UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE CIENCIAS Sistemática molecular del grupo de Epidendrum anisatum (Orchidaceae) T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: BIÓLOGO P R E S E N T A : SEBASTIÁN QUIROGA GONZÁLEZ DIRECTOR DE TESIS: DRA. CAROLINA GRANADOS MENDOZA Ciudad Universitaria, CD. MX. 2017 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis está protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. 2 1. Datos del alumno Apellido paterno: Quiroga Apellido materno: González Nombre(s): Sebastián Teléfono: 5521418929 Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Ciencias Carrera: Biología Número de cuenta: 413078122 2. Datos del tutor Grado: Dra Nombre(s): Carolina Apellido paterno: Granados Apellido materno: Mendoza 3. Datos del sinodal 1 Grado: Dr Nombre(s): Gerardo Adolfo Apellido paterno: Salazar Apellido materno: Chávez 4. Datos del sinodal 1 Grado: Dra Nombre(s): Martha Juana Apellido paterno: Martínez Apellido materno: Gordillo 5. Datos del sinodal 1 Grado: Dra Nombre(s): Susana Aurora Apellido paterno: Magallón Apellido materno: Puebla 6. Datos del sinodal 1 Grado: M en C Nombre(s): Itzi Apellido paterno: Fragoso Apellido materno: Martínez 7. Datos del trabajo escrito. Título: Sistemática molecular del grupo de Epidendrum anisatum (Orchidaceae) Subtitulo: No aplica Número de páginas: 58 Año: 2017 3 Índice general Agradecimientos .................................................................................... 6 Resumen ................................................................................................. 8 Introducción ......................................................................................... 10 Justificación .......................................................................................... 18 Hipótesis ............................................................................................... 18 Objetivos .............................................................................................. 18 Materiales y métodos .......................................................................... 19 Discusión .............................................................................................. 39 Conclusiones y consideraciones a futuro ............................................. 46 Bibliografía citada ................................................................................ 47 Anexo.................................................................................................... 52 Glosario ................................................................................................ 47 Abreviaturas ......................................................................................... 47 4 Índice de figuras y tablas Figura 1. Morfología vegetativa y floral del grupo de Epidendrum anisatum ....................... 11 Figura 2. Ejemplares de algunas de las especies empleadas en el estudio ........................... 12 Tabla 1. Especies reconocidas al interior del grupo de Epidendrum anisatum según Hágsater (1984) y García-Cruz (1995) ................................................................................................... 15 Tabla 2. Muestreo taxonómico empleado en el presente estudio ....................................... 20 Figura 3. Estructura general de los marcadores plastidiales (A-F) utilizados en el presente estudio .................................................................................................................................... 24 Figura 4. Estructura general de la región de los espaciadores internos transcritos (ITS1 e ITS2), de la familia multigénica ribosomal nuclear ................................................................ 25 Tabla 3. Primers empleados para la amplificación de las regiones exploradas en el presente estudio .................................................................................................................................... 27 Tabla 4. Reactivos y volúmenes utilizados en las reacciones de PCR de las regiones amplificadas ........................................................................................................................... 29 Tabla 5. Programas de PCR utilizados en la amplificación de los marcadores ...................... 29 Tabla 6. Longitud en pares de bases alineadas de los marcadores moleculares utilizados en el presente estudio................................................................................................................. 31 Tabla 7. Modelos de sustitución molecular de mejor ajuste y esquemas de partición de los datos obtenidos con PartitionFinder ..................................................................................... 32 Figura 5. Utilidad filogenética proporcionada por cada marcador molecular con base en el número de ramas altamente apoyados (PP≥0.85) ................................................................ 33 Figura 6. Árbol consenso de compromiso resultante del análisis de inferencia bayesiana de la matriz del marcador ribosomal-nuclear ITS, incluyendo 28 especies (13 del grupo interno y 15 del grupo externo) .......................................................................................................... 36 Figura 7. Árbol consenso de compromiso resultante del análisis de inferencia bayesiana de la matriz combinada de todos los marcadores de cloroplasto y el marcador nuclear ITS, incluyendo 28 especies (13 del grupo interno y 15 del grupo externo) ................................ 37 Figura 8. Árbol consenso de compromiso resultante del análisis de inferencia bayesiana de la matriz combinada de todos los marcadores de cloroplasto, incluyendo 28 especies (13 del grupo interno y 15 del grupo externo) ............................................................................. 38 Figura 9. Fenograma resultante del estudio de García-Cruz (1995) ...................................... 44 Figura 10. Árbol consenso de compromiso resultante del análisis de inferencia Bayesiana de la matriz del EIG atpI-atpH del cloroplasto, incluyendo 28 especies (13 del grupo interno y 15 del grupo externo) ............................................................................................................. 52 5 Figura 11. Árbol consenso de compromiso resultante del análisis de inferencia Bayesiana de la matriz de la región plastidial matK-trnK, incluyendo 28 especies (13 del grupo interno y 15 del grupo externo) ............................................................................................................. 53 Figura 12. Árbol consenso de compromiso resultante del análisis de inferencia Bayesiana de la matriz del intrón plastidial rps16, incluyendo 28 especies (13 del grupo interno y 15 del grupo externo) ....................................................................................................................... 54 Figura 13. Árbol consenso compromiso resultante del análisis de inferencia Bayesiana de la matriz del EIG plastidial trnH-psbA, incluyendo 28 especies (13 del grupo interno y 15 del grupo externo) ....................................................................................................................... 55 Figura 14. Árbol consenso compromiso resultante del análisis de inferencia Bayesiana de la matriz del EIG plastidial trnL-trnF, incluyendo 27 especies (13 del grupo interno y 14 del grupo externo) ....................................................................................................................... 56 Figura 15. Árbol consenso compromiso resultante del análisis de inferencia Bayesiana de la matriz de la región plastidial trnS-trnfM, incluyendo 28 especies (13 del grupo interno y 15 del grupo externo) .................................................................................................................. 57 6 Agradecimientos A Dios, por haberme permitido llegar a este punto, por brindarme la salud y las capacidades para desarrollarme como persona y lograr mis objetivos. A mis padres, por brindarme siempre su apoyo tanto moral como económico, así como por sus consejos y ejemplo como modelo científico a seguir. A la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), a la Facultad de Ciencias y su Herbario (FCME), por ofrecerme los recursos para desarrollarme como Biólogo. Al Instituto de Biología (IB-UNAM) y su Herbario Nacional (MEXU), por aceptarme como estudiante para el desarrollo de este proyecto y brindarme los recursos académicos y materiales para el mismo. Al Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica A. C. (IPICYT), por brindarme una beca de estancia en sus instalaciones, la cual fue crucial para la conclusión del presente trabajo. A PAPIIT/DGAPA/UNAM por el apoyo financiero a través del Proyecto IG200316 (Titular: Susana Aurora Magallón Puebla), con financiamiento adicional amablemente proporcionado por el Instituto Chinoín, A. C. A la Dra. Carolina Granados Mendoza, por fungir como mi asesora en este proyecto, por todo el tiempo, dedicación, enseñanza y paciencia que invirtió en mí y el término de este proyecto, así como por su amistad. Al Dr. Gerardo A. Salazar Chávez, por proporcionarme los medios para desarrollarme en el área de la sistemática y la orquideología, así como brindarme el espacio y su tiempo para asesorarme, desarrollar correctamente este proyecto en el Instituto de Biología, UNAM y por proporcionar recursos económicos para el presente trabajo. Al Ing. Eric Hágsater Gartenberg, por brindarme su asesoría con sus conocimientos sobre el género Epidendrum, el acceso al material vegetal de los ejemplares del invernadero del Herbario AMO y a su base de datos, así como brindar apoyo financiero para el desarrollo de este proyecto. A la Dra. Susana Magallón Puebla, por apoyarme en mi formación en la sistemática molecular por medio de su cátedra en la clase de Sistemática II como optativa de la carrera de Biología, Facultad de Ciencias, UNAM, así como por darme la oportunidad de participar en el proyecto UNAM-DGAPA-PAPIIT IG200316. A la Dra. Lidia Irene Cabrera Martínez, por su apoyo y asesoría en mi trabajo en el Laboratorio de Sistemática Molecular del Departamento de Botánica, IB-UNAM. A la M. en C. Laura Margarita Márquez Valdelamar, por su apoyo en el Laboratorio de Secuenciación del IB-UNAM, el cual fue crucial para la obtención de los datos utilizados en este proyecto. 7 A los Drs. Carolina Granados Mendoza, Gerardo Adolfo Salazar Chávez, Martha Juana Martínez Gordillo, Susana Magallón Puebla y la M. en C. Itzi Fragoso Martínez por revisar este escrito de tesis y participar como miembros de jurado de examen profesional. A mis profesores de Taller Sistemática de Angiospermas (Facultad de Ciencias, UNAM): Jaime Jiménez Ramírez, Martha Juana Martínez Gordillo, Mercedes Isolda Luna Vega, Leonardo Osvaldo Alvarado Cárdenas, Itzi Fragoso Martínez, Ramiro Cruz Durán y María Eugenia Muñiz Díaz de León, por la formación que me brindaron como botánico y sistémata, así como su asesoría en el desarrollo de este proyecto. A la UNAM y sus profesores, por marcar cada una de las etapas en mi formación universitaria y que me ayudaron con dudas en el desarrollo de este proyecto, y por brindar el apoyo en forma del proyecto PAPIIT al que estoy adjunto. A la maestra Beatriz González Hidalgo, por motivarme a decidir tomar la línea de la botánica después de tomar su clase de Plantas I durante mi formación universitaria. A mis amigos, Lidia Gabriela García Gutiérrez, Mónica Mariel Reyes Antúnez, Mariana Flores Navas, Alejandro Edgar Nava Guerrero, por su constante apoyo tanto en el ámbito académico como fuera de él. 8 Resumen Epidendrum es uno de los géneros neotropicales de plantas con flores más diversos, con ca. 1,500 especies descritas, que exhiben una gran diversidad de arquitecturas vegetativas y florales. A pesar de ello, aún existe un conocimiento limitado sobre las relaciones filogenéticas al interior del género. El presente trabajo se enfoca a investigar las relaciones filogenéticas en un grupo de especies representadas por E. anisatum, y restringidas a los bosques montanos húmedos de pino-encino y bosques de niebla de México. En 1995, García-Cruz identificó una agrupación de 18 spp. al que denominó grupo de E. anisatum, que dividió en tres subgrupos con base en sus similitudes morfológicas. El presente estudio tiene como objetivos: 1) evaluar la monofilia del grupo E. anisatum (sensu García-Cruz, 1995); 2) explorar las relaciones filogenéticas de las especies que lo conforman y, con ello evaluar la monofilia de los tres grupos recuperados por García-Cruz (1995). Para ello, se realizaron análisis de inferencia filogenética con estadística bayesiana, de secuencias de ADN correspondientes a marcadores plastídicos, consistentes en las regiones matK-trnK, trnH-psbA y trnS-trnfM, los espaciadores intergénicos (EIG) atpI-atpH y trnL- trnF, los intrones de los genes trnL y rps16, así como la región de los espaciadores internos transcritos (ITS) de la familia multigénica ribosomal nuclear. Se incluyeron 13 de las 18 spp. del grupo de E. anisatum sensu García-Cruz (1995), además de 15 especies que fueron empleadas como grupo externo: diez de ellas pertenecientes a diferentes grupos a lo largo del género Epidendrum y cinco especies de otros géneros de subtribus y tribus cercanas al género en cuestión. Los análisis combinados de los marcadores de cloroplasto y el ITS combinado con los de cloroplasto fueron altamente consistentes; sin embargo, el análisis de la región ITS mostró algunas inconsistencias topológicas. Todas las fuentes de datos corroboraron la monofilia del 9 grupo E. anisatum con un alto apoyo (PP=1). Al interior de dicho grupo, E. gasteriferum se encuentra como especie hermana del resto de las especies. Este último clado, a su vez, se divide en dos grupos: el clado [[[[E. lowilliamsi + E. matudae] [E. gomezii + E. anisatum]] E. pastranae] E. juergensenii]; y su clado hermano [[[E. hueycantenangense + E. guerrerense + E. mixtecanum + E. oaxacanum] E. costatum] E. cusii]. Ninguno de los tres grupos propuestos por García-Cruz (1995) fueron recuperados como monofiléticos en este trabajo. Palabras clave: Filogenia molecular, grupo de Epidendrum anisatum, grupo monofilético, marcadores moleculares, inferencia bayesiana. 10 Introducción El género neotropical Epidendrum L., con ca. 1,500 especies, es uno de los más diversos de la familia Orchidaceae (Asparagales; Frodin, 2004). Su distribución abarca desde el sureste de Estados Unidos (Carolina del Norte) hasta el norte de Argentina, siendo las cordilleras de los Andes y la Región de las Guayanas las zonas con mayor diversidad específica (Hágsater y Soto Arenas, 2005). En México se distribuyen 117 especies de Epidendrum, de las cuales 54 son endémicas al país (Villaseñor, 2016). El género habita en un amplio rango de tipos de vegetación, los cuales incluyen selvas húmedas tropicales, bosques de niebla y páramos (Hágsater y Soto Arenas, 2005). Características morfológicas de Epidendrum La mayoría de las especies de Epidendrum se distinguen de otras Orchidaceae por ser plantas con tallos en forma de cañas, en lugar de seudobulbos; sus flores presentan un falso nectario como resultado de la adnación del labelo con la columna; y presentan el rostelo paralelo al eje de la columna, bisectado tras la remoción del polinario y lóbulos laterales del estigma bien desarrollados (Figura 1; Hágsater y Soto Arenas, 2005). Las especies de Epidendrum son hierbas, ya sea cespitosas y erectas, rastreras o colgantes, con crecimiento simpodial, o rara vez monopodial y con tallos simples o en ocasiones ramificados en la parte superior. Su tallo puede ser delgado y a veces engrosado, formando un seudobulbo fusiforme o globoso. Sus hojas generalmente están arregladas dísticamente; pueden ser delgadas a coriáceas o suculentas, presentan una vaina cilíndrica y las láminas están generalmente articuladas a las vainas. Sus raíces generalmente surgen únicamente en la base 11 de los tallos, pero a veces lo hacen en los nodos, a lo largo del tallo. La inflorescencia es casi siempre apical, rara vez lateral, racemosa a paniculada y menos frecuentemente corimbosa (Hágsater y Soto Arenas, 2005). Figura 1. Morfología vegetativa y floral del grupo de Epidendrum anisatum. Como ejemplo se ilustra Epidendrum cusii. Dibujo modificado de Hágsater (1978). 12 Figura 2. Ejemplares de algunas de las especies empleadas en el estudio. Especies del grupo de E. anisatum (1-17), otros miembros de Epidendrum (18-27), y una especie del género Encyclia como grupo externo. 1) E. anisatum, 2) E. costatum, 3) E. cusii, 4) E. dorsocarinatum, 5) E. duranguense, 6) E. examinis, 7) E. gasteriferum, 8) E. gomezii, 9) E. guerrerense, 10) E. hueycantenangense, 11) E. juergensenii, 12) E. lowilliamsi, 13) E. matudae, 14) E. neogaliciense, 15) E. oaxacanum, 16) E. pastranae, 17) E. rosilloi, 18) E. eximium, 19) E. longicaule, 20) E. marmoratum, 21) E. mixtum, 22) E. nitens, 23) E. nocturnum, 24 ) E. parkinsonianum, 25) E. radicans, 26) E. radioferens, 27) E. verrucosum y 28) Encyclia cordigera. Imágenes tomadas de Hágsater et al (2005), Orchids of Mexico, First Edition. Ed. Instituto Chinoín A.C., Lago Tangañica 18, 11520 Mexico City. 13 Sus flores son hermafroditas y pueden presentar o no resupinación. Varían principalmente en el labelo (e.g. forma, bordes y nervación); el color del perianto, que va desde colores claros y brillantes hasta los oscuros y opacos; así como la presencia o ausencia de fragancia, la cual puede ser diferente entre individuos de la misma especie (Moya y Ackerman, 1993). En cuanto a su biología reproductiva y mecanismos de polinización, las especies del género Epidendrum se caracterizan por poseer una estructura de polinización conocida como “llave-cerradura”, en la cual el falso nectario floral tiene una longitud determinada, que obliga al polinizador a aproximarse mucho para poder introducir su probóscide o pico (mariposas y aves, respectivamente). De esta manera los polinizadores hacen contacto con el viscidio (la parte pegajosa que adhiere el polinario al polinizador). Los síndromes de polinización más frecuentes en Epidendrum son la psicofilia (mariposas) y falenofilia (polillas), y menos frecuentemente, la ornitofilia (aves, particularmente colibrís) y la mirmecofilia (hormigas; Almeida y Figueiredo, 2003). Ya que ninguna especie de Epidendrum, de las que han sido examinadas produce néctar floral, es muy probable que en muchos casos la polinización se lleve a cabo mediante un mecanismo de engaño (Bierzychudek, 1981). Biología evolutiva de Epidendrum La familia Orchidaceae pertenece al orden de las Asparagales, siendo la familia hermana de todas las demás Asparagales, divirgiendo como linaje independiente hace 109 millones de años (Magallón et al., 2015). Orchidaceae se divide en cinco subfamilias: Apostasioideae, Cypripedioideae, Vanilloideae, Orchidoideae y Epidendroideae. El género Epidendrum se clasifica dentro de la subtribu Laeliineae, tribu Epindendreae, de la subfamilia Epidendroideae (Cameron 14 et al., 1999; Chase et al., 2015). Estudios filogenéticos previos han identificado un clado dentro de las Epidendroideae denominado “alianza Epidendrum”, que además de Epidendrum (incluyendo Oerstedella Rchb. f., Amblostoma Scheidw., Lanium Lindl. y Nanodes Lindl.), consta de los géneros Barkeria Knowles y Westc., Caularthron Raf., Microepidendrum Brieger ex W. E. Higgins y Orleanesia Barb. Rodr. (van den Berg et al., 2000, 2009; Hágsater y Soto-Arenas, 2005). Entre los estudios filogenéticos previos, que han incluido especies de Epidendrum, se encuentran los trabajos de van den Berg (2000) y van den Berg et al. (2009); no obstante, debido a que el enfoque de dichos trabajos fue a niveles taxonómicos más inclusivos (i.e. tribu Epidendreae y subtribu Laeliinae), su muestreo al interior del género Epidendrum fue limitado (una y nueve especies, respectivamente), proporcionando información muy limitada sobre las relaciones filogenéticas del género. Tal como lo citan Chase et al. (2015), para la familia Orchidaceae en general, la clasificación de Epidendrum se ve afectada por el enorme número de especies que contiene y por el gran número de especies nuevas que se siguen describiendo cada año. Adicionalmente, la falta de un contexto filogenético firmemente establecido y la escaséz de caracteres morfológicos que sustenten hipótesis de homología, obstaculizan la generación de una clasificación más natural. Se han propuesto varios esquemas de clasificación infragenérica para Epidendrum. Ames et al. (1936), Lindley (1841), Bentham y Hooker (1883) y Hágsater (1984), entre otros, han basado sus clasificaciones de Epidendrum en características florales y vegetativas. Sin embargo, todas esas clasificaciones son artificiales y carecen de bases filogenéticas (Hágsater y Soto Arenas, 2005). 15 Grupo de Epidendrum anisatum Basado en caracteres morfológicos, Hágsater (1984) delimitó 31 grupos dentro de Epidendrum, identificándolos informalmente con el nombre de la especie mejor conocida o aquella que reúne el mayor número de características distintivas para cada grupo. Entre dichos grupos, destaca el de Epidendrum anisatum, que está integrado por 18 especies, distribuidas principalmente en la región montañosa del Pacífico Mexicano (Tabla 1). Las especies de dicho grupo se distinguen por ser plantas con hábito cespitoso, con tallos sencillos y racimos cortos, producidos generalmente a partir de una inflorescencia terminal corta. Cada año aparecen nuevos racimos axilares a partir del racimo interior, inclusive después de que los tallos han perdido las hojas; las hojas principalmente se distribuyen en la mitad apical del tallo (Figuras 1 y 21-17). Tabla 1. Especies reconocidas al interior del grupo de Epidendrum anisatum según Hágsater (1984) y García-Cruz (1995). Hágsater, 1984 García-Cruz, 1995 E. anisatum La Llave E. anisatum La Llave E. chloë Reichenbach No reconocida E. costatum Richard E. costatum Richard E. culmiforme Schlechter No reconocida E. cusii Hágsater E. cusii Hágsater E. dorsocarinatum Hágsater E. dorsocarinatum Hágsater E. duranguense Hágsater Sinónimo de E. vandifolium E. eustirum Ames No reconocida E. examinis Rosillo de Velasco Sinónimo de E. matudae E. gasteriferum Scheeren E. gasteriferum Scheeren E. gladiatum Lindley Sinónimo de E. anisatum E. gomezii Schlechter E. gomezii Schlechter E. juerguensenii Reichenbach E. juerguensenii Reichenbach E. lignosum La Llave No reconocida E. marmoratum Richard No reconocida E. matudae Williams E. matudae Williams E. neogaliciense Hágsater E. neogaliciense Hágsater 16 E. oaxacanum Rolfe E. oaxacanum Rolfe E. pastranae Hágsater E. pastranae Hágsater E. rosilloi Hágsater E. rosilloi Hágsater E. vandifolium Lindley E. vandifolium Lindley E. viridifuscatum De Wildeman No reconocida No reconocida E. guerrerense Hágsater No reconocida E. hueycatenangense Hágsater No reconocida E. mixtecanum Hágsater No reconocida E. lowilliamsii García-Cruz En su revisión, García-Cruz (1995) incluyó en el grupo de E. anisatum 18 especies (Tabla 1), delimitando las especies con base en caracteres anatómicos de la hoja (e.g. grosor de la cutícula, número de haces vasculares en la vena media, posición de las células oclusivas de los estomas, etc.); así como palinológicos (e.g. aspecto de la caudícula, forma de las tétradas, etc.). No obstante, su trabajo es un estudio fenético, es decir, es un estudio basado en similitud general entre las especies, donde se emplearon caracteres morfológicos con la finalidad fue esclarecer límites interespecíficos en el grupo, sin considerar las relaciones de ancestría-descendencia. Dicho autor recuperó las siguientes agrupaciones: (E. gasteriferum ((E. dorsocarinatum y E. lowilliamsii) (E. examinis, (grupo I (grupo II y grupo III))))). El grupo I incluye E. gomezii, E. costatum y (E. cusii + E. neogaliciense). El grupo II incluye a E. pastranae, E. rosilloi, E. juergensenii, E. vandofolium y (E. matudae + E. anisatum), mientras que el grupo III está formado por E. oaxacanum, E. hueycantenangense y (E. guerrerense + E. mixtecanum). El presente trabajo explora la utilidad de marcadores moleculares selectos para evaluar la monofilia del grupo de E. anisatum y los agrupamientos fenéticos obtenidos por García-Cruz (1995). Dichos marcadores se seleccionaron tomando bases en trabajos previos que los proponen. Lahaye et al. (2008), en su búsqueda de marcadores útiles para establecer un código 17 de barras genético para plantas, demostró la utilidad del espaciador intergénico (EIG) trnH-psbA y de la región matK-trnK en orquídeas. De manera similar, Marques et al. (2014), al estudiar los posibles mecanismos evolutivos que dieron origen a la actual diversidad de Epidendrum, mostró la resolución filogenética que la región matK-trnK, el intrón del gen rps16 y el EIG trnL-trnF aportan. van den Berg (2000) y van den Berg et al. (2009) demostraron la utilidad de los marcadores plastidiales matK-trnK, el intrón de trnL y el EIG trnL-trnF, así como la región de los espaciadores internos transcritos del DNA ribosomal nuclear (ITS, por sus siglas en inglés), para resolver relaciones entre especies de la subtribu Laeliinae. Si bien existe un estudio previo sobre el grupo de E. anisatum (García-Cruz, 1995), en él las relaciones filogenéticas del grupo no fueron exploradas. El presente trabajo busca, no solo resolver dichas relaciones, sino evaluar la monofilia del grupo, así como de los grupos recuperados por García-Cruz (1995) al interior de este. Para ello, se valió de la aplicación de métodos filogenéticos formales y el análisis de secuencias de ADN de diversas regiones plastídicas y nucleares. El contexto filogenético generado permitirá comprender con más claridad la evolución del grupo de E. anisatum, contribuyendo en nuestro entendimiento general sobre la evolución de Epidendrum. 18 Justificación Aunque García-Cruz (1995), aclaró los límites de las especies del grupo de E. anisatum y resolvió la nomenclatura de las mismas, no exploró las relaciones de parentesco, ya que aplicó únicamente métodos de similitud fenética. La aplicación de métodos filogenéticos formales permitirá explorar las relaciones de parentesco entre las especies del grupo, así como evaluar su monofilia, y las relaciones filogenéticas de este grupo con respecto a otros linajes de Epidendrum. El contexto filogenético, aquí generado, contribuirá a futuros estudios macroevolutivos que investiguen las causas de la actual megadiversidad de Epidendrum. Hipótesis 1) El grupo de Epidendrum anisatum conforma un grupo monofilético. 2) Las relaciones entre las especies que lo conforman serán congruentes con las agrupaciones propuestas por García-Cruz (1995). Objetivos - Evaluar la monofilia del grupo de Epidendrum anisatum (sensu García-Cruz, 1995). - Explorar las relaciones filogenéticas de las especies que lo conforman, y con ello evaluar la monofilia de los grupos recuperados por García-Cruz (1995). 19 Materiales y métodos Revisión bibliográfica Se revisó la literatura taxonómica concerniente al género Epidendrum y algunos géneros relacionados, incluyendo tratamientos florísticos, estudios taxonómicos y filogenéticos, así como descripciones originales de las especies objeto del grupo interno (García-Cruz, 1995; Hágsater y Salazar, 1993; van den Berg, 2000; Hágsater y Soto Arenas, 2005; van den Berg et al., 2009). Muestreo taxonómico El material vegetal fue obtenido de especímenes disponibles en la colección de plantas vivas del Herbario AMO o de la colección de tejidos y extractos de DNA del Dr. Gerardo A. Salazar, del Instituto de Biología de la UNAM. El muestreo taxonómico consistió en 28 especies (Tabla 2). Como grupo interno se incluyeron 13 de las 18 especies reconocidas por García-Cruz (1995) al interior del grupo de E. anisatum. Las cuatro especies faltantes corresponden a E. rosilloi, E. dorsocarinatum, E. neogaliciense y E. vandifolium, las cuales no fueron incluidas por falta de disponibilidad del material vegetal y/o la imposibilidad de su colecta en campo, al tratarse de localidades de difícil acceso. Como grupos externos se incluyeron 15 especies, diez de ellas representantes de los principales linajes del género Epidendrum reconocidos por Hágsater y Soto Arenas (2005), cuatro más pertenecientes a géneros de diferentes subtribus de la tribu Epidendreae, y una última representante de la tribu Dendrobieae (i.e. Dendrobium officinale), la cual se utilizó para arraigar los árboles (Tabla 2). 20 Tabla 2. Muestreo taxonómico empleado en el presente estudio. Especie Estado, país No. lab Colector, No. colecta Código de Genbank: ITS; Región matK-trnK; Región trnH-psbA; EIG trnL-trnF; Región trnS-trnfM Grupo interno E. anisatum Lex. Edo. de México, México E026 Hágsater, 14559 (MEXU) pendiente E. costatum A.Rich. & Galeotti Oaxaca, México E148 Salazar, 8322, (MEXU) pendiente E. cusii Hágsater Guerrero, México E432 Salazar, 7467, (MEXU) pendiente E. gasteriferum Scheeren Oaxaca, México E147 Salazar, 7566, (MEXU) pendiente E. gomezii Schltr. NA, NA E304 Soto, 8620, (MEXU) pendiente E. guerrerense Hágsater NA, NA E504 Salazar, 9847, (MEXU) pendiente E. hueycantenangense Hágsater Guerrero, México E146 Salazar, 7292, (MEXU) pendiente E. juergensenii Rchb.f. NA, NA E145 Salazar, 7867, (MEXU) pendiente E. lowilliamsi García-Cruz NA, NA E519 Jiménez, 1246, (MEXU) pendiente E. matudae L.O.Williams NA, NA E080 Hágsater, 12621, (MEXU) pendiente E. mixtecanum Hágsater NA, NA E424 Salazar, 7578, (MEXU) pendiente E. oaxacanum Rolfe México E434 Sánchez, s/n, (MEXU) pendiente E. pastranae Hágsater NA, NA E438 Salazar, 8328, (MEXU) pendiente Grupo externo 21 E. eximium L.O.Williams NA, NA E183 Hágsater, 11590, (MEXU) pendiente E. longicaule L.O.Williams Jalisco, México E013 Jiménez, 2763-B, (MEXU) pendiente E. marmoratum A.Rich. & Galeotti NA, NA E473 Pérez, s/n, (MEXU) pendiente E. mixtum Schltr. NA, NA E407 Soto, 6530, (MEXU) pendiente E. nitens Rchb.f. NA, NA E522 Dietz 12296, (MEXU) pendiente E. nocturnum Jacq. Quintana Roo, México E065 Hágsater 13963, (MEXU) pendiente E. parkinsonianum Hook. NA, NA E437 Salazar, 6406, (MEXU) pendiente E. radicans Pavón ex Lindl. NA, NA E521 Salazar, s/n, (MEXU) pendiente E. radioferens Hágsater NA, NA E520 Dietz 10122, (MEXU) pendiente E. verrucosum Sw. NA, NA E156 Soto, 7983, (MEXU) pendiente Encyclia cordigera (Kunth) Dressler NA, NA NA NA AY008528.1; AY396114.1; EU213735.1; AY422417.1; HM768328.1 Cattleya forbesii Lindl. NA, NA NA NA AY429394.1; AY396102.1; EU140032.1; AY422405.1. NA Bletia purpurea (Lam.) D.C. NA, NA NA NA AF302728.1; AY121719.1; NA; AY008451.1; NA Stelis emarginata Lindl. NA, NA NA NA AF262845.1; AF265466.1; NA; AF265514.1; NA Dendrobium officinale Kimura & Migo NA, NA NA NA GU339109.1; FJ794043.1; GQ153537.1; EF397937.1; NA 22 Selección de caracteres moleculares Se secuenciaron los siguientes marcadores del cloroplasto: - Región trnH-psbA: Abarca desde el gen trnH, pasando por el gen rps19 y terminando en psbA (a través de dos espaciadores intergénicos). (Figura3-A) - Región matK-trnK: Compuesta por el gen matK y porciones del los extremos 5’ y 3’ del intrón del gen trnK. La estructura de esta región es única por ubicarse matK dentro del gen trnK. (Figura3-B) - Intrón rps16: Corresponde únicamente a la porción no codificante dentro del gen de rps16. (Figura3-C) - Espaciador intergénico atpI-atpH: Abarca la porción no codificante del genoma plastidial ubicada entre los genes atpI y atpH. (Figura3-D) - Región trnS-trnfM: Esta región abarca desde el gen trnS pasando por los genes lhbA y trnG (y sus correspondientes espaciadores intergénicos) hasta el gen trnfM. (Figura3-E) - Región trnL-trnF: Esta región incluye al gen trnL, pasando por su intrón y dos exones, y llegando hasta el gen trnF a través del espaciador intergénico correspondiente. (Figura3- F) Estos marcadores fueron seleccionados para este trabajo debido a su utilidad filogenética a nivel de género y especie previamente reportada en otros grupos de Orchidaceae (van den Berg, 2000; Lahaye et al., 2008; Neubig et al., 2009; van den Berg et al., 2009; Monteiro et al., 2010; Konhar et al., 2016; Figura 3). Adicionalmente, se amplificó la región nuclear ITS (Figura 4), 23 que ha mostrado ser útil para estudiar las relaciones a nivel de especie en la familia (van den Berg et al., 2009). ITS corresponde a la porción no codificante del genoma nuclear ubicada entre los exones codificantes del RNA ribosomal (unidad pequeña y grande del RNA ribosomal, Soltis et al., 1992). 24 Figura 3. Estructura general de los marcadores plastidiales utilizados en el presente estudio y referidos en el texto con las letras A-F. Las longitudes y posición relativa de dichos marcadores en el plastoma se presentan usando como referencia Dendrobium nobile (No. de acceso a GenBank: KX377961.1; Konhar et al., 2016). Los corchetes indican la longitud aproximada de la región amplificada. Las cajas negras y grises corresponden a genes que codifican en dirección o en contra de las manecillas del reloj del esquema mostrado, respectivamente. 25 Figura 4. Estructura general de la región de los espaciadores internos transcritos (ITS1 e ITS2), de la familia multigénica ribosomal nuclear. Las cajas negras y blancas corresponden a regiones codificantes y no codificantes, respectivamente (Soltis et al., 1992). Se hicieron pruebas para incluir más marcadores que los aquí presentados; sin embargo, éstos presentaron diferentes problemas que llevaron a su exclusión. Entre ellos se encuentra el marcador nuclear conocido como Espaciador Transcrito Externo (ETS por sus siglas en inglés), el cual mostró múltiples bandas en los geles de electroforesis. Dichos productos de PCR fueron escindidos del gel y purificados por separado; no obstante, los electroferogramas presentaron aún dobles picos. Es altamente probable que existan múltiples copias del ETS en las especies focales (debido a que ETS corresponde a toda una familia de genes) y que dichas copias tengan una longitud nucleotídica demasiado similar como para poder ser separados en un gel de electroforesis. También se probaron dos regiones nucleares correspondientes a los genes AT3G19900 (proteína de función desconocida) y AT5G64050 (glutamato tRNA ligasa); sin embargo, los resultados fueron similares a los obtenidos con la región ribosomal-nuclear ETS, sugiriendo la presencia de múltiples copias para dichos marcadores nucleares. 26 Otros marcadores plastídicos considerados fueron el espaciador intergénico rpob-trnC y los intrones de los genes rpL16 y ycf1. Estos marcadores no lograron ser amplificados, probablemente debido a la inespecificidad de los primers empleados. Métodos moleculares Extracción de DNA Se extrajo ADN total a partir de material secado en gel de sílice usando una modificación por Salazar et al. (2003) del procedimiento del 2x CTAB descrito en Doyle y Doyle (1987). Para ello se molieron cerca de 20 mg de tejido seco y congelado con la ayuda del disruptor de tejidos TissueLyser (Quiagen) y balines metálicos. Al tejido ya molido se le agregaron 700 μl de CTAB con 4% de 2-mercaptoetanol, previamente calentado a 65°C. A dicha mezcla se le agregaron 7 μl de RNAsa (Quiagen), para ser posteriormente incubada a 65°C durante 45 min. Después de esta primera incubación, la mezcla se enfrió a temperatura ambiente por cinco min y se agregó proteinasa K (Quiagen), para incubar por segunda vez a 55°C por 30 min. La extracción se realizó con 600 μl de SEVAG (cloroformo:alcohol isoamílico 24:1), mezclando suavemente, varias veces, durante 15 min. El extracto fue centrifugado a 9,000 revoluciones por minuto (RPM) durante 10 min. El sobrenadante fue trasladado a un microtubo limpio, cuidando de no tomar la fase aceitosa ni los sólidos. El ADN fue precipitado por medio de la adición de lo equivalente a dos tercios del volumen del extracto obtenido de etanol absoluto pre-enfriado a -20°C, invirtiendo el microtubo suavemente varias veces, hasta observar enturbiamiento de la mezcla. El extracto se dejó reposar durante 12 horas a -20°C. Posteriormente se centrifugó a 13,000 RPM durante 5 min, se descartó el alcohol y el precipitado fue lavado añadiéndole 500 μl de etanol al 70% a temperatura 27 ambiente. Se efectuaron tres lavados más, pero con etanol pre-enfriado a -20°C. El alcohol fue descartado y el precipitado limpio fue secado en una centrífuga al vacío durante 4 min y resuspendido en 55 μl de buffer AE (Quiagen). El extracto se evaluó en un gel de agarosa al 1% teñido con GelRed para confirmar la obtención de ADN de alto peso molecular. Amplificación y secuenciación de las regiones de ADN de interés La amplificación de las regiones de ADN de interés se efectuó por medio de reacciones en cadena de la polimerasa (PCR), usando la mezcla comercial “Taq PCR Core Kit” (Qiagen), en volúmenes de 15 μl. Se amplificó un solo par de primers para cada marcador, excepto para la región matK-trnK, que por su longitud requirió tres pares de primers (Tabla 3). En la Tabla 4 se presentan los reactivos y cantidades que componen las mezclas para cada región. Los perfiles de temperatura utilizados para amplificar cada región se resumen en la Tablas 5. La obtención de producto de PCR se confirmó en un gel de agarosa al 1%, teñido con GelRed. En caso de existir múltiples productos de PCR (bandas), éstas fueron cortadas individualmente para posteriormente ser purificadas con un kit comercial (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen). La secuenciación de los productos de PCR fue realizada en el Laboratorio de Secuenciación Genómica de la Biodiversidad y la Salud del Instituto de Biología de la UNAM. Tabla 3. Primers empleados para la amplificación de las regiones exploradas en el presente estudio, secuencia y referencia bibliográfica. Marcador Primer forward: 5'-3' Autor EIG atpI- atpH atpI F: 5’-CCAAYCCAGCAGCAATAAC-3’ atpH R: 5’-AGCTTGAATACCRCTTGTAAATA-3’ (Provan et al., 2004) Región ITS ITS 5 F: 5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’ ITS 4 R: 5’-TCCTCCCGTTATTGATATGC-3’ (White et al., 1990) 28 Región matK-trnK matK -19 F: 5’-CCGTTMTSACCATATTGC-3’ matK 458 F: 5’-CTACTAATACCCYATCCCATC-3’ matK 556 R: 5’-TGGATMAAAGATGTTYCTTC-3’ matK 1309 F: 5’-GACTTTCTTGTGCTAGAACT-3’ matK 1326 R: 5’-ACTTCGACTTTCGTGTGCTAGA-3’ trnK 2R: 5’-AACTAGTCGGATGGAGTAG-3’ (Johnson and Soltis, 1994; Molvray et al., 2000) Intrón de rps16 rps16 F: 5’-CCTGTAGGYTGNGCNCCYTT-3’ rps16 R: 5’-AAACGATGTGGNAGNAARCA-3’ (Oxelman et al., 1997) Región trnH-psbA trnH F: 5’-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3’ psbA R: 5’-GAGCATTACGTTCATGCATAAC-3’ (Sang et al., 1995; Tate and Simpson, 2003) EIG trnL- trnF trnL F: 5’-CGAATTCGGTAGACGCTACG-3’ trnF R: 5’-CTCGTGTCACCAGTTCAAAT-3’ (Taberlet et al., 1991) Región trnS-trnfM trnS F: 5’-GAGAGAGAGCGATTCGAACC-3’ trnfM R: 5’-CCCGTGACCTCAAGGTTATG-3’ (Demesure et al., 1995) 29 Tabla 5. Programas de PCR utilizados en la amplificación de los marcadores. Temperatura/Tiempo Región matk- trnK Región trnS-trnfM, EIG atpI- atpH EIG trnL- trnF Intrón rps16 Región trnH- psbA Región ITS Pre-desnaturalización 94°C/2 min 94°C/2 min 94°C/2 min 94°C/2 min 94°C/1 min 94°C/2 min Desnaturalización 94°C/1 min 94°C/1 min 94°C/1 min 94°C/30s 94°C/30 min 94°C/1 min Re-naturalización 52°C/1 min 52°C/1 min 48°C/1 min 52°C/30s 53°C/40s 50°C/1 min Extensión 72°C/2 min 72°C/1 min 72°C/3 min 72°C/1 min 72°C/40s 72°C/1.5 min Número de ciclos 28 28 30 35 30 30 Extensión final 72°C/7 min 72°C/7 min 72°C/7 min 72°C/7 min 72°C/5 min 72°C/7 min Reactivos Región trnS-trnfM, EIG atpI-atpH Región matK-trnK, EIG trnL-trnF Región trnH-psbA Intrón rps16 ITS ADN total 0.1 μL 0.1 μL 0.1 μL 0.1 μL 0.1 μL H2O 11.75 μL 12.03 μL 11.89 μL 12.03 μL 12.03 μL PCR buffer 10X (MgCl2 15 mM) 1.4 μL 1.4 μL 1.4 μL 1.4 μL 1.4 μL Suero de albúmina bovina 0.56 μL 0 μL 0.56 μL 0.56 μL 0.56 μL DNTPs-Mix 10mM de cada dNTP 0.28 μL 0.28 μL 0.28 μL 0.28 μL 0.28 μL Primer forward 0.14 μL 0.14 μL 0.14 μL 0.14 μL 0.14 μL Primer reverse 0.14 μL 0.14 μL 0.14 μL 0.14 μL 0.14 μL MgCl2 0.28 μL 0.84 μL 0.42 μL 0.28 μL 0 μL DMSO 0.28 μL 0 μL 0 μL 0 μL 0.28 μL Polimerasa 5 U/μL 0.07 μL 0.07 μL 0.07 μL 0.07 μL 0.07 μL Tabla 4. Reactivos y volúmenes utilizados en las reacciones de PCR de las regiones 30 El marcador plastidial que incluye al intrón de trnL y al EIG trnL-trnF, aquí analizado, amplificó con facilidad para la mayoría de las especies; sin embargo, en E. juergensenii y E. pastranae se detectó una segunda copia de mayor longitud. Pruebas en otros linajes de Orchidaceae han detectado copias adicionales de mayor longitud para este marcador (Salazar et al., 2016), la mayoría de ellas de un tamaño de 1,150 pb, y una minoría de alrededor de 450 pb. Estos resultados sugieren la posibilidad de que existan dos copias de este marcador en el genoma de las Orchidaceae. La amplificación de una u otra copia depende de pequeñas variaciones en los parámetros de amplificación por PCR, en nuestro caso la copia amplificada fue la más larga. Edición de secuencias, alineamiento y codificación de indels Las secuencias fueron editadas con el programa Sequencher v. 5 (Genes Codes Corp.) y alineadas usando el servidor en línea del paquete de alineamiento automatizado MAFFT (Katoh and Standley, 2013, http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/). Posteriormente, los alineamientos fueron revisados y modificados manualmente, en caso de ser necesario, usando el programa PhyDE v. 0.9971 (Müller et al., 2010, http://www.phyde.de/download.html). Los eventos de inserción-deleción (indels) fueron codificados de manera manual por medio del método simple, propuesto por Simmons y Ochoterena (2000). Las inversiones encontradas se alinearon como indels para las especies que no contaran con ellas; en este trabajo se encontró una sola inversión de 35 pb de longitud en una especie (E. mixtum) en un solo marcador (región trnS-trnfM), por lo que no se realizó ninguna codificación especial para ella. La matriz combinada de los marcadores plastídicos y el ITS consistió de 28 terminales y un total de 8,388 caracteres de los cuales 8,352 son posiciones de nucléotidos y 36 son indels, es 31 decir, porciones de inserciones o deleciones en la secuencia de DNA codificados. La Tabla 6 muestra la longitud en pares de bases alineadas de cada uno de los marcadores analizados. Tabla 6. Longitud en pares de bases alineadas de los marcadores moleculares utilizados en el presente estudio. Longitud en pares de bases alineadas Región trnS-trnfM 1,106 pb Región matK-trnK 1,834 pb Región trnH-psbA 1,033 pb EIG trnL-trnF 1,150 pb EIG atpI-atpH 877 pb Intrón rps16 964 pb ITS 865 pb Análisis filogenéticos Los distintos marcadores moleculares fueron analizados individualmente para evaluar su desempeño en la reconstrucción filogenética, y también se analizaron en dos matrices combinadas y particionadas incluyendo: 1) todos los marcadores plastidiales y 2) los marcadores plastidiales más la región nuclear ITS. El análisis individual del marcador ITS tiene una utilidad adicional a los demás, que consiste en proporcionar un árbol filogenético que muestre una historia evolutiva del nucleo celular, para así contrastar con el cloroplasto. Primero se realizó un análisis de la matriz combinada de cloroplasto y nuclear en PartitionFinder v1.1.0 (Lanfear et al., 2012), con la finalidad de encontrar conjuntos de particiones a ser analizadas bajo el mismo modelo de sustitución molecular, así como para determinar el mejor modelo de sustitución molecular para dichos conjuntos. Con las particiones y modelos seleccionados por PartitionFinder (Tabla 7), se realizaron análisis de inferencia bayesiana de las matrices combinada de los marcadores plastidiales, plastidiales más la región nuclear ITS y de la región ITS individual. Los 32 análisis se realizaron con el programa MrBayes v3.2 (Ronquist et al., 2012) y consistieron en dos corridas independientes y simultáneas de cuatro cadenas, cada una con 2,000,000 de generaciones y frecuencia de muestreo cada 500 generaciones. Mediante el programa Tracer v1.6 (Rambaut y Drummond, 2007) se confirmó la convergencia de los análisis y se verificó que los valores del tamaño de muestreo efectivo (ESS, “Effective Sample Size”) no fueran menores a 100 en ninguno de los parámetros. El “burn-in” se estableció en 10% de las cadenas markovianas llevadas a cabo. Los árboles consenso de compromiso, es decir, de componentes combinables (que no entran en conflicto con los árboles comparados), y las probabilidades posteriores de las ramas fueron calculados con los árboles retenidos después de la exclusión del burn-in (de 5414 a 7197). Los árboles de consenso resultantes fueron editados con el programa FigTree v. 1.4.0 (Rambaut, 2009). Tabla 7. Modelos de sustitución molecular de mejor ajuste y esquemas de partición de los datos obtenidos con PartitionFinder. Partición Modelo evolutivo Regiones analizadas 1 JC Gen atpI, gen trnH, gen rps19, gen trnF, gen trnS 2 K81uf+I+G EIG atpI-atpH, porción 5´ del intrón trnK, exon rps16, EIG rps19- psbA, exon psbA, EIG trnL-trnF, intrón trnL 3 K81uf+I Exón atpH, gen matK, EIG trnH-rps19, EIG trnS-lhbA, gen lhbA, EIG lhbA-trnG, gen trnG 4 TrN+G ITS 5 F81 Porción 3´ del intrón trnK, EIG trnG-trnfM 33 Resultados PartitionFinder v1.1.0 dintinguió 22 particiones de entre todos los datos de los siete marcadores utilizados (Tabla 7). Considerando el número de ramas altamente apoyadas (Probabilidad Posterior, PP≥0.85) obtenido con cada marcador individual (independientemente de que fueran o no congruentes entre sí), los marcadores región matK-trnK e ITS fueron los más informativos, seguidos por los EIG trnS-trnfM y atpI-atpH, el intrón del gen rps16 y los EIG trnH-psbA y trnL-trnF (Figura 5). Los árboles de los marcadores moleculares individuales (excepto ITS; Fig. 6) se encuentran en el Anexo (Figuras 10 a 15). Figura 5. Utilidad filogenética proporcionada por cada marcador molecular con base en el número de ramas altamente apoyados (PP≥0.85). El análisis del marcador ribosomal-nuclear ITS resultó en algunas relaciones topológicas altamente apoyadas, que son incongruentes con aquellas encontradas en los dos análisis 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 N o . d e n o d o s al ta m en te a p o ya d o s Análisis Utilidad filogenética 34 combinados (Figura 6). En la primera de ellas, el género Epidendrum no aparece como monofilético, pues incluye también a Encyclia cordigera como hermana de Epidendrum marmoratum. Varias otras especies y clados de Epidendrum no pertenecientes al grupo E. anisatum aparecieron altamente apoyados en diferente posición con respecto a los dos análisis combinados, incluyendo a E. radioferens, E. parkinsonianum, y E. eximium; el clado conformado por E. mixtum, E. verrucosum, E. nitens, E. longicaule, E. nocturnum y E. radicans; y la relación de grupo hermano entre el clado anterior y el grupo de E. anisatum. En contraste, el grupo de E. anisatum es fuertemente apoyado como monofilético (PP=1.00). Al interior del grupo de E. anisatum todas las relaciones fuertemente apoyadas son consistentes con los análisis combinados. Los análisis de las matrices combinadas de cloroplasto, y cloroplasto más ITS (Figuras 7 y 8), mostraron las mismas relaciones filogenéticas con fuerte apoyo. El texto subsecuente sólo se referirá al árbol combinado de consenso de compromiso de todos los mardadores (Figura 7), haciendo referencia a los grupos altamente apoyados (PP≥0.85). Se obtiene un clado que incluye a Cattleya forbesii, Encyclia cordigera y todas las especies de Epidendrum. Al interior de éste se encuentra un clado conformado por E. nocturnum y E. radicans, como hermano de un linaje que contiene al resto de las especies del género. Dentro de este último linaje, forman un clado E. nitens, E. mixtum y E. verrucosum. Luego se forma un grado con E. longicaule, E. marmoratum y el resto de los Epidendrum. El siguiente clado apoyado es el del grupo de E. anisatum, que fue recuperado como monofilético y fuertemente apoyado (PP=1.00). Inmediatamente después se encuentra el clado de todos los miembros del grupo de E. anisatum excepto E. gasteriferum, 35 posicionándolo como la especie hermana del resto del grupo. Después, el grupo se divide en dos clados: 1) Clado 1: Conformado por E. matudae, E. lowilliamsi, E. anisatum, E. gomezii y E. pastranae. Después se forma un clado con todas las especies antes mencionadas, excepto E. pastranae, la cual se posiciona como hermana del resto del clado 1. Las relaciones someras restantes no se resuelven. 2) Clado 2: Conformado por E. mixtecanum, E. oaxacanum, E. hueycantenangense, E. guerrerense, E. costatum y E. cusii. Luego se forma un grado con E. cusii como la primera en divergir, seguida de E. costatum. El clado de las cuatro especies restantes (E. mixtecanum, E. oaxacanum, E. hueycantenangense, E. guerrerense) se mantiene bien apoyado, pero sin resolver las relaciones entre ellas. 36 Figura 6. Árbol consenso de compromiso resultante del análisis de inferencia bayesiana de la matriz del marcador ribosomal-nuclear ITS, incluyendo 28 especies (13 del grupo interno y 15 del grupo externo). Para facilitar la visualización, el largo de las ramas fue modificado a manera de cladograma en (B), mientras que (A) muestra la configuración original del largo de ramas. Los números junto a los nodos indican la probabilidad posterior obtenida para cada clado. 37 Figura 7. Árbol consenso de compromiso resultante del análisis de inferencia bayesiana de la matriz combinada de todos los marcadores de cloroplasto y el marcador nuclear ITS, incluyendo 28 especies (13 del grupo interno y 15 del grupo externo). Para facilitar la visualización, el largo de las ramas fue modificado a manera de cladograma en (B), mientras que (A) muestra las longitudes de ramas. Los números junto a los nodos indican la probabilidad posterior obtenida para cada clado, y con el mismo propósito se resaltan el clado (1) y (2) para posterior discusión de las relaciones altamente apoyadas. 38 Figura 8. Árbol consenso de compromiso resultante del análisis de inferencia bayesiana de la matriz combinada de todos los marcadores de cloroplasto, incluyendo 28 especies (13 del grupo interno y 15 del grupo externo). Para facilitar la visualización, el largo de las ramas fue modificado a manera de cladograma en (B), mientras que (A) muestra la configuración original del largo de ramas. Los números junto a los nodos indican la probabilidad posterior obtenida para cada clado. 39 Discusión Utilidad filogenética de los marcadores empleados El presente trabajo representa la primera evaluación formal de la monofilia y relaciones filogenéticas del grupo de Epidendrum anisatum, mediante la obtención y análisis de varios marcadores moleculares heredados por vía uniparental y biparental. Estudios previos en el grupo se habían enfocado únicamente en abordar propuestas prácticas de clasificación y delimitación de especies basadas en atributos morfológicos y anatómicos (García-Cruz, 1995; Hágsater, 1984). Sin embargo, ninguno de estos estudios aplicó métodos filogenéticos formales que permitieran evaluar la monofilia y relaciones dentro del grupo. Nuestro análisis combinado de las regiones del cloroplasto y el ITS obtuvo un árbol resuelto (excepto en divergencias someras), en donde la mayoría de las relaciones filogenéticas están altamente apoyadas (PP≥ 0.85), concentrándose el bajo apoyo en ramas de longitud comparablemente más cortas, localizadas, tanto en divergencias someras como profundas. La resolución poco apoyada de grupos a los que subyacen ramas cortas, en donde los linajes divergen en sucesión rápida, es un problema común en muchos estudios filogenéticos (Granados Mendoza et al., 2013; Naumann et al., 2013; Rothfels et al., 2012). En el caso de las ramas cortas y profundas, el bajo apoyo se ha atribuido a la baja probabilidad de que un carácter informativo cambie en un entrenudo ancestral, permaneciendo sin cambios subsecuentes durante la evolución del linaje de interés. También es posible que las divergencias filogenéticas ocurrieran lo muy rápido como para que los marcadores conservados las registren y los marcadores con mayores tasas de cambio se hallen saturados; mientras que las ramas cortas y someras 40 representan divergencias recientes, a partir de las cuales pocos cambios moleculares podrían haberse acumulado (Townsend y Leuenberger, 2011; Townsend, 2007). Los análisis combinado total y combinado de marcadores de cloroplasto, mostraron alta congruencia topológica, lo cual podría ser el resultado de la inclusión de una proporción considerablemente mayor de marcadores plastídicos, con relación al único marcador nuclear analizado. En contraste, el análisis individual del marcador nuclear (región ITS) mostró algunas relaciones altamente apoyadas, que no son congruentes con los resultados de los dos análisis combinados. La presencia de incongruencia topológica entre fuentes de datos plastídicos y nucleares ha sido reportada en varios linajes de angiospermas. Tal es el caso de las familias Plantaginaceae y Brassicaceae (Albach y Chase, 2004; Lihova et al., 2006). Dichas incongruencias han sido atribuidas principalmente a posibles eventos de hibridación o poliploidización. Posiciones alternativas de un terminal, en filogenias obtenidas por medio de análisis separados, de fuentes de datos uniparentales y biparentales, pueden sugerir cuáles son las especies o linajes parentales que dieron origen a un taxón híbrido. Un ejemplo de ello es el estudio de Majure et al. (2012), el cual sugiere el origen híbrido de Opuntia ficus-indica (el nopal comestible), mediante la reconstrucción filogenética con marcadores plastidiales y el marcador nuclear ITS. En el caso de este análisis de Epidendrum, fue de gran importancia contrastar los resultados de los análisis separados de grupos de datos heredados por vías parentales distintas, como el caso de E. juergensenii, que aparece en diferentes clados en los diferentes análisis (anque con bajo apoyo). Algunos estudios previos han reportado hibridación dentro del género Epidendrum, así como la presencia de especies poliploides (Pinheiro et al., 2010; Marques et al., 2014), sugiriendo que la 41 incongruencia topológica entre el marcador nuclear y los plastidiales, aquí encontrada, pudiera también deberse a alguno de estos procesos evolutivos. Otra razón que puede explicar la incongruencia topológica entre el cloroplasto y el núcleo, es que la región ITS, formando parte de una familia multigénica de la que pueden estar presentes miles de copias por genoma nuclear, puede presentar homogenización incompleta de la familia de genes que lo conforma (Granados Mendoza et al., 2015), siendo una posibilidad que la matriz de ITS incluya copias parálogas para algunas especies. Sin embargo, esta explicación alternativa no parece ser el caso para los datos presentes, ya que los geles de electroforesis mostraron una única banda (un solo producto de PCR) y los electroferogramas resultantes mostraron picos bien definidos, lo que indica que, en cada caso, solo una versión o copia fue amplificada y secuenciada. Esto, por ejemplo, no fue el caso de las pruebas con otro marcador ribosomal nuclear, el espaciador externo transcrito (ETS, por sus siglas en inglés; datos no mostrados), en donde se detectaron múltiples productos de PCR adicionales y posiciones con dobles picos en los electroferogramas. Al considerar cada marcador individual, la región plastidial matK-trnK y el ITS fueron los más informativos en términos de número de ramas altamente apoyadas. La región matK-trnK incluye a al gen matK y porciones del intrón del gen trnK, dentro del cual se encuentra inmerso, por lo que este marcador es una combinación de regiones codificantes y no codificantes, las cuales, en conjunto, pueden ser informativas a diferentes profundidades taxonómicas. La utilidad filogenética de la región del matK-trnK, a niveles taxonómicos finos, ha sido corroborada por varios estudios filogenéticos previos en Orchidaceae (p. ej. tribu Arethuseae; subtribu Aeridinae, (Goldman et al., 2001; Group et al., 2009; Topik et al., 2005)). Los trabajos de van den Berg (2000) 42 y van den Berg et al. (2009), corroboran la utilidad filogenética de matK-trnK en Epidendrum y géneros cercanos. Los marcadores ribosomales nucleares, por lo general, son más variables que aquellos provenientes del cloroplasto (van den Berg, 2000; Topik et al. 2005), lo cual es congruente con los resultados, en donde el ITS mostró un mayor número de grupos altamente apoyados respecto a casi todas las regiones del cloroplasto analizadas. Estudios previos en Orchidaceae, han reportado el uso exitoso del marcador ITS para resolver relaciones al nivel de especie en los géneros Phalaenopsis (Tsai et al. 2004) y Dendrobium (Tsai et al. 2005), mientras que el trabajo de Hágsater y Soto (2005) muestran la utilidad de ITS en el género Epidendrum. Monofilia de Epidendrum y del grupo de E. anisatum Una de las incongruencias topológicas más notables entre ITS y los marcadores de cloroplasto es la parafilia, en el primer caso, del género Epidendrum respecto a Encyclia cordigera. Si bien, históricamente, Encyclia y Epidendrum formaban parte de un solo género, ningún estudio filogenético formal previo ha encontrado a una especie de Encyclia dentro de Epidendrum (Hágsater y Soto, 2005). Si bien el apoyo es muy bajo, de acuerdo a los trabajos de van den Berg (2000) y van den Berg et al. (2009), Encyclia conforma su propio grupo, denominado “Alianza Encyclia”, el cual no fue recuperado como hermano o ni cercano al linaje de Epidendrum. Pese a las incongruencias topológicas detectadas entre esas dos fuentes de datos, la monofilia del grupo de E. anisatum fue consistente en ambos casos (Figuras 6 y 7). Este resultado fue también corroborado por los análisis individuales de las regiones del cloroplasto matK-trnK y trnS-trnfM, mientras que los análisis individuales restantes carecieron de resolución filogenética a dicho nivel. 43 Relaciones filogenéticas al interior del grupo de E. anisatum Los análisis filogenéticos recuperan dos linajes principales en el grupo de E. anisatum. El primero está conformado por E. matudae, E. anisatum, E. lowilliamsi, E. gomezii y E. pastranae, especies distribuidas en la Sierra Madre Occidental, el Eje Neovolcánico Transversal y la Sierra Madre del Sur. El segundo linaje está integrado por E. mixtecanum, E. oaxacanum, E. hueycantenangense, E. guerrerense, E. costatum y E. cusii, todas distribuidas en la Sierra Madre del Sur, en el estado de Oaxaca, excepto E. cusii, presente en la región del Eje Neovolcánico Transversal, en el Estado de México y la Sierra Madre del Sur, en el extremo occidental de Guerrero; y E. guerrerense distribuido en la región del extremo Oeste de la Sierra Madre Occidental, en Guerrero. Epidendrum gasteriferum, la especie hermana al resto de las especies del grupo E. anisatum, se distribuye en la Sierra Madre del Sur, en Oaxaca. En el caso de E. juergensenii, distribuida en los estados de Oaxaca y Veracruz, nuestros resultados no produjeron una indicación altamente apoyada de su posición filogenética. En general, el grupo de E. anisatum habita principalmente los bosques de encino, entre los 1200-2000 msnm. García-Cruz (1995), definió tres grupos principales en su fenograma (Fig. 9), basado en caracteres morfológicos y anatómicos, ubicando a algunas especies (E. examinis, E. dorsocarinatum, E. lowilliamsi y E. gasteriferum), al exterior de dichos grupos. Los grupos de García-Cruz (1995) están compuestos de la siguiente forma: 44 Figura 9. Fenograma resultante del estudio de García-Cruz (1995), los grupos I, II y III son los resultantes del análisis de conglomerados realizado en el mismo. Figura modificada de García- Cruz (1995). En conjunto, los grupos I y II, de dicho autor, corresponden casi por completo al clado 1 rescatado en el presente estudio, mientras que el tercer grupo corresponde al clado 2. Sin embargo, dicha correspondencia no es exacta, ya que E. costatum y E. cusii se ubicaron al interior del clado 2. Los resultados del presente estudio posicionan a E. gasteriferum como la primera especie divergente del grupo E. anisatum; de manera similar, García-Cruz (1995) denota a esta especie como la más diferente morfológicamente a todas las demás del grupo. Una diferencia 45 entre la agrupación de García-Cruz (1995) y el presente trabajo, es que E. lowilliamsi y E. examinis (sinónimo de E. matudae) forman parte del clado 1, y no están escalonadas junto con E. gasteriferum. La filogenia obtenida muestra congruencia con la morfología del labelo. Las flores de E. costatum, E. cusii, E. guerrerense, y E. hueycantenangense se distinguen por tener labelos anchos, ligeramente lobados. Por otro lado, E. anisatum, E. matudae, E. juergensenii, y E. lowilliamsi tienen labelos más angostos, rotundamente trilobados. Las excepciones son E. pastranae, perteneciente al clado 1, que tiene el labelo ancho y ligeramente trilobado, y E. gomezii, perteneciente a este mismo clado, pero presentando un labelo ancho y escasamente trilobado. De igual manera, E. oaxacanum, especie del clado 2, presenta un labelo angosto, notoriamente trilobado. 46 Conclusiones y consideraciones a futuro El grupo de E. anisatum fue encontrado como monofilético con un alto apoyo, tanto por los marcadores de cloroplasto, como por la región nuclear analizada. La mayoría de las relaciones filogenéticas obtenidas al interior del grupo recibieron alto apoyo, con excepción de aquellas correspondientes principalmente a las divergencias más recientes. Los resultados muestran una congruencia parcial con grupos propuestos por García-Cruz (1995). Las diferencias principales son que dicho trabajo separa en dos grupos (I y II) al clado 1, recuperado con alto apoyo como monofiletico, y E. lowilliamsi no aparece agrupado con E. matudae, E. anisatum, E. gomezii o E. pastranae (como sí ocurre en el presente análisis). De igual manera, se observó congruencia morfológica en lo que respecta la forma del labelo. Dichos caracteres florales, así como otros caracteres vegetativos y reproductivos, adicionales, podrían ser analizados en el futuro bajo el contexto filogenético aquí generado. Estudios futuros, que busquen mejorar la resolución y apoyo filogenético, aquí obtenidos, requerirán la inclusión de marcadores adicionales, tanto plastidiales como nucleares. Además, un muestreo mucho mayor de especies representativas de los diferentes linajes del género, identificados por Hágsater y Soto (2005), permitirá establecer un linaje hermano del grupo E. anisatum. La inclusión en el futuro de otros marcadores heredados biparentalmente, como son los genes nucleares de pocas o una copia, permitiría contrastar las incongruencias topológicas entre el marcador nuclear ITS y los marcadores plastídicos detectados aquí. 47 Bibliografía citada Albach, D.C., Chase, M.W., 2004. Incongruence in Veroniceae (Plantaginaceae): evidence from two plastid and a nuclear ribosomal DNA region. Mol. Phylogenet. Evol. 32: 183–197. doi:10.1016/j.ympev.2003.12.001 Almeida, A.M., Figueiredo, R.A., 2003. Ants visit nectaries of Epidendrum denticulatum (Orchidaceae) in a Brazilian rainforest: effects on herbivory and pollination. Braz. J. Biol. 63: 551–558. Ames, O., Schweinfurth, C., Hubbard, F.T., 1875-1936. The genus Epidendrum in the United States and Middle America. Botanical Museum, Cambridge, Mass. Bentham, G., Hooker, J.D., 1883. Genera plantarum: ad exemplaria imprimis in Herberiis Kewensibus servata definita /auctoribus G. Bentham et J.D. Hooker. A. 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Los números junto a los nodos indican la probabilidad posterior obtenida para cada clado. 53 Figura 11. Árbol consenso de compromiso resultante del análisis de inferencia Bayesiana de la matriz de la región plastidial matK-trnK, incluyendo 28 especies (13 del grupo interno y 15 del grupo externo). Para facilitar la visualización, el largo de las ramas fue modificado a manera de cladograma en (B), mientras que (A) muestra la configuración original del largo de ramas. Los números junto a los nodos indican la probabilidad posterior obtenida para cada clado. 54 Figura 12. Árbol consenso de compromiso resultante del análisis de inferencia Bayesiana de la matriz del intrón plastidial rps16, incluyendo 28 especies (13 del grupo interno y 15 del grupo externo). Para facilitar la visualización, el largo de las ramas fue modificado a manera de cladograma en (B), mientras que (A) muestra la configuración original del largo de ramas. Los números junto a los nodos indican la probabilidad posterior obtenida para cada clado. 55 Figura 13. Árbol consenso compromiso resultante del análisis de inferencia Bayesiana de la matriz del EIG plastidial trnH-psbA, incluyendo 28 especies (13 del grupo interno y 15 del grupo externo). Para facilitar la visualización, el largo de las ramas fue modificado a manera de cladograma en (B), mientras que (A) muestra la configuración original del largo de ramas. Los números junto a los nodos indican la probabilidad posterior obtenida para cada clado. 56 Figura 14. Árbol consenso compromiso resultante del análisis de inferencia Bayesiana de la matriz del EIG plastidial trnL-trnF, incluyendo 27 especies (13 del grupo interno y 14 del grupo externo). Para facilitar la visualización, el largo de las ramas fue modificado a manera de cladograma en (B), mientras que (A) muestra la configuración original del largo de ramas. Los números junto a los nodos indican la probabilidad posterior obtenida para cada clado. 57 Figura 15. Árbol consenso compromiso resultante del análisis de inferencia Bayesiana de la matriz de la región plastidial trnS-trnfM, incluyendo 28 especies (13 del grupo interno y 15 del grupo externo). Para facilitar la visualización, el largo de las ramas fue modificado a manera de cladograma en (B), mientras que (A) muestra la configuración original del largo de ramas. Los números junto a los nodos indican la probabilidad posterior obtenida para cada clado. 58 Glosario de términos botánicos Adnado: Adherido, concrescente. Órganos o partes de órganos diferentes que se unen o fusionan parcialmente, como ocurre entre los pétalos y los estambres. Cespitoso: Tipo de crecimiento donde la planta crece corta y muy junta a manera de césped, como el pasto. Célula oclusiva: Cada una de las dos células que forman un estoma, es sinónimo de célula guarda. Columna: Estructura formada por la adnación de los estambres, estilo y estigma en las flores de las orquídeas. Sinónimo de ginandro y ginostemio. Corimbo: Inflorescencia formada por agrupaciones de flores con pedicelos de diferentes largos pero cuyas flores llegan al mismo nivel o altura. Puede ser una inflorescencia simple o compuesta y cimosa o racemosa. Cutícula: Capa impermeable y cerosa sobre la cara externa de las células epidérmicas. Protege a las plantas de la desecación, generalmente cubre totalmente a la planta a excepción de las raíces, los órganos sumergidos de las plantas acuáticas y de algunas briofitas sensu lato. Dístico: Posición de órganos o apéndices que se arreglan en dos filas verticales opuestas. Generalmente se utiliza para referirse a la disposición de las hojas sobre los tallos. Estigma: En angiospermas, es la zona apical del pistilo de las flores, en donde se reciben los granos de polen. Puede tener diversas formas. Fusiforme: Con forma de uso, elipsoide, el centro ancho y adelgazado hacia los extremos. Labelo: Tépalo medio de las orquídeas que asume una posición basal, con mayor tamaño que los cinco restantes y cuya funicón principal es la de atraer a los polinizadores. Lámina: Porción aplanada de las hojas, tiene dos caras: haz y envés o adaxial y abaxial. Monopodial: Condición en la que se presenta un eje principal de crecimiento con o sin ramificaciones laterales. En este tipo de crecimiento los ejes laterales se desarrollan menos que el eje central o principal, produciéndose una dominancia apical. Panícula: Inflorescencia muy ramificada. Palinológico: Referente al estudio o tratado de las esporas y el polen. Perianto: Conjunto de veticilos estériles de la flor conformado por el cáliz y la corola, aunque estos pueden carecer de diferenciación, estar fusionados o solo estar presente uno de ellos. Racimo: Inflorescencia simple indefinida, presenta un eje central y flores pediceladas en torno a éste. Simpodial: Tipo de crecimiento ramificado de las plantas en donde no se distingue un eje principal o rama principal. Las ramas laterales se desarrollan más o igual que el eje principal. Vaina: Parte basal de una hoja que rodea al tallo a manera de tubo. Abreviaturas y acrónimos ADN: Ácido desoxirribonucleico EIG: Espaciador intergénico ETS: Espaciador externo transcrito (por sus siglas en inglés) ITS: Espaciador interno transcrito (por sus siglas en inglés) Min: Minutos PCR: Reacción en cadena de la polimerasa (por sus siglas en inglés)