000;   Wang  et  al.,  2013)  y  la  excitabilidad  neuronal,  al  modular  la  frecuencia  de  disparo  neuronal  (Allen  &   Brown,   2004;   Schiemann   et   al.,   2012;   Lemak   et   al.,   2014;   Lutas   et   al.,   2014),   la   liberación   de   neurotransmisores  (Amoroso  et  al.,  1990;  Stefan  &  Gold,  2001;  Griesemer  et  al.,  2002;  Avshalumov   &  Rice,  2003;  Wang  et  al.,  2004;  Chan  et  al.,  2007;  Soundarapandian  et  al.,  2007;  Steinkamp  et  al.,   2007;   Patel   et   al.,   2011;   Schiemann   et   al.,   2012;   Li   et   al.,   2017)   y   la   transmisión   sináptica   (Matsumoto  et  al.,  2002;  Bancila  et  al.,  2004;  Matias  et  al.,  2010;  Shen  &  Johnson,  2010;  Tanner  et   al.,  2011;  Mollajew  et  al.,  2013).  Esta  modulación  ha  sido  descrita  en  diversas  estructuras  cerebrales   como  el  hipotálamo  (Zhang  et  al.,  2007;  2010),  el  septum  medial  (Allen  &  Brown,  2004),  la  sustancia   nigra   (Schiemann  et  al.,  2012;  Lutas  et  al.,  2014),  el   tallo  cerebral  (Haller  et  al.,  2001;  Chen  et  al.,   2013),  el  estriado  (Lee  et  al.,  1997;  1998),  la  corteza  entorrinal  (Lemak  et  al.,  2014),  y  el  hipocampo   (Schröder   et   al.,   2004;   Soundarapandian   et   al.,   2007;   Chen  &  Wu,   2011).   Además   de  modular   la   excitabilidad   de   los   circuitos   neuronales   (Haller   et   al.,   2001;   Giménez-­‐Cassina   et   al.,   2012;   Schiemann   et   al.,   2012;   García   et   al.,   2013;   Varin   et   al.,   2015),   los   canales   KATP   participan   en   las   respuestas   eisiológicas  a  cambios  en  el  ambiente  (Schiemann  et  al.,  2012;  García  et  al.,  2013).  Por   ejemplo,  en  la  modulación  del  ritmo  respiratorio  (Richter  et  al.,  2000)  y  el  ciclo  del  sueño  (Varin  et   al.,  2015);  en  la  expresión  de  conductas  exploratorias  (Schiemann  et  al.,  2012)  y  de  tipo-­‐depresivas   (Nazari   et   al.,   2016;   Ostadhadi   et   al.,   2017),   así   como   en   procesos   de   aprendizaje   y   memoria   (Ghelardini  et  al.,  1998;  Ryan  et  al.,  2006).   31 • Función  de  los  canales  KATP  en  el  hipocampo   En  el  hipocampo,   los   cambios  en   los  niveles  de  glucosa  modieican   la  actividad  oscilatoria   (Florez  et   al.,   2015),   la   transmisión   sináptica   (Kamal  et   al.,   1999;  Huang  et   al.,   2007;   Jones  et   al.,   2015;  Macauley   et   al.,   2015),   la   plasticidad   sináptica   (Kamal   et   al.,   1999;   Huang   et   al.,   2007),   la   neurogénesis  (Mainardi  et  al.,  2015),  así  como  su  función  en  la  conducta  (Florez  et  al.,  2015)  y  los   procesos  mnémicos   (Grillo   et   al.,   2015;   Stollery   &   Christian,   2015).   Estos   cambios   en   la   función   hipocampal  producidos  por  la  glucosa  se  deben,  en  parte,  a  la  actividad  de  los  canales  KATP  (Stefani   et  al.,  1999;  Stefani  &  Gold,  2001;  Schröder  et  al.,  2004;  Huang  et  al.,  2007;  Macauley  et  al.,  2015).   En   este   sentido,   se   ha   demostrado   que   la   actividad   de   los   canales   KATP   modula   la   transmisión   sináptica   entre   las   eibras  musgosas   provenientes   del   giro   dentado   y   que   arriban   a   la   región   CA3   (Bancila   et   al.,   2004;   2005;   Matias   et   al.,   2010).   Los   canales   KATP   también   modulan   el   disparo   espontáneo  (Huang  et  al.,  2007;  Lemak  et  al.,  2014)  y  evocado  (Matsumoto  et  al.,  2002;  Lemak  et  al.,   2014)   de   las   neuronas   piramidales   de   la   región   CA1.   Asimismo,   los   canales   KATP   son   reclutados   durante   la   activación   de   las   células   granulares   del   giro   dentado   (Tanner   et   al.,   2011).   Más   importante   aún,   los   canales   KATP   pueden   modular   procesos   de   plasticidad   en   los   circuitos   neuronales  como   la  neurogénesis  (Yang  et  al.,  2012;  Ortega  et  al.,  2013)  y   la  LTP  (Schröder  et  al.,   2004;   Moriguchi   et   al.,   2016).   De   hecho,   los   canales   KATP   que   expresan   la   subunidad   KIR   6.2   participan  en  el  mantenimiento  de  la  LTP  en  la  región  CA1  del  hipocampo  (Moriguchi  et  al.,  2016).   Además,  se  ha  demostrado  que  el  cierre  de  los  mismos,  inducido  con  la  aplicación  de  glibenclamida,   incrementa  la  magnitud  de  la  LTP  (Schröder  et  al.,  2004).     Los  canales  KATP  también  participan  en  procesos  más  complejos  como  la  conducta  y  la  formación  de   la  memoria  dependientes  de  hipocampo.  Mediante  el  uso  de  modelos  transgénicos,  se  ha  mostrado   que  los  canales  KATP  que  expresan  la  subunidad  KIR  6.2,  pero  no  los  que  expresan  la  subunidad  KIR   6.1,   son   importantes   para   la   conducta   innata   (Deacon   et   al.,   2006)   y   la  memoria   (Choeiri   et   al.,   2006;  Moriguchi  et  al.,  2016).  El  modelo  animal   transgénico  que  no  expresa   la   subunidad  KIR   6.2   32 muestra  alteraciones  en  conductas  emotivas  y  una  reducción  en  la  conducta  de  burrowing  (Deacon   et  al.,  2006).  Asimismo,  este  modelo  animal  presenta  un  deterioro  en  la  memoria  de  trabajo,  en  la   memoria   espacial   y   en   la   memoria   de   contexto,   mismas   que   fueron   evaluadas   en   las   tareas   de   alternancia  espacial  en  el  laberinto  en  “T”  (Moriguchi  et  al.,  2016),  en  la  tarea  de  reconocimientos   de   objetos   (Choeiri   et   al.,   2006),   y   en   la   tarea   de   evitación   inhibitoria   (Moriguchi   et   al.,   2016),   respectivamente.   Coincidentemente,   la   aplicación   i.c.   de   activadores   de   los   canales   KATP,   como   la   Dzx,   deterioran   la   formación   de   la   memoria   de   trabajo   y   de   contexto,   evaluadas   en   la   tarea   de   evitación   inhibitoria   (Ghelardini   et   al.,   1998;  Rashidy-­‐Pour  A,   2001),   la   alternancia   espacial   en   el   laberinto   en   “T”   (Stefani   et   al.,   1999),   y   el   paradigma  de   condicionamiento   de  miedo   al   contexto   (Betourne  et  al.,  2009).  En  contraste,  la  aplicación  i.c.  de  antagonistas  de  los  canales  KATP,  como  la   Tol,  facilitan  la  formación  de  la  memoria  de  trabajo  (Stefani  et  al.,  1999;  Stefani  &  Gold,  2001)  y  de   la  memoria  de  contexto  (Ghelardini  et  al.,  1998;  Rashidy-­‐Pour  A,  2001;  Betourne  et  al.,  2009)  en  los   mismos  paradigmas  conductuales.  Más  aún,  Stefani  &  Gold  (2001)  mostraron  que  la  facilitación  de   la   memoria   de   trabajo   inducida   por   el   incremento   de   glucosa   o   por   la   aplicación   i.c.   de   glibenclamida,  involucra  un  incremento  en  la  liberación  de  acetilcolina  en  el  hipocampo  (Stefani  &   Gold,   2001).   De   manera   interesante,   los   pacientes   con   diabetes   tipo   2   que   son   tratados   con   sulfonilureas  presentan  una  mejora  en  el  desempeño  de  tareas  de  memoria  (Ryan  et  al.,  2006).   Relación  de  los  canales  KATP  con  la  enfermedad  de  Alzheimer  y  el  Aβ   Considerando  las  múltiples  funciones  con  las  que  está  relacionada  la  actividad  de  los  canales   KATP,   es   de   esperarse   que   el   fallo   en   su   actividad   esté   involucrado   en   varias   patologías.   Las   patologías  más  comúnmente  asociadas  con  un  incremento  o  reducción  en  la  actividad  de  los  canales   KATP  son  la  diabetes  neonatal  tipo  2  (Aguilar-­‐Bryan  et  al.,  2001)  y  la  hiperinsulinemia  (Gloyn  et  al.,   2004),   respectivamente.   En   el   SNC,   las   alteraciones   en   la   actividad   de   los   canales   KATP   están   involucradas  en  la  isquemia  cerebral  (Kurland  et  al.,  2013;  Ortega  et  al.,  2013),  en  las  alteraciones   33 asociadas   a   la   hipoxia   (Mironov   et   al.,   1998),   en   la   enfermedad   de   Parkinson   (Liss   et   al.,   2005;   Mironov   S,   2015)   y   en   las   demencias,   como   la   demencia   vascular   (Gupta   et   al.,   2016)   y   la   enfermedad  de  Alzheimer  (Ikeda  et  al.,  1993a  y  b;  Kim  &  Lubec,  2001;  Blass  et  al.,  2002;  Hoyer  S,   2002;  Caesar  et  al.,  2015;  Moriguchi  et  al.,  2016).     Los  pacientes  con  la  EA  cursan  con  alteraciones  en  el  metabolismo  de  la  glucosa  (Jagust  et  al.,  1991;   Hoyer  S,  2004),  de   la   insulina  (Neumann  et  al.,  2008;  Craft  et  al.,  2012;  Stanley  et  al.,  2016)  y  del   ATP  (Xing  et  al.,  2013),   las  cuales  podrían  estar  relacionadas  con  irregularidades  en  la   función  de   los   canales  KATP   (Ikeda   et   al.,   1993a  y  b;   Caesar   et   al.,   2015;  Macauley   et   al.,   2015;  Grifeith   et   al.,   2016;   Moriguchi   et   al.,   2016).   Estudios   histopatológicos   de   los   cerebros   de   pacientes   con   la   EA   muestran   una   alteración   en   la   densidad   de   las   subunidades  KIR   6.2   (Grifeith   et   al.,   2016)   y   SURx   (Ikeda   et   al.,   1993a   y   b)   en   el   hipocampo   y   la   corteza   temporal.   Asimismo,   se   han   observado   cambios  en  la  expresión  de  subunidades  KIR  6.1  y  KIR  6.2  en  el  hipocampo  de  modelos  animales  de   la  EA  (Grifeith  et  al.,  2016;  Moriguchi  et  al.,  2016).     Así   como   se   observa   en   la   EA   o   en   sus   modelos   animales,   los   oligómeros   del   Aβ   alteran   el   metabolismo   de   la   glucosa   (Mark   et   al.,   1997;   Saraiva   et   al.,   2010;   Macauley   et   al.,   2015;   Beglopoulos  et  al.,  2016),  de   la   insulina  (Pearson-­‐Leary  et  al.,  2012;  Dai  et  al.,  2014;  Caesar  et  al.,   2015),   y   del   ATP   (Yang   et   al.,   2009;   Fuentealba   et   al.,   2011;   Xing   et   al.,   2013).   Si   bien   estas   alteraciones  no  están  directamente  asociadas,  hasta  el  momento,  con  cambios  en  la  función  de  los   canales  KATP;  se  ha  descrito  que  los  cambios  en  los  niveles  de  la  glucosa  en  el  modelo  transgénico  de   la   EA   APP/PS1   modieican   los   niveles   del   Aβ   (Macauley   et   al.,   2015).   Asimismo,   la   aplicación   intrahipocampal  (Macauley  et  al.,  2015)  o  in  vitro  (Kong  et  al.,  2015)  de  moduladores  de  los  canales   KATP,   cambian   los   niveles   del   Aβ.   Mientras   que   la   aplicación   del   Aβ1-­‐42   en   cultivos   de   neuronas   colinérgicas  induce  el  incremento  de  la  expresión  de  las  subunidades  KIR  6.1,  KIR  6.2,  SUR1  y  SUR  2A   (Ma  et  al.,  2008;  2009).  De  manera  interesante,  el  incremento  en  la  expresión  de  las  subunidades  de   los  canales  KATP   inducida  por  el  Aβ,  depende  de  la  actividad  de  los  mismos  canales  KATP,  ya  que  el   34 pre-­‐tratamiento  con  la  Dzx  previene  dicho  efecto  (Ma  et  al.,  2009).  Más  aún,  se  ha  mostrado  que  el   Aβ  puede  modular   la  actividad  de   canales  KIR   (Qi   et   al.,   2004;  Zhang  et   al.,   2004),   incluyendo   los   canales  KATP  (Tan  et  al.,  2012).  En  el  trabajo  de  Tan  et  al.  (2012)  mostraron  que  la  aplicación  del  Aβ   a  cultivos  primarios  de  neuronas  colinérgicas  cambia  la  conductancia  de  los  canales  KATP.  Dado  que   dicho  efecto  no  ocurría  en  presencia  de  moduladores  de  los  canales  KATP,  Tan  et  al.  sugirieron  que  el   Aβ  podría  modular  directamente  la  actividad  de  los  canales  KATP  (Tan  et  al.  2012).     Debido  a  la  relación  funcional  que  parece  tener  el  Aβ  y  los  canales  KATP,  así  como  la  relevancia  de  los   mismos  en  la  modulación  y  en  el  correcto  funcionamiento  de   los  circuitos  neuronales,   los  canales   KATP   se  han  considerado  como  posibles  blancos   terapéuticos  para   la  EA.  De  hecho,  el   tratamiento   oral   por   21  días   con   glibenclamida   (antagonista   de   los   canales  KATP)   en   animales   inyectados   con   Aβ25-­‐35,  revierte  parcialmente  el  deterioro  en  la  memoria  espacial  y  de  la  memoria  de  contexto.  Lo   que  correlaciona  con  una  disminución  de  los  niveles  de  la  proteína  Tau  fosforilada  inducidos  por  la   inyección   i.c.   del   Aβ25-­‐35   (Baraka   &   ElGhotny,   2010).   Adicionalmente,   el   tratamiento   con   glibenclamida  también  evita  alteraciones  en  el  transporte  del  Aβ  en  la  barrera  hematoencefálica  y  la   muerte  celular  inducidas  por  el  Aβ1-­‐42  (Chen  et  al.,  2016).  De  manera  similar,  la  memantina  a  través   del  bloqueo  de  los  canales  KATP,  evita  el  deterioro  de  la  memoria  de  trabajo,  de  la  memoria  espacial   y   de   la   memoria   de   contexto   en   el   modelo   transgénico   APP23.   Además,   el   tratamiento   con   memantina  impide  la  reducción  de  la  transmisión  sináptica,  de  la  actividad  de  la  CaMKII  y  de  la  LTP   en  este  mismo  modelo   (Moriguchi  et  al.,  2016).  Por  su  parte,  el   tratamiento   in  vivo   e   in  vitro   con   KCOs  como   la  Dzx  y  el  nicorandil,   tienen  efectos  neuroprotectores  que  previenen   las  alteraciones   vasculares  (Chi  et  al.,  1999),  el  incremento  de  las  ROS  (Kong  et  al.,  2013a;  Zeng  et  al.,  2013;  Fu  et  al.,   2014;   Kong   et   al.,   2015),   la   excitotoxicidad   (Martínez-­‐Moreno   et   al.,   2016),   la   disfunción   mitocondrial  (Kong  &  Ba,  2012;  Kong  et  al.,  2013a)  y  la  muerte  celular  (Kong  &  Ba,  2012;  Kong  et   al.,  2013b;  Zeng  et  al.,  2013;  Fu  et  al.,  2014).  En  el  modelo  transgénico  3xTg-­‐AD  el  tratamiento  con  la   Dzx   también   contrarresta   el   deterioro   de   la   memoria   espacial,   reduce   la   formación   de   placas   35 amiloides   y   reduce   los   niveles   de   la   proteína   Tau   fosforilada   (Liu   et   al.,   2010).   Más   aún,   se   ha   sugerido  que  los  efectos  neuroprotectores  de  los  KCOs  están  relacionados  con  la  activación  de  vías   de  señalización  intracelulares,  como  la  vía  dependiente  de   la  PI3K  (Fosfoinositol  3-­‐cinasa)  y  de   la   Akt   (proteína   cinasa   B),   cuya   activación   antagoniza   la   activación   de   las   vías   dependientes   de   la   GSK-­‐3β  activadas  por  el  Aβ  (Kong  et  al.,  2013b;  Kong  et  al.,  2015).     En  conjunto,  estos  hallazgos  abren   la  posibilidad  de  que   los  canales  KATP  estén   involucrados  en   la   patología  de  la  EA  y  en  las  alteraciones  inducidas  por  el  Aβ.  En  este  sentido,  en  el  presente  trabajo,   mediante   el   uso   de   la   tolbutamida   (antagonista   especíeico   de   los   canales   KATP)   y   de   la   diazoxida   (activador  especíeico  de  los  canales  KATP),  se  evaluaron  los  efectos  de  la  modulación  de  la  actividad   de   los   canales  KATP   sobre   los   efectos   inducidos  por   el  Aβ  en   la   conducta   típica  de  burrowing   y   la   memoria   dependientes   de   hipocampo,   así   como   en   la   actividad   oscilatoria   espontánea   y   en   la   plasticidad  sináptica  (en  especíeico  la  LTP  y  la  LTD)  hipocampal.   36 RELEVANCIA   De  acuerdo  con  la  Alzheimer’s  Disease  International  Association,  se  estima  que  existen  35.6  millones   de  personas  con   la  EA  a  nivel  mundial  y  el  pronóstico  de   incremento  en  su   incidencia   indica  que   esta  cantidad  de  pacientes  se  duplicará  cada  20  años  hasta  alcanzar   los  90.3  millones  en  el  2040   (Prince   et   al.,   2015).   Actualmente,   una   gran   cantidad   de   evidencia   muestra   que   alteraciones   metabólicas  están  relacionadas  con  el  deterioro  cognoscitivo   (Ho  et  al.,  2008).  En  este  sentido,  el   incremento   de   la   prevalencia   global   de   enfermedades   metabólicas   como   la   diabetes   y   la   hipertensión   (Ceriello   &   Colagiuri,   2008),   incrementan   el   riesgo   de   desarrollar   la   EA   (Xu   et   al.,   2009;  Jauch-­‐Chara  &  Oltmanns,  2014;  Roberts  et  al.,  2014).  Ambos  tipos  de  enfermedades  son  muy   relevantes  para  México,  pues   la  prevalencia  de   la  EA  en   la  población  es  del  6.1%  (González  et  al.,   2010),   mientras   que   las   enfermedades   metabólicas   presentan   un   14.5%   de   mortandad   (WHO,   2016).  Además,   la  población  mexicana  es  1.5  veces  más  propensa  a  desarrollar   la  EA  comparada   con  otros  grupos  étnicos  (Mejía-­‐Arango  &  Gutiérrez,  2011;  Edwards  et  al.,  2016;  Vega  et  al.,  2017).   Debido   a   lo   anterior,   es   preciso   encontrar   blancos  moleculares   plausibles,   así   como   tratamientos   eeicaces  y  con  mayor  probabilidad  de  ser  utilizados  a  la  brevedad  posible  para  tratar  ambos  tipos  de   enfermedades.   En   este   sentido,   tanto   la   tolbutamida   como   la   diazoxida,   son   utilizados   rutinariamente   para   el   tratamiento   de   la   diabetes   (García-­‐Lara   et   al.,   2010)   y   la   hipertensión   (Abdelwahab  et  al.,  1995;  Shimizu  et  al.,  2015)  con  un  nivel  de  seguridad  y  eeicacia  muy  aceptables.   Considerando   lo   anterior,   su   uso   en   el   tratamiento   de   alteraciones   cognoscitivas   es   plausible.   Mediante  el  uso  de  ambos  fármacos,  la  realización  de  este  proyecto  de  tesis  nos  permitió  establecer   la   relevancia   de   los   canales   KATP   como   posibles   blancos   terapéuticos   en   la   EA.   Asimismo,   la   realización  de  este  proyecto  nos  permitió  evaluar  el  uso  de  estos  fármacos  a  dosis  que  no  alteraron   la  glucemia,  como  posible  tratamiento  de  la  demencia  en  adultos  mayores.  Considerando  que  ambos   fármacos   probaron   tener   efectos   benéeicos   sobre   el   deterioro   cognoscitivo,   estos   hallazgos   promueven  el  uso  de  estos  fármacos  como  estrategia  terapéutica  para  la  EA  en  un  futuro  próximo.   37 HIPÓTESIS   La   modulación   de   la   actividad   de   los   canales   de   K+   sensibles   a   ATP   (KATP)   con   el   antagonista   tolbutamida  y   el   agonista  diazoxida,  modieicará   los   efectos  deletéreos   inducidos  por   el  péptido  β   amiloide  (Aβ)  sobre  la  cognición,  la  actividad  eléctrica  hipocampal  y  la  plasticidad  sináptica.     38 OBJETIVOS   General   Evaluar  el  efecto  de  la  modulación  aguda  y  crónica  de  la  actividad  de  los  canales  KATP,  utilizando  el   antagonista   tolbutamida  y  el   agonista  diazoxida,   sobre   los  efectos  deletéreos   inducidos  por  el  Aβ   sobre  la  cognición,  la  actividad  eléctrica  hipocampal  y  la  plasticidad  sináptica.       EspecíBicos   I. Determinar  si  la  aplicación  in  vitro  de  la  tolbutamida  o  la  diazoxida  evita  la  disminución  de  la   actividad  oscilatoria  espontánea  hipocampal  inducida  por  la  aplicación  in  vitro  del  Aβ.   II. Determinar   si   el   tratamiento   oral   crónico   con   la   tolbutamida   o   la   diazoxida   evita   la   disminución  de   la  actividad  oscilatoria  espontánea  hipocampal   inducida  por   la  aplicación   in   vitro  del  Aβ.   III.Determinar  la  dosis  del  Aβ  que,  administrada  en  la  región  CA1  del  hipocampo  dorsal  (infusión   intrahipocampal,  i.h.),  produce  una  reducción  en  la  retención  de  la  memoria  de  contexto  y  un   cambio  en  la  conducta  típica  de  burrowing.     IV.Determinar,   en   ratas   administradas   con   el   Aβ   (i.h.),   si   el   tratamiento   oral   crónico   con   la   tolbutamida  o  la  diazoxida  previene  las  alteraciones  producidas  por  el  Aβ  en  la  conducta  típica   de  burrowing,  la  memoria  de  contexto,  la  actividad  oscilatoria  espontánea,  la  LTP  y  la  LTD  del   hipocampo.     39 MÉTODOS   Todos   los  experimentos  se   realizaron  de  acuerdo  con   los   lineamientos  del  Comité  de  Bioética  del   Instituto   de   Neurobiología,   Universidad   Nacional   Autónoma   de   México,   para   el   uso   de   animales   experimentales  y  está  acorde  a  las  normas  estipuladas  en  la  “Guide  for  Care  and  Use  of  Laboratory   Animals”  del  NIH  (NIH,  2011).   Sujetos   Se  utilizaron  ratas  macho  de   la  cepa  Wistar  de  300  a  330  g.  Todos   los  sujetos  se  mantuvieron  en   cajas  individuales,  con  alimento  y  agua  ad  libitum,  con  temperatura  controlada  (22  ±  1°C)  y  un  ciclo   de  12  h  luz/12  h  oscuridad.  Por  último,  todos  los  sujetos  fueron  llevados  al  bioterio  en  la  Unidad  de   Conducta  del  INB  una  semana  antes  de  cualquier  procedimiento  para  su  habituación  al  lugar.     Oligomerización  del  Aβ1-­‐42   El   protocolo   de   oligomerización   del   Aβ1-­‐42   (Bachem,   Heidelberg   Alemania)   se   realizó   como   fue   descrito   por   Lambert   et   al.   (1998)   y   Klein   et   al.   (2002).   Brevemente,   el   Aβ1-­‐42   lioeilizado   fue   incubado   con   1,1,1,3,3,3-­‐hexaeluoro-­‐2-­‐propanol   (HFIP)   a   una   concentración   einal   de   1   mM   del   péptido   por   60   min,   a   temperatura   ambiente.   La   solución   fue   posteriormente   evaporada   a   temperatura   ambiente   para   remover   todo   el   HFIP   durante   un   periodo   de   aproximadamente   18   horas.   Posteriormente,   el   péptido   fue   resuspendido   en   una   solución   5  mM   de   DMSO   al   100%   y,   posteriormente,   se   diluyó   en  Medio   F12   (MF12,   sin   rojo   fenol)   hasta   obtener   una   concentración   einal  de  100  µM  (100  pmoles/μL).  Esta  solución  se  incubó  por  24  horas  a  4  -­‐  5°C  y  se  centrifugó,  en   frío   (4°C),   a   14,000   rpm   durante   10   min.   La   solución   sobrenadante   (la   fase   donde   quedan   los   oligómeros)   fue  alicuotada,  mantenida  a  4°C  y  usada  directamente  para   los  siguientes  protocolos.   Para  corroborar  la  presencia  de  oligómeros  del  Aβ1-­‐42,  la  solución  preparada  se  analizó  mediante  un   SDS-­‐PAGE   teñido   con   plata   (Figura   11;   Balleza-­‐Tapia   et   al.,   2010).   La   caracterización   de   la   40 composición   de   esta   preparación  mostró   una  mezcla   de   formas   solubles   del   Aβ1-­‐42   que   incluyen:   monómeros,  dímeros,  trímeros  y  hexámeros  (Figura  11;  Balleza-­‐Tapia  et  al.,  2010).         Fig.  11.  Composición  de  la  solución  obtenida  de  la  oligomerización  del  Aβ1-­‐42.  Se  muestra  el   gel  de  poliacrilamida  (SDS-­‐PAGE)  teñido  con  nitrato  de  plata,  el  cual  presenta  varias  bandas   que   corresponden   a   las   diferentes   formas   de   agregación   del   Aβ1-­‐42   soluble.   En   la   parte   derecha  del  gel  se  puede  observar  las  diferentes  bandas  de  peso  (kDa)  del  marcador  de  peso   molecular.  Gel  representativo  obtenido  de  Balleza-­‐Tapia  et  al.,  2010.     Cirugía  estereotáxica     Para  la  infusión  bilateral  del  Aβ  o  su  vehículo  (MF12)  en  la  región  CA1  del  hipocampo  se  realizó  un   procedimiento  quirúrgico.  Brevemente,  las  ratas  fueron  anestesiadas  con  pentobarbital  sódico  (60   mg/kg)  y  se  les  administró  atropina  (0.4  mg/ml)  para  evitar  complicaciones  respiratorias.  Una  vez   anestesiadas,   se   eijaron   en   el   aparato   estereotáxico.   Se   hizo   una   incisión   de   1.5   cm   de   largo   en   sentido  anteroposterior  sobre  la  línea  media  de  la  cabeza.  Se  levantó  el  tejido  perióstico  y  se  hizo  un   orieicio  a   través  del   cual   se   introdujo  una  cánula  guía   (10  mm  de   largo,  núm.  23).  Las   cánulas   se   implantaron  en   la   región  CA1  del  hipocampo  dorsal   (bilateral)  de  acuerdo  a   las  coordenadas:  AP,   -­‐4.0  mm  de  la  Bregma;  ML,  ±  3.0  mm  de  la  línea  media;  y  DV,  -­‐  2.55  mm  de  la  supereicie  del  cráneo   (Paxinos  &  Watson,  2005).  Las  cánulas  se  sujetaron  a   la  supereicie  del  cráneo  utilizando  cemento   dental   y   tornillos.   Para  mantener   la   vía   de   la   cánula   abierta   se   colocó   un   tapón   en   cada   una,   los   41 cuales   únicamente   fueron   removidos   durante   la   administración   de   fármacos.   Al   término   de   la   implantación,   se   les   inyectó   1   ml   de   solución   salina   (0.9%,   s.c.)   para   evitar   deshidratación   y   meloxicam   (2   mg/kg,   s.c.)   como   analgésico.   Después   del   procedimiento   quirúrgico,   los   sujetos   fueron  llevados  a  su  caja  habitación  y  se  dejaron  recuperar  durante  7  días  antes  de  cualquier  otra   manipulación  experimental   Manipulación   Dentro  de  los  7  días  de  recuperación,  se  realizó  la  manipulación  de  los  sujetos  para  su  habituación   al   investigador   y   al   proceso   de   infusión   de   fármacos.   Los   sujetos   fueron   manipulados   de   tres   a   cuatro  días  alternados  antes  de   la  administración  de   los   fármacos   (entre  9:00  am  y  4:00  pm).  La   manipulación  consistió  en  sacar  a  la  rata  de  su  caja,  revisar  los  tapones,  y  sujetarla  de  tres  a  cinco   minutos.  En  el  último  día  de  manipulación  se  le  colocó  un  inyector  falso  con  las  medidas  de  la  aguja   empleada  durante  la  infusión  (11  mm).     Administración  de  los  fármacos   El  vehículo  (MF12)  o  Aβ  (100,  200,  400  ú  800  pmoles/rata)  se  administraron  en  la  región  CA1  del   hipocampo   (microinyección),   de   manera   bilateral,   utilizando   una   bomba   de   infusión   lenta.   Para   esto,  se  conectó  una  jeringa  Hamilton  de  10  μl  a  un  inyector  de  11  mm  de  longitud,  fabricado  con  un   tubo  de  aguja  hipodérmica  de  acero  inoxidable  del  número  30.  La  infusión  de  0.5,  1,  2  ó  4  μL  por   hemisferio  se  realizó  con  una  velocidad  de  0.2  μL/min.  Posteriormente,  se  dejó  el  inyector  de  5  a  10   minutos  más  para  permitir  una  mejor  difusión  de  la  solución  inyectada.  Una  semana  posterior  a  la   microinyección,  los  sujetos  fueron  tratados  crónicamente  (14  días)  con  vehículo  (agua),  Tol  (3  ó  10   mg/kg)   o   Dzx   (10   mg/kg)   de   manera   oral   (p.o.).   La   Tol   y   la   Dzx   (Sigma   Aldrich,   St.   Louis)   se   diluyeron  en  50  ml  de  agua  y  se  les  dio  a  los  sujetos  diariamente  una  hora  antes  del  comienzo  del   ciclo  de  oscuridad  (6:00  pm).  Al   inicio  del  ciclo  de   luz  (7:00  am)   la  botella  vacía  que  contenía   los   42 tratamientos   con   Tol   o   Dzx   fue   removida   y   reemplazada   con   una   botella   de   agua.   Este   procedimiento  fue  el  mismo  para  el  grupo  tratado  con  vehículo.     Pruebas  Conductuales   Campo  Abierto   Para  evaluar  los  niveles  de  ansiedad  en  los  sujetos,  se  utilizó  una  caja  tipo  “campo  abierto”  (70   cm  x  50  cm  x  30  cm,  dividida  en  cuadrados  de  10  ×  10  cm).  Los  sujetos  fueron  colocados  en  una  de   las  esquinas  de  la  caja  y  se  les  permitió  explorarla  por  5  minutos  mientras  eran  videograbados.  Los   videos  fueron  analizados  posteriormente  ya  sea  manualmente  o  utilizando  un  tool-­‐box  de  MATLAB   de  libre  acceso  (Patel  et  al.,  2014).  Los  parámetros  considerados  fueron:  distancia  recorrida,  tiempo   de  permanencia  en  el  centro  de  la  caja  (deeinida  como  la  zona  adyacente  hasta  6.5  cm  de  las  paredes   de  la  caja),  la  cantidad  de  rearing  (deeinida  como  la  frecuencia  con  la  que  los  animales  se  levantaron   en  las  patas  traseras),  el  tiempo  de  grooming  (deeinido  como  el  tiempo  que  los  animales  estuvieron   acicalándose),  tiempo  de  inmovilización  (deeinido  como  el  tiempo  en  el  que  el  animal  permaneció   inmóvil)  y  la  frecuencia  de  defecación  (Gould  et  al.,  2009).   Conducta  típica:  Burrowing   La   tarea   de  burrowing   se   realizó   con   un   tubo   de   plástico   de   30   cm   de   largo   con   10   cm   de   diámetro  que  está  cerrado  en  un  extremo  con  una  tapa  de  plástico  (Figura  12).  Los  sujetos  fueron   puestos  en  una  caja  habitación  que  contiene  comida,  agua  y  un  tubo  de  plástico  lleno  con  bolas  de   arcilla  (1540g,  Figura  12B).  Los  sujetos  se  dejaron  2  horas  (16:00  -­‐  18:00  hrs)  y  18  horas  (18:00  -­‐   12:00  hrs)  en  la  caja  con  la  einalidad  de  que  desplegaran  la  conducta  de  burrowing.  Enseguida,  los   sujetos   fueron   regresados   a   su   caja   habitación.   Posteriormente,   se   pesó   la   cantidad   de   bolas   de   arcilla  que  el  sujeto  haya  removido  del  tubo  (peso  removido;  Deacon  et  al.,  2009a).  Un  día  después,   los  sujetos  fueron  entrenados  en  la  tarea  de  evitación  inhibitoria.   43   Fig.  12.  Equipo  utilizado  en  la  tarea  de  burrowing.  Se  muestra  la  caja  con  el  tubo  de  plástico  (A)   que  contiene  las  bolitas  de  arcilla  (B)  con  las  que  se  evaluó  el  peso  removido  por  el  sujeto.   Evitación  Inhibitoria     El  entrenamiento  de  evitación   inhibitoria  y   la  prueba  de  retención  se  realizaron  en  una  caja   constituida  por  dos  compartimientos,  uno  de  seguridad  y  uno  de  castigo  de  las  mismas  dimensiones   (30   x   30   x   30   cm),   separados   por   una   puerta   tipo   guillotina   (Figura   13A).   El   piso   del   compartimiento   de   seguridad   está   hecho   con   barras   de   acero   inoxidable   de   6   mm   de   diámetro   separadas   con   1.5   cm   entre   sí   (Figura   13A).   Las   paredes   del   compartimiento   de   castigo   están   compuestas  de  dos  placas  de  acero   inoxidable   las  cuales  se  encuentran  separadas  en   la  mitad  del   piso   por   una   ranura   de   1   cm,   dando   una   forma   de   V,   lo   cual   permitió   que   los   sujetos   hicieran   contacto   con   ellas   todo   el   tiempo   y   pudieran   recibir   el   choque   eléctrico   (Figura   13A).   El   compartimiento   de   castigo   podía   ser   electrieicado   utilizando   un   generador   de   pulsos   cuadrados   (Grass-­‐Instruments   Co.,   modelo   S48)   conectado   en   serie   con   una   unidad   de   corriente   constante   (Grass-­‐Instruments  Co.,  modelo  CCU-­‐1A).  La  cámara  de  condicionamiento  está  ubicada  en  un  cuarto   sonoamortiguado  (2.44  X  1.95  X  2.50  m)  y  con  baja   iluminación  provista  de  un  enmascarador  de   ruido  (BRS/LVE,  modelo  AU-­‐902).  Se  utilizó  la  tarea  de  evitación  inhibitoria  para  la  evaluación  de  la   consolidación  de  la  memoria  de  largo  plazo  en  ratas  entrenadas  en  grupos  independientes.  La  tarea   consistió   en   una   sesión   de   entrenamiento   y   en   una   de   prueba   (Figura13B),   que   se   describen   a   continuación.   44 • Sesión  de  entrenamiento   Cada  sujeto  se  colocó  de  inicio  en  el  compartimiento  de  seguridad.  Diez  segundos  después,   la   puerta   de   separación   entre   compartimientos   se   abrió   y   la   latencia   del   sujeto   para   pasar   al   compartimiento  de  castigo  fue  medida  (latencia  de  entrenamiento).  Una  vez  que  el  sujeto  ingresó,  la   puerta  se  cerró  y  se  aplicó  un  choque  eléctrico  (0.7  mA  por  5  s).  Posteriormente,  se  abrió  la  puerta   de  separación  para  permitir  que  el  sujeto  escapara  al  compartimiento  de  seguridad.  La  latencia  para   pasar   al   compartimiento   de   seguridad   fue   medida   (latencia   de   escape).   Una   vez   en   el   compartimiento   de   seguridad,   se   dejó   al   sujeto   30   s   y   se   le   regresó   a   su   caja   habitación   (Figura   13B).   En   el   caso   de   que   el   sujeto   no   cruzara   al   compartimiento   de   castigo,   se   tomó   como   corte   arbitrario  100  s  y  se  dio  por  terminada  la  sesión.     Fig.  13.  Equipo  y  procedimiento  utilizado  en  la  tarea  de  evitación  inhibitoria.  A,  se  muestra  la   cámara   de   evitación   inhibitoria   y   un   acercamiento   a   los   compartimentos   de   seguridad   (izquierda)   y   de   castigo   (derecha).  B,   se   muestra   la   secuencia   del   entrenamiento,   donde   se   registran   la   latencia   de   entrenamiento   y   de   escape.   Abajo   se  muestra   la   prueba   de  memoria   donde  se  registra  la  latencia  de  retención.   45 • Sesión  de  prueba   En  esta  prueba,  que  se  realizó  48  h  después  del  entrenamiento,  se  evaluó  la  retención  de  la   experiencia   aversiva.   La   sesión   se   realizó   como   ya   fue   descrito   (sesión   de   entrenamiento)   con   la   excepción  de  que  no  se  aplicó  el  choque  eléctrico.  Se  midió  el  tiempo  que  el  sujeto  tardó  en  pasar   del  compartimiento  de  seguridad  al  compartimiento  de  castigo  (latencia  de  retención;  Figura  13B).   En  el  caso  de  que   la  rata  no  cruzara  al  compartimiento  de  castigo,  se   tomó  como  corte  arbitrario   600  s  y  se  dio  por  terminada  la  sesión.   Prueba  de  actividad  motora     Para  evaluar  la  actividad  motora  de  los  sujetos  se  utilizó  una  caja  con  una  rueda  de  ejercicio   (40   ×   20   ×   50   cm).   Los   sujetos   fueron   colocados   en   la   caja   de   ejercicio   por   dos   horas   con   libre   acceso   a   la   rueda   de   ejercicio   (4:00   –   6:00   pm).   Se   utilizó   el   software   Activity  Wheel  Monitor   de   Lafayette   Instruments   (versión   11.12)   para   registrar   los   parámetros   de   distancia   recorrida   y   velocidad.   Ganancia/pérdida  de  peso  corporal   Los  sujetos  con  o  sin  el  procedimiento  quirúrgico  se  pesaron  antes  de  cualquier   tratamiento  oral   (día  0,  peso  considerado  como  el  100%).  Posteriormente,  se  comenzó  a  tratar  a   los  sujetos  con  el   vehículo   (agua),  Tol,  o   la  Dzx.  En  cada  uno  de   los   siguientes  13  días   los   sujetos   fueron  pesados  y   tratados.  De  esta  manera  se  registró  el  progreso  de  la  ganancia  o  pérdida  de  peso  de  cada  sujeto,  la   cual  se  expresó  como  porcentaje  ±  SEM  del  peso  obtenido  en  el  día  0.     Análisis  de  glucosa  en  sangre   Los   sujetos   se   pesaron   y   después   fueron   deprivados   de   agua   por   24   horas.   Posteriormente,   los   sujetos  fueron  nuevamente  pesados  y  trasladados  a  una  caja  habitación  de  acrílico  transparente  con   46 aserrín  limpio  sin  comida  o  agua.  Una  dosis  única  de  la  Tol  (3,  10,  30,  ó  100  mg/kg)  o  la  Dzx  (10  ó   20  mg/kg)  se  diluyó  en  25  ml  de  agua  y  se  les  dio  a  los  sujetos.  Dos  horas  después  de  que  los  sujetos   terminaran  de  consumir  los  fármacos,  se  les  extrajo  una  muestra  de  sangre  de  la  punta  de  la  cola.  La   muestra  de  sangre   fue  analizada  con  el  sistema  AccuChek  Performa®  para  obtener   los  niveles  de   glucosa.  En  los  experimentos  con  el  tratamiento  crónico  de  la  Tol  (3  ó  10  mg/kg)  o  la  Dzx  (10  mg/ kg),   los   sujetos   no   fueron   deprivados   de   agua   o   comida.   El   tratamiento   oral   se   realizó   como   fue   descrito  en  la  sección  administración  de  los  fármacos.  La  muestra  de  sangre  se  obtuvo  y  se  analizó  al   término  de  los  14  días  de  tratamiento.   Obtención  de  rebanadas  de  hipocampo  dorsal   Los   sujetos   fueron   anestesiados   con   pentobarbital   sódico   (62   mg/Kg,   i.p.)   y   perfundidos   transcardialmente  con   líquido  cefalorraquídeo  artieicial  modieicado  (LCRAm),  con   la   reducción  de   NaCl  y  CaCl2  con  eines  de  neuroprotección.  El  LCRAm  contiene  (en  mM):  238  sacarosa,  30  glucosa,   25  NaHCO3,  3  KCl  y  2.5  MgCl2.  La  solución  se  mantuvo  a  4°C  y  con  gaseo  constante  con  una  mezcla   de   95%   O2   y   5%   CO2   (carbógeno).   Una   vez   einalizada   la   perfusión,   el   cerebro   fue   extraído   y   disectado   en   frío.   Se   obtuvieron   rebanadas   sagitales   de   hipocampo   dorsal   (400   μm)   de   ambos   hemisferios.   Las   rebanadas   obtenidas   se   colocaron   en   una   cámara   de   recuperación,   al   menos   durante  una  hora,   a   temperatura   ambiente   y   con   gaseo   constante.   Posteriormente,   las   rebanadas   fueron  transferidas  a  una  cámara  de  registro  perfundida  con  LCRA  normal  que  contiene  (en  mM):   119   NaCl,   30   glucosa,   25   NaHCO3,   3   KCl,   1   MgCl2   y   1.5   CaCl2.   El   pH   (7.4)   y   la   oxigenación   se   mantienen  constantes  por  gaseo  con  carbógeno  a  una  temperatura  de  29  -­‐  32°C.   Registros  electroBisiológicos   Actividad  espontánea  poblacional     Para  estos  registros  se  utilizó  un  electrodo  de  borosilicato  con  una  resistencia  de  0.5  -­‐  1  MΩ,  el   47 cual   se   llenó   con   LCRA.   Se   colocó   la   punta   del   electrodo   en   la   región   CA1   del   hipocampo   y   se   registró  la  actividad  oscilatoria  espontánea  basal  durante  20  min.  Posteriormente,  se  añadió  el  Aβ   (10  nM)  y  se  registró  la  actividad  durante  1  h.  Pasado  este  tiempo,  se  añadió  1  mM  de  lidocaína  y  se   registró  durante  20  min   (Figuras  14A  y  B).   La   lidocaína  bloquea   la   actividad  neuronal   y   permite   evaluar  la  viabilidad  de  la  rebanada  (Peña  et  al.,  2010).  Para  registrar  el  efecto  agudo  de  la  Tol  y  la   Dzx,   se   utilizaron   un   grupo   independiente   de   rebanadas   obtenidas   de   sujetos   näive   en   las   que   después  del  registro  de  la  actividad  basal,  se  aplicó  la  Tol  (50  μM)  o  la  Dzx  (300  μM),  y  se  registró  su   efecto  durante  30  minutos.  A  continuación,  se  aplicó  el  Aβ  (10  nM)  en  presencia  continua  de  uno  de   estos   fármacos   y   se   registraron   sus   efectos   durante   1   h.   Al   término   de   este   periodo,   se   añadió   lidocaína  1  mM  como  control  de  viabilidad  de  las  rebanadas  (Figuras  14A  y  B).  Las  soluciones  stock   de  la  Tol  y  de  la  Dzx  fueron  preparadas  a  1000x  y  se  disolvieron  en  DMSO.  Los  registros  de  animales   tratados  crónicamente  con  la  Tol  (3  y  10  mg/kg)  o  la  Dzx  (10  mg/kg)  tuvieron  el  mismo  protocolo   descrito  anteriormente  (registro  de  la  actividad  basal:  20  min,  registro  de  la  aplicación  del  Aβ  (10   nM):  60  min;  y  lidocaína).  Para  los  registros  de  los  animales  inyectados  con  vehículo  (MF12)  o  el  Aβ   (400   pmoles),   el   registro   de   la   actividad   basal   fue   de   80   minutos   seguido   de   la   aplicación   de   lidocaína  (1mM;  Figuras  14A  y  B).   Potenciación  de  largo  plazo  (LTP)   Para  los  experimentos  de  la  LTP,  se  colocó  un  electrodo  bipolar  concéntrico  (25  mm  diámetro;   FHC  Inc.,  Bowdoin  ME,  USA)  en  el  stratum  radiatum  del  hipocampo  para  estimular  las  Colaterales   de   Schaffer   (Figura   14C).   El   registro   de   Espigas   Poblacionales   (PS,   por   sus   siglas   en   inglés)   y   de   Potenciales   Postsinápticos   Excitatorios   (fEPSP,   por   sus   siglas   en   inglés)   se   realizó   en   el   stratum   pyramidale   (región   CA1).   Para   inducir   respuestas   sinápticas   pareadas   se   utilizó   un   protocolo   de   pulsos  pareados  (Peña  et  al.,  2002).  La  estimulación  fue  aplicada  a  0.04  Hz.  La  duración  del  estímulo   fue  de  100  μs  con  un  intervalo  entre  pulsos  de  60  -­‐  80  ms.  La  intensidad  del  estímulo  se  ajustó  en   48 cada  experimento  para  inducir  un  sináptico  con  amplitud  entre  30  -­‐  40%  de  la  respuesta  máxima,   determinada  mediante  la  evaluación  de  curvas  entrada-­‐salida  (intensidad  de  estímulo  -­‐  amplitud  de   la   respuesta   evocada).   Las   PS   y   los   fEPSP   fueron   registrados   durante   30   min   para   obtener   la   actividad  basal.  Posteriormente,  para  inducir  la  LTP  se  aplicó  un  protocolo  de  estimulación  de  alta   frecuencia  (HFS,  por  sus  siglas  en  inglés)  que  consistió  en  1  tren  de  100  Hz  por  1s  (Albensi  et  al.,   2007).  Las  PS  y  los  fEPSP  se  registraron  durante  60  min.  Por  último,  se  aplicó  200  μM  de  Cloruro  de   Cadmio  (ClCd2)  y  lidocaína  (1  mM)  para  bloquear  la  transmisión  sináptica  y  la  actividad  neuronal,   respectivamente   (Peña   et   al.,   2002;   Peña   et   al.,   2010;   Figura   14D).   Para   evaluar   los   efectos   de   la   aplicación   aguda   de   la   Tol   o   el   Aβ   en   la   LTP,   los   registros   se   realizaron   con   el  mismo   protocolo   previamente  descrito  a  excepción  de  que   la  Tol   (10µM)  o  el  Aβ  (10  nM)   fueron  aplicados  15  min   antes  de  la  HFS.  Para  la  evaluación  de  la  aplicación  de  ambos  fármacos,  la  Tol  se  aplicó  15  min  antes   que  el  Aβ  (Figura  14D).   Depresión  de  largo  plazo  (LTD)     Estos   experimentos   se   realizaron   como  ya   fue  descrito   (Potenciación  de   largo  plazo),   con   la   excepción   de   que   la   intensidad   de   los   estímulos   se   ajustó   al   50%   de   la   respuesta   máxima   y   el   protocolo   para   inducir   la   LTD   es   la   aplicación   de   una   estimulación   de   baja   frecuencia   (LFS,   300   pulsos  a  un  1  Hz;  Shankar  et  al.,  2008).   La  señal  poblacional  registrada  en  todos  los  protocolos  fue  amplieicada  y  eiltrada  (paso  altas,  0.5  Hz;   paso  bajas,  1.5  KHz)  utilizando  un  amplieicador  AC  de  banda  ancha  (Grass  Instruments,  Quincy,  MA,   USA).   Todos   los   registros   fueron   digitalizados   a   9   KHz   y   almacenados   en   un   equipo   de   cómputo   personal  con  un  sistema  de  adquisición  de  datos  de  National  Instruments.   49   Fig.   14.   Protocolos   experimentales   utilizados   para   el   registro   de   la   actividad   oscilatoria   espontánea  y  la  plasticidad  sináptica.  Se  muestra  un  esquema  de  la  rebanada  de  hipocampo  con   el  sitio  en  donde  se  colocaron  los  electrodos  de  registro  (A)  y  de  estimulación  (C)  para  evaluar   la   actividad   espontánea   y   los   protocolos   de   LTP,   respectivamente.   Abajo   de   cada   esquema   se   muestra  un  trazo  representativo  de   la  actividad  espontánea  hipocampal  y   las  PS  obtenidas  en   condiciones  control.  En  el  trazo  de  la  PS  se  muestran  la  parte  del  trazo  que  se  consideró  para  el   análisis  de  la  amplitud  de  las  PS  y  la  parte  del  trazo  que  se  consideró  para  la  pendiente  de  los   fEPSP.   A   la   derecha,   se  muestran   los   cursos   temporales   de   los   tres   tipos   de   registros   que   se   llevaron  a  cabo  de  la  actividad  espontánea  hipocampal  (B)  y  la  plasticidad  sináptica  (D).   Histología   Con  el  propósito  de   localizar   las  puntas  de   los   inyectores  y  analizar   la   integridad  de   la   formación   hipocampal,  se  realizó  un  análisis  histológico  utilizando  la  tinción  de  azul  de  toluidina  (Sridharan  &   Shankar,  2012).  Brevemente,  las  rebanadas  utilizadas  para  los  registros  electroeisiológicos  (400  μm   de   espesor)   fueron   colocadas   en   formaldehído   al   10%  por   6   días.   Posteriormente,   las   rebanadas   50 pasaron   por   un   proceso   de   deshidratación   y   paraeinización.   Los   bloques   de   paraeina   con   estas   rebanadas   fueron   cortados   con   un  microtomo   y   se   obtuvieron   cortes   de   10   -­‐   50   µm,   los   cuales   fueron   desparaeinados,   lavados   con   agua   destilada   y   sumergidos   en   azul   de   la   toluidina   (0.1g   de   azul  de  la  toluidina  en  100  ml  de  agua  destilada)  por  10  min.  Enseguida,  fueron  lavados  con  agua   destilada  y  sumergidos  en  alcohol  al  96%  y  alcohol  absoluto  por  1  min.  Por  último,  se  dejaron  al   menos  1  min  de  xileno  antes  de  colocar  el  medio  de  montaje  (Entellan).  Una  vez  eijos  y  teñidos,  los   cortes   fueron   examinados   en   el   microscopio   de   luz   en   donde   se   observó   si   las   puntas   de   los   inyectores   correspondían   a   la   zona   CA1   del   hipocampo.   Además,   se   obtuvieron   fotomicrograeías   obtenidas  con  una  magnieicación  de  4x,  las  cuales  se  analizaron  con  el  sistema  de  análisis  de  imagen   NIH   Image   J   1.47  para  obtener   el   área  de   las   capas  piramidal   y   granular  del   hipocampo   (Peña  &   Tapia;  1999;  2000;  Peña  et  al.,  2010).   Para  una  mejor  visualización  de  la  sucesión  y  aplicación  de  los  métodos  descritos  en  esta  sección,  el   diseño  experimental  se  muestra  en   la  Figura  15.  Especíeicamente,  se  muestra   la  cronología  de   los   protocolos   utilizados   y   el   curso   temporal   de   los   tratamientos   y   experimentos   para   cada   sujeto   experimental.  Cabe  mencionar  que  los  grupos  donde  se  utilizaron  animales  näive  únicamente  para   registros  electroeisiológicos  no  están  considerados  en  este  esquema.   Análisis  estadístico   Para  los  análisis  estadísticos  se  tomó  como  criterio  de  inclusión  la  posición  de  la  punta  del  inyector.   Si  la  punta  del  inyector  no  se  encontró  en  la  región  CA1  del  hipocampo,  el  sujeto  se  descartó  para   los  análisis  estadísticos  de  todas  las  pruebas  conductuales  y  todos  los  registros  electroeisiológicos.     Los   parámetros   obtenidos   de   las   pruebas   de   burrowing   y   evitación   inhibitoria   (peso   removido,   latencias   de   entrenamiento,   escape   y   retención)   se   analizaron   utilizando   ANOVA   no   paramétrica   Kruskall-­‐Wallis  y  como  post  hoc  la  prueba  U  de  Mann-­‐Whitney.   51   Fig.  15.  Esquema  del  diseño  experimental.  Se  muestran  cronológicamente   los  procedimientos   experimentales   aplicados   a   cada   sujeto   experimental   y   el   período   que   abarcan,   así   como   el   periodo  que  abarca  la  administración  de  los  fármacos.     Los  parámetros  de  la  actividad  motora  (distancia  recorrida  y  velocidad)  y  los  valores  de  glucemia   de   grupos   independientes   fueron   analizados   con   una   ANOVA   de   1   vía,   seguida   de   la   prueba   de   Tukey  como  post  hoc.  El  análisis  de  la  ganancia  de  peso  entre  los  grupos  experimentales  se  realizó   con   una   ANOVA   de   2   vías.   El   análisis   del   área   de   la   formación   hipocampal   (CA1   y   granular)   se   realizó  con  la  prueba  de  t  de  Student.   Para   el   análisis   de   los   registros   de   la   actividad   espontánea   hipocampal   se   utilizó   el   software   Clampeit  (Molecular  Devices,  versión  9.2).  Se  obtuvieron  espectros  de  potencia  de  segmentos  de  5  s   (libres  de  artefactos)  utilizando   la  Transformada  Rápida  de  Fourier   (Peña  &  Alavez-­‐Pérez,  2006).   Los  espectros  de  potencia,  de  1  a  50  Hz,  se  graeicaron  para  los  trazos  representativos  (un  segmento   de  5  s)  o  para  5  segmentos  de  los  últimos  5  minutos  de  cada  condición  experimental  (espectro  de   potencia  promedio).   Para   la   comparación  estadística   entre   las   condiciones   farmacológicas  dentro   de  un  mismo  grupo,  se  analizó  la  potencia  integrada  (deeinida  como  la  sumatoria  de  las  potencias  de   las   frecuencias   de   1   -­‐   50   Hz   de   cada   registro)   utilizando   la   prueba   de   Friedmann   (ANOVA   no   paramétrica   de  medidas   repetidas)   y   como  post   hoc   la   prueba  de   rangos   con   signo  de  Wilcoxon.   Para   la   comparación   de   los   efectos   de   la   aplicación   del   Aβ   (10   nM)   entre   grupos,   la   potencia   integrada  de  la  actividad  basal  fue  normalizada  al  100%  y  se  comparó  los  cambios  en  el  porcentaje   52 de   la  potencia  con   la  prueba  Kruskall-­‐Wallis  y   la  U  de  Mann-­‐Whitney.  Para   la  comparación  de   los   efectos  de   los   tratamientos   crónicos   con   la  Tol   (3   ó  10  mg/kg)   y   la  Dzx   (10  mg/kg),   así   como  el   efecto  del  Aβ  (i.h.)  y  su  co-­‐tratamiento  con  la  Tol  y/o  la  Dzx,  la  potencia  integrada  se  analizó  con  la   prueba   Kruskall-­‐Wallis   y   la   U   de   Mann-­‐Whitney.   Para   el   análisis   de   bandas   de   frecuencia   de   la   actividad  espontánea  de  los  grupos  tratados  con  el  Aβ  (i.h.),  se  obtuvo  la  potencia  absoluta  (deeinida   como  la  sumatoria  de  las  potencias  de  la  banda  de  frecuencia  especíeica)  de  bandas  de  frecuencia   delta   (δ,  0.5-­‐1.5  Hz),   theta   (θ,  2-­‐12  Hz),  beta   (β,  13-­‐35  Hz)  y  gamma   (γ,  36-­‐50  Hz)  agrupadas  de   acuerdo   con   Buzsáki   et   al.,   2012.   Para   cada   banda   de   frecuencia   también   se   analizó   la   potencia   relativa.   Para   la  potencia   relativa,   se  normalizó   la  potencia   absoluta  de   cada  banda  de   frecuencia   tomando   como   el   100%   la   potencia   integrada.   Para   la   comparación   de   la   potencia   absoluta   y   la   potencia  relativa  entre  grupos  se  utilizó  la  prueba  Kruskall-­‐Wallis  y  la  U  de  Mann-­‐Whitney.  Además,   también   se   analizó   la   frecuencia   relativa   para   cada   banda   de   frecuencia.   Para   el   análisis   de   frecuencia   relativa   se   promediaron   los   valores   de   potencia   de   cada   valor   de   frecuencia   que   conforma   una   banda   de   frecuencia   especíeica   teniendo   una   resolución   espectral   de   ≈   0.5   Hz.   La   comparación  de   las   frecuencias   relativas   entre   grupos   se   realizó   con  una  ANOVA  de  2  vías   y  una   prueba  de  comparación  múltiple  de  Bonferroni.   Para  el  análisis  de  las  curvas  intensidad-­‐respuesta,  la  LTP  y  la  LTD,  se  midieron  la  amplitud  de  las  PS   y  la  pendiente  de  los  fEPSP  utilizando  el  software  Clampeit.  Para  analizar  las  curvas  entrada-­‐salida   se  promedió  la  amplitud  de  las  PS  de  tres  trazos  individuales  por  cada  umbral  de  estimulación.  La   comparación  de  las  curvas  entre  grupos  se  realizó  con  una  ANOVA  de  2  vías  con  una  prueba  Tukey   como  post  hoc.  El  curso  temporal  de  los  registros  de  la  LTP  y  la  LTD  se  construyeron  promediando  la   amplitud  de  las  PS  de  6  trazos  individuales  que,  en  conjunto,  corresponden  a  2.5  min  del  registro.   Para  evaluar   la   inducción  de   la  LTP  y   la  LTD,   se   compararon   la  amplitud  promedio  de   las  PS  o   la   pendiente  promedio  de  los  fEPSP  de  los  últimos  10  min  de  la  actividad  basal  contra  la  amplitud  o   pendiente   promedio   de   dos   segmentos   de   10   min   del   registro   post-­‐estimulación   (segmento   1:   53 15-­‐25  min   y   segmento   2:   50-­‐60  min).   Para   esta   comparación   se   utilizó   una   ANOVA   de  medidas   repetidas   seguida   de   una   prueba   de   Tukey.   En   los   casos   donde   se   evaluó   la   aplicación   aguda   de   fármacos,  la  amplitud  o  pendiente  promedio  de  esos  segmentos  se  incluyeron  en  el  análisis.  Para  la   comparación  de  la  LTP  y  la  LTD  entre  grupos,  los  valores  de  la  amplitud  de  las  PS  y  la  pendiente  de   los   fEPSP   se   normalizaron   con   respecto   a   la   amplitud   o   pendiente   basal   (línea   base:   100%).   Los   valores  promedio  de  la  amplitud  de  las  PS  o  pendiente  de  los  fEPSP  normalizados  (%  de  la  basal)   correspondientes  a   los  últimos  10  min  del  registro  post-­‐estimulación  se  analizaron  con   la  prueba   Kruskall-­‐Wallis   seguida   de   la   prueba   U   de   Mann-­‐Whitney.   Por   último,   la   proporción   de   pulsos   pareados  (PPR,  por  sus  siglas  en  inglés)  se  obtuvo  dividiendo  la  amplitud  promedio  de  las  PS  de  la   segunda  respuesta  (P2,  pulso  2)  entre  la  amplitud  promedio  de  la  primera  respuesta  (P1,  pulso  1).   La  PPR  entre  grupos  se  compararon  utilizando  una  t  de  Student  no  pareada.     El  análisis  de  correlación  entre  la  conducta  típica  de  burrowing  y  la  memoria  se  realizó  utilizando   una  correlación  no  paramétrica  de  Spearman  y  el  análisis  de  regresión  lineal  de  los  valores  del  peso   removido  (tarea  de  burrowing)  y   la   latencia  de  retención  (tarea  de  evitación  inhibitoria)  obtenido   por  cada  sujeto  experimental.  El  análisis  de  correlación  entre  la  potencia  integrada  y  la  memoria,  y   la   potencia   absoluta   de   la   frecuencia   δ   y   la   memoria,   se   realizó   utilizando   una   correlación   no   paramétrica  de  Spearman  y  el  análisis  de  regresión  lineal  de  los  valores  de  la  potencia  integrada,  la   potencia   absoluta   de   la   frecuencia   δ   y   la   latencia   de   retención   (tarea   de   evitación   inhibitoria)   obtenido  por   cada   sujeto  experimental.  Para  el   análisis  de   correlación  de   la  memoria,   la  LTP  y   la   LTD,  se  realizó  un  análisis  de  regresión  múltiple  utilizando   los  valores  de   la   latencia  de  retención   (tarea  de  evitación  inhibitoria)  y  los  valores  promedio  de  la  amplitud  de  la  PS  60  min  después  de  la   HFS   o   la   LFS,   obtenidos   de   cada   sujeto   experimental.   Para   evaluar   si   el   análisis   tuvo   diferencias   estadísticamente  signieicativas  se  utilizó  una  ANOVA  de  1  vía.     Para  la  realización  de  todas  las  gráeicas  y  los  análisis  estadísticos  se  utilizaron  los  programas  Prism   Graph  Pad  (versión  5.0)  y  Origin  (versión  6.0).   54 RESULTADOS   La  modulación  farmacológica  aguda  de  los  canales  KATP  evita  las  alteraciones  de  la  actividad   espontánea  hipocampal  inducidas  por  el  Aβ   Diversos   estudios   han  mostrado   que   el   Aβ   puede   alterar   la   actividad   eléctrica   de   diversos   circuitos  en  el  cerebro,  como  el  hipocampo,  in  vitro  (Balleza-­‐Tapia  et  al.,  2010;  Peña  et  al.,  2010)  e  in   vivo   (Sun   &   Alkon,   2002;   Villette   et   al.,   2010).   De   acuerdo   con   lo   anteriormente   reportado,   los   registros   de   la   actividad   eléctrica   poblacional   de   la   región   CA1   del   hipocampo   muestran   una   reducción   de   la   actividad   hipocampal   60  min   después   de   la   aplicación   del   Aβ   (10   nM)   como   se   observan   en   los   trazos   y   espectros   de   potencia   representativos   (Figura   16A).   El   análisis   de   la   potencia  integrada  normalizada  mostró  que  la  actividad  basal  se  redujo  signieicativamente  a  un  57.3   ±   5.4%   (p   =   0.0039;   Figura   16A).   Para   asegurar   el   origen   neuronal   y   biológico   de   la   actividad   registrada,  se  aplicó  1  mM  de  lidocaína  al  término  del  registro.  El  bloqueo  de  los  canales  de  Na+  por   la   lidocaína   redujo   aún   más   la   actividad   hipocampal   (a   27.8   ±   2.2%   de   la   actividad   basal,   p   =   0.0039),   la   cual   es   también   signieicativamente   menor   que   la   actividad   observada   después   de   la   aplicación  del  Aβ  (p  =  0.0039).   Previamente,   nuestro   grupo  de   trabajo  mostró  que   los   efectos  del  Aβ   sobre   la   actividad  eléctrica   hipocampal   involucran   la   activación   de   una   vía   transduccional   en   la   que   participa   la   GSK-­‐3β   (Balleza-­‐Tapia  et  al.,  2009;  Balleza-­‐Tapia  et  al.,  2010;  Peña  et  al.,  2010;  Peña  et  al.,  2012;  Isla  et  al.,   2016).  De  manera  interesante,   la  GKS-­‐3β  es  uno  de  los  principales  modulares  de  la  función  de  los   canales   KATP   (Kamada   et   al.,   2008;   Ning   et   al.   2009;   Park   et   al.,   2013).   De   este   modo,   existe   la   posibilidad  de  que  los  canales  KATP  sean  parte  de  esta  vía  transduccional  por  la  cual  el  Aβ  reduce  la   actividad   espontánea   del   hipocampo.   Para   evaluar   lo   anterior,   se   registró   la   actividad   eléctrica   espontánea  de   la  región  CA1  en  presencia  de   la  Tol,  antagonista  de   los  canales  KATP   (Hibino  et  al.,   2010).  La  Tol   (50  µM)   fue  aplicada  30  min  antes  de   la  aplicación  del  Aβ  (10nM).  El  análisis  de   la   potencia  integrada  normalizada  mostró  que  la  aplicación  de  la  Tol  no  modieicó  signieicativamente  la   55 actividad  del  hipocampo  (106.2  ±  5.4%  de  la  actividad  basal,  p  =  0.5016).  En  contraste,  la  inhibición   de  los  canales  KATP  previo  a  la  aplicación  del  Aβ,  impidió  que  la  potencia  de  la  actividad  hipocampal   se  redujera  en  presencia  del  Aβ  (106.5  ±  21.1%  de  la  actividad  basal,  p  =  0.3910;  Figura  16B).  Esta   actividad   se   redujo   signieicativamente   después   de   la   aplicación   de   lidocaína   (26.7   ±   3.3%   de   la   actividad  basal;  p  =  0.0001).  Además,  la  potencia  integrada  normalizada  de  este  grupo  en  presencia   de  la  Tol  y  Aβ  es  signieicativamente  mayor  que  la  potencia  integrada  después  de  la  aplicación  del  Aβ   en  el  grupo  control  (p  =  0.0254).   Con  el  objetivo  de  evaluar  los  efectos  de  la  activación  de  los  canales  KATP,  se  utilizó  a  la  Dzx,  agonista   de  los  canales  KATP  (Hibino  et  al.,  2010).  La  activación  o  apertura  de  los  canales  KATP  incrementa  el   potencial  de  membrana  celular  favoreciendo  su  hiperpolarización  (Fujimura  et  al.,  1997;  Yamada  et   al.,   2001;  Wu  et   al.,   2006).   Los   resultados  muestran  que   la   aplicación  de   la  Dzx   (300  µM)   redujo   signieicativamente   la   actividad   hipocampal   (a   76.0   ±   5.3%   de   la   actividad   basal;   p   =   0.0156).   Inesperadamente,   la   aplicación   previa   de   la   Dzx   (30  min   antes   de   la   aplicación   del   Aβ)   también   evitó  la  reducción  de  la  actividad  hipocampal  inducida  por  el  Aβ  (98.8  ±  19.9%  de  la  actividad  basal,   p   =   0.9375;   Figura   16C).   Nuevamente,   la   posterior   aplicación   de   lidocaína   redujo   la   actividad   hipocampal  hasta  el  30.5  ±  1.3%  de  la  actividad  basal  (p  =  0.0156).  De  manera  similar  al  grupo  con   la  aplicación  de  la  Tol,  la  potencia  normalizada  de  la  actividad  espontánea  en  presencia  de  la  Dzx  y   el  Aβ  es  signieicativamente  mayor  a  la  observada  en  el  grupo  control  después  de  la  aplicación  del  Aβ   (p  =  0.0454).  En  conjunto,  estos  resultados  nos  sugieren  que  los  canales  de  KATP  participan  en  los   efectos   agudos   del   Aβ   sobre   la   actividad   espontánea   hipocampal.   Más   importante   aún,   que   la   modulación  de   los  canales  KATP  pueden  prevenir   los  efectos   inducidos  por   la  aplicación  aguda  del   Aβ.     56   Fig.   16.   La   modulación   de   los   canales   KATP   evita   la   reducción   de   la   actividad   hipocampal   inducida   por   el   Aβ.   A,   se   muestran   trazos   representativos   de   la   actividad   hipocampal   espontánea  registrada  en  condición  basal  (trazos  grises)  y  60  min  después  de  la  aplicación  de   Aβ  (10  nM,  trazos  negros).  Los  espectros  de  potencia  correspondientes  se  muestran  en  la  parte   media  y  la  potencia  integrada  normalizada  (potencia  basal  es  el  100%)  se  muestra  a  la  derecha.   Además,   se   muestra   la   potencia   de   la   actividad   del   hipocampo   (expresada   como   %   de   la   potencia  basal)  después  de  la  aplicación  de  1  mM  de  Lidocaína  (bloqueador  de  canales  de  Na+).   B,  se  muestran  registros  y  cuantieicaciones  similares  que  en  A,  pero  de  rebanadas  tratadas  con   50   μM   de   la   Tol   30  min   antes   de   la   aplicación   del   Aβ   en   presencia   continua   de   la   Tol.  C,   se   muestran  registros  y  cuantieicaciones  similares  que  en  A,  pero  de  rebanadas  tratadas  con  300   μM  de  la  Dzx  30  min  antes  de  la  aplicación  del  Aβ  en  presencia  continua  de  la  Dzx.  Nótese  que  la   aplicación  de  ambos  fármacos  previene  la  inhibición  de  la  actividad  hipocampal  inducida  por  el   Aβ.   Los   datos   se  muestran   en   promedio   ±   SEM.   *,   p   <   0.05   vs.   actividad   basal   (representada   como  la   línea  punteada).  #,  p  <  0.05  vs.  actividad  en  presencia  del  Aβ  (10  nM).  ●,  p  <  0.05  vs.   efecto  del  Aβ  (10  nM)  en  el  grupo  Control  (Ctrl),  (n  =  7-­‐13  rebanadas/grupo).     57 Efectos  del  tratamiento  oral  con  la  tolbutamida  y  la  diazoxida  sobre  la  glucemia,  la  ganancia   de  peso  y  la  actividad  motora     Clínicamente   la   Tol   y   la   Dzx   han   sido   ampliamente   utilizados   para   el   tratamiento   de   la   diabetes  tipo  2  y  la  hipertensión,  respectivamente  (Brunton  et  al.,  2005;  Krentz  &  Bailey,  2005).  El   efecto   principal   de   ambos   fármacos   es   la  modificación   de   los   niveles   de   glucosa   (Brunton   et   al.,   2005;  Krentz  &  Bailey,  2005).  La  concentración  normal  de  glucosa  en  sangre  (normoglucemia)  está   deeinida   como   los  niveles  de  glucosa  en  un   rango  de  90  a  126  mg/dL   (Wang  et   al.,   2010).  La  Tol   produce   hipoglucemia,   que   es   la   reducción   de   la   concentración   de   glucosa   en   sangre   a   concentraciones  de  64.8  a  70.2  mg/dL  (Maheandiran  et  al.,  2013).  Por  el  contrario,  la  Dzx  produce   hiperglucemia,  que  es  el  incremento  en  la  concentración  de  glucosa  de  199.8  a  250.2  mg/dL  (Krentz   &   Bailey,   2005;   Aquilante   C,   2010).   Debido   a   que   cambios   en   los   niveles   de   glucosa   pueden   modieicar   la   actividad   hipocampal   (Huang   et   al.,   2007;   Florez   et   al.,   2015;   Jones   et   al.,   2015;   Macauley  et  al.,  2015)  y  su  función  (Stefani  et  al.,  1999;  Stefani  &  Gold,  2001;  Stollery  et  al.,  2015),   buscamos  dosis  de   la  Tol   y  de   la  Dzx  que  no  modieicaran   los  niveles  de   glucosa.   En   este   sentido,   evaluamos  los  efectos  de  una  sola  administración  de  diferentes  dosis  de  la  Tol  (3,  10,  30,  y  100  mg/ kg)  y  de  la  Dzx  (10  y  20  mg/kg)  sobre  la  glucemia,  2  h  después  de  su  administración  (Figura  17).  El   grupo   control   mostró   valores   de   glucemia   normales   (104.1   ±   2.5   mg/dL).   De   igual   manera,   los   grupos  tratados  con  3  y  10  mg/kg  de   la  Tol  (94.3  ±  5.0  y  93  ±  5.3  mg/dL,  respectivamente)  y   los   tratados   con  10  mg/kg  de   la  Dzx   (103  ±  5.02  mg/dL)  presentaron  valores  normales  de  glucemia   (todos  los  valores  de  p  >  0.1;  Figura  17A).  En  contraste,  los  grupos  tratados  con  30  y  100  mg/kg  de   la  Tol  (70.7  ±  4.3  y  73.8  ±  6.2  mg/dL,  respectivamente)  y  los  tratados  con  20  mg/kg  de  Dzx  (122.2  ±   3.8,  p  <  0.05)  mostraron  valores  de  glucemia  signieicativamente  diferentes  al  grupo  control  (todos   los  valores  de  p  <  0.05;  Figura  17A).     Habiendo   identieicado   dos   dosis   de   la   Tol   (3   y   10   mg/kg)   y   una   de   Dzx   (10   mg/kg)   que   no   modieicaron  los  niveles  de  glucosa  de  manera  aguda,  estas  dosis  se  utilizaron  posteriormente  para   58 evaluar   sus   efectos   después   de   un   tratamiento   de   14   días   (una   dosis   por   día).   El   análisis   de   la   glucosa  después  de  14  días  de  tratamiento  mostró  que  ninguna  de  las  dosis  de  la  Tol  (3  y  10  mg/kg)   o   la   dosis   de   la   Dzx   (10   mg/kg)   modieicaron   signieicativamente   la   glucemia   comparada   con   los   valores  obtenidos  por  el  grupo  control  (F(3)=0.63,  p  =  0.6425;  Figura  17B).     Fig.  17.  El  tratamiento  crónico  con  dosis  bajas  de  la  tolbutamida  o  la  diazoxida  no  modieica  la   glucemia,   la   ganancia   de   peso   o   la   actividad   motora.   A,   se   muestran   los   niveles   de   glucosa   después  de  2h  de  la  administración  de  una  única  dosis  de  la  Tol  (3,  10,  30,  ó  100  mg/kg)  o  de  la   Dzx  (10  ó  20  mg/kg).  La  línea  punteada  negra  indica  los  niveles  de  normoglucemia  (≈104  mg/ dL).   Las   líneas   punteadas   grises   representan   los   niveles   de   hipoglucemia   (≈70   mg/dL)   y   de   hiperglucemia  (≈126  mg/dL).  Las  mismas  indicaciones  de  los  niveles  de  glucemia  aplican  para   el  panel  B.  B,  se  muestran  los  niveles  de  glucosa  después  de  14  días  de  tratamiento  oral  con  la   Tol  (3  ó  10  mg/kg)  o  la  Dzx  (10  mg/kg).  C,  se  graeica  la  ganancia  de  peso  (el  100%  es  el  peso  al   inicio   del   tratamiento)   de   los   sujetos   a   lo   largo   de   los   14   días   del   tratamiento   con   vehículo   (agua),  con  la  Tol  (3  ó  10  mg/kg),  o  la  Dzx  (10  mg/kg).  D,  se  muestra  la  actividad  motora  de  los   sujetos   en   la   rueda   ejercicio   medida   como   distancia   recorrida   (eje   vertical   izquierdo)   y   velocidad  (eje  vertical  derecho).  Los  datos  se  muestran  en  promedio  ±  SEM.  *,  p  <  0.05  vs.  grupo   Ctrl.     Además  de  la  modieicación  de  los  niveles  de  glucosa,  tanto  la  Tol  como  la  Dzx  tienen  otros  efectos   considerados   secundarios   bien   caracterizados:   cambios   en   la   ganancia/pérdida   de   peso   corporal   59 (Brunton   et   al.,   2005;   Krentz  &   Bailey,   2005)   y   alteraciones  motrices   (Brunton   et   al.,   2005).   Los   sujetos  tratados  con  las  dosis  de  la  Tol  (3  y  10  mg/kg)  y  de  la  Dzx  (10  mg/kg)  que  no  modieicaron  la   glucosa   fueron   pesados   diariamente   (a   lo   largo   de   los   14   días   del   tratamiento)   para   observar   el   cambio  en  la  ganancia  de  peso  y,  posteriormente,  fueron  colocados  en  una  rueda  de  ejercicio  para   evaluar   su   actividad  motora.   El   análisis   del   cambio  de   peso   corporal   (tomando   como   el   100%  el   peso  en  el  día  0)  mostró  que  todos  los  sujetos,  sin  importar  el  tratamiento,  tuvieron  una  ganancia   de  peso  signieicativa  (F(13,  560)=12.27,  p  <  0.0001).  Esta  ganancia  de  peso  no  fue  alterada  por  ninguno   de   los   tratamientos   con   la   Tol   o   la   Dzx   (F(3,   560)=1.24,   p   =   0.2959;   Figura   17C).   Además   de   no   modieicar   su   ganancia   en   peso,   los   tratamientos   con   la   Tol   (3   y   10  mg/kg)   y   la   Dzx   (10  mg/kg)   tampoco   modieicaron   la   distancia   recorrida   (ambos   valores   de   p   >   0.1)   o   la   velocidad   (ambos   valores  de  p  >  0.1)  de  los  sujetos  cuando  estuvieron  en  una  rueda  de  ejercicio  por  2  h  (Figura  17D).   Estos   resultados   nos   permitieron   deeinir   dosis   subclínicas   de   la   Tol   y   la   Dzx   que   pueden   ser   utilizadas  sin  afectar  la  glucemia  o  inducir  alteraciones  en  otras  funciones  de  los  sujetos  que,  a  su   vez,  pudieran  afectar  los  registros  de  la  actividad  hipocampal.   El   tratamiento   crónico   con   la   tolbutamida   y   la   diazoxida   evita   la   reducción   de   la   actividad   hipocampal  inducida  por  el  Aβ   Para  evaluar  los  efectos  del  tratamiento  crónico  con  la  Tol  y  la  Dzx  sobre  las  alteraciones  en  la   actividad  hipocampal  inducidas  por  la  aplicación  aguda  del  Aβ,  grupos  independientes  de  animales   fueron   tratados   con   la   Tol   (3   y   10  mg/kg)   y   la   Dzx   (10  mg/kg)   por   14   días.   Los   registros   de   la   actividad   hipocampal   del   grupo   control   mostraron   una   potencia   integrada   promedio   (actividad   basal)   de   2.9   ±   0.6   nV2   la   cual   se   redujo   a   1.7   ±   0.5   nV2   60  min  después   de   la   aplicación  del  Aβ   (10nM).  Esta  reducción  de   la  actividad  hipocampal  basal   inducida  por  el  Aβ  representa  un  55.9  ±   5.7%  en  la  potencia  integrada  normalizada  (p  =  0.0020;  Figura  18A).  Esta  actividad  remanente  se   60 redujo  aún  más  después  de  la  aplicación  de  1mM  de  lidocaína  (a  27.1  ±  3.3%  de  la  actividad  basal,  p   =  0.0020).   Está   ampliamente   descrito   que   la   inhibición   de   los   canales   KATP   por   sulfonilureas,   como   la   Tol,   incrementan   la   excitabilidad   celular   (Haller   et   al.,   2001;  Matias   et   al.,   2010;   Lemak   et   al.,   2014;   Chhabria  &  Chakravarthy,  2016)  y  la  liberación  de  neurotransmisores  excitadores  (Lee  et  al.,  1997;   Stefani  &  Gold,  2001;  Zhao  et  al.,  2013).  En  este  sentido,  el  tratamiento  crónico  con  la  Tol  3  y  10  mg/ kg   incrementó  signieicativamente   la  actividad  basal  del  hipocampo  (a  9.02  ±  2.8  y  11.5  ±  2.4  nV2,   respectivamente)  en  comparación  con  la  actividad  hipocampal  del  grupo  control  (p  =  0.0205  y  p  =   0.0021,  respectivamente;  Figuras  18B  y  C).  Además,  el  análisis  de  la  potencia  integrada  normalizada   mostró  que   la  actividad  hipocampal  de  ambos  grupos   tratados  con   la  Tol   (3  y  10  mg/kg)  evitó   la   reducción  de  la  actividad  hipocampal  después  de  la  aplicación  del  Aβ  (99.5  ±  8.4%  y  111.8  ±  12.6%   de  la  actividad  basal,  respectivamente).  En  ambos  grupos,   la  potencia  normalizada  de   la  actividad   hipocampal   en   presencia   del   Aβ   es   signieicativamente   mayor   que   la   potencia   normalizada   en   el   grupo  control  (p  =  0.0009  y  p  =  0.0003,  respectivamente;  Figuras  18B  y  C).   En   contraste   a   lo   observado   con   la   aplicación   aguda   (Figura   16),   y   de   manera   inesperada,   el   tratamiento  crónico  con  la  Dzx  también  incrementó  la  actividad  basal  del  hipocampo  (a  9.05  ±  1.9   nV2,  p  =  0.0021;  Figura  18D).  Además,  de   igual  manera,   también  evitó   los  efectos  del  Aβ  sobre   la   actividad  hipocampal  (102.8  ±  22.6%  de  la  actividad  basal,  p  =  0.7344;  Figura  18D).  Esta  actividad   también  es  signieicativamente  mayor  que  la  observada  en  el  grupo  control  (p  =  0.0279;  Figura  18D).   Consistentemente,   la  aplicación  de   lidocaína  redujo  signieicativamente   la  actividad  hipocampal  en   todos   los   grupos  experimentales   (Figura  18). En   conjunto  estos   resultados  nos   sugieren  que   los   canales  KATP  participan  en  los  efectos  inducidos  por  el  Aβ  sobre  la  actividad  oscilatoria  espontánea   hipocampal.  Asimismo,  nos   indican  que   la  modulación  constante  de   los  canales  KATP  dados  por  el   tratamiento  crónico  con  la  Tol  y  la  Dzx,  proveen  de  una  protección  al  circuito  hipocampal  ante  los   efectos  inducidos  por  el  Aβ.   61   Fig.  18.  El   tratamiento  crónico  con  tolbutamida  y  diazoxida  evita   la   inhibición  de   la  actividad   hipocampal  inducida  por  el  Aβ.  En  la  columna  izquierda  se  muestran  los  trazos  representativos   de  la  actividad  hipocampal  en  condición  basal  (trazos  grises)  de  rebanadas  de  animales  control   (A),   tratados   con  Tol  3  mg/kg   (B),  Tol  10  mg/kg   (C),   o  Dzx  10  mg/kg   (D).   Los   trazos  negros   muestran   la   actividad   hipocampal   de   las  mismas   rebanadas   60  min   después   de   la   aplicación   continua   del   Aβ   (10   nM).   En   la   columna   central   se   muestran   los   espectros   de   potencia   correspondientes   a   cada   condición   experimental.   En   la   columna   derecha   se   graeica   la   cuantieicación  de  la  potencia  integrada  (nV2;  la  línea  punteada  azul  representa  la  actividad  basal   promedio  en  el  grupo  control)  y  la  potencia  integrada  normalizada  (potencia  basal  es  el  100%).   Además,   se   muestra   la   potencia   de   la   actividad   del   hipocampo   (expresada   como   %   de   la   potencia  basal)  después  de  la  aplicación  de  1  mM  de  Lidocaína  (bloqueador  de  canales  de  Na+).   Nótese   que   los   grupos   tratados   con   Tol   y   con   Dzx   no   presentan   un   cambio   en   la   potencia   después  de   la  aplicación  del  Aβ.  Los  datos  se  muestran  como  promedio  ±  SEM.  *,  p  <  0.05  vs.   actividad  basal.   ○,   p  <  0.05   vs.   actividad  basal   del   grupo  Control.  #,   p  <  0.05   vs.   actividad   en   presencia  del  Aβ  (10  nM).  ●,  p  <  0.05  vs.  %  de  la  actividad  basal  en  presencia  del  Aβ  (10  nM)  en   el  grupo  Ctrl  (n  =  8-­‐10/grupo).   62 La  aplicación  intrahipocampal  del  Aβ  altera  la  conducta  de  burrowing  y  deteriora  la  memoria   de  contexto   Considerando  los  resultados  anteriores,  el  siguiente  objetivo  fue  evaluar  si   la  modulación  de   los  canales  KATP  también  podría  estar  participando  en  las  alteraciones  conductuales  y  cognoscitivas   (dependientes  de  la  función  hipocampal)  observadas  en  animales  microinyectados  con  el  Aβ.  Para   lograr  dicho  objetivo,  se  caracterizaron  las  alteraciones  inducidas  en  la  conducta  y  en  la  formación   de  memoria  dependientes  de  la  función  hipocampal  en  animales  microinyectados  con  el  Aβ.   Diversos   estudios   han   demostrado   que   mediante   una   única   inyección   (bilateral)   del   Aβ   en   el   hipocampo  se  puede  inducir  una  patología  similar  a   la  observada  en   la  EA  (Frautschy  et  al.  1996;   Zussy   et   al.,   2011;   2013).   Para   obtener   la   concentración   mínima   necesaria   del   Aβ   que   induzca   alteraciones  en  la  función  hipocampal  observables  en  la  conducta,  grupos  independientes  de  ratas   fueron  inyectados  en  la  región  CA1  del  hipocampo  con  vehículo  (MF12)  o  con  el  Aβ  (200,  400  y  800   pmoles/hemisferio).  Tres  semanas  después  de  la  infusión,  se  evaluó  la  conducta  típica  de  burrowing   y  la  memoria  de  contexto  en  la  tarea  de  evitación  inhibitoria.     La  conducta  típica  de  burrowing,  deeinida  como  la  acción  de  cavar  una  madriguera  (Deacon  et  al.,   2009a)   depende   de   la   integridad   de   la   función   hipocampal   (Deacon   &   Rawlins,   2005).   En   este   sentido,  no  es  sorpresa  que  modelos  naturales  (Deacon  et  al.,  2015)  y  transgénicos  (Deacon  et  al.,   2009b;  Janus  et  al.,  2015)  de  la  EA  manieiesten  alteraciones  en  dicha  conducta.  Sin  embargo,  no  se   ha  demostrado  que   la   infusión   i.c.   de  Aβ,   la   cual   induce  un  deterioro  en   la  memoria   (Geng  et   al.,   2010;  Bagheri  et  al.,  2011;  Nobakth  et  al.,  2011;  Salgado-­‐Puga  &  Peña-­‐Ortega,  2015),  modieique  la   conducta   de   burrowing.   En   este   sentido,   nuestros   resultados   muestran,   por   primera   vez,   que   la   inyección   bilateral   del   Aβ   en   el   hipocampo   altera   la   conducta   de   burrowing   (Figuras   19A   y   B)   asociada  al  deterioro  de  la  memoria  de  contexto  (Figuras  19C-­‐F).  El  análisis  de  la  fase  diurna  de  la   prueba   (2h)   muestra   que   la   aplicación   de   400   y   800   pmoles   del   Aβ   (me   =   570.0   y   400.0   g,   respectivamente;  p  =  0.0021  y  0.0079,  respectivamente),  pero  no  de  200  pmoles  (me  =  240.0  g,  p  =   63 0.0869),   incrementa   signieicativamente   el   peso   removido   comparado   con   el   grupo   control   (me  =   97.5  g,  Figura  19A).  Este   incremento  también  se  observa  en   la   fase  nocturna  de   la  prueba  (18  h),   donde   nuevamente   los   grupos   inyectados   con   400   y   800   pmoles   del   Aβ   presentan   un   peso   removido   mayor   (me   =   1435.0   y   1295.0   g,   respectivamente;   p   <   0.0001   y   p   =   0.0175,   respectivamente)   comparado   con   el   grupo   control   (me   =   812.5   g,   Figura   19B).   La   posterior   evaluación  de  la  memoria  de  contexto  en  la  tarea  de  evitación  inhibitoria,  mostró  que  ninguna  de   las  dosis  del  Aβ  modieicó   la   latencia  de  entrenamiento  (H(3)  =  5.6,  p  =  0.1294)  o  de  escape  (H(3)  =   1.1,  p  =  0.7699),  indicando  que  la  infusión  del  Aβ  no  modieicó  la  actividad  motora  o  la  percepción   del   choque   eléctrico   los   sujetos   (Figura   19C).  De  manera   interesante,   la   aplicación  de   400   y   800   pmoles  del  Aβ   (me  =  37.0  y  134.0   s,   respectivamente)  pero  no  de  200  pmoles   (me  =  499.1   s,   p  =   0.4289),   redujeron   signieicativamente   la   latencia   de   retención   (p   =   0.0006   y   0.0072,   respectivamente)   comparada   con   el   grupo   control   (me   =   600.0   s,   Figura   19D),   indicando   un   deterioro  en  la  formación  de  la  memoria  de  contexto.     Debido   a   que   las   mismas   dosis   del   Aβ   que   incrementaron   la   conducta   de   burrowing   también   indujeron   un   deterioro   en   la  memoria   de   contexto,   se   evaluó   la   posibilidad   de   que   estos   efectos   estuvieran  correlacionados.  El  análisis  de  regresión  lineal  entre  los  valores  del  peso  removido  y  la   latencia   de   retención   obtenidos   para   cada   uno   de   los   sujetos,  muestran   una   correlación   positiva   tanto  en  la  fase  diurna  (p  <  0.0308,  Figura  19E)  como  en  la  fase  nocturna  (p  <  0.0058,  Figura  19F)   de  la  tarea  de  burrowing.  Estos  resultados  nos  indican  que  el  Aβ  produce  cambios  en  la  conducta  de   burrowing  y,  además,  esta  alteración  está  relacionada  con  un  deterioro  en  la  memoria  dependiente   de  hipocampo.     Con  el  objetivo  de  caracterizar  a  más  detalle  el  deterioro  de  la  memoria  de  contexto  inducido  por  el   Aβ,   grupos   independientes  de   animales   fueron   inyectados   con  MF12  o  400  pmoles  del  Aβ   (dosis   más   efectiva   en   alterar   la   conducta   de   burrowing   y   de   reducir   la   latencia   de   retención).   Tres   semanas  después  de  la  infusión,  los  sujetos  fueron  entrenados  en  la  tarea  de  evitación  inhibitoria.   64 Para  evaluar  si  la  infusión  del  Aβ  alteraba  la  formación  de  la  memoria  alterando  el  aprendizaje  y/o   la  memoria   de   corto   plazo,   la   prueba   de   retención   se   realizó   30  min   después   del   entrenamiento   (Figura   20).   El   análisis   de   la   latencia   de   entrenamiento   (T)   comparada   contra   la   latencia   de   retención  30  min  después  del  entrenamiento  muestra  una  diferencia  estadísticamente  signieicativa   (p  =  0.0010),   lo  cual   indica  que   los  sujetos  aprendieron   la   tarea.  De  manera   interesante,  el  grupo   tratado  con  el  Aβ  también  mostró  una  diferencia  signieicativa  entre  la  latencia  de  entrenamiento  y  la   de   retención   (p   =   0.0010),   indicando   que   el   Aβ   no   intereirió   con   el   aprendizaje   y   la  memoria   de   corto  plazo  (Figura  20A).  Para  evaluar  la  consolidación  de  la  memoria  y  observar  una  memoria  de   largo  plazo,   los  mismos  sujetos  fueron  nuevamente  evaluados  48  h  después  del  entrenamiento.  El   grupo  Control  mostró  una   latencia  de   retención   igual  que   la   latencia  de   retención  obtenida  en   la   prueba  de  memoria  de  corto  plazo  evaluada  30  minutos  después  del  entrenamiento  (p  =  0.1250).   En  contraste,  el  grupo  tratado  con  el  Aβ  mostró  una  latencia  de  retención  signieicativamente  menor   que  la  obtenida  en  la  prueba  de  memoria  de  corto  plazo  (p  =  0.0010;  Figura  20A).  Estos  resultados   indican   que   la   infusión   del   Aβ   deteriora   los   procesos   de   consolidación   de   la   memoria   y   no   el   aprendizaje.   El   siguiente   objetivo   fue   determinar   si   los   efectos   deletéreos   del   Aβ   sobre   el   proceso   de   consolidación  son  inmediatos  o  requieren  de  tiempo  para  establecerse.  Para  evaluar  lo  anterior,  los   sujetos  tratados  con  400  pmoles  de  Aβ  fueron  entrenados  en  la  tarea  de  evitación  inhibitoria  una   semana  después  de  la  infusión  intrahipocampal.  La  prueba  de  retención  se  realizó  48  h  después  y  se   volvió  a  realizar  esta  prueba  2  y  3  semanas  posteriores  a  la  infusión  del  Aβ.  El  análisis  de  la  latencia   de  entrenamiento  mostró  diferencias  signieicativas  entre  el  grupo  Control  y  el  grupo  tratado  con  el   Aβ   (p   =   0.0095).   No   obstante,   ambos   grupos   mostraron   una   memoria   de   largo   plazo   normal,   presentando  una  latencia  de  retención  similar  (me  =  600  s,  p  =  0.1409;  Figura  20B).  La  prueba  de   memoria  en  la  segunda  semana  post-­‐inyección  muestra  que  el  grupo  control  mantiene  una  latencia   de   retención   alta   (me   =   519.1   s),   mientras   que   el   grupo   tratado   con   el   Aβ   obtuvo   valores   de   la   65 latencia  de  retención  menores  (me  =  194.7  s).  No  obstante,  estos  valores  no  son  estadísticamente   diferentes  del  grupo  Control  (p  =  0.0846,  Figura  20B).  En  la  última  prueba  de  retención  realizada  a   la  tercer  semana  post-­‐inyección,  el  grupo  Control  sigue  mostrando  valores  de  latencia  de  retención   altos   (me  =  529.0   s),  mientras   que   los   valores   obtenidos   por   el   grupo   tratado   con   el   Aβ   son   aún   menores   que   los   obtenidos   en   la   prueba   anterior   (me   =   61.85   s),   los   cuales   si   muestran   una   diferencia   estadísticamente   signieicativa   comparados   al   grupo   Control   (p   =   0.0014,   Figura   20B).   Estos   resultados   sugieren  que   la   inyección   intrahipocampal  de  400  pmoles  del  Aβ   requiere  de   al   menos   tres   semanas   para   afectar   el   proceso   de   consolidación,   y   posiblemente   el   proceso   de   evocación,  de  la  memoria.  En  conjunto,  estos  resultados  nos  muestran  que  la  infusión  del  Aβ  en  el   hipocampo   produce   alteraciones   en   la   conducta   y   la   formación   de   la   memoria,   los   cuales   concuerdan  con  el  fenotipo  observado  en  los  pacientes  con  la  EA  (Frautschy  et  al.  1996;  Cummings   et  al.,  1995;  2002).   La  conducta  de  burrowing  y  la  formación  de  la  memoria  pueden  ser  modieicados  por  cambios  en  el   estado  emocional  (Kim  et  al.,  1996;  Costa-­‐Nunes  et  al.,  2014;  Negrón-­‐Oyarzo  et  al.,  2016)  y/o  eísico   (Teeling  et   al.,   2007;   Jirkof  P,  2013;  2014;  Whittaker  et   al.,   2014)  de   los   sujetos.  Considerando   lo   anterior,  se  utilizó  la  tarea  de  campo  abierto  para  evaluar  si  el  Aβ  podía  alterar  el  estado  emocional   (medido  como  niveles  de  ansiedad)  y/o  el  estado  eísico  (medido  como  la  actividad  motora)  de  los   sujetos,   lo   cual  pudiera   ineluir   en  el   incremento  de   la   conducta  burrowing   y   en  el  deterioro  de   la   memoria   (Figura   21).   El   análisis   de   las   diferentes   variables   registradas   en   la   prueba   de   campo   abierto  mostró   que   únicamente   el   tiempo   de   inmovilización   es   diferente   entre   ambos   grupos.   El   grupo  tratado  con  el  Aβ  pasa  mayor  tiempo  inmóvil  (16.8  ±  8.74  s)  comparado  con  el  grupo  control   (0.92  ±  0.92  s,  p  =  0.0450;  Figura  20F).  Estos  resultados  indican  que  el  estado  eísico  de  los  sujetos   no  se  afectó  por  el  Aβ,  ya  que   la  distancia  recorrida  y   las   latencias  de  entrenamiento  y  escape  no   fueron  modieicadas  (Figuras  20  y  21A-­‐E).  Por  el  contrario,  el  cambio  en  el  tiempo  de  inmovilización   puede  indicar  un  cambio  en  el  estado  emocional  de  los  sujetos  (Gould  et  al.,  2009).  En  este  sentido,   66 el  Aβ  podría  estar  incrementando  la  conducta  de  burrowing  a  través  de  ligeros  cambios  en  el  estado   emocional  de   lo  sujetos,  como  un   incremento  en   la  ansiedad  (Gould  et  al.,  2009),   los  cuales  están   asociados  al  mal  funcionamiento  de  la  formación  hipocampal  en  los  procesos  de  memoria.     Fig.   19.   El   incremento   en   la   conducta   de   burrowing   inducido   por   el   Aβ   correlaciona   con   el   deterioro  en  la  memoria  de  contexto.  Se  graeicó  el  peso  removido  obtenido  en  la  fase  diurna  (2   h,  A)  y  la  fase  nocturna  (18  h,  B)  de  la  tarea  de  burrowing  del  grupo  Ctrl  y  los  grupos  tratados   con  200,  400,  y  800  pmoles  del  Aβ.  C,  Latencia  de  entrenamiento  (barras  blancas)  y  de  escape   (barras  grises)  obtenidas  en  el  entrenamiento  en  la  tarea  de  evitación  inhibitoria  del  grupo  Ctrl   y  los  grupos  tratados  con  200,  400,  y  800  pmoles  del  Aβ.  D,  Latencia  de  retención  obtenida  48  h   del  entrenamiento  en  la  tarea  de  evitación  inhibitoria.  E  y  F,  se  graeican  los  datos  de  la  mediana   del  peso  removido  en  la  fase  diurna  (E)  o  fase  nocturna  (F)  contra  los  valores  de  la  latencia  de   retención  obtenidas  por  cada  sujeto  tratado  con  MF12  (Ctrl)  o  200,  400,  y  800  pmoles  del  Aβ  (n   =   6–11   ratas/grupo).   Los   datos   de   las   eiguras   A-­‐D   se   muestran   en   mediana   ±   rangos   intercuartilares.  ∗,  p  <  0.05  vs.  grupo  Ctrl.     67 Además  del   estado   conductual  de   los   sujetos,   se  determinó   si   la   inyección  de  400  pmoles  del  Aβ   modieicó   la   integridad  anatómica  de   la   formación  hipocampal  (Zussy  et  al.,  2011;  2013),  de  modo   que  pudiera  alterar  la  conducta  de  burrowing  y  la  memoria.  Al  einalizar  las  pruebas  conductuales  se   obtuvieron  cortes  sagitales  de  50  µm  con  la   einalidad  de  evaluar  si  el  sitio  de   inyección  en  ambos   hemisferios   se   encontraba   en   la   región   CA1   del   hipocampo   (Figuras   22A   y   B).   Si   el   sitio   era   incorrecto,   los   datos   de   dicho   sujeto   se   excluyeron   de   los   análisis   estadísticos   de   las   pruebas   conductuales.  Asimismo,  se  obtuvieron  cortes  de  10  µm  en  los  que  se  analizó  el  área  de  las  zonas   piramidales  y  granulares  del  hipocampo  (Figuras  22C-­‐H).  La  cuantieicación  de   las   regiones  CA1  y   CA3,   así   como   del   giro   dentado   no   mostró   diferencias   signieicativas   (p   =   0.3583   y   0.3498,   respectivamente;  Figura  22I).  Estos  resultados  indican  que  la  inyección  del  Aβ  en  la  región  CA1  del   hipocampo  no  modieica  la  integridad  anatómica  de  la  formación  hipocampal.     Fig.   20.   El   Aβ   afecta   la   consolidación   de   la   memoria   de   contexto   3   semanas   después   de   su   aplicación.  A,  se  muestran  la  latencia  de  entrenamiento  (T)  y  latencia  de  retención  30  min  (30’)   y   48   h   después   del   entrenamiento   en   la   tarea   de   evitación   inhibitoria   de   los   grupos   control   (Ctrl)  y  Aβ  (400  pmoles;  n  =  10  ratas/grupo).  Nótese  que  el  grupo  tratado  con  el  Aβ  muestra   una  memoria  de  corto  plazo  (30’)  pero  no  una  memoria  de   largo  plazo  (48  h).  ∗,  p  <  0.05  vs.   latencia  de  entrenamiento.  #,  p  <  0.05  vs  30  min  latencia  de  retención.  B,  se  muestran  la  latencia   de  entrenamiento  (T)  y  la  latencia  de  retención  1,  2  y  3  semanas  después  de  la  inyección  i.h.  de   MF12  (Ctrl)  ó  400  pmoles  del  Aβ  (n  =  10  ratas/grupo).  Nótese  que  el  grupo  tratado  con  el  Aβ   presenta  deeiciencias  en  la  memoria  de  contexto  tres  semanas  después  de  la  inyección,  pero  no   antes.   ∗,   p   <   0.05   vs.   latencia   de   retención   del   grupo   Ctrl.   Todos   los   datos   se   muestran   en   medianas  ±  rangos  intercuartilares.   68 La  modulación   de   los   canales  KATP   previene   el   incremento   en   la   conducta   de   burrowing   y   el   deterioro  de  la  memoria  de  contexto  inducidos  por  el  Aβ   Una  vez  caracterizados  los  efectos  del  Aβ  sobre  la  conducta  típica  de  burrowing  y  la  memoria   de  contexto,  el  siguiente  objetivo  fue  evaluar  si  la  modulación  de  los  canales  KATP  con  el  tratamiento   con   la   Tol   o   la   Dzx   podía   evitar   el   incremento   en   la   conducta   de   burrowing   y   el   deterioro   de   la   memoria  de   contexto.  Para   lograr  el  objetivo  anterior,   y   considerando  que   la   inyección   i.c.  del  Aβ   puede   inducir   cambios   en   el  metabolismo  de   los   sujetos   (Takeda   et   al.,   2010;   Zussy   et   al.,   2011;   Macauley  et  al.,  2015),  primero  se  evaluó  si  la  inyección  i.h.  de  400  pmoles  del  Aβ  en  combinación   con   los   tratamientos   orales   de   la   Tol   (3  mg/kg)   o   la   Dzx   (10  mg/kg)  modieicaban   los   niveles   de   glucemia,  la  ganancia  de  peso  y  la  actividad  motora  de  sujetos  (Figura  23).  El  análisis  de  los  niveles   de  glucemia  mostró  que  tanto  el  grupo  Control,  como  los  grupos  tratados  con  el  Aβ,  Aβ+Tol,  y  Aβ +Dzx,   presentaron   niveles   normales   de   glucemia   (F(3)=   0.9,   p   =   0.4440;   Figura   23A).   De   igual   manera,  el  tratamiento  con  el  Aβ,  Aβ+Tol  y  Aβ+Dzx  no  modieicó  la  ganancia  de  peso  de  los  sujetos   (F(3,728)=  0.9,  p  =  0.4962;  Figura  23B)  o  su  actividad  motora  (p  =  0.4321  y  0.5223,  respectivamente;   Figura  23C).   Considerando  que   la  modulación  de   la   actividad  de   los   canales  KATP   puede  modieicar   la   conducta   innata   (Deacon  et  al.,   2006)  y   la   formación  de   la  memoria   (Stefani  &  Gold,  2001;  Betourne  et  al.,   2009),  se  determinó  si  los  tratamientos  crónicos  con  la  Tol  (3  mg/kg)  o  la  Dzx  (10  mg/kg)  podrían   modieicar   la   conducta   de   burrowing   y   la   formación   de   la   memoria   de   contexto   (Figura   24).   El   análisis  del  peso  removido  en  la  fase  diurna  (2h)  y  la  fase  nocturna  (18  h)  del  burrowing  mostró  la   Tol   (3   mg/kg)   o   la   Dzx   (10   mg/kg)   no   modieicaron,   por   sí   mismas,   la   conducta   de   burrowing   (H(2)=4.0,  p  =  0.1549,  Figura  24A).  El  análisis  de  las  latencias  de  entrenamiento  mostró  que  la  Tol  (3   mg/kg)  si  incrementó  esta  latencia  (p  =  0.0114;  Figura  24C),  sin  embargo  no  modieicó,  al  igual  que   la  Dzx   (10  mg/kg),   las   latencias  de  escape  y  retención  (todos   los  valores  de  p  >  0.1;  Figura  24C).   Estos   resultados   indican   que,   el   tratamiento   con   la   Tol   o   la   Dzx   por   sí   mismo,   no   modieican   la   69 actividad  motora,  la  percepción  del  choque  eléctrico  o  la  retención  de  la  memoria  de  contexto.     Fig.   21.   La   infusión   i.h.   del   Aβ   induce   ansiedad  moderada.   Se  muestran   la   cuantieicación   de   conductas  asociadas  a  niveles  de  ansiedad:  distancia  recorrida  (A),  tiempo  en  la  zona  central  de   la  arena  (B),  frecuencia  de  defecación  (C),  frecuencia  en  la  conducta  de  rearing  (D),  tiempo  de   grooming  (E)  y  de  inmovilización  (F),  obtenidas  en  la  prueba  de  campo  abierto.  Todos  los  datos   se  muestran  en  promedio  ±  SEM.  ∗,  p  <  0.05  vs.  grupo  Ctrl.   Previamente  mostramos  que   la   inyección  del  Aβ   incrementa   la   conducta  de  burrowing   en   ambas   fases  de  la  prueba  (Figura  19).  Nuevamente,  en  un  grupo  independiente  de  animales,   la   inyección   del  Aβ   i.h.   incrementó  el  peso  removido  en   la   fase  diurna  (p  =  0.0014)  y  en   la   fase  nocturna  (p  =   0.0009)  comparado  contra  el  grupo  control  (Figura  24B).  Interesantemente,  el  grupo  tratado  con  el   Aβ  y  3  mg/kg  de  la  Tol  no  presentó  un  incremento  signieicativo  del  peso  removido  en  la  fase  diurna   de   la   prueba   comparado   con   el   grupo   control   (p   =   0.2284).   No   obstante,   estos   datos   no   son   estadísticamente  diferentes  del  grupo  tratado  con  el  Aβ  (p  =  0.0946).  De  manera  similar,  los  valores   de  peso  removido  en   la   fase  nocturna  son  estadísticamente   iguales  al  grupo  control  (p  =  0.2783).   Sin  embargo,  sí  presentan  una  diferencia  signieicativa  comparados  contra  el  grupo  Aβ  (p  =  0.0122;   Figura  24B).  El  grupo  tratado  con  el  Aβ  y   la  Dzx  presentó  valores  similares  a   los  obtenidos  por  el   70 grupo  control  en  ambas  fases  de  la  prueba  (p  =  0.1010  y  0.125,  respectivamente;  Figura  24B).  De   manera   interesante,   los   datos   de   este   grupo   muestran   una   tendencia   de   ser   estadísticamente   menores   a   los   obtenidos   por   el   grupo   tratado   con   el   Aβ   (p   =   0.0750   y   0.0668).   Estos   resultados   indican  que  el  tratamiento  con  la  Tol  y   la  Dzx  previenen,  parcialmente,   los  efectos  del  Aβ  sobre  la   conducta  de  burrowing.       Fig.  22.  La  infusión  del  Aβ  no  afecta  la  integridad  anatómica  del  hipocampo.  A  y  B,  marcas  de   las  cánulas  y  puntas  de  los  inyectores  que  muestran  los  sitios  de  la  inyección  i.h.  de  MF12  o  del   Aβ  (200  pmoles/hemisferio).  C   -­‐  H,   fotomicrograeías  de   los  cortes  histológicos  del  hipocampo   obtenidos  de  sujetos  Ctrl  (C-­‐E)  o  tratados  con  el  Aβ  (F-­‐H).  C  y  F  muestran  una  vista  panorámica   del  hipocampo  dorsal  (10x).  A  la  derecha,  se  muestra  la  magnieicación  (40x)  del  giro  dentado  (D   y   G)   y   de   la   región   CA1   (E   y   H)   del   hipocampo   enmarcadas   en   C   y   en   F,   respectivamente.   I,   cuantieicación  del  área  (promedio  ±  SEM)  de  la  capa  granular  y  piramidal  del  hipocampo  de  los   sujetos  de  los  grupos  Ctrl  y  Aβ  (n  =  10  ratas/grupo).   71 Previamente  demostramos  que  una  única  inyección  de  400  pmoles  del  Aβ  afecta  la  consolidación  de   la  memoria  de  contexto  (Figura  20).  Para  estos  experimentos,  nuevamente  la  administración  de  400   pmoles   del   Aβ   i.h.   redujo   signieicativamente   la   latencia   de   retención   (me   =   44.6   s,   p   =   0.0002)   comparada  con  el  grupo  control  (me  =  572.7  s;  Figura  24F).  En  contraste,  el  grupo  co-­‐tratado  con  la   Tol   presenta   una   latencia   de   retención   normal   (me   =   600   s)   y   estadísticamente   mayor   que   los   valores  de  la  latencia  de  retención  del  grupo  tratado  con  el  Aβ  (p  =  0.0003;  Figura  24F).  De  manera   similar,   el   co-­‐tratamiento   con   la   Dzx   también   bloqueó   los   efectos   del   Aβ   sobre   la  memoria.   Este   grupo  presentó  una  latencia  de  retención  signieicativamente  mayor  que  el  grupo  tratado  con  el  Aβ   (p   =   0.0457;   Figura   24F).   No   obstante,   el   co-­‐tratamiento   con   Dzx   fue   signieicativamente   menos   efectivo  que  el  co-­‐tratamiento  con  Tol  en  prevenir  el  deterioro  de  la  memoria  inducido  por  el  Aβ  (p   =  0.0045).  En  conjunto,  estos  resultados   indican  que   la  modulación  de   la  actividad  de   los  canales   KATP  con  el  tratamiento  cónico  con  la  Tol  y  la  Dzx  previene  las  alteraciones  inducidas  por  el  Aβ  en  la   conducta  innata  y  en  la  memoria  dependientes  del  hipocampo,  siendo  el  tratamiento  con  la  Tol  más   eeiciente  que  el  tratamiento  con  la  Dzx.     Fig.  23.  La  infusión  del  Aβ  solo  o  en  combinación  con  el  tratamiento  oral  con  la  Tol  o  la  Dzx  no   afecta   la   glucemia,   la   ganancia   de   peso,   o   la   actividad   motora.   A,   se   graeican   los   niveles   de   glucosa  obtenidos  3  semanas  después  de  la   infusión  i.h.  de  MF12  (Ctrl)  o  Aβ  (400  pmoles)  en   combinación   con   los   tratamientos   orales   con   la   Tol   (3  mg/kg)   o   la  Dzx   (10  mg/kg;   n   =   9-­‐10   ratas/grupo).  La  línea  punteada  negra  indica  los  niveles  de  normoglucemia  (≈105  mg/dL).  Las   líneas   punteadas   grises   representan   los   niveles   de   hipoglucemia   (≈70   mg/dL)   y   de   hiperglucemia  (≈126  mg/dL).  B,  se  graeica  la  ganancia  de  peso  (el  100%  es  el  peso  al  inicio  del   tratamiento)  de  los  sujetos  a  lo  largo  de  los  14  días  del  tratamiento.  C,  se  muestra  la  actividad   motora  de  los  sujetos  en  la  rueda  ejercicio  medida  como  distancia  recorrida  (barras  blancas)  y   velocidad  (barras  grises).  Todos  los  datos  se  muestran  en  promedio  ±  SEM. 72 Las   alteraciones   conductuales   inducidas   por   el   Aβ   no   están   asociadas   a   cambios   en   la   actividad  espontánea  hipocampal  o  en  la  transmisión  sináptica   Con   la   einalidad   de   conocer   los   posibles   procesos   celulares   involucrados   en   los   efectos   descritos   del   Aβ   y   de   los   moduladores   de   los   canales   de   KATP,   así   como   para   correlacionar   los   cambios  de  la  actividad  eléctrica  hipocampal  y  los  efectos  protectores  del  tratamiento  con  la  Tol  y  la   Dzx  sobre   la  conducta  de  burrowing  y   la  memoria  de  contexto,   se  registró   la  actividad  oscilatoria   espontánea   y   la   transmisión   sináptica   de   rebanadas   de   hipocampo   obtenidas   de   los   sujetos   evaluados  en  las  pruebas  conductuales.     El  espectro  de  potencia  de  1-­‐50  Hz  y  el  análisis  de  la  potencia  integrada  de  la  actividad  espontánea   poblacional   de   los   sujetos   inyectados   con   MF12   (3.7   ±   0.7   nV2)   o   con   el   Aβ   (2.9   ±   0.4   nV2)   no   mostraron  diferencias  signieicativas  entre  los  grupos  (p  =  0.7243;  Figuras  25A  y  B).  Debido  a  que  el   Aβ   in   vitro   (Adaya-­‐Villanueva   et   al.,   2010;   Gutiérrez-­‐Lerma   et   al.,   2013)   e   in   vivo   (Villette   et   al.,   2010)   puede   alterar   la   actividad  de   bandas   de   frecuencia   especíeicas,   se   realizó   un   análisis   de   la   potencia  absoluta  de  la  actividad  hipocampal  en  los  rangos  de  frecuencia  delta  (δ,  0.5-­‐1.5  Hz),  theta   (θ,  2-­‐12  Hz),  beta  (β,  13-­‐35  Hz)  y  gamma  (γ,  36-­‐50  Hz)  con  la  einalidad  de  revelar  algún  cambio  que   no  se  pudiera  observar  con  el  análisis  de  la  potencia  integrada  en  la  banda  ancha  de  0  a  50  Hz.  El   análisis   de   la   potencia   absoluta   mostró   que   únicamente   la   potencia   de   la   banda   δ   es   signieicativamente  mayor  en  el  grupo  tratado  con  el  Aβ  (0.05  ±  0.02  nV2)  comparado  con  el  grupo   control   (0.02   ±   0.008   nV2,   p   =   0.0443;   Figura   25C).   La   potencia   de   las   bandas   de   θ,   β,   y   γ   no   mostraron  diferencias  signieicativas  entre  los  grupos  control  y  Aβ  (todos  los  valores  de  p  >  0.1).  El   análisis  de  la  frecuencia  relativa  de  la  banda  δ  muestra  que  a  0.5  Hz  hay  un  incremento  signieicativo   en  la  potencia  del  grupo  tratado  con  el  Aβ  (0.03  ±  0.01  nV2)  en  comparación  con  el  grupo  control   (0.005  ±  0.002  nV2,  p  =  0.0116;  Figura  25D).  Además  de  incrementar  la  potencia  de  la  banda  δ,  el   análisis  de  la  potencia  relativa  mostró  una  tendencia  en  el  incremento  de  la  proporción  de  la  banda   δ  (3.1  ±  1.5%)  en  comparación  con  el  grupo  control  (0.44  ±  0.2%,  p  =  0.0709;  Figura  25E).   73   Fig.   24.   Las   alteraciones   inducidas   por   el   Aβ   en   la   conducta   de  burrowing   y   la  memoria   son   prevenidas  por  la  modulación  de  los  canales  KATP.  A  y  B,  se  muestra  el  peso  removido  obtenido   en  la  fase  diurna  (2h,  barras  blancas)  y  nocturna  (18  h,  barras  grises)  de  la  tarea  de  burrowing   de  los  sujetos  Ctrl  (MF12,  i.h.),  los  tratados  con  la  Tol  (3  mg/kg,  p.o.),  con  la  Dzx  (10mg/kg,  p.o.),   con   el   Aβ   (400   pmoles,   i.h.),   Aβ+Tol,   y   Aβ+Dzx   (n   =   9-­‐10   ratas/grupo).   Nótese   que   el   tratamiento  con  la  Tol,  pero  no  con  la  Dzx,  previene  parcialmente  el  incremento  en  la  conducta   de   burrowing   inducido   por   el   Aβ.   C   y   E,   se   muestran   la   latencia   de   entrenamiento   (barras   blancas)   y   de   escape   (barras   grises)   obtenidas   en   el   entrenamiento   en   la   tarea   de   evitación   inhibitoria.  D  y  F,  se  muestra  la  latencia  de  retención  obtenida  48  h  después  del  entrenamiento   en  la  tarea  de  evitación  inhibitoria.  Nótese  que  la  Tol  previene  el  efecto  amnésico  inducido  por   la  infusión  del  Aβ,  el  cual  es  parcialmente  bloqueado  por  la  Dzx.  Todos  los  datos  se  muestran  en   medianas  ±  rangos  intercuartilares.  *,  p  <  0.05  vs.  grupo  Ctrl.  ●,  p  <  0.05  vs.  grupo  Aβ.  #,  p  <  0.05   vs.  grupo  Aβ+Tol.     74 Al  igual  que  lo  sujetos  tratados  únicamente  con  la  Tol  y  la  Dzx,  los  sujetos  tratados  con  el  Aβ+Tol  y  el   Aβ+Dzx  presentaron  un  incremento  en  la  actividad  espontánea  poblacional  del  hipocampo  (13.9  ±   4.7  nV2  y  9.9  ±  3.5  nV2,  respectivamente)  comparada  con  los  grupos  Control  (p  =  0.0039  y  0.0500,   respectivamente)  y  Aβ   (p  =  0.0011  y  0.0101,   respectivamente;  Figuras  26A  y  B).  El   análisis  de   la   potencia  absoluta  mostró  que  el  incremento  de  la  actividad  en  ambos  grupos  ocurre  principalmente   en  el  rango  de  frecuencia  β  (p  =  0.0115  y  0.0110).  Además,  el  grupo  tratado  con  el  Aβ+Tol  presenta   incremento  signieicativo  en  la  potencia  de  la  actividad  θ  (p  <  0.0314),  mientras  que  el  grupo  tratado   con  el  Aβ+Dzx  presentó  un   incremento   signieicativo  en   la  potencia  de   la   actividad  γ   (p  =  0.0005;   Figura  26B).  De  manera  interesante,  el  análisis  de  la  potencia  absoluta  (Figura  26B)  y  la  frecuencia   relativa   (Figura   26C)   de   la   actividad   δ,   cuya   potencia   fue   incrementada   por   la   infusión   del   Aβ,   muestra  que  la  actividad  en  esta  banda  de  frecuencia  no  se  encuentra  incrementada  en  los  grupos   tratados  con  el  Aβ+Tol  y  Aβ+Dzx  comparada  con  la  potencia  de  la  actividad  δ  del  grupo  Control  (p  =   0.2150   y   0.1122,   respectivamente).   Sin   embargo,   la   potencia   de   esta   actividad   tampoco   es   estadísticamente   diferente   del   grupo   tratado   con   el   Aβ   (p   =   0.2596   y   0.4436,   respectivamente;   Figuras  26B  y  C).  De  manera  similar,  el  análisis  de  la  potencia  relativa  de  la  actividad  δ  en  los  grupos   Aβ+Tol  y  Aβ+Dzx  (0.26  ±  0.09%  y  0.93  ±  0.5%,  respectivamente)  tampoco  presentan  una  diferencia   estadísticamente   signieicativa   comparada   con   el   grupo   tratado   con   el   Aβ   o   el   grupo  Control   (p   =   0.2761  y  0.4374,  respectivamente;  Figura  26D).  Estos  resultados  nos  indican  que  los  tratamientos   con  la  Tol  y  la  Dzx  evitan  parcialmente  el  incremento  de  la  potencia  de  actividad  δ.     Considerando   que   el   incremento   de   la   actividad   de   frecuencias   lentas   también   se   observa   en   pacientes  con  la  EA  y  que  está  asociado  con  el  deterioro  cognoscitivo  (Coben  et  al.,  1983;  Schreiter-­‐ Gasser   et   al.,   1994;   Kowalski   et   al.,   2001),   se   evaluó   la   posibilidad   de   que   el   incremento   en   la   actividad  δ  inducido  por  el  Aβ  pudiera  estar  relacionado  con  el  deterioro  en  la  memoria.  Asimismo,   se   evaluó   si   el   bloqueo   parcial   de   éste,   producido   por   el   tratamiento   con   la   Tol   y   la   Dzx,   está   relacionado  con  el  efecto  protector  en  la  memoria.     75   Fig.  25.  La  aplicación  del  Aβ  en  el  hipocampo  incrementa  la  potencia  de  frecuencias  lentas.  A,   espectro   de   potencia   promedio   de   los   grupos   Ctrl   y   Aβ.   Enmarcado   en   el   rectángulo   azul   punteado  se  muestra  el  incremento  de  la  potencia  de  frecuencias  lentas  (banda  delta)  inducido   por  el  Aβ  (la  cuantieicación  se  muestra  en  C).  B,  cuantieicación  de  la  potencia  integrada  (nV2)  de   1  a  50  Hz.  C,  cuantieicación  de  la  potencia  absoluta  de  la  actividad  en  los  rangos  de  frecuencia   delta   (0.5-­‐1.5   Hz),   theta   (2-­‐12   Hz),   beta   (13-­‐35   Hz)   y   gamma   (36-­‐50   Hz).   D,   se   graeica   el   espectro   de   potencia   correspondiente   a   la   actividad   en   la   banda   de   frecuencia   delta.   E,   cuantieicación  de  la  potencia  relativa  de  la  actividad  en  la  banda  de  frecuencia  delta.  Nótese  que   la  infusión  del  Aβ  incrementa  la  potencia  y  la  proporción  de  la  actividad  en  frecuencias  lentas.   Los   datos   se  muestran   como   promedio   ±   SEM.   *,   p   <   0.05   vs.   el   grupo   Ctrl   (n   =   8-­‐10   ratas/ grupo).   El  análisis  de  correlación  y  la  regresión  lineal  entre  los  valores  de  la  potencia  integrada  y  los  valores   de   la   latencia   de   retención   obtenidos   de   cada   sujeto   de   los   grupos   Control,   Aβ   y   Aβ+Tol,   no   mostraron   una   correlación   signieicativa   (p   =   0.1086;   Figura   26E).   En   contraste,   el   análisis   de   la   76 potencia  absoluta  de  la  banda  de  frecuencia  δ  y  los  valores  de  la  latencia  de  retención,  muestran  una   tendencia  a  estar  correlacionados   (r  =-­‐0.3426,  p  =  0.0638;  Figura  26F).  Más  aún,  el  análisis  de   la   correlación  y  la  regresión  lineal  entre  la  potencia  relativa  de  la  banda  de  frecuencia  δ  y  los  valores   de   la   latencia  de   retención  muestran  una   correlación   signieicativa   (r  =-­‐0.4287,  p  =  0.0181).  Estos   resultados   sugieren   que   el   efecto   protector   de   la   memoria   producido   por   la   Tol,   podría   estar   relacionado   con   el   bloqueo  parcial   del   incremento   en   la   potencia   y   proporción   de   la   actividad   δ,   ambos   inducidos  por  el  Aβ.  Por  otro   lado,  el  análisis  de  correlación  y   la  regresión   lineal  entre   los   valores  de  la  potencia  integrada  y  los  valores  de  la  latencia  de  retención  obtenidos  de  cada  sujeto  de   los  grupos  Control,  Aβ  y  Aβ+Dzx,  no  mostraron  una  correlación  signieicativa  (p  =  0.2894,  datos  no   mostrados).  De  igual  manera,  el  análisis  de  la  potencia  absoluta  y  la  potencia  relativa  de  la  banda  de   frecuencia   δ   y   los   valores   de   la   latencia   de   retención   no  mostraron   una   correlación   signieicativa   (ambos  valores  de  p  =  0.4915,  datos  no  mostrados).  Estos  resultados  indican  que  el  efecto  protector   de  la  Dzx  sobre  la  memoria  no  está  asociado  con  la  alteración  de  la  actividad  de  frecuencias  lentas   inducidas  por  el  Aβ.  En  conjunto,  estos  resultados  sugieren  que,  parcialmente,  los  canales  KATP  están   involucrados   en   el   deterioro   de   la   memoria   de   contexto   inducido   por   el   Aβ   a   través   de   la   modulación  de  la  actividad  hipocampal  en  la  banda  de  frecuencia  delta.   Con   el   objetivo   de   evaluar   los   efectos   del   Aβ   y   el   co-­‐tratamiento   con   la   Tol   y   la   Dzx   sobre   la   transmisión   sináptica,   se   realizaron   curvas   entrada-­‐salida   y   se   analizó   la   proporción   de   pulsos   pareados  en  la  sinápsis  entre  las  colaterales  de  Schaffer  y  las  neuronas  piramidales  de  CA1.  Como   era   de   esperarse,   los   resultados   de   las   curvas   entrada-­‐salida   del   grupo   Control   muestran   un   incremento  en  la  amplitud  de  las  PS  conforme  aumenta  la  intensidad  del  estímulo  (Figura  27A).  Del   mismo  modo,  la  curva  del  grupo  tratado  con  el  Aβ  muestra  un  incremento  en  la  amplitud  de  las  PS  y   presenta  valores  de  amplitud  similares  a  los  obtenidos  en  el  grupo  control  (F(1,80)=  0.25,  p  =  0.6133;   Figura   27A).   Además   de   la   amplitud,   los   valores   de   los   PPRs   tampoco   fueron   diferentes   entre   grupos   (p   =   0.1702;   Figura   27B).   Estos   resultados   indican   que   las   alteraciones   observadas   en   la   77 conducta   de   burrowing   y   en   la   memoria   de   contexto   no   están   asociados   a   la   alteración   de   la   transmisión   sináptica   basal   en   la   sinápsis   entre   las   colaterales   de   Schaffer   y   las   neuronas   piramidales  de  CA1.     Fig.  26.  Las  alteraciones  en   la  conducta  y   la  memoria   inducidas  por  el  Aβ  no  están  asociadas   con   los  cambios  en   la  actividad  espontánea  hipocampal.  A,   espectro  de  potencia  promedio  de   los   grupos   Ctrl,   Aβ   (400   pmoles),   Aβ   +   Tol   (3mg/kg)   y   Aβ   +   Dzx   (10mg/kg).   Anexo:   cuantieicación  de   la   potencia   integrada   (nV2).  B,   cuantieicación  de   la   potencia   absoluta   de   las   bandas   de   frecuencia   delta   (δ),   theta   (θ),   beta   (β)   y   gamma   (γ).  C,   se   graeica   el   espectro   de   potencia   correspondiente   a   la   actividad   en   la   banda   de   frecuencia   δ.  D,   cuantieicación   de   la   potencia  relativa  de  la  actividad  en  la  banda  de  frecuencia  δ.  Nótese  que  el  tratamiento  con  Tol  y   Dzx   evitan   parcialmente   el   incremento   en   la   potencia   de   la   actividad   δ   inducido   por   el   Aβ.   Análisis  de  correlación  de   los  valores  de   la  potencia   integrada  (E)  y   los  valores  de   la  potencia   absoluta  (F)  con  respecto  a  los  valores  de  la  latencia  de  retención  obtenidos  de  cada  sujeto  de   los   cuatro   grupos   experimentales   (n   =   9-­‐10   ratas/grupo).   Los   datos   se   muestran   como   promedio  ±  SEM.  *,  p  <  0.05  vs.  el  grupo  Ctrl.  #,  p  <  0.05  vs.  grupo  Aβ.   78 La   modulación   de   los   canales   KATP   previene   las   alteraciones   en   la   plasticidad   sináptica   inducidas  por  el  Aβ   Un  mecanismo  celular  cuya  alteración  ha  sido  asociada  con  deeiciencias  en   la  memoria  es   la   plasticidad  sináptica  (Tsien  et  al.,  1996;  Pastalkova  et  al.,  2006).  Por  ello,  se  evaluaron  los  procesos   de   la   LTP   y   la   LTD   en   rebanadas   de   hipocampo   de   los   mismos   sujetos   en   los   que   se   evaluó   la   conducta  típica  de  burrowing  y  la  memoria  de  contexto.  La  estimulación  de  alta  frecuencia  (1  Tren   100  Hz  por  1  s)  produjo  una  potenciación  signieicativa  de  la  amplitud  promedio  de  las  PS  (a  157.7  ±   13.8%  de  la  amplitud  basal,  p  =  0.0008)  y  la  pendiente  promedio  de  los  fEPSP  (a  158.5  ±  27.6%  de   la  pendiente  basal,  p  =  0.0255),  la  cual  se  mantuvo  por  60  min  (Figuras  28A-­‐C).  Los  grupos  tratados   únicamente  con  la  Tol  (3mg/kg)  o  la  Dzx  (10  mg/kg)  mostraron  una  potenciación  similar  tanto  de   las  PS  como  de  la  pendiente  de  los  fEPSP  (todos  los  valores  de  p  <  0.05,  Figuras  28A-­‐C).     Fig.  27.  La  inyección  i.h.  del  Aβ  no  modieica  la  transmisión  sináptica  basal  entre  las  colaterales   de  Schaffer  y   las  neuronas  piramidales  de  CA1.  A,   curvas  entrada-­‐salida  de   la  amplitud  de   las   espigas   poblacionales   (promedio   ±   SEM)   producidas   por   el   incremento   en   la   intensidad   del   estímulo   dado   (la   intensidad   del   estímulo   está   dada   como   múltiplos   del   umbral   de   estimulación).   B,   en   la   parte   superior   se   muestran   trazos   representativos   de   las   espigas   poblaciones   (PS)   obtenidas   con   el   protocolo   de   pulsos   pareados.   La   respuesta   al   pulso   1   se   muestra   en   negro   y,   sobrepuesta,   la   respuesta   al   pulso   2   se   muestra   en   azul.   Dividiendo   la   amplitud  de  la  segunda  respuesta  entre  la  primera  (P2/P1)  se  obtuvo  la  proporción  de  pulsos   pareados   (PPR,   por   sus   siglas   en   inglés)   durante   la   actividad   basal   con   un   intervalo   inter-­‐ estímulo   de   70   ms   (los   puntos   representan   los   datos   obtenidos   para   cada   sujeto   y   la   línea   horizontal  representa  el  promedio).   79 Los  efectos  de  la  inyección  i.h.  del  Aβ  sobre  la  plasticidad  sináptica  de  largo  plazo,  principalmente  la   inhibición   de   la   LTP,   están   ampliamente   descritos   (para   una   revisión   ver   Salgado-­‐Puga   &   Peña-­‐ Ortega,  2015).  De  acuerdo  con  lo  reportado  en  la  literatura,  nuestros  resultados  mostraron  que  la   administración  del  Aβ  i.h.  inhibe  la  LTP  (Figura  29A).  A  pesar  de  que  la  que  la  amplitud  promedio  de   las  PS  en  los  primeros  20  min  del  registro  presentan  una  potenciación  de  corto  plazo  signieicativa  (a   137.3  ±  18.6%  de  la  amplitud  basal,  p  =  0.0495),  esta  potenciación  va  decayendo  con  el  tiempo.  De   hecho,   en   los   últimos   10   min   del   registro   (50-­‐60   min   post-­‐estimulación)   la   amplitud   de   las   PS   alcanza  valores  de  la  amplitud  basal  (93.5  ±  9.6%  de  la  amplitud  basal,  p  =  0.6199;  Figuras  29A  y  C).   Esta  inhibición  en  la  inducción  de  la  potenciación  de  largo  plazo  en  las  PS  también  se  ve  reelejado  en   la  pendiente  promedio  de  los  fEPSP  (98.9  ±  10.2%  de  la  pendiente  basal,  p  =  0.8972;  Figura  29D).   La   amplitud   promedio   de   las   PS   y   la   pendiente   promedio   de   los   fEPSP   son   signieicativamente   menores   que   los   obtenidos   en   el   grupo   control   (ambos   valores   de   p   =   0.0120   y   0.0354,   respectivamente;  Figuras  29C  y  D).  De  manera  interesante,  el  co-­‐tratamiento  con  la  Tol  previno  los   efectos   inducidos   por   el   Aβ   en   la   LTP.   Las   rebanadas   obtenidas   de   los   sujetos   que   recibieron   el   tratamiento  con  el  Aβ+Tol  presentaron  una  potenciación  de  la  PS  de  203.7  ±  16.4%  de  la  amplitud   basal  (p  <  0.0001;  Figuras  29B  y  C)  y  un  cambio  en  la  pendiente  de  los  fEPSP  de  181.0  ±  28.1%  de  la   pendiente   basal   (p   =   0.0369;   Figuras   29B   y   D).   La   potenciación   de   la   amplitud   de   las   PS   y   la   pendiente   de   los   fEPSP   del   grupo   tratado   con   el   Aβ+Tol   es   signieicativamente   mayor   que   la   potenciación   exhibida   por   el   grupo   tratado   con   el   Aβ   (p   =   0.0001   y   0.0288,   respectivamente;   Figuras  29B-­‐D).  En  contraste,  el  co-­‐tratamiento  con  la  Dzx  no  evitó  los  efectos  del  Aβ  sobre  la  LTP.   La  HFS  en  el  grupo  tratado  con  el  Aβ+Dzx  indujo  un  incremento  en  la  amplitud  de  las  PS  de  123.4  ±   15.6%   de   la   amplitud   basal,   el   cual   no   es   diferente   estadísticamente   de   la   amplitud   basal   (p   =   0.3661;   Figuras   29B   y   C).   De  manera   similar,   la   pendiente   promedio   de   los   fEPSP   no  mostró   un   cambio  signieicativo  con  respecto  a  la  pendiente  basal  (105.3  ±  8.4%,  p  =  0.6907;  Figuras  29B  y  D).   80   Fig.  28.  Efecto  de  la  modulación  de  la  actividad  de  los  canales  KATP  sobre  la  plasticidad  sináptica   de   largo  plazo.  A,  se  graeica  el  curso  temporal  de   la  transmisión  sináptica  antes  y  después  del   protocolo  de  estimulación  para  la  inducción  de  la  LTP  (1  Tren  100  pulsos  a  100  Hz;  dado  en  el   tiempo  0)  en  rebanadas  obtenidas  de  los  grupos  Control,  tratados  con  la  Tol  (3  mg/kg),  y  con  la   Dzx  (10  mg/kg;  n  =  9-­‐10  ratas/grupo).  En  la  parte  superior  se  muestran  trazos  representativos   de   las   espigas  poblaciones   (PS)  y  de   los  potenciales  postsinápticos  excitatorios   (fEPSP)  antes   (trazos  obtenidos  al  tiempo  1)  y  60  min  después  de  la  estimulación  de  alta  frecuencia  (trazos   obtenidos  al  tiempo  2).  B  y  C,  cuantieicación  de  la  amplitud  promedio  de  las  PS  y  la  pendiente   promedio  de  los  fEPSP  (expresados  como  %  de  la  línea  base  [línea  punteada]  promedio  ±  SEM)   60  min   después   de   la   HFS   en   cada   grupo.  D,   se   graeica   el   curso   temporal   de   la   transmisión   sináptica  antes  y  después  del  protocolo  de  estimulación  débil  para  la  inducción  de  la  LTD  (300   pulsos  a  1  Hz;  dado  en  el  tiempo  0)  en  rebanadas  obtenidas  de  los  grupos  Control,  tratados  con   la   Tol   (3   mg/kg),   y   con   la   Dzx   (10   mg/kg;   n   =   9-­‐10   ratas/grupo).   En   la   parte   superior   se   muestran  trazos  representativos  de  las  PS  y  de  los  fEPSP  antes  (trazos  obtenidos  al  tiempo  1)  y   60  min  después  de   la  LFS  (trazos  obtenidos  al   tiempo  2).  E  y  F,   cuantieicación  de   la  amplitud   promedio  de  las  PS  y  la  pendiente  promedio  de  los  fEPSP  (expresados  como  %  de  la  línea  base   [línea   punteada]   promedio   ±   SEM)   60  min   después   de   la   estimulación   de   baja   frecuencia   en   cada  grupo.  Nótese  que  ninguno  de  los  tratamientos  (con  la  Tol  o  la  Dzx)  modieicó  la  inducción   de  la  LTP  de  las  PS  y  de  los  fEPSP.  En  contraste,  el  tratamiento  con  la  Dzx  si  facilitó  la  inducción   de  la  LTD  de  las  PS.  *,  p  <  0.05  vs.  línea  base.     81 Para  evaluar  los  efectos  de  los  diferentes  tratamientos  sobre  la  inducción  de  la  LTD,  utilizamos  un   protocolo  de  LFS   (300  pulsos  a  1  Hz)  el   cual,  por   sí   solo,  no   induce  una  LTD  en  el  grupo  Control   (Figuras  28  y  29)  pero  sí  se  induce  un  LTD  en  presencia  del  Aβ  (Figura  29;  Shankar  et  al.,  2008).  En   las   rebanadas   obtenidas   de   sujetos   control,   la   amplitud   promedio   de   las   PS   (95.9   ±   3.4%   de   la   amplitud  basal)   y   la  pendiente  promedio  de   los   fEPSP   (97.6  ±  6.7%  de   la  pendiente  basal)  no   se   modieicaron  después  del  protocolo  de  LFS  (p  =  0.4109  y  0.3686,  respectivamente;  Figuras  28D-­‐F).   El  tratamiento  con  la  Tol,  por  sí  solo,  no  modieicó  la  amplitud  promedio  de  las  PS  (147.7  ±  6.6%  de   la   amplitud   basal)   y   la   pendiente   promedio   de   los   fEPSP   (134.7   ±   19.4%   de   la   pendiente   basal)   después  del  protocolo  de  LFS  (p  =  0.6005  y  0.1407,  respectivamente;  Figuras  28D-­‐F).  En  contraste,   el   tratamiento  con   la  Dzx  si  redujo   la  amplitud  promedio  de   las  PS  (a  82.1  ±  6.6%  de   la  amplitud   basal,  p  =  0.0003)  pero  no  la  pendiente  promedio  de  los  fEPSP  (88.3  ±  6.4%  de  la  pendiente  basal,  p   =   0.2311;   Figura   28E   y   F).   De   igual   manera,   la   estimulación   LFS   indujo   un   LTD   de   la   amplitud   promedio  de  las  PS  (60.5  ±  9.6%  de  la  amplitud  basal,  p  =  0.0020)  y  de  la  pendiente  promedio  de  los   fEPSP  (60.6  ±  10.9%  de  la  pendiente  basal,  p  =  0.0041)  en  las  rebanadas  del  grupo  tratado  con  el  Aβ   (Figuras   29E-­‐H).   La   amplitud   de   las   PS   y   la   pendiente   de   los   fEPSP   del   grupo   Aβ   son   signieicativamente   menores   que   las   observadas   en   el   grupo   control   (p   =   0.0052   y   0.0152,   respectivamente;  Figuras  29G  y  H).  Una  vez  más,  el  co-­‐tratamiento  con  la  Tol  previno  la  inducción   de   la   LTD   producida   por   el   Aβ   (Figuras   29F-­‐H).   De   hecho,   en   este   grupo   la   LFS   no   indujo   una   reducción  de  la  amplitud  promedio  de  las  PS  (105.4  ±  9.8%  de  la  amplitud  basal,  p  =  0.8178)  o  de  la   pendiente  promedio  de   los   fEPSP  (105.6  ±  18.8%  de   la  pendiente  basal,  p  =  0.9267).  La  amplitud   promedio  de  las  PS  y  en  la  pendiente  promedio  de  los  fEPSP  son  estadísticamente  diferentes  de  los   obtenidos  en  el  grupo  tratado  con  el  Aβ  (p  =  0.0052  y  0.0379,  respectivamente;  Figuras  29G-­‐H).  En   contraste,  el  co-­‐tratamiento  con  la  Dzx  no  bloqueó  la  inducción  de  la  LTD  inducida  por  el  Aβ  (Figura   29F).   82   Fig.  29.  La  modulación  de  los  canales  KATP  previene  las  alteraciones  de  la  plasticidad  sináptica   inducidas  por  el  Aβ.  A,  se  graeica  el  curso  temporal  de  la  transmisión  sináptica  antes  y  después   del  protocolo  de  estimulación  para  la  inducción  de  la  LTP  (1  Tren  100  pulsos  a  100  Hz;  dado  en   el   tiempo  0)   en   rebanadas   obtenidas   de   los   grupos  Control   y  Aβ   (400  pmoles;   n   =   10   ratas/ grupo).  En  la  parte  superior  se  muestran  trazos  representativos  de  las  espigas  poblaciones  (PS)   y  de  los  potenciales  postsinápticos  excitatorios  (fEPSP)  antes  (trazos  obtenidos  al  tiempo  1)  y   60  min  después  de  la  estimulación  de  alta  frecuencia  (trazos  obtenidos  al  tiempo  2).  B,  misma   representación  que  en  (A)  para  los  registros  obtenidos  de  los  grupos  tratados  con  el  Aβ+Tol  (3   mg/kg)   y   el   Aβ+Dzx   (10  mg/kg;   n   =   9-­‐10   ratas/grupo).  C   y  D,   cuantieicación   de   la   amplitud   promedio  de  las  PS  y  la  pendiente  promedio  de  los  fEPSP  (expresados  como  %  de  la  línea  base   [línea   punteada]   promedio   ±   SEM)   60  min   después   de   la   HFS   en   cada   grupo.   Nótese   que   el   tratamiento  con  Tol  previene  la  inhibición  inducida  por  el  Aβ  de  la  LTP  tanto  en  la  amplitud  de   las  PS  como  en  la  pendiente  de  los  fEPSP.  Este  efecto  protector  no  es  producido  por  la  Dzx.  E,  se   graeica   el   curso   temporal   de   la   transmisión   sináptica   antes   y   después   del   protocolo   de   estimulación   débil   para   la   inducción   de   la   LTD   (300   pulsos   a   1  Hz;   dado   en   el   tiempo   0)   en   rebanadas  obtenidas  de   los  grupos  control  y  Aβ  (n  =  10  ratas/grupo).  En   la  parte  superior  se   muestran  trazos  representativos  de  las  PS  y  de  los  fEPSP  antes  (trazos  obtenidos  al  tiempo  1)  y   60  min  después  de  la  LFS  (trazos  obtenidos  al  tiempo  2).  F,  misma  representación  que  en  (E)   para   los  registros  obtenidos  de   los  grupos   tratados  con  el  Aβ+Tol   (3  mg/kg)  y  el  Aβ+Dzx  (10   mg/kg;   n   =   9-­‐10   ratas/grupo).  G   y  H,   cuantieicación   de   la   amplitud   promedio   de   las   PS   y   la   pendiente   promedio   de   los   fEPSP   (expresados   como   %   de   la   línea   base   [línea   punteada]   promedio  ±  SEM)  60  min  después  de  la  LFS  en  cada  grupo.  Nótese  que  en  ambos  casos   la  Tol   previene  la  inducción  de  la  LTD  inducida  por  el  Aβ.  *,  p  <  0.05  vs.  línea  base.  •,  p  <  0.05  vs.  grupo   Aβ.     83 La  amplitud  de  las  PS  (a  75.6  ±  5.2%  de  la  amplitud  basal,  p  =  0.0005)  y  la  pendiente  de  los  fEPSP  (a   83.8  ±  10.4%  de  la  pendiente  basal,  p  =  0.0195)  se  redujeron  signieicativamente  comparado  con  la   amplitud  y  pendiente  basal,  respectivamente.  A  pesar  de  que  la  depresión  de  la  amplitud  promedio   y  la  pendiente  promedio  es  menor  que  la  observada  en  el  grupo  tratado  con  el  Aβ,  los  efectos  del  co-­‐ tratamiento   con   la   Dzx   no   son   estadísticamente   diferentes   a   los   observados   con   el   Aβ   solo   (p   =   0.2404  y  0.1600,  respectivamente;  Figuras  29G  y  H).  En  conjunto,  estos  resultados  sugieren  que  las   alteraciones  inducidas  por  el  Aβ  sobre  la  plasticidad  sináptica  pueden  ser  prevenidos,  parcial  (Dzx)   o  totalmente  (Tol),  por  la  modulación  de  la  actividad  de  los  canales  KATP.       Fig.  30.  La  aplicación  aguda  de  la  Tolbutamida  no  evita  la  inhibición  de  la  LTP  inducida  por  el   Aβ.  A,  se  graeica  el  curso  temporal  de  la  transmisión  sináptica  antes  y  después  del  protocolo  de   estimulación  para  la  inducción  de  la  LTP  (1  Tren  100  pulsos  a  100  Hz;  dado  en  el  tiempo  0)  en   rebanadas  Control  o  tratadas  con  el  Aβ  (10  nM,  15  min  antes  de  la  aplicación  de  la  HFS).  B,  se   graeica  el  curso  temporal  de  la  transmisión  sináptica  antes  y  después  del  protocolo  de  HFS  en   rebanadas  tratadas  con  la  Tol  (10  μM,  15  min  antes  de  la  aplicación  de  la  HFS)  y  Tol+Aβ  (n  =  6-­‐8   rebanadas/grupo).   La   elecha   punteada   y   la   elecha   continua   indican   la   aplicación   de   Tol   y   Aβ,   respectivamente.  C,  cuantieicación  de  la  amplitud  promedio  de  las  PS  y  la  pendiente  promedio   de  los  fEPSP  (expresados  como  %  de  la  línea  base  [línea  punteada]  promedio  ±  SEM)  de  los  60   min  después  de  la  estimulación  en  cada  grupo.  *,  p  <  0.05  vs.  línea  base.   Dado  que  el  tratamiento  crónico  con  la  Tol  previno  de  manera  eeiciente  las  alteraciones  inducidas   por  el  Aβ  sobre  la  plasticidad  sináptica,  también  se  evaluó  la  posibilidad  que  la  aplicación  in  vitro  de   la   Tol   pudiera   evitar   la   inhibición   de   la   LTP   producida   por   la   aplicación   aguda   del   Aβ.   Para   este   objetivo,  se  utilizaron  rebanadas  sagitales  de  hipocampo  de  animales  näive  en  las  que  se  utilizó  el   mismo  protocolo  de   la  HFS   (1  Tren  100  Hz  por  1   s)  para   inducir   la  LTP.  En   rebanadas  del   grupo   84 Control,  el  protocolo  de  HFS  indujo  una  potenciación  signieicativa  de  la  amplitud  de  las  PS  (a  159.4   ±  29.9%  de  la  amplitud  basal,  p  =  0.0032).  En  contraste,  y  acorde  a  reportes  previos  (Wang  et  al.,   2010;  Klyubin  et  al.,  2011),  la  aplicación  de  10  nM  del  Aβ  antes  de  la  aplicación  de  la  HFS  (15  min)   inhibió   la   LTP   e   incluso   generó   una   depresión   de   la   transmisión   sináptica   (a   63.4   ±   5.4%   de   la   amplitud  basal,  p  =  0.0252;  Figura  30A  y  C).  Para  determinar  los  efectos  agudos  de  la  Tol  sobre  la   LTP,  se  aplicaron  50  µM  de  la  Tol  antes  de  la  aplicación  del  protocolo  de  HFS  (15  min).  En  contraste   a  lo  observado  in  vivo,  esta  concentración  de  la  Tol  inhibió  la  inducción  de  la  LTP  por  sí  misma  (85.9   ±  10.5%  de  la  amplitud  basal,  p  =  0.9).  Además  de  ser  incapaz  de  contrarrestar  los  efectos  inducidos   por  el  Aβ  (72.0  ±  29.9%  de  la  amplitud  basal,  p  =  0.9265).  Debido  a  lo  anterior,  se  decidió  utilizar   una  concentración  más  baja  de  la  Tol  (10  µM).  En  este  caso,  la  aplicación  de  10  µM  de  Tol  permitió   la  inducción  de  la  LTP  (a  155.9  ±  17.7%  de  la  amplitud  basal,  p  =  0.0217;  Figura  30B).  No  obstante,   la  Tol  a  esta  concentración,  no  fue  capaz  de  evitar  la  inhibición  de  la  LTP  inducida  por  el  Aβ  (78.4  ±   8.8%  de   la   amplitud  basal,   p   =  0.6298;   Figura  30B  y  C).   Estos   resultados   indican  que   los   efectos   protectores   de   la   Tol   sobre   la   plasticidad   sináptica,   anteriormente   mostrados,   requieren   de   un   tratamiento  crónico.   El  deterioro  de  la  memoria  de  contexto  inducido  por  el  Aβ  correlaciona  con  las  alteraciones  en   la  plasticidad  sináptica:  Prevención  a  través  del  antagonismo  de  los  canales  KATP   Para  evaluar  la  posible  correlación  entre  los  efectos  del  Aβ  sobre  la  memoria  contexto  (Figura   24)   y   las   alteraciones   en   la   plasticidad   sináptica   (Figura   29)   se   realizó   un   análisis   de   regresión   múltiple.  Los  valores  de  la  retención  de  memoria  (latencia  de  retención  expresados  en  segundos),  y   la  potenciación  y  depresión  de   la  amplitud  de   la  PS  (expresados  como  %  de   la  amplitud  basal  60   min   después   de   la   aplicación   del   protocolo   de   la   HFS   y   la   LFS,   respectivamente)   de   los   grupos   Control  y  Aβ  (400  pmoles)  mostraron  una  correlación  positiva  (F(2)  =  13.2,  p  =  0.0003;  Figura  31A).   Este   resultado   sugiere   que   el   deterioro   en   la   memoria   de   contexto   inducido   por   el   Aβ   está   85 relacionado  con  la  inhibición  de  la  LTP  y  la  inducción  de  la  LTD.  De  manera  interesante,  el  análisis   de   regresión   múltiple   también   mostró   una   correlación   positiva   y   signieicativa   con   el   grupo   co-­‐ tratado  con  la  Tol  (F(2)  =  10.3,  p  =  0.001;  Figura  31B),  lo  que  sugiere  que  los  efectos  protectores  de  la   Tol  sobre  la  memoria  están  relacionados  con  la  inducción  de  la  LTP  y  el  bloqueo  de  la  inducción  de   la  LTD.  A  pesar  de  que  el  co-­‐tratamiento  con  la  Dzx  bloqueó  el  deterioro  de  la  memoria  de  contexto,   el  hecho  de  que  no  evitara  las  alteraciones  en  la  plasticidad  sináptica  inducidas  por  el  Aβ  justieica  la   ausencia   de   una   correlación   signieicativa   entre   estas   variables,   como   lo   muestra   el   análisis   de   regresión  múltiple  (F(2)  =  0.52,  p  =  0.6015;  Figura  31C).  Esto  indica  que  el  efecto  protector  de  la  Dzx   sobre  la  memoria  del  contexto  no  está  asociado  a  cambios  en  la  plasticidad  sináptica.  En  conjunto,   estos  resultados  sugieren  que  los  canales  KATP  están  involucrados  en  el  deterioro  de  la  memoria  de   contexto  inducido  por  el  Aβ  a  través  de   la  modulación  de  los  procesos  de  plasticidad  sináptica  de   largo  plazo.       86   Fig.  31.  El  efecto  protector  de  la  tolbutamida  sobre  el  deterioro  de  la  memoria  inducido  por  el   Aβ ︎   correlaciona   con   la   restauración   del   balance   de   la   plasticidad   sináptica.   El   análisis   de   regresión  múltiple  de   los  cambios  en   la  amplitud  promedio  de   las  PS  (representados  como  %   con  respecto  a   la  amplitud  basal)  de  las  fases  tardías  de  la  LTP  y   la  LTD  y  el  desempeño  en  la   prueba  de  memoria  (valores  de   la   latencia  de  retención)  se  graeicó  de   la  siguiente  manera:  A,   datos  de  los  grupos  Aβ ︎  (círculos  negros)  y  Control  (círculos  grises);  B,  datos  de  los  grupos  Aβ ︎   (círculos  negros)  y  Aβ+Tol   (círculos  grises);  C,   datos  de   los  grupos  Aβ ︎   (círculos  negros)  y  Aβ +Dzx   (círculos  grises).   Los  valores  de   la   intersección   zy,   zx,   y   xy   (mostrados   como  cuadrados   grises)  están  proyectados  en  el  plano  correspondiente  para  cada  círculo  graeicado.  La  eigura  gris   es  la  representación  gráeica  del  análisis  de  regresión  múltiple.  En  la  columna  de  la  derecha,  se   puede  observar   la  misma  relación  entre   los  grupos  y   los  valores  de  memoria  y  de  plasticidad   representados   con   gráeicas   ternarias.   Nótese   que   el   deterioro   de   la   memoria   de   contexto   inducido   por   el   Aβ   correlaciona   con   la   inhibición   de   la   LTP   y   la   inducción   de   la   LTD.   Dichas   alteraciones  son  evitadas  con  el   tratamiento  con  Tol  (correlación  signieicativa),  pero  no  con  el   tratamiento  con  Dzx  (correlación  no  signieicativa).   87 DISCUSIÓN   En  el  presente  estudio,  demostramos  por  primera  vez  que  la  modulación  de  los  canales  KATP,   con   dosis   subclínicas   de   Tol   y   Dzx,   previenen   los   efectos   del   Aβ   sobre   la   conducta   típica   de   burrowing,  la  memoria  de  contexto,  la  actividad  oscilatoria  espontánea  hipocampal  y  la  plasticidad   sináptica  de  largo  plazo.  Además,  encontramos  que  los  efectos  protectores  de  la  Tol,  antagonista  de   los  canales  KATP,  sobre  el  deterioro  de  la  memoria  de  contexto  inducida  por  el  Aβ  están  asociados  a   la  restauración  del  balance  en  los  procesos  de  la  plasticidad  sináptica  de  largo  plazo.  Por  otro  lado,   los   efectos   protectores   de   la   Dzx,   activador   de   los   canales   KATP,   sobre   la   memoria   no   están   relacionados  con  cambios  en  la  plasticidad  sináptica  de  largo  plazo.   Efecto   de   la  modulación  de   los   canales  KATP   sobre   las   alteraciones   inducidas  por   el   Aβ   en   la   actividad  espontánea  hipocampal   Nuestros   resultados  muestran  que   la  modulación  de   los   canales  KATP   dado  por   la  aplicación   aguda  y  crónica  de  la  Tol  y  la  Dzx,  previenen  los  efectos  agudos  del  Aβ  sobre  la  actividad  espontánea   hipocampal.   Estos   resultados   indican   que   estos   canales   están   involucrados   en   los   efectos   patológicos  agudos  inducidos  por  el  Aβ.  Resultados  previos  del  laboratorio  han  demostrado  que  la   reducción  de   la  actividad  espontánea  hipocampal   inducida  por  el  Aβ   involucra   la  activación  de   la   GSK-­‐3︎β  (Balleza-­‐Tapia  &  Peña,  2009;  Peña-­‐Ortega  et  al.,  2012;  Isla  et  al.,  2016).  Considerando  que   un  blanco  molecular  de  la  GSK-­‐3︎β  ampliamente  conocido  es  el  canal  KATP  (Kamada  et  al.,  2008;  Ning   et  al.,  2009;  Park  et  al.,  2013),  una  posible  explicación  es  que  los  canales  KATP  sean  reclutados  por  el   Aβ  mediante   la  vía   transduccional  de   la  GSK-­‐3︎β   (Balleza-­‐Tapia  &  Peña,  2009).  Otra  posibilidad  es   que  el  Aβ  directamente  module  los  canales  KATP,  como  ha  sido  demostrado  en  neuronas  corticales  e   hipocampales   (Tan   et   al.,   2012).  Más   aún,   se   ha   demostrado  que   la   aplicación  del  Aβ   en   cultivos   neuronales  incrementa  la  expresión  de  las  subunidades  que  componen  a  los  canales  KATP  (Ma  et  al.,   88 2008;   2009).   En   este   sentido,   considerando   que   la   activación   de   los   canales   KATP   reduce   la   excitabilidad  celular  (Fujimura  et  al.,  1997;  Yamada  et  al.,  2001;  Wu  et  al.,  2006)  y  la  liberación  de   neurotransmisores  (Amoroso  et  al.,  1990;  Lee  et  al.,  1997;  Kilbinger  et  al.,  2002;  Bancila  et  al.,  2004;   Matias  et  al.,  2010),  es  probable  que  la  apertura  de  estos  canales  inducida  por  el  Aβ  contribuya  a  la   reducción  de  la  actividad  espontánea  hipocampal.     Diversos  estudios  muestran  que  la  Tol  incrementa  la  excitabilidad  celular  (Williams  &  Smith,  2006)   y   la   liberación   de   neurotransmisores   (Margaill   et   al.,   1992;   Ohno-­‐Shosaku   et   al.,   1993;   Stefani   &   Gold,  2001;  Matias  et  al.,  2010;  Zhao  et  al.,  2013).  Sin  embargo,  nuestros  resultados  muestran  que  la   inhibición  aguda  de   los  canales  KATP  con   la  Tol  no   incrementa  de  manera  signieicativa   la  actividad   hipocampal  (Figura  16).  Sin  embargo,  se  ha  demostrado  que  en  condiciones  basales  los  canales  KATP   contribuyen   muy   poco   al   mantenimiento   del   potencial   de   membrana   en   reposo   de   las   células   hipocampales  (Erdemli  &  Krnjevic,  1996;  Griesemer  et  al.,  2002;  Shanley  et  al.,  2002a  y  b;  Lemak  et   al.,  2014).  De  hecho,  en  presencia  de  la  Tol,  tanto  el  potencial  de  membrana  como  la  excitabilidad  de   las  células  hipocampales  cambia  muy  poco  (Yamada  et  al.,  2001;  Griesemer  et  al.,  2002;  Shanley  et   al.,  2002a  y  b;  Lemak  et  al.,  2014).  En  este  sentido,  el  cierre  de  los  canales  KATP  podría  afectar  muy   poco   la   potencia   de   la   actividad   espontánea   poblacional   del   hipocampo.   En   concordancia,   se   ha   reportado  que  el  cierre  de  los  canales  KATP  en  la  corteza  entorrinal  produce  un  ligero  incremento  en   la  actividad  neuronal  poblacional  (Lemak  et  al.,  2014).  Otra  posible  explicación,  es  que  debido  a  que   la   Tol   induce   la   liberación   tanto   de   neurotransmisores   inhibidores   (Margaill   et   al.,   1992;   Ohno-­‐ Shosaku  et  al.,  1993)  como  excitadores  (Stefani  &  Gold,  2001;  Matias  et  al.,  2010;  Zhao  et  al.,  2013),   los  efectos  de  ambos  transmisores  se  neutralicen  de  tal  manera  que  no  haya  un  cambio  signieicativo   en  la  actividad  poblacional  del  hipocampo.   En  contraste  con  los  efectos  de  la  Tol  in  vitro,  el  tratamiento  crónico  con  este  fármaco,  si  induce  un   incremento  signieicativo  de  la  actividad  hipocampal,  además  de  que  evita  el  efecto  inhibidor  del  Aβ   sobre  la  actividad  hipocampal  (Figura  18).  Como  se  mencionó  anteriormente,  los  efectos  agudos  de   89 la  Tol  sobre  la  actividad  hipocampal  pueden  ser  moderados  (Yamada  et  al.,  2001;  Griesemer  et  al.,   2002;  Shanley  et  al.,  2002a  y  b;  Lemak  et  al.,  2014),  pero  los  cambios  persistentes  en  la  excitabilidad   celular   y   la   transmisión   sináptica   pueden   inducir   un   cambio   signieicativo   en   la   actividad   de   un   circuito   neuronal,   como   ha   sido   observado   tanto   en   humanos   como   en   modelos   animales   transgénicos   en   los  que   la   función  de   los  KATP   esta  permanente  disminuida   (Karshin   et   al.,   1997;   Yamada  et  al.,  2001;  Hattersley  &  Ashcroft,  2005).  Por  ejemplo,  mutaciones  en  las  subunidades  KIR   6.2  o  SUR1,  que  conllevan  a  la  pérdida  de  conducción  de  los  canales  KATP,  resulta  en  un  incremento   constante   en   la   excitabilidad   celular   (Quan   et   al.,   2011).  De  manera   similar,   un   incremento   en   la   excitabilidad  neuronal  es  observado  en  ratones  que  carecen  de  la  subunidad  KIR  6.2  (Yamada  et  al.,   2001).   Interesantemente,   el   tratamiento   crónico   con   la  Tol  hace   resistente   al   hipocampo  ante   los   efectos  inhibidores  inducidos  por  la  aplicación  in  vitro  del  Aβ.  Entre  los  mecanismos  que  pudieran   explicar   este   efecto  protector,   se  ha  demostrado  que   la   inhibición  de   los   canales  KATP   estimula   la   liberación  de  insulina  (Gerozissis  &  Kyriaki,  2003;  Molnár  et  al.,  2014)  y  promueve  la  activación  de   la   vía   PI3K/Akt   (Vadas   et   al.,   2011;   Blázquez   et   al.,   2014;  Molnár   et   al.,   2014),   lo   que   induce   la   inhibición  de   la  GSK-­‐3β   (Salcedo-­‐Tello   et   al.,   2011).   En   concordancia,   recientemente   se   demostró   que  el   ejercicio   crónico   evita   la   reducción  de   la   actividad  hipocampal   inhibiendo   la   activación  de   GSK-­‐3β  inducida  por  el  Aβ  (Isla  et  al.,  2016).  De  esta  manera,  es  posible  que  el  tratamiento  crónico   con  la  Tol  podría  prevenir  la  modulación  de  los  canales  KATP  por  parte  del  Aβ  mediante  la  inhibición   de  la  actividad  de  la  GSK-­‐3β.   Como  se  mencionó  anteriormente,   la  activación  de   los  canales  KATP  y  por  ende   la  aplicación  de   la   Dzx,  producen  una  hiperpolarización  celular  (Fujimura  et  al.,  1997;  Yamada  et  al.,  2001;  Wu  et  al.,   2006),   inhiben   el   disparo   celular   (Fujimura   et   al.,   1997;   Yamada   et   al.,   2001;  Wu   et   al.,   2006)   y   reducen  la  liberación  de  neurotransmisores  (Amoroso  et  al.,  1990;  Lee  et  al.,  1997;  Kilbinger  et  al.,   2002;  Bancila  et  al.,  2004;  Matias  et  al.,  2010).  En  este  sentido,  no  fue  sorpresa  que  la  aplicación  in   vitro   de   la   Dzx   disminuyera   signieicativamente   la   actividad   hipocampal   e   incluso   ocluyera   90 parcialmente  la  inhibición  de  la  actividad  hipocampal  inducida  por  el  Aβ  (Figura  16).  De  hecho,  este   hallazgo   coincide   con   la   reducción   de   la   actividad   poblacional   inducida   por   la   Dzx   en   la   corteza   entorrinal   (Cunningham   et   al.,   2006;   Lemak   et   al.,   2014).   En   contraste,   nuestros   resultados   muestran   que   el   tratamiento   crónico   con   Dzx   incrementa   la   actividad   hipocampal   y   evita   su   reducción  inducida  por  el  Aβ  (Figura  18).  El  incremento  de  la  actividad  hipocampal  inducido  por  el   tratamiento   crónico   de   la   Dzx   puede   ser   producto   de   una   respuesta   homeostática   similar   a   la   observada  después  de  la  inhibición  crónica  del  disparo  celular  (Koch  et  al.,  2010;  Desai  et  al.,  2011;   Turrigiano  G,  2011).  Apoyando  esta  idea,  se  ha  observado  un  incremento  en  la  actividad  celular  en   humanos   y   en  modelos   transgénicos   que  presentan  una  mutación   “activante”   en   los   canales  KATP   (Hattersley  &  Ashcroft,  2005;  Bahi-­‐Buisson  et  al.,  2007;  Quan  et  al.,  2011;  Pearl  PL,  2012).  Por  otro   lado,   el   efecto  protector   obtenido   con   el   tratamiento   crónico   con   la  Dzx   sobre   la   reducción  de   la   actividad  hipocampal  producida  por  el  Aβ,  reeleja   las  propiedades  neuroprotectoras,  ampliamente   descritas,   de   los   activadores  de   los   canales  KATP   (Wang   et   al.,   2004;   Sun   et   al.,   2006;   Judge   et   al.,   2009;  Liu  et  al.,  2010;  Misonou  H,  2010;  Wang  et  al.,  2011;  Rodríguez  et  al.,  2013).  Particularmente,   la  aplicación  de  la  Dzx  previene  la  inhibición  de  la  función  mitocondrial  (Kong  &  Ba,  2012;  Zeng  et   al.,   2013),   la   generación   de   ROS   (Chapman   et   al.,   1999;   Kong   et   al.,   2013a),   la   peroxidación   de   lípidos  (Kong  &  Ba,  2012;  Kong  et  al.,  2013a)  y  el  daño  neuronal  (Kong  et  al.,  2013a  y  b;  Zeng  et  al.,   2013;  Fu  et  al.,  2014)  inducidos  por  el  Aβ.  A  su  vez,  este  hallazgo  coincide  con  el  efecto  protector  del   tratamiento   crónico   con   la   Dzx   ante   el   deterioro   del   aprendizaje   y   la  memoria   observado   en   un   modelo  transgénico  de  la  EA  (Liu  et  al.,  2010).  En  este  caso,  el  efecto  protector  correlacionó  con  una   reducción  del  estrés  oxidativo  y  una  mejoría  en  la  función  mitocondrial  (Liu  et  al.,  2010).  De  manera   interesante,   la   apertura   crónica   de   los   canales   KATP   también   reduce   la   actividad   de   la   GSK-­‐3β   inducida  por  el  Aβ  (Kong  et  al.,  2013b;  Kong  et  al.,  2015).  En  este  sentido,  también  es  posible  que  el   tratamiento  crónico  con  la  Dzx  pueda  prevenir  la  modulación  de  los  canales  KATP  por  parte  del  Aβ   mediante  la  inhibición  de  la  GSK-­‐3β,  además  de  promover  otros  mecanismos  neuroprotectores.     91 Inyección  intracerebral  única  del  Aβ  como  modelo  de  la  patología  tipo  EA   La  acumulación  del  Aβ  es  un  evento  temprano  y  crítico  en  la  patología  de  la  EA  (Glenner  y  Wong,   1984),  ocurriendo  primeramente  en  regiones  corticales  temporales  asociadas  a  la  formación  de  la   memoria,  como  el  hipocampo  (Lue  et  al.,  1999;  Näslund  et  al.,  2000).  En  este  sentido,  la  inyección   i.c.  del  Aβ  (que  incluye  la  inyección  i.c.v.  o  la  inyección  en  una  estructura  cerebral  especíeica)  ha  sido   utilizada   como   modelo   para   estudiar,   en   el   corto   y   largo   plazos,   los   efectos   inducidos   especíeicamente  por  el  Aβ  sobre  los  procesos  mnémicos  y  los  mecanismos  celulares  involucrados  en   los  mismos,  y  de  esta  manera,  evaluar  la  contribución  del  Aβ  en  el  desarrollo  de  la  patología  de  la   EA.  Esta  aproximación  está  sustentada  en  la  evidencia  de  que  el  Aβ  inyectado  puede  permanecer  en   el  cerebro  por  periodos  prolongados  de  tiempo  (Frautschy  et  al.,  1992;  Eisele  et  al.,  2009;  Zussy  et   al.,   2011;2013;   Sharma   et   al.,   2016)   y   en   la   propuesta   de   Jarrett   y   Lansbury   (1993)   que   sugiere   que   la   aplicación   de   pequeñas   cantidades   del   Aβ   exógeno,   pueden   acelerar   la   producción   y   la   acumulación   del   Aβ   endógeno   (fenómeno   denominado   como   “seeding”),   de   tal   manera   que   la   producción   y   agregación   continuas   del   Aβ   endógeno,   así   como   la   presencia   continua   del   Aβ   exógeno,   podrían   inducir   y   mantener   procesos   patológicos   que   emulan   la   patología   de   la   EA   (Frautschy  et  al.,  1996;  Kane  et  al.,  2000;  Stéphan  et  al.,  2001;  Meyer-­‐Luehmann  et  al.,  2006;  Eisele   et  al.,  2009;  Langer  et  al.,  2011;  Morales  et  al.,  2012;  Rosen  et  al.,  2012;  Zussy  et  al.,  2011;  2013;   Endres   et   al.,   2016).   Actualmente,   existe   una   gran   cantidad   de   estudios   que   demuestran   que   la   inyección   i.c.   del   Aβ   incrementa   la   expresión   de   la   proteína   precursora   amiloide   (APP)   y   la   producción  de  novo  del  Aβ  endógeno  (Frautschy  et  al.,  1996;  Kane  et  al.,  2000;  Stéphan  et  al.,  2001;   Meyer-­‐Luehmann  et  al.,  2006;  Eisele  et  al.,  2009;  Langer  et  al.,  2011;  Morales  et  al.,  2012;  Rosen  et   al.,  2012;  Zussy  et  al.,  2011;  2013;  Endres  et  al.,  2016).     La   producción   de   novo   del   Aβ   endógeno,   inducida   por   la   inyección   i.c.   del   Aβ   exógeno,   podría   contribuir   a   la   inducción   y  mantenimiento   del   deterioro   en   la   conducta   innata   y   en   la  memoria   dependientes  del   hipocampo   (Stéphan  et   al.,   2001;  Klementiev   et   al.,   2007;  Balducci   et   al.,   2010;   92 Dineley  et  al.,  2010;  Geng  et  al.,  2010;  Li  et  al.,  2010;  Srivareerat  et  al.,  2009;  2011;  Villette  et  al.,   2010;   Bagheri   et   al.,   2011;   Nobakht   et   al.,   2011;   Zussy   et   al.,   2011;2013;   Sharma   et   al.,   2016).   Además  la  aplicación  del  Aβ  exógeno  y  la  acumulación  del  Aβ  endógeno  puede  llevar  a  la  formación   de  placas  amiloides  (Frautschy  et  al.,  1996;  Stéphan  et  al.,  2001;  Klementiev  et  al.,  2007;  Sharma  et   al.,   2016),   al   incremento   en   los   niveles   de   la   proteína  Tau   fosforilada   y   la   formación  de  marañas   neuroeibrilares  (Klementiev  et  al.,  2007;  Nobakht  et  al.,  2011;  Zussy  et  al.,  2013),  a  alteraciones  en   la  actividad  eléctrica  celular  (Sun  &  Alkon,  2002;  Srivareerat  et  al.,  2009;  2011;  Villette  et  al.,  2010),   a  alteraciones  en  la  plasticidad  sináptica  (Stéphan  et  al.,  2001;  Dineley  et  al.,  2010;  Li  et  al.,  2010;   Srivareerat   et   al.,   2009;   2011),   a   un   incremento   en   procesos   de   estrés   celular   (e.g.   disfunción   mitocondrial,   disfunción   del   retículo   endoplásmico,   incremento   de   vías   asociadas   al   estrés   oxidativo;  Li  et  al.,  2010;  Zussy  et  al.,  2011;2013;  Sharma  et  al.,  2016),  a  una  activación  de  procesos   inelamatorios   (e.g.   gliosis   y   microgliosis;   Frautschy   et   al.,   1992;   1995;   Stéphan   et   al.,   2001;   Klementiev  et  al.,  2007;  Li  et  al.,  2010;  Sharma  et  al.,  2016),  y  a   la  muerte  celular  (Stéphan  et  al.,   2001;  Klementiev  et  al.,  2007;  Balducci  et  al.,  2010;  Geng  et  al.,  2010;  Nobakht  et  al.,  2011;  Zussy  et   al.,  2011;2013).  El  conjunto  de  estas  alteraciones,  desencadenadas  y  parcialmente  mantenidas  por   la  aplicación  del  Aβ  exógeno,   genera  un  cuadro  patológico  que   simula  varias   características  de   la   patología  de  la  EA  (Nixon  RA,  2002).  En  base  a  lo  anterior,  es  que  se  ha  considerado  a  la  infusión  i.c.   del  Aβ  exógeno  como  un  modelo  complementario  de  los  modelos  transgénicos  de  la  EA.  El  conjunto   de   ambos  modelos  ha  permitido  dilucidar   varios  de   los  mecanismos   celulares   y  moleculares  que   podrían  estar  involucrados  en  el  desarrollo  y  en  los  procesos  neurodegenerativos  observados  en  la   EA.   Para  explicar  cómo  la  infusión  i.c.  de  Aβ  puede  inducir  la  generación  de  novo  de  Aβ  y  así  generar  las   múltiples  alteraciones  anteriormente  mencionadas,  primero  se   tiene  que  describir   la  distribución   que  puede  tener  el  Aβ  inyectado,  su  permanencia  o  degradación  en  el  tejido  y,  en  general,  el  curso   temporal  de  la  progresión  de  la  patología  tipo  EA  que  se  induce  en  este  modelo.  El  grupo  de  Zussy  y   93 cols.,  demostraron  que  el  Aβ  (marcado  con  el  eluoróforo  HiLyte  Fluor  488,  Aβ25-­‐35-­‐HLF)  inyectado  de   manera   i.c.v.,   se   distribuye   ampliamente   en   el   cerebro   y   alcanza   diversas   estructuras   cerebrales,   como  el  septum  y  el  hipotálamo,  dentro  de  la  primera  hora  posterior  a  la  inyección.  Más  aún,  tres  y   seis  semanas  después  de  la  inyección,  la  presencia  del  Aβ25-­‐35-­‐HLF  se  encontró  en  otras  estructuras   cerebrales   como   el   hipocampo,   la   amígdala   y   la   corteza   frontal   (Zussy   et   al.,   2011;   2013).   El   incremento   progresivo   en   la   expresión   endógena   de   la   APP   y   los   fragmentos   Aβ1-­‐40   y   Aβ1-­‐42,   producidos  por  la  presencia  continua  del  Aβ25-­‐35-­‐HLF,  provocó  el  deterioro  paulatino  de  la  memoria   espacial.  Asimismo,   se   observó  que   la  presencia   continua  del  Aβ25-­‐35-­‐HLF  produce  una   alteración   progresiva   en   la   expresión   de  marcadores   histológicos   asociados   al   estrés   celular,   a   los   procesos   inelamatorios   y   a   la   muerte   celular   (Zussy   et   al.,   2011;   2013).   Cabe   resaltar   que,   a   pesar   de   no   generar  una  distribución  amplia  del  péptido  en  el  resto  del  cerebro,  la  inyección  de  Aβ  exógeno  en   una   estructura   cerebral   especíeica,   como   el   hipocampo,   también   mantiene   al   Aβ   exógeno   por   periodos  prolongados  de  tiempo,  incrementa  los  niveles  de  Aβ  endógeno  y  desencadena  las  mismas   alteraciones  anteriormente  mencionadas   (Giovannelli  et  al.,  1995;  Stéphan  et  al.,  2001;  Villette  et   al.,  2010;  Bagheri  et  al.,  2011;  Nobakht  et  al.,  2011;  Pearson-­‐Leary  &  McNay,  2012;  Liu  et  al.,  2013;   Zheng  et  al.,  2013;  Wang  et  al.,  2014;  Salgado-­‐Puga  et  al.,  2015;  Gordon  et  al.,  2017).     La  inyección  i.c.  de  Aβ  resulta  ser  un  modelo  con  resultados  consistentes  con  respecto  al  deterioro   cognitivo  y   la  neurodegeneración  observados  en  la  patología  de  la  EA  (para  una  revisión  Salgado-­‐ Puga   &   Peña-­‐Ortega,   2015).   Si   bien   la   mayoría   de   los   estudios   demuestran   que   el   Aβ   exógeno   inyectado  de  manera  i.c.  permanece  en  el  tejido  durante  días  o  semanas,  además  de  ser  sueiciente   para  inducir  amiloidosis  (Frautschy  et  al.,  1992;  Eisele  et  al.,  2009;  Zussy  et  al.,  2011;2013;  Sharma   et   al.,   2016);   existen   estudios   que   muestran   que   el   Aβ   inyectado   de   esta   manera   puede   ser   eliminado  o  degradado  en  un  rango  de  20  a  60  min  (Fujiyoshi  et  al.,  2000;  Shibata  et  al.,  2000;  Shiiki   et  al.,  2004).  Se  ha  propuesto  que  los  mecanismos  celulares  involucrados  en  la  degradación  rápida   del  Aβ  exógeno  inyectado  involucran  a  la  fagocitosis  microglial,  la  actividad  de  metaloproteinasas,  la   94 actividad   de   enzimas   degradadoras   como   la   enzima   que   degrada   insulina,   la   unión   a   proteínas   endógenas  como  la  proteína-­‐1  asociada  al  receptor  LDL,  la  recaptura  del  Aβ  en  lisosomas  de  varios   tipos   celulares,   y   su   unión   a   receptores   que   son   endocitados   (Ling   et   al.,   2003;   Kanekiyo   y   Bu,   2014).   Para   explicar   esta   aparente   contradicción   es   importante   considerar   que   diferencias   en   la   concentración  del  Aβ  exógeno  inyectado,  el  estado  de  agregación  del  Aβ  exógeno  inyectado,  y  el  tipo   de   detección   utilizada   para   localizarlo,   modieican   su   patrón   de   distribución   y   su   degradación   (Fraustchy  et  al.,  1995;  1996).  A  pesar  de  que  la  evidencia  que  muestra  que  el  Aβ  exógeno  inyectado   es  degradado,  es  minoritaria  (Fujiyoshi  et  al.,  2000;  Shibata  et  al.,  2000;  Shiiki  et  al.,  2004);  existe  la   posibilidad  de  que  el  Aβ  exógeno  inyectado  pudiera  inducir  los  fenómenos  patológicos  previamente   descritos  antes  de  ser  degradado,  contribuyendo  así  a   la   inducción,  pero  no  al  mantenimiento  del   fenómeno  patológico  antes  descrito.   Para   explicar   cómo   la   infusión   i.c.   de   Aβ   exógeno   puede   inducir   la   generación   de   novo   de   Aβ   endógeno   y   entender   la   progresión   de   la   patología   tipo   EA   que   se   induce   en   este  modelo,   se   ha   propuesto   un  mecanismo  molecular   que   involucra   la  modulación   de   la   cinasa   GSK-­‐3β,   por   el   Aβ   exógeno  inyectado  (Phiel  et  al.,  2003;  Ly  et  al.,  2013;  Qu  et  al.,  2014).  La  GSK-­‐3β  modula  la  actividad   de  la  enzima  BACE1,  la  cual  hidroliza  a  la  APP  en  la  posición  99  del  carboxilo  terminal,  y  produce  el   Aβ  (Ly  et  al.,  2013).  Además,  se  ha  propuesto  que  el  Aβ,  a  través  de  alterar  la  actividad  del  factor  de   necrosis  tumoral  alfa  (TNF-­‐α,  por  sus  siglas  en  inglés;  Chavant  et  al.,  2010)  y  el  factor  nuclear  de  las   cadenas  ligeras  kappa  de  las  células  B  activadas  (NFκB,  por  sus  siglas  en  inglés)  también  altera  la   actividad  de  las  enzimas  encargadas  de  hidrolizar  a  la  APP,  de  tal  manera  que  favorece  la  generación   del   Aβ   (Ly   et   al.,   2013).   De   esta   manera,   la   inyección   i.c.   única   del   Aβ   exógeno   produce   una   condición,   en   la   que,   después   de   la   inyección,   se   siguen   formando   agregados   solubles   del   Aβ   endógeno  de  manera  constante.  Siguiendo  esta  idea,  el  cambio  focal  (inyección  intraestructural)  o   global   (inyección   i.c.v.)   en   la   concentración  de  Aβ,   además  de   generar  Aβ,   también   incrementa   la   proporción  de  la  especie  Aβ1-­‐42  con  respecto  a  la  Aβ1-­‐40.  Esto  es  importante  ya  que  se  ha  reportado   95 que  el  incremento  en  la  proporción  Aβ1-­‐42/Aβ1-­‐40  está  asociado  con  el  desarrollo  de  la  patología  de   la   EA   (Cirrito   et   al,   2003;   Kuperstein   et   al.,   2010;   Dolev   et   al.,   2013).   Además,   la   generación   constante  de  Aβ  afecta  y  agota   los  mecanismos  involucrados  en  su  degradación  (Ling  et  al.,  2003;   Mizoguchi   et   al.,   2009),   lo   que   contribuye   al   incremento   de   los   niveles   de   Aβ   y   su   progresiva   agregación.   Estos   cambios   patológicos   generan   una   cascada   de   eventos   que   deterioran   progresivamente   la   actividad   celular,   la   función   de   los   circuitos   neuronales   y   los   procesos   conductuales   y  mnémicos   (Frautschy   et   al.,   1996;  Kane   et   al.,   2000;   Stéphan   et   al.,   2001;  Meyer-­‐ Luehmann   et   al.,   2006;   Eisele   et   al.,   2009;   Langer   et   al.,   2011;  Morales   et   al.,   2012;   Rosen   et   al.,   2012;  Zussy  et  al.,  2011;  2013;  Bergin  et  al.,  2015;  Endres  et  al.,  2016).  El  desarrollo  progresivo  y   sintetizado  de  estos  fenómenos  patológicos  se  describe  a  continuación:  en  primera  instancia,  el  Aβ   afecta  la  excitabilidad  celular  y  la  función  sináptica  (Zussy  et  al.,  2011;  2013;  Bergin  et  al.,  2015).  El   Aβ   afecta   a   estos  mecanismos   a   través   de   la  modulación   de   la   actividad   de   canales   iónicos   y   de   receptores   de   membrana   (Peña   et   al.,   2006;   Randall   et   al.,   2010;   Salgado-­‐Puga   &   Peña-­‐Ortega,   2015).  Además,  el  Aβ  soluble  promueve  la  activación  de  diversas  cascadas  de  señalización  las  cuales   repercuten   en   la   transmisión   sináptica   y   la   plasticidad   sináptica   (para   una   revisión   ver   Salgado-­‐ Puga  &   Peña-­‐Ortega,   2015).   Algunos   ejemplos   de   cascadas   transduccionales   inducidas   por   el   Aβ   son:  las  vías  asociadas  a  la  internalización  de  receptores  de  membrana  (activación  de  la  cinasa  Cdk5   y   GSK-­‐3β),   las   vías   asociadas   a   la   expresión   de   proteínas   asociadas   a   la   liberación   de   neurotransmisores   (e.g.   reducción   de   la   sinaptoeisina)   y   la   activación   de   fosfatasas   (e.g.   la   calcineurina,  misma  que  evita  la  activación  de  la  CaMKII  y  la  inducción  de  la  LTP;  Haass  &  Selkoe,   2007;  Salgado-­‐Puga  &  Peña-­‐Ortega,  2015).  Posteriormente,  el  Aβ  promueve  procesos  inelamatorios   a  través  de  la  activación  astrocítica  y  microglial,  los  cuales  liberan  interleucinas  (e.g.  IL-­‐β)  y  factores   pro-­‐inelamatorios  (e.g.  TNK-­‐α  y  NFκB;  Frautschy  et  al.,  1992;1996;  Kotilinek  et  al.,  2008;  Zussy  et  al.,   2011;2013).   Consecutivamente,   el   Aβ   genera   cambios   en   el   el   metabolismo   celular,   como   la   alteración  del  metabolismo  de  la  glucosa  (Mark  et  al.,  1997;  Macauley  et  al.,  2015;  Beglopoulos  et   96 al.,  2016),  del  ATP  (Yang  et  al.,  2009;  Fuentealba  et  al.,  2011;  Xing  et  al.,  2013),  de  los  aminoácidos   (Bergin  et  al.,  2015)  y  de  ROS  (Zussy  et  al.  2011;  2013;  Sharma  et  al.,  2016).  Este  proceso  patológico   secundario  del  Aβ  coincide  con  la  formación  de  agregados  de  Aβ  eibrilar  y  la  formación  de  marañas   eibrilares  (formadas  por  agregados  de  la  proteína  Tau  hiperfosforilada).  Por  último,  el  Aβ  induce  la   activación  de  vías  moleculares  asociadas  a   la  muerte  celular   (Randall  et  al.,  2010).  Es   importante   resaltar   que   todas   las   alteraciones   inducidas   por   el   Aβ   generan   a   su   vez   otras   alteraciones   secundarias  que  contribuyen  al  deterioro  en   la  actividad  eléctrica  de   los  circuitos  neuronales,   los   mecanismos   celulares   asociados   a   los   procesos   conductuales   y,   por   último,   los   cambios   en   la   morfología  y  la  viabilidad  celular.   Con  la  einalidad  de  corroborar  si  la  inyección  del  Aβ  exógeno  utilizada  en  esta  tesis  era  comparable   con   lo   reportado   en   la   literatura,   principalmente   en   los   que   respecta   a   la   deposición   del   Aβ,   se   realizó   un   análisis   histológico   del   tejido   de   animales   inyectados   con   el   Aβ   en   el   bulbo   olfatorio   (Figuras  32A  y  C;  Salgado-­‐Puga  et  al.,  2013)  o  en  el  hipocampo  (Figuras  32B  y  D,  Tesis  de  doctorado,   2017)   cuatro   semanas   después   de   la   inyección   intrabulbar   e   intrahipocampal   del   Aβ   exógeno.   A   continuación,   se  muestran   los   cortes  histológicos  de  dos   ratones   transgénicos   (15  y  19  meses  de   edad),  los  cuales  fueron  utilizados  como  control  positivo  para  la  tinción  con  rojo  tiazina,  el  cual  es   un   marcador   de   agregados   amiloides   dado   que   se   une   a   la   estructura   β   plegada   del   Aβ   eibrilar   (Bacskai   et   al.,   2003).   Enseguida,   se   muestran   los   cortes   del   bulbo   olfatorio   (50   µm)   y   del   hipocampo  dorsal  (5  µm)  teñidos  con  rojo  tiazina  de  animales  inyectados  con  vehículo  (Medio  F12)   y   con   el   Aβ   (200   pmoles/rata   en   el   bulbo   olfatorio   y   400   pmoles/rata   en   el   hipocampo).   Estos   resultados  sugieren  que   la   inyección  del  Aβ  que  estamos  realizando  podría  estar  promoviendo   la   generación  y  deposición  del  Aβ  y,  de  esta  manera,  afectar  crónicamente  los  circuitos  neuronales.   97   Fig.  32.  Infusión  intrabulbar  e  intrahipocampal  de  Aβ  induce  la  formación  de  depósitos  de  Aβ.  A   y   B,   en   el   panel   izquierdo   de   muestra   una   representación   esquemática   (Paxinos   &   Watson,   2005)   de   la   zona   del   bulbo   olfatorio   (A)   y   del   hipocampo   dorsal   (B)   mostrando   el   sitio   observado  en  los  cortes  histológicos  mostrados  en  las  siguientes  imágenes  (C  y  D  para  el  bulbo   olfatorio  y  el  hipocampo,  respectivamente).  En  el  panel  derecho  se  muestran   fotomicrograeías   de  cortes  histológicos  mostrando  la  tinción  con  rojo  tiazina  de  depósitos  del  Aβ  en  el  subiculum   (20x)   de   un   ratón   triple   transgénico   de   la   EA   (3xTg-­‐AD)   de   19   y   15   meses   de   edad,   respectivamente.   Los   cortes   realizados   para   el   ratón   WT   (animal   control)   y   3xTg-­‐AD   de   19   meses  de  edad  fueron  de  50  µm,  mientras  que  para  el  de  15  meses  de  edad  fueron  de  5  µm.  Para   éste   último,   se   llevó   a   cabo   una   doble   tinción   utilizando   DAPI   (marcaje   color   azul)   como   marcador  del  núcleo  celular  y  el  rojo  tiazina  (marcaje  color  rojo)  para  los  depósitos  del  Aβ.  C  y   D,  Fotomicrograeías  representativas  (magnieicación  20x)  de  los  cortes  histológicos  teñidos  con   rojo  tiazina  de  los  animales  Control  (inyectados  con  vehículo,  panel  izquierdo)  o  inyectados  con   200  pmoles/rata  del  Aβ  en  el  bulbo  olfatorio   (capa  granular)  y  400  pmoles/rata  del  Aβ  en  el   hipocampo  (subiculum,  panel  derecho).  Los  cortes  obtenidos  del  bulbo  olfatorio  presentan  un   grosor  de  50  µm  mientras  que   los  del  hipocampo  son  de  5  µm,  por   lo  que  para   la   tinción  del   hipocampo  se  utilizó   también  el  marcador  nuclear  DAPI.  Nótese  que  en  ambas  estructuras  el   grupo  tratado  con  el  Aβ  presenta  depósitos  marcados  con  rojo  tiazina,  mientras  que  los  grupos   Control  no  (n=9-­‐10  ratas/grupo).  Las  barras  de  escala  indican  200  μm.   Alteraciones   inducidas   por   el   Aβ   sobre   la   conducta   típica   y   la   memoria   dependientes   del   hipocampo   En   este   estudio,   también   se   evaluaron   los   efectos   de   la   inyección   intrahipocampal   sobre   la   conducta   típica   de   burrowing   y   la   memoria   de   contexto;   ambas   dependientes   de   la   función   hipocampal.  Nuestros  resultados  muestran  que  la  inyección  única  del  Aβ  deteriora  la  formación  de   la  memoria  de  contexto,  sin  afectar  el  aprendizaje,  así  como  incrementa  las  conductas  de  burrowing   y   de   inmovilización   sin   afectar   la   actividad  motora   de   los   sujetos   o   la   integridad   anatómica   del   hipocampo.     98 El  efecto  deletéreo  del  Aβ  sobre   la  memoria  de  contexto  observado  en  este   trabajo   (Figuras  19  y   20),  es  consistente  con  una  gran  cantidad  de  estudios  que  muestran  que  la  inyección  i.c.v  e  i.h.  del   Aβ  induce  deeiciencias  en  la  retención  de  la  memoria  evaluada  en  la  tarea  de  evitación  inhibitoria   (Nakamura   et   al.,   2001;  Olariu   et   al.,   2001;   Yamaguchi   et   al.   2006;   García-­‐Osta  &  Alberini,   2009;   Wang  et  al.,  2012;  Borlikova  et  al.,  2013;  Jiang  et  al.,  2013;  Zare  et  al.,  2015).  Además,  lo  resultados   obtenidos  de  la  evaluación  de  la  memoria  de  corto  plazo  (Figura  20A)  concuerdan  con  reportes  que   muestran  que  la  deeiciencia  en  la  memoria  de  contexto  no  se  debe  a  un  fallo  en  el  aprendizaje  sino   en   la  consolidación  de   la   tarea  (Nakamura  et  al.,  2001;  Olariu  et  al.,  2001;  Yamaguchi  et   la.  2006;   Wang  et  al.,  2012;  Borlikova  et  al.,  2013;  Liu  et  al.,  2015;  Zare  et  al.,  2015).  Por  último,  los  resultados   obtenidos  de  la  evaluación  de  la  prueba  de  retención  1,  2  y  3  semanas  posterior  a  la  infusión  del  Aβ   nos   sugieren   que   los   efectos   del   Aβ   sobre   la  memoria   observados   en   este   trabajo   dependen   del   tiempo  (Figura  20B).  En  concordancia  con  nuestros  resultados,  Zussy  et  al.  (2011)  mostraron  que  la   inyección  i.c.v.  del  Aβ25-­‐35  no  altera  la  formación  de  la  memoria  espacial  evaluada  una  semana  post-­‐ inyección.   No   obstante,   cuando   los   sujetos   fueron   evaluados   nuevamente   a   la   segunda   y   tercer   semana  post-­‐inyección,   los  sujetos  presentaron  un  deterioro  en   la  memoria  espacial   (Zussy  et  al.,   2011;  2013).  De  manera  similar  se  ha  demostrado  que  la  patología  inducida  por  la  inyección  del  Aβ   requiere   tiempo   para   inducir   cambios   signieicativos   y   afectar   la   función   de   otros   circuitos   neuronales  como  el  bulbo  olfatorio  (Salgado-­‐Puga  et  al.,  2013)  y  la  corteza  prefrontral  (Koukouli  et   al.,  2016).   El  incremento  en  la  conducta  de  burrowing  inducido  por  el  Aβ  y  su  correlación  con  el  deterioro  en   la  memoria   (Figura  19)  parece  contradecir   la  evidencia  observada  en  modelos   transgénicos  de   la   EA,  los  cuales  presentan  una  reducción  en  la  conducta  de  burrowing  y  un  deterioro  en  la  memoria   (Deacon  et  al.,  2008;  2009;  Sagare  et  al.,  2013).  Sin  embargo,   la  reducción  de  esta  conducta  en  el   modelo  Tg2576  (Deacon  et  al.,  2008)  o  en  el  modelo  APPswe  (Sagare  et  al.,  2013)  no  es  clara.  Por   ejemplo,  el  modelo  Tg2576  presenta  una  reducción  signieicativa  a   los  3  y  12  meses  de  edad,  pero   99 ningún   cambio   a   los   9   ó   21  meses   de   edad,   lo   que   indicaría   que   la   reducción   de   la   conducta   de   burrowing  en  este  modelo  animal  es  intermitente  (Deacon  et  al.,  2008).  Además,  el  deterioro  en  la   memoria  observado  en  este  modelo  animal,  que  una  vez  observado  es  persistente,  no  asemeja  estos   cambios  intermitentes  en  la  conducta  de  burrowing  (Deacon  et  al.,  2008).  En  este  sentido,  Deacon  et   al.,  2008  mostraron  que  las  alteraciones  en  la  conducta  de  burrowing  no  están  relacionadas  con  la   edad  de  los  sujetos,  contrario  a   la  evidencia  que  muestra  que  las  alteraciones  inducidas  por  el  Aβ   sobre  diferentes  circuitos  neuronales,  incluyendo  el  hipocampo,  dependen  de  la  edad  de  los  sujetos   (Billings  et  al.,  2005;  Balleza-­‐Tapia  et  al.,  2010;  Zussy  et  al.,  2011;2013;  Cohen  et  al.,  2013).  De  esta   manera,   nuestra   aproximación   experimental   (inyección   única   del   Aβ)   puede   que   produzca   un   estado  patológico  diferente  que  el  exhibido  en  los  modelos  transgénicos  de  la  EA  en  lo  que  respecta   a  la  combinación  entre  el  deterioro  de  la  memoria  y  la  conducta  de  burrowing.  En  este  sentido,  el   efecto  directo  de  la   infusión  i.h.  del  Aβ  sobre  esta  conducta  es  más  dieícil  de  explicar.  La  conducta   típica  de  burrowing  se  ha  utilizado  para  estudiar  la  función  hipocampal  (Deacon  et  al.,  2002;  Costa-­‐ Nunes  et  al.,  2014;  Jirkof  P,  2014)  y  el  bienestar  de  los  sujetos  (Jirkof  P,  2013;  2014,  Whittaker  et  al.,   2014).   En   este   sentido,   la   conducta   de   burrowing   se   ve   reducida   por   una   lesión   o   un   mal   funcionamiento   del   hipocampo   (Deacon   et   al.,   2002;   Costa-­‐Nunes   et   al.,   2014;   Jirkof   P,   2014).   Considerando  lo  anterior,  no  tenemos  claro  si  el  incremento  en  la  conducta  de  burrowing  inducido   por  el  Aβ  se  debe  a  una  mejora  en  el  bienestar  de   los   sujetos  o  de   la   función  hipocampal,   lo  que   consideramos  poco  probable.  Otra  posible  explicación,  es  que  esta  conducta  puede  estar  reelejando   un  cambio  negativo  en  el  estado  emocional  general  de  los  sujetos.  Esta  posibilidad  está  apoyada  por   estudios   que  muestran  un   incremento   en   la   conducta   de  burrowing   en   sujetos   en   abstinencia   de   moreina  (Teiger  DG,  1974;  Livingston  et  al.,  1988;  Rayner  et  al.,  1988;  El-­‐Kadi  &  Sharif,  1995a  y  b),   codeína  (Teiger  DG,  1974),  meperidina  (Teiger  DG,  1974)  y  metadona  (Ling  et  al.,  1984;  Darmani  et   al.,   1991).   En   estos   casos,   la   conducta   de   burrowing   ha   sido   considerada   como   una   conducta   de   “escape”.  Esta  posibilidad,  se  ve  soportada  por  estudios  donde  los  sujetos  muestran  un  incremento   100 en   la   conducta  de  burrowing   ante   la   exposición   al   olor  de  un  depredador   (Venton   et   al.,   2006)  o   piretroide   sintético   -­‐cielutrina-­‐   (Syed   et   al.,   2010).   La   conducta   de   burrowing   también   ha   sido   asociada  con  ansiedad  (Lavin  et  al.,  2011),  y  ha  sido  catalogada  como  una  conducta  tipo  depresiva/ ansiosa   (Lavin   et   al.,   2011),   por   lo   que   otra   posibilidad   es   que   el   incremento   en   la   conducta   de   burrowing  reeleje  una  alteración  en  el  estado  de  ansiedad  de  los  sujetos.  Apoyando  esta  posibilidad,   hay  evidencia  que  muestra  que   la  conducta  de  burrowing   se  ve   incrementada  en  condiciones  que   favorecen   la   depresión   y   la   ansiedad   como   el   ayuno   (Lavin   et   al.,   2011),   el   aislamiento   neonatal   (Kosten  &  Kehoe,  2010),  una  dieta  alta  en  grasa  (Kaczmarczyk  et  al.,  2013),  y  por   la  presencia  de   rejilla  como  piso  en  la  caja  habitación,  misma  que  genera  “malestar”  en  los  animales  (Bendtsen  et   al.,  2012).  Además,   fármacos  ansiolíticos   como   la  pregabalina   (Rutten  et  al.,  2014)  y  gabapentina   (Andrews   et   al.,   2012)   reducen   la   conducta   de  burrowing.   En   contraste   a   lo   argumentado,   se   ha   reportado   que   un   estado   ansioso   cursa   con   una   reducción   en   la   conducta   de   burrowing   (Costa-­‐ Nunes  et  al.,  2014).  Asimismo,  también  se  ha  reportado  que  animales  con  niveles  bajos  de  ansiedad   exhiben  un  incremento  en  la  conducta  de  burrowing  (Chen  et  al.,  2005;  Line  et  al.,  2011).  A  pesar  de   que  algunos  estudios  muestran  que  el  Aβ  induce  ansiedad  (Olariu  et  al.,  2001;  Yue  et  al.,  2014)  no   podemos  asociar  el   incremento  de  la  conducta  de  burrowing   inducido  por  el  Aβ  con  un  estado  de   ansiedad   signieicativo,   ya   que   tanto   las   latencias   de   entrenamiento   y   escape   (Figura   19C)   en   la   prueba   de   evitación   inhibitoria   como   los   parámetros   medidos   en   la   prueba   de   campo   abierto   (Figura   21)   no   reelejan   un   estado   ansioso   muy   evidente   en   los   animales   tratados.   Únicamente   encontramos  un  incremento  signieicativo  en  el   tiempo  que   los  sujetos  tratados  pasaban  inmóviles   (Figura  21F).  En  este  punto,  no  tenemos  una  evidencia  concluyente  que  indique  si  la  ansiedad  está   involucrada  o  no  en  este   incremento  de   la  conducta  de  burrowing   inducido  por  el  Aβ.  Es  posible,   que  el  Aβ  haya  inducido  un  estado  de  ansiedad  moderado  que  fue  revelado  en  el  incremento  de  la   conducta   de   burrowing   y   de   inmovilización,   pero   que   no   fue   lo   sueicientemente   severo   para   reelejarse   en   otros   parámetros  medidos   (movilidad,   latencias   de   entrenamiento   y   escape,   y   otras   101 mediciones  en  el  campo  abierto).  Hasta  este  momento,  el  incremento  de  la  conducta  de  burrowing   inducido  por  el  Aβ  puede  que  reeleje  una  perturbación  en  el  estado  emocional  de  los  sujetos  (tal  vez   asociado   a   un   estado   de   ansiedad  moderado,   una   necesidad   de   escapar,   o   ambas)  más   que   una   mejora  de  la  función  hipocampal  y  del  bienestar  de  los  sujetos,  ya  que  es  claro  que  la  inyección  i.c.   del  Aβ  altera  la  función  del  circuito  hipocampal  (para  una  revisión  ver  Salgado-­‐Puga  &  Peña-­‐Ortega,   2015).     Las   pruebas   de   evitación   inhibitoria   (Wishart  &  Mogenson,   1970;   Best  &  Orr,   1973;   Izquierdo  &   Medina,  1997;  Martínez  et  al.,  2002;  Garín-­‐Aguilar  et  al.,  2014)  y  de  burrowing  (Deacon  et  al.,  2002;   Costa-­‐Nunes   et   al.,   2014;   Jirkof   P,   2014)   dependen   de   la   integridad   y   función   del   hipocampo.   El   hecho  de  que  ambas  pruebas  fueran  afectadas  por  el  Aβ  sin  un  daño  evidente  en  la  anatomía  de  la   formación  hipocampal  (Figura  22),  es  consistente  con  observaciones  previas  que  muestran  que  el   Aβ  inhibe  la  actividad  del  circuito  hipocampal  in  vitro  (Sun  &  Alkon,  2002;  Adaya-­‐Villanueva  et  al.,   2010;  Peña  et  al.,  2010;  Peña-­‐Ortega  &  Bernal-­‐Predraza,  2012;  Gutiérrez-­‐Lerma  et  al.,  2013;  para   una  revisión  ver:  Peña-­‐Ortega  F,  2013)  e  in  vivo  (Colom  et  al.,  2010;  Peña  et  al.,  2010;  Villette  et  al.,   2010;  Peña-­‐Ortega  &  Bernal-­‐Predraza,  2012;  Gutiérrez-­‐Lerma  et  al.,  2013;  Yue  et  al.,  2014;  para  una   revisión  ver:  Peña-­‐Ortega  F,  2013).  De  esta  manera,  creemos  que  el   incremento  en   la  conducta  de   burrowing  y  el  deterioro  de  la  memoria  son  producto  de  la  alteración  del  circuito  hipocampal  (Peña   et  al.,  2010;  Peña-­‐Ortega  &  Bernal-­‐Predraza,  2012;  Yue  et  al.,  2014)  y  no  de  daño  de  la  estructura   hipocampal.   Efecto   de   la  modulación  de   los   canales  KATP   sobre   las   alteraciones   inducidas  por   el   Aβ   en   la   memoria,  la  actividad  espontánea  y  la  plasticidad  sináptica  de  largo  plazo   Esta   ampliamente   descrito   que   el   Aβ   induce   un   deterioro   de   la   memoria   a   través   de   alteraciones   en   la   actividad   oscilatoria   (Sun  &   Alkon,   2002;   Villette   et   al.,   2010)   y   la   plasticidad   sináptica  de  corto  y  largo  plazos  (Wang  et  al.,  2010;  Klyubin  et  al.,  2011;  Ardiles  et  al.,  2012;  Han  et   102 al.,  2013;  Liu  et  al.,  2013b;  Lv  et  al.,  2015).  De  acuerdo  con   lo  anteriormente  reportado,  nuestros   resultados  muestran  que  las  alteraciones  inducidas  por  el  Aβ  sobre  la  conducta  de  burrowing  y   la   memoria  de  contexto  correlacionan  con  la  inhibición  de  la  LTP  y  la  inducción  de  la  LTD,  pero  no  con   cambios  en  la  actividad  oscilatoria  espontánea  en  el  hipocampo.   Si   bien   los   resultados   con   la   aplicación  del  Aβ   in   vitro   sí  muestran  una  alteración  en   la   actividad   hipocampal   (Figuras   16   y   18),   los   resultados   de   la   actividad   espontánea,   evaluada   tres   semanas   después  de  la  infusión  i.h.  del  Aβ,  muestran  únicamente  un  incremento  en  la  potencia  y  proporción   de   la  actividad  en  la  banda  de  frecuencia  δ  (0.5  -­‐  1.5  Hz)  sin  cambio  alguno  en  la  actividad  de   las   bandas   θ,   β,   y   γ   (Figura   25).   Sin   embargo,   dichas   alteraciones   en   la   actividad   en   la   banda   de   frecuencia  δ,  tienden  a  estar  correlacionadas  con  el  deterioro  de  la  memoria  de  contexto  inducido   por  el  Aβ  (Figura  26).  Una  posible  explicación  para  estas  diferencias  es  que  los  efectos  sutiles  del  Aβ   sobre   la   actividad   espontánea   hipocampal   in   vivo   puedan   ser   sueicientes   para   alterar   la   sincronización  de  la  actividad  hipocampal  necesaria  para  generar  ritmos  asociados  a  la  formación   de   la   memoria   (McNaughton   et   al.,   2006;   Tort   et   al.,   2009).   Este   punto   no   fue   abordado   en   la   presente  tesis  y  deberá  ser  revelado  en  el  futuro.  Consistentemente  se  ha  reportado  que  la  inyección   i.c.   del   Aβ   afecta   la   capacidad   de   los   circuitos   neuronales,   incluidos   el   hipocampo,   para   producir   oscilaciones   θ   y   γ   (Sun   &   Alkon   et   al.,   2002;   Villette   et   al.,   2010;   Koukouli   et   al.,   2016;   Palop   &   Mucke,  2016;  Shabani  et  al.,  2016),  particularmente  durante  el  entrenamiento  o  prueba  de  tareas  de   memoria   (Sun  &  Alkon   et   al.,   2002;  Villette   et   al.,   2010;   Shabani   et   al.,   2016).  Dicha   incapacidad   también  es  observada  en  múltiples  modelos  transgénicos  de  la  EA  (Driver  et  al.,  2007;  Akay  et  al.,   2009;  Rubio  et  al.,  2012;  Verret  et  al.,  2012).  En  concordancia  a  lo  encontrado  en  esta  tesis,  Nicole  et   al.,  (2016)  demostraron  que  la  inyección  i.c.v.  del  Aβ1-­‐42  no  afecta  la  actividad  poblacional  basal  del   hipocampo  evaluado  15  días  después  de  la  inyección.  En  contraste,  el  Aβ1-­‐42  afectó  la  capacidad  del   hipocampo  para  generar  oscilaciones  de  alta  frecuencia  (120  -­‐  200  Hz)  durante  la  consolidación  y   evocación  de  la  memoria  espacial  (Nicole  et  al.,  2016).  Además,  considerando  que  el  incremento  en   103 frecuencias  más  lentas  en  el  EEG  observado  en  pacientes  con  la  EA  ha  sido  asociado  con  el  deterioro   cognoscitivo   en   la   enfermedad   (Coben   et   al.,   1983;   Schreiter-­‐Gasser   et   al.,   1994;   Kowalski   et   al.,   2001),  el  incremento  en  la  actividad  δ  inducido  por  el  Aβ,  podría  ser  un  indicio  de  la  alteración  de  la   capacidad  del  circuito  hipocampal  que  se  observa  como  un  déeicit  en  la  memoria.  Considerando  lo   anterior,   son   necesarios   más   experimentos   para   determinar   si   la   inyección   i.h.   del   Aβ   afecta   la   capacidad   del   circuito   hipocampal   para   oscilar   en   bandas   de   frecuencia   especíeicas   durante   las   pruebas  conductuales  y,  si  la  modulación  de  los  canales  KATP  es  relevante  para  estos  efectos.     Considerando  que  los  procesos  de  aprendizaje  y  memoria  requieren  un  balance  entre  los  procesos   plásticos   (Daoudal   &   Debanne,   2003;   Diamond   et   al.,   2005;   Whitlock   et   al.,   2006),   nosotros   encontramos  que  el  tratamiento  con  la  Tol  previene  las  alteraciones  en  la  plasticidad  sináptica  de   largo  plazo   inducidas  por  el  Aβ  y,  por  ende,  previene  el  deterioro  en   la  memoria  de  contexto.  Las   sulfonilureas,  incluyendo  la  Tol  y  la  glibenclamida,  mejoran  la  memoria  en  animales  (Stefani  &  Gold,   2001;   Zarrindast   et   al.,   2004a   y   b)   y   en   humanos   (Ryan   et   al.,   2006).  Más   aún,   las   sulfonilureas   previenen  el  deterioro  de  la  memoria  inducido  por  la  moreina  (Zarrindast  et  al.,  2004a  y  b),  el  litio   (Zarrindast   et   al.,   2004a   y   b),   la   endotelina-­‐1   (Verwey  &   Edwards,   2010),   y   los   agonistas   de   los   canales   KATP   (Ghelardini   et   al.,   1998;   Betourne   et   al.,   2009).   Además,   nuestros   resultados   concuerdan  con  los  mostrados  por  Baraka  y  ElGhotny  (2010),  donde  muestran  que  la  glibenclamida   revierte   el   deterioro   de   la   memoria   espacial   inducido   por   el   Aβ25-­‐35.   Nosotros,   además,   demostramos   que   los   efectos   protectores   de   los   antagonistas   de   los   canales   KATP   involucran   la   restauración  del  balance  en  los  procesos  de  la  plasticidad  sináptica,  resultado  que  también  coincide   con  el  único  reporte  que  muestra  que   la  aplicación  aguda  de  glibenclamida   incrementa   la  LTP  en   rebanadas  hipocampales   (Schröder  et  al.,  2004).  Más  aún,  nuestros   resultados   también  coinciden   con  los  efectos  protectores  de  otros  antagonistas  de  los  canales  KATP  que  restauran  la  memoria  y  la   LTP  en  un  modelo  transgénico  de  la  EA  (Moriguchi  et  al.,  2016).  Como  se  mencionó  previamente,  los   efectos  protectores  de  la  Tol  requieren  un  tratamiento  prolongado.  En  este  sentido,  el  tratamiento   104 crónico  con  la  Tol  induce  cambios  en  la  excitabilidad  del  circuito  hipocampal  (Figura  18;  Fujimura   et  al.,  1997;  Karschin  et  al.,  1997;  Griesemer  et  al.,  2002)  y  también  podría  llevar  a  la  inhibición  de   la  GSK-­‐3β ︎   a   través  de   la   activación  de   vías   dependientes   de   insulina   (Gerozissis  &  Kyriaki,   2003;   Vadas  et  al.,  2011;  Molnár  et  al.,  2014).  De  esta  manera,  la  inhibición  de  la  actividad  de  la  GSK-­‐3β  de   manera   dependiente   de   insulina   podría   estar   previniendo   las   alteraciones   en   la   conducta   típica   (Kondratiuk  et  al.,  2013),  la  memoria  (Rockenstein  et  al.,  2007;  Fiorentini  et  al.,  2010;  Onishi  et  al.,   2011),  la  inhibición  de  la  LTP  (Jo  et  al.,  2011;  Shipton  et  al.,  2011;  Wang  et  al.,  2012)  y  la  inducción   de   la  LTD   (Li   et   al.,   2009;  2011;  Cavallucci   et   al.,   2013).  Considerando   lo  anterior,   son  necesarios   más  experimentos  para  esclarecer  si  los  cambios  persistentes  en  la  excitabilidad,  en  el  metabolismo   celular,  o  una  combinación  de  ambos;  son  responsables  por  los  efectos  protectores  inducidos  por  el   tratamiento  crónico  con  la  Tol.       El  efecto  protector  de  la  Dzx  sobre  el  deterioro  de  la  memoria  inducido  por  el  Aβ  observado  en  este   trabajo,  es   similar  al  efecto  de  muchos  otros  agentes  neuroprotectores  que  restauran   la  memoria   (Wang  et  al.,  2010;  Klyubin  et  al.,  2011;  Ardiles  et  al.,  2012;  Han  et  al.,  2013;  Liu  et  al.,  2013b;  Lv  et   al.,  2015),  sin  restablecer  la  plasticidad  sináptica  (Wang  et  al.,  2010;  Klyubin  et  al.,  2011;  Ardiles  et   al.,  2012;  Han  et  al.,  2013;  Liu  et  al.,  2013b;  Lv  et  al.,  2015).  Como  se  mencionó  anteriormente,   la   protección  de  la  memoria  dado  por  el  tratamiento  con  Dzx  podría  estar  asociada  a  la  reducción  de   la  disfunción  mitocondrial  (Kong  &  Ba,  2012;  Zeng  et  al.,  2013),  la  generación  de  ROS  (Kong  et  al.,   2013a;  Fu  et  al.,  2014),  la  peroxidación  de  lípidos  (Kong  &  Ba,  2012;  Kong  et  al.,  2013a),  y  el  daño   neuronal   (Kong   et   al.,   2013a;   Zeng   et   al.,   2013;   Fu   et   al.,   2014).   No   obstante,   estos   efectos   neuroprotectores   podrían   no   tener   la   potencia   necesaria   como   para   prevenir   los   efectos   del   Aβ   sobre   la   plasticidad   sináptica.   De  manera   interesante,   se   han   descrito   hallazgos   similares   con   la   memantina   (Klyubin   et   al.,   2011),   el   péptido   similar   al   glucagón   tipo   1   (Wang   et   al.,   2010),   la   liraglutida  (Han  et  al.,  2013),  el  geniposido  (Lv  et  al.,  2015),  y  la  melatonina  (Liu  et  al.,  2013b),  en   los   que   el   efecto   protector   de   la  memoria   se   ve   acompañado   de   una   recuperación  mínima   de   la   105 plasticidad  sináptica  de  largo  plazo.       En   general,   nuestros   resultados   muestran   que   la   modulación   de   los   canales   KATP   modieican   los   efectos   inducidos   por   el   Aβ   sobre   la   conducta   de   burrowing   y   la   memoria   dependiente   de   hipocampo,   a   través  de   la  modulación  de   la   plasticidad   sináptica  de   largo  plazo.   En   este   sentido,   tanto   la   Tol   como   la   Dzx   podrían   considerarse   como   agentes   terapéuticos   plausibles   para   contrarrestar   la   disfunción   cerebral   inducida   por   el   Aβ   y   posiblemente   la   EA   (Ryan   et   al.,   2006;   Slingerland  et  al.,  2008;  Hsu  et  al.,  2011;  Exalto  et  al.,  2012;  Moriguchi  et  al.,  2016).  Esta  posibilidad   está   apoyada   por   evidencia   reciente   que   muestra   que   los   pacientes   con   diabetes   tratados   con   antagonistas  de  los  canales  KATP  presentan  un  menor  riesgo  de  desarrollar  la  EA  (Hsu  et  al.,  2011;   Exalto   et   al.,   2012),   además   de   presentar   una   mejora   en   las   pruebas   cognoscitivas   durante   el   tratamiento  (Ryan  et  al.,  2006;  Slingerland  et  al.,  2008).  Más  aún,  el  hallazgo  reciente  que  muestra   que  la  memantina  modula  los  canales  KATP  (Moriguchi  et  al.,  2016),  siendo  la  memantina  uno  de  los   fármacos   más   utilizados   en   el   tratamiento   de   la   EA   (Cummings   et   al.,   2015),   coneirma   que   los   canales  KATP  son  blancos  terapéuticos  prometedores  para  la  EA.  Además  de  la  EA,  los  antagonistas   de  los  canales  KATP  también  se  han  propuesto  como  tratamiento  para  el  trauma  cerebral  (Kurland  et   al.,   2013),   la   isquemia   (Jahangir   &   Terzic,   2005;   Kurland   et   al.,   2013;   Ortega   et   al.,   2013),   la   esclerosis  múltiple  (Virgili  et  al.,  2011;  Nelson  et  al.,  2015),  y  la  enfermedad  de  Parkinson  (Liss  et   al.,   2005;   Schiemann   et   al.,   2012).   De   manera   similar,   los   agonistas   de   los   canales   KATP   se   han   propuesto   como  neuroprotectores   en   diversas   patologías   neurodegenerativas   (Wang   et   al.,   2004;   Sun   et   al.,   2006;   Liu   et   al.,   2010;   Misonou   H,   2010;   Wang   et   al.,   2011;   Rodríguez   et   al.,   2013),   evidencia  que  apoya  el  uso  de  estos  fármacos  como  posible  tratamiento  para  la  EA.         106 CONCLUSIONES   a) La   modulación   aguda   de   los   canales   KATP   con   la   tolbutamida   (antagonista   de   los   canales   KATP),  y  parcialmente  con  la  diazoxida  (agonista  de  los  canales  KATP),  evita  los  efectos  agudos   del  Aβ  sobre  la  actividad  espontánea  hipocampal.     b) La  modulación   crónica  de   los   canales  KATP   con   la   tolbutamida  y   la  diazoxida  previenen   las   alteraciones   inducidas   por   el   Aβ   sobre   la   conducta   típica   y   la   memoria   dependiente   del   hipocampo,  sin  alterar  la  glucemia  de  los  sujetos.     c) El   tratamiento  crónico  con   tolbutamida,  pero  no  con  diazoxida,  previene  el  deterioro  de   la   memoria  de  contexto  a  través  de  la  modulación  de  la  plasticidad  sináptica  de  largo  plazo.       d) Debido  al  uso  común  de  ambos  moduladores  de  los  canales  KATP  en  la  clínica,  los  resultados   obtenidos   pereilan   a   los   canales   KATP   como   blancos   moleculares   relevantes   para   nuevas   estrategias  terapéuticas  para  tratar  a  la  EA.     107 REFERENCIAS  Aguilar-­‐Bryan,  L.; 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