UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
Maestría y Doctorado en Ciencias Bioquímicas
ESTUDIO DE LA INTERACCIÓN DE LA REGIÓN C-TERMINAL DE LA
PROTOXINA Cry1Ab de Bacillus thuringiensis CON LAS PROTEÍNAS DE LA
MICROVELLOSIDAD INTESTINAL DE Manduca sexta
TESIS
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE:
Doctora en Ciencias
PRESENTA:
M. en C. Arlen Idalia Peña Cardeña
TUTOR PRINCIPAL
Dra. Isabel Gómez Gómez (Instituto de Biotecnología, UNAM)
MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR
Dra. Alejandra Hernández Santoyo (Instituto de Química, UNAM)
Dr. Pavel Isa Haspra (Instituto de Biotecnología, UNAM)
Cuernavaca, Morelos. Octubre, 2024
 
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A papá, que estaría feliz y orgulloso.
A mamá, por no dejar de confiar en mí.
A mis hermanas, por su apoyo incondicional.
AGRADECIMIENTOS
A mi familia por su cariño y apoyo siempre.
A la Dra. Isabel Gómez, por su valiosa asesoría y confianza para realizar este
proyecto. Gracias por motivarme a buscar siempre la excelencia y transmitirme
esa gran pasión por la ciencia y el conocimiento.
Al Dr. Sabino Pacheco, Dr. Mario Soberón y a la Dra. Alejandra Bravo, por darme
la oportunidad de formar parte de su equipo de trabajo. Por todo el apoyo y
aportes al proyecto.
A los miembros del comité tutoral, Dra. Alejandra Hernández Santoyo y Dr. Pavel
Isa Haspra, por sus valiosas contribuciones y mejoras al proyecto.
A los integrantes del jurado de candidatura y sinodales, Dra. Leticia Moreno
Fierros, Dra. Bertha González Pedrajo, Dr. Ricardo Oropeza Navarro, Dr.
Guadalupe Peña Chora y Dr. Ernesto Ortiz Suri por sus acertados comentarios.
Al Dr. Fernando Zúñiga Navarrete, por todas las enseñanzas académicas y por
siempre animarme a seguir y mejorar a pesar de los obstáculos de la ciencia, por
el tiempo juntos haciendo más ligero y divertido el trabajo en el laboratorio.
Al apoyo técnico y administrativo del laboratorio, Biol. Lizbeth Cabrera, Biol. Jorge
Sánchez, Sra. Graciela Domínguez, Sr. Sergio Blancas y Sr. Alejandro Uribe.
A mis amigos y compañeros de laboratorio: Biviana, Carlos, Emiliano, Janette,
Josué, Leivi, Mary Carmen, Natalia, Vianca y Zeyu. Con su compañía y amistad
hicieron esta experiencia mejor.
A la Sra. Aurelia Ocampo y Don Mario Reyes por sus cuidados con tanto cariño.
A la Universidad Nacional Autónoma de México y al Instituto de Biotecnología, por
la gran formación que obtuve en estas instituciones.
Al CONACYT por la beca de doctorado.
El presente trabajo se realizó en el laboratorio del grupo de investigación
Bravo-Soberón del departamento de Microbiología Molecular en el Instituto
de Biotecnología de la Universidad Nacional Autónoma de México, bajo la
dirección de la Dra. Isabel Gómez Gómez.
Este proyecto contó con el financiamiento del Consejo Nacional de Ciencia
y Tecnología Fronteras 008 y PAPIIT-UNAM (Programa de Apoyo a
Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica-Universidad Nacional
Autónoma de México) IN202718 e IN213514.
ÍNDICE
Índice de Tablas………………………………………………………………………….. 4
Índice de Figuras………………………………………………………………………… 5
Abreviaturas………………………………………………………………………………. 7
Resumen…………………………………………………………………………………... 8
Abstract……………………………………………………………………………………. 9
Introducción………………………………………………………………………………. 10
Características generales de B. thuringiensis ………………………………… 11
Toxinas Cry de tres dominios (Cry-3D)………………………………………… 12
Mecanismo de acción de las toxinas Cry: modelo de formación de poro….. 16
Proteínas intestinales de unión de las toxinas Cry-3D………………………..
Cadherina……………………………………………………………………..
Transportador ABCC2……….………………………………………………
Aminopeptidasa N (APN)……………………………………………………
Fosfatasa alcalina (ALP)…………………………………………………….
18
19
20
21
23
Resistencia en insectos lepidópteros a las toxinas Cry………………………. 25
Antecedentes……………………………………………………………………………... 27
Hipótesis…………………………………………………………………………………... 33
Objetivos…………………………………………………………………………….…….. 33
Materiales y Métodos……………………………………………….…………………… 34
Cepas, plásmidos y medios de cultivo…………………………………………. 34
Crecimiento de Bt y obtención de cristales de Cry1Ab………………………. 35
Purificación de cristales de Cry1Ab…………………………………………….. 36
Solubilización de cristales de Cry1Ab………………………………………….. 36
Activación de protoxina Cry1Ab………………………………………………… 37
1
Clonación, expresión y purificación de la región C-terminal de Cry1Ab……. 37
Cuantificación de proteínas……………………………………………………… 37
Obtención de anticuerpo policlonal anti-C-terminal de Cry1Ab……………… 38
Western-blot para detectar Cry1Ab como protoxina, toxina activada y
C-terminal………………………………………………………………………….. 38
Bioensayos en M. sexta………………………………………………………….. 39
Extracción de intestino medio de M. sexta…………………………………….. 39
Purificación de VMMA de M. sexta……………………………………………... 39
Determinación de actividad enzimática de APN y ALP en las VMMA……… 40
Western-blot para detectar los receptores cadherina, APN y ALP en las
VMMA……………………………………………………………………………… 41
Unión de protoxina, toxina activada y C-terminal de Cry1Ab a VMMA
mediante ELISA…………………………………………………………………... 41
Ensayos de unión a ligando de Cry1Ab a VMMA…………………………….. 42
Ensayos de unión mediante pull-down…………………………………………. 43
Expresión heteróloga y purificación de receptores de M. sexta en E. coli…. 44
Unión de protoxina, toxina activada y C-terminal de Cry1Ab a receptores
heterólogos de M. sexta mediante ELISA……………………………………… 44
Ensayo de unión a ligando de protoxina, toxina activada y C-terminal de
Cry1Ab con fragmento de cadherina CR7-12, APN y ALP heterólogos de
M. sexta……………………………………………………………………………. 45
Purificación de mutantes de Cry1Ab…………………………………………… 45
Unión de mutantes de Cry1Ab a receptores heterólogos de M. sexta
mediante ELISA…………………………………………………………………... 46
Resultados………………………………………………………………………………… 47
Purificación de protoxina, toxina activada y C-terminal de Cry1Ab…………. 47
2
Toxicidad de protoxina, toxina activada y región C-terminal de Cry1Ab
hacia larvas de M. sexta…………………………………………………………. 49
Purificación de VMMA de M. sexta y detección de receptores……………… 50
La protoxina Cry1Ab se une a las VMMA de M. sexta con la misma
afinidad que la toxina activada Cry1Ab………………………………………… 51
La región C-terminal de Cry1Ab se une con afinidad similar que la
protoxina y la toxina activada Cry1Ab a las VMMA de M. sexta…………….. 52
Diferentes proteínas de las VMMA de M. sexta están involucradas en la
unión con protoxina Cry1Ab que las reconocidas por la toxina activada
Cry1Ab……………………………………………………………………………... 52
La región C-terminal se une a APN y ALP presentes en las VMMA de M.
sexta……………………………………………………………………………….. 53
Purificación de receptores de M. sexta expresados heterólogamente en E.
coli………………………………………………………………………………….. 54
La protoxina Cry1Ab tiene mayor afinidad a los receptores recombinantes
APN y ALP que la toxina activada Cry1Ab…………………………………….. 56
La región C-terminal de Cry1Ab se une a los receptores heterólogos APN
y ALP, pero no al fragmento de cadherina CR7-12…………………………… 60
Purificación de mutantes del dominio II de Cry1Ab como protoxinas y
toxinas activadas …...……………………………………………………………. 62
La interacción de la protoxina Cry1Ab con APN y ALP está mediada por
sitios de unión de la región C-terminal de Cry1Ab……………………………. 63
Discusión………………………………………………………………………………….. 66
Conclusiones……………………………………………………………………………... 74
Perspectivas………………………………………………………………………………. 74
Bibliografía………………………………………………………………………………... 75
Anexo I. Publicación derivada directamente del presente proyecto…………… 90
Anexo II. Colaboración de la estudiante en otro proyecto del grupo de
investigación……………………………………………………………..……….……… 91
3
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Cepas utilizadas………………………………………………………………… 34
Tabla 2. Plásmidos utilizados……………………………………………………………. 34
Tabla 3. Medios de cultivo utilizados……………………………………………………. 35
Tabla 4. Toxicidad de protoxina y toxina activada Cry1Ab hacia larvas neonatas
de M. sexta…………………………………………………………………………………. 50
Tabla 5. Kd en nM para las interacciones entre las protoxinas y toxinas activadas
Cry1Ab silvestres y mutantes con el fragmento de cadherina CR12, APN y ALP…. 63
4
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Esporas y cristales producidos por B. thuringiensis……………………….. 11
Figura 2. Estructura de la toxina Cry1Aa (PDB: 1CIY)……………………………….. 14
Figura 3. Mecanismo de acción secuencial de las proteínas Cry de B.
thuringiensis….…………………………………………………………………………….. 17
Figura 4. Visión general de los posibles mecanismos de resistencia relacionados
a cada paso del modo de acción de las toxinas Cry1A……………………………….. 26
Figura 5. Estructura cristalográfica de la protoxina Cry1Ac (PDB: 4W8J)................ 30
Figura 6. Purificación de Cry1Ab como espora cristal, protoxina soluble y toxina
activada…………………………………………………………………………………….. 47
Figura 7. Expresión y purificación de la región C-terminal de Cry1Ab……………… 48
Figura 8. Detección mediante western-blot de Cry1Ab como protoxina, toxina
activada y región C-terminal usando anticuerpos anti-toxina o anti-C-terminal de
Cry1Ab……………………………………………………………………………………… 49
Figura 9. Detección mediante western-blot de cadherina, APN y ALP en las
VMMA de M. sexta, 3er instar……………………………………………………………. 50
Figura 10. Interacción de protoxina y toxina activada Cry1Ab con VMMA de M.
sexta, 3er instar……………………………………………………………………………. 51
Figura 11. Interacción de protoxina, toxina activada y C-terminal de Cry1Ab con
VMMA de M. sexta, 3er instar……………………………………………………………. 52
Figura 12. Ensayo de unión a ligando de la protoxina y toxina activada Cry1Ab a
las VMMA de M. sexta, 3er instar………………………...……………………………... 53
Figura 13. Identificación de proteínas de unión en las VMMA de M. sexta de
Cry1Ab como protoxina, toxina activada y C-terminal mediante pull-down………… 54
Figura 14. Purificación de las proteínas de unión de M. sexta expresadas en E.
coli…………………………………………………………………………………………... 55
Figura 15. Detección mediante western-blot de proteínas recombinantes
purificadas: fragmento de cadherina CR7-12, APN y ALP…………………………… 56
5
Figura 16. Interacción de protoxina y toxina activada Cry1Ab con fragmento de
cadherina CR7-12 recombinante………………………………………………………… 57
Figura 17. Interacción de protoxina y toxina activada Cry1Ab con APN
recombinante………………………………………………………………………………. 58
Figura 18. Interacción de protoxina y toxina activada Cry1Ab con ALP
recombinante. ……………………………………………………………………………... 59
Figura 19. Interacción de la región C-terminal de Cry1Ab al fragmento de
cadherina CR7-12, APN y ALP recombinantes de M. sexta…………………………. 60
Figura 20. Ensayo de unión a ligando de protoxina, toxina activada y C-terminal
de Cry1Ab a receptores recombinantes de M. sexta………………………………….. 61
Figura 21. Purificación de mutantes de Cry1Ab del dominio II como protoxinas y
toxinas activadas...…………………………………………...…………………………… 62
Figura 22. Interacción de Cry1Ab silvestre y mutantes como protoxinas y toxinas
a los receptores recombinantes de M. sexta ………………………………………..… 65
Figura 23. Mecanismo de acción propuesto para las protoxinas Cry de Bt ……..... 73
6
ABREVIATURAS
ALP: fosfatasa alcalina
APN: aminopeptidasa N
C-terminal: carboxilo terminal
CBM: módulos de unión a carbohidratos (carbohydrates binding modules)
CR: repetidos de cadherina (cadherin repeat)
ELISA: ensayo por inmunoabsorción acoplado a enzimas (Enzyme-Linked
ImmunoSorbent Assay)
GPI: glicosilfosfatidilinositol
GalNAc: N-acetilgalactosamina
kDa: kilodalton
N-terminal: amino terminal
PFT: toxinas formadoras de poro (pore forming toxins)
RR: relación de resistencia
VMMA: vesículas de la microvellosidad media apical
7
RESUMEN
Bacillus thuringiensis (Bt) es una bacteria que produce inclusiones cristalinas de
naturaleza proteica denominadas toxinas Cry y Cyt las cuales tienen actividad
insecticida. Gracias a su especificidad, biodegradabilidad e inocuidad hacia
organismos no blanco se utilizan exitosamente como bioinsecticidas, siendo una
alternativa importante al uso de insecticidas químicos.
La propuesta vigente del mecanismo de acción sugiere que las toxinas de la
familia Cry1A son producidas como protoxinas de 130 kDa que requieren un
procesamiento proteolítico de las regiones amino (N-terminal) y carboxilo terminal
(C-terminal) para convertirse en una toxina activada de 65 kDa. Para ejercer su
efecto, esta toxina activada establece interacciones secuenciales con diferentes
proteínas de la membrana de los insectos blanco consideradas como “receptores”,
siendo las más caracterizadas la fosfatasa alcalina (ALP), aminopeptidasa N
(APN) y una proteína tipo cadherina.
De manera general, se ha asumido que la región C-terminal de las protoxinas
Cry-3D tiene un papel importante en la formación y estabilidad del cristal. No
obstante, con base en evidencia in vivo, un “modelo dual” de las toxinas Cry ha
planteado que tanto la protoxina como la toxina activada pueden causar
mortalidad mediante diferentes vías de interacción.
En el presente trabajo se analizó la interacción de la región C-terminal de la
protoxina Cry1Ab con las vesículas de la microvellosidad media apical (VMMA) de
Manduca sexta así como los receptores expresados heterólogamente en E. coli.
Mediante ensayos de unión por ELISA, unión a ligando y “pull-down” se determinó
que la región C-terminal de la protoxina Cry1Ab tiene sitios de unión extra que
interactúan con las proteínas de unión ancladas por glicosilfosfatidilinositol (GPI)
de M. sexta, como APN y ALP, pero no se observó interacción con la cadherina.
Además, con ensayos de unión tipo ELISA con mutantes del dominio II de Cry1Ab
se observó que la interacción con cadherina se reduce significativamente con las
protoxinas y toxinas mutantes activadas. Por el contrario, la unión de la protoxina a
APN y ALP no se afectó, por lo que la protoxina Cry1Ab tiene sitios de unión
adicionales con estos receptores, incluidos en la región C-terminal.
Se concluye que tanto el dominio II de la toxina activada como la región C-terminal
de la protoxina Cry1Ab están involucrados en la interacción con los receptores de
membrana. Nuestros resultados sustentan el modelo dual y sugieren la ingeniería
genética de la región C-terminal como una posible estrategia para modificar la
especificidad e incrementar la toxicidad de las proteínas Cry de Bt.
8
ABSTRACT
Bacillus thuringiensis is a bacterium that produces crystal inclusions known as Cry
and Cyt toxins which have insecticidal activity. Due to their specificity,
biodegradability and harmlessness to non-target organisms, they are successfully
used as biopesticides, being an important alternative to chemical insecticides.
The currently accepted mechanism of action proposes that Cry1A toxins are
produced as 130 kDa protoxins that require a proteolytic processing of the amino
and carboxyl terminal regions to become an activated toxin of 65 kDa. To exert the
effect, the activated toxin undergoes sequential interactions with different
membrane proteins called "receptors", being ALP, APN and cadherin the most
studied.
Recently, in agreement with in vivo results, a "dual model" of Cry toxins proposed
that both protoxin and activated toxin can cause mortality via different pathways.
It has been proposed that the C-terminal region is only involved in toxin
crystallization, but its role in receptor binding is undefined.
In this work, we analyzed the interaction of the C-terminal region of Cry1Ab
protoxin with BBMV from M. sexta as well as the recombinant receptors. ELISA,
SPR, ligand-blot and pull-down assays determined that the C-terminal region of the
Cry1Ab protoxin has extra binding sites wich interact with M. sexta midgut binding
proteins, such as ALP and APN, but not with cadherin.
Furthermore, ELISA binding assays with Cry1Ab mutants in loops 2 and 3 of
domain II showed that the interaction with cadherin is significantly reduced with
mutant protoxins and activated toxins. In contrast, the binding of protoxin to ALP
and APN was not affected, supporting that the Cry1Ab protoxin has additional
binding sites for these GPI-anchored receptors.
It is concluded that domain II and the C-terminal region of the Cry1Ab protoxin
mediate the binding to membrane receptors. Our results support the dual model
and suggest the manipulation of the C-terminal region as a possible strategy to
modify the specificity and increase toxicity of Bt proteins.
Key words: Bacillus thuringiensis, C-terminal region, Cry protoxin, alkaline
phosphatase, aminopeptidase, cadherin, glycosylphosphatidylinositol (GPI
anchor).
9
INTRODUCCIÓN
La demanda de alimentos para la población humana en constante crecimiento es
un tema de interés a nivel mundial debido a que, de los 150 millones de km2 de la
superficie terrestre, únicamente el 10% se utiliza para la producción agrícola . Por
tanto, la protección de los cultivos de diversas plagas que provocan pérdidas de
hasta el 20%, tanto en producción como en almacenamiento, es sumamente
importante para mejorar los rendimientos y calidad de los productos agrícolas
(Devine y Furlong, 2007). En este sentido, el uso de insecticidas químicos ha sido
una estrategia muy importante para el control de insectos plaga que afectan la
agricultura o aquellos que son vectores de enfermedades (Lamberth y col., 2013).
El empleo de estos productos se popularizó después de la segunda guerra
mundial con la introducción del diclorodifeniltricloroetano (DDT) como una opción
eficaz por su amplio espectro de acción, larga duración en el campo y fácil
aplicación. Sin embargo, con el paso del tiempo se cuestionó acerca de la
seguridad de tales productos ya que se han observado diversos efectos
perjudiciales a la salud humana, como intoxicaciones, cáncer, afectaciones en el
sistema nervioso y reproductivo, además de contaminación ambiental, destrucción
indiscriminada de insectos benéficos y de diversas especies no blanco (Devine y
Furlong, 2007). Por tanto, la industria alimentaria y agrícola se vio obligada a
buscar otras opciones de control biológico. En relación a esto, el uso de
bioinsecticidas, que incluyen principalmente bacterias como alternativa importante
para el control de plagas, ha sido bien aceptado ya que son altamente específicos,
efectivos y se descomponen rápidamente en comparación con los insecticidas
provenientes de síntesis química (Bravo y col., 2011). Si bien existe una amplia
diversidad de entomopatógenos, sólo algunos se han desarrollado exitosamente
como bioinsecticidas comerciales, destacando las bacterias entomopatógenas
Gram positivas, y dentro de éstas las de la familia Bacillaceae. Específicamente,
las toxinas producidas por B. thuringiensis son las más utilizadas a nivel mundial
representando más del 90% del mercado de insecticidas microbianos siendo
utilizado desde 1961 (Ruiu, 2015).
10
Características generales de B. thuringiensis
En 1901, el biólogo japonés Shigetane Ishiwatari aisló una bacteria que causaba la
muerte de las larvas de Bombyx mori (comúnmente llamado gusano de seda), a la
cual se le denominó Bacillus sotto (de “sotto”, colapso repentino). Diez años
después, en 1911, Ernst Berliner identificó la misma bacteria a partir de polillas de
la harina (Ephestia kuehniella) en la ciudad de Thuringia, Alemania por lo que se le
renombró como B. thuringiensis (Siegel, 2000).
B. thuringiensis es miembro de la familia Bacillaceae, perteneciente al grupo de B.
cereus, que incluye a B. cereus, B. anthracis y B. mycoides, las cuales se
distinguen de otras especies del grupo por sus propiedades entomopatógenas
(Rasko y col., 2005).
Bt es una bacteria Gram positiva, aerobia estricta y ubicua, que ha sido aislada en
diversas partes del mundo en una gran diversidad de nichos ecológicos tales
como tierra, agua, cadáveres de insectos, polvo, hojas, etc. (de Maagd y col.,
2003).
Durante su ciclo de vida Bt presenta dos etapas: la fase de crecimiento vegetativo,
en la cual se reproduce por bipartición, y la fase de esporulación, cuando la
bacteria se encuentra en condiciones desfavorables para su crecimiento. En esta
última etapa, Bt sintetiza un cuerpo paraesporal de naturaleza proteica conocido
como cristal que tiene propiedades insecticidas (Figura 1).
Figura 1. Esporas y cristales producidos por B. thuringiensis.
A. Célula de Bt en etapa de esporulación. B. Vista al microscopio de cristales producidos por Bt.
(Tomada de: BT and GMOs, s.f.)
11
El cristal está constituido por δ-endotoxinas, que incluyen principalmente a las
proteínas Cry (del inglés “crystal”) y Cyt (del inglés “cytolytic”), que son activas
contra diversos órdenes de insectos como lepidópteros (mariposas y polillas),
dípteros (mosquitos), coleópteros (escarabajos), ortópteros (grillos), himenópteros
(hormigas), hemípteros (chinches y pulgas) y malófagos (piojos) (Bravo y col.,
2019). Además, existen algunas cepas de Bt activas contra ácaros, protozoarios e
incluso contra invertebrados como nemátodos (Schnepf y col., 1998, de Maagd y
col., 2001)
Bt produce además otras proteínas tales como β-exotoxinas (ej. thuringiensina,
Thu), proteínas insecticidas vegetativas (VIP) (Estruch y col., 1996), toxinas tipo
binarias (Cry-Bin) (Wirth y col., 2010), toxinas tipo mosquitocidales (Cry-Mtx)
(Crickmore y col., 1998) y proteínas insecticidas secretadas (Sip) (Donovan y col.,
2006). Sin embargo, el grupo más grande y mejor caracterizado es el de las
toxinas Cry.
Por lo regular las distintas cepas de Bt producen mezclas de toxinas y la forma de
los cristales depende del tipo de proteínas que lo conforman. Así, podemos
encontrar cristales de forma bipiramidal, cuboidal, rectangular plana o sin forma
definida.
Actualmente el uso más importante de Bt para el control de plagas es a través de
plantas transgénicas que producen proteínas insecticidas, particularmente maíz y
algodón (James, 2010).
Toxinas Cry de tres dominios (Cry-3D)
Una toxina Cry se define oficialmente como cualquier proteína paraesporal de Bt
que muestre actividad insecticida, o cualquier efecto tóxico verificable
experimentalmente hacia algún organismo blanco, o bien, que muestre similitud
con la secuencia de las proteínas Cry existentes (Crickmore y col., 1998).
La primera nomenclatura propuesta para estas proteínas se basó en el porcentaje
de identidad de aminoácidos para nombrar 4 niveles (Crickmore y col., 1998). El
primer número arábigo indica al menos 45% de identidad (Cry1, Cry2, etc.).
12
El segundo nivel incluye a las proteínas con una letra mayúscula correspondiente
a una identidad del 45 al 76% (Cry1A, Cry1B, etc.). El tercer nivel se representa
con una letra minúscula que significa un porcentaje de identidad del 95 al 76%
(Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, etc.). Finalmente, se incluye un número arábigo al final
de la nomenclatura que denota al menos 95% de identidad (Cry1Aa1, Cry1Aa2,
etc.).
Sin embargo, a lo largo del tiempo se identificó que diversas proteínas con muy
baja similitud de secuencia estaban nombradas como Cry, y que existe una gran
variedad de proteínas insecticidas bacterianas. Por lo tanto, recientemente se
propuso un sistema nuevo de clasificación basado en la estructura tridimensional
de las proteínas insecticidas agrupándolas en 16 familias altamente diversas que
no están relacionadas por su secuencia primaria (Crickmore y col., 2021). No
obstante, la mnemotecnia Cry se ha conservado para aquellas proteínas
previamente identificadas por tener una estructura de tres dominios. Asimismo,
incluye aquellas que tienen o no un extremo C-terminal largo.
Las toxinas Cry pertenecen a la clase de toxinas formadoras de poro (PFT) tipo
alfa las cuales son secretadas como proteínas solubles y que experimentan
cambios conformacionales para insertar las hélices α en la membrana plasmática
de sus hospederos provocando así un poro. La formación del poro desencadena
un desequilibrio osmótico en las células del epitelio intestinal de las larvas
susceptibles y su muerte consecuente (Parker y Feil, 2005).
En la década de 1980 se descubrió que los genes que codifican para los
componentes de los cristales proteicos se localizan en plásmidos (González y col.,
1981). El análisis exhaustivo de las cepas de Bt y la secuencia de los genes cry ha
permitido la identificación de casi 800 secuencias clasificadas en más de 70
grupos (Crickmore y col., 2024).
Actualmente se han determinado las estructuras cristalográficas de diversas
toxinas Cry: Cry1Aa, Cry1Ac y Cry1Da con especificidad hacia lepidópteros
(Grochulski y col., 1995; Evdokimov y col., 2014; Wang y col., 2019; Tanaka y col.,
2023); Cry3Aa, Cry3Bb1 y Cry8Ea1 activas hacia coleópteros (Li y col., 1991;
13
Galitsky y col., 2001; Guo y col., 2009); Cry4Aa y Cry4Ba específicas hacia
dípteros (Boonserm y col., 2005; Boonserm y col., 2006); Cry2Aa con
especificidad dual hacia lepidópteros y dípteros (Morse y col., 2001); Cry5B con
actividad hacia nemátodos (Hui y col., 2012; Li y col., 2022) y Cry7Ca activa hacia
ortópteros (Jing y col., 2019). Todas estas estructuras están organizadas en tres
dominios por lo que a este grupo se le denomina toxinas Cry-3D (Figura 2).
Figura 2. Estructura de la toxina Cry1Aa (PDB: 1CIY).
Se muestran los dominios con diferentes colores. El dominio I en rojo, el dominio II en violeta y el
dominio III en verde.
Diversos estudios de estructura-función han permitido identificar la función de
cada uno de los dominios en el modo de acción contra los insectos blanco.
El dominio I que corresponde a la región N-terminal de la proteína, está constituido
por seis hélices α (α-1, α-2, α-3, α-4, α-6 y α-7) de naturaleza anfipática con
aminoácidos cargados o polares que rodean a una hélice α central altamente
hidrofóbica (α-5). Este dominio es el más conservado comparado con los dominios
II y III, y está implicado en la oligomerización de la toxina y en la formación del
poro (Jiménez-Juárez y col., 2007) mediante un rearreglo conformacional de la
estructura terciaria (Zavala y col., 2011; Pacheco y col., 2023). El dominio I
muestra alta similitud estructural con otras proteínas formadoras de poro como la
colicina producida por enterobacterias, la toxina diftérica de Corynebacterium
diphtheriae y la hemolisina E de Escherichia coli (Parker y Pattus, 1993).
14
El dominio II está formado por tres hojas β-antiparalelas en forma de un prisma β
empacadas alrededor de un centro hidrofóbico. Este dominio es el menos
conservado en secuencia y estructura terciaria debido a que las asas que unen las
láminas β (asa 1, 2, 3 y α-8) son muy heterogéneas en longitud, conformación y
secuencia entre las toxinas Cry (Boonserm y col., 2005). Mediante estudios de
mutagénesis sitio-dirigida de algunos de los aminoácidos que conforman las asas
se ha identificado que estas tienen un papel crucial en la especificidad e
interacción con los receptores (Dean y col., 1996; Bravo y col., 2007; Pacheco y
col., 2009a; Arenas y col., 2010). Este dominio II tiene similitud estructural con los
dominios tipo lectina, por lo que se ha especulado que puede unirse a
carbohidratos pero esto no ha sido demostrado (Pigott y Ellar, 2007).
El dominio III se compone de dos hojas β-antiparalelas cada una compuesta por 5
hebras-β formando un plegamiento tipo β-sándwich. Inicialmente se propuso que
su función sería proteger a las toxinas de la acción de las proteasas; no obstante,
mutaciones de este dominio en la toxina Cry1Ac resultaron afectadas en toxicidad
y unión a vesículas de intestinos de M. sexta y Heliothis virescens, pero sin afectar
la estabilidad de la toxina (Aronson y col., 1995; Arenas y col., 2010). Lo anterior
demostró que este dominio está involucrado en la interacción con los receptores
(Bravo, 1997). Además, se ha determinado que el dominio III tiene una importante
similitud con módulos de unión a carbohidratos (carbohydrates binding modules,
CBM) por lo que se sugiere que algunas toxinas Cry pueden unir azúcares en esta
región. Esto se ha demostrado para la toxina Cry1Ac que tiene una región tipo
bolsillo que participa en la unión con N-acetilgalactosamina (GalNAc) de los
receptores intestinales (Burton y col., 1999; Pardo-López y col., 2006), así como
para la toxina Cry5Ba que interacciona con diversos glicolípidos encontrados en
nemátodos (Hui y col., 2012).
15
Mecanismo de acción de las toxinas Cry: modelo de formación de poro
El modo de acción de las toxinas Cry1A se ha estudiado principalmente en
insectos lepidópteros. En términos generales, el mecanismo inicia cuando el
insecto susceptible ingiere los cristales que al llegar al intestino son solubilizados
debido al pH alcalino y a la presencia de agentes reductores. Una vez que se
libera la protoxina de aproximadamente 130 kDa, pierde alrededor de 25-30
aminoácidos de la región N-terminal y más de 500 aminoácidos de la región
C-terminal mediante la acción de proteasas intestinales, convirtiéndose en lo que
se denomina toxina activada de 60 kDa (Pardo-López y col., 2013; Adang y col.,
2014; Bravo y col., 2019). La toxina activada se une a diversas proteínas
presentes en la membrana del intestino que actúan como proteínas de unión o
receptores. Esta unión aumenta la concentración de la toxina en la membrana lo
que permite la formación de un oligómero o preporo que se inserta
irreversiblemente en la membrana provocando un desbalance osmótico y la
consecuente muerte del insecto (Schnepf y col., 1998; Bravo y col., 2007).
La interacción de las toxinas Cry con los receptores del intestino del insecto se ha
caracterizado más a detalle para la toxina Cry1Ab en el lepidóptero M. sexta y se
le ha denominado “modelo secuencial de ping-pong” (Figura 3) (Pacheco y col.,
2009a).
16
Figura 3. Mecanismo de acción secuencial de las proteínas Cry de B. thuringiensis.
Se muestran los diferentes pasos del proceso. APN: aminopeptidasa N, ALP: fosfatasa alcalina,
ABCC2: ATP Binding Cassette Subfamilia C Miembro 2. (Modificado de: Bravo y col., 2023).
Luego de la solubilización y activación de la protoxina de 130 kDa, se ha
propuesto que la primera interacción de la toxina Cry1Ab es a través del asa 3 del
dominio II y la lámina β16 del dominio III con los receptores APN y ALP de M.
sexta, respectivamente. Aunque estas moléculas receptoras tienen baja afinidad
por la toxina activada Cry1Ab (Kd=100 nM para APN y Kd=267 nM para ALP), son
abundantes en las balsas lipídicas de las membranas de las microvellosidades del
intestino. Por ello se propone que esta interacción favorece el acercamiento y
concentración de las moléculas de Cry1Ab en la membrana del intestino del
insecto (Pacheco y col., 2009a; Arenas y col., 2010).
Posteriormente se lleva a cabo la interacción de la toxina con el receptor tipo
cadherina que involucra la participación de tres sitios de unión que se localizan en
la región extracelular llamados “repetidos de cadherina” (CR). En M. sexta, la
toxina activada se une a CR7, CR11 y CR12 del receptor tipo cadherina a través
del asa 2, el asa α-8, y el asa 3 del dominio II, respectivamente (Gómez y col.,
2001; Gómez y col., 2002a; Gómez y col., 2003; Gómez y col., 2006) con una
afinidad global de 1 nM. Una vez que la toxina activada monomérica se une a la
17
cadherina, la toxina sufre un corte proteolítico de la hélice α-1 del dominio I, lo que
provoca la exposición de ciertas regiones hidrofóbicas del dominio I que derivan
en la formación del oligómero (Gómez y col., 2002b). Recientemente se determinó
que la unión de la toxina Cry a transportadores tipo ABC (ATP-binding cassette)
promueve también la oligomerización (Sato y col., 2019).
Una vez que la estructura oligomérica se ha formado, se lleva a cabo una segunda
interacción de alta afinidad con APN y ALP (Kd=0.6 nM y Kd=0.5 nM,
respectivamente) mediante el asa 2 del dominio II de Cry1Ab (Pacheco y col.,
2009a; Arenas y col., 2010). Esta unión resulta en la inserción del oligómero en la
membrana y la formación del poro, ocasionando la muerte del insecto
(Pardo-López y col., 2013).
La oligomerización es un paso esencial para la toxicidad de las toxinas Cry-3D, ya
que se ha reportado que mutantes de Cry1Ab incapaces de oligomerizar in vitro
pierden su actividad insecticida hacia larvas de M. sexta (Jiménez-Juárez y col.,
2007).
Cabe mencionar que existe un modelo alterno que propone que la muerte del
insecto está mediada por la unión a receptores, lo que activaría una ruta de
transducción de señales (Zhang y col., 2006). Sin embargo, este modelo está
basado en estudios con la línea celular Hi5 de Trichoplusia ni transformada con el
gen de cadherina de M. sexta sin evidencia experimental in vivo que sustente la
propuesta.
Proteínas intestinales de unión de las toxinas Cry-3D
La unión específica de las toxinas Cry a los receptores del epitelio intestinal de los
insectos blanco es un paso determinante para la toxicidad. Las proteínas mejor
estudiadas que se han identificado como receptores de las toxinas Cry incluyen a
proteínas transmembranales tipo cadherina y transportadores ABC; así como a
proteínas ancladas a la membrana mediante GPI como la aminopeptidasa N
(APN) y la fosfatasa alcalina (ALP) (Pigott y Ellar, 2007; Tanaka y col., 2013; Zhou
y col., 2016; Sato y col., 2019). También se han identificado glicolípidos,
18
glicoconjugados de 270 kDa y una proteína de 252 kDa como otros posibles
receptores; sin embargo, su función en el mecanismo de toxicidad no ha sido
caracterizada (Pigott y Ellar, 2007).
● Cadherina
Las proteínas tipo cadherina tienen un peso molecular de 200-250 kDa y son parte
de una gran familia de glicoproteínas dependientes de calcio que participan en
funciones tales como adhesión celular, organización del citoesqueleto,
morfogénesis, uniones celulares, etc. Estas proteínas regularmente se ubican a
nivel intercelular; sin embargo, aquellas que se unen a las toxinas Cry se localizan
principalmente en la membrana apical del epitelio del intestino medio (Chen y col.,
2005).
Están compuestas de un ectodominio formado de numerosos módulos repetidos
de cadherina (CR) en el extremo N-terminal, un dominio transmembranal y un
dominio intracelular en el extremo C-terminal. Este receptor tiene un papel
indispensable en el mecanismo de acción de las toxinas Cry, debido a que es el
responsable de la formación del oligómero (Gómez y col., 2002b; Pigott y Ellar,
2007). Las proteínas tipo cadherina han sido ampliamente estudiadas como
receptores de las toxinas Cry en diversos lepidópteros como M. sexta, H.
virescens, Ostrinia nubilalis, Helicoverpa armigera, B. mori, Pectinophora
gossypiella, Lymantria dispar (Pigott y Ellar, 2007); en dípteros como Aedes
aegypti (Chen y col., 2009) y Anopheles gambiae (Hua y col., 2008), y en el
coleóptero Tenebrio molitor (Fabrick y col., 2009).
El receptor tipo cadherina BtR1 (de Bt receptor 1) de M. sexta fue la primera
proteína de unión a Cry identificada, con un peso molecular de 210 kDa
(Vadlamudi y col., 1993; Vadlamudi y col., 1995). Desde entonces se ha
comprobado que es un genuino receptor mediante su expresión en líneas
celulares como COS-7, HEK-93, Sf21 (Keeton y Bulla, 1997), S2 (Hua y col.,
2004) y H5 (Zhang y col., 2005) confiriendo susceptibilidad a las toxinas Cry1A.
Asimismo, el papel funcional de la cadherina ha sido comprobado mediante la
19
caracterización de algunas poblaciones de insectos resistentes como H. virescens,
H. armigera, O. nubilalis, Ostrinia furnacalis y Plutella xylostella que contienen
mutaciones en alelos de cadherina (Peterson y col., 2017).
Por otro lado, existen reportes de que el fragmento de cadherina CR12 de M.
sexta sinergiza la toxicidad de la toxina Cry1Ab mediante el aumento de la
formación de oligómeros in vitro (Chen y col., 2007; Pacheco y col., 2009b). En M.
sexta, la expresión de cadherina incrementa conforme avanza el desarrollo
larvario y está correlacionada con la susceptibilidad a la toxina Cry1Ab (Griko y
col., 2008).
A la fecha no se ha descrito la función exacta de las proteínas tipo cadherina en el
intestino del insecto; no obstante, se propone que participan en mantener la
organización e integridad del epitelio intestinal durante la proliferación celular,
diferenciación y desarrollo larvario (Midboe y col., 2003; Pigott y Ellar, 2007).
● Transportador ABCC2
La familia de las proteínas ABC toman su nombre de ATP-binding cassette, que es
un dominio intracelular que une e hidroliza ATP para el transporte de moléculas
(como xenobióticos) a través de la membrana lipídica en contra de su gradiente de
concentración. Las proteínas ABC se encuentran en todos los organismos vivos y
se clasifican con las letras A-H de acuerdo a la similitud de secuencia de los
dominios conservados de unión a ATP. En animales, las proteínas ABC están
relacionadas a proteínas de resistencia a multifármacos (MRP) (Heckel, 2012).
Las proteínas de la subfamilia C (ABCC) consisten en un solo polipéptido que
comprende 12 hélices transmembranales (Slot y col., 2011). Específicamente en
insectos, se han identificado a las proteínas ortólogas ABCC2 y ABCC3 como
receptores funcionales de las toxinas Cry1 participando tanto en la unión de las
toxinas como en la oligomerización de éstas, facilitando la subsecuente inserción
en la membrana (Heckel, 2012; Ocelotl y col., 2017; Sato y col., 2019). En el caso
del transportador ABCC2, las asas extracelulares 1, 2 y 4 han mostrado estar
involucradas en la unión a Cry1Ac y Cry1Fa en diferentes insectos lepidópteros
20
(Liu y col., 2018; Liu y col., 2020; Liu y col., 2021). Recientemente se demostró
que el transportador ABCC2 de Spodoptera exigua se une principalmente a
oligómeros de Cry1A, mas que a las toxinas monoméricas, por lo que se propone
que ABCC2 está involucrado en la inserción del oligómero en la membrana
intestinal (Pinos y col., 2021).
Diversos estudios han demostrado que una mutación en el gen que codifica para
el transportador ABCC2 está ligada a resistencia a las toxinas Cry-3D en diversos
insectos como B. mori (Atsumi y col., 2012; Tanaka y col., 2013), H. armigera (Xiao
y col., 2014), H. virescens (Gahan y col., 2010), P. xylostella, T. ni (Baxter y col.,
2011) y S. exigua (Park y col., 2014).
Por otro lado, la expresión heteróloga del transportador ABCC2 de B. mori en la
línea celular Sf9 ocasionó su susceptibilidad a las toxinas Cry1A (Tanaka y col.,
2013). Del mismo modo, la expresión de ABCC2 de P. xylostella en células de
Drosophila confirió alta susceptibilidad a Cry1Ac (Stevens y col., 2017).
Se ha reportado que cuando diversas líneas celulares co-expresan tanto
cadherina como ABCC2 se sinergiza la toxicidad de diversas toxinas Cry-3D, sin
embargo, el mecanismo aún es desconocido (Tanaka y col., 2013; Soberón y col.,
2018).
● Aminopeptidasa N (APN)
Las APNs son una clase de enzimas que catalizan la ruptura de aminoácidos
neutros del N-terminal de las proteínas, que es un paso determinante para el
transporte de los aminoácidos a las células epiteliales. Estas proteínas se
encuentran ancladas a la membrana a través de un grupo GPI, están glicosiladas
con GalNAc (Lu y Adang, 1996) y tienen un tamaño de aproximadamente 90-170
kDa. En el caso de insectos lepidópteros, las APNs funcionan en cooperación con
endopeptidasas y carboxipeptidasas para digerir las proteínas de la dieta y se
encuentran abundantemente en la membrana apical de las células intestinales
(Wang y col., 2005).
Análisis filogenéticos de las APNs de lepidópteros agrupan a estas proteínas en
21
siete clases (Hughes, 2014), cinco de las cuales muestran unión a las toxinas Cry1
identificadas en diferentes especies de lepidópteros como M. sexta, H. virescens,
Spodoptera litura, H. armigera, B. mori, L. dispar, P. xylostella, y en dípteros como
Anopheles quadrimaculatus, A. gambiae y A. aegypti (Pigott y Ellar, 2007).
El papel de la APN como receptor de las toxinas Cry se ha validado en múltiples
reportes. Por mencionar algunos, mediante análisis de unión a ligando se mostró
que la toxina Cry1Ac puede unir a APN1 de M. sexta expresada en una línea
transgénica de Drosophila melanogaster lo que le confiere susceptibilidad (Gill y
Ellar, 2002). Otro caso fue la expresión de APN de H. armigera en células de T. ni
que fue capaz de unirse a las toxinas Cry1Aa, Cry1Ab y Cry1Ac (Rajagopal y col.,
2003). En cuanto a insectos dípteros, se demostró que fragmentos de APN de A.
gambiae pueden potenciar la actividad de la toxina Cry11Ba (Zhang y col., 2008).
También se ha demostrado la participación de APN como receptor de las toxinas
Cry en ensayos in vivo. Mediante el silenciamiento por ARN de interferencia
(RNAi) de APNs en los lepidópteros S. litura y S. exigua, Diatraea saccharalis y H.
armigera, se observó la resistencia a Cry1Ca (Rajagopal y col., 2002; Ren y col.,
2014), Cry1Ab (Yang y col., 2010) y Cry1Ac (Sivakumar y col., 2007)
respectivamente.
En relación a lo anterior, mutaciones o expresión reducida de APNs están
implicadas en la aparición de resistencia a diversas toxinas Cry. Tal es el caso de
una colonia de S. exigua que no expresa APN1 y es resistente a la toxina Cry1C
(Herrero y col., 2005). Para H. armigera, se demostró la resistencia a Cry1Ac
debido a una mutación en el gen apn1 (Zhang y col., 2009). De manera similar
existen reportes en otros insectos como O. nubilalis, T. ni, Helicoverpa zea y P.
xylostella (Peterson y col., 2017) con alteraciones en las proteínas APNs y la
consecuente aparición de resistencia.
En M. sexta se han reportado cuatro isoformas de APN: APN1, APN2, APN3 y
APN4; siendo la APN1 de 120 kDa es la más estudiada y caracterizada, ya que
fue la primera proteína identificada como receptor de la toxina Cry1Ac (Knight y
col., 1994). Posteriormente, mediante estudios de unión llevados a cabo mediante
22
análisis de resonancia de plasmones superficiales (SPR), se demostró que
también Cry1Aa y Cry1Ab pueden interactuar con APN1 (Masson y col., 1995).
En membranas de M. sexta tratadas con fosfolipasa C, específica para el corte del
grupo GPI, se disminuyó la incorporación de la toxina Cry1Ab a la membrana
intestinal por lo que se comprobó que la APN está implicada en la inserción de la
toxina en la membrana (Bravo y col., 2004). Este mismo tratamiento en las VMMA
de T. ni resultó en una actividad de formación de poro de Cry1Ac reducida
(Lorence y col., 1997).
Mediante el silenciamiento por dsRNA de APN1 de M. sexta se ha comprobado in
vivo el papel de esta proteína como receptor de las toxinas Cry, ya que al retar
larvas silenciadas de 3er instar con Cry1Aa, Cry1Ab y Cry1Ac disminuyó la
mortalidad en un 50, 40 y 70%, respectivamente (Flores-Escobar y col., 2013).
Cabe mencionar que específicamente la interacción de Cry1Ac y APN es
dependiente del monosacárido GalNAc que ha sido identificado en M. sexta
(Masson y col., 1995), H. virescens (Gill y col., 1995; Luo y col., 1997), L. dispar
(Jenkins y col., 2000) y H. armigera (Sarkar y col., 2009).
● Fosfatasa alcalina (ALP)
La ALP es una enzima hidrolasa que cataliza el corte de grupos fosfato de varios
sustratos como son nucleótidos, proteínas y alcaloides. Su actividad depende de
la presencia de Zn+2 o Mg+2.
Las ALPs de insectos se dividen en solubles (s-ALP) y unidas a la membrana
(m-ALP) que se encuentran ancladas en las células epiteliales del intestino
mediante GPI. Se ha descrito que en los insectos, la ALP tiene función en la
absorción de metabolitos provenientes de la dieta y en procesos de transporte
(Eguchi, 1995).
Su papel como receptor de las toxinas Cry ha sido menos estudiado en
comparación con APN y cadherina (Pigott y Ellar, 2007). Sin embargo, se ha
identificado como proteína de unión en lepidópteros como M. sexta (McNall y
Adang, 2003; Arenas y col., 2010), H. armigera (Upadhyay y Singh, 2011) y H.
23
virescens (Jurat-Fuentes y Adang, 2004); y en los dípteros A. aegypti (Fernandez
y col., 2006) y A. gambiae (Hua y col., 2009). Asimismo, se han reportado niveles
reducidos de ALP en poblaciones resistentes de H. virescens, H. armigera y
Spodoptera frugiperda (Jurat-Fuentes y col., 2011) a diversas toxinas Cry.
En el caso de M. sexta, se identificó a la ALP de 65 kDa como receptor mediante
la separación en dos dimensiones de VMMA y el análisis de unión a ligando con
Cry1Ac (McNall y Adang, 2003). Posteriormente, se reportó que una mutante del
dominio III de la toxina Cry1Ab pierde unión con la ALP de M. sexta disminuyendo
la toxicidad (Arenas y col., 2010). Con el silenciamiento de ALP de M. sexta por
dsRNA se demostró que este receptor juega un papel importante para la actividad
tóxica de Cry1Ab, al disminuir un 80% la mortalidad de las larvas silenciadas en
ALP (Flores-Escobar y col., 2013).
Al igual que APN, se ha demostrado que la unión de Cry1Ac a ALP de H.
virescens y H. armigera implica interacciones con GalNAc (Jurat-Fuentes y Adang,
2004; Ning y col., 2010; Sengupta y col., 2013).
Cabe mencionar que, además de las proteínas anteriormente mencionadas como
receptores principales de las toxinas Cry, también se han considerado otras
moléculas como posibles receptores. Entre ellas se encuentran glicolípidos en M.
sexta y Caenorhabditis elegans (Griffitts y col., 2005), un glicoconjugado de 270
kDa en L. dispar (Valaitis y col., 2001), una proteína de 252 kDa en B. mori
(Hossain y col., 2004), proteínas tipo lipocalina en H. armigera (Wang y col., 2020),
entre otras.
24
Resistencia en insectos lepidópteros a las toxinas Cry
Aunque las proteínas Bt han proporcionado beneficios importantes tanto
económicos como ambientales (James, 2010; Sanahuja y col., 2011), la aparición
de resistencia en los insectos plaga está reduciendo las ventajas de su empleo en
el campo (Tabashnik y Carrière, 2017).
Las primeras resistencias reportadas a productos comerciales en spray de Bt
fueron las de Plodia interpunctella en 1985 (McGaughey, 1985) y P. xylostella en
1986 (Tabashnik y col., 1990) bajo condiciones de laboratorio y campo,
respectivamente.
Posteriormente, en el año 2002 se reportó a H. zea como la primera especie que
desarrolló resistencia al algodón Bt, apenas 6 años después de la introducción de
los cultivos transgénicos Bt (Tabashnik y col., 2013).
Desde entonces han sido publicados numerosos reportes sobre la aparición de
resistencia a cultivos Bt en diferentes insectos y en diversas regiones geográficas,
por lo que es evidente que la evolución de resistencia es una amenaza importante
para el uso sostenible de esta tecnología. Entre estos insectos resistentes se
encuentran P. xylostella resistente a aplicaciones en spray (Ferré y Van Rie, 2002)
y al menos 6 diferentes especies resistentes a diversos cultivos-Bt. Como ejemplo,
se han reportado colonias de S. frugiperda resistentes a maíz-Cry1Fa en Puerto
Rico y Brasil (Storer y col., 2010; Farias y col., 2014), Busseola fusca resistente a
maíz-Cry1Ab en Sudáfrica (Van Rensburg, 2007), Pectinophora gossypiella
resistente a algodón-Cry1Ac en India (Dhurua y Gujar, 2011), H. zea resistente a
algodón-Cry1Ac (Tabashnik y col., 2008) y Diabrotica virgifera virgifera resistente a
maíz-Cry3Bb en USA (Gassmann y col., 2011).
La resistencia a las toxinas Cry puede ocurrir por el bloqueo de algún paso de la
vía de acción. En la Figura 4 se muestra una visión general de los mecanismos
posibles de resistencia relacionados a cada paso del modo de acción de las
toxinas Cry1A.
25
Modo de acción de toxinas Cry1A Posibles mecanismos de resistencia involucrados
Solubilización de proteína Cry para
liberación de protoxina
Solubilización incompleta por condiciones no óptimas del sistema digestivo
del insecto
Activación proteolítica de protoxina Degradación de protoxina por proteasas, expresión alterada/disminuida de
proteasas
Unión primaria toxina-receptor
Inmovilización de la toxina, procesamiento postraduccional de toxinas
alterado, disminución de afinidad, receptores mutantes o expresión génica
modulada, síntesis de oligosacáridos/alteración en glicosilación de proteínas
intestinales
Corte de α-hélice por proteasas del
insecto Ausencia de corte de α-hélice*
Oligomerización Inmovilización y/o secuestro de toxina activada
Unión secundaria toxina-receptor
Secuestro de la toxina, procesamiento postraduccional de toxinas alterado,
disminución de afinidad, receptores modificados (mutaciones o expresión
génica modulada), pérdida de receptores, síntesis de
oligosacáridos/alteración en glicosilación de proteínas intestinales
Unión del oligómero a receptores Ausencia de unión debido a proteínas modificadas
Inserción de oligómero en la membrana Propiedades/componentes de membrana alterados
Formación de poro Reparación del epitelio, respuestas de defensa a intoxicación
* Sin reportes a la fecha para este mecanismo.
Figura 4. Visión general de los posibles mecanismos de resistencia relacionados a cada
paso del modo de acción de las toxinas Cry1A.
(Modificado de Peterson y col., 2017).
Cabe mencionar que el mecanismo de resistencia más común es la alteración en
la unión de las toxinas Cry a los receptores (Ferré y Van Rie, 2002). No obstante,
se ha reportado que una sola especie puede desarrollar un repertorio de
mecanismos de resistencia a la misma o diferentes toxinas Cry.
Debido a lo anterior, nuevas proteínas insecticidas con alta toxicidad y/o
mecanismos de acción alternativos son necesarias para contrarrestar la
resistencia. Por ende, una mejor comprensión del modo de acción de las proteínas
insecticidas de Bt, así como la identificación de nuevos receptores, son necesarios
para determinar las bases moleculares de la acción de las toxinas Cry-3D, en aras
de mejorar su eficacia.
26
ANTECEDENTES
El empaquetamiento de las proteínas insecticidas Cry en un cristal paraesporal
incrementa la estabilidad de éstas en el ambiente; además, con ello se asegura la
ingestión de una alta dosis debido a la concentración de las toxinas en estas
inclusiones cristalinas (Raymond y col., 2010).
Para iniciar el proceso de intoxicación, se ha demostrado que se debe llevar a
cabo la solubilización y la liberación de la protoxina a partir del cristal. La
solubilización del cristal paraesporal se favorece por las condiciones fisiológicas
del intestino del insecto bajo un pH alcalino y un ambiente reductor (Angus, 1954).
Las diferencias en la solubilidad de los cristales de Bt se ha atribuido a la cantidad
de puentes disulfuro y la presencia de bloques de aminoácidos altamente
conservados en las protoxinas Cry (Du y col., 1994).
El “modelo clásico” de formación de poro de las toxinas Cry-3D propone que la
protoxina liberada a partir del cristal, es proteolizada en las regiones N-terminal y
C-terminal mediante la acción de enzimas digestivas presentes en el jugo gástrico
de los insectos. Luego, la toxina activada se une a los receptores intestinales ya
descritos, continuando con la oligomerización y la consecuente muerte del insecto.
Por tanto, este modelo no considera la unión de la región C-terminal de la
protoxina con las proteínas intestinales de los insectos blanco, ni participación
alguna de esta región en el mecanismo de acción de las toxinas Cry de Bt.
Contrario a este paradigma, en experimentos in vivo se observó que dos cepas
resistentes a la toxina activada Cry1Ab del lepidóptero O. nubilalis continúan
siendo susceptibles a la protoxina Cry1Ab (en promedio 9 veces más susceptibles
a protoxina que a la toxina activada). En este reporte no se detectaron diferencias
en la activación de la protoxina en las colonias resistentes comparado con la
colonia susceptible, por lo que los autores sugieren que la resistencia observada
podría estar relacionada a cambios en la unión a los receptores intestinales
(Siqueira y col., 2004).
En relación a lo anterior, Anilkumar y col. (2008) observaron que en una colonia de
H. zea es mayor la relación de resistencia (RR) en larvas tratadas con toxina
27
activada Cry1Ac (RR de 36 veces) que con una formulación comercial que
contiene cuerpos de inclusión de la protoxina Cry1Ac (RR de 5). Los autores no
observaron diferencias significativas en la unión de la toxina activada con las
VMMA de la colonia susceptible y resistente, por lo que sugieren una probable
activación diferencial de la protoxina en el intestino del insecto y que
específicamente, la región C-terminal puede proteger los dominios de la toxina
activada de la degradación prematura por las proteasas intestinales.
En experimentos de unión in vitro tipo dot-blot se observó que la protoxina Cry1Ac
es capaz de interaccionar con VMMA del lepidóptero P. gossypiella así como con
diversos fragmentos recombinantes del receptor cadherina del insecto
mencionado (Fabrick y Tabashnik, 2007). El análisis de interacción con los
fragmentos de cadherina mostró que, para algunos de estos, la unión de la
protoxina es mayor que la correspondiente a la toxina activada Cry1Ac. En este
reporte no se profundiza sobre la relevancia de este resultado in vivo; sin
embargo, se sugiere que la activación de la protoxina Cry1Ac podría ocurrir antes
o después de la unión al receptor y que la condición de activación podría influir en
el mecanismo y eficiencia de citotoxicidad.
En 2014, mediante ensayos de unión tipo ELISA, se demostró que la protoxina
Cry1Ab puede unir a un fragmento del receptor cadherina (CR7-12) de M. sexta
con una afinidad similar a la unión de la toxina activada Cry1Ab (Gómez y col.,
2014). En este mismo trabajo se analizó la formación del oligómero de Cry1Ab a
partir de toxina y protoxina (en presencia del fragmento de cadherina CR7-12) y se
observó que se forman dos estructuras oligoméricas diferentes siendo el formado
de protoxina Cry1Ab más termoestable en comparación con el oligómero formado
a partir de la toxina activada Cry1Ab. Aunado a lo anterior, al comparar la actividad
de formación de poro se observó que el oligómero formado a partir de la protoxina
Cry1Ab, en presencia de cadherina y tripsina, induce la formación de poros iónicos
altamente estables. En cuanto a la toxicidad hacia larvas de lepidópteros, esta fue
analizada mediante bioensayos con larvas de primer instar de M. sexta mostrando
valores similares de LC50 de 1 y 2 ng/cm2 para protoxina Cry1Ab y toxina activada
28
Cry1Ab, respectivamente (Gómez y col., 2014). Derivado de estas diferencias
observadas, los autores sugieren que la región C-terminal de la protoxina podría
tener un papel importante en el mecanismo de acción.
Posteriormente, Tabashnik y col. (2015) demostraron que en diversas colonias
resistentes de tres diferentes especies de lepidópteros (H. armigera, H. zea y
D. saccharalis), las protoxinas Cry1Ab y Cry1Ac fueron en promedio 10 veces más
tóxicas que las correspondientes toxinas activadas. Con base en estos resultados,
los autores proponen un mecanismo de acción dual para las toxinas Cry-3D, en el
cual la protoxina o porciones de la protoxina (diferentes a los dominios de la toxina
activada, es decir la región C-terminal) pueden causar mortalidad en insectos
resistentes mediante su interacción con receptores intestinales, ocasionando la
formación de un oligómero de distintas características observado por Gómez y
col., (2014).
En ensayos in vivo se comprobó que la protoxina Cry1Ac es igual de tóxica que la
toxina activada Cry1Ac hacia la línea celular CF-203 derivada de Choristoneura
fumiferana. Además, se observaron ciertas diferencias en cuanto a morfología
nuclear y de microtúbulos luego de ser tratadas con protoxina vs. toxina (Li y col.,
2018).
A la fecha se han determinado mediante cristalografía de rayos X tres estructuras
de protoxinas: la protoxina corta Cry2Aa (1I5P) y dos protoxinas largas Cry1Ac
(4W8J) y Cry1Aa (8W7N) (Morse y col., 2001; Evdokimov y col., 2014; Tanaka y
col., 2023).
En el caso de Cry2Ab, la región N-terminal corresponde a dos pequeñas hélices-α
que esconden fragmentos del dominio II de la toxina activada involucrados en la
interacción con los receptores (Morse y col., 2001). En este sentido, diversos
reportes muestran que la región N-terminal de las protoxinas Cry puede prevenir la
unión inespecífica a las membranas intestinales y la inserción temprana de la
toxina activada (Bravo y col., 2002).
Respecto a la estructura de la protoxina Cry1Ac, se observó que la región
C-terminal tiene un plegamiento definido que consiste en cuatro dominios
29
(Dominios IV-VII) (Figura 5) (Evdokimov y col., 2014). Los autores identificaron que
los dominios V y VII se asemejan a CBM y son estructuralmente similares a los
dominios II y III de la toxina activada, los cuales determinan la unión a los
receptores intestinales.
Figura 5. Estructura cristalográfica de la protoxina Cry1Ac (PDB: 4W8J).
En gris se muestran los dominios de la toxina activada (I-III) y en color los dominios
correspondientes a la región C-terminal de la protoxina (IV-VII). (Tomada de Evdokimov y col.,
2014)
En relación a lo anterior, mediante el análisis bioinformático de una quimera de la
toxina Cry4Ba con la región C-terminal de Cry1Ac, se predijeron cuatro posibles
carbohidratos que podrían ser ligandos de esta región: galactosa, N-
acetilglucosamina, manosa y xilosa. En este mismo reporte se observó que la
quimera Cry(4Ba-1Ac) sinergiza la mortalidad de las toxinas activadas Cry2Aa y
Cry4Ba contra Culex pipiens; los autores proponen que podrían existir más
regiones de interacción en la quimera que en la toxinas activadas (Zghal y col.,
2017).
Se ha demostrado que la región C-terminal de las protoxinas Cry-3D tiene un
papel importante en la formación y estabilidad del cristal debido a que esta región
es rica en residuos de cisteína, los cuales estabilizan los cristales (Bietlot y col.,
30
1990). No obstante, hasta ahora no se ha descrito cuál es el papel de la región
C-terminal en la interacción con receptores y por ende en la actividad insecticida.
De manera interesante, en otras toxinas de la familia de PFT, tanto α como β, se
ha identificado que la forma de protoxina es capaz de unirse a los receptores
específicos.
Un ejemplo es el caso de la citotoxina A (α-PFT) de Pseudomonas aeruginosa.
Esta protoxina (proCTX) es producida como un dímero que puede unirse a la
membrana de los eritrocitos, pero es citolíticamente inactiva, pues no oligomeriza.
Cuando el dímero de protoxina se encuentra concentrado en la membrana, la
región C-terminal es escindida por proteasas de la bacteria o del hospedero.
Gracias a este corte se obtienen los monómeros de toxina activada que
posteriormente forman un pentámero provocando la inserción en la membrana y la
formación de poro, efectos propios de esta PFT (Hayashi y col., 1989; Ohnishi y
col., 1998).
Otro caso ampliamente estudiado es el de la aerolisina de Aeromonas hydrophila.
La aerolisina es una β-PFT que es secretada al medio extracelular como
proaerolisina, un precursor soluble. Ésta se une con alta afinidad a proteínas
ancladas por GPI presentes en la célula blanco. Una vez concentrada en la
superficie celular, la proaerolisina es convertida a aerolisina por la proteasa furina,
propia de la célula eucariótica, asociada a esta región celular. Posteriormente, la
aerolisina activada puede oligomerizar en un anillo heptamérico, formar el poro e
iniciar los efectos intracelulares que conllevan a la muerte celular (Abrami y col.,
2000; Geny y Popoff, 2006).
De manera similar, entre otras β-PFT que se unen como protoxina a sus distintos
receptores encontramos a la α-toxina de Clostridium septicum (Gordon y col.,
1999), la α-toxina de Staphylococcus aureus (Bhakdi y Tranum-Jensen, 1991), la
citolisina de Vibrio cholerae (VCC) (Olson y Gouaux, 2005) y el antígeno protector
de ántrax (PA) (Collier y Young, 2003).
Una mejor comprensión del modo de acción de las proteínas Bt es necesaria para
mantener y mejorar su eficacia. De acuerdo a los antecedentes mencionados, se
31
requiere más información sobre el papel de la región C-terminal de las protoxinas
Cry en el mecanismo de acción y determinar si existe alguna interacción con las
diferentes proteínas hasta ahora descritas que funcionan como receptores.
Incluso, es posible que existan receptores hasta ahora no descritos para la toxina
activada.
Por ello, en este proyecto propusimos analizar la unión de la protoxina Cry1Ab con
los tres receptores más estudiados a la fecha: cadherina, APN y ALP. Además, se
planteó realizar el análisis de unión de la región C-terminal de Cry1Ab con las
VMMA de M. sexta y los receptores recombinantes anteriormente mencionados.
Asimismo, con el objetivo de conocer si la protoxina Cry1Ab interacciona con los
receptores intestinales de M. sexta utilizando los mismos sitios de unión que la
toxina activada, se realizó un análisis de unión de diversas mutantes de Cry1Ab
del dominio II con el fragmento de cadherina CR12, y con los receptores
recombinantes APN y ALP. Se seleccionaron dos mutantes del asa 2,
RR368-369AA y F371A, y una mutante del asa 3, G439D (Rajamohan y col., 1995;
Rajamohan y col., 1996; Smedley y Ellar, 1996; Jenkins y Dean, 2000; Lee y col.,
2000; Pacheco y col., 2009b; Rodríguez-Almazán y col, 2009).
32
HIPÓTESIS
La protoxina Cry1Ab ejerce su efecto tóxico hacia M. sexta a través de
interacciones adicionales de la región C-terminal con las proteínas de unión
presentes en la microvellosidad intestinal del insecto.
OBJETIVOS
Objetivo General
• Caracterizar el papel de la protoxina Cry1Ab en el mecanismo de acción hacia
M. sexta.
Objetivos Particulares
• Caracterizar las interacciones de la protoxina Cry1Ab con las vesículas de la
microvellosidad media apical (VMMA) de M. sexta.
• Caracterizar la unión de la protoxina Cry1Ab con receptores de M. sexta
expresados heterólogamente en E. coli.
• Clonar la región C-terminal de la protoxina Cry1Ab y caracterizar la unión de
éste con las VMMA y receptores recombinantes de M. sexta.
• Describir la participación de la región C-terminal de la protoxina Cry1Ab en el
mecanismo de acción de las toxinas Cry-3D.
33
MATERIALES Y MÉTODOS
Cepas, plásmidos y medios de cultivo
En las siguientes tablas se muestran las cepas, plásmidos y medios de cultivo que
se utilizaron en este proyecto.
Tabla 1. Cepas utilizadas
Cepa Descripción
B. thuringiensis 407- Cepa acristalífera que no produce cristales de proteína.
B. thuringiensis 407 Cry1Ab Cepa portadora del plásmido pHT315-cry1Ab,
pHT315-cry1AbRR368-369AA, pHT315-cry1AbF371A o
pHT315-cry1AbG439D que expresa los cristales de
Cry1Ab.
E. coli BL21 (DE3) Cepa utilizada para la expresión de la región C-terminal
de Cry1Ab; y APN y ALP de M. sexta.
E. coli ER2566 Cepa utilizada para la expresión de los fragmentos de
cadherina CR12 (G1370-A1485) y CR7-12
(M810-A1485).
Tabla 2. Plásmidos utilizados
Plásmidos Descripción
pET22b Vector de expresión (Novagene) con resistencia a
ampicilina que contiene la secuencia de CR12, CR7-12,
ALP y APN de M. sexta; y la región C-terminal de
Cry1Ab.
pHT315 Vector de expresión para E. coli y Bacillus que contiene
el gen de la toxina Cry1Ab silvestre y mutantes.
Resistente a eritromicina y ampicilina.
34
Tabla 3. Medios de cultivo utilizados
Medios de
cultivo Composición por litro Especificaciones
Medio HCT Bactotriptona 5.0 g, casaminoácidos
2.0 g, 50 mL solución I (KH2PO4 0.5
M), 1 mL solución II (MgSO4.7H2O
0.05 M, MnSO4.H2O 0.001 M,
ZnSO4.7H2O 0.005 M), 10 mL
solución III (FeSO4.7H2O 0.007 M,
H2SO4 1 N), 10 mL solución IV
(CaCl2.2H2O 0.5 M), 30 mL glucosa
10%.
Disolver la bactotriptona y los
casaminoácidos. Ajustar pH a
7.25 con KOH y esterilizar.
Antes de usar se adicionan las
soluciones I a IV y la glucosa.
Medio 2xTY Triptona 16.0 g, extracto de levadura
10.0 g, NaCl 5.0 g.
--
Medio Luria
Bertani (LB)
Triptona 10 g/L, extracto de levadura
5 g/L, NaCl 10 g/L.
Ajustar pH a 7.0 con NaOH.
Crecimiento de Bt y obtención de cristales de Cry1Ab
Para la obtención de Cry1Ab se utilizó la cepa acristalífera de B. thuringiensis 407
transformada con el plásmido pHT315 que contiene al gen cry1Ab. Las células se
crecieron en cajas petri con agar LB suplementado con eritromicina a una
concentración final de 10 µg/mL durante 12 h a 30°C. Transcurrido este tiempo, se
inocularon 200 mL de medio HCT líquido suplementado con eritromicina (10
µg/mL) raspando toda la caja crecida y se incubó a 30°C y 200 rpm durante 3 días
aproximadamente o hasta observar la formación de cristales al microscopio. Una
vez observada la esporulación, la biomasa se recuperó centrifugando el cultivo a
5,031 x g durante 15 min. Se realizaron tres lavados con solución NE (NaCl 300
mM, EDTA 10 mM pH 8.0) y tres lavados con PMSF 1 mM centrifugando a 12,857
x g durante 10 min. Se resuspendió la pastilla en un volumen pequeño de PMSF 1
mM (~2 mL) y se guardó a 4°C.
Para la producción de espora cristal de las mutantes de Cry1Ab utilizadas en este
proyecto (RR368-369AA, F371A y G439D) se siguió el protocolo anterior.
35
Purificación de cristales de Cry1Ab
Los cristales mantenidos en PMSF 1 mM se centrifugaron a 12,857 x g durante 10
min. y se descartó el sobrenadante. La pastilla se resuspendió en 5 mL de
amortiguador TTN (Tritón X-100 1%, Tris-HCl 20 mM, NaCl 300 mM, pH 7.2) y se
sonicó con 3 pulsos de 50 seg a una amplitud de 80%. Esta muestra se utilizó
para el proceso de purificación siguiente.
Para el gradiente de sacarosa, se prepararon concentraciones de sacarosa a 84,
79, 72 y 67% (w/v) adicionados con Tritón X-100 0.01%, Tris-HCl 50 mM pH 8.0 y
NaCl 10 mM. Se agregaron 6 mL por tubo de cada solución de mayor a menor
concentración y al final se colocó la muestra de espora-cristal, es decir, sobre el
gradiente de sacarosa formado. Se ultracentrifugó a 95,219 x g durante 20 min. a
15ºC. Las fracciones se colectaron por separado y se observaron al microscopio
para verificar la presencia de cristales.
Para eliminar la sacarosa de las fracciones colectadas que contienen los cristales,
se realizaron tres lavados con PMSF 1 mM. La pastilla se resuspendió en un
volumen pequeño de la misma solución (~1 mL) y se conservó a 4°C.
Solubilización de cristales de Cry1Ab
Se tomaron los cristales purificados de Cry1Ab y se centrifugaron a 6,708 x g
durante 10 min. para eliminar el PMSF 1 mM. Posteriormente, la pastilla se
resuspendió en aprox. 500 μL de amortiguador de carbonatos (Na2CO3 50 mM pH
10.5) adicionado con β-mercaptoetanol 0.02% y se incubó en agitación durante 1 h
a 37°C. La protoxina soluble se recuperó por centrifugación a 13,147 x g durante
10 min. La concentración de la protoxina soluble Cry1Ab se cuantificó mediante el
método de Bradford (1976) utilizando albúmina sérica bovina (BSA) como
estándar y se verificó en SDS-PAGE al 10%.
36
Activación de protoxina Cry1Ab
Se tomó un volumen pequeño de la solución de protoxina soluble Cry1Ab y se
ajustó el pH a 8.0 con Tris-HCl 1 M pH 8.0 en relación 1:4 Tris:protoxina (v/v). Se
agregó tripsina 1 mg/mL en una relación 1:20 tripsina:protoxina (p/p) y se incubó
durante 2 h a 37°C en agitación. Transcurrido este tiempo, se inactivó la enzima
con PMSF a una concentración final de 1 mM, se centrifugó a 13,147 x g durante
10 min. y se recuperó el sobrenadante. La concentración de la toxina activada
Cry1Ab se cuantificó mediante el método de Bradford utilizando BSA como
estándar y se verificó en SDS-PAGE al 10%.
Clonación, expresión y purificación de la región C-terminal de Cry1Ab
La región C-terminal de Cry1Ab se amplificó con los primers específicos: ForC-ter,
5’-TAT CTG GGA TCC TCG AAT TGA ATT TGT TCC GGC AG-3’; RevC-ter,
5’-GAG CTC GAA TTC AAT TCC TCC ATA AGA AGT AAT TCC-3’. El producto de
PCR se digirió con BamHI y EcoRI, y se clonó en el vector pET22b (Novagen,
Madison, WI). Los plásmidos fueron secuenciados en el Instituto de Biotecnología,
Universidad Nacional Autónoma de México.
La construcción se expresó en E. coli BL21 mediante la inducción con IPTG 1 mM
durante 4 h. La región C-terminal se purificó por cromatografía de afinidad a níquel
(Qiagen) que une proteínas recombinantes a través de una etiqueta de His
incluida en el vector de expresión pET22b. La concentración de la región
C-terminal de Cry1Ab se cuantificó mediante el método de Bradford utilizando BSA
como estándar y se verificó en SDS-PAGE al 10%.
Cuantificación de proteínas
Método de Bradford: Se realizó una dilución de la muestra problema y se tomaron
800 μL. A este volumen se agregaron 200 μL de reactivo de Bradford 5X (BioRad),
se vortexeó la mezcla y se incubó durante 5 min. a temperatura ambiente. La
absorbancia se midió a una longitud de onda de 595 nm y se interpoló con una
curva estándar de BSA.
37
Método de Lowry: Se tomaron 5 μL de la muestra y se adicionaron 125 μL de una
mezcla de solución A y solución S (50:1) del sistema DC Protein-dye (BioRad). La
mezcla se vortexeó y se incubó por 15 min. a temperatura ambiente. Transcurrido
este tiempo se adicionó 1 mL de solución B, se mezcló mediante vórtex y se
incubó durante 15 min. más. La absorbancia fue medida a 750 nm y los valores
obtenidos se referenciaron con una curva estándar de BSA para Lowry.
Obtención de anticuerpo policlonal anti-C-terminal de Cry1Ab
Conejos blancos de Nueva Zelanda se inmunizaron 3 veces en intervalos de 15
días con una mezcla de 1 mg de la región C-terminal de Cry1Ab purificada y
adyuvante incompleto de Freund. Después de este tiempo se obtuvo el suero. La
especificidad y sensibilidad se determinó en ensayos de unión a ligando de la
región C-terminal a diferentes concentraciones en tiras de nitrocelulosa y
analizada con diferentes concentraciones del anticuerpo anti-C-terminal
(diluciones desde 1:10,000 a 1:50,000) y anticuerpo secundario anti-conejo
acoplado a peroxidasa de rábano (HRP) en dilución 1:30,000 (Santa Cruz
Biotechnology). Todos los procedimientos que involucraron animales se realizaron
de acuerdo a las guías éticas del Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional
Autónoma de México.
Western-blot para detectar Cry1Ab como protoxina, toxina activada y
C-terminal
Se separaron 0.5 µg de cada proteína en un SDS-PAGE al 10% y se transfirieron
a una membrana de PVDF (Millipore). La membrana se lavó con PBS-1x pH 7.4
(NH2PO4.H2O 0.386 g/L, Na2HPO4.7H2O 1.022 g/L, NaCl 8.5 g/L) y se bloqueó con
leche descremada 5% preparada en PBS-1x y Tween 20 0.1% (PBS-T) durante 1
h a temperatura ambiente en agitación. Posteriormente, la membrana se lavó 3
veces con PBS-T durante 15 min. Para la detección de Cry1Ab se agregó
anticuerpo anti-Cry1Ab y anti-C-terminal en dilución 1:20,000 durante 1 h con
agitación suave. Luego de este tiempo se lavó la membrana 3 veces con PBS-T
38
durante 15 min. y se agregó un anticuerpo secundario anti-conejo acoplado a
peroxidasa de rábano (HRP) en dilución 1:20,000 (Santa Cruz Biotechnology)
durante 1 h en agitación. Las bandas se revelaron con un sustrato
quimioluminiscente (Pierce) de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
Bioensayos en M. sexta
Los bioensayos se realizaron con larvas neonatas de M. sexta por el método de
contaminación de superficie. En placas de 24 pozos que contienen dieta artificial,
se añadió sobre la superficie la proteína Cry1Ab como protoxina, toxina activada y
región C-terminal a diferentes concentraciones y se dejó secar a temperatura
ambiente. Se colocó una larva neonata por cada pozo y después de 7 días se
realizó el conteo del número de larvas muertas. La concentración letal 50 (LC50),
que se define como la concentración promedio de la toxina a la cual mueren la
mitad de los individuos evaluados, se estimó con un análisis PROBIT utilizando el
software PoloPlus. Como controles negativos se incluyeron placas sin proteína
Cry1Ab.
Extracción de intestino medio de M. sexta
Las larvas de M. sexta de 3er instar se mantuvieron en frío para su disección. Se
fijó cada uno de los extremos de la larva sobre un trozo de unicel utilizando
alfileres y se realizó un corte transversal con las tijeras descartando el primer
segmento de cada extremo de la larva. El tejido extraído se lavó con amortiguador
MET pH 7.4 (Manitol 300 mM, EGTA 5 mM, Tris-HCl 17 mM pH 8.0)
complementado con DTT 2 mM y PMSF 0.5 mM. Las muestras de intestino se
almacenaron a -70°C.
Purificación de VMMA de M. sexta
Se descongelaron los intestinos de M. sexta (3er instar) y se colocaron en un
homogeneizador de vidrio estéril inmerso en hielo y se agregó la solución I pH 7.4
fría (Manitol 300 mM, EGTA 5 mM, EDTA 1 mM, HEPES 10 mM, Tris-HCl 17 mM
39
pH 8.0, DTT 2 mM, PMSF 0.5 mM, leupeptina 100 μg/mL, pepstatina 150 μg/mL y
neomicina 2.4 μg/mL) en una relación 1:10 intestino:solución I (w/v). Se colocó el
émbolo estéril en un homogeneizador WiseStir® HS-30E de Wisd Laboratory
Instruments y se aplicaron 9 pulsos a 2,250 rpm para homogeneizar la muestra.
Posteriormente, se agregó un volumen equivalente de solución II (MgCl2 24 mM),
se mezcló suavemente por inversión y se incubó el homogeneizador de vidrio
durante 15 min. en hielo. Transcurrido este tiempo se centrifugó la solución a
2,445 x g durante 15 min. a 4°C. El sobrenadante se recuperó en tubos para
centrífuga fríos y estériles, y se centrifugó a 30,910 x g durante 30 min. a 4°C.
Posteriormente, se descartó el sobrenadante y se resuspendió la pastilla en medio
volumen de la solución I y medio volumen de la solución II. Nuevamente se
realizaron los dos pasos de centrifugación anteriormente mencionados y la pastilla
se resuspendió finalmente, según su tamaño, en solución I. Las VMMA se
mezclaron finalmente con un rotor portátil y se almacenaron a -70°C. La
cuantificación de proteína se realizó mediante el método de Lowry (DC Protein
Assay, Bio-Rad).
Determinación de actividad enzimática de APN y ALP en las VMMA
Para la determinación de actividad enzimática de APN en las VMMA de M. sexta
se preparó el sustrato L-leucina-p-nitroanilida (LpNA) (Sigma Aldrich) a una
concentración de 10 mM. En una celda para espectrofotómetro se mezclaron 400
µL agua bidestilada, 250 µL NaCl 5 M, 200 µL de Tris-HCl 1 M pH 8.0 y 3-5 µg/µL
de las VMMA. A esta mezcla se agregaron 100 µL del sustrato previamente
preparado y se mezcló mediante vórtex. La absorbancia se leyó a 405 nm a los
3.5, 7 y 10 min. Para calcular la actividad se consideró que 0.1 unidades de
absorbancia equivalen a 1 µmol/min. de producto.
Para la determinación de actividad enzimática de ALP en las VMMA de M. sexta
se preparó el sustrato p-nitrofenil fosfato (Sigma Aldrich) a una concentración de 1
mg/mL en MgCl2 0.5 mM y Tris-HCl 100 mM pH 9.5. En una celda para
espectrofotómetro se mezclaron 250 µL del sustrato previamente preparado y 3-5
40
µg/µL de las VMMA. La mezcla se incubó durante 15 min. y la reacción se detuvo
adicionando 250 µL de EDTA 250 mM pH 8.0. La absorbancia se leyó a 405 nm y
la actividad específica de la muestra se determinó mediante una curva estándar
considerándose que una unidad enzimática es la cantidad en mg de proteína
necesaria para transformar 1 nmol de p-nitrofenil en fosfato en 1 minuto.
Western-blot para detectar los receptores cadherina, APN y ALP en las
VMMA
Se separaron 5 µg de VMMA de M. sexta en un SDS-PAGE al 10% y se
transfirieron a una membrana de PVDF (Millipore). La membrana se lavó con
PBS-1x pH 7.4 y se bloqueó con leche descremada 5% preparada en PBS-T
durante 1 h a temperatura ambiente en agitación. Posteriormente, la membrana se
lavó 3 veces con PBS-T durante 15 min. Para la detección de los receptores se
agregaron anticuerpos específicos durante 1 h con agitación suave en las
siguientes diluciones: anti-cadherina 1:20,000, anti-APN y anti-ALP 1:10,000.
Luego de este tiempo se lavó la membrana 3 veces con PBS-T durante 15 min. y
se agregó un anticuerpo secundario anti-conejo acoplado a peroxidasa de rábano
(HRP) en dilución 1:20,000 (Santa Cruz Biotechnology) durante 1 h en agitación.
Las bandas se revelaron con un sustrato quimioluminiscente (Pierce) de acuerdo a
las instrucciones del fabricante.
Unión de protoxina, toxina activada y C-terminal de Cry1Ab a VMMA
mediante ELISA
En placas de ELISA de 96 pozos (Thermo Scientific) se fijó 1 µg por pozo de las
VMMA de M. sexta de 3er instar en PBS-1x y se incubaron durante 12 h a 4°C.
Transcurrido este tiempo, la placa se bloqueó con 200 µL por pozo de leche
descremada 5% preparada en PBS-1x y se incubó durante 2 h a 37°C.
Posteriormente se lavó 3 veces la placa con PBS-1x y se agregaron 100 µL por
pozo de las diluciones de la protoxina, toxina y C-terminal de Cry1Ab (de 0-250
nM) preparadas en PBS-T 0.1% y se incubó durante 2 h a temperatura ambiente.
41
Luego, el exceso de Cry1Ab se descartó y las proteínas no unidas se eliminaron
mediante 3 lavados con PBS-T y 3 lavados con PBS-1x. Se agregaron 100 µL por
pozo del anticuerpo primario anti-Cry1Ab en dilución 1:20,000 o anti-C-terminal en
dilución 1:30,000 durante 1 h a 37°C. El exceso de anticuerpo primario se eliminó
lavando 3 veces con PBS-T y 3 veces con PBS-1x y se agregó el anticuerpo
secundario anti-conejo acoplado a peroxidasa de rábano (HRP) en dilución
1:20,000 (Santa Cruz Biotechnology) y se incubó durante 1 h a 37°C. Finalmente
se lavaron los pozos 3 veces con PBS-T y 3 veces con PBS-1x. Para detectar la
unión se agregaron 100 µL por pozo de sustrato orto-fenilendiamina 2 mM (Sigma)
y H2O2 0.05% disuelto en NaH2PO4 100 mM pH 5.0. Una vez observada la
formación de color, se detuvo la reacción con 30 µL de HCl 5 M y se leyó la
absorbancia a 490 nm en un lector de placas de ELISA. Para calcular las
afinidades, los datos se analizaron en el programa SigmaPlot (versión 12.0) y se
ajustaron mediante la ecuación de Scatchard. Cada experimento se realizó por
triplicado con tres repeticiones.
Ensayos de unión a ligando de Cry1Ab a VMMA
Se separaron 2.5 µg de VMMA de M. sexta en un SDS-PAGE al 10% y se
transfirieron a una membrana de PVDF (Millipore). La membrana se lavó con
PBS-1x pH 7.4 y se bloqueó con leche descremada 5% preparada en PBS-T
durante 1 h a temperatura ambiente en agitación. Posteriormente, la membrana se
lavó 3 veces en PBS-T durante 10 min. Se incubó la membrana con 1 nM de la
protoxina o la toxina activada Cry1Ab, y 2.5 nM de la región C-terminal durante 1 h
a temperatura ambiente con agitación suave. El exceso de protoxina, toxina o
C-terminal de Cry1Ab se eliminó mediante 3 lavados con PBS-T durante 15 min.
Para la detección de la unión se agregó el anticuerpo primario anti-Cry1Ab o
anti-C-terminal en dilución 1:20,000 durante 1 h con agitación suave. Luego de
este tiempo se lavó la membrana 3 veces con PBS-T durante 15 min. y se agregó
un anticuerpo secundario anti-conejo acoplado a peroxidasa de rábano (HRP) en
dilución 1:20,000 (Santa Cruz Biotechnology) durante 1 h en agitación. Las bandas
42
se revelaron con un sustrato quimioluminiscente (Pierce) de acuerdo a las
instrucciones del fabricante.
Ensayos de unión mediante pull-down
Las VMMA de M. sexta se solubilizaron durante 2 h a 4ºC en amortiguador
CHAPS (Tris-HCl 20 mM pH 7.4, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, PMSF 1 mM,
CHAPS 1% (v/v)). El material insoluble se descartó mediante centrifugación a
100,000 x g durante 1 h a 4ºC. Se incubaron 100 µg de protoxina, toxina activada
o de la región C-terminal de Cry1Ab con 200 µL de CNBr-agarosa (GE Healthcare)
en amortiguador de fosfato de sodio 0.1 M (pH 7.5) durante 12 h a 4ºC. Las
proteínas no acopladas se descartaron mediante centrifugación. Los grupos CNBr
que no reaccionaron se bloquearon incubando con Tris-HCl 0.1 M pH 8.0 durante
2 h a temperatura ambiente. Luego la resina se lavó 5 veces con 500 µL de PBS.
Las perlas de CNBr-agarosa acopladas a la protoxina, toxina activada o C-terminal
se incubaron con 200 µg de las VMMA solubilizadas en 500 µL durante 1 h a 4ºC;
las proteínas de las VMMA no unidas se eliminaron mediante centrifugación a
18,400 x g durante 10 min. a 4ºC. Las perlas de CNBr-agarosa que contienen las
proteínas unidas de las VMMA se lavaron 5 veces con 500 µL de PBS
suplementado con NaCl 1 M, seguido de 5 lavados con 500 µL de PBS para
eliminar las proteínas no unidas. Las proteínas que permanecieron unidas a las
perlas de agarosa-Cry1Ab se disociaron mediante la incubación durante 5 min. a
100°C en 50 µL de amortiguador de carga para SDS-PAGE (Tris-HCl 100 mM,
DTT 200 mM, SDS 4%, azul de bromofenol 0.2% (w/v), glicerol 20% (v/v), pH 6.8).
Las proteínas unidas de cada reacción se separaron en un SDS-PAGE al 10% y
se transfirieron a membranas de PVDF para el análisis mediante western-blot de
acuerdo al protocolo mencionado. Como control negativo, la CNBr-agarosa
activada se incubó sin proteína Cry1Ab, se bloqueó y se realizó todo el
procedimiento descrito.
43
Expresión heteróloga y purificación de receptores de M. sexta en E. coli
Se preparó un preinóculo de 5 mL de medio 2xTY con ampicilina 100 μg/mL y
glucosa al 2% con una colonia transformada con cada plásmido que contiene el
gen de la proteína a expresar (fragmentos de cadherina CR7-12 y CR12; ALP,
APN de M. sexta). Cada precultivo se incubó durante 12 h a 37°C en agitación.
Luego de este tiempo, se inoculó un volumen de 50 mL de medio 2xTY con
ampicilina 100 μg/mL y glucosa al 0.1 % con 500 μL del precultivo. El cultivo se
incubó a 37 °C en agitación hasta que alcanzó una OD600nm de 0.6-0.7.
Una vez alcanzada esta OD, la expresión se indujo con IPTG a una concentración
final de 1 mM durante 5 h a 30°C en agitación. Se recuperó la biomasa
centrifugando a 3,214 x g durante 15 min. a 4°C.
Para la purificación, se resuspendió la pastilla anterior en solución de urea pH 8.0
(Urea 8 M, NaH2PO4 100 mM y Tris base 10 mM), se sonicó y ultracentrifugó a
249,135 x g durante 25 min. para recuperar el sobrenadante. Se empaquetó una
columna con 2 mL de resina de níquel-agarosa (Qiagen) y se equilibró con
imidazol 20 mM. Se cargaron 5 mL de cada lisado celular y se pasaron a través de
la resina por gravedad. Se agregaron 20 mL de imidazol 10 mM y 5 mL de
imidazol 35 mM para lavar la resina. Cada proteína se eluyó en fracciones de 1 mL
cada una con 5 mL de imidazol 250 mM y 5 mL de imidazol 500 mM. La
cuantificación de proteína se realizó por el método de Bradford utilizando BSA
como estándar y se verificó en SDS-PAGE al 10%. La detección de los receptores
heterólogos de M. sexta mediante western-blot se realizó de acuerdo al protocolo
mencionado con 5 µg de cada proteína.
Unión de protoxina, toxina activada y C-terminal de Cry1Ab a receptores
heterólogos de M. sexta mediante ELISA
Para los ensayos de unión por ELISA con los fragmentos de cadherina CR7-12,
APN y ALP recombinantes, se sigue el protocolo mencionado fijando 0.5 µg de
cada receptor por pozo.
44
Se agregaron diluciones de la protoxina, toxina y C-terminal de Cry1Ab (de 0-60
nM para el CR7-12 y de 0-300 para APN y ALP). Cada experimento se realizó por
triplicado con tres repeticiones.
Ensayo de unión a ligando de protoxina, toxina activada y C-terminal de
Cry1Ab con fragmento de cadherina CR7-12, APN y ALP heterólogos de M.
sexta
Se separaron concentraciones seriadas de los receptores heterólogos de M. sexta
CR7-12 (0.625-5 µg), APN (2.5-10 µg) y ALP (0.625-5 µg) en un SDS-PAGE al
10% y se transfirieron a una membrana de PVDF (Millipore). La membrana se lavó
con PBS-1x pH 7.4 y se bloqueó con leche descremada 5% preparada en PBS-T
durante 1 h a temperatura ambiente en agitación. Posteriormente, la membrana se
lavó 3 veces con PBS-T durante 10 min. Se incubó la membrana con 5 nM de la
protoxina, toxina activada o C-terminal de Cry1Ab para el ensayo de unión a
ligando con el CR7-12, y 200 nM para el ensayo con APN y ALP durante 1 h a
temperatura ambiente con agitación suave. El exceso de protoxina, toxina o
C-terminal de Cry1Ab se eliminó mediante 3 lavados durante 15 min. con PBS-T.
Para la detección de la unión se agregó el anticuerpo primario anti-Cry1Ab o anti
C-terminal, ambos en una dilución 1:20,000, durante 1 h con agitación suave.
Luego de este tiempo se lavó la membrana 3 veces con PBS-T durante 15 min.y
se agregó un anticuerpo secundario anti-conejo acoplado a peroxidasa de rábano
(HRP) en dilución 1:20,000 (Santa Cruz Biotechnology) durante 1 h en agitación.
Las bandas se revelaron con un sustrato quimioluminiscente (Pierce) de acuerdo a
las instrucciones del fabricante.
Purificación de mutantes de Cry1Ab
Para la obtención de las protoxinas y toxinas mutantes activadas de Cry1Ab
RR368-369AA, F371A y G439D, se sigue el protocolo antes mencionado para la
Cry1Ab silvestre.
45
Unión de mutantes de Cry1Ab a receptores heterólogos de M. sexta
mediante ELISA
Para los ensayos de unión por ELISA con los fragmentos de cadherina CR12,
APN y ALP recombinantes, se sigue el protocolo mencionado, fijando 0.5 µg de
cada receptor por pozo.
Se agregaron diluciones de las protoxinas y toxinas mutantes de Cry1Ab (de 0-800
nM para el CR12, de 0-250 nM para APN y de 0-500 nM ALP). Cada experimento
se realizó por triplicado con tres repeticiones.
46
RESULTADOS
Purificación de protoxina, toxina activada y C-terminal de Cry1Ab
Para poder comparar la toxicidad y la unión, se purificaron tanto la protoxina como
la toxina activada Cry1Ab a partir de espora cristal.
En la Figura 6 se observan las muestras de espora cristal, protoxina soluble y
toxina activada de Cry1Ab. La espora-cristal se obtuvo a partir del cultivo de Bt.
Puede notarse que la fracción mayoritaria corresponde al tamaño esperado de 130
kDa. Posteriormente, los cristales se purificaron por un gradiente de sacarosa y las
fracciones con mayor concentración de proteína se solubilizaron en condiciones
que simulan a las del intestino de M. sexta (ambiente alcalino y reductor). A partir
de la protoxina soluble se realizó la activación a toxina mediante el tratamiento con
tripsina, que imita el corte proteolítico realizado por las proteasas intestinales del
insecto obteniéndose la proteína con un tamaño de aprox. 65 kDa. La obtención
de una protoxina soluble sin trazas de toxina activada es importante para no tener
falsos resultados en los experimentos de unión.
Figura 6. Purificación de Cry1Ab como espora cristal, protoxina soluble y toxina activada.
Las proteínas se resolvieron en un gel de acrilamida al 10%. A la izquierda se muestra el marcador
de peso molecular en kDa.
47
Para poder estudiar y caracterizar la región C-terminal de la protoxina Cry1Ab, su
secuencia codificante se clonó en el vector de expresión pET22b. Después de
comprobar la secuencia correcta, se realizaron pruebas de expresión para verificar
que no existiera degradación de la proteína y luego se purificó mediante
cromatografía de afinidad (columna de níquel-agarosa). En la Figura 7, se muestra
un gel de acrilamida con la proteína expresada a las 4 horas de inducción y
purificada a partir de un cultivo de E. coli (BL21). Se observa que la región
C-terminal se expresó y purificó correctamente con un tamaño estimado de 76
kDa.
Figura 7. Expresión y purificación de la región C-terminal de Cry1Ab.
La expresión de la proteína se realizó mediante la inducción con IPTG 1 mM durante 4 h. La
purificación se realizó mediante cromatografía de afinidad a níquel. Las proteínas se resolvieron en
un gel de acrilamida al 10%. A la izquierda se muestra el marcador de peso molecular en kDa.
Con la proteína purificada, se inmunizó un conejo para la recuperación de
anticuerpos policlonales para los siguientes experimentos. En la Figura 8 se
presenta el western-blot para evaluar la especificidad del anticuerpo anti-Cry1Ab
(anti-toxina activada) y el anti-C-terminal. Se observó que el anti-Cry1Ab reconoce
a la toxina activada y la protoxina, pero no a la región C-terminal. En el caso del
48
anti-C-terminal reconoce tanto la protoxina Cry1Ab como la región C-terminal, pero
no la toxina activada.
Figura 8. Detección mediante western-blot de Cry1Ab como protoxina, toxina activada y
región C-terminal usando anticuerpos anti-toxina o anti-C-terminal de Cry1Ab. Las proteínas
se resolvieron en un gel de acrilamida al 10%, se transfirieron a PVDF y se detectaron con los
anticuerpos específicos. A la izquierda se muestra el marcador de peso molecular en kDa.
Toxicidad de protoxina, toxina activada y región C-terminal de Cry1Ab hacia
larvas de M. sexta
Mediante bioensayos se evaluó la actividad biológica de la protoxina, la toxina
activada y de la región C-terminal de Cry1Ab en larvas neonatas de M. sexta. Se
probaron diferentes dosis para determinar los valores de la dosis letal media
(LC50). En la Tabla 4 se aprecia que la protoxina Cry1Ab es tres veces más tóxica
que la toxina activada.
49
Tabla 4. Toxicidad de protoxina y toxina activada Cry1Ab hacia larvas neonatas
de M. sexta
Tratamiento LC50 (ng/cm2)*
Protoxina Cry1Ab 3.4 (2.5-4.3)
Toxina activada Cry1Ab 10.3 (7.8-13.0)
* Valores de LC50. Los números entre paréntesis muestran el
95% del límite de confianza.
Para el caso de la región C-terminal de Cry1Ab no observamos toxicidad, incluso a
una concentración de 5 μg/cm2, por lo que la LC50no pudo determinarse.
Purificación de VMMA de M. sexta y detección de receptores
Las VMMA de M. sexta (3er instar) se purificaron de acuerdo al protocolo indicado
en la sección de Materiales y métodos. Se realizaron ensayos de western-blot
para verificar la presencia de los receptores cadherina, APN y ALP. Para ello, las
proteínas de las VMMA se separaron mediante electroforesis en geles de
poliacrilamida al 10%; luego, se transfirieron a una membrana de PVDF y se
detectaron con anticuerpos específicos anti-cadherina, anti-APN y anti-ALP. En la
Figura 9 se observa la presencia de cadherina de 210 kDa, APN de 120 kDa y
ALP de 65 kDa en las VMMA purificadas.
Figura 9. Detección mediante western-blot de cadherina, APN y ALP en las VMMA de M.
sexta, 3er instar. Se resolvieron 5 μg de VMMA en un gel de acrilamida al 10%, se transfirieron a
PVDF y se detectaron con anticuerpos específicos. A la izquierda se muestra el marcador de peso
molecular en kDa.
50
Una vez confirmada la presencia de los tres receptores mencionados, se continuó
con los ensayos de unión a la protoxina, toxina activada y C-terminal de Cry1Ab.
La protoxina Cry1Ab se une a las VMMA de M. sexta con la misma afinidad
que la toxina activada Cry1Ab
Para analizar la interacción global, se realizaron ensayos de unión por ELISA con
las VMMA purificadas a partir de intestinos de M. sexta con Cry1Ab como
protoxina y toxina activada. En la Figura 10 se muestran resultados de afinidad
similares con valores de Kd = 23.7 ± 1.9 nM para la interacción con la protoxina
Cry1Ab y una Kd = 23.9 ± 5.3 nM con la toxina activada Cry1Ab.
Figura 10. Interacción de protoxina y toxina activada Cry1Ab con VMMA de M. sexta, 3er
instar. Análisis de unión mediante ELISA, se fijó 1 μg de VMMA y se incubaron con
concentraciones crecientes de protoxina o toxina activada Cry1Ab. Las Kd se calcularon a partir del
análisis de Scatchard.
Los resultados muestran que la afinidad hacia las VMMA, tanto de la protoxina
como de la toxina activada Cry1Ab, es similar (Kd = 24 nM en promedio).
51
La región C-terminal de Cry1Ab se une con afinidad similar que la protoxina
y la toxina activada Cry1Ab a las VMMA de M. sexta
Para evaluar la interacción de la región C-terminal de Cry1Ab con las VMMA se
realizaron ensayos de unión por ELISA. En la Figura 11B observamos que el
C-terminal de Cry1Ab interactúa con las VMMA de M. sexta con una afinidad
aparente (Kd = 25 nM) similar a la afinidad de la protoxina (Kd = 16 nM) y la toxina
activada (Kd = 18 nM) (Figura 11A).
Figura 11. Interacción de protoxina, toxina activada y C-terminal de Cry1Ab con VMMA de M.
sexta, 3er instar. Análisis de unión mediante ELISA, se fijó en la placa 1 μg de VMMA y se
incubaron con concentraciones crecientes de protoxina, toxina activada o C-terminal de Cry1Ab.
Las Kd se calcularon a partir del análisis de Scatchard. Unión revelada con anticuerpo anti-Cry1Ab
(A) y con anticuerpo anti-C-terminal (B).
Diferentes proteínas de las VMMA de M. sexta están involucradas en la unión
con protoxina Cry1Ab que las reconocidas por la toxina activada Cry1Ab
En los resultados mostrados en la Figura 10 se detectó la unión total a las VMMA,
por lo que para identificar si los mismos receptores están involucrados en la unión
con la protoxina vs toxina Cry1Ab procedimos a realizar ensayos de unión a
ligando.
Para estos experimentos se usaron VMMA obtenidas de larvas de 3er instar.
Primeramente realizamos una separación en SDS-PAGE al 10% de las VMMA
52
(2.5 μg de proteína total); luego, las proteínas se transfirieron a una membrana de
PVDF y se incubaron con 1 nM de cada protoxina o toxina. Finalmente detectamos
la unión con anticuerpos específicos.
En la Figura 12 se muestra la unión con la protoxina Cry1Ab y la toxina activada
Cry1Ab. Podemos observar un patrón diferencial de unión, ya que para el caso de
la protoxina Cry1Ab detectamos mayor número de proteínas de las VMMA con las
que interactúa. Asimismo, conforme al tamaño aproximado de las principales
proteínas de unión cadherina, APN y ALP.
Figura 12. Ensayo de unión a ligando de la protoxina y toxina activada Cry1Ab a las VMMA
de M. sexta, 3er instar. Se resolvieron 5 μg de VMMA en un gel de acrilamida al 10%, se
transfirieron a PVDF y se incubaron con 10 nM de protoxina o toxina activada Cry1Ab. A la
izquierda se muestra el marcador de peso molecular en kDa.
La región C-terminal se une a APN y ALP presentes en las VMMA de M. sexta
Para comprobar si la cadherina, APN y ALP son capaces de interactuar con la
región C-terminal de la protoxina Cry1Ab realizamos un experimento de tipo
pull-down. En la Figura 13 podemos apreciar que la región C-terminal interacciona
principalmente con ALP, y en menor grado con APN. Se muestra también que la
región C-terminal de la protoxina no es capaz de interaccionar con la cadherina.
53
Este resultado indica que únicamente las proteínas ancladas por GPI son
importantes en la interacción con la región C-terminal de Cry1Ab.
Respecto a la protoxina y toxina activada Cry1Ab se observó interacción con
cadherina y APN pero no con ALP.
Figura 13. Identificación de proteínas de unión en las VMMA de M. sexta de Cry1Ab como
protoxina, toxina activada y C-terminal mediante pull-down. 200 μg de VMMA de M. sexta se
incubaron con Cry1Ab acoplada a agarosa-CNBr, las proteínas unidas se resolvieron en un gel de
acrilamida al 10%, se transfirieron a PVDF y se detectó la presencia de APN, ALP y cadherina
mediante anticuerpos específicos. A la izquierda se muestra el marcador de peso molecular en
kDa.
Purificación de receptores de M. sexta expresados heterólogamente en E.
coli
Con base en los resultados de los ensayos de unión a ligando y pull-down, nos
interesó comparar la unión a los receptores cadherina, APN y ALP de M. sexta.
Estas proteínas han sido clonadas y expresadas heterólogamente en células de E.
coli. Para el caso de cadherina en este proyecto trabajamos con los fragmentos
CR7-12 y CR12. El fragmento CR7-12 (residuos M810-A1485 de cadherina de M.
sexta) contiene los tres epítopes del receptor cadherina implicados en la unión a
Cry1Ab (Chen y col., 2007; Gómez y col., 2003; Xie y col., 2005).
54
Luego de la expresión con IPTG 1 mM durante 5 h, se realizó la purificación de las
tres proteínas mediante cromatografía de afinidad a níquel.
En la Figura 14 observamos las proteínas puras del tamaño esperado para cada
una.
Figura 14. Purificación de las proteínas de unión de M. sexta expresadas en E. coli.
La purificación se realizó mediante cromatografía de afinidad a níquel. Las proteínas se resolvieron
en geles de acrilamida al 10% para CR7-12, APN y ALP y al 12% para CR12. A la izquierda se
muestra el marcador de peso molecular en kDa.
Se realizaron ensayos de western-blot para confirmar la pureza de los receptores
CR7-12, APN y ALP. Las proteínas se separaron mediante electroforesis en geles
de poliacrilamida al 10%; luego, se transfirieron a una membrana de PVDF y se
detectaron con anticuerpos específicos anti-cadherina, anti-APN y anti-ALP.
En la Figura 15 podemos identificar que los receptores se encuentran purificados.
55
Figura 15. Detección mediante western-blot de proteínas recombinantes purificadas:
fragmento de cadherina CR7-12, APN y ALP. Se resolvieron 5 μg de cada proteína en un gel de
acrilamida al 10%, se transfirieron a PVDF y se detectaron con anticuerpos específicos. A la
izquierda se muestra el marcador de peso molecular en kDa.
La protoxina Cry1Ab tiene mayor afinidad a los receptores recombinantes
APN y ALP que la toxina activada Cry1Ab
Para comparar las afinidades de Cry1Ab en forma de protoxina y toxina activada
con los receptores recombinantes realizamos ensayos de unión por ELISA.
En la Figura 16 se observa la unión de la protoxina y la toxina activada Cry1Ab
con el fragmento CR7-12. La interacción es muy similar mostrando valores de Kd=
4.3±1.3 nM para protoxina y Kd= 1.0±0.1 nM para toxina activada.
56
Figura 16. Interacción de protoxina y toxina activada Cry1Ab con fragmento de cadherina
CR7-12 recombinante. Análisis de unión mediante ELISA, se fijaron 0.5 μg de CR7-12 y se
incubaron con concentraciones crecientes de protoxina o toxina activada Cry1Ab. Las Kd se
calcularon a partir del análisis de Scatchard.
Para el caso de APN, en la Figura 17 se muestran los resultados de la unión con
Cry1Ab en forma de protoxina y toxina. Nuestros resultados muestran que la
interacción de APN con la protoxina Cry1Ab muestra 3.5 veces más afinidad en
comparación con la toxina activada Cry1Ab.
57
Figura 17. Interacción de protoxina y toxina activada Cry1Ab con APN recombinante.
Análisis de unión mediante ELISA, se fijaron 0.5 μg de APN y se incubaron con concentraciones
crecientes de protoxina o toxina activada Cry1Ab. Las Kd se calcularon a partir del análisis de
Scatchard.
En la Figura 18 se muestra la unión de Cry1Ab como protoxina y toxina activada
con la proteína ALP recombinante. La afinidad de la interacción de la protoxina
Cry1Ab es 10 veces mayor que la afinidad de la toxina activada Cry1Ab hacia este
receptor.
58
Figura 18. Interacción de protoxina y toxina activada Cry1Ab con ALP recombinante. Análisis
de unión mediante ELISA, se fijaron 0.5 μg de ALP y se incubaron con concentraciones crecientes
de protoxina o toxina activada Cry1Ab. Las Kd se calcularon a partir del análisis de Scatchard.
Estos resultados muestran que la protoxina Cry1Ab tiene una mayor afinidad de
interacción con los receptores APN y ALP en comparación con la toxina activada
Cry1Ab. Con base en esto, realizamos los análisis de unión a estos mismos
receptores con la región C-terminal de Cry1Ab.
59
La región C-terminal de Cry1Ab se une a los receptores heterólogos APN y
ALP, pero no al fragmento de cadherina CR7-12
Para conocer si específicamente la región C-terminal de Cry1Ab es capaz de
unirse a los principales receptores de M. sexta, realizamos diversos ensayos de
unión con el fragmento de cadherina CR7-12, APN y ALP recombinantes.
Los resultados mostraron que el C-terminal no se une al fragmento CR7-12, pero
sí a ALP (Kd = 55±9 nM) y a APN (Kd = 24±3 nM) (Figura 19).
Figura 19. Interacción de la región C-terminal de Cry1Ab al fragmento de cadherina CR7-12,
APN y ALP recombinantes de M. sexta. Análisis de unión mediante ELISA, se fijaron 0.5 μg de
cada receptor y se incubaron con concentraciones crecientes de la región C-terminal de Cry1Ab.
Las Kd se calcularon a partir del análisis de Scatchard.
Para confirmar los resultados de interacción obtenidos, se realizaron ensayos de
unión a ligando de Cry1Ab como protoxina, toxina activada y región C-terminal al
fragmento de cadherina CR7-12, APN y ALP recombinantes de M. sexta.
En la Figura 20 se muestran los resultados, donde confirmamos que la región
C-terminal de Cry1Ab no tiene interacción con cadherina, en este caso
específicamente con el fragmento CR7-12. Así mismo, únicamente las proteínas
ancladas por GPI APN y ALP están involucradas en la interacción de la región
C-terminal de la protoxina Cry1Ab.
60
Figura 20. Ensayo de unión a ligando de protoxina, toxina activada y C-terminal de Cry1Ab a
receptores recombinantes de M. sexta. Se resolvieron diferentes concentraciones de los
receptores en un gel de acrilamida al 10%, se transfirieron a PVDF y se incubaron con 5 nM o 200
nM de protoxina, toxina activada y región C-terminal de Cry1Ab para CR7-12 o APN y ALP,
respectivamente. A la izquierda se muestra el marcador de peso molecular en kDa.
61
Purificación de mutantes del dominio II de Cry1Ab como protoxinas y
toxinas activadas
Con el objetivo de conocer si la protoxina Cry1Ab interacciona con los receptores
intestinales de M. sexta utilizando los mismos sitios de unión conocidos para la
toxina activada, se realizó un análisis de unión de diversas mutantes de Cry1Ab
del dominio II con el fragmento de cadherina CR12, APN y ALP. Se seleccionaron
dos mutantes del asa 2 RR368-369AA y F371A; y una mutante del asa 3 G439D.
Las tres mutantes del dominio II de Cry1Ab estudiadas en este proyecto se
obtuvieron de manera similar a la Cry1Ab silvestre. En la Figura 21 se pueden
apreciar las protoxinas solubles de las mutantes que tienen un tamaño 130 kDa,
así como las toxinas mutantes activadas de 65 kDa.
Figura 21. Purificación de mutantes de Cry1Ab del dominio II como protoxinas y toxinas
activadas. Las proteínas se resolvieron en un gel de acrilamida al 10%. En la parte superior se
nombra cada mutante analizada. En el centro se indica el marcador de peso molecular en kDa para
ambos geles.
62
La interacción de la protoxina Cry1Ab con APN y ALP está mediada por
sitios de unión de la región C-terminal de Cry1Ab
Para los experimentos de unión de las mutantes del dominio II de Cry1Ab,
utilizamos el fragmento CR12 (residuos G1370-A1485 de cadherina de M. sexta)
ya que ésta es una región clave para la unión a Cry1Ab (de Maagd y col., 2003;
Gómez y col., 2003; Xie y col., 2005; Pacheco y col., 2009b) y se ha identificado
que una sola mutación en este fragmento compromete la unión de la toxina de
manera importante (Pacheco y col., 2009b).
En la Tabla 5 y Figura 22 se muestran los resultados de Kd en nM para las
interacciones de CR12, APN y ALP, tanto con las protoxinas y toxinas silvestres
como las mutantes mencionadas.
Tabla 5. Kd en nM para las interacciones entre las protoxinas y toxinas activadas
Cry1Ab silvestres y mutantes con el fragmento de cadherina CR12, APN y ALP
Fragmento CR12 APN ALP
Cry1Ab Protoxina Toxina Protoxina Toxina Protoxina Toxina
Silvestre 85±14 35±4 79±8 296±5 28±2 296±3
RR368-369AA No unión No unión 55±6 572±53 22±3 381±36
F371A No unión No unión 40±5 214±8 16±2 242±48
G439D No unión No unión 30±4 870±32 14±2 806±88
Respecto a la unión con el fragmento de cadherina CR12, se observó que
únicamente la protoxina silvestre Cry1Ab es capaz de unirse al fragmento de
cadherina con una Kd= 85±14 nM, mientras que las protoxinas mutantes están
afectadas en unión y, principalmente la mutante G439D, muestra una mayor
pérdida en interacción al fragmento CR12 (Figura 22A). La unión del CR12 con la
toxina activada Cry1Ab silvestre tiene una Kd= 35±4 nM y las mutantes de la
toxina activada se encuentran afectadas en unión al CR12.
Respecto a la interacción con APN (Figura 22B), las protoxinas mutantes no están
afectadas en unión con APN siendo la Kd muy similar. En el caso de las toxinas
activadas, con la mutante F371A no se reduce la interacción, con la mutante
RR368-369AA se reduce 2 veces y con la mutante G439D se reduce casi 3 veces
en comparación con la toxina activada silvestre.
63
Finalmente, para el caso de la unión de las mutantes con ALP (Figura 22C), las
protoxinas mutantes no están afectadas en unión con ALP siendo la Kd muy
similar a la protoxina Cry1Ab silvestre. Respecto a la unión de las toxinas
mutantes activadas a ALP, se observó que en la mutante F371A no se reduce la
afinidad de la interacción, con la mutante RR368-369AA se reduce 1.3 veces y con
la mutante G439D se reduce casi 3 veces en comparación con la toxina activada
silvestre.
Los resultados anteriores indican que la protoxina y la toxina activada Cry1Ab
interaccionan con cadherina mediante los mismos sitios, es decir, utilizando las
asas 2 y 3 del dominio II. Conforme a lo anterior, la región C-terminal no está
involucrada en la interacción con cadherina como se observó en nuestros
experimentos de ELISA, pull-down y unión a ligando. Particularmente el asa 3 del
dominio II participa en la unión de la toxina activada Cry1Ab a APN y ALP. Las
mutantes analizadas en el contexto de protoxina no estuvieron severamente
afectadas en unión a APN y ALP, sustentando que las regiones adicionales
presentes en la protoxina, es decir la región C-terminal, están involucradas en la
unión a los receptores anclados por GPI.
64
Figura 22. Interacción de Cry1Ab silvestre y mutantes como protoxinas y toxinas a los
receptores recombinantes de M. sexta. A. Unión a CR12, B. unión a APN, C. unión a ALP.
Análisis de unión mediante ELISA, se fijaron 0.5 μg de receptor y se incubaron con
concentraciones crecientes de protoxinas o toxinas. Las Kd se calcularon a partir del análisis de
Scatchard.
65
DISCUSIÓN
Los insecticidas formulados a partir de B. thuringiensis han sido extensamente
utilizados para el control de diversas plagas, por lo que conocer el modo de acción
de las toxinas Cry de Bt es crítico para poder plantear futuras estrategias que
puedan mejorar su actividad insecticida.
Gracias a la investigación de diversos grupos se han logrado avances
significativos en la comprensión del mecanismo de acción de las toxinas Cry-3D;
no obstante, a la fecha todavía existen muchas preguntas que resolver sobre
ciertos pasos específicos.
Se ha propuesto que la región C-terminal de las protoxinas Cry-3D participa en la
formación y estabilización del cristal específicamente por la presencia de residuos
de cisteína, los cuales estabilizan los cristales mediante puentes disulfuro
intermoleculares. De acuerdo a la estructura de la protoxina Cry1Ac, los residuos
de cisteína están localizados en asas flexibles cercanas por lo que puede existir
más de una versión de la red de puentes dentro del cristal (Evdokimov y col.,
2014).
Asimismo, se ha propuesto que esta región C-terminal tiene un papel importante
en la solubilización selectiva en el intestino del insecto (Dastidar y Nickerson,
1979; Whiteley y Schnepf, 1986). Sin embargo, dentro de la familia de las
protoxinas Cry-3D existen algunas proteínas que carecen de la región C-terminal,
como las protoxinas Cry3A o Cry11A que son capaces de formar inclusiones
cristalinas paraesporales, por lo que, entonces, la región C-terminal no es
estrictamente necesaria para la formación del cristal (Agaisse y Lereclus, 1995;
Adalat y col., 2017; Tetreau y col., 2021). En este sentido, las estructuras
cristalográficas de las protoxinas Cry1Ac (Evdokimov y col., 2014) y Cry1Aa
(Tanaka y col., 2023) revelaron que los residuos de cisteína y la formación de
puentes disulfuro no es necesaria para la cristalización en las células de Bt.
En relación a la participación directa de la región C-terminal de Cry1Ab en la
toxicidad hacia los insectos, no está completamente claro el rol de esta región. No
obstante, Tabashnik y col. (2015) propusieron que las toxinas Cry-3D pueden tener
66
un mecanismo dual, ya que se demostró que la protoxina Cry1Ac es capaz de
matar a insectos resistentes a la toxina activada Cry1Ac, sugiriendo que la
protoxina puede tener pasos o efectos adicionales a la toxina activada, y por tanto,
puede inducir una respuesta de muerte en diversos insectos resistentes.
En este proyecto planteamos como objetivo principal analizar si la región
C-terminal de la protoxina Cry1Ab tiene interacciones adicionales con las
principales proteínas intestinales de M. sexta consideradas como receptores. Para
ello la secuencia codificante de la región C-terminal de Cry1Ab se clonó y expresó
heterólogamente en E. coli.
Los resultados de toxicidad en larvas neonatas de M. sexta mostraron que la
región C-terminal de Cry1Ab no fue tóxica incluso a concentraciones de 5 μg/cm2.
Este resultado indica que la región C-terminal per se no es capaz de provocar la
mortalidad en las larvas, y que los dominios I-III de la toxina activada son
necesarios para ejercer el efecto tóxico. Sin embargo, ya que observamos distinta
mortalidad entre la protoxina y toxina activada Cry1Ab (Tabla 4), sugerimos que
estas diferencias podrían estar mediadas a nivel de interacción específicamente
de la región C-terminal de la protoxina Cry1Ab con los receptores intestinales de
M. sexta. Respecto a esto, se observó que la protoxina Cry8Ha tuvo mayor
toxicidad que la correspondiente toxina activada en los coleópteros Holotrichia
oblita y H. parallela (Shu y col., 2020).
En el análisis de unión de la proteína Cry1Ab con las VMMA de M. sexta
observamos que la protoxina se une a las VMMA con la misma afinidad que la
toxina activada en ensayos de ELISA (en promedio Kd= 23 nM) (Figura 10). La
interacción de la región C-terminal de Cry1Ab con las VMMA de M. sexta se
confirmó mediante ensayos de unión por ELISA (Figura 11) donde observamos
que la región C-terminal se une a las VMMA de M. sexta con similar afinidad que
la protoxina y la toxina activada Cry1Ab. Esto demuestra que, a pesar de que el
C-terminal no tiene un efecto tóxico como tal, podría participar en el anclaje de la
protoxina Cry1Ab a la microvellosidad intestinal de M. sexta.
La unión de la toxina activada Cry1Ab a las proteínas de las VMMA de M. sexta a
67
lo largo del desarrollo larvario fue analizada por Arenas y col. (2010) y
Flores-Escobar y col. (2013). En relación a lo anterior, nuestros resultados de los
ensayos de unión a ligando de Cry1Ab a las VMMA de M. sexta demostraron que
diferentes proteínas de las VMMA están involucradas en la unión con protoxina
Cry1Ab que las reconocidas por la toxina activada Cry1Ab (Figura 12). Podemos
observar que la toxina Cry1Ab se une a APN (~120 kDa) y a ALP (~ 65 kDa) tal
como ya se había reportado previamente por los autores mencionados. Así
mismo, identificamos la unión con una proteína de alto peso molecular (~250 kDa)
por lo cual podríamos sugerir que se trata de la cadherina por el tamaño, la cual
no había sido observada por Arenas y col. (2010) o por Flores-Escobar y col.
(2013) en las uniones con VMMA de M. sexta de 3er instar. Para el caso de la
protoxina Cry1Ab, nuestro trabajo es el primer reporte en donde se identifican las
proteínas de unión en las VMMA. En relación a estas diferencias, en otro reporte
se observó que la toxina activada Cry1Ac no compite la unión de la protoxina
Cry1Ac a las VMMA del lepidóptero P. xylostella, por lo que ambas formas de la
toxina pueden unir a diferentes receptores (Qi y col., 2020).
Dado que en nuestro laboratorio tenemos clonadas las proteínas principales
consideradas como receptores, decidimos comparar la interacción de estos con la
protoxina, toxina activada y región C-terminal de Cry1Ab. En el análisis del
fragmento de cadherina CR7-12 de M. sexta se obtuvieron valores de Kd=4.3 nM y
Kd=1.0 nM para la protoxina y toxina Cry1Ab, respectivamente (Figura 16), los
cuales son comparables a los reportados por Gómez y col. (2014). Estos autores
sugirieron que in vivo, tanto protoxina como toxina activada podrían ser capaces
de unirse al receptor cadherina de M. sexta.
En cuanto a la unión con los receptores anclados por GPI, la afinidad de la
protoxina Cry1Ab fue 3.5 y 10 veces mayor con APN y ALP, respectivamente, en
comparación con la unión con la toxina activada Cry1Ab (Figura 17 y Figura 18).
La alta afinidad de unión de la protoxina Cry1Ab a los receptores anclados por GPI
podría sugerir interacciones in vivo de la región C-terminal de Cry1Ab con APN y
ALP de las VMMA antes de la activación de proteasas, tal como se comprobó en
68
el ensayo de pull-down (Figura 13). La unión de la región C-terminal de Cry1Ab
con los receptores recombinantes se comprobó mediante el análisis de unión por
ELISA de la región C-terminal con CR7-12, APN y ALP (Figura 19) en donde
observamos unión con los receptores anclados por GPI, pero no con el fragmento
de cadherina CR7-12. Por tanto, nuestros resultados evidencian que la interacción
de la protoxina Cry1Ab y el fragmento de cadherina CR7-12 anteriormente
mencionada observada por Gómez y col., (2014) no está mediada por la región
C-terminal, sino por la toxina activada Cry1Ab. Por otro lado, la interacción de la
región C-terminal de Cry1Ab con los receptores anclados por GPI podría jugar un
papel importante para la recuperación de toxicidad en los casos donde la unión de
la toxina activada (DI-DIII) se encuentra afectada provocando resistencia (Siqueira
y col., 2004; Tabashnik y col., 2015).
En relación a lo anterior, mediante silenciamiento con CRISPR/Cas9 de los
receptores de Cry ya conocidos, se observaron diferencias en la toxicidad de la
protoxina y la toxina activada en diversos insectos. Como ejemplo, al silenciar el
receptor cadherina en H. armigera se observaron RR>10 veces con toxina
activada Cry1Ac en comparación con la protoxina Cry1Ac (Liao y col., 2022). En
contraste, en larvas de P. xylostella silenciadas en APN1 y APN3, se observó
mayor resistencia a la protoxina Cry1Ac RR=~400 veces en comparación con la
toxina activada, indicando que en este insecto las proteínas ancladas por GPI son
receptores funcionales para la protoxina Cry1Ac (Sun y col., 2022).
En los ensayos de unión a ligando de Cry1Ab con los receptores recombinantes
(Figura 20) confirmamos que no existe interacción de la región C-terminal con el
fragmento de cadherina CR7-12. Este comportamiento es contrario al caso de la
protoxina Cry1Ac, donde se ha observado que existe unión con algunos
fragmentos de cadherina del lepidóptero P. gossypiella (Fabrick y Tabashnik,
2007). Por el contrario, se observó que la interacción de la región C-terminal de
Cry1Ab es específicamente con APN y ALP.
Los resultados de unión con las tres mutantes de Cry1Ab del dominio II no tóxicas
y afectadas en la unión a receptores, mostraron que las toxinas mutantes
69
activadas evaluadas reducen significativamente su unión a APN y ALP en
comparación con las protoxinas mutantes (Tabla 5, Figura 22). Esto indica la
presencia de sitios de unión adicionales en la región C-terminal de Cry1Ab para
los receptores anclados por GPI mencionados. Respecto a lo anterior, la
estructura de la región C-terminal de la protoxina Cry1Ac, específicamente de los
dominios V y VII, sugiere similitudes con CBM por lo que la interacción con
azúcares que “decoran” a ciertas proteínas como APN y ALP podrían ser clave en
la interacción con el C-terminal (Evdokimov y col., 2014). Este posible anclaje a
carbohidratos se ha sugerido además para una quimera de toxina activada Cry4Ba
con el C-terminal de Cry1Ac, en donde mediante una predicción bioinformática se
identificaron cuatro posibles azúcares que podrían ser ligandos de la protoxina
Cry1Ac: galactosa, N- acetilglucosamina, manosa y xilosa (Zghal y col., 2017). En
este mismo reporte se observó que la quimera Cry(4Ba-1Ac) sinergiza la
mortalidad de las toxinas Cry2Aa y Cry4Ba contra C. pipiens y los autores
proponen que podrían existir más regiones de interacción en la quimera que en la
toxina activada Cry4Ba. Por lo anterior sería importante identificar en el futuro si la
región C-terminal de Cry1Ab puede interactuar con ciertos carbohidratos
presentes en los receptores intestinales mencionados.
La unión de las tres mutantes del dominio II con CR12 (Tabla 5, Figura 22A)
estuvo afectada tanto en forma de protoxina como toxina activada. Estos
resultados demuestran que la interacción está mediada por los mismos sitios, es
decir, utilizando las asas 2 y 3 del dominio II; por tanto, no existen sitios
adicionales de unión en la región C-terminal de Cry1Ab para el receptor cadherina
de M. sexta.
Si bien para que la toxina Cry1Ab ejerza su efecto insecticida se requiere la
interacción con el receptor cadherina que facilita la escisión adicional de la hélice
α-1 del dominio I y la formación del oligómero (Gómez y col., 2002b), la unión de la
región C-terminal de la protoxina Cry1Ab a las abundantes proteínas ancladas por
GPI (Chen y col., 2005) podría proporcionar los medios para la unión y
concentración de la protoxina a la membrana intestinal antes de su activación.
70
Adicionalmente, la interacción de la protoxina Cry1Ab con el receptor cadherina
mediante el dominio II, en presencia de proteasas, induciría la formación de un
oligómero con características diferentes (Gómez y col., 2014). García-Gómez y
col. (2019) determinaron que la chaperona Hsp90 del lepidóptero P. xylostella
incrementó la toxicidad tanto de las protoxinas Cry1Ab y Cry1Ac en P. xylostella y
S. frugiperda mediante la protección rápida de la degradación por las proteasas
intestinales lo que determinó la unión de las protoxinas a los receptores y la
toxicidad hacia el insecto.
Los mecanismos empleados por las PFT para ejercer su efecto tóxico incluyen
interacciones muy complejas con una o varias moléculas localizadas en la
superficie de la membrana celular de los organismos blanco. Diversas PFT se
sintetizan como “pro-péptidos” considerados precursores “inactivos” que requieren
ser proteolizados para iniciar su mecanismo de acción. En algunos casos se ha
demostrado que los pro-péptidos, una vez que son proteolizados pueden tener
funciones adicionales como chaperonas que ayudan a mantener soluble a la
proteína bajo condiciones determinadas, o incluso participar en la oligomerización
(Eder, 1995).
Como ejemplo, la aerolisina es producida como un precursor inactivo llamado
proaerolisina que es capaz de unirse a receptores específicos de las células
blanco (Abrami y col., 1998). La activación a aerolisina involucra el corte
proteolítico del pro-péptido de 43 residuos que se encuentra en la región
C-terminal, que es necesario para la correcta oligomerización y la formación del
poro (Iacovache y col., 2011). También, la alfa-toxina de C. septicum también es
secretada como protoxina y se ha demostrado que este propéptido funciona como
una chaperona intramolecular (Sellman y Tweten, 1997). Al igual que en la
aerolisina, la activación de la alfa-toxina es primordial para la formación de
complejos oligoméricos altamente estables que se insertan en las células blanco
(Gordon y col., 1999).
Las toxinas Cry forman parte de la familia de PFTs y en este proyecto se demostró
que la región C-terminal de la protoxina Cry1Ab está directamente involucrada en
71
la interacción con proteínas de las VMMA, principalmente a APN y ALP. Lo
anterior implica que la región C-terminal de diferentes protoxinas Cry contribuye a
la toxicidad hacia los insectos mediante la unión de sitios de adicionales a APN y
ALP, mientras que el dominio II de la toxina activada participa en la unión a
cadherina.
Cabe mencionar que los transportadores ABC también participan en la vía de la
protoxina Cry1Ac ya que en larvas de P. xylostella silenciadas en ABCC2 y ABCC3
se observó mayor RR para la protoxina Cry1Ac en comparación con la toxina
activada (Sun y col., 2022). Por tanto, también sería relevante analizar el papel de
las proteínas ABC en la unión con la región C-terminal de Cry1Ab.
Se ha demostrado que el intercambio de dominios y la mutagénesis sitio dirigida
de las toxinas han dado como resultado una mejora en toxicidad (Bravo y col.,
2013); por tanto, la ingeniería de la región C-terminal podría favorecer la obtención
de proteínas Cry más eficaces contra insectos específicos o ayudar a contrarrestar
la resistencia ocasionada por la pérdida de unión de la toxina activada. Como
ejemplo, recientemente se observó que la toxicidad en H. armigera de una
proteína quimera de Cry2Aa con el C-terminal de Cry1Ac incrementó
significativamente, comparado con la toxina Cry2Aa (Qiu y col., 2019).
Los resultados de este proyecto refutan el precedente de que la región C-terminal
de las protoxinas Cry-3D únicamente está involucrada en la formación del cristal y
no tiene un papel en la toxicidad de las proteínas Cry (Schnepf y col., 1998).
Recientemente, Li y col. (2019) reemplazaron los 14 residuos de Cys por serina
(Ser) ubicados en la región C-terminal de la protoxina Cry1Ac comprobando que
estos residuos no son esenciales para la formación de un cristal bipiramidal al
observarlos mediante microscopio electrónico de barrido. Por tanto, nuestros
resultados apoyan la propuesta de que la región C-terminal contribuye a la unión a
la microvellosidad intestinal y toxicidad de las proteínas Cry.
En la Figura 23 se muestra el modelo del mecanismo de acción de la protoxina
Cry1Ab con base en los resultados de este proyecto, mostrando que la interacción
con APN y ALP ayuda a que la protoxina alcance al receptor cadherina antes de la
72
activación por las proteasas intestinales. La interacción de la protoxina con
cadherina está mediada por las asas del dominio II, en presencia de proteasas
intestinales, lo que induce la formación de un oligómero estable que muestra
actividad de formación de poro con una conductancia simple y una probabilidad de
abierto alta tal como previamente se demostró (Gómez y col., 2014).
Figura 23. Mecanismo de acción propuesto para las protoxinas Cry de Bt.
1, los cristales parasporales son solubilizados; 2, la región C-terminal de la protoxina se une a APN
y ALP mediante los dominios V y VII; 3, la protoxina se une al receptor cadherina mediante las
asas del dominio II; 4, las proteasas activan la protoxina, induciendo la formación de oligómero a
partir de la toxina activada; 5, el oligómero se inserta en la membrana formando un poro que
provoca la muerte de la célula.
73
CONCLUSIONES
• La protoxina Cry1Ab es capaz de unirse a los receptores APN y ALP a
través de la interacción mediada por la región C-terminal.
• La protoxina Cry1Ab se une al receptor tipo cadherina de M. sexta mediante
el dominio II de la toxina activada, sin la participación de la región
C-terminal.
• El papel de la región C-terminal en la toxicidad hacia M. sexta está
relacionado con el anclaje de la protoxina en la microvellosidad intestinal
mediante la interacción con APN y ALP.
PERSPECTIVAS
● Identificar los aminoácidos de la región C-terminal de Cry1Ab involucrados
en la interacción con APN y ALP.
● Realizar ensayos de unión a ligando en 2D de la región C-terminal de
Cry1Ab con las VMMA de M. sexta para identificar y caracterizar otras
proteínas de unión.
74
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89
Anexo I
Publicación derivada directamente del presente proyecto
The C-terminal protoxin region of Bacillus thuringiensis Cry1Ab toxin has a
functional role in binding to GPI-anchored receptors in the insect midgut
Arlen Peña-Cardeña, Ricardo Grande, Jorge Sánchez, Bruce E Tabashnik,
Alejandra Bravo, Mario Soberón, Isabel Gómez
J Biol Chem (2018) Dec 28;293(52):20263-20272.
90
The C-terminal protoxin region of Bacillus thuringiensis
Cry1Ab toxin has a functional role in binding to GPI-anchored
receptors in the insect midgut
Received for publication, August 1, 2018, and in revised form, October 15, 2018 Published, Papers in Press, November 1, 2018, DOI 10.1074/jbc.RA118.005101
Arlen Peña-Cardeña‡, Ricardo Grande§, Jorge Sánchez‡, Bruce E. Tabashnik¶, Alejandra Bravo‡, Mario Soberón‡,
and X Isabel Gómez‡1
From the ‡Departamento de Microbiología Molecular and §Unidad de Secuenciación Masiva y Bioinformática, Instituto de
Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México, Avenida Universidad 2001, Colonia Chamilpa, Cuernavaca, Morelos
62210, México and the ¶Department of Entomology, University of Arizona, Tucson, Arizona 85721
Edited by Chris Whitfield
Bacillus thuringiensis Cry toxins are used worldwide for con-
trolling insects. Cry1Ab is produced as a 130-kDa protoxin that
is activated by proteolytic removal of an inert 500 amino-acid-
long C-terminal region, enabling the activated toxin to bind to
insect midgut receptor proteins, leading to its membrane inser-
tion and pore formation. It has been proposed that the C-termi-
nal region is only involved in toxin crystallization, but its role in
receptor binding is undefined. Here we show that the C-termi-
nal region of Cry1Ab protoxin provides additional binding sites
for alkaline phosphatase (ALP) and aminopeptidase N (APN)
insect receptors. ELISA, ligandblot, surface plasmon resonance,
and pulldown assays revealed that the Cry1Ab C-terminal
region binds to both ALP and APN but not to cadherin. Thus,
the C-terminal region provided a higher binding affinity of the
protoxin to the gut membrane that correlated with higher
toxicity of protoxin than activated toxin. Moreover, Cry1Ab
domain II loop 2 or 3mutations reduced binding of the protoxin
to cadherin but not to ALP or APN, supporting the idea that
protoxins have additional binding sites. These results imply that
twodifferent regionsmediate the binding ofCry1Abprotoxin to
membrane receptors, one located in domain II–III of the toxin
and another in its C-terminal region, suggesting an active role of
the C-terminal protoxin fragment in the mode of action of Cry
toxins. These results suggest that future manipulations of the
C-terminal protoxin region could alter the specificity and
increase the toxicity of B. thuringiensis proteins.
Insecticidal proteins from the soil bacterium Bacillus thur-
ingiensis (Bt)2 are used extensively in transgenic plants and
sprays to control insect pests (1, 2). These Bt proteins are espe-
cially valuable because they kill some of the world’s most harm-
ful pests but are not toxic to people and most other organisms
(3–5). Cultivation of crops genetically engineered to produce Bt
proteins increased to over 100 million hectares in 2017 (1).
Although Bt proteins have provided substantial economic and
environmentalbenefits (1,2,6–11), rapidevolutionofpestresis-
tance is reducing these advantages (12, 13).
A better understanding of themode of action of Bt proteins is
needed to improve and sustain their efficacy.Many studies have
investigated the mode of action of the crystalline (Cry) Bt pro-
teins in the Cry1A family, which kill caterpillar pests and are
produced by widely adopted transgenic Bt corn, cotton, and
soybeans (1, 2, 14, 15). To exert toxicity, Cry1A proteins bind to
insect midgut receptors, such as glycosylphosphatidylinositol-
anchored proteins like aminopeptidaseN (APN), alkaline phos-
phatase (ALP) or to a transmembrane cadherin (CAD) to exert
toxicity (14, 16). In particular, loops 2 and 3 of domain II of
Cry1A toxins are important for binding to midgut receptors
(14, 16). The different models of the Bt mode of action
described so far include conversion of the full-length Cry1A
protoxins by insect midgut proteases to yield activated toxins
that bind to insect midgut receptors (14–17). This activation
entails removal of 40 amino acids from the N terminus and
more than 500 amino acids from theC terminus, converting the
protoxins (130 kDa) into activated toxins (65 kDa) (14, 15).
The “classical model” of the Bt mode of action asserts that
protoxinsmust be converted to activated toxins before receptor
binding, toxin oligomerization, and pore formation. Thus, this
model does not include any role the C-terminal fragment of the
protoxin may have in the mode of action of Cry toxins (14, 15).
Contrary to this paradigm, bioassays performed against at least
10 resistant strains selected with activated Cry1Ac toxin of four
major lepidopteran pests showed that the Cry1Ac protoxin was
still able to kill populations resistant to activated toxin, showing
5- to 50-fold higher potency than the activated toxin (18–20).
These results with whole insects imply that the intact protoxin
or some part of the protoxin other than the activated toxin
contributes to toxicity.
In vitro experiments with different fragments of CAD recep-
tor from Pectinophora gossypiella andManduca sexta demon-
strated that both the protoxin and activated toxin forms of
Cry1Ac or Cry1Ab bind to the CAD receptor, specifically to
This work was supported in part by Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología
Fronteras 008 and PAPIIT-UNAM (Programa de Apoyo a Proyectos de
Investigación e Innovación Tecnológica-Universidad Nacional Autónoma
de México) IN202718 and IN213514. The authors declare that they have no
conflicts of interest with the contents of this article.
This article contains Figs. S1–S3.
1 To whom correspondence should be addressed: Tel./Fax: 52-777-329-1624;
E-mail: isabelg@ibt.unam.mx.
2 The abbreviations used are: Bt, Bacillus thuringiensis; Cry, crystalline; APN,
aminopeptidase N; ALP, alkaline phosphatase; CAD, cadherin; LC50, 50%
lethal concentration; BBMV, brush border membrane vesicle; SPR, surface
plasmon resonance; PMSF, phenylmethylsulfonyl fluoride; HRP, horserad-
ish peroxidase; PVDF, polyvinylidene difluoride; CNBr, cyanogen bromide.
cro
ARTICLE
J. Biol. Chem. (2018) 293(52) 20263–20272 20263
© 2018 Peña-Cardeña et al. Published under exclusive license by The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.
CAD repeats 8–11 (CR8–11) from P. gossypiella CAD and to
CR7–12 from M. sexta (21, 22). Furthermore, both forms pro-
moted different post-binding events in the toxic pathway; two
different pathways of oligomerization and pore formation have
been described that are based on the interaction of protoxin or
the activated toxin with the CAD receptor (18, 21). One oli-
gomer is formed by protease activation of the protoxin after
binding to CAD, and a different oligomer is formed by the acti-
vated toxin after binding to CAD (21). These oligomers have dif-
ferent sensitivities to temperature and differ in their open proba-
bility and conductance (21). In bioassays performed in the cell line
CF203 from Choristoneura fumiferana showed that both the
intact Cry1Ac protoxin without activation and the activated
Cry1Ac toxin were toxic to these cells, but the cytological damage
to treatedcells differedbetween them(23).Theaforementioned in
vitro experiments performed in the cell line directly tested the
effects of intact protoxins because they excluded the proteolytic
activation that occurs in insect midguts.
The C-terminal protoxin region of Cry1A toxins has been pro-
posed to be an inert region of the protein that is only involved in
crystallization of Cry proteins during the sporulation phase of Bt,
and no other role in the mechanism of action of Cry proteins has
been attributed to this region (15, 24). However, this C-terminal
protoxin region, which is removed during activation, is organized
into distinct structural domains (24), where domains V and VII
resemble carbohydrate-bindingmodules and are structurally sim-
ilar to domains II and III of the activated toxin (24), whichmediate
binding tomidgut receptors (15).
The objective of this work was to determine whether the
C-terminal region of the protein has a role in Cry toxicity. Our
hypothesis was that the C-terminal portion of the protoxin has
an active role in Cry toxicity by binding to insect midgut recep-
tors. Herewe report the first tests of that hypothesis, performed
with different binding assays. Also, we analyzed different sin-
gle-point Cry1Ab mutants with alterations in domain II that
were previously reported to be affected in binding interaction
with Cry receptors but were analyzed only as activated toxins
(25–31). Overall, our results indicate that the C-terminal frag-
ment of Cry1Ab protoxin is directly involved in the protoxin
mode of action by binding toCry toxin receptors. This region of
protoxin contributes to toxicity with additional binding sites to
ALP and APN, whereas domain II contributes to CAD binding.
Results
Binding of the C-terminal fragment of Cry1Ab-protoxin to
M. sexta brush border membrane vesicles and to Cry1Ab
receptors
To determine whether the C-terminal portion of Cry1Ab
protoxin binds to insect midgut receptors, the C-terminal
region ofCry1Abprotoxinwas cloned, expressed inEscherichia
coli cells, and purified by affinity chromatography (Fig. 1). The
Cry1Ab protoxinwas obtained from solubilized purified crystal
inclusions, and the Cry1Ab activated toxin was purified by
anion exchange chromatography after protoxin activation with
trypsin (Fig. S1). Fig. S2 shows the Western blot analysis of
these samples using anti-Cry1Ab toxin or anti-C-terminal anti-
bodies, showing that anti-Cry1Ab toxin antibody cross-reacts
with activated toxin and protoxin, but not with the C-terminal
fragment and the anti-C-terminal antibody recognized both
protoxin and the C-terminal fragment, and did not recognize
the activated toxin.
The toxicity of these samples was tested against M. sexta
neonate larvae. The C-terminal fragment was not toxic to the
larvae; no toxicity was observed with 5 g/cm2 of this protein.
However, the protoxin showed an LC50 value of 3.4 ng/cm2
(95% fiducial limits, 2.5–4.3), in contrast to the activated toxin,
which showed an LC50 value of 10.3 ng/cm2 (By 95% fiducial
limits, 7.8–13), showing that the protoxin was 3-fold more
toxic than the activated toxin.
The binding analysis of purified protoxin, activated toxin, or
C-terminal fragment to BBMVs fromM. sexta showed that the
C-terminal fragment also interacts with BBMVs with a high
apparent binding affinity (Kd  25 nM), similar to the apparent
binding affinity of the protoxin (Kd  16 nM) and the activated
toxin (Kd  18 nM) (Fig. 2). To determine whether the C-termi-
nal fragment was able to bind to Cry protein receptors such as
CAD, APN, or ALP, we performed ELISA binding assays using
purified ALP, APN, and CAD (CR7–12 fragment) expressed in
E. coli cells (Fig. S3). We used the CAD fragment CR7–12 (res-
idues M810-A1485 of M. sexta CAD) because this fragment
contains all three epitopes of CAD protein involved in Cry1Ab
binding (32–34). Our data show that the C-terminal fragment
bound to ALP and APN with high affinity (Kd values of 55  9
nM and 24 3 nM, respectively) (Fig. 3A) but showed extremely
low absorbance values at 490 nm in the ELISA binding assay in
the interaction with CAD (CR7–12). These data were con-
firmed by kinetic binding studies performed with the immobi-
lized C-terminal fragment in surface plasmon resonance (SPR)
assays, which showed that the C-terminal region was able to
bind to APN and ALP with high affinity (Kd values of 185  3
nM and 88  5 nM, respectively) but not to CAD (CR7–12) (Fig.
3B). We also performed ligand blot assays of the protoxin, acti-
vated toxin, and C-terminal fragment to different concentra-
tions of each receptor molecule (CR7–12, ALP, and APN).
Figure 1. Expression and purification of the recombinant C-terminal
region of the Cry1Ab protoxin in E. coli cells. The C-terminal (C-term) frag-
ment was purified by affinity chromatography through a nickel affinity col-
umn by using the His tag provided in the pET22b cloning vector and eluted
with 250 mM imidazole. The samples were analyzed by SDS-PAGE (10% acryl-
amide) stained with Coomassie Blue. M, molecular size marker; molecular
masses are shown in kDa.
C-terminal region of Cry1Ab protoxin binds to APN and ALP
20264 J. Biol. Chem. (2018) 293(52) 20263–20272
These data confirmed that the C-terminal fragment did not
bind to CAD (CR7–12) but was able to bind to ALP and APN
(Fig. 4).
Finally, to demonstrate that the C-terminal fragment of
Cry1Abwas able to interactwithAPNandALPbut notwith the
complete CAD receptor that is present in the insect BBMVs,
pulldown assays with BBMV proteins fromM. sexta were per-
formed. Fig. 5 shows that CADwas pulled down by the Cry1Ab
protoxin and by the activated toxin but not by the C-terminal
fragment, supporting that theC-terminal region of Cry1Abwas
unable to bind to theCAD receptor. As expected, we found that
APNwas pulled down by the Cry1Ab protoxin, activated toxin,
and C-terminal fragment (Fig. 5). However, ALP was pulled
down strongly by the C-terminal fragment but not by protoxin
and only weakly by activated toxin (Fig. 5).
Binding of WT and mutant Cry1Ab protoxins and activated
toxins to recombinant CAD, ALP, and APN receptors
We compared the binding interaction of Cry1Ab protoxin
and activated toxin with the recombinant purified receptors.
Fig. 6A shows the results of ELISA binding assays of WT
Cry1Abprotoxin and activated toxin toCAD (CR12), where the
apparent binding affinity was 2.4-fold higher for the activated
toxin than the protoxin (Fig. 6A and Table 1). Conversely, for
APN and ALP receptors, the apparent binding affinity was
higher for protoxin than for activated toxin (11- and 3.7-fold
higher for protoxin binding to ALP andAPN, respectively, than
the activated toxin) (Fig. 6, B and C, and Table 1).
We worked with some Cry1Ab mutant proteins (Cry1Ab-
RR368–369AA, Cry1Ab-F371A, and Cry1Ab-G439D) that are
located in domain II of Cry1Ab toxin and were characterized
previously, showing reduced binding to BBMVs and lower tox-
icity to M. sexta (25–31). It is important to mention that the
binding data of these mutants to BBMVs or to purified recep-
tors that were reported before were performed only with acti-
vated toxin. Here we compared the binding of the protoxin and
the activated toxin from these mutants to purified APN, ALP,
and CAD (CR12) receptors. Cry1Ab-RR368–369AA and
Cry1Ab-F371Ahavemutations in domain II loop 2 (16, 25–28).
Previous work showed that the activated Cry1Ab-RR368–
369AA mutant toxin had reduced binding to APN in SPR
Figure 2. ELISA binding analysis of Cry1Ab protoxin, Cry1Ab activated toxin, and the C-terminal fragment from Cry1Ab to BBMVs purified from
M. sexta midgut tissue. A, the binding of these proteins revealed with anti-Cry1Ab antibody that was raised against the activated Cry1Ab toxin. This antibody
does not cross-react with the C-terminal fragment (Fig. S1). B, the binding of these proteins revealed with anti-C-terminal antibody that was raised against the
purified C-terminal fragment. This antibody does not cross-react with Cry1Ab activated toxin (Fig. S1). A total of 1 g of protein of BBMVs was bound to each
of the wells of the ELISA plate. Each experiment was performed in duplicate with a total of three repetitions. Standard deviations are shown.
Figure 3. Binding analysis of the C-terminal fragment to CAD, APN, and ALP. A, ELISA binding assays of the C-terminal fragment of Cry1Ab to the purified
recombinant CR7–12 fragment, ALP, or APN expressed in E. coli cells. Each experiment was performed in duplicate with a total of three repetitions. Standard
deviations are shown. B, SPR binding analyses of the C-terminal fragment to Cry1Ab receptors, performed by immobilizing the C-terminal fragment by
conventional amine coupling. Sensorgrams of serial doubling dilutions of each purified receptor (CAD (CR7–12), APN, and ALP) are shown. RU, response units.
C-terminal region of Cry1Ab protoxin binds to APN and ALP
J. Biol. Chem. (2018) 293(52) 20263–20272 20265
assays, and the activated form of Cry1Ab-F371A mutant toxin
showed reduced binding to M. sexta BBMVs (16, 25–28). Pre-
vious work showed that the activated form of Cry1Ab-G439D
mutant toxin with a mutation in domain II loop 3 showed
reduced binding with the CAD (CR12) fragment (29–31). Fig.
S1 shows the purified protoxin and the activated toxin mole-
cules from the different mutant proteins. We used the CAD
fragment CR12 (residues G1370-A1485 of M. sexta CAD)
because it is an important Cry1Ab-binding region of CAD (33–
35), and the binding phenotype of the Cry1Ab mutants has
been reported previously with the CAD binding site CR12 (30).
For the three Cry1Ab mutants, the apparent binding affinity of
protoxins and activated toxins to CAD was reduced more than
11-fold relative to the WT Cry1Ab, and a final Kd value could
not be determined (Table 1 and Fig. 6A). These results imply
that both of these domain II exposed loops participate in the
binding of protoxin and activated toxin to CAD. In contrast,
the apparent binding affinity to ALP and APN was similar for
the protoxins of these threemutants relative to theWTCry1Ab
protoxin (Table 1 and Fig. 6, B and C). The binding analysis of
the activated toxin form of thesemutants showed that Cry1Ab-
F371A did not reduce binding to ALP or APN; Cry1Ab-
RR368–369AA reduced binding 1.3-fold toALP and 1.9-fold to
APN, andCry1Ab-G439D reduced binding 2.7-fold toALP and
2.9-fold to APN (Table 1, Fig. 6, B andC). These results suggest
that loops 2 and 3 of domain II, particularly loop 3, contribute to
binding of Cry1Ab activated toxin to ALP and APN. The new
data showed that thesemutationswere not affected in the bind-
ing interaction of their protoxin molecules to ALP and APN,
supporting that additional regions present in the protoxin are
involved in ALP and APN binding.
Discussion
We discovered that ALP and APN from M. sexta interact
with high affinity with the C-terminal region of Cry1Ab pro-
toxin (Figs. 3–5). The C-terminal fragment was produced in
Figure 4. Ligand blot assays of Cry1Ab protoxin, Cry1Ab activated toxin, and the C-terminal fragment from Cry1Ab to the purified recombinant CAD
(CR7–12) fragment, ALP, or APN proteins expressed in E. coli cells. Shown are serial dilutions of the recombinant receptor proteins that were loaded in
SDS-PAGE and transferred to PVDF membranes. These blots were used for ligand blot binding assays. The numbers under the bands represent the percentage
of each band on the blot, calculated after densitometry analysis of the bands using ImageJ software and selecting one band of the protoxin bound to the lower
concentration of receptor as 100% reference. Molecular masses are indicated. A, ligand blot assays of 5 nM Cry1Ab protoxin, Cry1Ab activated toxin, and the
C-terminal fragment from Cry1Ab to CAD (CR7–12). B, ligand blot assays of 200 nM Cry1Ab protoxin, Cry1Ab activated toxin, and the C-terminal fragment from
Cry1Ab to ALP. C, ligand blot assays of 200 nM Cry1Ab protoxin, Cry1Ab activated toxin, and the C-terminal fragment from Cry1Ab to APN. M, molecular size
marker; molecular masses are shown in kDa.
C-terminal region of Cry1Ab protoxin binds to APN and ALP
20266 J. Biol. Chem. (2018) 293(52) 20263–20272
E. coli because, after treatment of protoxins with trypsin, the
C-terminal fragment is cleaved further, making it impossible to
purify the C-terminal fragment after protoxin activation with
trypsin (36).
The binding affinity of Cry1Ab protoxin to both receptors
was higher than activated toxin (Table 1), indicating that C-ter-
minal fragment has additional binding sites for these receptors.
These results do not support the notion that the C-terminal
region of protoxins is solely involved in crystal formation and
has no role in the toxicity of Cry proteins (14, 15, 35, 37). Con-
versely, they are consistent with the proposition that the C-ter-
minal regions of protoxins contribute to the binding and toxic-
ity of Cry proteins (18, 21). The idea that protoxins participate
in toxicity by binding toCry toxin receptors is also supported by
the in vitro binding experiments of Cry1Ab and Cry1Ac pro-
toxin, performed with CAD protein from P. gossypiella and
M. sexta larvae (21, 22), with bioassays performed in the cell
line CF203 and 10 resistant strains of Diatraea saccharalis,
Helicoverpa armigera, Helicoverpa zea, and Ostrinia nubilalis,
against which protoxin was more potent than activated toxin
(18–20).
The new results revealing binding of theC-terminal region of
Cry1Ab protoxin to ALP and APN provide evidence of the
mechanism by which protoxin could exert toxicity by binding
to receptors, leading to toxin oligomerization and pore forma-
tion. For protoxins to exert toxicity, it is required that the full
protoxin reaches the CAD receptor located in brush border
membranes before activation by midgut proteases. Thus, high-
affinity binding sites of protoxins to the abundant glycosylphos-
phatidylinositol-anchored proteins could provide means for the
binding of protoxin to brush border membranes before its acti-
vation. Fig. 7 shows a model of the mechanism of action of
Cry1A protoxin, showing that interaction with APN and ALP
helps the protoxin to reach the CAD receptor before activation
by midgut proteases. Interaction of protoxin with CAD by
means of domain II exposed loops, in the presence of midgut
proteases, would induce the formation of a robust oligomer that
displays pore formation activity with a single conductance and
high open probability, as demonstrated previously (21).
The new results presented here show that mutations
Cry1Ab-RR368-369AA in loop 2 and Cry1Ab-G439D in loop 3
of domain II reduced binding to ALP and APN of the activated
toxin but not of the protoxin, indicating differences in binding
sites to ALP and APN between Cry1Ab protoxin and activated
toxin. The specific sites of protoxin involved in interactionwith
ALP and APN remain to be elucidated. In particular, it will be
useful to test the hypothesis that binding occurs via domains V
and VII, which resemble carbohydrate-binding modules and
are structurally similar to domains II and III of the activated
toxin (24). It also remains to be analyzed whether the C-termi-
nal region binds to the ABC transporter proteins that are
important proteins implicated in the toxicity of Cry1A toxins
(38–40). Recent data have shown that domain II loops are the
regions of Cry1A activated toxins involved in the interaction
with the ABCC2 transporter (41).
In contrast to the results withALP andAPN, binding toCAD
(CR12) by protoxin and activated toxin was greatly reduced for
all three of the Cry1Ab mutants tested (Cry1Ab-RR368–
369AA and Cry1Ab-F371A in loop 2 and Cry1Ab-G439D in
loop 3). These findings suggest that loops 2 and 3 of domain II
are important for binding of both Cry1Ab protoxin and acti-
vated toxin to CAD inM. sexta. Thus, similar sites of domain II
of both molecules participate in CAD interaction.
In other pore-forming toxins, it has been reported that they
bind to their receptors as protoxins and that the propeptides,
when they are proteolyzed, may display additional functions,
such as chaperones that help to keep the protein in question
soluble under certain conditions and assist with its secretion or
its oligomerization (42). For example, the C-terminal propep-
tide of aerolysin from Aeromonas hydrophila assists in oligo-
merization and pore formation (43). Also, the Clostridium sep-
ticum pore-forming -toxin is secreted as a protoxin, and its
propeptide function as a chaperone (44). Here we found that
the C-terminal region of Cry1Ab protoxin binds ALP andAPN.
An additional important implication of this finding is that this
regionmay influence specificity and toxicity. If so, then, similar
to achievements observed previously with activated toxins,
where it has been shown that domain swapping and site-di-
rected mutagenesis as well as evolution of toxins resulted in
improved toxins (45–47), the engineering of the C-terminal
region could potentially generate novel Cry proteins that could
be more potent against specific target insects or may help to
counter insect resistance.
Materials and methods
Purification of Cry1Ab WT and mutant proteins
The Bt 407 strain (48) transformed with pHT315-cry1Ab
(49), pHT315-cry1AbRR368–369AA, pHT315-cry1AbF371A,
or pHT315-cry1AbG439D (16, 30) plasmids was grown for 3
days at 30 °C until complete sporulation in SP medium (0.8%
nutrient broth, 1 mM MgSO47H2O, 13 mM KCl, and 10 mM
MnCl24H2O (pH 7.0) supplemented with 2 ml/liter of sterile
solution of 131 mM FeSO47H2O in 1NH2SO4 and 1 ml/liter of
Figure 5. Pulldown assays of BBMV proteins using Cry1Ab protoxin,
Cry1Ab activated toxin, and the C-terminal fragment from Cry1Ab
bound to CNBr-agarose. The precipitated BBMV proteins with Cry1Ab pro-
toxin, Cry1Ab activated toxin, and the C-terminal (C-term) fragment from
Cry1Ab were reveled with specific antibodies that recognize CAD, APN, or
ALP proteins. Molecular masses are indicated.
C-terminal region of Cry1Ab protoxin binds to APN and ALP
J. Biol. Chem. (2018) 293(52) 20263–20272 20267
  
  
   
Binding to CAD receptor 
1.0  
      
  
 
  
   
  
  
  
  
 
  A
b
s
o
r
b
a
n
c
e
 
49
0 
nm
 
  
10 7 
037 08 
E Cry1Ab E 
50 > 30 F371A 
E S o  RR368-369AAo 
E 04) E 04 a 
Z RR368-369AAr Z G4391F 
< < 
02, 02 
G439D» 
0.0 $ : : " 0.0 $ . " - 
0 200 400 600 800 0 200 400 600 800 
Cry1Ab Protoxin (nM) Cry1Ab Toxin (nM) 
Binding to ALP receptor 
12 CryjAb ETA 12 y 
RR368-369 AA so] 
d sd G439D* E : 
30 Ss 087 
3 0.6 3 0: - 
4 0.4 2 0.4 + 
0.2 0.2 y 
0.04 - - - - . 0.0 , . . , , 
100 200 300 400 500 0 100 200 300 400 500 
Cry1Ab Protoxin (nM) Cry1Ab Toxin (nM) 
Binding to APN receptor 
si Cry1Ab 
A
b
s
o
r
b
a
n
c
e
 
49
0 
nm
 
  
  
 
20 80 100 0 50 40 60 
Cry1Ab Protoxin (nM) 
100 150 200 250 
Cry1Ab Toxin (nM)   
¿ASBMB
Figure 6. ELISA binding assays of Cry1Ab and Cry1Ab-mutant proteins to the purified recombinant CAD (CR12), ALP, or APN expressed in E. coli cells.
The three Cry1Ab mutants (Cry1Ab-RR368 –369AA, Cry1Ab-F371A, and Cry1Ab-G439D) were affected in toxicity against M. sexta larvae. A, binding of protoxin
or activated toxin molecules to the purified CAD (CR12) receptor fragment. B, binding of protoxin or activated toxin molecules to purified ALP. C, binding of
protoxin or activated toxin molecules to purified APN. Each experiment was performed in duplicate with a total of three repetitions. Standard deviations are
shown.
C-terminal region of Cry1Ab protoxin binds to APN and ALP
20268 J. Biol. Chem. (2018) 293(52) 20263–20272
sterile 0.5 M CaCl2) supplemented with erythromycin at 10
g/ml. Spores/crystals were washed three times in 300 mM
NaCl and 10 mM EDTA and then three times with 1 mM phen-
ylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) and stored at 4 °C. The crys-
tal inclusions were purified by discontinuous sucrose gradients
as described previously (50). Protoxins were solubilized in alka-
line buffer (50 mM Na2CO3, 0.02% -mercaptoethanol (pH
10.5)) for 1 h at 37 °C and centrifuged for 20 min at 12,857  g.
For activation, the pH level of the protoxin solution was
lowered to 8.5 by adding 1:4 (w/w) of 1MTris buffer (pH 8), and
1:50 trypsin (trypsin:toxin) (L-1-tosylamido-2-phenylethyl
chloromethyl ketone–treated trypsin from bovine pancreas,
Sigma-Aldrich) was added for 1 h at 37 °C; after this incubation,
PMSF (1 mM final concentration) was added. The trypsin-acti-
vated toxins were loaded into a HiTrap Q HP column con-
nected to an FPLC system (ÄKTA, GE Healthcare Life Sci-
ences), washed with buffer A (50 mM NaCl and 50 mM Tris
buffer (pH 8)), and eluted with a 0–100% gradient of buffer B (1
M NaCl and 50 mM Tris buffer (pH 8.5)). The protein concen-
tration was determined by using the Bradford assay (Bio-Rad)
with BSA as the standard. The quality of the samples was ana-
lyzed by SDS-PAGE (10% acrylamide) stained with Coomassie
Blue and byWestern blotting using a specific anti-Cry1Ab anti-
body (Fig. S1).
Cloning of the C-terminal fragment
The C-terminal fragment was amplified with specific prim-
ers: ForC-ter, 5-TAT CTG GGA TCC TCG AAT TGA ATT
TGT TCC GGC AG-3; RevC-ter, 5-GAG CTC GAA TTC
AATTCCTCCATAAGAAGTAATTCC-3. The PCR prod-
uct was digested with BamHI and EcoRI and cloned into pET-
22b (Novagen, Madison, WI). Plasmids were DNA-sequenced
in the facilities of the Instituto de Biotecnología, Universidad
Nacional Autónoma de México.
Toxicity assays against M. sexta larvae
Bioassays were performed with neonate larvae using five
concentrations of Cry1Ab protoxin, activated toxin, or C-ter-
minal fragment solutions that were poured onto the surface of
the diet. We used 24-well polystyrene plates and one plate per
dose in triplicate. Mortality was analyzed after 7 days, and the
50% lethal concentration (LC50) was calculated with Probit
LeOra software. Negative controls without protein addition
were included.
Preparation of BBMVs from M. sexta larvae
The M. sexta colony was maintained on an artificial diet
under laboratory conditions at 28 2 °C and 65% 5% relative
humidity under a 12:12 (light-dark) photoperiod. The midgut
tissue was dissected from third-instar larvae. The BBMVs were
prepared as described previously (51) and stored at70 °C. The
BBMV protein concentrations were determined with the
Lowry DC protein assay (Bio-Rad) using BSA as the standard.
The enrichment of APN (5-fold) and ALP (4-fold) activities in
the BBMVs in relation to the homogenate was analyzed as
reported previously (16).
Expression and purification of recombinant Cry receptors and
the C-terminal fragment
CAD (CR12 and CR7–12), ALP, and APN fromM. sexta lar-
vae were cloned in pET-22b and expressed in E. coli cells (52–
54). The CAD fragments CR12 (G1370-A1485) and CR7–12
(M810-A1485) were expressed in E. coli ER2566. APN, ALP,
and the C-terminal fragment were expressed in E. coli BL21
(DE3) (Invitrogen). Expression was induced with 1 mM isopro-
pyl 1-thio--D-galactopyranoside, and inclusion bodies were
solubilized with 8 M urea as reported previously (52–54). The
recombinant proteins were purified through a nickel affinity
column that bound the recombinant proteins through the His
tag peptide added in the pET-22b cloning vector. Proteins were
eluted with 250 mM imidazole in PBS as described previously
(29, 52–54). The quality of the samples was analyzed by SDS-
PAGE (10% acrylamide) stained with Coomassie Blue and by
Western blotting using a specific anti-C terminus antibody
(Figs. S1 and S2).
ELISA binding assays
ELISAplates were coatedwith 0.5g ofM. sextaCAD (CR12
or CR7–12), APN, or ALP in 100 l of PBS/well overnight at
4 °C or with 1 g of BBMVs. Plates were washed three times
with PBS, blockedwith 200l/well of PBS-M (PBS and 2% skim
milk) for 2 h at 37 °C and washed three times with PBS. Differ-
ent concentrations of protoxin or activated toxins of WT or
mutants or the C-terminal fragment from Cry1Ab were added
to a total 100-l volume of PBST (PBS and 0.1% Tween 20) for
1 h at 37 °C. The unbound proteins were removed by three
washes with PBST and three washes with PBS. The bound pro-
teins were detected using 100 l of PBST buffer containing
anti-Cry1Ab (1:20,000) polyclonal antibody for 1 h at 37 °C or
anti-C-terminus (1:30,000) polyclonal antibody. After three
washes with PBST and three washes with PBS, we added 100 l
of PBST containing anti-rabbit HRP-conjugated antibody
(1:20,000) (Santa Cruz Biotechnology) for 1 h at 37 °C. Finally,
three washes with PBST were done, and proteins were incu-
bated with 100 l/well of substrate mixture (2 mM O-phe-
nylenediamine (Sigma) and 0.05% H2O2 in 0.1 M phosphate
buffer (pH5.0)). The reactionwas stoppedwith 60l of 5MHCl
and measured at A490 nm using an ELISA plate reader. Each
experiment was performed in duplicate with three repetitions.
Data were analyzed with the SigmaPlot program (version 12.0)
and adjusted with Scatchard plot analysis.
The anti-C-terminus polyclonal antibody was raised in a
New Zealand White rabbits after subcutaneous immunization
with purified C-terminal fragment. The rabbit was boosted
three times with 1 mg of the C-terminal fragment mixed with
incomplete Freund’s adjuvant at 15-day intervals. Blood serum
Table 1
Equilibrium dissociation constants (nanomolar) for interactions
between wildtype and mutant Cry1Ab protoxins and activated toxins
with recombinant CR12, ALP, and APN
NB, no binding.
Type of
Cry1Ab
CR12 ALP APN
Protoxin Toxin Protoxin Toxin Protoxin Toxin
WT 85  14 35  4 28  2 296  3 79  8 296  5
RR368–9AA NB NB 22  3 381  36 55  6 572  53
F371A NB NB 16  2 242  48 40  5 214  8
G439D NB NB 14  2 806  88 30  4 870  32
C-terminal region of Cry1Ab protoxin binds to APN and ALP
J. Biol. Chem. (2018) 293(52) 20263–20272 20269
was obtained. Specificity and sensitivity were determined in a
ligand blot assays of the C-terminal fragment spotted on nitro-
cellulose strips and analyzed with different concentrations of
the polyclonal anti-C-terminus antibody (from 1:10,000 to
1:50,000 dilutions) and the secondary goat anti-rabbit HRP
antibody (1:30,000 dilution). All procedures involving animals
were conducted according to the ethical guidelines of the Insti-
tuto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de
México.
Biosensor (SPR) analysis of C-terminal binding to
Cry1Ab-receptors
The SENSI-Q instrumentwas used to performSPRmeasure-
ments. Running buffer (HBS buffer (pH 7.4) containing 0.1 M
HEPES, 1.5 M NaCl, and 0.005% (v/v) Tween 20) was freshly
prepared, filtered (pore size of 0.22 m), and degassed. The
C-terminal fragment of Cry1Ab was immobilized onto a
COOH functionalized sensor chip (ICXNomadics) by conven-
tional amine coupling at densities of less than 1500 response
units (RU). Then 1 M ethanolamine at a flow rate of 10 l/min
for 5 min was injected to block flow cells. The analytes (CAD
(CR7–12), APN, or ALP) were injected at a flow rate of 25
l/min. Serial doubling dilutions of Cry1Ab receptors were
analyzed, and the surface was regenerated with a 1-min injec-
tion of 20mMNaOH. Injectionswere performed three times for
each receptor protein concentration. The data were analyzed
using SensiQ Software Qdat version B.02. This software
employs nonlinear regression and the Levenberg–Marquardt
algorithm to fit experimental data to a binding interaction
model that defines the interaction.
Ligand blot assays
Serial dilutions of the recombinant CAD (CR7–12), ALP (5,
2.5, 1.25, and 0.625 g), and APN (10, 5, and 2.5 g) proteins
were separated by 10% SDS-PAGE and transferred to a PVDF
membrane. The PVDF membrane was blocked with PBS sup-
plementedwith 5% skimmedmilk, and blots were incubated for
1 h at room temperaturewithCry1Abprotoxin, activated toxin,
or the C-terminal fragment. We used 5 nM protein in washing
buffer (0.1% Tween 20 in PBS) for the ligand blot analysis with
CR7–12 and 200 nM protein for the ligand blot analysis with
ALP and APN. Unbound proteins were removed by washing
three times in washing buffer for 15 min. Bound toxin and pro-
toxin were identified with anti-Cry1Ab polyclonal antibody
(1:20,000 dilution) and bound C-terminal fragment with anti-
C-terminus polyclonal antibody (1:20,000 dilution) for 1 h at
room temperature. After washing, the membrane was incu-
bated with the secondary goat anti-rabbit HRP antibody
(1:20,000 dilution) for 1 h at room temperature. After washing
the excess of unbound secondary antibody, proteins were visu-
alized with Super Signal chemiluminescence substrate (Pierce).
Pulldown assays
BBMVs from M. sexta were solubilized for 2 h at 4 °C in 20
mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, and 1 mM
PMSF containing 1% CHAPS (v/v). Undissolved material was
removed by centrifugation at 100,000  g for 1 h at 4 °C. We
used 100 g of purified Cry1Ab activated toxin, protoxin, or
C-terminus that was incubated with 200 l of CNBr-agarose
(GE Healthcare) in 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.5) at
4 °C overnight. The noncoupled proteins were removed by cen-
trifugation. The unreacted CNBr groups were blocked with 0.1
M Tris-HCl (pH 8) at room temperature for 2 h. The resin was
washed five times with 500 l of PBS. The CNBr beads coupled
to protoxin, activated toxin, or the C-terminal fragment were
incubated with 200 g of solubilized BBMV proteins in 500 l
for 1 h at 4 °C; the unbound BBMV proteins were removed by
centrifugation at 18,400  g for 10 min at 4 °C. The coupled
CNBr-agarose beads containing the bound proteins from BBMV
werewashed five timeswith 500l of PBS supplementedwith 1M
NaCl, followed by five washes with 500 l of PBS to remove
unboundproteins.Theproteins that remainedboundto theCNBr
protoxin–, activated toxin–, or C-terminal–agarose beads were
dissociated after 5min at 100 °C in 50l of loading buffer (100mM
Figure 7. Proposed mechanism of action of Cry protoxins from Bt. 1, the parasporal crystals are solubilized into protoxin. 2, the C-terminal region of
protoxin binds with highly abundant APN and ALP receptors. 3, the protoxin binds to the CAD receptor by the loops of domain II. 4, proteases activate the
protoxin, inducing oligomer formation. 5, the oligomer inserts into the membrane, forming a pore that kills the cell. The interaction with APN and ALP with the
C-terminal region helps the protoxin to reach the CAD receptor before proteolytic activation, and the interaction of protoxin with CAD in the presence of
midgut proteases induces the formation of a robust oligomer that displays high pore formation activity with single conductance and a high open probability,
as demonstrated previously (18).
C-terminal region of Cry1Ab protoxin binds to APN and ALP
20270 J. Biol. Chem. (2018) 293(52) 20263–20272
TrisCl, 200mMDTT, 4% SDS (w/v), 0.2% bromphenol blue (w/v),
and 20% glycerol (v/v) (pH 6.8)). As a negative control, the acti-
vated CNBr-agarose was incubated without Cry1Ab protein,
blocked as described above, and incubated with solubilized
BBMV. The pulled down proteins were separated in 10% SDS-
PAGE and transferred to PVDF membranes that were used in
Western blotting assays using anti-CAD, anti-ALP, and anti-APN
polyclonal antibodies as described below.
Western blotting assays
The anti-Cry1Ab, anti-CAD, anti-ALP, and anti-APN poly-
clonal antibodies were raised previously in our laboratory. The
anti-C-terminal antibody was raised for this work as reported
above. For Western blot assays, the PVDF membranes were
blockedwith 5% skimmedmilk in PBS buffer (pH 7.4) plus 0.1%
Tween 20 for 1 h at room temperature. The membranes were
rinsed once with the same buffer. The different proteins were
detected after 1-h incubation with the corresponding poly-
clonal antibody (anti-CAD 1:20,000, anti-ALP and anti-APN
1:10,000, anti-Cry1Ab 1:20,000, and anti-C-terminus 1:20,000
dilutions) and for 1 hwith goat anti-rabbit HPR secondary anti-
body (Santa Cruz Biotechnology) (1:20,000 dilution) and finally
visualized by incubation with Super Signal chemiluminescence
substrate (Pierce) according to themanufacturer’s instructions.
Author contributions—A. P.-C., B. E. T., A. B.,M. S., and I. G. formal
analysis; A. P.-C., R. G., A. B., M. S., and I. G. investigation; A. P.-C.,
R. G., J. S., M. S., and I. G. methodology; J. S. supervision; B. E. T.,
A. B.,M. S., and I. G. writing-review and editing; A. B. and I. G. fund-
ing acquisition; I. G. conceptualization; I. G. writing-original draft.
Acknowledgments—We thank Lizbeth Cabrera for technical
assistance.
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Anexo II
Colaboración de la estudiante en otro proyecto del grupo de investigación
Identification of Aminopeptidase-N2 as a Cry2Ab binding protein in Manduca
sexta
Janette Onofre, Meztlli O Gaytán, Arlen Peña-Cardeña, Blanca I
García-Gomez, Sabino Pacheco, Isabel Gómez, Alejandra Bravo, Mario
Soberón
Peptides (2017) Dec;98:93-98.
91
Peptides 98 (2017) 93–98
Contents lists available at ScienceDirect
Peptides
j  ourna l h  o mepa ge: www.elsev ier .com/ locate /pept ides
Identification  of  Aminopeptidase-N2  as  a Cry2Ab  binding  protein  in
Manduca  sexta
Janette  Onofre, Meztlli  O.  Gaytán,  Arlen  Peña-Cardeña,  Blanca  I. García-Gomez,
Sabino  Pacheco,  Isabel  Gómez, Alejandra  Bravo, Mario  Soberón ∗
Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México, Apdo, Postal 510-3, Cuernavaca 62250, Morelos, Mexico
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Article history:
Received 27 October 2016
Received in revised form 6 January 2017
Accepted 9 January 2017
Available online 17  January 2017
Keywords:
Bacillus thuringiensis
Transgenic crops
Gene stacking
Cry toxins
Cry-receptors
GPI-anchored proteins
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Bacillus  thuringiensis  Cry2Ab  toxin has  been  used  in combination  with Cry1Ac  for  resistance  management
on the  Bt-cotton  that  is  widely  planted  worldwide. However,  little is known  regarding  Cry2Ab  mode  of
action. Particularly,  there  is  a gap  of knowledge  on the  identification  of insect  midgut proteins  that bind
Cry2Ab  and mediate  toxicity. In  the  case of  Cry1Ab  toxin, a  transmembrane  cadherin protein and glycosyl-
phosphatidylinositol  (GPI) anchored proteins  like  aminopeptidase-N1  (APN1) or  alkaline-phosphatase
(ALP)  from  Manduca sexta, have  been shown to be  important  for oligomer formation  and insertion  into
the  membrane.  Binding  competition experiments  showed  that  Cry2Ab  toxin does  not  share binding
sites  with  Cry1Ab  toxin in  M. sexta  brush border  membrane vesicles  (BBMV).  Also, that  Cry2Ab  shows
reduced  binding to the  Cry1Ab  binding molecules  cadherin, APN1 or  ALP. Finally, ligand  blot experiments
and  protein  sequence by  LC–MS/MS identified  APN2 isoform  as  a Cry2Ab  binding protein.  Cloning and
expression  of APN2 confirmed  that APN2 is a Cry2Ab  binding protein.
©  2017 Elsevier  Inc. All  rights  reserved.
1. Introduction
Bacillus thuringiensis produces Cry proteins that  have insectici-
dal activity [15].  Cry proteins are highly specific, only kill a small
number of insect species and have been shown to  be harmless to
other organisms including humans [11,15].  Some cry genes have
been introduced into the genome of important crop plants result-
ing in an efficient control of different crop pests [11,16]. The first
generation of Bt-crops expressed a  single cry gene from the Cry1
gene family active against the most important lepidopteran pests
[16]. However, evolution of resistance to  Bt-crops expressing a  sin-
gle cry1 gene has been responsible for diminishing the efficacy of
Bt-crops in pest control [18].
Different strategies have been shown to  be successful for delay-
ing resistance to Cry toxins [19]. The stacking of more than one
toxin gene that kills the same pest in the plant genome has ren-
der the second generation of Bt-crops that have demonstrated to
be effective in delaying resistance evolution [18,19]. In the case of
Abbreviations: APN, aminopetidase-N; ALP, alkaline phosphatase;
LC–MS/MS, Liquid chromatography-tandem mass spectrometry; GPI, glycosyl-
phosphatidylinositol; kDa, Kilodalton; Bt, Bacillus thuringiensis; BBMV, brush
border  membrane vesicles.
∗ Corresponding author.
E-mail address: mario@ibt.unam.mx (M.  Soberón).
Bt-cotton, Cry2Ab, that  is also toxic to  lepidopteran pests, has been
used in  combination with Cry1Ac for resistance management and
Bt-cotton expressing both toxins is widely planted worldwide [11].
Resistance to  Cry1Ac toxin shows no cross-resistance to  Cry2Ab in
different lepidopteran insects [2,5,23].
One of the most important mechanisms of resistance to  Cry
toxins are mutations in  insect genes that affect the expression
or that code for midgut proteins that are involved in binding to
Cry toxins [5,12,22,26,28].  In  the case of resistance to  Cry1A tox-
ins, mutations affecting cadherin, aminopetidase-N  (APN), alkaline
phosphatase (ALP) or  ABCC2 transporter have been shown to be
linked to resistance [5,6,12,22,26,28].  Most of these proteins have
been proposed to participate in the sequential binding of Cry1A
toxins leading to  Cry1A toxin oligomerization, membrane inser-
tion and pore formation, killing insect-midgut cells by  osmotic
shock [15].  Cry1A protoxins of 130 kDa, are proteolytically pro-
cessed by insect gut proteases to yield a  60 kDa toxin that binds
to glycosyl-phosphatidylinositol (GPI) anchored proteins as APN or
ALP approaching the toxin to  the brush border membrane of midgut
cells. Activated toxins bind then to  cadherin that  facilitates further
proteolytic cleavage of the amino-terminal end including helix -1
resulting in  oligomerization of the toxin [7,8,14,15]. Finally, Cry1A
oligomers bind again with high affinity to APN or ALP resulting
in oligomer membrane insertion and pore formation [1,14]. The
ABCC2 has been identified as a Cry1A-binding protein [20,21] and
http://dx.doi.org/10.1016/j.peptides.2017.01.006
0196-9781/© 2017 Elsevier Inc. All rights reserved.
94 J.  Onofre et al. /  Peptides 98 (2017) 93–98
Table  1
Oligonucleotides used for PCR amplification.
Primer Sequence (5′-3′)
Cry2Ab d CAATCCATGGCAAATAGTGTATTG
Cry2Ab utr3 GCCCGGGGAATTCCTAAGAATAAAAATA
APN2For ATTCCGTCTCGAGATGATTGAAAATAG CCACAAAGAGAG
APN2Rev CGTACAGAG CTCCATGTATTCACTAATATT CTTGGCTC
it has been suggested that binding to ABCC2 facilitates oligomer
membrane insertion [9].
Despite the wide us of Cry2Ab in Bt-cotton, little is known
regarding its mode of action. In contrast to Cry1A protoxins, Cry2Ab
is a short protoxin of 70 kDa that is only processed in  the N-terminal
end to yield the activated toxin [15].  Activated Cry2Ab and Cry1A
toxins share limited amino acid sequence similarity but they share
similar three-dimensional fold suggesting that their mode of action
is conserved. Tricoplusia ni and Helicoverpa armigera resistant popu-
lations to Cry2Ab have been selected in  laboratory conditions by F2
screening from field collected individuals, suggesting the involve-
ment of novel midgut Cry binding molecules [17,23].  In the case
of H. armigera, resistance to Cry2Ab was linked to at least three
different mutant alleles of an ABCA2 transporter gene suggesting
that ABCA2 is a functional receptor of Cry2Ab toxin [23].  It was
proposed that binding to  ABCA2 could trigger Cry2Ab oligomeriza-
tion and also oligomer membrane insertion, but this remains to be
analyzed experimentally [23]. Since GPI-anchored proteins are also
playing an important role in  Cry1A toxins mode of action, we ana-
lyzed here if Cry2Ab binds specifically to  a GPI-anchored protein
from M.  sexta. Binding analysis of Cry2Ab to  GPI-anchored proteins
fraction identified the APN2 as a  putative Cry2Ab receptor. Fur-
ther analysis of Cry2Ab and Cry1Ab binding to  different M.  sexta
recombinant proteins expressed in E. coli, confirmed that APN2 is
a Cry2Ab binding molecule. Our results suggest that in the case of
Cry2Ab, GPI-anchored APN2 could be involved in toxicity.
2. Materials and methods
2.1. Cloning of Cry2Ab gene
Escherichia coli strain MC1061 (A  =  trpF F =  lacI Smr  Tcr) was
used as the host for construction of plasmids. A plasmid vector
containing the cry2Ab gene sequence was kindly provided by Dr.
Luke Masson. Cry2Ab gene sequence was amplified with forward
(Cry2Abd) and reverse (Cry2Ab utr3) oligonucleotides (Table 1)
that amplify a PCR product of 1.8 kb  using an AccuPrime Pfx
Taq DNA polymerase (Invitrogen). The PCR product fragment was
digested with NcoI and SmaI restriction enzymes and cloned into
plasmid pHT315 under the regulation of the cry3Aa promoter, pre-
viously digested with NcoI and SmaI  restriction enzymes, using a
T4 DNA ligase from New England BioLabs. A positive clone was
selected, purified, and verified by DNA sequencing in the Instituto
de Biotecnología-UNAMı́s facility. This clone was named pHT315-
Cry2AbWt and transformed in Bt acrystalliferous strain 407cry−.
2.2. Expression and activation of Cry1Ab and Cry2Ab proteins
For Cry1Ab production, pHT315–1Ab harboring the cry1Ab gene
in strain 407 cry− was used. Crystals of proteins were produced and
solubilized as previously described [4].  The Cry1Ab crystals were
solubilized in 50  mM Na2CO3/NaHCO3 buffer containing 0.02%
mercaptoethanol, pH 10.5, at 37 ◦C  for 2 h. For proteolytic acti-
vation, the solubilized protoxins were digested with 1:50 trypsin
(Sigma) (trypsin/protoxin) at 37 ◦C  for 2 h.
In the case of Cry2Ab, crystals inclusions were purified using a
hexane and centrifugation method as described [13]. Briefly, the
spore/crystal pellet was  suspended in 300 mM  NaCl, 10 mM EDTA,
1 mM PMSF, 10% hexane solution and sonicated 1 min  three times
with 5 min  repose in  ice between each pulse of sonication. The
sample was  centrifuged at 16000 rpm for 15 min  at 4 ◦C and the
pellet obtained after centrifugation was  subject to another round
of sonication-centrifugation and finally suspended in water with
1 mM PMSF. The Cry2Ab crystals were solubilized in 50 mM NaOH
at 4 ◦C for 1 h. For proteolytic activation, the solubilized protox-
ins were digested with 1:1 trypsin (Sigma) at 4 ◦C for 1 h.  Protein
concentration of toxins was  determined by Bradford procedure
(BioRad) using BSA as a  standard.
2.3. Brush border membrane vesicles (BBMV) preparation,
solubilization and Western blot
BBMV were prepared from dissected midgut tissue of third
instar M. sexta larvae following the protocol described by  Wolfers-
berger et al. [25]. For analysis of BBMV quality and the enrichment
during purification, the aminopetidase N and alkaline phosphatase
enzymatic activities were determined in the initial gut homogenate
and in  the final BBMV preparation. Typically, an enrichment of
5-fold and 10-fold for ALP and APN enzymatic activities, respec-
tively, were obtained. For BBMV solubilization, 5 mg/ml protein of
BBMV were suspended in  20 mM Tris-HCl pH 8.5 buffer contain-
ing 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF and 1% CHAPS. After
2 h at 4 ◦C, the solution was  centrifuged at 70,000 rpm for 40 min
and the membrane pellet and supernatant samples were recovered
for western blot analysis. Protein content was  measured by  the DC
protein-dye method (Bio-Rad) using bovine serum albumin as stan-
dard (Pierce). Five g  protein of BBMV or supernatant recovered
after membrane solubilization were boiled, separated by 9% SDS-
PAGE and electro transferred to polyvinylidene fluoride membrane
(PVDF) from Millipore. Blots were blocked with 5% non-fat dry milk
in  PBS- 0.1% Tween 20 (PBST), incubated with 1:30,000 anti-Cad,
1:25,000 anti-APN1 or 1:5000 anti-ALP antibodies in  PBST, revealed
with HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG (1:30,000) in  PBST from
Santa Cruz and developed with luminol (Pierce). These experiments
were done in  triplicate.
2.4. Competition binding analysis
Activated Cry1Ab was  biotinylated using biotinyl-N
–hydroxysuccinimide ester (Amersham) according to the man-
ufacturer’s instructions. Binding of biotinylated Cry1Ab, was
performed as previously described [14]. Ten g of BBMV protein
were incubated with 10 nM biotinylated toxin. The unbound
toxin was  removed by centrifugation for 10 min  at 14000 ×  g.  The
membrane pellet was  suspended in  100 l binding buffer and
washed twice. The samples were loaded in  9% SDS-PAGE gels and
electrotransferred to nitrocellulose membranes. The biotinylated
protein was  visualized by incubating with streptavidin-peroxidase
conjugate (1:4000 dilution) for 1 h, followed by luminol (Pierce).
For competition experiments biotinylated Cry1Ab was incubated
with different concentrations of unlabeled Cry1Ab or unlabeled
Cry2Ab 1 h at room temperature before incubating with BBMV
and reveled as described above. These experiments were done in
triplicate.
2.5. Ligand blot
Ligand blots were performed as previously described [15].  Ten
g of supernatant after BBMV solubilization, were separated on
9% SDS-PAGE and transferred to PVDF membranes. After block-
ing the membrane, 10 nM of Cry1Ab or 20 nM of Cry2Ab were
added and incubated for 1 h at room temperature. The blots were
then washed twice and overlaid with 1:30,000 anti-Cry1Ab or
J. Onofre et al. /  Peptides 98 (2017) 93–98 95
1:30,000 anti-Cry2Ab for 1 h. Then, blots were incubated with HRP-
conjugated goat anti-rabbit IgG (1:30,000) in PBST from Santa Cruz
and developed with luminol (Pierce). These experiments were done
in  triplicate.
2.6. Protein identification
The 110 kDa protein band observed in ligand blot assays with
Cry2Aa protein was excised from the SDS-PAGE for subsequent
identification by  the liquid chromatography-tandem mass spec-
trometry (LC–MS/MS) in  the Instituto de Biotecnología-UNAMı́s
facility. The gel band was subjected to proteolytic digestion on
a ProGest (Genomic Solutions) workstation using bovine trypsin.
Formic acid was added to stop the reaction, and the supernatant
was analyzed directly using nano liquid chromatography followed
by tandem mass spectrometry (LC–MS/MS) with a  30 min  gradient
on a LTQ Orbitrap XL mass spectrometer (ThermoFisher). Product
ion data were searched against the Uniprot database using the Mas-
cot search engine (Matrix Science, London, UK). Mascot output files
were parsed into the Scaffold 3 (version Scaffold 3 00 07,  Proteome
Software Inc., Portland, OR).
2.7. Cloning of amino-peptidase N2 and heterologous expression
of APN2, APN1, ALP and CR7-12 recombinant proteins
Total RNA from three 3rd instar M.  sexta midguts was  extracted
using RNeasy Mini kit (Qiagen). APN2 sequence was  obtained
from GenBank accession number: P91885. Primers for amplifica-
tion were designed and shown in Table 1.  A PCR product of 3 kb for
APN2 gene was obtained and digested with SacI  and XhoI restriction
enzymes, cloned into pET32b cloning vector and transformed into
E.  coli BL21 (D3) cells (Invitrogen). Plasmid from transformants was
purified and sequenced in the DNA-sequence facility of Instituto de
Biotecnología-UNAM.
APN2, APN1, ALP and CR7-12 recombinant proteins were
purified as previously described [4].  Transformants were grown
until OD600 0.7 and protein expression was induced with 1 mM
IPTG (Sigma) for six hours. For protein purification, cultures
were sonicated and cell-debris were eliminated by  centrifugation
(70,000 rpm for 30 min  at 15 ◦C). The supernatant was  subjected to
affinity purification using Ni-Agarose beads (Qiagen). After wash-
ing with 35 mM  imidazole in  PBS buffer (pH 7.5), the recombinant
protein was eluted with 250 mM imidazole and gradually dialyzed
against PBS buffer.
2.8. ELISA binding assays
ELISA binding assays were performed as previously reported
[8,14]. ELISA plates were coated with 1 g  of recombinant cad-
herin protein fragment (CR7-12), or with 250 ng of recombinant
APN1, ALP or APN2 from M.  sexta. Different non-saturated concen-
trations of activated Cry1Ab or Cry2Ab were used in  the different
binding assays as indicated in the text or in the figure legends. The
bound toxins were detected using rabbit anti-Cry1Ab (1:20,000) or
anti-Cry2Ab (1:2000) antibodies and then with the anti-rabbit anti-
body conjugated with horseradish peroxidase enzyme as described
above. Finally o-phenylenediamine (Sigma) and H2O2 were used as
substrates for peroxidase activity detection. Reaction was stopped
adding 50 l  of 1 M  H2SO4 and measured at 490 nm using an
ELISA microplate reader. All experiments were done in tripli-
cate. Comparison of binding data of Cry2Ab and Cry1Ab toxins
to different recombinant proteins were analyzed by  t-test using
GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, Inc version 5.0b), data
curves of Scatchard plots for obtaining relative binding affinities
Fig. 1. Cry1Ab and Cry2Ab toxins do not share binding sites. Homologous and het-
erologous binding competition of biotin-labeled Cry1Ab to M. sexta BBMV with
unlabeled Cry1Ab or Cry2Ab activated toxins. Binding of biotinylated-Cry1Ab to
BBMV  was  analyzed in the  absence or in the presence of different concentrations
of competitor from 50 up to 500-fold molar excess of activated Cry1Ab (A) or 500-
fold  molar excess of activated Cry2Ab. Fig. 1  shows a representative result of three
replicas.
(Kd)  were obtained by Scatchard equation using Scatchard analysis
with SigmaPlot (Systat Software).
2.9. Bioassays
Different doses of Cry2Ab spore/crystals (from 10 to  50 ng/cm2)
were applied onto the artificial diet surface of 24-well polystyrene
plates (Cell Wells, Corning). To determine insect mortality, 24 first
instar M. sexta larvae, one per well, were used per toxin con-
centration in three biological repetitions performed in  triplicate.
Mortality was recorded after 7 days, and the 50% lethal concentra-
tion (LC50) was estimated by using Probit analysis (Polo-PC LeOra
Software).
3. Results
3.1. Cry2Ab binds to M. sexta APN2 GPI-anchored protein
The toxicity of Cry2Ab toxin to M. sexta was analyzed as
described in Materials and methods showing an LC50 value of
21.9 ng/cm2 (fiducial limits 17.5–25.6). To determine if Cry1Ab and
Cry2Ab share binding sites  in  M. sexta brush border membranes,
we performed heterologous binding competition of biotynilated-
Cry1Ab toxin to BBMV. Fig. 1 shows that binding of biotin-labeled
Cry1Ab to  BBMV was  not  competed by unlabeled Cry2Ab and that
the binding of Cry1Ab was  specific since it was  competed by  unla-
beled Cry1Ab toxin. These results show that Cry1Ab and Cry2Ab do
not share binding sites in  M. sexta.
To determine if GPI-anchored proteins bind Cry2Ab toxin, we
performed a partial solubilization of M. sexta BBMV with CHAPS
and analyze by western blot if ALP or APN1, that  are GPI-anchored
proteins, and cadherin, a  transmembrane protein, were extracted
from BBMV. Fig. 2 shows that ALP and APN1 were released into
supernatant after partial solubilization with CHAPS in contrast to
cadherin that was retained in the membrane pellet. This data shows
that GPI-anchored proteins are specifically extracted from BBMV by
this solubilization procedure.
To analyze the GPI-anchored proteins that specifically bind
Cry2Ab we performed a  ligand blot of Cry2Ab against proteins
extracted from BBMV by the CHAPS procedure described above
and compare to the Cry1Ab binding proteins. We focus on proteins
with molecular weights of 100–150 kDa since APNı́s are within this
range of molecular sizes. Fig. 3 shows that Cry2Ab bound to dif-
ferent BBMV proteins than Cy1Ab. Cry2Ab bound to  smear from
96 J.  Onofre et al. /  Peptides 98 (2017) 93–98
Fig. 2. GPI-anchored proteins are preferentially extracted from  BBMV by  partial membrane solubilization. Western blot detection of ALP, APN or cadherin in  BBMV (lanes
2)  or in a protein extract obtained after solubilization of BBMV with 1% CHAPS (lanes 3). Lanes 1 corresponded to  MW  marker. Fig. 2 shows a  representative result of three
replicas.
100 to 120 kDa where a  110 kDa was predominant, and also to
a smear from 75 to 85 kDa proteins while Cry1Ab bound to dif-
Fig. 3. Cry2Ab binds to  a 110 kDa GPI-anchored protein. Figure shows the detection
of  Cry2Ab or Cry1Ab binding proteins in a  protein extract obtained after solubi-
lization of BBMV with 1% CHAPS. The arrow indicates the 110 kDa Cry2Ab binding
protein that was  identified as APN2 by MS/MS. Fig. 3  shows a  representative result
of three replicas.
ferent proteins of 120 kDa, and a  68 kDa, although the latter was
also recognized by Cry2Ab (Fig. 3). Previously the 120 kDa protein
that binds Cry1Ab was identified as APN1 [4].  The identity of  the
110 kDa protein that bound Cry2Ab, was analyzed by LC–MS/MS.
M. sexta APN2 was the protein with the highest score (6718.45)
obtained with 31 peptides matching sequences with a  coverage of
40%. Besides APN2, the next protein with high score (2268.29) was
M. sexta alanyl aminopeptidase with coverage of 30%. Also, we iden-
tified the 75–85 kDa Cry2Ab-binding protein showing again APN2
and alanyl aminopeptidase with similar coverage for both proteins
suggesting that this protein smear corresponded to  degradation
products of the 110 kDa protein.
3.2. Binding of Cry2Ab and Cry1Ab toxins to different
recombinant M. sexta proteins
To determine which APN binds Cry2Ab, we analyze the bind-
ing of Cry2Ab to APN2. We  cloned the APN2 gene from M. sexta
RNA samples as reported in  Materials and methods. The APN2
gene was  cloned into E. coli cells, expressed, and purified and
the binding to Cry2Ab was  analyzed by ELISA binding assays as
reported in  Materials and methods. Also, we  compared the binding
of Cry2Ab and Cry1Ab to recombinant M.  sexta APN1, ALP proteins
and to a  recombinant cadherin fragment containing Cry1Ab binding
sites (CR7-12), that were previously reported to bind Cry1Ab toxin
[4].  Fig. 4 shows that Cry2Ab bound APN2 while Cry1Ab showed
reduced binding to  this protein. Finally, Cry1Ab bound the three
recombinant proteins APN1, ALP and cadherin fragment, in con-
trast Cry2Ab showed less binding to APN1 than Cry1Ab and did not
bind ALP or cadherin proteins (Fig. 4).
J. Onofre et al. /  Peptides 98 (2017) 93–98 97
Fig. 4. Cry2Ab binds specifically to M. sexta APN2. ELISA binding assays of Cry2Ab or Cry1Ab to recombinant APN1, APN2, ALP or CR7-12 proteins. Black boxes represent
Cry2Ab and white boxes Cry1Ab binding to  each receptor. Data shows means of three replicas with standard deviations. The groups of data for each receptor were analyzed
by  t-test using GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, Inc). APN1 data showed that P value equals 0.0006; APN2 data showed that P  value equals 0.0004; ALP and CR7-12
data  showed a P value that is  less than 0.0001. All  these P values indicate that the differences in binding of Cry2Ab and Cry1Ab to  the  recombinant receptors are extremely
statistically significant.
Fig. 5. Cry2Ab binds to APN2 in a saturable way. Figure shows the ELISA bind-
ing  saturation assays of Cry2Ab toxin to APN2. Data show means of three replicas
with  standard deviations. Insert shows the Scatchard plot for Kd calculation using
Scatchard analysis with SigmaPlot (Systat Software).
To  determine the apparent binding affinity of Cry2Ab to APN2
we performed a binding saturation assay. Fig. 5  shows that Cry2Ab
bound to APN2 in a  concentration dependent manner. Calculation
of apparent binding affinities by Scatchard plot revealed an appar-
ent binding affinity (Kd)  of Cry2Ab to APN2 of 123.8 nM.
4. Discussion
Cry2Ab is widely used in transgenic crops in combination with
Cry1A proteins since it has been shown that there is no cross resis-
tance between these proteins and that Cry2Ab and Cry1Ac do  not
share binding sites in  different lepidopteran insects [2,3,10]. Here
we show that in  M. sexta Cry2Ab and Cry1Ab do not share the same
binding sites since binding of Cry1Ab to BBMV was  not  competed
by Cry2Ab toxin (Fig. 1). Also, Cry2A showed reduced binding to the
previously characterized Cry1Ab binding molecules, APN1, ALP and
cadherin (Fig.  4). In the case of Helicoverpa zea,  APN1 was shown to
be  a functional receptor of Cry1Ac but not of Cry2Ab [24].
GPI-anchored proteins have been shown to  be involved in toxi-
city of different Cry toxins that have different insect specificities to
lepidopteran, coleopteran or dipteran insects [15,27]. It  has been
suggested that binding to  GPI-anchored proteins concentrate acti-
vated toxins in  the brush border membranes and also facilitate
oligomer membrane insertion [1,14].  We identify GPI-anchored
APN2 as a  Cry2Ab binding protein by ligand blot and LC–MS/MS
sequencing. Analysis of binding to recombinant APN2 produced
in  E. coli confirmed that Cry2Ab binds specifically to APN2 since
Cry1Ab showed reduced binding to APN2 (Fig. 4). Saturation bind-
ing analysis showed that Cry2Ab bound APN2 with high affinity.
The apparent binding affinity of Cry2Ab to  APN2 (Kd =  123.8 nM)
is in the same order of magnitude as that of Cry1Ab to M.  sexta
APN1 or  ALP [4].  Peptide sequence of the 75–85 kDa protein band
showed that this was a  degradation product of APN2 and alanyl-
peptidase. It  was shown that Cry1Ab also binds to ALP [1]. We  show
here that Cry2Ab does not bind to the recombinant ALP that binds
Cry1Ab toxin. However, we  cannot rule out that Cry2Ab binds to
another ALP isoform different from the one recognized by Cry1Ab
since a  68 kDa protein was  recognized by both Cry2Ab and Cry1Ab.
In addition both toxins bound to  a  high molecular weight protein
with MW higher than 250 kDa. Since both protein bound to this
high molecular weight protein we  did not characterize further this
band. Finally, the identity of the additional low molecular weight
proteins recognized by Cry2Ab remains to  be determined.
ABCA2 transporter has been identified as key molecule involved
in Cry2Ab toxicity since resistance to Cry2Ab is linked to ABCA2
mutations in  H.  armigera [23]. The role of ABCA2 in the mode of
action of Cry2Ab remains to be determined. The identification of
98 J.  Onofre et al. /  Peptides 98 (2017) 93–98
APN2 as a Cry2Ab binding-protein suggest that  different midgut
membrane proteins could be involved in Cry2Ab toxicity as is
the  case of Cry1A toxins that  participate in  different steps of the
mechanism of action such as inducing Cry1A oligomerization and
oligomer membrane insertion [1,14]. Understanding the role of the
different Cry2Ab binding molecules in  its mode of action could pro-
vide methods for resistant gene monitoring in field conditions and
to evolve Cry2Ab toxicity to counter resistance.
Conflict of interests
The authors declare no  conflict of interests.
Author’s contribution
JO, performed binding analysis to  recombinant proteins; MG
set up experimental conditions for Cry2Ab production and bind-
ing analysis; AIP Performed partial solubilization of BBMV and
location of APN, ALP and cadherin; BIG cloning and expression of
Cry2Ab gene; IG performed ligand blots and cloning of APN2; SP
performed binding and Scatchard analysis; AB designed experi-
ments and wrote the manuscript; MS  designed experiments and
wrote manuscript.
Acknowledgments
We thank Jorge Sánchez for technical assistance and Lizbeth
Cabrera for insect maintenance. Also, to Dr. Cesar Ferreira and the
technical staff of the proteomics unit at Instituto de Biotecnología,
UNAM. To Pioneer Hi Bred for funding.
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