UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMÉDICAS INSTITUTO DE FISIOLOGÍA CELULAR EVALUACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE REST/NRSF Y LA POSIBLE REGULACIÓN TRANSCRIPCIONAL EJERCIDA SOBRE LOS GENES GRIA2 Y GABRD EN HIPOCAMPO DE PACIENTES CON EPILEPSIA DE LÓBULO TEMPORAL FARMACORRESISTENTE TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: DOCTOR EN CIENCIAS PRESENTA: M. en C. VÍCTOR NAVARRETE MODESTO DIRECTORA DE TESIS DRA. LUISA LILIA ROCHA ARRIETA DEPARTAMENTO DE FARMACOBIOLOGÍA, CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE ESTUDIOS AVANZADOS DEL INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL COMITÉ TUTOR DRA. ROSALINDA GUEVARA GUZMÁN FACULTAD DE MEDICINA, UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO DRA. CAROLINA ESCOBAR BRIONES FACULTAD DE MEDICINA, UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO CIUDAD DE MÉXICO. ENERO DE 2020 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. D bMORADO --- ' " CIENCI A S IOMÉm CA Esta tesis fue realizada en los siguientes laboratorios: Laboratorio 8 del Departamento de Farmacobiología del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN Unidad de Investigación Médica en Enfermedades Neurológicas del Hospital de Especialidades "Dr. Bernardo Sepúlveda Gutiérrez" del Centro Médico Nacional Siglo XXI del Instituto Mexicano del Seguro Social Laboratorio de Estructuras de Proteínas del Instituto Nacional de Medicina Genómica La presente tesis fue realizada gracias al apoyo de: Beca Nacional de Doctorado Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología CVU: 377494 Febrero 2014 - enero 2018 Programa de Becarios IMSS Instituto Mexicano del Seguro Social Matricula: 99096812 Marzo 2015 – febrero 2018 Esta tesis fue parte del proyecto R-2017-785-100 aprobado por el Comité Nacional de Investigación Científica del IMSS a nombre de la Doctora Sandra Adela Orozco Suárez Dedicada a: A mis padres Margarito y Plácida por todo su apoyo, su ejemplo y su guía, pues a ellos debo todo lo que soy. A mi pequeño Christian, quien le ha dado un nuevo sentido a mi vida, me ha mostrado una nueva y hermosa forma de amor y me ha dado las más grandes lecciones de vida. A mis hermanos Edgar y Daniel (junto a su familia) quienes le han dado sentido a la vida familiar y me han brindado su apoyo y su confianza. A la memoria de mis abuelos Francisco, Isabel y Florencio porque se que desde el lugar donde se encuentran, iluminan y guían cada paso en mi vida. A Pako, Yaravi y Víctor, porque a pesar de que la vida nos ha llevado por caminos distintos, su apoyo, su confianza y compañía fue parte fundamental en este camino. A todos los demás miembros de mi familia, tías, primos, sobrinos y en especial a mi abuelita Francisca, quienes siempre han creído en mí y me han brindado su mano para continuar en este camino. Y a mis amigos, tanto nuevos, como aquellos que por años han estado ahí, viéndome crecer y que me han mostrado que todos los días es una nueva oportunidad para vivir. Agradecimientos: A la Dra. Luisa Rocha, por su invaluable apoyo y su guía en el camino de la ciencia, haciéndome parte de su equipo de trabajo en el laboratorio 8 del Cinvestav Sur. A la Dra. Sandra Orozco por su apoyo, su asesoría y sobre todo por su gran calidad humana, que hicieron muy satisfactoria mi estancia en la UIMEN del CMNSXXI. A la Dra. Iris Feria de la UIMEN del CMNSXXI, por su asesoría, disposición y apoyo en la realización de este proyecto, siempre con miras a fortalecer mi formación. Así como al Dr. Julio Pérez del INMEGEN, por su disposición y su valiosa contribución para el desarrollo de mi proyecto. A las Dras. Rosalinda Guevara Guzmán y Carolina Escobar Briones por su tiempo en cada tutoral y su importante asesoría para el desarrollo del proyecto y en beneficio de mi formación. A la UNAM y al posgrado de Ciencias Biomédicas por brindar los medios que permiten enriquecer la formación académica y profesional. Especialmente a Sara, secretaria de la entidad académica Instituto de Fisiología Celular cuya ayuda es fundamental al brindarnos todas las facilidades para los trámites administrativos propios del posgrado. A todos los doctores que a través de los cursos comparten su tiempo y sus conocimientos favoreciendo nuestro desarrollo académico. A la Q.F.B. Francia Carmona Cruz del Cinvestav Sur por su asesoría y apoyo técnico en la realización del trabajo experimental A ILAE e IBRO cuyo apoyo fue fundamental en mi proceso formativo y han abierto un parteaguas invaluable en mi desarrollo profesional como científico y epileptólogo A todos aquellos compañeros y amigos que se volvieron parte fundamental de mi día a día, que hicieron más ameno el trabajo en el laboratorio (y fuera de él) al compartir momentos, charlas, sonrisas, tristezas, frustraciones y demás. Ángeles, Dany, Cindy, Marisol, José Luis, así como los doctores César, Ivette, Leonardo y Lupita del laboratorio 8 del Cinvestav. Monse, Angy, Viny, Estefy, Rodrigo, Josué, Lalo, Azul, Katia de la UIMEN del CMNSXXI. Así como Gabriel, mi teacher y gran amigo A mis amigos de la vida, Gaby, Héctor, Martin, Pily, Cris, Isa, Mary, Ely y Ely que son como hermanos, nos hemos visto crecer y siempre han estado ahí creyendo en mí. También a Hiro, Jess, Salma, Gris y Diana, amigos entrañables que ya forman parte invaluable de mi historia. A Pako, Yaravi y Víctor porque hicieron suyos mis sueños y recorrieron junto a mí una parte del camino. A mis padres y hermanos por su gran apoyo y compartir sus sueños con los míos, por ser la gran familia que somos y por todo aquello que no puedo expresar con palabras. A Christian Jesús, mi hijo, porque gracias a él la vida tiene otro sentido, y es mi mayor impulso para conseguir este logro. A mis abuelos Francisco, Isabel y Florencio por su Luz que siempre está conmigo, y a mi abuelita Francisca, por sus grandes enseñanzas de vida. A toda mi familia, quienes desde el inicio me han apoyado. Finalmente quiero agradecer a Dios por la maravillosa vida que me ha dado, la gente que ha puesto en mi camino y por ser mi eterno guía y a quien todo debo. Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente I Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM Contenido Índice de Abreviaturas ................................................................................................................................. III Índice de Figuras ......................................................................................................................................... V Índice de Tablas .......................................................................................................................................... V Resumen .................................................................................................................................................... VI Summary ................................................................................................................................................... VII 1 Introducción.......................................................................................................................................... 1 1.1 Epilepsia y Epilepsia de Lóbulo Temporal (ELTM) ...................................................................... 1 1.2 Tratamiento farmacológico y farmacorresistencia ....................................................................... 2 1.3 Comorbilidades psiquiátricas asociadas a epilepsia y síndromes epilépticos ............................. 8 1.4 Regulación génica en ELTM ....................................................................................................... 8 1.4.1 GluR2 ................................................................................................................................. 9 1.4.1.1 Estructura y regulación genómica .................................................................................. 9 1.4.1.2 Mecanismos funcionales .............................................................................................. 11 1.4.1.3 Implicaciones en epilepsia ........................................................................................... 12 1.4.2 GABAAδ ............................................................................................................................. 13 1.4.2.1 Estructura y regulación genómica ................................................................................ 13 1.4.2.2 Mecanismos funcionales .............................................................................................. 15 1.4.2.3 Implicaciones en epilepsia ........................................................................................... 16 1.5 Regulación transcripcional mediada por REST/NRSF .............................................................. 18 2 Justificación........................................................................................................................................ 20 3 Hipótesis ............................................................................................................................................ 20 4 Objetivos ............................................................................................................................................ 20 4.1 Objetivo General ....................................................................................................................... 20 4.2 Objetivos Particulares ............................................................................................................... 20 5 Materiales y métodos ......................................................................................................................... 21 5.1 Estandarización de la Reacción en Cadena de Polimerasa cuantitativa (qPCR) ...................... 21 5.1.1 Diseño de cebadores y sondas para sistema TaqMan con IDT ....................................... 21 5.1.2 Diseño de gBlocks para sistema TaqMan con IDT ........................................................... 23 5.1.3 Obtención de curvas de calibración .................................................................................. 23 5.1.3.1 Preparación de células químicas competentes ............................................................ 24 5.1.3.2 Transformación de células quimiocompetentes ........................................................... 24 5.1.3.3 PCR de colonias (Colony PCR) ................................................................................... 25 5.1.3.4 Curvas de calibración ................................................................................................... 25 5.2 Obtención de tejido hipocampal de autopsias ........................................................................... 26 5.2.1.1 Criterios de inclusión .................................................................................................... 27 5.2.1.2 Criterios de exclusión ................................................................................................... 27 5.3 Obtención de tejido hipocampal de pacientes con ELTM farmacorresistente ........................... 28 5.3.1.1 Criterios de inclusión .................................................................................................... 29 5.3.1.2 Criterios de exclusión ................................................................................................... 29 5.4 Procesamiento y manipulación del tejido hipocampal ............................................................... 30 5.5 Extracción y procesamiento de ARNm mediante qPCR ............................................................ 30 5.5.1 Síntesis de ADN complementario (ADNc) ........................................................................ 31 5.5.2 PCR en tiempo real .......................................................................................................... 32 5.6 Extracción y procesamiento de proteínas mediante western blot ............................................. 32 5.6.1 Extracción de proteínas totales ........................................................................................ 32 5.6.2 Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) ....................................................... 32 5.6.3 Transferencia .................................................................................................................... 33 5.6.4 Bloqueo e inmunodetección ............................................................................................. 33 5.6.5 Stripping & reblotting ........................................................................................................ 34 5.7 Inmunoprecipitación de cromatina ............................................................................................. 34 5.7.1 Disgregación del tejido y crooslinking ............................................................................... 34 5.7.2 Lisis celular ....................................................................................................................... 35 5.7.3 Optimización de la fragmentación del ADN mediante sonicación..................................... 35 Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente II Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM 5.7.4 Inmunoprecipitación y crooslinking reversal ..................................................................... 36 5.7.5 Amplificación de secuencias RE1 de los genes GRIA2 y GABRD por PCR .................... 38 5.7.5.1 Análisis predictivos de sitios RE1 y diseño de cebadores ............................................ 38 5.7.5.2 PCR punto final ............................................................................................................ 39 5.8 Análisis estadístico .................................................................................................................... 40 6 Resultados y discusión ...................................................................................................................... 41 6.1 Confiabilidad, sensibilidad y precisión en la amplificación génica ............................................. 41 6.2 Expresión de REST/NRSF en pacientes con ELTM farmacorresistente y su asociación con variables clínicas y psiquiátricas. ........................................................................................................... 43 6.2.1.1 Características clínicas de las autopsias...................................................................... 43 6.2.1.2 Características clínicas de los pacientes con ELTM farmacorresistentes .................... 43 6.2.1.3 Expresión de REST/NRSF en hipocampo de autopsias .............................................. 43 6.2.1.4 Expresión de REST/NRSF en hipocampo de pacientes con ELTM farmacorresistente y su asociación con las variables clínicas y comorbilidades psiquiátricas ........................................ 46 6.3 Unión de REST/NRSF a la secuencia ER1 en el promotor de los genes GRIA2 y GABRD ..... 50 6.3.1.1 Identificación de las secuencias RE1 en los promotores de GRIA2 y GABRD en corteza cerebral de autopsia ......................................................................................................... 51 6.3.1.2 Unión de REST/NRSF a las secuencias promotoras de GRIA2 y GABRD en hipocampo de autopsias y pacientes con ELTM. .......................................................................... 54 6.4 Expresión transcripcional de GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con ELTM y su asociación con la sobreexpresión de REST/NRSF ................................................................................ 57 6.4.1 Correlación entre los niveles de ARNm de GRIA2 y GABRD con las variables clínicas y la sobreexpresión de REST/NRSF ........................................................................................................ 60 7 Discusión general ............................................................................................................................... 63 8 Conclusiones ...................................................................................................................................... 67 9 Perspectivas ....................................................................................................................................... 68 10 Bibliografía ..................................................................................................................................... 71 11 Anexos ........................................................................................................................................... 82 11.1 Anexo 1. Carta de autorización para la obtención de tejido hipocampal de autopsias .............. 82 11.2 Anexo 2. Carta de aprobación del proyecto y protocolos relacionados. .................................... 83 11.3 Anexo 3. Membrana completa de western blot para REST/NRSF ............................................ 84 11.4 Anexo 4. Artículo Publicado ...................................................................................................... 85 11.5 Anexo 5: Otras Publicaciones (Articulo de Revisión) ................................................................ 91 11.6 Anexo 6: Otras Publicaciones (Capitulo de Libro) ................................................................... 104 11.7 Anexo 7: Participación en congresos y eventos científicos ..................................................... 121 Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente III Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM Índice de Abreviaturas ADAR Adenosina Deaminasa Dependiente de ARN ADN Ácido desoxirribonucleico AK Ácido kaínico AMPA Receptores α-amino-3-hidroxi-5-metilisoxazolepropionato a glutamato ANOVA Análisis de Varianzas AP2 Activator Protein 2/ Clathrin adaptor 2 (Proteína Activadora tipo 2/Adaptador de Clatrina tipo 2) ARNm Ácido Ribonucleico mensajero BD Bipolar Disorder (Desorden Bipolar) BPD Borderline Personality Disorder (Trastorno Limitrofe de Personalidad) BSF-1 Factor Específico de Cerebro 1 CA Regiones del Cornu Ammonio (Cuerno de Amón, Hipocampo) Ca2+ Ion calcio ADNc Ácido desoxiribonucleico complementario Cbp Cuanto baste para ChIP Chromatin immunoprecipitation (Inmunoprecipitación de cromatina) Cl- Ion cloro CP crooss point (Punto de cruce) CpG, isla Regiones con una gran concentración de pares de citosina y guanina enlazados por fosfatos (Citosina-fosfato-Guanina) CREB Cyclic Adenosine Monophosphate (cAMP) response element-binding protein (Proteína de unión al elemento de respuesta a Adenosín Monofosfato cíclico) DEPC Diethyl pyrocarbonate (Dietil pirocarbonato) DMSO Dimetilsulfóxido dNTP Deoxynucleotide Triphosphates (Deoxinucleótidos trifosfato) DO Densidad Óptica DRG Dorsal Root Ganglion (Ganglio de la raíz dorsal) EDTA Ácido etilendiaminotetraacético EEG Electroencefalograma EEM Error Estandar de la Media ELT Epilepsia de Lóbulo Temporal ENO2 Gen que codifica para Enolasa 2 ERK Extracellular-signal-Regulated Kinase pathway (Vía de las cinasas reguladas por señales extracelulares) FAE Fármaco Antiepiléptico GABA Ácido γ-aminobutírico GABAA Receptor tipo A para ácido γ-aminobutírico GABAAδ Subunidad delta de los receptores GABAA GABRD Gen que codifica para la subunidad δ de los receptores GABAA GDNF Glial cell-Derived Neurotrophic Factor (Factor Neurotrófico derivado de células gliales) GluR Subunidades de los receptores AMPA a glutamato GRIA2 Gen que codifica para la subunidad 2 de los receptores AMPA a glutamato GRIP Glutamate Receptor Interacting Protein (Proteína de interacción con el receptor a glutamato) HADS Hospital and Anxiety Depression Scale HCl Ácido clorhídrico HCN1 Gen que codifica para los canales de cationes acoplados a nucleótidos cíclicos de tipo 1 HDAC Histone Deacetylase (Desacetilasa de histonas) HMT Histone methyltransferases (Metiltransferasa de histonas) HS Hippocampal Sclerosis (Esclerosis hipocampal) IDT® Integrated DNA Technologies (Tecnologías integradas del ADN) Ih Corriente hiperpolarizante Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente IV Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM ILAE International League Against Epilepsy (Liga International contra la epilepsia) IPM Intervalo Post-Mortem K+ Ion potasio LB, agar Agar Luria-Bertani MAPK Mitogen-Activated Protein Kinase pathway (Vía de las proteínas cinasas activadas por mitógenos) MgCl2 Cloruro de Magnesio MgSO4 Sulfato de Magnesio M-MLV RT Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase Na+ Ion sodio NaCl Cloruro de sodio NC Nucleotide Complete. (Molécula genómica completa en base de datos de NCBI) NCBI National Center for Biotechnology Information (Centro Nacional para la Información en Biotecnología) NM Nucleotide Messenger (Secuencia ARNm en base de datos de NCBI) NP-40 Nonil Fenoxipolietoxiletanol NRF-1 Nuclear Respiratory Factor 1 (Factor Respiratorio Nuclear tipo 1) NRSF Neuron-Restrictive Silencer Factor (Factor Silenciador Restrictivo a Neuronas) NSF N-ethylmaleimide-sensitive fusion proteins (Proteínas de Fusión Sensibles a N- etilmaleimida. Nt Nucleótidos PBS Phosphate-Buffered Saline (Amortiguador salino de fosfatos) PCR Polymerase Chain Reaction (Reacción en cadena de la polimerasa) PDZ Dominio de reconocimiento proteico que repite la secuencia Glicina-Leucina-Glicina- Fenilalanina PICK1 Protein Interacting with C Kinase – 1 (Proteína que interactúa con la C cinasa 1) qPCR Quantitative PCR (PCR cuantitativa) r Coeficiente de correlación de Pearson R2 Coeficiente de correlación lineal. RE1 Represor Element 1 (Elemento represor tipo 1) REST Gen que codifica para el factor de transcripción REST/NRSF REST RE1-Silencing Transcription factor (Factor de Transcripción Silenciador de RE1) RT-PCR Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa reversa SDS Dodecilsulfato sódico SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis SEMEFO Servicio Médico Forense SFB Suero Fetal Bovino Sin3A Paired amphipathic helix protein (Proteína con hélices emparejadas anfipáticas) SNC Sistema Nervioso Central SOB, medio Medio “Super Optimal Broth” Sp1 Specific Protein 1 (Proteína Especifica 1) TATA, caja Secuencia del tipo 5'-TATAAA-3', que es seguida generalmente por tres o más adeninas encontrada en los promotores génicos. TBS Tris-Buffered Saline (Amortiguador salino de Tris) TM Dominios Transmembranales Tm Melting Temperature (Temperatura de Fusión) UTR Untranslated Region (Región no traducida) WNT Wingless/Integrated pathway (Vía Wingless/integrada) Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente V Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM Índice de Figuras Figura 1 Estructura y regulación del gen GRIA2…………………………………………………….. 10 Figura 2 Estructura y función de la subunidad GluR2……………………………………………… 11 Figura 3 Estructura y función del gen GABRD humano…………………………………………… 14 Figura 4 Estructura y función de los receptores GABAA…………………………………………… 15 Figura 5 Función y Estructura génica y proteica de REST/NRSF………………………………… 19 Figura 6 Fragmento gBlock global …….……………………………………………………………... 23 Figura 7 Patrones de fragmentación del ADN mediante sonicación ……………………………... 37 Figura 8 Ensayos predictivos ChIP-Seq para la unión de REST/NRSF en sitios RE1 de GRIA2 y GABRD………………………………..………………………………………………….… 39 Figura 9 Curvas de calibración para qPCR de ENO2, REST/NRSF, GRIA2 y GABRD…………. 42 Figura 10 Correlación de la edad con la expresión proteica de REST/NRSF en el hipocampo humano.………………………………………………………………………………………. 46 Figura 11 Expresión de REST/NRSF en el hipocampo de autopsias y pacientes con ELTM farmacorresistente…………………………………………………………………………… 47 Figura 12 Correlación entre la frecuencia de las crisis epilépticas y la expresión de proteína de REST/NRSF en el hipocampo de pacientes con ELTM farmacorresistente…………… 48 Figura 13 Expresión de REST/NRSF en el hipocampo de pacientes con ELTM farmacorresistente con y sin ansiedad y depresión comórbidas………………………… 49 Figura 14 Determinación de los sitios RE1 de los promotores de los genes GRIA2 y GABRD…... 52 Figura 15 Localización de las secuencias RE1 en los genes GRIA2 y GABRD…......................... 53 Figura 16 Unión de REST/NRSF a las secuencias RE1 de los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de autopsias y pacientes con ELTM………………………………………….. 56 Figura 17 Expresión de ARNm de GluR2 y GABAAδ en hipocampo de autopsias y pacientes con ELTM farmacorresistente………………………………………………………………. 59 Figura 18 Correlación de la edad con la expresión de ARNm de GluR2 en hipocampo de autopsias y pacientes con ELTM farmacorresistente…………………………………….. 60 Figura 19 Correlación entre la frecuencia de crisis epilépticas y la expresión de ARNm de GluR2 y GABAAδ en pacientes con ELTM farmacorresistente………………………………….. 62 Figura 20 Modelo de regulación transcripcional de los genes GRIA2 y GABRD mediada por REST/NRSF en hipocampo de pacientes con ELTM…………………………………….. 60 Índice de Tablas Tabla 1 Clasificación de los Fármacos Antiepilépticos utilizados en la clínica ………………. 3 Tabla 2 Características de los cebadores y sondas para REST/NRSF, GRIA2, GABRD y ENO2………...…………………………………………………………………………...… 22 Tabla 3 Programa de amplificación por qPCR para REST/NRSF y ENO en sistema LightCycler 2.0……………………………………………………………………………... 26 Tabla 4 Datos demográficos de las autopsias………………..…………………………………... 27 Tabla 5 Datos clínicos de los pacientes con ELTM ……………………………………………… 28 Tabla 6 Cebadores utilizados para amplificar las dos secuencias hipotéticas de unión de REST/NRSF a los promotores de GRIA2 y GABRD……………………………………. 38 Tabla 7 Valores de la ecuación de la recta obtenidos de curvas de calibración de ENO2 y REST/NRSF, GRIA2 y GABRD …………………………………………………….……. 42 Tabla 8 Valores de expresión de ARNm y proteínas de pacientes y autopsias...………...…… 44 Tabla 9 Correlaciones entre la expresión de REST/NRSF y las variables clínicas……...…… 45 Tabla 10 Correlaciones entre los niveles de ARNm de GluR2 y GABAAδ con las variables clínicas de las autopsias y pacientes con ELTM ….…..………………………………... 58 Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente VI Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM Resumen Introducción: REST/NRSF es un factor de transcripción que reprime genes neuronales al unirse a su secuencia consenso en el ácido desoxirribonucleico (ADN), conocida como sitio RE1. Diversos estudios experimentales han demostrado que los genes GRIA2 y GABRD tienen sitios RE1 en sus regiones promotoras. El gen GRIA2 codifica para la subunidad GluR2 de los receptores AMPA a glutamato, la cual regula la permeabilidad a calcio. El gen GABRD codifica para la subunidad δ de los receptores GABAA, la cual regula la corriente tónica a nivel extrasináptico. Por otra parte, se ha demostrado que en modelos experimentales de crisis convulsivas se incrementa la expresión de REST/NRSF a la vez que disminuyen los niveles de ARNm de GluR2 y GABAAδ. Sin embargo, a la fecha no se ha evaluado la expresión de REST/NRSF, ni su participación sobre la regulación transcripcional de los genes que codifican para GluR2 y GABAAδ en pacientes con Epilepsia de Lóbulo Temporal Mesial (ELTM) farmacorresistente. Materiales y Métodos: Se obtuvieron 28 hipocampos de pacientes con ELTM fármacorresistente sometidos a cirugía y 13 hipocampos de autopsias que fueron utilizados como condición control. La expresión de ARNm y proteína de REST/NRSF, GluR2 y GABAAδ se evaluó mediante PCR en tiempo real (qPCR) y western blot, respectivamente. La unión de REST/NRSF a las secuencias RE1 en los promotores de GRIA2 y GABRD se determinó mediante Inmunoprecipitación de Cromatina (ChIP) seguida de PCR punto final. En todos los casos se determinaron las correlaciones entre la expresión de ARNm y proteínas con las variables clínicas y con comorbilidades psiquiátricas como ansiedad y depresión. Resultados: Los resultados mostraron que el ARNm y la proteína de REST/NSRF se incrementan en pacientes versus autopsias. El incremento proteico de REST/NSRF se asocia con una mayor frecuencia de crisis epilépticas y se incrementa con la edad en autopsias. Además, la sobreexpresión de REST/NRSF fue más evidente en pacientes con MTLE sin ansiedad y depresión. Se determinaron los sitios RE1 de los promotores de GRIA2 y GABRD, y mediante ChIP se mostró que están más enriquecidos con REST/NRSF en pacientes que en autopsias. Además, la expresión de ARNm de GluR2 y GABAAδ disminuye en pacientes con ELTM. Dicha disminución correlaciona con una mayor frecuencia de crisis epilépticas de manera inversamente proporcional a la proteína de REST/NRSF. Así también, a mayor edad, los niveles de ARNm de GluR2 disminuyen tanto en pacientes como en autopsias. Conclusiones: El factor de transcripción REST/NRSF se sobreexpresa en el hipocampo de pacientes con ELTM. La sobreexpresión de REST/NRSF se asocia positivamente con la frecuencia de las crisis y con el desarrollo de comorbilidades psiquiátricas. La sobreexpresión de REST/NRSF en pacientes con ELTM induce una mayor unión a las secuencias RE1 de los genes GRIA2 y GABRD, lo que correlaciona con la disminución en sus niveles de ARNm. De acuerdo con lo anterior, la inhibición transcripcional mediada por REST/NRSF podría ser uno de los mecanismos represores de GRIA2 y GABRD, modificando su regulación y facilitando la actividad epiléptica, ya que dichos genes están involucrados en procesos de excitabilidad e inhibición de redes neuronales Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente VII Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM Summary Rational: REST / NRSF is a transcription factor that acts as a transcriptional repressor of neuronal genes by binding to its consensus sequence, known as the RE1 site, in DNA. Several experimental studies have shown that the GRIA2 and GABRD genes have RE1 sites in their promoter regions. The GRIA2 gene code for the GluR2 subunit of glutamate AMPA receptors, which regulates calcium permeability. The GABRD gene codes for the δ subunit of the GABAA receptors, which regulate the tonic current at the extrasynaptic level and the neuronal excitability, according to the chloride ion concentration gradient. On the other hand, it has been demonstrated that in experimental models of seizures, the expression of REST/NRSF is increased while the levels of mRNA of GluR2 and GABAAδ decrease. However, to date, the expression of REST/NRSF, nor its participation on the transcriptional regulation of genes encoding GluR2 and GABAAδ in patients with drug-resistant Mesial Temporal Lobe Epilepsy (mTLE) has not been evaluated. Materials and Methods: 28 hippocampi were obtained from patients with drug-resistant mTLE undergoing surgery and 13 autopsy hippocampi, that were used as controls. The expression of mRNA and proteins of REST/NRSF, GluR2 and GABAAδ was assessed by real-time PCR (qPCR) and western blot, respectively. The binding of REST/NRSF to RE1 sequences in the GRIA2 and GABRD promoters was determined by Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) followed by endpoint PCR. In all cases, the statistical correlations between the expression of mRNA and proteins with clinical variables and with psychiatric comorbidities were determined. Results: The results showed that both the mRNA and the REST/NSRF protein are increased in patients versus autopsies. The increase in protein expression is associated with a greater frequency of epileptic seizures. On the other hand, the REST/NRSF protein increases with age at autopsy. The RE1 sites of the GRIA2 and GABRD promoters were determined, and ChIP showed that they are more enriched with REST/NRSF in patients compared to autopsies. In addition, the expression of GluR2 and GABAAδ mRNA decreases in patients with mTLE. This decrease correlates with a higher frequency of epileptic seizures inversely proportional to the REST/NRSF protein. Also, at an older age, GluR2 mRNA levels decrease both in patients and in autopsies. Conclusions: The transcription factor REST/NRSF is overexpressed in the hippocampus of patients with mTLE. Overexpression of REST/NRSF is is positively associated with the frequency of seizures and with the development of psychiatric comorbidities. Overexpression of REST/NRSF in patients with mTLE induces a greater binding to the RE1 sequences of the GRIA2 and GABRD genes, which correlates with the decrease in their mRNA levels. According to the above, the transcriptional inhibition mediated by REST/NRSF could be one of the repressor mechanisms of GRIA2 and GABRD, modifying its regulation and facilitating epileptic activity, since these genes are involved in processes of excitability and inhibition of neural networks. 1 Introducción 1.1 Epilepsia y Epilepsia de Lóbulo Temporal (ELTM) La epilepsia es un desorden neurológico que afecta a casi el 1% de la población mundial equivalente a casi 70 millones de personas (Elger, 2002) y que ocupa el segundo lugar mundial en prevalencia de entre todas enfermedades neurológicas (Hwang et al., 2013). Se define como la condición recurrente de crisis epilépticas no provocadas (dos o más), debido a una predisposición genética o un estado patológico crónico adquirido (Stafstrom, 2010). Así, una crisis epiléptica se define como la alteración temporal de la función cerebral debido a una descarga excesiva y anormal en las neuronas corticales (Stafstrom, 2010). A nivel celular la comunicación neuronal está regulada a través de un complejo equilibrio entre las señales excitadoras, mediadas principalmente por glutamato, y las señales inhibitorias, mediadas principalmente por el ácido γ-aminobutírico (GABA). Cuando dicho equilibrio se altera por sobreexcitación, o bien por reducción de la inhibición, puede conducir a crisis epilépticas, las cuales se caracterizan por una hiperactividad eléctrica sincrónica e intermitente (Stafstrom, 2010, Cabo-de la Vega et al., 2006). Estas alteraciones eléctricas llevan al desarrollo de dos procesos característicos de la actividad epiléptica, el primero es la hiperexcitabilidad, la cual se refiere a la respuesta anormal de una neurona a estímulos excitatorios (una neurona hiperexcitable tiende a disparar ráfagas de múltiples potenciales de acción en lugar de solo uno o dos), y el segundo es la hipersincronía que se refiere a la respuesta simultánea de un amplio número de neuronas vecinas dentro de un modo de activación anormal (Stafstrom, 2010, Engel et al., 2009). En 1989 la Liga Internacional Contra la Epilepsia (ILAE por sus siglas en inglés), ya definía más de 40 tipos de epilepsias (ILAE, 1989), las cuales actualmente se han clasificado en 4 tipos (Scheffer et al., 2017): 1. Epilepsias focalizadas, las cuales se refieren a desórdenes mono o polifocales y crisis que involucran solo a un hemisferio cerebral. 2. Epilepsias generalizadas, las cuales involucran todas las áreas cerebrales, por lo cual, en el EEG muestran una actividad punta-onda generalizada. 3. Epilepsias focalizadas/generalizadas, que son la combinación de las dos primeras, y se presenta generalmente en síndromes como los de Dravet y Lennox- Gastaut. Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 2 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM 4. Epilepsias desconocidas, son aquellas con falta de información precisa o no concordante con los criterios de las dos primeras. En el grupo de las epilepsias focales, la más común es la Epilepsia de Lóbulo Temporal (ELT) (Bell et al., 2011). Se le da ese nombre por que surge de las regiones del lóbulo temporal mesial, en donde la actividad convulsiva involucra la formación hipocampal, en donde se presentan las principales características neuropatológicas, tales como la esclerosis hipocampal (HS, por sus siglas en inglés) (Aronica y Gorter, 2007) y en donde se presenta la exagerada sincronización neuronal característica de la epilepsia (Stafstrom, 2010, Malkki, 2014, ILAE, 1989). La HS se presenta en cerca del 65% de los pacientes con ELT y es una condición patológica caracterizada por una selectiva pérdida neuronal y gliosis en la región CA1 del hipocampo, además de la dispersión de células de la capa granular del giro dentado, neurogénesis de células granulares y reorganización sináptica de las fibras musgosas (Aronica y Gorter, 2007, Briellmann et al., 1999, Dichter, 2009). En condiciones normales el hipocampo muestra una robusta sincronización neuronal y un equilibrio en la actividad de los canales responsables de la neurotransmisión excitatoria e inhibitoria (Stafstrom, 2010). La neurotransmisión depende de canales activados por voltaje, en cuyo caso los canales de sodio y calcio son excitatorios, mientras que los de potasio y cloro son inhibitorios. También están los canales activados por ligando, en cuyo caso los receptores a glutamato son excitatorios y los receptores a GABA son inhibitorios (Jiruska et al., 2013, Bean, 2007). Los estudios anatómicos y patológicos en hipocampo de pacientes con ELT farmacorresistente, han mostrado que dicho desorden está asociado a una cierta pérdida de neuronas gabaérgicas (interneuronas) y a displasias corticales. Dichos eventos conllevan a un desequilibrio en la sincronización neuronal normal, haciendo que la actividad de los elementos excitatorios antes mencionados, esté por encima de los inhibitorios (Cabo-de la Vega et al., 2006). 1.2 Tratamiento farmacológico y farmacorresistencia El tratamiento farmacológico actual está dirigido a contrarrestar alguna o varias de las alteraciones producidas a nivel de transportadores, canales iónicos y/o los sistemas de neurotransmisión glutamatérgicos y gabaérgicos. En la tabla 1 uno se describen los mecanismos de acción y las crisis para las cuales son indicados los Fármacos Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 3 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM Antiepilépticos (FAEs) disponibles en la clínica, así como su clasificación de acuerdo con el periodo en que comenzaron a utilizarse (Brodie et al., 2016a). Tabla 1. Clasificación de los Fármacos Antiepilépticos utilizados en la clínica. FAE Tipo de Crisis Mecanismo Farmacológico Referencias Primera generación (1912-1978) Carbamazepina (CBZ) Focales y generalizadas Bloqueo de canales de Na+ dependientes de voltaje. (Cotterman-Hart, 2015, Willow et al., 1984, Sheets et al., 2008) Etosuximida (ESM) Ausencia Reducción de corrientes de Ca2+ de bajo umbral tipo T. (Cotterman-Hart, 2015, Coulter et al., 1989, Kostyuk et al., 1992) Fenobarbital (PB) Focales, generalizadas y de ausencia Prolonga la apertura de los canales GABAA e incrementa la afinidad del receptor por el ligando. (Czapinski et al., 2005, Macdonald y Barker, 1977) Fenitoína (PHT) Focales y generalizadas Inhibición de canales de Na+ dependientes de voltaje e incremento de la neurotransmisión gabaérgica reduciendo el eflujo de K+. (French y Gazzola, 2011, Hanaya y Arita, 2016, Wong y Teo, 1986, De Weer, 1980) Primidona (PRM) Focales y generalizadas Desconocido. (Se cree que inhibe la actividad de los canales de Na+ e incrementa la inhibición mediada por GABA). (Cotterman-Hart, 2015) Valproato (VPA) Generalizadas y de ausencia Inhibición de canales de Na+ y de Ca2+ tipo T acoplados a voltaje. Inhibición de la degradación metabólica de GABA debido al bloqueo de la GABA transaminasa. Potencia la inhibición mediada por GABA, mediante el incremento de la afinidad del receptor GABAA por el ligando. (Czapinski et al., 2005, Hanaya y Arita, 2016, Kelly et al., 1990, Macdonald y Bergey, 1978) Segunda generación (1989-2004) Clobazam (CBZ) Asociadas al Sx. Lennox- Gastaut Incremento de la neurotransmisión gabaérgica. (Tolou Ghamari et al., 2015, Nakamura et al., 1996) Clonazepam (CNZ) Generalizadas y asociadas a Sx. Lennox-Gastaut Favorece la neurotransmisión gabaérgica. (Tolou Ghamari et al., 2015, Jenner et al., 1986, Brodie et al., 2016b, Shangguan et al., 2015) Felbamato (FBM) Asociadas al Sx. de Lennox- Gastaut Bloqueo de canales de Na+ dependientes de voltaje. Inhibición de la neurotransmisión glutamatérgica vía interacciones con receptores AMPA/kainato y con la subunidad NR2B de los receptores NMDA e incremento de la inhibición mediada por GABA modulando la actividad de los receptores GABA. (Harty y Rogawski, 2000, Taglialatela et al., 1996, Rho et al., 1994, De Sarro et al., 1994, Rho et al., 1997) Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 4 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM Gabapentina (GBP) Focales Bloqueo de canales de Ca2+ dependientes de voltaje vía su unión a la subunidad α2δ e Incremento de la síntesis de GABA. (Gee et al., 1996, Bryans et al., 1998) Lacosamida (LCM) Focales y generalizadas Inactivación selectiva de los canales de Na+ dependientes de voltaje. (Asconape, 2013, Errington et al., 2008, Sheets et al., 2008) Lamotrigina (LTG) Focales, generalizadas y asociadas al Sx. Lennox-Gastaut Bloqueo de canales de Na+ dependientes de voltaje. Inhibe las corrientes de (Tipo N) en neuronas, inhibiendo la liberación de glutamato y aspartato. (Cotterman-Hart, 2015, Stefani et al., 1996, Xie et al., 1995, Ookubo et al., 2013) Levetiracetam (LEV) Focales y generalizadas. Inhibición selectiva de canales de Ca2+ tipo N y T dependientes de voltaje. Unión a proteínas sinápticas SV2A que alteran la liberación de neurotransmisores. (Lukyanetz et al., 2002, Hovinga, 2001, Lynch et al., 2004, Rigo et al., 2002, Madeja et al., 2003) Oxcarbazepina (OXC) Focales Bloqueo de canales de Na+ y Ca2+ (Cotterman-Hart, 2015, Wellington y Goa, 2001, Huang et al., 2008) Perampanel (E2007) Focales Agonista no competitivo, altamente selectivo de los canales AMPA postsinápticos. (Hanada et al., 2011, Plosker, 2012, Rektor, 2013) Pregabalina (PGB) Focales y generalizadas Bloqueo de canales de Ca2+ dependientes de voltaje vía su unión a la subunidad α2δ, con lo que reduce la liberación sináptica de varios neurotransmisores. (Cotterman-Hart, 2015, Fink et al., 2002, Taylor et al., 2007) Tiagabina (TGB) Focales y generalizadas Inhibe la recaptura glial y neuronal de GABA, incrementando sus niveles en la hendidura sináptica. (Czapinski et al., 2005, Nielsen et al., 1991) Topiramato (TPM) Focales y generalizadas. Inhibe las corrientes de Na+ y dependientes de voltaje, incrementa la inhibición mediada por GABA, incrementa las corrientes de potasio, reduce los niveles de glutamato y aspartato y modula los niveles de Ca2+ mediante la regulación de los receptores AMPA/KA. (Mula et al., 2006, Cotterman- Hart, 2015, Czapinski et al., 2005) Vigabatrina (VGB) Focales y espasmos infantiles. Incrementa los niveles de GABA por inhibición irreversible de la GABA transaminasa. (Cotterman-Hart, 2015, Jung et al., 1977) Zonisamida (ZNS) Focales y generalizadas Bloquea canales de Na+ dependientes de voltaje y canales de Ca2+ tipo T. Incrementa la neurotransmisión dopaminérgica, serotoninérgica y gabaérgica. Reduce la sobreproducción de óxido nítrico y radicales libres, favoreciendo efectos neuroprotectores y anticonvulsivantes. (Kito et al., 1996, Ueda et al., 2003, Schauf, 1987, Kaneko et al., 1993, Mori et al., 1998) Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 5 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM Tercera generación (Desde 2008) Brivaracetam (BRI) Focales y generalizadas Unión selectiva y de alta afinidad a SV2 Inhibe los canales de Na+ dependientes de voltaje (Zona et al., 2010, Nicolas et al., 2016) Canabidiol (CBD) Epilepsia Refractaria Antagonista no competitivo de los receptores CB1 y agonista inverso de los receptores CB2. Agonista de TRPV1-4, TRPA1, 5-HT1A, PPAR-γ y las subunidades α1 y α3 del receptor a glicina. Antagonista de TRPM8, GPR55 y canales de Ca2 + tipo T activados por voltaje. Modula TNFα, VDAC1 y los receptores a adenosina (A1 y A2) (Friedman y Devinsky, 2016, Perucca, 2017, Ibeas Bih et al., 2015) Canabidavirina (CBDV) Generalizadas Modulación de los canales TRP (Friedman y Devinsky, 2016, De Petrocellis et al., 2011) Carabersat (SB-204269) (CRB) Focales y generalizadas Se une a un sitio estereoespecífico en el SNC, regulando la excitabilidad neuronal. No sigue ningún mecanismo antes descrito para FAEs (Upton et al., 1997, Luszczki, 2009, Herdon et al., 1997) Carisbamato (CBM) Recurrentes y espontaneas Inhibe canales de Na+ y potenciales de acción. (Liu et al., 2009, Kulig y Malawska, 2007, Deshpande et al., 2008) Eslicarbazepin acetato (ESL) Focales y para epilepsia refractaria Bloquea los canales de Na+ dependiente de voltaje, estabilizando el disparo sostenido y repetitivo, con lo que inhibe la liberación de glutamato y otros neurotransmisores. (Ambrosio et al., 2001, Parada y Soares-da-Silva, 2002, Holtkamp et al., 2016, Tambucci et al., 2016) Fosfenitoin (FPHT) Focales Modula canales de Na+ dependientes de voltaje. (Boucher, 1996, Luszczki, 2009) Ganaxolona (GNX) Focales y espasmos infantiles Modulación de receptores GABAA incrementando la permeabilidad de Cl- sin activación de receptores nucleares a progesterona. A bajas concentraciones potencia la acción de GABA y a altas concentraciones activa el receptor GABAA. (Hosie et al., 2006, Carter et al., 1997, Monaghan et al., 1999, Nohria y Giller, 2007) Lacosamida (LCM) Focales Inactiva los canales de Na+ dependientes de voltaje y bloquea alostericamente los receptores NMDA uniéndose a la subunidad NR2B (Errington et al., 2008, Stohr et al., 2007, Kellinghaus, 2009) Pregabalina (PGB) Focales y generalizadas Atenúa la liberación de Ca2+ inducida por despolarización, esto mediante su unión a las subunidades α2δ tipo 1 y 2, con lo que inhibe la liberación de glutamato, norepinefrina y sustancia P (Dooley et al., 2002, Dooley et al., 2000, Taylor et al., 2007) Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 6 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM Retigabina (RTG) Focales y para epilepsia refractaria severa. Apertura de canales de potasio KCNQ (Tipo Kv7) Bloquea débilmente los canales de Na+ y Ca2+. Incrementa la síntesis de GABA y corrientes de Cl-. Modula positivamente los receptores GABAA que contienen las subunidades β2 y β3. (Gunthorpe et al., 2012, Wuttke et al., 2005, Otto et al., 2002, van Rijn y Willems-van Bree, 2003) Rufinamida (RUF) Asociadas con el Sx. Lennox- Gastaut Prolonga el estado de inactivación de los canales de Na+ dependientes de voltaje, limitando el disparo de los potenciales de acción. (Perucca et al., 2008, White et al., 2008, Luszczki, 2009) Seletracetam (SEL) Epilepsias genéticas. Unión selectiva y de alta afinidad a SV2A y reduce las corrientes de Ca2+ (Pollard, 2008, Martella et al., 2009) Talampanel (TLP) Focales y para epilepsia refractaria. Bloquea los receptores AMPA de manera estereoselectiva y no competitiva e inhibe débilmente los receptores a Kainato. (May et al., 1999, Wang y Niu, 2013, Howes y Bell, 2007) AMPA, receptores α-amino-3-hidroxi-5-metilo-4-isoxazolpropiónico; Ca2+, ion calcio; CB1, Receptor cannabinoide de tipo 1; CB2, Receptor cannabinoide de tipo 2; FAE, Fármaco Antiepiléptico; GABA, Ácido Gamma-aminobutírico; GABAA, Receptores a GABA tipo A; GPR55, Receptor 55 acoplado a proteína G; K+, ion potasio; KA, Kainato; Na+, ion sodio; NMDA, receptores de N-metil-D-aspartato; PPAR-γ, Receptor de peroxisoma-proliferador-activado gamma; SNC, Sistema Nervioso Central; SV2A, Proteína de Vesículas Sinápticas tipo 2A; Sx, síndrome; TNFα, Factor de Necrosis Tumoral alfa; TRPV1-4, Receptor de potencial transitorio V1-4; TRPA1-4, Receptor de potencial transitorio A1; TRPM8, Receptor de potencial transitorio M8, VDAC1, Canal dependiente de voltaje selectivo de aniones 1. En pacientes adultos, la ELT es la de mayor incidencia en resistencia al tratamiento farmacológico, debido a ello, el tratamiento de elección para estos pacientes suele ser la resección de las estructuras epileptogénicas a través de una lobectomía temporal (Bell et al., 2011). Se ha demostrado que en ELT la zona epileptogénica es amplia e involucra, además del hipocampo, a otras estructuras límbicas incluyendo la formación parahipocampal, la amígdala y las cortezas entorhinal y perirhinal (Bernasconi et al., 2003). Al inicio del tratamiento se prescribe un FAE en monoterapia y la dosis se incrementa de manera gradual hasta alcanzar un control total de las crisis o la aparición de efectos adversos. Con dicho régimen farmacológico, alrededor del 47% de los pacientes permanece libre de crisis a largo plazo. Del 53% de los pacientes que no se controlan con la monoterapia inicial, alrededor del 13% lo harán con un segundo FAE en monoterapia (o incluso un tercero) y un 3% lo hará con el uso simultáneo de dos FAEs. Sin embargo, existe un 30% de pacientes con epilepsia que no se controla tras probar Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 7 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM varios regímenes de politerapia, y si esto ocurre en un lapso de 1 a 2 años, se les denomina farmacorresistentes (Diaz, 2004, LaRoche y Helmers, 2004, Malkki, 2014). Las causas que llevan a este fenómeno de resistencia al tratamiento farmacológico se desconocen, aunque se ha demostrado que las crisis repetitivas inducen una menor respuesta a los FAEs y aumentan el riesgo de daño neuronal (Gutiérrez-Manjarrez y García-Ramos, 2010). Por otra parte, se han postulado varias hipótesis para tratar de explicar el fenómeno de la farmacorresistencia (Basic, 2016): - Hipótesis de los transportadores. Sugiere que hay una inadecuada penetración de los fármacos a través de la barrera hematoencefálica, causada por un incremento en la expresión o función de los transportadores de eflujo, llevando a niveles de fármaco insuficientes en el tejido cerebral epileptogénico. - Hipótesis del blanco terapéutico. Sugiere una reducción en la sensibilidad, causada por cambios intrínsecos o adquiridos en los principales blancos de los FAEs. - Hipótesis de las redes. Propone que la farmacorresistencia es consecuencia de alteraciones estructurales o cambios en las redes cerebrales (como en HS). - Hipótesis de las variantes génicas. Sugiere que existe una resistencia determinada por variantes genéticas que alteran la estructura y función de proteínas involucradas en la farmacocinética y la farmacodinámica de los FAEs. - Hipótesis de la farmacocinética. Postula el desarrollo de tolerancia metabólica, como respuesta adaptativa del cuerpo, tras la administración repetida de los FAEs. - Hipótesis de la severidad intrínseca. Sugiere que cuanto más severa es la epilepsia, se vuelve menos tratable farmacológicamente. - Hipótesis de la regulación de las redes bioenergéticas. Considera que la epilepsia es resultado de la disfunción de redes complejas, que implica no solo el desequilibrio de excitación e inhibición neuronal, sino también la disfunción del control glial de la homeostasis cerebral, procesos inflamatorios, alteraciones bioquímicas, cambios bioenergéticos y cambios epigenéticos (por ejemplo, la disfunción en la homeostasis cerebral del ribonucleósido de adenosina, el cual es parte del ATP). - Hipótesis de la metilación. Sugiere que los eventos desencadenantes iniciales y las convulsiones por sí mismas pueden inducir metilación del ADN. Este proceso altera la función de la cromatina e induce el fenotipo epileptogénico, que incluye convulsiones recurrentes crónicas, lesión estructural, resistencia al tratamiento y deterioro cognitivo. Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 8 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM 1.3 Comorbilidades psiquiátricas asociadas a epilepsia y síndromes epilépticos Independientemente del tipo de epilepsia, las comorbilidades psiquiátricas y otras enfermedades asociadas, son hasta ocho veces más comunes en personas con epilepsia que en la población general, lo cual depende de factores como la edad y/o el género (Keezer et al., 2016). Múltiples modelos pretenden explicar la presencia de condiciones cognitivas y psiquiátricas en epilepsia. Uno de ellos sugiere que la epilepsia o su tratamiento causan la condición comórbida. Contrario a ello, un modelo sugiere que la comorbilidad o su tratamiento causan la epilepsia. Un tercer modelo sugiere que un mecanismo subyacente compartido, ya sea biológico o medioambiental, media la ocurrencia de ambas condiciones (Seidenberg et al., 2009). Se ha encontrado que los pacientes con epilepsia tienen de 2 a 11 veces más probabilidad de presentar esquizofrenia que la población no epiléptica y que este fenómeno depende de la severidad de la epilepsia (Fruchter et al., 2014). Por otra parte, la depresión es la comorbilidad psiquiátrica más común en epilepsia y múltiples factores de riesgo, tales como el tratamiento con FAEs, características de las crisis y factores bioquímicos, se han relacionado con el desarrollo de la misma (Gaitatzis et al., 2004). Además, la presencia de depresión y epilepsia se han relacionado con el desarrollo de otras comorbilidades (Seidenberg et al., 2009). Los desórdenes de personalidad entre los pacientes epilépticos tienen una prevalencia del 18%, siendo el Trastorno Limítrofe de Personalidad (BPD) y el desorden bipolar (BD) los más comunes. El desarrollo de estos desórdenes de personalidad, parece ser consecuencia del tratamiento con AEDs, patologías de lóbulo temporal, así como antecedentes familiares (Swinkels et al., 2003, Sucksdorff et al., 2015). 1.4 Regulación génica en ELTM En ELTM el desequilibrio en los sistemas de neurotransmisión está asociada a cambios en la expresión de algunos genes como GRIA2, que codifica para la subunidad GluR2 de los receptores a glutamato, y GABRD que codifica para la subunidad delta (δ) de los receptores GABAA (McClelland et al., 2014). Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 9 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM 1.4.1 GluR2 1.4.1.1 Estructura y regulación genómica El gen GRIA2 codifica para la subunidad proteica GluR2 de los receptores α- amino-3-hidroxi-5-metilisoxazolepropionato (AMPA) a glutamato. Dicho gen consta de 17 exones y 16 intrones, siendo los exones 11, 12 y 16 los que codifican para las regiones transmembranales M1-M4. Por otra parte, los exones 14 y 15 codifican segmentos alternativos Flip-Flop, mientras que las secuencias carboxilo terminales (-C) son codificadas en los exones 16 y 17 (Figura 1) (Kohler et al., 1994). Con respecto a la regulación transcripcional, un análisis in vitro demostró que el promotor proximal contiene un elemento regulatorio negativo (RE1, Represor Element 1) y una región regulatoria positiva (Sp1 y NRF-1)(Figura 1) (Myers et al., 1998). Además, miR-124 interactúa con el ácido ribonucleico mensajero (ARNm) de GluR2 y regula la traducción y su distribución en la sinapsis (Ho et al., 2014). Figura 1. Estructura y regulación del gen GRIA2. A) Estructura del gen GRIA2 en la cual se muestran los 17 exones como recuadros y se señalan los tamaños de los 16 intrones en kilopares de bases. Las regiones no codificantes se muestran en ashurado. El inicio de la traducción está marcado por una punta de flecha. Las secuencias de codificación para las secuencias Ml-M4 y flip-flop se indican mediante recuadros negros. Los codones de parada para los dos extremos -C están marcados por símbolos de estrella abiertos (extremo -C corto) y relleno (extremo -C largo). Los extremos 3' de los principales ARNm de GluR2 están indicados por un círculo abierto (ARNm de 4 kb) o lleno (ARNm de 6 kb). B) Regiones regulatorias del promotor proximal del gen GRIA2 en el cual se muestra el inicio de la transcripción a partir de +1. En las regiones adyacentes se localizan los sitios regulatorios positivos (Sp1 y NRF1) señaladas como recuadros. También se señalan el codón de inicio (AUG), el elemento regulatorio negativo RE1 como un recuadro negro y un rombo negro indica la presencia de islas CpG. Modificados de Kohler et al., 1994 y Myers et al., 1998. Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 10 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM Los AMPA son receptores ionotrópicos que se localizan principalmente en los sitios post-sinápticos de la sinapsis excitatoria (Bassani et al., 2009). Dichos receptores están formados por 4 subunidades (GluR1-4) de tamaño similar (̴900 aminoácidos) que forman complejos heterotetraméricos (Hollmann y Heinemann, 1994). En el hipocampo y la corteza adultos, la mayoría de los receptores de AMPA están conformados por las subunidades GluR1/GluR2 y GluR2/GluR3 (Craig et al., 1993). Sin embargo, GluR3 se expresa en menor proporción, por lo que más del 70% de GluR2 se asocia con GluR1 (Wenthold et al., 1996) y en algunos casos, como en hipocampo inmaduro y otras regiones cerebrales maduras, con GluR4 (Zhu et al., 2000). Figura 2. Estructura y función de la subunidad GluR2. A) Una típica subunidad GluR consiste de su dominio amino terminal (-N) extracelular, un dominio de unión a ligando (S1 y S2), tres dominios transmembranales (TM I, III y IV), un loop citoplasmático reentrante (TM II), un cassete de splicing alternativo flip/flop (recuadro rojo) y un extremo C-terminal intracelular con dominios de unión a proteínas y un dominio de unión a PDZ. B) En la subunidad GluR2, la permeabilidad a Ca2+ depende de la presencia de glutamina (Q) o arginina (R) en el sitio de edición Q/R. GluR2 (R) evita la entrada de Ca+2, mientras que GluR2 (Q) o la ausencia de GluR2 la favorecen. Tomado y modificado de Wright y Vissel, 2012 y de www.bristol.ac.uk/synaptic/receptors/ampar/ Cada subunidad GluR tiene un dominio hidrofóbico en el extremo amino, en el cual se encuentran el péptido señal, tres dominios hidrofóbicos transmembranales (TM I, III y IV), un loop citoplasmático reentrante (TM II), un dominio de unión a ligando (formado en la región S1 y S2 extracelular), un cassete de splicing alternativo flip/flop (en el loop entre TM III y IV), un C-terminal (con sitios para interaccionar con un gran número de proteínas como NSF, AP2) y un dominio PDZ terminal que se une a PICK1 y GRIP (Figura 2A). Los efectos de las interacciones proteína-proteína son cruciales en la Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 11 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM localización y el tráfico de estos receptores. (Hollmann y Heinemann, 1994, Bassani et al., 2009). El cassette de splicing flip/flop es un segmento de 35 aminoácidos que precede a M3 y que es responsable de que los receptores GluR se produzcan en una de dos formas moleculares (Sommer et al., 1990a). Las variantes flip tienen una alta expresión prenatal, la cual se mantiene durante el desarrollo postnatal y en el adulto, mientras que las variantes flop se incrementan durante el desarrollo cerebral y hasta la adultez (Monyer et al., 1991). La regulación de estas variantes influye en las propiedades farmacológicas y cinéticas de los receptores, ya que las variantes flop tienden a desensibilizarse mucho más rápido en respuesta a glutamato (Monyer et al., 1991, Sommer et al., 1990a). 1.4.1.2 Mecanismos funcionales Los canales de los receptores AMPA nativos son impermeables al calcio, una función controlada por la subunidad GluR2 (Wright y Vissel, 2012). La permeabilidad al calcio de la subunidad GluR2 está determinada por la edición postranscripcional del ARNm de GluR2, que cambia un único aminoácido en la región TM II de glutamina (Q) a arginina (R). Este es el llamado sitio de edición Q/R. GluR2 (Q) es permeable al calcio, mientras que GluR2 (R) no lo es (Figura 2B) (Bowie y Mayer, 1995, Wright y Vissel, 2012). Casi toda la proteína GluR2 expresada en el Sistema Nervioso Central (SNC) está en la forma GluR2 (R), dando lugar a receptores de AMPA impermeables al calcio. Esto, junto con las interacciones con otras proteínas intracelulares, hace que GluR2 sea quizás la subunidad más importante del receptor AMPA. En el hipocampo, la mayoría de los receptores AMPA son heterotetrámetros de GluR1-GluR2 o GluR2-GluR3 con una cantidad más pequeña de monómeros de GluR1 (Wenthold et al., 1996). Los receptores GluR2-GluR3 entran y salen de sinapsis continuamente, mientras que aquellos que carecen de GluR2 (como los monómeros GluR1) y los receptores GluR1-GluR2 participan en la regulación de la vía de transporte de receptores (Malinow y Malenka, 2002). Como ya se mencionó, los receptores AMPA con la subunidad GluR2 median la mayoría de las transmisiones sinápticas excitatorias rápidas en el SNC de los vertebrados y juegan un papel importante en muchas funciones cerebrales diferentes, como el aprendizaje y la memoria (Bassani et al., 2009). Sin embargo, también participan activamente en procesos patológicos que involucran muerte celular por excitotoxicidad. Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 12 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM 1.4.1.3 Implicaciones en epilepsia Si bien se ha encontrado una disminución en la expresión de GluR2 en hipocampo de ratas y una distribución alterada de los mismos en procesos naturales como el envejecimiento (Yu et al., 2011, Liu et al., 2008, Hof et al., 2002, Pandey et al., 2015), la expresión también se ve alterada en procesos patológicos asociados a excitotoxicidad. Como ya se mencionó, la impermeabilidad al Ca2+ por parte de la subunidad GluR2 es conferida por el residuo de arginina que reside en el poro. Dicho residuo es introducido por la adenosina deaminasa dependiente de ARN (ADAR) la cual es degradada en neuronas expuestas a niveles excitotóxicos de glutamato (Mahajan et al., 2011). Se ha demostrado que, en isquemia transitoria inducida en cerebro de rata, la transcripción de GluR2 se reduce preferentemente en las neuronas de CA1 del hipocampo al tiempo que induce neurodegeneración (Pellegrini-Giampietro et al., 1992). Se ha demostrado también que en ratones transgénicos con una deficiente edición de la subunidad GluR2, hay una reducción del ARNm de dicha subunidad. Tal reducción se asocia con el incremento en las corrientes de Ca2+ en neuronas piramidales, lo cual hace a los animales son más susceptibles a las crisis convulsivas (Brusa et al., 1995). Por otra parte, se ha demostrado que, tras la inducción de estatus epiléptico (EE) en ratas, hay una disminución de ARNm y proteína GluR2 en hipocampo. Sin embargo, se muestra un incremento de GluR1, lo cual sugiere que la reducción de GluR2 induce la formación de receptores AMPA permeables a Ca2+, haciendo que las neuronas piramidales sean más vulnerables a la inducción del EE (Friedman, 1998, Grooms et al., 2000, Pellegrini- Giampietro et al., 1997, Gorter et al., 1997, Friedman et al., 1994). Esta disminución en la expresión de GluR2 tras la inducción de EE, parece estar relacionado con la desacetilación de la histona 4 (H4) en el promotor del gen Gria2 (Huang et al., 2002). En pacientes con ELT con HS se demostró por inmunohistoquímica que los niveles de GluR2 se reducen significativamente, sobre todo en aquellos subcampos con una pérdida sustancial de células neuronales (en particular CA1, CA4 y CA3), en comparación con hipocampo de autopsias (Blumcke et al., 1996). En otro estudio se demostró que a nivel proteico hay una disminución significativa de la subunidad GluR2 en hipocampo de pacientes con ELT comparado con autopsias y tejido hipocampal de primates no humanos. Dichos cambios no correlacionan con lo reportado a nivel de ARNm, en donde no se observaron cambios (Grigorenko et al., 1997) Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 13 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM La evidencia anterior sugiere que la disminución de la expresión de GluR2 puede desempeñar un papel en el daño excitotóxico inducido por glutamato. 1.4.2 GABAAδ 1.4.2.1 Estructura y regulación genómica El gen GABRD codifica para la subunidad proteica delta (δ) de los receptores tipo A para ácido γ-aminobutírico (GABAA). La mayoría de los genes GABR constan de 9 exones codificantes, sin embargo, GABRD es una excepción. Dicho gen consta de 8 (isoforma 1b) o 9 (isoforma 1a) exones y 7 a 8 intrones respectivamente (Windpassinger et al., 2002, Simon et al., 2004). El primer exón en el extremo 5’-UTR no es codificante, el segundo consta de 526 pb que codifican para los 37 aminoácidos iniciales que incluyen al péptido señal y continua con otra secuencia de 39 aminoácidos. Los 7 exones siguientes codifican para las secciones transmembranales y los sitios de unión a ligando, mientras que el ultimo exón codifica para el C- terminal, incluyendo una señal de poliadenilación (Poly A)(Figura 3) (Simon et al., 2004). Con respecto a su regulación transcripcional, se ha demostrado que su promotor tiene predisposición a ser silenciado epigenéticamente por metilación, ya que contiene regiones ricas en islas CpG y deficiencia de cajas TATA y CCAAT canónicas (Sommer et al., 1990b). También se ha reportado un elemento repetido de bases púricas en la región 5’ flanqueante al gen, el cual funge como sitio de unión para el Factor Específico de Cerebro (BSF1)(Motejlek et al., 1994). Además, a través de análisis in vitro e in vivo, se ha identificado un sitio regulatorio de unión para REST/NRSF, el cual está implicado en un débil silenciamiento (Schoenherr et al., 1996, Luscher et al., 1997) Figura 3. Estructura y regulación del gen GABRD humano. El gen GABRD está localizado en la banda p36.3 del cromosoma 1 y se han identificado dos subtipos. El subtipo 1a que consta de 9 exones (cajas) y 8 intrones (líneas continuas entre exones) y el subtipo 1b que consta de 8 exones y 7 intrones. Los tamaños de los exones e intrones se muestran en pares de bases (pb). Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 14 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM Los receptores GABAA son canales de cloro acoplados a ligando ampliamente distribuidos en el SNC y que median la neurotransmisión postsináptica inhibitoria. Estos receptores están formados por la combinación pentamérica de al menos 19 diferentes subunidades GABAR (α1—6, β1—3, γ1—3, δ, ε, π, θ y ρ1—3) (Simon et al., 2004). Cada subunidad está compuesta de un largo N-terminal, cuatro segmentos transmembranales (TM 1-4), un largo loop intracelular entre TM 3 y 4 y un pequeño dominio C-terminal. El segmento TM 2 de cada una de las 5 subunidades es de vital importancia, ya que se alinean hacia el centro para formar el poro (Figura 4A) (Schofield et al., 1987, Benarroch, 2007). De acuerdo con el prototipo de funcionamiento del receptor, dos moléculas de GABA se unen al dominio de unión a ligando formado por las subunidades α y β, lo cual favorece la apertura del poro y produce corrientes de cloro a través de la membrana (Figura 4B) (Benarroch, 2007). Debido a lo anterior, la expresión de las subunidades α y β es suficiente para producir receptores funcionales, sin embargo, la conformación pentamérica es necesaria para modular la cinética del receptor y para su regulación farmacológica. Figura 4. Estructura y función de los receptores GABAA. A) Los receptores GABAA poseen cuatro dominios transmembranales M1-M4. El dominio M2 posee cargas positivas que hace que se orienten hacia el centro para formar el poro. Los extremos carboxilo (corto) y amino (largo) orientados hacia el citoplasma. B) Los receptores GABAA tienen una composición pentamérica y la mayoría poseen dos subunidades α, dos β y una γ. Esta última puede ser remplazada por las subunidades δ, ε, θ y π y dependiendo de la combinación se modifican la cinética y su sensibilidad a GABA. C) Las corrientes de Cl- que pasan a través de los receptores GABAA pueden ser de dos tipos, fásica y tónica. La corriente fásica depende de los receptores localizados en la sinapsis (subunidad γ2) los cuales son sensibles a benzodiacepinas, mientras que la corriente tónica depende de los receptores localizados extrasinápticamente (subunidad δ), los cuales son modulados por neuroesteroides y anestésicos. Tomado y modificado de Benarroch, 2007. Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 15 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM La mayoría de los receptores GABAA nativos están compuestos de dos subunidades α, dos β y una γ, sin embargo, hay una amplia variabilidad de ellos que incluyen a las subunidades δ, ε, θ y ρ. (Figura 4B). De hecho, en la conformación de los receptores GABAA, las subunidades δ, ε y π parecen ser capaces de remplazar a la subunidad γ y la subunidad θ de remplazar a la subunidad β (Sieghart et al., 1999). Las diferentes combinaciones dan a lugar a receptores con variaciones en su sensibilidad a GABA, su cinética y en su modulación por ligandos (Sieghart, 1995). Por otra parte, los receptores GABAA generan dos formas prominentes de corriente: la fásica y la tónica. La corriente fásica depende de los receptores sinápticos y es rápidamente desensibilizada, mientras que la corriente tónica depende de los receptores extrasinápticos y es no desensibilizante (Figura 4C) (Whissell et al., 2015). En hipocampo, dichas corrientes tónicas dependientes de receptores extrasinapticos contienen a las subunidades δ o α-5 (Glykys et al., 2008). Estas subunidades poseen características particulares en su loop citoplasmático, lo que favorece su localización extrasináptica (Arslan et al., 2014). 1.4.2.2 Mecanismos funcionales La subunidad δ de los receptores GABAA (GABAAδ) generalmente se asocia a las subunidades α1, α4, α6, β2 o β3, de manera que al momento se han identificado tres diferentes subtipos de receptores GABAAδ. El receptor α1βδ que se expresa en interneuronas de varias regiones cerebrales incluyendo hipocampo y amígdala, el α4βδ expresado en proyecciones neuronales de hipocampo y tálamo, y el α6βδ expresado en células granulares cerebelares (Figura 4C) (Whissell et al., 2015, Brickley y Mody, 2012). Además de su localización extrasináptica, los receptores GABAAδ tienen propiedades que los hacen particularmente importantes para el SNC. I) Generan una corriente tónica persistente que afecta la excitabilidad neuronal. II) Están implicados en la regulación conductual incluyendo memoria, ansiedad y nocicepción, lo cual los coloca como blancos terapéuticos para el tratamiento de enfermedades neurológicas y neuropsiquiátricas. III) Muestran gran dinamismo para cambiar de acuerdo a diferentes condiciones fisiológicas o patológicas. Lo anterior tiene implicaciones en la regulación del comportamiento y en la sensibilidad de las redes neuronales a los fármacos y a compuestos dirigidos a los receptores GABAA (Whissell et al., 2015, Olsen y Sieghart, 2009). Los GABAAδ son receptores no sinápticos de alta afinidad y eficacia, con una alta sensibilidad a los neuroesteroides y anestésicos (Figura 4C) (Benarroch, 2007) Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 16 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM La regulación de la excitabilidad neuronal por parte de los receptores GABAAδ es bidireccional, ya que restringe o aumenta la excitabilidad según el gradiente de concentración de iones cloro (Cl-) (Ben-Ari et al., 2012). Esta regulación depende de tres factores: su alta sensibilidad a GABA, su baja cinética de desensibilización (Wlodarczyk et al., 2013) y su tendencia a la apertura espontánea en ausencia de GABA y otros ligandos endógenos (Tang et al., 2010, Wlodarczyk et al., 2013). Se ha observado que en neuronas maduras y sanas con una baja concentración intracelular de Cl-, la apertura del canal del receptor GABAAδ disminuye la excitabilidad al permitir la entrada de iones Cl- cargados negativamente, favoreciendo la hiperpolarización de la membrana y la reducción en la resistencia de entrada ("shunting inhibition"). En contraste con su efecto inhibitorio en neuronas maduras sanas, los receptores GABAAδ pueden incrementar la excitabilidad en neuronas maduras dañadas, neuronas inmaduras y otras células con una alta concentración intracelular de Cl-. En estas células, el potencial de inversión de Cl- es significativamente positivo en relación con el potencial de membrana en reposo. En consecuencia, la apertura del canal provoca el flujo de Cl- y la despolarización de la membrana, lo que puede aumentar la excitabilidad (Whissell et al., 2015). 1.4.2.3 Implicaciones en epilepsia Las alteraciones en la función extrasináptica de los receptores GABAAδ están implicados en varias formas de epilepsia. En estado normal, no patológico, los receptores GABAAδ muestran una alta expresión en giro dentado, subcampos del hipocampo, en el tálamo, corteza y cerebelo, así como bajos niveles en amígdala, hipotálamo, ganglios basales, tallo cerebral y médula espinal (Whissell et al., 2015). Específicamente, los receptores GABAAδ se localizan en la capa molecular y granular del giro dentado, en células de canasta con forma piramidal del hilus y en interneuronas de CA3 del hipocampo. En menor medida, también se ha observado su expresión en el estrato radiatum y oriens de CA1 del hipocampo y en la capa de células piramidales de CA1 y CA3. (Sperk et al., 1997, Tsunashima et al., 1997). Sin embargo, se ha demostrado que tras la inducción de crisis convulsivas con ácido kainico (AK), GABAAδ se expresa en astrocitos y disminuye su expresión en la capa molecular del giro dentado y en CA1 del hipocampo (Schwarzer et al., 1997, Tsunashima et al., 1997). Los estudios en diversos modelos animales de epilepsia, EE y crisis convulsivas son controversiales. En varios estudios se ha demostrado una reducción en los niveles de ARNm y proteína de GABAAδ hipocampal (Houser et al., 2012, Nishimura et al., 2005, Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 17 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM Peng et al., 2002, Zhang et al., 2007, Schwarzer et al., 1997, Brown et al., 2002). Lo anterior correlaciona con la disminución del incremento en las corrientes tónicas, lo cual evoca la respuesta epileptiforme y altera la respuesta de las corrientes gabaérgicas a una gran variedad de neuromoduladores (Mtchedlishvili et al., 2001, Qi et al., 2006, Rajasekaran et al., 2007, Rajasekaran et al., 2009). Sin embargo, hay estudios que reportan un incremento en la expresión de ARNm y proteína GABAAδ (Brooks-Kayal et al., 1998, Kharlamov et al., 2011, Scimemi et al., 2005), así como un incremento en las corrientes tónicas (Scimemi et al., 2005). Con base en estas evidencias, se han generado dos hipótesis respecto a la función de GABAAδ. La primera hipotetiza que la disminución en la actividad del receptor contribuye al desarrollo de epilepsia, ya que favorece la excitabilidad y la ocurrencia de crisis epilépticas secundarias a la pérdida de inhibición neuronal (Spigelman et al., 2002, Stell et al., 2003). La segunda hipótesis plantea que la reducción en la actividad del receptor es consecuencia (y no causa) de la epilepsia y del incremento de la excitabilidad (Joshi y Kapur, 2013). Considerando la expresión de los GABAAδ en las regiones talamocorticales y el papel que dicha región juega en el desarrollo de las crisis de ausencia, se ha reportado el incremento de la inhibición tónica dependiente de la activación de los receptores extrasinápticos en un modelo genético para este tipo de epilepsia (Cope et al., 2009). Debido a la alta sensibilidad de los receptores GABAAδ a los neuroesteroides, se cree que puede haber cambios en la excitabilidad neuronal asociados al ciclo menstrual. Con base en lo anterior, la inhibición tónica puede verse afectada durante el ciclo ovárico por las fluctuaciones en los niveles de los derivados de la progesterona. Se ha demostrado en ratones que, durante la fase de alta progesterona correspondiente a la fase lútea en las mujeres, hay mayor expresión de los receptores GABAAδ, asociada con el incremento en la inhibición tónica en las neuronas del hipocampo y una menor susceptibilidad a las crisis convulsivas (Maguire et al., 2005). Por otra parte, las mutaciones en el gen GABRD se han asociado con el desarrollo de epilepsias como la epilepsia mioclónica juvenil (Delgado-Escueta et al., 2013). Las variantes E177A y R220H están relacionadas con epilepsia generalizada idiopática (Feng et al., 2006) y la variante rara E177A se ha relacionado con epilepsias generalizadas debidas a crisis febriles (Dibbens et al., 2004) Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 18 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM 1.5 Regulación transcripcional mediada por REST/NRSF Como se ha descrito anteriormente, los genes GRIA2 y GABRD poseen sitios RE1 en sus promotores. Es decir, pueden ser regulados por el factor de transcripción REST/NRSF (RE1 silencing transcription factor/Neuron-restrictive silencer factor, por sus siglas en inglés). REST/NRSF es un factor de transcripción codificado por el gen REST, el cual consta de 5 intrones y 6 exones (Figura 5A) y que puede ser regulado por diversos factores de transcripción como CREB o por metilación de islas CpG en su promotor (Kreisler et al., 2010). Para llevar a cabo su función represora, este factor represor se une a su secuencia consenso en el ADN, la cual es conocida como sitio NRSE o RE1 (Neuron Restrictive Silencing Element o Repressor Element 1, por sus siglas en inglés). Los sitios RE1 constan de aproximadamente 21 nucleótidos cuya secuencia canónica es TTCAGCACCNNGGACAGNGCC. La unión del factor de transcripción se lleva a cabo gracias al dominio de unión al ADN que consiste de 8 dedos de zinc (Figura 5B) (Roopra et al., 2001). Una vez que dicho factor se une a su secuencia consenso, actúa reclutando cofactores represores, desacetilasas de histonas (HDACs) y metiltransferasas de histonas (HMT), para causar remodelamiento de la arquitectura de la cromatina alrededor de sus genes blanco (Figura 5C) (Garriga-Canut et al., 2006, Mulligan et al., 2008, McClelland et al., 2011) Figura 5. Función y estructura génica y proteica de REST/NRSF. A) El gen REST tiene un tamaño de 24 kb y consta de 5 intrones y 6 exones. Los intrones 1, 3 y 4 codifican para los 8 dedos de zinc que conforman el dominio de unión al ADN. B) La proteína REST/NSRF pesa 122 kDa y consta de su dominio de unión al ADN y dos dominios represores localizados en sus extremos -N y -C terminales. C) Una vez que localiza su secuencia consenso y se une de manera específica, REST/NSRF recluta cofactores represores y factores epigenéticos que van a inducir el remodelamiento de la cromatina para mantenerla silente. Tomado y modificado de (Roopra et al., 2012), McClelland et al., 2011 y http://atlasgeneticsoncology.org/Genes/GC_REST.html Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 19 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM En modelos experimentales se ha demostrado que REST/NRSF está fuertemente inducido en las neuronas granulares del giro dentado y en neuronas piramidales hipocampales después del EE inducido con AK (Palm et al., 1998). Además, Roopra en el 2001 demostró que en los más de 1300 genes blanco de REST/NRSF, se incluyen muchos genes conocidos por estar involucrados en la excitabilidad neuronal, tales como GABRA1, GABRB3, GABRD y GRIA2 (Roopra et al., 2001). Mas recientemente se ha demostrado que también reprime el gen que codifica para canales de cationes acoplados a nucleótidos cíclicos de tipo 1 (HCN1)(McClelland et al., 2011). Debido a ello se ha estudiado el papel de REST/NRSF en una gran variedad de procesos epilépticos, demostrando que la inhibición de REST/NRSF disminuye el número de convulsiones espontáneas (Garriga-Canut et al., 2006). Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 20 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM 2 Justificación El factor de transcripción REST/NRSF actúa como un represor transcripcional de genes neuronales cuando se une a su secuencia consenso (sitio RE1) en el ADN. Estudios in vivo e in vitro han demostrado que los genes GRIA2 y GABRD tienen sitios RE1 en sus regiones promotoras. Además, se sabe que la expresión de dicho factor se incrementa como consecuencia de las crisis convulsivas en modelos experimentales. Sin embargo, a la fecha no se ha evaluado la expresión de REST/NRSF, su asociación con las variables clínicas y psiquiátricas, ni su participación sobre la regulación transcripcional de los genes que codifican para GluR2 y GABAAδ en pacientes con ELTM farmacorresistente. 3 Hipótesis El factor de transcripción REST/NRSF se sobreexpresa en hipocampo de pacientes con ELTM farmacorresistente y se une a los elementos RE1 de los genes GRIA2 y GABRD participando en su represión transcripcional. 4 Objetivos 4.1 Objetivo General Evaluar los niveles de expresión de REST/NRSF y su participación en la regulación transcripcional de los genes que codifican para GluR2 y GABAAδ en pacientes con ELTM farmacorresistente, así como su asociación con las variables clínicas y psiquiátricas. 4.2 Objetivos Particulares • Evaluar los niveles de ARNm y proteína de REST/NSRF en hipocampo de autopsias y de pacientes con ELTM farmacorresistente. • Determinar la asociación entre los niveles de ARNm y proteína de REST/NRSF de hipocampo de autopsias y pacientes con ELTM farmacorresistente y las variables clínicas y psiquiátricas. • Determinar la unión de REST/NRSF a las secuencias RE1 en los promotores de los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de autopsias y pacientes con ELTM farmacorresistente. • Evaluar y correlacionar los niveles de ARNm y proteína de GluR2 y GABAAδ con la expresión de REST/NRSF de hipocampo de autopsias y pacientes con ELTM farmacorresistente y con las variables clínicas y psiquiátricas. Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 21 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM 5 Materiales y métodos 5.1 Estandarización de la Reacción en Cadena de Polimerasa cuantitativa (qPCR) La expresión génica es un mecanismo que controla la función y adaptabilidad de las células procariotas y eucariotas. Existen varias técnicas que permiten evaluar dicho mecanismo. Actualmente, la PCR en tiempo real (qPCR), precedida de retrotranscripción, es la técnica disponible con mayor sensibilidad para analizar y cuantificar el ARNm. Dentro de los métodos de qPCR basados en fluorescencia, se encuentran los que utilizan SYBR Green, pero son menos específicos que aquellas que emplean sondas de hibridación (TaqMan). Las sondas TaqMan están diseñadas para incrementar la especificidad de la qPCR. Dicha especificidad se debe a la actividad exonucleasa 5’-3’ de la Taq Polimerasa, la cual hidroliza fluorocromos acoplados a una sonda conforme se va sintetizando la secuencia complementaria a la cadena molde. Así, la emisión de fluorescencia es una medida cuantitativa de los productos de amplificación. 5.1.1 Diseño de cebadores y sondas para sistema TaqMan con IDT Con base en lo anterior, se estandarizó un sistema de qPCR con sondas TaqMan para detectar, en pacientes y autopsias, los niveles de expresión los genes REST/NRSF, GRIA2 y GABRD relativos al gen endógeno Enolasa 2 (ENO2) en un rango específico de concentración asociada a los ciclos de amplificación. A continuación, se describe el proceso de diseño de cebadores y sondas TaqMan para qPCR para REST/NRSF, GRIA2, GABRD y ENO2. Se obtuvieron las secuencias genómicas para cada gen, es decir, las secuencias de la región del cromosoma donde se localiza el gen de interés (NC en NCBI) y las secuencias codificantes de los genes, es decir, el ARNm (NM en NCBI). ENO2 NC_000012.12 (6914450-6923696) NM_001975.2 REST/NRSF NC_000004.12 (56907876-56935847) NM_001193508.1 GRIA2 NC_000004.12 (157220584-157370583) NM_000826.3 GABRD NC_000001.11 (2019329-2030753) NM_000815.4 Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 22 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM Las secuencias intrónicas y exónicas de cada gen se localizaron de forma manual determinando las concordancias entre la secuencia codificante y diferentes regiones genómicas. Una vez marcadas las secuencias exónicas, se eligieron al azar secuencias que involucran dos o más exones y sobre estas secuencias se realizó el diseño de cebadores, ya que al utilizar dos o más regiones aseguramos cierto grado de especificidad de los cebadores/sondas. Una vez determinadas las secuencias, se utilizó la herramienta PrimerQuest Tool de IDT para el diseño de cebadores y sondas. Los amplicones abarcaron más de un exón y su longitud fue menor a 200 nt, para evitar inespecificidad en el apareamiento de bases. Se seleccionaron un par de cebadores candidatos a los cuales se les realizó el análisis de propiedades utilizando la herramienta OligoAnalyzer Tool de IDT con los siguientes parámetros: concentración de MgCl2 ≈2.5-3.0 mM y de dNTPs ≈0.8mM. Nos aseguramos de que el porcentaje de guaninas y citosinas fuese mayor del 50% y que la Primer Melting Temperature (Tm) fuese similar entre cebadores, pero aproximadamente 5° C más para la sonda. Se determinó la posible formación de estructuras secundarias (hairpins, homo y heterodímeros) asegurando que el ΔG de los hairpins y de los homo y heterodímeros fuera menor del 10% de la ΔG max. Se precisó que los cebadores presentaran un máximo de 3 enlaces formados entre las estructuras secundarias para evitar apareamiento inespecífico y aumentar la probabilidad de apareamiento con la secuencia genómica. Los cebadores y sondas seleccionadas se muestran en la tabla 2. Tabla 2. Características de los cebadores y sondas para REST/NRSF, GRIA2, GABRD y ENO2. Gen Cebadores/Sondas nt Tm (°C) REST/NRSF Fw: 5’-GCATCAGGTGCTCCAGATATT-3’ Rv: 3’-GCTTCATATTGGCATGGCTTAC-5’ Snd: 3’-TTTGTCCTCCGCTCCAGGTGTTTC-5’ 21 22 24 62 ENO2 Fw: 5’- CAGGACTTTGTCAGGGACTATC-3’ Rv: 3’- CCCTACATTGGCTGTGAACT-5’ Snd: 3’- CCATTGAGGACCCATTTGACCAGGA-5’ 22 20 24 62 GRIA2 Fw: 5’-CACCTCTGGGCTTGAGAATAAG-3’ Rv: 3’-GTCAACACAGTAGCCCTCATAG-5’ Snd: 3’-ATGAAATGCTTGAAGGCAATGAGCG-5’ 22 22 25 62 GABRD Fw: 5’-ATGTCCTGGGTCTCCTTCT-3’ Rv: 3’-ATGAGCGTGGTCATCGTC-5’ Snd: 3’-ACCGTGGTGATGCCTAGAGACAC-5’ 19 18 23 62 Fw, Cebador Fordward; Rv, Cebador Reverse; Snd, Sonda; nt, nucleótidos; Tm, Primer Melting Temperature. Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 23 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM 5.1.2 Diseño de gBlocks para sistema TaqMan con IDT Los gBlock son secuencias verificadas de doble cadena de bloques genómicos diseñados ad hoc que se insertan en vectores para la transformación y recombinación bacteriana. Se utilizan para la estandarización de qPCR, edición de genomas e investigación de anticuerpos. Se realizó el diseño de un gBlock global que además de incluir los amplicones de REST/NRSF y ENO2, incluyó también las secuencias de amplificación para los genes blanco GRIA2 y GABRD. El procedimiento de diseño es el siguiente: Previamente se realizó el análisis de los cebadores y su respectiva sonda, con lo cual se predijo el largo de cada amplicón (ENO2: 200nt, REST: 185nt, GRIA2: 200 nt, GABRD: 180 nt). Cada amplicón puede constituir un gBlock, sin embargo, se puede construir un gBlock global con varios amplicones separados por medio de 5 timinas (TTTTT). El gBlock global obtenido se muestra en la figura 6. Figura 6. Fragmento gBlock global. Secuencia del gBlock utilizado para la transfección y transformación de bacterias E. coli DH5α. 5.1.3 Obtención de curvas de calibración Para estandarizar la qPCR se realizaron las curvas de calibración para ENO2, REST/NRSF, GRIA2 y GABRD. Dichas curvas fueron realizadas evaluando la expresión de los gBlocks en sistemas de expresión bacterianos, utilizando la cepa E. coli, DH5α quimiocompetente. Dicha quimiocompetencia se obtuvo de la siguiente forma: Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 24 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM 5.1.3.1 Preparación de células químicas competentes Partiendo de un cultivo bacteriano de E. coli DH5α en agar LB, se tomó una colonia bacteriana, se inoculó en 5 mL de medio SOB suplementado con MgS04 y MgCl2 (a una concentración final de 10 mM c/u) y se dejó incubar a 37°C en agitación durante 16 h. Posteriormente se realizó una dilución 1:100 del medio overnight con medio SOB fresco (500 µL en 50 mL) y se incubó a 37°C en agitación hasta el medio de cultivo tuvo una densidad óptica de 0.5 a 600 nm como consecuencia de la proliferación bacteriana. Tras obtener dicha característica, los cultivos se dejaron enfriar en hielo por 15 min y se cosecharon las células por centrifugación a 6000 rpm durante 10 minutos (min) a 4 °C. Se desechó el sobrenadante, las células se resuspendieron en 16 mL de Suero Fetal Bovino (SFB), y se incubaron en hielo durante 15 min. Las células se cosecharon por centrifugación a 6000 rpm durante 10 min a 4 °C. Se desechó el sobrenadante y las células se resuspendieron nuevamente en 4 mL de SFB. Se agregaron 140 µL de dimetilsulfóxido (DMSO) para una concentración final de 3.5% (v/v), se agitó e incubó 5 min en hielo. Una segunda alícuota de DMSO se agregó con el mismo volumen para obtener una concentración final de 7% (v/v) y se incubó en hielo por 15 min. Las bacterias se alicuotaron en volúmenes de ~200 µl en tubos previamente enfriados, y se congelaron inmediatamente utilizando hielo seco. Las bacterias se almacenaron a -70 °C hasta su utilización. Todo el proceso se realizó en condiciones de esterilidad. 5.1.3.2 Transformación de células quimiocompetentes Una vez obtenidas las bacterias quimiocompetentes se realizó la transformación utilizando el vector pJET1.2/blunt del CloneJET PCR Cloning Kit (#K1231 Thermo Scientific). La transformación se realizó con el procedimiento determinado para extremos romos de la siguiente forma: Se preparó la mezcla de ligación que contenía 10 µL de buffer de reacción 2X, 1 µL de gBlock, 1µL de plásmido pJET1.2/blunt, 1µ de DNA ligasa T4 y cuanto baste para (cbp) 20 µL de agua libre de nucleasas. Se mezcló con vortex, y se incubó a temperatura ambiente por 5 min. Se tomaron 200 µL de la solución que contenía bacterias quimiocompetentes y se le adicionaron 5 µL de mezcla de ligación. Dicha suspensión se incubó en hielo por 30 min, posteriormente a 37 °C por 5 min y finalmente en hielo durante 2 min. Una vez transcurrido el choque de temperaturas, se adicionó 1 mL de medio LB previamente Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 25 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM calentado a 37°C y se incubó a 37 °C por 1 h en agitación. Se cosecharon las células por centrifugación a 12000 rpm por 2 min y se retiró el sobrenadante dejando un remanente de aproximadamente 100 µl. Las células se resuspendieron en dicho remanente, se sembraron en agar LB con ampicilina y se incubaron toda la noche a 37 °C. 5.1.3.3 PCR de colonias (Colony PCR) Para evaluar la transformación de las bacterias recombinantes se debe corroborar que estas expresen la resistencia al antibiótico (ampicilina) y que el fragmento gBlock se haya insertado en el plásmido. Para ésto, se realizó el análisis de las clonas recombinantes de la siguiente forma: Se preparó el mix PCR para mezcla de reacción de 20 µL conteniendo lo siguiente: - Buffer Taq 10X – 2 µL - dNTPs 2 mM – 2 µL - MgCl2 25 mM – 1.2 µL - Cebador Forward pJET 1.2 10 mM – 0.4 µL - Cebador Reverse pJET 1.2 10 mM – 0. 4 µL - Agua libre de nucleasas – 13.9 µL - Taq DNA polimerasa 5u/µL – 0.1 µL Con un asa estéril se picaron diversas colonias y se resuspendieron en 20 µL de Mix PCR (cada una de manera individual). De dicha suspensión se realizó la PCR de 25 ciclos utilizando el siguiente programa de amplificación: 1. 95°C por 3 min 2. 94 ° C por 30 s 3. 60 °C por 30 s 4. 72 °C por 1 min Se determinó la presencia de los productos de PCR en un gel de agarosa al 1%. Una vez determinada la colonia recombinante, se resembró para expandir la clona y obtener más producto. 5.1.3.4 Curvas de calibración Las curvas de calibración se obtuvieron una vez expandida la colonia transformada y con el gBlock insertado. REST/NRSF, GRIA2, GABRD y ENO2 se Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 26 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM amplificaron por qPCR a través del sistema LyghtCycler TaqMan Master (Roche) que se realizó en un equipo LyghtCycler 2.0 (Roche) de 6 canales siguiendo el siguiente procedimiento: Se realizaron diluciones a concentraciones conocidas de plásmido, que van desde los 30 ng/µL hasta los 3fg/µL y se preparó el Master Mix LightCycler para REST/NRSF, GRIA2, GABRD y para ENO2 conteniendo lo siguiente: a. Agua grado biología molecular – 6 µL b. Sonda/cebador 10X – 1 µL c. Master Mix 5X – 2 µL Cada reacción de qPCR se realizó en capilares LyghtCycler en los cuales se adicionó 1 µL de la respectiva dilución de plásmido y 9 µL de Master Mix LightCycler. Los capilares con la mezcla de reacción se centrifugaron a 900 rpm por 30 s y se colocaron en el carrusel del equipo LyghtCycler 2.0. El programa de amplificación tuvo las siguientes especificaciones (Tabla 3): Tabla 3. Programa de amplificación por qPCR en sistema LightCycler 2.0 Una vez terminada la amplificación, se obtuvo el valor de CP (crooss point) que indica la cantidad inversamente proporcional a la concentración inicial de ADN. Se graficaron los valores de CP contra la concentración de plásmido y se obtuvieron los valores de la ecuación de la recta que fueron utilizados para la normalización de los valores obtenidos tras la amplificación del ADN complementario (ADNc) de las muestras de pacientes y autopsias. Las amplificaciones se realizaron por triplicado. 5.2 Obtención de tejido hipocampal de autopsias Las muestras de hipocampo de autopsias fueron obtenidas a del Servicio Médico Forense (SEMEFO) a través de un acuerdo de colaboración asentado en el acta Modo de análisis Ciclos Segmento Temperatura Tiempo Modo de adquisición Preincubación Ninguno 1 95°C 10 min Ninguno Amplificación Cuantificación 45 Desnaturalización 95 10 s Ninguno Anillamiento 62 30 s Ninguno Extensión 72 1 s Simple Enfriamiento Ninguno 1 37 30 s Ninguno Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 27 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM SP/INV/004/2013 (ANEXO 1). Las variables demográficas de 13 autopsias utilizadas para este estudio se presentan en la tabla 4. 5.2.1.1 Criterios de inclusión • Tejido proveniente de sujetos cuya causa de muerte no esté relacionada con enfermedades neurológicas. • Que el tejido haya sido retirado e inmediatamente congelado a -80° C en menos de 20 h (intervalo post-mortem <20 h) • Masculinos y femeninos sin considerar intervalo de edad específico. 5.2.1.2 Criterios de exclusión • Tejidos que provengan de sujetos con muerte relacionada a algún evento cerebral traumático. • Tejidos cuyo Intervalo Post-Mortem (IPM) y periodo de preservación sea mayor a 20 h. Tabla 4. Datos demográficos de las autopsias Sujeto Género Edad Causa de la muerte Intervalo Post-Mortem (h) A1 M 57 Infarto de miocardio 18 A2 M 40 Proyectil de arma de fuego 13 A3 F 45 Desconocido 10 A4 F 17 Asfixia 18 A5 M 16 Asfixia 18 A6 F 40 Proyectil de arma de fuego 20 A7 M 37 Infarto de miocardio ND A8 M 32 Proyectil de arma de fuego 12 A9 M 30 Proyectil de arma de fuego 13 A10 F 31 Asfixia 17 A11 M 34 Traumatismo torácico 15 A12 F 28 Diabetes 15 A13 F 42 Asfixia 18 M:7 F:6 34.5 ± 3.2 15.58±0.88 F, femenino; M, masculino; ND, No Determinado (dato excluido). En la parte inferior de la tabla se muestran promedios ± Error Estándar de la Media. Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 28 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM 5.3 Obtención de tejido hipocampal de pacientes con ELTM farmacorresistente Las muestras de tejido hipocampal fueron obtenidas de 28 pacientes diagnosticados con ELTM farmacorresistente sometidos a lobectomía temporal entre 2014 y 2017, según el protocolo establecido por el programa de cirugía de epilepsia del Instituto Nacional de Neurología y Neurocirugía y aprobado por el Instituto Mexicano del Seguro Social en el proyecto R-2017-785-100 (Anexo 1) Las características clínicas de los pacientes se presentan en la tabla 5. Tabla 5. Datos clínicos de los pacientes con ELTM Px Género Edad (años) Edad inicio de las crisis (años) Duración de la epilepsia (años) Frecuencia de crisis (por mes) Lado del foco #FAEs pre- cirugía Psi. 200 M 42 19 23 30 I 4 Dep/A 206 M 25 3 22 5 D 4 NP 239 M 38 10 28 3 I 3 Dep 240 F 29 25 4 60 D 5 Dep 241 M 40 10 40 4 D 10 Dep/A 242 F 27 8 19 5 D 4 A 243 F 33 28 5 8 I 3 Dep/A 244 F 31 12 19 7 D 5 Dep 271 M 37 1 36 6 I 1 NP 275 F 23 13 10 1 I 2 NP 281 M ND ND ND ND D ND NP 282 M 37 9 28 2 D 3 Dep/A 316 F 30 28 2 4 D 1 NP 324 F 35 2 33 4 I ND NP 326 F 38 15 23 50 I 2 A 329 M 40 42 8 8 D 2 NP 339 M 47 12 35 4 I 7 Dep 345 M 17 9 8 30 I 5 NP 359 M 33 27 6 30 D 5 NP 367 F 22 12 10 4 I 5 NP 369 F 28 10 18 15 D 7 NP 371 F 37 3 34 10 I 5 NP 386 M 32 ND ND ND I ND NP 408 F ND ND ND ND D ND NP 413 M 31 9 21 7 I 8 A 417 M 38 8 30 4 I 3 Dep 420 M 28 5 23 30 D 7 Dep/A 424 F ND ND ND ND D ND NP M:15 F:13 32±1.4 13.3±2.0 20.2±2.3 13.8±3.3 D:14 I:14 4.4±0.4 Dep: 5 A: 3 Dep/A:5 A, ansiedad; D, derecho; Dep, depresión; F, femenino; FAEs, Fármacos antiepilépticos; I, izquierdo; M, masculino; ND, no determinado; NP, no presenta; Psi, comorbilidades psiquiátricas. En la parte inferior de la tabla se muestran promedios ± Error Estándar. Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 29 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM Todos los pacientes se mantuvieron libres de FAEs por lo menos 24 h antes del procedimiento neuroquirúrgico. Los criterios para la selección de pacientes fueron los siguientes: 5.3.1.1 Criterios de inclusión • Pacientes candidatos a lobectomía temporal con diagnóstico de ELTM farmacorresistente • Masculinos o femeninos de entre 18 y 60 años. • Que supieran leer y escribir, con capacidad de cooperación adecuada y coeficiente intelectual de 90 a 109 • Con valoración preoperatoria completa que consistió en: - Historia clínica completa. - Evaluación neuropsicológica, la cual consistió en la aplicación de pruebas psicológicas que comprenden la valoración cuantitativa y cualitativa de las funciones cognitivas. Estas pruebas dan información acerca de la capacidad de integración y organización de las funciones superiores del paciente y permiten relacionarlas con regiones cerebrales específicas y el grado de compromiso de estas. - La presencia de depresión y trastornos de ansiedad se evaluó mediante la Hospital and Anxiety Depression Scale (HADS; versión en español). Los diagnósticos fueron confirmados con la entrevista clínica estructurada para trastornos del Eje I DSM-IV (SCID-I), aplicada por un psiquiatra que desconocía el diagnóstico de epilepsia. - Video electroencefalograma (EEG) • Ser diagnosticados como farmacorresistentes, es decir, fue indispensable que tuvieran antecedente de haber sido tratados farmacológicamente con politerapia por un espacio ininterrumpido de 2 años, con seguimiento de niveles séricos de FAE sin haber mostrado mejoría. • Que su epilepsia implique impedimento para realizar actividades cotidianas, es decir, que haya un detrimento en la calidad de vida. 5.3.1.2 Criterios de exclusión • Padecimiento de enfermedades sistémicas graves que contraindicaran una neurocirugía mayor. Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 30 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM • Diagnóstico de enfermedad neurodegenerativa. • Falta de cooperación con el tratamiento. • Presencia de implantes, prótesis metálicas y claustrofobia. • Pacientes previamente sometidos a cirugía extratemporal por cualquier indicación. • Que no hayan sido valorados adecuadamente. 5.4 Procesamiento y manipulación del tejido hipocampal El tejido hipocampal resecado de pacientes y autopsias se colocó en nitrógeno líquido inmediatamente después de su resección para preservar su integridad. Se trasladó y manipuló en estas condiciones, hasta su almacenamiento a -80 °C. Para las determinaciones experimentales, el tejido siempre fue manipulado en hielo seco y en condiciones de esterilidad. A cada fragmento de tejido se le realizaron cortes con bisturí totalmente estéril hasta obtener la cantidad necesaria para cada experimento (100 mg para extracción de ARNm y 200 mg para extracción de proteínas). 5.5 Extracción y procesamiento de ARNm mediante qPCR La extracción de ARNm se realizó con Trizol (Invitrogen) a partir de 100 mg de tejido y de acuerdo con el protocolo del fabricante: El tejido congelado se cortó en fragmentos pequeños de aproximadamente 3 mm3 y se pasó a un tubo de 1.5 mL. Se agregó 1 mL de Trizol, se homogenizó y se colocó en hielo por 10 min. Posteriormente se agregaron 200 μL de cloroformo frio, se mezcló por inversión y se centrifugó a 12000 rpm durante 20 min. a 4 °C. La fase acuosa se separó sin tocar la interfase y se agregaron 500 μL de isopropanol frío. Se mezcló por inversión y se incubó toda la noche a -20 °C. Después de la incubación, la mezcla se centrifugó a 12000 rpm durante 20 min a 4 °C, se decantó el sobrenadante y se lavó el pellet con 1mL de etanol al 75%. Dicha suspensión de lavado se centrifugó a 8000 rpm por 10 min, se decantó el sobrenadante y se dejó secar el pellet sobre papel absorbente hasta quitar todas las gotas de solución. El pellet de ARNm se disolvió en 50 μL de agua DEPC. Con el fin de incrementar la pureza y mantener la integridad del ARNm obtenido se realizó un proceso de re-purificación a través del sistema de perlas magnéticas Agentcourt RNA clean XP (Beckman Coulter) siguiendo el protocolo del fabricante. Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 31 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM A cada muestra de 50 µL de ARNm se le agregaron 90 µL de Agencourt RNAClean XP. Se homogenizó y se incubó 5 min a temperatura ambiente. Los tubos se colocaron en la gradilla magnética por 5 min para separar las perlas de la solución y la solución se aspiró suavemente cuidando de no tomar las perlas. Sin retirar las muestras de la gradilla magnética, se agregó 1 mL de etanol al 70% a cada tubo, se incubaron por 30 s a temperatura ambiente y se retiró el etanol. Este proceso de lavado se repitió 3 veces y una vez terminado, los tubos de reacción se mantuvieron abiertos hasta la evaporación total del etanol. Posteriormente se retiraron los tubos de la gradilla magnética, las perlas se resuspendieron en 30 µL de agua DEPC y nuevamente se colocaron en la gradilla magnética. Una vez separadas las perlas, la solución que contiene el ARNm se aspiró y se realizaron alícuotas que fueron almacenadas a -80 °C hasta su utilización. El ARNm obtenido se cuantificó espectrofotométricamente, se verificó su pureza mediante la relación 260/280 nm, la cual indica que valores de 1.8 a 2.0 son aceptables, dado que no presentan contaminación. La integridad se evaluó mediante un gel de agarosa 1%-formaldehido 1% que permite observar las bandas correspondientes a las diferentes subunidades ribosomales eucarióticas del ARN ribosomal (18S y 28S). 5.5.1 Síntesis de ADN complementario (ADNc) La síntesis de ADNc se realizó utilizando la M-MLV Reverse Transcriptase (Promega) de acuerdo con el protocolo del fabricante: En un tubo estéril se agregaron 2 µg de ARNm, el volumen equivalente a 1µg de random primer y cbp 15 µL de agua DEPC. Dicha mezcla de reacción se calentó a 70 °C durante 5 min para deshacer estructuras secundarias e inmediatamente después se colocó en hielo. Se agregaron los siguientes componentes y se mezcló suavemente: - Buffer de reacción M-MLV 5X – 5 µL - dNTPs 10 mM – 5 µL - M-MLV RT – 200 unidades - Agua DEPC - cbp 30 µL La mezcla de reacción se incubó por 1 h a 42 °C y 10 min a 70 °C y posteriormente el ADNc se almacenó a -20 °C hasta su utilización. Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 32 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM 5.5.2 PCR en tiempo real Una vez obtenido el ADNc del tejido cerebral, se llevó a cabo la qPCR bajo las mismas condiciones experimentales con las que se realizaron las curvas de calibración (sección 5.1.3.4). Se tomó el volumen equivalente a 500 ng de ADNc y se preparó la reacción utilizando los cebadores descritos en la Tabla 2 para REST/NRSF, GRIA2, GABRD y para ENO2. El programa de amplificación fue el descrito en la Tabla 3. 5.6 Extracción y procesamiento de proteínas mediante western blot Se evaluó la expresión proteica de REST/NRSF mediante western blot de acuerdo con el siguiente protocolo: 5.6.1 Extracción de proteínas totales La extracción de proteínas totales de tejido hipocampal se realizó a partir de 18 muestras utilizando un buffer NP-40 (Tris-HCl 1M, NaCl 0.4M, EDTA 0.5M, NP-40 y SDS al 10%) suplementado con inhibidores de proteasas (cOmplete, Roche). Se tomaron 200 mg de tejido hipocampal el cual se homogenizó con 1 mL de buffer de lisis NP-40 suplementado con inhibidores de proteasas, hasta que las partículas de tejido fueron de aproximadamente 1 mm. El homogenizado se incubó 30 min a temperatura ambiente agitando cada 10 min. Posteriormente se centrifugó a 14000 rpm por 10 min, se tomó el sobrenadante que contiene a las proteínas y se realizaron alícuotas que fueron almacenadas a -80°C hasta su utilización. Las proteínas se cuantificaron espectrofotométricamente por método colorimétrico de Bradford y se evaluó su integridad a través de una tinción de gel de poliacrilamida con azul de Coomassie. Dicha tinción permitió observar las bandas definidas de las proteínas de alto y bajo peso molecular. 5.6.2 Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) Una vez extraídas, las proteínas fueron separadas de acuerdo con su peso molecular a través de un gel SDS-PAGE al 10%. Para la SDS-PAGE de REST/NRSF se tomó el volumen correspondiente a 100 mg de proteínas y se agregó buffer de carga (1:1, v/v). Las muestras se desnaturalizaron al colocarlas en agua hirviendo por 5 min e inmediatamente después en hielo. Posteriormente se cargaron en los pozos de los geles a Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 33 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM la concentración indicada y en uno de los pozos se cargó el marcador de peso molecular. La cámara de electroforesis se aforó con buffer de corrida 1X y se corrió a 90 V o a 24 Amp por 2 h. 5.6.3 Transferencia Una vez terminada la electroforesis se procedió a transferir las proteínas separadas a un medio sólido (membrana de nitrocelulosa de 0.45 µm de porosidad). Para ello, se retiró el gel de la cámara y se enjuagó en buffer de transferencia para eliminar el SDS. Mientras tanto, se preparó el dispositivo de transferencia humedeciendo esponjas, bloques de papel filtro y la membrana de nitrocelulosa con buffer de transferencia, se comprimió y se colocó en la cámara de transferencia semiseca (Semidry, Biorad). Con buffer de transferencia se humidificó todo el dispositivo, se cerró la cámara y se puso a correr a 23 V por 1 h. Una vez concluido el tiempo, se retiró la membrana de nitrocelulosa y se tiñó por 3 min con rojo de Ponceau, para corroborar la transferencia adecuada de las proteínas. Dicha tinción transitoria fue removida enjuagando con agua destilada. 5.6.4 Bloqueo e inmunodetección Una vez que realizada la correcta transferencia de proteínas a la membrana de nitrocelulosa se procedió al bloqueo e inmunodetección. Con base en esto, la membrana de nitrocelulosa con las proteínas transferidas se incubó durante 1h con leche al 5% y SFB al 0.5% diluidos en PBS 1X-Tween-20 al 0.1% para bloquear la porosidad de la membrana y evitar reconocimiento antigénico inespecífico. Una vez concluido el bloqueo, la membrana se enjuago 10 s con PBS 1X. Inmediatamente después se incubó en una dilución 1:1000 del anticuerpo primario anti-REST/NRSF (Abcam ab75785) durante toda la noche a 4 °C. Posteriormente se retiró la membrana del anticuerpo primarios y se lavó 3 veces durante 10 min con PBS 1X-Tween-20 al 0.1%. Inmediatamente después se incubó en una dilución 1:10000 de anti-mouse durante 1h a temperatura ambiente. La membrana se retiró del anticuerpo secundario y se realizaron 3 lavados de 10 min con PBS 1X-Tween 20 al 0.1% y un lavado de 30 min con solución de alta sal (NaCl 1M). Para la obtención de las imágenes, se tomó la membrana y se adicionaron 200 mL de solución quimiolumicente (Luminata Cressendo, Millipore) y se colocó en el fotodocumentador (Fusion). Se ejecutó el programa de revelado y una vez Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 34 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM obtenidas las imágenes, la membrana se lavó con PBS 1X-Tween 20 al 0.1% durante 30 min. 5.6.5 Stripping & reblotting Tras la obtención de las imágenes de la respectiva proteína de interés, es importante corroborar que las posibles diferencias de expresión no sean resultado de diferencias en la concentración de las proteínas cargadas en el gel. De acuerdo con lo anterior, en las mismas membranas se evaluó el control de carga a través de la inmunodetección de una proteína expresada de manera endógena (β-actina). Para poder utilizar la misma membrana se realizó un proceso de “stripping” que permite retirar el bloqueo y el anticuerpo primario de la primera proteína de interés. Se realizó un procedimiento de stripping suave, el cual se describe a continuación: Tras el lavado del procedimiento anterior, se realizaron dos lavados a la membrana con stripping buffer de 5 a 10 min a temperatura ambiente. Posteriormente se realizaron dos lavados con PBS 1X durante 10 min a temperatura ambiente y dos lavados con TBS 1X durante 5 min a temperatura ambiente. Inmediatamente después de los lavados, se repitió el procedimiento de bloqueo e inmunodetección utilizando anti-β-actina (sc- 69879, 1:1000) como anticuerpo primario y anti-mouse (1:10000) como anticuerpo secundario. 5.7 Inmunoprecipitación de cromatina 5.7.1 Disgregación del tejido y crooslinking La estandarización de la técnica se realizó con tejido cortical de una autopsia. Así, se determinó que la cantidad de tejido requerida era de 400 mg. Con base en lo anterior se juntaron aleatoriamente 30 mg de tejido hipocampal de 14 pacientes y 40 mg de hipocampo de 10 autopsias respectivamente. El tejido congelado a -80 °C se manipuló en condiciones de esterilidad y se seccionó de la forma descrita en la sección 5.4. Las muestras fueron disgregadas hasta obtener pequeños trozos de aproximadamente 1-3mm3 y transferidas a tubos cónicos de 15 mL a los cuales se añadió 1 mL de PBS con inhibidores de proteasas (PBS+i). Para la reacción de crosslinking, a cada tubo que contenía la solución anterior se le agregaron 10 µL de formaldehido (concentración final del 1%) y se incubaron en rotación por 15 min a temperatura ambiente. El crosslinking se detuvo agregando 252.5 Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 35 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM µL de glicina 0.5 M (concentración final de 0.125 M) y se continuó la incubación rotatoria a temperatura ambiente por 5 min. Posteriormente las muestras fueron centrifugadas a 720 rpm por 5 min a 4 °C, se descartó el medio y la pastilla resultante se lavó una vez con PBS+i frio. Nuevamente las muestras fueron centrifugadas a 720 rpm por 5 min a 4° C, los pellets de tejido fueron resuspendidos en 1 mL de PBS+i frio y se colocaron en hielo. 5.7.2 Lisis celular De las pastillas resuspendidas en el procedimiento anterior, un volumen equivalente a 200 mg de tejido inicial fue transferido a tubos eppendorf de 1.5 mL. Se procedió a la disgregación del material utilizando un homogenizador tipo Potter- Elvehjem. Los tejidos macerados se centrifugaron a 1000 rpm a 4 °C por 10 min, se les aspiró el sobrenadante y fueron resuspendidos en buffer de lisis (SDS 1%, EDTA 10 mM, Tris-HCl 50mM) con inhibidores de proteasas (BL+i) hasta obtener una suspensión homogénea. Las suspensiones de lisis se incubaron en hielo por 15 min y posteriormente los núcleos se centrifugaron a 2500 rpm a 4 °C. Los sobrenadantes se descartaron, las pastillas resultantes se resuspendieron en BL+i a un volumen 5X y se incubaron en hielo por 20 min. 5.7.3 Optimización de la fragmentación del ADN mediante sonicación Se procedió a la fragmentación del ADN de las muestras, la cual se realizó por sonicación utilizando un sonicador Covaris®. La estandarización en corteza cerebral se realizó a partir de las suspensiones de lisis, de las cuales se tomaron 6 alícuotas de 100 µL. Dichas alícuotas fueron sonicadas probando 20, 30 y 40 ciclos de 30 segundos ON y 30 segundos Off por duplicado. Para confirmar la fragmentación de la cromatina se tomaron 50 µL de cada sonicado (equivalente a 20 mg de tejido inicial) y se agregaron 50 μL de agua. A estas soluciones se les agregó RNasa sin DNasa a una concentración de 20 µg/mL y se incubaron a 37 °C durante 1 h. Posteriormente se les añadió proteinasa K a una concentración de 20 µg/mL y se incubaron a 65 °C durante toda la noche. Después de la incubación, las soluciones fueron centrifugadas a 14000 rpm y los sobrenadantes se recuperaron. Se purificó el ADN de dichos sobrenadantes utilizando el kit MagJET Genomic DNA (Thermo Scientific) de acuerdo con el protocolo del fabricante descrito a continuación: Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 36 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM Al sobrenadante recuperado se resuspendió en 300 µL de BL+i y se transfirió a tubos que contenían una suspensión de 400 µL de isopropanol y 25 µL de perlas magnéticas. Dicha suspensión se agitó suavemente y los tubos se colocaron en una gradilla magnética. Una vez que las perlas se agregaron hacia el magneto, el sobrenadante fue removido cuidadosamente y se descartó. Los tubos se removieron de la gradilla magnética y las perlas se resuspendieron en 800 µL de wash buffer 1 suplementado con etanol. Nuevamente los tubos se colocaron en la gradilla magnética hasta que las perlas se agregaron y se removió el sobrenadante. Este procedimiento se repitió resuspendiendo en 800 µL de wash buffer 2 suplementado con etanol. Una vez removido el sobrenadante, las perlas se resuspendieron en 150 µL de Elution Buffer y los tubos se incubaron a 72 °C en agitación a 700 rpm por 5 min. Posteriormente se colocaron en la gradilla magnética hasta que las perlas se agregaron y el sobrenadante que contiene el ADN fue transferido a un tubo de 1.5 mL. Posteriormente se procedió a cuantificar el ADN espectrofotométricamente (Epoch®). Las muestras de ADN purificado (500 ng) fueron separadas por electroforesis en gel de agarosa al 1% para determinar el tamaño de los fragmentos conseguidos con la sonicación. Se determinó que los fragmentos de ADN adecuados para la amplificación (200-600 pb) se obtenían con 30 y 40 ciclos de sonicación. La mayor concentración de estos fragmentos se encontró con 30 ciclos. Estos parámetros de sonicación fueron reproducibles en tejido hipocampal de pacientes con ELTM y autopsias (Figura 7). 5.7.4 Inmunoprecipitación y crooslinking reversal El procedimiento de inmunoprecipitación se realizó con los 100 µL restantes de las muestras sonicadas utilizando el kit EpiQuik™ Tissue Chromatin Immunoprecipitation (Epigentek®) de acuerdo con el protocolo del fabricante: Se tomaron 100 µL del sonicado y se diluyeron con 100 μL de solución CP4. De dicha solución se pasaron 5 μL a un tubo, se etiquetó como "ADN input" y se colocó en hielo. Mientras tanto la placa se preparó lavando cada pocillo con 120 μl de CP1 y posteriormente 100 μl de CP2. Después se agregaron los anticuerpos de la siguiente forma: 1 μL de anti-IgG normal de ratón como control negativo (solo se expresa tras reacciones antigénicas), 1 μL de anti-RNA Polimerasa II como control positivo (su expresión es constante, pues transcribe los genes eucariotas) y 10 μg de anti-REST/NRSF (sc-374611, Santa Cruz Biotechnology, Inc.). Los pocillos fueron cubiertos con Parafilm Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 37 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM M y se incubaron a temperatura ambiente durante 90 min. Finalmente, la solución de incubación de anticuerpos se retiró y los pocillos se lavaron 3 veces con 150 μL de CP2. Figura 7. Patrones de fragmentación del ADN mediante sonicación. La imagen del lado izquierdo muestra los patrones de fragmentación de ADN de corteza cerebral a 20, 30 y 40 ciclos de sonicación (indicados en la parte superior de cada carril). La imagen del lado derecho muestra los patrones de fragmentación del ADN de hipocampo de autopsias y pacientes a 30 ciclos de sonicación. El marcador de pares de bases, para ambas figuras, se muestra del lado izquierdo. Nótese que el barrido a 30 ciclos de sonicación muestra mayor enriquecimiento de fragmentos entre 200-600 pb, mismos que fueron reproducibles en hipocampo de autopsias y pacientes. Se tomaron 100 µL del sobrenadante diluido y se agregaron a cada pozo. Los pocillos fueron cubiertos con Parafilm M y se incubaron durante 90 min en agitación a 80 rpm a temperatura ambiente. Una vez transcurrido el tiempo, se retiró el sobrenadante de cada pocillo y se realizaron 6 lavados de 2 min a 80 rpm con 150 µL de CP1 y un lavado con 150 µL de buffer TE 1X. A los pocillos y al vial “ADN input” se les agregaron 40 µL de una mezcla 1:40 de proteinasa K con CP5. Se cubrieron los pocillos con la tira de tapas y se incubó la placa y el tubo a 65 °C en un baño de agua durante 15 min. Después se agregaron 40 μl de CP6 a los pozos y al tubo, se mezcló, se volvieron a cubrir los pocillos con la tira de tapas y se incubaron a 65 °C en baño de agua durante 90 min. Se agregaron 150 µL de CP7 a las muestras y al tubo y estas mezclas se transfirieron a las columnas de centrifugado acopladas a los tubos de recolección de 2 mL. Estos dispositivos se centrifugaron a 12000 rpm durante 20 segundos. Se agregaron 200 μl de etanol al 70% a las columnas y se centrifugaron a 12000 rpm durante 15 segundos. Se Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 38 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM desecharon los flujos y se realizaron dos lavados a las columnas agregando 200 μl de etanol al 90% y centrifugando a 12000 rpm durante 35 segundos. Se desecharon los flujos, las columnas se colocaron en viales de 1.5 mL y se les agregaron 20 μl de CP8 directamente en el filtro. Los viales con las columnas se centrifugaron a 12000 rpm durante 20 segundos para eluir el ADN purificado, el cual se almacenó a –20 °C hasta su utilización. 5.7.5 Amplificación de secuencias RE1 de los genes GRIA2 y GABRD por PCR 5.7.5.1 Análisis predictivos de sitios RE1 y diseño de cebadores Para determinar los posibles sitios de unión de REST/NRSF a los sitios RE1 de los genes GRIA2 y GABRD se utilizó la base de datos ChIP qPCR Assay-SABiosciences (QIAGEN) con la cual se realizó un análisis de las siguientes secuencias: - GRIA2: Homo_sapiens-ENSG00000120251-GRIA2 ENSG00000120251; upstream from -1000 to 17000; size: 17001; location: chromosome:GRCh38:4:1:190214555:1 157203182 157220182 D - GABRD: Homo_sapiens-ENSG00000187730-GABRD ENSG00000187730; upstream from -3500 to 800; size: 4301; location: chromosome:GRCh38:1:1:248956422:1 2015798 2020098 D El análisis de secuencias arrojó dos posibles sitios de unión de REST/NRSF para cada gen (Figura 8). Partiendo de los ensayos predictivos, se diseñaron y analizaron los dos juegos de cebadores para cada gen (un juego por cada sitio de unión), siguiendo el protocolo descrito en la sección 5.1.1. Los cebadores diseñados se muestran en la tabla 6: Tabla 6. Cebadores utilizados para amplificar las dos secuencias hipotéticas de unión de REST/NRSF a los promotores de GRIA2 y GABRD. Gen Cebadores nt Tm (°C) GABRD (Secuencia 1) Fw- ACAACCTGAGACGCTTTCTAAC Rv- GAGTTTCTGTGCCCATGAGAT 22 21 62.5 GABRD (Secuencia 2) Fw- AGATAGCGGCTGGGAGAG Rv- CACCGAGTTCTCAGGTCTTTC 18 21 62.5 GRIA2 (Secuencia 1) Fw- GATCAGCTTTGCTGCATTTGG Rv- CGCTGAGAAAGCACAGCTC 21 19 63 GRIA2 (Secuencia 2) Fw- CGTGAGTGAGAGAGGAGAGA Rv- CTGAAGTGGAGGCAGAAGAA 20 20 62 nt, nucleótidos; Tm, Primer Melting Temperature. Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 39 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM Figura 8. Ensayos predictivos ChIP-Seq para la unión de REST/NRSF en sitios RE1 de GRIA2 y GABRD. Se muestra los resultados de los ensayos ChIP-Seq para los genes GRIA2 (arriba) y GABRD (abajo) en el que se muestran los posibles sitios de unión de REST/NRSF a dos posibles sitios RE1 en cada gen. La línea negra representa el fragmento del promotor sobre el cual se realizó el análisis predictivo. Al inicio y al final de la línea se muestran las localizaciones cromosómicas. Las flechas rojas indican los sitios de inicio de la transcripción, las flechas azules muestran los posibles sitios de hibridación de los cebadores y las líneas verdes perpendiculares indican el sitio específico de unión de REST/NRSF. Los ensayos fueron diseñados desde NCBI Homo Sapiens Build Number 37 Version 1. 5.7.5.2 PCR punto final Partiendo de los ADNs purificados, se llevó a cabo la amplificación de las secuencias RE1 de los genes GRIA2 y GABRD mediante PCR punto final. Se prepararon mezclas de reacción para un volumen de 20 µL y para cada sistema de amplificación (cebadores forward y reverse de cada secuencia). Dichas mezclas de reacción se prepararon de la siguiente forma: - ADN – 500 ng - Buffer Taq 5X – 2 µL - dNTPs 2 mM – 2 µL Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 40 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM - Cebador Forward 10 mM – 0.4 µL - Cebador Reverse 10 mM – 0. 4 µL - Taq DNA polimerasa 5u/µL – 0.2 µL - Agua libre de nucleasas – cbp 20 µL Se realizó la PCR punto final de 35 ciclos utilizando el siguiente programa de amplificación. a. 95°C por 3 min b. 94 ° C por 30 s c. 62 °C por 30 s d. 72 °C por 1 min Los productos de PCR se determinaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% y se evaluaron las diferencias en la amplificación de las secuencias de unión de REST/NRSF. 5.8 Análisis estadístico Para la estandarización de la qPCR, se determinó la sensibilidad y exactitud del sistema de medición en el rango de valores de 30 ng a 3 fg de plásmido mediante un análisis de linealidad. Para todos los genes en estudio se determinaron los valores de la ecuación de la recta (y=mx+b) y el ajuste del modelo a través del coeficiente de correlación (R2) ajustado. Las diferencias en la expresión de las proteínas se determinaron a través del análisis de imágenes por densidad óptica utilizando el software ImageJ ®. Los valores obtenidos fueron normalizados en proporción con los datos obtenidos para β-actina. Los valores de expresión obtenidos de los pacientes y las autopsias obtenidas por los diferentes procedimientos experimentales se compararon mediante la prueba t de Student con una prueba post hoc de Mann-Whitney. La influencia de las variables clínicas con la expresión proteica de cada grupo se determinó mediante coeficientes de correlación de Pearson con un α=0.05, en cuyo caso el p-valor se calculó siguiendo una ley de Student con N-2 grados de libertad y 95% de potencia. La dependencia de la expresión de ARNm y proteínas en las comorbilidades psiquiátricas se analizó mediante un análisis de varianza de una vía (ANOVA) con una prueba post hoc de Dunn-Sidak (Bonferroni). Se utilizó el Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 41 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM software SigmaPlot 12.5 para los análisis estadísticos. Los valores estadísticamente significativos fueron los siguientes: (*) p<0.05, (**) p<0.01 y (***) p<0.001. La tasa de unión de REST/NRSF a las secuencias RE1 de los genes GRIA2 y GABRD en tejido hipocampal de autopsias y pacientes con ELTM fue determinada mediante un análisis de densidad óptica realizado con el programa ImageJ (U. S. National Institutes of Health). Debido a la cantidad de tejido requerida para el experimento no fue posible realizar experimentos para cada paciente y por lo tanto no es posible establecer diferencias estadísticas. Los resultados fueron expresados como porcentajes de unión de REST/NRSF en unidades arbitrarias de densidad óptica. Dicho porcentaje de unión fue obtenido en comparación con el input, el cual fue considerado como el 100%. 6 Resultados y discusión 6.1 Confiabilidad, sensibilidad y precisión en la amplificación génica Verificar la linealidad de un método consiste en comprobar que una función matemática relacionada a un procedimiento analítico es efectivamente una recta para un intervalo definido de valores. Con base en lo anterior, se realizó un análisis de linealidad para determinar la sensibilidad y exactitud del sistema de medición en el rango de valores de 30 ng a 3 fg de plásmido y para ello se determinó el coeficiente de correlación (R2) ajustado para las curvas de cada gen en estudio. Con respecto a R2, se sabe que entre más cercano es el valor a 1, mayor es la linealidad y el ajuste al modelo planteado, es decir, el modelo es más confiable (Elena, 2005). El R2 de las curvas de concentración fue 0.999 para ENO2, 0.9921 para REST/NRSF, 0.9995 para GRIA2 y 0.9958 para GABRD (Figura 9, Tabla 7). Lo anterior indica que el modelo para determinar la concentración de ENO2 dependiente de la amplificación (CP) fue 99.9% confiable, 99.21% para la de REST/NRSF, 99.95% para la de GRIA2 y 99.58% para la de GABRD. Por otra parte, cada punto de las curvas se evaluó 3 veces, con lo cual se determinó que el sesgo es mínimo e insignificante (menor a 1 en cada uno de los 6 puntos). Este resultado indica que no existe sesgo dependiente de la concentración del plásmido como resultado del aumento en los ciclos de amplificación. Con base en estos resultados se determinó que el ajuste del modelo para la amplificación de ENO2, REST/NRSF, GRIA2 y GABRD por qPCR es muy bueno, ya que es confiable, sensible y preciso para describir la relación que existe entre las variables. Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 42 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM Figura 9. Curvas de calibración para qPCR de ENO2, REST/NRSF, GRIA2 y GABRD. A) La gráfica muestra la curva de calibración de ENO2 en la que se relaciona el logaritmo natural (ln) de la concentración de plásmido con respecto a los valores del CP (cross point) de la amplificación por qPCR, mientras que en B) se muestra la respectiva curva de calibración de REST/NRSF, en C) la de GRIA2 y en D) la de GABRD. En ambas gráficas se muestran los valores del coeficiente de correlación (R2) y la respectiva ecuación de la recta. Tabla 7. Valores de la ecuación de la recta obtenidos de curvas de calibración de ENO2 y REST/NRSF, GRIA2 y GABRD. m b r2 ENO2 -1.5348 20.37 0.999 REST/NRSF -1.5332 20.223 0.9921 GRIA2 -1.4247 18.68 0.9995 GABRD -1.4918 19.649 0.9958 Estos valores se utilizaron para la normalización de la qPCR en la que se evaluó la expresión de ARNm de REST/NRSF, GRIA2 y GABRD (con respecto al gen endógeno ENO2) en el tejido hipocampal de autopsias y pacientes con ELTM. Para dicho análisis, se procedió a seleccionar los tejidos hipocampales de acuerdo con los criterios de inclusión y exclusión establecidos. De dichos tejidos se extrajo el ARNm y las proteínas para las posteriores evaluaciones de expresión. Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 43 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM 6.2 Expresión de REST/NRSF en pacientes con ELTM farmacorresistente y su asociación con variables clínicas y psiquiátricas. Como se ha descrito anteriormente, existen evidencias de la sobreexpresión de REST/NRSF en regiones límbicas de modelos experimentales de crisis convulsivas. Sin embargo, aún se desconoce si REST/NRSF también se sobreexpresa en el hipocampo de pacientes con ELTM. Por otra parte, estudios señalan que el hipocampo de sujetos con ELTM exhibe cambios que facilitan la actividad epiléptica y los trastornos psiquiátricos como ansiedad y depresión, mismos que se han asociado al decremento de REST/NRSF. Con base en lo anterior, se evaluó la expresión de ARNm (n=28) y proteína (n=18) de REST/NRSF en el hipocampo de autopsias y de pacientes con ELTM farmacorresistente. Dichos valores de expresión se correlacionaron con las variables clínicas y con la presencia de ansiedad y depresión comórbidas. 6.2.1.1 Características clínicas de las autopsias Se obtuvieron 13 hipocampos de autopsias, de los cuales 7 fueron masculinos y 6 femeninos. Los datos clínicos de las autopsias se presentan como promedios ± Error estándar de la media (EEM): edad 34.5 ± 3.2 años e intervalo postmortem (IPM) 15.58±0.88). Tabla 4. 6.2.1.2 Características clínicas de los pacientes con ELTM farmacorresistentes Se obtuvieron 28 hipocampos de pacientes con ELTM, de los cuales 15 eran masculinos y 13 femeninos. Todos los pacientes recibieron politerapia previo a la cirugía. Los datos clínicos de los pacientes fueron los siguientes (promedio ±EEM): edad de inicio de las crisis epilépticas, 13.3±2.05 años, duración de la epilepsia, 20.2±2.3 años, frecuencia de crisis epilépticas, 13.8±3.3 crisis por mes, y número de fármacos antiepilépticos (FAEs) durante el periodo prequirúrgico, 4.4±0.48 FAEs. La edad de los pacientes no fue significativamente diferente comparada con la de las autopsias (32±1.4 años, p>0.05) (Tabla 5). 6.2.1.3 Expresión de REST/NRSF en hipocampo de autopsias Los datos de expresión de ARNm de REST/NRSF relativa al gen endógeno ENO2, así como los datos de expresión proteica expresados como unidades arbitrarias de Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 44 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM densidad óptica relativos a la expresión de β-actina, para pacientes y autopsias, se presentan en la tabla 8. Tabla 8. Valores de expresión de ARNm y proteínas de pacientes y autopsias. Pacientes Autopsias #Paciente ARNm Proteína #Autopsia ARNm Proteína 200 0.07 1.00 1 0.09 0.39 206 0.25 -- 2 0.08 0.35 239 0.11 13.76 3 0.11 0.53 240 0.23 -- 4 0.14 1.19 241 0.10 3.50 5 0.14 0.75 242 0.11 19.09 6 0.09 1.06 243 0.34 0.88 7 0.10 0.70 244 0.45 10.55 8 0.05 4.38 271 0.19 -- 9 0.12 2.25 275 0.11 4.28 10 0.08 5.40 281 0.14 -- 11 0.11 3.96 282 0.03 4.67 12 0.09 4.70 316 0.57 14.15 13 0.18 0.42 324 0.28 -- 326 0.17 2.78 329 0.05 -- 339 1.18 12.26 345 0.25 -- 359 0.26 6.25 367 0.35 -- 369 0.11 0.79 371 0.20 9.31 386 0.09 10.43 408 0.65 11.36 413 0.22 7.09 417 0.33 -- 420 0.07 -- 424 0.35 2.58 Promedios ± EEM 0.26±0.0446 7.49±1.266 0.11±0.0101 2.01±0.526 EEM, Error Estándar de la Media Con base en los datos presentados se realizaron los análisis de correlación con las variables clínicas de los pacientes y las autopsias según corresponde (Tabla 9). Se determinó el coeficiente de correlación de Pearson (r), con el cual se evaluó la fuerza y dirección en la relación entre dos variables cuantitativas relacionadas de forma lineal (valores de expresión de ARNm y proteínas vs variables clínicas). Para determinar la fuerza, el r comprende valores entre +1 y -1, así, mientras más se aleje su valor del cero, Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 45 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM más fuerte será la relación entre las dos variables. La dirección es determinada por la tendencia de ambas variables a aumentar (+) o disminuir (-) de manera conjunta. Finalmente, el cálculo de la significancia (p-valor) permite determinar si el valor de r es causal o casual, de tal forma que su valor es significativo cuando se puede afirmar con cierta probabilidad (95% en nuestro caso) que es diferente de cero. Con base en lo anterior, se sabe que la integridad del ARNm puede verse afectada por un prolongado IPM (Birdsill et al., 2011). Sin embargo, no se encontró correlación significativa entre el IPM (rango de 10-20 h) del grupo de autopsias y los niveles de expresión de ARNm y proteína REST/NRSF (r=0.435, p>0.05; y 0.0704, p>0.05, respectivamente) (Tabla 9). Estos resultados indican que, bajo las condiciones experimentales planteadas, el rango de IPM de las autopsias no influyó en la expresión de REST/NRSF y por lo tanto los valores pueden ser usados como condición control. Tabla 9. Correlaciones entre la expresión de REST/NRSF y las variables clínicas Pacientes Autopsias Variables clínicas ARNm (r) Proteína (r) ARNm (r) Proteína (r) Edad (años) -0.257 -0.0974 -0.417 0.646* Edad de inicio de crisis (años) 0.134 -0.197 -- -- Duración de la epilepsia (años) -0.357 0.0445 -- -- Frecuencia de crisis (por mes) -0.122 0.658* -- -- Número de FAEs previos a la cirugía -181 -0.140 -- -- Intervalo Post-Mortem (horas) -- -- 0.435 0.0704 FAEs, Fármacos Antiepilépticos; ARNm, ácido ribonucleico mensajero. Valores de r son coeficientes de correlación de Pearson. *p<0.05 Un hallazgo importante es que la expresión proteica de REST/NRSF correlacionó positivamente con la edad de las autopsias (r=0.646, p<0.05) (Tabla 9, Fig. 10), lo cual significa que, bajo las condiciones experimentales planteadas, a mayor edad, mayor expresión proteica de REST/NRSF en hipocampo de autopsias. Este resultado está de acuerdo con un estudio previo que indica que la mayor expresión de REST/NRSF en la corteza prefrontal y el hipocampo de los sujetos normales se correlaciona con una buena conservación de las funciones cognitivas y la edad, una situación que se pierde en sujetos con enfermedad de Alzheimer (Lu et al., 2014). Por otra parte, se encontró que, bajo las condiciones experimentales planteadas, la edad no correlaciona con los niveles de expresión de ARNm (r=-0.417, p>0.05) (Tabla 9), lo cual sugiere que, en condiciones Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 46 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM normales el factor de transcripción se traduce de acuerdo con los requerimientos celulares, independientemente de los niveles de ARNm. Figura 10. Correlación de la edad con la expresión proteica de REST/NRSF en el hipocampo humano. La gráfica muestra la correlación en la expresión de proteína de REST/NRSF expresada como densidad óptica (DO) con la edad de las autopsias y los pacientes. Se observa que la correlación significativa encontrada en las autopsias no es evidente en pacientes con ELTM farmacorresistente. r indica el valor del coeficiente de correlación de Pearson. * p <0.05. Bajo las condiciones experimentales planteadas no se encontraron otras correlaciones significativas en autopsias. 6.2.1.4 Expresión de REST/NRSF en hipocampo de pacientes con ELTM farmacorresistente y su asociación con las variables clínicas y comorbilidades psiquiátricas A diferencia de las autopsias, en hipocampo de pacientes con ELTM hubo un incremento significativo en la expresión de ARNm (146%, p<0.01) y proteína REST/NRSF (273%, p<0.01) (Fig. 11), bajo las condiciones experimentales planteadas. Dicho incremento de este factor de transcripción puede ser consecuencia del aumento en los niveles de glutamato extracelular que se produce en los pacientes con ELTM (During y Spencer, 1993). El glutamato activa cascadas transduccionales como ERK y JNP/MAPK, lo cual resulta en la fosforilación y activación del factor de transcripción cAMP response element-binding (CREB) (Vanhoutte et al., 1999). Se sabe que CREB regula positivamente al gen REST (Kreisler et al., 2010), así que es posible que la activación crónica de CREB inducida en el hipocampo de pacientes con ELTM (Park et al., 2003) resulte en la sobreexpresión de REST/NRSF. Por otra parte, la sobreexpresión de REST/NRSF está asociada con la activación de la vía canónica WNT que resulta del incremento en los niveles de glutamato extracelular (Lutgen et al., 2016). En la vía WNT, β-catenina regula directamente al gen REST y a otros genes relacionados Años 0 10 20 30 40 50 60 P ro po rc ió n de D O (R E S T- N R S F/ A ct in a) 0 5 10 15 20 r = 0.646 r = -0.0974 * Autopsias Pacientes Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 47 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM con el control de las células progenitoras (Nishihara et al., 2003). De hecho, la sobreexpresión de β-catenina y otros efectores de la vía WNT están asociadas con neurogénesis aberrante del hipocampo en un modelo experimental de ELTM (Qu et al., 2017). Figura 11. Expresión de REST/NRSF en el hipocampo de autopsias y pacientes con ELTM farmacorresistente. A) La gráfica muestra la expresión del ARNm de REST/NRSF relativa al gen endógeno ENO2. B) Se muestran las imágenes obtenidas por western blot, mientras que la gráfica muestra los valores de densidad óptica (proporción de DO) con relación a la expresión de proteínas de REST/NRSF y β-actina. Una imagen representativa del gel completo, en el que se muestra la especificidad de las bandas, se muestra como Anexo 3. Los resultados se expresan como media ± EEM. T-test * p <0.05, ** p <0.01. A, autopsias (n=13) y P, pacientes (n=28). Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 48 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM Por otra parte, el peso molecular de la proteína REST/NRSF obtenido en pacientes fue de entre 180-200 kDa, el cual es mayor de los 150 kDa de las autopsias y predicho para las condiciones experimentales planteadas (Figura 11B). Dicha situación puede ser consecuencia de las modificaciones postraduccionales, siendo la glicosilación de O la principal causa del cambio en el peso molecular de las proteínas (Unal et al., 2008, Gross et al., 1989). Al respecto, se ha reportado que la isoforma REST/NRSF 4 es O-glicosilada entre los residuos 87 y 152 (Lee et al., 2000), mismos que se encuentran en todas las isoformas de REST/NRSF. Además, existe evidencia experimental que demuestra la inducción de modificaciones postraduccionales asociados a epileptogénesis y actividad convulsiva. Se ha demostrado que la inducción de crisis convulsivas con ácido kainico en ratas, aumenta la carbonilación (adición de grupos funcionales que contienen monóxido de carbono) y disminuye la O-β-N-acetilglucosaminación (adición de β-N- acetilglucosamina en los residuos de serina y treonina) de proteínas hipocampales (Hartman, 2013, Sanchez et al., 2019) con lo cual se modifican las propiedades fisicoquímicas de las mismas. Futuros estudios deberán ser conducidos para determinar los mecanismos postraduccionales específicos de la fisiopatología de la ELTM humana y que podrían afectar directamente a REST/NRSF. Se ha observado en un modelo animal que la inducción de crisis convulsivas produce un incremento en los niveles de expresión de REST/NRSF, los cuales regresan a sus niveles basales 24 h después (Spencer et al., 2006). El análisis de correlación entre los niveles de expresión obtenidos y las variables clínicas mostró que la alta frecuencia de crisis está asociada con la alta expresión proteica de REST/NRSF en el hipocampo de los pacientes en estudio (r=0.658, p<0.05) (Tabla 9, Fig. 12). Ya que la liberación de glutamato incrementa con cada crisis epiléptica (Haglid et al., 1994), es posible sugerir que el incremento en la frecuencia de eventos convulsivos mantiene elevada la expresión de REST/NRSF, ya sea por un mecanismo mediado por CREB y/o por β-catenina. La correlación positiva encontrada en el grupo de autopsias entre la expresión proteica de REST/NRSF y la edad, no se presenta en los pacientes con ELTM de este estudio (Tabla 9, Figura 10). Lo cual sugiere que los cambios en la expresión de REST/NRSF son debidos a los cambios fisiopatológicos propios de la ELTM. Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 49 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM Figura 12. Correlación entre la frecuencia de las crisis epilépticas y la expresión de proteína de REST/NRSF en el hipocampo de pacientes con ELTM farmacorresistente. La gráfica muestra la correlación entre la expresión de proteínas de REST/NRSF expresada como densidad óptica y la frecuencia de las crisis epilépticas por mes. r indica el valor del coeficiente de correlación de Pearson. * p <0.05. Los datos clínicos muestran que de los 28 pacientes con ELTM, 13 presentan comorbilidades psiquiátricas. 3 pacientes presentan ansiedad, 5 tienen depresión y 5 presentan ansiedad y depresión (Tabla 5). Los pacientes con ELTM y comorbilidades psiquiátricas presentaron sobreexpresión de REST/NRSF, tanto a nivel de ARNm (55% vs autopsias, p<0.05), como de proteínas (148% vs autopsias, p>0.05). Mientras tanto, en hipocampo de los 15 pacientes que tenían ELTM sin desórdenes psiquiátricos la sobreexpresión de REST/NRSF fue más evidente tanto a nivel de ARNm (171% vs autopsias, p<0.001) como de proteína (230% vs autopsias, p<0.001) (Fig. 13). Expresión de ARNm Ex pr es ió n re la tiv a de A R N m de R ES T/ N R SF 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 Sin Ans/Dep Con Ans/Dep **** Autopsias Expresión proteica Pr op or ci ón d e DO (R ES T- NR SF /A ct in a) 0 2 4 6 8 10 12 Sin Ans/Dep Con Ans/Dep Autopsias *** * Figura 13. Expresión de REST/NRSF en el hipocampo de pacientes con ELTM farmacorresistente con y sin ansiedad y depresión comórbidas. Las gráficas muestran la expresión de ARNm (izquierda) y proteína (derecha) de REST/NRSF en autopsias, pacientes con ELTM sin trastornos del estado de ánimo y pacientes con ELTM y ansiedad y depresión comórbidas. Los resultados se expresan como media ± EEM. Prueba post hoc ANOVA y Dunn-Sidak. * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001. Crisis epilepticas/mes 0 10 20 30 40 50 60 P ro po rc ió n de D O (R E S T- N R S F/ A ct in ) 0 10 20 30 40 r = 0.658* Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 50 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM Estos resultados correlacionan con un estudio previo en donde se demuestra que el incremento de REST/NRSF está asociado con la reducción de los síntomas psiquiátricos asociados al estrés (Ashton et al., 2017). Por otra parte, la regulación mediada por CREB, también podría estar jugando un papel importante, ya que se ha demostrado que dicho factor de transcripción, tanto en su forma fosforilada como nativa, está disminuido en varias estructuras cerebrales de sujetos con ansiedad y depresión (Pandey et al., 2003, Barrot et al., 2005, Yamada et al., 2003). En contraste, la inducción transcripcional de CREB en el hipocampo de ratones tiene un efecto antidepresivo y ansiolítico (Chen et al., 2001), a la vez que el tratamiento con antidepresivos lleva al incremento en la expresión de CREB (Wallace et al., 2009, Dowlatshahi et al., 1998). Además, se sabe que la administración crónica de antidepresivos modifica también la expresión de múltiples componentes de la cascada de Wnt/β-catenina en hipocampo, incluido un aumento de WNT2, un subtipo de Wnts (Okamoto et al., 2010). En nuestro grupo de pacientes no se encontraron correlaciones significativas entre la expresión de REST/NRSF y otras variables clínicas (Tabla 9). Ninguna condición clínica correlacionó con la sobreexpresión de REST/NRSF con y sin trastornos del estado de ánimo. Estos resultados demuestran que, bajo las condiciones experimentales planteadas, tanto el ARNm y la proteína de REST/NRSF se incrementan en pacientes con ELTM. Sin embargo, la unión de dicho factor de transcripción a sus secuencias consenso en el ADN, puede ser independiente de los niveles de expresión. Con base en esto se evaluó la unión de dicho factor de transcripción a la secuencia RE1 en el promotor de genes blanco relacionados con la fisiopatología de la ELTM. 6.3 Unión de REST/NRSF a la secuencia ER1 en el promotor de los genes GRIA2 y GABRD Tras determinar que REST/NRSF está sobreexpresado en hipocampo de nuestro grupo de pacientes con ELTM, es importante evaluar el papel de dicha sobreexpresión sobre la regulación de genes que participan activamente en los procesos fisiopatológicos de este tipo de epilepsia. Genes como GRIA2 (gen que codifica para la subunidad GluR2 de los receptores AMPA) y GABRD (gen que codifica para la subunidad δ de los receptores GABAA) están involucrados en procesos relacionados con excitabilidad e inhibición y poseen sitios RE1 en sus secuencias promotoras. Con base en lo anterior, se determinó por primera vez en tejido humano, la unión de REST/NRSF a las secuencias Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 51 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM RE1 localizadas en el promotor de los genes GRIA2 y GABRD. También se evaluaron las diferencias en la unión de REST/NRSF a la secuencia RE1 de dichos genes, en hipocampo de autopsias y pacientes con ELTM. Para ello se realizó inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), la cual permite evaluar la asociación de cualquier proteína con una secuencia específica de ADN mediante el uso de un anticuerpo contra la proteína de interés. La ChIP se realizó de acuerdo con el siguiente procedimiento: 6.3.1.1 Identificación de las secuencias RE1 en los promotores de GRIA2 y GABRD en corteza cerebral de autopsia Como se ha descrito anteriormente, REST/NRSF se une a los sitios RE1 en las regiones promotoras de sus genes blanco (Roopra et al., 2001). Partiendo de la secuencia canónica antes descrita, se evaluaron dos sitios RE1 hipotéticos para los genes GRIA2 y GABRD en corteza cerebral de autopsia (Figuras 8 y 14). La secuencia 2 del gen GRIA2 mostró resultados positivos a la amplificación, mientras que para GABRD fue la secuencia 1, es decir, solo un sitio en cada gen fue positivo para la unión de REST/NRSF (Figura 14A). Estos datos correlacionan con estudios in vitro en los que se ha demostrado que REST/NRSF se une a la secuencia RE1 del gen GRIA2 (Myers et al., 1998) y GABRD (Schoenherr et al., 1996). Cada uno de los 21 nucleótidos de la secuencia canónica muestra una contribución diferencial para la unión de REST/NRSF. En dicha secuencia, las posiciones 2 a 9 y 12 a 17 son las que presentan menos variaciones y por lo tanto se les considera posiciones centrales (Figura 14B) (Wu y Xie, 2006). A pesar de presentar variaciones en dichas posiciones centrales, los sitios RE1 correspondientes a la secuencia 2 del gen GRIA2 y a la secuencia 1 del gen GABRD mostraron una homología del 80.1 % y 76.2 % respectivamente (Figura 14B). Al respecto, se ha reportado que en neuronas menos del 10% de los sitios RE1 son 100% homólogos con la secuencia canónica, la mayoría solo presenta fragmentos de dicha secuencia (Rockowitz et al., 2014). Por otra parte, varios estudios de genoma completo han analizado el sitio RE1 y han identificado diversos sitios de unión de REST/NRSF con nucleótidos variables. Estas variaciones son determinantes ya que de ello dependen las afinidades de unión y por lo tanto la predilección de los factores de transcripción por una secuencia en particular (Wu y Xie, 2006, Schoenherr et al., 1996). Al respecto, es importante notar que estas posiciones determinantes se pierden en las secuencias de los primers que no amplificaron tanto de GRIA2, como de GABRD. Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 52 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM Figura 14. Determinación de los sitios RE1 de los promotores de los genes GRIA2 y GABRD. A) Amplificación de los dos sitios RE1 hipotéticos. Solo la secuencia 2 del gen GRIA2 fue amplificada, mientras que para el gen GABRD fue la secuencia 1. B) Secuencias nucleotídicas de los sitios RE1. En la caja amarilla se muestra la secuencia canónica de los sitios RE1. La N en rojo indica que puede variar el nucleótido de esta región. En la caja morada se muestran las secuencias de los dos sitios RE1 hipotéticos para el gen GRIA2, mientras que las del gen GABRD se muestran en la caja rosa. Las secuencias positivas a la unión de REST/NRSF se muestran en azul y las negativas en verde. En todas secuencias se señala el porcentaje de homología con respecto a la secuencia canónica y en amarillo los nucleótidos que varían con respecto a dicha secuencia. Las flechas de color marrón indican el sentido de “lectura” por parte de REST/NRSF. Bajo las condiciones experimentales planteadas, la localización genómica de la secuencia RE1 del gen GRIA2 se encontró en la región 3, banda 2 y subbanda 1 del brazo largo (q) del cromosoma 4 (4q32.1). Su ubicación está comprendida entre 157220826- 157220847 del cromosoma 4 (Homo sapiens chromosome 4, GRCh38.p12 Primary Assembly) y en la posición +160 del gen, es decir, en el primer intrón. Con respecto a la localización genómica de la secuencia RE1 del gen GABRD, se encontró en 1p36.33. Su ubicación está comprendida entre 2016159-2016180 del cromosoma 1 (Homo sapiens chromosome 1, GRCh38.p12 Primary Assembly) y en la posición -3150 del promotor de GABRD (Figura 15). GABROD - 1p36.33 2015818 5'- TAGGAGCACACACCCCATCTCAAACGGGGAGACTTCCATTGATGGAGATCGGCCTTGTTACTGATTGTGAAAACCTCACCAGAGCCTCGTT CGGAGGGTGGGTTCTCCCACAGGACAGGAGATGGGGCATAACCTCCAGTATTCCCCAGAGAGCGGGCAGCCCAGGTCTCTGCAAAGTGGGT AGTCACTGTCAAACAAAACAACCTGAGACGCTTTCTAACAGAGTTCAGCACTTCTGACACTAAGAAAACCAATCACGACTCTCACCCTGTC Primer Fordward 2016169 2016180 ATTTTGTAAAAGAAGAAAACAAAACTGGGAAATAACTTCGCTGAGGTCACACGGCCAGTTTGGAGCAGAGCTGGGACTGGCACCCAGACCT Sitio RE1 (Sitio 1) CTGACTCCTGGAGCTCTTCCCAGATTCTTGAAAGGGGCCAAGAAGTGAGCTGCTTCCATCTCATGGGCACAGAAACTCCCTGTCCTGGGGC Primer Reverse TCACATCCACCAGGTGCCAGCCACACAGGCCCCAGTCACACAGGCCCCGGCTCCTGACCCCTGGGCCAGGCTGCTCCCCGGCTGGCCTTCC TGGTGCTGGCGTGGTCGGAGCTTCCCTGGGTGGAGGATGAGGCTAAGGAAGCCGACTGGTTATGCACATCACAATGGGATGGAAGTTCGGA AATGGCAACAAACTAATTCTCAAAAACCTTGAAAAAGAAATTATGAAAATTCCCGTTCTTCAGATCCAAACTGAAACATCAGTTAGGAGGC CGGGTGTGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGATGTGGGCCGATCACTTGAGGTCAGGAGTTCGAGACCAGCCTGGC CAACATGGTGAAACCCTGTCTCTACTAAAAATACAAAAATTAGCTGGGCATGGTCGCAGGCGCCTGTAATCCCAGCCACTTGGGAGGCTGA GGCAGGAGAATTGCTTGAACCCAGGAGGTGGAGGTTGCAATGAGCTGAGATAGTGCCACTGCCCTCCGGCCTAGGCAACAAGAGCGAAACT CCATCTCAAAAACAAAAAAGAAAGAAAGAAAGAAAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGACCAGTTAGGAACAATAAAGAATGGAAATGAAGTGTG CAGACTTCAAACCTTGCAGAAACCTGTGAATGATGGATGGGACATGCATTTGCCTCTAGGACTGAAGGAAGAGGAGACAATTTGATGCCAC CAAACCACCAGATATTTGGCTAAGATGCCCGCCCAGCTTCAACTGACATACACACAACAGCACGACTTTCCAGCAAAAGTTCAACATTGGC TGGGCACGGAGGCTCATGCCTGCAATCTCAGCACTTTGGGAGGCCACGGGGGAGGATCCCTTGAGGCCAGGAGTTTGAGACCAGCCTGGGA AACATAGTGAGACCCCATCTCTACAAAAAATAGAAAATTATCTGGGTGCAGTGACATGCCTCTGTGGTCCCAGCTCCTCCAGAAGCTGAGG TGCAAGGATCCCTTGAACCCGGGAGGTGGAGGCTACAGTGAGCTGAGATCGTGCCACTGCACTCCAGCCTGGGCCACAGAGCAAGACCTTG TCTCTTAAAAGAAAAAGAAGAAAATTGAATGTTAATTTTATGCCCCAGATAATAGAGGAGCGTGAAGAAAATGGCAATAGGGTGTGGCTTA TCCTGAATGAATCGGATCCAGTGAGTCAAGATCAACGCTGCTTCTCAGAGGTGATCAGCACCAAGATATCCTCAGATAAGCTCTTCGCAGA TATTGAAGGGATTGCGACCATGAACCACTCTCACTGCTTAGTTCCAAAGCTCAGGAAGGAAAGACAGGGAGGGCGGGGCACTGTCCGGAGG CAGTGATGGCGTGCTGGCCGCAGTGGGTGCATGGACTTTGCAGATGTGGAGTCTGCACCTCCTCCTACATTTGCTGAGCACCTACTTCATC CAATACACCACCAAGGAGAAGACGGACAAGACCCCTGTTCTGGAGGGGGAAGAATAAAAATAATGCCTCTCACCGGGGGCCGGGCCAAGCT CTGGGCACCTCTTCATGAATTAACTCCTAAATTAATCCATGGAAGGGACACGTGGGAAGGGGCACGTGTGCAGAGCACAGGCTCGGACAGG AACCCCGGGAACACAGGGAGGTCAGTGCTTCTGTACCCAAAGGACCCCTCTCGGCAGGGGCCAGTGAGCAGCCGGGAAGGGGGCCTTGGAG TTGAGACCTGTTGGGCTTGTTAGAGCCCCGTTCCTTGATTTAAGAAAGCAGGCTAGGGCTGGGTGCAGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGC ACTTTGGGAGGCCGAGGCGGGCGGATCACGGGGTCAGGAGTTCGAGACCAGCCTGGCCAACATGGTGAAATTCCGTCTGTACTAAAGATAC AAAAAAATAACCGAGCGTGGTGGCAGGTGCCTGTAATCCCACCTACTCGGGAAGCTGTGGCAGGAGACTTGCTTGAACCTGGGAGGCAGAA GTTGCAGTGAGCCGAGATTGTGCTCCAGCCTGGGTAACAGAGCCAGATTCCATCTCGAAAAATAACATAACATAACATAACATAACATAAC ATAACATAACATAACATAACATAACATAAATAAAGCAAGCAAACTGGAACCAGCCTCATTCTTCCACTTCCCACAGTAGGGATTGGGCTGG AAATTCCGAAGCAAATCCCTCTCTGCACTTTCCTCCACCTGCCCCTGTGCGGCCAGGGCCCTTCATCCAGAAGCACGCAGCCTCGGGGACA GCTTCGCCATTTTTAAGTGTTTTCACGAGGGGTTGACACTGTGCTGTCAGCGACATCGCGAGCCCAGAAGTGAATAACTGACACAACAATG ATTAAAGTTTGTGAGCAGCTTCAGGAAATGGCAGCGCAACTTTATGTTCAAAAGATCCAAGGCAGGAGAGTGTGAGGCCTTCCCTTTCCCA GATCCTAGGGGTGTGGAGGGCGGGCCTGGGGCCATGAGAGGTGTGGAGAGTCAGAACTGCGGCCTGCGGCGCAGCCCCCACCTGCTTTTCC TCTCCCCGCCCCCGTCOCGAGGGTCCCCAGGGATCAGGACTTGCTCCCAAAGTCGCOCTGGCCCCAGCTCCCGCGAAGGCAGGAGGGTTTTGGA AGCAGCCGCTGGTGGGGGTCTCTCTCCTGACAGCTGCAGGGACTGGCCCCCTCCCCACCCACCGCCGGCGCAGCCAGAAGCAGCCACGCAG ACGTGCGACCCCCCACAAACCGCCTCGGGACGAGGTTCTGCCGCGCCCGTGGGCCACAGTGTCCACGCGGGGCTTGTGCCGGTGTCGCCTC CCATGAAGACACCCGGAGGGTCCCGTCTGCGGCGCGTGAGGGCAGCGGTCCCGGAGAGCCAGACCCCGGCCAGGGAGAGCTGCCCGCGAGG GAGGGGGCGCGGCTGGCGGAGGGGGGCGGGATGGGGCGGGGGGCGGGGGGAGGAGAGGGGAGCGGCGGGCGGGGCCGGGCTGCAGGGAGCG Pe UF E EE E005 5505 E Inicio COTGTGCGGCCGCCGGGAGCCAAGTTTGCGCGGACCCCGTCCCGAGCCCGCCGCGGCCATGGACGCGCCOCGCCCGGCTGCTGGCCCCGCTC 2019535 CTGCTCCTCTGCGCGCAG : Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 53 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 54 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM Figura 15. Localización de las secuencias RE1 en los genes GRIA2 y GABRD. La secuencia de arriba muestra el sitio RE1 del gen GRIA2 en la posición +160 (caja gris) y en la posición 2016159 del cromosoma 1. La secuencia de abajo muestra la localización de la región RE1 en el sitio -3150 del promotor de GABRD (caja gris) y en la posición 157220826 del cromosoma 4. En ambos casos, el sitio de inicio de la transcripción se muestra con una caja azul y los sitios de hibridación de los cebadores utilizados para el ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP). Al respecto, se ha descrito que, en diferentes tipos de células, incluyendo neuronas, los sitios RE1 se pueden localizar en diversos sitios del genoma. Si bien, la mayor parte se concentra en las regiones promotoras de los genes, también se encuentran en intrones, exones, regiones intergénicas y sitios distales (Rockowitz et al., 2014, Johnson et al., 2007). 6.3.1.2 Unión de REST/NRSF a las secuencias promotoras de GRIA2 y GABRD en hipocampo de autopsias y pacientes con ELTM. Tras haber determinado los sitios RE1 en los promotores de los genes GRIA2 y GABRD en tejido cortical humano, se evaluó la unión de REST/NRSF en tejido hipocampal de nuestros grupos de autopsias y pacientes con ELTM. Considerando al input como el 100%, para GRIA2 se encontró que en autopsias hay un 2.5% de unión, mientras que en pacientes es del 5.87% (Figura 16). Es decir, el enriquecimiento de REST/NRSF sobre la región RE1 es 3.37% mayor en pacientes que en autopsias. Con respecto a GABRD se encontró que en autopsias hay un 4.37% de señal y en pacientes un 11.48% (Figura 16), lo cual indica que en pacientes el enriquecimiento es 7.11% mayor Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 55 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM que en autopsias. El incremento en la expresión de REST/NRSF demostrado previamente (Figura 11) podría estar asociado con el enriquecimiento en los sitios RE1 de los genes GRIA2 y GABRD. Dicho incremento parece suponer una mayor disponibilidad del factor de transcripción para unirse a las secuencias RE1 en los genes blanco. A pesar de que la expresión proteica de REST/NRSF se incrementó con la edad en nuestro grupo de autopsias (Figura 10), los niveles son bajos en cerebro maduro (Lu et al., 2014). Estos niveles bajos de REST/NRSF indican que la disponibilidad para unirse a los promotores es menor. Sin embargo, un estudio en ratas neonatales normales ha demostrado que cuanto más maduras son las células hipocampales hay una mayor especificidad de unión de REST/NRSF al sitio RE1 de GRIA2. Dicha especificidad de unión no cambia con situaciones estresantes como la deprivación maternal (Rodenas- Ruano et al., 2012). Es decir, en neuronas normales adultas, a pesar de los bajos niveles de REST/NRSF, su especificidad de unión al sitio RE1 de GRIA2 es alta y se mantiene constante incluso en situaciones estresantes. Por lo tanto, el enriquecimiento en GRIA2 de autopsias puede ser considerado como la unión basal de REST/NRSF al sitio RE1. Por otra parte, si bien no existen estudios que avalen el enriquecimiento basal en GABRD en autopsias, es posible considerar que la especificidad y disponibilidad de unión de REST/NRSF a un sitio RE1 sea similar en el en mismo tejido (hipocampo) y bajo el mismo microambiente. Nuestros resultados sugieren que el sitio RE1 del gen GRIA2 de nuestros pacientes con ELTM farmacorresistente tienen un mayor enriquecimiento de REST/NRSF con respecto a nuestro grupo de autopsias. Estos resultados están son similares a lo encontrado en células humanas de gliomas en donde se observó el enriquecimiento de REST/NRSF en el sitio RE1 del gen GRIA2 (Ekici et al., 2012). También en modelos experimentales de isquemia, se observó el incremento de REST/NRSF en la región CA1 del hipocampo y el enriquecimiento de este factor en el sitio RE1 del gen GRIA2 (Noh et al., 2012, Calderone et al., 2003). Además, un estudio in vitro demostró que una vez que REST/NRSF se une a su secuencia consenso en el gen GRIA2, recluta correpresores como Sin3A y HDACs con lo cual lleva cabo la represión transcripcional (Huang et al., 1999). Por otra parte, un estudio mostró que en células neuronales y neuroendocrinas REST/NRSF no regula a GRIA2 debido al microambiente represivo que rodea a la cromatina (Hohl y Thiel, 2005). Con base en este estudio, es posible sugerir que la ELTM induce un microambiente no represor de la cromatina y que debido a ellos REST/NRSF puede unirse a RE1 de GRIA2. Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 56 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM Figura 16. Unión de REST/NRSF a las secuencias RE1 de los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de autopsias y pacientes con ELTM. Las gráficas muestran el porcentaje de enriquecimiento de REST/NRSF sobre la región RE1 de los genes GRIA2 (arriba) y GABRD (abajo), tanto para autopsias y pacientes con ELTM. También se muestran los porcentajes de enriquecimiento al inmunoprecipitar la cromatina con anti-RNA Pol II (control positivo) y anti-IgG (control negativo). El input es el ADN total, por lo que su amplificación se considera el 100%. Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 57 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM La unión de REST/NRSF a sitios RE1 del gen GABRD ha sido menos estudiado. Algunos estudios señalan la presencia de sitios RE1 en el gen GABRD de rata y mediante estudios in vitro se ha demostrado la unión de REST/NRSF a los mismos (Schoenherr et al., 1996, Mu y Burt, 1999). Más recientemente en un ensayo in silico de alineamientos se mostró que dichas secuencias están conservadas en el humano (Joyce, 2007). Estos datos, están de acuerdo con nuestros resultados, los cuales mostraron que, en nuestro grupo de pacientes, el sitio RE1 del gen GABRD tiene un mayor enriquecimiento de REST/NRSF en pacientes con ELTM que en nuestro grupo de autopsias. Se ha demostrado que, bajo las condiciones experimentales planteadas, el ARNm y proteína de REST/NRSF están sobreexpresados en pacientes con ELTM y que dicho incremento correlaciona con el porcentaje de unión a los sitios RE1 en los genes GRIA2 y GABRD. Sin embargo, un estudio ha reportado que incluso cuando hay un match perfecto con el sitio RE1 canónico, la unión de REST/NRSF podría ocurrir de manera aleatoria y por lo tanto no necesariamente implica que sea funcional (Bruce et al., 2004). Con base en lo anterior, es importante determinar que la unión de REST/NRSF a los sitios RE1 de los genes GRIA2 y GABRD no sea un hecho aleatorio. Así, cabría esperar que los niveles transcripcionales de dichos genes se encuentren disminuidos como consecuencia de la sobreexpresión de REST/NRSF y el incremento en su unión a los sitios RE1. Al respecto, fue necesario evaluar los niveles de expresión de ARNm y proteína de GluR2 y GABAAδ. 6.4 Expresión transcripcional de GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con ELTM y su asociación con la sobreexpresión de REST/NRSF Además de demostrar la sobreexpresión de REST/NRSF en hipocampo de pacientes con ELTM, nuestra evaluación experimental sugiere que dicho incremento podría estar asociado con un mayor enriquecimiento de este factor a sus secuencias RE1 en los genes GRIA2 y GABRD. Sin embargo, la unión de REST/NRSF a sus secuencias consenso no garantiza que sea parte de un mecanismo transcripcional funcional. Con base en lo anterior, fue importante evaluar la actividad transcripcional de los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de autopsias y pacientes con ELTM. Para ello, en nuestros grupos de pacientes y autopsias, se evaluaron los niveles de expresión de ARNm de GluR2 y GABAAδ mediante retrotrascripción seguida de PCR en tiempo real y se asociaron con el enriquecimiento de REST/NRSF en los respectivos genes. La expresión de ARNm de Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 58 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM GluR2 y GABAAδ se correlacionó con las variables clínicas y con las comorbilidades psiquiátricas. Para la evaluación de los niveles de expresión de ARNm de GRIA2 y GABRD se tomaron las muestras de 13 hipocampos de autopsias y 28 hipocampos de pacientes con ELTM descritos previamente en las secciones 5.2 a 5.5. En dichas secciones se describen también los datos clínicos y demográficos de las autopsias y los pacientes. Bajo las condiciones experimentales plateadas, no se encontraron correlaciones significativas entre el IPM de las autopsias y los niveles de expresión de ARNm de GluR2 (r=0.238, p>0.05) y de GABAAδ (r=-0.0609, p>0.05) (Tablas 10). Estos resultados indican que el IPM no afectó la integridad del ARNm de las autopsias y, por lo tanto, los valores de expresión son viables para ser usados como controles. Tabla 10. Correlaciones entre los niveles de ARNm de GluR2 y GABAAδ con las variables clínicas de las autopsias y pacientes con ELTM FAEs, Fármacos Antiepilépticos. Los valores son coeficientes de correlación de Pearson (r). *p<0.05 Los resultados mostraron que, en comparación con el grupo de autopsias, en hipocampo del grupo de pacientes con ELTM, los niveles de ARNm de GluR2 y GABAAδ disminuyen un 36.2% (p<0.05) y un 28.3% (p<0.05) respectivamente (Figura 17). Estos datos, junto con el incremento en la unión de REST/NRSF a los sitios RE1 asociado a su sobreexpresión, sugieren que dicho factor podría estar participando en el silenciamiento transcripcional de los genes GRIA2 y GABRD en pacientes con ELTM (Figura 17). Con respecto a GluR2, son varios los estudios que reportan el decremento en los niveles de ARNm en hipocampo de modelos experimentales de crisis convulsivas asociado a la pérdida neuronal (Grooms et al., 2000, Huang et al., 2002, Friedman et al., 1994, Friedman, 1998). El mecanismo de represión transcripcional de GluR2 está influenciado por los diversos elementos regulatorios encontrados en la región 5’ proximal GluR2 GABAAδ Variables clínicas Autopsias Pacientes Autopsias Pacientes Edad (años) -0.574* -0.483* 0.0696 -0.0356 Edad de inicio de crisis (años) -- -0.105 -- -0.0895 Duración de la epilepsia (años) -- -0.232 -- 0.0213 Frecuencia de crisis (por mes) -- -0.448* -- -0.443* Número de FAEs previos a la cirugía -- -0.187 -- -0.142 Intervalo Post-Mortem (horas) 0.238 -- -0.0609 -- Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 59 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM del promotor, en el cual se encuentra una zona rica en CpGs propensa a ser metilada, así como el sitio RE1 para la unión de REST/NRSF (Myers et al., 1998, Huang et al., 1999, Huang et al., 2002). La represión transcripcional ejercida por REST/NRSF ya se ha demostrado en diversos modelos in vitro, así como en modelos experimentales de isquemia y de daño excitotóxico neuronal (Noh et al., 2012, Myers et al., 1998, Jia et al., 2006). Además, se ha reportado que la represión transcripcional de GluR2 por parte REST/NRSF es mediada por los factores neurotróficos BDNF y GNDF (Brene et al., 2000). Se ha demostrado que una vez que REST/NRSF se une a su secuencia consenso en el gen GRIA2, recluta correpresores como Sin3A y HDACs con lo cual lleva cabo el silenciamiento génico (Huang et al., 1999). Por otra parte, existe un estudio que muestra que los niveles de ARNm de GluR2 (evaluado mediante southern blot) no cambian en pacientes con ELT (Grigorenko et al., 1997). Figura 17. Expresión de ARNm de GluR2 y GABAAδ en hipocampo de autopsias y pacientes con ELTM farmacorresistente. Las gráficas muestran la expresión relativa de ARNm de GluR2 (izquierda) y de GABAAδ (derecha). Los resultados están expresados como media ±EEM. T-test * p <0.05. Con respecto a GABAAδ, en un modelo experimental de epileptogénesis se demostró la disminución de los niveles de ARNm desde antes que ocurrieran crisis espontáneas (epilepsia) (Joshi et al., 2017). Dicha disminución en los niveles de ARNm de GABAAδ también se observa en pacientes con esquizofrenia (Maldonado-Aviles et al., 2009). En el mecanismo de represión transcripcional de GABAAδ participan diversos elementos regulatorios, tal como regiones ricas en CpG propensas a ser silenciadas por metilación, así como deficiencia de cajas TATA y CCAAT canónicas (Sommer et al., 1990b). Además, un análisis in vitro demostró una débil represión transcripcional de Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 60 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM GABAAδ mediada por REST/NRSF al unirse al sitio RE1 en la región regulatoria del promotor de GABRD (Schoenherr et al., 1996). Una vez que REST/NRSF se une a los sitios RE1 a través de su dominio de dedos de zinc, recluta a otros factores represores. En el extremo -N terminal recluta a Sin3A y Sin 3B, los cuales son necesarios para reclutar HDACs, mientras que en el extremo -C terminal recluta a CoREST, un componente de los complejos HDAC (Roopra et al., 2001). 6.4.1 Correlación entre los niveles de ARNm de GRIA2 y GABRD con las variables clínicas y la sobreexpresión de REST/NRSF El análisis de correlación reveló que, bajo las condiciones experimentales planteadas, la expresión de ARNm de GluR2 disminuye con la edad tanto en autopsias (r=-0.574, p<0.05) como en pacientes con ELTM (r=-0.483, p<0.05) (Figura 18, Tabla 10). Figura 18. Correlación de la edad con la expresión de ARNm de GluR2 en hipocampo de autopsias y pacientes con ELTM farmacorresistente. La gráfica muestra las correlaciones entre la expresión relativa de ARNm de GluR2 con respecto a la edad de las autopsias (puntos y línea naranja) y de los pacientes (puntos y línea morados). r indica el valor del coeficiente de correlación de Pearson. * p <0.05. En autopsias estos datos correlacionan con un estudio previo en que se demostró que en ratones hay un incremento gradual de ARNm de GluR2 en etapas tempranas del desarrollo el cual disminuye en la etapa adulta (Pandey et al., 2003). Además, es importante notar que estos resultados son inversamente proporcionales a los niveles proteicos de REST/NRSF asociados a la edad de las autopsias (Figura 10, Tabla 9) y que dicho factor se une a su secuencia RE1 en el gen GRIA2 (Figura 16). Consideremos que los factores de transcripción son elementos de naturaleza proteica que regulan el proceso transcripcional (Aerts, 2012). Por lo tanto, es de esperarse que el incremento de la proteína Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 61 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM REST/NRSF, un factor de transcripción represor conlleve a una disminución en los niveles de ARNm de GluR2 y otros genes blanco. En cuanto a los pacientes, no hay evidencia que relacionen a la edad con los niveles de ARNm de GluR2, sin embargo, nuestros resultados parecen sugerir un efecto conjunto entre la edad y la sobreexpresión de REST/NRSF. Es decir, aunado al efecto represor de REST/NRSF, cuya sobreexpresión parece ser un proceso propio de la ELTM e independiente de la edad (Figura 10, Tabla 9), están los mecanismos que de manera normal inducen el decremento en el ARNm de GluR2 asociado al envejecimiento. Por otra parte, es importante considerar que GluR2 es un factor asociado con la respuesta al estrés oxidativo y por tanto asociado a los procesos de envejecimiento (Patel y Li, 2003). Dicha situación no ocurre con GABAAδ, el cual de manera normal tiene una baja expresión en el hipotálamo (una zona de respuesta al estrés) y, por lo tanto, no se considera un factor fundamental en el proceso de envejecimiento (Whissell et al., 2015). Con base en lo anterior, era de esperarse que, bajo las condiciones experimentales planteadas, nuestros resultados no muestren correlación significativa entre los niveles de ARNm de GABAAδ y la edad de autopsias y pacientes. El análisis de correlación mostró que, bajo las condiciones experimentales planteadas, a mayor frecuencia de crisis epilépticas los niveles de ARNm de GluR2 y GABAAδ disminuyen (r=-0.448, p<0.05 y r=-0.443, p<0.05, respectivamente) (Figura 19, Tabla 10). Estos resultados son inversamente proporcionales a los niveles proteicos de REST/NRSF asociados a la frecuencia de crisis (Figura 12, Tabla 9). Por lo tanto, es de suponer que, si la ocurrencia de las crisis epilépticas conlleva a un incremento proteico de REST/NRSF, los niveles de ARNm de GluR2 y GABAAδ disminuyan en función de dicho incremento, sobre todo, teniendo en consideración que el incremento en la expresión de REST/NRSF también se asocia con una mayor a unión a las secuencias RE1 de GRIA2 y GABRD (Figura 16). Al respecto, en un estudio previo en ratones, se determinó que la expresión de GluR2, como marcador de células musgosas glutamatérgicas, disminuye con la frecuencia y duración de las crisis convulsivas (Hester y Danzer, 2013). Dichos resultados no concuerdan con un estudio similar realizado en ratones, en el cual no encontraron correlación significativa entre la expresión de GluR2 y la frecuencia de crisis (Buckmaster et al., 2017). Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 62 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM Figura 19. Correlación entre la frecuencia de crisis epilépticas y la expresión de ARNm de GluR2 y GABAAδ en pacientes con ELTM farmacorresistente. Las gráficas muestran la correlación entre la expresión relativa de ARNm de GluR2 (arriba) y GABAAδ (abajo) y el número de crisis epilépticas por mes. r indica el valor del coeficiente de correlación de Pearson. * p <0.05. Por otra parte, no existen evidencias previas que asocien directamente la expresión del ARNm de GABAAδ con la frecuencia de crisis epilépticas. En un estudio se evaluó el efecto de ganaloxona, un neuroesteroide agonista de los receptores GABAA Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 63 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM extrasinápticos, el cual a dosis altas se une a los receptores que poseen la subunidad δ. La administración de ganaloxona a pacientes con espasmos infantiles redujo la frecuencia de crisis en al menos el 50% en un tercio de los pacientes (Kerrigan et al., 2000). En otro estudio en ratones evaluaron el efecto de los neuroesteroides derivados de la progesterona en el ciclo ovárico, demostrando que en la fase de diestro (altos niveles de progesterona), la expresión de los GABAAδ aumenta y la latencia de las crisis se incrementa (Maguire et al., 2005). Nuestros resultados sugieren la participación de REST/NRSF en el silenciamiento transcripcional de GRIA2 y GABRD, sin embargo, futuros estudios deberán ser conducidos para confirmar esta hipótesis. La utilización de modelos transgénicos cuya expresión de REST/NRSF se vea modificada (knock down o knock out) se presenta como una opción viable para evaluar la regulación de dichos genes bajo niveles definidos de REST/NRSF. Así también, interferir la expresión o función de REST/NRSF mediante el uso de antagonistas, miRNAs, oligonucleótidos u otros compuestos, es otra forma de dirigir estas aproximaciones. 7 Discusión general Este estudio estuvo enfocado en evaluar la expresión del factor de transcripción REST/NRSF y su participación en la regulación de la expresión génica de GluR2 y GABAAδ en el hipocampo de autopsias y pacientes con ELTM fármacorresistente. En nuestro grupo de autopsias, la expresión proteica de REST/NRSF fue dependiente de la edad, situación que no ocurre en pacientes con ELTM. Por otra parte, se demostró la sobreexpresión de REST/NRSF en hipocampo epiléptico bajo condiciones experimentales planteadas, aunque solo la sobreexpresión proteica correlacionó con la frecuencia de crisis. Además, la alta expresión de REST/NRSF fue más evidente en el grupo de pacientes sin ansiedad y depresión. Por otro lado, bajo las condiciones experimentales planteadas, se determinaron los sitios RE1 de los genes GRIA2 y GABRD humanos, los cuales están relacionados con procesos de excitabilidad e inhibición. Con base en lo anterior, se mostró por primera vez en tejido humano y bajo las condiciones experimentales planteadas que, la sobreexpresión de REST/NRSF en ELTM farmacorresistente podría estar asociada con el incremento en su unión a las secuencias RE1 de los genes GRIA2 y GABRD. Dicha situación correlacionó con un decremento en la actividad transcripcional de los genes mencionados. Además, el decremento en los Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 64 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM niveles de ARNm de GRIA2 y GABRD dependiente de la frecuencia de crisis epilépticas fue inversamente proporcional a los niveles de expresión proteica de REST/NRSF bajo las condiciones experimentales planteadas. En acuerdo con nuestros resultados, las evidencias experimentales muestran que, tras la inducción de crisis convulsivas y epilepsia, los niveles de REST/NRSF se incrementan (Palm et al., 1998, Spencer et al., 2006). Dicha sobreexpresión de REST/NRSF induce la represión de genes requeridos para la homeostasis neuronal, lo cual acentúa la sobreexcitación de los circuitos neuronales e induce neurodegeneración (Hwang y Zukin, 2018). Al respecto se sabe que genes que codifican para canales iónicos de sodio y potasio (SCNA2, KCNQ2 y 3) son reprimidos por REST/NRSF, lo que contribuye a la progresión de la epilepsia (Chong et al., 1995, Mucha et al., 2010). Esto correlaciona con nuestros resultados que demuestran que a mayor frecuencia de crisis epilépticas los niveles proteicos de REST/NRSF incrementan, ya que dicha variable clínica es un marcador de severidad y de daño cognitivo (Thompson y Duncan, 2005, Hester y Danzer, 2013). Si consideramos que, a su vez, el incremento en la frecuencia de crisis y la severidad correlacionan con un aumento de células granulares del giro dentado anormales (Hester y Danzer, 2013), se podría sugerir la participación de REST/NRSF en el desarrollo de dicho evento fisiopatológico característico de la esclerosis mesial en ELT. Futuros estudios deberán ser conducidos para determinar esta hipótesis. En contraste, también se ha demostrado que la sobreexpresión de REST/NRSF es un mecanismo neuroprotector, ya que inhibe los canales y las corrientes de sodio acoplados a voltaje, con lo que las neuronas reajustan la actividad de disparo a un estado fisiológico. De esta forma, REST/NRSF dirige el control homeostático inhibitorio para controlar la excitabilidad intrínseca (Pozzi et al., 2013). Por otra parte, se ha demostrado que la expresión aberrante de REST/NRSF está involucrada con la fisiopatología de diversos desordenes psiquiátricos, tales como esquizofrenia (Loe-Mie et al., 2010) y depresión (Otsuki et al., 2010). En un estudio realizado en sangre periférica de pacientes con Desorden Depresivo Mayor, se encontró que los niveles de REST/NRSF estaban disminuidos, mientras que genes que ‘inductores’ de depresión estaban aumentados (hormona liberadora de corticotropina, adenilato ciclasa 5 y factor de necrosis tumoral 12 y 13) (Otsuki et al., 2010). Lo anterior correlaciona con nuestros resultados al mostrar que los pacientes con ELTM con comorbilidades psiquiátricas tienen una menor sobreexpresión de REST/NRSF. De acuerdo con lo anterior, es posible sugerir la función dual de REST/NRSF en ELTM, ya que su Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 65 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM sobreexpresión parece favorecer la hiperexcitabilidad de las redes neuronales y a la vez disminuye los síntomas psiquiátricos. Dicha función dual representa una oportunidad en la búsqueda de opciones terapéuticas para ELTM, las cuales modulen la expresión de REST/NRSF para mantenerlo en niveles fisiológicos. Una de las estrategias experimentales ha utilizado silenciamiento de REST/NRFS mediante miRNAs, con lo cual se evitó la proliferación y migración de las células de glioblastoma (Zhang et al., 2016). En un estudio realizado en ratas, se realizó la administración intraventricular de oligodeoxinucleótidos que se unen selectivamente a REST/NRSF, evitando que se una a sus sitios RE1 en sus genes blanco y restaurando la expresión de estos (McClelland et al., 2014). Tal vez uno de los más prometedores es el uso de un derivado del benzoimidazol- 5-carboxamida, denominado X5050, el cual al ser usado en un modelo in vivo, indujo la degradación proteica de REST/NRFS con una baja toxicidad (Charbord et al., 2013). También es importante mencionar un estudio en ratones en el cual se demostró que tras 8 semanas de ejercicio físico la expresión génica de REST/NRSF disminuye, teniendo un efecto benéfico sobre el envejecimiento (Dallagnol et al., 2017). Considerando que en el genoma de mamíferos se han encontrado cerca de 2000 sitios RE1 en genes neuronales (Bruce et al., 2004), la modulación de los efectos de REST/NRSF es importante en ELTM. Es decir, REST/NRFS es un regulador maestro a nivel genómico, pero de manera específica regula un gran número de genes involucrados en la neurotransmisión excitatoria y en epileptogénesis (McClelland et al., 2014, Roopra et al., 2001). En este estudio mostramos, por primera vez en tejido humano epiléptico, datos preliminares de la unión de REST/NRSF a las secuencias RE1 de los genes GRIA2 y GABRD involucrados en procesos de neurotransmisión excitatoria e inhibitoria respectivamente. Este resultado sugiere que REST/NRSF podría participar activamente en la represión de dichos genes, lo cual correlaciona con la disminución en los niveles de ARNm. Adicionalmente el incremento de REST/NRSF es inversamente proporcional al decremento en el ARNm de GluR2 y GABAAδ asociados a la frecuencia de crisis. Al respecto se ha demostrado en cultivos de neuronas corticales que tras la exposición a ácido kainico, REST/NRSF media la represión de GluR2 a través de mecanismos epigenéticos, ya que induce la desacetilación de la histona 3 y 4 (Jia et al., 2006). Nuestros datos y las evidencias parecen indicar que en pacientes con ELTM, REST/NRSF forma parte de los diversos factores que regulan a dichos genes y sobre todo que participa como regulador maestro de la transcripción. Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 66 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM Si bien no existen estudios previos en humanos con ELTM, la evidencia experimental sugiere que la disminución en la expresión del ARNm que codifica para las subunidades GluR2 y GABAAδ podría acentuar las características fisiopatológicas del padecimiento. Se ha demostrado que en ratones transgénicos con una deficiente edición de GluR2, se reducen los niveles de ARNm, lo cual se asocia con el incremento en las corrientes de Ca2+ en neuronas piramidales del hipocampo, haciendo a los animales más susceptibles a las crisis convulsivas (Brusa et al., 1995). Por otra parte, en modelos de EE se ha demostrado que el ARNm de GluR2 disminuye tras las crisis convulsivas, pero se induce la transcripción de otras subunidades GluR, dando lugar a receptores AMPA permeables a Ca2+, lo cual vuelve a las neuronas más vulnerables a las crisis (Grooms et al., 2000, Friedman, 1998). Con respecto a GABAAδ, se ha demostrado que la disminución de su ARNm correlaciona con una disminución en las corrientes tónicas, evocando una respuesta epileptiforme secundaria a la perdida de inhibición neuronal (Spigelman et al., 2002). Como ya se ha descrito, los mecanismos funcionales de REST/NRSF no se restringen a su unión a los sitios RE1, pues solo es el inicio de toda una serie de eventos orquestados por este factor de transcripción. Uno de los mecanismos regulatorios de REST/NRSF es la remodelación epigenética, la cual ocurre como consecuencia del reclutamiento de factores correpresores como coREST y mSin3A (Ballas et al., 2001, Grimes et al., 2000), los cuales a su vez reclutan a HDACs que remueven a los grupos acetilo silenciando a los genes (Hwang et al., 2017) tal como acurre con GluR2. REST/NRSF también se asocia con la metiltransfererasa G9a (induciendo silenciamiento a largo plazo), con la demetilasa LSD1 y con MeCP2 (Proteína de Unión a Metil-CpG) (Roopra et al., 2004, Shi et al., 2005, Lombardi et al., 2015). Al respecto se ha demostrado que, en dolor neuropático, la asociación de REST/NRSF con G9a induce la marca epigenética represiva H3K9me2 en varios genes que codifican para canales de potasio (Laumet et al., 2015). Por otra parte, algunas mutaciones en el Dominio Proteico LIM de Interacción con REST (RILP, por sus siglas en inglés) evitan su interacción con REST/NRSF, lo cual produce un síndrome de epilepsia-ataxia mioclónica progresiva autosómica recesiva (Bassuk et al., 2008). También las mutaciones en KDM5C, una demetilasa de histonas, se ha asociado con epilepsia y retraso mental del cromosoma X, situación mediada por la interacción entre KDM5C y REST/NRSF (Tahiliani et al., 2007). Con base en nuestros resultados y la evidencia presentada bajo las condiciones experimentales planteadas, se sugiere que REST/NRSF es un factor importante en Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 67 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM fisiopatología de la ELTM al participar de la regulación transcripcional de genes como GRIA2 y GABRD. Sin embargo, no podemos dejar de lado que los mecanismos funcionales de REST/NRSF permiten ampliar el panorama en la búsqueda de mejores opciones terapéuticas para la mejora en la calidad de vida de los pacientes con ELTM. 8 Conclusiones Los resultados de este estudio indican que el factor de transcripción REST/NRSF está sobreexpresado en el grupo de pacientes con ELTM farmacorresistente en comparación con el de autopsias y que dicha sobreexpresión es menor en aquellos pacientes que presentan ansiedad o depresión comórbidas. Bajo las condiciones experimentales descritas, la sobreexpresión de REST/NRSF en pacientes con ELTM farmacorresistente correlaciona con un mayor enriquecimiento (versus autopsias) del factor de transcripción en los sitios RE1 de los genes GRIA2 y GABRD, los cuales codifican para la subunidad GluR2 de los receptores AMPA y para la subunidad δ de los receptores GABAA respectivamente. La disminución en los niveles de ARNm de GluR2 y GABAAδ en el grupo de pacientes comparado con el de autopsias, sugiere que el enriquecimiento de REST/NRSF en sus sitios consenso podría ser parte funcional del proceso transcripcional, y por lo tanto participa activamente en la regulación transcripcional de dichos genes. Esta situación se hace evidente con la relación inversa encontrada entre la sobreexpresión proteica de REST/NRSF y la disminución de los niveles transcripcionales de GluR2 y GABAAδ asociados al incremento en el número de crisis epilépticas (Figura 20). Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 68 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM Figura 20. Modelo de regulación transcripcional de los genes GRIA2 y GABRD mediada por REST/NRSF en hipocampo de pacientes con ELTM. 9 Perspectivas En este estudio se determinó por primera vez la sobreexpresión de REST/NRSF en un grupo de pacientes con ELTM y su posible asociación con la regulación transcripcional sobre los genes GRIA2 y GABRD. Teniendo en consideración que las aproximaciones experimentales sugieren que REST/NRSF es un regulador maestro que participa en diversos procesos neuronales, tanto en condiciones normales como patológicas, cabría esperar que su función regulatoria sea mucho más amplia. De tal forma que: • Para evaluar su papel como regulador maestro en procesos epilépticos, se deberá evaluar la expresión de otros genes blanco y la unión a sus promotores, en pacientes con ELTM farmacorresistente. Éstos deberían ser genes no solo relacionados con excitabilidad e inhibición, si no con procesos fisiopatológicos como esclerosis mesial (SCN1A, RELN), neurogénesis aberrante (FOXP2) y farmacorresistencia (ABCB1). Dichas evaluaciones se realizarían con un enfoque experimental similar al utilizado en este estudio (determinación de expresión de ARNm, proteínas, unión a promotores y asociaciones clínicas). • Si bien hemos mostrado una disminución en la expresión del ARNm de las subunidades GluR2 en nuestra cohorte de pacientes con ELTM, es importante determinar si el ARNm que está siendo transcrito es codificante para Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 69 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM subunidades permeables o impermeables a Ca2+. Para ello se evaluaría la proporción de ARNm Q/R editado, mediante RT-PCR (Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa reversa) seguida por un ensayo con las enzimas de restricción BbvI y AciI, las cuales reconocen las secuencias 5’-GCAGC-3’ y 5’-GCGG-3’ (sitios Q/R) respectivamente. Dichas enzimas realizan cortes de tamaños específicos que son detectados mediante electroforesis en gel de agarosa. De tal forma se podrá asociar no solo la represión transcripcional, sino también la funcionalidad de los receptores AMPA con GluR2 en pacientes con ELTM. • Para determinar si los mecanismos funcionales de REST/NRSF en autopsias pacientes con ELTM son similares a los descritos en estudios experimentales se determinarán y evaluarán las interacciones con otros factores de transcripción (LSD1, co-REST, SMCX, BRG1, Sin3A, SWI/SNF y HDAC1/2). Inicialmente se harán los cálculos de interacción in silico (docking) y eventualmente de manera experimental a través de co-inmunoprecipitación proteína-proteína. Se realizará la comparación de los porcentajes de unión de los factores de transcripción entre autopsias y pacientes y se correlacionaran con las variables clínicas y demográficas. • Considerando que serán positivas las interacciones de REST/NRSF con factores de transcripción como HDAC1/2 y LSD1 (remodeladores de la cromatina) será importante evaluar las diferencias entre autopsias y pacientes con ELTM a nivel epigenético. Para ello se realizará un análisis de metilación global del ADN, PCR especifica de metilación para evaluar genes específicos (GRIA1/2, GABRD/B, HCN1, SCNA1, ABCB1, RELN y FOXP2). De tal forma, que se logre una asociación entre los niveles de expresión, las modificaciones epigenéticas de los genes en estudio y la función transcripcional/remodeladora de la cromatina de REST/NRSF. De ser posible se analizará la reorganización de la cromatina en 3D, mediante Hi-C (método de captura de conformación de los cromosomas) y se analizaran los cambios asociados a la ELTM (vs autopsias). • Con el fin de evaluar los efectos de la intervención farmacológica sobre los niveles de REST/NRSF y sus genes blanco, se utilizará un modelo de epilepsia límbica inducida con litio-pilocarpina en ratas, a las cuales se les administraría el compuesto X5050 que induce la degradación de dicho factor. Se deberán Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 70 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM evaluar los cambios en la expresión de REST/NRSF y de sus genes blanco, así como la toxicidad a diferentes dosis y tiempos de administración del X5050. • Para determinar el efecto de la modulación de REST/NRSF sobre las características fisiopatológicas, se evaluarían los cambios citológicos e histológicos en el desarrollo de esclerosis mesial en el modelo de epilepsia límbica descrito anteriormente y de farmacorresistencia en el modelo de epilepsia resistente a fenitoína. • Para determinar los efectos epigenéticos de la actividad controlada de REST/NRSF y/o del uso mismo del modulador X5050, se deberán realizar las evaluaciones epigenéticas mencionadas previamente (metilación global, PRC metilo específica y Hi-C), antes y después de la administración del X5050 tanto ratas con epilepsia límbica, como en ratas control. Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 71 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM 10 Bibliografía AERTS, S. 2012. Computational strategies for the genome-wide identification of cis-regulatory elements and transcriptional targets. Curr Top Dev Biol, 98, 121-45. AMBROSIO, A. F., SILVA, A. P., MALVA, J. O., SOARES-DA-SILVA, P., CARVALHO, A. P. & CARVALHO, C. M. 2001. Inhibition of glutamate release by BIA 2-093 and BIA 2-024, two novel derivatives of carbamazepine, due to blockade of sodium but not calcium channels. Biochem Pharmacol, 61, 1271-5. ARONICA, E. & GORTER, J. A. 2007. Gene expression profile in temporal lobe epilepsy. Neuroscientist, 13, 100-8. ARSLAN, A., VON ENGELHARDT, J. & WISDEN, W. 2014. 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Carta de autorización para la obtención de tejido hipocampal de autopsias SIRELCIS Página 1 de 1 ES AÉVION Dirección de Prestaciones Médicas y VILAILWLA Unidad de Educación, Investigación y Políticas de Salud a Coordinación de Investigación en Salud á 10 de octubre del 2017 Ref. 09-B5-61-2800/201700/ 25097 7 Dr. Orozco Suárez Sandra Adela Unidad de Investigación Médica en Enfermedades Neurológicas Siglo XXI (U INVEST MED ENF NEUROL SXXD Nivel Central Presente: Informo a usted que el protocolo titulado: Evaluación de la expresión de REST/NRSF, GluR2, GABAA? y HCN1 en la Epilepsia del Lóbulo Temporal: acercamiento básico y clínico., fue sometido a la consideración de esta Comisión Nacional de Investigación Científica. Los procedimientos propuestos en el protocolo cumplen con los requerimientos de las normas vigentes, con base en las opiniones de los vocales del Comité de Ética en Investgación y del Comité de Investigación de la Comisión Nacional de Investigación Científica del IMSS, se ha emitido el dictamen de APROBADO, con número de registro: R-2017-785-100. De acuerdo a la normatividad vigente, deberá informar a esta Comisión en los meses de enero y julio de cada año, acerca del desarrollo del proyecto a su cargo. Este dictamen sólo tiene vigencia de un año. Por lo que en caso de ser necesario requerirá solicitar una reaprobación al Comité de Etica en Investigación de la Comisión Nacional de Investigación Ciérfífica, al término de la vigencia del mismo. Atentamente, Dr. Fabio Sal Presidente Comisión Nacional d estigación Científica Anexo comentari S: SXN/ iah. F-CNIC-2015-174 IMSS SEGURIDAD Y SOLIDARIDAD SUCIAL 4% pies Bloque"*E"'de la Unidad de Congresos My. Martino: 330 Col. Doctores Máaico 06720 96274900 ex 31310 corseñácis aub mx Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 83 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM 11.2 Anexo 2. Carta de aprobación del proyecto y protocolos relacionados. Evaluación de la expresión de REST/NRSF y la posible regulación transcripcional ejercida sobre los genes GRIA2 y GABRD en hipocampo de pacientes con epilepsia de lóbulo temporal farmacorresistente 84 Victor Navarrete Modesto | Doctorado en Ciencias Biomédicas | UNAM 11.3 Anexo 3. Membrana completa de western blot para REST/NRSF Anexo3. Imagen representativa del gel completo, en el que se muestra la especificidad del reconocimiento antigénico por parte del anticuerpo anti-REST/NRSF (Abcam ab75785). A la izquierda se muestra el marcador de peso molecular. A, autopsias y P, pacientes. REST/NRSF transcription factor is overexpressed in hippocampus of patients with drug-resistant mesial temporal lobe epilepsy Victor Navarrete-Modesto a,b, Sandra Orozco-Suárez b, Mario Alonso-Vanegas c, Iris A. Feria-Romero b,⁎, Luisa Rocha d,⁎ a Doctorado en Ciencias Biomédicas, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Autónoma de México, Ciudad de México, Mexico b Unidad de Investigación Médica en Enfermedades Neurológicas, Hospital de Especialidades “Dr. Bernardo Sepúlveda”, Centro Médico Nacional Siglo XXI, Instituto Mexicano del Seguro Social, Ciudad de México, Mexico c Departamento de Neurocirugía, Instituto Nacional de Neurología y Neurocirugía “Manuel Velasco Suarez”, Ciudad de México, Mexico d Departamento de Farmacobiología, Centro de Investigaciones y Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional (CINVESTAV), Mexico a b s t r a c ta r t i c l e i n f o Article history: Received 6 January 2019 Revised 6 February 2019 Accepted 8 February 2019 Available online xxxx The Repressor Element-1 Silencing Transcription factor or Neuron-Restrictive Silencer Factor (REST/NRSF) is a zinc finger repressor transcription factor of the Kruppel family. Several studies in experimental models have shown that overexpression of REST/NRSF occurs after the induction of seizures. In the present study, the expression of REST/NRSF (messenger ribonucleic acid (mRNA) and protein) was evaluated in the hippocampus of 28 patients with drug-resistant mesial temporal lobe epilepsy (MTLE) and their correlation with clinical vari- ables and comorbid anxiety and depression. The REST/NRSF protein expression was augmented in an age- dependent manner in the hippocampus of autopsied subjects. However, this condition was not observed in pa- tients with MTLE, in whom overexpression of this transcription factor occurred at both the mRNA and protein levels. The correlations with clinical variables showed that the frequency of epileptic seizures was proportional to the protein expression of REST/NRSF. The results revealed that the overexpression of REST/NRSFwasmore ev- ident in patients with MTLE without anxiety and depression. Our data indicate that the expression of REST/NRSF ismodified inpatientswithMTLE. This condition has implications in thepathophysiology of this disorder,making it a potential candidate for the optimization of clinical treatments. © 2019 Elsevier Inc. All rights reserved. Keywords: REST/NRSF Mesial temporal lobe epilepsy Hippocampus Seizure frequency Psychiatric comorbidities 1. Introduction The Repressor Element-1 Silencing Transcription factor or Neuron- Restrictive Silencer Factor (REST/NRSF) is a protein of approximately 121 kDa that belongs to the family of transcription-factors type GLi- Krüppel Repressor Class of Zinc Fingers [1]. The REST/NRSF has a deoxy- ribonucleic acid (DNA)-binding domain consisting of eight zinc fingers and carries out its repressor function by binding its consensus sequence (Repressor Element 1/Neuron-Restrictive Silencing Element (RE1/ NRSE)), a 17–33 bp site found in the regulatory regions of several genes [2]. Once REST/NRSF binds the RE1/NRSE site, it recruits repressor cofactors, histone deacetylases, and histone methyltransferases, which induce chromatin remodeling around the target genes [3,4]. The expression of REST/NRSF is high in nonneural tissues and in undifferentiated neuronal precursors during brain development, and decreases as the development process progresses [5]. The REST/NRSF expression is low in the adult brain and is associated with neuroprotective processes [6]. The REST/NRSF is found in brain areas such as olfactory system, cerebral cortex, hippocampal formation, diencephalon, midbrain, brain stem, and cerebellum [5]. It is a master regulator in the expression of more than 2000 neuronal genes [7]. Some of these genes are involved in axonal growth, vesicular transport and release, and ionic conductance [8,9]. Studies support that REST/NRSF represses genes related to the depression- and anxiety-like behaviors [10]. Indeed, REST/NRSF expres- sion is low in subjects with cognitive deterioration whereas its high ex- pression is associatedwith a low incidence of psychiatric disorders such as major depression [11,12]. Other studies indicate that the repression of genes induced by REST/NRSF is associated with neurological disorders such as the Parkinson's disease [13,14], Huntington's disease [15,16] and the reduced dendritic growth and complexity in Down syndrome [17]. This information indicates that REST/NRSF is involved in different process, and its effects depend on the cell type-specific necessities and the genetic context. Studies indicate that REST/NRSF is overexpressed as a consequence of seizure activity [5,18] and exacerbates the epileptogenesis process, a situation associated with the low expression of miR-124 [19]. Indeed, the overexpression of REST/NRSF may facilitate the neuronal Epilepsy & Behavior 94 (2019) 118–123 ⁎ Corresponding authors. E-mail addresses: iris.feria@imss.gob.mx (I.A. Feria-Romero), lrocha@cinvestav.mx (L. Rocha). https://doi.org/10.1016/j.yebeh.2019.02.012 1525-5050/© 2019 Elsevier Inc. All rights reserved. Contents lists available at ScienceDirect Epilepsy & Behavior j ourna l homepage: www.e lsev ie r .com/ locate /yebeh 11.4 Anexo 4: Artículo Publicado 85 excitability due to the transcriptional silencing of genes such as hyper- polarization activated cyclic nucleotide-gated potassium channel 1 (HCN1), glutamate ionotropic receptor AMPA type subunit 2 (GluA2), calbindin 1 (Calb1), glycine receptor alpha 2 (Glra2) and potassiumvolt- age-gated channel subfamily C member 2 (Kcnc2) [20–22]. Other stud- ies support that the overexpression of REST/NRSF contributes to antiepileptic effects. Concerning this issue, it is described that REST/ NRSF prevents hyperexcitability in mature hippocampal neurons by the reduced expression of voltage-gated Na+ channels [23]. The REST/ NRSF participates in the antiepileptogenic effects of 2-deoxyglucose through the repression of genes, such as brain derived neurotrophic fac- tor (BDNF) andneurotrophic receptor tyrosine kinase 2 (TrkB) [4]. In ad- dition, the seizure-induced overexpression of REST/NRSF represses some genes related to epileptogenesis in the mature rat hippocampus [22]. The information described above supports the notion that REST/ NRSF is associated in both pro- and antiepileptic processes. At present, it is unknown whether REST/NRSF is overexpressed in the hippocampus of patients with drug-resistant mesial temporal lobe epilepsy (MTLE), a frequently neurological disorder [24] with a high psychiatric comorbidity [25–27]. This situation is relevant because the hippocampus of subjects with MTLE exhibits changes that facilitate the epileptic activity and mood disorders [28–30]. Some of these changes include the modulation of genes [31], which can be associated with the severity of the seizure activity, clinical variables, and/or psychi- atric comorbidities. The aim of the present study was to elucidate changes in the messenger ribonucleic acid (mRNA) and protein expres- sion of REST/NRSF in the hippocampus of patients with drug-resistant MTLE and their correlation with clinical variables and comorbid anxiety and depression. 2. Materials and methods 2.1. Patient criteria and surgical samples Hippocampal samples were obtained from 28 patients diagnosed with drug-resistant MTLE (15 males and 13 females) undergoing surgery according to the protocol established by the Epilepsy Surgery Program of the National Institute of Neurology and Neurosurgery in Mexico City. The patients underwent a presurgical evaluation consisting of neurological, neuropsychiatric, and neuropsychological inspections, as well as electroencephalogram (EEG)-video recording and magnetic resonance imaging (MRI). In all patients, the presence of hippocampal mesial sclerosis was confirmed through histopathological and MRI evaluation. Hippocampal biopsies were collected immediately after resection during epilepsy surgery, frozen rapidly in powdered dry ice and stored at −70 °C until processing. The experimental protocol was previously approved by the scientific committees of the institutions involved in the present study, and informed consent was obtained from each patient. Table 1 presents a summary of clinical data of the patients in- cluded in this study. As a control condition, hippocampus samples were obtained from the autopsies of 13 subjects (7males and 6 females)whowere deceased because of different causes, without evidence of neurological diseases (Table 1). After resection, the samples were handled and stored as pre- viously described. 2.2. mRNA evaluation for REST/NRSF 2.2.1. mRNA extraction and cDNA synthesis The hippocampal tissue (100 mg) was homogenized in 0.5 ml of phenol and guanidine isothiocyanate solution (TRIzol®, Invitrogen, Cat. No.15596026), and the procedure was performed according to the manufacturer's protocol. Each mRNA sample was quantified spectrophotometrically (Biotech Epoch™ spectrophotometer), and the purity was determined by the 260/280 nm ratio, with an acceptable index in the range of 1.8 to 2.0. All samples exhibited an index between 1.9 and 2.0. The integrity of samples was also evaluated by agarose/ formaldehyde gel electrophoresis, which allowed observation of the presence of the eukaryotic ribosomal subunits 18S and 28S, indicating high integrity of the mRNA samples. To ensure integrity and purity, repurification was performed using the Agencourt® RNAClean™ XP kit (Beckman Coulter) according to the manufacturer's protocol. Complementary DNA (cDNA) was synthesized from 1 μg of mRNA and random hexamers in a total volume of 20 μl, according to the man- ufacturer's protocol, using Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT, Promega). 2.2.2. Real-time PCR Real time quantitative PCR was performed on a LightCycler 2.0 Real- time Polymerase chain reaction (PCR) platform (Roche), where each re- action contained a volume equivalent to 500 ng of cDNA, 0.5 μg of each primer, 0.2 μM TaqMan probe, 2 μl of TaqMan Master Mix (Roche) and ddH2O to a final volume of 10 μl. The primers used for the amplification of REST/NRSF were as follows: Fw: 5′-GCATCAGGTGCTCCAGATATT-3′, Rv: 3′-GCTTCATATTGGCATGGCTTAC-5′. Additionally, enolase-2 (ENO2, Fw: 5′-CAGGACTTTGTCAGGGACTATC-3′, Rv: 3′-CCCTACATTGGCTGTG AACT-5′) was amplified as an endogenous gene. The amplification pro- gram consisted of 1 cycle at 95 °C held for 10min, followed by 45 cycles at 95 °C for 10 s, 62 °C for 30 s, and 72 °C for 1 s. Standard qPCR curves were prepared with dilutions at known concentrations of gBlocks® fragments (Integrated DNA Technologies) of the sequences to be ampli- fied for REST/NRSF and ENO2, which had been previously transiently transfected in chemocompetent DH5-α Escherichia coli. The detection of transcripts was sensitive to concentrations of 30 ng to 3 fg. Normali- zation of the expression values was conducted by calculating the changes in expression relative to the ENO2 gene. The experimental data were analyzed using LightCycler software version 4.05 (Roche). Table 1 Summary of clinical data of patients with MTLE and autopsied subjects and their correlations with REST/NRSF expression. Patients Autopsies Clinical variables Subjects (n = 28) mRNA Correlation (r) Protein Correlation (r) Subjects (n = 13) mRNA Correlation (r) Protein Correlation (r) Gender (M:F) 15:13 – – 7:6 – – Age (years) 32 ± 1.4 −0.227 0.0779 34.5±3.2 −0.417 0.646⁎ Age of onset of seizures (years) 13.3 ± 2.05 0.0505 0.227 DNA – – Duration of epilepsy (years) 20.2 ± 2.3 0.0406 −0.151 DNA – – Seizure frequency (per month) 13.8 ± 3.3 −0.176 0.658⁎ DNA – – Focus laterality (R:L) 14:14 – – DNA – – Number of drugs prior to surgery 4.4 ± 0.48 0.111 0.0977 DNA – – Post-Mortem Interval (h) DNA – – 15.58±0.8 0.435 −0.0704 M, male; F, female; R, right; L, left; h, hours; DNA, Does not apply. Values are mean ± SEM, and values r are Pearson correlation Coefficients. ⁎ p b 0.05 indicated by bold values. 119V. Navarrete-Modesto et al. / Epilepsy & Behavior 94 (2019) 118–123 86 2.3. Evaluation of REST/NRSF protein expression 2.3.1. Protein extraction The hippocampal tissue was mechanically homogenized in a 1:5 ratio (weight/volume) with NP-40 lysis buffer supplemented with the cOmplete (Roche) cocktail of protease inhibitors. The homogenate was centrifuged at 12,000×g for 15 min at 4 °C, and the supernatant was separated and stored at −80 °C until processing. The integrity was determinated by Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Elec- trophoresis (SDS-PAGE) with Coomassie blue staining, which allowed the evaluation of bands of all molecular weights. The concentration of proteins was determined by the Bradford method, using the Pierce™ Coomassie Protein Assay kit (Thermo Scientific) according to the man- ufacturer's protocol. 2.3.2. Western blot A volume equivalent to 100 μg of protein was separated by electro- phoresis on an 8% SDS-polyacrylamide gel and transferred to a nitrocel- lulosemembrane,whichwas blockedwith albumin and skimmilk (1:5) diluted in Tris-buffered saline with 0.1% Tween 20 (TBST) for 1 h at room temperature. Subsequently, the membranes were incubated with primary antibodies against REST/NRSF (150 kDa, 1:1000, ab75785, Abcam) and β-actin as loading control (42 kDa, 1:1000, sc- 69879, Santa Cruz Biotechnology) at 4 °C overnight. After three washes with TBST, the membranes were incubated with secondary antibodies conjugated with horseradish peroxidase in TBST (1:5000) for 90 min at room temperature. After three washes with TBST, the membranes were washed with a solution of sodium chloride (NaCl) (0.5 M) and reacted for 2 min with the chemiluminescence reagent Luminata Cre- scendo Western HRP substrate (Millipore). Images were acquired with a FUSION-FX7 Advanced photodocumenter (Thermlab). The optical density of the bands was determined using ImageJ software (National Institutes of Health, NIH). 2.4. Statistical analysis The values obtained frompatients and autopsied subjectswere com- pared using Mann–Whitney test. Pearson's correlation coefficients be- tween the expression of REST/NRSF (mRNA and protein) and clinical factors were determined. The REST/NRSFmRNA and protein expression was also estimated according to psychiatric comorbidities and analyzed by one-way analysis of variance (ANOVA) with a post hoc Dunn–Sidak test (Bonferroni). SigmaPlot 12.5 software was used for all statistical analyses. A p-value ≤ 0.05 was considered statistically significant. 3. Results 3.1. Clinical characteristics of the experimental subjects The clinical data of the autopsieswere as follows ((mean±Standard Error of theMean (SEM)): age, 34.5± 3.2years and the postmortem in- terval (PMI), 15.58 ± 0.88 h. The age of the autopsied subjects was not significantly different when compared with that of patients with MTLE (32 ± 1.4 years, p N 0.05) (Table 1). Patients with MTLE used 2 or more antiepileptic drugs (AEDs) dur- ing the presurgical period. Their clinical datawere as follows: age of dis- order onset, 13.3 ± 2.05 years; duration of epilepsy, 20.2 ± 2.3 years; and frequency of epileptic seizures, 13.8 ± 3.3 per month (Table 1). 3.2. Expression of REST/NRSF in the hippocampus of autopsied subjects No significant correlationwas found between the PMI and the REST/ NRSF mRNA and protein expression values (r = 0.435, p N 0.05; and 0.0704, p N 0.05, respectively) (Table 1). These results indicate that the PMI range of the autopsied subjects evaluated in the present study did not influence the expression of REST/NRSF. The protein expression of REST/NRSF was positively correlated with the age of the autopsied subjects (r=0.646, p b 0.05), i.e., the older the age, the higher the protein expression of REST/NRSF in hippocampus. This condition was not evident for mRNA expression (r = −0.417, p N 0.05) (Table 1, Fig. 1). No other significant correlations were found. Fig. 1. Correlation of age with the REST/NRSF mRNA expression in human hippocampus. The graph shows the correlation of the relative expression of REST/NRSF mRNA with the age of autopsies and patients. Notice that the significant correlation found in autopsies is not evident in patients with drug-resistant MTLE. r indicates the value of the Pearson coefficient, *p b 0.05. Fig. 2. REST/NRSF expression in the hippocampus of autopsies and patients with pharmacoresistant MTLE. The left graph shows the relative expression of REST/NRSF mRNA. The right graph presents the optical density ratio between protein expression of REST/NRSF and the β-actin, and representative images obtained from the western blots. The results are expressed as mean ± SEM. T-test *p b 0.05, **p b 0.01. 120 V. Navarrete-Modesto et al. / Epilepsy & Behavior 94 (2019) 118–123 87 3.3. Expression of REST/NRSF in the hippocampus of patients with MTLE Compared with autopsied subjects, the hippocampus of patients with MTLE showed an increase in REST/NRSF expression for both mRNA (146%, p b 0.01) and protein (273%, p b 0.01) (Fig. 2). The correlation analysis of the results obtained with the clinical var- iables revealed that the higher frequency of seizures was associated with the higher protein expression of REST/NRSF in the hippocampus (r = 0.658, p b 0.05) (Table 1, Fig. 3). No significant correlations were found between the expression of REST/NRSF and other clinical variables. It is important to mention that the positive correlation between the protein expression of REST/NRSF and age that was found in autopsied subjects was not evident in patients with MTLE (Table 1, Fig. 1). Clinical evaluation revealed that 13 patients with MTLE presented comorbid mood alterations: 3 patients had anxiety, 5 had depression, and 5 underwent anxiety plus depression. These patients with MTLE plus mood disorders exhibited an overexpression of REST/NRSF in mRNA (55% vs autopsies, p N 0.05) and protein (148% vs autopsies, p b 0.05). Fifteen patients had MTLE without psychiatric disorders. The hippocampus of these patients showed a more evident overexpression of REST/NRSF (mRNA, 171%, p b 0.001 vs autopsies; protein, 230%, p b 0.001 vs autopsies) (Fig. 4). No clinical conditions correlate with the overexpression of REST/NRSF in patients with and without mood disorders. 4. Discussion The present study was focused to evaluate the expression of the transcription factor REST/NRSF in the hippocampus of autopsies and patients with pharmacoresistant MTLE. In autopsies, the protein expression of REST/NRSF was age-dependent, a condition not evident in the hippocampus of patients with MTLE. An important finding was that REST/NRSF was overexpressed in the epileptic hippocampus. The protein overexpression correlated with the seizure frequency. In addi- tion, the higher expression of REST/NRSF was more evident in patients with MTLE without anxiety and depression. For the present study, itwas essential to verify the viability and qual- ity of the autopsy samples in order to consider them as control condi- tion. In this regard, the spectrophotometric and integrity assessments were consistent with the established criteria (see Materials and methods section) [32,33]. It is known that the integrity of mRNA can be affected by a prolongedPMI [34]. Under our experimental conditions, we did not find a significant correlation between the PMI (range of 10 to 18 h) of autopsies and their mRNA and protein expression. These findings support that the values obtained from the autopsies can be con- sidered as a control condition. During brain development, REST/NRSF activity is high because it regulates the differentiation of nonneuronal cells to neurons through the silencing of proneuronal genes [5]. In the mature brain, neurodevelopmental activity decreases, and the levels of REST/NRSF are low [6]. The results obtained from autopsies support the low expres- sion of REST/NRSF in mature brain, a condition that can be regulated by epigenetic factors. Concerning this issue, it is known that the silencing of the REST gene results from the methylation of its promoter in three re- gions with high frequency of cytosines and guanines prone to be meth- ylated (CpG islands). [35]. The expression of REST/NRSF is also repressed by miR-124 [19]. In spite of its low expression, REST/NRSF plays an important role in the mature brain. A previous study indicates that the expression of REST/NRSF in the human prefrontal cortex and hippocampus positively correlateswith a good preservation of cognitive functions during aging, a condition that is lost in subjects with Alzheimer's disease [6]. An interesting finding from our experiments was that age correlated with the REST/NRSF protein, but not mRNA ex- pression, in the hippocampus of autopsies. This group of evidence sup- ports the notion that the age-dependent protein expression of REST/ NRSF may modulate neuroprotective mechanisms against toxic insults that increase with aging [6]. The mismatch between the expression of mRNA and protein of REST/NRSF in autopsies can be due to the partici- pation of many posttranscriptional mechanisms involved in translating Fig. 3. Correlation between the frequency of epileptic seizures and the protein expression of REST/NRSF in the hippocampus of patients with pharmacoresistant MTLE. The graph shows the correlation between the protein expression of REST/NRSF expressed as optical density and the frequency of seizures per month. r indicates the value of the Pearson coefficient, *p b 0.05. Fig. 4. REST/NRSF expression in the hippocampus of patients with drug-resistant MTLE with and without comorbid anxiety and depression. The graphs show themRNA (left) and protein (right) expression of REST/NRSF in autopsies, patients with MTLE without mood disorders, and patients with MTLE and comorbid anxiety and depression. The results are expressed as mean ± SEM. ANOVA and Dunn–Sidak post hoc test, *p b 0.05. 121V. Navarrete-Modesto et al. / Epilepsy & Behavior 94 (2019) 118–123 88 mRNA [36]. These mechanisms can modify the rate of transcription de- pending on the cellular necessities of protein expression. The above in- formation suggests that under normal conditions, the transcription factor is translated according to cellular requirements, independently of mRNA levels. Our results revealed that the epileptic hippocampus of patients with MTLE showed an overexpression of REST/NRSF. In contrast to autopsies, the REST/NRSF expression in patients with MTLE was not age- dependent. It is possible that in brain disorders such as epilepsy, the REST/NRSF expression depends on abnormal insults such as excessive oxidative stress. This situation leads to the silencing of target genes that are essential to prevent neuronal death [7]. The overexpression of REST/NRSF in epileptic tissue may result from the activation of the canonical Wingless/Integrated (WNT) pathway. In this pathway, β-catenin directly regulates the REST gene and other genes related to the control of progenitor cells [37]. The overexpression of β-catenin and other effectors of the WNT path- way is associated with aberrant hippocampal neurogenesis in MTLE [38]. In addition, Wnt/β-catenin signaling is involved in seizure-in- duced neurogenesis, seizure susceptibility, and epileptogenesis [39]. Other studies indicate that the activation of WNT pathway is a mecha- nism that reduces the high extracellular levels of glutamate by the expression of Excitatory Amino Acid Transporter 2 (EAAT2) [40]. Further studies are necessary to determine how the REST/NRSF expression regulated by β-catenin modifies the epileptic activity. It is known that the REST gene is positively regulated by cyclic aden- osine monophosphate (cAMP) response element-binding (CREB) pro- tein [35]. The activation of CREB results from the increase in extracellular levels of glutamate [41], a condition found in the hippo- campus of patients with drug-resistant MTLE [42]. In addition, the en- hanced expression of CREB is a consequence of the decreased expression of miR-124 in epileptic tissue [43]. The chronic activation of CREB induced in the epileptic hippocampus [44] represents other possible trigger factor for the REST/NSRF overexpression found in the present study. The results obtained revealed that subjects with the highest fre- quency of epileptic seizures exhibited the highest REST/NRSF protein expression. It is known that the induction of an ictal event produces an increase in REST/NRSF expression, which returns to baseline 24 h later [18]. Because the release of glutamate augments with each epilep- tic seizure [45], it is possible that a high frequency of ictal events maintains the elevated expression of REST/NRSF by increasing CREB and/or β-catenin. It is important to notice that both the overexpression of β-catenin and excess in glutamate augment the expression of P- glycoprotein in brain endothelial cells [46]. The overexpression of this multidrug transporter in the blood–brain barrier is a condition that facilitates the pharmacoresistant phenotype in epilepsy [47,48]. In the future, it will be important to determine the role of the overexpression of REST/NRSF in pharmacoresistant epilepsy. One important finding from our experiments was that patients with MTLE without psychiatric comorbidities showed a more evident over- expression of the REST/NRSF. This result supports a previous study indi- cating that the increase in REST/NRSF is associatedwith the reduction of psychiatry symptoms associated with stress [11]. The overexpression of REST/NRSF related with the absence of psychiatric comorbidities also supports a regulation mediated bymiR-124 and CREB in themanifesta- tion of mood disorders. The hippocampus of subjects with depression presents a high expression of miR-124 [49], a condition associated with low expression of CREB, in both its native and phosphorylated forms [50–52]. On the other hand, the transcriptional induction of CREB in the hippocampus of mice has an antidepressant and anxiolytic effect [53], and treatment with antidepressants leads to an increase in CREB expression [54,55]. In addition, the chronic antidepressant admin- istration modifies hippocampal expression of multiple components of the Wnt/β-catenin cascade, including an increase of WNT2, a subtype of Wnts [56]. In contrast to patients with MTLE without comorbid disorders, patients with MTLE plus anxiety and depression showed a less significant overexpression of REST/NRSF. Future studies should be carried out to determine the mechanism by which the REST/NRSF- induced silencing of genes avoids psychiatric disorders in MTLE. The AEDs received by patients during the presurgical period are another factor that can explain the changes in REST/NRSF expression. Topiramate and oxcarbazepine positively regulate CREB and activate the WNT pathway through Glycogen Synthase Kinase 3 (GSK3) [57–59]. In contrast, drugs such as levetiracetam and valproic acid neg- atively regulate CREB and inhibit GSK3β [60–62]. Antiepileptic drugs such as clobazam and lamotrigine do not induce changes in regulatory molecules of the WNT pathway [62]. In the present study, it was not possible to identify the influence of each AED administered during the presurgical period because all patients received polytherapy. Future studies in experimental models should be designed to identify the role of AEDs in the overexpression of REST/NRSF. 5. Conclusions The findings obtained in the present study indicate that REST/ NRSF is overexpressed in the hippocampus of patients with pharmacoresistant MTLE and that its protein expression is depen- dent on the frequency of epileptic seizures. In addition, our results support the notion that the increased expression of REST/NRSF is as- sociated with lower comorbid mood disorders. Finally, the overex- pression of this repressor transcription factor may be important in the regulation of genes that actively participate in the excitatory or inhibitory processes that lead to the development of MTLE and its comorbidities. Acknowledgments Thismanuscript constitutes a partial requirement to obtain the Ph.D. degree in the postgraduate program of “Ciencias Biomédicas” at the Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). Víctor Navarrete-Modesto received support from Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) (CVU 377494, grant 243431). Luisa Rocha re- ceived support from CONACyT (grant 220365). Sandra Orozco-Suárez received support from Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS) (Project R-2017-785-100). Conflict of interest None of the authors has any conflict of interest to disclose. We confirm that we have read the Journal's position on issues involved in ethical publication and affirm that this report is consistent with those guidelines. 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Feria-Romerob, Luisa Rochac, ⁎ a Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, Ciudad de México, México bUnidad de Investigación Médica en Enfermedades Neurológicas, Hospital de Especialidades “Dr. Bernardo Sepúlveda”, Centro Médico Nacional Siglo XXI, Instituto Mexicano desssl Seguro Social, Ciudad de México, México c Departamento de Farmacobiología, Centro de Investigaciones y Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional (CINVESTAV), México A R T I C L E I N F O Keywords: Epigenetics Chromatin Epilepsy Antiepileptic drugs A B S T R A C T Epilepsy is associated with several epigenetic changes, such as DNA methylation, histone modification, and alterations in the synthesis and functioning of non-coding RNAs (ncRNAs). Paradoxically, antiepileptic drugs (AEDs) that are widely used to control epilepsy may also induce epigenetic modifications and alter the structure of chromatin. As a consequence, changes in the expression of various factors involved in the pathology of epi- lepsy may positively or negatively affect the course of the disease. It should be noted that while AEDs are widely used in the treatment of epilepsy and other neurological disorders, many of their epigenetic consequences are still unknown. Moreover, an improved understanding of AED-induced epigenetic alterations could provide new targets for future therapeutic interventions. In this review, we give a general overview of the current scientific evidence concerning the epigenetic effects of AEDs that are currently in clinic use and have been evaluated to date. 1. Introduction Epilepsy is a neurological disorder with a high prevalence world- wide (4.7 to 12 per 1000) (Ngugi et al., 2010). People suffering from epilepsy present with spontaneous recurrent seizures that are a result of brain alterations. The quality of life for people with epilepsy can be impaired due to seizure activity, a high likelihood of mood and psy- chiatric disorders, cognitive alterations and the side effects of anti- epileptic drugs (AEDs). The purpose of any pharmacological anticonvulsant treatment is to control the epileptic activity and comorbid disorders, as well as to improve the quality of life for the patient (Wei et al., 2015). However, AEDs induce a number of side effects that include cognitive and be- havioral disorders (Cavanna et al., 2010; Loring and Meador, 2001) and emotional (Brodie et al., 2016) and endocrine impairments (Hamed, 2016). People with epilepsy present a high comorbidity of psychiatric disorders including psychosis, neuroses, mood disorders and behavioral changes with epilepsy (Tellez-Zenteno et al., 2007). Depression in epilepsy, the most common comorbidity, is associated with multiple risk factors, specific types of seizures and various biochemical altera- tions (Gaitatzis et al., 2004). Moreover, people with epilepsy are 2–11 times more likely to have schizophrenia than the people without epi- lepsy, depending upon the severity of seizures (Fruchter et al., 2014). Personality disorders, especially Borderline Personality Disorder (BPD) and bipolar disorder (BD), have a high prevalence (18%) in people with epilepsy. A number of explanations of the high comorbidity of psy- chiatric disorders in epilepsy have been put forth, including genetics, structural changes and pharmacological therapies (Sucksdorff et al., 2015; Swinkels et al., 2003). In addition, people with epilepsy may develop treatment-emergent psychiatric adverse events of AEDs, re- gardless of the mechanism of action of the drug (Mula, 2017; Mula et al., 2007). This information leads to suggest that epigenetic changes induced by AEDs in people with epilepsy may be involved in the high prevalence of comorbid psychiatric disorders (see Section 4), and they have to be considered during clinical therapy. Epigenetic modifications at the level of DNA or histones that are associated with epilepsy, as well as other mediating factors, could re- present new targets for the development of more selective and effective AEDs that have fewer side-effects (Wei et al., 2015). For example, the design of epigenetic therapies that selectively inhibit DNA methylation and thereby reactivate the expression of silenced genes represents an option for epilepsy treatment. The first section of this review includes a general description of https://doi.org/10.1016/j.eplepsyres.2018.11.006 Received 3 April 2018; Received in revised form 16 October 2018; Accepted 14 November 2018 ⁎ Corresponding author at: Department of Pharmacobiology, Center for Research and Advanced Studies, Mexico City, México. E-mail address: lrocha@cinvestav.mx (L. Rocha). Epilepsy Research 149 (2019) 53–65 Available online 16 November 20180920-1211/ © 2018 Elsevier B.V. All rights reserved. T 11.5 Anexo 5: Otras Publicaciones (Articulo de Revisión) 91 epigenetics. The next section presents information regarding the in- volvement of epigenetic regulation in human epilepsy. The last section focuses on the presentation of evidence of the induction of epigenetic changes by AEDs. This information was obtained through bibliographic searches of PubMed (NIH) and Google Scholar using the following search terms: “epigenetics and epilepsy”, “epilepsy and DNA methyla- tion”, “epilepsy and histones modifications”, “epilepsy and… (each one of the most common histone modifications)”, “epilepsy and ncRNAs”, “epigenetics and AEDs” and “epigenetics and…(each one of the 33 AEDs in clinical use currently)” (Supplementary Table). This search found evidence of involvement in epigenetic changes for only 13 AEDs, while for the remainder (20 AEDs), no such evidence was found. 2. Epigenetic regulation of gene expression DNA is compressed hierarchically into the cell nucleus via its as- sociation with positively charged small alkaline proteins known as histones. Each of the histones (H2 A, H2B, H3 and H4) consists of a globular domain, a flexible domain, and a charged amino (NH2)-term- inal end that protrudes from the nucleosome, known as the “histone tail” (Fischle et al., 2003; Jenuwein and Allis, 2001; Marino-Ramirez et al., 2005). In addition, histone variants are isoforms of the four ca- nonical histones that also can be incorporated into the nucleosome, undergo modifications and perform specific functions (Marino-Ramirez et al., 2005; Vaquero et al., 2003). Together, DNA and histones are part of the nucleosomes, each of which consists of ∼147 bp of DNA wrapped 1.75 times around an octamer histone core and constitutes the first level of chromatin compaction (Devaskar and Raychaudhuri, 2007). The second level of chromatin organization is the pearl necklace, which is composed of 11-nm beads (nucleosomes) connected by a fragment of DNA of ∼10–60 bp (Hansen, 2012; Vaquero et al., 2003). The third level of chromatin organization results when the "pearl necklace" is wrapped approximately six times to form a circular fibrillary structure of ∼30 nm in diameter that is stabilized by a histone known as an H1 linker (Vaquero et al., 2003). The fourth level of chromatin compaction consists of 300-nm loops. The fifth level of compaction occurs when these loops are folded into 250-nm fibers that are packed together to form chromatids, which comprise one-half of the two identical threadlike strands that make up each chromosome (Annunziato, 2008) (Fig. 1). The mechanism known as chromatin remodeling regulates the transcriptional state of DNA via a coordinated system of ATP-dependent protein complexes that are known as chromatin remodeling complexes (CRCs). These complexes regulate the degree of compaction of the chromatin by moving, expelling or restructuring the nucleosomes (Clapier and Cairns, 2009), in order to favor or prevent the binding of transcription factors to their specific binding sites within DNA (Li et al., 2015). Chromatin is found in two states: a) heterochromatin, which is in- accessible to the transcription process due to its tightly packed condi- tion, and b) euchromatin, which is less tightly packed in a way that facilitates the transcription process (Bannister and Kouzarides, 2011; Devaskar and Raychaudhuri, 2007; Grewal and Moazed, 2003) (Fig. 1). The conversion of heterochromatin into euchromatin and vice versa depends on the cell cycle and the environmental requirements of the cell (Bannister and Kouzarides, 2011). Epigenetics, strictly speaking, is defined as “genetics out of the or- dinary" (Jaenisch and Bird, 2003) and refers to heritable changes in gene expression and cell phenotype outside of modifications that affect the Watson-Crick pairing of bases (Goldberg et al., 2007). These mod- ifications can regulate the structure of chromatin and provide a 'fin- gerprint' based on the environmental experiences of the cell (including its history of exposure to pharmaceuticals). The known epigenetic mechanisms that can modify gene expression without altering the DNA sequence are described below. 2.1. DNA methylation Methylation is the covalent addition of methyl groups (eCH3) to cytosine residues that reside predominantly in CpG islands. These are regions of greater than 500 bp that are rich in guanine and cytosine (G+C) and are usually located within promoter regions, which are sites involved in the initiation and regulation of transcription (Bannister and Kouzarides, 2011; Egger et al., 2004; Fazzari and Greally, 2004). Over 60% of eukaryotic genes contain CpG islands in their promoters, and most are demethylated or hypomethylated (i.e., having a low proportion or loss of methyl groups) at all stages of development and in all tissues (Antequera, 2003). During aging or in several pathologies, however, a fraction of the CpG islands are liable to be methylated or hypermethylated (i.e., having excessive methyl groups) (Issa, 2000). Methylation is carried out by DNA methyltransferases (DNMTs), proteins that are responsible for the de novo methylation of genes during the early stages of development (DNMT 3A and 3B) as well as the maintenance of established patterns of methylation (DNMT 1) (Bhutani et al., 2011; Tost, 2010). In contrast, the ten-eleven translo- cation (TET) protein family is primarily responsible for demethylation, which involves the removal or modification of 5mC methyl groups by hydroxylation via the formation of 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) and other oxidation processes (Bhutani et al., 2011) (Fig. 1). The methylation of CpG dinucleotides may induce the inhibition of transcription and thereby repress genes by stabilizing their inactivation (Bird, 2002). Indeed, gene coding regions can also be strongly methy- lated as a mechanism of silencing alternative promoters, retro- transposons and other functional elements in order to maintain tran- scriptional efficiency (Yang et al., 2014). Various factors are involved in the methylation process. Methyl-CpG binding proteins (MBPs, complexes containing proteins such as MBD1, MBD2, MBD3 and MeCP2) mediate transcriptional repression via par- ticipation in three mechanisms: a) the addition of methyl groups that interfere with DNA-protein interactions, b) the methylation of CpG is- lands that attract inhibitory proteins; c) the recruitment of other asso- ciated proteins, such as histone deacetylases (HDACs), which are en- zymes that remove acetyl groups (Bird, 2002; Nan et al., 1998; Tost, 2010). 2.2. Histone modifications Histone modification is another type of epigenetic mechanism by which more than 100 different post-translational modifications may occur at the amino (N)-terminal ends of the histone tails in nucleo- somes. Such modifications include methylation, acetylation, ubiquiti- nation, phosphorylation, citrullination, ADP-ribosylation, sumoylation, and proline isomerization (Li et al., 2007) (Fig. 1). These modifications can result in the activation or repression of gene transcription, de- pending on the identity and location of the amino acid residue that is modified (Bernstein et al., 2007; Devaskar and Raychaudhuri, 2007; Li et al., 2007). Currently, the most commonly studied modifications are histone methylation, which leads to transcriptional silencing, and acetylation, which leads to transcriptional activation. There are a number of different types of effector proteins that mediate histone modification, including histone methyltransferases (HMTs), which are responsible for histone methylation, histone acetyltransferases (HATs), which mediate histone acetylation, and histone demethylases (HDMets), which remove methyl groups and HDACs (Devaskar and Raychaudhuri, 2007). In particular, the acetylation of lysine 9 in his- tone 3 (H3K9ac) and the trimethylation of lysine 4 in histone 3 (H3K4me3), as well as the general acetylation of H3, are associated with the active state of euchromatin, while the trimethylation of lysine 27 in histone 3 (H3K27me3) is associated with the silencing of het- erochromatin (Lee et al., 2015). ADP-ribosylation is another post-translational modification of his- tones that is mediated by ADP-ribose transferases, which transfer single V. Navarrete-Modesto et al. Epilepsy Research 149 (2019) 53–65 54 92 or multiple ADP-ribose moieties from NAD+ to histone tails. This modification is of great biological importance due to its participation in the processes of DNA repair, cell proliferation, apoptosis, gene tran- scription and signal transduction (Liu and Yu, 2015; Messner and Hottiger, 2011). In addition, there is a code that can be read and interpreted by the CRCs, known as the histone code, that transmits information about the presence of epigenetic changes and how they may influence other modifications (Jenuwein and Allis, 2001; Nightingale et al., 2006) and thereby modifies the rate of gene transcription (Egger et al., 2004; Strahl and Allis, 2000). 2.3. Non-coding RNAs Non-coding RNAs (ncRNAs) are RNA transcripts that do not encode proteins and therefore cannot be translated (Saetrom et al., 2007). They can be classified as short/micro (< 200 nt) or long/macro (> 200 nt) ncRNAs, depending on their size (Henshall and Kobow, 2015). The most studied ncRNAs are small interfering RNAs (siRNAs) and micro- RNAs (miRNAs), which are both processed by the proteins Dicer and RISC but differ in their biogenesis (Fig. 1). In their mature form, these ncRNAs are 21–26 nucleotides in length and must be joined to the complementary mRNA sequence to induce effects (Valencia-Sanchez et al., 2006). The regulation of genes by siRNAs is via the highly specific (single target) endonucleolytic cleavage of mRNA. miRNAs, on the other hand, usually induce transcriptional repression via the degrada- tion and proteolytic cleavage of mRNA within the 3′UTR region of as many as 100 target genes (Lam et al., 2015). In addition to regulating the stability and translation of mRNAs, siRNAs and miRNAs induce gene silencing through the promotion of methylation and the alteration of the structure of chromatin (Castanotto et al., 2005; Godfrey et al., 2007; Holmes and Soloway, 2006; Morris et al., 2004; Suzuki et al., 2005). Specifically, miRNAs are able to bind to histones and induce DNA methylation at specific loci (Egger et al., 2004; Godfrey et al., 2007; Wang et al., 2015), whereas siRNAs regulate the structure of chromatin via their interaction with the nuclease Dicer (Fukagawa et al., 2004) The long non-coding RNAs (lncRNAs) are a family of molecules located primarily in the nucleus that includes enhancer RNAs (eRNAs), antisense transcripts and intergenic RNAs (Henshall and Kobow, 2015). These lncRNAs control the structure and function of chromatin via the promotion of DNA methylation through the recruitment of DNMTs, the repositioning of the nucleosome and the formation of chromatin loops (Bohmdorfer and Wierzbicki, 2015). They also regulate, both positively and negatively, the transcriptional machinery and the stability of mRNA (Bohmdorfer and Wierzbicki, 2015; Kung et al., 2013). In the brain, the expression of lncRNAs differs depending on the region, stage of development, pluripotential conditions, and the status of neuronal and glial differentiation (Briggs et al., 2015; Quan et al., 2017). lncRNAs are involved in developmental processes, such as X-chromo- some silencing and genomic imprinting, as well as diseases such as cancer (Kung et al., 2013) and α-thalassemia (Tufarelli et al., 2003). At present, lncRNAs are considered to be potential targets for the treat- ment of neurological disorders. In an experimental model of Dravet Syndrome that was caused by a heterozygous loss-of-function mutation in the SCNA1 gene, Hsiao et al., (2016) demonstrated that the blockage of the repressor effect mediated by a lncRNA known as SCN1ANAT resulted in upregulation of the SCNA1 gene, leading to subsequent improvement in the control of convulsive activity and the excitability of hippocampal interneurons. 3. Epigenetic regulation in human epilepsy Epilepsy is a neurological disorder that is associated with great complexity in its epigenetic influences due to the presence of multiple etiologies (Qureshi and Mehler, 2010). The results of studies of both human and experimental models indicate that epileptogenesis and epilepsy itself are associated with the alteration of DNA methylation Fig. 1. Spatial organization of the genome and its epigenetic modifications. Chromosomes are formed from DNA "packaged" by histones into nucleosomes, and their structure depends on the degree of chromatin compaction, with heterochromatin being highly compacted and transcriptionally silent, while euchromatin has a more open structure and is transcriptionally active. The state of chromatin compaction can be regulated by epigenetic changes (DNA methylation via DNMTs; histone modifications through effector proteins; and the expression of ncRNAs) and depends on the transcriptional requirements of the cells. -NH2, N (amino)-terminal group; −CH3, methyl group; ncRNAs; DNMT, DNA methyltransferase; H1, histone 1, H2 A, histone 2 A; H2B, histone 2B; H3, histone 3; H4, histone 4; siRNA, miRNA, micro-RNA; non-coding RNAs; small interfering RNA; TET, Ten-Eleven traslocation protein. V. Navarrete-Modesto et al. Epilepsy Research 149 (2019) 53–65 55 93 Table 1 Epigenetic modifications induced by Antiepileptic Drugs (AEDs). DNA methylation AED Specific genes DNMT TET family Hypermethylation Hypomethylation CBZ GABRA1 gene 64 promoters in SK-N-SH neuroblastoma cells. SLC6A4 gene 14 promoters in SK-N-SH neuroblastoma cells. NA NA LCM NA NA NA NA LMT Contradictory results Contradictory results Global MTHFR amplicon NA NA OXC GABRB2 promoter NA NA NA PHT NA Global NA NA ESX NA NA Induces DNMT 1 and DNMT 3A NA GBP NA NA NA NA PB CDKN2 A gene (tumor suppressor protein p16) Global HRAS gene CYP2D10 gene Induces DNMT 1 NA VGB NA NA NA NA CBD Global KRT10 promoter NA Inhibit DNMT 1 NA LVT NA NA NA NA TPM NA NA Inhibit DNMT 1, DNMT 3A and DMAP1 NA VPA 64 promoters in SK-N-SH neuroblastoma cells. RELN gene. 36 promoters in SK-N-SH neuroblastoma cells. ALOX5 gene Global in epilepsy patients NA Inhibit mitochondrial TET1 Histones Modifications H1 H2A H2B H3 H4 HDACs Induction Inhibition CBZ NA NA NA NA Induction of Acetylation HDACs 2, 3, 5 and 8 Binding of HDAC1 to CYP3 A4 promoter HDACs of class I & II LCM NA NA NA NA NA NA YES LMT NA NA NA Induction of acetylation Induction of acetylation HDACs 2, 3, 5 and 8 YES HDACs 1 and 7 OXC NA NA NA NA NA NA NA PHT NA NA NA NA NA NA NO ESX NA NA NA NA NA NA NO GBP NA NA NA NA Does not induce acetylation NA NO PB Induction of ADP- ribosylation Not dependent ADP- ribosylation Induction of ADP- ribosylation Induces H3K4me3 and inhibits H3K9me3 in UGT1A gene. Induces H3K27me3, H3K4me2 and H3K9ac and inhibits H3K27me3 in CYP2B10 gene. Induces H3K4me3 in CYP3 A11 gene. Not dependent ADP- ribosylation NA NA VGB NA NA NA NA Induction of acetylation NA NO CBD NA NA NA Induces H3K9ac NA NA NA LVT NA NA NA Induction of acetylation NA HDACs 2, 3, 5 and 8 NA TPM NA NA NA NA Induction of acetylation NA NO VPA NA Induction of acetylation. NA Induction of acetylation Induces H3K9ac and H3K4me3 in LEPR gene. Induces acetylation in GAD1(67), MAGEB2 and MMP2 genes. Inhibits H3K27me3 in LEPR gene. Induction of acetylation. Induction of acetylation in CDKN1A (p21WAF1/CIP1) gene. Induction of acetylation in, MAGEB2 and MMP2 genes NA HDACs of class I & II HDACs 1, 2, 3, 5 and 7 ncRNAs Long RNAs Short RNAs miRNAs siRNAs Induction Inhibition CBZ NA NA NA NA LCM NA NA NA NA LMT NA NA NA NA OXC NA miR-134 NA NA PHT NA NA NA NA ESX NA NA NA NA (continued on next page) V. Navarrete-Modesto et al. Epilepsy Research 149 (2019) 53–65 56 94 signatures throughout the entire genome (Debski et al., 2016; Kobow and Blumcke, 2012). People with drug-resistant temporal lobe epilepsy (TLE) show an increase in the expression of DNMT1 and DNMT3 A in the temporal neocortex, which is associated with alterations in the excitability of neural networks and synaptic plasticity (Zhu et al., 2012). Human TLE is also associated with aberrant methylation of the promoters of genes that are involved in the development of seizures (Cpa6) and the dispersion of hippocampal granule cells (Reln) (Belhedi et al., 2014; Kobow et al., 2009). With regard to histone modification, epilepsy has been found to be associated with the overexpression of HDAC2, which is associated with an increase in deacetylase activity and inactivation of chromatin. These processes are involved in the regulation of genes associated with sy- naptic activity, plasticity and NMDA receptors, in both human (BDNF) and experimental models (Erg1, Creb1, fos) (Guan et al., 2009; Huang et al., 2012; Park et al., 2014). Epilepsy has been associated with modifications of ncRNAs. It has been suggested that a polymorphism in the 3′-UTR of the AP3M2 gene blocks the miR-422a binding site, which in turn facilitates epilepto- genesis in humans (Huang et al., 2007). Fragile X syndrome people who develop epilepsy show changes in the expression of the FMR4 and ASFMR1 lncRNAs (Khalil et al., 2008; Ladd et al., 2007), as well as alterations in the function of FMRP (Fragile X Mental Retardation protein), which is associated with the deregulation of miRNA pathways (Qureshi and Mehler, 2010). Seizure activity is also associated with the alteration of factors that are involved in regulating epigenetic modification. For example, in Rett syndrome, which is a neurodevelopmental disorder characterized by mental retardation, stereotypical behaviors, and recurrent seizures, there are mutations and duplications of the MECP2 gene that have functional implications for DNA methylation processes (Amir et al., 1999; Jian et al., 2006; Kinde et al., 2016). Alpha-thalassemia X-linked intellectual disability (ATR-X) syndrome, characterized by mental re- tardation, altered facial and genital morphology, and the development of epilepsy in 30% of those affected, results from mutation of the ATR-X gene that encodes a CRC that is involved in the formation of hetero- chromatin at mammalian centromeres and telomeres (De La Fuente et al., 2011; Guerrini et al., 2000). People with Sotos syndrome, also known as cerebral gigantism, have a high risk of seizures that is asso- ciated with mutations and deletions in the NSD1 gene, which encodes a histone methyltransferase (Baujat and Cormier-Daire, 2007). Mutations in the KDM5C (SMCX/JARID1C) histone demethylase gene have been directly associated with epilepsy and X-linked mental retardation (Abidi et al., 2008; Tzschach et al., 2006). Repressor element 1 (RE1)- silencing transcription factor/neuron-restrictive silencer factor (REST/ NRSF) represses the transcription of many neurological genes, in- cluding those related to epileptogenesis and epilepsy (Tahiliani et al., 2007). The absence of the interaction of REST/NRSF with the LIM domain protein as a consequence of mutations within the REST-inter- acting LIM domain protein (PRICKLE1/RILP) induces an autosomal- recessive, progressive myoclonus epilepsy-ataxia syndrome (Bassuk et al., 2008). Overall, there is much evidence to support the fact that epigenetic modifications commonly play a role in epilepsy. However, it is un- known at present whether or not epigenetic alterations are the con- sequence of treatment with AEDs. 4. Epigenetic modifications associated with AEDs According to the International League Against Epilepsy (ILAE), there are four types of epilepsy: focal epilepsies, which include unifocal and multifocal syndromes as well as seizures comprising one hemi- sphere; generalized epilepsies, in which the epileptiform activity ap- pears in the whole brain and is detected by EEG; combined generalized and focal epilepsy; this represents a combination of the first two types; and epilepsy of unknown type, a condition difficult to be determinate due to the lack of information (Scheffer et al., 2017). Therapy with AEDs focuses on the reduction of excessively fast neural firing during seizures and the avoidance of the spread of epi- leptic activity to surrounding brain areas through activity against dif- ferent targets that modulate neuronal activity. The most important channels that are involved in maintaining neuronal function (Na+, K+, Ca2+ and Cl− channels) are critical tar- gets for old and new AEDs (Brodie et al., 2016). The augmentation of inhibitory effects mediated by γ-aminobutyric acid (GABA) or the re- duction of neuronal excitation through the blockade of glutamatergic effects are also mechanisms utilized by AEDs (Barker-Haliski and White, 2015). Additionally, AEDs may also induce epigenetic changes that modify the course of the disease. This section describes the pre- sently known epigenetic effects of 13 AEDs that are in wide clinical use. Although other AEDs can induce epigenetic changes, there is not in- formation to support this notion (Table 1, Figs. 2–4). Table 1 (continued) ncRNAs Long RNAs Short RNAs miRNAs siRNAs Induction Inhibition GBP NA Does not induce miR-107 NA NA PB miR-200a/200b/429 and miR-96/182 miR-122 NA NA VGB NA NA NA NA CBD NA NA NA NA LVT miR-206, miR-374, miR-142-5p and miR-468 NA NA NA TPM NA NA NA NA VPA miR-144, miR-331, miR-30a-5p, miR-20a, miR-34a, miR-449a, miR-221, miR-15a, miR-16, miR-129, miR-519e, miR-194, miR-214, miR-449a, miR- 182, miR-206, miR-133a and miR-10a let-7b, let-7c, miR-128a, miR-24a, miR-30c, miR-34a, miR-885-3p, miR-222, miR-15a, miR-16, miR-144, miR-451, miR-155, miR-127a, miR-124a, miR-128 and miR-137 NA NA ALOX5, 5-lipoxygenase gene; CBD, Cannabidiol; CBZ, Carbamacepine; CDKN1A, cyclin-dependent kinase inhibitor 1 gene; CDKN2 A, cyclin dependent kinase inhibitor 2 A gene; CYP3 A4, Cytochrome P450 Family 3 Subfamily A polypeptide 4 gene; CYP3 A11, cytochrome P450 family 3 subfamily A polypeptide 11 gene; CYP2D10, cytochrome P450 family 2 subfamily D polypeptide 10 gene; DMAP1, Protein Associated with Dnmt1; DNMT, DNA methyltransferase; ESX, ethosuximide; GBP, gabapentin; GABRA1, GABAA receptor subunit α1 gene; GABRB2, GABAA receptor subunit β2 gene; GAD67, Glutamate Decarboxylase 1 (67 kDa) gene; H1, histone 1, H2 A, histone 2 A; H2B, histone 2B; H3, histone 3; H4, histone 4; HRAS, ha-ras proto-oncogene; HDAC, histone deacetylases; KRT10, keratin 10 gene; LCM, lacosamide; LEPR, Leptin Receptor gene; LMT, lamotrigine; LVT, levetiracetam; MAGEB2, Melanoma-associated antigen B2 gene; MMP2, Matrix Metallopeptidase 2 gene; MTHFR, methylenetetrahydrofolate reductase gene; miRNA, micro-RNA; NA, No information Available; OXC, oxcarbazepine; PHT, phenytoin; PB, pheno- barbital; RELN, reelin gene; siRNA, small interfering RNA; SLC6A4, solute carrier family 6 member 4 gene; TET, Ten-Eleven traslocation protein; TPM, topiramate; UGT1A, UDP-Glucuronosyltransferase Family 1 polypeptide A gene; VPA, valpric acid; VGB, vigabatrine. V. Navarrete-Modesto et al. Epilepsy Research 149 (2019) 53–65 57 95 4.1. AEDs that target voltage-dependent Na+ channels 4.1.1. Carbamazepine (CBZ) The main mechanism of action of carbamazepine is the blockade of voltage-gated Na+ channels. It is used to control focal or generalized seizures (Cotterman-Hart, 2015a; Sheets et al., 2008; Willow et al., 1984). Regarding its epigenetic effects, there is evidence that CBZ has effects on DNA methylation; the results of an in silico study suggested that CBZ modifies the methylation patterns of the GABAA receptor subunit α1 (GABRA1) gene (Houtepen et al., 2016). An in vitro genome- wide methylation study analyzing 14,475 genes in SK-N-SH neuro- blastoma cells demonstrated that CBZ induced hyper- and hypomethylation in CpGs in 64 and 14 gene promoters, respectively. One of the hypomethylated promoters is that of SLC6A4, which encodes a protein that transports serotonin in presynaptic neurons and could therefore affect the therapeutic efficacy of CBZ (Asai et al., 2013) (Table 1, Fig. 2). Concerning histone modification, observations indicate that CBZ diluted in hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HBC) induces H4 acetylation and inhibition of HDAC I and II in HepG2 cells (human liver cancer cell line) (Beutler et al., 2005). However, this effect was not detected in HeLa cells when CBZ was diluted in DMSO (Eyal et al., 2004). In C57BL/6 mice, CBZ induced the synthesis of HDACs in the striatum (HDAC2, HDAC3, and HDAC8), nucleus accumbens (HDAC2 and Fig. 2. Changes in DNA methylation elicited by AEDs. AEDs such as carbamazepine (CBZ), phenobarbital (PB) and valproic acid (VPA) can induce both genome-wide and gene-spe- cific hypermethylation and hypomethylation. Cannabidiol (CBD) induces both genome-wide and gene-specific hypermethylation and the inhibition of DNA methyltransferase (DNMT) 1. Genome-wide and gene-specific hypo- methylation is induced by lamotrigine (LMT), oxcarbazepine (OXC) and phenytoin (PHT). Ethosuximide (ESX) induces the expression of DNMT1 and 3 A; in contrast, topiramate (TPM) inhibits the expression of DNMT1 and the Protein Associated with Dnmt1 (DMAP1). VPA inhibits the expression of mitochondrial TET (Ten-Eleven traslocation protein) 1. Black ar- rows indicate active transcriptional processes; brown arrows indicate the induction of pro- cesses; and the dashed blue lines indicate in- hibition. 5-LOX, 5-lipoxygenase gene; A, ade- nine; CYP2D10, cytochrome P450, family 2, subfamily d, polypeptide 10 gene; C, cytosine; G, guanine; GABRA1, GABAA receptor subunit α1 gene; GABRB2, GABAA receptor subunit β2 gene; HA-RAS, ha-ras oncogene; K10, keratin 10 gene; MTHFR, methylenetetrahydrofolate reductase gene; P16, P16 gene; RELN, reelin gene; SLC6A4, solute carrier family 6 member 4 gene; T, timine. Fig. 3. Histone modifications mediated by AEDs. CBZ, LMT, TPM and vigabatrine (VGB) induce the acetylation (ac.) of H4, while VPA induces the acetylation of H2 A, H3 and H4. Acetylation of H3 is induced by LMT, levetiracetam (LVT) and CBD. PB can induce or inhibit the methylation (me) and acetylation of H3, and it can also affect the ADP-ribosylation of H1 and H2B, but not of H2 A and H4. Gabapentin (GBP) does not induce acetylation of H4. CBZ, LMT and LVT induce the expression of HDAC (Histone deacetylases) 2, 3 5 and 8. The expression of class I and II HDACs is reduced by CBZ, LMT, VPA and lacosamide (LCM). ESX, PHT, GBP, TPM and VGB do not inhibit (red X) HDACs. Some notations and abbreviations are the same as those used in Figs. 1–2 and Table 1. V. Navarrete-Modesto et al. Epilepsy Research 149 (2019) 53–65 58 96 HDAC3), and amygdala (HDAC3 and HDAC5) (Ookubo et al., 2013). Furthermore, it is known that CBZ induces the binding of HDAC1 to the CYP3 A4 promoter, which is an isoform of CYP3A that metabolizes various drugs (Wu et al., 2012) (Table 1, Fig. 3). At present, there is no evidence that CBZ regulates the synthesis or function of ncRNAs. 4.1.2. Lacosamide (LCM) Its pharmacological mechanism involves the inactivation of voltage- gated Na+ channels (Asconape, 2013; Errington et al., 2008; Sheets et al., 2008). Concerning its role in epigenetic processes, one study has demonstrated its ability to inhibit HDACs in the cerebral cortex of Wistar rats at a dosage of 30mg/kg (Bang et al., 2015) (Table 1, Fig. 3). No evidence exists that LCM induces DNA methylation or changes in the synthesis or function of ncRNAs. 4.1.3. Lamotrigine (LMT) The pharmacological activity of LMT involves the blockade of vol- tage-sensitive Na+ channels, Ca2+ currents and the reduction of the release of excitatory amino acids (Stefani et al., 1996; Xie et al., 1995). It is used to control focal and generalized seizures, such as those as- sociated with Lennox-Gastaut syndrome (Cotterman-Hart, 2015b; Rathaur et al., 2017). Some studies have suggested that LMT does not induce changes in DNA methylation patterns (Ni et al., 2015; Perisic et al., 2010). However, other studies have shown a decrease in genome- wide levels of methylation in the umbilical cord blood and placenta of infants prenatally exposed to LMT and other drugs (Smith et al., 2012). In the peripheral blood of people with epilepsy, LMT induced a re- duction in the level of methylation of the methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) amplicon (Ni et al., 2015). LMT modifies DNA methylation levels in blood cells of people with BPD, supporting epi- genetic effects of psychotropic drugs (Houtepen et al., 2016) (Table 1, Fig. 2). In relation to histone modification, it is known that LMT increases H3 acetylation in the cingulate cortex and the nucleus accumbens of C67BL/6 mice (Ookubo et al., 2013). In cerebellar granule cells, LMT, in association with VPA, induced the hyperacetylation of H3 and H4, the inhibition of HDAC activity, and other effects associated with neuroprotective processes against glutamate-induced excitotoxicity (Leng et al., 2013). In C57BL/6 mice, LMT inhibited the synthesis of HDACs in the hippocampus (HDAC5 and HDAC7) and their activity in the striatum (HDAC2, HDAC3, and HDAC8), nucleus accumbens (HDAC2 and HDAC3), and amygdala (HDAC3 and HDAC5) (Ookubo et al., 2013) (Table 1, Fig. 3). At present, there is no evidence that LMT regulates the synthesis or function of ncRNAs. 4.1.4. Oxcarbazepine (OXC) OXC acts via the blockade of voltage-gated Na+ (and possibly Ca2+) channels and is used to control focal seizures (Cotterman-Hart, 2015b; Huang et al., 2008; Wellington and Goa, 2001). Regarding its epige- netic effects, a previous study suggested that OXC induces the methy- lation of CpG sites in the Alu region of the GABRB2 (subunit GABAb2) gene in people with schizophrenia (Zong et al., 2017) (Table 1, Fig. 2). The results of another study revealed that treatment with OXC inhibited the expression of miR-134 in people with psychosis and BPD (Rong et al., 2011) (Table 1, Fig. 4). There is no current evidence that OXC induces histone modification. 4.1.5. Phenytoin (PHT) PHT inhibits voltage-gated Na+ channels and, at high concentra- tions, augments GABAergic neurotransmission by reducing K+ efflux (De Weer, 1980; Wong and Teo, 1986). PHT is used to control focal and generalized seizures (Hanaya and Arita, 2016). With regard to DNA methylation, an overall decrease in the level of methylation was ob- served in neonates prenatally exposed to multiple AEDs, including PHT (Smith et al., 2012) (Table 1, Fig. 2). In addition, an experimental study indicated that PHT does not have inhibitory effects on HDACs in HeLa cells (Eyal et al., 2004) (Table1, Fig. 3). There is no current evidence that suggests that PHT regulates the synthesis or function of ncRNAs. 4.2. AEDs that target Ca2+ channels 4.2.1. Ethosuximide (ESX) ESX is used to control absence seizures, and its main pharmacolo- gical action is the reduction of low-threshold T-type Ca2+ currents (Cotterman-Hart, 2015a; Coulter et al., 1989; Kostyuk et al., 1992). Regarding its epigenetic effects, chronic treatment with ESX increases the expression of Dnmt1 and Dnmt3A mRNAs in the somatosensory cortex of Strasbourg rats that are used as a genetic model of absence seizures (Dezsi et al., 2013) (Table 1, Fig. 2). ESX does not inhibit HDAC activity, even at concentrations that are five-fold higher than a typical therapeutic dose (Eyal et al., 2004) (Table 1, Fig. 3). Currently, there is no evidence that ESX regulates the synthesis or function of ncRNAs. 4.2.2. Gabapentin (GBP) GBP is used to reduce focal seizures and neuropathic pain (Czapinski et al., 2005), and its pharmacological effects result from the inhibition of high-threshold Ca2+ channel currents and the enhance- ment of GABA levels (Bryans et al., 1998; Gee et al., 1996; Honmou et al., 1995). GBP is not able to inhibit HDACs or induce H4 acetylation Fig. 4. Regulation of ncRNAs by AEDs. PB can induce and inhibit the expression of miRNAs related to hepatotoxicity. VPA reduces the ex- pression of miRNAs related to neurogenesis, axonal orientation, neurite growth, neurodeve- lopment, ischemia, cancer, erythropoiesis, psy- chosis and BPD. LVT induces the expression of miRNAs associated with its pharmacological response. OXC inhibits miR134. GBP does not modify miR-107 expression. Some notations and abbreviations are the same as those used in Figs. 1–3. V. Navarrete-Modesto et al. Epilepsy Research 149 (2019) 53–65 59 97 in HeLa cells (Eyal et al., 2004) (Table 1, Fig. 3). It does not regulate miR-107 in K562 or KCL-22 myeloid leukemia cells (Ruan et al., 2015) (Table 1, Fig. 4). At present, the participation of GBP in DNA methy- lation processes has not been evaluated. 4.3. AEDs that affect GABAergic neurotransmission 4.3.1. Phenobarbital (PB) PB is effective in the treatment of multiple types of seizures, in- cluding focal, generalized and absence seizures (Czapinski et al., 2005; Macdonald and Barker, 1977), and it induces inhibitory effects as a consequence of the activation of GABAA receptors. PB also induces hepatotoxicity as a consequence of epigenetic changes. With regard to DNA methylation, chronic treatment with PB produces hypomethylation throughout the genome, mainly in cells susceptible to liver tumorigenesis (C3H/He and B6C3F1) (Watson and Goodman, 2002); such hypomethylation is also correlated with the transcriptional activation of the Ha-ras gene and other genes associated with angiogenesis, invasion, and metastasis. In B6C3F1 mice, PB in- duces the demethylation of two CpG islands in the Cyp2b10 gene, which is involved in drug metabolism (Bachman et al., 2006; Lempiainen et al., 2011; Phillips and Goodman, 2008). PB increases the activity and expresion of DNMTs and induces silencing of the p16 tumor-suppressor gene promoter via hypermethylation (Kostka et al., 2007). DNMT1 mRNA and protein levels have been shown to be augmented in the liver of Wistar rats who were administered PB (Urbanek-Olejnik et al., 2014) (Table 1, Fig. 2). It has been shown that PB augments H3K4me3 (thalamus and the striatum) and reduces H3K9me3 (thalamus) in Sprague Dawley rats. These variations promote the transcriptional activation of genes that encode UGT1A, which is a drug-metabolizing enzyme (Sakakibara et al., 2016). PB mediates the epigenetic modification of genes encoding other drug-metabolizing enzymes, such as those of the Cyp450 family. For example, in B6C3F1/Crl mice, chronic PB treatment leads to the conversion of the Cyp2b10 gene promoter from a repressed state (in- creased H3K27me3) to an activated state (increased H3K4me2 and H3K9ac, and decreased H3K27me3) (Lempiainen et al., 2011). Also, neonatal exposure to PB was found to induce Cyp450 gene expression in the liver of adult C57BL/6 mice, a condition that is associated with the presence of H3K4me3 in the Cyp3 A11 gene promoter (Tien et al., 2016). In Wistar rats, PB induced ADP-ribosylation in H1 and H2B histones but not in H2 A, H3 A, and H4 histones, a state that has been implicated in the regulation of hepatic metabolism (Braz and Lechner, 1986) (Table 1, Fig. 3). With respect to the regulation of ncRNAs, chronic treatment with PB induces the synthesis of miR-200a/200b/429 and miR-96/182 in the liver of Fisher rats (Koufaris et al., 2013). In contrast, PB inhibited the synthesis of miR-122, which is related to the function and differentia- tion of hepatocytes in C3H/HeN mice and in HepG2 and HuH-7 human hepatoma cells. Indeed, inhibition of miR-122 was also found to lead to the activation of the constitutive androstane receptor (CAR) gene, which regulates the expression of genes such as CYP2B and CYP3 A (Shizu et al., 2012) (Table 1, Fig. 4). 4.3.2. Vigabatrin (VGB) VGB enhances GABA levels via the inhibition of GABA transami- nase. It is used to control focal seizures and infantile spasms (Cotterman-Hart, 2015b; Jung et al., 1977). Regarding its epigenetics effects, one study in HeLa cells showed that VGB induces an insignif- icant increase in H4 acetylation and does not inhibit HDACs (Eyal et al., 2004) (Table 1, Fig. 3). At present, there is no evidence that VGB affects DNA methylation or synthesis and function of ncRNAs. 4.4. AEDs with multiple mechanisms of action 4.4.1. Cannabidiol (CBD) CBD is currently considered a multitargeted drug since it interacts with various endocannabinoid and non-endocannabinoid systems. It is a non-competitive antagonist of CB1 receptors and an inverse agonist of CB2 receptors. CBD acts as an agonist towards TRPV1-4, TRPA1, 5- HT1A, PPAR-γ and the α1 and α3 glycine receptor subunits. It is also an antagonist of TRPM8, GPR55 and voltage-gated T-type Ca2+ channels. CBD also modulates the TNFα, VDAC1 and adenosine (A1 and A2) re- ceptors (Ibeas Bih et al., 2015; Perucca, 2017). There is evidence to suggest that CBD is effective in the control of drug-resistant epilepsy (Friedman and Devinsky, 2016). With regard to its epigenetic effects, CBD increases the methylation of the keratin 10 (K10) gene promoter, as well as overall methylation in HaCaT human keratinocytes, via a process mediated by CB1 receptors. It also inhibits the overexpression of the DNMT1 gene without mod- ifying DNMT 3A, 3B, and 3L levels (Pucci et al., 2013) (Table 1, Fig. 2). CBD induces H3K9 acetylation in the ventral tegmental area (VTA) in C57BL/6 mice, which has been associated with processes related to addiction (Todd et al., 2017) (Table 1, Fig. 3). At present, there is no evidence that CBD regulates the synthesis or function of ncRNAs. 4.4.2. Levetiracetam (LVT) The antiepileptic effects of LVT result from its inhibition of N- and T-type Ca2+ channels and its binding to SV2 A synaptic proteins (Lukyanetz et al., 2002; Lynch et al., 2004; Madeja et al., 2003; Rigo et al., 2002). It has been found to be effective in controlling focal and generalized seizures (Hovinga, 2001). With regard to its epigenetic effects, studies have shown that LVT induces H3 acetylation in the cingulate cortex and the nucleus ac- cumbens and stimulates the production of HDAC2, HDAC3, and HDAC8 in the striatum and HDAC3 and HDAC5 in the amygdala of C57BL/6 mice (Ookubo et al., 2013) (Table 1, Fig. 3). There is some evidence to suggest that LVT regulates the expression of miRNAs, especially miR-206, miR-374, miR-142-5p, and miR-468, all of which have been found to regulate pharmacological responses in a murine model of pilocarpine-induced epilepsy (Moon et al., 2014) (Table 1, Fig. 4). At present, there is no evidence that LVT participates in DNA methylation. 4.4.3. Topiramate (TPM) TPM has been demonstrated to block voltage-dependent Na+ channels, potentiate GABAergic neurotransmission, antagonize non- NMDA-type receptors and reduce the currents generated by high vol- tage-activated Ca2+ channels (Mula et al., 2006). It is used to control focal and generalized seizures (Cotterman-Hart, 2015b; Czapinski et al., 2005). Concerning its epigenetic effects, there is evidence that indicates that TPM prevents ethanol-induced overexpression of DNMT1, DNMT3 A, and DMAP1 (Dnmt1-Associated Protein 1) in Wistar rats (Echeverry-Alzate et al., 2014) (Table 1, Fig. 2). An in vitro study in HeLa cells revealed that TPM induces H4 hy- peracetylation while having no effects on the competitive inhibition of HDACs (Table 1, Fig. 3) (Eyal et al., 2004). There is no evidence that TPM regulates the synthesis or function of ncRNAs. 4.4.4. Valproic acid (VPA) The pharmacologic effects of VPA include blockade of voltage-gated Na+ and T-type Ca2+ channels and inhibition of GABA degradation via the blockade of GABA transaminase. VPA is used to control generalized and absence seizures (Hanaya and Arita, 2016; Kelly et al., 1990; Macdonald and Bergey, 1978). With regard to DNA methylation, it has been found that VPA in- duces the hyper- and hypomethylation of 64 and 14 genes, respectively, in SK-N-SH cells (Asai et al., 2013). In another study, which was con- ducted in primary cultures derived from cerebellar granule cells, it was V. Navarrete-Modesto et al. Epilepsy Research 149 (2019) 53–65 60 98 demonstrated that VPA induced hypomethylation of the promoter of the neuronal 5-LOX (5-lipoxygenase) gene, leading to its transcriptional activation and the consequent stimulation of cell proliferation (Manev and Uz, 2002). In mouse 3T3-L1 fibroblasts, VPA reduced the level of 5- hydroxymethylcytosine in mitochondrial DNA (mtDNA) and decreased the mRNA and protein levels of the mitochondrial demethylation en- zyme TET1 (Chen et al., 2012). In people with Major Depressive Dis- order, BPD and schizophrenia, VPA was shown to induce hy- permethylation (silencing) of the RELN gene (approved name reelin), whose protein is involved in neuronal migration and regeneration (Chen et al., 2002; Houtepen et al., 2016). VPA has also been found to induce genome-wide hypomethylation in the peripheral blood cells of people with epilepsy (Tremolizzo et al., 2012) (Table 1, Fig. 2). VPA has been found to increase H3 acetylation in NIH 3T3 fibro- blasts, which leads to subsequent chromatin decondensation in both euchromatin and heterochromatin (Felisbino et al., 2014). The induc- tion of transcriptional repression by H3 hyperacetylation (e.g., by H3K27me3 in the KAT2B and HDAC9 genes) in human embryonic stem cells (hESCs) is mediated by similar changes in chromatin structure (Balmer et al., 2012). In contrast, a study conducted in the rat hippo- campal cell line H19-7/IGF-IR demonstrated that VPA increases the levels of H3K9ac and H3K4me3 and reduces the level of H3K27me3 in the Lepr (leptin receptor) gene, which leads to alterations in neuro- genesis and behavior (Lee et al., 2015). In primary cultures derived from astrocytes, VPA-mediated H3 acetylation increases the expression of Glial Cell-Derived Neurotrophic Factor (GDNF), which promotes neuroprotective effects in dopaminergic neurons (Wu et al., 2008). VPA also increases H3 acetylation in the cingulate cortex and the nucleus accumbens of C57BL/6 mice (Ookubo et al., 2013). VPA-induced H3 acetylation in the hippocampus of B6129SF2/J mice was associated with behavioral changes (Yildirim et al., 2003). H3 acetylation medi- ated by VPA was also shown to have neuroprotective and anti-in- flammatory effects in the cortex and striatum of Sprague-Dawley rats affected by cerebral ischemia (Kim et al., 2007; Ren et al., 2004). In the lymphocytes of people with schizophrenia and BPD, VPA induces genome-wide acetylation of H3 as well as the specific acetylation of RELN and glutamate decarboxylase 67 (GAD67) (Dong et al., 2007; Sharma et al., 2006). VPA-induced H3 acetylation has neuroprotective effects in rats suffering from intracerebral hemorrhage (Sinn et al., 2007). VPA treatment has been found to be associated with an increase in H3 acetylation in the peripheral blood of both people with epilepsy and healthy subjects (Tremolizzo et al., 2012) (Table 1, Fig. 3). H4 acetylation is also associated with transcriptional activation. It has been shown that VPA increases H4 acetylation and the binding of the transcription factors Ets-1 and Ets-2 to the promoter of FOXP3, which has been found to be indispensable in the regulation of T-reg cells, in human T-cells derived from umbilical cord blood (Fayyad- Kazan et al., 2010). VPA increases genome-wide H4 acetylation (Eyal et al., 2004). Indeed, the antiproliferative effects of VPA in a number of cancer cell lines have been explained by its increase in H4 hyper- acetylation in genes such as p21WAF1/CIP1 (Travaglini et al., 2009) (Table 1, Fig. 3). It is also known that VPA can induce simultaneous H3 and H4 acetylation in several carcinoma cell lines, including F9 (ter- atocarcinoma), HeLa (human cervical cancer) (Gottlicher et al., 2001), U937 (human monocytic lymphoma), K562 (human erythroleukemia) (Gurvich et al., 2004), and OVCAR-3 (human ovarian cancer) (Kwiecińska et al., 2014). In MCF-7 cells (human breast cancer), VPA induces the depletion of proteins that comprise the structural support for heterochromatin, including SMCs, DNMT1, and HP1 (Marchion et al., 2005). In H322, H513, and TE12 (thoracic carcinoma) cells, VPA induces cell cycle arrest and apoptosis (Ziauddin et al., 2006). Simi- larly, in medulloblastoma cells, VPA induces the expression of p21 and suppresses TP53, CDK4, and CMYC expression, leading to growth ar- rest, apoptosis and senescence (Li et al., 2005). This suggests that VPA may be an effective therapeutic agent for use in cancer treatment. However, the H3 and H4 hyperacetylation that is induced by VPA has been shown to also take place in non-neoplastic cells, such as the splenocytes of mice (Gottlicher et al., 2001). In neurons, this effect could modify cell excitability by altering the expression of certain genes, such as BDNF and GABAARα4 (Fukuchi et al., 2009). In HEK 293 T embryonic kidney cells, VPA induces H3 and H4 acetylation, which leads to the activation of MAGEB2 (melanoma antigen B2) and MMP2 (metalloproteinase 2) (Milutinovic et al., 2007) and the inhibi- tion of the JARID1A and EZH2 demethylases; it also leads to the hypo- and hypermethylation of H3K27 and H3K4, respectively (Ganai et al., 2015). VPA also induces the acetylation of H3 and the H2A variant in the peripheral blood of people with epilepsy (Tremolizzo et al., 2012) (Table 1, Fig. 3). Previous studies have indicated that VPA inhibits the activity of class I and II HDACs, with the exception of HDAC6 and HDAC10, in F9, HEK 293 T (Gottlicher et al., 2001; Gurvich et al., 2004), HeLa (Eyal et al., 2004), and NIH 3T3 cells (Felisbino et al., 2014) via the pro- teasomal degradation pathway (Kramer et al., 2003). Also, VPA has been demonstrated to inhibit the expression of HDAC1, HDAC2, HDAC5, and HDAC7 in various cancer cell lines (Kwiecińska et al., 2014; Papi et al., 2010). The inhibition of HDACs leads to alterations in the nuclear structure of prostate carcinoma LNCaP, C4-2, DU145, and PC3 cells (Kortenhorst et al., 2009). The teratogenic potential of VPA is mediated by its inhibition of HDACs and induction of H4 hyper- acetylation (Eikel et al., 2006). These mechanisms appear to be im- portant to the increase of the formation of GABAergic neurons (GABA neurogenesis) induced by VPA (Laeng et al., 2004). On the other hand, experimental evidence indicates that VPA blocks seizure-induced aberrant neurogenesis (Jessberger et al., 2007). In the hippocampus of C57BL/6 mice, VPA inhibits the production of HDAC5 and HDAC7, whereas in the cingulate cortex, it increases the production of HDAC3 and HDAC5 (Ookubo et al., 2013). In the pancreas, VPA induces a decrease in cell proliferation and differentiation via its inhibition of HDACs, which delays cellular recovery after pancreatitis (Eisses et al., 2015) (Table 1, Fig. 3). VPA participates in the regulation, synthesis and function of ncRNAs (Detich et al., 2003; Dong et al., 2010; Phiel et al., 2001). VPA reduces the expression of let-7b, let-7c, miR-128a, miR-24a, miR-30c, miR-34a, and miR-221 while increasing the expression of miR-144 in the hippocampus of Wistar rats. These changes involve processes re- lated to neurogenesis, axonal orientation, neurite growth, and neuro- development, as well as the PTEN, ERK, Wnt/β-catenin, and β-adre- nergic signaling pathways. Additionally, it has been shown that the inhibition of miR-34a by VPA induced the expression of metabotropic glutamate receptor 7 (GRM7) (Zhou et al., 2009). In experimental models of ischemia, VPA treatment induces miR-331 overexpression while reducing miR-885-3p overexpression. The functional implications of these changes, however, are not yet well understood (Hunsberger et al., 2012). In SH-SY5Y neuroblastoma cells, combined treatment with lithium and VPA induces the expression of miR-30a-5p, which is a post- transcriptional inhibitor of BDNF (Croce et al., 2014). In LNCaP and PC3 cells, VPA treatment induces the expression of miR-20a, miR-34a, and miR-449a, all of which participate in the regulation of processes underlying epithelial-mesenchymal transition in cancer (Xia et al., 2016). With regard to erythropoiesis-related miRNAs, VPA induces miR-221 and inhibits miR-222, miR-15a, and miR-16 in Epo/TF1 cells. In K562 cells, VPA induces miR-221, miR-15a, and miR-16 and inhibits miR-222. VPA inhibited erythropoiesis via the inhibition of miR-144, miR-451, and GATA-1 transcription factor, while it induced mega- karyocyte differentiation via the inhibition of miR-155 and the induc- tion of GATA-2 and miR-127a (Trecul et al., 2014). In HEK 293 cells, the decrease in miR-92a-1 (and other miRNAs) upon VPA treatment is mediated by the proteasomal degradation of DICER, which is an en- zyme that participates in the synthesis of miRNAs. Under the same experimental conditions, VPA was also found to increase the expression of miR-129, miR-519e, miR-194, miR-214, miR-449a, and miR-182, V. Navarrete-Modesto et al. Epilepsy Research 149 (2019) 53–65 61 99 which most likely occurred via a DICER-independent mechanism, such as the Argonaut-2-dependent synthesis of miRNAs (Zhang et al., 2013). During the neural to myogenic lineage shift, VPA induced the over- expression of muscle-related miRNAs, such as miR-206, miR-133a, and miR-10a, and inhibited specific neurological miRNAs, such as miR- 124a, miR-128, and miR-137 (Smirnova et al., 2014). Finally, it has been observed that the inhibition of HDACs by VPA induces changes in the expression of miR-21 and miR-31 in umbilical cord blood T cells (Fayyad-Kazan et al., 2010) (Table 1, Fig. 4). People with psychosis and BPD were found to have a low level of miR-134, a condition that could be reversed by a number of anti- psychotic drugs, including VPA (Rong et al., 2011). Also, in people with BPD, the administration with VPA facilitates the expression of miR-206, which is associated with BDNF gene polymorphisms that contribute to the treatment response and the susceptibility to this particular pa- thology (Wang et al., 2014) (Table 1, Fig. 4). 5. Concluding remarks This review provides specific evidence that supports the hypothesis that a number of AEDs induce epigenetic changes. It is important to consider that epigenetic research related to the use of AEDs has been insufficient to reach any definite conclusions. Further research is ne- cessary to fully investigate all of the epigenetic modifications that are induced by each AED. In the future, the epigenetic modifications in- duced by AEDs, whether they be beneficial or harmful, and their clin- ical consequences must be considered during clinical use in epileptic people. In addition, epigenetic modifications associated with epilepsy represent potential clues in the search for novel AEDs that are more effective and selective and have fewer side effects (Wei et al., 2015). Acknowledgments VNM is a Ph.D. student from the program of Biomedical Sciences at the National Autonomous University of México (UNAM). This study was supported by the National Council of Science and Technology (CONACyT) (scholarship 243431, grant 220365), and Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS) (Project R-2017-785-100). Appendix A. Supplementary data Supplementary material related to this article can be found, in the online version, at doi:https://doi.org/10.1016/j.eplepsyres.2018.11. 006. References Abidi, F.E., Holloway, L., Moore, C.A., Weaver, D.D., Simensen, R.J., Stevenson, R.E., Rogers, R.C., Schwartz, C.E., 2008. Mutations in JARID1C are associated with X- linked mental retardation, short stature and hyperreflexia. J. Med. Genet. 45, 787–793. 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We describe three approaches that represent an excellent opportunity for the study of the underlying mechanisms of pharmacoresistant epilepsy: in vitro electro- physiological recordings, in vitro procedures for receptor evaluation, and genomic analyses. These proce- dures could allow individual diagnosis and personalized treatment for patients with pharmacoresistant epilepsy. Key words Temporal lobe epilepsy , Human brain tissue , Electrophysiology , Receptor analysis , Genomic analysis 1 Introduction The human epileptic brain exhibits unique network, cellular, and molecular properties. Therefore, using brain tissue from patients with mesial temporal lobe epilepsy (MTLE) is a fi rst-rate opportu- nity to characterize the electrophysiological, histological, molecu- lar, and genetic properties in this pathological condition. There is an increase of interest in the study of epilepsy directly in human tissue, estimated by the number of publications on this topic between 1976 and 2005 [ 1 ] (Fig. 1 ). Epilepsy is one of the most common neurologic disorders [ 2 ]. It is estimated that approximately 50 million people is affected with epilepsy worldwide [ 3 ]. Despite the severity and high prevalence of this disorder [ 4 ], the underlying neurobiology mechanisms associ- ated with epilepsy are poorly understood. Indeed, most of what is known about epilepsy has been obtained from the research done in animal models. Studying human brain tissue in vitro offers a crucial opportunity for the understanding of the disease. The increment of epilepsy surgery [ 5 ] and its effectiveness to reduce pharmacoresis- tant epilepsy [ 6 , 7 ] has increased the availability of brain tissue from 11.6 Anexo 6: Otras Publicaciones (Capitulo de Libro) 104 204 patients with this disorder. In this review, we focus in the relevance of evaluating the human epileptic tissue using the following approaches: electrophysiology, receptor analysis, and genetic evaluation. 2 Epilepsy and In Vitro Electrophysiology The fi rst topic to be addressed is the electrophysiological approach to study the brain tissue obtained from patients with pharmacore- sistant epilepsy. This situation allows us to explore directly the activity of human single neurons and networks of brain structures of patients with drug-resistant epilepsy (Fig. 2 ). Once the focus has been identifi ed, surgery often involves the resection of specifi c brain structures involved in the generation and propagation of the seizure activity [ 6 ]. It is essential to proceed fast in order to preserve the tissue in optimal conditions. After brain tissue samples have been excised, it is optimal to place them imme- diately in ice-cold (4 °C) artifi cial cerebrospinal fl uid (ACSF) gassed with a 95 % O 2 –5 % CO 2 mixture. The ACSF composition used for slice perfusion during electrophysiological experiments varies, but it generally includes (in mM): NaCl 124–129, KCl 2–4, CaCl 2 1.6–2.4, MgSO 4 1.3–2, NaH 2 PO 4 1.24–1.25, NaHCO 3 21–26, and glucose 10 [ 1 , 8 ]. When tissue transportation takes long periods (30 min), it is advised to use ACSF reduced in Na + (to prevent hypoxia-induced Na + infl ux) and α-tocopherol in addition (as a free radical scavenger) [ 9 ]. The thickness of brain slices varies depending if the procedure involves the evaluation of individual neurons or networks. Commonly it goes from 300 to 750 μm [ 8 – 14 ], although it is recom- mended a maximum of 600 μm for a proper slice oxygenation [ 1 ]. Fig. 1 Histogram showing the number of publications containing “human brain tissue” in PubMed search Leonardo Lara-Valderrábano et al. 105 205 It is important to consider that some types of epilepsy, such as mesial temporal lobe epilepsy (MTLE), are associated with neuro- nal damage and hippocampal sclerosis [ 15 – 17 ]. This condition makes the tissue diffi cult to be penetrated by the pipette or elec- trode. Also, the usual method to visualize neurons in patch- clamp mode (infrared differential interference contrast optics) could be diffi cult to implement. Reports about the evaluation of human cortex unitary activity in vivo exist since 1956 [ 18 ]. Extracellular fi eld potentials or uni- tary neuron recordings in vitro are valuable alternatives for the study of the underlying cellular mechanisms of epilepsy depending on the main goal of the study. Field potential recordings are used to study extracellular activity of network synchronization activity in hippocampal preparations [ 11 ] and synaptic plasticity properties [ 19 ]. This approach allows the description of spontaneous and rhythmic activity initiated in the subiculum, a condition that resem- bles the epileptiform discharges recorded by intracranial electrodes [ 20 ]. Concurrent to fi eld potential recordings, other measurements as extracellular ionic concentrations can be assessed [ 21 ]. The evaluation of unitary extracellular neuronal activity requires the incubation of the human brain tissue immediately after its resection [ 12 ]. The study of Schwartzkroin and Prince in 1976 represents the fi rst evaluation of intracellular recording of neurons from the human cortex neurons [ 22 ]. These authors employed the same criteria used for assessing neurons of animal Fig. 2 Schematic representation of the standard protocol used to evaluate electrophysiological activity in brain tissue obtained from patients with pharmacoresistant epilepsy. After slicing, the tissue is available for different techniques of electrophysiological recording ( right panels ); each one provides distinct kind of information depending on the aim of the study. For example, current-clamp allows the study of epileptiform activity and action potential dynamics of individual neurons; voltage-clamp could be used to analyze currents and channel properties; multielectrode arrays provide the opportunity of simultaneously stimulating and recording fi eld potentials, and/or action potentials in different areas of the tissue; fi eld potentials are used to evaluate multiple neuron activity of during epileptiform activity Human Brain Tissue as a Model for the Study of Epilepsy 106 Human brain Electrophys¡OIO . • leChn~~~reCOrding (300 ~¿i~~~ Current-clamp ~ ,.", f ( Co~t,AotC'. s.'"" dM~ !t, , _., ~,l od. arm~fLEeSiS(ant " ,~~ _. screening) rug Field ~ 206 cortex and used sharp electrodes (20–50 MΩ). The results obtained demonstrated that human cortical neurons present stable resting membrane potential (RMP), overshooting action potentials, and absence of rhythmic high-frequency spike fi ring. Although the number of neurons recorded was small, the authors stood out that the in vitro electrophysiology techniques can be used to obtain valuable data from human brain tissue [ 20 , 22 – 24 ]. The fi ring properties of human neurons evaluated by in vitro electrophysiology methods have shown to be similar to those iden- tifi ed in rodents and other species [ 1 , 24 , 25 ]. Other important approach represents the evaluation of neurotransmitter effects. For example, when GABA is applied to the brain slice, it may exert inhibitory effects crucial for controlling cerebral excitability [ 10 ]. This situation is perturbed in the cerebral tissue of patients with pharmacoresistant epilepsy [ 26 , 27 ]. The in vitro evaluation of the effects of other neurotransmitters such as acetylcholine, adenosine, histamine, norepinephrine, and serotonin reveals their effects and their contribution in the neuronal activity modulation [ 28 ]. The electrophysiological activity should be correlated with the cell morphology. Cellular labeling with fl uorescent dyes as Lucifer yellow [ 23 ] or biocytin [ 24 , 27 ] are techniques available for mor- phological reconstructions after the electrophysiological evalua- tion of the tissue. Morphological data of neurons in epileptic tissue should be carefully compared with data obtained from autopsies [ 29 , 30 ]. Biocytin-fi lled neurons in combination with immuno- chemistry [ 26 ] provide more information about the expression of particular proteins. There are some approaches that reduce the clamp problems such as the dissociation of the cells or neuronal cultures [ 31 ]. The isolation of neurons allows the characterization of essential events for the neuronal excitability, such as the transient currents in neo- cortical neurons [ 32 ]. The evaluation of astrocytes in cultures from medically intractable TLE allowed to establish that cells from the seizure focus exhibited action potential-like events in response to electrical stimulation [ 33 ]. Another new approach is the evaluation of electrical activity by multielectrode arrays (MEAs) . This procedure allows the analysis of spatiotemporal dynamics of the epileptiform activity in specifi c net- works, including the areas of seizure initiation and propagation. It also facilitates the analysis of effects induced by antiepileptic drugs at cellular and network levels, fi eld potentials, and action potentials of multiple neurons from diverse regions of the tissue [ 34 ]. One of the most interesting perspectives of the evaluation of the cerebral tissue obtained from patients with pharmacoresistant epi- lepsy using in vitro electrophysiology is the investigation on the mechanisms underlying the pharmacoresistance to antiepileptic drugs. For example, previous studies demonstrated that the blockage of sodium channels induced by carbamazepine (i.e., use- dependent Leonardo Lara-Valderrábano et al. 107 207 blocker of voltage-dependent sodium channels) is not detected in tissue obtained from some patients with pharmacoresistant epilepsy [ 35 ]. In another study, the modulation of Na + currents induced by valproic acid was tested in isolated neurons from patients with and without hippocampal sclerosis. The cellular response to valproic acid was consistent with previous reports in animal models. In spite of the important damage found in patients with mesial sclerosis, they did not demonstrate differences in the biophysical properties of the volt- age-gated sodium currents, when compared with the non-sclerotic tissue [ 36 ]. It is evident that the in vitro electrophysiology approaches can contribute to trace the underlying cellular mechanisms of epilepsy and the screening of new antiepileptic drugs and their effects. This approach can be used to determine the fi nal diagnosis and subse- quent individual therapy. However, it presents relevant limitations such as the scarce spontaneous epileptiform activity found in human brain slices possibly due to the isolation of complex net- works from other brain areas. 3 Evaluation of Receptor Changes in Human Brain Tissue A receptor is a cellular macromolecule, or an assembly of macro- molecules, that is involved in chemical signaling between and within cells [ 37 ]. Receptors should present at least the following characteristics to identify them: (1) Binding, specifi c, and saturable ligand binding are hallmarks of receptors. (2) Affi nity, the ability of a drug to bind to the specifi c receptor to form the drug-receptor complex. The dissociation constant (Kd) or affi nity of most recep- tors for their ligands is in the nanomolar or subnanomolar range. (3) Ligand binding to the receptors should be able to activate sig- naling pathways to trigger physiological responses [ 38 ]. The evaluation of the tissue of patients with epilepsy represents a great opportunity to investigate receptor changes associated with this disorder such as number, affi nity, binding, and coupling to transduction mechanisms. The knowledge obtained allows the design of new therapeutic strategies to strengthen or inhibit trans- ductional mechanisms [ 39 ]. Receptors in the cerebral tissue of patients with epilepsy have been evaluated through different in vitro and in vivo techniques. The method of choice depends upon the aim of the study. Western blot is a useful procedure to determine changes in the protein expression of the receptors [ 40 ]. In general, the methodology for Western blot is as follows: samples of human brain tissue are suspended in lysate buffer containing protease inhibitor cocktail including 50 mM HEPES buffer, 0.05 % Triton X-100, 0.62 mM phenylmethylsulfonyl fl uoride, and 20 mM sodium molybdate. Proteins from tissue are isolated by Human Brain Tissue as a Model for the Study of Epilepsy 108 208 electrophoresis using 8 % SDS-polyacrylamide Tris-glycine gels. Once separated, the proteins are transferred to a membrane of nitrocellulose in which each protein is located in specifi c bands according to the molecular weight. The membrane is then incu- bated with specifi c antibodies to label the protein of interest. The thickness and density of the band corresponds to the amount of protein present [ 40 , 41 ]. Although the results obtained from Western blot experiments give information about the protein expression of specifi c receptors, they do not give data about the capacity of these proteins to bind specifi c agonists and induce transductional mechanisms. Some in vivo and in vitro techniques are useful to determine receptor binding changes in the brain of patients with epilepsy. Positron emission tomography (PET) is an in vivo procedure that let us identify the distribution and density of specifi c receptors in specifi c brain areas of patients with epilepsy (Fig. 3a ). This proce- dure involves the systemic administration of ligands that may label particular receptors. However, be cautious regarding the interpre- tation of results due to the presence of endogenous ligands in the brain that may compete with the exogenous ligands. In vitro autoradiography is a useful procedure to label specifi c receptors and proteins involved in the transductional mechanisms in brain sections obtained from patients with pharmacoresistant epilepsy and submitted to epilepsy surgery. In vitro autoradiogra- phy procedures avoid endogenous ligands and give information about the anatomical localization of the receptors (Fig. 3b ) [ 42 ]. For in vitro autoradiography, brain sections are exposed to ligands labeled with a radioactive isotope and subsequently exposed to a fi lm [ 43 , 44 ]. The more commonly used isotopes for in vitro autoradiography are the following: 3 H gives the highest resolution and is used to label proteins, nucleic acids, and other molecules frequently involved in binding assays; 14 C replaces the nonradioac- tive carbon in order to trace chemical and biochemical reactions involving pharmacological substances; and 35 S is used to label pro- teins, nucleic acids, and amino acids containing a thiol group [ 45 ]. The in vitro autoradiography experiments can be carried out using brain sections of patients with pharmacoresistant epilepsy. Initially, the brain sections are washed to remove endogenous ligands and then incubated in a solution containing the specifi c radioligand at a concentration necessary to occupy 50 % of recep- tors (Kd) [ 39 ]. Nonspecifi c binding has to be detected in parallel sections from the same tissue and incubated under similar experi- mental conditions but including a high concentration of a non- labeled ligand (a concentration 500–1000 higher than that used for the 3 H-ligand). Specifi c binding is obtained from the difference between nonspecifi c and total binding. After incubation, the sec- tions are rinsed in buffer, dipped into distilled water, and dried under cold air stream. The dried sections are exposed to a sensitive Leonardo Lara-Valderrábano et al. 109 209 fi lm together with standards of the isotope used. After the expo- sure period, the fi lm is developed and used to determine optical densities of specifi c brain areas. The optical density is converted to radioactivity values (dpm/mm 2 ) and then to amount of receptors (fmol/mg protein) [ 46 – 48 ]. The in vitro autoradiography allows to determine the distribu- tion of receptors labeled with a specifi c ligand in selected brain areas of patients with pharmacoresistant epilepsy [ 43 , 49 ]. The results obtained will depend on the affi nity and number of recep- tors labeled. However, in vitro autoradiography is not an appropri- ate procedure to determine specifi c characteristics of the receptor binding like maximal binding (Bmax) and affi nity (Kd). Binding of an agonist to its receptor induces conformational changes in the receptor molecule. This situation leads to activation Fig. 3 Schematic representation of in vivo positron emission tomography (PET) ( a ) and in vitro autoradiography ( b ) procedures. Notice that in PET radiolabeled ligands compete with the endogenous ligands for the binding site in the receptors. In contrast, for autoradiography, the radioligand binds directly to the receptors because the endogenous ligands were previously washed Human Brain Tissue as a Model for the Study of Epilepsy 110 a 000 000 o Radiopharmaceuticals . Endogenous ligands b ••• ••• ~ Radioligands 210 of the G protein, a process during which the α subunit replaces the GDP with GTP. Functional autoradiography is a technique used to know if the receptor is capable to activate this reaction and subse- quent transductional signaling pathways. During the functional assay, the tissue is exposed to [ 35 S]-GTPγS that is resistant to hydrolysis. This situation provokes that [ 35 S]-GTPγS replaces the GDP upon receptor activation and remains irreversibly bound to the G proteins [ 39 , 42 ]. To perform functional autoradiography, the sections are ini- tially dipped in assay buffer (50 mM Tris, 3 mM MgCl 2 , 0.2 mM EGTA, 100 Mm NaCl, pH 7.4) at 25 °C for 10 min and then incubated with 2 mM GDP in assay buffer for 30 min at 25 °C. Thereafter, the process involves different assays in parallel sections under different conditions (Table 1 ). The specifi c binding results from the difference between the values obtained from the basal and nonspecifi c binding assays. At the end of each assay, slides are rinsed twice, 2 min each in 50 mM Tris–HCl buffer and once in deionized H 2 O at 4 °C. Slices are dried overnight and exposed to fi lm for 5 days in fi lm cassettes containing [ 14 C] microscales. A standard curve is generated from [ 14 C] microscales values. Optical density readings are converted into nanocuries of [ 35 S] per milligram of tissue. Net agonist-stimulated [ 35 S]-GTPγS binding is calculated by subtracting basal binding (obtained in absence of agonist) from agonist-stimulated binding [ 46 , 50 ]. A main limitation of the [ 35 S]-GTPγS autoradiography is that not all the G proteins can be detected with this method due to their low number or effi ciency. In addition, it results diffi cult to identify the types of G proteins labeled with [ 35 S]-GTPγS [ 42 , 51 ]. Binding assays in membranes are valuable procedures to deter- mine important receptor characteristics such as Bmax (propor- Table 1 Experimental conditions to implement functional autoradiography Basal activity G proteins are evaluated in presence of 2 mM GDP and 40 pM [ 35 S]-GTPγS. No agonists are included in the assay Agonist-stimulated [ 35 S]-GTPγS This step is carry out in presence of 2 mM GDP, 40 pM [ 35 S]-GTPγS, and a receptor agonist at a concentration necessary to produce maximal stimulation (μM) of the G proteins. The [ 35 S]-GTPγS labels the G proteins activated as consequence of the agonist Antagonist blockade of agonist- stimulated [ 35 S]-GTPγS A parallel assay has to be focused to evaluate the specifi city of the receptor that activates the labeled G protein. The assay is carry out according to the conditions described for the agonist-stimulated [ 35 S]-GTPγS but containing a specifi c antagonist at a concentration that blocks >90 % of the receptor- induced G protein activation Nonspecifi c binding The assay is similar to the agonist-stimulated [ 35 S]-GTPγS but with an excess of unlabelled GTPγS (10 μM). Leonardo Lara-Valderrábano et al. 111 211 tional to the number of receptors present in the brain tissue), Kd (equilibrium dissociation constant), Emax (concentration of an agonist to produce maximal stimulation), and potency of stimula- tion (EC 50 ). Binding assays can be used to determine changes in Bmax and Kd, and [ 3 H] is the most frequently used isotope for this purpose. For this procedure, brain tissue (~50 mg) is thawed and homoge- nized into a mixture of ice-cold 50 mM Tris–HCl and 1 mM EGTA, pH 7.4. After centrifugation (13,000 rpm, 20 min, 4 °C), the pellet is resuspended in 10 ml of 50 mM Tris–HCl buffer solu- tion (pH 7.4) and centrifuged again. The resulting pellet (crude membranes) is suspended in incubation buffer (50 mM Tris–HCl, 5 mM MgCl 2 , pH 7.4). Receptor binding assays are performed in triplicate in 0.5 ml of incubation buffer containing membranes (30–70 μg protein) and in presence of different concentrations of the radioligand with and without a non-labeled ligand. Specifi c binding is determined by subtracting the binding in the presence of non-labeled ligand from total binding. Incubations are termi- nated by rapid fi ltration through Whatman GF/C fi lters presoaked in 0.3 % polyethylenimine. Filters are washed three times with ice- cold 50 mM Tris–HCl buffer (pH 7.4), dried, and then immersed in Sigma-Fluor™ scintillation cocktail (Sigma). Radioactivity is determined using a Beckman LS6000SC liquid scintillation coun- ter. Data are expressed in fmol/mg of tissue. Binding assays in membranes can be also used to evaluate the ligand-induced activation of G proteins subsequent to the receptor stimulation (Emax and EC 50 ). The binding assays are as follows: brain tissue (~50 mg) is thawed and individually homogenized in 10 mM Tris–HCl solution containing 1 mM EGTA (pH 7.4) and centrifuged (10 min, 1800 rpm, 4 °C). The supernatants are col- lected and centrifuged at 13,000 rpm (20 min, 4 °C) and the pellet obtained is incubated (30 min, 30 °C) in 5 ml of assay buffer (50 mM Tris–HCl, 100 mM NaCl, 0.2 mM EDTA, pH 7.4). The incubation is stopped with the addition of 10 ml of ice-cold buffer. The obtained membranes are incubated (60 min, 60 °C) in 0.5 ml of assay buffer containing 0.02 % bovine serum albumin, [ 35 S]-GTPγS (50 pM), and increasing concentrations (10 −10 –10 −6 M) of a selective receptor agonist in the presence of excess GDP (10 μM). Basal binding is measured in the absence of the tested compound. Nonspecifi c bind- ing is determined in the presence of 20 μM unlabeled GTPγS and subtracted from total binding to calculate the specifi c binding. The reaction is initiated by adding [ 35 S]-GTPγS and terminated by fi ltra- tion of the samples through Whatman GF/B glass fi ber fi lters. Filters are washed three times with ice-cold 50 mM Tris–HCl buffer (pH 7.4), dried, and dipped in Sigma-Fluor™. Finally, bound radioactiv- ity is determined using a liquid scintillation counter. Data are subjected to nonlinear regression analysis of concentration effect curves performed by Prism (GraphPad Software) to determine Emax Human Brain Tissue as a Model for the Study of Epilepsy 112 212 and EC 50 values. Data are expressed in percentage of stimulation or in fmol/mg of protein [ 52 ]. One important limitation of the binding assays is that the changes evaluated correspond to big areas of the cerebral tissue. This procedure does not allow the evaluation of small brain areas. 4 Genomic Analysis of Brain Tissue from Patients with Pharmacoresistant Epilepsy According to the dogma of molecular biology (Fig. 4 ), nucleic acids (DNA and RNA) and proteins, through the processes of rep- lication, transcription, and translation, are key to perform genomic analyses. These represent the main tools in research, diagnosis, evaluation, treatment, and prognosis of many diseases, including various types of epilepsies. At present, genetic alterations are con- sidered relevant in the development of epilepsy [ 53 ] and various types of seizures, such as juvenile myoclonic epilepsy [ 54 ]. It is important to consider that some of the studies that demonstrate the role of genes in the development of epilepsy and the associated pathological processes (e.g., drug resistance and hippocampal scle- rosis) have been carried out using tissue obtained from patients subjected to epilepsy surgery [ 55 ]. When the cerebral tissue is removed from the human body, the neuronal cells begin to die. During this process, there is an activa- tion of specifi c caspases that in turn activate endo- and exonucle- ases responsible for the degradation of RNA [ 56 ]. In contrast with DNA, which has a double-stranded arrangement and a chemical structure that favors its preservation, RNA is more labile and sensi- tive to degradation due to its single-stranded conformation while the presence of ribose facilitates the reaction with oxygen [ 57 ]. Therefore, the experimental conditions to manipulate postsurgical Fig. 4 Central dogma of molecular biology. Notice the different methodological approaches that can be carried out to evaluate DNA, RNA, and protein expression Leonardo Lara-Valderrábano et al. 113 213 tissue are essential to maintain the quality of proteins and nucleic acids and give validity and reliability to the results obtained [ 58 ]. In practice, after surgical resection, the epileptic tissue should be immediately frozen and stored at −80 °C for the subsequent mRNA evaluation. Low temperatures (−60 °C or lower) prevent the activation of caspases and hence the degradation of nucleic acids and proteins [ 59 ]. However, RNA seems to maintain some reactivity at low temperatures. RNases and some ribozymes are still active at −20 °C and −70 °C, respectively [ 60 , 61 ]. At present, there are commercial compounds such as RNAlater ® (Qiagen) which are useful to stabilize and protect the structure of cellular RNA and prevent its oxidation. Formalin fi xation with paraffi n embedding represents other procedure for mRNA preservation and maintaining histology [ 62 ]. With this procedure, the proteins are kept whole and the DNA can be isolated with very good quality for several years after [ 63 – 65 ]. Other important factor for consid- eration is the period of storage. The integrity of nucleic acids and proteins are compromised when the tissue is stored for long peri- ods after the surgical resection. Some considerations are relevant to keep in mind when isolat- ing nucleic acids or proteins obtained from cerebral tissue: (1) one must work on ice and under complete sterile conditions; (2) the use of inhibitors of endo- and exonucleases in the case of nucleic acids is essential, and protease inhibitors in the case of proteins, (3) the material must be treated with diethylpyrocarbonate (DEPC) to 0.1 %, which is a potent inhibitor of RNase [ 66 ]. The nucleic acid isolation of cerebral tissue from patients with epilepsy is often achieved by common protocols. However, isola- tion of DNA, RNA, and proteins has to be done separately if we want to preserve the quality of the molecules. For DNA isolation, it is necessary to use extraction with organic solvents such as ethanol or acetone. This procedure preserves the DNA of high molecular weight. The RNA is isolated by phenol–chloroform extraction in addition to commercial solutions of guanidine isothiocyanate and ammonium thiocyanate (e.g., TrizolThermoFisher Sci.). Proteins are isolated through different buffers containing detergent and ionic salts. Once the RNA is obtained, it is necessary to confi rm its purity and integrity. The purity is determined by commonly used spectrophotometric assays, according to the ratio 260/280 nm. Using this procedure, an index of 1.8 for DNA and RNA 2 indi- cates high purity, whereas lower values indicate contamination with proteins or organic solvents. The integrity is determined by electro- phoretic assays using 1 % agarose gel. Using this procedure, a single band must be observed for DNA (no sweep), while for the RNA, it is common to detect electrophoretic migration patterns of the 28S, 18S, 5.8S, and 5S ribosomal subunit. These values represent the RNA integrity number (RIN) [ 67 ]. Pure samples of DNA should Human Brain Tissue as a Model for the Study of Epilepsy 114 214 be stored in solution because their dehydration leads to denatur- ation. In contrast, the RNA is best preserved dehydrated [ 59 ]. Concerning epilepsy and regardless of the level and the tech- niques used, the study of patients with this disorder is focused on the search for the “epilepsy gene.” Unfortunately this approach is uto- pian because it is impossible to attribute the cause of epilepsy to a single gene since it represents a multifactorial disorder from a physi- ological point of view [ 68 ]. Also, the molecular analysis of genes has to be associated with different factors, such as type of epilepsy, the epileptic focus, the treatments administered prior to surgical resec- tion, whether or not it is drug resistant, and other clinical variables. Despite the plurality in studies, when a search in PubMed (NCBI) is performed with the words “epilepsy and genes in humans,” they found only 6285 items, in which research ranges from the characterization and analysis of gene expression (the gene encoding the GABA A receptor subunit δ [ 69 ]) to variants associa- tions (atypical variants, p.G257R, p.R323Q, p.I389V in GABA A receptor associated with Rolandic epilepsy [ 70 ]), polymorphisms and mutations (the SNP c.3435C > T in the MDR1 gene encoding the P-glycoprotein transporter [ 71 ]), identifi cation and global study of microRNAs (miRNAs such as miR-204 and miR-218 that are downregulated in patients with TLE [ 72 ]), identifi cation of biomarkers (TGFβ1 that is increased in CSF of patients with drug- resistant epilepsy [ 73 ]), epigenomic analysis (hypermethylation- associated genes observed in neurotransmission and synaptic transmission in patients with TLE [ 74 ]), and inheritance (the dele- tion of 18q21.32 relatives inherited from a family with cases of idiopathic epilepsies [ 75 ]). Thanks to all the studies using tissue of patients with epilepsy, many genetic aspects of the disease have been identifi ed. However, there is still a long way to go in under- standing the mechanisms. An undeniable fact is that studies of gene expression have opened the door to a new era where the fi nal goal is the optimization and customization of treatments, thus improving the quality of life of patients. 5 Autopsy and Control Human Tissue A good research design should always consider a control condition to eliminate variables that could lead to the wrong conclusion. The evaluation of human brain tissue of patients with epilepsy implies the analysis of control tissue obtained from neurologically healthy subjects. However, this situation is diffi cult to obtain. Appropriate controls represent a crucial situation that must be addressed when human tissue is used for electrophysiology record- ings [ 76 ]. It is clear that normal tissue samples cannot be used for comparison for obvious ethical causes. Resected samples of non- epileptic patients due to removal of deeply laying tumors have been Leonardo Lara-Valderrábano et al. 115 215 used as “control tissue” [ 65 ]. Nevertheless, this tissue is not ade- quate for comparison because it comes from patients with a differ- ent pathology. Many studies include the evaluation of autopsy samples obtained from subjects who died of different causes and without evidence of neurological illness. However, it is important to con- sider various antemortem and postmortem factors that can directly impact on the quality and therefore the validity of the results obtained from autopsy samples. For example, the evaluation of nucleic acids from autopsies is particularly diffi cult (Table 2 ) [ 76 , 77 ]. Indeed, there are controversial studies indicating that the RNA of the brain tissue is stable and preserves integrity even sev- eral hours after death [ 78 , 79 ], while other studies suggest a rapid and defi nitive RNA degradation as the postmortem interval pro- gresses [ 76 , 80 ]. 6 Concluding Remarks Certain epilepsy animal models have received great acceptance as they exhibit similar development of spontaneous seizures and a spectrum of histological changes like those of showed by patients with epilepsy [ 81 ]. However, the study of brain tissue obtained from patients with pharmacoresistant epilepsy provides valuable information about human epilepsy pathophysiology [ 22 ] and represents an excellent tool for individual diagnosis and special- ized treatment. Indeed, correlations between the results obtained and different clinic data from the patients with pharmacoresis- tant epilepsy represent a valuable procedure to identify the pos- sible infl uence of relevant conditions that can be manipulated to modify the expression of the disease. Table 2 Factors that affect the quality of the brain samples for molecular studies in epilepsy Antemortem Postmortem Diseases Postmortem interval (PMI) Premedication Structural alterations of the pathophysiology of epilepsy (hippocampal sclerosis and cortical dysplasia) Fever pH of the brain or cerebrospinal fl uid Hypoxia-ischemia Ambient temperature in the postmortem period Acidosis Harvesting procedures Agonal conditions Storage temperature Accidental or systematic thawing and refreezing Human Brain Tissue as a Model for the Study of Epilepsy 116 216 Acknowledgments We thank Francia Carmona for her technical assistance and the National Council for Sciences and Technology of Mexico for the support provided for developing this work (grant 220365 (LR) and scholarships 232762 (LL), 243422 (IB), and 377494 (VN)) and by the Fogarty International Center of the National Institutes of Health (Award Number R21TW009384). References 1. 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USA • XLII Reunión Anual del Capitulo Mexicano de la Liga Internacional Contra la Epilepsia. 28-31 de agosto de 2019. Mazatlán, Sinaloa. México • X Congreso Latinoamericano de Epilepsia, 29 de septiembre-2 de octubre de 2018, San José, Costa Rica. • 32th International Congres of Epilepsy, 2-6 de septiembre de 2017, Barcelona, España. • Society for Neuroscience Annual Metting, 6-11 de noviembre de 2016 de 2016. San Diego CA. USA • IX Congreso Latinoamericano de Epilepsia, 20-23 de agosto de 2016, Cancún, Quintana Ro. México. • XXXVIII Reunión Anual del Capitulo Mexicano de la Liga Internacional Contra la Epilepsia. 29 de Julio al 2 de agosto de 2015. Ciudad de México. México • XXXVII Reunión Anual del Capitulo Mexicano de la Liga Internacional Contra la Epilepsia. Del 22-26 de agosto de 2014. León, Guanajuato. México Otros eventos científicos • Young Epilepsy Section: YES Kick-Off Workshop of ILAE., 11-13 de Mayo de 2018, Londres, Inglaterra. • IX Latinoamerican summer school Epilepsy (LASSE). Del 22 de febrero al 3 de marzo de 2015. Sao Paulo Brasil.