0 |FORMATO PARA LAS PÁGINAS 1 Y 2 DEL TEMA ESCRITO (Versión preliminar y definitiva)ANEXO II PASTA Y PÁGINA 1 (versión definitiva) (Escudo UNAM ángulo superior izquierdo y escudo F.Q. en ángulo inferior izquierdo). UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA T E S I S Producción de híbridos mejorados de P. ostreatus de color claro, estípites cortos y portadores del gen asporógeno QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE QUÍMICA DE ALIMENTOS PRESENTA MARICRUZ ZUÑIGA GARCIA CIUDAD UNIVERSITARIA, CD. MX 2017 1 JURADO ASIGNADO: PRESIDENTE Profesor: HERMILO LEAL LARA VOCAL Profesor: GUILLERMO ANTONIO SEGURA ESPINOSA SECRETARIO Profesor: SAMUEL CANIZALES QUINTEROS 1er. SUPLENTE Profesor: NORMA ANGELICA CASTELLANOS CHAVEZ 2° SUPLENTE Profesor: GENARO JIMENEZ REYES SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: FACULTAD DE QUÍMICA, DEPARTAMENTO DE ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA, CONJUNTO “E”, LABORATORIO 324, UNAM ASESOR DEL TEMA: __________________________________________ DR. HERMILO LEAL LARA SUPERVISOR TÉCNICO: __________________________________________ DRA. REBECA RAMÍREZ CARRILLO SUSTENTANTE: __________________________________________ MARICRUZ ZUÑIGA GARCIA 2 AGRADECIMIENTO A Dios Por haberme permitido llegar hasta este punto tan importante de mi formación profesional y haberme dado salud para lograr mis objetivos, así como los triunfos y los momentos difíciles que me han enseñado a valorar cada día. A la Universidad Nacional Autónoma de México Por permitirme ser parte de la mejor universidad de México y por abrirme las puertas de la Facultad de Química la cual no solo me lleno la cabeza de conocimiento, también me dio la oportunidad de conocer gente maravillosa. A mis maestros Al Dr. Hermilo Leal Lara por su valioso asesoramiento para la elaboración de esta tesis. Por compartir conmigo su conocimiento y por su ayuda brindada. A la Dra. Rebeca Ramírez por su gran apoyo, paciencia y motivación para la culminación de mis estudios profesionales, por su sincera amistad y sus consejos. Y finalmente a los maestros, aquellos que marcaron mi camino durante este tiempo. A los miembros del jurado Dr. Hermilo Leal Lara Prof. Guillermo Antonio Segura Espinosa Dr. Samuel Canizales Quinteros Profa. Norma Angélica Castellanos Chávez Prof. Genaro Jiménez Reyes 3 DEDICATORIA A mi mamá Roja Por darme la vida, quererme mucho, creer en mí y porque siempre me has apoyado en todo momento, por tus consejos, tus valores, por la motivación constante que me ha permitido ser una persona de bien, pero más que nada, por tu amor y por ser la madre más perfecta que puedo tener. A mi papá Juan Por ser el único hombre que siempre me adorará incondicionalmente, por ser un pilar fundamental en todo lo que soy, por tu incondicional apoyo, por el valor mostrado para salir adelante y por ser el mejor padre que puedo tener. A mis hermanos Omar y Mayra A ti Omar porque siempre serás mi mejor ejemplo para salir adelante, por ser mi hermano mayor del cual aprendo mucho y porque siempre estás en los momentos difíciles, a ti Mayra por estar conmigo, apoyarme siempre y darme tu cariño. ¡Los quiero mucho! Y espero se sientan muy orgullosos de mi, así como yo de ustedes. A mi Cuñada Mati y mis sobrinos Gretel, Dulce y Juan Por el apoyo que siempre me brindan día a día, y a mis sobrinos, para que vean en mí un ejemplo a seguir. A Dany Por ser mi compañero de vida, por dejarme lograr mis sueños y por quererlos lograr a mi lado. Porque gracias a ustedes, he logrado cumplir esta meta. Por ser mis más grandes motivos de vida, les dedico este trabajo. Mary “Por mi raza hablará el espíritu” 4 I. I. ÍNDICE 1 Resumen……………………………………………………….................. 6 2 Introducción…………………………………………………..................... 7 3 Antecedentes………………………………….……………….................. 8 3.1 Características y generalidades de P. ostreatus………………………. 8 3.1.1 Clasificación taxonómica del hongo Pleurotus ostreatus…… 8 3.1.2 Morfología de Pleurotus ostreatus…………………………….. 8 3.1.3 Ciclo reproductivo de Pleurotus ostreatus…………………..... 10 3.1.3.1 Ciclo de Basidiomycetos…………………………….… 10 3.1.3.2 Formación de fíbulas…………………………………... 11 3.1.4 Hongos comestibles cultivados............................................... 13 3.1.5 La importancia de los hongos………………………………….. 14 3.1.6 Factores que influyen en el rendimiento de Pleurotus ostreatus.….. 16 4 Justificación, objetivos, hipótesis………………………………………... 18 4.1 Justificación………...………………………………………….................. 18 4.2 Objetivos generales……………...………..…………….......................... 18 4.3 Objetivos particulares……..………………..……………........................ 18 4.4 Hipótesis……………………………...……………………....................... 19 5 Metodología…………….…………………………...……………………... 20 5.1 Esquema experimental…………..……………………………………...... 20 5.2 Material biológico……………………………………………………......... 22 5.3 Preparación de medio de extracto de malta agar (EMA)……………... 24 5.4 Resiembra y propagación vegetativa del micelio…………………….... 24 5.5 Apareamientos…………………………………………………………….. 25 5.6 Evaluación del desarrollo vegetativo de cepas parentales, híbridas y neohaplontes………………………………………………………………. 26 5.7 Fructificación de cepas parentales e híbridos………………..………... 26 5.7.1 Inóculo de grano……………………………………………….… 26 5.7.2 Determinación de humedad de componentes principales del sustrato………………………………………………………….... 27 5.7.3 Determinación de máxima capacidad de retención de agua de componentes principales del sustrato…………………...… 27 5.7.4 Preparación del sustrato……………………….………............. 28 5.7.5 Condiciones para la fructificación………………..….……….… 29 5 5.7.6 Cosecha de hongos……………………………...……………... 29 5.8 Obtención de esporas…………………..…………………...………….... 30 5.8.1 Método directo…………………………………………...…….... 30 5.8.2 Método de diluciones……………………………………........… 30 5. 9 Análisis estadístico……………………………………………..…………. 30 6 Resultados……..…………………………………………..………………. 31 6.1 Selección de híbridos para fructificación……………..……………….... 31 6.1.1 Caracterización y selección de los neohaplontes de la cepa “PSma”…………………………………………………………..... 31 6.1.1.1 Clasificación de los neohaplontes en tipos de compatibilidad……………………………………………………. 32 6.1.1.2 Evaluación del desarrollo vegetativo de neohaplontes y cepas regeneradas de PSma……………….. 35 6.1.2 Producción de híbridos……..………………………………....... 38 6.1.2.1 Apareamientos de neohaplontes de cepa PSma con monocariotes y neohaplontes de P. ostreatus y L. edodes..…. 38 6.1.2.2 Apareamientos de neohaplontes de cepa asporógena PAsp14 con neohaplontes y monocariotes de cepa PSma y de P. ostreatus………………………………….. 42 6.2 Fructificación de híbridos seleccionados……………….…………….… 49 6.2.1 Cepas parentales e híbridas……………………………………. 49 6.2.2 Fructificación…………………….……………………………….. 51 6.2.3 Cosecha de hongos y análisis de resultados………………… 55 6.2.3.1 Productividad de las cepas del lote 1……..……….... 56 6.2.3.2 Productividad de las cepas del lote 2………………... 60 6.2.3.3 Productividad de las cepas del lote 3……….……….. 64 6.2.3.4 Productividad de las cepas del lote 4…………..….… 69 6.2.3.5 Productividad de las cepas del lote 5…….…..……... 74 7 Discusión……………………………………………………………….…... 81 8 Conclusiones……………………...……………………….…………….… 82 9 Anexo……………………...……………………………………………….. 85 10 Bibliografía……………………………….……………………………….... 119 6 1. RESUMEN El cultivo de hongos comerciales es una actividad que se desarrolla en diversas partes del mundo. En América latina, específicamente en México Pleurotus ostreatus es un hongo cultivado a pequeña y gran escala. Una alternativa para desarrollar cepas mejoradas puede ser por medio de una separación artificial de los núcleos que componen una cepa original, para desarrollar híbridos por apareamientos de sus componentes monocarióticos (neohaplontes) con distintas cepas monocarióticas. El objetivo de este trabajo fue desarrollar híbridos mejorados a partir de dos cepas de P. ostreatus. Se partió de la cepa PSma con signos de degeneración que produce esporóforos de color blanco, estípite corto y actualmente ha decaído su buena eficiencia biológica y de la cepa asporógena PAsp14 que produce altos rendimientos en tiempos cortos de producción. Se produjeron híbridos de estas 2 cepas y de otras cepas de P. ostreatus con características apreciables para el cultivo comercial. Se aparearon 2 neohaplontes de la cepa PSma, representantes de los 2 tipos de compatibilidad con mayor velocidad de crecimiento micelial con: 5 neohaplontes de la cepa PAsp14, 5 monocariotes y 3 neohaplontes de P. ostreatus y 1 monocariote de L. edodes para seleccionar híbridos con mayor velocidad de crecimiento micelial. Las cepas seleccionadas se llevaron a fructificar, los cuerpos fructíferos se cosecharon durante 15 semanas registrando el peso para cada réplica. Con estos valores se calculó la producción semanal, producción semanal acumulada, eficiencia biológica (EB) y eficiencia biológica acumulada (EBA). Con los valores de EBA obtenidos para cada cepa se realizó un análisis de varianza para determinar la semana donde se obtuvo el rendimiento máximo significativo (RMS). Se seleccionaron de 11 híbridos fructificados 4 cepas híbridas que presentaron los mayores valores de EBA al RMS (95.5 a 102.8%), además de que formaron cuerpos fructíferos de coloración clara y con baja producción de esporas. Con los resultados obtenidos en este trabajo se concluyo que algunas de las cepas híbridas con mayor velocidad de crecimiento micelial también producen mayores EBA en 10 a 11 semanas similar a la cepa parental PSma (10 sem), manteniendo las características morfológicas deseadas además que estas cepas cuentan con EB cercanas a las cepas de la iniciativa privada que están alrededor del 80% como máximo. 7 2. INTRODUCCIÓN La producción comercial de Pleurotus spp. es una actividad relativamente reciente, en 1917 Falk fue el primero en reportar el cultivo de este hongo en trozos y en troncos en Europa, en los inicios del siglo XX. Este tipo de hongo se destaca por su aceptación en el mercado y un crecimiento rápido en la agroindustria, debido a que puede ser cultivado en cualquier latitud siempre y cuando se garantice las condiciones para su crecimiento y cultivo, las tecnologías disponibles varían desde muy complejas a simples (Curvetto et al., 2005). En América Latina y especialmente en México, el cultivo de hongos se encuentra muy poco desarrollado a pesar de la potencialidad que existe para cultivar hongos, que se desarrollan en forma silvestre en las regiones boscosas, crecen alrededor de 200 especies de hongos comestibles, las cuales se desarrollan cada año de manera abundante en la época de lluvias. (Villaseñor, 1997). El cultivo comercial de las especies de Pleurotus spp ha experimentado un gran auge debido a que tienen una calidad morfológica y organoléptica (color, olor y sabor) excelente (Guzmán et al., 1993), crecen sobre una gran diversidad de sustratos en un amplio intervalo de temperatura, son fáciles de cultivar, además de que para la instalación de naves para su cultivo se precisa poco capital inicial. Por ello, su cultivo resulta más sencillo que el de otros macromicetos conocidos y permite apreciar de manera directa el impacto benéfico de cultivar hongos para el aprovechamiento de desechos agropecuarios (Sánchez y Royse, 2001). Es probable que la producción comercial de Pleurotus continúe incrementándose en el corto plazo, por las siguientes razones:  Existe un gran número de especies potencialmente cultivables  Las tecnologías de producción son relativamente sencillas y de bajo nivel de inversión  Se han desarrollado cepas comerciales con amplio intervalo de temperaturas de fructificación y sustratos de cultivo  Las fructificaciones son bien aceptadas por los consumidores en muchos países (Bano y Rajarathhnam, 2004; Martínez-Carrera, 1998, Chang y Miles, 2004, Martínez-Carrera, 2007). 8 3. ANTECEDENTES 3.1 CARACTERISTICAS Y GENERALIDADES DE P. ostreatus Pleurotus ostreatus o seta ostra como se conoce comúnmente, es un hongo saprófito o parásito débil, descomponedor de madera, crece sobre residuos de material leñoso o ricos en fibra como troncos, ramas y bagazos (López et al, 2008). Estos hongos degradan el complejo lignocelulósico que forma parte de la pared de los vegetales. Es un degradador primario o colonizador, ya que inicia el proceso de degración. Según CODEX STAN 38-1981, se entiende por hongo o seta comestible los frutos pertenecientes a un grupo vegetal específico –fungí- que crecen en estado silvestre o que se cultivan para después utilizarse como alimento. Se calcula que existen cerca de 25,000 especies de hongos, entre las que pueden encontrarse variedades micro y macroscópicas. Estos organismos están constituidos por una fase vegetativa (micelio) y otra reproductora (cuerpo fructífero) (Quintero, 1987). Pleurotus ostreatus crece en forma escalonada, en racimos. Su sombrero tiene forma de ostra, su color varia de marrón claro a marrón oscuro y mide entre 6 y 20 cm. Las láminas son de color crema apretadas y lisas. El pie o estípite es muy pequeño o está ausente y se inserta en el borde del sombrero. Su carne es blanca con sabor agradable y su textura es firme (Ciappini et al., 2004). i. Clasificación taxonómica del hongo Pleurotus ostreatus Pleurotus, término que deriva del griego pleurá o pleurón (costado o lado) y del latín otus (oreja). Gaitán, R., et al., (2006). Reino: Fungi Familia: Pleurotaceae Filo: Basidiomycota Género: Pleurotus Clase: Homobasidiomycetes Especie: ostreatus Orden: Agaricales 3.1.2 Morfología de Pleurotus ostreatus 9 Los hongos macromicetos están conformados principalmente por los siguientes elementos (Solomon et al., 1996):  Sombrero o Píleo: es la parte superior del carpóforo, puede presentar una amplia gama de colores, tiene la forma de paraguas, que en general mide entre 6 y 20 cm de diámetro, en ocasiones alcanza dimensiones mayores, es redondeado con la superficie lisa, abomba y de crecimiento excéntrico. Evoluciona de liso a convexo y posteriormente a plano convexo, es sostenido por el pie, ejerce la función de protección en la formación y desarrollo de las esporas. Figura 1: Estructura de un cuerpo fructífero  Cutícula o Pellis: membrana exterior (observable a simple vista) que recubre el sombrero y el pie del carpóforo, compuesta por una o varias capas. Su función es proteger el hongo de los posibles agentes externos.  Himenóforo: parte inferior del sombrero, sostiene el himenio que es la capa fértil (láminas, poros, pliegues, etc.) donde se encuentran las esporas de origen sexual de los hongos. En los Basidiomicetos está compuesto de basidios, basidiolos y cistidios.  Píe o estípite: es la parte del carpóforo que sostiene el sombrero o el himenio en general y permite que el Himenóforo quede a cierta altura del 10 suelo y así liberar las esporas. Las partes más importantes del pie son (Huertes, 2012) : Tamaño: suele calificarse con adjetivos como largo, corto, grueso, delgado, etc. Inserción en el sombrero: puede ser de 3 tipos; central, excéntrico y lateral. Consistencia: es variado y puede ser lleno, esponjoso, algodonoso, hueco, cavernoso, etc. Pero un detalle a tener en cuenta es que no tiende a permanecer constante durante toda su fase de desarrollo.  Volva: parte subterránea y membranosa que rodea la base del pie de algunas especies en formas de círculo, cónicas o libres, de pie esférico.  Anillo: es el resto membranoso del velo y situado bajo el sombrero después de abrirse, tiene como misión proteger el himenio y facilitar la maduración de las esporas. 3.1.3 Ciclo reproductivo de Pleurotus ostreatus El ciclo biológico y reproductivo de los hongos superiores completo comprende tres fases: la formación del micelio primario uninucleado, micelio secundario binucleado y micelio terciario con basidios o ascas. 3.1.3.1 Ciclo de Basidiomycetos Cuando una espora de un Basidiomyceto germina en las condiciones adecuadas de humedad y temperatura origina un micelio con células uninucleadas o monocarióticas con n cromosomas. Esta célula por mitosis, comienza a multiplicarse y forma un conjunto de células o filamentos llamadas hifas, que poseen un mismo signo (+ o -) o carácter sexual. Al conjunto de hifas se le denomina micelio primario, que es haploide y está formado por hifas del mismo signo. El micelio primario no es más que una fase fugaz y provisional en la vida de un hongo. Cuando se encuentran dos micelios primarios con distinta polaridad o signo se puede producir, bajo condiciones adecuadas, la unión entre células (se fusionan los citoplasmas, pero los núcleos permanecen separados) y se produce la plasmogamia, dando lugar a células binucleadas o dicarióticas y haploides. A este 11 nuevo micelio se le denomina micelio secundario. El micelio secundario presenta células con 2 núcleos sin fusionar (n + n) que permanece uno junto al otro cuando se alargan las hifas. El crecimiento diferenciado y entrelazado de las hifas del micelio secundario produce unos nudos o abultamientos, el primordio seminal, que dará lugar al cuerpo fructífero, basidiocarpo u hongo. Este crecimiento ocurre bajo ciertas condiciones ambientales y tiene lugar gracias a la continua agregación de hifas, denominado este proceso fibulación. Esta seta produce y crea un esporóforo, sobre el que nacerán las células fértiles (basidios). Solo en las células fértiles se producirá la fecundación por fusión nuclear (cariogamia), apareciendo un núcleo con 2n cromosomas; por reducción cromática, meiosis, aparecen nuevamente dos núcleos, la diferenciación de la célula ya es muy marcada, viéndose que es un basidio con esbozos de esterigmas. A esta fase se la denomina micelio terciario. Figura 2: Ciclo reproductivo de los hongos Basidiomycetos “Pleurotus ostreatus”. Adaptación de http://biblio3.url.edu.gt/Libros/2011/bot/19.pdf 12 Las fíbulas son ramas cortas en forma de gancho que se producen en la célula terminal (1). En el gancho se ubica uno de los núcleos y el otro permanece en la célula terminal (2). Luego ambos núcleos se dividen simultáneamente (3), y se forman dos tabiques, uno en el punto de origen de la fíbula y otro transversalmente debajo del arco formado por ella. Como resultado de esta tabicación se forma una nueva célula terminal con dos núcleos hijos de distinta polaridad, mientras que la célula subterminal porta un núcleo hijo interno y el otro contenido en la fíbula (4). Cuando la parte terminal de esta última se contacta con la pared de la célula subterminal, se disuelve y deja pasar el núcleo que contiene, quedando la célula subterminal con dos núcleos hijos distintos (5). Así, se originan dos células hijas cada una con un par de núcleos homólogos al par original (dicario) (Cabral et al, 2013). (1) (2) (3-4) (5) Figura 3: Formación de las fíbulas http://www.micomania.rizoazul.com/microscopia%20el%20himeneo%20de%20los%20basidio mocetos.html El basidio es una estructura que porta en su superficie un determinado número de basidiosporas (cuatro por lo general), que se forman a consecuencia de cariogamia y la meiosis. El basidio típico, claviforme y simple, se forma como la célula terminal de una hifa binucleada, que queda separada del resto por un septo sobre el que generalmente se crea una fíbula; inicialmente es pequeño y estrecho, pero comienza su crecimiento alargándose y ensanchándose. En su interior los dos núcleos existentes se fusionan (cariogamia), experimentando pronto este zigoto una meiosis que da lugar a cuatro núcleos haploides. En la parte superior del basidio se forman cuatro evaginaciones llamadas esterigmas y su ápice se agranda, formando los primordios de las basidiosporas. Una vacuola comienza a crecer en el interior del basidio y a medida que se agranda desplaza el contenido del basidio, incluidos los núcleos, a los primordios. En alguna ocasión se produce una división mitótica posterior, antes de que los núcleos entren en el primordio o después; en cualquier caso, las basidiosporas liberadas son uninucleadas, y si 13 disponen de dos núcleos en su interior, uno de ellos regresa al basidio (asturnatura.com). Figura 4: Desarrollo de un basidio típico. http://www.asturnatura.com/articulos/hongos/basidiomycetes.php 3.1.4 Hongos comestibles cultivados La producción de hongos es un proceso de reconversión ecológica, pues transforma materiales lignocelulósicos residuales en alimento proteínico y en mercancía para la venta. Cultivar hongos es un arte, como tal, requiere conocer técnicas y adquirir experiencia para cosechar. Muchos países han desarrollado estrategias de producción para abastecer tanto a los mercados locales como externos, lo que ha generado procesos productivos que prácticamente no se detienen durante todo el año y que aprovechan diversos desechos agroforestales como sustratos para el cultivo y transformarlos en productos mucho menos nocivos para el ambiente (Schiess, 2006). Los gobiernos han puesto mayor atención al descubrir que los hongos, de acuerdo con las investigaciones efectuadas hasta la fecha, son más nutritivos de lo que se creía antes, con una calidad y cantidad de proteína mayor a la de la mayoría de los vegetales y menor que la carne y leche. Por lo ello, la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO) ha recomendado que se establezcan programas de extensión del cultivo de hongos en los países subdesarrollados para reducir la deficiencia proteica de la dieta de sus habitantes y reducir la contaminación ambiental mediante la degradación de los grandes volúmenes de residuos del sector agropecuario que suelen generarse. Según Schiess (2006), en cultivos artificiales de hongos, se obtienen producciones de 3.1 14 kg/m2, cifra superior a muchos cultivos agropecuarios (por ejemplo, trigo: 0.27 kg/m2, carne: 0.069 kg/m2). 3.1.5 La importancia de los hongos En la alimentación humana, los hongos tienen un valor importante debido al aporte dietético (bajo contenido en carbohidratos y grasas), significativo contenido de proteínas (de 20-40% del peso seco) y vitaminas, que los coloca por arriba de la mayoría de vegetales, frutas y verduras. Adicionalmente resultan ser complementos deliciosos en las comidas por sus propiedades organolépticas (Tormo, 1996). Pleurotus ostreatus se caracteriza por sus propiedades organolépticas, reflejada en su aspecto, aroma agradable, utilización para la elaboración de numerosos platillos. El hongo ostra presenta variaciones significativas en cuanto a su composición química proximal. Dichas variaciones se ven afectadas por el sustrato, el método de cultivo, así como el origen geográfico de la cepa (Rodríguez et al., 2005). La Tabla 1 muestra la composición de P. ostreatus de acuerdo a varios autores. Tabla 1: Composición del carpóforo de Pleurotus ostreatus Componente Cardona, 2001 Cisterna, 2002 Rodríguez et al., 2005 Promedio Agua 87-93 88-91 90 89.83 Proteína 24.64-30.40 14.40-19.90 15.70-30.0 22.51 Grasas 3.1-9.25 0.8-2.0 1.5-5.0 3.61 Carbohidratos 26.33-30.46 51.6-62 50-57 46.23 Minerales 7.66-8.79 0.83-13.3 7.90-8.0 7.75 Fibra 32.14-36.81 13.70-15.60 8.5-14 20.13 Calorías* 345 300 150-350 298.33 *: Las calorías están expresadas en kilocalorías por cien gramos de peso seco del hongo, los restantes componentes corresponden a gramos por cien gramos de hongo seco. El contenido de agua esta expresado en 100g de producto fresco En cuanto a la industria farmacéutica y productos medicinales, algunos son elaborados a partir de hongos. La penicilina por ejemplo, es un antibiótico 15 bactericida derivado del moho Penicillium notatum, la cual actúa matando a las bacterias e inhibiendo su crecimiento. Otro caso particularmente interesante es el hongo lignocelulósico shiitake (Lentinula edodes) que en su composición contiene compuestos como el Lentinano y el KS-2 que poseen importante actividad antitumoral y anticancerígeno, además de activar el sistema inmune (inmunoactivador), ser un potente hipoglicémico, reductor del colesterol entre otras propiedades. Los hongos también están involucrados en diversos procesos industriales de fermentación (pan, vino, cerveza, etanol, ciertos quesos, etc.). Algunos de los más importantes son Saccharomyces minor (levadura del pan) y la levadura Saccharomyces cerevisiae (Ascomicetes) utilizada en la elaboración de cerveza, vino y producción industrial de bioetanol obtenido por fermentación de hidratos de carbono a partir de enzimas formadas por este hongo. También se utilizan organismos fúngicos en la elaboración del queso Roquefort y maduración del queso Camembert. En el caso de uno de los quesos más caros: el Roquefort, elaborado con leche de cuatro razas de ovejas, el ingrediente principal después de la leche de ovejas, es el hongo Penicillium roquefortii. Así mismo, en la producción industrial de ácido cítrico, este se obtiene mediante fermentación del azúcar por la acción del hongo Aspergillus niger. El ácido cítrico se emplea como aditivo en bebidas y alimentos para darles un agradable sabor ácido. Los hongos que crecen en substratos lignocelulósicos tales como la madera o la paja, excretan una mezcla de enzimas hidrolíticas y oxidantes que despolimerizan los componentes del sustrato, que según Sánchez y Royse, (2002) están constituidos esencialmente por celulosa (45 a 60 por ciento), hemicelulosa (15 a 20 por ciento) y lignina (10 a 30 por ciento). Algunos hongos comestibles, como los del género Pleurotus, tienen la habilidad de colonizar el rastrojo y degradar la lignina, además de la hemicelulosa y la celulosa contenida en el sustrato. Estos tipos de hongos son considerados como agentes primarios de descomposición porque son capaces de utilizar los desechos agroforestales en su forma natural sin que hayan sido sujetos a algún proceso de degradación bioquímica o microbiológica (Sánchez y Royse, 2002). 16 3.1.6 Factores que influyen en el rendimiento de Pleurotus ostreatus El cultivo de Pleurotus es aparentemente sencillo, pero es necesario manejar la gran cantidad de factores que condicionan su óptimo desarrollo y productividad. En la producción de setas del hongo comestible Pleurotus ostreatus influyen factores físicos, químicos y biológicos, y que le van a afectar dependiendo cual sea su etapa de desarrollo (Rajarathnam y Bano, 1987). En la Tabla 2 se muestran los factores que afectan el rendimiento de Pleurotus ostreatus. Tabla 2: Factores que influyen la producción de un hongo Etapa de desarrollo en el inoculo Físicos Químicos Biológicos  Temperatura  Humedad  Tamaño de partícula del sustrato Azúcar Fenol Contenido Lignina Celulosa Hemicelulosa  Viabilidad  Potencia del cultivo  Contaminación por otros organismos Etapa de fructificación Físicos Químicos Biológicos  Temperatura  Humedad relativa  Concentración de oxigeno  Cantidad de luz  Tipo de sustratos  Contaminación bacterial y viral La cepa PSma es utilizada en la producción local ya que presenta características importantes como ser una cepa blanca y con estípite corto pero actualmente presenta carpóforos pequeños lo cual ya no la hace atractiva para la producción local. Sin embargo la cepa asporógena PAsp14 presenta atributos apreciados como el color blanco grisáceo, carpóforos grandes y buena eficiencia biológica, aunque también muestra características no deseadas como estípite grande y consistencia quebradiza, así mismo las cepas monocarióticas de P. ostreatus (P412, PSec-n1g y PUap-n2g) que son las más representativas en el siguiente trabajo presentan características como muy fructificantes con pocas esporas y la cepa de Lentinula presenta características de cuerpos fructíferos de tamaño grande a muy grande de color café oscuro típicos del genero. 17 Por las razones anteriores la obtención de híbridos de la cepa PSma con los demás neohaplontes provenientes de las cepas antes mencionadas es para aumentar la posibilidad de obtener cepas mejoradas con características deseadas para el mercado como lo son esporóforos de color claro, estípites cortos y portadores del gen asporógeno, lo cual es posible mediante un programa de mejoramiento genético en el cual los neohaplontes de la cepa PSma con mayor velocidad de crecimiento micelial son apareados con otros neohaplontes o monocariotes de P. ostreatus los cuales presentan característica atractivas y también tienen una velocidad de crecimiento micelial considerable, para que la mezcla entre estas cepas puedan generar cepas híbridas mejoradas con características que sean deseables para la producción comercial. Dado que en México y en otros países se ha incrementado el cultivo de Pleurotus spp. por pequeños productores de cepas silvestres o extranjeras el programa de mejoramiento genético de hongos es una alternativa para los productores que requieren de cepas aptas para las condiciones locales, que incrementen la rentabilidad de su proceso y así mismo puedan satisfacer las necesidades del productor como del consumidor. 18 4. JUSTIFICACIÓN, OBJETIVOS, HIPÓTESIS: 4.1 JUSTIFICACIÓN La cepa comercial PSma, de amplio uso local por los productores del Estado de México se caracteriza por poseer un fenotipo con estípite muy corto y ser una cepa de color blanca, sin embargo presentó problemas de degeneración. Una alternativa para mejorar las cepas existentes pude ser el mejoramiento genético por medio de una separación artificial de los núcleos que componen la cepa original, para buscar mejorarla por apareamientos de sus componentes monocarióticos (neohaplontes) con diversas cepas monocarióticas. 4.2 OBJETIVO GENERAL:  Obtener cepas híbridas de Pleurotus ostreatus mediante el apareamiento de neohaplontes los cuales muestren mejores características que la cepa parental “PSma” que presenta signos de degeneración. 4.3 OBJETIVOS PARTICULARES:  Realizar apareamientos de diferentes cepas monocarióticas de Pleurotus spp. con neohaplontes de la cepa comercial PSma de P. ostreatus, con señales de degeneración.  Evaluar la velocidad de crecimiento micelial de los apareamientos para seleccionar las cepas híbridas que serán candidatas para llevarlas a la etapa de fructificación.  Llevar las cepas seleccionadas a la etapa de fructificación para evaluar la EB (eficiencia biológica) y la EBA (eficiencia biológica acumulada) y determinar si estadísticamente han mejorado en comparación a la cepa parental “PSma”. 19 4.4 HIPÓTESIS:  Será posible producir híbridos con mayor velocidad de crecimiento micelial al aparear cepas monocarióticas con neohaplontes de la cepa de P. ostreatus “PSma” que presenta signos de degeneración.  Será posible que los híbridos con mayor velocidad de crecimiento micelial presenten mayor EB (eficiencia biológica) y EBA (eficiencia biológica acumulada) que la cepa parental “PSma”, además de conservar sus características morfológicas deseadas. 20 5. METODOLOGÍA 5.1 Esquema experimental A continuación se presentan los esquemas de trabajo seguidos para la realización del proyecto. Comprende dos etapas, las cuales se muestran en las Figuras 5 y 6. Resiembra de neohaplontes (nhs) de cepa PSma Preparación de medio EMA Incubación Apareamiento entre los nhs de cepa PSma Producción de híbridos por apareamiento de nhs Evaluación de crecimiento micelial de cepas: • Parentales • Híbridas • Regeneraciones Selección de cepas para la etapa de fructificación Revisión microscópica Confirmación del carácter monocariótico Clasificación de nhs en tipos de compatibilidad Apareamiento de 2 neohaplontes de cepa PSma con:  5 neohaplontes de cepa PAsp14  5 monocariotes de P. ostreatus  3 neohaplontes de P. ostreatus y 1 monocariote de L. edodes Obtención de híbridos Figura 5: Primera etapa del proyecto “Selección de híbridos para fructificación” -----+1·1 ~·I ----, '------,-------' L.....-----r-¡-----I -----+. L.....-I _-----1 ·L.....-I _-----1 I I ·11...--------1 21 Preparación del inóculo de grano Cocción del grano y pesado en base húmeda Adición de CaSO4 y CaCO3 Mezclado , llenado de bolsas y esterilización Enfriamiento, inoculación e incubación Preparación del sustrato Hidratación de aserrín, cascarilla de algodón, paja y mijo Adición de CaSO4 y CaCO3 Mezclado , llenado de bolsas y esterilización Inducción de la fructificación Enfriamiento, inoculación e incubación Fructificación Selección de primordios Cosecha de hongos Análisis de resultados • Registro de peso • Cálculo de EB, EBA • Análisis estadístico Figura 6: Segunda etapa del proyecto “Fructificación de híbridos seleccionados” 22 5.2 Material biológico En las Tablas 3 y 4 se indica el origen o características de cada una de las cepas utilizadas para el desarrollo de este trabajo. Tabla 3: Cepas monocarióticas de Pleurotus sp. Cepas monocarióticas CARACTERÍSTICAS Clave UNAM Clave donador P407 Mo24 Fructificantes, muy vigorosas (Alemania) P408 Mo35 P412 nh2/H1-Gy Productoras de pocas esporas (Alemania) P413 nh11 Asporógena P416 P3-/R/o3 Fructificante 23 Tabla 4: Cepas parentales y neohaplontes de Pleurotus spp. CEPAS CARACTERÍSTICAS Pa re nt al Género Clave donador Pleurotus PSma Pleurotus spp. comercial (con signos de degeneración) PAsp14 Pleurotus ostreatus asporógena (Sylvan, USA) N eo ha pl on te s Pleurotus PSma-n3j Obtenidos por Adaya, a partir de la cepa PSma PSma-n4j PSma-n5j PSma-n7j PSma-n10j PSma-n12j PSma-n14j PSma-n15j PSma-n16j PSma-n17j PSma-n18j PAsp14- n1a Tesis “Recuperación de componentes monocarióticos de cepas comerciales del género de Pleurotus por dedicariotización”, Sánchez (2013) PAsp14- n2a PAsp14- n5a PAsp14- n8a PAsp14- n26d Tesis “Desarrollo de una cepa híbrida asporógena de Pleurotus sp. Con fines comerciales”, Chávez (2013) PSec-n1g Obtenidos por Valencia del Toro, UPIBI, México (2002) PUap-n2g Nhfl1 Obtenido por Palacios, a partir de la cepa P. ostreatus florida, Alemania (2011) Lentinula L21- n3s/L4005 Obtenido por Segura a partir de la cepa Lentinula L21, Canadá (2008) 24 5.3 Preparación de medio de extracto de malta agar (EMA) Para preparar 500 ml de medio en un matraz Erlenmeyer con capacidad de 1 l se pesaron 7.5 g de extracto de malta y se agregaron 100 ml de agua destilada, después de 10 minutos de reposo, se agregaron 9 g de agar bacteriológico y se agitó para su dispersión. A continuación se agrego 400 ml de agua destilada en forma paulatina para la incorporación de los dos ingredientes y se tapo el matraz con hule espuma y papel aluminio. El medio se esterilizó junto con un matraz con 500 ml de agua destilada en autoclave a 121°C y 1.2 kg / cm2 de presión durante 45 minutos. Con la ayuda de una jeringa de llenado continuo, del medio estéril y caliente se vacían 12 ml en cajas Petri de plástico de 9 cm de diámetro, este paso se realiza en una campana de flujo laminar para mantener las condiciones de esterilidad. Una vez solidificado el medio se guardan las cajas Petri en bolsas de polietileno dentro de la incubadora a 24°C durante 24 horas para comprobar la esterilidad del medio. El medio estéril se coloca en forma invertida en la estufa de incubación hasta su uso para evitar contaminación y deshidratación. 5.4 Resiembra y propagación vegetativa del micelio Después de verificar la esterilidad del medio EMA, las cajas se resembraron colocando en cada caja con EMA, 4 pequeños cuadros (3 o 5 mm) cortados de las cepas mantenidas en refrigeración. Las cajas inoculadas se incubaron a 24°C y se observaron periódicamente al microscopio con resolución 16x hasta que el micelio invade completamente el medio de la caja Petri (Figura 7). Figura 7: Resiembra de cepas en medio EMA 25 5.5 Apareamientos Una vez que diferentes monocariotes se propagaron individualmente en medio EMA, se procedió a cortar un cuadro de agar con micelio de 2 o 3 mm aproximadamente, para colocarlo en una caja con medio EMA, al lado de este y lo más cerca posible se colocó otro cuadro de agar con micelio de la otra cepa de igual tamaño (Figura 8). Se realizaron de 5 a 6 apareamientos en una misma caja Petri. Al mismo tiempo, como control, en otra caja con medio EMA se colocó un cuadro de agar con micelio de las distintas cepas con que se aparearon para verificar ausencia de fíbulas y de contaminantes. Las cajas Petri se incubaron a 24°C durante 3 a 5 días, revisando periódicamente al microscopio el desarrollo de la nueva colonia. Los apareamientos que presentaron hifas con fíbulas (micelio de tipo dicariote) en por lo menos tres diferentes puntos equidistantes en la periferia de la colonia se consideraron como positivas, estos apareamientos se resembraron en cajas Petri con medio EMA, para verificar la presencia de fíbulas al desarrollarse nuevamente la colonia. Caja con apareamientos Caja control Figura 8: Apareamiento de neohaplontes para obtener híbridos 26 5.6 Evaluación del desarrollo vegetativo de cepas parentales, híbridas y neohaplontes Se evaluó el tiempo total necesario para que el desarrollo micelial de una cepa cubra totalmente una caja Petri con medio EMA. Con una punta de micropipeta invertida estéril se cortó un circulo de 0.5 cm de agar con micelio que se colocó en el centro de la caja Petri. Para cada cepa se inocularon 3 cajas Petri y se incubaron a 24°C y se midió el desarrollo micelial durante las dos primeras semanas cada tercer día y posteriormente en forma diaria. El diámetro de la colonia se midió con una regla tomando dos lecturas en puntos equidistantes (D1 y D2) los cuales se marcaron por fuera de la caja (Figura 9). Figura 9: Evaluación del desarrollo micelial en medio EMA 5.7 Fructificación de cepas parentales e híbridos 5.7.1 Inóculo de grano La preparación de inóculo se realizó con granos de trigo. Una vez limpio (libre de materia extraña), el trigo se lavó y se hirvió por aproximadamente 50 minutos de tal forma que el almidón gelifique sin que el grano se reblandezca y se reviente. Transcurrido este proceso se enjuago el grano en agua fría para detener la cocción, se dreno el agua en exceso y una vez frio se peso. Con base en el peso húmedo del trigo se añadió CaSO4 (1.3%) y CaCO3 (0.3%) y se mezclaron. En bolsas de polipropileno se colocaron 300 g del grano preparado y se esterilizó a 121°C y 1.2 kg / cm2 de presión durante 2 horas. Las bolsas con grano estéril se dejaron enfriar durante 24 horas para posteriormente inocularse con el micelio que previamente se desarrollo en placas con medio EMA. La caja con micelio se corto en cuadros de 1 cm2 aproximadamente con aguja micológica estéril y se transfirió a la bolsa con el grano estéril en condiciones de esterilidad. La bolsa se agito en forma manual para dispersar el micelio, una vez 27 realizado este proceso se cierro la bolsa colocando un tubo desinfectado previamente de PVC de aproximadamente 5 cm en la superficie, el cual se cubrió con hule espuma que sirve como entrada de oxigeno. Se incubaron las bolsas a 24°C en total oscuridad hasta que los granos estén invadidos en su totalidad por el micelio. 5.7.2. Determinación de humedad de componentes principales del sustrato Por separado se pesaron 10 g de cada material (aserrín, cascarilla de algodón, paja y mijo) en cajas de Petri de vidrio y se secaron en estufa de secado a 60°C hasta obtener peso constante. Las determinaciones se realizaron por triplicado. El contenido de humedad se calculó con la siguiente fórmula: Peso inicial: Peso de la muestra húmeda. Peso final: Peso de la muestra seca. 5.7.3 Determinación de máxima capacidad de retención de agua de componentes principales del sustrato Para cada componente del sustrato (aserrín, cascarilla de algodón, paja y mijo) se colocaron 100 g de cada muestra con un exceso de agua en un recipiente durante 24 horas, transcurrido el tiempo se dreno el agua y se determino la humedad retenida para cada material, secando cada componente en estufa de secado a 60°C hasta obtener peso constante. Las determinaciones se realizaron por triplicado. El contenido de humedad se calculó con la fórmula de humedad. Con los valores obtenidos de capacidad de retención de agua, se realizó el cálculo para determinar la cantidad de material seco y de agua necesarios para obtener una humedad de 70% en el sustrato para asegurar el desarrollo del micelio. 28 5.7.4 Preparación del sustrato El sustrato se preparo de acuerdo a la formulación de la Tabla 5. Los componentes como el aserrín, cascarilla de algodón, paja y mijo se pesaron, mezclaron y añadió el agua calculada para su hidratación. Se dejaron reposar por 24 horas y transcurrido el tiempo se adicionaron los componentes secos (sulfato de calcio y carbonato de calcio), se mezclaron hasta observar una distribución homogénea. Se llenaron bolsas de polipropileno con 1 Kg de sustrato húmedo y se esterilizaron en autoclave a 121°C y 1.2 kg / cm2 de presión durante 2 horas. Para cada lote se tomaron muestras para determinar la humedad del sustrato antes y después de esterilizar para conocer la humedad final del sustrato. Las bolsas de sustrato estériles se dejaron enfriar durante 1 día en la campana de flujo laminar. Posteriormente se adiciono el inóculo de grano en una porción del 5%, la bolsa se agito en forma manual para dispersar el inóculo de grano, una vez realizado este proceso se cierro la bolsa colocando un tubo (desinfectado previamente) de PVC de aproximadamente 5 cm en la superficie, el cual se cubrió con hule espuma que sirve como entrada de oxigeno. Las bolsas se incubaron a 24°C en total oscuridad hasta que el sustrato esté invadido en su totalidad por el micelio. Tabla 5: Composición del sustrato empleado para la evaluación Componentes del sustrato Composición en base húmeda (g / 1000 g mezcla) Aserrín de encino blanco 290 Cascarilla de algodón 290 Paja 290 Mijo 90 CaSO4 30 CaCO3 10 29 5.7.5 Condiciones para la fructificación Una vez completado el tiempo de incubación se retiraron los tubos de PVC y los hules espuma que permitían la entrada de oxígeno. Se amarraron las bolsas y se invirtieron para hacer dos aberturas en forma de un triangulo invertido en dos extremos de la bolsa. Cada sustrato fue rotulado con una etiqueta que indicaba: cepa, humedad, lote, número de repetición, fecha de incubación y de transferencia al cuarto de fructificación. Los sustratos fueron colocados en el cuarto de fructificación, en donde se mantuvieron en condiciones para inducir la fructificación, temperatura entre 16 y 20°C, alta humedad relativa (80) y ventilación semi continua (20 minutos de operación por 20 minutos de paro) con iluminación artificial continúa. 5.7.6 Cosecha de hongos Después de 3 o 4 días de haber pasado los sustratos al cuarto de fructificación se inició la formación de primordios los cuales fueron parcialmente eliminados dejando de 6 a 8 primordios por bolsa de sustrato. El momento óptimo para la cosecha de hongos fue cuando los bordes del sombrero (esporóforo) se habían expandido por completo. Los hongos cosechados fueron pesados de manera individual con y sin estípite para cada bolsa de sustrato durante 15 semanas de cosecha. Con esta información se calculó la producción semanal y semanal acumulada. Posteriormente con los valores de peso seco del sustrato se calculó la EB y EBA. La eficiencia biológica se calcula con la siguiente fórmula: Se determinó la humedad del sustrato después de la esterilización para calcular el peso seco en cada bolsa a partir de los pesos de cada bolsa de sustrato después de la inoculación. Este se realizó con la siguiente fórmula: 30 5.8 Obtención de esporas 5.8.1 Método directo El esporóforo maduro se corto y se fijo del estípite dentro de una caja Petri estéril que contenía papel filtro estéril y cubreobjetos estériles. Para evitar que el hongo humedeciera el papel se sujeto con puntas de micropipeta estéril que sirvieron como base. La caja Petri se colocó dentro de una cámara húmeda que consto de una bolsa de polietileno con agua en el fondo y 8 perforaciones a la altura del borde de la caja Petri permitiendo la entrada de aire; la humedad se mantiene colocando papel absorbente a la largo de la bolsa y debajo de la caja Petri. En la cámara húmeda el esporóforo se dejo esporular a temperatura ambiente por 24 horas. Las esporas se guardan en un sobre estéril dentro de una bolsa de polietileno con granos de sílica gel y se refrigeraron. 5.8.2 Método de diluciones El esporóforo maduro se corto, se elimino el estípite y con la ayuda de dos varillas de vidrio estériles que sirvieron de soporte, se coloco durante 30 segundos sobre una caja Petri que contiene medio agar extracto de malta. A continuación, usando las mismas condiciones, el esporóforo se pasó a una segunda caja Petri durante 1 minuto y así sucesivamente duplicando los tiempos 2, 4 y hasta 8 minutos. Las cajas Petri se incubaron a 24°C, revisando diariamente al microscopio el desarrollo de la nueva colonia para aislar y posteriormente determinar el tipo de compatibilidad de las esporas. 5. 9 Análisis estadístico Con los valores de eficiencia biológica obtenidos para cada cepa en cada lote se realizó un análisis de varianza y por medio de la prueba de rango múltiple de Duncan se identificó la semana donde se obtuvo su rendimiento máximo significativo (RMS) es decir la semana donde los incrementos posteriores en la eficiencia biológica ya no fueron estadísticamente significativos. 31 6. RESULTADOS La cepa “PSma” de Pleurotus ostreatus es una cepa comercial con características muy interesantes, particularmente debido a que produce esporóforos de color blanco, de estípite sumamente cortos y buena eficiencia biológica, lo que la hace de gran interés para el mercado nacional. No obstante esta cepa presenta señales de que se está degenerando, crece muy lento tanto en medios de laboratorio como en los sustratos lignocelulósicos comerciales. Para recuperar esta cepa y sobre todo, las características interesantes (esporóforos de color blanco, estípite corto y buena eficiencia biológica) que presenta, se planteó obtener cepas híbridas en donde se combinen su material genético con el de diferentes cepas que aporten también características interesantes (cepas portadoras del gen asporógeno, productoras de cuerpos fructíferos grandes a muy grandes y cepas que producen altos rendimientos en tiempos cortos). Para lograr este objetivo, se realizaron apareamientos de los componentes monocarióticos de la cepa PSma, (neohaplontes), con distintos monocariotes y neohaplontes de otras cepas de P. ostreatus con características apreciables antes mencionadas para el cultivo comercial. 6.1 Selección de híbridos para fructificación Como primera etapa del proyecto se requería producir una variedad de híbridos y realizar pruebas para seleccionar a los mejores candidatos para llevarlos a fructificar. Para la producción de los híbridos se requería entonces hacer también una selección de los neohaplontes (nhs) de la cepa PSma. 6.1.1 Caracterización y selección de los neohaplontes de la cepa “PSma” Se disponían de 14 neohaplontes (Tabla 6) de la cepa PSma que previamente fueron recuperados por dedicariotización en el laboratorio del Departamento de Alimentos y Biotecnología de la Facultad de Química (UNAM). Una vez que los 14 neohaplontes fueron resembrados y el micelio alcanzó un diámetro de 1 a 2 cm, se revisó al microscopio en las hifas de la periferia de la colonia su condición monocariótica (ausencia de fíbulas). 32 En la Tabla 7 se muestra que solo 11 neohaplontes presentaron micelio de tipo monocariótico y 3 neohaplontes fueron descartados por presentar micelio de tipo dicariótico. Tabla 6: Neohaplontes de cepa comercial de Pleurotus sp. “PSma” Neohaplontes de cepa PSma PSma-n3j PSma-n9j PSma-n15j PSma-n4j PSma-n10j PSma-n16j PSma-n5j PSma-n11j PSma-n17j PSma-n6j PSma-n12j PSma-n18j PSma-n7j PSma-n14j Tabla 7: Evaluación del tipo de micelio de los 14 neohaplontes recuperados de cepa comercial de Pleurotus sp. “PSma” 6.1.1.1 Clasificación de los neohaplontes en tipos de compatibilidad Para clasificar los 11 neohaplontes en su tipo de compatibilidad se cruzaron todos los neohaplontes con 2 neohaplontes tomados al azar (PSma-n12j y PSma-n17j). En la Tabla 8 se observa que el neohaplonte PSma-n12j fue compatible con los neohaplontes 4, 16 y 17 por la presencia de fíbulas observadas al microscopio en cada uno de estos apareamientos. Este resultado nos indica que estos 3 neohaplontes (4, 16 y 17) pertenecen a un tipo de compatibilidad diferente al neohaplonte 12. Por otro lado el neohaplonte PSma-n17j fue compatible con los Cepas monocarióticas (neohaplontes) Cepas dicarióticas PSma-n3j PSma-n10j PSma-n16j PSma-n6j PSma-n4j PSma-n12j PSma-n17j PSma-n9j PSma-n5j PSma-n14j PSma-n18j PSma-n11j PSma-n7j PSma-n15j 33 neohaplontes 3, 5, 7, 10, 12, 14, 15 y 18 al presentar también presencia de fíbulas indicando que estos 8 neohaplontes corresponden al otro tipo de compatibilidad. Tabla 8: Apareamiento de neohaplontes para clasificarlos en tipos de compatibilidad Neohaplontes de cepa PSma Apareamientos Neohaplontes de cepa PSma PSma-n12j PSma-n17j PSma-n3j ‒ + PSma-n5j ‒ + PSma-n7j ‒ + PSma-n10j ‒ + PSma-n12j ‒ + PSma-n14j ‒ + PSma-n15j ‒ + PSma-n18j ‒ + PSma-n4j + ‒ PSma-n16j + ‒ PSma-n17j + ‒ ( ‒ )Monocariote, ( + ) Dicariote En la Tabla 9 se muestra la clasificación de los 11 neohaplontes de la cepa PSma en los 2 tipos de compatibilidad (Tipo I y Tipo II), de acuerdo a los resultados obtenidos en la Tabla 8. Una vez clasificados los neohaplontes de la cepa PSma en los 2 tipos de compatibilidad se utilizó la prueba de χ2 para determinar la distribución de los 2 tipos de compatibilidad. Los valores de χ2 obtenidos para los neohaplontes fue menor de 6.63 (valor obtenido de Tablas) con lo que se confirma con una 34 probabilidad del 95% que la distribución en los 2 tipos de compatibilidad fue 1:1, siendo una distribución simétrica (Tabla 10). Este tipo de comportamiento era el esperado, ya que se partió de una cepa con micelio dicariótico en donde la segregación de los neohaplontes se presenta en igual proporción los 2 tipos de compatibilidad. En estudios realizados por Ramírez (2011) se sabe que los componentes monocarióticos (obtenidos por dedicariotización) de 7 cepas de Lentinula, en 6 cepas se recuperaron sus dos componentes monocarióticos en una proporción 1:1 y solo la cepa L19, la recuperación no fue 1:1, lo que muestra que este comportamiento era el esperado ya que la cepa de Lentinula edodes también es un organismo de tipo tetrapolar heterotálico como lo es Pleurotus ostreatus. Tabla 9: Clasificación de neohaplontes de cepa PSma en los 2 tipos de compatibilidad Neohaplontes de cepa PSma Tipo I Tipo II PSma-n3j PSma-n12j PSma-n4j PSma-n5j PSma-n14j PSma-n16j PSma-n7j PSma-n15j PSma-n17j PSma-n10j PSma-n18j 35 Tabla 10: Prueba de χ2 para determinar la distribución de los neohaplontes de la cepa PSma en los 2 tipos de compatibilidad. Tipos de compatibilidad I II Frecuencia de recuperación 8 3 Frecuencia esperada 5.5 5.5 Desviación 2.5 2.5 d2 / e 1.136 1.136 χ2 Calculada = 2.27 χ2 Tablas = 6.63 Valores de χ2 calculados < 6.63, indican recuperación de neohaplontes fue 1:1. Además de aparear los neohaplontes para clasificarlos en sus tipos de compatibilidad, durante esta etapa fue posible de manera simultánea obtener la regeneración de la cepa parental PSma al identificar los apareamientos positivos entre los diferentes neohaplontes (Tabla 8). La regeneración de la cepa parental se realizó con el fin de observar si al separar un micelio dicariótico (dedicariotización) y aparear sus componentes monocarióticos, se mantienen o se pierden sus características fenotípicas y de productividad durante la etapa de fructificación. 6.1.1.2 Evaluación del desarrollo vegetativo de neohaplontes y cepas regeneradas de PSma Una vez que los 11 neohaplontes se clasificaron en tipos de compatibilidad se evaluó su crecimiento micelial, así como el de 12 cepas regeneradas (7 cepas reconstituidas con el neohaplonte PSma-n17j, 2 cepas reconstituidas con el neohaplonte PSma-n12j y 3 cepas reconstituidas con el neohaplonte PSma-n4j) y el de la cepa parental para conocer la velocidad de crecimiento. Para cada cepa la evaluación se realizó por triplicado y en la Tabla 11 se reporta la media y desviación estándar. Posteriormente se realizó una análisis de varianza (Tabla 41) y la prueba de rango múltiple de Duncan (Tabla 42) con los valores obtenidos del tiempo total que requirió cada cepa en cubrir con su desarrollo vegetativo una caja 36 Petri con medio de EMA, clasificando las 24 cepas evaluadas en 6 grupos estadísticamente diferentes. En la Tabla 11 se observa que los neohaplontes PSma-n17j y PSma-n5j necesitaron 12 y 11 días para cubrir una caja Petri con su desarrollo micelial y al ser apareados, el tiempo que requirió la nueva cepa reconstituida PSma-n17j x PSma-n5j fue de sólo 9 días, siendo este tiempo menor al de la cepa parental PSma (10 días). Por otro lado la cepa reconstituida PSma- n17j x PSma-n7j también muestra buena velocidad de desarrollo miceliar (9.3 días) pero estadísticamente corresponde a un grupo diferente de la otra cepa reconstituida PSma-n17j x PSma-n5j por ello esta evaluación permitió identificar a las cepas que se podrán llevar a la etapa de fructificación como cepas controles.  PSma (Cepa parental)  PSma-n17j x PSma-n5j (Cepa regenerada de PSma) Las regeneraciones obtenidas con el neohaplonte PSma-n4j fueron con el propósito de observar si había diferencia en la velocidad de crecimiento micelial al reconstituir a la cepa parental con otros neohaplontes diferentes a las cepas PSma-n12j y PSma-n17j. En la Tabla 11 se observa que las regeneraciones con el neohaplonte PSma-n4j necesitaron 11 días para cubrir la caja Petri con su desarrollo micelial siendo las cepas reconstituidas más lentas evaluadas. 37 Tabla 11: Desarrollo vegetativo de cepa PSma, neohaplontes y cepas reconstituidas Cepas Tiempo para cubrir caja Petri con EMA (días) * Cepa parental (PSma) 10.0 ± 0 c Neohaplontes Tipo I PSma-n3j 10.0 ± 0 c PSma-n5j 11.0 ± 0 ef PSma-n7j 10.7 ± 0.6 e PSma-n10j 11.0 ± 0 ef PSma-n12j 10.0 ± 0 c PSma-n14j 11.0 ± 0 ef PSma-n15j 11.0 ± 0 ef PSma-n18j 11.0 ± 0 ef Neohaplontes Tipo II PSma-n4j 12.0 ± 0 g PSma-n16j 12.0 ± 0 g PSma-n17j 12.0 ± 0 g Cepas reconstituidas PSma-n4j x PSma-n5j 11.0 ± 0 ef PSma-n4j x PSma-n10j 11.3 ± 0.5 f PSma-n4j x PSma-n18j 11.0 ± 0 ef PSma-n12j x PSma-n4j 10.0 ± 0 c PSma-n12j x PSma-n16j 10.7 ± 0.5 e PSma-n17j x PSma-n5j 9.0 ± 0 a PSma-n17j x PSma-n7j 9.3 ± 0.5 b PSma-n17j x PSma-n10j 10.8 ± 0.4 e PSma-n17j x PSma-n12j 10.0 ± 0 c PSma-n17j x PSma-n14j 11.0 ± 0 ef PSma-n17j x PSma-n15j 10.3 ± 0.5 d PSma-n17j x PSma-n18j 10.0 ± 0 c *Letras diferentes en el tiempo para cubrir la caja Petri con EMA indica diferencia significativa entre cepas según la prueba de Duncan (α=0.05). 38 6.1.2 Producción de híbridos 6.1.2.1 Apareamientos de neohaplontes de cepa PSma con monocariotes y neohaplontes de P. ostreatus y L. edodes Con los resultados anteriores se seleccionaron 2 neohaplontes de la cepa PSma de diferente tipo de compatibilidad (Tipo I y Tipo II respectivamente) y que mostraron el mejor crecimiento (menor tiempo para invadir la caja Petri), los neohaplontes PSma-n12j y PSma-n17j. Estos dos neohaplontes se aparearon con 5 cepas monocarióticas de P. ostreatus, 3 neohaplonte de P. ostreatus y un neohaplonte de L. edodes y como resultado se obtuvieron 8 cruzas positivas (Tabla 12). Los resultados permiten suponer que los monocariotes P407, P408 y P412 tiene alelos de compatibilidad totalmente diferente a los 2 neohaplontes de la cepa PSma. Tabla 12: Apareamiento de neohaplontes de cepa PSma con monocariotes y neohaplontes de P. ostreatus y L. edodes. Cepas Neohaplontes de PSma Tipo I Tipo II PSma-n12j PSma-n17j Monocariotes de P. ostreatus P407 + + P408 + + P412 + + P413 ‒ ‒ P416 ‒ ‒ Neohaplontes de P. ostreatus PFl-n1a ‒ ‒ PSec-n1g ‒ + PUap-n2g + ‒ L. edodes L21-n3s/L4005 ‒ ‒ ( - ) Monocariote, ( + ) Dicariote 39 El neohaplonte PUap-n2g, a su vez, fue compatible sólo con el neohaplonte de la cepa PSma de Tipo I (PSma-n12j) lo que indica que probablemente este monocariote cuenta con alelos comunes al neohaplonte PSma-n17j de compatibilidad Tipo II. De forma similar, el monocariote PSec-n1g fue compatible únicamente con el neohaplonte de PSma de Tipo II (PSma-n17j) por lo que posiblemente también cuenta con alelos comunes al neohaplonte PSma-n12j de compatibilidad Tipo I. Tabla 13: Apareamiento entre monocariotes y neohaplontes de P. ostreatus Monocariotes y neohaplontes de P. ostreatus P407 P408 P412 PSec-n1g PUap-n2g P407 ‒ ‒ ‒ ‒ + P408 ‒ ‒ ‒ + + P412 ‒ ‒ ‒ ‒ + PSec-n1g ‒ + ‒ ‒ + PUap-n2g + + + + ‒ ( ‒ )Monocariote, ( + ) Dicariote Dado que en los apareamientos anteriores sólo 5 cepas monocarióticas presentaron compatibilidad con alguno de los neohaplontes de la cepa PSma se procedió a realizar el apareamiento entre ellos mismos, obteniendo 5 cruzas positivas. En la Tabla 13 se observa que el neohaplonte PUap-n2g tiene mayor capacidad de apareamiento al ser compatible con las 4 cepas monocarióticas (P407, P408, P412 y PSec-n1g) que el neohaplonte PSec-n1g dado que solo fue compatible con el monocariote P408 permitiendo suponer que el neohaplonte PUap-n2g presenta alelos diferentes que las 4 cepas monocarióticas, mientras que el neohaplonte PSec-n1g cuenta con alelos totalmente diferentes que el monocariote P408. 40 Los híbridos obtenidos de los apareamientos positivos mostrados en las Tablas 12 y 13 fueron evaluados en su velocidad de crecimiento micelial. En la Tabla 14 se reporta la media y desviación estándar para cada cepa (evaluada por triplicado). Con los resultados obtenidos se realizó un análisis de varianza (Tabla 43) y la prueba de rango múltiple de Duncan (Tabla 44) para identificar las cepas con mayor velocidad de desarrollo vegetativo, obteniendo una clasificación de las 20 cepas evaluadas en 7 grupos estadísticamente diferentes. En la Tabla 14 se observa que los apareamientos del neohaplonte de la cepa PSma de Tipo I (PSma-n12j) con los monocariotes P412 y PUap-n2g de P. ostreatus muestran una velocidad de desarrollo vegetativo estadísticamente mayor que sus respectivos monocariotes de P. ostreatus, PUap-n2g y P412. Es importante resaltar que en estos apareamientos se encuentran los 2 monocariotes que forman a los híbridos con mayor velocidad de crecimiento, pero que al ser evaluados de manera individual en la forma monocariótica, el tiempo para cubrir con su desarrollo micelial una caja Petri con medio de EMA se incrementó notablemente (10 y 20 días). Por otro lado el apareamiento del neohaplonte Tipo II de PSma (PSma-n17j) con el monocariote P407 presentó una velocidad de crecimiento micelial buena pero que es menor que los híbridos antes mencionados, por ello esta evaluación permitió seleccionar a las cepas que se llevaran a la etapa de fructificación, las cuales son: Cepas híbridas (controles):  PUap-n2g x P412 (8.3 días)  PUap-n2g x P408 (9.0 días)  PUap-n2g x PSec-n1g (9.0 días) Cepas híbridas con mayores velocidades de crecimiento micelial:  PSma-n12j x P412 (8.0 días)  PSma-n12j x PUap-n2g (8.0 días)  PSma-n17j x P407 (9.0 días) 41 Tabla 14: Desarrollo vegetativo de monocariotes, neohaplontes de P. ostreatus e híbridos de neohaplontes de PSma con monocariotes de P. ostreatus Cepas Tiempo para cubrir caja Petri con EMA (días) * Cepa parental** PSma 10 ± 0 c Monocariotes de P. ostreatus P407 12.3 ± 0.5 e P408 15.7 ± 0.5 f P412 20.7 ± 1.4 g Neohaplontes de P. ostreatus PSec-n1g 12.3 ± 0.5 e PUap-n2g 10.0 ± 0 c Neohaplontes de PSma PSma-n12j 10.0 ± 0 c PSma-n17j 12.0 ± 0 e Híbridos de PSma (nhs Tipo I) con monocariotes de P. ostreatus PSma-n12j x P407 9.0 ± 0 b PSma-n12j x P408 9.7 ± 0.5 c PSma-n12j x P412 8.0 ± 0 a PSma-n12j x PUap-n2g 8.0 ± 0 a Híbridos de PSma (nhs Tipo II) con monocariotes de P. ostreatus PSma-n17j x P407 9.0 ± 0 b PSma-n17j x P408 11.0 ± 0 d PSma-n17j x P412 11.0 ± 0 d PSma-n17j x PSec-n1g 10.0 ± 0 c Apareamientos entre monocariotes de P. ostreatus PSec-n1g x P408 10.0 ± 0 c PUap-n2g x P408 9.0 ± 0 b PUap-n2g x P412 8.3 ± 0.5 a PUap-n2g x PSec-n1g 9.0 ± 0b *Letras diferentes en el tiempo para cubrir caja Petri con medio EMA indica diferencia significativa entre cepas según la prueba de Duncan (α=0.05). **Valor para cepa parental tomado de la Tabla 9. 42 6.1.2.2 Apareamientos de neohaplontes de cepa asporógena PAsp14 con neohaplontes y monocariotes de cepa PSma y de P. ostreatus. Dado que resultaba interesante producir híbridos con carácter asporógeno, se utilizaron 5 neohaplontes de la cepa PAsp14 de P. ostreatus, los cuales fueron primeramente apareados entre sí para conocer su tipo de compatibilidad. Se estableció que 2 neohaplontes (el 1 y 2) pertenecen al Tipo I mientras que 3 neohaplontes (5, 8 y 26) fueron del Tipo II. Tabla 15: Apareamiento de neohaplontes de cepa asporógena PAsp14 con neohaplontes de cepa PSma y cepas monocarióticas de P. ostreatus Tipo de cepa Neohaplontes de capa asporógena de P. ostreatus (PAsp14) Tipo I Tipo II PAsp14-n1a PAsp14-n2a PAsp14-n5a PAsp14-n8a PAsp14- n26d nhs de cepa PSma PSma-n12j + + + + + PSma-n17j + + + + + Monocariotes de P. ostreatus P407 + + + + + P408 + + + + + P412 + + + + + nhs de P. ostreatus PSec-n1g _ _ + _ + PUap-n2g + + + + + ( - ) Monocariote, ( + ) Dicariote Los 5 neohaplontes de la cepa PAsp14 fueron apareados con los 2 neohaplontes seleccionados de la cepa PSma (PSma-n12j y PSma-n17j), con los 3 monocariotes y con los 2 neohaplontes de P. ostreatus que presentaron reacciones de compatibilidad en los experimentos previos (ver Tabla 13). En la Tabla 15 se observa que se obtuvieron 32 apareamientos positivos, de los cuales los neohaplontes de la cepa PSma (PSma-n12j y PSma-n17j) y los monocariotes P407, P408, P412 y PUap-n2g presentaron compatibilidad con todos los neohaplontes de la cepa PAsp14. 43 Sin embargo al analizar la Tabla 15 el neohaplonte PSec-n1g que no fue compatible con los 2 neohaplontes de la cepa PSma de compatibilidad Tipo I, en este caso, al ser apareado con los 3 neohaplontes de la cepa PAsp14 de compatibilidad Tipo II, uno de los 3 apareamientos fue negativo. Existe la posibilidad de que esto fuese un falso negativo, lo cual requeriría una confirmación. En la Tabla 16 se presenta un resumen de los resultados de los apareamientos mostrados en las Tablas 12, 13 y 15, indicando una interpretación en términos de los patrones y tipos de compatibilidad de estas cepas. Con excepción del neohaplonte PSec-n1g, los patrones de apareamiento resultan totalmente congruentes con los tipos de compatibilidad asignados en la Tabla 16. Nuevamente se presenta la posibilidad de una falta de formación del dicariote de esta cepa (PSec-n1g) con el neohaplonte PAsp14-n1a sea una respuesta falsa negativa. Resulta de todos modos intrascendente para los fines de este proyecto esclarecer este tema ya que la mayor parte de los apareamientos fueron positivos y congruentes con los tipos de compatibilidad mostrados en la Tabla 16. 44 Tabla 16: Clasificación de los neohaplontes y monocariotes de Pleurotus sp. en tipos de compatibilidad A2B1 A1B2 A3B3 A4B2 A3B4 A5B? A6B5 CEPAS P412 P407 P408 PSec-n1g PUap-n2g PSma-n12j PSma-n17j PAsp14-n1a PAsp14-n5a P412 ‒ ‒ ‒ ‒ + + + + + P407 ‒ ‒ ‒ + + + + + A2B1 P408 ‒ + + + + + + A1B2 PSec-n1g ‒ + ‒ + ‒ + A3B3 PUap-n2g ‒ + ‒ + + A4B2 PSma-n12j ‒ + + + A3B4 PSma-n17j ‒ + + A5B? PAsp14-n1a ‒ + A6B5 PAsp14-n5a ‒ Tipos de compatibilidad Tipos de compatibilidad A1B1 A1B1 ( ‒ )Monocariote, ( + ) Dicariote 45 Se evaluó el tiempo total para cubrir con desarrollo vegetativo la caja Petri con medio de EMA de todos los híbridos obtenidos previamente (Tabla 14), así como de sus respectivos neohaplontes parentales. En la Tabla 17 se muestran los valores obtenidos y los resultados del análisis de varianza (Tabla 45) y la prueba de rango múltiple de Duncan (Tabla 46), con lo cual fue posible clasificar las 42 cepas en 17 grupos estadísticamente diferentes. Se observó que la mayoría de los híbridos obtenidos con los 3 neohaplontes de la cepa PAsp14 con compatibilidad de Tipo II fueron los que presentaron mayor velocidad de crecimiento micelial, que los producidos al aparearse con los 2 neohaplontes de la cepa PAsp14 con compatibilidad Tipo de I. El apareamiento PAsp-n8a x PSma-n12j fue el que presentó la mayor velocidad de crecimiento micelial (6 días) seguido de los apareamientos PAsp-n8a x PUap-n2g y PAsp- n26d x PUap-n2g con 6.7 y 7.3 días respectivamente, confirmando nuevamente que el monocariote PUap-n2g además de presentar mayor capacidad de apareamiento produce híbridos que presentan una rápida velocidad para invadir el medio EMA. Es importante destacar que en estos apareamientos la obtención de híbridos con rápida velocidad de crecimiento no necesariamente implica que las 2 cepas monocarióticas parentales presenten una rápida velocidad para invadir el medio EMA. Como ejemplo podemos observar que el híbrido PAsp-n8a x PSma-n12j que fue el que presentó la mayor velocidad de crecimiento micelial (6 días) provenía de los neohaplontes PAsp-n8a (22.7 días) y PSma-n12j (10 días). Razón por la cual se hace necesario evaluar el crecimiento micelial de todos los híbridos obtenidos. Otros apareamientos que también resultan importantes por su rápida velocidad de crecimiento son los obtenidos entre el neohaplontes PAsp-n5a y los monocariotes P407, P408, P412, PSec-n1g y PUap-n2g además de los híbridos obtenidos entre el neohaplonte PAsp-n8a y los monocariotes P408 y P412. A partir de los resultados descritos y del análisis estadístico fue posible obtener varias cepas candidatas que serán llevadas a la etapa de fructificación, las cuales se muestran en la Tabla 18. 46 Tabla 17: Desarrollo vegetativo de apareamientos entre neohaplontes de cepa asporógena PAsp14 y monocariotes de Pleurotus ostreatus Tiempo para cubrir caja Petri con medio EMA (días) * Cepas Neohaplontes de cepa asporógena PAsp 14 Tipo I Tipo II PAsp14-n1a PAsp14-n2a PAsp14-n5a PAsp14-n8a PAsp14-n26d 9.7 ± 0.5g 12.0 ± 0k 16.0 ± 0l 22.7 ± 0.5p 27.0 ± 0.9r P407 12.3 ± 0.5k 20.0 ± 0n 24.3 ± 1.4q 8.0 ± 0de 8.0 ± 0de 10.0 ± 0gh P408 15.7 ± 0.5l 10.7 ± 0.5i 10.3 ± 0.5hi 8.0 ± 0de 8.7 ± 0.5ef 10.0 ± 0gh P412 20.7 ± 1.4o 23.8 ± 0.4q 18.7 ± 0.5m 8.0 ± 0de 8.0 ± 0de 10.0 ± 0gh PSec-n1g 12.3 ± 0.5k Incompatible Incompatible 8.0 ± 0de Incompatible 8.0 ± 0de PUap-n2g 10.0 ± 0gh 9.7 ± 0.5g 10.3 ± 0.5hi 8.0 ± 0de 6.7 ± 1.0b 7.3 ± 1.0c PSma-n12j 10.0 ± 0gh 8.0 ± 0de 9.0 ± 0f 8.0 ± 0de 6.0 ± 0a 8.0 ± 0de PSma-n17j 12.0 ± 0k 8.0 ± 0de 9.0 ± 0f 8.7 ± 0.5ef 10.0 ± 0gh 11.3 ± 0.5j *Letras diferentes en el tiempo para cubrir la caja Petri con medio EMA indican diferencias significativas entre las cepas según la prueba de Duncan (α = 0.05) 47 Tabla 18: Cepas control candidatas con mayor velocidad de crecimiento micelial Cepa Tiempo para cubrir caja Petri con EMA (días) * C O N TR O LE S PSma 10.0 ± 0 c PAsp14*** 11 ± 0 PSma-n17j x PSma-n5j 9.0 ± 0 a PSma-n17j x PSma-n7j 9.3 ± 0.5 b PAsp14-n1 x PAsp14-n5a*** 13 ± 0 PUap-n2g x P408 9.0 ± 0 b PUap-n2g x P412 8.3 ± 0.5 a PUap-n2g x PSec-n1g 9.0 ± 0 b *Letras diferentes en el tiempo para cubrir la caja Petri con medio EMA indican diferencias significativas entre las cepas según la prueba de Duncan (α=0.05). **Todos los valores de las cepas son tomados de las Tablas 11 (verde) y 14 (azul). ***Las cepas fueron evaluadas por separado por lo cual no se realizó análisis estadístico. 48 Tabla 19: Cepas híbridas candidatas con mayor velocidad de crecimiento micelial Cepa Tiempo para cubrir caja Petri con EMA (días) * H ÍB R ID O S PSma-n12j x P407 9.0 ± 0 b PSma-n12j x P408 9.7 ± 0.5 c PSma-n12j x P412 8.0 ± 0 a PSma-n12j x PUap-n2g 8.0 ± 0 a PSma-n17j x P407 9.0 ± 0 b PSma-n17j x P412 11.0 ± 0 d PAsp14-n1a x PUap-n2g 9.7 ± 0.5 g PAsp14-n1a x PSma-n12j 8.0 ± 0de PAsp14-n1a x PSma-n17j 8.0 ± 0de PAsp14-n2a x PSma-n12j 9.0 ± 0 f PAsp14-n2a x PSma-n17j 9.0 ± 0 f PAsp14-n5a x P407 8.0 ± 0de PAsp14-n5a x P408 8.0 ± 0de PAsp14-n5a x P412 8.0 ± 0de PAsp14-n5a x PSec-n1g 8.0 ± 0de PAsp14-n5a x PUap-n2g 8.0 ± 0de PAsp14-n5a x PSma-n12j 8.0 ± 0de PAsp14-n5a x PSma-n17j 8.7 ± 0.5ef PAsp14-n8a x P408 8.7 ± 0.5ef PAsp14-n8a x P412 8.0 ± 0de PAsp14-n8a x PUap-n2g 6.7 ± 1.0b PAsp14-n8a x PSma-n12j 6.0 ± 0a PAsp14-n8a x PSma-n17j 10.0 ± 0gh PAsp14-n26a x PSec-n1g 8.0 ± 0de PAsp14-n26a x PUap-n2g 7.3 ± 1.0c PAsp14-n26a x PSma-n12j 8.0 ± 0de *Letras diferentes en el tiempo para cubrir la caja Petri con medio EMA indican diferencias significativas entre las cepas según la prueba de Duncan (α=0.05). **Todos los valores de las cepas son tomados de las Tablas 14 (azul) y 17 (naranja). 49 6.2 Fructificación de híbridos seleccionados 6.2.1 Cepas parentales e híbridas Las Tablas 18 y 19 muestran las 34 cepas que fueron preselección para ser fructificadas. Debido al gran número, se seleccionaron las 16 cepas que se muestran en la Tabla 20. Tabla 20: Cepas seleccionadas para la etapa de fructificación Cepa Velocidad de crecimiento micelial Lote C O N TR O LE S PSma 10.0 ± 0 1, 3, 5 PAsp14* 11 ± 0 1 PSma-n17j x PSma-n5j 9.0 ± 0 2,4 PAsp14-n1 x PAsp14-n5a* 13 ± 0 4 PUap-n2g x P412 8.3 ± 0.5 3,5 H ÍB R ID O S PSma-n12j x PAsp14-n8a 6.0 ± 0 1 PSma-n12j x PAsp14-n1a 8.0 ± 0 3,5 PSma-n12j x PAsp14-n5a 8.0 ± 0 2 PSma-n17j x PAsp14-n1a 8.0 ± 0 4 PSma-n17j x PAsp14-n5a 8.7 ± 0.5 1 PSma-n17j x PAsp14-n8a 10.0 ± 0 2 PSma-n12j x PUap-n2g 8.0 ± 0 3,5 PSma-n12j x P412 8.0 ± 0 4 PSma-n17j x P407 9.0 ± 0 4 PSma-n12j x P408 9.7 ± 0.5 4 PSma-n17j x P412 11.0 ± 0 3,5 *Las cepas fueron evaluadas por separado por lo que no se realizo análisis estadístico 50 Además de una rápida velocidad de crecimiento, se consideró su capacidad de aparearse con un mayor número de cepas, de tal forma que al mismo tiempo se aumentara la diversidad genética de los híbridos. Tabla 21: Cepas a fructificar en trabajos posteriores Cepa Velocidad de crecimiento micelial C O N TR O LE S PSma-n17j x PSma-n7j 9.3 ± 0.5 PUap-n2g x P408 9.0 ± 0 PUap-n2g x PSec-n1g 9.0 ± 0 H ÍB R ID O S PSma-n12j x P407 9.0 ± 0 PUap-n2g x PAsp14-n1a 9.7 ± 0.5 PSma-n12j x PAsp14-n2a 9.0 ± 0 PSma-n17j x PAsp14-n2a 9.0 ± 0 PAsp14-n5a x P407 8.0 ± 0 PAsp14-n5a x P408 8.0 ± 0 PAsp14-n5a x P412 8.0 ± 0 PAsp14-n5a x PSec-n1g 8.0 ± 0 PAsp14-n5a x PUap-n2g 8.0 ± 0 PAsp14-n8a x P408 8.7 ± 0.5 PAsp14-n8a x P412 8.0 ± 0 PAsp14-n8a x PUap-n2g 6.7 ± 1.0 PAsp14-n26a x PSec-n1g 8.0 ± 0 PAsp14-n26a x PUap-n2g 7.3 ± 1.03 PSma-n12j x PAsp14-n26a 8.0 ± 0 51 Debido a las limitaciones experimentales como la capacidad de la autoclave y del cuarto de fructificación así como para facilitar el trabajo de cosecha de los hongos, las 16 cepas, se dividieron en 4 lotes de 4 cepas cada uno. En la Tabla 21 se muestran las cepas que restarían para ser evaluadas en experimentos posteriores. 6.2.2 Fructificación Para preparar el sustrato se utilizó la formulación reportada en la Tabla 5 (Materiales y Métodos) debido a que en experimentos previos en el laboratorio ha permitido obtener una buena invasión del sustrato y altos rendimientos durante la evaluación de diferentes cepas de Pleurotus spp. (Sánchez, 2013 y Marroquín, 2009). Determinación de humedad y máxima capacidad de hidratación de los componentes principales del sustrato. Para preparar el sustrato se determinó la humedad que presentaba cada componente (aserrín, cascarilla de algodón, paja y mijo) y por otro lado también se determinó su máxima capacidad de hidratación. En la Tabla 22 se presentan los valores promedio de humedad y máxima capacidad de hidratación del sustrato preparado en cada uno de los 5 lotes. Con los valores obtenidos para cada componente (Tabla 22) y la composición del sustrato (Tabla 5), se realizó el cálculo para conocer la cantidad de cada componente y el volumen de agua necesaria para obtener una humedad final del 70% aproximadamente. En la Tabla 23 se presenta la cantidad de cada componente necesaria para preparar 16 bolsas de 1000 g de sustrato. Además se presenta la cantidad de agua que aporta cada componente y se observa que la humedad teórica del sustrato fue del 70.26%. 52 Tabla 22: Determinación de humedad y máxima capacidad de retención de agua de los compontes principales para la preparación del sustrato Componentes del sustrato Lotes 1 y 2 Lotes 3, 4 y 5 Humedad Humedad Material original (%) A máxima capacidad de hidratación (%) Material original (%) A máxima capacidad de hidratación (%) Aserrín de encino blanco 7.0 73.0 6.6 72.3 Cascarilla de algodón 8.0 67.5 7.2 70.9 Paja de trigo 8.7 79.5 5.9 83.7 Mijo 7.3 33.3 6.7 31.3 Una vez preparado el sustrato se tomaron muestras de cada lote antes y después de la esterilización para conocer el valor promedio de la humedad final de los sustratos, estos datos son de suma importancia, ya que para reportar la eficiencia biológica (g de hongo fresco / 100 g de sustrato seco) se debe conocer la cantidad de sustrato seco. 53 Tabla 23: Cálculo de las cantidades necesarias de cada componente y del agua necesaria para obtener un sustrato con una humedad final de 70% Humedades Composición de 100 9 ... s!nlto lÑrMdo (9'100) Ciilculo para 16 bolsos de 1 kg (1 mhirM capacidad de hklffiacl6n) "" ... - , ..... ~ '''' Motfllo¡ "~ del susU-MO ~, copacldad Composición ConIInldo b . ~ -, Idlclona '''' "'",Iona '''' '00 ofIgllIIl ~ del su.!nIto ~ ... ~ ofIglllll1 ~~ .. tl ml I ~. ~'OO .. t.mIl ,%1 hidratación (BI .. Humeda) '" '" p .. or(g) mltorlol odlclona, ofIgllIIl ~, ..,Ic"""" ,%1 orIylllll oo1gillll ..... ninde ' .00 13.00 ~ 21.17 , . ~ 8.42 0.59 ~ . 1193.5 m 3500.9 .nclno~nco CI.cotIllo de '.00 67.50 ~ 19.58 ' .0 10.24 0.82 18.76 1452.3 116.2 3190.4 .- PIJa de lrIgo ' .M 19.50 ~ 23.06 ,." 6.51 0.57 22.49 m.. M.' 3825,5 Mijo , . ~ " . ~ • ' .00 ' .00 , . ~ 0.47 2.52 918,0 61,0 42S,4 CISo. , '00 '00 480.0 ,~~ , '.00 '.00 160.0 I PESO TOTAL I 16013 I I IIUmedacl~ I ." I I Humedacl ~ I 10.26 I susUato iIIicial susUato fonal . 54 Los sustratos presentaron las siguientes humedades antes y después del tratamiento térmico (Tabla 24), es importante destacar que la humedad final no fue la esperada según el cálculo, a continuación se presenta algunas de las posibles causas:  Acondicionamiento del sustrato: la forma de hidratación de los componentes del sustrato en el lote 1 fue por separado y luego se mezclaron, mientras que en los siguientes lotes se mezclaron todos los componentes y luego se hidrataron.  El tipo de bolsa para el llenado del sustrato: la bolsa no fue la misma para todos los lotes lo que provocaba que en algunos casos se rompiera la bolsa después de la esterilización provocando pérdida de humedad. Tabla 24: Humedad de los sustratos de los lotes 1 al 5 Humedades Lote Calculada Antes de esterilizar Después de esterilizar 1 70.2 66.1 ± 1.5 61.4 ± 0.3 2 70.2 69.2 ± 1.3 63.0 ± 3.1 3 65.9 67.4 ± 2.4 52.8 ± 3.3 4 65.9 65.1 ± 1.5 61.4 ± 0.9 5 65.9 64.8 ± 0.9 60.5 ± 1.4 En la etapa de incubación de los sustratos inoculados se observó lo siguiente: Invasión: en esta etapa se presentaron diferencias en los tiempos y grados de invasión pero se decidió sacar después de 30 días todas las cepas para la inducción a la fructificación; la diferencia en los grados de invasión del sustrato se debió en algunos casos al exceso de agua que contenían, la cual se tuvo que drenar y en algunos otros casos a la falta de humedad en el sustrato. 55 Para evaluar la capacidad de productividad de los cuerpos fructíferos de los híbridos, se compararon con las cepas parentales, así como de las cepas regeneradas y cepas silvestres de Pleurotus spp., que servirán como referencia según sea el caso. 6.2.3 Cosecha de hongos y análisis de resultados En las Tablas 25, 28, 31, 34, y 37 se presentan las características morfológicas de los esporóforos producidos en los 5 lotes, algunas de las características son color, consistencia y textura. Estas características varían de una cepa a otra pero se mantienen constantes para cada una de ellas durante todo el período de producción. En la coloración de las diferentes cepas fructificadas se reporta la apreciación personal de los esporóforos y primordios. En general las cepas presentaron una coloración más oscura cuando aparecieron los primordios y al formarse los esporóforos se tornaron de un tono más claro pero manteniéndose el color que predomino. En cuanto a la consistencia y textura de los hongos en todas las cepas fue suave, grueso y/o delgado y el estípite correoso, grueso y/o delgados La consistencia y textura de los carpóforos es de buena calidad en general, ya que la parte de interés comercial es el carpóforo y no el estípite para el caso de Pleurotus spp., el cual en todas las cepas presenta una consistencia suave y gruesa o delgada. Para la coloración, consistencia y textura sólo se reporta la apreciación personal de los carpóforos durante la etapa de fructificación. 56 6.2.3.1 Productividad de las cepas del Lote 1 En el Tabla 26 se reporta los valores de eficiencia biológica semanal acumulada (EBSA) sin estípite. Para cada cepa se realizó un análisis de varianza de bloques (Tablas 47, 49, 51 y 53), tomando como variable independiente semanas de corte y como vía las replicas. Como resultado se observaron diferencias altamente significativas en las EBA obtenidas en las diferentes semanas de corte, por ello se realizó la prueba de rango múltiple de Duncan (Tablas 48, 50, 52 y 54), para determinar en qué semana se obtuvo el rendimiento máximo significativo (RMS) para cada cepa. En la Tabla 26 se observan que los valores sombreados corresponden a la semana donde se alcanzó el RMS. El RMS de las cepas parentales PSma y PAsp14 fueron alcanzados a la 10a y 9a semana con valores de 51.5% y 46.5% respectivamente mientras que las cepas híbridas PSma-n17j x PAsp14-n5a y PSma-n12j x PAsp14-n8a su RMS lo alcanzaron a la 8ª y 9ª semana con valores de 53.1% y 49.9%. Los resultados obtenidos indican que existen diferencias en los tiempos para alcanzar el RMS entre las cepas (Tabla 27). No obstante fue posible obtener cepas híbridas con eficiencias biológicas significativas mayores que la cepa original, la cepa PSma-n17j x PAsp14-n5a muestra el mayor rendimiento en el menor tiempo, mientras que la cepa PSma-n12j x PAsp14-n8a presenta un rendimiento semejante a la cepa parental PAsp14 pero menor que la cepa parental PSma. En experimentos de Sánchez, (2013), observó que a una humedad de 64% en el sustrato las cepas PSma y PAsp14 produjeron una EBA de 54.3% y 50.6% respectivamente valores similares a los obtenidos en este lote con una humedad de 61.4%. Por otro lado, encontró que con 72% de humedad en el sustrato, ambas cepas produjeron los más altos rendimientos (63.0% y 73.0%) de eficiencia biológica. Cabe destacar que las eficiencias biológicas se ven incrementadas al aumentar el contenido de humedad en los sustratos. 57 Tabla 25: Fenotipos de los esporóforos producidos en el Lote 1 Fructificaciones Características PSma Estípite Corto Correoso Píleo Blanco Carnoso Suave Sp + PAsp14 Estípite Corto Correoso Píleo Blanco grisáceo Carnoso Quebradizo Sp - PSma-n17j x PAsp14-n5a Estípite Corto Correoso Píleo Crema gris Carnoso Suave Sp + PSma-n12j x PAsp14-n8a Estípite Corto Correoso Píleo Crema café Carnoso Suave Sp + 58 Tabla 26: Eficiencia biológica semanal acumulada (sin estípite) de 4 cepas de Pleurotus ostreatus. (Lote 1, H = 61.4 ± 0.3) Eficiencia biológica semanal acumulada (EBA) (g hongos frescos / 100 g de sustrato seco) Se m an as Cepas PSma PAsp14 PSma - n17j x PAsp14 - n5a PSma - n12j x PAsp14 - n8a 1 11.0 ± 15.5a 26.1 ± 2.8a 35.8 ± 9.2a 24.1 ± 13.7a 2 22.3 ± 14.1b 26.1 ± 2.8a 35.9 ± 9.1a 25.3 ± 13.4a 3 29.9 ± 7.6bc 26.1 ± 2.8a 39.1 ± 6.4ab 33.4 ± 7.9b 4 32.8 ± 6.5cd 30.7 ± 6.0a 41.5 ± 7.3b 38.0 ± 9.2bc 5 40.2 ± 5.0de 37.9 ± 5.9b 47.9 ± 5.2c 42.0 ± 7.4cd 6 43.9 ± 4.7ef 37.9 ± 5.9b 49.2 ± 7.0cd 46.8 ± 5.8de 7 46.6 ± 6.9efg 39.3 ± 3.2b 51.9 ± 7.2cde 47.4 ± 5.8def 8 46.6 ± 6.9efg 43.8 ± 3.8c 53.1 ± 5.0def 48.4 ± 4.3efg 9 49.3 ± 7.2fgh 46.5 ± 6.0cd 54.2 ± 7.0ef 49.9 ± 5.6efgh 10 51.5 ± 8.8fghi 46.5 ± 6.0cd 55.6 ± 6.7ef 51.9 ± 5.4efgh 11 51.5 ± 8.8fghi 46.5 ± 6.0cd 56.5 ± 6.2ef 52.7 ± 5.4efgh 12 55.3 ± 3.9ghi 47.9 ± 5.6cd 57.6 ± 5.2f 53.2 ± 5.9fgh 13 57.3 ± 4.7hi 49.9 ± 4.9d 57.6 ± 5.2f 53.8 ± 5.4gh 14 58.7 ± 5.4i 50.3 ± 4.7d 57.6 ± 5.2f 54.7 ± 6.0h 15 58.7 ± 5.4i 51.0 ± 5.6d 58.1 ± 5.1f 55.5 ± 5.5h * Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas según Duncan (α = 0.05%) Valores sombreados corresponden a la semana donde se alcanzó el rendimiento máximo significativo (RMS) 59 Tabla 27: EBA (sin estípite) al RMS de 4 cepas de Pleurotus del Lote 1 Cepa EBA al RMS Tiempo para alcanzar RMS (semanas) PSma - n17j x PAsp14 – n5a 53.1 ± 5.0 a 8 PSma 51.5 ± 8.8 a 10 PSma - n12j x PAsp14 – n8a 49.9 ± 5.6 a 9 PAsp14 46.5 ± 6.0 a 9 * Letras iguales indica que no hay diferencias estadísticamente significativas entre cepas según Duncan (α = 0.05%) Los valores estadísticos se obtuvieron de la Tabla 26 En la Gráfica 1 se representa la EBA de las cepas de la Tabla 27 señalando el tiempo en que se alcanzó el RMS y según el análisis de varianza para estas 4 cepas se determinó que no hay diferencias significativas entre las cepas, sus EBA al RMS son muy cercanas (46.5% a 53.1%) (Ver Tabla 93). 60 6.2.3.2 Productividad de las cepas del lote 2 De manera semejante al lote 1 en la Tabla 29 se reporta los valores de eficiencia biológica semanal acumulada (EBSA) sin estípite de 3 cepas. Para cada cepa se realizó un análisis de varianza de bloques (Tablas 55, 57 y 59), tomando como variable independiente semanas de corte y como vía las replicas. Como resultado se observaron diferencias altamente significativas en las EBA obtenidas en las diferentes semanas de corte, por ello se realizó la prueba de rango múltiple de Duncan (Tablas 56, 58 y 60), para determinar en qué semana se obtuvo el rendimiento máximo significativo (RMS) para cada cepa. En la Tabla 29 se observan que los valores sombreados corresponden a la semana donde se alcanzó el RMS. El RMS de la cepa regenerada PSma-n17j x PSma-n5j fue a la 9a semana con valor de 35.1%, mientras que para las cepas híbridas PSma-n17j x PAsp14-n8a y PSma-n12j x PAsp14-n5a el RMS se alcanzó a la 10ª y 11ª semana con valores de 61.6% y 95.5% respectivamente. Los resultados obtenidos indican que existen diferencias en los tiempos para alcanzar el RMS entre las cepas (Tabla 30). No obstante fue posible obtener cepas híbridas con eficiencias biológicas significativas mayores que la cepa regenerada, la cepa PSma-n17j x PAsp14-n8a muestra un mayor rendimiento aunque en mayor tiempo, mientras que la cepa PSma-n12j x PAsp14-n5a presenta un rendimiento superior a la cepa regenerada y que el híbrido antes mencionado aunque tardo una semana más en alcanzar su RMS. 61 Tabla 28: Fenotipos de los esporóforos producidos en el Lote 2 Fructificaciones Características PSma-n17j x PSma-n5j Estípite Corto Correoso Píleo Gris claro Carnoso Suave Sp + PSma-n17j x PAsp14-n8a Estípite Corto Correoso Píleo Café claro Carnoso Suave Sp + PSma-n12j x PAsp14-n5a Estípite Corto Correoso Píleo Café claro Carnoso Suave Sp + 62 Tabla 29: Eficiencia biológica semanal acumulada (sin estípite) de 3 cepas de Pleurotus ostreatus (Lote 2, H = 63.0 ± 3.1) Eficiencia biológica semanal acumulada (EBA) (g hongos frescos / 100 g de sustrato seco) Se m an as Cepas PSma - n17j x PSma - n5j PSma - n17j x PAsp14 - n8a PSma - n12j x PAsp14 - n5a 1 7.3 ± 5.3a 25.3 ± 14.2a 25.6 ± 2.6a 2 14.8 ± 3.2b 30.5 ± 2.8a 58.7 ± 3.8b 3 16.9 ± 2.9b 30.5 ± 2.8a 58.7 ± 3.8b 4 21.0 ± 6.5c 45.5 ± 2.8b 74.9 ± 5.8c 5 25.5 ± 8.2d 45.5 ± 2.8b 74.9 ± 5.8c 6 26.5 ± 6.3d 45.5 ± 2.8b 80.5 ± 9.9d 7 29.5 ± 5.4de 55.9 ± 3.4c 83.9 ± 5.5de 8 31.3 ± 6.3ef 55.9 ± 3.4c 86.4 ± 5.0e 9 35.1 ± 6.3fg 57.0 ± 4.5cd 91.8 ± 5.1f 10 36.0 ± 6.8g 61.6 ± 3.1cde 93.7 ± 3.9fg 11 36.6 ± 7.3g 61.6 ± 3.1cde 95.5 ± 6.7fgh 12 36.6 ± 7.3g 62.5 ± 3.9cde 97.2 ± 5.0gh 13 38.4 ± 6.0g 63.5 ± 5.1de 97.9 ± 6.2gh 14 38.4 ± 6.g 64.0 ± 4.2e 99.2 ± 5.1h 15 38.4 ± 6.0g 64.2 ± 4.1e 99.2 ± 5.1h * Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas según Duncan (α = 0.05%) Valores sombreados corresponden a la semana donde se alcanzó el rendimiento máximo significativo (RMS) 63 Tabla 30: EBA (sin estípite) al RMS de 3 cepas de Pleurotus del Lote 2 Cepa EBA al RMS Tiempo para alcanzar RMS (semanas) PSma - n12j x PAsp14 – n5a 95.5 ± 6.7 c 11 PSma - n17j x PAsp14 – n8a 61.6 ± 3.1 b 10 PSma - n17j x PSma – n5j 35.1 ± 6.3 a 9 * Letras diferentes indican diferencias estadísticas significativas según Duncan (α = 0.05%) Los valores estadísticos se obtuvieron de la Tabla 29 En la Gráfica 2 se representa la EBA de las cepas de la Tabla 30 señalando el tiempo en que se alcanzó el RMS y según el análisis de varianza para estas 3 cepas se determinó que hay diferencias altamente significativas entre las cepas, por lo que se realizó la prueba de Duncan para conocer la cepa que presento la mayor EBA al RMS la cual fue la cepa PSma - n12j x PAsp14 – n5a (95.5%). 64 6.2.3.3 Productividad de las cepas del Lote 3 Siguiendo el procedimiento en el Tabla 32 se reporto los valores de eficiencia biológica semanal acumulada (EBSA) sin estípite de 5 cepas. Para cada cepa se realizó un análisis de varianza de bloques (Tablas 61, 63, 65, 67 y 69), tomando como variable independiente semanas de corte y como vía las replicas. Como resultado se observaron diferencias altamente significativas en las EBA obtenidas en las diferentes semanas de corte, por ello se realizó la prueba de rango múltiple de Duncan (Tablas 62, 64, 66, 68 y 70), para determinar en qué semana se obtuvo el rendimiento máximo significativo (RMS) para cada cepa. En la Tabla 32 se observaron que los valores sombreados corresponden a la semana donde se alcanzó el RMS. En este lote se observó adicionalmente la influencia que tiene la humedad con respecto al tiempo y producción de los hongos, debido a que en este experimento el tipo de bolsa que se utilizo para la elaboración del sustrato se rompió en la estilización, este percance provocó la pérdida de agua y como consecuencia disminución de la producción. Aun así se obtuvieron los datos para corroborar este efecto los cuales son los siguientes: El RMS de la cepa parental PSma fue alcanzado en la 10a semana con valores de 35.6% mientras que las cepas híbridas PUap-n2g x P412 y PSma-n12j x PAsp14- n1a su RMS lo alcanzaron a la 12ª semana con valores de 32.6% y 43.6% respectivamente y finalmente las cepas híbridas PSma-n12j x PUap-n2g y PSma- n17j x P412 alcanzaron su RMS a la 13a y 15a semana con valores de 45% y 44% respectivamente. Los resultados obtenidos indican que existen diferencias en los tiempos para alcanzar el RMS entre las cepas (Tabla 33), además de que los rendimientos son muy bajos lo cual se atribuye a la baja humedad que tuvieron los sustratos en este lote. No obstante fue posible obtener cepas híbridas con eficiencias biológicas significativas mayores que la cepa original, PSma aunque en un mayor tiempo de cosecha se alcanzaron los RMS, por lo que estas cepas se volvieron a evaluar (Lote 5) con una humedad de sustrato mayor para observar cómo afecta los rendimientos si no se mantienen las condiciones óptimas de producción de hongos como lo fue en este lote. 65 Tabla 31: Fenotipos de los esporóforos producidos en el Lote 3 Fructificaciones Características PSma Estípite Corto Correoso Píleo Blanco Carnoso Suave Sp + PUap-n2g x P412 Estípite Corto Correoso Píleo Café cremoso Carnoso Suave Sp + PSma-n12j x PAsp14-n1a Estípite Corto Correoso Píleo Gris claro Carnoso Suave Sp + PSma-n12j x PUap-n2g Estípite Corto Correoso Píleo Blanco cremoso Carnoso Suave Sp + 66 Fructificaciones Características PSma-n17j x P412 Estípite Corto Correoso Píleo Blanco cremoso Carnoso Suave Sp + 67 Tabla 32: Eficiencia biológica semanal acumulada (sin estípite) de 5 cepas de Pleurotus ostreatus (Lote 3, H = 52.8 ± 3) Eficiencia biológica semanal acumulada (EBA) (g hongos frescos/100 g de sustrato seco) Se m an as CEPAS PSma PUap - n2g x P412 PSma - n12j x PAsp14 - n1a PSma - n12j x PUap - n2g PSma - n17j x P412** 1 6.6 ± 9.4a 5.4 ± 6.3a 11.1 ± 10.9a 18.6 ± 7.2a 3.1 ± 7.0a 2 13.2 ± 5.0b 12.5 ± 4.3b 14.4 ± 9.1a 21.7 ± 3.6a 14.5 ± 4.1b 3 14.7 ± 7.8b 12.5 ± 4.3b 19.6 ± 12.9ab 23.3 ± 1.4a 16.7 ± 4.2bc 4 15.9 ± 8.0b 12.5 ± 4.3b 19.6 ± 12.9ab 23.3 ± 1.4a 16.7 ± 4.2bc 5 21.6 ± 8.0c 16.1 ± 7.3bc 24.9 ± 17.0bc 30.5 ± 2.7b 22.3 ± 6.2cd 6 22.8 ± 8.0c 20.6 ± 6.4cd 25.8 ± 17.2bc 32.3 ± 0.9b 23.9 ± 4.9de 7 28.4 ± 9.0d 21.4 ± 6.1d 32.9 ± 17.5cd 34.9 ± 3.6bc 24.8 ± 5.5de 8 28.4 ± 9.0d 21.4 ± 6.1d 33.6 ± 17.7cd 34.9 ± 3.6bc 26.0 ± 6.8def 9 32.6 ± 8.1e 23.9 ± 5.8d 36.6 ± 18.7de 35.6 ± 4.9bc 26.4 ± 7.2def 10 35.6 ± 10.2ef 29.5 ± 4.2e 39.3 ± 20.1de 40.1 ± 4.9cd 30.4 ± 6.6ef 11 36.1 ± 9.6ef 29.5 ± 4.2e 40.1 ± 20.2de 40.8 ± 4.1cd 30.9 ± 5.9ef 12 37.6 ± 11.0f 32.6 ± 4.0ef 43.6 ± 19.6ef 43.9 ± 9.9d 33.3 ± 7.0f 13 37.6 ± 11.0f 32.6 ± 4.0ef 43.6 ± 19.6ef 45.0 ± 9.0de 33.3 ± 7.0f 14 39.0 ± 9.9f 34.1 ± 3.5ef 44.2 ± 19.6ef 45.0 ± 9.0de 33.3 ± 7.0f 15 39.0 ± 9.9f 37.1 ± 5.1f 50.3 ± 7.2f 50.3 ± 6.6e 44.4 ± 5.7g * Letras diferentes indican diferencias estadísticas significativas según Duncan (α = 0.05%) ** Letras diferentes indican diferencias estadísticas significativas según S.N.K (α = 0.05%) Valores sombreados corresponden a la semana donde se alcanzó el rendimiento máximo significativo (RMS) 68 Tabla 33: EBA (sin estípite) al RMS de 5 cepas de Pleurotus del Lote 3 Cepa EBA al RMS Tiempo para alcanzar RMS (semanas) PSma - n12j x PUap - n2g 44.99 ± 9.0 a 13 PSma - n17j x P412 44.44 ± 5.7 a 15 PSma - n12j x PAsp14 - n1a 43.59 ± 19.6 a 12 PSma 35.59 ± 10.2 a 10 PUap - n2g x P412 32.60 ± 4.0 a 12 * Letras iguales indica que no hay diferencias estadísticamente significativas entre cepas según Duncan (α = 0.05%) En la Gráfica 3 se representa la EBA de las cepas de la Tabla 33 señalando el tiempo en que se alcanzó el RMS y según el análisis de varianza para estas 5 cepas se determinó que no hay diferencias significativas entre las cepas, sus EBA al RMS son muy cercanas (32.6 a 45) (Ver Tabla 96). 69 6.2.3.4 Productividad de las cepas del Lote 4 En el Tabla 35 se reportan los valores de eficiencia biológica semanal acumulada (EBSA) sin estípite de 6 cepas. Para cada cepa se realizó un análisis de varianza de bloques (Tablas 71, 73, 75, 77, 79 y 81), tomando como variable independiente semanas de corte y como vía las replicas. Como resultado se observaron diferencias altamente significativas en las EBA obtenidas en las diferentes semanas de corte, por ello se realizó la prueba de rango múltiple de Duncan (Tablas 72, 74, 76, 78, 80 y 82), para determinar en qué semana se obtuvo el rendimiento máximo significativo (RMS) para cada cepa. En la Tabla 35 se observan que los valores sombreados corresponden a la semana donde se alcanzó el RMS. El RMS de las cepas regeneradas PSma-n17j x PSma-n5j y PAsp14-n1a x PAsp14-n5a fue alcanzado en la 13a y 11a semana con valores de 36.8% y 57.5% respectivamente, las cepas híbridas PSma-n12j x P408 y PSma-n17j x P407 lo alcanzaron a la 11a semana con valores de RMS de 14.5% y 41.1%, mientras que los híbridos PSma-n12j x P412 y PSma-n17j x PAsp14-n1a lo alcanzaron a la 8ª y 9ª semana con un valor de RMS de 31.4% y 51.7 %. Los resultados obtenidos indican que existen diferencias en los tiempos para alcanzar el RMS entre las cepas (Tabla 36), además de que los rendimientos son muy bajos como en el caso de la cepa PSma-n12j x P408 lo que indica que es probable que en este caso la cepa tenga buena velocidad de crecimiento micelial (8 días) pero que en la etapa de fructificación las condiciones no le favorezcan para tener buena productividad en tiempos cortos como se esperaría al observar su etapa micelial. Sin embargo, la cepa híbrida PSma-n17j x PAsp14-n1a presentó un RMS muy cercano a la cepa regenerada PAsp14-n1a x PAsp14-n5a pero en menor tiempo. Sánchez, (2013), reporta que al regenerar y fructificar la cepa PAsp14-n1a x PAsp14-n5a obtuvo una EBA de 50.8% lo cual representa valores similares a los obtenidos al reconstituir esta misma cepa (57.53%). 70 Tabla 34: Fenotipos de los esporóforos producidos en el Lote 4 Fructificaciones Características PSma-n17j x PSma-n 5j Estípite Corto Correoso Píleo Café claro Carnoso Suave Sp + PSma-n12j x P408 Estípite Corto Correoso Píleo Café claro Carnoso Suave Sp + PSma-n12j x P412 Estípite Corto Correoso Píleo Café claro Carnoso Suave Sp + PSma-n17j x PAsp14-n1a Estípite Corto Correoso Píleo Gris claro Carnoso Suave Sp + 71 Fructificaciones Características PSma-n17j x P407 Estípite Corto Correoso Píleo Blanco cremoso Carnoso Suave Sp + PAsp14-n1a x PAsp14-n5a Estípite Corto Correoso Píleo Gris claro Carnoso Suave Sp + 72 Tabla 35: Eficiencia biológica semanal acumulada (sin estípite) de 6 cepas de Pleurotus ostreatus (Lote 4, H = 61.4 ± 0.9) Eficiencia biológica semanal acumulada (EBA) (g hongos frescos/100 g de sustrato seco) Se m an as CEPAS PSma - n17j x PSma - n5j PSma - n12j x P408 PSma - n12j x P412 PSma - n17j x PAsp14 - n1a PSma - n17j x P407 PAsp14 - n1a x PAsp14 - n5a 1 4.1 ± 9.1a 0 ± 0a 6.3 ± 9.2a 20.4 ± 6.1a 19.8 ± 17.3a 11.8 ± 9.2a 2 4.1 ± 9.1a 0 ± 0a 7.5 ± 8.4ª 20.4 ± 6.1a 19.8 ± 17.3a 21.0 ± 8.8b 3 4.1 ± 9.1a 0 ± 0a 11.4 ± 10.8a 20.4 ± 6.1a 20.6 ± 18.0a 30.4 ± 5.0c 4 10.8 ± 14.4b 0 ± 0a 20.0 ± 15.7b 28.6 ± 8.8ab 27.3 ± 10.6ab 33.4 ± 9.2c 5 11.8 ± 14.4b 0 ± 0a 26.4 ± 12.8c 31.9 ± 6.8bc 30.1 ± 11.2bc 40.6 ± 7.7d 6 14.2 ± 12.8b 0 ± 0a 27.9 ± 11.3cd 39.7 ± 8.4cd 30.9 ± 10.9bc 42.2 ± 6.9d 7 14.2 ± 12.8b 0 ± 0a 27.9 ± 11.3cd 43.8 ± 9.0de 30.9 ± 10.9bc 43.4 ± 5.9de 8 22.2 ± 10.8c 0 ± 0a 31.4 ± 7.6cde 45.1 ± 11.5de 31.7 ± 10.9bcd 48.3 ± 6.3ef 9 29.1 ± 11.2d 0 ± 0a 33.4 ± 9.6de 51.7 ± 9.9ef 38.9 ± 9.2cde 51.7 ± 7.3fg 10 30.7 ± 10.9d 0 ± 0a 36.2 ± 6.1e 52.6 ± 11.1ef 40.2 ± 9.0de 56.0 ± 6.9gh 11 32.2 ± 10.6de 14.5 ± 12.7b 36.2 ± 6.1e 54.0 ± 11.0ef 41.1 ± 10.3ef 57.5 ± 5.7hi 12 33.1 ± 10.8de 14.5 ± 12.7b 37.4 ± 4.9e 54.0 ± 11.0ef 42.1 ± 10.8ef 58.0 ± 4.9hi 13 36.8 ± 7.1ef 21.1 ± 1.9b 37.4 ± 4.9e 54.0 ± 11.0ef 49.6 ± 4.2f 58.8 ± 5.1hi 14 36.8 ± 7.1ef 21.1 ± 1.9b 37.4 ± 4.9e 60.6 ± 8.0f 49.6 ± 4.2f 60.4 ± 4.7hi 15 40.1 ± 7.7f 21.1 ± 1.9b 37.4 ± 4.9e 60.6 ± 8.0f 49.6 ± 4.2f 62.0 ± 4.9i * Letras diferentes indican diferencias estadísticas significativas según Duncan (α = 0.05%) Valores sombreados corresponden a la semana donde se alcanzó el rendimiento máximo significativo (RMS) 73 Tabla 36: EBA (sin estípite) al RMS de 6 cepas de Pleurotus del Lote 4 Cepa EBA al RMS PAsp14 - n1a x PAsp14 - n5a 57.53 ± 5.7 f PSma - n17j x PAsp14 - n1a 51.74 ± 9.9 e PSma - n17j x P407 41.06 ± 10.3 d PSma - n17j x PSma - n5j 36.81 ± 7.1 c PSma - n12j x P412 31.44 ± 7.6 b PSma - n12j x P408 14.52 ± 12.7 a * Letras diferentes indican diferencias estadísticas significativas según Duncan (α = 0.05%) En la Gráfica 4 se representa la EBA de las cepas de la Tabla 36 señalando el tiempo en que se alcanzó el RMS y según el análisis de varianza para estas 6 cepas se determinó que hay diferencias altamente significativas entre las cepas, por lo que se realizó la prueba de Duncan para conocer la cepa que presentó la mayor EBA al RMS, la cual fue la cepa PAsp14 – n1a x PAsp14 – n5a (57.5%). 74 6.2.3.5 Productividad de las cepas del Lote 5 Finalmente, en el Tabla 37 se reportan los valores de eficiencia biológica semanal acumulada (EBSA) sin estípite de 5 cepas. Para cada cepa se realizó un análisis de varianza de bloques (Tablas 83, 85, 87, 89 y 91), tomando como variable independiente semanas de corte y como vía las replicas. Como resultado se observaron diferencias altamente significativas en las EBA obtenidas en las diferentes semanas de corte, por ello se realizó la prueba de rango múltiple de Duncan (Tablas 84, 86, 88, 90 y 92), para determinar en qué semana se obtuvo el rendimiento máximo significativo (RMS) para cada cepa. En la Tabla 37 se observan que los valores sombreados corresponden a la semana dónde se alcanzó el RMS. El RMS de la cepa parental PSma fue alcanzado a la 11a semana con valores de 87.0 mientras que las cepas híbridas PSma-n12j x PUap- n2g y PSma-n17j x P412 su RMS lo alcanzaron a la 10ª semana con valores de 97.9% y 96.3% respectivamente, y las cepas híbridas PUap- n2g x P412 y PSma-n12j x PAsp14- n1a el RMS lo alcanzaron en la 12ª y 11ª semana con valores de 73.3% y 102.8% cada una. Con estos valores obtenidos se confirma nuevamente que al mantener condiciones óptimas para la producción de hongos es posible elevar la productividad lo cual se vio reflejada en los resultados obtenidos en el Lote 3 (H: 52.8%) que presentaron una baja humedad y dando como resultado una disminución en los rendimientos. Sin embargo, en este lote al mantener condiciones óptimas se observó un aumento en la productividad de todas las cepas. Los resultados obtenidos indican que existen diferencias en los tiempos para alcanzar el RMS entre las cepas (Tabla 39). No obstante fue posible obtener cepas híbridas con eficiencias biológicas significativas mayores que la cepa parental, la cepa PSma-n12j x PAsp14-n1a muestra el mayor rendimiento en igual tiempo con respecto a la cepa parental, mientras que las cepas PSma-n12j x PUap-n2g y PSma-n17j x P412 presentan rendimientos mayores que la cepa parental PSma pero en menor tiempo que la cepa híbrida con mayor productividad antes mencionada. 75 Tabla 37: Fenotipos de los esporóforos producidos en el Lote 5 Fructificaciones Características PSma Estípite Corto Correoso Píleo Blanco Carnoso Suave Sp + PUap-n2g x P412 Estípite Corto Correoso Píleo Café claro Carnoso Suave Sp + PSma-n12j x PAsp14-n1a Estípite Corto Correoso Píleo Gris claro Carnoso Suave Sp + PSma-n12j x PUap-n2g Estípite Corto Correoso Píleo Blanco cremoso Carnoso Suave Sp + 76 Fructificaciones Características PSma-n17j x P412 Estípite Corto Correoso Píleo Café claro Carnoso Suave Sp + 77 Tabla 38: Eficiencia biológica semanal acumulada (sin estípite) de 5 cepas de Pleurotus ostreatus (Lote 5, H = 60.5 ± 1.4) Eficiencia biológica semanal acumulada (EBA) (g hongos frescos/100 g de sustrato seco) Se m an as CEPAS PSma** PUap - n2g x P412* PSma - n12j x PAsp14 - n1a* PSma - n12j x PUap - n2g* PSma - n17j x P412* 1 25.0 ± 0.9a 0.0 ± 0.0a 37.8 ± 5.8a 23.5 ± 17.5a 23.6 ± 17.4a 2 25.0 ± 0.9a 22.5 ± 2.9b 38.0 ± 5.5a 24.2 ± 16.1a 24.3 ± 16.0a 3 25.0 ± 0.9a 22.5 ± 2.9b 45.1 ± 14.7a 29.7 ± 8.3a 47.5 ± 26.6b 4 31.7 ± 10.4a 29.1 ± 11.4b 54.6 ± 9.8b 49.1 ± 23.5b 54.3 ± 23.2bc 5 53.0 ± 10.4b 49.5 ± 10.6c 69.4 ± 9.9c 57.0 ± 18.1bc 63.7 ± 17.4c 6 57.6 ± 6.0bc 55.0 ± 9.0cd 74.3 ± 17.0cd 64.4 ± 13.7cd 76.3 ± 20.5d 7 60.6 ± 7.6bc 56.3 ± 11.6cd 82.5 ± 14.4de 72.5 ± 14.9d 83.5 ± 19.0de 8 64.4 ± 5.7c 56.3 ± 11.6cd 84.6 ± 12.3e 74.0 ± 14.2de 85.0 ± 19.2de 9 81.0 ± 8.5d 59.4 ± 9.8de 88.5 ± 15.1ef 85.1 ± 18.0e 89.7 ± 20.7ef 10 83.1 ± 7.3de 61.3 ± 11.5de 95.4 ± 9.0fg 97.9 ± 13.6f 96.3 ± 21.2efg 11 87.0 ± 12.5def 65.5 ± 10.8ef 102.8 ± 17.6gh 99.2 ± 11.8f 98.1 ± 19.3fg 12 88.7 ± 10.6def 73.3 ± 7.8fg 108.2 ± 11.3h 102.4 ± 11.9f 104.4 ± 16.8g 13 94.6 ± 10.0ef 73.3 ± 7.8fg 108.2 ± 11.3h 104.1 ± 14.4f 104.4 ± 16.8g 14 94.6 ± 10.0ef 75.1 ± 5.2g 109.2 ± 10.2h 104.6 ± 15.4f 104.4 ± 16.8g 15 95.6 ± 8.2f 75.1 ± 5.2g 109.9 ± 11.3h 105.9 ± 14.3f 106.1 ± 16.2g * Letras diferentes indican diferencias estadísticas significativas según Duncan (α = 0.05%) ** Letras diferentes indican diferencias estadísticas significativas según S.N.K (α = 0.05%) Valores sombreados corresponden a la semana donde se alcanzó el rendimiento máximo significativo (RMS) 78 Tabla 39: EBA (sin estípite) al RMS de 5 cepas de Pleurotus del Lote 5 Cepa EBA al RMS PSma - n12j x PAsp14 - n1a 102.81 ± 17.6 a PSma - n12j x PUap - n2g 97.93 ± 13.6 a PSma - n17j x P412 96.26 ± 21.2 a PSma 86.97 ± 12.5 a PUap-n2g x P412 73.33 ± 7.8 a * Letras iguales indica que no hay diferencias estadísticamente significativas entre cepas según Duncan (α = 0.05%) En la Gráfica 5 se representa la EBA de las cepas de la Tabla 39 señalando el tiempo en que se alcanzó el RMS y según el análisis de varianza para estas 5 cepas se determinó que no hay diferencias significativas entre las cepas, debido a que su EBA es de 73.3 a 102.8% valores muy crecanos entre sí. Es de notarse que en este lote se obtuvieron los mayores EBA de todos los experimentos con todas las cepas (Ver Tabla 99). 79 En la Tabla 40 se muestra la velocidad de crecimiento micelial de las 16 cepas que se fructificarón asi como su respectiva EBA al RMS. Es posible observar que de las 11 cepas híbridas evaluadas, 8 cepas mostraron mayor velocidad de crecimiento micelial que la cepa parental PSma (10 días). Sin embargo, de estas 8 cepas no todas presentaron mayor EBA que la cepa parental PSma, 4 de las cepas híbridas, PSma-n12j x PAsp14-n1a, PSma-n12j x PAsp14-n5a, PSma-n12j x PUap-n2g y PSma-n17j x P412 mostraron resultados satisfactorios ya que su EBA al RMS es muy cercana al 100% ademas de que estas 4 cepas producen esporóforos de color claro, lo cual resulta agradable para los consumidores. La cepa reconstituida PSma-n17j x PSma-n5j que se fructificó en los lotes 2 y 4 con humedades semejantes (H: 63 ± 3.1 y H: 61.4 ± 0.9, respectivamente) produjo una EBA de 35.1 a 36.8% valores similares, pero rendimientos bajos, muy por debajo de los valores obtenidos al fructificar la cepa original PSma que produjo una EBA DE 51.5 a 87% (H = 61.4 ± 0.3 y H = 60.5 ± 1.4, respectivamente). Mientras que la cepa reconstituida PAsp14 - n1a x PAsp14 - n5a que se fructifico en el lote 4 (H: 61.4 ± 0.9) produjo una EBA de 57.5% un valor superior que el de la cepa original PAsp14 con una EBA de 46.5% (H = 61.4 ± 0.3), pero rendimientos bajos para ambas cepas. Sin embargo, esta cepa también fue reconstituida en experimentos de Sánchez (2013), donde observo que su EBA fue de 50.8%, mientras que la cepa PAsp14 tuvo una EBA de 50.6% en ambos casos el incremento en comparación a los obtenidos en este trabajo fue mínimo. Los bajos valores de EBA al RMS de las 7 cepas híbridas restantes pudo deberse en primera estancia que en el Lote 1 se hidrató por separado cada componete del sustrato para después ser mezclado mientras que en los lotes posteriores, se mezclaron primero todos los componentes y luego se hidrató el sustrato. El caso del lote 5, donde se obtuvieron los mayores valores de EBA,puede ser atribuido aque para entonces ya se contaba con mayor habilidad experimental asi como a un mayor control de las variables experimentales, tales como la preparación del inóculo y el sustrato ademas de tener mejores condiciones de control en la etapa de fructificacion 80 Finalmente, si bien no todas las cepas híbridas fructificadas cumplieron con el objetivo de obtener mayor EBA que la cepa parental PSma, fue posible obtener cepas de Pleurotus con un adecuado fenotipo comercial, es decir con caracteristicas morfológicas aceptables (colores claros). Tabla 40: EBA Sin estípite al RMS de 16 cepas de Pleurotus evaluadas Cepa Lote Velocidad de crecimiento micelial (días) EBA al RMS Tiempo para alcanzar RMS (semanas) CONTROLES PSma 1 10 51.5 ± 8.8 10 3 35.5 ± 10.2 10 5 87.0 ± 12.5* 11 PAsp14 1 11 46.5 ± 6.0 9 PSma-n17j x PSma-n5j 2 9 35.1 ± 6.3 9 4 36.8 ± 7.1 13 PAsp14 - n1a x PAsp14 - n5a 4 13 57.5 ± 5.7 11 PUap - n2g x P412 3 8.3 32.6 ± 4.0 12 5 73.3 ± 7.8 12 HÍBRIDOS PSma-n12j x PAsp14-n8a 1 6 49.9 ± 5.6 9 PSma-n12j x PAsp14-n1a 3 8 43.6 ± 19.6 12 5 102.8 ± 17.6* 11 PSma-n12j x PAsp14-n5a 2 8 95.5 ± 6.7* 11 PSma-n17j x PAsp14-n1a 4 8 51.7 ± 9.9 9 PSma-n17j x PAsp14-n5a 1 8.7 53.1 ± 5.0 8 PSma-n17j x PAsp14-n8a 2 10 61.6 ± 3.1 10 PSma-n12j x PUap-n2g 3 8 45.0 ± 9.0 13 5 97.9 ± 13.6* 10 PSma-n12j x P412 4 8 31.4 ± 7.6 8 PSma-n17j x P407 4 9 41.1 ± 10.3 11 PSma-n12j x P408 4 9.7 14.5 ± 12.7 11 PSma-n17j x P412 3 11 44.4 ± 5.7 15 5 96.3 ± 21.2* 10 *Cepas con mayor EBA al RMS Valores sombreados corresponden a las cepas del lote con menor humedad (H = 52.8 ± 3) Valores sombreados corresponden a las cepas con mayor EBA 81 7. DISCUSIÓN: De los 11 neohaplontes de la cepa PSma fue posible clasificarlos en sus dos tipos de compatibilidad, esta recuperación de neohaplontes fue simétrica (1:1), es decir en proporciones iguales. En un estudio realizado por Ramírez (2011), reporta la recuperación simétrica de componentes monocarióticos de Lentinula edodes el cual también es un organismo de tipo tetrapolar heterotálico como lo es Pleurotus ostreatus. En esa misma investigación Ramírez (2011) señalo que los componentes monocarióticos (obtenidos por el método de dedicariotización) de cepas de distintas especies pueden ser apareados y obtener híbridos fértiles con rendimientos comerciales. En la presente investigación se aparearon los neohaplontes de la cepa PAsp14 con neohaplontes de la cepa PSma y se reporto la EBA de 6 híbridos seleccionados para la etapa de fructificación. Con la finalidad de obtener mejores EBA que las cepa parental PSma que presenta signos de degeneración, pero inicialmente esta cepa comercial presentaba características apreciables para el mercado (color blanco, estípite corto y buena eficiencia biológica). Además, de que al introducir el gen asporógeno en estos híbridos al recuperar la progenie meiótica y posteriormente aparear los componentes monocarióticos originales de la cepa PAsp14 con las esporas. De alguna manera se espera que algunos dicariotes generados se tengan presente el alelo recesivo en los dos núcleos y será posible obtener cepas de carácter asporógeno con características de la cepa comercial PSma, lo cual se ha logrado realizar con otras cepas de P. ostreatus, Baars y Hensen (2008). En los lotes 3 y 5 (Humedad 52.8% y 60.5%respectivamente) se pudo evaluar el efecto del contenido de humedad en el sustrato sobre la productividad, donde se demostró que al incrementar el contenido de agua en el sustrato hay un aumento en la eficiencia biológica. Estos resultados representan un aporte al conocimiento científico ya que hay muy poca información reportada sobre la influencia del contenido de humedad en el sustrato sobre la productividad. 82 8. CONCLUSIONES:  De los 11 neohaplontes de la cepa PSma; 8 neohaplontes fueron clasificados en el tipo I de compatibilidad y 3 en el tipo II. De acuerdo con la prueba de χ2, la distribución de los neohaplontes de la cepa PSma en los 2 tipos de compatibilidad fue simétrica (1:1)  De 12 apareamientos realizados para la regeneración de la cepa PSma el apareamiento PSma-n17j x PSma-n5j fue el que presentó la mayor velocidad de crecimiento micelial (9 días), siendo incluso más rápido que la cepa parental PSma (10 días).  Al aparear neohaplontes de la cepa PSma con monocariotes y neohaplontes de P. ostreatus así como con neohaplontes de L. edodes, se obtuvieron 8 híbridos.  Al aparear los neohaplontes de la cepa asporógena PAsp14 con neohaplontes de la cepa PSma y con las cepas monocarióticas de P. ostreatus se obtuvieron 32 híbridos.  Los 11 híbridos con más alta velocidad de crecimiento micelial fueron seleccionados para llevarlos a fructificar, con el propósito de identificar una cepa asporógena, que produjera esporóforos blancos con estípites cortos y altos rendimientos en tiempos cortos de producción. Adicionalmente, se incluyeron como cepas control, las cepas parentales (PSma, PAsp14), sus correspondientes cepas regeneradas (PSma-n17j x PSma-n5j y PAsp14 - n1a x PAsp14 - n5a) y un dicariote producido al aparear 2 cepas silvestres (PUap - n2g x P412).  Se observó que el color de los carpóforos no cambio durante todo el experimento, esto se debe a que las condiciones se mantuvieron constantes a lo largo de todo el cultivo. Aunque el color no es un criterio taxonómico, desde un punto de vista comercial, el color presenta un atributo de calidad, el cual es bueno en estas cepas, ya que presentan coloración blanca muy cercana a la cepa parental PSma (color blanca), haciendo que sean atractivas visualmente para el consumidor. 83  De los 11 híbridos que fueron fructificados, 4 híbridos produjeron eficiencias biológicas cercanas al 100% (95.5 a 102.8%) y presentaron morfologías adecuadas para su producción comercial.  En la Tabla 40 se observa que la cepa que presentó la mayor EBA al RMS fue PSma-n12j x PAsp14-n1a (EBA 102.8%) a la 11a semana seguida de las cepas PSma-n12j x PUap-n2g (EBA 97.9%), PSma-n17j x P412 (EBA 96.3%) alcanzándolo a la 10a semana y PSma-n12j x PAsp14-n5a (EBA 95.5%) lo alcanzó a la 11a semana.  Los 4 híbridos con mayor EBA representan material importante para estudios de mejoramiento genético posteriores, ya que en ellos se conjuntan dos atributos valiosos como lo son la coloración atractiva y la productividad aceptable.  Al comparar los lotes 3 y 5 (Tablas 32 y 38) en donde se fructificaron las mismas cepas pero en sustratos con diferente humedad (H: 52.8 ± 3.3 y H: 60.5 ±1.4% respectivamente), se observó un incremento significativo de EBA con todas las cepas, al aumentar la humedad del sustrato. Estos resultados nos indican que es de suma importancia mantener la humedad del sustrato a lo largo de toda la etapa de preparación y en particular durante la etapa de esterilización para no afectar los rendimientos en la fructificación.  La cepa PSma-n12j x P408 fue la que produjo los menores rendimientos de EBA (14.5%).  La cepa reconstituida PSma-n17j x PSma-n5j que se fructificó en los lotes 2 y 4 con humedades semejantes (H: 63 ± 3.1 y H: 61.4 ± 0.9, respectivamente) produjo una EBA de 35.1 a 36.8% valores similares, pero rendimientos bajos. Muy por debajo de los valores obtenidos al fructificar la cepa original PSma que produjo una EBA DE 51.5 a 87% (H = 61.4 ± 0.3 y H = 60.5 ± 1.4, respectivamente).  En este trabajo se obtuvieron híbridos de cepas con fenotipos de interés comercial como estípite corto, píleo de color claro, que además en algunos casos son portadoras del gen asporógeno. Se evaluó la productividad de estas cepas lo cual permite contar con una colección de cepas adecuadas 84 para la producción comercial, que también representan material genético valioso para obtener en un futuro cepas asporógenas con fenotipos comerciales.  Para mejorar la producción comercial de hongos comestibles resulta importante proporcionar al mercado (a los consumidores), un producto atractivo, de buena calidad, con alto contenido proteico y en forma continua. Los resultados obtenidos en este trabajo, al desarrollar híbridos de P. ostreatus con fenotipos de interés comercial y altamente productivos, es una contribución importante en este sentido. Para su implementación y un posible impacto positivo sobre el mercado, se necesita hacer una mayor difusión de esta información y desarrollar nuevas alternativas de comercialización. 85 9. ANEXO Figura 10: OBSERVACION DEL MICELIO AL MICROSCOPIO I. Micelio monocariótico (ausencia de fíbulas) II. Micelio dicariótico (presencia de fíbulas) Figura 11: PREPARACIÓN DEL INÓCULO DE GRANO a) Cocción del trigo b) Enjuague del grano c) Autoclave para esterilización d) Desembolsado del grano e) Caja petri con micelio cortado f) Transferencia de micelio al grano g) Transferencia de micelio al grano h) Dispersión del micelio i) Colocación del tubo PVC 86 j) Colocación del hule espuma k) Bolsa de trigo inoculada l) Etiquetado del inóculo Figura 12: PREPARACIÓN DEL SUSTRATO 1) Inóculo no invadido 2) Condiciones de incubación 3) Inóculo invadido de micelio 4) Vaciado de componentes 5) Mezclado de componentes 6) Hidratación de componentes 7) Reposo de 24 horas 8) Llenado de la autoclave 9) Enfriado en campana de flujo 87 10) Inóculo de grano invadido 11) Sustrato cubierto con saco de tela 12) Sustrato frío 13) Adición de inóculo al sustrato 14) Dispersión del inóculo 15) Comprimido del sustrato 16) Colocación del tubo PVC 17) Colocación del tubo PVC 88 18) Colocación del hule espuma 19) Sustrato inoculado 20) Etiquetado del sustrato 21) Sustrato no invadido 22) Sustrato invadido de micelio 23) Abertura en forma de triangulo invertido 24) Cuarto de fructificación 25) Formación de primordios 26) Hongos óptimos para cosecha 27) Pesado de hongos 89 Tabla 41: Análisis de varianza aleatorio para el desarrollo vegetativo de cepa PSma, neohaplontes y cepas reconstituidas Análisis de varianza aleatorio Fuente de variación Suma de cuadrados G.L Cuadrado medio F(α) Interpretación Calculada Tablas (0.05 0.01) Cepas 84.15 23 3.65 58.54 1.62 1.97 ** *Error 7.5 120 0.06 Total 91.65 143 ** = Existe diferencia altamente significativa El análisis de varianza indica que existen diferencias altamente significativas para la variable cepas, por lo que se realizó la prueba de Duncan para identificar la cepa con mayor velocidad de crecimiento micelial. Tabla 42: Prueba de Duncan para el desarrollo vegetativo de cepa PSma, neohaplontes y cepas reconstituidas Clasificación con el paquete estadístico SPPS Interpretación Cepas Grupos 1 2 3 4 5 6 7 PSma-n17j x PSma-n5j 9 9.0 ± 0 a PSma-n17j x PSma-n7j 9.3 9.3 ± 0.5 b PSma 10 10.0 ± 0 c PSma-n3j 10 10.0 ± 0 c PSma-n12j 10 10.0 ± 0 c PSma-n12j x PSma-n4j 10 10.0 ± 0 c PSma-n17j x PSma-n12j 10 10.0 ± 0 c PSma-n17j x PSma-n18j 10 10.0 ± 0 c PSma-n17j x PSma-n15j 10.3 10.3 ± 0.5 d PSma-n7j 10.7 10.7 ± 0.6 e PSma-n12j x PSma-n16j 10.7 10.7 ± 0.5 e PSma-n17j x PSma-n10j 10.8 10.8 ± 0.4 e PSma-n5j 11 11 11.0 ± 0 ef PSma-n10j 11 11 11.0 ± 0 ef PSma-n14j 11 11 11.0 ± 0 ef PSma-n15j 11 11 11.0 ± 0 ef PSma-n18j 11 11 11.0 ± 0 ef PSma-n4j x PSma-n5j 11 11 11.0 ± 0 ef Psma-n4j x Psma-n18j 11 11 11.0 ± 0 ef PSma-n17j x PSma-n14j 11 11 11.0 ± 0 ef PSma-n4j x PSma-n10j 11.3 11.3 ± 0.5 f PSma-n4j 12 12.0 ± 0 g PSma-n16j 12 12.0 ± 0 g PSma-n17j 12 12.0 ± 0 g *Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre las semanas Como resultado de la prueba de Duncan el paquete estadístico reportó 7 grupos. Para su interpretación, se asignó una letra diferente a cada grupo. Para identificar la cepa más rápida, se consideró que el grupo que inició corresponde a la letra “a”, así se concluyó que la cepa con mayor velocidad de crecimiento micelial lo alcanzó a la 9 días. 90 Tabla 43: Análisis de varianza aleatorio para el desarrollo vegetativo de monocariotes y neohaplontes de P. ostreatus e híbridos de neohaplontes de PSma con monocariotes de P. ostreatus Análisis de varianza aleatorio Fuente de variación Suma de cuadrados G.L Cuadrado medio F(α) Interpretación Calculada Tablas (0.05 0.01) Cepas 982.35 16 61.39 326.17 1.76 2.22 ** Error 16 85 .018 Total 998.35 101 **= Existe diferencia altamente significativa El análisis de varianza indica que existen diferencias altamente significativas para la variable cepas, por lo que se realizó la prueba de Duncan para identificar la cepa con mayor velocidad de crecimiento micelial. Tabla 44: Prueba de Duncan para el desarrollo vegetativo de cepa PSma, neohaplontes y cepas reconstituidas Clasificación con el paquete estadístico SPPS Interpretación Cepas Grupos 1 2 3 4 5 6 7 PSma-n12j x P412 8 8.0 ± 0 a PSma-n12j x PUap-n2g 8 8.0 ± 0 a PUap-n2g x P412 8.3 8.3 ± 0.5 a PSma-n12j x P407 9 9.0 ± 0 b PSma-n17j x P407 9 9.0 ± 0 b PUap-n2g x P408 9 9.0 ± 0 b PUap-n2g x PSec-n1g 9 9.0 ± 0 b PSma-n12j x P408 9.7 9.7 ± 0.5 c PUap-n2g 10 10.0 ± 0 c PSma-n17j x PSec-n1g 10 10.0 ± 0 c PSec-n1g x P408 10 10.0 ± 0 c PSma-n17j x P408 11 11.0 ± 0 d PSma-n17j x P412 11 11.0 ± 0 d P407 12.3 12.3 ± 0.5 e PSec-n1g 12.3 12.3 ± 0.5 e P408 15.7 15.7 ± 0.5 f P412 20.7 20.7 ± 1.4 g *Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre las semanas Como resultado de la prueba de Duncan el paquete estadístico reportó 7 grupos. Para su interpretación, se asignó una letra diferente a cada grupo. Para identificar la cepa más rápida, se consideró que el grupo que inició corresponde a la letra “a”, así se concluyó que las cepas con mayor velocidad de crecimiento micelial lo alcanzó a los 8 días. 91 Tabla 45: Análisis de varianza aleatorio para el desarrollo vegetativo de apareamientos entre neohaplontes de cepa asporógena PAsp14 y monocariotes de Pleurotus ostreatus Análisis de varianza aleatorio Fuente de variación Suma de cuadrados G.L Cuadrado medio F(α) Interpretación Calculada Tablas (0.05 0.01) Cepas 7027.49 41 171.40 698.92 1.45 1.68 ** Error 51.5 210 0.24 Total 7078.99 251 **= Existe diferencia altamente significativa El análisis de varianza indica que existen diferencias altamente significativas para la variable cepas, por lo que se realizó la prueba de Duncan para identificar la cepa con mayor velocidad de crecimiento micelial. Tabla 46: Prueba de Duncan para el desarrollo vegetativo de apareamientos entre neohaplontes de cepa asporógena PAsp14 y monocariotes de Pleurotus ostreatus Clasificación con el paquete estadístico SPPS Interpretación Cepas Grupos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 PAsp14-n1a 6 6 ± 0a PAsp14 n2a 6.7 6.7 ± 1b PAsp14 n5a 7.3 7.3 ± 1c PAsp14 n8a 8 8 8 ± 0de PAsp14 n26d 8 8 8 ± 0de P407 8 8 8 ± 0de P408 8 8 8 ± 0de P412 8 8 8 ± 0de PSec-n1g 8 8 8 ± 0de PUap-n2g 8 8 8 ± 0de PSma-12j 8 8 8 ± 0de PSma-n17j 8 8 8 ± 0de PAsp14 n1a x P407 8 8 8 ± 0de PAsp14 n1a x P408 8.7 8.7 8.7 ± 0.5ef PAsp14 n1a x P412 8.7 8.7 8.7 ± 0.5ef PAsp14 n1a x PUap-n2g 9 9 ± 0f PAsp14 n1a x PSma-n12j 9 9 ± 0f 92 PAsp14 n2a x P407 9.7 9.7 ± 0.5g PAsp14 n2a x P408 9.7 9.7 ± 0.5g PAsp14 n2a x P412 10 10 10 ± 0gh PAsp14 n2a x PUap-n2g 10 10 10 ± 0gh PAsp14 n2a x PSma-n12j 10 10 10 ± 0gh PAsp14 n2a x PSma-n17j 10 10 10 ± 0gh PAsp14 n5a x P407 10 10 10 ± 0gh PAsp14 n5a x P408 10 10 10 ± 0gh PAsp14 n5a x P412 10.3 10.3 10.3 ± 0.5hi PAsp14 n5a x PSec-n1g 10.3 10.3 10.3 ± 0.5hi PAsp14 n5a x PUap-n2g 10.7 10.7 ± 0.5i PAsp14 n5a x PSma-n12j 11.3 11.3 ± 0.5j PAsp14 n5a x PSma-n17j 12 12 ± 0k PAsp14 n8a x P408 12 12 ± 0k PAsp14 n8a x P412 12.3 12.3 ± 0.5k PAsp14 n8a x PUap-n2g 12.3 12.3 ± 0.5k PAsp14 n8a x PSma-n12j 15.7 15.7 ± 0.5l PAsp14 n8a x PSma-n17j 16 16 ± 0l PAsp14 n26d x P407 18.7 18.7 ± 0.5m PAsp14 n26d x P408 20 20 ± 0n PAsp14 n26d x P412 20.7 20.7 ± 1.4o PAsp14 n26d x PSec-n1g 22.7 22.7 ± 0.5p PAsp14 n26d x PUap-n2g 23.8 23.8 ± 0.4q PAsp14 n26d x PSma-n12j 24.3 24.3 ± 1.4q PAsp14 n26d x PSma-n17j 27 27 ± 0.9r *Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre las semanas Como resultado de la prueba de Duncan el paquete estadístico reportó 17 grupos. Para su interpretación, se asignó una letra diferente a cada grupo. Para identificar la cepa más rápida, se consideró que el grupo que inició corresponde a la letra “a”, así se concluyó que las cepas con mayor velocidad de crecimiento micelial lo alcanzó a los 6 días. 93 Tabla 47: Análisis de varianza de bloques para identificar diferencias significativas en la eficiencia biológica acumulada durante 15 semanas de cosecha de la cepa PSma (Lote 1, H = 61.4 ± 0.3) Análisis de varianza en bloques Fuente de variación Suma de cuadrados G.L Cuadrado medio F(α) Interpretación Calculada Tablas (0.05 0.01) Semanas 13932.75 14 995.19 24.67 1.87 2.54 ** Repeticiones 1668.33 4 417.08 10.33 2.54 3.67 ** Error 2259.08 56 40.34 Total 17860.16 74 ** = Existe diferencia altamente significativa El análisis de varianza indica que existen diferencias altamente significativas para las variables semanas y repeticiones, por lo que se realizó la prueba de Duncan para identificar la semana donde se alcanzó el rendimiento máximo significativo. Tabla 48: Prueba de Duncan para la cepa PSma (Lote 1, H = 61.4 ± 0.3) Clasificación con el paquete estadístico SPPS Interpretación Semana de corte Grupos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 11.0 11.0 ± 15.5a 2 22.3 22.3 ± 14.1b 3 29.9 29.9 29.9 ± 7.6bc 4 32.8 32.8 32.8 ± 6.5cd 5 40.2 40.2 40.2 ± 5.0de 6 43.9 43.9 43.9 ± 4.7ef 7 46.6 46.6 46.6 46.6 ± 6.9efg 8 46.6 46.6 46.6 46.6 ± 6.9efg 9 49.3 49.3 49.3 49.3 ± 7.2fgh 10 51.5 51.5 51.5 51.5 51.5 ± 8.8fghi 11 51.5 51.5 51.5 51.5 51.5 ± 8.8fghi 12 55.3 55.3 55.3 55.3 ± 3.9ghi 13 57.3 57.3 57.3 ± 4.7hi 14 58.7 58.7 ± 5.4i 15 58.7 58.7 ± 5.4i *Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre las semanas Como resultado de la prueba de Duncan el paquete estadístico reportó 9 grupos. Para su interpretación, se asignó una letra diferente a cada grupo. Para identificar la semana dónde se alcanzó el rendimiento máximo significativo (RMS), se consideró la semana dónde inició el último grupo que corresponde a la letra “i”, así se concluyó que el RMS se alcanzó a la 10ª semana de producción. 94 Tabla 49: Análisis de varianza de bloques para identificar diferencias significativas en la eficiencia biológica acumulada durante 15 semanas de cosecha de la cepa PAsp14 (Lote 1, H = 61.4 ± 0.3) Análisis de varianza en bloques Fuente de variación Suma de cuadrados G.L Cuadrado medio F(α) Interpretación Calculada Tablas (0.05 0.01) Semanas 9629.87 14 687.84 36.32 1.79 2.27 ** Repeticiones 1116.97 7 159.56 8.42 2.10 2.83 ** Error 1855.56 98 18.93 Total 12602.40 119 ** = Existe diferencia altamente significativa El análisis de varianza indica que existen diferencias altamente significativas para las variables semanas y repeticiones, por lo que se realizó la prueba de Duncan para identificar la semana donde se alcanzó el rendimiento máximo significativo. Tabla 50: Prueba de Duncan para la cepa PAsp14 (Lote 1, H = 61.4 ± 0.3) Clasificación con el paquete estadístico SPPS Interpretación Semana de corte Grupos 1 2 3 4 1 26.1 26.1 ± 2.8a 2 26.1 26.1 ± 2.8a 3 26.1 26.1 ± 2.8a 4 30.7 30.7 ± 6.0a 5 37.9 37.9 ± 5.9b 6 37.9 37.9 ± 5.9b 7 39.3 39.3 ± 3.2b 8 43.8 43.8 ± 3.8c 9 46.5 46.5 46.5 ± 6.0cd 10 46.5 46.5 46.5 ± 6.0cd 11 46.5 46.5 46.5 ± 6.0cd 12 47.9 47.9 47.9 ± 5.6cd 13 49.9 49.9 ± 4.9d 14 50.3 50.3 ± 4.7d 15 51.0 51.0 ± 5.6d *Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre las semanas Como resultado de la prueba de Duncan el paquete estadístico reportó 4 grupos. Para su interpretación, se asignó una letra diferente a cada grupo. Para identificar la semana dónde se alcanzó el rendimiento máximo significativo (RMS), se consideró la semana dónde inició el último grupo que corresponde a la letra “d”, así se concluyó que el RMS se alcanzó a la 9ª semana de producción. 95 Tabla 51: Análisis de varianza de bloques para identificar diferencias significativas en la eficiencia biológica acumulada durante 15 semanas de cosecha de la cepa PSma - n17j x PAsp14 - n5a (Lote 1, H = 61.4 ± 0.3) Análisis de varianza en bloques Fuente de variación Suma de cuadrados G.L Cuadrado medio F(α) Interpretación Calculada Tablas (0.05 0.01) Semanas 5664.85 14 404.63 27.08 1.84 2.35 ** Repeticiones 2229.15 5 445.83 29.84 2.35 3.29 ** Error 1045.74 70 14.93 Total 8939.75 89 ** = Existe diferencia altamente significativa El análisis de varianza indica que existen diferencias altamente significativas para las variables semanas y repeticiones, por lo que se realizó la prueba de Duncan para identificar la semana donde se alcanzó el rendimiento máximo significativo. Tabla 52: Prueba de Duncan para la cepa PSma - n17j x PAsp14 - n5a (Lote 1, H = 61.4 ± 0.3) Clasificación con el paquete estadístico SPPS Interpretación Semana de corte Grupos 1 2 3 4 5 6 1 35.8 35.8 ± 9.2a 2 35.9 35.9 ± 9.1a 3 39.1 39.1 39.1 ± 6.4ab 4 41.5 41.5 ± 7.3b 5 47.9 47.9 ± 5.2c 6 49.2 49.2 49.2 ± 7.0cd 7 51.9 51.9 51.9 51.9 ± 7.2cde 8 53.1 53.1 53.1 53.1 ± 5.0def 9 54.2 54.2 54.2 ± 7.0ef 10 55.6 55.6 55.6 ± 6.7ef 11 56.5 56.5 56.5 ± 6.2ef 12 57.6 57.6 ± 5.2f 13 57.6 57.6 ± 5.2f 14 57.6 57.6 ± 5.2f 15 58.1 58.1 ± 5.1f *Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre las semanas Como resultado de la prueba de Duncan el paquete estadístico reportó 6 grupos. Para su interpretación, se asignó una letra diferente a cada grupo. Para identificar la semana dónde se alcanzó el rendimiento máximo significativo (RMS), se consideró la semana dónde inició el último grupo que corresponde a la letra “f”, así se concluyó que el RMS se alcanzó a la 8ª semana de producción. 96 Tabla 53: Análisis de varianza de bloques para identificar diferencias significativas en la eficiencia biológica acumulada durante 15 semanas de cosecha de la cepa PSma - n12j x PAsp14 - n8a (Lote 1, H = 61.4 ± 0.3) Análisis de varianza en bloques Fuente de variación Suma de cuadrados G.L Cuadrado medio F(α) Interpretación Calculada Tablas (0.05 0.01) Semanas 9112.31 14 650.88 30.14 1.84 2.35 ** Repeticiones 2877.79 5 575.55 26.65 2.35 3.29 ** Error 1511.44 70 21.592 Total 13501.54 89 ** = Existe diferencia altamente significativa NS = No existe diferencia significativa El análisis de varianza indica que existen diferencias altamente significativas para las variables semanas y repeticiones, por lo que se realizó la prueba de Duncan para identificar la semana donde se alcanzó el rendimiento máximo significativo. Tabla 54: Prueba de Duncan para la cepa PSma - n12j x PAsp14 - n8a (Lote 1, H = 61.4 ± 0.3) Clasificación con el paquete estadístico SPPS Interpretación Semana de corte Grupos 1 2 3 4 5 6 7 8 1 24.1 24.1 ± 13.7a 2 25.3 25.3 ± 13.4a 3 33.4 33.4 ± 7.9b 4 38.0 38.0 38.0 ± 9.2bc 5 42.0 42.0 42.0 ± 7.4cd 6 46.8 46.8 46.8 ± 5.8de 7 47.4 47.4 47.4 47.4 ± 5.8def 8 48.4 48.4 48.4 48.4 ± 4.3efg 9 49.9 49.9 49.9 49.9 49.9 ± 5.6efgh 10 51.9 51.9 51.9 51.9 51.9 ± 5.4efgh 11 52.7 52.7 52.7 52.7 52.7 ± 5.4efgh 12 53.2 53.2 53.2 53.2 ± 5.9fgh 13 53.8 53.8 53.8 ± 5.4gh 14 54.7 54.7 ± 6.0h 15 55.5 55.5 ± 5.5h *Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre las semanas Como resultado de la prueba de Duncan el paquete estadístico reportó 8 grupos. Para su interpretación, se asignó una letra diferente a cada grupo. Para identificar la semana dónde se alcanzó el rendimiento máximo significativo (RMS), se consideró la semana dónde inició el último grupo que corresponde a la letra “h”, así se concluyó que el RMS se alcanzó a la 9ª semana de producción. 97 Tabla 55: Análisis de varianza de bloques para identificar diferencias significativas en la eficiencia biológica acumulada durante 15 semanas de cosecha de la cepa PSma - n17j x PSma - n5j (Lote 2, H = 63.0 ± 3.1) Análisis de varianza en bloques Fuente de variación Suma de cuadrados G.L Cuadrado medio F(α) Interpretación Calculada Tablas (0.05 0.01) Semanas 5492.71 14 392.33 56.14 1.94 2.54 ** Repeticiones 1395.27 3 465.09 66.55 2.83 4.29 ** Error 293.51 42 6.98 Total 7181.49 59 * = Existe diferencia altamente significativa El análisis de varianza indica que existen diferencias altamente significativas para las variables semanas y repeticiones, por lo que se realizó la prueba de Duncan para identificar la semana donde se alcanzó el rendimiento máximo significativo. Tabla 56: Prueba de Duncan para la cepa PSma - n17j x PSma - n5j (Lote 2, H = 63.0 ± 3.1) Clasificación con el paquete estadístico SPPS Interpretación Semana de corte Grupos 1 2 3 4 5 6 7 1 7.3 7.3 ± 5.3a 2 14.8 14.8 ± 3.2b 3 16.9 16.9 ± 2.9b 4 21.0 21.0 ± 6.5c 5 25.5 25.5 ± 8.2d 6 26.5 26.5 ± 6.3d 7 29.5 29.5 29.5 ± 5.4de 8 31.3 31.3 31.3 ± 6.3ef 9 35.1 35.1 35.1 ± 6.3fg 10 36.0 36.0 ± 6.8g 11 36.6 36.6 ± 7.3g 12 36.6 36.6 ± 7.3g 13 38.4 38.4 ± 6.0g 14 38.4 38.4 ± 6.0g 15 38.4 38.4 ± 6.0g *Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre las semanas Como resultado de la prueba de Duncan el paquete estadístico reportó 7 grupos. Para su interpretación, se asignó una letra diferente a cada grupo. Para identificar la semana dónde se alcanzó el rendimiento máximo significativo (RMS), se consideró la semana dónde inició el último grupo que corresponde a la letra “g”, así se concluyó que el RMS se alcanzó a la 9ª semana de producción. 98 Tabla 57: Análisis de varianza de bloques para identificar diferencias significativas en la eficiencia biológica acumulada durante 15 semanas de cosecha de la cepa PSma - n17j x PAsp14 - n8a (Lote 2, H = 63.0 ± 3.1) Análisis de varianza en bloques Fuente de variación Suma de cuadrados G.L Cuadrado medio F(α) Interpretación Calculada Tablas (0.05 0.01) Semanas 12647.91 14 903.422 41.08 1.87 2.42 ** Repeticiones 287.16 4 71.79 3.26 2.54 3.67 * Error 1231.31 56 21.98 Total 14166.40 74 * = Existe diferencia significativa ** = Existe diferencia altamente significativa El análisis de varianza indica que existen diferencias altamente significativas para la variable semana y solo diferencia significativa para la variable repeticiones, por lo que se realizó la prueba de Duncan para identificar la semana donde se alcanzó el rendimiento máximo significativo. Tabla 58: Prueba de Duncan para la cepa PSma - n17j x PAsp14 - n8a (Lote 2, H = 63.0 ± 3.1) Clasificación con el paquete estadístico SPPS Interpretación Semana de corte Grupos 1 2 3 4 5 1 25.3 25.3 ± 14.2a 2 30.5 30.5 ± 2.8a 3 30.5 30.5 ± 2.8a 4 45.5 45.5 ± 2.8b 5 45.5 45.5 ± 2.8b 6 45.5 45.5 ± 2.8b 7 55.9 55.9 ± 3.4c 8 55.9 55.9 ± 3.4c 9 57.0 57.0 57.0 ± 4.5cd 10 61.6 61.6 61.6 61.6 ± 3.1cde 11 61.6 61.6 61.6 61.6 ± 3.1cde 12 62.5 62.5 62.5 62.5 ± 3.9cde 13 63.5 63.5 63.5 ± 5.1de 14 64.0 64.0 ± 4.2e 15 64.2 64.2 ± 4.1e *Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre las semanas Como resultado de la prueba de Duncan el paquete estadístico reportó 5 grupos. Para su interpretación, se asignó una letra diferente a cada grupo. Para identificar la semana dónde se alcanzó el rendimiento máximo significativo (RMS), se consideró la semana dónde inició el último grupo que corresponde a la letra “e”, así se concluyó que el RMS se alcanzó a la 10ª semana de producción. 99 Tabla 59: Análisis de varianza de bloques para identificar diferencias significativas en la eficiencia biológica acumulada durante 15 semanas de cosecha de la cepa PSma - n12j x PAsp14 - n5a (Lote 2, H = 63.0 ± 3.1) Análisis de varianza en bloques Fuente de variación Suma de cuadrados G.L Cuadrado medio F(α) Interpretación Calculada Tablas (0.05 0.01) Semanas 17599.78 14 1257.12 230.87 2.06 2.79 ** Repeticiones 760.07 2 380.03 69.79 3.34 5.45 ** Error 152.46 28 5.44 Total 18512.32 44 ** = Existe diferencia altamente significativa El análisis de varianza indica que existen diferencias altamente significativas para las variables semanas y repeticiones, por lo que se realizó la prueba de Duncan para identificar la semana donde se alcanzó el rendimiento máximo significativo. Tabla 60: Prueba de Duncan para la cepa PSma - n12j x PAsp14 - n5a (Lote 2, H = 63.0 ± 3.1) Clasificación con el paquete estadístico SPPS Interpretación Semana de corte Grupos 1 2 3 4 5 6 7 8 1 25.6 25.6 ± 2.6a 2 58.7 58.7 ± 3.8b 3 58.7 58.7 ± 3.8b 4 74.9 74.9 ± 5.8c 5 74.9 74.9 ± 5.8c 6 80.5 80.5 ± 9.9d 7 83.9 83.9 83.9 ± 5.5de 8 86.4 86.4 ± 5.0e 9 91.8 91.8 ± 5.1f 10 93.7 93.7 93.7 ± 3.9fg 11 95.5 95.5 95.5 95.5 ± 6.7fgh 12 97.2 97.2 97.2 ± 5.0gh 13 97.9 97.9 97.9 ± 6.2gh 14 99.2 99.2 ± 5.1h 15 99.2 99.2 ± 5.1h *Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre las semanas Como resultado de la prueba de Duncan el paquete estadístico reportó 8 grupos. Para su interpretación, se asignó una letra diferente a cada grupo. Para identificar la semana dónde se alcanzó el rendimiento máximo significativo (RMS), se consideró la semana dónde inició el último grupo que corresponde a la letra “h”, así se concluyó que el RMS se alcanzó a la 11ª semana de producción. 100 Tabla 61: Análisis de varianza de bloques para identificar diferencias significativas en la eficiencia biológica acumulada durante 15 semanas de cosecha de la cepa PSma (Lote 3, H = 52.8 ± 3) Análisis de varianza en bloques Fuente de variación Suma de cuadrados G.L Cuadrado medio F(α) Interpretación Calculada Tablas (0.05 0.01) Semanas 8159.28 14 582.80 64.46 1.87 2.42 ** Repeticiones 4416.35 4 1104.08 122.12 2.54 3.67 ** Error 506.28 56 9.04 Total 13081.93 74 **= Existe diferencia altamente significativa El análisis de varianza indica que existen diferencias altamente significativas para las variables semanas y repeticiones, por lo que se realizó la prueba de Duncan para identificar la semana donde se alcanzó el rendimiento máximo significativo. Tabla 62: Prueba de Duncan para la cepa PSma (Lote 3, H = 52.8 ± 3) Clasificación con el paquete estadístico SPPS Interpretación Semana de corte Grupos 1 2 3 4 5 6 1 6.6 6.6 ± 9.4a 2 13.2 13.2 ± 5.0b 3 14.7 14.7 ± 7.8b 4 15.9 15.9 ± 8.0b 5 21.6 21.6 ± 8.0c 6 22.8 22.8 ± 8.0c 7 28.4 28.4 ± 9.0d 8 28.4 28.4 ± 9.0d 9 32.6 32.6 ± 8.1e 10 35.6 35.6 35.6 ± 10.2ef 11 36.1 36.1 36.1 ± 9.6ef 12 37.6 37.6 ± 11.0f 13 37.6 37.6 ± 11.0f 14 39.0 39.0 ± 9.9f 15 39.0 39.0 ± 9.9f *Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre las semanas Como resultado de la prueba de Duncan el paquete estadístico reportó 6 grupos. Para su interpretación, se asignó una letra diferente a cada grupo. Para identificar la semana dónde se alcanzó el rendimiento máximo significativo (RMS), se consideró la semana dónde inició el último grupo que corresponde a la letra “f”, así se concluyó que el RMS se alcanzó a la 10ª semana de producción. 101 Tabla 63: Análisis de varianza de bloques para identificar diferencias significativas en la eficiencia biológica acumulada durante 15 semanas de cosecha de la cepa PUap - n2g x P412 (Lote 3, H = 52.8 ± 3) Análisis de varianza en bloques Fuente de variación Suma de cuadrados G.L Cuadrado medio F(α) Interpretación Calculada Tablas (0.05 0.01) Semanas 7737.13 14 552.65 33.61 1.84 2.35 ** Repeticiones 860.69 5 172.13 10.47 2.35 3.29 ** Error 1150.83 70 16.44 Total 9748.66 89 **= Existe diferencia significativa El análisis de varianza indica que existen diferencias altamente significativas para las variables semanas y repeticiones, por lo que se realizó la prueba de Duncan para identificar la semana donde se alcanzó el rendimiento máximo significativo. Tabla 64: Prueba de Duncan para la cepa PUap - n2g x P412 (Lote 3, H = 52.8 ± 3) Clasificación con el paquete estadístico SPPS Interpretación Semana de corte Grupos 1 2 3 4 5 6 1 5.4 5.4 ± 6.3a 2 12.5 12.5 ± 4.3b 3 12.5 12.5 ± 4.3b 4 12.5 12.5 ± 4.3b 5 16.1 16.1 16.1 ± 7.3bc 6 20.6 20.6 20.6 ± 6.4cd 7 21.4 21.4 ± 6.1d 8 21.4 21.4 ± 6.1d 9 23.9 23.9 ± 5.8d 10 29.5 29.5 ± 4.2e 11 29.5 29.5 ± 4.2e 12 32.6 32.6 32.6 ± 4.0ef 13 32.6 32.6 32.6 ± 4.0ef 14 34.1 34.1 34.1 ± 3.5ef 15 37.1 37.1 ± 5.1f *Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre las semanas Como resultado de la prueba de Duncan el paquete estadístico reportó 6 grupos. Para su interpretación, se asignó una letra diferente a cada grupo. Para identificar la semana dónde se alcanzó el rendimiento máximo significativo (RMS), se consideró la semana dónde inició el último grupo que corresponde a la letra “f”, así se concluyó que el RMS se alcanzó a la 12ª semana de producción. 102 Tabla 65: Análisis de varianza de bloques para identificar diferencias significativas en la eficiencia biológica acumulada durante 15 semanas de cosecha de la cepa PSma - n12j x PAsp14 - n1a (Lote 3, H = 52.8 ± 3) Análisis de varianza de dos vías Fuente de variación Suma de cuadrados G.L Cuadrado medio F(α) Interpretación Calculada Tablas (0.05 0.01) Semanas 10216.10 14 729.72 17.59 1.87 2.42 ** Repeticiones 14108.65 4 3527.16 85.05 2.54 3.67 ** Error 2322.19 56 41.46 Total 26646.94 74 **= Existe diferencia altamente significativa El análisis de varianza indica que existen diferencias altamente significativas para las variables semanas y repeticiones, por lo que se realizó la prueba de Duncan para identificar la semana donde se alcanzó el rendimiento máximo significativo. Tabla 66: Prueba de Duncan para la cepa PSma - n12j x PAsp14 - n1a (Lote 3, H = 52.8 ± 3) Clasificación con el paquete estadístico SPPS Interpretación Semana de corte Grupos 1 2 3 4 5 6 1 11.1 11.1 ± 10.9a 2 14.4 14.4 ± 9.1a 3 19.6 19.6 19.6 ± 12.9ab 4 19.6 19.6 19.6 ± 12.9ab 5 24.9 24.9 24.9 ± 17.0bc 6 25.8 25.8 25.8 ± 17.2bc 7 32.9 32.9 32.9 ± 17.5cd 8 33.6 33.6 33.6 ± 17.7cd 9 36.6 36.6 36.6 ± 18.7de 10 39.3 39.3 39.3 ± 20.1de 11 40.1 40.1 40.1 ± 20.2de 12 43.6 43.6 43.6 ± 19.6ef 13 43.6 43.6 43.6 ± 19.6ef 14 44.2 44.2 44.2 ± 19.6ef 15 50.3 50.3 ± 7.2f *Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre las semanas Como resultado de la prueba de Duncan el paquete estadístico reportó 6 grupos. Para su interpretación, se asignó una letra diferente a cada grupo. Para identificar la semana dónde se alcanzó el rendimiento máximo significativo (RMS), se consideró la semana dónde inició el último grupo que corresponde a la letra “f”, así se concluyó que el RMS se alcanzó a la 12ª semana de producción. 103 Tabla 67: Análisis de varianza de bloques para identificar diferencias significativas en la eficiencia biológica acumulada durante 15 semanas de cosecha de la cepa PSma - n12j x PUap - n2g (Lote 3, H = 52.8 ± 3) Análisis de varianza en bloques Fuente de variación Suma de cuadrados G.L Cuadrado medio F(α) Interpretación Calculada Tablas (0.05 0.01) Semanas 5265.57 14 376.11 27.55 1.94 2.54 ** Repeticiones 848.44 3 282.81 20.72 2.83 4.29 ** Error 573.20 42 13.64 Total 6687.22 59 ** = Existe diferencia altamente significativa El análisis de varianza indica que existen diferencias altamente significativas para las variables semanas y repeticiones, por lo que se realizó la prueba de Duncan para identificar la semana donde se alcanzó el rendimiento máximo significativo. Tabla 68: Prueba de Duncan para la cepa PSma - n12j x PUap - n2g (Lote 3, H = 52.8 ± 3) Clasificación con el paquete estadístico SPPS Interpretación Semana de corte Grupos 1 2 3 4 5 1 18.6 18.6 ± 7.2a 2 21.7 21.7 ± 3.6a 3 23.3 23.3 ± 1.4a 4 23.3 23.3 ± 1.4a 5 30.5 30.5 ± 2.7b 6 32.3 32.3 ± 0.9b 7 34.9 34.9 34.9 ± 3.6bc 8 34.9 34.9 34.9 ± 3.6bc 9 35.6 35.6 35.6 ± 4.9bc 10 40.1 40.1 40.1 ± 4.9cd 11 40.8 40.8 40.8 ± 4.1cd 12 43.9 43.9 ± 9.9d 13 45.0 45.0 45.0 ± 9.0de 14 45.0 45.0 45.0 ± 9.0de 15 50.3 50.3 ± 6.6e *Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre las semanas Como resultado de la prueba de Duncan el paquete estadístico reportó 5 grupos. Para su interpretación, se asignó una letra diferente a cada grupo. Para identificar la semana dónde se alcanzó el rendimiento máximo significativo (RMS), se consideró la semana dónde inició el último grupo que corresponde a la letra “e”, así se concluyó que el RMS se alcanzó a la 13ª semana de producción. 104 Tabla 69: Análisis de varianza de bloques para identificar diferencias significativas en la eficiencia biológica acumulada durante 15 semanas de cosecha de la cepa PSma - n17j x P412 (Lote 3, H = 52.8 ± 3) Análisis de varianza en bloques Fuente de variación Suma de cuadrados G.L Cuadrado medio F(α) Interpretación Calculada Tablas (0.05 0.01) Semanas 6917.05 14 494.07 32.86 1.87 2.42 ** Repeticiones 1363.04 4 340.76 22.66 2.54 3.67 ** Error 841.85 56 15.03 Total 9121.95 74 *= Prueba de S.N.K ** = Existe diferencia altamente significativa El análisis de varianza indica que existen diferencias altamente significativas para las variables semanas y repeticiones, por lo que se realizó la prueba de S.N.K para identificar la semana donde se alcanzó el rendimiento máximo significativo. Tabla 70: Prueba de S.N.K para la cepa PSma - n17j x P412 (Lote 3, H = 52.8 ± 3) Clasificación con el paquete estadístico SPPS Interpretación Semana de corte Grupos 1 2 3 4 5 6 7 1 3.1 3.1 ± 7.0a 2 14.5 14.5 ± 4.1b 3 16.7 16.7 16.7 ± 4.2bc 4 16.7 16.7 16.7 ± 4.2bc 5 22.3 22.3 22.3 ± 6.2cd 6 23.9 23.9 23.9 ± 4.9de 7 24.8 24.8 24.8 ± 5.5de 8 26.0 26.0 26.0 26.0 ± 6.8def 9 26.4 26.4 26.4 26.4 ± 7.2def 10 30.4 30.4 30.4 ± 6.6ef 11 30.9 30.9 30.9 ± 5.9ef 12 33.3 33.3 ± 7.0f 13 33.3 33.3 ± 7.0f 14 33.3 33.3 ± 7.0f 15 44.4 44.4 ± 5.7g *Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre las semanas Como resultado de la prueba de S.N.K el paquete estadístico reportó 7 grupos. Para su interpretación, se asignó una letra diferente a cada grupo. Para identificar la semana dónde se alcanzó el rendimiento máximo significativo (RMS), se consideró la semana dónde inició el último grupo que corresponde a la letra “g”, así se concluyó que el RMS se alcanzó a la 15ª semana de producción. 105 Tabla 71: Análisis de varianza de bloques para identificar diferencias significativas en la eficiencia biológica acumulada durante 15 semanas de cosecha de la cepa PSma - n17j x PSma - n5j (Lote 4, H = 61.4 ± 0.9) Análisis de varianza en bloques Fuente de variación Suma de cuadrados G.L Cuadrado medio F(α) Interpretación Calculada Tablas (0.05 0.01) Semanas 12170.80 14 869.34 52.31 1.87 2.42 ** Repeticiones 6043.81 4 1510.95 90.92 2.54 3.67 ** Error 930.60 56 16.61 Total 19145.22 74 ** = Existe diferencia altamente significativa El análisis de varianza indica que existen diferencias altamente significativas para las variables semanas y repeticiones, por lo que se realizó la prueba de Duncan para identificar la semana donde se alcanzó el rendimiento máximo significativo. Tabla 72: Prueba de Duncan para la cepa PSma - n17j x PSma - n5j (Lote 4, H = 61.4 ± 0.9) Clasificación con el paquete estadístico SPPS Interpretación Semana de corte Grupos 1 2 3 4 5 6 1 4.1 4.1 ± 9.1a 2 4.1 4.1 ± 9.1a 3 4.1 4.1 ± 9.1a 4 10.8 10.8 ± 14.4b 5 11.8 11.8 ± 14.4b 6 14.2 14.2 ± 12.8b 7 14.2 14.2 ± 12.8b 8 22.2 22.2 ± 10.8c 9 29.1 29.1 ± 11.2d 10 30.7 30.7 ± 10.9d 11 32.2 32.2 32.2 ± 10.6de 12 33.1 33.1 33.1 ± 10.8de 13 36.8 36.8 36.8 ± 7.1ef 14 36.8 36.8 36.8 ± 7.1ef 15 40.1 40.1 ± 7.7f *Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre las semanas Como resultado de la prueba de Duncan el paquete estadístico reportó 6 grupos. Para su interpretación, se asignó una letra diferente a cada grupo. Para identificar la semana dónde se alcanzó el rendimiento máximo significativo (RMS), se consideró la semana dónde inició el último grupo que corresponde a la letra “f”, así se concluyó que el RMS se alcanzó a la 13ª semana de producción. 106 Tabla 73: Análisis de varianza de bloques para identificar diferencias significativas en la eficiencia biológica acumulada durante 15 semanas de cosecha de la cepa PSma - n12j x P408 (Lote 4, H = 61.4 ± 0.9) Análisis de varianza en bloques Fuente de variación Suma de cuadrados G.L Cuadrado medio F(α) Interpretación Calculada Tablas (0.05 0.01) Semanas 3567.43 14 254.81 13.04 2.06 2.79 ** Repeticiones 117.46 2 58.73 3.00 3.34 5.45 NS Error 546.98 28 19.53 Total 4231.88 44 * *= Existe diferencia altamente significativa El análisis de varianza indica que existen diferencias altamente significativas para las variables semanas y no hay diferencia significativa para la variable repeticiones, por lo que se realizó la prueba de Duncan para identificar la semana donde se alcanzó el rendimiento máximo significativo. Tabla 74: Prueba de Duncan para la cepa PSma - n12j x P408 (Lote 4, H = 61.4 ± 0.9) Clasificación con el paquete estadístico SPPS Interpretación Semana de corte Grupos 1 2 1 0 0 ± 0a 2 0 0 ± 0a 3 0 0 ± 0a 4 0 0 ± 0a 5 0 0 ± 0a 6 0 0 ± 0a 7 0 0 ± 0a 8 0 0 ± 0a 9 0 0 ± 0a 10 0 0 ± 0a 11 14.5 14.5 ± 12.7b 12 14.5 14.5 ± 12.7b 13 21.1 21.1 ± 1.9b 14 21.1 21.1 ± 1.9b 15 21.1 21.1 ± 1.9b *Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre las semanas Como resultado de la prueba de Duncan el paquete estadístico reportó 2 grupos. Para su interpretación, se asignó una letra diferente a cada grupo. Para identificar la semana dónde se alcanzó el rendimiento máximo significativo (RMS), se consideró la semana dónde inició el último grupo que corresponde a la letra “b”, así se concluyó que el RMS se alcanzó a la 11ª semana de producción. 107 Tabla 75: Análisis de varianza de bloques para identificar diferencias significativas en la eficiencia biológica acumulada durante 15 semanas de cosecha de la cepa PSma - n12j x P412 (Lote 4, H = 61.4 ± 0.9) Análisis de varianza en bloques Fuente de variación Suma de cuadrados G.L Cuadrado medio F(α) Interpretación Calculada Tablas (0.05 0.01) Semanas 7048.93 14 503.49 32.26 1.94 2.54 ** Repeticiones 3123.22 3 1041.07 66.71 2.83 4.29 ** Error 655.43 42 15.60 Total 10827.58 59 **= Existe diferencia altamente significativa El análisis de varianza indica que existen diferencias altamente significativas para las variables semanas y repeticiones, por lo que se realizó la prueba de Duncan para identificar la semana donde se alcanzó el rendimiento máximo significativo. Tabla 76: Prueba de Duncan para la cepa PSma - n12j x P412 (Lote 4, H = 61.4 ± 0.9) Clasificación con el paquete estadístico SPPS Interpretación Semana de corte Grupos 1 2 3 4 5 1 6.3 6.3 ± 9.2a 2 7.5 7.5 ± 8.4ª 3 11.4 11.4 ± 10.8a 4 20.0 20.0 ± 15.7b 5 26.4 26.4 ± 12.8c 6 27.9 27.9 27.9 ± 11.3cd 7 27.9 27.9 27.9 ± 11.3cd 8 31.4 31.4 31.4 31.4 ± 7.6cde 9 33.4 33.4 33.4 ± 9.6de 10 36.2 36.2 ± 6.1e 11 36.2 36.2 ± 6.1e 12 37.4 37.4 ± 4.9e 13 37.4 37.4 ± 4.9e 14 37.4 37.4 ± 4.9e 15 37.4 37.4 ± 4.9e *Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre las semanas Como resultado de la prueba de Duncan el paquete estadístico reportó 5 grupos. Para su interpretación, se asignó una letra diferente a cada grupo. Para identificar la semana dónde se alcanzó el rendimiento máximo significativo (RMS), se consideró la semana dónde inició el último grupo que corresponde a la letra “e”, así se concluyó que el RMS se alcanzó a la 8ª semana de producción. 108 Tabla 77: Análisis de varianza de bloques para identificar diferencias significativas en la eficiencia biológica acumulada durante 15 semanas de cosecha de la cepa PSma - n17j x PAsp14 - n1a (Lote 4, H = 61.4 ± 0.9) Análisis de varianza en bloques Fuente de variación Suma de cuadrados G.L Cuadrado medio F(α) Interpretación Calculada Tablas (0.05 0.01) Semanas 12064.17 14 861.72 16.54 1.94 2.54 ** Repeticiones 1504.42 3 501.47 9.62 2.83 4.29 ** Error 2187.34 42 52.08 Total 15755.94 59 ** = Existe diferencia altamente significativa El análisis de varianza indica que existen diferencias altamente significativas para las variables semanas y repeticiones, por lo que se realizó la prueba de Duncan para identificar la semana donde se alcanzó el rendimiento máximo significativo. Tabla 78: Prueba de Duncan para la cepa PSma - n17j x PAsp14 - n1a (Lote 4, H = 61.4 ± 0.9) Clasificación con el paquete estadístico SPPS Interpretación Semana de corte Grupos 1 2 3 4 5 6 1 20.4 20.4 ± 6.1a 2 20.4 20.4 ± 6.1a 3 20.4 20.4 ± 6.1a 4 28.6 28.6 28.6 ± 8.8ab 5 31.9 31.9 31.9 ± 6.8bc 6 39.7 39.7 39.7 ± 8.4cd 7 43.8 43.8 43.8 ± 9.0de 8 45.1 45.1 45.1 ± 11.5de 9 51.7 51.7 51.7 ± 9.9ef 10 52.6 52.6 52.6 ± 11.1ef 11 54.0 54.0 54.0 ± 11.0ef 12 54.0 54.0 54.0 ± 11.0ef 13 54.0 54.0 54.0 ± 11.0ef 14 60.6 60.6 ± 8.0f 15 60.6 60.6 ± 8.0f *Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre las semanas Como resultado de la prueba de Duncan el paquete estadístico reportó 6 grupos. Para su interpretación, se asignó una letra diferente a cada grupo. Para identificar la semana dónde se alcanzó el rendimiento máximo significativo (RMS), se consideró la semana dónde inició el último grupo que corresponde a la letra “f”, así se concluyó que el RMS se alcanzó a la 9ª semana de producción. 109 Tabla 79: Análisis de varianza de bloques para identificar diferencias significativas en la eficiencia biológica acumulada durante 15 semanas de cosecha de la cepa PSma - n17j x P407 (Lote 4, H = 61.4 ± 0.9) Análisis de varianza en bloques Fuente de variación Suma de cuadrados G.L Cuadrado medio F(α) Interpretación Calculada Tablas (0.05 0.01) Semanas 9398.77 14 671.34 13.50 1.84 2.35 ** Repeticiones 6308.03 5 1261.60 25.38 2.35 3.29 ** Error 3479.03 70 49.70 Total 19185 89 ** = Existe diferencia altamente significativa El análisis de varianza indica que existen diferencias altamente significativas para las variables semanas y repeticiones, por lo que se realizó la prueba de Duncan para identificar la semana donde se alcanzó el rendimiento máximo significativo. Tabla 80: Prueba de Duncan para la cepa PSma - n17j x P407 (Lote 4, H = 61.4 ± 0.9) Clasificación con el paquete estadístico SPPS Interpretación Semana de corte Grupos 1 2 3 4 5 6 1 19.8 19.8 ± 17.3a 2 19.8 19.8 ± 17.3a 3 20.6 20.6 ± 18.0a 4 27.3 27.3 27.3 ± 10.6ab 5 30.1 30.1 30.1 ± 11.2bc 6 30.9 30.9 30.9 ± 10.9bc 7 30.9 30.9 30.9 ± 10.9bc 8 31.7 31.7 31.7 31.7 ± 10.9bcd 9 38.9 38.9 38.9 38.9 ± 9.2cde 10 40.2 40.2 40.2 ± 9.0de 11 41.1 41.1 41.1 ± 10.3ef 12 42.1 42.1 42.1 ± 10.8ef 13 49.6 49.6 ± 4.2f 14 49.6 49.6 ± 4.2f 15 49.6 49.6 ± 4.2f *Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre las semanas Como resultado de la prueba de Duncan el paquete estadístico reportó 6 grupos. Para su interpretación, se asignó una letra diferente a cada grupo. Para identificar la semana dónde se alcanzó el rendimiento máximo significativo (RMS), se consideró la semana dónde inició el último grupo que corresponde a la letra “f”, así se concluyó que el RMS se alcanzó a la 11ª semana de producción. 110 Tabla 81: Análisis de varianza de bloques para identificar diferencias significativas en la eficiencia biológica acumulada durante 15 semanas de cosecha de la cepa PAsp14 - n1a x PAsp14 - n5a (Lote 4, H = 61.4 ± 0.9) Análisis de varianza en bloques Fuente de variación Suma de cuadrados G.L Cuadrado medio F(α) Interpretación Calculada Tablas (0.05 0.01) Semanas 22935.31 14 1638.23 75.00 1.81 2.30 ** Repeticiones 2258.53 6 376.42 17.23 2.21 3.02 ** Error 1834.60 84 21.84 Total 27028.45 104 ** = Existe diferencia altamente significativa El análisis de varianza indica que existen diferencias altamente significativas para las variables semanas y repeticiones, por lo que se realizó la prueba de Duncan para identificar la semana donde se alcanzó el rendimiento máximo significativo. Tabla 82: Prueba de Duncan para la cepa PAsp14 - n1a x PAsp14 - n5a (Lote 4, H = 61.4 ± 0.9) Clasificación con el paquete estadístico SPPS Interpretación Semana de corte Grupos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 11.8 11.8 ± 9.2a 2 21.0 21.0 ± 8.8b 3 30.4 30.4 ± 5.0c 4 33.4 33.4 ± 9.2c 5 40.6 40.6 ± 7.7d 6 42.2 42.2 ± 6.9d 7 43.4 43.4 43.4 ± 5.9de 8 48.3 48.3 48.3 ± 6.3ef 9 51.7 51.7 51.7 ± 7.3fg 10 56.0 56.0 56.0 ± 6.9gh 11 57.5 57.5 57.5 ± 5.7hi 12 58.0 58.0 58.0 ± 4.9hi 13 58.8 58.8 58.8 ± 5.1hi 14 60.4 60.4 60.4 ± 4.7hi 15 62.0 62.0 ± 4.9i *Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre las semanas Como resultado de la prueba de Duncan el paquete estadístico reportó 9 grupos. Para su interpretación, se asignó una letra diferente a cada grupo. Para identificar la semana dónde se alcanzó el rendimiento máximo significativo (RMS), se consideró la semana dónde inició el último grupo que corresponde a la letra “i”, así se concluyó que el RMS se alcanzó a la 11ª semana de producción. 111 Tabla 83: Análisis de varianza de bloques para identificar diferencias significativas en la eficiencia biológica acumulada durante 15 semanas de cosecha de la cepa PSma** (Lote 5, H = 60.5 ± 1.4) Análisis de varianza en bloques Fuente de variación Suma de cuadrados G.L Cuadrado medio F(α) Interpretación Calculada Tablas (0.05 0.01) Semanas 52151.15 14 3725.08 89.37 1.87 2.42 ** Repeticiones 1689.44 4 422.36 10.13 2.54 3.67 ** Error 2334.09 56 41.68 Total 56174.69 74 **= Existe diferencia altamente significativa El análisis de varianza indica que existen diferencias altamente significativas para las variables semanas y repeticiones, por lo que se realizó la prueba de S.N.K para identificar la semana donde se alcanzó el rendimiento máximo significativo. Tabla 84: Prueba de S.N.K para la cepa PSma** (Lote 5, H = 60.5 ± 1.4) Clasificación con el paquete estadístico SPPS Interpretación Semana de corte Grupos 1 2 3 4 5 6 1 25.0 25.0 ± 0.9a 2 25.0 25.0 ± 0.9a 3 25.0 25.0 ± 0.9a 4 31.7 31.7 ± 10.4a 5 53.0 53.0 ± 10.4b 6 57.6 57.6 57.6 ± 6.0bc 7 60.6 60.6 60.6 ± 7.6bc 8 64.4 64.4 ± 5.7c 9 81.0 81.0 ± 8.5d 10 83.1 83.1 83.1 ± 7.3de 11 87.0 87.0 87.0 87.0 ± 12.5def 12 88.7 88.7 88.7 88.7 ± 10.6def 13 94.6 94.6 94.6 ± 10.0ef 14 94.6 94.6 94.6 ± 10.0ef 15 95.6 95.6 ± 8.2f *Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre las semanas Como resultado de la prueba de S.N.K el paquete estadístico reportó 6 grupos. Para su interpretación, se asignó una letra diferente a cada grupo. Para identificar la semana dónde se alcanzó el rendimiento máximo significativo (RMS), se consideró la semana dónde inició el último grupo que corresponde a la letra “f”, así se concluyó que el RMS se alcanzó a la 11ª semana de producción. 112 Tabla 85: Análisis de varianza de bloques para identificar diferencias significativas en la eficiencia biológica acumulada durante 15 semanas de cosecha de la cepa PUap - n2g x P412 (Lote 5, H = 60.5 ± 1.4) Análisis de varianza en bloques Fuente de variación Suma de cuadrados G.L Cuadrado medio F(α) Interpretación Calculada Tablas (0.05 0.01) Semanas 29259.48 14 2089.96 71.10 1.94 2.54 ** Repeticiones 2163.70 3 721.23 24.53 2.83 4.29 ** Error 1234.53 42 29.39 Total 32657.72 59 ** = Existe diferencia altamente significativa El análisis de varianza indica que existen diferencias altamente significativas para las variables semanas y repeticiones, por lo que se realizó la prueba de Duncan para identificar la semana donde se alcanzó el rendimiento máximo significativo. Tabla 86: Prueba de Duncan para la cepa PUap - n2g x P412 (Lote 5, H = 60.5 ± 1.4) Clasificación con el paquete estadístico SPPS Interpretación Semana de corte Grupos 1 2 3 4 5 6 7 1 0 0.0 ± 0.0a 2 22.5 22.5 ± 2.9b 3 22.5 22.5 ± 2.9b 4 29.1 29.1 ± 11.4b 5 49.5 49.5 ± 10.6c 6 55.0 55.0 55.0 ± 9.0cd 7 56.3 56.3 56.3 ± 11.6cd 8 56.3 56.3 56.3 ± 11.6cd 9 59.4 59.4 59.4 ± 9.8de 10 61.3 61.3 61.3 ± 11.5de 11 65.5 65.5 65.5 ± 10.8ef 12 73.3 73.3 73.3 ± 7.8fg 13 73.3 73.3 73.3 ± 7.8fg 14 75.1 75.1 ± 5.2g 15 75.1 75.1 ± 5.2g *Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre las semanas Como resultado de la prueba de Duncan el paquete estadístico reportó 7 grupos. Para su interpretación, se asignó una letra diferente a cada grupo. Para identificar la semana dónde se alcanzó el rendimiento máximo significativo (RMS), se consideró la semana dónde inició el último grupo que corresponde a la letra “g”, así se concluyó que el RMS se alcanzó a la 12ª semana de producción. 113 Tabla 87: Análisis de varianza de bloques para identificar diferencias significativas en la eficiencia biológica acumulada durante 15 semanas de cosecha de la cepa PSma - n12j x PAsp14 - n1a (Lote 5, H = 60.5 ± 1.4) Análisis de varianza en bloques Fuente de variación Suma de cuadrados G.L Cuadrado medio F(α) Interpretación Calculada Tablas (0.05 0.01) Semanas 38994.26 14 2785.30 67.07 1.94 2.54 ** Repeticiones 4935.37 3 1645.12 39.61 2.83 4.29 ** Error 1743.97 42 41.52 Total 45673.61 59 ** = Existe diferencia altamente significativa El análisis de varianza indica que existen diferencias altamente significativas para las variables semanas y repeticiones, por lo que se realizó la prueba de Duncan para identificar la semana donde se alcanzó el rendimiento máximo significativo. Tabla 88: Prueba de Duncan para la cepa PSma - n12j x PAsp14 - n1a (Lote 5, H = 60.5 ± 1.4) Clasificación con el paquete estadístico SPPS Interpretación Semana de corte Grupos 1 2 3 4 5 6 7 8 1 37.8 37.8 ± 5.8a 2 38.0 38.0 ± 5.5a 3 45.1 45.1 ± 14.7a 4 54.6 54.6 ± 9.8b 5 69.4 69.4 ± 9.9c 6 74.3 74.3 74.3 ± 17.0cd 7 82.5 82.5 82.5 ± 14.4de 8 84.6 84.6 ± 12.3e 9 88.5 88.5 88.5 ± 15.1ef 10 95.4 95.4 95.4 ± 9.0fg 11 102.8 102.8 102.8 ± 17.6gh 12 108.2 108.2 ± 11.3h 13 108.2 108.2 ± 11.3h 14 109.2 109.2 ± 10.2h 15 109.9 109.9 ± 11.3h *Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre las semanas Como resultado de la prueba de Duncan el paquete estadístico reportó 8 grupos. Para su interpretación, se asignó una letra diferente a cada grupo. Para identificar la semana dónde se alcanzó el rendimiento máximo significativo (RMS), se consideró la semana dónde inició el último grupo que corresponde a la letra “h”, así se concluyó que el RMS se alcanzó a la 11ª semana de producción. 114 Tabla 89: Análisis de varianza de bloques para identificar diferencias significativas en la eficiencia biológica acumulada durante 15 semanas de cosecha de la cepa PSma - n12j x PUap - n2g (Lote 5, H = 60.5 ± 1.4) Análisis de varianza en bloques Fuente de variación Suma de cuadrados G.L Cuadrado medio F(α) Interpretación Calculada Tablas (0.05 0.01) Semanas 51908.42 14 3707.74 60.43 1.94 2.54 ** Repeticiones 8117.64 3 2705.88 44.10 2.83 4.29 ** Error 2576.69 42 61.35 Total 62602.76 59 ** = Existe diferencia altamente significativa El análisis de varianza indica que existen diferencias altamente significativas para las variables semanas y repeticiones, por lo que se realizó la prueba de Duncan para identificar la semana donde se alcanzó el rendimiento máximo significativo. Tabla 90: Prueba de Duncan para la cepa PSma - n12j x PUap - n2g (Lote 5, H = 60.5 ± 1.4) Clasificación con el paquete estadístico SPPS Interpretación Semana de corte Grupos 1 2 3 4 5 6 1 23.5 23.5 ± 17.5a 2 24.2 24.2 ± 16.1a 3 29.7 29.7 ± 8.3a 4 49.1 49.1 ± 23.5b 5 57.0 57.0 57.0 ± 18.1bc 6 64.4 64.4 64.4 ± 13.7cd 7 72.5 72.5 ± 14.9d 8 74.0 74.0 74.0 ± 14.2de 9 85.1 85.1 ± 18.0e 10 97.9 97.9 ± 13.6f 11 99.2 99.2 ± 11.8f 12 102.4 102.4 ± 11.9f 13 104.1 104.1 ± 14.4f 14 104.6 104.6 ± 15.4f 15 105.9 105.9 ± 14.3f *Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre las semanas Como resultado de la prueba de Duncan el paquete estadístico reportó 6 grupos. Para su interpretación, se asignó una letra diferente a cada grupo. Para identificar la semana dónde se alcanzó el rendimiento máximo significativo (RMS), se consideró la semana dónde inició el último grupo que corresponde a la letra “f”, así se concluyó que el RMS se alcanzó a la 10ª semana de producción. 115 Tabla 91: Análisis de varianza de bloques para identificar diferencias significativas en la eficiencia biológica acumulada durante 15 semanas de cosecha de la cepa PSma - n17j x P412 (Lote 5, H = 60.5 ± 1.4) Análisis de varianza en bloques Fuente de variación Suma de cuadrados G.L Cuadrado medio F(α) Interpretación Calculada Tablas (0.05 0.01) Semanas 45456.37 14 3246.88 46.69 1.94 2.54 ** Repeticiones 13944.56 3 4648.18 66.84 2.83 4.29 ** Error 2920.71 42 69.54 Total 62321.65 59 ** = Existe diferencia significativa El análisis de varianza indica que existen diferencias altamente significativas para las variables semanas y repeticiones, por lo que se realizó la prueba de Duncan para identificar la semana donde se alcanzó el rendimiento máximo significativo. Tabla 92 Prueba de Duncan para la cepa PSma - n17j x P412 (Lote 5, H = 60.5 ± 1.4) Clasificación con el paquete estadístico SPPS Interpretación Semana de corte Grupos 1 2 3 4 5 6 7 1 23.6 23.6 ± 17.4a 2 24.3 24.3 ± 16.0a 3 47.5 47.5 ± 26.6b 4 54.3 54.3 54.3 ± 23.2bc 5 63.7 63.7 ± 17.4c 6 76.3 76.3 ± 20.5d 7 83.5 83.5 83.5 ± 19.0de 8 85.0 85.0 85.0 ± 19.2de 9 89.7 89.7 89.7 ± 20.7ef 10 96.3 96.3 96.3 96.3 ± 21.2efg 11 98.1 98.1 98.1 ± 19.3fg 12 104.4 104.4 ± 16.8g 13 104.4 104.4 ± 16.8g 14 104.4 104.4 ± 16.8g 15 106.1 106.1 ± 16.2g *Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre las semanas Como resultado de la prueba de Duncan el paquete estadístico reportó 7 grupos. Para su interpretación, se asignó una letra diferente a cada grupo. Para identificar la semana dónde se alcanzó el rendimiento máximo significativo (RMS), se consideró la semana dónde inició el último grupo que corresponde a la letra “g”, así se concluyó que el RMS se alcanzó a la 10ª semana de producción. 116 Tabla 93: Análisis de varianza aleatorio de la EBA al RMS para 4 cepas del lote 1 (Lote 1, H = 61.4 ± 0.3) Análisis de varianza aleatorio Fuente de variación Suma de cuadrados G.L Cuadrado medio F(α) Interpretación Calculada Tablas (0.05 0.01) Cepas 165.31 3 55.10 1.307 3.07 4.87 NS Error 885.45 21 42.16 Total 1050.77 24 NS = No existe diferencia significativa El análisis de varianza indica que no existen diferencias significativas para las cepas del lote 1, por lo que ya no se realizó la prueba de Duncan. Tabla 94: Análisis de varianza aleatorio de la EBA al RMS para 3 cepas del lote 2 (Lote 2, H = 61.4 ± 0.3) Análisis de varianza de aleatorio Fuente de variación Suma de cuadrados G.L Cuadrado medio F(α) Interpretación Calculada Tablas (0.05 0.01) Cepas 5595.01 2 2797.50 115.20 5.79 13.27 ** Error 121.41 5 24.28 Total 6490.04 11 ** = Existe diferencia altamente significativa El análisis de varianza indica que existen diferencias altamente significativas para la variable cepa, por lo que se realizó la prueba de Duncan para identificar la cepa con mayor EBA al RMS para el lote 2. Tabla 95: Prueba de Duncan para identificar la cepa más productiva en el lote 2 (Lote 2, H = 61.4 ± 0.3) Clasificación con el paquete estadístico SPPS Interpretación Cepa Grupos 1 2 3 PSma - n12j x PAsp14 - n5a 95.46 95.46 ± 6.0c PSma - n17j x PAsp14 - n8a 61.64 61.64 ± 3.1b PSma - n17j x PSma - n5j 35.12 35.12 ± 6.3a *Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre las cepas Como resultado de la prueba de Duncan el paquete estadístico reportó 3 grupos. Para su interpretación, se asignó una letra diferente a cada grupo. Para identificar la semana dónde se alcanzó el rendimiento máximo significativo (RMS), se consideró la semana dónde inició el primer grupo que corresponde a la letra “c”, así se concluyó que la cepa con mayor EBA al RMS del lote 2 fue PSma - n12j x PAsp14 - n5a. 117 Tabla 96: Análisis de varianza de aleatorio de la EBA al RMS para 5 cepas del lote 3 (Lote 3, H = 52.8 ± 3) Análisis de varianza aleatorio Fuente de variación Suma de cuadrados G.L Cuadrado medio F(α) Interpretación Calculada Tablas (0.05 0.01) Cepas 686.57 4 171.64 2.40 2.87 4.43 NS Error 2406.67 20 120.33 Total 3093.25 24 NS = No existe diferencia significativa El análisis de varianza indica que no existen diferencias significativas para la variable cepas, por lo que ya no se realizó la prueba de Duncan. Tabla 97: Análisis de varianza aleatorio de la EBA al RMS para 6 cepas del lote 4 (Lote 4, H = 61.4 ± 0.9) Análisis de varianza aleatorio Fuente de variación Suma de cuadrados G.L Cuadrado medio F(α) Interpretación Calculada Tablas (0.05 0.01) Cepas 4915.61 5 983.12 13.11 2.64 3.94 ** Error 1723.72 23 74.94 Total 6639.33 28 ** = Existe diferencia altamente significativa El análisis de varianza indica que existen diferencias altamente significativas para la variable cepas, por lo que se realizó la prueba de Duncan para identificar la cepa con mayor EBA al RMS para el lote 4. Tabla 98: Prueba de Duncan para identificar la cepa más productiva en el lote 4 (Lote 4, H = 61.4 ± 0.9) Clasificación con el paquete estadístico SPPS Interpretación Cepa Grupos 1 2 3 4 5 6 PSma - n12j x P408 14.52 14.52 ± 12.7a PSma - n12j x P412 31.44 31.44 ± 7.6b PSma - n17j x PSma - n5j 36.81 36.81 ± 7.1c PSma - n17j x P407 41.06 41.06 ± 10.3d PSma - n17j x PAsp14 - n1a 51.74 51.74 ± 9.9e PAsp14 - n1a x PAsp14 - n5a 57.53 57.53 ± 5.7f *Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre las cepas Como resultado de la prueba de Duncan el paquete estadístico reportó 6 grupos. Para su interpretación, se asignó una letra diferente a cada grupo. Para identificar la cepa con el máximo rendimiento significativo (RMS) del lote 4, se consideró la cepa dónde inició el último grupo que corresponde a la letra “f”, así se concluyó que la cepa con mayor EBA al RMS del lote 4 fue PAsp14 - n1a x PAsp14 - n5a. 118 Tabla 99: Análisis de varianza aleatorio de la EBA al RMS para 5 cepas del lote 5 (Lote 5, H = 60.5 ± 1.4) Análisis de varianza aleatorio Fuente de variación Suma de cuadrados G.L Cuadrado medio F(α) Interpretación Calculada Tablas (0.05 0.01) Cepas 2188.65 4 547.16 2.40 3.01 4.77 NS Error 3638.81 16 227.42 Total 5827.46 20 NS = No existe diferencia significativa El análisis de varianza indica que no existen diferencias significativas para la variable cepas, por lo que ya no se realizó la prueba de Duncan. 119 10. BIBLIOGRAFÍA  Asturnatura.com. Consultado 04 noviembre 2016. http://www.asturnatura.com/articulos/hongos/basidiomycetes.php  Bano, Z., S. Rajarathnam. 1989. Pleurotus mushrooms as a nutritious food. Pp. 363-380. In: Tropical Mushrooms, Biological Nature and Cultivation Methods. Eds. S. T. Chang y T. H. Quimio. The Chinese University Press, Shatin.  Baars, J.J.P, H. Hesen.(2008). Experience with sporeless strains of oyster mushroom (Pleurotus ostreatus) in commercial production, In: Mushroo Science XVII Proceedings of the 18th International Congress Science and Cultivation of Edible and Medicinal Fungi Greuning M.V. Ed. Pretoria, South AFRICA, 774-787.  Cabral, E.L., V.S, Romero F, 2013. Hongos diversidad vegetal. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura, (UNNE).  Cardona Urrea, L. F. 2001. Anotaciones acerca de la bromatología y el cultivo del hongo comestible Pleurotus ostreatus (en línea). Crónica Forestal y del Medio Ambiente 16(6): 99-119. Universidad Nacional de Colombia. Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica, San Luis Potosí, México. Consultado 4 nov. 2016. http://sipicyt.ipicyt.edu.mx:7777/materialbiblioteca/BaenaGonzal ezArmando3.pdf  Chang, S.T., P. G. Miles. 2004. Mushrooms: cultivation, nutritional value, medicinal effect and environmental impact. CRC Press, Boca Raton.  Ciappini, C. Ma., Gatti, B, López, Z.l. Ma., Pleurotus ostreatus, una opción en el menú. Estudio sobre las gírgolas en la dieta diaria. Consultado 07 noviembre 2016. file:///C:/Users/pilli_000/Downloads/Dialnet- PleurotusOstreatusUnaOpcionEnElMenu-3331404.pdf  Cisterna Lagos, C. 2002. Cultivo del Champiñón Ostra en Chile (en línea). Mycotec, Ltda. Editores–Concepción, Chile. Consultado 4 de nov. 2016. http://www.micotec.cl/Libro%20Cultivo%20Hongo%20Ostra%20en%20Chile.pdf  CODEX STAN 38-1981 “Norma general del CODEX para los hongos comestibles y sus productos”. 120  Curvetto, N. 2004. Biotecnología en los hongos superiores. parte I. Revista AgroUNS. No.2. AÑO I: 12-15  Gaitán, R., Salmones, D., Pérez, R., Mata, G. 2006. Manual práctico del cultivo de Setas. Aislamiento, siembra y producción. Instituto de Ecología, A.C. Veracruz, México. Disponible en PDF.  Guzmán, G., G. Mata, D. Salmones., C. Soto-Velazco., L. Gúzman-Davalos. 1993. El cultivo de los hongos comestibles. Trabajo de grado.IPN. 1a. Edición. México D.F.  Huertes de Pablo, P., 2013. Estudio micológico de las especies más representativas del Valle del Jaramilla y Pico del Ocejón (Guadalajara), Consultado 16 de octubre 2016. http://oa.upm.es/15576/1/PFC_Pablo_Huertes.pdf  López, Rodríguez. C., R. Hernández Corredor. 2008. Evaluación del crecimiento y producción de Pleurotus ostreatus sobre diferentes residuos agroindustriales del departamento de Cundinamarca. Trabajo de grado. Pontificia Universidad Javeriana, Facultad de Ciencias, Microbiología Industrial Bogotá, D. C.  Martínez-Carrera., D. 1998. Oyster mushrooms. McGraw-Hill Yearbook of Science &Technology 1999. McGrawHill, Inc., Nueva York.  Martínez-Carrera, Mora. D., V.M., 2007. Investigaciones básicas, aplicadas y socioeconómicas sobre el cultivo de setas (Pleurotus) en México. Colegio de Postgrados (COLPOS), Campus Puebla, Biotecnología de Hongos Comestibles.  Marroquín Corona C., 2009. Mejoramiento genético de hongos comestibles a partir de neohaplontes de Pleurotus eryngii. Tesis licenciatura, Facultad de Química, UNAM.  Quintero. R., (compilador) 1987. Prospectivas de la biotecnología en México. Fundación Justo Sierra. México.  Rajarathnam, Bano. S. Y., 1987. Pleurotus Mushroom. Part B. Morphology, life cicle, taxonomy, breending and cultivation. CRC Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 121  Ramírez- Carrillo, R. (2011). Mejoramiento genético de Lentinula. Tesis Doctoral. UNAM. México, D.F.  Rodríguez Macias, R; González González R, Ruiz López M. A, García López P M, Ruiz Moreno J, Zamora Natera J F y Salcedo Pérez E., 2005. Perspectivas de producción de hongos comestibles (Pleurotus spp.) en la región nordeste del estado de Nuevo León (en línea). Revista SCIENTIA 8(2): 163-170. Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias (UCBA), Universidad de Guadalajara. Consultado 4 septiembre 2016. http://www.cucba.udg.mx/new/publicaciones/page_scientia_cucba/Scientia_8_2.pdf  Sánchez Hernández A. 2013. Recuperación de componentes monocarióticos de cepas comerciales del género de Pleurotus por dedicariotización, Tesis licenciatura, Facultad de ciencias, IPN.  Sánchez, J.E., y D., Royse., 2001. La biología y el cultivo de Pleurotus spp.1a. ed. ECOSUR. San Cristóbal de las casas, Chiapas.  Sánchez, J; Royse, D., 2002. La biología y el cultivo de Pleurotus spp. Colegio de la Frontera Sur (ECOSUR), Chiapas, México, D. F., MX, Editorial Limusa, S.A.  Schiess, M. 2006. Hongos comestibles (en línea). Universidad de Chile, Facultad de ciencias agronómicas. La Pintana, Santiago de Chile. Consultado 23 de octubre 2016. http://agronomia.uchile.cl/webcursos/cmd/12003/Macarena%20Schiess/DHCEx port /default.htm  Solomon, E. P. Berg, L. R. Martin, D.W. Villen, C. 1996. Biológia de Villee. 3ra edición. Ed. Interamericana McGraw-Hill. México D.F.  Tormo Molina, R. 1996. Los hongos: generalidades (en línea). Lecciones hipertextuales de botánica, España. Consultado 14 septiembre. 2016. http://www.unex.es/polen/LHB/hongos/hongos0.htm  Tormo Molina, R. 1996. Desarrollo del basidiocarpo en amanita (en línea). Universidad de Extremadura, Extremadura, España. Universidad de Hamburg, Alemania. Consultado 19 de septiembre 2016. http://www.biologie.unihamburg.de/bonline//ibc99/botanica/botánica/amanita.htm 122  Villaseñor, I. L, A. García. Arias., O. Rodríguez Alcanzar. 1997. Hongos comestibles que podemos cultivar. Sección Universitaria, Internet. México. http://biblio3.url.edu.gt/Libros/2011/bot/19.pdf Consultado 28 de octubre 2016.  http://www.micomania.rizoazul.com/microscopia%20el%20himeneo%20de %20los%20basidiomocetos.html. Consultado 28 de octubre 2016.