\: \ 1 í ¡ / UNIVERSIDAD NACIONAL AUiTi centrilobular) para ácidos biliares y también hay un gradiente en el diámetro canalicular, sugiriendo que en condiciones fisiológicas la mayor secreción de ácidos biliares ocurre en la región periportal. El flujo biliar canalicular está linealmente relacionado a la tasa de secreción de ácidos biliares. Existe la hipótesis de que los ácidos biliares incrementan el flujo biliar dado que dan una fuerza osmótica para la filtración de agua y electrolitos. Ciertos ácidos biliares tienen poca tendencia a formar micelas y su actividad osmótica es mayor, es decir, son coleréticos, por ejemplo, el ácido dehidrocólico y sus conjugados. Por otro lado, otros ácidos biliares que inducen hipercolerésis se les asocia con un incremento en la concentración de bicarbonato, como el ursodesoxicólico, utilizado para la disolución de cálculos de colesterol. 20 Tejidos periféricos Colestero Vesícula biliar Sangre Hígado Bilis Fosfolípidos Ácidos biliares Ácidos biliares Quilomi crones Figura 4. Principales componentes del metabolismo del colesterol y ácidos biliares y principales transportadores de la membrana basolateral y canalicular. Lipoproteínas de baja densidad (LDL), lipoproteínas de alta densidad (HDL), lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), proteína relacionada al receptor LDL (LRP), acil CoA:colesterol aciltransferasa (ACAT), proteína tranasportadora de taurocolato dependiente de sodio NTCP (SLS10A1), proteína transportedora de aniones orgánicos OATPs (SLC21A), transportador de sales biliares ileal/apical dependiente de sodio (SLC10A2), multiresistencia a drogas MDR1 (ABCB1), MRP2, 3 (ABCC2). Colangiocitos 3.4 Metabolismo intestinal y circulación enterohepática de los ácidos biliares Los ácidos biliares formados en el hígado son absorbidos activamente por el intestino delgado por el transportador de ácidos biliares apical dependiente de sodio (ASBT), el cual es el principal transportador, aunque también está OATP3. Cada molécula de ácido biliar sufre múltiples circulaciones enterohepáticas antes de ser excretado. En el intestino delgado los ácidos biliares solubilizan los lípidos de la dieta promoviendo su absorción. Las bacterias intestinales pueden transformar ácidos biliares y esteroles. Una parte de los ácidos biliares primarios (cólico y quenodesoxicólico) pasan al intestino grueso y son desconjugados, por la ß-glucuronidasa bacterial, y deshidroxilados, por la 7-deshidroxilasa, con lo que se convierten en ácidos biliares secundarios (desoxicólico y litocólico, respectivamente), parte de los cuales entran en circulación enterohepática. El ácido litocólico es en su mayor parte eliminado en las heces (Hofman, 2007), mientras que el ácido desoxicólico se ha asociado con la colelitiasis de colesterol, como resultado de un prolongado tránsito intestinal (Shoda et al, 1995; Mamianetti et al, 1999; Thomas et al, 2000; Heaton, 2000). Por otra parte, los ácidos biliares también juegan un papel importante en la etiología del cáncer de colon por actuar como promotores de procesos tumorigénicos (Hughes y Rowland, 2000). 21 Una herramienta de estudio de la microbiota intestinal y sus productos es la colección de heces al contener una muestra representativa de éstos (Mai y Morris, 2004). La microbiota puede ser alterada por el tratamiento con antibióticos entre otros factores. Se ha reportado en ratas que el tratamiento con antibióticos disminuye los microbios anaerobios fecales, reduciendo los ácidos biliares fecales totales (Hashimoto et al, 1996). 3.5 Colestasis El término colestasis puede definirse como la manifestación clínica, bioquímica e histológica de defectos en la secreción de bilis desde el hígado hacia el intestino (Poupon et al, 2000). Esta puede ser debida a una obstrucción de los conductos biliares, por tumores, litiasis, colangitis esclerosante o ligadura del conducto biliar, denominándose entonces como colestasis extrahepática. También puede deberse a anormalidades a nivel de los hepatocitos, denominándose colestasis intrahepática, las causas pueden ser sustancias endógenas o exógenas, o mutaciones genéticas (Kullak-Ublick et al, 2000). La acumulación de las sustancias que deberían ser secretadas en la bilis es lo que causa las alteraciones hepáticas y biliares observadas en la colestasis. De estas los ácidos biliares son la principal causa de las alteraciones. El potencial hepatotóxico de las sales biliares es prevenido en grado significativo por sulfatación y glucuronidación durante la colestasis. Los ésteres son rápidamente excretados por el riñón y pobremente reabsorbidos en el intestino delgado (Kullak-Ublick et al, 2000). Las manifestaciones clínicas de colestasis intra y extrahepática incluyen ictericia, prurito y elevación en suero de sales biliares, bilirrubina, fosfatasa alcalina y enzimas membranales como 5- nucleotidasa, gama-glutamiltranspeptidasa y leucinoamonipeptidasa. Sin embargo, estas anormalidades solo se reflejan cuando cerca del 80% de la capacidad de la función hepática está impedida, por lo que se requiere de una medición del flujo biliar no invasiva para detectar la colestasis. Mediante una cuidadosa evaluación clínica, serológica, e histológica es posible deducir sobre la patogénesis de la colestasis, con la utilización de ultrasonido, colangiografía transhepática percutánea y colangiografía endoscópica retrógrada, se logra una diagnosis anatómica exacta, separando así la colestasis intra de la extrahepática. La colestasis evoluciona en la mayoría de los casos a hepatitis colestática, cirrosis o falla hepática fulminante (Poupon et al, 2000). Los niveles de actividad de la fosfatasa alcalina en suero se emplean en la clínica como marcador de colestasis. Esta enzima está presente en células epiteliales ductulares y hepatocelulares, en estas últimas su liberación es mayormente estimulada por la ligadura del ducto biliar, alcanzando su máximo pico después de 24hrs, mientras que la proliferación ductular incrementa después de los siete días. La enzima existe en la membrana y el citosol, sólo la primera está incrementada en la colestasis y es debido a un incremento en su síntesis. El incremento de esta enzima es un fenómeno que ocurre tanto en la colestasis intra como extrahepática. 22 En el modelo de colestasis extrahepática de rata con ligadura del ducto biliar, se asemeja grandemente a lo que ocurre en la colestasis obstructiva por cálculos, neoplasias y colangitis esclerosante. Así la ligadura del ducto lleva a una alteración de la polarización del hepatocito con acumulación de vesículas pericanaliculares que contienen las proteínas apicales (Stieger et al, 1994). La alta presión biliar produce cambios en las uniones gap, giros de las ramas de las uniones estrechas observándose una nueva formación del canalículo. Los transportadores basolaterales NTCP y OATP1 reducen su cantidad, lo mismo que los canaliculares como BSEP y MRP2. Otros incrementan su presencia como MRP3 y MRP1, quizás para compensar la disminución de MRP2; también se incrementan MDR1b, una bomba de cationes, y MDR2, la translocasa de fosfolípidos. La colestasis intrahepática progresiva familiar (PFIC) tipo 1 se debe a mutación del gen FIC1, que codifica para una translocasa canalicular de fosfatidilserina y fosfatidiletanolamina de la parte externa hacia la parte interna de la membrana. Esto lleva a colestasis, pero sin proliferación de los ductos biliares y evoluciona hacia cirrosis (Bull et al, 1998). Lo mismo ocurre en la colestasis intrahepática benigna recurrente (BRCI), pero de forma menos severa y no progresa hacia cirrosis (Kullak-Ublick, 2000). En el tipo 2 de la PFIC, la mutación ocurre en BSEP, mientras que en el tipo 3 hay deficiencia de MDR3, la translocasa de fosfatidilcolina que en roedores es MDR2. En esta última la falta de fosfolípidos en la bilis provoca que los ácidos biliares dañen los conductos biliares. A diferencia del tipo 1, en la tipo 3 hay proliferación de ductos biliares (Boyer, 2007). Polimorfismos en el gen MDR3 parece que predisponen a la colestasis de la preñez y a la provocada por algunas drogas exógenas (Jaquemin et al, 1999). La mutación del gen del regulador de conductancia transmembranal de la fibrosis quística (CFTR) puede provocar colestasis (Kullak-Ublick, 2000). CFTR es un canal de Cl- que se expresa en los colangiocitos, es estimulado por secretina. Junto con el intercambiador Cl-/HCO3 son responsables de la secreción biliar ductal, que es parte de la secreción biliar independiente de sales biliares. Las colestasis intrahepáticas pueden también ser provocadas por drogas endógenas y exógenas. Entre las primeras se encuentran las citocinas interleucinas 1-beta y TNFalfa, producidas en respuesta a lipopolisacárido (LPS) bacterial, que reducen a los transportadores NTCP y/o BSEP (Mc Clure et al, 1998). LPS, al parecer también a través de citocinas, reduce la presencia de MRP2 en la membrana canalicular y con ello la secreción de glutatión y bicarbonato, principales responsables de la secreción biliar independiente de ácidos biliares (Kubitz et al, 1999). Los estrógenos son también inductores de colestasis, que junto con algunas formas de MDR3 desencadenan la colestasis intrahepática de la preñez. El tratamiento con estrógenos por terapia de reemplazo o anticonceptivos también favorecen la colestasis en sujetos susceptibles. El etinil estradiol en ratas reduce la cantidad de BSEP, mientras que el metabolito del estradiol 17β-D-glucurónido de estradiol inhibe la actividad de la BSEP (Fiorucci et al, 2005). Esta inhibición de BSEP requiere de la presencia de MRP2, la cual transporta normalmente al glucurónido. El ácido biliar litocolato, tanto conjugado como libre, es un fuerte agente colestático. El litocolato, que se produce por deshidroxilación del quenodesoxicolato en el intestino, se encuentra en 23 muy baja concentración en la bilis, pues casi no entra en circulación enterohepática. Experimentalmente se ha visto que aumenta la rigidez de la membrana canalicular, inhibe el transporte intracelular de vesículas y previene la fusión de éstas con la membrana canalicular (Kullak-Ublick et al, 2000). Las drogas son la causa más común de colestasis intrahepática. En la mayoría de los casos el mecanismo para la colestasis inducida por drogas no es conocido, por la baja incidencia de colestasis asociada con la mayoría de los agentes terapéuticos, pero que pueden afectar el sistema excretor biliar y producir colestasis. La expresión clínica es hepatitis aguda, sin embargo, pueden llevar a hepatitis fulminante y cirrosis. Diversas sustancias exógenas producen colestasis intrahepática (Boyer, 2007). Aunque la patogénesis de muchas no ha sido establecida, al parecer actúan inhibiendo alguno o varios de los transportadores, como es el caso de ciclosporina que inhibe a la BSEP, además de inhibir el flujo independiente de sales biliares (Chan et al, 1998). La rifamicina y la rifampicina también inhiben a la BSEP. 3.6 Colelitiasis La colelitiasis es una enfermedad en la cual se produce uno o varios cuerpos duros en la vesícula biliar o en las vías biliares intra o extrahepáticas, por precipitación de una sustancia normalmente presente en la bilis, la cual aumenta su concentración relativa y precipita. La presencia de cálculos biliares puede pasar inadvertida durante años, inclusive toda la vida, denominándose éstos como cálculos asintomáticos (Attili et al, 1995); sin embargo, los cálculos pueden volverse sintomáticos al provocar obstrucción de los conductos cístico o colédoco, causando ictericia obstructiva y colecistitis crónica o aguda, la cual puede llegar hasta gangrena y perforación de la vesícula, o causar empiema; la obstrucción del cístico puede también causar daño a la vesícula debido a la bilis retenida. Asimismo, el carcinoma de vesícula se encuentra generalmente asociado a cálculos biliares y colecistitis (Sherlock, 1981). La composición de la bilis es determinante para la formación de los cálculos, aunque otros factores también influyen, tales como alteraciones en el vaciamiento o concentración de la bilis por la vesícula (Shoda et al, 1995). La composición de la bilis es muy variable, sin embargo, la bilis cuya composición favorezca la formación de cálculos biliares se denomina bilis litogénica. De acuerdo a su composición química, los cálculos biliares se clasifican en tres tipos principales (Sherlock, 1981, Trotman, 1982): Los pigmentarios, compuestos por sales orgánicas e inorgánicas de calcio, los mixtos, constituidos por pigmentos biliares, sales de calcio y hasta un 70% de colesterol y los de colesterol que contienen este lípido hasta en un 98% de su peso. Estos últimos son cristalinos, radiados y translúcidos de forma redondeada u ovoidea y de superficie lisa o nodulada; miden en el hombre de 1 a 4 cm. de diámetro. Generalmente son solitarios, aunque también los hay múltiples. 24 La colelitiasis de colesterol, dentro de la cual se incluye la mixta, es mucho más frecuente en el mundo occidental que en Oriente y África. Los países con las más elevadas frecuencias de este tipo de colelitasis son Chile y Suecia, en donde el 33 y 20% de la población, respectivamente, presentan cálculos de colesterol (Roda et al, 1989). En EU la colelitiasis es la diagnosis más común entre las enfermedades gastrointestinales y hepáticas (Russo et al, 2004). Se ha estimado que cerca de 20 millones de personas padecen colelitiasis, y de estas aproximadamente 70% presentan cálculos de colesterol (Heaton, 1973; Trotman, 1975). En el mundo occidental, la mayor incidencia se presenta en los indios norteamericanos (64.1% en mujeres de 47 años de edad (Everhart et al, 2002). En los países orientales la colelitiasis pigmentaria es más frecuente que la de colesterol, sin embargo, la occidentalización de las costumbres, como ocurre en las zonas urbanas del Japón (Tazuma, 2006), provocan un incremento en la colelitiasis de colesterol y una disminución de la pigmentaria. Por el contrario, África está casi excenta de colelitiasis (Heaton, 1973; Wasmuth et al, 2004). Para Latinoamérica hemos señalado la alta frecuencia en Chile; en un estudio en Bolivia se encontraron sólo cálculos de colesterol en un alto porcentaje (Soloway, 1977). En México un estudio señala que 14.3% de la población presenta cálculos biliares (Méndez et al, 1993), y en cuanto a su composición, se conoce que más del 85% de cálculos son de colesterol puros y mixtos (Méndez et al, 1995). La prevalencia de colelitiasis en la Ciudad de México se ha estimado en un promedio de 14.1% (5.8% en hombres y 19.7% en mujeres), esta fue asociada con la edad, el sexo y la multiparidad (González et al, 1997). La Secretaría de Salubridad y Asistencia reportó que en 2002 esta fue la tercera causa de hospitalización (33474 casos, 2.05% de todos los casos; SSA, 2002). La etiología de la colelitiasis es influida por varios factores, tales como la dieta, edad, sexo, obesidad, herencia, raza, clase social y varias asociaciones clínicas como la hipertrigliceridemia, terapia con estrógenos, multiparidad, anticonceptivos orales, etc. (Diehl, 1991). Las dietas hipercalóricas, altas en carbohidratos refinados, colesterol y ácidos grasos de cadena corta como las grasas animales se han asociado con una mayor frecuencia de colelitiasis (Dam, 1969; Thornton, 1983; Marshall y Einarsson, 2007). La fibra dietética también es importante para mantener una bilis menos saturada de colesterol (Kritchevsky, 1988). El consumo de leguminosas se ha asociado con una mayor incidencia de litiasis (Nervi et al, 1989). Por otro lado, el ayuno se ha asociado con un aumento en la litogenicidad de la bilis por aumento de la secreción de colesterol relativa a ácidos biliares, así como la disminución de la secreción de fosfolípidos (Goldstein, 1975). Los cálculos de colesterol se presentan en todas las edades, sin embargo, en la década de los cuarentas, son más frecuentes, especialmente en mujeres con antecedentes de embarazo o con el uso de anticonceptivos orales (Roda, 1989; Marschall y Einarson, 2007). La raza afecta la frecuencia de colelitiasis, así, las poblaciones de indios americanos, tales como Pima, Chipewa y Navajos presentan una altísima frecuencia de colelitiasis (48.6%; Goldstein, 1975; Méndez-Sánchez et al, 2004). En Estados Unidos, la población México-americana presenta una prevalencia de colelitiasis intermedia entre los indios americanos y la población anglosajona (Hanis, 25 1985), mientras que la raza negra es la menos susceptible a la colelitiasis (Tyroler, 1980), lo cual concuerda con la baja frecuencia de colelitiasis encontrada en África (Heaton, 1973; Wasmuth et al, 2004). La obesidad se asocia con mayor frecuencia de colelitiasis. Se ha correlacionado el colesterol biliar con el grado de obesidad; asimismo, la síntesis de colesterol es proporcional al peso corporal (Goldstein, 1975). El síndrome metabólico y la diabetes tipo 2 son factores de riesgo para el desarrollo de cálculos (Pazzi et al, 2000; Grundy, 2004). Por otro lado, se presenta un alto riesgo de formar cálculos con una rápida reducción de peso por medios dietéticos (Broomfield, 1988; Méndez et al, 1996). La patogénesis de la colelitiasis de colesterol es indudablemente multifactorial; en la que participan eventos hepáticos y vesiculares, puesto que la vesícula es el sitio más común de formación del cálculo. La producción de una bilis sobresaturada de colesterol es el principal requisito para la precipitación de éste y su consolidación en la vesícula; esta saturación puede ser debida a una secreción excesiva o a una reducción de sales biliares y fosfolípidos (Carey, 1992; Holzbach, 1985), los cuales mantienen el colesterol en solución. Las diferentes sales biliares tienen distinto efecto sobre la cantidad de colesterol secretado, siendo mas efectivas las más hidrofóbicas, que son las más detergentes (Bilhartz, 1988). Se ha asociado el ácido desoxicólico con una mayor secreción de colesterol (Hussaini et al, 1995; Shoda et al, 1995). También se ha señalado que una proporción significativa de pacientes con cálculos de colesterol, presentan un aumento en la secreción de colesterol y una secreción normal de sales biliares y fosfolípidos (Marschall y Einarson, 2007). De manera general los pacientes con cálculos tienen índices de saturación de colesterol más elevados que las personas sin cálculos. En la patogénesis de los cálculos biliares de colesterol, se ha establecido que en la bilis la agregación de vesículas unilamelares para formar vesículas multilamelares es importante para permitir la formación de cristales de colesterol monohidratado, que es la primera etapa en la precipitación del colesterol (Holzbach, 1990); sin embargo, solo la agregación de vesículas sobresaturadas con el esterol (i.e., con una elevada proporción de colesterol/fosfolípidos) permite la cristalización de éste. El cálculo biliar se forma por la adición y crecimiento de los cristales precipitados, a los cuales se les puede o no agregar sales de calcio, dando lugar a los cálculos radioopacos y radiolúcidos. De lo anterior se desprende el concepto de tiempo de nucleación definido como el tiempo de aparición de cristales de colesterol en una muestra de bilis incubada a 37°C. La nucleación del colesterol es un complejo proceso que involucra fusión, agregación o ruptura de vesículas enriquecidas de colesterol (Harvey y Upadhya, 1995). El tiempo de nucleación es más rápido en bilis vesicular que en bilis hepática, debido a la mayor concentración de la primera (Van Erpecum et al, 1990). La nucleación es promovida por la mucina, cuya secreción por el epitelio de la vesícula biliar se incrementa antes y durante la formación de los cálculos (Malet et al, 1989). 26 Otro factor que puede contribuir de manera importante a la formación de los cálculos es la deficiente función motora de la vesícula biliar. La estásis vesicular provoca la estratificación de la bilis, pues en el fondo de esta se acumula bilis mas concentrada y densa que la recién llegada del hígado, asimismo se depositan sedimentos en el fondo, tales como mucoproteínas, sales de calcio, pigmentos biliares, células epiteliales descamadas, bacterias (Swidsinski et al, 1995) y/o residuos por reflujo intestinal (Holzbach, 1983). Los hábitos sedentarios y el ayuno (Schlierf, 1981) producen una mayor estratificación y permanencia de la bilis en la vesícula biliar, lo cual ayuda en la nucleación de colesterol. Además, defectos en el vaciamiento vesicular provocan que esta bilis concentrada y los sedimentos acumulados no se evacuen, lo cual propicia la formación de cálculos. Se han propuesto varios mecanismos por los cuales se ve alterada la contractilidad de la vesícula: puede ser debido a una insuficiente secreción de colecistocinina para estimular adecuadamente la contracción vesicular (Thompson, 1982), o a un reducido número o menor afinidad de los receptores vesiculares de la hormona (Fridhandler, 1983), así como el tratamiento con octreotido (Dowling, 2000). La hipomotilidad de la vesícula biliar se ha encontrado en pacientes con colelitiasis (Shoda et al, 1995; Méndez et al, 1996; Van Erpecum et al, 2000). Actualmente se emplean diversos tratamientos para la litiasis biliar; sin embargo, el tratamiento quirúrgico por colecistectomía sigue siendo el más empleado, debido a su baja morbimortalidad y a que es un tratamiento casi siempre definitivo. Sus inconvenientes son, que es un procedimiento invasivo, en el que hay riesgo, aunque bajo, de una lesión iatrogénica de las vías biliares, se realiza bajo anestesia general, provoca días de incapacidad y tiene un costo elevado para el paciente. A la técnica clásica se han sumado dos variantes como son la colecistectomía por mini laparotomía y por laparoscopía, procedimientos que mejoran las cifras de morbimortalidad, con menores molestias postoperatorias para el paciente, mas rápida recuperación y breve estancia hospitalaria (Frimberger, 1989). Se ha publicado que la colecistectomía se asocia con riesgo de cáncer del colon, dado que se incrementa la formación de ácidos biliares secundarios por bacterias intestinales, especialmente de DCA (Kullak-Ublick et al, 1995). En el tratamiento de la coledocolitiasis con alto riesgo quirúrgico y en los cálculos residuales después de colecistectomía, la esfinterotomía endoscópica es el tratamiento de elección (Dowsett, 1988). En la búsqueda de tratamientos no invasivos, se ha empleado la disolución de los cálculos por medio de ácidos biliares y de solventes orgánicos. La fragmentación por medio de ondas de choque extracorpóreas (litotripsia) de los cálculos permite que éstos sean evacuados directamente o más fácilmente disueltos pero ha sido casi completamente abandonada debido a sus complicaciones (Marschall y Einarsson, 2007). 27 Los ácidos biliares empleados para disolver cálculos son el ácido quenodesoxicólico y su 7-beta epímero, el ácido ursodesoxicólico. Con la administración de ácidos biliares se busca aumentar la proporción de sales biliares y disminuir la de colesterol en la bilis, para conseguir la solubilización del exceso de colesterol presente en el cálculo. El primero en utilizarse fue el ácido quenodesoxicólico (Danzínger et al, 1972), el cual es un ácido biliar primario que constituye entre el 20 y el 30% de las sales biliares en la bilis humana normal. La administración oral de quenodesoxicólico (15mg/kg/día) provoca la disminución en la secreción biliar de colesterol, (sin cambiar la secreción de ácidos biliares, y posee la capacidad de mantener una proporción casi constante de colesterol/lecitina biliar en presencia de una secreción reducida de sales biliares, como ocurre durante el ayuno, con lo cual se forma una bilis menos saturada. Asimismo el ácido quenodesoxicólico inhibe la HMG-CoA reductasa hepática, sin embargo, esta inhibición no parece ser la causa de la menor secreción de colesterol. La bilis enriquecida con ácido quenodesoxicólico y no saturada de colesterol, al entrar en contacto con la superficie del cálculo, solubiliza el colesterol en micelas mixtas, en un proceso de micelación semejante al que ocurre cuando el colesterol es secretado en vesículas unilamelares (Igimi y Carey, 1981). Sin embargo, no todos los cálculos se disuelven con este tratamiento, se ha estimado que su eficacia es del 60% en cálculos radiolúcidos, además de que una vez interrumpido el tratamiento hay una elevada recurrencia de cálculos. Se ha estimado también que los cálculos de gran tamaño, no responden al tratamiento, así como los cálculos con cubiertas calcificadas radioopacas. El tratamiento con ácido quenodesoxicólico provoca ciertos efectos nocivos, así un 25 a 30% de pacientes desarrollan diarrea e incrementan en aproximadamente 10% el colesterol LDL, también se presenta un 30% de lesiones hepáticas, además del costo elevado del tratamiento (Sleisenger y Fordtran, 1985). El ácido ursodesoxicólico se encuentra en muy pequeñas cantidades en la bilis humana, pero es abundante en algunas especies animales, tales como el oso y la nutria. Este ácido es más hidrofílico y menos detergente que el quenodesoxicólico, por lo que al aumentar su proporción en la bilis por administración oral (8 a 10mg/kg/día), es menos efectivo para solubilizar las grasas de la dieta, por lo que el colesterol dietético se absorbe menos; así mismo, el ácido ursodesoxicólico disminuye la secreción biliar de colesterol en mayor grado que el ácido quenodesoxicólico, en parte por ser mas hidrofílico (Ward, 1984). La disolución del cálculo por el ursodeoxicólico es más rápida que con el quenodesoxicólico debido a que es mayor el área de interacción entre la capa de fosfolípidos y el cálculo, que entre éste y la micela mixta, además de que las vesículas unilamelares tienen mayor capacidad para transportar al colesterol (Roda, 1995). Además no reduce la síntesis de sales biliares, que es una vía de eliminación de colesterol y no produce alteraciones funcionales hepáticas, ni provoca diarrea, sin embargo, el costo es aún más elevado (Sleisenger y Fordtran, 1985; Petroni et al, 2001). No todos los pacientes con cálculos de colesterol pueden ser tratados con ácidos biliares para disolver cálculos. Los criterios de selección son que presente cálculos pequeños (lo cual puede ser 28 resuelto mediante litotripsia), no calcificados y flotantes. La disolución de los cálculos de colesterol también se puede lograr con el empleo de solventes ogánicos como el metil terbutil éter y el diglicérido de cadena media ácido monooctanóico, los cuales son mucho más efectivos para disolver el colesterol, sin embargo, deben ser aplicados por medio de un cateter transhepático colocado mediante punción percutánea de la vesícula biliar o de las vías biliares (Thistle, 1989). Tanto la litotripsia como los solventes orgánicos prácticamente ya no se utilizan por los riesgos que conllevan. Lo anterior muestra que, aunque se tiene una gama de alternativas, todavía no se tiene un método ideal para el tratamiento de la colelitiasis, por lo que se requiere continuar investigando y evaluando mecanismos y nuevos agentes terapéuticos de tratamiento, prevención y disolución de este tipo de colelitiasis. 3. 7 El hámster como modelo de colelitiasis Debido a la importancia de conocer la etiología de la colelitiasis humana, se han estudiado procesos fisiológicos normales y patológicos en modelos animales como el ratón albino, la ardilla, el perro de las praderas, los primates y por supuesto el hámster (Cárdenas, 1991). Este ha sido utilizado como modelo de colelitiasis, pues por medios dietéticos y/u hormonales produce en corto tiempo cálculos biliares de colesterol, pigmentarios o mixtos (Cárdenas, 1996) Figura 5. El hámster se asemeja al hombre en parámetros biliares y en el metabolismo del colesterol (Roda et al, 1995; Spady et al, 1983). En comparación con la rata, el hámster sí presenta vesícula biliar. La bilis del hámster también se asemeja más a la humana, pues consiste principalmente de ácidos cólico y desoxicólico conjugados con glicina y taurina, siendo la mayor proporción de glicocolato, con menores cantidades de quenodesoxicolato y litocolato. No hay síntesis de ácido muricólico (Siegel, 1985). Figura 5. Hámster. Mesocricetus auratus 29 Dam (1969) desarrolló en el hámster cálculos de colesterol con dietas libres de grasas y con carbohidratos refinados de fácil absorción, las que provocan una elevada concentración de colesterol biliar y disminución de sales biliares, favoreciendo la precipitación del colesterol y la formación de cálculos. Esta dieta litogénica también produce deficiencia de ácidos grasos esenciales, y la actividad de HMG-CoA reductasa se encuentra muy elevada, por lo que hay un incremento en la síntesis de colesterol por el hígado (Spady et al, 1983). Como se mencionó anteriormente, en estudios previos se encontró que L. tridentata previene la colelitiasis pigmentaria (Cárdenas y Arteaga, 1999) y la de colesterol (Arteaga et al, 1995) en el hámster. La primera por reducir la concentración de fosfato inorgánico biliar, impidiendo así su precipitación en forma de hidroxiapatita, mientras que en la segunda reduce el porcentaje molar de colesterol, por lo que este no se precipita en la bilis. 30 IV PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Puesto que ya se tienen antecedentes sobre la prevención por L. tridentata de la colelitiasis de colesterol, de su efecto colestático sobre duplas de hepatocitos y hepatotoxicidad, así como de su acción antibiótica a nivel intestinal, en esta investigación se determinará si el efecto del extracto etanólico de L. tridentata y del NDGA sobre la composición de la bilis y patrón de ácidos biliares es a nivel hepático, a nivel intestinal o ambos. La prevención por L. tridentata de la colelitiasis de colesterol del hámster se asocia con una reducción del porcentaje molar de colesterol biliar respecto a lípidos biliares (Arteaga y Cárdenas, 1995), y a cambios en la composición de ácidos biliares en la bilis. L. tridentata produce un aumento de ácido quenodesoxicólico, que se emplea para disolver los cálculos y disminuir la saturación de colesterol de la bilis en humanos, y disminuye el ácido desoxicólico (Cárdenas y Arteaga 1998), éste último, estimula una mayor secreción de colesterol hacia la bilis (Thomas et al, 2000; Heaton, 2000. Además por el efecto antibiótico del extracto alcohólico de L. tridentata (Zamora y Mora, 1985; Verastegui, 1996) podría esperarse una modificación de la flora bacteriana intestinal y por consiguiente una modificación de la formación de ácidos biliares secundarios. Asimismo, se establecerá si las dosis tóxicas, expresadas como colestásis, son similares o no a las dosis que modifican la composición de la bilis haciéndola menos litogénica, pues de ello depende el posible uso terapéutico en la colelitiasis de esta planta. V HIPÓTESIS Ha. Tanto el extracto etanólico de L. tridentata como el NDGA en dosis menores a la EC50, producirán un aumento en la concentración de ácido quenodesoxicólico y una disminución de ácido desoxicólico, en la composición de la bilis del hígado de hámster perfundido. Asimismo, debido al efecto antibiótico de L. tridentata se reducirá la cantidad de ácidos biliares fecales, los cuales tendrán una menor proporción de ácidos biliares secundarios. Ho. El extracto etanólico de L. tridentata y el ácido nordehidroguaiarético (NDGA) no afectarán la composición de la bilis, ni el perfil de ácidos biliares a nivel hepático, ni la concentración y composición de los ácidos biliares fecales. VI OBJETIVOS 6.1 OBJETIVO GENERAL Estudiar los efectos que producen el extracto etanólico de L. tridentata y el NDGA sobre la secreción y composición biliares en el hígado del hámster perfundido, así como el efecto del extracto etanólico de L. tridentata sobre la excreción de ácidos biliares en las heces, como una estimación indirecta de las modificaciones del metabolismo intestinal de los ácidos biliares. OBJETIVOS PARTICULARES -Establecer la concentración efectiva 50 (EC50) del NDGA y del extracto etanólico de L. tridentata sobre el flujo biliar de hígados perfundidos de hámsteres alimentados con Purina. -Analizar la composición lipídica biliar (colesterol y sales biliares) producida por una concentración menor a la EC50 del extracto etanólico de L. tridentata y del NDGA en hámster con dieta litogénica. -Analizar el perfil de ácidos biliares bajo el efecto de una concentración menor a la EC50 del extracto etanólico de L. tridentata y del NDGA. -Determinar la concentración y el perfil de ácidos biliares fecales de animales alimentados con dieta litogénica y tratados con extracto etanólico de L. tridentata y su infusión ad libitum. 31 VII MATERIAL Y METODOS 7.1.1 Animales En el presente estudio se emplearon hámsteres dorados machos, cepa ChC, de 100 días de edad promedio inicial, con peso promedio de 100 g, los animales se obtuvieron de la colonia que se tiene en el Bioterio de la Facultad de Ciencias de la UNAM y se mantuvieron en jaulas de acero inoxidable con piso y frente de malla de alambre, bajo condiciones ambientales de temperatura y humedad controladas y con un fotoperiodo de luz:oscuridad de 12:12h Cada jaula tuvo tres animales. El protocolo fue realizado en apego a la Norma Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999 "Especificaciones Técnicas para la Reproducción, el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio". 7.1.2 Extracto etanólico de L. tridentata. La planta empleada para realizar los extractos, se obtuvo en el mercado de Sonora procedente de San Luis Potosí. Ejemplares de la especie que nos ocupa ya se identificaron taxonómicamente y se corroboró que se tratara de la misma especie (MEXU No. 534807, IMSSN No. 11319, FCME No. 048231, ENCB). El extracto alcohólico de Larrea se realizó colocando 100g de hojas y talluelos en un matraz kitazato de 2 L, al que se agregó 1 L de etanol absoluto, se agitó durante 30 min a temperatura ambiente, se filtró a vacío en papel Watman No.1 y se evaporó hasta aproximadamente 40 ml, finalmente se evaporó a 40° C durante la noche en estufa. Finalmente se obtiene una resina con rendimiento de aproximadamente 10 g/100 g de planta. 7.1.3 Acido nordehidroguaiarético (NDGA) El ácido nordehidroguaiarético (1,4-bis[3,4-Dihidroxifenil]-2,3-dimetilbutano) (NDGA), empleado en los experimentos fue obtenido en Sigma Chemical CO, USA. 7.1.4 Dietas: Como dieta básica de mantenimiento para los animales de grupos de control, se suministraron Nutricubos Purina para Roedores Pequeños de Purina S.A., México, D. F., pulverizados. Como dieta litogénica, se empleó la dieta para cálculos de colesterol, libre de grasas y alta en glucosa (Dam, 1969). Los materiales para la elaboración de las dietas experimentales fueron los siguientes: 20% de caseinato de calcio (Casein purified high nitrogen) de ICN Biomedicals, Inc. Ohio, USA, 66.3% de glucosa anhidra Polidex M. A. de Aranz, S.A., México, D. F., 8% de celulosa (Alfacel, ICN), 5% de mezcla de minerales No. 2 USP XIII y suplemento para mezcla de minerales No. 2 USP XIII de ICN Biomedicals México, D. F., 0.5% 31 de mezcla de vitaminas de ICN Biomedicals, Inc. Ohio, USA y 0.2% de cloruro de colina de ICN Biomedicals, Inc. Ohio, USA. 7.1.5 Infusión de L. tridentata Se utilizó una infusión de L. tridentata, la cual se preparó con 15 g de hojas y pequeños talluelos de la planta que se agregaron a 1 L de agua hirviendo, permaneciendo así por 5 minutos. La infusión se colocó ad libitum en los bebederos dentro de las jaulas y se midió el consumo. 7.1. 6 Medio y equipo de perfusión La solución de perfusión fue Krebs-Henseleit (K-H), pH 7.4, adicionada con 1% de albúmina sérica bovina y 2% de glucosa anhídra (Cheung et al, 1996). Solución Krebs-Helenseit, pH 7.4 Reactivos mM Na Cl 118mM KCl 4.8mM MgSO4.7H2O 1.2mM KH2 PO4 1.0mM NaHCO3 24mM CaCl2.2H20 3.2mM Glucosa 0.2% Albúmina sérica bovina 1.0% El equipo de perfusión consta de bomba peristáltica Masterflex L/S" Modelo 7519-20, tubos platinum LS16 DI:0.12”, conectores 1/8”, 1/8x1/16, 1/16”, tanque de oxígeno medicinal INFRA, oxigenador de acrílico, trampa de aire, baño termorregulado, estuche de disección, tubos Eppendorf de 1 ml, reservorio del buffer y charola de disección adherida al sistema como se muestra en la Figura 6: 32 . Reservorio Tanque de oxígeno Trampa de aire Oxigenador Bomba peristáltica Termómetro Figura 6. Esquema del sistema de perfusión Debido a las dificultades iniciales para obtener un buen flujo biliar en los hígados perfundidos, se ensayaron diferentes métodos en busca de obtener o mejorar el flujo biliar. Se hizo un control positivo agregando al medio 30 µM de ácido taurocólico, teniendo un marcado incremento en el flujo biliar, el cual no se mantuvo más de 40 minutos. Sin embargo, se decidió utilizar el medio K-H sin ácidos biliares, para tener la secreción basal en ausencia de circulación enterohepática. Por otro lado, para probar el efecto del extracto y del NDGA sobre la secreción biliar, fue necesario hacer diferentes pruebas de disolución para mantener ambos compuestos en suspensión. Puesto que son muy solubles en etanol y metanol, inicialmente se disolvieron en etanol para posteriormente llevarlos a una suspensión acuosa que pudiera ser suministrada en el medio de perfusión. Se ensayaron suspensiones con diferentes solventes, para después formar una suspensión acuosa por adición de agua. La mejor opción fue disolver el extracto o el NDGA en etanol, después agregar glicerol y posteriormente agregar esta mezcla al medio de perfusión. La solubilización del extracto etanólico de L. tridentata y de NDGA se hizo disolviendo las sustancias de la siguiente manera: 33 NDGA (mg/dL) Etanol (µl) Glicerol (µl) Extracto L. tridentata (mg/dL) Etanol (µl) Glicerol (µl) 5 30 10 5 40 20 10 40 15 10 50 30 20 75 25 20 50 50 40 100 75 40 50 50 80 120 75 60 100 50 80 125 50 Debido al método de solubilidad de los compuestos, se realizaron pruebas sobre el efecto del vehículo sobre la secreción biliar. Para esto se diluyó la mezcla de etanol-glicerol en 100 ml del medio de perfusión. 7.2. Efecto colestático sobre la secreción biliar del hámster. Los hámsteres que se emplearon fueron pesados y anestesiados con pentobarbital (6 mg/100 g de peso corporal, i.p.). El método de perfusión de hígado fue recirculado, basado en Seglen (1976). Previamente a la perfusión hepática, a través de una incisión ventral de aproximadamente 1 cm se ligó el conducto cístico y se colocó en el colédoco una cánula de polietileno PE-10 (Clay Adams, Parsippany, NJ, USA). Inmediatamente después se realizó la perfusión del hígado in vivo e in situ como sigue: se abrió el animal ventralmente, y se colocaron 2 ligaduras sujetando la vena porta, sin interrumpir el flujo sanguíneo; se insertó un catéter (24x ¾” Termo Surflo I.V.) en la vena porta, se sujetó con las ligaduras y se inyectó 0.1 ml de heparina sódica (75 U/ml, Hycel de México, S.A. de C. V.) en la parte posterior de la cava inferior. En seguida se conectó el catéter a la línea de perfusión, ya regulada a temperatura de 37 ºC, oxigenada (O2 medicinal, INFRA) y a un flujo de entre 3 y 3.5 ml/min/g de hígado. Ajustado de acuerdo al cálculo del peso corporal del animal, considerando que el peso del hígado en un animal de 100 g en promedio es de 3.4 g. Comenzando la perfusión, la vena cava inferior se cortó en su parte posterior para permitir el flujo del medio de perfusión y se arregló el sistema para recircular el medio a través del hígado, abriendo la caja torácica, se hizo una incisión en la aurícula y mediante dos ligaduras se conectó una cánula para recircular el medio al reservorio, en seguida se cerró el flujo hacia la parte posterior de la vena cava con una ligadura colocada por encima de los riñones. Se colectaron muestras de bilis cada 10 min durante 90 min en tubos de polietileno de 500 µl previamente pesados, los cuales se mantuvieron en hielo y se guardaron para su posterior análisis. Se determinó flujo biliar gravimétricamente. Después de 30 min de perfusión con el medio Krebs-Henseleit, se inició la perfusión con medio adicionado del componente a probar a una determinada concentración, sin interrumpir el flujo. Al cabo de 10 min se 34 volvió a perfundir el medio solo, para determinar si el efecto era reversible. Se colectaron muestras de bilis cada 10 min por 90 min, en tubos de polipropileno de 0.5 ml previamente pesados. El cálculo del porcentaje de reducción sobre la secreción biliar, se obtuvo mediante el cálculo de la pendiente de la curva durante el tratamiento completo, es decir, al principio de la perfusión, durante el tratamiento (NDGA o extracto de L. tridentata) y posterior a este, restando entonces la pendiente del tratamiento a la pendiente inicial. Inmediatamente después de terminar la recolección de bilis, todos los animales aún bajo anestesia se sacrificaron por dislocación cervical y se realizaron inmediatamente las necropsias parciales (tórax, abdomen, ciego), examinándose la vesícula biliar y su contenido con microscopio estereoscópico (Zeiss, West Germany) para determinar la presencia de cálculos o cristales de colesterol. El hígado se disectó y se registraron los pesos en una balanza analítica Mettler A30. Las concentraciones del extracto de L. tridentata fueron 5, 10, 20, 40, y 80 mg dL-1, y de NDGA fueron 5, 10, 20 40 y 80 mg dL-1 (165, 330, 660, 1320, y 2640 µM). Por cada concentración se perfundieron 4 o 5 hígados. Se estableció la dosis colestática 50 (EC50) por método gráfico. 7.3 Efecto sobre el perfil de ácidos biliares de hígados perfundidos de hámster y sobre la composición de lípidos biliares de hámsteres con dieta litogénica Se realizaron ensayos para determinar el efecto de diferentes dosis del extracto alcohólico de L. tridentata y de NDGA sobre la composición biliar y el perfil de ácidos biliares de hígados perfundidos de hámster. Se emplearon animales alimentados con purina o con dieta litogénica y tratados con concentraciones inferiores a la EC50 de NDGA y L. tridentata. 7.4 Análisis de lípidos biliares La muestra de bilis (15 a 30 µl) fue adicionada a una mezcla de cloroformo:metanol, 2:1 (1.8 ml). Se agitó en vórtex por 1 minuto. Después se agregaron 0.370 ml de solución salina al 1%, se agitó nuevamente y se centrifugó por 2 min a 3000 rpm. Se colectó la fase acuosa y de ahí se concentraron los ácidos biliares por extracción de fase sólida con cartuchos de C18. Los ácidos biliares en metanol se separaron por TLC, se corrieron junto con estándares en placas de sílica gel 60 de 10x20 cm. El sistema de corrimiento de TLC fue cloroformo:isopropanol:ácido acético:agua (30:30:4:1). La columna de estándares se reveló con ácido fosfomolíbdico y las correspondientes áreas en las muestras se rasparon de la placa y se determinaron las concentraciones de ácidos biliares enzimáticamente. La fase clorofórmica se evaporó y se determinó colesterol por método de CHOD-PAP empleando un juego de reactivos de Human. 35 Las concentraciones de ácidos biliares se determinaron por método enzimático (Turley y Diestchy, 1978) como sigue: 500 µl de Buffer TrisEDTA, mas 330 µl de sulfato de hidrazina mas 100 µl de NAD mas 20 µl de la muestra de bilis hepática mas 35 µl de enzima 3alfaHSD o bien, 35µl de bufer de fosfatos a los blancos. Se hizo la lectura de absorbancia a 340 nm en espectrofotómetro con luz UV. Se empleó la dieta experimental de Dam, adicionada de 0.125% de extracto etanólico de L. tridentata, administrada durante tres semanas previo a la perfusión hepática, se utilizó la infusión de L. tridentata preparada como se indicó en el punto 6.1.5. Se midió el consumo de alimento y agua o té en los grupos diseñados para estudiar el efecto del té y las dietas experimentales. 7.5 Efecto sobre la cantidad y el perfil de ácidos biliares fecales. Se realizó el análisis de ácidos biliares fecales totales y el perfil de ácidos biliares fecales por TLC de animales alimentados durante 3 semanas con las siguientes dietas: Grupo 1, Purina pulverizada; Grupo 2, dieta litogénica (DL); Grupo 3, DL más infusión de L. tridentata ad libitum; Grupo 4, DL adicionada al 0.125% de extracto de L. tridentata. Se recolectaron muestras de heces de 24 h durante 5 días de todos los animales, en la última semana de administración de las dietas experimentales. Las muestras se secaron en estufa hasta obtener peso constante y almacenadas para la extracción y análisis del contenido de ácidos biliares secundarios. Al término del periodo experimental, los animales fueron sacrificados por una sobredosis de anestesia con pentobarbital. Se les disectó y pesó el hígado, el intestino grueso y el ciego, y se examinó la vesícula biliar para determinar la presencia de cálculos. 7.6 Extracción de ácidos biliares fecales (Czubayko et al, 1991). Se extrajeron esteroles neutros y esteroles ácidos de la siguiente manera: 100 mg de heces se homogenizaron con 100 µl de agua, y se adicionaron de 2 ml 1N NaOH en etanol al 90% a 67°C por 1h. Se agregó 1 ml agua y se extrajeron los esteroles neutros con ciclohexano (2 ml x3). A la fase acuosa se agregó 2 ml de 10 N NaOH acuoso, calentando 3hr a 120°C. Luego se adicionó 1 ml agua, se enfrió y se llevó a pH 1.5 con ácido clorhídrico al 25%, finalmente se extrajeron los esteroles ácidos con éter etílico (2 ml x3). 7.7 Determinación de ácidos biliares fecales (Major et al, 1980). Los esteroles ácidos fueron resuspendidos en 200 µl de metanol y en una alícuota se determinaron ácidos biliares enzimáticamente. Se corrieron muestras de los extractos de esteroles ácidos, junto con 36 estándares de los ácidos biliares cólico, quenodesoxicólico, desoxicólico y litocólico (Sigma), en placas de TLC de sílicagel 60 de 20x20 (espesor 0.25 mm). La fase móvil fue hexano: metiletilcetona: ácido acético glacial (56:36:8). Las placas se revelaron asperjando la columna de estándares con ácido acético: ácido sulfúrico: anisaldehído (50:1:0.5), y calentando la placa a 120°C x 5 min. Las bandas correspondientes a cada estándar en las columnas de muestras se rasparon y se determinó la concentración de ácido biliar enzimáticamente como se señalo arriba. 7.8 Análisis estadístico Los resultados se expresan como promedio ± desviación estándar. El análisis estadístico de los datos se realizó por análisis de varianza de una vía, seguido de la prueba de comparación múltiple de Bonferroni y con Prueba de t de Student pareada. Los valores fueron considerados estadísticamente significativos con una P<0.05. 37 VIII. RESULTADOS 8.1 Efecto directo hepático del extracto de L. tridentata 8.1.1 Perfusiones preliminares y efecto del vehículo. Los resultados de la fase experimental en la que se probó el efecto del extracto etanólico de L. tridentata y del NDGA sobre el hígado son los siguientes. Inicialmente se estandarizó el método de perfusión, se utilizó como medio la solución Krebs Henseleit (K-H) adicionada con 2% de glucosa anhídra y 1% de albúmina bovina, con lo cual se logró una buena secreción biliar por un tiempo prolongado (mínimo 60 min). Se realizaron perfusiones por 10 min con el medio K-H adicionado del vehículo del extracto de la planta y del NDGA, que constaba de 100 µl de etanol y 50 µl de glicerol, para comprobar que el vehículo por sí mismo no tuviera algún efecto sobre la secreción biliar, como lo muestra la Figura 7. 0 20 40 60 80 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Tiempo (min) % d el v ol um en to ta l d e bi lis Controles Vehículo Vehículo Figura 7. Secreción porcentual biliar acumulativa en hígados de hámsteres perfundidos por 90 minutos. Controles: perfundido solo con K-H durante todo el período; vehículo: perfundido con K-H sólo y con K-H adicionado del vehículo del extracto de L. tridentata y del NDGA, por 10 min. (entre los 20 a 30 min). Los datos del vehículo se desplazaron 2 min para no encimar los valores con el control. Los valores son media ± D.S. (n=5). 38 8.1.2. Efecto colestático del extracto de L. tridentata y del NDGA Los resultados del efecto tóxico sobre el hígado, expresado como colestásis, por perfundir durante 10 min diferentes concentraciones del extracto etanólico de L. tridentata y del NDGA, se presentan en la Tabla 1. Se presentan los datos del porcentaje de reducción del flujo biliar de hígados de animales alimentados con purina. Los hígados perfundidos con diferentes concentraciones de extracto etanólico de L. tridentata, presentaron una reducción del flujo biliar gradual, conforme se incrementó la concentración del extracto, se puede notar también que en las concentraciones intermedios (20 y 40 mg), existe poco aumento en la respuesta. Tabla 1. Efecto de diferentes concentraciones de L. tridentata y NDGA perfundidos en el hígado durante 10 min sobre la reducción del flujo biliar* Concentraciones perfundidas (mg dl-1) 5 10 20 40 80 Tratamiento % de reducción del flujo biliar Extracto EtOH de L. tridentata n 10.1 ± 0.8 4 25.8 ± 10.8 4 46.7 ± 20.0 4 53.2 ± 10.8 5 98.9 ± 0.7 2 NDGA n 28.8 ± 20.9 4 35.5 ± 21.6 3 40.0 ± 21.9 5 69.1 ± 22.2 5 92.5 ± 0.4 4 *Los datos se expresan como media ± D.S. El tratamiento con diferentes concentraciones de NDGA produjo un efecto colestático mayor en las concentraciones de 5, 10 y 40 mg dl-1 (165, 330, 1320µM), respecto al extracto de la planta. 39 0 20 40 60 80 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 mg/dL-1 % R ed uc ci ón d el f lu jo b ili ar NDGA L. tridentata Figura 8. Efecto colestático del extracto etanólico de L. tridentata y del NDGA en hígado perfundido de hámsters. Posterior a un período estable de 20 min., el hígado se perfundió con el medio KH conteniendo el extracto etanólico o el NDGA por 10 min. El efecto sobre la secreción biliar fue determinado gravimétricamente. Los datos se expresan como media ± D.S. Con los datos obtenidos se calcularon las concentraciones efectivas 50 del efecto colestático (EC50) por el método gráfico (Figura 8). Para el extracto de L. tridentata se obtuvo un valor de 34 mg dl-1, mientras que para el NDGA fue de 28 mg dl-1 (926µM). El efecto colestático fue reversible, excepto en algunas preparaciones con 40 mg dl-1 y en todas las de 80 mg dl-1. 8.2. Efecto sobre la secreción biliar del extracto de L. tridentata y de NDGA en hígados perfundidos de hámsters alimentados con dieta litogénica. 8.2.1 Efecto sobre el flujo biliar. Puesto que se ha demostrado que el extracto de L. tridentata previene la litiasis de colesterol en el hámster, en esta sección se ensayó el efecto de una dosis de 10mg dL-1 del extracto etanólico de la planta y del NDGA (330µM), que están por debajo de las EC50, tanto sobre el flujo biliar como en la composición de la bilis de hámsters alimentados con dieta litogénica por 3 semanas, comparándose con el efecto en el hígado de animales alimentados con dieta de mantenimiento (Nutricubos Purina). 40 Respecto al flujo biliar, en todos los grupos se observó una colestásis menor o cercana a la producida por la EC50. La concentración ensayada del extracto de L. tridentata y de NDGA sobre hígados de animales que recibieron la dieta litogénica por 3 semanas, tuvieron una tendencia a una menor reducción en el flujo biliar, i.e. menor colestasis, que los que recibieron purina (Tabla 2). Tabla 2. Efecto colestático de L. tridentata y NDGA sobre hígados perfundidos de animales alimentados con purina o con dieta litogénica., expresado como porcentaje de reducción del flujo biliar.* Dietas Tratamiento (10mg dl -1 10min-1) % Reducción del flujo biliar Purina Exto. EtOH de L. tridentata n 37.7 ± 16.5ab 4 Dieta Litogénica Exto. EtOH de L. tridentata n 11.8 ± 11.9b 4 Purina NDGA n 48.7 ± 16.4a 4 Dieta Litogénica NDGA n 21.3 ± 4.5ab 4 *Los valores se expresan como media ± DS. Diferente letra en la columna indica P<0.05. 8.2.2 Efecto sobre la composición de lípidos biliares La Tabla 3 muestra datos de la concentración de colesterol antes de la perfusión con L. tridentata o NDGA. Se observa que el valor para el grupo alimentado con purina y con dieta litogénica adicionada con 0.125% del extracto de la planta, administrada por tres semanas, presenta prácticamente el mismo nivel de colesterol, lo que indica un efecto crónico del extracto sobre la composición de la bilis. Por otro lado la concentración de ácidos biliares totales es mayor en el grupo de animales alimentados sólo con purina antes del tratamiento. Tabla 3. Lípidos biliares en bilis de hígados perfundidos en períodos previos a la adición de los compuestos de prueba.* Dietas* Colesterol (mM) Acidos biliares totales (mM) Purina 0.28 ± 0.04 ab 4 6.77 ± 2.32 a 4 Dieta Litogénica 0.43 ± 0.13 a 4 2.28 ± 1.42 b 4 DL + 0.125% Exto EtOH L. tridentata 0.25 ± 0.03 b 4 1.68 ± 0.48 b 4 41 *Administradas durante 3 semanas. Los valores se expresan como media ± D.S. Diferente superíndice indica P<0.05. La Tabla 4 muestra los resultados obtenidos sobre la composición biliar de los mismos hígados después de recibir los tratamientos que se señalan en cada caso. Tabla 4. Efecto de diferentes tratamientos sobre la concentración de lípidos biliares, expresado como porcentaje respecto a la concentración del período previo al tratamiento. Los compuestos (10 mg dL-1) se prefundieron por 10 min.* Porcentaje de lípidos biliares Dieta Tratamiento Colesterol Acidos Biliares Totales Purina Vehículo 99.5 ± 9.7 4 86.0 ± 19.9 4 Purina Exto EtOH L. tridentata 83,0 ± 7.0 4 89.0 ± 23.8 4 Purina NDGA 89.0 ± 10.9 4 82.6 ± 26.0 4 Dieta Litogénica Vehículo 101.4 ± 7.0 4 93.7 ± 17.4 4 Dieta Litogénica 10 mg Exto EtOH L. tridentata 60.6 ± 8.7 a 4 189.0 ± 38.3a 4 Dieta Litogénica 10 mg NDGA 53.1 ± 17.9 a 4 137.6 ± 28.6a 4 DL + 0.125% Exto L. tridentata Vehículo 96.8 ± 6.0 4 76.2 ± 22.3 4 *Los valores son expresados como media ± D.S. a P<0.05 vs vehículo con la misma dieta. Los hígados de animales que se alimentaron con purina no mostraron un cambio significativo ni en el colesterol ni en los ácidos biliares por el tratamiento con los compuestos de prueba. En los hígados de animales que recibieron la dieta litogénica se encontró una reducción significativa en el colesterol biliar entre los grupos prefundidos con extracto de L. tridentata y con NDGA respecto al que solo se les perfundió el vehículo. En estos mismos grupos, la cantidad de ácidos biliares totales se incrementó significativamente, especialmente en los perfundidos con extracto de L. tridentata. 8.2.3 Efecto sobre el perfil de ácidos biliares Se encontró que en los hígados de animales alimentados con purina, solo el extracto etanólico de L. tridentata produjo una tendencia a disminuir la proporción del ácido cólico, así como a incrementar la del ácido quenodesoxicólico, sin embargo, estos efectos no alcanzaron a ser significativos (Tabla 5). En los hígados de animales previamente alimentados con la dieta litogénica durante tres semanas, al ser perfundidos con extracto de L. tridentata mostraron una significativa reducción del ácido cólico y un aumento del 42 quenodesoxicólico, mientras que el NDGA tendió hacia el mismo efecto, pero no alcanzó significancia estadística. Por otro lado, los hígados de animales con dieta litogénica y 0.125% de extracto de L. tridentata mostraron una proporción de quenodesoxicólico solo ligera y no significativamente mayor que los que recibieron solo la dieta litogénica y se perfundieron con vehículo. Tabla 5. Porcentaje de ácidos biliares primarios después de perfundir el hígado con extracto de L. tridentata o NDGA por 10 min a la concentración de 10 mg dL-1.* Porcentaje del perfil de ácidos biliares Dieta Tratamiento Previo Posterior Previo Posterior Cólico Cólico Quenodesoxi cólico Quenodesoxi cólico Purina Vehículo 61.1 ± 14.8 4 61.7 ± 17.8 4 38.9 ± 14.8 4 38.3 ± 17.8 4 Purina 10 mg Exto EtOH L. tridentata 58.2 ± 18.3 4 48.2 ± 19.1 4 21.8 ± 19.5 4 31.8 ± 19.1 4 Purina 10 mg NDGA 66.7 ± 10.7 4 65.0 ± 4.4 4 33.3 ± 10.7 4 34.9 ± 4.4 4 D Litogénica Vehículo 53.8 ± 7.9 4 56.0 ± 5.0 4 45.6 ± 6.9 4 44.8 ± 6.1 4 D Litogénica 10 mg Exto EtOH L. tridentata 59. 2 ± 16.7 4 36.9 ± 3.4 a 4 40.8 ± 16.7 4 63.1 ± 3.4 a 4 D Litogénica 10 mg NDGA 68.7 ± 12.1 4 60.3 ± 17.4 4 31.3 ± 14.2 4 39.7 ± 17.4 4 DL + 0.125% Exto EtOH L. tridentata Vehículo 49.6 ± 10.9 4 43.2 ± 21.5 4 50.1 ± 11.6 4 56.8 ± 21.6 4 *Los valores son expresados como media ± D.S. a indica P<0.05 vs proporción del ácido biliar previo al tratamiento. Los ácidos biliares cólico y quenodesoxicólico entran en la circulación enterohepática y como se sabe, de ellos depende la solubilización del colesterol, especialmente del quenodesoxicolato, mientras que desoxicolato, proveniente del colato incrementa la secreción de colesterol. Por lo que se considera una bilis menos litogénica. 43 8.3 Efecto del té de L. tridentata suministrado por 3 semanas sobre la secreción biliar del hámster alimentado durante el mismo periodo con dieta litogénica Respecto al efecto de la infusión de L. tridentata suministrada como agua ad libitum por 3 semanas, se encontró que no reduce significativamente la concentración de colesterol ni el porciento molar de colesterol respecto al grupo que también consumió dieta litogénica, sin embargo, hay una ligera reducción de éstos parámetros cuando beben el té, esto pudo resultar en la formación de una bilis menos litogénica, lo cual explicaría la ausencia de cálculos biliares (Tabla 6). Se observó también en la necropsia que el tamaño del ciego fue significativamente mayor en ese mismo grupo. Tabla 6. Efecto del té de L. tridentata sobre lípidos biliares.* Dieta Flujo biliar µl/m/gHíg Colesterol mM Sales biliares mM Fosfolípidos mM % Molar Colesterol Cálculos Ciego g Purina + Agua 2,5 ± 0,8 0.3 ± 0,1ª 10,3 ± 0,8 2,2 ± 0,5 2,2 ± 0,3ª 0/6 2,6 ± 0,3a b D L + Agua 2,9 ± 0,5 0,8 ± 0,0b 8,1 ± 1,9 1,7 ± 0,5 7,6 ± 2,4b 5/6 1,5 ± 0,3a D L + Té L. tridentata 3.0 ± 0,3 0,6 ± 0,3b 8,7 ± 1,4 2,1 ± 0,5 5,2 ± 1,7b 0/6 3,0 ± 0,9b *Los valores son expresados como media ± D.S. Diferente superíndice indica P<0.05. n=6. Por otra parte, para verificar que los animales consumieran la dieta y bebieran la infusión de L. tridentata se realizaron mediciones del consumo de la dieta, del agua y la infusión durante el tratamiento, se presentan en la Tabla 7. Tabla 7. Mediciones del consumo de dieta y agua o té de L. tridentata.* Dieta* Consumo Dieta (g/animal) Consumo Té/Agua (ml/animal) Purina + Agua 7.1 ± 1.8a 7.5 ± 1.2 D L + Agua 5.2 ± 0.1 b 5.9 ± 2.33 D L + Té L. tridentata 5.1 ± 0.1b 4.8 ± 1.75 *Administrados durante 3 semanas. Los valores son expresados como media ± D.S. Diferente superíndice indica P<0.05. n=6. Al parecer la dieta litogénica induce menor consumo respecto a purina, que es su dieta básica. Se encontró un menor consumo del té, sin embargo, la diferencia no es significativa. 44 8.4 Efecto sobre la cantidad y el perfil de ácidos biliares fecales Finalmente, se realizó el análisis de ácidos biliares fecales totales y el perfil de ácidos biliares fecales por cromatografía en capa fina de animales alimentados con purina, dieta litogénica (DL), DL más infusión de L. tridentata ad libitum o con DL + 0.125% del extracto de la planta, obteniendo los siguientes resultados. En la Tabla 8, se presenta la frecuencia de colelitiasis en los diferentes grupos, observándose que la dieta litogénica produjo cálculos en el 100% de los animales, mientras que sólo uno de los animales que tomó el té los presentó, y ninguno de los que recibieron el extracto de L. tridentata. Tabla 8. Concentración de ácidos biliares totales, peso del ciego y colelitiasis.* Dieta Acidos biliares (nmoles /g heces) Peso del ciego (mg) Frecuencia de cálculos Purina + agua 1130 ± 100a 2.6 ± 0.3a 0/4 D L + agua 270 ± 94b 1.5 ± 0.3b 4/4 DL + Té L. tridentata 141 ± 47b 3.3 ± 0.6a,c 1/4 DL + 0.125% Exto L tridentata + agua 154 ± 42b 4.4 ± 0.5d 0/4 *Los valores son expresados como media ± D.S. Diferente letra indica P <0,05, n=4. El tamaño del ciego de los animales que recibieron el té y el extracto se ve aumentado aproximadamente al doble que en los animales que sólo recibieron la dieta litogénica, quizás por el efecto antibiótico de L. tridentata. Por otro lado, en los análisis de ácidos biliares fecales expresados en nanomoles de ácidos biliares por gramo de heces, se observa que en el grupo control alimentado con purina, presentó el valor más elevado, puesto que esta dieta contiene más fibra, respecto a los grupos de dieta litogénica que sólo contienen 8% de celulosa. En los grupos tratados con L. tridentata, tanto en té como en extracto, hay una menor cantidad de ácidos biliares fecales, aunque la diferencia no alcanzó a ser estadísticamente significativa, respecto del grupo con la misma dieta litogénica sola. 45 Tabla 9. Porcentaje de ácidos biliares fecales.* Dieta Cólico Quenodesoxicólico Desoxicólico Litocólico Purina + agua 9.2 ± 1.6a 21.8 ± 4.6ac 46.5 ± 16.0 22.5 ± 12.6 D L + agua 10.1 ± 7.0 a 11.6 ± 7.3a 53.0 ± 20.0 25.2 ± 16.5 DL + Té L. tridentata 29.7 ± 6.5b 25.6 ± 4.5bc 23.4 ± 9.0 21.3 ± 1.0 DL + Exto L tridentata + agua 13.7 ± 9.4a 36.5 ± 6.2b 22.5 ± 11.5 27.3 ± 10.8 *Los valores se expresan como media ± D.S. Diferente letra en la misma columna indica P <0.05, n=4. En la Tabla 9 se muestran los resultados sobre el perfil de ácidos biliares fecales. Se observa un incremento significativo del ácido quenodesoxicólico en los grupos tratados con L. tridentata, tanto en té como en extracto, mientras que la proporción de ácido litocólico se mantiene prácticamente igual. Por otro lado se observa un decremento en la proporción de desoxicolato en esos mismos grupos, respecto al control de purina y DL sola, aunque no alcanzó a ser estadísticamente significativo. Tabla 10. Porcentajes de ácidos biliares Primarios contra Secundarios.* Dieta Cólico + Quenodesoxicólico Desoxicólico + Litocólico Purina + agua 31.0 ± 3.6ac 69.0 ± 3.6ac D L + agua 21.8 ± 13.4a 78.2 ± 13.4a DL + Té L. tridentata 57.1 ± 11.0b 42.9 ± 11.0b DL + Exto L tridentata + agua 50.2 ± 12.0bc 49.8 ± 12.0bc *Los valores son media ± D.S. Diferente letra indica P<0.05, n=4. En la proporción de ácidos biliares primarios y secundarios en las heces, se observa un incremento significativo de los ácidos biliares primarios, así como un decremento de los secundarios con el tratamiento de L. tridentata en forma de infusión o extracto adicionado a la dieta (Tabla 10). Esto sugiere una menor capacidad de deshidroxilación intestinal de los ácidos biliares por la microbiota del intestino debido al efecto antibiótico. 46 IX DISCUSIÓN La colelitiasis es una de las enfermedades gastrointestinales más frecuentes, con una importante carga para los sistemas de salud, la cual se incrementa en edades avanzadas de poblaciones en riesgo (Marschall y Einarsson, 2007). Por otra parte, la medicina tradicional en México es una práctica ancestral que utiliza derivados, preparaciones e infusiones de plantas, que se siguen utilizando, por lo menos en parte, debido a la falta de recursos en la atención médica (Hersch-Martínez, 1995). Sin embargo, también se ha reconocido la hepatotoxicidad de medicinas herbales debido al autoconsumo de productos herbales comúnmente considerados como seguros y efectivos, pero que carecen de regulación (Pak, et al, 2004). El hígado, ubicado entre la superficie absortiva del tracto intestinal y la distribución sistémica, es el primer destino de fármacos que ingresan por vía oral, por lo que también es un importante blanco de su toxicidad, que pueden causar daño a los hepatocitos, a las células de los ductos biliares y generar colestasis (Jaeschke et al, 2002). Más del 75% de casos de reacciones ideosincráticas a drogas resultan en transplante hepático o muerte (Lee, 2003). Aunque es controversial L. tridentata se emplea para una variedad de padecimientos (Arteaga et al, 2005), sin embargo, produce toxicidad renal y hepática, en el último caso el daño consta de hepatitis aguda, necrosis hepática subaguda, hepatitis colestática y falla hepática aguda (Chitturi y Farrel, 2000; Brent 1999). En ensayos previos realizados en este laboratorio con L. tridentata se encontró un efecto preventivo de la colelitiasis. Sin embargo, se desconocía su modo de acción y la posibilidad de otros efectos no benéficos. Así se continuó indagando en la posibilidad de un uso terapéutico del extracto etanólico de L. tridentata y su principal metabolito, realizando ensayos para establecer inicialmente el efecto directo sobre la secreción biliar, mediante la perfusión hepática. El empleo de éste modelo in vitro e in situ, permitió evaluar el efecto agudo del extracto y el NDGA sobre la secreción biliar. Inicialmente se estandarizó el método de perfusión hepática con recirculación, (Seglen, 1976; Cheung et al, 1996), hasta lograr una secreción biliar mayor y por un tiempo más prolongado. Efecto colestático sobre la secreción biliar del hámster En la primera fase experimental los resultados indican que efectivamente en el hígado perfundido hay un efecto colestático cuando se aplica un tratamiento agudo con el extracto etanólico de L. tridentata, o bien, con el NDGA, existiendo una relación dosis-respuesta, lo cual confirma su hepatotoxicidad (Sheik et al, 1997). Se estableció que bajo las condiciones estudiadas, la EC50, para el extracto etanólico de L. tridentata 47 fue de 34 mg dL-1 y para el NDGA de 28 mg dL-1. A bajas concentraciones (5 a 40 mg dL-1) el efecto es reversible. Puesto que el efecto en las curvas dosis respuesta es muy similar, y más acentuado en el caso del metabolito solo, al parecer el efecto colestático de L. tridentata es debido a NDGA, y quizás a los otros lignanos relacionados y presentes en el extracto. Este efecto colestático reversible se ha observado también en duplas de hepatocitos de rata con el extracto de la planta a concentraciones de 2 a 12µg/ml (Cárdenas et al, 2000), lo cual apoya estos resultados. Sin embargo, no se puede descartar que puede haber otros compuestos que también participen. Un posible mecanismo por el que se produce la colestásis puede estar relacionado con la alteración en el transporte vesicular intracelular que provoca NDGA a una concentración de 25µM (Drecktrah et al, 1998) y 100µM (Ramoner et al, 1998). También se ha observado la disgregación del aparato de Golgi con 30µM de NDGA (Fujiwara et al, 1998). Esto sería similar al mecanismo de acción del taurolitocolato, que induce daño selectivo de la membrana canalicular, aumentando la rigidez de la membrana, perdiendo el microvilli, e impidiendo el movimiento transcelular de vesículas, así como también la fusión de vesículas al polo apical. Además impide la secreción de aniones orgánicos debido a un descenso en la densidad de MDR2 en la membrana canalicular, lo que conduce a colestasis y daño hepatocelular (Kullak-Ublick, 2000). No se pueden descartar sin embargo inhibiciones directas en los transportadores canaliculares, ya sea de colesterol ABCG5/8, ácidos biliares ABC11 (BSEP) o fosfolípidos MDR2 (Marschall y Einarsson, 2007; Hoffman, 2007). Efecto sobre la secreción biliar del extracto de L. tridentata y de NDGA en hígados perfundidos de hámsteres alimentados con dieta litogénica. La dieta litogénica para cálculos de colesterol, que es sin grasas y alta en azúcares refinados, provoca un incremento en la síntesis y secreción de colesterol. El hígado de animales con esta dieta es microscópicamente normal, pero histológicamente muestra esteatosis. Los hígados de animales que recibieron esta dieta por 3 semanas, parecen ser menos susceptibles a la colestasis inducida por L. tridentata y por NDGA (Tabla 2). La probable alteración en la fluidez de membranas por el exceso de colesterol y/o el cúmulo de grasa podrían ser la causa de esta tendencia. Efecto sobre la composición de lípidos biliares Respecto a los lípidos biliares de hígados perfundidos anteriores a los tratamientos (Tabla 3) podemos señalar que la adición del extracto de la planta a la dieta litogénica al nivel de 0.125%, administrado durante tres semanas, reduce el colesterol biliar a concentraciones similares a las de los alimentados con purina, reflejando un efecto producido por la administración contínua del extracto sobre la composición de la bilis. 48 Sin embargo, no cambia los ácidos biliares totales, lo que indica que la síntesis y secreción de ácidos biliares totales no se afecta crónicamente. Los tratamientos con L. tridentata y NDGA de los hígados perfundidos de animales que recibieron dietas diferentes, indican que en los que reciben purina no hay un efecto agudo sobre los lípidos biliares analizados. Los que reciben la dieta litogénica sí exhiben un efecto agudo, con una reducción del colesterol y un incremento en sales biliares (Tabla 4), lo que podría conducir a una bilis menos litogénica. Sin embargo, falta analizar lo que ocurre con los fosfolípidos, que no pudieron ser analizados por el reducido volumen de bilis de que se disponía. El incremento en la concentración de sales biliares pudiera deberse a que la colestasis inducida afecte mayormente a la fracción independiente de sales biliares, provocando así su mayor concentración. La reducción en el colesterol podría explicarse por la inhibición en el tránsito intracelular de vesículas, que es como el colesterol llega al canalículo. En relación al perfil de ácidos biliares primarios (Tabla 5), con el tratamiento del extracto de la planta, el ácido quenodesoxicólico tendió a incrementarse y el colato a disminuir, aunque solo alcanzó una diferencia significativa en los animales alimentados con dieta litogénica. Como se sabe este perfil produce una menor litogenicidad biliar (Hofman, 2007). El NDGA solo mostró ligeramente esta tendencia con la dieta litogénica, lo que aunado con una menor incremento en los ácidos biliares totales sugiere que en el extracto de L. tridentata hay algo más que el NDGA que afecta la secreción de lípidos biliares. Esto podría deberse a otro grupo de compuestos o a diferencias farmacológicas con alguno de los otros lignanos. No obstante el NDGA si redujo el colesterol biliar, lo que podría relacionarse con su mayor efecto colestático. Un mecanismo por el cual L. tridentata y NDGA afectan la secreción y el perfil de ácidos biliares puede estar relacionado con la disposición de las zonas que conforman el acino hepático, la periportal, y la centrolobulillar, las cuales difieren en su capacidad y velocidad para excretar ácidos biliares, y para procesar drogas (Baier et al, 2006). Algunos estudios sugieren que las células más cercanas a la vénula hepática (zona centrilobulillar) contribuyen predominantemente al metabolismo de fármacos vía el citocromo P-450, y son predominantemente alterados con estos (Erlinger et al, 1988). Esto puede tener relación con el efecto colestático de los compuestos probados, al tener un mayor efecto sobre los hepatocitos periportales que sobre los pericentrales, los cuales metabolizan los ácidos biliares de manera diferente (Baumgartner et al 2001). Efecto del té de L. tridentata suministrado por 3 semanas sobre la secreción biliar del hámster alimentado durante el mismo periodo con dieta litogénica El extracto etanólico es efectivo en reducir la incidencia de cálculos de colesterol en hámsters alimentados con una dieta litogénica. Sin embargo, puesto que en la medicina tradicional se emplea el té, también se administró ad libitum en sustitución de agua, encontrándose que previene la formación de cálculos 49 biliares. Aunque no reduce significativamente el porciento molar de colesterol, todos los cambios en lípidos biliares, incluyendo el aumento en fosfolípidos, tienden hacia una bilis menos litogénica. Se observó también en la necropsia que el tamaño del ciego fue significativamente mayor en ese mismo grupo, lo que indica alteraciones a nivel intestinal, muy probablemente la acción antibiótica de L. tridentata. Modificaciones sobre la cantidad y el perfil de los ácidos biliares fecales La secreción biliar depende en gran medida de la circulación enterohepática. La formación de la poza de ácidos biliares resulta de la conservación intestinal eficiente, mediada en gran parte por el sistema de transporte ileal de ácidos biliares conjugados (Hoffman, 2007). La dieta litogénica per se produce una reducción en los ácidos biliares fecales, lo cual se debe al tipo y contenido de fibra, que provoca menor arrastre de los ácidos biliares y mayor tiempo de retención, que facilita su extracción del contenido intestinal. El suministro de L. tridentata como té o extracto induce un incremento en el tamaño del ciego, y una reducción aún mayor que la producida por la dieta litogénica sola en los ácidos biliares fecales totales, lo cual se dede al conocido efecto antibiótico del extracto de la planta (Mabry y Bohnstedt, 1981; Argueta, 1994; Verastegui et al, 1996). En el perfil de ácidos biliares también se observa un aumento significativo del ácido quenodesoxicólico, tanto en los animales que bebieron el té como los que consumieron el extracto. Como consecuencia, las proporciones de ácidos biliares fecales primarios se incrementaron significativamente, así como también disminuyeron los secundarios con ambos tratamientos de L. tridentata, particularmente el ácido desoxicólico, el cual se ha asociado a una mayor secreción de colesterol, colelitiasis y tránsito intestinal lento (Dowling2000; Thomas 2000). Los resultados concuerdan con los estudios reportados en rata, en donde se observó que el tratamiento con antibióticos disminuye los microbios anaerobios fecales, reduciendo los ácidos biliares fecales totales. También se observó un decremento de ácidos biliares secundarios, mientras que los primarios se volvieron predominantes. Asimismo, el tamaño del ciego aumentó al doble de los animales sin tratamiento (Hashimoto, 1996), por lo que nuestros resultados indican que hay un efecto antibiótico de L. tridentata, el cual parece ser inclusive más fuerte con el té que con el extracto de la planta adicionado a la dieta. Los resultados obtenidos en estudios con extractos etanólicos y clorofórmicos de L. tridentata, que inhibieron Entamoeba hystolitica y E. invadens in vitro, sugieren que la polaridad de la molécula y la formación de ortoquinona está involucrada en su actividad antibiótica y antiparasitaria (Segura, 1978; Calzado-Flores et al, 1995). Se sabe que los lignanos son metabolizados a enterodiol y enterolactona por la flora intestinal y que el NDGA es convertido por la microflora intestinal a compuestos con actividad estrogénica in vitro e in vivo (Fujimoto et al, 2004). 50 Algunos otros aspectos que pueden analizarse para tener una información más completa es la determinación de los niveles sanguíneos de NDGA en hámsters con dieta litogénica y en humanos que consumen el té, lo cual podría ayudar a establecer claramente las dosis terapéutica y tóxica. No debemos olvidar también que el extracto etanólico de L. tridentata contiene un gran número de otros metabolitos secundarios, como lignanos y flavonoides, que pudieran ser el principio activo, o bien ser parte de la actividad como sinergistas. Se ha informado que los flavonoides alteran procesos de transporte y secreción a nivel del intestino y del colon que podrían interferir con la circulación enterohepática de sales biliares, o que por sus propiedades antioxidantes o quelantes pudieran estar alterando la microbiota intestinal, además de que las agliconas flavonoides poseen una parte hidrofóbica que pueden formar micelas en el proceso del transporte transcelular y alterarlo (Manach et al, 2004). Con base en la información presentada, los padecimientos como colelitiasis, colestasis y hepatotoxicidad (incluyendo como causa común la automedicación herbal) continúan representando un problema global de salud, y aunque hay variaciones en su epidemiología, se continúan reportando una importante prevalencia (Alderman, 1994; Sheik et al, 1997; Brent, 1999; Larrey, 2000; Chitturi y Farrel, 2000; Stickel et al, 2000; Pak et al, 2004). A pesar de que existen instituciones que intentan regular los productos herbales (DSHEA (Dietary Supplement Health and Education Act), FDA), algunas veces se emplean altas y/o prolongadas dosis de productos herbales, cuya identificación es dudosa o incluso es sustituida, o también hay alguna variación en las preparaciones de los ingredientes activos, resultando en efectos no benéficos como la hepatitis tóxica o la enfermedad veno-oclusiva, etc. (Alderman et al, 1994; Gordon et al, 1995). Una alternativa es que se determinaran los diferentes efectos con diferentes métodos de preparación, o mejor aún que fueran procesados para eliminar o reducir la toxicidad o incrementar los efectos terapéuticos; de cualquier manera es importante que los pacientes estén informados de los potenciales riesgos y beneficios de los productos naturales (Ko, 1999). Serían también requeridos estudios prospectivos para establecer claramente la incidencia de hepatotoxicidad por remedios herbales, mientras tanto se requiere la vigilancia médica es requerida para disminuir el problema en el uso de fitoterapias o terapias alternativas (Chitturi y Farrel, 2000). Por otra parte no se puede dejar de considerar la tendencia general a una vida sedentaria y una dieta alta en grasas, obesidad e hipertrigliceridemia, lo cual favorece la formación de cálculos de colesterol (Marshall y Einarson, 2007). El tratamiento principal sigue siendo de tipo quirúrgico, mediante la colecistectomía, y a pesar de la menos invasiva colecistectomía laparoscópica, la mortalidad, las complicaciones y el tiempo de operación no difiere entre ellas (Keus et al, 2006), de tal modo, se vuelve indispensable una forma preventiva o una estrategia alternativa de tratamiento. En este sentido, la identificación de actividad preventiva segura, del extracto de L. tridentata y del NDGA puede representar 51 una oportunidad de incorporar un fármaco, al intervenir favorablemente en el proceso de formación y secreción biliar. Aunque se ha confirmado el potencial farmacológico de L. tridentata, se requieren más estudios con el objetivo de obtener un compuesto seguro, y que además por su condición natural, sería renovable y de bajo costo, dando una mayor utilidad a esta abundante planta de nuestros desiertos. 52 X Conclusiones Dentro de los mecanismos que conducen a la prevención de la litiasis por el extracto etanólico de Larrea tridentata, se encontraron efectos tanto a nivel hepático como intestinal. Se encontró un efecto colestático tanto del extracto de Gobernadora como del NDGA. Bajo las condiciones de estudio, se establecieron las concentraciones efectivas 50 (EC50) para el extracto etanólico de la planta, 34 mg dL-1 y para el NDGA, 28 mg dL-1, lo cual confirma su hepatotoxicidad. El efecto colestático es reversible en dosis menores a 40 mg dL-1. En los hígados de hámsters alimentados con dieta litogénica, la perfusión tanto de extracto etanólico de L. tridentata como de NDGA a 10 mg dL-1 por 10 minutos produce una reducción significativa de la concentración de colesterol biliar y un incremento de la de ácidos biliares totales. Este efecto no ocurre en el hígado perfundido de animales alimentados con purina. La perfusión de 10 mg dL-1 de extracto de L. tridentata incrementa la proporción de ácido quenodesoxicólico y disminuye la de ácido cólico, en los hígados de animales alimentados con dieta litogénica. En hámsters, la infusión de L. tridentata y extracto adicionado al 0.125% a la dieta litogénica previenen en alto porcentaje la colelitiasis. El tamaño del ciego de estos animales se incrementa significativamente. Los ácidos biliares fecales totales se reducen, con un incremento de quenodesoxicolato y una reducción de desoxicolato. En consecuencia la proporción de ácidos biliares primarios se incrementa. Los resultados sugieren que L. tridentata puede se usada en el tratamiento de la colelitasis de colesterol. Sin embargo, su uso debe ser muy cuidadoso, ya que los niveles preventivo y tóxico podrían estar muy cercanos, especialmente en el caso del NDGA. BIBLIOGRAFÍA Abou-Gazar H, Bedir E, Takamats S, Ferreira D, Khan, I. 2004. Antioxidant lignans from Larrea tridentata. Phytochemistry 65, 2499-2505. Agarwal R, Wang D, Bik P, Mukhtar H. 1991. Nordihydroguaiaretic acid, an inhibitor of lipoxygenase, also inhibits cytochrome P-450-mediated monooxygenase activity in rat epidermal and hepatic microsomes. Drug Metab Dispos 19, 620-624. Alderman S, Kailas S, Goldfarb S, Singaram C, Malone D. 1994. Cholestatic hepatitis after ingestion of chaparral leaf: confirmation by endoscopic retrograde cholangiopancreatography and liver biopsy. J Clin Gastroenterol 19, 242-247. Ansar S, Iqbal M, Athar M. 1999. Molecular epidemiology and cancer prevention. 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