UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMÉDICAS INSTITUTO DE NEUROBIOLOGIA EFECTO DEL 17Β - ESTRADIOL EN LA PLASTICIDAD DE LAS FIBRAS MUSGOSAS DEL HIPOCAMPO DORSAL DE LA RATA TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: DOCTOR EN CIENCIAS PRESENTA: EURÍDICE PADILLA GÓMEZ DIRECTOR DE TESIS DRA. SOFÍA YOLANDA DÍAZ MIRANDA INSTITUTO DE NEUROBIOLOGÍA COMITÉ TUTOR DRA. GINA LORENA QUIRARTE INSTITUTO DE NEUROBIOLOGÍA DRA. CAROLINA ESCOBAR BRIONES FACULTAD DE MEDICINA UNAM JURIQUILLA, QUERÉTARO. NOVIEMBRE DEL 2014 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. II AGRADECIMIENTOS INSTITUCIONALES Quiero expresar mi sincero agradecimiento a las siguientes instituciones y unidades por todo el apoyo necesario para la realización de este trabajo. A la Universidad Nacional Autónoma de México por brindarme la oportunidad de realizar el Doctorado en Ciencias Biomédicas en el Instituto de Neurobiología. A las Unidades de Apoyo del Instituto de Neurobiología, Campus UNAM Juriquilla, Querétaro: • Del Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, por la asesoría de Zenaida Martínez Estrella responsable de servicios escolares. • De Microscopía y Análisis de Imágenes. Por el apoyo Técnico a la I.Q. Lourdes Palma Tirado y la Ing. Nydia E. Hernández Ríos. • De Enseñanza, a la M. en C. Leonor Casanova Rico y a la Sra. Ma. del Carmen Vázquez Rodríguez. • De Computo, por la asistencia técnica de los Ingenieros en Sistemas: Ramón Martínez, Alberto Lara Ruvalcaba, Sandra Hernández García y Omar González Hernández. • De Videoconferencia, por el apoyo técnico de la Lic. Lourdes Lara Ayala. • Bioterio, por el manejo de animales al M.V.Z. José Martín García Servín y a la Dra. Alejandra Castilla León. A las facilidades prestadas por el Dr. Francisco Javier Valles Valenzuela y la Lic. Soledad Medina Aragón de la Biblioteca del Campus. Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por la Beca otorgada para llevar a cabo mis estudios del Doctorado. Registro No. 215710. A la Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA-UNAM), Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), por las Becas a través de los proyectos IN202809 y IN201613. III También quiero expresar mi mas profundo agradecimiento a A la Dra. Sofía Y. Díaz Miranda. Por brindarme la oportunidad y la confianza de realizar este bonito proyecto, por mostrarme que se aprenden mas de los errores que de los aciertos y gracias también por enseñarme a hacer ciencia con toda la paciencia y el cariño que la caracterizan. A la Dra. Carolina Escobar y Dra. Gina Quirarte quienes formaron parte de mi comité tutelar y cada semestre hicieron valiosas aportaciones para enriquecer este trabajo de investigación. A las integrantes del jurado Dra. Gabriela Morali, Dra. Tere Morales, Dra. Selva Rivas y Dra. Araceli Díaz por la revisión del trabajo y atinadas sugerencias para mejorarlo. Al Dr. Camilo Ríos, Dra. Araceli Díaz Ruíz, Dra. Francisca Pérez, Dr. Sergio Montes del Instituto de Neurología por todo el apoyo brindado y aportaciones para la realización de este proyecto de investigación. A la M. en C. Azucena Ruth Vázquez por todo su apoyo técnico brindado en el laboratorio. Y también gracias por ser una luz en el camino cuando todo se puso obscuro. A la técnico Dra. Cristina Medina Fragoso y MVZ. Norma Serafín López, M. en C. Gema Martínez Cabrera gracias por el apoyo técnico para la realización del trabajo A los laboratoristas Lic. Verónica Tonánzin Pineda Martínez, Jorge Abraham Servín León y Ángel Méndez Olalde por toda la ayuda. A todos los que son y han sido compañeros y amig@s del laboratorio C02 con quienes he compartido conocimientos y muchos agradables momentos plagados de innumerables risas, Vicente Beltrán, Irma González, Uriel León, Susana Castro, Paty de la Rosa, Jorge Servín, Laura Pinedo, Erika Orta, Martha Degollado, Alfonso Arrazola, Israel Poblano, Jesús Mancilla y Pascal Morin. A mis queridas amigas y compañeras HM Ara, Dany, Eva Meny y Rebe por todo su apoyo y cariño, por todos esos jueves de tertulia y buenos momentos que hemos pasado juntas, gracias por ser amigas. A Adriana Chaparro mi otra familia, te quiero. Gracias ... Por último quiero dar gracias, al modelo animal murino, pues son animales extraordinarios IV Quiero dedicar esta tesis a las personas que mas quiero y que me han apoyado incondicionalmente que son mi familia. Mis hermanos Eugenio y Fernando. Mis sobrin@s Artemio, Totú, Naty, Amy y Mia. A mi mami que amo mucho Luzmaría Gómez Oliver, simplemente sin ti nunca hubiera hecho tan buen logro, que en gran parte es tuyo también. V A Dante, Eugenia e Iñaki con mucho amor VI ÍNDICE ÍNDICE VI ÍNDICE DE FIGURAS VIII LiSTA DE ABREVIATURAS X RESUMEN XI SUMMARY XII I. INTRODUCCION 1 II. ANTECEDENTES 3 1. Formación hipocampal 3 1.1 Hipocampo o Cornu Ammonis (CA) 4 1.1.2 CA1-CA3 5 1.1.3 Giro Dentado 6 1.2 Circuito hipocampal 7 1.3. Neurogénesis 10 1.3.1 La célula granular 12 1.3.2 Las Fibras Musgosas 13 1.4 La célula piramidal 15 1.5 La célula musgosa 18 1.5.1 Proyecciones de las fibras musgosas 18 1.6 Interneuronas del giro dentado 19 1.6.1 Células piramidales en canasta 19 1.6.2 Otras interneuronas 20 2. Plasticidad 21 2.1 Plasticidad sináptica en la conexión FM-CA3 e interneuronas 22 2.2 Función del zinc en la LTP de las fibras musgosas 24 2.3 Plasticidad estructural 25 2.3.1. El 17β - estradiol y la remodelación sináptica 27 3. Estrógenos 28 3.1 Biosíntesis de los Estrógenos 29 3.2 Fisiología de la Reproducción 32 3.2.1 Ciclo estral de la rata 32 3.3 Efecto de los estrógenos en la plasticidad de la formación hipocampal 34 3.4 Mecanismos de acción 37 3.5 Relación del Oxido Nítrico con el hipocampo 39 3.6 Formación hipocampal, estrógenos y memoria 42 VII III. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 44 IV. HIPÓTESIS 45 V. OBJETIVO GENERAL 46 V.I Objetivos particulares 46 VI. MÉTODOS 47 VI.1 Sujetos 47 VI.2 Cirugía 47 VI.3 Desarrollo de los objetivos particulares VI.3.I Dosis 48 VI.3.2 Análisis de la actividad de la cNOSs 48 VI 3.3 Derterminación del zinc 48 VI.3.4 Área de las FM 48 VI.3.5 Análisis de la ultraestructura sináptica 48 VI.3.6 Suplementación de estrógenos 48 VI.4 Análisis estadístico 54 VII. RESULTADOS 52 VII.1 Análisis histológico en grupos con dosis diferentes de suplementación 54 VII.2. Efecto del 17β - estradiol en la actividad de la NOS constitutiva 55 VII.3 Análisis de la cantidad total de zinc en el hipocampo 56 VII.4 Análisis histológico 56 VII.5 Ultraestructura densidad sináptica 57 VII.6 Prueba de comportamiento en Ovx y OvxE (aprendizaje y memoria) 60 VIII. DISCUSIÓN 63 IX. CONCLUSIONES 70 X. BIBLIOGRAFIA 71 XI. ANEXO 1 94 XII. ANEXO 2 104 XIII. ANEXO 3 110 VIII ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Esquema de la formación hipocampal 4 Figura 2. Esquemas de hipocampo 7 Figura 3. Circuito neural en el hipocampo del roedor 9 Figura 4. Corte coronal del hipocampo y giro dentado 10 Figura 5. Neurogénesis en el giro dentado adulto y sinaptogénesis 11 Figura 6. Esquema de giro dentado 12 Figura 7. Fotografías de células granulares en las tres capas de giro dentado 14 Figura 8. Dibujo de dos especializaciones sinápticas de las fibras musgosas FM 15 Figura 9. Dibujo en cámara lúcida de una neurona piramidal de CA3 16 Figura 10. Fotomicrografías electrónicas y reconstrucción tridimensional del complejo sináptico 17 Figura 11. Fotomicrografía de una célula musgosa (A) y su dibujo en cámara lúcida (B) 18 Figura 12. Localización de la célula piramidal en cesta (pbc) dentro del giro dentado 20 Figura 13. Dibujo de la región hilar mostrando los tipos de interneuronas del hilus en el giro dentado 21 Figura 14. Plasticidad estructural del hipocampo 28 Figura 15. Hormonas estrogenas 29 Figura 16. Biosíntesis del estradiol desde el colesterol 31 Figura 17. Concentración en plasma de las hormonas de la reproducción 33 Figura 18. Electromicrografia del stratum radiatum de la región hipocampal 35 Figura 19. Fluctuaciones cíclicas en la densidad y morfología de las espinas dendríticas a lo largo del ciclo estral en el CA1 del hipocampo 36 Figura 20. Mecanismos de acción entre la interacción de los estrógenos y el BDNF 39 Figura 21. Inmunohistoquímica de la nNOS en el Hipocampo 41 Figura 22. Corte coronal de hipocampo dorsal 50 Figura 23. Corte coronal representativo del HD 52 IX Figura 24. Esquema del laberinto acuático de Morris (LAM) 54 Figura 25. Área (Dosis) 55 Figura 26. Actividad de NOS dependiente de Ca2+ 56 Figura 27. Contenido total de zinc. 57 Figura 28. Área 58 Figura 29. Imágenes representativas del Stratum lucidum (Sl) de los diferentes grupos 59 Figura 30. Densidad sináptica 60 Figura 31. Fotomicrografias de imágenes representativas tomadas con el microscopio electrónico de transmisión 61 Figura 32. Aprendizaje 62 Figura 33. Memoria 63 X LISTA DE ABREVIATURAS AMPA α-amino-3-hidroxi-5-metil-isoxazole-ácido propionico BDNF Brain derivd neurotrophic factor o factor neurotrófico derivado del cerebro BFM Botones gigantes de las fibras musgosas CA1 Cornu Ammonis 1 ó campo CA1 CA2 Cornu Ammonis 2 ó campo CA2 CA3 Cornu Ammonis 3 ó campo CA3 CEL Corteza entorrinal lateral CEM Corteza entorrinal medial CP Célula piramidal CG Célula granular D Diestro E Estrógenos E2 17β - estradiol EA Enfermedad de Alzheimer ER Receptores a estrógenos (α, β) ERK Extracellular signal-Regulated kinases Es Estro FM Fibras Musgosas FH Formación Hipocampal FSH Hormona Folículo Estimulante IGF-1 Factor de crecimiento parecido a la insulina GABA Ácido gamma amino butírico CE Corteza entorrinal GD Giro dentado HD Hipocampo Dorsal LAM Laberinto acuático de Morris LH Hormona luteìnizante LTP Potenciación a largo plazo MT Metalotioneínas NF-kB Factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células. NMDA N-metil-D-aspartate NO Óxido nítrico (por sus siglas en inglés) NT Factor neurotrófico Ovx Ovariectomizado OvxE Ovariectomizado suplementado con 17β - estradiol P Proestro P4 Progesterona PG Ovariectomizado suplementado con progesterona y benzoato de estradiol PRL Prolactina SL Stratum lucidum SNC Sistema nervioso central SLM Stratum lacunosum moleculare SO Stratum oriens SR Stratum radiatum SP Stratum piramidale SUB Subiculum XI RESUMEN El 17β - estradiol (E2), es una hormona sexual con capacidad neuroprotectora, es capaz de modular la neurogénesis del giro dentado y la plasticidad de las espinas del área CA1 del hipocampo durante el ciclo estral de la hembra. El sistema de fibras musgosas (FM) es plástico en el cerebro del adulto y responde al aprendizaje, la memoria y estrés, pero no se conoce si el E2 es capaz de modular la plasticidad anatómica y sináptica de las FM a través del ciclo estral. En 5 grupos de hembras entre 70 - 90 días de edad de la cepa Sprague- Dawley se estudió el efecto del E2 en tres etapas del ciclo estral: diestro (D), proestro (P) y estro (Es) comparadas con grupos de ratas Ovariectomizadas (Ovx) y suplementadas con una dosis de 10 µg/K de Benzoato de estradiol (OvxE). Se midió en el hipocampo: 1) la actividad de la NOS constitutiva dependiente de Ca2+ por conversión de la L-arginina en NO y L-citrulina, 2) la cantidad de zinc por espectrofotometría de absorción atómica, 3) el área de las FM en el stratum lucidum (SL) del CA3 (con la técnica del Timm) y 4) el número total de sinapsis en el SL en las etapas de P y Es comparados con los grupos Ovx y OvxE. Por otra parte, se midió el aprendizaje y la memoria espacial en dos grupos (Ovx y OvxE) con la prueba del laberinto acuático de Morris (LAM). Las comparaciones entre los grupos indican que en el hipocampo, tanto la actividad de la NOS, la cantidad en el contenido total de zinc (µg/g de tejido) el área de las FM y el número de sinapsis se redujeron por falta de el E2 en los grupos D, Es y Ovx y que la suplementación del E2 en el grupo OvxE restituye los niveles semejantes al del grupo P. Por otro lado el grupo Ovx fue deficiente en la prueba del aprendizaje y memoria y el grupo OvxE tuvo un mejor desempeño. Estos resultados sugieren que el E2 juega un rol importante en la neuroproección y en el mantenimiento de la morfología, el contenido de zinc y en la conectividad sináptica del área de las FM del CA3 del hipocampo dorsal de la rata y está asociado con un mejor rendimiento en el aprendizaje y la memoria. XII SUMMARY 17β - estradiol (E2) is a sex hormone with neuroprotective capacity, able to modulate dentate gyrus neurogenesis and spine plasticity on hippocampal CA1 area during the female estrous cycle. The mossy fiber system (MF) in the adult brain is plastic and responds to learning, memory and stress, but it is not known whether E2 is able to modulate the anatomical and synaptic plasticity of MF through the estrous cycle. The effect of E2 was studied in 5 groups of females 70-90 days old of the Sprague-Dawley strain at three stages of the estrous cycle: diestrus (D), proestrus (P) and estrus (Es), compared with ovariectomized rats (Ovx) and supplemented with 10 µg / K estradiol Benzoate (OvxE). The following measurements were performed in the hippocampus: 1) NOS activity was assayed by measuring the conversion of L-arginine to NO and L-citrulline, 2) Zinc determination was assayed in an atomic absorption spectrophotometer, 3) the MF area of CA3 stratum lucidum (SL) was measured with the Timm´s technique and 4) the total number of synapses in the SL in D, P, and Es stages compared with Ovx and OvxE groups. In addition, learning and memory were evaluated in a spatial task in the Morris water maze. Comparisons between groups indicate that hippocampal NOS activity, zinc determination (mg / g tissue) in the MF area and the number of synapses were reduced by the absence of E2 in D, Es and Ovx groups, and was restored by supplementation in the OvxE group reaching the P group levels. Moreover the Ovx group performed deficiently in the learning and memory test and the OvxE group performed better. These results suggest that E2 plays an important role in the neuroprotection and maintenance of morphology, the amount of zinc and synaptic connectivity, the MF to CA3 area of the dorsal hippocampus of the rat and is associated with better performance in learning and memory.     1 I. INTRODUCCIÓN Se han demostrado los efectos no reproductivos del 17β - estradiol (E2) en el sistema nervioso central (SNC) por su control en la actividad neuronal relacionada a procesos de cognición, la modulación del estado de ánimo, así como el mejoramiento del aprendizaje y la memoria. Se sabe que durante las fluctuaciones hormonales del ciclo menstrual de la mujer se presentan deficiencias cognitivas leves, como la dificultad para concentrarse y la disminución de la memoria verbal y conforme se van perdiendo los niveles de E2 durante la premenopausia, estos síntomas se acentúan (Foy, 2001; Sherwin, 2009). Por lo que es relevante la terapia de reemplazo (neuroprotección) que se administra a mujeres mayores después de la menopausia. Además, esta terapia, puede retrasar o prevenir la aparición de la enfermedades neurodegenerativas como el Parkinson y Alzheimer (Pike, et al., 2009). El E2 tiene efectos directos en el sistema límbico, hipotálamo, hipófisis y la formación hipocampal (FH), que controla el estado de ánimo y la cognición y en donde se localizan receptores a estrógenos (ER por sus siglas en inglés). Parte de la FH es el hipocampo, una de las estructuras más estudiadas en el SNC por su organización celular (clara estratificación), además de ser el sitio anatómico en donde se consolida la memoria de corto a largo plazo y de tener una función importante en la memoria de tipo espacial (Moser & Moser, 1998). Se ha demostrado que el H conserva su plasticidad en el cerebro adulto por que responde de manera directa, a cambios en el medio ambiente, la edad, el aprendizaje, la memoria y las hormonas; entre éstas las sexuales como el E2. Este mecanismo plástico del hipocampo puede ser regulado a través de factores tróficos como es el BDNF (Brain derived neurotrophic factor) o por el óxido nítrico (NO por sus siglas en ingles) el cual además de su papel como neurotransmisor y su relación con los estrógenos y las neurotrofinas en el hipocampo de los murinos, permite modular procesos de aprendizaje y memoria (Hu & Zhu, 2014; Maur et al., 2015). Los estrógenos también pueden producir cambios plásticos que se traducen en modificaciones en la estructura, distribución y número de sinapsis, lo que sugiere una relación entre los cambios bioquímicos, morfológicos y la formación de la memoria (Foy, 2001; Brinton, 2009). En la rata adulta, se han reportado cambios plásticos por la influencia de los estrógenos durante el ciclo estral y en ratas ovariectomizadas (Ovx) y suplementados con E2 (OvxE) en el campo CA1 y en el giro dentado (GD) del hipocampo dorsal (HD), pero hasta el momento hay poca información 2 sobre cambios plásticos morfológicos en el sistema de fibras musgosas (FM) del HD. La finalidad de este trabajo es determinar la influencia que tiene el E2 en la organización anatómica y la conectividad sináptica de las FM durante las diferentes etapas del ciclo estral. 3 II. ANTECEDENTES 1. Formación hipocampal (FH) de la rata La FH es parte del sistema límbico y de la arquicorteza, junto con el subículo y el giro dentado (GD), es una estructura pareada con dos mitades que son imágenes especulares en ambos hemisferios cerebrales. La invaginación del giro parahipocampal en el cuerno inferior del ventrículo lateral forma 3 regiones: el hipocampo propio, el giro dentado o área dentada y el subículo. La FH tiene una importancia primordial, pues es un centro de memoria y aprendizaje, siendo el hipocampo el sitio de regulación de la memoria de corto plazo y cuya alteración da inicio a la enfermedad de Alzheimer. Anatómicamente la FH está constituida por una serie de estructuras conectadas entre sí a través de un patrón intrínseco, cada una tiene una organización citoarquitectónica especial que le atribuye diferentes funciones cognitivas. Entre las funciones complejas que le confieren son la navegación espacial (Gothard et al., 1996), el aprendizaje (Moser et al., 1993; Bunsey & Eichenbaum, 1996; Duva et al., 1997); la memoria episódica de corto plazo o memoria declarativa (Squire et al., 1993; Eichenbaum, 2001) y la elaboración de un mapa cognitivo de la experiencia del animal en un ambiente determinado (O’Keefe, 1990; Nadel, 1992). La FH, tanto en humanos como en primates, se localiza en la parte medial o interna del lóbulo temporal, bajo la superficie cortical, la forma de caballito de mar es típica de primates, pero en otros mamíferos tiene formas variadas. En otro contexto histórico se le comparó con un cuerno de carnero por los cuernos de la antigua deidad egipcia Ammón. En los roedores es una estructura en forma de “C” que se ubica en el diencéfalo mide aproximadamente 1.2 cm3 en la rata adulta y tiene una posición rostro caudal desde la altura de los polos septales siguiendo un eje caudo ventral hacia el lóbulo temporal, el polo septal esta localizado en la parte dorsal del encéfalo y es más anterior al resto del hipocampo y el polo temporal se localiza en la parte ventral y caudal del encéfalo (Scharfman & Myers, 2012) (Figura 1). La FH, se encuentra formada por las cortezas entorrinal (medial y lateral), perirrinal y parahipocampal, el complejo subicular (subiculum, pre y parasubiculum), y el propio hipocampo o Cornu Ammonis (CA) con sus cuatro campos en el humano y tres en la rata (CA 1-3) y el GD ver Figura 2 (Amaral et al., 2007). 4 1.1 Hipocampo o Cornu Ammonis (CA) de la rata Desde hace más de 50 años que el hipocampo es motivo de estudio y el caso H.M. (Henry Molaison) dio gran información sobre su función, cuando fue sometido a la extracción del lóbulo temporal medial como tratamiento de una epilepsia intratable, H.M. perdió gran cantidad de memorias y fue incapaz de consolidar nuevas experiencias. Desde entonces y hasta ahora, la cantidad de información sobre el funcionamiento del hipocampo que tiene en los procesos cognitivos en humanos, primates y roedores como la rata ha sido enriquecedora (Scoville & Milner, 1957; Squire, 1992). Figura 1. Esquema de la formación hipocampal. Los colores muestran las diferentes estructuras, giro dentado (DG; café obscuro), CA3 (café claro), CA1 (naranja). El complejo subicular se divide en subiculum (Sub; amarillo), presubiculum (PrS; azul claro) parasubiculum (PaS; azul obscuro). También se observa la corteza entorrinal lateral (LEA; verde obscuro) y la medial (MEA; verde claro), la corteza perrinal se observa en morado y rosa. Los números romanos (I-VI) corresponden a las capas de la corteza entorrinal (Esquema modificado de van Strien et al., 2009). En la rata por ejemplo, se ha demostrado que el daño permanente, produce deficiencias cognitivas en memorias dependientes del hipocampo. Según Squire (1992) el hipocampo está implicado en la memoria declarativa y juega una función crucial en la ! 5 codificación y formación de memorias de tipo espacial, según el procesamiento mnemónico en la formación hipocampal solo es temporal y necesario para que las memorias sensoriales multimodales se almacenen en estructuras no hipocampales como la corteza prefrontal a través de la consolidación. Funcionalmente se le divide en tres compartimentos: ventral, intermedio y dorsal, el hipocampo ventral se relaciona con las emociones el estrés y el afecto, el hipocampo intermedio es una zona de transición donde se sobrelapan las regiones dorsal y ventral. El hipocampo dorsal desempeña funciones cognitivas que se relacionan con el procesamiento de información (Fanselow & Dong 2009). La disposición en la citoarquitectura del hipocampo hace que su estudio sea específico, en la rata los estratos principales y las regiones anatómicas neuronales se definen por sus conexiones específicas, las que se distribuyen en tres grandes regiones o áras; el regio superior que corresponde al campo CA1; el regio inferior (campos CA2 y CA3) y el giro dentado (GD) con el hilus. En el humano, el mayor tamaño corresponde al área CA1, que está entre el subículo y el hipocampo propiamente tal. Tiene relevancia por se sensible a la hipoxia (producida por aterosclerosis), siendo ésta una causa de la demencia senil, por la disminución de la irrigación de las neuronas que están comprometidas en el control de la memoria a corto plazo. 1.1.2 CA1-CA3 En los dos regios (superior CA1 e inferior CA3) se localiza la capa celular principal, el stratum piramidale (SP), conformada por los somas de las células piramidales (CP), las células en el CA3 se encuentran poco más separadas que en el CA1, que está constituido por CP grandes y pequeñas y de acuerdo a su tamaño, se organizan en tres capas; la más superior es densa, otra de menor tamaño y una capa de mayor tamaño aunque menos densa ubicada en el nivel más abajo, solamente las neuronas de este estrato envían sus prolongaciones fuera del hipocampo y son las únicas que responden a los estímulos que llegan al hipocampo; además, sus axones van a constituir el alveus y la fimbria, por lo tanto la CP es una neurona principal, extrínseca o de proyección, Golgi tipo II. El CA2 es menos marcado y presenta dos capas de células piramidales. Las CP del CA3, presentan un claro árbol dendrítico, dirigido hacia el GD, sus dendritas presentan numerosas espinas y las 6 cercanas al soma se modifican como excrecencias espinosas, de mayor tamaño e inervadas por las FM, sus axones forman las colaterales de Shaffer que inervan a las CP del CA1. En la organización laminar del campo CA3, además del estrato piramidal (somas), se localiza el molecular (dendritas apicales y las excrecencias espinosas) y el polimorfo o stratum oriens (SO) que contiene varias clases de interneuronas y las dendritas basales de las CP, así como las conexiones de asociación y las conexiones del CA3 al CA1 (colaterales de Schaffer), es la zona más superficial y está constituida por neuronas de diferentes formas y tamaños, tiene neuronas intrínsecas o Golgi tipo I porque sus axones no salen del hipocampo, se arborizan alrededor de las CP del segundo estrato, formándoles una especie de canasta alrededor, cuya función es liberar al neurotrasmisor inhibitorio el ácido gamma amino butírico (GABA), son controladoras de las CP inhibiéndolas, cada célula GABA se relaciona con 200 a 500 CP. Solo en el campo CA3 hay una zona acelular, el stratum lucidum (SL), localizado justo por arriba de la capa de CP y a está llegan las FM. En el CA1, el estrato molecular se distingue como stratum radiatum (SR) corresponde a la región suprapiramidal en donde se encuentran localizadas las conexiones entre los dos hipocampos de asociación y las conexiones a los campos CA3 y CA1 que son las colaterales de Schaffer y la capa más superficial, el stratum lacunosum-moleculare (SLM) es en donde las fibras de la corteza entorrinal terminan (patrón perforante), además de las conexiones aferentes de otras regiones como el núcleo reuniens de la línea media del tálamo que hace sinapsis tanto con el SR como en el SLM y ambos strata, contienen una amplia variedad de neuronas (Amaral et al., 2007) 1.1.3 Giro Dentado El área dentada o GD en el humano, corresponde a la sustancia gris de la arquicorteza que se extiende hacia atrás, formando la fasciola cinerea (giro fasciolar) y luego el inducio gris sobre el cuerpo calloso. Es una estructura común a todos los mamíferos, como parte de la FH recibe información de la corteza entorrinal la cual procesa y detecta la información de las experiencias nuevas de las ya almacenadas para transmitirlas al campo CA3 del hipocampo (Bischofberger et al., 2006; Treves et al., 2008). El GD, tiene una organización laminar de tres capas: molecular, granular y polimórfica (Figura 4), la más externa es la 7 molecular y en la rata mide aproximadamente 250 µm de ancho y está formada por dendritas terminales de las células granulares (DG), fibras del patrón perforante que se originan en la corteza entorrinal, interneuronas y terminaciones de conexiones extrínsecas. La capa principal intermedia esta compuesta por 4-8 capas de CG. En la capa granular también se localizan interneuronas del tipo de CP en canasta cerca del borde del hilus. La última capa es la polimórfica en ésta se encuentran varios tipos celulares, la más predominante es la célula musgosa (Amaral et al., 2007). El GD es una estructura capaz de formar neuronas nuevas en el adulto, proceso llamado “neurogénesis”.   Figura 2. Esquemas del hipocampo. Se muestra en 1, la posición y forma del hipocampo en el cerebro de la rata, con los elementos neuronales principales y sus conexiones intrínsecas en la formación hipocampal. Abreviaciones. Campos hipocampales principales (CA1, CA3), giro dentado (DG), subículo (S), fibras musgosa (mf), colaterales de Schaffer (sc), patrón perforante (pp). (Andersen et al, 2004). En 2 se muestran de secciones coronales de hipocampo dorsal (A) y ventral (B) indicando las áreas CA1 y CA3 y su correspondiente límite en Bregma (Esquema modificado de Paxinos & Watson, 1982). 1.2 Circuito hipocampal Los mecanismos por los cuales el sistema hipocampal media las diferentes funciones en la memoria depende de la información guardada y el flujo de información fuera y a través del sistema. La representación clásica de la organización en el sistema de memoria hipocampal es referido como el “circuito trisináptico” el primer punto empieza en la corteza entorrinal 1" 2" 8 (CE) y termina en el giro dentado (GD). El segundo se origina en las células granulares del GD y termina en las CP del CA3, el tercero ocurre entre las CP del CA3 y las CP del CA1 (Figura 3). Esto es un esquema simplificado de lo que realmente esta ocurriendo (Naber et al., 2000) ya que solo se toman en cuenta las sinapsis glutamatérgicas excitatorias principales. Así a esta vía trisináptica clásica se le deben adicionar otras conexiones como las de las células musgosas a las células granulares y por otra parte las de las interneuronas o de las mismas conexiones excitatorias recurrentes de las CP del CA3. También las dos proyecciones de la corteza entorrinal, ambas referidas como vías del patrón perforante el cual proyecta a todos los campos del hipocampo y el subículo (SUB). Las neuronas de la capa II de la corteza entorrinal proyectan al GD y al CA3 en contraste con las células de la capa III que proyectan directamente al área CA1 y al SUB. Estos dos componentes de la vía perforante se originan de la corteza entorrinal lateral (CEL) o de la corteza entorrinal medial (CEM), respectivamente. Se ha sugerido que las dos vías transmiten diferentes tipos de información (Mcnaughton, 1980; Colino & Malenka, 1993) La CEL procesa información no espacial como objetos y olores y la CEM información espacial (Witter et al., 1989; Hargreaves et al., 2013). La diferencia entre las dos vías DG/CA3 y CA1/SUB es más funcional. Hay una vía larga polisináptica que atraviesa todo el hipocampo (EC/DG/CA3/CA1/SUB) la otra ruta representa una vía corta monosináptica que empieza en la CE y termina directamente en el CA1/SUB (CE ⇒ SUB). Las dos vías funcionan independientes una de la otra sin embargo; una puede modular la otra. El SUB es el último relevo en el hipocampo y da lugar a las conexiones de salida hacia el área septal, núcleo acumbens e hipotálamo entre otras áreas (Naber et al., 2000). 9 Colaterales de Schaffer Fibras musgosas Giro dentado Vía Perforante Vía Temporo ammónica Hipocampo Células Musgosas Interneuronas Giro Dentado Fibras musgosas Colaterales de Schaffer   Figura 3. Circuito neural en el hipocampo del roedor. En la ilustración del circuito hipocampal. b Diagrama de la red neural hipocampal. La vía tradicional excitatoria trisináptica (Corteza entorrrinal (EC)- DG-CA3-CA1-EC) es representada con flechas sólidas. Los axones de las neuronas de la capa II en la EC proyectan al GD a través de la vía del patrón perforante (PP), incluyendo la vía lateral perforante (LPP) y la vía medial perforante (MPP). El GD manda proyecciones a las células piramidales en CA3 a través de las fibras musgosas. Las neuronas piramidales de CA3 relevan la información a las neuronas piramidales de CA1 a través de las colaterales de Schaffer. Las neuronas piramidales envían de regreso proyecciones en la capa profunda de las neuronas de la CE. CA3 también recibe proyecciones directas de capa CE de las neuronas de la capa II a través del patrón perforante. CA1 recibe entradas de la capa III de las neuronas a través de la vía temporo ammonica. Las células granulares del GD también proyectan a las células musgosas en el hilus e interneuronas hiliares las cuales envían proyecciones excitatorias e inhibitorias respectivamente de regreso a las células granulares (Esquema modificado de Deng et al., 2010).       10   Figura 4. Corte coronal del hipocampo y giro dentado. Donde se observan los diferentes estratos. El stratum piramidale (CP), stratum lucidum (SL), stratum radiatum (SR) y stratum oriens (SO). Se observan los campos CA1, CA3 y CA4 del hipocampo y del giro dentado (GD) se observan los estratos: granular (G) con las células granulares (CG) y estrato molecular (SLM). (Esquema modificado de Berberich, 2007). 1.3 Neurogénesis del GD Una característica del GD es que persiste la neurogénesis incluso en el adulto (Rapp & Gallagher, 1996). Se estima que cada día se generan nuevas neuronas en el GD, un proceso complejo que se inicia con la proliferación de precursores neurales en la capa subgranular aunque el 50% de células nuevas mueren durante los primeros días (Dayer et al., 2003). Las células que sobreviven, se diferencian en neuronas granulares y viven durante meses, integrándose en los circuitos hipocámpicos mostrando propiedades fisiológicas similares a las neuronas granulares maduras (Ramirez-Amaya et al., 2006; Laplagne et al., 2006), se ha postulado que las neuronas nacidas en el hipocampo adulto pueden participar en los procesos de memoria y aprendizaje y también que la tasa de neurogénesis se correlaciona de forma positiva con el aprendizaje de tareas mediadas por el hipocampo; también el aprendizaje especial, incrementa tanto la proliferación como la supervivencia de las nuevas neuronas (Gould et al.,1999; Dalla et al., 2007) (Figura 5). ! 11 0 sem Células progenitoras 1 sem 2 meses 3 sem Vía Perforante Células progenitoras Boton existente Boton nuevo de una CG Excrecencia espinosa Dendrita piramidal de CA3 Botón axonal de una neurona de CE Filopodio de una CG nueva Espina existente Figura 5. Neurogénesis en el giro dentado adulto y sinaptogénesis. Semana 0 Las células progenitoras neurales generan a las células granulares del GD (en verde), se producen cambios graduales morfológicos y fisiológicos. Semana 1. Las células del GD extienden sus dendritas dentro de la capa granular (GCL) y molecular (MOL) proyecta su axón hacia el hilus y el área CA3. Las células del DGC reciben proyecciones inhibitorias GABAérgicas de interneuronas locales (en azul). Durante la tercera semana las DGC reciben entradas glutamatérgicas (Glu) de la vía del patrón perforante en este momento las entradas GABA dejan de ser excitatorias para ser inhibitorias. Las sinapsis eferentes y aferentes se forman a partir de los días 24-26. Alrededor de los 2 meses de edad las propiedades fisiológicas son iguales a una CG madura. Abajo se ilustra la formación de nuevas sinapsis en P24 a P25. Izquierda se muestra un botón pequeño (en verde) del axón de una CG nueva que contacta con una excrecencia espinosa de una neurona piramidal del CA3 (en gris) se observa un botón axonal existente de la CE (en rojo). Derecha, se observan filopodios (en verde), que se extienden a un botón axonal en rojo que se asocia con otra espina existente (en amarillo) (Esquema modificado de Deng et al., 2010). 12 1.3.1 La célula granular El tipo celular principal del GD es la célula granular (CG) que presenta un soma elíptico de 10 µm de ancho por 18 µm de largo, por su conexión directa con el campo CA3, existe una relación entre el número de células granulares y las CP además su distribución es diferente, así cerca del área septal la relación de CP y CG es de 12:1 y en la zona del área temporal es de 2:3, el número de capas de CG es de 6 a 8 colocadas de manera muy cercana una célula de la otra, el árbol dendrítico apical tiene forma cónica y sus ramas se extienden a lo largo de la capa molecular (Gonzales et al., 2001; Amaral et al., 2007). El axón de la CG se origina en el GD y hace sinapsis tanto con las células musgosas del hilus, como con las CP del SL del CA3 del hipocampo (Figura 6). Las entradas a las CP del CA3 es diverso y si bien el que recibe del GD por medio de la vía de las fibras musgosas es escaso (Kee et al., 2007), éste es determinante para la función del CA3 (Clelland et al., 2009). Solamente entre 10 a 18 sinapsis musgosas hacen contacto con cada CP, mientras que el número de sinapsis que llegan a las CP de vías más débiles como las colaterales del CA3 o las vías provenientes del CA1, está en el orden de los miles (Tashiro et al., 2007). cg# cg# cp# gr# Figura 6. Esquema de giro dentado. Células granulares (cg) y las diferentes capas; molecular; ml, granular; gr y polimórfica, pl. En rojo se observan las fibras musgosas hacia el estrato lucidum (gris) de las células piramidales (cp) del CA3. Un plexo colateral hace más de 200 sinapsis con la capa polimórfica o hilus (Esquema modificado de Amaral et al., 2007). 13 1.3.2 Las fibras musgosas (FM) La función principal de la formación hipocampal es el aprendizaje y el paso de memoria de corto a largo plazo, esta función se inicia por la entrada de la información multimodal de la corteza entorrinal hacia la capa molecular del GD y de ésta al área del CA3 en donde se filtra la información relevante, por lo tanto esta sinapsis entre las FM y el CA3 (FM-CA3) tiene un papel importante para el almacén y recuerdos de la información de tipo espacial en las redes del hipocampo, como una función crítica en la que se identifica como el patrón de completación y de separación así como el almacenamiento de secuencias de eventos (Lisman, 1999; Nicoll & Schmitz, 2005; Bischofberger et al., 2006; Si & Treves, 2009). Los modelos programados por computación han formulado las hipótesis de que las FM ayudan a implementar e integrar un nuevo patrón de separación en las CP del CA3 que representan una nueva memoria, la cual prevalece a pesar de la interferencia que producen las memorias almacenadas a través de las conexiones colaterales recurrentes del CA3 (Treves et al., 2008). El sistema de FM es una estructura altamente compleja que conecta la corteza entorrinal con las CP glutamatérgicas e interneuronas GABAérgicas en la región hilar o hilus y del SL de la subregión del CA3. Se supone, que una CG inerva aproximadamente de 12 a 15 CP del CA3 y cada CP puede recibir cerca de 50 llegadas de las FM (Claiborne et al., 1990; Ishizuka et al., 1990); También existen pequeñas terminales que asemejan botones de otras neuronas hipocampales y éstas, hacen contacto con las interneuronas del CA3 (Figura 7), (Henze et al., 2000). Los axones que forman las FM fueron descritos primeramente por Golgi y Salas y después fueron nombradas por Santiago Ramón y Cajal por su parecido anatómico de las fibras encontradas en el cerebelo. Cada CG, da origen a un solo axón desmielinizado de aproximadamente de 0.2 µm de diámetro que origina una serie extensa de colaterales finas, las cuales inervan diferentes tipos de células en la región hilar y continúan formando contactos en el SL para hacer sinapsis dentro de las primeras 100 µm de la dendrita apical de la CP del CA3 y en algunas zonas también en las dendritas basales. Otro aspecto anatómico importante de la vía de las FM es que éstas generalmente están restringidas a una banda estrecha que corre en el SL. Cabe destacar que el desempeño de las pruebas 14 espaciales en los roedores, sugieren una correlación con la magnitud de llegadas de las FM en el SL y en el SO (Nerad et al., 1996; Henze et al., 2000). Figura 7. Fotografías de células granulares en las tres capas de giro dentado. Capas: molecular (m); granular (g) y polimórfica o hilus (h). La flecha indica las fibras musgosas; las cabezas de flecha blancas indican colaterales en la región del hilus y la región CA3 del hipocampo dorsal. En el recuadro de la derecha se observa una ampliación de una terminal musgosa (flecha) en la región hilar, la doble cabeza de flecha indica una extensión filopodial y las cabezas de flechas blancas indican pequeños botones en passant. Escala de la barra 10 µm (Esquema modificado de Acsády et al., 1998). Las FM presentan tres especializaciones presinápticas a todo lo largo de su axón principal; la primera, son botones gigantes de las FM (BFM), que inervan tanto a las células musgosas como a las CP del CA3, en la región hilar los BFM miden entre 4 a 10 µm, el número total a lo largo de un simple axón es de 10 (7 -12) y su contacto principal es la célula musgosa, en la subregión del CA3 en el SL el principal sitio de sinapsis es con la CP y el número de BFM es de 14 (11-18). La segunda son pequeños botones en passant y la tercera son extensiones de filopodios que se proyectan desde los BFM de los cuales salen de 2 a 3 extensiones de filopodios, que son móviles, ambas miden de 0.5 µm – 2.0 µm de largo (Figura 8). Las extensiones filopodiales y los botones en passant inervan selectivamente a interneuronas inhibitorias en el hilus y en el SL (Amaral, 1979; Claiborne et al., 1990; Frotscher, 1991; Acsády et al., 1998;). Estas terminales forman casi siempre 15 sinapsis asimétricas y perforadas en los cuerpos celulares de las dendritas y espinas de interneuronas GABAérgicas. Las FM son glutamatérgicas pero también contienen GABA (Sandler & Smith, 1991; Frotscher et al., 2006; Jaffe & Gutierrez, 2007) y el péptido opiáceo dinorfina (McGinty et al., 1983; Drake et al., 2007). Como resultado, el número mayor de contactos de las FM en el CA3 es con interneuronas inhibitorias más que con CP (Henze et al., 2000). Figura 8. Dibujo de dos especializaciones sinápticas de las fibras musgosas (FM). Extensiones filopodiales en color amarillo; de los botones gigantes de las FM en azul; espinas y dendritas de neuronas GABAérgicas en naranja (Esquema modificado de Mcbain et al.,1999). 1.4 La célula piramidal del CA3 El tipo principal de neurona en el hipocampo es la célula piramidal (CP) cuyo tamaño y organización es variable, tiene dendritas basales que se extienden dentro del SO y un árbol dendrítico apical que se abre formando el SLM. Las CP del CA3 localizadas cerca del giro dentado son de menor tamaño y con árboles dendríticos que miden entre 8-10 mm, pueden recibir información proveniente de la corteza entorrinal a través del patrón perforante (Figura 9). Hay células pequeñas que se encuentran cerca de los borde del giro dentado, el soma mide 300 µm2 o 20 µm de diámetro; las células más grandes se encuentran distales en el campo y el tamaño del soma puede ser de hasta 700 µm2 o 30 µm de diámetro. Las CP reciben una gran cantidad de terminales de las fibras musgosas (FM) en su árbol dendrítico Dendritas! Filopodios ! Botones'gigantes'de'FM' 16 apical y basal y las que se encuentran más distales reciben información de las FM solo en la dendrita apical (Ishizuka et al., 1990; Henze et al., 2000). Sr# Sl# Cp# So# Figura 9. Dibujo en cámara lúcida de una neurona piramidal de CA3. La localización en los diferentes estratos: radiatum (Sr); lucidum (Sl); oriens (So) y de células piramidales (Cp). Se observan las excrecencias espinosas en su mayoría localizadas en la dendrita apical en su porción proximal. La barra = 100µm (modificado de Ishizuka, 1990). Los botones de las FM son estructuras únicas en una variedad de formas, además de los contactos sinápticos como los filopodios contienen una gran densidad de vesículas electrodensas y redondas que expresan más de una zona activa y envuelven una compleja espina de las ramas dendríticas que surge de las CP del CA3 (Amaral, 1979; Amaral & Dent, 1981). Los estudios a nivel de microscopía electrónica muestran que los BFM contienen retículo endoplásmico liso y un gran número de mitocondrias (Chicurel & Harris, 1992). En esta sinapsis, el elemento posináptico es una estructura altamente ramificada llamada excrecencia espinosa parecido a un gran complejo espinoso que se encuentra en la parte proximal de la dendrita apical de la CP de CA3 (Figura 10) estas estructuras también se encuentran en un número menor en las dendritas proximales basales. La excrecencia invagina en las terminaciones presinápticas y presentan dos tipos de especialización en membranas llamadas zonas activas, estos son sitios de liberación del transmisor y puncta adherentia que son complejos de adhesión (Urban & Henze, 2001; Mcbain, 2009; Lawrence et al., 2003; McBain, 2008). 17 Figura 10. Fotomicrografías electrónicas y reconstrucción tridimensional del complejo sináptico. Entre la presinapsis de la fibra musgosa (FM) y la posinapsis de la excrecencia espinosa (Ee), en la dendrita (DEN) de la célula piramidal del CA3. A, La presinapsis se identifica por la terminal de la FM, con numerosas y pequeñas vesículas (v), y por las mitocondrias (M). Con la Ee, se observan algunas uniones simétricas entre la DEN y los botones de las FM representativos de puncta adherentia (cabezas de flecha) nótese que no hay vesículas a su alrededor, en contraste con las uniones asimétricas (flechas) que si las tienen. B, representación esquemática del complejo pre y posináptico. (modificado de Henze et al., 2000). C, Microscopía electrónica de dos botones de FM adyacentes (MFB1,2) ambos botones en amarillo terminan en diferentes segmentos dendríticos (azul y naranja), las onas activas sinápticas se marcan en rojo. Escala 1 µm (modificado de Rollenhagen y Lübke (2007). En D Inervación densa y múltiples botones de las FM (MFBs) de diferente forma y tamaño (en varios colores) que hacen sinapsis con la dendrita (azul) Escala 1 µm E, 1.Reconstrucciones tridimensionales de un botón de la FM (amarillo), sobre la dendrita (azul) 2. La distribución de las dos membranas (zonas activas en rojo) y puntia adherentia (en naranja). En 3, organización de las vesículas sinápticas (puntos verdes) y de las mitocondrias (en blanco) de cada botón sináptico de la FM y en la rata adulta (modificado de Rollenhagen et al., 2010). v  C   1 2 3 C E D 18 1.5 La célula musgosa En la capa polimórfica también se encuentra una gran variedad de tipos neuronales la más común es la célula musgosa, la cual es tal vez la que Santiago Ramón y Cajal describió como célula estelada o triangular cuyo soma es grande (25 a 35 µm) y su forma es triangular o multipolar. Su árbol dendrítico se extiende a todo lo largo de la capa polimórfica y ocasionalmente hasta la capa molecular y nunca entran al campo CA3 adyacente. Una característica muy distintiva de las células musgosas son las enormes espinas llamadas excrecencias espinosas de las dendritas proximales que son grandes y complejas, este tipo de espinas también se observa en las CP del CA3 pero no tan densas y tan complejas (Figura 11). Figura 11. Fotomicrografía de una célula musgosa (A) y su dibujo en cámara lúcida (B). Se aprecian las excrecencias espinosas en las porciones proximales de las dendritas. Las dendritas se extienden en la capa polimórfica (pl) del hilus en el giro dentado y otras hasta las capas granular (gl) y molecular (ml). Barra = 25 µm (A) y 50 µm (B). (Esquema modificado de Amaral et al., 2007). 1.5.1 Proyecciones de las células musgosas En el interior de la capa molecular recibe proyecciones que se originan exclusivamente de neuronas en la capa polimórfica (Frotscher, 1991; Buckmaster et al., 1992; Buckmaster et al., 1996). En la rata las proyecciones se originan tanto del lado ipsilateral como del lado contralateral del GD a esto se le llama proyección de asociación/comisural hay evidencia de 19 que las proyecciones emergen de la capa polimórfica y casi exclusivamente de las células musgosas (Amaral et al., 2007). Las células musgosas son excitatorias e inmunoreactivas a glutamato (Frotscher et al., 1994). Se ha demostrado su naturaleza excitatoria al inervar a las CG (Scharfman, 1994), también pueden inervar a otras células glutamatérgicas y a células GABAérgicas (Buckmaster et al., 1996). Las células musgosas reciben una inervación masiva de las CG en el mismo nivel a través de las FM colaterales en la capa polimórfica. No hay un consenso acerca de cuál es la función exacta de las células musgosas; lo que se sabe es que inhiben localmente y estimulan distalmente a las CG, por lo que podrían participar en una modulación efectiva de la red del GD que promueve el patrón de separación por las CG (Scharfman & Myers, 2012). 1.6 Interneuronas del giro dentado 1.6.1 Células piramidales en canasta La interneurona más estudiada es la célula piramidal en canasta, se encuentra a lo largo de la capa granular (Figura 12). Estas células tienen un soma de forma piramidal que mide entre 25 y 35 µm de diámetro y el axón de estas células rodea las sinapsis con los somas de las CG; Santiago Ramón y Cajal fue el primero en describirlas, sus dendritas no presentan espinas y algunas de las dendritas basales se ramifican y extienden hacia la capa polimórfica, la mayoría de estas células contienen GABA como neurotransmisor inhibitorio en sus terminales. Estas sinapsis forman contactos simétricos con las CG localizados principalmente en los somas celulares y en las dendritas proximales de la dendrita apical (Seress & Ribak, 1983). 20 Figura 12. Localización de la célula piramidal en cesta (pbc) dentro del giro dentado. En A, impregnación argéntica de Golgi y ensamble de una pbc después de una inyección de neurobiotina y su dibujo en B con cámara lúcida mostrando sus características anatómicas y su posición en los diferentes estratos del giro dentado: molecular (ml), granular (gl) y polimórfico (pl). La flecha indica el origen del axón. La barra de calibración = 25 µm. (Esquema modificado de Amaral et al., 2007). 1.6.2 Otras Interneuronas Anatómicamente se describen 21 tipos diferentes de interneuronas en la formación hipocampal de la rata (Amaral, 1978; Freund & Buzsáki, 1996). Las interneuronas hipocampales forman una población heterogénea que lleva a cabo diferentes funciones; las interneuronas se diferencian entre sí por sus terminaciones nerviosas, por las bases de sus impulsos o por sus características electrofisiológicas, muchas tienen altas frecuencias y disparan en relación con el ritmo theta, razón por la cual son llamadas células theta (Sik et al., 1997), que liberan GABA. En el giro dentado, se han descrito 21diferentes tipos de interneuronas, de acuerdo a su localización, a la forma del soma, a su estructura dendrítica y la presencia o no de espinas (Amaral, 1978; Houser, 2007) (Figura 13). 21 Figura 13. Dibujo de la región hilar mostrando los tipos de interneuronas del hilus en el giro dentado. Células piramidales (1-3), gigante estrellada sin espinas (4), piramidal no alineada (5), musgosa (6), multipolar espinosa (7), ovoide (8), pequeñas células estrelladas sin espinas con un plexo axonal (9), suprapramidal sin espinas (10), estrellada del ápex con axón descendente (11), fusiforme (12), esferoide (13), 2 tipos de piramidales en cesta (14, 15), y horizontal en cesta (16), interneuronas limitantes (17,18). Célula Granular (cg) del giro dentado y capa granular (LG), axones de las cg, las fibras musgosas (FM), y capa polimorfa (PL). (Esquema modificado de Amaral, 1978). 2. PLASTICIDAD La plasticidad del Sistema Nervioso Central (SNC) es la capacidad de las células nerviosas para cambiar sus propiedades, desarrollando nuevas sinapsis, modificando la forma o la función de las existentes o desarrollando nuevos procesos, como resultado de la experiencia (aprendizaje), las lesiones, o procesos degenerativos. En el cerebro del adulto, la plasticidad es el resultado de cambios en la fisiología y / o en la bioquímica de los circuitos neuronales así como cambios en la estructura física establecida durante el desarrollo (Arnold & Breedlove, 1985; McEwen et al., 1991). Estos cambios en las propiedades neuronales, hacen posible la organización de las funciones cognitivas (sistemas funcionales complejos) el cual puede ser visto desde distintos niveles de análisis, desde el nivel molecular, con la liberación de factores tróficos (promotores del crecimiento) como respuesta al daño cerebral; el nivel bioquímico, en donde se producen cambios en el flujo de iones; los niveles de neurotransmisores y la estructura pre y posináptica, como respuesta al daño cerebral o el nivel anatómico en donde se establecen nuevas conexiones o vías en forma 22 espontánea en respuesta a cambios medio ambientales, hasta el nivel psicológico en donde se producen cambios en los aspectos perceptivos, cognitivos y emocionales de la conducta tras una experiencia. Esta propiedad del SNC de modificarse como consecuencia de su propia actividad, ha permitido entender los mecanismos que subyacen en áreas específicas como el hipocampo, una de las áreas principales de plasticidad en el cerebro y cuya estructura es fundamental para el almacenamiento de la memoria explícita. La neuroplasticidad del hipocampo se ha probado en diversos acercamientos experimentales desde estudios conductuales hasta los análisis de actividad y expresión de proteínas, acompañada de modificaciones en las conexiones de los circuitos neurales implicados, en donde las sinapsis posibilitan la interacción funcional para estos procesos de aprendizaje y memoria. Durante procesamiento de memoria, las neuronas hipocampales del CA1 desempeñan un papel crucial en la integración sináptica excitatoria de entrada proveniente del CA3 y la corteza entorrinal. Estas neuronas reciben entrada excitadora casi exclusivamente en las espinas dendríticas, cuya formación y eliminación (plasticidad estructural) son el reflejo de los cambios de la red del hipocampo (Gu et al., 2014). 2.1 Plasticidad sináptica en la conexión FM-CA3 e interneuronas La mayoría de los modelos computacionales sugieren que la subregión CA3 puede ser representada como una red atractora auto asociativa en el sistema de memoria, se asume que el CA3 opera de esta forma por las conexiones excitatorias recurrentes entre las células piramidales del CA3 la presencia de la potenciación a largo plazo (LTP, por sus siglas en inglés), las modificaciones sinápticas y asociaciones tipo Hebbian las cuales están formadas entre las células pre y posinápticas en conjunción con un set de procesos inhibitorios (Rolls & Kesner, 2006; Hunsaker et al., 2007) a todo esto en su conjunto se le llama plasticidad sináptica. La neurotransmisión excitatoria de las FM, depende de la liberación de glutamato y de la activación de receptores posinápticos a glutamato. El principal transmisor excitatorio en el hipocampo de los mamíferos es el glutamato, este despolariza las neuronas hipocampales, más aún, la estimulación eléctrica provoca su liberación. El glutamato activa tres tipos diferentes de receptores que median la transmisión excitatoria ionotrópica: 23 Kainato, α-amino-3-hidroxi-5-metil-isoxazole-ácido propionico (AMPA), y N-metil-D- aspartato (NMDA), además múltiples mecanismos del receptor pueden existir en la misma sinapsis. El blanco celular dicta no solo el tipo de receptor presináptico sino también el tipo de plasticidad que esta expresada en una sinapsis particular de la FM, es importante mencionar que también hay varias formas de plasticidad sináptica a largo plazo (Henze et al., 2000) La LTP es la forma duradera de la plasticidad sináptica que sirve como modelo de memoria (Warren, 1995; Bliss & Collingridge, 1993; Nicoll & Malenka, 1995;), si se activan mecanismos pre y posinápticos es llamado LTP tipo Hebbian y si solo se activan procesos presinápticos o posinápticos se le llama tipo no Hebbian, de cualquier forma la LTP está presente en la mayoría de las sinapsis excitatorias del SNC y puede encontrarse de manera prominente en estructuras que involucran aprendizaje y memoria como la amígdala y el hipocampo, varios estudios han dejado la idea de que la LTP puede subyacer ciertas funciones mnemónicas. La LTP ha sido estudiada en dos tipos de sinapsis excitatorias dependientes de receptores a NMDA en CP del CA3 en roedores; una, son sinapsis formadas por los axones de fibras comisurales/asociación y requiere de la activación del receptor NMDA y la otra, son las sinapsis formadas entre las colaterales de Schaffer y neuronas piramidales de CA1. Por otra parte se ha demostrado que en la sinapsis de las FM y las neuronas piramidales de CA3 la LTP es independiente de la activación de receptores a NMDA (Zalutsky & Nicoll, 1990; Nicoll & Roche, 2013) y dependiente de receptores a opioides por lo tanto los receptores opioides Mu, Delta y péptidos opioides como las encefalinas y dinorfina juegan un rol muy importante en la inducción de la LTP en terminales de las FM (Derrick, 1992; Derrick & Martinez, 1994) La plasticidad sináptica se ha visto modulada por multiples factores extrínsecos e intrínsecos como factores tróficos y hormonales y entre ellas hormonas sexuales como los estrógenos, en el siguiente capítulo veremos la fisiologia de los estrógenos y cómo afecta a distintas áreas del hipocampo y la plasticidad estructural y sináptica. 24 2.2 Función del zinc en la LTP de las fibras musgosas Otro de los elementos que se encuentra modulando la plasticidad sináptica de la vía excitatoria glutamatérgica en las terminaciones axónicas de las FM es el zinc un catión divalente que se encuentra dentro de las vesículas de los BFM. El zinc es un oligoelemento esencial, cuya importancia para el funcionamiento SNC es cada vez más apreciada. Hay múltiples mecanismos del zinc extracelular que puede estar modulando receptores a glutamato ionotrópicos y transportadores a glutamato, el zinc varía dependiendo de su concentración. Los blancos mejor caracterizados son los receptores a NMDA (NMDAR), se ha descubierto que a concentraciones micromolares selectivamente inhiben NMDAR, un análisis posterior que revela que a diferencia del Mg2+ que actúa como un bloqueador del canal, el mayor efecto del zinc en la actividad de los NMDAR es producir una inhibición voltaje independiente no competitiva, que se traduce como una menor probabilidad para abrir el canal (Legendre & Westbrook, 1990). Altas concentraciones también producen una inhibición voltaje dependiente de la corriente del NMDAR (Paoletti et al., 1997). Poco se sabe de los efectos del zinc en los receptores a AMPA (AMPAR) que co-localizan con los NMDAR en la membrana posináptica de las sinapsis glutamatérgicas, algunos estudios han encontrado al menos dos diferencias en el modo de acción entre ambos receptores, primero, los efectos son opuestos, ya que el zinc actúa como un potenciador de los AMPAR, la inhibición también se ha visto, pero solo a concentraciones muy altas algunos estudios han encontrado que tiene efectos complejos sobre receptores NMDA y puede ser una modulación endógena de plasticidad sináptica. En cortes del CA1, se observó que las bajas concentraciones de zinc micromolar disminuye las respuestas sinápticas en 40-50% de los receptores NMDA y se impide la depresión a largo plazo (LTD) pero no la LTP (Izumi et al., 2006). Hay evidencia de que el zinc puede ser liberado de las FM durante la estimulación sináptica y además es co-liberado con L-Glutamato (Assaf & Chung, 1984; Howell, Welch, & Frederickson, 1994; Quinta-Ferreira et al., 2004). También puede modular la función de varios ligandos y canales de iones dependientes de voltaje (Harrison & Gibbons, 1994; Xie & Smart, 1994; Ueno et al., 2002). Por el contrario, se ha observado que varios quelantes de zinc inhiben la inducción de la LTP de las FM (Budde et al., 1997; Lu et al., 2000; Li et al., 2001). Además la administración de zinc puede inducir la LTP de la transmisión de las 25 FM (Li et al., 2001). La LTP requiere de la entrada de zinc del espacio extracelular en la neurona posináptica usando vías permeables de Ca2+ como receptores AMPA o Kainato o a través de canales de iones dependientes de voltaje (Jia et al., 2002; Li et al., 2001). Existen tres fuentes principales de zinc en el cerebro, la primera se localiza en vesículas sinápticas de los nervios terminales, o bien se encuentra unido a la membrana en forma de metaloproteínas o en complejos proteína-metal; ambas pueden formar parte de reacciones metabólicas y no metabólicas, por último como iones libres en el citoplasma (Cuajungco & Lees, 1997). En condiciones normales, el zinc se modula en las vesículas sinápticas a través de receptores posinápticos ionotrópicos y metabotrópicos y se establecen controles para evitar la acumulación excesiva de zinc o su deficiencia. Esta homeostasis celular es el resultado de una regulación coordinada por diferentes proteínas que intervienen en la absorción, excreción y almacenamiento intracelular y del tráfico de zinc. Estas proteínas, en la membrana transportan al zinc, son las Zip y las intracelulares, son las metalotioneínas (MT) que controlan los niveles de zinc. Curiosamente, las alteraciones en las MT recientemente se han descrito tanto en el envejecimiento como para la EA. Cuando las concentraciones de zinc se ven disminuidas se observan cambios en la homeostasis por lo tanto se propone como un factor de riesgo para la depresión, la enfermedad de Alzheimer (EA), el envejecimiento y otras enfermedades neurodegenerativas lo que sugiere que el zinc es un factor clave en el desarrollo de varios trastornos neuropsiquiátricos y cambios en la neurogénesis, de hecho, la carencia de zinc se ha demostrado que afecta la neurogénesis y su aumento provoca apoptosis neuronal, lo cual puede llevar a un proceso de aprendizaje y déficit de memoria respectivamente. Por otro lado cuando se observa traumatismo craneoencefálico, accidente cerebrovascular o epilepsia, el exceso de afluencia del zinc en las neuronas provoca neurotoxicidad y muerte neuronal. (Cuajungco & Lees, 1997). 2.3 Plasticidad Estructural Además de la plasticidad sináptica hay varios estudios que han demostrado que la formación hipocampal presenta gran capacidad de plasticidad estructural esto quiere decir que es capaz no solo de reorganización cuando se daña el tejido si no que también suceden cambios estructurales que pueden llegar a ser dramáticos en un tejido intacto y sano a lo largo de la vida y que se ve influenciado por numerosos estímulos extrínsecos e intrínsecos, 26 como el medio ambiente, el aprendizaje, memoria, factores tróficos como el neuronal (NT), el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), y los hormonales como los glucocorticoides, y esteroides sexuales como los estrógenos. Las modificaciones en las neuronas (morfogénesis) suceden de manera dinámica y continua en la estructura del árbol dendrítico (dendrogénesis) así como en sus espinas (espinogénesis), también se observa en la formación de sinapsis (sinaptogénesis), en su reorganización o en su eliminación (Figura 13) y en crecimiento de los axones (axogénesis). Además en el giro dentado se siguen produciendo cambios en el número de nuevas neuronas un proceso llamado neurogénesis (Cameron & McKay, 2001) de igual forma varios estudios han identificado que la neurogénesis es modulada por múltiples condiciones (Stahnisch & Nitsch, 2002). Aunque muchos estudios han identificado moléculas y las condiciones que regulan la neurogénesis, el control transcripcional de la neurogénesis hipocámpica durante la edad adulta es menos clara (Suh et al., 2009). Se ha propuesto que el NF-kB (factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células) un complejo proteico que controla la transcripción del ADN y también está implicado en procesos de plasticidad sináptica y de memoria. Específicamente en el giro dentado (sitio de neurogénesis) el NF-κB regula las proyecciones de las FM del CA3 y la reconstitución del giro dentado (Suh et al., 2009). Durante el envejecimiento hay pérdida cognitiva que se relaciona con una pérdida continua de las células dentro del cerebro y, en particular en el hipocampo, que se podrían regenerar a través de la neurogénesis en el adulto. Sin embargo, lo que ocurre es que se altera la proliferación de células madre, la axogénesis, la sinaptogénesis y los mecanismos neuroprotectivos, lo que da lugar a la alteración de la vía y la fibra musgosa del giro dentado durante el envejecimiento (Imielski et al., 2012). Por otra parte, a finales de la década de 1980, la conclusión de que el giro dentado del hipocampo, contiene más células granulares en los machos que en las hembras de ciertas cepas de ratón estableció los efectos de los esteroides sexuales durante el desarrollo. Las hormonas gonadales también juegan un papel crucial en la conformación de la función y morfología del cerebro adulto. Además de los procesos relacionados con la reproducción, 27 los esteroides sexuales tienen una mayor participación en las operaciones cerebrales como la cognición y el estado de ánimo, en las que el hipocampo es un mediador. Por ser parte de la formación hipocampal, el GD, esta involucrado en dichos mecanismos y como tal, responde a los efectos de los esteroides sexuales. La primera indicación de que los esteroides sexuales pueden influir la neurogénesis en el GD adulto, fue lo demostrado por Tanapat y sus colegas (1999), las ratas hembras producen más neurogénesis que los machos. Lo importante es que también presentan una fluctuación en la proliferación celular durante el ciclo estral: las hembras producen más neuronas nuevas en proestro (cuando los niveles de estrógeno son más altas) en comparación con el diestro y estro. Además la ovariectomía disminuye la neurogénesis, mientras que la suplementación con E2 la aumenta, un efecto que se puede invertir mediante la administración de progesterona (P4) (Tanapat et al., 1999; Falconer & Galea, 2003; Tanapat et al., 2005). 2.3.1. El 17β - estradiol y la remodelación sináptica En 1990, el descubrimiento de que las fluctuaciones del E2 durante el ciclo estral de la rata, producían una mayor o menor densidad de los sitios posinápticos (espinas) de la dendrita apical de las neuronas piramidales del CA1 del hipocampo, marcó el comienzo de una nueva era en la investigación de los esteroides sexuales (Woolley & McEwen, 1992), ver figura 14. Una extensa labor ha demostrado que los esteroides sexuales tienen efecto sobre la sinaptogénesis en el hipocampo adulto. Por ejemplo, el reemplazo de la hormona induce cambios entre 50-100% en el número de espinas del CA1 (MacLusky et al., 2005; Parducz et al., 2006). De hecho, hay evidencia acumulada que sugiere una rápida remodelación y estabilización de las pequeñas espinas que pueden representar un mecanismo de formación y el almacenamiento de la memoria (Kasai et al., 2003; Sorra & Harris, 2000). Al medir un marcador de las espinas dendríticas (espinofilina) en el CA3 y en el hilus se observó una disminución en la inmunorreactividad para espinofilina en ratas Ovx, después de suplementar un grupo Ovx con estrógenos durante dos días, se observó una recuperación en la cantidad de espinofilina inmunoreactiva (Brake et al., 2001). 28 Figura 14. Plasticidad estructural del hipocampo. Izquierda, imágenes de la poda de espinas en un segmento dendrítico de las células piramidales del CA1, de una rata con hipoestrogenismo, las flechas indican las espinas de tipo hongo, A, rata suplementada con E2 y B, rata Ovx (Esquema modificado de Woolley & McEwen, 1990b). Derecha se muestra una tinción con Timm del stratum lucidum (sl) y del stratum oriens (so) en el CA3 del hipocampo de una rata sometida a sobreentrenamiento para mostrar la plasticidad de las FM (Esquema modificado de Ramírez- Amaya et al., 1999). 3. ESTRÓGENOS Los estrógenos son hormonas sexuales endógenas que tienen varios efectos fisiológicos vinculados con la reproducción como en el control de la ovulación, fecundación e implantación. Tambien son importantes durante el desarrollo, tiene efectos sobre el metabolismo de minerales, carbohidratos, proteínas y lípidos. En los ultimos años se ha visto que los estrógenos tienen una participación importante en diversas funciones del SNC como el desarrollo, induce dimorfismo sexual en el área preóptica y ventromedial del núcleo de el hipotálamo (Gorski et al., 1978; Davis et al., 1996), en los comportamientos afectivos, la epilepsia y procesos cognitivos del SNC, en especial en la memoria regulada por el hipocampo (Huang & Woolley, 2012). Existen tres tipos de estrógenos biológicamente relevantes el más activo es el 17β - estradiol (C18H24O2, E2) seguido por la estrona (C18H22O1, E1) y el estriol (C18H24O3, E3), cada una de esas moléculas es un esteroide de 18 átomos de carbono, que contiene un anillo fenólico A (un anillo aromático con un grupo hidroxilo en el carbono 3), y un grupo b- 29 hidroxilo o cetona en la posición 17 del anillo D. El anillo fenólico A es la principal característica estructural, de la cual depende la unión selectiva y de alta afinidad a receptores de estrógenos. (Figura 15). HO HO OH OH OH Estradiol Estriol OH =O Estrona Figura 15. Hormonas estrógenas. Estrona, estradiol y estriol, moléculas de 18 átomos de carbonos en cuatro anillos, con su anillo fenólico A y grupos hidroxilo, el estradiol presenta dos moléculas hidroxilo la estrona tiene un grupo hidroxilo y el estriol presenta tres (Esquema modificadeo de Aguila, et. al, 1999). En el hígado, el estrógeno secretado se oxida de manera reversible hasta generar estrona mediante la 17 - hidroxiesteroide deshidrogenasa y esos dos estrógenos pueden convertirse en estriol. Los tres estrógenos se excretan en la orina junto con glucurónidos y conjugados fosfato. En varones y mujeres posmenopaúsicas la principal fuente de estrógenos es el estroma del tejido adiposo a partir de la deshidroepiandrosterona secretada por la corteza suprarrenal. De este modo la concentración de estrógenos está regulada en parte por la disponibilidad de precursores androgénicos. 3.1 Biosintésis de los Estrógenos Los ovarios constituyen la principal fuente de estrógenos circulantes antes de la menopausia el principal producto secretor es el E2, sintetizado por células de la granulosa a partir de precursores androgénicos proporcionados por células de la teca, la actividad de la aromatasa es inducida por las gonadotropinas, que actúan por medio de receptores de membrana plasmática para incrementar las concentraciones intracelulares de adenosina 3´5´- monofosfato. Las gonadotropinas y el AMP cíclico también incrementan la actividad de la enzima de desintegración de la cadena lateral del colesterol y facilitan su transporte. 30 Los estrógenos se forman a partir de androstenediona o testosterona como precursores inmediatos y la reacción comprende la aromatización del anillo A que es catalizada en tres pasos por un complejo de enzimas monooxigenasa (aromatasa) utilizando la forma reducida de la coenzima nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) y oxigeno molecular como sustratos. El paso inicial en la biosíntesis de los estrógenos es la conversión de colesterol a pregnenolona, la cual es catalizada por la enzima citocromo P450 cortadora de la cadena lateral (P450scc). En 1987 Hu et al., demostraron que en las mitocondrias aisladas de oligodendrocitos (células gliales) de la rata eran capaces de convertir colesterol en pregnenolona. También se ha observado la presencia de la enzima aromatasa en los astrocitos capaces de sintetizar estrógenos (Garcia-Segura et al., 2008). La actividad de la aromatasa reside dentro de una glucoproteína transmembranal (familia P450 de monooxigenasas) también es esencial una flavoproteína omnipresente, la NADPH- citocromo P450 reductasa. Ambas proteínas se localizan en el retículo endoplásmico de células de la granulosa ovárica, células del estroma de tejido adiposo, sinsiciotrofoblastos placentarios, blastocisto previo a la implantación y diversas regiones del cerebro incluido el hipocampo en donde se ha visto la síntesis de estrógenos (hembras y machos) por la enzima final; la aromatasa (Figura 16). Por lo tanto un nuevo paradigma surge cuando se muestra que el E2 es sintetizado de novo en esta parte del cerebro. Además, estudios in vitro e in vivo han mostrado que el E2 originado en el hipocampo contribuye a la función hipocampal en particular la plasticidad sináptica, estructural y en la neuroprotección (Fester et al., 2011) El cerebro, las adrenales, las gonadas y la placenta son organos estereidogénicos (productores de hormonas esteroideas). Baulieu & Robel en 1990 mostraron que los esteroides como la pregnenolona y dehidroepiandrosterona tienen mayores concentraciones en el cerebro que en el plasma (Do Rego et al., 2009; Pelletier, 2010; Reddy, 2011; Kato et al., 2013). Además esta demostrado que los esteroides persisten en el SNC después de la gonadectomía o adrenalectomía. Los neuroesteroides son definidos como esteroides que se acumulan en el cerebro aun en ausencia de glándulas estereidogénicas y los cuales son sintetizados en el cerebro de precursores endógenos por enzimas presentes in situ (Baulieu & Robel, 1990). 31 Figura 16. Biosíntesis del estradiol desde el colesterol. Citocromo P450 enzima cortadora de la cadena lateral del colesterol (P450scc), 3β- hidroxiesteroide deshidrogenasa (3β-HSD), 17β - hidroxiesteroide deshidrogenasa (17β - HSD). (Esquema modificado de Woolley, 2007). Tanto los esteroides como los neuroesteroides son sintetizados a partir del colesterol por una serie de reacciones enzimaticas mediadas por el citocromo P450 y otras enzimas. De hecho la presencia de estas enzimas en el sistema nervioso han sido documentadas en varias especies, y el cerebro esta equipado con toda la bateria enzimática necesaria como para sintetizarlas a partir del colesterol (Do Rego et al., 2009; Pelletier, 2010). Como las gonadas son las principales fuentes de esteroides, los efectos producidos por los estrógenos en el hipocampo son atribuidos a la regulación endócrina por lo cual el E2 alcanza su blanco 32 a través del plasma. Las concentraciones de E2 en el suero son más bajas que las concentraciones en el tejido hipocampal (Hojo et al., 2008; Kato et al., 2013). Sin embargo suceden toda una serie de eventos plásticos a través del ciclo estral de la rata. Las diferencias enzimáticas y de expresión de aromatasa en las diferentes secciones del tejido hipocampal sugieren que los niveles de E2 difieren en varias regiones y pueden ser más altos en a región CA3 (Prange-Kiel & Rune, 2006). 3.2 Fisiología de la reproducción 3.2.1 Ciclo estral de la rata Las ratas presentan un ciclo reproductivo llamado ciclo estral que consiste en la ovulación de manera cíclica (con una duración de 4 a 5 días) pasando por cuatro estados básicos que son: diestro I o metaestro, diestro II, proestro y estro. Tienen como consecuencia un comportamiento sexual femenino determinado y estos mecanismos están mediados por las concentraciones hormonales. El ciclo ovárico comienza con la liberación pulsátil de la GnRH, factor que estimula la liberación de dos hormonas gonadotrópicas primarias de la glándula pituitaria anterior: la hormona folículo estimulante (FSH, por sus siglas en ingles) y la hormona luteinizante (LH, por sus siglas en ingles). La FSH a su vez, estimula el crecimiento de los folículos del ovario (células epiteliales que se encuentran rodeando cada óvulo); conforme los ovarios maduran secretan estradiol que genera un crecimiento epitelial de las paredes del útero (preparación para la implantación del óvulo). El incremento de estradiol genera una activación en la hipófisis y se libera LH, la cual genera la ovulación (rompimiento de los folículos maduros). 33 Figura 17. Concentración en plasma de las hormonas de la reproducción. Folículo Estimulante (FSH), Luteinizante (LH), Estradiol (E2), Prolactina (PRL) y Progesterona (P 4 ) en el transcurso del ciclo expresado en ng/ml ó pg/ml. En la gráfica se indica el período en el cual ocurre la ovulación y el periodo de receptividad sexual que es a finales del Proestro e inicio del Estro. Las barras negras representan el intervalo de oscuridad en un ciclo 12-12. (Esquema modificado de Smith, et al.,1975). La influencia continua de LH genera que la ruptura del folículo se vuelva cuerpo lúteo que produce estradiol y progesterona. Por lo tanto la FSH y la LH son las encargadas de estimular el crecimiento de los folículos y la síntesis de esteroides en el ovario. En la rata, este periodo dura dos días, siendo el primero la fase de proestro, cuando la hembra se encuentra receptiva sexualmente, y el segundo fase de estro, cuando ocurre la ruptura de los CITOLOGIA(VAGINAL( 34 folículos generando la ovulación (Jenkins & Becker 2005). La concentración de E2 fluctúa entre 100 y 150 pg/ml en el proestro, aproximadamente 6 a 12 horas antes de la ovulación. La P4 se incrementa unas horas (4 a 6 horas) antes de la ovulación después de la liberación del E2 durante el proestro. En estas etapas se presentan cambios en el tipo de células que están presentes en el útero de la hembra, estos cambios en la concentración de hormonas y la citología vaginal durante el ciclo estral de la rata se ejemplifican en la figura 17 (Marcondes et al., 2002; Goldman et al., 2007; Hawkins et al., 1975). 3.3 Efecto de los estrógenos en la plasticidad de la formación hipocampal Hace más de 20 años que se sabe de la participación de los estrógenos en la, el mantenimiento de la estructura neuronal, en la plasticidad sináptica y en la neuroprotección del hipocampo, se han demostrado cambios dramáticos en la fisiología y morfología celular del hipocampo dorsal en ratas ovariectomizadas (Ovx) y suplementadas con 17β - estradiol (OvxE) tanto in vitro como in vivo y también en las diferentes fases del ciclo estral, en donde se observa una pico alto en la concentración de los estrógenos en etapa de proestro y una concentración más baja en etapa de estro (Figura 17). Woolley et al., (1990) fueron los primeros en mostrar las consecuencias plásticas con la ovariectomía en la estructura de las neuronas piramidales del área CA1 de las ratas hembras, resultando en un decremento de la densidad espinosa de las dendritas y después del tratamiento sistémico con E2 la recuperación en el número de espinas dendríticas en esta región, estos mismos efectos se observaron a través del ciclo estral, en particular, la densidad de las espinas y de las sinapsis que varía en respuesta a las diferentes concentraciones de E2 a través de las diferentes etapas del ciclo estral. Otros cambios reportados incluyen, la facilitación de la memoria y aumento en el número de sinapsis espinosas, en roedores y primates (Smith & McMahon, 2005; Mukai et al., 2010;), incremento en la transmisión sináptica mediada por receptores NMDA (Foy, 2001; Smith & McMahon, 2005; Jelks et al., 2007) y en la magnitud de la LTP (Mukai et al. 2010; Smith & McMahon 2006), la expresión de receptores a estrógenos (ERs α y β por sus siglas en ingles) se modula también por el E2 (Adams et al., 2004; Jelks et al., 2007). Se muestra una clara influencia en el metabolismo del neurotransmisor GABA, la falta de estrógenos ováricos reduce la sintesis de la subunidad 35 GABAA (Morrell, 2002) y el mRNA que regula la enzima GAD para la síntesis de GABA (Ikeda et al., 2006; Zhou et al., 2007), hay estudios que demuestran que el E2 estimula la formación de sinapsis glutamatérgicas a través de mecanismos dependientes de ERα, (Jelks et al., 2007); la activación de ERβ induce cambios morfológicos en neuronas hipocampales que incluyen el incremento de ramas y densidad de espinas (tipo hongo) dendríticas (estudios in vivo) mejorando procesos cognitivos como la memoria (Liu et al., 2001), también se propone que los estrogenos producidos de novo en el hipocampo tienen un efecto en la espinogénesis mediada por mecanismos indirectos que son regulados endogena y paracrinamente (Prange-Kiel & Rune, 2006). Un reporte de (Smejkalova & Woolley, 2010) demuestra que el E2 puede potenciar la transmisión excitatoria a través de mecanismos presinápticos por promover la liberación multivesicular del glutamato; un decremento en la densidad de espinas y de las sinapsis fue observada en menos de 24 horas entre el proestro y estro tardio, al igual que los niveles de el E2 (Woolley & Mcewen, 1990, 1992 ; Bi et al., 2001; Marhaham et al., 2005) (Figura 18). 2552 Woolley and McEwen l Synapse Density Fluctuates during the Estrous Cycle Figure 2. Electron micrographs of the stratum radiatum in the hippocampal CA 1 region of an ovariectomized adult female rat that received oil (A) or estradiol (B). Synapses on dendritic spines are marked by solid arrows, whereas the open arrow in A marks a synapse on a dendritic shaft. Scale bar, 1 pm. served a fluctuation in the density of hippocampal synapses occurring during the estrous cycle in experimentally unmanipu- lated animals. While this fluctuation in synapse density could result from alterations in the levels of either gonadal or pituitary hormones, the fact that we observe such similar, short-term changes with estradiol manipulation strongly suggests that the differences in synapse density we have observed across the es- trous cycle are mediated by estradiol. Previous observations of gonadal steroid regulation of den- dritic morphology have been made in sexually dimorphic nuclei that are involved in reproductive behavior (De Voogd and Not- tebohm, 198 1; Carrer and Aoki, 1982; De Voogd et al., 1985; Km-z et al., 1986; Forger and Breedlove, 1987; Miyakawa and Arai, 1987) or have been associated with the development of reproductive function (Meyer et al., 1978). Of these, the changes that occur naturally in the adult are seasonal (De Voogd et al., 1985; Forger and Breedlove, 1987) and thus take place over long periods of time. The steroid-mediated differences in syn- apse density we have observed are unique in that they occur naturally, over a period of as little as 24 hr, in a region of the adult mammalian brain that is not known to be sexually di- morphic or involved in reproductive function. I he changes in dendritic spine and synapse density that we have observed are most likely the result of changes in the num- ber of dendritic spine/synaptic junction complexes present in the tissue as a function of hormonal state. While it is possible that treatment effects on synapse size or dendritic arborization could affect estimates of synaptic density without actually chang- ing the number of spine/synapse complexes present, we have evidence that these factors are not responsible for the differences we have observed. First, with regard to synapse size, we found no difference in the mean length of synaptic transects with es- tradiol treatment; the difference in synapse density calculated with a “conventional” formula was clearly due to a greater number of synaptic profiles observed in estradiol-treated com- pared to control animals. Further, we observed very similar estradiol-mediated differences in synapse density using the Di- sector method, which is not biased by differences in the shape, size, or orientation of the test objects subjected to analysis (Ste- rio, 1984; DeGroot and Bierman, 1986). Second, it seems un- likely that estradiol is affecting dendritic arborization, as we have recently obtained evidence that parameters such as number of apical dendritic branch points and total apical dendritic length in CA 1 pyramidal cells are not changed by estradiol treatment (C. S. Woolley and B. S. McEwen, unpublished observations). Thus, while it must be considered a possibility that a change in the volume of some component of the CA1 stratum radiatum could alter the total volume of this region, making differences in the density of synapses appear as a change in synapse number, it does not appear that an overall shrinking or extension of the pyramidal cell dendritic tree can account for estradiol-mediated changes in dendritic spine and synapse density. We have observed changes in the density of axospinous syn- apses, but not in the density of contacts made on dendritic shafts. This, in combination with the fact that we observed very few asymmetric synapses on dendritic shafts in any treatment group, indicates that the decrease in the density of axospinous synapses reflects a loss of spine/synapse complexes with no concomitant increase in the number of synapses made on dendritic shafts. Thus, it appears that, in parallel with fluctuating estradiol levels, we are observing a fluctuation in the actual number of asym- metric synapses present rather than shifts in synapse location between spine and shaft. It is quite likely that transition states between dendritic spines with associated synapses and “empty” dendritic shaft regions exist, for example, presynaptic terminals lacking postsynaptic densities or vice versa. However, it is not possible to identify dendritic shaft regions positively as belong- ing to a spiny pyramidal neuron or to an aspiny hippocampal Figura 18. Electromicrografia del stratum radiatu de la región hipocampal. En ratas adultas Ovx (A) que recibieron vehículo y ratas Ovx suplementa s con E2 (B). Sinapsis con espinas dendríticas (flechas negras) y sinapsis con ramas dendríticas (flecha blanca). Barra= 1µm. (Esquema modificado de Woolley & McEwen, 1992). 36 También se ha reportado una mayor neurogénesis y menor apoptosis en GD en etapa de proestro y en ratas Ovx y OvxE (Tanapat et al., 1999; Patima Tanapat et al., 2005); Así como una variedad de marcadores sinápticos, PSD95, espinofilina y sinaptofisina entre otros que también son regulados por la aplicación de estrógenos sistémicos (McEwen, 1992), confirmando el rol de los estrógenos en la formación y consolidación de las sinapsis. Kato en el 2013, mostró una fluctuación en las concentraciones de las hormonas esteroideas de E2 y P4 a través del ciclo estral siendo mayor en el hipocampo que en plasma, también observó fluctuación de las espinas dendríticas observándose una mayor densidad en Proestro y Diestro 2 (Figura 19), pero la expresión de las enzimas estereidogénicas (P450 y 17β - HSD) así como los receptores esteroideos no cambió significativamente durante el ciclo estral, . ! ! ! A ! B Figura 19. Fluctuaciones cíclicas en la densidad y morfología de las espinas dendríticas a lo largo del ciclo estral en el CA1 del hipocampo. En A, las imágenes de la dendrita en el estrato radial en ratas hembras durante el Proestro (P), Estro (Es), Diestro 1 (D1) y Diestro 2 (D2). En B, el numero total de espinas en los cuatro estados del ciclo estral, comparados con el macho, en donde hubo diferencias significativas entre Est y D2 en relación al Pro, el cual fue similar al total de espinas en el macho. (Esquema modificado de Kato et al., 2013). 37 Por otra parte se ha visto que el E2 pueden tener efecto en la plasticidad mediante la estimulación de factores tróficos y/o en la neuroprotección del hipocampo, basada en evidencia experimental sobre modelos in situ de animales y celulares in vitro; sugiriendo que los estrógenos suprimen el proceso inflamatorio por diversos mecanismos en el SNC (revisión de Woolley, 2007). Este efecto perdura durante la vida adulta y se mantiene constante por ser indispensable para la plasticidad de nuevas conexiones sinápticas. Al mismo tiempo, existe la posibilidad de que el E2 regule la síntesis de proteínas protectoras contra agentes apoptóticos e influya en el control de respuestas inflamatorias de la microglía reactiva y la función vascular aumentando la perfusión; Se ha visto que la NOS juega un rol en estos mecanismos, la nNOS en la inducción de la LTP, la iNOS modulando la inflamación y la eNOS mejorando la perfusión (Maggi et. al., 2004). Diversos estudios tanto de inmunocitoquímica como de hibridación in situ han demostrado la presencia de ER α y β en diversas áreas extra hipotalámicas e inclusive fuera de la localización clásica nuclear. Se ha demostrado la presencia de receptores sobre la región CA1 del hipocampo, asociadas a las mitocondrias, árboles dendríticos y sus espinas sinápticas (McEwen et al., 2001; Milner et al., 2005; Spencer et al., 2008). Se ha demostrado por numerosos estudios in vivo e in vitro en donde la aplicacion de agonistas y antagonistas del E2, así como la aplicación de E2 por vía sistémica o en cultivos celulares por lo tanto se proponen como moduladores de la plasticidad sinaptica estructural de manera endócrina y parácrina (Rune & Frotscher, 2005; Zhou et al., 2007), 3.4 Mecanismos de acción Los estrógenos actuan a través de receptores (ER), los receptores nucleares a estrógenos se dividen en ERα y ERβ y se han identificado dos isoformas del ERβ (β1, β2), se han reportado también receptores de membrana como ERα y ERβ además de el receptor GPR30 (7TMR) este es un receptor intracelular transmembranal que actúa de manera independiente e influye en la activación del factor de crecimiento epidermal (EGF). Técnicas de inmunohistoquímica con anticuerpos específicos contra los receptores revelan la presencia de estas proteínas en el núcleo y citoplasma de neuronas hipocampales, además se pueden observar tinciones en las dendritas apicales de células piramidales (Prange-Kiel & Rune, 38 2006). Uniéndose a su ligando deja una cascada de activación que finalmente resulta en la traslocación del receptor al núcleo, induce cascadas de señalización las cuales pueden tener efectos genómicos clásicos asociados a ER; efectos no genómicos, que involucran sistemas de segundos mensajeros y vías de proteínas cinasas; y efectos antioxidantes independientes de receptor (Klinge, 2001). Las acciones de los estrógenos incluyen diferentes mecanismos tales como la vía genómica que es aquella en la que los estrógenos se unen a las isoformas de los ER, resultando en la regulación de la transcripción de genes. En ausencia de estrógenos los ER son asociados a proteínas de choque térmico en un estado transcripcional inactivo. La unión de 17β - estradiol con su ER produce un cambio conformacional y esto promueve la homodimerización de los ER y en ciertos tejidos la subsecuente translocación nuclear. En el núcleo el ER actúa como un factor de transcripción uniéndose a los elementos de respuesta a estrógenos (ERE) en los promotores de los genes blancos, esto da como resultado el reclutamiento de correguladores específicos y un posterior decremento o incremento de la transcripción de los genes blanco. En el SNC las acciones no genómicas de los estrógenos han sido estudiados en tres escenarios, en los cuales los estrógenos también tienen efectos genómicos. Estos son: reproducción, neurotrofismo y neuroprotección. Todos los estudios también dejan la especulación de como la naturaleza del receptor media los efectos no genómicos. Existen efectos extremadamente rápidos de los estrógenos sobre la excitabilidad de la membrana, donde los estrógenos son capaces de unirse a receptores específicos en la membrana plasmática, aunque la naturaleza de éstos es aún controvertida. La unión a estos receptores, puede estimular diferentes mecanismos de señalización intracelular, como la apertura de canales iónicos y señalización de neurotransmisores con receptores acoplados a proteínas G, que afecta corrientes de calcio, la activación de cAMP y a la vía de las proteinas cinasas (MAP-kinasas), que actúan sobre sus blancos como el kainato y neurotrofinas o factores de crecimiento como el factor de crecimiento parecido a la Insulina -1 (IGF-1) o el BDNF, (Prange-Kiel & Rune, 2006). Las neurotrofinas son factores de crecimiento críticos para el desarrollo, mantenimiento y restauración de la función del cerebro, se ha propuesto que los estrógenos ejercen efectos sobre el SNC a través de la activación de neurotrofinas. Los estrógenos potencian la expresión de mRNAs de agentes neurotróficos, como el BDNF y el 39 factor neurotrófico derivado de la glia (GDNF), el factor de crecimiento neuronal (NGF) y el IGF-1. La habilidad de los estrógenos para activar estas neurotrofinas y sus efectos sobre el mantenimiento y restauración del SNC han sido descritos en varias regiones incluidas el hipocampo (Figura 20). Algunas líneas de investigación sugieren que el E2 regula la expresión BDNF (Sohrabji et al., 1995). Consistentemente con esta hipótesis las ratas Ovx disminuyen la expresión de RNAm de BDNF en el hipocampo, esto se revierte con la suplementación de E2 (Singh et al., 2014), esto puede ser debido a que las FM contienen concentraciones altas de BDNF (Scharfman et al., 2008). Un reporte de Smejkalova y Woolley (2010) demuestra que el E2 es capaz de potenciar la transmisión excitatoria a través de mecanismos presinápticos por promover la liberación multivesicular del glutamato.   Figura 20. Mecanismos de acción entre la interacción de los estrógenos y el BDNF. Dibujo que muestra los dos mecanismos de acción, izquierda es la convergencia y derecha es Inducción. (Esquema modificado de Scharfman & MacLusky, 2006). 3.5 Relación del óxido nítrico con el hipocampo El sistema nervioso es especialmente vulnerable al envejecimiento, algunas regiones del cerebro vinculadas a la memoria como el hipocampo, son afectadas por el estrés oxidativo. Estudios en animales sugieren, que tanto las enfermedades neurodegenerativas como las alteraciones cognitivas asociadas a la edad, son reflejo de la vulnerabilidad de ciertas poblaciones neuronales al estrés oxidativo. Estrógeno   Estrógeno   Plasticidad  neuronal,  Crecimiento  axonal,  supervivencia,  aprendizaje   40 Una de las posibles formas de como el SNC obtiene neuroprotección a través de la síntesis de óxido nítrico (NO), es por ser una molécula que tiene participación en la señalización intra e intercelular, además de que presenta un rol en diversos mecanismos fisiológicos y patofisiológicos en varios sistemas (cardiovascular, inmunológico y nervioso); regula el tono de los vasos sanguíneos mejorando la perfusión cerebral, media respuestas inmunes de células inflamatorias, actúa como mediador biológico, similar a los neurotransmisores en las neuronas (Aktan, 2004) de hecho funciona como un neurotransmisor retrógrado en el sistema nervioso periférico y central, además de producir plasticidad sináptica (Brenman & Bredt, 1997; Hardingham et al., 2013; Shepherd & Harris, 1998). Por el otro lado es un radical libre de oxígeno que actúa como un agente citotóxico en procesos patológicos particularmente en desordenes inflamatorios (Alderton et al., 2001; Bogdan, 2001). La sobreproducción de NO independientemente de las concentraciones de calcio intracelulares es debido a iNOS y da como resultado efectos celulares de protección y dañinos (Aktan, 2004). A partir del descubrimiento de que las neuronas son capaces de sintetizar NO en el SNC, su estudio como mensajero neuronal ha despertado gran interés dependiente de la función de las áreas donde se sintetiza. El NO se forma de la arginina por la enzima óxido nítrico sintasa (NOS), la cual oxida al nitrógeno de la arginina liberando NO y citrulina. La NOS es una familia de enzimas (E.C.1.14.13.39) representada por las isoformas, inducible independiente de Ca2+ (iNOS) y la constitutiva o dependiente de Ca2+ que a su vez, se divide en endotelial (eNOS) y neuronal (nNOS) (Alderton et al., 2001). La iNOS (también conocida como NOS-II , NOS-2 o tipo II) se encuentra principalmente en la glía y no en las neuronas (Saha & Pahan, 2006; Jaffrey & Snyder, 1995), no se expresa bajo condiciones fisiológicas. En condiciones normales eNOS y nNOS se sintetizan en pequeñas cantidades, y juegan un rol en el SN y en la circulación sanguínea (Jesko et al., 2003). La eNOS (NOS- III, NOS-3 o tipo III) se puede encontrar en células endoteliales de vasos sanguíneos y en astrocitos más que en neuronas (Iwase et al., 2000), regula la reactividad vascular en la periferia; nNOS (NOS-I, NOS-1 o tipo I) fue purificada en cerebros de roedores y cerdos, son las isoformas más abundantes en el cerebro (Fagan et al., 1999). Se ha demostrado que tanto la eNOs como la nNOS se expresan en neuronas hipocampales, pero los mecanismos exactos no están bien definidos (Dinerman et al., 1994). Los ER regulan la transcripción de 41 genes blanco como es el eNOS en una manera específica de la célula por unión del complejo en los elementos de respuesta a estrógenos (ERE) en la región promotora respectiva. Dentro de los efectos no genómicos (rápidos) esta la activación de la MAP cinasa (Singer et al., 1999). Los genes que codifican a la eNOS contienen ERE en su región promotora y son regulados por ER. Las neuronas piramidales de las áreas CA3 y CA1 así como las células granulares en el GD expresan receptores ERα y ERβ (Jelks et al., 2007; Shughrue & Merchenthaler, 2000a; Shughrue & Merchenthaler, 2000b; Shughrue et al., 1997), con la expresión nuclear de ERα más fuerte en neuronas piramidales del CA3 que en las del CA1 (Rune et al., 2002). A concentraciones fisiológicas los E2 inducen la formación de NO en la neocorteza y por lo tanto la vasodilatación mejora la perfusión, la cual finalmente resulta en neuroprotección (Grohé et al., 2004; Pelligrino et al., 1998). El receptor biológico para el NO más estudiado es la guanilato ciclasa soluble citoplasmática que al unirse con en NO forma GMPc e inicia las cascadas de señalización. La transmisión nitrinérgica constituye una nueva y particular forma de neurotransmisión. Por otra parte, estudios recientes de Lourenço et al., (2014), in vitro indican que la estimulación de neuronas glutamatérgicas promueve la elevación transitoria del nNOS en cada región del hipocampo (CA1, CA3 y GD) (Figura 21). Figura 21. Inmunohistoquimica de la nNOS en el Hipocampo. Izquierda, mostrando las áreas del hipocampo (CA-CA3) y el giro dentado (DG), en B y C las capas de los campos CA1 y CA3 (oriens (or); piramidal (py) y radiatum (rad). En D, el Giro dentado y las neuronas inmunoreactivas a la nNOS en la capa polimorfa (po) del hilus, en la capa granular (gr) y extensiones en la capa molecular (mo). Derecha, dinámica del efecto del NO por la activación del glutamato (glu) en cada campo del hipocampo y del giro dentado (DG). (Esquema modificado de Lourenço et al., 2014). 42 Así, en los murinos, los estrógenos pueden contribuir con cambios bioquímicos por la interrelación entre el NO, los glucocorticoides y las neurotrofinas en el hipocampo estructura clave en los procesos de aprendizaje y memoria de tipo espacial (Maur et al., 2015). 3.6 Formación hipocampal, estrógenos y memoria Los efectos de las hormonas sexuales tienen especial interés en la FH dada la importancia de esta estructura en la formación de memoria de tipo espacial y episódicas (Spencer et al., 2008) así como su vulnerabilidad a los efectos perjudiciales del envejecimiento y la enfermedad de Alzheimer (deToledo-Morrell et al., 2007; Foy et al., 2008). Se han hecho pruebas en diferentes especies, paradigmas, tipos de estrógenos, diferentes dosis y diferentes vías de administración, los ratas y ratones son especies en las cuales mejora su desempeño con cantidades de E2 similares a las de proestro (Daniel, 2006; Korol & Kolo, 2002; Xu & Zhang, 2006). Las pruebas diseñadas para probarlo son reconocimiento de objetos, evitación activa e inhibitoria, condicionamiento de miedo al contexto, laberinto en T, en Y, radial y acuático, entre otros, al menos 48 horas de suplementación con E2 mejora el desempeño en estas pruebas debido a una mejor consolidación de la memoria después de la ovariectomía (Packard & Theater 1998). Los efectos conductuales de las ratas en edad reproductiva están marcados por el ciclo estral, las altas concentraciones (proestro) y bajas concentraciones de los estrógenos (estro) dan como resultado cambios en la conducta reproductiva y en las conductas dependientes del hipocampo con resultados controversiales (Spencer et al., 2008), algunos trabajos muestran que altos niveles de E2 y de P4 durante el ciclo estral se asocian con un mejor desempeño en la memoria de tipo espacial (Frick et al., 2000), memoria de trabajo (Pompili et al., 2010), y uso de la estrategia espacial (Korol et al., 2004), otros estudios no reportan estas mejoras en pruebas dependientes de hipocampo (Berry et al., 1997; Markham et al., 2002; Sutcliffe et al., 2007; Walf et al., 2006; Warren & Juraska, 1997), que pone de manifiesto la dificultad de evaluar por medio de la conducta los efectos de la rápida fluctuación de los niveles hormonales en el hipocampo. 43 Existe cierto consenso en la literatura, al evaluar el aprendizaje y memoria de animales ovariectomizados y suplementados con E2, observándose un mejor desempeño en pruebas dependientes del hipocampo (Frick, 2009; Gibbs, 2010). Tanto en ratas y ratones envejecidos también se observa una disminución de la memoria dependiente de hipocampo, en particular, de la memoria de tipo espacial en una prueba de laberinto acuático de Morris (LAM), estos efectos se presentan antes en las hembras que en los machos y la aparición de esta pérdida de memoria espacial prematura en las hembras coincide con la pérdida hormonal (Frick, 2009), en efecto también la expresión de los ER α y β se reducen en el hipocampo envejecido de la hembra (Adams et al., 2002; Mehra et al., 2005; Waters et al., 2011) y las respuestas plásticas de las neuronas piramidales CA1 al E2 (por ejemplo, la densidad de las espinas dendríticas y el número de los receptores NMDA). Además, la supresión de cualquiera de los dos receptores pueden afectar la memoria de referencia espacial en el laberinto acuático de Morris (Fugger et al., 2000; Rissman et al., 2002). Se ha demostrado que la suplementación pueden mejorar o retrasar la presentación de daños en la función cognitiva en modelos animales y humanos (Luine, 2008). 44 III. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Existe abundante información acerca de la importancia de los estrógenos en el SNC y de su influencia en las funciones y plasticidad del hipocampo. Esta plasticidad se debe a que el hipocampo es un blanco funcional que responde de manera directa a cambios en el medio ambiente, el estrés, la edad y el aprendizaje, regulada, entre otros factores por las hormonas sexuales, entre éstas los estrógenos como el estradiol (E2). En los animales murinos de experimentación, se sabe que pueden contribuir con cambios bioquímicos, en la estructura, distribución y número de sinapsis, lo que sugiere una relación entre los cambios morfológicos y la formación de la memoria. En la rata adulta, se han reportado cambios plásticos por la influencia del E2 durante el ciclo estral y en animales ovariectomizados (Ovx) y suplementados con E2 (OvxE), en el campo CA1 y en el GD, pero hasta el momento hay poca información sobre cambios plásticos morfológicos en el sistema de fibras musgosas (FM), cuyo contenido en zinc es importante. Además se sabe poco de la influencia de los estrógenos durante el ciclo estral en el área CA3 del hipocampo. Por lo tanto, la finalidad de este trabajo es determinar la influencia que tienen los estrógenos en la actividad de la NOS constitutiva como un índice de neuroprotección y /o plasticidad así como en la organización anatómica y la conectividad sináptica de las FM; durante las diferentes etapas del ciclo estral de la rata adulta y en las ratas Ovx y los posible efectos funcionales por la suplementación con E2. 45 IV. HIPÓTESIS 1. Se producirán cambios en la actividad de la NOS constitutiva, en la organización anatómica y en conectividad sináptica de las diferentes etapas del ciclo estral, siendo mayores los cambios en la etapa de proestro, y menores en la de estro. 2. En ratas ovariectomizadas se observará una disminución de la NOS constitutiva, de la organización anatómica y de la conectividad sináptica, y se observará una recuperación con la suplementación de 10 µg de Benzoato de estradiol, observándose un mejor desempeño en una tarea de tipo espacial. 46 V. OBJETIVO GENERAL Evaluar el efecto de 17β - estradiol en la actividad de la NOS constitutiva, el contenido de zinc, el área de las FM y el número de sinapsis en las tres fases del ciclo estral: Diestro (D), Proestro (P), Estro (Es), en animales ovariectomizados (Ovx) y suplementados (OvxE) con una dosis adecuada de benzoato de estradiol, así como el comparar el desempeño de una tarea conductual entre ratas Ovx, y OvxE. V.I. OBJETIVOS PARTICULARES V.I.1 Incubacón de 500µ VI. MATERIAL Y MÉTODOS VI.1. Sujetos Se utilizaron ratas un total de 134 hembras adultas de la cepa Sprague - Dawley, de 70-90 días de edad (270-290g), tratados de acuerdo a los lineamientos de la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio del NIH y aprobado por el comité de bioética del INB- UNAM. Durante el tiempo que duró el experimento las ratas fueron alojadas de 2 o 3 animales por caja de policarbonato (45x24x21 cm) con suficiente material de anidación, adecuada limpieza además de agua y alimento (Purina Chow, formula No. 5001) ad libitum. Los animales se mantuvieron bajo condiciones de ciclo luz invertido (12 hrs luz – 12 hrs obscuridad; la luz se encendía a las 21:00 hrs) la temperatura entre 22-23oC y humedad relativa de 40-50%. En cada animal, se tomaron frotis vaginales entre 9:00 y 10:00 am y después de tres frotis seriados se determinó la etapa del ciclo estral en cada uno de los 3 grupos estudiados en: 1. Proestro; 2. Estro y 3. Diestro. VI.2. Cirugía 47 Para formar los grupos de animales ovariectomizados (Ovx), se extrajeron quirúrgicamente los ovarios, bajo anestesia con una combinación de los anestésicos Xilazina-Ketamina (30%-/70%), dosis de 1ml/kg; xilacina de Procin, PiSA A099884 y ketamina, Cheminova salud animal KTCHH11L05) mediante procedimientos asépticos. Todas las ratas operadas, recibieron ketofen (2 x 1 mg por día) por vía subcutánea durante tres días después de la cirugía para aliviar el malestar y se alojaron dos o tres animales por jaula. El periodo de recuperación fue de dos semanas y luego se formaron cada uno de los grupos para suplementar el E2 (una inyección por día, durante tres días). La ovariectomía se verificó mediante inmunoensayo para determinar los niveles de E2 en plasma (Beltrán-campos et al., 2010). Los niveles en sangre de E2 en animales Ovx (18,1 ± 2,43 pg / ml) se determinaron 15 días después de la cirugía. A pesar de que el método de ELISA no es suficientemente preciso para determinar el nivel de E2 en sangre, las medidas obtenidas fueron inferiores a los reportados durante el proestro, lo que indica que la ovariectomía fue eficaz en la reducción de los niveles circulantes de E2. Por otra parte, la ovariectomía se verificó cuidadosamente por inspección visual. La suplementación se hizo con inyecciones subcutáneas de benzoato de estradiol 17β - estradiol (E2) en un volumen total de 0.2ml/rata. El benzoato de estradiol (10µg/rata 3-Benzoato de β-Estradiol Sigma Aldrich. 5 g) se administró 2 días antes de la prueba conductual, mientras que la progesterona se hizo con inyecciones subcutáneas de pregnona (500 µg/rata; 4 Pregnona-3, 20 diona Sigma Aldrich. 25g) se administró junto con el E2. Las inyecciones siempre se administraron a la misma hora (9-10 am). VI.3 Desarrollo de los objetivos particulares VI.3.1 Objetivo particular 1 (Dosis) La dosis adecuada se estableció midiendo la plasticidad de las FM; se midió el área del SL mediante la técnica de Timm (se describirá en el objetivo 4) se administraron diferentes dosis a un total de 12 ratas Ovx por vía subcutánea a la altura de las vértebras sacras con jeringa de 1 ml. Para evitar el estrés durante la inyección, los animales fueron manipulados gentilmente. Se aplicaron tres diferentes concentraciones de estrógenos (Ovx, E10, E50 y PG ) y se formaron los siguientes grupos n = 3 hembras: 48 Grupo Ovx suplementado con vehículo (aceite vegetal) 0.2ml. Grupo E10 suplementado con 10 µg de benzoato de estradiol. Grupo E50 suplementado con 50 µg de benzoato de estradiol. Grupo PG suplementado con 500 µg de Progesterona / 10 µg benzoato de estradiol. Se comprobó que la dosis de 10 µg de Benzoato de estradiol fue la que generó mayor plasticidad en la rata, por lo tanto se utilizó para el desarrollo de los demás objetivos. VI.3.2 Objetivo particular 2 (Análisis de la Actividad de la cNOS) Análisis de la actividad de la cNOS dependiente de Ca2+ en el hipocampo se llevó a cabo midiendo la conversión de L-arginina en NO y L-citrulina. El hipocampo de 6 animales por grupo fue homogenizado en tampón (50 mM de Tris-HCl, EDTA 0,1 mM, 0,1 mM EGTA, 0,1% y B-mercaptoetanol, pH 7.5), que contiene un cóctel de inhibidores de proteasas y 0.1% (v/v) de Nonidet P-40. Se incubaron 500 microlitros de proteína 30 minutos a 37ºC en presencia de 10 mM de L-arginina-HCl, 1 mM de NADPH, 100 nM de calmodulina, 30µM de tetrahidrobiopterina, 2.5 mM CaCl2 y 0.2 mCi de [3H] L-arginina. Para probar la actividad de iNOS, las incubaciones se realizaron en presencia de 1 mM de EGTA y CaCl2 no se añadió. La mezcla de reacción se aplicó a una columna (Dowex-50W), que retiene [3H] L-arginina. La cantidad de [3H]-L-citrulina se midió utilizando un contador de centelleo Beckman LS6500. Los resultados se expresaron como ng L-citrulina/500 mg proteina/30 min (Aguilera et al., 2007). VI.3.3. Objetivo particular 3 (Determinación del Zinc) La determination de zinc se llevó en 30 animales 6 por cada etapa del ciclo estral (D, P, Es) y en los grupos Ovx y OvxE (suplementado con 10µg de benzoato de estradiol) para la determinación del contenido del zinc en el hipocampo, el cual se separó del cerebro tan rápidamente como fue posible y se colocó en tubos previamente lavados con una solución de ácido nítrico al 30% para evitar la contaminación externa. Todo el hipocampo se pesó en fresco, se registraron los datos y se les agregó 1 ml de ácido nítrico redestilado a las muestras. Los tubos cuidadosamente tapados se colocaron en baño de agitación a 60 º C por 49 30 minutos. El zinc fue medido en la solución resultante en un espectrofotómetro de absorción atómica equipado con un horno de grafito y corrección Zeeman fond (Analyst 600, Perkin Elmer). El equipo fue calibrado previamente con una solución de zinc comercial (Perkin Elmer GFAAS estándar mixto). El control de calidad se aseguró mediante la determinación de zinc en una matriz biológica basada en material estándar (1577b bovino hígado, NIST); la sesión de análisis se consideró adecuada cuando el estándar de calidad de control fue del 95-105% de su valor nominal. Los resultados se expresan como mg de zinc por gramo de tejido húmedo (Montes et al., 2008). VI.3.4. Objetivo particular 4. Área de las FM El área de las FM, se midió en un total de 30 animales 6 por cada grupo (D, P, Es, Ovx, OvxE), se midió el área del haz suprapiramidal de las FM, teñidas con la técnica histológica de Timm. Se perfundieron por vía intracardiaca previa anestesia con pentobarbital sódico (50 mg/k), con una solución de sulfuro de sodio al 0.4% pasando un total de 1ml/g. La perfusión se continuó con fijador de “Karnovsky (1.0% de paraformaldheido y 1.25% de glutaraldheido en 0.1M de solución de fosfatos a un pH 7.4) (West et al., 1981). Los cerebros fueron extraídos y para su crioprotección se colocaron en frascos con una solución de Karnovsky con sacarosa al 30% se mantuvieron en el refrigerador por 72 horas o hasta que el tejido bajó al fondo del frasco. Una vez fijados se procedió a cortar por congelación en secciones coronales de 40 µm. Las secciones fueron colectadas en estricta seriación y procesados usando una modificación de la técnica de Timm sulfuro de plata (Cintra et al., 1997). Este método se basa en la conversión del zinc a sulfuro de zinc de los botones gigantes de las terminales nerviosas de las FM, sobre las cuales se deposita el nitrato de plata cuando los tejidos son puestos en una solución que contiene un estabilizador (goma arábiga) un agente reductor que precipita la plata (hidroquinona) (Danscher & Zimmer, 1978). El haz de las FM que corresponde al área del SL se estimó en secciones del hipocampo dorsal, cada quinta sección. La primera, se obtuvo a partir de una posición inicial aleatoria dentro de los primeros cinco cortes de la serie montada. Para cada sección, 50 de los límites del haz suprapiramidal se definieron de acuerdo con (Amaral & Dent, 1981; Gaarskjaer, 1985), el área fue determinada en el hipocampo derecho (Figura 22). Figura 22. Corte coronal de hipocampo dorsal. Representativo usado para estimar el área de las FM en el SL (flechas negras). También se muestra el area del giro entado (DG) y zona CA1; barra, 300 µm. La captura de las imágenes se realizó con una cámara digital acoplada a un microscopio fotónico a través de un objetivo 4 x y analizadas con el programa Ip Lab. Se eligió el primer corte dentro de las primeras 5 secciones del hipocampo y después cada 160 µm de separación entre los cortes siguientes hasta capturar seis imágenes por animal. Se delimitó el área correspondiente al las FM con el programa Image “J”. El área obtenida (en µm2) fue corregida considerando la contracción del tejido (SFV). Para este propósito, una sección coronal de la formación del hipocampo se obtuvo inmediatamente después de la perfusión usando un microtomo de congelación. El SFV se calculó para estas áreas utilizando el método descrito por Van Eden & Uylings (1985). VI.3.5. Objetivo particular 5. Análisis de la ultraestructura sináptica El análisis de la ultraestructura sináptica se realizó por microscopía electrónica en cuatro grupos: P, Es, Ovx y OvxE y en 3 animales por grupo, cada uno se perfundió previa anestesia con pentobarbital sódico (50 mg/kg) por vía intraperitoneal, con solución salina al 0.9% 1ml/g, seguido de una solución de paraformaldheido al 4% y glutaraldehido al 1.5 % en una solución de 0.1M de buffer fosfatos a pH 7.4, se posfijaron 2 horas más en la misma solución fijadora y se dejaron en buffer de fosfatos para ser cortados en rebanadas Ovx$ SL MF DG CA1 51 coronales de 400µm en vibratomo (marca Vibratome 3000). Se separó el hipocampo dorsal según las coordenadas del atlas de Paxinos & Watson, (1982) (-3.3 Bregma), se localizó el área CA3 y cada bloque se fijó en una solución de glutaraldehido al 5% y tetróxido de osmio (Ted Pella Inc.) al 2%; posteriormente se deshidrataron en etanol a concentraciones crecientes (50%, 70%, 80%, 90%, 96% y alcohol etílico absoluto) manteniendo la orientación del tejido. La inclusión en resina del tejido se inició con una primera polimerización en plano dejándolos 24 horas para luego pegarla en una cápsula Beem, con una segunda re polimerización. Para ubicar el área de estudio, se efectuaron cortes semifinos con una cuchilla de vidrio en el Ultramicrotomo (Reichert Um03) para lo cual el tejido se separó de la cápsula y se redujeron los bordes para su orientación. Una vez lograda la orientación correcta y paralela de la capa de células piramidales del CA3, se obtuvieron los cortes finos a 90 nm en el mismo ultramicrotomo pero solo cambiando la cuchilla por la de punta de diamante. Estas secciones fueron colocadas en rejillas para ser contrastadas con acetato de uranilo y dejadas en citrato, finalmente fueron teñidas con azul de tolouidina en una solución de Borato al 0.1M pH alcalino. Cada corte fue observado en un microscopio electrónico de transmisión JEOL 100 B (operado a 60-80 KV) y las imágenes se obtuvieron con una cámara acoplada modelo ORIUS de Gatan con resolución de 0.25nm. El Análisis de imágenes capturadas a través del microscopio electrónico se llevó a cabo primero eligiendo el área del CA3 en los cortes semifinos del hipocampo donde se identificó una célula piramidal en donde se mostraba la dendrita apical con el área de las excrecencias espinosas en el SL (Figura 23), y se tomaron seis campos diferentes obteniéndose imágenes a 5,000 x; 10,000 x y ampliaciones a 25,000 x y 30,000 x. Sobre las imágenes de 10,000 x, se realizaron conteos de sinapsis y mitocondrias cercanas a las sinapsis en 6 campos diferentes de tres animales con el mismo tratamiento con el programa Image “J”. 52 Figura 23. Corte coronal representativo del HD (Izquierda). En el cual se observa el área de FM (negro), y el lugar donde se hicieron los cortes semifinos y finos (círculo blanco), del stratum lucidum (SL). Barra = 200 micrómetros. Derecha identificación de la dendrita apical en la neurona piramidal (d). Aumento 5000x. VI.3.6. Objetivo particular 6. Suplementación de estrógenos en una prueba espacial laberinto acuático de Morris (LAM) Comprobar el efecto de la suplementación de estradiol en la prueba espacial de LAM. Se formaron dos grupos más de ratas ovariectomizadas cada uno de 10 animales, con (OvxE) y sin suplementación de estrógenos (Ovx) después de la recuperación de la cirugía y suplementación, los dos grupos de animales se sometieron a una tarea de aprendizaje espacial en el LAM y la captura de cada ensayo se llevó a cabo mediante un sistema informático de seguimiento de Poly-track (San Diego Instruments), que controlan y registran la trayectoria de natación de las ratas para su posterior análisis. El laberinto consta de un tanque de plástico negro (1.5 m de diámetro y 45 cm de profundidad) cuyo nivel de agua fue de 26.5 cm. La temperatura del agua se ajustó a 25° C (± 0.5°C). Se colocó una plataforma cuadrada, de 10 cm por lado de acrílico transparente en el tanque, en una ubicación fija en el centro de un cuadrante imaginario y sumergida 1.5 cm bajo el agua. El tanque ubicado en una habitación separada, iluminada por luz blanca, y rodeada por 4 claves espaciales en la pared (Figura 24). Las ratas aprendieron a navegar a la plataforma guiándose mediante señales visuales en las cercanías del tanque (1,5 - 3 m) para escapar del agua. 53 El paradigma de LAM consistió en 2 sesiones idénticas una por día (LAM1 y LAM2) de 10 ensayos cada uno. Cada animal fue introducido en la piscina en diferentes puntos de partida para cada ensayo de manera aleatoria y constante para todos los animales (Ramírez-Amaya et al 2001). A cada animal se le permitió nadar hasta encontrar la plataforma, en el primer ensayo, si el animal no encontró la plataforma durante el límite de tiempo (60 s), se le guió a la plataforma con la mano y luego se colocó en una jaula de espera durante 30 s. La latencia de escape se midió en cada ensayo para cada animal. La memoria se midió 24 h después de la última sesión de entrenamiento (LAM2), una sesión de un solo ensayo se realizó en las mismas condiciones de la tarea de aprendizaje; pero sin plataforma de escape; el parámetro medido fue el tiempo que la rata tardó en llegar al area donde se encontraba la plataforma. Figura 24. Esquema del laberinto acuático de Morris (LAM) (izquierda). En donde se indica una plataforma oculta, la rata nada de manera aleatoria antes del entrenamiento y después del entrenamiento la rata alcanza la plataforma rápidamente. A la derecha abajo el tanque utilizado en las sesiones de aprendizaje y memoria de LAM y se observa a la rata sobre la plataforma oculta y dos de las pistas en las paredes y arriba se muestra el esquema de los 10 puntos de salida utilizado en las sesiones y el rectángulo negro, indica, el lugar donde se localizó la plataforma. Plataforma oculta Antes del entrenamiento Después del entrenamiento 4 3 1 5 109 2 8 6 7 N S O E 54 VI.4. Análisis estadístico Para el análisis de las variables: Actividad de la NOS, cantidad de zinc, área de las FM y densidad sináptica se realizó un ANOVA factorial de una vía seguida de la prueba post hoc de Fisher utilizando el programa Stat View tomando como nivel de significancia P < 0.05. Para la prueba del LAM, se hizo un ANOVA de medidas repetidas seguida de las pruebas post hoc de Fisher. La memoria se analizó midiendo el tiempo de llegada al área donde se encontraba la plataforma, se utilizó la prueba de t-student no pareada entre los grupos Ovx y OvxE. Los resultados se consideraron estadísticamente significativas scon una p ≤ 0.05. 55 VII. RESULTADOS VII. 1. Análisis histológico en grupos con dosis diferentes de suplementación Primero se analizó el área de las FM en el SL con la tinción de Timm en un grupo de animales con una n=3 por grupo para comprobar la dosis adecuada. El grupo suplementado con 10 µg de Benzoato de estradiol (E10) presentó la mayor cantidad de área de FM en el SL al compararlo con el grupo Ovx (Figura 25). Figura 25. Área (Dosis). Gráfica en la que se muestran los valores promedio ± E.E. de 3 animales por grupo. Ovx. Ovariectomizadas, E10, suplementadas con 10 µg de benzoato de estradiol, E50, suplementadas con 50 µg y PG, suplementadas con P4 500 µg + 10 µg de benzoato de estradiol. Se indica con un asterisco la diferencia significativa (p < 0.01) del incremento del área de las FM. comparado con el grupo Ovx. ANOVA factorial, seguida de la prueba post hoc de Fisher. VII.2. Efecto del 17β - estradiol en la actividad de la NOS constitutiva La ANOVA factorial de una vía de la NOS constitutiva o dependiente de la actividad de Ca2+ (eNOS / nNOS), muestra diferencias estadísticamente significativas (F4, 19 = 4.104; p = 0.0146), la prueba post hoc de Fisher muestra diferencias entre el grupo estro comparado con el grupo proestro, (p = 0.0050), del grupo Ovx comparado con el grupo proestro (p = 0.0030) y con el grupo OvxE (p = 0.03). También se observan una recuperación del grupo OvxE ya que no se encontraron diferencias significativas con el grupo proestro. ver Figura 27. Á re a (µ m 2 ) 56 Cabe señalar que se midió la NOS inducible independiente de Ca2+ y no se encontraron diferencias significativas entre los diferentes grupos. 0 50 100 150 200 250 300 350 D P Es Ovx OvxE A ct iv id aa d d e N O S d ep en d ie n te d e C a2+ ( n g d e L - ci tr u li n a /5 00 µ g d e p ro te ín a /3 0 m in )! * * P * P * Es Ovx   Figura 26. Actividad de NOS dependiente de Ca2+ Gráfica en la que se muestran los valores promedio ± E.E. de 10 animales por grupo de la actividad de la sintasa del óxido nítrico constitutiva dependiente de calcio (NOSc). Se observan diferencias estadísticas. El asterisco (*) indica una diferencia etadística de p < 0.01. D, Diestro, P, Proestro, Es, Estro, Ovx, ovariectomizadas y OvxE ovariectomizadas suplementadas con E2. ANOVA factorial seguida de la prueba post hoc de Fisher. VII.3. Análisis de la cantidad total de zinc en el hipocampo Se determinó la variación del contenido de zinc en el hipocampo por espectofotometría de masa atómica, y a través del ciclo estral (D, P, Es) y en animales Ovx y OxvE. El ANOVA factorial de una vía mostró diferencias estadíasticas (F4,25 = 4.879; p = 0.0048) entre los grupos, y el análisis post hoc de Fisher que los grupos diestro (p = 0.0383 ), Es (p = 0.0015), y Ovx (p = 0.009) son diferentes al grupo proestro. Por otro lado, el contenido de zinc del grupo OvxE fue significativamente mayor (p = 0.0395 ) con respecto al grupo Ovx. (Figura 27). 57 Figura 27. Contenido total de zinc. Gráfica en la que se muestran los valores promedio ± E.E de 10 animales por grupo del contenido total de zinc. Las barras representan la cantidad de zinc en el hipocampo de los cinco grupos: D, Diestro, P, proestro, Es, estro, Ovx, ovariectomizadas y OvxE, suplementadas con E2. El asterisco (*) indica una disminución de zinc en los grupos D, Es, y Ovx comparado con el grupo P. Se observa un incremento en el grupo OvxE comparado con los grupos Ovx y Es. ANOVA factorial seguida de la prueba post hoc de Fisher. VII. 4. Análisis histológico Se realizó una ANOVA factorial de una vía para analizar el efecto del E2 en el área de las FM del SL en los diferentes grupos (F4 , 25 = 4,633, p = 0.0062). En la fase de estro se observó una disminución significativa (p = 0.0031) del área de las FM en comparación con los animales del grupo P y OvxE. El grupo de animales Ovx también tuvo una disminución en el área del las FM comparado con el grupo P (p = 0.0007); y la suplementación con E2 revirtió la pérdida del área de FM. (Figura 28). 58 0 50,000 100,000 150,000 200,000 250,000 D P Es Ovx OvxE Á re a (µ m 2 ) * P * D P * Es Ovx Figura 28. Área. Gráfica en la que se muestran los valores promedio ± E.E de 6 animales por grupo. Las barras representan los cinco grupos comparados: D, Diestro, P, proestro, Es, estro, Ovx, ovariectomizadas y OvxE suplementadas con E2. Los asteriscos (*) indican una disminución significativa en los grupos Es y Ovx comparados con el grupo P. También se observa un incremento significativo (p < 0.01) del grupo OvxE comparado con los grupos Ovx y Es. ANOVA factorial seguida de la prueba post hoc de Fisher. En la figura 29 se muestran imágenes de cortes coronales del Sl representativos de cada una de las etapas del ciclo estral y de ratas Ovx, OvxE del hipocampo dorsal, obtenidas mediante la técnica de TIMM y microscopio de luz. 59 Figura 29. Imágenes representativas del Stratum lucidum (Sl ) de cada uno de los grupos. Se observa el área de las FM en negro, correspondiente al zinc precipitado en los botones gigantes, en A rata en Diestro, B, Proestro, C, Estro, D, Ovx y E, OvxE. También se aprecia una otra banda en el Stratum oriens (SO). Barra = 200 µm. VII.5. Ultraestructura, densidad sináptica Se decidió quitar el grupo diestro ya que no hay diferencias anatómicas con el grupo proestro. Se realizó una ANOVA factorial de una vía. (F3,40 = 9.176; p < 0.0001) con la finalidad de demostrar el efecto del E2 en la cantidad de sinapsis en 1.828 µm2 del SL del área CA3 del hipocampo. Los resultados muestran una disminución en el número de sinapsis en los grupos Es y Ovx comparado con el grupo P, en ratas OvxE se observó una restitución de las sinápsis (Figura 29). 60 0 5 10 15 20 25 30 35 P Es Ovx OvxE D en si d a d s in á p ti ca * * Figura 30. Densidad sináptica. Gráfica en la que se muestran los valores promedio ± E.E de 3 animales por grupo. Las barras representan la cantidad de sinapsis en cada grupo, P, proestro, Es, estro, Ovx, ovariectomizada, OvxE, Ovariectomizada suplemntada con E2. El asterisco (*) indica diferencias significativas (p < 0.01) con respecto a los tres grupos. No se encontraron diferencias entre los grupos Es y Ovx. ANOVA factorial seguida de prueba post hoc de Fisher. En la Figura 30 se muestran fotomicrografías representativas obtenidas en el microscopio electrónico de transmisión (MET) de cada uno de los grupos analizados (P, Es, Ovx, y OvxE). Se puede apreciar las sinapsis como zonas electrodensas que en muchas ocasiones se muestran cerca de ellas vesículas grises asumiendo que tienen en su interior glutamato y zinc; las cuales corresponden a botones de las FM y también se pueden apreciar múltiples mitocondrias. Se puede observar claramente que en el grupo proestro (A), una mayor cantidad de sinapsis, es evidente como el número de sinapsis disminuye 12 horas después durante la etapa de estro (B); también se puede apreciar la pérdida de zonas electrodensas, en las sinapsis del grupo Ovx (D) y la restitución parcial después de la suplementación con E2 (C). 61 A b b m B m b A b s m C m b b D Figura 31. Fotomicrografias de imágenes representativas tomadas con el microscopio electrónico de transmisión. Las imágenes corresponden al primer tercio de la dendrita apical de las células piramidales del SL del CA3. En A, se indica el grupo en proestro; en B, grupo en estro, en C, grupo OvxE y D, grupo Ovx. Se observan botones (b), mitocondrias (m) y zonas electrodensas correspondientes a las sinapsis (flechas blancas). Se aprecia una menor cantidad de sinapsis en estro y Ovx, respectivamenre. Aumento 10,000 x. Las barras indican 1µm. 62 VII. 6. Prueba de comportamiento en Ovx y OvxE (aprendizaje y memoria) Los resultados de los dos dias de ejecución en el laberinto acuático de Morris (LAM) fueron analizados con ANOVA factorial y de medidas repetidas (tiempo x tratamiento) seguido de un análisis post hoc con la prueba de Fisher. En la Figura 30 se observa la latencia de llegada a la plataforma de los grupos Ovx y OvxE, las ratas en ambos grupos reducen el tiempo de latencia para alcanzar la plataforma (Día 1: F9.180 = 2.237 y p = 0.0034; Día 2: F19,180 = 2.515 y p = 0.00084). Sin embargo, la comparación entre los grupos mostró que las ratas Ovx tomaron más tiempo para encontrar la plataforma que las ratas OvxE en los ensayos 9 y 10 del día 1. Este efecto fue más evidente en la sesión del día 2, alcanzando significancia estadística en los ensayos 5 y 7 – 10 (p < 0.05). Los resultados demuestran que el grupo OvxE presenta diferencias estadísticas entre los ensayos 1vs10 (p = 0.042) 1 vs 5 (p = 0.0216) indicando que este grupo aprendió la tarea en contraste con el grupo Ovx que exhibió deficiencias en esta prueba de aprendizaje espacial. L at en ci a (s )! Dia 1! Dia 2! Figura 32. Aprendizaje. Gráfica en la que se muestran los valores promedio ± E.E de 10 animales por grupo del aprendizaje en el LAM. Las gráficas representan el promedio de la latencia para encontrar la plataforma (60 segundos) en 10 ensayos durante dos dias de entrenamiento. Cada punto representa la latencia promedio de llegada a la plataforma en 10 ensayos. Los asteriscos (*) indican las diferencias significativas, dia 1(p =0.0034) Día 2 (p = 0.00084) entre ambos grupos (Ovx y OvxE). ANOVA de medidas repetidas y factorial, seguido de una prueba post hoc de Fisher. 63 Para la prueba de memoria, se midió la latencia para llegar a la localización donde se encontraba la plataforma, realizado 24 horas después de la última sesión de aprendizaje en un solo ensayo (120 segundos). Los resultados de la prueba t-student (Figura 32) muestran que las ratas OvxE recordaron la tarea (p = 0.0366), mientras que las ratas Ovx no alcanzaron el umbral de memoria . ANOVA de medidas repetidas y factorial 0" 10" 20" 30" 40" 50" 60" 70" 80" 90" 100" Ovx" OvxE" L a te n c ia ( s ) *   Figura 33. Memoria. Gráfica en la que se muestran los valores promedio ± E.E de 10 animales por grupo de la latencia para llegar al lugar donde se encontraba la plataforma durante la adquisición. El asterisco (*) indica diferencias significativas (p < 0.05) entre los grupos Ovx, Ovariectomizados y OvxE, ovariectomizados suplementados con E2. t- student no pareada 64 VIII. DISCUSIÓN En este estudio presentamos evidencia que sugiere que el 17β - estradiol (E2) tiene un papel importante en la plasticidad y mantenimiento de las FM en CA3 del hipocampo, eventos valorados por el número de sinapsis, la cantidad total de zinc, la actividad de la NOSc, el aprendizaje y la memoria de tipo espacial en la rata albina a través del ciclo estral y en ratas ovariectomizadas (Ovx) y suplementadas con E2 (OvxE). Las FM fueron evaluadas mediante tinción de Timm; el área del haz suprapiramidal se redujo significativamente en los grupos con niveles bajos de E2 (Estro y Ovx), fenómeno que se invierte en ambos grupos, cuando los animales presentan concentraciones altas (etapa de proestro) y en las ratas que se complementan con dosis fisiológicas del E2 (OvxE). Además, los niveles del zinc totales en el hipocampo también se redujeron producto de la ovariectomía, y después de la suplementación con E2 se revirtió el efecto. Por otra parte, el E2 modula la actividad de la NOSc dependiente de Ca2+ observándose un decremento en el grupo de ratas Ovx y su recuperación después de la suplementación. Finalmente al probar los grupos de ratas Ovx y OvxE en una conducta de tipo espacial, las ratas Ovx no mostraron un buen rendimiento en el LAM en comparación con aquellas que si se suplementaron con el E2. Así, estos resultados sugieren que el E2 es importante en la regulación de zinc del hipocampo, cantidad de NOSc, plasticidad sináptica y por lo tanto en la memoria espacial. El papel fisiológico del zinc en las vesículas sinápticas glutamatérgicas sigue siendo poco conocido a pesar de que se sabe que la homeostasis del zinc es modulada por la señalización de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK- Mitogen-Activated Protein Kinase) y quinasas reguladas externamente (ERK - Extracellular signal-regulated kinases) en la presinapsis, además de que los eventos derivados de esta cascada son necesarios para la consolidación de la memoria dependiente del hipocampo. Es evidente el vínculo entre el estrógeno y la memoria espacial estudios anteriores han demostrado que la ovariectomía produce deficiencias en la adquisición de la tarea espacial como el LAM (Sarkaki et al., 2008) y otros estudios que muestran como el reemplazo hormonal mejora el rendimiento en el aprendizaje espacial (Daniel et al., 1997; Fader et al., 1998; Luine et al., 1998; El-bakri et al., 2004; Gresack & Frick, 2006; Xu & Zhang, 2006), lo que demuestra 65 que deficiencias en el aprendizaje pudieran estar relacionados con bajos niveles de E2 circulante. Además, el sustrato anatómico (hipocampo) responde a los niveles bajos de E2 por la disminución de la superficie de las FM, el nivel de zinc y menor número de sinapsis; efectos que se invirtieron con el reemplazo hormonal adecuado. Por otra parte, el área de las FM más grande y una mayor cantidad de zinc en el hipocampo se relacionan con un mejor rendimiento en las tareas espaciales en la rata. El estudio de Smith et al., (2009) está de acuerdo con el hecho de que esta hormona aumenta la función sináptica y la plasticidad sináptica en el hipocampo y altera la morfología de los sitios posinápticos. Se sabe también que las terminales de las FM forman un tipo distintivo de sinapsis las cuales son ricas en zinc y participan en la regulación de los canales iónicos y en las vías de señalización intracelular implicados en el aprendizaje, la memoria y la neuroplasticidad (Sindreu et al., 2011; Tóth, 2011). El zinc vesicular presináptico promueve y el postsináptico, inhibe la potenciación a largo plazo de las sinapsis de las FM en el CA3 (Pan et al., 2011). Al parecer, el zinc satisface varios criterios para ser un mensajero neuronal: se almacena en las vesículas sinápticas, se libera tras la despolarización, y actúa en varios receptores de la membrana. La asociación selectiva de zinc con las vesículas sinápticas que contiene glutamato sugiere que el zinc podría ser un co-transmisor en algunas sinapsis excitatorias (Paoletti et al., 1997). El zinc puede modular la estructura y la función de la densidad posináptica, así como la organización molecular y la plasticidad de la zona presináptica, lo que permite la expresión de la plasticidad sináptica (Gundelfinger et al., 2006; Grabrucker et al., 2011; Gundelfinger & Fejtova, 2012). Una característica única de este ion de metal divalente que es propuesto candidato para la transmisión como un mensajero anterógrado en neuronas posinápticas en el hipocampo (Ketterman & Li, 2008). Se discuten los efectos duales del zinc, la falta y el exceso de la señal de zinc producen disfunción de la transmisión sináptica y neurodegeneración (Takeda et al., 2013). En la revisión Tóth (2011), el autor afirma que la liberación de zinc fisiológico podría estar relacionado con el mantenimiento de una red neuronal estable y prevenir la muerte celular. La premisa paralela de estos efectos es que el zinc debe estar dentro de los niveles específicos en esta región del cerebro para cumplir una función fisiológica. El hecho de que los ratones que carecen del transportador del zinc (ZnT3) son más susceptibles a los ataques inducidos por ácido kaínico (Cole et al., 2000) 66 refuerza la idea de que el zinc desempeña un papel fisiológico protector, contra la sobreexcitación al glutamato, ya que la liberación de zinc a partir de las FM provocado por glutamato atenúa la entrada de calcio en las células posinápticas del CA3, lo que sugiere un papel modulador del metal en este sistema (Takeda et al., 2007). Las señales de calcio por lo tanto se modulan a través de la liberación de zinc no sólo como consecuencia de la liberación de glutamato, sino también a nivel de los canales y los receptores, ya que el zinc es capaz de inhibir los receptores de NMDA y los canales de calcio dependientes de voltaje (Paoletti et al., 2009). También se ha encontrado que los niveles de zinc podrían estar sujetos a la regulación de esteroides en diferentes niveles, hay evidencia experimental de que las ratas ovariectomizadas muestran disminución de los niveles circulantes de zinc (Ulas & Cay, 2011). En los seres humanos, los niveles de zinc en plasma fluctúan durante el ciclo menstrual, y estos cambios tienen una correlación positiva con las concentraciones de estrógeno en el plasma (Michos et al., 2010) un hecho que podría estar relacionado con la disponibilidad de zinc disminuida durante la menstruación en todo el organismo, incluyendo el cerebro. Es posible, entonces, que el estrógeno está implicado en la homeostasis del zinc, en todo el cuerpo así como en el cerebro y, además, en áreas específicas del cerebro como es el hipocampo. Incluyendo el hecho de la producción de la hormona sexual disminuye en el envejecimiento, lo que podría estar relacionado con la homeostasis alterada de zinc en el hipocampo y por lo tanto a problemas de memoria asociados con la edad. En relación a la homeostasis del zinc disfuncional también podría estar relacionado con enfermedades neurodegenerativas ya que se ha encontrado acumulación de zinc en las placas seniles cerebrales de pacientes con Alzheimer (Danscher et al., 1997). Se ha visto como un aumento de la superficie de FM en el SO del CA3 debido al exceso de entrenamiento en ratas macho produce un mejor desempeño en el LAM (Ramírez- Amaya et al., 1999; Gomes da Silva et al., 2012) sin embargo, en las hembras este efecto depende de la fase del ciclo estral y la cantidad de BDNF, que es la molécula candidato que pudiera tener mas probabilidades de estar involucrados en la regulación de las FM, sus acciones son muy complejas en parte por que hay diferentes vías por las cuales 67 su gene puede ser regulado, además de factores epigenéticos (Timmusk et al., 1993; Lubin et al., 2008). Se encuentran expresados ERs y trkB en todos los campos hipocampales en compartimentos pre y posinapticos (ver review Luine & Frankfurt, 2013) puede actuar como una señal para el crecimiento de nuevas y más FM ampliando la posibilidad de formar nuevas sinapsis. La ovariectomía en ratas deja una reducción de inmunoreactividad al BDNF en la vía de las FM comparado con ratas intactas (Scharfman et al., 2003) estos datos sugieren que las fluctuaciones en los niveles de plasma de E2 tambien provoca una fluctuación en la concentración de proteina BDNF en las FM (Scharfman et al., 2003; Sato, et al., 2007, Wolley et al., 1992). Usando rebanadas hipocampales de ratas en diferentes etapas del ciclo estral se demostró que la transmisión se incrementa cuando las concentraciones de BDNF fueron mayores (por ejemplo en la mañana de proestro de la rata hembra) y que curiosamente es cuando los animales responden mejor a las pruebas de reconocmiento de objetos y de lugar (Scharfman, 2007). La cantidad de las vesículas sinápticas que contienen zinc en el cerebro es especial debido a su labilidad, solo puede ser identificado mediante técnicas histoquímicas, como con el Timm (Frederickson et al., 2000). Aquí, se utilizó una variante mejorada de la antigua técnica para obtener consistentemente una mejor visualización del sistema de FM del hipocampo de los 5 grupos estudiados; los resultados mostraron que las fluctuaciones fisiológicas de los niveles de E2 pueden afectar profundamente la zona de las FM en el hipocampo dorsal; esta área aumenta significativamente durante el proestro, en un 22% en comparación con el grupo de estro y en un 26 % en comparación con el grupo ovariectomizado. Además, la ovariectomía tiene un efecto a largo plazo, esto se pudo valorar, ya que el resultado se midió 15 días después de la cirugía, la suplementación de una dosis baja de E2 fue suficiente para restablecer el área de las fibras musgosas en el hipocampo dorsal. Esto es consistente con el hallazgo reportado por Tanapat et al., (1999, 2005) un aumento en la neurogénesis de células granulares del GD durante el proestro y un aumento de la neurogénesis en ratas Ovx suplementadas con 10 µg de 17β - estradiol. Scharfman et al., (2007) encontraron cambios en la función del hipocampo de ratas Ovx después de dosis secuenciales bajas de E2, ellos reportan que la estimulación de las FM evocó la expresión del BDNF. En tejido aislado del hipocampo del ratón in vitro, Teter et al., (1999) reportaron un incremento del 75 % en el giro dentado dorsal durante el 68 tratamiento con E2 (100 pM), sin embargo esta respuesta es bloqueada por P4 y tamoxifeno. En la mayoría de los estudios revisados la sustitución estrogénica se realiza utilizando el E2 en distintas dosis (10 a 50 microgramos/Kg) y por diferentes vías (intracraneal, s.c. o por implantación de Pellets). En este estudio, no se encontraron diferencias significativas en el área de fibras musgosas cuando se empleó una mayor dosis (50 µg) de E2 y con la suplementación de P4, pero sí cuando se compararon con el grupo suplementado con 10 µg/día, este presentó una mayor plasticidad. Xu y Zhang en el 2006 suplementaron animales ovariectomizados con Benzoato de estradiol y observaron que estos animales normalizaron de manera eficaz los cambios producidos por la ovariectomía (Ovx), reduciendo el ancho de la hendidura sináptica y agrandando el grosor de densidad posináptica, incrementando el número de vesículas en la presinapsis del CA1 del hipocampo. La relación entre las hormonas esteroideas y el zinc en el hipocampo puede tener otras implicaciones importantes, ya que se ha visto que los corticosteroides tambien modulan las concentraciones de zinc en neuronas zincérgicas y producen cambios en la conducta cognitiva y emocional (Takeda & Tamano, 2012). Por otra parte y en relación a la medida de la actividad de la NOS constitutiva dependiente de la actividad de Ca2+ (eNOS y nNOS) en los 3 grupos de las diferentes etapas del ciclo estral y en los dos grupos Ovx y OvxE, se encontraron diferencias estadísticamente significativas, lo que indica que la actividad depende también de la cantidad de E2 circulante (Nicola et al., en 2008) en donde la eNOS y nNOS producen neuroprotección gracias a que mejoran la perfusión y la plasticidad sináptica y por lo tanto los procesos cognitivos como el aprendizaje y la memoria. Los estrógenos son agentes antioxidantes por ser donantes de hidrógenos que neutralizan los radicales libres, principalmente en el radical hidroxilo. Este mecanismo general puede disminuir la cantidad de radicales libres en las células nerviosas, siendo un punto de apoyo para la protección neuronal per se, además de actuar en otras vías diferentes, evitando muerte celular por estrés oxidativo o excitotoxicidad, como se indica en la revisión de Woolley en 2007. El E2 se ha propuesto que juega un rol importante en la prevención contra enfermedades neurodegenerativas, en parte, mediante la activación de sistemas de defensa antioxidantes 69 de especies reactivas del oxígeno, limita daños a la proteína mitocondrial, y mejora la cadena de transporte de electrones (Nilsen, 2008). También se ha reportado que el E2 media la expresión de la relación Cu/Zn de la enzima superóxido dismutasa en cortes de cerebro, como un mecanismo para proteger a las neuronas de isquemia (Rao et al., 2011). Así, estos resultados están concuerdan con los estudios de (Grohé et al., 2004) que reportó que la disminución del E2 en ratas Ovx disminuyó la actividad de la NOS dependiente de Ca2+ en el hipocampo y la suplementación revirtió los efectos, alcanzando los niveles del proestro (Figura 26). Los datos aquí presentados sugieren un efecto plástico, de encendido / apagado de los estrógenos circulantes en la zona del SL del hipocampo dorsal de la rata en el transcurso del ciclo estral. El área ocupada por las FM en el SL fue mayor durante la etapa de proestro, que coincide con un aumento en la concentración de estrógenos circulantes. Además, la cantidad de zinc en el hipocampo se correlaciona con un mayor sustrato en el área de musgo de la FM, dando como resultado un mejor rendimiento en las tareas espaciales. En ratas Ovx los valores de estos parámetros fueron menores y se asociaron con un decremento del rendimiento en el LAM. Los presentes resultados muestran por primera vez que el estrógeno modula la plasticidad y el mantenimiento de las FM en el CA3 del hipocampo durante el proestro. Se observó en el área CA3 una fluctuación en el número de sinapsis a través del ciclo estral, el grupo estro tuvo una disminución de las sinapsis comparado con el grupo proestro, cambios que ocurren en 12 horas o menos que es el tiempo que tarda en pasar de proestro a estro; se hizo la comprobación en el laboratorio con dos grupos de ratas Ovx, uno suplementado con E2 en el que se hubo una recuperación parcial en número de sinapsis, cambios que coinciden con lo reportado por Woolley et al., 1992 en el área CA1 del hipocampo. Es probable que el mantenimiento de sinapsis dependa también de la cantidad de E2 circulante, in vitro en rebanadas de hipocampo en cultivo, la inhibición de la aromatasa con letrozole da una regulación a la baja en la síntesis de estrógeno y por lo tanto disminuye el número de sinapsis en los cultivos hipocampales y también el número de botones sinápticos. La inmunohistoquímica revela la regulación a la baja de espinofilina un marcador de espinas, y sinaptofisina una proteína de vesículas presinápticas por acción del letrozole (Kretz et al., 2004). Por otro lado usando una reconstrucción tridimensional de electromicrografías Ledoux & Woolley (2005) encontraron que los estrógenos disminuyen 70 el número de vesículas sinápticas adyacentes a la membrana presináptica de las sinapsis inhibitorias. Sin afectar el número de vesículas y la densidad de entradas inhibitorias en las neuronas hipocampales de CA1. Un estudio en primates no humanos, en monos verdes africanos (Cercopithecus aethiops sabaeus) (Leranth 2002) demostró que el número de sinapsis disminuye en un 43.33% en animales Ovx comparado con el grupo OvxE (Leranth et al., 2002). Se ha descrito que los estrógenos inducen sinaptogénesis en las neuronas piramidales de CA1 y se ha demostrado que los estrógenos sintetizados de novo sirven para el mantenimiento de las sinapsis y síntesis de proteínas sinápticas. Hajszan (2010) demostró como el E2 ayuda a ratas en estrés lo que responde por primera vez la pregunta acerca de que los cambios en la conectividad sináptica, siguen el mismo patrón de plasticidad sináptica entre la FM y el SL del CA3. Otro estudio con suplementación de estrógeno conjugado equino aplicado cronicamente aumenta la densidad sináptica en el área CA1en ratas Ovx (Silva 2000). Xu and Zhang 2006 no encontraron diferencias de densidad sinaptica los diferentes grupos de ratas Ovx y suplementados con Benzoato de estradiol a dosis de 20, 100 y 200 µg/diaria S.C. por 4-5 semanas en ratones, esto pudiera ser debido a que las dosis utilizadas fueron muy altas. En resumen, los hallazgos aquí presentados pudieran apoyar la idea de que los estrógenos tienen efectos protectores para el hipocampo; primero porque la ovariectomía disminuyó la actividad de la NOS dependiente de Ca2+ y la suplementación estrogénica revirtió los efectos, alcanzando los niveles del proestro. Además, la importante influencia que tienen los estrógenos en la organización anatómica y la conectividad sináptica de las fibras musgosas durante las diferentes etapas del ciclo estral de la rata adulta, conservando la plasticidad sináptica entre la fibra musgosa y el estrato lucido del CA3 indicando la gran capacidad plástica para modificar la estructura sináptica, necesaria para responder a los cambios del ciclo hormonal durante la vida adulta. 71 IX. CONCLUSIONES La organización anatómica y sináptica de las FM con las células piramidales de CA3 en el Stratum lucidum y la concentración de zinc en el hipocampo, valoradas a través del ciclo estral presentaron un nivel máximo en la etapa de proestro y disminuyeron en la etapa de estro . La falta de E2 debido a la ovariectomía produjo cambios en la disminución en la actividad de la NOS constitutiva, en las concentraciones de zinc, y en la en la organización anatómica y sináptica del hipocampo dorsal, así como disminución del área de las FM y en el número de sinapsis del Stratum lucidum. Todos estos efectos producidos por la falta del E2, fueron restablecidos con la suplementación de E2 aplicando a una dosis de 10 mg/K por vía subcutánea durante tres días. Los cambios plásticos se podrían relacionar con la ejecución de la tarea de aprendizaje y memoria espacial evaluada en dos grupos experimentales con (OvxE) o sin suplementación (Ovx) de E2. Así, la falta de E2 ováricos, produce deficiencia en el desempeño de estas tareas. La suplementación con E2 mejora el desempeño de las ratas en un paradigma de tipo espacial; lo que sugiere fuertemente que el E2 juega un papel importante en el mantenimiento de las sinapsis del área del CA3 del hipocampo dorsal y por lo tanto en procesos cognitivos dependientes del hipocampo dorsal de la rata. 72 X. BIBLIOGRAFIA Acsády, L., Kamondi, A., Sík, A., Freund, T., & Buzsáki, G. (1998). GABAergic cells are the major postsynaptic targets of mossy fibers in the rat hippocampus. The Journal of Neuroscience  : The Official Journal of the Society for Neuroscience, 18(9), 3386–403. Adams, M. M., Fink, S. E., Janssen, W. G. M., Shah, R. a, & Morrison, J. H. (2004). Estrogen modulates synaptic N-methyl-D-aspartate receptor subunit distribution in the aged hippocampus. The Journal of Comparative Neurology, 474(3), 419–26. doi:10.1002/cne.20148 Adams, M. M., Fink, S. E., Shah, R. A., Janssen, W. G. M., Hayashi, S., Milner, T. A., … Morrison, J. H. (2002). 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Online ISSN: 0966- FI= 3.23. • Beltrán-Campos V, Padilla-Gómez E, Díaz-Ruiz, M. Alcaraz-Zubeldia, S. Galván- Arzate, C. Ríos, Prado-Alcalá RA, Ramírez-Amaya V, Díaz-Cintra S. Estrogen modulation, oxidative stress and aging on dendritic spines of CA1 pyramidal cells of the dorsal hippocampus. Neurología. 2014.   • Beltrán-Campos, Vicente, Padilla-Gómez, Eúridice, Aguilar-Vázquez, Azucena, Palma, Lourdes, Díaz-Cintra, Sofía. Bases neurobiológicas del envejecimiento neuronal. Revista Universitaria Digital, Marzo 2011 Revista Digital Universitaria [en línea]. 1 de marzo de 2011, Vol. 12, No.3. Internet: http://www.revista.unam.mx/vol.12/num3/art32/index.html ISSN: 1607-6079. 94 Effect of 17ß-estradiol on zinc content of hippocampal mossy fibers in ovariectomized adult rats E. Padilla-Gómez • V. Beltrán-Campos • S. Montes • A. Dı́az-Ruı́z • G. L. Quirarte • C. Rı́os • S. Diaz-Cintra Received: 3 February 2012 / Accepted: 13 July 2012 ! Springer Science+Business Media, LLC. 2012 Abstract Sex hormones such as estrogen (17ß-estra- diol) may modulate the zinc content of the hippocam- pus during the female estrous cycle. The mossy fiber system is highly plastic in the adult brain and is influenced by multiple factors including learning, memory, and stress. However, whether 17ß-estradiol is able to modulate the morphological plasticity of the mossy fibers throughout the estrous cycle remains unknown. Ovariectomized (Ovx) female 70- to 90-day- old Sprague-Dawley rats without or with estrogen supplement (OvxE) were compared with control rats in three stages of the estrous cycle: diestrus, proestrus, and estrus. The brain tissue from each of the five groupswas processed with Timm’s silver sulfide technique using the Image J program to measure the mossy fiber area in the stratum lucidum of CA3. Total zinc in the hippo- campus was measured using Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrophotometry. Two additional (Ovx and OvxE) groups were examined in spatial learning andmemory tasks using theMorriswatermaze. Similar increases in total zinc content andmossy fiber areawere observed. Themossy fiber area decreased by 26 ± 2 % (difference ± SEMpercentages) inOvxand23 ± 4 % in estrus as compared to the proestrus group and by 18 ± 2 % in Ovx compared to OvxE. Additionally, only the OvxE group learned and remembered the task. These results suggest that estradiol has a significant effect on zinc content in hippocampal CA3 during the proestrus stage of the estrous cycle and is associated with correct performance in learning and memory. Keywords Zinc ! Hippocampus ! Mossy fibers ! Estrous cycle ! Estrogen Introduction In the adult rat hippocampus, mossy fiber axons of dentate granule cells converge in the dentate hilus and run through a narrow area called the stratum luci- dum, where the axons form excitatory glutamatergic E. Padilla-Gómez ! V. Beltrán-Campos ! S. Diaz-Cintra (&) Departamento de Neurobiologı́a del Desarrollo y Neurofisiologı́a, Instituto de Neurobiologı́a, Universidad Nacional Autónoma de México, Campus UNAM Juriquilla, Boulevard Juriquilla 3001, 76230 Querétaro, Mexico e-mail: yoldi@unam.mx V. Beltrán-Campos División de Ciencias de la Salud e Ingenierı́as, Universidad de Guanajuato, campus Celaya-Salvatierra, 38110 Guanajuato, Mexico S. Montes ! A. Dı́az-Ruı́z ! C. Rı́os Departamento de Neuroquı́mica, Instituto Nacional de Neurologı́a y Neurocirugı́a, SSA, 14269 Mexico, DF, Mexico G. L. Quirarte Departamento de Neurobiologı́a Conductual y Cognitiva, Instituto de Neurobiologı́a, Universidad Nacional Autónoma de México, Campus Juriquilla, 76230 Querétaro, Mexico 123 Biometals DOI 10.1007/s10534-012-9575-1       95 synapses with hilar and CA3 pyramidal neurons. The well-documented synaptic rearrangement of mossy fibers is associated with several events such as seizures (Weidner et al. 2011), temporal lobe epilepsy (San- chez et al. 2012), malnutrition (Granados-Rojas et al. 2004), learning, memory (Sindreu and Storm 2011), hormone-related factors like stress (Takeda and Tamano 2012), and the pathogenesis of depression (Takeda 2012); these rearrangements could play a crucial role in both neuroprotective and neurotoxic functions (for review see Tóth 2011). The mossy fiber architecture is linked to neurotrophic factors such as fibroblast growth factor-2 and brain-derived neurotro- phic factor (BDNF) (Paradiso et al. 2011); the latter has also been proposed as a key regulator and mediator of long-term synaptic modifications related to learning and memory maintenance (Gómez-Palacio-Schjetnan and Escobar 2008). During proestrus, hippocampal mossy fiber axons contain the highest concentration of BDNF (Scharfman et al. 2003). The first evidence of zinc accumulation in hippo- campal mossy fibers was obtained 50 years ago, using the Timm staining method which precipitates metal cations in situ and allows their visualization by silver amplification (Timm 1958; Danscher 1981). The physiological role of synaptic zinc has remained enigmatic, and many of the recent findings on syn- aptic zinc had not been anticipated until 5 years ago. In mossy fibers, zinc-containing vesicles represent a subpopulation with a unique composition of mem- brane proteins (Tóth 2011). Recent studies using knock-out mice for the synapse-specific zinc trans- porter ZnT-3 indicate that vesicular zinc is required for the formation of hippocampus- and amygdala-depen- dent memories; these two brain centers are promi- nently innervated by zinc-rich fibers (Sindreu and Storm 2011). Pre-synaptic zinc is observed in brain from mammals but is largely restricted to cortical and limbic regions and the mossy fiber terminals of the hippocampus, which represent a special case, as they are both glutamatergic and GABAergic (Ruiz et al. 2004; Beltrán et al. 2012). Several studies have also examined the effects of zinc on synaptic ion channels, receptors (GABA, kainate, NMDA, AMPA), and plasticity that participate in the molecular mechanisms underlying the increased propensity of these fibers to invade the inner molecular layer (Lin et al. 2011) or the basal dendrites localized in the stratum oriens of CA3, indicating its high plasticity due to overtraining in spatial memory tasks (Ramı́rez-Amaya et al. 1999; 2001). Estrogens have a profound influence on neuronal excitability, seizures, and epilepsy (Scharfman and MacLusky 2006) and in hippocampal damage induced by status epilepticus (Velı́sková et al. 2000); they also have neuroprotective effects in Alzheimer’s disease (Petrovska et al. 2012), ischemia (Dı́az Cintra et al. 2009; Lebesgue et al. 2009), stroke (Rexrode and Manson 2012), and other conditions leading to neu- ronal cell death, suggesting that acute estrogen therapy has an anti-apoptotic effect and increases cerebral plasticity. Thus, multiple lines of evidence suggest that estrogens play an important role in cerebropro- tection (Wappler et al. 2011). Estrogens are known to elicit broad effects on neuronal plasticity, as shown in studies of estrogen- deprivation that leads to increased vulnerability of granule cells in adult hippocampus and may cause a predisposition to neurological diseases and increased incidence of deficits in working memory occurring after menopause (Liu et al. 2001). In addition, estrogen enhances spine density on apical dendrites of CA1 pyramidal cells in the hippocampus, a brain region required for spatial learning (Woolley et al. 1997; Woolley 2007; McEwen 2002; Smith et al. 2009). In CA3–CA1 synapses between pyramidal cells, estrogen has also been shown to enhance the synaptic NMDA receptor current and the magnitude of long-term potentiation (LTP), having cellular corre- lates with learning and memory (Woolley 2007). This hormone increases synaptic function and, in doing so, it modulates potential mechanisms contributing to estrogen-induced changes in synaptic morphology and plasticity (Tanapat et al. 1999; Xu and Zhang 2006; Sato et al. 2007). Zinc plays an important role in glutamatergic synapses, which form clusters with large amounts of zinc in the mossy fibers. The incorporation of zinc into vesicles is associated with a pre-synaptic transporter protein (ZnT3) which is only expressed in brain (Palmiter et al. 1996; Wenzel et al. 1997). This transporter has been located by immunocytochemistry along mossy fibers in CA4, CA3, and the hilus of dentate gyrus (Cole et al. 1999). The physiological activity of free zinc in brain might largely depend on the pool of synaptic-vesicle zinc, which is determined by ZnT3 (Lee et al. 2011). Both zinc and its transporter (ZnT3) are necessary for LTP in the hippocampus (Sindreu and Storm 2011). Biometals 123   96 In spite of its crucial role, only scarce information is available regarding the role of zinc in estrogen- induced morphological and functional changes of the mossy fibers and stratum lucidum in CA3 pyramidal cells over the course of the estrous cycle. Hippocam- pal zinc regulation by 17b-estradiol in CA3 could be a key event in hippocampus since this could be related to hippocampal estrogen-receptor density which, in turn, varies during the estrous cycle (Gruart and Delgado-Garcı́a 2007). The only study on this subject showed that ovariectomy in mice increased total and vesicular zinc, while estrogen supplement in ovariec- tomized rats reduced zinc levels (Lee et al. 2004). However, the latter study did not determine whether estrogens can alter the zinc content of hippocampal mossy fibers in every stage of the estrogenic cycle. Thus, we designed this study in order to determine if changes in the level of hippocampal zinc can be related to histological changes during the rat estrous cycle and how estrogen is related to learning and memory performance. Materials and methods Subjects A total of 80 Sprague-Dawley female rats, 70–90 days of age (270–290 g),were used and treated in accordance with the NIH Guide for Care and Use of Laboratory Animals, and the local AnimalCare andUseCommittee approved the experiments. Rats were pair-housed in polycarbonate cages (45 9 24 9 21 cm)with adequate clean nesting material and free access to food (standard Purina Chow, formula 5001) and purified water throughout the experiment. Animals were maintained with a 12/12-h inverted light/dark cycle (lights off at 9:00 h) at 22–23 !C and 40–50 % humidity. To detect normal cycles, three vaginal smears were taken daily from 36 female rats, and groups were euthanized at proestrus, estrus, or diestrus (12 rats per stage). Tissue from each group (n = 6) was obtained for either Timm staining or zinc measurement. Additionally, 44 female rats were ovariectomized (Ovx), and half of them were supplemented with 17ß-estradiol (OvxE). Four groups of six rats were formed and studied either by Timm staining or zinc measurement, and two more groups of ten rats each were tested for learning andmemory in the Morris Water Maze (MWM). Surgery Ovaries were surgically removed (Ovx groups) from 38 animals under anesthesia with a combination of ketamine/xylazine (65/7.5 mg/kg) using aseptic pro- cedures. These rats received ketofen (2 9 1 mg per day, s.c.) for 3 days following surgery to alleviate discomfort. After surgery, two animals were housed per cage. The recovery period was 2 weeks; then, four groups were formed for hormone supplementa- tion (one injection per day, s.c., for 3 days): (1) the Ovx group was injected with vehicle, 0.2 ml of vegetable oil, and (2) the OvxE group was sup- plemented with 10 lg of estradiol benzoate. Ovariectomy was verified by using immunoassay to determine estradiol plasma levels (Beltrán-Campos et al. 2011). Blood estradiol levels in Ovx animals (18.1 ± 2.43 pg/ml) were determined 15 days after surgery. Even though the ELISA method is not accurate enough to precisely determine blood estra- diol, measures obtained were below those reported during proestrus, indicating that ovariectomy was effective in reducing the circulating levels of estra- diol. Moreover, ovariectomy was carefully verified by visual inspection. Tissue collection for Timm staining To estimate the area of the suprapyramidal bundle of the mossy fibers, a total of 30 animals (proestrus, estrus, diestrus, Ovx, and OvxE), six per group, were analyzed using the Timm histological technique. All animals were anesthetized (pentobarbital, 0.63 mg/ kg), weighed, and perfused transcardially with a buffered sodium sulfide solution (5.85 g Na2S, 5.95 g NaH2PO4!H2O in 500 ml distilled water) followed by 1 % paraformaldehyde and 1.25 % glutaraldehyde in 0.10 Mphosphate buffer, pH 7.4 (as described byWest et al. 1988). Brains were removed, weighed, and post- fixed in the same fixative containing 30 % sucrose and remained in this solution until they sank to the bottom of the container. Then the hippocampal formation was frozen and cut into coronal sections at a nominal 40 lm thickness. Sections were serially mounted and pro- cessed using a modification of Timm’s sulfide silver technique, as described elsewhere (Cintra et al. 1997; Granados-Rojas et al. 2004). Each slide was assigned a randomnumber to ensure that the observerwas blind to treatments (Fig. 1). Biometals 123     97 Area of the mossy fiber system suprapyramidal bundle The mossy fiber area in the suprapyramidal bundle, corresponding to the stratum lucidum, was estimated in sections selected from the dorsal hippocampus; every fifth section was obtained from a random starting position within the first five serially mounted sections. For each section, the boundaries of the suprapyramidal bundle were defined in agreement with Gaarskjaer (1985) and Amaral and Dent (1981), and its area was determined in right-side hippocampal sections with a 49 objective lens and with the aid of a computer-assisted imaging analysis system (Image J), Fig. 1. The mean section thickness was 39.1 ± 1.2 lm. This was estimated from measurements of sections selected by a systematic, random-sampling procedure, using amicrocator attached to the stage of a microscope and a 1009 oil immersion objective lens (Granados-Rojas et al. 2001, 2004). The area obtained (in lm2) was subsequently corrected by a tissue shrinkage factor (SFv). For this purpose, a coronal section of hippocampal formation was obtained immediately after perfusion using a freezing micro- tome. The section was photographed and its cross- sectional area determined; the adjacent section was processed with Timm staining and photographed, and its cross-sectional area was determined. The SFv was then calculated for these areas using the method described by Van Eden and Uylings (1985). No significant differences were found in this parameter among the studied groups, i.e., the same SFv (1.11) was used throughout. Zinc determination Six animals per group at each stage of the EC (diestrus, proestrus and estrus), Ovx, and OvxE were used for zinc determination. Hippocampal tissue was dissected out from brain as rapidly as possible and placed in tubes previously washed with 30 % nitric acid solution to avoid external contamination. All the hippocampus weights were carefully recorded, and 1 ml of redis- tilled nitric acid was added to the samples. Tubes were then capped and placed on a shaking bath at 60 !C for 30 min. The resulting solution was assayed for zinc content in an atomic absorption spectrophotometer equipped with a graphite furnace and Zeeman back- ground correction (Analyst 600, Perkin Elmer). The equipment was previously calibrated with a com- mercial zinc solution (Perkin Elmer GFAAS mixed standard). Quality control was assured by determina- tion of zinc in a biological matrix-based standard material (Bovine liver 1577b, NIST); the analytical session was considered adequate when the quality control standard was 95–105 % of its nominal value. Results are expressed as lg of zinc per gram of wet tissue. Spatial navigation apparatus After surgery recovery and treatments, the two ten- animal groups were given a spatial training task in a MWM consisting of a circular pool with the computer SMART system (San Diego Instruments) software program, which monitored and recorded the swim- ming path of the rats for later analysis. The maze was constructed of black plastic (1.5 m diameter and 45 cm deep) and filled with water to a depth of 26.5 cm. The water temperature was adjusted to 25 !C (± 0.5 !C). A 10-cm square, transparent acrylic platform was placed into the tank at a fixed location in the center of one imaginary quadrant and sub- merged 1.5 cm under water. The water maze tank was located in a separate room, illuminated by dim light, and surrounded by several spatial cues. As the platform could not be seen or detected by smell, rats had to learn to navigate to the platform by using visual cues (e.g. posters) in the vicinity of the tank (1.5–3 m) to escape the cold water. The training in the MWM consisted of 1 or 2 identical daily sessions (MWM1 and MWM2) of ten trials each. Every animal was introduced into the pool at different starting points for Fig. 1 Representative hippocampal coronal section used to estimate the area of the mossy fibers (MF) in the stratum lucidum (SL), limited with arrows; also shown are the dentate gyrus (DG) and CA1 areas; bar, 300 lm Biometals 123   98 each trial, and their order was constant for all the animals (Ramı́rez-Amaya et al. 2001; Beltrán-Campos et al. 2011). Each animal was allowed to swim until finding the platform and permitted to stay on the platform for 30 s. In the first trial, if the animal did not find the platform during the time limit (60 s), it was led to the platform by hand and then placed in a waiting cage for 30 s. Escape latency was measured on each trial for every animal. To measure memory, 24 h after the last training session, MWM2, a single-trial session was conducted under training conditions similar to those of the learning task; the only variation was that the platform was removed, and the measured param- eter was the time spent in the quadrant where the platform was previously localized. Statistical analysis Repeated measures Analyses of Variance (ANOVA) tests were performed for acquisition results, and when the F-ratios were significant, Fisher’s protected least significant difference test (Fisher’s PLSD) was used to determine potential statistical differences of pair-wise comparisons. The memory parameter was analyzed with an unpaired Student’s t test between Ovx and OvxE groups. Results were considered to be statisti- cally significant if P\ 0.05. Statview software was used for the analysis. Results Histological analysis Figure 1 shows a representative Timm’s silver stain- ing of the hippocampal formation, highlighting mossy fibers in the stratum lucidum; images were digitalized and analyzed as described in the methods section. To find out if the estrous cycle in the rat influences signal from these areas, we used female rats from different estrous phases, as well as Ovx and OvxE animals (F4,25 = 4.633; P = 0.0062). We found that female rats in estrus phase showed decreased mossy fibers (23 ± 4 %, difference ± SEM percentages) in comparison with animals in proestrus phase (P\ 0.05). Ovx animals also showed decreased signal area (P\ 0.05) in both groups this decreased was estimated by a 26 ± 2 % compared to proestrus; estrogen supplement in OvxE partially prevented this effect which was calculated by a 10 ± 3 % as compared to the proestrus group (Fig. 2). Tissue zinc content Timm’s staining is related to zinc content, for this reason the metal content was determined in hippo- campal tissue (F4,25 = 4.879; P = 0.0048). Figure 3 shows that zinc content was lower in the hippo- campus of rats in estrus (71 ± 13 %) and diestrus (37 ± 13 %) than in those from proestrus. In addition, a reduction in zinc content (81 ± 12 %) was observed in the hippocampus of Ovx animals (P\ 0.05 versus proestrus). Interestingly, hormonal supplement par- tially restored in a 46 ± 12 % Zn levels as compared to Ovx animals. Behavioral test in Ovx and OvxE After observing that zinc, mossy fiber, and stratum lucidum areas evaluated by Timm’s staining varied Fig. 2 Area (mean ± SEM) of the mossy fiber stratum lucidum in five groups: gonadally intact: diestrus (D), proestrus (P), and estrus (Es) from cycling female rats; and ovariectomized without supplementation (Ovx) and with a 10 lg dose of 17b- estradiol (OvxE). Note the *significant decreases in Ovx compared to D (P\ 0.05), Es (P\ 0.001) and Ovx (P\ 0.001) in relation with P, and a significant increase in OvxE (P\ 0.01) compared to Ovx and Es Biometals 123     99 depending on the estrous cycle, and since zinc has been related to the LTP phenomenon in the hippo- campus, we explored the possibility that spatial learning and memory may also be influenced by estrogens in female rats. Learning performance in MWM was evaluated individually and showed that rats in both the Ovx and OvxE groups reduced the latency time to reach the platform after sequential training (Day 1: F(19,180) = 2.237 and P = 0.0034; Day 2: F(19,180) = 2.515 and P = 0.00084). However, the comparison between groups showed that Ovx rats took more time to find the platform than OvxE rats in trials 9 and 10 on day 1. This effect was more evident on the sessions of day 2, reaching statistical significance on trials 5 and 7–10 (Fig. 4). For the memory test, latency to reach the learned platform location was measured 24 h after the last learning session in a single trial. Figure 5 shows that OvxE rats remembered the task (P = 0.0366) while Ovx rats did not attain the memory threshold. Discussion In this study we present suggestive evidence that estrogen plays an important role in the plasticity and maintenance of mossy fibers in hippocampal CA3 evaluated by Timm’s staining. The area of the suprapyramidal bundle of the mossy fibers, evaluated by Timm’s staining, was significantly reduced in Ovx, with a 26 ± 2 % decrease compared to proestrus; a phenomenon that is reversed when the animals are supplemented with physiological doses of 17b estra- diol (OvxE). Zinc levels are also reduced in 46 ± 12 % in that same brain area in Ovx compared to OvxE rats. Interestingly, Ovx rats showed a poorer performance in the MWM than the Ovx rats supplemented with estrogen. The results obtained here suggest that estro- gen, hippocampal zinc regulation, and spatial memory could be related. The physiological role of vesicular zinc at gluta- matergic synapses remains poorly understood, even though it is well known that zinc homeostasis is modulated by pre-synaptic MAPK/ERK signaling and that events derived from this cascade are required for hippocampus-dependent memory consolidation. A link between estrogen, and spatial memory is in Fig. 3 Zinc content (mean ± SEM) in five groups: gonadally intact: diestrus (D), proestrus (P), and estrus (Es) from cycling female rats, Ovx and OvxE. Note the *significant decreases in the D, Es, and Ovx groups in relation to the P group and a significant increase in OvxE compared to Ovx and Es Fig. 4 Mean ± SEM of acquisition performance of animals subjected to 2 days of training (MWM1 and MWM2). Each point represents the latency to reach the target platform on each consecutive trial. Repeated measures ANOVA showed *signif- icant differences on trials 9 and 10 of day 1 and on trials 5, 7, 8, 9, and 10 on day 2 for trained OvxE groups. Also, between trials 1 and 10, only the OvxE group showed significantly reduced latency; the Ovx group did not reach the required latency threshold (30 s) that would indicate learning Biometals 123     100 agreement with previous studies in which ovariectomy produces deficits in the acquisition of the MWM task (Xu and Zhang 2006; Sarkaki et al. 2008) and with others showing that hormone replacement improves performance in spatial learning tasks (Daniel et al. 1997; Fader et al. 1998; Luine et al. 1998; El-Bakri et al. 2004; Li et al. 2004; Xu and Zhang 2006; Gresack and Frick 2006), demonstrating that these learning deficits are related to low levels of circulating estradiol. In addition, the anatomical substrate (hip- pocampus) responds to low levels of estradiol by decreasing the area of mossy fibers and the level of zinc; both effects were reversed with adequate hormone replacement. Moreover, the larger mossy fiber area and greater zinc density of the hippocampal mossy fibers correlate with better performance in spatial tasks in the rat. The increase of mossy fiber area in the stratum oriens of CA3 due to overtraining in male rats (Ramı́rez-Amaya et al. 1999) or to exercise (Toscano-Silva et al. 2010; Gomes da Silva et al. 2010) is well documented; however, in females this effect depends on the estrous cycle stage and on BDNF, which is the most likely candidate molecule to be involved in regulating mossy fiber pathfinding and may act as a signal for new mossy fibers to fasciculate and extend further to form synapses (Scharfman et al. 2003; Sato et al. 2007). Another important observation is that, in adult female rats, hippocampal changes occur when estradiol rises on the morning of proestrus, when animals respond better to object- and place- recognition tests (Scharfman et al. 2007). The study of Smith et al. (2009) agrees with the fact that this hormone increases synaptic function and plasticity and alters synaptic morphology. Mossy fiber terminals form a distinctive type of synapse rich in zinc and involved in regulating ion channels and intracellular signaling pathways impli- cated in learning, memory, and neuroplasticity (Sind- reu and Storm 2011; Tóth 2011). Vesicular zinc promotes presynaptic and inhibits postsynaptic long- term potentiation of mossy fiber-CA3 synapses (Pan et al. 2011). Thus, zinc seems to satisfy several criteria for a neural messenger: it is stored in synaptic vesicles, is released upon depolarization, and acts at various membrane targets. The selective association of zinc with glutamate-containing synaptic vesicles suggests that zinc might be a co-transmitter at some excitatory synapses (Paoletti et al. 2009). Zinc may modulate the structure and the function of the post-synaptic density as well as the molecular organization and plasticity of the pre-synaptic cytomatrix zone, allowing the expres- sion of synaptic plasticity (Gundelfinger et al. 2006; Grabrucker et al. 2011; Gundelfinger and Fejtova 2011). A feature unique to this divalent metal ion is that it is a candidate for transynaptic anterograde messenger into postsynaptic neurons in the hippo- campus (Ketterman and Li 2008). The pool of zinc-containing synaptic vesicles in brain is special because of its lability; it can be identified using simple histochemical techniques such as Timm’s staining or dye fluorescence (Frederickson et al. 1987). Here, we used an improved variant of the former technique to obtain consistently better visual- ization of the hippocampal mossy fiber system in the five groups studied; the results showed that physio- logical fluctuations of estradiol levels profoundly affect the area of the mossy fibers in the dorsal hippocampus; this area increases significantly during proestrus, by 22 ± 4 % compared to the estrus group and by 26 ± 2 % compared to the Ovx group. Ovariectomy has a long-term effect, because the result was measured 15 days after surgery. The low dose (10 lg) of estradiol was enough to re-establish the Fig. 5 Mean ± SEM of water maze performance during the memory test after 2 days of learning. Latency in seconds spent by the Ovx and OvxE groups to locate the platform area. The Student’s t test showed *significant differences between groups Biometals 123     101 area of the mossy fibers. This is consistent with the finding of increased neurogenesis of granular cells during proestrus and a neurogenesis peak in Ovx rats supplemented with 10 lg of 17b-estradiol (Tanapat et al. 1999, 2005). Scharfman et al. (2007) found changes in hippocampal function of Ovx rats after sequential low doses of estradiol; they reported that mossy fiber stimulation evoked the expression of BDNF and multiple population spikes in CA3. In mouse hippocampal slices in vitro, Teter et al. (1999)reported an increase of 75 % in dorsal sprouting of the dentate gyrus during treatment with 17b- estradiol (100 pM); however, this response is blocked by both progesterone and tamoxifen. We did not find significant differences in the mossy fiber area when a daily dose of 50 lg of 17b-estradiol was compared to the low dose of 10 lg/day (data not shown). In the recent review by Tóth (2011), the fact that Zn can be either disruptive or protective in the hippocam- pus connectivity is suggestive; furthermore, the author states that physiological zinc release could be related to maintaining a stable neuron network and preventing cell death. The premise for these effects is that zinc should be within specific levels in this brain region to fulfill a physiological role. The fact that mice lacking the ZnT3 transport are more susceptible to kainic acid- induced seizures (Cole et al. 2000) reinforces the idea that zinc is playing a physiological, protective role against glutamate overexcitation, since zinc release from mossy fibers excited by glutamate attenuated calcium entrance into postsynaptic CA3 cells, sug- gesting a modulatory role of the metal (Takeda et al. 2007). Calcium signals are thus modulated through Zn release not only as a consequence of glutamate release, but also at the level of channels and receptors, since zinc is able to inhibit NMDA receptors (Paoletti et al. 2009) and voltage-dependent calcium channels (Takahashi and Akaike 1991). It has also been reported that zinc levels could be subject to steroidal regulation at different levels; there is experimental evidence that ovariectomized rats showed decreased levels of circulating zinc (Ulas and Cay 2011). In humans, plasma zinc levels fluctuate during the menstrual cycle, and these changes showed a positive correlation with plasma estrogen concen- trations (Michos et al. 2010), a fact that could be related to diminished zinc availability during men- struation in the whole organism, including brain. It is possible, then, that estrogen is involved in zinc homeostasis, in the whole body as well as in brain and, furthermore, in specific brain areas. With the results presented here, we cannot discard the possibility that estradiol could be acting to counterbalance the effects produced by corticosteroid hormones in the hippocampus, on both zinc levels and cognitive performance, as observed in severe stress: reduced cognitive performance, reduced zinc neuro- transmission, and increased corticosteroid hormones (Takeda and Tamano 2012). The relationship between steroid hormones and zinc in the hippocampus may have other important implications, including the fact of diminished sex hormone production in aging, which could be related to altered zinc homeostasis in the hippocampus and thus to memory impairments associated with age. In a more speculative vein, dysfunctional zinc homeostasis could also be linked to neurodegenerative diseases since zinc accumulation in the senile plaques from Alzheimer brain patients has been reported (Danscher et al. 1997). The data reported here suggest a plastic, on/off effect of circulating estrogen in the stratum lucidum area of the rat dorsal hippocampus over the course of the estrous cycle. The area occupied by mossy fibers in the stratum lucidum was larger during the proestrus stage, which coincides with a higher concentration of circulating estrogens. In addition, the amount of zinc in the hippocampus correlates with mossy fiber area as well as with better performance in spatial tasks. In Ovx rats, the values of these parameters were lower and were associated with poorer performance in the MWM. The present results show for the first time that estrogen modulates the plasticity and maintenance of mossy fibers in hippocampal CA3 during proestrus. While suggestive, these data are not sufficient to infer changes in synaptic connectivity; therefore, another approach to the problemwould be to use electronmicroscopy to look for ultrastructural modifications at pre- and post-synap- tic sites (i.e., post-synaptic density in thorny excres- cences in the stratum lucidum as well as pre-cytomatrix density in mossy fibers) in groups of rats with different estrogen levels associated with ZnT3 levels, the key protein for zinc transport by synaptic vesicles. Acknowledgments This work was carried out in partial fulfillment of the requirements to obtain the Doctor0s Degree (Doctorado en Ciencias Biomédicas, UNAM) by E. Padilla- Gómez, who was a recipient of graduate scholarship from CONACYT (17276) and by the support of DGAPA-UNAM. Biometals 123   102 The authors wish to thank A. Aguilar Vázquez, T. Martı́nez, L. Palma, N. Hernández, N. Serafin, and M. Garcı́a for technical assistance. We are grateful to M.Sc. S. Castro for her invaluable suggestions on the manuscript and to Dr. D. Pless for proofreading. References Amaral DG, Dent JA (1981) Development of the mossy fibers of the dentate gyrus: a light and electron microscopic study of the mossy fibers and their expansions. J Comp Neurol 195:51–86 Beltrán JQ, Reyes S, Pérez-Guzmán JA, Elı́as-Viñas D, Gut- iérrez R (2012) Dissociation of CA3 pyramidal cells with attached, functional, identified mossy fiber and interneu- ronal boutons for studying glutamatergic and GABAergic synaptic transmission. J Neurosci Methods 208:155–160 Beltrán-Campos V, Prado-Alcalá RA, León-Jacinto U, Aguilar Vázquez A, Quirarte GL, Ramı́rez-Amaya V, Dı́az-Cintra S (2011) Increase of mushroom spine density in CA1 apical dendrites produced by water maze training is prevented by ovariectomy. 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ANEXO 2   Cómo citar este artículo: Beltrán-Campos V, et al. Efecto de la tibolona en la densidad de las espinas dendríticas en el hipocampo de la rata. Neurología. 2014. doi:10.1016/j.nrl.2014.03.002 ARTICLE IN PRESS +Model NRL-615; No. of Pages 6 Neurología. 2014;xxx(xx):xxx—xxx NEUROLOGÍA www.elsevier.es/neurologia ORIGINAL Efecto de la tibolona en la densidad de las espinas dendríticas en el hipocampo de la rata V. Beltrán-Campos a, A. Díaz-Ruizb, E. Padilla-Gómez c, H. Aguilar Zavala a, C. Ríosb y S. Díaz Cintra c,∗ a División de Ciencias de las Salud e Ingenierías, Universidad de Guanajuato, Campus Celaya-Salvatierra, Guanajuato, México b Departamento de Neuroquímica, Instituto Nacional de Neurología y Neurocirugía, Dr. Manuel Velasco Suarez, México D.F., México c Instituto de Neurobiología, Campus UNAM-Juriquilla Querétaro, Querétaro, México Recibido el 14 de febrero de 2014; aceptado el 2 de marzo de 2014 PALABRAS CLAVE Hipoestrogenismo; Tibolona; Hipocampo; Área CA1; Morfología; Espinas dendríticas Resumen Introducción: El hipoestrogenismo produce estrés oxidativo (EO) y cambios en las neuronas del hipocampo (H) y reduce la densidad de las espinas dendríticas (ED). Estas alteraciones reper- cuten en la respuesta plástica del H. La terapia de sustitución intraperitoneal con estrógenos revierte estos efectos, pero no se sabe si ocurre lo mismo con la tibolona (TB). El objetivo fue comprobar los efectos neuroprotectivos de la TB administrada por vía oral a largo plazo y su capacidad para revertir la poda de ED de las neuronas piramidales (NP) del CA1 del H. Métodos: Ratas Sprague Dawley jóvenes: distribuidas en 3 grupos: control en proestro (Pro) y 2 grupos ovariectomizados (Ovx), uno suplementado con dosis diaria de TB (1 mg/kg), OvxTB, y otro con vehículo (OvxV), por 40 días. Se analizaron la peroxidación de lípidos y la densidad de las ED en 3 segmentos de la dendrita apical de las NP del CA1 del H. Resultados: La TB no redujo la peroxidación de lípidos en el H, pero recuperó la poda de espinas en las NP del CA1 del H, producida por la ovariectomía. Conclusiones: La terapia de sustitución estrogénica en el hipoestrogenismo por ovariectomía tiene un efecto protector. © 2014 Sociedad Española de Neurología. Publicado por Elsevier España, S.L. Todos los derechos reservados. KEYWORDS Estrogen deficiency; Tibolone; Hippocampus; Area CA1; Morphology; Dendritic spines Effect of tibolone on dendritic spine density in the rat hippocampus Abstract Introduction: Oestrogen deficiency produces oxidative stress (OS) and changes in hippocampal neurons and also reduces the density of dendritic spines (DS). These alterations affect the plastic response of the hippocampus. Oestrogen replacement therapy reverses these effects, but it remains to be seen whether the same changes are produced by tibolone (TB). The aim of ∗ Autor para correspondencia. Correo electrónico: yoldi@unam.mx (S. Díaz Cintra). 0213-4853/$ – see front matter © 2014 Sociedad Española de Neurología. Publicado por Elsevier España, S.L. Todos los derechos reservados. doi:10.1016/j.nrl.2014.03.002   106 Cómo citar este artículo: Beltrán-Campos V, et al. Efecto de la tibolona en la densidad de las espinas dendríticas en el hipocampo de la rata. Neurología. 2014. doi:10.1016/j.nrl.2014.03.002 ARTICLE IN PRESS +Model NRL-615; No. of Pages 6 2 V. Beltrán-Campos et al this study was to test the neuroprotective effects of long-term oral TB treatment and its ability to reverse DS pruning in pyramidal neurons (PN) of hippocampal area CA1. Methods: Young Sprague Dawley rats were distributed in 3 groups: a control group in proestrus (Pro) and two ovariectomised groups (Ovx), of which one was provided with a daily TB dose (1 mg/kg), OvxTB and the other with vehicle (OvxV), for 40 days in both cases. We analysed lipid peroxidation and DS density in 3 segments of apical dendrites from PNs in hippocampal area CA1. Results: TB did not reduce lipid peroxidation but it did reverse the spine pruning in CA1 pyramidal neurons of the hippocampus which had been caused by ovariectomy. Conclusions: Oestrogen replacement therapy for ovariectomy-induced oestrogen deficiency has a protective effect on synaptic plasticity in the hippocampus. © 2014 Sociedad Española de Neurología. Published by Elsevier España, S.L. All rights reserved. Introducción El incremento de los radicales libres, la disfunción mito- condrial y el estrés oxidativo (EO) como mecanismos interdependientes se han propuesto como los principales factores que producen daño cerebral al promover reaccio- nes en cadena en presencia de iones metálicos catalíticos dañando a los fosfolípidos de las membranas, a las proteí- nas y, principalmente, al ADN de la célula1-3. El EO junto con la inflamación se incrementan con la edad, así como la función inmunitaria innata y la comunicación neuronal con las células gliales, que son eventos críticos en el envejeci- miento del cerebro y las enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer4,5. Por la edad, en el humano y en pri- mates, ocurren cambios en la morfología de las neuronas corticales e hipocampales, manifestados como reducciones en la complejidad y longitud del árbol dendrítico, y de los sitios postsinápticos o espinas dendríticas (ED)6. Las ED son complejos morfológicamente especializados para la inter- acción sináptica y se han estudiado in vitro, encontrando que tanto el número como el tipo de espinas son altamente mutables sobre una escala de tiempo de segundos a días por diversos mecanismos intrínsecos que ejercen un control dinámico sobre ellas7. In situ, estos cambios en el tipo y en la densidad de espinas ocurren bajo condiciones fisiológicas y patológicas, las cuales han sido ligadas con alteracio- nes funcionales de los circuitos neuronales y pérdida de la memoria8,9. Las ED representan la región postsináptica de entrada excitatoria de las neuronas que responden a la estimulación con cambios en su densidad y en su tipo; el mecanismo por el cual estos cambios ocurren son a tra- vés de la activación de los genes primarios agregados al efecto de los factores de crecimiento; ambos modifican la citoarquitectura membranal, dando como resultado la gene- ración de nuevas espinas o bien la maduración de las ya existentes10. Por otra parte, en la mujer, diversas actividades pueden contribuir a los cambios o modificaciones que ocurren en estas entradas de información, como el proceso de enve- jecimiento, pérdida de la memoria, la homeostasis redox y la disminución de los niveles circulantes de estradiol. Para reducir estas alteraciones relacionadas con la disminución de hormonas circulantes durante la menopausia, se han pro- bado diversas terapias sustitutivas con productos que tienen acción estrogénica (fitoestrógenos; 17-!-estradiol, proges- tágenos, acetato de medroxiprogesterona)11,12 y derivados estrogénicos como la tibolona (TB), la cual es el precur- sor de metabolitos hidroxilados. En vivo, este se comporta como estrógenos en el hígado y el endometrio, y puede tener acción como progestágeno y actividad androgénica (bajando triglicéridos y colesterol) y protege contra la pér- dida de la masa ósea13. En 2008, de Aguiar et al.14 reportaron los efectos del valerato de estradiol (VE, 0,3 mg/kg) y 2 concentraciones de TB (0,5 y 1,0 mg/kg) sobre el EO en el cerebro y en la bioquímica de la sangre en ratas hem- bras ovariectomizadas, en 3 estados: joven, adulto y viejo. Encontraron disminución del hidroperóxido de lípido en la corteza cerebral de ratas jóvenes y viejas, y ambas dosis de TB produjeron un incremento de la capacidad antioxidante total en comparación con los niveles obtenidos en las ratas hembras adultas tratadas con VE y las ovariectomizadas en todos los tratamientos mostraron los niveles más bajos de la capacidad antioxidante total en el hipocampo comparadas con sus controles. El EO fue más alto en las viejas compara- das con las jóvenes y las ovariectomizadas tratadas con TB (1,0 mg/kg), en donde se aumentaron los niveles de lípidos de baja densidad comparados con los animales control y con los tratados con EV. En este estudio, el objetivo fue compro- bar los efectos antioxidantes y neuroprotectores implicados en la actividad farmacológica de la TB, administrada por vía oral a largo plazo, y si este tratamiento es capaz de revertir el EO y la poda de ED de las células piramidales del CA1 en el hipocampo. Metodología Animales El protocolo se realizó conforme con las normas internacio- nales para el manejo y uso de animales de experimentación establecidas por los National Institutes of Health y la National Academy of Science, y aprobado por el Comité de Bioética del Instituto de Neurobiología (INB) de la Universidad Nacional Autónoma de México. Un total de 30 ratas hembras Sprague-Dawley (200 a 250 g de peso) fueron utilizadas para los diferentes procedimientos. Las ratas se alojaron individualmente en jaulas de policarbo- nato (45 × 24 × 21 cm), con aserrín limpio como material de habitación y teniendo libre acceso a la alimenta- ción (comida estándar Purina®, fórmula de 5001) y agua purificada durante todo el experimento. Se mantuvieron   107 Cómo citar este artículo: Beltrán-Campos V, et al. Efecto de la tibolona en la densidad de las espinas dendríticas en el hipocampo de la rata. Neurología. 2014. doi:10.1016/j.nrl.2014.03.002 ARTICLE IN PRESS +Model NRL-615; No. of Pages 6 Tibolona y plasticidad del hipoampo 3 bajo condiciones de ciclo de luz/oscuridad 12 h/12 h (luces encendidas a las 7:00 am), a una temperatura de entre 22 y 23 ◦C y con un 40-50% de humedad. Diseño experimental y obtención de las muestras Se diseñó un estudio experimental, aleatorizado, doble ciego y controlado con placebo con un total de 30 ratas hembras de la cepa Sprague-Dawley de 200 a 250 g de peso, las cuales fueron divididas en 3 grupos con las siguientes características: grupo 1, animales controles en etapa de proestro (Pro); grupo 2, ratas ovariectomizadas (Ovx) y tra- tadas con vehículo (solución salina) cada 24 h por 40 días (OvxV), y grupo 3, animales con Ovx y suplementadas con TB a una dosis de 1 mg/kg de peso cada 24 h por 40 días (OvxTB). Pasado este tiempo y después de la administra- ción del tratamiento, los animales fueron sacrificados por decapitación para la obtención del cerebro, que se colocó en una matriz calibrada de metal, se seccionó para sepa- rar en forma aleatoria ambos hemicerebros para los análisis bioquímico y morfométrico. Cuantificación de la peroxidación de lípidos Para cuantificar los productos finales de la peroxidación de lípidos (PL), se utilizó la técnica descrita por Triggs y Willmore15. Se separó el hipocampo de uno de los hemisfe- rios cerebrales, el cual fue homogenizado en 3 ml de solución salina (0,9% NaCl), se tomó una alícuota de 1 ml y se le añadieron 4 ml de una mezcla de cloroformo/metanol (2:1 v/v) y las muestras se dejaron incubar durante 30 min en hielo para permitir la separación de la fase clorofórmica que contenía que contenía los productos finales fluorescentes de la PL; posteriormente, se obtuvo una alícuota de 1 ml que fue leída en un espectrofotómetro de luminiscencia Perkin Elmer L5500B a 370 nm de excitación y 430 nm de emisión. La sensibilidad del espectrofotómetro fue ajustado a 330 U de fluorescencia con una solución estándar de quinina (0,1 !g/ml). Los resultados fueron expresados en unidades de fluorescencia por gramo de tejido fresco. Análisis morfométrico de la densidad de las espinas dendríticas Se procesaron 6 hemicerebros, con la técnica de Golgi rápido16; se fijaron por inmersión en formalina al 10% en PBS, después de 72 h; se obtuvieron bloques rostrales de 4 mm de ancho abarcando el área de hipocampo dorsal (bregma 2,8-4,2) y colocados durante 13 días en una solu- ción de dicromato de potasio al 4,5% con ácido ósmico al 1% (8:1), diferenciados en nitrato de plata al 0,75% durante 24 h, seguida de su deshidratación en alcoholes graduales (50% hasta alcohol etílico absoluto y éter) por 30 min en cada uno. Se obtuvieron cortes coronales de 120 !m en un microtomo de deslizamiento (Leitz Wetlar 47160), previa inclusión en nitrocelulosa de baja viscosidad. Su deshidra- tación se hizo en alcoholes graduales y su aclaramiento en terpinol, seguido de xileno y su montaje con entellan. En las preparaciones así obtenidas de cada sujeto experimen- tal, se seleccionaron aquellas neuronas piramidales (NP) del 0 50 100 150 200 250 300 350 Pro OvxV OvxTB U . d e F . / g r d e t e jid o Figura 1 Gráfica en donde se muestran los valores promedio±error estándar de 10 animales por grupo. Los resul- tados se expresan en unidades de fluorescencia por gramo de tejido fresco. OvxV: ovariectomizados con vehículo (OvxV); OvxTB: ovariec- tomizados tratados con Tibolona (1 mg/kg); Pro: animales en proestro. CA1 del hipocampo que mostraban su árbol dendrítico com- pleto, el soma piramidal y dendritas basales (fig. 2 A). Las mediciones se efectuaron evitando que el observador cono- ciera el grupo experimental, asignando un número al azar a cada preparación. Se midieron aquellas NP que pudieran ser observadas en un plano focal que las permitiera ver cla- ramente a 10X, con una impregnación homogénea y cuyas dendritas apicales estuvieran completas hasta su término en el stratum lacunosum moleculare (SLM). Estas NP del CA1 se caracterizan por tener de 3 a 5 dendritas basales primarias y un árbol dendrítico apical que asciende hasta el SLM con ramas secundarias sobre el stratum radiatum. Las dendritas se dividieron en 3 segmentos representati- vos de sus aferencias principales (fig. 2 B). El proximal de 100 !m (comisurales y zona principal de entradas inhibito- rias). El segmento medial entre 150 !m del soma y el límite de 350 !m (comisurales de Shaffer). El segmento distal se localizó en el inicio de la curvatura de la dendrita sobre el SLM (aferencias del patrón perforante)17 y el número de las espinas se contó en segmentos de 10 !m a 100X en cada dendrita. Análisis estadístico Todos los valores fueron analizados con la prueba de Levene para determinar la homogeneidad de la variancia y utili- zar una estadística paramétrica. Posteriormente, el análisis estadístico de los resultados de la PL se llevó a cabo con la prueba de análisis de variancia (ANDEVA) de una vía seguida de una prueba post hoc de Tukey; se tomó como diferencia estadísticamente significativa una valor de p ≤ 0,05. Para el análisis del total de espinas en los grupos de tratamiento se realizó con un ANDEVA de una vía, en donde el factor inde- pendiente es el tratamiento y el dependiente el promedio del número total de espinas en cada uno de los segmentos estudiados. Seguida de una prueba post hoc de Tukey con una p ≤ 0,05.   108 Cómo citar este artículo: Beltrán-Campos V, et al. Efecto de la tibolona en la densidad de las espinas dendríticas en el hipocampo de la rata. Neurología. 2014. doi:10.1016/j.nrl.2014.03.002 ARTICLE IN PRESS +Model NRL-615; No. of Pages 6 4 V. Beltrán-Campos et al Proximal (AC ) Terminal (PP ) Medial (SC) A B C 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 Pro OvxV OvxTB Proximal (a) Medial (b) Distal (c ) * * * 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Pro OvxV OvxTB E s p in a s / μ E s p in a s / μ * * D Figura 2 A) Fotomicrografías de una célula piramidal completa del CA1 del hipocampo. B) Las flechas indican los segmentos estudiados, así como las abreviaturas que representan la entrada de información. En B los segmentos dendríticos a 40X. En las gráficas C y D se indica la media±error estándar del total de espinas/‘‘m lineal y en los 3 grupos: proestro (Pro), ovariectomizados tratados únicamente con vehículo (OvxV) y ovariectomizados tratados con tibolona (OvxTB). Nótese en la gráfica C las reducciones significativas (*p < 0,005) del grupo OvxV vs. los grupos OvxTB y Pro. En las gráficas de los segmentos en los 3 grupos (D), se indican reducciones significativas (*) entre el segmento c vs. a y b en los grupos Pro y OvxV y entre los segmentos a vs. b y c en el grupo OvxTB. AC: comisurales de asociación; PP: patrón perforante; SC: colaterales de Schaffer. Resultados Peroxidación de lípidos Los resultados obtenidos del efecto de la TB sobre la los nive- les de la PL presente en el hipocampo de ratas con Ovx se muestran en la figura 1. Los resultados están dados como el valor promedio ± error estándar de 10 animales por grupo y están expresados en unidades de fluorescencia por gramo de tejido fresco. Se puede observar que no existen diferencias estadísticamente significativas entre los valores promedio de los 3 grupos evaluados (Pro, OvxV y OvxTB), 40 días des- pués de la administración de los tratamientos. ANDEVA de una vía (F2,25 = 2,429, p = 0,107). Efectos sobre la densidad total de espinas dendíticas El ANDEVA de una vía realizado para la densidad total de espinas, donde se incluyen todos los segmentos (fig. 2 C), muestra diferencias estadísticamente significativas entre los diferentes grupos de tratamiento (F2,9 = 2.323,306, p < 0,003). La prueba post hoc de Fisher indicó que el grupo OvxV posee menor densidad de espinas dendríticas comparadas con el grupo OvxTB y con el grupo control en etapa de proestro (Pro) con valores de p = 0,003 y 0,002, respectivamente. Efectos sobre la densidad de las espinas dendríticas El ANDEVA de 2 vías realizado para la densidad de espinas dendríticas en cada uno de los segmentos revela diferen- cias estadísticamente significativas respecto al tratamiento (F2,27 = 2.2946,00; p < 0,001) entre los diferentes grupos. En la figura 2 C, se muestran las diferencias estadísticamente significativas respecto a cada uno de los segmentos estu- diados (F2,27 = 17,39; p < 0,001), pero no hay diferencias en la intersección entre ellos. La prueba post hoc de Fischer muestra que el grupo Pro aumenta la densidad de espi- nas en los segmentos proximal, medial y distal, mientras que los animales OvxTB muestran diferencias significativas en la densidad de espinas del segmento proximal con res- pecto al segmento distal. Además, los animales Ovx tuvieron diferencias significativas en la densidad de espinas del seg- mento distal con respecto a los segmentos proximal y medial (p < 0,02) para cada uno de los casos. Esto permite inferir que el segmento distal es el que no se encuentra afectado por el tratamiento o que posee mayor resistencia a los cam- bios de niveles hormonales derivados de estrógenos.   109 Cómo citar este artículo: Beltrán-Campos V, et al. Efecto de la tibolona en la densidad de las espinas dendríticas en el hipocampo de la rata. Neurología. 2014. doi:10.1016/j.nrl.2014.03.002 ARTICLE IN PRESS +Model NRL-615; No. of Pages 6 Tibolona y plasticidad del hipoampo 5 Discusión Los resultados mostraron que el tratamiento con TB no tuvo efecto sobre la PL en los 3 grupos estudiados, lo que concuerda con lo reportado por de Aguilar et al. (2008)14, quienes administraron 2 dosis (0,5 mg/kg y 1 mg/kg) de TB por 12 semanas a ratas adultas ovariectomizadas y no encon- traron efecto sobre los niveles de PL, concluyendo que la TB no incide sobre el daño oxidativo generado por efecto de la ovariectomía. Sin embargo, en este estudio, la dosis de TB (1 mg/kg) administrada al grupo Ovx, durante 40 días, revir- tió la poda de las espinas provocada por la ovariectomía. En la evaluación histológica del conteo de espinas realizada en los segmentos proximal, medial y distal en las células piramidales del CA1 del hipocampo de ratas ovariectomiza- das mostró una reducción en la cantidad de espinas, lo que indica que las ED como sitios postsinápticos son altamente sensibles a la falta de estrógenos. En estudios previos, rea- lizados por nuestro grupo y por otros18-20, se ha reportado que la distribución de las ED es heterogénea, dependiendo del segmento estudiado. Se sabe que en el segmento dis- tal existe un mayor número de espinas en comparación con el segmento proximal; esta distribución fue observada nue- vamente en los 3 grupos estudiados en este trabajo. Por otra parte, se comprobó que el grupo Ovx mostró un menor número de espinas, aunque conservando el mismo patrón de distribución normal, es decir, hay una mayor reducción de espinas en el segmento distal (en donde hay más espi- nas) que en el segmento proximal (donde de manera normal hay menos espinas). Asimismo, la suplementación oral de TB recupera la pérdida de espinas en esta área plástica cerebral que participa en la regulación de los procesos de aprendi- zaje y memoria. El mecanismo por el cual la TB ejerce este efecto no se conoce, ya que es el primer trabajo donde se describe la capacidad de la TB para inhibir la reducción en el número de espinas en las células piramidales del CA1 del hipocampo. En relación con el efecto de la TB, solo existe un reporte por Espinoza Raya et al. (2012)21, en el cual se demuestra que el tratamiento con TB mejora el aprendi- zaje de ratas ovariectomizadas. Los autores reportan que el mecanismo puede estar relacionado con la modulación de la función colinérgica y del sistema serotonérgico, ya que se observó un aumento del contenido de triptófano hidro- xilasa por efecto del tratamiento con TB. Sobre la base de esta información, es probable que la TB ejerza su efecto neuroprotector tanto por la regulación de la síntesis de neu- rotransmisores involucrados en la memoria y el aprendizaje, como por las vías de señalización relacionadas con las ED. Por otra parte, en el humano, se infiere que técnicas terapéuticas con estrógenos sintéticos pueden modificar la diversas actividades fisiológicas a nivel de órganos sistémi- cos como del cerebro y huesos; sin embargo, aún se discuten los efectos de los compuestos, como la TB, en vista de los importantes efectos secundarios que se reportan10 después de la menopausia y en asociación entre los niveles de tejido y las funciones cerebrales, así como de la distribución de sus metabolitos mono y trisulfatados22. En este estudio, aunque no se encontró la respuesta anti- oxidante del tratamiento con TB, hubo una recuperación o rescate de la poda de ED producida por la ovariectomía a lo largo de la dendrita apical de las neuronas piramidales del CA1, dato que se relaciona con diversos estudios de plastici- dad hipocampal con tratamientos con estrógenos exógenos, considerándose estos cambios plásticos como fluctuaciones inherentes al cambio de las concentraciones hormonales en el plasma a lo largo del ciclo estral18,19. Es interesante que la ovariectomía afecta a los 3 segmentos estudiados (proximal, medial y distal), mientras que el tratamiento con TB tiene un efecto diferencial sobre el segmento proximal donde la densidad de espinas dendríticas no es capaz de recuperarse después de la administración por 40 días de esta la hormona sintética. Estos resultados permiten indagar en un futuro cuáles serían los mecanismos de neuroprotección específicos de la TB que favorecen la plasticidad cerebral y qué relación podríamos encontrar con respecto al segmento proximal y los receptores a estrógenos que se expresan en esta zona determinada, que es la vía de entrada comisural de infor- mación proveniente de las colaterales de Shaffer, afectando al intracircuito del hipocampo para el paso de información de memoria de corto a largo plazo. Financiación Este trabajo fue financiado parcialmente por el CONACYT (Becas: 173299 y 17276), Programa de Doctorado de Ciencias Biomédicas (PDCB), DGAPA-UNAM y PROMEP UGTO-PTC-324. Programa para el mejoramiento del profesorado (PROMEP), Universidad de Guanajuato. Conflicto de intereses Los autores declaran que no existe ningún conflicto de inte- reses. Agradecimientos Los autores desean agradecer A. Aguilar Vázquez, M. García Servín y a L. López Villanueva por su ayuda con el cuidado de los animales. Bibliografía 1. Oliveira BF, Nogueira-Machado JA, Chaves MM. The role of oxi- dative stress in the aging process. Scientific World Journal. 2010;10:1121—8. 2. Chakrabarti S, Munshi S, Banerjee K, Thakurta IG, Sinha M, Bagh MB. Mitochondrial dysfunction during brain aging: Role of oxi- dative stress and modulation by antioxidant supplementation. Aging Dis. 2011;2:242—56. 3. Sharma S, Ebadi M. Significance of metallothioneins in aging brain. Neurochem Int. 2014;65C:40-8. 4. Aliev G, Priyadarshini M, Reddy VP, Grieg NH, Kaminsky Y, et al. Oxidative stress mediated mitochondrial and vascular lesions as markers in the pathogenesis of alzheimer disease. Curr Med Chem. 2013. [Epub ahead of print]. 5. Perez-Cruz C, Nolte MW, van Gaalen MM, Rustay NR, Termont A, Tanghe A, et al. Reduced spine density in specific regions of CA1 pyramidal neurons in two transgenic mouse models of Alzheimer’s disease. J Neurosci. 2011;31:3926—34.   110 ARTICLE IN PRESS +Model NRL-615; No. of Pages 6 6 V. Beltrán-Campos et al 6. Dickstein DL, Kabaso D, Rocher AB, Luebke JI, Wearne SL, Hof PR. Changes in the structural complexity of the aged brain. Aging Cell. 2007;6:275—84. 7. Smart FM, Halpain S. Regulation of dendritic spine stability. Hippocampus. 2000;10:542—54. 8. Gould E, Woolley C, Frankfurt M, McEwen B. Gonadal steroids regulate dendritic spine density in hippocampal pyramidal cells in adulthood. J Neurosci. 1990;10:1286—91. 9. Korkotian E, Segal M. Structure-function relations in dendritic spines: Is size important? Hippocampus. 2000;10:587—95. 10. Li CJ, Brake WG, Romeo RD, Dunlop JC, Gordon M, Buzescu R, et al. Estrogen alters hippocampal dendritic spine shape and enhances synaptic protein immunoreactivity and spa- tial memory in female mice. Proc Natl Acad Sci USA. 2004;101:2185—90. 11. Al-Anazi AF, Qureshi VF, Javaid K, Qureshi S. Preventive effects of phytoestrogens against postmenopausal osteoporosis as com- pared to the available therapeutic choices: An overview. 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The female brain is influenced by multiple factors including the decrease in estrogen levels, with that commonly accompanies to stress and aging. However, plasticity in the hippocampus in pre- and postsynaptic sites, such as the mossy fiber system and dendritic spines, responds to the neuroprotective and antioxidant actions of hormone supplementation. Furthermore, in hippocampus, the ovariectomy produces spine pruning in pyramidal cells of CA1, a reduction of the mossy fiber area in CA3, a decrease of the zinc in the whole hippocampus and an increase in oxidative stress. Following supplementation with a minimal dose of 17β-estradiol, the effects are revers and these parameters have values similar to those observed during the proestrus stage of the estrous cycle, which is associated with a better performance in learning and memory in female rats. These studies confirm the roles of estrogen in protecting the hippocampus before oxidative stress and maintaining its synaptic plasticity.     Introduction       Estrogens  are  known  to  have  broad  effects  on  hippocampus  synaptic  plasticity   which   is   also   affected   by   oxidative   stress   and   aging   (Foy,   2010).   Multiple   lines   of   evidence   suggest   that   loss   of   estrogens   in   the   aging   brain   may   play   a   role   in   the   cognitive  decline  associated  with  Alzheimer´s  disease  (Janicki  &,  Schupf,  2010;  Barron   &   Pike,   2012).   The   hippocampus   has   steroid   receptors   (Spencer-­‐Segal   et   al.,   2012)   113 that  make  it  sensitive  to  the  interaction  between  antioxidant  defense  systems  and  sex   steroids.  This  effect   is  shown   in  studies  of  estrogen  deprivation  which   increases   the   vulnerability  to  injury  of  granule  cells  in  the  adult  hippocampus  and  may  predispose   to  neurological  diseases  and  deficits   in  working  memory  occurring  after  menopause   (Liu  et  al.,  2001).  Estrogen  can  prevent  oxidative  stress  in  neurons  (Behl  et  al.,  1997,   2003),  and,  in  the  hippocampus,  they  can  act  as  an  antioxidant  agent  to  modulate  lipid   oxidation,  thereby  regulating  oxidative  phosphorylation  (Yao,  et  al,  2011).  It  has  been   demonstrated   that   estrogens   produce   a   neurotrophic   effect   that   prevents   neuronal   damage  in  the  adult  brain,  protecting  and  supporting  synaptic  connections  which  are   essential   for   signaling   and   neural   survival   (Maggi   et   al,   2004;   Yao   et   al.,   2011;   Srivastava,  2012).  This  mechanism  regulates  pre-­‐  and  postsynaptic  proteins   such  as   synaptophysin,   syntaxin,   and   spinophilin   in  CA1  pyramidal   cells   (Brake  et   al.,   2001;   Prange-­‐Kiel  et  al.,  2006).  These  synaptic  changes  in  hippocampal  pyramidal  cells  are   also   related   to   spatial   behavioral   experience   (Ramírez-­‐Amaya   et   al.,   1999;   2001;   Beltrán  Campos  et  al.,  2010).     In   the   hippocampus   of   the   adult   rat,   mossy   fiber   (MF)   axons   from   dentate   granule  cells  converge  in  the  dentate  hilus  and  run  through  a  narrow  area  called  the   stratum   lucidum   (CA3)   forming   excitatory   glutamatergic   synapses.   The   well-­‐ documented   synaptic   rearrangement   of   MFs   is   associated   with   several   factors   like   learning,  memory,   temporal   lobe  epilepsy  (Koyama  et  al.,  2004),  malnutrition  (Díaz-­‐ Cintra  et  al.,  1991,  1997,  2007),  stress  and  neurotrophic  factors.  The  idea  that  levels  of   circulating  estrogens  are  also  important  for  cognition  is  supported  by  animal  studies   in  which  ovariectomy  produces  acquisition  deficits  in  Morris  water  maze  (MWM)  task   (Xu  &  Zhang,  2006;  Sarkaki  et  al.,  2008).       Here  the  main  objetives  were  to  study  the  protective  effects  of  estrogens  before   oxidative  stress  and  the  pre  and  postsynaptic  dorsal  hippocampal  plasticity  (MFs  and   spines,   respectively)   involved   in   the   regulation  of   spatial  memory.  Our   experiments   designs   were   performed   in   female   Sprague-­‐Dawley   rats   which   were   treated   in   accordance   with   the   NIH   Guide   for   Care   and   Use   of   Laboratory   Animals.   The   experimental  protocols  were  approved  by  the  local  Animal  Care  and  Use  Committee.       1.  Estrogen  Modulation  of  Hippocampal   Oxidative  Stress       Oxidative   stress   (OS)   together   with   inflammatory   processes   and   the   aggregation  of  oxidized  products  of  aberrant  proteins  in  the  brain  induces  apoptosis   and   autophagy   (Caballero  &  Coto-­‐Montes,   2012).  Biological   aging   is   associated  with   neurodegeneration   due   to   the   presence   of   lipid   peroxidation   products,   protein   oxidation  and  oxidative  modifications  in  nuclear  and  mitochondrial  DNA  (Richwine  et   al.,  2005;  Zhu  et  al.,  2006;  Poon  et  al.,  2006).  In  addition,  the  decrease  of  sexual  steroid   levels  due  to  aging  can  have  an  impact  on  brain  functions;  thus,  therapies  to  replace   these   hormones   may   reduce   this   impact,   which   is   supported   by   evidence   in   114 experimental   animals   (Green   &   Simpkins,   2000;   Garcia-­‐Segura   et   al.,   2001;   Lee   &   McEwen,   2001;   Feng,   2005).   To   test   if   the   interaction   between   antioxidant   defense   systems  and  sex  steroids  affects  the  antioxidant  activity  in  the  hippocampus  of  young   and  senile  animals,  we  evaluated  lipid  peroxidation  in  five  experimental  groups,  each   contain   10   animals:   young   proestrus   (Pro),   young   ovariectomized   (OvxV),   young   ovariectomized   supplemented   with   a   minimal   dose   of   17β-­‐estradiol   (OvxE),   senile   (SenV)  and  senile  supplemented  with  the  same  minimal  17β-­‐estradiol  dose  (SenE).   Methodology  and  Results       The  young  animals  were  ovariectomized  (Ovx,  n  =  20)  with  xylazine/ketamine   anesthesia   (13   mg/kg   xylazine   and   40   mg/kg   ketamine)   to   minimize   pain   and   discomfort,  using  aseptic  procedures.  An  incision  was  made  in  the  abdominal  zone  to   visualize   the   ovaries.   A   clip   was   placed   1   cm   below   the   ovaries   which   were   then   completely   removed.   A   two-­‐week   recovery   period   was   provided   before   hormone   supplementation.  Then,  one  of  the  young  ovariectomized  (OvxE)  and  one  of  the  senile   (SenE)  groups  were  given  hormone  supplementation  (10  µg  of  17-­‐β  -­‐  estradiol  in  0.2   ml  oil   solution).  Two  other  groups   (OvxV  and  SenV)  received  vehicle   (0.2  ml  of  oil).   The  supplementation  was  administered  subcutaneously  every  24  h  for  3  consecutive   days.  After  the  treatments,  the  animals  were  sacrificed,  and  the  brains  of  the  animals   (in  all  groups)  were  extracted  and  distributed  randomly  (6  hemi-­‐brains  per  assay)  for   different  measurements.  Quantification  of  lipid  peroxidation  and  determination  of  its   final  products  were  performed  using  the  technique  of  Triggs  &  Willmore  (1984).  The   complete  hippocampus  of  each  of  the  6  hemi-­‐brains  per  group  was  carefully  removed   and  homogenized  in  3  ml  of  saline  solution  (0.9%  NaCl  in  buffer);  an  aliquot  of  1  ml  of   this  homogenate  was  mixed  with  4  ml  of  chloroform/methanol  (2:1  v/v)  and  then  left   on   ice   for   30   min   to   allow   phase   separation   fluorescence   of   the   chloroform   was   masured   in   a   Perkin  Elmer   L5500B   spectrophotometer   (luminescence:   excitation   at   370  nm  and  emission  at  430  nm).  The  spectrophotometer  sensitivity  was  adjusted  to   330U  of  fluorescence  with  a  standard  solution  of  quinine  (0.1μg/ml).  The  results  were   expressed   in   fluorescence  units   per   gram  of   tissue.  ANOVA   tests   showed   significant   differences   in   the   levels  of   lipid  peroxidation   they  were   similar   in   the  young   female   rats  in  proestrus  (Pro)  and  after  treatment  (OvxE).  Moreover,  supplementation  with  a   low  dose  of   17β-­‐estradiol   produced  a  decrease   in   lipid  peroxidation   levels   in   senile   females  (SenE)  as  well  as  in  young  OvxE  as  shown  in  Figure  1.     115 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Pro OvxV OvxE SenV SenE U o f F / g r o f ti s s u e Lipid  peroxidation a ac b bd Figure 1. Mean ± SEM of fluorescence units (U of F) per gram of tissue and the significant differences (p < 0.05) between groups: a - vs Pro; b - vs OvxV; c - vs OvxE; d - vs SenV. Modified from Beltrán-Campos et al. (2011).   2.  Estrogen  Supplementation   Effects  on  Spine  Density       Structural   synaptic   changes   are   believed   to   be   responsible   for   stabilizing   the   activity  patterns   in  neuronal  ensembles  during  memory  consolidation  (Hebb,  1949).   Following   learning,   structural   remodeling   of   synapses   has   been   studied   in   different   brain  regions  after  varied  learning  experiences  in  several  animal  species  (Bailey  et  al.,   2008;   Butz   et   al.,   2009).   In   hippocampal   CA1   pyramidal   neurons,   the   number   of   dendritic   spine   increases   when   rats   experience,   for   several   days,   a   complex   environment  that  promotes  spatial  learning  (Moser  et  al.,  1994).  Also,  training  rats  in   the  MWM  spatial   task   induces  changes   in  the  distribution  of  dendritic  spines   in  CA1   neurons  as  observed  using  electron  microscopy  (Rusakov  et  al.,  1997).  Trace  eyeblink   conditioning  training,  which  is  an  associative  learning  task  dependent  on  the  integrity   of  the  hippocampus  (Solomon  et  al.,  1986),  increases  spine  density  in  CA1  neurons  as   observed  with  Golgi   staining  24  h   after   learning   (Leuner   et   al.,   2003).   This   staining   method  has   also   revealed   that   spatial  water  maze   training   increases   the   number   of   some,  but  not  all,  spine  types  in  CA1  neurons  (Diamond  et  al.,  2006).  Interestingly,  the   dendritic   spine   number   in   CA1   neurons   can   also   be  modulated   by   extrinsic   factors   such   as   circulating   gonadal   steroids   (Brusco   et   al.,   2008;   González-­‐Burgos,   2005).   Dendritic   spines   have   a   highly   plastic   capacity   and   can   modify   their   structure   in   respond   to   hormonal   influences   (Murakami   et   al.,   2006;   Sato   et   al.,   2007).   For   example,   it   is   well   established   that   ovariectomy   in   young   animals   reduces   their   dendritic   spine   number   in   CA1   hippocampal   pyramidal   neurons,   and   this   effect   is   reversed  by  estradiol  and  progesterone  replacement  (Gould  et  al.,  1990).  We  studied   this  effect  in  the  same  CA1  hippocampal  pyramidal  neurons  by  administering  of  17β-­‐ estradiol   not   only   in   ovariectomized   young,   but   also   in   senile   females,   in   order   to   know   if   these   spines   retain   their   plastic   capacity   as   a   result   of   estradiol   influence.   116 Moreover,   we   evaluated   if   the   spine   number   recovered   to   levels   similar   to   those   observed  in  animals  at  proestrus,  which  are  the  highest  of  the  estrous  cycle.         Methodology  and  Results       The   dorsal   hippocampus   (Bregma   -­‐2.8   to   -­‐   4.2;   Paxinos   &  Watson,   1998)   of   each  hemi-­‐brain   (10  per  group)  was  carefully   removed,   immediately   fixed   in  a  10%   buffered  formalin  solution,  and  divided  into  4mm-­‐thick  blocks  after  4  hours  with  the   aid  of  a  stereoscopic  microscope.  Each  block  was   impregnated  using   the  rapid  Golgi   technique  following  the  modification  of  Díaz-­‐Cintra  et  al.  (1994).  After  12  days,  each   block  was  transferred  to  a  solution  of  0.75%  silver  nitrate  in  double  distilled  water  for   12  h,  washed  in  50%  alcohol,  embedded  in  low-­‐viscosity  nitrocellulose,  and  cut  along   the  frontal  plane  at  a  thickness  of  120  μm.  Each  section  was  collected  in  70%  alcohol,   dehydrated,   and  mounted   in   Entellan®  medium.   Each   slide   had   16   sections   of   the   dorsal   hippocampus   and   was   assigned   a   random   number   to   ensure   that   observers   were   blind   to   experimental   conditions.   Morphometric   analysis   was   made   in   six   complete   and  well-­‐impregnated  CA1  dorsal  hippocampus  neurons   chosen   randomly   from  each  of   the  6   animals   per   group   and  was   analyzed  using   an  Optiphot-­‐2  Nikon   microscope.  A  20x  Plan®  objective  (0.5  NA)  with  an  optically  calibrated  reticule  and  a   100×  Plan-­‐Apochromat®  objective  (1.3  NA)  were  used   for   the  analysis.  An   image  of   the   selected   pyramidal   cell   was   captured   with   the   20x   objective   by   carefully   identifying   the   optical   plane   in   which   the   whole   apical   dendrite   was   visible.   This   image  was   then  used  as   the   reference   image.  This   study  was  performed  only   in   the   CA1   Golgi-­‐impregnated   pyramidal   neurons   whose   dendrites   reached   the   stratum   lacunosum  molecular  (slm)  as  shown  in  Figure  2.  Using  the  reference  image,  the  apical   dendrite  segments  were  designated  according  to  the  following  criteria:  The  proximal   segment  was   considered  as   the   first  100  μm  closer   to   the   soma.  The  distal   segment   was  considered  to  start  at  the  slm,  where  the  apical  dendrite  folds.  Finally,  the  medial   segment  was  considered  the  whole  section  between  the  proximal  and  distal  segments.   The   spine   density   analysis   was   performed   on   one   secondary   dendritic   branch   attached  to  the  main  apical  dendrite  of  each  segment.  In  each  selected  branch,  a  25  μm   length  was  chosen  randomly  for  spine  classification  and  density  analysis.  We  analyzed   secondary   branches,   rather   than   the   main   dendritic   shaft,   because   the   proximal   segment  of  the  main  apical  dendrite  is  devoid  of  spines  within  the  first  100  μm  from   the  soma  (Megías  et  al.,  2001).  Golgi-­‐stained  neurons  were  classified  and  analyzed  for   spine   density   by   direct   microscopic   observation.   Dendritic   spine   density   was   calculated   as   the   number   of   spines   divided   by   125   microns   (sum   of   these   three   segments)   in  the  apical  dendrite   in  hippocampal  CA1  neurons,  and  analyzed  by  one-­‐ way   ANOVA   comparing   groups   (Pro,   OvxV,   OvxE,   SenV   and   SenE).   Significant   differences   (P   <   0.0001)   were   found   and   a   subsequent   a   post   hoc   Fisher´s   test   indicated   significant   reductions   (P   <   0.0001)   in   the   OvxV   and   the   SenV   groups   compared  to  the  Pro  group  as  shown  in  Figure  2.  These  results  show  that  the  young   animals  tested  during  the  proestrus  stage  had  1.7  spines  per  linear  µm,  but  a  decrease   of  more  than  50%  in  Ovx  animals  was  found.  After  the  10  µg  dose  of  17-­‐β  estradiol,   117 spine  density  recovered  and  was  similar  to  that   in  young  animals  at  proestrus.  Also,   the  spine  density  of  the  senile  groups  showed  equivalent  pruning  and  recovery  effects,   Figure  2.       3.  Effect  of  17β-­‐Estradiol  on  Plasticity  of   Hippocampal  MF       Studies  testing  the  hippocampal  plasticity  show  an  increased  propensity  of  MFs   synapses   to   reorganize   in   the   inner   molecular   layer   following   seizures   (Lin   et   al.,   2011).  Estrogen  deprivation  increases  the  vulnerability  to  injury  of  granule  cells  in  the   adult   hippocampus   and   may   predispose   to   neurological   diseases   and   an   increased   incidence   of  memory   deficits   after  menopause   (Liu   et   al.,   2001;   Sherwin,   2012).   In   hippocampal   pyramidal   cells,   estrogen   has   also   been   shown   to   enhance   long-­‐term   potentiation   and   potentiate   acute   excitatory   transmission,   a   cellular   correlate   of   learning  and  memory  (Woolley,  2007;  Smejkalova  &  Wooley,  2010).  It  is  well  accepted   that   estrogen   increases   synaptic   function   and   induces   neurogenesis   in   the   adult   (Gould   et   al.,   2000).  Neurogenesis   and   less   apoptosis   in   hippocampal   dentate   gyrus   during   proestrus   and   in   rats   with   estrogenic   supplementation   have   been   reported   (Tanapat  et  al.,  2005).  The  MFs  is  highly  plastic  in  the  adult  brain  and  is  influenced  by   multiple  factors  including  learning  and  memory.  In  addition,  zinc  plays  an  important   modulatory   role   in   hippocampal   neuronal   signal   transduction   (Sindreu   &   Storm,   2011)  and  in  memory  formation  and  stress.  Since  the  relation  between  MFs  plasticity   and   their   zinc   content   in   entire   hippocampus   throughout   the   estrous   cycle   remains   unknown,  we  designed  this  study  in  order  to  test  estrogen  (17ß-­‐estradiol)  modulation   and  zinc  content  of  the  hippocampus  over  the  course  of  the  female  estrous  cycle.  Thus,   ovariectomized  female  rats  without  (Ovx)  or  with  estrogen  supplement  (OvxE)  were   compared  with   control   rats   at   three   stages   of   the   estrous   cycle:   diestrus,   proestrus,   and  estrus.       Methodology  and  Results       Subjects,   their   ovariectomy   surgery,   and   estrogenic   supplementation   were   described  earlier  in  this  chapter.  In  order  to  detect  normal  cycles,  daily  vaginal  smears   were  taken  for  three  days  from  36  female  rats  that  were  euthanized  at  proestrus  (P),   estrus   (Es)   or   diestrus   (D)   stages   (12   rats   per   stage).   Groups   of   six   rats  were   used   either   for   Timm   staining   or   zinc   measurement.   For   estrogen   deprivation   and   replacement,   24   female   rats   were   ovariectomized   (Ovx),   half   of   which   were   supplemented  with  E  (OvxE).  Four  six-­‐rat  groups  were  formed  and  studied  either  by   Timm  staining  or  zinc.measurement.  Additionally,  20  female  rats  were  ovariectomized   (Ovx),   and   ten   of   them   supplemented   with   E   (OvxE),   and   subjected   to   behavioral   118 testing  in  the  MWM  (Section  4,  Effects  of  ovariectomy  on  the  performance  of  a  spatial   task).     Figure 2. Example of a CA1 pyramidal cell stained with the rapid Golgi technique and enlargements of its dendritic segments (distal, middle and proximal). Scale bars: 100 and 10 µm, on left and right respectively. Graphs show the mean ± SEM spine density (spine / µ) in the five groups analyzed; significant (p < 0.05) reductions in OvxV and SenV groups and recovery with estrogen supplementation were founf (OvxE and SenE groups); a - vs Pro; b - vs OvxV; c - vs OvxE; d - vs SenV. Modified from Beltrán-Campos et al. (2011). 119 Figure 3. Example of hippocampal coronal section used to estimate the volume of the mossy fibers (MF) limit with arrows; and to estimate areas: dentate gyrus (DG), CA1, and stratum lucidum (SL); bar, 300 µm. The graph shows the mean ±SEM of the MF stratum lucidum area in five groups: gonadally intact divided into: diestrus (D), proestrus (P) and estrus (Es) from cycling young female rats, and two ovariectomized (Ovx) without supplementation and with a 10µg dose of 17β-estradiol (OvxE). Note the significant decreases in the Es (p = 0.001) and Ovx (p = 0.01) groups relative to the P group and a significant (p =0.001) increase in OvxE with respect to the Ovx and Es groups. Modified from Padilla-Gómez et al. (2012).     Tissue   collection   (Timm   staining).  A   total   of   30   animals   (P,   Es,   D,   Ovx   and   OvxE),   6   per   group,   were   studied   with   the   histological   Timm   technique   (Padilla-­‐ Gómez   et   al.,   2011).   Sections   were   serially   mounted   and   processed   using   a   modification  of  Timm’s  sulfide  silver  technique  as  described  elsewhere  (Granados  et   al.,   2002).   A   coronal   section   from   the   hippocampal   formation   was   obtained   immediately   after   perfusion.   These   sections   were   used   to   estimate   the   area   of   the   suprapyramidal   bundle   of   the   MF   system.   Every   fifth   section   was   selected   from   a   random  starting  position  within  the  first  five  serially  mounted  sections.  Each  slide  was   assigned   a   random   number   to   ensure   that   the   observer   was   unaware   of   the   experimental  conditions.  The  area  of  the  MF  system  (expressed  in  µm2)  was  measured   in  the  suprapyramidal  bundle,  which  broadly  corresponds  to  the  stratum  lucidum  (SL),   and  in  the  sections  selected  from  the  dorsal  hippocampus  (Figure  3A).  The  results  are   shown  in  Figure  3,  with  the  mean  area  ±SEM  of  the  MF  system  and  SL  in  five  groups:   cycling  female  rats  (D,  P,  Es)  and  Ovx  alone  or  with  17β-­‐estradiol  supplement  (OvxE).   ANOVA  testing  showed  significant  (p  =  0.006)  differences  among  groups  and  Fisher´s   post  hoc  test  showed  a  significant  (p  =  0.003)  area  reduction  in  Es  and  Ovx  (p=0.0007)   groups   in  relation  with  P  group.  The  zinc  determination  was  made   in  six  animals  at   each   stage  of   the  estrous   cycle   (D,  P,  Es),   and   in  Ovx  and  OvxE.  Hippocampal   tissue   was  dissected  out  from  the  skull  as  rapidly  as  possible  and  placed  in  tubes  previously   washed   with   30%   nitric   acid   solution   to   avoid   external   contamination.   All   the   hippocampus  weights  were  recorded,  and  1  ml  of  redistilled  nitric  acid  was  added  to   the  samples.  Tubes  were  then  capped  and  placed  on  a  shaking  bath  at  60°C  for  30  min.   The   resulting   solution   was   assayed   for   zinc   content   in   an   atomic   absorption   spectrophotometer   equipped   with   a   graphite   furnace   and   Zeeman   background   correction  (Analyst  600,  Perkin  Elmer).  Results  are  expressed  as  µg  of  zinc  per  gram   120 of  wet   tissue  as   shown   in  Figure  3b.  This  data   showed   that   estrogen  modulates   the   plasticity   and   maintenance   of   MFs   during   proestrous   in   hippocampal   CA3   during   proestrous   because   the   MF   area   is   reduced   in   Ovx   animals   and   recover   to   normal   when  they  are  supplemented  with  a  physiological  doses  of  10µg  dose  of  17β-­‐estradiol.   Estradiol  supplementation  had  similar  effects  on  the  hippocampal  zinc  content  in  the   same  five  experimental  groups:  cycling  female  rats  (D,  P,  Es)  and  Ovx  with  or  without   E  (OvxE)  (Figure  4).       4.  Effects  of  Ovariectomy  on  the  Performance   of  a  Spatial  Task       Ovariectomy  produces  deficits  in  the  performance  of  hippocampus-­‐dependent   learning   tasks   (Wallace   et   al.,   2006);   these   deficits   are   ameliorated   by   estradiol   administration   (Xu  &   Zhang,   2006),   demonstrating   that   they   are   due   to   inadequate   levels  of  circulating  estradiol.  Some  studies  have  found  that  ovariectomy  may  improve   hippocampus-­‐dependent   learning  (Bimonte-­‐Nelson  et  al.,  2003);  however,   this  effect   was   observed   1.5–6   months   after   ovariectomy,   when   the   endocrine   system   of   the   animal   had   already   adapted   to   the   lack   of   ovaries,   and   estrogens  might   be   released   from   other   sources,   such   as   adipose   tissue   (for   reviews   see  Mendelson  &   Simpson,   1987;  Nelson  &  Bulun,  2001).  Moreover,  it  has  also  been  observed  that  low  estrogen   levels  during  the  estrous  cycle  inhibit  the  acquisition  of  spatial  tasks  (Frye  &  Sturgis,   1995;   Sarkaki   et   al.,   2008),   which   is   consistent   with   the   detrimental   effect   of   ovariectomy   on   hippocampus-­‐dependent   spatial-­‐   memory   tasks.   In   order   to   demonstrate  the  effect  of  hormone  replacement  we  studied   learning  and  memory   in   Ovx  and  OvxE  groups  using  a  MWM.     Figure 4. Zinc content (mean ± SEM) in five groups: gonadally intact: diestrus (D), proestrus (P) and estrous (E) from cycling female rats, Ovx and OvxE. Note the significant decreases in the E, D, and Ovx groups in relation to the P group and a significant increase in the OvxE compared to the Ovx group. Modified from Padilla-Gómez et al. (2012). 121 Figure 5. Mean ± SEM of acquisition performance of animals subjected to 2 days of training. Points represent the latency to reach the target platform on consecutive trial. Repeated measures ANOVA showed significant differences (*) between the Ovx and OvxE groups on trials 9 and 10 on day 1; and on trials 5, 7, 8, 9, and 10 on day 2. Also, between trials 1 to 10, only the OvxE group showed significantly reduced latency; the Ovx group did not reach the latency threshold (30 s) that would indicate learning. Modified from Padilla-Gómez et al. (2012).   Figure 6. Mean ± SEM of water maze performance during the memory test after two days of learning. Latency in seconds spent by the Ovx and OvxE groups to locate the platform area. The Student’s t-test showed significant differences (*) between groups. Modified from Padilla-Gómez et al. (2012).     122 Methodology  and  Results     We  trained  young  Ovx  and  OvxE  animals   in  the  MWM  spatial   training  task  (Subjects   described  in  Methodology  for  Section  3).  The  training  consisted  of  one  session  of  10   trials.  The  animal  was   introduced   into   the  pool  at  a  different  starting  point   for  each   trial  up  to  a  total  of  10  trials  (Ramírez-­‐Amaya  et  al.,  2001).  The  animal  was  allowed  to   swim   for  a  maximum  of  60   s,   or  until   it   located   the  platform,  and   it  was  allowed   to   stand  on  the  platform  for  30  s.  Escape  latency  was  measured  for  each  trial.  Figure  5,   shows  that  Ovx  rats,  had  higher  latencies,  indicating  poorer  performance  in  the  MWM.   Learning  was  evaluated  in  two  sessions  of  10  trials  each,  and  memory  was  tested  24  h   later.  The  OvxE  group  performed  significantly  better  in  both  learning  (trials  5,  8,  9,  10   on,  day  1  and  trials  5,  9,  10  on,  day  2)  and  in  memory,  Figure  6.         Concluding  Remarks  and  Future  Directions       We   have   reported   that   ovariectomy   produces   an   increase   in   oxidative   stress   and  spine  pruning  in  CA1  pyramidal  cells  (Beltrán-­‐Campos  et  al.,  2010);  other  effects   found   are   reduction   in   the  MF   area   in   the   CA3   and   a   decrease   in   the   level   of   total   hippocampal  zinc  (Padilla-­‐Gómez  et  al.,  2011).  Animals  trated  with  a  minimal  dose  of   17β-­‐estradiol,   showed   a   reversal   of   these   latter   effects   and   had  MF   areas   and   sinc   levels   similar   to   those   observed   during   the   proestrus   stage   of   the   estrous   cycle.   In   addition,   the  OvxE  group  acquired   and   remembered   the   spatial   task,   suggesting   the   important   role   of   estrogen   for  maintaining   hippocampal   plasticity   and   zinc   level   in   MF-­‐CA3  synapses  during  proestrus,  parameters  associated  with  better  performance  in   learning  and  memory.  While  suggestive,  these  data  are  not  sufficient  to  infer  changes   in   synaptic   connectivity;   therefore,   another   approach   to   the   problem  will   be   to   use   electron   microscopy   to   look   for   ultrastructural   modifications   at   postsynaptic   sites   through  the  estrous  cycle  of  rats.     The  findings  concerning  spine  density  support  the  idea  that  gonadal  activity  is   required   for   some   structural   changes   in   spines   underlying   hippocampus-­‐dependent   cognition  in  female  animals  (Gould  et  al.,  1990;  Woolley  et  al.,  1993;  1997).  We  have   reported   (Beltrán-­‐Campos,   2010)   that   the   different   dendritic   spine   types   (stubby,   thin,   and  mushroom)   had   different   density   distributions   across   the   apical   dendrite   from  CA1  pyramidal  neurons,  because  the  sites  of  the  input  are  altered  differentially.   Ovariectomy  (Ovx)  produced  spine  pruning   in  all  dendritic  segments.   It   is  necessary   to   know   the   differential   effects   of   estrogen   supplementation   on   oxidative   stress   (protective),  on  hippocampal  plasticity  (maintenance)  and  on  the  the  density  of  spine   (recovery),  which  have  high  plastic  capacity  to  modify  their  structure  in  relation  with   estrogen  levels.       123 Acknowledgments       This  study  was  supported  by  PDCB,  DGAPA-­‐UNAM,  and  CONACYT  fellowships   (173299,   17276,   210873)   and   CB2012-­‐178841,   UNAM-­‐PAPIIT   IN-­‐201613.   The   authors   wish   to   thank   A.   Aguilar   Vázquez,   T.   Martínez,   L.   Palma,   N.   Hernández,   N.   Serafin   and   M.   García   for   technical   assistance.   We   are   grateful   to   Dr.   D.   Pless   for   proofreading.       References     Barron, A. 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