UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS Instituto de Biología Biología Experimental GENÓMICA COMPARATIVA DE Laccaria trichodermophora COMO HERRAMIENTA PARA ENTENDER SU POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: DOCTOR EN CIENCIAS PRESENTA: RODOLFO ENRIQUE ÁNGELES ARGÁIZ TUTOR PRINCIPAL DE TESIS: DR. ROBERTO GARIBAY ORIJEL INSTITUTO DE BIOLOGÍA, UNAM COMITÉ TUTOR: DR. MAURICIO ALBERTO TRUJILLO ROLDÁN INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS, UNAM DR. JORGE NIETO SOTELO INSTITUTO DE BIOLOGÍA, UNAM Ciudad Universitaria, CD. MX., Octubre, 2021.
 2 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 3 COORDINACIÓN DEL POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS INSTITUTO DE BIOLOGÍA OFICIO CPCB/932/2021 ASUNTO: Oficio de Jurado M. en C. Ivonne Ramírez Wence Directora General de Administración Escolar, UNAM P r e s e n t e Me permito informar a usted que en la reunión ordinaria del Comité Académico del Posgrado en Ciencias Biológicas, celebrada el día 21 de junio de 2021 se aprobó el siguiente jurado para el examen de grado de DOCTOR EN CIENCIAS del estudiante ÁNGELES ARGÁIZ RODOLFO ENRIQUE con número de cuenta 513023819 con la tesis titulada “Genómica comparativa de Laccaria trichodermophora como herramienta para entender su potencial biotecnológico”, realizada bajo la dirección del DR. ROBERTO GARIBAY ORIJEL, quedando integrado de la siguiente manera: Presidente: DR. JESÚS PÉREZ MORENO Vocal: DRA. LAILA PAMELA PARTIDA MARTÍNEZ Vocal: DR. LORENZO PATRICK SEGOVIA FORCELLA Vocal: DRA. MARÍA DEL CARMEN AUXILIO GONZÁLEZ VILLASEÑOR Secretario: DR. MAURICIO ALBERTO TRUJILLO ROLDÁN Sin otro particular, me es grato enviarle un cordial saludo. A T E N T A M E N T E “POR MI RAZA HABLARÁ EL ESPÍRITU” Ciudad Universitaria, Cd. Mx., a 28 de septiembre de 2021 COORDINADOR DEL PROGRAMA Agradecimientos institucionales Agradezco al Posgrado en Ciencias Biológicas de la UNAM, por aceptarme en su programa de posgrado. También agradezco al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por aceptarme en el programa de Becas Nacionales número 291047, con registro de becario 289835, número de beca 428868 y número de CVU 439184, así como al programa PAEP por las becas recibidas. A los proyectos PAPIIT-UNAM IN-210217, IT-200719, IN-212521 por financiar mi investigación. A mi Tutor Principal, el Dr. Roberto Garibay Orijel y a los miembros de mi Comité Tutor, el Dr. Mauricio Trujillo Roldán y el Dr. Jorge Nieto Sotelo. 
 4 Agradecimientos a título personal Agradesco a mucho a Diana y a Diego por acompañarme e impulsarme para seguir haciendo lo que me gusta, a mis padres por su apoyo constante, a mi profesor Roberto por mostrarme el camino y abrirme tantas puertas, a mis compañeros del laboratorio, en los que encontré buenos amigos, y a la comunidad del IB, del IIB, de la FC, del CCG, del IBT y del Posgrado por tantos buenos momentos. 
 5 Índice Índice 6 ...................................................................................................................................... Resumen 7 ................................................................................................................................ Abstract 8 .................................................................................................................................. Introducción general 9 ............................................................................................................... Capítulo I- La evolución de la simbiosis ectomicorrízica desde la perspectiva genómica 15 ... Capítulo II- From field sampling to pneumatic bioreactor mycelia production of the ectomycorrhizal mushroom Laccaria trichodermophora 31 ...................................................... Capítulo III- Long-read sequencing do not collapse Laccaria trichodermophora (CA15-11, CA15-75, CA15-F10 and EF-36) strains genome assemblies and reveal its intraspecific genome diversity 61 ................................................................................................................................ Capítulo IV- El contenido de enzimas CAZy y péptidos efectores en los genomas accesorios de Laccaria trichodermophora confiere a las cepas capacidades simbióticas diferenciales 118 ... Discusión general y conclusiones 177 ...................................................................................... Referencias Bibliográficas 191 .................................................................................................. Anexos 202............................................................................................................................... 6 Resumen La deforestación y la pérdida de suelo son causa y consecuencia del cambio climático global, y tienen un fuerte impacto social, principalmente en comunidades rurales. Desafortunadamente, en México la atención que se le da a este problema es poco exitosa. Para aumentar las tasas de supervivencia de las plántulas producidas en invernadero destinadas a los programas de restauración y conservación, es necesaria su micorrización exitosa. Para reforestar ecosistemas forestales, los árboles deben inocularse con hongos ectomicorrízicos. En este trabajo se seleccionó al hongo ectomicorrízico Laccaria trichodermophora debido a sus características ecológicas y a la posibilidad de cultivar su micelio en condiciones axénicas. Sin embargo, el conocimiento profundo sobre los mecanismos celulares y moleculares que dan a estos hongos su potencial de aprovechamiento biotecnológico está en camino de desarrollo, mientras que las tecnologías para la masificación de la producción de inóculo vegetativo han sido pobremente exploradas. En esta tesis, después de desarrollar la producción, a escala piloto, de inóculo miceliar de L. trichodermophora (Capítulo I), y de secuenciar y analizar cuatro genomas de la especie (Capítulos III y IV), identificamos parámetros de cultivo y genes relacionados con el crecimiento y las capacidades de colonización simbiótica. La producción de micelio vivo alcanzó rendimientos de hasta YX/S = 0.54 ± 0.09 gBiomasa/gGlucosa con producciones de biomasa de casi 6 gBiomasa/LMedio de cultivo, cantidad suficiente para miles de pinos de vivero con cultivos en medio líquido de 4 semanas, iniciando desde la reactivación de la cepa refrigerada. Los genomas de las distintas cepas variaron en tamaño entre 59.1 y 111.9 Mpb, estas diferencias se centran principalmente en el tamaño de las familias génicas, el genoma core de la especie representa del 54% al 76% de las familias de genes homólogos. La ausencia de genes simbióticos, como los codificantes para la poligalacturonasas (GH28) y la endoglucanasa (GH5_5) con módulo de unión a carbohidrato (CBM1), así como el número de péptidos efectores se co-relacionan con la pérdida de la capacidad simbiótica en algunas de las cepas analizadas. Además, desde la perspectiva de la genómica evolutiva comparada, se analizan otros aspectos genómicos que empujan el entendimiento de la evolución genómica de la simbiosis y de su ecología. 
 7 Abstract Deforestation and soil loss are the cause and product of the global climatic change and have a strong social impact, mainly in rural communities. Unfortunately, in Mexico the attention given to this problem is not very successful. To increase the survival rates of greenhouse grown seedlings for restoration and conservation programs, their successful mycorrhization is necessary. To reforest forest ecosystems, trees must be inoculated with ectomycorrhizal fungi. In this thesis, the Mexican ectomycorrhizal fungus Laccaria trichodermophora was selected, due to its ecological characteristics and the possibility of cultivating its mycelium under axenic conditions. However, in-depth knowledge of the cellular and molecular mechanisms that give these fungi its biotechnological potential use is under-developed, while technologies for mass production of vegetative inoculum have been poorly explored. In this thesis, after developing production at a pilot scale of mycelial inoculum of L. trichodermophora (Chapter 1), and sequencing and analyzing four genomes of the species (Chapters 2 and 3), we identified culture parameters and genes related to the micelial growth or symbiotic colonization capabilities. Live mycelium production reached yields of up to YX/ S = 0.54 ± 0.09 gBiomass/gGlucose with biomass production of about 6 gBiomass/LCulture media, sufficient quantity for thousands of nursery pines with cultures in liquid medium of 4 weeks, starting since the reactivation of the chilled strain. The genomes of the different strains varied in size between 59.1 and 111.9 Mbp, most of these differences are due the size of the gene families, while the core-genome of the species represents 54% to 76% of the homologous gene families. The absence of symbiotic genes, such as those coding for polygalacturonase (GH28) and endoglucanase (GH5_5) with carbohydrate binding module (CBM1), as well as the number of effector peptides are co-related to the loss of symbiotic capability in some of the analyzed strains. In addition, from the perspective of comparative evolutionary genomics, other genomic aspects that push the understanding of the genomic evolution of symbiosis and its ecology are analyzed. 
 8 Introducción general Los hongos ectomicorrízicos (HEM) forman una íntima asociación entre su micelio y las raíces de varios árboles importantes y otras plantas (Pérez-Moreno y Read 2004; Smith y Read 2010). Para el funcionamiento de esta asociación se requiere una estrecha comunicación a nivel celular, la cual está mediada por una compleja red de señalización entre simbiontes (Plett y Martin 2015). La gran cantidad de taxa de HEM (más de 20 mil especies, Comandini et al. 2012; Tedersoo y Smith 2017), la naturaleza polifilética de esta simbiosis (82 linajes fúngicos, Tedersoo y Smith 2017), y el grado de especificidad por su hospedero, generan un complejo mosaico fisiológico y ecológico (Plett y Martin 2011). Además, la alta riqueza de las comunidades ectomicorrízicas, la exclusión competitiva y la redundancia ecológica han moldeado los genomas de los HEM. Laccaria trichodermophora Muell. 1984 es un HEM que se distribuye en México y Estados Unidos de América (Mueller 1992). En los volcanes del centro de México, en el Eje Neovolcánico Transversal Mexicano (ENTM), L. trichodermophora se asocia principalmente a Pinus montezumae Lamb. 1832 en los bosques de alrededor de 3,000 msnm y a P. hartwegii Lindl. 1839 en los límites superiores del bosque abierto, alrededor de 4,000 msnm, donde es uno de los hongos de mayor producción de esporomas (Mueller 1992; Pérez et al. 2012; Reverchón et al. 2012; Galindo-Flores et al. 2015; Franco-Mass et al. 2016; López-García et al. 2017; Kong et al. 2018; Rodríguez-Gutiérrez et al. 2019; Ángeles-Argáiz et al. 2020; Quintero-Corrales et al. 2020; ver Mueller y Strack 1992; Ramos et al. 2017 para salto de hospedero en condiciones de introducción) (Figura 1 y 2). La posibilidad de cultivar el micelio de esta especie de manera axénica, considerando además algunas de sus características ecológicas, como su preferencia por hospedero y hábitat, otorgan a L. trichodermophora un gran potencial para su aprovechamiento biotecnológico en la industria forestal y en la conservación de los bosques de altura (Pérez-Moreno et al. 2010, Carrasco-Hernández et al. 2018). Sin embargo, tanto las técnicas para la producción de su micelio, como el trasfondo genético que otorga a esta especie sus capacidades fisiológicas y ecológicas se desconocían. En contraste, desde el punto de 9 vista de la simbiosis (fisiología, ontogenia y expresión génica), uno de los hongos ectomicorrízicos más estudiados es L. bicolor (Maire) P.D. Orton 1960 (Martin et al. 2008). Está estrechamente emparentado con L. trichodermophora, con alrededor de seis millones de años de divergencia evolutiva (Wilson et al. 2017), por lo que sus similitudes y contrastes genómicos nos permiten hacer extrapolaciones sobre L. trichodermophora. Figura 1. Distribución de Laccaria trichodermophora (círculos morados), Pinus montezumae (triángulos verde claro) y Pinus hartwegii (triángulos invertidos verde oscuro) en México. Los datos fueron tomados de GBIF (doi.org/10.15468/dl.u25dnc, 10.15468/dl.945x6w y 10.15468/dl.6bfz2r) y el mapa se hizo en R con el script en el anexo 1). 10 120°W 110°W 100°W 90°W 80°W 1 0 °N 1 5 °N 2 0 °N 2 5 °N 3 0 °N 3 5 °N Figura 2. Basidiomas de Laccaria trichodermophora en su ambiente natural. En nuestro grupo de investigación se han desarrollado proyectos (PAPIIT-UNAM: IN-210217 y IT-200719) para estudiar la efectividad de Laccaria como inoculante y simbionte ectomicorrízico para Pinus (Flores-Almaráz, 2020; Rodríguez-Gutiérrez et al. 2019); la estructura genética de sus poblaciones (Quintero-Corrales et al. 2020) y de sus comunidades (Garibay-Orijel et al. 2009; Pérez-Pazos, 2018; Rodríguez-Gutiérrez et al. 2020; Ramírez-Miguel et al. 2021) y el cultivo de su micelio a diferentes escalas (Ángeles-Argáiz 2015; Ángeles-Argáiz et al. 2020; Carmona-Reyes en prep., Campos- López en prep.). Las investigaciones de Quintero-Corrales et al. (2020) respecto a la genética de las poblaciones de L. trichodermophora en el centro del país, mostraron que la estructura simpátrica de sus poblaciones en el Eje Neovolcánico Transversal está dada por el aislamiento por distancia y no por la identidad del hospedero/elevación en la montaña. Además, nos permitieron seleccionar algunas de las cepas más divergentes, genéticamente, para su análisis genómico. Posteriormente, al comparar el 11 desempeño de distintas cepas bajo las mismas condiciones de cultivo en medio líquido, permitieron ver al alta variabilidad en acumulación de biomasa y consumo de sustrato (resultados incluidos en el Capítulo I de esta tesis, Ángeles-Argáiz et al. 2020). Para obtener cepas viables con capacidades infectivas ectomicorrízicas se realizaron los aislamientos a partir del contexto de esporomas silvestres, pues el contexto además de ser relativamente abundante y limpio, está compuesto por micelio secundario, justo el tipo de micelio con el que los basidiomycetes ectomicorrízicos colonizan las raíces de sus hospederos (Smith y Read, 2010). Por otro lado, el contenido nuclear diploide, y en muchos casos heterocariótico, del micelio secundario, puede complicar su estudio genómico. Durante el desarrollo de la presente tesis, la investigación de Flores-Almaraz (2020) demostró que antes de un emprendimiento biotecnológico, las capacidades simbióticas de las cepas deben comprobarse mediante bioensayos. Ella evaluó tres factores al bioinoculante desarrollado con la cepa EF-36: Viabilidad, infectividad y efectividad. Detectó que con ninguna de las formulaciones probadas se consiguió micorrizar las plantas. Procedió entonces a comparar distintas cepas con un solo método de inoculación, detectó que el factor determinante en el grado de infectividad fue justo la identidad de la cepa, haciendo evidente que el genotipo de la cepa seleccionada influye directamente sobre el fenotipo; en este caso, expresado tanto en el crecimiento miceliar asimbiótico como en la interacción simbiótica. Particularmente, la cepa CA15-F10 fue la única capaz de desarrollar abundante y pronta colonización de la raíz (Flores-Almaraz, 2020) pero un pobre crecimiento miceliar en medio líquido (Ángeles-Argáiz et al. 2020). Por estos motivos, las investigaciones de Campos-López (Tesis de doctorado en proceso), enfocadas a determinar el efecto de la formulación de los medios de cultivo sobre las capacidades simbióticas de L. trichodermophora, usan a la cepa CA15-F10. En esta tesis se pretende profundizar en el entendimiento de la biología de la interacción de L. trichodermophora con su hospedero y su ambiente desde la perspectiva genómica, así como avanzar en el desarrollo tecnológico hacia la producción de inóculo vegetativo (micelio activo) a escala piloto. La tesis está dividida en seis secciones. La primera es esta breve introducción general. La segunda sección 12 es un Capítulo introductorio (Capítulo I) con marco teórico sobre la genómica de la simbiosis ectomicorrízica, en forma de un artículo de revisión publicado. Los siguientes tres Capítulos (Capítulos del II - IV) son artículos de investigación, cada uno enfocado en cada uno de los objetivos particulares. En el segundo Capítulo se estudió la propagación del micelio de L. trichodermophora, partiendo desde la recolecta en campo y el aislamiento de la cepa, hasta el escalamiento del cultivo en biorreactor de columna de burbujeo. Este Capítulo ya está publicado. En el tercer Capítulo se identificaron las implicaciones metodológicas de la secuenciación y ensamble genómico, sobre las inferencias funcionales, usando como modelo cuatro cepas de L. trichodermophora. Mientras que el cuarto Capítulo está enfocado en identificar genes involucrados en las capacidades simbióticas de diferentes cepas. Finalmente la tesis concluye con una sección en la que se discuten aspectos adicionales como la selección de cepas, la propagación clonal, algunas dinámicas de expansión genómica y funciones genómicas potencialmente relacionadas con la preferencia por hospedero y se integran conceptos y descubrimientos genómicos con su aplicación biotecnológica hacia la conservación de los bosques templados mediante la inoculación ectomicorrízica. Justificación Una de las maneras de mitigar los efectos del cambio climático es la reforestación. Si los programas de reforestación son apoyados por el desarrollo y la aplicación de bioinoculantes, sus beneficios son mayores. En México, y particularmente para sus bosques de altura, hongos ectomicorrízicos como Laccaria trichodermophora presentan un gran potencial para su aprovechamiento biotecnológico en la conservación, la industria forestal y la propagación de hongos comestibles silvestres. Sin embargo, tanto las técnicas para la producción de su micelio, como la comprensión del trasfondo genético que otorga a esta especie sus capacidades fisiológicas y ecológicas, están en desarrollo incipiente. 13 Pregunta de investigación ¿Cómo producir un bioinoculante vegetativo ectomicorrízico tomando en cuenta la ingeniería de bioprocesos y la genómica funcional? Objetivo general Identificar parámetros de cultivo y características genómicas relevantes en el aprovechamiento biotecnológico de Laccaria trichodermophora. Objetivos particulares 1.- Identificar los parámetros de cultivo que generan alta producción de biomasa miceliar de L. trichodermophora en medio líquido y escalar estos cultivos a biorreactor. 2.- Identificar el efecto de la longitud de las lecturas de secuenciación sobre la calidad del ensamble genómico de novo de Laccaria trichodermophora, y a su vez, el efecto de la calidad del ensamble en las inferencias genómico-funcionales. 3.- Identificar genes potencialmente involucrados en la fisio-ecología simbiótica de las distintas cepas de Laccaria trichodermophora. 14 Capítulo I- La evolución de la simbiosis ectomicorrízica desde la perspectiva genómica En este Capítulo se hizo una revisión de la literatura relacionada con la genómica funcional y evolutiva de los hongos ectomicorrízicos. Se destacan dinámicas evolutivas guiadas, a nivel genético por la actividad de transposones, y a nivel macroecológico por la diversificación de hospederos y el salto de uno a otro. También se enfatiza la importancia de juegos genéticos particulares para la explotación del suelo en busca de nutrientes nitrogenados, la penetración de los tejidos radiculares, la formación de la ectomicorriza y la comunicación entre simbiontes mediante efectores moleculares. El Capítulo fue publicado como artículo de revisión en la revista Scientia Fungorum (2019, 49:e1247, doi.org/10.33885/sf.2019.49.1247) con el título “La evolución de la simbiosis ectomicorrízica desde la perspectiva genómica”.
 15 18/9/21 22:55 localhost:10202/session/viewhtml5b2c20d85caf/index.html localhost:10202/session/viewhtml5b2c20d85caf/index.html 1/1 16 1 CORRESPONDING AUTHOR Roberto Garibay-Orijel, rgaribay@ib.unam.mx ORCID: 0000-0002-6977-6550 Reviews ARTICLE HISTORY Received 09 February 2019 / Accepted 12 December 2019 Published on line: 31 december 2019 DOI: 10.33885/sf.2019.49.1247 (2019) Vol. 49:e1247 La evolución de la simbiosis ectomicorrízica desde la perspectiva genómica The evolution of ectomycorrhizal symbiosis from the genomic perspective Rodolfo Ángeles-Argáiz, Roberto Garibay-Orijel Laboratorio de Sistemática, Ecología y Aprovechamiento de Hongos Ectomicorrízicos, Instituto de Biología, Universidad Nacional Autónoma de México, Ciudad de México. RESUMEN Antecedentes: En los genomas de hongos ectomicorrízicos, están las huellas de las interacciones biológicas que los han transformado y les confirieren sus características fisiológicas y ecológicas. Objetivos: Analizar los principales patrones relativos a la evolución y genómica funcional de los hongos ectomi- corrízicos. Métodos: Se revisó la bibliografía sobre historia evolutiva, diversificación, genómica funcional y genómica com- parativa de hongos ectomicorrízicos. Resultados y conclusiones: Los hongos ectomicorrízicos evolucionaron independientemente a partir de diver- sos ancestros saprobios con dos picos de diversificación, uno en la transición del Jurásico-Cretácico y el segun- do a partir del Paleoceno. La condición ectomicorrízica generó diversificación de especies en muchos géneros que lo adoptaron. La pérdida múltiple e independiente de enzimas degradadoras de pared celular vegetal es una característica común entre estos linajes; mientras que la reinvención de la comunicación con la planta a través de nuevos genes huérfanos es característica de algunos linajes. El tamaño de ciertas familias génicas ha aumentado guiado por la actividad de transposones. Diversos estudios evidencian un mosaico evolutivo y funcional desarrollado independientemente en estos hongos. La masificación de la genómica y transcriptómica es necesaria para entender las relaciones entre las presiones ambientales o biológicas y la evolución y función de los hongos. Palabras clave: origen evolutivo, patrones de diversificación, genómica funcional ABSTRACT Background: In the ectomycorrhizal fungal genomes we can found the fingerprints of the biological interactions that have transformed them and conferred their physiological and ecological traits. Objectives: To analyze the main functional genomic and evolutionary patterns related to the ectomycorrhizal lifestyle. Methods: We reviewed bibliography on ectomycorrhizal fungi evolutionary history, diversification, functional ge- nomics and comparative genomics. Results and conclusions: Ectomycorrhizal fungi evolved independently from diverse saprotrophic ancestors with two diversification peaks, one in the Jurassic-Cretaceous transition and the second since the Paleocene. The ec- tomycorrhizal lifestyle generated diversification in many species of the genera that adopted it. The multiple and independent loss of plant cell wall degrading enzymes seems to be the only common evolutionary patter among these lineages. In contrast, the reinvention of communication with the plant host, through the development of new orphan genes is a trait present just in some lineages. Some gene families have increased in size through transposons activity. Several studies show an evolutionary and functional mosaic developed independently en these fungidependent evolution. The widespread of genomic and transcriptomic is necessary to understand the effect environmental and biological pressures on fungal evolution and function. Keywords: evolutionary origin, diversification patterns, functional genomics 
 17 ÁNGELES-ARGÁIZ Y GARIBAY-ORIJEL. LA EVOLUCIÓN DE LA SIMBIOSIS ECTOMICORRÍZICA ... 2 INTRODUCCIÓN Una de las simbiosis biológicas más relevantes y am- pliamente distribuidas en los ecosistemas terrestres es la simbiosis ectomicorrízica. Ésta se presenta entre las hifas y las raíces de un amplio número de linajes fúngicos y vegetales y ha aparecido en más de 80 ocasiones a lo largo de la historia de la vida terrestre (Tedersoo y Smith, 2017). A continuación se hace una revisión de los principales patrones históricos y evolu- tivos que han moldeado la diversidad genómica ac- tual de los hongos ectomicorrízicos (HEM), y se identi- fican las características genómicas que les otorgan sus particularidades ecológicas y fisiológicas. Es así como identificamos que la simbiosis ectomicorrízica es un complejo mosaico de diversidad taxonómica y funcio- nal sobre el cual actúan fuerzas genómicas de manera diferencial en linajes fúngicos diversos. DIVERSIDAD DE PLANTAS Y HONGOS ECTOMICORRÍZICOS Aproximadamente 2-3 % de las plantas vasculares terrestres actuales presentan simbiosis ectomicorrízi- ca (Brundrett, 2009; Smith y Read, 2008). Tedersoo y Brundrett (2017) estimaron 6,000-7,000 especies de plantas ectomicorrízicas, en 250-300 géneros, que representan 30 linajes botánicos independientes. La mayor parte son eudicotiledóneas, excepto Pinales, Gnetaceae (coníferas) y Kobresia (Liliopsida). Las plan- tas ectomicorrízicas derivan de ancestros que presen- taron una asociación con hongos micorrízicos arbuscu- lares (HMA) en Glomeromycotina (Brundrett, 2009). La micorriza arbuscular es una característica ancestral de las plantas vasculares terrestres. No obstante, se reco- noce que al menos cinco linajes (Coccoloba, Persicaria vivipara, Gymnopodium y Pisonea en Caryophyllales y Kobresia en Poales) evolucionaron de ancestros facul- tativos o no-micorrízicos (Tedersoo y Brundrett, 2017). Aunque algunos autores consideran que las plantas no vasculares (e.g. hepáticas) con HEM en sus talos adoptaron la simbiosis recientemente (Tedersoo y Brundrett, 2017), se ha propuesto que la asociación entre HEM en Mucoromycotina pudo ser tan antigua e importante como la de Glomeromycotina y las prime- ras plantas vasculares (Chang et al., 2019). La familia Pinaceae es el grupo de plantas ectomico- rrízicas más antiguo que se conoce a la fecha, ésta di- vergió hace 320-340 Ma y sus géneros más antiguos con representantes actuales aparecieron hace 175-198 Ma (Tedersoo y Brundrett, 2017). Las pináceaeas se asocian con la mayoría de los linajes de HEM, ya que suelen ser los principales elementos botánicos de los ecosistemas templados y boreales. En Ericaceae, Fa- gales y Fabales se desarrollaron ectomicorrizas, mico- rrizas ericoides, arbutoides, simbiosis actinorrízica y rizobia (Brundrett, 2002; Tedersoo y Brundrett, 2017; Peterson et al., 2004). La mayoría de los linajes restan- tes de plantas ectomicorrízicas se distribuyen en zo- nas tropicales o australes, con excepción de la familia Salicaeae (Tedersoo y Brundrett, 2017). En las familias Pinaceae, Fagaceae y Betulaceae se encuentran árboles particularmente importantes que cubren grandes extensiones forestales del hemisferio norte, mientras que las plantas ectomicorrízcas de las familias Nothofagaceae, Myrtaceae, Dipterocarpaceae y Fabales son dominantes en bosques del hemisferio sur y/o en ecosistemas tropicales. No obstante, sigue aumentando la información sobre nuevas plantas ec- tomicorrízicas en los trópicos húmedos y secos (Álva- rez-Manjarrez et al., 2018), lo que ayuda a comprender la historia evolutiva de la simbiosis ectomicorrízica. Tedersoo y Smith (2017) reconocen 284 géneros de HEM. De manera conservadora, la riqueza de HEM es de 7,950 especies documentadas y 20,000 estimadas, pertenecientes a los Phyla Ascomycota y Basidiomy- cota, y al sub-Phylum Mucoromycotina (Comandini et al., 2012). Con el uso del criterio “duro” (la presencia del órgano ectomicorriza anatómicamente completo) aunado a los criterios “secundarios” (posicionamiento filogené- tico y perfil de isótopos estables), el conteo de linajes fúngicos ha pasado de 66 (Tedersoo et al., 2010) a 78 (Tedersoo y Smith, 2013) y posteriormente a 86 (Te- dersoo y Smith, 2017), esto en menos de 10 años. En algunos casos una especie, género o familia botáni- ca completa mantienen su estatus trófico; sin embargo, en muchas otras situaciones la cuantificación de géne- ros o familias no es equiparable al número de ocasio- nes en que la simbiosis ectomicorrízica evolucionó (Te- dersoo et al., 2010). Por ejemplo, mientras Rinaldi et al. (2008) consideraron un sólo origen de la simbiosis ec- tomicorrízica en Thelephorales, Tedersoo et al. (2010) detectaron cinco orígenes independientes dentro de este grupo. Por estos motivos se usa el término “linaje” como entidad taxonómica discreta (aunque informal). 
 18 3 (2019) Vol. 49: e1247 La simbiosis ectomicorrízica apareció en 34 linajes en Ascomycota, en las Clases Dothideomycetes (1), Euro- tiomycetes (1), Leotiomycetes (9), Sordariomycetes (2) y principalmente en Pezizomycetes (21); mientras que en Basidiomycota surgió en 48 linajes: Phragmobasi- diomycetes (3), Sebacinales (1), Cantharellales (6), His- terangiales (2), Gomphales (2), Hymenochaetales (1), Agaricales (11), Tricholomatales (3), Russulales (2), The- lephorales (6), Poliporales (6) y Boletales (5). Así mis- mo, la simbiosis ectomicorrrízica evolucionó en 4 oca- siones independientes en Mucoromycotina (Tedersoo y Smith, 2017). Además, es importante destacar que algunos linajes presentan muy alta diversidad, por ejemplo, en Cortinarius está representado por más de 2,000 especies y en Russula y Lactarius con más de 2,500. En contraste, linajes raros como Meliniomyces (Leotiales) sólo está representado por 4 especies (Te- dersoo et al., 2010). EL ORIGEN DE LA SIMBIOSIS ECTOMICORRÍZICA Los HEM forman un grupo polifilético integrado por 86 linajes fúngicos independientes en Basidiomyco- ta, Ascomycota y Mucoromycota (Tedersoo y Smith, 2017). Este grupo fue denominado así por el órgano de intercambio y comunicación formado por tejido fúngico y vegetal, la ectomicorriza. Este órgano ha sido desarrollado de manera convergente en 30 lina- jes botánicos (Tedersoo y Brundrett, 2017). Históricamente se han planteado tres hipótesis sobre el origen evolutivo de la simbiosis ectomicorrízica: 1) Múltiples orígenes filogenéticos con varias reversio- nes hacia la saprotrofía (Hibbett et al., 2000; James et al., 2006). En este escenario, focalizado en los Ho- mobasidiomycetes, se reconstruye al último ancestro común (UAC) de los Agaricales y Boletales como un HEM. 2) El último ancestro común de los Agaricomy- cetes fue un HEM, posteriormente hubo cambios ha- cia la saprotrofía de manera convergente en múltiples linajes (Weiss et al., 2004). Esta hipótesis se basa en el hecho de que uno de los grupos basales de Ho- mobasidiomycetes, los Sebacinales, presentan prác- ticamente todos los tipos de asociaciones biotróficas, tanto benéficas como detrimentales, por lo que se postula al UAC de Homobasidiomycetes como biotró- fico, con múltiples saltos hacia la saprotofia median- te el desarrollo de la maquinaria enzimática para la pudrición blanca y marrón. Esta hipótesis encuentra respaldo en similitudes entre el genoma del endófito Piriformospora indica (Sebacinales) y los genomas de HEM, como la reducción de metabolismos secunda- rios y presencia de péptidos efectores, pero también con los genomas de hongos saprobios, ya que cuenta con expansiones en las enzimas degradadoras de pa- red celular vegetal (PCWDEs), metaloproteasas y do- minios de unión a pared celular (Zuccaro et al., 2011). Se ha postulado que algunos linajes de HEM pasaron por un estado endofítico intermedio durante la tran- sición de saprótrofos a biótrofos (Selosse et al., 2009; van der Heijden et al., 2015). 3) Los UACs fueron sa- probios, con múltiples cambios hacia la simbiosis pero sin reversiones al estado anterior. En este escenario se consideran tanto a Basidiomycetes como Ascomy- cetes y Endogonales (Mucoromycota), proponiendo 86 saltos convergentes hacia la simbiosis ectomico- rrízica (Tedersoo et al., 2010; Wolfe et al., 2012). Tomando en cuenta los eventos de diversificación y el tiempo geológico, las filogenias datadas son una herramienta útil para hacer estimaciones confiables acerca de la historia evolutiva de los grupos biológi- cos para los que no se cuenta con evidencia fósil, o cuando ésta es muy pobre. Con base en relojes mole- culares del marcador ribosomal SSU calibrados con fó- siles de ectomicorrizas suilloides (LePage et al., 1997), Bruns et al. (1998) propusieron que la simbiosis ecto- micorrízica pudo haber diversificado simultáneamente durante el Eoceno-Oligoceno (65-35 Ma). En ese mo- mento geológico, el clima global comenzaba a enfria- se, abriendo paso a la aparición de grandes extensio- nes de bosques templados dominados por miembros de Pinaceae y Fagales. Por otra parte, Halling (2001) propuso que la simbiosis evolucionó simultáneamen- te con Pinaceae desde el periodo Jurásico (180 Ma), con una posterior explosión de diversificación durante el Cretácico (125-65 Ma), en conjunto con la diversi- ficación de las Angiospermas en un planeta más cá- lido. Posteriormente se rechazaron las hipótesis del UAC de Agaricomycetes como HEM y de estos hon- gos como los primeros socios de Pinaceae (Hibbett y Matheny 2009; Ryberg y Matheny 2011), por la dis- cordancia encontrada en las edades de los clados de HEM del orden Agaricales, los cuales probablemente aparecieron mucho después del Jurásico, durante el Cretácico y el Paleógeno (entre 100 y 40 Ma) (Hibbett y Matheny, 2009). Sin embargo, grupos de HEM más antiguos como Tuberaceae (Pezizales, Ascomycota), 
 19 ÁNGELES-ARGÁIZ Y GARIBAY-ORIJEL. LA EVOLUCIÓN DE LA SIMBIOSIS ECTOMICORRÍZICA ... 4 parecen haber surgido durante el límite Jurásico-Cre- tácico y diversificado posteriormente durante el Cretácico y el Paleógeno (Bonito et al., 2013; Murat et al., 2018; O’Donnell et al., 2011). La visión actual, propuesta por Kohler et al., (2015), es la más robusta metodológicamente. Estos autores analizaron 542 genes ortólogos de una copia en los genomas de 49 taxa, donde incluyeron HEM, hongos formadores de micorriza orquidioide, ericoide, en- dófitos, patógenos de plantas, de animales, hongos saprobios de pudrición blanca, marrón y descompo- nedores de hojarasca. Los autores detectaron múlti- ples eventos evolutivos de aparición de la simbiosis ectomicorrízica, la mayoría de los cuales parecen ha- ber ocurrido en el periodo Cenozoico, (incluyendo el antiguo linaje de Tuber melanosporum). Sólo un linaje (Sebacina spp.) parece haber aparecido antes, a fina- les del Cretácico. Estos resultados contrastan con los de otros autores que proponen la aparición de la sim- biosis ectomicorrízica como un paralelismo a la apari- ción de las primeras Pinaceae en Laurasia durante el Jurásico medio (Strullu-Derrien et al., 2018). Kohler et al. (2015) proponen, que la clase Agaricomy- cetes divergió mucho antes, en el Pérmico (300 Ma), por lo que la separación entre Ascomycota y Basi- diomycota debió ocurrir antes. Ésto indica que la apa- rición de ambos grupos es muy antigua y que pasó mucho tiempo hasta el cambio en tipo de nutrición biotrófica (Brundrett y Tedersoo, 2018). En casi todas las hipótesis se propone que el ancestro de cada lina- je con simbiosis ectomicorrízica fue saprobio, aunque permanece la discusión sobre un posible evento de reversión en Boletales (Kohler et al., 2015). Esta postu- ra concuerda con la reciente propuesta de “evolución micorrízica en tres olas” (Brundrett y Tedersoo, 2018) donde la segunda y tercera ola de aparición de linajes botánicos ectomicorrízicos pudieron haber ocurrido durante el Cretácico y en el Paleoceno, posiblemente en consecuencia de grandes cambios climáticos glo- bales. Así mismo, la edad de divergencia de Tubera- ceae se ha estimado, recientemente y de manera muy robusta, en el Cretácico temprano (Murat et al., 2018). Kohler et al. (2015) no incluyeron datos de Endogo- nales (Mucoromycota), Heterobasidiomycetes ni de otros linajes en Ascomycota de los que no se contaba con genomas secuenciados. Por otro lado, aunque el origen de Endogonales se ha propuesto tan antiguo como el de Glomeromycotina, durante el Silúrico, el origen del linaje ectomicorrízico de Endogonaceae se ha fechado en el límite del Pérmico-Triásico. Ade- más, dado que el ancestro de Endogonales ha sido re- construido como simbionte de plantas criptogámicas (Chang et al., 2019), constituye otro caso en el que el origen de la simbiosis a partir de un ancestro saprobio podría no cumplirse. Investigación similar en Sebaci- nales deberá aumentar e incluir hongos representan- tes de distintos estatus tróficos para así modelar el estatus trófico de los ancestros de los HEM en estos linajes. Nuevas investigaciones sobre grupos antiguos podrían resolver el enigma sobre la simbiosis ecto- micorrízica en el Triásico y Jurásico por las antiguas Pinaceae y Gnetaceae. Es así como, con más de diez años de datos genómi- cos en el estudio de la evolución de la simbiosis ec- tomicorrízica, no se observa un patrón universal que aplique para todos los linajes. Sin embargo, son pocos los grupos para los que el estado trófico de su ances- tro sigue en discusión, mientras que se hacen eviden- tes dos grandes picos de aparición/diversificación de la simbiosis, en el límite Jurásico-Cretácico y a partir del Paleoceno. EVIDENCIA FÓSIL La evidencia más contundente de la existencia de los organismos del pasado son los fósiles. Las esporas de los hongos suelen ser duras y abundantes, sin em- bargo, otras estructuras fúngicas son blandas, lo que las hace muy escasas en el registro fósil (Taylor et al., 2015). En la cantera Princeton, en la Columbia Británica ca- nadiense, fueron encontradas las primeras ectomico- rrizas fósiles. Se trata de raíces de Pinus perminerali- zadas, con patrones de ramificación que van desde dicotómicos hasta complejos coraloides, sin vellosida- des radicales, manto pseudoparenquimatoso, red de Hartig que se extiende hasta la endodermis, y micelio externo de septo simple. Aunque no se encontraron esporomas, esclerocios ni rizomorfos en la cantera, se asume que las ectomicorrizas fósiles pertenecen a algún hongo cercano al linaje Suillus-Rhizopogon de hace unos 50 millones Ma de antigüedad (LePage et al., 1997). Posteriormente, en la mina Tadkeshwar, India, se encontraron raíces de un representante de Dipterocarpaceae preservadas en ámbar. Son siste- mas micorrízicos cruciformes a monopodial-pinados, 
 20 5 (2019) Vol. 49: e1247 de coloraciones obscuras, abundante micelio externo melanizado y sin fíbulas. A partir de ellas se propuso el registro de una nueva especie, Eomelanomyces ce- nococcoides, un representante anamórfico extinto de Dothidiomycetes (Ascomycota), de hace 52 Ma (Beim- forde et al., 2011). Estas dos evidencias aseguran que los hongos ecto- micorrízicos ancestrales formaron ectomicorrizas en las raíces de coníferas y Angiospermas desde hace al menos 52 Ma. Es importante destacar que estas únicas dos ectomicorrizas fosilizadas pertenecen a paleoambientes tropicales o templado-cálidos (Stru- llu-Derrien et al., 2018). PATRONES BIOGEOGRÁFICOS DE DIVERSIDAD En biogeografía microbiana “todas las especies están en todos lados” fue un paradigma imperante durante el siglo pasado. Este paradigma cayó, en gran medi- da, gracias a la secuenciación masiva de muestras am- bientales (e.g. Tedersoo et al., 2014). El gradiente latitudinal de diversidad que muestra un incremento en la riqueza hacia los trópicos es un pa- trón aceptado a través de todo el árbol de la vida, incluyendo los hongos (Brown, 2014). No obstante para los HEM en particular, el máximo de diversidad se alcanza en latitudes templadas (Tedersoo y Nara, 2010), lo cual no es sorprendente al considerar que el ecosistema mejor explotado por estos hongos se desarrolla en climas templados y fríos (Soudzilovskaia et al., 2017). En latitudes tropicales los HEM presentes son más antiguos, mientras que en los ecosistemas fríos suelen ser de reciente diversificación (Tedersoo et al., 2014). Este patrón debe ser explicado, desde la perspecti- va macroevolutiva, a través de procesos de diversifi- cación, extinción y dispersión sustentados en análisis filogeográficos. Kennedy et al., (2012) detectaron que un clado particular de Clavulina, propio de ecosiste- mas templados presenta una tasa de diversificación 2.6 veces mayor al resto del género, que es principal- mente tropical. Este hallazgo fue posteriormente res- paldado por Sánchez-Ramírez et al. (2015a) al poner en evidencia que los clados templados del complejo Amanita caesarea diversificaron más rápido que los tropicales. Del mismo modo, se detectó una alta tasa de diversificación en los clados templados de Russula, junto con posteriores interaciones de dispersión bi- direccional entre ecosistemas tropicales y templados (Looney et al., 2018). LA CONDICIÓN ECTOMICORRÍZICA COMO MOTOR DE DIVERSIFICACIÓN La condición ectomicorrízica parece ser una fuente de diversificación para los hongos que la adoptaron. La diversidad de plantas y hongos implicados en este tipo de simbiosis es una de las evidencias más simples. La múltiple e independiente ocurrencia de la simbio- sis, a través del tiempo, respalda esta aseveración. Muchos linajes de HEM son muy diversos, lo cual es aún más evidente al compararlos con clados asim- bióticos cercanamente emparentados. En Russulales, la Familia Russulaceae es ectomicorrízica y está inte- grada por 2,018 especies, en contraste, las familias asimbióticas Auriscalpiaceae (76), Bondarzewiaceae (72), Echinodontiaceae (7), Gloeocystidiellaceae (9) y Stereaceae (290) son menos diversas (Looney et al., 2018). Por otro lado, este patrón no se repite en el otro linaje ectomicorrízico de Russulales, el género Alba- trellus, con sólo 26 especies. Algo similar ocurre en la Familia Tricholomateceae (Agaricales), donde el géne- ro Tricholoma presenta una mayor diversidad que los grupos asimbióticos de la misma familia; sin embargo, Albomagister y Porpoloma, linajes ectomicorrízicos independientes dentro de Tricholomataceae, no son tan diversos. En Russula, los saltos de hospedero de coníferas a an- giospermas se postulan como importantes motores de la diversificación (Looney et al., 2016). Así mismo, cambios de hospedero de angiospermas a Pinaceae han sido interpretados como fuente de diversificación, como sucede en el complejo Amanita caesarea (Sán- chez-Ramírez et al., 2015a; 2015b), en Hysterangiales (Hosaka et al., 2008), así como para algunos miembros de Inocybaceae (Matheny et al., 2009), Laccaria (Wil- son et al., 2017a, 2017b), Leccinum (Den Bakker et al., 2004) y Tuberaceae (Bonito et al., 2013). Wilson et al. (2011) estudiaron los efectos de la gaste- romicetización sobre las tasas de diversificación de al- gunos HEM en Boletales. Encontraron que los clados de HEM gasteroides tienen una tasa de diversificación mayor en comparación con sus parientes agaricoides. Aunque hasta el momento la hipótesis de la simbio- sis ectomicorrízica como clave en la diversificación de los hongos no está totalmente sostenida y sigue en 
 21 ÁNGELES-ARGÁIZ Y GARIBAY-ORIJEL. LA EVOLUCIÓN DE LA SIMBIOSIS ECTOMICORRÍZICA ... 6 discusión (Looney et al., 2018; Sánchez-García y Ma- theny, 2017), se continúa acumulando evidencia que da mayor soporte a esta teoría. La investigación so- bre los efectos que la especificidad y los cambios de hospedero tienen sobre la diversificación de los HEM ofrece la oportunidad de clarificar el panorama de la historia evolutiva de los mismos. En este sentido, nuestro grupo de investigación ha secuenciado ge- nomas del HEM Laccaria trichodermophora, una es- pecie joven de hace unos 6 Ma de divergencia y con una fuerte preferencia por hospederos del género Pinus, aunque existen reportes de cambio de hospe- dero a Fagus (Ramos et al., 2017) y Quercus (Mueller y Strack, 1992). Ante esta situación ha surgido pregun- tas como ¿Cuál es o fue el hospedero ancestral de L. trichodermophora? ¿Es el genoma de L. trichoder- mophora el de un HEM especialista? y ¿Existen en el genoma de L. trichodermophora genes involucrados en la selección de hospedero? Para responder estas preguntas se pueden utilizar aproximaciones de la genómica comparativa y la filogeografía. CO-EVOLUCIÓN Y LA HIPÓTESIS DE LA PLANTA PUENTE Como se ha revisado, hongos y plantas ectomicorrízi- cas han compartido su historia evolutiva por decenas de millones de años. Procesos co-evolutivos similares se han atribuido a los HMA desde los inicios de la vida vegetal en los ambientes terrestres (450 Ma), con in- fluencia en la alternancia desde gametofitos de talo rastrero hacia esporofitos con raíces. Los esporofitos evolucionaron como un ambiente favorable para es- tos hongos y el desarrollo de sus funciones (Brundrett, 2002). La especificidad en la simbiosis es requisito para la co-evolución, y en muchos grupos biológicos que la presentan, ha generado diversificación. Los HEM, al compararlos con los HMA pueden parecer especí- ficos, atendiendo al número de especies botánicas involucradas. Sin embargo, los pocos ejemplos de especificidad que se conocen en la simbiosis ectomi- corrízica apenas alcanzan el nivel de género. Un sólo hospedero ectomicorrízico puede asociarse simultáneamente a un elevado número de especies de HEM, e.g Quercus posee entre 50 a 200 espe- cies de hongos asociados según el continente (Gar- cía-Guzmán et al., 2017). La excepción la presenta el género Alnus, con comunidades de HEM en sus raíces de entre 15 y 25 especies. Kennedy et al. (2011) com- pararon las comunidades de HEM de Alnus en México con las de otras partes de Norteamérica. Detectaron que a pesar de que la composición de especies fue distinta, la composición de linajes fue similar. Con ello, además de respaldar la hipótesis de co-migración, se sugiere algún tipo de co-evolución difusa. Además, la comunidad restringida de HEM en las raíces de Alnus puede estar relacionada con el desarrollo de la sim- biosis actinorrízica (Kennedy et al., 2015). En Ericales, diversos miembros desarrollaron nue- vos tipos de micorriza (arbutoide y monotropoide) en asociación con HEM. Estas asociaciones son más específicas que las que se encuentran en la simbiosis ectomicorrízica. Pterospora y Sarcodes (Ericaceae) úni- camente se asocian con algunas especies de Rhizopo- gon (Agaricomycetes, Brundrett, 2002), Monotropa se asocia con algunas especies de Russula y Lactarius (Agaricomycetes, Kong et al., 2016). En estos casos la especialización es sólo por parte de la planta, ya que los HEM deben formar parte de la red micorrízica co- mún para poder mantener a estas plantas aclorofíli- cas. Es así que son pocos los ejemplos de HEM para los que sí se reconoce cierto grado de especificidad, como Lactarius (Geml et al., 2009; Looney et al., 2016) y Suillus-Rhizopogon (Nguyen et al., 2016). Cada vez hay mayor evidencia de que la estructura y composición de las comunidades de HEM están fuer- temente segregadas por factores ambientales (tipo de suelo, pH, disponibilidad de P, N, etc.) y no por la identidad taxonómica de los hospederos (e.g. Co- rrales et al., 2016; Geml et al., 2009; Looney et al., 2016; Truong et al., 2017; Vasco-Palacios et al., 2019). Es así como los HEM colonizan por dispersión am- bientes similares en asociación con plantas ectomico- rrízicas distintas, como se ha detectado en especies HEM invasivas, según Vellinga et al., (2009). Bajo este esquema, siguiendo la hipótesis de la planta-puente (Looney et al., 2018), un HEM puede saltar desde un hospedero con poblaciones en reducción hacia otro con tamaños poblacionales crecientes. De este modo, HEM asociados a angiospermas tropicales adoptaron a las plantas ectomicorrízicas templadas que avanza- ban en terreno y diversidad durante los periodos de enfriamiento ocurridos desde el Paleógeno, lo que podría explicar las explosiones de diversidad de HEM de esa época. 
 22 7 (2019) Vol. 49: e1247 LA PÉRDIDA CONVERGENTE DEL PODER DEGRADADOR DE LA PARED CELULAR VEGETAL La limitada capacidad de asimilar compuestos carbo- nados complejos es una de las características conoci- das de los HEM desde la microbiología clásica (Frank, 2005; Hutchison, 1991); sin embargo, no fue hasta la introducción de las herramientas genómicas que se pusieron en evidencia los genes relacionados con es- tas funciones. La evolución polifilética en muchos hongos ecto- micorrízicos y el cambio en el modo nutricional, de saprobio a biotrófico, se caracteriza por las pérdidas convergentes de genes codificantes para enzimas de- gradadoras de la pared celular (PCWDEs) y peroxida- sas ligninoxidativas de clase II (PC2). Las pérdidas son más pronunciadas en genes que codifican PC2, esen- ciales para la oxidación de lignina, y en exocelulasas que degradan celulosa cristalina. De hecho, la ausen- cia, casi total, de genes que codifican las celobiohi- drolasas GH6 y GH7 en los genomas de Agaricales y Boletales es sobresaliente (Kohler et al., 2015; Kohler y Martin, 2017; Martin et al., 2016). En Ascomycota, Tuber melanosporum tampoco pre- senta estos genes, aunque Cenococcum geophilum los ha retenido (Martin et al., 2010, 2016; Murat et al., 2018; Peter et al., 2016). Reducciones similares se detectaron para los genes codificadores de enzimas degradadoras de hemicelulosa o de pectina (Martin y Selosse, 2008). Todos los HEM analizados retienen al menos un gen para monooxigenasas líticas de polisacáridos (LPMOs), las cuales cumplen funciones ligno-celulolíticas, aun- que en los HEM las LPMOs están más bien involucradas en el crecimiento celular y el desarrollo de pseudoteji- dos mediante la oxidación de la quitina (principal com- ponente de la pared celular fúngica). Según Hess et al. (2014, 2018) Amanita evolucionó a partir de un grupo de Agaricales descomponedo- res de hojarasca. Estos Agaricales no desarrollaron PC2, por lo que ni el genoma de A. muscaria ni el de A. thiersii (=Saproamanita thiersii) presentan PC2. En contraste, algunos HEM como Hebeloma cylin- drosporum, descendiente de un grupo de pudrición blanca en el que se desarrollaron PC2 (y muchas otras PCWDEs), retuvieron algunas peroxidasas (Dore et al., 2015). En H. cylindrosporum las PC2 son producto de duplicaciones recientes y las sobreexpresa en la ectomicorriza, lo que sugiere que tienen algún valor adaptativo relacionado con la colonización de la raíz y el desarrollo de la ectomicorriza (Dore et al., 2015; Kohler y Martin, 2017; Martin et al., 2016). Caso similar ocurrió independientemente en Cortinarius glauco- pus, el cual presenta un número alto de PC2, compa- rable con el de hongos de pudrición blanca y expresa- dos en el suelo (Bödeker et al., 2014). En ambos casos, las PC2 son manganeso-peroxidasas u otras formas atípicas (carecen de triptófanos expuestos y tienen modificaciones en los módulos de unión a Mn) que no presentan actividad versátil o ligninolítica. Laccaria bicolor también tiene 12 PC2, pero estas no se expre- san en la ectomicorriza (Pellitier y Zak, 2018). Los perfiles transcripcionales en simbiosis han mos- trado evidencia de que en los grupos analizados se expresa un “núcleo de genes” conservados con los ancestros saprobios. Dichos genes son transportado- res de membrana, enzimas asimilativas y oxidoreduc- tasas (Kohler et al., 2015; Kohler y Martin, 2017). En es- tos genes la evolución parece haber actuado sobre la regulación de su expresión, aunque también podrían haber adquirido nuevas funciones. En los genomas de HEM se conservaron genes que codifican lacasas y peroxidasas decolorantes. Estos mecanismos no son utilizados en la degradación de la pared celular, pero están relacionados con la des- composición de materia orgánica del suelo (MOS, e.g compuestos húmicos). El conteo y expresión de PCWDEs de los HEM pone en evidencia que estos hongos son dependientes de la planta para la obtención de carbono, pero al mismo tiempo respetan la integridad de la pared celular de la raíz, evitando así ser repelidos y mantener el suminis- tro de nutrientes (Plett y Martin, 2015, 2018). BÚSQUEDA Y TRANSPORTE DE NITRÓGENO Los HEM se desarrollan generalmente en suelos po- bres en N (como los bosques templados) y sus po- blaciones son sensibles a la fertilización con N. En el suelo, el 95% del N es acumulado y secuestrado por la MOS. El micelio exploratorio de algunos HEM es hidrofóbico, y aunque prolifera en residuos orgánicos puede acceder a compuestos insolubles. Además, los HEM presentan la capacidad de asimilar compues- tos orgánicos como urea, poliamidas, aminoácidos y péptidos pequeños (Näsholm et al., 2009; Pena et al., 2016; Read y Pérez-Moreno, 2003). 
 23 ÁNGELES-ARGÁIZ Y GARIBAY-ORIJEL. LA EVOLUCIÓN DE LA SIMBIOSIS ECTOMICORRÍZICA ... 8 A pesar de la pérdida paralela de PCWDEs por los HEM en general, varias especies (e.g. C. glaucopus, H. cylindrosporum, L. bicolor y Piloderma croceum) conservan algunas PC2, y por tanto conservan la ca- pacidad de oxidar lignina o residuos polifenólicos de la MOS, lo que les da acceso al N secuestrado en los complejos recalcitrantes de difícil acceso. Paxillus in- volutus y otros HEM, son capaces de modificar los biopolímeros de la MOS durante la asimilación de N mediante la excreción de radicales hidroxilo con la re- acción Fenton (Rineau et al., 2013). La reacción Fenton es típica de los hongos de pudrición marrón, que no cuentan con la capacidad de descomponer la lignina, cualidad propia de los hongos de pudrición blanca. La vía Fenton es costosa energéticamente y dependien- te de glucosa. Otras alternativas para la obtención de N del suelo son las LPMOs que oxidan polisacáridos y otras enzimas como las peroxigenasas aromáticas, hemo-peroxidasas, lacasas y tirosinasas, que oxidan fenoles y peptidasas que actúan sobre proteínas y péptidos (Martin et al., 2016). Los HEM también presentan transportadores de mem- brana, selectivos para aminoácidos ricos en N, y trans- portadores de nitrato; también pueden importar amo- nio por dos vías enzimáticas distintas. Toda la absorción del N es mediante transportadores activos dependien- tes de ATP o NADP (Read y Pérez-Moreno, 2003; Talbot et al., 2010). Se ha detectado que distintos HEM pre- sentan preferencia por fuentes de N distintas, así como diferencias en sus capacidades de acceso y asimilación. Esto fue respaldado por la presencia de juegos genéti- cos distintos en genomas de HEM secuenciados (Näs- holm et al., 2019; Pellitier y Zak, 2018). Los HEM no tienen una actividad muy fuerte en sus- tratos ricos en carbono, como la lignina de la made- ra. Esta actividad recae principalmente en hongos saprobios. Sin embargo, los HEM participan en la transformación de estos substratos para la moviliza- ción del N, promoviendo la actividad microbiana al descargar energía fotosintética y depositarla en el suelo (“priming effect” como lo han llamado Lindahl y Tunlid, 2015). Pelliter y Zak (2018) revisaron la literatu- ra referente a este tema y argumentan que todos los estudios presentan evidencia parcial y fragmentada. Para comprobar verazmente la liberación, obtención y transporte de N hacia la planta, un HEM deberá te- ner genes codificantes para las enzimas (secretadas) y transportadores, además de expresarlos en alguno de sus tejidos. Estas enzimas/transportadores deberán demostrar su actividad sobre los sustratos y el N del MOS deberá ser transportado hasta la planta. Ade- más, algunos estudios de expresión de transcritos en micelio están realizados con cultivos axénicos in vitro, por lo que no se cuenta con el flujo de glucosa de la planta (Pelliter y Zak, 2018). EL POTENCIAL SAPROBIO DE LOS HONGOS ECTOMICORRÍZICOS Desde los inicios del estudio de la simbiosis ectomico- rrízica, Frank (1894) sugirió que los HEM participaban en la descomposición de la MOS con el fin de encon- trar los nutrientes para la planta. Esta hipótesis fue ol- vidada durante mucho tiempo y vuelta a retomar en la década de 1980 (Koide et al., 2008). El impacto de los HEM en el ciclo del carbono, a diferentes escalas, es muy claro (Ekblad et al., 2013). Sin embargo, el poten- cial saprobio de los HEM es un tema aún en discusión (Kohler y Martin, 2017; Lindahl y Tunlid, 2015). Ya se ha dicho que los HEM derivaron de ancestros sa- probios y que perdieron la mayoría de los genes que sintetizan PCWDEs. Los hongos saprobios, han sido funcionalmente clasificados como hongos de pudri- ción blanca (degradan lignina) o de pudrición marrón (no degradan lignina). La reconstrucción del UAC de Basidiomycota lo describe como un hongo saprobio no ligninolítico, con 4 copias de LPMOs, mientras el de Agaricomycetes como un hongo de pudrición blanca con 27 copias de LPMOs. Se asume que la pu- drición café aparece posteriormente de manera polifi- lética dentro de Agaricomycetes mediante la perdida de genes celulolíticos y desarrollo de genes de la vía Fenton. Además, los hongos descomponedores del mantillo (sin actividad ligninolítica pero con actividad de otras enzimas sobre compuestos carbonados) pa- recen haber surgido a partir de ancestros de pudrición blanca (Kohler et al., 2015; Kohler y Martin, 2017). Es decir, los HEM heredarían su remanente de PCWDEs de manera diferencial, atendiendo al estilo de sapro- trofía que sus ancestros practicaron. La mayoría de los HEM con genoma secuenciado parecen utilizar la glucosa vegetal para “financiar” la oxidación de la MOS, aunque no utilizan mucho los productos de esta degradación para cubrir su propia demanda de C. Incluso, se asume que el costo ener- gético de la oxidación de MOS es más elevado que su 
 24 9 (2019) Vol. 49: e1247 ganancia, lo que sugiere que los HEM pueden efecti- vamente descomponer MOS sin actuar como verda- deros saprótrofos (Lindahl y Tunlid, 2015). Paxillus involutus, cuyo linaje derivó de hongos de pu- drición marrón, codifica algunos genes de PCWDEs de la vía Fenton y su efecto sobre los sustratos es tí- pico de un ataque radical hidroxilo. Sin embargo, no codifica para glicosil-hidrolasas como los hongos de pudrición marrón que usan esta vía. Como ya se ha mencionado, HEM como A. muscaria o H. cylindros- porum retienen muy pocos genes para la degradación de pared celular pero los utilizan principalmente en la organogénesis de la ectomicorriza. Así mismo, los pocos genes de PCWDEs de L. bicolor, expresados en el micelio, están relacionados con la obtención de N (Martin et al., 2016). Cantharellales y Sebacinales son linajes de Agaricomy- cetes de temprana divergencia. En los genomas de Sebacina vermifera y Tulasnella calospora, en contras- te con Agaricales y Boletales, se conservan genes de glioxil oxidasas, así como una batería genética que les permite la degradación y asimilación de compuestos carbonados complejos; sin embargo, la asociación simbiótica mutualista que generan es la micorriza or- quideoide. Los hongos formadores de micorriza orqui- deoide efectivamente exploran los sustratos, toman carbohidratos de la celulosa cristalina y los entregan a la planta. En los genomas de Oidiodendron, Meli- niomyces y Rhizoscyphus (Helotiales, Ascomycota), hongos de condición trófica dual (biótrofo/saprotrofo) y formadores de micorriza ericoide, no solo retienen un repertorio genético que le da altas capacidades sa- protróficas si no que han expandido algunas familias, mismas que sólo son expresadas en el micelio y no en el tejido simbiótico (Kohler et al., 2015; Marino et al., 2018; Perotto et al., 2018). Caso similar es el del endó- fito Piriformospora indica. Aunque se cuenta con una mayor cantidad de genomas de HEM, estos patrones genéticos no se han detectado en ellos (Grelet et al., 2017; Kohler et al., 2015). Por otro lado, Phlebopus portentosus forma sintéti- camente ectomicorrizas anatómicamente completas con Pinus y Acacia. Sin embargo, esta especie ha demostrado su capacidad de obtener el total de sus necesidades nutrimentales y cumplir su ciclo de vida en ausencia de una planta ectomicorrízica (Kumla et al., 2016). Tedersoo y Smith (2017) desconocen a P. portentosus como un HEM, aunque lo consideran bio- trófico. Ellos argumentan que sus ectomicorrizas no se desarrollan de manera natural, que la micorrización sintética forza la asociación y que en la planta no se detectan efectos benéficos atribuibles al hongo (Te- dersoo y Smith, 2017). Considerando la evidencia genómica y experimental, las definiciónes de HEM y/o de hongo saprobio deben flexibilizarse. El continuo evolutivo y fisio-ecológico que los hongos representan a lo largo de un gradiente de biotrofía/saprotrofía impide su clasificación estricta. La constante transformación de los hongos saprobios en HEM está ocurriendo desde hace por lo menos 60 Ma, y no se detiene. El estudio de los genomas de los hongos podría ayudar a resolver preguntas tales como ¿Cuáles son las características genómicas que predis- ponen a los hongos saprobios a saltar hacia la biotrofía y formar estructuras tipo ectomicorriza en las distintas plantas? o ¿Son las plantas las que contienen la predis- posición de adoptar hongos en sus raíces? BIOLOGÍA EFECTORA Las plantas que colonizaron los suelos primitivos con- vivieron con microorganismos simbióticos mutualistas al mismo tiempo que con patógenos y saprobios. Las plantas son capaces de percibir a los microorganismos del suelo y reaccionar diferencialmente según el caso (Plett y Martin, 2018). Cuando la planta detecta la pre- sencia de un microorganismo frente a su pared celular reacciona entrando en un “estado hipertenso” que se caracteriza por suprimir el transporte de toxinas, acu- mular especies reactivas de oxígeno y empaquetar la energía para su transporte. Además, la planta en estado hipertenso, prepara mecanismos de defensa como la vía del jasmonato (JA), del etileno (ET) o del ácido salicí- lico (AS). Si la planta detecta daño a su pared (como el causado por un microorganismo patógeno) desencade- na estos metabolismos de defensa (Plett y Martin, 2018). Los mecanismos de manipulación de la respuesta inmu- ne son muy conocidos en los microorganismos patóge- nos (Toruño et al., 2016). Los HEM, al carecer de PCW- DEs, respetan la integridad de la pared, pero al mismo tiempo inhiben la respuesta inmune, bloqueando mole- cularmente puntos claves en la señalización, a lo que se le llama “biología efectora” (Toruño et al., 2016). En la célula de la raíz, la conjugación de jasmonato con isoleucina (JA-ILe) forma una hormona que induce la ex- presión de genes de defensa de la planta. A bajas con- 
 25 ÁNGELES-ARGÁIZ Y GARIBAY-ORIJEL. LA EVOLUCIÓN DE LA SIMBIOSIS ECTOMICORRÍZICA ... 10 centraciones de JA-ILe, el factor de transcripción MYC2 está bloqueado por el complejo JAZ6. El factor MYC2 está asociado al sitio de reconocimiento de los genes de defensa relacionados con JA. Altas concentraciones de JA-ILe (inducidas por la detección de microorganis- mos) son detectadas por el complejo F-box por lo que COI1 se asocia a JAZ6. COI1 es parte del complejo ubi- quitín ligasa SCFCOI1, por lo que JAZ6 es marcado para degradación por el proteosoma 26S. Esta reacción libe- ra a MYC2, e impide el crecimiento micelial mediante la expresión los genes relacionados a JA. No obstante, en el escenario de la colonización de la raíz por Laccaria bicolor, una vez que se formó la red de Hartig entre las células de las raíces de Populus trichocarpa, el HEM percibe flavonoides de la planta, por lo que secreta el péptido efector MiSSP7 (proteína pequeña secretada inducida en micorriza de 7 kDa). MiSSP7 es transportada al núcleo de la célula vegetal, donde interactúa con JAZ6. MiSSP7 se asocia a JAZ6 y evita su reconocimiento por COI1, por lo que no es degradada, el factor MYC2 no se libera y los genes relacionados con JA no se activan (Martin et al., 2016; Plett y Martin, 2012; Plett et al., 2011; 2014; Veneault- Fourrey et al., 2014). Cuando L. bicolor entra en simbiosis con algún hos- pedero ectomicorrízico expresa una “batería genética núcleo” de regulación, pero también expresa genes específicos atendiendo a la identidad taxonómica del hospedero. Esto ha sido evidenciado en la interac- ción de L. bicolor con Populus trichocarpa y P. del- tioides (Salicaceae, Magnoliophyta) en el estudio de Tschaplinski et al. (2014); así como con Pseudotsuga menziensii (Pinaceae), según Plett et al. (2015). Los péptidos efectores, como MiSSP7, son proteínas pequeñas secretadas (SSPs) que actúan sobre otras moléculas activando o reprimiendo su función. Son conocidos en bacterias, hongos, ácaros y nemátodos. Populus trichocarpa también secreta SSPs en la ec- tomicorriza (Plett et al., 2017). Algunas de estas SSPs vegetales entran a la célula fúngica y se ha propuesto que podrían interferir en la regulación del crecimiento y la morfología hifal (Plett et al., 2017). Un ejemplo distinto es MiSSP8, un péptido de L. bi- color, que a pesar de ser expresado durante la aso- ciación, no se considera efector ya que no interac- túa con el genoma del simbionte. Se expresa en el esporoma y en las primeras etapas de la formación de la ectomicorriza. El silenciamiento de MiSSP8 con RNAi, impide el desarrollo del manto y red de Hartig. Además, MiSSP8 comparte dominios conservados con SSPs de hongos saprobios, por lo que se propo- ne que MiSSP8 es un péptido retenido del ancestro saprobio involucrado en el desarrollo tisular (Pelle- grin et al., 2019). El genoma de Laccaria bicolor codifica cerca de 200 SSPs con funciones desconocidas (Martin et al., 2008), lo que resulta alto si se compara con el 1 al 2% de los genes de Amanita muscaria, Piloderma croceum, He- beloma cylindrosporum y Suillus luteus que codifican SSPs (Plett y Martin, 2015). Del total de genes expre- sados en la ectomicorriza, entre 7 y 38 % son genes específicos de una especie de HEM. Incluso dentro de los linajes mejor muestreados (Boletales 6 genomas, Amanita 7 genomas) las especies comparten muy po- cos genes de SSPs. Por ejemplo, solo un tercio de los genes huérfanos de L. bicolor tienen homólogos en su especie hermana L. amethystina, la cual divergió del linaje de L. bicolor hace alrededor de 20 Ma (Kohler et al., 2015; Wilson et al., 2015a). En el genoma de L. bicolor se han estudiado factores transcripcionales codificados. Entre otras cosas, Da- guerre y colaboradores (2017) detectaron una nueva familia de factores transcripcionales con señal de se- creción. Ellos propusieron que estos factores trans- cripcionales secretados podrían asociarse al DNA nuclear en la planta y participar como efectores en la regulación a favor de la simbiosis (Daguerre et al., 2017). Otro mecanismo de regulación y represión de la expresión genética del simbionte es el siRNA. A di- ferencia de hongos patógenos y plantas, en los HEM aún no se han detectado siRNA secretado en la célula del hospedero (Plett y Martin, 2018). Aunque Kohler et al. (2015) encontraron como común denominador el gran número de SSPs en los geno- mas de Basidiomycota, Hess et al. (2018) no encontra- ron dicho patrón en diferentes especies de Amanita. Estos autores identificaron que en las especies ec- tomicorrízicas de Amanita con genomas grandes (A. brunnescens y A. muscaria) las SSPs presentan expan- siones considerables, sin embargo, esta cualidad se presenta también en la especie asimbiótica A. thiersii la cual está relacionada con Volvariella volvacea y pre- senta un número aún mayor de SSPs. También detec- taron, en concordancia con lo propuesto por Kohler et al. (2015), que la mayor proporción de SSPs representa genes de linaje-específicos; lo que pone en evidencia 
 26 11 (2019) Vol. 49: e1247 una dinámica evolutiva acelerada posterior a la adop- ción del estilo trófico ectomicorrízico. La evidencia genómica sugiere que la biología efecto- ra juega un papel determinante en el establecimien- to o mantenimiento de la simbiosis y que cada linaje de HEM ha logrado comunicarse con su hospedero mediante nuevos genes, muchos de ellos codificantes para SSPs. Sin embargo, de manera general, los HEM de Basidiomycota presentan un elevado contenido de SSPs, mientras que Ascomycetes y Endogonales presentan una cantidad mucho menor y relativamente equiparable entre ellos (Chang et al., 2019). ACTIVIDAD DE TRANSPOSONES Los transposones o elementos transponibles (ETs), son fragmentos del DNA que se caracterizan por mul- tiplicarse y moverse “al azar” al interior de un geno- ma. Mediante el análisis de estos elementos en 1,746 genomas de hongos, Muszewska et al. (2017) detec- taron patrones relacionados con el estilo de vida de esos hongos y el tamaño de su genoma. Los geno- mas secuenciados de los HEM son de los más gran- des entre los hongos, aunque algunos fitopatógenos también presentan genomas grandes (e.g. saprobios: Saccharomyces cerevisiae 12 Mb, Aspergillus niger 35 Mb, Neurospora crassa 40 Mb, Agaricus bisporus 31 Mb; patógenos Ustilago maydis 20 Mb, Puccinia gra- minis 116 Mb; HEM: Laccaria bicolor 65 Mb, Amanita muscaria 54 Mb, Hebeloma cylindrosporum 38 Mb, Tuber melanosporum 125 Mb y Cenococcum geophi- llum 178 Mb, según NCBI, 17 de marzo del 2018). Los HEM pudieron tener reducciones en el contenido ge- nético codificante para PCWDEs y para procesos me- tabólicos secundarios, sin embargo, aunque los ETs pueden incrementar el tamaño de las familias génicas, su genoma creció en cuanto a su DNA no codificante (Muszewska et al., 2017). El contenido de elementos móviles en el genoma es regido por dos fuerzas opuestas: la propia capacidad proliferativa de los ETs y la capacidad de defensa del genoma hospedero para mantener su estabilidad e integridad. Los ETs son eliminados constantemente por recombinación ectópica y por deleciones, aunque los mecanismos para eliminar ETs no están muy estu- diados en hongos (Muszewska et al., 2017). Muchos mecanismos para reprimir la proliferación de ETs ocu- rren en la meiosis, por lo que hongos con reproduc- ción clonal presentan genomas altamente poblados por ETs. Este podría ser el caso del ectomicorrízico Cenococcum geophilum (Ascomycota, Mytilindales, para el cual no se conoce fase sexual), con el genoma fúngico más grande conocido para el momento de su publicación (178 Mb, Peter et al., 2016). Sin embargo, los genes MAT 1-1-1 y otros involucrados en la repro- ducción sexual están presentes en su genoma. La di- versidad genética en esta especie presenta huellas de recombinación, por lo que Peter et al. (2016) han pro- puesto que sí se reproduce sexualmente en la natura- leza. El HMA Rhizophagus irregularis se destaca entre todos los hongos por su diversidad y abundancia de ETs en su gran genoma (101 Mpb con más de 80,000 ETs en 16 de las 19 súper familias de ETs analizadas, Muszewska et al., 2017; Tisserant et al., 2013). Los hongos asociados a plantas presentan la tenden- cia a acumular TEs lo que propicia incremento en ta- maño genómico. Esto es más evidente en hongos bio- tróficos que patógenos. En contraste, los patógenos de animales poseen genomas compactos y pequeños. Algunos de los ETs encontrados en hongos simbion- tes de plantas multiplican RNAi que podrían actuar como mecanismos efectores en la comunicación con la planta hospedera (Hess y Pringle, 2014; Muszewska et al., 2017; Plett y Martin, 2018). Hess et al. (2014) analizaron el contenido de ETs en los genomas de varias especies de Amanita, ectomi- corrízicas y saprobias encontrando que de manera general las especies de HEM presentan un mayor con- tenido de ETs (aunque el saprobio Amanita thiersii no se ajusta al patrón). Eventos demográficos como “cuellos de botella” pue- den reducir los tamaños poblacionales, disminuyendo la tasa de pérdida de ETs, lo que a su vez propicia que estos elementos se fijen en los genomas. A diferencia de los hongos saprobios, que suelen tener distribucio- nes muy amplias y transcontinentales, las especies de HEM presentan distribuciones más restringidas. Ade- más, su historia evolutiva relacionada con expansio- nes y contracciones de los bosques templados, podría contribuir a la acumulación de ETs. LA VÍA METABÓLICA SIMBIÓTICA COMÚN La más antigua de las interacciones simbióticas mutua- listas de la rizósfera, la micorriza arbuscular, desarrolló en conjunto con la planta los mecanismos moleculares 
 27 ÁNGELES-ARGÁIZ Y GARIBAY-ORIJEL. LA EVOLUCIÓN DE LA SIMBIOSIS ECTOMICORRÍZICA ... 12 de comunicación, mismos que han sido heredados a li- najes botánicos actuales. Las plantas liberan estrigolac- tonas para comunicarse con los hongos y bacterias del suelo. En los HMA, las estrigolactonas desencadenan la germinación de esporas, ramificación hifal, metabolis- mo mitocondrial, reprogramación traduccional y secre- ción de lipoquito-oligosacáridos y quito-oligosacáridos. La planta, percibe éstos y otros “patrones moleculares asociados a microorganismos” mediante varios recep- tores LysM tipo cinasa. A partir de ahí, se desencadena la traducción de señales proteicas, como los recepto- res cinasa DMI2 y DMI3, los canales iónicos nucleares CASTOR y POLLUX, y el factor de transcripción IPD3, requeridos para la activación del programa simbiótico de la planta. Después, RAM1, un factor de transcrip- ción GRAS (involucrado en el desarrollo) y RAM2 una glicerol-3-fosfato acil transferasa, permiten el estable- cimiento de la micorriza arbuscular (Venkateshwaran et al., 2013). A esta cascada de señalización y maquinaria molecular vegetal se le conoce como “la vía metabólica simbiótica común”. Estos genes son altamente conser- vados entre angiospermas y gimnospermas. La pérdida de estos genes en varios linajes se correlaciona con la pérdida de la simbiosis micorrízica-arbuscular (Delaux et al., 2014). Gracias a esta maquinaria genética, algu- nas plantas desarrollaron la simbiosis con las bacterias fijadoras de N (Parniske, 2008). Los genomas de los HEM codifican los distintos me- canismos que evolucionaron de manera convergente para formar estructuras y funciones similares (Plett y Martin, 2017). No hay evidencia de que los HEM se- creten lipoquito-oligosacáridos ni quito-oligosacári- dos, aunque constantemente liberan derivados de la quitina en su ambiente, así como auxinas, etileno y sesquiterpenos. Las Pinaceae carecen de la mayoría de los genes antes mencionados (excepto RAM2), lo que refuerza la idea de que los HEM en Pinaceae no utilizan la llamada “vía metabólica simbiótica común” (Garcia et al., 2015). Otras sustancias químicas, hormonales o efectoras se- cretadas por los HEM podrían estar actuando sobre alguno los genes de la vía metabólica simbiótica co- mún, aunque aún no hay evidencia de esto. CONSIDERACIONES FINALES El nivel de investigación actual ha permitido conocer algunos procesos de la evolución de los HEM, de sus propiedades genómicas y patrones de diversificación, sin embargo, la mayor parte de la teoría sobre la ge- nómica funcional y sus implicaciones fisiológicas está constituida por una colección de observaciones par- ticulares realizadas en distintos modelos lejanamente emparentados. El continuo saprotrofía-biotrofia en el estatus trófico de una especie, el grado de especifici- dad hacia hospedero, la co-evolución y la hipótesis de la planta puente como motor de diversificación, son algunos de los temas que siguen en discusión y están siendo investigados mediante genómica funcional y comparativa. El análisis genómico de organismos no modelo ofrece la oportunidad de comprender a mayor profundidad las generalidades, y particularidades de la simbiosis. Así mismo, la genómica comparativa intraespecífica es aún un campo apenas explorado, pero con un gran potencial, dado que la microbiología clásica demostró la importancia de la identidad de la cepa (variación genética intraespecífica) en muchos aspectos fisioló- gicos y ecológicos de la interacción micorrízica (Di Ba- ttista et al., 1996). LITERATURA CITADA Álvarez-Manjarrez, J., R. Garibay-Orijel, M.E. Smith, 2018. Caryophy- llales are the main hosts of a unique set of ectomycorrhizal fungi in a Neotropical dry forest. Mycorrhiza 28: 103-115. Beimforde, C., N. Schäfer, H. Dörfelt, P.C. Nascimbene, H. Singh, J. Heinrichs, et al., 2011. Ectomycorrhizas from a Lower Eocene angiosperm forest. New Phytologist 192: 988-996. Bonito, G., M.E. Smith, M. Nowak, R.A. Healy, G. Guevara, E. Cá- zares, et al., 2013. Historical biogeography and diversification of truffles in the Tuberaceae and their newly identified southern hemisphere sister lineage. PloS one 8: e52765. Bödeker, I., K.E. 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Se describieron los procesos involucrados en la obtención del germoplasma de Laccaria trichodermophora en el campo, el aislamiento y purificación de cepas, la identificación de parámetros de cultivo de alta producción de biomas en medio sólido y líquido, la identificación de cepas productivas y el escalamiento del cultivo a biorreactor de columna de burbujas. Con los protocolos ensayados se alcanzó una producción máxima de 5.93 ± 1.44 g/L de biomasa (expresada en peso seco). El micelio producido deberá ser formulado para su almacenamiento y aplicación como inóculo ectomicorrízico para la producción de pino en vivero. El Capítulo fue publicado como artículo de investigación en la revista Fungal Biology (2020, 124:205-218, doi.org/10.1016/j.funbio.2020.02.003) con el título “From field sampling to pneumatic bioreactor mycelia production of the ectomycorrhizal mushroom Laccaria trichodermophora”.
 31 18/9/21 23:12 localhost:10202/session/viewhtml5b2c3f408546/index.html localhost:10202/session/viewhtml5b2c3f408546/index.html 1/1 
 32 From field sampling to pneumatic bioreactor mycelia production of the ectomycorrhizal mushroom Laccaria trichodermophora Rodolfo E. !Angeles-Arg!aiz a, b, c, Ilse A. Carmona-Reyes c, Christian Armando Quintero-Corrales a, b, Francisco J. Medina-Macías c, Abel Blancas-Cabrera c, Norma A. Valdez-Cruz c, Miguel Ulloa b, Mauricio A. Trujillo-Rold!an c, Roberto Garibay-Orijel b, * a Posgrado en Ciencias Biol!ogicas, Universidad Nacional Aut!onoma de M!exico, A.P 70-153, Ciudad de M!exico, C.P. 04510, Mexico b Instituto de Biología, Universidad Nacional Aut!onoma de M!exico, A.P. 70-233, Ciudad de M!exico, C.P. 04510, Mexico c Programa de Investigaci!on de Producci!on de Biomol!eculas, Departamento de Biología Molecular y Biotecnología, Instituto de Investigaciones Biom!edicas, Universidad Nacional Aut!onoma de M!exico, AP. 70-228, Ciudad de M!exico, C.P. 04510, Mexico a r t i c l e i n f o Article history: Received 22 November 2019 Received in revised form 5 February 2020 Accepted 7 February 2020 Available online 21 February 2020 Corresponding Editor: Nicholas P Money Keywords: Ectomycorrhizal vegetative inoculum Large scale production Submerged culture Volumetric oxygen transfer coefficient a b s t r a c t In order to increase survival rates of greenhouse seedlings destined for restoration and conservation programs, successful mycorrhization of the seedlings is necessary. To reforest forest ecosystems, host trees must be inoculated with ectomycorrhizal fungi and, in order to guarantee a sufficient supply of ectomycorrhizal inoculum, it is necessary to develop technologies for the mass production of ectomy- corrhizal fungi mycelia. We selected the ectomycorrhizal fungus Laccaria trichodermophora, due to its ecological traits and feasible mycelia production in asymbiotic conditions. Here, we report the field sampling of genetic resources, as well as the highly productive nutritional media and cultivation pa- rameters in solid cultures. Furthermore, in order to achieve high mycelial production, we used strain screening and evaluated pH, carbon source concentration, and culture conditions of submerged cultures in normal and baffled shake flasks. The higher productivity culture conditions in shake flasks were selected for evaluation in a pneumatic bioreactor, using modified BAF media with a 10 g/L glucose, pH 5.5, 25 !C, and a volumetric oxygen transfer coefficient (KLa) of 36 h"1. Under those conditions less biomass (12e37 %) was produced in the pneumatic bioreactor compared with the baffled shake flasks. This approach shows that L. trichodermophora can generate a large biomass concentration and constitute the biotechnological foundation of its mycelia mass production. © 2020 British Mycological Society. Published by Elsevier Ltd. All rights reserved. 1. Introduction The survival of nursery-produced plants in the field is the main indicator of reforestation programs success, but is usually their weakest point (Vadell et al., 2016), mainly in developing countries (Le et al., 2014). Plant survival has been reported above 50 % in two- year experimental pine plantations in Mexico (L!opez-Guti!errez et al., 2018), while in governmental reforestation programs, plant survival averages 50e60 % in the first year (Burney et al., 2015; Ramírez-Soto et al., 2018), but usually falls down to 5 % in following years (Ricker et al., 2010). To address this problem, nursery plants must be inoculated with their natural symbionts; in the case of pines, ectomycorrhizal fungi (EM) are required (Castellano and Molina, 1989; Rossi et al., 2007). In 2017 the world demand for wood was around 5500 million cubic meters (FAOSTAT, 2018). Assuming a production of 400 m3/ha (Rossi et al., 2007), it would be necessary to inoculate 22,000 million plants to recover deforested areas and maintain the worldwide supply. One of the main limitations for large-scale plant inoculation is the availability of enough ectomycorrhizal inoculum (Rossi et al., 2007). Spores in suspension or ground pileus applied in irrigation water have demonstrated good results, mainly when the EM species are chosen from a particular forest region (Barrag!an- Soriano et al., 2018; L!opez-Guti!errez et al., 2018) or are sympatric * Corresponding author. Laboratorio de Sistem!atica, Ecología y Aprovechamiento de Hongos Ectomicorrízicos, Departamento de Bot!anica, Instituto de Biología, Universidad Nacional Aut!onoma de M!exico, A.P. 70-233, Ciudad de M!exico, CP. 04510, Mexico. E-mail address: rgaribay@ib.unam.mx (R. Garibay-Orijel). Contents lists available at ScienceDirect Fungal Biology journal homepage: www.elsevier .com/locate/ funbio https://doi.org/10.1016/j.funbio.2020.02.003 1878-6146/© 2020 British Mycological Society. Published by Elsevier Ltd. All rights reserved. Fungal Biology 124 (2020) 205e218 
 33 with the target tree species (Rodríguez-Guti!errez et al., 2019). This method is dependent on the supply of spores, which are obtained from few commercial species such as Pisolithus tinctorius or Scleroderma spp. (Rossi et al., 2007; Rep!a"c, 2011). The production of mycorrhizal inocula is limited by the fungi seasonal life cycle in natural environments or farms and is mainly restricted to exotic species with high spore production (Rep!a"c, 2011). Additionally, the effects of the introduction of exotic EM are not very well under- stood (Dickie et al., 2016) and could potentially impact soil aggre- gation, nutrient cycling, primary production, carbon storage, and plant and microbial community structure (Pringle et al., 2009). Therefore, native EM may eventually be displaced by alien EM (Murat et al., 2008), which could facilitate plant invasion (Vellinga et al., 2009). Vegetative inoculum based on active mycelia has been pro- posed as an alternative to spore-based inoculum (Rossi et al., 2007). However, vegetative inoculum is made from an axenic single genetic clone, so lacks the genetic intraspecific diversity and the microbiota that are associated with spore-based inoculum that sustain complex and resilient biological interactions in nature. Moreover, ectomycorrhizal fungi cultivation at an industrial scale is not well understood, and each species has its own optimal culture conditions. Among the main reasons for this lack of knowledge are the difficulty of cultivating EM in controlled and reproducible conditions and their slow growth (Hutchison, 1991; Rossi et al., 2007; Rep!a"c, 2011), the second of which is mainly due to the reduced battery of active enzymes on the plant cell wall compounds and the lack of complex sugar membrane transporters (Hutchison, 1991; Kohler et al., 2015; Nehls et al., 2016; Ogawa et al., 2019; Pellitier and Zak, 2018, Smith and Read, 2010). These are also the causes hindering the development and indus- trial production of vegetative ectomycorrhizal inoculum (Rossi et al., 2016). In order to guarantee a sufficient supply of ectomycorrhizal inoculum, technologies must be developed for the mass production of ectomycorrhizal fungi mycelia. Submerged mycelial culture of the Lactarius (Ch!avez et al., 2015), Pisolithus (Pradella et al., 1991; Rossi et al., 2002), Rhizopogon (Oliveira et al., 2006; Rossi et al., 2016, 2017), and Tricholoma (Kawagoe et al., 1999; Kim et al., 2010) species has been experimentally performed in stirred and/ or pneumatic tank bioreactors. Pneumatic bioreactors are the best strategy for the mass pro- duction of EM (Rossi et al., 2007), due to the lowgeneration of shear stress and because they enable thorough mixing by the hydrody- namics of air injection (De Jesus et al., 2017; Garcia-Ochoa and Gomez, 2009; Rossi et al., 2017). Pneumatic bioreactors reach the oxygen demand of EM cultures by mass transference via small, homogeneous air bubbles. At the same time, they prevent the ef- fects of deformation caused by mechanical agitation in a stirred tank over growing mycelial pellets. We selected the ectomycorrhizal fungus Laccaria trichodermo- phora (Mueller, 1984) as our study model. It belongs to the Laccaria genus, which includes several edible and marketable species (Montoya et al., 2014; Zambonelli and Bonito, 2013), fruiting pro- fusely in young forests (Frankland, 1998; Garibay-Orijel et al., 2009; Reverchon et al., 2010). However, these pioneer species tend to be even more abundant in plantations in areas without forest vocation (Savoie and Largeteau, 2011). Laccaria spores have been used as ectomycorrhizal inocula and their prevalence has been detected after field transplantation in the roots of inoculated plants, both in damaged sites after forest fires (Franco et al., 2014), and in natural areas in competition with other native EM (Villeneuve et al., 1991). Among other functions, Laccaria improves the growth of pine seedlings by promoting the assimilation of K and Mg (Christophe et al., 2010). In particular, L. trichodermophora is an edible wild mushroom commonly sold in markets in central Mexico (“Xocoyulli” in the Mexican pre-Hispanic language Nahuatl) and usually fruits throughout the rainy season (Montoya et al., 2014). It is closely related to Laccaria bicolor, sharing macromorphological character- istics of their fruit bodies, but can be microscopically distinguished by its spore size and pileus surface (Mueller, 1984). It associates with several white pines (Carrasco-Hern!andez et al., 2010; Perea- Estrada et al., 2009; Reverchon et al., 2012; Mueller, 1984), and produces abundant fruit bodies in young forests (Reverchon et al., 2010, 2012) and disturbed areas. This species can be found fruit- ing from mature soils within the forest bulk to sandy young vol- canic soils at the forest edge (Mueller, 1984; Reverchon et al., 2010). Due to its host preference towards young pines, physiological ad- aptations to poor soil, and added value as an edible mushroom, L. trichodermophora is an ideal candidate to be used as bioinoculant in pine reforestation programs. Abbreviations BCB bubble column bioreactor BF baffled Erlenmeyer shake flask CL: bulk dissolved oxygen concentration (mmol O2/L) CL* saturation dissolved oxygen concentration (mmol O2/L) DC diameter of the pneumatic bioreactor (m) DD diffuser diameter of the pneumatic bioreactor (m) DOT dissolved oxygen tension (air saturation %) EM ectomycorrhizal mushroom HC height of the pneumatic bioreactor (m) HL: liquid height of the pneumatic bioreactor (m) KLa volumetric oxygen transfer coefficient (h!1) m.a.s.l. meters above sea level (m) NF normal conventional Erlenmeyer shake flask OUR oxygen uptake rate (mmol O2/L h) OTR oxygen transfer rate (mmol O2/L h) PX volumetric productivity (gbiomass/L*day) qS specific substrate consumption rate (gglucose/ gbiomass*day) S substrate, glucose as carbon source (g/L) Si initial substrate concentration (g/L) Sf final substrate concentration (g/L) s.l. sensu lato t culture time (days) Tº temperature ("C) X biomass dry weight (g/L) Xi biomass dry weight at inoculation (g/L) Xf final biomass dry weight (g/L) XMAX maximum biomass dry weight achieved in a culture (g/L) YX/S biomass/substrate yield (gbiomass/gglucose) Greek symbols m specific growth rate during the exponential growth phase (d!1) R.E. !Angeles-Arg!aiz et al. / Fungal Biology 124 (2020) 205e218206 
 34 Most studies of Laccariamycelia production have focused on the plantefungus interaction, mycorrhization percentages, and plant growth (Carrasco-Hern!andez et al., 2010; Castellano and Molina, 1989; Pera and Parlad!e, 2005; Vaario and Suzuk, 2004; Xu et al., 2016; Zhang et al., 2019). However, there are few studies on the biotechnological aspects of the axenic cultivation of Laccaria mycelia (Kuek, 1996; Santiago-Martínez et al., 2003; V!azquez- García et al., 2002). To obtain the vegetative EM inoculum and understand its pro- duction in a pneumatic bioreactor, we isolated strains from wild basidiomata. Highly productive culture parameters (initial pH and temperature) and culture media were identified in solid culture experiments. Subsequently, the best liquid culture conditions for glucose concentration, initial pH and the volumetric oxygen transfer coefficient (KLa) were identified in submerged cultures in shake flasks (normal conventional and baffled). Finally, highly productive culture conditions were implemented into a pneumatic bioreactor (5 L bubble column), in order to optimize the biomass production. 2. Materials and methods 2.1. Sampling and specific assignment For the field sampling of genetic resources, we visited pine forests on four volcanoes located on the Transmexican Volcanic Belt in central Mexico (Table 1) and chose young, well-developed L. trichodermophora basidiomata. Basidiomata of EM are inhabited by a full microbiota (Bahram et al., 2018; Bertaux et al., 2003; Garbaye et al., 1990); therefore, for isolation media we used MMN-RBC, which is designed to avoid contamination. Base me- dium MMN was added with rose bengal (RB) and chloramphenicol (C) (Table 2). The first acts as fungicide that prevents the extensive growth of fast-growing saprotrophic fungal contamination, while the second is a broad-spectrum antibiotic to inhibit bacterial growth. Strains were isolated from the dikaryotic inner section of the base of the pileus and serial cultures were made in PDA to obtain pure cultures (Table 2). Vouchers with enough material left were deposited in the National Herbarium of Mexico (MEXU) (Table 1). The working strain bank was maintained at 4 !C in PDA and fresh medium was inoculated every 4e6 m before use. Strains were deposited in the INECOL Strain Collection in Xalapa, Mexico under records IE6003 - IE 6013. The specific assignment of voucher collections was made by morphological characterization (Mueller, 1992) and phylogenetic analysis, using the nuclear marker ITS (internal transcribed spacer). The identity of most strains has been previously reported (Quintero-Corrales, 2019); for the remaining strains, the ITS region of the rDNA was obtained following our previously reported pro- tocol (!Angeles-Arg!aiz et al., 2016) and the ITS sequences are available in GenBank (Table 1). Wemade sequence alignments with ClustalW2 (Larkin et al., 2007). We used the GTR nucleotide sub- stitution model, as suggested by JModelTest (Posada, 2008). The maximum likelihood analysis was performed with the PhyML program (Guindon et al., 2010), with 1000 bootstrap repetitions. The resulting tree was then edited with FigTree (Rambaut and Drummond, 2016). We confirmed the identity of the strains for inocula and produced mycelia of each culture by re-sequencing the ITS region. Table 1 Accessibility and provenance of Laccaria trichodermophora vouchers, strains, and ITS sequences. Collection number/Strain Volcano Altitude (masl) pH Host MEXU NCBI (ITS) REAA13-59/EF-36 VP 3094 6.6 P. montezumae 27 575 KT354980 CA15-33 NT 3152 5.6 P. montezumae e e CA15-34 NT 3153 5.6 P. montezumae e MN710461 CA15-40 NT 3150 5.6 P. montezumae e MN710462 CA15-42 NT 3149 5.6 P. montezumae e MN710479 CA15-73 LM 3064 6.4 P. montezumae 29 990 MN710466 CA15-75 LM 3067 6.4 P. montezumae 29 985 MN710467 CA15-Ru4 NT 3050 5.6 P. montezumae 29 994 MN710482 CA15-4 SN 3888 5.5 P. harwegii 29 989 MN710459 CA15-11 SN 3836 5.5 P. harwegii 29 986 MN710460 CA15-77 NT 4033 5.5 P. harwegii 29 991 MN710468 CA15-F8 NT 4037 5.5 P. harwegii 29 992 MN710471 CA15-F10 NT 4028 5.5 P. harwegii 29 987 MN710481 REAA15-138/R38 LM 3950 5.5 P. harwegii 29 988 MN710473 CA15-Ru1 NT 4053 5.5 P. harwegii 29 993 MN710472 CA15-29 NT 3598 5.5 P. harwegii e e VP ¼ Volc!an Pelado, SN ¼ Sierra Negra, NT ¼ Nevado de Toluca, LM ¼ La Malinche. Table 2 Culture media composition for Laccaria trichodermophora solid cultures. Reagent MMN BAF DRBC PDA Dextrose 10 g a30 g 10 g 20 g Peptone ni 2 g 5 g ni Malt extract 3 g ni ni ni Yeast extract ni 0.2 g ni ni Potato infusion ni ni ni b CaCl2 0.05 g 100 mg ni ni NaCl 0.025 g ni ni ni KH2PO4 0.05 g 0.5 g 1 g ni (NH4)2HPO4 0.025 g ni ni ni MgSO4 7H2O 0.15 g 0.5 g ni ni FeCl3 (1 %) 0.012 mg 10 mg ni ni ZnSO4 Ni 1 mg ni ni MnSO4 Ni 5 mg ni ni Thiamin HCL 100 mg 100 mg ni ni Biotin Ni 1 mg ni ni Folic acid Ni 100 mg ni ni Inositol Ni 50 mg ni ni Rose Bengal Ni ni 25 mg ni Dicloran Ni ni 2 mg ni Chloramphenicol 0.1 g 0.1 g 0.1 g 0.1 g Bacto Agarc 15 g 15 g 15 g 15 g Water 1000 mL 1000 mL 1000 mL 1000 mL MMN ¼ Melin Norkrans Modified, BAF ¼ Biotin folic acid (www.dsmz.de), DRBC ¼ Dicloran, Rose of Bengal, chloramphenicol (www.dsmz.de), PDA ¼ Potato dextrose, agar, ni ¼ not included. a In some cultures 10 g/L of glucose was used. b 200 g/L of potato were used and the obtained liquid was adjusted to 1 L. c Agar was only added for solid cultures. R.E. !Angeles-Arg!aiz et al. / Fungal Biology 124 (2020) 205e218 207 
 35 2.2. Highly productive culture conditions in solid media In order to select the highly productive culture media, we per- formed a 3 ! 3 multifactorial experiment on solid cultures, evalu- ating the effect of nutritive media (PDA, MMN, and BAF; Table 1), pH (4.5, 5.5, and 6.5) and temperature (23, 25, and 28 "C) on the biomass production. Twenty-seven experimental treatments, composed of five experimental units, were performed in 10 cm Petri dishes with 25 mL of solid medium. These cultures were inoculated with 50 mm2 fragments of 20-day-old colonies. The colony growth kinetics was tracked for 48 d, after which the pro- jected area of the colony and final dry weight were measured. To evaluate colony growth, the lower face of each Petri dish was photographed (Nikon D5000 camera, Japan, captured 30 cm from the target) every 48 h. The projected area was calculated with ImageJ 1.47v software (Abr!amoff et al., 2004). In order to evaluate final dry weight, after 48 d of culture, the mediumwas melted in a water bath (60 "C); still hot, the suspension was filtered on Whatman No. 4 paper (GE Healtcare Life Science, UK) under a vacuum. Subsequently, the mycelia were dried for 24 h (65 "C) in a dry heat oven and were finally weighed at a constant value (Simadzu ATX124 Uni Bioc, Japan) (reported as grams of biomass dry weight per liter of solid medium). 2.3. Strain screening in submerged culture In order to identify the strains with higher domestication potential, we compared the growth performance of each in sub- merged cultures (Table 1). The cultures were made in conven- tional normal Erlenmeyer flasks of 250 mL filled to 20 % capacity (50 mL of BAF culture medium, at 25 ± 2 "C, pH 5.5) and were orbitally shaken (New Brunswick Scientific Classic C25, Orbital shaker, USA) at 100 rpm (Kuek, 1996). Each flask was inoculated with four pieces (0.25 cm2) of a 15-day-old colony growing in solid PDA. After a 30-day culture, the final dry biomass was determined using gravimetry by filtration (Whatman paper #4, GE Healtcare Life Science, UK) (Trujillo-Rold"an et al., 2001) and the final pH of the samplewasmeasured with a potentiometer (Corning 430) from the supernatant. Substrate consumption (glucose concentration) was determined in 1 mL of the supernatant in a Biochemistry Analyzer YSI 2900 (YSI Life Sciences, USA). 2.4. Substrate concentration and oxygen transference in shake flask and pneumatic bioreactor In order to increase the maximum biomass production, we set up two experiments in shake flasks. The first was designed to evaluate the effect of initial pH (3.5, 4.5, 5.5, 6.5, and 7.5) on biomass production. The second had a two-factor design to determine the effect of the shake flask design (conventional vs. baffled) and the concentration of the carbon source (10 vs.15 g/L of glucose) on biomass production. Baffled flasks consisted of con- ventional flasks (Duran®, Erlenmeyer flask, narrow neck, Boro- silicate Glass, USA) with three indentations that were 4.5 cm high, 2.0 cmwide, and 2.5 cm deep (Gamboa-Suasnavart et al., 2011). All experiments were inoculated with 1 mL (2 %, approximately 0.09 mg/L of dry biomass) of non-homogenized 16-day-old baffled shake flask culture broth. Every 48 h, the total contents of two flasks were used to measure biomass, morphology, pH, and glucose consumption. Finally, taking advantage of the results of the previous experi- ments, we selected the highly productive culture conditions to be implemented in a pneumatic bioreactor. Pneumatic bioreactor cultures were done in a homemade design bubble column bioreactor (BCB) with a working volume of 5.0 L (BAF culture me- dium, initial pH 5.5 and 25 ± 0.4 "C) and a nominal volume of 6.6 L, in Pyrex glass with a stainless-steel top and bottom and a column height to diameter ratio of 5.7 (Fig. 1). Unless mentioned, the airflow was maintained at a constant 1.55 L/min (0.31 vvm), ster- ilized through a vent filter unit (0.2 mm, Merck-Millipore, USA), and diffused in small bubbles by a sintered glass plate of 70 mm diameter (Duran, DWK LIFE SCIENCES GMBH, Germany) with pore sizes between 100 and 160 mm. BCB cultures were instrumented with pH, DOT, and temperature sensors (Mettler Toledo, USA and Applisens, Applikon Biotechnology, Netherlands) with two ADI- 1030 and ADI-1010 bio-controllers (Applikon Biotechnology, Netherlands), and data acquisition was followed online (BioXpert® Software, Applikon Biotechnology, Netherlands). The temperature was maintained at 25 ± 0.4 "C by a proportional-integral-derivative (PID) control strategy (Trujillo-Rold"an et al., 2001) with a heating jacket. The BAF medium used for the pneumatic bioreactor cultures (10 g/L of glucose, without vitamins and FeCl3) was sterilized at 121 "C and 2.2 psig for 40 min. The thermolabile components of the nutrient medium were sterilized by filtration (0.2 mm filter, Merck-Millipore, USA) and added at the time of inoculation. BCB experiments were inoculated with two non-homogenized shake flasks cultures (15 d) via peristaltic pump (Cole-Palmer, USA). Periodic samples of 10 mL were taken every 48 h to measure pH and residual glucose (YSI 2900 biochemical analyzer). Wet biomass was inferred by suspending the air injection for 10 min, after which the percentage of the column height occupied by the compacted biomass at the bottomwas measured. At the end of the fermentation (34 d), the accumulated wet biomass was weighed and dried to a constant weight. The final dry weight was correlated to final wet biomass. 2.5. Kinetic and stoichiometric parameters The kinetic and stoichiometric parameters used to describe the performance of the culture in flasks and pneumatic bioreactors were: Yield (YX/S), Equation (1). YX=S ¼ Xf $ Xi Si $ Sf (1) Productivity (Px/s), Equation (2). PX=S ¼ Yx=s t (2) Volumetric productivity (Px), Equation (3). PX ¼ Xf t (3) The specific growth rate (m) was obtained by calculating the slope of the line from the biomass values (in natural logarithm) during the exponential phase. The m is defined by Equation (4). dX dt ¼mx (4) The specific substrate consumption rate (qS) was calculatedwith Equation (5). qs ¼ m Yx=s (5) R.E. "Angeles-Arg"aiz et al. / Fungal Biology 124 (2020) 205e218208 
 36 2.6. Volumetric oxygen transfer coefficient (KLa) measurements by the gassing-out method in shake flasks and the pneumatic bioreactor During any submerged culture, the oxygen availability is dictated by the oxygen transfer and oxygen uptake rates (cellular respiration), as described by Equation (6). The oxygen transfer rate (OTR) is defined as the rate of oxygen transferred through the gaseliquid interphase (liquid surface in shaken flasks or bubbles in the pneumatic bioreactor) into the bulk liquid, as described in Equation (7), as follows: dCL dt ¼OTR" OUR (6) OTR¼ kLa ! C* L "CL " (7) Where (CL*eCL) corresponds to the oxygen concentration gradient between the interfacial saturation and the liquid bulk, and the KLa is the volumetric mass transfer coefficient. Shake flasks (normal and baffled) were filled (20 %) with BAF medium and oxygen was removed by adding Na2SO3 with CoCl2 as the catalyst to achieve a final concentration under 6 # 10"3 M and 5 # 10"7 M, respectively. The sulphite oxidation reaction was used to displace dissolved oxygen in the liquid phase, and the KLa measurement took place only when the oxidation reaction had ceased (Reynoso-Cereceda et al., 2016). The incubator was started after the medium was oxygen-free, and DOT was recorded online. Measurements of DOT in shake flasks were recorded online with the oxygen optical meter Fibox3, using a PSt3 sensor-spot (PreSens, Regensburg, Germany). The sensor-spot was attached to the bottom inside of each Erlenmeyer flask, and the probe was placed outside the flask over a coaster (Reynoso-Cereceda et al., 2016). The KLa measurements in the pneumatic bioreactors were done using nitrogen to displace the oxygen and assure an oxygen-free medium (Trujillo-Rold!an et al., 2013). Dissolved oxygen tension (Applisens, Applikon Biotechnology, Netherlands) was recorded by ADI-1030 and ADI-1010 bio-controllers and acquisition was fol- lowed online (BioXpert® Software, Applikon Biotechnology, Netherlands). The KLa was obtained as the resulting linear slope by plotting the logarithmic expression against time, as shown in Equation (8), using data between 10 and 60 % DOT. This expression results after integration of Equation (7) (between two different times), considering OTR as described in Equation (8) with OUR ¼ 0 (Reynoso-Cereceda et al., 2016). ln # C* L " CL2 C* L " CL1 $ ¼ " kLaðt2 " t1Þ (8) 2.7. Statistical analysis To identify the statistical differences between the treatments in solid media cultures, multivariate ANOVA, Tukey’s post hoc, and non-parametric multiple correlation tests were performed using STATISTICA software (Weib, 2007). To analyze the differences be- tween specific growth rate, performance, and productivity in sub- merged cultures, Fisher’s exact and multiple range tests were performed using STATGRAPHICS (Centurion XVI.I). Fig. 1. Pneumatic bioreactor design. (A) schematic representation and dimensions. DOT: dissolved oxygen tension (% of air saturation); T&: temperature (&C); HC: Column height; HL: Liquid height; DC: Column diameter; DD: Diffuser diameter. (B) Thirty-two-day culture of L. trichodermophora in BAF medium. R.E. !Angeles-Arg!aiz et al. / Fungal Biology 124 (2020) 205e218 209 
 37 3. Results 3.1. Specific assignation The macro- and micro-morphology of the voucher collections matchedwith L. trichodermophora (Mueller,1984,1992) (Fig. 2). The Maximum Likelihood analysis showed that the ITS sequences of our samples formed a well-supported clade (Maximum Likelihood Bootstrap value ¼ 93 %) with L. trichodermophora sequences including that of the species type material. This clade is sister to the L. bicolor s.l. complex, as represented by L. bicolor and Laccaria longipes. Both the morphological and phylogenetic results confirmed that all strains belonged to L. trichodermophora (Fig. 2). 3.2. Culture conditions in solid media and colony morphology The separate colonies of L. trichodermophora strain EF-36 developed several different morphologies under the assayed con- ditions (Supplementary Material and Figure S1, A-F). The nutritive medium and the culture parameters that generated the highest biomass production were BAF, pH 5.5, 25 "C (Tukey’s P ¼ 0.043 to 0.000) (0.079 ± 0.015 g/L) (Fig. 3A, Table S1). The colony-projected area growth kinetics showed a constant colony growth in most cases, while in less productive cases (MMN and/or 28 "C) the growth stopped or did not progress until around 14e17 d after inoculation (Figs. S2eS10). The average projected colony area failed tomatch with or predict average final dry weight (Fig. 3B, Table S2). Kendall and Spearman tests showed significative but low correla- tions between average projected area and average final dry weights (Tables S1e2). 3.3. Strain selection in submerged culture Different L. trichodermophora strains showed high heterogeneity between their biomass production, substrate consumption, pH change and YX/S. The final biomass production values ranged from 3.95 ± 0.26 to 0.12 ± 0.04 g/L; the glucose consumption ranged between 7.0 ± 0.77 and 0.4 ± 1.48 g/L; and YX/S values were be- tween 0.24 ± 0.21 and 0.004 ± 0.003 gbiomass/gglucose (Table 3). Three strains were grouped together in the high-biomass homogeneous group by the multiple range test (Fig. 4). These same strains were also the highest glucose consumers. Nevertheless, strains with low growth and glucose consumption attained higher YX/S values (0.24 ± 0.21 and 0.19 ± 0.30 gbiomass/gglucose), but also higher standard deviations. For downstream experimental explo- ration we selected the EF-36 strain, since it belonged to the high- biomass producing homogeneous group, it is also among the highest glucose consumers, and during reseeding it showed the highest colony recovery and less bacterial contamination. 3.4. Effect of pH, glucose, and shake flask design on L. trichodermophora growth in liquid culture Using just one of the productive strains (EF-36) in submerged shake flask cultures with different pH values as the causal factor, the highest growth yield was observed at pH 7.5 (r ¼ 9.337, P ¼ 0.053) (YX/S ¼ 0.58 ± 0.08 gbiomass/gglucose), with a maximal biomass of 4.71 ± 0.71 g/L at 16 d of culture (Table 4). However, a decrease in the biomass was observed up to 2.33 ± 0.57 g/L at the end of the culture (Fig. 5A.5). The highest biomass concentration (5.00 ± 0.04 g/L) was obtained at an initial pH of 5.5 after 20 d of culture (r ¼ 12.033, P ¼ 0.017), with a smaller decrease in biomass at the end of the culture (Fig. 5A.3). Only at pH 4.5 was the for- mation of large pellets observed in all 24 shake flasks tested. When comparing flask design and glucose concentration, the 10 g/L in BF (KLa near 38 h#1) has non-significative (r ¼ 7.179, P ¼ 0.126), but higher XMAX value (5.93 ± 1.44 g/L) than other treatments. The PX was similar between both 10 and 15 g/L, regardless of flask design. The glucose consumption of 10 g/L in BF (7.36 ± 2.30 g/L) was comparable with any other treatment. How- ever, although 10 g/L of glucose in BF presented a high qS (r¼ 8.217, P ¼ 0.083) (1.54 ± 0.49 gglucose/gbiomass *d) comparable with that of 15 g/L of glucose in NF, the latter never depleted the carbon source, while 10 g/L in BF treatment reached its XMAX at 16 d and depleted the substrate at 20 d after inoculation. The YX/S (0.54± 0.09 gbiomass/ gglucose) and specific growth rate (m ¼ 0.37 ± 0.07 d#1) of 10 g/L of glucose in BF were surpassed only by the 15 g/L in BF treatment (YX/ S 0.73 ± 0.03 gbiomass/gglucose, m ¼ 0.76 ± 0.00 d#1). Nevertheless PX (0.37 ± 0.09 gbiomass/L*d) and time to XMAX (16 d) were better in the 10 g/L in BF group. Therefore, 10 g/L of substrate in BF was the Fig. 2. Morphological characteristics of Laccaria trichodermophora and specific assignment. (A) Basidioma from where EF-36 strain was isolated, (B) Basidiospores observed with scanning electron microscopy, (C) Ectomycorrhiza in Pinus montezumae roots, (D) ITS phylogram generated with Maximum Likelihood for the L. bicolor s.l. complex with, Bootstrap ¼ 1000 and GTR. R.E. !Angeles-Arg!aiz et al. / Fungal Biology 124 (2020) 205e218210 
 38 fastest and most productive assay (Table 5, Fig. 6) and its culture parameters were replicated in the bioreactor. 3.5. Bubble column bioreactor cultures In order to compare the mycelial production between BF and BCB, we used the culture with the highest productivity conditions found in BF (BAF mediumwith 10 g/L of glucose, pH 5.5 and 25 !C), and adjusted the air injection in BCB to 0.31 vvm to use a similar KLa (38.3 ± 4.1 h"1) as that of BF (Table 5). Culture in the BCB reached XMAX of 4.03 ± 0.03 g/L with an almost total depletion of the carbon source at 36 d of culture (Table 5, Fig. 7). The cultures in BCB were slower than those in shake flasks (m¼ 0.23 ± 0.02 vs. 0.37 ± 0.07 d"1 respectively) (Table 5). Accordingly, at the long culture time, the specific glucose consumption rate in the BCB (qS) was almost 2.7 times lower than in BF (Table 5). Moreover, themycelia productivity (PX) was almost 3.4 times lower in BCB than in BF (Table 5). How- ever, the pH behaved similarly to those in flasks. There was no limitation by oxygen in the cultures in the BCB; the lower value of dissolved oxygen tension was above 60 % of air saturation (Fig. 7). 4. Discussion 4.1. Specific assignment The morphological and ITS Maximum Likelihood analyses placed all our samples (vouchers and strains) as L. trichodermophora (Fig. 2). The ITS sequence of the EF-36 strain was used as the representative sequence, since all ITS sequences were identical (100 % nucleotide similarity) (Table 1). This species belongs to the Fig. 3. Solid media cultures. (A′) Mean final biomass production (y axis, g/L) comparison in 27 treatments (x axis), upper case corresponds with the colony morphologies (Fig. S1), lower case addresses Tukey’s test for homogeny in groups of the variance analysis, segments represent the standard deviation. (B′) Mean final projected area comparison. Table 3 Growth performance of several Laccaria trichodermophora strains in shake flasks. XMAX (g/L) Glucose consumed (g/L) YX/S (gbiomass/gglucose) Final pH PX (mg/L*day) CA15-4 3.95 ± 0.26 7.0 ± 0.77 0.02 ± 0.002 3.3 ± 0.2 3.68 ± 0.06 CA15-11 3.56 ± 0.88 5.4 ± 0.71 0.02 ± 0.004 3.6 ± 0.1 3.14 ± 0.29 EF-36 3.08 ± 079 6.6 ± 1.84 0.01 ± 0.001 3.4 ± 0.4 2.75 ± 0.56 CA15-33 2.81 ± 0.77 5.0 ± 0.90 0.02 ± 0.009 4.0 ± 0.0 3.32 ± 0.65 CA15-77 1.99 ± 0.97 4.1 ± 1.34 0.02 ± 0.12 3.7 ± 0.2 1.97 ± 0.88 CA15-R38 1.86 ± 0.42 2.4 ± 0.38 0.03 ± 0.004 3.9 ± 0.1 2.49 ± 0.10 CA15-F10 1.73 ± 0.14 4.0 ± 0.69 0.01 ± 0.003 3.8 ± 0.2 1.79 ± 0.06 CA15-40 1.63 ± 1.27 4.0 ± 2.63 0.03 ± 0.049 4.2 ± 0.2 1.25 ± 1.52 CA15-42 1.61 ± 0.17 2.9 ± 0.60 0.02 ± 0.006 4.3 ± 0.1 2.03 ± 0.31 CA15-34 1.60 ± 0.48 2.8 ± 1.81 0.02 ± 0.021 4.8 ± 0.1 1.64 ± 0.42 CA15-RU1 1.28±- 1.6±- 0.02±- 4.1±- 1.02±- CA15-F8 1.06 ± 0.03 4.4 ± 0.02 0.01 ± 0.001 3.5 ± 0.2 1.89 ± 0.17 CA15-75 0.63 ± 0.82 0.9 ± 1.34 0.19 ± 0.295 5.3 ± 0.2 0.73 ± 0.09 CA15-29 0.16 ± 0.09 1.6 ± 0.35 0.00 ± 0.003 5.7 ± 0.1 0.21 ± 0.12 CA15-RU4 0.12 ± 0.08 0.8 ± 0.20 0.01 ± 0.005 5.6 ± 0.1 0.14 ± 0.08 CA15-73 0.12 ± 0.04 0.4 ± 1.48 0.24 ± 0.213 5.5 ± 0.0 0.14 ± 0.04 R.E. !Angeles-Arg!aiz et al. / Fungal Biology 124 (2020) 205e218 211 
 39 L. bicolor complex; a group populated by American and Asiatic species, of which at least half are not yet described (Wilson et al., 2017). 4.2. Colony morphology and media selection Our results show that the highest biomass concentration (0.079 ± 0.015 g/L) was reached with BAF, pH 5.5, and 25 !C in solid media (Fig. 3). In general, PDA and BAF treatments at low temper- atures were more productive, while MMN high temperatures were less productive (Fig. 3). Similarly to Santiago-Martínez et al. (2003), Mexican strains of L. bicolor s.l. showed greater biomass production in BAF and EMA culture media, compared with MMN. Considering the composition of the media and culture condi- tions, solid cultures generated different colony morphologies (Figs. S1AeF). Indeed, Laccaria colonies are known for their morphological plasticity (Di Battista et al., 1996). Our results are very similar to those previously reported on L. bicolor s.l. in BAF, PDA, and MMN (Santiago-Martínez et al., 2003). While the high biomass production treatments produced colonies with uniform edges; in less productive treatments, the colonies presented two very evident growth fronts (Fig. 3, S1). These second fronts were generated by a thin and submerged exploratory mycelia, involved in the search of distant nutrients and vitamins, and without significative biomass production. The lack of nutrients or vitamins, like thiamine, could also be involved in the absence of colony coloration produced by secondary metabolisms (Georg, 1951; Hutchison, 1991). Dry weight and projected area showed low cor- relation values (0.56 and 0.40). Consequently, the projected area cannot be used as an appropriate parameter to describe the mycelial growth of L. trichodermophora. 4.3. Strain screening and intra-specific variability Microbial strain identity is an important factor determining several physiological, ecological, and biotechnological characteris- tics of the bioinoculants. Intraspecific differences in biomass pro- duction, nutrient acquisition and respiration have been demonstrated in in vitro cultures of EM (e.j. Wilkinson et al., 2010, 2012) including L. bicolor s.l. (Nguyen et al., 1992; De la Bastide Fig. 4. Comparison the biomass production (A), glucose consumption (B), pH change (C) and biomass/substrate yield (D) of 16 strains of L. trichodermophora in cultures in liquid medium carried out in 250 mL Erlenmeyer flasks filled to 20 % capacity (50 mL of BAF culture medium) at 25 ± 2 !C, and orbitally shaken at 100 rpm. Average and standard deviation of at least three independent experiments are shown. Lower case addresses Tukey’s test for homogeny in groups of the variance analysis. Table 4 Effects of pH on the stoichiometric and kinetic parameters of submerged culture of Laccaria trichodermophora in shake flasks. Parameter/pH 3.5 4.5 5.5 6.5 7.5 XMAX (g/L) 2.11 ± 0.06c 1.31 ± 0.31c 5.00 ± 0.04a 3.76 ± 0.71b 4.71 ± 0.71a Time to XMAX (days) 20 24 20 24 16 m (days"1) 0.31 ± 0.03a 0.26 ± 0.10a 0.28 ± 0.02a 0.32 ± 0.02a 0.32 ± 0.03a AGlucose consumed (g/L) 6.26 ± 0.37b 7.57 ± 0.45b 10.0 ± 0.00a 9.90 ± 0.09a 10.0 ± 0.00a BYX/S (gbiomass/gglucose) 0.42 ± 0.08b 0.23 ± 0.03c 0.55 ± 0.09ab 0.42 ± 0.10b 0.58 ± 0.08a qS (gglucose/gbiomass *day) 0.77 ± 0.16ab 1.12 ± 0.48a 0.62 ± 0.20b 0.81 ± 0.20ab 0.57 ± 0.13b PX (gbiomass/L*day) 0.73 ± 0.01d 0.39 ± 0.01d 0.14 ± 0.01b 0.12 ± 0.03c 0.08 ± 0.02a pH at the end of culture 2.92 ± 0.03 4.42 ± 0.09 5.63 ± 1.58 6.82 ± 0.37 7.11 ± 0.16 A, Glucose consumed (g/L) corresponds to the initial concentration minus the glucose concentration in culture medium until the time to XMAX (days). B, Biomass/substrate yield (gbiomass/gglucose) was calculated using the glucose consumed until the time to XMAX (days). Lowercase superscript near a value indicate homogenous groups in the Multiple Range Tests. R.E. !Angeles-Arg!aiz et al. / Fungal Biology 124 (2020) 205e218212 
 40 et al., 1995a). Our results matched the detection of high intraspe- cific variability in biomass production of L. trichodermophora strains in shake flask axenic cultures. Different strains of L. bicolor s.l. also vary in pine root coloniza- tion (Kropp et al., 1987; Wong et al., 1990; De la Bastide et al., 1995b) and even in plant nutrition (Hazard et al., 2017a, b), affecting CO2 cycling and soil nutrient retention. The proper strain selection is therefore a critical step during prospection and bio- process development, particularly if the project aims to extend the use of certain strains to inoculate plants for field transplantation. Additionally, the relation of the biomass production in pure culture to the ectomycorrhizal infectivity and efficacy of plant growth promotion must be tested. 4.4. PH dynamics and the effect on productivity In submerged culture experiments, which were performed to identify the effect of the initial pH, we compared XMAX, as well as the specific growth rate (m), growth yield (YX/S), and time to XMAX. The highest specific growth rate (m) was observed at pH 7.5 (0.32 ± 0.03 d!1) with non-significative differences in all other assays. Simultaneously, treatments at pH 5.5 and 7.5 showed similar yields (YX/S) (0.55 ± 0.09 and 0.58 ± 0.08 gbiomass/gglucose, respectively), but the highest biomass production (XMAX) (5.00 ± 0.04 g/L) was obtained at pH 5.5 at 20 d of culture, followed by pH 7.5 (4.71 ± 0.71 g/L), both clustered in the same homogeneous group (Table 4). Thus, we used pH 5.5 for follow experiments, due to its high volumetric productivity (PX) (0.14 ± 0.01 g/L*d) and its low XMAX standard deviation. On the other hand, the pH 4.5 treatment showed the lowest XMAX (1.31 ± 0.31 g/L), YX/S (0.23 ± 0.03 gbiomass/gglucose), and m (0.26 ± 0.10 d!1) values. Similarly to our results, in a submerged culture of Tricholoma batschii a higher biomass production was detected in pH values close to 5.5, and a lower biomass production was seen at pH 4.5, even though lower pH values were being tested (Lazarevi!c et al., 2016). The lowest growth of L. trichodermophora cultures at an initial pH of 4.5 was associated with the formation of the highest and irregular biomass aggregates. In all L. trichodermophora cultures, the pH values decreased during the exponential growth phase, but increased when sta- tionary phase appeared. In some treatments, this matched with the carbon source depletion (Figs. 5 and 6). This pattern was also seen in the third experiment; but in cultures with a greater and more rapid production of biomass, the rise in pH was more drastic as the carbon source was more quickly depleted (Fig. 6). The total con- sumption of glucose promotes increased pH by at least two units in Laccaria laccata cultures, possibly by the use of alternative sub- strates for cellular energy maintenance, which causes the removal of acidic compounds, or by the production of new alkaline com- pounds (Kuek, 1996). The pH affects membrane function, cell morphology and structure, nutrient consumption, and product synthesis (Hwang et al., 2004), which can cause adverse effects in Fig. 5. Initial pH effect (3.5, 4.5, 5.5, 6.5, and 7.5) on the growth of L. trichodermophora (A), glucose consumption (B), and evolution of pH (C) in cultures in liquid medium carried out in 250 mL Erlenmeyer flasks filled to 20 % capacity (50 mL of BAF culture medium) at 25 ± 2 "C, and orbitally shaken at 100 rpm. Average and standard deviation of at least three independent experiments are shown. Table 5 Stoichiometric and kinetic parameters of submerged culture of Laccaria trichodermophora in shake flasks and a 5 L bubble column bioreactor. Parameter Normal Flask Baffled Flask Bubble Column Bioreactor Glucose (g/L) 10 15 10 15 10 XMAX (g/L) 5.35 ± 0.35ab 5.20 ± 0.70ab 5.93 ± 1.44b 4.34 ± 0.34ab 4.03 ± 0.03a Time to XMAX (days) 14 30 16 30 36 m (days!1) 0.52 ± 0.12b 0.33 ± 0.08a 0.37 ± 0.07a 0.76 ± 0.00c 0.23 ± 0.02a AGlucose consumed (g/L) 9.08 ± 0.84b 9.90 ± 2.55b 7.36 ± 2.30ab 5.57 ± 0.69a 9.76 ± 0.30b BYX/S (gbiomass/gglucose) 0.47 ± 0.02ab 0.51 ± 0.05ab 0.54 ± 0.09b 0.73 ± 0.03c 0.41 ± 0.02a qS (gglucose/gbiomass*day) 0.93 ± 0.24ab 1.64 ± 0.59b 1.54 ± 0.49b 0.96 ± 0.03ab 0.56 ± 0.07a PX (g/L*day) 0.38 ± 0.02b 0.17 ± 0.02a 0.37 ± 0.09b 0.15 ± 0.01a 0.11 ± 0.00a KLa (h!1) 11.6 ± 2.0 13.9 ± 4.0 38.3 ± 4.1 34.3 ± 3.6 36.2 ± 2.1 A, Glucose consumed (g/L) corresponds to the initial concentration minus the glucose concentration in culture medium until the time to XMAX (days). B, Biomass/substrate yield (gbiomass/gglucose) was calculated using the glucose consumed until the time to XMAX (days). Lowercase superscript near a value indicate homogenous groups in the Multiple Range Tests. R.E. !Angeles-Arg!aiz et al. / Fungal Biology 124 (2020) 205e218 213 
 41 cells, due to the subsequent high pH variability present in the cell cultures. In some of our L. trichodermophora cultures, the pH increasedwhen biomass values decreased (Fig. 5: A3, A4, A5, C3, C4, C5). This phenomenon could be associated with cell death and the plasmatic material released in the broth. The addition of physiologically inert buffer MES (2-(N-mor- pholino) ethanesulfonic acid has demonstrated good pH stabiliza- tion between pH values of 3 and 7 as well as promotion of Laccaria mycelial growth (Yamanaka, 2003) and a reduction in the vari- ability of mycelial biomass accumulation values of Lactarius species (Guerin-Laguette et al., 2000). Therefore, the addition of physio- logically inert buffers could improve both, biomass production and experimental reproducibility in further ectomycorrhizal vegetative inoculum scaling. In natural field conditions, L. trichodermophora inhabit acidic to neutral forest soils, mainly humic andosoils (Table 1). Acidic soil conditions increase P availability and have been related to enzy- matic N search by Laccaria species (Carrino-Kyker et al., 2016). In contrast, the P in the culture media was supplied by KH2PO4 and the N by proteins from the peptone and yeast extract (Table 2). 4.5. Substrate concentration and oxygen transfer rates in shake flask cultures A depletion of the carbon source (10 g/L) was observed between days 16 and 26 in BF and NF submerged cultures of L. trichodermophora EF-36, respectively. In contrast, the substrate never depleted when cultures were carried out at 15 g/L of glucose. Several EMs have shown culture times ranging between 15 and 40 d (Hutchison, 1991; Kuek, 1996; Rossi et al., 2017). However, unlike the 10 g/L treatments, in which cell death was detected in the last days of the culture, the 15 g/L treatments showed a lower biomass production, even when the microorganism reached its stationary phase (10 d in both flask morphologies) (Fig. 6). In the culture of an Asian strain of L. laccata s.l., the biomass production was higher at the lower initial glucose concentration when comparing treatments with 10 and 20 g/L of the carbon source (Kuek, 1996). In addition, the osmotic stress generated by high glucose concentrations was interpreted as the reason for the inhi- bition of mycelial growth seen in the EM Tricholoma matsutake (Kusuda et al., 2007). The maximum concentration of the carbon source in the culture medium in batch cultivation of an EM has been proposed to be around 16 g/L (Rossi et al., 2017). While the 10 g/L BF cultures generated the highest biomass production (5.93 ± 1.44 g/L) in the shortest time (16 d), a higher yield (0.73± 0.03 gbiomass/gglucose) was obtained at 15 g/L in BF. Kuek (1996) reports a yield between 0.63 and 0.74 gbiomass/gglucose, using the E439 L. laccata s.l. strain. Differences between the composition of our media and the media used by Kuek (1996) are mainly in peptone (2 vs. 10 g/L respectively) and yeast extract (0.2 vs. 2 g/L respectively) concentrations. There is no inorganic nitrogen source in BAFmedium, so all the nitrogen comes from the peptone and the yeast extract. The concentration of phosphate salts in the medium used in this study was one magnitude order lower than that used by Kuek (1996). However, he reports that the decreased concen- tration of phosphate in the culture of L. laccata E439 generates 10 % increase in growth. The shake flask design determined the differences in oxygen transfer rates, measured as the specific volumetric mass transfer coefficient (KLa), while the agitation rate was equal in all experi- ments (100 rpm) (Table 4). An elevated oxygen transfer rate allows for a better exchange of oxygen for cellular respiration and CO2 Fig. 6. Carbon source initial concentration (glucose of 10 and 15 g/L) and shake flask design effects on L. trichodermophora growth. (A), glucose consumption (B), and evolution of pH (C). All cultures were carried out in normal (closed dots) and baffled (open dots) Erlenmeyer flasks of 250 mL filled to 20 % capacity (50 mL of BAF culture medium) at 25 ± 2 !C, and orbitally shaken at 100 rpm. Average and standard deviation of at least three independent experiments are shown. (G-J), illustrate the biomass production over time (t: days of culture) in the four kinetics by bottom flask pictures. R.E. !Angeles-Arg!aiz et al. / Fungal Biology 124 (2020) 205e218214 
 42 elimination from the broth. Moreover, elevated agitation rates (or differential hydrodynamics) generate shear stress that is normally detrimental to the cellular integrity (Rossi et al., 2017), decreasing the size of the mycelial aggregates, as could be the case with baffled shake flasks. Submerged cultures of Ganoderma lucidum demon- strated that the initial KLa has an effect on the cellular growth rate and ganoderic acid production (Tang and Zhong, 2003). Different KLa values were obtained by maintaining a constant agitation of 200 rpm and modifying the air injection between 220 and 3500 mL/min in G. lucidum cultures. The highest biomass was ob- tained when KLa was near 78 h!1, while the maximum ganoderic acid productivity was seen when KLa was 96 h!1 (Tang and Zhong, 2003). Increased KLa modifies the cell morphology and increases the formation of mycelial aggregates (Tang and Zhong, 2003). Accordingly, the L. trichodermophora cultures with elevated KLa values in our study were determined to have increased XMAX values. In this work, shake flask design produced different pellet mor- phologies (Fig. 6GeJ). The mycelia produced in BF were fragmented and the pellets were compact with growing hyphae throughout their surface, while in NF, the mycelia formed larger and less fila- mentary pellets (Fig. 6GeJ). Larger pellets have deficiencies in ox- ygen and nutrient diffusion, which leads low growth (Garcia-Ochoa and Gomez, 2009; Gibbs et al., 2000). Additionally, the coloration of the culturemedia became dark towards the last days of the kinetics, probably due to the production of secondary metabolites or pro- teins excreted by the fungus. This darkening of the medium was also reported in L. laccata cultures, but the compounds or culture conditions that cause the color change in the medium were not identified (Kuek, 1996). 4.6. Oxygen transference in the bubble column bioreactor The bubble column bioreactor was operated at similar KLa values (36.2 ± 2.1 h!1) as in cultures carried out at 10 g/L of glucose in BF (38.3 ± 4.1 h!1). The XMAX valuewas lower (BCB: 4.03 ± 0.03 g/ L, BF: 5.93 ± 1.44 g/L) but with non-significant differences (r ¼ 7.179, P ¼ 0.126). This was also true for other kinetic parame- ters, like YX/S, qS, and PX (Table 5), while there were low statistical differences between the m values (r ¼ 9.584, P ¼ 0.48). To our knowledge, the only work that has described oxygen transference in EM cultures was done for Rhizopogon nigrescens in an airlift bioreactor (Rossi et al., 2017). These experiments operated at KLa values near 25 and 56 h!1 and obtained final biomass concentra- tions of 6.4 and 6.6 g/L, respectively (Rossi et al., 2017). The authors argue that, during cultivation, the biomass growthwas a function of pellet size. However, they also detected a drop in oxygen con- sumption associated with increasing pellet size (Rossi et al., 2017). In our study of L. trichodermophora, large pellets appeared after 18 d of culture (Figs. 1 and 7). Bigger pellets reduce the relationship between their area and volume and, subsequently, the contact with the culture medium. Therefore, the mass transfer from the broth to the inner hyphae of the pellet decreases (Dynesen and Nielsen, 2003; Veiter et al., 2018). This gradient in the pellet layers was also observed in airlift bioreactor cultures of R. nigrescens (Rossi et al., 2017). In our study, the L. trichodermophora pellets in BCB cultures were almost twice the size of those in shake baffled flasks and related limitations to the transfer of oxygen to the interior of the compressed, agglomerated hyphae might have led to a meta- bolic gradient, generating a central necrotic zone and hollow pel- lets. After 20 d, the pH fell to 4.7 and the broth began to darken, as detected in shake flasks. In order to avoid lethal or sub-lethal effects in this work, we avoided the use of a microbiological blender for the homogeniza- tion of the inoculum and decide to use baffled shake flasks cultures, which guarantee better pellet size homogeneity (Gamboa- Suasnavart et al., 2011). In addition, the homogenization step increased the inoculum contamination risk, which is very relevant in long span cultures. Both the stirred flasks and the BCB were inoculated with 2 % of a previous culture in baffled shake flasks. Cultures in shake flasks were inoculated with 1 mL of liquid culture using a micropipette with cut tip opening of 2 mm2. On the other hand, the BCBs were inoculated by a peristaltic pump with the whole broth of two 50 mL shake baffled flask cultures, which allowed the passage of different size pellets. The pellet size in the inoculum might determine the differences in pellet size between flasks and BCBs, affecting the mass transfer and impacting the final biomass (Hotop et al., 1993; Glazebrook et al., 1992; Yang and Liau, 1998). 4.7. Downstream process and inoculum formulation Vegetative inocula can be applied to the target plants in several ways, including slurries, carried in the substrate or immobilized in Fig. 7. L. trichodermophora growth kinetics in pneumatic bioreactor. (A), glucose con- sumption (B), and pH evolution and dissolved oxygen tension (C) in bubble column bioreactor cultures. Cultures were carried in a home-made pneumatic bioreactor (Fig. 1) with a working volume of 5.0 L (BAF culture medium, initial pH 5.5, aeration of 1.55 L/min, and 25 ± 0.4 #C). Average and standard error of at least two independent experiments are shown. R.E. !Angeles-Arg!aiz et al. / Fungal Biology 124 (2020) 205e218 215 
 43 polymer beads (Rep!a"c, 2011). The mycelia produced in our process is pellet shaped, thus homogenization and formulation steps must be performed prior to the greenhouse application. Homogenization in blender shakers increases the number of infective units and al- lows mixing with substrate or application by irrigation equipment (Rep!a"c, 2011). However, the mechanical damage and the intracel- lular toxins released affect the viability of the inocula (Lapeyrie and Bruchet, 1985), reducing the shelf life of the final product. Long- term preservation methods, such as lyophilization or cryopreser- vation are not recommended for EM because sterile mycelia lack resistant propagules as spores or conidia (Lalaymia et al., 2014). Mycelia immobilization in polymeric beads has been demonstrated to conserve infectivity and inocula life span (Kuek et al., 1992; Le Tacon et al., 1985; Mauperin et al., 1987; Mortier et al., 1989). Therefore, calcium alginate should be tested in the final inoculum formulation. However, inocula production should be coordinated with greenhouse production, in order to ensure enough fresh inocula and avoid long term storage. 5. Conclusions In this paper we described the isolation, domestication, and screening of L. trichodermophora strains; the selection of highly productive culture conditions in solid and liquid media; and the mycelia cultivation in bubble column bioreactor at a 5 L scale. Our results show that the projected area of the colony in solid medium cultures is not a good parameter to estimate the growth of L. trichodermophora, since it does not strongly correlate with the final dry weight. We detected high variability in biomass produc- tion by sixteen conspecific strains. Among the tested conditions, BAF, 25 !C, and an initial pH of 5.5, yielded the highest biomass production in solid cultures. These conditions were corroborated in submerged cultures, and higher biomass production when using 10 g/L of the carbon source in baffled flasks was also detected. Additionally, we found high variability in biomass production be- tween different conspecific strains in shake flasks. Despite repro- ducing the volumetric oxygen transference coefficient from a high productive flask culture to bubble column bioreactor, the lower biomass production and yield between the bubble column biore- actor and baffled flasks can be attributed to the differences in pellet size and morphology caused by the bioreactor hydrodynamics. Our results support L. trichodermophora as a good ectomycorrhizal model, capable of producing high quantities of mycelial biomass on bioreactors with the potential to be applied as forest bioinoculant. In order to develop a vegetative inoculum with high infectivity, efficacy and long viability, it will be necessary to evaluate the downstream process, the final product formulation and the plant response. Funding This work was financed by the “Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología” (CONACYT 247473, 220795) and “Programa de Apoyo a Proyectos de Investigaci!on e Innovaci!on Tecnol!ogica, Universidad Nacional Aut!onoma de M!exico” (PAPIIT-UNAM IN-210217; IT- 200719, IN-208415). Compliance with ethical standards All authors disclose no actual or potential conflict of interest involving this publication. The work described has not been pub- lished previously. Declaration of Competing Interest On behalf of all the authors, the corresponding author states that there is no conflict of interest. Acknowledgements REAA is grateful for the support of the Programa de Posgrado en Ciencias Biol!ogicas, UNAM, and CONACYT, for granting scholarships for the completion of their PhD (LAG CVU. No. 439184). We thank Erandy Villegas Salvador Biol., for the strain screening cultures; María Berenit Mendoza-Garfias M. Sc., head of the Electron Mi- croscopy Laboratory in the Biology Institute at the Universidad Nacional Aut!onoma de M!exico; Laura Margarita M!arquez Valde- lamar M.Sc., head of the Biodiversity and Health Sequencing Massive Laboratory of IB-UNAM; Lidia Irene Cabrera Martínez Ph.D., head of the Molecular Biology Laboratory of the Botany Department of IB-UNAM; Samuel Aguilar Ogarrio, Biol., for his support in the work at the Mycology Laboratory of IB-UNAM; Gerardo Montes de Oca PhD., head of the strain collection at INECOL; Rams!es I. García Cabrera M. Sc. and Alberto Campos Lopez M. Sc., for their support at the Bioprocess Unit of Biomedical Research Institute (IIB-UNAM); Julieta !Alvarez Manjarrez M. Sc. Ulises Salas Martínez Eng., Daniel Tejeda Dur!an Biol., Ren!e S!anchez Rivera Biol., Rodrigo Olivera Gonz!alez Biol., Fabiola Gandarilla Aizpuro Biol., Veronica Reyes P!erez M. Sc., Carlos Vencedor Meraz Biol., Alicia Mastretta Yanes Ph. D. for their support in field work; Valeria Flores Almaraz Biol., for her support in strain reseeding; and the anonymous reviewers who evaluated this work for publication. This project was developed under the Institutional Program of the Instituto de Investigaciones Biom!edicas-UNAM: “La producci!on de biomol!eculas de inter!es biom!edico en bacterias y hongos.” Appendix A. Supplementary data Supplementary data to this article can be found online at https://doi.org/10.1016/j.funbio.2020.02.003. References Abr#amoff, M.D., Magalh~aes, P.J., Ram, S.J., 2004. Image processing with ImageJ. Biophot. Int. 11, 36e42. !Angeles-Arg!aiz, R.E., Flores-García, A., Ulloa, M., Garibay-Orijel, R., 2016. 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 46 1 SUPPLEMENTARY MATERIAL From field sampling to pneumatic bioreactor mycelia production of the ectomycorrhizal mushroom Laccaria trichodermophora Rodolfo E. Ángeles-Argáiza,b,c, Ilse A. Carmona-Reyesc, Christian Armando Quintero- Corralesa,b Francisco J. Medina-Macíasc, Abel Blancas-Cabrerac, Norma A. Valdez- Cruzc, Miguel Ulloab, Mauricio A. Trujillo-Roldánc, Roberto Garibay-Orijelb* a Posgrado en Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Autónoma de México. A.P 70-153, C.P. 04510, Ciudad de México, México. b Instituto de Biología, Universidad Nacional Autónoma de México. A.P. 70-233, Ciudad de México, C.P. 04510, México. c Programa de Investigación de Producción de Biomoléculas, Departamento de Biología Molecular y Biotecnología, Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México. AP. 70-228, Ciudad de México, C.P. 04510, México. *Corresponding author: Dr. Roberto Garibay-Orijel. Laboratorio de Sistemática, Ecología y Aprovechamiento de Hongos Ectomicorrízicos, Departamento de Botánica, Instituto de Biología, Universidad Nacional Autónoma de México. A.P. 70-233, Ciudad de México, CP. 04510, México. Email: rgaribay@ib.unam.mx. Phone +52 55 56229250 ext. 47836. 
 47 2 Appendix. Colony morphology in Petri dish Under the culture media, pH and temperatures tested, L. trichodermophora showed six different morphologies: A) Dense, velvety white irregular colonies with diffuse margins and slow growing aggregated exploratory mycelia. This morphology was observed in MMN, pH 4.5 in all temperatures assayed; and PDA, pH 5.5, 28 ºC (Figure S1A). B) Soft, white regular submerged colonies with diffuse or defined margins and fast growing dispersed exploratory mycelia. This morphology was observed in MMN at 23 ºC, 5.5 and pH 6.5 as well as 25 ºC, pH 6.5 (Figure S1B). C) Soft, white regular submerged colonies with clearly defined margins and slow growing mycelia. This morphology was observed in MMN, pH 6.5, 25 and 28 ºC (Figure S1C). D) Dense, thin, velvety white or lilac irregular colonies with a central light brown zonate irregular margin and dispersed exploratory mycelia. This morphology was observed in PDA, pH 4.5, 23 and 25 ºC (Figure S1D). E) Dense, thick, velvety white colonies with a central light brown zonate and regular or irregular margin. This morphology was observed in all PDA, pH 6.5; pH 5.5, 23 and 25 ºC; pH 4.5, 28 ºC; and BAF, 28 ºC at all pH values (Figure S1E). F) Dense, thick, velvety white or lilac irregular colonies with a central dark brown zonate and irregular margin, sometimes with a second growing front of dispersed exploratory mycelia. This morphology was observed in BAF, 23 and 25 ºC at all pH values (Figure S1F). 
 48 3 Table S1. Average final projected area and final dry weight of the Laccaria trichodermophora solid media culture. Assay ºC Media pH Xmax (g/L) Colony area (mm2) 1 23 PDA 4.5 0.073±0.073 2,127±366 2 23 PDA 5.5 0.040±0.006 2,830±613 3 23 PDA 6.5 0.035±0.023 1,053±332 4 23 MMN 4.5 0.026±0.008 886±177 5 23 MMN 5.5 0.038±0.012 3,137±745 6 23 MMN 6.5 0.040±0.038 2,809±969 7 23 BAF 4.5 0.057±0.005 3,675±343 8 23 BAF 5.5 0.055±0.007 3,464±372 9 23 BAF 6.5 0.059±0.010 3,380±553 10 25 PDA 4.5 0.036±0.006 1,052±314 11 25 PDA 5.5 0.040±0.005 1,697±215 12 25 PDA 6.5 0.029±0.005 1,124±273 13 25 MMN 4.5 0.027±0.005 734±287 14 25 MMN 5.5 0.025±0.007 536±426 15 25 MMN 6.5 0.046±0.019 2,234±635 16 25 BAF 4.5 0.064±0.011 823±741 17 25 BAF 5.5 0.079±0.015 3,210±402 18 25 BAF 6.5 0.075±0.009 2,003±498 
 49 4 Assay ºC Media pH Xmax (g/L) Colony area (mm2) 19 28 PDA 4.5 0.046±0.016 2,194±531 20 28 PDA 5.5 0.049±0.017 2,718±267 21 28 PDA 6.5 0.049±0.012 2,391±236 22 28 MMN 4.5 0.014±0.004 2,125±123 23 28 MMN 5.5 0.006±0.003 1,426±267 24 28 MMN 6.5 0.025±0.025 1,333±183 25 28 BAF 4.5 0.040±0.005 3,642±404 26 28 BAF 5.5 0.056±0.007 3,529±348 27 28 BAF 6.5 0.041±0.006 862±161 
 50 5 Table S2. Spearman correlations and Kendall test between Laccaria trichodermophora colony projected area and dry weight. Red fonts correspond to significative correlations. Spearman correlation Kendall test Colony area (mm) Dry weight (g/L) Colony area (mm) Dry weight (g/L) Colony area (mm) 1.000000 0.560409 1.000000 0.401837 Dry weight (g/L) 0.560409 1.000000 0.401837 1.000000 
 51 6 Figure S1. Laccaria trichodermophora culture on solid medium. A-F) different colony morphologies. 
 52 7 Figure S2. Laccaria trichodermophora colony area growth kinetics in solid PDA at 23 ºC with three pH values. Figure shapes correspond to different pH values. Bars correspond to standard deviation. 
 53 8 Figure S3. Laccaria trichodermophora colony area growth kinetics in solid MMN at 23 ºC with three pH values. Figure shapes correspond to different pH values. Bars correspond to standard deviation. 
 54 9 Figure S4. Laccaria trichodermophora colony area growth kinetics in solid BAF at 23 ºC with three pH values. Figure shapes correspond to different pH values. Bars correspond to standard deviation. 
 55 10 Figure S5. Laccaria trichodermophora colony area growth kinetics in solid PDA at 25 ºC with three pH values. Figure shapes correspond to different pH values. Bars correspond to standard deviation. 
 56 11 Figure S6. Laccaria trichodermophora colony area growth kinetics in solid MMN at 25 ºC with three pH values. Figure shapes correspond to different pH values. Bars correspond to standard deviation. 
 57 12 Figure S7. Laccaria trichodermophora colony area growth kinetics in solid BAF at 25 ºC with three pH values. Figure shapes correspond to different pH values. Bars correspond to standard deviation. 
 58 13 Figure S8. Laccaria trichodermophora colony area growth kinetics in solid PDA at 28 ºC with three pH values. Figure shapes correspond to different pH values. Bars correspond to standard deviation. 
 59 14 Figure S9. Laccaria trichodermophora colony area growth kinetics in solid MMN at 28 ºC with three pH values. Figure shapes correspond to different pH values. Bars correspond to standard deviation. 
 60 15 Figure S10. Laccaria trichodermophora colony area growth kinetics in solid BAF at 28 ºC with three pH values. Figure shapes correspond to different pH values. Bars correspond to standard deviation. Capítulo I I I- Long-read sequencing do not collapse Laccaria trichodermophora (CA15-11, CA15-75, CA15-F10 and EF-36) strains genome assemblies and reveal its intraspecific genome diversity En este Capítulo se abordó el segundo objetivo particular de la tesis: Identificar el efecto de la longitud de lectura de secuenciación sobre la calidad del ensamble genómico de novo de Laccaria trichodermophora; también se estudió el efecto de la calidad del ensamble en las inferencias genómico-funcionales. Se secuenciaron los genomas de cuatro cepas de L. trichodermophora por plataformas de segunda y tercera generación de secuenciación y se ensamblaron de novo por diferentes aproximaciones bioinformáticas. Se hizo evidente que la longitud de la lectura tiene un impacto en la calidad del ensamble genómico, y este a su vez, en las inferencias funcionales. Esto principalmente por el cambio en el número de copias y tamaño de las familias génicas, aunque también, pero en menor grado, funciones enteras fueron detectadas solo mediante el uso de estrategias de secuenciación y ensamble híbridas. El Capítulo será sometido para su publicación como artículo de investigación en la revista Genes Genomes and Genetics (IF: 2.8) con el título “Long-read sequencing do not collapse Laccaria trichodermophora (CA15-11, CA15-75, CA15-F10 and EF-36) strains genome assemblies and reveals its intraspecific genome diversity”.
 61 18/9/21 22:58 localhost:10202/session/viewhtml5b2c5cacf601/index.html localhost:10202/session/viewhtml5b2c5cacf601/index.html 1/1 “Long-read sequencing do not collapse Laccaria trichodermophora (CA15-11, CA15-75, CA15-F10 and EF-36) strains genome assemblies and reveal its intraspecific genome diversity” Rodolfo Enrique Ángeles-Argáiz*†, Luis Fernando Lozano Aguirre-Beltrán‡, Christian Armando Quintero-Corrales*†, Mauricio Trujillo-Roldán§, Santiago Castillo-Ramírez‡, Roberto Garibay-Orijel† * Posgrado en Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Autónoma de México, Circuito de los Posgrados s/n, Ciudad Universitaria, Ciudad de México, México, C.P. 04510. † Instituto de Biología, Universidad Nacional Autónoma de México, Tercer Circuito s/ n, Ciudad Universitaria, Delegación Coyoacán, Ciudad de México, México, C.P. 04510. ‡ Centro de Ciencias Genómicas, Universidad Nacional Autónoma de México, Avenida Universidad s/n, Universidad Autónoma del Estado de Morelos, Cuernavaca, Morelos, C.P 62210. § Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, Tercer Circuito s/n, Ciudad Universitaria, Delegación Coyoacán, Ciudad de México, México, C.P. 04510. 
 62 Laccaria trichodermophora genome assembly Key words Biotrophic fungal genome, hybrid genome assembly, intraspecific genome variability, sequencing technologies comparison. Corresponding autor Roberto Garibay Orijel, Instituto de Biología, Universidad Nacional Autónoma de México, Tercer Circuito s/n, Ciudad Universitaria, Delegación Coyoacán, C.P. 04510, Ciudad de México, México, +52 56229250 ext. 47836, rgaribay@ib.unam.mx Abstract Genome assembly and annotation using short-paired reads is challenging for eukaryotic organisms, mainly due to the high number of repeated transposable elements populating these genomes. However, using single molecule long reads improves the assembly quality but their high error rate brings new assembling challenges. In order to address the effect of the read length on the genome assembly quality, gene prediction and annotation, we performed a comparison among genome assemblers and sequencing technologies with four strains of the ectomycorrhizal mushroom Laccaria trichodermophora. The effects of the assembly quality on the functional inferences were tested by annotating and comparing the carbohydrate activity enzymatic kit. Libraries were generated using three different sequencing platforms (Illumina Next-Seq 2x76 b, Mi-Seq 2x300 b and PacBio Sequel 1 >10 kb), the genomes 63 were assembled using single libraries and hybrid strategies. We detected that only long reads assemblers were able to decompress repeated regions and displayed the real number and variation of genes copies. Indeed, the best quality genomes assemblies were also the larger ones. High quality genomes showed larger genomic contents mainly represented by expansion of genes families; in extreme cases, they even allowed to recover full genomic functions missing in the short reads assemblies. Additionally, we found large differences in genome size within L. trichodermophora strains corresponding to high genomic interspecific variation rather than methodological artifacts. 64 1 Introduction Genome assembly quality and completeness relies on intrinsic genome features, sequencing data and computational assembly approaches (Alkan 2011). Each high throughput sequencing technology has its particular limitations. In 454 pyrosequencing and Ion Torrent libraries, homopolymers were a major concern; the short pair-end reads from Illumina or BGI often yield assemblies with a large number of contigs, while third generation sequencing technologies such as PacBio or NanoPore are often superior in assembly completeness due to the low number of resulting contigs, but their high error frequency is still problematic (Smits 2019; Watson and Warr, 2019). In consequence, several assembly approaches have been developed to deal with sequencing data features as the k-mer sorting, graph construction, aligning and overlapping of short or long reads, scaffolding, filling gaps, correcting misassembles and polishing results in order to offer an accurate genome assembly hypothesis (Amarasinghe et al. 2010; Koren et al. 2012; Sedlazeck et al. 2018; Koren et al. 2019; Wang and Au, 2020). Eukaryotic genomes contain non-coding regions and transposable elements that hinder the accuracy of genome assembly affecting assembly size (Elliott and Gregory 2015). By means of sequencing coverage, it has been estimated that the genome size of some ectomycorrhizal fungi, particularly species of Amanita, could be larger than those proposed by genomic assemblies (Hess et al. 2014; 2018). This is maybe due to the complexity of these genomes in terms of the repeated regions. This phenomenon is promoted by particular families of transposable elements (Hess et al. 2014; 2018), and could be prominent on large genomes of plant-associated biotrophic fungi (Muszewska et al. 2017), especially ectomycorrhizal ones (Miyauchi et al. 2020). 65 Recently, assemblies of large and high repetitive eukaryotic genomes have been addressed through the use of third generation sequencing technologies (such as PacBio and NanoPore) and new assembly and quality improving computational tools and pipelines (e.g., Nowoshilow et al. 2018; Osipowski et al. 2019; Yu et al. 2019; Tobias et al. 2020). In order to understand the effects of read length on the quality and completeness of de novo assembly of an ectomycorrhizal genome, we selected four conspecific strains of Laccaria trichodermophora for wide genome shotgun sequencing and assembling. We generated and compared the genomic assemblies obtained with two short-read (SR) libraries (2x76 b and 2x300 b) and one long-read (LR) library (>10 Kb). Genomes were assembled using i) each library separately, ii) the two SR libraries together, and iii) the three libraries in a hybrid approach. Likewise, we analyzed the effect of the assembly quality on the functional genomic inferences. To highlight differences in functional annotation, we focused on the low plant cell wall degrading capability, one of the genomic fingerprints of the ectomycorrhizal life style (Veneault-Fourrey et al. 2014; Kohler et al. 2015), mainly coded in carbohydrate activity enzyme (CAZyme) genes. 2 Materials and Methods 2.1 Strains origin and derivation We selected the ectomycorrhizal fungus Laccaria trichodermophora Muell. as model organism. It is a close relative of L. bicolor from whom the first mycorrhizal genome was sequenced by cloning in plasmids and fosmids (Martin et al. 2008). These two lineages diverged around 6 mill ion years ago (Wilson et al. 2015), and share 66 macromorphological features (Mueller 1984). Within Laccaria, the genome assembly of L. amethystina (Kohler et al. 2015) was obtained based on pair-end second-generation sequencing technology. Laccaria bicolor and L. amethystina are transcontinental distributed host generalists; in contrast, L. trichodermophora has a relative restricted distribution area and has a strong preference for pine hosts (Mueller 1992; Pérez et al. 2012; Reverchón et al. 2012; Galindo-Flores et al. 2015; Franco-Mass et al. 2016; López-García et al. 2017; Kong et al. 2018; Rodríguez-Gutiérrez et al. 2019; Ángeles- Argáiz et al. 2020; Quintero-Corrales et al. 2020; see Mueller y Strack 1992; Ramos et al. 2017 for host shift under particular conditions). For the strain selection we took advantage of the genetic resources, the genotype, and phenotype data recently generated in previous studies (Table 1, Figure S1). Ángeles-Argáiz et al. (2020) compared the growth and substrate consumption in shake flask cultures of these strains and identified wide differences in culture performance of these conspecific samples. Furthermore, Quintero-Corrales et al. (2020) found that the genomic structure in L. trichodermophora populations across the Transmexican Volcanic Belt is determined neither by the elevation differences on the volcanoes nor by identity of the host (pine species) but by geographic distance. The selection of the four strains used in this study was designed to represent the wide intraspecific (genetic and phenotypic) diversity of the species. The field sampling and strain isolation from dikaryotic basidiomata are detailed in Ángeles-Argáiz et al. (2020), and the strain genotyping is presented in Quintero-Corrales et al. (2020). 67 Table 1 Strain derivation and accessibility. 2.2 Sequencing methods and library features DNA extractions were performed from 16-day-old cultured mycelia of the four strains. The mycelial cultures were growth in 250 mL baffled shake Erlenmeyer flasks (100 rpm) filled to 20% (50 mL of modified BAF culture medium, at 25±2 °C, initial pH 5.5). Mycelial cultures were filtered through sterile Waltman #4 filters using a vacuum plump. Filtered mycelia were stored in sterile Falcon tubes at -70 ºC until downstream procedures. High quality DNA extractions were achieved using the DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN) protocol with modifications (Supplementary material). DNA concentrations were measured with NanoDrop and Qubit before delivering for genomic sequencing. For each strain two SR Illumina sequencing libraries were prepared in the "Instituto Nacional de Medicina Genómica" in Mexico City and for two strains we obtained one LR PacBio library from MacroGen in South Korea (Table 2). One of the SR libraries was a Strain CA15-11 CA15-75 CA15-F10 EF-36 Voucher CA15-11 CA15-75 CA15-F10 REAA13-59 MEXU 29986 29985 29987 27575 Origin SN LM NT VP Latitude 18.98375 19.28429 19.12212 19.125575 Longitude -97.29178 -98.04142 -99.77871 -99.21537 Elevation (masl) 3,836 3,067 4,028 3,094 Host P. hartwegii P. montezumae P. hartwegii P. montezumae ITS/NCBI MN710460 MN710467 MN710481 KT354980 BioProject/NCBI PRJNA642675 VP = Volcán Pelado, Mexico City; SN = Serra Negra, Puebla; NT = Nevado de Toluca, Mexico Estate; LM = La Malinche, Tlaxcala 68 high deep sequencing library using four Illumina Next-Seq flow cells per sample, consisting in pair end 2x76 b with overlap. The second was made with a full Illumina Mi- Seq flow cell per sample and consisted of a pair end 2x300 b with average distance of 100 b between forward and reverse reads. For the LR library one full PacBio Sequel 1 flow cell per sample was used to obtain libraries mainly consisting in >10 Kb read-length (but even >90 Kb length-reads were obtained). For the PacBio sequencing we selected the strain with the great amount of biotechnological data (EF-36) and a geographically distant one (CA15-11). Table 2 Shotgun whole genome sequencing data summary. 2.3 Genome assembly Several de novo assembly assays were performed using different assembler algorithms for each of the three libraries together and alone (Figure 1). Strain Illumina Next-Seq 
 (2x76 b)(SR) Illumina Mi-Sec
 (2x300 b)(SR) PacBio Sequel 1 
 (>10 Kb)(LR) Raw read number Clean read number Raw read number Clean read number Reads Subreads Corrected reads CA15-11 106,996,984 63,107,798 4,066,964 4,022,332 679,396 1,293,905 191,573 CA15-75 106,996,984 103,956,030 6,797,912 6,634,218 - - - CA15-F10 64,249,826 26,371,613 2,040,731 2,019,889 - - - EF-36 128,404,683 124,772,395 7,981,238 7,787,611 709,445 1,038,541 181,727 69 Figure 1. Laccaria trichodermophora de novo genomic assemblies general workflow. A) Short read assemblies, B) Long read and hybrid assemblies. Lilac boxes represent raw sequencing, trimmed or corrected data; light blue boxes represent assemblers; yellow boxes represent complementary software such as cleaner, mapping or polishing tools; green boxes represent resulting assemblies. 70 A B Short-read data cleaning was performed with Trimm-Galore (v0.6.4, Krueger 2015) and the quality controls on raw and clean data using FastQC (v0.11.8, Andrews et al. 2010) (Figures S2-9). Using only one strain and the 76x2 b clean library, we selected the pair-end assembler. ABySS assembler (v2.0.1, Simpson et al. 2009) was tested with 53, 63, 73, 83 and 93 k-mer sizes. IDBA (v1.1.3, ”IDBA_UD”, Peng et al. 2012) was used with interleaved reads; the k-mer size was ranged between 31 and 121 with 10 b steps. SPAdes (v3.13.1, Bankevich et al. 2012) was used with three k-mer size combinations: k-mer size ranged between 31 to 71 with steps of 10 b, with k-mer size ranged between 31 to 75 with steps of 4 and 6 b, and with the default parameters. The k-mer size tested with Velvet (v1.2.10, Zerbino y Birney 2008) were 67, 69, 71, 73 and 75, these values were selected because the optimal k-mer size proposed by VelvetOptimiser (v2.2.6) was k = 71. We did the quality assessment for the genome assemblies with QUAST (v5.0.2, Gurevich et al. 2013) and chose the best result of each assembler. The remaining strains were assembled following the parameters that gave the best result for the first one (SPAdes default). Those assemblies were used for scaffolding by SSPACE (v3.0, ”SSPACE_Standard”, Boetzer et al. 2011) and processed with GapFiller (v1-10, Nadalin et al. 2012), in order to get a high accurate genome assembly with SR. LRs assemblies were made with Canu (v2.0, Koren et al. 2017) on diploid mode. De novo hybrid assembling approaches vary in the use of the input data and could be classified in three groups: 1) Methods that start assembling SRs and then utilize LRs to generate longer contigs; 2) Methods that correct raw LRs using SRs and then build contigs with corrected LRs only; 3) Methods that assemble LRs first and then use SRs 71 to polish the resulting assembly. Here, we used hybridSPAdes (v3.13.1, Antipov et al. 2016) to assemble SRs and then we used LRs to extend and join contigs. We used the MaSuRCA method (v3.3.8b, Zimin et al. 2017) to correct raw LRs using SRs and then to build contigs using corrected LRs. We built contigs with wtdbg2 (v2.5, Ruan and Li 2019) using LRs and then polished them with the SRs. Also, we tested a method that first assemble self-corrected LRs (using Canu v2.0 in diploid mode), scaffold contigs with LRs (using SSPACE-LR v1-1, Boetzer and Pirovano, 2014), then improve the resulting assembly by filling gaps with SRs (using GapFiller v1-10), and finally detect mis-assemblies and indels or block substitution events with three rounds of the polishing tool Pilon (v1.23, Walker et al. 2014). Pilon used the SRs and LRs mapped over the assembly with Bowtie2 (v2.3.5, Langmead and Salzberg, 2012) and Minimap2 (v2.17, Li 2018) respectively. Reads were aligned to the polished previous round assembly for the second and third Pilon polishing rounds. From the polished diploid assemblies, diploid repeated contigs were detected and discarded using the Purge Haplotigs pipeline (v1.1.1, Roach et al. 2018), that use the LRs coverage on the contigs by aligning with Minimap2 (v2.17) and Lastz (v1.04.03, Harris, 2007). Genomic completeness and duplicate evaluation were made with BUSCO (v4.0.5, Seppey et al. 2019) by comparing the genomic assemblies versus the Agaricales database (agaricales_odb10) composed by 3,870 conserved markers. QUAST (v5.0.2) analyses were also used to get general assembly quality features. Finally, representative assembling results were selected. Single (76 b and 300 b) and both SRs assemblies of the four strains were obtained from SPAdes plus scaffolding and gap filling. Furthermore, the Canu assemblies (only LR) and the Canu plus Pilon 72 (hybrid assemblies) for the two strains with LRs were selected. These three (CA15-F10 and CA15-75) or five (CA15-11 and EF-36) genome assemblies per strain were used for annotation and consequent analyses (Figure 1). 2.4 Non-targeted organism identification in long-read assemblies Due to the large differences found between the assemblies generated with short reads and long reads, and in order to identify and dismiss contaminations coming from non-target organisms, we analyzed the genomic assemblies as if they were metagenomes using MaxBin (v2.2.1, Wu et al. 2015) and VizBin (v1.0.0 Laczny et al. 2015). The MaxBin analysis uses a bacterial gene library (housekeeping and ribosomal) for taxonomic assignment of contigs within the assembly. VizBin generates a two- dimensional map of the contigs using their intrinsic properties such as GC content and tetramers use. From the VizBin result (scatterplot), dots far away from the main dot- cloud are treated as outliers and selected as potential contaminants, on which the online version of BLAST (Johnson et al. 2008) was used against the NCBI nr database for taxonomic assignment. 2.5 Genome size calculation by k-mer coverage In order to estimate the genome size of the samples without underestimation due to repeated regions within the SR assemblies (Hess et al. 2014), we used Jellyfish (v2.3.0, Marçais and Kingsford, 2011) on the SR libraries of each sample. K-mer sizes (19, 21, 23, 25 and 27) were large enough to allow them to map uniquely to the genome. The k- mer frequency follows a Poisson distribution around the mean coverage of k-mer counts 73 (Lander & Waterman ,1988; Simpson, 2014). In consequence a genome size estimate was obtained by div iding the total k-mers by the coverage (https:/ / bioinformatics.uconn.edu/genome-size-estimation-tutorial/). 2.6 CAZome annotation and comparative analysis Carbohydrate activity enzymes (CAZymes) are a reduced but important gene set on the ectomycorrhizal symbioses (Kohler et al. 2015; Miyauch et al. 2020). Thus, in order to identify the effect of the assembly quality on the functional inferences, we focused on the analyses of these enzymes. For each strain, all assemblies were used in the gene model prediction with AUGUSTUS (v3.2.3, Stanke et al. 2004), which was trained with the L. bicolor cDNA (--species=laccaria_bicolor), in single strand and complete gen model mode, allowing non-alternative transcripts. CAZyme coding genes were annotated with dbCAN2 (v2.0.11, Zhang et al. 2018). Only HMMER (Finn et al. 2011) outcomes from the CAZy database (Lombard et al. 2013) were taken into account for comparative analyses (Stewart et al. 2019). 2.7 Data availability Voucher herbarium specimens where strains belong are deposited in MEXU, strains are deposited in XAL strain collection (Ángeles-Argáiz et al. 2020). Final genome assemblies, ITS sequences and raw shotgun sequencing data are available on NCBI (Table 1). Code, and whole pipeline for the genome assembly assays and CAZyme annotation are available online (https://github.com/Rodolfo47/LtG.git). 74 3 Results and Discussion 3.1 Genome assembly After comparing the performance of SRs assemblers (Tables S1-5), the SPAdes assemblies were selected for further refinement; LR assemblies were done with Canu; likewise, among hybrid assemblers the Canu plus Pilon assemblies were selected (Table S6). Sixteen Laccaria trichodermophora genome assemblies representing the genomes of four strains were subjected to annotation and further comparison (Table 3). All strains have SR data, but just two (CA15-11 and EF-36) have LR data. Table 3 Laccaria trichodermophora genome features and assemblies’ comparison. Assembly 76 b 300 b SRs LRs Hybrid Strain CA15-11 Total length (Mbp) 46.86 68.15 70.78 111.69 111.90 Contigs 14,968 20,119 18,965 1,119 876 Largest contig (Kbp) 55.40 86.95 86.72 917.15 1,052.63 N50 (Kbp) 4.11 4.70 5.49 171.95 241.04 L50 3,172 3,985 3,456 180 133 Gene number 23,114 31,420 31,734 34,575 34,713 Genome completeness (%) 50.8 60.6 61.4 94.2 95.7 Genome duplication (%) 1.7 7.0 8.7 30.5 37.6 Exome length (Mbp) 22.16 30.30 31.76 50.13 51.09 Genetic density (%) 47.30 44.46 44.87 44.89 45.66 CAZymes 243 349 363 525 537 GC (%) 47.47 47.13 47.12 46.65 46.67 # N's per 100 Kbp 144.59 91.10 103.71 0.00 349.37 Strain CA15-75 Total length (Mbp) 46.72 66.75 75.35 - - 75 Contigs 13,822 18,038 18,845 - - Largest contig (Kbp) 125.60 126.77 127.70 - - N50 (Kbp) 4.65 5.55 6.09 - - L50 2,820 3,239 3,292 - - Gene number 22,384 29,941 31,229 - - Genome completeness (%) 48.10 57.80 65.10 - - Genome duplication (%) 2.70 9.40 15.20 - - Exome length (Mbp) 22.15 29.95 33.35 - - Genetic density (%) 47.41 44.87 44.26 - - CAZymes 250 358 392 - - GC (%) 47.43 47.07 47.04 - - # N's per 100 Kbp 184.43 100.82 152.65 - - Strain CA15-F10 Total length (Mbp) 41.23 57.29 65.27 - - Contigs 15,893 19,562 18,694 - - Largest contig (Kbp) 83.35 91.45 91.72 - - N50 (Kbp) 3.03 3.76 4.94 - - L50 3,718 4,196 3,603 - - Gene number 21,334 27,242 29,663 - - Genome completeness (%) 46.2 65.3 64.7 - - Genome duplication (%) 0.5 2.3 6.7 - - Exome length (Mbp) 19.32 25.70 29.54 - - Genetic density (%) 46.84 44.86 45.27 - - CAZymes 221 310 347 - - GC (%) 47.60 47.29 47.21 - - # N's per 100 Kbp 386.15 168.65 114.08 - - Strain EF-36 Total length (Mbp) 43.82 50.32 50.33 58.99 59.06 Contigs 3,787 3,434 3,341 94 77 Assembly 76 b 300 b SRs LRs Hybrid 76 By comparing assembly size and genetic content of the three SR assemblies it was evident that read length does have an effect on assembly size. As read length increases the genome assembly length also does (correlation values: tau = 0.61, p = 0.003; rho = 0.73, p = 0.001 Figure S10; Figure 2A). Only considering the contigs bigger than 1 Kbp, assemblies of 76 b read length of strains CA15-F10, CA15-11, EF-36 and CA15-75 proposed genome sizes of ~41, 47, 44 and 47 Mbp respectively. With this read length the EF-36 genome appears to be the best assembled, with 3,787 contigs and N50 of 29.86 Kbp, compared to 13,822 - 15,893 contigs of the other genomes. With 300 b read length, all genomes increased their sizes to ~57, 68, 50 and 67 Mbp. The genome of EF-36 was again the smallest, but still the best assembled, with 3,434 contigs compared to 18,038 - 20,119 contigs of the other strains. It is worth to mention that the genomes of CA15-F10 and EF-36 strains decreased in contig number but increased in genome size, while the rest increased in genome size and also in contig number. Using Largest contig (Kbp) 504.87 568.43 576.99 4,959.16 5,316.68 N50 (Kbp) 29.86 43.00 43.96 1,351.60 1,464.17 L50 363 299 283 12 12 Gene number 16,168 17,522 17,579 18,691 18,708 Genome completeness (%) 97.4 97.3 97.5 97.5 97.6 Genome duplication (%) 1.0 1.3 1.2 1.6 1.6 Exome length (Mbp) 22.91 25.03 25.10 28.38 28.47 Genetic density (%) 52.28 49.74 49.87 48.11 48.20 CAZymes 309 318 318 322 320 GC (%) 47.70 47.23 47.24 46.84 46.84 # N's per 100 Kbp 9.40 37.96 26.55 0.00 91.36 Assembly 76 b 300 b SRs LRs Hybrid 77 both SRs libraries together (76 b/300 b), genome size kept growing (70, 49 and 65 Mbp) (except in EF-36: ~65 Mbp), but the contig number decreased (except in CA15-75). For all strains, as read length increased, the number of predicted genes also increased (Table 3). Figure 2. Genome sizes of four L. trichodermophora strains. A) Effect of strain and assembly on L. trichodermophora genome size and genetic density. 76 = SPAdes assembly with Next-Seq library of 76 b pair end reads, 300 = SPAdes assembly with Mi- Seq library of 300 b pair end reads, SR = Refined assembly with both short read libraries, LR = Canu assembly with Sequel long read library, Hyb = Hybrid polished Canu + Pilon assembly with LR and both SR libraries. B) Genome size of the four strains estimated by five k-mer length using two short paired read libraries. 
 78 Taking into account the best outcomes for SRs, CA15-75 genome assembly was the largest, reaching 75.35 Mbp and 31,229 predicted genes, while EF-36 the smallest, just 50.32 Mbp in size with 17,579 genes. Simultaneously, the strain with smaller genome (EF-36) was the one with lower fragmentation (near to 3K contigs vs. almost 19K contigs). Also, EF-36 strain showed less variation in genome size and gene count while comparing 76 b, 300 b or SR assemblies (Table 3, Figure 2A); notwithstanding in both cases only LRs were capable to cover particular genomic regions (Figures S11 and S12). Since the earliest genomes generated by Sanger sequencing (low sequencing depth with long reads) were compared with the first genomes assembled entirely by short paired reads (great sequencing depth but heterogeneously distributed across the genome), it is known that longer read length is better than a high sequencing depth when the genome completeness is the aim (Sims et al. 2014). Therefore, hybrid approaches combining high depth SRs libraries with LRs (Sanger, 454, Illumina Mate- Pair and more recently PacBio and NanoPore) have shown better results (e.g., DiGuistini et al. 2009; Tobias et al. 2020). In our data, when comparing SR vs. LR assemblies, it was evident that LR assemblies were larger than SR assemblies regardless strain identity. Also, regardless the sequencing method, we found differences between strain genome lengths. Long reads increased the quality of genome assemblies (CA15-11 from 18,965 SR contigs to 1,119 LR contigs; EF-36 from 3,341 SR contigs to 94 LR contigs). The increase in the genome size of the strain with the largest and most fragmented assembly (CA15-11) was more prominent than the smallest and well-solved one (EF-36) (~58 vs 17% respectively) (Figure 2A). 79 Because there were huge differences between SR and LR assemblies we used metagenomic approaches to figure out if genomic DNA contamination in LR libraries was the cause. In MaxBin analyzes no bin was assigned to bacterial taxa (Table S7). The potential outlier contigs obtained with VizBin analyses belonged to sequences matching with genes or hypothetical proteins of sequenced Laccaria amethystina and Laccaria bicolor NCBI available genomes (Table S8). Notwithstanding the low fragmentation of the LR assemblies, their reads high error rate is a concern, with potential impact on genetic prediction. Thus, hybrid assembling takes advantage of the accurate base calling and high coverage of the short-paired reads to break misassemblies and improve base assignation (Chakraborty et al. 2016). Here, the Canu + Pilon method offered the best result (Table S6). Hybrid assemblies’ genome lengths were quite similar to those of LR assemblies but worked better in terms of fragmentation and gene prediction. The revision of the diploid genomes of both strains with Purge Haplotigs had a minor impact on their primary assemblies. Only 10 secondary contigs were reassigned as allelic contigs and dismissed from the primary assembly of CA15-11 strain, totaling less than 281 Kbp (0.25 %), and no contig of EF-36 strain was reassigned. Finally, hybrid assemblies of CA15-11 reached 111.90 Mbp genome length while EF-36 reached 59.06 Mbp, parcel out in 876 and 77 contigs respectively, including nuclear and mitochondrial genome. Due to the differences in genome size proposed by sequencing and assembling methods, we explored an assembly-independent approximation. Consistent with the general pattern of genome sizes obtained by assembling, the analyses of genomic sizes by k-mer coverage estimated most strain genomes round 135 Mbp (CA15-F10 = 80 139.26, CA15-11 = 134.42, CA15-75 = 129.18 Mbp average), but EF-36 about half (65.1 Mbp) (Figure 2B). Genomes of ectomycorrhizal fungi in Agaricales such as Amanita have been proposed from 8 to more than 600% larger than its genome assemblies, mostly due to the effect of the repeated regions of the genome while assembling with SRs (Hess et al. 2014; 2018). Likewise, using LRs and SRs together the complete, surprisingly large, and high accurate assemblies of the early divergent Basidiomycete rust Austropuccinia psidii were achieved (1,018 Mpb) (Tobias et al. 2020). Previous draft assemblies of this fungi estimated genome size between 103 and 145 Mb (Tan et al. 2014). The results provided by these hybrid assemblies were supported by the calculation of the genomic size by k-mer coverage, and by flow cytometry (Tobias et al. 2020). Here, the L. trichodermophora genomic assemblies generated with SR were also smaller than estimated by k-mer coverage, but genome size obtained with hybrid assemblies remained similar to those estimated by sequencing depth (Figure 2). In concordance to the Amanita genomes (Hess et al. 2014; 2018), the genome of the strain with larger and most fragmented SR assembly (CA15-11) increased in size more than the genome of the smallest and less fragmented one (EF-36) did. This intraspecific genome variation is not a methodological effect given the consistency of several assembly-dependent calculations with k-mer coverage estimation and the minimal effect of the Purge Haplotigs analysis. Fungal genomes are very dynamic in nature (Mohanta and Bae, 2015), even members of the same genus can show remarkable divergence at the genomic level, in terms of amino acid sequence identity and genome synteny. The size of the genome 81 assemblies of six Rhizophagus irregularis (Glomerales, Mucoromycota) conspecific isolates ranges from 122 to 138 Mb in size, with large numbers of orphan genes and strain-specific gene family expansions (Chen et al. 2018). Whole genome duplication and large-scale genomic variation in both overall ploidy and individual chromosomal copy numbers are not rare in clinical yeast isolates (Zhu et al. 2016). Although often deleterious, stress-induced chromosomal duplication examples, with beneficial effects have been reported for yeasts belong to the Basidiomycota and Ascomycota with biotrophic and saprotrophic life stiles (Gerstein et al. 2015; Linder et al. 2017). Laccaria trichodermophora EF-36 genome assembled with hybrid approach showed around half-length compared to strain CA15-11 (Figure 2A). Genome sizes of the remaining two strains were predicted (by k-mer coverage) similar to the larger one (Figure 2B). For instance, several mutations have been identified that lead to genome reduction from diploid to haploid in Saccharomyces cerevisiae (Todd et al. 2017), some of them occur over a relatively short amount of time (∼50 generations). Also, drastic losses of heterozygosity have been attributed to laboratory maintenance conditions, but for distant related to Laccaria, highly specialized and genetically minimalist animal pathogenic fungi (Encephalitozoon cuniculi, Selman et al. 2013). Here L. trichodermophora strains were serial reseeded during the isolation and maintenance time lapse, which started in 2013 for EF-36 and in 2015 for the remaining strains. Although, mechanistically causes of this size differences remain unclear. 3.2 CAZyme annotation comparative analysis 82 Read length and assembling methods do have an effect on genomic functional inferences. This phenomenon was clearly reflected on the CAZyme gene set annotation of L. trichodermophora (correlation values: tau = 0.61494, p = 0.003045; rho = 0.7291531, p = 0.001351; Figure 3, S14). In general, as the read size increased, the number of CAZymes did (Figure S11). However, it is important to identify that there were not only additions; we found also losses of CAZymes, although in a much smaller proportion (Figure 3). Figure 3A shows the amount of CAZymes gained or lost by the different assemblies with respect to the 76 b assembly. Figure 3B shows the CAZymes common to the 3 or 5 assemblies of each strain, as well as the CAZymes exclusive to each assembly or shared by only some of them. To facilitate the visualization of the differences, the gene copies found at the intersection of all circles in figure 3B were no plotted in figure 3C. Figure 3. Comparison of predicted CAZyme content of four strains of Laccaria trichodermophora genomes assembled by three or five methods/libraries. A) CAZyme genes gain and loss in four different strains/assemblies. B) Venn diagram grouping the CAZy enzymes common or exclusive for the different assemblies for each strain. C) Heatmap comparing the predicted CAZy gene content. Only differences are plotted, genes common for all assemblies were not included in the graphic (for the full CAZy set see supplementary figure 13). White color corresponds to differences in number of genes; blue, purple and red indicate the copy number additions as indicated in the color key. Row dendrogram cluster together enzymes with similar copy number means. 83 330 > 280 7 C A Z y m e n u m b e r s O 380 7 230 7 — 00 o 1 130 > $. a CA15-11 CA15-75 CA15-F10 EF-36 287 127 115 298 29 27 26 =5 119 11-10 152 E 100 ww 830. » 300SR LRHyb 300SR LRHyb 300SR LRHyb 300SR LRHyb Assembly C A 1 5 - 1 1 _ 7 6 b C A 1 5 - 1 1 _ 3 0 0 b Lega E rw | IIA eee = 3 o Cee Leen GENESIS nota. “loo t ANNE coria — cut y SIZZRZ "6 Gains A Losses 
 84 When comparing the CAZyme contents of the three assemblies generated with SRs, all strains increased in their gene numbers by almost a third using 300b respect to 76 b; however, in the small genome of EF-36, the differences were just 10%. Using both SR libraries together few additional CAZymes were detected in three strains, but no one in EF-36 (Table 3, Figure 3). Taking into account all assemblies, in the shortest and well- solved genome (EF-36), CAZyme number showed minimum variation (309, 318, 318, 322 and 320) regarding read length increase. In contrast, in the largest and more complex genome (CA15-11), CAZymes almost duplicated their number (243, 349, 363, 525 and 537). In most cases, the variation in the size of each CAZy families ranged between 1 and 7 copies (blue colors in figure 3C); there were outstanding cases, such as CE10 or GH5, where the variation was more than 15 copies (purple and red colors in figure 3C). Within the CE10 family, there were arylesterases and lipases involved in the metabolism of fatty acids and vitamins. The CE10 of L. trichodermophora were not assigned to specific subfamilies by dbCAN, because of how rare these enzymes are. Enzymes in GH5 have activity in cellulose and hemicellulose. The GH5 enzymes annotated in the L. trichodermophora genomes accounted for at least seven sub- families (Figure S12), among them, GH5_9 was the most affected by the assembling manner. This means that when assembling with SRs, the glucanase, xylanase, glucosidase and mannosidase capacities were underestimated. This pattern was more prominent for the CA15-11 strain, while there was no variation for the EF-36 strain. Enzymes such as GT8 and GH25 in the EF-36 strain could only be detected when assembling with LRs, while in the CA15-11 strain this phenomenon was detected for more than 20 enzymes, in addition to several enzymes forming homomeric or 85 heteromeric dimers that were only assembled as such by LRs. In extreme cases, such as AA7 or CE4, the use of LRs detected a number of copies, while the SRs did not detect any one (Figure 3, S12). In consequence, several oxidating activities on glycosyl residues of oligosaccharides and several chitooligosaccharide acetylase activities would have passed unnoticed in SRs assemblies. All together, our results suggest that read length impact not only on the fragmentation rate or genomic size estimation, but in the functional inferences, as were illustrated in the CAZy gene set. These underestimations could have serious effects in the repeated genes causing misinterpretations of the diversity and strength of particular functions, which could be prominent in complex genomes of heterokariotic fungi. Furthermore, when gathering the evidence generated with different sequencing libraries, different assembly methods for different conspecific strains, the high intraspecific genomic diversity in L. trichodermophora became evident. 4 Acknowledgements REAA is grateful for the support of the "Programa de Posgrado en Ciencias Biológicas", UNAM, and CONACYT, for granting PhD scholarships (LAG CVU. No. 439184). We thank the "Unidad de Apoyo Técnico Informático", CCG-UNAM for their support with hardware and software; to Lidia Irene Cabrera Martínez the technician of the "Laboratorio de Biología Molecular del Departamento de Botánica", IB-UNAM; and to Alberto Campos and Valeria Flores Almaraz for strain maintenance. This work was funded by PAPIIT-UNAM IN-210217 to RGO. 
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 97 
 98 Supplementary material of: Long-read sequencing decompresses Laccaria trichodermophora (CA15-11, CA15-75, CA15-F10 and EF-36) strains genome assemblies and reveal its intraspecific genome diversity Rodolfo Enrique Ángeles-Argáiz*†, Luis Fernando Lozano Aguirre-Beltrán‡, Christian Armando Quintero-Corrales*†, Mauricio Alberto Trujillo-Roldán§, Santiago Castillo- Ramírez‡, Roberto Garibay-Orijel† Material and Methods Modifications to the DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN) fabricant suggestions were: Double amount of fresh filtered micelial biomass per reaction; Addition of a mechanic cell lysis with liquid nitrogen as initial step; Increasing the incubation time in the lysis buffer five times; Starting the protocols with five reactions for each sample, to finally join the five reactions through a single DNA affinity column; Incubating the elution reaction in the DNA affinity column for 5 min before centrifuging and repeating this twice. These modifications were necessary to reach at less 1µg of high integrity DNA as required by sequencing service providers. 
 
 99 Figure S1. Laccaria trichodermophora strain selection representing de genotype and phenotype diversity of the central Mexico populations. A) Position of three strains in the Transmexican Volcanic Belt population genetic STRUCTURE analysis and SNPs ML phylogram, B) PCA clustering using SNPs, C) biomass production and D) glucose consumption of four strains in shake flask culture. (Figures taken and modified from Quintero-Corrales et al. 2020 and Ángeles-Argáiz et al. 2020 with authors permission). F in a l X ( g /L ) 0.00 1.25 2.50 3.75 5.00 a ab ab bc cde abcd de ef e ef efg cde fg g g g C o n s u m e d S ( g /L ) 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 C A 1 5 -4 C A 1 5 -1 1 E F -3 6 C A 1 5 -3 3 C A 1 5 -7 7 C A 1 5 -R 3 8 C A 1 5 -F 1 0 C A 1 5 -4 0 C A 1 5 -4 2 C A 1 5 -3 4 C A 1 5 -R U 1 C A 1 5 -F 8 C A 1 5 -7 5 C A 1 5 -2 9 C A 1 5 -R U 4 C A 1 5 -7 3 a abc ab cd bcd cde bcde cde efh def bcdef abcd fgh gh gh h A B C D 
 100 Figure S2. Quality control of raw and clean Next-Seq (76b) pair end reads of CA15-11 strain. Raw reads Clean reads R1 R2 
 101 Figure S3. Quality control of raw and clean Mi-Seq (300b) pair end reads of CA15-11 strain. Raw reads Clean reads R1 R2 
 102 Figure S4. Quality control of raw and clean Next-Seq (76b) pair end reads of CA15-75 strain. Raw reads Clean reads R1 R2 
 103 Figure S5. Quality control of raw and clean Mi-Seq (300b) pair end reads of CA15-75 strain. Raw reads Clean reads R1 R2 
 104 Figure S6. Quality control of raw and clean Next-Seq (76b) pair end reads of CA15-F10 strain. Raw reads Clean reads R1 R2 
 105 Figure S7. Quality control of raw and clean Mi-Seq (300b) pair end reads of CA15-F10 strain. Raw reads Clean reads R1 R2 
 106 Figure S8. Quality control of raw and clean Next-Seq (76b) pair end reads of EF-36 strain. Raw reads Clean reads R1 R2 
 107 Figure S9. Quality control of raw and clean Mi-Seq (300b) pair end reads of EF-36 strain. Raw reads Clean reads R1 R2 
 108 Figure S10. Icarus alignment viewer of L. trichodermophora CA15-11 assemblies generated with Quast using the CA15-11 hybrid (Canu + Pilon) assembly as reference. A) Display a fragment of the alignment in B. B) display first 177 scaffolds. A B 
 109 Figure S11. Icarus alignment viewer of L. trichodermophora EF-36 assemblies generated with Quast using the CA15-11 hybrid (Canu + Pilon) assembly as reference. A) Display a fragment of the alignment in B. B) display first 31 scaffolds. A B 
 110 Figure S12. Heatmap comparing the predicted CAZy gene content. Row dendrogram cluster together enzymes with similar copy number means. C A 1 5 − 1 1 _ 7 6 b C A 1 5 − 1 1 _ 3 0 0 b C A 1 5 − 1 1 _ S R s C A 1 5 − 1 1 _ L R s C A 1 5 − 1 1 _ H y b ri d C A 1 5 − 7 5 _ 7 6 b C A 1 5 − 7 5 _ 3 0 0 b C A 1 5 − 7 5 _ S R s C A 1 5 − F 1 0 _ 7 6 b C A 1 5 − F 1 0 _ 3 0 0 b C A 1 5 − F 1 0 _ S R s E F − 3 6 _ 7 6 b E F − 3 6 _ 3 0 0 b E F − 3 6 _ S R s E F − 3 6 _ L R s E F − 3 6 H y b ri d AA14 GT4 GH13_40 GT2_Glyco_trans_2_3 CE16 GT39 GT20 GH31 PL14_4 GH28 CBM13 GT2_Chitin_synth_1 GH71 GH72 GT15 GT8 AA9 AA7 CE4 GH128 GT90 GH105 AA5_1 GT22 GT2_Chitin_synth_2 GH13_8 CE1 CE8 PL14_5 GT3 GH30 GH9 GT76 PL35 GH88 GH13_25 GT21 GT32 GT59 GT33 GH38 GH95 GH15+CBM20 GT58 CBM52 CBM20 GT35 GH2 PL14 CE5 GH76 GT2_Chitin_synth_1+GT2_Chitin_synth_2 PL8_4 GH5_5 GH5_5+GH5_5 GT20+GT20 GH13_22+GH13_22 GH13_1+GH13_1 GH15+AA1_2 GH3+GH3 GT17 GT50 GH13_22+GH13_22+GH13_22 AA3 GH37+CE10 GH47+GH47 AA1_1+AA1_2 AA3_2+AA3_2 CBM52+CBM52 GH3+GH3+GH3 GT39+GT39 GH5_50+GT58 GH30_4 AA2+AA2 GH5_9+GH5_9 GT28 GT15+GT15+GT15 GT1+GT1 GH128+GH128 CE10+CE10 GH79+GH79 GT3+GT3 GT22+GT22 PL8 GT48+GH152 GH31+GH31 GT48+GT48 GH85 GH154 GT24 GT2_Glyco_tranf_2_3 GT66 GH131 GH25 GH20 GH13_22 GH13_5 GH37 CBM21 GH5_50 GH63 AA5 GT15+GT15 GH24 GT48 GH152 GT69 AA3_3 AA6 GH13_1 GT2_Glycos_transf_2 GH35 GH30_3 GH12 GT1 GH17 GT57 AA1_2 GH55 GH92 GH5_30 GH5_15 AA2 GH5_12 GH15 GH3 AA3_2 GH5_9 GH47 GH18 GH79 AA1_1 GH16 CE10 0 5 10 15 20 30 36 
 111 Table S1. Comparison between Laccaria trichodermophora EF-36 ABySS (Assembly By Short Sequences) assemblies generated with different k-mer sizes. Assembly k33 k43 k53 k63 k73 Contigs # Contigs 4,813 4,966 5,056 5,186 74 Largest contig 268,483 268,417 407,597 407,675 7,885 Total length 31,602,418 35,887,993 38,782,502 40,934,162 137,874 GC (%) 48.27 48.15 48.02 47.90 38.66 N50 12,376 14,621 16,272 16,940 1,927 L50 600 576 570 573 22 # N's per 100 kbp 25.03 21.08 27.52 85.18 501.18 Scaffolds # Contigs 3,633 3,682 3,759 3,803 49 Largest contig 488,177 332,910 563,323 511,709 16,978 Total length 31,641,266 35,928,407 38,827,325 40,978,089 138,636 GC (%) 48.27 48.15 48.02 47.90 38.67 N50 18,825 21,647 23,686 25,468 4,798 L50 404 402 397 406 8 # N's per 100 kbp 155.05 142.03 140.03 188.69 968.00 All values considering contigs/scaffolds bigger than 1Kb. 
 112 Table S2. Comparison between Laccaria trichodermophora EF-36 IDBA_UD (Iterative De Bruijn Assembler with Uneven Depth) assemblies generated with different k-mer sizes. Assembly k31 k41 k51 k61 k71 k81 # Contigs 6,004 6,326 6,369 6,476 6,437 6,141 Largest contig 108,564 142,015 210,314 303,532 303,552 303,572 Total length 29,141,15 2 33,409,87 6 36,644,31 3 39,142,98 4 41,079,88 9 41,947,04 1 GC (%) 48.31 48.20 48.07 47.91 47.81 47.77 N50 9,231 10,497 12,449 13,714 14,993 16,587 L50 747 740 684 656 631 590 # N's per 100 kbp 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 k91 k101 k111 k121 Scaffolds # Contigs 5,965 5,967 5,837 5,793 5,684 Largest contig 407,601 407,621 569,291 569,530 569,530 Total length 43,077,76 3 44,213,52 1 45,315,08 3 46,287,21 3 46,287,71 7 GC (%) 47.71 47.64 47.57 47.51 47.51 N50 18,072 18,991 20,244 21,378 21,961 L50 558 537 519 508 493 # N's per 100 kbp 0.00 0.00 0.00 0.00 0.05 All values considering contigs/scaffolds bigger than 1Kb. 
 113 Table S3. Comparison between Laccaria trichodermophora EF-36 SPAdes (St. Petersburg genome assembler) assemblies generated with different set of k-mer sizes. Assembly Default Step10 Step5 Default Step10 Step5 Contigs Scaffolds # Contigs 3,915 5,034 5,331 3,785 4,881 4,701 Largest contig 504,919 447,787 478,617 504,919 447,787 478,617 Total length 43,812,47 1 44,868,83 1 47,293,3 03 43,837,338 44,965,206 48,054,54 4 GC (%) 47.70 47.61 47.48 47.70 47.61 47.43 N50 28,693 23,414 23,761 29,857 24,320 28,092 L50 372 455 478 362 442 419 # N's per 100 kbp 0.00 0.00 0.00 29.06 21.92 27.75 All values considering contigs/scaffolds bigger than 1Kb. 
 114 Table S4. Comparison between Laccaria trichodermophora EF-36 Velvet assemblies generated with different k-mer sizes. Assembly k63 k65 k67 k69 k71 Contigs 7,058 8,006 11,717 13,394 156 Largest contig 177,176 94,476 25,735 14,069 26,051 Total length 38,634,369 38,636,637 36,990,772 21,716,930 285,257 GC (%) 47.92 47.91 47.92 48.03 41.86 N50 10,791 8,460 4,116 1,632 1,628 L50 862 1,192 2,699 4,763 39 # N's per 100 kbp 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 All values considering contigs/scaffolds bigger than 1Kb. 
 115 Table S5. Comparison between Laccaria trichodermophora EF-36 best results of different short-reads genome assemblers. Assembly ABySS IDBA_UD Contigs Scaffolds Contigs Scaffolds Contigs 5,186 3,803 5,793 5,684 Largest contig 407,675 511,709 569,530 569,530 Total length 40,934,162 40,978,089 46,287,213 46,287,717 GC (%) 47.90 47.90 47.51 47.51 N50 16,940 25,468 21,378 21,961 L50 573 406 508 493 # N's per 100 kbp 85.18 188.69 0.00 0.05 SPAdes Velvet Contigs Scaffolds Contigs Contigs 3,915 3,785 7,058 - Largest contig 504,919 504,919 177,176 - Total length 43,812,471 43,837,338 38,634,369 - GC (%) 47.70 47.70 47.92 - N50 28,693 29,857 10,791 - L50 372 362 862 - # N's per 100 kbp 0.00 29.06 0.00 - All values considering contigs/scaffolds bigger than 1Kb. 
 116 Table S6. Long reads and hybrid assemblies comparison. Assembly Canu Pilon HybSPADes MaSuRCA Wtdbg2 PurgeHap Strain CA15-11 Contigs 1,119 886 9,346 1,422 925 876 Largest contig 917,15 1 1,052,634 140,606 1,352,507 1,502,983 1,052,634 Total length (Mb) 111.69 112.18 85.23 115.56 74.55 111.90 GC (%) 46.65 46.66 47.15 46.44 46.38 46.67 N50 171,94 8 238,470 20,484 140,738 207,334 241,037 L50 180 134 1,133 216 91 133 # N's per 100 kbp 0.00 348.50 4,574.74 1.56 0.00 349.37 Strain EF-36 Contigs 94 77 1,363 241 224 77 Largest contig 4,959,1 63 5,316,676 1,506,708 3,140,828 2,571,081 5,316,676 Total length (Mb) 58.99 59.06 53.20 61.05 52.44 59.06 GC (%) 46.84 46.84 47.02 46.73 46.89 46.84 N50 1,351,5 96 1,464,168 158,178 624,154 522,856 1,464,168 L50 12 12 86 27 24 12 # N's per 100 kbp 0.00 91.36 123.28 0.33 0.00 91.36 All values considering contigs/scaffolds bigger than 1Kb; Canu assemblies were made using only long reads while the remaining five in a hybrid approach: Pilon were made over the results of Canu, and Purge haplotigs over Pilon. 
 117 Table S7. MaxBin analyses results. Abundance % Coverage % Genome size Mpb 36.LR Bin 1 0.12 1.9 21 Bin 2 0.12 11.2 37 11.LR Bin 1 0.09 3.7 48 Bin 2 0.08 13.1 65 Capítulo IV- El contenido de enzimas CAZy y péptidos efectores en los genomas accesorios de Laccaria trichodermophora confiere a las cepas capacidades simbióticas diferenciales En este Capítulo se abordó el tercer objetivo particular de la tesis: Identificar genes potencialmente involucrados en la fisio-ecología simbiótica de las distintas cepas de Laccaria trichodermophora. Se anotaron y analizaron los genomas de cuatro cepas de L. trichodermophora en conjunto con otros genomas disponibles del Género Laccaria y hongos saprobios cercanamente emparentados. Mediante análisis pan-genómicos se detectaron genes involucrados en funciones simbióticas. Los análisis filogenómicos apoyan la monofilia del conjunto de cepas analizadas de L. trichodermophora. Se detectaron y discutieron las funciones genéticas relacionadas con la explotación de la materia orgánica y necromasa, la infección de la raíz y la organogénesis de la ectomicorriza, así como la comunicación con el hospedero y la evasión de la respuesta inmune vegetal. Se detectó que algunas cepas no presentan genes centrales en el desarrollo de la simbiosis, como es el caso de la poligalacturonasas (GH28) y la endoglucanasa (GH5_5) con módulo de unión a carbohidrato (CBM1), así como un menor número de péptidos efectores predichos. Lo que parece estar relacionado con su capacidad de colonización. 
 118 18/9/21 23:00 localhost:10202/session/viewhtml5b2c2f968b89/index.html localhost:10202/session/viewhtml5b2c2f968b89/index.html 1/1 El contenido de enzimas CAZy y péptidos efectores en los genomas accesorios de Laccaria trichodermophora le confiere capacidades simbióticas diferenciales Rodolfo Enrique Ángeles-Argáiz*† y Roberto Garibay-Orijel† * Posgrado en Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Autónoma de México. Ciudad de México, México, C.P. 04510. † Instituto de Biología, Universidad Nacional Autónoma de México, Ciudad de México, México, C.P. 04510. Palabras clave Capacidad infectiva, enzimas CAZy, genoma accesorio, predicción de péptidos efectores, variabilidad genómica intraespecífica. Autor de correspondencia Roberto Garibay Orijel, Instituto de Biología, Tercer Circuito s/n, Ciudad Universitaria, Delegación Coyoacán, A.P. 70-233, C.P. 04510, Ciudad de México, México, +52 56229250 ext. 47836, rgaribay@ib.unam.mx 
 119 Resumen En los genomas de los hongos ectomicorrízicos están codificadas las capacidades fisiológicas que les han permitido lograr la asociación simbiótica con sus hospederos. La variación genética intraespecífica tiene efecto en su fenotipo y en sus interacciones simbióticas. Con la intención de identificar el trasfondo genómico que da a distintas cepas sus capacidades infectivas diferenciales, se realizó el análisis comparativo de cuatro genomas de Laccaria trichodermophora. Este es un hongo ectomicorrízico asociado a pinos y con un importante potencial en la biotecnología forestal. A pesar de las diferencias genómicas entre las cepas de L. trichodermophora, todas formaron un grupo monofilético hermano a L. bicolor. Su genoma core estuvo integrado por 6,756 grupos de genes ortólogos y el porcentaje del genoma accesorio varió entre el 18% y el 29% (genes). La batería genética codificante para enzimas de actividad sobre carbohidratos (CAZy) de L. trichodermophora es muy similar a la reportada para L. bicolor, con genes simbióticos involucrados en la evasión y confrontación del sistema inmune vegetal, en la colonización y organogénesis de la ectomicorriza, en la competencia contra otros microorganismos rizosféricos y en la explotación de la materia orgánica nitrogenada de difícil acceso en el suelo. Sin embargo, la ausencia de genes importantes, cómo poligalacturonasas GH28 parecen haber comprometido la eficiencia simbiótica de algunas de las cepas analizadas. La cepa CA15-F10 fue la única que codificó el homólogo de la endoglucanasa LbGH5-CBM1, crucial en la formación de la ectomicorriza, lo que en conjunto con su elevada batería de péptidos efectores (SSPs) explica su mayor capacidad simbiótica. 120 1 Introducción La simbiosis ectomicorrízica se presenta entre las raíces de más de 30 linajes de plantas (Tedersoo y Brundett 2017) y las hifas de más de 80 linajes de hongos (Tedersoo y Smith 2017) y tiene implicaciones que van desde el establecimiento de las plántulas hasta los ciclos biogeoquímicos globales (Smith y Read, 2009). El estudio de la simbiosis ectomicorrízica se ha viso robustecido por el análisis de genomas completos (Kohler y Martin 2016; Martin et al. 2016; Miyauchi et al. 2020; Plett y Martin, 2015). Mediante la secuenciación de los primeros genomas de especies micorrízicas se hicieron evidentes las características que llevaron a linajes independientes de hongos saprobios a convertirse en simbiontes micorrízicos biótrofos, así como la diversidad y heterogeneidad de los mecanismos moleculares que los hongos micorrízicos emplean en la comunicación con sus socios vegetales (Kuo et al. 2014; Martin et al. 2008, 2010; Tisserant et al. 2013). Una de las metas del estudio genómico de la simbiosis ectomicorrízica es identificar los “genes simbióticos” con los que cualquier especie de hongo micorrízico entabla comunicación e intercambio con sus distintos hospederos (Kuo et al. 2014). Con el análisis y comparación de genomas de hongos biótrofos y saprótrofos, fue posible señalar la pérdida de la capacidad enzimática degradadora de pared celular vegetal como una convergencia evolutiva en hongos ectomicorrízicos. Por otro lado, también se ha hecho evidente que partes importantes de la batería genética involucrada en la comunicación con el hospedero son linaje-específicas (Kohler et al. 2015; Kohler y Martin 2016; Martin et al. 2016; Plett y Martin, 2015). En el genoma de Laccaria bicolor, se encontraron péptidos efectores (SSPs) inducidos en la micorriza (MiSSPs, Martin et al. 2008). Algunos de ellos, como MiSSP7 (Plett et al. 2014; Martin et al. 2016) o MiSSP7.6 (Kang et al. 2020) presentaron actividad efectora en el interior de las células de la raíz de su hospedero, mientras que otras, como MiSSP8 (Pellegrin et al. 2019a), mostraron participación en la penetración intercelular. Proteínas efectoras de este tipo son bien conocidas por su papel en la colonización de los tejidos vegetales por parte de hongos patógenos y endófitos (Plett y Martin, 2015; Stergiopoulos y Wit, 2009). Ahora, sabemos que la biología efectora 121 juega un papel fundamental en la comunicación entre el hongo y la planta durante el establecimiento de la simbiosis, su maduración y desempeño (Pellegrin et al. 2019b; Plett y Martin 2011; Plett et al. 2011; Rocafort et al. 2020; Toro y Brachmann, 2016). Con el empleo de datos transcriptómicos, se identificó un “regulón estable”, compuesto por 1,249 genes involucrados en la regulación de la simbiosis entre L. bicolor y algunos de sus hospederos. Simultáneamente, fue identificado un conjunto de 1,210 genes expresados diferencialmente durante la simbiosis, pero esta vez, específicos para los distintos hospederos estudiados Populus trichocarpa y Pseudotsuga menziesii (Plett et al. 2015). Así mismo, los perfiles de expresión diferencial de enzimas de actividad sobre carbohidratos (CAZy) fueron relacionados con las distintas etapas de la ontogénesis de la ectomicorriza (Veneault-Fourrey et al. 2014). Con la caracterización de algunas de estas enzimas, como LbGH5‐CBM1 (Zhang et al. 2018a), la comprensión sobre su participación en la simbiosis comienza a esclarecerse. La teoría sobre la fisiología de las interacciones micorrízicas se ha forjado sobre una colección de observaciones experimentales y genómicas realizadas en distintas especies o cepas modelo, en muchos casos representantes de linajes micorrízicos independientes. En el caso de la simbiosis ectomicorrízica, modelos como Laccaria bicolor (Martin et al. 2008) y Tuber melanosporum (Martin et al. 2010) han permitido comprender aspectos fisio-ecológicos y evolutivos de las interacciones. Al mismo tiempo, la microbiología clásica remarcó la importancia de la identidad de la cepa en el fenotipo de prácticamente cualquier especie microbiana. Ahora, mediante el análisis de genomas completos, se llega a conclusiones similares (Welch et al. 2002). De manera experimental se ha comprobado en L. bicolor que la identidad de la cepa es determinante en las diferencias tanto en crecimiento micelial in vitro como en el desempeño de la planta inoculada (Di Battista et al. 1996; Hazard et al. 2017; Flores- Almaraz, 2020). Dentro del Género Laccaria se ha reportado la variabilidad interespecífica al comparar los genomas de L. bicolor y L. amethystina (Kholer et al. 2015). Pero también, se han detectado importantes diferencias genómicas al interior de la misma especie, como la presencia de doce genes codificantes para hidrofobinas de 122 la clase 1 en L. bicolor S238N-H82 y solo nueve en el de L. bicolor 81306 (Plett et al. 2012). Con análisis de genómica comparada enfocada a la diversidad intraespecífica en especies modelo (Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Cryptococcus neoformans y Aspergillus fumigatus), se detectó que los hongos evolucionan mediante innovaciones a nivel de cepa, como la duplicación de genes, en lugar de la transferencia horizontal a gran escala, y que la mayoría de los genes accesorios se agrupan dentro de las regiones cromosómicas sub-terminales y están involucrados en la patogenicidad y resistencia antimicrobiana (McCarthy y Fitzpatrick, 2019). Mediante muestreos sub-genómicos se evidenció que el hongo micorrízico arbuscular Rhizophagus irregularis (= Glomus irregularis, Rhizoglomus irregulare) presenta diferencias considerables en el número de copias genéticas entre cepas, divergencia entre las copias, aneuploidía; e incluso en algunas cepas heterocarióticas, esta variabilidad se presenta entre núcleo y núcleo. La variación en sus regiones codificantes es equiparable a la de las regiones no codificantes, lo que se relaciona con características fenotípicas en cuanto al desempeño de la planta simbionte (Wyss et al. 2016). Resultados similares se encontraron mediante genómica comparada, las diferencias entre los ensambles de siete cepas van desde el tamaño del genoma, el porcentaje de regiones repetidas, número de genes y genes huérfanos. Esta variación afectó elementos transponibles, diversos dominios proteicos funcionales péptidos efectores y otros genes simbióticos. Además, mediante análisis pan-genómicos se encontró el intercambio genético entre cepas, lo que es muy relevante en estos hongos supuestamente clonales, para los que no se conoce reproducción sexual (Chen et al. 2018). Al analizar cuatro cepas geográficamente cercanas del hongo ectomicorrízico Pisolithus microcarpus en cultivo axénico, se detectaron sutiles diferencias en sus perfiles de expresión transcriptómica. Sin embargo, al modificar las concentraciones de la fuente de carbono (glucosa) en el medio, las distintas cepas reaccionaron de manera considerablemente diferente en cuanto a su acumulación de biomasa y perfil de azúcares en el micelio. En simbiosis con su hospedero, Eucalyptus grandis, se 123 demostró que a pesar de que la respuesta simbiótica general se mantiene en todas las cepas, la mayoría de los genes regulados de manera específica para la simbiosis son cepa específicos. De éstos, cerca de la mitad son de función desconocida, pero también una buena proporción son SSPs, transportadores y enzimas CAZy (Plett et al. 2020). Por lo tanto, cada vez es mas clara la importancia de estudiar la variación genómica intraespecífica para hacer interpretaciones generales, forjar teoría y comprender el trasfondo genético de los fenotipos observados (Ángeles-Argáiz et al. 2020; Chen et al. 2018; Hortal et al. 2017; Pellitier y Zak, 2018; Plett et al. 2020; Hazard et al. 2017). La selección de la cepa es crucial en un desarrollo biotecnológico, por lo que es necesario fenotipificarlas y analizar sus genomas. En este Capítulo se presenta la anotación funcional de cuatro genomas completos de cepas de Laccaria trichodermophora, así como el análisis comparativo en busca de genes y funciones potencialmente implicadas en sus capacidades de colonización. Estas cepas representan poblaciones geograficamente aisladas (Quintero-Corrales et al. 2020), presentan diferencias en su acumulación de biomasa al ser cultivadas en medios líquido (Ángeles-Argáiz et al. 2020) y también presentan diferencias en su capasidad de colonizar la raíz de su hospedero (Flores-Almaraz, 2020). La cepa EF-36 de L. trichodermophora acumula altas concentraciones de biomasa en cultivo líquido (Ángeles-Argáiz et al. 2020), pero desarrolla una pobre e incompleta colonización de la raíz de su hospedero (Flores-Almaraz, 2020), mientras que la cepa CA15-F10 no acumula tanta biomasa en la mismas condiciones de cultivo (Ángeles-Argáiz et al. 2020) pero alcanza buenos porcentajes de micorrización y en tiempos relativamente cortos (Flores-Almaraz, 2020). Como hipótesis, se asume que dentro del pan-genoma de L. trichodermophora se encontrarán diferencias en cuanto al tamaño de familias génicas y a la identidad de los genes. Algunas de estas diferencias, de presentarse en genes involucrados en la simbiosis como SSPs y enzimas CAZy, podrían estar relacionadas con la capacidad de establecer la simbiosis. Por lo tanto, se plantearon las siguientes preguntas de investigación: ¿Cuáles son las principales diferencias genómicas entre las especies del 124 Género Laccaria y sus parientes saprobios más cercanos? ¿Cuáles son los genes comunes a las tres especies de Laccaria con genoma secuenciado? ¿Cuáles son los genes exclusivos de cada especie o cepa? y ¿Cómo estas diferencias explican sus capacidades diferenciales para establecer la simbiosis? Para atender estas interrogantes se planteó analizar de manera comparativa los genomas disponibles de L. amethystina, L. bicolor y L. trichodermophora. De manera particular, identificar los genes compartidos y/o únicos en el pan-genoma Laccaria trichodermophora. Así mismo, de entre los genes involucrados en la simbiosis, identificar su variación inter- e intraespecífica en cuanto a identidad y tamaño de familias génicas. Para finalmente, detectar genes potencialmente relacionados con sus capacidades diferenciales para establecer la simbiosis. 2 Material y métodos 2.1 Genomas analizados y modelos de estudio El modelo de estudio fue la especie Laccaria trichodermophora (Muell. 1984), un Basidiomycete ectomicorrízico que se distribuye en México y Estados Unidos de América (Mueller, 1992; Wilson et al. 2017). En los volcanes del centro de México, particularmente en el Eje Neovolcánico Transversal Mexicano, es uno de los hongos con mayor producción de esporomas (Montoya et al. 2014; Reverchon et al. 2012). Laccaria trichodermophora se asocia con Pinus montezumae en los bosques de alrededor de 3,000 msnm y con P. harwegii en los límites superiores del bosque, alrededor de 4,000 msnm. Al estar cercanamente emparentada a L. bicolor (Wilson et al. 2017) comparte características morfo-anatómicas, pero parte de su ecología es distinta. Mientras L. bicolor es generalista pues se asocia tanto a gimnospermas como a angiospermas, L. trichodermophora muestra una fuerte preferencia por hospederos en el Género Pinus dentro de su rango de distribución natural, los reportes sobre su asociación con Fagus o Quercus refieren a saltos de hospedero fuera de su distribución natural (Mueller y Strack 1992; Ramos et al. 2017). Partiendo de análisis de estructura 125 poblacional (Quintero-Corrales et al. 2020) y de cultivo en medio líquido (Ángeles- Argáiz et al. 2020), se seleccionaron cuatro cepas de L. trichodermophora con la intención de capturar la mayor diversidad genética y fenotípica de la especie dentro del centro de México. Los protocolos de extracción de DNA, secuenciación y ensamble genómico fueron reportados por Ángeles Argáiz et al. (en preparación, Capítulo III de esta tesis). Junto con los genomas de L. trichodermophora, se analizaron genomas públicamente disponibles que fueron ensamblados y secuenciados con distintas estrategias. El genoma de L. bicolor S238N-H82 se ensambló a partir de librerías de fósmidos (Martin et al. 2008). Los genomas de L. amethystina LaAM-08-1 (Kohler et al. 2015), L. trichodermophora CA15-F10 y L. trichodermophora CA15-75 (Ángeles-Argáiz et al. en preparación, Capítulo III de esta tesis) fueron generados mediante secuenciación Illumina. Mientras que los de L. bicolor D101_1 (sin publicar, disponible en MycoCosm de JGI; Grigoriev et al. 2014), L. trichodermophora CA15-11 y L. trichodermophora EF-36 (Ángeles-Argáiz et al. en preparación) son ensambles híbridos (PacBio e Illumina). El tipo de secuenciación y ensamble genómico, así como la calidad del ensamble, pueden tener efectos sobre las inferencias funcionales (Ángeles-Argáiz et al. en preparación, Capítulo III de esta tesis), por lo que se tomó en cuenta durante la interpretación de los resultados. Todas las muestras de Laccaria pertenecen a especies ectomicorrízicas. No se cuenta con genomas secuenciados de otros representantes de la Familia Hydnangiaceae, por lo que, se incluyeron siete genomas de hongos descomponedores del mantillo, representantes de la Familia más cercana, Psathyrellaceae (Varga et al. 2019; Wilson et al. 2017) (Tabla 1). Los datos genómicos, así como en código utilizado y otra información relacionada, se encuentran disponibles en linea (https://github.com/Rodolfo47/LtC.git). 
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 1 2 7 Tabla 1. Estadísticos básicos, autoría y procedencia de los ensambles genómicos utilizados. Especie Cepa Tamaño del genoma (Mpb) Número de Contigs/Scaffolds Tamaño del contig/ scaffold mayor (Mpb) N50 (Mpb) GC (%) Números de acceso Secuenciación Cita Coprinellus angulatus CBS 144469 93.565 517 2.228 0.482 52.77 NCBI: PRJNA463278 PacBio Steindorff et al. 2020 Coprinellus angulatus CBS 175.51 59.300 273 3.712 0.754 52.56 NCBI: PRJNA496351 PacBio Floudas et al. 2020 Coprinellus micaceus FP101781_FA13 77.386 704 2.253 0.315 53.73 NCBI: PRJNA247835 Illumina y PacBio Varga et al. 2019 Coprinopsis cinerea okayama7-130 36.192 68 4.146 3.468 51.64 NCBI: PRJNA1447 Sanger Stajich et al. 2010 Coprinopsis marcescibilis CBS 121175 38.912 817 1.435 0.134 49.26 NCBI: PRJNA247837 Illumina Varga et al. 2019 Coprinopsis strossmayeri 76940 33.316 622 1.580 0.190 48.98 NCBI: PRJEB18786 Illumina Banks et al. 2017 Laccaria amethystina LaAM-08-1 52.197 1,299 0.841 0.120 42.84 NCBI: PRJNA196025 Illumina Kohler et al. 2015 Laccaria bicolor D101_1 69.814 2,820 1.014 0.107 45.52 JGI: 1019115 Illumina y PacBio - Laccaria bicolor S238N-H82 64.877 665 3.566 0.784 42.48 NCBI: PRJNA29019 Sanger Martin et al. 2008 Laccaria trichodermophora CA15-11 111.822 873 1.052 0.241 46.5 NCBI: PRJNA642675 Illumina y PacBio Ángeles-Argáiz et al. sin publicar Laccaria trichodermophora CA15-75 82.555 28,921 0.127 0.005 46.97 NCBI: PRJNA642675 Illumina Ángeles-Argáiz et al. sin publicar Laccaria trichodermophora CA15-F10 75.974 34,046 0.091 0.004 47.16 NCBI: PRJNA642675 Illumina Ángeles-Argáiz et al. sin publicar Laccaria trichodermophora EF-36 58.859 72 5.316 1.464 46.83 NCBI: PRJNA642675 Illumina y PacBio Ángeles-Argáiz et al. sin publicar Psathyrella aberdarensis ASM4126641v1 60.609 2,303 0.354 0.057 50.25 NCBI: PRJNA516162 IonTorrent - El tamaño del el genoma reportado es posterior a la limpieza de contigs repetidos por Funannotate (ver tabla 2). 2.2 Anotación funcional general Se utilizó el pipeline Funannotate (v1.7.4, Palmer, 2017) sobre los ensambles genómicos para homogeneizar la anotación funcional de todas las muestras. Como primer paso se descartaron contigs/scaffolds repetidos (de longitud 95% similitud nucleotídica y >95% de cobertura con algún otro contig/scaffold) y se enmascararon regiones repetidas del genoma con Tantan (v13, Frith, 2011) (softmasking = repetidos en letras minúsculas). Se sumaron los resultados de tres predictores de modelos génicos: Augustus (v3.3.3, Stanke y Waack, 2003), GlimmerHMM (v3.0.4, Majoros et al. 2004) y SNAP (Korf, 2013). Se usó el proteoma predicho de L. bicolor S238N-H82 (GCF_000143565.1_V1.0_protein.faa, Martin et al. 2008) como evidencia para entrenar al predictor Augustus. Para la anotación funcional se ejecutó InterProScan (v5.41-78.0, Jones et al. 2014), con lo que se detectaron términos IPR y términos GO (Gene Ontology Consortium, 2006). Se usó el servidor online de fungiSMASH (v5.2.0, Blin et al. 2019) para identificar clusters de genes potencialmente implicados en la producción de metabolitos secundarios y el de Phobius (Käll et al. 2007) para dominios transmembranales. Con búsquedas HMMer (v3.3.2, Wheeler y Eddy, 2013) se identificaron enzimas CAZy (dbCAN2 v8.0, Zhang et al. 2018b) y dominios Pfam (v33.1, Bateman et al. 2004), con búsquedas Diamond (v0.9.21, Buchfink et al. 2015) sobre la base de datos UniProt KB (v2020_02, UniProt Consortium 2019) se identificaron proteasas (MEROPS v12.0, Rawlings et al. 2010), también se predijeron proteínas secretadas (SignalP v4.1, Petersen et al. 2011). Se evaluó lo completo de los ensambles mediante Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs (BUSCO, colección: basidiomycota_odb9, Simão et al. 2005). Para detectar similitudes funcionales entre las muestras se realizaron análisis de escalamiento multidimensional con las matrices de anotación IPR y Pfam. 2.3 Análisis filogenómico Para confirmar la monofilia de las muestras de L. trichodermophora, se hicieron un par de análisis filogenómicos: uno basado en una super-matriz y uno en un super-árbol. 128 El primero fue un análisis de máxima verosimilitud mediante RAxML (v8.2.12, Stamatakis, 2014) con Funannotate. El análisis usó como modelo de sustitución de aminoácidos JTT+DCMut,100 inferencias rápidas de bootstrap y una búsqueda exhaustiva de máxima verosimilitud, realizado a partir de un super-alineamiento concatenado con longitud de 79,012 aminoácidos e integrado por 148 marcadores BUSCO presentes como copia única en todas las muestras. El segundo fue un super- árbol resultante del consenso de 895 árboles de genes ortólogos. Cada árbol de genes fue inferido por máxima verosimilitud de FastTree (Price et al. 2010) con OrthoFinder (v2.5.2, Emms y Kelly, 2015; 2019), y los alineamientos realizados con MAFFT (Katoh et al. 2013). Al menos 85.7% de las especies analizadas contribuyeron con un gene a los grupos de ortólogos usados. El árbol de especies se consensó con STAG (Emms y Kelly, 2018) y se enraizó con STRIDE basado en los eventos de duplicación genética (Emms y Kelly, 2017). Los árboles resultantes se editaron con FigTree (v1.4.3, Rambaut, 2012). 2.4 Cálculo del pan-genoma El pan-genoma de L. trichodermophora estuvo integrado por la suma de todos los grupos de modelos génicos ortólogos de todos los genomas de la especie, el genoma core se integró solo por los ortólogos con (al menos) una copia en cada cepa. La homología entre los modelos génicos se detectó mediante OrthoFinder (v2.5.2, Emms y Kelly, 2015; 2019) sobre los proteomas predichos por Funannotate. OrthoFinder generó grupos de genes ortólogos mediante MCL (Dongen, 2000) a partir de grafos, con genes como nodos conectados por el score normalizado de los mejores hits recíprocos de BlastP/Diamond (v0.9.21, Buchfink et al. 2015). Posteriormente, OrthoFinder hizo árboles para cada grupo de genes, con los que construye un árbol de especies y con base en esa información filogenética corrige los propios grupos de ortologos (v2.5.2, Emms y Kelly, 2019). Para asegurar una mejor asignación de ortólogos se incluyeron en el análisis las muestras de la Familia Psathyrellaceae como grupo externo (Tabla 1). 129 2.5 Anotación de enzimas CAZy Las enzimas CAZy relajan la pared celular de la raíz durante la simbiosis permitiendo la colonización intercelular (Veneault-Fourrey et al. 2014). Para profundizar en el análisis de este grupo genético/funcional se partió de la predicción de modelos génicos realizada con Funannotate para posteriormente detectar enzimas CAZy con dbCAN2 (v2.0.11, Zhang et al. 2018b). Se utilizaron los resultados del método de búsqueda HMMer (dbCAN-HMMdb-V8), ya que se ha considerado el más robusto de los tres (Stewart et al. 2019). 2.6 Predicción de péptidos efectores Las proteínas efectoras secretadas por los hongos facilitan la infección de los tejidos vegetales. Para su predicción, el proteoma predicho con Funannotate se tamizó con los programas SignalP (v5.0b, Armenteros et al. 2019), EffectorP (v2.0, Sperschneider et al. 2018a) y ApoplastP (v1.0, Sperschneider et al. 2018b). SignalP-5 es un programa basado en redes neurales destinado a la predicción de proteínas secretadas, con el cual se detectó la señal de secreción, se cortó y se discriminó de los motivos transmembranales y las proteínas de localización mitocondrial o de retículo endoplasmático (Armenteros et al. 2019). A partir del secretoma, se predijeron los péptidos potencialmente efectores con EffectorP, un programa basado en “Machine Learning”, entrenado con péptidos efectores de hongos patógenos y simbióticos, que toma en cuenta la carga neta de la proteína, longitud de su cadena, su contenido de cisteína y la evidencia de selección diversificante (Sperschneider et al. 2018a). A su vez, a partir de estos resultados, se realizó un tercer filtrado con ApoplastP, que selecciona los péptidos con una potencial localización en el apoplasto. Para lo que también, mediante “Machine Learning”, busca secuencias enriquecidas con ácido glutámico y en aminoácidos ácidos pequeños y cargados (Sperschneider et al. 2018b). Los péptidos obtenidos después de los tres pasos de filtrado fueron agrupados por su ortología con OrthoFinder, como se describe en la sección 2.4. 130 3 Resultados y discusión 3.1 Comparación funcional general Se asignaron anotaciones funcionales o dominios proteicos conocidos a más de la mitad de las proteínas predichas de las muestras de L. trichodermophora ((promedio ± desviación estandar) µ = 59.85 ± 4.62 %), aunque para las otras muestras del Género Laccaria (µ = 66.86 ± 2.84 %) y para las de la Familia Psathyrellace (µ = 72.50 ± 3.67 %) el porcentaje de proteínas anotadas fue mayor (Tabla 2). Al comparar la diversidad de funciones representadas por dominios Pfam o IPRs, se observó que las cepas ectomicorrízicas, o sea, todas del Género Laccaria, se agrupan entre sí, mientras que las cepas saprobias, aunque de distintos Géneros, formaron un grupo independiente, sin embargo los altos valores de tensión de ambos análisis indican que la ordenación fue arbitraria, ya que este valor indica el grado en que el análisis representa las diferencias entre los datos (Figura 1). 3.2 Posición filogenética Los análisis filogenómicos apoyan que las cuatro cepas de L. trichodermophora, formaron un grupo monofilético bien soportado (soporte bootstrap del análisis de super- matriz =100, soporte de las ramas del análisis de super-árbol = 1) en ambos análisis, a pesar de las diferencias genómicas en tamaño y contenido en los genomas . El Género Laccaria (100/1) y la especie L. bicolor (98/0.997) también aparecen como monofiléticos. Lo mismo ocurrió con todos los Géneros o especies para los que se incluyo más de una muestra en el análisis (Figura 2). La especie hermana de L. trichodermophora fue L. bicolor (100/1), mientras que L. amethystina fue la especie más externa dentro de Laccaria, lo que concuerda con previos análisis morfo- anatómicos (Osmundson et al. 2005) y filogenéticos multi-loci (Wilson et al. 2017).
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 1 3 2 Tabla 2. Principales resultados de la anotación funcional de los ensambles genómicos. Especie Cepa Completitud del ensamble (%) Contigs repetidos Repetidos enmascarados Modelos génicos Proteinas Proteinas anotadas (%) tRNAs Pfam UniProt InterProScan GO CAZymes MEROPS Sec. Met. Secretados Coprinellus angulatus CBS 144469 86.8 (D:46.0) 0; 0 bp (0.00%) 6,800,894 bp (7.27%) 25,190 24,648 70.02 542 18,318 741 43,694 10,139 1,062 603 21 1,894 Coprinellus angulatus CBS 175.51 86.3 (D:2.6) 0; 0 bp (0.00%) 6,369,509 bp (10.74%) 14,429 14,043 69.73 386 10,912 465 25,847 5,905 606 345 13 892 Coprinellus micaceus FP101781_FA13 80.9 (D:23.4) 0; 0 bp (0.00%) 8,573,706 bp (11.08%) 18,349 17,881 69.10 468 13,038 611 32,205 7,419 787 459 20 956 Coprinopsis cinerea okayama7-130 91.1 (D:0.5) 0; 0 bp (0.00%) 3,315,551 bp (9.16%) 11,687 11,419 74.69 268 9,990 451 22,746 5,326 650 312 16 912 Coprinopsis marcescibilis CBS 121175 91.4 (D:0.7) 0; 0 bp (0.00%) 993,305 bp (2.55%) 11,696 11,459 77.06 237 10,349 399 23,477 5,504 627 333 17 842 Coprinopsis strossmayeri 76940 79.4 (D:0.4) 0; 0 bp (0.00%) 2,417,872 bp (7.26%) 9,585 9,350 77.19 235 8,395 415 20,164 4,790 455 280 15 530 Laccaria amethystina LaAM-08-1 93.3 (D:1.5) 0; 0 bp (0.00%) 6,190,404 bp (11.86%) 12,635 12,414 69.99 221 10,120 411 23,696 5,428 403 301 19 373 Laccaria bicolor D101_1 93.8 (D:7.3) 100; 214,808 bp (0.31%) 3,540,422 bp (5.07%) 18,390 17,997 64.47 397 13,102 501 29,865 6,953 530 371 20 203 Laccaria bicolor S238N-H82 88.8 (D:2.4) 0; 0 bp (0.00%) 8,480,540 bp (13.07%) 14,655 14,319 66.11 339 10,794 412 25,405 5,731 427 344 21 165 Laccaria trichodermophora CA15-11 86.1 (D:34.6) 3; 79,604 bp (0.07%) 7,141,517 bp (6.39%) 25,500 24,885 63.11 609 17,121 670 40,199 9,102 635 541 39 141 Laccaria trichodermophora CA15-75 49.7 (D:12.1) 125; 85,163 bp (0.10%) 3,871,341 bp (4.69%) 22,024 21,508 56.30 532 10,218 773 27,447 6,934 382 376 15 75 Laccaria trichodermophora CA15-F10 53.3 (D:6.0) 101; 68,978 bp (0.09%) 3,323,251 bp (4.37%) 24,980 24,505 55.49 484 10,824 808 30,365 7,899 359 431 22 43 Laccaria trichodermophora EF-36 81.9 (D:2.0) 5; 203,654 bp (0.34%) 3,574,890 bp (6.07%) 14,410 14,083 64.51 330 9,932 427 23,748 5,446 379 308 17 137 Psathyrella aberdarensis ASM4126641v1 78 (D:1.9) 0; 0 bp (0.00%) 5,160,575 bp (8.51%) 14,350 14,108 69.73 250 10,056 477 24,763 5,724 604 351 21 99 El porcentaje de completitud del ensamble se detectó mediante BUSCO: D = porcentaje de BUSCOs duplicados. Figura 1. Análisis de escalamiento multidimensional de (A) dominios IPR y (B) dominios Pfam. Los círculos rojos señalan las muestras del Género Laccaria, los círculos verdes señalan las muestras de la Familia Psathyrellaceae. El análisis fue resultado de Funannotate. 
 133 Ectomicorrízico Saprobio A B Figura 2. Análisis filogenómicos. (A) Análisis de máxima verosimilitud (RAxML) con 148 genes BUSCO en alineamiento concatenado, con modelo de sustitución de aminoácidos JTT+DCMut ,100 inferencias rápidas de bootstrap y una búsqueda exhaustiva de ML. (B) Árbol consenso de 895 árboles de genes ortólogos de máxima verosimilitud (FastTree), consensado con STAG y enraizado con STRIDE. Los valores de soporte indican el porcentaje de árboles de genes que soportan la rama. 134 0.04 Coprinopsis_cinerea_okayama7-130 Laccaria_trichodermophora_CA15-11 Laccaria_bicolor_D101-1 Psathyrella_aberdarensis_ASM4126641v1 Laccaria_bicolor_S238N-H82 Coprinellus_angulatus_CBS-144469 Laccaria_amethystina_LaAM-08-1 Coprinellus_angulatus_CBS-175.51 Laccaria_trichodermophora_EF-36 Laccaria_trichodermophora_CA15-F10 Coprinellus_micaceus_FP101781-FA13 Laccaria_trichodermophora_CA15-75 Coprinopsis_strossmayeri_76940 Coprinopsis_marcescibilis_CBS-121175 100 100 98 96 100 92 100 100 100 100 100 A 0.05 Coprinellus_micaceus_FP101781_FA13 Coprinellus_angulatus_CBS_144469 Coprinopsis_strossmayeri_76940 Laccaria_trichodermophora_CA15-F10 Psathyrella_aberdarensis_ASM412664v1 Coprinopsis_marcescibilis_CBS_121175 Laccaria_amethystina_LaAM-08-1 Laccaria_trichodermophora_CA15-11 Laccaria_trichodermophora_CA15-75 Laccaria_trichodermophora_EF-36 Coprinellus_angulatus_CBS_175.51 Laccaria_bicolor_S238N-H82 Coprinopsis_cinerea_okayama7-130 Laccaria_bicolor_D101_1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0.997 B 3.3 El pan-genoma de Laccaria trichodermophora Las distintas cepas de L. trichodermophora acumularon entre 14,083 (EF-36) y 24,885 (CA15-11) modelos génicos (Tabla 3). Los 84,981 modelos génicos totales del pan-genoma de L. trichodermophora se integraron en 12,513 grupos de ortólogos. El genoma core de la especie se integró por 6,756 (54%) grupos de genes ortólogos representados por una o varias copias. En los genomas de cada cepa, del 54% al 76% fueron grupos de ortólogos core, lo que en genes representa del 71% al 82% del genoma (Tabla 3, Figura 3B). El genoma de la cepa CA15-F10 presentó el mayor número de grupos de ortólogos exclusivos (717), mientras que la cepa EF-36 presentó el menor (93) (Figura 3A); estas mismas cepas presentaron el mayor y menor número de genes no agrupados en ortólogos respectivamente (1,279 y 193, Tabla 3). En bioensayos de inoculación de las cuatro cepas en las raíces de su hospedero, CA15- F10 fue la que presentó mayor infectividad (Flores-Almaraz, 2020). La relación entre la presencia y eventual expresión de los genes exclusivos de CA15-F10 y su capacidad diferencial de colonización deberá ser comprobada. El conjunto de siete genomas del Género Laccaria sumaron 132,594 modelos génicos agrupados en 13,733 ortólogos. Se detectaron solo 5,548 ortólogos compartidos por todas las muestras del Género (Figura 3C). Estos resultados hacen 135 Tabla 3. Número de grupos de ortólogos y genes en distintos estratos pan-genómicos de Laccaria trichodermophora. Cepas Genes Genes en grupos de ortólogos Genes no agrupados # (%) Grupos de ortólogos # (% del pan-genoma) Grupos de ortólogos del core- genoma # (%) Genes del core- genoma # (%) L. trichodermophora CA15-11 24,885 24,208 (97.28) 677 (2.72) 9,859 (78.79) 6,756 (68.53) 19,303 (77.57) L. trichodermophora CA15-75 21,508 20,591 (95.72) 917 (4.26) 9,796 (78.29) 6,756 (68.97) 16,250 (75.55) L. trichodermophora CA15-F10 24,505 23,226 (94.78) 1,279 (5.22) 10,560 (84.39) 6,756 (63.98) 17,439 (71.17) L. trichodermophora EF-36 14,083 13,890 (98.63) 193 (1.37) 8,882 (70.98) 6,756 (76.06) 11,480 (81.52) Pan-genoma 84,981 81,915 (96.39) 3,066 (3.61) 12,513 (100) 6,756 (53.99) - Core-genoma 64,472 64,472 (75.87) - 6,756 (53.99) 6,756 (100) 64,472 (75.87) evidente no sólo la alta variabilidad genómica a nivel de tamaño y contenido génico de la especie L. trichodermophora, si no también para L. bicolor, que a pesar de solo haber incluido dos muestras en este análisis su diversidad genómica es equiparable a la detectada para L. trichodermophora. Este resultado no es sorprendente, pues ya se contaba con evidencia de la disparidad genómica en genes particulares entre cepas de L. bicolor (Plett et al. 2012) y la inminente publicación del proyecto The Laccaria Pan- Genome por parte de JGI/MycoCosm dará más claridad a este fenómeno. Figura 3. El pan-genoma de Laccaria trichodermophora. Los diagramas de Venn representan la intersección de los grupos de genes ortólogos presentes en (A) los cuatro genomas de L. trichodermophora, o (C) los siete genomas del Género Laccaria generados por OrthoFinder. (B) Gráficos de pastel que representan la cantidad de genes por cepa compartidos por todas las muestras (Core) exclusivos de una solo cepa (Exclusivos) o compartidas por varias, pero no todas las cepas (Accesorios).
 136 5926 15 283 80 250 58 492 43 102 66 160 48 147 65 149 133 104 14 73 20 51 8 44 16 35 13 26 18 20 17 43 75 108 29 154 23 68 2277 29 65 13 66 48 62 29 115 167 106 8 51 20 14 12 42 31 35 23 41 64 16 36 89 455 112 10 57 5 26 8 31 14 25 4 14 18 10 7 26 44 23 2 18 4 10 5 8 10 9 5 10 14 6 11 17 85 54 4 44 15 25 6 32 27 15 11 23 51 24 32 58 249 42 11 37 44 18 22 36 98 21 70 57 526 39 224 165 5548 L.a.LaAM−08−1 L.b.D101_1 L.b.S238N−H82 L.t.CA15−11 L.t.CA15−75 L.t.CA15−F10 L.t.EF−36 93 717 211 462 141 762 268 307 205 397 787 324 421 662 6756 L.t.CA15−11 L.t.CA15−75 L.t.CA15−F10 L.t.EF−36 A B 82% 16% 2% 78% 18% 5% 76% 17% 8% 71% 19% 10% L.t.CA15-11 L.t.CA15-75 L.t.CA15-F10 L.t.EF.36 Core Accessory Exclusives C En microorganismos bacterianos la relación entre los genes del genoma core con respecto al pan-genoma de la especie puede ser tan baja como del 5%, y sus fenotipos asociados suelen presentar características contrastantes, particularmente relacionadas a la interacción con sus hospederos, ya sea de manera simbiótica mutualista o detrimentaria (González et al. 2019; McInerney et al. 2017; Rouli et al. 2015). En microorganismos eucariontes las cifras no son tan extremas, hongos modelo han presentado genomas core de entre el 80 y 90% (McCarthy y Fitzpatrick, 2019). Las relaciones entre core y pan-genomas de microorganismos eucarióticos pueden estar influenciadas por el uso de ensambles genómicos incompletos, lo que puede afectar ambos estratos genómicos. Sin embargo, es preciso considerar que gran parte de las regiones descubiertas por los ensambles genómicos son regiones teloméricas. En hongos asociados a plantas estas regiones típicamente están pobladas por elementos repetidos, que a su vez promueven el enriquecimiento de genes relacionados con la interacción simbiótica (Möller y Stukenbrock, 2017). En muchos casos este tipo de genes teloméricos son más bien pertenecientes al estrato accesorio de los pan- genomas de las especies, por lo que es posible considerar que los efectos de la calidad de los ensambles sobre la acumulación de genes en los pan-genomas eucariontes pudiera afectar al genoma accesorio en mayor medida que al core. Este fenómeno fue reportado para cepas de Leptosphaeria maculans codificantes para genes accesorios de interacción con su hospedero vegetal, pero localizados en gaps teloméricos del ensamble de referencia (Plissonneau et al. 2016). Con el uso de seis ensambles “telómero a telómero” del fitopatógeno Zymoseptoria tritici se detectaron cromosomas accesorios completos, se destacó la relevancia del genoma accesorio en la interacción con el hospedero y un genoma core de cerca del 60% (Plissonneau et al. 2018). Esta relación se mantuvo al incrementar el muestreo a 19 genomas de alta calidad procedentes de seis continentes (Badet et al. 2020) o incluir una colección global mayor a cien genomas (Plissonneau et al. 2018). Se encontraron 549 grupos de ortólogos del Género Laccaria ausentes en L. trichodermophora, 20 de ellos fueron anotados a genes conocidos, pero cerca de la mitad tuvieron anotación a dominios funcionales de las bases de datos PFam (310, 56%), InterProScan (390, 71%), términos GO (289, 53%) o las tres (246, 45%). Solo 10 137 grupos de ortólogos tuvieron anotación a enzimas CAZy, 17 a proteasas MEROPS y 9 con señal de secreción, aunque de estas ninguna proteasa y solo una enzima CAZy (glucanasa GH152) presentó señal de secreción. Además, 100 grupos de ortólogos presentaron dominios transmembranales, de estos solo dos se predijeron como secretados, pero cerca de la mitad tuvieron anotaciones PFam (52), InterProScan (65), términos GO (43) o los tres (39). 3.4 El poder degradador de pared celular vegetal de Laccaria Se detectaron 259 enzimas CAZy en el genoma de L. amethystina, 324 y 295 en los de L. bicolor (D101_1 y S238N-H82 respectivamente), mientras que las cepas de L. trichodermophora promediaron 310 ± 81 enzimas CAZy (CA15-11: 428, CA15-75: 274, CA15-F10: 289 y EF-36: 248). El Género Laccaria promedió 302 ± 61 enzimas CAZy mientras que las especies saprobias de la Familia Psathyrellaceae acumularon 521 ± 159. Como se esperaba, fueron varias las enzimas CAZy presentes en Psathyrellaceae y ausentes en Laccaria. De las 203 funciones CAZy anotadas en total (considerando a los genes que presentaron dos motivos funcionales como distintos a los de un solo motivo) Laccaria solo presentó 116 (57%) y Psathyrellaceae 191 (94%). Este patrón se relaciona con el estilo de nutrición de estos dos linajes cercanamente emparentados y es una evidencia más que sostiene la hipótesis de la pérdida de enzimas de actividad sobre pared celular vegetal como una de las principales características genéticas/ fisiológicas que definen a la simbiosis ectomicorrízica en Basidiomycota (Kohler et al. 2015; Wolfe et al. 2012). Sin embargo, también se encontraron algunas enzimas CAZy exclusivas en Laccaria (Figura 4), estas se discuten a continuación. Figura 4. Heatmap de la comparación del contenido de enzimas CAZy (filas) en los genomas de representantes del Género Laccaria y representantes de la Familia Psathyrellaceae (columnas). El color blanco representa la ausencia de la sub-familia, los colores fríos representan un número bajo de genes de cada sub-familia mientras los colores cálidos representan altos números de genes. El dendograma agrupa los genes por su ocupación en los genomas y similitud en número de copias. Las barras superiores señalan el estilo trófico de los hongos analizados: morados = ectomicorrízicos (todos del Género Laccaria); anaranjados = saprobios (todos de la Familia Psathyrellaceae). 
 138 Saprobios Ectomicorrízicos LAY99Z LHINSV Sisualeplaqe “d €l VW 18ZL0LdW snaseow 9 LS'S21 seo s n j e j n b u e “9 6 9 y v y ! seo smenbue *9 GL1 131 Sgo s i i q i u s e s e w 9 0 + y 6 9 / 1 J 9 S Á e u s s o n s “ 9 0€|'¿euweAeyo ealaulo o L'80'Nve7 eunsÁyjewe 7] LLOLO 10JO91q 7 Z8H'N8€ZS J0/091q 7] LIS WO e l o y d o u e p o y o l y "71 G/'S voy e l o y d o u w l e p o y a n y *7 OL4'SL WO e l o y d o u e p o y a n y “71 9€ 3 e o y d o u e p o y a l “71 N 00 - d OQ — : Á Z W O seulzuy 
 139 3.4.1 Funciones de Laccaria no detectadas en Psathyrellaceae Los genes CAZy exclusivos de Laccaria, no detectados en Psathyrellaceae fueron AA3_4, CE8, GH12, GH13_31, GH30, GH76 y GH95, así como los dímeros AA1_1+AA1_1 , GT20+GT20 , GH13_1+GH13_1 , GH13_8+GH13_8 y GH5_15+GH5_15. Todos los dímeros fueron detectados como monómeros en casi todas las muestras de Psathyrellaceae (excepto GH5_15). La función AA3_4 solo estuvo presente en L. amethystina, por el contrario GH30 no se encontró en esta especie pero sí en varias cepas de las otras especies de Laccaria. Genes de CE8 se detectaron en todas las especies aunque no en todas las cepas. Genes de GH12 y GH95 fueron detectados en todas las especies pero no en todas las cepas de L. trichodermophora. GH13_31 fue exclusiva de la cepa CA15-11 de L. trichodermophora, aunque varios miembros de la familia GH13, asignados a otras sub-familias fueron detectados en Laccaria y Psathyrellaceae. Finalmente GH76 fue la única función detectada para todas las cepas de Laccaria y ninguna de Psathyrellaceae (Figura 4). Las GH76 son endo-α-mananasas con capacidad de utilizar manano lineal, pero tienen poca actividad en manano ramificado. Este tipo de enzimas están involucradas en la reticulación de lipo-proteínas de la pared celular fúngica actuando como transglicosilasas y manosiltransferasas (CAZypedia Consortium, 2018). Son comunes en los genomas de patógenos necrotróficos, pero más bien raras en los biotróficos (Zhao et al. 2014). Cepas de levaduras patógenas de plantas deficientes en estas funciones son altamente susceptibles a la respuesta inmune vegetal mediada por osmotinas PR-5 (Ibeas et al. 2000). Dada la ausencia de esta función en todos los saprobios analizados, y su presencia en todos los ectomicorrízicos, se puede especular que este es uno de los “genes simbióticos” de Laccaria, ya que la enzima está relacionada con el “camuflaje molecular”, al enmascarar ramas externas de la quitina ligadas a mananos y d β-glucanos propios de la pared celular fúngica, evadiendo así su detección y atenuando la respuesta inmune de la planta (Gow et al. 2017). Lo que a su vez permite el desarrollo de la simbiosis ectomicorrízica (Plett y Martin 2018). En L. amethystina fue detectada la función AA3_4 pero no se detectó en sus congéneres, ni en las especies de Psathyrellaceae. Las enzimas de la subfamilia 140 AA3_4 son piranosa oxidasas (POX), que participan en facilitar la degradación de compuestos lignocelulósicos. Típicamente se expresan en conjunto con peroxidasas (AA2) y monooxigenasas líticas de polisacáridos (AA9), en las puntas de las raíces de ectomicorrizadas probablemente modificando la pared celular de la planta durante la colonización del espacio apoplásico (Kohler et al. 2015; Veneault-Fourrey et al. 2014). Estas enzimas son parte del regulón estable independiente a la identidad del hospedero (Plett et al. 2015). A diferencia de otras AA3, las POX (AA3_4) están asociadas a vesículas o membranas hifales periplasmáticas, y usan metales y quinonas, que son catalíticamente más eficientes que el oxígeno, como aceptores de iones (Ludwig et al. 2018); esto le da a los hongos una actividad fuerte y generalista sobre sustratos lignificados justo sobre la superficie de la hifa. Por el contrario, L. amethystina no presentó la enzimas GH30 (a nivel de familia enzimática), un grupo xilanasas fúngicas poco específicas, activas tanto en glucuronoxilanos como en arabinoxilanos, que liberan xilosa o xilobiosa de las decoraciones de los xilooligosacaridos de la hemicelulosa y pueden tener actividad transglicosilasa (Espinoza y Eyzaguirre, 2018; Katsimpouras et al. 2019). Estas enzimas no se detectaron en las muestras de Psathyrellaceae, pero sí en las otras especies de Laccaria. Enzimas similares, clasificadas en la subfamilia GH30_3 fueron detectadas en todas las especies de Laccaria, incluyendo L. amethystina mientras que GH30_7 solo se detectó en las muestras de Psathyrellaceae. Es difícil interpretar estos resultados, aunque este tipo de enzimas, por actuar sobre la hemicelulosa de la pared primaria, podrían tener funciones simbióticas en la colonización o la organogénezis de la ectomicorriza. Por otra parte, podrían tener alguna participación en la modulación de las comunidades microbianas en la rizósfera mediante la liberación de carbohidratos solubles probióticos. Las CE8, GH12 y GH95 ausentes en los saprobios en Pasthyrellaceae, fueron detectadas en todas las especies de Laccaria, aunque no en todas las muestras. Las enzimas CAZy clasificadas en la familia CE8 son metílesterasas de pectina, la cual es el principal componente de la lámina media, y también se encuentra en la pared celular primaria en plantas. Recientemente, se detectó la expresión de CE8 en micelio de L. 141 bicolor S238N-H82 bajo condiciones de agotamiento de nitrógeno, por lo que se asume que esta enzima participa activamente en la obtención de nitrógeno de la materia orgánica del suelo (Nicolás et al. 2019). Por otra parte, en los transcriptomas de hongos formadores de micorriza ericoide todas o casi todas sus CE8 fueron sobre expresadas durante la simbiosis (Martino et al. 2018). Las enzimas de actividad sobre pectina sobre expresadas en la simbiosis de L. bicolor S238N-H82 y Populus trichocarpa fueron clasificadas en la familia GH28, no en CE8 (Veneault-Fourrey et al. 2014). Sin embargo, la actividad de CE8 anclada a la pared fúngica, en conjunto con expansinas, se ha asociado a la penetración de la hifa en el espacio apoplástico, a pesar de que su expresión es disminuida en la ectomicorriza (Vincent et al. 2012). En este trabajo se detectó la presencia de metílesterasas de la familia CE8 en el genoma de la cepa S238N-H82 de L. bicolor, pero no en el de la cepa D101-1 de la misma especie, de manera similar, solo dos cepas de L. trichodermophora (CA15-75 y EF-36) codificaron esta enzima en sus genomas, mientras que la cepa L. amethystina LaAM-08-1 presentó dos genes. El número y diversidad de estas enzimas podría estar relacionado con la capacidad diferencial de colonización de la raíz del hospedero. Las GH95, son α-L-fucosidasas y α-L-galactosidasas de acción sobre oligosacáridos y arabinoxilano, componentes de la hemicelulosa. Al igual que CE8, GH95, fueron sobre-expresadas en las micorrizas ericoides de Oidiodendron maius (Martino et al. 2018) y al igual que CE8, están ausentes en los genomas de hongos endófitos como Xylona heveae (Gazis et al. 2016) aunque esta enzima no se destaca en los transcriptomas o secretomas de L. bicolor en investigaciones previas. Las GH12 son endo-β-1,4-glucanasas capaces de degradar celulosa y son una de las pocas familias de enzimas degradadoras de celulosa remanentes en Laccaria. Estas enzimas también presentan actividad hidrolasa sobre xiloglucano. Su sobre expresión ha sido detectada en fases tempranas de la colonización de la raíz (Veneault-Fourrey et al. 2014). Se ha observado el relajamiento de la pared celular vegetal por este tipo de enzimas, propias de hongos Ascomycota, en ensayos experimentales (Yuan, 2001). Se ha detectado que sustituciones particulares en la secuencia de aminoácidos del sitio catalítico de las endoglucanasas fúngicas de la 142 familia GH12 propician modificaciones estructurales, que a su vez transforman xiloglucanasas específicas en glucanasas más generalistas (Damásio et al. 2014), por lo que es posible que el análisis evolutivo sobre secuencias y dominios estructurales permita hipotetizar el componente de la pared celular vegetal que es sustrato de las GH12 de Laccaria y así aproximarse al entendimiento de su participación en la simbiosis o en la explotación de la materia orgánica en el suelo. 3.4.2 Las funciones CAZy más numerosas en Laccaria En los genomas de Laccaria, las 10 funciones CAZy más numerosas fueron CE10, AA3_2, GH18, GH47, GH16, GH5_9, GH79, GT2_Chitin_synth_2, GT90 y AA1_1. Este patrón fue constante al interior de las especies y cepas. En el genoma de L. amethystina se detectó un alto número de enzimas CAZy de las actividades CE10 (14 genes), GH16 (10), GH5_9 (10) y AA7 (10). En los genomas de L. bicolor, las enzimas CAZy más numerosas fueron CE10 (19 y 17 genes en las cepas D101_1 y S238N-H82 respectivamente), GH16 (13 y 12), GH18 (12 y 11), GH5_9 (10 y 10). En los genomas de L. trichodermophora las enzimas CAZy más numerosas fueron CE10 (24, 11, 15 y 15 genes en las cepas CA15-11, CA15-75, CA15-F10 y EF-36 respectivamente), AA3_2 (18, 17, 14, 10), GH47 (15, 14, 13, 12) y GH18 (16, 13, 12,10). La enzima CAZy más numerosa en todas las especies y cepas de Laccaria fue CE10, aunque Psathyrellaceae presentó contenidos aún mayores (16 ± 4 vs 23 ± 6). CE10 pertenece a la superfamilia de las esterasas de carbohidratos, pero particularmente CE10 es una acetilesterasa. Esta familia fue retirada de la base de datos CAZy dado que la gran mayoría de sus integrantes presentan actividad sobre sustratos distintos a carbohidratos, como ésteres y gliceroles decorativos (CAZypedia Consortium, 2018). Por ejemplo, una CE10 de Aspergillus presenta actividad sobre ésteres de vinilo de cadena corta (derivados de alcohol) y tricilgliceroles (Bourne et al. 2004), mientras que otra presenta actividad sobre propilenglicol derivado de ácidos grasos (Oleas et al. 2017). Son raros los hongos fitopatógenos que codifican altos contenidos de acetilesterasa de la familia CE10, como Macrophomina phaseolina (32 genes, Islam et al. 2012), Corynespora cassiicola (92 genes, Looi et al. 2017) o Colletotrichum truncatum (87 genes, Rao y Nandineni, 2017) por lo que se les 143 considera con estilos infectivos poco habituales. Las especies hemibiotróficas de Oomycetes codifican mayor cantidad de acetilesterasa CE10 que las biotróficas o necrotróficas (Vries y Vries, 2020), y no presentan un patrón general en cuanto a su transcripción en micelio de vida libre o micelio infeccioso, por lo que se infiere que las distintas especies usan sus acetilesterasas durante su actividad saprobia o patógena de manera diferencial (Vries y Vries, 2020). Así mismo, la transcripción de estos genes por parte de Oomycetes asociados a plantas es más variable (de una especie a otra) que las patógenas de animales, aunque estadísticamente similares (Vries y Vries, 2020). Ya que las acetilesterasas de la familia CE10 no fueron expresadas por hongos filamentosos cultivados en presencia de glucosa (a pesar de codificarlos en sus genomas), es posible que estas enzimas desempeñen un papel en la conversión de biomasa relacionado con la modificación de la lignina (Arntzen et al. 2020). En Laccaria, algunos de estos genes podrían estar participando en la modificación de la pared vegetal en la colonización y organogénesis en conjunto con LPMOs (AA9), mientras que algunos otros en la explotación de la materia orgánica del suelo. CE10 es una familia CAZy poco estudiada y con características enzimáticas que la hacen interesante para su estudio desde la perspectiva de las simbiosis fúngicas, sin embargo ha pasado desapercibida. La segunda subfamilia CAZy mejor representada en los genomas de Laccaria es la actividad auxiliar AA3_2, aunque en comparación con sus parientes saprobios está reducida a un tercio (Laccaria = 12 ± 4, Psathyrellaceae 34 ± 11 genes); cabe destacar que homodimeros de este dominio fueron detectados en L. trichodermophora y no en sus congéneres. De manera general, las enzimas CAZy con actividades auxiliares son familias de proteínas catalíticas que están implicadas en la degradación de las paredes celulares vegetales gracias a su capacidad de ayudar a otras enzimas (GH, PL y CE) a acceder a los carbohidratos que la componen. Particularmente, en AA3_2 se encuentran oxidorreductasas de alcohol arílico (AAO), glucosa oxidasas (GOX) o glucosa deshidrogenasas (GDH) y piranosa deshidrogenasas (PDH). Las AAO son secretadas por hongos Basidiomycetes, particularmente saprobios de pudrición blanca y descomponedores del mantillo, ya que están involucradas en la degradación de la lignina. Los principales sustratos de las AAO son alcoholes bencílicos secretados del 144 metabolismo secundario, o alcoholes relacionados que se acumulan durante la degradación de la lignina. Durante la reacción de oxidación se forma peróxido de hidrógeno, esencial para la actividad de las peroxidasas degradadoras de lignina. Por su parte GOX y GDH catalizan la oxidación de β-D-glucosa hacia D-glucano-1,5- lactona selectivamente. Ambas enzimas son estructuralmente similares y difíciles de discriminar por su secuencia. Las GOX reducen el oxígeno a peróxido, mientras que las GDH prefieren quinonas o fenoxi-radicales sobre el oxígeno, como aceptores de iones (CAZypedia Consortium, 2018). A estas enzimas fúngicas se les ha atribuido la neutralización de la actividad de la laccasa de la planta durante la colonización de los tejidos vegetales por parte de hongos patógenos (Sygmund et al. 2011). Simultáneamente, PDHs catalizan oxidaciones y di-oxidaciones, y se caracterizan por su alta promiscuidad en cuanto a sustratos mono-, oligo- y polisacáridos. Se detectó su sobre expresión en el micelio de Laccaria cultivado en condiciones pobres de nitrógeno, por lo que estas funciones podrían ser parte de la oxidación de compuestos recalcitrantes del suelo, en la búsqueda de nitrógeno que se les ha atribuido a los HEM (Nicolás et al. 2019). La familia GH18 agrupa glicosil hidrolasas con actividades catalíticas tanto quitinasas como endo-β-N-acetílglucosaminidasas. Pueden ser endo-quitinasas no procesivas o endo/ecto procesivas, que producen quitobiosa, o productos más largos, pero no actúan sobre trímeros o tetrámeros (Davies et al. 2013). Así que estas enzimas CAZy participan en la síntesis, degradación y remodelación de la propia pared hifal e incluso podrían participar en el antagonismo y depredación que Laccaria ejerce en contra de otros hongos micotróficos como especies de Trichoderma (Werner et al. 2002). Otra glicosil hidrolasa, esta vez en la familia GH47, se detectó entre las enzimas CAZy más numerosas del Género. Son exo-α-1,2-mannosidasas de clase 1, localizadas en retículo endoplásmico y dictiosoma participantes en la maduración de las glicoproteínas, por lo que se consideran de metabolismo central (Williams y Williams 2015). 145 Las GHs miembros de la familia 16 tienen actividad en los enlaces glicosídicos β-1,4 o β-1,3 en varios glucanos y galactanos, algunos con actividad transglicosilasa como xiloglicosil transferasas o enzimas de reticulación de quitina/beta-glucano (CAZypedia Consortium, 2018). La abundancia de estos genes en los genomas de Laccaria los hacen candidatos a una profunda exploración. El gran tamaño y diversidad funcional de la familia GH16 hace difícil su estudio, aunque recientemente fue propuesta una clasificación robusta y más detallada (Viborg et al. 2019). En L. bicolor, las numerosas GH16 se consideran implicadas en la remodelación, tanto de la pared vegetal como de la pared fúngica (particularmente sobre β-glucanos), y se detectó su sobre expresión en el micelio de vida libre (Veneault-Fourrey et al. 2014). Así mismo, estas enzimas podrían ser responsables de características nutracéuticas y/o inmunopotenciadoras de los esporomas de este Género de hongos comestibles silvestres. Las especies de Laccaria codificaron 10 ± 3 genes de GH5_9, mientras que solo 2 o 3 genes para las otras funciones de la familia GH5 (GH5_12, GH5_15, GH5_30 o GH5_50). A diferencia de muchas CAZy, el contenido de GH5_9 en Laccaria no es muy distinto al de Psathyrellaceae (12 ± 3), aunque la diversidad funcional de GH5 en Psathyrellaceae asciende a 16 sub-familias. GH5 es una de las familias de glicosil hidrolasas más grandes, son también conocidas como la familia celulasa A y contiene enzimas de actividad sobre pared vegetal y fúngica. GH5_9 son enzimas modificadoras de la pared celular fúngica. Esta subfamilia sólo contiene enzimas fúngicas secretadas o ancladas a la membrana (CAZypedia Consortium, 2018). En ascomycetes han sido identificadas como exo-β-1,3-glucanasas modificadoras de pared celular fúngica (Koseki et al. 2018) y productoras de material de la pared (Aspeborg et al. 2012). Sin embargo, a estas enzimas se les ha atribuido participación en la colonización de tejidos vegetales por parte de hongos endófitos (Bhatnagar et al. 2018; Ehsan et al. 2020). Dentro de la familia GH5, el único representante de la sub-familia GH5_5 se asume como la única enzima de actividad directa sobre celulosa en el genoma de L. bicolor S238N-H82, esta se encuentra asociada a un, también único, módulo de unión a carbohidrato de la familia CBM1 (Martin et al. 2008). Dicho complejo presentó expresión en la ectomicorriza, se predijo como secretado y su relación filogenética con 146 las GH5_5 fúngicas fue analizada (Veneault-Fourrey et al. 2014). Posteriormente se demostró que la expresión, de la llamada LbGH5‐CBM1, está inducida en la ectomicorriza, que tiene su mayor actividad sobre celulosa y galactomananos, pero no sobre pared fúngica y que su localización es la periferia de las hifas que forman la red de Hartig y el manto (Zhang et al. 2018a). En este trabajo detectamos al homólogo de LbGH5-CBM1 asignado a la subfamilia GH5_5 y asociado a CMB1 en los genomas de las dos cepas de L. bicolor pero solo en la cepa CA15-F10 de L. trichodermophora, pero no en L. amethystina ni en las otras cepas de L. trichodermophora. Recientemente se comprobó la infectividad de las cuatro cepas de L. trichodermophora y se detectó que sólo la cepa CA15-F10 fue capaz de desarrollar ectomicorrizas maduras, mientras que las otras tres cepas colonizaron las raíces de Pinus montezumae desarrollando estructuras incompletas y poco numerosas (Flores-Almaraz, 2020). Cabe destacar que solo con los programas DIAMOND o HotPep se detectó esta proteína con todos sus dominios (ver: /C3/out/dbCAN/*overview.txt en el repositorio de GitHub) mientras que con HMMer solo se detectaron los dominios GH5_5 (Figura 4). GH79 es una familia de β-glucuronidasas con actividad sobre arabinogalactanos protéicos, un componente de la pared celular vegetal que en la raíz se han relacionado con la regulación de la colonización por patógenos y mutualistas (Nguema-Ona et al. 2013). Las funciones GH79 son típicamente más abundantes en Ascomycetes (Zhao et al. 2014) y les da mayores capacidades saprobias y preferencias particulares por sustrato a hongos formadores de micorriza ericoide (Martino et al. 2018). Los genomas de Laccaria promediaron solo un poco más genes de esta familia que los de Psathyrellaceae (9 ± 3 vs 7 ± 3). La presencia de GH79 en el genoma de L. bicolor S238N-H82 fue interpretada como una capacidad para degradar oligosacáridos animales o bacterianos (Martin et al. 2008). En particular a los miembros de esta familia subexpresados en la ectomicorriza de Laccaria se les atribuye actividad en la defensa contra bacterias patógenas (Veneault-Fourrey et al. 2014), al igual que en el genoma de Russula griseocarnosa (Yu et al. 2020). La expresión de estas enzimas se relacionó con el enriquecimiento de biomasa bacteriana en la materia orgánica del suelo en experimentos metagenómicos (López-Mondéjar et al. 2020). Al mismo tiempo, varios 147 genes GH79 presentan péptidos señal o anclajes glicosilfosfatidilinositol, lo que es característico de enzimas de actividad en la pared fúngica (Veneault-Fourrey et al. 2014). Algunos miembros de esta familia fueron sobre expresados en la ectomicorriza de L. bicolor S238N-H82, por lo que se sugiere que estos genes GH79, mediante la hidrolización del arabinogalactano protéico, pueden estar implicados en la comunicación entre las células fúngicas y las células de la raíz (Veneault-Fourrey et al. 2014). En las ectomicorrizas de Hebeloma cylindrosporum y Pinus pinaster también se detectaron GH79 sobreexpresadas (Doré et al. 2015), mientras que en las de Pisolithus microcarpus y Eucalyptus grandis, sus β-glucuronidasas GH79 estuvieron subexpresadas (Plett et al. 2020). Así que esta es una de las familias CAZy para las que sí se cuenta con información transcriptómica y proteómica de la simbiosis, lo que permite suponer que algunas enzimas de esta familia participan en la colonización y la organogénesis mientras que otras enzimas participan en la protección contra patógenos bacterianos o el forrajeo en busca de fuentes carbonadas y nitrogenadas en forma de microartrópodos, nemátodos, necromasa y otros hongos del suelo (Perez- Moreno y Read, 2001). En los genomas de Laccaria se detectó un número considerablemente alto de los genes GT2_Chitin_synth_2. Estos genes están presentes en prácticamente todos los hongos (Zhao et al. 2013), dado que la quitina es el principal componente de la pared celular fúngica. Expansiones en estos genes fueron detectadas en L. bicolor S238N- H82 (Veneault-Fourrey et al. 2014), aunque al comparar los contenidos de estos genes en el Género Laccaria con sus relativos saprobios se presentaron valores similares (8 ± 2 vs 7 ± 3). Este tipo de genes son abundantes en hongos patógenos dimórficos (Prakash et al. 2020) y en hongos micorrízico arbusculares, como Gigaspora margarita (38 genes, Venice et al. 2020). De entre las enzimas CAZy sobre expresadas durante la infección de Colletotrichum lupini, GT2 fue la única que no estuvo relacionada con la degradación de la pared vegetal, principalmente en estados avanzados de la infección, por lo que no se interpretó como relacionada con la formación del apresorio, su estructura de penetración e infección (Dubrulle et al. 2020). Las actividades potencialmente simbióticas de las sintetasas de quitina son proteger la pared celular fúngica de la acción de la quitinasa de la planta y evadir la detección y consecuente 148 activación de su respuesta inmune, en ambos casos a través de la desacetilación de su quitina a quitosano. Sin embargo esta reacción química recae principalmente en enzimas de la familia CE4 por su actividad desacetilasa (Merzendorfer, 2011; Veneault- Fourrey et al. 2014), por lo que GT2 más bien podría estar involucrada en la plasticidad de las paredes de la red de Hartig. Otra glicosil transferasa, esta vez de la familia GT90 fue numerosa en los genomas de Laccaria, un poco más que en los de Psathyrellaceae (8 ± 3 vs 6 ± 2). Estas enzimas son xilosiltransferasas y glucosiltransferasas participantes en la síntesis de UDP-xilosa y UDP-glucosa (CAZypedia Consortium, 2018). GT90 se detectó como activa de manera intracelular en el genoma del micorrízico ericoide Cairneyella variabilis (Midgley et al. 2016) y su expresión aumentó durante la simbiosis entre Cenococcum geophilum con Pinus sylvestris, pero no con Populus tremula × Populus alba (de Freitas Pereira et al. 2018). Es muy numerosa en el genoma de la levadura endófita Rhodotorula mucilaginosa (Sen et al. 2019), aunque su actividad en las levaduras patogénicas Cryptococcus neoformans se ha asociado a la formación de la cápsula, la cual es su principal factor de virulencia. La cápsula está formada de glucuronoxilomananos y galactoxilomananos, y aparentemente tiene una función del “camuflaje molecular” (Griffith et al. 2004; Muszewska et al. 2018). Tanto GT90 como GT2 son las principales funciones GT en los genomas de Basidiomycetes saprobios basales (Aliyu et al. 2020). Por lo tanto, de haber relación de estas funciones con la biología de la simbiosis ectomicorrízica en Laccaria, deberá estar asociada a genes particulares, potencialmente involucrada en la evasión de la respuesta inmune vegetal. En la familia AA1_1 se encuentran laccasas, oxidoreductasas y oxigenasas multicobre con participación en la degradación de lignina. Aunque en Laccaria esta función CAZy es una de las 10 más representadas (7 ± 2) es considerablemente menos numerosa que en Psathyrellaceae (16 ± 6), sin embargo, L. trichodermophora presentó genes con doble dominio activo. El hongo micorrízico arbuscular G. margarita presenta expandida la familia AA1, la expresa y secreta de manera abundante en simbiosis, particularmente cuando el hongo contiene bacterias endosimbióticas, lo que se ha interpretado como un mecanismo de colonización de la raíz (Venice et al. 2020). El 149 hongo ectomicorrízico Paxillus involutus expresa AA1_1 en el suelo, en condiciones experimentales de baja disponibilidad de carbono, pero no a baja disponibilidad de nitrógeno. Al mismo tiempo, tanto P. involutus como L. bicolor expresan otras laccasas (AA1 no clasificadas a subfamilia) en condiciones de poco nitrógeno y en coordinación con peptidasas y transportadores de nitrógeno (Nicolás et al. 2019). En este trabajo solo se detectaron AA1_1 y AA1_2 en los genomas de Laccaria, pero la función AA1_2 solo presentó de 1 a 3 genes en cada genoma. Los hongos formadores de micorriza ericoide presentan un juego considerablemente más grande de estos genes en comparación con los hongos ectomicorrízicos e incluso más grandes que la de los saprobios. La mayoría de las laccasas y oxigenasas multicobre de Laccaria son homologas a las de C. cinerea, algunas se expresan en la ectomicorriza, otras en el micelio y otras en el basidioma, su estructura macroscópica de reproducción sexual (Courty et al. 2009), por lo que las potenciales funciones simbióticas no están distribuidas a lo ancho de esta familia CAZy. 3.4.3 Las funciones CAZy de Laccaria trichodermophora Al contrario de lo esperado, la especie L. trichodermophora no presentó un número considerablemente menor de enzimas CAZy en sus genomas en comparación con las especies generalistas de Laccaria, aunque de manera individual la mayoría de las cepas de L. trichodermophora sí presentaron menos enzimas CAZy que cualquiera de las cepas de L. bicolor, aunque más que la cepa de L. amethystina (Figura 5). Es así que se asume que el número total de genes codificantes para enzimas CAZy, considerando todas las sub-familias enzimáticas, no se relaciona con la preferencia por hospedero en este Género ectomicorrízico, por lo que, de existir esta relación, deberá estar en la presencia, tamaño o identidad de sub-familias particulares. 150 Figura 5. Comparación de la abundancia de genes codificantes para las seis súper- familias de enzimas CAZy. (A) Las gráficas de violín comparan HEM (hongos ectomicorrízicos) contra Sap (saprobios). (B) El tamaño de la burbuja representa el número de genes. (AA: Actividades Auxiliares, CBM: Módulos de Unión a Carbohidratos, CE: Carbohidrato Esterasas, GH: Glicosil Hidolasas, GT: Glicosiltransferasas, PL: Liasas de Polisacárido) en los genomas de Laccaria y sus parientes saprobios en Psathyrellaceae. 151 PL GT GH CE CBM AA L ._ tr ic h o d e rm o p h o ra _ C A 1 5 − F 1 0 L ._ tr ic h o d e rm o p h o ra _ E F − 3 6 L ._ tr ic h o d e rm o p h o ra _ C A 1 5 − 7 5 L ._ tr ic h o d e rm o p h o ra _ C A 1 5 − 1 1 L ._ b ic o lo r_ D 1 0 1 _ 1 L ._ b ic o lo r_ S 2 3 8 N − H 8 2 L ._ a m e th y s ti n a _ L a A M − 0 8 − 1 C ._ c in e re a _ o k a y a m a 7 − 1 3 0 C ._ s tr o s s m a y e ri _ 7 6 9 4 0 C ._ m a rc e s c ib ili s _ C B S _ 1 2 1 1 7 5 C ._ a n g u la tu s _ C B S _ 1 4 4 4 6 9 C ._ a n g u la tu s _ C B S _ 1 7 5 .5 1 C ._ m ic a c e u s _ F P 1 0 1 7 8 1 _ F A 1 3 P ._ a b e rd a re n s is _ A S M 4 1 2 6 6 4 v 1 Abundancia 10 100 200 300 A B Fueron pocos los genes CAZy exclusivos de L. trichodermophora: AA1_1+AA1_1 (lacasas), AA3_2+AA3_2 (celobiosa deshidrogenasa), GH13_1+GH13_1 (amilasas), GH13_31, GH13_8+GH13_8 (amilasas), todos compuestos por homodímeros de funciones compartidas con otras especie de Laccaria analizadas e incluso con Psathyrellaceae. Genes con múltiples dominios catalíticos de la misma función incrementan la potencia enzimática, por lo que la multiplicación de estos dominios podría traducirse en mayor afinidad por sustrato y velocidad de reacción. Al comparar entre cepas de L. trichodermophora, se encontraron pocas funciones CAZy restringidas a una sola cepa. La cepa CA15-11 presentó un número de enzimas CAZy alrededor de un tercio mayor al del resto de las muestras de L. trichodermophora. Esta cepa fue secuenciada y ensamblada con datos de segunda y tercera generación de secuenciación, y su genoma y exoma también presentaron un tamaño mayor al resto de las muestras. Sin embargo, aunque el genoma de EF-36 fue generado mediante los mismos protocolos y tipo de datos, su genoma, exoma y CAZoma no son mayores a los del resto de las muestras (Tabla 2). A pesar del alto número de enzimas CAZy de la cepa CA15-11, no se detectaron diferencias relevantes en su diversidad funcional (Figura 4). Las únicas seis enzimas CAZy restringidas a la cepa CA15-11 fueron AA1_1+AA1_1, AA3, AA3_2+AA3_2, GH13, GH13_1+GH13_1 y GH13_31. De estas, todas las funciones de doble dominio fueron también detectadas con dominio simple en las demás muestras. Las enzimas AA3 son celobiosa deshidrogenasas, no se detectaron en las otras muestras de L. trichodermophora ni en L. bicolor, pero sí en L. amethystina (tres genes). Las enzimas GH13 son amilasas, solo se presentó una copia en L. trichodermophora CA15-11, una en L. bicolor D101-1 y una en P. aberdarensis. Mientras que las amilasas asignadas a la subfamilia GH13_31 no se encontraron en ninguna de las muestras analizadas a excepción de CA15-11. Las funciones exclusivas de CA15-75 fueron: β-galactosidasa de GH2 compartidas con todas las muestras excepto con las otras cepas de L. trichodermophora; endo-β-N- acetylglucosaminidasas de GH85 también compartidas con todas las muestras excepto con las otras cepas de L. trichodermophora ni con L. bicolor S238N-H82; y β- galactosyltransferasas de GT28, detectadas solo en L. bicolor y Coprinopsis. 152 Las únicas dos funciones CAZy restringidas a CA15-F10 fueron GH5_5, una celulasa simbiótica sobre la que ya se discutió su potencial relación con capacidades infectivas de esta cepa; y GH25 una lisozima compartida con L. bicolor D101-1. La familia de GH25 son lisozimas conocidas como del tipo de Chalaropsis, por haber sido descubiertas en dicho hongo (Hash et al. 1967), aunque se han encontrado con mayor frecuencia en bacterias y bacteriófagos (Taylor y Davies, 2011). Estas enzimas típicamente escinden en el enlace glicosídico β-1,4, entre acido N-acetílmuramico y al N-acetilglucosamina del peptidoglicano de la pared celular bacteriana. Esta enzima se ha reportado acompañada de un motivo de secreción, por lo que se le atribuye una posición extracelular (Taylor y Davies, 2011). Por consiguiente, funciones relacionadas con actividad antibacteriana o con el acceso a nutrientes propios de las paredes bacterianas o sus contenidos celulares. Enzimas CAZy de la familia GH25 han sido detectadas en más de 40 genomas de hongos (Zhao et al. 2014). Las GH25 caracterizadas muestran baja identidad (18-51%), pero son muy conservadas en su dominio funcional. En contraste, los residuos de asociación al sustrato no son conservados (Korczynska et al. 2010). GH25 como función exclusiva de L. trichodermophora CA15-F10 no es un resultado robusto, pues esta lizosima ha sido detectada en el transcriptoma y secretoma de L. bicolor S238N-H82 en estudios previos (Vincent et al. 2012) y se sobre expresa en la ectomicorriza. En H. cylindrosporum es sobre expresada un poco en la micorriza in vitro pero mucho más en la ectomicorriza en vivero (Doré et al. 2015) donde se espera una mayor y más compleja diversidad microbiana. Estas lisozimas podrían ser exploradas biotecnológicamente como antimicrobianos alternativos. Un hallazgo interesante, fue la ausencia de genes codificantes para glucosidasas de la familia GH152 en todos los genomas de L. trichodermophora, mientras que estuvieron presentes en todos los genomas de la especie hermana L. bicolor y en la mayoría de los saprobios cercanos. En plantas estas enzimas son comunes, conocidas como “thaumatin-like”, presentan actividad de unión a la calosa (Li et al. 2020; Trudel et al. 1998), un componente efímero de la pared celular vegetal, típicamente encontrado en células crecientes, dañadas o bajo estrés biótico. En Populus trichocarpa su expresión fue abundante en el floema y en las zonas de expansión radial del cambrium 153 (Kumar et al. 2019), lo que confirma su participación en el metabolismo de la calosa en tejidos en desarrollo. Cepas de Pleurotus mutantes en factores transcripcionales relacionados a la pudrición blanca mostraron una baja en la expresión de varias de sus GH152 (Wu et al. 2020), lo que hace evidente la participación de estas enzimas en la actividad saprobia en hongos de esa naturaleza. Enzimas GH152 de Lentinula edodes, un patógeno de encinos, demostraron actividad endo-1,3-β-D-glucosidasa y degradación de lentinanos (β-glucanos) de la propia pared fúngica (Sakamoto et al. 2006) lo que respalda la participación de enzimas vegetales de esta familia como parte de la respuesta inmune antifúngica, aunque también se les pueden atribuir el papel de disimular la pared celular fúngica durante la infección. En contraste, y a pesar de que los β-glucanos son integrales de pared en prácticamente todos los hongos, no todos los hongos codifican GH152 (Blatzer et al. 2020), y en contra de lo esperado, no se encontraron estas enzimas en el repertorio de glucosidasa usadas por bacterias que se alimentan de biomasa fúngica (Starke et al. 2020). La familia GH152 fue recientemente incorporada a la base de datos CAZy (Garron et al. 2019), lo que podría explicar que no se mencione en los estudios enfocados a enzimas CAZy en la simbiosis de L. bicolor (ej., Veneault-Fourrey et al. 2014) sin embargo, la afinidad molecular y su participación fisio-ecológica en la organogénesis y la interacción planta-hongo, en otros modelos, hacen a GH152 un candidato para descartar su participación como uno de los genes simbióticos. Del mismo modo, ortólogos de genes codificantes para enzimas CAZy de las familias GH28 y GH16 fueron detectados como ausentes en los genomas de L. trichodermophora, pero presentes en otras muestras de Laccaria. Ya se mencionó que algunas de las poligalacturonasas GH28 de L. bicolor S238N-H82 se detectaron sobre expresadas en su ectomicorriza madura o temprana con P. trichocarpa, a lo que los autores llamaron “remodelación suave (de la pared celular vegetal) a través de la hidrólisis de la pectina (homogalacturonano)” (Veneault-Fourrey et al. 2014). Las poligalacturonasas GH28 son parte del llamado “regulón estable”, un grupo de genes que se expresan a niveles homogeneamente altos a través del desarrollo de la ectomicorriza tanto en P. trichocarpa como en Pseudotsuga menziesii (Plett et al. 2015). Poligalacturonasas GH28 están incluidas entre las funciones CAZy remanentes 154 de ancestros saprobios, pero neofuncionalizadas a la remodelación de la raíz para la penetración de la lamina media y la colonización de los espacios intercelulares por la red de Hartig, no solo por L. bicolor (Kohler et al. 2015; Martin et al. 2008), si no también por otros Basidiomycetes (Doré et al. 2015) y Pezizomycetes (Martin et al. 2010; Murat et al. 2018). Es decir, la ausencia de este gene, de ser ortólogo a GH28 de L. bicolor S238N-H82 definitivamente impacta en la actividad simbiótica de L. trichodermophora. Es imprescindible mencionar que, como en el caso de la glucosiltransferasa de xilano (GH16) laccasas (AA1_1) o NADPH: p-benzoquinona oxidorreductasa (AA6), no todos los genes anotados con una función CAZy particular estuvieron agrupados en un solo grupo de ortólogos, es así que en este análisis las cepas de L. bicolor presentaron dos o tres genes de GH28, los saprobios hasta nueve, y las cepas CA15-11 y CA15- F10 de L. trichodermophora presentaron un gene. Cave reiterar que de entre las cuatro cepas estudiadas, CA15-F10 fue la única que generó ectomicorrizas maduras en las raíces de P. montezumae (Flores-Almaraz, 2020). En la batería genética codificante para enzimas CAZy del Género Laccaria se detectó evidencia de su estilo de vida ectomicorrízico, al compararla con sus parientes saprobios asimbióticos. Las endo-α-mananasas (GH76), sintetasas de quitina (GT2) y glicosil transferasas (GT90), mediante la remodelación de pared fúngica, despliegan un “camuflaje molecular” que le permite a Laccaria soportar y evadir la respuesta inmune del hospedero e incluso inhibirla mediante oxidorreductasas (AA3_2). Metílesterasas (CE8) y endo-β-1,4-glucanasas (GH12) propician de la penetración de la hifa en el espacio apoplástico, y permiten el relajamiento de la pared celular vegetal. Quitinasas (GH18) participan en el antagonismo y depredación que Laccaria ejerce en contra de otros hongos micotróficos de la rizósfera. Incluso, fueron detectadas enzimas involucradas en características nutracéuticas del Género (GH16). Mientras que β- glucuronidasas (GH79) y otras enzimas CAZy parecen participar en dos frentes al intervenir en la colonización y organogénesis de la ectomicorriza con algunos de sus miembros, y en la explotación de nutrientes del suelo con otros miembros, principalmente en la búsqueda y transporte de compuestos nitrogenados. No se 155 detectaron funciones exclusivas en L. trichodermophora, aunque al comparar el estrato accesorio de los genomas de las especies de Laccaria, la ausencia de ortólogos de poligalacturonasas (GH28) en varias cepas compromete su capacidad simbiótica, particularmente la cepa CA15-F10 fue la única para la que se pudo detectar el ortólogo de la endoglucanasa con modulo de unión LbGH5-CBM1, asignado a la subfamilia GH5_5, lo que podría explicar la pobre capacidad colonizadora detectada para el resto de las cepas (Flores-Almaraz, 2020). 3.5 Los péptidos efectores de Laccaria trichodermophora El Género Laccaria codificó para 367 SSPs intracelulares en total (Figura 6), OrthoFinder asignó 252 genes (68.7%) a 62 grupos de ortólogos, lo que hace evidente el gran número de genes huérfanos (>30% de SSPs intracelulares del Género) y/o la rápida tasa evolutiva que actúa sobre este tipo de genes. Solo 5 de estos grupos de ortólogos contó con genes representantes de todas las especies (Figura 6B) y de estos grupos solo uno estuvo enteramente compuesto por genes de copia única. Laccaria trichodermophora codificó entre 932 (CA15-11) y 512 (EF-36) péptidos secretados, de los cuales entre 156 (CA15-F10) y 80 (EF-36) fueron predichos como péptidos efectores (SSPs). De entre los efectores predichos, 78 (CA15-F10) y 44 (EF-36) son secretados al interior de la célula vegetal; estas cantidades fueron equiparables a las contenidas en los genomas de las otras especies de Laccaria (Figura 6). Los SSPs intracelulares de L. trichodermophora se agruparon en 58 grupos de ortólogos (solo 4 grupos de ortólogos menos que en el Género), 9 de estos grupos se consideran parte del genoma core de la especie (5 de ellos son también parte del core de Laccaria) integrados por máximo 3 parálogos. La cepa CA15-F10 presentó 8 grupos de ortólogos de SSPs intracelulares únicos, mientras que el resto de las cepas presentaron 2 (Figura 7A). Además, entre 31 (CA15-F10) y 11 (EF-36) SSPs no fueron agrupadas y representan genes huérfanos. El alto contenido de SSPs intracelulares en CA15-F10 podría estar relacionado con sus capacidades simbióticas superiores a las de las otras cepas de L. trichodermophora.
 156 Figura 6. Comparación del contenido de péptidos secretados, efectores y péptidos efectores de localización no apoplástica en los genomas de Laccaria. Los números en gris sobre las barras indican el número total de péptidos secretados o de efectores, los números en negro dentro de las barras indican el número de péptidos secretados o efectores excluyendo los efectores o no apoplasticos según el caso. En el eje X se presentan las cepas de Laccaria con el Género y especie abreviados. 157 Figura 7. Intersecciones entre los grupos de ortólogos de péptidos efectores no apoplásticos de (A) varias cepas de L. trichodermophora y (B) siete cepas de Laccaria. Los números grises fuera de los círculos representan la cantidad de genes no asignados a grupos de ortólogos. La ortología entre los péptidos fue detectada con OrthoFinder. 
 158 1 1 1 1 4 1 2 2 1 2 1 4 1 1 1 1 1 3 2 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 11 2 1 1 1 1 5 L.a.LaAM−08−1 L.b.D101_1 L.b.S238N−H82 L.t.CA15−11 L.t.CA15−75 L.t.CA15−F10 L.t.EF−36 2 8 3 2 3 4 3 2 5 5 3 3 4 2 9 L.t.CA15−11 L.t.CA15−75 L.t.CA15−F10 L.t.EF−36 A B 14 18 31 11 14 18 31 11 11 20 10 Dada la naturaleza no enzimática de este tipo de proteínas, no se cuenta con información que permita inferir su función. Es imprescindible destacar la dificultad de su predicción, no solo por los programas específicamente destinados a detectar el secretoma o los efectores, si no desde la predicción de los modelos génicos. En este trabajo, mediante tblastn, detectamos una o dos copias homólogas a MiSSP7 de L. bicolor en los ensambles genómicos de todas las muestras (Tabla 3), por el contrario, este importante péptido no fue detectado (con blastp) en el grupo de péptidos efectores, ni en el secretoma, ni siquiera en el proteoma de ninguna de las muestras, lo que indica que nuestros protocolos de predicción de genes no fueron capaces de detectarlos. 4 Conclusiones 1. Se confirmó que a pesar de las diferencias genómicas entre las cepas de L. trichodermophora, forman un grupo monofilético bien soportado, hermano a la especie L. bicolor. 2. Al analizar los genomas de L. trichodermophora de manera pan-genómica se hizo evidente una gran cantidad de genes cepa específicos y un genoma core de alrededor de 6,756 grupos de genes ortólogos. El genoma accesorio comprendió entre el 18 y el 29% de los genes predichos. 3. Se detectaron 549 grupos de ortólogos de Laccaria ausentes en L. trichodermophora, entre los cuales menos de la mitad tuvieron algún tipo de anotación funcional. 4. La batería genética codificante para enzimas CAZy del L. trichodermophora es muy similar a la reportada para L. bicolor con genes simbióticos involucrados en la evasión y confrontación del sistema inmune vegetal, la colonización y organogénesis de la ectomicorriza, la competencia contra otros microorganismos rizosféricos y la explotación de la materia orgánica nitrogenada de difícil acceso en el suelo. 159 5. Sin embargo, varias cepas de L. trichodermophora no presentaron genes centrales en el desarrollo de la simbiosis, como es el caso de la poligalacturonasas GH28 y la endoglucanasa GH5_5 con modulo de unión a carbohidrato CBM1, ambas funciones presentes en la cepa CA15-10, lo que en conjunto con su elevada batería de SSPs intracelulares se relaciona con su mayor capacidad de colonización. 6. Dada la naturaleza de los análisis de genómica comparada, todos los hallazgos planteados demandan un respaldo experimental. 5 Agradecimientos Este trabajo fue financiado por el proyecto PAPIIT-UNAM IN-210217. Se agradece al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por la beca de manutención otorgada al primer autor, por la asesoría bioinformática a Diana Hernández Oaxaca, Alicia Mastretta Yañes y Luis Fernando Lozano Aguirre Beltrán, y al grupo UATI por la administración de los servidores del Centro de Ciencias Genómicas, UNAM, donde se realizaron todos los análisis. 6 Referencias Aliyu, H., Gorte, O., Zhou, X., Neumann, A., & Ochsenreither, K. (2020). In silico proteomic analysis provides insights into phylogenomics and plant biomass deconstruction potentials of the Tremelalles. Frontiers in bioengineering and biotechnology, 8, 226. Ángeles-Argáiz, R. E., Carmona-Reyes, I. A., Quintero-Corrales, C. A., Medina-Macías, F. J., Blancas-Cabrera, A., Valdez-Cruz, N. 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Los inóculos vegetativos ofrecen la posibilidad de su producción en altos volúmenes, pero ya que consisten en micelio activo de una cepa en particular, su formulación, las técnicas para su aplicación en la planta y la selección de las cepas son determinantes. El objetivo de las plantaciones influye en el diseño de los procesos e inóculos empleados. En cualquier caso, es necesaria la compatibilidad entre las especies usadas como bioinóculos, las plantas, y las condiciones climáticas y edáficas de los sitios de plantación. Por otra parte, la micorrización controlada puede estar destinada a la aforestación de suelos degradados, sin “vocación forestal”, o la propagación de hongos comestibles silvestres. En estos escenarios, el suelo carece de microorganismos competentes y tanto las plantas como los hongos son artificialmente introducidos al ambiente. Se ha reportado que hongos de los Géneros Amanita, Laccaria o Suillus producen abundantes fructificaciones en este tipo de sistemas forestales manejados (ej., Barroetaveña et al. 2007; Hayward et al. 2015; Karkouri et al. 2006; Nuñez et al. 2009; Policelli et al. 2019). Además, es justo en estos sistemas donde la propagación de hongos ectomicorrízicos comestibles han dado mejores resultados (ej., Guerin-Laguette et al. 2020; Morte et al. 2020). En los casos en que los inoculantes ectomicorrízicos estén destinados a la conservación, no se espera que las especies inoculadas permanezcan a largo plazo, se busca impulsar la dinámica sucesional y permitir que la biota nativa eventualmente ocupe su nicho, esto es una de las metas finales de la restauración ecológica 177 (Argüelles-Moyao y Garibay-Orijel, 2018; Young, 2020). En los sitios forestales ya existen comunidades microbianas, generalmente muy diversas en los suelos y raíces de las plantas vecinas (Argüelles-Moyao et al. 2017; Álvarez-Manjarrez et al. 2018; García-Guzmán et al. 2017). Estos hongos nativos suelen desplazar a los hongos inoculados en las plantas de reforestación (ej., Flores-Rentería et al. 2018; Hortal et al. 2009). No se deberá perder de vista que el objetivo de los bioinoculantes ectomicorrízicos es la sobrevivencia de la planta durante los primeros años posteriores al trasplante a campo. Una planta que logró establecerse, puede entonces prescindir del inoculante particular y hacer simbiosis con los microorganismos nativos del suelo, mismos que seguramente podrán satisfacer sus necesidades nutricionales y de toda índole. Es así que la potencial debilidad (en cuanto a la diversidad genética) del la “monoinoculación” es eventualmente eliminada por la diversidad natural. El uso de microorganismos nativos a los sitios de reforestación no solo tiene el efecto de evitar la introducción artificial (Dickie et al. 2016). Se ha demostrado que Laccaria desarrolla una simbiosis más efectiva (en cuanto a la nutrición de la planta) cuando sus socios vegetales son especies simpátricas (Rodríguez-Gutiérrez et al. 2019). Laccaria, como otros HEM, son pioneros o de etapas tempranas de la sucesión ecológica (ej. De la Bastide et al. 1994; Nara et al. 2003). En este trabajo se desarrollaron las bases para la producción de inóculo, destinado a especies particulares de pino, habitantes de sitios forestales, particulares también. Sin embargo, el uso de consorcios biológicos ofrece un panorama más completo y exitoso para las reforestaciones de conservación. Es decir, lo que se busca es eventualmente inocular varias especies de plantas pioneras con diferentes hongos capaces de asociarse a plantas en la segunda o tercera etapa de la sucesión, y hacerlo de manera longitudinal y escalonada en tiempo y espacio, para así promover la “migración asistida” (Argüelles- Moyao y Garibay-Orijel, 2018). En cualquier caso, si la intención es la micorrización controlada de números elevados de plantas, usar inóculos vegetativos seleccionados a partir de la microbiota local permitirá una homogénea micorrización y la obtención de resultados esperados en vivero y en campo, evitando además la problemática de la introducción accidental de 178 agentes desconocidos, como lo son otros hongos ectomicorrízicos competidores, microorganismos patógenos (que atacan la planta de vivero o las plantas silvestres en las plantaciones), e incluso artrópodos comensales y potenciales plagas (Dickie et al. 2016; Repáč et al. 2011). La prospección y correcta selección del germoplasma permitirá además, la valorización de los recursos microbianos locales y la detección/ uso de cepas “elite” con capacidades productivas, simbióticas u organolépticas deseadas o superiores. Al mismo tiempo, es por sí misma una línea innovadora que permitirá la independencia económica y la soberanía tecnológica ante los inóculos importados, mismos que son producidos con especies exóticas a los bosques mexicanos. Los primeros bioinoculantes, compuestos de bacterias diazotróficas “rizobios” (aplicadas a la agricultura) tienen más de cien años (Santos et al. 2019). Desde entonces, la correcta selección de cepas y especies ha sido un tema relevante (Drew et al. 2012). Se han detectado diferencias en la infectividad (capacidad de colonización) o en la efectividad (grado o potencia del efecto benéfico o antagónico) de cepas usadas como inoculantes microbianos, tanto de hongos como de bacterias, aplicados al control de plagas, al manejo de enfermedades y a la promoción del crecimiento vegetal en la agricultura y el manejo forestal. En algunos modelos, las diferencias fenotípicas de las cepas fueron ligadas con la presencia/ausencia o regulación de genes o procesos moleculares (Chen et al. 2018; Fields et al. 2021; Mathieu et al. 2018; Rohrlich et al. 2018; Valero-Jiménez et al. 2016). El potencial biotecnológico de Laccaria trichodermophora como bioinoculante forestal esta dado por la suma de algunas de sus características ecológicas y la posibilidad del cultivo axénico de su micelio. Sin embargo el estudio de la genética de estas características y las diferencias entre cepa y cepa sigue siendo un reto, principalmente en especies no modelo. En el segundo Capítulo de esta tesis, el micelio de la cepa EF-36 de L. trichodermophora demostró que puede crecer y producir abundante biomasa al ser cultivado en medio líquido, lo que hace evidente la viabilidad de su producción masiva cómo bioinoculante vegetativo forestal (Ángeles-Argáiz et al. 2020). En los cultivos 179 ensayados, el micelio de L. trichodermophora creció en forma de colonias en medio solido en caja Petri, y desarrolló distintas coloraciones y morfologías al ser sometido a condiciones de cultivo y distintos nutrientes. Al ser cultivado en medio líquido en matraz agitado alcanzó sus máximos crecimientos cuando la transferencia de oxígeno fue mayor, dada por la hidrodinámica del matraz “bafleado”. Mientras que en condiciones similares (de transferencia volumétrica de oxígeno, pH, medio de cultivo y concentración de la fuente de carbono) en biorreactor de columna de burbujas, el tamaño de los pellets fue tan alto que la transferencia de nutrientes (entre ellos el oxígeno) se redujo, por lo que los cultivos no pudieron igualar la producción de biomasa alcanzada en matraz (Ángeles-Argáiz et al. 2020). Tanto la formulación del inoculante para su aplicación y la comprobación de su infectividad se investigaron posteriormente. En los genomas de las cepas de L. trichodermophora fueron detectadas importantes diferencias, que van desde el tamaño del genoma (Ángeles-Argáiz et al. en preparación: Capítulo III de esta tesis), expansiones en familias particulares de genes y número e identidad de péptidos y enzimas involucradas en las actividades simbióticas (Ángeles-Argáiz et al. en preparación: Capítulo IV de esta tesis). Estas diferencias en el contenido génico pueden permanecer enmascaradas cuando el ensamble genómico se hace a partir de secuencias cortas, por lo que con el uso de secuencias largas como las de PacBio, las regiones repetidas no se colapsan y el verdadero tamaño de las familias génicas puede ser detectado (Ángeles-Argáiz et al. en preparación: Capítulo III de esta tesis; Rhie et al. 2021; Whibley et al. 2021; Yahav y Privman, 2019). Sin embargo, independientemente del tipo de secuenciación y de los métodos de ensamble, algunas cepas de L. trichodermophora presentaron mayores contenidos de péptidos potencialmente efectores y de enzimas CAZy relacionadas con la simbiosis (Ángeles-Argáiz et al. en preparación: Capítulo IV de esta tesis). Al analizar estos genomas de manera comparativa, se detectó la ausencia de dos importantes enzimas involucradas en la colonización de la raíz en los genomas de las cepas no infectivas; así mismo la cepa infectiva (CA15-F10) presentó un número mayor de péptidos predichos potencialmente efectores. Las enzimas fueron una poligalacturonasa GH28 y la endoglucanasa GH5_5 con módulo de unión a carbohidrato CBM1, ambas con funciones simbióticas reconocidas en L. bicolor S238N-H83 mediante genómica, 180 transcriptómica, bioensayos e ingeniería genética (Plett et al. 2015; Veneault-Fourrey et al. 2014; Zhang et al. 2018). Es así que gracias a las herramientas genómicas fue posible atribuir un fenotipo simbiótico a la ausencia de genes particulares, sin embargo la secuenciación genómica podría ser innecesaria en la mayoría de los proyectos prospectivos. El diseño de primers o sondas de hibridación puede ser una alternativa más inmediata para la detección de genes conocidos. La comprobación directa de los fenotipos en interacción deberá siempre ser un requisito temprano, sin embargo, al tratar con grupos grandes de cepas, particularmente para la generación de inoculantes ectomicorrízicos vegetativos, el aislamiento, la propagación axénica y el montaje de los bioensayos suele ser retador, y consume mucho tiempo y espacio. La ploidía, la actividad de transposones y la domesticación microbiana podría explicar las diferencias en los tamaños genómicos de Laccaria trichodermophora La calidad de un ensamblaje genómico y su integridad dependen tanto de las metodologías de secuenciación y ensamble, como de las características intrínsecas del propio genoma (Alkan 2011). Los hongos Basidiomycetes, como L. trichodermophora, desarrollan sus esporomas a partir de micelio secundario, el cual presenta células binucleadas. Ambos núcleos son haploides, pero pueden tener una composición alélica idéntica (homocarión) o distinta (heterocarión) (Ulloa y Hanlin, 2000). Este fenómeno complica el ensamble genómico, ya que con el uso de secuencias cortas pareadas (Illumina o BGI), tanto los alelos como los genes parálogos (o regiones duplicadas por actividad de transposones) suelen estar colapsados en los ensambles genómicos, lo que resulta en ensambles haploides altamente fragmentados y de tamaños reducidos (Smits 2019). Por otra parte, mediante el uso de secuencias largas (PacBio o NanoPore) las regiones duplicadas o repetitivas se sostienen, pero además de la necesidad del pulido con secuencias cortas (Montoliu-Nerin et al. 2020), las distintas versiones alélicas también se ensamblan de manera independiente, lo que resulta en ensambles genómicos de tamaños exagerados, debido a falsas duplicaciones (Rhie et 181 al. 2021; Whibley et al. 2021; Yahav y Privman, 2019), por lo que protocolos enfocados a la limpieza de este tipo de artefactos son indispensables (Roach et al. 2018). Además, se ha estimado que el tamaño del genoma de algunos hongos ectomicorrízicos, particularmente especies de Amanita, es mayor que lo propuesto por sus ensambles genómicos, esto debido a su complejidad en términos de las regiones repetidas de los genomas eucariontes, lo que a su vez es promovido por la actividad de transposones (Hess et al. 2014; 2018). Para ofrecer una hipótesis robusta de ensamble genómico, en el tercer Capítulo de esta tesis se usaron múltiples métodos bioinformáticos y datos de secuenciación de segunda y tercera generación, de manera independiente o híbrida. Es importante reiterar que el micelio cultivado de donde se extrajo el DNA para la secuenciación genómica, fue aislado a partir del contexto de esporomas silvestres, por lo que los aislamientos obtenidos consisten en micelio secundario producto de la plasmogamia y con composición genética nuclear diploide n + n. Se decidió obtener aislamientos puros de esta fuente debido a que es precisamente el micelio secundario (y no el micelio primario haploide producto de la germinación de una basidiospora meiótica) el tejido con el que los Basidiomycetes ectomicorrízicos colonizan las raíces de sus hospederos vegetales (Smith y Read, 2010). Además, obtener cultivos puros a partir del contexto de los esporomas en más sencillo en comparación con los cultivos monospóricos. Ya que los protocolos de cultivos monosporicos parten de diluciones de esporas, mismas que no siempre germinan en medio nutritivo, para posteriormente ensayar cruzas hasta encontrar genetos compatibles, que se “apareen” y generen micelio secundario infectivo. Además de detectar el efecto del tipo de secuenciación y los métodos de ensamble sobre la hipótesis genómica y la predicción funcional, en el Capítulo III se detectó una importante diversidad genómica intraespecífica, evidente en primera instancia en el tamaño del genoma (Tabla 1). Simultáneamente, al predecir el tamaño esperado por profundidad de k-meros, se obtuvieron resultados contrastantes entre cepas, pero consistentes entre métodos (CA15-F10 = 139.26, CA15-11 = 134.42, CA15-75 = 182 129.18, EF-36 = 65.1 Mbp promedio) (Ángeles-Argáiz et al. en proceso: Capítulo III de esta tesis). Tomando en cuenta que sólo para las cepas CA15-11 y EF-36 se contó con datos de secuenciación de tercera generación, y que los resultados de estimación del tamaño por profundidad de k-mero son congruentes con los ensambles de estas dos cepas, se asume que los ensambles genómicos de las cepas CA15-75 y CA15-F10 están colapsados por efecto del uso de lecturas cortas. Sin embargo, con los análisis realizados en el Capítulo III, las causas de esta drástica diferencia en tamaños genómicos no pudieron ser explicados. Tabla 1. Tamaños de los ensambles genómicos de las cuatro cepas de Laccaria trichodermophora. Cepa y ensamble CA15-11 CA15-11 enmascarado CA15-75 CA15-75 enmascarado CA15-F10 CA15-F10 enmascarado EF-36 EF-36 enmascarado Tamaño del ensamble (>= 0 bp) 111,901,891 111,822,287 94,069,926 82,555,314 96,960,722 75,974,168 59,062,912 58,859,258 Tamaño del ensamble >= 1000 bp) 111,901,891 111,822,287 75,346,584 75,343,489 65,267,308 65,266,201 59,062,912 58,859,258 Número de contigs (>= 0 bp) 876 873 71,988 28,921 114,118 34,046 77 72 Número de contigs (>= 1000 bp) 876 873 18,845 18,842 18,694 18,693 77 72 Tamaño del contig mayor 1,052,634 1,052,634 127,703 127,703 91,720 91,720 5,316,676 5,316,676 GC (%) 46.67 46.67 47.04 47.04 47.21 47.21 46.84 46.87 N50 241,037 241,037 5,359 5,364 4,036 4,043 1,464,168 1,464,168 L50 133 133 3,932 3,924 4,809 4,800 12 12 # N's por 100 kbp 349.37 349.62 140.46 140.61 97.97 98.06 91.36 91.67 El “enmascaramiento” del ensamble se realizó con el pipeline FunAnnotate (Palmer y Stajich, 2017) y es el reportado en el Capítulo IV, mientras que el no enmascarado se usó en el Capítulo III. 183 Por lo anterior se plantean dos posibles hipótesis: 1) La cepa EF-36 es un homocarión con un ensamble (híbrido) de tamaño correcto, las otras tres son heterocariones, de las cuales solo CA15-11 tiene un ensamble (híbrido) de tamaño correcto, mientras que para CA15-75 y CA15-F10 se obtuvieron ensambles colapsados por efecto del uso de lecturas cortas; 2) La expansión de los genomas en tres de las cuatro cepas es efecto de actividad reciente de transposones, que impactó de manera diferencial las poblaciones del centro del país. La primera hipótesis, de sostenerse, significa que el ensamble de la cepa CA15-11 no es un ensamble haploide y en él se representan los dos núcleos heterocariones de manera independiente. En otras palabras, todo el ensamble de CA15-11 está duplicado y los métodos de limpieza y “enmascaramiento” ejecutados no fueron efectivos. De sostenerse la segunda, significa que la diversidad genómica intraespecífica de L. trichodermophora es enorme, y que este fenómeno podría extrapolarse a L. bicolor o a otros Basidiomycetes con ecologías o historias evolutivas similares. A manera de perspectiva, para rechazar estas hipótesis, serán necesarios análisis bioinformáticos y experimentos citológicos. La medición de contenido de DNA nuclear mediante citometría de flujo ofrece un dato puntual de la cantidad de cromatina contenida en cada núcleo (Bourge et al. 2018; Tavares et al. 2014). Herramientas bioinformáticas de la genómica de poblaciones, como VCFtools (Danecek et al. 2011), ipyrad (Eaton y Overcast, 2020) o detectRUNS (Biscarini et al. 2018), en conjunto con los datos de genómica poblacional de L. trichodermophora (Quintero-Corrales et al. 2020), ofrecen la posibilidad de evaluar métricas sobre el contenido alélico, cantidad de genes parálogos e índices de heterocigozidad. Así mismo, la anotación y predicción de regiones repetidas y transposónicas deberá llevarse a cabo con el uso de herramientas como RepeatMasker (Tarailo‐Graovac y Chen, 2009) o SGA-PreQC (Simpson, 2013). Además de la variación natural del tamaño genómico entre las cepas de L. trichodermophora, ya sea inducida por su ploidía o no, el manejo en laboratorio del germoplasma pudo propiciar una reducción de su contenido genómico. Como se mencionó, todas las cepas aquí secuenciadas fuero aisladas a partir de esporomas silvestres. Se ha detectado que los esporomas de algunos Basidiomycetes 184 ectomicorrízicos, como los del Género Clavulina, presentan perfiles isotópicos relacionados a la obtención de nutrientes del suelo mientras que los perfiles de otros esporomas son claramente relacionados a la nutrición biotrófica micorrízica (Pérez- Pazos et al. 2019). La evidencia sobre el continuo saprotrofría-biotrofía se sigue acumulando (Smith et al. 2017), sin embargo son muy raros los ejemplos en el que un hongo de hábito ectomicorrízico logre completar su ciclo de vida en independencia a su hospedero vegetal (Sanmee et al. 2010). Por lo que se asume que los esporomas silvestres de L. trichodermophora debieron estar asociados a las raíces de un pino hospedero, para poder fructificar. Es decir, en estado silvestre, las cuatro muestras de L. trichodermophora tuvieron capacidad simbiótica. En contraste, en el laboratorio, solo una de ellas (CA15-F10) desarrolló ectomicorrizas in vitro (Flores-Almaraz, 2020) y presentó un juego genético simbiótico completo (Ángeles-Argáiz et al. en preparación: Capítulo IV de esta tesis), lo que pudo ser resultado de la domesticación de estas cepas en laboratorio. Se entiende por “domesticación” a la modificación genética y fenotípica de un organismo al ser aislado de su población ancestral con la intención de mejorar sus características útiles. En microbiología, se ha usado el término para referirnos a estos procesos desde una perspectiva dirigida a cepas particulares y en escalas de tiempo operativo para la ciencia o la industria. Particularmente, es deseable que una cepa microbiana logre sobrevivir en cultivo puro y/o mejorar sus capacidades fermentativas después de haber sido aislada de un ambiente natural. Los principales ejemplos de la domesticación de microorganismos se refieren a levaduras o bacterias de las bebidas o alimentos fermentados mediante mecanismos genómicos como pseudogenización, hibridación interespecífica, duplicación genética y transferencia horizontal (Gibbons y Rinker, 2015; Steensels et al. 2019). Hongos macroscópicos comestibles, como algunos representantes cultivados de los Géneros Lentinula (Smith, 2021) o Auricularia (Zhao et al. 2019) también muestran evidencias de domesticación en sus genomas. La tradición milenaria del cultivo de hongos comestibles explica estos ejemplos, aunque también se han documentado cambios genómicos en cepas microbianas aisladas del campo y mantenidas en laboratorio a escalas de tiempo mucho menores (Clark y Anderson, 2004; Valenzuela-Miranda et al. 2020). 185 En los ambientes naturales, los microbios se enfrentan a condiciones abióticas lábiles y a una intensa competencia por los nutrientes, pues los nutrientes se distribuyen de forma heterogénea en tiempo y espacio. En contraste, los medios de cultivo en laboratorio representan un nicho estable, abundante, simplificado y sin competencia en el que la selección artificial pronto impulsa la optimización del genoma microbiano (Gibbons y Rinker, 2015). Particularmente, microorganismos simbióticos (mutualistas o parásitos) pierden genes relacionados con su estilo de nutrición biotrófica o con la colonización y comunicación con el hospedero, lo que ha sido usado por ejemplo para el desarrollo de vacunas a partir de microorganismos patógenos atenuados, por ejemplo (Valenzuela-Miranda et al. 2020; Toida, 2020). Además, a diferencia de los procesos “tradicionales de domesticación microbiana” como la que se dio durante el desarrollo de la cerveza o el yogurt, donde una población es sometida a un nicho particular y la crianza selectiva refiere a una población o comunidad microbiana con un abierto intercambio genético al interior de la población y con poblaciones ambientales (Steensels et al. 2019), en condiciones de laboratorio se aísla una cepa pura y se somete a un nicho estable, por lo que los procesos evolutivos plausibles en esas condiciones no son dados por las dinámicas poblacionales, sino por la reproducción clonal y vegetativa sin intercambio ni flujo genético. Las cepas de L. trichodermophora fueron aisladas en los años 2013 y 2015 para estudiar su comportamiento en cultivo puro y la estructura de sus poblaciones silvestres, pero fue hasta los años 2018 y 2019 que se realizó la secuenciación de sus genomas y los ensayos de micorrización controlada. Además, estas cepas no sobrevivieron a los ensayos de criopreservación para el mantenimiento de un banco de trabajo (Ángeles-Argáiz, 2015), por lo que su mantenimiento se logró solo mediante resiembras seriales con perodicidad semestral. Por lo que además de la variación natural en el tamaño y contenido genómico, estas cepas pudieron ser sujeto de la pérdida de genes simbióticos como resultado de las presiones selectivas que el cultivo continuo y las resiembras seriales ejercen sobre los genomas. Es importante mencionar que no hay una relación directa con el tamaño del genoma y la capacidad simbiótica de las cepas o con la velocidad de crecimiento o acumulación de biomasa (Ángeles-Argáiz et al. 2020; Ángeles-Argáiz et al. en proceso: Capítulo III de esta tesis). 186 Por otro lado, la cepa con el genoma más pequeño (EF-36) sí es dos años más vieja que el resto. Se ha reportado la reducción del tamaño del genoma bacteriano 10% menor al tamaño original después de 200 pases de cultivo (Valenzuela-Miranda et al. 2020). Así que se asume que las resiembras consecutivas pueden tener un efecto importante en la pérdida de genes funcionales, pero no es el principal factor que explica la variación en tamaño genómico. Por otra parte, para analizar el efecto del número de pases o la edad de la cepa en su contenido génico, sería necesario el diseño experimental exprofeso para generar los genomas del esporoma silvestre, la cepa en cultivo puro y un número de cepas sometidos a distinta cantidad de pases de cultivo serial, acompañado de experimentos de micorrización controlada con distintos sub- cultivos. La preferencia de los hongos ectomicorrízicos por por su hospedero Una de las características a tomar en cuenta durante la prospección del germoplasma ectomicorrízico para el desarrollo de bioinoculantes forestales es la compatibilidad con el hospedero (Dulmer et al. 2014; Repáč, 2011). Aunque al compararlos con hongos formadores de micorriza arbuscular, los HEM puedan parecer específicos, muchas especies son generalistas, ya que se asocian a diversas familias, Géneros y especies de plantas (Tedersoo y Brundrett, 2017; Tedersoo y Smith, 2017). Un bioinoculante de un hongo generalista puede funcionar para distintas especies forestales, pero el uso de especies “especialistas” limita la dispersión de los inóculos introducidos. Sin embargo, el salto de hospedero ha sido uno motor evolutivo para la diversificación de los HEM (Ángeles-Argáiz y Garibay-Orijel, 2019), por lo que a diferencia de los hongos patógenos (Borah et al. 2018), son raros los ejemplos de HEM con rangos de hospederos muy estrechos (Geml et al. 2009; Kennedy et al. 2011; Lofgren et al. 2020; Looney et al. 2016; Polme et al. 2017). Son varios los factores que determinan la preferencia por hospedero de un HEM. Desde la perspectiva ecológica, las características edáficas, la sucesión de las comunidades fúngicas y vegetales y la exclusión competitiva explican este fenómeno (Corrales et al. 2021; Essene et al. 2017; Kennedy et al. 2020; Nara, 2008; Truong et al. 187 2019). Desde la perspectiva genómica, la identidad de los péptidos efectores y algunos metabolitos secundarios han demostrado implicaciones en la comunicación con hospederos particulares (Lofgren et al. 2020; Plett et al. 2015). Otro grupo genético con un potencial efecto en la preferencia por hospedero son las enzimas CAZy, involucradas en la colonización de los tejidos vegetales (Veneault-Fourrey et al. 2014). La preferencia por hospedero es un campo recientemente explorado en la simbiosis ectomicorrízica (Lofgren et al. 2018; Kennedy et al. 2020; Pérez-Pazos et al. 2021), particularmente desde la perspectiva genómica (Lofgren et al. 2020), mientras que la preferencia, e incluso la especificidad hacia un hospedero ha sido ampliamente estudiada en hongos simbióticos de carácter fitopatógeno (ej., Borah et al. 2018; Fouché et al. 2018; Henry et al. 2021; Poloni y Schirawski, 2016; Rana et al. 2017). En estos modelos, los llamados “genes de resistencia” de las plantas interactúan con los “genes de virulencia” de los hongos (Borah et al. 2018; Rana et al. 2017). Los péptidos efectores también desempeñan un papel importante en la selección del hospedero. Otros elementos moleculares de especificidad son toxinas producto metabolismos secundarios. Sin embargo, no todos los efectores, metabolitos secundarios o genes de virulencia se relacionan con la especificidad (Borah et al. 2018). Elementos genéticos codificantes para péptidos efectores presentan dinámicas genómicas y evolutivas particulares y distintas a otros elementos de los genomas fúngicos. Comúnmente son elementos con tasas evolutivas mayores, tanto en su diversificación como su multiplicación (Fouché et al. 2018; Möller y Stukenbrock, 2017). Se sitúan en regiones teloméricas y subteloméricas, incluso pueden formar parte de los llamados “cromosomas de patogenicidad o linaje específicos” donde la elevada actividad de transposones es la fuerza molecular que alimenta los modelos evolutivos conocido como “arm race” y “two-spreed genome”. Estas mismas características dificultan su detección (Möller y Stukenbrock, 2017). La evolución y diversificación de los elementos genéticos codificantes para péptidos efectores ocurre tan rápido que es evidente a escalas poblacionales. Es decir, distintas poblaciones de la especie presentan genes distintos que les dan patogenicidad y especificidad. Debido a esto, se han descrito “razas”, “patovars” y “formae speciales”. 188 Además, a diferencia de los HEM (quienes presentan una limitada batería de genes para la degradación de la pared celular vegetal), los hongos patógenos (particularmente necrotróficos) presentan fuertes capacidades degradadoras de los tejidos vegetales, actuando en muchos casos como saprobios de descomposición temprana (Borah et al. 2018; Möller y Stukenbrock, 2017). En HEM, muchas de las enzimas CAZy de actividad sobre pared celular vegetal están más bien involucradas en el desarrollo de la ectomicorriza. Por lo que se plantea aquí la hipótesis de que la relación entre la composición diferencial de la pared celular radical del hospedero y el contenido de enzimas CAZy especificas de sustrato podrían tener un papel en la capacidad de colonización de los tejidos vegetales, y por ende, en la preferencia por hospedero. Por lo que la comparación de HEM restringidos a hospederos de maderas duras o de maderas blandas con HEM generalistas permitirá rechazar esta hipótesis. Además, la capacidad de contender con los compuestos anti- fúngicos presentes en las resinas de las coníferas podría ser también considerado como un factor de virulencia para la colonización de estos hospederos. La variación en estos genes deberá ser analizadas mediante la expresión diferencial en asociación con los distintos hospederos y mediante genómica comparada entre especies de hongos. Sin embargo atendiendo a las dinámicas evolutivas descritas para los hongos patógenos, es posible que el comportamiento de estos elementos, aquí propuestos como factores de virulencia, tenga una escala mas bien poblacional, por lo que la comparación de cepas naturalmente asociadas a los distintos hospederos podrá dar luz al fenómeno de la preferencia por el hospedero. En todo caso, la documentación precisa de los hospederos naturales de las cepas analizadas como la comprobación experimental de la asociación con distintos hospederos será crucial para la interpretación de los resultados. Además, la simple presencia/ausencia de genes dista de la función biológica, por lo que la detección de su expresión mediante RNA-seq, proteómica y metabolómica ofrece una panorama integral de la fisiología molecular de la interacción ectomicorrízica. 189 Conclusiones 1) El desarrollo de protocolos para la producción masiva de un inoculante ectomicorrízico forestal permitió no sólo la producción de grandes volúmenes de micelio, si no también hizo evidente la necesidad de la correcta y oportuna selección del germoplasma mediante la detección de su potencial simbiótico. 2) Laccaria trichodermophora fue capaz de crecer en medio líquido en distintos contenedores, formulaciones del medio nutritivo y parámetros de cultivo, y alcanzó rendimientos de hasta YX/S = 0.54 ± 0.09 gBiomasa/gGlucosa. 3) Los genomas de distintas cepas de Laccaria trichodermophora variaron en tamaño entre 59.1 y 111.9 Mpb. Estas diferencias se centran principalmente en el tamaño de las familias génicas. El genoma core de la especie representa del 54% al 76% de las familias de genes homólogos. 4) La ausencia de genes simbióticos, como los codificantes para la poligalacturonasas GH28 y la endoglucanasa con modulo de unión a carbohidrato GH5_5-CBM1, así como el número e identidad de péptidos efectores se relacionan con la pérdida de la capacidad simbiótica en algunas de las cepas analizadas. 5) Mediante la generación y análisis de genomas de distintas cepas destinadas a la inoculación de pino, se hizo evidente no sólo la alta diversidad genómica intraespecífica, si no también el posible efecto que la manipulación a largo plazo tiene sobre el contenido génico simbiótico de cepas particulares y la necesidad de la continua prospección enfocada a los sitios de reforestación y a las especies forestales. 190 Referencias Bibliográficas Alvarez-Manjarrez, J., Garibay-Orijel, R., & Smith, M. E. (2018). 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 201 Anexos
 202 Anexo 1. Mapa de distribución de especies para la introducción de la tesis Rodolfo Ángeles, Septiembre del 2021 Objetivo: Mostrar la distribución de Laccaria trichodermophora, Pinus montezumae y P. hartwegii en un mapa. Procedimiento: 1. Descargar los datos de GBIF 2. Hacer la grafica con R Ejecución: 1. Navegar hasta GBIF (https://www.gbif.org/), buscar cada especie, descargar las ocurrencias en formato .csv y guardarlos en el directorio /Users/REAnAr/Omix/maps_PhD . 2. Ejecutar el siguiente código en RStudio. #go to wd setwd('/Users/REAnAr/Omix/maps_PhD') #instal and load packages install.packages("maptools") install.packages("rgeos") install.packages("raster") install.packages("rgdal") install.packages("dismo") library(maptools) library(rgeos) library(raster) library(rgdal) library(dismo) #create the map data("wrld_simpl") #the map #load the points Lt <- read.csv("Lt.csv") Lt.coords = Lt[,c(10, 22, 23)] 
 203 Pm <- read.csv("Pm.csv") Pm.coords = Pm[,c(10, 22, 23)] Ph <- read.csv("Ph.csv") Ph.coords = Ph[,c(10, 22, 23)] ##plotting #narrow mexico plot(wrld_simpl, xlim=c(-115,-80), ylim=c(10,35), axes=T) #put the points points(Pm.coords$decimalLongitude, Pm.coords$decimalLatitude, col="yellowgreen", pch=2, cex = 0.4) points(Ph.coords$decimalLongitude, Ph.coords$decimalLatitude, col="forestgreen", pch=6, cex = 0.4) points(Lt.coords$decimalLongitude, Lt.coords$decimalLatitude, col="purple", pch=1, cex = 0.6) ##end 
 204 Anexo 2. Nubes de palabras para los resúmenes de cada capítulo Rodolfo Ángeles, Septiembre del 2021 Objetivo: Facilitar al lector una idea rápida del contenido de cada capitulo mediante una imagen. Procedimiento: 1. Crear un .txt para cada capítulo. 2. Generar una matriz de conteo de palabras con text mining en RStudio. 3. Generar las gráficas. Ejecución: 1. A partir de la última versión de la tesis (14 de septiembre del 2021), exportar los textos de cada capítulo (sin referencias) a archivos .txt independientes y situarlos en /Users/REAnAr/Omix/nube . 2. Ejecutar el siguiente código en RStudio para hacer la matriz. #go to wd setwd('/Users/REAnAr/Omix/nube') #install and load packages if(!require(NLP)) {install.packages("NLP", dependencies = TRUE)} # for text mining if(!require(tm)) {install.packages("tm", dependencies = TRUE)} # for text stemming if(!require(SnowballC)) {install.packages("SnowballC", dependencies = TRUE)} # word-cloud generator if(!require(wordcloud)) {install.packages("wordcloud", dependencies = TRUE)} # word-cloud generator 2 if(!require(wordcloud2)) {install.packages("wordcloud2", dependencies = TRUE)} # color palettes if(!require(RColorBrewer)) {install.packages("RColorBrewer", dependencies = TRUE)} 
 205 3. Ejecutar el siguiente código en RStudio para hacer la gráfica. library("tm") library("SnowballC") library("wordcloud") library("wordcloud2") library("RColorBrewer") #Load the text filePath <- "reactores.txt" text <- readLines(filePath,encoding="UTF-8") # Convert Character Vector between Encodings text = iconv(text, to="ASCII//TRANSLIT") #formato de texto corpus <- Corpus(VectorSource(text)) d <- tm_map(corpus, tolower) # go to lowercase d <- tm_map(d, stripWhitespace) # remove blanks d <- tm_map(d, removePunctuation) # remove punctuation marks d <- tm_map(d, removeNumbers) # remove numeric characters #take off pronouns and little words of both languages d <- tm_map(d, removeWords, stopwords("spanish")) d <- tm_map(d, removeWords, stopwords("english")) # create the matrix tdm <- TermDocumentMatrix(d) findFreqTerms(tdm, lowfreq=20) frecuentes<-findFreqTerms(tdm, lowfreq=20) #findAssocs(tdm, "laccaria", 0.45) #findAssocs(tdm, frecuentes, rep(0.45, rep=5) ) #get the sums m <- as.matrix(tdm) #lo vuelve una matriz v <- sort(rowSums(m),decreasing=TRUE) #lo ordena y suma df <- data.frame(word = names(v),freq=v) # lo nombra y le da formato de data.frame ### make a barplot barplot(df[1:10,]$freq, las = 2, names.arg = df[1:10,]$word, col ="lightblue", main ="PALABRAS MÁS FRECUENTES", ylab = "Frecuencia de palabras") 206 ### make the word cloud #wordcloud(words = df$word, freq = df$freq, min.freq = 6, # max.words=100, random.order=FALSE, rot.per=0.35, # colors=brewer.pal(8, "Dark2")) subsample <- df[1:80, ] wordcloud2(subsample, size = 1, ellipticity = 0.3) ### end