UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS 
FACULTAD DE MEDICINA 
BIOMEDICINA 
 
RELACIÓN DE LA REMODELACIÓN DE LAS VÍAS AÉREAS A NIVEL 
ESTRUCTURAL Y MOLECULAR CON EL DESARROLLO DE LA 
HIPERREACTIVIDAD EN UN MODELO DE ASMA ALÉRGICA 
 
TESIS 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: 
DOCTORA EN CIENCIAS 
 
 
PRESENTA: 
ÁLVAREZ SANTOS MAYRA DINORAH 
 
                     TUTORA PRINCIPAL DE TESIS: DRA. BLANCA MARGARITA BAZÁN PERKINS 
FACULTAD DE MEDICINA, UNAM 
                                           COMITÉ TUTOR: DRA. ROSA NAVARRO GONZÁLEZ 
INSTITUTO DE FISIOLOGÍA CELULAR, UNAM 
COMITÉ TUTOR: DR. VÍCTOR MANUEL RUÍZ LÓPEZ 
FACULTAD DE MEDICINA, UNAM 
 
MÉXICO, CD. MX., MAYO 2017 
 
 
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respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
UN l f ¡,\&i 
POSGR D O~ 
Ciendu Biológica. 
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COORDINACiÓN 
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Eec'''temal del Posgrado." CierICi .. 8>o16gICn, en.., "1,,," O/dinao. del dla 31 de octul)r, de 
20111, aprobO el jurado par. 111 pr .. ,ntackm 0.1 ".men poo" obtener el grado de DOCTORA EN 
CIENC!AS de .. alumrni ÁLVAREZ SANTOS M,t,YRA DINORAH con numero de cuenta 
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Voe.l. 
Stcrtt .. iQ 
Sup~n!e 
DA. RICARDO lASCURAlN LEDESMA 
DR JAV1ER ROLANDO AMBROSIO HERHANcEZ 
DR VlCTOR MANUEL RUIZ LÓPEZ 
DR. ROBERTO ALEJA.NDRO AAREGUIN ESPINOSA DE LOS 
MONTEROS 
DRA. HORMA ARACEU BOBADILLA SANDOVAL 
Sin OtrO P"'t0eu1a., me el grato enviarte un cordial uluOo 
ATENTAMENTE 
· POR MI RAZA HABLARÁ EL EspIRITU" 
Cd, Unl ....... ILI.I., Cd. Mx., I 03 d. mlrzO d. 2017 
;ALQc.o~ ' 
ORA. MAR!A DEL CORO ARlZMENDI ARRIAGA 
COORDINADORA OEl PROGRAMA 
Unld ... do fuo~ , CoontiDac;.x, dol ""-0<10 on c ..... u... Bi.L6&lc .. Edór.clo D, t .. , Pi .... C"''';'o <k ~ Cd. Un;,"'''';''''';' 
o..lopciOn eo¡."." ... c.P. IJoUIO Mbko. D.F. T. l 5Oi2l 1002 kt<pJlpcbiol.po.pado. .... orn ...... 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
________________________________________________________________________ 
 
 
1. Primeramente, al Posgrado en Ciencias Biológicas, UNAM. 
 
2. Al apoyo recibido por CONACYT con número de registro 294207. 
 
3. A la Dra. Blanca Margarita Bazán Perkins, a la Dra. Rosa Navarro González y al Dr. Víctor 
Manuel Ruíz López por ser miembros del Comité Tutor.  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS A TÍTULO PERSONAL 
________________________________________________________________________ 
 
ESTE ESTUDIO SE LLEVÓ A CABO EN EL INSTITUTO NACIONAL DE ENFERMEDADES RESPIRATORIAS Y 
FUE FINANCIADO POR EL FONDO DE CIENCIA BÁSICA 256197. 
 
ME AGRADEZCO POR DARME LA OPORTUNIDAD DE CONOCERME, ARRIESGARME, ENFRENTAR MIS 
PEORES MIEDOS, POR TOMAR DECISIONES IMPORTANTES, POR QUERER Y TENER LAS GANAS DE 
SIEMPRE SALIR ADELANTE HASTA EN LAS PEORES CIRCUNSTANCIAS Y POR PERMITIRME LUCHAR 
POR LO QUE MÁS QUIERO, SER FELIZ.  
 
A MI MADRE, POR SIEMPRE ESTAR EN TODO MOMENTO, POR SER MI COMPAÑERA DE VIDA Y POR 
SIEMPRE ESTAR PRESENTE EN CUALQUIER CIRCUNSTANCIA. TE AMO. 
 
A ROSA MARÍA SANTOS, ADRIÁN, RAFAEL, CRISTIAN, GALADRIEL, ROSA MARÍA RODRÍGUEZ Y 
GERARDO POR SER PARTE DE LA GRANDIOSA FAMILIA QUE HEMOS FORMADO. SÉ QUE CUENTO 
CON ELLOS Y ME LLENAN DE ORGULLO. 
  
A MIS QUERIDAS AMIGAS LOOPY, ROXANA Y TLAMA QUE HAN ESTADO A MI LADO DURANTE 
MUCHOS AÑOS COMPARTIENDO TODO TIPO DE HISTORIAS. GRACIAS POR IR CONMIGO EN ESTE 
CAMINO CON MUCHOS TROPIEZOS, PERO TAMBIÉN CON GRANDES ÉXITOS. SON Y SEGUIRÁN 
SIENDO PARTE DE MI HISTORIA.  
 
A LA DRA. BLANCA BAZÁN LE AGRADEZCO DE UNA FORMA MUY ESPECIAL, GRACIAS A ELLA ME HE 
FORMADO PROFESIONALMENTE. ES UN GRAN EJEMPLO A SEGUIR. LE ADMIRO POR TODO LO QUE 
HA PODIDO LOGRAR GRACIAS A LA LUCHA CONSTANTE POR PERSEGUIR SUS OBJETIVOS. ES Y SERÁ 
MI EJEMPLO. GRACIAS POR TODA LA PACIENCIA. 
 
A MARYANA Y SANDY QUE ME HAN ENSEÑADO TANTO EN EL CAMINO PROFESIONAL. MIS MAS 
GRANDES ALUMNAS. LAS ADMIRO POR TODO LO QUE HAN LOGRADO Y POR FORMAR PARTE DE MI 
CAMINO EN LA CIENCIA.  
 
DE FORMA GENERAL, GRACIAS A TODAS LAS PERSONAS QUE CONOCÍ EN ESTE CAMINO, POR SUS 
ENSEÑANZAS, POR LOS MOMENTOS QUE SONREÍMOS, POR LOS MOMENTOS QUE NOS ENOJAMOS 
PORQUE NOS SIRVIÓ DE APRENDIZAJE Y SOBRE TODO, GRACIAS POR HACERME FELIZ A SU LADO. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
La mayor aventura es la que nos espera.  
Hoy y mañana aún no se han dicho.  
Las posibilidades, los cambios son todos vuestros por hacer.  
El molde de su vida en sus manos está para romper. 
-El Hobbit de J.R.R. Tolkien. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ÍNDICE 
_______________________________________________________________________________ 
 
 
LISTA DE FIGURAS Y TABLAS ................................................................................................................. i 
ABREVIATURAS .................................................................................................................................... ii 
RESUMEN ............................................................................................................................................ 1 
ABSTRACT ............................................................................................................................................ 3 
INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................... 5 
          VÍAS AÉREAS .................................................................................................................................. 5 
          ASMA ........................................................................................................................................... 6 
          EPIDEMIOLOGÍA DEL ASMA ............................................................................................................... 8 
          FENOTIPOS DEL ASMA ...................................................................................................................... 9 
          ASMA ALÉRGICA ........................................................................................................................... 10 
          REMODELACIÓN ESTRUCTURAL DE LAS VÍAS AÉREAS  ........................................................................... 11 
          OBSTRUCCIÓN DE LAS VÍAS AÉREAS .................................................................................................. 12 
          HIPERREACTIVIDAD DE LAS VÍAS AÉREAS  ........................................................................................... 13 
          MÚSCULO LISO DE LAS VÍAS AÉREAS ................................................................................................. 14 
          CONTRACCIÓN DEL MÚSCULO LISO DE LAS VÍAS AÉREAS ....................................................................... 14 
          MECANISMOS DE SENSIBILIZACIÓN DE LA MAQUINARIA CONTRÁCTIL DEL MÚSCULO LISO ........................ 17 
          CAVEOLAS ................................................................................................................................... 18 
          ADHESIONES FOCALES .................................................................................................................... 20 
          INTEGRINAS ................................................................................................................................. 22 
          ILK .............................................................................................................................................. 24 
          MLCP .......................................................................................................................................... 25 
          MYPT1 ........................................................................................................................................ 25 
          FOSFORILACIÓN DE LA MYPT1.......................................................................................................... 27 
JUSTIFICACIÓN .................................................................................................................................. 29 
HIPÓTESIS .......................................................................................................................................... 30 
OBJETIVO GENERAL ........................................................................................................................... 30 
OBJETIVOS PARTICULARES ................................................................................................................ 30 
METODOLOGÍA.................................................................................................................................. 31 
          ANIMALES ................................................................................................................................... 32 
          SENSIBILIZACIÓN ANTIGÉNICA ......................................................................................................... 32 
          PLETISMOGRAFÍA BAROMÉTRICA ..................................................................................................... 33 
          REACTIVIDAD DE LAS VÍAS AÉREAS .................................................................................................... 35 
 
 
          EUTANASIA DE LOS COBAYOS  Y EXTRACCIÓN DE TRÁQUEA ................................................................... 35 
          HISTOLOGÍA CONVENCIONAL Y ANÁLISIS MORFOMÉTRICO AUTOMATIZADO ............................................. 36 
          INMUNOFLUORESCENCIA ................................................................................................................ 36 
          CITOMETRÍA DE FLUJO ................................................................................................................... 37 
          PROTEÍNAS .................................................................................................................................. 38 
          ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA .................................................................................... 39 
          INMUNOELECTROTRANSFERENCIA  ................................................................................................... 39 
          ANÁLISIS COMPUTACIONAL DE EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS .................................................................... 40 
          MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA ........................................................................................................... 40 
          EXTRACCIÓN DE RNA ..................................................................................................................... 41 
          PCR CUANTITATIVA EN TIEMPO REAL ................................................................................................. 41 
          RACE-PCR..................................................................................................................................... 42 
          MATERIALES ................................................................................................................................ 43 
          ANÁLISIS ESTADÍSTICO ................................................................................................................... 43 
RESULTADOS ..................................................................................................................................... 44 
DISCUSIÓN ......................................................................................................................................... 55 
CONCLUSIÓN ..................................................................................................................................... 63 
PERSPECTIVAS ................................................................................................................................... 64 
LITERATURA CITADA .......................................................................................................................... 65 
ANEXO I: ARTÍCULO REQUISITO I ...................................................................................................... 75 
ANEXO II: ARTÍCULO REQUISITO II  ................................................................................................... 88 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE FIGURAS Y TABLAS 
_______________________________________________________________________________ 
 
Figura 1. Estructura de las vías aéreas en humano 
Figura 2. Estructura de la pared de las vías aéreas 
Figura 3. Mecanismos inmunológicos en el asma alérgica 
Figura 4. Cambios estructurales en la pared de las vías aéreas 
Figura 5. Vías de movilización de Ca2+ para el desarrollo de la contracción del músculo liso de las              
vías aéreas 
Figura 6. Mecanismos de sensibilización al Ca2+ 
Figura 7. Representación espacial de la caveola y el retículo sarcoplásmico 
Figura 8. Representación esquemática de la estructura de la MLCP 
Figura 9. Modelo de sensibilización y administración de retos antigénicos en cobayos 
Figura 10. Equipo de pletismografía barométrica para animales en libre movimiento 
Figura 11. Obstrucción e hiperreactividad de las vías aéreas inducida por reto antigénico en cobayos 
sensibilizados 
Figura 12. Remodelación de las vías aéreas de cobayos con modelo de asma 
Figura 13. Expresión de Caspasa 3 en músculo liso de cobayos del modelo de asma 
Figura 14. Expresión de Caveolina-1 en miocitos traqueales de cobayos del modelo de asma 
Figura 15. Determinación de los dominios citosólico y extracelular de la subunidad 1 de integrina 
en la pared de las vías aéreas 
Figura 16. Expresión de la subunidad 1 de inetrgina en miocitos y tejido conectivo de las vías aéreas 
Figura 17. Expresión de ITGB1 en miocitos traqueales de cobayo 
Figura 18. Expresión de ILK en miocitos traqueales en un modelo de asma 
Figura 19. Expresión de Paxilina, Talina y Actina en miocitos traqueales en un modelo de asma 
Figura 20. Expresión de MYPT1 Thr696 en un modelo de asma 
Figura 21. Modelo de remodelación molecular de las adhesiones focales y el desarrollo de la 
contracción muscular 
Tabla 1. Oligonucleótidos empleados para la RT-PCR cuantitativa 
Tabla 2. Intensidad relativa de fragmentos polipeptídicos de la subunidad 1 de integrina 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
i 
 
 
ABREVIATURAS 
_______________________________________________________________________________ 
 
 
GINA      Global Initiative for Asthma 
OMS     Organización Mundial de la Salud 
IgE     Inmunoglobulina E 
FcRI     Receptor de alta afinidad de IgE 
MLVA     Músculo liso de las vías aéreas 
MEC     Matriz extracelular 
Na+     Ion sodio 
Ca2+     Ion calcio 
[Ca2+]i     Concentraciones intracelulares del ion calcio 
VOCC     Canales de calcio operados por voltaje 
GPCR     Receptores de calcio acoplados a proteína G 
GTP     Guanosina trifosfato 
PLC-     Fosfolipasa C, isotipo  
PIP2     Fosfatidilinositol 4,5-bifosfato 
IP3     Inositol 1,4,5-trifosfato 
DAG     Diacilglicerol 
IP3R     Receptor de IP3 
RyR     Receptor de rianodina 
SOCC     Canales de calcio operados por almacén 
STIM1     Molécula de interacción estromal 1 
Orai1     Proteína canal de calcio activada por la liberación de calcio  
ATP     Adenosina trifosfato      
MLCK     Cinasa de la cadena ligera de miosina 
MLCP     Fosfatasa de la cadena ligera de miosina 
Cav-1     Caveolina-1 
SERCA     ATPasa de calcio del retículo sarcoplásmico 
NCX     Intercambiador sodio/calcio 
TRPC1     Receptor canal transitorio 1 
ILK     Cinasa ligada a integrina 
PP1c     Subunidad catalítica de fosfatasa tipo 1, isoforma  
MYPT1     Subunidad 1 de la fosfatasa de miosina 
ROK     Cinasa de Rho 
MYPT1K    Cinasa de MYPT1 
CPI17     Inhibidor de la fosfatasa 1 potenciada por cinasa C  
PKC     Proteína cinasa C 
PCR     Reacción en cadena de la Polimerasa 
RT-PCR     Reacción en cadena de la Polimerasa en tiempo real 
RACE-PCR    Rápida amplificación de DNA complementario terminal 
mRNA     Ácido ribonucleico mensajero 
RhoA     Proteína A GTPasa pequeña de la familia de Rho 
RhoGEF     Factores de intercambio de nucleótidos de guanina 
 
 
 
ii 
 
 
RESÚMEN 
_______________________________________________________________________________  
 
En términos generales, la remodelación es un concepto que se usa para describir modificaciones, 
alteraciones o transformaciones que suceden al nivel de la estructura de un órgano o tejido 
incluyendo sus componentes moleculares. En el asma, se ha descrito al proceso de remodelación 
como cambios estructurales y moleculares de las vías aéreas. En particular, se ha enfatizado en el 
estudio de la remodelación molecular de las adhesiones focales del músculo liso debido a que este 
tejido es el principal protagonista de la fisiopatología del asma. Esta remodelación incluye una 
reorganización espacio-temporal de las moléculas de adhesión y receptores, como las Integrinas, y 
adaptadores, como la caveolina, talina y paxilina. No obstante, se ha reconocido que el papel de la 
remodelación tanto estructural como molecular en la fisiopatología del asma es poco claro. En el 
presente estudio se evaluó el efecto de la remodelación del músculo liso en un modelo de asma 
alérgica en el cobayo. Para esto, se utilizaron cobayos sensibilizados y retados con antígeno 
(ovoalbúmina). El grupo de cobayos control recibió solución salina en vez del antígeno. Los retos 
antigénicos administrados cada diez días indujeron broncoobstrucción e hiperreactividad, 
proliferación de células caliciformes en epitelio bronquial e hiperplasia de músculo liso vascular en 
el tercer reto antigénico. En el músculo liso vascular la hiperplasia se acompañó de la disminución 
en la expresión de caspasa-3. Paradójicamente, el músculo liso de las vías aéreas no mostró 
hiperplasia ni hipertrofia, ni se observó la fibrosis de la vía aérea característica de la remodelación 
de este tejido. A nivel molecular, el análisis de citometría de flujo en miocitos traqueales del modelo 
de asma, mostró un mayor número de células positivas a caveolina-1 comparado con el grupo 
control. Este incremento en la expresión de caveolina-1 también fue demostrado por western blot. 
La obstrucción de las vías aéreas y la hiperreactividad correlacionó con el incremento en la expresión 
de caveolina-1 en los miocitos (P < 0.05; r = 0.69 y -0.52, respectivamente). Una proteína asociada 
a caveolina-1, la subunidad 1 de integrina, se observó, mediante estudios de inmunohistoquímica 
-  1  - 
 
 
y microscopía electrónica, compartiendo la misma distribución en estructuras en las vías aéreas 
incluyendo zonas de la lámina propia. Un análisis posterior, también por microscopía electrónica, 
mostró que la subunidad 1 de integrina contenía tanto los dominios citosólicos y extracelulares 
distribuidos en la lámina propia. Mediante la técnica de western blot, se detectaron varios 
polipéptidos con pesos moleculares similares que fueron identificados por anticuerpos específicos 
contra los dominios citosólico y extracelular en miocitos de las vías aéreas y en el tejido conectivo 
que rodea la banda del músculo liso sin mostrar cambios en el peso molecular entre los grupos 
control y modelo de asma. En el músculo liso traqueal, estudios en citometría de flujo y western 
blot mostraron que la expresión de los dominios citosólico y extracelular de la subunidad 1 de 
integrina también fue similar en ambos grupos. No obstante, se observó un incremento en el mRNA 
de ITGB1 (gen de la subunidad 1 de integrina) en miocitos traqueales en el grupo de cobayos del 
modelo de asma, aunque el análisis de RACE-PCR de ITGB1 en miocitos traqueales no mostró 
variantes por empalme alternativo. Los niveles de expresión de proteínas asociadas a la subunidad 
1 de integrina como la cinasa ligada a integrina (ILK) y la paxilina disminuyeron en los cobayos del 
modelo de asma, pero no los de talina ni -actina. Asimismo, los niveles de una proteína asociada a 
ILK, la subunidad 1 de la fosfatasa de la miosina (MYPT1) fosforilada en la Thr696, se incrementaron 
en los cobayos del modelo de asma. Conclusión, aunque se observó remodelación epitelial en la vía 
aérea y estructural en el músculo liso vascular, no se observaron cambios en la estructura del 
músculo liso de la vía aérea. No obstante, a nivel molecular, el músculo liso de las vías aéreas mostró 
cambios en la expresión de caveolina-1, ILK, paxilina y MYPT1. Por otro lado, la subunidad 1 de 
integrina es secretada en la pared de las vías aéreas de cobayos, aunque la secreción no cambia en 
el modelo de asma en comparación con los controles. Sin embargo, parece estar asociada a una 
alteración en el ensamblaje de proteínas en las adhesiones focales como ILK y paxilina sugiriendo 
un proceso de remodelación molecular de estas adhesiones focales.  
-  2  - 
 
 
ABSTRACT  
_______________________________________________________________________________ 
 
In general terms, remodeling is a concept that is used to describe modifications, alterations or 
transformations that occur at the level of the structure of an organ or tissue including its molecular 
components. In asthma, the remodeling process has been described as structural and molecular 
changes of the airways. It has been emphasized in the study of the molecular remodeling of the 
focal adhesions of smooth muscle because this tissue is the main protagonist of the pathophysiology 
of asthma. This remodeling includes a space-time reorganization of adhesion molecules and 
receptors, such as Integrin’s, and adapters, such as Caveolin, Talina and Paxilin. However, it has been 
recognized that the role of structural and molecular remodeling in the pathophysiology of asthma 
is unclear. In the present study we evaluated the effect of smooth muscle remodeling on a model 
of allergic asthma in the guinea pig. For this, guinea pigs sensitized and challenged with antigen 
(ovalbumin) were used. The guinea pig control group received saline instead of the antigen. 
Antigenic challenges administered every ten days induced broncho obstruction and 
hyperresponsiveness, proliferation of goblet cells in bronchial epithelium and vascular smooth 
muscle hyperplasia in the third antigenic challenge. In vascular smooth muscle hyperplasia was 
accompanied by a decrease in Caspase-3 expression. Paradoxically, smooth muscle of the airways 
did not show hyperplasia or hypertrophy, nor was airway fibrosis characteristic of the remodeling 
of this tissue. At the molecular level, flow cytometry analysis in tracheal myocytes of the asthma 
model group showed a high number of cells positive to Caveolina-1 compared to the control group. 
This increase was demonstrated by western blot. Airway obstruction and hyperresponsiveness 
correlated with increased expression of Caveolin-1 in myocytes (P <0.05, r = 0.69 and -0.52, 
respectively). A protein associated with Caveolina-1, the integrin 1 subunit, was observed, through 
immunohistochemical studies and immunoelectronic microscopy, to share the same distribution in 
structures in the airways including non-cellular zones of the lamina propria. Further analysis showed 
-  3  - 
 
 
that the integrin 1 subunit contained both the cytosolic and extracellular domains distributed in 
the non-celluar regions. Several polypeptides with similar molecular weights were detected by 
antibodies against the cytosolic and extracellular domains in myocytes of the airways and in the 
connective tissue surrounding the smooth muscle band without showing changes between the 
control and asthma models. In the tracheal smooth muscle, studies in flow cytometry and western 
blot showed that the expression of the cytosolic and extracellular domains of the integrin 1 subunit 
was also similar in both groups. However, an increase in ITGB1 mRNA was observed in tracheal 
myocytes in the guinea pig group of the asthma model, although the RACE-PCR analysis of ITGB1 in 
tracheal myocytes did not show alternative splicing variants. Protein expression levels associated 
with the integrin 1 subunit such as integrin linked kinase (ILK) and Paxilin decreased in the guinea 
pigs of the asthma model, but not those of Talina or -Actin. Similarly, levels of an ILK-associated 
protein, myosin phosphatase subunit 1 (MYPT1) phosphorylated in Thr696, were increased in guinea 
pigs in the asthma model. Our data suggest that, although was observed epithelial remodeling in 
the airway and structural epithelial remodeling in vascular smooth muscle, no changes were 
observed in smooth muscle structure of the airway. However, at the molecular level, smooth muscle 
of the airways showed changes in the expression of Caveolina-1, ILK, Paxilin and MYPT1. On the 
other hand, the integrin 1 subunit appears to be secreted into the wall of the guinea-pig airways, 
although this secretion does not change in the asthma model, but appears to be associated with an 
alteration in the protein assemblage at focal adhesions as ILK and Paxilin suggesting a process of 
molecular remodeling of these focal adhesions. 
 
 
 
 
 
 
 
 
-  4  - 
 
 
INTRODUCCIÓN 
________________________________________________________________________________ 
 
VÍAS AÉREAS 
La principal función de las vías aéreas es llevar el oxígeno hasta la región de intercambio de 
gases del pulmón donde el oxígeno difunde a través de las paredes de los alveolos para llegar a la 
sangre que circula por los capilares alveolares (David A. and Wagner G., 2012). Además, las vías 
aéreas tienen como función calentar el aire, humectarlo y limpiarlo de impurezas para mantener la 
esterilidad y prevenir infecciones, así como sus consecuencias adversas (Welsch U., 2008). Las vías 
aéreas son muy susceptibles a daño ante humo de tabaco, polvo industrial, así como patógenos 
específicos que atacan o destruyen sus mecanismos de defensa y causan una alteración de su 
función. El aparato respiratorio inicia desde de la nariz y la boca, a través de las vías aéreas 
conductoras situadas dentro de la cabeza y el tórax, hasta los alveolos, donde tiene lugar el 
intercambio respiratorio de gases entre los alveolos y la sangre capilar que fluye a su alrededor 
(David A. and Wagner G., 2012). 
 Las vías aéreas están compuestas de tubos ramificados que se vuelven más estrechos, más 
cortos y más numerosos a medida que penetran más profundamente en el pulmón (West J., 2002). 
En base a su estructura, las vías aéreas se clasifican en superiores e inferiores. Las vías superiores 
están conformadas por las cavidades nasales, senos paranasales, faringe y laringe, mientras que las 
vías inferiores están conformadas por tráquea, bronquios, bronquiolos y bronquiolos respiratorios 
(Figura 1). En base a su histología la pared de la tráquea y bronquios está compuesta por un epitelio 
seudoestratificado cilíndrico ciliado con células caliciformes, glándulas subepiteliales, tejido 
conectivo, músculo liso y placas de cartílago. Por su parte, los bronquiolos se caracterizan por 
presentar un epitelio cuboidal pseudoestratificado ciliado con células clara, tejido conectivo, 
músculo liso con ausencia de glándulas y cartílago (West J., 2002). Como se muestra en la Figura 2, 
-  5  - 
 
 
indicado por las flechas, todos estos componentes de la pared de las vías aéreas van disminuyendo 
conforme éstos penetran hacia las zonas distales.  
Las vías aéreas son susceptibles de presentar enfermedades. En primer lugar a nivel mundial 
se encuentra el asma, en segundo lugar el EPOC, en tercer lugar las infecciones respiratorias agudas, 
en cuarto lugar la tuberculosis y finalmente, en quinto lugar, el cáncer de pulmón según lo reportado 
en el Foro de Sociedades Internacionales de Enfermedades Respiratorias en el 2014 (e-ISBN: 978-1-
84984-057-6). 
 
ASMA 
La palabra “asma” es una palabra griega utilizada por Hipócrates para designar síntomas como 
jadeo o falta de aliento, por lo que cualquier individuo con esta característica era clasificado como 
asmático. El concepto fue modificado a finales del siglo XIX, cuando se definió al asma como “disnea 
paroxística de un carácter peculiar con intervalos de respiración sana entre los ataques” (Holgate 
S., 2010). En la actualidad el asma se define como una enfermedad heterogénea caracterizada por 
inflamación crónica de las vías aéreas y la historia de los síntomas respiratorios tales como 
sibilancias, dificultad para respirar, opresión en el pecho y tos que varía a través del tiempo en 
intensidad con una limitación del flujo de aire espiratorio (Kim H. et al., 2010; Lloyd C. and Hessel 
M., 2010; GINA 2015). 
 
 
 
 
 
 
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Figura 1. Estructura de las vías aéreas en humano. Las vías aéreas se dividen en superiores e inferiores. Las 
superiores integran desde las fosas nasales hasta la laringe, mientras que las inferiores desde la tráquea hasta 
los bronquiolos. Modificado de https://in.pinterest.com/pin/428264245788766309/ 
 
 
 
  
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2. Estructura de la pared de las vías aéreas. Las flechas indican hasta que estructura de la vía aérea se 
presenta cada componente, desde epitelio hasta las fibras elásticas. Modificado de 
http://myanatomymentor.com/2014/09/ 
 
 
 
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EPIDEMIOLOGÍA DEL ASMA 
En la actualidad el asma es un problema de salud pública mundial ya que afecta entre 1 al 
18% de la población de diferentes países (GINA 2015). Según la OMS, la tasa de mortalidad del asma 
es relativamente baja en comparación con otras enfermedades crónicas. En 2005 fallecieron 
255,000 personas por este padecimiento. La OMS ha calculado que en la actualidad hay 235 
millones de pacientes con asma y afecta a 30 % de los niños y 10 % de los adultos del mundo, lo que 
produce una importante carga social y económica, ausentismo escolar y laboral, limitación en las 
actividades físicas y un mayor uso de los servicios de salud. Además, el asma está presente en todos 
los países, independientemente de su grado de desarrollo. No obstante, más del 80% de las muertes 
por asma tienen lugar en países de ingresos bajos y medios-bajos (OMS, 2016). 
En México, el asma constituía la decimotercera causa de morbilidad en 2008. El análisis de la 
morbilidad por grupo de edad, de acuerdo con los casos notificados a la Secretaría de Salud en ese 
mismo año, muestra que la tasa más alta la tiene el grupo de edad de 0 a 4 años (732.6 casos por 
100,000 habitantes), seguida por el grupo de 5 a 9 años (540.8 casos por 100,000 habitantes). Los 
grupos de edad con menos tasa son el de 15 a 19 años (142.1 casos por 100,000 habitantes) y el de 
20 a 24 años (136.9 casos por 100,000 habitantes). A partir de esta edad se incrementa la morbilidad 
hasta alcanzar la tasa de 215.7 casos por 100,000 habitantes en el grupo de edad de 60 a 64 años. 
En el grupo de 65 y más años, la tasa es de 119.4 casos por 100,000 habitantes. En nuestro país, a 
pesar de que la tasa de mortalidad por asma es baja (<1.5 por 100,000 habitantes en 2006), la 
morbilidad es tan alta que ocasiona una gran carga a los servicios de salud (morbilidad promedio 
2003-2009 de 283.3 casos por 100 000 habitantes). Con base en estas cifras se considera que el 
asma es una causa importante de enfermedad en la población mexicana de adultos y que no ha sido 
estudiada extensamente (García-Sancho C. et al., 2012). 
 
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FENOTIPOS DEL ASMA 
El asma es una enfermedad heterogénea con diferentes procesos fisiológicos y patológicos 
para el desarrollo de ésta. Características demográficas, clínicas y/o fisiopatológicas se han 
agrupado para la formación de los fenotipos de asma (GINA 2015; Ying S. et al., 2006; Kim H. et al., 
2010; Shin Y. et al., 2009). Muchos fenotipos se han identificado, algunos de los más comunes 
incluyen:  
- Asma alérgica. Éste es el fenotipo de asma más fácilmente reconocible y a menudo inicia 
en la infancia y está asociada a una historia de familiares con enfermedades alérgicas. El 
examen de esputo inducido a los pacientes revela inflamación eosinofílica de las vías 
respiratorias. Los pacientes con este fenotipo de asma por lo general responden bien al 
tratamiento de corticoesteroides inhalado.   
- Asma no alérgica. Algunos individuos presentan un tipo de asma que no está asociado a 
un proceso alérgico. El perfil celular del esputo de estos pacientes puede ser neutrofílico, 
eosinofílico o contener unas pocas células inflamatorias. Los pacientes con asma no 
alérgica responden menos al tratamiento de corticoesteroide inhalado. 
- Asma tardía. Algunos adultos particularmente mujeres presentan este tipo de asma en 
las primeras etapas de la vida adulta. Estos pacientes tienden a ser no alérgicos y 
requieren altas dosis de corticoesteroides inhalados y son relativamente refractaros al 
tratamiento con corticoesteroides.  
- Asma con limitación del flujo de aire fijo. Algunos pacientes con asma de larga duración 
desarrollan una limitación al flujo de aire fijo que se piensa que es debido a la 
remodelación de la pared las vías aéreas. 
- Asma con obesidad. Algunos pacientes obesos con asma tiene síntomas respiratorios 
evidentes y poca inflamación de las vías aéreas de tipo eosinofílica. 
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ASMA ALÉRGICA  
La alergia es la respuesta del sistema inmune a estímulos externos en individuos 
sensibilizados. Por esta razón se conoce al asma alérgica como extrínseca. El proceso alérgico 
asociado a este tipo de asma se inicia cuando un alérgeno ingresa a las vías aéreas donde se endocita 
y procesa por células presentadoras de antígenos profesionales como las células dendríticas y 
macrófagos; aunque los basófilos, eosinófilos y mastocitos también pueden llevar a cabo esta 
función (Kim H. et al., 2010). Los fragmentos del alérgeno son presentados mediante el MHC-II a los 
linfocitos T vírgenes que se activan, maduran y proliferan como linfocitos T cooperadores del tipo 
Th2 para luego interaccionar con los linfocitos B. Estos últimos son los productores de anticuerpos 
IgE específicos para el alérgeno. Cuando la IgE se une a su receptor de alta afinidad FcRI que se 
encuentra en mastocitos y basófilos, el individuo se ha sensibilizado al alérgeno (Vennera M. and 
Picado C., 2012). La expresión del asma es un evento posterior que se inicia cuando aparece de 
nuevo el alérgeno y es reconocido por la IgE que se encuentra en las células sensibilizadas, es decir, 
cuando hay una re-exposición al mismo alérgeno. Estas células liberan diferentes tipos de 
mediadores como la histamina, generando tanto respuestas inflamatorias como síntomas 
respiratorios derivados de la obstrucción de las vías aéreas (Figura 3). La hipersecreción de moco, 
edema y contracción del músculo liso de las vías aéreas son los principales mecanismos que inducen 
la obstrucción de las vías aéreas durante una exacerbación producida por el alérgeno. Además, un 
incremento en el depósito de fibras de colágena y cambios estructurales de las vías aéreas, proceso 
conocido como remodelación estructural, también contribuye a la obstrucción de las vías aéreas 
(Vennera M. and Picado C., 2012).  
 
 
 
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Figura 3. Mecanismos inmunológicos en el asma alérgica. Tomado de Vennera M. and Picado C. (2012). 
 
REMODELACIÓN ESTRUCTURAL DE LAS VÍAS AÉREAS 
            Una característica adicional del asma son los cambios estructurales de las vías aéreas, que en 
conjunto se denominan como remodelación estructural de las vías aéreas (Figura 4). Se ha 
propuesto que la remodelación estructural de las vías aéreas resulta en una función pulmonar 
deficiente que es caracterizada por engrosamiento subepitelial por el depósito de colágena, 
descamación epitelial con metaplasia de células caliciformes, angiogénesis, alteraciones en los 
componentes de la matriz extracelular tales como colágenas, proteoglicanos y glicoproteínas en la 
pared de las vías aéreas y un incremento en la masa del músculo liso de las vías aéreas (Wiparat M., 
2014). Desde el punto de vista funcional, el principal papel del músculo liso de las vías aéreas es la 
regulación del tono de las vías aéreas a través de un balance entre la contracción y la dilatación en 
respuesta a factores circulantes o locales. De acuerdo con esto, los factores que producen o 
incrementan la broncoconstricción con un daño repetitivo de mecanismos de dilatación pueden 
resultar en un tono de las vías aéreas incrementado que es típico del asma. Además, cambios 
estructurales inducidos por factores intrínsecos pueden resultar en reducir el lumen de las vías 
aéreas, llevando a un proceso de obstrucción de mismas (Prakash Y., 2013). 
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Figura 4. Cambios estructurales en la pared de las vías aéreas. MLVA: Músculo liso de las vías aéreas. MEC: 
Matriz extracelular. Tomado de Prakash Y. (2013). 
 
 
OBSTRUCCIÓN DE LAS VÍAS AÉREAS 
           La obstrucción del flujo de aire es la principal alteración funcional causante del asma y da 
lugar a la crisis o exacerbación asmática. Durante la exacerbación asmática, la obstrucción puede 
ocurrir en cualquier nivel del árbol traqueo-bronquial, sin embargo, las vías aéreas periféricas son 
el principal sitio de obstrucción (Burgel P. et al, 2009). La obstrucción es ocasionada por la 
disminución del calibre de las vías aéreas, especialmente durante la espiración y las principales 
causas son: 1) formación de edema, 2) hipersecreción de moco, 3) inflamación y 4) contracción del 
músculo liso, que, hasta el momento, es la principal causa para que se desarrolle la obstrucción 
(GINA, 2015; Vargas Becerra M., 2009). Durante la exacerbación asmática, la obstrucción del flujo 
de aire suele ser episódica y generalmente es reversible de manera espontánea o con tratamiento. 
Sin embargo, en algunos pacientes la obstrucción se vuelve permanente debido al engrosamiento 
de la pared traqueo-bronquial como resultado de la remodelación estructural y la inflamación 
crónica, lo que posiblemente contribuye al desarrollo de hiperreactividad de las vías aéreas 
(Yamauchi K., and Inoue H. 2007).  
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HIPERREACTIVIDAD DE LAS VÍAS AÉREAS 
            La excesiva respuesta contráctil del músculo liso de las vías aéreas en el asma resulta en una 
broncoconstricción desordenada y una obstrucción del flujo de aire en respuesta a relativamente 
poca provocación. A este fenómeno se le conoce como hiperreactividad de las vías aéreas y es una 
característica fisiológica típica del asma. Una gran variedad de estímulos físicos y químicos pueden 
llevar hacia la broncoconstricción. Por ejemplo agonistas colinérgicos, histamina, leucotrienos, 
prostaglandinas, endotoxinas, alérgenos, ejercicio, incremento en la masa del musculo liso de las 
vías aéreas  e incremento del tono vagal. Los agonistas contráctiles como metacolina pueden activar 
directamente receptores en células del músculo liso de las vías aéreas, lo que inicia la contracción 
de los miocitos y una consecuente broncoconstricción. Esta es la base teórica de exámenes de reto 
con metacolina usados para diagnosticar el asma. Los individuos que tienen asma, suelen responder 
mas rápido a los retos de metacolina en comparación con los individuos sanos. Actualmente, se 
sabe que hay contribución de mecanismos que incluyen un incremento en la disponibilidad de 
mediadores contráctiles como la histamina proveniente de mastocitos en las vías aéreas de 
asmáticos, además de un incremento de la masa del músculo liso de las vías aéreas (Doeing C. and 
Solway J., 2013). Otra explicación para la hiperreactividad de las vías aéreas incluye el aumento en 
el calcio libre intracelular que a su vez incrementa la contractilidad celular del músculo liso de las 
vías aéreas (Hakonarson H. and Grunstein M., 1998), así como la activación de la vía de la cinasa de 
Rho (Schaafsma D. et al., 2008; Chiba Y. et al., 2010). El incremento en los niveles de proteína de 
RhoA ha sido identificado en modelos animales de asma alérgica (Chiba Y. et al., 1999; Chiba Y. et 
al., 2005; Schaafsma D. et al., 2004) y la inhibición de la vía de la cinasa de Rho-RhoA pueden 
prevenir o revertir la hiperreactividad de las vías aéreas (Schaafsma D. et al., 2006; Schaafsma D. et 
al., 2008). 
 
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MÚSCULO LISO DE LAS VÍAS AÉREAS 
            El músculo liso de las vías aéreas participa en varios procesos patológicos del asma. La 
contracción exagerada de este tejido es el principal mecanismo para que se lleve a cabo la 
hiperreactividad de las vías aéreas, además de participar en la perpetuación de la inflamación y en 
la remodelación de las vías aéreas (Moore C. et al., 2010; Cockroft D. and Davis B., 2006; Pelaia G. 
et al., 2008). Las propiedades mecánicas del músculo liso de las vías aéreas son fundamentales para 
la regulación de sus funciones, particularmente en el caso del asma, es importante entender el 
proceso de contracción del músculo liso. 
 
CONTRACCIÓN DEL MÚSCULO LISO DE LAS VÍAS AÉREAS 
           La contracción del músculo depende del incremento de la concentración de iones de Calcio 
en el citoplasma ([Ca2+]i). El mecanismo de contracción resulta de la despolarización de la 
membrana plasmática llevando a un flujo interno de Ca2+ por medio de la vía de canales de Ca2+ 
dependientes de voltaje. Se ha visto que el potencial de membrana de las células del músculo liso 
de las vías aéreas oscila espontáneamente, generando las llamadas ondas lentas (Thirstrup S., 
2000). Las ondas lentas generalmente no llegan a un potencial de acción por una rectificación muy 
fuerte que contrarresta cualquier tendencia de despolarización. Estas corrientes rectificantes están 
mediadas por la apertura de canales de gran conductancia de Ca2+ y especialmente por canales de 
Potasio rectificadores dependientes de voltaje, que son responsables de la repolarización e 
hiperpolarización, lo que confiere una gran estabilidad eléctrica a esta célula muscular (Figura 5A) 
(Pelaia G. et al, 2002). La generación de potenciales de acción en espiga y la consecuente activación 
de los canales de calcio operados por voltaje (VOCC) pueden ocurrir en estas células musculares 
lisas sólo cuando se bloquean experimentalmente los rectificadores de potasio. De hecho, se ha 
observado que el Ca2+ que proviene de los reservorios intracelulares es el principal contribuidor 
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para el inicio de la contracción del músculo liso de las vías aéreas (An S. et al., 2007; Pelaia G. et al, 
2008; Kim H. et al., 2008).  
           En el músculo liso de las vías aéreas existen múltiples vías para el incremento de la [Ca2+]i 
(Figura 5B). Por ejemplo, el incremento de [Ca2+]i por la acción de la acetilcolina (Liu X. and Farley 
J., 1996; Pérez J. and Sanderson M., 2005), activa receptores acoplados a proteínas G (GPCR) que 
están asociadas a Gq. La proteína Gq cargada con GTP activa a su efector río abajo, la fosfolipasa 
C- (PLC, que a su vez hidroliza al fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2) para producir inositol 1,4,5-
trifosfato (IP3) y 1,2 diacilglicerol (DAG). El IP3 se une a los receptores de IP3 (IP3R) del retículo 
sarcoplásmico para liberar al Ca2+ hacia el citosol (Bergner A. and Sanderson M., 2002; Kannan M. 
et al., 1997). Otro tipo de receptores del retículo sarcoplásmico, los de rianodina (RyR), que son 
activados por el incremento de [Ca2+]i. Además, se ha visto que la entrada de Ca2+ a través de canales 
de Ca2+ tipo L permite que este ion se una a los RyR, liberando Ca2+ y amplificando la señal. A este 
mecanismo se le ha llamado liberación de Ca2+ inducido por Ca2+ (Figura 5B) (Dai J. et al., 2006; Kip 
S. et al., 2006). En el músculo liso de las vías aéreas la apertura de los VOCC por la estimulación con 
agonistas no despolariza a la célula lo suficiente a la célula (Janssen L., 2002), por lo que existen 
otros mecanismos que pueden contribuir al incremento de [Ca2+]i. La entrada de Ca2+ a la célula 
puede ocurrir también como resultado del vaciado de los reservorios internos mediante canales de 
Ca2+ operados por almacén (SOCC) (Parekh A. and Putney J., 2005). El mecanismo que liga la 
disminución de Ca2+ en el retículo sarcoplásmico para la apertura de los SOCC no es claro, pero 
recientes estudios han identificado un sensor de Ca2+, el STIM1 que se encuentra en la membrana 
del retículo sarcoplásmico y tiene interacción con una proteína o canal de la membrana plasmática 
conocida como Orai1 (Parekh A., 2006; Smyth J. et al., 2006). 
           La entrada de Ca2+ puede también estar influenciado por agonistas de la contracción iniciando 
tanto la activación de canales operados por receptor o por segundos mensajeros (Figura 5B). 
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Además, la participación de corrientes catiónicas no específicas dependientes de Ca2+ pueden llevar 
a un incremento de Sodio intracelular, revirtiendo al intercambiador de Sodio/Calcio para 
incrementar la entrada de Ca2+ (Hirota S. et al., 2007). Por todo lo anterior, las células del músculo 
liso de las vías aéreas cuentan con varias vías de Ca2+ para asegurar la movilización de este ion 
dentro de la célula y poder iniciar el proceso de contracción muscular (Figura 5B). 
           Una vez que el Ca2+ incrementa su concentración dentro de la célula, se une a la calmodulina. 
Esta unión, incrementa la afinidad por la subunidad catalítica de la cinasa de la cadena ligera de 
miosina. La formación de este complejo permite la fosforilación en la serina 19 de la ATPasa de 
miosina, activándola y permitiendo la interacción de los filamentos de actina y miosina para dar 
inicio al desarrollo de la contracción muscular. Una vez que el Ca2+ disminuye, la cinasa de la cadena 
ligera de miosina se inactiva, la miosina se desfosforila y el músculo liso se relaja (Gunst S. and Tang 
D., 2000; Rodger I., 1985). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5. Vías de movilización de Ca2+ para el desarrollo de la contracción del músculo liso de las vías aéreas. 
La célula muscular lisa de las vías aéreas tiene una gran estabilidad eléctrica dado que posee en su membrana 
plasmática rectificadores de K+ que no permiten la generación de un potencial de acción (A). La entrada de 
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Ca2+ a la célula puede iniciar por dos vías independientes. Una vía es por la activación de proteínas G a través 
de receptores acoplados a proteínas G y la otra vía por la activación de diferentes canales de Ca2+ que se 
encuentran en la membrana plasmática del miocito. La liberación de Ca2+ del retículo sarcoplásmico es por la 
activación de los receptores de IP3 y de rianodina. Este último receptor se activa por el Ca2+ que entra a la 
célula y a su vez permite la liberación de Ca2+ del almacén, a lo que se conoce como incremento de Ca2+ 
inducido por Ca2+. STIM1 se encuentra en la membrana del retículo sarcoplásmico y es el sensor de los niveles 
de Ca2+. STIM1 se comunica con Orai 1, que se encuentra en la membrana plasmática del miocito. Una vez 
que las concentraciones de Ca2+ están elevadas en el citosol, inicia el proceso de contracción del músculo liso 
de las vías aéreas.    
 
 
MECANISMO QUE SENSIBILIZA A LA MAQUINARIA CONTRÁCTIL DEL MÚSCULO LISO  
          Un fenómeno interesante de la contracción del músculo liso de las vías aéreas es que su inicio 
depende de un incremento importante de la [Ca2+]i, pero este incremento es siempre transitorio, 
pues la contracción se sostiene hasta por mucho tiempo a bajas [Ca2+]i, esto es, a niveles solo por 
arriba de la [Ca2+]i basal (Somlyo A. and Somlyo A., 2003) (Figura 6A). En estas condiciones se ha 
sugerido que existen mecanismos que sensibilizan la maquinaria contráctil al Ca2+ para sostener la 
contracción (Murray R. et al., 1993).  
            Por ejemplo, las células del músculo liso tienen gran cantidad de interacciones de 
entrecruzamiento de actina-miosina durante la contracción muscular. Esta actividad de 
entrecruzamiento depende del estado de fosforilación de la cadena ligera reguladora de la miosina, 
la cual, está determinada por las actividades antagonistas de la cinasa de la cadena ligera de la 
miosina (MLCK) y de la fosfatasa de la cadena ligera de la miosina (MLCP) (Figura 6B). La actividad 
de la MLCK está generalmente en función de la [Ca2+]i y la actividad de la MLCP depende de una 
variedad de cinasas y fosfatasas, y su función es independiente de Ca2+ (An S. et al., 2007). En este 
sentido, la sensibilización al Ca2+ podría estar relacionada con la regulación negativa de la MLCP, es 
decir, a los diferentes sitios de fosforilación que inhiben a la subunidad reguladora de la MLCP, lo 
cual podría imposibilitar a la MLCP para cumplir la función de desfosforilar a la cadena reguladora 
de la miosina generando una contracción muscular constante (Figura 6B).  
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Figura 6. Mecanismo que sensibiliza a la maquinaria contráctil del músculo liso. La estimulación con un 
agonista contráctil al músculo liso de las vías aéreas induce que las concentraciones de Ca2+ intracelular [Ca2+]i 
incrementen, aunque rápidamente bajan a un patrón estable tan sólo un poco mayor a los niveles basales de 
Ca2+. La contracción del músculo liso de las vías aéreas permanece constante aun cuando las [Ca2+]i se 
mantienen bajas (A). Un mecanismo que puede explicar la sensibilización al Ca2+ es la inhibición de la fosfatasa 
de la cadena ligera de la miosina (MLCP) (B). P = fosforilación. 
 
            Actualmente existe la propuesta que aspectos estructurales también pueden contribuir al 
desarrollo de la sensibilización al Ca2+ como el reciente papel que tienen las caveolas y sus proteínas 
regulatorias caveolinas y cavinas (Prakash Y., 2013). 
 
CAVEOLAS 
          Las caveolas son invaginaciones de 50-60 nm en forma de matraz y son características de las 
membranas plasmáticas en muchos tipos celulares, incluyendo adipocitos, células endoteliales y 
células musculares. Las caveolas generalmente muestran una distribución celular desigual y las 
proteínas asociadas a las caveolas tienen distintos perfiles de expresión, sugiriendo que poseen 
funciones altamente especializadas. Varios estudios han revelado una gran diversidad de funciones 
para la caveola, incluyendo el recambio de lípidos y la organización de la membrana plasmática, 
dando una plataforma para la regulación de moléculas de señalización y enzimas (Parton R. and del 
Pozo M., 2013). Las caveolas fueron observadas por microscopía electrónica en los años 50’s, 
mientras que su principal componente, la caveolina-1 (Cav-1) fue identificada 40 años después. 
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Posteriormente se identificaron a caveolina-2 y caveolina-3 que es específica del músculo. Por 
último, en la década pasada, se identificó un segundo componente abundante estructural y esencial 
de las caveolas, las proteínas de la familia de las cavinas (Kovtun O., 2015). 
           En muchos músculos lisos, la caveola se encuentra en una cercana proximidad al retículo 
sarcoplásmico, lo cual puede ser de gran importancia funcional dado el papel principal de esta 
estructura en la regulación de las concentraciones de Ca2+ intracelular. Además, la periferia del 
retículo sarcoplásmico puede formar una red continua tubular con la membrana nuclear y después 
envolver completamente a la caveola (Taggart M., 2001). Estudios de microscopía 
inmunoelectrónica localizaron tanto a la ATPasa de Ca2+ como al receptor IP3 en las caveolas del 
músculo liso (Fujimoto T. et al., 1992). El fraccionamiento subcelular y la inmunoprecipitación de 
células de músculo liso cultivadas, sugiere una acumulación de receptores para agentes contráctiles 
en las caveolas (De Weerd W. and Leeb-Lundberg L., 1997). Además, la microscopía de luz de alta 
resolución sugiere que la actividad del intercambiador de Na+/Ca2+, está cercanamente influenciado 
por el Ca2+ liberado del retículo sarcoplásmico, puede ser enriquecido en regiones caveolares de 
membranas de células de músculo liso (Moore E. et al., 1993). Con esto, la residencia de las caveolas 
adyacentes al retículo sarcoplásmico, separados por distancias de 10-40 nm, junto con la 
localización caveolar de proteínas importantes para la movilización y transporte de Ca2+, apoya la 
hipótesis que estas estructuras plasmalemales pueden estar influenciando en la regulación de la 
homeostasis del Ca2+ en el músculo liso (Isshiki M., 1998) (Figura 7). Por todo lo anterior, la caveola 
podría ser una región plasmalemal involucrada en la integración de señales extracelulares 
contráctiles y efectores intracelulares en el músculo liso. Tal coordinación localizada en la 
membrana de los eventos de transducción de señales permitiría un mecanismo eficiente para el 
acople de excitación-contracción del músculo liso (Taggart M., 2001). 
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            De las tres isoformas de caveolina, Cav-1 podría facilitar el incremento de las concentraciones 
de Ca2+ intracelular y por tanto de las respuestas contráctiles ante un evento inflamatorio (Sathish 
V. et al, 2011). Por el contrario, una expresión reducida de Cav-1 podría facilitar la proliferación del 
músculo liso de las vías aéreas (Gosens R. et al., 2008). Por lo anterior, el posible que Cav-1 
contribuya a un balance entre un fenotipo contráctil contra un fenotipo proliferativo del músculo 
liso de las vías aéreas en un contexto de inflamación, lo cual produciría cambios en las vías aéreas 
como ocurre en el asma. Además, en virtud de su capacidad para interactuar con elementos 
intracelulares del citoesqueleto, la caveola puede formar nexos o uniones entre estructuras 
intracelulares y extracelulares (Prakash Y., 2013) y con ello facilitar eventos de señalización como 
los que están involucrados con las integrinas y con las adhesiones focales (Salanueva I. et al., 2007). 
 
Figura 7. Representación espacial de la caveola y el retículo sarcoplásmico. Se observa la presencia en la 
caveola de diferentes receptores que participan en la regulación del Ca2+. GPCR, receptor acoplado a proteínas 
G; IP3, inositol 1,4,5-trifosfato; IP3R, receptor de IP3; SERCA, ATPasa de Ca2+ del retículo sarcoplásmico; NCX, 
intercambiador de Na+/Ca2+; TRPC1, receptor transitorio potencial canal 1. Tomado de Hardin C. and Vallejo 
J. (2009). 
 
ADHESIONES FOCALES 
 La dinámica de la adhesión celular a la matriz que la rodea es esencial para que ocurran 
diversos procesos celulares, incluyendo migración, morfogénesis y contracción muscular. Se han 
descrito dos estados de adhesión a la matriz. El primero es la formación de adhesiones focales 
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nacientes y el segundo es la maduración de los mismos. Las adhesiones focales nacientes entran 
rápidamente en un recambio continuo de proteínas para llegar a su estado de maduración, crecen 
en tamaño e incrementan su fuerza para el anclaje con las fibras de estrés como la actina (Geiger B. 
et al., 2009). La formación de adhesiones focales es iniciada por interacciones entre integrinas 
transmembrana y proteínas de la matriz extracelular que llevan a una acumulación dinámica de 
estructuras de proteínas que forman la adhesión focal en el lado citoplásmico de la membrana. 
Muchos factores influyen en la composición de las adhesiones focales, incluyendo eventos de 
señalización que regulan interacciones proteína-proteína involucradas en el ensamble de estos 
complejos de adhesión focal y propiedades físicas tales como rigidez de la matriz que regula la 
tensión generada por la contracción. Las proteínas reclutadas a las adhesiones focales son 
necesarias para transmitir y responder a complejos químicos y señales topográficas de la matriz 
(Gallegos L. et al., 2011).  
Las integrinas orquestan el proceso de remodelación del citoesqueleto que ocurre cuando 
las células están en movimiento (Wiesner S. et al, 2005). Hay evidencia que un proceso similar de 
ensamble de complejos de adhesión focal ocurre en respuesta a la estimulación contráctil en 
músculo liso, y que la formación de este complejo es esencial para la regulación de la polimerización 
de actina y generación de la tensión inducida por estímulo (Gunst S. and Zhang D., 2008). Proteínas 
de adhesión, tales como las integrinas, son receptores que se encuentran dentro de plataformas 
proteolipídicas en las membranas plasmáticas de las células del músculo liso. Recientemente se ha 
observado que ocurren procesos de remodelación molecular en las adhesiones focales y se ha 
asociado con procesos altamente dinámicos donde hay una reorganización de moléculas de 
adhesión, receptores y adaptadores que se relacionan directamente con la modulación de la 
estructura/función. El ensamble de estos complejos supramoleculares está continuamente 
-  21  - 
 
 
balanceado por eventos dinámicos, por adhesiones remodeladas en escalas de tiempo definidas, 
notablemente por cambios de conformaciones moleculares, etc. (Sergé A., 2016). 
 
INTEGRINAS 
                En musculo liso, las uniones de adhesión focal denimonadas “cuerpos densos asociados a 
membrana” se forman cuando en el lado citoplásmico las integrinas se unen a filamentos de actina, 
y de manera simultánea, en el espacio extracelular a la matriz extracelular (Gunst S. and Zhang D., 
2008). En estas uniones, los filamentos de actina están conectados a integrinas vía proteínas 
adaptadoras de los complejos de adhesión focal tales como -actinina, talina, paxilina, filamina, ILK 
(cinasa ligada a integrina), entre otros. Estos complejos se unen con filamentos de actina que a su 
vez se unen a la subunidad  de los heterodímeros de integrina (Critchley D., 2000). De esta forma, 
las integrinas interaccionan con cuerpos densos citosólicos que están compuestos principalmente 
de actina entrecruzada con -actinina (Gunst S. and Zhang D., 2008). 
                En años recientes se ha propuesto que los complejos de adhesión del músculo liso no son 
estructuras estáticas. Estudios en músculo liso de las vías aéreas y en células aisladas de músculo 
liso muestran que la localización de proteínas del citoesqueleto a los complejos de adhesión está 
regulado de forma dinámica durante la estimulación contráctil (Kim H. et al., 2004; Opazo S. et al., 
2004; Zhang W. and Gunst S., 2006). Diversos estudios experimentales han demostrado que la 
estimulación de la contracción produce el reclutamiento de proteínas estructurales y de 
señalización hacia la membrana celular del músculo liso, y esto estimula la asociación de proteínas 
de adhesión con la subunidad  de los heterodímeros de integrina (Kim H. et al., 2004 and Zhang 
W. and Gunst S., 2006).  
           La primera integrina descrita fue el receptor de la fibronectina (Pytela, 1985) que, junto con 
los demás miembros de esta familia, muestran la misma estructura básica: glicoproteínas 
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transmembranales constituidas por dos cadenas proteicas, o subunidades  y . De la subunidad  
se conocen hasta el momento 18 subunidades y 8 de la , que combinadas producen los 24 
heterodímeros de integrina hasta ahora conocidos.  
           Las subunidades α y  son proteínas transmembrana tipo I, es decir, contienen un gran 
dominio extracelular y un pequeño dominio citosólico con 700-1100 y 30-50 residuos de 
aminoácidos, respectivamente. Todos los dímeros de las integrinas se disocian por detergentes 
iónicos, indicando que las subunidades están unidas por interacciones no covalentes (Humphries 
M., 2000). De las 18 subunidades  conocidas, sólo 8 tienen un dominio I que contiene 
aproximadamente 200 residuos de aminoácidos y es el responsable de la unión a componentes de 
la matriz extracelular (Pasqualini R. et al., 1995; Humphries M., 2000). Generalmente hay un exceso 
de subunidad  en el retículo endoplásmico y la cantidad de subunidad  determinará la cantidad 
de receptor que puede ser transportado a la membrana plasmática. Subunidades  y  libres no se 
encuentran en la membrana plasmática (Barczyk M. et al., 2010). 
            La subunidad  de integrina tiene la capacidad de activarse por Mg2+, lo que la lleva a un 
cambio conformacional y son capaces de unirse a componentes del citoesqueleto. Por ejemplo, la 
unión de talina a esta subunidad permite un cambio conformacional para su activación, mientras 
que la unión de filamina A regula negativamente esta activación (Barczyk M. et al., 2010). Además, 
se ha observado que la subunidad  no sólo tiene capacidad para unirse a componentes del 
citoesqueleto, sino también a proteínas citosólicas que están implicadas en la regulación de vías de 
señalización como la ILK (Attwell S. et al., 2003).  
            La familia de integrinas 1 está constituida por doce heterodímeros  que incluyen de la  a  
la  y la v. Cada una constituye una molécula distinta con diferentes propiedades y 
características. Las integrinas 1 están ampliamente distribuidas y predominantemente son 
receptores de moléculas de la matriz extracelular como fibronectina, colágeno, vitronectina y 
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laminina (Takada Y. et al., 1988). Los dominios extracelular, transmembranal y citosólico de la 
subunidad 1 de integrina están codificados en un único gen, ITGB1 en humanos y el locus se localiza 
en el cromosoma 10 p11.22. En las vías aéreas la subunidad  de integrina se expresa en músculo 
liso, fibroblastos, eosinófilos y linfocitos T (Abraham W. et al., 2004; Nguyen T. et al., 2005). La 
activación de la subunidad 1 de integrina en el músculo liso de las vías aéreas por colágena 
monomérica tipo I y fibronectina regula la capacidad de diferenciación, secreción y proliferación del 
músculo (Nguyen T. et al., 2005; Peng Q. et al., 2005). Además, en un modelo de asma alérgica en 
oveja, el tratamiento con anticuerpos contra las integrinas 11 y 41 evita el desarrollo de la 
hiperreactividad de las vías aéreas (Abraham W. et al., 2004).  
 
ILK 
             La ILK es una proteína cinasa de serina/treonina que contiene repeticiones de ankirina. ILK 
Interactúa con el dominio citosólico de la subunidad 1 y 3 de integrina y regula las funciones 
celulares dependientes de integrinas (Hannigan G. et al., 1996). La ILK se acopla a integrinas y a 
factores de crecimiento para activar vías de señalización río abajo, aunque en el caso de integrinas, 
puede ser río arriba también. Estas vías de señalización llevan a la regulación de procesos celulares 
diversos como el progreso del ciclo celular, supervivencia, división celular y cambios en la 
morfología (Dedhar S., 2000 and Wu C. and Dedhar S., 2001). Se conoce que la adhesión celular a la 
matriz extracelular mediada por integrinas induce una reorganización masiva del citoesqueleto de 
actina, lo que resulta en la formación de adhesiones focales (Petit V. and Thiery J., 2000). Muchas 
proteínas, incluyendo la ILK así como proteínas estructurales como talina, vinculina y paxilina son 
reclutadas a las adhesiones focales en respuesta a la adhesión celular lo que lleva a cambios 
morfológicos y a la activación de vías de señalización (Calderwood D. et al., 2000; Zamir E. and 
Geiger B., 2001). Por otro lado, se ha observado que una de las vías de señalización dirigidas por la 
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ILK, es la contracción del músculo liso por la sensibilización de la maquinaria contráctil al Ca2+, esto, 
mediante la fosforilación de la fosfatasa de la cadena ligera de la miosina (MLCP por sus siglas en 
inglés) (Murányi A. et al., 2002).  
 
MLCP 
           La MLCP es un componente regulador clave del proceso de sensibilización de la maquinaria 
contráctil al Ca2+. La caracterización inicial de MLCP fue reportada desde hace dos décadas a partir 
de molleja de pollo (Alessi D. et al., 1992). La estructura de la MLCP consta de un heterotrímero 
compuesto de una subunidad catalítica de fosfatasa tipo 1 (isoforma ) de 38 kDa (PP1c), una 
subunidad reguladora (MYPT1, myosin phosphatase target subunit 1) de 110 kDa y una última 
subunidad de 20 kDa de función desconocida (M20) (Ito M. et al., 2004; Matsumura F. and 
Hartshorne D.J., 2008). La MYPT1 interactúa con PP1c en el amino terminal y con M20 en el 
carboxilo terminal, formando una holoenzima (Somlyo A. and Somlyo A., 2003) (Figura 8). Uno de 
los sitios más importantes de la MLCP es la subunidad reguladora de MYPT1, ya que esta subunidad 
está conformada por varios aminoácidos que pueden ser fosforilados. Cuando esto ocurre, la MYPT1 
es regulada de forma positiva o negativa de acuerdo a los sitios donde es fosforilada (Kim H. et al., 
2008).  
 
MYPT1 
           La MYPT1 ha sido clonada en varias especies y se han identificado varias isoformas que 
contienen cerca de 1000 aminoácidos con una masa aproximada de 110 kDa (Hartshorne D. et al., 
1998). Una estructura característica de todas las isoformas de MYPT1 es la región de 7 repeticiones 
de ankirina en el amino terminal, que se encuentra cerca de un motivo de unión a PP1c. En algunas 
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isoformas se presentan agrupaciones de 6 o 7 motivos de zipper de leucina en el extremo carboxilo 
terminal (Ito M. et al., 2004). 
           El gen de MYPT1 se ha descrito como un gen constitutivo que se expresa en muchos tejidos, 
aunque se presenta a altos niveles en músculos lisos (Okubo S. et al., 1994, Boudrez A. et al., 1999). 
MYPT1 está codificado por un simple gen en el cromosoma de humano 12q15-q21.2 (Takahashi N. 
et al., 1997). Las isoformas están dadas por eventos de empalme alternativo de dos exones 
generando 4 isoformas principales, que difieren en la presencia de un inserto central y/o un motivo 
de zipper de leucina en el carboxilo terminal de MYPT1 (isoformas LZ+ y LZ-) (Dirksen W. et al., 2000; 
Khatri J. et al., 2001). En la MYPT1 de pollo hay dos isoformas que difieren en la ausencia o presencia 
de un exón central de 123 nucleótidos. La denominada M130 corresponde a la ausencia del inserto 
central, mientras que la M133 concierne a su presencia (Shimizu H. et al., 1994). En rata, el exón 
alternativo encontrado en pollo es constitutivo y dos exones río abajo de forma inmediata son 
alternativos, resultando en 5 isoformas del inserto central (Dirksen W. et al., 2000). La isoforma que 
contiene el inserto más largo, originalmente reportada como rat3 es equivalente a MYPT1 de 
humano (Johnson D. et al., 1997). Las otras variantes por empalme alternativo refleja la presencia 
o ausencia de los motivos de zipper de leucina en el carboxilo terminal. En el pollo, el salto del 
nucleótido 31 en el exón 24 genera una isoforma positiva para el zipper, mientras que la inclusión 
del nucleótido 31 cambia el marco de lectura induciendo un codón de paro prematuro y resultando 
en la isoforma negativa para el zipper (Dippold R. and Fisher S., 2014). 
           Uno de los aspectos importantes de MYPT1 es que es una plataforma de interacción para 
múltiples ligandos. La interacción más conocida es la de MYPT1 con la miosina fosforilada, que 
promueve el proceso de desfosforilación de la misma miosina y por lo tanto la relajación del 
músculo liso. En este sentido, el sitio de unión para miosina está dentro del amino terminal donde 
se encuentran las repeticiones de ankirina (Ichikawa K. et al., 1996; Hirano K. et al., 1997). Se ha 
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sugerido que la unión de la cadena ligera de miosina fosforilada con esta región podría reducir la 
Km de PP1c por su sustrato (Tanaka J. et al., 1998). Por otro lado, se ha propuesto que la 
fosforilación de Thr850 (Thr853 en MYPT1 de humano) por la cinasa de Rho (ROK) reduce la unión a la 
miosina (Velasco G. et al., 2002). Otras interacciones con MYPT1 incluyen la unión de RhoA activo 
(unido a GTP) a la región carboxilo terminal de MYPT1 (Kimura K. et al., 1996). No se sabe si esta 
unión tiene algún papel fisiológico pero podría representar un sitio de unión alternativo en la 
membrana plasmática (Surks H. et al., 1999). La inhibición de la MLCP se lleva a cabo a través de 
varios mecanismos (Hartshorne D. et al., 1998; Somlyo A. and Somlyo A., 2003) siendo uno de los 
principales la fosforilación de la MYPT1.  
 
FOSFORILACIÓN DE LA MYPT1 
            La primera cinasa identificada que lleva a cabo la fosforilación de MYPT1 y por tanto la 
inhibición de la MLCP es la ROK (Kimura K. et al., 1996) (Figura 8), la cual es activada por RhoA 
estando unida a GTP (Somlyo A. and Somlyo A., 2003). Hay dos sitios principales de fosforilación 
para ROK en la MYPT1 de aves, Thr695 y Thr850 (sitios equivalentes en la MYPT1 de humano, Thr696 y 
Thr853). Thr695/696 son sitios de fosforilación inhibitorias (Feng J. et al, 1999). Otras cinasas también 
pueden fosforilar los sitios inhibitorios en la MYPT1, la cinasa MYPT1K (recientemente nombrada 
cinasa de MYPT1) (MacDonald J. et al., 2001) y la ILK. La ILK nativa es efectiva inhibiendo la actividad 
de la MLCP vía fosforilación de su sitio inhibitorio en la MYPT1 (Murányi A. et al., 2002) (Figura 8). 
En citoesqueleto de plaquetas, la ILK se ha identificado como la principal cinasa que fosforila e 
inhibe la actividad de la MLCP (Kiss E. et al., 2002). La inhibición de la MLCP correlaciona con el 
grado de fosforilación en Thr695. Además, estas cinasas (ROK, MYPT1K e ILK) pueden fosforilar 
directamente a la cadena ligera reguladora de la miosina en Ser19 (sitio fosforilado por MLCK) y están 
-  27  - 
 
 
implicadas en la contracción independiente de Ca2+ del músculo liso (Amano M. et al., 1996; Niiro 
N. and Ikebe M., 2001).  
               La MLCP también puede emplear un mecanismo de autoinhibición. Cuando la MYPT1 esta 
fosforilada en Thr696 o Thr853, los residuos fosforilados interactúan con el sitio activo de PP1c e 
inhiben la actividad de la fosfatasa. Se ha observado que tanto la ROK como la ILK fosforilan a Thr696, 
sin embargo, la fosforilación en Thr853 está regulada exclusivamente por la ROK (Ramachandran C. 
et al., 2011). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 8. Representación esquemática de la estructura de la MLCP. Está conformada por una subunidad 
catalítica (PP1C), una subunidad reguladora (MYPT1) y una última subunidad de 20 kDa (M20). La 
fosforilación en Thr696 y Thr853 (en humano) sobre MYPT1 regula de forma negativa a la MLCP (fosfatasa de 
la cadena ligera de la miosina), inhibiendo su actividad e impidiendo la desfosforilación de la MLCK (cinasa 
de la cadena ligera de la miosina), lo que llevaría a la contracción del músculo liso de las vías aéreas en un 
estado constante. La fosforilación se puede dar por ROK (cinasa de Rho), por MYPT1K (cinasa de MYPT1) y 
por ILK (cinasa ligada a integrina). Por otro lado, la inhibición de la MLCP se puede llevar a cabo por la 
inhibición de PP1c (subunidad catalítica) mediada por CPI17 (inhibidor de la proteína fosfatasa 1 
potenciada por la cinasa C) a través de PKC (proteína cinasa C).    
 
             
 
 
 
 
 
 
-    - 
 
 
JUSTIFICACIÓN 
________________________________________________________________________________ 
 
El cobayo es un excelente modelo experimental para evaluar el desarrollo del asma, ya que las 
características fisiológicas y patológicas del asma están bien representadas en este modelo animal.  
La hiperreactividad de las vías aéreas es la característica fisiopatológica más importante del asma, 
ya que todos los pacientes asmáticos que llegan a una unidad de urgencias es por un evento de 
hiperreactividad.  Sin embargo, hasta el momento no se conocen del todo los mecanismos que la 
generan. Uno de los mecanismos que podrían explicar el fenómeno de hiperreactividad de las vías 
aéreas podría ser la remodelación tanto estructural como molecular. En este estudio se evaluarán 
diferentes mecanismos de remodelación, tanto de cambios estructurales en las vías aéreas como 
de cambios moleculares en las adhesiones focales en los miocitos en un modelo de asma alérgica 
en el cobayo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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HIPÓTESIS 
________________________________________________________________________________ 
  
La remodelación de las vías aéreas podría estar relacionada con el desarrollo de 
hiperreactividad en un modelo de asma alérgica. 
 
OBJETIVOS 
________________________________________________________________________________ 
 
OBJETIVO GENERAL 
 
             Determinar si la remodelación a nivel estructural y/o molecular en miocitos está relacionada 
con el desarrollo de hiperreactividad de las vías aéreas en un modelo de asma alérgica en el cobayo. 
 
OBJETIVOS PARTICULARES 
 
1. Remodelación estructural de las vías aéreas de cobayos del modelo de asma 
Determinar el grado de broncoobstrucción y de reactividad de las vías aéreas de cobayos del 
modelo de asma. 
En estos cobayos evaluar los cambios estructurales en las vías aéreas. 
2. Remodelación molecular de las adhesiones focales en miocitos de cobayos del modelo de 
asma 
Determinar la expresión de Caveolina-1, subunidad 1 de integrina, ILK, paxilina, talina, -actina 
y MYPT1 en miocitos traqueales en cobayos del modelo de asma. 
 
 
 
-  30  - 
 
 
METODOLOGÍA 
________________________________________________________________________________ 
 
A continuación, se muestra el esquema general del desarrollo experimental para la realización de 
este proyecto. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
-    - 
 
 
ANIMALES 
Se utilizaron cobayos (Cavia porcellus) machos de la cepa HsdPoc:DH de Harlan México con 
pesos aproximados de 350 a 400 g que se mantuvieron en condiciones convencionales de humedad, 
temperatura y alimentación en el bioterio del INER: 12/12 de ciclo luz y oscuridad, aire filtrado a 21 
± 1°C, 50-70 % humedad y cama esterilizada. Se alimentaron con croquetas para cobayo (Harlan S.A. 
de C.V.) y agua esterilizada ad libitum. Se emplearon dos grupos de cobayos: controles y modelo de 
asma. Este proyecto fue aprobado por el Comité Ético y Científico del INER (B37-12, DI/CCB/344/12, 
29 de noviembre de 2012). 
  
SENSIBILIZACIÓN ANTIGÉNICA 
Se preparó una solución con ovoalbúmina (OVA; 0.06 mg/ml, Sigma St Louis, EU) e hidróxido 
de aluminio como adyuvante (1 mg/ml; J.T. Baker, NJ, EU), disueltos en 30 ml de solución salina 
fisiológica (SSF). En el día 1, se inyectaron a 6 cobayos con 1 ml de la solución de OVA por vía 
subdérmica e intraperitoneal, mientras que a 6 cobayos controles se les administró una inyección 
con el mismo volumen, pero únicamente con SSF (Figura 9). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 9. Modelo de sensibilización y administración de retos antigénicos en cobayos. 
 
 
 
-    - 
-    - 
 
 
PLETISMOGRAFÍA BAROMÉTRICA 
En el día 8 se reforzó la sensibilización de los cobayos con OVA (Figura 9). Para esto, se colocó 
al cobayo dentro de una cámara donde se registró el índice de broncoobstrucción (íB) basal con la 
ayuda de un pletismógrafo barométrico (Figura 10) para animales en libre movimiento (Buxco 
Electronics Inc., Troy, NY, USA). Posteriormente se les suministró aerosoles de OVA (3 mg/ml SSF) 
durante 5 min con un nebulizador US-Bennett (flujo de 2 ml/min). Este nebulizador produce una 
mezcla de partículas con la siguiente distribución: el 44% es menor a 4 µm de diámetro, el 38% de 
4 a 10 µm, y el 18% mayor a 10 µm. La cámara fue provista de un flujo de aire continuo (10 ml/s), 
que no modifica la señal respiratoria durante el experimento. Posteriormente se realizó el registro 
pletismográfico durante una hora para obtener la respuesta de broncoobstrucción máxima. 
El sistema de pletismografía barométrica se basó en la medición directa de las fluctuaciones 
de presión que se presentan dentro de la cámara y las compara con una cámara de referencia. 
Dichas fluctuaciones se registraron con un transductor de presión diferencial (SCXL004DN SenSym, 
Milpitas, CA, EU) conectado a un preamplificador. La señal generada fue procesada y analizada 
continuamente por un programa (Buxco Biosystem XA v1.1). Este programa fue ajustado para incluir 
solamente volúmenes corrientes de 1 ml o más, con un tiempo espiratorio mínimo de 0.15 s, tiempo 
inspiratorio de 3 s y una diferencia máxima entre los volúmenes inspiratorios y espiratorios del 10%. 
El ajuste de estos parámetros en el programa se realizó con el fin de no incluir artefactos en los 
registros. De esta forma aproximadamente del 7 al 10% de las ventilaciones de cada período fueron 
eliminadas principalmente por movimientos del cobayo. Cada valor del íB fue el promedio de 15 s 
de lecturas y, de éstas, el promedio de los últimos 5 min de cada período. 
El íB se fundamenta en los cambios de volumen del aire ambiental y el que está dentro del 
pulmón del cobayo, debido a que el aire ambiental se calienta de ~25 oC a 37 oC una vez que está 
dentro de los pulmones, además también se humidifica al 100%. Los sensores de la cámara de 
-  33  - 
 
 
pletismografía detectan este cambio en el volumen como un aumento en la presión en el interior 
de la cámara. Este incremento en la presión es transitorio, pues disminuye conforme el cobayo 
exhala el aire. Debido a que el aire exhalado pierde humedad y temperatura rápidamente, durante 
la exhalación baja el volumen del aire dentro de la cámara y esto se registra como una disminución 
en la presión. De esta manera, aunque el transductor no mide directamente los flujos espiratorios 
e inspiratorios, el programa de la computadora puede calcular el flujo de manera indirecta 
evaluando los cambios de presión durante la inspiración y espiración en el equipo previamente 
calibrado (Hamelmann E. et al, 1997). La información es procesada para dar el valor del íB que es 
obtenido con la siguiente fórmula: 
íB = [(Te-Tr)/Tr] [PFE/PFI] 
donde: 
Te = Tiempo total espiratorio (s) 
Tr = Tiempo total de relajación (s) 
PFE = Pico de flujo espiratorio (presión positiva máxima, cmH2O) 
PFI = Pico de flujo inspiratorio (presión negativa máxima, cmH2O) 
Los días 15, 25 y 35 se aplicaron tres retos con el antígeno, el día 15 se administró una 
solución de 20 mg de OVA disuelto en 20 ml de SSF. Los días 25 y 35 con se administró una solución 
de 10 mg de OVA disuelto en 20 ml de SSF. Todos los retos duraron un minuto y el íB fue registrado 
durante una hora. Los cobayos control solo recibieron SSF durante los retos.  
 
 
 
 
 
 
-  34  - 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 10. Equipo de pletismografía barométrica para animales en libre movimiento. En la figura se ejemplifica 
a un cobayo dentro de una cámara de pletismografía barométrica. Para medir los cambios de presión 
generados dentro de la cámara se utiliza un transductor de presión diferencial que registrara dichos cambios 
con relación a la presión atmosférica que es constante. La señal generada por los transductores es transferida 
a un amplificador y posteriormente hacia una computadora para su procesamiento. 
 
 
REACTIVIDAD DE LAS VÍAS AÉREAS 
La reactividad de las vías aéreas fue evaluada en los grupos controles y en el grupo 
experimental en el tercer reto con OVA (día 35), comparando las curvas dosis respuesta a la 
histamina antes y después de la administración de OVA. Para esto, inicialmente se obtuvo el íB basal 
y posteriormente se nebulizaron dosis no acumulativas de histamina (desde 0.01 hasta 0.32 mg/ml; 
Sigma St Louis, EU) durante 1 min. Para cada dosis se registró el íB durante 5 min continuos y se 
obtuvo el valor promedio. El intervalo entre la administración de cada dosis fue de 10 min. La curva 
dosis-respuesta se terminó una vez que la histamina produjo una broncoobstrucción que triplicó el 
valor basal del íB (Dosis provocativa 200 o PD200). Después se esperó a que la broncoobstrucción 
disminuyera a un íB aproximado al 50% del valor basal (Bazán-Perkins B. et al, 2004), y se retó con 
aerosoles de OVA (0.5 mg/ mL SSF, 1 min). La segunda curva de histamina se realizó tres horas 
después de la administración de OVA siguiendo el mismo protocolo de la primera curva.  
 
EUTANASIA DE LOS COBAYOS Y EXTRACCIÓN DE TRÁQUEA Y PULMÓN 
            Veinticuatro horas después de terminada la segunda curva de histamina, los cobayos se 
eutanasiaron mediante una sobredosis con pentobarbital sódico (28 mg/Kg). Una vez que los 
 
Amplificador
Transductor
Salida
Entrada de aire
-    - 
 
 
cobayos tuvieron paro cardiorespiratorio, se les realizó una incisión en el cuello para disecar la 
tráquea, a la cual se le eliminó la fascia superficial. El músculo liso traqueal obtenido se procesó para 
obtener RNA y proteínas. Por otro lado, se obtuvo el pulmón inferior izquierdo para hacer análisis 
histológicos. 
 
HISTOLOGÍA CONVENCIONAL Y ANÁLISIS MORFOMÉTRICO AUTOMATIZADO.  
El lóbulo pulmonar inferior izquierdo de los cobayos fue obtenido y fijado por perfusión 
manual con solución de formaldehído al 10 % vía intra arterial hasta que el lóbulo pulmonar 
estuviera libre de sangre. Los fragmentos pulmonares obtenidos por corte sagital fueron embebidos 
en parafina. Algunas secciones pulmonares de 4 m de grosor fueron teñidas con PAS para hacer 
determinación de número de células caliciformes, mientras que otras secciones pulmonares fueron 
teñidas con Tricrómica de Masson para el análisis de morfometría.  
Las áreas de superficie m2 de músculo liso de las vías aéreas y lámina propia fueron determinadas 
mediante el uso de morfometría automatizada (Qwin, Leica Microsystems Imaging Solutions, 
Cambridge, UK). Los datos fueron ajustados por el perímetro de la membrana basal correspondiente 
y su promedio fue considerado el resultado final. Todas las mediciones fueron realizadas en seis 
bronquios y seis bronquiolos (  ̴100 m de diámetro) elegidos aleatoriamente en cada cobayo. El 
total de células epiteliales totales en seis bronquios de cada cobayo se contó y el porcentaje de 
células caliciformes se obtuvo. Los bronquios y bronquiolos fueron identificados por la presencia o 
ausencia de cartílago en la pared de las vías aéreas, respectivamente. 
 
INMUNOFLUORESCENCIA 
Para la detección de caspasa 3 por inmunofluorescencia, el lóbulo pulmonar inferior 
izquierdo embebido en parafina se cortó en secciones de 4-6 m de grosor que fueron incubadas 
-  36  - 
 
 
por 30 min a 55 °C. Las laminillas con el tejido fueron desparafinadas en xileno 2 veces por 10 min 
cada vez. Las secciones fueron hidratadas gradualmente mediante alcoholes graduados usando 2 
cambios por 10 min en cada una de las siguientes soluciones: etanol 100 %, etanol 95 % y agua 
desionizada. Para la recuperación antigénica, las laminillas fueron cubiertas con 10 mM con buffer 
de citrato de sodio, pH 6.0 a 95 °C por 5 min. Las laminillas fueron enfriadas en buffer TBS-T por 20 
min a temperatura ambiente. Para inhibir la unión no específica del anticuerpo, las laminillas fueron 
incubadas con 0.2 % de albúmina sérica bovina en PBS por 20 min a 4 °C. Después, la 
inmunofluorescencia se llevó a cabo por el cubrimiento de cada laminilla con 20 l de anticuerpo 
policlonal de conejo anti-caspasa 3 (Abcam, San Francisco, CA, USA) por 2 h a 4 °C. Después de lavar 
en buffer de TBS-T por 5 min, se llevó a cabo la incubación del anticuerpo secundario IgG de cabra 
anti-inmunoglobulinas de conejo conjugado con FITC (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. 
Amish Country, PA, USA) por 30 min a 4 °C. Después de lavar dos veces, las laminillas fueron 
contrateñidas con medio de montaje y DAPI (Sigma-Aldrich Co, St Louis, MO, USA) para identificar 
en azul los núcleos celulares. Todas las incubaciones se llevaron a cabo en una cámara húmeda 
oscura. En otros experimentos, las laminillas fueron incubadas sólo con el anticuerpo secundario 
conjugado con FITC, el cual fue usado como control de tinción. Finalmente, las laminillas fueron 
examinadas por microscopía de fluorescencia con filtros apropiados (Leica DM-LS 2000, Mannheim, 
Germany) y analizados con el software ImageJ64 (http://rsb.info.nih.gov/ij/). 
 
CITOMETRÍA DE FLUJO 
Para la detección de producción de Caveolina-1 y los dominios intracelular y extracelular de 
la subunidad 1 de integrina en células de músculo liso de las vías aéreas aisladas se empleó triple 
inmunofluorescencia. Los miocitos aislados fueron incubados con 10 g/ml de brefeldina A (Sigma 
Chemical Co., St. Louis, MO, US) por 4 h para inhibir la liberación de citocinas. Después, las células 
-  37  - 
 
 
fueron lavadas, fijadas con p-formaldehido al 4 % por 10 min a 4 °C, lavadas y permeabilizadas con 
0.1 % de saponina en PBS con BSA al 10 % y NaN3 al 1%. Posteriormente, las células fueron agitadas 
suavemente en oscuridad por 15 min a temperatura ambiente y 1 x 106 células fueron separadas 
para ser incubadas 30 min con los anticuerpos contra caveolina-1 (BD Biosciences Pharmingen, San 
Diego, CA, US), Integrina 1 intracelular (Millipore, Temecula, CA, US) e Integrina 1 extracelular 
(Millipore, Temecula, CA, US). Luego de lavar, las células fueron incubadas con los anticuerpos 
secundarios anti-IgG de ratón conjugado a FITC (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA, US) y 
anti-IgG de rata conjugado a PE (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA, US). Finalmente, las 
células fueron lavadas y 10,000 eventos fueron adquiridos en un citómetro de flujo FACScan (Becton 
Dickinson, San Diego, CA, US) analizando mediante el software CellQuest. La intensidad de 
fluorescencia fue medida en unidades de media de fluorescencia. La fluorescencia inespecífica de 
cada incubación (tinción de fondo) fue obtenida usando anticuerpos del mismo isotipo dirigidos 
contra antígenos irrelevantes y conjugados con el mismo fluorocromo. La tinción de fondo fue <1 % 
y extraída de los valores experimentales. 
 
PROTEÍNAS 
El músculo liso traqueal fue homogenizado (PRO200; Pro Scientific Inc., Oxford, CT, USA) en 
buffer de fosfatos (PO4 6.7 mM a un pH de 7.4 con KCL 0.04 M y MgCl2 1 mM) a 4 °C y sonicado tres 
veces a 30 U de amplitud por 30 segundos con intervalos de 1 minuto en hielo (Vibra-cell 75185; 
Sonics and Materials Inc. Newtown, CT, USA). La suspensión fue desalinizada y precipitada a -20 °C 
en una solución que contiene acetona, 10% TCA y 20 mM de ditiotreitol (DTT). Los botones celulares 
fueron resuspendidos en buffer de fosfatos a 4 °C. La concentración de proteínas fue determinada 
con un Kit de ensayo de proteínas DC (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). El extracto de proteínas fue 
dividido en alícuotas y almacenado a -70 °C hasta su uso.  
-  38  - 
 
 
ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA 
Se obtuvieron los perfiles de proteínas con electroforesis de una dimensión (1D) usando los 
reactivos y los geles preparados en condiciones reductoras con 2.5% de 2-mercaptoetanol en los 
geles electroforéticos de 1D, como está recomendado por Laemmli (1970). Las proteínas (30 
g/carril) fueron separadas con un mini-sistema comercial (Mini-Protean II; Bio-Rad) usando 10% 
de acrilamida/bis-acrilamida (30% T, 2.67% C) a 80 V para concentración y 120 V para separación, 
usando un Power Pack 3000 (Bio-Rad) de acuerdo con las especificaciones de Harlow and Lane 
(1999). La electroforesis 1D incluyó marcadores de peso molecular comerciales (Precision Plus 
Protein All Blue; Bio-Rad) y los geles usados para transferir las proteínas a membranas de PVDF 
incluyó un marcador de peso molecular estándar (Precision Plus Protein™ WesternC™ Standards; 
Bio-Rad). Después de la separación electroforética, los geles se retiraron de la placa de acetato 
usando una placa (GE Healthcare Bio-Sciences AB) y las proteínas fueron transferidas a membranas 
PVDF con una cámara húmeda (XCell SureLock™ Mini-Cell Device) dentro de XCell II™ Blot Module, 
y NuPAGE Transfer Buffer con NuPAGE Antioxidant por 1 h a 30 V. Las proteínas transferidas a PVDF 
fueron analizadas mediante western blot. 
 
INMUNOELECTROFORESIS 
             La inmunoelectroforesis fue realizada con membranas activadas de PVDF Immobilon-P 
(Millipore, Bedford, MA, USA) siguiendo instrucciones de manufacturación. Después de transferir, 
las membranas fueron secadas a temperatura ambiente y almacenadas a – 20 °C hasta su uso. 
Para el reconocimiento de caveolina- 1 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA, US) se 
empleó una dilución de 1:1000, para las subunidades 1 de integrina intracelular y extracelular así 
como ILK y paxilina (Millipore, Temecula, CA, US) se emplearon diluciones de 1:500. Para el 
reconocimiento de talina (Millipore, Temecula, CA, US) se empleó una dilución 1:1000 y finalmente 
-  39  - 
 
 
para MYPT1 (Cell Signaling Technology, Massachusetts, USA) fue una dilución de 1:500. Todos los 
anticuerpos primarios se incubaron a 37 °C por 1 h. Se lavaron las membranas con TBS-T por 5 min 
5 veces. Posteriormente se incubaron las membranas por 1 h a 37 °C con anticuerpos secundarios 
anti-IgG de conejo diluido 1:1000 (Cell Signaling Technology, Massachusetts, USA), anti-ratón diluido 
1:3000 (Millipore, Temecula, CA, US) y anti-cabra diluido 1:1000 (Millipore, Temecula, CA, US) 
conjugados con HRP. Después, las membranas se lavaron con TBS-T por 5 min, 5 veces. Finalmente, 
el ensayo de quimioluminiscencia fue realizado con 20X LumiGLO (Cell Signaling Technology, 
Massachusetts, USA). Después de cada reacción, las membranas PVDF fueron desnudadas a 
temperatura ambiente. 
 
ANÁLISIS COMPUTACIONAL DE EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS 
Imágenes de geles y reacciones inmunoquímicas de electroforesis 1D fueron registradas y 
procesadas con Chemidoc XRS Device (Bio-Rad Laboratories, Segrate, Milan, Italy) usando el 
Software Quantity One 1D Analysis versión 4.6 (Bio-Rad Laboratories, Inc.). 
 
MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN 
Se realizó microscopía electrónica para la localización subcelular de la subunidad 1 de 
integrina en la pared de las vías aéreas. Para esto, cinco animales de modelo de asma se 
eutanasiaron y se disecaron pequeños fragmentos de la tráquea para ser deshidratados en alcoholes 
graduados y embebidos en resina hidrosoluble LR-White (London Resin Co., Hampshire, UK). 
Secciones de 1 m se obtuvieron de 5 bloques diferentes por animal y se tiñeron con azul de 
toloudina y se revisaron las distintas estructuras que conforman la tráquea usando microscopía 
convencional. Los tejidos seleccionados fueron ajustados a 70-90 nm de ancho para reducir el área 
seleccionada de las secciones, colocados en rejillas de Níquel e incubados toda la noche a 4°C con 
-  40  - 
 
 
los mismos anticuerpos específicos para la subunidad 1 de integrina diluidos 1/5 en PBS. Las rejillas 
fueron incubadas por 1 h a temperatura ambiente con los respectivos anticuerpos secundarios 
conjugados a partículas de oro de 5 nm o 10 nm (Sigma-Aldrich Co, St Louis, MO, USA) diluidos 1/20 
en PBS. Las rejillas fueron contrastadas con sales de Uranio (Electron Microscopy Sciences, Fort 
Washington, PA, USA) y examinadas con un microscopio electrónico M-10 Zeiss (Karl Zeiss, Jena, 
Germany). Como control negativo, el suero normal de conejo fue sustituido por el anticuerpo 
primario. 
 
EXTRACCIÓN DE RNA 
Una vez obtenida la banda de músculo liso traqueal, se dejó secar y se obtuvo su peso. Por 
cada 50 mg de muestra se agregó 1 ml de trizol y se homogenizó en hielo. Por cada ml de trizol, se 
agregaron 200 µl de cloroformo y se centrifugó a 10,000 rpm por 16 min a 4 °C. En tubos cónicos 
marca eppendorf nuevos, se agregaron 500 µl de isopropanol por cada ml de trizol. En estos tubos 
se agregó la primera fase de lo obtenido en la centrifugación que corresponde al RNA. Se dejó 
reposar a temperatura ambiente por 10 min y se centrifugó a 10,000 rpm por 11 min a 4 °C. Se 
desechó el isopropanol y se agregó 1 ml de etanol por cada 1 ml de trizol. Se centrifugó a 7500 rpm 
por 6 min a 4 °C. Se desechó el etanol y se dejó evaporar el etanol que quedó sobre las paredes del 
tubo por 10 min. Se agregaron 10 µl de agua libre de RNAsas y se mantuvo en hielo para su posterior 
cuantificación.  
 
PCR CUANTITATIVA EN TIEMPO REAL 
Una vez que se cuantificó el RNA, se evaluó la calidad del RNA mediante su resolución en geles 
de agarosa al 1 % y por la medición de la relación de absorbancia 260/280 nm. 1 g de RNA total se 
transcribió de forma reversa usando DNasa, buffer DNasa,  EDTA (FERMENTAS, Waltham, 
-  41  - 
 
 
Massachusetts), buffer RT 10x, dNTP´s 25x, iniciadores al azar 10x, inhibidor RNasa y transcriptasa 
reversa (High-Capacity cDNA reverse Transcription Kits with RNase Inhibitor, Applied Biosystems, 
Grand Island, NY) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La amplificación por PCR cuantitativa 
en tiempo real se realizó usando un equipo i-Cycler iQ Detection System (Bio-Rad, Hercules, CA). La 
PCR se efectuó con una mezcla de trabajo de cDNA en un volumen de reacción de 15 µl conteniendo 
2 µl de cDNA, MgCl2 50 mM, buffer MgCl2 10x, dNTP´s 2 mM, 10 µM de iniciadores específicos 5´ y 
3´, 0.15 µl Taq DNA (Invitrogen, Grand Island, NY), y 10 nM de fluoresceína y tinción SYBR green I 
diluida 1:50,000 (Roche, Indianapolis, IN). Un par de oligonucleótidos para los genes de ITGB1 e ILK 
fueron diseñados en Primer BLAST (Tabla 1). 
 
Tabla 1. Oligonucleótidos empleados para la RT-PCR cuantitativa  
Gen Oligonucleótido sentido  Oligonucleótido anti-sentido 
ITGB1 GAGAGTGTATCCAAGCGGGG ACCCTCAGCACATCCTTCAG 
ILK TGTCACTTGCCACAAGGTGT AGCCGCACTATTTCACCTGAT 
 
Todas las PCRs se realizaron por triplicado. Los resultados se expresaron como 2-CT en 
donde la CT se obtuvo CTgen-CTrRi18s. La prueba estadística que se realizó fue t de Student no 
pareada. 
 
RACE-PCR 
Se incubaron 10 µg de RNA total con CIP a 37 °C por 1 h. Posteriormente se extrajo el RNA 
con fenol:cloroformo y después con cloroformo únicamente. Se precipitó con 150 µl de isopropanol 
en hielo por 10 min y el botón celular se lavó con etanol al 70 % en frío. El RNA se resuspendió en 
-  42  - 
 
 
agua libre de RNAsa y fue tratado con TAP a 37 °C por 1 h. Se ligó un adaptador en el extremo 5’ y 
se incubó a 37 °C por 1 h. Se realizó una reacción Transcriptasa Reversa y se incubó a 42 °C por 1 h. 
Se ensambló un oligonucleótido externo al extremo 5’ y un oligonucleótido específico para ITGB1 
en el extremo 5’ a una concentración de 10 µM. Posteriormente se ensambló un oligonucleótido 
externo al extremo 3’ y un oligonucleótido específico para ITGB1 en el extremo 3’ a una 
concentración de 10 µM. Finalmente se analizaron los productos mediante un gel de agarosa con 1 
µg/ml de bromuro de etidio y se visualizó en un transiluminador UV. 
 
MATERIALES 
             Ovoalbúmina (chicken egg albumin) grado II fue comprado de Sigma Chemical Co. (US). El 
hidróxido de aluminio fue comprado de J.T. Baker, US. El pentobarbital sódico fue adquirido de 
Pfizer, México.  
 
ANÁLISIS ESTADÍSTICO 
 La hiperreactividad de las vías aéreas a la histamina fue evaluada por el promedio de la dosis 
provocativa 200 % (DP200), obtenido a partir del valor de la DP200 después del reto con la DP200 
obtenido antes del reto. El cambio en la reactividad a la histamina inducida por reto antigénico fue 
evaluado por el cociente de DP200. La comparación entre los grupos control y modelo de asma fue 
evaluado por las medias mediante la prueba de t de Student no pareada. Las relaciones entre dos 
variables independientes fueron evaluadas mediante el coeficiente de correlación de Pearson. La 
significancia estadística fue asignada como P<0.05 a dos colas. Los datos en el texto y figuras están 
expresados como media ± error estándar. 
 
 
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RESULTADOS 
_________________________________________________________________________ 
 
1. Obstrucción y reactividad de las vías aéreas en cobayos con modelo de asma. 
Se evaluó la obstrucción y la reactividad de las vías aéreas en todos los cobayos. En los cobayos con 
modelo de asma se observó un incremento en la respuesta de obstrucción máxima ante la 
administración del reto antigénico de OVA (Figura 11A) en comparación con los cobayos controles. 
Además, mediante la administración de histamina, los cobayos con modelo de asma necesitaron 
una menor dosis en la segunda curva-respuesta de histamina en comparación con la primera curva-
respuesta. Esto sugiere que los cobayos con modelo de asma presentan una mayor reactividad de 
las vías aéreas en comparación con los cobayos controles (Figura 11B).  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 11. Obstrucción e hiperreactividad de las vías aéreas inducida por reto antigénico en cobayos 
sensibilizados. A) Promedio de índice de broncoobstrucción máxima (Rmax) inducido por la 
administración de ovoalbúmina en cobayos del modelo de asma (barra negra) y con solución salina en los 
cobayos controles (barra blanca). B) el cociente de la DP200 que corresponde al valor de DP200 observado 
después del reto antigénico dividido entre el valor DP200 antes del reto antigénico. La línea discontinua 
señala el límite entre la hiporreactividad e hiperreactividad. Las barras corresponden a promedios ± error 
estándar de n=6 cobayos por grupo. **P<0.01, *P<0.05; prueba no pareada de t de Student.  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
-    - 
 
 
2. Remodelación de las vías aéreas de cobayos con modelo de asma. 
 
Para evaluar la remodelación epitelial de bronquios se realizó histología convencional mediante la 
tinción de PAS. Se determinó que hay un incremento estadísticamente significativo en el número de 
células caliciformes del epitelio bronquial de cobayos con modelo de asma en comparación con los 
cobayos controles (Figura 12A). Por otro lado, se realizaron tinciones de tricrómica de Masson para 
distinguir la capa de músculo liso basado en la tinción rojo fuerte que corresponde al citoplasma y 
azul que indica fibras de la matriz extracelular (Figura 12B). El análisis morfométrico automatizado 
de la masa del músculo liso (Figura 12C) y de la fibrosis subepitelial (Figura 12D) de bronquios y 
bronquiolos no mostraron diferencias significativas entre cobayos controles y con modelo de asma. 
 
 
 
  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 12. Remodelación de las vías aéreas de cobayos del modelo de asma. A) Porcentaje de células 
caliciformes en epitelio bronquial. B) Cortes histológicos de bronquios de cobayos controles y con modelo de 
asma teñidos mediante la técnica de tricrómica de Masson para diferenciar núcleos, citoplasma y fibras de 
colágena. El asterisco rojo se señala la banda que corresponde al músculo liso de las vías aéreas y las barras 
negras indican una observación a 40x. C) Área de capa de músculo liso y D) Lámina propia de bronquiolos 
(barras blancas) y bronquios (barras negras) ajustados por el perímetro de la membrana basal (MB) y medidos 
por morfometría automatizada. Las barras corresponden a la media ± error estándar de n=6 cobayos por 
grupo. *P<0.05 comparado con el control (prueba de t de Student no pareada). 
 
 
 
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3. Expresión de caspasa 3 en músculo liso de cobayos del modelo de asma. 
 
Cortes de tejido pulmonar de cobayos fueron incubados con el anticuerpo contra caspasa 3. Los 
núcleos fueron contrateñidos con DAPI que se muestran en azul. Las células positivas para caspasa 
3 (células apoptóticas), que se muestran en verde, están distribuidas uniformemente en los 
bronquios de cobayos controles y con modelo de asma (panel superior observado a una 
magnificación de 40x). Por el contrario, se observa una disminución significativa de células 
apoptóticas en vasos pulmonares en cobayos con modelo de asma (panel inferior observado a una 
magnificación de 20x) (Figura 13).  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 13. Expresión de caspasa 3 en músculo liso de cobayos del modelo de asma. Imágenes representativas 
de al menos dos experimentos independientes. * corresponde a las bandas de músculo liso en bronquios y 
vasos pulmonares.  
 
 
 
 
 
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4. Expresión de caveolina-1 en cobayos con modelo de asma. 
 
El análisis de la expresión de caveolina-1 en miocitos traqueales mediante citometría de flujo, 
mostró que hay un incremento significativo en la expresión de caveolina-1 en los miocitos de 
cobayos con modelo de asma en comparación con los cobayos controles (Figura 14A). Además, por 
medio de inmunoelectroforesis se observaron dos isoformas de caveolina-1, una de 20 y la otra de 
18 kDa. Esta última mostró una disminución en su expresión en cobayos con modelo de asma con 
respecto al control que fue evaluado mediante densitometría (Figura 14B). Por otro lado, 
observamos que cambios funcionales en el modelo de asma correlacionó con el número de células 
de músculo liso que expresaron caveolina-1. Por ejemplo, la hiperreactividad de las vías aéreas 
mostró una correlación inversa con la caveolina-1 que se expresa en el músculo liso (r= -0.517, P < 
0.05, n=13) (Figura 14C) y la Rmax correlacionó con el número de células positivas para Caveolina-1 
(r= 0.691, P < 0.01, n=13) (Figura 14D).  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 14. Expresión de caveolina-1 en miocitos traqueales de cobayos del modelo de asma. A) La expresión 
de caveolina-1 en miocitos traqueales de las vías aéreas evaluado por citometría de flujo (n = 6 por grupo). B) 
Inmunoelectroforesis representativa de caveolina-1 de miocitos traqueales de las vías aéreas (n = 3 por 
grupo). Las barras corresponden al promedio ± error estándar. *P < 0.01 comparado con el control mediante 
la prueba de t de Student no pareada. C) Gráfico de dispersión mostrando una correlación directa entre la 
Rmax y la expresión de caveolina-1. D) Correlación entre el grado de hiperreactividad de las vías aéreas y la 
expresión de caveolina-1. r = coeficiente de correlación de Spearman.  
-    - 
 
 
5. Localización de los dominios citosólico y extracelular de la subunidad β1 de integrina en la 
pared de las vías aéreas. 
La distribución de los dominios citosólico  y extracelular en el músculo liso de las vías aéreas y 
en el epitelio fue similar en los cobayos con modelo de asma y en los controles. 
Inesperadamente, el dominio citosólico compartió la misma localización que el dominio 
extracelular, encontrándose en la capa adventicia y la lámina propia (flecha negra, Figura 15A). 
Mediante la microscopía electrónica de transmisión, se confirmó que el reconocimiento 
inmunológico para los dominios citosólico (flechas rojas) y extracelular (flechas blancas) se 
encuentra asociado a las fibras de colágena que rodean el músculo liso (Figura 15B) y la capa 
adventicia (Figura 15C). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 15. Determinación de los dominios citosólico y extracelular de la subunidad β1 de integrina en la 
pared de las vías aéreas. A) Secciones representativas de la pared de bronquiolos mostrando la tinción 
del dominio citosólico y extracelular en cobayos con modelo de asma y en controles. La distribución de la 
tinción entre los grupos fue similar (flechas negras). Las barras corresponden a 10 m. ML: músculo liso 
y E: epitelio. B-C) Micrografías representativas de la localización del dominio citosólico (flechas rojas) y 
extracelular (flechas blancas) determinado por microscopía electrónica después de tres retos de 
ovoalbúmina. EE: espacio extracelular, Cit: citoplasma de una célula de músculo liso. C) Tejido fibroso de 
adventicia. Las flechas azules muestran la membrana plasmática de la célula de músculo liso. La 
magnificación electroscópica corresponde a B) x 31,000 y C) x 80,000.  
 
 
-    - 
 
 
6. Expresión de β1 integrina en miocitos traqueales aislados y en tejido conectivo. 
Para determinar la expresión de los dominios de la subunidad 1 de integrinas en el músculo 
liso se realizó citometría de flujo. En el grupo de cobayos con modelo de asma y en los controles 
el número de células de músculo liso de las vías aéreas que expresan el dominio citosólico de la 
subunidad β1 de integrina fue similar al número de células que expresan el dominio extracelular 
(Figura 16A). No se observó correlación entre las variables funcionales con los dominios 
extracelular o citosólico de la subunidad β1 de integrina (dominio citosólico vs. Rmax y cociente 
DP200: r = 0.31, P = 0.13, y r = -0.30, P = 0.14 respectivamente; dominio extracelular vs. Rmax y 
cociente DP200: r = 0.41, P = 0.07, y r = -0.34, P = 0.11 respectivamente, n = 15). 
En células de músculo liso aislado y tejido conectivo que rodea el músculo liso traqueal en 
cobayos controles y con modelo de asma, se usaron anticuerpos dirigidos contra el dominio 
citosólico y extracelular de la subunidad β1 de integrina detectando bandas que corresponden 
a polipéptidos de 130 y 100 kDa (Figura 16B). La intensidad relativa de las bandas del dominio 
extracelular y citosólico fue similar en células y tejido conectivo en todos los grupos. En tejido 
conectivo, los fragmentos polipeptídicos del dominio extracelular con pesos moleculares 
correspondientes a 50, 55 y 60 kDa incrementaron significativamente en comparación con los 
fragmentos con pesos moleculares similares detectados para el dominio citosólico en los grupos 
controles (P < 0.05; n = 4 en cada grupo; Tabla 1). Además, la expresión del polipéptido del 
dominio extracelular de la subunidad β1 integrina con peso molecular de 100 kDa fue más 
abundante en músculo liso que en tejido conectivo (P < 0.01, n = 4 en cada grupo; Tabla 1). 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 16. Expresión de la subunidad β1 de integrina en miocitos y tejido conectivo de las vías aéreas. A) 
Expresión de β1 integrina citosólico y extracelular en miocitos aislados de las vías aéreas evaluados por 
citometría de flujo en cobayos con modelo de asma (barras negras) y control (barras blancas), n = 9 y 6, 
respectivamente. Las barras representan la media + error estándar. B) Las inmunoelectroforesis 
representativas de los dominios citosólico y extracelular de la subunidad β1 de integrina en células de 
músculo liso aisladas y tejido conectivo de adventicia de cobayos con modelo de asma y controles.  
 
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Tabla 2. Intensidad relativa de los fragmentos polipeptídicos de la subunidad 1 de integrina.  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Se determinó la intensidad relativa de los fragmentos polipeptídicos de los dominios citosólico y 
extracelular de la subunidad β1 de integrina en músculo liso y en tejido conectivo de cobayos con modelo 
de asma y controles. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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7. Expresión de ITGB1 en miocitos traqueales de cobayo con modelo de asma. 
Se evaluó la expresión de la subunidad β1 de integrina a nivel génico (ITGB1) en el músculo liso de 
las vías aéreas. Mediante RT-PCR cuantitativa se mostró un incremento en la expresión del gen 
ITGB1 en cobayos con modelo de asma comparado con los controles (P < 0.001; n = 6 en cada grupo; 
Figura 17A). Para determinar la existencia de variantes transcripcionales de ITGB1, el mRNA de 
ITGB1 fue analizado por RACE-PCR. Los productos fueron evaluados en un gel de agarosa y sólo se 
observó una banda de peso molecular aproximado de 2000 pares de bases tanto en cobayos con 
modelo de asma como en controles (n = 5 en cada grupo; Figura 17B). Esta banda podría representar 
la longitud total del gen ITGB1 que corresponde al reportado en la literatura. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 17. Expresión de ITGB1 en miocitos traqueales de cobayo. A) RT-PCR. Las barras corresponden al 
promedio ± el error estándar en cobayos con modelo de asma (barra negra) y cobayos controles (barra 
blanca); n = 6 respectivamente. *P < 0.001 comparado con el grupo control (prueba t de Student no pareada). 
B) Productos del RACE-PCR del gen ITGB1 evaluados en un gel de agarosa en miocitos traqueales. La figura es 
representativa de cinco animales por grupo.  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
-    - 
 
 
8. Expresión de paxilina, talina y -actina en miocitos traqueales en un modelo de asma. 
 
Por medio de western blot y con anticuerpos específicos contra Paxilina, se identificaron dos bandas 
con pesos moleculares de 68 y 50 kDa (Figura 18A). La intensidad relativa de ambos polipéptidos 
disminuyó significativamente en el grupo de cobayos con modelo de asma (P < 0.05; n = 4; Figura 
18A). Por otro lado, talina también mostró dos bandas, de 270 y 250 kDa y la intensidad relativa fue 
similar entre los grupos (n = 4; Figura 18B). Finalmente, -actina con un peso de 40 kDa, no mostró 
cambios en su expresión en cobayos del modelo de asma en comparación con los controles (n = 3; 
Figura 18C). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 18. Expresión de paxilina, talina y -actina en miocitos traqueales en un modelo de asma. Intensidad 
relativa obtenida de western blot de A) paxilina (bandas de 68 y 50 kDa) y B) talina (bandas de 270 y 250 kDa). 
Los western blots de paxilina y talina son representativos de cuatro cobayos con modelo de asma y cuatro 
controles. En C) se muestran los resultados para -actina y el western blot es representativo de tres cobayos 
controles y tres cobayos con modelo de asma. Las barras representan el promedio ± el error estándar en 
modelo de asma (barras negras) y controles (barras blancas). **P < 0.001 y *P < 0.05 comparado con su grupo 
control (prueba t de Student no pareada).  
 
 
 
 
-    - 
 
 
9. Expresión de ILK en miocitos traqueales en un modelo de asma. 
 
La técnica de western blot empleando un anticuerpo específico dirigido contra ILK mostró una banda 
de 50 kDa (Figura 19A). La intensidad relativa de esta banda fue significativamente más alta en el 
grupo de cobayos controles con respecto a los cobayos con modelo de asma (P < 0.001; n = 6; Figura 
19A). La disminución de ILK también se observó a nivel gene (P < 0.05; n = 5; Figura 18B). Como se 
observa en la Figura 19C y 19D, los niveles proteicos de ILK tuvieron una relación inversa con la 
broncoobstrucción y el grado de hiperreactividad (P < 0.01, n = 10).     
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 19. Expresión de ILK en miocitos traqueales en cobayos con modelo de asma. A) Intensidad relativa de 
la banda de ILK de 50 kDa observada mediante western blot en cobayos controles y con modelo de asma (n = 
6). B) RT-PCR del gene ILK. Las barras representan el promedio ± el error estándar en cobayos con modelo de 
asma (barras negras) y controles (barras blancas) (n = 5). **P < 0.001 y *P < 0.05 comparado con su respectivo 
grupo control (prueba t de Student no pareada). C) Gráfico de dispersión mostrando la intensidad relativa de 
ILK correlacionada con el grado de hiperreactividad de las vías aéreas (cociente DP200) (n = 10) y D) se muestra 
una correlación inversa con el grado de Rmax (promedio de retos de OVA) (n = 10). r = coeficiente de 
correlación de Spearman.  
 
 
-    - 
 
 
10. Expresión de MYPT1 fosforilada en el residuo Thr696 en miocitos traqueales en un modelo 
de asma. 
 
La expresión de MYPT1 fosforilada en el residuo Thr696 fue evaluada mediante western blot. El 
western blot mostró un polipéptido con peso molecular de 130 kDa que incrementa su expresión 
en el grupo de cobayos del modelo de asma comparado con el grupo control (P<0.05, n = 6, Figura 
20). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 20. Expresión de MYPT1 fosforilada en el residuo Thr696 en miocitos traqueales de cobayos con modelo 
de asma. Western blot representativo de seis cobayos para cada grupo. Las barras representan el promedio ± 
el error estándar. *P < 0.05 comparado con su grupo control (prueba t de Student no pareada).  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
-    - 
 
 
DISCUSIÓN 
________________________________________________________________________________ 
 
El cobayo ha sido un modelo animal útil en el estudio del asma, ya que presenta algunas 
ventajas con respecto a otros modelos animales como la rata o el ratón. El cobayo comparte varias 
características farmacológicas que se observan en un individuo humano con asma, además de la 
fuerte respuesta obstructiva de las vías aéreas después de la estimulación con agonistas (Canning 
B. and Chou Y., 2008). La respuesta fisiológica al reto antigénico en cobayo con modelo de asma 
está caracterizada por una obstrucción de las vías aéreas rápida y transitoria en animales 
sensibilizados (Bazán-Perkins B. et al., 2009; Ramos-Ramírez P. et al., 2013). En este estudio, el reto 
con solución salina no modificó el índice de broncoobstrucción basal en el grupo control, pero el 
reto con OVA provocó un incremento transitorio en el mismo índice que alcanzó significancia 
estadística en comparación con el grupo control. Otra característica importante del asma es el 
desarrollo de hiperreactividad de las vías aéreas, que se refiere a la capacidad de las vías aéreas de 
acercarse de una forma exagerada a un estímulo que no resulta comparable al grado de 
acercamiento en individuos sanos (Lauzon A. and Martin J., 2016). En este estudio, la 
hiperreactividad de las vías aéreas fue evaluada mediante curvas de respuesta a la histamina, 
mostrando que los cobayos sensibilizados con el antígeno presentan hiperreactividad a la histamina.  
Se ha propuesto que el desarrollo de hiperreactividad de las vías aéreas tiene un 
componente persistente, el cual se ha relacionado a cambios estructurales de las vías aéreas que en 
conjunto se ha llamado remodelación estructural de las vías aéreas. Los mecanismos no se conocen 
del todo, pero el calibre reducido de las vías aéreas, el incremento en el grosor de la pared de las 
vías aéreas, el incremento en la masa del músculo liso de las vías aéreas y la contractilidad pueden 
estar participando (Cockcroft D. and Davis B., 2006). En este estudio, encontramos un incremento 
significativo de células caliciformes en epitelio bronquial de cobayos del modelo de asma en 
-  55  - 
 
 
comparación con los cobayos controles, lo que sugiere que este modelo de asma aguda induce 
cambios estructurales en el epitelio de las vías aéreas. Para evaluar la remodelación de las vías 
aéreas en los cobayos, se tiñeron cortes pulmonares con Tricrómica de Masson para distinguir las 
capas de músculo liso pulmonar basadas en la tinción del citoplasma en color rojo intenso. A pesar 
que no se observaron cambios en la masa del músculo liso ni en lámina propia de bronquios ni 
bronquiolos, se detectó ensanchamiento de los vasos sanguíneos pulmonares de las vías aéreas 
adyacentes fue observado. También observamos una disminución evidente de la expresión de 
Caspasa 3 en músculo liso pulmonar de vasos sanguíneos en los cobayos de modelo de asma, lo que 
sugiere que la apoptosis es inhibida en músculo liso vascular. Estos resultados sugieren que el 
músculo liso pulmonar de vasos sanguíneos, pero no el músculo liso de las vías aéreas, es capaz de 
generar cambios de remodelación estructural en el modelo de asma aguda en cobayos. 
      En comparación con otras células, el músculo liso de las vías aéreas expresa mayor 
cantidad de Caveolina-1 en la membrana plasmática (Gabella G., 1976). En músculo liso de las vías 
aéreas, la plataforma de señalización asociada a Caveolina-1 tiene un papel fundamental en el 
reclutamiento de varias proteínas de señalización que están involucradas en la contracción muscular 
(Darby P. et al., 2000). En este estudio, los experimentos de citometría de flujo demostraron que el 
número de células que expresaron Caveolina-1 incrementó significativamente en los cobayos del 
modelo de asma comparados con los cobayos controles. En las bandas del músculo liso de vías 
aéreas de animales experimentales se han observado resultados similares por medio de 
inmunohistoquímica (Gosens R. et al., 2011). Por otro lado, en nuestro estudio se observaron por 
inmunoelectroforesis dos bandas específicas para Caveolina-1 de aproximadamente de 18 y 20 kDa 
respectivamente, las cuales podrían ser las dos isoformas que se han descrito en la literatura, la 
isoforma  (de migración lenta) que corresponde a la de 20 kDa y la isoforma  (de migración rápida) 
que corresponde a la de 18 kDa (Cohen A. et al., 2004). En nuestro análisis de densitometría, la 
-  56  - 
 
 
isoforma  tiende a incrementar en los cobayos del modelo de asma, aunque, la isoforma  es 
similar en ambos grupos. Se ha reportado que la expresión de estas dos isoformas es diferencial en 
distintos tipos celulares y en determinados estadios de la vida de un organismo. Por ejemplo, 
durante el desarrollo embrionario en ratones, ambas isoformas pueden ser detectadas en el pulmón 
a las 12.5 semanas, pero después del nacimiento la isoforma  sólo se detecta hasta pasados dos 
meses de vida en vasos sanguíneos y en células alveolares tipo I (Maniatis N. et al., 2012). Además, 
se ha observado que ambas isoformas presentan la capacidad de fosforilarse en residuos de serina 
in vitro, pero sólo la isoforma  lo hace in vivo. Esto sugiere, que las isoformas correspondientes a 
Caveolina-1 podrían tener funciones biológicas distintas y por tanto una expresión diferencial en los 
tejidos (Gupta R. et al., 2014). En este estudio también observamos cambios funcionales en los 
cobayos del modelo de asma que correlacionaron con el número de células de músculo liso que 
expresaron Caveolina-1. Esto sugiere que a mayor número de células que expresan Caveolina-1 hay 
mayor hiperreactividad de las vías aéreas de los cobayos del modelo de asma. Además, la 
obstrucción de las vías aéreas inducida por antígeno está asociada directamente con las células del 
músculo de las vías aéreas que expresan Caveolina-1. Cabe recordar que las plataformas de 
señalización que se encuentran en la membrana plasmática de las células del musculo liso de las 
vías aéreas contienen Caveolina-1 entre otras proteínas como las integrinas.  
Las integrinas son sensores clave de los componentes de la matriz extracelular y se 
encuentran alojadas en las adhesiones focales (Hynes R., 2002). Aunque se sabe que los 
componentes de la matriz extracelular se modifican en el asma, poco se sabe sobre el papel de las 
integrinas. Previamente, usando el mismo modelo de asma que en este estudio observamos que la 
acumulación del dominio extracelular de la subunidad 1 integrinas en fibras de colágeno y en las 
bandas de músculo liso se asociaron con el grado de fibrosis de las vías aéreas, inflamación e 
hiperreactividad (Bazán-Perkins B. et al., 2009). En este estudio empleamos microscopía electrónica 
-  57  - 
 
 
de transmisión para evaluar la expresión de ambos dominios de 1 integrinas. Confirmamos que el 
dominio citosólico y extracelular de la subunidad 1 de integrina está localizado sobre fibras de 
colágena que no contienen restos celulares en la zona. La subunidad 1 de integrina no es capaz de 
interactuar con componentes de la matriz extracelular, por tanto, la unión de 1 integrina a la 
colágena puede ocurrir a través del dominio I que se encuentra en la subunidad  de las integrinas 
(Popova et al., 2007). Algunas 1 integrinas como 11, 21, 101 y 111 son receptores de 
colágena. De acuerdo con lo mencionado, la subunidad 1 de integrina que se encuentra cercana a 
las fibras de colágena podría estar asociada con una subunidad  de integrina. La presencia de las 
subunidades 1 y 2 de integrinas en las mismas áreas fue descrita previamente (Bazán-Perkins B. 
et al., 2009). Las integrinas encontradas en este estudio en áreas de matriz extracelular 
probablemente sean 11 y 21 sin descartar a otras posibles integrinas. Por otro lado, también 
encontramos que los niveles de los dominios extracelular y citosólico de la subunidad 1 de 
integrina en las células del músculo liso de las vías aéreas son iguales en cobayos del modelo de 
asma y de controles, lo que sugiere que el músculo liso de las vías aéreas no sea el tejido que esté 
sobre produciendo ni escindiendo a la subunidad 1 integrina.  
La subunidad 1 de integrina en humano y cobayo es un polipéptido de 88 kDa con 
aproximadamente 92.6 % grado de homología a nivel de secuencia de aminoácidos (BLAST at Swiss 
Institute of Bioinformatics), sugiriendo una cercana similitud bioquímica entre especies. Las 
modificaciones post-traduccionales tales como glicosilación y fosforilación podrían inducir cambios 
en el peso molecular de los polipéptidos. La subunidad 1 de integrina tiene 12 sitios de glicosilación 
y 5 posibles sitios de fosforilación (Zheng M. et al., 1994; Mulrooney J. et al., 2001). En humano, la 
glicosilación parcial en el retículo endoplásmico y en aparato de Golgi genera un polipéptido 
inmaduro de 105-110 kDa que no se encuentra en la membrana plasmática. La forma madura 
funcional de 1 integrina en la superficie celular es aproximadamente de 125-130 kDa (Argraves W. 
-  58  - 
 
 
et al., 1987; She S. et al., 2010). En nuestro estudio, encontramos que los anticuerpos que reconocen 
al dominio citosólico y al extracelular reconocieron polipéptidos de 100 y 130 kDa en músculo liso, 
lo que sugiere que algunos de estos polipéptidos corresponden a la subunidad de integrina madura 
e inmadura. Sorprendentemente, los dos polipéptidos (100 y 130 kDa) también fueron detectados 
en tejido conectivo, donde el componente más abundante es la colágena (Gelse et al., 2003). Hasta 
el momento, se desconoce si los dominios citoplásmicos de las integrinas se encuentran de manera 
extracelular. Sin embargo, hay evidencia documentada de integrinas solubles empleando 
anticuerpos que reconocen el dominio extracelular. En sitios inflamatorios, el flujo de macrófagos 
en ratón es promovido por el corte de 2 integrinas por metaloproteasas, un proceso que limita la 
inflamación local (Gómez I. et al., 2012). Además, la subunidad 1 de integrina se ha encontrado en 
plasma de humano (Bank I. et al., 1999).  Por otro lado, se ha observado que la secreción de 
receptores es un fenómeno común, por ejemplo, el receptor de insulina soluble fue encontrado en 
plasma como una proteína funcional (Papa V. et al., 1993). Por todo esto, es probable que las 
integrinas pudieran ser producidas como proteínas solubles, al menos en cobayo.  
Un papel principal de la fragmentación del dominio extracelular de receptores de 
membrana en células estimuladas y no estimuladas es la modulación de la función del receptor y el 
recambio de la proteína (Arribas J. and Borroto A., 2002). Además, en cáncer de colon, el corte de 
la subunidad 1 de integrinas induce otros efectos como la disminución de la adhesión celular e 
incrementa la motilidad (Kryczka J. et al., 2012). De hecho, los fragmentos solubles de 1 integrinas 
pueden alterar la interacción celular con componentes de la matriz extracelular, luego estos 
fragmentos en miocitos inducen el anclaje a colágena pero no a fibronectina o laminina (Goldsmith 
E. et al., 2003). Es posible que los fragmentos solubles de 1 integrinas tengan funciones similares 
que las descritas con los fragmentos de integrinas cortados actuando como ligandos solubles en las 
vías aéreas.  
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La inmunoelectroforesis detectó un incremento en el dominio extracelular de 1 integrina 
sólo en tejido conectivo en el grupo control. Dos mecanismos que podrían inducir este incremento 
es el corte de la proteína o un empalme alternativo del mRNA. Para evaluar la segunda posibilidad, 
el mRNA de ITGB1 (gen de 1 integrina) se evaluó en miocitos. La expresión del ITGB1 incrementó 
en el grupo del modelo de asma. El mRNA de ITGB1 fue sobre producido en el modelo de asma, pero 
mediante la técnica de RACE-PCR sólo encontramos una banda correspondiente a 2000 pares de 
bases, lo que indica que posiblemente el mARN de ITGB1 no produzca variantes por empalme 
alternativo. Con todo lo anterior, la integrina podría ser modificada post-traduccionalmente. 
En términos generales, la contracción muscular es el resultado de rearreglos del 
citoesqueleto asociado a integrinas en el músculo liso. Un efector citoplásmico importante de las 
integrinas es una molécula llamada ILK, una pseudocinasa involucrada en el rearreglo de los 
filamentos de actina, ensamble de adhesiones focales y la conducción de fuerzas a la matriz 
extracelular (Qian Y. et al., 2005; Eckes B. et al., 2014). Algunos autores han sugerido la importancia 
de la expresión de ILK en el músculo liso. Por ejemplo, se sabe que ILK es capaz de fosforilar 
directamente a MYPT1 en Thr696. MYPT1 es la subunidad reguladora de la fosfatasa de la cadena 
ligera de miosina (MLCP), una proteína principal en la relajación del músculo liso. La fosforilación de 
sitios específicos en MYPT1 puede inducir a la inhibición o estimulación de la actividad de MYPT1. 
En particular la fosforilación en Thr696 de MYPT1 inhibe la actividad de MLCP y promueve la 
contracción (Feng J. et al., 1999; Velasco G. et al., 2002). Por medio de PCR y por 
inmunoelectroforesis encontramos que la expresión de ILK en los cobayos del modelo de asma 
disminuyó con respecto a los controles. Por lo anterior, esperábamos una disminución en la 
fosforilación de Thr696 en MYPT1, pero encontramos lo opuesto. Es posible que esto se deba a que 
la ILK no es la principal cinasa que participa en la fosforilación de esta proteína, se sabe que otras 
cinasas como ROK fosforilan este sitio. Otros estudios sugieren que ILK tiene otras funciones. Se ha 
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demostrado que la depleción de ILK en células de músculo liso traqueal de perros mestizos 
incrementó la expresión de genes de diferenciación (Wu Y. et al., 2008). De manera interesante, se 
ha mostrado que la disminución de ILK conlleva a un fenotipo hipercontráctil en células de músculo 
liso vascular (Montanez E. et al., 2009). Los datos mostrados en este estudio, concuerdan con este 
último hallazgo, ya que el grado de hiperreactividad y broncoobstrucción de las vías aéreas están 
inversamente relacionadas a los niveles de ILK en el músculo liso de las vías aéreas. Además, el 
ensamble apropiado de la organización del complejo de la señalización de 1 integrina in vivo está 
asociado con la expresión de ILK (Zong H. et al., 2009). Por esto, nuestros hallazgos sugieren que la 
disminución de ILK podría reflejar un ensamble alterado de 1 integrina en el músculo liso de las 
vías aéreas de cobayos del modelo de asma.  
Otras proteínas involucradas en el ensamble de adhesiones focales son Paxilina y Talina. Se 
ha visto que ambas proteínas están involucradas en funciones diferentes en las adhesiones focales. 
Por ejemplo, se sabe que la Paxilina es fundamental en el inicio de la polimerización de actina 
durante la activación contráctil del músculo liso y está asociada al complejo de ILK (ILK/PINCH/-
parvina) (Zhang W. et al., 2007; Gunst S. and Zhang W., 2008). Talina es necesaria para el 
mantenimiento de la expresión de 1 integrina, pero no para su activación. Además, la unión de 1 
integrina a Talina previene su degradación (Liu J. et al., 2011). En nuestro estudio, observamos una 
disminución en la expresión de Paxilina que fue similar a la disminución de ILK, lo que sugiere que 
ambas podrían estar asociadas en músculo liso de cobayo, sin embargo, los niveles de expresión de 
Talina no fueron modificados en el modelo de asma. Se ha sugerido que hay diferentes tipos de 
adhesiones focales definidas por su localización subcelular, tamaño y composición (Wozniak M. et 
al., 2004). También, parece que las adhesiones focales asociadas con Talina no están alteradas en el 
modelo de asma, pero aquéllas donde ILK y Paxilina están involucradas, disminuyen o están 
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desensambladas. Por todo lo anterior, es posible que las adhesiones focales de miocitos de cobayo 
del modelo de asma tengan un proceso de remodelación molecular. 
Finalmente, en la Figura 21 mostramos un modelo molecular que sintetiza algunos de los 
resultados expuestos en este estudio. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 21. Modelo de remodelación molecular de las adhesiones focales y el desarrollo de la contracción 
muscular. El incremento en la expresión de Cav-1 en miocitos, podría favorecer el reclutamiento de proteínas 
de señalización involucradas en la contracción. Por otro lado, la subunidad b1 de integrinas recluta moléculas 
pertenecientes a las adhesiones focales que podrían estar participando en el desarrollo de un fenotipo 
hipercontráctil, tales como ILK, Paxilina y MLCP (Fosfatasa de la cadena ligera de la miosina). Finalmente, la 
fosforilación en Thr696 de la subunidad catalítica de MLCP, MYPT1Thr696, evita la desfosforilación de la Miosina, 
manteniendo así la contracción del músculo liso de las vías aéreas. Se muestran las proteínas que incrementan 
(rojo), las que disminuyen (azul) y las que no se modifica (negro) su expresión en las adhesiones focales de 
miocitos del modelo de asma. Las proteínas mostradas en gris no fueron evaluadas en este estudio.  
 
 
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CONCLUSIÓN 
________________________________________________________________________________ 
 
Nuestros datos sugieren que el modelo de asma en cobayo parece inducir un fenotipo contráctil en 
el músculo liso de las vías aéreas y un fenotipo proliferativo del músculo liso en vasos pulmonares. 
Además, 1 integrina es secretada en la pared de las vías aéreas de cobayos, y estas proteínas son 
capaces de anclarse a la colágena. Es posible que 1 integrina no esté debidamente ensamblada en 
las adhesiones focales que contienen ILK y Paxilina en el músculo liso de las vías aéreas en el modelo 
de asma. Además, ILK no está involucrada en el desarrollo de hiperreactividad de las vías aéreas. Es 
posible que los fragmentos de 1 integrina sean cortados de otras células y no del músculo liso de 
las vías aéreas de cobayo. Un mecanismo importante que podría contribuir a la hiperreactividad de 
las vías aéreas en el modelo de asma es la regulación positiva de la fosfoliración de MYPT1Thr696 y 
la remodelación molecular de las adhesiones focales. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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PERSPECTIVAS 
_________________________________________________________________________ 
 
1. Mediante secuenciación, determinar las posibles modificaciones que tienen los 
dominios citosólico y extracelular de la subunidad 1 de integrina. 
2. Evaluar qué tipos celulares son los que están liberando los fragmentos de la 
subunidad 1 de integrina y depositándolos en la pared de las vías aéreas. 
3. Determinar qué cinasa puede estar regulando la actividad de MYPT1 fosforilada en 
Thr696 para desarrollar el fenotipo hipercontráctil del músculo liso de las vías 
aéreas. 
4. Profundizar más en el estudio de la remodelación molecular de las adhesiones 
focales en el modelo de asma y su relación con el desarrollo de la contracción del 
músculo liso de las vías aéreas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
-  64  - 
 
 
LITERATURA CITADA 
________________________________________________________________________________ 
 
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-  74  - 
 
 
ANEXO I: ARTÍCULO REQUISITO I 
________________________________________________________________________________________ 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
-  75  - 
Alvarez·Sanlos f1 al. CJinicol and Tronsknioool AJIwgy (201S) S:I. 
OOIlo.ll861 s 1l601~15-0058 -7 dinical and Translational 
Alle"1Y 
RESEARCH Open Access 
Antigen-induced airway hyperresponsiveness and 
obstruction is related to caveolin-l expression in 
airway smooth muscle in a guinea pig asthma 
model 
Mayra Alvarez-Santos1
, Patricia Ramos-Ramírez1
, Femando Gutiérrez-Aguilar1
, Sandra Sánchez-Hemández 1, 
Ricardo lascurain1, Raúl OImos-Zuñiga1
, Rogelio Jasso-Vidoria1
• Norma A Bobadilla45 and Blanca Bazan-Perkins1
' 
Abstract 
Background: CaveoIin-l is a fundamell!al signalling scaffold protein involved in contfaction; however, the role of 
caveolin-l in ailWay responsiveness remains uncleal. We evaluated !he relationship betweefl caveoIin-l expression in 
ailWay smoom musde (ASM) arxI antigen-induced airway responsiveness arxI obstruction in a guinea pig asthma modeI. 
Methods: AilWay obstruct ion in sensitised guinea pigs, induced by antigenic (ovalbumin) challenges administered 
every 10 days, was measured. Antigen-induced responsiveness to histamine and tlle expression of caveolin-l and 
cavin " 2 and 3 wee evaluated at me third ovalbumin challenge. The control group received saline soIution instead of 
ovalbumin. 
Results: Alter the first challeoge, antigeo exposule induced a tlansient ailWay obstruction and ailWay 
hyperresponsiveoess. high Ievels of Il-4 and Il-S in lung and ailWay giobet cells proliferation at the third antigenic 
challenge. CaveoIin-l mRNA IeveIs in totallung decreased in the experimental group compared with contro/s. FIow 
cytometric analysis of ASM from the experimental g loup showed a high number of cells expressing caveolin-l 
compared with contro ls. This increase was confirmed by westem bIol AilWay obstn.ction aOO hyperresponsiveness 
cOllelated with the degree of increased caveolin-l expression in ASM cells (P < ODS; r "" 0.69 aOO -052, respectivety). 
lhe expres.sion of cavins 1, 2 and 3 in ASM also increased in lhe experimental g roup compared 10 controls. 
Immunohistocllemical findings reveal that differences in ASM caveolin- l were not evident between g roups. 
Nevertheless, a marked decrease in caveolin-l and caspase 3 was observed in the pulmonary vasculal smooth 
muscle of asthma model compared with controls. Histological analysis did not reveal di fferences In smooth 
muscles mass 0 1 subepithelial fib(Qsls Ievels in ailWays between g roups. However, an enlargement of smooth 
muscle mass was observe<! in the pulmonary microvessels of experimental animals. lhis enlargement did not 
induce changes in pulmonary 0 1 systemic anerial Pfessures. 
Condusions: Our data suggest that caveolin-l expression in ASM has a crucial role in Ihe development of 
antigen-indUCed ailWay obstruClion and hyperresponsiveness in a guinea pig asthma modeI. In addit ion, the 
asthma model in guinea pigs appears to induce a contract ile smooth muscle Phenotype in the ailWays and a 
prolif€fative smooth musde phenotype in pulmonary vessels. 
Keywords: AXway hyperresponsiveOess,l\Kway obstructiOr\ Nrway smooth muscle, Asthma, caspase 3, (aveolin-l , 
(avin, Pulmonary arterial smooth musde 
• Co csp::w d ... o::e: ~.gob.m:o: 
'lrnliIuto N.Jóon;II di: ~ ~ l:;maeI CWo ~ 
~odl:Hipcr~IIr~~ di: TWpan.W. -. F" i :A al.uhJt ~ is ~ '" d>e cnd old>e >rtide 
( ) BioMed Central 
o XI1 ~ ~S"'O' ....... II(........, MoMtd c-.all ......... Opoon _ ""dodllGbAOld ...... \he""""aI.,," 
c-;...,Convnonr.Anftlu6on~()'Inp/~-'l_~~ __ 
dowIWÓQI\ ~ ""I'fOduoion In ""'1 ............ PfII'OÜ<Ilhe orIgINI....::.k i\ ll"QIlI'III" ~ lhe CrN .... Commans l'\.IbIic 
o.::..-~_""J1/bM 0'-"'9"1> ... 'llOW1M ....... IO\hedNmade~lnth& Oftide._ .. ___ 
 
 
     
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
-  76  - 
AIv~",z - Sant'" '" 01. CIniaJI ond T",n,~rio<JaI AlItrgy (201 SI 5:14 
Bac;kground 
Airway sll1()()(:h muscle is a central stnlcture in asthma 
pathogenesis. An important characteristic of asthma is 
that numerous stimuli can trigger intense and rap id 
bronchospasm in a phenomenon callcd airway hyperre--
sponsiveness [1.2)_ Currently, the precise mechanism by 
which the development of hypcrrcsponsiveness is induced 
remains unlmown. Nevcrthcless, airway remodelling fea-
tures such as fibrosis and smooth musde hypcrtrophyl 
hyperplasia nave bcen rccognised as playing a part (2). 
Caveolin-I is a hairpin-loop prolein titat forms omega-
shape invaginations in the plasma membrane, which are 
known as caveola (3). In asthma, a shortage of caVCQiin-1 
has bccn obsocrvcd in the airways of asthmatic patients (4). 
Similar results have ocoen noted in the lungs of ovalbumin-
challengcd mke, wnere a reduction of caveolin-I mRNA 
cxpression has bccn observe<! [5,6]. In contrast, increased 
lcvels of caveolin-I are found in the airway smooth muscle 
of antigen-cnallengcd in mice [7[ and the lungs of guinea 
pigs subjccted lo an asthma model (8). 
In airways, caveolin- I is involved in the downregula-
tion of fibrosis and smooth musde proliferation [9,10). 
However, the role of caveolin-I in airway hyper_ 
responsiveness is undcar. The developmenl of airway 
hypcrreiponsiveness in allergen (ovalbumin)-challenged 
mke without caveolin-I has been observed [7,11), and 
Hsia and colleagucs (12) have found the absence of 
caveolin-I induced airway hyperresponsiveness in endo-
toxin (lipopolysacrharide)-challenged mice. Moreover, 
the role of caveolin-I in airway hyperresponsiveness has 
become highly controvers ial due lo the view that 
caveolin-I is related to the regulation of contractile 
me<;hanisms [9,13,14), induding, proteins that partid-
pate in intracellular Ca" mobilisation [15.16). For ex-
ample. M3 muscarinic, bradyldnin. and HI histamine 
re<:eptors and store-operated ea" entry-regulalory 
me<;hanisms colocalise with caveol in- l [171. Addition-
ally, the re<;ruitrnent of Ca" sensitisation components 
such as RhoA and PKCa is caveol in-I-dependent 
[18.191. Furthermore, caveolin- I is a key regulator of 
slore-operated Ca" entry by increasing Orail expression 
in airway smooth muscle [201. 
Since 2005 sorne proteins named cavins has been asso-
óated with caveola biogenesis and organization [21]. In 
particular. cavin 1 (RNA poi [ transcription factor), cavin 
2 (serum deprivation protein response) and cavin 3 
(SDR- related gene product that binds lo C kinase) are 
widely expressed in tissucs, induded smooth musdcs 
(22). Recently. it has becn observed a decrease in expres-
sion of cavins in airways of caveolin-I knock-out mice, 
although its role in airway contraction its unknown [71. 
Experimental asthma models are fundamental in 
asthma resean::h. Partkularly, guinea pigs asthma modcl 
are susceptible lo develop early and late allergk 
P"9" 2 of 13 
reiponses a!'ter allergen chalh:nge and aloo can be uKcl 
as a model for chronic allergic asthma [23.24). Asthma 
model in guinea pig is uscful since the lung phannacology 
and the response lo inflammalory medialors is similar lo 
humans in oompanson lo rats and mousc [25.26). 
In the current study. we determined the relationship 
bctween caveolin-I express ion and the pathophysio-
logical characteristics of asthma ,,"d found that 
caveolin-I expression increases in airway smooth 
musde and that this increase is re1ated to antigen-
induced obstruction and hyperrcsponsiveness. In con-
trasto pulmonary vascular smooth muscle showed low 
expression of caveolin-I. which was accompanied by 
smooth musde cell prol iferation. 
Ml!thods 
We used outbrcd maJe guinea pigs weighing 0.35-0.4 kg 
from Harlan Mexico (slrain HsdPoc:DH). Tne animals 
were mainlained in our inslilulional laboralory animal 
facilities with fiJlercd air oondilioned at 21 ± 1°C and 50-
70')(, humidity. 12/12-h lighttdark cycles, slerilised peHets 
(2040 Harlan Teklad Guinea Pig Die!) and waler avaH-
abJe ad libilum. AH animals were handled acoording 10 
protocols approved by lhe Scienlific and Bioethics Com-
miltee of Ihe Instiluto Nacional de Enfermedades 
Respiratorias. 
Study design 
'1'0 determinate the role of caveolin- I in airway smootn 
muscle pathopnysiology during asthma. ovalbumin sen-
sitised gu inea pigs werc exposed to three antigenic 
challenges, eaen admin istrated every 10 days (Figure 1). 
During each challenge. the broncho-obstructive index 
was measured. At the thi rd antigenk challenge. the de-
velopment of antigen-induced airway hyperresponsive-
ness was evaluated by performing dose-response 
curves to histamine before and aftcr an antigenic chal-
lenge. Animals were then sacrificed lo obtain lung and 
tracheal samplcs. In lung samples. caveol in- I mRNA 
was measured by RT-PCR. Additionally. ehanges in Ihe 
amounl of eollagen in Ihe airway lamina propria and 
the extent of airway and pulmonary mkrovcssel 
smooth muscle layers were analysed via light mkros-
copy. Caveolin-J expression was examined using immu-
nohistochemistry. Caveolin-I express ion in smootn 
muscle cells from tracheae was measured by flow cy-
tomctry. Tracheal smooth muscle strips were used to 
evaluate the exprcssion of caveolin-I and cavins 1, 2 
and 3 by western blot. Systemk and pulmonary arterial 
pressures were measured at the third challenge. Control 
an imals re<::eived sham manoeuvrcs performed with sa-
Une solution. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
-  77  - 
P"!I"'3d13 
Inlt la l Antigen Antigen 
immu nization re info rce m ent c ha lle nges 
Subdennal l' ~ ~ ~ :~o (3 o 00 
I /'" I ....... 
Intraperitonea /~ • • • • • ,o< ,... :r' 
Challenge number 
I I I I I 
o 8 15 25 35 
Days 
Figurll l ~I.-..;gn. Ahe< ~ irrIrru'IIsaOOn and fE'in(OIcemefll wilh anligen (avalbumin), guinea pq..ecei>.oed IIv"" ""I!gen 
cll.:!lroges. ~l lh "d choil llco<Jc the evalu.Jtion of bfOl1(t>o-ot>.tlllOM> indco<. dow-.. "po."e e"""" lo mI...,...., as""" as immYnoIo<jcaI. 
I'VslOpathologiaJl and ~ f....:lion anaty,;is we<e petfonned. 
Asthma modeI 
Guinea pigs were sensitised and challenges were per-
formed acoording to previously described methods 
[23,27[. The antigen sensitisation of guinea pigs was 
perfonned by intI':ilperitoneal (0.5 mglml) and subder-
mal (0.5 mglml) injections with a combination of 
60 pglml ovalbumin plus I mglml aluminium hydrox-
ide dispersed in saline solution (Figure 1). The doses 
used in sensitisation and challenges in this asthma 
mede! were adjusted lo reduce a naphylactic shock dur-
ing challenges. Antigen seru;itisation was ceinforced eig.ht 
days later with ovaIbumin aen¡,o;oI (3 mglml saline) deIiv-
ered over five minutes. Aero.;o!s w ..... e pl'Oduced by a US-I 
Bennett nebu1iser (nuw, 2 ml/ min; Multistage liquid 
impinger, Bun:ard Manufacturing Co., Rickmansworth, 
Hertfordshire, UK) releasing mixed particles wi!h sizes 
uf <4 pm (44~), 4-10 pm (38%), and , 10 pm (18" ). 
From day 15 onward, guinea pigs were challenged over 
une min ute with an ovalbumin aerosol every 10 days 
(1 mg/ml during !he fin t dtallenge and 0.5 mg/ml in 
subsequent challenges) (Figure 1). 
Acute airway obst ructive responses after o""lbumin 
inha lation challenges were recorder using a !>aromet-
rie plethysmograph. A whole-body single-ehamber 
plethysmograph for fr""ly moving animals was u5l'd 
(Buxeo Ek>ctronics Ine .. T roy, NY, USA) to evaluate 
pulmonary funetion. The s ignal from !he ehamber was 
processed with eompute r-insta lled software (Buxeo 
8io System XA vl.l) to ealeulate several respiratory 
parameters, including the broneho-obstroctive index, 
Penh. We ea\culated this index using the following 
eq ua tion [28[: 
Penh = ((Te-Rt)/Rt) (PEPIPIP) 
where Te = expiralory time (s), Rt = relaxation time (5), 
PEP = peak exptralory pressure (cmH20), and PIP = peak 
inspiratory pressure (cmH20). The software was 
adjusted lO include only breaths with a tidal volume uf I 
millilitre or more. with milÚmal inspiratory time ofO.15 sec-
onds, maximal i~tory time of 3 seconds, and maximal 
diff .. Tl'f'lCe between i ~tory and expiratory voIumes of 
10%. This guinea pig model ol aIlergic asthma does oot 
develop a nociceabIe late airway response. We COITOboratted 
that this sensitisation procedure induces tht: increment of 
1112 (CD4 + ILl3+) lymphocytes in bronchoalveolar lava8\'. 
Antigen-induced airway JeSponsiven<Ms 
In guinea pigs, airway hyperresponsiveness waS mea-
sured aft.,.. antigen challense in sensitised (n = 18; 
asthma mode!) and non-sensitised (n = 13; control 
group) animab (27]. Airway respolll5i""ne.;s was evalu-
atM on day 35 (third ovalbumin challenge) by exposing 
eaeh animal lo increasing non-cumulative doses of hista-
mine aerosols (0.001 to 0.32 mg/ml; Sigma Chemical 
Co., St. Louis, MO, US) aft.,.. an initial broncho-
obstructive inde>: acquisition before and after ovalbumin 
administrabon. Each histamine dese WllS delivered over 
I minute, and the average of the broncho-obstructive 
index over the following 10 min WllS obtained. The inter-
val between doses was 10 mino The dose-- response curve 
finished when the broncho-obstructive inde>: reached 
thn:e tim\'$ i\:$ Queline leve!' O nC\' the index returned to 
the initia! baseline value « ~ incremcnt), the ovalbumin 
challenge WllS administered. A lleUKld WI"Yl' was measured 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
-  78  - 
AIv~rez - Sant'" '" al Clnicalond rranwrio<Jal AlIergy (201 SI 5:14 
th.ce hoors later_ Control group received saline instead 
ovaJbumin administration_ 
Oissection of airway s moolh musc:le strips lo. flow 
cytometry and Westem bIot studies 
Twenty-four hours afier oonduding histamine curves, 
sorne sensitiscd (n " JO) and non-sensitised (n " 9) 
guinea pigs were overdosed with an intraperitoneal in-
je<::tion of pentobarbital sodium (65 mg/kg), and thci. 
tracheae wcre d isscdcd to obtain airway smooth rnusde 
st. ips. 
¡solation of airway smooth musc!e cells 
The strips of 7 sensitised and 6 non-sensitiscd guinea 
pigs were incubated at 37"C fo. 10 min in 5 mI of Hanki 
soIution (Gibco, Gaithersburg, MD, US) with 2 mg cyst-
cine and 0.05 U/mI p<Jpain (Sigma ÜIt'mical Co" Stl..ouis, 
MO, US). The strips wcre then washcd in LeilxlViu's solu-
tion (Gibco, Gaithersburg, MD, US) and placed in a 
ph)'Siological saline solution (!>Ss, mM) containing 11 8 
NaO, 25 NaHCO", 4,6 Ka, L2 MgSO ... 1.2 KH,P04 and 
II glucose (S igma Chemkal Co., St. I..ouis, MO, US). 
Smooth m...wc strips were cut (0.5 x 5 mm), and frag-
ments weighing 200 mg total wcre placed in 2.5 mI !>SS 
with collagenase ~ I (1 mg/ml; Sigma OIemÍ<;;al Co., 
US) and dispase 11 (4 mgfml; Sigma Ülcmkal Co., St. 
I..ouis, MO, US) at 37'C Tcn minutes later; the fragmcnts 
were transferred to similar I'SS oontaining fresh enzymes. 
Tissuc was dispersed mechanically until isolated cells \Vere 
obscrvcd. Lciboviu's solution was addoo to stop the en-
zymatic activity. 
Flow cyton>etry 
For the detection of caveolin- I production in the iso--
lated airway smooth musde cells, a three-color immuno-
f1uorescence approach was used following a previously 
described method [29). lsolated myocytes were incu-
bated with 10 lIg/ml brefeldin-A (Sigma OIemkal Co.; 
Sl Louis, MO, US) for foor hours to inhibit new cyto-
kine release. Afier staining, cells were washed, fued with 
4% p-formaldehyde for 10 min at 4"C, washed, and per-
rneabiliscd with 0. 1% saponin in I'BS with 10% BSA and 
1% NaN", Afierwards, cells were gendy shaken in the 
da.k for 15 min at room temperaturc and 1 I.¡l/!xllf 
cells were labelled with caveoHn-1 antibody (HD Hiosd-
ences I'harmingen, San Diego, CA, US). 'Inen, cells were 
incubated du. ing 30 min with secondary antibody RTC 
rnouse (HD Biosciences I'harmingen, San Diego, CA, US). 
Finruly, cells were analysed for the expression of markers, 
on a FACScan f10w cytomete. (Becton Dickinson, San 
Diego, CA, US) using software, and 10,000 events were 
counted. 1'0 analyse the staining of intracellular caveolin-
1, the blasts were initially gated by thei. ph)'Sical proper-
tíes (forward aOO side scatter). A second gate was then 
P"9" 4 oi 13 
drawn based on the f1uoresomce characteristics of the 
gated cells, assessing f1uorescence intensity by histograms. 
Inteflsity of f1uorescence staining is expressed as the mean 
f1uorescence intensity. Control sta ins were performed 
using f1uorochrorne-oonjugated isotypc-matchcd anti-
bodies. BackgrooOO stain ing was <1% and subtractcd from 
experimental values. 
Weslern bIot analysis 
Smooth musde strips from guinea pig tracheac (n " 3, 
each group) were placed in l)'Sis buffe!' (1% Trilon X-
100, SO mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaO, 0.1 mM EDTA 
and EGTA, LO mM phcnylrnethylsulfonyl f1uoridc, 
lO j.lglrnl aprOOnin and leupeptin, LO mM Na3VO ... and 
50 mM NaF; Sigma OIemical Co.; Sl I..ouis, MO, US) 
and homogenised (Polytron PT3100, Kinematica, 
Swiuerland). T issue protein (4() j.lg) from cach sample 
was loadcd in d ifferent lanes of a 12% SDS-polyacrylamide 
gel. In an add itional lane, a control protein (GAPDH; 
Sigma OIemÍ<;;al Co.; US) was ruso added. After electro-
phoretic separation unde!' redudng cond itions, prott.'ins 
were transferred lo a nitrocellulose membrane a nd 
quenched with Tris-buffe!'ed sal ine (TBS) COllta ining 5'l(, 
non-fat milk and 0.1% Twcen-20. Membranes were sub-
jected lo ovemight incubation (12 h, 4' C) with rabbit poIy-
clonal antibodies raised against caveol in-I (BD Biosdences 
Pharmingen, San Diego CA, US), cavin- I (AntilPTRFI 
Cavin-I , MilIipore, BilIerica MA, USA), cavin-2 (SDR, 
'Ibe!'rno S<;ientific, Rockford IL, USA) and cavin-3 
(PRKCDBp, 'Ibenno SdentiflC, Rockford IL, USA), aOO 
then washed th ree times with TBS-Tween-2(} (0.1%). Cav-
eoIin aOO cavins were detected by adding horseradish 
peroxidase-Iabelled anti-mouse antibodies. Immunoblots 
were developro m ing an enhanced chemiluminescent 
reactant (LumiGLO, Ccll Signalling; US) and an optimal 
exposition of the nitrocellulose sheets lo X-ray films (Hio-
max ML Film, Kodak, Rochester, NY US). Caveolin- I an<! 
cavin immunoblots were analysed by densitornetry ming 
Kodak digitalliCÍt.'nce ID software ve/'!jion 2.03 (Eastman 
Kodak, Rochester, NY, US). 
RNA ,solation 
Total RNA from the right lung of sorne sensitised and 
non-sensitised (n " 3, each group) guinea pigs was isolated 
following the guanidine isothiocyanate-caesiurn chloride 
method [30). Total RNA was examined by 1')(, agarose gel 
electrophoresis, and the RNA concentration was dele!'-
mined by UV Iight absorbance at 260 nrn lo evaluate the 
integrity of RNA (Beckman DU640, Fullerton, CA, US). 
RT-POI 
The relative level of caveolin- I mRNA expression was 
assessed in left lung homogenates by semiquantitative 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
-  79  - 
AIv~",z · Sant'" <t 01. Clnical ond T ",n,~riona/ AlItrgy (201 SI 5:14 
RT· I'CR, as previously described (31). Briefly, a1l pri -
mer sequences were cuslom ordered from GIBCO 
BRl.. (Gaithersburg, MD, US). Sense caveolin· 1 
primers were amplified to obtain a fragment of 230 bp, 
bases I to 230 (sense S·· ATG TCT GGG GGT AAA 
TAC GT· 3· and antisense: S' ·CCT TCT GGT TCC 
GCA ATC AC· 3). A fragment of GAI'DH was also 
amplified to evaluate or reduce nonspeciflC effects of 
experimental treatment and to semi-quantify caveolin-
l expression. RNA samples were treated with DNAse 
to evaJuate genomic DNA conlamination relative to 
samples passed through a I'CR procedure without 
adding reverse transcriptase. RT-PCR was carried out 
using 2.5 ]Jg o f total RNA from lung homogenate. Be-
fore the RT-PCR reaclion. total RNA was heated at 65' 
C for 10 mino RT· PCR was performed at 37'C for 
60 min in a total volume of 20 fll us ing 200 U of the 
Moloney murine leukaemia vi rus reverse transcriptase 
(GIBCO BRl.., Gaithen;burg, MD, US), 100 pM of ran-
dom h"xam" r~ (Gmco. BRl.. Gai l hcr~burg. MD, US). 
0.5 mM of each dNTP (Sigma. St. l..ouis, MO. US), 
and Ix RT buffer (75 mM KCI , SO mM Tris·HCI, 
3 mM Mgal> 10 mM DIT. pH 8.3). Samples were 
heated at 9S' C for S min to inactivate the reverse tran-
seriptase and diluted to 40 Id wi th PCR-grade water. 
One-tenth of RT· PCR individual samples from each 
group was used for caveolin- I or GAPDH amplifica-
tion in 20- ]JI final volume reactions containing 1 x 
PCR buffer (10 mM Tri ~· HCI. 1.5 mM MgCIl> 50 mM 
Ka, pH 8.3), 0.1 mM of each dNTP, 0.2 ]JCi of 
[a32P]-dCTP (3,000 Ci/ mmol, 9.25 MBq, 250 ¡.oCi), 
10 ]JM of each primer, and one unit of Taq DNA 
polymerase (GIBCO, BRl.. Gaithersburg, MD, US). 
Samples were overlaid with 30 ]JI of mineral oil and 
PCR cycles were performed in a DNA thermal cyeler 
(M.J. Research, Watertown, MA, US), with the fol · 
lowing profile: denaturatíon for 1 min at 94' C; ano 
nealing for 1 min at 55' C and a I· min extension 
step at n·e. The last cyele was followed by a final 
extension step of 5 min at 7re. Control gene waS 
co· amplified simultaneously in each reaction. Ampli· 
fication kinetics were performed following our stand· 
ard procooure [31]. To analyse PCR products, one· 
hal f of each reaction was electrophoresed in a 5'11\ 
acrylamide gel. Bands were sta ined with ethid ium 
bromide, visualised under UV light, cu t out, sus· 
pended in I mI of scintillation cocktail (Ecolume, 
ICN, Aurora, OH, US) , and counted by liquid scin-
tillation (Reckman l..S6SOO, Fullerton, CA, US). The 
amount of radioactivíty recovered from the excised 
bands was plotted in a log scale against the number 
of cyc1es. To semi-quantify caveol in-I and the con-
trol gene, all reactions were performed at least in 
quadruplicate. 
P"9" S d 13 
Conventional histology aOO automated mofphometry 
aOillysis 
l..eft caudal lung lobes of sorne guinea pigs (n = 6, each 
group) were dissected and fued by manual perfusion of 
lO')(, neutral buffered formaldehyde solution vía intra-
arterial route until the lung lobe was exsanguinated. 
l..ung fragments obtained by sagittaJ cutting were em-
bedded in paraffin, and 4 ]Jm-thick lung sections were 
stained with Masson trichrome stain. The surfuce areas 
(]Jm ~ ) of airway smooth muscle and lamina propria, as 
weU as the vascular smooth musele of adjacent vessels, 
were determined through the use of aulomated morph-
ometry (Qwin, l..eica Microsystems Imaging Solutions. 
Cambridge, UK). Data were adjusted by length of the 
corresponding basement membrane, and their average 
was considered the final result. All measurements were 
condueted in six bronchi, six bronchioles and six arteri-
oles (-100 Ilm diameter) ehosen randomly from each 
animal. Total epithelial eells in six bronehi of each 
guin"a pig ,",re count"d and Ihe I"'"",nlag" oC globct 
cell was obtained. lbe bronchus and bronchiole were 
identified by the presence or absence of cartilage in the 
airway wall. respectively. 
ELISA 
Anti-hwnan interferon-y (IFN-y; R&D Systcm, Minncapolís, 
USA). inttrlcukin4 (ILA; R&D Systcm, Minnropolís, USA) 
and IL-5 (done lltl'K5; DD I'twmingcn, USA), antibodiC'l 
wcre u.'ICd in lung ~ or SL11Sitizcd and rIOII scnsitisod 
guiool pig¡ (n - 6, ead1 group) 10 rooas..-c c)1Okines by ELISA 
as previously ooscriboo 127J. 
Immunohlstochemlstry aOO Immunofluorescence 
The Same paraffin-embedded lung tissue blocks used for 
the morphometric study were used for immunohisto-
ehemistry (n = 6, eaeh group) and immunofluorescenee 
(" = 2, each group). Sections (3 ¡tm) were deparaffinised 
(55"C, 30 min) and rehydrated through submersion in 
graded alcohols (xylene, 1:1 xylene·alcobol, alcohol, and 
70')(, alcohol for 10 min each, followed by rinsing in dis-
tílled water). Antigen retrieval was performed with 
10 mM citra1c buffer, pH 6. for 5 min in a microwave 
oven. Samples were treat.ed with hydrogen ""roxide (3'11\) 
lo quench endogenous peroxidase, and nonspecific sites 
were blocked later with home serum (2'11\). Sections were 
incubat.ed at 4' C ovemight with an antibody lo caveolin-
I (BO Biosciences Pharmingen, San Diego CA, US). 1'0 
dctect the specific binding of this primary antibody, an 
R.T.U. Vcctastain Universal Quick Kit was used (Vector 
l..aboratories, lnc., Burlingame, CA, USA) in which tíssues 
were incubat.ed 5equentially wíth blocking serum, a pan-
speciflC sccondary antibody, and streptavidin/peroxidase 
complex. Finally, 3-amino-9-ethyl-carbazole (BioGcncx, 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
-  80  - 
AIv~",z · Sant'" <t 01. Clnical ond T rt:ln,~rio<Ja/ AlItrgy (201 SI 5:14 P"9" 6 d 13 
A) 
~ • 
~ 
~ ~ • ~ o 
E ~ e 
" ~ ~ ~ 
'00 G • " 
" , , 
Challenge number 
Control Asthma model 
FigoQ 2 ~ ~irw<oy obs1ru<:tion ..el ~ in sens.itis<ed ~ pigs. A,) Averaqe 01 n'IiI>ÓITo,.-n b orrl-o-<lbstrlld~ i'lde>c 
(IQna>:) iI'd.xed by CNat...m (dosed ~,....¡ SilIine (opero SQlJolI"<I d\aIeorges .. """,,!sed guine.1 pig;. B) l'D:w ratio cor~ 10 l'D:w v.llue 
obI<.wed aflor arO;¡cfl chaler1gc <Mlod by l'D:w ....., tóJ<e ~ lla<5 'cprCSl'fll: .,....." i ~ (n = 7 ~ group). ' p< 0JJ5 (~ ..oth antrol 
(R.l>eil(OO ,~es AH:}I/\ wilh Dlnle'lf. m,AHple C""'''''&<\!lIe\ll. 'p <o.os C\lIT"p:Wed wilh cor.rd ( .. ~ $(uder.·s 1-1.esO. 
San Ramon, CA, USA) was u:sed as a chrornogen. Sections 
were counterstained with Mayer's haematoxylin. Stidcs 
were rinsed twice with 0. 1% TW\."l'n-20 phosphate--
t>uffeTW R1i~ during the who1e prQC~ l"o control for 
the non-speciflC binding of the secondary antibody, 
A) 
" il 
B) 
• 
" 3 
sect:ions fmm the samio' lung were processed without the 
primary antibody. No positive staining was observed in 
non-spedfic binding control$. 'Ibe rabb it IgG (Southern 
6 iotech, Birmingham, Al., USA) i~ COlJtro! W\\s 
negative. 
FIgou .. ] Cytokme Dp~ ond globet celk percentage in senWzed gulnN pig .. Al Levek 01 inlerterorq O~ N vt in\erleubn (L).<j iIJId 
11.-5 in Iu'x¡ homogerlate; 8) GIober. cell p ercer~"')e . \ bror .. :hi. The bars ,ep,eo;er'l lhe ",e,,<lU SI: 01 n = 6 gu' -.ea pig\ . \ eadr group. ' P < O.C15 
romparro wilh CQJllrol (unpaited Sludorl1·, 1-1"'l}. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
-  81  - 
AIv~",z · Sant'" <t 01. Clnical ond T ",n,~rio<Ja/ AlItrgy (201 SI 5:14 P"9" 7 d 13 
Al • 
C) ...... 
""'" - - "~ CavoloIin-l _,e"l» 
2 , 
" ~ g.8 
12 g .• 
I - -, _ . ~ 
~~, 
_ ,Otoa 
_ " td,lo -BI 
H 
.¡:;~ ¡-•• f! 
figoure 4 Úlveolin· ' e>epres.ion in ";rway smooIh mu>de, Aj C;r.oroIin·1 mRNA ~ ir¡ "-"'9 (n = 3 in all groupsl. al (avroIin., ~ in 
lr¡o:;ht>al ;mled ai'way myO<:y1es, rnt'il:AAed by f10w <:y1ome\ry {{r ~ 6, 7 tor con" oI ar ~1 asllvna modeI gr""-'V>l. o llepreser~;J1o.e a<rlc<a.Iioc.l'aphs 
01 caveoIin- I aoo Gl'\Iiros·l . 2 aod 3 by """1<",, bIoI In tr ~ al.rw~ smoo!h m."cle (n _ 3 In aII grOUJl'l. "'" rep<e«'Ilt """'" ± SEM ' P «lOl 
(omp.:lred with control (unp.:lired S100<.-<11"5 n",t). 
For the dete<:tion or caspase 3 by immunolluores-
cence, paraffin-embedded tissue was cut 4-6 m thick 
and tissue sections were placed in slides and incubated 
ror 30 min at SS' e. Tissue slides were deparaffinized in 
xylenes twice ror 10 min each. Hydrate sections grad-
ually through graded aleohols using 2 changes ror 
10 min each or the rollowing solutions: 100% ethanol, 
95% ethanol, and deionized water. For antigen unmask-
ing, slides were covered with 10 mM sodium cittate 
buffer, pH 6.0, and heat at 9S"C ror 5 mino Slides were 
then cooled in TBS·T bu ffer ror 20 min at rOOm 
temperature. To suppress non·specific binding or anti· 
bodi\!s, lis .. u\! .. lides were incubate<! with 0.2% BSA in 
PBS ror 20 min at 4"C. Arter that, immunolluorescence 
staining was carned out by overlaying each slide with 
20 Id or rabbit polyclonal anti-caspase 3 antibody 
(Abcam, San Francisco, CA. USA) ror 2 h at 4' e. After 
washing in TBS·T bu((er ror 5 min, a secondary incuba· 
t ion was penormed with Iluorescein isothiocyanate 
(FITC)· labeled goat a nti · rabbit IgG (Jackson Immu· 
noReseareh Laborato ries Ine. Amish Country, PA, 
USA) ror 30 min at 4°C. Arter twice washing, slides 
were eounterstained with f1uoroshield mounting 
medium with DAPI (S igma-Aldrieh Co, Sto Louis, MO, 
USA) for nuelei sta in ing (blue ehannel). AIl ineuba-
t ions were carri ed out in a humid ified dark chamber. 
In other experimenls, t issue sl ides were ineubated 
only with FITC·labeled secondary antibody, whieh was 
used as background sta ining control. Finally, tissue 
sl ides were examined by fluorescenee microscope with 
appropriate filters (Leica DM· LS 2000, Mannheim, 
German y), and analyzed by ImageJ64 sortware (hltp:/I 
rsb.inro .nih.govfijt). 
Hemodynamk 
After 12 h or rasting. sorne guinea pigs (n = 8 for sensi · 
tised, and n = 4 ror non-sensitisoo) were anaesthetistc-d 
with isofluorane (1.5%, Solloran, México. DF) delivered by 
a precision vapor;" ... r (isotec 3, Ohm ~ -da, Steeton, West 
Yorkshire, UK) carried in oxygen. Their hea rt mtes were 
monitored with an automatic non·invasive device Dala-
stop<: Passport MOOe! EL (Oatascope Corp, Mahwah, NJ, 
USA). and after deep anaesthesia, animals were ventilated 
through a trachea cannula that was ronnected to both, a 
ventilator (Harvard, ROOent Model Ventilator 683) and 
the vaporiser. Then, the right carotid artery was dissected, 
and a catheter was inttodueed to measure the S)'l'ltemie aro 
terial pressure and diastolic arterial pre.;sute. A similar 
procedure was perl'onned to introduce a eatheter into the 
pulrnonary artery through the right venttide to dctennine 
the pulmonary arterial pressure. Oatascope Passport mono 
itored all pressures. 
M .. teriill$ 
OvaJbumin (chid<en egg albumin) grade 11 and all stains for 
microscopy were purchased from Sigma ClIemical Co. (US). 
Aluminium hydroxide was purchased from J.T. Ba.ker, USA. 
Pcntobarbital oodium was acquired &om Ptizcr, Me.xico. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
-  82  - 
Paye 11 of 13 
Control Asthma model 
figure S Oete<mination of CilveolÓII- l e"",,...ion in cont>oI ",nd asthma modeI gu;,- pig. by immunohi.todlemisUy. Uppef irT'oil<Je' 
(4)<) are " ~ pr eser ~ a(r...e ,;e<;lÍ<:ns (1 <X<\lrol lnd as(trna rnodeI 9I . r~ pig\ e<hibi1lr'<'l caveoIin- l immunoMa' \Ór><) In ... , ;JÍIWJy W and Iung ~ 
M An ""lJIifocalion (1 aifwar and 1009 v_ ....... S/000lh rrosdes ¡, Ihown in bollOO\ images with ..-rows. Figures are repre.ental;"" (1 6 guinea 
pO}< in each ~ 
Statistical ~nalysis 
Airway rcsponsivl'ness lo histamine was evaluated by means 
of the prm'OCatÍVl.' dosc 2OCl% (PI),..,). Le., the interpolated 
histamine dosc that caused a three--fold increase of basal 
broncho-obstIUctive index. Olange in histamine responsÍYe-
I>e$li indu<;ed by antigcn dli\lJenge ~ eva!1,IiIte<;l by \he 
1'D:m ratio. i.e., 1'D:m value observed alter OVA chaUenge 
dívided by PD:m vaJue Wore chaJlenge. In multiple compar-
isons. ooe--wayor repeated-measure ANOVA folJowed by 
Dunnett's tests was US\.od. Comparioon ~ control and 
asthma modeI groups was l'vaIuated by means of Student's 
unpaired t-test. Associations between caveolin- I and air-
way responsiveness and obstruction were assessed 
th rough Spearman's conelation coeffic ient. Statistical 
significance was set at two-tailed l' < 0.05. Data in the 
text and figures are expressed as the mean :l: SEM. 
Results and discussion 
Antigen-induced airway obstruction and responsiveneS5 
The guinea pig has serve<! as a helpful model in the 
study of asthma. with sorne advantages over other 
models such as the rot and mouse. because it shares 
various pharmacological characteristics of human 
asthma. besides the strong airway obstructive response 
that guinea pigs exhibit after agonist stimulation [32]. 
Responses lo antigen challenge in guinea pig asthma 
mooels are ~haracte ri:¡ed by a rap ir;! and tran$iel)t airway 
obstruction in sensitised animaJs [23,27[. In the current 
study. the values of basal airway obstruction index were 
similar between control and experimental groups (data 
not shown). Saline challenge did not modify the basal 
obstruction index in the control group, but ovalbumin 
challenge induced a transient increase in the index that 
reache<! statistical significance in comparison with the 
control group (p <O.05; n = 18 asthma modelo and n = 13 
control grouP¡ Figure 2A). 
An important pathophysiological (eature of asthma is 
the development of airway hyperrcsponsiveness. In this 
study, the basal histamine I '~ value was similar be-
twccn the control and experimental groups (data not 
shown). In the control group. the histamine I'D200 value 
after saline chaJlenge was similar lo the basal l'~ 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
-  83  - 
AIv~rez - Sant'" '" 01. C/inicalond rranstnional AlItrgy (201 SI 5:14 
value. [n the experimental group. the 1'0,.", value after 
ovalbumin challenge was lower than the basal ['o,.", 
value. [n the oontrol grOtlp. the I'D_ ratio was signifi-
cantly lower than that obtained Íll the oontrol group (P < 
0.05; 11 = 18 asthma model , and n = 13 control group; 
Figure 28), implying that al! guinea pigs sensitised with 
the antigen showed hyperresponsiveness to histamine. 
lnllammatory markers in asthma as the '1112 cytokines 
IL-4 and IL-S 133] significantly increases in lung homog-
enates of asthma model guinea pigs Íll oomparison with 
oontrols (J> < 0.05; n = 6 each group: Figure 3A). In oontrast 
IFN-y. a 'In l cytokine, has similar levels in both groups 
(Figure 3A). In addition, a signiflcantly incremenl oí gJobet 
ceUs was observed in bronchi epithelium oí asthma model 
group (1' < 0.05; n = 6 each group: Figure 3B) suggesting 
mal this model of acule asthma induces struClural changes 
in airway epithelium. 
(aveolin-, expresslon in aSlhma model 
In oomparison with other ceHs, smooth muscle expresses 
high levels of caveolin- I in Ihe plasma membrane [34]. 
In airway smooth muscle. the signalling p1atfonn associated 
with caveolin- I takes importanl roles in the recruilment of 
various signalling proteins involved in oontraction. For ex-
ample, caveolin- I is involved in Cal. homeostasis via !he 
presence of voltage galed L-rype Cal. channels, !he plasma 
membrane Cal. ATrase, calsequestrin and calreüculin in 
caveolin-t:nricOC-d membrnnes [151. Other OOmpol\t:nb mat 
A) 
Airway 
smooth 
muscle 
Control 
P"9" 9 d 13 
play a role in airway smooth muscle oontraction, such as 
M3 mUscaTinic. brac\ykinin. H 1 lústamine, phosphoUpase 
qH. Guq and store-operated Ca~ ' entry-regu!atory mecha-
IÚSms. oo-Iocalise with caveolÍll- 1 [17.35]. Moreover, TNF-
a, a fundamef\tal cytoIdne in asthma pathogenesis [36], in -
duces RhoA activation, enhances force responses lo 
acetyJcholine, and increases Cal' responses to acetyl -
choline, histamine and bradykinin Ihrough caveolin- I 
upregulation [18.37,38]_ Certainly. caveolin- I is associ-
ated with key molecules Ihal participate in airway 
smooth muscle contraclion_ 
[n agreement with other studies [4-6], we found that 
caveolin- I is downregulated in Ihe lung homogenates of 
experimental animals. as shown in Figure 4A. The level 
of caveolin- I mRNA in the lung homogenate of oontrols 
was significantJy higher in oomparison to the experimen-
tal group (P < 0.01: n = 3 in aH groups); nevertheless. 
Ilow cytomelric sludies in isolated myocytes demon-
strated that the number of ceHs thal express caveolin- I 
increase<! significantly in the experimental group com-
pared to oonlrols (P < 0.01; n = 6 and 7 for oontrol and 
asthma mooel group5, respectively; Figure 48). Similar 
results in lile airway smooth muscle bundles of experi-
menlal group animals oblained by immunohistochem-
istry analysis have been described previously [81. In 
our study. we observed Ihal funclional changes in Ihe 
aslhma model oorrelaled with the number of smoolh 
musde cells lhal expressed caveolin- 1. The PD200 ratio 
Asthma model 
e) 
flgunl 6l1epresent.lliYe hlstological featllreoJ of airway in a 9'1'''" plg allergic asth"... modeI. Al low-power micrograph (10)(1 ¡rom \he 
k.r¡g; o/ ronuol ond ~ .......... pig' showing twonchi. 8) i\rm 01 YOOOIh ~ l.:Jf"J ond O l¡yrOro !>"opr" 01 tw .. ~ loioIl., (whilc b.ml ond 
twond~ (lkk bar>1 adju'k'd by U.., bascfJ .... ~ rnerrt>-ar.., (I'M) p erim<.~~~. 35 rroeasu-cd by ao. 'lorna1ed ..-.::w¡~ 'OlrT"<.~oy. lliO"> ar ~ l \(."f1ica! mes are ,...,..., 
±SE 01 n m6 P'" 91"'" ' P < 0.01 (tq>:Wed SIu<b"i'<He<Q_ 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
-  84  - 
AIv~rez - s..mos '" 01. C/iniwlOrtd rransbrio<>d AJJorgy (201 S) 5:14 P;oge 10 cA 13 
A) 
Asthma model 
B) g * 
Lung 
vascular 
smooth 
mucle 
C) 
• w 
~ 35 
~ '" 
~ Ci 25 
• I 
tE", • E 
.2 - 15 
* 10 
¡¡¡ ~ 
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Control 
O) 
• , 
• • • ~ 
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• E 2-S • e 
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Asthma model 
-" • • • 
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> 
g> , 
~ 
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" 
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• 
• 
• , 
• 
Con." Asthma model 
F~ 7 Re ~ sentative hisl oIogiaol k!<>turfl of Iung vaKUl¡or $_h rnusdes in • g .... nea pig ,,'Ie<gi( asthmil lI'IOdo!I. A) Low-p:;>'I'<'Cr 
micrograph (l a.) from ti-.. k.<q; 01 control aod a<;lJuna modeI ~ pig< <.howing. brooch", and "" "'1"'''''''. Nole t"" extern;"" VOOOIh 
musde (SM) area in ti-.. asthma modeI arter""". SI /Vea el arteriole $M Iay>r, '" l1l&lSIJ"ed b¡ autormted ~ry (fl ~ 6 per 9''''4'). Q Sy;Iemc 
aneri<ll ¡o-~e ",Id D) 1:Urmnaty an<)ri¡,l ¡o-e,;o..es (fl = 4 .. Id 8 gI"nCoJ pig< Í'\ «<\Uol arld aslhma rr.:del <)'OIop, repediYelyl. l\;Ir; and .... "'ical l. e 
are mean ± SE ' P< 001 (uopaiIed Sluderi'<He<t) 
was inversely correlated with airway smooth muscle 
caveolin-I (r ~ -0.5 17, p < 0.05: n ~ 13), implying that a 
greater number of cells positive for caveolin-l corre-
sponded to greater antigen-induced airway responsive--
ness. In addition, the Rmax correlated with the number of 
cells positive for caveolin-l (r ~ 0.691, P < 0.01: n ~ 13), in-
dicating that antigen-induced airway obstruction is dir-
ectly associated with caveolin-I in airway smooth muscLe 
cells_ 
Western blot anal)'5is dctected two specific bands for 
cavool in-¡ at approximately 18 to 20 kDa, and the ex-
pression of both bands increased in the experimental 
group (Figure 4<:: n ~ 3 all groups). In addition, cavins 1, 
2 and 3, a group of proteins that, along with c:weolin-l , 
regulates caveolae org:misation and function (3), were 
found in controls but were more highly expresscd in the 
experimental group (Figure 4<:: n ~ 3 in all groups). Pre-
viously, cavins 1, 2 and 3 have been found to increase in 
the airway smooth muscle of ovalbumin-sensitised mice 
[7]. Although the role of cavins in asthma is unknown, 
TNF-Il induced the upregulation of cavins in airway 
smooth muscle, suggesting that inf1ammation may regu-
late cavin expTCSSion (39]. 
lmmunohistochemiod images did nol reveal notice-
able changes in caveolin- I staining between controls and 
asthma model groups in airway smooth muscle or par-
enchyma (Figure 5; n = 6 all groups); nevertheless a 
strong reduction of caveolin- I expression in vascular 
smooth muscle of the experi mental group was observed 
in comparison with controls (Figure 5). In view that only 
pulmonary vascular smooth muscle showed a strong re-
duction in caveol in-I expTCSSion in asthma model, and 
the other structures d id nol exhibit changes, it is pos-
sibil' that the intense decrease in caveolin-I mRNA 
levels in total lung homogcnates (Figure 4A) of the 
asthma model was likely produced by the downregulation 
of caveol in-I in this smooth muscle. 
Airway and lung vascular $tl"looth musc:1e structure 
Airway remodelling has been proposed as an important 
factor associated with caveolin in the development of 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
-  85  - 
AIv~",z · Sant'" '" 01. Clnit;alond rran,brional A&rgy (201 SI 5:14 
airway hyperresponsiveness. For example, in a previous 
study 123] of a model of chronic asthma in guinea pigs 
(nine antigen chalJenges), we found an association 
between subepi thelial fibrosis and airway hyperre-
sponsiveness. Caveolin- l contributes to remodelling 
by producing suppressive effects in airway smooth 
muscle proliferation [9], likely through the inhibition of 
constitutive p42f p44 MAI'K act.ívity [40] and by inducing 
type 1 coUagen in lung tissue 151. Airway hyperresponsive-
ness is a ooosequence of airway remodelling induced by 
the lad of caveolin- l in knock·out mice [7, 11 ]. 
To evaluate airway remodeUing in guinea pigs, Masson 
trichrome staining was used to distinguish airway and lung 
vascular smooth musde layers based on their strong red 
..c 
(J 
e 
Control 
e co Asthma 
model 
(J) 
Control 
Q) 
(J) 
(J) 
Q) 
> 
01 
e 
Asthma :::J 
--' model 
P"9" 11 of 13 
cytoplasmic staining (figures 6A and 7 A). Automated 
morphometric analysis of smooth musde mass and sube-
pitheliaJ fibrosis of broochioles and bronchi did noc show 
significant differef\Ce5 between control and asthma rnodels 
(Figure 6B and C; n = 6 in OOfltrol and n = 7 in asthma 
model groups). In addition, we did not observe an associ · 
ation between the degree of hyperresponsiveness and the 
leve! of subepitheliaJ fibrosis (r = 0.25; n = 13) or airway 
smooth muscle mass (r " 0.18: /J = 13). Nevertheless, 
widen ing o f the airway adjacent vessels was observed 
(1' < 0.05; n = 6 per group; Figure 7 A and B). The total 
numbers o f smooth muscle nudei in bronchioles in the 
experimental and control groups were similar (29 ± 2.3 
and 28 ± 2.5 nudei, respectively; n = 6 per group, data 
figure 111 Immu~na mi<.ToKOpy showed .. .;gniflCillnl reduced fluoo-_l . tilining lo, c.spilse 3 in smooth mu.d .. from 
bIood vessels. L...-og li,....:: St.'<:I"",, hom <¡"iroe.¡ pig ....e<e ir-.:ubalcd "'lh ,abbi1¡JOIy<:Ion¡II a'lI-QI;pil>e 3 ",'ub:xly. fo/klw<.'<J by ATe -lilbcled 
goal anli ,obbit 19G. N udo ~ """" cocnI{J1lained ",m DM aM lhey .. e """""' in bIue. Caspase 3 polO"'" (apoplOli<) ceIs are !.OIormtj distributcd in 
bronchi .,;tlu in ~ from rro::Id iI5I:hmi! or rorooIluppcr p.Jn<.+; """""'-'d by -lO:< mognJlC<lIioriI '" weI .s '" thxl ..."..,¡ horn cootrd (rroJilm 
1).J ,Id. 20x rnagnifrcallon).ln C OO lr~t a 5J9'\ifo:ar>1 deo~'ilse o( apoplolic ceII, '\ bIood "" ,;el smool h rnusdc ceI> 1> ob5erwd In a:;thrna 
",odet Reptesentilli"" 1""'9'" o( al 1eas1 1,,", Indepeodenl ex"","""",,,," • a:>r'~ lo sroooIh "'u,de bar-.ls In btonchi aro lung ""'~ 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
-  86  - 
AIv~",z - Sant'" <t 01. Clnicalond rranwrio<Jal AlItrgy (201 SI 5:14 
not ilIustrated); however, an increase in the numbcr of 
total smooth muscle cel1 nudei from airway adjaomt YeS-
sds was ob5ervcd in experimental guinea pigs comparW 
with controls (SI J: 10.4 and 12 J: 1.2 nude i, respect-
ivdy; P<O.OI; n = 6 per group, data nol shown). In 
addition, caspase 3 express ion determinate by immuno-
fluoreseence in bronchi smooth musde d id not show 
noticeable change in asthma modd and control groups; 
nevertheless, an evident dirninution of caspase 3 ex-
pression was observed in lung smooth musele from 
vessels in asthma model group (n = 2: Figure 8). lt sug-
gests that apoptosis is inh ibited in vascular smooth 
musde in asthma model, a tissue that also shows a dee-
rement of caveolin-I expression (FiguTl' S) and an enlarge-
menl of tissue area (Figure 76). According to the aboye, 
these find ings are in agreement with the antiprol ifera-
tive and proapoptotic effects induced by cavrol in-] ob-
served in almost cell types [41]. Then, in condusion 
these results suggest tha t pulmonary vaseular smooth 
musele, but nol airway smooth musele, is capable to 
show remodelling changes in acute asthma modd in 
gu inea pigs and thal caveol in-I is assodatcd with this 
phenomenom. 
Arterial pressure in asthma model 
A fcature of the contractile, but not proliferative, airway 
smooth musde phenotype is the abundance of caveolae, 
suggesting that caveolin-¡ may have an inhibitory role in 
airway smooth musele proliferation [9]. In contrast, the 
intense diminution of caveolin-I observcd in smooth 
musde from airway adjacenl vessels in experimental 
guinea pigs appea rs to be related to the increase in pro-
liferation. In th is sense, it is known that cavrolin-I has 
a fundamental role in regulating the proli feration of 
vascular smooth musde [421. In mice, the absence of 
caveol in-I has been shown to modify arterial filling and 
increase pulmonary vaseular resistance [43). To deter-
minate the putative physiopathological efreet of vascu-
lar smooth musde hyperplasia on our experimental 
guinea pigs, systemic and pulmonary arterial pressures 
were evaluated. The experimental and control groups 
did not show differences in systemic or pulmonary ar-
terial pressures (n = 4 in control, and n = 8 in asthma 
group; Figure 7e and D). Vascular smooth musele 
hyperplasia is observed in asthma patients [44). but this 
hyperplasia is unrelate<! to pulmonary hypertension be-
cause it indudes not only hyperplasia of the smooth 
musde but a1so enhanced vascular contractility and im-
paire<! vasodilation [45[. 
Conclusions 
Qur results suggest thal the development of antigen-
induced airway obstruction and hyperresponsiveness is 
associatcd with caveolin- l expression in airway smooth 
musele in a guinea pig modd of asthma. It appears tha t 
the model induces the development of two different 
phenotypes, one contradile in airway smooth musde 
and the otller proliferative in pulmonary vessels. In 
add ition, although the asthma model induced a strong 
cavool in-I downrcgulation in vascula r smooth muscle ac-
oompanied by m)'QC)'te proliferation, this pl>enomenon 
d id not induce pathopnysiological consequences such as 
changes in arterial pressure. 
C<>mpeOng int~ 
lhe 0UIh0r> ded>o"c 1ho1 thcy """" ..., o;omp<"Iir-.¡ ino:CfCS\~ 
"""-" <:<>ntRbo.nóotI. 
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doto. 8IIP ond l<Wl ~ o:he <:t>to. IIBP ~ d ond desigocd o:he 
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...........,.;p(. 
Aduoo""edge"""'1O 
M¡r¡r¡o AIv¡wcr$oRo;Ol WiOS ""WO'1oo lo< tos goo\lOCe >lOO'" b\I !he Posgo-ildo 
en ~ ~ ~ /Ib"jo;n¡oI o\l.WrIorm de Mé<ico (tWIM),nI 
CONACyl fo< prcMdir-.¡o scho/iorship nombcr l'J'I107. W<I. thonk 1n,' itulO 
~ de f nfc'mc<lodes IIc>pirolo<'" 10< lhe """""",i<: "-'PP"'1 gi"", 
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CosIo III ~ Gbada de 11.>Ip¡on 4501. """"i<:o. ~ Phy>ioIogy Unit 
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Mé<i<;o. México, -. """ilUtO ~ de CicncioI ~ y No.~ rió6r0 
~ Zul;Wón. Del""'''''''''' of NcpIvol<og)', ~ """"i<:o. 
f\eceive<l; 22 December 2014 Ac.cepted 7 Morth 2015 
Publi,hI.-.J ooli",,: 26 Marclt 20 15 --80Jc M. DluriIo M. vrIl M. 8OJco.\l M. ~~ <1 b-Oto<toiaI 
. !Itrno. Ard> ...........,. 1her bp (Wors>l. 2O"»;57:3J1-44. 
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9. I~ AJ. T' .... T. Go\ens " P!>enoo:ype ..-.J rlO"alonirl ~ ¡;J -..y 
smooo:h ~ role d GIWOIoe ..-.J """"'*". Proc Arn ThoIac Soc 
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The role ¡;J GIWOOr> 1 in puIn>oro.yy maIri:oc ,emodeIing ..-.J ~ 
propett .... Arn J PhysioIlUf'9 e .. Mol PhysioI. 2IDI;295i 1007-101 7 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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AIv~rez · Sa nt '" <t al Clnicalond r ra"sbrional AlItrgy (201 SI 5:1 4 
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musde. Am ) PIY¡'Si<II L..-.:¡ Col Mol Physiol 2OO1;29l:l11 18-1 1./6, 
la 1-b:'1te< l N""" G. S",n'" comp"",,..,r.al" '''ion "n,,,,,,, neao<i< f"""" 
{Thf)~,. I~ ligniIIir>¡:¡ pathwoy< in hr.rnon airw~ smooth 
musde """'-lipid ralt, are """"'i.lIlor ~ _ion á 
li>oii buI ~ for !he a<:t¡" .. ion á the ~ and MM1( 
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35, SI'oona p. G/>ir.tarnI S. ~ GL M<Neil KO, M"~ MM. ~ T. 
O! al. beQ{)y>t,og/)gn binds GM'oI in·1 in smootI> ~ ~ 1...-.:1""'" 
role in «M'OIae <istrnJtion..-d ca:>. "'""'" J CeI Sd. 2010;121Jl»I-1O. 
.l6. BriQIlr:Iir'9 c. Broy M, 1Vw ... y, Taro;¡e\ir'g TNF-o!pIw; a """" the<opeutic 
owroad> lar ostIvna, J I<krg¡ On """""""- 2(ffl1215---10, """'1-12 
37, SolIVsh V. Abc:ojo AJ, V....oost,-", SIl; Thornpson ....... I'ral;ash YS, PdbeId. 
CM úYroIin-l in <)'IOkine-i<do::ed enI>inc'-"""'l1 "inlracelrJar OO.) in 
............ ~ ~h musde. Anl J PI>fSIoIloog Col Mol Physiol 
201IJOI :l607---6H, 
.l& So1hisI\ V. Viii\/) 8, MeocheI LW, V~'-'" SIl; ~ AJ, Thompsot¡ 1M. <'1 al 
c...eoIin 1 ..-d force reguLxion in pcwóne ~ smootI> musde. Am 
J PI'tysIoI Lung CeI Mol Physlol20ll JOO;l920-929. 
39, SolIVsh V.lhorn¡,.,.-, ....... so+.. So <;;edc GC. I'ral;ash YS, PdbeId. CM 
inIIammation. GIWOIoe..-d CD38·mro.tro caIcIum fI'gUIaOOn in ............ 
~ \lI'IOOlh """"",, 8iochim BiopI>fs """,, I&0;2014J46---51 
-10. Gosens" Dr.Jed< G, GeI1I'd1e< wr. Urvuh H, laiIgIrna J, Meuro; 1\ O! ... 
~~ I.W' 1Onasea<:t¡"'nKln i< _ ,o~ r ""~_ 
<kmlir>s in ~ smootI> musde. Anl J PI'r)'IIoI L..-.:¡ CeI Mol Physiol 
2007-292;1.1 163----1 172 
il Jin y, Lee SJ. MInshaI RO. CI>oI AM. c-oIin-l : a altical reg..Iat,. á Irs>g 
irj.Joy. MI J I'IrysioI L..-.:¡ Col Mol Physiol201IJOO;lI51-lffi 
i2 Seó:ing !Xi, EIr<un--OuAaeul oc. c-.l: dual role ro. proIt"'''KIn á 
."",""" \lI'IOOlh .-....or. «'1< TrencI< Ülrclio<a>c Med. 200'>;1650---5 
il Mania,~ w., Shi<WI V. S<l>rarlnilgel OC 0I:adiI S. V"'J'I SM. MiI/iI;, Al!, '" al In"",.sed ~.""""", resistance..-d _ ~ artery 
flling in ~I-I- "'""'. Anl J PtrysioI Lung c.II MIj 1'tIysioI. 
21nI;l'J.4i865---f113 
+1 ~ LM.1:aniIbar V. Sharma lIS. We<.tergren-Thorsson G, tar,,,,,,-
C*l1", M Pulmonary .. soL>r c/\ange' in .,1IvniI ..-d COPO, Pt.1-I! 
I'I>aJrM<OI Thn 201-1. 
iS 'fllclit P. MoIeoJar rne<hani<rn< á pulmonary """"""""""" Oin Oim Acta. 
2009,1019---16. 
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· Con""'" ........ lUbmiuion 
• Thooough - ---
• No ~ _1IInU or",," figIn r;haveI 
• _ ..... publkatlon on ...".,....,. 
• lndusIon in PuIJfMd. CAS. S<opus _ Goouh ~ 
• R-w. ......... /s fNooIy .... 11 ... fo< ..... trll>ouIIon 
Submtt,..... """"Kript .. _._ ... """"'-'-
 
 
ANEXO II: ARTÍCULO REQUISITO II 
________________________________________________________________________________________ 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
-  88  - 
ARTIeLE ••• , •• 1.1 Callular 
Biochemistry 
Airway Hyperr~sponsiv~ness in Asthma Mod~1 Occurs 
Ind~p~nd~ntly of Secrdion of ~ 1 Int~grins in Airway Wall 
and Focal Adhesions Prot~ins Down R~gulation 
Mayra Átvarcz-Sa ntos, I Verón ica C arb a~aV Olivia Tcllez-J iméncz, 1 
Erasmo Mart r n ez - C ord c ro . ~ Victor Ruiz. Rogcllo licrnándC7.-Pando,4 
Ricardo Lascurain ,~ Alfredo Santibañez-Salgado,6 and Blanca Bazan-Perkins 1o 
'lkJtIo" ...... "o ,¡~ /U,."...m1ÜM B ",otqIIw, IN<I;rMfO N.o"; ...... , u ENf tftlltdars Rr:<piN¡ ...... I . .. d ('o.ío 
VI/ •• e./t_ do' T1.,.N 4S02. ( 'oS. S..m'6N XVI, Alúiro VP 14080, Mt.rk'/) 
·lI<'poI" ..... "o IIr E'Ifmoo"" ..... CniNicG-o..,nomlliwu:. ".,IiNIO N..no""l lIr E~ ,.. .. '¡ .. ,O .... I . .. rl 
C",d" Vil,.... ... C.IzU.o« n .. ,.. 4S02. Col. s..riblr XVI, Ubiro ,JI' / 4080. Alúko 
" ....... 10 ... « 8;0/"'" Mol ...... ,.,'. Iru¡jlMlo Noori ... l llr f:'IfrntI ..... Nr.,; .. toria< b _ rI C",Í<t Vi' • • 
e.lz""" 11. n.o,... 4Slll, Col. Sm-Ui. XVI, AlrIku Vf' 140!U.1, M¡'.rico 
'Vrp.<t ...... ¡O 11. ''''ologl. EqnI_. I, , • • ,IIMIO Noori_l llr CInfi • • /lfUir..y NMlririoloo. V ~ 11. Otoi .. 
/ 5. "'"ril'o f) f - liooo, Wnc-o 
·,Ñ7"" ...... to IIr m.,..¡ .. INo, UorfttNJl4MI N..n ... ¡ AMI __ « Mt.r/..", Mfxü-t. /JI' 70159. ""'xü-t. 
"lunlMlo N.m..1 ti. h fr .... ..sun 1I ... 'i .. l ........ "_1 Co.<Ío ViII ....... Ca,""" ti. na,.. 4501. Col. s.móoo 
XVI, Mtn.." /JI' 1f0/IIJ. Mr1iro 
ABSTRACT 
Th< .. 'D<YIlul" do""in. of IIOme memb .. "" pro'ein. oon b<.h<d fro .. ,ho ... 11. A . imil .. phenolll<oon O<'N., .. ilh 111 inl .. nn. (u I p I 
, nd ft!II') In ~uln<, pi!!. lb< pul"i •• ,01, oflll In'<Rrln .ubunl, , llc",Hm. d.,.. '0 .h«ldinM In ,I""y .moolh mus<k" (ASM) In ,n 
,1I'rgi< .. ,hm. mod,1 w .. o •• lu",OII , U.ln .. pigs .. o ...... n. i'i ,od .nd <hallonMod .. i,b , n'i~<n . Anri~,nic rh.llonM'" indu«d 
bronchoobs'ruclion ,nd hypcm:.p:m,IV1On"", o, ,n.: ,hinl , n,IM<o;" <,,"II<nM<. Im,"unohi"oclKmis'!)' and Immunocl"" ronmi<.o><opy 
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