UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMÉDICAS CENTRO DE CIENCIAS GENÓMICAS ESTUDIO METAGENÓMICO DE MICROORGANISMOS EXTREMÓFILOS DEL CAMPO GEOTÉRMICO DE LOS AZUFRES Y DIVERSIDAD GENÓMICA DE SIMBIONTES DE PHASEOLUS E INSECTOS NATIVOS DE MÉXICO TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: DOCTOR EN CIENCIAS PRESENTA: LUIS EDUARDO SERVÍN GARCIDUEÑAS TUTORA PRINCIPAL DE TESIS: DRA. MARÍA ESPERANZA MARTÍNEZ ROMERO CENTRO DE CIENCIAS GENÓMICAS COMITÉ TUTOR: DRA. ELDA GUADALUPE ESPÍN OCAMPO INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA DR. FEDERICO ESTEBAN SÁNCHEZ RODRÍGUEZ INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA CUERNAVACA, MORELOS SEPTIEMBRE, 2015 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. Agradecimientos A la Universidad Nacional Autónoma de México y al Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, UNAM por darme las herramientas para desarrollarme académicamente asistiendo a cursos, congresos y estancias de investigación. Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por la beca otorgada para realizar mis estudios de posgrado. Al Programa de Apoyo a los Estudios de Posgrado de la UNAM y al CONACYT por los apoyos de viaje y de Beca Mixta para realizar una estancia de investigación en Dinamarca. Al CONACYT por aprobar y financiar el proyecto de Ciencia Básica con número de referencia 154453. Al Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica de la Dirección General Asuntos del Personal Académico de la UNAM por apoyar los proyectos PAPIIT UNAM IN205412 y PAPIIT UNAM IN207615. Al Subsistema Nacional de Recursos Genéticos Microbianos de la Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación por el financiamiento recibido. A mi tutora la Dra. Esperanza Martínez Romero por sus pláticas maravillosas. Sus enseñanzas y consejos han contribuido a mi formación académica y personal. Estoy agradecido por su esfuerzo, apoyo incondicional, motivación, paciencia y confianza. Los momentos en el laboratorio, los seminarios y todas sus clases fueron experiencias fascinantes. A la Dra. Lupita Espín y al Dr. Federico Sánchez por formar parte de mi comité tutor y por brindarme consejos y apoyo. Al Dr. Jesús Campos por permitirme utilizar su laboratorio en la Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo. A las Doctoras Luisa Falcón, Katy Juárez y Esperanza Martínez y a los Doctores Alfredo Martínez y Diego Cortez por formar parte de mi comité sinodal, por sus recomendaciones y por su apoyo. Agradecimientos a título personal A la Dra. Susana Brom, al Dr. Pablo Vinuesa y al Dr. Otto Geiger por su apoyo como responsables del Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas durante diferentes periodos de mi formación académica. A la Lic. Gladys Avilés por todo su apoyo y orientación. A los profesores Roger Garrett, Xu Peng y Susanne Erdmann por permitirme realizar una estancia agradable y de provecho en Dinamarca y por sus contribuciones. A Ernesto Ormeño, Mónica Rosenblueth, Marco Rogel y Julio Martínez por su paciencia y ayuda en el laboratorio, y por todos sus consejos y charlas. A todos los integrantes del programa de Ecología Genómica que me ha tocado conocer a lo largo de estos años. A mis compañeros en el laboratorio, Tania Rosas, Luis Bolaños, Diana Sahonero, Tabita Ramírez, Miguel Vences, Arturo Vera, Mariana Reyes y Berenice Jiménez. A mis grandes amigas Alejandra Zayas, Alejandra Medina y Ared Mendoza por todos los momentos en Cuernavaca así como todo el apoyo para la realización de proyectos. A todos mis amigos y alumnos de la Licenciatura en Ciencias Genómicas por su motivación. Dedicatoria Este trabajo se lo dedico a mis padres, Cecilia Garcidueñas y José Luis Servín, y a mi amigo Jonathan López. Estoy muy agradecido por su apoyo, compañía y buenos deseos. Mi trayectoria académica no hubiera sido posible sin sus esfuerzos. PREFACIO Mis estudios de doctorado se realizaron en el Programa de Ecología Genómica del Centro de Ciencias Genómicas de la UNAM que se concentra en el estudio de poblaciones bacterianas, su diversidad y taxonomía, así como en la base molecular de las funciones bacterianas que participan en las interacciones de las bacterias con otros organismos. Dentro del Programa, formé parte del Grupo de Microbiología Ambiental y Simbiótica a cargo de la Dra. Esperanza Martínez Romero donde tuve la oportunidad de proponer y colaborar en proyectos enfocados en estudiar a las bacterias fijadoras de nitrógeno en los nódulos de las leguminosas y a los simbiontes de artrópodos. Por otra parte, el grupo de la Dra. Esperanza Martínez Romero tiene interés de analizar la diversidad microbiana en ambientes naturales de México. Dentro de esta área de investigación surge mi interés y curiosidad personal de explorar la diversidad microbiana del campo geotérmico de Los Azufres ubicado en Michoacán, México. Al ser originario de Michoacán es mi intención realizar investigaciones sobre microorganismos presentes en este Estado. El proyecto de Los Azufres emerge por la fascinación de conocer microorganismos capaces de habitar en condiciones volcánicas así como analizar su potencial genético de resistencia a temperatura, acidez y niveles elevados de metales pesados. De esta manera, mi reto principal consistió en obtener ADN ambiental y generar secuencias metagenómicas para sobrepasar las limitantes de las técnicas de cultivo de microorganismos. En el primer capítulo de esta tesis se presentan los resultados obtenidos a partir del análisis de un metagenoma de una manifestación termal de Los Azufres. En este primer estudio recuperamos los primeros genomas de arqueas y arqueovirus de ambientes termales dentro de territorio continental de México. Se presentan también avances obtenidos para comprender la diversidad microbiana presente en otras comunidades microbianas del mismo campo geotérmico. Durante el transcurso de mi licenciatura y doctorado, mostré un especial interés en conocer el fenómeno de simbiosis entre plantas leguminosas y bacterias fijadoras de nitrógeno. En el segundo capítulo de la tesis se presentan resultados sobre la diversidad genómica de rizobios de frijoles nativos de México. De manera especial se profundizó en analizar los rizobios de una especie de frijol nativa de las regiones montañosas de Michoacán y Jalisco. Al participar en los seminarios del grupo de investigación surgió la posibilidad de analizar la diversidad de bacterias de insectos nativos de México. Mi propuesta fue explorar la microbiota intestinal de la mariposa monarca ya que había permanecido sin estudiar mediante técnicas moleculares. Las mariposas monarca son insectos icónicos y en riesgo que realizan una fascinante migración a través de Norteamérica para arribar a una región de bosques de oyamel en Michoacán. En el tercer capítulo de la tesis se presentan los primeros resultados sobre la diversidad de la microbiota intestinal de las mariposas monarca y resultados adicionales que surgen de proyectos de colaboración sobre otros insectos y artrópodos de México. Al final de esta tesis se incluyen resúmenes para cada uno de los capítulos. Resumen La metagenómica permite analizar la diversidad microbiana que habita en distintas condiciones ambientales tales como las presentes en aéreas volcánicas. El presente estudio analizó la diversidad microbiana que reside en el campo geotérmico de Los Azufres usando técnicas metagenómicas. La diversidad genómica de los microorganismos de Los Azufres no se había estudiado previamente. Se emplearon técnicas de secuenciación de ADN ambiental y análisis bioinformáticos para revelar la diversidad microbiana y para generar ensambles de genomas de microorganismos abundantes. En el metagenoma de una fuente termal se identificó una comunidad integrada por arqueas termoacidófilas. Del metagenoma de la fuente termal se obtuvieron genomas de arqueovirus y de arqueas Sulfolobales y Thermoproteales. En un metagenoma de sedimentos termales se identificó una comunidad dominada por una microalga de la familia Cyanidiaceae. A partir de este metagenoma se obtuvo el genoma de una nueva arquea del filo Parvarchaeota. También se identificó una comunidad compuesta principalmente por bacterias acidófilas y por una microalga de la clase Trebouxiophyceae en el metagenoma de una laguna ácida. Los genomas de los organelos de la microalga se ensamblaron a partir de las secuencias del metagenoma. Además se obtuvo de células en cultivo, el primer genoma de bacterias del género Acidocella. Las manifestaciones termales del campo geotérmico de Los Azufres contienen comunidades microbianas novedosas con diversidad limitada. Los microorganismos identificados poseen atributos funcionales potenciales que son consistentes con las condiciones geoquímicas. Por último, la tesis contiene capítulos adicionales con resultados sobre la diversidad genómica de bacterias fijadoras de nitrógeno de especies de Phaseolus y de bacterias simbiontes de insectos de México. Abstract Metagenomics allow the study of the microbial diversity that inhabit different environmental conditions such as the ones present in volcanic areas. This study analyzed the microbial diversity that thrives at the Los Azufres geothermal field by using metagenomic techniques. The genomic diversity of the microorganisms residing at Los Azufres had not been previously studied. Environmental DNA sequencing and bioinformatic analyses were used to reveal the microbial diversity and to obtain genomic assemblies of abundant microorganisms. A community of thermoacidiphilic archaeons was identified from a hot spring. From the hot spring metagenome, novel genomes were reconstructed for archaeovirus and Sulfolobales and Thermoproteales archaeons. A metagenome of thermal sediments contains a community dominated by a microalga belonging to the Cyanidiaceae family. The first genome of a novel archaeon from the Parvarchaeota phylum was obtained from this metagenome. Also, a community integrated mainly by acidophilic bacteria and by a microalga belonging to the Trebouxiophyceae class was identified from the metagenome of an acidic lagoon. The microalga organelle genomes were assembled by using metagenomic sequences. Moreover, the first bacterial genome of the Acidocella genus was obtained from cultured cells. To conclude, the thermal features at the Los Azufres geothermal field contain novel microbial communities with limited diversity. The identified microorganisms have potential functional attributes that are consistent with geochemical conditions. Finally, this thesis contains additional chapters with results about the genomic diversity of nitrogen fixing bacteria of Phaseolus species and symbiotic bacteria of insects from Mexico. ÍNDICE Capítulo I Diversidad genómica de microorganismos extremófilos de Los Azufres Introducción y antecedentes ................................................................................................. 2 Planteamiento del problema ................................................................................................ 5 Hipótesis ................................................................................................................................. 5 Objetivos ................................................................................................................................ 6 Resultados y discusión .......................................................................................................... 7 Diversidad de comunidades de arqueas de manantiales termales de Los Azufres 12 Artículo: Draft genome sequence of the Sulfolobales archaeon AZ1, obtained through metagenomic analysis of a Mexican hot spring 17 Artículo: Genome sequence of a novel archaeal rudivirus recovered from a Mexican hot spring 27 Artículo: Genome sequence of a novel archaeal fusellovirus assembled from the metagenome of a Mexican hot spring 31 Diversidad de comunidades microbianas de sedimentos fotosintéticos de Los Azufres 45 Diversidad de comunidades microbianas de una laguna ácida de Los Azufres 63 Artículo: Complete mitochondrial and plastid genomes of the green microalga Trebouxiophyceae sp. MX-AZ01 isolated from a highly acidic geothermal lake 76 Artículo: Genome sequence of the acidophilic bacterium Acidocella sp. strain MX-AZ02 81 Diversidad de otras comunidades bacterianas de Los Azufres 84 Conclusiones .......................................................................................................................... 87 Perspectivas ........................................................................................................................... 89 Bibliografía ............................................................................................................................ 92 Capítulo II Diversidad genómica de rizobios de Phaseolus nativos de México Introducción y antecedentes ................................................................................................. 102 Planteamiento del problema ................................................................................................ 105 Hipótesis ................................................................................................................................. 105 Objetivos ................................................................................................................................ 105 Resultados y discusión .......................................................................................................... 106 Artículo: Symbiont shift towards Rhizobium nodulation in a group of phylogenetically related Phaseolus species 106 Artículo: Genome sequence of Rhizobium sp. strain CCGE 510, a symbiont isolated from nodules of the endangered wild bean Phaseolus albescens 118 Artículo: Phylogenetic evidence of the transfer of nodZ and nolL genes from Bradyrhizobium to other rhizobia 121 Artículo: Taxonomy of rhizobia and agrobacteria from the Rhizobiaceae family in light of genomics 127 Artículo: Gut and root microbiota commonalities 133 Conclusiones ........................................................................................................................... 142 Perspectivas ........................................................................................................................... 143 Bibliografía ............................................................................................................................ 144 Capítulo III Resultados adicionales Diversidad genómica de simbiontes de insectos y artrópodos nativos de México Introducción y antecedentes ................................................................................................. 149 Planteamiento del problema ................................................................................................ 152 Hipótesis ................................................................................................................................. 152 Objetivos ................................................................................................................................ 152 Resultados y discusión .......................................................................................................... 153 Diversidad bacteriana de la microbiota intestinal de mariposas monarca 153 Artículo: Draft genome sequence of Commensalibacter papalotli MX01, a symbiont identified from the guts of overwintering Monarch butterflies 157 Artículo: Complete mitochondrial genome recovered from the gut metagenome of overwintering monarch butterflies, Danaus plexippus (L.) (Lepidoptera: Nymphalidae, Danainae) 169 Artículo: Species in Wolbachia? Proposal for the designation of ‘Candidatus Wolbachia bourtzisii’, ‘Candidatus Wolbachia onchocercicola’, ‘Candidatus Wolbachia blaxteri’, ‘Candidatus Wolbachia brugii’, ‘Candidatus Wolbachia taylori’, ‘Candidatus Wolbachia collembolicola’, and ‘Candidatus Wolbachia multihospitum’ for the different species within Wolbachia supergroups 172 Artículo: Arthropod-Spiroplasma relationship in the genomic era 183 Conclusiones .......................................................................................................................... 192 Perspectivas ........................................................................................................................... 193 Bibliografía ............................................................................................................................ 194 Apéndices Apéndice I Resumen Capítulo I ............................................................................................. 197 Apéndice II Resumen Capítulo II .......................................................................................... 198 Apéndice III Resumen Capítulo III ....................................................................................... 199 Apéndice IV Técnicas de PCR ............................................................................................... 200 Capítulo I Diversidad genómica de microorganismos extremófilos de Los Azufres 1 Introducción y antecedentes En algunos sitios volcánicos se encuentran manifestaciones termales con condiciones de acidez extrema, de temperaturas elevadas y de concentraciones tóxicas de metales (condiciones extremas). Los análisis de diversidad de comunidades microbianas de dichas manifestaciones termales han identificado microorganismos que pertenecen a los dominios Bacteria, Archaea y Eucaria y que son capaces de contender con las presiones ambientales (Huber et al., 2000). Estas comunidades microbianas pudieran ser aprovechadas para mejorar los procesos actuales de biorremediación, de biomineria y otros procesos industriales (van den Burg, 2003; Podar y Reysenbach, 2006; González-Pastor y Mirete, 2010). En las manifestaciones termales tenemos la oportunidad de analizar comunidades conformadas por virus y microorganismos desconocidos o pobremente caracterizados. En México, el campo geotérmico de Los Azufres alberga una gran cantidad de manifestaciones geotérmicas de origen natural. El campo geotérmico de Los Azufres se localiza en el Estado de Michoacán, dentro de la sierra de San Andrés en el Cinturón Volcánico Transmexicano en el occidente de México. Las manifestaciones geotérmicas que se pueden encontrar en Los Azufres son principalmente manantiales termales, fumarolas y solfataras (pozas termales de lodos ácidos) que llegan a alcanzar los 90 ºC, con pH menores que 4.0 y altas concentraciones de sulfatos, silicatos y metales pesados (Tello-López y Suarez-Arriaga, 2000). Los estudios microbiológicos que se han realizado en Los Azufres se han enfocado en determinar microorganismos de muestras de metales corroidos o de tuberias empleadas para la generación de energía geotérmica (Torres-Sanchez et al. 1996; Valdez-Salas et al., 2000; Alfaro- Cuevas-Villanueva et al., 2006; Castorena et al., 2006). Estos estudios han detectato la presencia de bacterias pertenecientes a los géneros Desulfotomaculum, Desulforomonas, Desulfobacter, Desulfovibrio, Burkholderia y Thermodesulfobacterium. El estudio de Navarrette-Bedolla et al., 1999 fue el primero en reportar arqueas del género Thermoproteus en tuberías de las plantas geotérmicas. La identificación de los microorganismos en estos estudios se realizó analizando imágenes de microscopía electrónica o pruebas bioquímicas. 2 La gran mayoría de la diversidad microbiana de las manifestaciones termales de Los Azufres se desconoce por completo. En el año 2014 se publicó un primer trabajo que utilizó secuencias y patrónes de digestión enzimática de genes ribosomales 16S rRNA de muestras de lodo y agua de una área pequeña que es utilizada como un spa natural para cientos de turistas (Brito et al., 2014). En este estudio se identificaron y se lograron aislar bacterias pertenecientes a los géneros Rhodobacter, Acidithiobacillus, Lyzobacter, Thermodesulfobium, Desulfurella, Thiomonas y Thermodesulfobium. Los estudios microbiológicos realizados en Los Azufres han analizado la diversidad microbiana presente en manifestaciones termales que han sufrido impacto de actividades humanas, principalmente debido a las actividades recreativas y de generación de energía geotérmica. Es común encontrar manantiales termales que han sido entubados y sellados con concreto para bombear las aguas termales con el propósito de llenar albercas para turistas. En otros casos, se extraen los lodos y sedimentos ácidos con propósitos de exfoliar la piel o se pavimentan los caminos por donde se pueden encontrar pequeñas pozas termales. Además es frecuente encontrar ganado vacuno que genera desechos orgánicos que modifican la composición de nutrientes presentes en suelos y manantiales. Finalmente, la generación de energía geotérmica también tiene un impacto ecologíco al bombear agua geotérmica, generar salmuera y provocar la acumulación de metales pesados en la superficie. La diversidad genómica de los microorganismos que residen en las manifestaciones termales de Los Azufres había permanecido sin explorar. En el laboratorio de la Dra. Esperanza Martínez se desarrolla una línea de investigación en genómica ambiental en la que propuse analizar la diversidad de comunidades microbianas de Los Azufres mediante técnicas metagenómicas. Este proyecto representa una oportunidad para analizar comunidades microbianas que de otra forma permanecerían desconocidas. 3 Los mecanismos microbianos de resistencia a condiciones ambientales son conocidos en su mayoria a partir del estudio de microorganismos cultivados (van den Burg, 2003). Una enorme cantidad de microorganismos permanecen como entidades desconocidas para la ciencia si se considera que alrededor del 99% de la diversidad microbiana que reside en un ambiente en particular no se puede cultivar con técnicas tradicionales en el laboratorio (Amann et al., 1995; Hugenholtz et al., 1998; Rappé y Giovannoni, 2003; DeLong y Pace, 2001; Pace, 2007; Epstein, 2009; Chaffron, et al., 2010; Pham y Kim, 2012). La metagenómica es una aproximación que trata de revertir el desconocimiento que tenemos sobre los microorganismos que conforman las comunidades microbianas tal como se encuentran en la naturaleza (Podar y Reysenbach, 2006). La metagenómica contempla una serie de métodos independientes del cultivo microbiano que permite, en teoría, tener acceso al ADN de todos los microorganismos cultivables y no cultivables de un ambiente específico y con ello, es posible determinar la composición, la estructura y el metabolismo potencial de tales microorganismos (Handelsman et al., 2002; Riesenfeld et al., 2004). La secuenciación de metagenomas es efectiva para caracterizar comunidades microbianas de complejidad limitada ya que poseen un número reducido de diferentes microorganismos. Algunos ejemplos incluyen las comunidades microbianas de biofilmes de una mina ácida de California que presentan altas concentraciones de metales pesados (Tyson et al., 2004), las aguas profundas que drenan una mina de oro en África a 2.8 km de profundidad, con nutrientes limitados y en un ambiente aislado de la luz solar (Chivian et al., 2008) y las comunidades microbianas de las pozas termales de Yellowstone que presentan altas temperaturas y acidez extrema (Inskeep et al., 2010). Recientemente se han obtenido cerca de 800 genomas casi completos de bacterias diminutas (de incluso menos de 400 nm) que no se han podido cultivar y que representan más de 35 filos nuevos. Los genomas de estas bacterias se obtuvieron al realizar análisis metagenómicos de muestras de aguas subterraneas de un sitio de remediacion en Colorado. Se ha estimado que estos filos nuevos representan más del 15% de los grupos conocidos de bacterias (Brown et al., 2015). Los hallagos de los estudios metagenómicos han permitido descubrir una enorme diversidad microbiana y han remodelado el árbol de la vida. 4 De igual forma se han publicado estudios metagenómicos fascinantes que han identificado nuevas ramas dentro del dominio Archaea incluyendo filos de arqueas hiperhalófilas (Narasingarao et al. 2012) y de arqueas del fondo marino (Spang et al., 2015). Además las técnicas metagenómicas en conjunto con análisis de células únicas han permitido recuperar una gran cantidad de genomas de microorganismos de ambientes extremos (Rinke et al., 2013). En los ejemplos antes expuestos, los análisis metagenómicos recuperaron los genomas consenso de las poblaciones de microorganismos más abundantes. Los estudios metagenómicos ayudan a detectar microorganismos totalmente nuevos para la ciencia y abren la posibilidad de analizar sus potenciales genéticos sobrepasando las limitantes de su cultivo. Planteamiento del problema La diversidad de las comunidades microbianas que residen en las manifestaciones termales del campo geotérmico de Los Azufres no se había estudiado mediante técnicas metagenómicas. A la fecha no se habían realizado análisis metagenómicos de sitios geotérmicos que presentan condiciones extremas de temperatura y de acidez extrema del Eje Volcánico de México. Hipótesis Las condiciones geoquímicas y térmicas imponen una presión de selección significativa en la diversidad de las comunidades microbianas. Bajo las restricciones de los nichos ecológicos de Los Azufres, las comunidades microbianas de este campo geotérmico presentan baja complejidad y poseen atributos funcionales potenciales de resistencia a condiciones ambientales extremas. 5 Objetivos Realizar censos de diversidad microbiana de nichos representativos y con condiciones ambientales extremas del campo geotérmico de Los Azufres (Figura 1) usando análisis filogenéticos de genes ribosomales. Seleccionar comunidades microbianas de baja complejidad y con microoganismos filogenéticamente novedosos en base a los resultados de los análisis de diversidad. Posteriormente, realizar la secuenciación metagenómica de las comunidades seleccionadas. Evaluar la diversidad de las comunidades microbianas seleccionadas mediante el análisis de secuencias metagenómicas para evitar los sesgos inherentes a las técnicas de amplificación de genes ribosomales. Determinar el metabolismo potencial contenido en las secuencias metagenómicas utilizando análisis comparativos de identidad de secuencia con genes ya conocidos. Realizar análisis de presencia de dominios funcionales en secuencias de genes desconocidos que pudieran dar alguna evidencia de su función posible. Identificar genes codificantes que sirvan como marcadores clave para determinar los mecanismos de resistencia a las condiciones extremas tales como los ya conocidos para la detoxificación de metales pesados, fijación de nitrógeno y carbono y estabilidad del ADN. 6 Resultados y discusión Muestreo de los sitios termales de Los Azufres Se realizaron muestreos en s ambiental. Los sitios muestreados fueron una solfatara ácida (Figura 1A), un manantial hidrotermal conocido como manantial de Marítaro (Figura 1B), sedimentos fotosintéticos expuestos a una fumarola (Figura 1C), una laguna ácida (Figura 1D), un pozo de enfriamiento de agua geotérmica (Figura 1E) y además se analizó vapor desde el reservorio geotérmico hasta la superficie. Los sitios termales se eligieron en actividades humanas. Los sitios se localizaron en viajes de exploración y por recomendación del personal del campo geotérmico consorcios microbianos no descritos debido al aislamiento geográfico de Los Azufres. También se esperaba encontrar microorganismos extremas particulares a cada sitio termal. Figura 1. Sitios termales de Los Azufres de diversidad microbiana. eis sitios termales de Los Azufres para obtener ADN agua condensada de una tubería que transporta base a su fácil acceso y por el bajo nivel de impacto de . En estos sitios se esperaba encontrar microorganismos capaces de contender con las condiciones donde se tomaron muestras para analizar la y ambientales 7 Uno de los objetivos primarios fue realizar los censos de diversidad microbiana de los sitios elegidos (Figura 1) usando análisis filogenéticos de genes ribosomales. Por ello se realizaron muestreos múltiples de agua y sedimentos que variaron dependiendo de cada sitio. En algunos casos solo fue posible realizar una única toma de muestras debido a que los consorcios microbianos se encontraban en abundancia limitada como fue el caso de los sedimentos termales (Figura 1C). Otros sitios fueron muestreados en múltiples ocasiones debido a la extensión de las manifestaciones o para verificar la estabilidad de las comunidades microbianas cuando la cantidad de material biológico no era limitante, como por ejemplo las muestras de agua de la laguna verde (Figura 1D) y de la solfata ácida (Figura 1A). Cada sitio termal se analizó siguiendo una dinámica particular sin perder de vista el objetivo común de explorar su diversidad microbiana con fines a seleccionar las comunidades microbianas que pudieran ser las mejores candidatas a ser analizadas mediante enfoques metagenómicos. Se buscó encontrar comunidades microbianas de baja complejidad o que poseyeran consorcios microbianos poco comunes o con miembros no reportados. También se deseaba que las comunidades microbianas fueran estables y que se encontraran en sitios termales donde la toma de muestras fuera accesible y abundante, esto con miras a seguir estudiando las comunidades en su ambiente natural en proyectos futuros. Las muestras de todos los sitios fueron de un litro por triplicado y las muestras se conservaron en frascos estériles a temperatura ambiente. En el caso de las muestras de sedimento la colecta se realizó directamente con cajas de Petri estériles. La laguna verde (Figura 1D) y la solfatara ácida (Figura 1A) recibieron interés especial debido a que su acceso es sencillo, a que presentan condiciones geoquímicas y térmicas contrastantes y a que permiten la toma de muestras en abundancia. Los muestreos de agua de la laguna ácida y de la solfatara ácida se realizaron durante el mes de marzo (estación de primavera) de tres años consecutivos (2008, 2009 y 2010) para determinar la estabilidad de las estructuras de las comunidades microbianas. 8 Dos muestreos adicionales se realizaron durante julio (sequia) y noviembre (posterior a la época de lluvias) de 2009 para determinar la estabilidad de las estructuras de las comunidades durante las estaciones de un mismo año. Estos muestreos se realizaron en los mismos lugares de colecta. El lugar de colecta de la laguna ácida estaba seco durante julio de 2009 debido a la sequía por tanto se colectó agua cerca del centro de la laguna a cuatro metros de una manifestación geotérmica que normalmente se encuentra en el fondo. La colecta de agua del pozo de enfriamiento (Figura 1E) y del manantial Marítaro (Figura 1B) se realizó durante marzo de 2009. La colecta de agua geotérmica de las tuberías se realizó durante mayo de 2010. Finalmente la colecta de sedimentos termales y fotosintéticos se realizó durante julio de 2009 en el área de Maritaro (Figura 1C) y durante abril de 2013. Análisis geoquímicos Los análisis de la composición química del agua de la laguna ácida y de la solfatara ácida se presentan en la Tabla 1. Los análisis se llevaron a cabo en el Instituto Mexicano de Tecnología del Agua (IMTA). Las muestras empleadas para los análisis químicos fueron las mismas que se utilizaron para los análisis de secuenciación masiva. Tabla 1. Composición química de las muestras de agua colectadas durante 2010 de la laguna ácida y de la solfatara ácida y que se utilizaron para purificar y secuenciar ADN metagenómico. 9 La temperatura y el pH se determinaron durante los muestreos utilizando termómetros estándar y tiras indicadoras de pH (Fermont). Adicionalmente, el pH de las muestras se determinó en el laboratorio utilizando un potenciómetro (accumet AB15). En general los pHs se mantuvieron estables en la laguna verde y en la solfatara ácida y solo presentaron variaciones pequeñas en las épocas de lluvia. Esto se explicará más adelante en el capítulo. Extracción de ADN Las muestras colectadas de cada sitio se procesaron el mismo día de colecta o al día siguiente para evitar que las poblaciones microbianas se alteraran. Las muestras de ADN de la laguna ácida, de los sedimentos, del pozo de enfriamiento y de la muestra de agua geotérmica se purificaron utilizando el Ultra-Clean microbial DNA Isolation Kit (MoBio Laboratories, Inc., Carlsbad, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las muestras de ADN del manantial de Marítaro y de la solfatara ácida se purificaron utilizando el Ultra-Clean mega soil DNA Kit (MoBio Laboratories, Inc., Solana Beach, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Análisis de diversidad Los genes ribosomales 16S rRNA y 18S rRNA se amplificaron mediante reacciones de PCR para determinar la diversidad de las comunidades microbianas (Apéndice IV). Se utilizaron distintas parejas de oligonucleótidos para evitar el sesgo inherente a las técnicas de PCR (Tabla 2). Los productos de PCR se amplificaron y se clonaron utilizando el TOPO-TA Cloning Kit for Sequencing (pCR4- TOPO) de Invitrogen y se siguieron las instrucciones del fabricante. Los productos de PCR se purificaron utilizando el High Pure PCR Product Purification Kit de Roche. Los productos de PCR purificados se secuenciaron en Macrogen Inc. en Seúl, Corea del Sur. La identidad de secuencia de los genes ribosomales se determinó mediante búsquedas de BLASTN (las identidades de secuencia se presentan en la sección correspondiente a cada sitio termal). Se obtuvieron secuencias de GenBank para realizar análisis filogenéticos. Las secuencias se alinearon utilizando MUSCLE v.3.8.31. Las reconstrucciones filogenéticas se infirieron con MrBayes v.3.1.2 ( Ronquist y Huelsenbeck, 2003) y PhyML v.3.0 (Guindon et al., 2010). Los árboles filogenéticos se editaron en TreeDyn v.198.3 (Chevenet et al., 2006). Los datos para realizar las curvas de rarefacción se calcularon en mothur v.1.7.2 (Schloss et al., 2010). 10 Tabla 2. Oligonucleótidos utilizados para los análisis de diversidad microbiana. Oligonucleótido Tamaño Sentido Reverso Referencia 16S rRNA Bacteria 1 1500 pb FD1 RD1 Weisburg et al., 1991 16S rRNA Bacteria 2 700 pb 799f 1492r Chelius y Triplett, 2001 16S rRNA Arquea 1 600 pb Arch0333aS15 Arch0958aA19 Lepp et al., 1999 16S rRNA Arquea 2 660/1300 pb UA751F UA1406R Baker et al., 2004 16S rRNA Arquea 3 1000/1700 pb Arch0333aS15 UA1406R Lepp et al., 1999, Baker et al., 2004 16S rRNA Arquea 4 1460/2000 pb A2F U1510R Hugenholtz et al., 1998 18S rRNA Eucariota 1700 pb 90F B Yuasa et al., 2004 arsenito oxidasa aoxB 1100 pb aoxBM1-2F aoxBM3-2R Quéméneur et al., 2008 11 Diversidad de comunidades de arqueas de manantiales termales de Los Azufres El manantial de Marítaro (Figura 1B) mostró una temperatura de 89 °C y un pH de 3.7 mientras que la solfatara ácida (Figura 1A) tiene pH y temperaturas constantes en todos los muestreos (~pH =3, ~T=65 °C). Las comunidades de la solfatara ácida y del manantial de Marítaro presentaron diversidad limitada y están conformadas por poblaciones de arqueas. Las reacciones de PCR no amplificaron genes ribosomales de bacterias ni de eucariotas. Se identificaron dos secuencias distintas de genes ribosomales 16S rRNA de arqueas en las librerías. Las secuencias de la arquea predominante representa más de tres cuartas partes de la librería de la solfatara ácida (40 de 50 secuencias) y casi la totalidad de la librería del manantial de Marítaro (28 de 30 secuencias). La secuencia del gen ribosomal 16S rRNA de la arquea predominante es similar a secuencias de arqueas del orden Sulfolobales y las cepas más cercanas corresponden al género Acidianus. La cepa tipo más cercana corresponde a Acidianus infernus So4aT que presenta una identidad de 92.8% en 1334 nucleótidos. El género Acidianus no es monofilético (Figura 2). El género Acidianus sensu stricto está definido por la cepa tipo de Acidianus infernus So4aT. Un análisis filogenético basado en genes ribosomales 16S rRNA agrupa las secuencias de la arquea predominante de la solfatara ácida de Los Azufres en un grupo independiente las cepas del grupo de Acidianus sensu stricto (Figura 2). La arquea predominante se designó como arquea Sulfolobales AZ1. Las cepas de "Acidianus brierleyi" DSM 1651 y "Acidianus tengchongensis" S5 poseen una identidad de 92% en 1334 nucleótidos pero su clasificación taxonómica no se ha resuelto. 12 Figura 2. Reconstrucción filogenética de arqueas del orden Sulfolobales. En negritas se indica la posición de secuencias correspondientes a la arquea Sulfolobales AZ1. El alineamiento de secuencias contiene 1426 caracteres. La reconstrucción filogenética bayesiana se realizó en MrBayes3 (Ronquist & Huelsenbeck, 2003) utilizando el modelo de sustitución GTR+I+G. Se muestran los números de acceso de GenBank de las secuencias de referencia. Los valores de soporte de las ramas se muestran como probabilidades posteriores bayesianas. La barra de escala representa el número promedio de sustitución de nucleótidos por sitio. La arquea Sulfolobales AZ1 cumple los requisitos para considerarse como la representante de un nuevo género candidato si consideramos los criterios de clasificación taxonómica actuales (Hugenholtz et al, 1998; Tindall et al., 2010; Yarza et al., 2008; Yarza et al., 2010; Yarza et al., 2014). Los criterios incluyen que la identidad de secuencia del gen ribosomal 16S rRNA sea menor a 94.9±0.4%, que la secuencia sea mayor a 1000 nucleótidos, que la secuencia se recupere tres o más veces en productos de PCR independientes y que las reconstrucciones filogenéticas den soporte a clados independientes. 13 Las secuencias del gen ribosomal 16S rRNA de la arquea minoritaria presentan una identidad de entre 97 y 98% en 1,031 nucleótidos con secuencias de arqueas Thermoproteales del género Thermoproteus. La arquea minoritaria se designó como Thermoproteus sp. AZ2. En un análisis filogenético basado en genes ribosomales 16S rRNA se encontró que la posición filogenética de Thermoproteus sp. AZ2 es externa dentro del clado Thermoproteus, lo que provee evidencia de que pudiera corresponder a una especie nueva (Figura 3). Figura 3. Reconstrucción filogenética de arqueas del orden Thermoproteales. En negritas se indica la posición de secuencias correspondientes a Thermoproteus sp. AZ2 ("Ca. Thermoproteus azufrensis"). También se presenta la posición de la arquea Vulcanisaeta sp. AZ3 ("Ca. Vulcanisaeta taximaroa" AZ3). La arqueas Thermoproteales y sus nombres candidatos serán presentados más adelante en el capítulo I. El alineamiento de secuencias contiene 1445 caracteres. La reconstrucción filogenética bayesiana se realizó en MrBayes3 (Ronquist & Huelsenbeck, 2003) utilizando el modelo de sustitución GTR+I+G. Se muestran los números de acceso de GenBank de las secuencias de referencia. Los valores de soporte de las ramas se muestran como probabilidades posteriores bayesianas. La barra de escala representa el número promedio de sustitución de nucleótidos por sitio. 14 En conjunto, estos resultados nos indican que las comunidades microbianas son de complejidad limitada en la solfatara ácida y en el manantial de Marítaro, que las comunidades están integradas predominantemente por arqueas y que la población de arqueas mayoritaria pertenece a un grupo filogenético novedoso del orden Sulfolobales. Se realizaron estos análisis de diversidad con la finalidad de determinar si las comunidades microbianas de la solfatara ácida son estables a través del tiempo. Los análisis de diversidad de la solfatara ácida realizados durante el mes de marzo de tres años consecutivos (2008, 2009 y 2010) y de julio y noviembre de 2009 identifican a los mismos grupos filogenéticos. Varias manifestaciones termales alrededor del mundo presentan comunidades microbianas estables (Wilson et al., 2008; Satoh et al., 2013; Wemheuer et al., 2013). En general se esperaban pocos cambios en las poblaciones de arqueas de la solfatara ácida debido a la baja complejidad y a la estabilidad de las condiciones geoquímicas y de temperatura. Análisis de secuencias metagenómicas de la solfatara ácida La solfatara ácida se eligió como uno de los sitios para realizar la secuenciación de un metagenoma debido a que sus comunidades microbianas son estables a través del tiempo, son de diversidad limitada y están integradas por una población abundante de arqueas Sulfolobales de un nuevo género candidato. La solfatara ácida se encuentra en un sitio aislado que no muestra impacto humano y presenta condiciones extremas de pH y de temperatura. Además no existían genomas de referencia de los grupos filogenéticos identificados. La zona donde se encuentra el manantial de Marítaro se seca casi por completo durante la estación de sequía y solo permanecen algunos pequeños riachuelos. A partir de finales del año 2009 la zona del manantial de Maritaro se convirtió en una zona de recreación humana. El manantial de Maritaro quedo inaccesible debido a que fue sellado con varillas y concreto y sus aguas termales son bombeadas a través de tuberías a piscinas para turistas. También se ha permitido el ingreso de ganado a la zona. Debido a estas razones ya no se continuó analizando el manantial de Marítaro. 15 El primer metagenoma de la solfatara se secuenció en la plataforma de Illumina-Solexa como uno de los proyectos piloto de la Unidad Universitaria de Secuenciación Masiva de la UNAM. Las secuencias metagenómicas comprenden 12.5 millones de lecturas pareadas de 35 bases que integran 436 Mb. El ensamble de las lecturas se realizó durante 2009 usando Velvet v.1.0.13 (Zerbino y Birney, 2008). Posteriormente se continuaron realizando ensambles adicionales con los programas Edena (Hernandez et al., 2008), SOAPdenovo (Luo et al., 2012) y Metavelvet (Namiki et al., 2012) pero no fue posible mejorar los ensambles. Las secuencias metagenómicas revelaron la composición filogenética de la comunidad de la solfatara ácida y permitieron la reconstrucción del genoma parcial de la arquea Sulfolobales AZ1 y de arqueovirus novedosos. 16 Artículo: Servín-Garcidueñas LE, Martínez-Romero E. 2014. Draft genome sequence of the Sulfolobales archaeon AZ1, obtained through metagenomic analysis of a Mexican hot spring. Genome Announc. 2: e00164-14. A partir del ensamble del primer metagenoma de la solfatara ácida de Los Azufres logramos identificar solo un gen ribosomal 16S rRNA que corresponde a la arquea Sulfolobales AZ1. El primer metagenoma se obtuvo de una muestra de agua de la superficie de la solfatara ácida. Es decir, la muestra de ADN ambiental que se secuenció estaba naturalmente enriquecida en arqueas aeróbicas o aeróbicas facultativas, que en este caso correspondieron a la población de la arquea Sulfolobales AZ1. En este primer metagenoma no se obtuvieron secuencias genómicas de las poblaciones de arqueas Thermoproteales ya que son anaeróbicas. En base a la comparación de secuencias de genes ribosomales y de secuencias genómicas se encontró que la arquea Sulfolobales AZ1 representa una especie candidata de un género nuevo dentro del orden Sulfolobales y se ha propuesto el nombre 'Candidatus Aramenus sulfurataquae'. En este artículo se reporta el ensamble del genoma de la arquea Sulfolobales AZ1 a partir de las secuencias metagenómicas de la solfatara ácida. Este ensamble representa el primer genoma obtenido de una arquea que habita en el Eje Volcánico de México. Se encontró que el contenido de G+C del genoma de la arquea Sulfolobales AZ1 (47%) es de los más altos reportados para arqueas Sulfolobales. Además el contenido de G+C promedio de sus 47 genes de ARN de transferencia predichos es incluso más alto, de 65%, lo que reflejaría las adaptaciones a las condiciones termales extremas. Las principales características del genoma de la arquea Sulfolobales AZ1 se presentan en el artículo. 17 Draft Genome Sequence of the Sulfolobales Archaeon AZ1, Obtained through Metagenomic Analysis of a Mexican Hot Spring Luis E. Servín-Garcidueñas, Esperanza Martínez-Romero Center for Genomic Sciences, Department of Ecological Genomics, National University of Mexico, Cuernavaca, Morelos, Mexico The Sulfolobales archaea have been found inhabiting acidic hot springs all over the world. Here, we report the 1.798-Mbp draft genome sequence of the thermoacidophilic Sulfolobales archaeon AZ1, reconstructed from the metagenome of a Mexican hot spring. Sequence-based comparisons revealed that the Sulfolobales archaeon AZ1 represents a novel candidate genus. Received 10 February 2014 Accepted 13 February 2014 Published 6 March 2014 Citation Servín-Garcidueñas LE, Martínez-Romero E. 2014. Draft genome sequence of the Sulfolobales archaeon AZ1, obtained through metagenomic analysis of a Mexican hot spring. Genome Announc. 2(2):e00164-14. doi:10.1128/genomeA.00164-14. Copyright © 2014 Servín-Garcidueñas and Martínez-Romero. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution 3.0 Unported license. Address correspondence to Luis E. Servín-Garcidueñas, luis.e.servin@gmail.com. The order Sulfolobales is placed within the phylum Crenar- chaeota (1), and some of its species are considered model or- ganisms (2). The order Sulfolobales comprises the genera Sulfolo- bus, Acidianus, Metallosphaera, Stygiolobus, and Sulfurisphaera (3– 7). Sulfolobus contains the highest number of sequenced strains (8–15), and until now, only one complete Acidianus genome se- quence was available (16). Metallosphaera contains three se- quenced species (17, 18, 19), including “Metallosphaera yellow- stonensis,” which was first described through metagenomic efforts (20). A novel Sulfolobales archaeon has also been discovered from a metagenomic study (21). We report the draft metagenomic se- quence of the Sulfolobales archaeon AZ1, the first member of the “Candidatus Aramenus” genus. Samples were collected from a hot spring (pH 3.6 and 65°C) located at Los Azufres National Park, Mexico, during March 2009. Environmental DNA was purified using the Ultra-Clean micro- bial DNA and the Ultra-Clean mega soil DNA kits (MoBio Labo- ratories, Inc., Carlsbad and Solana Beach, CA). Sequencing was performed with an Illumina-GAIIx platform, producing 36-bp paired-end reads with 300-bp inserts representing 216 Mbp. Reads were assembled de novo using Velvet version 1.2.10 (22). A total of 163 contigs were verified by BLASTN searches to be of archaeal origin. All other contigs were assembled into the Sulfolo- bales Mexican rudivirus 1 (SMR1) (23) and the Sulfolobales Mex- ican fusellovirus 1 (SMF1) (24) sequences. All reads were mapped to the archaeal contigs using Maq 0.7.1 (25). The mapping reads were reassembled to eliminate gaps from the archaeal contigs by sequence extensions. Genome annotation was performed with the NCBI Prokaryotic Genomes Automatic Annotation Pipeline ver- sion 2.0 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/annotation _prok/). DNA-DNA hybridization (DDH) values were computed using the Genome-to-Genome Distance Calculator (26, 27) ver- sion 2.0 (28). The metagenome assembly was 1,798,894 bp, and only one type of 16S rRNA gene was detected. We retrieved a consensus genome of a population consisting of a dominant Sulfolobales ar- chaeon that was designated AZ1. The consensus genome contains 46 contigs with a coverage of 71.9 and an N50 value of 223,688 bp. A total of 2,002 genes were predicted, including 1,975 protein- coding genes. The consensus genome had a GC content of 47%, higher than the 34.1% of the Acidianus hospitalis W1 genome and the 32.8 to 36.7% of the Sulfolobus genomes. The GC content more closely resembles the 42 to 47.7% GC contents of Metal- losphaera genomes. The 16S rRNA gene from the archaeon AZ1 shares 93% se- quence identity with the corresponding gene from A. hospitalis W1. A 95% sequence identity has been proposed as a reasonable value to limit different genera (29, 30). Genome sequence com- parisons between the archaeon AZ1 and A. hospitalis W1 revealed a DDH estimate of 16.10%, well below the 70% proposed for species definition (30, 31). The archaeon AZ1 would then corre- spond to a novel Sulfolobales genus. The name “Candidatus Ara- menus sulfurataquae,” meaning “the guardian of the sulfurated water,” is proposed. The word “Arameni,” from the Mexican Purepecha language, means “guardian/custodian of the water.” Further characterization of the “Candidatus Aramenus” genus is in progress. Nucleotide sequence accession number. This whole-genome shotgun project has been deposited at DDBJ/EMBL/GenBank un- der the accession no. ASRH00000000. ACKNOWLEDGMENTS This research was supported by PAPIIT IN205412 from DGAPA, UNAM, and SUBNARGEM, SAGARPA. L.E.S.-G. received a Ph.D. scholarship from CONACYT (Mexico). We thank Jean P. Euzéby (nomenclature reviewer of the International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology) for reviewing scien- tific names. We also thank the Programa de Doctorado en Ciencias Bio- médicas from UNAM. We thank the UUSM from UNAM for sample sequencing. The Comisión Federal de Electricidad personnel provided a permit for sampling. We thank Jesús Campos García from the UMSNH for providing laboratory facilities. Samplings were carried out with the efforts of Jonathan Lopez, José Luis Servín, and Cecilia Garcidueñas. March/April 2014 Volume 2 Issue 2 e00164-14 genomea.asm.org 118 REFERENCES 1. Stetter KO, López-Casillas F, Bai DH, Luo X, Pape ME. 1989. Order III. Sulfolobales ord. nov. family Sulfolobaceae fam. nov., p 2250 –2251. In Staley JT, Bryant MP, Pfennig N, Holt JG, López-Casillas F, Bai DH, Luo X, Pape ME (ed), Bergey’s manual of systematic bacteriology, vol 3, 1st ed. Williams & Wilkins, Baltimore, MD. 2. Leigh JA, Albers SV, Atomi H, Allers T. 2011. Model organisms for genetics in the domain Archaea: methanogens, halophiles, Thermococcales and Sulfolobales. FEMS Microbiol. Rev. 35:577– 608. http://dx.doi.org/10 .1111/j.1574-6976.2011.00265.x. 3. Brock TD, Brock KM, Belly RT, Weiss RL. 1972. Sulfolobus: a new genus of sulfur-oxidizing bacteria living at low pH and high temperature. Arch. Mikrobiol. 84:54 – 68. http://dx.doi.org/10.1007/BF00408082. 4. Segerer A, Neuner AM, Kristjansson JK, Stetter KO. 1986. Acidianus infernus gen. nov., sp. nov., and Acidianus brierleyi comb. nov.: faculta- tively aerobic, extremely acidophilic thermophilic sulfur-metabolizing ar- chaebacteria. Int. J. Syst. Bacteriol. 36:559 –564. http://dx.doi.org/10.109 9/00207713-36-4-559. 5. Huber G, Spinnler C, Gambacorta A, Stetter KO. 1989. Metallosphaera sedula gen. nov. and sp. nov. represents a new genus of aerobic, metal- mobilizing, thermoacidophilic archaebacteria. Syst. Appl. Microbiol. 12: 38 – 47. http://dx.doi.org/10.1016/S0723-2020(89)80038-4. 6. Segerer AH, Trincone A, Gahrtz M, Stetter KO. 1991. Stygiolobus azori- cus gen. nov., sp. nov. represents a novel genus of anaerobic, extremely thermoacidophilic archaebacteria of the order Sulfolobales. Int. J. Syst. Bacteriol. 41:495–501. http://dx.doi.org/10.1099/00207713-41-4-495. 7. Kurosawa N, Itoh YH, Iwai T, Sugai A, Uda I, Kimura N, Horiuchi T, Itoh T. 1998. Sulfurisphaera ohwakuensis gen. nov., sp. nov., a novel ex- tremely thermophilic acidophile of the order Sulfolobales. Int. J. Syst. Bac- teriol. 48(Pt 2):451– 456. http://dx.doi.org/10.1099/00207713-48-2-451. 8. She Q, Singh RK, Confalonieri F, Zivanovic Y, Allard G, Awayez MJ, Chan-Weiher CC, Clausen IG, Curtis BA, De Moors A, Erauso G, Fletcher C, Gordon PM, Heikamp-de Jong I, Jeffries AC, Kozera CJ, Medina N, Peng X, Thi-Ngoc HP, Redder P, Schenk ME, Theriault C, Tolstrup N, Charlebois RL, Doolittle WF, Duguet M, Gaasterland T, Garrett RA, Ragan MA, Sensen CW, Van der Oost J. 2001. The complete genome of the crenarchaeon Sulfolobus solfataricus P2. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98:7835–7840. http://dx.doi.org/10.1073/pnas.141222098. 9. Kawarabayasi Y, Hino Y, Horikawa H, Jin-no K, Takahashi M, Sekine M, Baba S, Ankai A, Kosugi H, Hosoyama A, Fukui S, Nagai Y, Nishijima K, Otsuka R, Nakazawa H, Takamiya M, Kato Y, Yoshizawa T, Tanaka T, Kudoh Y, Yamazaki J, Kushida N, Oguchi A, Aoki K, Masuda S, Yanagii M, Nishimura M, Yamagishi A, Oshima T, Kikuchi H. 2001. Complete genome sequence of an aerobic thermoacidophilic crenarchaeon, Sulfolobus tokodaii strain 7. DNA Res. 8:123–140. http://dx .doi.org/10.1093/dnares/8.4.123. 10. Chen L, Brügger K, Skovgaard M, Redder P, She Q, Torarinsson E, Greve B, Awayez M, Zibat A, Klenk HP, Garrett RA. 2005. The genome of Sulfolobus acidocaldarius, a model organism of the Crenarchaeota. J. Bacteriol. 187:4992– 4999. http://dx.doi.org/10.1128/JB.187.14.4992-499 9.2005. 11. Reno ML, Held NL, Fields CJ, Burke PV, Whitaker RJ. 2009. Biogeog- raphy of the Sulfolobus islandicus pan-genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106:8605– 8610. http://dx.doi.org/10.1073/pnas.0808945106. 12. Guo L, Brügger K, Liu C, Shah SA, Zheng H, Zhu Y, Wang S, Lillestøl RK, Chen L, Frank J, Prangishvili D, Paulin L, She Q, Huang L, Garrett RA. 2011. Genome analyses of Icelandic strains of Sulfolobus islandicus, model organisms for genetic and virus-host interaction studies. J. Bacte- riol. 193:1672–1680. http://dx.doi.org/10.1128/JB.01487-10. 13. Cadillo-Quiroz H, Didelot X, Held NL, Herrera A, Darling A, Reno ML, Krause DJ, Whitaker RJ. 2012. Patterns of gene flow define species of thermophilic Archaea. PLoS Biol. 10:e1001265. http://dx.doi.org/10.1371 /journal.pbio.1001265. 14. Mao D, Grogan D. 2012. Genomic evidence of rapid, global-scale gene flow in a Sulfolobus species. ISME J. 6:1613–1616. http://dx.doi.org/10.10 38/ismej.2012.20. 15. Jaubert C, Danioux C, Oberto J, Cortez D, Bize A, Krupovic M, She Q, Forterre P, Prangishvili D, Sezonov G. 2013. Genomics and genetics of Sulfolobus islandicus LAL14/1, a model hyperthermophilic archaeon. Open Biol. 3:130010. http://dx.doi.org/10.1098/rsob.130010. 16. You XY, Liu C, Wang SY, Jiang CY, Shah SA, Prangishvili D, She Q, Liu SJ, Garrett RA. 2011. Genomic analysis of Acidianus hospitalis W1 a host for studying crenarchaeal virus and plasmid life cycles. Extremophiles 15:487– 497. http://dx.doi.org/10.1007/s00792-011-0379-y. 17. Auernik KS, Maezato Y, Blum PH, Kelly RM. 2008. The genome se- quence of the metal-mobilizing, extremely thermoacidophilic archaeon Metallosphaera sedula provides insights into bioleaching-associated me- tabolism. Appl. Environ. Microbiol. 74:682– 692. http://dx.doi.org/10.11 28/AEM.02019-07. 18. Liu LJ, You XY, Zheng H, Wang S, Jiang CY, Liu SJ. 2011. Complete genome sequence of Metallosphaera cuprina, a metal sulfide-oxidizing ar- chaeon from a hot spring. J. Bacteriol. 193:3387–3388. http://dx.doi.org/ 10.1128/JB.05038-11. 19. Kozubal MA, Dlakic M, Macur RE, Inskeep WP. 2011. Terminal oxidase diversity and function in “Metallosphaera yellowstonensis”: gene expres- sion and protein modeling suggest mechanisms of Fe(II) oxidation in the Sulfolobales. Appl. Environ. Microbiol. 77:1844 –1853. http://dx.doi.org/ 10.1128/AEM.01646-10. 20. Inskeep WP, Rusch DB, Jay ZJ, Herrgard MJ, Kozubal MA, Richardson TH, Macur RE, Hamamura N, Jennings Rd, Fouke BW, Reysenbach AL, Roberto F, Young M, Schwartz A, Boyd ES, Badger JH, Mathur EJ, Ortmann AC, Bateson M, Geesey G, Frazier M. 2010. Metagenomes from high-temperature chemotrophic systems reveal geochemical con- trols on microbial community structure and function. PLoS One 5:e9773. http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0009773. 21. Podar M, Makarova KS, Graham DE, Wolf YI, Koonin EV, Reysenbach AL. 2013. Insights into archaeal evolution and symbiosis from the ge- nomes of a nanoarchaeon and its inferred crenarchaeal host from Obsid- ian Pool, Yellowstone National Park. Biol. Direct 8:9. http://dx.doi.org/1 0.1186/1745-6150-8-9. 22. Zerbino DR, Birney E. 2008. Velvet: algorithms for de novo short read assembly using de Bruijn graphs. Genome Res. 18:821– 829. http://dx.doi .org/10.1101/gr.074492.107. 23. Servín-Garcidueñas LE, Peng X, Garrett RA, Martínez-Romero E. 2013. Genome sequence of a novel archaeal rudivirus recovered from a Mexican hot spring. Genome Announc. 1(1):e00040-12. http://dx.doi.org/10.1128 /genomeA.00040-12. 24. Servín-Garcidueñas LE, Peng X, Garrett RA, Martínez-Romero E. 2013. Genome sequence of a novel archaeal fusellovirus assembled from the metagenome of a Mexican hot spring. Genome Announc. 1(2):e00164-13. http://dx.doi.org/10.1128/genomeA.00164-13. 25. Li H, Ruan J, Durbin R. 2008. Mapping short DNA sequencing reads and calling variants using mapping quality scores. Genome Res. 18:1851–1858. http://dx.doi.org/10.1101/gr.078212.108. 26. Auch AF, Klenk HP, Göker M. 2010. Standard operating procedure for calculating genome-to-genome distances based on high-scoring segment pairs. Stand. Genomic Sci. 2:142–148. http://dx.doi.org/10.4056/sigs.541 628. 27. Auch AF, von Jan M, Klenk HP, Göker M. 2010. Digital DNA-DNA hybridization for microbial species delineation by means of genome-to- genome sequence comparison. Stand. Genomic Sci. 2:117–134. http://dx .doi.org/10.4056/sigs.531120. 28. Meier-Kolthoff JP, Auch AF, Klenk HP, Göker M. 2013. Genome sequence-based species delimitation with confidence intervals and im- proved distance functions. BMC Bioinformatics 14:60. http://dx.doi.org/ 10.1186/1471-2105-14-60. 29. Yarza P, Richter M, Peplies J, Euzeby J, Amann R, Schleifer KH, Ludwig W, Glöckner FO, Rosselló-Móra R. 2008. The all-species living tree project: a 16S rRNA-based phylogenetic tree of all sequenced type strains. Syst. Appl. Microbiol. 31:241–250. http://dx.doi.org/10.1016/j.syapm.200 8.07.001. 30. Tindall BJ, Rosselló-Móra R, Busse HJ, Ludwig W, Kämpfer P. 2010. Notes on the characterization of prokaryote strains for taxonomic pur- poses. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 60:249 –266. http://dx.doi.org/10.1099 /ijs.0.016949-0. 31. Wayne LG, Brenner DJ, Colwell RR, Grimont PAD, Kandler O, Krichevsky MI, Moore LH, Moore WEC, Murray RGE, Stackebrandt E, Starr MP, Truper HG. 1987. Report of the ad hoc committee on recon- ciliation of approaches to bacterial systematics. Int. J. Syst. Bacteriol. 37: 463– 464. http://dx.doi.org/10.1099/00207713-37-4-463. Servín-Garcidueñas and Martínez-Romero 2 genomea.asm.org March/April 2014 Volume 2 Issue 2 e00164-1419 Diversidad filogenética de las arqueas Sulfolobales Al realizar análisis filogenéticos de la arquea Sulfolobales AZ1 nos dimos cuenta de que existían inconsistencias en la clasificación de las arqueas Sulfolobales. El orden Sulfolobales contiene varios grupos de arqueas que no han sido descritas y que pueden representar géneros diferentes. Además varias especies descritas formalmente no tienen una clasificación adecuada. Para estudiar la diversidad de las arqueas Sulfolobales realizamos un análisis de agrupamiento de 94 secuencias de genes ribosomales 16S rRNA de cepas tipo, de aislados y de secuencias ambientales. Este análisis reveló 15 grupos de arqueas Sulfolobales cuando se aplicó un valor de corte de identidad de secuencia de 94.9%, que es el valor del límite máximo para definir géneros en base a genes ribosomales 16S rRNA. Solo cinco de los 15 grupos contienen cepas tipo de los géneros Acidianus, Metallosphaera, Stygiolobus, Sulfolobus y Sulfurisphaera. Una reconstrucción filogenética del mismo conjunto de secuencias de genes ribosomales reveló que 14 de los 15 grupos identificados en el análisis de agrupamiento son monofiléticos (Figura 4). La única excepción fue la arquea "Sulfolobus vallisabyssus" F que no ha sido descrita y que es un grupo externo dentro del grupo de Sulfurisphaera ohwakuensis TA1T. También comprobamos que los géneros Acidianus y Sulfolobus no son monofiléticos. Las inconsistencias en la clasificación de las arqueas Sulfolobales han sido documentadas extensivamente (Stetter et al., 1989; Goebel et al., 2000; Fuchs et al., 1996; Trevisanato et al., 1996; Burggraf et al., 1997; Kurosawa et al., 1998; Huber y Prangishvili, 2006). A la fecha no se ha adoptado una reclasificación formal de los géneros del orden Sulfolobales. Las principales limitantes han sido tradicionalmente la falta de morfologías, de pruebas bioquímicas y de metabolismos diferenciales, además de que muchas cepas reportadas en la literatura no han sido depositadas en centro de cultivo internacionales. 20 Figura 4. Reconstrucción filogenética de arqueas del orden Sulfolobales basada en genes ribosomales 16S rRNA (ver siguiente página para explicación de la reconstrucción filogenética). 21 C I"OO2425 "Sulfolohus ishllldicIIS" RE' 15 \ (-) CPOOIM)O "Sulfolobus tilal/diclls" ' 1 . 1 ~.l5 (-) C POO I800 "SulfolobllS solfatariclls" 9812 (-) A[~ I "Sulfolobus l oIfalaricus" "2 C-) Du..90 "Sulfolobus solfatan'CIIs" PI (T) GQ495670 " SulfololJ/n~ 'p. G4ST·2 078 AF-t!5652 "SuIIlIl(lblll" ~p. AM PI Y99 . C POO I404 "SulfolobllS isltmdiCIIs" V.N. 15.51 C-) O 78 AF~25653 "Su/ro/viII/s," ~p. RC6100 . A Y907890 "SlIljololJ/H \p_ JP3 1. 0.7 AY907B89 "Sulfúlollll.{ 'p.JP2 ~lJlSo.& 'SlIlfolobll$ :r hibola~" IH2 en AF~256S7 "Slllfolomu' \p. MV2199 DQ8341S6 clone SK9().l 0.9 FJ489512 "SII/foll/PIII- \P, TYQIJ 1.00 A' 135637 ''SIllfolobus u "gclumgeusis" RTX-I (TI 0.94 FJ489513 "SlIljúlolms" ~p. IIB 59 1. 0.99 l . EU729124 "SlIlfoloOO(" ~p. K4- 1 GU256550 "S,,/fi¡/ob/u" ~p. TI EF660.HS "S/I/fáfllb'H h('itoll" DBS 00181319 clonc MTC-A_Clol1C_IOA DQ383326 clone MTC-A_Oone_ 41 B 0.99 J1'\944177 "SIII[olobllf" "P. ~ IK 3 1,00 1.00 g~~~~~ : :::%~J7:;;: ::,~~:;:!;;'~;:,f:;:~: ~ 1 1 ~~:~~ EF660336 "SlIlfo/oIm.f ' ·olli.ftlbY.HlIs " F ABOI0957 ' '5lllfolobllS J"Ollgmil/ g~ n :r is " V1\ 11 (T) 0.9 BAOOOOlJ "SI/lfolobus lokodaii" 7 (T)(-) 1.00 D85507 Sulfllrispl/Oero ol''''''ak"e" sis TAl (T ) 1 00 J:\:989263 clone arcluJ 1I . OQ383321 clone MTC-A_donc_ 226.&89 ''Addulllus bri e rl ~)' ; " DSM 16.51 ('1') ,---"".00"'l' AF226987 ' 'Acidionlls lengchongfmsis" S5 (T ) AJ884675 ~ AeitliiuU/S /1O:.:poliellsis " r ___ --'- 1. ~ 00 "l JQ S I3288 'Clm did4lJI$ Ackl lanus copa.hue nsls' ALE I ('1')(. ) J X989259 clone arch_a7 AV907891 "Acidiollll :r n djidú'lJro JJs" JP7 en A B182~ 98 ' 'AcidiallllS mau:,aeJJs is" NA I (T) "J 1~ 5 16 . \ cidilllllu (J ",bj¡'a/~1U lAi 10 (T) ·\J6'17(>1,\,I\B6flm~~ l·l\mc 1I01xS"A"~ O 62 0.55 rx.px_, \:'i:! d¡'llc '1T(' R n" . 00350777 archaeon KOZOI B 1. 1.00 JN971014 Melallosplwera )·elloWSIOIiI'IlSis MKI (1')(-) JQ346779 clone YOBP2 l . KJ 7351 O I M ~ tallo :r l)/u w m tens c1KJtl8e/1s is Ric-F 10735100 M~tallo s p"o ~ ra t ~ 1I 8clu)llK~IfS ; S Ric·A (T ) ' )86414 M ~ lall(l $ p"aero ¡/akollellsis HOI- I (T)(- ) CPOO26.56 M~tollo:rpho~,o cllpn·"o Ar-4 (T )(- ) DQ383339 clone MTC-B_Clol1C_2OC AFI67083 M ~ ltill o.( pIIlIUa sp. JI DQ383332 clone MTC-A_C1ont:_25 B 0 .9 EF I42855 M('wllosl" llfu a s p. YN23 1.00 CP000682 Metallosplloera sed/tia TH2 (T)(-) 0.69 X9