UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO PROGRAMA DE DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMÉDICAS INSTITUTO DE NEUROBIOLOGÍA Caracterización del locus acal y su relación con la vía de señalización de la cinasa de Jun (JNK) en Drosophila melanogaster. TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: DOCTOR EN CIENCIAS PRESENTA: LIBB. LUIS DANIEL RÍOS BARRERA TUTOR: DR. JUAN RAFAEL RIESGO ESCOVAR INSTITUTO DE NEUROBIOLOGÍA MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR: DRA. CARMEN CLAPP JIMÉNEZ LABORA INSTITUTO DE NEUROBIOLOGÍA DR. JESÚS CHIMAL MONROY INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS JURIQUILLA, QUERÉTARO, 28 DE FEBRERO DE 2015 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. 1 Queda prohibido llorar sin aprender, levantarme un día sin saber qué hacer, tener miedo a mis recuerdos, sentirme sólo alguna vez. Queda prohibido no sonreír a los problemas, no luchar por lo que quiero, abandonarlo todo por tener miedo, no convertir en realidad mis sueños. Queda prohibido dejar a mis amigos, no intentar comprender lo que vivimos, llamarles sólo cuando les necesito, no ver que también nosotros somos distintos. Queda prohibido no ser yo ante la gente, fingir ante las personas que no me importan, hacerme el gracioso con tal de que me recuerden, olvidar a toda la gente que me quiere. Queda prohibido no hacer las cosas por mí mismo, no creer en mi y no hacer mi destino, tener miedo a la vida y a sus castigos, no vivir cada día como si fuera un último suspiro. Queda prohibido no intentar comprender a las personas, pensar que sus vidas valen más o menos que la mía, no saber que cada uno tiene su camino y su dicha, pensar que con su falta el mundo se termina. Queda prohibido no crear mi historia, dejar de dar las gracias a mi familia por mi vida, no tener un momento para la gente que me necesita, no comprender que lo que la vida nos da, también nos lo quita. Alfredo Cuervo Barrero (Modificado). 2 Dedico esta tesis a Silvia Barrera, mi madre. Con el ejemplo, me enseñaste a luchar y a soñar, y gracias a eso, el día de hoy soy quien soy. Jamás dejaré de agradecer y admirar tu amor y tus sacrificios. A Adriana, mi hermana, mi confidente y mi protectora. A mis tíos: Chela, Luisa, Angel y Alfonso, mis segundos padres. A mis primos: Margarita, Luis, Sergio, Ramón, Iritna y Lili, mis hermanos mayores. A mis sobrinos Kamila y Juan Pablo, que espero lean esto algún día :) A mi familia en Querétaro: Eduardo Rojas (Lalingui), Karla Vega y Azalea Reyes, no sé quién sería hoy sin haberlos conocido. A mi tutor y amigo Juan Riesgo, por tus enseñanzas y tu apoyo dentro y fuera del laboratorio. A mi papá, José Luis Ríos, por estos años que nos reencontramos en Querétaro. A María Eugenia Torres, por enseñarme, aconsejarme y motivarme a seguir avanzando. A mis tutores, Jesús Chimal y Carmen Clapp, por su apoyo a lo largo de mi formación. A todas las personas que han estado cerca de mi, de una u otra manera, en uno u otro momento. En el DF, mis hermanitas: Jimena Olguín, Patricia Garay, Brenda Paredes y Natalia Martagón. En Querétaro: Karyna Yc, Ximena Castillo, Mario Nava, Silvia Angulo, Amanda Raggi, Alejandro Martínez, Raúl Hernández, Laura Cuaya, Yutsil Leyva, Leticia Robles, Penélope Martínez, Juan Carlos Méndez, Laura Pinedo, Benjamín Velarde, Juan Manuel Murillo, Aldo Tellez y Miguel Angel Mendoza. 3 ÍNDICE I.   AGRADECIMIENTOS. ........................................................................................................... 6   II.   LISTA DE FIGURAS. .............................................................................................................. 7   III.   RESUMEN. ............................................................................................................................. 9   IV.  ABSTRACT. ......................................................................................................................... 10   V.   INTRODUCCIÓN. ................................................................................................................. 11   VI.  ANTECEDENTES. ............................................................................................................... 14   1.   Ciclo de vida de Drosophila melanogaster. ..................................................................... 14   2.   Desarrollo embrionario de Drosophila melanogaster. ...................................................... 15   3.   Vías de señalización de tipo MAPK. ................................................................................ 18   4.   La vía de señalización de JNK. ........................................................................................ 20   5.   El cerrado dorsal como modelo de estudio de la vía de JNK. ......................................... 21   VII.  ANTECEDENTES DIRECTOS. ............................................................................................ 26   VIII.  HIPÓTESIS. ........................................................................................................................ 27   IX.  OBJETIVO GENERAL. ......................................................................................................... 27   X.   OBJETIVOS PARTICULARES. ............................................................................................ 27   XI.  METODOLOGÍA EXPERIMENTAL ...................................................................................... 28   1.   Cepas de Drosophila melanogaster ................................................................................. 28   2.   Mapeo genético y molecular ............................................................................................ 29   3.   Construcciones de rescate. ............................................................................................. 29   4.   Preparaciones de cutículas embrionarias. ....................................................................... 30   5.   Hibridación in situ. ............................................................................................................ 30   6.   Tinción con X-gal. ............................................................................................................ 31   4 7.   Northern blots. ................................................................................................................. 32   8.   Northern blots para RNAs pequeños. .............................................................................. 32   9.   Enriquecimiento de RNA nuclear. .................................................................................... 33   10.   Retrotranscripción, PCR semi-cuantitativa, y PCR en tiempo real. ................................. 33   11.   Microscopía de fluorescencia (transgenes fluorescentes). .............................................. 34   12.   Inmunofluorescencia de montaje completo de embriones y cerebros larvarios. ............. 34   13.   Microscopía electronica de barrido. ................................................................................. 35   14.   Cálculo de índice de hendidura torácica. ......................................................................... 35   15.   Cálculo del índice de curvatura del ala. ........................................................................... 35   16.   Cuantificación de peines sexuales ectópicos. ................................................................. 36   17.   Análisis transcriptómico. .................................................................................................. 36   18.   Bioinformática. ................................................................................................................. 37   19.   Análisis estadístico. ......................................................................................................... 37   XII.  RESULTADOS. .................................................................................................................... 39   1.   Cuantificación de los fenotipos cuticulares de embriones mutantes de acal. .................. 39   2.   Las mutaciones de acal mapean genética y molecularmente a un gen no anotado. ...... 40   3.   acal es un RNA no codificante. ........................................................................................ 48   4.   Expresión de acal durante el desarrollo embrionario. ...................................................... 54   5.   acal regula negativamente la vía de JNK durante el cerrado dorsal. .............................. 57   6.   acal actúa debajo de raw, un regulador negativo de la vía de JNK. ................................ 62   7.   acal y raw regulan la expresión de Cka, una proteína de andamiaje de la vía de JNK. .. 67   8.   acal y raw regulan la expresión de aop, un factor de transcripción regulador de la vía de JNK. ........................................................................................................................................ 70   9.   acal y raw interactúan genéticamente con Polycomb. ..................................................... 72   10.   Análisis del transcriptoma de los embriones mutantes de acal. ...................................... 77   11.   Participación de acal en otros procesos del desarrollo: Defectos en la formación del sistema nervioso de los embriones mutantes de acal. ........................................................... 80   5 12.   Defectos en el sistema nervioso de las larvas mutantes de acal. ................................... 83   13.   Identificación de genes involucrados en la hiperplasia del sistema nervioso en embriones y larvas mutantes para acal. ................................................................................................... 85   XIII.  DISCUSIÓN. ....................................................................................................................... 92   XIV.  REFERENCIAS. ................................................................................................................ 100   XV.  ANEXOS. ............................................................................................................................ 112   1.   Portada de revista. ......................................................................................................... 112   2.   Artículo de revisión. ....................................................................................................... 112   3.   Artículo de investigación original. .................................................................................. 112   6 I. AGRADECIMIENTOS. El presente trabajo se llevó a cabo en el laboratorio de Genética de transducción de señales, del departamento de Neurobiología del Desarrollo y Neurofisiología del Instituto de Neurobiología de la Universidad Nacional Autónoma de México, campus Juriquilla, de Agosto de 2009 a Mayo de 2014. El comité tutor que asesoró el desarrollo de este trabajo estuvo conformado por el Dr. Juan Rafael Riesgo Escovar y la Dra. Carmen Clapp Jiménez Labora, del Instituto de Neurobiología, UNAM, y por el Dr. Jesús Chimal Monroy, del Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM. Durante la realización de este trabajo, se contó con el apoyo técnico de las siguientes unidades y personal académico: Unidad de Enseñanza: Dra. Aurea Orozco Rivas M. en C. Leonor Casanova Rico Ma. Del Carmen Vázquez Rodríguez Unidad de Proteogenómica: Dra. Anaid Antaramian Salas M. en C. Adriana González Gallardo Dr. Micheal Jeziorski Unidad de Microscopía: Ing. Nydia Hernández Ríos Unidad de Videoconferencia: Lic. Lourdes Lara Ayala Unidad de Cómputo: Ing. Ramón Martínez Olvera Ing. Alberto Lara R Ing. Sandra Hernández García Biblioteca del Campus Juriquilla: Dr. Francisco Javier Valles Valenzuela y personal de la biblioteca. 7 II. LISTA DE FIGURAS. Figura 1. Ciclo de vida de Drosophila melanogaster. ................................................................. 15   Figura 2. El cerrado dorsal en Drosophila melanogaster. .......................................................... 17   Figura 3. Mutantes para componentes de la vía de JNK muestran defectos en el cerrado dorsal. ............................................................................................................................................ 22   Figura 4. La vía de JNK en Drosophila melanogaster. ............................................................... 23   Figura 5. Cuantificación de los fenotipos cuticulares de los mutantes de acal. ......................... 40   Figura 6. Representación esquemática de las deficiencias empleadas en el mapeo genético de acal. ..................................................................................................................................... 41   Figura 7. La heterocigosis para acal suprime el fenotipo mutante de peb1. ............................... 43   Figura 8. Representación esquemática y detección del cDNA SD08925. ................................. 45   Figura 9. Rescate genómico de los alelos mutantes de acal. .................................................... 46   Figura 10. Expresión y sobre-expresión de SD08925 en embriones mutantes de acal. ........... 47   Figura 11. Análisis de la conservación de acal y de su potencial codificante. ........................... 50   Figura 12. Detección de fragmentos de acal por Northern blot para RNAs pequeños. ............. 53   Figura 13. Patrón de expresión de acal durante el desarrollo embrionario de embriones silvestres. ............................................................................................................................ 55   Figura 14. Patrón de expresión de acal durante el desarrollo embrionario de embriones mutantes. ............................................................................................................................. 56   Figura 15. Activación del reportero TRE-DsRed durante el cerrado dorsal de embriones mutantes para acal y silvestres. .......................................................................................... 58   Figura 16. Expresión del reportero puclacZ en embriones silvestres y mutantes para acal, e interacciones genéticas con componentes de la vía de JNK. ............................................. 60   Figura 17. Efecto de sobre-activar la vía de JNK en embriones heterocigotos para acal. ......... 62   Figura 18. acal y raw actúan juntos para inhibir la vía de JNK durante el cerrado dorsal. ......... 64   Figura 19. Sobre-expresión de acal y de raw en el tórax. .......................................................... 66   Figura 20. acal y raw regulan la expresión de Cka. ................................................................... 69   Figura 21. aop actúa río abajo de acal. ...................................................................................... 71   8 Figura 22. La sobre-expresión de acal inhibe la expresión de Cka y aop. ................................. 72   Figura 23. Polycomb interactúa genéticamente con acal y con raw. ......................................... 74   Figura 24. Los animales doble heterocigotos para Pc y acal o raw presentan defectos en las alas. ..................................................................................................................................... 75   Figura 25. Sobre-expresión de lola y psq en embriones silvestres. ........................................... 76   Figura 26. Análisis del transcriptoma de los embriones mutantes de acal. ................................ 79   Figura 27. Categorías sobre-representadas en los genes de expresión diferencial. ................. 81   Figura 28. Defectos en el sistema nervioso en los embriones mutantes de acal. ...................... 82   Figura 29. Fenotipos mutantes de acal en estadios post-embrionarios. .................................... 83   Figura 30. Diferenciación de precursores neurales en cerebros larvarios silvestres y mutantes. ............................................................................................................................................ 85   Figura 31. Determinación por qPCR de la expresión de Dl y l(2)gl en animales silvestres y mutantes. ............................................................................................................................. 87   Figura 32. Expresión de las isoformas de lola en embriones silvestres y mutantes para acal. . 88   Figura 33. Resumen de las funciones de acal durante el desarrollo embrionario. ..................... 90   9 III. RESUMEN. La cinasa amino-terminal de Jun (Jun N-terminal Kinase, JNK) y su vía de señalización se encuentran altamente conservadas en eucariontes. Drosophila melanogaster ha sido un organismo muy útil para identificar genes involucrados en esta vía de señalización, y para estudiar sus funciones. El primer requerimiento de la vía de JNK en Drosophila ocurre en el cerrado dorsal embrionario, donde dos láminas de epidermis lateral se estiran hasta fusionarse en la línea media dorsal del embrión. La vía de JNK se activa únicamente en las células más dorsales de la epidermis, donde induce cambios en la forma celular y propaga la señalización a células aledañas. A pesar de que se han descrito varios componentes de la vía de señalización de JNK y varios de sus efectores, aún no se entiende cómo se regula su activación. En este trabajo caracterizamos al gen acal, un nuevo regulador de la vía de JNK durante el cerrado dorsal. Las mutaciones en acal resultan en defectos en el cerrado dorsal. Nuestros resultados demuestran que estos defectos se deben a la activación ectópica de la vía de JNK en células más laterales de la epidermis, resultando en un estiramiento aberrante de la epidermis. acal es un RNA no codificante largo nuclear, que se procesa a fragmentos de 40 a 120 nucleótidos de longitud, y que se expresa en la epidermis lateral. Su expresión es regulada al menos indirectamente por Raw, una proteína pionera. Nuestros resultados muestran que acal y raw regulan la expresión de dos componentes de la vía de JNK: Connector of kinase to AP1 (Cka) y Anterior open (Aop). Cka es una proteína de andamiaje entre JNK y Jun, su sustrato, y Aop es un factor de transcripción que favorece la diferenciación de la epidermis previo al cerrado dorsal. acal interactúa genéticamente con Polycomb (Pc), un componente de complejos remodeladores de la cromatina que reprime la expresión génica. Esto sugiere que acal podría formar parte de complejos remodeladores de la cromatina como lo hacen otros RNAs no codificantes largos. Finalmente, mostramos que acal también se expresa en el sistema nervioso y que los mutantes de acal presentan hiperplasia del sistema nervioso durante la embriogénesis y el desarrollo larvario. La función de acal en este tejido es independiente de su función en el cerrado dorsal, posiblemente regulando la expresión de genes aledaños con funciones neurogénicas ampliamente estudiadas. 10 IV. ABSTRACT. The Jun N-terminal Kinase (JNK) and its signaling pathway are highly conserved in eukaryotes. Drosophila melanogaster has been a very useful model organism for the identification of genes involved in this signaling pathway, and to study its functions. The first requirement of the JNK pathway in Drosophila occurs during embryonic dorsal closure, where two lateral sheets of epidermis stretch until they fuse at the dorsal midline of the embryo. JNK is activated only at the most dorsal row of epidermal cells, where it induces cell shape changes and propagates the morphogenetic signal to adjacent cells. In spite of previous detailed characterizations of some JNK signaling components and effectors, how pathway activation is brought about and regulated is not well understood. In this work, we characterize the acal gene, a novel regulator of JNK signaling during dorsal closure. Mutations in acal give rise to dorsal closure defects. Our results show that these defects are due to ectopic JNK signaling in lateral epidermal cells, producing aberrant epidermis stretching. acal is a nuclear, long non-coding RNA that is processed into fragments 40 to 120 nucleotides long, expressed in the lateral epidermis. This expression is regulated at least indirectly by Raw, a pioneer protein. Our results point that acal and raw regulate the expression of two JNK signaling components: Connector of kinase to AP1 (Cka) and anterior open (aop). Cka is a scaffold protein between JNK and Jun, its substrate. Aop is a transcription factor that favours lateral epidermis differentiation previous to dorsal closure. acal genetically interacts with Polycomb (Pc), a component of chromatin remodelling complexes that represses gene expression. This suggests that acal could be a member of chromatin remodelling complexes, as other long non-coding RNAs do. Finally, we show that acal is also expressed in the developing nervous system, and that acal mutants show neurogenic phenotypes during embryogenesis and larval development. acal function in this tissue is independent from its role in JNK signaling, possibly regulating the expression of adjacent genes that have well-known neurogenic functions. 11 V. INTRODUCCIÓN. La comunicación celular es indispensable para el adecuado funcionamiento de un organismo. Las células están expuestas a una gran variedad de señales tanto endógenas como exógenas, por lo que la percepción de estímulos y la comunicación intercelular deben ser constantes para mantener la homeostasis. Para detectar el estado de su entorno, las células emplean receptores y vías de señalización que regulan el comportamiento celular en respuesta a estos estímulos. Uno de los ejemplos más dramáticos de la importancia de esta comunicación es el desarrollo embrionario. En este proceso, a partir de una célula indiferenciada se debe coordinar la proliferación y la diferenciación, y éstas a su vez, regular la morfogénesis de un organismo. Durante el desarrollo embrionario, las células interpretan su medio exterior para a partir de él, modificar su expresión génica y detonar distintas respuestas; desde cambios de forma y de posición, muerte o proliferación, hasta inducir respuestas en otras células. Por estas razones, entender cómo se genera un organismo a partir de un huevo es un campo de estudio de gran interés en sí, pero además, es un excelente “experimento natural” para entender cómo las células responden y coordinan a diferentes estímulos de su ambiente. Uno de los modelos que ha permitido hacer este tipo de estudios es la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster. Este organismo muestra varias ventajas como modelo experimental, empezando con un ciclo de vida corto, una alta fecundidad, y fácil mantenimiento en el laboratorio. Al inicio del siglo XX, Thomas Hunt Morgan utilizó a Drosophila en estudios de genética y esto le permitió sentar las bases de la genética moderna: entre otros aportes, la teoría cromosómica de la herencia (Weiner, 1999). De esta manera, desde hace más de cien años, se han aislado y caracterizado centenas de fenotipos mutantes (Lindsley y Zimm, 1992). Subsecuentemente, en la década de los ochentas del siglo pasado, Christianne Nüsslein-Volhard y Eric Wieschaus aislaron un gran número de líneas mutantes con fenotipos embrionarios, creando así el campo de la genética del desarrollo (Jürgens et al., 1984). En consecuencia, y con el avance de la biología molecular, Drosophila se ha convertido en los últimos treinta años en uno de los modelos más recurridos para estudiar el desarrollo embrionario. 12 Las tecnologías actuales de alto rendimiento (denomiandas en inglés “high throughput”) han permitido un conocimiento más profundo de la biología de Drosophila. No sólo su genoma es de los mejor anotados, sino que también se sabe mucho de sus genes y la expresión espacio-temporal de los mismos, de la función de sus productos, de la participación en diversos procesos, y de las homologías de estos con otras especies (McQuilton et al., 2012). Drosophila melanogaster ha sido un modelo experimental muy útil para estudiar y caracterizar vías de señalización y su participación en el desarrollo. En primer lugar, gracias a las técnicas existentes, se pueden hacer estudios de ganancia y pérdida de función en un contexto fisiológico y del organismo completo (Venken y Bellen, 2005). En segundo lugar, por su alta fecundidad y rápido desarrollo, es posible realizar tamizajes genéticos a gran escala de manera sencilla e identificar y caracterizar genes que participen en un proceso en particular (St Johnston, 2002). En tercer lugar, este organismo posee una alta conservación génica con una baja redundancia, lo que significa que muchos de sus genes están presentes en otros organismos como los vertebrados, pero con un bajo número de copias o parálogos (Adams et al., 2000). Finalmente, las características de su ciclo de vida permiten realizar estudios comparativos entre diferentes etapas del mismo: Durante el desarrollo embrionario se genera un organismo completo a partir de un huevo fecundado, y nuevamente, durante la metamorfosis, ocurre una reformación cuando la mayoría de los tejidos larvarios se histolizan y se genera un nuevo organismo a partir de primordios presentes en la larva (Demerec, 1994). En este trabajo, utilizamos como modelo a Drosophila melanogaster para estudiar cómo la comunicación celular coordina la morfogénesis de un organismo. En particular, nos centramos en el estudio del cerrado dorsal, un proceso de remodelación de la epidermis regulado por la vía de señalización de la cinasa N-terminal de Jun (Jun N- terminal kinase, JNK). En este proceso, intervienen diferentes tejidos y tipos celulares, y de la interacción entre estos resultan cambios drásticos en la forma celular y tisular, en los cuales la vía de JNK juega un papel muy importante. Por estas razones, este proceso es un excelente modelo para entender la relación entre comunicación celular, 13 expresión génica y comportamiento celular en el contexto del desarrollo embrionario. Además, permite ahondar en el conocimiento de una vía de señalización de gran importancia filogenética y ontogenética; la vía de JNK está conservada desde levaduras hasta vertebrados, por lo que Drosophila resulta un modelo muy útil para entender mejor las funciones de esta vía de señalización. Se sabe que los efectos de esta vía pueden ir desde inducir cambios en la forma celular, hasta respuestas a estrés. 14 VI. ANTECEDENTES. 1. Ciclo de vida de Drosophila melanogaster. Drosophila melanogaster es un insecto del orden de los dípteros (insectos con un par de alas). Los dípteros, así como otros insectos, presentan una metamorfosis completa de la forma larvaria a la adulta, fenómeno conocido como holometabolismo (Demerec, 1994). En el caso de Drosophila melanogaster, el ciclo de vida, desde el embrión hasta el adulto, tiene una duración de diez días a 25 ºC [Figura 1, (Campos-Ortega y Hartenstein, 1997)]. El desarrollo embrionario se completa en sólo 24 horas. Esta gran velocidad se debe en parte a que desde la ovogénesis se definen los ejes anterior- posterior y dorsal-ventral del embrión. La hembra posee una espermateca donde puede almacenar un gran número de espermatozoides, haciendo muy eficiente la ovoposición de huevos fecundados (Greenspan, 2004). Al desarrollo embrionario le siguen tres estadios larvarios; los primeros dos con 24 horas de duración, y el tercero con 48 horas. Durante el desarrollo larvario, el organismo aumenta constantemente de tamaño, pasando de un embrión de 0.45 por 0.15 milímetros, a 200 veces esas dimensiones (Grewal, 2012). Los dos primeros estadios larvarios están separados por la ecdisis o muda del exoesqueleto, lo cual le permite al individuo aumentar de volumen. A diferencia de la epidermis, que debe reemplazarse en puntos discretos mediante la ecdisis, otras estructuras se encuentran en constante crecimiento y remodelación, como son el intestino y los discos imagales (Demerec, 1994). Posteriormente, el tercer estadio finaliza con la formación de una pupa. En la etapa de pupa se da la metamorfosis a la forma adulta. Durante la metamorfosis, la mayor parte de los tejidos larvarios sufren muerte celular programada y son sustituidos por nuevos tejidos. Los discos imagales, mencionados anteriormente, juegan un papel muy importante en este momento del desarrollo. Presentes desde la larva, los discos imagales son sacos de epitelio que durante la metamorfosis completan su 15 diferenciación y crecimiento para formar varios órganos del adulto, como genitales, ojos, antenas, patas, alas y extremidades. Además, por la fusión de algunos de estos discos se forman gran parte de la cabeza, tórax y abdomen del adulto (Demerec, 1994). Al concluir la metamorfosis, eclosiona un adulto que es fértil en menos de 10 horas (Greenspan, 2004). Figura 1. Ciclo de vida de Drosophila melanogaster. Se resaltan algunos procesos del desarrollo embrionario de Drosophila. En azul, se muestra la duración del proceso o etapa correspondiente. 2. Desarrollo embrionario de Drosophila melanogaster. Los dípteros como Drosophila melanogaster son organismos de banda germinal larga. Esto significa que durante el desarrollo embrionario las capas germinales del ectodermo y mesodermo en conjunto (banda germinal), se extienden a todo lo largo del huevo, y también, que todos los segmentos del organismo se determinan simultáneamente. En contraste con insectos de banda germinal corta, cuyos segmentos deben especificarse secuencialmente, el desarrollo embrionario de los 16 insectos de banda germinal larga es muy rápido (Gilbert, 2006). Como se menciona arriba, en el caso de Drosophila melanogaster, el desarrollo embrionario se completa en sólo 24 horas, a una temperatura de 25 ºC. Para su estudio, el desarrollo embrionario de Drosophila se ha dividido en 17 estadios, de acuerdo a Campos-Ortega y Hartenstein (1997), como se detalla a continuación. Durante los estadios 1 a 4 (0 a 2:10 horas post-fecundación, hpf) se forma un blastodermo sincicial, para lo cual el núcleo cigótico se divide 13 veces (Figura 1). Las primeras diez divisiones ocurren de manera dispersa a lo largo del huevo, mientras que las últimas tres se dan junto con la migración de los mismos hacia la periferia del huevo. En esta etapa se forman dominios mitóticos, que prefiguran futuros tejidos y capas embrionarias (Foe y Alberts, 1983). Posteriormente, durante el estadio 5 (2:10 a 2:50 hpf) se forma el blastodermo celular, como consecuencia de la celularización de la mayoría de los núcleos cigóticos (Figura 1). En este momento, la aportación de RNAs mensajeros (mRNAs) maternos comienza a degradarse, y el genoma cigótico comienza a expresarse (Tadros y Lipshitz, 2009). Una vez celularizado el embrión, se lleva a cabo la gastrulación. Este proceso comprende las etapas 6 y 7 (2:50 a 3:10 hpf) y consiste en la invaginación de las células ventrales para formar el mesodermo, y la invaginación de células de los extremos posterior y antero-ventral para formar el endodermo (Figura 1). En consecuencia, el ectodermo permanece en la superficie exterior del embrión junto con la amnioserosa, un epitelio extraembrionario que se diferencia en la superficie dorsal del embrión, y que sufre muerte celular programada antes de completarse la embriogénesis (Campos-Ortega y Hartenstein, 1997). Luego de la gastrulación inicia la elongación de la banda germinal, de la etapa 8 a la 11 (3:10 a 7:20 hpf). En este proceso, el conjunto del ectodermo y el mesodermo –la banda germinal– se distribuyen hacia la parte posterior del embrión por proliferación, y por un proceso de rearreglo de células conocido como convergencia y extensión. Al alcanzar el extremo terminal, la elongación de la banda germinal continúa hacia la región dorso-medial. Durante este proceso comienza la diferenciación del sistema nervioso por la delaminación de los neuroblastos del ectodermo ventral o neuroectodermo (etapa 9). Paralelamente inicia la morfogénesis de los intestinos 17 anterior y posterior (etapa 10). Una vez que la banda germinal alcanza su longitud máxima (etapa 11), la segmentación metamérica del embrión comienza a ser morfológicamente visible por la condensación en segmentos de células mesodérmicas y por la presencia de pliegues en la epidermis. Justo después de la extensión de la banda germinal, ésta se retrae durante las etapas 12 y 13 (7:20 a 10:20 hpf, Figura 2). Al mismo tiempo, el intestino anterior inicia su fusión con el posterior, y el sistema nervioso central se separa completamente de la epidermis. Al momento de concluir la retracción de la banda germinal (etapa 13), la epidermis se posiciona en las regiones laterales y ventrales del embrión, mientras que la amnioserosa está presente en la región dorsal. En este momento inicia el cerrado dorsal, que consiste en el estiramiento de la epidermis hacia la región dorsal, sobre la amnioserosa, hasta su fusión en la línea media dorsal (Figura 2). Simultáneamente, los segmentos que darán lugar a la cabeza se internalizan y permanecen así durante el desarrollo larvario. Figura 2. El cerrado dorsal en Drosophila melanogaster. Luego de la retracción de la banda germinal en el estadio 12, la epidermis se localiza en la región ventral y lateral del embrión, quedando en la región dorsal la amnioserosa. Durante el cerrado dorsal, la epidermis se estira hacia la línea media dorsal hasta fusionarse completamente. 18 El cerrado dorsal continúa durante los estadios 14 y 15. Hacia el final del estadio 14 (10:20 a 11:20 hpf), la epidermis recubre el 80% del perímetro dorsoventral del embrión. En el estadio 15 (11:20 a 13:00 hpf), las dos láminas laterales de la epidermis se fusionan en la línea media dorsal, internalizando a la amnioserosa. La yema, sobre la cual se encontraba la amnioserosa, termina encapsulada completamente por la fusión del intestino anterior con el posterior. Como consecuencia de estos dos fenómenos, las restantes células de la amnioserosa mueren. Simultáneamente, los segmentos que darán lugar a la cabeza se internalizan y permanecen así durante el desarrollo larvario. Una vez culminado el cerrado dorsal, en la etapa 16 (13:00 a 16:00) termina la invaginación de la cabeza. En esta etapa, la diferenciación y maduración de todos los tejidos del embrión es evidente: se definen los músculos y el corazón, el sistema digestivo completa su morfogénesis, y termina la condensación del sistema nervioso central. De manera importante, la epidermis se diferencia completamente y secreta el exoesqueleto o cutícula de la futura larva. Dado que la cutícula refleja el metamerismo y la diferenciación de la epidermis del organismo, el estudio de la morfología y de las alteraciones de la cutícula en embriones mutantes facilita de manera importante el estudio de defectos en el desarrollo (Nüsslein-Volhard y Wieschaus, 1980). Finalmente, durante el estadio 17 (16:00 hpf a la eclosión, 22-24:00 hpf) continúan procesos de organogénesis y de maduración de estructuras; el sistema nervioso se desarrolla completamente, termina la formación de las vías respiratorias y algunas especializaciones de la cutícula se refinan. Igualmente, inicia la contracción muscular, y el desarrollo culmina con la eclosión de la larva de primer estadio (Weigmann et al., 2003). 3. Vías de señalización de tipo MAPK. Dentro de las moléculas que conectan señales extracelulares con una respuesta intracelular se encuentran las proteínas cinasas activadas por mitógenos (Mitogen- 19 Activated Protein Kinases, MAPKs). Este tipo de cinasas comprenden una superfamilia presente en todos los eucariontes donde se han estudiado y regulan una amplia gama de procesos además del desarrollo embrionario. Las MAPKs se describieron inicialmente en Saccharomyces cerevisiae (Courchesne et al., 1989). Esta levadura posee cinco vías de señalización de tipo MAPK: la vía de apareamiento (Courchesne et al., 1989), de esporulación (Elion et al., 1990), de formación de filamentos (Torres et al., 1991), de remodelación de la pared celular (Krisak et al., 1994) y de respuesta a estrés osmótico (Brewster et al., 1993). La característica distintiva de las MAPKs, que las distingue de la mayor parte de las cinasas, es que forman parte de cascadas de fosforilación secuencial, también conservadas estructural y funcionalmente. Las MAPKs son fosforiladas en la llamada asa de activación. Las MAPKs son las únicas proteínas conocidas que requieren una fosforilación tanto en un residuo de serina/treonina como en un residuo de tirosina para su activación, el motivo S/TXY. Esta doble fosforilación, tanto en residuos de tirosina como en residuos de serina o treonina, únicamente pueden llevarla a cabo cinasas de especificidad dual, llamadas MAP2Ks. A su vez, las MAP2Ks deben ser activadas por fosforilación en residuos de serina o treonina, reacción catalizada por las MAP3Ks. En algunos casos, hay MAP4K por encima de las MAP3K. Una vez activadas, las MAPKs tienen como sustratos principales a factores de transcripción, aunque se han descrito como blancos a modificadores del citoesqueleto e incluso a otras proteínas cinasas. Como reguladores directos, existen fosfatasas de actividad dual que desfosforilan el motivo S/TXY de las MAPKs (Qi y Elion, 2005). La organización del módulo MAP3K-MAP2K-MAPK le confiere una regulación de alta especificidad y rapidez, al tiempo que puede ser inducido bajo diversos contextos. El éxito evolutivo de este tipo de vías de señalización es tal, que no sólo están presentes en todos los eucariontes, sino que también controlan una gran variedad de procesos. Para su estudio, en metazoarios se han dividido en tres principales grupos. La familia de ERK (Extracellular-regulated kinase) regula proliferación y diferenciación (Boulton et al., 1990); la familia de p38 controla la respuesta al estrés (Lee et al., 1994), y la familia de JNK (Jun N-terminal kinase) regula tanto condiciones de estrés, como cambios en la forma celular (Galcheva-Gargova et al., 1994). Organismos como Drosophila poseen al 20 menos un miembro de cada clase de cinasas, mientras que en los vertebrados existen varias cinasas de cada familia (Manning et al., 2002). 4. La vía de señalización de JNK. Estudios sobre respuesta a estrés en Saccharomyces cerevisiae identificaron a una proteína cinasa de la familia de las MAPKs, activada por alta osmolaridad e indispensable para la resistencia a dicho estrés (Brewster et al., 1993). Posteriormente, se identificó al homólogo de esta proteína en líneas celulares de humano y ratón, y se le denominó JNK, ya que era capaz de fosforilar al factor de transcripción Jun en el extremo amino terminal (Galcheva-Gargova et al., 1994). Se observó que JNK no sólo se activaba en respuesta a estrés osmótico, sino en respuesta a otros tipos de estrés y que además puede rescatar la falta de función de su homólogo en levadura. Análisis posteriores demostraron que en vertebrados existen tres genes con esta actividad y con alta homología: JNK 1, 2 y 3 (Kuan et al., 1999). JNK1 y JNK2 se expresan de manera ubicua, mientras que JNK3 se expresa mayoritariamente en el sistema nervioso (Yang et al., 1997). JNK1 y JNK2 son parcialmente redundantes en función. Ratones con pérdida de función para ambos genes mueren durante el desarrollo, con defectos en el cerrado del tubo neural y en el cerrado de los párpados (Xia y Karin, 2004). Como cabría esperarse, pérdida de función del factor de transcripción c-Jun, sustrato de las JNKs, también resulta en defectos en el cerrado del tubo neural y de los párpados (Xia y Karin, 2004). Además de los fenotipos embrionarios, se han reportado numerosos escenarios que llevan a la activación de la vía de JNK, aunque en muchos casos, se requiere de evidencia fisiológica para poder corroborar dichas funciones. Se ha propuesto que JNK puede mediar la inducción de apoptosis de citocinas proinflamatorias como el factor de necrosis tumoral alfa (Tumor necrosis factor alpha, TNFα), y que es capaz de desensibiliar a la vía de la insulina mediante la fosforilación en residuos de serina y 21 treonina de los sustratos del receptor a insulina (Insulin receptor substrates, IRSs), entre otras funciones (Raman et al., 2007). El alto número de parálogos para cada componente de la vía de JNK ha dificultado su estudio en vertebrados. Se sabe que las cinasas que son capaces de fosforilar y activar a JNK son MKK4 (Map kinase kinase 4) y MKK7 (Map kinase kinase 7), aunque se ha observado que estas cinasas también pueden fosforilar a miembros del grupo de p38. Actuando como MAP3Ks, se han descrito las MEKK1-4 (Mek kinase 1-4), bona fide activadoras de la vía de ERK; la cinasa regulada por apoptosis 1 (Apoptosis-signal regulated kinase, ASK1); la cinasa activada por TGFβ 1 (TGFβ-activated kinase 1, TAK1), y las cinasas de linaje mixto 1 a 4 (Mixed lineage kinase 1-4, MLK1-4). Además, como MAP4K (cinasa cuatro de la vía de JNK, JNK4K), se encuentran homólogos de Ste-20 de levadura (Cuevas et al., 2007). La variedad de puntos de entrada para la activación de JNK explicaría por qué esta vía de señalización puede inducir respuestas tan diferentes, como inducción de apoptosis y cambio de la forma celular. Sin embargo, es importante refrendar fisiológicamente la contribución de cada uno de estos elementos propuestos en la activación de JNK. 5. El cerrado dorsal como modelo de estudio de la vía de JNK. Drosophila melanogaster ha sido un modelo muy útil para estudiar la vía de JNK. Esto se debe a que en contraste con vertebrados, Drosophila posee sólo un homólogo para la mayoría de los componentes de la vía. Además, el análisis de los fenotipos mutantes para estos genes es muy fácil de estudiar. Diferentes tamizajes genéticos diseñados para obtener mutaciones letales embrionarias, en los ochentas y noventas, identificaron un grupo de mutantes que presentaban un fenotipo letal embrionario consistente en agujeros en la región dorsal del embrión (Jürgens et al., 1984). A este fenotipo se le conoce como “fenotipo de apertura dorsal”, y se relaciona con fallas en el cerrado dorsal embrionario (Figura 3). La subsecuente clonación y caracterización de los genes alterados, demostró que muchos de ellos correspondían a los hómologos de la vía de 22 JNK en Drosophila (Hou et al., 1997). Esto significa que los genes la vía de JNK, además de estar conservados estructuralmente en Drosophila, también conservan la función de remodelación de epitelios. Figura 3. Mutantes para componentes de la vía de JNK muestran defectos en el cerrado dorsal. Se muestran imágenes de microscopía de campo oscuro, de cutículas sin defectos y mutantes para bsk (JNK) y para Jra (Jun). Los embriones están orientados con la porción anterior a la izquierda, y la porción dorsal hacia arriba. Las cabezas de flecha muestran la extensión de la apertura dorsal en los embriones mutantes. La vía de JNK también es necesaria durante la metamorfosis en los tejidos precursores del tórax. El tórax se forma por la fusión de los discos imagales de ala en la región dorsal del animal, y la activación de la vía de JNK permite que las láminas laterales se estiren y se adhieran entre sí. Animales mutantes hipomorfos para algunos componentes de la vía son capaces de sobrevivir la embriogénesis, pero presentan defectos en el cerrado torácico (Martin-Blanco et al., 2000). El cerrado dorsal es el modelo de activación de la vía de JNK mejor caracterizado en Drosophila. Este proceso sucede durante los estadios embrionarios 13 al 15 (9:20 - 13:00 hpf), y en él, como se ha mencionado, la epidermis se estira hacia la línea media dorsal del embrión para recubrirlo completamente (Campos-Ortega y Hartenstein, 1997). El proceso del cerrado se ha dividido en tres fases: iniciación, propagación y sutura (Harden, 2002). En la fase de iniciación, se da la activación de la vía de JNK. Esto sucede únicamente en la hilera más dorsal de células de la epidermis, o células de la hilera líder, que serán el centro de señalización que coordina el cerrado (Riesgo-Escovar et al., 1996). El estímulo que lleva a la activación de la vía se desconoce; sin embargo, se han 23 caracterizado buena parte de los componentes intracelulares de la vía, como se esquematizan en la Figura 4. Dentro de los elementos río arriba de JNK se encuentran las cinasas citosólicas de tirosina de la familia de Src: Src42A, Src64B y Btk29A (Tateno et al., 2000). Estas cinasas fosforilan a la proteína adaptadora, Dok, que recluta y activa a otra cinasa citosólica de tirosina, Shark (Fernandez et al., 2000). La activación de Shark lleva, a su vez, a la activación de las proteínas G monoméricas: Rac1, Rac2 y Mtl (Hakeda-Suzuki et al., 2002; Riesgo-Escovar et al., 1996). Las Racs activadas forman un complejo con Misshapen (Msn), una JN4K de la familia de Ste-20 y con Slipper (Slpr), único miembro de la familia de MLK (o mixed lineage kinase, por sus siglas en inglés) en Drosophila y que actúa como JN3K (Garlena et al., 2010). Msn fosforila y activa a Slpr, que a su vez fosforila y activa a Hemipterous (Hep), la única JN2K, homóloga a MKK7 de vertebrados (Glise et al., 1995). Hep activa directamente a JNK, fosforilándola. A su vez, JNK fosforila al factor de transcripción Jra [único homólogo de c-Jun de vertebrados (Bogoyevitch y Kobe, 2006)]. Figura 4. La vía de JNK en Drosophila melanogaster. Se muestran los componentes que participan en la vía de JNK durante el cerrado dorsal. Los círculos rojos representan reguladores negativos. 24 Una vez fosforilado, Jra dimeriza con Kay (único homologo de c-Fos de vertebrados) para formar el complejo AP-1 e inducir la expresión de genes blanco (Riesgo-Escovar y Hafen, 1997a). Para que se lleve a cabo la reacción de fosforilación de Hep, y a su vez de JNK, es necesaria la presencia de Cka (Connector of Kinase to AP-1), una proteína de andamiaje que favorece la interacción de Hep, JNK, Jra y Kay (Chen et al., 2002). Se ha propuesto que Cka recluta a Hep y a JNK en el citoplasma, y después se trasloca al núcleo con JNK para reclutar a Jra y Kay y facilitar así su activación. Entre los blancos transcripcionales de la vía se encuentra el gen de la profilina, que favorece la polimerización del citoesqueleto de actina (Jasper et al., 2001). Como resultado de esta fase, las células de la hilera líder se estiran hacia la región dorsal del embrión (Riesgo-Escovar y Hafen, 1997b). La segunda fase del cerrado dorsal, la fase de propagación, sucede en respuesta a la activación de la vía de JNK en las células de la hilera líder. En esta fase, células de la epidermis más lateral también cambian de forma, estirándose hacia la porción dorsal del embrión. Esto sucede porque otro gen inducido transcripcionalmente por la vía de JNK es decapentaplegic (dpp), homólogo de las proteínas morfogenéticas de hueso 2 y 4 (Bone morphogenetic protein 2/4, Bmp2/4) de vertebrados. Dpp es captado por las células laterales de la epidermis, ventrales a la hilera líder, e induce en ellas la expresión de genes como la miosina no muscular, para favorecer el cambio de forma (Riesgo-Escovar y Hafen, 1997b). El resultado neto de estos rearreglos celulares es el estiramiento de la epidermis lateral hacia la porción dorsal. Finalmente, en la fase de sutura, las dos láminas laterales de la epidermis se encuentran en la línea media dorsal y se sellan formando un continuo perfecto. En esta fase también participa la vía de JNK, al inducir la expresión de las integrinas αPS3 y la única integrina de tipo β, βPS, en las células de la hilera líder. Esto favorece la formación de uniones entre las láminas de la epidermis (Homsy et al., 2006). Cabe señalar que así como mutaciones en componentes de la vía resultan en defectos en el cerrado dorsal, mutaciones en reguladores negativos, en los que la vía se activa de manera ectópica, también se traducen en defectos en el cerrado. Gracias a esto, 25 igualmente se han identificado varios elementos que inhiben la activación de la vía de JNK durante el cerrado dorsal. El primer inhibidor de la vía en identificarse fue una fosfatasa de especificidad dual llamada Puckered (Puc) que defosforila el asa de activación de JNK. Puc es inducida transcripcionalmente por la misma vía de señalización, por lo que se ha propuesto que su función es regular de manera fina la activación de la vía (Martín-Blanco et al., 1998). Otro regulador de la vía es Anterior open (Aop). Aop juega un papel dual, ya que primero evita que las células de la epidermis lateral se dividan, manteniéndolas en un estado post-mitótico durante el cerrado dorsal. Además, en las células de la hilera líder Aop mantiene reprimidos los blancos transcripcionales de la vía. Esta última función es inhibida por JNK directamente (Riesgo-Escovar y Hafen, 1997b). La vía de JNK se mantiene inactiva en las células de la amnioserosa por la expresión del factor de transcripción Pebbled (Peb, también conocido como Hnt). Se ha demostrado que Peb impide la acumulación de Jra en el núcleo de las células de la amnioserosa. En los mutantes de Peb, la vía de JNK se activa en la amnioserosa y el cerrado dorsal no se puede llevar a cabo, aunque se desconoce cómo es que Peb regula la activación de la vía en ese tejido. Finalmente, la activación de la vía de JNK también debe inhibirse en la epidermis lateral, y en este proceso participa un gen conservado, pero de función desconocida, llamado Raw. Raw se expresa en la epidermis lateral y se localiza en el citoplasma. Por interacciones genéticas, se ha propuesto que Raw actúa a nivel de Jra y de JNK, de manera independiente a Puc y a Aop; sin embargo, tampoco se conoce cómo es que lleva a cabo su función (Byars et al., 1999). 26 VII. ANTECEDENTES DIRECTOS. Con la finalidad de encontrar genes no caracterizados que participen en la vía de señalización de JNK, en nuestro grupo de trabajo se han aislado mutantes que presentan defectos en el cerrado dorsal (Peña-Rangel et al., 2002). Una manera de generar mutaciones al azar es mediante el uso de elementos P. Los elementos P son transposones de Drosophila introducidos como herramienta experimental en la década de los ochentas (Sullivan et al., 2000). La sola inserción de un elemento P en una posición del genoma puede generar mutaciones. Sin embargo, en algunos casos, los elementos P se insertan en regiones putativamente intergénicas y no afectan la viabilidad del organismo. Estas inserciones aún pueden ser útiles para generar mutaciones, ya que al escindirse, los elementos P generan una ruptura de doble cadena en el sitio original de inserción. El sistema de reparación de la célula detecta esta ruptura y la restaura; sin embargo, en un porcentaje de los casos, el sistema altera la secuencia y genera así nuevas mutaciones (Sullivan et al., 2000). En nuestro laboratorio, al inducir la escisión imprecisa del elemento P KG09113, se obtuvieron dos mutantes incapaces de completar el cerrado dorsal, fácilmente identificables en preparaciones de cutículas embrionarias. Para facilitar la caracterización del locus, adicionalmente generamos tres alelos por mutagénesis química. Estas mutaciones son letales entre sí; por consiguiente alteran el mismo gen. Debido a que las mutaciones en este locus resultan en un fenotipo de apertura dorsal, se le ha denominado acal, palabra que en náhuatl significa “balsa”, por la similitud de las cutículas mutantes a estas embarcaciones. 27 VIII. HIPÓTESIS. El locus acal codifica para un gen que participa en la vía de JNK de Drosophila melanogaster. IX. OBJETIVO GENERAL. Caracterizar genética y molecularmente el locus acal y definir cómo es su participación en la vía de señalización de JNK de Drosophila melanogaster. X. OBJETIVOS PARTICULARES. 1. Mapear molecularmente el locus de acal e identificar la naturaleza de la lesión en los alelos mutantes. 2. Identificar la(s) función(es) molecular(es) del gen. 3. Describir el patrón de expresión de acal durante la embriogénesis. 4. Definir la relación de acal con genes con los que interactúa, por medio de pruebas genéticas o moleculares (en particular, con genes que participan en la vía de JNK). 5. Explorar la participación de acal en otros procesos del desarrollo. 28 XI. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL 1. Cepas de Drosophila melanogaster Las líneas mutantes aop1, bsk1, raw1 y raw2 fueron obtenidas de la colección de cepas de Drosophila de Tübingen (Tübingen Drosophila Stock Collection). pucE69 fue donada por Alfonso Martínez-Arias (Universidad de Cambridge, Reino Unido), peb308 por Howard Lipshitz (Universidad de Toronto, Canada), Cka1, peb1, lola00642, psqKG09291, Df(2R)BSC595, Df(2R)ED2098, Df(2R)ED2076, Pc3, y P[SUPorP]KG0911, son del Centro de cepas de Drosophila de Bloomington (Bloomington Drosophila Stock Center, BDSC, #11451, #80, #10946, #14784, #25428, #9277, #8909, #1730, y #14782 respectivamente); Δ18, lolarev6, y psqrev12 fueron obsequiadas por María Domínguez (Universidad Miguel Hernández, España), pnrMD237 por Ginés Morata (Universidad Autónoma de Madrid, España), 69B por Andrea Brand (Universidad de Cambridge, Reino Unido), TRE-DsRed por Dirk Bohmann (Centro Médico de la Universidad de Rochester, EUA), sGMCA por Dan Kiehart (Universidad de Duke, EUA), UAS-aopACT por Ilaria Rebay (Universidad de Chicago, EUA), UAS-rawRA y UAS-rawRB por Mark Van Doren (Universidad Johns Hopkins, EUA), y hs-Cka por Steven Hou (NIH, EUA). Cka-IR proviene del proyecto de líneas transgénicas de RNAi (Transgenic RNAi Project, TRiP, #JF01432). Las cepas mutantes se mantuvieron en heterocigosis sobre cromosomas balanceadores, los cuales poseen marcadores dominantes visibles que permiten identificar a la progenie con el genotipo de interés. Dichas líneas son CyO,twi>GFP, CyO-TM3,hs>GFP, y SMB6B,eve>lacZ (BDSC #6662, #5703, y #335, respectivamente). Estos cromosomas poseen construcciones que expresan la proteína verde fluorescente (GFP) o el gen de la β-galactosidasa, lacZ, para así identificar visualmente a los individuos heterocigotos y homocigotos de estos cromosomas (y separar a los homocigotos mutantes, que son los que carecen de estos marcadores). Todas las cruzas, así como la colección de embriones, se realizaron a 25 ºC y 50 % de humedad relativa. Para la inducción de choque térmico, las cruzas se realizaron a 29 ºC. 29 2. Mapeo genético y molecular El mapeo genético se realizó por pruebas de complementación, cruzando moscas mutantes de acal, con moscas mutantes para genes aledaños (lola y psq) y moscas con deleciones del locus de interés. Se cruzaron hembras vírgenes con machos, y se cuantificó la progenie que eclosionó como adultos. Se cuantificaron al menos 100 individuos para determinar si dos mutaciones dadas complementan o no. En los casos donde eclosionaron moscas trans-heterocigotas, se tomaron hembras vírgenes y machos, y se cruzaron con moscas silvestres, para determinar la fertilidad de dichas moscas. Para el mapeo molecular, se obtuvo DNA genómico a partir de embriones homocigotos mutantes, los cuales fueron homogenizados en una solución de TRIS-HCl, pH 8.2, 10 mM, EDTA 1 mM, NaCl 25 mM y Tritón X-100 0.2%. A partir de esta preparación, se amplificaron por PCR convencional 4.7 kb del locus de acal. Los oligonucleótidos usados se describen en la Tabla 1. Los fragmentos de PCR obtenidos se purificaron y clonaron en el plásmido pGEM-T Easy (Promega, EUA). El inserto se secuenció usando los oligonucleótidos estándar M13 forward y M13 reverse. Las mutaciones identificadas se corroboraron secuenciando muestras independientes. 3. Construcciones de rescate. El fragmento de rescate genómico se obtuvo del projecto P[acman] (#CH322-178D09), el cual ha generado cromosomas artificiales bacterianos conteniendo fragmentos del genoma de Drosophila. Esta construcción se amplificó y purificó para generar moscas transgénicas. La construcción se inyectó en embriones de la línea PBac[y+-attP- 9A]VK00013, para permitir la recombinación sitio específica en la posición 76A2 del genoma de Drosophila. Para la generación de la línea UAS-acal, el cDNA SD08925 obtenido del Centro de recursos genómicos de Drosophila (Drosophila Genomics Resource Center, EUA) se subclonó en el plásmido pUAST. La construcción se secuenció para corroborar la 30 integridad del cDNA, y se inyectó en embriones con una fuente de transposasa, para permitir la integración de la construcción en el genoma de las moscas. Inserciones independientes se mapearon a nivel de cromosoma por cruzas convencionales. 4. Preparaciones de cutículas embrionarias. Se colectaron embriones de las cruzas de interés en placas de agar por 24 horas, y la progenie del balanceador se descartó (identificada por la presencia de GFP). Las placas se mantuvieron a 25ºC por al menos tres días para permitir la eclosión de larvas y cuantificar la letalidad embrionaria. Los embriones muertos se decorionaron en hipoclorito de sodio al 50%, y posteriormente se lavaron en PBS. Posteriormente, los embriones se montaron en medio PVA comercial, y se mantuvieron a 45ºC por al menos 24 horas para digerir los tejidos blandos y permitir la visualización de la cutícula. Posteriormente, las cutículas se analizaron y contabilizaron en un microscopio de campo oscuro. Para mostrar imágenes representativas de las cutículas con defectos, los embriones se colectaron de la misma manera, y adicionalmente se se les removió el vitelo agitándolos vigorosamente en PBS/Metanol 1:1. Después, se montaron en PVA como se describe antes, y se fotografiaron en un microscopio de campo oscuro. 5. Hibridación in situ. Para detectar la expresión de acal, un fragmento correspondiente a 955 pares de bases (pb) del transcrito de acal se amplificó por PCR a partir de DNA genómico de embriones silvestres (los oligonucleótidos empleados se muestran en la Tabla 1). El producto se clonó en el vector pGEM-T Easy para usarlo como templado para la síntesis de una ribosonda, marcada con digoxigenina. Para detectar la expresión de dpp, la clona de cDNA RE20611 (Drosphila Genomics Resource Center, EUA), se digirió con DraI para generar extremos romos, y al fragmento obtenido se le adicionaron adeninas en los extremos 3’ utilizando Taq polimerasa, siguiendo las 31 recomendaciones del fabricante. Posteriormente, el fragmento se clonó en pGEM-T Easy para generar la sonda, como se describe arriba. Tanto para acal como para dpp, además de la sonda anti-sentido, se generaron sondas sentido que fueron empleadas como control negativo. La hibridación in situ se realizó colectando embriones en placas de agar, a los cuales se se les removiño el corion usando hipoclorito de sodio al 50%, y se fijaron en una solución de heptano 50%, formaldehído 7.4% en PBS por 25 minutos. Posteriormente, los embriones se devitelinizaron en heptano/metanol 1:1, y se aclararon en una solución de xileno-etanol. A continuación, los embriones se trataron con proteinasa K para favorecer la internalización de la sonda y se hibridaron toda la noche con la sonda correspondiente a 55ºC. Al día siguiente, los embriones se lavaron en PBS-Tween 0.3% a 60ºC, y se incubaron con un anticuerpo contra digoxigenina, acoplado a fosfatasa alcalina, en una dilución 1:2000. Luego de lavar con PBS-Tween 0.3%, se agregó el sustrato colorimétrico NBT/BCIP. La reacción se detuvo con PBS, y los embriones se montaron en Polymount. Finalmente, las laminillas se analizaron en un microscopio de campo claro. 6. Tinción con X-gal. Se colectaron embriones que expresan el gen de la β-galactosidasa, lacZ, en placas de agar, y se les removió el corion en hipoclorito de sodio al 50%. Posteriormente, los embriones se fijaron con glutaraldehído al 1%, y se preincubaron en una solución conteniendo NaPO4 pH 7.2 10 mM, NaCl 150 mM, MgCl2 1 mM, Tritón X-100 0.3%, K4[FeII(CN)6] 3.1 mM y K3[FeIII(CN)6] 3.1 mM. La reacción se reveló a 37ºC en esta misma solución añadiendo X-gal a una concentración final de 0.2%. La reacción se detuvo con PBS, y los embriones se montaron con Polymount y se fotografiaron en un microscopio de campo claro. 32 7. Northern blots. Se aisló RNA de embriones, larvas, pupas y adultos de la línea silvestre yw. Los animales se colectaron en tubos de 1.5 mL, se homogenizaron con TRIzol, y se congelaron a -70ºC. Posteriormente, se utilizó el kit Direct-Zol RNA mini-prep kit para purificar el RNA. Se separaron 20 µg de RNA por muestra en geles de agarosa al 0.8%, MOPS 1x, y se transfirieron a membranas de nylon por capilaridad empleando TBE como acarreador. El RNA se fijó a la membrana usando un entrecruzador de luz UV a 70,000 µJ/cm2. Inmediatamente, las membranas se lavaron y pre-hibridaron en solución de hibridación (formamida 50%, SSC 5x, 0.1% SDS, Solución de Denhardt 0.05x y 100 µg/mL de DNA de esperma de salmón). Las membranas se hibridaron toda la noche a 42ºC con sondas radioactivas, y al día siguiente, se lavaron dos veces con SDS 0.1%, SSC 0.1x. Finalmente, las membranas se expusieron a pantallas de fósforo por al menos 7 días, y se visualizaron usando el sistema Storm 860. Las sondas radioactivas se sintetizaron usando dCTP [⍺-32P], y oligonucleótidos aleatorios, con el kit Prime-it RmT. Como DNA molde, se usaron 50 ng del cDNA SD08925, digerido y liberado del plásmido pOT2, y como control de carga se usó Rp49, a partir de un producto amplificado por PCR (los oligos empleados se muestran en la Tabla 1). 8. Northern blots para RNAs pequeños. Se aisló RNA como se describe arriba, y se separaron 25 µg de RNA por muestra en geles de acrilamida al 15%, urea 8 M, TBE 1x. Posteriormente, el RNA se transfirió a membranas de nylon usando un sistema semi-seco, con 3 mA/cm2 por 40 minutos. El RNA se fijó con dos pulsos de luz UV a 70,000 µJ/cm2. Después, las membranas se pre-hibridaron por 30 minutos en una solución conteniendo formamida al 50%, SSPE 5x, solución Denhardt 5x, SDS 0.5%, de acuerdo al protocolo de Pall y Hamilton (2008). A continuación se añadió la sonda radioactiva, que consistió en 10 pmoles de oligonucleótidos marcados con ATP [γ-32P] usando T4 polinucleótido cinasa. Se dejó 33 hibridar toda la noche a 40ºC y posteriormente, se hicieron dos lavados con SSC 2x, SDS 0.2%, a 40ºC. Las membranas se expusieron como se describe arriba. Como control positivo, se utilizó una sonda contra miR-8. Los experimentos se realizaron 4 veces de manera independiente. Los oligonucleótidos empleados como sondas se describen en la Tabla 1. 9. Enriquecimiento de RNA nuclear. Para enriquecer la fracción nuclear, modificamos el protocolo descrito por Sullivan et al. (2000). Brevemente, se colectó 1 mg de embriones silvestres de la línea yw en placas de agar, los cuales se decorionaron con hipoclorito de cloro al 50%. Los embriones se homogenizaron en una solución de HEPES 15 mM, KCl 10 mM, MgCl2 5 mM, EDTA 0.1 mM, EGTA 0.5 mM, sacarosa 350 mM, DTT 1 mM y metabisulfito de sodio 1 mM. El homogenado se filtró a través de gasa estéril y se centrifugó. El sobrenadante (fracción citoplásmica) y el botón (fracción nuclear) se procesaron de manera independiente para extraer el RNA, para lo cual se utilizó TRIzol y el kit Direct-Zol RNA mini prep. 10. Retrotranscripción, PCR semi-cuantitativa, y PCR en tiempo real. Se purificó el RNA de la muestra de interés usando TRIzol y el kit Direct-Zol RNA mini prep, que incluye un tratamiento con DNase I para remover el DNA genómico. Partimos de 2 µg de RNA para sintetizar cDNA, usando la transcriptasa reversa M-MLV. Como control, realizamos la misma preparación en ausencia de enzima, para asegurar que los reactivos no estuvieran contaminados con DNA genómico. Para la PCR semi- cuantitativa, realizamos PCR estándar, y las muestras se corrieron en geles de agarosa al 1%. La densidad de las bandas se cuantificó usando ImageJ, y los experimentos se realizaron 5 veces a partir de muestras independientes. Para cuantificar la expresión de Cka y aop, utilizamos PCR en tiempo real, generando cDNA de mRNAs poliadenilados, usando un oligonucleótido de deoxi-timidina x 15 (oligo-dT), y como control de carga, utilizamos oligonucleótidos contra el gen de expresión constitutiva, Rp49. Para acal, 34 sintetizamos cDNA con oligonucleótidos específicos para acal, para facilitar su detección. En este último caso, generamos cDNA específico para Rp49 a partir del mismo RNA, para usarse como control de abundancia relativa. En todos los casos, utilizamos el kit Maxima SYBR Green qPCR o FastStart DNA Master SYBR Green I en el equipo LightCycler 1.0. Los oligonucleótidos empleados se enlistan en la Tabla 1. 11. Microscopía de fluorescencia (transgenes fluorescentes). Se colectaron embriones de interés en placas de agar, y se les removiño el corion con hipoclorito de sodio al 50%. Los embriones se montaron en aceite de halógeno 700 (Halocarbon oil 700), y se analizaron en un microscopio confocal Zeiss LSM 780. Los empalmes en el eje Z se procesaron usando el programa ImageJ. La intensidad de fluorescencia se analizó con el mismo programa. 12. Inmunofluorescencia de montaje completo de embriones y cerebros larvarios. Se colectaron embriones en placas de agar, se les removió el corion con hipoclorito de sodio al 50%, y se se les removió el vitelo por agitación en una solución 1:1 de heptano-metanol. Después, los embriones se fijaron con PBS 1x, Tritón X-100 0.1%, formaldehído 20% por 5 minutos. A continuación, los embriones se incubaron con una solución de PBS 1x, Tritón X-100 0.1%, suero fetal de bovino al 5%, para bloquear sitios inespecíficos, y después se incubó en la misma solución con los anticuerpos primarios (22C10 o BP102) a una dilución de 1:100 toda la noche a 4ºC. Al día siguiente se lavó el anticuerpo primario y se incubó con un anticuerpo acoplado a Alexa-568 por 1 hora a temperatura ambiente. Después, los embriones se montaron en VectaShield, y se analizaron en un microscopio confocal Zeiss LSM 510. En el caso de los cerebros larvarios, se colectaron larvas de tercer estadio y se disecaron en PBS, usando fórceps. Los cerebros se fijaron por 20 minutos en paraformaldehído 4%-PBS 1x a 4ºC, y se lavaron con PBS-Tritón X-100 0.3%. Posteriormente, se incubaron en 35 una solución de PBS-Tritón X-100 0.3%, suero fetal de bovino al 5%, y en la misma solución se incubaron con los anticuerpos primarios (anti-Prospero y anti-DE-Cad). 13. Microscopía electronica de barrido. Para tomar imágenes del ojo o del tórax de moscas adultas, los animales de interés se anestesiaron por frío (colocándolos en hielo), y se colocaron en soportes metálicos, usando pintura conductora de carbón para evitar que se concentraran los electrones en la muestra. Las imágenes se tomaron en un microscopio electrónico de barrido JEOL JSM 6060. 14. Cálculo de índice de hendidura torácica. Sacrificamos hembras adultas con etil acetato, y después, éstas se colocaron con la parte dorsal hacia arriba empleando alfileres entomológicos. Se tomaron fotos del tórax en un estereoscopio equipado con cámara a un aumento de 63x. Por medio del programa iVision, medimos la distancia sin microquetas localizada en la región central del tórax, a la altura de las macroquetas dorsocentrales anteriores. Este valor se normalizó con respecto a la distancia entre las macroquetas dorsocentrales anteriores y posteriores. A este cociente, se le denominó “Índice de hendidura torácica”. Para ilustrar el fenotipo torácico, las moscas se visualizaron por microscopía electrónica de barrido, como se describe arriba. 15. Cálculo del índice de curvatura del ala. Hembras del genotipo de interés se inmovilizaron y se fotografiaron en una vista lateral, como se describe arriba. Empleamos el programa iVision para medir el ángulo formado entre tres intersecciones: De la intersección de la vena L1 al borde del ala hacia la 36 intersección de la vena L2 al borde del ala, y de esta última intersección, hacia la intersección de la vena L3 con el borde del ala. 16. Cuantificación de peines sexuales ectópicos. Fijamos machos del genotipo de interés en una solución de etanol-glicerol 1:1, y posteriormente, disecamos las extremidades. Éstas se trataron en una solución de KOH al 10%, por 10 minutos a 100ºC, para remover lípidos y aclarar los tejidos. Después, las extremidades se deshidrataron en etanol, y se montaron en una solución de etanol-ácido láctico. Los peines se analizaron en un microscopio de campo claro. 17. Análisis transcriptómico. Para cada experimento, se colectaron 1000 embriones homocigotos de acal2, y 1000 embriones de la línea silvestre yw, de 2 a 24 horas de desarollo. Los embriones se les eomvio el corion en una solución de hipoclorito de sodio al 50% y posteriormente, se lavaron con PBS y se homogenizaron en TRIzol. El RNA total se extrajo utilizando el kit Direct-Zol RNA mini prep, incluyendo tratamiento con DNasa I para eliminar el DNA genómico. A continuación, se removieron los RNAs ribosomales utilizando el kit RiboMinus (Invitrogen). El RNA obtenido se envió a la Unidad Universitaria de Secuenciación Masiva de DNA (UUSMD) donde se utilizó para preparar una biblioteca de fragmentos cDNAs con adaptómeros para la identificación de las lecturas. La secuenciación masiva se realizó en un equipo Illumina , con 37 ciclos de secuenciación (es decir, las lecturas poseen una longitud de 37 nucleótidos), y con el protocolo de lecturas sencillas, donde sólo se secuencia un extremo de cada fragmento. Las lecturas obtenidas se analizaron utilizando el paquete bioinformático de Tuxedo (Trapnell et al., 2012), utilizando como genoma de referencia de Drosophila la liberación 3 (Dm3) generada por la Universidad de California en Santa Cruz (Karolchik et al., 2014). 37 18. Bioinformática. Los alineamientos múltiples de secuencias se realizaron con el programa CLC, con configuraciones de espaciamiento (“gap cost”) estándar, y la opción de alineamiento lento. El árbol de similitud se creó con el mismo programa, realizando 10000 réplicas de remuestreo (bootstrapping), y el resto de los parámetros estándar. La búsqueda de marcos abiertos de lectura se realizó con CLC, fijando una longitud mínima de 30 nucleótidos. La presencia de secuencias Kozak se analizó usando el programa de Salamov et al. (1998). El análisis de conservación de secuencias se realizó en CLC, o a partir del navegador del genoma de la Universidad de California en Santa Cruz (Karolchik et al., 2013). Los marcos abiertos de lectura propuestos se analizaron por BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, Herramienta de búsqueda local básica de alineamientos), usando la base de datos de UniProtKB (UniProt, 2013). Algunas secuencias arrojaron similitudes con valores p mayores a 5, y no se consideraron significativos. Para el cálculo del potencial codificante, las secuencias de referencia se tomaron de Flybase, usando los transcritos más largos disponibles, y para acal, usamos la secuencia del cDNA SD08925. 19. Análisis estadístico. Se emplearon pruebas de χ2 para determinar la significancia de los cambios en la proporción de fenotipos embrionarios. El cambio en el índice de hendidura torácica se comparó mediante ANOVA con corrección de Bonferroni, para múltiples comparaciones. En el caso de PCR semi-cuantitativa y en tiempo real, se utilizaron pruebas t de Student. Para comparar la distribución de la intensidad de fluorescencia entre embriones silvestres y mutantes que expresan TRE-Ds.Red, utilizamos la prueba Kolmogorov-Smirnov. Todas las pruebas se realizaron como se implementan en el programa GraphPad, o de acuerdo a Kirkman, T. W. (http://www.physics.csbsju.edu/stats/). 38 Tabla 1. Lista de oligonucleótidos usados en este estudio. Par de oligo- nucleótidos Secuencia Aplicación Tamaño del amplicón acal1 acal2 5’-ACACGGGCAACTGAAATGATCTCACC-3’ 5’-TGCCAAACGAGTTTTGGAACTCTGG-3’ Secuenciación 932 acal3 acal4 5’-GAGGGAAAGAAGAAGCAGAGG-3’ 5’-GGGAACAAATTCGAGAGGCATG-3’ Secuenciación PCR semi- cuantitativa 831 acal5 (acalB) acal6 5’-TCCCAGTGTACGAGTGATGGATGG-3’ 5’-GCAGCAGGAGTTGGAAAAAGTTGGGG- 3’ Secuenciación Sonda de hibridación in situ 955 acal7 (acalD) acal8 5’-CCCCAACTTTTTCCAACTCCTGCTG-3’ 5’-TCCCGAGCATTAGACGAAGTAGTAGC-3’ Secuenciación 906 acal9 acal10 5’-CCAACCCCTAAAACCCCGAAAACGG-3’ 5’-ATGCCAGCGGGGCAACATGG-3’ Secuenciación 1602 banF banR 5’-ACCGTTCCCTTCGCACGCTT-3’ 5’-CCGACTGGGATCGGTCGGCAT-3’ PCR semi- cuantitativa 837 Rp49a Rp49b 5’-TCAAGATGACCATCCGCCCA-3’ 5’-GTTCTCTTGAGAACGCAGGC-3’ PCR semi- cuantitativa Sonda de Northern blot 404 Rp49b 5’-GTTCTCTTGAGAACGCAGGC-3’ Síntesis de cDNA - acal1 5’-GAGGGAAAGAAGAAGCAGAGG-3’ Síntesis de cDNA - acalQ1 acalQ2 5’-CGCTGTGAAGAGTGTGAGGA-3’ 5’-CATTATGATTTCGCGCCGCT-3’ PCR cuantitativa 150 ckaQ1 ckaQ2 5’-TTCATCCAGCACGAGTGGTC-3’ 5’-CAGTGCGTACTCCAGCATCT-3’ PCR cuantitativa 162 Rp49Q1 Rp49Q2 5’-AGATCGTGAAGAAGCGCACC-3’ 5’-ATCCGTAACCGATGTTGGGC-3’ PCR cuantitativa 151 acal-A 5’-TTTGTGTGTGCGTGTGTGTGTGT-3’ small RNA Northern blot probe - acal-B (acal3) 5’-TCCCAGTGTACGAGTGATGGATGG-3’ Sonda de Northern blots - acal-C 5’-CCAACATCATCATCATCATCATCAC-3’ Sonda de Northern blots - acal-D (acal7) 5’-CCCCAACTTTTTCCAACTCCTGCTG-3’ Sonda de Northern blots - mir8 5’-GACATCTTTACCTGACAGTATTA-3’ Sonda de Northern blots - 39 XII. RESULTADOS. 1. Cuantificación de los fenotipos cuticulares de embriones mutantes de acal. Las mutaciones aisladas en acal son letales, ya que nunca se observan adultos homocigotos. Muchos de estos organismos mueren durante el desarrollo embrionario; sin embargo, algunos animales sobreviven a la embriogénesis y mueren en etapas posteriores, ya sea durante el desarrollo larvario o al inicio de la metamorfosis. Esta variabilidad implica penetrancia incompleta o parcial de una mutación. Una mutación, entre más altere la función de un gen, suele tener mayor homogeneidad y fenotipos más acusados, tendiendo a una penetrancia del 100%, es decir, mayor será el número de individuos que presenten los fenotipos mutantes a nivel poblacional. Como primer paso para la caracterización del locus acal y su papel en el desarrollo embrionario, cuantificamos la letalidad embrionaria de los mutantes de acal, así como la proporción de embriones que mueren con defectos en el cerrado dorsal, por medio de preparaciones de cutículas embrionarias. Observamos que los alelos mutantes de acal con mayor penetrancia tienen también los fenotipos más acusados (Figura 5). Observamos que los cinco alelos mutantes de acal presentan defectos en el cerrado dorsal, que van desde pequeños agujeros en la región dorsal de la cutícula, aperturas completas de la región dorsal, hasta agujeros en la región anterior, un defecto tardío del cerrado dorsal (Figura 5A-H). Algunos embriones mueren sin defectos en la cutícula. Esto significa que estos animales completaron el cerrado dorsal, pero murieron por un requerimiento del gen acal durante otro proceso posterior al cerrado dorsal. De acuerdo a la letalidad embrionaria, el alelo mutante más fuerte es acal5, ya que cerca del 85% de los animales mutantes mueren durante la embriogénesis, y el alelo más débil es acal1, ya que sólo el 10% de los animales mutantes mueren como embriones (Figura 5I). Esta caracterización nos permitió analizar también si la letalidad embrionaria observada por una mutación en acal se modifica al inhibir la función o al sobre-expresar otros genes de interés. 40 Figura 5. Cuantificación de los fenotipos cuticulares de los mutantes de acal. (A-F) Imágenes de campo oscuro de cuticulas embrionarias, la región dorsal se observa arriba y la anterior a la derecha. Las cabezas de flecha muestran el grado de apertura dorsal o anterior. (I) Cuantificación de los fenotipos observados en cada condición. Número de animales analizados: acal1/1= 217, acal2/2= 192, acal3/3= 110, acal4/4= 329, acal5/5= 391. 2. Las mutaciones de acal mapean genética y molecularmente a un gen no anotado. Las mutaciones acal1 y acal2 se generaron a partir de la escisión de un elemento P. Como la escisión altera regiones cercanas al sitio original de la inserción, no necesariamente en el punto de inserción mismo, mapeamos las mutaciones por medio de pruebas de complementación con deficiencias (deleciones genómicas) que abarcan esta región genómica. En estas pruebas, y dado que las mutantes de acal son homocigotas letales, si nacen individuos con la deleción y con la mutación en acal, significa que la región deletada no incluye al gen acal. En contraste, si sólo nacen individuos heterocigotos para la mutación o para la deficiencia, significa que la región deletada sí incluye al gen acal, ya que los individuos que heredaron una copia mutante de acal y otra de la deficiencia, murieron. La condición heterocigota para la mutación o para la deficiencia se determina empleando cromosomas balanceadores; estos cromosomas aportan una copia silvestre del gen y marcadores visibles en el adulto. 41 Figura 6. Representación esquemática de las deficiencias empleadas en el mapeo genético de acal. La línea superior representa un fragmento del brazo izquierdo del cromosoma dos (2L), donde se localiza KG09113, la inserción original de donde se generaron los alelos acal1 y acal2. Se muestran los genes aledaños a dicha inserción, lola, CR45135 y psq (por simplicidad, no se muestran otros genes). Abajo se muestran las deficiencias usadas para mapear el locus. Se realizaron pruebas de complementación con las deficiencias BSC595, ED2076, ED2098 y Δ18. La longitud de estas deficiencias va desde aproximadamente 900,000 pares de bases (900 kb) hasta 30 kb (Figura 6). A partir de estas pruebas, se acotó el locus de interés a una región de 30 kb. Esta región incluye parcialmente los genes lola, un RNA no codificante, CR45135, y psq. CR45135 abarca un exón de lola, y muchas mutaciones de lola caen en esta región. Para verificar si las mutaciones de acal caen en estos genes ya caracterizados (es decir, son alélicas a lola/CR45135 o psq), se realizaron pruebas de complementación entre alelos mutantes de acal con alelos mutantes de lola y de psq. Las mutantes de acal complementan alelos mutantes de ambos genes (Tabla 2). Por lo tanto, acotamos aún más la región de interés a la zona entre lola/CR45135 y psq, a un espacio de 14kb. En esta región no hay genes anotados en las bases de datos, por lo que estas mutaciones afectan un gen no anotado en bases de datos, presente entre lola y psq. En primer lugar buscamos evidencia en la literatura de la expresión de un gen para este locus que acotamos genéticamente. 42 Tabla 2. Pruebas de complementación entre mutantes de acal y genes aledaños. lola00642 lolarev6 acal1 acal2 acal3 acal4 acal5 psqKG09291 psqrev7 psqrev12 lola00642 X VF VF VF VF VF VF VF VF lolarev6 X VF VF VF VF VF VF acal1 X X X X X VF VF VF acal2 X X X X VF VF VF acal3 X X X VF VF VF acal4 X X VF VF VF acal5 X VF VF VF psqKG09291 X VF HE psqrev7 X psqrev12 X Se realizaron cruzas entre moscas heterocigotas para acal y lola o psq, y se analizó la progenie. Con una X, se indica los alelos que no complementan entre sí (que son alélicos). VF indica que la progenie además de ser viable, es fértil. HE indica que las moscas que poseen dos alelos determinados son viables, pero las hembras no son fértiles. En un reporte previo, se mostró que en esta misma región existe al menos una mutación que complementa a lola y psq (Wilk et al., 2004). En ese trabajo se demostró que dicha mutación, l(2)00297, suprime el fenotipo mutante de peb1 en el ojo. peb1 es una mutación viable, que afecta la formación del ojo de la mosca, y como consecuencia, los omatidios y quetas mecano-receptoras del ojo tienen un tamaño variable; algunas de estas quetas se encuentran duplicadas en los mutantes (Wilk et al., 2004). l(2)00297 suprime este fenotipo, aunque se desconoce la naturaleza del gen alterado en l(2)00297. Al observar que l(2)00297 se encuentra en la misma región en donde mapean las mutantes de acal, decidimos observar si nuestras mutantes también son capaces de suprimir el fenotipo mutante de peb1, lo que sugeriría que l(2)00297 y acal pudieran ser alélicos, porque el alelo mutante de l(2)00297 ya no existe para realizar pruebas de complementación. Observamos que, en efecto, todos los alelos mutantes de acal suprimen dicho fenotipo (Figura 7). Estos resultados sugieren que 43 l(2)00297 y nuestras mutantes afectan al mismo gen. Además, aportan evidencia independiente de un locus letal localizado entre lola y psq. Muchos genes de Drosophila melanogaster, así como los de otros organismos, se han anotado gracias a herramientas bioinformáticas que permiten identificar marcos abiertos de lectura y otras secuencias consenso. Sin embargo, para genes no convencionales se debe recurrir a otras estrategias, principalmente experimentales, para su identificación. Figura 7. La heterocigosis para acal suprime el fenotipo mutante de peb1. Imágenes de microscopía electrónica de barrido del fenotipo de ojo rugoso de peb1 (omatidios de tamaños variables y desorganizados, y quetas desalineadas), y su supresión parcial por la heterocigosis de acal. La barra equivale a 100 µm. Vistas laterales, la región anterior se observa a la izquierda, y la dorsal hacia arriba. Los páneles de abajo muestran las posiciones de las quetas de la ampliación de los paneles centrales. 44 En una biblioteca de DNAs complementarios (cDNAs) de Drosophila publicada en una base de datos, identificamos un cDNA parcialmente secuenciado que mapea a 3.7 kb de lola. Obtuvimos este cDNA, llamado SD08925, y lo secuenciamos completamente (registrado en Pubmed con el número #KJ598082). SD08925 posee una longitud de 2.3 kb, no posee intrones, y además de estar poli-adenilado, presenta un potencial sitio de poli-adenilación en el extremo 3’ (Figura 8A). Por medio de Northern blots, confirmamos que SD08925 es un cDNA completo, ya que pudimos detectar una banda del tamaño esperado. SD08925 se expresa muy débilmente en todos los estadios del ciclo de vida de Drosophila (Figura 8B). Adicionalmente, en un trabajo en donde se caracteriza y clona al gen lola, aledaño al locus de acal, se aísla un transcrito cercano a lola, cuyo mapeo coincide con la posición de SD08925 (Giniger et al 1994). Estas tres evidencias independientes muestras que este locus se transcribe in vivo. Para determinar si SD08925 corresponde al gen de acal, secuenciamos 4.7 kb del locus, a partir de DNA genómico de embriones homocigotos mutantes y de líneas control (línea silvestre yw y la línea parental, Figura 8A). Dentro de la secuencia correspondiente a SD08925 encontramos una inserción de 20 pares de bases en acal1, localizada a 1031 pares de bases del sitio original de inserción del elemento P, en la posición +931 del cDNA. Similarmente, en el alelo acal2 encontramos una deleción de 2 pb a 1630 pb del sitio de inserción original del elemento P, en la posición +299 del cDNA (Figura 8). A partir de estos resultados, supusimos que dichos cambios en la secuencia son debidos a la escisión imprecisa del elemento P, y probablemente responsables de los fenotipos mutantes de acal1 y de acal2, respectivamente, ya que estas alteraciones no se encuentran en ninguno de los controles ni em los otros alelos mutantes de acal. 45 Figura 8. Representación esquemática y detección del cDNA SD08925. (A) La línea superior representa un fragmento del brazo izquierdo del cromosoma dos (2L). Se detallan el sitio de inserción original del elemento P KG09113, el probable sitio de poli- adenilación de SD08925, y las lesiones moleculares de los alelos acal1 y acal2. Además, se muestran los amplicones secuenciados en las líneas mutantes (líneas inferiores marcadas con los números de los oligonucleótidos utilizados para amplificarlos; ver Tabla 1 para la secuencia de los oligonucleótidos). (B) Detección por Northern blot de SD08925 (acal) y de Rp49 como control de carga. Para detectar ambos transcritos, la membrana se incubó con una sonda radiactiva contra SD08925, y posteriormente, se hibridó con una sonda para Rp49. Para corroborar que este locus es el responsable del fenotipo mutante de acal, realizamos un experimento de rescate genómico, en el cual insertamos una construcción de aproximadamente 20 kb comprendiendo la secuencia silvestre de SD08925, en moscas heterocitogas para acal, de tal forma que la progenie homocigota mutante poseerá también dicha construcción. Esta construcción, llamada 178D09, deberá de proveer la función del gen de acal y por tanto, rescatar la viabilidad de dichos organismos. 178D09 abarca un extremo del gen lola, CR45135, la región de SD08925, y aproximadamente 7 kb río arriba de SD08925 (Figura 9A). 178D09 rescata significativamente la letalidad embrionaria de acal1 y de acal2, sugiriendo que las 46 mutaciones afectan el locus acotado (Figura 9B). La expression de SD08925 no cambia significativamente en presencia de esta construcción, presumiblemente debido a secuencias regulatorias endógenas que mantienen niveles de expresión bajos, aunque el rescate contribuya con transcritos funcionales (Figura 9C). Figura 9. Rescate genómico de los alelos mutantes de acal. (A) Representación esquemática de la construcción de rescate, 178D09, que abarca el extremo 5’ del gen lola, CR45135, SD08925, y 7 kb río arriba del mismo. (B) Cuantificación de cutículas embrionarias y su modificación por la construcción de rescate. Número de animales analizados: acal1/1=217, acal1/1;178D09/+=314, acal2/2=192, acal2/2;178D09/+=159, prueba de χ 2. (C) Expresión relativa de acal (SD08925) en embriones mutantes de acal2 en presencia o ausencia de la construcción de rescate. Se grafica el promedio de tres experimentos independientes, realizados por duplicado. En los alelos acal3, acal4 y acal5 no encontramos ningún cambio en la secuencia en la región analizada. Dado que secuenciamos toda la región correspondiente a SD08925, decidimos explorar si algunas de estas mutaciones afectan la región regulatoria (ya que la región codificante no tenía cambios). Para determinar esto, cuantificamos la expresión de SD08925 en embriones mutantes. Analizamos los alelos acal2 y acal5, en etapas del cerrado dorsal. Encontramos que en mutantes de acal2 no hay cambios en la expresión con respecto a embriones silvestres. En contraste, la expresión de 47 SD08925 se encuentra disminuida significativamente en embriones homocigotos para acal5, sugiriendo que esta mutación cae en una región regulatoria, lo cual afecta la expresión de SD08925 (Figura 10A), y es consistente con que el locus donde se localiza SD08925 corresponde al gen acal. Figura 10. Expresión y sobre-expresión de SD08925 en embriones mutantes de acal. (A) Cuantificación por qPCR de la expresión de SD08925 en embriones silvestres y mutantes, durante la etapa del cerrado dorsal. (B) Cuantificación de fenotipos en cutículas de embriones mutantes para acal5. Embriones que sólo poseen el transgen UAS-acal, o que sólo poseen la línea gal4 presentan más defectos en el cerrado dorsal que aquellos que poseen ambas construcciones (que sobre-expresan el transgen UAS-acal). 69B expresa gal4 en todo el ectodermo, y pnr en la epidermis lateral. Número de animales analizados: acal5/5,UAS- acal/+=240, acal5/5;69B-gal4/+=441, acal5/5;69B>acal= 237, acal5/5;pnr-gal4/+=435, acal5/5;pnr>acal=130. (B’-B’’’) Imágenes representativas de embriones mutantes para acal5, sobre-expresando el transgén UAS-acal. Los defectos en cutícula son indistinguibles al de los embriones mutantes para acal5 sin rescate, pero su abundancia disminuye significativamente. (C) Cuantificación por qPCR de la expresión de SD08925 en embriones control (acal5/5,UAS- acal/+, acal5/5;69B-gal4/+) y en embriones que sobre-expresan SD08925 en el ectodermo (acal5/5;69B>acal). En A y C, se grafica el promedio de tres experimentos independientes realizados por duplicado. La significancia se determinó usando t de Student (A, C) y χ2 (B). 48 Finalmente, para corroborar que SD08925 es el gen responsable de las mutaciones de acal, recurrimos al sistema binario de expresión UAS/Gal4. UAS y Gal4 son elementos endógenos de levadura, y se han adaptado como herramienta experimental para expresión de genes en Drosophila (Brand y Dormand, 1995). UAS es una secuencia de DNA que constituye un elemento de respuesta a Gal4, un factor de transcripción. Se han generado muchas líneas transgénicas de moscas que expresan Gal4 en diferentes tejidos y etapas del desarrollo de la mosca, por lo que es sencillo hacer experimentos de expresión ectópica, generando transgenes unidos a la secuencia UAS y cruzando a estas moscas con líneas que expresan Gal4 en un patrón de interés. En este caso, fusionamos la secuencia UAS al cDNA SD08925, y generamos líneas de moscas transgénicas que poseen esta construcción (referida como UAS-acal). Esto nos permitió sobre-expresar a SD08925 en todo el ectodermo de embriones mutantes para acal5 (usando la línea 69B-gal4), o sobre-expresarlo sólo en la epidermis lateral de estos embriones (usando la línea pnr-gal4). La sobre-expresión de SD08925 en el ectodermo de embriones mutantes para acal5 resultó en una disminución significativa en la proporción de embriones con defectos en el cerrado dorsal, y en la letalidad embrionaria. Por otro lado, la sobre-expresión de SD08925 en la epidermis lateral resultó en una disminución significativa de embriones con defectos en el cerrado dorsal (Figura 10B). Además, corroboramos que el transgén realmente se sobre-expresa al usar el sistema Gal4/UAS (Figura 10C). En conjunto, todos estos resultados muestran que SD08925 corresponde al gen acal. 3. acal es un RNA no codificante. Nuestros experimentos de mapeo y de rescate de los alelos mutantes de acal demuestran que el gen alterado en los mutantes corresponde a un gen no anotado en bases de datos, de una longitud de 2.3 kb, sin intrones, y poli-adenilado. El locus de acal está conservado en otras especies de Drosophila y en otros dípteros como Anopheles gambiae (Figura 11A–B). Las mutaciones de acal1 y acal2 caen alrededor de 49 sitios conservados en el transcrito. Para determinar cuál podría ser el producto funcional del gen, realizamos una búsqueda de marcos abiertos de lectura, que podrían traducirse a proteínas. Sin embargo, encontramos que acal posee sólo marcos abiertos de lectura pequeños (menores a 243 nucléotidos, equivalentes a 81 residuos, Figura 11C). Estos marcos abiertos de lectura no están conservados en las especies en la que sí está acal (Figura 11C), por lo que es poco probable que se traduzcan a péptidos o proteínas. Recientemente se han identificado genes policistrónicos, que codifican para péptidos de hasta 11 aminoácidos [por ejemplo, polished rice (pri) y pncr003 (Kondo et al., 2010; Savard et al., 2006)]. Sin embargo, en estos genes se observan varios marcos abiertos de lectura en tándem que presentan homología entre sí. Estos péptidos tienen homólogos en especies cercanas. En el caso de acal, los marcos abiertos de lectura presentes en el gen no presentan homología entre sí, y no están conservados. Los péptidos putativos no arrojan secuencias homólogas en bases de datos de secuencias de proteínas, ya sea anotadas por predicción u obtenidas experimentalmente (Loevenich et al., 2009; St Pierre et al., 2014). Para obtener un parámetro cuantitativo de qué tan probable es que acal codifique a proteínas o no, utilizamos un algoritmo que calcula el potencial codificante de un RNA (Kong et al., 2007). Este algoritmo considera seis criterios para determinar si un gen codifica o no: 1) presencia de marcos abiertos de lectura, 2) cobertura de los marcos abiertos con respecto a la longitud del RNA, 3) presencia de codones de inicio y de paro, 4) número de resultados en un análisis de BLASTX, 5) alta calidad en los resultados de BLASTX, y 6) que los resultados de BLASTX correspondan con algún marco abierto de lectura. Como referencia, determinamos el potencial codificante de otros genes conocidos (Figura 11D). Encontramos que, como se esperaba, los transcritos de genes que codifican para proteínas tienen un alto potencial codificante, incluso aquellos que codifican para péptidos pequeños como pri. Por otra parte, acal arrojó un potencial codificante extremadamente bajo, similar a otros RNAs no codificantes conocidos (Figura 11D). 50 Figura 11. Análisis de la conservación de acal y de su potencial codificante. (A) Se muestra la conservación de acal en dípteros con respecto a la secuencia de D. melanogaster. También se esquematizan las mutaciones acal1 y acal2. (B) Filograma de acal en Drosofílidos. Se muestran los valores de confianza del cálculo de las relaciones entre especies. (C) Alineamiento de secuencias múltiples de acal en diferentes Drosofílidos. Los marcos abiertos de lectura de la secuencia de D. melanogaster se muestran en azul. (D) Potencial codificante de acal y otros genes. pipsqueak (psq) es un factor de transcripción, basket (bsk) es una cinasa, polished rice (pri) y pncr003 codifican para péptidos pequeños. roX1 (RNA on the X 1), msa (male-specific abdominal), bereft (bft), Hsrw (Heat shot response omega) y iab-4 (infra- abdominal 4) son RNAs no codificantes. Los asteriscos denotan significancia en el resultado. (E) RT-PCRs semi-cuantitativas para detectar acal en RNA total [T], citoplásmico [C], o nuclear [N]. Como control, se amplificó DNA genómico [G]. Como control de carga, se empleó Rp49, y como control de un RNA nuclear, el precursor de bantam (pre-ban). (F) La amplificación de acal se cuantificó por densitometría a partir de 5 experimentos independientes, y su significancia se determinó con t de Student. 51 De manera general, los RNAs no codificantes pueden dividirse en RNAs no codificantes cortos, de hasta 200 nucleótidos de longitud, y RNAs no codificantes largos, de hasta varios kilobases de longitud (Rinn y Chang, 2012). Hasta ahora, los RNAs no codificantes cortos han sido mejor caracterizados ya que comparten la misma maquinaria para su biogénesis y generalmente funcionan silenciando a otros mensajeros (Berezikov et al., 2011; Okamura et al., 2004). Por ejemplo, los microRNAs se generan a partir de precursores largos (incluso de más de 5 kilobases) que luego son procesados a sus formas maduras, de 24 nucleótidos en promedio (Krol et al., 2010). Estos precursores no salen del núcleo, ya que rápidamente son procesados. De manera similar, la gran mayoría de los RNAs no codificantes largos (lncRNAs) tienen funciones nucleares, por lo que son retenidos en el núcleo luego de ser sintetizados (Fatica y Bozzoni, 2014). En contraste, los RNAs codificantes son exportados al citoplasma para ser traducidos. Decidimos explorar la localización intracelular de acal. Para esto, purificamos RNA a partir de una fracción nuclear, citoplásmica, y de un extracto total. Posteriormente, detectamos el transcrito por PCR semi-cuantitativa. Como control de un RNA que se localiza en el núcleo, amplificamos el precursor del microRNA bantam (ban), y como control de carga, analizamos a Rp49, un RNA codificante que es transportado al citoplasma (Figura 11E). Detectamos amplificación del precursor de ban (pre-ban) únicamente en la fracción nuclear. pre-ban no es detectable en el RNA total, posiblemente porque es procesado rápidamente hacia la forma madura de ban. Rp49 es detectable en ambas fracciones, mientras que acal se encuentra significativamente enriquecido en la fracción nuclear (Figura 11E-F). La localización nuclear de acal, su bajo potencial codificante, y la ausencia de marcos abiertos de lectura conservados, apoyan fuertemente que acal es un RNA no codificante. Recientemente, se han empleado técnicas de secuenciación masiva de RNA en la identificación y anotación de RNAs pequeños existentes en el genoma de Drosophila (Berezikov et al., 2011). Estos proyectos han sido liberados en bases de datos públicas (McQuilton et al., 2012; St Pierre et al., 2014). Dado que acal es un RNA no codificante, buscamos en estas bases de datos si es que existen lecturas de RNAs pequeños 52 mapeando dentro del transcrito de acal, que pudieran ser los productos maduros del gen. Encontramos que existen dos grupos de lecturas en el rango de los 20 nucleótidos, detectadas bajo diferentes condiciones de cultivo y durante diferentes estadios del desarrollo. Planteamos la hipótesis que estos RNAs pequeños podrían ser los productos funcionales de acal, posiblemente microRNAs, y que el transcrito de 2.3 kb podría ser su precursor. Estas especies de RNA no han sido anotadas en el genoma ya que no cumplieron los criterios de inclusión para su anotación. Denominamos a estas regiones “acal-A” y “acal-C”, y decidimos validar experimentalmente su procesamiento (Figura 12). Para esto, purificamos RNA de embriones, larvas, pupas y adultos silvestres y lo analizamos por Northern blot en geles de acrilamida, donde sólo se separan RNAs de hasta 200 nucleótidos de longitud. Utilizando una sonda complementaria a acal-A, encontramos al menos 7 fragmentos que van de ~50 a ~115 nucleótidos de longitud. Estos fragmentos son más abundantes durante el estadio de pupa (Figura 12C, por simplicidad, sólo se muestran los estadios de embrión y pupa). Este tipo de fragmentación apoya que acal es un RNA no codificante, y descarta que acal sea un precursor de microRNAs, ya que no encontramos ninguna banda del tamaño de los microRNAs (22-27 nucleótidos). A la fecha, no existen reportes de otros RNAs procesados a estos tamaños, por lo que su función es difícil de determinar. Utilizando una sonda complementaria a acal-C, no detectamos fragmentos en ningún estadio (Figura 12C). Sin embargo, decidimos explorar si se generan fragmentos de otras regiones del transcrito, usando dos sondas más: acal-B y acal-D (Figura 12A). acal-B cae en una porción altamente conservada del transcrito. Interesantemente, detectamos un fragmento de 56 nucleótidos, un tamaño coincidente con el de la región conservada (Figura 12B). Utilizando la sonda acal-D, no detectamos fragmentos en ningún estadio (Figura 12C). 53 Figura 12. Detección de fragmentos de acal por Northern blot para RNAs pequeños. (A) Esquema de acal y de las sondas empleadas en ensayos de Northern blot. El recuadro en acal-B se muestra en detalle en (B). (C) Northern blots a partir de RNA total de embriones [E], larvas [L], pupas [P] y adultos [A]. Se muestran los tamaños estimados, a partir de 5 ensayos independientes 54 Desafortunadamente, no pudimos explorar si los fragmentos provenientes de acal-A y acal-B se modifican en los mutantes de acal, ya que su producción es más evidente durante el estadio de pupa, y los mutantes de acal mueren como embriones o como larvas. Aún así, a partir de estos resultados proponemos que acal es un RNA no codificante largo (lncRNA), que es procesado de manera no convencional. Los lncRNAs son una clase emergente de reguladores de la expresión génica. La gran mayoría tienen una localización nuclear, y tienen diversos mecanismos de acción (Fatica y Bozzoni, 2014). A pesar de ser muy abundantes en el genoma, sus funciones no son del todo claras, ya que no necesariamente operan de la misma manera. Por su longitud, nuestros resultados clasifican a acal como un lncRNA que es procesado a varios fragmentos en su extremo 3’. La relevancia fisiológica de este procesamiento aún debe determinarse. 4. Expresión de acal durante el desarrollo embrionario. Muchos embriones mutantes para acal mueren con defectos en el cerrado dorsal. Para definir el papel de acal durante la embriogénesis, y en particular, durante el cerrado dorsal, decidimos estudiar en qué etapas y en qué tejidos se expresa el gen. Entonces, generamos una sonda de 1 kb, complementaria a acal, acoplada a digoxigenina, y la empleamos en ensayos de hibridación in situ en embriones silvestres. Como control negativo de la tinción, utilizamos una sonda no complementaria, o sentido. Observamos que acal se encuentra presente y de manera homogénea, desde etapas muy tempranas del desarrollo (Figura 13, estadio 5), sugiriendo que es depositado en el ovocito durante la ovogénesis (contribución materna). Sin embargo, a partir de la gastrulación, su localización comienza a restringirse a los plieges cefálicos, dorsales y ventrales (Figura 13, estadio 7). A partir de la extensión y retracción de la banda germinal, su expresión comienza a restringirse a la epidermis lateral y al sistema nervioso (Figura 13, estadios 9-11). 55 Consistente con los fenotipos mutantes, en etapas del cerrado dorsal se observa expresión importante en la epidermis lateral. También existe expresión en el sistema nervioso en formación (Figura 13, estadios 13-15). Una vez completado el cerrado dorsal, la expresión en la epidermis disminuye significativamente, y sólo se observa expresión en el sistema nervioso (Figura 13, estadio 17). Figura 13. Patrón de expresión de acal durante el desarrollo embrionario de embriones silvestres. Hibridación in situ de acal en embriones de la línea yw. Vistas laterales de embriones. La porción anterior se muestra a la izquierda, y la dorsal hacia arriba. Para cada estadio, se muestra el control negativo o sentido. Las flechas muestran expresión en la epidermis lateral, y las cabezas de flecha muestran expresión en el sistema nervioso. Los recuadros en los estadios 13-17 se amplifican en los paneles inferiores. El patrón de expresión de acal es consistente con el experimento de rescate usando el sistema UAS-gal4. Con este sistema, pudimos rescatar los fenotipos mutantes de acal, sobre-expresando el transgén silvestre en todo el ectodermo, o sólo en la epidermis 56 lateral (Figura 10B). Cabe destacar que la sobre-expresión en el ectodermo es más efectiva que la sobre-expresión únicamente en la epidermis lateral, presumiblemente porque en embriones silvestres, acal se expresa tanto en la epidermis lateral como en el sistema nervioso, sugiriendo tener función(es) en los dos tejidos. Figura 14. Patrón de expresión de acal durante el desarrollo embrionario de embriones mutantes. (A) Hibridación in situ contra acal en embriones silvestres de la línea yw, y en embriones mutantes acal5. Vistas laterales de embriones. La porción anterior se muestra a la izquierda, y la dorsal hacia arriba. Para cada estadio, se muestra el control negativo o sentido. Las cabezas de flecha muestran la disminución en la expresión de acal en los embriones mutantes. Los recuadros se amplifican en los paneles inferiores. (B) Cuantificación de la tinción por densitometría. Se muestra el promedio de 5 embriones +/- error estándar. La significancia se determinó con pruebas de t de Student. 57 Nuestros experimentos de PCR en tiempo real sugieren que acal5 es una mutación regulatoria, ya que en estos embriones se observa una menor expresión de acal (ver Figura 10A). Confirmamos este cambio en la expresión por medio de hibridación in situ. Encontramos que a partir del estadio 13, cuando inicia el cerrado dorsal, los embriones mutantes para acal5 muestran una reducción en la expresión de acal en la epidermis lateral, mientras que la expresión en el sistema nervioso no se ve afectada (Figura 14). En estadios posteriores, la expresión en el sistema nervioso también disminuye significativamente. Estos resultados refuerzan nuestra hipótesis de que acal5 es una mutación regulatoria que afecta la expresión de acal. Aunado a los experimentos de sobre-expresión en la epidermis, los resultados de hibridación in situ muestran que acal se expresa en la epidermis, y que esta expresión es requerida para completar el cerrado dorsal. 5. acal regula negativamente la vía de JNK durante el cerrado dorsal. Hasta ahora, en este trabajo hemos demostrado que acal es un RNA no codificante y que su expresión en la epidermis lateral es necesaria para completar el cerrado dorsal. El cerrado dorsal es regulado por la vía de JNK, y actualmente, existen diferentes reporteros disponibles para monitorear la activación de la vía. Analizamos la expresión de la proteína roja fluorescente DsRed bajo el promotor TRE (Tetradecanoylphorbol acetate Response Element), al cual se une el complejo AP-1 al ser activado por JNK (Chatterjee y Bohmann, 2012), y al mismo tiempo, expresamos un marcador del citoesqueleto cortical fusionado a GFP [sGMCA, también conocido como Moesina-GFP (Kiehart et al., 2000)]. Esto nos permitió analizar la activación de la vía de JNK y los cambios en la forma celular en los mutantes de acal. 58 Figura 15. Activación del reportero TRE-DsRed durante el cerrado dorsal de embriones mutantes para acal y silvestres. (A-B) Embriones en estadio 13. (C-D) Embriones en estadio 17. Los recuadros blancos se amplifican debajo de cada embrión. sGMCA marca el citoesqueleto cortical, y TRE-DsRed marca las células donde se activa la vía de JNK. (E) Cuantificación de la intensidad de fluorescencia a lo largo del eje dorsal-ventral, de embriones en estadio 13 silvestres y mutantes. Se grafica el promedio de 5 embriones para cada condición. Las distribuciones son significativamente diferentes (p<0.001, prueba Kolmogorov-Smirnoff). 59 En embriones silvestres en estadio 13, las células de la epidermis lateral comienzan a estirarse hacia la región dorsal. Además, se observa la expresión de TRE-DsRed en las células de la hilera líder, y una baja expresión en algunas células de la amnioserosa (Figura 15A). En los mutantes de acal, las células de la epidermis también se estiran, pero lo hacen de una manera desorganizada. Esta desorganización coincide con una expresión ectópica de TRE-DsRed (Figura 15B). En embriones silvestres en etapa 17, las láminas laterales de la epidermis lateral se han fusionado completamente, y aún se observa expresión de TRE-DsRed en la línea media dorsal (Figura 15C). En embriones mutantes de acal se observan fallas en la fusión de las láminas de la epidermis lateral, y nuevamente, estiramiento aberrante que coincide con la activación ectópica de TRE-DsRed (Figura 15D). Estos resultados sugieren que en los mutantes de acal, la vía de JNK se activa de manera aberrante, no sólo en las células de la hilera líder, sino también en algunas células de la epidermis lateral. Esta activación ectópica resulta en un estiramiento desorganizado de la epidermis y en consecuencia, en fallas en el cerrado dorsal. Esto implica que durante el cerrado dorsal, tanto la falta como el exceso de activación de la vía de JNK impiden el adecuado estiramiento de la epidermis. Confirmamos también que la vía de JNK se sobre-activa en los mutantes de acal siguiendo la expresión de un gen blanco de la vía, la fosfatasa puckered (puc). La expresión de puc es inducida por la vía de JNK. El gen puc codifica para una fosfatasa de especificidad dual de JNK, y el hecho de que la misma vía de JNK induzca su expresión es una manera de auto-regular la activación de la vía. Para seguir la expresión de puc, usamos una inserción de lacZ en el locus de puc (puclacZ), de tal forma que usando un ensayo de β -galactosidasa podemos revelar el patrón de expresión del gen (Martín-Blanco et al., 1998). Al igual que TRE-DsRed, puclacZ marca las células de la hilera líder en embriones silvestres (Figura 16A,C). En embriones mutantes de acal se observa expresión ectópica de puclacZ en la epidermis lateral, corroborando los resultados obtenidos con TRE-DsRed (Figura 16B,C). Además, dado que puc es un inhibidor de la vía, podemos estudiar qué pasa cuando se mutan tanto acal como puc. Si acal es un regulador negativo de la vía, embriones dobles mutantes 60 para acal y puc deben tener fenotipos más severos. En efecto, encontramos que los fenotipos mutantes de acal se exacerban cuando además hay reducción de la dosis de la fosfatasa Puc (Figura 16D). Figura 16. Expresión del reportero puclacZ en embriones silvestres y mutantes para acal, e interacciones genéticas con componentes de la vía de JNK. (A) Expresión de puclacZ en embriones silvestres. Vista dorso-lateral de los embriones, con anterior hacia la izquierda, igual que en (B). (B) Expresión de puclacZ en embriones mutantes para acal. Las cabezas de flecha muestran expresión ectópica. (C) Cuantificación de embriones con patrón de expresión silvestre y mutante. Número de animales analizados: acal+/+;puclacZ/+=108, acal1/1;puclacZ/+=229, acal2/2;puclacZ/+=48, acal5/5;puclacZ/+=62. (D) Fenotipos en cutículas de mutantes para acal y puc. Número de animales analizados: acal2/2=192, acal2/2;puclacZ/+=204, acal5/5=391, acal5/5;puclacZ/+=178. (E) Fenotipos en cutículas de mutantes para acal y bsk. Número de animales analizados: bsk1/1;acal+/+=154, bsk1/1;acal5/+=210, bsk+/+;acal5/5=391, bsk1/+;acal5/5=166. (F) Fenotipos en cutículas de mutantes para acal y peb. Número de animales analizados: peb308/Y;/+= 665, peb308/Y; acal5/+=247. La significancia se determinó con pruebas de χ2. 61 Otra manera de confirmar que la vía de JNK se encuentra sobre-activada en los mutantes de acal es reduciendo la dosis de bsk, que codifica para JNK. Para esto, estudiamos cómo se modifica la letalidad de los embriones mutantes de acal, en presencia de una copia mutante de bsk. De acuerdo a lo esperado, una copia mutante de bsk reduce los defectos del cerrado dorsal y la letalidad de los embriones mutantes de acal, confirmando que en estos embriones, hay un exceso de actividad de la vía (Figura 16E). La activación ectópica de la vía de JNK en la epidermis lateral de los embriones mutantes de acal es consistente con el patrón de expresión silvestre de acal en la epidermis lateral. También va de acuerdo con el rescate de los fenotipos mutantes al sobre-expresar acal en la epidermis de los embriones mutantes. Para descartar un papel de acal en la amnioserosa, otro tejido requerido para completar el cerrado dorsal, analizamos interacciones genéticas con pebbled (peb), un gen que se expresa en la amnioserosa y que inhibe a la vía de JNK en ese tejido. Observamos que acal no modifica el fenotipo mutante de peb, sugiriendo funciones independientes entre los dos genes, y que acal no se require en la amnioserosa durante el cerrado dorsal (Figura 16F). Adicionalmente, decidimos estudiar el efecto de sobre-activar la vía de JNK en embriones heterocigotos para acal. Sobre-expresamos el gen hemipterous (hep), que codifica para la cinasa de JNK. La sobre-expresión de una forma constitutivamente activada de este gen (hepACT) resulta en defectos en el cerrado dorsal (Figura 17A). En embriones heterocigotos para acal, los defectos son más fuertes (mayor número de embriones con defectos en el cerrado dorsal). La sobre-expresión de la forma silvestre de hep resulta en letalidad parcial embrionaria, aunque con fenotipos menos severos que al sobre-expresar la forma activa de hep (Figura 17B). Aún así, en embriones heterocigotos, dicha letalidad aumenta. En conjunto, nuestros resultados demuestran que acal regula negativamente la vía de JNK en la epidermis lateral durante el cerrado dorsal. 62 Figura 17. Efecto de sobre-activar la vía de JNK en embriones heterocigotos para acal. (A) Sobre-expresión de una forma activa de la cinasa de JNK, hep (hepACT) en todo el ectodermo de embriones silvestres y heterocigotos para acal. (B) Sobre-expresión de la forma silvestre de hep en embriones silvestres y heterocigotos para acal. Número de animales analizados: 69B>hepACT=1208, acal1/+,69B>hepACT=563, acal2/+,69B>hepACT=363, acal5/+, 69B>hepACT= 923, 69B>hep=107, acal1/+,69B>hepACT=141, acal2/+,69B>hepACT=107, acal5/+, 69B>hepACT= 51. La significancia se determinó usando pruebas de χ2. 6. acal actúa debajo de raw, un regulador negativo de la vía de JNK. A la fecha, se han caracterizado diferentes genes y mecanismos por los que se restringe la actividad de la vía de JNK durante el cerrado dorsal (Rios-Barrera y Riesgo- Escovar, 2013). Ya que nuestros resultados colocan a acal como un regulador negativo de la vía de JNK en la epidermis lateral (y no en la amnioserosa), exploramos otros reguladores que podrían colaborar con acal para ejercer su función. En particular, nos interesamos en estudiar a raw, un gen cuyo patrón de expresión es muy parecido al de acal durante el cerrado dorsal (Bates et al., 2008). Raw antagoniza la activación de la vía de JNK en la epidermis lateral. En los mutantes de raw, la vía se activa en toda la epidermis, lo que resulta en expresión de dpp en todo el tejido. Como dpp es un morfógeno que define la región dorsal del embrión, los 63 mutantes de raw pierden caracterísitcas ventrales, como los dentículos de la cutícula, además de que no completan el cerrado dorsal (Figura 18A-B). Como primer acercamiento para estudiar la relación entre acal y raw, analizamos interacciones genéticas entre mutantes de ambos genes. Encontramos que todos los embriones mutantes para acal, con una sola copia mutante de raw, mueren durante el desarrollo. De manera interesante, algunos embriones incluso mueren con el fenotipo dorsalizado de raw (Figura 18C). Una copia mutante de acal no afecta a los embriones mutantes de raw, sugiriendo que acal actúa debajo de raw (Figura 18C). Interpretamos estos resultados como que acal y raw actúan de manera similar para regular la vía de JNK, y que raw podría regular la función de acal. Después, analizamos cómo se modifica el patrón de expresión de acal en los embriones mutantes de raw. Encontramos que en estos embriones, la expresión de acal en la epidermis lateral disminuye significativamente (Figura 18D-E), mientras que la expresión en el sistema nervioso no cambia. Esto nos llevó a pensar que acal podría actuar río abajo de raw para regular la vía de JNK. Para apoyar esto, determinamos si la pérdida de función de raw se puede rescatar sobre-expresando a acal. Usando el sistema Gal4-UAS, sobre-expresamos acal en todo el ectodermo de los mutantes de raw, y encontramos que acal rescata parcialmente el fenotipo mutante de raw, ya que en una parte de los mutantes que sobre-expresan acal, se recupera la presencia de dentículos ventrales en la cutícula (en otras palabras, son embriones menos dorsalizados, presumiblemente porque activan menos la vía de JNK, Figura 18F-H). 64 Figura 18. acal y raw actúan juntos para inhibir la vía de JNK durante el cerrado dorsal. Cutícula embrionaria silvestre (A) y mutante para raw2 (B). (C) Interacción genética de raw y acal. La heterocigosis de raw aumenta la letalidad de los embriones mutantes de acal. El fenotipo mutante de raw no aumenta con la heterocigosis de acal, sugiriendo que acal actúa río abajo de raw. Número de animales analizados: raw+/+,acal5/5=391, raw2/+,acal5/5=139, raw2/2,acal+/+=366, raw2/2,acal5/+=152, raw2/2,acal5/5=208. (D-E) Hibridación in situ de acal en embriones heterocigotos y mutantes de raw. En embriones homocigotos para raw2, la expresión de acal en la epidermis disminuye (flecha). (F) La sobre-expresión de acal en el ectodermo de embriones mutantes de raw rescata parcialmente la presencia de dentículos ventrales. Número de animales analizados: raw1/1;UAS-acal/+=53, raw1/1; 69B-gal4/+=283, raw1/1;69B>acal=28. (G-H) Cutículas sin y con dentículos ventrales, con apertura dorsal. La 65 significancia se determinó usando χ 2 (C, F). (I-J) Hibridación in situ de dpp en embriones silvestres (I), mutantes de acal (J), mutantes para raw (K), y mutantes para raw expresando acal en un patrón segmentado, bajo el patrón de en-gal4. Las cabezas de flecha en (L) apuntan a una disminución en la expresión de dpp, en comparación con (K). En todas las imágenes, la porción anterior se observa a la izquierda, y la dorsal hacia arriba. En los mutantes de acal, la expresión de dpp no se expande a toda la epidermis lateral, como sucede en los mutantes de raw (Figura 18I-J), por lo que raw podría tener otros mediadores además de acal. Sin embargo, inducir la expresión de acal en un patrón segmentado en embriones mutantes de raw, reduce la expresión de dpp en la epidermis en el mismo patrón segmentado (Figura 18K-L). Estos datos sugieren fuertemente que acal y raw colaboran para inhibir la vía de JNK, raw actuando río arriba de acal. Además, nuestros resultados sugieren que raw regula otros genes además de acal. Con el fin de confirmar que raw y acal actúan en la misma cascada para inhibir a la vía de JNK, recurrimos a un modelo de sobre-expresión en el cual fácilmente podemos estudiar la vía de JNK: la formación del tórax. El tórax se forma durante la metamorfosis (Figura 1), mediante la fusión de los discos imagales de las alas. Este proceso es análogo al cerrado dorsal, y su formación también depende de la activación de la vía de JNK. De hecho, existen mutaciones hipomorfas en genes de la vía de JNK que permiten completar el cerrado dorsal y la embriogénesis; sin embargo, los adultos homocigotos para estas mutaciones presentan defectos en el cerrado torácico (Demerec, 1994; Riesgo-Escovar y Hafen, 1997a; Zeitlinger y Bohmann, 1999). Para estudiar la relación de raw y acal, empleamos la línea pnr-gal4, que sobre- expresa Gal4 en la región dorsal de todo el organismo, incluyendo el anlagen del tórax. Usando esta línea, sobre-expresamos sólo acal, sólo raw o ambos (Figura 19). Al ser inhibidores de JNK, la sobre-expresión de acal o raw en el tórax debería de generar defectos en el cerrado torácico. Además, de actuar en la misma cascada, la sobre- expresión simultánea de ambos transgenes debería producir fenotipos más extremos. Para hacer un análisis cuantitativo del grado de apertura torácica, medimos el tamaño de la ‘hendidura torácica’ (o región desprovista de microquetas entre las macroquetas 66 dorsocentrales). Esta medición se realizó a la altura de las quetas dorsocentrales anteriores y se normalizó al tamaño del tórax, usando como referencia la distancia entre las quetas dorsocentrales anteriores y posteriores. A este valor lo denominamos “Índice de apertura torácica” (Figura 19C). Figura 19. Sobre-expresión de acal y de raw en el tórax. Se empleó el sistema Gal4/UAS para analizar la relación de acal y raw. (A) Control UAS-acal/+. (B) Control pnr-gal4/+. (C) Sobre-expresión de dos copias de UAS-acal usando pnr-gal4. El recuadro se amplifica en (D). (D) Se muestran los parámetros usados para calcular el índice de apertura torácica: El tamaño de la hendidura (línea horizontal roja) se normalizó con respecto a la distancia entre las quetas dorsocentrales anteriores y posteriores (DCA y DCP, respectivamente; línea vertical roja). La medición se tomó a la altura de las quetas DCA. (E) Cambio en el índice de apertura torácica en diferentes condiciones experimentales, con 67 respecto al control pnr-gal4/+. Se muestra el promedio de 10 moscas en cada caso +/- error estándar. La significancia se determinó con ANOVA y ajuste de Bonferroni. Encontramos que sobre-expresar una copia del transgén UAS-acal no altera el índice de apertura torácica. Sin embargo, sobre-expresar dos copias del transgen resulta en un aumento del 20% del índice, con respecto a los controles (Figura 19). De igual forma, sobre-expresar una copia de raw (UAS-rawRA), no altera el cerrado torácico (Figura 19E), pero la sobre-expresión simultánea de una copia de UAS-acal y de una copia de UAS-rawRA tiene un efecto sinérgico, con un aumento significativo del 75% en el índice de apertura torácica. raw produce dos isoformas, rawRA y rawRB, y en ambos casos se observa el efecto sinérgico (Figura 19E). Adicionalmente, sobre- expresamos raw en un fondo heterocigoto para acal, esperando suprimir el efecto de sobre-expresar únicamente raw, pero dado que la sobre-expresión de raw per se produce un efecto muy sutil, no encontramos diferencias significativas. Estos resultados validan de manera independiente que acal y raw actúan juntos, ya que la doble sobre-expresión de estos genes afectan el cerrado torácico. Además, sugieren que acal y raw podrían actuar normalmente en el cerrado torácico, pero es necesario realizar experimentos de falta de función para comprobar este papel. 7. acal y raw regulan la expresión de Cka, una proteína de andamiaje de la vía de JNK. Nuestro análisis de la interacción genética entre acal y bsk (JNK) sugieren que acal actúa a nivel de JNK, ya que al disminuir la dosis génica de esta cinasa se rescata el fenotipo mutante de acal (Figura 16E). Esto mismo se ha demostrado para raw, durante la formación de la gónada de los machos (Jemc et al., 2012). También se ha sugerido que raw actúa al nivel de Jun, por debajo de JNK en el cerrado dorsal (Bates et al., 2008). Con base en estos antecedentes, planteamos la hipótesis que raw, y por lo tanto acal, 68 podrían actuar sobre algún mediador de JNK y de Jun. JNK activa directamente a Jun, facilitado por la proteína de andamiaje Cka (Chen et al., 2002). Si acal y raw regularan la expresión de Cka, esto explicaría por qué se ha visto que raw actúa al nivel de JNK y también al nivel de Jun. Para probar esto, cuantificamos la expresión de Cka en embriones silvestres, y en embriones mutantes de acal y de raw. Consistente con nuestra hipótesis, la expresión de Cka se incrementa aproximadamente 50% en los embriones mutantes con respecto a los silvestres (Figura 20A). Esto se reafirma al analizar interacciones genéticas con mutantes de acal, ya que la heterocigosis de Cka rescata fuertemente los defectos en el cerrado dorsal de los mutantes de acal (Figura 20B). En conjunto, estos datos indican que la sobre-expresión de Cka en los mutantes de acal (y de raw) son causales de los defectos en el cerrado dorsal de estos embriones. Utilizando un transgén que sobre-expresa Cka bajo un promotor de choque térmico (HS-Cka), encontramos que la sobre-expresión de Cka es suficiente para inducir defectos en el cerrado dorsal (Figura 20C-D). Con esto, proponemos que raw y acal regulan la expresión de Cka, y que en los mutantes, la sobre-expresión de Cka resulta en un cerrado dorsal defectuoso. Para corroborar la cascada de regulación raw-acal-Cka, analizamos si el silenciamiento de Cka con RNA de interferencia (Cka-IR) es capaz de rescatar el fenotipo mutante de raw. Con este fin, seguimos la expresión de dpp, gen blanco de la vía de JNK. En embriones silvestres, dpp se expresa en las células de la hilera líder durante el cerrado dorsal (Figura 20E). En los mutantes de raw, como la vía de JNK se activa de manera ectópica, la expresión de dpp se extiende a toda la epidermis lateral (Figura 20F). Sin embargo, al silenciar la expresión de Cka (utilizando en-gal4, que se expresa en la epidermis en un patrón segmentado), observamos que la expresión de dpp se restringe a la hilera líder en las regiones en que se expresa gal4, al igual que cuando expresamos una forma silvestre de raw en ese mismo patrón (Figura 20G-H). Estos experimentos confirman que en los mutantes de raw (y de acal) Cka se sobre-expresa, resultando en la activación ectópica de la vía de JNK. 69 Figura 20. acal y raw regulan la expresión de Cka. (A) Expresión relativa de Cka, determinada por PCR en tiempo real. Se muestra el promedio de tres experimentos independientes, corridos en duplicado. (B) Interacción genética entre Cka y acal. Número de animales analizados: Cka+/+,acal2/2=192, Cka1/+,acal2/2=219, Cka+/+,acal5/5=391, Cka1/+,acal5/5=171. (C) La sobre-expresión de Cka por choque térmico induce defectos en el cerrado dorsal. Número de animales analizados: yw, 25ºC=526, yw, 29ºC=591, HS-Cka, 25ºC=2006, HS-Cka, 29ºC=3227. (D) Confirmación de la sobre-expresión de Cka por PCR en tiempo real. Se muestra el promedio de tres experimentos independientes, analizados por duplicado. La significancia se calculó usando t de Student (A, D) y χ2 (B, C). (E–H) Todos los embriones son vistas laterales, con aterior a la izquierda. En embriones silvestres, dpp se expresa en las células de la hilera líder (flecha, E). En embriones mutantes para raw, la expresión de dpp se extiende a células más laterales de la epidermis (flecha, F). La línea en- gal4 se expresa en la región posterior de cada segmento, sin embargo no afecta el fenotipo mutante de raw por sí misma. La expresión de una copia silvestre de raw-RA con la línea en- gal4 (en>raw-RA) abate la expresión de dpp en los embriones mutantes de raw, en la región donde se expresa en-gal4 (cabezas de flecha, G). Similarmente, la expresión de un RNAi contra Cka (Cka-IR) con la línea en-gal4 impide la expresión ectópica de dpp en el patrón de en-gal4 (cabezas de flecha, H). 70 8. acal y raw regulan la expresión de aop, un factor de transcripción regulador de la vía de JNK. De acuerdo con nuestros resultados y con trabajos previos, acal y raw se expresan en la epidermis lateral, e impiden la activación de la vía de JNK en ese tejido. En la epidermis, también se expresa anterior open (aop), un factor de transcripción que regula ampliamente el cerrado dorsal. Su expresión en la epidermis lateral mantiene el tejido en un estado post-mitótico (Riesgo-Escovar y Hafen, 1997b). Además, en las células de la hilera líder, Aop impide la expresión prematura de genes blanco de la vía de JNK. Luego de la activación de JNK, ésta fosforila a Aop e induce su degradación, permitiendo la expresió de genes blanco (Rebay y Rubin, 1995). Sin embargo, la expresión de Aop en el resto de la epidermis debe mantenerse para impedir la proliferación. En los mutantes de aop, se observan mitosis persistentes en la epidermis, además de expresión ectópica de los blancos de la vía de JNK, por lo que es un punto nodal en la regulación del cerrado dorsal. Por estas razones, decidimos analizar la relación entre acal y aop, por medio de interacciones genéticas. La heterocigosis de aop no altera el fenotipo mutante de acal, pero la heterocigosis de acal suprime fuertemente el fenotipo mutante de aop, sugiriendo que acal actúa antes que aop (Figura 21A). Decidimos explorar si la expresión de aop está alterada en los mutantes de acal, como sucede con Cka. Por medio de PCR en tiempo real, encontramos que en los mutantes de acal y de raw, aop se encuentra 2 veces sobre- expresado (Figura 21B). Estos resultados muestran que acal actúa por arriba de aop, regulando su expresión. También, estos resultados muestran que acal regula tanto componentes positivos (Cka) como positivos/negativos (aop) de la vía de JNK, implicando una regulación muy fina de la activación de la vía. 71 Figura 21. aop actúa río abajo de acal. (A) Interacción genética entre acal y aop. Número de animales analizados: aop+/+,acal5/5=391, aop1/+,acal5/5=253, aop1/1,acal+/+=269, aop1/1,acal5/+=185. (B) Expresión relativa de aop en embriones silvestres y mutantes para acal y raw. Se muestra el promedio de tres experimentos independientes, corridos por duplicado. (C) Expresión de aopACT en embriones silvestres y mutantes para acal. Para dirigir la expresión de aopACT se usó 69B-gal4 (expresión en todo el ectodermo) o pnr-gal4 (expresión en la epidermis lateral). La significancia se determinó usando χ 2 (A, C) y t de Student (B). En un trabajo previo, se describió que la expresión de una forma constitutivamente activa de aop (aopACT) resulta en defectos en el cerrado dorsal, debido a que aopACT no permite la expresión de los blancos de JNK en las células de la hilera líder, a pesar de que la vía está activada (Riesgo-Escovar y Hafen, 1997b). Como nuestros resultados muestran que acal es parcialmente un inhibidor de la vía de JNK, predecimos que expresar aopACT en un fondo mutante para acal, podría resultar en defectos en el cerrado dorsal menos pronunciados, ya que la sobre-expresión de la vía de JNK en los mutantes de acal contrarrestaría la presencia de aopACT. Efectivamente, la expresión de aopACT en todo el ectodermo de embriones homocigotos mutantes para acal produce fenotipos menos pronunciados que cuando expresamos aopACT en embriones silvestres (Figura 21). Este rescate es más fuerte si la expresión de aopACT es más restringida, expresándolo sólo en la epidermis lateral (Figura 21C). Con este experimento, demostramos que como balance general, acal impide la activación de la vía de JNK. Además, para confirmar que acal regula la expresión de Cka y de aop, analizamos la expresión de estos genes tras sobre-expresar acal en embriones silvestres, utilizando 69B-gal4 para dirigir la expresión en todo el ectodermo. Encontramos que 72 efectivamente, la sobre-expresión de acal inhibe la expresión de Cka y aop (Figura 22). La sobre-expresión de acal en embriones silvestres es viable, lo cual significa que a pesar de que la expresión de Cka y de aop se encuentre reducida, aún es suficiente para cubrir los requerimentos de estos genes. Figura 22. La sobre-expresión de acal inhibe la expresión de Cka y aop. Se determinó por qPCR la expresión de Cka y de aop en embriones control (UAS-acal/+) y embriones que sobre-expresan acal en todo el ectodermo (69B>acal). Se grafica el promedio de 3 experimentos (Cka) y 4 experimentos (aop) independientes, +/- error estándar. 9. acal y raw interactúan genéticamente con Polycomb. Como hemos demostrado en este trabajo, en los mutantes de acal se sobre-expresan dos componentes de la vía de señalización de JNK: Cka y aop. Muchos RNAs no codificantes largos regulan la expresión génica, aunque generalmente actúan como moduladores o reguladores “finos” de la expresión (Batista y Chang, 2013; Gummalla et al., 2012). Los lncRNAs pueden regular la expresión de genes aledaños (función en cis) o pueden actuar en sitios lejanos al propio (función en trans), interactuando con complejos remodeladores de la cromatina para activar o inhibir la expresión. Con base en nuestros resultados, planteamos la hipótesis de que acal actúa en trans, ya que nuestras construcciones de rescate genómico y de sobre-expresión (UAS-acal) no están insertadas en el sitio endógeno donde se encuentra acal, y aún así son capaces de rescatar los defectos en el cerrado dorsal. Similarmente, el locus de acal se 73 encuentra muy lejano al de Cka o al de aop (asumiendo que acal regulara su expresión de manera directa), obligando una función en trans. Uno de los complejos remodeladores de la cromatina capaces de interactuar con lncRNAs es el complejo represivo de Polycomb 1 (PRC1). Este complejo inhibe la expresión génica al inducir la tri-metilación de la lisina 27 de la histona 3 (H3K27me3), una marca de compactación de la cromatina (Rinn y Chang, 2012). Este complejo se describió inicialmente en Drosophila, y está altamente conservado en metazoarios (Schwartz y Pirrotta, 2013). El primer componente de este complejo en ser identificado fue Polycomb (Pc). En contraste a los machos silvestres, que poseen un peine sexual en el par de patas más anterior, un porcentaje de los machos heterocigotos mutantes de Pc también tienen peines sexuales en el segundo y tercer par de patas [(Lewis, 1978) Figura 23A-B)]. Esta transformación homeótica se debe a que normalmente PRC1 reprime ciertos genes en el segundo y tercer par de patas, inhibiendo la identidad de “pata anterior”, y en los mutantes de Pc, esta represión se pierde (Castelli- Gair y Garcia-Bellido, 1990). El fenotipo mutante de Pc es muy sensible a una adicional pérdida de función: Si otros componentes de PRC1 no están presentes, la transformación homeótica es más fuerte. Al ser un fenotipo dominante y fácilmente visible, Pc ha sido una herramienta muy útil para identificar elementos que interactúan con PRC1 (Ferres-Marco et al., 2006). Para explorar si acal podría regular a sus genes blanco en conjunto con PRC1, estudiamos la frecuencia del fenotipo de peines ectópicos de Pc. Para confirmar la cascada de regulación, analizamos también si raw modifica el fenotipo de Pc. Encontramos que raw1, una mutación fuerte de raw, exacerba significativamente el fenotipo mutante de Pc. Similarmente, acal5, que es el alelo mutante más fuerte de acal, también exacerba significativamente el fenotipo mutante de Pc en las patas (Figura 23C). Resultados similares se observan en el segundo y tercer par de patas. 74 Figura 23. Polycomb interactúa genéticamente con acal y con raw. (A) Patas de un macho silvestre. Los números indican el número de pata de anterior a posterior, y el asterisco marca el peine sexual en la pata 1. El recuadro en la pata 2 se amplifica en (A’). (B) Patas de un macho heterocigoto para Pc3. Los números indican el número de pata de anterior a posterior, y el asterisco marca el peine sexual en la pata 1. El recuadro en la pata 2, con peines sexuales ectópicos, se amplifica en (B’). (C) Cuantificación del número de cerdas por peine en la pata 2 y en la pata 3. Se grafica el promedio de 10 moscas por condición, +/- error estándar. La significancia se determinó usando t de Student. Adicionalmente, analizamos si ese fenotipo se observa en los mutantes de Cka y aop, genes río abajo de acal. Observamos que mutaciones en Cka no alteran significativamente el fenotipo mutante de Pc, y la heterocigosis de aop no modifica significativamente el fenotipo mutante de Pc en el segundo par de patas, aunque lo suprime significativamente en el tercer par. Esto podría deberse a que aop, al ser un gen con muchas funciones, actuando como represor transcripcional, podría también interactuar con PRC1, independiente de acal/raw. En este caso, la interacción genética 75 ocurre en sentido contrario a la interacción entre Pc y acal/raw. Además de estos resultados, al obtener los individuos doble heterocigotos para acal o raw y para Pc, encontramos un nuevo fenotipo altamente penetrante: El compartimento posterior de las alas de estos animales se observa atrofiado, haciendo que las alas se curven en dirección posterior (Figura 24A’-B’). Para cuantificar esta curvatura, medimos el ángulo formado en las intersecciones de la vena 1 con la vena 2, y de la vena 1 con la vena 3 (Figura 24E-F). Este fenotipo se observa en mutantes de Pc heterocigotos para acal o para raw, pero no en heterocigotos para Cka o para aop (Figura 24C’-D’). Figura 24. Los animales doble heterocigotos para Pc y acal o raw presentan defectos en las alas. (A-D) Alas de moscas hembras heterocigotas para acal (A), raw (B), Cka (C) y aop (D). (A’-D’) Alas de moscas hembras doble heterocigotas para Pc y para acal (A’), raw (B’), Cka (C’) y aop (D’). En (A’) y (B’), las flechas muestran la reducción en el compartimento posterior del ala. (E) Ala de mosca heterocigota para Pc. Para medir la curvatura de las alas con fenotipo mutante se midió el ángulo entre las venas 1 y 3, como se esquematiza con líneas punteadas (“ángulo del ala”). (F) Cuantificación del “ángulo del ala”. Se grafica el promedio de 10 moscas hembras por condición. La significancia se determinó usando t de Student. Estos resultados sugirieren que la cascada de raw-acal participa con PRC1 para regular la expresión génica durante el desarrollo de las alas, como posiblemente lo 76 hacen en otros procesos como el cerrado dorsal. Como se menciona anteriormente, los RNA no codificantes largos también pueden regular la expresión de genes aledaños (en cis). acal se localiza entre dos silenciadores epigenéticos, lola y psq, y los defectos en el cerrado dorsal en los embriones mutantes de acal podrían deberse a fallas en la regulación de estos genes. Tanto lola como psq han sido ampliamente estudiados, y los embriones mutantes para cualquiera de estos genes no presentan defectos en el cerrado dorsal. Sin embargo, es posible que la sobre-expresión de estos genes resulte en defectos en el cerrado dorsal, como los que observamos en acal. Bajo esta hipótesis, Cka y aop estarían río abajo de lola o psq. Para explorar esta posibilidad, decidimos sobre-expresar lola y psq en embriones silvestres. Utilizamos una inserción localizada en el primer intrón de lola, que posee dos secuencias UAS, una apuntando hacia lola, y la otra apuntando hacia psq. Se ha demostrado que esta línea, llamada GS88A8, es capaz de sobre-expresar simultáneamente a lola y a psq usando diferentes líneas gal4 (Ferres-Marco et al., 2006). Figura 25. Sobre-expresión de lola y psq en embriones silvestres. Se usó la línea GS88A8 (88A8) que posee una secuencia UAS apuntando a lola y una secuencia UAS apuntando a psq, y la línea 69B, que expresa gal4 en todo el ectodermo. Número de animales analizados: yw = 526, 69B>88A8 = 544. 77 Al sobre-expresar a lola y a psq en todo el ectodermo de embriones silvestres, no encontramos defectos en el cerrado dorsal (Figura 25). La sobre-expresión de ambos genes resulta en una letalidad parcial en etapas de larva y de pupa, aunque algunos organismos logran eclosionar como adultos. Aún así, no se observan defectos relacionados con el cerrado dorsal, o incluso con el cerrado torácico. Estos resultados indican que la participación de acal en el cerrado dorsal es independiente de lola y psq, aún si acal regula la expresión de estos dos genes en otros contextos. 10. Análisis del transcriptoma de los embriones mutantes de acal. Hasta ahora, hemos mostrado que acal podría regular la vía de JNK inhibiendo la expresión de dos genes: Cka y aop. Los RNAs no codificantes largos pueden regular ampliamente la expresión génica al interactuar con complejos remodeladores de la cromatina. De hecho, nuestras interacciónes génicas con Polycomb apoyan que acal regula la expresión génica junto con el complejo PRC1. Para conocer que otros genes podrían ser regulados por acal, aislamos RNA total de embriones silvestres y mutantes, removimos los RNAs ribosomales, y generamos una biblioteca de fragmentos de cDNAs para secuenciarlos con el sistema de Illumina, de secuenciación masiva de ácidos nucleicos. Para este análisis, elegimos el alelo acal2, ya que tiene una penetrancia relativamente alta y es de los mejor caracterizados molecular y genéticamente. Además, decidimos analizar embriones de todas las etapas del desarrollo, para explorar otros procesos en los que acal pudiera participar. Los embriones silvestres y mutantes se colectaron al mismo tiempo y en las mismas condiciones, y realizamos triplicados biológicos. De cada experimento, obtuvimos alrededor de 50 millones de lecturas, de las cuales, alrededor del 40% fueron mapeadas exitosamente al genoma. Dada la alta sensibilidad de este tipo de secuenciación, siempre se obtienen lecturas no mapeables, ya que corresponden a más de una posición en el genoma, o no poseen suficiente calidad para ser mapeadas exitosamente. Las lecturas mapeadas al genoma cubren en su 78 totalidad los genes anotados en la referencia genómica (13,889 genes), lo cual muestra la alta sensibilidad del ensayo. Del total de los genes, encontramos 147 que muestran expresión significativamente diferente en los embriones mutantes contra los silvestres (aproximadamente el 1% de los genes, Figura 26A). De los genes con expresión significativamente diferente, 75 tienen una menor expresión en los mutantes, mientras que 72 tienen una mayor expresión. En primer lugar, analizamos la expresión de los genes que se ha reportado que participan en la vía de JNK (Figura 26B). De acuerdo a nuestros experimentos anteriores, Cka y aop se encuentran sobre-expresados en los embriones mutantes de acal. A pesar de que ambos genes muestran un incremento en la expresión similar a lo que observamos en nuestros resultados de qPCR, únicamente aop mostró una diferencia significativa (Figura 26E). Cka muestra una tendencia al aumento en la expresión, pero esta diferencia no es significativa. Posiblemente se requiere un mayor número de repeticiones para disminuir la dispersión de los datos. Destaca que aop es el único gen de la vía de JNK que muestra una expresión significativamente diferente, corroborando nuestros experimentos anteriores. Se sabe que además de la vía de JNK, durante el cerrado dorsal se requiere la activación de la vía de Dpp. De hecho, dpp es un gen blanco de la vía de JNK. De acuerdo a nuestros resultados, ningún gen de la vía de señalización de Dpp se expresa de manera significativamente diferente en los embriones mutantes de acal (Figura 26C). Además, el cerrado dorsal depende mecánicamente de proteínas del citoesqueleto que actúan como efectores, modificando la forma celular. El análisis transcriptómico muestra que ningún gen del citoesqueleto cambia significativamente su expresión en los embriones mutantes de acal (Figura 26D). Estos resultados confirman que acal regula específicamente la vía de JNK, y que los defectos en el cerrado dorsal se deben a esta función y no a un papel en la vía de Dpp o a la regulación de componentes del citoesqueleto. 79 Figura 26. Análisis del transcriptoma de los embriones mutantes de acal. (A) Gráfica de volcán del transcriptoma completo, comparando la expresión en embriones silvestres y mutantes para acal. Se muestra la interpretación de los ejes X y Y en ésta y en otras gráficas de volcán. (B) Gráfica de volcán de la expresión de los genes de la vía de JNK. (C) Gráfica de volcán de la expresión de los genes de la vía de Dpp. (D) Gráfica de volcán de la expresión de genes de componentes del citoesqueleto. (E) Expresión de Cka y aop en embriones mutantes para acal con respecto a la expresión en embriones silvestres, como se determinó por medio de secuenciación masiva de RNA. 80 11. Participación de acal en otros procesos del desarrollo: Defectos en la formación del sistema nervioso de los embriones mutantes de acal. Además de analizar los genes involucrados en el cerrado dorsal en los embriones mutantes de acal, estudiamos las funciones de los genes que mostraron una expresión significativamente diferente en los experimentos de secuenciación masiva de RNA. Este es un análisis no sesgado de qué genes están alterados en los embriones mutantes, y su clasificación nos permite esclarecer otras funciones de acal durante el desarrollo. Para este análisis, analizamos el vocabulario controlado del proyecto de “Gene Ontology”. El proyecto de “Gene Ontology” tiene como finalidad facilitar el estudio de miles de genes de manera simultánea, ya que a cada gen se le asignan categorías relacionadas con su función biológica. Con este vocabulario controlado, podemos determinar si en un grupo de genes de interés (en este caso, los genes de expresión diferencial), está sobre-representada alguna categoría de vocabulario controlado, y por lo tanto descubrir si alguna función biológica en particular se encuentra alterada en los embriones mutantes de acal (Ashburner et al., 2000; St Pierre et al., 2014). Tomamos los 147 genes con una expresión significativamente diferente, y analizamos el enriquecimiento de categorías de vocabulario controlado. Encontramos varios términos sobre-representados en nuestra lista de genes de expresión diferencial, y de manera general, estos términos se pueden clasificar en tres categorías: Desarrollo neural (26 genes), ciclo celular y división celular (24 genes), y desarrollo de la cutícula (18 genes, Figura 25). La mayoría de los genes de expresión diferencial que caen en las categorías de desarrollo neural y de ciclo celular y división celular, se encuentran sobre-expresados. En contraste, los genes de expresión diferencial involucrados con el desarrollo de la cutícula, están reprimidos con respecto al transcriptoma control. La sobre-representación de genes involucrados en el desarrollo neural va en línea con los experimentos de expresión y de rescate de acal. Estos resultados muestran que acal se requiere en todo el ectodermo durante la embriogénesis (Figura 10), y que se expresa en el sistema nervioso desde las etapas de elongación y retracción de la 81 banda germinal, e incluso una vez concluido el cerrado dorsal (Figura 13). El análisis transcriptómico apoya que acal también está involucrado en el desarrollo del sistema nervioso, ya que en los embriones mutantes se desregula la expresión de genes involucrados requeridos durante el desarrollo neural. Figura 27. Categorías sobre-representadas en los genes de expresión diferencial. Gráficas de volcán mostrando la expresión de genes involucrados en desarrollo neural, desarrollo de la cutícula, y ciclo celular y división celular. También encontramos que muchos genes involucrados con el desarrollo de la cutícula tienen una menor expresión en los embriones mutantes que en los silvestres. La cutícula es secretada por la epidermis; su secreción comienza en el estadio 16, una vez que la epidermis se encuentra completamente diferenciada y que se completó el cerrado dorsal (Campos-Ortega y Hartenstein, 1997). De hecho, la secreción de la cutícula es un marcador de diferenciación de la epidermis. Nuestro análisis indica que en los mutantes de acal, la diferenciación de la epidermis se encuentra al menos retrasada. En embriones mutantes para aop se observa un fenómeno similar, ya que en la epidermis lateral de estos embriones hay divisiones celulares persistentes en las etapas del cerrado dorsal (Riesgo-Escovar y Hafen, 1997b). Al igual que la secreción de cutícula, el arresto del ciclo celular es un indicador de la diferenciación de la epidermis. 82 Finalmente, encontramos que muchos genes involucrados en el ciclo celular y en la división celular se encuentran sobre-expresados en los mutantes de acal (Figura 27). La diferenciación incompleta de la epidermis (y la inhibición de genes cuticulares) podría deberse a que este tejido continúa proliferando en etapas tardías. También contemplamos la posibilidad de que acal regule la proliferación en el desarrollo neural, ya que la formación del sistema nervioso depende en gran medida de la división controlada de neuroblastos que dan lugar a diversos linajes neurales (Campos-Ortega y Hartenstein, 1997). Figura 28. Defectos en el sistema nervioso en los embriones mutantes de acal. Se hicieron tinciones por inmunofluorescencia con 22C10, que marca el sistema nervioso central y el periférico (SNC y SNP), y con BP102, que marca los axones del SNC. La línea yw se uso como control silvestre. Analizamos el sistema nervioso de los embriones mutantes de acal, para observar si nuestros datos de secuenciación masiva de RNA eran consistentes con los fenotipos en este tejido. Para esto, hicimos inmuno-tinciones usando dos anticuerpos: 22C10, cuyo epítopo se expresa en las neuronas del sistema nervioso central y del periférico, y BP102, que marca los axones del sistema nervioso central. Encontramos que de acuerdo a lo esperado, los mutantes de acal tienen importantes defectos en la formación del sistema nervioso. Algunos de estos defectos son la formación de proyecciones aberrantes, sobre-proliferación o ausencia de tejido neural en algunas regiones del embrión (Figura 28). Estos fenotipos van de acuerdo con el análisis 83 transcriptómico, donde encontramos muchos genes neurales y del ciclo celular sobre- expresados en los embriones mutantes. También, explica por qué hay embriones que mueren sin defectos en la cutícula. 12. Defectos en el sistema nervioso de las larvas mutantes de acal. Las mutaciones en acal resultan en defectos en el cerrado dorsal y en el desarrollo del sistema nervioso, consistente con la expresión de acal, analizada por hibridación in situ. Sin embargo, existen animales homocigotos que eclosionan, y que mueren durante estadios larvarios. Ya que sabemos que acal continua expresándose en el sistema nervioso durante estadios embrionarios tardíos, decidimos explorar si en las larvas existen defectos en este tejido. Figura 29. Fenotipos mutantes de acal en estadios post-embrionarios. (A) Larvas control acal1/+ y homocigotas para acal1. (B) Pupas control acal1/+ y homocigotas para acal1. (C) Cerebros larvarios control acal1/+ y homocigotas para acal1. (C’) y (C’’) son magnificaciones de (C). (A-C) Se tomó en una sola fotografía el control y el mutante, para ilustrar las diferencias en tamaño. (D) Cuantificación de la letalidad embrionaria, larvaria, y de pupa de los organismos homocigotos mutantes para acal. Número de animales analizados: acal1/1= 217, acal2/2= 192, acal3/3= 110, acal4/4= 329, acal5/5= 391. 84 Observamos que algunas larvas sobreviven hasta el tercer estadio larvario, y que además, este estadio se extiende más allá del periodo normal de dos días. Por la misma razón, estas larvas continúan creciendo (Figura 29A). Eventualmente, dichas larvas inician la formación de la pupa, pero una vez que comienzan a formar el pupario, mueren con evidencia de necrosis en el interior (Figura 29B). Al disecar el cerebro de las larvas mutantes, observamos una hiperplasia del sistema nervioso, particularmente de los ganglios supraesofágicos en comparación a sus hermanos heterocigotos (Figura 29C-C’’). En los alelos donde hay una mayor sobrevivencia embrionaria, este fenotipo es más penetrante. Esto tiene sentido, ya que los alelos con alta letalidad embrionaria son más fuertes y la mayoría de los animales muere antes de llegar a estadios larvarios tardíos (Figura 29D). Durante el desarrollo larvario, las células del cerebro continúan proliferando. En la parte más externa de los lóbulos supra-esofágicos se localiza un epitelio conocido como neuro-epitelio, del cual se delaminan algunas células para formar neuroblastos. Esta proliferación es evidente sobre todo hacia el final de la etapa larvaria, y durante la metamorfosis. Estos neuroblastos atraviesan al menos una ronda de división celular para formar células madre ganglionares; estas se dividen entonces para formar células diferenciadas: neuronas y glía (Campos-Ortega y Hartenstein, 1997; Li et al., 2013). Como los cerebros de las larvas mutantes para acal son más grandes que los cerebros silvestres, quisimos explorar si este fenotipo se debe a una sobre-proliferación de los precursores neurales. Para esto, realizamos inmuno-tinciones contra Miranda, un marcador de neuroblastos involucrado en la división asimétrica de los mismos. Al mismo tiempo, analizamos la distribución de DE-Cadherina (DE-Cad), un marcador de neuroepitelio. Observamos que en los cerebros mutantes de acal, se observa una disminución de neuroepitelio, con un aumento concomitante en el número de neuroblastos (Figura 30). 85 Figura 30. Diferenciación de precursores neurales en cerebros larvarios silvestres y mutantes. En cada panel, se muestra un lóbulo supra-esofágico de larvas de tercer estadio. Comparado con el control (acal1/+), los cerebros de larvas homocigotas mutantes muestran un incremento en el número de neuroblastos (Miranda), y menos neuroepitelio (DE-Cad). Resultados similares se encontraron en los diferentes alelos mutantes de acal, y en cruzas trans-heterocigotas. Del aumento en el número de neuroblastos podemos inferir que existe una sobre-proliferación de tejido neural que lleva a la hiperplasia de los lóbulos supra-esofágicos. Cabe señalar que esta sobre-proliferación se observa incluso antes de que el cerebro sea visiblemente hiperplásico (Figura 30). Además, estos resultados sugieren que acal se requiere para regular la transición de neuroepitelio a la formación de neuroblastos. 13. Identificación de genes involucrados en la hiperplasia del sistema nervioso en embriones y larvas mutantes para acal. El análisis del transcriptoma de los embriones mutantes de acal reveló que muchos de los genes sobre-expresados en los mutantes participan en el desarrollo neural. Dentro de estos genes, encontramos dos con funciones cruciales durante la neurogénesis: Delta (Dl) y lethal (2) giant larvae (l(2)gl). Dl es una proteína de membrana que activa la vía de señalización de Notch en células vecinas. Los neuroblastos expresan Dl, que 86 activa la vía de Notch en células aledañas, inhibiendo su diferenciación hacia el linaje neural, y promoviendo la diferenciación hacia otros tipos celulares (Fiuza and Martinez- Arias, 2007). Dl y la vía de Notch se requieren después en repetidas ocasiones para la diferenciación de diferentes componentes del sistema nervioso central y periférico. Por su parte, l(2)gl es también una proteína de membrana involucrada en el establecimiento de la polaridad celular y en la arquitectura epitelial. Las mutaciones en l(2)gl impiden la segregación de determinantes celulares, importantes para la diferenciación neuronal, y promueven una transición epitelio-mesénquima (Bilder et al., 2000). Como en los cerebros de larvas mutantes de acal observamos un aumento en el número de neuroblastos, y una menor cantidad de neuroepitelio, pensamos que esto podría deberse a la sobre-expresión de Dl, o a la inhibición de l(2)gl. Para determinar esto, analizamos la expresión de ambos genes por PCR en tiempo real, tanto en embriones –en parte para corroborar los resultados de la secuenciación masiva– como en cerebros larvarios, para determinar si su expresión es también relevante en estas etapas del desarrollo (Figura 31). Por medio de qPCR, pudimos confirmar que los niveles de RNA mensajero de Dl son mayores en embriones mutantes que en los silvestres, no sólo en embriones mutantes de acal2, empleados en el análisis transcriptómico, sino también en embriones acal1 y acal5. Similarmente, los niveles de mRNA de l(2)gl en los embriones mutantes para acal1, acal2 y acal5 son menores que en los embriones silvestres (Figura 31A). En contraste, al analizar la expresión de estos mismos genes en los cerebros larvarios, encontramos que la expresión de Dl no cambia significativamente entre la condición silvestre y mutante. La expresión de l(2)gl sí se encuentra fuertemente disminuida en los cerebros mutantes (Figura 31B). Este resultado sugiere que l(2)gl juega un papel importante en los defectos del sistema nervioso, ya que sus niveles disminuyen tanto en etapas embrionarias como larvarias. Como Dl se requiere para la diferenciación del sistema nervioso durante la embriogénesis, su des-regulación en las etapas embrionarias podría formar parte del origen de las alteraciones subsecuentes en el desarrollo larvario, en donde los 87 neuroblastos proliferan aberrantemente. De este modo, aunque no hayamos encontrado diferencias en la expresión de Dl en cerebros larvarios, los defectos que ocurrieron en el desarrollo embrionario, donde la expresión de Dl si está alterada, se reflejan en una mayor proliferación de neuroblastos. Dl se requiere para diferenciar neuroblastos del epitelio neural precursor, los que una vez ya ‘diferenciados’ en neuroblastos aberrantemente, generarán fenotipos más extremos en la vida larvaria, aunque la expresión de Dl no varie significativamente entonces. Sin embargo, es necesario realizar más experimentos para determinar si efectivamente los cambios en la expresión de Dl en etapas embrionarias, influye en el fenotipo larvario Figura 31. Determinación por qPCR de la expresión de Dl y l(2)gl en animales silvestres y mutantes. (A) Expresión relativa de Dl (izquierda) y de l(2)gl (derecha) en embriones control (yw) y mutantes para acal. (B) Expresión relativa de Dl (izquierda) y de l(2)gl (derecha) en cerebros larvarios control (yw) y mutantes para acal. Debido a que acal5 es letal embrionario, sólo se determinó la expresión embrionaria para dicho alelo. La expresión urales disminuyen tanto en etapas embrionarias como larvarias. Se muestra el promedio de tres experimentos independientes, realizados por duplicado. La significancia se determinó con pruebas de t de Student. 88 Los embriones mutantes para lola, el gen más cercano a acal en su extremo 3’, tienen defectos en la formación del sistema nervioso, y la sobre-expresión de lola resulta en hiperplasia del sistema nervioso en diferentes etapas del ciclo de vida de la mosca. Figura 32. Expresión de las isoformas de lola en embriones silvestres y mutantes para acal. (A) Representación esquemática del locus de lola y de sus 26 isoformas. Cada isoforma corresponde a la letra graficada en (B). (B) Expresión de las isoformas de lola en embriones mutantes para acal2, con respecto a la expresión en embriones silvestres. Se grafica el promedio de los tres experimentos independientes de secuenciación masiva, +/- error estándar. (C) Validación de la expresión de las isoformas R/G y T/U por qPCR. Se grafica el promedio de tres experimentos independientes, corridos por duplicado. La significancia se determinó con pruebas de t de Student. 89 A pesar de que nuestros resultados muestran que durante el cerrado dorsal acal actúa de manera independiente a lola y psq, decidimos analizar si la expresión de estos genes está alterada en los mutantes de acal. De existir estas alteraciones, esto sugeriría que acal tiene funciones tanto en cis como en trans, como ya se ha demostrado para otros lncRNAs, y podría ser parte de la explicación del fenotipo tumoral que observamos en el sistema nervioso (junto con los efectos en Dl y en l(2)gl). Para analizar la expresión de lola en los embriones mutantes de acal, como primer abordaje recurrimos a nuestros resultados de secuenciación masiva de RNA. lola es un gen de una gran complejidad, ya que el locus tiene una longitud de 60 kilobases, y codifica para 22 factores de transcripción diferentes (cada uno con un dominio de unión al DNA diferente), a partir de 26 isoformas generadas por “splicing” alternativo (Figura 32A). Además, se ha demostrado que algunas isoformas de lola tienen funciones antagónicas entre sí, por lo que decidimos analizar la expresión de cada una de ellas. Desafortunadamente, los modelos estadísticos empleados en el análisis de datos de secuenciación masiva tienen una baja sensibilidad para encontrar diferencias significativas en loci complejos como el de lola. Esto se debe a que es difícil cuantificar una lectura determinada si ésta cae en un exón compartido por varias isoformas, lo cual, en el caso de lola, es extremadamente común. Sin embargo, encontramos dos isoformas cuya expresión cambia en los embriones mutantes: lola-G y lola-I. lola-G es 400% más abundante en embriones mutantes que en silvestres, mientras que la expresión de lola-I se encuentra completamente abatida (Figura 32). Por medio de PCR cuantitativa, analizamos la expresión de lola-G. Debido a que esta isoforma comparte casi todos sus exones con lola-R, es imposible amplificar únicamente una de las dos. Sin embargo, ambas isoformas comparten la misma secuencia codificante (Figura 32A). La expresión de lola-R/G es significativamente diferente en embriones mutantes para acal1 (Figura 32C). En los alelos acal2 y acal5, no encontramos una diferencia significativa, aunque la tendencia es similar a la de acal1. 90 Figura 33. Resumen de las funciones de acal durante el desarrollo embrionario. En la parte central, se muestra un embrión en estadio 13. En azul, se esquematiza la epidermis y en morado, el sistema nervioso. (A) Se muestran los tres tejidos involucrados en el cerrado dorsal, con acal actuando en la epidermis lateral. (B) Modelo del mecanismo de acción de acal en el cerrado dorsal. Raw induce la expresión de acal, que en conjunto con Pc, regula la expresión de Cka y de aop en un mecanismo en trans. (C) Esquema de la función de acal en el sistema nervioso. acal regula al menos indirectamente la expresión de Dl, l(2)gl, y de dos isoformas de lola, para regular la diferenciación neuronal. 91 Sorprendentemente, los niveles aumentan alrededor de 1500% con respecto al control, en los tres alelos. Para corroborar que este aumento tan dramático es real, y no algún artefacto en la preparación del cDNA o en la qPCR, analizamos la expresión de una isoforma que por RNA-seq no muestra cambios significativos: lola-T/U (al igual que las isoformas G y R, las isoformas T y U comparten la misma secuencia codificante). En el caso de estas isoformas, encontramos una abundancia similar en embriones silvestres y mutantes (Figura 32C). Este resultado sugiere que acal regula la expresión de al menos algunas isoformas de lola, y que en los embriones mutantes, la desregulación de lola podría ocasionar los defectos en la formación del sistema nervioso observado en dichos animales. Bajo esta premisa, acal tendría una función en trans, regulando genes que participan en el cerrado dorsal, y una función en cis, regulando la expresión de al menos lola durante la formación del sistema nervioso (resumido en la Figura 33). 92 XIII. DISCUSIÓN. En este trabajo caracterizamos un RNA no codificante largo (lncRNA), acal, con requerimentos durante el desarrollo de Drosophila melanogaster. Las mutaciones en acal son letales en estadios embrionarios y larvarios. Salvo algunos ejemplos de microRNAs, como bantam y bereft (Brennecke et al., 2003; Hardiman et al., 2002), la identificación por mutagénesis al azar de un RNA no codificante vital, no ha sido común en ningún modelo experimental. En el caso de los lncRNAs, esto se debe a que suelen tener una expresión muy baja, no poseen secuencias consenso o predecibles que faciliten su identificación, y su contribución fenotípica suele ser mucho menor que la de otro tipo de genes. Estas características han dificultado su estudio, por lo que se conoce muy poco de sus funciones e importancia biológica. Por lo tanto, el estudio de acal no sólo es útil en el campo del desarrollo embrionario, sino también en la profundización de la biología de esta gran familia génica. En contraste con otros tipos de RNAs, como los RNAs no codificantes pequeños, los lncRNAs no poseen secuencias evidentes (secuencias consenso, palindrómicas o altamente conservadas) que faciliten su identificación (Derrien et al., 2012). La conservación a nivel de nucleótidos de los lncRNAs es baja, aunque tengan homólogos funcionales en diferentes organismos (Haerty y Ponting, 2013). Sin embargo, en los últimos años, gracias a las nuevas tecnologías de secuenciación masiva de ácidos nucleicos, se han identificado un gran número de lncRNAs en diferentes organismos, comprendiendo hasta un 15% del transcriptoma de Drosophila, y un 90% del transcriptoma humano (Ilott y Ponting, 2013; Young et al., 2012). De hecho, alrededor del 30% de las lecturas obtenidas en proyectos de secuenciación masiva del transcriptoma de Drosophila mapean en regiones sin genes anotados (Celniker et al., 2009). La función de la gran mayoría de los lncRNAs aún se desconoce. Se propone que los lncRNAs son reguladores finos de la expresión génica, y en muchos casos, su 93 contribución fenotípica suele ser limitada (Haerty y Ponting, 2013; Rinn y Chang, 2012). Esto ha llevado a pensar que algunos lncRNAs son producto de “transcripción de fondo”, y que su relevancia biológica es nula. En este trabajo, contrario a esta idea, identificamos un lncRNA cuyas mutaciones son letales. Fuera de la letalidad y las alteraciones larvarias al sistema nervioso, que son del 100%, los fenotipos embrionarios que encontramos en los alelos mutantes de acal no tienen una alta penetrancia como la observada para otros genes, apoyando la noción de que este tipo de moléculas pueden regular a sus blancos, en principio, de manera sutil (Batista y Chang, 2013). Se ha propuesto que los lncRNAs actúan reafirmando estados de regulación pre-establecidos por otros mecanismos [por ejemplo, la presencia o ausencia de factores de transcripción o el estado de compactación de la cromatina (Agostini et al., 2013)]. Es decir, se puede regular de manera razonablemente sutil a algunos genes efectores, y la sumatoria de esta regulación fina es evidenciada en embriones mutantes, donde se observan defectos claros y letales. Debido a que las mutaciones en acal se identificaron por un abordaje clásico de genética directa, identificamos un lncRNA con clara relevancia fenotípica, en contraste con otros estudios de genética reversa, donde se ha visto que eliminar un lncRNA de manera dirigida puede llevar a identificar moléculas con fenotipos mutantes indetectables (Guttman et al., 2011; Ponjavic et al., 2007). Esto implica que al menos algunos lncRNAs sí tienen consecuencias fenotípicas claras, y fenotipos sustantivos. El gen acal, en muchos sentidos, es poco convencional. Además de producir un lncRNA, no posee intrones. Cerca del 20% de los genes de Drosophila carecen de intrones, y se ha propuesto que éste es un mecanismo para acelerar la expresión génica y por lo tanto, el desarrollo embrionario. De los genes con un solo exón, la gran mayoría tienen funciones durante la embriogénesis (De Renzis et al., 2007). Encontramos que acal es procesado a fragmentos de entre 40 y hasta al menos 120 nucleótidos de longitud. Cabe señalar que a pesar de que no pudimos detectar microRNAs maduros producidos en el locus de acal, es posible que esto se deba a limitaciones técnicas. Desafortunadamente, debido a que acal presenta niveles de expresión muy bajos, detectar y estudiar su procesamiento es difícil. Más aún, dado 94 que el procesamiento de acal es más evidente durante estadios de pupa, y debido a la letalidad embrionaria/larvaria de nuestros alelos mutantes, es imposible, con las herramientas actuales, analizar cómo se modifica este procesamiento en los organismos homocigotos mutantes. Dado que los fragmentos generados corresponden a regiones altamente conservadas de acal, es posible que estos fragmentos sean los productos funcionales del gen, e incluso podrían tratarse de precursores intermediarios de microRNAs. A la fecha, no existen reportes de RNAs procesados de una manera similar en eucariontes; sin embargo, se ha demostrado que algunos lncRNAs interactúan con la cromatina con regiones de sólo 40 nucleótidos (Grote et al., 2013). Análisis bioinformáticos detallados podrían revelar si las regiones donde acal se procesa son capaces de interactuar con posiciones específicas en el genoma, o si regiones del transcrito poseen la estructura secundaria necesaria para formar microRNAs. De manera importante, logramos identificar que acal tiene una localización nuclear, similar a otros lncRNAs, apoyando la premisa de que acal ejerce su función a nivel transcripcional. El gen acal se expresa principalmente en dos tejidos: la epidermis y el sistema nervioso, ambos de origen ectodérmico. De acuerdo con nuestros resultados, la expresión en la epidermis es importante para completar el cerrado dorsal, mientras que la expresión en el sistema nervioso regula la proliferación de los precursores neurales. Nuestras construcciones de rescate (UAS-acal, y el rescate genómico), que están insertadas en posiciones diferentes a la endógena (e incluso en otro cromosoma), rescatan los defectos del cerrado dorsal de los embriones mutantes de acal, implicando que acal actúa en trans para regular el cerrado dorsal. Más aún, la sobre-expresión de los genes aledaños a acal y mutaciones de estos mismos genes no afecta el cerrado dorsal. Por otra parte, nuestras construcciones de rescate no son suficientes para obtener organismos adultos, sugiriendo que otras funciones de acal no se restablecen por completo, por ejemplo, su función en el sistema nervioso. Esto podría deberse a que acal tiene una función en cis, que no se rescata al re-introducir una copia silvestre del gen en otra posición del genoma, aunque otras explicaciones también son posibles, como que la expresión endógena no se recapitula por completo. 95 Se ha demostrado que muchos lncRNAs ejercen su función en cis, regulando la expresión de genes aledaños al impedir estéricamente el reclutamiento de factores de transcripción, de la RNA polimerasa, o reclutando maquinaria epigenética durante la transcripción del propio lncRNA (Fatica y Bozzoni, 2014). Aquí mostramos evidencia de que en los mutantes de acal, la expresión de una isoforma del gen más cercano al locus de acal se sobre-expresa de manera muy extrema, mientras que otra isoforma se inhibe. Este gen, lola, se expresa en el sistema nervioso del embrión y en general, su sobre-expresión resulta en proliferación excesiva de precursores neurales (Neumuller et al., 2011; Ohsako et al., 2003). Este mismo fenotipo se observa en los embriones mutantes de acal, abriendo la posibilidad de que la des-regulación de acal resulte en cambios en la expresión de las isoformas de lola y consecuentemente, en defectos en la formación del sistema nervioso. Será importante encontrar una manera de rescatar la función de acal en cis, para determinar si esto restablece la expresión silvestre de lola e inhibe la proliferación de los precursores neurales. Aunado a esto, la sobre-expresión de Dl y la inhibición de la expresión de l(2)gl, ya sea directa o indirectamente (tal vez a través de la alteración de la expresión de lola) por acal, se conjuntan con la desregulación de lola para generar fenotipos mutantes en el desarrollo y formación del sistema nervioso. Este efecto recapitula, al menos parcialmente, lo reportado por Ferres-Marco et al. (2006). En este trabajo, se reportó que la sobre-expresión simultánea de Dl, lola y psq (localizado río abajo de lola y de acal) durante la formación del ojo, resulta en hiperplasia de dicho órgano. Dado que en ese reporte se desconocía la existencia de acal entre lola y psq, es posible que acal también contribuya a dicho fenotipo, ya que la construcción empleada para sobre- expresar lola y psq se encuentra insertada muy cerca del locus de acal. Muchos lncRNAs forman complejos con otras moléculas para efectuar su función (Fatica y Bozzoni, 2014). Nuestros resultados apuntan que acal podría formar parte de complejos remodeladores de la cromatina, ya que observamos una fuerte interacción genética entre mutantes para acal y para Pc, un componente del complejo PRC1, represor de la cromatina (Margueron y Reinberg, 2011). El fenotipo mutante de Pc se ha usado frecuentemente para identificar genes que regulan el estado de la cromatina, 96 y muchos genes que forman parte del complejo de PRC1 se han identificado por interacciones genéticas con Pc (Blastyak et al., 2006; Castelli-Gair y Garcia-Bellido, 1990; Ferres-Marco et al., 2006; Schwartz y Pirrotta, 2013). Por lo tanto, la interacción genética entre acal y Pc es altamente sugerente de una asociación física entre los productos de estos dos genes. Esta propuesta podría indicar que acal ejerce su función al inducir remodelación de la cromatina, teniendo algunos blancos en cis (por ejemplo, en la formación del sistema nervioso), y otros blancos en trans (en el cerrado dorsal). Sin embargo, será importante demostrar si acal se asocia físicamente con Pc u otro componente del complejo PRC1, o si ejerce su función con otros complejos protéicos. En este sentido, se sabe que algunos ncRNAs actúan a un nivel post-transcripcional, promoviendo o inhibiendo la traducción de RNAs mensajeros. En este trabajo identificamos transcritos cuya expresión cambia como consecuencia de mutaciones en acal, sin embargo, no podemos descartar que acal regule los niveles de algunos componentes a nivel traduccional. Nuestros resultados demuestran que la expresión de acal en la epidermis es importante para el cerrado dorsal. En los embriones mutantes para acal, se observa una sobre- activación de la vía de JNK, el principal regulador del cerrado dorsal (Rios-Barrera y Riesgo-Escovar, 2013). Esta sobre-activación de la vía de JNK es de severidad variable y en general no es tan extrema como se observa en mutantes para otros reguladores negativos (Byars et al., 1999; Rousset et al., 2010). Sin embargo, nuestros resultados muestran que un cambio menor en la expresión de genes de la vía, como Cka, puede afectar el cerrado dorsal de manera similar a lo que se observa en los embriones mutantes de acal. Al igual que en embriones mutantes para otros reguladores negativos de la vía de JNK (Blake et al., 1998; Byars et al., 1999; Reed et al., 2001; Sorrosal et al., 2010), en los mutantes de acal se observa una correlación entre la activación ectópica de JNK y cambios de forma celular aberrante. A partir de estas observaciones, proponemos que la activación de la vía de JNK debe regularse muy estrechamente, ya que tanto la pérdida como la ganancia de actividad de esta vía afecta el cerrado dorsal. La expresión de acal en la epidermis lateral es regulada por Raw, una proteína pionera 97 conservada en artrópodos y en el nemátodo C. elegans (Bauer Huang et al., 2007; Jemc et al., 2012). Raw tiene una localización citoplásmica, y su homólogo en C. elegans incluso posee un dominio transmembranal (Bauer Huang et al., 2007). Por estas razones, es muy probable que Raw regule la expresión de acal de manera indirecta. Se ha demostrado que los defectos en el cerrado dorsal de los mutantes de raw se rescatan expresando un transgén silvestre durante la etapa de la retracción de la banda germinal, y si este transgen se expresa durante el cerrado dorsal, el cerrado dorsal ya no se puede rescatar. En otras palabras, Raw se requiere desde antes del cerrado dorsal, durante la retracción de la banda germinal (Bates et al., 2008). Esto sugiere que, en efecto, Raw actúa de manera temprana y que desata una cascada génica que incluye a acal, para regular el cerrado dorsal en estadios posteriores. El fenotipo mutante de raw es muy fuerte, incluso en pérdidas de función parciales. Dado que el fenotipo mutante de acal es mucho más débil, proponemos que Raw tiene otros mediadores además de acal. Será importante estudiar en detalle si Raw regula a acal en otros procesos o estadios del desarrollo, como durante la formación del tórax adulto, en donde nuestros resultados apuntan a que pudiera existir regulación de raw mediada, al menos en parte, por acal. raw también se expresa en el sistema nervioso, como acal, aunque en los embriones mutantes de raw, la expresión de acal en este tejido se conserva. Esto significa que la expresión de acal en el sistema nervioso no depende de raw. Por otro lado, esta expresión podría provenir de la contribución materna de acal depositada durante la ovogénesis. Río abajo de raw y acal identificamos como blancos a Cka y a aop. La función de raw ya se había definido genéticamente al nivel de Jun (Bates et al., 2008), y posteriormente se propuso al nivel de JNK (Jemc et al., 2012). Estos resultados aparentemente contradictorios podrían converger en Cka, que precisamente une físicamente a Jun y a JNK (Chen et al., 2002). Nuestros resultados muestran que la sobre-expresión de acal resulta en menor abundancia de Cka. Cka es depositado en el ovocito de manera muy abundante durante la ovogénesis (Chou y Perrimon, 1996). Es posible que por esta razón, los embriones que sobre-expresan a acal logren sobrevivir hasta adultos a pesar de que los niveles de Cka estén disminuidos. Además es posible 98 que la proteína Cka pueda aún traducirse a partir del mRNA disminuido, y contrarrestar el efecto de sobre-expresar acal. Con estos datos, nuestros resultados desenmascararon un nuevo punto de regulación de la vía de JNK, al nivel de Cka. A pesar de que se conocen varias proteínas de andamiaje en la vía de JNK en vertebrados, y en las vías de otras MAPKs en general (Brown y Sacks, 2008; Turjanski et al., 2007), su participación como reguladoras de la activación de JNK no se ha explorado detalladamente. Nuestros resultados muestran que aumentar los niveles de expresión de Cka alteran de manera importante la activación de la vía de JNK. Esto mismo se ha demostrado bioquímicamente en sistemas de expresión heterólogos (Chen et al., 2002). De manera similar, se ha demostrado que en condiciones de estrés, donde aumenta la actividad de la vía de JNK, también se observa sobre-expresión de JIP-3, un homólogo funcional de Cka en vertebrados. Además, disminuir o aumentar los niveles de JIP-3 afecta directamente la activación de la vía de JNK (Xu et al., 2010). En conjunto, estos resultados muestran que además del mecanismo clásico de regulación de JNK por el módulo de MAP4K- MAP3K-MAP2K, la abundancia de proteínas de andamiaje controla el grado de activación de la vía de señalización. Además de Cka, encontramos que acal regula la expresión de aop. Aop es un factor de transcripción con homólogos en vertebrados, y se encuentra involucrado en muchos procesos durante el desarrollo. Aop actúa en la vía de ERK durante la embriogénesis, y su función es importante para la diferenciación de la epidermis (Rebay y Rubin, 1995; Riesgo-Escovar y Hafen, 1997b; Rogge et al., 1995). Cuando una célula se diferencia, deja de dividirse. En los mutantes de aop, la epidermis contínua proliferando y se estira de manera aberrante (Riesgo-Escovar y Hafen, 1997b). Aop también tiene un papel antagónico a la vía de JNK, ya que impide la expresión de los genes blanco de la vía. Sin embargo, esta función es inhibida directamente por JNK, que lo fosforila y lleva a degradación (Riesgo-Escovar et al., 1996; Rogge et al., 1995). Por lo tanto, aop juega un papel dual durante el cerrado dorsal. Nuestros resultados muestran que en los embriones mutantes para acal, muchos 99 genes relacionados con la síntesis de la cutícula tienen una expresión disminuida. Como la secreción de cutícula es un resultado de la diferenciación de la epidermis (Campos-Ortega y Hartenstein, 1997), es sugerente que en los mutantes de acal este proceso no se lleva a cabo de manera adecuada. En resumen, se conocen varios reguladores negativos de la vía de JNK durante el cerrado dorsal: aop (con la función dual ya mencionada), puckered (puc), peb y raw. aop actúa previo al cerrado dorsal, preparando la epidermis para el cerrado dorsal (Riesgo-Escovar y Hafen, 1997b). La expresión de puc se induce por la misma vía de JNK, por lo que actúa como un modulador fino de la vía (Martín-Blanco et al., 1998). peb impide la activación de la vía de JNK en la amnioserosa, y lleva a cabo esta función desde la retracción de la banda germinal (Reed et al., 2001). Finalmente, raw actúa sólo en la epidermis lateral, impidiendo la activación de la vía de JNK fuera de las células de la hilera líder (Bates et al., 2008). Hasta ahora, no se conocía ninguna conexión entre estos componentes, ya que todos actúan de manera diferente y en diferentes tipos celulares. Sin embargo, nuestros resultados muestran una interacción entre raw y aop que no se había descrito anteriormente. Esta interacción es mediada por acal, que ejerce su función río abajo de raw, regulando la expresión de aop. Los tres genes se requieren en la epidermis lateral para regular la activación de JNK en este tejido, y de manera independiente de puc y de peb, como ya se había sugerido para raw (Byars et al., 1999). A la fecha, se desconoce qué mecanismo induce la activación de la vía de JNK sólo en estas células, pero el presente trabajo, además de introducir un nuevo mecanismo de regulación para la vía de JNK por un lncRNA, ayuda a entender cómo se restringe la activación de la vía de JNK a las células del borde de la epidermis durante el cerrado dorsal. 100 XIV. REFERENCIAS. Adams, M.D., Celniker, S.E., Holt, R.A., Evans, C.A., Gocayne, J.D., Amanatides, P.G., Scherer, S.E., Li, P.W., Hoskins, R.A., Galle, R.F., et al. (2000). The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science 287, 2185-2195. Agostini, F., Cirillo, D., Bolognesi, B. y Tartaglia, G.G. (2013). X-inactivation: quantitative predictions of protein interactions in the Xist network. Nucleic Acids Res 41, e31. 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Halpern Baltimore, Maryland Ian Hope Leeds, United Kingdom Andrew Hudson Edinburgh, United Kingdom Randy Johnson Houston, Texas Susan Kidson Cape Town, South Africa James Kramer Chicago, lIIinois Tsutomu Kume Chicago, lIIinois Michel Labouesse IIIkirch, France Patrick Lemaire Marseille, France Susan Mackem Bethesda, Maryland Terry Magnuson Chapel Hill, North Carolina William Mattox Houston, Texas David R. McClay Durham, North Carolina David M. Miller, III Nashville, Tennessee Yuji Mishina Ann Arbor, Michigan Mary Mullins Philadelphia, Pennsylvania Andras Nagy Toronto, Canada Petra Pandur Ulm, Germany Helen Salz Cleveland, Ohio Yoshiki Sasai Kobe,Japan Nori Satoh Uruma, Japan Michael Scanlon Ithaca, New York John Schimenti Ithaca, New York Guojun Sheng Kobe, Japan Patrick Tam Wentworthville, Australia Gerald Thomsen Stony Brook, New York Christopher Wright Nashville, Tennessee Lyle Zimmerman London, United Kingdom Mario Zurita Cuernavaca Morelos, México Disclaimer. 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As of January 2000, Developmental Genetics was renamed and relaunched as genesis: The Journal of Genetics and Development, with a new scope and Editorial Board. The journal focuses on work that addresses the genetics of development and the fundamental mechanisms of embryological processes in animals and plants. With increased awareness of the interplay between genetics and evolutionary change, particularly during developmental processes, we encourage submission of manuscripts from all ecological niches. The expanded numbers of genomes for which sequencing is being completed will facilitate genetic and genomic examination of developmental issues, even if the model system does not fit the “classical genetic” mold. Therefore, we encour- age submission of manuscripts from all species. Other areas of particular interest include: 1) the roles of epigenetics, microRNAs and environment on developmental processes; 2) genome-wide stud- ies; 3) novel imaging techniques for the study of gene expression and cellular function; 4) comparative genetics and genomics and 5) animal models of human genetic and developmental disorders. genesis presents reviews, full research articles, short research letters, and state-of-the-art technology reports that promote an understanding of the function of genes and the roles they play in com- plex developmental processes. genesis accepts articles for Open Access publication. Please visit http://olabout.wiley.com/WileyCDA/Section/id-406241.html for further information about OnlineOpen. Cover illustration: The figure illustrates the extreme changes in cell shape that amnioserosal cells undergo during germ band extension in the developing Drosophila melanogaster embryo. Amnioserosa cells (middle) are stretched in an anterior-posterior direction, whilst lateral epidermal cells (left and right sides) are cuboidal prior to the dorsal closure process. The image is a projec- tion of confocal planes of a living embryo expressing cadherin::GFP. ISSN 1526-968X (Online) Editorial Board Editor-in-Chief Associate Editors Sally A. Moody George Washington University 207 Ross Hall, 2300 I Street, NW Washington DC 20037 Tel: 202-994-2878 E-mail: samoody@gwu.edu Deborah L. Chapman Department of Biological Sciences University of Pittsburgh Room 141 Life Sciences Annex 4249 Fifth Avenue Pittsburgh, PA 15260 Tel: 412-624-0774 Lab: 412-624-0580 Fax: 412-624-4759 E-mail: dlc7@pitt.edu Kathryn Cheah Department of Biochemistry University of Hong Kong Sassoon Rd Hong Kong SAR China Tel: 852-2819-9240 Fax: 852-2855-1254 E-mail: hrmbdkc@hkusua.hku.hk Justin Kumar Department of Biology Indiana University Jordan Hall A318 1001 East Third Street Bloomington, IN 47405 Tel: 812-856-2621 Fax: 812-856-1566 E-mail: jkumar@indiana.edu Website: www.bio.indiana. edu/~kumarlab José Xavier-Neto LNBio Campus do LNLS: Rua Giuseppe Máximo Scolfaro, 10000 Pólo Il de Alta Tecnologia de Campinas Campinas, SP CEP 13083-970 Brasil Tel: +55 19 3512-1249 Fax: +55 19 3512-1004 E-mail: xavier.neto@lnbio.org.br Valerie Reinke Department of Genetics Yale University School of Medicine PO Box 208005 233 Cedar Street New Haven CT 06520-8005 Tel: 203-785-5228 Fax: 203-785-6350 E-mail: valerie.reinke@yale.edu REVIEW Regulating Cell Morphogenesis: The Drosophila Jun N-Terminal Kinase Pathway Luis Daniel Rı́os-Barrera and Juan Rafael Riesgo-Escovar* Developmental Neurobioloy and Neurophysiology Department, Instituto de Neurobiologı́a, Universidad Nacional Autónoma de México, Boulevard Juriquilla #3001, Querétaro, Querétaro, México, c.p. 76230 Received 2 September 2012; Revised 14 October 2012; Accepted 19 October 2012 Summary: The Jun-N-terminal Kinase pathway (JNK), known also as stress activated protein kinase pathway (SAPK), is an eukaryotic evolutionarily conserved signal- ing pathway. From a purported evolutionarily ‘‘ancient’’ function as stress mediator, it evolved in multicellular eukaryotes to permanent roles in development, without leaving its original function. In Drosophila melanogaster, it is required for follicle cell morphogenesis, embryonic dorsal closure, pupal thoracic closure and genital disc rotation closure, all processes with requisite cell shape changes. Besides, it is activated during wound healing and in response to stress (UV irradiation, oxidative stress) where it may signal cell death or proliferation. Despite these varied roles, it has a conserved core of molecules that follow the MAPKKK/MAPKK/MAPK logic of mitogen activated protein kinases pathways. Regulation of the JNK pathway appears majorly negative, with phospha- tases, transcription factors and proteins of novel struc- ture ‘‘holding back’’ on JNK activation in different tissues. This particular mode of regulation may hark back to the pathway’s origin as stress detector and responder, implying readiness to respond, from which the develop- mental roles may have evolved as conditions demanding obligate and predicted stress responses (i.e., embryonic dorsal closure viewed as a ‘‘wound of development’’). genesis 51:147–162, 2013. VC 2012 Wiley Periodicals, Inc. Key words: dorsal closure; wound healing; cell shape change; signal regulation INTRODUCTION MAPK Signaling Cell–cell interactions are critical for multicellularity. They have also shaped its evolution. Perhaps the best example of unrestricted cell–cell communication occurs during embryonic development. Embryonic de- velopment depends on gene expression, local environ- ment, and cell and tissue behavior. For this task, cells rely on signaling pathways that coordinate extracellular with intracellular events, and allow communication between cells. Throughout the life cycle of an organism, and irrespective of whether change is effected in response to endogenous or exogenous stimuli, cells must react properly to maintain homeostasis and ac- quire final morphology and function. Among key mole- cules that link extracellular signals to modified gene expression and intracellular changes are members of the mitogen activated protein kinases (MAPKs) signal- ing pathways. These pathways use protein phosphoryla- tion to convey signals intracellularly. MAPK pathways also have important roles in adult metazoan physiology, besides development [reviewed in Qi and Elion (2005), Raman et al. (2007), and Turjanski et al. (2007)]. Early experiments in the 70s in the last century helped establish protein phosphorylation as one of the major signaling currencies of cells. Since then, the search has been on to identify, isolate and characterize protein kinases and their flip-sides, protein phospha- tases. Properties like membrane attachment, kinase do- main, and substrate specificity were used to subdivide kinases into different classes and families (Hanks and * Correspondence to: Juan Rafael Riesgo-Escovar, Instituto de Neurobio- logı́a, Universidad Nacional Autónoma de México, Boulevard Juriquilla #3001, Querétaro, Querétaro, México, c.p. 76230. E-mail: juanriesgo@prodigy.net.mx Contract grant sponsor: CONACYT, Contract grant number: #81864; Contract grant sponsor: PAPIIT, Contract grant number: #IN203110; Contract grant sponsor: UNAM. Published online 29 October 2012 in Wiley Online Library (wileyonlinelibrary.com). DOI: 10.1002/dvg.22354 ' 2012 Wiley Periodicals, Inc. genesis 51:147–162 (2013) Hunter, 1995; Manning et al., 2002). Protein phospha- tase groups were separated in a similar vein. With the advent of complete genomes, the kinome, or the com- plete set of protein kinases and phosphatases present in a genome were compiled and annotated. MAPKs and their corresponding phosphatases were found to consti- tute a large group of related, evolutionarily conserved enzymes (Hunter, 1995; Alonso et al., 2004; Johnson and Hunter, 2005). MAPKs have been found in all eukaryotic cells studied. In the budding yeast (Saccharomyces cerevisiae), for example, there are five main MAPK pathways: the phero- mone, cell-wall integrity, spore-wall assembly, filamentous/ invasive behavior, and high osmolarity and stress pathways (Courchesne et al., 1989; Elion et al., 1990; Torres et al., 1991; Brewster et al., 1993; Krisak et al., 1994). However, classically, the MAPK superfamily has been subdivided into three principal groups: the extracellular regulated kinase (ERK) group, named after the first MAPK cloned (Rosso- mando et al., 1989; Boulton et al., 1990), the p38 group, and the Jun-N-terminal Kinase (JNK) group (Galcheva-Gar- gova et al., 1994; Lee et al., 1994). Eukaryotes ranging from unicellular organisms to mammals variously possess members of these groups. Besides having all different types of MAPKs, vertebrates usually have multiple members of any one pathway: for example, they have two partially redundant ERKs, p42 and p44, and also three partially redundant JNK genes (Kallunki et al., 1994; Kuan et al., 1999; Yang et al., 1997). These pathways, centered upon a tiered-stage of three sequential phosphorylations, are conserved both structurally and functionally. The core MAPK module encompasses three kinases: a MAPKKK (or MAPK ki- nase kinase), a ser/thr kinase that phosphorylates and activates a MAPKK (or MAPK kinase), which is a dual- specificity kinase, phosphorylating a TXY motif in the target requisite MAPK, and the MAPK proper, a ser/thr kinase whose nuclear and cytoplasmic targets are nor- mally transcription factors, but include cytoskeleton- associated proteins and other kinases as well. Each of these module kinases and the cascades they take part in, have specific spatial and temporal regulators that are usually conserved. Once activated, MAPKs command a pivotal role in signaling, leading to cellular change and modification of gene expression. The evolutionary suc- cess of this type of pathways is borne out by the wide number of processes they coordinate, like cellular dif- ferentiation, proliferation, apoptosis, stress responses, and morphogenesis (Widmann et al., 1999; Bogoyevitch and Kobe, 2006; Raman et al., 2007; Brown and Sacks, 2008). This kind of regulation allows for specific and immediate changes in the activity of the module. In the fruit fly Drosophila melanogaster, the three main MAPK pathways are well represented, with little or no redundancy. The wide variety of genetic tools avail- able to perform forward and reverse genetics, and ‘‘whole organism’’ approaches, allow for detailed and so- phisticated studies. In this model organism, the JNK pathway has been the focus of studies in the past 15 years, after JNKK, coded by the hemipterous (hep) locus and JNK, coded by basket (bsk), were isolated and char- acterized within a short time-span (Glise et al., 1995; Riesgo-Escovar et al., 1996; Sluss et al., 1996; Kockel et al., 1997). Part of the success of the field can be ascribed to the relative ease with which mutations in genes of the pathway can be recovered. The Nüsslein- Volhard/Wieschaus screens identified a class of embry- onic lethal lines with cuticles bearing dorsal holes, the ‘‘dorsal open’’ phenotype (Jürgens et al., 1984; Nüsslein- Volhard et al., 1984). Subsequent cloning and characteri- zation by several groups of some of these dorsal open lines yielded mutations in JNK pathway genes (Riesgo- Escovar et al., 1996; Sluss et al., 1996; Glise and Noselli, 1997; Hou et al., 1997; Riesgo-Escovar and Hafen, 1997a, b; Byars et al., 1999). Thus, a paradigm was established for JNK signaling elements: mutations in them have dor- sal holes in the embryonic cuticle, a lethal or semi-lethal condition, delineated as the ‘‘canonical’’ JNK signaling pathway (Lesch et al., 2010). This review is focused on the regulation of the JNK signaling pathway in Drosoph- ila development, and in the forthcoming, ‘‘Bsk’’ will refer to the Drosophila JNK homolog, whereas ‘‘JNK’’ will refer to the JNK pathway as a whole. Besides JNK path- way genes, mutants for the Dpp and Rho/Rock kinase signaling pathways, together with cytoskeleton compo- nents, are unable to complete closure and also die during embryogenesis with the dorsal open characteristic defect (Fig. 1; Affolter et al., 1994; Simin et al., 1998; Harden et al., 1999; Halsell et al., 2000; Mizuno et al., 2002). JNK IN DEVELOPMENT Cell Elongation Requires Basket Signaling Development recurrently relies on changes in cell shape, and some, like cell elongation, are regulated by Bsk signaling, a JNK evolutionarily conserved function. In flies embryonic dorsal closure, follicle cell morpho- genesis, thorax closure and male genitalia disc rotation/ closure during metamorphosis require Bsk activation (Agnès et al., 1999; Martı́n-Blanco et al., 2000; Dobens et al., 2001; Macı́as et al., 2004; Rousset et al., 2010). Wound healing recapitulates these developmental proc- esses in a regenerative environment (Wood et al., 2002). Ventral closure, in Caenorhabditis elegans, and hindbrain closure in vertebrates, together with verte- brate wound healing, use the JNK pathway [for reviews see, Martin and Parkhurst (2004), Belacortu and Paricio (2011), Gorfinkiel et al. (2011)]. Hypomorphic alleles and partial disruption of Bsk signaling may survive embryogenesis but bear defects in thorax or male geni- talia closure: non-sutured thoraces are known as split- 148 DROSOPHILA JUN N-TERMINAL KINASE PATHWAY thorax phenotypes (Glise et al., 1995; Zeitlinger and Bohmann, 1999; Rousset et al., 2010). Genetic screens for modifiers of these and other phenotypes have identi- fied genes participating in Basket signaling (Wilk et al., 2004). Finally, gain-of-function and over-expression in dorsal thoracic cells may result in split-thorax pheno- types. Screens designed for these conditions have also been successfully conducted and extrapolated to em- bryonic dorsal closure (Peña-Rangel et al., 2002). Over- all, these screens have contributed to a better under- standing of the pathway. Embryonic Dorsal Closure The process of dorsal closure has been richly described in the literature due to its experimental amena- bility and ease identifying participating genes. Occurring first, but mechanistically similar to thoracic and genitalia closure and wound healing, dorsal closure is the most studied process, being the last major morphogenetic rearrangement of embryogenesis, at stages 12–15. Dorsal closure is the dorsal enveloping of the embryo by the stretching cells of the lateral epithelium. Prior to that, germ band retraction posits the epidermis in the ventral and lateral regions of the embryo, leaving the amnioser- osa as the sole, but transient, dorsal ectodermal cover (Fig. 1; Campos-Ortega and Hartenstein, 1997). In embryos, both the amnioserosa and the lateral epi- dermis are ectodermal derivatives induced and specified by an anti-neural signal: the Decapentaplegic (Dpp, Drosophila BMP2/4 homolog) morphogen earlier in de- velopment. The amnioserosa, marked by expression of zerknüllt (zen), and related to angiotensin converting enzyme (race), forms at the highest level of Dpp activ- ity, whereas the lateral epidermis requires lower levels of Dpp function. Neural precursors and ventral epider- mis are specified in the absence of this morphogen (Rushlow et al., 1987; Tatei et al., 1995; Stronach and Perrimon, 2001). The amnioserosa is an extraembryonic tissue, and suf- fers histolysis in several forms: anoikis, autophagy, and apoptosis (Reed et al., 2004; Toyama et al., 2008; Teng and Toyama, 2011; Cormier et al., 2012). For the lateral epidermis to completely surround the embryo, the two sets of lateral epidermal sheets must change shape and stretch over the amnioserosa toward the dorsal midline, and finally form a scarless continuum. This process has been divided in three phases. During the initiation phase, only the dorsal-most row of cells, the leading edge (LE) cells, elongate dorso-ventrally and project filli- podia towards the dorsal side of the embryo. These cells also act as a signaling center for the epithelium as a whole, releasing the Dpp morphogen to instruct ventral epithelial cells. Later on, in the propagation phase, the remainder lateral epithelial cells elongate and a supra- cellular actin cable is formed apically in LE cells. Finally, in the suture phase, filopodia from opposing lateral epi- thelial cells reach across and contact each other, and ad- hesion molecules bridge both epidermal sheets together to seal the embryo (Harden, 2002). Originally, it was proposed that stretching lateral epi- thelial cells contributed the majority of the force for clo- sure, in what was termed a ‘‘purse-string’’ model (Kiehart et al., 2000); however, laser ablation studies in LE cells showed that closure would still happen in the absence of contiguity of the actin supracellular cable, FIG. 1. Embryonic dorsal closure in D. melanogaster, and embryonic phenotypes of Basket signaling mutants. (a–a@) During dorsal closure, the lateral epithelium (white) stretches over the amnioserosal cells (pink), guided by the LE cells, the top most row of lateral epithelial cells (dotted lines). (a) Initiation phase. (a0) Propagation phase. (a@). Suturing phase. In all panels, lateral views are shown, with anterior to the left and dorsal up. (b) A wild type first instar larva at the end of embryonic development is completely surrounded by cuticle (left). In basket par- tial loss of function mutants, dorsal closure does not occur fully and an antero-dorsal hole is seen in the cuticle (middle panel; extent of dor- sal hole in this and Jra mutant, right, marked by arrowheads and dotted white lines). This phenotype is also seen in mutants for other mem- bers of the pathway, such as Jra1 (right panel). In this last, the mutant phenotype is more extreme, as the dorsal hole occupies the complete dorsal aspect of the cuticle, whereas the basket mutant cuticle showcases a hypomorphic condition, where some degree of closure (in the dorsal posterior aspect) is accrued. 149RÍOS-BARRERA AND RIESGO-ESCOVAR and also of LE cells (Jacinto et al., 2002). Data from in vivo microscopy analyses, laser ablation experiments and biophysical modeling led to the formulation of alter- native hypotheses where amnioserosa cells, pulsing rythmically and periodically, generated also part of the force needed for closure (Solon et al., 2009; Blanchard et al., 2010). However, recent results show that interfer- ing with amnioserosa contraction by inhibiting endoso- mal trafficking only delays dorsal closure, but certainly does not abrogate it (Mateus et al., 2011). Finally, the small percentage of amnioserosal cell delamination and death from the epithelium was also thought to generate forces for closure (Reed et al., 2004; Toyama et al., 2008). Subsequent quantitation of the phenomenon and, again, laser ablation studies showed that closure indeed would still happen in perturbed amnioserosal cell delamination and autophagy (Muliyil et al., 2011; Cormier et al., 2012). Several reviews and papers have been written proposing alternative models to account for closure. Currently, a mix of LE cells apical supracel- lular actin cable contraction, reduced amnioserosal cells’ apical surface, and occasional amnioserosal cell loss are thought to cooperate to achieve closure. These forces are also helped in later stages by LE cells’ fillipo- dia and adhesion molecules contributing to alignment and zippering of the epidermis (Peralta et al., 2008; Almeida et al., 2011; Gorfinkiel et al., 2011; Guevorkian et al., 2011; Sokolow et al., 2012). In the abdomen, ‘‘mixer cells,’’ anterior compartment LE cells that switch to posterior compartment identity, and LE intercalating cells moving from the row of cells immediately ventral to the LE, are thought to contribute tension relaxation during dorsal closure, allowing proper LE alignment and suture (Gettings et al., 2010). However, despite this multitude of forces acting dur- ing closure, the signaling center responsible for coordi- nating these events are the LE cells. Bsk is only activated in this row of cells, and from there orchestrates behavior in amnioserosa and epidermis. The instructions sent forth by Bsk are mainly conducted through Dpp secre- tion from LE cells. Dpp acts ventral to the LE cells and in the amnioserosa (Glise and Noselli, 1997; Hou et al., 1997; Riesgo-Escovar and Hafen, 1997b; Garcı́a-Fernán- dez et al., 2007). Integrins, profilin, and Puckered (Puc), a phosphatase, among other Bsk responsive genes, are expressed and mediate closure (Glise et al., 1995; Mar- tı́n-Blanco et al., 1998; Jasper et al., 2001; Homsy et al., 2006). The most extensive study of Bsk immediate early and responsive genes was a SAGE experiment, where not only some of the aforementioned where identified but also genes required for stress responses (Jasper et al., 2001); however, other approaches for identifying target genes have further contributed to delineate JNK signaling effectors (Thomas et al., 2009; Rousset et al., 2010). The JNK pathway roles in development may have come about from earlier roles in stress signaling. In fruit flies, though, the JNK role in development has been studied most thoroughly and is better known; hence, following earlier use in fly literature (Lesch et al., 2010), the term ‘‘canonical’’ here is used to describe pathway components activated during development, especially embryonic dorsal closure. This distinction is clearly not absolute, as many ‘‘canonical’’ pathway components are also activated in JNK responses to stress; nevertheless, the division provides a useful, albeit somewhat artificial, separation. This division allows separate discussion and characterization of pathway components required dur- ing development from those involved in stress responses, highlighting shared and non-shared genes. The JNK developmental roles have been the focus of new series of studies, aimed at understanding at greater depth the pathway itself, and how signaling is regulated. The JNK ‘‘Canonical’’ Signaling Pathway Neither extracellular molecules nor membrane recep- tors leading to Bsk activation during dorsal closure have been identified. The most upstream acting molecules identified for Bsk signaling during dorsal closure are non- receptor tyrosine kinases of the Src family: Src42A, Src64B, and Btk29A (also known as Tec29; Fig. 2 and Ta- ble 1). Single loss of function mutations in these genes do not show a dorsal open phenotype, but combinations of double mutants have dorsal closure defects, suggesting re- dundancy between them. Overexpression of Src42A in the wing disc results in ectopic Basket activation moni- tored with puc-lacZ expression (Tateno et al., 2000). Another nonreceptor tyrosine kinase involved in Bsk signaling activation is Shark. Removing the maternal con- tribution of shark ends up in defective closure (Fer- nandez et al., 2000). Shark possesses SH2 domains, and in modified yeast two-hybrid assays, where tyrosine phos- phorylation is favored by Src expression, Shark interacts with the Dok adapter protein. Dok mutants have dorsal closure defects; however, expression of constitutively active Src42A does not rescue Dok loss of function. Shark overexpression does rescue Dok mutants. Thus, a model has been proposed, where Src42A phosphorylates Dok; then, Dok recruits Shark and activates it (Biswas et al., 2006). How these kinases relay the signal to downstream components is still not well understood. Rho family G proteins, Rac (Rac1, Rac2, and Mtl) and Cdc42, are required to complete dorsal closure because triple Rac or single Cdc42 mutants or dominant nega- tive Cdc42 expression have dorsal open phenotypes (Riesgo-Escovar et al., 1996; Harden et al., 1999; Hakeda-Suzuki et al., 2002). However, participation of Cdc42 is downstream of Bsk, since Cdc42 mutants express Basket targets at the LE cells, whereas Rac pro- teins mediate the activation of the MAPK module (Ricos et al., 1999; Genova et al., 2000). Since Rac2, mtl dou- 150 DROSOPHILA JUN N-TERMINAL KINASE PATHWAY ble mutants are viable and fertile, it would seem that Rac1 is the main activator of Basket signaling. Slipper (Slpr), a MAP3K of the MLK (Mixed Lineage Kinase) family, interacts physically with Rac1 and with Misshapen (Msn), a MAP4K of the Ste20 (Sterile-20) fam- ily, in GST pull down assays in vitro. Slpr interacts with the C-terminus of Msn via a central region encompass- ing the leucine zipper, linker, and CRIB domains of Slpr, and with Rac via the CRIB domain (Garlena et al., 2010). Mutations in both kinases, Slpr and Msn, have a ‘‘dorsal open’’ phenotype (Su et al., 2000; Stronach and Perrimon, 2002). Originally, msn mutations were iso- lated in a screen for suppressors of eye malformations due to the Glass mutation. msn flies show defects in photorreceptor cells shape in the compount eye. It was subsequently found that null alleles are embryonic le- thal with dorsal closure defects (Su et al., 1998). slpr mutants were isolated from a screen for maternal effect genes (Perrimon et al., 1989; Chou and Perrimon, 1996). Apart from defective dorsal closure, slpr mutants have also thorax closure and male genitalia rotation defects (Stronach and Perrimon, 2002; Polaski et al., 2006). Slpr appears to require both Rac1 and Msn for activation; because Rac1, Rac2, and Mtl are genetically redundant, the interaction with Slpr may be similar for all three (Garlena et al., 2010). It is thought that Msn phosphorylates Slpr, thus activating it. Hep, a dual spec- ificity kinase, is then the phosphorylation target of acti- vated Slpr, a serine threonine kinase. Hep is well established as the mediator between MAP3Ks and Bsk activation, and it was the first element of the pathway shown to participate in dorsal closure (Glise et al., 1995). Hep is a MAP2K homologous to mammalian MKK7. Epistasis experiments have placed hep downstream of Rac1 during dorsal closure; not sur- prisingly, hep mutant embryos do not express Bsk re- sponsive genes. Hep phosphorylates Basket in a TPY motif, activating it. hep1 mutants are hypomorphic, and thus, viable, presenting, with low penetrance, a lack of one wing eversion. This has been used extensively to address genetic interaction experiments (Zeitlinger and Bohmann, 1999; Martı́n-Blanco et al., 2000). bsk, the fly JNK homolog, is an embryonic lethal locus, like hep, with the requisite failure of embryonic dorsal closure (Riesgo-Escovar et al., 1996; Sluss et al., 1996). The first mutant alleles were isolated by Wie- FIG. 2. The Drosophila JNK signaling pathway and its negative regulators. Shaded in different colors are pathways proposed to lead to Basket activation. Left, the molecules involved in Basket signaling during dorsal closure. Right, signaling induced by Eiger/TNF. Asterisks mark elements transcriptionally induced by Basket signaling. Negative regulators are presented in red. Abbreviations used: Alph, Alphabet; Aop, Anterior open; Bsk, Basket; Cka, Connector of kinase to AP-1; Dok, Downstream of kinase; Hep, Hemipterous; Jra, Jun related anti- gen; Kay, Kayak; MAP3K collectively refers to both Slipper and Tak1; MKK4, Mitogen-activated protein kinase kinase 4; Msn, Misshapen; Peb, Pebbled; Puc, Puckered; Rac referes collectively to Rac1, Rac2, and Mtl; Scaf, Scarface; Shark, SH2 domain ankyrin repeat kinase; Slpr, Slipper; Src collectively refers to Src42A, Btk29A, and Src64B; TAB2, TAK1-binding protein 2; TAK1, Transforming growth factor b-acti- vated kinase 1; TRAF4, TNF-associated factor 4. 151RÍOS-BARRERA AND RIESGO-ESCOVAR schaus, Nüsslein-Volhard, and coworkers in the famous genetic screens for embryonic lethals (Jürgens et al., 1984; Nüsslein-Volhard et al., 1984). Activated Bsk par- ticipates in embryonic dorsal closure, thoracic closure, and genital disc rotation and closure during develop- ment, but is dispensable for eye and wing development during metamorphosis [(Riesgo-Escovar et al. 1996), Riesgo-Escovar et al., unpublished data]. Activated Bsk phosphorylates the Jra (DJun) tran- scription factor, the sole fly mammalian c-Jun homolog, in serine and threonine residues at its N-termini. This phosphorylation triggers Jra association with Kayak (Kay, DFos) to form the AP-1 complex. Both Jra and Kay are leucine zipper containing transcription factors (Bogoyevitch and Kobe, 2006). Unlike their vertebrate homologues, fly Jra and Kay can form homodimers in vitro besides the well-characterized AP-1 complex, and may form other types of complexes [(Perkins et al., 1988) Riesgo-Escovar et al., unpublished observations]. As mentioned above, both Jra and Kay mutants were originally isolated in the Nüsslein-Volhard et al. screens, and both are embryonic lethal with a dorsal open phe- notype; kay has a maternal contribution and is also required for other embryonic processes, like oogenesis and endoderm specification (Riesgo-Escovar and Hafen, 1997a; Souid and Yanicostas, 2003). An important regulator at this level of the pathway is Cka (Connector of Kinase to AP-1). Mutations in the Cka gene were identified in a screen for maternal effect mutations (Perrimon et al., 1996). Zygotic mutants for Cka die as pupae, but lack of maternal transcripts results in embryonic lethality with a ‘‘dorsal open’’ phe- notype (Chen et al., 2002). Cka is a scaffold molecule thought to form a complex with Hep, Bsk, and Jra/Kay. How this occurs is not clear, since Hep resides in the cytoplasm whereas normally Jra resides in the nucleus, and Kay shuttles back and forth between the cytoplasm and the nucleus (Kockel et al., 1997; Zeitlinger and Boh- Table 1 Genes in the Drosophila JNK Signaling Pathway Gene name/symbol Molecular function DC MC SR alphabet/alph Protein phosphatase 2C X X X anterior open/aop (yan) Transcriptional repressor X basket/bsk Jun N-terminal kinase (JNK) homolog X X X Btk family kinase at 29A/Btk29A (Tec29) Cytoplasmic protein tyrosine kinase X Cdc42 Rho family G protein X X X Connector of kinase to AP-1/Cka Scaffold protein X X decapentaplegic/dpp Transforming growth factor-b (TGFb) family ligand X X X Protein kinase at 92B/Pk92B (DASK1) Mitogen-activated protein kinase kinase kinase (MAP3K) X cylindromatosis/CYLD Deubiquitinating enzyme X Downstream of kinase / Dok Adaptor protein X X eiger/egr Tumor necrosis factor (TNF) family ligand X hemipterous/hep Mitogen-activated protein kinase kinase (MAP2K) X X X pebbled/peb (hnt) Transcription factor X Jun-related antigen/Jra (DJun) Transcription factor X X X kayak/kay (DFos) Transcription factor X X X MAP kinase kinase 4/Mkk4 Mitogen-activated protein kinase kinase (MAP2K) X Mig-2-like/Mtl Rho family G protein X misshapen/msn Mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase (MAP4K) X X X puckered/puc Dual specificity JNK phosphatase X X X Rac1 Rho family G protein X X X Rac2 Rho family G protein X raw Novel gene product X ribbon/rib Transcription factor X scarface/scaf Serine-protease homolog X X SH2 ankyrin repeat kinase/shark Cytoplasmic protein tyrosine kinase X X slipper/slpr Mitogen-activated protein kinase kinase kinase (MAP3K) X X X Src oncogene at 42A / Src42A Cytoplasmic protein tyrosine kinase X X Src oncogene at 64B/Src64B Cytoplasmic protein tyrosine kinase X TAK1-associated binding protein 2/Tab2 Adaptor protein X TGFb-activated kinase 1/Tak1 Mitogen-activated protein kinase kinase kinase (MAP3K) X TNF-receptor-associated factor 4/Traf4 (DTRAF1) TNF receptor adaptor X wengen/wgn TNF receptor family member X Genes with synonyms in common use are added in parenthesis after the abbreviations. DC signifies involvement in dorsal closure; MC signi- fies involvement in developmental closures during metamorphosis (i.e., thoracic closure and genital disc rotation and closure); SR signifies involvement in stress responses including wound healing. 152 DROSOPHILA JUN N-TERMINAL KINASE PATHWAY mann, 1999) as is postulated to occur with Bsk as well. Cka does seem to act as a scaffold from Hep to AP-1, though, as no physical interaction has been shown with other pathway molecules. Transcriptional targets of AP-1 have been identified during dorsal closure using SAGE, microarrays, and genetic interactions and screens (Jürgens et al., 1984; Nüsslein-Volhard et al., 1984; Perrimon et al., 1989; Su et al., 1998; Jasper et al., 2001; Peña-Rangel et al., 2002; Wilk et al., 2004; Rousset et al., 2010). Chief among the targets is Dpp, that signals to the amnioserosa and the lateral epidermis to induce cell shape changes (Garcı́a- Fernández et al., 2007; Wada et al., 2007). Secreted Dpp from the LE is thought to generate a morphogen gradient ventral to the LE, inducing cell shape change, and thus, conveying the elongation message to the whole lateral epithelium (Glise and Noselli, 1997; Hou et al., 1997; Riesgo-Escovar and Hafen, 1997b). Mem- bers of the Dpp signaling pathway also have dorsal open phenotypes, like the Dpp receptors Thick Veins (Tkv) and Punt (Affolter et al., 1994; Simin et al., 1998). The Puckered (Puc) protein, a dual specificity phos- phatase, is an immediate early gene that turns off the ac- tivity of the pathway by dephosphorylating Bsk (Martı́n- Blanco et al., 1998). The expression of Dpp and Puc, whether by in situ hybridization or by enhancer trap lacZ alleles, has been widely used as readouts of Bsk ac- tivity in different genetic backgrounds. Bsk signaling also activates expression of Chickadee, the fly homolog of vertebrate profilins (Jasper et al., 2001). As profilin is a well-known regulator of the actin cytoskeleton, its expression points to the immediacy of Bsk control of cell shape changes. Other Bsk targets include cytos- keletal genes, like integrins, matrix metalloproteinases, and stress-related proteins (Wang et al., 2003; Homsy et al., 2006; Stevens and Page-McCaw, 2012). REGULATING THE JNK PATHWAY Positive and Negative Regulators Control of JNK signaling during development is a multilevel process, requiring spatial, temporal, and lin- ear restrictions. Dorsal closure is a process where multi- ple cell types and tissues participate, facilitating study of spatial restrictions for Bsk activity. Contrary to some of the ‘‘positive’’ elements of the pathway, that show JNK-regulated processes ‘‘exclusivity,’’ like Jra or Hep, many JNK negative regulators also function in other processes and/or are shared with other signaling path- ways. This may account for relative difficulties in estab- lishing rigorous proof of JNK-associated function. From a mis-expression screen centered on thoracic closure, several components of chromatin remodeling complexes were found to alter it (Peña-Rangel et al., 2002). Recently, three chromatin regulatory genes were characterized that might affect JNK pathway transcrip- tional regulation, the Nf-Y complex (A, B, and C) (Yosh- ioka et al., 2008), Dref (Yoshioka et al., 2012), and the XNP helicase (known as ATRX) (Valadez-Graham et al., 2012). The best characterized elements are straightforward inhibitors that directly antagonize the pathway. This is the case for Puc, a dual-specificity phosphatase of the VH1 group induced by Bsk, that catalyzes dephospho- rylation of Bsk itself (Martı́n-Blanco et al., 1998). Puc acts once the pathway is activated, modulating its strength, by removing both phosphates from the Bsk TPY activation motif, and as such Puc expression and participation in Bsk signaling is generally thought to depend on the level of activation of the pathway. Muta- tions in puc lead to a puckering of the epidermis toward the dorsal midline, implying that both loss of function and ectopic activation of the JNK pathway coalesce to a more or less common phenotype of abnormal dorsal closure. Examples of over activation of the pathway leading to abnormal closures akin to loss of function phenotypes include gain of function screens where dpp over-expression leads to a thoracic cleft phenotype (Peña-Rangel et al., 2002), and loss of function of nega- tive regulators, like puc and raw, that give rise to dorsal holes in the cuticle (Martı́n-Blanco et al., 1998; Byars et al., 1999). The Puc negative feedback loop is not only employed during follicle cell morphogenesis, dor- sal and thoracic closures; puc is also expressed in stress responses and other models (Karkali and Panayotou, 2012). Besides Puc, Alphabet (Alph), a non vital protein phosphatase 2C homolog in flies, negatively regulates dorsal closure at the level of JNKKK. Alph regulates the p38 and ERK pathways in flies (Baril and Therrien, 2006; Baril et al., 2009). Anterior open (Aop, also known as Yan), an ETS tran- scriptional repressor acting in the Rolled (ERK homo- logue) signaling pathway, is a transcriptional repressor that opposes Jra/Kay function (Rebay and Rubin, 1995; Riesgo-Escovar and Hafen, 1997b). Aop is a nuclear con- stitutive repressor that has to be inactivated, to release inhibition. This is borne out by Bsk phosphorylation of Aop, which then instructs Aop to disengage from DNA binding and exit the nucleus, and redirects it to degrada- tion via the proteasome. Aop was one of the first identified inhibitors of the JNK pathway. Mutants for aop show delayed differentia- tion of the epidermis and ectopic proliferation of its precursors (Rogge et al., 1995; Riesgo-Escovar and Hafen, 1997b). In contrast with other members of the pathway, aop null alleles do not result in a ‘‘dorsal open’’ phenotype; instead, a hole is found on the ante- rior portion of the embryo, accompanied with other head defects. As Aop is required early in development in the Rolled signaling pathway, there might be a mater- nal contribution that partially fulfills dorsal closure 153RÍOS-BARRERA AND RIESGO-ESCOVAR requirements. A consensus sequence for Aop binding was found in the dpp promoter region, suggesting that binding of Aop blocks this JNK immediate early gene transcription. Consistently, mutants for aop have ec- topic dpp and puc expression (Riesgo-Escovar and Hafen, 1997b). It is thought that activated Bsk phospho- rylates Aop and induces its cytoplasmic translocation, as stated, as Rolled does. In parallel, Bsk phosphorylates Jra to activate it. The Scarface (Scaf) protein creates another regulatory negative feedback loop. Scaf is a serine-protease homo- logue family member identified by two groups as a JNK signaling transcriptional target (Rousset et al., 2010; Sorrosal et al., 2010). scaf mutants show dorsal closure and male genitalia rotation/closure defects, besides ec- topic puc expression. Scaf is a secreted protein, yet how it antagonizes dorsal closure is not known. The ex- istence of an extracellular regulator of the pathway gives credence to the notion of an as yet unknown membrane-associated and/or extracellular compo- nent(s) of the pathway. Ribbon (Rib) is a BTB/POZ domain containing pro- tein. This BTB/POZ domain has a Zn-finger, known to bind DNA, conserved between metazoa. Rib also has a dual nuclear localization signal, so it could conceivably translocate to the nucleus and counteract Bsk at the transcriptional level. rib mutants show a dorsal-open phenotype but also other defects related to EGFR and FGF signaling pathways (Blake et al., 1998; Bradley and Andrew, 2001). Both EGFR and FGF pathways are de- pendent on Rolled signaling, so Rib could be a promis- cuous regulator of MAPK pathways, as is Aop or Alph. Other genes, like Raw and Pebbled (Peb, also known as Hindsight), are known regulators of the pathway, but their molecular mechanisms are not well understood (Byars et al., 1999; Reed et al., 2001). Raw is a pioneer protein that counteracts Bsk func- tion. There is no good sequence-based clue about the function(s) of Raw. Structurally, Raw consists of a 191 aminoacid residue domain present two times in the pro- tein and conserved within species (Byars et al., 1999). Besides these domains, Raw possesses a C-terminal gln- rich region. This gln-rich region is not present in the Caenorhabditis elegans (C. elegans) homologue, OLRN-1. Interestingly, OLRN-1 has a putative transmem- brane region absent in Drosophila Raw. Nevertheless, the gene is involved also in JNK signaling in this nema- tode during differentiation of an olfactory neuron. Null olrn-1 alleles are not available, so whether it acts earlier in development, specifically in ventral closure, has not been determined (Bauer Huang et al., 2007). The mechanism of action of Raw and Rib has been difficult to resolve. By epistasis analysis, Raw acts down- stream of Bsk and upstream of Jra. As it is well estab- lished that Jra is a direct target of Bsk, Raw could be act- ing in parallel to Bsk, ending Jra activation (Bates et al., 2008). As expected, Raw mutants also show ectopic expression of puc-lacZ (Byars et al., 1999). raw and rib mutants do not synergize, in opposition with puc and raw double mutants that have more severe dorsal clo- sure defects. Mutants for other negative regulators of the pathway, such as Aop, also show ectopic activation of JNK signaling (Byars et al., 1999; Bates et al., 2008). One way to rationalize the genetic interactions results between puc, raw, and rib is that Puc functions in a branch of the pathway parallel to Raw/Rib downregulat- ing Jra/Kay signaling. It remains to be determined in detail where these genes and others cooperate (Fig. 3). One particularly interesting feature of puc, raw, and rib loss of function mutants, one that mimics ectopic expression of Jra, dpp, or tkv, is that all of them are par- tially dorsalized (Stronach and Perrimon, 2001; Bates et al., 2008). This is explained by the fact that in all of them the dorsal-defining dpp gene is ectopically expressed in the lateral epidermis of mutant embryos, and this late ectopic Dpp then reinforces dorsal cell fates. Variations in the level of dpp expression in the lat- eral epithelium during dorsal closure has come to be a hallmark of JNK activity, just as variations of Puc-lacZ FIG. 3. Spatial regulation of Basket signaling during dorsal clo- sure. (a) During germband retraction, amnioserosal cells are stretched in an antero-posterior axis, and lateral epithelial cells have not changed shape from a cuboidal arrangement. During dor- sal closure, amnioserosal cells are polygonal in shape, and lateral epithelial cells stretch dorso-ventrally. AS, amnioserosa; LE, LE cells of the lateral epithelium; E, lateral epithelium. Images are pro- jections from confocal stacks of living embryos expressing DE- Cadherin::GFP. Scale bar is 5 lm. (b) Before the onset of dorsal clo- sure, Basket signaling is downregulated in several tissues (left box). An unknown signal activates the Basket pathway only at the lateral epithelial LE cells. Basket signaling continues repressed in adjacent tissues (middle box). As closure ends, the pathway is turned off by an autoregulatory feedback loop in the LE (right box). Dorsal is up. Abbreviations used: Aop, Anterior open; Bsk, Basket; Peb, Pebbled; Puc, Puckered. 154 DROSOPHILA JUN N-TERMINAL KINASE PATHWAY expression also are. Deviations from wild type levels of expression in these markers are regarded as a sensitive way to assess net effects and types of mutations, espe- cially relevant since both loss and gain of function al- leles concur on a reasonably common dorsal open phenotype. Another level of regulation for JNK signaling takes place in the amnioserosa. An important contribution for Bsk/dorsal closure studies was the characterization of Peb, a Zn-finger transcription factor expressed in the amnioserosa (Fig. 3; Lamka and Lipshitz, 1999). Peb localizes to the nucleus and impedes nuclear Jra/Kay accumulation (Reed et al., 2001). Peb is required for amnioserosa survival at germ band extension/retraction stages; peb mutants are unable to complete these proc- esses properly. The defect is caused by premature apo- ptosis of amnioserosa cells (Frank and Rushlow, 1996; Lamka and Lipshitz, 1999). Peb has been shown to turn off JNK signaling. A peb hypomorph that partially res- cued germ band retraction, died with a dorsal-open phe- notype (Reed et al., 2001). This failure is accounted not only by amnioserosa loss; actually, what is seen in this and other peb hypomorphs is active JNK signaling in the amnioserosa and subsequent cell death. Detailed analyses of dorsal closure revealed that JNK signaling in the amnioserosa is actively turned off by Peb. Both JNK activation and subsequent inhibition in the amnioserosa are required for accurate closure. Peb might create a boundary of high/low JNK signal- ing activity, and act as a trigger for Bsk activation in the LE cells. This is an intriguing possibility; especially since currently there are no good ligand and/or receptor candi- dates for JNK signaling during dorsal closure. Besides, amnioserosa/epidermis fields can be experimentally ge- netically expanded or reduced, with the LE always speci- fied in the lateral epithelia at the border between these tissues (evidenced by puc expression) (Stronach and Per- rimon, 2001). Another relevant finding is that peb expression in the amnioserosa is directly controlled by factors inducing the differentiation of this tissue: the Dpp early expression gradient. This could conceivably mean that early in development, Dpp controls Bsk induc- tion at the LE by specifying the amnioserosa through fac- tors such as Peb, which along with other repressors in the epidermis, such as Raw and Rib, and Aop, determines the actual place and time for Bsk activation (Fig. 3). Mutations in peb decrease expression of non-JNK genes in LE cells (Wilk et al., 2004), arguing in favor of communication between these tissues, and of Bsk acti- vation at the boundary of Peb and Raw expression domains. Consistently, amnioserosa cells physical or genetic ablation during dorsal closure stages, by itself, does not alter Bsk activation in LE cells (Kiehart et al., 2000; Scuderi and Letsou, 2005), suggesting Peb as a key amnioserosal inhibitor of JNK signaling, and not just acting to ensure cell viability in this tissue. This alternative hypothesis to Bsk activity, different from Bsk being switched on by an extracellular ligand and a membrane receptor, implies that there are no such elements in the pathway. This may be in taking with the ‘‘ancestral’’ stress function of JNK signaling, dorsal closure constituting a predictable ‘‘developmen- tal stress’’ response resulting from germband retraction and amnioserosa and lateral epithelium cellular defor- mation. The default state of JNK signaling in dorsal clo- sure would then be ‘‘on,’’ and adequate activation in space and time would be achieved by the action of sev- eral negative regulators, as represented in Figure 3. Bates et al. (2008) have proposed that the Jra/Kay AP-1 transcription factor is ‘‘noisy,’’ and thus, the presence of negative regulators restrains this basal activity. This also means that Jra/Kay could have Bsk-independent activ- ities, something that has clearly been shown for Kay (Riesgo-Escovar and Hafen, 1997a; Ciapponi et al., 2001; Souid and Yanicostas, 2003). The products of raw, rib, and puc would then execute this basal quenching; however, this last, puc, being an immediate early JNK gene, is expressed only in the LE at appreci- able levels, and would in principle only act late to con- trol Bsk activation there. Raw regulates JNK signaling in contexts other than dorsal closure (Jemc et al., 2012). The C. elegans Raw homolog, OLRN-1, seems to interact with JNK signaling in the nervous system (Bauer Huang et al., 2007). To- gether, this might imply that Drosophila Raw regulates JNK signaling in many cell types. Mutations for mem- bers of JNK signaling are capable of modifying a domi- nant eye phenotype of a viable peb allele, but the effects of this mutation in the eye might constitute a ‘‘stress’’ signal, for Jra and bsk mutations, in clones, have no dis- cernible eye phenotypes, and thus, in principle, no function in this tissue (Riesgo-Escovar et al., 1996; Wilk et al., 2004). Taking all the evidence together, neverthe- less, it is reasonable to assume that both Raw and Peb are involved in other Bsk dependent processes. In this regard, it would be interesting to find if in peb mutants, the observed amnioserosa cells premature death is a consequence of JNK signaling deregulation, or due to a different function of Peb in these cells. Puc is crucial for adequate tuning of the pathway not only during dorsal closure, but also may be involved in other Bsk-independent functions. Bsk and Jra are not required for eye formation, as stated; in contrast, loss of Puc function in this tissue leads to cell death and subse- quent eye field reduction. The same is true for other tis- sues like the wing imaginal disc (McEwen and Peifer, 2005). Finally, Puc might also act at low levels to repress JNK signaling in other tissues, independent of Bsk induction. During embryogenesis, besides the defects on dorsal closure seen on puc mutants, a fraction of mu- tant embryos die with generalized Bsk activity (Rı́os-Bar- 155RÍOS-BARRERA AND RIESGO-ESCOVAR rera and Riesgo-Escovar, unpublished observations). This Bsk high level of activity is also the main pheno- type of zygotic puc mutants whose maternal puc contri- bution is reduced or absent (McEwen and Peifer, 2005). Interestingly, JNK signaling also has been associated with tissue overgrowth. When apoptosis is experimen- tally blocked in cells lacking Puc function, there is an increase in tissue size; moreover, an inhibitor of Src42A, Csk, has been shown to produce tissue overgrowth in a Bsk-dependent manner (Read et al., 2004). Can over- growth be a late stress response, especially if apoptosis is blocked? Future studies should address this issue. REGULATING STRESS, HEALING, AND DEATH Basket Signaling Programmed cell death allows organisms to eliminate sick or endangered cells, or developmentally redundant cells, to keep tissue/organism homeostasis. To trigger the response specifically in cells destined to die, quality control and survival signals are constantly being trans- duced and different cell death/survival signaling thresh- olds compared. In fact, even when programmed cell death seems to have taken a sure hold on the cell’s future, for instance, by activation of caspases, DNA frag- mentation, or vigorous expression of reactive oxygen species (ROS), these cell death fates can be countered, allowing cells to survive [a process termed anastasis (Tang et al., 2012)]. Most cells are poised and ready to undergo programmed cell death, yet not destined to, necessarily. This means that there is normally expres- sion of pro- and anti-apoptotic genes at low levels, and programmed cell death, when effected, is then the net result of an active and ongoing process, whose sum tips the balance toward death (Steller, 2008). The first JNK reports in yeast and in mammalian tis- sue culture cells showed that this kinase was involved in stress responses, where programmed cell death may well be one of the consequences [hence the reason for the other name of JNK: Stress Activated Protein Kinase (Galcheva-Gargova et al., 1994; Stronach and Perrimon, 1999)]. It appears that JNK-dependent programmed cell death is only partially, if at all, dependent on caspase activation; rather, it appears to promote an outcome more akin to necroptosis, a form of programmed cell death different from apoptosis, which is caspase medi- ated. Necroptosis courses with generation of ROS to effect death (Kanda et al., 2011). Drosophila Basket is activated in response to several classes of stresses, like UV exposure and irradiation, wound healing, oxidative stress, or immune challenges (Riesgo-Escovar et al., 1996; Stronach and Perrimon, 1999; Rämet et al., 2002; Bosch et al., 2005; Bidla et al., 2007; Karkali and Panayotou, 2012). In mammals, acti- vation of JNK occurs at the open edges of wounds, these cells acting as surrogate LE cells in stretching and covering the exposed wound surface during healing. In Drosophila, JNK signaling is likewise activated at the wound site, and seems to mediate epithelial cells’ shape changes and reestablishment of a continuos epithelium, mimicking closely cellular events that occur during dor- sal closure (Galko and Krasnow, 2004; Lesch et al., 2010; Brock et al., 2012). This activation courses with well-characterized elements of the JNK pathway, like Rho family G proteins, Kay, and Puc, showcasing involvement of JNK signaling in wound healing (Wood et al., 2002; Martin and Parkhurst, 2004; Baek et al., 2010; Razzell et al., 2011). Paraquat treatment has been classically used in tissue culture cells and organisms to induce excessive oxida- tive stress (Arking et al., 1991; Chatterjee and Boh- mann, 2012). In Drosophila, paraquat treatment results in reduced lifespan and an increase in oxidized pro- teins. Heterozygosity for Puc counteracted these effects, increasing lifespan and decreasing protein oxi- dation. A hypomorphic condition for Hep in this back- ground generally abrogated these effects, implicating JNK pathway activation as a countermeasure to oxida- tive stress (Wang et al., 2003). A model has been developed where eye-specific, ec- topic expression of the Drosophila tumor necrosis fac- tor (TNF) family member homolog, Eiger (Egr), a pro- inflammatory cytokine, or TAK1, a MAPKKK, leads to massive death in the prospective eye territory (Mihaly et al., 2001; Igaki et al., 2002). Activation of JNK by Egr over-expression in tissue culture cells has also been studied (Geuking et al., 2005). In these cases, JNK acti- vation leads to expression of stress responsive genes, some pro-apoptotic genes, cytoskeletal and signaling components (Jasper et al., 2001). Other cell-death mod- els in imaginal tissues, like cell–cell competition (Moreno and Basler, 2004), morphogen gradient discon- tinuities (Adachi-Yamada et al., 1999; Adachi-Yamada and O’Connor, 2002; Shen and Dahmann, 2005), and cytoskeletal alterations based on ectopic expression of Myc or Rho1, countered by ectopic expression of the phosphatase Puc or Thread (also known as DIAP1), or the baculovirus anti-apoptoic gene p35 have also been employed to study JNK involvement in promotion of ap- optosis (Kuranaga et al., 2002; Neisch et al., 2010). Using these mainly ectopic expression experiments a tentative signaling pathway has been assembled with Egr/Wengen (Wgn) as a ligand/membrane receptor pair, signaling through TAB2 (Geuking et al., 2005), CYLD (Xue et al., 2007), and TRAF4 (Also known as DTRAF1) to TAK1 (JNKKK), MKK4 and/or Hep (JNKKs), to Bsk (Cha et al., 2003; Geuking et al., 2009). This ‘‘non-ca- nonical’’ pathway is certainly not required for develop- ment, and seems to be employed solely in the aforemen- tioned instances, as the other examples where the JNK pathway is activated due to stress do require the JNK 156 DROSOPHILA JUN N-TERMINAL KINASE PATHWAY ‘‘canonical’’ pathway (see Fig. 2 and Table 1). Besides TAK1, another MAP3K mediating cell death induction, Pk92B (also known as DASK1) has been described. It is thought that Pk92B is recruited by TRAF4 and that both of them may mediate Bsk activation (Kuranaga et al., 2002). No loss of function mutations for Pk92B are available. egr, CYLD, and Mkk4 mutants are viable and fertile, including null alleles (Xue et al., 2007; Geuking et al., 2009; McQuilton et al., 2012). The sole wgn mutant al- lele described is also viable and fertile. Tak1 mutants are viable and fertile as well, but very susceptible to Gram-negative infections. TAK1 is also known to signal through the Imd and p38 pathways, at least when expressed ectopically (Vidal et al., 2001; Geuking et al., 2009). Death signaling in response to Egr seems, in sum- mary, not to entail vital genes, except Bsk (and Hep), but care should be taken with conclusions gleaned from gain-of-function analyses where physiological rele- vance in vivo has not been asserted. Conversely, demonstrating concurrence of Bsk and JNK pathway vital genes’ activation during stress lead- ing to cell death is difficult to assess, since loss of a vital gene may trigger programmed cell death per se. It could even be argued, from its role in development and in stress responses, that the JNK pathway seems to be dichotomously used in flies: as an obligate element of development, ensuring appropriate changes in cell mor- phogenesis at multiple points (follicle cells develop- ment, embryonic dorsal closure, dorsal thoracic clo- sure, and genital disc rotation and closure during meta- morphosis), and as a conveyor belt for stress stimuli. The latter could be the evolutionarily more ancient function, from which the ‘‘new’’ developmental roles accrued. Because of these JNK pathway varied roles, ideally evidence should be carefully weighted to fully support direct participation of a certain putative regula- tor. Still, it should be interesting to determine the whole spectrum of cellular death signals, and in that context, the relationship(s) to Basket signaling. CONCLUDING REMARKS JNK signaling regulates and executes several critical de- velopmental processes in flies. It is also an excellent model in which to study how cellular signaling circuitry may be used and redirected during evolution to regulate different processes and effect varied responses such as cytoskeleton modifications in dorsal closure and wound healing, springing from stress response mechanisms to even direct tissue growth. It may be that, very much like the apoptosis signaling pathway, there is a need to constantly silence Basket to achieve an accurate level of activity. This ‘‘ready-state’’ might relate to JNK signaling in response to stress, a stimulus type that is neither pre- dictable nor generally reproducible in the lives of organ- isms. In this view, JNK obligate activity during develop- ment is a late acquisition. This buffering of signaling potential may also condi- tion how cells variously ‘‘read’’ a signal in order to exe- cute a response, besides the presence or absence of par- ticular molecules to imbue specificity in a pathway. For Basket signaling, a basal ‘‘on’’ repressed state, in con- trast to the more classical signal-induced activation, may imply a need to rapidly activate (un-inhibit) the path- way. Such a mechanism might give a time advantage during injury responses, and may have been applied as well for developmental processes such as dorsal clo- sure. An interesting point to highlight is that most of the JNK negative regulators act at the level of Bsk/Jra (Puc, Raw, Peb, and Aop), which might argue in favor to Jra/Kay leaky activity, yet Kay needs to be translo- cated to the nucleus during pathway activation, which might negate some of this time advantage. For assessing the physiological relevance of gene inter- actions, establishment of more physiological models are still needed. For example, the eye as a model tissue for gene interactions is useful as a first-glance gene discovery tool, but confirmatory scenarios for JNK signaling are mandatory. In this way, suppression in gain-of-function screens in the eye or other tissues can be confirmed. In the same sense, if an otherwise viable mutation is chal- lenged under conceivably relevant stimuli, as pathogen infection or stressor exposure, a reflected reduced fit- ness would strongly imply relevant functions. ACKNOWLEDGMENTS The authors thank Martha Vázquez-Laslop and Rosa Nav- arro-González for helpful comments and discussions. LITERATURE CITED Adachi-Yamada T, Fujimura-Kamada K, Nishida Y, Matsu- moto K. 1999. Distortion of proximodistal informa- tion causes JNK-dependent apoptosis in Drosophila wing. Nature 400:166–169. Adachi-Yamada T, O’Connor M. 2002. Morphogenetic apoptosis: a mechanism for correcting discontinu- ities in morphogen gradients. Dev Biol 251:74–90. Affolter M, Nellen D, Nussbaumer U, Basler K. 1994. Multiple requirements for the receptor serine/threo- nine kinase thick veins reveal novel functions of TGF beta homologs during Drosophila embryogene- sis. 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The acal locus codes for a conserved, long, non-coding, nuclear RNA. Long non-coding RNAs are an abundant and diverse class of gene regulators. Mutations in acal are lethal. acal mRNA expression is dynamic and is processed into a collection of 50 to 120 bp fragments. We show that acal lies downstream of raw, a pioneer protein, helping explain part of raw functions, and interacts genetically with Polycomb. acal functions in trans regulating mRNA expression of two genes involved in JNK signaling and dorsal closure: Connector of kinase to AP1 (Cka) and anterior open (aop). Cka is a conserved scaffold protein that brings together JNK and Jun, and aop is a transcription factor. Misregulation of Cka and aop can account for dorsal closure phenotypes in acal mutants. Author Summary Changes in cell shape affect many critical cellular and bodily processes, like wound healing and developmental events, and when gone awry, metastatic processes in cancer [1]. Evolutionarily conserved signaling pathways govern regulation of these cellular changes. The Jun-N-terminal kinase pathway regulates cell stretching during wound healing and normal development [2]. An extensively studied developmental process is embryonic dorsal closure in fruit flies, a well established model for the regulation and manner of this cell shape changes [3]. Here we describe and characterize a processed, long non-coding RNA locus, acal, that adds a new layer of complexity to the Jun-N- terminal kinase signaling, acting as a negative regulator of the pathway. acal modulates the expression of two key genes in the pathway: the scaffold protein Cka, and the transcription factor Aop. Together, they enable the proper level of Jun-N-terminal kinase pathway activation to occur to allow cell stretching and closure. Introduction A large fraction of the eukaryotic genome codes for non-coding RNAs (ncRNAs), which are very abundant and diverse, yet mostly uncharacterized and of unknown functions [4,5]. Nevertheless, some are critical players in gene expression regulation. Non-coding RNAs encompass different classes of molecules. The best-characterized ncRNAs are small RNAs. Broadly, small RNAs recruit silencing machinery to mRNAs to inhibit translation and/or target them for degradation [6]. Small crass characterization was facilitated because they base-pair with cognate mRNA targets, and interact with common protein complexes to regulate gene expression [7]. In contrast, long non coding RNAs (lncRNAs) encode a diverse group of ncRNAs, which may be part of different molecular complexes, and can stimulate or inhibit gene expression [8]. Recognized lncRNAs range from 200 nucleotides to several kilobases [9]. Since they do not have evident sequence motifs for annotation, their identification and relevance has remained elusive. In addition, many have low expression levels, hindering isolation and characterization. Next-generation RNA sequencing uncovered many lncRNAs (over 50% of transcribed species [5,10]), increasing dramatically their number and repertoire [11]. Despite this, in most cases contribution of lncRNAs to gene expression regulation or other still awaits genetic and functional validation. In Drosophila melanogaster some lncRNAs have been annotated [12], and play important roles in gene expression, as in vertebrates [13]. In spite of extensive genetic screens, forward genetics identification of lncRNAs has been very limited, as they are found to fine- tune gene expression with mild phenotypical contributions. Here we characterize a Drosophila lncRNA with strong embryonic phenotypes and lethality. Mutations in this locus, acal, result in partially penetrant dorsal closure (DC) defects due to Jun N-terminal kinase (JNK) signaling over-activation. This results in failure of DC, leading to a lethal dorsal open phenotype. During DC, lateral epidermal sheets stretch over a dorsal extra-embryonic cell layer, the amnioserosa, and fuse at the dorsal midline [14]. The JNK signaling pathway regulates DC, and is activated at the dorsalmost row of epidermal cells, the leading edge cells (LE), which act as a signaling center for DC ([15], reviewed in [3]). In these epidermal cells, JNK activation induces expression of cytoskeleton and adhesion regulators for cell stretching [16]. JNK activation at the LE spreads the morphogenetic rearrangement by inducing the signaling ligand decapentaplegic (dpp), a fly homolog of vertebrate BMPs. Dpp signals to lateral epidermal cells and amnioserosa to promote cell shape changes [17,18]. This response induces stretching of lateral epithelia in absence of cell proliferation, and final zippering. It is not known how JNK activation is triggered at the LE, nor completely known how LE restriction occurs. The JNK signaling pathway is an evolutionarily conserved, MAPK-type signaling pathway. It consists, at its core, of a cascade of kinases, from JN4K (the gene misshapen in flies), to JN3K (slipper), JN2K (hemipterous), and finally JNK proper (basket). Activated JNK–bound to a scaffold protein called Connector of kinase to AP1 (Cka)–, phosphorylates the transcription factor Jra (Drosophila Jun). Jra, together with Kayak (Drosophila Fos), constitute the AP-1 transcription complex activating JNK target genes. Besides Jra, JNK also phosphorylates Anterior open (Aop), leading to Aop nuclear export, de-repressing JNK target genes. The JNK pathway is required for orchestration of embryonic dorsal closure, but also for wound healing and in response to certain stressful conditions [3]. During DC JNK activity is restrained from the lateral epidermis partly by aop, although this transcription factor also functions earlier in the tissue in a positive way by promoting epidermis differentiation, preventing ectopic mitoses [17]. The ‘raw-group genes’: raw, a pioneer protein, and ribbon, a transcription factor (rib, [19,20]) also restrict JNK activation in the lateral epithelia. Another member, puckered (puc), coding for a JNK phosphatase, acts in a feedback loop in the LE, dephosphorylating active JNK, and stopping signaling. JNK activation is also antagonized in the amnioserosa by pebbled (peb), which codes for a transcription factor [21]. We show here that acal lncRNA partly mediates Raw JNK signaling antagonism in the lateral epidermis. acal partakes in regulating expression of the scaffold protein Cka [22]. This explains partly raw function (raw as an acal regulator), and provides a framework for JNK activity down-regulation at the lateral epidermis during DC. We find that mutations in acal also alter the expression of aop, balancing JNK activation. Acal also shows a genetic interaction with Polycomb, suggesting a relationship between acal and the Polycomb repressive complex. Overall, this provides a rationale for acal DC phenotypes. Results acal is a novel ‘dorsal open’ gene Mutations in fly JNK signaling genes — like bsk, the fly JNK gene [15], Cka [22], and aop [17]— lead to an embryonic lethal condition with a dorsal hole in the cuticle (Figure 1B–D). This ‘dorsal open’ phenotype has been used to identify JNK and other DC genes [3]. We identified a lethal locus where a fraction of mutant embryos die with dorsal closure defects. We called it acal, or ‘boat’ in Náhuatl, due to the cuticular appearance of mutants. Two alleles, acal1 and acal2 (Figure 1E–F), are lethal excisions of P{KG09113}, a viable and fertile P-element transposon insertion at 47A13 (Figure 1M’’). Three more EMS alleles were isolated over acal1 and acal2 by lack of complementation (acal3, acal4, and acal5, Figure 1G–J). A sixth lethal mutant allele is a mapped P element insertion in the locus, P{GS325ND3} (Figure 1K-L and M’’). All mutations are lethal, with embryonic, larval, and pupal phenocritical periods. No adults are ever observed. A fraction of mutant embryos have DC defects, with holes in either the dorsal or anterior ends of embryos (Figure 1E–L and S1A). Dorsal or anterior holes are the only cuticular defects seen in these mutants. acal mutants have an extended phenocritical period, since a fraction of mutant embryos die without cuticular defects, and finally another fraction of mutant embryos survive embryogenesis and die later during larval stages up to the beginning of pupariation. This means that acal is required at various times during development. Larval lethality varies from 10 to 50% depending on the allele studied, and pupal death from 3 to 40%. As stated, no adult homozygous mutant flies are ever recovered, except 1-2% adult acal6 escapers. In this work, we focus on the embryonic mutant phenotypes. Using these embryonic phenotypes, mutant alleles conform to an allelic series with acal5 as the strongest, and acal1 as the weakest (Figure S1A). acal maps to an intergenic unannotated region and to SD08925 We used deficiencies uncovering P{KG09113} to map acal in complementation tests, and established a 100 kb interval where acal maps. This interval includes three annotated genes: longitudinals lacking (lola), pipsqueak (psq), and CR45135 (Figure 1M). acal mutations complement lola and psq alleles (Table S1). Besides, lola and psq have different embryonic mutant phenotypes from acal, with no cuticular phenotypes, like dorsal or anterior holes ([23,24] and Figure S7A). CR45135 is not characterized, but partially overlaps a lola exon, so CR45135 mutations should affect lola. Moreover, many lola lethal insertions overlap this gene [25]. A previous report showed that there is at least another locus whose mutation complements lola and psq, despite being unannotated [26]. This mutation, l(2)00297, suppresses the peb1 heat-shock sensitive rough eye phenotype. acal mutant alleles also suppress, in our experimental conditions, this subtle but clear phenotype (Figure S1B). This suggests that acal and l(2)00297 are allelic, and is independent evidence of a lethal locus between lola and psq. Another paper independently reports the existence of a long non-coding transcript approximately 4 kb from the start of lola [23]. The size of this transcript is stated as 4 kb, but this was an approximation, as the evidence supports a maximum size of 3.4 Kb, since this cDNA hybridized to a 2.8 and a 0.6 Kb neighboring restriction fragments in Southern blots ([23], and Edward Giniger, personal communication). An EST in Flybase, SD08925, sequenced partially at the 5’ end, maps 3.8 kb away from lola, precisely where Giniger et al. report the location of their ‘alpha’ long non-coding transcript [23]. We believe this transcript is the same as SD08925. We sequenced fully this EST (Genbank accession number # KJ598082). SD08925 is 2.3 kb long, poly-adenylated, and a single exon. Its genomic 3’ end bears an A-rich stretch (Figure 1M’’), characteristic of poly-adenylation sites [27]. We also obtained a 2.3 kb weak Northern blot signal (compared to control Rp49), demonstrating SD08925 expression, and confirming that SD08925 is a full-length cDNA. This band was detected throughout the life cycle and was nearly absent in the ∆18 deficiency strain uncovering the locus by semi-quantitative RT- PCR (Figure S1C-D). Consistent with the weak Northern signal, RNA-seq and microarray data show low SD08925 expression levels [28,29]. We sequenced 4.7 kb of the SD08925 genomic region in acal mutant and control lines. In these and following experiments, we selected and separated mutant embryos from heterozygous controls by lack of embryonic GFP-expression due to a balancer chromosome (see Materials and Methods). Within this region, we found a 20 base pair insertion in acal1. The acal1 lesion is 1031 bp away from P{KG09113}, at +931 of the cDNA, a position conserved in closely related species. Similarly, we found a 2 bp deletion 1630 bp away from P{KG09113} within the 5’ end of SD08925 in acal2, in a conserved region (Figure 1M’’ and 3A). In both cases, no trace of the original P element was found. We reasoned that both, found 1-2 Kb away from the original insertion site (which is in itself viable and fertile), are likely consequences of P-element imprecise excisions and repair, due to nicking and repair of the DNA break, leading to lethality, and responsible for the acal1 and acal2 mutant phenotypes, respectively. In both cases, the changes are not present in any of the other strains (genome reference assembly, yw wild type control, parental strain, or other acal mutants). acal6 is a P-element insertion mapping to the locus, 3 Kb 5’ from the transcription start site. We found no differences in the sequence in the 4.7 kb genomic region sequenced centered around the SD08925 transcribed region for acal3, acal4, and acal5. The sequenced genomic region includes the whole transcript, plus some neighboring 5’ and 3’ sequences (Figure 1M’'), suggesting that mutations in acal3, acal4, and acal5 lie outside the transcript. This is consistent with a regulatory nature for these alleles, rather than molecular lesions within the transcribed region, like acal6. We performed a genomic rescue experiment (Figure 1M’–N), rescuing fully the embryonic lethality of acal1 and acal2 mutants with a ~20 kb genomic construct called 178D09. 178D09 spans a small portion of the 5’ region of lola, wholly the SD08925 transcript region, plus ~7 kb upstream of SD08925 in the intergenic region between SD08925 and psq (Figure 1M’). Besides the 5’-most exon of lola, which is part of the untranslated 5’ leader sequence of some lola splice variants and CR45135, no other transcript is included, except SD08925. SD08925 expression levels are not changed in rescued embryos versus controls, presumably due to endogenous regulatory sequences maintaining overall low expression levels (Figure S1E). SD08925 is conserved in eleven Drosophila species surveyed, and recognizable in A. gambiae (Figure 1O; 3A). Together, these data are consistent with a low-expression locus involved in DC. We quantified SD08925 expression during DC in acal2 and acal5 mutant embryos by qRT- PCR. acal2 expression is similar to wild type, but acal5 expression is significantly reduced (Figure 2A). This is consistent with acal5 being a regulatory mutant, although other interpretations are possible. To ensure consistency, whenever possible we performed experiments with multiple acal mutant alleles, with similar results. These data are also consistent with SD08925 coding for acal. In contrast, using primers that detect all lola isoforms, or all psq isoforms (both loci have alternative splicing) no significant differences in expression levels are seen in acal1, acal2, acal5, and acal6 (Figure S7C). In order to more rigorously test whether SD08925 is acal, we generated a UAS transgene containing only the complete SD08925 cDNA (2.3 kb). We expressed this construct in acal5 mutants, using the 69B ectodermal driver. This resulted in significant rescue of acal5 DC defects and reduction of embryonic lethality (Figure 2B–B’’’). 69B over-expression of UAS-acal in acal5 mutants significantly increased SD08925 expression (40%, Figure S2A). We also show that pnrMD237 gal4 (pnr-gal4) driven expression of SD08925 rescues DC defects in acal5 (Figure 2B). Regardless of the nature of acal5, augmenting SD08925 expression in the mutant significantly rescues the embryonic phenotypes, arguing that reduction of acal expression is responsible for the acal5 DC and embryonic lethality phenotypes. Taken together, (1) the complete lack of complementation and similar mutant phenotypes of all six acal alleles to each other (but complementation to and dissimilar to mutant phenotypes of the neighboring lola and psq loci), (2) the molecular mapping of acal1, acal2, and acal6 to the SD08925 locus, (3) the significant genomic and UAS-acal rescues for acal1, acal2, and acal5, and (4) the significantly reduced SD08925 expression in acal5 both by qRT-PCR and in situ hybridization (see below), compared to no differences in lola and psq expression levels in acal1, acal2, acal5, and acal6 establish the SD08925 locus as the acal locus. acal embryonic expression In situ hybridization with SD08925 in wild type embryos revealed a dynamic expression pattern, mainly in two tissues: the lateral epidermis and the central nervous system. At early stages, the transcript is detectable throughout the embryo but falls at gastrulation (Figure 2D). From germband retraction to DC, expression is seen in germband derivatives, mainly the lateral epidermis and nervous system (Figure 2D). This is consistent with a role in DC and the UAS-acal rescue in the ectoderm and/or lateral epidermis (Figure 2B). Later, expression appears in the mesoderm, but the bulk of expression is in the condensing nervous system and closing lateral epithelia. At the end of embryogenesis, expression occurs in the nervous system (Figure 2D). In acal5 mutant embryos, expression is significantly reduced in the lateral epithelium during DC, consistent with acal5 being a regulatory mutant and with the UAS rescue (Figure 2B– D). Nervous system expression is not altered in acal5 during DC stages, but decreases significantly later (Figure S2B–C). acal is a processed, long non-coding RNA Is SD08925, from now on referred to as the acal transcript, translated? The acal transcript is 2.3 kb long and could potentially code for protein(s). The locus is also evolutionarily conserved in other dipteran species (Figure 3A), but not outside Diptera. We find that in the dipteran species examined, the locus is devoid of conserved open reading frames (ORFs), sporting only variable, non-conserved ORFs ranging from 33 up to 243 nucleotides in size (Figure S3A), even though other regions of the transcript are conserved (Figure 3A; S3B). Unlike short ORF-bearing transcripts like polished rice (pri, [30]), the putative short ORFs in SD08925 and homologues have no common motifs. The deduced protein sequences of these ORFs in D. melanogaster show no homology with annotated proteins, and are not present in Drosophila proteomics databases (see Materials and Methods). Using an algorithm that measures coding potential [31], based on six different criteria [(1) feasibility of ORFs, (2) coverage of ORFs within transcript, (3) presence of in-frame initiation and stop codons, (4) number of hits in BLASTX, (5) high quality in any given BLASTX hit, and (6) whether any given hit is in frame with the predicted ORFs], we determined that acal has an extremely low coding potential, similar to other characterized long non-coding RNAs (Figure 3B). Genes harboring short ORFs have been erroneously classified as long non-coding RNAs, and later found to code for small peptides [30,32,33]. Does acal code for short, translated ORFs? Genes coding for short ORFs still have a protein coding score, unlike acal (Figure 3B), and are exported to the cytoplasm for translation. In contrast, many non-coding RNAs reside in the nucleus. We detected acal transcripts enrichment in a nuclear fraction, different from Rp49, a protein-coding mRNA (Figure 3C–D). As control, we also detected a small enrichment in the nuclear fraction of pre-bantam (ban), a well-known miRNA precursor. The enrichment is small, likely because it is quickly processed to mature ban. acal nuclear enrichment also suggests a non-coding nature. High-throughput RNA sequencing projects have deeply annotated small RNAs in the Drosophila genome [34]. Within acal, we found two groups of sequence reads reported to appear under various experimental conditions that did not qualify as functional small RNAs. We designated these groups of reads as acal-A and acal-C (Figure 3A), and performed small RNA Northern blotting, reasoning these could be the mature products of the acal transcript. With this Northern protocol, larger RNA fragments are not detected, but small RNA species are well separated. Using the acal-A probe, we found evidence of acal fragmentation throughout the life cycle of the fly, particularly during pupal stages (Figure 3E; S3C). Instead of a roughly 22-nucleotide fragment, we found a group of small bands from about 50 to 118 nucleotides (Figure 3E). These bands are not detectable in regular agarose gels due to their size. In contrast, acal-C did not reveal evidence of processing (Figure S3C). We used two additional probes, acal-B and acal-D, to look for evidence of further processing. acal-D revealed no processing (Figure S3C), but acal-B revealed at least a 59 nucleotides-long fragment (Figure 3E). Both acal-A and acal-B fall within conserved positions of the gene at the 3’ end (Figure 3A); acal-B lies within a 60 nucleotide-long conserved region, a size coincidental with the band we found in small RNA Northern blots (for detail, see Figure S3B). In conclusion, we have evidence that the 3’ half of the acal transcript undergoes processing, whereas the 5’ half does not. Unfortunately, as the signal we detected was mostly from pupae, we could not test mutants, because mutants die as embryos and larvae, and never reach pupation proper. Taken together, we propose acal is an unconventional long non-coding RNA partially processed into small fragments. acal down-regulates JNK signaling during DC We next studied JNK signaling, the DC trigger, to characterize DC defects in acal. We tracked and quantitated expression of a DsRed reporter under control of an AP-1 response element, TRE (Tetradecanoylphorbol acetate Response Element, see Figure 4A and [35]). In parallel, we tagged cellular membranes using sGMCA, a fusion protein of the actin- binding domain of Moesin and GFP [36]. These constructs were expressed in an acal mutant and wild type backgrounds. In stage 13 wild type embryos, TRE-DsRed marks only the LE [a very faint amnioserosa DsRed positive staining is also present (Figure 4B, 4B’’)]. At this stage, lateral epidermal cells are stretching towards the dorsal side (Figure 4B, B’). In acal mutants, the TRE-DsRed is ectopically expressed in the lateral epidermis and in some amnioserosa cells (Figure 4C–E). Quantitation of the signal uncovers significantly higher JNK activation levels in the lateral epidermis of acal mutants, and a significantly higher sGMCA signal, consistent with the observed mis-stretching and local accumulation of lateral epithelial cells at the border of the epithelium during DC (Figure 4E). Ectopic JNK activation coincides with mis-stretching of the lateral epidermis, seen as a contraction of the epithelium where JNK ectopic activation occurs (Figure 4C–D). Similar results are seen at later DC stages (Figure S4A–D). JNK ectopic activation in the amnioserosa of acal mutants is likely a consequence of lateral epithelium defects, as acal rescue solely in the lateral epithelium rescues DC defects. Significant ectopic JNK reporter activity in the lateral epidermis underneath the leading edge cells and in the amnioserosa was also observed using another weaker acal allele (acal2) (Figure S4E–G), with a GFP-based TRE JNK activity reporter [35]. Results for acal2 are normalized for nuclear density. This strongly suggests that acal DC defects are due to JNK gain-of-function signaling in more lateral epidermal cells, resulting in disorganized stretching. As a second and independent means to study the consequences of acal mutations in JNK activity, we over-activated JNK signaling in acal mutant and control embryos by expressing both a constitutively active form of the JNK kinase, Hep (HepACT), and a wild type version of the same gene (Hep) in the ectoderm (using 69B-gal4). We found that expressing hepACT in acal heterozygotes results in significantly stronger and more penetrant closure defects compared to wild type embryos expressing hepACT (Figure S4I), exacerbating the hepACT over-expression phenotypes and supporting the notion that acal mutants promote increased JNK activity. We also see the appearance of a new phenotype, ‘early’ embryonic death, where embryos die without forming a cuticle. Over-expression of hep in acal heterozygotes has milder effects, but significantly leads to an increase in death of fully formed embryos in acal heterozygotes, compared to wild type embryos over-expressing Hep (Figure S4H). Homozygosity for acal5 together with hepACT over-expression, or for acal2 together with hep over-expression, lead to significant further increases of the respective mutant phenotypes (Figure S4H-I). These hep gain-of-function experiments together with acal loss-of-functions are all consistent with a role for acal in negative regulation of JNK activity during dorsal closure in the lateral epithelium. We then corroborated this in two other independent ways: using a second JNK signaling reporter, and performing genetic interactions with JNK mutants. If acal acts to negatively regulate JNK activity, then in acal mutants we should see enhanced JNK reporter line expression (similar to the TRE results, above), or suppression of acal phenotypes in partial JNK loss-of-function. puc is a transcriptional target of JNK signaling coding for a JNK phosphatase, a negative feedback loop that halts JNK. pucE69 is a lacZ enhancer trap allele (from now on referred to as puclacZ). Heterozygosity for puclacZ provides a JNK sensitive signaling reporter, and a sensitized background disrupting the feedback loop [20]. Despite decreased puc dosage in puclacZ heterozygotes, in approximately 90% of embryos, JNK signaling is restricted to LE (Figure 4F–H). In acal homozygotes (acal1, acal2, or acal5), heterozygous for puclacZ, the proportion of embryos with ectopic puclacZ expression in amnioserosa and lateral epidermis significantly grows to around 50% or more, similar to JNK ectopic activation with TRE- constructs (Figure 4G–H and S4A–G). acal mutants heterozygous for puclacZ also show more extreme cuticle phenotypes. This is consistent with a potentiation of the puc effect on acal phenotypes, both genes acting to counteract JNK signaling (Figure S5A). Finally, we reduced JNK dosage to see whether it would ameliorate acal mutant phenotypes. Heterozygosity for bsk1, a JNK loss-of-function mutation, significantly suppresses acal5 phenotypes (Figure 4I), meaning that JNK signaling over-activation of acal mutants depends on JNK itself. Conversely, acal5 heterozygosity does not alter the bsk1 mutant phenotype (Figure 4I), consistent with acal mutant phenotypes dependent on JNK. We confirmed this genetic interaction in a different genetic background and found similar results (Figure S5B). Taken all data together, the (1) two types of JNK reporters (TRE-based and puclacZ ) tested with several acal alleles, and (2) genetic interactions for several acal alleles with bsk and puc (loss-of-function), and hep (ectopic expression), all establish acal as a negative regulator of JNK signaling. We next tested if acal mutations interact with dorsal open group mutations known to act in the amnioserosa, in order to determine if acal could have a function in this tissue. We used peb308, a hypomorphic mutation that affects peb expression in the amnioserosa, and, consequently, DC [21]. The peb308 DC defects were not modified in an acal sensitized background, consistent with acal required only in the lateral epidermis (Figure S5C). The pioneer protein Raw and acal act together to counteract JNK signaling acal might interact with other negative regulators of JNK signaling. raw, a conserved gene of unknown molecular function, counters JNK signaling in the lateral epithelium, like acal. raw and acal have very similar expression patterns during DC (Figure 2D for acal; for raw see [19]). Raw function is genetically positioned at the level of JNK [37], like acal, and Jra [19]. raw mutant cuticular phenotypes are stronger than acal, with dorsalized embryos consequence of dpp ectopic expression at the lateral epidermis (see Figure 5A–B and Figure 6E–F, [19]). raw mutants have dpp ectopic expression during DC in rows of cells ventral to the leading edge ([19] and Figure S6C). acal ectopic expression in the posterior part of each segment of these embryos (en-gal4 driver) reduces cell-autonomously dpp over expression (Figure S6D). This is consistent with acal acting to inhibit JNK pathway on the lateral epithelium during DC. On their own, acal mutant embryos are not dorsalized (Figure 1E-L), and show no clear ectopic dpp over-expression (Figure S6A–B), yet at least under conditions of dpp over-expression, acal can repress dpp. Altogether, this argues that acal is a negative regulator of JNK activity, and that it has a subtler effect to that of raw. We analysed genetic interactions between acal and raw. Heterozygosity for raw2 increases the embryonic lethality of acal5 embryos, with a quarter phenocopying the raw2 dorsalized phenotype (‘raw-like phenotype’, Figure 5C). acal5 heterozygosity does not enhance the already strong raw2 homozygous condition, and double homozygotes do not show a stronger phenotype. Similar results are observed between acal2 and raw1 (Figure S6E). These genetic interactions are consistent with acal acting downstream of raw. We looked for acal expression in raw mutants, and found that acal lateral epidermis expression is significantly decreased in these embryos (Figure 5D–E). This suggests that raw regulates acal lateral epidermis expression. Nervous system acal expression is unchanged in these raw mutant embryos, acting as an internal control. This also ties in with acal5 being a regulatory mutant with reduced lateral epithelium expression (Figure 2D), and suggests a raw dependent acal control module for the lateral epidermis. Consistent with acal acting downstream of raw, as a raw effector, 69B-gal4 UAS-acal expression partially rescues the raw dorsalized cuticle phenotypes (Figure S6F–H), as expected from the dpp in situ hybridization in raw mutants over-expressing acal (Figure S6D). Altogether, these results indicate that acal mediates part of Raw function during DC. raw over-expression in the lateral epidermis of wild type embryos has no effect in DC, in spite of the strong raw loss-of-function phenotype [19]. Likewise, acal over-expression in wild type embryos has no DC effects (embryonic lethality of 69B>acal embryos is around 1%, n=791; also pnrMD237>acal shows no lethality or overt phenotypes, with equal numbers of control and over-expression siblings, n=104). These lack of gain-of-function phenotypes for both genes indicate that raw/acal JNK negative regulation has a limit beyond which it cannot be exercised further during dorsal closure, suggesting other regulatory mechanisms might act in concert. Thoracic closure during metamorphosis also depends on JNK signaling, much like DC does [38,39] Altering JNK signaling at the notum anlagen results in an antero-posterior cleft spanning the adult thorax (Figure 5G–H). Some JNK signaling loss-of-function conditions have cleft thoraces [40,41]. This process has been used also in miss- expression screens for JNK signaling, where gain-of-function phenotypes are repeatedly encountered [42]. We thus used thorax closure as a model where we might be able to study acal and raw gain-of-function conditions. For this, we hypothesized that acal and/or raw over-expression at the notum anlagen could result in a cleft phenotype, using pnr-gal4 (expressed at the dorsal heminota, equivalent to the lateral epidermis, Figure 5F–H). pnr- gal4 also provides a sensitized genetic background, as heterozygosity for this allele generates a mild thoracic phenotype, increasing the sensitivity of the assay [41]. Thoracic cleft was not enhanced by raw notum over-expression, as quantified by a ‘Thoracic cleft’ index (Figure 5I-J; Materials and Methods). Similar results were observed for RawRA or RawRB isoforms, generated by alternative splicing (Figure 5J). In contrast, two copies of the UAS-acal transgene had a significant effect (one copy was ineffective; Figure 5H–J). If raw over-expression induces acal, adding more acal would then lead to a more extreme phenotype, as adding two transgene copies of acal do in the dorsal thorax. Simultaneous over-expression of acal and raw single copy transgenes had a significant synergistic effect, inducing stronger cleft formation (Figure 5J). Both raw isoforms show synergism with acal. This is consistent with raw positively regulating acal, and both counteracting JNK signaling. Taken together, these results show that acal and Raw act together to counteract JNK signaling, acal downstream of raw. This is consistent with Raw acting at the level of JNK and/or Jra, as our experiments with acal point. Expression of Cka, a JNK scaffold, is regulated by Raw and acal Both raw and acal act genetically at the level of JNK (Figure 4I; [37]). Yet raw has been shown to act also at the level of Jra [19]. Could raw do both? Could raw via acal modulate a mediator of both JNK and Jra, for example? Cka is a scaffold protein that interacts with JNK and Jra [22]. We tested whether acal and Cka interact genetically. acal DC defects are dependent on Cka, since heterozygosity for Cka1 rescues the acal mutant phenotype (Figure 6A). This is in fact a stronger genetic interaction than that seen with bsk (JNK) mutants. Moreover, Cka expression is similarly significantly increased (to 50% above control values) in both acal and raw mutants (Figure 6B). Conversely, acal embryonic over-expression (gain-of-function) leads to a significant reduction in Cka expression in otherwise wild type embryos, although this condition bears no observable phenotypic consequences (Figure 7D). To test the raw-acal-Cka genetic pathway, we silenced Cka to see if it suffices to rescue the raw mutant phenotype, using again the strong raw mutation-dependent dpp over- expression phenotype as readout (Figure 6E–F). If this pathway is true, expressing Cka RNAi in the en-gal4 expression pattern in raw mutants would silence dpp expression only at posterior compartments of each segment, the anterior compartments serving as internal controls. We found that Cka knockdown suppresses cell-autonomously raw ectopic dpp expression (Figure 6F versus 6H), similar to rescuing raw function with UAS-rawRA (Figure 6F–G). Taken together, both the loss-of-function as well as the ectopic expression results argue in favor of raw acting through acal down-regulating JNK signaling by regulating Cka expression, and accommodates the apparently conflicting results that raw acts at the JNK and/or Jun levels. Genetic interactions do not imply direct interactions, and so, acal, as a raw mediator, could act indirectly on Cka and regulate in this way JNK and Jra. Cka sole over-expression should alter DC. Using a heat-shock inducible Cka, hs-Cka [22], we found that 29ºC treatment of embryos throughout development significantly induces DC defects (Figure 6C). Heat-shock induction indeed increases Cka expression (Figure 6D). Taken together, these results define a novel regulatory path for JNK signaling, raw counteracting Cka expression through acal. acal fine-tunes DC by regulating aop expression Does acal interact with other DC regulators? Aop serves at least two functions during DC. In the lateral epidermal cells, Aop promotes tissue differentiation by preventing ectopic mitoses. As an extension, in the LE, it has a second function preventing ectopic and precocious expression of JNK activity and of AP-1 target genes, and thus, acting against dorsal closure, an activity countered by JNK via phosphorylation. Hence, over-expression of a constitutively active Aop (aopACT) that cannot be inactivated by JNK in the LE, results in DC defects due to lack of JNK targets expression. On the other hand, aop loss-of- function leads to anterior holes in the cuticle and faulty DC resulting from both ectopic mitoses in the tissue, and JNK over-activation. The wild type stretching lateral epithelium is a post-mitotic, competent tissue for DC in part due to aop dual roles (i.e., mitosis and precocious DC repression [17]). So, aop regulation can be a nodal, sensitive point for DC regulation. Genetic analyses show that acal and aop interact. acal mutations powerfully rescue aop loss-of-function, but aop loss-of-function does not alter acal mutants, showing that acal acts above or at the level of aop (Figure 7A). Indeed, we found that aop expression is significantly increased in acal and raw mutants (Figure 7B). Conversely, acal over-expression in wild type embryos leads to a significant reduction of aop expression (Figure 7D), without phenotypic consequences (similar to Cka), consistent with a modulatory role for acal. In accordance with an acal role as JNK negative regulator, aopACT that presumably locks in the post-mitotic nature of the lateral epithelia, while preventing JNK target gene expression, is countered by acal mutants, more so if aopACT expression is less widespread (Figure 7C). A possible explanation for the puzzling interactions between acal and aop, resides in the dual nature of aop function in the LE and the lateral epidermis. In wild type embryos, aop is only phosphorylated and inactivated at the LE by JNK. Expressing aopACT conceivably affects only the JNK-regulated function of aop (i.e., its role in the LE). Thus, the JNK over-activation seen in acal mutants might compensate partially for LE aopACT. In contrast, in aop mutants, low aop levels throughout the epidermis might be partially restored to more wild type levels by acal loss-of-function conditions, as acal mutants over- express aop. Taken together, by regulating aop expression, acal can powerfully influence DC. In summary, we show that acal critically regulates both positive (Cka) and positive/negative (aop) components of JNK signaling. acal acts in trans during DC How does acal regulate expression of other genes? One possibility is that acal acts in cis, exerting an effect on neighboring genes, something reported for other lncRNAs [13,43]. To study this possibility, we made use of a Gene Search insertion line, a transposon that can lead to ectopic expression outwards in both directions from the insertion side. GS88A8 maps in the same interval as acal. Using gal4 lines, GS88A8 generates ectopic expression of neighboring genes, namely lola and psq [44]. We used the 69B-gal4 line to drive ectopic expression from GS88A8 in the embryonic ectoderm. If acal negatively regulates neighboring genes (lola and psq) and they are relevant for DC, then ectopic expression from GS88A8 should phenocopy acal mutant phenotypes. Instead, this condition mainly leads to larval and pupal lethality plus some adult escapers (Figure S7B), with hardly any embryonic phenotypes, consistent with unaltered lola and psq expression profiles in acal mutants (Figure S8C). Moreover, acal mutations complement lola and psq mutations (Table S1), and mutations in these genes lead to different embryonic phenotypes (Figure S7A). Altogether, we conclude that it is not very likely that acal acts in cis during DC. Some long non-coding RNAs work in trans. One possibility is as part of chromatin remodeling complexes, for instance, although other mechanisms are possible [45,46]. In order to explore whether acal might function through remodeling complexes, we performed genetic interactions with Polycomb3 (Pc3) mutants. Pc is a critical member of the Pc chromatin repressive complex 1 (PRC1, [47]). acal and Pc3 double heterozygotes show novel strong wing defects [significantly twisted wings, with reduced posterior territory (Figure S8A and F)]. Consistently, this interaction is seen with raw mutant alleles, albeit to a lesser degree (Figure S8B). Cka and aop do not show this interaction (Figure S8C–D). acal5 also significantly enhances the Pc3 extra sex combs phenotype, as does raw1 (aop1 reduces extra sex combs, presumably due to a repressive function in sex combs formation, Figure S8G–I). These non-allelic non-complementation results are reminiscent of the ‘extended-wing’ phenotype used to detect direct interactors / components of other chromatin remodeling complexes, like the brahma or kismet complexes [48], suggesting a common regulatory pathway for acal, downstream of raw, with PRC1. The fact that raw and acal show the same genetic interactions with Pc, but not Cka and aop, underscores the fact that Cka and aop are downstream from the former two (raw and acal), as regulatory targets in the same signaling cascade. Discussion Several lines of evidence show that acal is a putative nuclear, processed, lncRNA, whose mutations are homozygous lethal, with requirements in DC. We show that acal mutants (three of which map molecularly to the SD08925, or acal, locus) fail to complement each other, but complement neighboring genes (lola and psq), regulate the same downstream genes (Cka and aop), have the same JNK negative regulation function [evidenced by two different reporter gene systems and genetic interactions with several JNK pathway component (bsk, hep, and Cka) and regulator genes (puc, raw, and aop)], are rescued by the SD08925 locus, with one allele having significantly reduced SD08925 expression, and all having similar mutant phenotypes and phenocritical periods. The locus produces a nuclear 2.3 Kb transcript with low coding potential that is processed into smaller pieces. Altogether, these data establish acal as a lncRNA locus in DC. lncRNAs are ubiquitous species, probably tied to most biological processes. Yet, few have been characterized [49]. They fine-tune target abundance in multiple ways [4]. lncRNA species probably form diverse complexes with multiple mechanisms of action, and are not a rigorously defined class of molecules. Identifying lncRNA mutants with clear phenotypes in genetic models is a clear way forward. acal has an extremely low coding potential and no evolutionarily conserved ORFs. The putative acal ORFs show no homology to known peptides / proteins. Unlike short-ORF bearing transcripts [50], these putative ORFs have no sequence redundancy among them, reliable Kozak sequences, or high coding potential. This places acal as a non-translated transcript. acal is a Dipteran-conserved locus. As many lncRNAs, it is not broadly conserved across species. acal RNA is processed into smaller fragments. These fragments have probably been missed in high-throughput sequencing projects due to RNA cut-off sizes [34]. acal functions in trans to regulate DC, as DC defects can be rescued in trans with a wild type full-length cDNA targeted to the epidermis. acal foci for DC is the lateral epidermis. JNK loss-of-function result in lack or reduction of lateral epidermal cells stretching. In contrast, negative regulators, such as peb, puc, and raw also cause DC defects, due to disorganized and / or precocious cell stretching [3]. In acal mutants, cells also stretch in a disorganized manner. Predictably, reducing bsk gene dosage significantly reduces acal defects in DC, and JNK activity monitors show enhanced JNK function in acal mutants. This prompted study of acal and other negative regulators. raw male gonad morphogenesis defects are ameliorated by bsk gene dosage reduction [37]. acal and raw collaborate to down-regulate JNK signaling at the lateral epidermis. In situ hybridization experiments, embryonic genetic interactions, and raw and acal over- expression studies in the thorax, put raw upstream of acal, yet they do not strictly phenocopy. This means that raw has other effectors. raw mutant embryos are dorsalized due to strong ectopic dpp expression in the lateral epidermis [19]. acal mutants do not dorsalize or show overt dpp misregulation. Furthermore, since Raw is localized in the cytoplasm, and acal is present in the nucleus, it is reasonable to assume that Raw regulates acal expression indirectly. Over-expression of either raw or acal in wild type embryos has no discernible effect on DC ([19] and this work), yet simultaneous over- expression in the thorax disrupts thorax closure, and acal over-expression reduces both Cka and aop transcript levels. Cka expression is elevated in raw and acal mutants. Genetically decreasing Cka levels rescues DC defects in raw and acal mutants. Consistently, Cka over-expression itself causes DC defects. Work in the mammalian Cka functional homologue JIP-3 has shown this scaffold protein up-regulated under stress conditions. JIP-3 depletion and over- expression directly influence JNK activity [51]. Together with our results, these findings show that JNK scaffolds are an important point for JNK regulation, since augmenting scaffold availability augments JNK activity. In fact, this has been demonstrated biochemically for Cka [22]. Another critical JNK regulatory point by acal is aop. aop is also over-expressed in acal mutants, and down-regulated in acal over-expression. aop plays a complex role in DC making the tissue ready early, before DC, by preventing mitosis and early activation of JNK targets. For this, Aop function is required in the LE and lateral epidermal cells ventral to the LE [17]. Later, aop is inhibited by the JNK pathway only in the LE, allowing target gene expression there. In cells ventral to the LE, acal (together with raw) prevents JNK activation. In these cells there is no JNK activity to inhibit aop, yet aop expression regulation must be effected. This may be accomplished by acal (and raw). Thus, controlling aop levels, like Cka levels, may be a critical point for DC. For both genes, acal acts genetically as a repressor, with the net result of allowing JNK activity only in the LE in wild type. In acal mutants, Cka over-expression leads to JNK ectopic activation in more lateral epithelium cells. However, the fact that aop is also over-expressed in acal mutants may mask a stronger JNK over-activation, as JNK signaling may inhibit at least in part Aop function, Aop being a JNK direct target. Future work will focus on how acal fine-tunes these signaling genes (Figure 8). We show here that acal function modifies gene expression. Whether this is direct, as has been proposed for other lncRNAs [47,52], or is done in some other fashion, is not yet clear. acal interacts genetically with Pc (raw, that regulates acal, also interacts with Pc). This opens the interesting possibility that acal acts directly with chromatin remodeling complexes, as has been demonstrated for other Pc interactors [44,53-55]. Yet other possibilities and/or indirect modes are clearly plausible. In conclusion, we show that a lncRNA locus is required for DC regulation and JNK signaling. lncRNAs have not been implicated before in JNK signaling, and hence, this adds a new layer of control in JNK regulation. Materials and Methods For detailed protocols, please refer to Protocol S1. Fly husbandry Detailed description of stocks is available in Protocolo S1 Information. Crosses were done at 25ºC under standard conditions. For heat-shock treatments (hs-Cka and peb1 experiments), animals were maintained at 29ºC throughout development. Cuticle preparations Mutant embryos were processed as in [56]. Cuticles were examined under a dark field microscope. Molecular mapping and rescue 4.7 kb of genomic DNA encompassing the acal locus of homozygous embryos was PCR amplified, cloned, and sequenced. The SD08925 clone was sequenced fully. A genomic (178D09) and a UAS-cDNA (UAS-acal) rescue constructs were synthesized and employed. In situ hybridization and LacZ staining For in situ hybridization, embryos were fixed, hybridized with digoxigenin-labeled RNA probes, and developed with alkaline phosphatase-NBT/BCIP. Pixel intensity was quantified using ImageJ. For LacZ staining, embryos were fixed and developed with X-Gal. Northern blots Nothern blots were done according to standard procedures [57]. Small RNA Northern blots were resolved by PAGE, and hybridized with labeled DNA oligonucleotides. Nuclear fraction preparation Embryos were dechorionated and processed for nuclei low-salt extraction by centrifugation. Supernatant was recovered as the cytoplasmic fraction. Both fractions were homogenized in TRIzol. cDNA synthesis, semi-quantitative PCR, and real time PCR RNA was purified and retro-transcribed with M-MLV reverse transcriptase. Semi- quantitative PCR and real time PCR were done by standard methods. Densitometry analysis was done using ImageJ. Primers used are listed in Table S2. Fluorescence microscopy Z-stacks of embryos undergoing DC were obtained using a Zeiss LSM 780 microscope and processed using ImageJ. Fluorescence intensity was calculated using ImageJ. Scanning Electron Microscopy For imaging eyes and thoraces, animals were cold anesthetized, attached to SEM stubs with carbon paint and glue, and imaged under high vacuum in a JEOL JSM-6060. Thoracic cleft index and wing angle quantification. Measurements were done with iVision software. Adult Leg Preparation Adult male thoraces were digested with potassium hydroxide and mounted for viewing and quantification of sex combs. Bioinformatics acal homologous sequences were extracted from the Flybase Genome Browser [58]. Multiple sequence alignments were done with the CLC sequence viewer software (http://www.clcbio.com). Putative translated ORFs were analyzed with BLAST and compared in the Drosophila PeptideAtlas server [59]. Protein coding capacity was calculated according to [31]. Statistics All tests were done as implemented in GraphPad software or according to Kirkman, T. W. (http://www.physics.csbsju.edu/stats/). Acknowledgements We acknowledge assistance of Dolors Ferrés-Marco and María Teresa Peña-Rangel. References 1. Gilbert SF (2013) Developmental biology. Sunderlad, Mass.: Sinauer Associates, Inc. Publishers. 719 p. 2. Harden N (2002) Signaling pathways directing the movement and fusion of epithelial sheets: lessons from dorsal closure in Drosophila. Differentiation 70: 181-203. 3. Rios-Barrera LD, Riesgo-Escovar JR (2013) Regulating cell morphogenesis: the Drosophila Jun N-terminal kinase pathway. Genesis 51: 147-162. 4. Mercer TR, Dinger ME, Mattick JS (2009) Long non-coding RNAs: insights into functions. Nat Rev Genet 10: 155-159. 5. Fatica A, Bozzoni I (2014) Long non-coding RNAs: new players in cell differentiation and development. Nat Rev Genet 15: 7-21. 6. 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In these and following experiments, cuticular phenotypes do not change, unless otherwise stated. No new cuticular phenotypes are found; thus, examples are not depicted in all figures. Numbers analyzed: acal5/5,UAS-acal/+=240, acal5/5;69B-gal4/+=441, acal5/5;69B>acal=237, acal5/5;pnr-gal4/+=435, acal5/5;pnr>acal=130. Statistical significance was calculated using chi square tests. (C) Quantification of in situ hybridization shown in (D) in stage 13 embryos (acal5/5, n=10; yw, n=6). acal mutants have significantly lower expression levels in lateral epithelia; chi square test. (D) acal in situ hybridization in embryos throughout embryonic development. Wild type embryos are yw, and mutant is acal5/5. Arrows indicate expression in the lateral epidermis and arrowheads point to expression in the central nervous system. Sense (negative) controls are also shown. Insets show boxed areas in stages 13, 15, and 17 embryos. See also Figure S2. Figure 3. acal is a processed long non-coding RNA. Probes acal-A acal-B acal-C acal-D pri pncrOO3 roX1 msa bft * HsftiJ * acal * iab-4 * -1 .5 acal T E E P P * * O 1.5 3.0 4.5 score units Re.49 e N G T e N Estimated sizes (nt): 16.5 D G E E P P * , F .,,¡ t , l I e (A) acal full-length transcript sequence conservation plot compared to other dipterans, and pairwise alignments between acal in D. melanogaster and its homologs (adapted from the UCSC genome browser). Location of molecular lesions in acal1 [1] and acal2 [60] are shown in the transcript (gray arrow). Above the plot are the location of the probes used for small RNA Northern blots in (E) and in Figure S3. (B) Protein coding potential of acal and other well known coding (white) and non-coding (black) RNAs. pipsqueak (psq) is a transcription factor and basket (bsk) codes for JNK. polished rice (pri) and pncr003 are polycistronic and code for small peptides. roX1 (RNA on the X1), iab-4 (infra-abdominal 4), and Heat shock RNA ω (Hsrω) are long non-coding RNAs. bereft (bft) is a microRNA precursor. Negative values correspond to non-coding scores, and positive values are for protein coding RNAs. Asterisks denote significantly coding or non-coding scores. (C) Semi-quantitative RT-PCR of total [T], cytoplasmic [C], and nuclear [N] RNA against acal, Rp49 (protein coding gene), and bantam microRNA precursor (pre-ban). [G] is the genomic control. (D) Band intensity of acal cytoplasmic and nuclear amplification, compared to total RNA amplification. Means of 5 independent experiments +/- SEM. Significance was assessed using Student’s t test. (E) Small RNA Northern blots for acal A and B probes, using wild type embryos [E] and pupae [P] RNA. Sizes were estimated from 4 independent experiments. Figure 4. Ectopic JNK signaling activation in acal mutants. (A) TRE-DsRed works as an AP-1 responsive element driving expression of DsRed. (B– B’’) Wild type embryos, (C–D’') acal2 mutants. sGMCA is a marker for cortical cytoskeleton (green in B, C, and D). (B–D) Images are representative of five embryos per condition. (D– D’’) Boxed area in C. Ectopic TRE-DsRed activity is shown (arrowheads). Scale bars in (B, C, and D) are 50 µm. (E) Mean fluorescence intensity +/- SEM of sGMCA and TRE-DsRed in acal5 mutants and in control embryos. Leading edge region is highlighted in gray. n=5 for each condition. For both channels, distributions are significantly different (Kolmogorov- Smirnov test, asterisk and bar depicting significant ectopic JNK activation in lateral epithelia ventral to the LE, p<0.001). (F-H) puclacZ staining of control (F) and mutant (G) embryos. Arrowheads in (G) mark ectopic puclacZ activation. (H) Quantification of acal mutant phenotypes using puclacZ heterozygosity as JNK signaling reporter and genetic sensitized background. Mutant embryos were selected by lack of eve-lacZ staining, present in balancer chromosomes. Number of embryos analyzed: acal+/+;puclacZ/+=108, acal1/1;puclacZ/+=229, acal2/2;puclacZ/+=48, acal5/5;puclacZ/+=62. See also Figure S4. (I) Genetic interaction between bsk1 and acal5 mutants. Only the dead embryos are classified, the mutants surviving embryogenesis are the remaining percentage to amount to a hundred percent (open space above bars). Number of animals analyzed: bsk1/1;acal+/+=154, bsk1/1;acal5/+=210, bsk+/+;acal5/5=391, bsk1/+;acal5/5=166. Significance in (H-I) was calculated using chi square tests. Figure 5. raw and acal act together to counteract JNK signaling. (A) Wild type cuticle. (B) Cuticle phenotype of raw mutant embryo. (C) Genetic interaction between raw2 and acal5 mutants. raw-like phenotype is depicted in (B). In raw+/+; acal5/5 mutants a small percentage survives embryogenesis, and constitute the open space above the bar to amount to a hundred percent total. Number of animals analyzed: raw+/+,acal5/5=391, raw2/+,acal5/5=139, raw2/2,acal+/+=366, raw2/2,acal5/+=152, raw2/2,acal5/5=208. Significance was assessed with chi square tests. (D-E) acal in situ hybridization in raw2 mutants (n=45; D) and heterozygous siblings (n=106; E). Arrow in (E) points to decreased acal expression in the lateral epidermis. See also Figure S5. (F-I) Scanning electron micrographs of dorsal views of adult thoraces, anterior is up. Scale bars are 100 µm. (F) UAS-acal/+ control, (G) pnr-gal4/+ control, and (H) over-expression of two UAS-acal copies. The white box in (H) is amplified in (I), depicting distances (red lines) measured to determine the thoracic cleft index, using anterior dorso-central (ADC) and posterior dorso-central (PDC) bristles as references (see Materials and Methods). (J) Percentage change of thoracic cleft index for different experimental conditions. Mean of 15 flies +/- SEM. Significance was calculated using ANOVA and Bonferroni correction. Figure 6. Cka is downstream of raw and acal. (A) Genetic interaction between Cka and acal mutants. Number of animals analyzed: Cka+/+,acal2/2=192, Cka1/+,acal2/2=219, Cka+/+,acal5/5=391, Cka1/+,acal5/5=171. (B) Cka relative expression in wild type and mutant embryos, as determined by qPCR. (C) Expression of a heat-shock inducible Cka transgene results in DC defects. Number of animals analyzed: yw, 25ºC=526, yw, 29ºC=591, HS-Cka, 25ºC=2006, HS-Cka, 29ºC=3227. (D) Cka expression increase due to heat shock in hs-Cka flies was confirmed by qPCR. For (A,C) embryos surviving embryogenesis represent the open space above the bar to amount to one hundred percent total of embryos analyzed. Chi square tests were used to calculate significance. For (B,D) represents the means of three independent experiments run twice +/- SEM. Significance was assessed using Student’s t test. (E-H) dpp in situ hybridization experiments, showing JNK-induced dpp expression (arrows). (E) Wild type embryo. (F) raw1/1,en-gal4/+ control, showing dpp ectopic activation (arrow). (G) Expression of UAS-rawRA with en-gal 4, which expresses gal 4 at posterior compartments of each segment. Arrowheads show cell-autonomous suppression of dpp ectopic expression. (H) Silencing of Cka with an RNAi construct (UAS-Cka-IR) under en-gal 4 also suppresses dpp ectopic expression in posterior compartments of raw1 mutants (arrowheads). Figure 7. acal regulates aop expression. (A) Genetic interaction between aop and acal mutants. Embryos surviving embryogenesis represent the open space above bars to amount to a hundred percent total embryos analyzed. Number of animals analyzed: aop+/+,acal5/5=391, aop1/+,acal5/5=253, aop1/1,acal+/+=269, aop1/1,acal5/+=185. (B) Relative expression of aop in wild type and mutant embryos, as determined by qPCR. (C) Expression of a constitutive active aop transgene (UAS-aopACT) in the ectoderm (69B-gal 4) or in the lateral epidermis (pnr-gal 4), of wild type or acal mutant embryos. Number of animals analyzed: 69B>aopACT=642, 69B>aopACT;acal5/5=210, pnr>aopACT=310, pnr>aopACT;acal5/5=180. (D) acal over- expression under the 69B-gal4 driver results in significantly decreased Cka and aop expression. In (B) and (D), graphs show mean values +/- SEM of at least three independent experiments run twice. Figure 8. Model for acal function during DC. acal, expressed in the lateral epidermis (blue), restrains JNK activation to the leading edge cells. Raw, also expressed in the lateral epidermis, regulates acal expression. In turn, acal regulates the expression of Cka and aop to fine-tune JNK signaling. Not depicted is aop positive role during DC. Figure S1. Phenotypic analysis of acal mutants and characterization of SD08925. A t ¡ , e ,..,- , :o- '.'- " .- ! ! ,~ <0_ • .- , • - I/CIl! ~ , ,.,- , , • .,- • • , 11 .C' _ , _Rp49 • , ,., ... • • ¡ ¡ ..,- • '.0-.. ,- í ,~ 0_ ,- a 1I1 ~ • , ~ ,- (A) An allelic series of embryonic cuticle defects for ∆18 (a deficiency removing a segment of lola and of psq, plus fully acal and CR45135, and expected to bear multiple defects), and acal mutants. Alleles are organized by decreasing embryonic lethality and frequency of phenotypes. Mutant embryos surviving embryogenesis are represented by the open spaces above the bars up to 100% in the graph, and were not studied. The acal allelic series deduced is: acal5 >acal6>acal3 >acal2 >acal4 >acal1. Embryos surviving embryogenesis are the open spaces above the bars to amount to a hundred percent. (B) Scanning electron microscope images of the peb1 rough eye phenotype (smaller, disorganized ommatidia, duplicated and mis-aligned bristles) observed at the restrictive temperature (29ºC), and partial suppression by heterozygosity for acal mutants. Scale bar is 100 µm. Anterior is left, dorsal is up. Lower panels show the positions of bristles seen in middle panels highlighting the suppression of the peb1 bristle disorganization phenotype. (C) RNA from wild type embryos [E], larvae [L], pupae [P], and adults [A] analyzed by Northern blot, using a probe derived from SD08925, and then re-hybridized for Rp49 without stripping. Molecular weight marker sizes are shown, and the corresponding bands for acal and Rp49. (D) acal semi-quantitative RT-PCR in control (yw) and homozygous embryos for Δ18, a deficiency that removes acal. (E) SD08925 relative expression in acal2 mutants with or without the genomic rescue construct, 178D09. n=3 with duplicates. Figure S2. UAS-acal expression and acal in situ hybridization. (A) acal relative expression in acal5 mutant controls and in UAS-acal over-expressing mutant embryos, as determined by qPCR. Experiments were done three independent times, and run twice each time. Significance was determined using Student’s t-tests. (B) In situ hybridization against acal, in wild type (yw) and mutant (acal5) embryos, stage 17. Sense probes were used as negative controls. acal5 homozygous embryos were selected by lack of GFP expression, present in balancer chromosomes, prior to embryo fixation and hybridization. (C) Pixel intensity quantification of the same experiment as (B). Number of animals analyzed: yw=5, acal5=6, sense=9. Significance was assessed using Student’s t tests. Figure S3. acal is a conserved non-coding RNA. (A) Multiple sequences alignment of the acal genomic locus of 12 Drosophila species. Black lines represent aligned sequences, and white spaces are gaps. On top, putative ORFs present in the Drosophila melanogaster locus are shown. To keep co-linearity with the genome, 5’ ends are shown to the left. Note that most ORFs present in D. melanogaster correspond to gaps in other species. (B) Conservation of the acal-B probe in other Drosophila species. The most conserved region corresponds in length with the band detected in small RNA Northern blots (Fig. 3E). (C) RNA was purified from wild type embryos (E), larvae (L), pupae (P), adult males (M), and adult females (F). Fragments detected with acal-A and miR-8 (control) are marked with arrowheads. Northern blots under equivalent hybridization and exposure conditions show no signal for acal-C and acal-D, except for very faint marks in the wells at the top of the lanes (arrowheads). Figure S4. acal negatively regulates JNK signaling in the epidermis. (A–A’’, C–C’’) Wild type embryos, (B–B’’, D–D’’) acal5 mutant embryos. sGMCA is a marker for cortical cytoskeleton, TRE-DsRed is a JNK activity reporter. Images are representative of five embryos per condition. Boxed areas in A and B are magnified in C and D. Note disorganized and ectopic expression of DsRed in the mutant embryo. (E) Wild type embryos, (F) acal2 mutant embryos, TO-PRO-3 labels nuclei, TRE-GFP is a JNK activity reporter. Images are representative of four embryos per condition. (E’) and (F’) show the TO-PRO-3 (blue) channels of wild type and acal2 embryos, respectively. (E’’) and (F’’) show the GFP (green) channels in wild type and acal2 embryos, respectively. Merged images for the doubly stained embryos are shown in (E) and (F) for the same wild type and acal2 embryos. Scale bars in (A, C, and E) are 50 µm. (G) Signal intensity quantification of TRE-GFP in lateral epithelia ventral to the LE, normalized against TO- PRO-3 signal intensity. Significance was assessed using Student’s t test. (H) Embryonic lethality caused by over-expression of wild type hep (69B>hep) is enhanced by acal heterozygosity. Number of animals analyzed: 69B>hep control for acal1/+; 69B>hep=95; acal1/+; 69B>hep=98; 69B>hep control for acal2; 69B>hep=166; acal2/+; 69B>hep=141; acal2/2; 69B>hep=93; 69B>hep control for acal5/+; 69B>hep=354; acal5/+; 69B>hep=443. (I) Dorsal closure and embryonic lethality and defects seen by over-expression of a constitutively active form of hemipterous in the ectoderm (69B>hepACT), are enhanced by acal heterozygosity. Number of animals analysed: 69B>hepACT control for acal1/+; 69B>hepACT=263; acal1/+; 69B>hepACT=563; 69B>hepACT control for acal2/+; 69B>hepACT=321; acal2/+; 69B>hepACT=363; 69B>hepACT control for acal5; 69B>hepACT=624; acal5/+; 69B>hepACT=923; acal5/5; 69B>hepACT=153. (H-I) Significance was assessed using chi square tests, and open spaces above bars up to a hundred percent represent embryos surviving embryogenesis. Figure S5. Genetic interactions between acal and JNK signaling components. (A) puclacZ heterozygosity enhances the acal mutant phenotypes. Number of animals analyzed: acal1/1=217, acal1/1;puclacZ/+=296, acal2/2=192, acal2/2;puclacZ/+=204, acal5/5=391, acal5/5;puclacZ/+=178. (B) bsk heterozygosity significantly suppresses acal homozygous mutant embryos in a different genetic background (in the absence of balancer chromosomes, back-crossed to a yw strain). Mutant stocks were first crossed to a yw control strain, and then to each other. Dead embryos were analyzed. Number of animals: bsk1/+ x bsk1/+=652; bsk1/+,acal5/+ x bsk1/+=452; acal5/+ x acal5/+=633; acal5/+ x acal5/+,bsk1/+=643. (C) An acal sensitized background does not alter the embryonic peb308 mutant phenotype. Number of animals analyzed: peb308/Y;/+= 665, peb308/Y; acal5/+=247. Figure S6. acal over-expression partially rescues raw mutant phenotypes. (A) Control expression of dpp in a yw embryo. Expression in the leading edge is seen as a thin line surrounding the amnioserosa. (B) In an acal2 mutant background, the dpp expression domain in the leading edge is not strongly over-expressed. (C) dpp in situ hybridization in raw mutants show robust ectopic expression of dpp in the lateral epithelium during dorsal closure (arrowheads; see also [19]). (D) acal over expression driven by the en-gal4 driver in posterior compartments of segments rescues cell autonomously in these posterior compartments the raw induced dpp over expression (arrowheads). Number of animals analyzed: raw2/2; en-gal4= 5, raw2/2; en>acal=5. (E) raw1 heterozygosity enhances the acal2 embryonic mutant phenotype. Number of animals analyzed: acal2/2=416, raw1/+,acal2/2=258, raw1/1=278, acal2/+,raw1/1=487, acal2/2,raw1/1=253. (F) UAS-acal over-expression in the ectoderm of raw1 mutant embryos, using the 69B-gal4 driver partially rescues the raw mutant phenotypes. Number of animals analyzed: raw1/1;UAS-acal/+=53, raw1/1; 69B-gal4/+=283, raw1/1;69B>acal=28. Significance was calculated using chi square tests. (G-G’) raw1 mutants show dorsal closure defects and absence of denticles. (G’) is an enlargement of (G). (H-H’) acal over-expression in the ectoderm of raw1 mutants rescues the presence of denticles (some examples are marked by arrowheads in H-H’). (H’) is an enlargement of (H). Figure S7. lola and psq over expression leads to partial larval and pupal death. (A) Cuticular analysis and quantification of larvae of lola and psq mutant embryos. Both lolarev6 and psqrev12 are null alleles. Number of animals analyzed: lolarev6/rev6=366, psqrev12/rev12=311. (B) shows survival of embryos in a control stock, yw, where only a very small fraction (1%) die during embryogenesis. All other embryos reach the adult stage. Over expression of lola and psq via the 88A8 gene search transposon (GS88A8) using 69B-gal4 leads to partial larval and pupal death, but no significant changes in embryonic lethality compared to the yw control strain. Numbers of animals analyzed: yw=526, and 69B>GS88A8=554. (C) qPCR of lola and psq in acal mutant embryos, normalized against control heterozygous siblings. Primers used detect all lola or all psq isoforms. Experiments were done three times and run in duplicate. Figure S8. acal and Polycomb genetically interact. (A-B) Wing defects of acal or raw and Polycomb (Pc) double heterozygotes and control siblings. Arrows in (A’) and (B’) point to posterior wing compartment reduction.(C-D) Cka and aop heterozygotes do not have wing defects. (C’) Cka and (D’) aop heterozygotes also do not interact with Pc3 heterozygotes in the wing. (E) Pc3 control wing. (F) ‘Wing angle’ quantification in raw, acal, Cka, and aop heterozygotes with or without a mutant Pc3 copy. ‘Wing angle’ was measured as in (E). (G-G’) Wild type male legs and (H-H’) extra sex combs phenotype. Numbers indicate leg identity from anterior to posterior. Asterisks mark sex combs in the first pair of male legs. (I) Quantification of the extra sex combs phenotype of Pc3/+ with raw, acal, Cka, or aop heterozygosity, compared to Pc3/+ siblings. Student’s t test (F, I) were used to assess significance. n=10 for each condition. Table S1. Complementation tests of acal, lola, and psq mutants. Progeny was analyzed for the presence of balancer chromosomes (CyO, i. e., heterozygotes), and flies without balancer chromosomes, i.e., heteroallelic combinations, if present. At least 100 animals were counted for each condition. When heteroallelic flies hatched, males and virgin females were crossed to yw adults (virgin females or males, respectively). If no progeny was observed after 4 days, heteroallelic flies were considered sterile. VF means viable and fertile, FS means female sterile, and X means non-complementing. Protocol S1. Additional materials and methods as well as additional references are provided in the Protocol S1 archive. Table S2. List of primers used in this study. Primer pairs are shown, along with the expected product size. For other applications, single primers with no product size are shown.