UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO FACULTAD DE QUI MICA "DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE EXTRACTOS Y COMPUESTOS PUROS DERIVADOS DE HONGOS Y ESPECIES VEGETALES DE AMPLIO USO EN LA MEDICINA TRADICIONAL DE MEXICO''. T E s s QUE PARA OBTENER EL TITULO DE QUIMICA FARMACEUTICA BIOLOGA PRESENTA BERTHA ADRIAN~ LOPEZ MENDOZA &Q1' ~ &AMENES PROFESIONALES MEXICO. D.fWCULTAD DE OUIMICA 2003 ' UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. JURADO ASIGNADO PRESIDENTE VOCAL SECRETARIO PRIMER SUPLENTE SEGUNDO SUPLENTE Sitio donde se dCS1UTOlló el terna Dra. Maria -· Aguilar Laurents Dra. R.acbcl Mata Essayag Dr. Rogelio Gregario Pereda Miranda Dr. Frm>eisco Hcrnández Luis M. en C. Laura Alicia Acevedo Artcaga Laboratorio 124. Dcpa11amento de Fannacia. Edificio ~E". Facultad de Química. UNAM. Asesor del tema Dra. Rache! Mata Essayag Supervisot" técnico M. en C. Isabel Rivera Cruz Sustentmitc Bertha Adriana Lópcz Mendoza rcfie f !fokPJ:h-4 r-::..c'1.=1E:»I 12fu,:;,oce,.. C_ ·\ulunz.o a 1a 01reccioh ..,~•w1 ·' UNAM a difundir en form;iw electron• contenidc, de rni 11 aÍ"ill".'I . .: NO M B RE.---~~~'ie manera muy especial. con profunda admiración y respeto. a la Dra. Rachel Mata por pcrmitinne fonnar parte de su equipo de trabajo, por su invaluable gula para la realiz:ación del presente trabajo de tesis y por su apoyo y comprensión. 3 DEDICATORIAS A Iván. mi bet:M!: Por la felicidad que trajo a mi vida con su llegada, por todas las sonrisas que me regala dfa a día, por su inmensa tem~ porque este trabajo lo realizamos juntos y porque es mi razón mú gnnde para de..,.,. ~e. A mi muná: por todo el 11111or,. el apoyo,. la comprensión y la paciencia que me ha brindado,. porque siempre ha sido un ejemplo a seguir,. por todas sus enseftanzas y por ser la persona que más -.U-0. Porque lo poco o mucho que be lo¡pwlo ha sido ¡p11Cias a ella.. A mi papi y a ~ Firona porque aunque ya no estáa fisicamente con nosotros siempre pennanccerén en mi mente y. sobre todo,. en mi corazón. A Alex. por ser todo lo que ha sido para mi, porque no hubiera podido seguir adelante sin su apoyo y sus consejos. Gracias por tu comprensión,. por tus ocurn::nc:ias y por hacer especial cada momento. A Man:e, por todo lo que hemos compartido, por haberme regalado el tesoro mas valioso que .,.-.. existir, porque en todos estos llllos siempre ha estado a mi lado mpoyándomc y alendndomc en los momentos diflciles y,. principabnente,. por el amor,. comprensión y respeto que siempre 111e ha -· A Ricmdo y s.ndra por CSllS tres chiquitas tan maravillosas que trajeron a oucslra fmoilia. A Mariana. Nmtalia y Sofill. por ser tan especiales. por sus travesuras. sus detalles. la ternura que poseen y por dmr - alq¡ria a mi vida A Ale, Maye., Luis y Salomón por la llllÚ- que me bao brindado todos esu>s ldlos. A Isa, Blanca, lli. Elena. Nonna. 1-Manba, J..-, Sergio y ToGo por los momcn10s tan ~es que pum!lOS en el laboratorio. Lista de Cuadros Lista de Figuras Lista de Esquemas Lista de Abreviaturas l. INTRODUCCIÓN INDICE 1.1 Búsqueda de agentes antimicrobianos de origen vegetal Página 1 111 111 IV Página 1.2 Antecedentes de Arracacla tolucensls 3 1.3 Antecedentes de Bric/rellia veron/caefolia 4 1.4 Antecedentes de Geranium niveum 6 l .S Antecedentes de Guanomyces pofythrix 8 1.6 Antecedentes sobre las orqufdcas estudiadas en la presente investigación 12 1. 7 Antecedentes de S..faglnella lepidophylla 19 J .8 Antecedentes de Prionosciadium watsoni 21 1.9 Antecedentes de Farrowia longtcollea, Gym~~l/a danlrallensls y Malbranchea Ollriantaca 24 U.OBJETIVOS 25 111. PARTE EXPERIMENTAL 26 3.1 Material vegetal y preparación de los extractos vegetales 26 3.2 Especies fiíngicas y preparación de los extractos füngicos 26 3.3 Detenninmción de la actividad antimicrobiana 27 3.3.1 Mlcroorpnismos de prueba a) Micruol'ganismos de prueba y medios de cultivo 27 3.3.2 Deb:nninación del número de células por medio del estándar turbidimétrico de Me Farland 27 b) Detenninación de la concentración critica de antibióticos 28 b. l) Preparación de los inóculos b.2) Preparación de las concentraciones de antibióticos 29 b.3) Preparación de las placas de agar 30 b.4) Bioensayo 30 3.3.3 Detenninación cualitativa de la actividad antimicrobiana por el método de difusión en agar utilizando discos de papel filtro como rcservorio 3.3.4 Determinación de la Concentración Mlnima Inhibitoria IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN V. RESUMEN Y CONCLUSIONES VI BIBLIOGRAFiA 31 32 33 48 so Cuadro 1 Cuadro2 Cuadro 3 Cuadro4 Cuadro S Cuadro6 Cuadro7 Cuadro8 Cuadro9 Cuadro 10 Cuadro 11 Cuadro 12 Cuadro 13 Cuadro 14 Cuadro IS Cuadro 16 Cuadro 17 CmidrolB Cuadro 19 Cuadro20 Cuadro 21 Página Metabolitos aislados de Brickellia veronicaefolia 5 Proantocianidinas de Geranium niveum 7 Metabolitos secundarios descritos para Guanomyces polythrbt 1 O Metabolitos aisl8<1os de M-illaria densa 14 Metabolitos aislados de Scaphyglotis livida l 5 Metabolitos aisl8<1os de Selaginella lepidoplrylla 20 Metabolitos aislados de Priono.sciadiaun watsoni 22 Especies vegetlllcs objeto de evaluación 26 Especies fiíngicas objeto de evaluación 27 Microor¡pmismos de prueba y medios de cultivo 28 Estándar turbidimétrico de Me Farland 28 Antibióticos a los cuales se dctenninó la concentración inhibitoria critica Disolventes empleados para la disolución de los antibióticos Volumen de inóculo emplC8do para los ensayos CODCelltneión de ~uno de los antibióticos de prueba acleccionados como control positivo Dilaneuos de la zona de inhibición (mm2> desarrollados por los cxtrw::tos 8Ctivos sobre Slaphylococcm aureus Dilaneuos de la zona de inhibición (mm'} desarrollados por los cxtrw::tos activos sobre Baclllus sublllls Dilaneuos de la zona de inhibición (mm') dcsanollados por los cxtJW:tos activos 90bn:: Esclterichia coli Dilaneuos de la zona de inhibición (mm') dcsanollados por los cxtrw::tos 11Ctivos sobre Sal_,_lla typhl ~de la zona de inhibición (mm') dcsanollados px los cxtrw::tos activos 90bn: PseudolftOftCU aervginosa ~de la zona de inhibición (mm') dcsanollados px los cxtrw::tos activos sobre Calfdlda alblcans 29 30 30 31 36 36 37 37 38 39 Cuadro22 Estructuras de los compuestos evaluados 40 Cuadro23 Diámetros de la zona de inhibición (mm2 ) desanollados por los compuestos activos sobl'e Stophylococcus aureus 43 Cuadro24 Dilanettos de la zona de inhibición (mm2 ) desanollados por los compuestos activos sobre Escherlchia co/i 44 Cuadro25 Diámetros de la zona de inhibición (mm2 ) desanollados por los compuestos activos sobre Salmonel/a typhi 44 Cuadro26 Diámetros de la zona de inhibición (mm2 ) desanollados por los compuestos activos sobre Pseudo1nOnas aeruginosa 45 Cuadro27 Diámetros de la zona de inhibición (mm2 ) desanollados por los CODJpUCstos activos sotxe Candida albicans 46 Cuadro28 Microorganismos susceptibles a los extractos evaluados 48 n Figura 1 Figura2 Figura3 Figura4 Figuras Figura6 Figma7 FigmaB Figma9 Figma 10 Figura 11 Figma 12 Figura 13 Esquema 1 Esqucma2 Arracacia lol1MYnsis Brlckllia 'tl'f!ronlcaefolia GerOlfluat lfitlie11111 Hongo coprófilo G-.,.ces polythrlx en un cultivo de - _..ctextmsa a__,..,,.,es polythrbt: Maxil/arla densa Lindley Scaplryglotis /lvlda (Linley) Scbelter Nlde.w. bootlUI Epidertdnlm ccvdlochllwn Epldendnuri rigúhun &/aglnella /epldoplrylla Spring Prionoscladilllft wot.sonl Couber A. Rose Colocación de los discos y de las concentraciones a eval.- en el bioensayo Esttalegia ..-odológica cmplc..ta en el estudio de las esi-:ies -etales E!ilnllegia metodológica emplc..ta en el estudio de las esi-:ies fi'.mgicas 111 Página 4 4 6 9 9 16 16 17 111 18 19 21 31 Página 33 34 AcOEt ATCC CIM cm cm2 CH2Cl2 DMSO ºC Gnun (+) Gnun(-) g lb L M MeOH m 1'8 mL mm mm' NA NoCel o/o VIH Lillta de Abrevlahlr115 Acetato de etilo American Typc Culture Collection Concentración inhibitoria minima centímetro centímetro cuadrado diclorometano dimetilsulfóxido grados centígrados Gnun positiva Gram negativa gramos libras litros rnolar mctanol metros miaograrnos mililitros milfmetros milfmetros c....trados nom:tivo Número de células por ciento Virus de irununodeficiem:ia humana IV , PAGINACION DISCONTINUA l. ANTECEDENTES J.J ll6MI-• --- --1c.....--o1e oripo• "---' Desde que mie ~ de átos sirven pera pmteger1as contre pdágenos microbianos. EstllS sustancias son conocides como fi-":ipinas. si """' constituyentes de la planta. y fitoelexinas si sus niveles ,.., iocremcntan como --• una invesión micn>bima. Los com.,.-s D8lUlales se claaifican como mllimicn>bianoa con - en pnaebes de suaceptibilidad que permilen - su concentnción inhibitoria mlnime (CIM). ~ como ectivos equellos con CIM's compendidas en el intervalo entre 100 y 1000 µa/mL Un ~ que es ~ corno ..._...- • una invasión patógena y que se requiere _.proteger a la plmita pero que muestra una pequclla actividad en pruebas de suaccptibilidad in vitro no es necesariamente un antimicrobiaoo. La mayoría de los metabolitos secundarios muestnm WJa actividad considerable contra i-:tcrias Gram (+)pero no contra O....(-) y levaduras. Este comportamiento se debe a que las Gram (-) y las levaduras - cubiertas por una membnma que posee una c:sttuctura tal que impide el paso de los compuestos lllltimicrobimlos; en cambio. las i-tcrills Gram (+) poseen una membrana que pcnnitc el puo de dichos compuestos. Aunado a CSIO, las bacterias Gram ( - ) poseen proteínas resistentes a los fúmacos que se encargan de expulsar cualquier producto que pudiera penetrar a travb de la membrana externa de la bacteria. Esta es la principal razón por lo que en la actualidad los antimicrobianos de origen vegetal no aon util~ de manera sistemática como antibióticos (Tegos et al •• 2002). Como solución a esta limitante. se realizó un estudio (Stermitz et al .• 2000; Tcgos et al .• 2002) en el que se encontró que pua que los compuestos producidos por las plantas sean eCectivos contra todo tipo de bacterias y levaduras es ncccsuio encontrar la manera de introducirlos en las células patógenas. siendo esto posible si sc inhiben las protclnas rcsistctttcs a los tannacos. En la medicina actual sc ha inaemcntado el uao de antimicrobianos y otros fánnacos derivados de plantas. ya que los antibióticos tradicionales se bmt vuelto poco efectivos para el tratamiento de cnfcnnc:dadcs infecciosas y virales. El creciente intcrb por este tipo de compuestos se debe a varias razones. asl. ,,., estima que existen entre 2so.ooo y soo.ooo especies de plantas en la Tierra; un pcqucflo porcenlltje de estas (1 a 10"/o) son utilizadas por el hombre y lllgunas especies animllles como lllimcnto. y es posible que un porcentaje mayor sea empleado con fines medicinales. Asf mismo. el aumento en el número de penonas aCectadas por el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y otras enfermedades infecciosas ha intensificado las investigaciones sobre derivados de las plantas que puedan ser efectivos. especialmente _. su uso en pai!ICS poco desanollados que no tienen acceso a medicmnentos costo!IOS. Mhúco es un pals con una v- biodiversidad y una grmn tradición en el uao de plantas con fines medicinales. Mue- llDD laa especies que gozmi de reputación folldórica como agentes ~ En COD!ICCuencia. la biodivcrsidad de México oftece buenas -'ivas pana el descubrimiento de nuevos agentes medicinllles con propiedades~- En la llCtUalidmd las i.mlestipo:K.-. conducentes a la -ión de principios activos veptales ,,., re111iz1m ~ ~ biodirigidas (Taylor et al .• 1995; Eloft; 1991; Cutler y Cudcr. 2000) empleando un biocnsayo c:onveniente pua guiar el aislamiento de los constituyenles bioactivos. sin 2 importar suS propiedades quúnicas o sus concenttaciones relativas en los exttactOs. Los estudioe biodirigidos., aanmtizan la obtención de compuestos bioactivos, muchos de los c:ualcs pueden -=r- estructunlmentc novedosos contribuyendo no solamente al campo de la química farmacéutica. sino también a otras áreas más especificas del conocimiento de los productos naturales (Cutlcr y CUtlcr, 2000). Para la detennimlción de la actividad antimiCTObiana se empican métodos de dilución y m6todoa de difusión en -- En __.i. los ensayos biológicos se realizan con una serie de mic..,.,._¡smos de prueba que incluyen '-'terias Gram positivas (Baclllus subtllls y Staphylococcus aureus). O.... negativas (E.sclterlchia co/i, Salmonella typhi y Pseudo_,nas oervginosa). levlldunos (C~ albican.s) y hongos (Aspergll/us niger y Trlchophyton mentagrophyte:s) tanto resistentes como susceptibles. La susceptibilidad de tales microor¡¡anismos al agente potencial 11ntimicrobimK> ae detennina en dos fases: en la primera se realiza un ensayo cualitativo primario que permite det- la presencia o ausencia de aictividad. En la segunda, se cuantific:a la potencia relativa (Romero, 1994; Kooeman. 1989; Vanden Berllhe et al .• 1991). Para realizar el ensayo primario oc utiliza generalmente. el - de difusión en p1- de -· en el cual las muestras a evaluar (exrnoctos.. fia<:ciones o compuestos puros) contenidas en un reservorio se ponen en ~ con un medio apropiado previamente inoculado con el miCl'OOl'¡Janismo de prueba. El ensayo se realiza en placas de Pctri o en placas de 911 pozos y después de un periodo de incubación lldcculldo. se examina la p1- en busca de zonas de inhibición del cn:cimiento microbiano aln:dedor del rcservorio (Paxton. 1991; Vanden Berllhe et al .• 1991; Stermitz et al .• 2000). Durmlte la incubación el IUltibiótic:o difimdc desde su rcscrvorio. micntnlS la población microbiana aumenta por división celular. El limite de la zona de inhibición se forma cuando se alcm>7.a la concentración critica del antibiótico. es decir. la mlnima concentración que inhibe el cn:ocimicnto de la población mi~ presente. Las zonas de inhibición se c:ompanm con las ~das con los lllltibióticos de referencia previamente establecidos por medio de pn>ebas de susceptibilidad. 1.2 Aloteceoleala de,..__-~- Arracacla tolw:en:sts (Umbellifcrae) (Fiaura 1) se conoce popularmente con el nombre de perejil. neldo. hierba del venado y cominos rústicos. En Méxi<:o. la plmlta entera se utiliza como condimento y pua el trammlcnto de la tos y la bronquitis (Ar¡paeta. 1994). Es importante de-.r - esta especie no ha sido C>t!ieto de estudios fitoquimicos previos. sin embeq¡o el estudio qufmico de la 3 especie relacionada Arracacia ne/sonli permitió el aislamiento y la caracterización de cumarinas. como los principales metabolitos secundarios (Delgado et al., 1986). 1.3 Antecedentes de Brickellia veronicaefolia Bricke//iu veronicaefolia (Kunth) Gray (Asterncene) (Figura 2) es un arbusto pequef\o cuyas medidas oscilan entre 40 cm y 1 tn de altura. Presenta hojas opuestas, ovaladas de 4 a 15 cm de largo por 5 cm de ancho. borde crcnudo. pecíolos de 3 u 6 cm de largo; las flores en cabezuelas miden de 12 a 17 1nm y son rosudns. La especie tiene por hábitat el bosque mesófilo de montn11.a y el bosque de encino o de pino, a una altitud de 1750 a 2750 rn sobre nivel del mar (Argueta. 1994). Figura 2 .. Bricke/liu veronicaefolia 4 TESIS CON 1 FALLA DE ORIGEN En México se conoce popularmente con el nombre de peistón o pexto y se utiliza pmra trmar desórdenes gastrointestinales y bifüues (Argueta et al., 1994). Desde el punto de vista fitoqufmico. lu especies del género Bricke/lla poseen una - diversidml de mctabolitos Meundarios los cu.tes pertenec:en a las c:ategorias de los sesquiterpenoides (Zdero et al .• 1991; Bohlmmm et al .• 1978; Doblmann et al .• 19112). polienos,, ditapenoides de tipo 1abdlmo (Bohlmann et al •• 1982; calclcron. et al.. 1983) y 0.Vonoidcs. en su mayada 6- metoxiflavonoides (Timmermann et al .• 1979; Mues et al .• 1979; Ulubelen et al •• 1980; R..- et al_ 19llO; Timmcnnum et al .• 1981; Rosler et al •• 19114; Goodwin et al .• 19114; Norris y Mabcy. 1985). A manera de ejemplo en el C- 1 se ilustran algunos metabolitos aislados de B. veronicaefolla. c-..1.M_...._ ........... llric-~.U. RP~ a.o , OH O M_..__yaefea ria -. ... Rl 112 R3 R4 7-metil éter de la6-metoxi~ H Me H H etal .• 1980l 3.6.7-trimetil éter de la quen:etagenina Me Me H H - et al. 1980) 7.4'-dimeiil éter de la 6-metoxiq.-.:etina H Me H Me ltR-..etal .• 1980) c.ticina Me Me H Me ln>.-....etal .• 1980) 3,7,3".4"..-U éter de la 6-metoxiquen:etina Me Me Me Me , .... ...___etal .• 1980) Brikellina ~ (liouanaetal, 1985) OH o 5 1.4 Antecedentes de Geranium niveum Geranium niveum es una hierba de la familia Geraniaceae que crece a lo largo de las orillas secas de los arroyos y en pastos de bosques de pinos y robles en las montañas de la parte occidental de Chihuahua, México. Los indigenas Tarahumaras reconocen a la planta con el nombre de umakikiu y emplean la decocción de la miz para el tratamiento de fiebres, problemas gastrointestinales y dolor de riñones. Para ello se toma una taza de té por In mai\ana y otra en la tarde (Bye, 1985; Rascón-Torres et al., 1994 ). De manera adicional, a esta especie se le atribuyen propiedades laxantes. En Jo que respecta a la actividad biológica del género Geranium, en la literatura se ha descrito que el extracto metanólico de la miz del G. niveum (Figura 3) presenta actividad moderada contra el hongo Trichophyton mentagrophytes. En el mismo estudio se demostró que el extracto integro de la planta carece de actividad antibacteriann contra cuatro cepas de bacterias tipo (Staphy/ococcus aureus. Bacillus subtilü·, Escherlchia coli y Pseudornonas aeruginasa) (Gutiérrez et al., 1995) Estudios químicos recientes de la especie G. niveum permitieron el aislmniento y cnrnctcrización de varias proantocianidinas novedosas y otros compuestos aromáticos (Calzada et cil., 1999; Calzada et al., 2001). En el Cuadro 2 se resumen los metabolitos aislados de esta especie. Figura 3. Gerani11m niveum 6 'rESlS C011 FALLA DE ORIGEN OenninaA (Calzada et al. 2001) GenninaB (Calzada et al. 2001) GenninaC (Calzada et al. 1999) Gennin&D (Calzada et al, 1999) 7 1.5 --ta de G-/IOIYllorlx El hongo coprófilo G_o...,,.,es polythrix Gonzálcz. Hanlin y Ulloa (Figura 4) penenece a 1D1 génen> nuevo de ucomicetos recientemente descrito (González et al., 2000). El nuevo género Guanomyces se encuentra estrechamente relecionado a los géneros C-10,,.lrun y Fanvwla, pertenecientes también a la familia Chaetomiaceae (orden Sonlariales). A diferencia de otros ~ de ésta familia, el nuevo taxón se c__,teriz.a por la presencia de un pcritecio con _.,. delicueacentes, ascosporas hialinas unicelulares sin \DI poro gcmioal y un cuello ostiolat largo, provisto de pelos laterales alandulares (FilJUl'BS SA. SB y SC). Con base a esta última car.cteristica se dcsip a la especie con el nombn: de G_,,.yces polythrlx. G. polytlrrbc se llisl6 a pmtir de IJumtO del murciélago úptmrycterl.s hlvalis en la Zona m de la Cueva del Diablo, siw.da en Tepoztlán., estado de Mon:los. México, durante Wlll expedición n:alizada en febrero de 1978 pea cano:teriz.at la Dora y la fauna de la cueva. Una ~ca relevante del honao copr6filo G. polythrtx es su capacidad de acumular liquido en las puobls de los 6pices de los pelos laterales. donde se forman pequetlas sotas (Fisuras 50 y SE). Apaaeuk:- la 8CUlllulacióo de este liquido _.,ce durante el alal'¡¡amiento de los pelos lateEales. CUllDdo el ascoma alcanza el e.a.do maduro, las IJOlaS del llquldo tienen una _.;eocia cima y brilt.nte. El estudio micro9cópico de este liquido permitió obaervar que después de pennmneccr unos minutos entre el porta y el cubre-objetos, s -..Sfonna en una pequdla mma cristalina. Además, me oi-rv6 que los c:ristales 900 solubles instantllnelllnente en -. lk:ido -.:ético y en etanol. Cabe mencionar que no me conoce claramente el papel biol6gico de -- ~iones, pero - presume que _,_como .... Yentes de iosectos. favoreciendo la disemllWCión del honao (Oonzález et al., 2000). La investi1J8Ción química del honao (MJoclas et al., 2000 y M.clas et al .• 2001) penniti6 el aislamiento y purificación de catorce metllbolitos secundarios, incluyendo siete derivados novedosos del tipo de las naftopironas. una xantona y meis compuestos conocidos: la rubrofusarina B, la emodina. el mctil...,.._..,, el lk:ido-4-bidroxibc:nzoico, el eraosta-4,6,8(14),22-wu.en-3-ona y la citridioa. Sus ~•ttucturu'"" il..-.n en el C.-0 3. 8 Figura 4. Hongo coprófilo Guanomyces polythrix en un cultivo de ugar de pupu-dextrosn 11 9 Figura S. Guanomyces polythrix (A) ascoma inmaduro tomado de una colonia de 4 d{ns de crecimiento. (B) ascomn con cuello largo oman1cntado con pelos lntcralcs. tomado de una colonia de 7 dins de crecimiento. (C) amplificación de los pelos laterales glandulares, (D) pelo lateral glandular y (E) vista de las puntas TESIS CON FALLA DE ORIGEN C ....... 3. M---____ ..._ -rit- ..... G---polytllrb: (Macias et al .• 2000 v Macias et al .• 2001) M-- Ea-ra ( + )-(2S.3S)-5-hidroxi-6.8-dimetoxi-2.3-dimctil- ~ 2,.3-, y los ,,q,.los miden aproximada"""""' 1 cm de largo. Esta cspcc:ic en particular tiene por hábi- la !11Clva alta. y el bosque algo !llCCO prcmom...., a bosque meaófilo de montalla. a una altitud de 600 a 1450 m (Hictz y Hietz-Scifcrt. 1994). Maxillaria densa (Sin: Ornlthúlilllft densUlll Lindley) es una epifita que ., disttibuye en Guatemala. Honduras y Ml!xico (Ames y Corrcll. 1952). En nuestro pais se encuentra principmlmente en la zona de los Tuxtlas. Estado de Venocruz. El ¡i6l>Cl'O Scaphyg/oit/s Poeppig & Endlichcr incluye 20 especies distribuidas en los trópicos de: Aml!rica (Ames y Corrcll. 1952). S. /lvida es una epifita que se distribuye en Guat.emaJa. Honduras y Ml!xico. La especie S. //vida es una planta erecta. con tallos 2 a 3 veces ramificados. y ..- nma con un scudobulbo f\Jsifonnc. delgado y.,.,,.-; los !llCUdobulbos llegan a medir basta 10 cm de largo por 8 mm de diámetro y con 2 hojas. Las hojas son anaostas y lineares., y miden de 4 a 12 cm de largo y de 3 a 4 mm de: ancho. con lipicc retuso. Las flores son escasas en el seudobulbo terminal y peq- con ovarios conos de color verdoso-<:rcma con lineas violetas. Los p!talos y sl!palos miden aproximedamcnte 2 mm de largo. Tiene por b.bitat principalmente la selva alta y el bosque seco premontafto a bosque mesófilo de montalla, a una altitud de 600 a 1500 m (Hictz y Hietz-Scitert. 1994). Desde el punto de vista fitoquúnico. un tiacciomunicnto biodiri¡pdo de los extnM:tos activos de M. densa y S. llvida permitió et aislamiento de los estilbenoidcs cspasmoliticos que se indican en los c.-ros 4 y 5 rcspec:tivameme. 13 Cuadro 4. Metaboli- ablados de M-m.rl• tkrua Metabellto y referemcia E•tructura 2,S-dihidroxi-3,.4-dimetoxif"cnantreno <=&-(Estrada et al .• 1999) 9, 1 O-dihidro-2,S-ditúdroxi-3,4-dimetoxifenantrcno ctR.-(Estrada et al.. 1999) Nudo! ~H (EstJ'ada. 2000) OMe OMe Gimnopusina ~ (Valencia et al .• 2002) FimbrolA Q:Q--(Estrada. 2000) OHOMe ~ Eriantridina ~ (Valencia et al .• 2002) OMe OMe 14 c ....... 5. M-boUto• als .. dos de SellpltYflfods 1- M-bolltoy ~- Em-ra Batatasina 1µ ~ (Estrada et al .• 1999) 3.4'-dihiporCionadas por los Drs. Miguel Ulloa y Mmia del Carmen Gonz6lez del lnsli- de Biolopa y se indican en el Cuadro 9. Los exuactoa se __.,n a _.ttr del micelio y los medios de f"ermc:ntación de los J>onaos (10 L). La f"ermen&al:ión ... reali2.ó • - ~ de 211" e y dunmte IS días utilizando PDA (DIFCO) como medio de cultivo. Al Cllbo de la fermentación se _.., el micelio del medio vla cenlrifUa-cjón. En <*la .,.,.., el micelio se ~ vla ma&:el'8Ción con CHzC'2 y AcOEL El medio de cultivo,,., ~o COD9CCutivamente con CH,Ch y Ac:<>Et mediante un proceso de partición. 26 En el caso de Guanomyces polithrbc y Malbranchea aurantiaca se combinaron el extracto del micelio y el extracto del caldo. e-re 9. ~- Fma...,_ objeto de eval-iéa R_._ __ de ead• estnieto VomcHr E•peeie Fmapa v--• Ea-del Ell-clel IFa•IUa» cmlthfon ... --·-· --·-· U2201-I Farrowia longicollea 10 3.0 0.2 CChactorniaceae \ 2001-2 Gymnascel/a dankaltensis 20 22.4 6.8 l C91dvO l'l' _ll. -elio••• 24486 Guano,,,,,,ces pollthrbc 10 7.6 CChaetomillCCaC) 2001-3 Malbrancleea a11rantiaca. 22 11.4 r¡pllÜsmos de prueba. a) Miaoorganisrnos de prueba y medios de cultivo. Pana la realización de los bioensayos se cmplemon cepas de microorgmlisrnos ATCC (Americ- Type Culture Collection) que incluyen '-:terillS (Cñmn positivas y Grant negativas) y una levadura. Todos los microorganismos fueron propon::iou.los por el Cepmrio de la Facultad de Química. UNAM. En el C....tro 10 se indican los microorganismos de pnaeba y ,,., mencionan wnbil!n las condiciones de incubación y los medios de conscrvmción apropiados plll"a cala uno de ellos. Los medios de cultivo se rehidrataron de mcucrdo con las indicaciones de la casa comercial. Los medios resultantes se esterilizaron en autoclave a 121 ° C y 1 S lblcm2 , dmantc 30 núnutos. 3.3.2 Detenninación del número de células por medio del estm.dar tulbidimétrico de McFarland. El número de - en un medio liquido .,.-se ser~ por la comparación visual de su turbidez con la de un esdndar turbidimétrico que representa W1 número conocido de bmcterias en suspensión. 27 En el Cuadro 11 se enumeran los reactivos y las cantidades necesarias de las soluciones requeridas para la prepuación del estándar turbidimétrico de McFarland. La turbidez generada por la mezcla de los reactivos a una detenninada proporción corresponde aun número aproximado de células becterim1115 presentes en el medio liquido. CUADRO Je Mie._.....,la•-• ..-.... y ---·--o Gn1pode Mie.....,.•la•o c--.nde Medio de .1c .......... - -· ... -· coaaervacl6•* Ciram Slaphylococca.s aureus 37º c. aerobias Agar Nutritivo Positivo (ATCC 25923) Bacterias Bactllus .subtilis 37º c. aerobias Agar Nutritivo (ATCC6633) E.scherk:hia coli 37º c. aerobias Agar Nutritivo Gram (ATCC 10S63) Negativo SalMO-lla typhi 37º c. aerobias Agar Nutritivo Pseudomona.r aerMginosa 37º c. aerobias Agar Nutritivo (ATCC 27853) Hongos Lcvadurifonne Canidora critica se m.-i en el Cuadro 12. En el Cuadro 13 se indican los disolventes mdecuados para la realización de la !IOlución stock y para la preparación de las ooluciones de los 1111tibióticos. CUADRO 12. Amti-•- ., _____ .. _.....,..._ i.•lbidoraerttka Microo ...... illmo Aatibl6tieo C..-aradoaea (µsf•L) Staphylococew1 aureus Ampicilina 1.0, 2.S, S.0, 7.S. 10.0 Baci/lus subtilis Estreptomicina 1.0. 2.s. s.o. 7.s. 10.0 &clteric#Ua coli Gcntamicina 1.0, 2.S. S.O, 7.S. to.O Sal-.-lla typhi Gentam.icina 1.0. 2.s. s.o. 7 .s. to.o P.seudo11WJncu aerugi~ Gcntamicina 1.0. 2.s. s.o. 7.s. to.o Candida albicans AnCotericina B 10, IS, 20,2S, 30 29 b.3) PrqJaración de las placas de agar. Las placas de &glll' se prepararon colocando 10 mL de asar inoculado con el microorganismo de prueba en cada caja Pctri. El volumen de inóculo empleado para cada microorganismo se indica en el C....tro 14. CUADRO 13. _..,_,_-..-...para la d .... -'69 de._ ... 1-. A•ttloi6dco _..,_te ........ -••ci6• __ ... .,.. ...... te ...... ~- (nürtl) (at~rtl) Ampicilina Buffer de pH 8 • Agua destilada Estrq>tom.icina Buft"erdepH 8 Agua destilada Gcntam.icina Buffer de pH 8 Agua destilada Anfotericina B Dimetilsulfóxido•• Buffer de pH 8 • Fosfato de Potasio 0.1 M •• Disolvente que se emplea sin esterilizar. CUADRO 14. V-de-. .. -..-. para ... _y_ ~- 1-.1o por can•• •L de -r Slaphylococcus QllTeta 0.2mL Bacillll!l Sllbtllis 0.2mL Esclwrichia coli 0.2mL Sol-lla typhl 0.2mL Pseudolnonas aeruginosa 0.2mL Candida alblcans 2.0mL b.4) Bioeosayo. Una vez"°~ t.s p1- de - se colocuon dos disc:os en fürma equidistante en~ p'-. Un disc:o contenfa S ""del mttibiótico (c!dndmr) y el .mu contcola 10. 7.S. s. 2.s o 1 pg/mL. de una conceotncióo düercnte (Figura 13). Las cajas se: preincubaron dunmte 30 minutos a temperatura ambiente y luego llC incubson en t.s condiciones ~ para el crecimiento de los miCToorgaoismos utiliDodos en el estudio (CUMlro 1 O) (Linton. 1983). El ensayo se noalizó p>r triplicado pua obtener un valor de la concentración mínima inhibitoria. Posteriormente. el ensayo ,,., 30 realizó 4 veces más. paro obtener un total de 5 valores de concentración critica para cada microorganismo. esto con el fin de poder realizar un tratnn1icnto esléu.lístico y asi dctcnninar la concentración a utilizar en la evaluución de Jos extractos y sus compuestos. La concentración de cada uno de lo..o; antibióticos de prueba seleccionados para su empleo como control positivo se presentan en el Cuadro 1 S. A .. D E Co1.ccntntción • mL) JO.o 7.S 5.0 2.S 1.0 A ~-.lución de M.cfi..-n..11cio CUADRO IS. Concentr•~ión de c:aid• uno de loa •nliblótleo• de prueba •ele-c..-:io••dos como control nositi"'º· Microorganisn10 Antibiótico S1unhvloccoc11.o; uure11 . .; Amnicilina Bacill11s subti/i.o; Estrcotornicina E . .;C'herichiu coli Gcntamicina Salmunella IVtJhi Genlamicina Pseudomona.~ acr11Pino . .;a Gcntmnicina Cundida albkans Anfotcricina B Concentración (µglmL) 0.20873 0.22970 0.67684 0.72983 1.00167 0.77458 Concentración utili7..ada en el CllSDYO (uu/mL) 0.6 0.6 2.0 2.0 2.7 11.0 e 3.3.3 Dctcrm.inación cualitativa de la actividad antimicrobiana por el método de difusión en agar utilizando discos de papel filtro como rcscrvorio. Para Ja detenninación de la actividad potencial antimicrobiana de los extractos y compuestos se siguió el mismo procedimiento empicado para la dctcnninación de la concentración inhibidora critica de los antibióticos con la variante de que tos discos se impregnaron con 100 µL del extracto disuelto en DMSO conteniendo 1000. 500 y 100 µglmL de extracto. Los compuestos. también disueltos en DMSO. se evaluaron a 100 .. 10 y 1 µg/mL. AJcmtis se utilizó el control positivo del nntibiótico 31 adecuado. dependiendo del microorganismo de prueba. a una concentración mayor a la concenttación inbibidora critica dctcnninada previamente. 3.3.4 Detcnninación de la Concentración Mlnima Inhibitoria (CMI). Los valores de CMI que se presentan en este estudio se determinaron a partir de la COl""'ntr.ción critica inhibitoria de .cuerdo al ...-...iento de Linton (Linton. 19113 ). 32 IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN En el presente estudio se determinó la actividad antimicrobiana de 1 O extractos derivados de especies vegetales y cuatto extractos deñvados de especies füngicas recolectadas en la Rep(ablica Mexicana. La estrategia metodológica empleada para la realización del presente trabajo se resume en los esquemas 1 y 2. Especies vegetales malicinalcs pre selcccionmdas pua el presente estudio l ~~~ 1M=~·1 1 Drogas- molidas 1 l 1 Exlnctos ~ 1 33 ~ióncual_.va --- . . EM1-• 2. E•tratesim •etoclol6ska empicada e• el ntudlo de ... apeeia ffo•pcaa. Micelio Cultivo o fermentación de las especies fúngicas seleccionadas .,_.. el presente estudio Ccntrifus-ción Medio de fcnnentación Exaw:ción vla llWCCl"llCÍÓll Exlr9cción vla partición Detennir..ción cualitativa de la Ktividlld mntimicrobiana 1 Micelio y extncto 1 - potencialmente -iKpticos - La selección del material vegetal objeto de estudio se reali7.6 principalmente con base en su uso en las prácticas medicinales alternativas de México. En el caso de las orquideas E. cardiochilum. E. bootltii y E. rlgldwlt la Belección se reali7.ó con bue en el criterio quimiotaxonómico, ya que se han repo- lllgunas orquidcas con propiedades antisépticas ( Tezuca et 111 •• 1990; Takagi et al., 19113: Yamaki et al., 1990)). Tres de las especies lüngicas se seleccionaron al azar, en tanto que G. politlrüc se sclccc:ionó con base en el criterio ecológico (Macias. 2001). Es importante hacer notar que estos criterios de selec:ción - bien docwnentados en la literatutB (Eloff. 1998; Cutler y Cutler, 2000; Newman et al, 2000). 34 En todos los casos el material vegetal recolectado se desecó y se fragmentó para obtener las drogas crudas molidas. Posteriormente. las drogas crudas se extrajeron mediante lDl proceso de maceración empleando una mezcla de CH2Ch- McOH (1 :1) como disolvente. En el caso de las especies füngi~ los exttactos se prepararon a partir del micelio y los medios de fermentación de los hongos utilizando como disolvente CH2Ch y AcOEt. Los extractos orgánicos correspondientes (CH2C'2 y AcOEt) se combinaron. Todos los extractos se evaluaron mediante el método de difusión en agar utilizando discos de papel como rcservorio y los antibióticos apropiados como controles positivos. Los microorganismos de prueba fueron seleccionados de acuerdo a su patogcnicidad sobre el hombre y los animales: El g.!nero Staplty/ococcus es una de las causas más frecuentes de infecciones en la piel, ya que contiene patógenos comunes al hombre y tos animales. P. aeruglnosa es responsable de cnf"ermedades como dermatitis y otitis externa. S. typlti y E. coli destacan entre los principales agentes causales de gastroenteritis y fiebres entéricas, además de ocasionar septicemia e inCccciones urinarias. C. albicans es considerada Wl patógeno oportunista.. pero puede alojarse en diferentes zonas del CUCl'JIO humano y causar candidiasis y vaainitis en las mujeres. Se midieron los halos de inhibición generados por el extracto sobre el crecimiento de cada uno de los microotganismos de prueba (S. aureus, B. subtilis, E. co/i, S. typhl, P. ae,...gtnosa y C. a/bicans) compmnondo ésto9 con los halos de inhibición genendos por el control positivo seleccionado a partir de la detcnninación de la concentr11eión inhibidora critica. La concentr11eión del antibiótico empleada fue mayor a la concentnleión inhibitoria critica con la finlllidad de guantizar la difusión de la cantidlKI de antibiótico que cause un balo de inhibición significativo y que sea similar a la c:on<:CDtración inhibitoria núnima (CIM) (Linton. 19113) Los extnlCtos"" evaluaron a Ju coocentraciones de 100. SOO y 1000 J.18/mL. considerando que un extracto "" considera activo a concentraciones menores de 1 msfmL. (Tegos et al .• 2002). Las rcspucstaS genemdas por el extracto se compmaron con l~ gcnemdas por el control positivo adecuado. Los resulllldos"" presentan en los C.-!ros 16 - 21. 35 CUADRO 16.. --- de .. zoaa de lallúbici6• (•• ·).._. ............ _por los e:al..---- .oltre~-·- Extracto (Extracto) Control [Extracto) Control [Extracto) Control 1000 uo/mL positivo 500 ""'mL positivo 100 ··-1mL --itivo Arracacia tolucensis 22.33 29.00 N.A. N.A. ±0.47 ±0.82 Epide-.,,,. c-diochil..- 22.67 35.33 22.67 31.00 N.A. ±0.47 ±0.47 ±0.94 ±0.82 Núlewta boothii 24.67 35.33 29.33 32.00 N.A. -- ±0.471 ±0.47 ±0.94 ±0.82 Gyrnnascel/a dankaliensis 33.67 29.67 31.67 29.00 25.67 40.33 l'mice/io) ±0.47 ± 1.247 ±0.47 ±0.82 ±0.47 ± 1.25 Malbranchea aurantiaca 21.67 29.33 21.00 29.67 N.A. -- ±0.94 ±0.47 ±0.82 ±0.47 Maxillaria densa 30.67 31.67 27.33 30.67 25.00 30.67 ±0.94 ±2.36 ± 1.89 ±0.94 ±0.82 ±0.94 Scaphyglotls livida 33.00 33.67 26.67 34.67 N.A. ±0.82 ±2.63 ±2.87 ±2.63 N. A.: No Activo . . ... Control positivo: Amp1c1hna [0.6 µg/mL] Diámetro del di!ICO: 16 mm. CUADROl7. -dela-acle-- (••·)-....-.mper __ _...._ -re..,,,._._. Extracto (Extracto) Control (Exu.cto] Control (Extracto] Control l()()Ouo/mL nr>J11itivo 500uo/mL positivo I00•• 0 'mL positivo Núle,,,,,. boothil N.A. -- 22.00 29.33 N.A. -- ±1.63 ±0.47 Fan-owia /ongicollea N.A. -- 24.00 35.00 N.A. -- ±1.41 ±0.82 Gyrnnascel/a danmllen.d6 30.00 30.00 29.67 30.00 26.00 31.00 (extracto) ±0.00 ±0.82 ±0.47 ±0.82 ±0.82 ±0.82 Prionosciadium watsoni 17.33 32.00 16.67 34.67 17.33 34.67 ±0.47 ±0.00 ±0.47 ±0.47 ±0.47 ±0.94 N. A.: No Activo .. Control positivo: Estteptonucma (0.6 µglmL) Dimnetro del disco: 16 mm. 36 CUADRO IL DIA•-de la-de i.lllbiei6m (a•') desa........__ por los es-activos -.. Escllwrie"*- coll Extracto (Extracto] Conttol (Extracto) Conuol [Extracto] Conlrol IOOOualmL nositivo 500··-'mL positivo 100 ··-1mL --itivo Arracacia tolucensis 24.00 23.00 24.00 23.00 N.A. -- ±0.00 ±0.00 ±0.82 ±0.00 Briclcellia veronicaefolia 26.00 18.00 23.67 18.00 21.00 22.00 ±1.63 ±0.82 ±0.94 ±0.82 ±0.82 Epidendnmt cardiochilurn 21.67 21.33 21.67 22.00 N.A. -- ±0.47 ±0.47 ±0.47 ±0.82 Farrowia /ongicollea N.A. -- 22.67 25.67 N.A. -- ±0.94 ± 1.25 Geraniiun niveum 22.00 30.33 20.67 30.00 N.A. -- ±0.00 ± 1.25 ±0.47 ±0.82 Guanomyces polythrb: 23.33 22.67 22.33 23.00 22.00 22.33 ±0.47 ±0.47 ±0.47 ±0.00 ±0.82 ±0.47 Gyrrutascella dankaliensls 23.33 23.00 22.00 22.67 21.67 21.33 ltcaldoJ ±0.47 ±0.82 ±0.000 ±0.47 ±0.47 ±0.47 G>""""-'cella dankaliensis 21.67 22.33 21.33 23.00 N.A. -- [(,,.ú:dioJ ±0.47 ±0.47 ±0.47 ±0.82 Malbranclwa ,,_anliaca N.A. -- 21.00 22.33 N.A. -- ±0.00 ±0.47 Selagi-lla lepidoplrylla 27.33 17.33 24.00 17.67 N.A. -- ±0.47 ±0.47 ±0.82 ±0.47 Prlonosclodiiun watsoni 22.33 25.00 20.00 23.00 19.00 21.67 ±0.47 ±0.00 ±0.82 ±0.00 ±0.00 ±0.47 N. A.: No Activo Control positivo: Gc:nlamlcina (2 µBfmL] Diámetro del disco: 16 mm. CVADR019.~dela-tle' 'lb~ ,, <-') 5 pj ··-•• por _____ sollre s.r.o.dlta ,,.,., ExlnlCla (Exlraclo] Coabol [Extrw:lo) Coolrol ~ Conlrol 1000··-'mL nositivo 500ua/mL . nrM1.itivo nn.itivo Arracacio tolucencis 24.00 21.67 23.33 20.67 25.00 25.67 ±1.41 ±0.47 ± 1.25 ±0.47 ±0.00 ±0.47 Epülendntm cardioclúl- 22.67 20.00 N.A. -- N.A. -- ±0.94 ±0.00 NideMO bootlúi 23.33 20.33 22.67 21.00 22.33 26.33 ±0.47 ±0.47 ±0.94 ±0.00 ±0.47 ±0.94 Epidendntm rigidlun 21.00 20.00 N.A. -- N.A. -- ±0.00 ±0.00 37 CUADRO 19 • .,.. ___ 1a-t1e ill•- (•• ·)~per_es ____ .... re ~ --61 lContinu.::ión) Extracto [Extracto] Control [Extracto] Control [Extracto] Conuol 1000 "-'mL oositivo 500 ua/mL positivo lOOua/mL positivo Farrowia longicollea 21.00 24.67 N.A. -- N.A. -- ±0.00 ± 1.25 GeranillM nivelUft 22.33 22.33 N.A. N.A. ±0.47 ±1.70 Gwmo,,.,,ces polythr/% 24.00 21.33 21.67 20.67 24.67 25.00 ±0.82 ±0.47 ±0.47 ±0.47 ±0.94 ±0.82 Gyrnnascel/a dankaliensis 23.33 20.33 21.33 20.00 23.33 25.67 lfca/do) ± 1.25 ±0.47 ±0.47 ±0.00 ±0.47 ±0.47 Gymnascella danlralknsis 22.00 20.00 N.A. -- N.A. lfmice/iol ±0.00 ±0.00 Malbranchea cauanliaca 24.00 20.00 23.33 20.00 24.33 24.67 ±0.82 ±0.00 ±0.94 ±0.00 ±0.47 ±0.47 Maxi/laria densa 21.67 20.00 21.00 20.00 25.00 25.67 ±0.47 ±0.00 ±0.00 ±0.00 ±0.82 ±0.94 Scaplryglmts livida 23.67 21.33 22.33 20.67 23.00 26.33 ±0.94 ±0.47 ±0.47 ±0.47 ±0.112 ±0.47 Selagl-1/a /epidoplrylla 22.00 20.00 20.33 19.67 23.67 26.00 ±0.82 ±0.00 ±0.47 ±0.47 ± 1.25 ±0.112 Prionosciodi11111 walsoni 20.33 25.00 20.67 23.67 20.67 23.67 ±0.94 ±1.41 ±0.47 ±0.47 ±0.47 ±0.47 N.A.: No Acttvo .. Control pos1Uvo: Gentamlctna (2 µg/mL] Düimetro del disco: 16 mm. CUADROZe-tlela-tlel•k*I U•(••·)~ ..... -~-- ..ttrel'Wt ... 1 ... -.&!' ... 1 -Extnicto (Ex1nlcto] Coalrol (Ex1ncto] Coalrol [Extracto] Control lOOOua/mL nositivo 500 ""1mL nositivo IOOuo/mL D1H:itivo Epidendrwrt cardioclril_,, 23.67 21.67 23.33 22.33 N.A. -- ±0.47 ±0.47 ±0.94 ±0.47 Epide-- rlgidwlo 22.00 21.00 N.A. -- N.A. -- ±0.00 ±0.00 Gt!raniaun ~ 22.33 24.00 N.A. -- N.A. -- ±0.47 ±1.41 Ma/branclwa _.anliaca 23.67 21.33 N.A. -- N.A. -- ±0.47 ±0.471 Priono&ciadi,,,., wal.soni 18.7 23.67 19.00 25.00 18.33 26.00 ±0.47 ±0.94 ±0.00 ±1.41 ±0.47 ±0.00 N. A.: No Acttvo .. .. Control pos1uvo: Gcntamictna (2.7 µg/mL] Düimetro del disco: 16 mm. 38 ClJADR021-.-dela-de -·- (•• ., _.....,_ per ______ -c.--_,..,_ Extracto [Extracto) Control [Extracto] Conúol [Extracto) Conbol 100() .. almL --.itivo SOO "ª'mL ~tivo lOOna/mL positivo Arracacla 10/ucencU 26.67 30.00 24.67 28.33 20.33 30.00 ± 1.2 ±0.00 ± l.2S ±1.70 ±0.47 ±0.00 JlTtcl:ellia veronic-falta 23.00 31.33 22.33 3S.OO 20.67 28.00 ±2.16 ±0.47 ±0.47 ±0.00 ±0.47 ±0.82 Eptdendnun cardtochilutn 2S.OO 34.67 2S.OO 3S.67 21.33 3S.OO ±2.4S ±0.94 ±0.82 ±0.47 ±0.47 ±0.82 Núk- bootldi 24.67 3S.67 21.33 34.67 22.33 28.00 ±0.47 ±0.47 ±0.47 ±0.94 ±0.47 ±0.82 Eptdendnun rtgldwn 26.33 30.67 23.67 33.67 20.00 29.00 ±0.94 ±0.47 ±0.47 ±1.89 ±0.00 ±0.00 Farrowia longlcol/ea 22.67 28.67 21.67 30.33 21.33 30.33 ±0.94 ± l.2S ±0.47 ±0.47 ±0.47 ±0.47 Geranitun niw'Mlft 23.00 30.33 21.33 32.00 20.67 31.33 ±0.82 ±0.47 ±0.47 ±1.41 ±0.47 ±l.2S GuanoMyCes pol]lflrb< 23.00 30.33 23.33 31.33 21.33 29.67 ±1.41 ±0.47 ±0.47 ± l.2S ±0.47 ±0.47 GyrrutaScella danlta/ie>Uts 27.33 30.00 23.67 30.00 22.33 30.33 lrcaldoJ ±0.94 ±0.00 ±1.24 ±0.81 ±0.47 ±0.47 GyrrutaSce/la danA;a/ien.sU 27.67 30.00 27.00 29.67 24.67 30.33 1 (tnice/io) ± 1.25 ±0.00 ±0.82 ±0.47 ±0.47 ±0.47 Malbr-.chea--'-'a 28.33 29.33 27.00 29.33 25.33 30.33 ±0.47 ±0.94 ±0.00 ±0.47 ±0.47 ±0.47 Alaztllarta denso 26.00 30.00 22.67 30.00 21.67 32.33 ±0.82 ±0.00 ± t.2S ±0.00 ±1.70 ±2.62 Scophyglotl.s ltvlda 24.33 30.00 23.00 30.00 22.33 30.67 ±0.47 ±0.00 ±0.00 ±0.00 ±0.47 ±0.47 PriortOSciadilllft wal~onl 19.67 28.67 19.00 28.00 18.67 28.67 ±0.47 ±0.94 ±0.00 ±1.63 ±0.47 ±0.47 N. A.: No Activo . . .. Control -"'vo: AnCotencma B [l lpg/mL) Dimnetru del di11CO: 16 mm. De mcuenlo a esaos resu1.- podemos ..-Var que _,a S. ~- siete extractos pK9Cntaroo mctividad. los ...- mctivos fiaeroa los couespondientes a M. densa. S. livtda y el mi<:clio de G. don/ralieJUts. Pma B. Sllbll/ts, ""'° el extracto de G. dallkalie>Ul.s presentó una buena a:tividad. En el cuo de E. cali, cuabu extnctos ...-- mctivid8d. Estos 90D los de B. _,,,,,le-falla. G. ""-- G. polytlrri% y S. lepidoplrylla. Como B. _,.,,,kaefolio. G . .u-,,,.. y S. /epidoplly/la ""° utilizadas en la 39 medicina tradicional para el tratamiento de desórdenes gastrointestinales es altamente probable que este resultado esté relacionado con el uso popular de las plantas. S. typhi fue susceptible a seis extractos, incluyendo a Jos de A. tolw:ensis. N. boothll. G. polythrlx, S. livida, M. awrantiaca y el caldo de G. danka/iensis. P. aeruglnosa resultó sensible a los extractos de E. cardioclúlum y M. aurantiaca. En el caso de C. albicans los extractos de A. to/ucensis. M. densa. E. rigiclum, y los provenientes del micelio y el caldo de G. dankaliensis y M. ª"'antiaca. fueron los que inhibiCTOn en mayor grado el desarrollo de la levadura. Con base en estos resultados podemos observar que G. dankaliensis presentó actividad contra tres bacterias (una Grlllll positiva y dos Gram negativas) y la levadura, por lo que esta especie fúngica constituye una fuente potencial de antibióticos de amplio espectro. M. aurantiaca inhibió el crecimiento de dos enterobacterias y de C.albicans, de tal forma que es recomendable estudiar la especie con el rm de descubrir antibióticos útiles para el tratamiento de infecciones gastrointestinales. De las cinco orqufdcas evaluadas, M. densa y S. livida fueron activas contra S. aurem, por lo que podemos pensar que contienen sustancias útiles para combatir infecciones de la piel y otras producidas por mic:fOOl"ll'UÚSl11os Gram ( + ). Los compuestos ensayados se evaluaron únicamente 90bre los microorganismos susceptibles al cxttllCtO de origen. Los co1npucstos analizados se presentan en el Cuadro 22. Los resultados se presentan en los CUlldros 23 - 27. C ... ro:z:z • ..._ .... ._ ____ __........ Nombn: de Comn11r!dn Extracto de oriRcn Estruc:tura Clave Nudol Maxil/arla densa ~~ 1 OMm O- 2,S-dihidroxi-3,4- Maxil/aria densa c8=cH 11 dirnetoxifcnantrcno OH o- OM9 40 c ...... n.. ~ ...... - --·--•l..._ (Continuación) Nombre de Com~ e- de -gen EslnJctura 2.5-dihidroxi-3,4- Almcillarla •-a dimetoXi-9,10- dibidrufenantreno Oimnopusina Erimmidina (+)-{2S,,3S}-5-hidroxi- 6.--.C0xi-2,,3- dimetil-2,,3- dihldrolwftopirona (+}-(2S,,3S}-5-bidroxi- 6.8,l«Hrimdoxi-2,,3- dimetil-2,,3- dihidronaftopir 41 Clave lll IV V VI Vil vm C••dro ZZ.. Estftld8 .... de loe ee•...-.•oe ew•l•Mla• (Continuación) Nombn: de Compuesto Extnocto de origen Estructura Clave Ergosta-4,6.8( 14 ).22- Gua,,,,_,,ce .. polythrix ro 1'06. IX tetncn-3~ .,..,_ ~ft - ~ ~r L] I .J. J ~ - - Seravshanina Prionosciadi11m watsoni X ~ + "o o (9R, I OR}-9-acctiloxi- I O- PrionosciadiMlfll watsoni XI propioniloxi-1.1-dimctil- 9, 10-dihidro-2H.IH- benzo[ 1.2-b:3.4- ~ b']dipiran-2-ona y- "o o (9/l.JOR}- 10-hidn>xi- Prionosciadi11111 watsoni ~ XII l.l-dimetil-9,10-dihidro- 2H.llH-ben:zD( 1.2-b:3,4- b']dipiran-2-ona-9-éster o (9R-1 OR}-9-bidroxi-1 O- Prionosciodilllft wauol'li XIII isobutiroiloxi-8.8- dimctil-9,10-dihidro- 2H.IH-benzo[ 1.2-b:3,4- ~ b']dipinn-2-ona + o 42 c ........ 21. Ea-chlraa de - -•P•--eval- (Continuación) Nomhl'e de Compuesto Extracto de origen EstTUctura Clave (+)-cis- kellactona Priono.sciadiaun watsoni ffe- XIV Jatamansina Prionosciadium watsoni ~ XV o (9R)- 9-hidroxi-8,8- Prlonosciadirun watsonl ~ XVI dimetil-9, l 0-dihidro- 2H,8H-benzo[l .2-b:3.4- b')dipiran-2-ona o CUADRO 23. --de la - de bolliblei6m (••-)_..........._por - _..,._... _.,re .st.plr]flococr-·-- Compuesto [Compuesto) Control [Compuesto) Control [Compuesto) Control 100 uo/mL positivo 10 ~olmL nositivo lu;,lmL l"'lnlllitivo 1 35.33 29.33 N.A. -- N.A. -- ±0.47 ±0.47 11 22.33 31.00 N.A. -- N.A. -- ±0.47 ±1.41 m 25.00 29.33 23.67 30.00 N.A. -- ±0.82 ±0.94 ± 1.25 ±0.00 N. A .. No Activo .. .. Control posauvo: Amp1cabna [0.6 pg/mL) Diámetro del dasco: 16 mm. 43 TESIS CO?J LA DE ORIGEN CUADRO 24. Di6- ele i. -•• de l••lbici61l (••» d,...rrola.d ... por ._ __ .,.._,_ -"' Est:ll,ric:lliM t:Oli Compuesto [Compuesto] Control [Compuesto] Control [Compuesto] Control 100 uu/mL oositivo 10 »olmL positivo 1 "º'mL positivo VI 20.00 21.67 N.A. -- N.A. -- ±0.82 ±0.47 VIII 27.67 24.00 23.67 24.00 22.33 24.33 ±0.94 ±0.82 ±0.47 ±0.00 ±0.47 ±0.47 X 25.33 23.67 N.A. -- N.A. -- ±0.47 ±0.94 XI 25.33 24.33 23.33 25.00 25.67 28.33 ±0.47 ±0.47 ±0.47 ±0.00 ±0.94 ±0.47 XII 25.00 23.67 23.67 24.67 22.67 22.67 ±0.00 ±0.94 ±0.94 ±0.47 ±0.94 ±0.47 Xlll 23.33 26.67 N.A. -- N.A. -- ±0.47 ±0.47 XIV 23.00 23.67 22.67 22.33 22.67 22.67 ±0.82 ±0.47 ±0.47 ±0.47 ±0.94 ±0.47 XV 24.67 27.67 23.67 27.67 22.00 27.33 ± 1.25 ±0.47 ± 1.25 ±0.94 ±0.00 ±0.47 XVI 24.33 22.00 N.A. -- N.A. -- ±0.47 ±0.00 N. A..: No Acbvo .. .. Control positivo: OentamJcma [2 µglmL] Diámetro del disco: 16 mm. CUADRO 25. - de i. - de -ibici611 (•••) d-rro-Oll por ... eo•pa- -bre _,,,_ ,,,,.., Compuesto [Compuesto] Control [Compuesto] Control [Compuesto] Control IOOuo/tnL ftn!llitivo IO"º'mL positivo l "º'mL oositivo 1 30.33 26.33 N.A. -- N.A. -- ±0.47 ±0.47 11 26.33 26.67 21.33 27.67 23.67 26.00 ± 1.25 ±0.94 ±0.94 ±0.47 ±1.70 ±0.00 111 22.00 25.33 20.33 25.67 26.67 25.33 ±0.41 ±0.47 ±0.47 ±0.47 ±0.94 ±0.47 IV 24.67 27.33 24.67 25.33 22.67 24.67 ±0.47 ±0.47 ±0.47 ±0.47 ±0.94 ±0.47 V 26.667 25.67 24.67 28.00 23.67 28.00 ±0.47 ±0.94 ±0.47 ±0.00 ±0.47 ±0.82 VI 28.33 28.00 27.00 27.00 26.67 26.00 ±2.36 ±0.00 ±1.41 ±0.82 ±0.94 ±0.00 VII 24.33 27.33 22.67 28.00 23.00 25.67 ±0.47 ±0.47 ±0.94 ±0.00 ±1.63 ±0.94 44 CUADRO 25. Diámctro9 de a. zona de labibicióa (•-,.;) desarrollados por los co•puestos llObre s.1-'"" typlli (Continuación) Compuesto [Compuesto] Control [Compuesto] Control [Compuesto) Control 100 cu•/mL positivo 10 "º'mL positivo 1 uolmL positivo IX 25.33 28.00 23.33 27.67 23.67 26.33 ±0.47 ±0.82 ± 1.25 ±0.94 ± 1.25 ±0.94 X 26.33 25.00 23.67 24.00 23.33 27.33 ±0.94 ±0.00 ±0.94 ±0.00 ±0.47 ±0.94 XI 26.67 28.33 25.33 28.67 25.67 28.33 ± 1.25 ± 1.25 ±1.89 ±0.94 ±0.94 ±0.47 XII 27.33 25.67 25.67 25.33 24.33 25.33 ±0.47 ±0.47 ±0.94 ±0.47 ±0.47 ±0.47 XIII 28.33 25.67 25.33 24.33 24.33 24.67 ± 1.25 ±1.70 ±0.47 ±0.47 ±0.47 ±0.47 XIV 24.67 26.67 22.67 26.33 22.33 26.00 ±0.94 ±0.47 ±0.94 ±0.47 ±0.47 ±0.00 XV 27.33 26.33 25.00 25.67 25.33 26.33 ±0.47 ±0.47 ±0.82 ±0.47 ±0.47 ±0.47 N.A.: No Activo . . .. Control pos1t1vo: Gentamicma (2 µg/mL] Diámetro del disco: 16 mm . CUADRO :Z6. Diá•eh'e9 de a. zo•a de .. lllblcióa (•-·) desarro ... doe por ..,. co-p•ntos ......... ,.,.,...___._ Compuesto [Compuesto) Control [Compuesto] Control [Compuesto] Control 100 uolmL nmiitivo IOuolmL nrKitivo 1 "º'mL positivo VI 25.67 27.00 24.67 23.67 N.A. -- ±0.47 ±0.00 ±0.94 ±0.94 X 24.33 23.33 22.67 24.33 22.00 22.67 ± 1.25 ± 1.25 ±0.94 ±0.47 ±0.82 ±0.47 XI 27.33 23.33 25.33 20.33 24.33 21.33 ±1.70 ±0.94 ±0.47 ±0.47 ±0.47 ±0.47 XII 24.67 22.00 22.67 22.33 21.33 21.33 ±0.47 ±0.00 ±0.94 ±0.47 ±0.47 ±0.47 XIII 24.67 22.00 23.33 22.00 22.33 21.33 ±0.47 ±0.00 ±0.47 ±0.00 ±0.47 ±0.47 XIV 27.33 22.67 26.67 22.67 23.33 22.33 ±0.47 ±0.47 ±0.94 ±0.94 ±0.47 ±0.47 XV 24.33 23.67 23.33 23.33 21.67 23.33 ±0.94 ±0.94 ±0.47 ±0.47 ±0.47 ±0.94 XVI 25.67 22.33 24.67 22.67 23.33 22.67 ± 1.25 ±0.47 ±0.47 ±0.47 ±0.94 ±0.47 XVI 26.00 25.00 24.33 25.33 24.00 26.00 ±0.82 ±0.00 ±0.47 ±0.47 ±0.00 ±0.82 45 CUADRO 27. DWl•e- de la zoaa de la•lbk16a (••') desarrollados por - comp•estoa - .... c_t1,_.,.,.,._ Compuesto (Compuesto) Control [Compuesto] Control (Compuesto] Control 100 "º'rnL nositivo IOuolmL positivo 1 "º'rnL DOsitivo 1 27.67 27.67 26.00 31.67 21.00 30.33 ±1.70 ±1.70 ±1.63 ± 1.25 ±0.00 ±0.47 11 29.33 27.33 21.33 27.33 22.67 28.67 ±0.47 ± 1.25 ±0.94 ±1.70 ±0.47 ±0.47 111 23.67 26.00 21.33 26.67 20.33 25.67 ± 1.25 ±0.82 ±0.94 ± 1.25 ±0.47 ±0.47 IV 24.00 24.67 20.33 27.67 20.67 28.67 ±0.82 ± 1.25 ±0.47 ±0.47 ±0.47 ±0.47 V 21.00 25.33 21.00 24.67 20.33 26.67 ±0.00 ± 1.25 ±0.00 ±0.47 ±0.47 ±0.47 VI 22.33 26.00 21.33 25.00 18.67 27.67 ± 1.25 ±0.82 ±0.47 ±0.82 ±0.47 ±0.47 VII 20.67 24.67 20.67 27.00 20.33 28.00 ±0.47 ±0.47 ±0.47 ±0.82 ±0.47 ±0.00 VIII 27.33 28.00 26.33 27.33 25.33 27.67 ±0.94 ±0.82 ±1.89 ±0.47 ±0.47 ±0.94 IX 23.67 27.33 21.33 25.00 20.33 28.33 ± 1.25 ±0.47 ±0.47 ±1.41 ±0.47 ±0.47 X 27.33 25.33 27.00 26.67 24.67 25.67 ±1.70 ±0.47 ±0.82 ±0.47 ±0.47 ±0.47 XI 25.00 25.33 24.33 25.33 23.33 25.33 ±1.41 ±0.47 ±0.47 ±0.47 ±0.47 ±0.47 XII 24.00 27.00 22.67 27.67 22.67 28.33 ±0.82 ±1.41 ±0.94 ±0.47 ±0.94 ±0.47 XIII 26.67 25.00 25.33 25.33 22.67 25.33 ±0.94 ±0.00 ±0.47 ±0.47 ±0.47 ±0.47 XIV 22.67 28.00 22.33 29.67 22.33 30.33 ±0.94 ±1.63 ±0.47 ±0.471 ±0.47 ±0.47 XV 24.33 30.00 22.67 28.67 22.67 28.67 ±0.47 ±0.00 ±0.94 ±0.94 ±0.94 ±0.47 XVI 22.67 28.67 23.33 29.33 22.33 28.33 ±0.94 ±0.94 ±0.94 ±0.47 ±0.47 ±0.94 N. A.: No Activo .. . . Contn>I positivo: Anfotcticma B [ 11 ¡.ig/rnL] Diámetro del disco: 16 mm. Con ~to a los compuestos evaluados. el cornpucsto 1 fue el único que presentó actividad sobre S. aureus. y solamente: a la concentración de 100 µg/rnL. Todos los compuestos de P. watsonl presentaron actividad contra P. aeruglno.sa~ siendo el compuesto XIV el mas activo aún a la concentración de 1 µglrnL. El efecto de este producto fue mayor 46 al del control positivo. Estos resultados indican que en la serie de las cumarinas, aquellos compuestos que presentan dos hidroxilos libres en el anillo pirano son los más activos; la esterificación de al menos WlO de estos grupos disminuye la actividad antimicrobiana.. El crecimiento de E. coli fue inhibido por VIII. X. XL XII y XVI (Cuadro 22). En este caso los productos derivados de la cis-kellactona fi.Jeron más activos. Los productos XII y XIV presentaron una actividad sinülar a la del control positivo. Los compuestos l. V. VI. X. XII. XIII. XIV y XV (Cuadro 22) mostraron actividad contra S. typhi a una concentración de 100 µ.g/mL, de éstos 9 solo la gcranina y las cumarinas XII y XIII fueron activos a concentraciones de 1 µg/mL. Para la levad~ todos los compuestos evaluados presentaron actividad, sin embargo, únicamente el compuesto 11 mostró actividad significativa 47 V. RESUMEN Y CONCLUSIONES En el presente ~o de tesis se realizó un estudio conducente a detenninar la potencialidad de ex.tractos naturales como agentes antimicrobianos. Se evaluaron diez extractos derivados de especies vegetales. cuatro extractos derivados de especies fúngicas y dieciséis compuestos puros. cada uno de los extractos se evaluó sobre las bacterias Slaphy/ococcus aureu.s, Bacillus subtilis. Escherichia coli. Sa/monella typlri. Pseudo11WJnas ae"'glnosa y !IObre la levadura Candida albicans. En cada caso se utilizó W1 antibiótico apropiado como control positivo y cada evaluación se realizó por triplicado. Los resultados indican que las especies A. lo/ucensis, B. veronicaefolia.. N. bootltii. E. cardiochilwn, E. rigldwn, G. polithrix. M. densa, S. lívida. S. /epidophyla, G. danka/iensis y M. aurantiaca contienen principios antibacterianos. En el Cuadro 28 se resumen los organismos susceptibles a cada extracto. •msce---lea a.._ estract09 eval .... os Estrado Microo---- tal ••-tibie l•l A. tolucen.sis S. .....,...,.,-, C. albican.s B. wronict#To/ia E. coli G."""'8M s. IVn#d N. hoothii s. hlnhi E. cardioclúlum P. aeruginosa C. albicans G. nn1;11v;;c E. coli. S. IVnhi M. densa C. albicans S. lívida S.l'Vnlli S. leDido......u/a E.coli B subtilis. S. ...,...,.; M aurantiaca S. ~;. P. aerueinosa. C. albicans Al realizar la determinación 1111timicrobiana por el método de difusión en - file posible detectar que todas las ~ies presentaron actividad contra algún núcroor¡¡anismo. Los resultados obcenidos parecen validar el uso popular de las especies B. veronicaefolia. G. niveiun y S. lepldophyla para tratar ~irnientos de origen '-tcrim>o. La especie füngica G. dankal~nsis constituye Wlll fuente potencial de antibióticos de mnplio espx:tro ya que mostró actividad contra tres bect.crias (una Gnun positiva y dos Gram ne¡pbvas) y la levadura; en tanto que M. auranllaca inhibió el crecimiento de dos enterobM:t.crias y C. albic..u. lo cual convierte a esta especie fúngica en un buen candidato para descubrir antibióticos de utilidad para el tndamiento de infecciones ~intestinales. Cabe destacar que estos dos hongos y el extracto de P. 48 watsoni mostraron buena actividad contra bacterias Gram (-) lo cual parece indicar que contienen compuestos que bien inhiben las proteínas resistentes a los fármacos o que penetran con facilidad las membranas de estos organismos. Considerando que son pocos los productos naturales eficaces para el trBlallliento de infecciones producidas por bacterias Onun (-) resulta de gran importancia el estudio futuro de estas especies. De los compuestos ensayados los productos Gcranina (VI), (9R.IOR)- IO-hidroxi-8.8-dimctil- 9,IO-dihidro-2H.8H-benzo[l.2-b:3,4-b']dipiran-2-ona-9-éster (XII) y (9R-IOR)-9-hidroxi-10- isobutiroiloxi-8.8-dimetil-9,IO-dihidro-2H.8H-bcnzo[l,2·b:3,4-b')dipinm-2-ona (XIII) presentaron una actividad significativa contra las tres bacterias Gram (-) ensayadas. Estos resultados son bastante satisfactorios ya que la rnayoria de los productos vegetales (Tegos.. et al .• 2002) son inactivos contra este tipo de bacterias (Tegos. et al., 2002). De los productos activos destacan la (9R,IOR)-9-acctiloxi- l O-propiooiloxi-8,8-dimetil-9, l O-dihidro-2H,8H-bcnzo[ l .2-b:3.4-b • ]dipiran-2-ona (XI). activa contra P. aeruginosu; y el 2 .. S-dihidroxi-3,4-d.imetoxi~9 .. 10-dihidrofenantreno (111). activo contra S. typhi: que presentaron una actividad mayor que et control positivo. Los restantes productos presentan una actividad. igual a la del control positivo. Las propiedades antibaeterianas de los productos Nudol (l). 2,S-dihidroxi-3,4- dimetoxifenantn:no (11). Eriantridina (V). Geraoina A (VI), (+)-(2S.3S)-S-hidroxi-6,8,IO-trimetoxi-2.3- dimetil-2,.3-dihidronaftopirona (VIII), Seravshanina (X), (9R. IOR)-9-acetiloxi-10-propiooiloxi-ll,8- dimetil-9, 1 O-dihidro-2H.8H-benzo[ l ,2-b:3.4-b']dipiran-2-ona (XI). (9R. JOR)- 10-hidroxi-8,8-dimetil- 9, l O-dihidro-2H. 8H-benzo( 1.2-b:J,4-b ']dipiran-2-ona-9-éster (XII), (9R-1 OR)-9-hidroxi-1 O- isobutiroiloxi-8,8-dimetil-9, 1O-dihidro-2H.8H-bcnzo[1.2-b:3,4-b']dipiran-2-ona (XIII). ( + )-cls- kellactona (XIV). Jatamansina (XV) y (9R)- 9-hidroxi-S.11-dimetil-9,IO-dihidro-2H,8H-benzo[l.2- b:3,4-b']dipiran-2-ona (XVI); constituyen una aportación original del ""'5C11te trabajo y una contribución al conocimiento de los productos naturales medicinales de México. 49 ESTA TESIS NOS/".~ -P DE LA BIBl.IOT::S'.•C_;,; IV. BIBLIOGRAFiA Aguilar. A. J .• Camacho. S .• Chino. P .• Jácquez. P., López M. 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