UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO Maestría y Doctorado en Ciencias Bioquímicas LA INACTIVACIÓN HETERÓLOGA DEPENDIENTE DE CALCIO DE Orai1 POR CANALES TRPV1 CERCANOS, MODULA LA MIGRACIÓN CELULAR TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: Doctor en Ciencias PRESENTA: CARLOS ERNESTO BASTIÁN EUGENIO TUTOR PRINCIPAL DR. LUIS ALFONSO VACA DOMÍNGUEZ Instituto de Fisiología Celular, UNAM MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR DR. LEÓN DAVID ISLAS SUÁREZ Facultad de Medicina, UNAM DR. ARTURO HERNÁNDEZ CRUZ Instituto de Fisiología Celular, UNAM Ciudad de México. Noviembre, 2022 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. Programa de Maestría y Doctorado CIÉNCIAS | ¡OQUIMICAS CGEP/PMDCB/1171/2022 Asunto: jurado de examen Bastian Eugenio Carlos Ernesto Estudiante de Doctorado en Ciencias Bioquímicas Presente Los miembros del Subcomité Académico en reunión ordinaria del 20 de junio del presente año, conocieron su solicitud de asignación de JURADO DE EXAMEN para optar por el grado de Doctor en Ciencias, con la réplica de la tesis “La inactivación heteróloga dependiente de calcio de Orail por canales TRPVi cercanos, modula la migración celular”, dirigida por el Dr. Vaca Domínguez Luis Alfonso. De su análisis se acordó nombrar el siguiente jurado integrado por los doctores: PRESIDENTE Escobar Pérez Leonila Irma Laura (FM) VOCAL López González Ignacio (Bt) VOCAL Martínez Torres Ataúlfo (INB) VOCAL Cifuentes Navarro Freddy Roberto (IIBo) SECRETARIO Gómora Martínez Juan Carlos (IFC) A LOS MIEMBROS DEL JURADO: Es obligación de los tutores de este programa participar en éstas y otras actividades académicas encomendadas por nuestro Comité Académico. Sin embargo, en caso de que tenga un impedimento académico o de salud para cumplir con esta encomienda, es muy importante contar con su respuesta (Formato anexo) en un plazo no mayor a una semana. Tome en cuenta que usted tiene 30 (Doctorado) días hábiles para emitir su voto con las rondas de revisión que considere necesarias. Sin otro particular por el momento, aprovecho la ocasión para enviarle un cordial saludo. Atentamente , “POR MI RAZA, HABLARA EL ESPIRITU” Cd. Universitaria, Cd. Mx., a 27 de junio de 2022 COORDINADORA A Dra. Claudia Lydia Treviño Santa Cruz Ponte (Jukim Pta E its, S Contacto: macbaOposgrado.unam.mx Tel. 55-5623-7006 I AGRADECIMIENTOS INSTITUCIONALES A la Dra. Alicia Sampieri García por su apoyo técnico como Técnico Académico del laboratorio. Al Laboratorio Nacional de Microscopia Avanzada (LNMA), en especial al M. en C. José Pablo Ocelotl Oviedo por el apoyo técnico brindado para los experimentos de microscopía de súper-resolución. Al M.C. Rodolfo Paredes y Dra. Ruth Rincón Heredia de la Unidad de Imagenología del IFC, por el apoyo brindado para algunos experimentos de microscopía. Al Ing. Juan Manuel Barbosa Castillo y la Unidad de Cómputo por su apoyo con el soporte técnico y mantenimiento de los sistemas de cómputo. Al Ing. Aurey Galván Lobato y el Ing. Manuel Ortínez Benavides del Taller de Mantenimiento Electrónico, Eléctrico y Mecánico por mantener en buen estado el funcionamiento de los equipos de laboratorio. A la Unidad de Biología Molecular, por el apoyo técnico y permitirnos el uso de algunas de las herramientas en dicha unidad. Al programa de Maestría y Doctorado en Ciencias Bioquímicas, por el apoyo brindado en la parte administrativa. Al CONACYT por brindarme una beca durante mi maestría y doctorado (277682), (CVU 486558). Al Programa de Apoyo a los Estudiantes de Posgrado (PAEP), por el apoyo brindado para la realización de una estancia en el extranjero. A los miembros del Jurado de Examen de grado, Dra. Laura Escobar, Dr. Ignacio López, Dr. Ataulfo Martínez, Dr. Fredy Cifuentes y Dr. Juan Carlos Gómora, por todas las críticas, observaciones y recomendaciones para mejorar este trabajo escrito. A la Dirección General de Asuntos de Personal Académico (DGAPA), por los apoyos PAPIIT IN206323 y AV200320, que auspiciaron este trabajo de investigación. II DEDICATORIA A mis padres Braulio y Gisela, que siempre me han alentado y siempre confiaron en mí. A mi hermana Laura, que siempre ha estado presente. A todos mis abuelos. A Gabriela, por ser parte fundamental en mi vida. III AGRADECIMIENTOS PERSONALES A la Universidad Nacional Autónoma de México, en especial a la Facultad de Ciencias, la Facultad de Química y al Instituto de Fisiología Celular. Es un orgullo pertenecer a esta comunidad. Al programa de Maestría y Doctorado en Ciencias Bioquímicas y todos sus profesores, gracias por enseñarme tanto. A mi tutor, Dr. Luis Vaca, gracias por permitirme ser parte de su laboratorio, por animarme a culminar este trabajo y por todos los consejos y recomendaciones, he aprendido mucho de usted, de verdad muchas gracias. A los miembros de mi comité tutor, el Dr. León Islas Suárez y el Dr. Arturo Hernández Cruz, por sus comentarios y sugerencias que enriquecieron enormemente este trabajo. A todos los miembros del laboratorio 126 Norte, a los que ya no están y los que continúan. Todos me dejaron alguna lección. Jonathan, Josué, Emma, Jesús, Margarita y Daniel. A Alicia y Doña Salus, por el club del tamal, en especial a Doña Salus por brindarme su cariño durante todo el tiempo que estuve ahí. A mis amigos en el lab, ahora mis amigos de los sábados, Adolfo, Arlette, Karla y Kevin, gracias por las risas y el apoyo durante el tiempo que estuvimos juntos. Sin ustedes no hubiera sido divertido. A mis amigos del IFC, por las retas de fut y la ayuda con reactivos. En especial a Dany, Gabriel, Pily, Martha, Josué, JD y Erik. A mis amigos de Cancerología, Julio y Luisra, gracias por confiar en que si terminaría esto. A todos los que estuvieron en alguna parte de este trayecto, gracias Don Juan, Doña Lola por recibirme al llegar a la Ciudad de México. A Joseph por ayudarme en el LNMA.A Danilo y José por darme mi primer trabajo. Y a tantos más que ya no me queda espacio para agradecer. IV A mis padres, gracias por su amor incondicional. A mi hermana Laura, gracias por todo el cariño y apoyo. A mi familia, en especial a mis abuelos, nunca olvidaré mis raíces totonacas. A Gaby, gracias por formar parte fundamental de mi vida y por alentarme a culminar esta etapa, gracias por todo tu amor y paciencia. Lo logramos. ¡Paxkatkatsini! 1 ÍNDICE ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS ..................................................................................................... 3 ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS ................................................................................................... 4 RESUMEN ................................................................................................................................... 7 ABSTRACT .................................................................................................................................. 8 1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................... 9 1.1. Señalización de Ca2+ intracelular ...................................................................................... 9 1.2. Microdominios y nanodominios de Ca2+ ........................................................................ 10 1.3. Canales de calcio ............................................................................................................. 11 1.4. Entrada de calcio activada por las reservas (SOCE) ....................................................... 12 1.5. Canales Orai1 .................................................................................................................. 14 1.5.1. Inactivación dependiente de calcio del canal Orai1 ...................................................... 14 1.6. Algunas herramientas para el estudio de la SOCE......................................................... 17 1.6.1. Indicadores de calcio ...................................................................................................... 17 1.6.2. Microscopía de super-resolución ................................................................................... 19 1.7. Astrocitos ........................................................................................................................ 21 1.7.1. Migración celular en astrocitos ...................................................................................... 23 2. PLANTEAMIENTO Y JUSTIFICACIÓN ................................................................................ 26 3. HIPÓTESIS ..................................................................................................................... 26 4. OBJETIVOS .................................................................................................................... 26 4.1. Objetivo general ............................................................................................................. 26 4.2. Objetivos particulares .................................................................................................... 26 5. MATERIALES Y MÉTODOS .............................................................................................. 27 5.1. Reactivos ......................................................................................................................... 27 5.2. Plásmidos ........................................................................................................................ 27 5.3. Cultivo celular y transfección ......................................................................................... 28 5.4. Detección de proteínas (Western blot).......................................................................... 29 5.5. Electrofisiología .............................................................................................................. 29 5.6. Microscopía confocal ...................................................................................................... 31 5.7. Imagenología de calcio ................................................................................................... 31 5.8. Microscopía de super-resolución ................................................................................... 32 5.9. Mediciones de FRET ........................................................................................................ 33 5.10. Ensayo de co-inmunoprecipitación ................................................................................ 34 5.11. Dominios anquirina fusionados a la GFP ....................................................................... 35 2 5.12. Microarreglos de péptidos con TIRF .............................................................................. 36 5.13. Ensayo de cicatrización o cierre de la herida ................................................................. 37 6. RESULTADOS ................................................................................................................. 39 6.1. Desarrollo y caracterización del sensor Orai1-GCaMP3 ................................................ 39 6.2. Orai1-GCaMP3 detecta incrementos locales de Ca2 ...................................................... 41 6.3. La activación del canal TRPV1 induce la CDI del canal Orai1 ........................................ 42 6.4. Orai1 se encuentra próximo a TRPV1, pero no a P2X4 .................................................. 44 6.5. Orai1 se asocia con TRPV1, pero no con P2X4 ............................................................... 46 6.6. El C-terminal de Orai1 y los dominios de anquirina de TRPV1 son los responsables de su asociación ................................................................................................................................... 47 6.7. La CDI de Orai1 inducida por la activación de TRPV1 modula la migración celular de astrocitos corticales. ....................................................................................................................... 50 7. DISCUSIÓN .................................................................................................................... 53 8. CONCLUSIONES ............................................................................................................. 58 9. PERSPECTIVAS ............................................................................................................... 58 10. LITERATURA CITADA ...................................................................................................... 59 11. ANEXOS......................................................................................................................... 72 Anexo 1. Publicaciones derivadas del trabajo doctoral ................................................................ 72 Anexo 2. Otras publicaciones realizadas durante la estancia doctoral ........................................ 97 3 ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS Figura 1. Señalización de calcio intracelular ........................................................................................ 9 Figura 2. Principales componentes de la entrada de Ca2+activada por las reservas (SOCE) ............ 12 Figura 3. Mecanismo de activación de la entrada activada por las reservas ................................... 13 Figura 4. Inactivación rápida y lenta dependiente de Ca2+. .............................................................. 16 Figura 5. Indicadores de calcio codificados genéticamente de una sola proteína fluorescente ..... 18 Figura 6. Microscopía de super-resolución aplicada al estudio de la SOCE ..................................... 20 Figura 7. Perfil de expresión de canales de calcio en astrocitos ....................................................... 22 Figura 8. Construcción de la proteína de fusión Orai1-GCaMP3 ...................................................... 28 Figura 9. Protocolo de patch clamp de activación secuencial........................................................... 30 Figura 10. Desarrollo y pruebas del sensor Orai1-GCaMP3 .............................................................. 40 Figura 11. Orai1-GCaMP3 detecta los incrementos de Ca2+ de TRPV1, pero no los de P2X4 ........... 41 Figura 12. El sensor Lck-GCaMP5 detecta incrementos de Ca2+ inducidos por CTP ........................ 42 Figura 13. Mediciones de patch perforado en células control HEK-293 expresando Orai1 (WT)-GFP y Stim1-DsRed ..................................................................................................................................... 42 Figura 14. La activación de TRPV1 induce una fuerte CDI en Orai1 .................................................. 43 Figura 15. La mutante Y80W de Orai1 es insensible a la CDI de Orai1 inducida por TRPV1. ........... 44 Figura 16 . Microscopía de super-resolución revela que TRPV1 y Orai1 se mueven cerca uno del otro en la membrana plasmática ............................................................................................................... 45 Figura 17. Canales unitarios Orai1-GCaMP3 detectan los incrementos de Ca2+ de TRPV1, pero no los de P2X4. ............................................................................................................................................... 46 Figura 18. TRPV1 se encuentra cercano a Orai1 ................................................................................ 47 Figura 19. El primer dominio anquirina de TRPV1 se asocia al C-terminal de Orai1 para favorecer la agrupación de TRPV1-Orai1 ............................................................................................................... 48 Figura 20. La deleción del dominio ANK1 aumenta la distancia entre Orai1 y TRPV1. .................... 49 Figura 21. La deleción de ANK1 no afecta la entrada de Ca2+ por TRPV1 y disminuye su efecto sobre la CDI de Orai1 .................................................................................................................................... 50 Figura 22. El Ca2+ que entra por TRPV1 induce CDI en Orai1 en astrocitos corticales ..................... 51 Figura 23. La inducción de la CDI de Orai1 por TPV1 modula la cicatrización de la herida en astrocitos. ........................................................................................................................................... 52 Figura 24. Mecanismo propuesto para el efecto de la inactivación heteróloga dependiente de Ca2+ en la migración celular. ...................................................................................................................... 57 Tabla 1. Resumen de propiedades de los mecanismos de inactivación de calcio ......................... 16 Tabla 2.Principales funciones de los astrocitos en el cerebro ........................................................ 21 Tabla 3. Comparación de diferentes ensayos de migración in vitro. ............................................ 24 Tabla 4. Principales reactivos utilizados durante el desarrollo de este trabajo .......................... 27 4 ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS aa: Aminoácidos. ANK: Dominio anquirina (Ankyrin domain). ANOVA: Análisis de la variancia (Analysis of variance). AUC: Área bajo la curva (area under the curve). Ca2+: Ion calcio. Cap: Capsaicina. CDI: Inactivación dependiente de calcio (Calcium-dependent inactivation). CFP: Proteína cian fluorescente (Cyan fluorescent protein). . Co-IP: Co-inmunoprecipitación. C-terminal: Carboxilo terminal. CRAC: Canales de Ca2+ activados por la liberación de Ca2+. CTP: Citidin trifosfato. DNA: Ácido desoxirribonucleico. ER: Retículo endoplásmico. EFRET: Eficiencia de FRET. FCDI: Inactivación rápida dependiente de calcio (Fast calcium-dependent inactivation). FF-SRM: Microscopía de super-resolución por fluctuación de la fluorescencia FRET: Transferencia de energía de resonancia de Förster (Förster resonance Energy transfer). GECI: Indicador de calcio codificado genéticamente (Genetically encoded Ca2+ indicator). GFP: Proteína verde fluorescente (Green fluorescent protein). GPCRs: Receptores acoplados a proteínas G (G-protein-coupled receptors). HEK-293: Línea celular derivada de riñón de embrión humano (Human embryonic kidney). 5 IP3: Inositol 1,4,5-trisfosfato. IP3R: Receptor de IP3 MP: Membrana plasmática MSR: Microscopía de super-resolución N-terminal: Amino terminal. OG3: Orai1-GCaMP3 PALM: Microscopía de localización fotoactivada (Photoactivated Localization Microscopy) PCC: Coeficiente de correlación de Pearson (Pearson’s correlation coefficient). PCR: Reacción en cadena de la polimerasa. R-GECO: Indicador de calcio rojo fluorescente codificado genéticamente para imagenología óptica. ROI: Región de interés (Region of interest). ROC: Canales activados por receptor (Receptor operated channels). SCDI: Inactivación lenta dependiente de calcio (Slow calcium-dependent inactivation). SARAF: Factor regulador asociado a SOCE (SOCE-associated regulatory factor). SIM: Microscopía de iluminación estructurada (Structured Illumination Microscopy) siRNA: Ácido ribonucleico de interferencia pequeño (Small interference RNA). SOAR: Región de activación STIM-Orai1 (STIM-Orai activating region). SOCE: Entrada de calcio activada por las reservas (Store-operated calcium entry). SOC: Canales de calcio activados por las reservas (Store operated channels). SRRF: Super resolución por fluctuación radial (Super resolution radial fluctuation). STED: Microscopía de agotamiento de la emisión (STimulated Emission Depletion microscopy) STORM: Microscopía de Reconstrucción Óptica Estocástica (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) 6 SWA: Ensayo de cierre o cicatrización de la herida (Scratch-wound assay). TG: Tapsigargina. Thr: Trombina. TIRF: Fluorescencia de reflexión interna total (Total internal reflection fluorescence). TIRFM: Microscopía usando iluminación TIRF (Microscopy TIRF). TRPV1: Receptor (canal) de potencial transitorio vaniloide subtipo 1. VOC: Canales activados por voltaje (Voltaje Operated Channels). WT: Tipo silvestre (Wild type). YFP: Proteína amarilla fluorescente (Yellow Fluorescent Protein). 7 RESUMEN El ion Ca2+ es uno de los segundos mensajeros más importantes para diversos procesos celulares. La entrada de Ca2+ activada por las reservas (SOCE) es el principal mecanismo para la movilización de este ion en células no excitables. Los componentes esenciales de la SOCE son el sensor de Ca2+ del retículo endoplásmico (ER), STIM1 y el canal de Ca2+ de la membrana plasmática (PM) Orai1. La actividad de Orai1 está regulada por varios mecanismos, uno de los más importantes es por medio de un mecanismo de retroalimentación negativa que mantiene la homeostasis intracelular de Ca2+ previniendo la entrada excesiva de Ca2+. Este mecanismo es llamado inactivación dependiente de Ca2+ (CDI). La CDI consiste en la inactivación lenta dependiente de Ca2+ (SCDI) y la inactivación rápida dependiente de Ca2+ (FCDI), las cuales tienen diferentes cinéticas y sitios de acción. La FCDI transcurre dentro de ~10 a 100 milisegundos después de la activación del canal y es controlada por la unión de Ca2+ a un sitio localizado a ~8 nanómetros del poro del canal. Hasta donde conocemos, todos los estudios llevados a cabo a la fecha para explorar la CDI en Orai1 han sido conducidos por el aumento intracelular de Ca2+ de manera artificial por medio de la pipeta de “patch-clamp”, lo que refleja la CDI inducida por Ca2+ que entra a través del poro del canal (inactivación homologa dependiente de Ca2+). Menos estudiadas están las fuentes fisiológicas de Ca2+, tales como otros canales. En el presente estudio hemos explorado otras fuentes de Ca2+ provenientes de diferentes canales. Encontramos que el Ca2+ entrante a través de los canales TRPV1 induce una fuerte CDI en Orai1, mientras que el Ca2+ que entra por medio de los canales P2X4 no la induce. Estudios de microscopía de super resolución, co-inmunoprecipitación (co-IP) y FRET (Transferencia de energía por resonancia de Förster) indican que Orai1 y TRPV1 están asociados y se mueven juntos en la PM, mientras que Orai1 y P2X4 no se encuentran asociados. Estos resultados indican que existe una asociación entre los canales Orai1 y TRPV1, lo cual resulta en un elevado microambiente (nanodominio) de Ca2+cuando los canales TRPV1 son activados, lo cual intensifica la CDI en Orai1. Debido a que Orai1 y P2X4 no se encuentran cercanos uno de otro, el Ca2+ que entra por P2X4 no afecta la CDI en Orai1, a pesar del hecho de que el Ca2+ entrante a través de P2X4 contribuye al incremento de la concentración citosólica Ca2+. Los análisis de deleción de segmentos y arreglos peptídicos mostraron que el primer dominio anquirina (ANK1) en TRPV1 es requerido para la asociación de este canal al dominio N-terminal de Orai1. Este dominio ANK1 mantiene ambos canales cerca y favorece la CDI en Orai1. La supresión de este dominio reduce significativamente la CDI en Orai1 promovida por el Ca2+ que entra a través de TRPV1. Nuestros resultados tienen importantes implicaciones fisiológicas en la modulación de la entrada de Ca2+ en células donde TRPV1 y Orai1 coexisten, tales como los astrocitos. Mostramos que TRPV1 es un modulador importante de la actividad del canal Orai1 en astrocitos corticales por medio del control de la CDI en este canal, reduciendo la cantidad de Ca2+ que entra a la célula cuando TRPV1 y Orai1 son simultánea o secuencialmente activados. Esta modulación heteróloga del CDI desempeña un papel en el control de la migración celular y en el cierre de la herida en cultivo de astrocitos. 8 ABSTRACT Calcium ion (Ca2+) is a second messenger important in numerous cellular processes. Store operated calcium entry (SOCE) is the main mechanism for calcium mobilization in non- excitable cells. The essential components of SOCE are the endoplasmic reticulum (ER) Ca2+ sensor STIM1 and the plasma membrane (PM) channel Orai1. Orai1 activity is regulated bu several mechanisms, one of the most important is through a negative feedback mechanism that maintains intracellular Ca2+ homeostasis and prevents excessive Ca2+ influx. Such mechanism is known as Ca2+-dependent inactivation (CDI). CDI consists of slow CDI (SCDI) and fast CDI (FCDI), which have distinct kinetics and sites of action. FCDI takes place within ~10 to 100 milliseconds after channel activation and is controlled by Ca2+ binding to a site located ~8 nanometers from the channel pore. To our knowledge, all the studies carried out to this date to explore CDI in Orai1 have been conducted by artificially increasing intracellular Ca2+ via the patch clamp pipette, which reflects CDI induced by Ca2+ entering through the Orai1 channel pore (homologous CDI). Less studied are the physiological sources of Ca2+, such as other channels. In the present study we have explored other sources of Ca2+ arising from different channels. We have found that Ca2+ entering the cell trough TRPV1 channels induce strong CDI in Orai1, while Ca2+ entering trough P2X4 purinergic channels does not. Super resolution, co- immunoprecipitation (co-IP) and Förster resonance energy transfer (FRET) studies indicate that Orai1 and TRPV1 are associated and move in close proximity to each other at the PM, while P2X4 and Orai1 do not. These results indicate that a close association between TRPV1 and Orai1 results in an elevated Ca2+ microenvironment (nanodomain) when TRPV1 channels are activated, which enhances CDI in Orai1. Because P2X4 and Orai1 are not found in proximity, Ca2+ entering P2X4 channels do not affect CDI in Orai1, in spite the fact that Ca2+ entering trough P2X4 contributes to increments in cytosolic Ca2+ concentrations. Deletion analysis and peptide arrays show that the first ankyrin domain (ANK1) in TRPV1 is required for the association of this channel to the N-terminal domain from Orai1. This ANK1 domain maintains both channels close and favors CDI in Orai1. Deleting this domain significantly reduces CDI in Orai1 elicited by Ca2+ entering trough the TRPV1. Our results have important physiological implications in the modulation of Ca2+ influx in cells where TRPV1 and Orai1 channels coexist, as within astrocytes. We show that TRPV1 is an important modulator of Orai1 channel activity in cortical astrocytes by controlling CDI in this channel and thus reducing the amount of Ca2+ entering to the cell when TRPV1 and Orai1 are simultaneously or sequentially activated. This heterologous modulation of CDI plays a role in controlling cell migration and wound healing in astrocytes culture. 9 1. INTRODUCCIÓN 1.1. Señalización de Ca2+ intracelular El ion calcio (Ca2+) es uno de los agentes de señalización celular más universales y versátiles en los seres vivos. Cambios en la concentración intracelular de este ion son responsables de controlar una gran variedad de procesos biológicos fundamentales, tales como la transcripción, el ciclo celular, la migración celular, la muerte celular programada, entre muchos otros1–3. ¿Pero cómo es que una señal que parece tan simple, como la elevación de Ca2+ logra regular tantos diversos procesos? Esta increíble versatilidad se logra mediante patrones espacio-temporales, de velocidad y de amplitud; por esta razón, la señalización de Ca2+ debe de ser regulada de manera flexible, pero con alta precisión al mismo tiempo. Estas dos características se logran gracias a la existencia de una sofisticada maquinaria molecular que regula con precisión las señales de Ca2+. Esta maquinaria está compuesta por transportadores de Ca2+ (canales de Ca2+, bombas de Ca2+, intercambiadores), proteínas amortiguadoras de Ca2+ y proteínas sensoras de Ca2+ 4–6. A este conjunto de proteínas Berridge hace ya 20 años le dio el nombre de “herramientas de trabajo de Ca2+ “ (Ca2+ toolkit en inglés) y alrededor de este término se ha desarrollado nuestro entendimiento de la señalización de este ion (Fig. 1) 1. Figura 1. Señalización de calcio intracelular. Los principales componentes de la señalización de Ca2+ son: (1) los canales de calcio divididos en activados por voltaje (VOC), activados por receptor (ROC) y activados por la reserva (SOC) y los TRP; (2) las bombas de Ca2+, (3) los amortiguadores de Ca2+ y (4) los intercambiadores de Ca2+. Las principales fuentes de Ca2+ son el medio extracelular, el RE y la mitocondria. 10 La esencia de la señalización basada en Ca2+, en cualquier organismo eucarionte, es que la concentración de Ca2+ intracelular (Ca2+ cyt) en condiciones basales es extremadamente baja, aproximadamente 100 nM3 (Fig. 1), sin embargo, después de un estímulo esta concentración puede aumentar hasta alcanzar una concentración de alrededor de 1 µM 5. Este aumento se logra mediante la entrada de Ca2+ extracelular (~1-2 mM) a través de los canales de la membrana plasmática y por la liberación de Ca2+ de los compartimentos intracelulares (retículo endoplásmico, ~100-800 µM), aunque cabe aclarar que el incremento en la concentración de este ion se da únicamente en las localizaciones celulares donde es requerido. Los aumentos de Ca2+ generan señales que pueden ser de amplitud y duración variable, además de que pueden estar restringidas a un pequeño dominio o a toda la célula. La mayoría de las señales de Ca2+ se dan como breves transitorios, que a menudo se organizan en oscilaciones regulares. La frecuencia de estas oscilaciones repetitivas es modulada y codifica información para controlar distintos procesos celulares1,4,7. La organización espacial del Ca2+ en distintos microdominios y/o nanodominios, es una manera de mejorar la versatilidad de este sistema de señalización, permitiendo a las células regular diferentes procesos dentro de regiones localizadas de la célula8,9. 1.2. Microdominios y nanodominios de Ca2+ La compartimentación en microdominios y nanodominios es un importante mecanismo para el control de la señalización de Ca2+. A pesar de que los términos de microdominio y nanodominio de Ca2+ son ampliamente usados, sus definiciones no son muy precisas y han sufrido cambios a través del tiempo9–11. Originalmente el termino microdominio fue usado para describir altas concentraciones de Ca2+ encontradas en las proximidades de un canal de Ca2+. A pesar del nombre, estos microdominios tienen realmente dimensiones espaciales en el rango de nanómetros (“micro” en “microdominios” significa “pequeño” y proviene del griego). Más recientemente, los términos microdominio y nanodominio han sido ampliamente utilizados para distinguir acoplamientos moleculares estrechos y lejanos. Su definición es confusa, ya que el límite para separar ambos dominios se da entre 50 a 150 nm. De manera general podemos definir un microdominio de Ca2+ como aquellas regiones celulares con una concentración elevada de Ca2+ que se extiende por arriba de los 100 nm. En cuanto a los nanodominios de Ca2+ estos pueden ser definidos como las regiones de concentración elevada de Ca2+ menores a 100 nm10,12. Varios reportes han apoyado la existencia de los micro y nanodominios y son consistentes con cálculos teóricos de la concentración de Ca2+ esperada en el poro de un canal de Ca2+ en la membrana plasmática, esto con la ayuda del gran poder amortiguador del citosol. La distinción entre las señales de corto alcance (micro y nanodominios) de las señales globales de calcio, incrementan la capacidad informativa de la señalización intracelular. Los microdominios y nanodominios, regulan diversos procesos tales como la transmisión sináptica13, la plasticidad neuronal14, el acoplamiento cardiaco de contracción y excitación15, 11 secreción de insulina16, entre otros17–19. En contraste los incrementos globales de calcio regulan también procesos sumamente importantes tales como la proliferación, diferenciación o la apoptosis20,21. Para regular el tipo de señal de calcio (global o local), la célula hace uso del “kit” de herramientas, en especial de las bombas, intercambiadores y canales de Ca2+. En este escrito me enfocaré en el papel de los canales de Ca2+en la homeostasis de este ion. 1.3. Canales de calcio El control del movimiento del Ca2+ a través de las membranas representa el núcleo del sistema de señalización de esta molécula. El transporte de Ca2+ se da principalmente por medio de los canales de Ca2+. Los canales de Ca2+ son esencialmente proteínas transmembranales que tienen un poro acuoso con un filtro de selectividad y mecanismos de apertura y cierre que le permiten la difusión dirigida de calcio por medio de un gradiente electroquímico. Estos canales de Ca2+ son de manera global divididos en canales de la membrana plasmática y en canales intracelulares, todos estos a su vez son divididos en varias familias dependiendo de su mecanismo de apertura y cierre, su selectividad y su función. Los canales de Ca2+ de la membrana plasmática se dividen de manera muy general en canales activados por voltaje (VOC, por sus siglas en ingles), canales activados por receptor (ROC), canales TRP (Transient receptor potential) y canales activados por las reservas (SOC) (Fig. 1). Como su nombre indica, los VOC son regulados por cambios en el voltaje que existen en la membrana plasmática. En general estos canales se encuentran cerrados cuando la membrana esta hiperpolarizada, pero estos se abren durante una despolarización. El gran número de VOC ha sido dividido en tres grandes familias: Cav1, Cav2 y Cav322. Los canales de calcio activados por receptores son canales iónicos multiméricos cuya apertura es regulada por agonistas externos tales como neurotransmisores y hormonas. Estos tienen dos importantes funciones de señalización. Primero, su apertura y selectividad iónica (a Na+, K+, Cl- y/o Ca2+) altera el potencial de membrana, siendo esenciales para el control de células excitables tales como neuronas y células musculares. Además, su permeabilidad a Ca2+ representa un importante mecanismo para la regulación de este segundo mensajero. Existen tres principales grupos de ROC, los receptores con loops de cisteínas (como los receptores de acetilcolina tipo nicotínico y los receptores GABA), los receptores de glutamato (receptores AMPA y NMDA) y los receptores sensibles a ATP (receptores P2, como los P2Y2 y los P2X4), en esta clasificación generalizada, se podría incluir a la familia de los canales TRP, que además de tener agonistas que permiten su apertura, también están regulados por otro tipo de estímulos como el movimiento y la temperatura, como ejemplos de este tipo de canales están el canal TRPV1 y el TRPM823. Los canales de Ca2+ activados por la reserva (SOC) son aquellos en los que sus mecanismos de apertura se dan en respuesta al vaciamiento de las reservas de Ca2+ del retículo endoplásmico (RE). Este mecanismo de apertura de canales se da como una manera de 12 asegurar una constante recaptura de Ca2+ por parte de las pozas internas (RE y mitocondria), ya que gran parte del Ca2+ usado en la señalización es liberado desde la reserva de Ca2+ del RE22,24. 1.4. Entrada de calcio activada por las reservas (SOCE) Orai1 junto con STIM1 son las proteínas que forman la base molecular de la entrada de calcio activada por las reservas (SOCE por sus siglas en inglés) (Fig. 2), la cual fue propuesta por Putney en 1986. La importancia de esta entrada de calcio ha sido ampliamente demostrada en muchos tipos celulares (principalmente en células no excitables) y también se sabe que es una de las principales vías de calcio presentes en casi todos los metazoarios. Fisiológicamente la SOCE es un mecanismo de entrada de calcio relevante en diversos procesos, tales como la maduración de linfocitos T y B, la liberación de histamina y serotonina en células cebadas, la exocitosis de gránulos líticos de células T citotóxicas, proliferación, entre muchos otros25–27. Figura 2. Principales componentes de la entrada de Ca2+activada por las reservas (SOCE). La SOCE tiene como principales dos componentes principales al sensor de Ca2+ del RE, STIM1 y el canal de Ca2+ de la membrana plasmática Orai1. TM: Dominio transmembranal; CC: Doble espiral; SAM: Motivo alfa estéril; K: región rica en lisina; S/P, región rica en serina y prolina; SOAR/CAD: región de activación STIM1-Orai1/ Dominio de activación de CRAC. De manera fisiológica la SOCE es activada por estímulos que liberan calcio del retículo endoplásmico. La activación de la SOCE se da a través de una compleja coreografía entre Orai1 y STIM1 (Fig. 3), esta activación generalmente involucra la estimulación de receptores acoplados a proteínas G (como por ejemplo el receptor de ácido muscarínico y los receptores activados por proteasas) que activan a la fosfolipasa C específica para fosfoinosítidos (PLC) que resulta en la producción de inositol 1,4,5- trifosfato (IP3) el cual a su vez activa a los 13 receptores de IP3 (IP3R) en el RE, la apertura de estos canales receptores permite el vaciamiento del RE por la liberación del Ca2+ hacia el citosol. La disminución de Ca2+ en el RE es detectada por la mano-EF de STIM1, lo que provoca un cambio conformacional de esta proteína, produciendo su oligomerización y su translocación vía microtúbulos y acumulación en las cercanías de la MP. Al mismo tiempo, Orai1 se acumula en sitios de la membrana plasmática directamente opuestos a STIM1, donde finalmente STIM1 se une a Orai1 y permite su apertura formando estructuras parecidas a “puntos” (puncta en latín) que se pueden observar con microscopía confocal. Estos puntos periféricos corresponden a nivel estructural a regiones especializadas de retículo endoplásmico liso posicionadas a ~10-20 nm de la membrana plasmática, estas estructuras son conocidas como uniones retículo endoplásmico- membrana plasmática (ER-PM), donde se genera la entrada de calcio. De manera experimental para lograr toda esta coreografía molecular se utiliza frecuentemente un inhibidor de la ATPasa del retículo sarco-endoplásmico (SERCA) llamado tapsigargina (TG), que independientemente de los GPCRs y de IP3 vacía el retículo endoplásmico a través de un mecanismo de fuga desconocido 25,28,29. Figura 3. Mecanismo de activación de la entrada activada por las reservas. Para una descripción detallada por favor referirse al texto. PAR: Receptor activado por proteasas; Gp: Proteína G; PLC: Fosfolipasa C. La SOCE tiene 3 características principales, la primera es su activación exclusiva por el vaciamiento del retículo endoplásmico, la segunda es la alta selectividad por el calcio sobre 14 otros cationes monovalentes y en tercer lugar la inactivación dependiente de Ca2+ (CDI por sus siglas en inglés) 25–27, esta última característica será detallada más adelante. 1.5. Canales Orai1 Uno de los dos componentes principales de la SOCE es el canal Orai1, este fue identificado en el 2006, cuando se encontró un polimorfismo de un solo nucleótido (R91W, Fig. 2) dentro del canal Orai1 en una familia que presentaba una forma hereditaria de inmunodeficiencia combinada grave (SCID, severe combined immunodeficiency), lo cual hace que existan defectos en la SOCE de los linfocitos T y por lo tanto problemas en su maduración30. De acuerdo a la estructura cristalográfica del canal dOrai (obtenido de Drosophila melanogaster) la estequiometría funcional de los canales Orai1 es de hexámeros31. Sin embargo, otros tipos de evidencias experimentales apuntan a una conformación tetramérica32– 34. Existe todavía una amplia discusión sobre este tema. La estructura cristalográfica de dOrai (73% de homología con Orai1) revela un ensamble hexamérico de subunidades. Estas subunidades estas acomodadas de manera simétrica como trímeros de dímeros alrededor de un eje central del canal para formar el poro. Cada subunidad está compuesta por cuatro dominios transmembranales (dominios TM, Fig. 2) de α-hélices (M1-M4) y una extensión del dominio M4 que se encuentra inmersa dentro del citosol. La vista de la estructura del canal desde el lado extracelular es de tres anillos concéntricos de los dominios TM. El anillo más interno está compuesto de dominios M1 y forma la vía de conducción del canal. El anillo intermedio, está compuesto de los dominios M2 y M3 y brinda rigidez e integridad estructural. El anillo concéntrico más externo está compuesto por el dominio M4 y su extensión, es el más periférico y móvil. Los residuos N-terminal (74-90) de Orai1 están altamente conservados y son esenciales para la activación. En esta parte se encuentra el dominio N terminal de unión a calmodulina (aa. 68-91) y mutaciones en este dominio disminuyen la CDI. Otros residuos del C-terminal (268- 291) son importantes para la unión de STIM1 y también se ha observado que esta región muy probablemente regule la CDI35,36. 1.5.1. Inactivación dependiente de calcio del canal Orai1 La inactivación dependiente de Ca2+ es un mecanismo de retroalimentación negativa que mantiene la homeostasis intracelular de Ca2+ y que previene la entrada excesiva de este ion al citoplasma ya que una elevación exacerbada de Ca2+ dentro del citoplasma, puede modificar y destruir el delicado balance que ejerce el calcio en la regulación de diversos procesos e incluso puede llevar a la muerte celular35,37–39. Este mecanismo fue primero descrito en canales de calcio modulados por voltaje40,41. Las altas concentraciones de Ca2+ intracelular inhiben la función de Orai1 de dos maneras distintas, la primera es la inactivación rápida dependiente de Ca2+ (FCDI, por sus siglas en ingles) que ocurre en el rango de los milisegundos42–44 y la segunda es la inactivación lenta dependiente de Ca2+ (SCDI, por sus siglas en inglés) que se da en las decenas de segundos 15 después de la activación de Orai144,45. Es importante resaltar que ninguna de las dos formas de la CDI parecen involucrar un desacople funcional ni físico de Orai1 y STIM139 (Tabla 1). La FCDI de Orai1 puede ser observada durante registros de electrofisiología de célula completa al aplicar rampas de voltaje a potenciales negativos desde un potencial de mantenimiento de 0 mV después de la completa activación de la SOCE por el vaciamiento del retículo. La rampa de voltaje negativa da como resultado un incremento instantáneo en la corriente a través de los canales Orai1 abiertos, pero la corriente se inactiva desde su pico al estado basal con un curso temporal bi-exponencial, con constantes temporales de 10 ms y 100 ms (Fig. 4a). La evidencia de que este tipo de inactivación en este canal depende de calcio, viene de pruebas realizadas con diferentes amortiguadores de calcio intracelulares y extracelulares en la cinética de esta entrada de Ca2+. El amortiguador de Ca2+ rápido BAPTA con la pipeta del patch, reduce de manera más rápida la inactivación en comparación del amortiguador de calcio lento EGTA42,46,47. Se observó también que la FCDI es completamente abolida cuando esta corriente está compuesta únicamente de cationes monovalentes, por la ausencia de cationes divalentes (Fig. 4a, línea roja), mientras que el incremento de la concentración de calcio extracelular resulta en un incremento y aceleración de la inactivación35,44. Los diferentes efectos de EGTA o BAPTA en la FCDI condujeron a la propuesta de que este mecanismo es llevado a cabo por el flujo de Ca2+ que entra a través del canal mismo y que esto probablemente esta mediado por la unión de Ca2+ a sitios en la proximidad del poro del canal (aproximadamente a 8 nm)42,43,48. El mecanismo exacto de la FCDI de Orai1 no está completamente entendido aun; sin embargo, se ha reportado que diferentes regiones de Orai1 tienen un papel relevante en este mecanismo, incluyendo el bucle citosólico entre las regiones transmembranales 2 y 3 (aa 137-173)49 y el dominio de unión a calmodulina de Orai1 (aa 68-91)37, cuya identificación dio apoyo al modelo de la calmodulina como sensor para la FCDI; la interacción física entre Orai1 y calmodulina fue después confirmada por una estructura cristalizada del dominio de unión a calmodulina de Orai1. Los residuos con papel más relevantes fueron identificados como el W76 y Y8031,50. Otros estudios mostraron que estos residuos podrían estar involucrados en transiciones conformacionales dentro del poro de Orai1, que llevan a la FCDI. Es interesante notar que se observó que la mutación del aminoácido Y80 a W80 prevenía completamente la FCDI (Fig. 2)46,51. Estudios más recientes sobre la calmodulina en la FCDI se han enfocado en la interacción con STIM152. También ha sido reportado que los primeros 63 aa del N- terminal de Orai1 pueden estar involucrados con la FCDI53,54. Por otro lado, se ha observado que la FCDI además parece ser dependiente de la estequiometría de STIM1:Orai1, ya que incrementos en el cociente de expresión de STIM1:Orai1 potencian la FCDI, y la disminución de este cociente abole la FCDI35,55. También se ha reportado que corrientes mediadas por SOAR de STIM1(Fig. 2) no exhiben a la FCDI, lo que indica que esta porción de STIM1 es relevante para la FCDI37. Sin embargo, como se comentó previamente, la manera en cómo todas estas regiones y componentes moleculares interactúan para lograr la FCDI es aún poco conocido. 16 Resumen de las propiedades de los mecanismos de inactivación de calcio Tipo Tiempo Distancia Sensibilidad Mecanismos propuestos Rápida Bi-exponencial 10-100 ms 10 nm del poro Sensible a BAPTA, pero no a EGTA Interacción de aminoácidos de STIM1 y Orai1, calmodulina. Lenta 70 segundos 100 nm Bloqueada por EGTA Mitocondria, SARAF Tabla 1. Resumen de propiedades de los mecanismos de inactivación de calcio. Modificado de 48. Figura 4. Inactivación rápida y lenta dependiente de Ca2+. a) La FCDI puede ser vista después de la hiperpolarización del potencial de membrana a 100mV desde un potencial de mantenimiento de 0 mV. Se puede observar la FCDI en una solución con Ca2+(línea negra) comparada con una solución libre de divalentes, donde se pierde la inactivación (línea roja). Experimentos realizados en linfocitos T. b) SCDI, se da en las decenas de segundos. Para las células cebadas RBL dializadas con IP3 en un buffer débil (EGTA) y tapsigargina el decaimiento completo se da a los 400 segundos. Sin embargo, la SCDI es prevenida cuando se asegura que la mitocondria está en un estado energizado por la inclusión de un coctel mitocondrial. Modificado de 48,56. A pesar de haber sido caracterizada hace más de dos décadas, al igual que la FCDI, el mecanismo subyacente de la SCDI también permanece aún poco entendido. La característica que define la SCDI es que se desarrolla gradualmente en el orden de las decenas de segundos, y se ha observado que depende de los incrementos globales de la concentración de Ca2+ citosólico45, pero a diferencia de la FCDI, esta es sensible a EGTA, ya que altas concentraciones de este quelante (≥10 mM) suprimen la SCDI48. La inactivación de la SOCE mediada por la SCDI se asemeja a la desactivación del canal por la restauración del Ca2+ del RE. Sin embargo, la CDI no es sensible a la tapsigargina (TG). También en contraste con la FCDI, se ha observado que la SCDI está dirigida por el aumento de calcio global con el paso crítico dependiente de Ca2+ localizado al menos a 100 nm del poro del canal39,48. Se ha propuesto que la mitocondria tiene un papel en la SCDI, de acuerdo con este modelo, la mitocondria es capaz de absorber el calcio cuando aumentan la concentración de Ca2+ citosólico que proviene de Orai1, lo que reduce la cantidad de Ca2+ disponible para la SERCA y los mecanismos de inactivación, lo que evita el reabastecimiento de las reservas de calcio del RE y atenúa la velocidad y alcance de la FDCI, lo que da como resultado un incremento en el tamaño y duración de la SOCE57. 17 Un estudio reciente proporcionó evidencia de que la calmodulina tiene un papel en la SCDI a través de su interacción con la región SOAR de STIM1, esta interacción es dependiente de Ca2+ e induce la SCDI44. En otro estudio se encontró de manera fortuita un regulador clave de la SCDI, la proteína SARAF (SOCE-associated regulatory factor). La sobreexpresión de SARAF en HEK-293 junto con la co-expresión de STIM1 y Orai1 disminuye la SOCE en aproximadamente 83% después de 300 s de haber alcanzado su pico. La disminución de la expresión de SARAF previene casi de manera completa la disminución de la SOCE. Se observó que SARAF migra a las uniones MP-RE después del vaciamiento del RE. El modelo que se propuso es que SARAF disocia STIM1 de Orai1 después de que la SERCA ya ha llenado las reservas de calcio del RE. Sin embargo, queda la interrogante de cómo es que SARAF detecta el calcio, ya que esta proteína no tiene ningún dominio conocido que se una a calcio, por lo que se cree que existen proteínas que le ayudan con esta función. Otra alternativa del funcionamiento de SARAF es que esta proteína sirve para dirigir las punctas de Orai1-STIM1 a sitios de unión MP-RE donde la SCDI se está desarrollando. Sin embargo existen otros mecanismos que tratan de explicar el papel de SARAF en la SCDI39,44,48. 1.6. Algunas herramientas para el estudio de la SOCE 1.6.1. Indicadores de calcio Para el estudio de la dinámica de Ca2+intracelular se han implementado distintos tipos de metodologías, entre las que destacan la electrofisiología y la imagenología con indicadores fluorescentes de Ca2+. Existen diversas técnicas de imagenología de fluorescencia para la visualización de dinámicas de Ca2+ en células, tejidos y organismos. Siendo el marcaje con indicadores inorgánicos o químicos de Ca2+ uno de los más ampliamente utilizados, ejemplos de estos son el Fura-2 o Fluo-4. Con indicadores apropiados, la imagenología de las dinámicas de calcio intracelular puede ser usada para medir actividad sináptica neuronal o transitorios de Ca2+ en astrocitos 58,59. Sin embargo, estas moléculas tienen varios inconvenientes que impiden su aplicación en una diversa gama de preguntas, por ejemplo, esta clase de indicadores no pueden ser dirigidos con facilidad a tipos celulares, poblaciones o localizaciones celulares en específico; también el cargado de estos también es altamente invasivo y puede ser perjudicial para el tejido, por lo que son incompatibles con mediciones in vivo crónicas y repetidas59. Los indicadores de Ca2+ codificados genéticamente (GECI, por sus siglas en inglés) están basados en proteínas fluorescentes quiméricas y resuelven muchas de las limitaciones antes planteadas, brindando una alternativa al uso de indicadores inorgánicos. Los GECI pueden ser dirigidos a células, poblaciones o compartimentos celulares específicos a diferencia de los indicadores inorgánicos. El direccionamiento de GECI a tejidos y organismos intactos (usando transgénesis o construcciones virales) es mínimamente invasiva y por lo tanto compatible con mediciones repetitivas in vivo a largo plazo 58. 18 Desde la aparición de los primeros GECI, varias estrategias han sido desarrolladas para generar herramientas más útiles para la imagenología de calcio. Entre los diversos tipos de GECI descritos a la fecha incluyen reporteros basados en la acuaporina60; indicadores basados la transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET), como D3cpV y TN-XXL; y sensores intensiométricos basados en cambios de la intensidad de fluorescencia de una sola proteína fluorescente, como el sensor GCaMP3. Estos dos últimos tipos de sistemas son los utilizados principalmente en la actualidad61. Los GECI basados en una sola proteína fluorescente consisten típicamente de una proteína fluorescente permutada (GFP o sus variantes) unida a un elemento de unión a calcio (por ejemplo, calmodulina o troponina C). Actualmente, la creciente familia de GCaMP es la más utilizada en este tipo de GECI. En la pasada década, generaciones sucesivas de estos indicadores de calcio con alta afinidad han logrado mejorar progresivamente el cociente ruido- señal, el rango dinámico y la cinética de sus predecesores61–63. Los GCaMPs han sido exitosamente expresados y utilizados para detectar transitorios de calcio en una amplia variedad de células y tejidos, incluyendo células HEK, miotubos de ratón, neuronas quimiosensibles de C. elegans, neuronas de lóbulo de la antena de moscas, neuronas de la corteza sensorial del ratón, neuronas motoras de pez cebra, entre otras62. GCaMP3 consiste en la fusión de una EGFP circularmente permutada, flanqueada en un lado por una calmodulina (CaM) y por el otro lado por el péptido M13 (péptido de unión a Ca2+/CaM derivado de la cinasa de la cadena ligera de la miosina de músculo esquelético). Este GECI basa su funcionamiento en los cambios conformacionales que se dan por la asociación de la calmodulina con el Ca2+, los cuales llevan a su vez a un cambio conformacional en la GFP permutada, causando un aumento en la intensidad de su fluorescencia (Fig. 5a)58,64,65. Figura 5. Indicadores de calcio codificados genéticamente de una sola proteína fluorescente. a) GCaMPs y b) GECOs. La unión de Ca2+ promueve un reacomodo conformacional intramolecular que cambia la intensidad de fluorescencia. Los colores denotan el rango de la fluorescencia de emisión de cada proteína fluorescente. La afinidad al Ca2+ por los motivos de unión a Ca2+ derivados de la calmodulina. 19 GCaMP3 ha sido utilizado para la detección de actividad en poblaciones neuronales en la corteza motora y el hipocampo. Estudios de imagenología a largo plazo de GCaMP3 han revelado cambios de circuitos relacionados con el aprendizaje in vivo, este GECI también ha sido utilizado para probar la excitación dendrítica en la capa de dendritas in vivo y recientemente ha sido utilizado para medir señales de Ca2+ en regiones cercanas a la membrana en procesos de astrocitos66. Por medio de mutagénesis aleatoria de GCaMP3 acompañada de una detección (screening) de alto rendimiento, se crearon proteínas fluorescentes que expandieron la paleta de colores disponible en ese momento, lo que permitió el desarrollo de indicadores intensiométricos con longitudes de onda en el espectro rojo y el azul. Las mejores variantes fueron llamadas GECOs (indicadores de Ca2+ genéticamente codificados para la imagenología óptica, por sus siglas en inglés) (Fig. 5b). Esta familia de indicadores codificados genéticamente se compone de G- GECO (GECO verde), R-GECO (GECO rojo) y B-GECO (GECO azul) 64,67. Sin embargo, el uso en general de estos sensores sigue limitado prácticamente al estudio de las dinámicas globales de Ca2+ (en todo el citosol). Estudios recientes han aprovechado la capacidad de esta herramienta para dirigirse a regiones celulares en específico lo que ha permitido el estudio de microdominios o nanodominios de calcio en distintos tipos celulares10. En este trabajo hacemos uso de estas herramientas para el estudio de nanodominios como se mostrará más adelante. 1.6.2. Microscopía de super-resolución No existe un consenso en la definición de la microscopía de super-resolución (MSR), en este trabajo la definimos como todas aquellas técnicas de microscopía que sobrepasen los límites de difracción clásicos de la resolución óptica (200 nm en el eje lateral y 800 nm en el eje axial)68,69. Estas técnicas conservan las ventajas de la microscopía de fluorescencia (monitoreo en tiempo real, marcaje especifico, etc.70,71) pero están continuamente empujando la resolución hacia escalas nanométricas, por lo que la MSR permite el estudio de células con mayor detalle, a menudo obteniendo con algunas de estas técnicas, información a escala molecular72,73. Existen varias maneras para realizar técnicas que sobrepasen el límite de resolución óptica y diversos métodos han sido desarrollados. En la actualidad una gran variedad de sistemas de MSR están comercialmente disponibles o son auto ensamblados, lo que tiene como consecuencia que muchos investigadores estén interesados en utilizar estas técnicas en sus experimentos para obtener más información. Dentro de las principales metodologías de MSR podemos mencionar a la microscopía de iluminación estructurada (SIM y sus variantes), la microscopía de localización de molécula única (SMLM, como PALM y STORM), microscopía de agotamiento de la emisión (STED) y la microscopía de super-resolución basada en fluctuaciones de la fluorescencia (FF-SRM), de esta última ahondaré con más detalle posteriormente. Todas estas técnicas de MSR han sido utilizadas para estudiar con mayor detalle las interacciones de los componentes de la SOCE. Usando SIM un estudio 20 reciente identificó a la septina-7 como un modulador de los canales Orai74 y la asociación entre estas dos proteinas75 y en otro estudio usando esta misma técnica demostraron que STIM1 se asocia con EB176 (Fig. 6, círculo rojo). Figura 6. Microscopía de super-resolución aplicada al estudio de la SOCE. Las elipses amarillas representan estudios realizados con microscopía de agotamiento de la emisión; las elipses naranjas muestran estudios representativos de microscopía de super-resolución basada en fluctuaciones de la fluorescencia; los círculos rojos son ejemplos de investigaciones realizadas con microscopía de iluminación estructurada y los círculos azules son estudios representativos de estudios de microscopía de super-resolución de molécula única. Por otro lado, usando STORM, se demostró la asociación espaciotemporal entre STIM1 y EB1 a una escala nanométrica77. STORM también demostró el papel de la junctofilina-4 en las punctas Orai1-STIM178, además de que datos de STORM brindan apoyo a la asociación entre STIM1 y BIN279 (Fig. 6, círculos azules). En cuanto a la microscopía STED, esta demostró el entrecruzamiento de monómeros de Orai1 son inducidos por STIM1 para formar un canal funcional80 y otro estudio demostró la asociación entre STIM2 y syt781 (Fig. 6, elipses amarillas). Por la relevancia para este trabajo, aquí abordaré con más detalle la microscopía basada en las fluctuaciones de la fluorescencia, esta técnica se basa en que cuando un fluoróforo es excitado con luz continua, su emisión varia aleatoriamente a través del tiempo. Esto se debe a las transiciones entre los estados no fluorescentes o a sus interacciones con el ambiente que rodea el fluoróforo. Una vez que se capturan estas oscilaciones en decenas, cientos o miles de imágenes, se aplicar algoritmos para determinar las correlaciones temporales en estas oscilaciones y así discernir la presencia y localización de los fluoroforos a una resolución mejorada70. FF-SRM es un campo emergente que es compatible con la imagenología in vivo y que permite sobrepasar el límite de difracción. Existen varios algoritmos usados para la 21 realización de esta técnica, entre los que destacan SOFI (Super-resolution Optical Fluctuation Imaging), MUSICAL (MUltiple Signal Classification ALgorithm), 3B (Bayesian analysis of Blinking and Bleaching) y SRRF (Super-Resolution Radial Fluctuations). FF-SRM ha sido también usada para estudiar la SOCE, por ejemplo, SOFI mostró la organización a nivel nanométrico de la SOCE en células vivas82. En este trabajo hicimos uso del algoritmo de SRRF, que nos permitió el análisis de Orai1 a una escala nanométrica. 1.7. Astrocitos Los astrocitos (del griego astron - estrella y cyte - célula), son un tipo de célula glial propio del sistema nervioso central. Identificados en 1858 por Rudolph Virchow, son el tipo celular más abundante en el cerebro. Estas células fueron posteriormente teñidas y observadas por Camilo Golgi lo que permitió establecer su morfología estrellada, aunque técnicas recientes han revelado una forma más parecida a una esponja. Su nombre les fue otorgado por Lenhossek en 189183,84. Su complejidad morfológica correlaciona con la gran cantidad de funciones que estas células ejecutan en el sistema nervioso central, que incluye la homeostasis, dando soporte metabólico y neurotrófico, promoviendo la sinaptogénesis; la recaptura y reciclaje de neurotransmisores; la modulación de la plasticidad, la densidad de la sinapsis, entre muchas otras funciones (Ver Tabla 1). Función Mecanismo Referencias Desarrollo Guía para el crecimiento neurítico Formación de puentes de Tenascina-C y proteoglicanos, expresión de moléculas de adhesión celular (N-cadherina) 85 Sinaptogénesis Liberación de trombospondina, remodelación de la matriz extracelular 86 Homeostasis Iónica Acuaporinas, transportadores de K+ 87 pH Intercambiador Na+/H+, transportadores de NaHCO3, transportadores de ácido monocarboxílico, ATPasa de protones, P2Y1 88 Recaptura de neurotransmisores Transportadores de Glutamato, GABA y glicina 89 Modulación sináptica Precursores de neurotransmisores Producción de glicina 90 Liberación de gliotransmisores Glutamato, GABA, purinas y D-serina 89 Memoria a largo plazo Producción de lactato 91 Regulación de la liberación sináptica Liberación de purinas 92 Metabolismo Almacenamiento de glicógeno, producción de lactato 93 Regulación del flujo sanguíneo Liberación de prostaglandinas, óxido nítrico y ácido araquidónico 94 Tabla 2. Principales funciones de los astrocitos en el cerebro. A pesar de que los astrocitos no son excitables eléctricamente, poseen conductas oscilatorias de calcio muy dinámicas que les permiten regular la liberación de gliotransmisores (glutamato, la D-serina y ATP), lo cual modula la función de las neuronas y glía que los rodea, por esta 22 razón los astrocitos han sido considerados como un componente más de la sinapsis en el modelo de “sinapsis tripartita”95,96, cabe aclarar que la idea de que los aumentos de la concentración Ca2+ en astrocitos como liberadoras de transmisores es controversial, y permanece en debate, pero es innegable que existe evidencia que apoya este modelo (véase la revisión de Bazargani de 2016)97. Aunque los astrocitos expresan canales dependientes de voltaje, incluyendo algunos de sodio, potasio e incluso de calcio, estas células no tienen la capacidad de disparar potenciales de acción como lo hacen las neuronas. Sin embargo, los astrocitos son células altamente activas que se comunican constantemente con su entorno, para esto han desarrollado una forma de “excitabilidad” basada en variaciones en la concentración de calcio intracelular, lo cual les permite comunicarse con otros astrocitos y otras células gliales mediante ondas de calcio intracelulares y con las neuronas mediante la liberación dependiente de calcio de gliotransmisores83,96. Existen varios mecanismos que disparan la elevación de los niveles de Ca2+ intracelular en los astrocitos, entre los que destacan los canales de Ca2+, y como se puede observar en la figura 7 este tipo celular expresa una gran diversidad de canales de Ca2+. Figura 7. Perfil de expresión de canales de calcio en astrocitos. Es importante destacar algunos puntos: 1) El patrón de expresión de RyR en astrocitos es contradictorio, pero hay reportes de que se expresan todos los subtipos. 2) El receptor IP3R2 es expresado en células gliales especialmente en astrocitos. 3) La evidencia que apoya la expresión de VOC en astrocitos es contradictoria, pero parece ser que su expresión es especifica de la especie, dependiente de la región del cerebro y de la etapa del desarrollo; la función de estos canales en estas células es la liberación de gliotransmisores. Modificado de 98 Sin embargo, la principal vía de entrada de Ca2+ o una de las mejor caracterizadas es la activación de GPCRs que disparan la cascada de señalización de IP3 que resulta en la elevación robusta de Ca2+ intracelular, principalmente por la activación de IP3R299. Los astrocitos 23 expresan una gran variedad de GPCRs, incluyendo receptores a glutamato, purinas, serotonina, acetilcolina, dopamina y trombina98,100. La liberación de calcio a través de IP3R2 es indispensable para el inicio de las ondas de Ca2+ en el astrocito83. En los astrocitos, la liberación de calcio desde el RE a través de los IP3R2 conlleva a la activación de la SOCE83. La SOCE está ubicuamente expresada en la astroglia. La estimulación de astrocitos in vitro o in situ con agonistas metabotrópicos (tales como el ATP, noradrenalina, histamina, trombina o endotelina) dispara una respuesta de Ca2+ intracelular bifásica con una fase de estabilidad casi completamente dependiente del Ca2+ extracelular; esta dependencia refleja la expresión y funcionalidad de la SOCE101–103; además está bien documentado que la SOCE puede ser inducida en astrocitos en el sistema nervioso central104. De manera similar, diversos estudios han demostrado que el vaciamiento de las reservas de Ca2+ del RE de los astrocitos con bloqueadores de la SERCA disparan la SOCE, 105,106. La SOCE en los astrocitos esta principalmente localizada cerca de los sitios de rellenado de Ca2+ del RE (muy próximo a la SERCA) lo que promueve la restauración de las reservas de Ca2+ de este organelo107. Se ha observado que, en astrocitos hipocampales, la SOCE activada por trombina regula la señalización de Ca2+, la liberación de gliotransmisores y la inhibición tónica mediada por astrocitos de las neuronas piramidales CA1108. En astrocitos corticales, STIM1 en combinación con Orai1 y Orai3 modulan la SOCE105,109. Además la relevancia de la SOCE que se da por la activación del receptor activado por proteasa (PAR) con trombina ha sido demostrada por nuestro grupo105 y otros más100,108,110.Tambien se ha demostrado que la trombina en astrocitos modula la astrogliosis100, la migración111–115, la proliferación celular114, apoptosis112, autofagia116 y liberación de gliotransmisores108. 1.7.1. Migración celular en astrocitos La migración celular es un proceso central durante el desarrollo, la homeostasis y las enfermedades. Es un fenómeno celular fundamental que constituye la base de la morfogénesis, la respuesta inmune y la cicatrización de las heridas117,118,119. Se sabe que los astrocitos llevan a cabo este proceso celular cuando están desempeñando acciones morfológicas normales y en la formación de cicatrices por razones patológicas. Durante el desarrollo, los astrocitos recién diferenciados migran para poder alcanzar su destino final, mientras que los astrocitos en el tejido adulto se encuentran quiescentes bajo condiciones fisiológicas normales120. Sin embargo, cuando ocurren eventos en respuesta al daño cerebral esto involucra la participación de células gliales y, particularmente de los astrocitos. Durante las primeras etapas de una lesión, los axones dañados son expuestos a moléculas inhibitorias que promueven una ligera capacidad regenerativa en el proceso neuronal, pero adicionalmente, los astrocitos sufren cambios morfológicos y moleculares por medio de un proceso llamada gliosis reactiva o astrogliosis, si este proceso es beneficioso o perjudicial es aún controversial, pero es claro que es un proceso crítico en la respuesta de protección inmediata al daño en el sistema nervioso central117,120. Este proceso es disparado por diferentes moléculas derivadas del torrente sanguíneo, las células inflamatorias o liberadas de las células dañadas, tales como la adenosina 24 trifosfato (ATP)121, la endotelina-1122, el factor de necrosis tumoral (TNF)123, y como habíamos comentado anteriormente la trombina100. Por lo que después de daño severo, se da una importante hipertrofia del cuerpo y proceso de los astrocitos, lo que lleva a la migración de estas células al sitio dañado donde incrementan su proliferación120. Para el estudio de este proceso celular se han desarrollado diversos ensayos, entre los que desatacan, el ensayo de la cicatrización de la herida (SWA), la cámara de Boyden, los sistemas basados en microfluidos y el ensayo ECIS (Electric Cell-substrate Impedance Sensing), cada uno con ventajas y desventajas (ver Tabla 3). Debido a la relevancia para este trabajo se comentará con más detalle el ensayo de cicatrización de la herida. Ensayo de cicatrización de la herida Cámara de Boyden Sistema basado en microfluidos ECIS Tipo celular disponibles para su análisis Células adherentes, monocapa es requerida. Células adherentes Células adherentes Células adherentes, monocapa es requerida. Tipo de muestras Población o célula individual Población Primariamente células individuales Población o célula individual Posibilidad de rastrear células individuales Si No Si Si Gradientes No Si Si Posible Tamaño de muestra en un ensayo Una condición por plato de cultivo Hasta 96 condiciones diferentes Una condición por cámara de ensayo Hasta 96 condiciones diferentes Complejidad del experimento Extremadamente fácil Cámaras disponibles comercialmente, fácil. Placas comerciales, fácil Tiempo de incubación antes del ensayo 1-2 días Ninguno Ninguno 1-2 días Tiempo del ensayo Dependiente del tipo celular (promedio 14 horas) Dependiente del tipo celular (promedio 6 horas) Dependiente del tipo celular (promedio 4 horas) Dependiente del tipo celular (promedio 10 horas) Colección de datos y análisis Conteo celular con microscopio, y procesamiento de imágenes con hardware y software Conteo celular con microscopio, y procesamiento de imágenes con hardware y software Rastreo celular individual con microscopio, y procesamiento de imágenes con hardware y software Dispositivos especialmente diseñados y por detección por medio de software Costo del equipo Sin costo extra, barato. Cámaras y filtros de membranas comerciales, poco caro. Instalaciones son requeridas, muy caro. Instrumentos comerciales, caro Tabla 3. Comparación de diferentes ensayos de migración in vitro. Modificado de 124. El ensayo de cicatrización de la herida es un método sencillo y económico para el estudio de la migración in vitro. Este método se basa en observar que bajo la creación de un espacio 25 artificial, también llamada herida, en una monocapa de células confluentes, las células en las orillas del recién creado espacio se mueven hacia el espacio vacío para cerrar la herida hasta que los contactos célula-célula son establecidos nuevamente. Este tipo de ensayos consiste en tres pasos: 1) El daño a la monocapa; 2) El monitoreo del proceso de cicatrización a intervalos regulares; y 3) la adquisición y evaluación de datos para determinar la velocidad de la migración celular124,125. Una de las principales ventajas de este método es que este imita hasta cierto punto la migración de las células in vivo124. Otra de las ventajas es su idoneidad para el estudio de la regulación de la migración celular por la interacción celular con la matriz extracelular y las interacciones célula-célula. Adicionalmente, el ensayo de cicatrización de la herida es compatible con la microscopia incluyendo el seguimiento en tiempo real, lo que permite el análisis de eventos de señalización intracelular durante la migración celular. Y finalmente es probablemente el métodos de estudio de la migración celular in vitro más simple y barato que se puede realizar en laboratorios donde se realice cultivo celular124,125. Sin embargo, también existen algunas desventajas y limitaciones de este método, por ejemplo, para llevarse a cabo estos ensayos son necesarios tiempos relativamente más largos en comparación de otros métodos, también son necesarias grandes cantidades de células y químicos, lo que limita su uso en células especializadas como células troncales o en experimentos donde se utilicen reactivos caros. Aunque a pesar de estas limitaciones este método, este es una gran opción para evaluar la migración celular117,124,125. Este método ha sido ampliamente usado para estudiar la migración en astrocitos126,127,128,129 y se ha observado que este linaje celular lleva a cabo una lenta y polarizada migración en dirección perpendicular a la herida. Las células no se mueven individualmente sino que migran como una fila hacia el otro extremo de la herida y la migración se detiene cuando los dos extremos de la herida se unen130. 26 2. PLANTEAMIENTO Y JUSTIFICACIÓN DEL TRABAJO El estudio de la inactivación dependiente de calcio en el canal Orai1 ha sido intensa durante los últimos años, llegándose a conocer de manera parcial los mecanismos estructurales y mecanísticos de cómo se lleva a cabo este proceso31-35. Sin embargo, este tipo de estudios se han enfocado principalmente en el Ca2+ proveniente del propio canal o el Ca2+ agregado mediante la pipeta de registro (inactivación homóloga dependiente de Ca2+). No obstante, dentro de la célula existen otras fuentes de Ca2+ que podrían contribuir a la CDI, como por ejemplo otros canales de la membrana celular, canales intracelulares, intercambiadores o incluso bombas. Es reconocido que elevaciones de calcio especificas en una pequeña región (microdominios y nanodominios) regulan distintos procesos celulares de manera específica11,12,38, existen algunos reportes donde se observa que elevaciones de Ca2+ dadas por diferentes tipos de canales de calcio regulan el comportamiento de otros canales131,132. Nosotros decidimos investigar si canales cercanos a Orai1 pueden regular la inactivación dependiente de Ca2+ de este canal (inactivación heteróloga dependiente de Ca2+). Además, debido a la relevancia que tiene la SOCE en un gran número de procesos y tipos celulares, proponemos que la regulación de la inactivación dependiente de Ca2+ de Orai1 por parte de otros canales de Ca2+ cercanos regula procesos celulares tales como la migración celular. 3. HIPÓTESIS El Ca2+ que entra al citosol a través de canales TRPV1 cercanos a Orai1 incrementan su inactivación rápida dependiente de calcio, modulando por medio de este mecanismo la migración celular. 4. OBJETIVOS 4.1. Objetivo general Determinar si fuentes de Ca2+ cercanas a Orai1 son capaces de modular la inactivación rápida dependiente de Ca2+ de este canal y de esta manera regular la migración celular. 4.2. Objetivos particulares  Construcción de un sensor de Ca2+ capaz de detectar de manera específica Ca2+ cercano al poro del canal Orai1 (Orai1-GCaMP3).  Caracterizar la correcta localización y funcionamiento del sensor Orai1-GCaMP3.  Evaluar nanodominios cercanos al poro del canal Orai1 con Orai1-GCaMP3.  Evaluar la regulación de la inactivación rápida dependiente de calcio de Orai1 por distintas fuentes de Ca2+ (canales TRPV1 y P2X4).  Determinar la distancia entre los pares de canales Orai1-TRPV1 y Orai1-P2X4.  Determinar la interacción entre los canales Orai1 y TRPV1.  Identificar los dominios de interacción entre los canales Orai1 y TRPV1.  Determinar el papel de la inactivación heteróloga dependiente de Ca2+ de Orai1 por parte de TRPV1 sobre la migración celular. 27 5. MATERIALES Y MÉTODOS 5.1. Reactivos Fura 2-AM (acetoxymethyl ester), fue comprado a Molecular Probes (Oregon, EUA), todas las enzimas de restricción fueron compradas a New England Biolabs (Massachusetts, EUA), la T4 DNA ligasa fue comprada a Promega (Wisconsin, EUA), tapsigargina fue comprada a Calbiochem (Massachusetts, EUA), la sal de citidin trifosfato (CTP) fue adquirida de Affymetrix (California, EUA), la capsaicina y capsazepina fueron adquirida a Sigma-Aldrich (Missouri, EUA). Todos los demás reactivos no mencionados específicamente fueron adquiridos a Sigma-Aldrich (Missouri, EUA) Fuente Número de catálogo Reactivos Fura2-AM Molecular Probes F1221 DNA ligasa Promega M180a Tapsigargina Calbiochem 586005 Citidin trifosfato Affymetrix 14121 Capsaicina Sigma-Aldrich M2028 Capsazepina Sigma-Aldrich C191 DMEM Gibco D5030 Suero fetal bovino Thermo Fisher 26140 Penicilina-estreptomicina Gibco 15140122 Lipofectamina 2000 Invitrogen 11668019 Opti-MEM Thermo Fisher 31985062 Coctel inhibidor de proteasas Roche 11697498001 Poli-L-lisina Sigma-Aldrich P4707 Tripsina Sigma-Aldrich t-4665 Anticuerpos Orai1 Abcam ab59330 VR1 Santa Cruz Biotechnology sc-398417 c-myc Invitrogen MA1-21316 P2X4 Abcam ab134559 GFP Clontech 632376 Tabla 4. Principales reactivos utilizados durante el desarrollo de este trabajo. 5.2. Plásmidos Los plásmidos de Orai1-GFP, GCaMP3, STIM1-DsRed, H2B-mCherry y Lck-GCaMP5 fueron adquiridos a Addgene (Massachusetts, EUA), R-GECO fue donado amablemente por el Dr. Takeharu Nagai de la Universidad de Hokkaido en Japón, los plásmidos de TRPV1- CFP y TRPV1-YFP fueron donados amablemente por el Dr. León Islas de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional Autónoma de México y el plásmido CFP-P2X4 fue donado gentilmente por el Dr. Jorge Arreola de la Universidad Autónoma de San Luis. Mediante técnicas de DNA recombinante se realizó la construcción de la proteína de fusión Orai1-GCaMP3 (OG3), esto a través de PCRs y digestiones con las enzimas de restricción BamHI y EcoRI (Fig. 8) y la ligación con una T4 DNA ligasa. La construcción fue corroborada por secuenciación y por medio de un western-blot. 28 Figura 8. Construcción de la proteína de fusión Orai1-GCaMP3. Mapa del plásmido y representación gráfica de la proteína de fusión Orai1-GCaMP3. Imágenes creadas usando PlasMapper y Biorender, editadas con Adobe Illustrator. 5.3. Cultivo celular y transfección La línea celular HEK-293 (Human Embryonic Kidney 293, por sus siglas en inglés) adquirida a ATCC (Virginia, EUA) fue usada en este estudio como modelo celular. Estas células fueron cultivadas en DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s Medium) (Gibco, Massachusetts, EUA), con 10% SFB (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EUA) y 50 I.U./mL de antibiótico penicilina- 50 µg/mL estreptomicina (Gibco, Massachusetts, EUA). Se mantuvieron a 37 °C, con 5% de CO2 y una humedad relativa de ~85% en una incubadora. Estas células fueron transfectadas con Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Massachusetts, EUA) de acuerdo con el protocolo estándar, el cual para cajas de 35 mm consiste brevemente en el sembrado de células en estas cajas hasta alcanzar una confluencia de aproximadamente entre el 85 y 90% durante el día de la transfección. Una hora antes de la transfección, se les cambiaba el medio de crecimiento DMEM por medio de transfección Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EUA). La mezcla de transfección para una caja de 35 mm fue de 5 µL de Lipofectamina 2000 y 500 ng de cada plásmido de interés, esta mezcla fue agregada para obtener un volumen final de 1 ml en la caja de 35 mm. Se dejó la mezcla de transfección durante 24 horas y se hizo un cambio a medio DMEM. Las células fueron utilizadas para los experimentos 24 o 48 horas después de la transfección. Para transfecciones de cajas con volúmenes más grandes se escalaron los reactivos conservando las proporciones. 29 5.4. Detección de proteínas (Western blot) Los extractos de proteínas obtenidos de células HEK-293 transfectadas con Orai1-GCaMP3 o con Orai1-GFP o extractos protéicos obtenidos de astrocitos, fueron realizados como se describe anteriormente, de manera breve: Las células se lavaron con PBS frío y se homogenizaron con buffer de lisis RIPA (Tris-HCl pH 8.0 50 mM, NaCl 150 Mm, Triton x- 100 1%, deoxicolato de sodio 0.5%, DSS 1% y 2 mg/mL de inhibidores de proteasa -Complete de Roche-). Las proteínas fueron separadas en geles SDS-PAGE (acrilamida 10%), posteriormente se transfirieron a membranas de nylon (Biorad, California, EUA) por medio de una cámara de transferencia húmeda (Biorad, California, EUA) durante 1 hora a 110 v. Después de la transferencia, se bloqueó la membrana con leche libre de grasa al 5% en TBS con 0.5% de Tween durante 2 horas, posteriormente se incubaron las membranas con el anticuerpo primario Orai1 (Abcam, Massachusetts, EUA) o el anticuerpo VR1 (Santa Cruz Biotechnology, California, EUA) durante toda la noche de acuerdo con las concentraciones indicadas por los proveedores. Transcurrido ese tiempo se lavaron las membranas con TBS+Tween 2% (TTBS) durante 1 hora y media. Posteriormente se incubó la membrana con un anticuerpo secundario contra conejo o ratón conjugado con la peroxidasa del rábano picante (HRP) (Millipore, Massachusetts, EUA) durante dos horas con agitación a temperatura ambiente. Para retirar el exceso de anticuerpo secundario se lavaron las membranas con TTBS por hora y media. Se sometieron a las membranas a una reacción química de la HRP para producir quimioluminiscencia (Inmobilon Western, Millipore, Massachusetts, EUA), cuya señal fue detectada por medio de un escáner c-Digit (Li-COR, Nebraska, EUA) o por medio de una placa fotográfica y digitalizados y analizados posteriormente usando el software ImageJ. 5.5. Electrofisiología Células HEK-293 expresando las diferentes construcciones descritas en los pies de figura de las figuras 13 a 16 fueron colocadas en cubreobjetos cubiertos con poli-(L)lisina (Sigma, Missouri, EUA). Las células fueron estudiadas entre 24-48 horas post-transfección. Los cubreobjetos fueron montados en una cámara de perfusión (TIRF labs, Carolina del Norte, EUA). El amplificador de patch clamp utilizado para los registros de célula completa fue el EPC-10 (Heka Electroniks, Lambrecht, Alemania). Las pipetas para el patch clamp fueron preparadas de vidrios Corning 7052 y tenían una resistencia de 1-5 MΩ cuando fueron llenadas con la solución de pipeta. Un electrodo de Ag/AgCl fue utilizado para obtener continuidad eléctrica y fue conectado a la solución de baño por medio de un puente de KCl- agar. La tapsigargina (Calbiochem, Massachusetts, EUA) fue aplicada usando un sistema de perfusión multibarril guiado por gravedad (TIRF Labs, N.C., EUA). Para los estudios de corrientes de célula completa se utilizó patch clamp en su versión perforada, La anfotericina B fue disuelta en 50 µL de DMSO para obtener una solución de stock de 60 mg/mL y fue almacenada a -20 °C hasta su uso. La solución stock de anfotericina fue disuelta para obtener una concentración final de 0.24 mg/mL en una jeringa que contenía 30 la solución de la pipeta, compuesta de la siguiente manera: aspartato de cesio 120 mM, EGTA 5 mM, HEPES 10 mM, MgCl2 2 mM y NaCl 8 mM. El pH fue ajustado a 7.2 con CsOH. La solución del baño contenía: NaCl 120 mM, cloruro de tetrilamonio (TEA-Cl) 10 mM, CaCl2 10 mM, MgCl2 2 mM, glucosa 30 mM y HEPES 10 mM. El pH fue ajustado a 7.2 con NaOH. La osmolaridad de ambas soluciones fue ajustada a 310 mOsm con manitol (Sigma, Missouri, EUA). Para determinar la corriente de inactivación de Orai1, la célula fue primero estimulada con 1 µM de capsaicina o 10 µM de citidin trifosfato (CTP) por aproximadamente un minuto. La solución fue removida y lavada por un minuto con solución de lavado antes de la estimulación con 1 µM de tapsigargina (Fig. 9). La inactivación relativa fue obtenida después de obtener la densidad de corriente relativa para la mutante no activable de Orai1 Y80S (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2741279/). Figura 9. Protocolo de patch clamp de activación secuencial. Cubreobjetos con poblaciones celulares confluentes con los distintos tipos de transfección indicadas en las figuras 13 a la 16, se realizó un protocolo de patch clamp en su versión perforada para obtener mediciones basales de la FCDI de Orai1 en cada una de estas poblaciones celulares. Después se agrego un primer estimulo, tras lo cual se realizó una nueva medición de la FCDI de Orai1. Posteriormente, el primer estimulo fue lavado durante 1 minuto tras lo cual se agrego un segundo estímulo y finalmente se medio el efecto de ese segundo estimulo en la FCDI de Orai1. Imagen creada con Biorender. La densidad de corriente fue obtenida después de dividir la corriente de cada célula por la capacitancia de la célula (medida directamente desde la lectura de salida del amplificador) El amplificador suministró la densidad de corriente en tiempo real calculada por medio del software Patchmaster y de la electrónica EPC10 (Heka Electroniks, Lambrecht, Alemania). Para el estudio de cursos temporales de las corrientes de activación de célula completa de Orai1, la tapsigargina fue aplicada mientras el potencial de membrana fue fijado a -100 mV. Todas las corrientes de célula completa ilustradas en la figura 11 representan la media ± la 31 desviación estándar de al menos 30 células independientes obtenidas de 4 días y transfecciones diferentes. Las corrientes de célula completa de Orai1 fueron importadas a Igor pro v. 7 (Wavematrics, Oregon, EUA) para su análisis y graficado. Las figuras finales fueron creadas con Adobe Illustrator (Adobe Systems, California, EUA). 5.6. Microscopía confocal Células HEK-293 fueron transfectadas con Orai1-GCaMP3, o las combinaciones Orai1- GCaMP3 más H2B-mCherry, Orai1-GCaMP3 más STIM1-DsRed y Orai1-GFP más STIM1- DsRed en cubreobjetos de 25 mm sembrados en cajas de 35 mm. Las células fueron observadas al microscopio en solución de Krebs-Ringer (119mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1mM NaH2PO4, 1.8 mM CaCl2,1.3 mM MgCl2, 20 mM HEPES, 11 mM glucosa, 1 mM EGTA y ajustada a 7.4 de pH). Tapsigargina (TG) 1 µM fue usada para vaciar el Ca2+ del retículo endoplásmico. La adquisición de imágenes para los experimentos de co- localización fue llevada a cabo 12 minutos después del vaciamiento del retículo. GFP, GCaMP3, DsRed y mCherry fueron excitados a 488, 488, 494 y 594 nm, respectivamente. La fluorescencia de emisión fue recolectada a 500-540 nm para GFP y GCaMP3, y 605-650 para DsRed y mCherry. Todas las imágenes fueron capturadas a temperatura ambiente con un objetivo 60x de inmersión en aceite con una apertura numérica de 1.40, todo controlado por el software Fluoview (Olympus, Tokio, Japón) en un microscopio confocal FV10i (Olympus, Tokio Japón). El coeficiente de correlación de Pearson fue calculado con el software Fluoview (Olympus, Tokio, Japón) 5.7. Imagenología de calcio Para medir los incrementos de Ca2+ en poblaciones celulares, se transfectaron células HEK- 293 con Orai1-GCaMP3 o con Orai1-GFP (como control) más STIM1-DsRed y 24 horas después se cargaron los dos tipos de transfección y un grupo de células sin transfectar, con el indicador Fura-2-AM (Molecular Probes, Oregón, EUA) a una concentración final de 2µM, Fura-2 fue incubado por 30 minutos a 25 C. Con las células cargadas, se realizó el protocolo clásico de re- adición de Ca2+ 133,134, brevemente: las células cargadas con Fura-2 se colocaron en una solución Krebs libre de calcio (119mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1mM NaH2PO4, 1.3 mM MgCl2, 20 mM HEPES, 11 mM glucosa, 1 mM EGTA y ajustada a 7.4 de pH), después las células fueron lavadas con la misma solución y fueron expuestas a 1µM de tapsigargina para inducir el vaciamiento de Ca2+ del RE y la activación de Orai1, finalmente para observar la entrada de Ca2+ a través de Orai1se agregó calcio al medio extracelular hasta alcanzar una concentración de 1.8 mM. Las mediciones de calcio poblacionales se realizaron a través de un espectrómetro de luminiscencia Aminco-Bowman (Thermo Electron, Massachusetts, EUA). La excitación dual de la longitud de onda fue de 340 y 380 nm y la emisión fue colectada a 510 nm. El muestreo de la fluorescencia fue llevado a cabo cada 10 segundos durante 1000 segundos. 32 Para las cinéticas de Ca2+ para medir nanodominios de Ca2+ por medio de microscopía de epifluorescencia se transfectaron células con los plásmidos indicados en cada figura usando cubreobjetos de 25 mm en cajas de 35 mm. Las células expresando Orai1-GCaMP3 fueron expuestas a TG (1 µM) para inducir el vaciamiento del RE y la activación de Orai1. Capsaicina (4 µM) fue utilizada para activar de manera selectiva a los canales TRPV1 y citidin trifosfato (CTP, 150 µM) fue utilizado para abrir los canales P2X4 de manera selectiva. Las dinámicas de calcio fueron medidas individualmente (al menos 30 células por cubreobjeto por condición), utilizando un microscopio invertido de campo amplio IX-81 de Olympus (Japón) con un objetivo 60X 1.42 NA de inmersión en aceite, con un sistema de iluminación MT-20, filtros de excitación de 484/25, 550/40, filtros de emisión 520/40, 550/25 y 605/40, usando una cámara EMCCD iXon-897 (Oxford Instruments, Massachusetts, EUA). El muestreo se realizó cada segundo por 300 segundos. Los experimentos fueron analizados con ImageJ (NIH, Maryland, EUA) y graficados y analizados con GraphPad Prism (California, EUA). 5.8. Microscopía de super-resolución Todas las mediciones de imágenes de super-resolución fueron llevadas a cabo en un microscopio invertido Olympus IX-81 configurado para microscopía de reflexión interna total de la fluorescencia (TIRF, por sus siglas en inglés) (cellTIRF Illuminator, Olympus, Tokio, Japón). El ángulo de excitación fue determinado de tal manera que la onda evanescente tuviera una penetración de al menos ~100 nm (Xcellence software v1.2; Olympus Imaging Solution GMBH). Las muestras fueron iluminadas continuamente usando las fuentes de excitación dependiendo del fluoróforo usado. Azul (TRPV1-CFP y CFP-P2X4) y verde (Orai1-GCaMP3 y Orai1-YFP) fueron excitados con láser de estado sólido bombeados ópticamente por diodos de 405 nm y 491 nm respectivamente. El poder máximo del láser estuvo entre 20 a 25 mW, dependiendo de la línea de láser usada. La selección del rayo y modulación de la intensidad del láser fueron controlados por medio del software Xcellence v1.2. Un cubo de laser multibanda fue usado para discriminar las fuentes de luz usadas (LF 405/488/635 A-OMF, Bright Line; Semrock). La fluorescencia fue colectada usando un objetivo de inmersión en aceite Olympus UApo N 100x con apertura numérica de 1.49 con lentes de extra- magnificación 1.6x. Todas las secuencias de imágenes fueron grabadas en un chip (512x512) de una cámara EMCCD (Andor, Ixon 888) a 100 nm por píxel. Las imágenes de sub-difracción fueron derivadas del análisis SRRF (Super Resolution Radial Fluctuation)135. Para cada reconstrucción de super-resolución miles de imágenes en TIRF fueron adquiridas dentro del campo evanescente. Las imágenes fueron colectadas estroboscópicamente, alternando entre las líneas de láser, cada uno con una exposición temporal de 1-5 ms y a 100 Hz. Cada serie de imágenes fue analizada con los plugins NanoJ- core y NanoJ-SRRF de Fiji (ImageJ, NIH, Maryland, EUA)136, considerando bloques temporales de 300 imágenes. Los siguientes parámetros fueron considerados: radio del anillo 0.5, magnificación de la radialidad 5, ejes en el anillo 10; todos los demás parámetros se dejaron con las opciones predeterminadas. Los mapas de radialidad fueron corregidos usando 33 tablas de desviaciones calculadas obtenidas con la herramienta de desviación estimada, considerando un promedio de 300 imágenes. Los mapas de radialidad corregidos fueron finalmente integradas en una imagen de super-resolución por medio de un cálculo de acumulación en el orden de segundos de las autocorrelaciones de las radialidades temporales (para imágenes de super-resolución en células fijas) o por medio del producto de la media pareada de la radialidad temporal (para imágenes de super-resolución para células vivas). Para obtener distancias entre Orai1 y TRPV1 o entre Orai1 y P2X4 durante los experimentos usamos el método de correlación de rastreo de la imagen. Para este propósito, células HEK- 293 fueron transfectadas con una combinación de Orai1-YFP y TRPV1 o la combinación Orai1-YFP y CFP-P2X4, respectivamente. La señal de los fluoroforos individuales fue rastreada durante los experimentos alternando las longitudes de onda, como se describió previamente. Bloques temporales de 300 imágenes fueron analizados. Con la correlación de rastreo de la imagen se realizó un análisis de colocalización de partículas únicas a lo largo de toda su trayectoria, esto basado en la correlación cruzada de las imágenes locales. La precisión de la correlación está limitada al SRRF, el cual en nuestro caso está entre ~40 y 60 nm. Todos estos análisis fueron programados con MATLAB (The MathWorks, Massachusetts, EUA) usando los algoritmos originales descritos por Dupont y colaboradores137. A diferencia del estudio original, el cual rastrea partículas en un espacio de tres dimensiones (3D), nosotros realizamos solo un rastreo en dos dimensiones (2D) de las partículas dentro de la profundidad de la onda evanescente producida por el TIRF (100 nm) lo que provee una alta precisión para la determinación de la localización espacial en 2D de las partículas cuando se compara con la microscopía confocal, la cual en el mejor de los escenarios tiene una resolución en z (profundidad) de alrededor de ~800 nm138,139. 5.9. Mediciones de FRET Para estos experimentos se sembraron células sobre cubreobjetos de 25 mm y se co- transfectaron con TRPV1-CFP y Orai1-YFP. Realizamos mediciones de transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) usando el método de fotoblanqueo del aceptor, utilizando a TRPV1-CFP como donador y a Orai1-YFP como aceptor, como previamente se ha descrito140. Las imágenes para el fotoblanqueamiento del aceptor fueron adquiridas con un microscopio confocal invertido FV1000 de (Olympus, Japón). El fotoblanqueamiento del aceptor fue llevado a cabo exponiendo la región de interés (ROI, region of interest) seleccionada al laser a 50% de su intensidad máxima (la ROI está indicada por un recuadro amarillo en la figura 15) a una longitud de onda de 492 nm. Esta longitud de onda no afecta al donador puesto que la excitación de GFP más allá de los 480 nm es despreciable. El protocolo de fotoblanqueamiento consistió en la excitación continua a 492 nm por un lapso de 4 minutos, durante este tiempo, la fluorescencia de emisión de CFP y YFP fueron monitoreados usando el microscopio confocal. La excitación del fotoblanqueamiento fue alternada con la 34 adquisición de imagen de CFP (460 nm), y YFP (520 nm). Para la adquisición de imágenes se utilizó un objetivo 100x con una apertura numérica de 1.45 (Olympus, Tokio, Japón). La eficiencia de FRET, la cual indica el porcentaje de fotones excitados que contribuyen al FRET, fue calculada midiendo la intensidad de fluorescencia en un ROI, antes y después del fotoblanqueamiento del aceptor (Orai1-YFP), también medimos la fluorescencia del aceptor y del donador en una ROI diferente, es decir una región donde el protocolo de fotoblanqueamiento no fue aplicado, esto es indicado por un círculo amarillo en la figura 15. Esta ROI fue usada para corregir el fotoblanqueamiento que puede ocurrir durante la adquisición que no está relacionado al protocolo de fotoblanqueamiento. La eficiencia de FRET fue calculada con la formula EFRET = (Dpost - Dpre) / Dpost, donde Dpre y Dpost, son la fluorescencia de YFP antes y después del protocolo de fotoblanqueamiento, respectivamente. El valor de EFRET calculado del área que no estuvo sujeta al protocolo de fotoblanqueamiento fue considerado como la línea basal. Estos valores de línea basal fueron indistinguibles del valor de FRET obtenido entre Orai1-YFP y CFP-P2X4. 5.10. Ensayo de co-inmunoprecipitación Se siguió el protocolo de Pankow, et al141 con ligeras modificaciones. De manera breve, se cultivaron células HEK-293 en cajas de cultivo de 100 mm de superficie y se transfectaron con los plásmidos c-myc-Orai1 con TRPV1-YFP o con CFP- P2X4. Las cajas con las células transfectadas fueron lavadas dos veces con PBS frio, después las células fueron lisadas con el buffer de lisis TNI (0.5% Igepal CA-630, 50 mM Tris [pH 7.5], 250 mM NaCl, 1 mM EDTA y una pastilla de Complete ULTRA EDTA-free Protease Inhibitor cocktail) durante 30 minutos con agitación a 4 °C. Posteriormente el lisado fue sometido a ultrasonidos por medio de un sonicador de baño (55 KHz, 5 minutos). Las muestras fueron centrifugadas por 40 minutos (4 °C, 18,000 x g) y el sobrenadante fue incubado toda la noche con las perlas de resina de sefarosa acopladas al anticuerpo c-myc de Invitrogen (Massachusetts, EUA). Los complejos proteínas-perlas fueron recuperados mediante la centrifugación de las perlas (4 °C, 500 x g). Las proteínas unidas fueron eluídas, incubando dos veces con el buffer de elución (0.2 M glicina, pH 2.3/ 0.5% Igepal CA-630) durante 30 minutos a 37 °C, el buffer de elución fue neutralizado con Tris-HCl pH 8.0. Las proteínas fueron analizadas usando western blot usando anticuerpos específicos para c-myc (Invitrogen, Massachusetts, EUA) para Orai1 endógeno y c-my-Orai1 (~50 KDa), VR1 (Santa Cruz Biotechnology, California, EUA) para TRPV1-YFP (~125 kDa) y P2X4 (Abcam, Massachusetts, EUA) para CFP-P2X4, todos los anticuerpos fueron utilizados de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Para Orai1 y TRPV1 endógeno de los astrocitos usamos el siguiente protocolo. Células de entre 5 y 7 cajas Petri de 100 mm con cultivos primarios en monocapa de astrocitos fueron lavados y despegados mecánicamente. Todas las células de las cajas de cultivo fueron concentradas y lisadas en buffer de lisis TNI durante 30 minutos con agitación a 4 °C y posteriormente fueron sonicadas usando un sonicador de baño (55 kHz, 5 minutos). Las 35 muestras fueron centrifugadas durante 40 minutos (4 °C, 500 x g). Las proteínas fueron analizadas por western blot usando los anticuerpos específicos descritos arriba. 5.11. Dominios anquirina fusionados a la GFP Los oligonucleótidos utilizados fueron sintetizados (Integrated DNA Technologies, Iowa, EUA) para generar péptidos que correspondieran a la secuencia de aminoácidos para los seis dominios de anquirina (ANK) del canal TRPV1 de rata (Genbank NM_031982). Los dominios anquirina fueron tomados de 142. Los oligonucleótidos fueron clonados en el plásmido pDrive después de su amplificación por PCR y clonadas en marco de lectura en el 5’ de la GFP. Los péptidos resultantes fueron: ANK1 110..152 (42 aa) RLYDRRSIFDAVAQSNCQELESLLPFLQRSKKRLTDSEFKDPE ANK2 153..199 (46 aa) TGKTCLLKAMLNLHNGQNDTIALLLDVARKTDSLKQFVNASYTDSYY ANK3 200..246 (46 aa) KGQTALHIAIERRNMTLVTLLVENGADVQAAANGDFFKKTKGRPGFY ANK4 247..282 (35 aa) FGELPLSLAACTNQLAIVKFLLQNSWQPADISARDS ANK5 283..331 (48 aa) VGNTVLHALVEVADNTVDNTKFVTSMYNEILILGAKLHPTLKLEEITNR ANK6 332..358 (26 aa) KGLTPLALAASSGKIGVLAYILQREIH Todas seguidas por la secuencia de la EGFP. Todas las proteínas de fusión fueron completamente secuenciadas antes de usarse. Para los estudios de Co-IP el plásmido pcDNA3.1 fue usado, conteniendo cada una de las secuencias de nucleótidos para los seis dominios anquirina individualmente fusionados a la GFP. Estos plásmidos fueron transfectados en células HEK-293 combinadas con el plásmido Orai1. Para los estudios de microarreglos de péptidos, los plásmidos mencionados anteriormente fueron transfectados en células HEK-293 mantenidas en frascos de 500 mL para producir las proteínas de fusión. Las células fueron cosechadas y sonicadas para romper la membrana celular. Los sobrenadantes fueron inmunoprecipitados usando el anticuerpo comercial α-GFP (Clontech, California, EUA). Las alícuotas de los seis dominios anquirina fusionados a la GFP fueron utilizados para los estudios de microarreglos peptídicos con TIRFM como previamente se describieron143. 36 Brevemente, el vidrio de sílice fue recubierto con 0.01 mg/mL de poli-L-lisina. El péptido Orai1- COOH-DsRed fue puesto en “spots” sobre la platina del microarreglo usando una solución del péptido de 500 ng en 50 µL. Aproximadamente 2 µL fueron depositados de manera manual en cada uno de los “spots” usando una micropipeta. Los “spots” se dejaron secando durante 20 minutos a temperatura ambiente antes de iniciar el experimento en el microarreglo de TIRFM. Las platinas del microarreglo fueron montadas en la cámara cerrada del sistema LG-TIRFM (TIRF Labs, N.C., EUA). Una estrategia de PCR similar fue llevada a cabo para producir las proteínas de fusión entre el amino terminal de Orai1 y GFP (NH2-GFP), el carboxilo terminal de Orai1 y GFP (COOH- GFP) y el carboxilo terminal de Orai1 fusionado a la proteína roja fluorescente DsRed (Takara Bio, California, EUA). La producción y purificación de las proteínas fusionadas se hizo de la misma manera que lo descrito arriba. El dominio Orai1-COOH contiene los últimos 38 aminoácidos (200-237) con la secuencia: HKTDRQFQELNELAEFARLQDQLDHRGDHPLTPGSHYA (Genbank: AAH13386.1) Esta secuencia fue seguida por la proteína GFP o la DsRed. El amino terminal de Orai1 contiene los primeros 54 aminoácidos de esta proteína (aminoácidos 1-54): MSLNEHSMQALSWRKLYLSRAKLKASSRTSALLSGFAMVAMVEVQLDADHDYPP (Genbank: AAH13386.1) La secuencia fue seguida por la proteína GFP. La mutante con la deleción de la anquirina 1 de TRPV1 (TRPV1-ΔANK1) fue producida por la amplificación con PCR del cDNA de TRPV1 usando oligonucleótidos que tenían su inicio después del nucleótido 536 (aminoácido 153). 5.12. Microarreglos de péptidos con TIRF Para los estudios de microarreglos de péptidos usando los dominios anquirina fusionados a GFP utilizamos un sistema específicamente desarrollado para este propósito basado en TIRFM143. En nuestro laboratorio hemos documentado ampliamente este sistema144. El sistema consiste en la purificación de los péptidos, en este caso los péptidos fueron el dominio ANK1 (anquirina 1 de TRPV1) o el dominio terminal de Orai1-COOH-DsRed, estos péptidos fueron impresos usando una micropipeta en microarreglos de vidrio convencionales que previamente habían sido cubiertos con 0.01 mg/mL de poli-L-lisina. La cámara del microarreglo cerrada fue bañada con una solución que contenía los dominios ANK fusionados a la GFP a una concentración final de 1 µM. Después de tres minutos de incubación, la cámara 37 fue bañada con solución salina y la señal de fluorescencia fue colectada por un minuto. La excitación se realizó en modo de TIRFM usando el sistema LG-TIRFM (TIRFM basado en una luz guiada) (TIRF Labs, N.C., EUA). La excitación fue alternada entre 405 nm (excitación de la GFP) y 594 nm (excitación de la DsRed). La emisión de la DsRed para evaluar la cantidad de Orai1-COOH-DsRed depositada en cada uno de los pozos. Los pozos de los microarreglos que contenían menos del 80% de la fluorescencia promedio de DsRed fueron descartados por insuficiente cantidad de Orai1-COOH-DsRed había sido depositada en el pozo. Las emisiones de GFP (D505/540m) y DsRed (ET620/60m) fueron colectadas usando un filtro de emisión de una sola banda de alta calidad de Chroma (Chroma Technology Corporation, VT, EUA). Para mayores referencias de esta metodología por favor diríjase a la siguiente referencia 144. 5.13. Ensayo de cicatrización o cierre de la herida Los cultivos primarios de astrocitos corticales fueron aislados de cerebros de rata105. Todos los procedimientos para el mantenimiento de las ratas y el aislamiento de los astrocitos fueron aprobados por el Comité Interno de Cuidado Animal del Instituto de Fisiología Celular de la Universidad Nacional Autónoma de México (Protocolo número LVD102(66)-16). Los cultivos de astrocitos corticales fueron obtenidos de ratas neonatas Wistar de uno o dos días de nacido145,146. El procedimiento de manera breve fue el siguiente: La corteza cerebral de 6 a 8 neonatos fue separada de las meninges y fue puesta en solución Krebs (119mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1mM NaH2PO4, 1.3 mM MgCl2, 1.8 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 11 mM glucosa, 1 mM EGTA y ajustada a 7.4 de pH) y cortada hasta obtener trozos pequeños. El tejido fue disociado con una solución Krebs que contenía tripsina 4800 U/mL, (T-4665, Sigma, EUA) durante 10 minutos. Después las células fueron disociadas mecánicamente pasándolas a través de una membrana de nylon de 80 µM y posteriormente fueron resuspendidas en medio de cultivo BME (Basal Medium Eagle, Gibco, Massachusetts, EUA), suplementado con con 10% SFB (Thermo Fisher Scientific, Missouri, EUA), 2 mM de glutamina (Gibco, Massachusetts, EUA) y 50 I.U./mL de antibiótico penicilina- 50 µg/mL estreptomicina (Gibco, Massachusetts, EUA). Los astrocitos disociados fueron sembrados en cajas Petri de 35 mm e incubados a 37 °C con humedad, 5% de CO2 y después de 2 o 3 semanas en cultivo, los astrocitos fueron usados. Los astrocitos fueron transfectados con las construcciones descritas en cada uno de los pies de figura usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Massachusetts, EUA). Para los experimentos de RNA de interferencia, los astrocitos fueron cultivados hasta tener una confluencia de ~80% en cajas de 35 mm y fueron transfectados con un juego de tres oligonucleótidos de “Stealth” siRNAs para Orai1 (RSS357633, RSS357634, RSS357635) comprados a Invitrogen. Un “Stealth” siRNA “scramble” fue usado como control negativo (Invitrogen, Massachusetts, EUA). La transfección con los siRNA fue realizada en los astrocitos primarios con Lipofectamina 2000 y Opti-MEM de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Massachusetts, EUA). 38 Para el ensayo de cicatrización de la herida seguimos el siguiente protocolo: Cámaras con fondo de vidrio (Thermo Scientific, Massachusetts, EUA) fueron recubiertas con 0.01 mg/mL de poli-L-lisina (Sigma, EUA). Astrocitos corticales confluentes fueron sembrados sobre las cámaras. Una vez confluentes de nuevo, los astrocitos fueron desprovistos de suero durante toda la noche para disminuir su proliferación celular. Una herida sencilla fue realizada con una punta de pipeta de 1 mL en la monocapa del cultivo de astrocitos, después las células fueron lavadas gentilmente tres veces con medio libre de suero. El área de la herida fue marcada con un marcador para su posterior identificación y posicionamiento en el microscopio. Las imágenes de las células fueron realizadas con un objetivo de baja magnificación 10x de un microscopio IX81 (Olympus, Tokio, Japón). Una cámara para microscopio de baja resolución de 5 MP USB (Zoowaysoon) conectada al puerto c del microscopio fue usada para adquirir imágenes individuales del área del cierre de la herida en el tiempo 0 (pre-herida), inmediatamente después el cierre de la herida, 5, 10, 15, 20 y 25 horas después de hacerse la herida. Después de cada adquisición las células fueron regresadas a la incubadora a 37 °C con 5% de CO2. 39 6. RESULTADOS 6.1. Desarrollo y caracterización del sensor Orai1-GCaMP3 Con el objetivo de poder identificar cambios en la concentración de Ca2+ cerca del poro del canal Orai1, diseñamos una proteína de fusión que consiste en el canal Orai1 al que se le fusionó en el carboxilo terminal la proteína GCaMP3 (Orai1-GCaMP3, mapa en Fig. 8). Durante los experimentos llevados a cabo en este trabajo, utilizamos el indicador de calcio rojo fluorescente R-GECO para medir simultáneamente los cambios en el calcio global en el citosol y comparamos estos con los cambios de concentración locales reportados por Orai1- GCaMP3 (OG3), los cuales esperábamos reportaran únicamente los cambios de concentración de Ca2+ cerca del poro de Orai1. Una vez realizada la construcción del sensor Orai1-GCaMP3, decidimos determinar si la proteína de fusión tenía el mismo comportamiento que su contraparte silvestre, empezando con la identificación de la expresión de la proteína de fusión por medio de western blot (Fig. 10b), donde en las células transfectadas con OG3 observamos dos bandas que corresponden a Orai1 silvestre y a nuestro sensor expresado, lo mismo que se observó en nuestro control que se transfectó con Orai1-GFP. Posteriormente se realizó microscopía confocal y como se esperaba se encontró que Orai1-GCaMP3 se expresaba principalmente en la MP, esto de manera similar al canal solo o la construcción Orai1-GFP usados como controles (Fig. 10a). Para determinar la funcionalidad de nuestro sensor se realizó como primera aproximación el protocolo clásico de re-adición de Ca2+, y como esperábamos las células que sobre-expresaban Orai1-GCaMP3 u Orai1-GFP mostraron una SOCE potenciada (Fig. 10c, d) indicando que la funcionalidad de Orai1 es indistinguible de la de Orai1-GFP, esto es demostrado claramente con la medición del área bajo la curva (AUC) de la entrada de Ca2+, pero también es evidente con los incrementos en el pico de fluorescencia de Fura-2 de los mismos datos (Orai1- GCaMP3 -línea verde-, y Orai1-GFP -línea azul-, Fig. 10c). La siguiente aproximación para probar la funcionalidad de nuestro sensor, fue ver su capacidad de crear puntos fluorescentes de manera regular, y nuevamente, como esperábamos, encontramos que Orai1-GCaMP3 era capaz de crear estas estructuras junto con STIM1 cuando los depósitos de Ca2+ interno son vaciados con TG (Fig. 10e), esto fue cuantificado por medio del índice de co-localización de Pearson entre STIM1 y Orai1 que es equiparable al índice de co-localización de nuestro control Orai1-GFP (Fig. 10f, g). Juntos todos estos resultados nos indican que la función de Orai1 no se alteró por la fusión del indicador de calcio GCaMP3. 40 Figura 10. Desarrollo y pruebas del sensor Orai1-GCaMP3. a. Imágenes confocales representativas obtenidas con Orai1-GCaMP3 (verde) y la histona 2B-mCherry como marcador nuclear (rojo) expresadas en células HEK-23. Los paneles de la izquierda son las proyecciones en 3D (ejes X, Y y Z) para ilustrar la localización de Orai1-GCaMP3 en la MP. Barra de escala de 5 µm. b. Análisis de western blot de células HEK-293 expresando Orai1-GCaMP3 y Orai1-GFP. Notar que la banda de 55 KDa corresponde a Orai1 endógeno y la banda de 79 KDa corresponde a Orai1-GCaMP3 y Orai1-GFP. c. Mediciones de Ca2+ de poblaciones celulares, usando HEK-293 que expresaban Orai1-GFP+STIM1-DsRed (azul) u Orai1-GCaMP3+STIM1-DsRed (verde) o midiendo la SOCE endógena (negro). d. Área bajo la curva (AUC) de la fluorescencia obtenida después de la adición de 2mM de Ca2+ (entrada de calcio) con Orai1 endógeno (negro), Orai1-GFP (azul) y Orai1-GCaMP3 (verde). e. Imágenes confocales representativas de la formación de puntos fluorescentes después de la aplicación de tapsigargina en células expresando Orai1- GCaMP3 (verde) y STIM1-DsRed (rojo). Las imágenes muestran un plano ecuatorial y uno cortical. Escala de 5 µm. f. Índice de co-localización (coeficiente de Pearson) para Orai1-GCaMP3+STIM1-DsRed antes y después de la tapsigargina. g. Índice de co-localización (coeficiente de Pearson) para Orai1-GFP+STIM1-DsRed antes y después de la tapsigargina. Todos los datos muestran la media ± la desviación estándar. * p < 0.01. La significancia estadística fue de < 0.05. La estadística se llevó a cabo por una prueba t de Student en GraphPad Prism. 41 . 6.2. Orai1-GCaMP3 detecta incrementos locales de Ca2+ Una vez corroborada la funcionalidad de nuestro sensor, decidimos examinar la capacidad de Orai1- GCaMP3 para detectar los incrementos en la concentración de Ca2+ cuando otros canales que permean calcio son activados; para esto exploramos varios canales y encontramos que OG3 detecta el Ca2+ que proviene del canal TRPV1 (Fig. 11a, b) pero no el Ca2+ proveniente del receptor purinérgico P2X4 (Fig. 11c, d). Como control en ambas condiciones se utilizó el indicador R-GECO como sensor de Ca2+ citosólico, y se puede observar que tanto la activación de TRPV1 como de P2X4 promovieron un aumento en la señal de este indicador de Ca2+, comportamiento que no se replicaba en nuestro sensor que nos permitió diferenciar ambas entradas de Ca2+. Como control adicional se utilizó el sensor de Ca2+ Lck-GCaMP5, el cual es un GECI diseñado para expresarse en la membra plasmática y que detecta el calcio en esta región celular66, de manera interesante encontramos que este indicador de Ca2+ detectó incrementos de Ca2+ inducidos por la activación de los canales P2X4 a diferencia del sensor Oira1-GCaMP3 (Fig. 12a, b). Juntos estos resultados sugieren que, a pesar de que ambas proteínas de fusión (Lck-GCaMP5 y Orai1-GCaMP3) están localizadas en la membrana plasmática, ambas se encuentran contenidas dentro de diferentes microdominios lo cual les confiere una diferente sensibilidad a los incrementos de Ca2+ de distintos tipos de fuentes. Figura 11. Orai1-GCaMP3 detecta los incrementos de Ca2+ de TRPV1, pero no los de P2X4. a. Incrementos de Ca2+ reportados por R-GECO cuando las células fueron expuestas a capsaicina, Orai1-GCaMP3 con capsaicina y Orai1-GCaMP3 con tapsigargina. b. Área bajo la curva (AUC) de la fluorescencia R-GECO con capsaicina (naranja), Orai1-GCaMP3 con capsaicina (azul) y Orai1-GCaMP3 con tapsigargina (verde). c. Incrementos de Ca2+ reportados por R-GECO cuando las células fueron expuestas a CTP, Orai1-GCaMP3 con CTP y Orai1-GCaMP3 con tapsigargina. b. Área bajo la curva (AUC) de la fluorescencia R-GECO con CTP (amarillo), Orai1-GCaMP3 con CTP (azul) y Orai1-GCaMP3 con tapsigargina (verde). Nótese que Orai-GCaMP3 no detecta los incrementos de Ca2+ mientras R-GECO reporta grandes incrementos. Se muestra la media ± el error estándar. **p < 0.01, *p < 0.05. La significancia estadística fue p< 0.05. Se uso ANOVA de una cola. 42 Figura 12. El sensor Lck-GCaMP5 detecta incrementos de Ca2+ inducidos por CTP. a. Mediciones de calcio de poblaciones celulares usando el indicador de calcio dirigido a la MP Lck-GCaMP5 (verde y azul) y el sensor de calcio citosólico R-GECO (magenta y naranja). Lck-GCaMP5 es un GCaMP5 que es dirigido a la membrana plasmática al estar fusionado con los primeros 26 aa de Lck, una tirosina- cinasa de la familia Src que contiene dos dominios de palmitoilación y un dominio de miristoilación. b. Área bajo la curva de las diferentes condiciones mostradas en a. En todos los casos se muestra la media ± la desviación estándar. 6.3. La activación del canal TRPV1 induce la CDI del canal Orai1 Decidimos caracterizar a mayor detalle las interacciones entre Orai1-TRPV1 y Orai1-P2X4 en un intento de identificar los posibles mecanismos moleculares responsables de la detección de Ca2+ diferencial de OG3 cuando TRPV1 y P2X4 son activados. Si Orai1-GCaMP3 puede detectar los incrementos de Ca+ después de la activación de TRPV1, pero no los de P2X4, entonces el calcio que se acumula en la cercanía de Orai1 debería tener un efecto en la CDI de Orai1. Para probar esta hipótesis, desarrollamos un protocolo de patch clamp de activación secuencial para inducir primero la activación de los canales TRPV1 o P2X4 (con sus agonistas específicos capsaicina y CTP respectivamente) seguido por la activación de los canales Orai1 con TG y se midieron las corrientes de célula completa en la modalidad de patch clamp perforado (Fig. 9). Los controles del experimento consistieron en la perfusión con solución extracelular que nos proporcionó la actividad basal de Orai1 y un control para la CDI del mismo canal (Fig. 13a, b). Figura 13. Mediciones de patch perforado en células control HEK-293 expresando Orai1 (WT)-GFP y Stim1-DsRed. a. El protocolo secuencial consistió en la aplicación de la solución extracelular seguida por una segunda aplicación de solución extracelular control (SE) y finalmente tapsigargina. La aplicación de SE fue remplazada por capsaicina o CTP en los siguientes experimentos. b. Acercamiento de los dos últimos pasos del protocolo secuencial en este control. Este control es usado como comparación con la activación Orai1 cuando se abren los canales TRPV1 con capsaicina y P2X4 con CTP en los experimentos posteriores. 43 La activación de TRPV1 con capsaicina (Cap) seguida por la activación de Orai1 con TG resultó en una fuerte CDI (Fig. 14a, b). Este fenómeno no fue observado cuando activamos P2X4 con citidin trifosfato (CTP) seguido por la activación de Orai1 con TG (Fig. 14c, d). Figura 14. La activación de TRPV1 induce una fuerte CDI en Orai1. a. Mediciones de patch perforado usando el protocolo secuencial de pre-estimulación con capsaicina en células transfectadas con Orai1 y TRPV1. El panel de en medio muestra la corriente provocada por TRPV1. El panel de la derecha muestra la subsecuente activación de Orai1 con tapsigargina y su subsecuente inactivación. b. Corriente relativa que ilustra la activación aplicando rampas de voltaje de 0 a -100 mV para células expresando Orai1 y TRPV1 pre-estimuladas con capsaicina (negro), Orai1 solo con tapsigargina (rojo) y células pre-estimuladas con capsaicina incubadas con BAPTA-AM (verde). c. Mediciones de patch perforado usando el protocolo secuencial de pre-estimulación con CTP en células transfectadas con Orai1 y P2X4. El panel de en medio muestra la corriente provocada por P2X4. El panel de la derecha muestra la subsecuente activación de Orai1 con tapsigargina. d. Corriente relativa que ilustra la activación aplicando rampas de voltaje de 0 a -100 mV para células expresando Orai1 y TRPV1 pre-estimuladas con CTP (negro), Orai1 solo con tapsigargina (rojo) y células pre-estimuladas con capsaicina incubadas con BAPTA-AM (verde). Todos los experimentos muestran la media ± la desviación estándar de al menos 20 células. Para demostrar que la rápida caída de la corriente de Orai1 era resultado de la CDI, llevamos a cabo experimentos con una mutante insensible a la CDI (Orai1-Y80W)51. La activación de TRPV1 seguida de la activación de Orai1-Y80W no indujo un aumento en la CDI (Fig. 15a, b). Además, como otro control usamos el quelante rápido de calcio BAPTA dentro de la célula (BAPTA-AM) y confirmamos que la rápida reducción de la corriente de Orai1 después de la activación de TRPV1 era resultado de la CDI (Fig. 14b, d). La CDI observada en Orai1 después de la activación de TRPV1 fue evidente en todos los voltajes explorados (Fig. 15c). 44 Figura 15. La mutante Y80W de Orai1 es insensible a la CDI de Orai1 inducida por TRPV1. a. Mediciones de patch perforado usando el protocolo secuencial en células expresando la mutante natural resistente a la CDI Orai1-Y80W y TRPV1. b. Corriente relativa que ilustra la activación para células expresando Orai1 tipo silvestre (WT) con pre-estimulación con capsaicina (negro) y células expresando Orai1 Y80W con pre-estimulación (rojo) o sin pre-estimulación (verde). b. Corrientes relativas de la mutante Y80W de Orai1 a diferentes voltajes. Las células pre-estimuladas con CTP (circulo negro), con capsaicina (círculo blanco) o células no expuestas a capsaicina, solamente tapsigargina (NT, cuadros blancos). Todos los experimentos muestran la media ± la desviación estándar de al menos 20 células. 6.4. Orai1 se encuentra próximo a TRPV1, pero no a P2X4 Si el Ca2+ que entra por TRPV1 es capaz de inducir una fuerte CDI de Orai1, pero el calcio que entra a través de P2X4 no induce este mecanismo, esto nos sugiere fuertemente que TRPV1 y Orai1 se encuentran cerca uno del otro. Para explorar a nivel de canal único, como el calcio que entra a través de TRPV1 es detectado por nuestra proteína de fusión Orai-GCaMP3, llevamos a cabo estudios de microscopía de super-resolución usando un método de fluctuación (SRRF), nuestros experimentos de super- resolución mostraron canales Orai1, TRPV1 y P2X4 individuales moviéndose libremente en la MP de células vivas (Fig. 16a). La medición de la distancia entre canales individuales Orai1 y TRPV1 fue significativamente menor que la distancia entre los canales Orai1 y P2X4 (Fig. 16b) Las distancias promedio en el transcurso del tiempo obtenidas de cientos de canales individuales mostraron que la distancia entre Orai1 y P2X4 era al menos unas 4 veces más grande comparada a la distancia entre Orai1 y TRPV1, además pudimos observar que estas distancias no se ven afectadas por la apertura de los canales (Fig. 16c). 45 Figura 16 . Microscopía de super-resolución revela que TRPV1 y Orai1 se mueven cerca uno del otro en la membrana plasmática. a. Imágenes de super-resolución de células expresando Orai1 (verde) y P2X4 (magenta) u Orai1 (verde) y TRPV1 (azul). Escala de 60 nm. b. Distancia relativa a través del tiempo para pares de canales en células expresando Orai1-P2X4 y Orai1-TRPV1. c. Distancia relativa de cientos de canales antes y después de su respectivo estímulo. Con ayuda de la microscopía de super-resolución, pudimos detectar incrementos de Ca2+ en canales individuales con Orai1-GCaMP3, estos experimentos mostraron que esta proteína de fusión era capaz de detectar incrementos de Ca2+ cuando se activaban los canales TRPV1, pero no cuando se activaban los canales P2X4 (Fig. 17a, b). Este comportamiento de OG3 para detectar de manera diferencial el Ca2+ que entra al activar TRPV1 o P2X4 fue también observado cuando realizamos mediciones de los cambios promedios en la fluorescencia de docenas (campo de visión completo) de canales individuales de Orai1-GCaMP3 (Fig. 17c, d). 46 Figura 17. Canales unitarios Orai1-GCaMP3 detectan los incrementos de Ca2+ de TRPV1, pero no los de P2X4. a. Imágenes de super-resolución de canal único de células expresando Orai1-GCaMP3 (verde)+ P2X4-CFP (paneles de la izquierda) o TRPV1-CF (paneles de la derecha) antes y después de la estimulación con CTP o capsaicina. Nótese el incremento en la fluorescencia de canales unitarios Orai1-GCaMP3 después de la estimulación con capsaicina, pero no con CTP. Barra de escala de 200 nm. b. Intensidad de fluorescencia en unidades arbitrarias (AUF) reportadas por el sensor Orai1-GCaMP3 bajo los distintos tipos de estimulación. Notar que las células que expresan TRPV1-CFP expuestas a capsaicina tuvieron un incremento en la fluorescencia (trazos azules). La estimulación con capsaicina en células sin TRPV1 (trazos rojos y magentas) o las células expresando TRPV1, pero sin exposición a capsaicina (trazos verdes) no tuvo un incremento en la fluorescencia de OG3. c. Mediciones de fluorescencia de campos de visión enteros (con decenas de canales individuales) a través del tiempo de células expresando el sensor Orai1-GCaMP3 y TRPV1 (línea azul) o P2X4 (línea magenta) estimulando con sus agonistas respectivos. Las líneas muestran la media ± la desviación estándar (punteado). La fluorescencia del sensor Orai1-GCaMP3 incremento únicamente después de la estimulación con capsaicina en células que expresaban TRPV1 d. Área bajo la curva (AUC) para las condiciones de c *p0.01. La significancia fue p0.05. Se utilizó la prueba de t de Student. 6.5. Orai1 se asocia con TRPV1, pero no con P2X4 Los experimentos de super-resolución nos mostraron que los canales TRPV1 se encontraban más cercanos a Orai1 en comparación de los canales P2X4, esto nos hizo preguntarnos si los canales TRPV1 y Orai1 podrían estar interactuando. Para responder esta hipótesis como primer acercamiento realizamos microscopía de FRET por fotoblanqueamiento del aceptor. Como esperábamos nuestros experimentos mostraron que Orai1-YFP (donador) y TRPV1- CFP (aceptor) tienen FRET (Fig. 18a, c). Sin embargo, Orai1-YFP y P2X4-CFP no tenían ninguna eficiencia de FRET (Fig. 18b, c). Estos resultados nos indican que Orai1 y TRPV1 permanecen a una distancia de 10 nm o menos uno del otro y que Orai1 y P2X4 tenían una distancia mayor a esta. 47 Para confirmar estos resultados realizamos experimentos de co-inmunoprecipitación, y usando a Orai1 como cebo, los resultados de estos experimentos presentaron las mismas tendencias que los ensayos de FRET, ya que únicamente encontramos co-inmunoprecipitación entre Orai1 y TRPV1, pero no entre Orai1 y P2X4 (Fig. 18d). Figura 18. TRPV1 se encuentra cercano a Orai1. a. Imágenes confocales representativas de la expresión de Orai1-YFP y TRPV1- CFP antes y después del fotoblaqueamiento. El cuadrado muestra el área fotoblanqueda y el circulo un área control. Se usaron ambas áreas para calcular la eficiencia del FRET. El panel de la derecha muestra la eficiencia de FRET en pseudocolor. Escala de 1 µM. b. Imágenes confocales representativas de la expresión de Orai1-YFP y CFP-P2X4. Los parámetros son iguales al inciso anterior. c. Porcentaje de eficiencia de FRET obtenido de al menos 45 células para cada pareja de fluoroforos. Los datos muestran la media ± la desviación estándar. d. Análisis de co-inmunoprecipitación de células expresando c-myc-Orai1 y TRPV1-YFP o P2X4-CFP. El total indica las proteínas que no fueron retenidas en la columna de afinidad. Los blots son ejemplos de tres experimentos independientes. 6.6. El C-terminal de Orai1 y los dominios de anquirina de TRPV1 son los responsables de su asociación Con el objetivo de identificar las estructuras moleculares responsables de la asociación entre los canales Orai1 y TRPV1, llevamos a cabo un amplio tamizaje usando microarreglos peptídicos con una plataforma que anteriormente se desarrolló y probó en el laboratorio144. Estudios previos han resaltado el papel de los dominios anquirina de TRPV1 en la asociación con proteínas reguladoras y de andamiaje147. Para evaluar el papel de cada uno de los dominios de anquirina de TRPV1 produjimos proteínas de fusión de cada uno de los dominios con la proteína verde fluorescente (GFP) y llevamos a cabo estudios de co-inmunoprecipitación usando nuevamente a Orai1 como cebo. Nuestros análisis de co-inmunoprecipitación 48 revelaron que los primeros cuatro dominios de anquirina se asocian a Orai1. Sin embargo, fue el primer dominio de anquirina (ANK1) el que mostró la interacción más fuerte (Fig. 19a). Para determinar qué secuencia de Orai1 era la responsable de la asociación con ANK1 de TRPV1, realizamos proteínas de fusión entre el amino terminal de Orai1 con GFP (Orai1- NH2-GFP) y el carboxilo terminal de Orai1 con GFP (Orai1-COOH-GFP). Los estudios de microarreglos de péptidos usando como cebo a ANK1, dejaron ver que la interacción más fuerte se da entre el dominio ANK1 y Orai1-COOH-GFP (Fig. 19b). Para corroborar nuestros resultados, decidimos hacer estudios de microarreglos usando a Orai1-COOH como cebo, para asegurarnos que la cantidad de Orai1-COOH depositada en cada pozo era la misma, produjimos una proteína de fusión del C-terminal de Orai1 unida a la proteína roja fluorescente DsRed (Orai1-COOH-DsRed), usando esta construcción podíamos simultáneamente determinar la cantidad de Orai1-COOH depositada en cada pozo del microarreglo (usando el canal de fluorescencia rojo) y la unión de los 6 dominios de ANK fusionados a GFP (usando el canal de fluorescencia verde). Tal como esperábamos, observamos resultados similares a la co-IP, Orai1-COOH-DsRed interactuó con los primeros 4 dominios de anquirina de TRPV1, pero con una interacción más fuerte con ANK1 (Fig. 19c). Debajo de las tiras del microarreglo de los seis dominios de anquirina se muestran ejemplos del Orai1-COOH-DsRed depositado en cada condición (Fig. 19c, panel inferior). Figura 19. El primer dominio anquirina de TRPV1 se asocia al C-terminal de Orai1 para favorecer la agrupación de TRPV1-Orai1. a. Análisis de co-inmunoprecipitación de células expresando c-myc-Orai1 y los 6 dominios anquirina unidos a GFP (ANK1-ANK6). b. Esquema que muestra la fusión de los N y C-terminales de Orai1 a GFP. El panel inferior muestra los resultados de los microarreglos de péptidos usando ANK1 como señuelo. Únicamente el C-terminal de Orai1 fue capturado por el dominio anquirina-1 c. Microarreglo de péptidos usando los 6 dominios anquirina individualmente fusionados a GFP. Se usó como cebo a Orai1 C-terminal. Nótese que el C-terminal de Orai1 retuvo a los primeros dos dominios de anquirina, de manera menos eficiente a ANK3 y ANK4 y no retuvo a ANK5 y ANK6. 49 Para explorar el papel de los dominios de anquirina de la proteína TRPV1 completa, produjimos deleciones individuales de los primeros tres dominios, desafortunadamente, solo la deleción del primer dominio produjo canales que alcanzaron la MP, la deleción de más allá del primer dominio de anquirina resultó en canales que se retuvieron en los compartimentos intracelulares. A pesar de esto, se logró estudiar el papel del primer dominio de anquirina de TRPV1 en la CDI de Orai1 usando la mutante TRPV1-ΔANK1 que carece del primer dominio de anquirina. Nuestro análisis de imágenes de super-resolución mostró que la distancia relativa entre TRPV1-ΔANK1 y Orai1 es mayor que la distancia entre TRPV1 tipo silvestre (TRPV1-WT) y Orai1 (Fig. 20a-c). De manera muy interesante, OG3 solo detectó de manera parcial los cambios en la concentración de Ca2+ cuando TRPV1-ΔANK1 era activado con capsaicina en comparación con TRPV1-WT (Fig. 20d). Figura 20. La deleción del dominio ANK1 aumenta la distancia entre Orai1 y TRPV1. a. Imágenes de microscopía de super- resolución de células expresando TRPV1 tipo silvestre (TRPV1-WT, azul) más Orai1 (verde) o TRPV1-ΔANK1 (panel derecho, b. Los circulos rojos muentran las distancia entre los pares de canales mas cercanos y la linea conecta los pares. c. Distancia media relativa obtenida de cientos de canales individuales de Orai1 con TRPV1-WT (azul) o TRPV1-ΔANK1 (rojo). Los datos muestran la media ± la desviación estándar. d. Los incrementos de la fluorescencia reportados por el sensor Orai1-GCaMP3 con o sin la estimulación de capsaicina. Nótese que la fluorescencia Orai1-GCaMP3 incrementa solo la mitad después de la aplicación de la capsaicina en células que expresan TRPV1-ΔANK1 en comparación a células estimuladas con capsaicina y que expresan TRPV1- WT. Esto indica que la deleción del primer dominio de anquirina de TRPV1 resultó en el alejamiento de TRPV1 y Orai1-GCaMP3, por lo que este reporta menos del calcio que entra por el canal TRPV1. *p < 0.01. La significancia estadística fue de p < 0.05. La estadística fue realizada con una ANOVA con prueba de Tukey post-hoc. 50 La activación de TRPV1 y TRPV1-ΔANK1 con capsaicina resultó en un incremento robusto en el calcio intracelular reportado por R-GECO que se encuentra soluble en el citosol (Fig. 21a). Con esto descartamos la posibilidad de que la reducción del Ca2+ detectado por OG3 que entra por TRPV1-ΔANK1 (Fig. 20d) sea el resultado de una reducción del calcio que entra por TRPV1 debido a la deleción del dominio ANK1. La activación de TRPV1- ΔANK1 usando nuestro protocolo de patch-clamp de activación secuencial mostró una reducción en la CDI del canal Orai1 (Fig. 21b, flechas verdes) comparada a la fuerte CDI producida por el Ca2+ de TRPV1-WT en Orai1 (Fig. 14a). Figura 21. La deleción de ANK1 no afecta la entrada de Ca2+ por TRPV1 y disminuye su efecto sobre la CDI de Orai1. a. Mediciones de Ca2+ usando el sensor de Ca2+ citosólico R-GECO en células HEK-293 transfectadas con TRPV1-WT (trazos rojos) o TRPV1-ΔANK1 (trazos negros) y R-GECO. Las células sin tranfectar no respondieron a capsaicina (trazos color cian). Nótese que no hubo cambios significativos en las entradas de calcio de TRPV1-WT y TRPV1-ΔANK1. En todos los casos los datos muestran la media ± la desviación estándar de al menos 5 transfecciones independientes. b. Medición de corrientes con patch perforado usando el protocolo secuencial de pre-estimulación con capsaicina usado en la figura 12 en células transfectadas con Orai1 y TRPV1-ΔANK1 o TRPV1- WT. Nótese la reducción en el efecto sobre la CDI de Orai1 (flechas verdes) de TRPV1- ΔANK1. 6.7. La CDI de Orai1 inducida por la activación de TRPV1 modula la migración celular de astrocitos corticales. Para facilitar el estudio de las interacciones entre TRPV1 y Orai1, y para la identificación de los dominios proteicos involucrados en esta asociación, llevamos a cabo todos los experimentos descritos hasta este punto en células HEK-293. Sin embargo, con el objetivo de evaluar el efecto de la CDI inducida por TRPV1 en los canales Orai1 en un modelo fisiológico, implementamos un ensayo de cicatrización de la herida (SWA) usando un cultivo primario de astrocitos corticales. Previamente nuestro laboratorio demostró que la entrada de Ca2+ activada por trombina (Thr) es principalmente compuesta por los canales Orai1105. Además, como previamente se mencionó, se ha demostrado que la trombina tiene un papel relevante en la migración y curación de heridas en astrocitos115,148–150. 51 Para llevar a cabo los experimentos de SWA primero validamos que nuestro sensor Orai1- GCaMP3 se comportara en los astrocitos de manera similar a lo observado en HEK-293. En efecto, los cultivos primarios de astrocitos que expresaban nuestro sensor respondían a la estimulación de TRPV1 con capsaicina, pero no a la activación de los receptores purinérgicos P2X4 activados con CTP (Fig. 22). También, como esperábamos, los astrocitos respondieron de manera normal a CTP con un incremento robusto al medir el Ca2+ intracelular con el indicador de Ca2+ citosólico R-GECO (Fig. 22a, trazo magenta). OG3 también detectó los incrementos de calcio inducidos por TG. Todos estos resultados recapitulan lo observado en las células HEK-293 (Fig. 11). Utilizando nuestro protocolo de patch-clamp secuencial, observamos que la capsaicina induce una robusta CDI de Orai1 en astrocitos corticales pero que la estimulación con CTP no induce CDI (Fig. 22b). Además observamos que el uso de BAPTA hizo que se perdiera el efecto del Ca2+ proveniente de TRPV1 en la CDI de Orai1 (Fig. 22c). Finalmente, observamos también que la transfección del primer dominio de anquirina (ANK1-GFP) en los astrocitos reduce la potencia de la CDI obtenida con la pre-estimulación con capcaicina (Fig. 22d). Figura 22. El Ca2+ que entra por TRPV1 induce CDI en Orai1 en astrocitos corticales. a. Mediciones de Ca2+obtenidas en cultivos primarios de astrocitos corticales transfectados con Orai1-GCaMP3. TRPV1 y P2X4 endógenos fueron usados. OG3 detecta los incrementos de Ca2+ evocados por capsaicina (500 nM, azul) y tapsigargina (1 µM, cian), pero no por CTP (negro). CTP estimuló incrementos de Ca2+ en el citosol que fueron reportados por R-GECO (magenta). Los datos muestran la media ± la desviación estándar de al menos 10 mediciones independientes obtenidas de 5 cultivos diferentes. b.La estimulación con capsaicina (500 nM) antes de la activacion de Orai1 con trombina indujó una potente CDI. La estimulación con CTP indujo fuertes corrientes de P2X4, sin embargo no tuvo efecto en la CDI de Orai1 (activada por trombina). c. Medición de corrientes con patch perforado evocadas por una rampa de voltaje desde 0 a -100 mV en respuesta a capsaicina seguida por trombina (trazos negros), trombina solamente (trazos magenta) y capsaicina mas trombina en celulas incubadas con BAPTA-AM (cian). La incubacion con BAPTA reduce enormemente la CDI en celulas estimuladas con capsaicina más trombina. La capsaicina fue incubada por tres minutos y despues 52 las células fueron lavadas con PBS fresco por tres minutos antes de la estimulación con trombina. d. Medición de corrientes con patch perforado evocadas por una rampa de voltaje desde 0 a -100 mV en respuesta a capsaicina más trombina en astrocitos usando el TRPV1 endógeno (trazos negros), astrocitos expresando el dominio ANK1-GFP (trazos cian) y células incubadas con BAPTA-AM (trazos magenta). Nótese que la transfeccion con ANK1-GFP disminuyó el efecto del calcio entrante por TRPV1 en la CDI de Orai1. Usando el modelo de SWA, encontramos que el Orai1 endógeno participa en la migración celular y curación de la herida inducida por trombina de los astrocitos corticales, esto es corroborado con la transfección de los astrocitos con un siRNA para Orai1, el cual previno los efectos de la trombina en la cicatrización de la herida (Fig. 23c). La estimulación con capsaicina antes de la activación de Orai1 con trombina reduce significativamente la cicatrización de la herida (Fig. 23a, b trazo negro), este efecto no fue observado con el antagonista sintético de la capsaicina, capsazepina (Fig. 23c, trazo cian). Observamos también que la expresión de ANK1-GFP en los astrocitos corticales previene parcialmente el efecto de la capsaicina en la cicatrización de la herida (Fig. 23a, b, trazo azul). Todos estos resultados sugieren fuertemente que la activación de canales TRPV1 endógenos en los astrocitos corticales modula la actividad de los canales Orai1 endógenos induciendo su CDI y por lo tanto reduciendo la entrada de Ca2+ a través de estos canales. La CDI de Orai1 potenciada reduce la migración celular y la cicatrización de la herida en astrocitos. Figura 23. La inducción de la CDI de Orai1 por TPV1 modula la cicatrización de la herida en astrocitos. a. Ensayo de la cicatrización de la herida en astrocitos corticales. Imágenes representativas de los cultivos celulares alrededor del área donde se efectuó la herida son mostradas por 10 y 25 horas después de la realización de la herida. La etiqueta medio representa células que fueron mantenidas en DMEM. Trombina indica células tratadas con trombina (5 U mL-1) por tres minutos. Los cultivos celulares fueron expuestos a capsaicina (500 nM) por tres minutos y después fueron incubados con trombina (5 U mL-1) por tres minutos. b. Porcentaje de confluencia en el área de cicatrización bajo las diferentes condiciones usadas en a. Las células también fueron transfectadas con ANK-1-GFP (puntos azules) c. Porcentaje de confluencia celular de controles usados en estos experimentos. Nótese que el antagonista de capsaicina (capsazepina) no tuvo efecto en la cicatrización de la herida inducida por trombina. Los astrocitos transfectados con un siRNA para Orai1 previnieron el efecto de la cicatrización de la herida inducida por trombina. Los datos en b y c muestran la media ± la desviación estándar de al menos 6 células de 3 diferentes transfecciones. * muestra valores de p de 0.01. La significancia estadística es de p0.05 de acuerdo con ANOVA. 53 7. DISCUSIÓN La inactivación dependiente de Ca2+ es un proceso de retroalimentación negativa que previene la entrada excesiva del calcio por medio de los canales Orai1, lo que evita efectos citotóxicos en la célula. La CDI de Orai1 es un regulador clave y una de las características más importantes de la SOCE. Comparando el conocimiento que se tiene de la activación de esta entrada de calcio con el conocimiento que se tiene de los mecanismos inherentes a la CDI, estos últimos mecanismos son mucho menos conocidos y permanecen aún poco claros. En nuestro estudio, hemos identificado los determinantes moleculares de la asociación entre los canales Orai1 y TRPV1, esta asociación favorece la inactivación dependiente de Ca2+ de Orai1 por el Ca2+ que entra a través de los canales TRPV1. Mediante el uso de estudios de microscopía de super-resolución en células vivas, fuimos capaces de observar que ambos canales se mueven asociados en la MP, esta interacción física resulta clave para la modulación fisiológica de la actividad del canal, ya que TRPV1 contribuye a la CDI de Orai1. Este comportamiento no fue observado con otro canal que no está asociado a Orai1, el receptor purinérgico P2X4, aun cuando la activación del canal resultó en un incremento robusto en el calcio citosólico lo cual fue reportado por nuestro sensor que estaba soluble en el citosol, R- GECO (Figs. 11 y 12). Hasta ahora la CDI había sido estudiada usando mediciones electrofisiológicas de corriente de célula completa causadas por los canales Orai151,151,152. Para inducir la CDI bajo estas circunstancias, las condiciones de calcio extracelular e intracelular son controladas artificialmente. Hasta donde hemos podido investigar, este es el primer reporte donde se muestra que una fuente fisiológica de Ca2+ distinta al propio canal (la activación de los canales TRPV1) puede inducir CDI en Orai1 tanto en un sistema de expresión heteróloga (células HEK-293) como en células que expresan naturalmente estos canales (astrocitos corticales). Mostramos que la inducción de la inactivación dependiente de calcio de Orai1 es el resultado de la estrecha cercanía entre los canales Orai1 y TRPV1 en la membrana plasmática, fenómeno que no fue observado con la activación de un canal diferente que no se encuentra cerca de Orai1 (P2X4). Estas observaciones son apoyadas por nuestros estudios de super- resolución, donde se observa que los canales Orai1 y TRPV1 se mueven cerca uno del otro, pero esto no se observa con los canales Orai1 y P2X4. El uso de nuestro sensor de calcio local Orai1-GCaMP3 en los estudios de super-resolución nos permitió detectar incrementos de Ca2+ en canales Orai1 individuales cuando se activan los canales TRPV1 mientras están difundidos libremente en la MP. Nuestro sensor OG3 no detectó los incrementos en la concentración de calcio después de la activación de P2X4. Estos resultados indican que Orai1 y TRPV1 se mueven cerca uno del otro, manteniendo un microambiente donde el Ca2+ que entra por medio de TRPV1 se acumula cerca de Orai1 y esto promueve la inactivación dependiente de Ca2+ de Orai1. El uso de fusiones entre Orai1 y un GECI también ha sido usado por otro grupo de investigación que demostró que estas fusiones (Orai1-GECO, Orai1-GCaMP6) reportan de manera selectiva y directa la actividad del canal Orai1153. Otros canales de calcio también han sido estudiados con una aproximación similar, por ejemplo los canales P2X2 154, Cav2.2155, 54 TRPC4156 y TRPV4157, donde en cada uno de estos trabajos se demostró que este tipo de construcciones son capaces de medir nanodominios de calcio cerca del poro de cada uno de estos canales, lo cual podría apoyar la idea de que Orai1 y TRPV1 están formando un nanodominio. Los análisis de super-resolución mostraron una distancia al menos 4 veces mayor entre P2X4 y Orai1 comparada con la distancia entre TRPV1 y Orai1(Fig. 16c). La distancia promedio entre los canales TRPV1 y Orai1 obtenida de los experimentos de super-resolución fue alrededor de 60 nm. Esta distancia contrasta con lo que observamos con nuestros estudios de FRET, ya que las distancias que son determinadas típicamente con esta técnica son debajo de 10 nm. La discrepancia entre estos dos resultados puede ser explicada por los límites de resolución que se pueden lograr por ambos métodos. Mientras el FRET detecta distancias entre proteínas menores a 10 nm (100 Å), nuestro método de super-resolución, aun cuando sobrepasa los límites de difracción de la luz, está aún lejos de la resolución del FRET. Por ejemplo, se ha observado que en el STED (stimulated emission depletion), otra técnica de super-resolución, la resolución de las imágenes que se logran cuando se usan tinciones orgánicas es de 20 nm, pero que cuando se usan proteínas fluorescentes es de 50-70 nm158. Otra explicación es que una distancia de separación mayor de 10 nm no puede ser medida por FRET, pero esta ausencia de la señal de FRET no puede ser interpretada como la ausencia de interacción molecular159. Por esta razón se realizó un abordaje bioquímico para corroborar lo encontrado a través de estas técnicas de microscopia. La asociación entre los canales Orai1 y TRPV1 también fue evaluada con estudios de CoIP, aunque todos los estudios de CoIP obtenidos durante este trabajo están en concordancia con los resultados de super-resolución y FRET, observamos y resaltamos que el peso molecular obtenido de Orai1 (50 kDa) difiere del peso molecular predicho de esta proteína (33 kDa), por lo que debemos tomar estos estudios con precaución, aunque también debemos aclarar que hay muchos otros reportes que han mostrado discrepancias similares en el peso molecular de Orai1160–167. La explicación dada para este peso molecular observado es que esto se debe a modificaciones postransduccionales tales como la glicosilación, la fosforilación o alguna de otro tipo32,164,168,169. Identificamos en este estudio que el primer dominio de anquirina de TRPV1 funciona como una estructura responsable para la asociación de TRPV1 con el C-terminal de Orai1. La deleción de este dominio de anquirina (TRPV1-ΔANK1) disminuye el efecto en la CDI de Orai1 mediada por el Ca2+ entrante por TRPV1 (Fig. 21b); y los canales Orai1-GCaMP3 unitarios no detectaron el Ca2+ que entra por medio de TRPV1-ΔANK1 (Fig. 20d). Estos resultados resaltan la importancia de ANK1 para la asociación de TRPV1 con Orai1. Esta interacción brinda apoyo a la formación de un complejo entre TRPV1 y Orai1, por lo que entonces este dominio ANK1 permite a los dos canales estar en cercanía. La asociación entre estos dos canales favorece la generación de un microambiente de Ca2+ (nanodominio) cerca del poro del canal Orai1 cuando TRPV1 es activado, lo cual promueve la CDI de Orai1. La potente CDI observada en los canales Orai1 inducida por la activación de 55 los canales TRPV1 permanece aún después de que TRPV1 ya no se encuentra activo o que este está desensibilizado170,171 (Fig. 14a, b). Estos resultados sugieren que el Ca2+ que entra a través de TRPV1 dispara los pasos iniciales de la FCDI en los canales Orai1, pero un mecanismo sostenido mantiene la CDI aun cuando la entrada de Ca2+ a través de TRPV1 ya no se encuentra activa (por el lavado de la capsaicina). El mantenimiento continuo de la CDI puede ser explicado por el hecho de que la FCDI esta modulada tanto por las altas concentraciones de Ca2+ dentro del poro de Orai1 como por las por interacciones entre las proteínas que componen la SOCE. Por ejemplo, las interacciones entre Orai1 y STIM1 pueden ser moduladas por el cociente de expresión STIM1-Orai135,55, por la región de aminoácidos negativamente cargados en STIM151,151,172, por el bucle intracelular de Orai149, por una serie de aminoácidos de Orai131,50, por el amino terminal de Orai153,54 y por el sitio de unión a calmodulina de Orai137. De manera interesante, un estudio reciente identificó al ácido benzóico 4-((5-phenyl-4-(trifluoromethyl)-thiazol-2-yl)amino) (IA65) como un potenciador de la actividad de Orai1, que ayuda a modular la CDI de Orai1, pero que no tiene efecto en Orai3; esta especificidad de IA65 se puede explicar debido a la importancia del N-terminal de Orai1 en la CDI, ya que esta región en Orai3 es más extensa y tiene algunas deleciones en comparación de Orai1173, esto nos habla de la importancia de los sitios que interaccionan para producir la FCDI. Por ejemplo, otro estudio reciente demostró IDSTIM (el dominio de inactivación de STIM1) ayuda a mantener la inactivación manteniendo una conformación inactiva de STIM1172. También por otro lado se sabe que TRPV1 tiene un mecanismo de desensibilización dependiente de Ca2+ en la que está involucrada la calmodulina que se une al N-terminal de TRPV1174, se sabe que la calmodulina también interacciona con Orai137, por lo que estas tres proteínas podrían estar en una proximidad tal que promovieran la regulación de ambos canales por la calmodulina. Otra posible explicación se da con un estudio donde se observó que la PKA fosforila de manera directa en la serina-34 de Orai1 para inducir la CDI152, por lo que es posible que la PKA sea reclutada en el nanodominio de Orai1-TRPV1 y fosforile a este último, promoviendo y manteniendo la CDI de Orai1. Un estudio previo mostró hace ya 20 años que la capsaicina inhibe la activación de las células T (Jurkat) por el bloqueo de la SOCE175. Otros estudios un poco más recientes también mostraron que la capsaicina o la activación de TRPV1 inhibe la SOCE176–179. Sin embargo, el mecanismo molecular para estas observaciones permanecía desconocido hasta ahora. En este estudio, enfocamos nuestra atención en el papel del Ca2+ proveniente de un canal de Ca2+ distinto a Orai1 (TRPV1) en la inducción de CDI de este mismo canal, a este fenómeno lo denominamos aquí como inactivación heteróloga dependiente de Ca2+, como un opuesto a la inactivación homóloga dependiente de Ca2+, la cual se induce por el Ca2+ que entra a través del poro del mismo canal. Identificamos al dominio anquirina-1 de TRPV1 y al carboxilo terminal de Orai1 como secuencias requeridas para la asociación entre estos dos canales. Sin embargo, no podemos descartar la participación de otras proteínas o aminoácidos como se mencionó previamente. Por lo que más estudios son necesarios para evaluar la participación de otras proteínas y/o aminoácidos de Orai1 y TRPV1 en la CDI de Orai1. Muchas células y tejidos expresan tanto canales Orai1 como TRPV1178,180,181, en particular como se describió previamente los astrocitos expresan ambos canales98,108,182. En estas células, 56 la activación de TRPV1 podría modular la activación subsecuente (o concomitante) de los canales Orai1183. En este trabajo demostramos que la activación con capsaicina de canales TRPV1 endógenos induce la CDI de los canales Orai1 endógenos de los astrocitos corticales (Fig. 19c). También mostramos que la modulación heteróloga de la FCDI de Orai1 por TRPV1 tiene un papel en el control de la migración de los astrocitos promovida por daño celular (Fig. 20). Como se explicó previamente, la migración es una de las funciones moduladas por la SOCE activada por trombina en astrocitos111–115, pero por otro lado se sabe que la entrada de Ca2+ a través TRPV1 también puede mediar la migración celular de los astrocitos después de daño mecanico126 y de la privación de glucosa y oxígeno184, aunque el mecanismo por el cual se activan los canales TRPV1 no es claro aún, un par de las posibles explicaciones son, primero, que este tipo de canales se activan por estrés mecánico185 (en el caso del daño celular) o por factores proinflamatorios como ocurre en la microglía186. Se sabe que la entrada excesiva de Ca2+ en los astrocitos puede causar estrés del RE y la activación excesiva de este linaje celular convirtiéndose en astrocitos reactivos, lo que pueden llevar a la neurodegeneración por la liberación de especies reactivas de oxígeno, especies reactivas de nitrógeno y de factores proinflamatorios187. Por lo anterior, es posible que la activación de ambos canales no se pueda dar al mismo tiempo, a pesar de que los dos lleven a la migración celular. Es importante destacar que el Ca2+ es un importante modulador de la reorganización del citoesqueleto y la migración en múltiples tipos celulares, pero que la señalización de Ca2+ regula la migración en diferentes aspectos: la rotación de las adhesiones focales, las contracciones de fibras actina-miosina, la ondulación de la membrana plasmática y la formación de podosomas188. Por lo que la forma en que se promueve la migración en astrocitos por parte de Orai1 y TRPV1 es distinta. En el caso de Orai1, reportes previos indican que se da por la rotación de las adhesiones focales a través de NFAT y la cinasa de adhesiones focales (FAK)189–191. A pesar de que en TRPV1, el mecanismo aún no está muy claro, se ha observado que esto se podría dar por un aumento en la polimerización de G-actina a F-actina184. También es importante señalar que en otros tipos celulares diversos estudios han mostrado efectos ambiguos en el efecto de la entrada de Ca2+ por TRPV1 en la migración celular192. Todo lo anterior sugiere que la inactivación heteróloga dependiente de Ca2+ que propone este trabajo es un mecanismo que protege al astrocito de la entrada excesiva de Ca2+ y de sus efectos negativos. Por otro lado, el nanodominio de Ca2+ entre Orai1 y TRPV1 detectado en este trabajo y el efecto funcional que tiene el Ca2+ de TRPV1 en la CDI de Orai1, puede ser apoyado por la existencia de otros nanodominios formados por dos canales o canales y proteínas sensoras de Ca2+. En un estudio se demostró que la activación de los canales de K+ activados por Ca2+ (KCa2+: BK y SK2) son regulados por la entrada de Ca2+ que se da a través del canal Cav2.1 y que estos canales KCa2+ forman nanodominios con Cav2.1193. Otro estudio mostró que los canales Cav3.2 y KCa3.1, colocalizan y se asocian proporcionando un mecanismo de regulación dependiente de Ca2+ a nivel de nanodominio194. En otra publicación se expuso un nanodominio formado por Orai1, AKAP79, calcineurina y NFAT, el cual permite una mejor comunicación entre Orai1 y calcineurina que a su vez permite la activación selectiva de NFAT195. En el caso de los astrocitos un estudio demostró la existencia de un nanodominio 57 de Ca2+, donde la activación de los canales aniónicos rectificadores salientes sensibles a volumen (VSOR) depende del Ca2+ que ingresa por los canales SOCE196. De manera interesante en una publicación reciente se encontró que en neuronas somatosensoriales periféricas existe un complejo formado por ANO1 (canal de Cl- activado por Ca2+), TRPV1 e IP3R1, este estudio encontró que estas proteínas se encuentran a una gran cercanía, esto con el fin de asegurar que el Ca2+ entrante a través de TRPV1 proporcione suficiente concentración de Ca2+ para activar a PLC, y que esta lleve a la activación de IP3R, liberando Ca2+ de las reservas del RE para maximizar la activación de ANO1, lo que lleva a la salida de Cl- y despolarización de la neurona197. Es interesante que nuestro laboratorio demostró que IP3R se encuentra directamente asociado a STIM1 en la puncta198, otros estudios apoyan esta asociación199,200. Esto apuntala la idea de un complejo de proteínas que regulan la SOCE, donde TRPV1 podría tener también un papel destacado. Todos los resultados aquí presentados proporcionan la primera evidencia (hasta donde tenemos conocimiento) que destaca el papel de la inactivación heteróloga dependiente de Ca2+ en modular la entrada de Ca2+ de Orai1 y como esto modula la migración de astrocitos corticales, lo cual se resume en la figura 24. Figura 24. Mecanismo propuesto para el efecto de la inactivación heteróloga dependiente de Ca2+ en la migración celular. Los canales TRPV1 y Orai1 forman un nanodominio de Ca2+ (elipse verde), este nanodominio facilita que el Ca2+ que entra a través de TRPV1 promueva la inactivación dependiente de Ca2+ de Orai1 (inactivación heteróloga dependiente de Ca2+, flecha con remate roja). La CDI de Orai1 promueve una disminución en la entrada de Ca2+ a través de Orai1 lo que a su vez genera una disminución en la migración celular promovida por la SOCE (panel de la derecha, flecha naranja). En el panel de la izquierda se muestra un canal que no se encuentra dentro del nanodominio de Orai1 (P2X4), por lo que no tiene efecto en la CDI de Orai1 y no afecta la migración promovida por la SOCE (flecha verde). Imagen creada con Biorender y editada con Adobe Illustrator. 58 8. CONCLUSIONES  Los canales Orai1 y TRPV1 difunden en la membrana plasmática manteniendo una cercanía entre ellos de 60 nm, lo que permite formar un nanodominio. La entrada de Ca2+ a través del canal TRPV1 induce CDI en Orai1.  Los canales Orai1 y P2X4 mantienen una distancia entre ellos mayor a 300 nm. Esto impide que la entrada de Ca2+ a través de canales P2X4 afecte al canal Orai1. Por ello no se induce CDI.  El dominio de anquirina (ANK1) del canal TRPV1 se asocia al C-terminal de Orai1. Lo anterior permite mantener el nanodominio de Ca2+ entre ambos canales.  La inactivación heteróloga dependiente de Ca2+ de Orai1 inducida por TRPV1 modula la migración celular en astrocitos necesaria para la reparación intercelular. 9. PERSPECTIVAS  Realizar la construcción de un sensor de Ca2+ capaz de detectar el Ca2+ entrante a través del canal TRPV1 para observar cambios locales en el poro del Ca2+ TRPV1. Con esta herramienta recrear experimentos realizados en esta tesis.  Determinar si la entrada de Ca2+ a través de Orai1 puede producir la desensibilización de TRPV1.  Determinar la vía de señalización responsable de la migración celular.  Estudiar si la inactivación heteróloga dependiente de Ca2+ de Orai1 es capaz de modular otros mecanismos celulares como la proliferación, la liberación de gliotransmisores, o la activación de los astrocitos. En el caso de células del sistema inmune estudiar su participación en la activación de células T.  Buscar otros canales que tengan este mecanismo de inactivación heterólogo de Ca2+. 59 10. LITERATURA CITADA 1. Berridge, M. J., Lipp, P. & Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 11–21 (2000). 2. Bootman, M. D. & Berridge, M. J. The Elemental Principles of Calcium Signaling Minireview. Cell 83, 675–678 (1995). 3. Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell 131, 1047–1058 (2007). 4. Berridge, M. J., Bootman, M. D. & Lipp, P. Calcium--a life and death signal. Nature 395, 645–8 (1998). 5. Schwaller, B. The Regulation of a Cell’s Ca 2+ Signaling Toolkit: The Ca 2+ Homeostasome. in Calcium Signaling, Advances in Experimental Medicine and Biology (ed. Islam, M. S.) vol. 740 1–25 (Springer Netherlands, 2012). 6. Bootman, M. D. & Bultynck, G. Fundamentals of cellular calcium signaling: A primer. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 12, (2020). 7. Berridge, M. J. Calcium microdomains: organization and function. Cell Calcium 40, 405–12 (2006). 8. Laude, A. J. & Simpson, A. W. M. Compartmentalized signalling: Ca2+ compartments, microdomains and the many facets of Ca2+ signalling. FEBS J. 276, 1800–16 (2009). 9. Parekh, A. B. Ca2+ microdomains near plasma membrane Ca2+ channels: impact on cell function. J. Physiol. 586, 3043–3054 (2008). 10. Eggermann, E., Bucurenciu, I., Goswami, S. P. & Jonas, P. Nanodomain coupling between Ca2+ channels and sensors of exocytosis at fast mammalian synapses. Nat. Rev. Neurosci. 13, 7–21 (2012). 11. Demuro, A. & Parker, I. Imaging single-channel calcium microdomains. Cell Calcium 40, 413–422 (2006). 12. Tay, L. H. et al. Nanodomain Ca2+ of Ca2+ channels detected by a tethered genetically encoded Ca2+ sensor. Nat. Commun. 3, 778 (2012). 13. Neher, E. Vesicle pools and Ca2+ microdomains: New tools for understanding their roles in neurotransmitter release. Neuron 20, 389–399 (1998). 14. Arai, I. & Jonas, P. Nanodomain coupling explains Ca2+ independence of transmitter release time course at a fast central synapse. Elife 3, 1–13 (2014). 15. Shang, W. et al. Imaging Ca2+ Nanosparks in Heart With a New Targeted Biosensor. Circ. Res. 114, 412–420 (2014). 16. Rutter, G. A., Tsuboi, T. & Ravier, M. A. Ca2+ microdomains and the control of insulin secretion. Cell Calcium 40, 539–551 (2006). 17. Tadross, M. R., Tsien, R. W. & Yue, D. T. Ca2+ channel nanodomains boost local Ca2+ amplitude. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 15794–15799 (2013). 18. Akita, T., Fedorovich, S. V & Okada, Y. Cellular Physiology and Biochemistr y 60 Biochemistry Ca 2 + Nanodomain-Mediated Component of Swelling-Induced Volume-Sensitive Outwardly Rectifying Anion Current Triggered by Autocrine Action of ATP in Mouse Astrocytes. 8585, (2011). 19. Akita, T., Fedorovich, S. V. & Okada, Y. Ca2+ nanodomain-mediated component of swelling-induced volume-sensitive outwardly rectifying anion current triggered by autocrine action of ATP in mouse astrocytes. Cell. Physiol. Biochem. 28, 1181–1190 (2011). 20. Wolf, I. M. A., Guse, A. H. & Guse, A. H. Ca2+ Microdomains in T-lymphocytes. Front. Oncol. 7, 1–11 (2017). 21. Katona, D., Rajki, A., Di, G., Pozzan, T. & Spät, A. Calcium-dependent mitochondrial cAMP production enhances aldosterone secretion. Mol. Cell. Endocrinol. 412, 196–204 (2015). 22. Berridge, M. J. Module 3: Ion Channels. Cell Signal. Biol. 6, csb0001003 (2014). 23. Mori, M. X. et al. Dynamics of receptor-operated Ca2+ currents through TRPC channels controlled via the PI(4,5)P2-PLC signaling pathway. Front. Pharmacol. 6, 2–6 (2015). 24. Garaschuk, O. & Griesbeck, O. Calcium Measurement Methods. 43, 101–117 (2010). 25. Calcium Signaling. (Springer Dordrecht, 2012). doi:10.1007/978-94-007-2888-2. 26. Putney, J. W. Alternative Forms of the Store-Operated Calcium Entry Mediators , STIM1 and Orai1. in CRAC or ORAI Channels vol. 71 109–123 (Elsevier Inc., 2013). 27. Lopez, J. J. et al. Molecular modulators of store-operated calcium entry. Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. 1863, 2037–2043 (2016). 28. Cahalan, M. D. STIMulating store-operated Ca2+ entry. Nat. Cell Biol. 11, 669–677 (2009). 29. Shim, A. H., Tirado-lee, L. & Prakriya, M. Structural and Functional Mechanisms of CRAC Channel Regulation. J. Mol. Biol. 427, 77–93 (2015). 30. Feske, S. et al. A mutation in Orai1 causes immune deficiency by abrogating CRAC channel function. Nature 441, 179–85 (2006). 31. Hou, X., Pedi, L., Diver, M. M. & Long, S. B. Crystal Structure of the Calcium Release–Activated Calcium Channel Orai. Science (80-. ). 338, 1308–1313 (2012). 32. Penna, A. et al. The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers. Nature 456, 116–20 (2008). 33. Chen, L. & Xu, T. On the Stoichiometry of Resting and Activated CRAC Channels. in Current Topics in Membranes vol. 71 95–108 (Elsevier Inc., 2013). 34. Zhou, Y., Ramachandran, S., Oh-Hora, M., Rao, A. & Hogan, P. G. Pore architecture of the ORAI1 store-operated calcium channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 4896–901 (2010). 35. Scrimgeour, N. R., Wilson, D. P., Barritt, G. J. & Rychkov, G. Y. Structural and 61 stoichiometric determinants of Ca2 + release-activated Ca2 + (CRAC) channel Ca2 +- dependent inactivation. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1838, 1281–1287 (2014). 36. Amcheslavsky, A. et al. Molecular biophysics of Orai store-operated Ca2+ channels. Biophys. J. 108, 237–246 (2015). 37. Mullins, F. M., Park, C. Y., Dolmetsch, R. E. & Lewis, R. S. STIM1 and calmodulin interact with Orai1 to induce Ca2+-dependent inactivation of CRAC channels. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 15495–500 (2009). 38. Tadross, M. R., Tsien, R. W. & Yue, D. T. Ca2+ channel nanodomains boost local Ca2+ amplitude. Proc. Natl. Acad. Sci. 110, 15794–15799 (2013). 39. Dagan, I. & Palty, R. Regulation of store-operated Ca2+ entry by saraf. Cells 10, (2021). 40. Morad, M. & Soldatov, N. Calcium channel inactivation: Possible role in signal transduction and Ca2+ signaling. Cell Calcium 38, 223–231 (2005). 41. Scrimgeour, N. R., Wilson, D. P. & Rychkov, G. Y. Glu 106 in the Orai1 pore contributes to fast Ca 2+ -dependent inactivation and pH dependence of Ca 2+ release- activated Ca 2+ (CRAC) current. Biochem. J. 441, 743–753 (2012). 42. Zweifach, A. & Lewis, R. S. Rapid inactivation of depletion-activated calcium current (ICRAC) due to local calcium feedback. J. Gen. Physiol. 105, 209–226 (1995). 43. Fierro, L. & Parekh, A. B. Fast calcium-dependent inactivation of calcium release- activated calcium current (CRAC) in RBL-1 cells. J. Membr. Biol. 168, 9–17 (1999). 44. Jardín, I. et al. Fine-tuning of store-operated calcium entry by fast and slow Ca2+- dependent inactivation: Involvement of SARAF. Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. 1865, 463–469 (2018). 45. Zweifach, A. & Lewis, R. S. Slow Calcium-dependent Inactivation of Depletion- activated Calcium Current. STORE-DEPENDENT AND -INDEPENDENT MECHANISMS. J. Biol. Chem. 270, 14445–14451 (1995). 46. Zhang, S. L. et al. Mutations in Orai1 transmembrane segment 1 cause STIM1- independent activation of Orai1 channels at glycine 98 and channel closure at arginine 91. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 17838–43 (2011). 47. Montalvo, G. B., Artalejo, A. R. & Gilabert, J. A. ATP from subplasmalemmal mitochondria controls Ca2+-dependent inactivation of CRAC channels. J. Biol. Chem. 281, 35616–35623 (2006). 48. Parekh, A. B. Regulation of CRAC channels by Ca2+-dependent inactivation. Cell Calcium 63, 20–23 (2017). 49. Srikanth, S., Jung, H. J., Ribalet, B. & Gwack, Y. The intracellular loop of Orai1 plays a central role in fast inactivation of Ca2+ release-activated Ca2+ channels. J. Biol. Chem. 285, 5066–5075 (2010). 50. Liu, Y. et al. Crystal structure of calmodulin binding domain of Orai1 in complex 62 with Ca2+ ·calmodulin displays a unique binding mode. J. Biol. Chem. 287, 43030– 43041 (2012). 51. Mullins, F. M., Yen, M. & Lewis, R. S. Orai1 pore residues control CRAC channel inactivation independently of calmodulin. J. Gen. Physiol. 147, 137–152 (2016). 52. Li, X. et al. Calmodulin dissociates the STIM1-Orai1 complex and STIM1 oligomers. Nat. Commun. 8, (2017). 53. Fukushima, M., Tomita, T., Janoshazi, a. & Putney, J. W. Alternative translation initiation gives rise to two isoforms of orai1 with distinct plasma membrane mobilities. J. Cell Sci. (2012) doi:10.1242/jcs.104919. 54. Desai, P. N. et al. Multiple types of calcium channels arising from alternative translation initiation of the Orai1 message. Sci. Signal. 8, 1–11 (2015). 55. Scrimgeour, N., Litjens, T., Ma, L., Barritt, G. J. & Rychkov, G. Y. Properties of Orai1 mediated store-operated current depend on the expression levels of STIM1 and Orai1 proteins. J. Physiol. 587, 2903–2918 (2009). 56. Krizova, A., Maltan, L. & Derler, I. Critical parameters maintaining authentic CRAC channel hallmarks. Eur. Biophys. J. 48, 425–445 (2019). 57. Gilabert, J. A. & Parekh, A. B. Respiring mitochondria determine the pattern of activation and inactivation of the store-operated Ca2+ current I(CRAC). EMBO J. 19, 6401–6407 (2000). 58. Akerboom, J. et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J. Neurosci. 32, 13819–40 (2012). 59. Tian, L., Hires, S. A. & Looger, L. L. Imaging neuronal activity with genetically encoded calcium indicators. Cold Spring Harb. Protoc. 2012, 647–56 (2012). 60. Navas-Navarro, P. et al. GFP-Aequorin Protein Sensor for Ex Vivo and In Vivo Resource GFP-Aequorin Protein Sensor for Ex Vivo and In Vivo Imaging. Cell Chem. Biol. 23, 738–745 (2016). 61. Rose, T., Goltstein, P. M., Portugues, R. & Griesbeck, O. Putting a finishing touch on GECIs. Front. Mol. Neurosci. 7, 1–15 (2014). 62. Podor, B. et al. Comparison of genetically encoded calcium indicators for monitoring action potentials in mammalian brain by two-photon excitation fluorescence microscopy. Neurophotonics 2, 021014 (2015). 63. Gee, J. M. et al. Imaging activity in astrocytes and neurons with genetically encoded calcium indicators following in utero electroporation. Front. Mol. Neurosci. 8, 10 (2015). 64. Yamada, Y. & Mikoshiba, K. Quantitative comparison of novel GCaMP-type genetically encoded Ca(2+) indicators in mammalian neurons. Front. Cell. Neurosci. 6, 41 (2012). 65. Ohkura, M., Sasaki, T., Kobayashi, C., Ikegaya, Y. & Nakai, J. An improved genetically encoded red fluorescent Ca2+ indicator for detecting optically evoked 63 action potentials. PLoS One 7, e39933 (2012). 66. Shigetomi, E., Kracun, S. & Khakh, B. S. Monitoring astrocyte calcium microdomains with improved membrane targeted GCaMP reporters. Neuron Glia Biol. 6, 183–91 (2010). 67. Zhao, Y. et al. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science 333, 1888–91 (2011). 68. Bastian, C., Sampieri, A., Benavides, M. O., Guerrero, A. & Vaca, L. Super- resolution microscopy for the study of store-operated calcium entry. Cell Calcium 104, (2022). 69. Vangindertael, J. et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods Appl. Fluoresc. 6, (2018). 70. Jacquemet, G., Carisey, A. F., Hamidi, H., Henriques, R. & Leterrier, C. The cell biologist’s guide to super-resolution microscopy. J. Cell Sci. 133, (2020). 71. Wang, X. et al. Super-resolution microscopy and its applications in neuroscience. J. Innov. Opt. Health Sci. 10, 1–11 (2017). 72. Sahl, S. J. & Moerner, W. E. Super-resolution fluorescence imaging with single molecules. Current Opinion in Structural Biology vol. 23 778–787 (2013). 73. Sauer, M. & Heilemann, M. Single-Molecule Localization Microscopy in Eukaryotes. Chemical Reviews vol. 117 7478–7509 (2017). 74. Deb, B. K., Pathak, T. & Hasan, G. Store-independent modulation of Ca 2+ entry through Orai by Septin 7. Nat. Commun. 7, 11751 (2016). 75. Deb, B. K., Chakraborty, P., Gopurappilly, R. & Hasan, G. SEPT7 regulates Ca2+ entry through Orai channels in human neural progenitor cells and neurons. Cell Calcium 90, 102252 (2020). 76. Pavez, M. et al. STIM1 is required for remodeling of the endoplasmic reticulum and microtubule cytoskeleton in steering growth cones. J. Neurosci. 39, 5095–5114 (2019). 77. Huang, Y., Hsu, Y., Chen, Y. & Shen, M. Super-Resolution Microscopy Reveals That Stromal Interaction Molecule 1 Trafficking Depends on Microtubule Dynamics. Front. Physiol. 12, 1–14 (2021). 78. Hogea A, Shah S, Jones F, Carver CM, Hao H, Liang C, Huang D, Du X, G. N. Junctophilin-4 facilitates inflammatory signalling at plasma membrane-endoplasmic reticulum junctions in sensory neurons. J. Physiol. 599, (2021). 79. Volz, J. et al. BIN2 orchestrates platelet calcium signaling in thrombosis and thrombo-inflammation. J. Clin. Investig. 130, 6064–6079 (2020). 80. Zhou, Y. et al. Cross-linking of Orai1 channels by STIM proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. 115, E3398–E3407 (2018). 81. Chanaday, N. L. et al. Presynaptic store-operated Ca2+ entry drives excitatory 64 spontaneous neurotransmission and augments endoplasmic reticulum stress ll ll Article Presynaptic store-operated Ca2+ entry drives excitatory spontaneous neurotransmission and augments endoplasmic re. Neuron 109, 1314–1332 (2021). 82. Hertel, F., Mo, G. C. H., Duwé, S., Dedecker, P. & Zhang, J. RefSOFI for Mapping Nanoscale Organization of Protein-Protein Interactions in Living Cells. Cell Rep. 14, 390–400 (2016). 83. Moreno, C. Papel de las proteínas Stim1 y Orai1 en la respuesta de los astrocitos a la trombina. (Universidad Nacional Autónoma de México, 2012). 84. Schiweck, J., Eickholt, B. J. & Murk, K. Important shapeshifter: Mechanisms allowing astrocytes to respond to the changing nervous system during development, injury and disease. Front. Cell. Neurosci. 12, 1–17 (2018). 85. Okada, T. & Suzuki, H. The Role of Tenascin-C in Tissue Injury and Repair After Stroke. Front. Immunol. 11, 1–14 (2021). 86. Baldwin, K. T. & Eroglu, C. Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis. Curr. Opin. Neurobiol. 45, 113–120 (2017). 87. Potokar, M., Jorgačevski, J. & Zorec, R. Astrocyte aquaporin dynamics in health and disease. Int. J. Mol. Sci. 17, 1–18 (2016). 88. Theparambil, S. M. et al. Astrocytes regulate brain extracellular pH via a neuronal activity-dependent bicarbonate shuttle. Nat. Commun. 11, 1–15 (2020). 89. Gao, X. et al. STIMs and Orai1 regulate cytokine production in spinal astrocytes. J. Neuroinflammation 13, 1–13 (2016). 90. Shibasaki, K., Hosoi, N., Kaneko, R., Tominaga, M. & Yamada, K. Glycine release from astrocytes via functional reversal of GlyT1. J. Neurochem. 140, 395–403 (2017). 91. Descalzi, G., Gao, V., Steinman, M. Q., Suzuki, A. & Alberini, C. M. Lactate from astrocytes fuels learning-induced mRNA translation in excitatory and inhibitory neurons. Commun. Biol. 2, (2019). 92. Carlsen, E. M. & Perrier, J.-F. Purines released from astrocytes inhibit excitatory synaptic transmission in the ventral horn of the spinal cord. Front. Neural Circuits 8, 1–11 (2014). 93. Alberini, C. M., Cruz, E., Descalzi, G., Bessières, B. & Gao, V. Astrocyte glycogen and lactate: New insights into learning and memory mechanisms. Glia 66, 1244–1262 (2018). 94. Stobart, J. L. L., Lu, L., Anderson, H. D. I., Mori, H. & Anderson, C. M. Astrocyte- induced cortical vasodilation is mediated by D-serine and endothelial nitric oxide synthase. Proc. Natl. Acad. Sci. 110, 3149–3154 (2013). 95. Allen, N. J. Astrocyte Regulation of Synaptic Behavior. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 30, 439–463 (2014). 96. Huda, R., Chang, Z., Do, J., Mccrimmon, D. R. & Martina, M. Activation of 65 astrocytic PAR1 receptors in the rat nucleus of the solitary tract regulates breathing through modulation of presynaptic TRPV1. J. Physiol. 596, 497–513 (2018). 97. Bazargani, N. & Attwell, D. Astrocyte calcium signaling: The third wave. Nat. Neurosci. 19, 182–189 (2016). 98. Enders, M., Heider, T., Ludwig, A. & Kuerten, S. Strategies for Neuroprotection in Multiple Sclerosis and the Role of Calcium. Int. J. Mol. Sci. 21, 1663 (2020). 99. Guerra-Gomes, S., Sousa, N., Pinto, L. & Oliveira, J. F. Functional Roles of Astrocyte Calcium Elevations: From Synapses to Behavior. Front. Cell. Neurosci. 11, 1–7 (2018). 100. Chen, X. et al. Thrombin induces morphological and inflammatory astrocytic responses via activation of PAR1 receptor. Cell Death Discov. 8, 1–9 (2022). 101. Verkhratsky, A. & Parpura, V. Store-operated calcium entry in neuroglia. Neurosci. Bull. 30, 125–133 (2014). 102. Emrich, S. M., Yoast, R. E. & Trebak, M. Physiological Functions of CRAC Channels. Annu. Rev. Physiol. 84, 355–379 (2022). 103. Verkhratsky, A., Rodríguez, J. J. & Parpura, V. Calcium signalling in astroglia. Mol. Cell. Endocrinol. 353, 45–56 (2012). 104. Zhang, I. & Hu, H. Store-Operated Calcium Channels in Physiological and Pathological States of the Nervous System. Front. Cell. Neurosci. 14, 1–13 (2020). 105. Moreno, C., Sampieri, A., Vivas, O., Peña-Segura, C. & Vaca, L. STIM1 and Orai1 mediate thrombin-induced Ca2+ influx in rat cortical astrocytes. Cell Calcium 52, (2012). 106. Schulte, A. et al. Homeostatic calcium fluxes, ER calcium release, SOCE, and calcium oscillations in cultured astrocytes are interlinked by a small calcium toolkit. Cell Calcium 101, 102515 (2022). 107. Golovina, V. A. Visualization of localized store-operated calcium entry in mouse astrocytes. Close proximity to the endoplasmic reticulum. J. Physiol. 564, 737–749 (2005). 108. Toth, A. B. et al. CRAC channels regulate astrocyte Ca 2+ signaling and gliotransmitter release to modulate hippocampal GABAergic transmission. Sci. Signal. 12, 53–58 (2019). 109. Kwon, J. et al. Orai1 and Orai3 in combination with STIM1 mediate the majority of store-operated calcium entry in astrocytes. Exp. Neurobiol. 26, 42–54 (2017). 110. Ubl, J. J. & Reiser, G. Characteristics of Thrombin-Induced Calcium Signals in Rat Astrocytes. Glia 369, 361–369 (1997). 111. Lin, C. C. et al. Thrombin mediates migration of rat brain astrocytes via PLC, Ca 2+, CaMKII, PKCα, and AP-1-dependent matrix metalloproteinase-9 expression. Mol. Neurobiol. 48, 616–630 (2013). 66 112. Rajput, P. S. et al. Neuron-generated thrombin induces a protective astrocyte response via protease activated receptors. Glia 68, 246–262 (2020). 113. Kim, J. et al. Thrombin-induced migration and matrix metalloproteinase-9 expression are regulated by MAPK and PI3K pathways in C6 glioma cells. Korean J. Physiol. Pharmacol. 15, 211–216 (2011). 114. Kundumani-Sridharan, V. et al. Novel interactions between NFATc1 (nuclear factor of activated T cells c1) and STAT-3 (signal transducer and activator of transcription- 3) mediate G protein-coupled receptor agonist, thrombin-induced biphasic expression of cyclin D1, with first phase infl. J. Biol. Chem. 287, 22463–22482 (2012). 115. Wang, H., Ubl, J. J., Stricker, R. & Reiser, G. Thrombin (PAR-1)-induced proliferation in astrocytes via MAPK involves multiple signaling pathways. Am. J. Physiol. Physiol. 283, C1351–C1364 (2002). 116. Hu, S., Wu, G., Ding, X. & Zhang, Y. Thrombin preferentially induces autophagy in glia cells in the rat central nervous system. Neurosci. Lett. 630, 53–58 (2016). 117. Zhan, J. S. et al. Astrocytes in Migration. Neurochem. Res. 42, 272–282 (2017). 118. Shu, Q. et al. Orexin-A Promotes Cell Migration in Cultured Rat Astrocytes via Ca2+-Dependent PKCα and ERK1/2 Signals. PLoS One 9, e95259 (2014). 119. Ridley, A. J. et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science 302, 1704–9 (2003). 120. Lagos-Cabré, R., Burgos-Bravo, F., Avalos, A. M. & Leyton, L. Connexins in astrocyte migration. Front. Pharmacol. 10, 1–16 (2020). 121. Ahmed, S. M., Rzigalinski, B. A., Willoughby, K. A., Sitterding, H. A. & Ellis, E. F. Stretch-Induced Injury Alters Mitochondrial Membrane Potential and Cellular ATP in Cultured Astrocytes and Neurons. J. Neurochem. 74, 1951–1960 (2008). 122. Gadea, A., Schinelli, S. & Gallo, V. Endothelin-1 regulates astrocyte proliferation and reactive gliosis via a JNK/c-Jun signaling pathway. J. Neurosci. 28, 2394–2408 (2008). 123. Su, Z. et al. Reactive astrocytes in glial scar attract olfactory ensheathing cells migration by secreted TNF-α in spinal cord Lesion Of Rat. PLoS One 4, (2009). 124. Liang, C. C., Park, A. Y. & Guan, J. L. In vitro scratch assay: A convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2, 329–333 (2007). 125. Martinotti, S. & Ranzato, E. Scratch wound healing assay. Methods Mol. Biol. 2109, 225–229 (2020). 126. Ho, K. W., Lambert, W. S. & Calkins, D. J. Activation of the TRPV1 cation channel contributes to stress-induced astrocyte migration. Glia 62, 1435–1451 (2014). 127. Lin, A. et al. Serum amyloid A inhibits astrocyte migration via activating p38 MAPK. J. Neuroinflammation 17, 1–14 (2020). 67 128. Nishio, T. et al. Tenascin-C regulates proliferation and migration of cultured astrocytes in a scratch wound assay. Neuroscience 132, 87–102 (2005). 129. Hsu, J. Y. C. et al. Matrix metalloproteinase-9 facilitates glial scar formation in the injured spinal cord. J. Neurosci. 28, 13467–13477 (2008). 130. Etienne-Manneville, S. In vitro assay of primary astrocyte migration as a tool to study Rho GTPase function in cell polarization. Methods Enzymol. 406, 565–578 (2006). 131. Rozov, A. & Burnashev, N. Fast interaction between AMPA and NMDA receptors by intracellular calcium. Cell Calcium 60, 407–414 (2016). 132. Zhao, Y. et al. Sensitized signalling between L-type Ca 2 1 channels and ryanodine receptors in the absence or inhibition of FKBP12.6 in cardiomyocytes. Cardiovasc. Res. 113, 332–342 (2017). 133. Courjaret, R., Dib, M. & Machaca, K. Spatially restricted subcellular Ca2+ signaling downstream of store-operated calcium entry encoded by a cortical tunneling mechanism. Sci. Rep. 8, 1–13 (2018). 134. Guilcher, C. Le, Luyten, T., Parys, J. B., Pucheault, M. & Dellis, O. Synthesis and characterization of store-operated calcium entry inhibitors active in the submicromolar range. Int. J. Mol. Sci. 21, 1–23 (2020). 135. Gustafsson, N. et al. Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations. Nat. Commun. 7, (2016). 136. Schindelin, J. et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods 9, 676–682 (2012). 137. Dupont, A., Stirnnagel, K., Lindemann, D. & Lamb, D. C. Tracking image correlation: Combining single-particle tracking and image correlation. Biophys. J. 104, 2373–2382 (2013). 138. Cox, G. & Sheppard, C. J. R. Practical Limits of Resolution in Confocal and Non- Linear Microscopy. Microsc. Res. Tech. 63, 18–22 (2004). 139. Huang, B., Bates, M. & Zhuang, X. Super-Resolution Flourescence Microscopy. Annu. Rev. Biochem. 78, 993–1016 (2009). 140. Bohórquez-Hernández, A., Gratton, E., Pacheco, J., Asanov, A. & Vaca, L. Cholesterol modulates the cellular localization of Orai1 channels and its disposition among membrane domains. BBA - Mol. Cell Biol. Lipids 1862, 1481–1490 (2017). 141. Pankow, S., Bamberger, C., Calzolari, D., Bamberger, A. & Yates, J. R. Deep interactome profiling of membrane proteins by co-interacting protein identification technology. Nat. Protoc. 11, 2515–2528 (2016). 142. Cao, E., Liao, M., Cheng, Y. & Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature 504, 113–118 (2013). 143. Asanov, A., Zepeda, A. & Vaca, L. A novel form of Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (LG-TIRFM) reveals different and independent lipid raft domains in living cells. Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Biol. Lipids 1801, 147– 68 155 (2010). 144. Asanov, A., Zepeda, A. & Vaca, L. A platform for combined dna and protein microarrays based on total internal reflection fluorescence. Sensors 12, 1800–1815 (2012). 145. Blondeau, J. ‐P, Beslin, A., Chantoux, F. & Francon, J. Triiodothyronine Is a High‐ Affinity Inhibitor of Amino Acid Transport System L1 in Cultured Astrocytes. J. Neurochem. 60, 1407–1413 (1993). 146. Fernandes, A. et al. Glycoursodeoxycholic acid and interleukin-10 modulate the reactivity of rat cortical astrocytes to unconjugated bilirubin. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 66, 789–798 (2007). 147. Lishko, P. V., Procko, E., Jin, X., Phelps, C. B. & Gaudet, R. The Ankyrin Repeats of TRPV1 Bind Multiple Ligands and Modulate Channel Sensitivity. Neuron 54, 905– 918 (2007). 148. Huang, C. et al. Existence and distinction of acid-evoked currents in rat astrocytes. Glia 58, 1415–1424 (2010). 149. Ebrahimi, S. et al. Role of thrombin in the pathogenesis of central nervous system inflammatory diseases. J. Cell. Physiol. 232, 482–485 (2017). 150. Lin, C.-C. et al. Thrombin mediates migration of rat brain astrocytes via PLC, Ca2+, CaMKII, PKCα, and AP-1-dependent matrix metalloproteinase-9 expression. Mol. Neurobiol. 48, 616–30 (2013). 151. Mullins, F. M. & Lewis, R. S. The inactivation domain of STIM1 is functionally coupled with the Orai1 pore to enable Ca2+-dependent inactivation. J. Gen. Physiol. 147, 153–164 (2016). 152. Zhang, X. et al. A calcium/cAMP signaling loop at the ORAI1 mouth drives channel inactivation to shape NFAT induction. Nat. Commun. 10, (2019). 153. Dynes, J. L., Amcheslavsky, A. & Cahalan, M. D. Genetically targeted single-channel optical recording reveals multiple Orai1 gating states and oscillations in calcium influx. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113, 440–445 (2016). 154. Richler, E., Chaumont, S., Shigetomi, E., Sagasti, A. & Khakh, B. S. Tracking transmitter-gated P2X cation channel activation in vitro and in vivo. Nat. Methods 5, 87–93 (2008). 155. Tay, L. H. et al. Nanodomain Ca2+ of Ca2+ channels detected by a tethered genetically encoded Ca2+ sensor. Nat. Commun. 3, 711–778 (2012). 156. Ko, J., Myeong, J., Yang, D. & So, I. Calcium permeability of transient receptor potential canonical (TRPC) 4 channels measured by TRPC4-GCaMP6s. Korean J. Physiol. Pharmacol. 21, 133–140 (2017). 157. Vellino, S. et al. Cross-talk between the calcium channel TRPV4 and reactive oxygen species interlocks adhesive and degradative functions of invadosomes. J. Cell Biol. 220, (2021). 69 158. Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Opt. InfoBase Conf. Pap. 2, 1153–1159 (2009). 159. Coelho, S. et al. Ultraprecise single-molecule localization microscopy enables in situ distance measurements in intact cells. Sci. Adv. 6, 1–10 (2020). 160. Sahu, I. et al. NFAT5-sensitive Orai1 expression and store-operated Ca2+ entry in megakaryocytes. FASEB J. 31, 3439–3448 (2017). 161. Michiels, C. F., Fransen, P., De Munck, D. G., De Meyer, G. R. Y. & Martinet, W. Defective autophagy in vascular smooth muscle cells alters contractility and Ca2+ homeostasis in mice. Am. J. Physiol. - Hear. Circ. Physiol. 308, H557–H567 (2015). 162. Giachini, F. R. C. et al. STIM1/Orai1 contributes to sex differences in vascular responses to calcium in spontaneously hypertensive rats. Clin. Sci. 122, 215–226 (2012). 163. Li, H. et al. Impaired Orai1-mediated resting Ca2+ entry reduces the cytosolic [Ca2+] and sarcoplasmic reticulum Ca2+ loading in quiescent junctophilin 1 knock-out myotubes. J. Biol. Chem. 285, 39171–39179 (2010). 164. Sztretye, M. et al. The Role of Orai1 in Regulating Sarcoplasmic Calcium Release, Mitochondrial Morphology and Function in Myostatin Deficient Skeletal Muscle. Front. Physiol. 11, 1–15 (2020). 165. Alansary, D., Bogeski, I. & Niemeyer, B. A. Facilitation of Orai3 targeting and store- operated function by Orai1. Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. 1853, 1541–1550 (2015). 166. Wang, Y. Y. et al. Expression of Orai1 and STIM1 in human oral squamous cell carcinogenesis. J. Dent. Sci. 17, 78–88 (2022). 167. Kilch, T. et al. Mutations of the ca2+-sensing stromal interaction molecule stim1 regulate ca2+ influx by altered oligomerization of stim1 and by destabilization of the ca2+ channel orai1. J. Biol. Chem. 288, 1653–1664 (2013). 168. Fukushima, M., Tomita, T., Janoshazi, A. & Putney, J. W. Alternative translation initiation gives rise to two isoforms of Orai1 with distinct plasma membrane mobilities. J. Cell Sci. 125, 4354–4361 (2012). 169. Henke, N. et al. The plasma membrane channel ORAI1 mediates detrimental calcium influx caused by endogenous oxidative stress. Cell Death Dis. 4, 1–9 (2013). 170. Vyklický, L. et al. Calcium-dependent desensitization of vanilloid receptor TRPV1: A mechanism possibly involved in analgesia induced by topical application of capsaicin. Physiol. Res. 57, (2008). 171. Liao, M., Cao, E., Julius, D. & Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature 504, 107–112 (2013). 172. Lee, S. K. et al. IDstim helps STIM1 keep inactive via intramolecular binding to the coiled-coil domain in a resting state. J. Cell Sci. 133, (2019). 173. Azimi, I. et al. A New Selective Pharmacological Enhancer of the Orai1 Ca 2+ 70 Channel Reveals Roles for Orai1 in Smooth and Skeletal Muscle Functions. ACS Pharmacol. Trnalational Sci. 3, 135–147 (2020). 174. Rosenbaum, T., Gordon-shaag, A., Munari, M. & Gordon, S. E. Ca2+/ Calmodulin Modulates TRPV1 Activation by Capsaicin. J. Gen. Physiol. 123, (2004). 175. Fischer BS, Qin D, Kim K, M. T. Capsaicin inhibits Jurkat T-cell activation by blocking calcium entry current I(CRAC). J Pharmacol Exp Ther. 299, 238–246 (2001). 176. Choi SY, K. K. Capsaicin inhibits phospholipase C-mediated Ca(2+) increase by blocking thapsigargin-sensitive store-operated Ca(2+) entry in PC12 cells. J Pharmacol Exp Ther. 291, 107–14 (1999). 177. Wang, J., Tseng, C. & Sun, S. Capsaicin stimulates the non-store-operated Ca 2 + entry but inhibits the store-operated Ca 2 + entry in neutrophils. Toxicol. Appl. Pharmacol. 209, 134–144 (2005). 178. Gouin, O. et al. Major Role for TRPV1 and InsP3R in PAR2-Elicited Inflammatory Mediator Production in Differentiated Human Keratinocytes. J. Invest. Dermatol. 138, 1564–1572 (2018). 179. Nakayama, A. & Wakamori, M. Inhibition of CRAC channel current by TRPV1 channel agonist and antagonist in RBL cells. in Proceedings for The 94th Annual Meeting of the Japanese Pharmacological Society 2021 (2021). 180. Woo, J. H. et al. Nootkatol prevents ultraviolet radiation-induced photoaging via ORAI1 and TRPV1 inhibition in melanocytes and keratinocytes. Korean J. Physiol. Pharmacol. 25, 87–94 (2021). 181. Mergler S, Valtink M, Takayoshi S, Okada Y, Miyajima M, Saika S, Reinach PS.Mergler S, Valtink M, Takayoshi S, Okada Y, Miyajima M, Saika S, R. P. Temperature-Sensitive Transient Receptor Potential Channels in Corneal Tissue Layers and Cells. Ophthalmic Res. 52, 151–159 (2014). 182. Nam, J. H. et al. TRPV1 on astrocytes rescues nigral dopamine neurons in Parkinson’s disease via CNTF. Brain 138, 3610–3622 (2015). 183. Zhang, E. & Liao, P. Brain Transient Receptor Potential Channels and Stroke. J. Neurosci. Res. 93, 1165–83 (2014). 184. Wang, X. et al. TRPV1 translocated to astrocytic membrane to promote migration and inflammatory infiltration thus promotes epilepsy after hypoxic ischemia in immature brain. J. Neuroinflammation 16, 1–14 (2019). 185. Sappington, R. M. et al. Activation of transient receptor potential vanilloid-1 (TRPV1) influences how retinal ganglion cell neurons respond to pressure-related stress. Channels 9, 102–113 (2015). 186. Kong, W. et al. Activation of TRPV1 Contributes to Recurrent Febrile Seizures via Inhibiting the Microglial M2 Phenotype in the Immature Brain. Front. Cell. Neurosci. 13, 1–16 (2019). 187. Li, K., Li, J., Zheng, J. & Qin, S. Reactive astrocytes in neurodegenerative diseases. 71 Aging Dis. 10, 664–675 (2019). 188. Lopez-Guerrero, A. M. et al. RAC1-Dependent ORAI1 Translocation to the Leading Edge Supports Lamellipodia Formation and Directional Persistence. Sci. Rep. 10, 1– 18 (2020). 189. Diez-Bello, R., Jardin, I., Salido, G. M. & Rosado, J. A. Orai1 and Orai2 mediate store-operated calcium entry that regulates HL60 cell migration and FAK phosphorylation. Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. 1864, 1064–1070 (2017). 190. Yang, N. et al. Blockade of store-operated Ca(2+) entry inhibits hepatocarcinoma cell migration and invasion by regulating focal adhesion turnover. Cancer Lett. 330, 163– 9 (2013). 191. Vandenberghe, M. et al. ORAI1 calcium channel orchestrates skin homeostasis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, (2013). 192. Li, L. et al. The impact of TRPV1 on cancer pathogenesis and therapy: A systematic review. Int. J. Biol. Sci. 17, 2034–2049 (2021). 193. Indriati, D. W. et al. Quantitative localization of Cav2.1 (P/Q-Type) voltage- dependent calcium channels in Purkinje cells: Somatodendritic gradient and distinct somatic Coclustering with calcium-activated potassium channels. J. Neurosci. 33, 3668–3678 (2013). 194. Engbers, J. D. T. et al. Intermediate conductance calcium-activated potassium channels modulate summation of parallel fiber input in cerebellar Purkinje cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 2601–2606 (2012). 195. Kar, P. et al. The N terminus of Orai1 couples to the AKAP79 signaling complex to drive NFAT1 activation by local Ca2+entry. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 118, 1–11 (2021). 196. Akita, T. & Okada, Y. Regulation of bradykinin-induced activation of volume- sensitive outwardly rectifying anion channels by Ca 2+ nanodomains in mouse astrocytes. J. Physiol. 589, 3909–3927 (2011). 197. Shah, S. et al. Local Ca2+ signals couple activation of TRPV1 and ANO1 sensory ion channels. Sci. Signal. 13, (2020). 198. Sampieri, A., Santoyo, K., Asanov, A. & Vaca, L. Association of the IP3R to STIM1 provides a reduced intraluminal calcium microenvironment, resulting in enhanced store-operated calcium entry. Sci. Rep. 8, 1–13 (2018). 199. Béliveau, É., Lessard, V. & Guillemette, G. STIM1 Positively Regulates the Ca2+ Release Activity of the Inositol 1,4,5-Trisphosphate Receptor in Bovine Aortic Endothelial Cells. PLoS One 9, e114718 (2014). 200. Thillaiappan, N. B., Chavda, A. P., Tovey, S. C., Prole, D. L. & Taylor, C. W. Ca2+ signals initiate at immobile IP3 receptors adjacent to ER-plasma membrane junctions. Nat. Commun. 8, (2017). 72 11. ANEXOS Anexo 1. Publicaciones derivadas del trabajo doctoral 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 Cell Calcium 104 (2022) 102595 ELSEVIER Contents lists available at ScienceDirect Cell Calcium journal homepage: www.elsevier.com/locate/ceca Se (1 (ll) Ed 7 Review Super-resolution microscopy for the study of store-operated calcium entry Check for | Updates. Carlos Bastian”, Alicia Sampieri”, Manuel Ortínez Benavides b Adán Guerrero”, Luis Vaca” * Departamento de Biología Celular y del Desarrollo, Universidad Nacional Autónoma de México, CDMX 04510, Mexico D Taller de electrónica y mecánica, Instituto de Fisiología Celular. Universidad Nacional Autónoma de México, CDMX 04510, Mexico * Laboratorio Nacional de Microscopía Avanzada, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México, Cuernavaca, Morelos, Mexico ARTICLE INFO ABSTRACT Keywords: The use of a variety of techniques based on super-resolution (SR) microscopy unveiled a close and complex SOCE relationship between cytoskeleton reorganization and SOCE. By using SR microscopy many new proteins Super-resolution, STIM1 Orail involved in SOCE regulation have been identified over the last few years. Many enigmas remain unsolved in this highly dynamic field, however, recent developments in SR microscopy promise new answers soon. In the present review, we describe the most relevant findings in SOCE components and SOCE modulation using different methods derived from SR microscopy. 1. Introduction The ion calcium is one of the most relevant second messengers in the cell. Calcium has numerous roles in very different processes ranging from cellular division to cellular death; for this reason, calcium con- centration is finely controlled. During evolution, cells have acquired a sophisticated toolkit to regulate the intracellular calcium concentration. This kit is composed of calcium pumps, calcium sensors, calcium buff- ering systems, calcium - activated enzymes and calcium permeable ion channels. One of the most important mechanisms for the control of calcium in non-excitable cells is the store-operated calcium entry (SOCE), which is constituted mainly of Orai channels and the protein calcium sensor STIM1 (Stromal interaction molecule 1). These molecules are the core of the SOCE, however other proteins also have important roles. SOCE is physiologically relevant in many processes, such as B- and T-cell acti- vation[1,2], releasing of histamine and serotonin in mast cells [3], proliferation [4], differentiation [5], control of gene expression [6] and many other cellular mechanisms [7]. SOCE is activated by stimuli that release calcium from the endo- plasmic reticulum (ER), which is the main reservoir of calcium in the cell. Calcium release from the ER begins when G-protein-coupled re- ceptors activate phospholipase C, provoking the generation of inositol 1,4,5-triphosphate (IPs), which binds to the IPz receptors (IP3R) located at the ER membrane, opening this channel, and leading to the release of calcium from the ER into the cytosol. The decrement of calcium in the ER is sensed by STIM1, which then oligomerizes and accumulates at ER- * Corresponding author. E-mail address: lvacaQife.unam.mx (L. Vaca). https: //doi.org/10.1016/j.ceca.2022.102595 plasma membrane (ER-PM) junctions, where this protein recruits and activates Orai channels, resulting in calcium influx [8,9]. In the last decade, many studies have presented new advances in our understanding of the molecular interactions and dynamics of SOCE components. In recent years super-resolution (SR) microscopy has pro- vided new insights into the assembly of the SOCE complex at very high resolutions. The present review summarizes recent findings on the structural and functional aspects of SOCE, where SR microscopy has played a significant role. 2. SOCE components 2.1. STIM and Orai Store-operated calcium entry (SOCE) is a phenomenon identified early as the activation of calcium influx into the cell, triggered by the depletion of intracellular calcium from the ER [10]. This mechanism of calcium mobilization was initially identified in parotid acinar cells and named capacitative calcium entry [11]. The more appropriate name Store-Operated Calcium Entry (SOCE) was later adopted in the field n21. For many years the molecular mechanisms linking the depletion of the ER with the subsequent activation of calcium entry were unclear. In 2005, RNA interferences (RNAi) screening studies in Drosophila $2 cells identified STIM (dSTIM) as an ER membrane protein that senses the changes in the calcium concentrations in ER lumen, two months later were identified the mammalian homologs STIM1 and STIM2 in HELA Received 22 March 2022; Received in revised form 3 May 2022; Accepted 5 May 2022 Available online 6 May 2022 0143-4160/0) 2022 Elsevier Ltd. All rights reserved. 86 C. Bastian et al. cells [13,14]. STIM1 was originally identified as a ubiquitously expressed tumor suppressor protein. STIM1 is a 77 KDa single pass ER membrane protein and is divided in several domains, the luminal N-terminal portion con- tains an EF-hand motif and SAM (sterile a motif) domain, have a transmembrane region, and the C-terminal portion, which includes 3 coiled-coiled domains (CC1-3), a serine-proline-rich domain and a lysine-rich domain. STIM1 has been established as an ER calcium sensor. Its EF-hand domain in N-terminal binds calcium in the range of resting ER calcium concentrations (Kd = —200-600 uM) [15]. Once the calcium ER sensor STIM was identified, many attempts were directed to the identification of the channel responsible for calcium influx after ER depletion. The so-called Calcium-Release Activated Cal- cium Current (Icrac) channel was identified in 2006, after a genetic analysis of patients suffering hereditary severe combined immune deficiency (SCID) syndrome [16]. In the same year was demonstrated that the combined expression of Orai and STIM1 reconstitutes SOCE and Icrac [17]. 2.2. Orail and STIM1 interactions Since most of the STIM1 protein is located at the ER while the ma- jority of Orai channels reside at the plasma membrane of the cells, it became obvious earlier in the study of these two proteins that they most come in closed proximity to interact and for STIM1 to activate calcium influx via Orial. Several studies have identified the protein sequences or domains in charge of the association between STIM1 and Orai channels [18]. The physical interaction between ER and PM poses a very inter- esting challenge particularly well suited for microscopy studies. Unfor- tunately, physics imposes a resolution barrier to classical optical microscopy limiting its capacity to observe events occurring at the nanoscale level: the so-called light diffraction limit [19]. While electron microscopy provides higher resolution compared to optical microscopy, unfortunately, electron microscopy does not provide any temporal res- olution and the dynamics of protein-protein interactions cannot be resolved using electron microscopy. This is the main reason why optical microscopy has benefitted so much from the improvements provided in spatial resolution by the recent development of super-resolution (SR) methods. Even though in mammals there are 3 genes (Orail-Orai3) encoding Orai channels, most of the SR microscopy studies have been directed to the study of Orail. A similar phenomenon has been observed with STIM proteins. There are two STIM genes, but the focus of most SR microscopy studies has been placed on STIM1. Several studies have shown that Orai2 and Orai3 are mainly present in intracellular membranes, but SR microscopy research is still lacking with these two channels. For many years it was known that 2-Aminoethyl diphenylborinate (2-APB) at low concentrations (< 5 microM) was a potentiator of SOCE and lcrac, but at higher concentrations (> 10 microM) was an inhibitor [20]. The mechanisms responsible for SOCE activation by low concen- trations of 2-APB remained unclear. In 2017 we showed that Orai3 forms an ER leak channel activated by 2-APB [21]. The leak of calcium from the ER via Orai3 channel results in the subsequent activation of SOCE. 3. Fluorescence microscopy Much of our knowledge concerning cell biology at the cellular and molecular level has come from various microscopy techniques. From four hundred years ago with the first studies of biological structures by pioneers like Hooke or Van Leeuwenhoek to today, the invention of light microscopy strongly influenced biological research. Fluorescence microscopy (FM) is currently one of the most versatile and powerful techniques of light microscopy available for biological sciences, for two important advantages: noninvasive molecule-specific labeling of cellular components and live-cell monitoring in real-time. FM is one of the leading technologies used to drive discoveries in Cell Calcium 104 (2022) 102595 modern biology [22-24]. Confocal microscopy (CM) is perhaps one of the most important in- novations in FM, mainly because generates high-contrast images through optical sectioning, and additionally improves the resolution obtained with FM by advancing imaging into the third dimension[25, 26]. Unfortunately, the optical resolution of FM (including CM) is limited by the nature of the light. The diffraction of the light imposes a limita- tion on the spatial resolution of about 200-300 nm in the lateral di- rection (x-y) and 500-700 nm in the axial direction (2), this is nearly two orders of magnitude larger than the size of a typical protein molecule [27-29], therefore FM and confocal microscopy might be sufficient for observe whole-cell dynamics or tissue morphology, for example, but are inadequate for studies of organelles, subcellular structures or multi- protein complexes such as the Store-Operated Calcium Influx Complex (SOCIC) [26,28]. 3.1. Resolution limit in microscopy The spatial resolution of an optical system can be defined as the smallest distance between two light emitting points that can be resolved, allowing the identification of two independent objects [26,30]. Under- standing this principle is essential to visualize the complexity involved in breaking the optical diffraction limit barrier. There are numerous criteria which can be used to calculate the res- olution of an optical system. For example, the Abbe limit and the Ray- leigh criterion, both with similar results [31]. Ernst Abbe in nineteenth-century proposed that the optical resolu- tion is fundamentally restricted by the properties of light diffraction, which commonly sets the limit to half the emission wavelength (-4/2), this prevents resolving structures smaller than about half the wave- length of the emitted light[32]. In practice, the resolution limit of a microscope depends on two main factors, the wavelength of light (2 is light in the visible range between 400 nm to 700 nm) and the numerical aperture (NA) of the objective lens [26,33], which can be defined as: NA =nsina here, n is the refractive index of the medium and q is the half-cone angle of the focused light of the objective, NA can be defined in a simple way as the ability of an objective to capture light. Applying a simplified equation based on Abbe principle [26, 30, 33], the resolution of a mi- croscope (d) in terms of the NA of an objective lens is: 4 —2NA On another hand, Lord Rayleigh redefined this equation to produce the Rayleigh criterion for resolution. The Rayleigh principle defines resolution as the shortest distance at which two point emitters can be discerned as two separate objects. In the case of FM (where the objective lens serves also as a condenser), the resolution limit is defined by: d d=0.61 obj Both criteria (Rayleigh and Abbe) are still widely accepted as useful and convenient mathematical treatments for the lateral resolution of FM [26,27,33]. In addition to these criteria, resolution can be quantified by analyzing the point spread function (PSF), defined as the three- dimensional (3D) intensity profiles of the light emitted by an infinitely small point object. In a hypothetical perfect optical system, the PSF is equivalent to the Airy pattern. Resolution can be expressed by the above-mentioned criteria on PSF, for example, the Rayleigh criterion is satisfied when the distance between the images of two neighboring point sources is equal to the width between the maximum peak of the PSF 87 C. Bastian et al. from one source with the minimum peak of the other. The width of the PSF is also used as a measure for the resolution limit of microscopy. However, it is important to know that the width of the PSF can be defined in different ways. For example, a widely accepted measure ¡is the full width at half.maximum (FWHM) that is the width of the central Airy disk at the half of the maximum intensity [30]. Applying the Rayleigh criterion with imaging samples with light (2480 nm), using modern objectives with immersion liquids (oil) to attain maximal NAs (1.49), the best theoretical resolution is 190 nm. However, in a practical condition, the lateral resolution in fluorescence microscopy is lower (around 250 nm). Axial resolution (Zmin) can be defined by the minimum distance that the diffraction images of two points can approach each other along the axis of the microscope, yet still be differentiated as two emitters. Axial resolution is also determined mainly by the NA of the objective and the 4. Thus, Zmin can be calculated by: 24n (Nay min = The axial resolution is about 3 times larger than the lateral resolution for high NA objectives. When imaging with light (2=480 nm), high NA objectives (1.49), and oil (1.5), the theoretical resolution is —650 nm, however in real conditions is usually larger than 700 nm. The resolution calculated for FM or confocal microscopy is enough to study tissues or whole-cell dynamics but is insufficient for study of the vast majority of subcellular structures that are smaller than the wave- length of the light[26,28]. Fortunately, scientists in the two past decades have developed imaging techniques which break the light diffraction limit, allowing access to dimensions near to the electron microscopy resolution[22,29,30,32]. In the following sections we will discuss the main SR techniques and how they help to shape our current knowledge about the different actors involved in initiating, assembling, and controlling SOCE and its components. 4. Super-resolution microscopy There is no consensus on the definition of super-resolution (SR) microscopy, here we defined SR as all the microscopy techniques that overcome the “classical” diffraction limit of optical resolution [29,33]. These techniques conserve the advantages of FM (target specificity, live-cell monitoring) but incessantly are pushing the resolution towards nanometric scale, therefore SRM allows the studying of cells with more detail, often obtaining, with some of these techniques, information to molecular scale[29,32]. A recent study shows that calcium entry through SOCE activates synaptotagmin-1 (E-syt1) resulting in its repositioning 12 nm closer to the plasma membrane [34]. This small movement would not be detectable using traditional confocal microscopy. Surprisingly, E-sytl does not form part of the RE-PM junction but instead facilitates the rearrangement of neighboring ER to form the junctions. E-syt1 sur- rounds the so-called puncta (RE-PM junction) similarly to what we have observed with the SERCA [35]. In our study, we identified the sarco- plasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase 2 (SERCA2) as a new member of the store-operated calcium influx complex (SOCIC) [36]. The SERCA2 is not incorporated into the RE-PM junction but rather forms a ring around the junction ensuring an expedite (and focalized) calcium refilling of the ER. The findings of rings of SERCA decorating the ER-PM junctions provided a feasible explanation for an old observation about calcium entering the cell via SOCE. Initial studies on calcium entry upon depletion of the ER obtained with a preparation of lacrimal gland showed that calcium entry could rapidly refill the ER without a discernible increment in eytosolic calcium [37]. These results suggested that calcium could enter from the extracelular space directly into the Cell Calcium 104 (2022) 102595 ER, bypassing the cytosol. Our finding together with many other relevant observations demonstrated that the rapid refilling of the ER is the result of the structural reorganization of the ER-PM junction and the recruiting of SERCA. IP3R and other members from the SOCIC. In particular, SERCA relocation near the ER-PM junction accelerates ER refilling, although calcium do transit the cytosol [36]. Fig. 1 illustrates the recruitment of the SERCA near the ER-PM junction. The participation of the inositol trisphosphate receptor (IP3R) in modulating store-operated calcium entry (SOCE) was established many years ago. However, the precise role of IP3R in the formation of the ER- PM junction was unknown. A recent study shows that the IP3R de- termines the size of the puncta, by modulating the intraluminal calcium levels at the ER near the ER-PM junction (Fig. 1) [38]. Overexpression of the IP3R provides a reduced intraluminal calcium microenvironment near STIM1, resulting in enhanced activation of Orai currents and SOCE, with the concomitant increase in the size of the ER-PM junction (observed by SR as puncta). Individual puncta were observed using a novel form of total internal reflection microscopy (TIRFM), which pro- vides enhanced resolution over conventional TIRFM, by splitting the excitation and emission optical pathways, while reducing stray light [59]. Combination of SR microscopy and organelle optogenetics has pro- vided relevant information about the spatiotemporal calcium dynamics upon depletion of the ER and activation of SOCE. By expressing a ER- targeted rhodopsin to induce ER calcium depletion with light, Asano and colleagues have shown with great detail the spatiotemporal calcium dynamics in the ER and cytosol upon activation of SOCE [40]. 4.1. Super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM) SR-SIM is considered among the original super-resolution techniques and have been implemented in many different variants, some are two- dimensional SIM (2D-SIM), three-dimensional SIM (3D SIM), total in- ternal reflection fluorescence SIM (TIRF-SIM), coherent SIM, spot scanning SR-SIM, etc. [41-45]. The idea of SR-SIM can be explained with the Moiré fringes, all the implementations utilize periodic interference patterns (structured illu- mination), such as nonhomogeneous illuminations with known spatial patterns (originally a sinusoidal grid, however other distributions also are used) [46], which generates interferences with the high frequency variations in the fluorescence caused by the small structures in the sample producing lower frequency Moiré interference pattern[30], different orientations and phases are registered and finally because the illumination pattern is known, the original sample frequencies can be mathematically calculated from the recorded lower frequency Moiré pattern (inverse Fourier transform) producing the super-resolution im- ages[26]. Other SR-SIM alternatives approaches use photon reassignment mi- croscopy such as image scanning microscopy (ISM), rescan confocal microscopy, etc. [17]., however, the physical principles are the same [22,41]. The spatial resolution in SR-SIM is improved 2X in all the three di- mensions (—100 nm lateral and —300 nm axial) and despite other SR methods having more spatial resolution in comparison to SR-SIM, this is still the best option for SR imaging of live samples, particularly in 4D applications[23,41]. SR-SIM is one of the SR microscopy techniques most frequently used (and perhaps one of the most accessible) because the design is based often on widefield configuration, facilitating the use of conventional fluorescence microscopes [26]. SR-SIM can be applied to samples pre- pared for FM because does not require special fluorochromes to improve the resolution [47,48], this helps to acquire multicolor images (typically three or four color channels) [22]. Moreover, conventional excitation light sources can be used to acquire images, resulting in less photo- damage in comparison to other SR techniques [33]. 88 C. Bastian et al. A Endogenous IP3R (puncta of typical size) Average Average (3D) Endogenous -13 pa 77 Overexpressed IP3R O A Fl uo re sc en ce in te ns it y (A U) Cell Calcium 104 (2022) 102595 Fig. 1. Schematic representation of the effect on the ER-PM junction of the overexpression of the IPSR. A, Cartoon illustrating the ER-PM junction with the SERCA and the IPSR in close proximity to STIM1. Under these conditions the intraluminal calcium at the ER is low and therefore the ER-PM junction is formed. B, Cartoon illustrating the ef- fect of the overexpression of the IP3R on the size of the ER-PM junction (puncta) and the intraluminal calcium concentration. Under these conditions with high expression of the IP3R the size of the puncta is larger, and the intraluminal calcium is very low, compared to the condition where the IP3R is endogenous. C, effect of overexpressing the IP3R on the size of the puncta. The image shows the average of at least 120 individual punctum obtained from 15 independent transfections with the IP3R (for details please refer to [38]). Average 3D shows the fluorescence intensity represented in the third axes as the depth of image. Thus image height shows the intensity of fluorescence. 89 C. Bastian et al. Using SR-SIM a recent study has identified Septin7 as a modulator of Orai channels [49]. Septins are GTP-binding proteins that function as diffusion barriers in cells. Thus, septins play key roles in cellular cyto- skeleton organization. Most surprisingly, Septin7 can activate Orai and SOCE without ER store depletion [19]. Knockdown of Septin7 increases spontaneous calcium entry in human neurons [50]. Septin7 modulates SOCE via association of its N-terminal domain to Orai channels [50]. The identification of the role of Septin7 in SOCE in human neural pro- genitor cells and neurons was possible, in part, thanks to the use of fluorescently labelled Septin7, Orai observed with SR-SIM [50]. Another study, using SIM demonstrates that STIMI is required for dynamic EB localization and the remodeling of microtubules and ER [51]. 4.2. Single-molecule localization microscopy (PALM/STORM) Single-molecule localization microscopy (SMLM) is a group of computational-based microscopy techniques that instead of detecting the fluorescence signal of all fluorophores in a sample, detect single fluorescence, as the name suggests, molecule by molecule[33, 52, 53]. The main principle of SMLM is that the position of a spatially isolated fluorophore can be determined with great accuracy, an isolated point spread function (PFS) can be approximated by a Gaussian intensity distribution, allowing the determination of the exact center of a single emitter [26,54],. The necessary separation of fluorophores is done by the temporal confinement of fluorescence emission, using fluorophores that exhibit stochastic photo-switching, photo-activation, photo-convertibility or binding reversibly to a target structure. Alter- natively, blinking can be achieved by the transient interaction between two short DNA sequences, one labeled and one unlabeled (a method known as DNA painting)[22,52,55,56]. The use of STORM was essential to demonstrate that STIM1 traf- ficking relies on microtubule dynamics, the microtubule end binding protein (EB1) is required for correct STIM1 trafficking [57]. STORM shows the spatiotemporal association of STIM1 to the microtubule EB1 protein at nanometer scales [57]. Another study with STORM described that cathepsin inhibition decreases the colocalization between STIM1 and EB1 [58]. The results show that mutations in STIM1 which alter microtubule dynamics may have profound effects on cancer and calcium signaling. A recent study took advantage of STORM to illustrate the clustering and functional coupling of a variety of ionic channels including TRPV1 with G-protein coupled receptors and kinases [59]. All these proteins form macromolecular complexes to expedite cellular signaling and to restrict the signal to confine spaces within the cell. The clustering of TRPV1 with components from SOCE is a rather interesting observation, since we have recently shown that calcium entering individual TRPV1 channels is sufficient to induce calcium-dependent inactivation of Orail [60]. This inactivation takes place while TRPV1 and Orail diffuse freely at the plasma membrane [60]. Another study revealed that in cardiomyocytes, functional SOCE sites and the corresponding molecular complexes of STIM1-Orail are enriched at discrete regions located in the intercalated discs (IDs) [61]. Furthermore, redistribution of STIM1 and ORAI1 from interior regions to the IDs resulted in augmented SOCE in myocytes from arrhythmia-prone (CPVT) hearts [61]. Using proximity ligation and STORM a recent study identified the role of Junctophilin-4 in facilitating the convey of inflammatory signaling pathways at the ER-PM junctions in sensory neurons [62]. Junctophilin-4 (JPH4) is a member of the junctophilin family, these proteins are found in all excitable cells from striated muscle to neurons. Interestingly, data obtained with FRAP and PALM demonstrate that septin4 promotes ER-PM junctions that enhance the STIM1 and Orail interactions [63]. Moreover, STORM data support the interaction of STIM1 with the BAR domain superfamily member bridging integrator 2 (BIN2), this association is important for the role of BIN2 as central regulator of platelet activation [64]. Cell Calcium 104 (2022) 102595 4.3. STED Stimulated emission depletion (STED) microscopy is one of the techniques in super-resolution microscopy. It creates super-resolution images by the selective deactivation of fluorophores, minimizing the area of illumination at the focal point and therefore reducing the point spread function (PFS). This technique gained attention for the high resolution attained, earning the Nobel Prize in chemistry to its inventor Dr. Stefan W. Hell in 2014. The endoplasmic reticulum (ER) is a very dynamic organelle, rather than being considered as a single compartment, one must consider the sophisticated network arrangement of the ER. This complex and dy- namic arrangement of the ER has been explored only recently due to the complex spatiotemporal changes of the ER network which are difficult to resolve using conventional microscopy. A recent study using STED has shown just how complex and dynamic the ER is by surveying the dy- namic nanoscale morphology changes [65]. One of the most impressive findings is the fact that rapidly moving ER tubules where originally mistaken for sheets by conventional light microscopy [65]. These novel findings invite us to revisit the classical view of the ER, and most importantly, the dynamic association of this organelle with other membranes, including the plasma membrane and the role of such in- teractions in the formation of nanodomains. The role of the ER remolding via microtubules and the participation of STIMI1 in this pro- cess was described earlier in a compelling study [66]. In this study, it was demonstrated that STIM1 is indeed a bona fide microtubule plus-end tracking protein. The constant remodeling of the ER, particu- larly near the plasma membrane, via ER-derived tubules is essential for SOCE activation, as we and others have shown [35,66-70,35]. STED was one of the first super-resolution methods used to identify the mechanism by which STIM1 reunites several Orail channels at the ER-PM junction to initiate calcium entry upon depletion of the ER [71]. In this elegant study, Yandong Zhou and colleagues showed that a cross-linking of Orail monomers was induced by STIM1 to form a functional calcium entry channel [71]. More recently, STED identified STIM2 as the molecule responsible for activating SOCE upon depletion of the ER in neurons [72]. This study showed that SOCE is mediated by STIM2 and drives neurotransmitter release through syt7 [72]. In hippocampal neurons, ER calcium deple- tion increases presynaptic calcium levels via SOCE and glutamate release through a pathway dependent on STIM2. This finding is most interesting and surprising since many of the studies on SOCE show that STIM1 is the molecule responsible for Orail activation. Using time-lapse FRET imaging with TIRF microscopy and ground- state depletion (GSD) super-resolution (SRM) imaging a recent study has identified that two nonsteroidal anti-inflammatory drugs (Aspirin and Sulindac) exert their effects by inhibiting SOCE via different mechanisms [73]. This finding is relevant for the treatment of different inflammatory diseases [73]. Using a new form of depletion microscopy known as GSDIM (ground state depletion microscopy followed by individual molecule return), a recent study identified the role of STIM1 in governing the contractility of vascular smooth muscle cells [74]. The study highlights the role of STIM1 in controlling sarcoplasmic reticulum (SR) and plasma mem- brane (PM) junctions and the assembly of the Store-Operated Calcium Influx Complex (SOCIC) at the SR-PM sites. These findings were rein- forced by analyzing tissue obtained from STIM1-knockout (Stim1-- smKO) mice [74]. Using STED in different studies, it was possible to define with greater clarity concepts like local calcium signals and calcium microdomains [75]. Complex supramolecular microdomains involving the local mod- ulation of calcium, phospholipids [75], RYR [76] and even cAMP [77] has been possible using STED and other SR imaging techniques. Using SR and other high-resolution imaging techniques, we have shown that adenylyl cyclase (AC8) directly controls its micro-environment by modulating the reorganization of the cytoskeleton in a very dynamic 90 C. Bastian et al. way [77]. Furthermore, we have shown that the N-terminus of AC8 is responsible for redistributing actin filaments near the PM [77]. The microdomains near the PM generated by AC8 facilitate the synchronous elevation of local calcium and cAMP as a result of direct binding be- tween Orai channels and AC8 [78]. 4.4. Fluctuation based super-resolution microscopy Fluorescence fluctuations-based super-resolution microscopy (FF- SRM) is an emerging field promising live-cell compatible imaging beyond the light diffraction limit. There are a handful of techniques derived from FF-SRM. For a comprehensive review of the different methods used for FF-SRM refer to [79,80]. Using super-resolution optical fluctuation imaging (SOFI, a form of A -Capsaicin Cell Calcium 104 (2022) 102595 FF-SRM) a study shows the nanoscale organization of SOCIC in living cells [81]. Most interestingly, the study shows that SOCE activation increases the number, rather than the size, of STIM1-Orail puncta. There appears to be a control governing the maximum puncta size. We have recently shown that such control might be the local calcium con- centration, since we can increase the puncta size by overexpressing the IP3 receptor (IP3R) and thus drastically reducing the local intraluminal (ER) calcium in closed proximity to the puncta where the SOCIC is being assembled [38]. The enhanced reduction of ER intraluminal calcium in nanodomains near the ER-PM junction results in larger puncta. Even when under these conditions the puncta are larger, still there appears to be a limit to which puncta can grow. The mechanisms controlling and limiting the maximum puncta size remain largely unexplored to this date. +Capsaicin Thapsigargin Re la ti ve cu rr en t 0 200 400 Time (ms) Orail + Capsaicin Orail Orail + Capsaicin + BAPTA 600 Fig. 2. Calcium entering via individual TRPV1 channels inactivate neighboring Orail channels. A, Schematic representation of the association between individual TRPV1 and Orail channels. Activation of TRPV1 with capsaicin results in the influx of calcium, which provokes calcium-dependent inactivation of the neighboring Orail. Association of single TRPV1 and Orail channels was demonstrated by SFFR analysis [60]. B, Data shows the mean + standard deviation of whole cell inward currents produced by Orail channels in the absence (red) and presence (black) TRPV1 channels activated with capsaicin. Notice how current inactivation is greatly increased when TRPV1 channels are activated with capsaicin. To demonstrate that the Orail inactivation is produced by the calcium entering TRPV1 channels, cells were incubated with the calcium chelator BAPTA (green). Under these conditions, Orail current inactivation is greatly reduced, even when TRPV1 channels were activated with capsaicin. For additional results and control experiments please refer to [60]. 91 C. Bastian et al. Using Super-Resolution Radial Fluctuation (SRRF) analysis, we have recently shown that Orai associates and travels the PM in close prox- imity to TRPV1 channels [60]. Calcium entering via the TRPV1 channel induces calcium-dependent inactivation of neighboring Orai channels (Fig. 2A) [60]. Using SRRF we identified single TRPV1 and single Orai interacting at the PM of living cells [60]. The calcium-dependent inactivation of Orai channels is an essential mech- anism to prevent cell damage for exaggerated calcium influx through Orail channels (Fig. 2B). As far as we know, this was the first study using SR to identify single ion channels interacting at the PM of living cells and affecting the function of each other by this interaction. Furthermore, the dynamics of the interactions of single Orail and TRPV1 channels could be monitored over time with high temporal resolution. This would have been impossible to resolve using electron microscopy or conventional optical microscopy methods. Recently, we have extended the use of SRRF to study single TRPV1 channels (Fig. 3AB). By creating a fusion protein consisting of the GECI (Genetically Encoded Calcium Indicator) calcium sensor (we used the GCaMP 5A [82]) attached to the carboxyl terminal domain from the TRPV1 channel (TRPV1-GECI), we have observed local calcium in- crements resulting from the opening of individual TRPV1 channels diffusing freely at the PM of a living cell (Fig. 3C). TRPV1 channel activation was achieved by perfusing the cell with capsaicin (8-meth- yl-N-vanillyl-6-nonenamide), an active component of chili peppers, and a natural activator of this channel (Fig. 3C). As illustrated in this figure, individual TRPV1-GECI channels are monitored at the PM of a living cell and increments in fluorescence intensity are observed after capsaicin application (Fig. 3C). Measuring the fluorescence from many individual TRPV1-GECI channels shows clearly that the increment occurs after capsaicin application (Fig. 3D). The combination of TIRFM and SRRF provide a relatively inexpensive approach to SR without the use of special fluorophores or complex confocal systems like those required for STED and other SR methods. This method facilitates the use of geneti- cally encoded fluorescent indicators, providing the opportunity to target proteins to desired compartments or regions of the cell. channels 5. SC-SMD (Single channel-single molecule determinations) SC-SMD method combines two powerful technologies: single- channel electrophysiological measurements and single-molecule de- terminations, a powerful new method we have developed for the study of ionic channels and in particular for transient receptor potential (TRPC) channels [83,84]. Although this technique relies on electro- physiological measurements, it may be considered as part of SR micro- scopy because uses also single-molecule imaging to determine single-channel stoichiometry and functionality of individual channels. Using this novel method, we have identified the stoichiometry of the entire TRPC family of channels and went to show that all form tetramers as a functional channel unit [83]. Unfortunately, SC-SMD cannot be utilized with Orai channels since the channel conductance is below the resolution limit of single-channel electrophysiological recordings. This method only works with channels whose conductance is resolvable with the patch clamp technique. Recently we have used the fusion protein TRPV1-GECI to illustrate the correlation between local calcium increments via single TRPV1 channels and channel activity via single channel electrophysiological recordings. As illustrated in Fig. 4, using our SC-SMD system (Fig. 4A) in patches of membrane obtained from cells expressing the fusion protein TRPV1-GECI (Fig. 4B), we measured the fluorescence emitted by the GECI attached to the TRPV1 channel and correlated fluorescence in- crements with single channel currents (Fig. 4CD). A clear correlation in the time courses of cumulative single channel currents (black line) and fluorescence integral (red line) from individual channels is observed, when plotting side to side both measurements from several independent experiments (Fig. 2E). Worth highlighting is the fact that increments in fluorescence from individual TRPV1-GECI channels and single channel Cell Calcium 104 (2022) 102595 currents is triggered by the application of capsaicin. Video 1 ¡llustrates a typical time course of fluorescence and single channel currents obtained with the SC-SMD system with the TRPV1-GECI channel. Notice the correlation between channel opening and the increment of fluorescence reported by the GECI in the TRPV1-GECI fusion protein after capsaicin application. A similar method was developed by Weatherill and Wallace [85] in 2015. However, SC-SMD attains higher signal-to-noise ratios because we use the patch pipette as a light guide to propagate an evanescence wave through the glass pipette (Fig. 2A), resulting in total internal reflection fluorescence illumination at the tip of the patch pipette [83]. This results in restricted illumination near the patch of the membrane containing the channel of interest. Using the patch pipette as a light guide allows the separation of the excitation and emission, reducing stray light and improving the signal-to-noise ratio. For a detail explanation of the principles of SC-SMD please refer to [83,84]. 6. Conclusions The use of a variety of SR microscopy techniques has broadened our understanding of the complex interplay between cytoskeleton, cellular microdomains and ion channel organization to modulate SOCE. While understanding SOCE dynamics we have learnt also novel properties and uncovered a new structural organization of the ER. SOCE activation requires a profound reorganization of specialized areas of the ER and the PM, by forming the so-called ER-PM junctions. The direct visualization of these junctions would have not been possible using conventional microscopy methods, because of the diffraction limit imposed on con- ventional optical microscopy. The rapid advancement of SR microscopy and the constant devel- opment of novel methods to improve spatial or temporal resolutions will provide, without a doubt, new insights into the complex relationship between cytoskeleton reorganization and calcium signaling. Broadening our understanding about SOCE and the multiple molecular mechanisms controlling it may help in the development of novel therapies for dis- eases where calcium signaling is altered. The future of SR microscopy is bright and enlightening, and many groups around the world are engaged in developing new alternatives in this highly dynamic area. Computational methods such as SRRF, SOFI and others in combination with TIRFM and epifluorescence microscopy will help to broaden the use of SR, by eliminating the need of acquiring expensive equipment. Author contributions CB, AS, MOB, AG and LV wrote the manuscript. CB and LV coordi- nated the final edits. CB, AG and LV produced the figures. All authors approved the final version of the manuscript. Supplementary materials Video 1. Time course of a typical SC-SMD experiment with TRPV1- GECI. The upper panel shows the fluorescence generated by the TRPV1- GECI fusion protein. The green Genetically Encoded Calcium Indicator (GECI) was fused to TRPV1 at its carboxyl terminus end. GECI is based on GCaMP 5 [82]. Fluorescence intensity is presented in pseudo-color using the scale shown at the right of the video (arbitrary units from 0 to 100). Excitation was 450 nm and emission collected at 515 nm. The Ixon EMCCD camera (Oxford Instruments) was used for image acquisi- tion. The lower panel shows the single channel activity before and after stimulation with capsaicin. White arrow shows the closed (zero current) level. Downward deflections indicate channel openings. Amplitude scale shows 5 pA. Time scale shows a total of 1 min and 19 s. Video images and single channel current are acquired simultaneously (for a detail description of the SC-SMD system please refer to [83,84]). 92 C. Bastian et al. Cell Calcium 104 (2022) 102595 A EW Cell Coverslip TRPV1-GECI channels TIRFM B SRRF analysis iffracti SRRF difítaction limited enhanced resolution — superresolved >. + Y e: E NI. ol=ls x «he ele > x% Timón interpolation radiality temporal analysis transformation Resolution: -250 nm 170 nm - 50 nm TRPV1 (TIRFM) TRPV1 (SRRF) C Resolution: 245 nm -41 nm Time (s) 0 20 40 60 200 nm e o D N 4 UU o IS] e o Capsaicin 2 S 100 u o Fl uo re sc en ce in te ns it y (A U) T T T T T T T T 0 10 20 30 40 50 60 70 Time (s) Fig. 3. Combination of TIREM and Super-Resolution Radial Fluctuation (SRRE) analysis for the study of individual TRPV1 channels. A, typical TIRFM experiment using cells expressing the fusion protein TRPV1-GECI. B, schematic representation of the SRRF analysis of images acquired with TIRFM. C, typical SRRF result of individual TRPV1-GECI channel fluorescence before and after capsaicin application. Capsaicin applied at second 9. D, time course of fluorescence of many individual TRPV1-GECI channels as those illustrated in the panels on C. Data shows the mean =+ standard deviation of individual fluorescence spots (single TRPV1-GECI channels) obtained after SRRF analysis. Arrow indicates time of capsaicin application. 93 C. Bastian et al. Cell Calcium 104 (2022) 102595 Fiber optics cable B TRPV1 closed TRPV1 open Electrode, Patch clamp pipette IO Optical traps Excitation light TRPV1 channel C 100 03 E OOOO AN J3) Ar Lo D Capsaicin 10 seconds es p20 2 6000 A s S E FIS o 2 o E 4000 Capsaicin > 8 HIO E 8 £ 3 2000 Ls 3 DH E S 3 E o a HO T T T T T T 0 10 20 30 40 50 60 Time (seconds) Fig. 4. SC-SMD measurements correlating local increments in calcium with single TRPV1 channel activity. A, Schematic representation illustrating the configuration of the SC-SMD system. B, cartoon illustrating the configuration of the patch clamp with the TRPV1-GECI with and without capsaicin application (via a second pipette illustrated in red). C, fluorescence signal produced by a single TRPV1-GECI fusion channel in response to capsaicin application. Fluorescence emitted by the GECI fused to the c-terminal domain from TRPV1 is synchronized with the electrophysiological single channel recording (D) in the SC-SMD system. D, single channel currents measured with the SC-S5MD system. GECI fluorescence (C) and channel currents (D) are measured simultaneously. Arow indicates the time of capsaicin application. E, Fluorescence integral (shown in red) and cumulative single channel activity (shown in black) obtained from 5 independent SC-SMD experiments like the one illustrated in panels C and D. For a detail explanation of the SC-SMD system please refers to [83]. 94 C. Bastian et al. Declaration of Competing Interest The authors declare no conflict of interest. Acknowledgements This work was partially supported by grants IN201319 and AV200320 from the Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA) to LV. CB (CVU 486558) performed this study in partial fulfillment of the requirements for the PhD in Programa de Maestría y Doctorado en Ciencias Bioquímicas at the Universidad Nacional Autónoma de México and he was a recipient of PhD fellowship (277682) from The Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT). Supplementary materials Supplementary material associated with this article can be found, in the online version, at doi:10.1016/j.ceca.2022.102595. References [1] J. Pacheco, L. Vaca, A microscopic view of the store-operated calcium entry- pathway, ISRN Cell Biol. 2013 (2013) 1-13, https://doi.org/10.1155/2013/ 237192. [2] Y. Baba, M. Matsumoto, T. Kurosaki, Calcium signaling in B cells: regulation of eytosolic Ca2+ increase and its sensor molecules, STIM1 and STIM2, Mol. Immunol. 62 (2014) 339-343, https: //doi.org/10.1016/j.molimm.2013.10.006, [3] M. Yamashita, L. Navarro-Borelly, B.A. MeNally, M. Prakriya, Orail mutations alter ¡on permeation and Ca 2+ «dependent fast inactivation of CRAC channels: evidence for coupling of permeation and gating, J. Gen. Physiol. 130 (2007) 525-540, https://doi.org/10.1085/jgp.200709872. [4] A. Bokhobza, N. Ziental-Gelus, L. Allart, O. lamshanova, F. Vanden Abeele, Impact of SOCE abolition by Orail knockout on the proliferation, adhesion, and migration of HEK-293 cells, Cells 10 (2021), https://doi.org/10.3390/cells10113016. B. Darbellay, S. Arnaudeau, S. Kónig, H. Jousset, C. Bader, N. Demaurex, L. Bernheim, STIM1- and Orail-dependent store-operated calcium entry regulates human myoblast differentiation, J. Biol. Chem. 284 (2009) 5370-5380, https:// doi.org/10.1074/jbc.M806726200. [6] P.J. Shaw, S. Feske, Regulation of lymphocyte function by ORAI and STIM proteins in infection and autoimmunity, J. Physiol. 590 (2012) 4157-4167, https://doi.org/ 10.1113/jphysiol.2012.233221. N. Zhang, H. Pan, X. Liang, J. Xie, W. Han, The roles of transmembrane family proteins in the regulation of store-operated Ca2+ entry, Cell. Mol. Life Sci. 79 (2022) 1-13, https://doi.org/10.1007/500018-021-04034-y. [8] A. Jairaman, M. Prakriya, Molecular pharmacology of store-operated CRAC channels, Channels 7 (2013) 402-414, https://doi.org/10.4161/chan.25292. [9] S.M. Emrich, R.E. Yoast, M. Trebak, Physiological functions of CRAC channels, Annu. Rev. Physiol. 84 (2022) 355-379, https://doi.org/10.1146/annurev- physiol-052521-013426. [10] J.W. Putney, J.W. Putney, A model for receptor-regulated calcium entry, Cell Calcium 7 (1986) 1-12, https://doi.org/10.1016/0143-4160(86)90026-6. [11] H. Takemura, J.W. Putney, Capacitative calcium entry in parotid acinar cells, Biochem. J. 258 (1989) 409-412, https://doi.org/10.1042/bj2580409. [12] J.W. Putney, A personal journey, Cell Calcium 72 (2018) 127-131, hattps://doi. org/10.1016/j.ceca.2018.05.004. [13] J. Roos, P.J. DiGregorio, A.V. Yeromin, K. Ohlsen, M. Lioudyno, S. Zhang, O. Safrina, J.A. Kozak, S.L. Wagner, M.D. Cahalan, G. Velicelebi, K.A. Stauderman, G. Veli??elebi, K.A, Stauderman, STIM1, an essential and conserved component of store-operated Ca2+ channel function, J Cell Biol 169 (2005) 435-445, lttps:// doi.org/10.1083/jcb.200502019, [14] J. Liou, M.L. Kim, D.H. Won, J.T. Jones, J.W. Myers, J.E. Ferrell, T. Meyer, STIM is a Ca2+sensor essential for Ca2++-store- depletion-triggered Ca2+influx, Curr. Biol. 15 (2005) 1235-1241, Ixttps://doi.org/10.1016/j.cub.2005.05.055. [15] P.B. Stathopulos, L. Zheng, G.-.Y. Li, M.J. Plevin, M, Ikura, Structural and mechanistic insights into STIM1-mediated initiation of store-operated calcium entry, Cell 135 (2008) 110-122, https://doi.org/10.1016/j.cell.2008.08.006. [16] S. Feske, Y. Gwack, M. Prakriya, S. Srikanth, S.-H.H. Puppel, B. Tanasa, P. G. Hogan, R.S. Lewis, M. Daly, A. Rao, A mutation in Orail causes immune deficiency by abrogating CRAC channel function, Nature 441 (2006) 179-185, https://doi.org/10.1038/nature04702. [17] A.V. Yeromin, S.L. Zhang, W. Jiang, Y. Yu, O. Safrina, M.D. Cahalan, Molecular identification of the CRAC channel by altered ion selectivity in a mutant of Orai, Nature 443 (2006) 226-229, nature05108 [pii]10.1038/nature05108. [18] M.M. Wu, R.M. Luik, R.S. Lewis, Some assembly required: constructing the elementary units of store-operated Ca2+ entry, Cell Calcium 42 (2007) 163-172, https://doi.org/10.1016/j.ceca.2007.03.003. [s: 7. 10 9 p20] Ru [22] [23] 124] [25] [26] 7 [28] [29] [30] Eu [32] [33] [34] [35] [36] 37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] 144] [as] [46] Cell Calcium 104 (2022) 102595 S. Weiss, Shattering the diffraction limit of light: a revolution in fluorescence microscopy? Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (2000) 8747-8749, https://doi.org/ 10.1073/pnas.97.16.8747. M. Prakriya, R.S. Lewis, Potentiation and inhibition of Ca(2+, release-activated Ca (2+) channels by 2-aminoethyldipheny] borate (2-APB) occurs independently of IP (3) receptors, J. Physiol. 536 (2001) 3-19, https://doi.org/10.1111/j.1469 7793.2001.101-1-00003.x. D. Leon-Aparicio, J. Pacheco, J. Chavez-Reyes, J.M. Galindo, J. Valdes, L. Vaca, A. Guerrero-Hernandez, Orai3 channel is the 2-APB-induced endoplasmic reticulum calcium leak, Cell Calcium 65 (2017) 91-101, https://doi.org/10.1016/ j.ceca.2017.01.012. G. Jacquemet, A.F. Carisey, H. Hamidi, R. Henriques, C. Leterrier, The cell biologist's guide to super-resolution microscopy, J. Cell Sci, 133 (2020), https: // doi.org/10.1242/jc5.240713. X. Wang, J. Wang, X. Zhu, Y. Zheng, K. Si, W. Gong, Super-resolution microscopy and its applications in neuroscience, 10 (2017) 1-11. 10.1142/ $1793545817300014. J.W. Lichtman, J.-.A. Conchello, Fluorescence mieroscopy, Nat. Methods. 2 (2005) 910-919, https://doi.org/10.1038/nmeth817. J. Jonkman, C.M. Brown, G.D. Wright, K.I. Anderson, A.J. North, Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy, Nat. Protoc. 15 (2020) 1585-1611, https://doi.org/10.1038/541596-020-0313-9 J. Vangindertael, R. Camacho, W. Sempels, H. Mizuno, P. Dedecker, K.P.F. Janssen, An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist, Methods Appl. Fluoresc. 6 (2018), https://doi.org/10.1088/2050-6120/ anaeOc. B. Huang, M. Bates, X. Zhuang, Super-resolution flourescence microscopy, Annu. Rev. Biochem. 78 (2009) 993-1016, https://doi.org/10.1146/annurev. biochem.77.061906.092014. C.G. Galbraith, J.A. Galbraith, Super-resolution mieroscopy at a glance, J. Cell Sci. 124 (2011) 1607-1611, https://doi.org/10.1242/jc5.080085, L. Schermelleh, A. Ferrand, T. Huser, C. Eggeling, M. Sauer, O. Biehlmaier, G.P. C. Drummen, Super-resolution microscopy demystified, Nat. Cell Biol. 21 (2019) 72-84, https://doi.org/10.1038/541556-018-0251-8. E. Sezgin, Super-resolution optical microscopy for studying membrane structure and dynamics, J. Phys. Condens. Matter. (2017) 29, https://doi.org/10.1088/ 1361-648X/aa7185. 5. Cox, Super-resolution imaging in live cells, Dev. Biol. 401 (2015) 175-181, https://doi.org/10.1016/j.ydbio.2014.11.025, S.J. Sahl, S.W. Hell, S. Jakobs, Fluorescence nanoscopy in cell biology, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18 (2017) 685-701, https://doi.org/10.1038/nrm.2017.71. J.A. Thorley, J. Pike, J.Z. Rappoport, Super-resolution microscopy: a comparison of commercially available options, Fluoresc. Microsc. Super-Resolution Other Nov. Tech (2014) 199-212, 10.1016/B978-0-12-409513-7.00014-2. F. Kang, M. Zhou, X. Huang, J. Fan, L. Wei, J. Boulanger, Z. Liu, J. Salamero, Y. Liu, L. Chen, E-sytl re-arranges STIM1 clusters to stabilize ring-shaped ER-PM contact sites and accelerate Ca2+ store replenishment, Sci. Rep. 9 (2019) 3975, https:// doi.org/10.1038/541598-019-40331-0. A. Sampieri, A. Zepeda, A. Asanov, L. Vaca, Visualizing the store-operated channel complex assembly in real time: identification of SERCA2 as a new member, Cell Calcium 45 (2009) 439-446, https://doi.o18/10.1016/j.ceca.2009.02.010. L. Vaca, SOCIC: the store-operated calcium influx complex, Cell Calcium 47 (2010) 199-209, https://doi.org/10.1016/j.ceca.2010.01.002. R.J. Parod, J.W. Putney, Stimulus-permeability coupling in rat lacrimal gland, Am. J. Physiol. Liver Physiol. 239 (1980) G106-G113, https://doi.org/10.1152/ ajpgi.1980.239.2.G106. A. Sampieri, K. Santoyo, A. Asanov, L. Vaca, Association of the IP3R to STIM1 provides a reduced intraluminal calcium microenvironment, resulting in enhanced store-operated calcium entry, Sci. Rep. 8 (2018) 13252, https://doi.org/10.1038/ 541598-018-31621-0. A. Asanov, A. Zepeda, L. Vaca, A novel form of total internal reflection fluorescence microscopy (LG-TIRFM) reveals different and independent lipid raft domains in living cells, Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Biol. Lipids. 1801 (2010) 147-155, https://doi.org/10.1016/j.bbalip.2009.10.004. T. Asano, H. Igarashi, T. Ishizuka, H. Yawo, Organelle Optogenetics, Direct manipulation of intracellular Ca2+ dynamics by light, Front. Neurosci. 12 (2018) 561, https://doi.org/10.3389/fnins.2018.00561. Y. Wu, H. Shrofí, Faster, sharper, and deeper: structured ¡llumination microscopy for biological imaging, Nat, Methods. 15 (2018) 1011-1019, https://doi.org/ 10.1038/541592-018-0211-2. A. Zhovmer, C.A. Combs, A step-by-step guide to instant structured ¡llumination microscopy (iSIM), Methods Mol. Biol. 2304 (2021) 347-359, 10.1007/978-1 0716-1402-0 19. J. Demmerle, C. Innocent, A.J. North, G. Ball, M. Miiller, E. Miron, A. Matsuda, l. M. Dobbie, Y. Markaki, L. Schermelleh, Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy, Nat. Protoc. 12 (2017) 988-1010, https://doi.org/10.1038/nprot.2017.019. J. Mertz, Optical sectioning microscopy with planar or structured ¡llumination, Nat, Methods. 8 (2011) 811-819, https://doi.org/10.1038/nmeth.1709, M.F. Langhorst, J. Schaffer, B. Goetze, Structure brings clarity: structured illumination microscopy in cell biology, Biotechnol. J. 4 (2009) 858-865, https:// doi.org/10.1002/biot.200900025. A.G. Godin, B. Lounis, L. Cognet, Super-resolution microscopy approaches for live cell imaging, Biophys. J. 107 (2014) 1777-1784, https://doi.org/10.1016/j. bpj.2014.08.028. 95 C. Bastian et al. [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] R. Heintzmann, T. Huser, Super-resolution structured illumination microscopy, Chem. Rev. 117 (2017) 13890-13908, https://doi.org/10.1021/acs. chemrev.7b00218, M. Yamanaka, N.l. Smith, K. Fujita, Introduction to super-resolution microscopy, Microscopy 63 (2014) 177-192, hattps://doi.org/10.1093/jmicro/dfu0o7. B.K. Deb, T. Pathak, G. Hasan, Store-independent modulation of Ca 2+ entry through Orai by septin 7, Nat. Commun. 7 (2016), https: //doi.org/10.1038/ ncomms11751, B.K. Deb, P. Chakraborty, R. Gopurappilly, G. Hasan, SEPT? regulates Ca2+ entry through Orai channels in human neural progenitor cells and neurons, Cell Calcium 90 (2020), 102252, https://doi.org/10.1016/j.ceca.2020.102252. M, Pavez, A.C. Thompson, H.J. Arnott, C.B. Mitchell, I. D'Atri, E.K. Don, J. K. Chilton, E.K. Scott, J.Y. Lin, K.M. Young, R.J. Gasperini, L. Foa, STIM1 is required for remodeling of the endoplasmic reticulum and microtubule eytoskeleton in steering growth cones, J. Neurosci. 39 (2019) 5095-5114, https:// doi.org/10.1523/JNEUROSCI.2496-18.2019. M, Sauer, M. Heilemann, Single-molecule localization microscopy in eukaryotes, Chem. Rev. 117 (2017) 7478-7509, https://doi.org/10.1021/as. chemrev.6b00667. G. Huszka, M.A.M. Gijs, Super-resolution optical imaging: a comparison, Micro Nano Eng 2 (2019) 7-28, https://doi.org/10.1016/j.mne.2018.11.005. B.O. Leung, K.C. Chou, Review of super - Resolution fluorescence microscopy for biology, Appl. Spectrosc. 65 (2011) 967-980, https: //doi.org/10.1366/11-06398. L. Schermelleh, R. Heintzmann, H. Leonhardt, A guide to super-resolution fluorescence microscopy, J. Cell Biol. 190 (2010) 165-175, https://doi.org/ 10.1083/jcb.201002018. R. Jungmann, M.S. Avendaño, J.B. Woehrstein, M. Dai, W.M. Shih, P. Yin, Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange- PAINT, Nat. Methods. 11 (2014) 313-318, https://doi.org/10.1038/nmeth.2835. Y.-.T. Huang, Y.-.T. Hsu, Y.-.F. Chen, M.-.R. Shen, Super-resolution microscopy reveals that stromal interaction molecule 1 trafficking depends on microtubule dynamics, Front. Physiol. 12 (2021), 762387, https://doi.org/10.3389/ fphys.2021.762387. H.H. Lin, S.J. Chen, M.R. Shen, Y.T. Huang, H.P. Hsieh, S.Y. Lin, C.C. Lin, W.S. W. Chang, J.Y. Chang, Lysosomal cysteine protease cathepsin S is involved in cancer cell motility by regulating store-operated Ca2-+ entry, Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. 1866 (2019), 118517, hxttps://doi.org/10.1016/). bbamer.2019,07.012. J. Zhang, C.M. Carver, F-S. Choveau, M.S. Shapiro, Clustering and functional coupling of diverse ion channels and signaling proteins revealed by super- resolution STORM microscopy in neurons, Neuron 92 (2016) 461-478, hxttps://doi. org/10.1016/j.neuron.2016.09.014. C.E.C.E. Bastián-Eugenio, A. Bohórquez-Hernández, J. Pacheco, A. Sampieri, A. Asanov, J.P.J.P. Ocelotl-Oviedo, A. Guerrero, A. Darszon, L. Vaca, Heterologous calcium-dependent inactivation of Orail by neighboring TRPV1 channels 'modulates cell migration and wound healing, Commun. Biol. 2 (2019) 88, lxttps:// doi.org/10.1038/542003-019-0338-1. LM. Bonilla, A.E. Belevych, S. Baine, A. Stepanov, L. Mezache, T. Bodnar, B. Liu, P. Volpe, S. Priori, N. Weisleder, G. Sakuta, C.A. Carnes, P.B. Radwaúski, R. Veeraraghavan, S. Gyorke, Enhancement of cardiac store operated calcium entry (SOCE) within novel intercalated disk microdomains in arrhythmic disease, Sci. Rep. 9 (2019) 10179, https://doi.org/10.1038/541598-019-46427-x. A. Hogea, S. Shah, F. Jones, C.M. Carver, H. Hao, C. Liang, D. Huang, X. Du, N. Gamper, Junctophilin-4 facilitates inflammatory signalling at plasma membrane-endoplasmic reticulum junctions in sensory neurons, J. Physiol. 599 (2021) 2103-2123, https://doi.org/10.1113/JP281331. Z.B. Katz, C. Zhang, A. Quintana, B.F. Lillemeier, P.G. Hogan, Septins organize endoplasmic reticulum-plasma membrane junctions for STIMI-ORAIL calcium signalling, Sci. Rep. 9 (2019) 1-17, https://doi.org/10.1038/541598-019-46862- w. J. Volz, C. Kusch, S. Beck, M. Popp, T. Vógtle, M. Meub, 1. Scheller, H.S. Heil, J. Preu, M.K. Schuhmann, K. Hemmen, T. Premsler, A. Sickmann, K.G. Heinze, D. Stegner, G. Stoll, A. Braun, M. Sauer, B. Nieswandt, BIN2 orchestrates platelet calcium signaling in thrombosis and thrombo-inflammation, . Clin. Invest. (2020), https://doi.org/10.1172/jci136457. L.K. Schroeder, A.E.S. Barentine, H. Merta, S. Sehweighofer, Y. Zhang, D. Baddeley, J. Bewersdorf, S. Bahmanyar, Dynamic nanoscale morphology of the ER surveyed by STED microscopy, J. Cell Biol. 218 (2019) 83-96, hxttps://doi.org/10.1083/ ¡cb.201809107. 1. Grigoriev, S.M. Gouveia, B. van der Vaart, J. Demmers, J.T. Smyth, S. Honnappa, D. Splinter, M.O. Steinmetz, J.W. Putney, C.C. Hoogenraad, A. Akhmanova, STIM1 is a MT-plus-end-tracking protein involved in remodeling of the ER, Curr. Biol. 18 (2008) 177-182, https://doi.org/10.1016/j.cub.2007.12.050. [67] [68] [69] [70] ra 72 [73] [74] [75] [76] [77 [78] [79] [80] [s1] [82] [s3] [84] [85] Cell Calcium 104 (2022) 102595 K. Groschner, N. Shrestha, N. Fameli, Non-Orai partners of STIM proteins: role in ER-PM communication and Ca2+ signaling, 2018. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed/30299651. K.P. Subedi, H.L. Ong, 1.5. Ambudkar, Assembly of ER-PM junctions: a critical determinant in the regulation of SOCE and TRPC1, Adv. Exp. Med. Biol. 981 (2017) 253-276, https://doi.org/10.1007/978-3-319-55858-5.11. L.B. de Souza, H.L. Ong, X. Liu, 1.5. Ambudkar, PIP2 and septin control STIM1/ Orail assembly by regulating eytoskeletal remodeling via a CDC42-WASP/WAVE- ARP2/3 protein complex, Cell Calcium 99 (2021), 102475, https://doi.o18/ 10.1016/j.ceca.2021.102475. C. Moreno, L. Vaca, Mierodomain organization and the role of second messengers microdomain organization of SOCE signaling, 2013. 10.1007/978-3-7091-0962-5. 7. Y. Zhou, R.M. Nwokonko, X. Cai, N.A. Loktionova, R. Abdulgadir, P. Xin, B. A. Niemeyer, Y. Wang, M. Trebak, D.L. Gill, Cross-linking of Orail channels by STIM proteins, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 115 (2018) E3398-E3407, lattps:// doi.org/10.1073/pnas.1720810115. N.L. Chanaday, E. Nosyreva, O.-.H. Shin, H. Zhang, 1. Aklan, D. Atasoy, 1 Bezprozvamny, E.T. Kavalali, Presynaptic store-operated Ca2+ entry drives excitatory spontaneous neurotransmission and augments endoplasmic reticulum stress, Neuron 109 (2021) 1314-1332, https://doi.org/10.1016/). neuron.2021.02.023, eS. Y.-.S. Wang, N.-.K. Huang, Y.-.C. Lin, W.-.C. Chang, W.-.C. Huang, Aspirin and Sulindac act via different mechanisms to inhibit store-operated calcium channel: implications for colorectal cancer metastasis, Biomed. Pharmacother. 145 (2022), 112476, https: //doi.org/10.1016/j.biopha.2021.112476. V. Krishnan, S. Ali, A.L. Gonzales, P. Thakore, C.S. Griffin, E. Yamasaki, M. G. Alvarado, M.T. Johnson, M. Trebak, S. Earley, STIM1-dependent peripheral coupling governs the contractility of vascular smooth muscle cells, Elife (2022) 11, https://doi.org/10.7554/eLife.70278. A.H. Guse, D.C. Gil Montoya, B.-.P. Diercks, Mechanisms and functions of calcium microdomains produced by ORAI channels, D-myo-inositol 1,4,5-trisphosphate receptors, or ryanodine receptors, Pharmacol. Ther. 223 (2021), 107804, https:// doi.org/10.1016/j.pharmthera.2021.107804. B. Diercks, R. Werner, P. Weidemiiller, F. Czarniak, L. Hernandez, C. Lehmann, A. Rosche, A. Kriiger, U. Kaufmann, M. Vaeth, A.V. Failla, B. Zobiak, F.I. Kandil, D. Schetelig, A. Ruthenbeck, C. Meier, D. Lodygin, A. Fliigel, D. Ren, 1.M.A. Wolf, S. Feske, A.H. Guse, ORAIL, STIM1/2, and RYR1 shape subsecond Ca2+ microdomains upon T cell activation, Sci. Signal. 11 (2018) 1-14, https://doi.org/ 10.1126/scisignal.aat0358. L.J.J. Ayling, S.J.J. Briddon, M.L.L. Halls, G.R.V.R. Hammond, L. Vaca, J. Pacheco, 5.J.J. Hill, D.M.F.M. Cooper, Adenylyl eyclase ACS directly controls its micro- environment by recruiting the actin cytoskeleton in a cholesterol-rich milieu, J. Cell Sci 125 (2012) 869-886, https://doi.org/10.1242/jc5.091090. D. Willoughby, K.L.L.K.L. Everett, M.L.L.M.L. Halls, J. Pacheco, P. Skroblin, L. Vaca, E. Klussmann, D.M.F.D.M.F.M.F. Cooper, Direct binding between Orail and ACS mediates dynamic interplay between Ca2+ and cAMP signaling, Sci. Signal. 5 (2012), https://doi.org/10.1126/scisignal.2002299 ra29-ra29. LC. Patel, J.A. Sirs, Dispersion of solutes during blood flow through curved tubes, Med. Biol. Eng. Comput. 21 (1983) 113-118, https://doi.org/10.1007/ BF02441524. WE. Moerner, Y. Shechtman, Q. Wang, Single-molecule spectroscopy and imaging over the decades, Faraday Discuss. 184 (2015) 9-36. 10.1039/c5fd00149h. F. Hertel, G.C.H. Mo, S. Duwé, P. Dedecker, J. Zhang, RefSOFI for mapping nanoscale organization of protein-protein interactions in living cells, Cell Rep 14 (2016) 390-400, https: //doi.org/10.1016/j.celrep.2015.12.036. J. Akerboom, T.-.W. Chen, T.J. Wardill, L. Tian, J.S. Marvin, S. Mutlu, N. C. Calderón, F. Esposti, B.G. Borghuis, X.R. Sun, A. Gordus, M.B. Orger, R. Portugues, F. Engert, J.J. Macklin, A. Filosa, A. Aggarwal, R.A. Kerr, R. Takagi, S. Kracun, E. Shigetomi, B.S. Khakh, H. Baier, L. Lagnado, S.S.-H. Wang, C. 1 Bargmann, B.E. Kimmel, V. Jayaraman, K. Svoboda, D.S. Kim, E.R. Schreiter, L. L. Looger, Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging, J. Neurosci. 32 (2012) 13819-13840, https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.2601- 12.2012. A. Asanov, A. Sampieri, C. Moreno, J. Pacheco, A. Salgado, R. Sherry, L. Vaca, Combined single channel and single molecule detection identifies subunit composition of STIM]-activated transient receptor potential canonical (TRPC) channels, Cell Calcium. 57 (2015) 1-13. 10.1016/j.ceca.2014.10.011. L.G. Ceballos, A. Asanov, L. Vaca, Single-channel single-molecule detection (SC- SMD) system, Methods Mol. Biol. 1843 (2018) 189-201, https: //doi.org/10.1007/ 978-1-4939-8704-7_16. E.E. Weatherill, M.I. Wallace, Combining single-molecule imaging and single- channel electrophysiology, J. Mol. Biol. 427 (2015) 146-157, hattps://doi.org/ 10.1016/j.¿mb.2014.07.007. 96 Cruz-Reséndiz et al. BMC Biotechnology https://doi.org/10.1186/512896-019-0592-9 (2020) 20:1 BMC Biotechnology RESEARCH ARTICLE pen Access A self-aggregating peptide: implications for the development of thermostable vaccine candidates Check for updates Adolfo Cruz-Reséndiz!, Jesús Zepeda-Cervantes”, Alicia Sampieri”, Carlos Bastián-Eugenio', Gonzalo Acero”, J. Iván Sánchez-Betancourt?, Goar Gevorkian? and Luis Vaca'*(B) Abstract Background: The use of biomaterials has been expanded to improve the characteristics of vaccines. Recently we have identified that the peptide PH;,_;10, from polyhedrin self-aggregates and incorporates foreign proteins to form particles. We have proposed that this peptide can be used as an antigen carrying system for vaccines. However, the immune response generated by the antigen fused to the peptide has not been fully characterized. In addition, the adjuvant effect and thermostability of the particles has not been evaluated. Results: In the present study we demonstrate the use of a system developed to generate nano and microparticles carrying as a fusion protein peptides or proteins of interest to be used as vaccines. These particles are purified easily temperature, preserving their immunological properties. or areas with no electricity. by centrifugation. Immunization of animals with the particles in the absence of adjuvant result in a robust and long-lasting immune response. Proteins contained inside the particles are maintained for over 1 year at ambient Conclusion: The rapid and efficient production of the particles in addition to the robust immune response they generate position this system as an excellent method for the rapid response against emerging diseases. The thermostability conferred by the particle system facilitates the distribution of the vaccines in developing countries Keywords: Vaccines, Particles, Self-assembling, Thermostable, Immunology Background Vaccines are considered one of the most important med- ical advances in the history of humanity, preventing and eradicating diseases [1, 2]. The World Health Organization (WHO) estimates that vaccines save around 2-3 million lives a year [3]. Traditional vaccines are based on two main methodologies: live-attenuated and inactivated/killed path- ogens [4]. Even though vaccines produced with these methods are immunologically effective, they still show some disadvantages, such as the need for a cold-chain, re- duced shelf life and the time-consuming processes involved in the production and purification [5-7]. On the other * Correspondence: Ivacaeifc.unam.mx 'Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México, CDMX 04510 Mexico City, Mexico “Department of Physiology and Biophysics, University of Washington School of Medicine, Seattle, WA 93124, USA Full list of author information is available at the end of the article MN BMC hand, new methodologies have been used such as subunit and recombinant vaccines that weakly stimulate the im- mune system and their immunological effect is of short durability, so they require the use of adjuvant to potentiate their effect. Currently available adjuvants may lead to unwanted effects such as the generation of granulomas, allergies and neurotoxicity due to the different components used [5, 8, 9]. However, even with the evolution of vaccines, vaccination continues to represent a high cost mainly for developing countries, due to the fact that they have the highest number of people vulnerable to infectious diseases [10-12]. An effective, low cost technology to produce thermostable vaccines would represent a major advancement in the fight against infectious diseases worldwide, and may significantly reduce the risk of pandemics [13]. 0 The Author(s). 2020 Open Access This article is distributed under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0 International License (http.//creativecommons.org/licenses/by/4.0/), which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided you give appropriate credit to the original author(s) and the source, provide a link to the Creative Commons license, and indicate if changes were made. The Creative Commons Public Domain Dedication waiver (htip./creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) applies to the data made available in this article, unless othenise stated. 97 Anexo 2. Otras publicaciones realizadas durante la estancia doctoral Reccived: 8 February 2021 Revised: 27 April 2021 Accepted: 17 May 2021 DOL: 10.1096/fj.202100243R RESEARCH ARTICLE Palmitic acid induces insulin resistance by a mechanism associated with energy metabolism and calcium entry in neuronal cells Karina Sánchez-Alegría' | Carlos Ernesto Bastián-Eugenio” | Luis Vaca? | Clorinda Arias TDepartamento de Medicina Genómica y Toxicología Ambiental, Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, Ciudad de México, Mexico Departamento de Genética Molecular, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México, Ciudad de México, Mexico Correspondence Clorinda Arias, Departamento de Medicina Genómica y Toxicología Ambiental, Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, AP 70-228, 04510, Ciudad de México, Mexico. Email: cariasQunam.mx Funding information Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), Grant/Award Number: A1-S9559; UNAMIDirección General de Asuntos del Personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México (DGAPA, UNAM), Grant/Award Number: 1N202318 Abstract Palmitic acid (PA) is a saturated fatty acid whose high consumption has been largely associated with the development of different metabolic alterations, such as insulin resistance, metabolic syndrome, and type 2 diabetes. Particularly in the brain, insulin signaling disruption has been linked to cognitive decline and is considered a risk factor for Alzheimer's disease. Cumulative evidence has demonstrated the participa- tion of PA in the molecular cascade underlying cellular insulin resistance in periph- eral tissues, but its role in the development of neuronal insulin resistance and the mechanisms involved are not fully understood. It has generally been accepted that the brain does not utilize fatty acids as a primary energy source, but recent evidence shows that neurons possess the machinery for fatty acid P-oxidation. However, it is still unclear under what conditions neurons use fatty acids as energy substrates and the implications of their oxidative metabolism in modifying insulin-stimulated effects. In the present work, we have found that neurons differentiated from human neuroblastoma MSN exposed to high but nontoxic concentrations of PA generate ATP through mitochondrial metabolism, which is associated with an increase in the eytosolic Ca?* and diminished insulin signaling in neurons. These findings reveal a novel mechanism by which saturated fatty acids produce Cats entry and insulin resistance that may play a causal role in increasing neuronal vulnerability associated with metabolic diseases. KEYWORDS intraneuronal Ca?*, neuronal insulin resistance, neuronal $-oxidation, palmitic acid, PKC activation Abbreviations: ATP, adenosine triphosphate; BIM, bisindolylmaleimide 1; BSA, bovine serum albumin; CPT, carnitine palmitoyltransferase I; DHA, docosahexaenoic acid; DNA, deoxyribonucleic acid; ECL, enhanced chemiluminescence; EBS, fetal bovine serum; GPR40, G-protein-coupled receptor 40; HPFD, high-fat diet; InRs, insulin receptors; mTORC1, mammalian target of rapamycin complex 1; MTT, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-y1)-2,5- diphenyltetrazolium bromide; NAD+, nicotinamide adenine dinucleotide; NADH, reduced nicotinamide adenine dinucleotide; NGF, nerve growth factor; PA, palmitic acid; PBS, phosphate-buffered saline; PI3K, phosphoin sitide-3-kinase; PKC, protein kinase C; RIPA, radioimmunoprecipitation assay; RNA, ribonucleic acid; ROS, reactive oxygen species; RT, room temperature; RT-PCR, reverse transcription polymerase chain reaction; SEM, standard error of the mean; VGCCs, voltage-gated calcium channels. 0 2021 Federation of American Societies for Experi: ¡mental Biology The FASEB Journal. 2021:35:e21712. httos://doi.ore/10.1096/fi.202100243R wileyonlinelibrary.com/journal/fsb2 1Lor13 98 Cell Calcium 106 (2022) 102631 ELSEVIER Contents lists available at ScienceDirect Cell Calcium journal homepage: www.elsevier.com/locate/ceca (1 calcium LIPID transfer proteins regulate store-operated calcium entry via control of plasma membrane phosphoinositides Gergo Gulyas”*, Marek K. Korzeniowski b,1 Carlos Ernesto Bastián Eugenio”, Luis Vaca“, a* Yeun Ju Kim”, Tamas Balla * Section on Molecular Signal Transduction, Program for Developmental Neuroscience, Eunice Kennedy Shriver NICHD, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 20892, USA * Department of Anatomy, Physiology, and Genetics, Uniformed Services University, Bethesda, MD, USA * Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de Mexico City DF, CP, 04510, USA ARTICLE INFO ABSTRACT Keywords: Calcium Plasma membrane ER Membrane contact sites Lipid transfer proteins Phosphatidylinositol Phosphoinositides The ER-resident proteins STIM1 together with the plasma membrane (PM)-localized Orail channels constitute the molecular components of the store-operated Ca?* entry (SOCE) pathway. Prepositioning of STIM1 to the peripheral ER close to the PM ensures its efficient interaction with Orail upon a decrease in the ER luminal Ca?* concentration. The C-terminal polybasic domain of STIM1 has been identified as mediating the interaction with PM phosphoinositides and hence positions the molecule to ER-PM contact sites. Here we show that STIMI re- quires PM phosphatidylinositol 4-phosphate (PI4P) for efficient PM interaction. Accordingly, oxysterol binding protein related proteins (ORPs) that work at ER-PM junctions and consume PI4P gradients exert important control over the Ca?* entry process. These studies reveal an important connection between non-vesicular lipid transport at ER-PM contact sites and regulation of ER Ca*store refilling. 1. Introduction Store-operated ca?+ entry (SOCE) has been recognized long time ago as an important Ca?” influx pathway present in most mammalian cells [1]. Itis now understood that SOCE requires the interplay between two distinct molecules: the ER-localized STIM1 that senses the ER luminal Ca?* concentration and the plasma membrane (PM)-localized Orail channels, that directly interact when the ER luminal Ca?* concentration decreases [2-5]. Substantial experimental evidence has accumulated concerning the activation sequence leading to Ca?* influx through this pathway. Briefly, a drop in the ER luminal Ca?* concentration sensed by EF hands in the ER-luminal side of the single membrane spanning STIM1 molecule initiates a conformational change that results in the disruption of an intramolecular clamp in the cytoplasmic segment of the molecule [6,7]. This rearrangement which liberates the Orail activation domain within the STIM1 molecule called SOAR [8] or CAD [9], also induces STIM1 clustering and promotes interaction with the PM-located Orail molecules [10-12]. Several structural features of STIM1 and Orail have been identified as critical for the various steps in the activation sequence (see Qiu and Lewis for a recent review [13)). An important aspect of STIM1/Orail function is its sensitivity to the lipid-environment of the PM. It has been postulated early on that the polybasic C-terminus of STIM1 is important for its PM interaction likely due to its binding to acidic phospholipids found in the inner leaflet of the PM [14]. Importantly, however, the polybasic domain becomes dispensable when both STIM1 and Orail are overexpressed due to the strong direct interaction between the respective domains of STIM1 and Orail that mediate their activation [15,16]. Even before STIM1 and Orail were discovered, it was reported that SOCE and its current equivalent, Icrac was inhibited by concentrations of the PI 3-kinase inhibitor, wortmannin (Wm) that inhibited phosphatidylinositol 4-phos- phate (PI4P) formation, suggesting for the first time that PM lipids and not their hydrolytic product, inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) was important for SOCE [17]. This finding was further confirmed by our previous studies using various PI kinase inhibitors leading to the tentative conclusion that PI4P rather than phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PI(4,5)P2) was required for the STIM1/Orail-mediated Ca?* entry process [18]. Consistent with the * Corresponding author at: National Institutes of Health, Bldg 35A, Rm 2D842, 35 Convent Drive, Bethesda, MD 20892, USA. E-mail address: ballatOmail.nih.gov (T. Balla). 1 These authors equally contributed to this work. https: //doi.org/10.1016/j.ceca.2022.102631 Received 14 March 2022; Received in revised form 24 June 2022; Accepted 8 July 2022 Available online 11 July 2022 0143-4160/Published by Elsevier Ltd. 99