CIENCIAS B IO l1:'DICA UNIVERSIDAD NACIONAL AUTéNOMA DE MÉXICO POSGRADO EN CIENCIAS BIOMÉDICAS FACULTAD DE MEDICINA CARACTERIZACléN FENOTIPICA DE LlNFOCITOS T PERIFÉRICOS E INFILTRANTES DEL TUMOR EN PACIENTES CON CANCER CERVICOUTERINO. T E S I S QUE PARA OSTENER EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS BIOMÉDICAS (INMUNOLOGiA) PRESENTA BIOL. CINTHYA ESTEFHANY DIAZ BENiTEZ DIRECTOR DE TESIS: DR. VICENTE MADRID MARINA MÉXICO, D.F. 2011 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. 2 DEDICATORIA A mis dos invaluables tesoros, Dara Vanessa y Jairo Isaac por ser mi mejor incentivo en la vida y en la culminación de este proyecto. Gracias por su sincero amor, por sus inolvidables sonrisas y abrazos, por comprender el no tener una madre disponible al 100%, pero que siempre los tiene presentes en su pensamiento y corazón, procurando estén bien en todo momento. A dos grandes pilares en la vida, mis queridos padres Alfredo Díaz Pedroza y Maricela Benítez de Díaz por todo su amor y entrega para darme siempre lo que consideraron mejor. Gracias por su apoyo constante e incondicional en muchos sentidos. Gracias por ser mis padres. A mis mejores amigos y queridos hermanos, Priscilla Díaz Benítez y Alfredo Díaz Benítez por su amor, apoyo y por ser también un incentivo en este difícil y largo proceso de formación académica. A mi esposo Ismael Hernández Lucas, por su amor, comprensión y motivación en los momentos difíciles, por el apoyo académico, en la donación de reactivos; pero sobre todo por compartir conmigo el cuidado de nuestros hijos y permitirme así realizar el Doctorado. A mi abuela Josefina Ortega por su amor y apoyo que también contribuyó en mi carrera como profesionista. A mis parientes y amigos por desatenderlos un poco en el afán de concluir con este proyecto. A dos entrañables amigos, el Dr. Jesús Caballero Mellado que estuvo siempre pendiente de mi formación académica, mi trabajo y mi familia, y del que tendré siempre gratos recuerdos. Y a mi otro querido hermano Ramsés Hernández Lucas por su sincero amor y apoyo en muchos sentidos. También dedico esta tesis a personas que contribuyeron con el inicio de esta carrera y a las que aprecio mucho, la Dra. Yolanda Fuchs Gómez y el Dr. Marco A. Pardo. 3 AGRADECIMIENTOS Y RECONOCIMIENTOS Agradezco sinceramente al Dr. Vicente Madrid Marina por haberme abierto las puertas de su laboratorio, por permitirme continuar con mi formación académica al realizar un Doctorado directo, y por todas las experiencias obtenidas durante la realización de este trabajo. A los miembros del comité tutoral, la Dra. Yvonne Rosenstein Asoulay y el Dr. Hernández Pando; así como al Dr. José Moreno Rodríguez por permitirme hacer uso de sus laboratorios y reactivos. Por sus muy acertados comentarios y correcciones durante los tutorales o en la revisión del artículo, por su comprensión y apoyo, gracias. A los Doctores miembros del Jurado de tesis: Sara Huerta Yepez, Alejandro Manuel García Carranca, Patricio Gariglio Vidal, Carlos Rosales Ledezma y Vicente Madrid Marina por su amable atención y valiosas correcciones. Al Dr. Celso Ramos y Dr. Raúl Barrera por su permitirme muy amablemente hacer uso de equipo en su laboratorio. Al Dr. Felipe Uribe por su apoyo con el análisis estadístico. A los patólogos y médicos: Guillermina López, Ludwig González, Edgar Román, Patricia Alonso por su entusiasta participación para proporcionarme las muestras biológicas y el diagnóstico colposcópico o histopatológico. A las Dras. Guadalupe Ayala e Ivone castro por su comprensión y apoyo. A mis amigos o compañeros de los diferentes laboratorios por su apoyo, comprensión y en algunos casos por proporcionar tips para llevar a cabo algunas técnicas de laboratorio: Janet Juárez, Flor Tavernier, Atala Flores, Karla Navarro, Jesús Martínez, Carla Contreras, Margarita Bahena, Guillermo Perales, Víctor Bermúdez, Alfredo Lagunas, Oscar Peralta, Gloria Fernández, del CISEI (INSP). Al actual director del INSP, el Dr. Mario Henry Rodríguez por su apoyo y comprensión. A Patricia Rojo y Gibrán Pérez del Centro Médico SXXI. Al Dr. Llorente, Milena Sakí, Héctor Maldonado, Héctor Orozco y Diana Aguilar del INNSSZ. A la Lic. Natalia López y al personal de la biblioteca del INSP por su amable atención. Y a todas aquellas personas que por su compañerismo dieron apoyo moral en la realización de esta tesis o incluso donaron sangre para los experimentos. Agradezco al Posgrado en Ciencias Biomédicas de la Facultad de Medicina de la UNAM por haberme permitido realizar mis estudios de posgrado en este programa de excelencia. Y al personal que lo constituye por todo el apoyo y orientación para la realización de mis trámites, especialmente a la Dra. Yolanda López Vidal y a la secretaria Evita Vargas. Me honra presentar esta tesis ante dicha Institución de gran prestigio internacional, y que dignamente representa uno de los más altos niveles académicos de nuestro país. Agradezco de igual manera al Centro de Investigación sobre enfermedades infecciosas del Instituto Nacional de Salud Pública de México (INSP) por formar parte él, brindarme la oportunidad de estudiar en este posgrado, y por la infraestructura y financiamiento otorgado para la realización de la tesis. Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT-SEP) por financiar el proyecto 49574-24483-M y por el apoyo económico otorgado para conseguir reactivos, asistir a Congresos y por la beca designada con el número 153082, los cuales fueron indispensables para mi formación académica y la realización de esta tesis. 4 INDICE 1 RESUMEN .............................................................................................................. .6 2 ABSTRACT ............................................................................................................. 7 3 INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 8 3.1 Cáncer cervicouterino (CaCU) ............................................................................ 8 3.1.1 Aspectos epidemiológicos y generalidades ....................................................... 8 3.1.2 Histopatología ........................................................................................................ 9 3.1.3 Manifestaciones clínicas y tratamiento ............................................................. 11 3.1.4 Factores de riesgo ............................................................................................... 12 3.2 Virus del Papiloma Humano (VPH) .................................................................. 14 3.2.1 Características y clasificación del VPH ............................................................ 14 3.2.2 Ciclo del VPH ....................................................................................................... 19 3.3 Respuesta inmune en lesiones del cérvix y CaCU .................................. 22 3.3.1 Características generales de la inmunidad ...................................................... 22 3.3.2 Alteraciones provocadas por el VPH en la respuesta inmune local ............ 28 3.3.3 Linfocitos T y CaCU ............................................................................................ 32 3.4 Activación de linfocitos T y CaCU .................................................................. 35 3.4.1 Receptor de células T .......................................................................................... 35 3.4.2 Señalización a través del TCR/CD3 ................................................................. 37 3.4.3 CaCU y otras patologías relacionadas con la expresión de CD3ζ ............... 40 4 JUSTIFICACIÓN ................................................................................................. .41 5 HIPÓTESIS ........................................................................................................... 41 6 OBJETIVOS ......................................................................................................... 42 6.1 Objetivo general ...................................................................................................... 42 6.2 Objetivos específicos ............................................................................................ 42 7 MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................. 43 7.1 Reactivos y medios de cultivo ......................................................................... 43 7.2 Selección de pacientes ....................................................................................... 43 7.3 Criterios de inclusión y exclusión .................................................................. 43 7.4 Recolección de muestras ................................................................................... 43 7.5 Aislamiento de leucocitos periféricos e infiltrantes del tumor .......... 44 7.6 Cuantificación de leucocitos ............................................................................ 44 7.7 Digestión de tejido cervical con proteinasa K .......................................... 45 5 7.8 Extracción de RNA total de leucocitos y biopsias .................................. 45 7.9 Síntesis de la cadena complementaria de DNA (cDNA) ......................... 45 7.10 Extracción de DNA total de biopsias ........................................................... 46 7.11 Amplificación por PCR de una región conservada del VPH ............. 46 7.12 Determinación del tipo de VPH ..................................................................... 46 7.13 Citometría de flujo ............................................................................................... 47 7.14 Inmunohistoquímica .......................................................................................... 47 7.15 Ensayo de estimulación y proliferación de linfocitos T periféricos e infiltrantes del tumor ....................................................................................... 48 7.16 RT-PCR de citocinas y CD3ζ .......................................................................... 48 7.17 Análisis estadístico ............................................................................................ 50 8 RESULTADOS ..................................................................................................... 50 8.1 Determinación del tipo viral a partir de DNA de los tejidos cervicales .................................................................................................................. 50 8.2 Proporción y localización de células T en biopsias cervicales de pacientes con CaCU .............................................................................................. 51 8.3 Respuesta proliferativa de linfocitos T en pacientes con CaCU ....... 53 8.4 Patrón de citocinas en células T de pacientes con CaCU ................... 56 8.5 Presencia del RNA mensajero de CD3ζ en linfocitos periféricos e infiltrantes del tumor ............................................................................................. 60 9 DISCUSIÓN .......................................................................................................... 64 10 CONCLUSIONES .............................................................................................. 68 11 PERSPECTIVAS ............................................................................................... 69 12 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................. 70 13 ANEXOS ............................................................................................................. 92 13.1 Publicaciones generadas como productos de la realización de la presente tesis ........................................................................................................ 92 13.1.1 Díaz-Benítez CE, Madrid-Marina V, et al. CD3-ζ expression and T cell proliferation are inhibited by TGF-β1 and IL-10 in cervical cancer patients. Journal of Clinical Immunology 2009, 29:532-544. 13.1.2 Díaz-Benítez CE, Madrid-Marina V, et al. TGF-β and IL-10 inhibit T lymphocytes proliferation and CD3-ζ Expression in cervical cancer women. UICC World Cancer Congress. Free Papers. Washington, DC., U.S.A. Medimond International Proceedings. 8-12 de Julio de 2006. 6 1 RESUMEN El virus del papiloma humano es el agente causal del cáncer cervicouterino (CaCU). Alteraciones inmunológicas favorecen la persistencia viral y como consecuencia el desarrollo del CaCU. En el presente trabajo analizamos el comportamiento molecular y funcional de linfocitos T periféricos e infiltrantes del tumor en mujeres con lesiones intraepiteliales escamosas del cérvix o CaCU. Las células T fueron evaluadas mediante proliferación celular, presencia del RNAm de citocinas Th1, Th2, Th3, y de la cadena zeta del receptor de linfocitos T. También se determinó la proporción de linfocitos T CD4 y de CD8 por citometría de flujo e inmunohistoquímica. Los resultados demostraron que al inicio de la enfermedad, la respuesta de las células T periféricas de mujeres con lesión intraepitelial es muy similar a la de mujeres sanas; excepto por la presencia del RNAm de la cadena zeta, cuya frecuencia disminuye significativamente conforme progresa la enfermedad. En mujeres con CaCU se observaron diversos cambios en la respuesta de linfocitos T periféricos e infiltrantes del tumor tales como: baja respuesta proliferativa, disminución en la frecuencia del RNAm de citocinas Th1 y de la cadena zeta; así como prevalencia del RNAm de citocinas Th2 (IL-4) y Th3 (TGF-beta1). Además, la proporción de linfocitos T CD8 fue mayor que la de CD4 en muestras de sangre y biopsias cervicales de mujeres con cáncer. Estos resultados demuestran que los linfocitos T en mujeres con CaCU presentan múltiples alteraciones funcionales, las cuales impiden una respuesta inmunológica adecuada en contra del virus del papiloma humano. De acuerdo a lo anterior proponemos que la enfermedad progresa debido a estas alteraciones inmunológicas, sin duda inducidas por la acción de las oncoproteínas virales. Estos hallazgos constituyen una base de referencia para futuros estudios de inmunoterapia y desarrollo de vacunas en los cuales se requiere conocer el comportamiento molecular, la distribución y abundancia de linfocitos T en las diferentes etapas de evolución a CaCU. 7 2 ABSTRACT The human papillomavirus is the etiologic and causal agent of cervical cancer (CC). Immunologic alterations favor viral persistence and consequent CC development. In this work, we analyzed molecular performance of peripheral and tumor infiltrating T lymphocytes in women with squamous intraepithelial lesions of the cervix or CC. T cells were evaluated by cellular proliferation, presence of mRNA for Th1, Th2, Th3 cytokines and of the CD3 zeta chain from the T cell receptor. The proportion of CD4 and of CD8 T cells was determined by flow cytometry and immunohistochemistry. The results demonstrated that at the beginning of the illness, peripheral T cells response in women with intraepithelial lesions is very similar to that observed in T cells from healthy women, except for the presence of CD3 zeta mRNA whose frequency diminished significantly according to the illness progression. Different changes were observed in peripheral and tumor infiltrating T cell response in women with CC such as low proliferation, diminished frequency of Th1 cytokines and CD3 zeta mRNA, as well as in the prevalence of Th2 (IL-4) and Th3 (TGF-beta1) cytokines mRNA. Additionally, the proportion of CD8 T lymphocytes was higher than CD4 cells in samples from blood and cervical biopsies of women with cancer. These results demonstrated that T lymphocytes in women with CC have functional alterations that cause an inefficient immunological response against the human papillomavirus. Based on this, we propose that CC progression is due to these immunological alterations undoubtedly induced by the action of viral oncoproteins. These findings will be useful for future studies in immunotherapy and vaccines that require knowledge of the molecular performance, distribution and proportion of T cells during different stages of CC. 8 3 INTRODUCCIÓN 3.1 Cáncer cervicouterino (CaCU) 3.1.1 Aspectos epidemiológicos y generalidades El cáncer cervicouterino es considerado en el 2002 como el segundo cáncer común en mujeres de todo el mundo; con un registro de 493,000 casos y 274,000 muertes.1 Figura 1. Se estima que de los 493,000 casos diagnosticados con CaCU; 83,400 provienen de países desarrollados y 409,400 de países en vías de desarrollo.2 Figura 1. Números estimados de casos de cáncer (incidencia) y de muertes (mortalidad) en el 2002.1 El análisis estadístico de tasas estandarizadas por edad en el 2008 ubica al CaCU en el tercer lugar de los canceres más comunes en mujeres, con una estimación de 530,000 nuevos casos (76,000 en países desarrollados y 453,000 de países en vías de desarrollo) y 275,000 muertes. La prevalencia de este cáncer ha disminuido en los países desarrollados debido a la implementación de programas de diagnóstico temprano; sin embargo, continúa presentándose una alta incidencia en Oriente-Occidente y Sur de África, en Melanesia, Sur-Centro de Asia, América latina y en el Caribe (http://globocan.iarc.fr/factsheets/cancers/cervix.asp#MORTALITY). En una 9 reunión convocada en Mayo del 2008 por la Organización Mundial de la Salud (OMS), la Organización Panamericana de la Salud (OPS), el Instituto de Vacunas Sabin, y los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades de Estados Unidos (CDC), se estimó que 33,000 mujeres mueren cada año en América Latina y el Caribe por CaCU (http://www.paho.org/spanish/dd/pin/ps080514.htm). El número de casos en México para 1996 fue de 15,312; que represento el 18.1 % de los tumores malignos totales.3 En el 2000, se estimaron 6650 muertes en México, considerándose a este país como el segundo con más casos en Latinoamérica después de Brazil.4 Los nuevos casos y muertes para el 2008 fueron de 10,186 y 5061, respectivamente (http://globocan.iarc.fr/factsheets/cancers/cervix.asp#MORTALITY). 3.1.2 Histopatología El CaCU se origina como resultado de una serie de alteraciones genéticas que regulan la proliferación celular y apoptosis desestabilizando así la homeostasis celular. Esta neoplasia se genera en una zona de alto riesgo de transformación displásica, la zona escamocolumnar o de transición; en la que se unen el epitelio cilíndrico glandular del endocérvix y el epitelio plano pluriestratificado no queratinizado del ectocérvix. Este sitio de unión se caracteriza por tener una gran actividad de proliferación y de remodelación debido al continuo efecto de hormonas ováricas, coito, menarca, embarazo, reacciones inflamatorias, traumas físicos, que provocan un cambio del epitelio cilíndrico al epitelio plano denominado metaplasia.5 Normalmente el CaCU comienza con lesiones locales limitadas al epitelio que son anormalidades histológicas denominadas lesiones intraepiteliales escamosas (LIE) o neoplasias intraepiteliales cervicales (NIC). De acuerdo al sistema de Bethesda, las LIE de bajo grado (LIEBG), corresponden a un condiloma, displasia leve, coilocito o NIC I; y las de alto grado (LIEAG) son la displasia moderada/severa, NIC II-III y carcinoma in situ (que presenta un aumento de células, núcleos atípicos y falta de diferenciación del tejido).6 Se estima que aproximadamente 20% de los NIC I progresaran a NIC II, y que el 30% de estas lesiones puede progresar a una lesión más severa si no se somete a un tratamiento. Además, el 40% de las NIC III puede progresar a CaCU.7 Cuando las células neoplásicas rompen la membrana basal se produce la invasión del estroma conocida como carcinoma invasor. Los estadios del CaCU se clasifican en I-IV de acuerdo a la Federación Internacional de Ginecología y Obstetricia (FIGO 2002, http://www.biocancer.com/journal/211/cancer-de-cervix). Tabla 1, Figura 2. 10 TABLA 1. ESTADIOS DEL CaCU. TNM* FIGO DESCRIPCIÓN Tis Estadio 0 Carcinoma in situ, carcinoma intraepitelial. T1 Estadio I Carcinoma confinado estrictamente al cuello uterino (no debe tomarse en cuenta la extensión hacia el cuello uterino). T1a Estadio IA Carcinomas preclínicos del cuello uterino, diagnosticados solo por microscopio. T1a1 Estadio IA1 Invasión del estroma <3mm a partir de la base del epitelio, ya sea superficial o glandular desde el cual se origina y no >7mm de ancho. T1a2 Estadio IA2 Invasión del estroma <3mm en profundidad pero no >5 mm, y no debe exceder de >7mm de ancho. T1b Estadio IB Lesiones preclínicas de mayor extensión que el IA o tumores clínicos limitados al cérvix. T1b1 Estadio IB1 Lesiones de 4 cm o menos. T1b2 Estadio IB2 Lesiones que miden más de 4 cm (en forma de barril o bulky) T2 Estadio II El carcinoma se extiende más allá del cuello uterino, pero sin alcanzar la pared pélvica. El carcinoma afecta la vagina, sin llegar al tercio inferior de esta. T2a Estadio IIA No hay afección paramétrica. Pueden afectase hasta 2/3 superiores de la vagina. T2b Estadio IIB Hay afección paramétrica manifiesta, sin llegar a la pared pélvica. T3 Estadio III El carcinoma se ha extendido hasta la pared pélvica (a la exploración rectal no se encuentra espacio libre de cáncer entre el tumor y la pared pélvica), el tumor abarca al tercio inferior de la vagina, existe hidronefrosis o insuficiencia renal. T3a Estadio IIIA No hay extensión hacia la pared pélvica, pero si a 1/3 inferior de la vagina. T3b Estadio IIIB Extensión hacia la pared pélvica, hidronefrosis o insuficiencia renal. T4 Estadio IV El carcinoma se ha extendido más allá de la pelvis verdadera o afecta desde el punto de vista clínico a la mucosa de la vejiga o recto. El edema bulloso, como tal, no permite que un caso se incluya IV. N1 Estadio IVA Extensión del crecimiento hacia los órganos adyacentes. M1 Estadio IVB Extensión hasta órganos a distancia. *TNM equivale a las siglas de “Tumor, Node, Metastasis” de acuerdo al Comité Estadounidense de la Unión Internacional contra el Cáncer (American Joint Committee on Cancer, AJCC, 2002). 11 Figura 2. Clasificación de la FIGO. Representación de la extensión del CaCU. Estadio I: carcinoma confinado al cérvix. Estadio IIa y IIIa: carcinoma invasor en vagina. Estadio IIb y IIIb: carcinoma con infiltración de parametrios y extensión hacia pared pélvica. www.biocancer.com/journal/211/cancer-de-cervix. En México, el tipo de CaCU más frecuente es el escamoso o epidermoide (>90%), que se inicia en la región del epitelio escamoso del ectocérvix. A este grupo pertenecen los carcinomas no queratinizantes de células grandes (70%), los queratinizantes (21%), y los de células pequeñas (~4%). El adenocarcinoma del endocérvix representa con este último el 4%.8 3.1.3 Manifestaciones clínicas y tratamiento La enfermedad pre-invasiva puede ocurrir sin producir síntomas y generalmente es detectada en los estudios citológicos del cérvix por Papanicolaou y colposcopia. Cuando la enfermedad es invasiva, se presenta un sangrado vaginal anormal a veces oloroso después del coito o ducha vaginal. El dolor pélvico o por debajo de las costillas y por encima del íleon es signo probable de una hidronefrosis asintomática complicada con pielonefritis. También se presenta dolor en la ciática y edema en la pierna que están asociados con la metástasis del tumor. Las pacientes con tumores avanzados tienen hematuria o incontinencia de la fístula vesícula-vaginal causada por la invasión de la vejiga. Los casos de estreñimiento son debido a la compresión del recto por un tumor primario masivo. En estas pacientes, los estudios de Tomografía Axial Computarizada (TAC) de pelvis y abdomen, Cistoscopia, Rectoscopia, Radiografía de tórax, ayudan a definir el grado de avance de acuerdo al riesgo de diseminación.9 La elección del tipo de tratamiento para las lesiones pre-invasoras está determinada por el criterio clínico del especialista de acuerdo a la experiencia, los recursos, y la validación clínica de la paciente individual.10 Cuando existen lesiones pre-invasoras se puede utilizar crio-coagulación, diatermo-coagulación, conización en frío, conización asa LEEP (Loop Electrosurgical Excisional Procedure) y ablación con 12 láser. En casos de recidiva de una lesión de alto grado se realiza histerectomía. En lesiones invasoras se indica: conización (en casos etapificados como FIGO I A1, que desean preservar fertilidad), histerectomía radical, linfadenectomía pélvica, radioterapia externa con o sin quimioterapia concomitante, radioterapia intracavitaria.9, 11-12 3.1.4 Factores de riesgo y alteraciones genéticas La presencia del genoma del virus del papiloma humano (VPH) en más del 99% de las biopsias provenientes de pacientes con CaCU13 y la alteración en diferentes procesos celulares mediada por las proteínas del virus (ver Tablas 2-5), sugieren que el VPH es la principal causa del desarrollo de lesiones pre-malignas y malignas del cérvix. Evidencias epidemiológicas reportan que solo los casos con infecciones persistentes por el VPH pueden progresar a CaCU, mientras que los estudios in vitro demuestran que las oncoproteínas virales E6 y E7 cooperan con oncogenes celulares para inducir la inmortalización y la transformación de las células epiteliales normales del huésped. Por lo que la presencia del VPH aunada a la acción de otros factores contribuye a la carcinogénesis del cérvix.14 Aún se desconoce si el VPH es el inductor de los cambios que favorecen el desarrollo del CaCU o si se asocia a otros factores desencadenando la enfermedad. Así, se ha demostrado que algunos cofactores exógenos y endógenos, junto con la infección por el VPH pueden influir en la progresión de la infección a CaCU; entre ellos, los partos múltiples, el tabaquismo y el uso de anticonceptivos orales por largos períodos.15 La co-infección con otros patógenos como el virus Herpes simplex y C. trachomatis también está asociada con el riesgo de CaCU en mujeres con infección persistente por el VPH de alto riesgo.16-18 Las personas inmunosuprimidas y las VIH positivas tienen mayor riesgo de infectarse con el VPH y desarrollar la enfermedad.19 La mayoría de edad, la carga viral alta, el inicio de la vida sexual a edad temprana, el número de parejas sexuales y el nivel socioeconómico bajo se asocian con un mayor riesgo de infección por VPH e indirectamente con el desarrollo de LIE y CaCU debido a la persistencia del virus.20 Otros estudios sugieren que en infecciones persistentes por el VPH, los nutrientes pueden conferir un efecto protector de neoplasias cervicales como son los folatos, el retinol y la vitamina E; posiblemente también los vegetales, las vitaminas C y B12, los alfa-carotenos, los beta-carotenos, el licopeno, la luteína/zeaxantina y la criptoxantina. Mientras que altos niveles de homocisteína en sangre se asocian con un alto riesgo de desarrollar neoplasias cervicales.21 13 Además de los factores anteriormente mencionados, diversos análisis moleculares y citogenéticos han demostrado que existen cambios genéticos que determinan el desarrollo del CaCU. Así, la pérdida de la función de genes es necesaria para originar una neoplasia. Se ha identificado pérdida de la heterocigosidad (mutaciones en ambos alelos del gene) en los brazos de los cromosomas 1q, 2q, 3q, 4p, 4q, 5p, 5q, 6q, 7q, 8p, 8q, 11q, 13q, 16p, 18p y 19p en el 20-33% de los tumores cervicales. Mientras que el porcentaje de tumores cervicales con pérdida de heterocigosidad en los cromosomas 6p, 3p, 18q, 11p y 17p es del 43, 39, 35, 16 y 15% respectivamente.22 Cabe resaltar que en el cromosoma 11 se encuentra el protoncogén H-ras-1.14 Mutaciones de este gen dan lugar a proteínas alteradas que contribuyen a la transformación celular maligna al provocar un aumento de la capacidad de invasión y metástasis del tumor, así como disminución de la apoptosis; al regular positivamente los niveles de expresión de las oncoproteínas E6 y E7 del VPH.23-25 Interesantemente, se observa que del 90% de los canceres cervicales con fenotipo-genotipo alterado del HLA clase I (complejo mayor de histocompatibilidad, MHC, conocido como antígeno de leucocitos humanos), el 70% es debido a múltiples alteraciones genéticas en el cromosoma 6p21.26 Así mismo, tres genes supresores de tumores se encuentran en la región terminal 5p15.3,27 conocidos como PDCD6 (cuya proteína ALG-2 es importante para el receptor de células T, de Fas, y de la muerte celular inducida por glucocorticoides),28 el gen TERT (del componente de la transcriptasa reversa de la telomerasa cuya disfunción promueve la inestabilidad de los cromosomas),29 y el gen TRIP13 (cuya proteína interactúa con el receptor hormonal de la tiroides y se une a la proteína E1 del VPH16).30 En esta misma región terminal se encuentra el gen POLS que codifica para la DNA polimerasa σ, la cual participa en la replicación del DNA y en la unión de las cromátides hermanas.31 Los análisis por Reacción en Cadena de la Polimerasa en Transcripción Reversa (RT-PCR, Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) semicuantitativo en líneas celulares derivadas de CaCU no muestran cambios en la expresión de estos genes,27 sin embargo, se ha visto que la delesión genómica en el brazo 5p correlaciona con vías de inactivación genética o epigenética de p53 (mutaciones y delesiones) y con infecciones del cérvix por el VPH.32 Otros eventos encontrados en los estadios avanzados del tumor son la amplificación de los genes PIK3CA,33 c-myc, ErbB234 y cIAP1;35 mutaciones en ras,34 y expresión disminuida de PTEN2936 y TSLC1.37 Cabe notar que existe una correlación en las alteraciones ocurridas entre c-myc y ras, que además son indicio de un pronóstico no favorable en las pacientes.38-39 Esta diversidad en los patrones de alteración genómica determinan los diferentes perfiles de riesgo y la patogénesis 14 molecular necesarios en el desarrollo del CaCU, y por lo tanto en el pronóstico y desenlace de la enfermedad.32 Sin embargo, cabe resaltar que la persistencia del VPH es crucial en el desarrollo del CaCU; ya que este virus para replicar su genoma modula el ciclo celular y a la vez ejerce mecanismos que le permiten escapar de la respuesta inmune del huésped, de la senescencia celular y de la apoptosis. De esta manera, el VPH contribuye directa o indirectamente a la inestabilidad genómica favoreciendo eventos genéticos de transformación y progresión hacia la malignidad.40 3.2 Virus del papiloma humano (VPH) 3.2.1 Características y clasificación del VPH Los virus del papiloma (VP) pertenecientes a la familia Papillomaviridae se han clasificado en base a las secuencias nucleotídicas del marco de lectura abierto del gen que codifica para la proteína L1 de la cápside viral. Se han descrito completamente 118 tipos de VP, de los cuales 96 infectan al humano.41 Figura 3. Figura 3. Electro-microfotografía del VPH. Superficie reconstruida del VPH-1 (izquierda) y representación de partículas virales (derecha) con los capsómeros en forma de estrella.42 http://images.search.yahoo.com/search/images?ei=UTF.8&fr=sfp&p=human+papillomavirus Las partículas del VP con diámetro de 52-55 nm, están compuestas por una cápside con simetría icosaédrica de 72 capsómeros, sin envoltura. Esta cápside consiste de dos proteínas estructurales: la mayor o L1 con peso molecular de 55 kDa (que representa ~80% de la proteína total del virus) y la proteína menor o L2 de ~70 kDa. La cápside contiene el genoma viral constituido por una molécula circular de DNA 15 de doble cadena de 7.8-8 kb dividido en 3 regiones: 1) una región no codificante conocida como región larga de control (LCR) o región regulatoria (URR) de ~1 kb; 2) una región temprana con marcos de lectura abierto de los genes E6, E7, E1, E2, E4, E5; y 3) una región tardía que codifica para L1 y L2 de la cápside.43 Figura 4. Figura 4. Organización del genoma del VPH16. El genoma de los diferentes tipos de VPH es altamente conservado. Las proteínas tempranas (E) son requeridas para la replicación del DNA y expresión de los genes virales. Las proteínas tardías (L) forman la cápside viral. Solo una de las dos cadenas de DNA sirve de templado para la expresión de los genes virales que codifican para varios transcritos de RNAm policistrónico. La transcripción es regulada por secuencias potenciadoras en la región regulatoria URR a la cual se unen factores celulares y la proteína E2 del virus. Los sitios de inicio de la transcripción varían dependiendo el tipo viral, pero todos los promotores dependen de la diferenciación de los queratinocitos.44 Las proteínas virales de expresión temprana regulan la replicación del DNA viral, el control de la transcripción y contribuyen en la transformación celular. Mientras que las de expresión tardía participan en el ensamblaje viral.44 Tabla 2. 16 TABLA 2. FUNCIÓN DE LAS PROTEÍNAS DE VPH DE ALTO RIESGO.44 ORF FUNCIÓN E1 Actividad de helicasa, ATPasa, proteína de unión de ATP esencial para la replicación viral. E2 Factor de transcripción viral. Se une a E1 para facilitar la replicación del DNA viral importante en el encapsidamiento del genoma. E4 Interactúa con las proteínas del citoesqueleto. Permite el ensamblaje viral. E5 Actividad transformante débil. Regula (+) los receptores del factor de crecimiento en la membrana celular. E6 Se une a p53 induciendo su degradación por ubiquitinación. Inmortaliza queratinocitos humanos junto con E7. E7 Se une a pRB y desregula los puntos de control del ciclo celular en las fases G1/S. L1 Proteína de la cápside mayor. L2 Proteína de la cápside menor. Especialmente, las proteínas E6, E7 y E1 regulan la expresión de genes heterólogos al interactuar con otras proteínas celulares, generando en conjunto con otros factores, un proceso de transformación e inmortalización de la célula epitelial.45 Tablas 3-5. TABLA 3. PROTEÍNAS CELULARES QUE SE UNEN A E6.46 PROTEÍNA CELULAR BLANCO FUNCIÓN CELULAR DE LA PROTEÍNA BLANCO POSIBLES CONSECUENCIAS DE LA INTERACCIÓN PARA LA CÉLULA AMF-1/Gps2 Incrementa la actividad de p300. Supresión de Gps2. Activación de la transcripción. Bak Miembro de la familia Bcl-2; proteína pro-apoptótica. Efecto anti-apoptótico CBP/p300 Coactivador de p53. Activación de genes de control del ciclo celular, de la diferenciación y de la respuesta inmune. Regulación negativa de la transcripción dependiente de p53. c-Myc Factor de transcripción; inducción de apoptosis. Impedir la apoptosis dependiente de c-Myc. E6AP Regulación de la transducción de señales en células en proliferación mediante la degradación de la cinasa Blk de la familia src. Desregulación de estas señales de transducción. Factor esencial para la actividad degradativa de E6. E6TP1 Proteína activadora de la GTPasa (GAP) – Regulador negativo de Rab. Inhibición de la señal mitogénica mediada por Rab. ERC55 (E6BP) Proteína de unión a calcio, participa en la diferenciación de las células epiteliales y en la inhibición de la apoptosis. Inhibición de la diferenciación terminal de células epiteliales. Inhibición de la apoptosis independiente de p53. hDLG/Sap97 Homólogo humano de la proteína supresora de tumores de los discos largos de Drosophila, importante en la formación de polaridad en células epiteliales en diferenciación. Formación y mantenimiento de las uniones intercelulares. Afecta la adhesión celular, polaridad y proliferación, lo que contribuye a la actividad invasora de las células transformadas. HScrib Homólogo humano de la proteína supresora de tumores Scrib de Drosophila, que controla la formación de las uniones intercelulares epiteliales e inhibe el crecimiento celular. Pérdida de la adhesión celular y de la polaridad. 17 Factor regulatorio 3 del interferón Inducción del RNAm del interferón. Transactivador de los interferones. Respuesta celular inadecuada a la infección viral (no hay interferencia con la replicación viral, ni incremento de MHC-I, ni activación de las células NK. MAGI – 1/2/3 Proteínas de la unión estrecha; formación de complejo con β- catenina. Regulador del supresor de tumores PTEN. Afecta la señalización Akt. Inhibición de la apoptosis independiente de p53. Mcm7 Iniciación de la replicación del DNA. Omisión del punto de arresto en G1. Posible modulación de la abundancia de Mcm7. Mupp1 Proteína de andamio con múltiples sitios PDZ. Posible papel en la transducción de señales. Ruptura del ensamblaje de los complejos de señalización en las membranas de las células epiteliales. Paxilina Proteína de adhesión focal; participa en la adhesión celular y en la regulación del citoesqueleto de actina. Ruptura del citoesqueleto de actina y de las interacciones de la matriz celular. p53 Proteína supresora de tumores. Presenta relación con la respuesta inmune celular al regular los eventos mitogénicos. Pérdida del control del ciclo celular. Efectos anti-apoptóticos. XRCC1 Proteína de reparación del DNA. Interferencia con la eficiencia de reparación. TABLA 4. PROTEÍNAS CELULARES QUE SE UNEN A E7.46 PROTEÍNA CELULAR BLANCO FUNCIÓN CELULAR DE LA PROTEÍNA BLANCO POSIBLES CONSECUENCIAS DE LA INTERACCIÓN PARA LA CÉLULA Miembros de la familia AP1 Factores de transcripción Pérdida de la actividad de IRF-1 α-glucosidasa Enzima del control glucolítico Activación alostérica que consume las reservas de glucógeno. Promoción de hiperproliferación celular Ciclina A, Ciclina E Actividad de cinasa Activación de ciclina A y E Cinasa de la histona H1 Actividad de cinasa Interferencia con la transición G2/M del ciclo celular HTid-1 Homólogo al supresor de tumores de Drosophila Tid56 DnaJ, modulador de la apoptosis Activación de los promotores que responden a E2F IGFBP-3 (proteína de unión al factor de crecimiento tipo insulina) Blanco transcripcional de p53 que limita la disponibilidad de IGF Decremento en la cantidad de IGFBP IRF-1 (Factor transcripcional inducido por el interferón-γ) Regula la expresión de IFN-β Inhibición de la activación del promotor del IFN-β mediada por el IRF-1, a través de una deacetilasa de histonas Mi2β Deacetilasa de histonas Pérdida de la actividad transcripcional de IRF-1 Mpp2 Factor de transcripción Carente actividad de IRF-1 M2 piruvato-cinasa (M2-PK) Modulación de la actividad de la enzima glucolítica M2 Cambio de la forma tetramérica de alta afinidad por su sustrato al estado dimérico de baja afinidad de la M2- PK Prb Regula el ciclo celular al unirse al factor de transcripción E2F Fosforilación de pRB y subsecuente liberación de E2F que induce ubiquitinación y degradación Proteínas pocket asociadas a Prb Regula el control del ciclo celular Pérdida del control del ciclo celular y activación de genes específicos para la progresión del ciclo celular P21CIP-1 Inhibidor de cinasas dependientes de ciclinas Estimulación del crecimiento mediante la pérdida del control del ciclo celular P27KIP-1 Inhibidor de cinasas dependientes de ciclinas Estimulación del crecimiento mediante la pérdida del control del ciclo celular 18 p48 Proteína reguladora de interferón (componente de unión al DNA de ISGF3). Proteína mensajera Inhibición de las vías de señalización del interferón por medio de la translocación de p48 a núcleo debido a la estimulación con IFN-α ATPasa subunidad 4 Subunidad S4 del proteosoma 26S Degradación de pRB mediante la unión directa al proteosoma TAF110 (Factor asociado a la proteína de unión a la caja TATA) Co-activador en la regulación del inicio de la transcripción Modulación de la transcripción TBP (Proteína de unión a la caja TATA) Involucrada en el inicio de la transcripción Interferencia con la activación de los promotores que responden a p53 TABLA 5. PROTEÍNAS CELULARES QUE SE UNEN A E1.46 PROTEINA CELULAR BLANCO FUNCION CELULAR DE LA PROTEINA BLANCO POSIBLES CONSECUENCIAS DE LA INTERACCION PARA LA CELULA DNA Polimerasa á (DNA-Pá), subunidades p70 y p180 Replicación Atracción hacia el complejo de iniciación, una vez liberado E2 ESPECIE RPA Replicación Estabilización de la cadena sencilla, una vez abierto el dúplex Histona H1 (58) Empaquetamiento de la cromatina Descondensación de la cromatina por delante de la horquilla de replicación Ini1/hSNF5 (59) Regulación de la transcripción al remodelar la cromatina Contribución de SWI / SNF en la replicación al remodelar la cromatina Chaperona Hsp40 y Hsp70 (54) Maduración de proteínas Promoción de unión de E1 al DNA, formación de hexámeros dobles en el Ori Todos estos reportes hacen evidente la implicación que tiene el VPH en el desarrollo de la enfermedad al interferir en diversos procesos celulares mediante la interacción de sus proteínas virales con proteínas del hospedero. Los VPH son específicos de especie y con una historia natural de la infección diferente dependiendo del tipo viral.47 El análisis filogenético de una región nucleotídica del gen E6 de 24 VPH agrupa a estos virus de acuerdo a su tropismo por un tejido específico y al potencial oncogénico en 2 grupos: virus que infectan la piel y los que infectan las membranas de mucosas.48 Mientras que la relación entre el grado de lesión en el cérvix y la presencia de un tipo de VPH define a los VPH en 4 categorías: los de bajo riesgo (VPH 6, 11, 42, 43, 44) presentes en lesiones cervicales de bajo grado; los de riesgo intermedio (VPH 31, 33, 35, 51, 52, 58) presentes en lesiones cervicales prioritariamente de alto grado; los de alto riesgo/VPH16 asociados con lesiones de alto grado y cáncer; y los de alto riesgo/VPH18 (VPH 18, 45 y 56) más frecuentes en carcinomas invasores.49 De acuerdo a lo evaluado por la International Agency for Research on Cancer (IARC) en el 2005, los tipos virales involucrados en el desarrollo del CaCU son los virus HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 66. 19 El VPH16 juega un papel causal en el cáncer de vulva, vagina, pene, ano, cavidad oral y orofaringe, y una limitada asociación con el cáncer de laringe y piel periungal.2 Este virus se ha asociado con tumores queratinizantes de células grandes y una menor tasa de recurrencia. Mientras que el VPH18 se asocia más con adenocarcinomas o carcinomas adenoescamosos, pobremente diferenciados, con un comportamiento más agresivo; por lo que presenta una alta incidencia de metástasis hacia los nódulos linfáticos, pobre respuesta al tratamiento y una alta tasa de recurrencia de la enfermedad.50-54 La infección por el VPH es asintomática y puede pasar inadvertida clínicamente, e incluso desaparecer en varios meses, o persistir (en 15% de los casos). Dependiendo del tipo viral y de los tejidos infectados, la persistencia de los VPH puede conducir a diversas alteraciones entre ellas, la formación de verrugas, neoplasias intraepiteliales e incluso carcinomas.47, 55 A nivel celular, la infección por este virus se caracteriza por la presencia de coilocitos mono y binucleados, vacuolización citoplásmica prominente, disqueratocitos de citoplasma queratinizado con núcleos grandes e irregulares.56 3.2.2 Ciclo del VPH El ciclo viral está ligado al proceso de diferenciación de los queratinocitos. El virus infecta a estas células en las capas basales del epitelio, posteriormente estas células infectadas se diferencian en las capas intermedias del epitelio donde se producen altos niveles de proteínas virales y en las capas superficiales ocurre el ensamblaje del virus.57 Al inicio de la infección, las abrasiones o lesiones microcutáneas favorecen que el VPH tenga acceso a las células basales del epitelio, que se encuentran en proliferación y son más susceptibles a la infección por este virus. Se ha demostrado que los virones del VPH16 se unen al Heparán Sulfato ubicado en la superficie celular58-60 a través de la proteína viral L1.61 Esto desencadena cambios conformacionales en la proteína L2 de la cápside lo cual expone el extremo amino de esta proteína a la acción enzimática de la convertasa de pro-proteínas furina, conocida como PACE (Paired basic Amino acid Cleaving Enzyme).62 La proteólisis de L2 expone sitios ocultos de L1 que son necesarios para que el virus pueda unirse a los receptores putativos de adhesión celular α6β1 y α6β4, pertenecientes a la familia de las integrinas.63-64 El mecanismo de entrada a la célula de la mayoría de los VPH es por endocitosis mediada por clatrina; sin embargo, los VPH 16, 31 y 58 tienen diversos mecanismos de infección.65-67 Las partículas virales se desensamblan en los endosomas tardíos o lisosomas, y el DNA es conducido al núcleo con la ayuda de la 20 proteína viral L2. Los transcritos virales pueden detectarse 12 h después de la infección, incrementándose con los días. Posteriormente se lleva a cabo el ensamblaje y liberación de los viriones.66,68 El VPH inicia su ciclo infectivo con un DNA circular de bajo número de copias.57 Manteniéndose así y probablemente en un estado de latencia en las células basales en división. Las células infectadas en las capas parabasales entran en una fase proliferativa en la cual el DNA viral está en forma episomal y la expresión de los genes virales tempranos es mínima, especialmente la de E6 y E7, que se encuentran reprimidos por E2.69-70 Al parecer, existe replicación del DNA viral durante la fase S del ciclo celular inducida por las proteínas tempranas del virus E1 y E2, que son las primeras en expresarse. Estas dos proteínas forman un complejo que se une al origen de replicación viral reclutando polimerasas y proteínas accesorias de la célula para que se lleve a cabo la replicación del DNA viral en sincronía con el de la célula.71-73 El establecimiento del genoma viral está asociado con la expresión de transcritos tempranos del VPH que codifican para las oncoproteínas E6, E7 y E5 y para las proteínas E1 y E2.74 E2 juega un papel crucial en la segregación del genoma generándose cerca de 50 a 100 copias virales por célula.75 Durante la división de las células infectadas, una de las células hijas continua dividiéndose promoviendo la replicación del DNA viral en el estrato basal y parabasal; mientras que la otra célula migra a la región intermedia correspondiente al compartimento de diferenciación.57,74,69 Aquí, las proteínas E6 y E7 del virus al interaccionar con las proteínas celulares p53 y pRB respectivamente, inhiben el arresto del ciclo celular y alteran el proceso normal de diferenciación activándose así el promotor del virus.76 E7 reactiva la maquinaria de replicación de DNA de la célula huésped favoreciendo la replicación viral.77 Así, existe mayor replicación del DNA viral, expresión masiva de los genes virales tempranos y tardíos; y amplificación del número de copias virales hasta al menos 1000 copias por célula.78 Por último, en las capas superiores del epitelio, se observa que cesa la producción de las oncoproteínas virales E6 y E7 y se expresa la proteína E4, la cual participa con las proteínas L1 y L2 en el ensamblaje de las partículas virales. Posteriormente los viriones serán liberados por las células senescentes o en descamación.57,69,79-81 Por lo que el virus no requiere de lisar o necrosar a la célula para propagarse e infectar a nuevos individuos. Figura 5. 21 Figura 5. Ciclo productivo del VPH16. El ciclo infectivo es dependiente del programa de diferenciación de los queratinocitos, los virus infectan la capa basal del epitelio y solo en los queratinocitos diferenciados se ensamblan las partículas virales.44 Este ciclo de replicación viral ocurre en alrededor de tres semanas. Sin embargo, cuando la infección por el VPH de alto riesgo es persistente y no se completa el ciclo viral, se originan lesiones del epitelio en lapso de semanas o meses. En las LIEBG el genoma viral se encuentra generalmente en forma episomal, mientras que en lesiones avanzadas o cáncer se integra al DNA de la célula huésped.82 La integración del DNA viral ocurre frecuentemente con delesiones grandes de DNA,83 lo cual rompe el marco de lectura de E2 que provoca la pérdida de su función transcripcional represora, por lo tanto, existe expresión desregulada de las oncoproteínas E6 y E7. Como se mencionó anteriormente, estas proteínas al unirse a diversas proteínas celulares favorecen la acumulación de cambios genéticos y en conjunto con otros factores el desarrollo del CaCU.84-85 Esto representa el fin del ciclo viral, debido a que ya no se producen viriones infecciosos y se puede observar que las células en proliferación y con presencia de E6 y E7 ocupan gran parte del epitelio en LIEAG severas.69,74 Figura 6. 22 Figura 6. Modelo de la infección productiva y no productiva del VPH. El virus infecta las capas basales del epitelio. Las proteínas E6 y E7 se representan como círculos rojos y se expresan en las capas basales, parabasales e intermedias del epitelio. Los círculos azules representan los núcleos de células no infectadas o no permisivas. Las células en verde expresan E4. Los núcleos de células que expresan L1 se representan en naranja, mientras que los núcleos color turquesa solo contienen el DNA viral amplificado. Este modelo indica que al igual que en una infección productiva, en las capas superficiales de una LIEBG (NIC-I) se observan regiones con expresión de proteínas requeridas para el ensamblaje viral como E4, L1, L2; mientras que en LIEAG severas (NIC-III) en donde el ciclo viral no se completa, estas proteínas son escasas y existe mayor expresión de E6 y E7 en gran parte del epitelio. 69,74,79 3.3. Respuesta inmune en lesiones del cérvix y CaCU 3.3.1 Características generales de la inmunidad El tracto genitourinario en mujeres al igual que los demás sistemas de mucosas, responde ante la constante presencia de antígenos extraños. El mecanismo exacto por el cual el VPH infecta el estrato basal del epitelio del cérvix y activa la respuesta inmune de mucosas y sistémica en las pacientes infectadas no se ha esclarecido. Sin embargo, se supone que la primera barrera de defensa ante el VPH en el tracto genital son las células epiteliales de la mucosa vaginal o queratinocitos;86 que se encuentra reforzada por otros elementos de la inmunidad natural local como son los bacilos de Doderlein, la acidez vaginal, el moco cervico vaginal, y secreciones de β-defensinas (péptidos con actividad bactericida y antiviral) por las mismas células epiteliales.87-88 Estas células también producen citocinas (GM-CSF, IL-1β, TNF-α e IL-10) y quimiocinas (MIP-3α y RANTES) que ayudan a la migración, activación y diferenciación de células de la inmunidad innata (células de Langerhans, macrófagos, células asesinas naturales o NK, neutrófilos) y a la activación de la respuesta inmune 23 adaptativa específica mediada por células T y B.89-393 En la activación de estas células también participan los receptores tipo Toll (TLR). Estos receptores se expresan en diversas células (células dendríticas, macrófagos, monocitos, células B y T, células epiteliales, fibroblastos), confiriéndoles capacidad para alertar al sistema inmune al reconocer patrones moleculares asociados a los patógenos (PAMPs). Estos productos derivados de patógenos actúan como ligandos de los TLRs específicos para componentes de la pared celular, proteínas, ácidos nucleicos o compuestos químicos sintéticos.94-97 La infección por el VPH no produce un daño o alteración celular evidente, así, en mujeres aparentemente sanas, el virus se encuentra en un estado latente en el cual no se generan partículas virales que sean reconocidas por la respuesta inmune innata. Posteriormente, al final de la etapa productiva del virus, los virones se liberan debido al proceso de descamación de las células epiteliales y pueden desencadenar una respuesta inmune innata y adaptativa. De esta manera la infección es detectada clínicamente. De acuerdo a lo que se conoce sobre las infecciones virales, las células de Langerhans o dendríticas inmaduras de la epidermis son capaces de captar y procesar a los antígenos virales en el sitio de la infección. Posteriormente, estas células en proceso de maduración migran a través de los vasos linfáticos hasta los ganglios linfáticos cercanos. Ahí, las células dendríticas maduras actúan como células presentadoras de antígeno profesionales (CPA) exponiendo en su superficie los péptidos antigénicos virales asociados al MHC. El reconocimiento de estos péptidos activa a las células T antígeno específicas las cuales después de un período de proliferación y diferenciación podrán ejercer su función para eliminar a las células infectadas.98-101 La expresión del MHC es muy importante ya que de ello depende la presentación de antígenos por las CPA y el reconocimiento de estos por las células T. Las moléculas del MHC-I presentan preferentemente pequeños péptidos antigénicos derivados de proteínas endógenas, que son generados por la degradación de proteínas en el citosol, posiblemente por la acción del complejo proteosomal.102-103 Estos péptidos son translocados al retículo endoplásmico por los transportadores asociados con la presentación de antígenos (TAP).104-106 Posteriormente el complejo MHC-I/péptido es presentado en la superficie de las CPA a las células T CD8+, lo cual activa a estas células cuya actividad citotóxica eventualmente conducirá a la destrucción de la célula infectada.101-102,106 La expansión de células T citotóxicas in vivo depende de IL-2 y otras citocinas producidas por las células T CD4+ ayudadoras (Th), las cuales son activadas al 24 reconocer antígenos endógenos o exógenos opsonizados asociados al MHC-II, el cual se expresa en las CPA. Los linfocitos T vírgenes CD4+ y CD8+, una vez activados son atraídos posteriormente al sitio de la infección en donde cumplen su función dependiendo de la estirpe celular.101 Figura 7. Figura 7. Reconocimiento de los antígenos virales y respuesta de células T. Los antígenos son procesados y presentados en asociación con el MHC por las CPA. Las células T CD4+ reconocen los péptidos procesados y se activan produciendo citocinas que activan tanto a las CPA como a las células CD8+. Estas últimas reconocen los péptidos virales asociados al MHC-I en las células infectadas, eliminándolas. Las células infectadas también secretan citocinas que ayudan a las células vecinas a evitar una infección por el virus.101 Las células T citotóxicas CD8+ eliminan a los tumores o células infectadas por virus mediante un mecanismo de citotoxicidad antígeno específico, induciendo a las células blanco al proceso de apoptosis mediante la liberación de gránulos de perforina y granzima (también se pueden liberar TNF-α y linfotoxina-“TNF-β”), o a través de la interacción de ligando de Fas (en el linfocito) y su receptor (en la célula blanco). La mayoría de las células T citotóxicas son CD8+, sin embargo, cerca del 10% son CD4+ y su mecanismo de citotoxicidad es principalmente a través de FasL. Mientras que las células NK utilizan sus gránulos.107 Figura 8. 25 Figura 8. Mediadores de la fase lítica de linfocitos T. Después del reconocimiento de antígeno a través del TCR se pueden activar dos vías independientes de citotoxicidad mediada por células T, que finalmente conducen a la muerte de la célula blanco: la liberación de gránulos que contienen perforina y granzima; y la activación de apoptosis a través de FasL- Fas. TNF e IFN-γ pueden contribuir a este efecto citotóxico.107 .www.inmunologiaenlinea.com # Editor: José Peña Martínez Por otra parte, dependiendo de la respuesta inmune primaria, del microambiente y de las señales recibidas de ciertas citocinas, las células T CD4+ se pueden diferenciar a su vez en tres o cuatro clases diferentes y secretar diversos patrones de citocinas regulando una respuesta inmune eficiente contra el patógeno Figura 9. Así, las citocinas IFN-γ e IL-12 inducen la diferenciación de células CD4+ Th1 productoras de IFN-γ, lo cual favorece la eliminación de patógenos intracelulares. Sin embargo, en presencia de IL-4 se diferencian células Th2, que producen IL-4, IL-5 e IL-13 y median una respuesta inmune contra helmintos.108 Cuando predominan IL-6 en conjunto con TGF-β e IL-23 se genera un linaje recién descrito denominado Th17, que induce la producción de quimiocinas por células epiteliales y del estroma para reclutar neutrófilos al sitio infectado por bacterias extracelulares y hongos.109 En ciertas condiciones, TGF-β o IL-10 inducen la diferenciación de células T CD4+ reguladoras (Treg), que regulan la respuesta inmune por diferentes mecanismos.110-112 26 Figura 9. Diversificación de linfocitos T CD4+. Las células vírgenes post tímicas, precursoras de linfocitos T CD4 (Tn) y las células precursoras tímicas (Tp) se diferencian en diversos linajes de linfocitos T CD4 dependiendo del predominio de ciertas citocinas (flechas). Las células diferenciadas dependiendo de la estirpe celular producen citocinas efectoras o supresoras. Particularmente las células T reguladoras naturales (nTreg) presentan un mecanismo de supresión contacto dependiente. La flecha punteada representa un linaje aún no definido. 109 Otro componente de la respuesta inmune adaptativa que se activa por una infección viral son los linfocitos B, los cuales se diferencian en células plasmáticas productoras de anticuerpos y en células de memoria capaces de reconocer al virus en posteriores infecciones. Los anticuerpos neutralizan al virus al unirse a él e impedir su entrada a la célula blanco; y promueven el proceso de fagocitosis o internalización del virus opsonizado en CPA. El cambio de tipo de inmunoglobulinas en células B está regulado por el origen de estas células, la presencia de citocinas y otras señales recibidas por ellas. Así, en ratón, IL-4 induce IgG1 e IgE (IgE e IgG4 en humano), IL-5 aumenta la producción de IgA, IFN-γ induce IGg3 e IgG2a, mientras que TGF-β induce IgG2b e IgA. IL-2 e IL-6 inducen o aumentan la cantidad de los diferentes tipos de IgG dependiendo de otras señales recibidas.113-116 La presencia de anticuerpos neutralizantes en suero de mujeres VPH16+ predomina en mujeres sin lesión, disminuye de acuerdo al grado de LIE y es nula en mujeres con CaCU. Por lo que estos anticuerpos determinan la regresión de las LIE de bajo grado.117 Sin embargo, la detección de estos anticuerpos es mayor en suero (78%) que en lavados cervicales (38%) de mujeres VPH16+.118 La detección de anticuerpos contra partículas virales L1 del VPH 16, 18, 31 y 45 en secreciones 27 cervico-vaginales y de VPH16 en suero ha permitido observar que la presencia de IgA e IgG varía dependiendo del compartimento en estudio, la infección persistente por el virus y el grado de avance de la enfermedad. Las IgA e IgG séricas que reconocen L1 de VPH16 son inducidas en mujeres con infección por el VPH16. También se encuentran presentes en mujeres con VPH 31,33, 35,58 pero no en aquellas positivas para VPH18 o 45.119 Las IgG séricas se pueden considerar como marcadores de una exposición continua al VPH16 a lo largo de la vida, mientras que la IgA lo es de una infección reciente o actual.120 También en las secreciones vaginales, la IgA está presente cuando existen infecciones actuales por VPH, mientras que la IgG se encuentra en pacientes de 40 a 49 años de edad, con infecciones persistentes del VPH y en aquellas con LIE o CaCU.121 Sin embargo, solo el 60-70% de las mujeres con infección o LIE presentan anticuerpos IgG anti-VPH16.119,122-123 La magnitud y frecuencia de IgA cervicales específicos contra VPH16 es más elevada en mujeres infectadas o con LIEAG.124 Interesantemente, la seroprevalencia de anticuerpos anti- VPH16 se presenta entre el 46 y 59% de mujeres con citología normal que fueron positivas para el DNA viral.122,125-127 Esta conversión se encuentra asociada con una mayor exposición antigénica, la cual está determinada por una carga viral alta (riesgo relativo de 5.7 para IgG) o por la infección persistente con el virus (riesgo relativo de 3.4 para IgA). El promedio de duración de ambos anticuerpos es de 36 meses.128 En mujeres con CaCU, la detección de anticuerpos contra las proteínas E6 y E7 de VPH16 o 18 es detectada en 53% de las muestras de suero. Interesantemente, la seroreactividad VPH específica coincide con el tipo viral detectado en las biopsias cervicales.129 Generalmente, la respuesta inmune local es capaz de controlar la infección por el VPH de manera que no se generan lesiones en el cérvix ni existen manifestaciones clínicas, o de lo contrario, estas pueden revertir sin desarrollarse un CaCU.130-132 Solo una pequeña fracción de las personas contagiadas, denominadas portadores crónicos o persistentes no elimina al virus y desarrolla CaCU.133 Esto es claramente demostrable en mujeres con inmunodeficiencia.134 Sin embargo, a pesar de los diferentes mecanismos de defensa que presenta el organismo para eliminar al virus, existen condiciones particulares, algunas de ellas mencionadas anteriormente, que determinan una infección persistente; entre ellas la acción de las oncoproteínas virales. 28 3.3.2 Alteraciones provocadas por el VPH en la respuesta inmune local Las oncoproteínas de los VPH de alto riego pueden interferir con la respuesta inmune local al alterar la expresión de proteínas como citocinas, quimiocinas y componentes del procesamiento de antígeno. Normalmente se pensaría que los queratinocitos infectados por el VPH activen el mecanismo de defensa antiviral mediado por los interferones tipo 1, IFN-α e IFN-β; con efecto anti-proliferativo, anti-angiogénico e inmunoestimulador, que sirve como conexión entre la respuesta inmune innata y la adaptativa.135 Sin embargo, en LIE y CaCU, los VPH de alto riesgo pueden regular negativamente la expresión de genes inducidos por IFN-α.136 Esto es claramente observado en ratones transgénicos con E6 de VPH16 en los que se inhibe la expresión de los genes homólogos Ifi203, Ifi202a, Irf1, Ifit2, Mx1 (myxovirus, gen de resistencia al virus de la influenza 1) y Oas2 (2'-5' oligo A de la familia de la sintetasa, que media el decaimiento del RNA como parte de la vía de inmunidad innata antiviral); así como del gen de la subunidad α del receptor de IFN-α (IFNAR2).137 E7 inhibe las señales de transducción mediadas por IFN-α al unirse al complejo P48/IRF-9 (factor regulador de interferón-9) previniendo así la formación del complejo transcripcional ISGF-3 (gen del factor-3 estimulado por interferón, o activador transcripcional inducido por IFN-α con múltiples cadenas polipeptídicas) que normalmente se une a los elementos de respuesta específicos para interferón (ISRE) en el núcleo.138 Además, la unión de E7 con IRF-1, favorece el reclutamiento de histonas deacetilasas al promotor de IFN-β.139 Esto se asocia con la baja expresión de genes inducidos por IRF-1 como TAP1 (del transportador asociado con la presentación de péptidos antigénicos-1), IFN-β y MCP-1 (de la proteína quimiotáctica de monocitos- 1).140 Interesantemente IL-10 (citocina anti-inflamatoria cuya expresión aumenta en CaCU) puede regular positivamente la transcripción de E7.141 E6 inhibe la señalización mediada por IFN-α al unirse a Tyk2 e impedir su unión a la región citoplásmica del receptor;142 y al unirse a IRF-3 inhibiendo la transcripción del RNAm de IFN-α.143 Además, esta oncoproteína reconoce indirectamente elementos reguladores en el promotor humano de TGF-β, citocina anti-inflamatoria con abundante expresión en los tumores cervicales144-145 que actúa como potente inmunosupresor de la respuesta inmune innata y adaptativa. Esta citocina presenta actividad inhibitoria de la proliferación epitelial, induce la expresión de genes que codifican para la matriz extracelular e inhibe la expresión de genes de metaloproteasas.146 E6 también puede inhibir la expresión de IL-18 y la señalización a través del receptor.147 IL-18 tiene diferentes funciones biológicas como son la estimulación de la actividad citotóxica de células T y NK, de proliferación de células T, inducción de IFN-γ, IL-2 y de GM-CSF por células T activadas.148-149 IL-12 e IL-18 29 actúan sinergísticamente en células T para inducir la producción de IFN-γ por lo que juegan un papel importante en la respuesta inmune contra el tumor y en los efectos protectores contra la infección de patógenos intracelulares incluyendo los virus.150-151. Ambas proteínas virales, E6 y E7, regulan negativamente tanto el promotor de IL-8 (quimiocina que atrae células T y neotrófilos) al disociar el complejo transcripcional;152 como la expresión de IFN-γ (inducida por IL-18) en células mononucleares y NK de sangre periférica al unirse a la porción extracelular de la cadena-α del receptor de IL-18.153 También las oncoproteínas virales suprimen la expresión de MCP-1154 e inhiben la transcripción del gen TLR9 (al reconocer una región reguladora del promotor),155 en líneas celulares y cáncer primario de células epiteliales del cérvix. TLR9 es un receptor presente en células B y células dendríticas plasmocitoides, que reconoce motivos CpG en DNA de doble cadena de bacterias y algunos virus, incluyendo DNA de E6 de VPH16. La señalización a través de este receptor induce la activación del factor transcripcional NF-κB y de factores reguladores de interferón (IRFS) regulando así la expresión de genes de citocinas como IFN- α/β.155-156 Por lo que las oncoproteínas virales además de favorecer el desarrollo de las células tumorales al unirse a diferentes proteínas de estas células, también pueden intervenir en procesos de maduración, diferenciación, función y migración de células de la respuesta inmune innata y adaptativa al regular la expresión de ciertas citocinas, quimiocinas y TLRs. Otra de las proteínas del virus, E5, interacciona con la subunidad de la ATPasa vacuolar H+ inhibiendo la acidificación de los endosomas y la degradación del receptor del factor de crecimiento epidermal en los compartimentos endosomales durante la endocitosis del receptor después de la estimulación con el ligando.157 Esta proteína viral también alcaliniza el complejo de Golgi interfiriendo con el transporte y expresión en la superficie celular del HLA-A y HLA-B que presentan los péptidos virales a los linfocitos T citotóxicos, pero no la de HLA-C y HLA-E, que son los ligandos que inhiben a las células NK.158 Incluso interfiere con la presentación de antígenos por el MHC-II al inhibir la degradación en los compartimentos endocíticos de la cadena invariante (li), que es una chaperona requerida para que el acoplamiento del péptido antigénico al MHC159 Por lo tanto, se observa que los péptidos inmunogénicos de E6 y E7 no son procesados ni presentados eficientemente por las células tumorales VPH+. Esto correlaciona con alteraciones en la maquinaria del procesamiento de antígeno como son expresión disminuida del HLA-I, de las proteínas 2 y 7 de bajo peso molecular que forman la subunidad del proteosoma (LMP); y de TAP 1 y 2 en líneas celulares y biopsias de carcinoma cervical.160-164 La pérdida parcial del HLA-I y la total de TAP1 se asocia con una menor sobrevida, mientras que la baja expresión de las subunidades 30 del proteosoma (excepto LMP10, calnexina y calreticulina) está asociada con un menor riesgo de metástasis linfogénica.164 Interesantemente, la progresión de las LIE en las pacientes se encuentra asociada con la pérdida del HLA.163 Así, las proteínas virales pueden regular directa o indirectamente la función y migración de células de la respuesta inmune; lo cual constituye otro mecanismo de evasión tumoral debido a la presencia del virus. Así, se observa que conforme progresa la enfermedad, la presencia de macrófagos infiltrantes del epitelio en el cérvix es casi nula.165 Esto correlaciona con una menor expresión del RNAm de la quimiocina MCP-1 y con la expresión del RNAm de E6 y E7 del VPH.166-167 Sin embargo, la presencia de macrófagos en el estroma del cérvix contribuye a la angiogénesis que favorece la metástasis hacia ganglios linfáticos de pacientes con CaCU.168 La síntesis de TNF-α (potente activador de células de Langerhans) disminuye cuando hay infecciones por VPH y esto se asocia con la menor expresión de la molécula coestimulatoria B7.1 debido a la escasa presencia de células de Langerhans durante la infección y en lesiones premalignas del cérvix.169-171 Se ha reportado que las proteínas E6 y E7 del VPH inhiben la transcripción de MIP-3α, quimiocina que atrae a células de Langerhans inmaduras.172 La baja expresión de moléculas de MHC-I en los tumores cervicales debido a la acción de E7173 impide la presentación de péptidos virales a las células T CD8+, lo cual teóricamente facilitaría la acción de células NK. Estas células con capacidad citolítica, producen citocinas (IFN-γ y TNF-α) que les permiten eliminar a las células tumorales o infectadas sin requerir presentación de antígenos.107 Figura 10. 31 Figura 10. Función de células NK. Estas células presentan dos receptores, uno activador y otro inhibitorio (KIR). Los receptores KIR reconocen al MHC-I en la célula blanco e inhiben la señal de citotoxicidad. Así las células NK solo ejercen su efecto citotóxico en células blanco que no presenten en su superficie el MHC-I.107 Sin embargo, se observa que en pacientes con estadios más avanzados del CaCU las células NK presentan menor actividad citotóxica.174 Esto podría explicarse por la disminuida expresión de receptores de activación en estas células como NKG2D, NKp30, NKp46, y por la abundante presencia en suero del ligando soluble de NKG2D, MICA.175-176 La acumulación de MICA en suero puede facilitar la internalización del receptor y su degradación en el lisosoma.177 Además, los receptores de las células NK pueden ser inhibidos por diferentes moléculas que se encuentran sobre-expresadas en los tumores cervicales como TGF-β, indolamina-2,3 dioxigenasa, prostaglandina E2, y por la acción de corticosteroides, 17-beta-estradiol y especies de oxígeno reactivas.178-182 Así, la regulación negativa de NKp30, NKp46 y NKG2D representa un mecanismo de evasión asociado a la baja actividad de las células NK, a la infección por VPH 16 y a la progresión del CaCU.183 De esta manera el virus puede evadir la respuesta de células NK, células T citotóxicas CD8+ y células T ayudadoras CD4+. 32 3.3.3 Linfocitos T y CaCU Como se menciono anteriormente, el VPH está implicado mediante la función de sus oncoproteínas en múltiples mecanismos que le permiten evadir la respuesta inmune innata y adaptativa; entre ellos se encuentra la alterada expresión del MHC. En este mismo contexto, existen alteraciones genéticas que se caracterizan por la pérdida del haplotipo HLA asociado con pérdida de heterocigosidad (50%), que incluye la pérdida de alelos A o B debido a mutaciones, y mutación en el gen β2-microglobulina. También se observa pérdida del antígeno total del HLA-I y retención de heterocigosidad (ROH, 10%), y regulación negativa del locus B o del HLA-A/B asociado con ROH y/o desbalance alélico (10%).26 Así, la expresión del HLA-I disminuye en 60% de las metástasis cervicales, mientras que la expresión del HLA-II aumenta en un 50% de estos casos.184 Esto repercute en la activación de los linfocitos T y su respuesta ante las células tumorales. Además, la presencia de TGF-β e IL-10 en los tumores provee un microambiente que no permite la diferenciación de células Th1,185-187 por lo que existe menor expresión de citocinas Th1 y mayor expresión de citocinas Th2 en el cérvix.188 TGF-β e IL-10 también afectan la producción de citocinas, la diferenciación y actividad citotóxica de células T CD8+, e inhiben la proliferación de células T dependientes de IL-2.189-190 Lo cual se refleja en una menor infiltración de las células Th1 y en la carente actividad funcional de las CD8+ en el microambiente tumoral del epitelio cervical.191 A nivel periférico también hay menor expresión de IL-2 e IFN-γ y mayor presencia de IL-10; mientras que existe controversia en la presencia de IL-4.192- 193. Este patrón de citocinas favorece una respuesta humoral más que la respuesta celular necesaria para la eliminación del tumor. También se observa que el fenotipo y función de las células T varía dependiendo del sitio anatómico donde se encuentren, del reto antigénico al que son expuestas y del grado de avance de la enfermedad. La proporción de células T CD4+ respecto a la de CD8+ es mayor en sangre periférica y ganglios linfáticos. Esta relación se invierte en el tejido tumoral.194 Inicialmente en lesiones NIC-I regresivas, las células T CD4+ predominan en el estroma y epitelio cervical, siendo el índice CD4+/CD8+ más alto que en lesiones persistentes NIC-I, NIC-II-III y CaCU. En lesiones con NIC-III ambas poblaciones se organizan en estructuras foliculares linfoides; mientras que en CaCU predominan las células T CD8+ y células de memoria CD45RO+ con respecto a las CD4+.195 Los resultados encontrados pueden variar de acuerdo al tiempo en que se toman las biopsias durante la enfermedad o por el marcador utilizado para detectar a las células. Así, se observa al inicio de un estudio longitudinal, mayor número de células NK y de linfocitos T CD8+ (ambos granzima B positivos) que de células T CD4+ y FOXP3+ en el epitelio de mujeres con LIEBG cuya lesión desaparece 33 posteriormente. Mientras que en el estroma prevalecen linfocitos T CD8+ respecto a células CD4+, FOXP3+ y NK. Al año de seguimiento hay más células CD8+ en el epitelio; predominio de células CD4+ y disminución de células FOXP3+ en el estroma.196 Interesantemente el aumento de células T reguladoras FOXP3+ en LIEAG y CaCU se asocia con persistencia de la lesión y con la respuesta de células T a E7 de VPH16.197-198 Cuando la lesión persiste o progresa a LIEAG, predominan las células CD8+ en epitelio y CD4+ en el estroma; pero el número de células granzima B+ disminuye en ambas regiones cuando la lesión progresa. Lo anterior demuestra que en lesiones regresivas existe una eficiente respuesta citotóxica de células NK y linfocitos T CD8+ en el epitelio, mientras que en lesiones persistentes o progresivas se encuentran principalmente linfocitos T CD8+ pero con baja actividad citotóxica.196 Las células Th tienen un papel crucial en la amplificación de respuestas citotóxicas específicas de las células T CD8+, por lo que la inadecuada activación de células Th específicas o su escasa presencia en el tumor conduce a una falla en la respuesta inmune antitumoral.199 Clínicamente se observa que las mujeres con bajas proporciones de células T CD4+ periféricas tienen mayor riesgo de desarrollar CaCU,200 mientras que en aquellas con CaCU la disminución correlaciona con un crecimiento rápido del tumor, metástasis hacia los ganglios linfáticos201 y una menor sobrevida de las pacientes.202 Por el contrario, el aumento en la densidad intratumoral de células T CD3+, CD4+ y CD8+ disminuye el riesgo de recurrencia en pacientes con estadio IB y IIA de CaCU que recibieron tratamiento.203 Especialmente un mayor número de células CD3+ infiltrantes del tumor se asocia con una mejor sobrevida después del tratamiento.204 Mientras que la presencia de células CD8+ intratumorales en CaCU correlaciona con la ausente metástasis hacia nódulos pélvicos e indirectamente con un mejor pronóstico.205 Otras características diferenciales son que las células T en ganglios linfáticos presentan el marcador de activación temprana CD25 (receptor de IL-2) y el de activación tardía HLA-DR; mientras que en el ambiente tumoral del cérvix son principalmente HLA-DR+.194 Respecto a la producción de citocinas, los linfocitos T periféricos de mujeres con CaCU presentan un patrón Th1; sin embargo, existe controversia en el patrón de citocinas que presentan los linfocitos infiltrantes del tumor185,194 La presencia de estos marcadores de activación en linfocitos T infiltrantes del tumor indican que estas células han recibido un reto antigénico y señales quimiotácticas que inducen su migración desde los ganglios linfáticos hasta el sitio de la lesión. Por lo anterior, diversos autores han tratado de esclarecer ex vivo si la respuesta de células T CD4+ periféricas específica para las proteínas completas o 34 péptidos virales de los antígenos E2, E5, E6, E7 y L1 del VPH16 está asociada con la regresión o progresión de la enfermedad en mujeres sanas o con LIE. También se han utilizado partículas semejantes al virus.206-221 La capacidad de respuesta se determina generalmente en base a la producción de IL-2, IFN-γ o IL-4.192, 210-211, 215, 222-225 La mayoría de estos estudios sugieren que la respuesta proliferativa y de producción de citocinas Th1 en células T CD4+ es deficiente en mujeres con CaCU comparada con lo observado en mujeres sanas que han eliminado la infección o lesión cervical. Se sabe que la respuesta de linfocitos T periféricos se eleva cuando la carga viral disminuye.226 Sin embargo, cuando las respuestas son prioritariamente Th2, se asocian a disminución en la sobrevida libre de enfermedad, y por lo tanto son indicativas de un mal pronóstico o recurrencia.227 Algunos autores reportan que ciertos epítopes de las proteínas virales desencadenan una respuesta protectora VPH específica que se asocia con un pronóstico favorable de la enfermedad. Así, cuando los linfocitos T CD4+ periféricos de mujeres con CaCU son estimulados in vitro con péptidos sintéticos de la región carboxilo terminal de E7 de VPH16 (aa 67-98), se observa que esta región es altamente inmunogénica, con un alto potencial de diagnóstico y terapéutico.211,215,222-225 Interesantemente, la respuesta de estas células a los péptidos (aa 71-85) de E7 de VPH16 correlaciona con la regresión de LIEAG. Estás células reconocen a los péptidos endógenos asociados al complejo HLA-DQB1*02 y presentan un fenotipo Th1 debido a que secretan IFN-γ y TNF-α, y en menor cantidad IL-2; IL-4 o IL-10 no son secretados.228 Sin embargo, en mujeres con CaCU después del tratamiento con radioterapia, el aumento en la respuesta a E7 de linfocitos T CD4+ (con producción de IFN-γ), no se asocia con una respuesta clínica exitosa, más bien podría considerase como indicador de la gravedad del CaCU.227 Notablemente, otros autores demuestran que las células T CD4+ con respuesta proliferativa y nula producción de citocinas Th1/Th2 ante E7 de VPH16, se encuentran en pacientes VPH16+ con LIEAG persistente o recurrente.214,229 Lo cual indica que a pesar de reconocer el antígeno específico, estas células T de pacientes con LIEAG presentan una respuesta alterada e ineficiente; que se explica ahora por la presencia de células T reguladoras.229 La permanencia de estas células requiere del continuo reto antigénico ya que la respuesta proliferativa disminuye en pacientes IgG+ que han eliminado la infección.214,223 La producción de IFN-γ por células T en respuesta a E6 de VPH16 se ha asociado a la infección y eliminación reciente de este virus.230 Sin embargo, en LIEBG la respuesta a E6 se asocia con persistencia de la lesión. Mientras que la respuesta a E2 (con producción de IFN-γ) está asociada con regresión.231,232 Las LIEBG que 35 progresan a LIEAG no presentan respuesta a E2 ni a E7; pero en infecciones persistentes con el VPH16 se observa una baja frecuencia en la respuesta a estas oncoproteínas.231 Por lo tanto, la respuesta específica de linfocitos T en presencia de E6 y E7 de VPH16 es marginal y no correlaciona con la regresión de LIEAG.233 Hasta el momento no se ha logrado esclarecer si estas respuestas generadas in vitro son primarias o de memoria, lo cual sería un indicio de la evolución de la enfermedad. Una inmunidad viral efectiva esta caracterizada por una bien balanceada producción de citocinas Th1 y Th2, mientras que las infecciones virales crónicas frecuentemente se acompañan de una respuesta prioritariamente Th2.234-235 En lesiones cervicales avanzadas, los queratinocitos presentan aumento en la expresión del MHC-II y ausencia de señales coestimuladoras que resultan en la activación preferentemente de células Th2, lo cual interfiere con una respuesta antiviral efectiva Th1 y citotóxica.236-240 También se ha detectado en pacientes con infección previa o actual con el virus, respuesta de células T CD4+ o CD8+ citotóxicas específicas contra péptidos de las proteínas E6, E7 y E2 del VPH16, unidos a la superficie de diversas células blanco. Sin embargo, esto pudiera estar seleccionando clonas de células que no representen una infección natural debido a que solo se utilizan ciertos péptidos asociados a determinados HLA. De manera que la re-estimulación con proteínas completas y naturalmente procesadas del VPH pudiera ser más exitosa. Así, se demuestra que existen células citotóxicas específicas para E6 y E7 del VPH16 en mujeres sanas o con CaCU. Sin embargo, en estas últimas es poco frecuente encontrar este tipo de células. Además, la ausente respuesta citotóxica ante estos antígenos virales se asocia con la persistencia del virus o progresión de las lesiones cervicales.206,241-258 Poco se conoce sobre la respuesta citotóxica a otras proteínas completas del virus, entre ellas E2.254,258 3.4 Activación de linfocitos T y CaCU 3.4.1 Receptor de células T Como se menciono anteriormente, los linfocitos T vírgenes localizados en ganglios linfáticos, reconocen el complejo Ag-HLA que se encuentra en la superficie de las CD maduras originarias del sitio infectado. El complejo es reconocido por el receptor de antígenos de las células T (TCR-CD3) vírgenes CD4+ o CD8+. El TCR-CD3 es uno de los receptores transmembranales más complejos. Las señales enviadas a través de este receptor son requeridas para el desarrollo de células T en el timo, la inducción de respuestas inmunes contra agentes infecciosos y para la diferenciación de células T efectoras y de memoria con propiedades 36 funcionales discretas.259 Este receptor está formado por seis diferentes proteínas transmembranales tipo I. TCRαβ: CD3δε: CD3γε: ζζ.259-260 Las cadenas TCRα y TCRβ (o TCRγ, TCRδ), forman heterodímeros de 40-45 kDa unidos por enlaces disulfuro que reconocen directamente el complejo Ag-HLA. Además de cuatro proteínas del complejo CD3 que se asocian en forma no covalente con el TCR; la cadena γ (26 kDa), la δ (21 kDa), dos subunidades de ε (25 kDa) y dos cadenas ζ (16 kDa). CD3ζ se expresa normalmente como homodímeros ζ-ζ, pero puede formar heterodímeros ζ-η (10-20%).261-262 Figura 11. En total, estas proteínas del CD3 presentan 10 motivos de tirosinas y leucinas (D/Ex0-2YxxL/I-X6-8-YXXL/I)263 conocidos como ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif) que se encuentran unidos por enlaces disulfuro y son fosforilados cuando ocurre activación a través del TCR/CD3. Esto desencadena la acción de diversos componentes de la señalización intracelular259,264-265 que inducen la expresión de genes esenciales para la función de la célula T activada,266 como proliferación celular, actividad citotóxica y producción de citocinas. Figura 11. Receptor de células T (TCR) y complejo CD3. Este receptor está formado por la asociación de 2 cadenas polipeptídicas polimórficas (αβ o γδ) que reconocen al antígeno asociado al MHC en la célula presentadora de antígeno. La señal de reconocimiento es transmitida por las cadenas ζ y el complejo CD3 que se encuentran unidas al TCR. www.youtube.com/watch?v=dd5S10sW-4M 37 3.4.2 Señalización a través del TCR/CD3 Durante el reconocimiento del antígeno, el TCR se une al complejo MHC-Ag; al mismo tiempo los receptores CD4 y CD8 de los respectivos linfocitos T se unen a las regiones no polimórficas del MHC-II o MHC-I respectivamente en la CPA (“primera señal de activación”). Esta interacción, que activa a ambos tipos celulares, se potencia con la unión de otras moléculas de adhesión (LFA-3 y CD2, ICAM-1 y LFA-1) y co- estimuladoras como B7-1 o B7-2 y CD28 (“segunda señal); generando así la respuesta inmune primaria de linfocitos T.267-268 Figura 12. Figura 12. Moléculas que participan en la sinapsis entre linfocitos T y CPA durante la presentación de antígeno. La interacción entre estas moléculas es conocida como la 1ra. (TCR-MHC-Ag, CD4 o CD8) y 2da señal (moléculas de adhesión y coestimuladoras), requeridas para la correcta activación de los linfocitos T.www.inmunologiaenlinea.com # Editor: José Peña Martínez A nivel intracelular, la tirosina cinasa p56lck de la familia Scr de las PTKs (Protein Tyrosine Kinases), se encuentra unida a las colas citoplásmicas del CD4 o CD8 y se activa por autofosforilación (después de la defosforilación por la fosfatasa CD45), actuando así sobre los ITAMs del complejo CD3. La tirosina cinasa Fyn también juega un papel similar. Los ITAM fosforilados del CD3ζ son sitios de unión de la tirosina cinasa ZAP-70 a través de sus dos dominios SH2 (Src homology-2). ZAP-70 es fosforilada por Lck, adquiriendo su propia actividad de tirosina cinasa. A su vez, ZAP-70 fosforila proteínas adaptadoras importantes para la activación de las células T 38 como LAT (Linker Activation of T cell) y SLP-76 (SH2 domain-containing Leukocyte Protein). Una vez fosforiladas, estas proteínas se unen a otras proteínas. LAT se une a Grb-2 (SH2 domain-containing adapter protein) que a su vez es fosforilada por ZAP-70 convirtiéndose así en un sitio para Sos, factor de intercambio de GTP/GDP. Así, Ras- GDP es convertido a Ras-GTP activando la vía de las MAP cinasas (Mitogen Activated Proteins), siendo el prototipo ERK (Extracellular Receptor-activated Kinase). En paralelo actúa la vía Rac-GTP que también activa a las MAP cinasas, entre ellas c-Jun del amino terminal (JNK) o proteína activada por estrés (SAP). Ambas vía dan lugar a la producción de los componentes Fos y c-Jun del factor transcripcional AP-1. LAT también recluta hasta la membrana celular a la isoforma γ1 de la enzima fosfolipasa C (PLC-γ1), de esta manera ayuda a que ZAP-70 la fosforile. Así PLC-γ1 cataliza la hidrólisis del fosfolípido de membrana, fosfatidilinositol 3, 5 bifosfato (PIP2) generando dos productos: inositol 1, 4, 5 trifosfato (IP3) y diacilglicerol (DAG). IP3 produce un aumento del Ca2+ citosólico el cual forma un complejo con la calmodulina. Dicho complejo activa fosfatasas de serina y treonina como la calcineurina que a su vez activa al factor transcripcional nuclear de células T activadas (NFAT) requerido para la expresión de IL-2, IL-4, TNF y otras citocinas. Por otra parte, el DAG activa a la proteína cinasa C (PKC) la cual parcialmente participa en la activación del factor transcripcional NF-κB esencial para la expresión de genes de citocinas y sus receptores.264 Figura 13. 39 Figura 13. Cascada de señalización durante la activación de linfocitos T. Diversos eventos bioquímicos se generan después de la interacción entre Ag-TCR. En un inicio, las tirosinas cinasas fyn y lck fosforilan la cadena ζ del complejo CD3. Estas cadenas fosforiladas sirven como sustrato de las cinasas ZAP-70 y fyn, las cuales van a activar una serie de cascadas de señalización mediadas por cinasas, entre ellas las MAP cinasas y la fosfolipasa C, lo cual conduce a la activación de factores transcripcionales que actúan sobre genes cuyos productos son requeridos para la proliferación, diferenciación y actividad efectora de los linfocitos T. www.inmunologiaenlinea.com # Editor: José Peña Martínez 40 3.4.3 CaCU y otras patologías relacionadas con la expresión de CD3ζ Como se mencionó anteriormente, la infiltración de células T en las lesiones cervicales juega un papel relevante en la respuesta inmune específica a nivel local. Sin embargo, en pacientes con CaCU esta respuesta es nula o deficiente a pesar del aumento de células T citotóxicas CD8+. En diversas patologías como la del CaCU, en las que existe una persistente estimulación de la respuesta inmune, se observa que tanto en células T como en células NK periféricas y en linfocitos infiltrantes del tumor, el estado de tolerancia se encuentra relacionado con alteraciones en la maquinaria de transducción de señales. Entre ellas están la disminuida expresión de CD3ζ, CD3-ε, ZAP-70, p56lck, p59fyn y aumento en la expresión de la MAP cinasa fosfatasa-I (MKP-I) que inactiva a la MAP cinasa.269-277 Así, en comparación con células T periféricas de mujeres sanas, se observa menos expresión de CD3ζ en linfocitos T periféricos e infiltrantes del tumor, y en células NK de pacientes con CaCU,271-272 cáncer colorectal,273,278-279 ovárico,274 de mama,277 de células renales,271,276 de cabeza y cuello270, y de melanoma.280 La cercanía con el tumor determina un mayor grado de alteración en los linfocitos T infiltrantes respecto a los periféricos,272-273,275-276,278 mientras que en linfocitos T de nódulos linfáticos pélvicos de mujeres con o sin metástasis no se encuentra dicha alteración.272 Lo cual sugiere que existen factores en el microambiente tumoral que interfieren con la actividad funcional. Esto se comprueba en algunos casos donde la expresión de CD3ζ se restaura cuando las células son cultivadas in vitro por varios días en presencia de IL-2 y otros mitógenos (PHA, anti-CD3, anti-CD2) o con los anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28.273,275,279 Además, existe una correlación inversa entre los niveles de expresión de esta proteína, el estadio de la enfermedad273,279 y la tasa de sobrevivencia entre pacientes con un crecimiento tumoral más rápido.280 Incluso, en diversos cánceres se han correlacionado estas alteraciones en células T con la baja respuesta proliferativa y la capacidad para producir citocinas.274, 276, 280-282 41 4 JUSTIFICACIÓN Como se mencionó anteriormente, el CaCU continúa siendo un problema de salud pública en los países subdesarrollados. En la búsqueda por erradicar este tipo de cáncer, se ha realizado investigación básica, epidemiológica y clínica que nos ha permitido entender más sobre esta enfermedad. Se ha estudiado ampliamente la asociación que existe entre el CaCU y otros factores causales, tales como, la infección por el VPH, alteraciones genéticas y de la respuesta inmune. Sin embargo, persisten dudas sobre la respuesta inmune en los diferentes estadios del CaCU. Por lo tanto se requiere generar conocimiento sobre la respuesta inmune durante la progresión del CaCU, especialmente del papel que desempeñan las células T periféricas e infiltrantes del tumor en las distintas etapas del CaCU. Los resultados generados de estas investigaciones son relevantes tanto para el tratamiento actual de las mujeres con esta enfermedad así como para el diseño de vacunas preventivas que sean aplicadas a futuras generaciones. 5 HIPÓTESIS Diversos estudios han demostrado que el desarrollo del CaCU depende de la persistencia del VPH así como de factores genéticos e inmunológicos. Así, se conoce que durante el transcurso de la enfermedad el aumento de citocinas inhibidoras de linfocitos T como IL-10 y TGF-β ha correlacionado con la progresión de las lesiones en cérvix hacia CaCU, por lo anterior se espera que en estadios avanzados de la enfermedad se presenten cambios moleculares y funcionales en los linfocitos T que impidan una correcta respuesta inmunológica para eliminar a las células dañadas o tumorales. 42 6 OBJETIVOS 6.1 Objetivo general Identificar cambios moleculares y funcionales de los linfocitos T periféricos e infiltrantes del tumor en mujeres con lesiones en cérvix y CaCU. 6.2 Objetivos específicos 1. Determinar la localización de linfocitos T CD3+/CD4+ y de linfocitos T CD3+/CD8+ en biopsias de cérvix de pacientes con LIE o CaCU. 2. Establecer el patrón de proliferación de linfocitos T periféricos e infiltrantes del tumor de pacientes con LIE o CaCU. 3. Analizar la presencia del RNAm de citocinas Th1, Th2 y Th3 en linfocitos T periféricos e infiltrantes del tumor de pacientes con LIE o CaCU. 4. Determinar la presencia del RNAm de CD3ζ del TCR/CD3 en linfocitos T periféricos e infiltrantes del tumor de pacientes con LIE o CaCU. 5. Demostrar si existe asociación entre las diferentes variables analizadas (proliferación, citocinas, CD3ζ, edad, estadios de la enfermedad). 43 7 MATERIALES Y MÉTODOS 7.1 Reactivos y medios de cultivo El anticuerpo monoclonal anti-CD3 (OKT3) fue producido a partir de un hibridoma de la línea ATCC CRL-800-1 donada por el Dr. José Moreno. El colorante azul de tripano, el medio de cultivo RPMI, el suero bovino fetal (SBF), la penicilina-estreptomicina (100 U/ml), el reactivo de TRIzol y todos los reactivos para RT-PCR fueron obtenidos de Invitrogen Life Technologies Inc. San Diego, CA. La fitohemaglutinina (PHA-M) y el Ficoll-hypaque (Hystopaque) fueron comprados a Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. 7.2 Selección de pacientes Se obtuvieron muestras de sangre periférica y biopsias de cérvix de mujeres con lesiones intraepiteliales o cáncer en cérvix de 69 pacientes del Hospital General de la Cd. de México y del Hospital General Parres de la Cd. de Cuernavaca (Morelos). El diagnóstico histopatológico de las biopsias cervicales fue obtenido de los departamentos de Patología o archivos clínicos en los respectivos hospitales. Se seleccionaron para el análisis estadístico de los datos solo muestras de 57 pacientes que reunieron los criterios de inclusión y exclusión. El grupo de estudio estuvo constituido por un total de 29 mujeres con CaCU, 26 de ellas con carcinoma escamoso del cérvix (estadios IA1-IIIB) y tres con adenocarcinoma (edad de 23-66 años, promedio de edad 46); y por 28 mujeres con LIE de bajo y alto grado (edad de 19-61, promedio de edad 34). Como controles se incluyeron a 32 mujeres sanas (edad de 21- 61 años, promedio de edad 34) de las cuales se obtuvieron solo muestras de sangre periférica. Las pacientes firmaron su consentimiento informado sobre la toma de muestras para el estudio. 7.3 Criterios de inclusión y exclusión Los criterios de inclusión para la selección de las pacientes fueron los siguientes: presencia de LIE o CaCU, estar exentas de algún tratamiento que afecte la respuesta inmune como inmunosupresores, quimioterapia o radioterapia al momento de tomar las muestras, y carecer de alguna otra enfermedad. Los criterios de exclusión de las muestras fueron: incorrecto diagnóstico, muestra insuficiente, resultados erróneos. 7.4 Recolección de muestras Las muestras de sangre periférica (20 ml) fueron colectadas con dispositivos Vacutainer con heparina como anticoagulante (Becton Dickinson, BD, Franklin Lakes, 44 N.J.) antes de cualquier intervención médica. Se colectaron raspados cervicales de pacientes con LIEBG y biopsias de 2 mm3 (antes del tratamiento por conización) de pacientes con LIEAG para la determinar la presencia del VPH. Se obtuvieron biopsias de 5-10 mm3 durante la histerectomía radical en 13 mujeres con CaCU para la purificación de linfocitos infiltrantes del tumor (LIT). Las biopsias cervicales fueron inmediatamente colocadas en tubos Falcón de 15 ml con medio RPMI suplementado al 10% con SBF, y antibióticos. Se transportaron en hielo. 7.5 Aislamiento de leucocitos periféricos e infiltrantes del tumor Las células mononucleares de sangre periférica (CMP) se obtuvieron por gradiente de Ficoll-hypaque (Hystopaque, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Brevemente, se diluyó la sangre heparinizada 2:1 con solución de fosfatos (PBS) en tubos Falcón estériles de 50 ml y se agregó a tubos Falcón de 15 ml conteniendo 3.5 ml de Ficoll- hypaque por cada 10 ml de sangre diluida. Se centrifugaron los tubos a 1800-2000 rpm durante 30 min a 20°C en una centrífuga Eppendo rf 5804R con rotor de columpio A4-44. Se recuperó la fase intermedia del gradiente (la cual contiene los leucocitos) y se colocó en tubos Falcón de 50 ml con 20 ml de PBS. Se centrifugó a 1500 rpm por 10 min. Se repitió este lavado dos veces. Se decantó el sobrenadante, y las células fueron resuspendidas en RPMI al 10%. Las biopsias de histerectomía fueron cortadas finamente con bisturí en cajas Petri estériles y digeridas con 2% colagenasa en RPMI al 10% durante 1-2 h, con una atmósfera de 5% CO2, a 37°C. El tejido disociado fue lavado con RPMI y f iltrado en mallas de nylon. Los LIT fueron aislados por gradiente de Ficoll-hypaque al 100%-75% como se mencionó anteriormente.283 7.6 Cuantificación de leucocitos Se agregaron 20 µl de una dilución 2:1 de los leucocitos con azul de tripano a una cámara de Neubauer de 0.100 mm (Marienfeld). Se cuantificaron las células de los cuatro cuadrantes de la cámara en un microscopio invertido utilizando el objetivo de 40X. Se calculó la cantidad de leucocitos/ ml de sangre mediante la siguiente fórmula: La sumatoria de las células/4 cuadrantes x dilución x factor de corrección de la cámara (104)= células/ ml. Si se multiplica por el total de mililitros en los que se resuspendieron los leucocitos se obtiene el número de células totales por mililitro de sangre. La viabilidad de los linfocitos periféricos e infiltrantes fue de >99% y ≥90% respectivamente. 45 7.7 Digestión de tejido cervical con proteinasa K Se lavaron las biopsias o raspados cervicales con PBS para eliminar los restos de sangre. Se colocó el tejido en tubos Eppendorf estériles de 1.5 ml al cual se agregaron 10 µl de proteinasa K (20 mg/ml) y 300 µl de su respectivo buffer (Tris HCl 10 mM, EDTA 5 mM, SDS 0.5%). Se mantuvo a 56°C toda la noc he. Se centrifugó la muestra a 2000 rpm por 5 min a 4°C en una centrifuga 5804R con un rotor Eppendorf HE040. Se decantó y la pastilla se homogenizó con 1 ml del reactivo de TRIzol (solución monofásica con fenol e isotiocianato de guanidina). Se extrajo el RNA y el DNA de las muestras como se menciona posteriormente. 7.8 Extracción de RNA total de leucocitos y biopsias Los homogenizados de las muestras con TRIzol se colocaron en hielo por cinco minutos y se extrajo el RNA total por el método de Chomczynski284 como a continuación se describe: Se agregaron 200 µl de cloroformo por cada mililitro de TRIzol. Se homogenizó durante 20 s en vortex-2 genie. Se colocaron los tubos en hielo durante 3 min y se centrifugaron a 12,000 rpm por 15 min a 4°C en una centrifuga 5804R con rotor Eppendorf HE040. Se transfirió la fase acuosa incolora (RNA) a otro tubo Eppendorf estéril de 1.5 ml y se almacenó la fase orgánica blanca (DNA-proteínas) a -20°C para obtener posteriormente el DNA total. Se agregaron 500 µl de isopropanol a la fase acuosa. Se homogenizó con vortex durante 15 s y se mantuvo a -20°C por 10 min. Se centrifugaron los tu bos por 10 min como se mencionó anteriormente, se decantó, y la pastilla se resuspendió con etanol al 75% con agua tratada con dietil pirocarbonato (DEPC, SIGMA). Se centrifugó a 10,000 rpm por 5 min, se decantó y se colocaron los tubos cerca de un mechero Bunsen para secar la pastilla. Se resuspendió en 15 µl de agua con DEPC y se colocaron los tubos en baño (de) maría a 56°C por 10 min. Se almacenó el RNA a -70°C. 7.9 Síntesis de la cadena complementaria de DNA (cDNA) Se adicionaron 2.5 µg de RNA total y 1 µl de oligo dT (0.025 µg, Roche) en un tubo Eppendorf de 1.5 ml, se homogenizó con vortex por 15 s, y se mantuvo la reacción en baño (de) maría a 70°C por 10 min. Se dejó enfriar a temperatura ambiente y se agregaron 11 µl de la mezcla de reacción (Buffer de Transcriptasa Reversa (RT) 1x, 10mM DTT, 200µM dNTPs, 10 U inhibidor de RNAsa y 100 U TR). Se homogenizó, y se colocaron los tubos a 37°C por una 1 h en baño ( de) maría. Se almacenó el cDNA a -20°C. 46 7.10 Extracción de DNA total de biopsias A las muestras procesadas con TRIzol que contienen DNA-proteína se les agregó 300 µl de etanol al 100%. Se mezclaron por inversión y se mantuvieron por 5 min a 4°C. Se centrifugaron a 10,000 rpm por 10 min a 4°C. Se precipitaron las pastillas con 1 ml de 0.1 M de citrato de sodio en etanol al 10%. Se colocaron los tubos a temperatura ambiente con agitación por 30 min y se centrifugaron nuevamente. Se decantó el sobrenadante y las pastillas se resuspendieron con 1.5 ml de etanol al 75%. Se mantuvieron a temperatura ambiente por 10 min con agitación en vortex, se centrifugaron, y se dejaron secar las pastillas cerca de un mechero. Se resuspendieron en 30 µl de agua estéril y se colocaron los tubos en baño (de) maría a 90°C por 10 min. El DNA se almacenó a -20°C. 7.11 Amplificación por PCR de una región conservada del VPH Se determinó si existía DNA del VPH en las muestras del cérvix obtenidas al amplificar por PCR la región conservada de L1 del DNA viral, utilizando los siguientes oligonucleótidos ya reportados:285 Sentido 5’ CGTAAACGTTTTCCCTATTTTTTT 3’ Anti-sentido 5’ TACCCTAAATACTCTGTATTG 3’ La reacción se realizó en un volumen total de 50 l conteniendo: 1 g de DNA, 0.2 mM deoxinucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 30 pmol de cada uno de los oligonucleótidos, buffer de reacción 1X, 1.5 mM MgCl2, y 2 U de Taq DNA polimerasa recombinante. Las reacciones de amplificación por PCR se realizaron en un Mastercycler PCR Gradient (Eppendorf, Germany) con las siguientes condiciones: 5 min a 95°C; después 40 ciclos a 95°C por 1 min, 4 8°C por 90 s y 72°C por 2 min. Por último, un ciclo de extensión a 72°C por 5 min. Los productos de PCR de ~260 pb fueron separados por peso molecular en geles de poliacrilamida (PAGE) al 6% teñidos con bromuro de etidio y visualizados por UV. 7.12 Determinación del tipo de VPH Los productos de PCR fueron digeridos con enzimas de restricción y el tipo viral se determinó en base a los patrones de digestión enzimática (RFLP) reportados por Yoshikawa 1991.285 Tabla 6. 47 TABLA 6. TIPIFICACIÓN DE ALGUNOS VPH POR RFLP. Enzimas VPH 6 VPH 11 VPH 16 VPH 18 VPH 31 VPH 33 VPH 42 VPH 52 VPH 58 Rsa I - 204, 40 - - 216, 40 141, 62, 40,13 - 190, 70 195, 65 Dde I - - 169, 84 216, 37 - - - 180, 80 170, 90 Hae III 207, 37 207, 37 200, 53 210, 43 122, 91, 43 112, 91, 43,10 140, 60 190, 50 200, 40 Hinf I - 147, 97 - 141, 112 - - - - - Xba I 143, 101 143, 101 - 146, 107 - - - - - Acc I - - 193, 60 - 196, 60 - - - - Pst I - - - 190, 63 - - - - - Kpn I - - - - - 218, 38 - - - *Productos de restricción en pares de bases (pb) 7.13 Citometría de flujo Para corroborar la presencia de linfocitos T infiltrantes del tumor en algunas biopsias obtenidas, se determinó por citometría de tres colores, la proporción de células T CD3+ que presentaran los marcadores de superficie CD4+ o CD8+. ≤ 5 x 105 CMSP y ≤ 2 x 105 LIT fueron teñidos con el anticuerpo Opticlone CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PECY5 (Coulter, Marseille, France). Se utilizó un control de isotipo respectivo obtenido de BD Biosciences, San José, CA and Coulter. Después de incubar las células con los anticuerpos a 4°C por 30 min, se lavaron con buffer de lavado y se fijaron con paraformaldehído al 1%. La citometría de flujo se realizó en un aparato FACS Calibur de BD. Los datos fueron adquiridos con un software Cell Quest utilizando los parámetros de forward and side scatter con 10,000 eventos. Se utilizó la región leucocitaria para medir la proporción de células T. El programa WinMDI versión 2.8 fue utilizado para analizar los resultados. 7.14 Inmunohistoquímica La presencia y localización in situ de células T CD3+, CD4+ y CD8+ fue analizada por inmunohistoquímica. Se lograron obtener biopsias de cérvix de 15 pacientes que participaron en el estudio, pero solo se analizaron por inmunohistoquímica las biopsias de seis pacientes que conservaban la lesión diagnosticada. Se hicieron cortes 48 histológicos de 4 m con micrótomo de las biopsias embebidas en parafina. Se tiñeron los cortes histológicos utilizando un aparato con sistema automatizado para tinción histológica de Ventana Medical Systems Inc., Tucson. Después de la incubación con los anticuerpos específicos, se agregó a las laminillas un anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano y se reveló con 3, 3- diaminobencidina. Las laminillas fueron examinadas en un microscopio con objetivo de 400x para contar el número de células teñidas por campo en las áreas definidas y el área del tejido fue medida con un software Leica Qwin (Wetzlar, Germany). Las imágenes fueron salvadas con el programa Leica Meteor Live Image. El número de células positivas en regiones normales, con lesión escamosa o CaCU, del estroma y del epitelio cervical, fue expresado como número de células por µm2 del área total del tejido. 7.15 Ensayo de estimulación y proliferación de linfocitos T periféricos e infiltrantes del tumor Se determinó la respuesta ante mitógenos específicos como PHA y anti-CD3, de los linfocitos T periféricos e infiltrantes del tumor de las pacientes, mediante el método de incorporación de timidina marcada con tritio radiactivo (metil 3H-timidina). Brevemente, 8 x 104 células obtenidas de pacientes o donadoras sanas fueron estimuladas con PHA o anti-CD3 (adherido previamente a la caja, a 4°C toda la noche) a una concentración final de 5 µg/ml y 0.5 µg/ml respectivamente en 200 µl de RPMI al 10%. Los cultivos se realizaron por triplicado en cajas estériles de 96 pozos con fondo en U (Corning Costar Corp., NY, USA). Se incubaron por 72 h a 37°C con 5% CO2. Se agregó 1 µCi por pozo de metil 3H-timidina (6.7 Ci/ mmol, NEN Life Science Products, Inc., Boston, MA, USA) 12 h antes de terminar el período de incubación. Se cosecharon las células en papel filtro y la incorporación al DNA de timidina radiactiva fue cuantificada en un contador de centelleo líquido. Los resultados se obtuvieron en cuentas por minuto. NOTA: Todo el procedimiento de proliferación antes de cosechar las células fue realizado en condiciones de esterilidad en una campana de flujo laminar con protección adecuada. Se separaron correctamente desechos biológicos y radiactivos. 7.16 RT-PCR de citocinas y CD3ζ Se analizó la presencia o ausencia del RNAm de citocinas Th1, Th2 y Th3, y de CD3ζ en 2 x 106 CMP y en <1 x 106 LIT. Las células fueron estimuladas bajo las mismas 49 condiciones que se mencionaron anteriormente en presencia de PHA para el análisis del RNAm de citocinas y con anti-CD3 para la expresión de CD3ζ. En este caso, las células fueron incubadas en cajas de seis pozos estériles durante 15 h. El RNA total fue aislado de las células no adherentes usando el reactivo de TRIzol. Se realizó la síntesis de cDNA de acuerdo a las condiciones establecidas por Invitrogen. Se utilizaron 2.5 g de RNA para la síntesis de cDNA en presencia de 200 U de transcriptasa reversa M-MLV. Se determinó por PCR la expresión de citocinas y de CD3ζ. Las reacciones se realizaron en un volumen total de 25 l conteniendo: 1 l de cDNA, 0.2 mM dNTPs, 15 pmol de cada uno de los oligonucleótidos, 2 mM MgCl2, buffer de reacción 1X y 1 U de Taq DNA polimerasa recombinante. Se amplificó el gen constitutivo β2µ globulina para verificar la integridad del cDNA. Las secuencias de los oligonucleótidos utilizados y los ciclos de amplificación por PCR (5 min de desnaturalización a 94°C, 30-40 ciclos de alineamie nto, y un ciclo de extensión final de 5-10 min a 72°C) se detallan en la tabla 7. Los productos de PCR fueron separados en 6% PAGE, teñidos con bromuro de etidio y visualizados por UV. TABLA 7. OLIGONUCLEÓTIDOS Y CONDICIONES DE PCR Gene Secuencia de oligonucleótidos Producto de PCR Ciclos de alineamiento Interleucinas IL-2187* S 5’CATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCA3 AS 5’CGTTGATATTGCTGATTAAGTCCCTG3’ 305 pb 94°C- 1 min 68°C- 1.5 min 72°C- 2 min IFN-γ286 S 5’ATCAGCAGCGACTCCTTTTCCGCTT3’ AS 5’GAAAGCCTAGAAAGTCTGAATAACT3’ 427 pb 95°C- 1 min 60°C -1 min 72°C -1 min IL-4286 S 5’ACTCTGTGCACCGAGTTGACCG3’ AS 5’GTCGAGCCGTTTCAGGAATCG3’ 197 pb 94°C- 40s 60°C- 1 min 72°C- 1 min IL-10 287 S 5’ATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCA3’ AS 5’CTCTCAAGGGGCTGGGTCAGCTATCCCA3’ 351pb 94°C- 1 min 65°C- 1 min 72°C- 1 min TGF-β1 187 S 5’GCCCTGGACACCAACTATTGCT3’ AS 5’AGGCTCCAAATGTAGGGGCAGG3’ 161pb 94°C- 1min 60°C- 1 min 72°C- 1 min Cadena del TCR CD3ζ 286 S 5’CTCTGCTACCTGCTGGATGGAA3’ AS 5’ATGTGAAGGGCGTCGTAGGT3 380 pb 94°C- 1 min 64°C- 45s 72°C- 1.5 min Constitutivo β2µ- globulina288 S 5’ACCCCCACTGAAAAAGATGAGTAT3’ AS 5’ATGATGCTGCTTACATGTCTCGAT3’ 100 pb 94°C- 30s 60°C- 1 min 72°C- 1 min *Citas. S= oligonucleótido sentido, AS= anti sentido. 50 7.17 Análisis estadístico Los datos de proliferación de linfocitos periféricos e infiltrantes del tumor de cada paciente fueron expresados como la desviación estándar promedio (±DE). La prueba de análisis de varianza se utilizó para: estimar diferencias en edad de acuerdo al estado de salud (o estadio de la enfermedad), diferencias en la proliferación de linfocitos T periféricos estimulados respecto al estado de salud, diferencias entre 4 grupos estratificados de edad y proliferación de linfocitos T periféricos estimulados. La prueba de Scheffé nos permitió evaluar las diferencias significativas entre estos grupos. Se utilizó la prueba t de Student para estimar las diferencias de proliferación entre linfocitos T estimulados periféricos e infiltrantes de mujeres con CaCU. La asociación entre la proporción de muestras positivas para el RNAm de las citocinas o de CD3ζ en linfocitos T periféricos y la edad estratificada, estado de salud o los grupos de proliferación en linfocitos T periféricos se calculó por la prueba de Chi cuadrada. La relación entre la presencia del RNAm de las citocinas y la de CD3ζ en linfocitos T periféricos se estudió con la prueba exacta de Fisher. También se utilizó esta prueba para determinar la proporción de muestras positivas para la presencia del RNAm de las citocinas o de CD3ζ en linfocitos T periféricos e infiltrantes del tumor de 12 mujeres con CaCU. Las diferencias estadísticas en todas las pruebas fueron consideradas significativas cuando los valores p eran menores de 0.05. 8 RESULTADOS 8.1 Determinación del tipo viral a partir de DNA de los tejidos cervicales Las oncoproteínas del VPH intervienen en diferentes procesos celulares incluyendo la respuesta inmune. De tal manera que el tipo viral puede determinar en parte el transcurso de la enfermedad en base a la capacidad oncogénica de sus proteínas. Por lo que en el presente trabajo se detectó por PCR, la presencia del VPH en biopsias y raspados cervicales de las pacientes en estudio. Para tener una referencia de los tipos virales en nuestra población de estudio, se determinó el tipo viral en base a patrones de restricción enzimática, de acuerdo a lo descrito por Yoshikawa 1991. Tabla 6.285 Se encontraron los tipos de VPH 6, 16, 18, 31, 33, 42, 52, 58; y dobles infecciones con VPH 16/18, 16/31 y 52/33, en 20 de las 37 muestras analizadas por histopatología o PCR. Tabla 8. El 24.2% del total de las muestras analizadas por PCR fueron positivos para VPH 16, el 21.2% para el VPH 18, el 12.2% para VPH 33, y 6.1% fueron positivas para VPH 31. Así, los tipos virales 16 y 18 son los principales agentes 51 causales de la enfermedad, seguidos de los tipos 31 y 33 como se ha reportado en otros trabajos.289 No se realizó el análisis estadístico para comparar si el estadio de la enfermedad o las otras variables analizadas se encontraban asociadas con algún tipo viral debido al escaso número de casos analizados para la variedad de tipos virales detectados. TABLA 8. PRESENCIA DEL VPH EN BIOPSIAS O RASPADOS CERVICALES DE LAS PACIENTES. Tipo viral Lesión Total* + (%) - (%) ND 6 16 18 33 42 58 DI LIE 24 14(58.3) 6(25) 3(12.5) 2(8.3) 1(4.2) 1(4.2) 1(4.2) 1(4.2) 1(4.2) 4(16.7) CaCU 13 13(100) 0(0) 4(30.8) 0(0) 2(15.4) 3(23.1) 2(15.4) 0(0) 0(0) 2(15.4) Total 37 27(72.9) 6(16.2) 7(18.9) 2(5.4) 3(8.1) 4(10.8) 3(8.1) 1(2.7) 1(2.7) 6(16.2) *Total de muestras analizadas por histopatología o PCR para la presencia del VPH. +, VPH positivos por PCR. -, VPH negativas por PCR. ND, tipo viral no determinado. DI, dobles infecciones. Nota : todos los VPH– son VPH+ por histopatología. 8.2 Proporción y localización de células T en biopsias cervicales de pacientes con CaCU Para corroborar la presencia y proporción de linfocitos T infiltrantes del tumor en las biopsias de cérvix, analizamos por citometría de flujo la relación de células T CD4+ o CD8+ periféricas e infiltrantes del cérvix en dos mujeres con CaCU, y la comparamos con la relación existente en linfocitos periféricos de dos mujeres sanas y de dos mujeres con LIEBG. Las donadoras sanas y las mujeres con LIE presentaron una relación de células T CD4+/CD8+ periféricas de 1.4 y de 1.7, respectivamente. Mientras que en las mujeres con CaCU esta relación se invierte tanto en los linfocitos periféricos (0.71) como en los infiltrantes del tumor (0.97). Lo cual sugiere que las células T CD8+ son las que predominan en mujeres con CaCU. Como se mencionó anteriormente, la localización, el tipo celular, el número de células así como la correcta activación de células T, pueden determinar el grado de avance de la enfermedad y tienen cierto valor pronóstico de la progresión de . Por lo cual se analizó por inmunohistoquímica, la distribución de células T en el epitelio y estroma de biopsias cervicales embebidas en parafina, de cinco mujeres con LIE (incluyendo un carcinoma in situ y una región normal) y una mujer con carcinoma 52 microinvasor del cérvix. En general se observaron más linfocitos infiltrantes en el estroma que en el epitelio independientemente del estadio de la enfermedad, prevaleciendo las células T CD8+. Figura 14, Tabla 9. Estos resultados concuerdan con los obtenidos por citometría de flujo en CaCU de este trabajo, y con los ya reportados por otros autores.191,194,201,205 Sin embargo, aún no existen reportes que esclarezcan la causa de esta distribución ni la inoperancia de las células T en los dos compartimentos del cérvix de pacientes con CaCU. Esto es debido a la escasa disponibilidad de muestra y de estas células en los compartimentos específicos. Figura 14. Mayor infiltración de linfocitos T en el estroma que en el epitelio cervical de mujeres con CaCU. Imágenes representativas de la presencia de linfocitos T CD3+, CD4+ o CD8+ teñidos por inmunohistoquímica. 53 TABLA 9 PREDOMINIO DE LINFOCITOS T INFILTRANTES CD8+ EN EPITELIO Y ESTROMA DE CÉRVIX EN MUJERES CON LIEAG O CACU. Regiones con neoplasia aCélulas CD3+ Ki67+ / Células CD4+/ Células CD8+/ bÁrea (µm2) Epitelio No LIE (n=2) 8(±3) a/216719(±30045)b 0(0) 0(0) LIEBG (n=3) 7(±4)/ 207530(±34829) 1(±1)/ 178251(±30508) 4(±5)/ 169847(±50235) LIEAG (n=4) 11(±8)/ 204200(±46519) 4(±4)/ 203855(±45350) 8(±5)/ 221495(±35194) CaCU (n=1) 11(±4)/ 208064(±34342) 8(±9)/ 209708(±39649) 6(±4)/ 218879(±43421) Estroma No LIE (n=2) 13(±7)/ 188102(±67657) 3(±2)/ 219457(±38052) 0(0) LIEBG (n=3) 32(±33)/ 135750(±66310) 9(±7)/ 163560(62100) 9(±10)/ 167950(±61374) LIEAG (n=4) 90(±77)/ 198074(±44483) 24(±19)/ 207810(±42300) 34(±28)/ 215920(±37215) CaCU (n=1) 133(±129)/ 144753(±84078) 15(±17)/ 114030(±86488) 30(±35)/ 124839(±81657) *Análisis por inmunohistoquímica de los datos obtenidos de cinco mujeres con lesiones intraepiteliales escamosas (incluyendo un carcinoma in situ y tejido normal del cérvix) y de una mujer con CaCU microinvasor. Promedio del número de linfocitosa y de las áreas obtenidasb de 10 diferentes campos analizados (400x) de cada región neoplásica usando un microscopio compuesto y el programa LEICA. La DE se muestran en paréntesis. No LIE = cérvix normal en las biopsias de pacientes. 8.3 Respuesta proliferativa de linfocitos T en pacientes con CaCU La evidente infiltración de células T citotóxicas CD8+ y la escasa presencia de células T CD4+ en el tumor sugiere que existe una desregulación en la respuesta de ambas, ya que las células T CD4+ son requeridas para la eficiente actividad citotóxicas de las primeras. Con el propósito de elucidar la funcionalidad de las células T durante el desarrollo del CaCU, nosotros comparamos la proliferación de linfocitos T periféricos e infiltrantes del tumor de mujeres con CaCU o LIE, con la proliferación de linfocitos T de donadoras sanas. Analizamos 22, 19 y 27 muestras de linfocitos T periféricos de las pacientes; y siete muestras de linfocitos infiltrantes del tumor. La proliferación de estas células se analizó mediante el método de incorporación al DNA de timidina marcada radiactivamente, para lo cual se estimularon estas células con fitohemaglutinina o anti- CD3 durante 3 días. Se observó una diferencia significativa entre los diferentes grupos. Particularmente, existió una menor proliferación de linfocitos T periféricos en mujeres 54 con CaCU que en linfocitos T de donadoras sanas cuando las células fueron estimuladas con PHA (p=0.01) y anti-CD3 (p≤0.05). Sin embargo, la diferencia en la proliferación de células T de mujeres con LIE y de donadoras sanas no fue significativa. Esto indica que las células T de mujeres con LIE no presentan una alterada respuesta proliferativa lo cual es de suponerse ya que en estas pacientes puede haber regresión de las lesiones cervicales. Figura 15. Figura 15. Baja respuesta proliferativa de células T periféricas en mujeres con CaCU respecto a mujeres sanas y con LIE. Estimulación por 72 h con mitógenos o sin mitógenos (RPMI al 10%). Resultados representativos del promedio de cpm (±DE) de los cultivos por triplicado para cada muestra. Se observa diferencia significativamente estadística en la proliferación de linfocitos T entre los grupos de estudio mediante la prueba de ANOVA. p=0.036, estimulados con anti-CD3 y p< 0.001 con PHA. Sin embargo, en las pacientes con CaCU, no solo la activación de las células T a través del TCR se encuentra alterada sino también la de vías alternas, ya que su actividad proliferativa en presencia de ésteres de forbol (PMA, Phorbol-Myristate Acetate) y ionóforos de calcio (Ionomicina) es menor que la observada en pacientes con LIE o mujeres sanas. Figura 16. 55 Figura 16. Baja respuesta proliferativa a diferentes mitógenos en células T de mujeres con CaCU. Estimulación por 72 h en presencia de 5 g/ml anti-CD3, 5 g/ml PHA o 10ng/ml PMA y 1 g/ml Ionomicina. Resultados representativos del promedio de cpm (±DE) de los cultivos por triplicado para cada muestra. El análisis de proliferación de los linfocitos T infiltrantes del tumor demostró que estas células tienen en general una respuesta nula a los mitógenos utilizados. De manera que al comparar la proliferación de estas células con las de sangre periférica de las mismas pacientes se observa una diferencia significativa. Esto indica claramente que la respuesta proliferativa de linfocitos T periféricos de mujeres con CaCU es deficiente mientras que los linfocitos infiltrantes no responden. Figura 17. 56 Figura 17. Nula respuesta proliferativa de linfocitos infiltrantes del tumor comparada con la respuesta de células T periféricas de mujeres con CaCU. Estimulación por 72 h en presencia de 0.5 g/ml anti-CD3, 5 g/ml PHA o sin mitógeno (RPMI al 10%). Resultados representativos del promedio de cpm (±DE) de los cultivos por triplicado para cada muestra. Solo se observa diferencia significativamente estadística entre las dos poblaciones celulares estimuladas con PHA mediante el análisis con la prueba t de Student (p<0.001). Se sabe que la respuesta inmune tiende a disminuir en personas sanas de 70 años de edad o mayores.290 Aunque ninguna de las pacientes analizadas en el presente trabajo tuvo 70 años o más; se analizó estadísticamente cual era el promedio de edad de las pacientes y si esta variable estaba asociada con la respuesta proliferativa. Se determinó con la prueba de Scheffé que las pacientes con CaCU analizadas en este trabajo tuvieron un promedio de edad de 46 años, que fue mayor que el de mujeres con LIE y donadoras sanas (promedio 34, ambas p<0.001). Esto concuerda con el promedio de edad (45.1 -48.6 años) de mujeres con estadios iniciales del CaCU (estadios I–II) reportado en otros trabajos.291 No se encontró relación entre la edad y la disminuida proliferación de células T en mujeres con CaCU al compararlas con las donadoras sanas (anti-CD3, p=0.834; PHA, p=0.321). 8.4 Patrón de citocinas en células T de pacientes con CaCU Otra característica que determina el estado funcional de las células T es la producción de citocinas. Estas juegan un papel muy importante en el desarrollo de la enfermedad al regular la respuesta inmune. Por lo que se analizó la presencia del RNAm de las 57 principales citocinas Th1, Th2, Th3 en linfocitos T periféricos e infiltrantes del tumor de mujeres con LIE o CaCU, y se compararon los resultados con los de linfocitos T periféricos de donadoras sanas. En la Figura 18 se ejemplifica la expresión del RNAm de las citocinas y el gen constitutivo en algunas pacientes con LIEAG. Figura 18. Geles representativos del análisis por RT-PCR de la expresión de citocinas Th1, Th2 y Th3 en linfocitos periféricos estimulados con PHA de mujeres con LIEAG. Geles de poliacrilamida al 6%. Carril: 1) Marcador de peso molecular; 2) Control sin cDNA, 3) Control +, cDNA de mujeres sanas, 4-7) cDNA pacientes. β2-G, gen constitutivo β2 microglobulina. Existe un número significativamente menor de muestras positivas para el RNAm de IL-2, IL-10 e IFN-γ en los estadios avanzados de la enfermedad. El número de muestras positivas para IL-4 y TGF-β1 fue similar en los grupos de estudio; aunque mayor respecto a los mensajeros de las otras citocinas en mujeres con CaCU. Tabla 10. Estos resultados indican que los linfocitos T periféricos de pacientes con CaCU tienen una disminuida respuesta pro-inflamatoria que hace preponderar una respuesta Th2/Th3 no efectiva para eliminar el tumor. Además, se observa en estas pacientes que la presencia del RNAm de IL-10 en células T periféricas no es tan frecuente como se reporta en suero y biopsias de cérvix de pacientes con CaCU en otros estudios. Esto sugiere que esta citocina proviene de otras células, siendo la principal fuente las células tumorales. 58 TABLA 10. MENOR NÚMERO DE MUESTRAS POSITIVAS PARA LOS RNAM DE CITOCINAS TH1 E IL-10 EN LINFOCITOS T PERIFÉRICOS DE MUJERES CON CACU. No. de mujeres (%) Citocinas Sanas n=26 LIE n=20 CaCU n=20 valor p* IL-2 22(84.6%) 14(70%) 10(50%) p = 0.040 IFN-γ 23(88.5%) 18(90%) 10(50%) p = 0.002 IL-4 20(76.9%) 16(80%) 16(80%) p = 0.956 IL-10 19(73.1%) 8(42.1%) 5(25%) p = 0.004 TGF-β1 20(76.9%) 12(63.2%) 14(70%) p = 0.602 Análisis por RT-PCR de la presencia de citocinas en linfocitos periféricos estimulados con PHA. *Asociación entre las muestras positivas y el estado de salud con la prueba Chi-cuadrada. Resulta importante conocer si el patrón de citocinas en linfocitos T periféricos es similar al que presentan los infiltrantes del tumor en mujeres con CaCU, ya que en la práctica clínica es más fácil obtener sangre periférica que nos indique el estado inmunológico de la paciente. Existe una tendencia a haber menor cantidad de muestras positivas para la mayoría de las citocinas en linfocitos infiltrantes del tumor comparados con los linfocitos periféricos. Sin embargo, al hacer el análisis estadístico de los datos en estas poblaciones no se encontró una diferencia significativa para cualquiera de los mensajeros de citocinas, excepto para el RNAm de IL-4; el cual se observó en más muestras de linfocitos T periféricos que en infiltrantes del tumor. Esto muy probablemente se deba al número de muestras analizadas. Tabla 11. 59 TABLA 11. PREDOMINIO DE MUESTRAS POSITIVAS PARA EL RNAM DE TGF-Β EN LINFOCITOS T INFILTRANTES DEL TUMOR. No. de casos (%) Citocinas CMP (n=12) LIT (n=10) Valor p* IL-2 8(66.7%) 3(30%) p = 0.099 IFN-γ 8(66.7%) 4(40%) p = 0.206 IL-4 10(83.3%) 4(40%) p = 0.048 IL-10 3(25%) 1(10%) p = 0.368 TGF-β1 8(66.7%) 6(60%) p = 0.546 Análisis por RT-PCR de la presencia de citocinas en linfocitos periféricos e infiltrantes del tumor de mujeres con CaCU estimulados con PHA. *La relación en la proporción de muestras positivas entre ambas poblaciones celulares fue estudiada con la prueba de Fisher. Interesantemente el RNAm de TGF-β1 se encontró en más muestras de linfocitos infiltrantes en comparación con el resto de los RNAm de las otras citocinas. Cuando se analizan los resultados individuales esta citocina es la única que se expresa en tres muestras de linfocitos infiltrantes del tumor; mientras que en linfocitos periféricos de las mismas pacientes se expresan todas las citocinas excepto IL-10, y dos de estas últimas muestras presentan una baja respuesta proliferativa a anti-CD3. Por el contrario, en tres mujeres con CaCU cuyos linfocitos T periféricos tienen una buena respuesta proliferativa, se observa expresión de la mayoría de las citocinas, especialmente IL-2 e IFN-γ en linfocitos periféricos e infiltrantes del tumor. Esto podría indicar que una correcta respuesta inmunológica asociada a citocinas Th1 de linfocitos T periféricos en pacientes con CaCU está acompañada de una mejor respuesta de los linfocitos infiltrantes del tumor, y probablemente de un mejor pronóstico para estas pacientes. Los resultados hasta aquí mostrados indican que en el ambiente tumoral existen más factores que inhiben tanto la infiltración como la capacidad funcional de las células T in situ. Además, alteraciones en los linfocitos de sangre periférica pueden ser indicio de mayores cambios en el cérvix. La interacción de IL-2 con su receptor es necesaria para regular la proliferación de células T inducida por los antígenos. Sin embargo, cuando prevalece la producción de IL-4 en una respuesta de células T, la proliferación puede estar restringida a células Th2.292 Por lo que se analizó si existía una asociación entre los mensajeros de las citocinas y los datos obtenidos en tres grupos de proliferación de linfocitos T periféricos. No se encontró asociación estadística entre estas variables. Tampoco se 60 encontró relación alguna con los datos por edad estratificada. Lo cual sugiere que la menor frecuencia de muestras positivas para el RNAm de citocinas Th1 en mujeres con CaCU es debida a la enfermedad y no al proceso de envejecimiento de los linfocitos T humanos, caracterizado por una deficiencia general en la inducción de genes cuyos productos son requeridos para la fase S del ciclo celular.293 8.5 Presencia del RNA mensajero de CD3ζ en linfocitos periféricos e infiltrantes del tumor Hasta el momento se desconoce el mecanismo molecular exacto por el cual las células T son inhibidas en las pacientes con CaCU. Sin embargo, estudios previos demuestran que existe una expresión disminuida de la proteína CD3ζ en células NK y linfocitos T periféricos así como en los tumores primarios de mujeres con CaCU.269,271- 272 Esto sugiere que la ineficiente función de las células T en estas pacientes puede estar asociada a la alterada expresión de CD3ζ. Debido a que no existen reportes sobre la expresión del RNAm de CD3ζ en mujeres con CaCU; se examinó por RT-PCR la presencia de este en linfocitos T periféricos e infiltrantes de las pacientes con diferentes estadios de la enfermedad. Para lo cual se realizó el diseño de oligonucleótidos que comprendieran la región codificadora de CD3ζ y su isoforma de splicing CD3η utilizando el programa Vector NT1. A partir de la cadena complementaria de DNA, se amplificaron por PCR 380 pb de las 492 pb que corresponden al marco de lectura abierto de este gen. Se corroboró la amplificación de este producto al digerir con Pst1 el fragmento de DNA amplificado, que genera fragmentos de 252 pb y 134 pb, correspondientes a los tamaños esperados en base al mapa de restricción reportado para la cadena complementaria de CD3ζ. Figuras 19 y 20. Figura 19. Mapa de restricción del cDNA de CD3ζ. 61 Figura 20. Digestión con Pst I del fragmento amplificado por RT-PCR de la cadena ζ de linfocitos T periféricos estimulados con 0.5 g/ml anti-CD3 por 16 h. Gel de poliacrilamida al 6%. Carriles: 1,4) Marcador de peso molecular L-50; 2) Producto de PCR; 3) Digestión con Pst I del producto amplificado. Se analizó la presencia del RNAm de CD3ζ en 32 muestras de linfocitos T periféricos estimulados con anti-CD3 de donadoras sanas, 20 de mujeres con LIE y 20 de mujeres con CaCU; y en 10 muestras de linfocitos infiltrantes del tumor. Se observó asociación entre la progresión del CaCU y un menor número de muestras positivas para la expresión del RNAm de CD3ζ, lo cual fue más evidente en muestras de linfocitos infiltrantes. Figuras 21 y 22. 62 Figura 21. Disminución en sangre periférica del número de muestras positivas para el RNAm de CD3ζ durante el desarrollo del CaCU. Análisis por RT-PCR de linfocitos T periféricos estimulados con 0.5 g/ml anti-CD3 durante 15 h. La asociación entre la proporción de muestras positivas para CD3ζ y el estado de salud fue calculada con la prueba de Chi- cuadrada (p< 0.001). 63 Figura 22. Menor número de muestras positivas para el RNAm de CD3ζ en linfocitos T infiltrantes del tumor que en linfocitos periféricos de mujeres con CaCU. Análisis por RT- PCR de linfocitos T estimulados con 0.5 g/ml anti-CD3 durante 15 h. No hubo asociación significativa en la proporción de muestras positivas para CD3ζ entre las dos poblaciones celulares al usar la prueba exacta de Fisher. Posteriormente determinamos si el número de muestras positivas para expresión del RNAm de CD3ζ correlaciona con la baja proliferación de células T en mujeres con CaCU. Interesantemente hubo una correlación significativa entre estas dos variables cuando se estimularon a las células con anti-CD3 (p= 0.04). Esto sugiere que la función disminuida de las células T correlaciona con alteraciones en la activación a través del TCR que conducen a la progresión del CaCU. Las citocinas son proteínas multifuncionales que regulan diferentes procesos celulares entre ellos la activación, maduración y diferenciación de diversos tipos celulares.294 Por lo que se evaluó la relación existente entre la presencia del RNAm de citocinas y el RNAm de CD3ζ en linfocitos periféricos (LP) de los diferentes grupos de estudio; y entre los LP y los LIT de las mujeres con CaCU. Se encontró una asociación positiva significativa entre las muestras positivas para los RNAm de CD3ζ/IL-2 (LP, p=0.011, LP comparados con LIT, p=0.015) y CD3ζ/IFN-γ (LP, p=0.012, LP comparados con LIT p=0.038). Interesantemente, se observó una relación inversa entre el número de muestras positivas para el RNAm de IL-10 y CD3ζ en linfocitos periféricos (p=0.029). No se encontró una asociación entre las muestras que expresaron CD3ζ e IL-4 (o TGF-β1) en linfocitos periféricos. Sin embargo, la 64 presencia del RNAm de IL-4 se asoció positivamente con la de CD3ζ cuando se compararon linfocitos periféricos e infiltrantes (p=0.026). Por lo anterior se deduce que la expresión óptima del mensajero de CD3ζ está asociada con la expresión de los mensajeros de IL-2 y de IFN-γ, lo cual muy probablemente ocurra también en las respectivas proteínas. Se evaluó si la edad estratificada estaba relacionada con la presencia del RNAm de CD3ζ. Una menor proporción de muestras positivas para este mensajero fue encontrada en las pacientes pero no en mujeres sanas ≥ de 50 años de edad (p = 0.040). Esto sugiere que otros factores relacionados con la enfermedad determinan esta asociación entre la edad y la presencia del RNAm de CD3ζ en las pacientes. 9 DISCUSIÓN Los resultados presentados en este estudio demuestran que los linfocitos T de las pacientes tienen alteraciones funcionales que pueden estar asociadas a factores encontrados en los estadios avanzados de la enfermedad, independientes de la edad. Así, se observa que la respuesta de células T de mujeres con LIE es muy similar a la de donadoras sanas. Mientras que en las pacientes con CaCU disminuye la capacidad proliferativa, la presencia de mensajeros de citocinas Th1 y la de CD3ζ en linfocitos T periféricos. Estas alteraciones fueron mucho más evidentes en los linfocitos infiltrantes del tumor, lo cual indica que el grado de inhibición de la funcionalidad en células T depende de su proximidad al sitio primario del tumor. Esto ha sido demostrado in vitro en células T provenientes de sitios cercanos al tumor que presentan baja respuesta a mitógenos e IL-2.134,295 Similar a lo observado en el presente trabajo, las citocinas Th1, IL-2 e IFN-γ, disminuyen en sobrenadantes del cultivo de células mononucleares periféricas,192 en sangre296 y en plasma193 de mujeres con LIEAG o CaCU. Por el contrario, Sheu185 y Santin,194 encuentran un patrón de citocinas Th1 en linfocitos T periféricos de mujeres con CaCU. Aunque no hubo significancia estadística entre los grupos de estudio, en el presente trabajo prevaleció la expresión del RNAm de IL-4 en los linfocitos T periféricos de mujeres con CaCU. Esto concuerda con la elevada producción de esta citocina en células mononucleares periféricas192 pero se opone a los bajos niveles encontrados en plasma193 y en linfocitos T periféricos185,194 de mujeres con LIE o CaCU. Además, se encontró que la expresión del RNAm de IL-10 disminuye tanto en linfocitos periféricos como en los infiltrantes del tumor en estadios avanzados de la enfermedad; similar a lo reportado en sangre por Bais et al.296, y contrario a lo 65 observado en cérvix186 y en sangre periférica192-193 de mujeres con LIE por otros autores. La menor presencia de los mensajeros de citocinas en los linfocitos infiltrantes del tumor no fue significativa al comparar linfocitos periféricos e infiltrantes de mujeres con CaCU. Excepto IL-4, que se observa en menor número de muestras de linfocitos infiltrantes contrario a lo reportado por Sheu et al.185,194 Interesantemente, encontramos que el 60% de estas células expresó TGF-β1, de las cuales el 30% solo expreso esta citocina. Las diferencias encontradas en el tipo de citocinas producidas por las células T en los diversos reportes pueden deberse a los métodos o mitógenos utilizados, a la presencia de otras células como fuente de estas citocinas, al estadio de la enfermedad, al número de muestras o incluso a la población analizada. Por lo anterior, en el presente trabajo se confirma que existen menos muestras positivas para los RNAm de IL-2 e IFN-γ, predominando IL-4 en linfocitos T periféricos y prevaleciendo TGF-β1 en linfocitos infiltrantes de mujeres con CaCU. Así, estas mujeres presentan un alterado patrón de citocinas que favorece el desarrollo del CaCU. Además, estos resultados apoyan los ya reportados sobre la presencia de células T reguladoras (Treg) en nódulos linfáticos de mujeres con CaCU.295 Debido a que los linfocitos infiltrantes aquí estudiados presentan características semejantes a las de células regulatorias; que al ser estimuladas a través del TCR producen altas cantidades de TGF-β1, baja expresión de IL-4 e IL-10 y carente expresión de IL-2 e IFN-γ.297 Las células Treg inhiben la activación y proliferación de otras células por contacto entre célula-célula o al producir IL-10 o TGF-β1, evitando así una respuesta inmune inflamatoria.298-299 TGF-β1 induce la transcripción del factor transcripcional específico de células Treg, FOXP3; el cual participa en la diferenciación a nivel periférico de células T vírgenes CD4+ CD25- hacia una población de células Treg.300 Por lo que TGF-β1 o IL-10 favorecen la diferenciación y expansión de células Th2/Tc2185 o Treg301 generando tolerancia inmunológica. De esta manera, la persistencia del VPH y la expresión elevada de TGF-β1 e IL-10 en el microambiente tumoral, entre otros factores, pueden inducir la acumulación de células T anérgicas con mayor frecuencia en el cérvix que en periferia.302 Interesantemente observamos una mejor respuesta proliferativa en linfocitos periféricos cuando estos y los infiltrantes del tumor en una misma paciente expresan casi todas las citocinas, especialmente IL-2 e IFN-γ. Esto sugiere que las citocinas Th1 son cruciales para eliminar la infección o lesiones del cérvix en el inicio de la enfermedad sin que se pierda el balance dinámico de citocinas Th1/Th2. Sin embargo, cuando no se logran revertir estas lesiones y continua el virus presente, predominan 66 las citocinas Th2 y posteriormente las Th3 para evitar los daños provocados por una inflamación prolongada, pero que finalmente pueden repercutir en el desarrollo de la enfermedad. Sin embargo, antes de que esto ocurra el sistema inmunológico tiene diferentes mecanismos que le permiten evitar estos daños en el organismo. Estudios recientes sugieren que la función alterada de células T y la baja expresión de CD3ζ pudiera ser un mecanismo fisiológico para potencialmente prevenir las consecuencias de una prolongada respuesta inflamatoria.303 Así, se observa que las pacientes con CaCU presentan baja expresión de CD3ζ en células T periféricas, en células asesinas naturales o NK y en linfocitos infiltrantes del tumor.271-272 En el presente trabajo se demostró por primera vez que no solo la proteína reportada por otros autores sino que también el RNAm de CD3ζ disminuye conforme avanza la enfermedad. Además, la presencia de este mensajero está relacionada con la baja proliferación de linfocitos T periféricos estimulados con anti-CD3, sugiriendo que muy probablemente la vía de señalización a través del TCR se encuentre alterada, ya que también se observa que la expresión de este mensajero se asocia con la de citocinas proinflamatorias como IL- 2 e IFN-γ. Por lo que probable en las muestras negativas para el RNAm de CD3ζ existan bajos niveles de la proteína, regulando así funciones importantes de las células T como son la proliferación y producción de citocinas. Por lo anterior, diferentes mecanismos pudieran participar en la disminuida expresión de CD3ζ en células T de mujeres con CaCU, entre ellos son: la baja estabilidad de las isoforma del gen,304 la acción de las caspasas en las células T apoptóticas,305 el estrés oxidativo inducido por macrófagos,306 la acción de la proteína cinasa GCN2 (General Control Non- derepressing-2) que responde a los bajos niveles de triptófano,307 y los bajos niveles de L-arginina que reducen la vida media del RNAm de CD3ζ.308 Interesantemente, diversas enzimas que participan en estos mecanismos se encuentran altamente expresadas en células presentadoras de antígeno de mujeres con LIE o en células tumorales de mujeres con CaCU.309-311 Y son: la enzima indolamina 2, 3 dioxigenasa (IDO), que cataboliza el triptófano y regula la proteína cinasa GCN2,312 y el receptor E-prostanoide-4 de prostaglandina E2 (PGE2) y la ciclooxigenasa-2 (COX2) que inducen la arginasa I.313 Particularmente, la transcripción de COX2 es inducida por las oncoproteínas E6 y E7 del VPH16.314 Es de suma relevancia notar que estas enzimas y los efectos tardíos del catabolismo del triptófano (vía TGF-β) favorecen la actividad de células Treg al inducir la expresión de Foxp3.307,315 Las células Treg producen TGF-β que suprime la actividad cito tóxica específica contra el tumor de células T CD8+ 316 y pueden inducir la diferenciación de células dendríticas para que secreten altos niveles de IL-10, TGF-β bioactivo y bajos 67 niveles de IL-12p70.317 A manera de retroalimentación, las células dendríticas son reclutadas a los nódulos linfáticos y estimulan la proliferación de células Treg a través del receptor de TGF-β II.318 Más aún, en presencia de PGE2, la respuesta de Th1 es suprimida y se induce una respuesta predominantemente Th2 con producción de IL-4 e IL-5.319 Es importante destacar que la abundante expresión de TGF-β e IL-10 en biopsias y en los fluidos del cérvix y vagina de mujeres con LIEAG o CaCU185,187,320 deriva de varios de los mecanismos anteriormente mencionados. La expresión aberrante de estas citocinas también se ha encontrado en otro tipo de canceres como el de páncreas, mama y melanoma.321-324 Además, altos niveles de estas citocinas en suero de pacientes con cáncer pancreático correlacionan con la perdida de CD3ζ en linfocitos infiltrantes,322 que pueden considerarse como marcadores pronóstico o de sobrevida no muy favorables.325 Resultados derivados en el laboratorio, del presente trabajo, confirman que la exposición prolongada in vitro de linfocitos T de donadoras sanas en presencia de las recombinantes humanas de TGF-β e IL-10 mantiene niveles bajos de expresión de CD3ζ e inhibe la proliferación de estas células. Hasta el momento se sabe que el VPH puede inducir la expresión de citocinas como TGF-β e IL-10, que además de inhibir la función de las células T, aumentan la expresión de proteínas del VPH, contribuyendo a la persistencia y progresión a CaCU de las lesiones cervicales asociadas al virus. Por lo tanto, nosotros hemos contribuido a elucidar el probable mecanismo de la baja respuesta de células T relacionado con la ausente expresión del mensajero de CD3ζ en mujeres con CaCU. Aunado a esto se demostró que no solo los linfocitos infiltrantes sino que también los linfocitos periféricos de mujeres con CaCU presentan alteraciones funcionales a pesar de la lejanía con el tumor. Estas alteraciones funcionales como son la anergia, prevalencia de mensajeros de citocinas Th2 y probable presencia de Treg está caracterizada por la baja respuesta proliferativa, baja expresión del mensajero de CD3ζ y alterada expresión de los RNAm de citocinas (y por lo tanto de las proteínas) generando una ineficiente respuesta inmune que favorece el desarrollo del CaCU. Por lo que la funcionalidad de los linfocitos periféricos puede servir como parámetro del tipo y calidad de la respuesta inmune en las lesiones cervicales. Considerándose a CD3ζ como marcador candidato del pronóstico de la enfermedad. Así, la respuesta linfoproliferativa a péptidos específicos del VPH parece asociarse a la eliminación de la infección y a la regresión de las lesiones cervicales.211 Por lo que resulta indispensable que además de la intervención oportuna en las pacientes al realizar la prueba de Papanicolaou y tratamientos específicos; se analice la respuesta inmune en los diferentes estadios de la enfermedad de manera que se pueda generar suficiente 68 información para la implementación de inmunoterapias que no solo eliminen al virus sino que modifiquen las alteraciones en la respuesta inmune que se originaron por la presencia de este. De esta manera los esfuerzos por erradicar las lesiones o tumores en el cérvix tendrán mayor probabilidad de ser exitosos. 10 CONCLUSIONES 1. La presencia de DNA del VPH fue encontrada en 69% de las biopsias analizadas, siendo los tipos de VPH 16, 18 y 33 los más frecuentes. Es importante mencionar que el 78% de las muestras de LIE diagnosticadas con presencia de VPH por histopatología fueron confirmadas por PCR. 2. A nivel local y periférico, existe mayor proporción de células T CD8+ en estadios avanzados de la enfermedad. Lo cual demuestra una alterada relación de linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+ es un indicio de cambios funcionales en estas células. 3. La prevalencia de linfocitos (especialmente los CD8+) en el estroma respecto al epitelio cervical de mujeres con LIE y CaCU sugiere que durante la progresión de la enfermedad, diversos factores inhiben la funcionalidad y migración de las células T en el epitelio del cérvix. 4. La baja respuesta proliferativa de linfocitos T periféricos e infiltrantes del tumor de mujeres con CaCU demuestra que la función de estas células está alterada en estadios avanzados de la enfermedad. 5. El desequilibrio en el balance de expresión de los RNAm para citocinas con patrones Th2/Th3 no favorecen la eliminación de las lesiones cervicales, las cuales progresan a CaCU. Además, la preponderante expresión del RNAm de TGF-β1 en linfocitos infiltrantes de pacientes con CaCU indica la presencia de células T reguladoras cuya constante acción anti-inflamatoria puede contribuir al desarrollo de la enfermedad. 6. La progresión del CaCU está asociada a una menor expresión del RNAm de CD3ζ. Esto demuestra que además de las alteraciones postraduccionales reportadas para la proteína en las pacientes, existen cambios en la transcripción cuya causa se desconoce y que determinan un probable mecanismo de las alteraciones en el estado de activación y funcionalidad de los linfocitos T en las pacientes con LIE o CaCU. 69 7. La correlación significativa entre la menor presencia del RNAm de CD3ζ, la baja proliferación de células T estimuladas a través del TCR, y la menor proporción de muestras positivas para citocinas Th1, indican la importancia de la expresión de CD3ζ y de este tipo de citocinas en la correcta activación y funcionalidad de los linfocitos T durante el desarrollo del CaCU. 8. Por lo anterior se concluye que existen cambios a nivel molecular y funcional en células T periféricas de mujeres con lesiones avanzadas de alto grado y CaCU. Además, estas alteraciones encontradas en linfocitos periféricos son más evidentes en los infiltrantes del tumor. 9. Basados en los datos de nuestra investigación (Díaz-Benítez CE, J Clin Immunol 2009) y en trabajos reportados sobre la acción inhibitoria de TGF-β1 e IL-10 se deduce que la baja proliferación, la disminuida expresión de CD3ζ y la diferenciación a Th2-Th3 de linfocitos T de pacientes con CaCU es mediada por la presencia de estas citocinas inmunosupresoras. 11 PERSPECTIVAS 1. Evaluar en linfocitos T CD4+, CD8+, Treg y células NK periféricos si los parámetros analizados en el presente trabajo se modifican cuando las pacientes con LIE o CaCU reciben el tratamiento terapéutico respectivo. Sería también interesante evaluar la respuesta inmune de células T en mujeres vacunadas con VPH 2. Analizar el mecanismo molecular por el cual IL-10 y TGF-β inhiben la expresión de CD3ζ en linfocitos T. 3. Determinar mediante enfoques genómicos los transcritos prevalentes en linfocitos T periféricos de mujeres con LIE Y CaCU. 70 12 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Parkin DM, Bray F, Ferlay J, Pisani P. 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Florl's-SoS:1 • Janrt Ju :in'z-Dia z o Fl"lipr J . Urihr-Salas o Edgu Ronuln-B:I S:lUrr o Lud\\ig E. GOllz:llrz-!'Ilrn :1 ol':lIrieia Alon so dr Ruiz . GlIilIrrmina Loprz-Estrad:l o Alrn'do Lagunas.i\I:lrtitwz . Vietor H. Brrmlid l'z.Moral l'S o J Il :1I1 !'II. Alrocrr-Goll zalrz o J(·su s Muti nrz-Ba rnctl'hl' o Rogdio l1rrn:\ndrz-I':1 ndo o \" 'Ol1l1l' Rosl'nstdn oJosé Morrno o Viel'ntl' !'IhHlrid -!'Ilarina R~iw<..l : 8 D~>cember 2008 ' Accq>l<.'cnologla, Uniwrs,dad Nacional AulÒnoma de México, Cutlma,·aca. Mcxico 1. MoJ\.'Ilo Unidad dtl lnv~,>tigaciòn cn Enfcmledades autoinrnunes. Divisiòn dtl lnfecciones Oònicas y Clncer. Instituto Nacional <..le Salud Pilblica <..le México, Mexioo City. Mcxico 94 J Clin lmmunol (2009) 29:532- 544 Int rod urtion Cenrical cancer (CC) afTects about 500,000 women every year worldwide, with 40% having an expectancy of survival of 5 years [I]. Progression of a cervix lesion to CC depends on severa] factors; the best known is infection with high risk human papillomavirus (HPV), which is found in 99.7% of CC biopsies [2]. Although host local immune response can control HPV infection and abon the course of disease [3, 4], with cellular immunity being a criticai factor in preventing squamous intraepithelial lesions (SIL) development to CC [5], CC patients frequently have a deficient local cell-medimed immunity [6]. The main mediators o f cell-medimed inununity against virus-infecte99% and ;:6100/.., respectively, as detennined by dye exc1usion. Flow Cytometry Anal ysis and Immunohistochemical Stains ofT Cells from Patients The proponion of CD3-t- T cells expressing CD4-t- or COS-t- surface markers in the periphery and in situ were detennined by triple color now cyt.ometry. PBL (S5" 10s) and TIL (::::2" 10s) were stained with Opticlone CD4-F1TCI C08-PFJC03-PECY5 (Coulter, Marseille. France) and the respective isotype controls from BO Biosciences, San José, CA and Coulter. After incubation at 4°C for 30 min with antibodies, cells were \Vashed with washing buffer and fixoo with 1% pmarOlmaldehyde. Flow cyt.omeuy \VaS TInal ur i al lissue) and one ",()man wiili icroinvasive CC o SIL nonn"l ed fro aboul ten high po er lid . (400~) for eaeh neoplasia "'gioo """"'l'e analyzed using a Iighl icrosoope and ilic I 1'r !.'1'lUTl. l dard cvialion. re OOwn i arml eses I Ell MA GSIL c HGSIL c . · i~ . l resenu ofinfihrnring Tcdls in ~piLhdium and stro a ()fccn'ix biopsK>s fro nen I (fl"ec. epl\.'Senl,ui,·e exa ples oflhepresence of D3"', CD4"', or og- T cells staincd by lr nun()hisIOChemistry. HGS1L high·grnde squa ous inlrnepilhchal ksions. CC cervical cancer 98 J Clin Immunol (2009) 29:532- 544 predominant compared to CD4+ T ceJ1s in women with Cc. However, what are the mechanisms behind this distribution as well as behind the inability of these ceJ1s to eli minate the tumor in CC remain uncJear. Cells from CC Patients Have a Decreased Proliferative Capacity To better understand T ceJ1 behavior during the course of CC disease, we first examined proliferation of PBl and TI l from patients with STL or CC and comparoo them to that of healthy donors. Thus. PBl from SrL (11= 19) orce (11 = 22) patients and healthy women (11'=27), as weJ1 as TU.. from women with CC (11= 7), were stimulated with PHA or immobilized anti-CD3 for 3 days. As shown in Fig. 2a, proliferative responses among groups were significantly difTerent. For PHA, PBl from CC patients proliferated less H,,,,,,, _ RPMI l'ii anti-CD3 "'HA cc _ RPMI l'ii anti-CD3 "'HA Fil! . 2 Decn>ascd T cdI prolif~rntion in SIL and Cc. Proliferntion was examined by means of JH TdR inC<)rporntion assays in cdls from women with SIL, CC, or from healthy dono ..... 8 ~ 104 cdls wcre incubatcd at 37"C during 72 h in the pl\.'Sencc ofO.5 J.lglml anti-CDJ. 5 l'glml PhylOhcnunagglutinin (PHA) or alone (RPMI). Result. r~1'=1 the mean cpm±SD of triplicale cultures for each sample. a Significanl diffcrrnces ",ere o]),;cr\"~'d with ,,"li.cD3 (p=0.036) or PHA (p< 0.001 ). h ProliferJ.lion diff~'1lces bctwecn PBL and TIL from women with CC were only found in T cdls stimulak>d with PHA (p< O'(lOl , Studc'Ill"s I k-sl) than those from STL patienls (p n with SIL (n- 26) (11 - 20) 22 (84.6%) 14 (70%) 23 (88.5%) 18 (90%) 20 (76.9"10) 16 (80%) 19(73.1 %) 8{42.1 %) 20 (76.9"10) 12 (63.2%) Women with CC (n - 20) IO (50"1o) IO (50"1o) 16(80"10) 5 (25%) 14 (70'%) P valuc' O.{)40 OJ)()2 0.956 0.004 0.602 PBL (2)< [if ) from hcalLhy donor.! or patients wen! stimulat~'(\ with 5 ).!glml PHA during 15 h at 37"C. Cytokine expl\.'Ssion was analyz~'(\ by RT-PCR ' Chi-squarc ICst wllS u.oo lO analyz.: th~ associalion betwern posit;,·" samptes for cyrokines md heahh status in PBL samples populations ofT cells. Table rn shows thal al though there was a tendency lo a smaller number of positi ve samples for mosl cytokines in TIL, no statistic..111y significant difTereoce was found for any of these cytokines between TIL and PBL. except for IL-4. Oecreased C03( mRNA expression by PBL and llL rel1ecl~ disease progression in Cc. Previous srudies have suggeste or pal:k..>nts W\.'re incubatoJ witb 0.5 ;.! association OClwCUI l~ proportion of positive >r:J.lion by supcmatmts of CC ccII lines C(lntaining TGF - ~l and IL- IO. l'BL (8xlO·) from hwlthy donors were stimulatoo duting 72 h ar 3 T'C with 0.5 l'glmI anti-CD3 in the presence of supematanlS (sn) from cdi lincs oonlaining 65 pgl mi TGF-~l (H~La. SiHa). 33 pglml TGF-~l (C33-A). and -4.4 pgtml IL·IO (HeLa). T celi prolifl'Tation was analyzed by 3H Tpresent lite mean cpm±SD of triplicate cultures from th.ree diff~'reIIt expcnrnt'11ts experirnental setllp, proliferating T ceJ1s were producing endogenous IL-10 as a result of TGF -p 1 activity. Therefore, to funher define tlle contributing roles ofTGF- p l or IL-IO to the inhibition ofT celi proliferation, PBMC were stimulated with anti-CD3 in absence of exogenous cytokines or in the presence of rhTGF-~ 1 or rhIL-10, with or without tlleir respective neutralizing polyclonal antibodies. \Ve found that tlle inhibitory efTect o fr hTG F-~ 1 was totally counteracted with 41.6 nglml neutralizing anti-rhTGF-~ 1 (Fig. 5.1). whereas the inhibitory efTect of rhlLlO was blocked with 23 nglml neutralizing a:-nllL-1O (Fig. 5b). lbesedata indicate that both cytokines independently produce a profound inhibitory efTect on T celi proliferation. However, both cytokines together did not inhibit T celi proliferation at a higher level thml eitherone alone (data not shown). Presence ofTGF-pl and IL-IO Reduces CD3( Expression in PBL Results obtained herein showed thm supematants from the CC celi lines as well as tlle rhTGF-~1 and rhIL-IO inhibited proliferation of T cells from healthy donors. However, tlle mechanism by which these cytokines accomplish their effect is unknown. One possibility is th.at these cytokines were afTecting expression of CD3(, a phenomenon which is frequt'ntly associated with a Ioss of T celi function. T celi stimulation does not interfere with CD3( protein expression (Fig. 6a). Hence, we examined CD3( protein expression by unstimulated l'BL from healthy donors at varying time lengths afier tlle addition of rhTGF-PI and rhIL-lO at concentrations known to be procluce by CC celi lines. Control cells cultured in RPMI medium up-regulated CD3( ~ SpTingeT 101 54O a -, ft -• ; - ~ ~ ! - ;f ~ t ,= > , - ,,- 32.5 P')Im 10.4rl\j1m1 2\).8 nginj 41.6 nginj ~ ,lirGF~ 1 ..... TGI'-tl ...nTGF-f.l o-rhTGf~1 b ~ ~ -f Wl,' - ""''' ""'" 'l,W ""''' - Wl.' 'l,W ,Wl Wl.' ~ -l,W .WI Wl.' ~ w", ,"'" ""M 'NN ," '" ""M ! 'N'" ,Wl ""M ,~ 'N'" ,Wl 'N'" ,Wl 'NN ,Wl ;f ,= 'NN ,Wl 'NN ,Wl t ~ i , - """" ,,- rilL-lO. "'l-IO. "'l-IO. ~ "'L-IO " "'"' l1JSro'm! "",", "",,,l-IO _ l_IO <>reSClll tbc mrun cpm±SD or triplicai;: rultures frorn lhree difK'lCnl expcrimerts protein expression alter 8 h of culrure. which persisteers partieipaling in iliis .. udy as \\idi as Ihe stafT of ilie Dt"f'artInenlS of Palhology and Surgery from llIe gcncrnl hospilats. We also appn..'Ciate Ihe kindness of Dr. Cel<;o Ramos (INSP) and Dr. Raill Barrera (INER) for sharing some inslrumenls for llIe prolifcralion Icchnique; llIe "illingnes.s IO sllare some leehnical tips. for TIL isol:J.tion of Dr. Llorenle (INNSSZ); :md 11m I«hnical advice of Milena Saki and Hector Maldonado (INNSSZ). Palricia Rojo and Gibrin Pé>rez (Dr. Morenos's !ab), and Carla Olvia (INSP). 111is wori< was suppork'nl of a fdlowship from CONACYT. 111is w()rk was submined in partial fullillmenl of llIe n..'quircmcnlS for tbe PhD. degree ofDlaz Benilez C, E. from lite Prugrarna de Doclorndo rn Cieneias BiomMicas, Univcrsidzd Nacional Aulonoma de México, Mexico. Rcfl'rC ntCs I. MilChdl MF, Hinclman WN, Hong WK, Lotan R. Schonenfdd D. 111e r.alural hislory of cervical inlrnepiilielial nooplasia: an argum:nl for inlcrmc<.lialc (>ndpoinl biomarh'rs. Can""r Epid~miol Biornarkers Prov. 1994;3:619-26. 2. W3tb<:.>Jtll'r. 1M. 1=,," MV, M""o.> MM. 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TG F-fJ/ or IL - I O t!fff!('f 011 peripheral T /ymphOf.'J'It!$. 8 x 1(Jl lrealrl ,)' lIol/o rs' P8L {II = 6 ) wcr e ('lIlwre,J in RPMJ JfYlc alUJ j·tjmularcd ",itlr (contro! + J or \l'ulro ul (aJlurol ·J 0.5 JIglmlllluj-CD3 and tlle IJr(' f t;'lIce oj 31,,5 pglml r"TGP·bJ or J8 PRImi rh/L- I O. PBL / rom l1'(}mell wi,h ('(' n ' ie(II C(IP'cer (CC) \l'ere also $l ;mul' lIed \t'ith cmt;-CDJ. Cells H'ere iI,c f/ba teti dllring 71 h at J 7°C ÙI 5% CO:!, / JH } TII.m,idine illCOrpOrfllioll by l 'eJ/.\' \l'fU' l l .tsay ,.tI lIt thl' fast 12 Ir. Rcmlt,f reprl' .ft' /ll tlre mt!{II' cpm (if triplicare II·ell.r ± SO (erro r Im r ). 110 44 ulce lVorld Caneer COllgress CD3-ç 16 KDa p-Acl in 43 KDa FIg. 2. CDJ-ç pmtein dOh'Ilreg ll/mùJ/l b~ ' rhTCF·fJ/ {Urd rli/L- I O ÙI l' (",,,p/roc.wt!.\' Irom h/,tlIlI,,' dOlltu's. Ct'lIj' l' ere ;'Ic flb(lled lor 16 li ( I . ~ d ~scr;be( J al)()'-e. To",J proleil, Wl"" o l)- wined culti COl-t; expr eSS;ti /1 \\'tU' wwIY:f!d by WeslL'm 81or. I ) U"stiltwlmed ce/Is : ] . J ) U lUfjmularl'd celJ.I' wirlr (ltTCP-pl (65 rg/ml) lIlIlI rML- IO (65 'g/ml) , reSfJecl/l 'e l .v: 4 ) S,im/l- '(lieti ('elh wirh (ll/Ii · CD3 (O.5pglml); 5·6) Sr;mu!rlled cells 1\';111 rhTCF- fJ/ ,md rh /L. / O. re.vJt!cli\'(dy. ~ tlCfi n 11'(1.1' wwh:.t'tl (IS comroJ Ro!e of TGF -jJ I and IL-IO 011 T Iympllol:yles p roliferalion. To evaluate tlle aCl ion of TGF-B I and IL-IO on T lymphoeYles proliferalion. PBL from healthy donors were stimul ;:l led w ith anti-CD3 in the prescncc of rhTGF-6 1 or rhl L - IO. Res llhs howed thal rhTGF-BI is mOre effective in inhibiting T Iymphocylcs proliferalioll thiln rhlL-IO (Fig. 1). When we analyzed the proliferati ve sta te of PBL from patiems. we fOllnd similar resullS as those observed in T lymphocytes froll1 health)' don or.; incub3\ed wilh rhTGF·BI (Fig. I ). éffeci o[ TGF-j31 amI IL - IO Dn CDl -t; p rOlt! in express;oll. To analyze the eI'feel of rhTGF-B I or rh l L-IO on CD3-ç prolein expression. PBL from healthy donors \Ve re incub<.lled in the presence of rhTGF-BI 01" I"hI L- 1 O. 8 0lh cytoki lles inhibilcd C D3-ç prolcin exprcssion when cells were stimulated with ami-C D3 (Fig. 2). Wc also fO ll nd ~I low CD3-re mRNA expression in PB L from palient5 (Dala noi shown). In concl usion. Ihese resu lt s st rongly suggesl Ihm TG F-p J .md IL- ! O cOll lci be implicatcd in thc low T Iymphocytcs response of plllicnls wi th CC. by affeel ing CD 3-ç expression. Ack nowlcd gments This work was supponed by a granI o. 1018·M 9 11 from O ACYT in M exieo and a fe llowshi p No. 153082 from CONAC YT ( A M ) \O Cinl hy" E. Diaz. Benflcz. Refercnces I . Walboomer .. JM . et al. Hum:1Il p~l p !l l o m Olv i rus i" a ncccssary cause of i 11\':""1 "C ccr\i cal canea worldwidc. J . P.Hhol. 189: 12-9: 1999. 2. Bo!->ch FX . f"1 CI I . Thc causa rclalion bc l wecn human papilloma"i ru s and cc rvical cuncer. J . Clin. Pmhol. 5: 244-265 : 2002. 3. Sarkar AK. CI (l'. 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