UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO 7 INSTITUTO DE BIOTECNOLOGIA, DEPARTAMENTO DE BIOESTRUCTURA Y RECONOCIMIENTO MOLECULAR, UNAM, CUERNAVACA, MORELOS * EXPRESION Y CARACTERIZACIÓN DE LOS PRODUCTOS DEL GENE CNGT 1 DEL ALACRAN CENTRUROIDES NOXIUS HOFFMANN Y DE VARIANTES GENERADAS POR MUTAGENESIS SITIO ESPECIFICA T E Ss s | QUE PARA OBTENER Et GRADO DE ” D o c T o Bb; deecnal o3 (As: P R E s E N T : LA M. EN C. MA. CONSUELO GARCIA RODRIGUEZ CUERNAVACA, MORELOS 1997 TÉ SIS CON FALLA DE ORIGEN 0.,30!? ~ I RSI D CI AL A E MEXICO i" I I TO E I NOLOGIA, ENTO E I CTUllA Y~' NOCIMIENTO OLECULAR, AM, llNAVACA, OllELOS' f f I RACJf I CION f l UCTOS fl f f GT 11 fl l N f ROIDf S XIUS ff N f Y RIANTfS 6fNfR AS R UTA6fNfSIS I I f f lfl UE RA TENER L ADO O O C O ES N l . f . A. NSUUO 6 CIA DRIGUfl ft N P. t A E ERNAVACA, RELOS 97 .. ··"- UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. INSTITUTO DE BIOTECNOLOGIA, DEPARTAMENTO DE BIOESTRUCTURA Y RECONOCIMIENTO MOLECULAR. UNAM. CUERNAVACA, MORELOS. TESIS: Expre•lón y caracterización de lo• productos del gene Cngt 11 del alacrán C•ntrurold•• noxlu• Hoffmann y de variantes generadas por mutagáneal• •ltlo e•peclflca. COMITE TUTORIAL: DR. BALTAZAR BECERRIL L. DR. LOURIVAL D. POSSANI P. DR. ARTURO LIEVANO M. DR. XAVIER SOBERON M. ALUMNO: M. en c. MA. CONSUELO GARCIA RODRIGUEZ CUERNAVACA, MORELOS, AGOSTO DE 1997. Esta tesis fue realizada en el laboratorio del Dr. Lourival Domingos Possani Postay, bajo la tutoria principal del Dr. 9altazar Becerril Luján y contó con la ayuda financiera de los siguientes organismos: -Howard Hughes Medica! lnstitute, donativo N-s75191-527104 y 75197- 527107. -CONACyT, 4734-N9406. -DGAPA-UNAM, IN211996. -Beca Crédito para estudios de Doctorado. CONACyT No. de Registro 85802. CONTENIDO PRESENTACION RESUMEN SUMMARY ABREVIATURA 1 INTROOUCCION 11 ANTECEDENTES 111 HIPOTESIS IV OBJETIVOS V METODOLOGIA VI DATOS NO PUBLICADOS VII RESUL TACOS PUBLICADOS INDICE -García et al. 1997. Comp. Biochem. Physiol. 118b(3): 315-322 VIII DISCUSION Y CONCLUSIONES IX PERSPECTIVAS X ANEXO -Becerril et al. 1995. J. Toxlcol.-Toxln Reviews, 14(3): 339-357 -Selisko et al. 1996. Eur. J. Biochem. 242: 235-242 XI BIBLIOGRAFIA PAGINA 1 2 2 3 4 13 20 20 21 32 47 48 63 64 65 PRESENTACION Esta tesis está enfocada al estudio de la relación estructura-función de fas toxinas del veneno del alacrán Centruroides noxius Hoffmann, en particular a las toxinas que reconocen canales de sodio dependientes de voltaje. La tesis se encuentra dividida en seis partes: la primera es una breve introducción a las toxinas y su interación con canales iónicos: en fa segunda parte se hace una descripción de los antecedentes que sirvieron de base para formular la hipótesis de trabajo; en Ja tercera parte se presenta un trabajo publicado con los resultados de esta tesis; en la cuarta parte se describen las metodologías y datos que no han sido publicados; en la quinta parte se hace una discusión de los resultados y por último un anexo que comprende dos trabajos en los cuales participo como coautora. En este trabajo se reporta la expresión de la toxina Cn 5 del alacrán Centruroides noxius Haffmann Ta cual reconoce canales de sodio. Inicialmente se hace una caracterización de la toxina nativa lo cual nos permite catalogarla como una toxina contra artrópodos que muestra una mayor toxicidad hacia crustáceos. Se hacen comparaciones de secuencia primaria entre varias toxinas de alacrán. tanto de toxinas contra artrópodos como de toxinas contra mamíferos, con el fin de buscar los sitios o regiones de la toxina que pudieran estar participando en la especificidad y/o toxicidad de la molécula. La expresión se lleva a cabo probando diferentes estrategias de expresión en Escherichia coli. También se reporta el plegamiento in vitro da la toxina recombinante. Se discute el problema del plegamiento de proteínas en relación a este trabajo. Así mismo se inicia la construcción de toxinas mutantes que nos permitan confirmar los resultados de las comparaciones. SLMMARY We are presenting a work on expression of toxin Cn 5 from the scorpion Centruroides noxius Hoffmann. This protein affects sodium channels. First we characterize the nativa toxin which shows that it presents toxic activity against crustaceans. In arder to identily the motifs that participate in the specificity or toxicity we comparad the primary sequence of toxins against mammals and toxins against arthropods.Three different expression strategies in Escherichia coli and the in vitro refolding of the recombinan! toxin are reportad. We discuss the protein folding problem lor !he interest ol this work. Finally. the iniliation ol the construction of toxin mutants is reportad, this will enable us to test the results of the sequence comparison. 2 ABREVIATURAS ¡i-ME- beta-mercaptoetanol CNBr- bromuro de cianógeno DTT- ditiotreitol EGTA• bis (¡i-aminoeter) etilenglicol ELISA• ensayo inmunoabsorbente unido a enzima (siglas en inglés) Gnd HCl-cloruro de guanidina GSH- glutatión reducido GSSG• glutatión oxidado HPLC- cromatografía líquida de alta resolución (siglas en inglés) IPTG- isopropiltiogalactopiranósido mbp• proteína acarreadora de maltosa (siglas en inglés) NMR• resonancia magnética nuclear (siglas en inglés) PBS- solución salina amortiguadora (siglas en inglés) PCR- reacción en cadena de la polimerasa (siglas en inglés) PAGE•electrofóresis en gel de poliacrilamida- sodio dodecil sulfato (siglas en inglés) sos- sodio dodecil sulfato AaH Be BmK Bol Cll CnH CsE Css Lqh Lqq Pi Ts - Androctonus australis - Buthus eupeus - Buthus martensii Karsch - Buthus occitanus tunetanus - Centruroides /impidus limpidus - Centruroides noxius Hoffmann - Centruroides sculpturatus Ewing - Centruroides suffusus suffusus - Leiurus quinquestriatus hebraeus - Leiurus quinquestriatus quinquestriatus - Pandinus imperator - Tityus serrulatus 3 '·'··-···--~~--·---- INTRODUCCION EL VENENO DE ALACRAN El veneno de alacrán es, en su estado natural, un líquido blanquecino que presenta una gran estabilidad el cual está constituido por proteínas, sales, mucoproteínas, aminoácidos libres, lípidos, nucleótidos y pequeños péptidos. El veneno liofilizado y almacenado a 4aC conserva sus propiedades tóxicas por tiempo indefinido. Este material liofilizado se reconstituye en agua y mediante centrifugación se puede separar la fracción tóxica que es soluble, de los restos celulares insolubles (Stahnke 1978). En general el veneno carece de actividad enzimática y cuando la presenta, ésta, es muy pobre. La única enzima que se ha reportado es la hialuronidasa (Zlotkin 1978, Possani 1983). Los venenos de alacranes contienen una familia de proteínas homólogas, las cuales son responsables de la actividad neurotóxica que produce la picadura del alacrán (Babin 1974, Possani 1984). Esta actividad tóxica varía de acuerdo a la especie de alacrán. desde malestares locales en el área de la picadura hasta envenenamiento severo con manifestaciones sistémicas que pueden ocacionar la muerte (Keegan 1980). TOXINAS DEL VENENO Las neurotoxinas del veneno de alacrán presentan una alta afinidad hacia canales iónicos (Rocha! 1979, Carbone 1982, Granier 1989, Blaustein 1991) en membranas de células excitables. Cada especie de alacrán contiene una serie de toxinas propias, entre las cuales existen diferencias en cuanto a secuencia primaria y un amplio rango en su grado de toxicidad y especificidad hacia Jos diferentes grupos animales. Las neurotoxinas son pequeños péptidos de una sola cadena, generalmente básicos y altamente estables debido a la presencia de varios puentes disulfuro. Dependiendo de la longitud de la cadena, que puede ser de 30 a 70 aminoácidos, las toxinas se dividen en toxinas de cadena corta y toxinas de cadena larga. TOXINAS DE CADENA CORTA El primer grupo llamado toxinas de cadena corta constan de 31 a 39 aminoácidos y presentan tres o cuatro puentes disulfuro (Possani,1984). La mayoría de las toxinas de este grupo son estabilizadas mediante tres 4 puentes disulfuro (Carbone 1982, Granier 1989), aunque recientemente se han reportado toxinas de cadena corta con 4 puentes disulfuro (Olamendi- Portugal 1996). Estas toxinas bloqueana la conductancia iónica de los canales de potasio. sin modificar los mecanismos de compuerta. Un ejemplo de toxinas bloqueadoras de canales de potasio es la Noxiustoxina (Ntx) del alacrán mexicano Centruraides naxius Hoffmann (Carbone 1982, Possani 1982). Existe un segundo grupo de toxinas de cadena corta las cuales presentan actividad contra insectos: son móleculas estabilizadas por cuatro puentes disulfuro y presentan reconocimiento hacia diferentes receptores. Una de estas toxinas, llamada Clorotoxina (Cltx), es un bloqueador especftico del canal de cloro de baja conductancia (Lippens 1995). Sin embargo, esta actividad sólo se presenta cuando la toxina es aplicada en el lado intracelular del canal, por lo que es poco probable que dicho canal sea el blanco natural de este tipo de toxinas. Otro ejemplo de toxinas de este grupo es la toxina lsA del alacrán Buthus eupeus, la cual reconoce al receptor de glutamato (Arseniev, 1984). TOXINAS DE CADENA LARGA Las toxinas de cadena larga poseen de 60 a 70 aminoácidos y están estabilizadas por cuatro puentes disulfuro. Este grupo de toxinas presenta reconocimiento hacia canales de sodio. Se han descrito varias toxinas que presentan especificidad hacia mamíferos, insectos o crustáceos. Sin embargo, generalmente la selectividad hacia una especie no es absoluta. Se han reportado varias toxinas que muestran actividad hacia varios grupos tilogenéticos. A.- TOXINAS CONTRA MAMIFEROS Las toxinas que reconocen al canal de sodio en mamíferos se subdividen, de acuerdo a su mecanismo de acción en dos tipos a y Jl (Couraud 1982, Meves 1984, Meves 1987, Caterall 1991). Las toxinas tipo a se unen al sitio 3 del canal de sodio sensible a voltaje y retardan la inactivación, lo cual produce una prolongación del potencial de acción. Además, la unión es dependiente del potencial de membrana por lo que su afinidad decrece con la depolarización. La toxina mejor caracterizada del grupo es la toxina 11 del alacrán Norte Africano Androctonus australis Hector (AaH 11). Las toxinas tipo ¡l se unen, de forma independiente del voltaje, al sitio 4 del canal e inducen la aparición de una corriente anormal de sodio, debida a un 5 cambio transitorio en la dependencia de la activación al voltaje. Un ejemplo de toxinas tipo ¡l es la toxina 11 del alacrán Mexicano Centruroides suffusus suffusus (Css 11). Ambos tipos de toxinas, a y ¡l. modifican la dependencia de la inactivación al voltaje, haciéndola incompleta (Meves 1987). En general se considera que el mecanismo de acción de las toxinas tipo a es característico del veneno de Jos alacranes del viejo mundo mientras que el de las toxinas tipo ~ es característico de alacranes del nuevo mundo. Sin embargo. para alacranes de los géneros Centruroides y Tityus (alacranes americanos) se han reportado toxinas con mecanismo de acción tipo a (Meves 1984, Kirsch 1989). Aunque, se debe mencionar que estas toxinas tipo a americanas no desplazan ni a las toxinas tipo a ni a las tipo ¡l, en ensayos de unión a sinaptosomas (Jover 1980, Wheeler 1983) y que sólo se han descrito dos sitios de unión al canal de sodio para las toxinas de alacrán (Tabla 1). B.- TOXINAS CONTRA INSECTOS La clasificación de toxinas que reconocen canales de sodio de insectos, es más compleja. Actualmente se pueden definir tres grupos los cuales no abarcan a todas las toxinas contra insectos reportadas hasta el momento. Los tres grupos comprenden toxinas áltamente tóxicas que en general pertenecen a alacranes del viejo mundo (Zlotkin 1985). El primer grupo está conformado por toxinas a contra insectos, esto es porque al igual que las toxinas tipo a de mamífero. prolongan el potencial de acción evocado mediante una inhibición de la inactivación del canal. Este grupo ha sido descrito con la toxina a. contra insectos del alacrán Leiurus quienquistratus hebraeus (Lqha IT, Eitan 1990). El segundo grupo corresponde a las toxinas depresoras, las cuales producen en el insecto una parálisis flácida progresiva mediante un bloqueo del potencial de acción debido a la depolarización de la membrana y supresión de la corriente de sodio. Un ejemplo de una toxina depresante es la toxina Lqh IT2, del alacrán israelita Leiurus quinquestriatus hebraeus. El tercer grupo corresponde a las toxinas excitatorias las cuales producen una rápida parálisis espasmódica y se unen al canal de forma independiente del voltaje. La toxina AaHIT, de A. australis Hector es un claro ejemplo de dicho grupo. El mecanismo de interacción de las toxinas excitatorias es 6 . f de mamiferos. También existe cierta similitud entre el mecanismo de acción de las toxinas depresoras y las excitatorias pues en ambas se ha reportado (Zlotkin 1991) una fase de contracción excitatoria que en tas depresoras es transitoria mientras que en las excitatorias se presenta de forma sostenida (Zlotkin, 1991). Por último, se puede mencionar un cuarto grupo de toxinas contra insectos, O artrópodos en general, que no pertenecen a ninguno de los tres grupos descritos y que son, principalmente, toxinas de alacranes americanos que presentan baja toxicidad y baja especificidad hacia los modelos biológicos en los que han sido ensayadas. En este grupo se encuentran toxinas como las variantes 1-6 del alacrán Norte Americano C. scu/lpturatus Ewing (CsEv1-CsEv6) y las toxinas de alacranes Mexicanos: Cnt, Cn5 y Cn10 de C. noxíus y la toxina Clli de C. fimpidus limpidus (Meves 1984, Vázquez 1995, Lebreton 1994, Selisko 1996, García 1997). Otro aspecto que hace más compleja la clasificación de las toxinas de alácran es la existencia de toxinas que presentan características típicas de dos o más tipos de toxinas. Por ejemplo, algunas toxinas tipo f del alácran brasileño Tityus serrulatus presentan alta toxicidad, tanto contra mamíteros como contra insectos (Martin 1985, De Lima 1986). Una de estas toxinas Ts y, ha sido probada en ensayos de unión a sinaptosomas y se encontró que es capaz de desplazar tanto a toxinas contra insectos, como toxinas contra mamíferos (De Lima 1986). Otro caso similar es el de la toxina 4 contra insectos del alácran Androctonus australis Hector (AaH 1T4). Esta toxina depresante es capaz de unirse a ambos sitios en el canal de sodio en sinaptosomas de mamiferos (Loret 1991). En las toxinas del alacrán morte americano Centruroides sculpturatus Ewing, se presentan toxinas caracterizadas estructuralmente como tipo f. y sin embargo, en el nódulo de Ranvier su efecto electrofisiológico es tipo a: CsEV, CsEv3, etc. (Meves, 1984). CANALES DE SODIO Los canales iónicos dependientes del voltaje son los responsables de generar el potencial de acción en células excitables y participan en procesos reguladores en células no excitables (Caterall 1991). La característica más importante de estos canales es la capacidad de controlar su conductancia iónica, en una escala temporal de milisegundos, mediante cambios en el potencial de membrana. Así mismo, presentan un 7 áltamente similar al de las toxinas tipo ~ e amíferos. bién xiste i rta i ilit d tre l ecanis o e ci n e s i as resoras s cit torias es n bas a rt do l tkin 91) a e e ntr cción citatoria e l s resoras s sitoria ientras e n s cit torias r senta e a st nida l tkin, 91 ). or l o, e ede encionar n arto r po e i as ntra ctos. o r ró dos n neral, e o rt cen i no e s s r os scritos e n. r i l ente, i as e l r es ericanos e entan ja i i d ja pecifi i ad cia s odelos i l i os n s e n i o sayadas. n ste r po cuentran i as o s ri ntes -6 el l r n orte ericano . u/ r t s ing v1- sEv6) s i as e l r nes exicanos: n1, n5 n10 e . xius i a l1 e . lim i us im i us eves 84, ázquez 95, breton 94, eli ko 96, arcía 97). tro pecto e ce ás pleja l if i n e s i as e l ran s i t ncia e i as e entan racterísti as s e s ás s e i as. or j plo, l nas i as ~ el l ran r sil no i s rr /atus entan lta i i ad, to ntra amíferos o ntra n ctos artin 85, e i a 86). na e tas i as s , a i o ada sayos e i n as e contró e s paz e splazar to i as ntra ctos. o i as ntra amíferos e i a 86). tro so i ilar s l e i a ntra n ctos el l r n ndroctonus stra/is ector H I 4). sta i a presante s paz e irse bos it s n l nal e dio n n as e amíferos ret 91 ). n s i as el l r n n rte ericano entruroides l t ratus ing, entan i as r cteri das t t r l ente o J3. i bargo, l dulo e anvier f cto l ctr fi i l gico s : sEV, sEv3, tc. eves, 84). ANALES DE SODIO s nales i s pendientes el lt je n s nsables e nerar l tencial e ción n l l s cit bles rti i n n sos l ores n l l s o cit bles aterall 91 ). a racterística ás portante e stos nales s acidad e ntrolar ductancia ica. a cala poral e il ndos, ediante bios l tencial e embrana. sí is o, entan n mecanismo de compuerta dependiente del voltaje para el que se han descrito dos actividades: Ja activación, que controla la velocidad de apertura y la inactivación, que controla la velocidad de cerrado del canal. La conductancia de los canales activados por voltaje es extremadamente rápida y altamente selectiva. Entre los canales activados por voltaje se encuentran los de sodio, para los que se han descrito 5 sitios receptores de neurotoxinas, cada uno con diferentes efectos en la función del canal (Tabla 1, tomada de Caterall, 1991). T•bla 1. Drogas y toxinas que se unen a Jos sitios receplores1·5 de neurotoxinas y algunos sirios adicionales no identificados en el canal de Na•. 2 3 4 5 Tetrodotoxina Saxitoxina µ-Conotoxinas Verarridina Aconilina Grayanotoxina Barracoroxina Toxinas u: de alacrán Toxinas de anémona marina Toxinas ll de alacrán Breveroxinas Ciguaroxinas Jnsecricidas Toxina deGonoiopora Toxina de Conus striatus Anestésicos foca/es Antiarrftmicos Anticonvulsionantes • S1t1os no 1dentll1cados. ESTRUCTURA DE LAS TOXINAS Inhibición de Ja conductancJa iónica. Aclivación persistenra. Inhibición de la fnacrivaclón: aumenta la acllvación persJstente. Modifica Ja dependencia de voltaje de Ja acUvac/ón. Disparos repetitivos; modifican Ja dependencia del voltaje de la acrivac/ón, Disparos repetitivos; activación persistente. Inhibe la inactlvación • Inhiben la lrecuencia y la dependencia del vollaje. La homología entre todas las toxinas de alacrán se manifiesta claramente cuando se hace un análisis de fas secuencias primarias. Como se muestra en fa Tabla 2, af hacer alineamientos de secuencias primarias en base a fa posición de las cisteinas, es posible observar posiciones o segmentos conservados así como la conservación del patrón de puentes disulfuro B (Meves 1984, Possani 1985, Bontems 1991, Becerril 1995). En cuanto a su estructura tridimensional, se ha obtenido suficiente información con base en estudios de dicroísmo circular, resonancia magnética nuclear y cristalografía de rayos X, lo cual permite establecer la conservación de un marco estructural entre todas las toxinas del veneno de alacrán (Fontecilla-Camps 1980, Arseniev 1984, Pashkov 1 988, Bontems 1991. Lebreton 1994, Oauplais 1995, Jablonsky 1995, Lippens 1995, Li 1 996, Delepierre 1997). Los elementos principales de la estructura secundaria son: una hélice a de dos y media vueltas y una lamina ~ plegada antiparalela formada por dos o tres segmentos de la cadena (Fig. 1). La hélice a se encuentra conectada, mediante dos puentes disulfuro. a la lámina ~ formando el dominio hélice a estabilizada por cisternas (CSH). Este dominio se ha propuesto como un motivo estructural común de péptidos neurotóxicos que reconocen canales iónicos (Kobayashi, 1991 ). Cerca de esta región se localiza un tercer puente disulfuro que une dos asas. Estos tres puentes disulfuro se encuentran conservados en todas las toxinas de alacrán. El cuarto puente disulfuro puede modificar su posición, como en el caso de las toxinas excitatorias o no estar presente como en algunas toxinas de cadena corta (Tabla 2). Estos elementos conforman un núcleo compacto y son superponibles entre todas las toxinas de las cuales se ha determinado la estructura, tanto entre toxinas de cadena corta (Arseniev 1984, Bontems 1991, Duplais 1995, Lippens 1995), como toxinas de cadena larga, sin importar el grado de toxicidad (Fontecilla-Camps 1980, Jablonsky 1995, Hong-Min 1996) o la especificidad (Pashkov 1988, Loret 1991, Lebreton 1994, Delepierre 1997). Varias asas salen de este núcleo, dos de ellas las asas B y J. Estas asas representan elementos estructurales que permiten diferenciar entre toxinas tipo a y !}. El asa B es de mayor longitud en las toxinas tipo a mientras que el asa J es mayor en toxinas tipo ~ (Meves 1984). Las regiones más flexibles de la estructura se encuentran en los extremos N-terminal y C-terminal de la molécula. Es de esperarse que las diferencias funcionales deben residir en los segmentos variables ya sea en las asas y/o en las regiones terminales, tanto en el tipo de aminoácidoscomo en la longitud de la cadena. IMPORTANCIA DEL ESTUDIO DE LAS TOXINAS El estímulo inicial para el estudio de su veneno fue el aspecto médico de 9 Ol AaH TI Lgq IV GYRDAYIADDK Be M9 -ARDAYIARPA- BmA MB -GRDAYIADSE- Ts — Y --KEGYLHDHE tn 2 cl 1 Cn 5 --KEGYL Cn 10 --KEGYLVNKSTOOKYNCL ILGE--NEN MERA KNOGGS YGHUYK====- CsEv3 Lqh 172 ---DGYIKRR- Lgq 1T2 ---DOYIRKR- AaK IT -KKNGYAVDSSGK Lqq 171 -KKNGYAVDSSGK- O E NTX PI L-==-> Be IA ====-=-=-=-"- CR en. Tabla 2 — Alineamiento de secuencias primarias representalivas de los diferentes grupos de toxinas de alacrán. Las secuencias han sido alineadas en base a las cisteínas con objeto de mostrar la conservación de tres de los puentes disutiuro. Este arreglo de puentes disulfuro se mantiene en todas las toxinas de alacrán. El cuarto puente puede o no estar presente y lener una posición diferente en algunas toxinas, como en las depresantes contra inseclos. ~ o AaH lI -VKDGYIVDDV- qq I V DAYIA DK- Be H9 -A AYI KPH- K B - YIADSE- s e ell e Lqh IT2 ---DG I R- qq I 2 ---DG I R- ehTX NTX Be ISA ----- - ---- elTX ------------ IIN 1FVTIN Tabla 2 Alineamiento de secuencias primarias represenlati s i t s os t i s de alacrán. Las secuencias han sido alineadas en se l i s n j t ostrar la conservación de tres de los puentes disulfuro. Este arr l ntes i lf r anti ne t das las toxinas de alacrán. El cuarto puente puede no t r r nte t er a si i n if r t en algunas toxinas, co o en l s r santes ntr n t . Fig. 1 A: Representación esquemática de la estructura tridimensional de la toxina CsEv3. Muestra los principales motivos estructurales que se conservan en todas las toxinas de alacrán: tres hebras, que comprenden de los aminoácidos: 1 a 4, 37 a 41 y 46 a 50, formando una lámina j3-plegada y una hélice o: de aproximadamente 2.5 vueltas (aminoácidos del 20 al 32). Dos puentes disulfuro, entre los residuos 25 y 46 y los resíduos 29 y 48. que unen ambos elementos formando el motivo CSH (hélice ex estabilizada por cisteínas) y un tercer puente cercano a este núcleo. entre los resíduos16 ·y 41; Uniendo Jos extremos amino y carboxilo se encuentra el cuarto puente formado entre el aminoácido12 y el 65. 11 la picadura de alacrán. Por lo tanto las toxinas que afectan mamíferos son las mejor caracterizadas. Actualmente el alacranismo (envenenamiento producido por la picadura del alacrán) aún representa un serio problema de salud en varias regiones del mundo. Afecta grandes núcleos de población, tanto en el medio rural como en el urbano. y da lugar a altas tasas anuales de morbilidad. Se estima que en México por lo menos 200,000 personas son picadas anualmente por estos arácnidos, ocasionando entre 700 a 800 muertes (Possani 1996). Aunque el interés médico por el estudio del veneno de alacrán sigue siendo válido han surgido nuevos motivos para esta investigación. Al ser péptidos neuroactivos son frecuentemente usados en el estudio de procesos fisiológicos donde están involucradas membranas excitables (Kirsch 1989, Caterall 1991 ). En el estudio de la estructura y función de los canales iónicos así como en su aislamiento, las toxinas de alacrán han jugado un papel muy importante (De Lima 1986, Blaustein 1991, Chul-Seung 1992), El número y diversidad de canales iónicos expresados en las neuronas es muy grande y para evaluar esta diversidad molecular son necesarias sondas específicas que permitan diferenciar entre los subtipos. Debido a ta actividad altamente específica, de las neurotoxinas, sobre sus blancos moleculares representan herramientas efectivas para caracterizar y diferenciar el creciente número de canales y receptores del sistema nervioso. Asimismo, en el campo de los insecticidas algunas de las toxinas de alacranes pueden ser de gran utilidad debido a su actividad insecticida y a su alta especificidad. Con la participación conjunta de la biología molecular y Ja toxicología podemos esperar que se desarrollen nuevas móteculas las cuales podran ser diseñadas específicamente para reconocer con alta afinidad a un receptor determinado (Possani 1990, Adams 1994). ALACRANES MEXICANOS DE IMPORTANCIA MEDICA Es importante mencionar que de las aproximadamente 800 especies de alacranes descritas, menos de 50 representan algún peligro para el hombre (Keegan, 1980). Estas especies se encuentran agrupadas en la familia Buthidae a la cual pertenece el género Centruroides y cuyo centro de radiación es México. En nuestro país se han reportado 28 especies de este género, B de las cuales se consideran peligrosas al humano: C. elegans, C. infamatus infamatus, C. limpidus tecomanus, C. /impidus limpidus, C. sculpturatus Ewing. C. noxius Hoffmann., C. suffusus suffusus y C. pallidiceps. 12 ANTECEDENTES TOXINA CsEv3 En 1974 en un trabajo publicado por Babln et al. se describieron las secuencias de aminoácidos de tres toxinas del alacrán C. sculpturatus Ewing (Babin, 1974). Denominadas variantes 1, 2 y 3, los tres péptidos fueron fácilmente purificadas debido a su gran abundancia en el veneno. Las tres secuencias resultaron altamente homólogas y en los ensayos de toxicidad mostraron una actividad muy baja contra mamíferos. Estas fueron secuenciadas sólo como apoyo para determinar las secuencias de otras toxinas poco abundantes. pero de alta toxicidad. Las clasificaron como toxinas contra insectos pues en los bioensayos fueron capaces de producir una parálisis total en grillos, con duración de dos a tres horas. Se determinaron las dosis efectivas medias (EDso). las cuales fueron de 11. 21.5 y 255 mg/kg de peso para las variantes 1, 2 y 3, respectivamente. En 1980 se logró determinar Ja estructura tridimensional de la variante 3 (CsEv3) utilizando cristalografía de rayos X , con una resolución de 3.0 A. Esta fue la primera toxina de alacrán cuya estructura tridimensional se determinó (Fig. 1) y la primera vez que se propuso un modelo general para la estructura de las toxinas de alacrán (Fontecilla-Camps 1980). En 1983 el mismo grupo publicó un refinamiento de Ja estructura obtenida con una resolución de 1.8 A (Almassay, 1983). En este trabajo comprobaron que la estructura propuesta es correcta y reportaron Ja configuración en cis de Ja prolina 59. GENE Cngtll Como trabajo de maestría realicé una búsqueda en un banco de ADNc de C. noxius H., cuyo objetivo era buscar el gene que codificara para una toxina semejante a la CsEv3 (Becerril 1993). Consideramos importante para el estudio de la relación estructura-función trabajar con una toxina cuya estructura tridimensional fuera conocida. Se utilizó como sonda una clona truncada que codifica para un péptido altamente similar al extremo carboxilo terminal de la CsEv3. Se aislaron varias clonas dos de las cuales corresponden a genes que codifican para dos proteínas diferentes muy parecidas a las variantes de C. sculpturatus E. A estos genes se les llamó Cngt // y Cngt ///. Ambas clonas están completas e incluyen un péptido 13 señal. región codificadora para la toxina, codón de terminación, una región 3' no codificadora donde se encuentra la señal de poliadenilación y la secuencia poli A (Fig. 2). FLEXIBILIDAD DEL EXTREMO CARBOXILO DE ALGUNAS TOXINAS DE ALACRAN En un estudio de dicroísmo circular presentado por Loret et al., (Loret, 1990), se propone que la ausencia de prolinas en el extremo carboxilo de una toxina es determinante para la flexibilidad de esa región. En este trabajo se relaciona la flexibilidad molecular con la especificidad de las toxinas, proponiendo una explicación a la capacidad que tiene la toxina Ts y. del alacrán brasileño Tityus serrulatus. para afectar tanto insectos como mamíferos. Los autores se refieren a la toxina y como toxina VII sin embargo, dicha toxina fue reportada originalmente como toxina y (Possani, 1977) por lo tanto seguiré esta nomenclatura durante todo el texto. Concluyen que esta flexibilidad le permite al extremo carboxilo adoptar las diferentes conformaciones necesarias para reconocer los dos tipos de canales. Esta interpretación se basa en el análisis de los espectros de dicroísmo circular de tres toxinas, las cuales representan tres actividades farmacológicas diferentes. La toxina Css 11 que afecta mamíferos, AaH IT2 que afecta insectos y Ts y que afecta ambos. Los espectros de cada una de las toxinas en agua fueron comparados con aquellos obtenidos después de hacer un cambio gradual del -solvente, a TFA (2,2,2-trifluroetanol) que promueve la formación de hélices a. Hacen una comparación y la única molécula capaz de modificar su conformación es la toxina Ts y. Posteriormente, el mismo grupo realizó otro estudio de dicroísmo circular con una toxina contra canales de sodio de insectos, AaH IT4 (Loret, 1991). Esta molécula presenta características de diversos grupos de toxinas de alacrán. a pesar de tener una baja homología de secuencia primaria con el resto de ellas. Presenta toxicidad tanto hacia insectos como a mamíferos; en estudios de pegado al canal de sodio de mamíferos es capaz de desplazar toxinas tipo a. y tipo 13. En experimentos inmunológicos encuentran que la toxina AaH IT4, que es una toxina de un alacrán del norte de Africa, presenta reactividad cruzada sólo con Css 11 que es una toxina tipo 13 de un alacrán Norte Americano. También encuentran que esta toxina no contiene prolina, que es un aminoácido común en las toxinas de alacrán. Al igual que en el caso de Ts y. el espectro de dicroísmo circular muestra 14 -l.9 -'l.O·: M N S L L .,M ··I . T. A.· C' :L• .. ·F·; .L ··. J:. G' T ATG AAC. =G TTG.TTG A= ATC ACT.GCT =T. TTG ~;.c=.ÁTC-GGA ACA ---------.- ":"".---.-...:.--.----:-:-~".""--PéPtido ·· se:f'1a1-7_-__ ._·-:-:-_- --:...--.-;~.-::--":6---':'."- "'-.~::- ~ .. ·~':' .; - --~~~ '... .. :·/-_· ,;;D~ - ~.'7:_:-~, ~-: .. ..'e TGC .. ,- ., .. '.<.5o:\j :;i·.- 'Y(;:·;- ~ ~G ~~·~~· GGT.,TTG,CCC:GAA;AGT ACA ~~G:~¿; ~t~·c~c ,J: C~T ... \ ·.::. ( -''·' :··¡':<~' .'. :.. './,'.' ..... i1:;_< ,''-_,.!_:~,, •. ·,.~¡ -~'/ :' ·'·::~·-. ':.-·-:,, -"·-- ., • '; .,_:_:\:·~- 68- Fin N K S C S K K AAT AAA TCT TGC AGC AAA A.AA. TAA Fig 2 Secuencia nucleótidica correspondiente a la clona Cngt 11 obtenida a partir de ADNc. Esta secuencia codifica para la toxina Cn 5 del alacrán Centruroides noxius Hoffmann. 15 que la región carboxilo presenta una flexibilidad que le daría la capacidad de modificar su conformación. Por lo tanto, en este trabajo también relacionan Ja ausencia de prolina con una mayor flexibilidad estructural de la región carboxllo de la mólecula y con la capacidad de toxinas de afectar tanto canales de sodio de mamíferos como de insectos. EFECTO DE LAS PROLINAS EN LA ESTRUCTURA DE PROTEINAS La relación entre flexibilidad y la ausencia de prolinas se puede explicar al observar la estructura de la prolina. Presenta un grupo amino secundario (realmente es un iminoácido). el cual se mantiene en una conformación estructural rígida debido a que el último átomo de la cadena lateral se une al primer átomo de la cadena principal formando un anillo. Esto reduce considerablemente la flexibilidad estructural cuando en la cadena se encuentra una prolina. En el caso de la glicina sucede lo contrario. dado que presenta una cadena lateral con la estructura más simple: un átomo de hidrógeno. Por lo tanto, el impedimento estérico es mínimo y esto le proporciona una mayor flexibilidad a la estructura donde se encuentra la glicina (Branden 1991 ). Gllclna ~ H2C/ 'CH2 ' / HN-CH-C02 H Prollna Debido a la conformación especial de la prolina presenta un efecto sobre el enlace peptídico que precede a una prefina. Existen 2 conformaciones posibles del enlace peptídico, una en la que los carbonos a (CªJ mantienen una posición trans y otra en que su posición es cis. La forma trans se favorece energéticamente debido a que existe una menor repulsión entre los átomos que no participan en el enlace, incluyendo la cadena lateral de cada aminoácido. En general la forma trans se presenta en las proteínas en relación 1000:1 sobre la cis. Esta regla se rompe cuando el residuo siguiente (i+1) es una prolina, en este caso la relación trans/cis es de solo 4:1. Esto es posible gracias a que la configuración cíclica de la cadena 16 lateral de la prolina reduce la repulsión entre los átomos y la estabilidad intrínseca del isómero cis es comparable a la del isómero trans (Creighton, 1993) ESTUDIO DE LA RELACION ESTRUCTURA-FUNCION DE LAS TOXINAS Para poder analizar la relación estructura-función de las toxinas es posible hacer uso de la tecnología de ADN recombinante. Mediante mutaciones dirigidas se puede estudiar la participación de regiones o sitios específicos en la función. Adicionalmente esta tecnología puede aplicarse en la optimización de toxinas ya conocidas o para introducir nuevas funciones a estas moléculas. En este tipo de análisis debemos considerar los siguientes aspectos (Adams 1994): a) Que ya se conocen múltiples isoformas naturales que nos permiten hacer comparaciones de las secuencias primarias y estructuras tridimensionales, para tratar de determinar cuáles son las posiciones o regiones asociadas con cierta función. b) Que existen posiciones altamente conservadas en todas las toxinas de alacrán, las cuales pueden tener la función de mantener el marco estructural. como son las cisteínas y la glicina 39 (o posición correspondiente). Estas posiciones deben respetarse en los ensayos de mutagénesis. e) Que la afinidad hacia un receptor no está siempre en relación directa con el efecto funcional de la toxina. En la mayoría de los estudios con neurotoxinas se asume que cuando una toxina se une a un receptor de igual forma lo afecta funcionalmente y esto no siempre es cierto. Por ejemplo, en ensayos de unión a membranas de cerebro de rata in vitro. la toxina AaH IT4 presenta una afinidad similar con AaH IT2, mientras que en ensayos de toxicidad in vivo fue 50 veces menos tóxica (Loret '1991). EXPRESION DE TOXINAS RECOMBINANTES Hasta el momento existen varios estudios de expresión de toxinas decadena larga: la expresión de estas toxinas se ha intentado en varios sistemas, tanto procariotes como eucariotes, desde E. coli hasta células en cultivo, por ejemplo células COS-7. También se ha ensayado en baculovirus que se considera un buen modelo gracias a su potencial en el control de insectos y su probada eficiencia como vector de expresión heteróloga. El otro modelo de expresión que ha sido ensayado es el de 17 levadura. A continuación describo varios trabajos de expresión de toxinas de cadena larga, en los diferentes sistemas. a) En 1989, Bougis et al., ensayaron la expresión de la toxina contra mamíferos, AaH 11. Transfectaron células COS-7 con un plásmido que lleva el ADNc de esta toxina. Lograron una expresión transitoria que les permitió confirmar la expresión de una toxina activa. Sin embargo, mencionan que Ja cantidad de toxina recombinante fue tan pequeña que no les permitió la caracterización de la toxina recombinante. Enfatizaron en sus conclusiones que es necesario analizar otros sistemas de expresión que les permita obtener mayor cantidad de toxina. b) Dee et al., 1990, presentaron un trabajo de expresión de la toxina AalT en células de fibroblastos murinos (NIH/3T3). Prepararon un gene sintético de la toxina precedido por el péptido señal de la interleucina-2 de humano, con el fín de dirigir Ja secreción de la tóxina al medio de cultivo. Lograron probar la actividad tóxica de la proteína recombinante, pero la cantidad de toxina producida no fue suficiente para realizar otros ensayos. c) En 1990 se publicó un trabajo de Stewart et al. en el cual mencionan que construyeron un baculovirus recombinante derivado del virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica y la toxina AaH IT. Su objetivo fue reducir el tiempo que tarda el virus en matar al insecto hospedero (el virus silvestre requiere de 4 a 5 días para matar al hospedero). Primero ensayaron la expresión de su construcción en células de Spodoptera frugiperda y encontraron que sí expresaban una tóxina activa. En el paso siguiente alimentaron larvas de Trichop/usia ni con polihedra y observaron que las patologías asociadas con la infección del virus recombinante y el silvestre eran distintas. En el caso del recombinante se presentan los síntomas típicos de envenenamiento por Ja toxina. Lograron reducir el tiempo de vida de las larvas, después de ingerir el virus recombinante, a 50 °/o del correspondiente al del virus silvestre. Esto es importante pues se traduce en menor daño a los cultivos que se busca proteger. La producción de toxina se estimó en aproximadamente 400 ng/ml. d) Resultados similares fueron obtenidos por Maeda et al., 1991, empleando otro baculovirus y la misma toxina. Sintetizaron el gene para AalT y lo insertaron en un vector de transferencia para el virus de la polyhedrosis nuclear del gusano de seda Bombyx mori . El gene quedó bajo el promotor de la polihedrina y con el péptido señal de la bombyxina. Inyectaron larvas de B. morí con el virus para determinar el efecto 18 insecticida. Observaron una reducción de 40°/o en el tiempo necesario para matar al hospedero. Se observó un cambio en la actividad motriz de los organismos, aproximadamente 40 hr después de la inyección, que les impide comer. Estos dos efectos se suman para que haya un dar.o menor a los cultivos. La producción de toxina recombinante fue de 5 µg/ml de hemolinfa. e) Martin-Eauclaire et al., (1994) realizaron un trabajo donde expresaron la toxina AaH IT1 en la levadura Saccharomyces cerevisae. En un plásmido de alto número de copias (pMA 91) que contiene un promotor fuerte (PGK1), insertaron la secuencia que codifica para la toxina, generando dos construcciones: una con el péptido señal propio de la toxina y la otra con un péptido señal de la levadura. Aunque obtuvieron una toxina recombinante activa. la producción en el caso de la construcción con el péptido senal de la toxina fue muy baja (0.7 a 4 ug /L). Para la construcción, donde usan el péptido señal de la levadura, la producción fue aún más baja.Los autores analizaron el problema de la expresión de toxinas de cadena larga y comentan que el principal problema es la baja expresión, pues aún en el caso del baculovirus que tiene mayor producción, la purificación de la proteína a partir de la hemalinfa limita mucho la cantidad final que se obtiene. Ellos creen que los bajos niveles de producción que se obtienen pueden ser debido principalmente a tres causas: 1) Una tasa baja de síntesis de la proteína. Una causa podría ser el diferente uso de codones. 2) Baja estabilidad de la proteína. Principalmente debido a digestión proteolftica por ser una proteína extraña al organismo. 3) Toxicidad de la proteína a las células del cultivo. Esto podría suceder si la toxina reconoce canales por el lado intracelular, como en el caso de la cloro toxina (Lippens 1995). 19 HIPO TESIS Loret et al. (1990; 1991) sugieren que la ausencia de prolinas del carboxilo terminal les proporciona la flexibilidad que les permite a las toxinas Ts y y AaH IT4 competir por el sitio de unión al canal tanto de las toxinas a y p, de mamíferos como por los sitios de las toxinas que reconocen al canal de sodio en insectos. Por lo tanto nuestra hipótesis de trabajo es: la pralina por ser un iminoácido introduce una constricción que impide la estructuración del extremo carboxilo. Al sustituirla por glicina o por otros aminoácidos con mayor grado de movilidad que las prolinas. se favorecería la flexibilidad necesaria para unirse a ambos tipos de canales de sodio (mamífero e insecto). 08.JETIVOS OB.JETIVO GENERAL El objetivo general de este trabajo es participar en el estudio de la relación estructura-función de las toxinas de alacrán, utilizando como modelo la toxina contra crustáceos Cn 5. OB.JETIVOS ESPECIFICOS -Purificación de la toxina nativa -Caracterización de la toxina Cn 5: a) determinación de la secuencia primaria b) determinación de las posiciones de los puentes disulfuro c) determinación de la toxicidad en acociles (LDso) d) determinación del sitio de unión a sinaptosomas -Clonación y expresión del gene Cngt 11 a) expresión como péptido de fusión b) expresión directa utilizando el péptido señal propio 20 c) expresión directa utilizando un péptido señal bacteriano -Purificación de los productos de expresión -Plegamiento in vitro de Jos productos de expresión -Caracterización de los productos de expresión. Además de los puntos propuestos para la caracterización de la toxina nativa. se probará el reconocimiento por los anticuerpos policlonales obtenidos contra la toxina nativa. -Análisis y comparaciones de secuencias primarias para, determinar las mutaciones necesarias que nos permitan analizar la flexibilidad del extremo carboxilo de la proteína Cn 5 -Clonación y expresión de genes mutantes METOOOl...OGIA En esta sección se presentan únicamente las metodologías que no han sido descritas en las publicaciones que acompai'lan este trabajo (ver trabajos anexos). EDICION V AMPLIFICACION DEL GENE La edición del gene se hizo mediante PCR (Vent Polimerasa) y dependiendo del plásmido donde se clonó se disei'laron diferentes oligos. a) pMal-C2 (BioLabs New England): plásmido para expresión citoplásmica, como péptido de fusión unido a la proteína mbp (proteína acarreadora de maltosa). Se utilizaron los siguientes oligos: 2-Mal-N, el cual elimina el péptido sei'lal e introduce una metionina que permite liberar la toxina mediante corte con bromuro de cianógeno (CNBr), incluye los codones para los 7 primeros aminoácidos del extremo amino. 1-Mal-C, contiene los codones para los últimos 7 aminoácidos, con este aligo se eliminan las dos lisinas finales. y un codón de terminación. Es un oligo reverso por lo que 21 permite amplificar del extremo 3' hacia el s· (ver Figuras 2 y 3). Oligo 2-Mal-N s· 3· ATG AAA GAA GGT TAT CTG GTA AAC Oligo 1-Mal-C s ~ TTA GCT GCA AGA TTT ATT AGG AAG b) pKK223-3, (Pharmacia Biotech): plásmido para expresión directa, utilizando el péptido sella! propio de la proteína. Oligo PKK#1 N-Eco Al: permite amplificar por el extremo 5', incluye los codones para los primeros 6 aminoácidos del péptido seilal, además introduce un sitio de reconocimiento para fa enzima de restricción Eco RI. Para amplificar por el extremo 3' utilizamos el aligo 1-Mal-C (ver Figuras 2 y 4). Oligo PKK#1 N-Eco RI 5· 3· GGG AAT TCC ATG AAC TCG TTG TTG ATG c) pPACIB.1 (proporcionado por el Dr. Jorge Gavilondo, IBT Habana Cuba): plásmido para expresión dirigida a periplasma, el vector cuenta con el péptido seilal de Omp A. Oligo PACIB1/0ir introduce en el extremo 5' un sitio de corte para Eco RI y un codón para metionina el cual permite hacer cortes con CNBr. Mediante este aligo se elimina el péptido sei\al de la toxina pues presenta Jos codones para los primeros 7 aminoácidos del péptido maduro. El aligo PACIB1/Rev elimina los dos codones finales. agrega dos codones de terminación e introduce el sitio de corte para la enzima Sal 1 (ver Figuras 2 y 5). Oligo PACIB1/0ir ~ ~ CCG AAT TCT ATG AAA GAA GGT TAT CTG GTA AA Oligo PACIB1/Rev 5' 3' CCG TCGACCTATTAG CTG CAAGATTTA TTAGGA 22 pMAL-c2,-p2polylinker pMAL-2 vector• --=-----~· ori pBA ori rS«".1-, mo.IC TCG AGC TCG AAC AAC AAC AAC AAT AAC AAT AAC AAC AAC CTC GGG #1 Mat/N ,-.-.1--, r~R.1,¡8t>mH.1Jrx,,..,, rs...1.1, r~"-, r"'"d.11, ATC GAG GGA AGG ATTTCA GAATTC GGATCC TCTAGA GTC GAC CTG CAG GCA AGCTT0 ••. .1 ..... zcr. 1• Olu Gty Arg Jt2 Mal/C ~ Factor Xa creavov• eit• Fig 3. pMAL-C2: vector de expresión citoplásmica como péptido de fusión unido a la proteína acarreadora de maltosa (mbp). La construcción permite Insertar la secuencia de. interés unida al gene mal E que codifica para mbp, el cual se encuentra bajo un promotor fuerte (tac). Presenta un sitio múltiple de clonación. La selección de colonias se hace por color ya que cuenta con lac Za. El péptido de fusión queda unido mediante un espaciador poli asparagina y además, presenta un sitio de corte para el factor Xa, que permite la liberación de la proteína de interés. 23 Sphl(443) Sall(53Zl Accl Hlncll 3 498 4!5~ 1 1 1 GAATTCCCGGGGATCCGTCGACCTGCAGCCAAGCTT 'E.coRI' 'Smol' 'aamHI! Sol! ! Ps11 1 ~ Xtnol Accl Hinc.11 Accl (2127) Flg 4. pKK223-3: vector de expresión directa por lo que las proteínas pueden ser dirigidas fuera del citoplasma mediante una señal adecuada. Contiene al promotor ta.e el cual es inducido mediante adición de IPTG al medio de cultivo. La construcción tiene un sitio múltiple de clonación, así como un terminador ribosomal (rrnB) que impide una lectura corrida. Presenta un sitio de unión al ribosoma que puede ser utilizado si el codón de iniciación del inserto se encuentra entre cinco y nueve bases del sitio de reconocimiento de la enzima Eco RI. 24 Aatl Pvull Bgll, Pstl, Scal ompA Clal Nrul 6 histidlnes Hindlll EcoRI, EcoRV, Sall pPACIB.1 (ca. 2.8 kb) Pvull Secuencia sella! de omp A, secuencia del oligopéptido y sitios de clonación. Met Lis Lis Tre ~-la :IJ.e Al.a :ue Al.a Val. Al.a Leu Al.a G1i Fen ATG AAA AAG ACA GCT A= GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGT = .Al.a Tre Va1 Al.a Gl.n .Al.a Ser Ser His His His His His His G1i Gct ACC GT.A GCG CAG GC~ C.AC CAC C.'l.C C.AC CAC C.AC GGG Xho J: Gli. GG~ = = ~ EcoRI EcoRV Sal.I BarnHI Fig 5. pPACIB.1: vector de expresión periplásmica. La construcción queda bajo el promotor de triptofano el cual es inducible mediante adición de ácido J3-indol-acrflico al medio de cultivo. Cuenta con el pép!ido sefial de omp A, un oligopéptido de histidina, y el terminador del fago T4. La proteína se expresa fusionada a un dominio de afinidad a metales, lo cual facilita la purificación mediante cromatografía de afinidad. 25 CLONACION En los diagramas correspondientes a los tres vehículos de clonación se pueden observar los sitios de clonación en cada caso (Figuras 3, 4 y 5). En los tres casos la transformación se hizo en la cepa Escherichia coli DH5a. Para probar la presencia del inserto se llevó a cabo la purificación y la digestión de los plásmidos. Para comprobar que las construcciones estuvieran correctas se hizo la secuencia nucleotídica de cada construcción. a)pMal-C2; la clonación se hizo en el sitio de Xmn l. b)pKK223-3; la clonación se hizo en el sitio de Sma l. c)pPACIB. 1; la clonación se hizo en el sitio de Eco RV. EXPRESION Y PURIFICACION a) pMal-C2/Cngt 11: la expresión se llevó a cabo en la cepa de E. co/iCMK, en medio Luria adicionado con glucosa (2g/I) y ampicilina (200 µg/ml), a 37oC. La inducción se hizo mediante IPTG, 0.5 mM, cuando el cultivo alcanzó una A 800-0.5. Se tomaron muestras antes y después de la inducción para determinar el nivel de expresión en gel SDS-PAGE. La cosecha se realizó aproximadamente 3.5 h después de la inducción. La purificación del péptido de fusión se llevo a cabo siguiendo las instrucciones descritas por el proveedor mediante cromatografía de afinidad, utilizando una resina de agarosa-amilosa a la cual se une el péptido acarreador. Para eluir se utilizó el mismo amortiguador que para la corrida (fosfatos, pH-7.2, iomM, NaCI 0.5M, azida de sodio 1mM, ¡l-mercapto etanol 10mM, EGTA 1 mM) más 1 OmM de maltosa. Para quitar la maltosa se pasa por una columna (62.0 cm x 1 .O cm) de SephadexR G-75 con un amortiguador de corrida de 20 mM NH4 Ac, pH-4.7. El corte con CNBr se hizo según el protocolo descrito por Smith et al. (1996). Brevemente, se solubilizó la proteína en 70% de ácido fórmico y cloruro de guanidina (Gnd HCI) ·6M, se mantuvo la reacción por 16-20 hr a 20-2SoC en un medio libre de oxígeno (burbujeando N, por 15 min) y se agregó el CNBr en una relación molar de 100 veces por cada metionina presente en la proteína. El corte con factor Xa se realizó siguiendo el protocolo del proveedor, el cual consiste en solubilizar la proteína en el amortiguador de corte de la enzima (Tris-CI, pH-7.2, 20 mM, NaCI 100mM, CaCI, 2mM, azida de sodio 1mM) y agregar la enzima en una relación 1 :200 peso/peso respecto a la proteína de fusión. Se deja a temperatura ambiente por 24 hr. 26 b) pKK-223-3/Cngt 11, se ensayó la expresión en 5 diferentes cepas de E. coli; BL21 DE3, Ec W3110, Ec BMH71.18, EcMM294 y Ec LE392. Los cultivos se hicieron en medio Luria con ampicilina {200µg/ml) a 30•C, la inducción se hizo 3.5 hr. después de iniciado el cultivo, con 2.5 mM de IPTG. Se tomaron muestras antes y después de la inducción, de 2 a 24 horas, para probar la expresión en electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida {SDS-PAGE) y mediante ensayo inmunoabsorbente unido a enzima {ELISA). c) pPACIB.1/Cngt 11, expresión en las cepas de E. coli; BL21, Ec W3110, Ec BMH71.18, Ec MM294 y Ec LE392. Al igual que para el caso anterior las bacterias fueron crecidas en medio Luria adicionado con ampicilina {200µg/ml) a 30•C; 2 hr despues se indujo la expresión agregando 50 µg/ml de ácido l}-indolacrllico. Se cosechó 3.5 hr después de la inducción y la expresión se demostró mediante SDS-PAGE y por ELISA. La purificación de la proteina se llevó a cabo siguiendo las instrucciones del proveedor mediante cromatografia de afinidad en una resina de agarosa-niquel. Se hizo en condiciones desnaturalizantes. La elución se llevó a cabo modificando el pH del amortiguador de columna {8M urea, 0.1 M fosfato de sodio, 0.01 M Tris-HCI, pH- 8.0, 6.3, 5.9 y 4.5). ENSAYOS DE PLEGAMIENTO in vitro: Los protocolos de plegamiento se presentan separados de acuerdo a la proteina que se utilizó para el ensayo. En todos los casos la reacción de plegamiento se detuvo acidificando la mezcla con ácido acético hasta pH- 4.5. Para analizar el resultado de cada reacción se hizo una separación de las diferentes fracciones mediante cromatografia liquida de alta presión {HPLC) de una o varias muestras. En algunos ensayos se realizo ELISA y SDS-PAGE de las diferentes fracciones obtenidas de HPLC. 1 • Péptido de fusión sin digerir: a) Diálisis de la proteina {1.0 mg/ml) con el siguiente amortiguador: 50 mM Tris-HCI (pH-7.0), 50 mM NaCI, 5mM 2-l}ME, en bolsas con tamaño de exclusión del poro de 12 - 14,000 Da. Se mantuvo a 4•C por 48 hrs y se hizo un cambio del amortiguador a las 24 hrs. 27 b) Dilución de la proteína (4mg/ml) 1 :1 O en 20 mM de acetato de amonio, pH- B.O. Se mantuvo en agitación y se tomaron muestras a las 44, 90 y 140 hrs. e) Diálisis del péptido (1.0 mg/ml) contra H 2 0 a 4oC. Se hicieron cuatro cambios del amortiguador para diálisis, cada doce horas y en cada cambio se modificó el pH (7.5, 7.0, 6.5 y 6.0). El iamai'lo de exclusión del poro de las bolsas de diálisis utilizadas fue de 12- 14,000 Da. 2• Péptido de fusión digerido (Factor Xa o CNBr): En todos los siguientes ensayos se desnaturalizó y redujo la proteína en 6M Gnd HCI, 50 mM DTT y 100 mM Tris-HCI. A 37oC en condiciones libres de oxígeno, por 12 hrs (Jaenicke, 1989). Para eliminar el Gnd HCI se pasó por una columna de Sephadex G15 con 20 mM de NH4 Ac, pH-4.7. En el caso de los ensayos de plegamiento por dilución se aplicó la mezcla directamente sin eliminar Gnd HCI por goteo a la solución de plegamiento en agitación. a) Diálisis de la proteína (2mg/ml), digerida con CNBr, contra concentraciones decrecientes de Gnd HCI en PBS más 0.5 mM de 2-PME. Los cambios de amortiguador fueron 7 y se hicieron cada 15 min, utilizando 5M, 4M, 3M, 2M, 1 M, OM y OM de Gnd HCI a temperatura ambiente y en agitación. El tamai'lo de exclusión del poro en las bolsas de diálisis fue de 3,000 Da. Este protocolo fue tomado de Hattori et al, (1993). b) Plegamiento por dilución, 1 :1 O, utlizando un amortiguador sin Gnd HCI, a temperatura ambiente en agitación, se tomaron muestras a las 12, 24 y 48 hr (Hattori, 1993). Posteriormente las muestras se dializaron contra agua por 4 hrs con 4 cambios. e) Se utilizó un protocolo descrito por Huth et al , (1993); dilución de la proteína (2mg/ml), cortada con factor Xa, 1 :15 en el siguiente amortiguador: 50 mM Tris-HCI (pH-7.4), 10 mM cisteamina/cistamina (en 10mM HCI), se dejo en agitación a temperatura ambiente y en un medio libre de oxígeno. Se tomaron muestras a las 24, 48 y 72 h. 28 d) Este ensayo es igual al anterior pero con la proteína digerida con factor Xa. El ensayo se hizo a temperatura ambiente y a 4oc. e) Es similar al ensayo e pero se ensayaron 2 amortiguadores diferentes: 50 mM Tris-HCI (pH-8.7) y solución salina de fosfatos (PBS). 1) El péptido digerido con factor Xa se resuspendió (0.2 mg/ml) en el siguiente amortiguador: 50 mM fosfato de sodio (pH-7.8), 0.2M NaCI, 5mM glutation reducido (GSH) y 0.5 mM glutation oxidado (GSSG), en agitación y a temperatura ambiente por 2 h. g) Filtración molecular del péptido de fusión digerido con factor Xa, en SephadexR G-15 y para la corrida se usó un amortiguador de ac. acético 10°4. Se liofilizaron todas fas fracciones proteícas y se resuspendió en ácido acético 10%. h) El péptido de fusión digerido con factor Xa, sin liofilizar después de la columna de SephadexR G-15, se dializó en el siguiente amortiguador: 0.1M fosfato de sodio (pH-8.0), 0.1 M NaCI, 0.02M guanidina, 1 mM GSH y 1 mM GSSG. Se mantuvo a temperatura ambiente y en membranas con un límite de exclusión aproximado de 1 ,200 Da. 1) El péptido de fusión digerido con factor Xa se dializó con el siguiente amortiguador: 100 mM fosfato de potasio (pH-8.0), 1 mM GSSG, 0.02M guanidina, por 24 hr. a temperatura ambiente utilizando bolsas con un límite de exclusión del poro de 12-14,000 Da. Se colectó el amortiguador de diálisis y se dializó contra: 1 mM fosfato de potasio (pH-8.0), en bolsas con un tamaño de exclusión del poro de 3,000 Da a temperatura ambiente, por 2 hr y con cambios cada 30 min. Al terminar se liofilizó y resuspendió en 1 mi de ac. acético 1 Oo/o. 3 11 Toxina Cn 5 nativa: En todos los ensayos con la proteína nativa se desnaturalizó y se redujo igual que la anterior. Para quitar el Gnd HCI se pasó por una columna de SephadexR G-15 con 1 Oo/o de ac. acético. Las fracciones correspondientes a Ja toxina se liofilizaron para ser utilizadas en los ensayos posteriores. 29 a) La proteína liofilizada (20 µg) se resuspendió en ácido acético 10º/o (pH-3.2) y se pasó por HPLC. b) La proteína desnaturalizada y reducida (50 µg) se pasó por SephadexR G- 15 con 20 mM de NH, Ac, pH-4.7. e) Se dializó la proteína (35 µg/ml) en el siguiente amortiguador: 0.1 M fosfato de sodio (pH-8.0), 0.1M NaCI, 1 mM GSH. 1 mM GSSG, en bolsas con un límite de exclusión de 3,500 Da, a temperatura ambiente, por 48 horas, con un cambio a las 24 horas. d) Se dejó la proteína (50 µg) a 4•C, 1 h. en una solución de pre- plegamiento: 0.1M fosfato de sodio (pH-7.8), 0.1M NaCI, tmM GSH y 1mM GSSG. El plegamiento se hizo por diálisis en la misma solución pero sin el par redox, usando bolsas con un tamaño de exclusión del poro de 1,200 Da a temperatura ambiente por cuatro horas, con un cambio del amortiguador de diálisis a las dos horas. e) Igual que el anterior pero la diálisis se dejó toda la noche. f) La proteína (50 µg) desnaturalizada y reducida se agregó por goteo al amortiguador: SOmM fosfato de sodio (pH-7.8), 0.2M NaCI, SmM GSH y 0.5 mM GSSG hasta alcanzar una dilución de 1 :80. Se dejó en agitación por dos horas a temperatura ambiente. g) Igual que el ensayo anterior pero usando los dos componentes del par redox en una concentración de 5mM. 4° Toxina recombinante libre (His-Cn Sr): a) A 50 µg de la toxina recombinante desnaturalizada y reducida se les hizo un ensayo de plegamiento por dilución. Se llevó a cabo mediante el protocolo g utilizado para la toxina nativa. HPLC En todos los ensayos de plegamiento el protocolo de HPLC fue el mismo. Se usó una columna C1 e de fase reversa. La elución se hizo mediante un 30 gradiente linear de amortiguador A (0.12% de ácido trifluoroacético en agua) a 60o/o de amortiguador B (0.1 % de ácido trifluoroacético en acetonitrilo). La elución fue por 60 minutos con un flujo de 1 mi/ min. Para cada ensayo de plegamiento que se pasó por HPLC se hizo una corrida control con la toxina nativa. MUTAGENESIS Los cambios realizados al gene silvestre se hicieron mediante amplificación por PCR. utilizando eliges mutagénicos que se diseñaron específicamente para introducir los cambios programados en los sitios exactos. En este caso se diseñaron sólo Jos oligos mutagénicos, ya que para hacer la reamplificación completa. después de amplificar con el oligo mutante, se pueden utilizar las oligos que se disenaron para Ja clonación del gene silvestre. El primer oligo: mut-1, es un oligo para amplificar a partir del extremo 3', modifica los codones para las 4 prolinas (posiciones 52, 56, 59 y 61 ), sustituyéndolas por alaninas. Este oligo comprende desde el codón para el aminoácido numero 48 hasta los dos codones de terminación y presenta Ja delación correspondiente a las dos lisinas finales del péptido maduro (Fig. 2). Se usó como ADN templado la construcción del gene Cngt 11 en pPACIB.1. Para amplificar por el extremo 5' utilizamos el oligo PACIB/Dir. El segundo oligo: MUT-3 introduce los codones para sustituir las prolinas 56 y 59 por tirosina y valina, respectivamente. Este oligo comprende desde el codón para el aminoácido 47 hasta el codón para el aminoácido 62, por lo que fue necesaria una segunda amplificación para tener el gene completo. El ADN templado que se usó es la construcción del gene silvestre en pPACIB.1. Para amplificar a partir del extremo 5' se utilizó el oligo PACl81/Dir y para la reamplificación se usó, además del primer producto de PCR, el aligo PACIB1/Rev. OLIGO mut-1 s r CTA TTA GCT GCA AGA TTT ATT AGC AAG AGC ATA AGT AGC TGT ACT TTC AGC CAA ACC TTC GCAOLIGO mut-3 s r A TTT ATT AGG AAG GGG ATA AGT AAC TGT ACT TTC GTA CAA ACC TTC GCACCA 31 Los productos de PCR que se obtuvieron fueron clonados y secuenciados de la misma forma que se describe para el gene silvestre. RESULTADOS En este apartado se describen únicamente resultados no publicados. Los resultados restantes son descritos en los dos artículos del anexo y, principalmente, en el artículo incluido en la tesis. EDICKJN DEL GENE Con el objeto de clonar el gene Cngt 11 en los tres vectores de expresión que se probaron, este se amplificó mediante PCR utilizando los diferentes aligas que generan las modificaciones descritas en la metodología. La Fig. 6 muestra que para cada caso se obtuvo el producto de PCR del tamaño esperado, de acuerdo a Jos aligas empleados. Utilizando los aligas para hacer la clonación en pMal-C2 esperábamos un fragmento de 204 pb. Para la clonación en pKK223-3 el tamaño del fragmento fue de 264 pb y un fragmento de 21 B pb para la clonación en pPACIB. 1. CLONACION La construcción en pMal-C2 se generó mediante la clonación del producto de PCR en un sitio de extremos rasurados, por lo que a varias de las clonas positivas se les hizo secuencia de nucleótidos para encontrar aquellas que tuvieran la orientación y fase de lectura correcta. Para las construcciónes en pKK223-3 y pPACIB. t se diseñaron oligos que permitían hacer una clonación dirigida. Sin embargo, debido a problemas con la doble digestión del inserto se optó posteriormente por la clonación en sitios de extremos rasurados con Jos productos de PCR sin digerir. Una vez que se comprobó por secuencia nucleotídica que la orientación de estos insertos era correcta se digirieron con la enzima Eco RI (figuras 4 y 5) y se volvieron a ligar sobre si mismas con el fin de dejar en fase ambas construcciones. Finalmente, mediante secuencia nucleotídica, se comprobó la fase de lectura de ambos insertos. EXPRESION Y PURIFICACION a) Construcción en pMal-C2. Para detectar la expresión se prepararon 32 A pb 210 162 79 B pb 220 154 Fig 6. Geles de agarosa 1°/o que muestran el tamaño de los tres productos de amplificación por PCR del gene Cngt 11. A: carril 1. marcador de peso molecular: carril 2 y 3, fragmentos de 201 pb para la construcción en pMAL. B: carril 1. marcador de peso molecular; carril 2, fragmento de 267 pb para la construcción en pKK223-3; carril 3, fragmento de 224 pb para la construcción en pPACIB.1. kDo ao- 67- 43- 30- -~---- Fig 7. En un gel de poliacrilamida '10°/o se muestran las fracciones. 2 a 8, de la elución de la columna de afinidad de agarosa-maltosa. El tamaño esperado de la proteína de fusión es de aprox. 49.5 kDa (42.0 kDa de la proleína mbp y 7.5 kDa de la 1oxina CnS). 33 cultivos de 5-25 mi a partir de varias clonas positivas. Se comprobó, mediante electroforesis en SDS-PAGE, la expresión de una proteína con el peso molecular aproximado al esperado (42,000 Da de la proteína acarreadora más 7,200. aproximadamente, de la toxina recombinante). Posteriormente se prepararon cultivos de 0.5 1 cada uno para llevar a cabo Ja inducción y purificación de la proteína de fusión mediante cromatografía de afinidad. Se obtuvieron aproximadamente 2.5 g de células (peso seco) por cultivo. Para la purificación, se pasó el extracto celular sonicado y centrifugado por la columna de afinidad y se obtuvieron 56.25 mg de proteína de fusión total ó 112.5 mg/I. Esto equivale aproximadamente al 20°/o del total de la proteína celular. Como se observa en la Fig. 7 la pureza de la proteína de fusión es alta. Al hacer la digestión con el factor Xa de la proteína purificada, se obtuvieron dos bandas que corresponden a los tamaños esperados de la toxina recombinante y de la proteína acarreadora. Finalmente, se hizo una inmunodetección para comprobar la identidad de la proteína recombinante. Como se observa en la Fig. a, Jos anticuerpos policlonales contra la toxina nativa reconocen la proteína de fusión y al péptido pequeño que resulta de la digestión pero no a la proteína acarreadora (mbp). Se determinó la secuencia de aminoácidos de la banda pequeña producto de la digestión. Los primeros 20 aminoácidos corresponden al extremo amino de la toxina Cn 5 recombinante. Esta toxina recombinante presenta además de Ja secuencia del amino terminal de Ja toxina nativa Ja metionina adicionada. b) Construcción en pKK223-3. Se hicieron ensayos de expresión en varias cepas y debido a la baja expresión en este sistema sólo fue posible detectarla mediante ELISA. Se hicieron varios esfuerzos por tener una mejor producción de la toxina recombinante pero no fue posible obtenerlo por lo que se abandonó este sistema. c) Construcción en pPACIB.1. Se hicieron· análisis de expresión en varias cepas y se demostró mediante ELISA que en las cepas Ec W3110, Ec BMH 71. 18 y Ec MM 294 se lograron los mejores rendimientos (Fig. 9). Para la purificación de la proteína recombinante. se preparó un cultivo de 0.5 1 en el cual se obtuvieron, 2.9 g de células (peso húmedo). Se probaron diferentes condiciones de expresión y se encontró que las mejores condiciones para la producción de la toxina recombinante eran a 30DC, con 50 µg/ml de ácido 13-indol acrílico y en medio Luria. El extracto celular 34 .- LD |— 66 » 45 + > L— 29 — O HL 1942 1, a Fig 8. Expresión de la proteína de fusión mbp-Cn 5. A: gel de poliacrilarida 10% y B: Western blot. Carril 1: cepa sin transformar, carril 2: cepa transformada sin inducir, carril 3: cepa transftormeda e inducida, carril 4: proteína de fusión después de la purificeción, carril 5: proteína de fusión purificada y digerida con el factor Xa, carril 6: toxina Cn 5, carril 7: marcador de peso molecular. Las dos bandas que eparecen después de la digestión corresponden a los tamaños esperados (42 y 7.5 kDa). a 0 A] A2 43 61 22 E3 €t+t C2 212 D1 02 D3 Er El E3 Cn5 Ab 54 92 am Cepas Fig 9. Ensayo por ELISA de expresión de Ja construcción em pPACI!B.1, utilizando diferentes cepas. Á: BL2*, B: EcW3110, C: EcBMH71.18, D: EcMM2394, E: EcLE392. 1: antes de la inducción, 2 y 3: dos y 6 horas después de la inducción, respectivamente. 35 A A A A A A A A A A A e a 2 3 4 5 6 7 2 3 4 5 6 7 kDc ---.- i~ -6 ' <--- 5 ,._ ...... .. • • -2 ~-~ 111 -· -14. i B. xpresión e l r t í a e f i n bp-Cn . : el e Jiacril mida °/o 8: estern lot. arril "I: pa ! f r ar, a ril : pa ra ada i i ucir, a ril : pa for ada i ucida, a ril : r teína e f i n pués e l rifi ación, arril : r teína e i n rifi da i erida n l tor a, a ril : i a n , a ril : arcador e so olecular. as es das e a arecen pués e l i sti n r nden l s ta años erados 2 . a). 1.0 o.a ¡¡¡ 0.6 ~ ]¡ 0.4 < 0.2 1 2 ... 3 e, e2 3 C:1 2 C3 01 2 C3 1 2 3 indica el pico que presenta el tiempo de retención similar a la nativa. 38 O.!S --- --_...- --- so !<-''--".ll-~~--'~2~0,...-~~.!.-~~-4-,L,o~~~~~~-s~oº Tiempo (m1nutos) Fig 12. Cromatograma de HPLC correspondiente al ensayo a de plegamiento in vitro utilizando el péptido de fusión (mbp-Cn 5) sin digerir, la digestión se hizo después del plegamiento. Se recupera un pico con el tiempo de retención del péptido sin digerir (51.15 min), el resto del material se ha perdido por precipitación. i ~o.os e ,,--tJ t. "º ~J.L.~~~-.,2~0,,_~~~~---,~~o:--~~~~~60° Tiel":"lpo (minufcs) Fig 13. Cromatograma de HPLC correspondiente a la digestión mediante CNBr del péptido de fusión. La presencia de varios picos (-/), los cuales son reconocidos por los anticuerpos policlonales contra Cn s. nos indica que la digestión fue parcial y que se están generando diversos péptidos debido a la presencia de metioninas en la proteína mbp. 39 Para este caso también se probaran diferentes parámetros y en ef caso del corte con CNBr se observó que no hubo plegamiento. Se hizo ELISA de las diferentes fracciones obtenidas después del corte y se demostró que todas son reconocidas por ros anticuerpos contra la toxina nativa por Jo que pensamos que la digestión fue muy parcial. Esto se puede observar en el cromatograma de la Fig. 13. Para evitar el problema de la digestión parcial decidimos hacer solamente cortes con factor Xa, pues mediante geles SOS- PAGE habíamos observado que esta digestión es casi total. Con los ensayos de plegamiento de la proteína digerida con el Factor Xa se obtuvieron fracciones que presentaban eJ tiempo de retención de la nativa. Los ensayos que dieron resultados positivos, fas más exitosos fueron aquellos en que se hizo eJ plegamiento mediante dilución utilizando un par redox. Como ejemplo, podemos observar los cromatogramas del ensayo e, en el cual ya se observa un pico que eluye en el tiempo de retención de la toxina nativa (Fig. 14}. En el ensayo e se realizó un ELISA a las fracciones obtenidas en los diferentes tiempos del proceso de plegamiento. Se observó que el reconocimiento de Jos anticuerpos aumentaba con el tiempo (Fig.15). En cambio, en los ensayos que se hicieron mediante diálisis, no se observó plegamiento. En el caso particular del ensayo i se formó un precipitado en la bolsa. Se comprobó que en el precipitado se encuentra la mayor parte de la toxina recombinante y parte de la proteína mbp como se puede ver en el gel SDS-PAGE de la Fig. 16. Este fenómeno de agregación ya se había observado en otros ensayos de plegamiento en los que se usó la proteína de fusión digerida con el Factor Xa. 3°. Toxina Nativa (ver Tabla 3). En todos los ensayos de plegamiento con la toxina nativa se obtuvo una fracción con el tiempo de retención de la proteína nativa. En algunos ensayos el porcentaje fue menor como, en el caso de los ensayos a y b que fueron por filtración molecular. Se observaron varias conformaciones o diferentes plegamientos que se manifiestan por la presencia de varios picos bien definidos en el cromatograma (Fig. 17). En la base de los picos se puede ver el material que seguramente presenta fases de plegamiento muy diferentes. El método de diálisis permitió una buena recuperación del material, como se muestra en la Figura 18 para el caso del ensayo c. En este cromatograma se ve un pico bien definido que presenta el tiempo de retención correspondiente a fa toxina nativa. Además, la cantidad de material recuperado nos está indicando que el proceso de plegamiento fue 40 o.ce ,, ,, ,,"' ,, 60 a> .. 0·0 o]'J...-=---2='0,._ ____ -,4"=0,......-----='so~-' 0 Tlem~o (minutos) Fig 14. Cromatograma de HPLC correspondiente a un ensayo de plegamiento mediante dilución. Se utilizó el péptido desnaturalizado, reducido y digerido con factor Xa (ensayo e). Se observa la presencia de un pequel'lo pico que presenta el tiempo de retención da la toxina nativa c·i. el cual es reconocir;!f por Jos anticuerpos contra Ja toxina Cn 5. I ... "'---•·u.~C :: :: ~ ;' g:: ;:r¡ ;:;;;~ ¡: ¡:;;: ,.. ;s· • R; ~ Flg 15. ELISA de diferentes alícuotas del ensayo de plegamiento c. Podemos observar un aumento en el reconocimiento de los anticuerpos al transcurrir el tiempo del ensayo. Los tres conjuntos de datos corresponden a los tiempos de plegamiento: 24, 48 y 72 h 41 2 3 4 5 6 Fig 16. Gel de poliacrilamica 12.5% correspondiante al ensayo i de plegamiento de la toxina digerida con factor Xa. Carril 1: precipitado (desnaturalizado y reducido). carril 2: proteína mbp,carril 3: toxina Cn 5, carril 4: alfcuo:a del ensayo reducido, carril 5: sobrenadante reducido, carril 6: precipitado (sin reducir y desnaturalizar). Podemos observar que la mayor par1e de la toxina recombinante se encuentra en el precipitado, m'º"" .. '"º •o ., ·]r·· ·· __ ·:~:r~~::f '"º ....... do.o __U.,/JJJl~ •o 2~ •o •:lº Fig 17. Cromatograma de HPLC ~~Orré~pQ;.:diente al ensayo de plegamiento b da la proteína nativa. Se muestra la gran recuperación del material. aún cuando no todo está plegado. Suponemos que los tres picos corresponden a tres isoformas estructurales de la proteína plegada, mientras que la base seguramente representa material soluble no plegado. 42 favorecido sobre el proceso de agregación. Tambi•n podemos asumir que no todas las vías de plegamiento fueron productivas. pues la base del pico presenta muchas irregularidad•• las cuales reflejan diferentes conformaciones de la mol6cula. En los en.-yoa de plegamiento anteriores, utilizando la toxina recombinante. especialmente loa que •• hicieron mediante di41isia, Is p•rdida del material por agregación fue casi del 100%. Por esto al no haber proteína soluble, el tamallo de loa picos en el cromatograma as apenas detectable (Fig. 12). En general podemos decir que con la toxina nativa se aumentó la cantidad de toxina plegada aunque no toda con la configuración correcta pues. aún que es proteína soluble, no eiuye como un solo pico bien definido. Se observó un incremento en el plegamiento cuando se usa el par redox GSH/GSSG y pare- ser mejor cuando la relación da aste par •• 1 :1 que 1 :10. Esto se mostró en loa ensayos fy 11 que se preaentsn en loa crometogramaa de la Fig 19 y Fig 20, respectivamente. 4• Toxina Recombinante Libre (ver Tebla 3). Con la toxina recombinante (Hia-Cn5). ya liberada del oligop•ptido de hiatidinas. se hicieron loa ensayos d• plegamiento similares a loa de la toxina nativa. En la Fig. 21 se observa el cromatograma correspondiente a un ensayo por dilución en el que se utiliza el par redox en relación 1 :1 (protocolo 11 de la toxina nativa). Aún cuando el pico presenta el tiempo de retención correspondiente a la nativa. la poca definición indica una alta heterogeneidad molecular. En pruebas de toxicidad en cochinillas, este material presenta actividad tóxica letal aunque con mayor dosis que la toxina nativa. MUTAGENESIS Hasta el momento se cuenta con la clona correspondiente a la mutante 1 en la cual se sustituyeron las 4 prolinas por alaninas. Mediante secuencia de nucleótidos se comprobó que la clona está en tase, que tiene las cuatro mutaciones y que no se encuentran las 2 lisinas finales. Antes de hacer la construcción se analizó (Dra. Barbara Selisko) la estructura preliminar obtenida por NMR de la toxina nativa (datos sin publicar). Utilizando el programa INSIGHT 11 de Biosym Technologies. San Diego en una estación de trabajo SILICON GRAPHICS IRIS 4D/35. Se midieron los ángulos e;> y ljf que presentan las prefinas en la estructura y se encontró que corresponden a valores permitidos para alaninas (Cantor, 1 980). Adicionalmente, se 43 0.1 * 60 / ,. ,. / / ,. ,. ,. ,. ,. ,. I! ,./ ~o.os ,. ,. CI .. ,. .. Fig 1 B. Cromatograma de HPLC correspondiente al ensayo de plegamiento e de la proteína nativa. En este ensayo de diálisis podemos observar un pico bien definido, que presenta el tiempo de retención de la toxina nativa. o.os o.o o~----zolo.------:.oi<----~.,p Tlel"l'lpo {mlnu105) "' .. Fig 19. Cromatograma de HPLC correspondiente al ensayo d e plegamiento de la toxina nativa. En este ensayo por dilución, se utilizó un par redox con una relación uno a diez del oxidante sobre el reductor. Se observa un pico mayoritario aunque no totalmente definido. 44 1 y *o so 20 Tiempo (minutos) Fig 20. Cromatograma de HPLC correspondiente al ensayo de plegamiento g de la proteína nativa. Ensayo similar al f sólo que la relación del par redox es uno a uno. Se observa un pico mayoritario muy bien definido. 0.2 s0 % 01 < em ¿e e Á 205 20 20 ES Tiempo (minutos) Fig 21. Cromatograma- de HPLC correspondiente al ensayo de plegamiento a de la proteína recombinante His-Cn5Sr. Como se puede ver existe una alta recuperación del material lo cual indica que la proteína está soluble y no precipitada. El pico mayoritario esta muy cerca del tiempo de retención de la toxina nativa y el material recuperado presenta actividad tóxica. 45 ~ 0 0~----~2~0===------,.~o,_------d •. : i po i u1oa) i 0. r atogra a e LC r ondiente l sayo e l iento e r t í a ativa.· sayo i ilar l lo e l i n el ar a ox s o o. e serva n i o ayoritario uy i n fi ido. 1 ~ .1 e "' .. 0 · 0 0~.L----o'20-----,.Lo-----'so 0 i po i utos) i 1. r tograma· e LC r ondiente l sayo e l iento e f r teína binante His~CnSr. o e ede er iste a lta eración el aterial al i a e r t ína stá l ble o r cipit da. l i o ayoritario sta uy rca el ie po e ci n e i a ativa l aterial erado r senta ti i ad ica. modificaron las prolinas a alaninas usando el programa BIOPOL YMER de Biosym y se hizo una dinámica del modelo mediante el programa DISCOVER de Biosym (20 ps a una temperatura de 300 K). La estructura final muestra cambios mínimos en las posiciones Ca de la región C terminal. residuos 50 a 65, de hasta 1 .29 A. Este resultado muestra que el modelo presenta una forma energéticamente estable. Este análisis nos permite asumir que las sustituciones no son un factor que impida una correcta estructuración de la toxina mutante. Sin embargo, la situación real del plegamiento de la mutante va a diferir por la presencia de la Ala 59 en el lugar de la Pro 59, que presenta un enlace peptídico en cis. La forma trans en un residuo como alanina estará favorecida 1000:1 sobre la cis por lo que es poco probable que se forme un enlace cis, similar a la nativa. Sólo en el caso en que la situación entre las cadenas laterales cerca de la posición 59. presentando un enlace cis antes de la Ala 59. sea tan energéticamente favorable que permita su formación. 46 RESULTADOS PUBLICADOS -García C., Becerril B., Selisko B., Delepierre M. and Possanl L. D. (1997). lsolatlon, characterization and comparison of a novel crustacean toxin with a mammallan toxin from the venom o! the scorplon Centruroides noxius Hoffmann. Comp. Biochem. Physiol. 1168(3): 315-322. 47 A A e A e mp. Biochern. Phvstol. Val. 114B. No. 3. pp. 315-322, 1997 Coprtigha D 1997 Elevier Science bras. ISSN 0305-0494 1/97/$17.00 Pl S5Í305-0491(96)00246-5 ELSEVIEN Isolation, Characterization and Comparison of a Novel Crustacean Toxin with a Mammalian Toxin from the Venom of the Scorpion Centruroides noxius Hoffmann Consuelo García,! Baltazar Becerril,! Barbara SelisRo,' Muriel Delepierre? and Lotrival D. Possani'-* ¡DEPARTMENT OF MoticuLan RECOGNITION AND SreLOTURAL BióLogY. ÍxsTIrrUTE Or Brorecunot00y, NaTIONAL AUTONOMOUS Un ¡VERS ¡TY OP RÍEXICO, AVENIDA LINIVERSIDAS, 2001, APARTADO Posrai 510.3 Cusana vada, MongLozs ¿RS UTOm 62271 Mexico, ano LaBomaToORY Of Nuctrar Macneric Resonanci ( URA 1129) Pastaca Insrirute, 23 ace bu Da. Roux, 73015 Parts. FRANCE ABSTRACT. A novel erustacean-specific toxin, En3. containing 66 amino acid residues was isolated frorn the venom of the acorpion Centrurortes noxis Hoffmann. lt is stabilized by four disuláde bridges. formed berween Cvs12-Cys65, Cys16-Cy341, Cvs25-Cyad6 and Cys29-Cya 43. Toxicity teses revealed that Cn$ is a toxin tha añíects arthropods but pot mammals. However, at high concentfatiots, En5 docs displace the mamnmal-specific toxin En2 from rar brain synaprormomes. The conceneration of Cnó3 that produces half.maximal inhibicion (1€,,) was estimated to be 100 Mt, Seguence comparison of Cn$ with toxin Cn, a marmmal-specific toxin from the same acorpion showed 1he premenue of two sequence 1 strerches. a positions 30 co 38 and 49 co 59, where the majority of che difirrences are concentrated. On the th Of CNS it is dJemonatrated char these two sequence +ererches form a continuous surface región, near the site chought to bind ta the sodium din h channel. We assume chaz chis region might boi E species speciá COMP esrsiol 1168/3:315-322, 1997. E 1997 Elsevier Sciente ne. KEY WORDS. Amino acid c channel, species specificity. three-dimensional olla INTRODUCTION Scorpion toxins have been shown to affect ion permeabiliry ofexcitable ceils (1). Four differene families of peptides have been described, which specifically recognize membrane- bound proteins, Na*-channels (1,2,3), K7-channels (4,5), Cl "-channels (6) and Ca7?-channels (7). Despice the face thar the primary seructures of these proteins can be quite different: (3), their cthrec-dimensional structure is extremely similar. Except for che Ca"7-channels speciiic scorpion tox- ima, whose structure is seill unknown (7). all these toxins were shown to contain a core structure, formed by an a hebix and a three-stranded Aiheer that are connected by two disulnde bridges formed betueen two conserved se- quente arrecches, Oys-X-X-X-Cys and Cys-X-Cy as, where X isa variable amino acid (9-11) Alisa FEDTIFA TEgucdos E Lounval, E Posuni. Imbiuto of Brorechnol- AM. Acverida Univer IL, Aportado Portal 510-3, Cuer- 77 TIOS Fon (5273) 172335, E- ona Na ES ell ecul: pora: mu- En, Cenmrurockos novias Horfimann; CM-Celfulose, car- honymethi Leeflulose RE-tosin. tuu teduced and carturumetho Late 'H-NMR, proron nuelear magaros reonans Receved 29 June 190: ecepted 6 September 1995. CS F iñe toxin, scorpion toxins, sodium All known Na7-channel specific scorpion toxins are com- posed of 61-70 amino acid residues, srabilized by four distl- fde bridges (3,1216). According to toxiciry tests, binding experiments or electrophysiological experiments, they can be divided into roxins tha: are specifically toxic to mammals or arthropods. The term “specific,” however, does not mean “exclusively effective" bur refers zo low toxicity or afánity in one group and/or higher coxicicy or afániry in the arher. There are many reports of roxins thar show: effects towards borh maramals and arthropods (17-20). Mammal-3peciñic toxins can be grouped into ar-toxims binding to site 3 of mammal Na*-channels, slowing down their inactivarion process, and ¿toxins binding to site 4 of the channel affecting the acrivation of the channel (21,22) Displacement experiments on exclrtarory tissues 3howed that the two binding sites are not related (21,23). Comparing structural features, - and (Zroxins vary in the size of two Ílvop regions, the J-loop and the B-loop (24). Arthropod-+peciñc toxins have been tested 50 fas mainly in imsects (13,17-20), eg, plowfly larvae, crickets, cock- raaches, and some of them in crusraceans (13,17,25), e.g.. erayfishes and cochinillas. Insect crcoxims show the classic ceroxin effect on insect sodium channels (17,26). This type c;::o.np. Bt~'C'.h•m. Phnk>I. .:.I. 1168. u. l. rp. JU-l??. 1997 .'f"•lchr e t"cn:r, t u;h c~nc.enrratioru, CnS J cs J11rlai;:e t e am al-spcc.iñc. toxin CnZ riu rar bl'il1n 'l·n.11rro...., e-s. The c.:ini;:enrraunn of n5 char produces h.tlr-maxi .a.I ,nhibirion (J~) """:U nrim.ue.J t be 100 µl\I. cqucni:e c .. "lmp.lnk:ln c-f n5 """lth t in n2, a a mal-spcc16c t ln ñu t e u e SCl,,)l'f'ii;Jn, .-howeJ che rrc:ten.:e ..,( r o sc~uenc.c succ.:hes, at pcuirlons JO co JB anJ 49 co SB, here thc ~juriry ~fche diffcrences are i;:..,n.:cntr:ueJ. n che thrce-d1mcrulonal nruc.rure of n5 it Is de orutratcd that thesc t o sequencc tcrccc:he1 for .11 c~nunuous turf:1ce rca1on near the stte thou¡:ht to b1nd to the to.:liu c .. nnel. \X.'e auu e rh;n th1.- rcamn hihr loe 1mrhc.accJ In dctennln1n¡r srecles 1r-ccificiri.·. C MP atoc:H•M PHYllOL l 68;3:JIS-l!!. 9; . .C 199"':' IJc\·lcr Sc1encc lnc. EY ""'OllDS. mmo ac.1.J tc~uencc, C.:nrrun>id.tJ no.n"!, crusraccan·•~lfic toxin, scorpion t..,illins. to.:liu ch.11nnel, •recae.- 1pc.:.1ricir), thr.:c-Jimcn.-1 .. •n.JI modclhna IN UCTION S.:orpi..,n tuxins han~ bcen sho n to affe.:c ion ¡:oermeabilir)" f cxcital:-le ce lis ( 1 ). Four.:l1fferenc fa ihe'i ofpe¡:ociJes ha\·e Nen Jescri~. hich s¡:oeciñc.dly re.: .... ¡ni:e cmt-rane· Nund r'«"ltelns, a··channds (l,2.3), ·-channcl:1 (4,5), l"-channels (6) anJ ca:--channcls (7l. Despm~ che facc chac che ¡:orimar)· scru.:cures of thcsc rr'3teins can be .:¡uite drffen:nc (S), c cir chrec-Jimcnsion31 nru..:rure i.t cxrremel~· si il.lr. ExCCi"C r .... r che ca:--channels ~re.:iric scorpite scructure is uill unkn~-."·n (7 ). ali the:se to. . xin:s efe sh.,"·n to C•"'lnt.:111n a c .. -.re uru.:curn nu.::lc:ir m.:i111nc11..-: to<• .. •n.1n.:c. "•••·...J !, J n" I~ • ...:.: .. r1cJ 6 5..rrc t>cr 1~6. li "''n a·· a nel s eclfi.: sc r ion c xins re - NSeJ fól- 0 a ino acid rcsi.:lues, uabili:ed by four disul- fide brida:es (J,12-16). .:cordina to toxlclcy tests, binJina "r ri enu r electror l-'Sioloaical ex~rlmenu, r y n i\·i cd inco r ins th.ar are spcclfically tolclc t a mals r arthro¡:oods. he rer "s eclhc," howc~·er, does or ean "'cxd sh'el)· effeccive" ut refers t lo"· toxiclt)· r aíñ it)· In one ¡r ur a J/or hi¡h~r roxicir)· or affiniry i rhe .·nhet. · here are an)· re¡:"Orts í r ins t at sho""' efiects t ards both am al.s and arrhr.:iro.:fs ( 17-20). ~lammal·spcciñc [OXins can ~e ¡:rou¡:'C'(f into a•tolClns t-i ding t tit f .i mal :--.=a-·channels, sl lng n t eer l acti acion roceu, d ~rox1ns i din¡ t sire 4 f thc .:hannel, aífectin¡ the acci"·ation of the channel (:! l ,:!:! ). isrlace cnc cxrcri enu on exdtatot)" cissucs s cJ c at t e c o b1nd1ne tit s are ot relaced ( ,23). o r'aring structural feat1.1res, a- an..i ~toxlns vary in t c si:e f '"· k-op regions, 1he J-loo¡:o and the ·loop (24). rt r J-s¡:occ1ñc t ins h.;we ~een cestcd so far ainly i insc.:u (IJ, -20). e.:r., blo3wt1,.· lar ae, crickets, ck· rcia.:hes, d s e í [ e i cr stacearu ( 3.17,25). e.e., cra tishes a d c chinillas. l scct a-coxln:i: s t e das.sic O'·tOlCin effc:cr on insccr s.xl1um channds ( 17 ,26). This C)•pe ... 1,.1fto,.;ins ar.: N11.:\.·.:J to> t>inJ to rc.:c¡:-t.:tr sit.: 3 (:?6). Toxin Tsy(al,..,., c.illcJ T:. \"ti) ff\1m thc ?-:c ..... ·-\X.º..,rlJ ..:o~IL"n Ti- r,u1 s~m1kitus ¡,.a P.r .. -.s.tn that sh,:.""-s t.,xi.: .:ri';:.:u in ins.:cu and in m:tmmah llS.1.7). P,.T.:>xins likc Tsyare thought t..:. bln.! ro th.: rec:crr .. -.r sitc -l on inH".:t sod1um ch.lnnc:h <=6). .-\n as¡:-cct ""·hi.:h J1sdn¡¡:uish~ tOKins •s:ainH tru.:.:t ,.._.,,;hum ch.lnncls ir .. 1m thr- mcr t:.ln N funh.:r d1,•iJcJ 1nt._... cxcit3t..,ry anJ d.:rrr.uant hlxins, .:ou~in.i: a c.1ntr.:1.:rory '"' flac:dJ ¡:oou,1h·si,;. r~~­ u .. ·.:h· (;:S). &.1th r..ixin ''Tes .J1srb.:c e:i.:h .,thcr t:?S-3.)). tour th.:ir r.:.:cri.'r sit6 ar.: n .. .,, iJcnril::tl (31). Thc qu.:.d .. ">n wh\· fCL'fT'k"'n toxin m .... tc.:ules vdth thcir simibr thrcc..J1mcnti._,nal ,;.,¡,J sh .... w m:irkeJ .hñ'Crence:J in th.:ir iun..:ti • ..,n.11 char.uacrbtic:s, i.c .• sr-.:..:ihc: afñnit\' t ... ., s.,...,. dium ch:lnneh of R r'·lft1..:ular animal r-h\·la. sutl tC"m:lins undear. R,uhC"r sm.iill Jiiferen..:.:s. i . .:., -s1n¡;le amin•"' a..:iJ m • .....t.iñ.:.Ui•"'nt w1th1n thc cnu..:.d binJ1n¡; rc¡tl .... n ui thc ••'Sin t., it:t re..:erc..,r. s..ecm t..:> \:-e ..:>ne s:"U"iblc cxrl.1nauon. Thus far. th.:rc ha" bcen httle information ruHiihcJ c:onceming th.: i.JC"ntihc:.nion i.>f ..:.:n:un r.:¡i..-.n> or reotiJue:s that mi¡zht Ji:tcrminc thc s~c1ricit\' ..:>i $.:•"'r¡"i•"'" t.:>x1ns. ln rh.: rries.:nt con1mun1.::.ltiC1n thr.:oc oure.;u of .J. ""'""'el cru .. ta..:.:-.1n·•rc..:tri.:: t..:"sin. Cn5, fr..,m thc ~·'rf'ii.>n c .. ,.trun>· ;J..oj nn:..iuJ, :are r'fé"lo.:ont.:-J: l) che i.s..-,l.iu .... n. thc Jct.:ormin;1· tinn \..lÍ thC rrim.iry 4UU.:'tufC anJ thc J:""'Sltl•"'" oithc J.1~ult\Jc t>riJ1i1c;, ~) 1ts ot¡:occies "rcc:1h.:tt\· anJ ab1luy t.:> C•..,mr.:te with th.:o mamm.il· .. ¡:-c.::1ñ..: ti.>Mn Cn~ f.,,.,r bindin~ ,.,,., rae brain syn· art.~"'nlC:S .1n..i 3) a sc..:¡uen.::e .:: .. ,m¡:.-ari$..:>n .. -.iCn5 with mam· m.11·s¡:"ie.::iñ..: t ... -.,.;ins .-.( thc ¡::cnut Cenm1roiJ.i¡ resultina in thc tJenuñ..:ath..,n "'( a .:ontinu.-.ut re~••"'" on the surface of thc t•'xin m .... te.:ulc, whi.:h m1i;ht ~e rc,.po.ln .. il:-lc f.;,r th.:ir src.:i• ri..:ity. ~IATERIALS A:r-."D METHODS S.0..rc:e of Vornom 'Vcn,:,m from S.:'-'ll"k•nt uf the !>r"Ccies Centrurod.es no.,;1w H,...ffm.1nn v.·a.s .. ,bt.1ineJ b\· clc..:tn..:..11 stimul.u1.:-n of th.:o an• a.:-sthcu:cJ anim.ils. The vcn .. ,m w.u rcn1trcn.Ji=J i.n "·arcr :in.! c:cntrit'u1J:cJ for 15 nun at 10 . .:'C0 x •· Suhe~ucnth·. tt w;b fri=i=:e .JricJ anJ Lcrt at -:.:-,,c. ChC"Tnical and Reaaenu Onty an3\ytt.:::al ¡,r:iJi= i:hcmi..:.31:. "c::ri= uic::J thr.:iui;h .. ,ut thit wi.:irk. Rcai,.:nu f .. -.r 5e~t1en.:1n~ wcri= all C1bta1ncJ ir..:im :-..tithGcn/B1 ..... .,e . .u.:h, D..,,.¡,.¡ .. ,n ... .,f ~till1r.::iri= (Burhngt .. ,n. ~t • .\. l. Ai:ct...,nitrilc anJ tntlu1."ra..:cuc: a.;iJ "ere ft ... ,m P1er.:c (R......,:Lfor.!, ILl. Tn.·¡:"'l-in anJ c:h-rm ..... t~·r'l-in "ere:: 5e4ucn.:.: ~r.1Je c::n:\·mcs (r ... m S.."'é'hrtnJ!!cr !\t.,nnheim (!\t.1nnheim. Gcrm.,n\·). Fr .... tc:ue 'VS ir.."'m Sr.irh;i.k,.,;o.:.:"1d .:i1or¿1u wa;. kinJly rri.> .. ·iJeJ t-..· Dr. Sn:t.n ~brtin (Sl~tH. Ekth.:.,.fa, !\IDL 5c¡:"h.1Jes 0-5..:" (m.:J1um·~r.lJ.i=) ";u ¡:"ur..:h.1~c::J fr,,m Fh.um.1..:ia Fmc Chc::m1.:.ll~ (L'f'¡:":t.ll.i, Swc::..ic::nl. carh.-.:..\·· m.:th\"l·..:cllul~c lCM·3:l ir.::im \X.'h.ltm.,n (Chft..,.,n, NJ>. Rca~cnu f.,r rc..iuc:tlon anJ. alkylat1on wcrc ""'btalncJ from Sig:ma (St U..ub, ~tO). Ocl.;ini:cJ, doublc distill.:J water was uu-d. throu¡¡hout. Scparadon Proccdwrc.s Si.>lublc \.•cn...,m from thc sc:orplon Ccnm1roid.::s noxius Hoff· mann was •cr.iratcd b\0 chr..:imato¡::n.phlc rroc::cdurcs as car• her Jc~r1l:-cJ (S,3:). Bricíl\·· thc hnt rurlh..:ati.:>n seer con• sbted 1n a gel ñhracion stcp u:tin& a Sc¡:>haJcx 0-50 column. F.:>r funhcr ruri.r\.:ation thc m.itenal v.·at arrlicd onto a c:ar· Nlm O to 0.5 ~t 1'aCl. The t:hird and lan ¡:iurlñcation seer was c:onduc:tc..i .,.,na \'t•atcu (fl..11llirore Co .• M1lforJ., ~tA. USA) hiih ¡:-cri.:>rm.lncc li4uid chn.,matogr.:irh\· (HPLC) system usan¡: a C .. re\·o:rsc ¡:"h:i.,c .:::olumn (VyJac, His¡:-eria. CA). For dctail~ refer to .:onc5~nJ1n¡ ñ~rc lc¡cnJ. Thc homeoacne- 1t~· of thc r.:sulttng c1..,mponenu wcrc a:sscned b\· threc inde· · ren..icnt mean'l: HPLC scraration on a Cu rc .. ·ene rhoue micn...,r .... rc c..:>lumn (: mm l.D.) usln¡ thc Watcn S\"Stcm tMillir--.,re Ce>., ~lilí.:-.rd, MA. U.S.A.). ¡:i..:>ly:ic:~·lamlJc ¡el cle.:tr .. ,¡:ih.:irc'liS in ai:iJic: c • ..,nduioru (3)) or ln ¡:irn.eni:c of w..i1utn J.::iJ.:ql >ulfatc (H) and mkro:sc::~"u::nclng as Jc- s.:ribcJ rcl"""" Bio•a.ssays Lcthality tCH:lo wcrc rcrt-..irmcJ In three distinc:t: s¡:-eclcs of animals, followin¡ ar¡:-ro\'cJ ¡:"rotoc:ols b.,· ~he Animal Carc Commiut..~n .;;if thc ln .. titutc ot"Bi.::ic.:c:hn.::it.."ti:\·· Adult albino mi.:c {nu.in CDl. ª"·cu¡;,e b,:,J.y weight 20 ¡) were uscJ t.:l tese thc vari ..... ut i:hr.:>m.Jitogr.1rhic frai:tions includtn¡; the ru· rihc.:l t .. ,xin. A ¡:wcn amciunt of ¡:"rotein d1!isoh·cd ln ?C'C' µl ¡:"hos¡:oh.ite•ruffcrc.J satine (PB5) was 1njectc.:l intrapcriconc· alh.·. Bioauo\.,·s with lnsccts anJ c:rustai:ean> were ¡:-ert·orrnc.:l using cr1d:.eu (.~h.wCJ S¡:"¡:".) an.:l freshwatcr crayfuhes (CarnNrdli..s moru.::urnah-cd in 2C' µl water.wcrc injected As c .. -.ntrol c....:¡:"crimenu te5t an1mals were i.njectcJ with rurc PS5 ... ,r w .uer. Prinia.T)' Stri.tc:rure Deterniinarfon of Cn.5 Thc amino ac:1d se..:¡uence of toxin Cn3 was obtaincJ b\· Jircc:t •e..:¡ucnc:ing thc nauvc te>lxin (RC·t..:ixin) a:5 ""·ell as fragments ¡encr• ateJ. bv en:,·m.u1.: .:le.1vai:c .;,( RC·toxin. The redui:tion of che t~.,i..in "ith dtthi..-,thre1t,...l, thc all.:.,·lation v.·ith iódoai:etic a..:1d anJ thc cn:vmnuc: cle:wal!?.: with t~'p!iin. chymotr1~in and ¡:"r..:ic.:.1,e VS "c::rc rerformcd as Jcs.:ril:-cd ()5,36). Thc ¡:"Cf'tlJcs rr....Ju..:cJ k-y cn:.,·mati.: h\·Jr<.)h·sis were seraratc.i ~.,. HFLC as des.:nl:-cd {37). Mti:n'.>S~...¡ucni:c dctcrminatlon wa.o carne.! out w1th a ~htl1¡;:cn Pr"'5cqucnc.:r moJ.:l 66....""'0 (Oh.-isi .. ,n etf!\.hlli¡:-.."'f'e Co. :..tnf~.,r.J.1'.t.~. U.S.A.) usin~ ror...,... t~..C~lh "'ºlth thc f'C('ti.Jc Cithcer a.J:S<)r\:-ce.J ~"Ir Cl0Wn\cndy atto'.\i:hcd to Sc..¡uel.:Jn~ mc:mbrancs (Ar)o·I a1ninc " ... r DlTC) as rre.,·l~--.wty .Jces-:ribc:J ()5-3f\. Amin ... , aciJ an.'\l\·tis w;.u rcrformcJ on famrli:i,, h~·· dC\..,l\>-:eJ. in 6 X HCl with C.5°b phcnol at 11..:'lºC in cva.:u• ateJ, '-•MlcJ tul:-c:i a:1 Je,¡cril:-.e.J (38). Dctcrmination of Dbul/itk Bridacs ,'\.\iquL.,U (u,¡uall~· 100 µ~ \'r'Otein) oí nau,·e Cn5 werc d1. gcneJ. "":ith tr'if'"'"· ch~·m~.,t1·'¡:~in an.J cnJoro=rtiJa,i:i VS. or a o,:,.,mrin.ui .. ,n of thc~c cn:ymes. Thc .:ort'ellf'lnd1nil ¡:'e¡"• t1Ji:i1 werc ~.-.n:itcJ \:-)· HFLC ami :oe'4ucnccJ ufin¡: thc J."n.."'• r....:..i\ dc....:r1MJ a\:<..ivc. To:rin Bindin& to Rat e ... ain Syna¡no10tncs The ruriri.catl,.,nofrat brain fynaJ."t .. .,~mH (fraction Pll anJ l-inJ1n4°.Jbrl;..:cmcnr assa'¡t wcrc p-erf<.lm'\cJ as dc.i.:ri.i-eJ. (39). Bri.efly. rat l:oraln mcml:or01ncs "ºere aJJc:J to a buffcrcJ soluti.:•n 04~ mM :-,:.,et. 5 m~t KCl, !.5 m~l CaCl:. l.S mM Mi;SO •• !..:'! m~I Trb·HCl. r-H f.4 • ..:".l'\:1 65 . ..\) .. .,f ::•1. lal:-clcd Cn 2 with or with....,ut unlabclo:-d t..,ln C~1-ccllulL"i0: g¡\·in~ 14 sub·fr.:tcti. .. •ns, as dcs.:ril-e.! in Ji:it.lil in (S,3~). Fra.:ti .. in 11·5 lthc tlith .: ... .,m¡-\.,ncnt fr,1m thc SeT.tr.lti"""" on C~\·..:dlu· IL.,'1-Cl w,"". O\"t r.1x1.: h""' nii..:e. t>ut t ... , in!c.:t:- an..! .::ru~r.1.:eans. \':.'e rur11ieJ th1~ lr.1.:u ... ,n íurthcr lo\· tc::\·cr,..: ¡:oh.he HrLC lF1.:. l l. In L'"lr..lo:r t • ., i;:u ... r.tntc::c lt:> ¡-urit"!-·· che ñr'th .: .. "'lt\f'"nent ,,;,f thc ii:hr • .,m.u • .,~r:;im ¡p.,·i:in 1n Fi~. l \\3;; ri:i•1rrhi:iJ t.:i an HPLC C1. rc.,·c::r-..: r-ho'.\~C' colurnn (f1~. l. tn;;.:tl. Thc h1,.1m.._.,. ~cncit\· oí rhc ol:-tain.:..i roe¡-u..ic n:imcJ Cn5 wa~ ii:.,nfirme..i l:oy i;cl clectr.::irh.::ir.: .. h (,;bt:\ n .... t sh .. •nn} ;in..i l-"· d1re.:t ~o:· .;¡uc::n.:ino; thc n.ui"c r-c::tttJ.: .. ~ .-1ni::lo: '-'c~1ui:in..: ... ,.\·~~ .-t-. r.unc::J f,,r th ... S-tcrmm.11 ¡-o:r-uJo:: KEOYL\""SK::-TGX· KYGXLLLGX:-.:E (\\her.:: X h ,i. l-l.1n\... ~r-.1.:.: ii: • .,rr.:-;-.. •nJ:n.::: t • ., .:.,·!C:in g:;i,.·c an unc...¡ui.,·o.:al ]17 F1G. 1. HPLC •ep11ratlon of to111;in Cn5. Sub-&.cdon 11°5 l 500 pal from the -cond purification step on CJ¡.l•ceUulo.c hee !lolaterial and Methods) was appUed to a seml•¡trepal'a• th:e C .. re'-·ene•phuc ..:olumn l:Z5 cm JC l crn t.D •• pankle •l=e 10 ,._rn, Vydac, H"t·•peria, u.s.A.) and Mparated durina 61) mln U•lna a linear sradient from .aludan A (0.12°0 trlfluoricacetic add in "ªter) to 6Cl""o aolutlon B {acetonhrlle in pre.rnce of 0.1~ lrifluoroa..:etlc acid1. Cornponent 5, t.• bcled M·\th a sta.r, cone•pondt to Cn5. The lnset shoW9 th• pro61e of the re-chrom•toaraphy of Cn5 on an HPLC e,. re ... ·ene ph111e column u•in¡r. the linear aradient alven above. d1rc..:t anlino ac1..i 1.:.1~1o:n.:i:i u¡- "" ro::.iJue ar t"'<-""'SltiC"ln 51 .. ..\ tn,Ttic fr.1~m.:-nt (clut.:~i :it S3 man in a 9C' min graJicnt- J.i.ra not thown) ot' the RC•t ...... xin resultc:J in an º"·erlarpinp: s.:.:¡ui:in.:c deri.nin¡; rc:siJucs 31 i.i 5~. An ali~uot .,( the samc tc¡'.'tiJc Wol.f d110!eHe..t "·1rh trNe.i:..: vs. Th.: sur•¡'.'eptiJc (Tl \.'$). dutin~ at ~9.~0 011n. ~;we tho:- amin ... , acid resl• Juc: "''"" iJcnnlicJ \:-\· amm • ., .l.:1J an;.lni!- .,.,f the fu\\ lcn¡;th t ... •l Xw-Glu- ly el cu- Pro Armas adal eguerilos uete obramed Pe Minute aude purñed by HILO utrer che clerivage e Enf ch tn ps : mun. The nymber on top of the a A ñ E UEncon Xxx mes Fun avs + the pusttion of cistime (a comperent ch. repridy te Ts ai il. Tire Percen prtentheter Moss al Puros the in ad srgrence and engritts Cher je pei plus one additional serine, We concluded thar the fase posi ción, aran acid 66, was occupied by a serine. These find. ings were confrmed by che amino acid sequence deduced from the nucleotide seguence of the ¿ODXA clune Engel encoding roxin Ca (40) DETERMINATION OF THE DISULFIDE BRIDGES. Several ali- gue of native Cn5 were hydrolvzed with erypsio follawed by an additional cleavage with chvmotrepsin. The resulung peptides were separated by reverse phase HPLC and se- yguerved. Over forty ditrerent fractions were sequence d (nor shown), some of which gave two amino ende per step. indi. catiny the presence of two peptides cannected br a disulñide bridge (dimeric pepride)d. Table 1 shows four sequences char allowed us to propose how the disulñide bridges are arranged in che nacive toxin. The dimer eluring ar 23.75 min gave sequences enmsisteno wrth che Jisulide bridge Cos I6-CO +. Similady. eche pepride-pair elurma ac 31.90 min vcorre- sponded to peprido frazments around che disulide Pridue Crs25-Erdo. The oligomer elutine at 36.14 gerve three se- quenves from nhich che disulide bridee Cis12-Crs63 was ifentiñed. since the remauning pepuide of the irimerio se- yuence correponded 20 the pair of Cvsl6 and Cy>4 1. al- trendy identified, Finallo, the peptide elutina ar 36.62 min wave a dimeric sequence compatible with the disulíñde bridye Cv:29-Cy5+ Specios Specificity Lecthaticr resto mice showed rhar Cn 3 is ner roxic up to a quanciy al 370 ta per lO e average body weighr. En con- trase. in arthropued» the injection of Cn3 yielded roxié ef- fevts 39 excitability, paralvois and death. In borh crickets Jarcia et al, 100 bin din g “S 1C n2 to p, au e] L ml 1 A AL j O e 8 ” 6 > —tog [peptide] (M) FIG. 3. Displacement of '-Cn2 binding to rat brain 3ynap- ctosome membranes by Cas. £ brain synaptosome tnrem- branes (90 ug/200 ¿sl per assay) were incubated witch 300 px of“N.Cn2 at room temperature for 1 hr, in the presence of increasing concentracion of native Cn? (2) or ECn3 (8), then filtered and counted as described in Marecrials and Methods. One hundred percent binding was obtained in ab- 3ence of Cn3. All values are means of triplicates. a crarfishes, the oaser of zoxicicy lies ardoses of less than O e per g body weighe, Nevertheless, appiyinr 20 ¿tg in ES we observed a fast recuperacion (after 30 min) whereas che toxic effect in cravfishes was rogar and longer lastine (more chan 6 hr). The onset of lethaliy (ar least one test animal died of intoxication) in erickers was detected ar 150 e per e Pody weight whereas in crayishes ac coniderably lower doses. ar 30 e per g body weighe. in erayñshes a preliminary LD: was determined using three groups af six test animals applving doses of 23, 30 and 35 An per e body weighe (results not shown). From this data a LO: 023.5 ee per s body weight was estimated. Biínding and Displacement Assays la order to obtain adudrrronal ntormatida On the specincity of coxin Cn, its binding properties to ear brain stnapto” somes were studied usina the mammal-specific toxin En2 as a comparison. Figure 3 shows the resules of binding and ,.. c. o~rcia ~t l. BLE l. rnlno• :fdwquence fhet:eropolymericpep d- n1u ndlna 10 e i• Jfide ri ••• f Cn !I 0 l"IJQn PLC mino -.:ld "•nc• n'11'9pondl.n• flftinl •l•l'Df'Olt"m•r i•• lfid• 11.rid•• )l.~ J .l.f 1 ! ) .. .5 Oh· T•·r·C'l' · H·.-\1"' Oh·X,..11· Lr., 1 ! l .. 5 " A-m·Ol.,·Ch·.C)"S·A~·Lu .o\J.1. tw· Oh··C'rS 1 ! ) .. Ñr•Thr.011.··C"'l'S $.tr-X.... .-o\.n-Oln·Ol•·CH1.· ••• I •rJ 1 : 1 01.,.c,·$- .-.. •.11..01.,.oh·Leu·r,,.. u !- u6S •·•IC"-C•HI The lil''"'" .nn•n.• ...:1.J ~urn.:.e• ,..,,.. ..... ro11ne.f t-.· m1<.:r. _ _,.,.,.n.:1nli' rcr• 11.t- ,...,. .. ·.J ..... r C.ili f"t • l ... 1•.l!l'"ut"Cn5 .. uh ¡:-•on .in.J . lnm ... !,."J:_:~~.:~:.':..:," .. "~~L'',.:::,::•:;-.;.;::;.~:;;~",, r;:;·~r::~~:;;·r:J!~; C'f:O: ro:;..,,. t•• e '"''"""" .,; .. ''º"""' l.1 .:.. r-•n.,.nr h.u .. ¡.. .. ,..¡.., o1r 1 .. 'X" n111 e '"'""J"l'nJ• f•' d'll• "'"""'" ..._ .,,. Jl'Ull•nc ....,, .. .,.rn r ,,..,nrh .. ..,. ,.._. • ..,,...,..,.J f-.1...-.J o•n t .. .1i 1n.• .1.:1.J w.¡ ..... n.:e .11'1.l v :•nur1.; .:fr.1•.1•~ ,,..,..,.,. ,. .. ., .. rl t nc Jjiri11n.JI ff"t1nc. \'tºc C("Jndu.:fcj t .n t c Jan r iai· rittn. min•"I .:t.J 6. \\"iH ()o:CUf'h:.:I t;.,· 1 r1ne. hete ñn.:1- p crc .. i rir e.J \· t e d inu i.J co..1ucni:e J'cJ' o::eJ fn.i r e lC<."Jfide :da. ne ndred c-t.:enr i dina ....-.. obuin~ • .- • .:e í nS. U .. ·•l i:• ete e•n• í l lic•r". n.J i:rarli,;hc,. t t!'nn.s.:-r 0ÍtL,X1i:in· l1et dL'"J.ses cifloe-s.s n ! ..... µ-; r r f..:odr eight. ?\:"oe- .. ·erthcle", rrll·im: 0 µ i cri.:koe-t1 u·c cif.-,,er .. ·.,.J .sr ci: r.:rar10n Caft t .:tn .. i.Jc:"r.11:-I~· ki er J .. 1,,c:< •• 1r J.._, µfi!. rrr ¡r ....J)· right. I o::.r.1~ri,.hr1 r chm1 .1ry O._. Wd)" cighr a.s c-1rimared. i i g Qnd isplQ•"•!T11o!nt ,..\..:sJa~.s In •• ..:f"'°r .. ~ t.•~rJ1n .1.J.J1n .. , .1I 1nf ... •r .1t1 .. 1n ~in 1 e rcdrii:it)· i tt.)xin nS, u t-1nJing rr..~r.:-rrit:'s r r e f:.r.1in s~·narto• :....•n1c• u-ere .st .11cd t1-s1n}! r c mamm.11·.s~ciri.: r .. ~:ocin Cn2 • .t .:u p.ttU·•"'"· i re: J :sh.iws c sulu i 1 d1ng displacement experiments accomplished with i:tt-CnZ and CnS. Toxln Cn5 displaced labeleJ Cn:= "'·ith a difference offourordet1 ofmaanltude wirh resp.ect t.., thedisplacement bv non-labeled Cn2. 'The 50% inhibition consrants IC1.: •·ere decermlned to be 16 nM and 100 µ~( for CnZ and CnS, r-cspecrively. DISCUSSION ln chis communlcation we repon rhe amino acid sequence o( •n unknown toxin of Cennvroides noJdws Hoffmann which y,·e named Cn5. The amino acid sequence corre• sponds to a mature pepride derived from a precursor oí whlch the cONA was reported earlier (4"). The determina• tion oí the full amino acid sequence by peptide chemi.nry resulred to be impon:anr. because the comparison M.·ith che •mino acid sequence deduced from the cDNA shoM."J chat the roxin is •)·nrhesi:e-d in 1.it.o as a pre-pco-pepdde. The precunor lncludn a si,enal pepride of 19 amino acids and two addicional baslc residues in the C-tenninal. The pro- c~ins ofrhe C·terminal "- counrerpart in mam· mal-sreciti.; toxlru. The position of rhe d1sulriJe bridi'c-s. C)·sl2-C)·s65, Cl·sl6·C~-s.J1, C~·s2.5-Crs46 and C)·s29-C~·s4S, corresponds ro che t)·pical pdttem found In rhe major10· of sodium-ch3n• nel·hindm¡ tC"lxins M.·ith che exception of excitatory insect• s¡:oecitic toxins from okl·"-·orld scorpions ( 16). Ha,·ing a lonj' J-IO('IJ:" (residues 16 ro 24) and a short B-loop (rcsi.::luc-s 42 tL, 45), Cn.5 bdongs srructurally to che group of ,O.roxins. The bio!ngk:al assa)·s su¡:-¡:"Ort rhe abo,·c obsen.·ar1on of Cn5 bcing an arrhropod-spcciñc t~xin. le d1d noc sho"" <1ny S)·m¡:oromsoftoxii::it}° rowa•.:fs mammab using up ro 570µ¡¡./ 2" a ª'"cra¡:e bod)· wci¡ht m.Juse. In rhis rcspcct, it is impor- rant ro nocc, th<1t a M:Orpion of rhe s¡:-ecies C.rnrruroi.:ks nox- iw.s can pttJ,·idc up to 5.J µ¡: 'l.·cnon ¡:-er sinj¡?le clecrricalf)- . .............. - ...... .. ~L i~U- FIG. •· Seq11ence com~ o( .uchropod•specUic: (A) •ncl m.mm•l-9pecJfic (BJ to.U.• ofllhe ••n111 Cen~ C•P9 we,.. lnuoduced to tnmdmiJ:e llmllaria.... llelow each eo.U. f.nú.lt" lhe con-n.slJJ ~uence b •h- whic:h ... ......,. .. the MqL1enc• llloillh the moe.t ~ntmd.._ .,.,&no 9CJd. X •a.nd• for • VU'iab&. ._..iclLle Witt- no ob'l.iou• pNf....nce. Cnl (•J), Cnl and CnJ (4.3, .... ), Cn• (4ZJ ...... CnlO (8. s. .. Usko, C. G•rcla. B. Becerril, M. De...,..._. LD. PoNen.I, in p-p.) arw &om Crn~ ncudu .. c .. n frum C"trn· ~••ull'ú•u• •U'9il•u• e-. ... v1ew 8J, C•EYl 0 C•Ev.Z UMI C•EvJ _. from Cr11a•u-oidr• ~ulp./u-"6• Ewin• (5•). Clll ( IJJ 0 CUlm UJ) and CUl (J9) tTDln Crnlnl,.,.,.. ~· /,inpldu., CU 1 liom Crntl'U.l'Oldr. inliun.N• in,.,.._Ns ()9 J •nd Cltl &omi CrnD'UTOIJr. U.rnpidu• t.com.Aau (J6J, The Yerdc•I ban indicare klenticy of che re•pecdYe --WLI.._ scimulated exrraccion (3). Thus, the maximum dOfes we ap .. plied per mousc is approx1marel)· 10 timn hiaher than the amount of ,•cnom prC"lduced b)· a sin,¡le scorplon in a alven clme. ln concrast ro the absence ofroxic effects in mlce, Cn5 shows roxic c-ffecu a¡:oplym,¡ 2C' J4/a a...-cra¡:e body wd1hc C'tÍ arrhro¡:-ods (o;rid:.cu and cra\·ñshcs). Therefore, CnS can be coruidered a ro:ocin "'"·irh hi~h specihctq,· to"-·ards arthro('Ods. The comparbon of its acti,·1t)" In insects venus CNStaceans shO\\ºS thar it is more effecti\·e in cn.istace.ins. In order to ln...-escieare rhe extenr and thc molecular base ofthe spc-cic-s speci6cityofCn5 furrher, wc compared ir with mammal•s¡:occiñ.:: roxins ofrhe acnus Centntroides, especial!~· With to!'ll:in en:= of Co.?nm1To1.lc!'s no:ri1u C-fS). Cn2 has been characro::ri:ed. functi.:mallr as a P.ro:rcin (39). Therefore. it is e:oc¡:oc.::tcd to bmJ to sitc 4 at ,·erccbrato: so.:f1um channels. Lcthalit)· te.su, con.:fuctcd "·ith Cn2 in mice, shL.,wed an LDt.: of 0.4 µg/Z~ a moL1.se (45) where:is m crustaceans it did not show an...- to:r<.ic effect up ro 25 ~/a bod.)· wei1hr (S. Serrano and L. D. Pouani, un¡:oubluheJ rcsulu). Tho:: displa.::ement of i:• J-Cn2 by Cn5 and Cn2 itself showcd chat, againn our expectat1on, CnS "·as al-Je to dis• place Cn2 from its hnd1ng .sites on rat brain slo·na¡:oto.somes. Thc h1gh amount ofCn.5. neceuari: ro displ~ce Cn~. reflC""Cts rhe d1ffercnce.s in srec:1c-s Ss."eC11icltl· o( [hcse ro:xins. 8.."lth rox1ns bo:long srructurallr ro rhe ,0.[0!'ll:in clan. Th1s indi .. cace!'I that thc d1s¡:ol.accmenr sho"'·n might ~~.:fue to competi• tion for thc samc sitc. Smce Cn~ binds to si ce 4 of the Na·· channel, we expect Cn.5 to bind ro site 4 as well. The low 3%0 aihnit)' oí Cn5 t"..:>r rhc mammalian ~a--c:hannc1 mi¡:ht 1-c thc cause .. ,( thc al-5-cnc:c .. .,f a tosic rcs~nf.e abscn:eJ in mammab cvcn at his;h .:l .. "'9-cs.. \X·ñcclci .:t .21. (23) usins; thrc-c anhtop..~·:ff"eCifü: r .. ,xins: C!-E•d, CE,·2 .\n.:l C,.E,·3, from C .. ""nmcroi.Üs scul;imT•UIU E\\·ing. 1n 1:-inJing and di:frla.::c- mcnr cx('<'rimC"nts founJ n.,.-, .:vmrcriu .. in among thc anhro- ~-s~d6c: t .. "1xins anJ rh .. ,sc .. ,f rwo mammal-~¡:-cc1fü: r.;:1x- lns: Andro.:ion:d atl$tT~fis t. . ,>..in 11 {an a-r.:-xin). and C~"11mu-oi.:ks St.Jl1cUd Sl'ijimu J] (a t\r1c:al ~t.:'l~in). This a¡:"· rarC"nt Jb.crcrancy ro rhc rcsult!" .. ,f .. .,ur Hudy is n:ry hl..ely .!uc re...., rhc limitcJ .:: .. inccnrrari .. ,n ,._1.npc u~cd 1-y \'\'heder ..-r al. (.:3). \'\'hile thC'y u~ .. ·J .:: ..... n.:C"ntr:n1 .. ,nf ur h., 1 µ~1. we rcstcd C•"OCC'ntrau.,ns ur t. .... J ~ µ!'<.t. whu:h ·was rhc c~ti· matcd IC•:· Rcccntk. Q,-.rJ,,n Ccurnn¡:: in thc case of ,t1-h">xin9, i.e., that Cn5 t-1n,J,. t..., a ma.::r•">•rcccrr..."r snc 4 cin th.:o mammal "'"..,J1um .:h..1nncl. 1.-ut n...-.1 c,...actly ,._.., th.:o s..unc ,.¡t.: as en::. In th1,o. .:.-t~C thc J1!'rla.::cmcnt C<."lulJ l-c c.tu~.J l-y .tn alk-.Hcri.:: cllc.:t .:'Ir t-y Hcr1c h1ndrancc ,,f thc tw.-. t .. '>x1n" l-indin~ t•" ._..,,·crl.'lí'f'in~ s1tcs. Thc fc.;¡ucncc comr.u1,.....,n ,..,f r.:-xan Cn5 \• tth a C<...,n! th.:u rhc ;immo a.:::1d dufeorcnccs are C•~nccntratc.-d m.:unl\' 1n ''' .. -. tc..¡ueonce sttc1ches. l->ctwccn ries1Jucf. J~ to JS anJ 49 t..., 55. \'X'e aHumc that thc:i.e 1\,.,.., l'tretches are in,-,..,JvcJ m the .:lcrin1t1on of thc !hect 1'tructurc. Fntl .. ~wm¡: 1hc r-r.-.rosal ol Fon1cc1lla-Dmp!> .:r al. ( 12) """ w1ll call th1~ t1 .. ic thc- "fa.::c" ,-.,; the moleoculc. Thc a-h..-lix, in tum. 1s i;iruatc.::I ~,n the r.:ir--rack of thc- mo.Jcl. Fi~rc 5 deme>nnr.uc-s th:i.t thc '!-c.:¡ucnce nreu:hcs 3~-JS :.111J 49-55 tsh""'" m 1-lad.:J forma conunuous llur- face rci!ion at thc- ,,..,í' and lefr .. 1Je •"Í the mole-cu le. In rc-rmll ._..,( scc .. ~nJary Hru.:::ture, rcsa.:lucs 30:--3S c.:imr-riM: thc tum (rcsiducs JC-35} bc1n·c-en rhc a-hellx an.:I r.hc tl>C'cond P. nr.inJ anJ 1he ñrl't re~1Jucs of rh1s P.stranJ. Rcsiduc-s 49- 55 al'e in\·ol\'eJ 1n che thirJ {m1.:IJlel P.stranJ {rc-s1Jucs 49 anJ 5C') <1n.:I thc 1'c-¡:1nnini;:: .. .,( the C-rcrmmal (rcs1.Juc-s 51- 55) "·h1ch d.">cs n .. ..,t ,-iJ .... r-1 a r-arucul.u ,.c-ccinJary structurc. L.,rct .. ·r .:ll. (46) •• lftcr an.tlv:inµ rhc tc-conJary struc:ture e-le· 1nC'nt!'< ,,f thn.-c '"'1nt th.n .. h0"' Ju'icrenccs in the1r srcc1• ticity. :11,..~ rr ... r-.... c-J thc C-t.:rrrun.-il a~ rc-1ni; 1n ... ·ol~·cJ In the Jetcm1ina1i,1n of thc cro.-.::1cs ~rcc11i.:nv. In thb rCSf'C."Ct, u ,,. 1nrerc .. tin¡;: t<"I ncitc, that Cn5 as •"'thcr arthr0pc-.:l-spcc16c tn:>.:ins ( .. C'C Fii;. 4) c • ..,nt.i1ns rw.--. ror0l1n1C"ll at rosat1ons 52 anJ 56. Thcy are "'"f'C'.::teJ h"I .:: .. -.nfer a ccrta1n ng1Jity to rhc C.l.i.1r.:i.1.:1.:U'. no. s. Reaion o( ,·ariat.le rc-siduc .. ilC\-31'1, 49-58, colnred in dark are'\·) identific-d b~· comiu1ri,.on o(anhrorod-•~cific toxin Cn5 and man1mal•spccitic 10J1.i11 Cn?. A •race-tiilled pre1entation ofthe :-O:~IR-uru.:::turo:" o(Cn5 1F. Let.rcton, C. GarTla. LO. Possani, ~t. Ddcpierrc-, in rA-r•I ¡,. 'houn pre• •c-ntlna thc "front" of thc- n1olecul ... in thC! uprcr fi5:Ul'C! and thc ''top" in the lo\\·C!r fi¡:urc • l-acl.:r....,nc. In .:: .. r.rr.l•t. 1n en: 1hC'·C' r .. • .. 1.!u"'"' ;in· . ..._·r.ur-1eJ l-y T~·r anJ lle. r<.'~f't:O:tl'\eh·. Thc l'"'"1l-le 1nn•h· .. ·1n .. ·1n ,,(thc 1 .. l .. ·n11ti ... .:l .. urft1.:e t.:'L:l••n in thc dcrin1th•n "f thc ·1"<-'..:1c .. •¡"C.:1ri.;;1ty •~ furthcr ~ur· J'ittcJ l-y ltf. rcin¡::: ,.ltll.H<.'J .H ~he •l,l<.' ,..,( the h''IO th,n l!i thought to l-1nJ t.• th<.• dunnd. f.,r O'· .1!' udl .1,. Í••r /> t<.>x1n~ cxi!'tf. cv1Jcn.::c 1h.11 th .. · d.n ·urf.1.: ..... r th.: '""''"· foc· in¡! thc- \ 0 iewcr 1n F1;..:ur ... 5 . .:.•nt.un,. thc- .:h.1nnd-1"ind1n¡;: SllC (47-52). Th..-r ... ·l-\. •r .. .-.::1.11 UUJ'•rt.1nc ... ª"' ¡.::i\Cn hl the arnmatic cluster. f,•nn .. •J l-\ rt.·•1.fuc,. 4. 4.:", .;.::, 47 .1n.J 55 1n m;1mnl.1l-·['·..:1:i.: t .. ..in• 1r.•1U !".·\\-\\',.r!J ~"rí'•••ni;;. In .trthr,..,.....,J.,.r ... ..:1:i.: t••,111• 1h .. · .1r.•1n.H1C .:lu•tc·r 1• L''.'lotenJt.·J l-y T\r3S. Th ..... urf.t.::C' ro;:::1 .. 11. 1h.n ..... rr••r-•· ... h .. ·rc hl t-c ~rec16c11,·-Jeto:rm1n1n~. 1• .. u11.11 .. ·.l 1n 1h .. "•..:1n1t\ ··f1}.c .n~•­ matic clustC't. In f,1..:1. r .. · .. 1.lu..-.. ;~ •• n.I 'lS .1rc r-•rt ,.f n. ThC' m."lximum •• fa,.t.1n.:<.· J...,·t\• c .. ·n , ..... 1,! .. ,· .. ;.:-- '\:- .1n.J 4q_ 58 •. 1n.f thc .,;:,.,rre,.r•.,t'Jint¡l nc.uc11ot resiJue of the ar • .,mat1i: cluster in CnS i:1o 1".6 .~. c,.,n .. iJcrinl.': that thc .J1mcn .. i~n1 ofthc bin..i- in'!t .. itc ,.,f Ch.1~·bJo•to1l su"~ that ali the~ rC11oiJucs c;:.1n be 11oitu.HeJ within C'lr in rhi: lmmcJi~nc \'1dnity ,.,,- thc t-1ndiniz site anJ therc(1...,rc N ,.,.¡ intluen.:c. H .. .,wc\·er. the J11t.in.:c 'l:1vcn 11 thc Jircct d1,.. r.,n.:c l-.:n\ccn rhc Ca .1t.•m11o. it J."".,. O••t .: ... n .. iJ.:r che .. ci· t~.:t1\·c·· J1,.r.1n..:c Jc...:nt-.:J t,.· th.: :iourt:1.:c ,,f thc m .. 1lc.::ul.:-. Thc \ 0 ifu.1I 1n•rc.:th1n ... f thc thrcc-J1mcn .. i.1n,1I nru.:rurc ¡.-n1\•1..Jc,. m<.•rc inf,1rm.1u ... n in th.u rc .. rc.:t. lt re\·c.11.:-J r.hat rc,.1Jue .. }l. 33 anJ 3°' ,u.: C'rientc..1 rnthcr '•' thc ba.:L; ._ ... f thc 1n .. 1IC'.:ul.: "·h.:-rc.H r.:-fiJu.:-, 51 r.1 56 t.• thC' lcr"t .¡Je. Thc "'u ... .,u .. n r.:-m.un .. 1f rhc..c r.1rtii:ul.1r r.:s1Juc .. .:••ulJ still 1n- fü,.1.:n.:c th.: l-1nJ1n.,: ~rC'.:1ñ.:1n.· .:if r.h.:- r: .. •x1ns. In .:<.1n.:lu-i.-.n. <.•ur .: .. -.n1r.1r.uivc ,;.t:uJ1c,,. inJ1.: ue th.u th.: suri.I.:.: r.:.;:1 .. 1n .::.:imf'r¡.,.1ni1 r.:,.1Jm:-s 3,:i_3~ .:1nJ ".:)-55 nught t-.:- rc .. f''""''t-lo:: f,,, the "rC'.:1.:5 trc.:iñc1t\· ._,f .1 '"~'"· Th.: .. .: tC,C rru5: anJ rr,•56 oh Well a• thé' re,1Ju.:-, th.lt ,\f.: r.1rr •• f lrc .. ldu.: .. 3:$ .111J 5:'l ... , in .:1 .... .: .. .-1.::1n1t\• r.• thC' .u ••. m.1t1.: .:lu·t~r (ri:,,1Juc:-, '.\..:'. }~. 35. 3t-, 37. °'~· 5.:', 57). Thn u•,,.k u.u •ur~·~r.·.! :-o.1rr:.1l::- i., i:o-.1nt• /"•"'" r"i.: H''"..i,.J Hu.:"-:• . \.l.:Ji..-.tl lu•llfllf ... l;'f'l"l-!l:i: .. •41 .m..l th.: EuM~.11\ c .. mmu<1.ot\ 11...":ll"'-CT ~4 ........... 4!l1 , .. L Dr .. P·''" co ..... : ..... c:-T-~1 ..... 1..-u 11.-..:. -1:-.l41 .in.! Dt,;.-\.r ...... c~ ...... :-..111: ... :.1.".(~~.\1 ,,, s e .i.U '1 ~n .. t.i .. Jh•:o JT,11n th..• .-\l,,, .. ,..1.,.L,...-.,.,t1•Humi...·U1 f•111u..L11"'"· Q .. ·nn.m:- I•• 8 S \\:·.- ""uU fil, •• '" t~:nl.. F,.-.-n.:""1.• =..mu.!1.J. T1nt •• 1.·o1 L"'>l.:m.:nJ1. Ft.:.J., Cn• "'""'• .1n.! L-11 ... 1..1•1 S.:!J.. .... i.. fU• 1h_., .. 1.·_..hn1,·..1f ..i..~1<10:.,,:.: References l. C.urC'r.111. "\'\:. S,·ur. •t.•-..1n. th.u .•.:1 ••n , ... 1t,1.:C'·...,n~1t1' c ,....,. Jium .:h.1nn..1· in ,.,..-u.1Hc r.\..-1nl-r.tne .... ..\nnu. RC', .. rh.1rm.1- .:.•I. T.•,1.:.•I ~..:':li-~\.l-l,..:O. -· R•. 4. C.~.1r ... •n•:. E.; \"\".ml..:-. E.: r'r..••tor•n•" (.i. [".•-·.1n1. Ll°" .• ~l.1..-· h..:l.c .. ..\. ~ .. l.: .. •n., t-1.-.:l..•:.;.: •'I '"h.1.:e·Jc;cnJ..-nt ¡.,:· .:h.1n· n..-1- .. ,. ·' n.o•d '•ºTI"'" t.•'111 S.nurC' .!'"'t' .:i,:_-ll,l.;I:.'-:.. 5. ~tiu ... r. C.; !\l,.,::\Jl ... Hl.1. E.; L .. 1t.•rrC'. R,., í'h1ll1r• !\l. Ch.1· n.t-.l.•t .. ,1n. " rr .. tc:-1n 1nh1l-1t.·r •• f .. 1n.:I..- C.1···.1.:t1•.11.:J ¡..:· .:h.mnd• rr .. 111111.1111n1.1h.u\ -l.dC'r.11 mu-d.:- S.1cur..- ll l:lló- 'l,;..l.,J"'.'.'~. C! l'\:f;10 .. 1 . ..\.; !\l 1.:.:•"· JE .. :::1ri..:h .. rt:. O R. ruriri.:.111.~n .1nJ .:h.ar.1.:1eri:.1u .. 11 ,.¡ .:hl.•r.•t,•'1n. ·' .:ht. 0 r1J.,. .:h.tnnel h.:o1nJ tr·•m thC' '""··m .•r rh.: '"ll"'•'" Ccll I"h'•'·'I. :.6.+ C.\01- C.:\o->.l•l-ll ;. "\.'.11.lt,a.1. H H . ...:1rl-\. !\I ~: L~.1..-rC'r. "\\:".J. C••r.•n.1.J,,. 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EJin~un.:h ':NB . .:ll-1..:'3.I~Q:. 11. e..•nren1 ... F.o R,,,.inic:-.. r.inJ. C.o 011..¡"'"· B.: ~1oinc:. A.: Tu"'"'· f. RC"ñn .... I .,¡n1.:1urc ..... ¡ Ch.u1~J.•to•,1n: .:.>111m.•n m..,uf .. 1n ~·lll"t••n tol'l.ln• .1nJ 1n..cct Jefennn ... S..:1.:0.:,.. :: '7~: 1511-1 SZJ; 1-NI. 1!. F.•ntC'ctll.1-C.im; ... J C ... --1\.lm.b·•· R.J.: ~uJJ.nh. F.L: \X.".itt. D.D.: Bu~i.:. C. E. Thrc:-c·J1mcn.1.-.n.d ;;1n.o..:1urc ..,f • ('f••tC'ln rr.•m ~"rr1 .. ~n '.:-n••n\: . ..\ nc" ""'"'.:1u1.1l cl.-u .:if ncur .. •c..•x1n~. rr . ..:. ?'.111. . ..\.:.1J. $..:1 L·~ . ..\ 47:64%-6S.: .. "'olq:::t.:'. 11. Lck'rct .. •n. f. L'..-IC'í'•"'rre. !\!.: R.1mir ... : .. 41..S.; B.ilJcr.n.C.: r.~. ""•'"'· L.t:'l. rrmMI'"' .1n.J S!\IR rhrce_·J1mcr,_1.,n.1I .. uucrurc Je• 1crnun.111.1n ,,, " n,1\·cl cru.t.•.:e .. n 1u:..1n tr.•m the ,.,..n .. -.m ,-.f thC' ..:.•rr1 .. •n c~r.l'!""i.•.tl..Í.:l' lunpt.ÍuJ 1tmrL11u ..:.ar..ch. Bt.....:hcm. H.l l 13S-l l l1'"''1.:i.:i4 14. Lec.~".; ~t ..... •rc. C.H.: \\'.1n. 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DISCUSION Y CONCLUSIONES Con el objeto de realizar un estudio sobre la relación estructura-función de las toxinas de alacrán, iniciamos la caracterización de la toxina Cn 5 del alacrán Cantruroidas noxius Hoffmann. Algunos de los elementos que nos ofrecía esta toxina como modelo en este análisis fueron los siguientes: a) Se conocía la estructura tridimensional de una toxina muy semejante (Fontecilla-Camps, 1980), con la cual presenta una identidad de 88º/o. b) Contábamos con el gene Cngt 11, que codifica para Cn 5 (Becerril 1993). c) La toxina presenta algunas características que posiblemente nos permitirían, mediante mutaciones puntuales, analizar la participación de la región carboxilo en la función. Iniciamos el trabajo con la purificación de la toxina nativa para así poder caracterizarla. Esto con el objetivo de conocer el funcionamiento de la toxina y para tener parámetros que permitan identificar y comparar los productos de la expresión, tanto de la toxina recombinante como de las mutantes. SECUENCIA PRIMARIA DE LA TOXINA Cn 5. Los primeros datos que obtuvimos fueron respecto a la secuencia primaria, la cual corresponde con la secuencia de aminoácidos que se deriva del gene Cngt 11. Este gene codifica para una pre-proteína de 87 aminoácidos, la proteína madura que se encuentra en el veneno ha sido procesada y únicamente presenta 66 aminoácidos. Este tipo de procesamiento es similar al de otros péptidos neuroactivos y ya ha sido reportado para toxinas de alacrán (Bougis 1988, Vázquez 1993, Becerril 1993). Para las hormonas se han descrito varios tipos de estas modificaciones postraduccionales. En las toxinas de alacrán se llevan a cabo tres de estas modificaciones: la primera consiste en la eliminación del péptido sel'lal que se lleva a cabo mediante una peptidasa localizada en la membrana del retículo endoplásmico rugoso (Karp, 1990). La segunda consiste en la remoción de los aminoácidos básicos que se encuentran al final del extremo carboxilo; por lo general, en las toxinas se presentan uno o dos aminoácidos básicos. Para este corte proteolítico se han descrito diferentes carboxipeptidasas, las cuales pueden remover desde uno hasta cuatro resíduos básicos (Creighton 1993). Estos dos pasos de. maduración se han descrito para todas las toxinas de alacrán cuya secuencia nucleotídica se conoce. La tercera modificación se presenta sólo en 48 algunas toxinas y consiste en la adición de un grupo amida al extremo carboxilo de la proteína. En este proceso participan dos enzimas y es necesaria la presencia de una glicina, la cual al ser procesada actúa como donador del grupo amida (Creighton, 1993). Es por esto que en los ARN mensajeros que codifican para las toxinas se encuentra Ja información para el péptido señal, la secuencia que codifica para la proteína y los codones para uno o dos aminoácidos básicos, los cuales en ocasiones son precedidos por una glicina (Fig.2). Esta glicina participa en la amidación de la proteína, lo cual se piensa que afecta la estabilidad biológica e incluso que en algunos casos es indispensable para la actividad biológica. Todavía no se conoce el significado de este procesamiento y se ha reportado una toxina contra canales de potasio en la que la toxina recombinante no requiere la amidación para su actividad. aún cuando la toxina nativa si esta amidada (Martínez, 1996). En la secuencia de Cn 5 no se encontró esta glicina por lo que no esperábamos un péptido amidado. Se determinó la posición de los 4 puentes disulfuros, la cual corresponde a las posiciones típicas en la mayoría de las toxinas de atacrán. Esto era de esperarse, por que hasta el momento todas las toxinas de cadena larga de alacranes americanos han presentado el patrón consenso de los puentes disulfuro. Las únicas toxinas con un puente en posición atípica que se conocen son las toxinas excitatorlas contra insectos de alacranes del Viejo Mundo (Tabla 2). ACTIVIDAD BIOLOGICA Y SU AELACION CON LA ESTRUCTURA. Para hacer un análisis de la relación estructura-función es necesario definir esta función. Por lo general se utilizan, para determinar esta función alguno de los siguientes tipos de ensayo. Ensayos de toxicidad, utilizando dieferentes modelos biológicos lo cual nos permite determinar especificidad y grado de toxicidad de la molécula (determinación de LD50). Ensayos de unión, utilzando la toxina marcada radioactivamente para determinar afinidad y especificidad hacia ciertos sitios. Diferentes ensayos fisiológicos, en los cuales se puede medir el efecto funcional de la toxina sobre su receptor. A pesar de la información que estos· ensayos nos dan presentan algunas limitantes que deben considerarse al analizar la función de estas moléculas. Primero, el modelo biológico que se utiliza para determinar la actividad y especificidad de estas neurotoxinas el cual en muchas ocaciones es un organismo taxonómicamente. muy alejado de su blanco natural. Por ejemplo en el estudio de toxinas de caracoles marinos 49 (predadores de peces), arañas (predadores de insectos) y de alacranes (predadores de artrópodos) se han utilizado membranas de mamíferos para determinar la actividad y especificidad de sus toxinas. Segundo, en los ensayos de unión es común asumir que sí existe una alta afinidad por el receptor existe un efecto funcional. En la revisión sobre neurotoxinas de Adams y Olivera (1994) mencionan varios ejemplos donde se muestra que no siempre existe una relación directa entre afinidad por un receptor y efecto funcional. Los autores mencionan como un hecho biológico fundamental que todas las toxinas naturales han evolucionado para funcionar en un contexto biológico específico. Que mientras la toxina cumpla los requerimientos del organismo que la produce, todas aquellas características que no afecten la eficiencia de la toxina pueden, en princ1p10, variar libremente. Por esto pensamos que para hacer una análisis completo de la función de una toxina e intentar relacionarla con su estructura es necesario basarse en los resultados de los ensayos mencionados considerando siempre contexto biológico donde actúa dicha molécula. Los ensayos de toxicidad con la toxina Cn 5 mostraron que ésta actua sobre Insectos y crustáceos pero no sobre mamíferos (Tabla 1, artículo 2 del anexo). Se observó mayor toxicidad hacia crustáceos por lo que se determino la dosis letal media en dos organismos pertenecientes a este grupo. En Armadillidium vu/gare (cochinillas), en el cual presento una LDso un poco mayor que en Cambarel/us montezumae spp. (acociles). La cochinilla representa un modelo mas conveniente para este trabajo ya que su pequeño tamarao nos permite utilizar cantidades menores de toxina, en comparación a los acociles. Esto es una ventaja importante sobre todo para las toxinas recombinantes. Además, se hicieron ensayos de desplazamiento de la toxina 12s1-Cn 2, que es específica a mamíferos, con la Cn 5 en sinapotosomas de cerebro de rata. En contra de lo esperado se observó que la toxina Cn 5 es capaz de desplazar a la Cn 2 de mamíferos (Fig. 3 del artículo 3). Estructuralmente, las dos toxinas se pueden clasificar como toxinas tipo~ (Meves, 1984) por lo que suponemos que ambas están reconociendo el mismo sitio de union en el canaL Para la toxina Cn 2 se ha demostrado que en un canal de sodio dependiente del voltaje su actividad corresponde a una toxina tipo ~ (Dehesa-Dávila, 1996). Es de esperarse que la toxina Cn 2, por ser una toxina tipo ~. se una al sitio 4 del canal de sodio dependiente de voltaje y que la toxina Cn 5 este uniéndose al mismo sitio. Sin embargo, con los experimentos hechos 50 no podemos determinar el tipo de inhibición que existe y así identificar el sitio de unión de la toxina Cn 5. La alta concentración de toxina Cn 5 necesaria para desplazar a Ja toxina Cn 2 podría estar relacionada con la ausencia de actividad tóxica en mamíferos. En los ensayos de actividad se demostró que la toxina Cn s. aún en altas concentraciones. no presenta actividad tóxica en mamíferos (ratón) y sí en artrópodos. Otra posibilidad es que la ausencia de efectos que se observa en mamíferos sea debido a que el canal al cual se une en cerebro sea particular de ese tejido y no se encuentre en las regiones corporales a las cuales tiene acceso la toxina una vez que es inyectada en músculo. Por último esto puede ser un indicio de que, aún cuando la toxina se une al canal, no tiene ningún efecto funcional sobre el mismo. En el análisis de Ja relación estructura-función de Ja toxina Cn 5 hicimos dos comparaciones de secuencias primarias de toxinas de cadena larga de alacranes del género Centruroides. La primera comparación la hicimos con toxinas contra artrópodos y en la segunda toxinas contra mamíferos. En la comparación del grupo de toxinas con especificidad hacia artrópodos observamos que los residuos que varían con mayor frecuencia se presentan hacia el lado derecho de la molécula, en este caso dichas posiciones no presentan una continuidad clara (Fig 4, panel A, del artículo). Se pueden observar regiones donde se presentan con mayor frecuencia estos cambios como el inicio de la hélice a (aminoácidos 17 a 21) o el asa entre la segunda y tercera hebras 13 (aminoácidos 42 a 45). Diferencias entre toxinas de un mismo grupo podrían indicarnos sitios o regiones posiblemente involucrados en el grado de toxicidad. En la comparación con toxinas contra mamíferos observamos que la variación de aminoácidos se agrupa principalmente en dos regiones de la molécula, del residuo 30 al 38 y del 49 al 58. Pensamos que estas regiones podrían estar involucradas en la especificidad. Al analizar sus posiciones en la estructura tridimensional (Fig. 5, del artículo) se observó que los cambios se presentan dentro de una región continua en el lado izquierdo de las caras frontal y superior de la molécula. Estos datos apoyan la hipótesis de la participación de las prolinas, principalmente las 52 y SS, en la especificidad de las toxinas. Tomando en cuenta que en la secuencia consenso de toxinas contra mamíferos se presentan tirosina y valina, en las posiciones 52 y 56 respectivamente, se considera importante probar una mutante de Cn 5 con tirosina y valina en dichas posiciones. Con estos resultados podemos diseñar algunas mutantes que nos permitan analizar la 51 relación estructura-función. Para evaluar el efecto de estas mutaciones será necesario. además de los ensayos de toxicidad y unión a membranas. contar con un ensayo que nos permita medir el efecto directo al receptor. EX PRES ION. Para la expresión del gene Cngt 11 decidimos ensayar en un sistema procariote: Escherichia coli. Las razones de elegir este sistema fueron dos. Primero, los datos que encontramos en la literatura nos indicaban que la expresión de toxinas de cadena larga recombinantes ha sido problemática: sin importar el sistema empleado la producción de toxina ha sido muy pobre. Se podría pensar que por ser una proteína eucariote el sistema ideal sería uno eucariote; sin embargo, esto no ha sido así. En los sistemas eucariotes que se han probado la producción de toxina activa ha sido muy baja (Bougis 1989, Dee 1990, Maeda 1991. Martin-Eauclaire 1994). Segundo, la expresión de genes heterólogos en bacteria es hasta el momento el sistema más sencillo y económico para la producción de proteínas con fines de investigación o comercialización (Georgiou. 1996). Las desventajas que con frecuencia se presentan al expresar en E. coli son las siguientes: 1) que la proteína no presente Ja estructura nativa, 2) que sea reconocida por la maquinaria proteolítica de la célula y; 3) que en este sistema no se pueden realizar modificaciones postraduccionales de sistemas eucariotes. Para este proyecto las modificaciones postraduccionales, no representan un problema pues para la toxina Cn 5 ya se conocen cuáles son estas modificaciones y se pueden obtener los mismos resultados con la edición del gene mediante PCR. El unico paso de maduración de las toxinas de alacrán que requiere un sistema eucariote es fa amidación que para esta toxina no se presenta y por lo tanto no requerimos de un sistema eucariote. Las otras dos desventajas no se pueden predecir y es necesario experimentar con cada proteína que se planee expresar. Además, cada día surgen nuevas estrategias que permiten minimizar estas desventajas y así obtener una proteína activa de cultivos en E. coli (Georgiou 1 996, Makrides 1996). Por ejemplo, para obtener proteínas cuya estructuración requiere de la formación de· puentes disulfuro, se ha optado por dirigir la proteína expresada al espacio periplásmico. En este compartimiento existe un ambiente oxidante, se encuentran proteínas que participan en el plegamiento y la concentración de proteínas es mucho menor que en citoplasma (Georgiou, 1996). Todas estas condiciones favorecen el plegamiento de proteínas con puentes 52 disulfuro. Para el transporte de proteínas a través de la membrana normalmente es necesario la presencia de una región de la secuencia que actué como señal de secreción. Este péptido señal consiste en una región de la secuencia, fa cual no se encuentra presente en la proteína madura y que sirve para iniciar el transporte a través de las membranas citoplásmica en procariotes o la del retículo endoplásmico en eucariotes (Von Heijne, 1986). Ya se han descrito las secuencias para varios péptidos señal de E. coli. lo cual permite la construcción de los vectores necesarios para la expresión en periplasma. En el citoplasma el ambiente reductor favorece Ja agregación de las proteínas que presentan puentes disulfuro (Georgiou 1996, Makrides 1996). Estas proteínas, al no presentar la estructura nativa, exponen superficies hidrofóbicas que favorecen la agregación intermolecular. Esta agregación de moléculas es la base para la formación de cuerpos de inclusión que son agregados de alta densidad de Ja proteína expresada. Otra estrategia común para la expresión citopfásmica es expresar la proteína de interés unida a una proteína bacteriana (Makrides, 1996). De esta forma la proteína queda protegida de la degradación por proteasas. Adicionalmente en muchos casos la proteína acarreadora favorece la solubilidad y facilita la purificación de la proteína de interés. Es común diseñar un sistema de separación mediante cromatografía de afinidad para la proteína acarreadora. Para este proyecto utilizamos tres vectores, los cuales nos ofrecen diferentes características para expresar proteínas heterólogas en bacterias. Decidimos ensayar diferentes estrategias de expresión, esperando encontrar una que nos diera la cantidad de proteína adecuada para desarrollar el proyecto. Esto podría ser producción de proteína activa o inactiva. En el caso de proteína inactiva, ésta podría ser recuperada mediante un proceso de plegamiento in vitro. La primer construcción nos permitió expresar a Cn 5 en citoplasma como péptido de fusión, unida a una proteína acarreadora que es propia de la bacteria (mbp). Esta fusión ayudó a evitar que la proteína fuera reconocida por las proteasas de la célula. Con este sistema no esperábamos, por estar en citoplasma, que Ja toxina presentara la estructura nativa ya que presenta 4 puentes disulfuro. Además, la proteína acarreadora podría estar interfiriendo en el plegamiento. Sin embargo, esperábamos tener una cantidad adecuada como para permitirnos establecer un protocolo de plegamiento in vitro. En este sistema, además del sitio de corte del factor 53 Xa que nos permite liberar la toxina del péptido acarreador, se introdujo un codón para metionina lo cual nos permite hacer un corte con CNBr y así obtener una toxina recombinante que presente el extremo amino de la toxina nativa. Con este sistema obtuvimos un alto rendimiento (aproximadamente 20°/o de la proteína total) lo cual sugiere que el reconocimiento por proteasas fue muy poco gracias a la presencia de la proteína acarreadora. También este producto se mantuvo en forma soluble gracias a la proteína acarreadora, pues aún cuando la concentración fue muy alta no se presentaron problemas de agregación de la proteína. El corte con factor Xa nos dio únicamente dos péptidos del tamaño esperado. Sin embargo, una separación eficiente de estos productos no fue posible debido a la formación de polímeros de la toxina. El corte con bromuro de cianógeno resultó poco conveniente debido a la presencia de ocho metioninas en la proteína acarreadora. La segunda construcción dirige la proteína hacia el espacio periplásmico, donde es posible la formación de los puentes disulfuro y por lo tanto la correcta estructu'ración. En esta construcción utilizamos el péptido señal propio de la toxina, el cual presenta todas las regiones necesarias para actuar como señal de exportación. El sitio de corte cumple con los requerimientos necesarios para ser reconocido por una aminopeptidasa (Van Heijne, 1986), por lo que esperábamos que el producto se dirigiera a periplasma y presentara el extremo amino y la estructura de la toxina nativa. Este sistema lo consideramos muy ventajoso, pues en caso de que el péptido señal fuera reconocido nos permitiría obtener una toxina con la estructura nativa, sin necesidad de efectuar algún tipo de corte para liberar el extremo amino o proceso de plegamiento. El principal inconveniente de este sistema fue que la secuencia entera es extrana a la bacteria, por lo que existe mayor posibilidad de que sea substrato de la maquinaria proteolítica de la célula. Otro inconveniente de este sistema fue no tener un sistema de purificación eficiente. Nuestros resultados indican que la expresión fue muy poco eficiente o el reconocimiento por proteasas muy alto ya que sólo pudimos confirmar la expresión de la toxina mediante ensayos de ELISA. Otra posibilidad es que la proteína esté sufriendo un fenómeno de agregación y por lo tanto no la encontramos en él material soluble. En este caso, sería recomendable recuperar el material agregado, sólo si éste se encuentra en periplasma, pues si está en citoplasma, la toxina estaría unida al péptido señal y no contamos con un protocolo de corte para liberar a la toxina recombinante. 54 La tercera construcción es también dirigida al espacio periplásmico, pero el péptido señal es propio de la bacteria (Omp A) lo cual asegura que éste sea reconocido por la célula. Además de exportar la proteína a periplasma, el péptido señal tiene Ja ventaja de ser bacteriano por lo que el reconocimiento por proteasas deberá ser menor. Además, en esta construcción se adiciona a la proteína una cola de histidinas, Ja cual presenta afinidad a metales y facilita así su aislamiento. Para liberar a la proteína de Ja región de histidinas se introdujo una metionina que nos permitiera hacer un corte con bromuro de cianógeno y así obtener una toxina recombinante que presente el extremo amino naUvo. Otra ventaja de este sistema es que por tener un péptido señal bacteriana el reconocimiento por las proteasas deberá ser menor que en el segundo sistema. Los resultados obtenidos parecen indicar que asi fue pues con este sistema logramos obtener un rendimiento de aproximadamente 2°/o de la proteína total. En este caso se presentó un problema de purificación, pues sólo fue posible hacerlo en condiciones desnaturalizantes. Esto puede indicarnos que la proteína esta formando agregados, ya sea en citoplasma o periplasma, por lo que las histidinas no se encuentran expuestas. Una vez que se desnaturaliza la proteína o el agregado, las histidinas quedan expuestas y es posible aislar el péptido mediante cromatografía de afinidad. Este sistema nos permitió obtener el material suficiente para realizar ensayos de plegamiento in vítro e iniciar la caracterización de Ja toxina recombinante. Consideramos que este sistema fue exitoso ya que tuvo: primero, un nivel de expresión alto y segundo, en éste no se dio un proceso, cuantitativamente importante, de degradación por proteasas de la proteína recombinante. Además, la purificación mediante cromatografía de afinidad es una ventaja muy importante. En los tres casos logramos expresar la toxina recombinante, con niveles de producción muy diferentes en cada caso, sin embargo, en los tres casos podríamos implementar estrategias que lleven a mejorar el nivel de producción o el nivel de proteína activa. Para la expresión en citoplasma el nivel de producción se puede elevar considerablemente mediante cultivos de alta densidad. Estos cultivos permiten obtener más de 100g de células/I (peso húmedo). Sin embargo, esta estrategia no nos aumentaría directamente el rendimiento de proteína activa y el rendimiento actual es suficiente para nuestros 55 requerimientos. En el caso de la expresión periplásmica se pueden implementar estrategias para obtener la proteína activa tanto a nivel de fermentación o mediante técnicas de ADN recombinante (Georgiou 1996, Mackrides 1996). Para la fermentación se pueden modificar las condiciones de temperatura y composición del medio, a condiciones que favorezcan el plegamiento y reduzcan la agregación de proteínas en periplasma. Bajar la temperatura durante el periodo de crecimiento del cultivo, sobre todo después de la inducción, es una técnica que ha sido ampliamente usada para la obtención de proteínas activas. Otra opción para evitar la agregación y obtener una proteína activa es bajar el nivel de síntesis de proteínas, ya sea utilizando un promotor débil o reduciendo las condiciones de inducción_ Una de las estrategias más sencillas para obtener mejores rendimientos de proteínas activas, es modificar el medio de cultivo mediante la adición de reactivos que favorecen directa o indirectamente el plegamiento de proteínas (Georgiou, 1996). Como ejemplo, Blackwell et al.. (1991) realizaron un trabajo en el cual logran incrementar la producción de proteína activa cuatrocientas veces. Esto lo llevan a cabo manteniendo el cultivo bajo estrés osmótico, producido por la adición de sorbitol directamente al medio de cultivo. Otros aditivos que favorecen la expresión de proteínas solubles en periplasma incluyen al etanol (induce la expresión de proteínas de choque térmico), tioles y disulfuros de bajo peso molecular (modifican el potencial redox del espacio periplásmico) (Georgiou 1996, Makrides 1996). Para la segunda estrategia las técnicas de ADN recombinante nos permiten modificar el transporte y el plegamiento de las proteínas, pues es posible ce-expresar proteínas que participan en estos procesos (Dueñas, 1994). Por ejemplo, algunas proteínas que serían útiles en la expresión de esta toxina son: proteína disulfuro isomerasa, proteína prolil isomerasa y chaperonas del tipo Gro EL (Gething 1992, Saibil 1994). La primera comprende varias enzimas, tanto procariotes como eucariotes, que participan en el plegamiento de proteínas con puentes disulfuro (Freedman 1994, Derman 1993). Estas proteínas catalizan las reacciones de intercambio tiol-disulfuro y, dependiendo del péptido sustrato y del potencial redox, promueven la formación, isomerización o reducción de los disulfuros. Estas proteínas no determinan las vías de plegamiento de las proteínas, más bien facilitan la formación del conjunto correcto de disulfuros mediante un rápido rearreglo de los puentes disulfuros incorrectos (Fischer, 1990). Las 56 proteínas que presentan actividad de peptidil prolil cis-trans isomerasas catalizan la reacción de isomerización del enlace peptídico que precede a algunas prolinas. Se ha visto que en ausencia de dicha proteína la isomerización constituye una barrera cinética importante que impide la rápida estructuración de la proteína cuando la posición del enlace es en cis (Brandts 1 975, Texter 1 992, Weissman 1 995). Otro grupo de prole ínas, a las que ahora se conoce con el nombre colectiva de chaperonas. funcionan in vivo no como catalizadores de la formación de la estructura sino. en el reconocimiento y estabilización de los intermediarios durante el plegamiento de los péptidos (Gething 1992, Saibil 1994). De esta forma evitan la formación de estructuras aberrantes y dirigen los péptidos hacia vias de plegamiento biológicamente productivas. Las chaperonas incluso se han descrito como cajas o compartimentos que actuan separando a la proteína del ambiente y ofreciendo asi un espacio adecuado para la correcta estructuración (Ellis, 1996). PLEGAMIENTO in vitro. Hasta el momento se tiene un conocimiento "primitivo·• sobre el mecanismo mediante el cual las proteínas llegan a su conformación nativa dentro de la célula, pero aún en caso de lograr decifrarlo, es difícil pensar que condiciones idénticas se puedan aplicar para en procesos de plegamiento in vitro. Frecuentemente la eficiencia del plegamiento in vitro as baja en comparación con el plegamiento in vivo, y comunmente se requiere emplear concentraciones de proteína y condiciones físico- químicas muy diferentes a las que ocurren en la célula (Gething, 1992). En general para obtener una proteína biológicamente activa, se requiere que su cadena peptídica presente una conformación tridimensional específica. Esta estructura nativa está determinada por su secuencia primaria; pero únicamente bajo ciertas condiciones físicas del medio. Un aumento en las características caotrópicas del solvente favorece la desnaturalización de la proteína, la cual puede volver a su estado nativo una vez que las condiciones del medio sean adecuadas. Cada proteína presenta características propias de desnaturalización y renaturalización por lo que no existe una técnica de renaturalización común para todas las proteínas. Se considera que las variables más importantes para encontrar las condiciones de plegamiento de una proteína son: concentración, pH, temperatura, fuerza iónica y agentes caotrópicos (Rainer, 1990). Además, para proteínas con puentes disulfuro un factor que influye 57 sustancialmente tanto en la tasa como en fa vía de plegamiento, es el potencial redox de la solución de renaturalización. El agente redox debe presentarse tanto en su forma oxidada como reducida para permitir el rearreglo de los puentes disulfuro incorrectos. los cuales se generan rápidamente al inicio de la reoxidación (Fischer, 1990). En este trabajo ensayamos varios protocolos de plegamiento de la proteína recambinante en los cuales hicimos modificaciones de uno o varios de estas parámetros. Sin embargo. en la mayoría de los ensayos el porcentaje de renaturalización fue muy bajo. En los ensayos de plegamiento en Jos cuales utilizamos la toxina expresada coma péptido de fusión. consideramos que además de los problemas intrínsecos del plegamiento de la toxina, la presencia del péptido acarreador (mbp) puede ser un problema adicional importante. Es posible que el péptido acarreador influya en el proceso de plegamiento evitando la estructuración y favoreciendo fa agregación. Sin embargo, los ensayos con el péptido liberado • con factor Xa a con bromuro de cianógeno, el incremento en la renaturalización no fue significativo. Consideramos que Ja presencia de otros péptidos en la mezcla de reacción puede estar influenciando de forma importante el proceso de renaturalización, especialmente el corte can bromuro de cianógeno en el cual se obtienen varios péptidos, ya que la proteína acarreadora presenta ocho metioninas. Al presentarse estos problemas en el plegamiento in vitro con las toxinas recambinantes decidimos determinar las condiciones de plegamiento para la toxina nativa y después continuar con la toxina recombinante. Pensamos que era importante determinar estas condiciones para Cn 5; primera, por que así podríamos descartar que es un problema intrínseca de la toxina recombinante y segundo por que era necesario tener dichas condiciones como marca de referncia para los ensayos con la toxina recombinante. Encontramos que, aún para la toxina nativa fue difícil definir las condiciones que nos permitieran obtener un rendimiento alto en el proceso de renaturalización. No obstante, en todos los ensayos de plegamiento utilizando fa toxina nativa logramos obtener proteína renaturalizada. Pensamos que el principal factor fue la pureza del péptido que al no estar contaminado con otros péptidos fa reacción de plegamiento se favorece. Con Ja toxina nativa encontramos condiciones que nos permitieron recuperar aproximadamente 30 °/o del material y este fue el rendimiento más alto que logramos obtener. Los datos de plegamiento in vitro nos indican que para esta proteína la 58 renaturalización no es un proceso fácilmente reversible. Suponemos que esta baja recuperación se está dando por que existe competencia entre el proceso de plegamiento y la agregación de moléculas desnaturalizadas o parcialmente renaturalizadas. Durante el plegamiento in vitro el fenómeno de agregación es considerablemente importante ya que los intermediarios cinéticos presentan una alta tendencia de agregación transitoria debida a que exponen gran parte de sus regiones hidrofóbicas. Fischer & Schmid (1990) explican que este fenómeno se presenta porque no se han encontrado las condiciones adecuadas de la solución de plegamiento o que puede reflejar un "problema genuino" del plegamiento in vitro. Mencionan que un problema verdadero de plegamiento in vitro se presenta cuando el proceso incluye barreras cinéticas producidas por modificaciones covalentes, como la formación de puentes disulfuro o por la isomerización cis-trans del enlace peptídico en el caso de las cis- prolinas presentes en la proteína nativa. La toxina CnS, además de ocho cisternas que forman cuatro puentes disulfuro, presenta cuatro prolinas de las cuales tres participan en enlaces trans y una.la prolina 59, en cis. Estos datos fueron aportados por un estudio preliminar de NMR a la toxina Cn 5 (datos no publicado) y por comparación con los datos estructurales de toxinas similares; cristalografía de rayos-x de la toxina CsEv3 (Almassy, 1983) y NMR de la toxina Cll 1 (Lebreton, 1994). Estas tres toxinas homólogas presentan una alta similitud en secuencia primaria. El proceso de plegamiento para proteínas que no presentan puentes disulfuro puede realizarse en cuestión de milisegundos, en contraste con el plegamiento in vitro de toxinas que si los presentan, el cual puede tomar horas e incluso días (Bardwell, 1994). Para el caso de proteínas con puentes disulfuro múltiples el número de combinaciones posibles aumenta considerablemente. Por ejemplo, para la toxina Cn 5 que presenta cuatro puentes disulfuro existen 105 posibles (Jaenick and Rudolph, 1990) y sólo una de ellas representa el arreglo nativo. Además, para la formación completa del juego de puentes disulfuro es necesario que los grupos sulfhidrilos correspondientes se mantengan accesibles. Esto es. que las moléculas parcialmente plegadas y reoxidadas presenten una estructura flexible, que permita el acceso al grupo sulfhidrilo correspondiente o al agente redox. Un ejemplo ilustrativo de este problema es el plegamiento in vitro del fragmento Fab de un anticuerpo recombinante (Lilie, 1994). Este 59 fragmento presenta un plegamiento exageradamente lento y la recuperación de proteína nativa en la mayoría de los casos es menor al 10°/o. Al adicionar una enzima disulfuro isomerasa (POI) a la reacción de plegamiento se obtiene un gran incremento en la recuperación de proteína nativa, pero únicamente cuando ta POI se adiciona al inicio del plegamiento. Esto demuestra que la enzima se requiere en los estados tempranos del plegamiento para favorecer las formas productivas de las moléculas desnaturalizadas y de los intermediarios tempranos. La ARNasa T1 es otro ejemplo donde se ha detectado la falta de flexibilidad molecular debido a que la formación prematura de los puentes disulfuro nativos reduce la tasa de plegamiento in vitro (Weissman, 1995). La tasa de plegamiento para proteínas varía considerablemente y además una misma proteína puede presentar fases rápida y lenta de renaturalización. La presencia de dichas fases cinéticas en el plegamiento de un proteína se explica en algunos casos, mediante la hipótesis de la prolina propuesta por Brandts et al., en 1975. Su planteamiento asume que la fase lenta es debida al isomerismo cis-trans de las prolinas en el estado desnaturalizado. Esto es, que sólo aquella fracción de las moléculas desnaturalizadas que presente el arreglo de isómeros idénticos a la conformación nativa pueden llegar directamente al estado nativo. El resto de las moléculas deberán obtener primero el arreglo correcto de isómeros antes de pasar al estado nativo. Pero no todas las prolinas de un péptido contribuyen a la cinética de plegamiento de la misma forma. Las prolinas, cuyo enlace peptídico presenta la conformación cls en el estado nativo tienen un fuerte efecto en la cinética de plegamiento porque la configuración trans, no nativa, predomina en la proteína desnaturalizada (Schindler, 1996). Aún en el estado desnaturalizado la tasa de isomerización del enlace peptídico cis-trans es, por lo general, más lenta que la tasa de plegamiento (Weissman, 1995). Aunque se han reportado varias proteínas con actividad catalizadora de esta isomerización, ,a eficiencia de catálisis varía dependiendo de la proteína sustrato. Incluso se ha propuesto que esta reacción pudiera ser usada como mecanismo de regulación, pues es posible que la isomerización de ciertas prolinas prevenga el plegamiento de un péptido hasta que éste encuentre la isomerasa propia, la cual catalizarfa esta reacción en el tiempo y espacio adecuado (Kyte, 1995). Para la toxina Cn 5 esto pudiera suceder ya que el veneno es secretado en vesículas (Stahnke, 1978) en las que, además de la toxina, se podrían estar empacando las enzimas del procesamiento y las 60 proteínas plegadoras. La regulación del procesamiento en gránulos secretorios, donde se empaca la proteína junto con las enzimas necesarias. se ha reportado para otros péptidos neuroactivos (Sossin. 1991 ). Esto, además de propiciar un espacio adecuado para el plegamiento y procesamiento de la toxina, podría proteger al organismo de la actividad de la proteína madura. Otro aspecto que influye en la tasa de isomerización es el efecto estérico de las cadenas laterales de los aminoácidos vecinos. La isomerización se hace más lenta conforme aumenta el tamaño de la cadena lateral del aminoácido inmediato que precede a la prolina (Brandts, 1975). La toxina Cn 5 además de ocho cisteínas que forman cuatro puentes disulfuro, tiene cuatro prolinas de las cuales tres presentan enlaces trans y sólo la prolina 59 presenta enlace cis. Lo anterior ha sido propuesto a partir de datos preliminares de NMR a Ja toxina Cn 5 (Lebreton et al., datos no publicados). así como por los datos de cristalografía de rayos-X de la toxina CsEv3 (Almassy, 1983) y Jos datos de NMR de la toxina Cll 1 (Lebreton, 1994). Estas tres toxinas homólogas presentan una alta similitud en su secuencia primaria. Además, en la toxina Cn 5 el aminoácido que precede a la prolina 59 que presenta la configuración cis, es una tirosina. Con esto podemos asumir que la isomerización de la prolina 59 deberá participar de forma muy importante en la cinética de plegamiento. Considerando estas características y basándonos en los datos del plegamiento in vitro. podemos decir que la toxina Cn 5 presenta un problema genuino en el proceso de plegamiento. No podemos descartar la posibilidad de que no hemos encontrado las condiciones adecuadas de la solución de renaturalización pues pensamos que para todos los casos puede existir una condición que permita una recuperación mayoritariamente nativa. Sin embargo, para proteínas con verdaderos problemas de plegamiento deberá ser más difícil encontrar dichas condiciones. Pensamos que durante el plegamiento in vivo también existen estas barreras cinéticas. sólo que en la célula se presentan una serie de proteínas cuya función es superar esas barreras y favorecer el plegamiento evitando así Ja agregación de las proteínas. TRABAJOS RECIENTES Durante el tiempo en que se desarrolló este trabajo otros grupos trabajaron en la expresión de toxinas de cadena larga. Dos de estos grupos 61 recientemente lograron obtener toxinas recombinantes funcionales. En ambos casos se utilizó una estrategia de expresión en E. coli. En el primer trabajo expresan la toxina Bol XIV como p6plido de fusión con dos dominios de la proteína A. deS. eureus, los cuales se unen a lgG. El vector de expresión que usaron permite la secreción de la proteína por lo que recuperan proteína recombinante activa directamente del medio de cultivo. Mediante un corte con CNBr obtienen cerca de 1 mg/I de toxina recombinante ya purificada. En el per1il de HPLC obtienen dos picos de los cuales uno, que representa el33.33% de la proteína pura, muestra actividad similar a la toxina nativa. En el -gundo pico (86.68%) detectan un poco de actividad y explican que esto puede deberse a que este pico contiene material parcialmente plegado (Bouhaouala-Zahar, 1996). En el segundo trabajo hacen la expresión de la toxina Lqh alT. en forma de cuerpos de inclusión y mediante un proceso de plegamiento in vifro llegan logran obtener 5mg/I de proteína activa, esto es 10% de plegamiento (Zilberberg, 1996). Adem4s, en este trabajo hacen alteraciones a la toxina mediante mutag6nesis sitio específica. Hacen tras sustiluciones en el extremo carboxilo (V491, A50K y N54K), las cuales resultan en una disminución en la toxicidad contra mamíferos da 6.4 veces sin que asto modifique la unión a sinaptosomas da rata. En la actividad tóxica contra insectos no encuentran modificaciones, por lo que crean que estos sitios del extremo carboxilo están participando en la toxicidad hacia mamíferos. Los dos grupos siguen la misma estrategia que nosotros planteamos da expresión en Escherichia coli. Obtienen la toxina recombinante activa en cantidades tales que les permiten realizar una serie de estudios. No obstante, en ambos trabajos se observa que el proceso de plegamiento no es ni cercano al 100o/o (10°/o en el primer caso y 33% en el segundo). Estos trabajos son hasta el momento los únicos reportes de expresión eficiente de una toxina de cadena larga. Ambos trabajos apoyan la estrategia seguida en nuestro proyecto ya que en los dos hacen la expresión de toxinas de alacrán en E. coli . Concluimos que para la expresión de toxinas de cadena larga E. coli parece ser la mejor opción para expresión. De igual los forma los resultados de estos trabajos nos permiten confirmar que las toxinas de cadena larga presentan verdaderos problemas de plegamiento. 62 PERSPECTIVAS 1 o Continuar con el diseflo y expresión de toxinas mutantes que nos permitan participar en el estudio de la relación estructura-función de fas toxinas de cadena larga del veneno de alacrán. 2 o Buscar sistemas o modelos biológicos para los que Ja toxina Cn 5 presente una mayor afinidad y asf requerir de menores cantidades de toxina para los ensayos. 3" Realizar ensayos electrofisiológicos que nos permitan hacer tanto una caracterización tina de estas proteínas. así como descifrar el mecanismo de acción de las mismas. 40 Continuar con el análisis racional de los datos de estructura primaria, actividad. mecanismo de acción y estructura tridimensional. que están disponibles hasta el momento, de las toxinas que reconocen canales de sodio. Al retacionar estos tres aspectos de las toxinas podremos tener un mejor panorama para compararlas. Con lo anterior intentar inferir los razgos estructurales qua hacen las diferencias entre estas toxinas. so Utilizar a las toxinas de cadena larga como un modelo para estudiar el plegamiento de proteínas. Además del conocimiento básico sobre el plegamiento en general de las proteínas que se puede obtener, para este trabajo es particularmente importante estudiar la participación del plegamiento en Ja actividad de estas toxinas. 63 -Becerril B., Corona M., García C., Bolívar F. and Possanl L. D. (1995). Cloning of genes encoding scorpion toxlns: an Interpretativa revlew. J. Toxicol.-Toxin Reviews, 14(3): 339-357 -Selisko B., García C., Becerril B., Delepierre M. and Possanl L. D. (1996). An insect-specific toxin from Centruroides naxius Hoffmann cDNA, primary structure, three dimensional modal and electrostatlc surface potentials in comparlson with other toxln variants. Eur. J. Biochem. 242: 235-242 64 J. TOXJCOL.-TOXJN REVIEWS, 14(3), 339-357 (1995) CLOX::tNQ OP GENE• ENCOD%NQ SCORP%CX TOZ%X81 JUI :tlft"ERPRETA.T::tVS REV%EW Sa1tazar Becerri1, Miquei corona, consue1o Gare!a, Francisco Bolívar and Louriva1 D. Poasani• rnatituto de Biotecno1og!a, Universidad Naciona1 Aut6noma de MAxico, Avenida Univeraidad, 2001, Apartado Posta1 510-3, cuernavaca, Moreloa 62271, ~Axico 'l'ABLI: or COHTEHT8 ABSTRACT--------------------------------------------------------339 XNTRODUCTl:ON---------------------------------------~------------3~0 ANALYSl:S OF THE Sl:GNAL PEPT::CDE ANO 3 •NON-CODl:NG SEQUENCES-------341 cONA SEQUE:NCE ANALYS.IS------------~~--_; ____ :;__~.:.:.:.::~: ... ::_;_,;_ _____ . _____ 343 GENOMXC DNA CLONl'.NG---------~-----~-~-·-.~'~º-~~~"'.'"~~~~~~·~-"."'~~~~~~-.-."';'~~. 5 SYNTHETIC GENE CLONl:NG-----:--~-::--.--:.~.";:~~~~--:.,.:;,~~.~~~:~~:!:';:~,~7f,..;.~-=:.:.-7~~3~~ ~~~~~~~r::~~~-~~:~_s_1:_c:~~~:~~~~~~.:~~~j~º~2~~I:.:.:r:~~::l::::~::::~¡:-:, R.EFERENCES---------------~-~--~----·~.;_:~:.:,~.:_:..:..::.::_~:..:_.;.:::,'..'_:.,_;:;:.,;,~.:~'--_:~:.:_:~~.:.,;3;·2 ., .·· ,--~' Sccrpicn tcxins (Stcx) are pc1ypeptides intensive1y investigated because they are e>i:ce11ent mode1s to study protein-structure- .t"uncticn re1ationshipa and exquisita tco1s to access ion channe1 .t"unctions. Recent1y, techniquas o.t" mo1ecu1ar bio1oqy hava been used to c1cne th• genes encoding toxins spec.ir.ic .t"or i:a+-channe1s. Genes .t"rcm scorpicns or th• genus A..">dro&;t:onus, centruroide.s, Leiuru.s, T:ityu.s and Bot;hu.s hava l>een c1oned and theír nllc1eot.ide (nt} sequance daterm.inad. Data .t"rorn comp1emantary D~A (cONA) c1on.ing or stox rrom the genus be.t"ore mentioned and geno~íc c1oninq o.t" Stox genes .t"ro:n scorpions o.t" the qenus Tit:yus and A.'ldroctonus have 339 340 BECERRIL ET AL. p:rovided .i.n:Cormat.ion ~or th• deduction or the .struc:ture or the transcr~ptional units encoding tox.i.n genes o~ these scorp.ions. %~ aeems that transc.ription o:f these 9enomic reqiona 9enerates pre messenger RN'As (pre-m.RNAsJ o~ approx.i.mate1y soont contain~n9 an intron or approx~mate1y 470nt, 1ocated within the req.ion encodin9 th• si9nai peptide. Th• processing o~ thes• pra-r.tlUZAs originat•• a matur• mo1ecule or approKi~ately 330 nt. ~h• translation o~ th• :r.RNA• give precursora ot approxi::iatel.y a2-s9 ar:dno acid (aa) res.idues, vhich .in sor.ie e.ases ar• proc:essed at both anti.no- and carboxy1-terminus ends. At th• a~ino terminus, a lS-21 aa signa1 ~eptide is re1eAsed ~y a siqnai peptidase. ~t the c-terrninus, basic residues (Lys or Arg) are eli:rn1r.:4ted by a c::arbcxypeptidase .. In so::ia case•, th• c-term1na1 residues ere proeessed qiven rise to a ~ina1 a:midated aa.. In thia review., ':he in.Cormat.io.r.i availabl.e on this aubject .is surn:mar.ized .and we al.so presen1: an interpret.ive review o~ the m.a;in Stox structure kno .. ·n. \..-ith t:.h• possible ;izt.p1icationa ~or their ~unet~cn en excitab1• ce11s. %.NTRODOC'7'%0H Scorpion venor.us ccntain an asscrt~ant o~ l.c:w 1:10J.ec::ular \.'•.i7ht ~!f~~~ª(1:~f~ns¿6:p1~~x;~n~~.~ 1 !~e~:~ts~~~i~~~rn~º~~!f~d~g~rh~=f~ c~asses or toxins: po1ypeptides e~ 60-70 aa• residues whic::h a~ract the ~unc::tion or Na+-channels o~ excitable c•1l• {4.,SJ, peptide• or 3?-39 aa rasidues blockera o~ K•-ehann•1• or excitab1• ee1l.s (6-10) and non exeitab1• eel1s (11). paptid•• or 37 aa re•1dues that ar• apecir.ie ~or cnloride c:hanneJ.s (l.2J and rinal.1y, low UiOl.ecuJ.ar :mas• proteins or unkno•·n atructures 1:.hai: art'ec"C. th• c:a2•-rel.ease c:hanne1 or sareop1a•mic reticul.um (1~). Ar.iong th• best studied seorp.icn :oxi.ns (Stox) are thosa that r.u:>diry na•-chann•1• and have been c1assi~i•d as a and S (S.,14,l.S). Thi•· c::1asairic::ation has Deen prc:iposed based on tvo d.istJ..nc:'t:. phyaio109ica1 erreet• exerted ~y Stcx en th• Na•-channe2s. ~h• a- Stox• specírica11y a~~ect axona1 ccnductanee ~y a prclon9ation or th• aetion pctent.ia1 as a result cr a sl.owin9 or bl.oc~ade or the xa•-channel inaetivation (l.6-20), 'lo:hil.• a-stoxs prererentia1.ly alter the aetivation rnechanJ..sm cr thes• channels (21-23)~ l rhe abbrevLations used in th~s ehapter are: a, arornatic residue; .aa., amino acid(s); AaH, A..~~roctonus aust:raiis Hector; Arr"-~, Androctanu$ maureean:J..cua G.auret:an1cus; b, Dasic res~~ue; a3, But:ho'Cus :Ju~a:J.cus; .sot:, .sueht:s ot:e.:it:anus t:i.:neeanus; bp, .base pa~r(s); CONA, CNA comple~entary ~oRnA; c~e, ceneruroides i:J..mpi~us teeo.manus; Cngt: • c:DHA t'rc:n Cr:.H c::loned .into 1arnbda qt11; Cr.H, Cen.t:ruro:J..des ncx.i.us Hc:f'~mann; csE, ee.'1t:~ro.i.e:!es scuJ¡:t:urat::us .rwing; Css., cent::rvroidss sufrusus surLusus; h, hy~rophobic resLdue; Lqh, .Z.e:l.urus quinqueser:iat:us habraeus; Lqq., Le.iurt:6 qu1nquestr:J..at:us qu:J..nquest::riat::us; nt., nuc1eotide(s); oligonueleotida(•) .. oliqodeoxyribonuc1eotide(s); PCR, pol)'111eraa• ehaín reaction; pre- mRNA., pre-rnessen9er R:HA; Stox, scorpion toxin(s); SP, si9na1 pepe.idefs) Ts., Tjtyus serruiaeus. CLO:--"ING OF GENES 341 our qroup has contributed durinq the last seventeen years to the knowledge or the structure-function relationship or the toxins or the venom rrom several species cr Brazilian and Mexican scorpions. Purirication, chemica1 and physio1ogica1 charaeterization or more than 30 different toxins were obtained during this period (3, 2~- 26). Recent1y, we hava started to use molecular bio1ogy strategies ror cloninq, cutagenization, and heterclcgous expression or speciric stox-encoding genes (27-29). Th• first report on the clcning or stox appeared in 1989 (30). %n this work, four cONA sequenees encoding manunal-specific toxins and thre• eCNAs encoding insect-specific tcxins rrom A..~droc~onus aust:ra.i.:!s Hector (AaH), \..·ere published. Since t.hen, severa1 other cONA sequences encodi:iq Stox have been pt:.blished (27-28, 31-34). Tha purpose of this review is to present the infcrmation availab1e in the literatura in this r.:atter, as ,,.·ell as to compare the known structures obtained by eloning and direct nt sequencing, with the known runctions. At this mo~ent the knowledge is restricted to the na•-channel speeific Stox. The genes that cede 'Cor other elasses or toxina have not been cloned, excep'C t"or a c:ouple or synthetic genes, correspondin9 to x•-channe1 b1ocking peptides (35-36). ANALYS%B OF THZ S%GNAL PEPT%DEB AN'D THZ 3' NCN-COD%NQ SEQUENCES or cDNA• ENCOD%NQ STOX A c:ompari.son or the signal pepti.des (SP) enc:oded by cCNAs or represantati.ve reportad STcx is shown i.n Fig.1. They have been grouped in three distinct cat.egcries; SP or 19-20 aa resi.dues of New World STox (Centri:roides noxius and T'ityi.:s serrulatus), SP or 19 aa residues correspondinq to 01d World STox (A...,droct:onu.s austra.i~s and Leiurus quínques'f:riaeus hebraeus) and, 18 or 21 aa residues SP or Old World STox (A...,c!'roc:'tonus auseral.:!s or .Sothu.s judaicus and Le.:!urus qu.:!r.quest:ria'tt:s J:ebraeus). Cor.sensus sequences are proposed ~cr ea ch group and 'Cor the three groups together. · These sequences are in agreeDent with the rules proposed by ven Heijne (37) fer eleavage sitas in aukaryotic SP. Tor the New World Stox SP, the residues -a through -11 are :r.ostly h)'drophobic or aronatic, probably as part ot" an hydrophobic ecre. Worth mentionin9 is residue -9 '"''hich in spite et" a different eodon in eac:h eONA (27, 33), it is alwa)'s Leu. :rt is striking to o:bserve an extraordinary riehness or h)•c!ro}:)hcbic and/=r aroma.tic residues i.n the reqion -9 thro~gh -19 cr group 3 SP. rt is also re~arkable to rind a Val residue in pcsiticn -3 fer all the S? shown in Fig. 1. T'.:!t:yus serrula'tus (Ts) vrr SP ~as bee:i. ine.luc!ed in group 1, but it has severa1 conserved residues with grol.:ps 2 and 3. The comparison ot" 3 • -non-coding co::A sequences is sho,,.·n i.n Fiq. 2. The nucleotide sequences ,,.·ere a.li9r.ed a.nd gaps inserted to optimiza similarities. This align:nent allo ... ·ed us to c!et:ect several wel.1- eonserved regions including those located a.round nt is, 30, ~o, 50 and 75. Particularly conserved are the sequences 'l!rom nt 35 through 45, and 70 through so. This 1ast region contains the polyadenylation signal. Xt is nctiCeable the sirnilarity between LqhaXT and AaHIT in so~e o~ these conservad regions. Xt is not kno,,.·n ir the conserved sequences above r..entioned :might be irnp1icated in mRNA processing. The cONAs c:orresponding to cngtl::r Ceneoding toxin cnS) and cngtIV do not include a typica1 342 BECERRJL ET AL. ->O -1s -10 -1 V cngeJ'I " .. . L L H % .,. .. e L p L % a .,. .. .. C'ni;'CJ'll: " .. . L L H % .,. .. e L V L r a .,. V .. .. CnQ'CJ'V " .. • L L % % .,. .. e L V L % a .,. - - V .. .. Cngev " .. • L L H % .,. .. e L .. L V a .,. V .. .. ,..VJI " " a " % L p % s e L L L % a % V .. e c:on•. 1 .. .. . L L .. % .,. ... e L V :c. % a .,. V w ... A•HI " .. r L V H % s I. " I. - I. L H % G - V .. s AaH%%1 H N r I. V M % s :c. " L - I. I. M T a - V .. s Aaffl"J M H r I. V H % s I. " I. - I. r V T G - V .. s LvhaIT H H H I. V M % s I. .. I. - I. L I. I. a - V .. s con•. 2 .. .. r L V .. % . :c. " L - :c. L .. .,. a - V .. • A•H.tT " " r L L L r L V V I. p • H G - V L " AaH:ITl " " r L L L r I. V V L p • H G - V r " AaHl.T2 H " r L I. L r L V V L p • H G ;: V L " a;j?T2 H " L L L L L V . s " s M L L .. e V N .. con•. 3 .. " r :c. :c. L r L V V L • . .. a - V L .. 1-3 .. • z L L .. • z .. z L .. L b z z a ¡; " . V L r b " e • H a ., - r1g. 1. compar~•oa or •~gna1 peptid••· SP or representative toxin-encodinq CONA• f'ro~ New World and Old Worl.d scorp.iona are compared.. Gap• (-) were introduc•d •·her• necessary to n:ax.imiz• sirnil.arities. Th• aa res.idues or SP were numbered t'rom -1 to -21 takinq .S;IIT2 as ret'erence. A consenaua sequenc:e ,,.•as derivad f'or each c;roup or SP sequen ces. A gl.ob•l. conaensua '"''ªª deduced t'rom eac:h partial. consensua. A second poss.ibl.e global. consensus (next ~ost abundant residuea), ia al.so sho••n. For consensua sequences, X :ieans variab1• reaidue, a-aromatic residue, b-basic residue and h-hydrophobic reaidue. 10 20 30 40 'º 60 10 90 T cccuccACTTT T T ... T1 cT CCA T A.u.caG ....... , .. T 0 1cT Af.CGC1TCT~ ...... TTC;A· el T ...... TC· •• : ...... T.UU.TÓC· T· .... - • ...;, TACCA TT 't GGCAACG.liCTTT TT A 1 T GT CCACC.Lt.CA; ......... T AG• TGT A.&CGCTT CT TU TTCCAA:OT • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • TCGCAACGACT • TTT A T TGT T1 ACCUCAG ......... TA T • TGT AAC:OCTTCTT.U. TTGCA • GT T .......... t G• • • • • • • - • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • ·- T GGCAACGAC1TTT TA TT GCCCACCAAC'AGAAA TA T • T G1 .UCGCTT CTTAA TTTCAA. • T TA.AA i G •••·AA.A. T ............ • TA T• ••••TA TACCTT T A TT• 1GT T T CGCTCAA.(AT CC1 TT ACA.AA T C• A.A•• CT G• •TA.A T • • • MGT T • • • T GGCAAAAA. T MM•• •AA.A•••• TGTT • C• • • ACC• TGT A•· GAGTAAAA TCACAUG.1.4· TGT A T C·CT AA· AA.A TA.ACT CGT • • • • • • • • • • MA. T AM• ••CATA•••• ACTA••• AT ATC• TGT •• - GAACA T ........ c .. c.t.UGAA.• T GT ... T C·C1 ........ CA.A TT GA TC• ....................... TAU- ... T•T· ........ - - - ... - • - - T • • T GT A•• ••••A TA.A 1 ••TA T •CU.•• GT A T • • • T• ••CA.A T TGATC• •TA·•••••• ·AAA T A.AMT GCACA• • • • 1 A TA T• • •T ACC• TGT A· • A.A.CC,.....A• C•CAAAGAAT • CT A TC• CTG••AM TA.ACT GGT • • ••••••••AA.A T.v..\••• CA TA••• •AGTA• ••A T A T• •TA. T AA• GA TC• • • • • • • • •••CA.A T• GT A T C· C':' AA• GT A te·••·•••· AA T GTT • •A.AA T AA•••· TA T AA T C ............ • •A TT CCC· • CT AC• • TGCA T • GAA. TA T CTTTGTCA• CA.AA• ·AATC• ••U•· T AT • AC:O • • • • • • • TG• C• AA.U. T AAA• • • • GTAAACTTCA TCCA• • r~g. a. Aliqnm•nt or 3•-non-co4inq ••qu•nc••· Th• 3'-non-coding regions or the indicat•d cONAs wer• al.iqned. Gap• ror di:f'rerent St>c and cONAs were lntrodcced ,,.here necessary to maximiza simil.arity. Numbers en top or sequences are ror re~erenc• purposes only. cns is eneoded by cn~err. Sources o~ nt sequence• ar• tha same as in Fiq. 3. CLONING OF GENES 343 pol.yadenyl.ation signal. but they present a polyA tail. (27). A posaibl.e interpretation ror thi• discrepancy i• that th• region between nt 70-BO (which is rich in adenosinea), coul.d have hybridized with ol.igo(dT) to pri1:1e th• ~irst strand or cDNA synthesia and what we showed as a polyA in the case et CngtXX and cngerv, i• actual.l.y the co=ple1:1entary or such an ol.iqo (dT). cDNA BEQCEKCZ JUOALY8%• Fiq.3 shows a nt sequenc:e co:::parison bet\o.'een New Wor1d (Cngt:rr, CngtZV and TsVII; 27.33) and Old ~orld (AaHI-rrx and haHXT; 30; BjIT2; 31; LqhoIT; 32) CONA nt sequences. This cor:iparison sho••• some general. features about the Stox coding cDSA•. cDNAs encoding AaHI-AaHIXX STcx are closely re1ated. cONAs that cede ror AaHX and AaHI:IX are a1so more similar bet••een themselves than with 1:.he cDNA enc:oding Aattrr. Th• s• non-codin9 regions, SP coding regions and 3' noncoding regions are well-conserved in all th•se three cONA• (Fig. 3; al.so see reference 30). These observations indicate that AaHX- AaHIXX STox are encod•d ~y genes that r:iight have originated trom dupl.ications of an ancestral c;ene and each duplicate evo1ved independently. A similar event r-iqht hav• been responsible ror c. nox.J.us STox-encoding gene •i:r:i.ilaritie• in "''hic?'l c:CN'A• corresponding to cngerr-c~gev (27), seem to have apparently criginated a1so ~y duplications or an ancestral gene and each duplicate evol.ved independentl.y. Thus, it is c1ear that Stox are encoded by closely relatad genes probably originated frcm an ancestral. gene. It is al.so c1ear that duplicated c;enes ha.ve been cnder dif'f'•rent sel.ective pressures. For instance. s• and 3' non-coding sequences are very wel.1-conserved amonq c •• "lox.J.us or A. ai:sera.I.:l.s Stox c;enes but codinq regions show dir~e=ent levels o~ variability. In Centruroídes noxíus Hof'f'mann (Cr.H) genes, the similarity at the n~ level. is at 1east aot but at t~e aa level it is 6St (See al.so Fiq.4, below). Part or the expla~ation f'cr this phenomenon can ba f'ound in the existence o:r regions or high variability a'C. the aa 1evel., maybe, hot spots f'or mutation (27). Clear exar:iples of' this variabil.ity are the regions around residue nur..ber 10 and the carboxyl. terr.:inus. Sir.iilar cha:acteristics are present in cONAs :rrom AaH. Another impcrtant observation in this ii;ornparison is the signif'icant si:milarity bet\o.•een Lq.'JaIT and AaHI-AaHIIr cDNAs. A'T:. the nt level., Lqho.:I'r cDNA is more similar to AaHXI cCXA: a 9St simi1arity at the SP sequenca, a 72\" simi1arity at the ::iature peptide sequence anda 60t sirnilarity at 1:.he 3 1 non-codinq sequence (Figs. 1 and 3). These are clear indications that the cCNAs encodinq AaHIX and LqhoIT are speci.fied by closely rel.ated genes. It is al.so re~arkable the el.ese simi1arity o.f 1:.he 3' ncn-coding region or the cOHAs encoding ~!:oIT and A.aH.I. In spite o.f a nctic:eabl.e si:r.iilarity bet\.,:'een Lq1:C"IT and AaHIX, they ha ve di.f~erent speci.ficities. It has been demonst~ated that ~aHXI a.t:rects ~a~:mal.s (38) '\o.'hi1e LqhaI'r is hic;hl.y tcxic to insects and crustaceans but 1ess toxic 1:.o mice (20). LqhoIT (Fig. 4), see~s to be processed by r.;eans or the hydro1ysis o.f t'"'o basic aa residues at its c-terminus (32). Processing at carboxyl-terminus has been observad on1y f'or mamma1ian STox AaHI-AaH.I.I.I (30). We ha.ve reportad similar processing .ter toxin 4 o.t c. ."'Jox.J.us, in ~·hich it has been demonstrated, by rnaans o.f rnass spectrometry, that the c-terrninus o.f ~ .. -,.=in Cn4 is cysteinyl-asparagine-amide (28). Martin-Euclaire et BECERJllL ET AL • .. .. !l.•111 .... UMll ,,.,. .. 1.1na !.tYll ---~-~·--~---~--~-­ va D G T f W OS 11: • CYT•CVll -----~------------- 1r a OC 1' f V Y"•• CVTlllCWll -----~-~----=--=--­ V C 0 li T l W O D Y• CTT,CO• -----~-----------=­V• DA T l • c • T • ·CVYICP• -------------------0 G T l • c • 0111.ccvactt -----=------=-=--=-c l G T L 110 • l·GC1tL•c•t """'" """'" !,alllT ...... ..- "' u.T CTG GT• u.e: -G AGC •CG ce.e TGC ...... TAC G:OI TGC C:TG C:T• clGTL••CSTCCCTGCLL ••• A&G GAC GGT U,f CTG GTG G&C GTA ••• A.t.G cc;.c 1GC &U UG AAT TGC T&T 11,U, e o G T L v o v . e 11 .e e•• e Te -----------------== Cll:•Gtavo• s'Gl:AlllCLL 41.111 a.•1• ~·11" .IJl12 .?.l.Yll ......... ......... !.J:ltlT .!,aWtll ü•• .!,aMll .LJ;l!!:•IT IJITZ l.i.Wll ..,,.. .. """'" UMtT ,!.allltl !.t:"'f !.a"" ...,. .. UITZ .ta.VII ....... .o 10 ao r.i too no . . ' ... ..-··.. . . ca -·· --· --- •••••• '" G&C "' ,, .. TGT ..... ··- "'" AAC GGT "' ....... •GT " . e D : • :. L • e - IE e • G •• • • CCA ••• ••• ••• ••• ••• TGC Gae GGT. 'fTA 1'GT &aG ••• .r.u UC: GG:T GG:T TCG aGT " e o a ··t." e e e • 11 o a a --------------=----· • a.,. e·•··• ·1 .. ·c .. , .. L e a • a ••• ••• • •• i:..tl.T GU 1A1 1GC UC ~ 11& 1GT •CC ••• AAG AAC GGf GCf TeG UT .D·a,,-· C· •l. L C-f · I' • G & 1 1 .... '"" ........ , GA& GGf .TGC CGT ......... G.AA ta.e en C:f •••••• c•e GGT GGC TCT .,·,··•·c·c·•cl.CYA •GGI ••• AG.& Ce& TCG GGA TAC TGC GGC •C... G.AA 1GC c:;a. Alf ........ AAG GGC Te& te• ••• •· ., .. , .-,..-c 11·• 1. e.e 1 e e e•• =------------------L .... 1 G c. D .. 1 e •• e • a G G • =------------------L G l •O.- c • • • c c • c • • G G • .......... •GC ...... , T•C TG1" AAC AAC G&& •Ge •U. ... Gt• CAT 1AT G.CT coac ...... l•TC••llCTCV•T&DC uo 1'0 150 160 110 -·--~=~~~--~-=~---~ 'llCG•Ll•IGL•CVICY&L -----=~=-=-=------~ GICIFLYll'IGLACVCl'DL ••• GCT 1AT '" cu TGG =- •GT cea 1AT ""'••C GCC TGT ,., 1GC 1AT ......,. TTG llTCOll&l•.-•waCTICTCL -----------------== • T e • V • • e ,. • • a c. V e T • L =--=-------=-------.... e W 111GLalCVCll•L ••• GGt; TAT 1GC GCC 1GG CCC ••• ••• ••• ••• ••• ;cG TGT TAC 1Ge t•C G.:o CTT c. cav• aCTCTGL TAC CGC 1AT 1"Ge T•C Get TTT ••• """ ••• ••• ••• GGG TGC TGG TGC GAA "T TTG Tll'CT&• GCWCIGL TAC GCC Ta1' "'fGC "'fAC Gi:..tl. TTT ••• ••• ••• ••• ••• "G TGC 1at 'GT CA.A G~ 11& TITC.-GF 'G·CTCl.GL ••• ~ 1AT 1GC 1GC 1JA C1T ••• ••• ••• ••••••te.a 1G1.1A1 1GC TTC GGT C1& aYCCLL 1c.-c•11L tao 1ita 210 &20 2:so ccc GaT ..;e c1a ccc; ati .... "' cea : ••.••• ,ca ,;, &U ••• •• : '" e.u &GC Cea TM •o•w•lcD• ITC c ....... ccc "' .u.e GTA ccc "'' ·- "' •ca ......... tea CGG ......... tGC •Ce coc '" , ..... •o•w•tcot ••I'· cta ..... .,... ccc "' C-f CITA CGT •et ....... GGA ••••••••• CCA GGc "'"hich is not processed. Since .LqhaZT ia an insect-speciric STox and it has a e-terminal sequence compatible with the rules :t'or processin9 (39) • we propase that addJ.tiona1 elementa should be added to the previously proposed model. Z:t' th• insect-speciric STox i• exci.tatory (70 aa reaiduea i.n l•nqth). th• e-terminal or th• precursor apparently ia not processed. but ir it is or the LqhoIT t)·pe or depressant (Fiq. 4, qroup 9,) they seem to be processed. Ho·aever, the rules et' processinq are nct still clearly understood in this last group. BjZT2, ""'"hose precursor has the carboxyl-end -cys-Gly-Arq-Lys-Lys (31), is processed givin9 the ~ature carboxyl-end -cys-Gly. The expected mature carboxyl-end ir th• rules were consistent with o- amidation (39) • "''ould have been c:r·steine-ar.iide. A similar ~aturation t'or tha precursor or LqhZT2 has been recent1y reportad (34). Perhapa another rula ror th• processinq ot' Stcx \o,"Cu1d be that \o•hen th• carboxy1-end or the precursor ha• three bas.ic resi.dues. in spit• or th• presenca cr a G1y residue preced.inq a basic tripeptide,, the matur• end is qenerated af'te.r the hydrolysis or the baaic triad only. Althoush sor.ie rules t'or Stox precursor processinq are c1ear and in accorda.nce "'"ith the rules f'or processinq or neuroactive polype}:)tides (3S) • new possi.bil.ities are er.ler9in9 based en the anal.yaia or the cD~As sequences encodinq stox and the determination or the a~ seq\,¡encea o~ the carboxyl-ends or the corresponding mature Stox. These kind o:t' inter~retationa have been only possibl• by rneans ot' the cloning or toxin genes. Tha anal.ysis or cDNA sequenc•• and the aa sequencea or rnatur• toxins al1owed to postu1ata the existenc• of' new enzyr.ia ac1:ivities as the carboxypeptidasa, necessary ror the process.inq of' i:>recursor stox by •1imina.tion or three basic residues at the e- terminus as in BjZT2 or .LqhZT2. GENOM%C D~A CLON%NQ To tha best or our knowledge, cur group has published tha only t'ormal. report en the c1oninq or a scorpicn gene in which the ccrnpl.ete genonic nucleoti~e sequenee is presented (29). The gene encodin9 toxin gam..~a t'rom tha Brazilian scorpion ~íty~s serru~at~s ""'"ªª a.rnpliri.ad by PCR t'ro:m. geno:mic ONA e::ployin9 synthati.c Piq. 3. cocpariaoc or CONA nt aequencea. Th• cDNA sequences rro:m North and South American STox (27,,33) • were a1iqned with North A:t'rican STox cONAs (30-32), taking Cys codons as rererence. Gaps were inc1uded ~here necessary to maximiza sirnila.rities. Frorn North Al:'lerican Stox cONAs. we have included only cngt:r:r a.nd cngt:ZV (27). cngt%IX and Cngt:V \oo"ere not inc1uded because they ara very similar to cngt:ZX and Cngt:ZV, respactively. Tha numbers en top or the sequences ,.,•ere placed ~or rererenca purpose; they do not correspond necessari.ly with the positions in the origina1 publications. Last diqits or nurnerals are aliqned with correspondinq nt. 346 BECERRIL ET AL. Group JO 20 30 •O $0 60 2 3 4 5 6 7 e 9 I Cn2 Caal:I C.lC1 en> Cng~V Ccn•.1 CaEv1 Cn;ocll:I CaEv2 Cngtl:I C•Ev> Con•.2 C•EJ' Cn¡;-clV Cnl con•.~ :l"aVl:I rae can•.4 AaH:I Aaff:Zl:I Con•.S Z.i;-holT ~:I •oi:X:I Z.9qV Ccn•.6 KEGYLvr:IKl'tTCC'J1>1'EC1.IU..GDND1'CLRECJtQOC1'KCAC.C'rC1'Ar-----AC"lllC'THLYEQAJVWPL--P11KJl-C• KEGYLVSKSTCC'KYECl..Kl.C:DNDYCLRECKOQ)'GJ.SSGC'tCY,.r-----AC"lllC-:-HLYEQAV\"""PL--PNKT-CN KECOYLVNHSTCClllYECrlllt-cDNDYCLJlECJIOCYG .. C ... GGYCYAr-----ccwCTHLYl:OA\.'VVPL--P .. KT-ca KECYL\."El.oGTCCKYECTKl.oGONDYCLRECKAIOYCKG,.C.CYC'YAr-----GCWC"':'OLYEQAV'l."WPL--KHKT-c• KECYLVNSY'TCC'JtYECTKl.oG;:INDYC'!.IOCCKOQYCKCAGGYC't"4T-----C.CVC'THLYEQA\1'\"WPL--KNKT-C:""Gll llt&CY1,.Vl: .. STOCS.Yl:aA:l.oCDJlt'Y~C'llOOQYGltCAGcYCYAP-----~C'TKl..YEQAVVVPL--PNICT-C• 1 20 1 1 lso nnnn ªª"""""""""""""""" nnnB.'3B nar.!lnn KECYLVKKS:>CCKYDCn.'LCKNCHCNTEC',...a.KNQCGS'rC\"CY"'F-----AC'VC'EC!.PESTPT\"'PL--PNK--C'S k.l:CYLVNKSTCCKYCcnr...cKNCCC'DKCC......,.n~sl"GYCYAr-----c.cwcccLPCSTPTlºPL--PNKT-CS~ KECYLVNKSTCC'KYCC'LJU.CCNECC::OkECKAlo:.H~SYCYCYAT-----ACVCCCLPESTPTYPL--PNK--css l'-CCYLVNKSTCCl"YCCLLLCKNEGC't)):.EC'rJ.KN~CSYC'YC\"AT-----Gcwc1:cLPESTPTYPL--PNKS-CS~ l'.ECYLVKXSDGCKYGC!.K!.GCNCCCDTCC,.JJ'JllQCGSYCYC\"AT--- .. -AcvcccLPES':'PTrPt.--PNKS-c: k&OYLVWKSTOCllOYGCLZl..oGll:N'"EOCDlt&C~goc•YCYCYAr-----acwc:ccLPE:STPTYPL--PNK•-c•K& 10 20 30 "º so 60 IU>CYJ.VEK-TCCKKTCYKLC'CNDFCp,¡Jl.ECKlo'foi..HICCSYG\"'CYCF-----ccYCCCLPOS~-:'1oo·Pt.--PNIC--CT KDCYLVDV•J(GCKKNCYJtLCCp,¡DrCNRECKl'IKHl'l.CGS'ICYCYGT-----cCYCCCLSDSTPTW"PL--PNKJl.-CCG• 111.DCYt.VDA-llGCKJtNCYKLCKNOYCNJl.E:CRJ-l)o;.HP.GCSYGYC'IGF-----GCYCCCl.SOSTPTWPL--PNKT-C kJllGYLVDl:-ll0CJ:XNCYIQ..Gt:,,D"l'c:Jlf1lCCQU(.Hae<;;sYC"l'CYCr-----ccYCECLSDSTPrwPL--PNK:r.-ca:ca JO 20 30 .co so 60 k.l:CY~HE-CCKLScr J- RPSCrccR%:CC :r.-KCSS-GYCA,WP- ----AC"YCYC!.PNW"VJC"\."W"Dfl.A-TNK--C'CICJt k.l:CYJVol!>HE-CCJCTSCFl-Jl.PACTC:icYCJ(':'H:.,:Ass-cyc;.,.;p-----ACYC'YC'l."POHJJ(\'W'CIYA-TNK--c: ltECYZKIJIUC-GCltlscrt-llPZCeCZJ:J:CZJ:J:J:J(J:SS-C"l'CAW"P-----ACYCYCbPJ:J:bltV'WtlZA-TM•--c 10 20 30 40 so 60 IUU>CY lvYPNN-C\"THC\'PP-- ---cDC:..CKJ<.N-ccss-cscs TL\'PSCt.Ac..ic~LPONVP lKOT--SfUC--CT•. VRDCYlvr:ISKN-C'VYHCVPP-----cocLCXKN-GAJOCS-CY.J.VXX.XN-C\'YHCVPP-----cocLCKKN-cxxs-cscxFLhPSGLAC"oo·cxxLPDN\."PlKCIX--SXK--C.xx.Jl 10 1 1 20 1 i 40 1 150 nno ª"'ª""ºººªe"'' n.'J nr..::ui enr..~t?:'ln ~DAY1:A.JtW'YN-C'\.'YECFR---D ... YCl'ELC'TKN-GASS-CYC'Q"'AGKYCllAC'WCYALPDNVPlR\'P---CK--CHa.a V'KDCY%VDDVN-CTYrcc:R---NAYCHCECTKL•KCES-CYCQ>o:ASPYCNAC'l'CYKLPDHVRTKCP---CR--CHGa LK!>C'I' l l DDLN-C":'FFCCR---NAYCD::iCCKY.x-c..ccs-cy~ .. • ... spycr; ... cwcl.·tu..poRVS l ....rK---CJl--CN LkDGY%VOOJUf•CTFFCGR---NAYCNOECU-K•GCES•CYCQ"''ASPYCliJ.C'WCYKLPOKVRTVQA---CA-•CN LkDCY %V1'DKH•C'TF'FCCR·•-N ... YCNOCCKKK•CGES-CYCQ..,.AS PYCNACWCYK=.PORVS l KEK---C lll--CN l-ltDGT%VDD:l:M-CTrrce•---NAY~E~-Gecs-GYcg ...... s.rcNA.C'WCTJCLPDSVSJ~l:---c•--c:wz~ lO 20 30 .. o 50 60 •cic 1: G-ke ... Y J:AOPCN•C'VYEC ... 0---NSYCNOLCTKQ-CA':"S•CYCO .. "LCXYCl' ... CWCK!>LPOJlVPl Kl P---CK--CHP •ocJ:J: c-kC'-Y:IAOPEN•C'VYECAK---NSYCNOl..CTY...N-G ... t:s-cYCQW1.G1'WGNACYClDLPDKVPlRlE---cK--CHP Lqq:ZV GVJIUIAY:ZADOKN-CVYTCCS---NSYC'NTCCT .. n-ci..cs-crco .. "1.Cl"YC1',.Cl0'C:JU..PDK\'PlRlP---CK--C• Con• • ., GV1t.DAYJ:AQPCM-CV'YECAZ---•SYCWt>LC"!l'~-GAJ:S-GYCg .. '2.Glt'YC'"AC'WCID1.PDllN'PlRIP---Gll--C•P AaHJT Z.qqlT1 Con•.• .Li;-hlT2 .LqQ"lT2 •.1JT2 Ccn•.9 1 ,, . 'º 1 i i.o 1 1 $0 1 nna. º""""ª""""""ªª .. nnnnn nnr.r..'!n JC.KlfCYAVD-.SSCl'.APCC.t.L---sNYCYNCC"":'KV-H'IAOt:GYCC1.L-----scYCFCLNDCKKVLCt.SDARXJCTCD~:r• ~QYAVD-SSCJ:.APC~---SWYCYNECTJCV-•YIJ:>l"CYCCLL-----scrcrc1-"'00IUtV1.EISDJlllKl:YCD:ll:ZZl• 10 20 30 "º so 60 t>CY:IKJl.R-OCCJ(VACLl-C-NCCCDKCClCCKLSCLF-C-NCGCNKE:CKSY--ccsycyc-1o-r--wcLACWCCC1.PDEKTWKSC--':'N-T-co DCY :r R)l.k-DCCKVSC'l I -C-NCCCl'l.1'EC'\';.H- -ces F"GYc-w-:--vct. ... c~ccnLPDAVTWKSS--TN-T-CCIUC& DCY 1111..KA-DiCCKVSCLl -C-NEGCJllt.ECJUll. "l'--CCSYGYC-WT--WCLACWCCCLPOl:KTWllOJ:C--TM-T-CG JO 40 30 .ce SO 60 JCJCDCYPVOSCN-CKYCCLJC---DOYC'llCILC'LCR-P'J.:JC-GYCYW-CKVS--CYC-CLPONSPTK-T--SCK--CNPA 10 20 30 - 'º so 60 CHCYLt.J:KY"TCCl'c x•, ci-, or ca::•-channe1s, has not been reported. Reeentl.y, a synthetic gene encoding charybdotoxin (CTX), a ca2-- activated x•-channel. blocker from Leiurus quinquestriaCus venom, has been cl.oned and expressed as a ~usion protein in ~scherichia coii (35) • Reco~binant CTX showed b1ockinq and disaociation kinetica identical to the native venom toxin (35). Speci~ic mutageneaia or raco:m?a:inant CTX in combination wi.th rnechanistic anal.ysia oL single ca••-activated K•-channel.a has she.:S. sorne l.i.c;h-c en tha important region• or the toxi.n•a rnol.ecul.ar surface that interact with the channel. pore (.;l.). Another synthetic gene encodinq Margatoxin (MgTX) a vol.tage-activated K•-channe1 blocker rrom Ce::itruroide• 1r.arga:rit:atus venor.i, has also been c1oned and expressed in similar syste~s (36). Li.ke ChTX, ~gTX bl.ocks the n- type eurrent"or human T-l)""l:lphocytes (Kyl. .. 3 channel.) but cor.pared to ChTX, i.s 20-roid mere potent (36). cur group, usin9 the sarna syste:n reportad ~or tha expression of CTX~ has synthesized and expressed the gene encoding Noxiustcxin (7), a x•-channe1 blocker ~rom Ce~eruroides noxius vencm (unpubl.ished resul.ts). DEDOCED AM%~0 AC%0 SEQUENCES DER%VED FROM cDKA• ~ALYS%S ~D COMPARXSOH W%TH DXFFERE~7 PR%Y...AllY STOX SEQCENCES %n order to compare the difrerent aa sequences deduced frorn the cl.oned c. nexius cONAs (27) ""•ith other Stox, \..ºe perforJ:1.e.d a 1iteratura survey choosinq the principa1 representati'\'e t)•pes or di.rrerent STox. Thes.e aa sequences ~ere grouped acccrding to their si::ii.lari.ties, aligning them "'"ith. respect to C)•s residues and introduci.nq gaps (-) •·here necessary to ::'l.axi:rn.iz.e si::iilarities. The STox ~•re c1ustered i.nto ni.ne 9ro~ps, plus two sinql.e sequences (Fig.4). The fi.rst three groups correspond to Cent:ruroides STox. Each :main 9roup •·as a1igned and a consensus sequence ~as proposed fer each ene or them. Sorne particular di~~ere.nces a~cng groups 1-3 can be observed, especiall.y se'\.-era1 del.etions o~ ene aa residue. A distinctive feature amon9 these three 9rcups c:I! Stcx seems to be th• l.ast ~ifteen residues at the carboxy1-ter~inus. These alignrnents .i~pose the existen~e of t~ree ~ain gaps, l.ocated arter residues 19, 45 and 60 taking groups l.-4 as re~erence. The portions or the sequences al.igned with these 9aps (-), correspond to l.oops in the respective STox. The loops around resich:es 20 and ~S hava been ca11ed l.oops J and s respect.ivel.y (42). We prcpcse eonsequent1y, on a co~parati.ve basis, that 9aps could be cal.l.ed accordingl.y: gaps J and B, respectivel.y .. The third loop (around CLOS'INO OF OENES 349 position 60) which is characteristic of' excitatory insect-speciric STox (group a), is proposed to be ca11ed •'EITS" (Excitatory Insect Toxin Specif'ic). It is worth =.entioninq that in 9roup 8 Stox. a B qap is also present. An explanation ror the presence or such qaps, might be f'ound in their three-dirnensiona1 structure (43). In these STox an atypica1 disulride bridge is estab1ished between Cys residues 38 and 64. C;¡.•s 38 is located just in the vicinity cf' the reqion equ.iva1ent to locp B of' STox rrom groups s-7. Resid'Ues 63-65 ar• aituated in the spaca reservad ror a B loop. Th'Us, apparently it aeerns incompatible to hava both a B loop and a 1arger c-terminus (••• Fiq. 4, group a Stox) 1 • .-hen an at)"pical. disulride bond is f'orrned between Cys residues 38 and 64. In most cases, groups or STcx sho•·n in Fiq. 4 hava specif'ic pharrnacological properties. Fer instanee, group 1 Stcx correspond to a-type anti-rnar.unal toxins or New World seorpions. Sased en the ai:rnílarities of' tha aa seqcences. group 1 1 2 and 3, would correspond to .B-type toxins, ho;,.·ever, '"ariants .l-3 f'rcm c. scu.lpturatus have been su9gested to be a-t)•pe toxina based o:i phar:macologica1 data (42). Yet 1 they bind to the r'o'Urth si te or the Na•-chann•l•, "'"hile the 01d World a-toxins; bind to the third si.te (SO). croup 4 correspond to .13-'type Sto>< rrc::i •·h.ich TsVl.'.:C af'f'ect• maz:unal• and insects (44). Croups S-7 correspond to c-typa anti- mam:nal toxina f'rom old ~orld scorpions except LqhoI'I" "-"hich is a new insect toxin, and is not strictly selectiva !'or insects. Xt is hiqhly toxic to crustaceans and it sho,,.•s a 1cw but measurable toxicity to mica (20). Group a ccr.;prises excitatory insect- sel•ctive toxins, which induce a repetitive ~irinq in the motor nerves dua to an increas• in peak Na• currents and a vol.taqe- dependent slowinq or Na• current inactivation (45). Finall.y, group 9 comprises depressant insect-selective toxins, ~hich block act.ion potentia1s by depolarizinq axonal r.ie::il=ranes and suppressing Na• currents (46). A new insect-specir ic STo>e (.AaHIT4) , has been recently isolated rrom. Androcto.nus australis Hectcr scorpion venc:n (47). It is toxic to insects and also to r.iar.-'":'lals and cotr.petes with insect-specir.ic STOX rcr binding to the Na• channel. of' insects. Xt also ~odul.ates the bindinq of' a-type and a--::ype r.:a::-.:na1-specir'íc STox to the. r.:a?:Unalian i-:a•-channel (.;7). It is interesting to observe that this toxin (Group X) shares sorne s!::iilariti.es with New World and Ol.d World tcxin sequences. J:t is striking to observe a .;6' similarity at th• aa leve1 with tc>i:in e.os (encoded by Ci:ige.II). :rt can be surmised that ~aHIT4 has structural characteristics or both a- and a-type stox. In ract it can be cbserved fro~ Fiq.4 that it rnight have both 1oops (B and J) altheugh sr.;a1ler than the t)•pical enes. A New Wor1d Stox sharing se~uence similarities with Old ~or1d Stox is toxin V or • c. sculpeurat:us Ei.•ing. It has a strueture interrnediary bet~een o and B Stcx but it has been ~e~o~strated that it has electrophysiological characteristics oran a toxin (42). It ~oul.d be interesting to explcre the structural characteristics of' thase particular Sto>e to stuc!y •·hich dc::;ains ~eter:mine their particular properties. Another similar dual. specifícity has been observed fer a a STox (:"'sVII). ""'hi.ch ""'as found to co~pete with typica1 STox ror binding en bct.h insect and ::-.a::'l..":lal.ia.n synaptoscmes of' nervous tissues (4.;). This dual specificity 'lo•as attributed to a high :molecul.ar f'lexibility -..·hich ..... "O'Uld enable it to bind to bcth tha rnam.'"':'!al B-type and insect Na•-channe1 receptora (48) .. What AaHIT4 and TsVJ: :r STox ha ve in co::-.. '":'lon seer..s to be a molecuJ.ar ~l.e>cibil.ity putative1y attributed to a J.ack of Pro residues in their e-terminal regions (47-.;a). In this regard, it is interestinq 350 BECERRIL ET AL. to note tha.t amonq New World STcx, there is a variability in tha richnesa or Pro residuea in the 1ast 15 aa residues or tha c- termina1 region. c. scu.lpturat:us variants 1-3 and toxins, encoded by cngt:rr and cngtil:I cCHAs (9roup 2 STox), are rich in Pro reaidues, whil.e grcup 4 (T..ityus serru.latu.s) STox have only ene Pro residue in this stretch within the c-ten:inal regíon. c. scu.Ipt:urat:us variants 1-3 (-42) and tcxin cns (unpi:blished rasults),, arrects crustanceans and insects but not rna::unals. Toxins or group 1 with a presumably very similar three dimensional structure and a rel.ativel.y c:onserved seque nea with reqard to CsEv3, ar':f'ect r.iar.:.mals. Al.so a notorious varia.bility bet\o."een grcups 1 and 2 (Fig • .;) is round within tha last t"i:f"teen residues or the ca:-boxyl.-terminus, in which a variabílity in Pro riehnesa is also observed. These observations support the propcsition rnade by Lcret et al.(.io7-.ioS), in """hich one ot" the elernents involved in -che specit"icity or Stcx could ba the earboxy1-termin~s, ~ain1y re9ardin9 the presence er pro.1.ines. ?:evertheless, the relationship bet·..-een Pro riehness, mol.ecular r1exibil.ity and speci:f'icity :f'or these STcx stil.1 rernains to be de:f'ini-eivel.y established. Further~ore, the various speeies speciricity di:f"t"erences rou.nd a:r:iong r.iar.ur.al.ian, insect. and crustacean toxins are not necessaril.y due exclusivel.y to the Stox structures. Zt r.d .. ght ~·el.l. be c!ue to tha diversity o:f' Na• channel.s present in distinct tissues and or9anisrns. There is a wide variation o:f' types and sub-t:,•pes or ua• channel. :olecules (.io9-SO). Fig.4 al.so sho~s that Stox a~rectin9 Na• channels, have a pol.ypeptide chain cornprising 60-70 aa residues and cross-linked by :f'our disulride bonds (51). They shara sir.-.il.arities in their aa saquences and in their three-di~er.sional structcres as it has been demonstrated by x-ray di:f't"raction cs2-s:J), two-dir..ensional. h"'XR (43) and modelin9 with c:omputer graphic techniques (54). From these studies, it is cl.ear that scorpion toxins a:f't"ectinq ~a· c:hannel.s, have a símil.ar three-dirnensiona1 structure with a gl.cbular shape CoJT1prising three strands ot' antiparal.lel. e-sheet and ene stretch ot" a-hel.ix. The helix motir is linked to the carbcxy1-proximal strand ot" the sheet by t"'·o or the four disulride bonds. The c:,·steine pair ot' the a-hel.ix dc:rr.ain establíshing this t•·o disult'ide bonds is· spaced by a tripeptide •·hile t:he pair ot" cysteine residues ot' the carboxyl-proxirnal. strand is spac:ed by cnly one a~ residue. These structural elemen'Cs are conserved in all toxins sho~n in Fiq.4. Símil.ar el.ernents have been observed in other toxins that a:f't"ect ionic channel.s and in other nen relatad proteína (55-57). ~ third structurall.y conserved disulride bond is establis~ed bet\o."een the cysteine residue l.ocated at the rniddle strand et" the B sheet and the sec:ond rnost ar.iil'!lo proximal. c::t•steine residt.:e, except :f'or the excitatory insec'C tcxins (group a), in "''hich there are t\o."O contiquous Cys residues in their ccrrespondinq ~iddle strand ot" the a-shee'C. One ot" these establishes a positionally conservad disu1:f'ide bond and the other establishes an atypical. disul.t'ide bond with cysteine residue at position 64. The three conserved disult'ide bonds, participate in the stabil.ization ot" a strcc:tural.l.y conservad cera ot" sccrpion toxins. This structural. cera is al.so conservad in Stox at"fectir.g x•-channel.s (SS). The fourth disul:f'ide bond is estab1ished bet"-·een the most amino a~d carboxyl.-proxir.:al. cysteine residues except in grcup e toxins in •·hich .it is established bat\o.•een cysteine residues 38 and 64 (43). This di:f'.t'erence ho\o.•ever, has no substantial et't"ect on the overa.11 ccnserved fo1ding o:f' this ki.nd or toxins. The re9ions corresponding to these structura1 domains are indicated in Fig.4. The inspecti.on ot' the sequences shown in this :f'igure, permita to suppose that they al.1 adopt an evol.utionary conservad :f'ol.ding. A el.eser ana1ysis indicates that CLONINO OF GENES 351 th• di%%erent ~olecu1es can acccr...~odate insertions deletions and mutations "''hich apparently conf'er the:::t dit'f'erent speciricitiea .. 01d World stox (except qroup a and AaHZT~) have a B loop and a J gap .. New World Stox (except CsE:V) have the opposi-::e# a B qap and a J loup .. Basically, Old '°"orld Stox are considered a-Stox and New World Stox are con•idered B-Stox. Ho,.,·ever, es toxin V and varianta :Z.-3 are phar:ciacoloqically a-t)·pe but "structura.l.ly" B-type. Takinq toqether all these observations# it seems that specit'icity i• located on the loops ot' these STox. In a-toxina in Vhich the B loop is relatively conserved, it could be expeeted that speciricity depended on the c-terr.drn.:s. Zn the case of' excitatcry inaect- •p•ciric: STox (qroup B). their sp•c;:iriciti•• aeem to depend on their a~ypica1 disult'ide bridge and on their lonq c-t•rminu•. %n th• case or ~haZT, increased insect selectivity could be poasib.ly attributed to an extra Pro-reside• (reaidue 56) at th• carboxy.l- terminu• and/or to a mutation that changad Pro residue 41 ror Lya# comparad to AaH%:t. Finally. insect selectivity in c;roup 9 stex •••m• to depend en their shcrter amino termin~• and/or atypica1 J gap and B loop. Although serna indicativa t'eatures et' atructur•- apeei:f'i.c.ity relation•hip are et:.erqing, :much :mere data wil.l be requir•d in ord•r to acquire a =era co~plete understanding or th• atrueture-runction relationship cr STex. Molecular cloning or STcx gen••• and ••lected •ite-direeted =utaqeneaia should certainly he1p c1arit'yinq aome or th• structu.ra1 and :t'unctiona.l relationahip diacuased h•re. CONCt.t!8%0N8 Cor.i.p1ementary ONA and genomic cloning or stcx genes# apeci:ric ror Na•-chann•l•. ha• allo,.,•ed ua to deduce th• &tructure or the transcription u.ni.ta eneodin9 texins :t'rom the scorpions or the genus TiCyu• and .A.."'ldrocConus. Zt seez:.s that transcription or thes• genomic regions genera.tes pre ~.RNAs o:r approxi~ately SOOnt conta.ining an intron or apprcxi:ately 470 nt, located close to th• end or the rec;ion encoding th• signa1 peptide. The procesainq o:r theae pre mRNAs might c;ive a ~ature rnolecule et' approximately 330 nt. Th• translation or the mR.~Aa give po.lypeptide precursora et' approxi:mately 82-89 aa residues. ~hich in sor.e cases are processed at both enc:!s (a:mino a.nd c-ter:ninus) .. At the arnino terminus. a 18-21 aa signa.l peptidq is released by a signa1 peptidase. At th• c- terminua, basic extra resid1.:es (Lys or Arg) are alirninated by a. carboxypeptidase. Finally, \oo"hen a c;lycina residue precedes ene or two o:r these extra basic residues, th• a:mino group or thia q1ycin• i• utiliz.ed to a:midate the p:ecedinc; residue. Similaritie• in atructure and aa sequene:es provided support f'or the su9qeatien that Stox genes ha.ve evolved f'rorn an ancestra1 gene "'"hich se•ma to ha'\•e undergone severa1 duplicatiens and each du¡:ilicate have evolved indepenc:!ently. Zndependent evo1uticn e!! eaeh d\!plicate by rneans or inserticns, deletions and ~utaticns at dit'f'erent leve1s and sites~ can explain Stex varia!:lility in terr..s et' sequene:e and specirie:ity o!! action. BECER.RJL ET AL. ACkHOWLEDGEMEJtT• Thi• work vas partia11Y supported by gran'C.s .f'ror.i: Ho .... •ard HUghea Medica1 %nstitute No.75191-527104, OGAPA-IJNAM No. 205893, CONACYT No. 001B-N9105 and No. 1105-N9201. Th• technica1 aaaistanc• or Mr. Fernando Zamudio, Timoteo Olar.iendi-Por'C.uga1 and Fredy Corona.•- Va1derrama ia greatly appreciated REFER.ENCE• 1. 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POSSANI' * Departmen: of Molecular Recognition and Structural Biolog> Institute of Biotechnology. Universidad Nacional Autonoma de Mexico. Cuemavaca. MM + Laboratory of clear Magnetic Resonanse ¿(CNRS URA 1129) Pasteur Institute. Paris, France 1Received 5 July 1996) — EJB 96 1000/3 Scorpion 1oxins acting an sodium channels differ in their specificity. Toxie peptides specific towards marmmals and arihropods (insects and/or crustaceans) have been describe: dimensional fold of these peptides. the molecular base of their specificity js thought to reside ín certain differences at the lerel of amino acid resíidues especially within or near the binding site of the to: d. Because of the similar three- to the particular ion channel. The EaÑa- amino acid sequence and biological activity of an insect-specific The toxin, Cn10, from the noxíus surface around a nta dimencional mode! of Cn10 was calculated. Ii revealed that residues Tyr4, Lys123, lle18, Leu19. Gly20. Lys32. Leu44. Thr57. Tvr58. Pro$9. Thró64 and Cy565, situated at the side of the 10xin proposed in the lirerature to bind to the sodium channel. constitute a positive surface region. There- fore. hey may form 1he site shat binds to the channel. Cn10 was included in a compara e analysis of two groups of natural variants. highly similar peptides of the genus Centruroides with specificities towards mammals or anhropod: s. A number of surface-accessible residues, consistently different berween the two groups and situated near the putative binding site. may be of importance for the specificity of the analyzed toxins. Keywords: amino acid sequence; Centruroides noxius; scorpion toxin; sodium channel; three-dimen- sional structure. i are basic of la mass which affect jon channels of excitable cols (Possani. 1984). The toxins acting on sodium channels (Lazdunski es al. 1986) characterized so far consist of 60—70 amino acids. They contain four disulfide bridges, The existing three- dimensional structures [Fontecilla-Camps et al., 1980 (first structure solved); Darbon et al., 1991;.Zhao et al.. 1992: Housset et al.. 1993: Jablonsky et al.. 1995: Lebreton et a!.. 1994: Lee et al., 1994a.b) provide strong evidence that they are all folded in a similar way forming a core region of one short e-helix of about 2.5 turns and a three-siranded anti-paralle! [-sheet. The core is stabilized by three disulfide bridges shared by all known structures. Two of the core disulfides couple the conserved segment -Cys-Xaa- Xaa-Xaa-Cys- (where Xaa is variable) of the e-helix to the mid- dle A-strand containing the segment -Cys?Xaa-Cys- forming a structural motif found also in other cysteine-rich proteins like Correspondence 10 L- D. Possani. Depariment of Molecular Rec» ognition and Structural Biology. Institute of Biotechnology /UNAM. Apartado Postal $103, Cuernavaca. Morelos 62250, Mexico Fax: $52 73 172388. Abbreviations, Cil, Centruroides infamarus infamatus toxán 1: CHI. 112 and Cll1m. Centrurmides limpids limpidus xoxins 3. 2 and mamma- lan toxin 1: Cll. Centrurvides limpidus tecomans toxin 1: En? Cn3. Grs. EnS and Gni0. Centrurordes narius toxins2, 3, 4. 5 and 10. respec CsEv1. CsEv2 and C1Ev3. Centrurvides sculpturotus Ewing vari- 2 and 3, respectively. se. The novel amino acid sequence data published here has been deposited with ibe EMBL sequence dala bank and is available under accession number YO8270. insect defensins and plant defense proteins (Bontems et al., 1991; Bruix et al., 1993), Despite their highly Sc conserved tertiary structure. the toxinas acting on sodium channels have shown rather large differences in their functional properties on all three levels in which the funcion of toxins can be tested: in species specificity und de- Eree of toxicity. in their binding affinities to excitable tissves and in their direct electrophy siological ¿effects on sodium channels. D to their 4 toxins ne been divided into toxins that affeci mammals or anhropads (tinsects and/or crustaceans). Some toxins were reported to affect species of both groups (Eitan et al.. 1990: Gurevitz et al.. 1991: Gordon and Zlotkin, 1993; De Lima et al.. 1986: Loret et al.. 1991). Recently, a study of the binding and toxicity of various toxríns towards mammals and insects revealed that even toxins known as mammal-specific can show effects towards insects and vice versa (Gordon et a).. 1996). Therefore. the concept of speci- ficity seerns to be rather a matter of relative toxicities than of exclusive effects. The molecular basis of toxin specificity has been studied widely for various reasons; (a) in order to understand the toxic effect of scorpion venom in mammals as a prerequisito for the of more efíici and secure 2 1D) to study the target molecules of scorpion moni, ie. ion channels in excitable tissues, in order to understand their molec- ular and ion; (c) to develop toxins that can be used as insecticides, However, the existing knowt- edge ús still too limited to give clear answers. Rather small dif- Eur. J. Bk..:hcm. J.J~. :.13-:..&: lf U6t BS 'J96 n ct-specific in e11tr11roides 11oxi11s off a n SA, r ary 1ure, l · ensional odel d l 1rostalic rface otentials parison ith t er x ,·ariants arb:ira 5 LJS1'0'. onsuelo OARCIA'. al1azar ECE RIL'. ~lurie-1 ELEPIE RE• d ouri,·af O. SSA."'I' • OC'pan en1 f !\folccular cco¡'niiion oind 1r .-:1ural 8 l;'J ¡;)· l Jotit 1.: f Bio1e-.:hnol"1t~·. L"nhcni :id S .;-ion:il .. -.u1onoma e :O.fc:i1.ico. ucma,·aca. !'-fc,.ko : abor.a1ory f !'udc.:ar !\.f.:asnctic csonan.:c 1CS S L"RA : J .u1cur l 1i1u1c. arh. rancc cchcd 3 ly 961 - JB 6 00/3 corpion xins ti ¡: on i a ncls i c cir ecificiry. oxic eptidcs !ipecific "·ards a mals d nhr ods fi i; cts d/or r st ccansJ a\C ccn csc-ribc . eca.use flhC' ihlr C'- ensiona.I ld f cse cp1idcs. 1hc olec-ular ase f eir spedflcit~· i 1 u1h1 si e i cn in i.ffcrc c:cs l c c\cl f ino id si cs c ecia ly "i in rn ar c i din¡ i.ilc f e "'in l e 31tk l r i n a ncJ. Thc cDS'A. ino id scquenC"C' d i J i :31 :th'ity f n i s.e-ci.,:pec:ific t in, nlO. fr t e sc-orpion Cemrltroides ,, .,·ius Hotrmann is reponed. he elcc:troMatic po1cnlial s rf' c:c r nd lhrcc-di cnsional odC'I f lO as calculated. Jt r \·calcd t at rc i ucs )r..a. ysl::t. I c 8, euJ9. Cil)·:?O. Lys.-a~. eu+a. hr!'i7. 7)·r!'i8. ro59. hr6..a d )·s6S. 1 a1ed l l - l c f e tOliCin r poscd c t re 10 t ind 10 e i a ncl. ns1itu1e ositi\·e ñ :c fon. here- re- thC)" a}' nn t c ite 1ha1t>inds10 e a ncl. nlO as l dcd panuh· .nalysis f 1 o ¡ ps f atural \·arian1s. l¡ ly i ilar eptides f t e s us C~mruroid"s ith s c:iOciti -s 1 ards a mals r .nhropod . bcr f c :c-cssible c .iducs. nsistcnily l -rcnt c1 ccn C' o r ups d l lcd car 1hc utati\·c i dina ilc. ay e f pon c:e Cor c ccifi :ity f c al zed 10'1.ins. eywords: ino id c uencc: emn1roldes 110.\·/us~ rpion toxin~ i a ncl: cc i en- nal cturc. Scorpfon neurotoxins re a5ic pro1eins f ow mole-c-ular a s hkh ffect I n a ncls f c:irccilable- :clls 1 o sani. 19~). hc t ins ncli g n sc>dium :ha nC'ls CLazdunski t l •• 5186) .rnc:terized 50 r nsisl f -70 ino fdli. hcy ntain ur i lfide ri ses. he c:dsd ¡: r c· cnsional struc:ruf'C's { ontecilla• a ps et al., 80 lfirst s1ru.:1urc soh·edJ~ arbon t l., 1:- hao t l .• 9:?: ouHcl t :al .• 94: l nsky t l .• 9S: cbre-ton t l.. ..a: c t l .• 94a.bJ r \'idc uron.s; \·i c c:e 1hat t ey re li f l cd i i ilar ay nnin• re ion f nc on o- cli"t f ou1 ::?.5 1 ms d cc t .i ded ti a.rallcl P-=oheet. hc rc 1 l:i1lized y rcc i lfldc ri scs arcd y i n nn.i :tures. o f c rc Jsulfidcs uple c ser\'ed sc~ment )·s-X a- aa- a-Cys- hcrc a ariable' f c o-hclh. 10 e id- lc P-str nd ntainins c .cs cnt ys:x a-Crs- nnins 1n.ic1ural otif nd lso t er .: stC'inc-ric:h r tcins Ji c -c;;;;;pc11denc-'°" O. ouanl. cp11nmen1 í !\tole-cul:ir e-c- snlti n d tr ctural i l a-y. J "lit 1c ( :Sf rc:hnolo¡';)ofL'.!'A!\t. plltUdo 1o1al !'itO-J. ucma,aca. !\forelos :!!0. u.ko a.r: -~2 .3 :3 8. . b1Ttla1ions. iil, r•itruroides l'ffun1 111s ioif 111s l \in : llt. Cll2 d ll . rntrurvidrs fr11pidus pid ..s 10,,.in• 1.: nd a ma- ian r :dn : lt. entnirvi e:i l piJ.,s "'""'""º'"" lo•dn 1: e :. nJ. Cn i. Cn!! d CnlO. e-ntrur"'de:i n.rius r :ii.ins2. . .!! d JO. nr1opcc- 1hely: sE\ l.C \·.2 d sE\3. '1rtruroide-s -1.1/p1ura1U:1 "' in¡ ,·ari- an1s 1 • .:!: and J. J"'C'Spcc1i'ely. Nou•. hc \"el ino ac:id t.cqucncc ala blit -d cre h111o cen cposilcd hh 1hc .'1BL 1oequcncc ala . oand i a~·•iJablc dcr ccui n bcr 08l70. i sect fcnsins d l nc efensc rolcins ontc s t l .• 91: rulx -1 l.. 993J. • cspite eir i¡ ly n•ed -niary 1n.ic1urc. 1hc xins :lin¡: n i -ha nets \'C' \\·n .ithcr r c i rc c ces eir c1ional r peni -s n i rec ,·cJs hic:h 1hc :1lon f ins n e 1cstcd: ecics " ec:ificif)º nd c- grcc f :ir ci1y. eir i din¡ liC'S 10 cita Me ucs d l cir irc.:t c :troph) ¡;i :al c c :1s n r.odium a nels. 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Thc supiem;.1tan1 .:L•ntainini,; thc !>olul:olc 1i.cnom w~ frcczc-dried an.J kcpt al -~o·c until u .. c. Onl,.· anaho·1i.::3l ¡:.r..ide rca¡;cnb anJ biJi .. til1cd wa1cr (o'l.·cr quartz) wcrc uo.ie-J 1hrouphou1. bolalion and nquencina or cDS..\.. Thce con .. 1nic1ion of thc cDSA libr..ir') from 1cJo;.on" of thc .. .:L">C"piLln C. noxiu.f Hoffmann. ª" "'cell ª' thc .....:rcecenin¡:. fllt scqucn.;c., of putath·c- 3rthroP'~­ !'pci.:lti.: to:'\ins :ictln~ on sOOium .::h.J.nneh. ha .. b.:cn dc .. .:ribeJ In Jc1..1ll b,.· Bce.:crril ct ni. l 199)1. A .. ól N"ult. "ce ob1aincJ l.'.\ po .. ici'l.c .:lonc". Onc of thc:r..:: i.:lc-ne .. 'l.La" amplifieJ b) PCR tGcncAmp PCR Sy~tem Per..,in Elml)mcra,.c 1Bi0Lah .. 1. The PCR prL~u.:1 "ª" puri• ficJ frnm the ¡;:el. cut 1') Et:oRV rc .. tn.:1ic>n cnJL•nu..:lc.i..c 1 B1n- L.J.b .. 1 anJ !>ul:>.:lon.:d into the Ec.•R\." "itc: of thc ph.lJ;o::miJ Blu.:: .. cript 11KS-1S1r . .lt.l~cnc1. Sut-.. c.:;ucnll,.. cumpo:1cnt E ••. ;,. .• rkhit1 ct•fi OH~·a i.:.:11 .. CG1to.:o BRL1 \\cero: tr.J.n,..formcJ. Thce pla .. miJ OSA of \Lh11ce .:ol<'nice" \\.ith an in .. cn ,,f thc c'pe.:1.:oJ .,¡zc of ar,,unJ ..ioo top "ª .. ¡,.,,lateJ ;.1nJ 1he in .. cen .... ce.:;ucn.:cd u .. in~ thc Scequena .. e J..11 T7 OS.'"'- rol)mcera .. e 1L·s B10.:hcem1.:al1 anJ 1hc ab,n e i.i;t 1 1 primers. To,in purlOi:atlon. Thc fir .. t anJ .. c:.:onJ !ooh:p of th.: 10,in puritkation h.lL e tieen dce .. .:riticJ m dce1..1il t">) V.J.l.Ji' 1a et al. e 19C1,:onJ run1ic31i. . ,n -<;tc:p .:.:.n .. i .. tcJ t"f , .... n-c,.:h.:an¡;c: .:hn,m.i: .. -..¡;raph,. on C,_1-i.:ellulc> .. c. Thce po....,led fr.ii.:1ion,. \\ere 1.: .. 1.:oJ f.._,r l•..,,i.:i1,_. Pc:::iJ.. 5 fH-..m 1he sce.: ... -.nJ punti.:31iL..,n "le:? \\ .,, .. thcen funhcr puri- ficJ b) HPLC ,.,na i.emi-prcparaü'"e C.rc: ... er .. ce-ph.1 .. c column t...:.: fiJ¡;utc lc~cenJ¡. Sin~k pe3J..o;. "ere .:ollc.:tcd and 1c,.1cJ íor l\""ld.:h~ in m..1mm3J... in.,.e.:h and .:ru .. 13.:cean ... Thc putifl.:ation "ªi. follu"eJ b,. mea.;.urin¡; thc ab .. .:.rb..in.:c 3t ~30 nm. Rce.:-o""cr) "ª .. cakul.1tcd b..1 .. cJ on thc nb .. orb..in.:c. Sc-quence dc-tc-rmlna1lon. For !>cequiencc dc1cennin3tion. the 1o:or;in Cn 10 v.as puritied. rcduccd and carbo'>·-mceth) la1cd ns de· M:ribcd by Po"''loani et al. ( 19851. lt was then di¡csted by 1hc endopro1casc!> V8 tBochrin¡cr. ,..tannheimJ in 100 mM ammo- nium bi.:arbonatie and A!!>p•S fBochrin¡cr. Mannhciml in 50 m~I sodium phosphatc pH 8.0 using in both cases a todn/cndopro- t.:"a!ic ratio af :00:2 µg. Thc rc .. ulting pieptidc mbuurcs "crc purified on an nnaly1ic e,. re""·ersc-phase column. N-tenninal amino :i.cid !>cqucnce analysi" of single peaks wns ob13ined by Edman dc~rad.:¡tion CEdman and Bcgg:. 19671 using n microsc- quen.:cr modcl 6-'00/6600 (MilhGen/Bio!>can:h1. Lc-thalil)· tests. Lcthality was tcstcd on mammal!> (mi.:e>. ino;.ce~h (Cri.::J..ceh. At:hOo.'ta spp. > 3nd cru .. taecans (Cra)'fi!>hes. Camban-llus mm11f':::11mar spp.l. dce1cctinv 1.'1.hcthcr u gi\en quan- ti1,.· of to'l.in \C'as non-to~ic. 1odc or lcth31. Non-to:"tic meant that thc anim3ls sho"cd no s:io·mptom,¡, of in1oxic31ion u.i1hin .:?..l h from thc injcction. slmil3rl,. 10 ha""·iniJ bo:cn injo::ctcd 1o1o ith phos- phatc-buffcred ~linc solution 4SaCVP, - 11'7.0 m:\t l"aCI. :!.O m,_1 KCI. ID.O m,_1 l'Oa~HPO~. 1.8 m!\I KH~PO~. pH 7 • ..lJ or wa1er alonc. To:dc me3nl that thcy !>howed S) mp1oms of lntod- callon likc e'\dtabilil.,.-. salh;ation. l..1.:rimation. d)o·spnoca... ti!!mp<>- rary p3ralysis of limbs tmiceJ or.paralysis Ccrickcts and era,•· fhhco;.), Thc to.'\lc cfl"c.:1 "ª"' assi¡;ned as lcethal if at lcast one of thc tc<;t animuls died af1cer inje.:tion. Eai.:h con.:cntrntion 1mai. .. /a\·crage body m3'!>SJ """"·as tcstcd in parall.:I \ltilh füur Cin thc ca.,.:: ot" micc l\\OI tc-o;.t animals. Femalc albino mii.:c (01,er.J.J;C: bod,. maslo :o ¡:1 of thc sira.in CD l Cap- pro,, 6 "cck" oldJ were lnjcctciJ intt3pcritonceall:io "ith up to 500 µ¡ frccZe•dncJ material in :!00 µI l"a..Cl/P,. Crickcets \\Crc injc.:tced "ith 10-50 µg/anlmal Ca.\cernge bod,.· ma .. 'i 0.5 s• and frc.,hwa1cr crn)fi,¡,hcs Y.ith 60-110 µ¡;/3nimal Ca\.Ctn&e bOOy ma<;s t g1 in :o µI biJisti11ed \\.aler. :\lodclllna and 11n11l)osls of thc- three•dlmenslonal struc- turc. Th.: modcllinlJ. culcul31ivn of.::ncri;,.· minimiza1ion. moliec- ul01r d)n3mico;. 3nJ an..ily'"i!' of the modch '"'ere perfonnied on a Sili.:on Graphic"' IRIS ..l0/35 "'ork,..t.J.tion U'iing thc ¡raphic dis- pla)o prolit.immc ISSIGHT 11 anJ th.: HO,.IOLOG"t". BIOPOLY- !\IER. OISCQVER and ASALQGY p3.:ka¡;eo;. from Bio .. ,_m Tc.:hnoli'.'J?ie"'· Thc mL~cl,. wcr.:: buih on thc tiasi:. of known s1n.a.:1urc:,. of th.:"" todn .. C"'E"") 1Zh3o et a.L. 19~:!1. Clll fLc• brcwn el al.. 1he\! of a thi.:knc.;;., ofO.~ nm ""'ªs 3Jdcd. Thc .. 1ru.:1urc .. \Lcrce optimiz~J \Lith che .:on,.htcn1 \3lc:n.:c for.:.:: field u .. in;1 th.: m.nimum Jceri'l.31i'"c anJ thc 1vtul encr;;,. 10 monitor c..1.:h <;tcep of 1h.: moJc:llin¡;. A" 3 fir .. 1 ,¡,tep ...... ( m1n1mizatic:>n thc ""'ª1cr ,.hell ólnJ thi: h)dro~cen"" of th 3tonh li"\ce.Ji L\ith Mccrc .. t dc,..:.:n1do\\n10 33-'.7: lJ/ nm anJ CL•nju,¡;a1c i;raJ1cn1 d1..~'""" 10 S~.68 ._J/mn. As thc f.•llc>'' in}; "tcer. an unrc .. 1raino:d minim1za11on "ª"' p.:rfonnied \\llh 101.:0.:¡:-o: .. 1 Jce .. .:("nt .J1..'\'n lLl :".1-' -:: u·nn' anJ .:'""'"JU~ati: i;r;.i- .J1.:n1 \"1.Íth 3 ffi.l'\imum J.:ri~:lll\.:' .:tf-'1 S..l U.'nm. :'lolo!.:.:ular d)o- nam1.:.,. "crce pcrformcJ u .. inl! 3 \."crkt lc.ipfro;; alsmrithm; the r.:~um.: ph3~c al 300 K ".:l" :!tl p .. nimce .. 1ep 1 f->I .:¡flcer an cquili- t'or3tion pha .. c of 1 p .. 10 rc.l.:h i.:on .. 1.J.nt 1en1po:raturc. The stru.:- 1ure ¡:i,en ti) tho: l.l .. t fr3mc of the tt3jector) con,;,1irntini an cncr¡;:-· mmimum "ª" thcn funhcer minimizcd 10 ...i..IS..l Ulnm In lho:: final SICp. Selisko et al. (Enr J. Blegtvn. 2423) RATTAAACARLATARAATOTARTACETTCAMARARARA D A AA . OTO AAC ARQ AOS ACA 000 VOÓN Ox 2 Toa 30 E OLL ARG MAC CAR OLA q o. .» 0-0 »' TAT CCC ATP COT rro» Fig.1. DNA sequence of tos!n Cn10 and lts deduced amino acid sequence. The signal peptide is underlined, the polsadenslation site is printed in bold letters. Surface accessibilities were determined using the graphic display programme INSIGHT Il w 'h calculates the total acces- sible surface area of single amino as residues in a protein ac- c1cin - o i g C"Oll)' ( t 83). d:nh·c rf ce :a c:essibililies \\'etc l uhned cícni g 10 t c 101al c sible rl' :c tta í 1 c :o respondins e ino id. hc c c :t 1:11ic 1c t al l cl 1r 1ion nd e r ins \.\'D.5 :alculated sins diti na ly 1 c :t \·e- cn1ioned ro- cs t c LPHJ d:asc i s cchnolo¡;ics c:r-:lc:holls n d onig. J 9t>. he rc>&r:i. me ses acr C1pic r :h hi :h e r tein d <'hcnt re is cd i 'crcnt iclc :tric nstants c~.O d SO.O. c .:1h·cJy1: c c-di- cnsional t t re f t c r tcin fi es 1 e undaries. \\"e scd l c cfauh e1crs shc b~· LPHJ ith 1he cl>cep- rder i;.pacc of . .S . h:ir,sc ui¡:n en1s crc ade fare 1 e k l ti n. cni ¡ e f c edi 10 . si a e L"ILDER odule. hc 1en1i.al ;:rce b l latcd y h•in¡ crically c ar nn f c l - oh a n C'qua1ion. 11.ESt.'LTS l nl K• J a er 10 A1cnd 1 e bcr f n nh od- ec:inc t Ains r ions f 1 e ¡ us f."mruroi C's e r ed SA lib~· c arcd 1cl ns f t e U"orpion i-mr mi C's xills off a n usin~ s r bc a SA ne hich as Sc;c. i l!'n1ical 10 t e -1enninal c¡; cnt Oa't .u ues) f e nhropod-f c~mruroidC's c-ul 111ra1us ina e ecerril t l.. 931. J t e c nd tcp f c nins " scd ¡on :lco1ide \\hich C'O TCSponds ino i s -J6° f t c c t l>in s \·J c cc:C'rril c1 l •• J 9J). hc :h c!iulrcd i IJ osithc l es f hich c as l m:d .and c cn.:cd. ig. i;..ho i;. t c cncc f c e c hins :r-:A l ne d il c uced ino :id 5c ucm:e. oxln rJn atl n d SC'QUC'ncln¡z:. r ,·i .:d i1h 1 c J..nowl- c ge f c ew Sl!'QUcncc \\e 1 l!'d 10 '°olatc e 10>.in c \·c s scri cd i ~!a1crhds d ~f.e1hodi;.. hc inl rifica- l 1cp " s o!'rl'onned "i g l>ize-cll.d !!oion o u10Br.1phy e c hadcx 0-50. hc ti n mfile \\.as 5 \\ n y \:aldivia .et l. 9.o: i t tal. ur fr.:ac1ions " re c1 .:tcd f\\ i.:h l)' t c nd li n " n·ed 11 10,k t 1 i mice. he i;.. cond Mcp. l ange a1o¡:raph} C"On c clh} l• J .,c. rc~ullcd i 4 o!'aks. or 1 e cf 1ion rotilc " fcr u~ain 10 '\"aldi,·ia l l. e ..J 1. r c1iun !o f !o r lile v. as l.•und 10 e 10.,ic i ..,e.:ts d .. 1.:..::e:i.n~. v. he re.a~ o 10,k ffc.:t v. as ctcclcd i icc. hh fr.:.clic1" uas 1 cn n cr riliC'd y PLC si g rc,cn-e-pha~e rom tC"Osraph!t s "' l.'lWM is. ~­ Automa1cd Ed an dcgr.rd•nion indica1cJ at ak cC"Ontain~ thc "' 10.,in. &· 3 "' s c l incd ino id c cc: f c ,.in v.hi.:h "ªs cd n10 c au ..c l i~ e 1cnth b cl . --¡"° / / _:.,.,-- i! • f 1 o .b fg. l. ir,·ene- h•r.e Pl.C .. l e 1 lrd 11ep r M nunalo- •-P lc rlO ul n r nJO. rcczeo-drieod m:11eori l ar fro1c1iun ·5 1~.2msJ e SC"cond ri :1tion 1.1cp (\'aldi,ia 1 l .• 41 a1. rified y PLC n 1.Cmi·prcpal'llli\e . rc\C'~-ph:1~ :ol n ::!!1 xl . i o t.i c to ~m! )dac:) ohnC'd r ti.O in v.ith · .r ~r.:idieni ~cner.:i1ed y illi.in¡ ~lullon 10.1:::~ 1 nucir ace1ic .:id I atcrJ d i.olullon c1 nitrilC' ilh .Jq. triflu ro;a.:eti.: :ldJ 111 n ... · llllC' f ~ l/min. c::al.; 3 co~~pond1. nJO. O \ •• 1\ " n M H !; ;;;; ;;;;::: ;'; ;J~~:~~i:!j~ ~;.;;; :::!. 7 .:. :.: .:.7.7. 7 .:.: .:. : . : .~ .: ... .. ... " .. .. G ... 11 ,. C' ... LA C' .. e • G L. •,!-!.~vI.r,~o: .:a.:-!.!-~_!.!.~ '''''"'~f'•IC•JC.lt •t 1011••01 11ool J •• 3. l>elennln•don f l ir al')· ll"UC'fUry uf nlO. lnn :J.:i 1. :::0 v.crc t ined } c 1 f.Cqucnci 11. :::$ .:.nd .::::6-~ h)' -.e- quiencin~ t r: pep1idc fra¡:men1s ¡;cnera1cd )' cndopro1ea..e .,p.:-,:. ~..i- 7 too} 1.equcn;:ins e ~plidir: ni11meni scncr.:i1ed t>} c C"1J'l'Olu1-.e \'8. hc pep1ides \\ere nficd n :in :il}1ic , re\C'r~·ph:.-.eo n 1:' c ...:0,.Jfo c . an1cle ,¡ze' ~m~ }d:1c1 \lllh" ar s .:idicn1 scn- o.1cd } hi g 11cin 1 .1:c:;. 1 Ouorno.cr:1ic 1d .. a1cr1 1.1nd -.ol 1ion 1:1.:ctonnrilr: v. lh Q. triOuo n .:r:lic :1.:id1. hc no ... · ..ic "!!" V in. hc c1 1ion limo:• f c r.:i r:ni.. i.ire ~i\cn. ino ;i.:id 8 ""'ª' 1.k1cnnined } :i ino id :1m1ly1.1" A 1 . pcp1idc C'qul!'m:e f 1a1h e 10,in. ti g n 1u nncl!i. f C. 1io.,fos. C' r .1 .::o oimino .:id5 "'ere cll!'nnincd y i cc1 ~cquen.:in& f 1 c rcdu~·ed d u.r 'lló)'mi:1hylatcd .,in. he c uinini; ino di;.. p c .. uc 7 crc c 1ified y "iC- qucncin~ r:p1idcs v. hic:h .. ed di~c5tion f t c cna• 1 rcd 10,in \\ ith c c>pro1cina.,e"i .~5p•N d S. Lys68 uld ot e dc1ec1l!'d y automa1cd an de~rada1ion. a c:ommon c .. ufl r 1 c J.:a ..1 c .. 1Jue oí 1ide e 10 h .. .. orp1hm nJ l c " clun e t>ranc. o" 1!'\ cr. 1 c lcar c1ection f 1 e e. 2.38 Sel/1t.o ft •f. fE1u: J. Bit .. ·hrm. !-l:!J 'lltbf• l. Tot.ldllet. ol .. Mted tu•llU ff'Vtn ~urpWn• of' ltw ~'"'" Cr#llrunHJ,s. Dota of CnlO. Cn$ and CnJ ftom C'n1rurt>Wr1 rt1ulur trom lhi" paper: Clan:la. C .. Bc.:ttril. B- ~list.o. B .• DelepietTe. Aof. an~ PQ.soni. L D. funp.ablished) a'"1 %.imudlu el al. (199!J. ~pectiwly: CJU fmm C"""'""'"ñ1 lintpldu11inrpldau from l-c:bre1on C'I •l. (199-i:t: C.Evl. Ct.Ev:? and Cd;"3 from c,,,,,,.n11J,1 •c-ufptul'atu• Ewin• (8;ibin er al_ 197-11. ED- 1tarld9 ror efTecd"c dow UO~ ot the lffl anirn.:af., u..rct show .,.mpconui otinto•lcadonJ. LD..,for lcthoal dot.e f50'* ot lhe ''"' animal• died ot in1odc:arionJ. Tlle" •"Cl'lllSe body m.,.u of mouse """" :?O•· c:ric:ke1 0.3 •· C:tll.)'lish 1 s and c:hid,; ~ •· To•in Te-N animal ..... non• lcdml LO..,. ED- CnlO -~ c:ric:ke1 C'~.)'li•h Cn> -~ .. ·rkJ.;c1 C'~.)'füh CUI ....... aid,e1 cr.a.)'fit.h C1Evl ch id; c:ric:J,;e1 Ci.E':? c:hid: cric:L:.:1 C.i.E"J ddc:k cric:Let Cn! 10.dc: "' <-'00 >U >90 <-'70 >40 <>00 < 30 >30 >!SOOO >:?3000 >:.!'1000 lcrhoJI <110 ne o( 1tw mole.:ulc 1• i.ho ... n: c:olouted in whire are lh.: u-heh' onc"'ared lo lhe ~k o( 1he molecule aod 1h.: P·shee1 si1u:11eJ on 1he f1an1 .. ide o( CnlO fil inc:Jude" rei.idun 37. J8 ólnd 49 . .501. Al:kiiti•m..11Jy. the tour di1ultide bndse• fCysl.:!.C:yi.6$. Cyi.16-CyWI. Cys.:!$-Cy~. C)·s::?9· CyMSI .ate 1ho"n in yeflo"·· The C· ;inJ lhc X·lenoinal are indic:.:ared. Re1iduc116. J.!. J.5, J7. J8. 49. !I0 • .57 and .58. "hi<:h dilp/il)" sianitio::an1 differen.:cs t-ci"een 1ru1mm.i./-.,peo:ific lll'ld .:arthropod-spe<:iti.: 10,in1 rsce 01..c:uu-ion and Fi&. 6J. ate R"pnescmeJ in R"~ ~ irh lhoeir i1Joe ch:iins. li~hed follo\\in.r 1hc: prolocoJ outlined in ,'\forc:riaJs and Mc:thoJs Fig • .i is a stc:rc:o,·iew of 1hc: CnlO model l.lcrhcd from CnS. \\"c: will refer ro lhc: pan of 1hc: moleculc: fücing 1hc: 'ic:wcr as 1he fronr of rhc ro, in. as proposo:d by FonlC'o:il/:a-Camp" e1 aJ. ( 19801. nuldrnatc residuc Thr67 and rhc: dcrcction oían additional Lys by analyzin¡: lhc amino add composirion oí lhc C·tttmlnal pep• tidc: from rhc va di.scsdon cstablishc-d lhC' prc:scnC'C' of Lys68 in lhc: ma1ure pepdde. Thc: s.:oc:ondar) •Struc:turc: clemc:nts. an a-hc:/h lnclu~in.;- n::"!ioiducs :!J-JO on 1he upper pan of thc bac:k of 1hc to,;n :and a rhrc:c· stranded P·shc:e1 consis1ing of rcsiducs 2-4. J7-41 and 46-.!'lO whic:h is s.itu:ared on lhe upp.:-r pnn: oí lh.:- front. aré' rctaino:d in 1his modc:I as in 1ho: rwo modcls from CsE,·J and CllJ. Thc: supetposltion of 1he rhrc:c modds sho\.l.cd 1ha1 1his cote rcgion consisrinB' of 1he rlemen1s oí sc..:ond3.f)· suuc:1urc: supc:rimposes 'lo"c:ry wc:IJ rrm~ in 1hesc posilions whcn 5uperimposin& rhc: 1r.i.cc: of amino :acid1 1-6.5 are in thc rangc: 0.07-0.099 nm) ""·hc:rc:as lt1~erdific:rc:nc:es appe:il in rcgions 6-15. J~-37 :ind cspeciall) in thc: C·lo:nnin:al !'i0-68. In ordc:r 10 choosc: 1hc: moJcl '4·hich s.ho\\s 1he c.:i.,ic:s1 ac:cgmmod:a1ion of 1hc mu1:irions inro lhc: un· dcrlyin~ slru.:rurc. \.l.e m.::i~ured lhc: nnsd bct\\ec:n thc sr.:irting and rh.: final 'ifruc1urc of .:-ach modc:IJinJ; p~c:·"'· Supcrimpo,;ing thc: .:ntirc: rrao:c. 1hc nn..J of che Co :itoms \.l.O:t"C" O.J J:::? nm. O.JJO nm .:i.nd 0.1.1.l nm for rhc modc:Jo¡ from Cn.!'i. C\Et.·3 and Blolo1kal 1nts. The Jcth:alily of 1hc 10.~in \.l.·as lhen testcd in mic:e. c:ric:kers and c:ra)·fishcs (1i;lblc: l J. \\"c: found 1ha1 CnJO is no1 toicic: to mh:c- appl_yin.s up 10 500 µ~O g at.craie body mass. In chis rcspec-t i1 is inrc:rcsting ro no1c that a scorpion of lhc spcdcs C. no.t:ius Ho"mann tclc:a~s abour 50 µg pro1c:in/\·c:nom e.,lr.11..:tion (Poss.3nl. 198-U. To tc:sr rhc todc c:ff. Toxic: symproms st.aned al 90 µglanim<:il bul dosc:s up 10 110 µglanim:al did nOI c::iusc: a Jc:th:al c:ft"ei:t in c:ra)·fishc:s. ~fodellln1 of lhe lh~·dlmenslonal slrucrure. A lhrce..-dimcn• sional m(ldc:I of Cn 10 was ~c:ncr..i1o:d in ordo:r 10 calculare 1hc: cl.:-crros1a1ic surfaco: porcnti:al m.ap around CnlO and ro localizo: amino aC'iJ ,·ou"iarion" in Cn 10 in compan.,on to 01hcr toJdns. \\·o: u"o:d thrce s1ru.:ruro:s as b.ssc .. of rho: modo:llin& tu be abre:- tu c:omparc: rho: r and tho: rwo N!\.IR srruc:1un:" of Clll oí Cr1ur11midrs llmpldus litttpldus (Let>rc1on c:t al .• 19'}.l} and Cn.S of C. 1w.r11ts Holfmann {Lcbtfi,.ho:d 1 Jo:1c:rmino:d h.>· our group. Thc moJcJ,,; "'-C'rc: .:- .. rab· ~~1r:t~~~i:C:c:~~ri1,~~h~~~n~í1~h~~h~:at!:~1~;~º¿!~1¡:~¡~~~ !>CqucnC'c afrc:r 1hc: disulndc: briJgc: l:::?-65 con,;l~ts in Cn5 nnd CJJ 1 of onl)· onc: re-sidu~ nnd is 101:illy ab~nt in CsEv3 whc:rens Cn ro continu.:s up ro r.:.,iduc: 68. Thc accommod.:i.rion of rhc: rhrcc C·rctmin.al rcsidue" 66-68 is lhercforc rarhc:r :irbitr.iry. "hio;h shoul.i h.: con,idered "hen comparing Mru.::rur.iJ fcarurcs or CnlO \t.ilh e'pcrimcnr.:all,.· estabfi!oh.:od s1ruc1ur.:1. c.Jculnlion or thc: elecrrostatlC' surface potrnrlaJ map. Bc- c:au...e of the ap~r.:-nt impon:incc: oí posilhc: u~iJu.:-s for thc bindin_g of r~-.,ins ro chann.:b 1hal lr.:msíc:r pusithdy ch:argcd ion,. tSrampc ce ni •• J9<1J: GoJJ\lein c:t al .• 199-1: Hidalgo and f\.la..:Kinnon. 1995: Lnrc1 et al .• 199-4: J.;.uzel c1 .al ... 1995) \.\e o:a!.."ul.a1.:-J' 1h.: ~lcctro .. 1.a1ii: ticJJ' Ji~rribution aruunJ CnlO usin,i!: Fls-5. El~nKlallc polrnllld n..ld dlsu·lhulion ..... rrunl tokln º' tollJns CnlO flopl. Cn$ CmiddleJ and CnZ cbollnt11I. Rrd contou,.., re· pi-cs.ent lhe n<"¡':llnC cquipo1cnti:il 9'urf.;aec :11 -1 l.Tlc. bluc comc>un. 1hc COrTrspc>ndin¡ ~1>11i\c surfa....-c a1 1 l.Tlc and ... hite <.'"(>nloun 1hc ncu1r.il cquipotcntial tourf;tcc nf O l.. Tic. Thc pThn .. ·n in ~cllow. lhc DELPHI pro¡:rnm CNicholls and Honis. 1991). Fii;. S (tOpl 10hows lhc suñai:c potcntial m.ap of thc fronl of CnlO. Thcrc is a largc continuous positi\c rci;ion Csho"n in bluc, cin the rii;ht side of thc molcculc comprising 1he ri.&ht !iidc of thc P·shee1 ATOund thc l1XJp bct" ccn thc ~ond ¡ind 1hc 1hird P·r.trand and thc C-tcnninal (rcfer to Fig. 4 for s~ondar)"•stnicturc clcmcnls}. h continucs along thc lcfl b.:>.ck side of•thc moleculc dl!ituri>cd by a ncutnil p.:uch f!ihown in "-"hitcl around rcsiducs !'i7-61. Thc ccntr.d I?ª" of 1hc P·t.hcct displa}'S nn clcctronci;:ath·c suñacc (shov.-n In red) 1hat conlinuc~ towards thc 1op to thc ceniral pan of the o·hclilll.. DISCUSSIOS Clonlna •nd sequcndn& uf •he purlOed peplldc. In 1his paper "'C repon lhc cDNA and amino acid scqucncc of a novel 1oxin from thc scorpion Cc>tnn,rnidrs t1n.t:ius Ho«rnann which wc namcd Cn10. The cDNA o( Cn10 comprises 3"'6 nuclccnides includins 1hc pol~·uden~·lurion "'ire. A compari'!>On of 1hc 'ipmd pcptide with hi¡;hly 'imilar 'ii;n.al pep1idcs of .:D!':Ao;. oí rel.ated 239 1c.n.im; li cclls in ordcr 10 produce the recombinant 1oxlns and ils mu1an1,.. wc dccidcd no1 10 sc&1rch for the C'omplc1c signa! pcp1ide ,.cqucnce. Bfoloekal lnts. A scqucncc compari<.0n "·ith 01hcr toxins of thc ¡cnus Cc>mrurvidn. tFig. 61 !!.hows lhou CnlO sharc5 53-:¡. simila:rity to a conscnsu5 scquence of IOll.ins a¡;ainst mamrnals and 80~ simil01ri1y to a conl'C'nsus scqucnec of tnllins a¡ains1 :anhropods. The sub5Cquent biologic:al tests rro,•cd that CnlO bclon¡;s to thc Janer group. Table 1 comp:arcs thc toll.icily data of CnlO "·hh data of othcr !'C'lectcd toxins of thc gcnus Cc>ntru• nlidc>s. In the liJtht of this data CnlO can be rc'ardcd as a 1oxin i.pccifk 'º"'ards anhropods wi1h a sli¡;hlly hi.&hcr acih·ity 'º"ards insccu; •. Other to:i1.ins of 1hc anhropod•specific group are: CnS tGarci.:11. C .• Becerril. B .• Sclisko. B .• Dclcpierrc. M. and Possani. L. D .• unpub!h,hcd). Cll1 1L.:brc1on el al .• 1994J as v.cJJ as CsE\·1. C!!.E\·2 and CsE"\·3 tBabin c1 al .• 197~1 ~hich "Crc no11csted in cnistaccans. Cn1 cZamudio e1 al.. 199.:a i'li gh·cn as an cxamplc of a 1o:i1.in ··••ilh hi_gh spc..:ificily 1owards mammals. Funhcr clanification of thc unhropod·spccific tolll.ins inlo insect- spceific and cnistaccan·spccific sub·sroups is difficult bccause thc cxis1ins data are noe complctc and somc1imcs no1 compati· ble. Howc\Cr. wc C'OUld Cl3!o!iify CnlO IOJ;ethcr with CsE\•I and C,.E,·2 as spccific 1owards insccti; ""·hcrc:i.s CnS and Cllt sccm to be more spccific 1owanh cnisiaceans. For 1hc purpo'C o( this di"1.Cus.1>ion we should rcícr to !!opccificity more as a mancr of rcl .. 1h.·c toxicity than of exclush·c effccls. h is wonh no1ing th.:11. in thc c,·cnt of prcy hun1inJ;. 1hc s;corpion will not dclh·cr only onc 1oxin since the ,·cnom is a complcx mixture or tollins. ••hkh prcJ.Cnl differcnt acth·ities. spcdlicities and dc¡!rccs of toxicily. Thcrcfore. in asole "\Cnom injcction sc\·cral 1011ins \\"ill be acling 1ogether against the ~me orsanism. ~fodelllna of thc lhrct·dlmenslonal structure and calculatlon or thc ~led:roslatic surfacc potcnllal map around CnJO.. The 1hrec-dimcnsional modcJ ofCnlO was uscd 10 calcuJa1e 1hc clcc· troslatic !'uñace po1cn1ial map. Chcmical modifkation e•pcri· ments (Fon1ccilla·Camps e1 al.. 1982; Kharra1 ce al •• 1989. 1990; El·Aycb et al.. 1986: Darbon and Angelidc.i;. 198..i) and muta· lional analysis (S1ampc e1 al .• 1994: Gold:ncin ce al •• 1994; Hi· dalgo and .MacKinnon. 1995: Lorc1 et al .• 1994) indicatc thal 1hc biologicaJ ac1h-ity of s.corpion toxins requirc posieively chargW amino acid residues. Thc suñacc po1entiaJ m:i.p ofCnlO in Fig. S (1op) shows 1he front of thc molccule. thc sidc o( scorpion toxin molcculcs 1ha1 is of panicular ineerc51 becau!OC thcrc are s1rong indicalions 1hae il may bind 10 thc channcl. Firs1ty. sc\·cral srudics i..howed 1ha1 thc aroma.tic cluster of a-1oxins (1oxins af· feclin¡: thc inaceh·:uion proccu of sodium channels) 10itua1ed on 1hat sidc of thc moleculc plays a role in channcl bindins (Fontc· cilla·Camps e1 ni .• 1982: Kharr.u et al •• 1989}. Sccondly. for p. toxins (lo:i1.ins affec1in,g. 1hc ac1h·a1ion of thc channcl) tlt.1 also di5play a cJus1cr of aroma1ic residucs at 1hc front of1hc molccule ie was shown that hydrophobic rcsidues takc pan in rccep1or bindini: dClloxin. a small 1oxin lhar has lhe samc 1hrcc-dimcnsional fold and is thcreforc e"olulion· arily stron.a;ly rcla1ed to thc sodium-channcl·bindini;: 1oxins. in· 1erac1s wilh thc poe:i.ssium ch .. nnel ,.¡a 1ha1 suñ .. cc (51.ampc el al .• 1994: Goldsecin el al.. 19941. '\\.·hen charybdo1oxin inlcracts wilh thc hii;:h-conduc1ancc ca:·.acli\·.:ucd polassium channcl. thc residues 1ha1 wcre found lo he crucial íor rcccplor binding S.:\i,..\..o .et a\. 1t:ur: J. Bu,.:l1rm. :0...1:1 A ~· ~· ~· C••ll CJ.U• CUI CU\ Ch.\ .......,..... .. .. - .. YS.QAZ-UIOJUllCS- Yt.Qa.,,,_.t.llll11Tc:ll-- L.J< .. ~ .. -- 1.1' .. 11Tc:IO-- uarrt:Y-- uanc•-- l.l'lt~N-­ l.l'JlirTCS-- VVWl'l.Pltir:TC:X-- 11111 111111 1 11 1 1 111 1 1111 111 1 1 1 1 111 •C.GYl. .. ,.KSTCC•"110e1.ti.c:uoa~~cLt.bQOCSYOTCT«UO.C.C:ll4l.Pt.STP'f'T?lPGrrC11Tt: B .. , ... CUl c ..... , c ..... z c.s. .. J - ' ..... _,_,.ta-a~~,...:;;,,.· llE.G'll."'°UTGClt'l=t.t. llt..GTJ..VNK.STCCKTQCPW ltlt:OTLVIU<='l>GCltTOCTW Fla.6. ~uenc• comp•rbon of mammal-•SM·dOc tAI •nd arthropod·•~inc cB1 to,ln• of •h• pnus CcnrruroldH •nd CnlO. Capto t-l "'ere inuodu.:.:d 10 rna ... imi.z.: t.imilariu.: ... B.:lo" .:01.:h u .... in f01m1I~ th.: .. ·01hcn-.u~ s.:qu.:m:e i• •hu"n "'h1.:h rcpr.:~nu the uquer..:c with thC' mMI r.:prc..ent011h.e :i.mlno 01.:id in e:i.o:h p<:>.;ition. X 1:1o 01 .. 01n.ibl.: re•idue .... ith no ob .. iou .. preíeren.:e. Cnl tV;u:quez e1 011 .• 199~1. Cn:' :i.nJ. Cn.J t~nu.nlh> el al- 199.!: V~qu.:z .:1 al .• 19951. Cn-' 1V01zquez e1 a\ .. lm C. ltV~m11t11.1 1111<011nms tOche .. ól•D01"i101 et 31 .. \'JUtu ;and Clll írom C. limpidus 1.-coma1111s t).b.nln et :al •• t9SS). 11.nldun thal ITl4y lnOueR(:e UICI spccilicit~ of a to'l.in 1...:-c Di~uui.:in1 are ¡ib.en in bold. ;ire situnted in t~ P·sheet and in the o:-heli"- bclon}lin¡ 10 the top pan of the mole.:ule. The functional cpitope of .:h.J.~bdoto,in in this en~ compri~s nn nre;a of l.OnmXt.!-nm t~ee St:i.mpc et c.I •• 19941. the channel or they could. ha,·e steric lnfluencc on the p:inl.:ular conform.:i.tion of the receptor bindin¡ silc. As demonstr.ucd in Fi¡. ~ etop1 thc front oí CntO prcscnts mninly po!>iti\·c or ncum1l reg.ions. This supports the abo\ e-out• llncd c\·\de:n.:c of its in,·oln~ment in bindin¡. to the sodium .:han• nct. Ho\li.cver. the ccnu-:il p.:i.rt of the P-sheet unJ thc o-he\i'I. siiu:ued towMds the top of thc molc.:ul.: are stron¡I!' neg;ati\e due to rcsidueio Olu:. Olu:!I. Asp:6. 01u:s anJ. Olu-'9. Residucs T:or38. Tyr-Ul. TH4: and Trp47 are situ1ucd \\\thin this rei;ion nnd. us outlincd ubo\ e. they are the aromalic resiJues suppo!>· cdly in,·ohed in 1he bindin¡ of thc to:o1.in hl thc chann.:1. 1t ~ems \"ef"!'" untikcl:-· th:it this rc¡ion could M part o( thc to.,in bin.iin¡ site. ''\"e thcrefore assume that thc bindin¡. site of entO is shu- atcd mu.:h more on thc right and lo\li.et pan of th.: molecule front comprbin¡ rcsidues T~·r-'. L:o·st3. 11et8. Lcut9. at:-·:o. L:-·r.-i.3. Leu+l. ThrS7. THSS. Pro~9. Thr6--' and C!-s6!'. For com- p:i.rlson \\.e c;alculat.:d thc surfa.;:e patential m;s.p .. for the r-.::i-.tR structure o{ enS (.Lebreton. F .• Garcia. e .. Po'isani. L. O. and ~1epiene. M .• unpublished) and the thrcc-dimcn .. ional mode\ of en: tGutTOla et al .• 1994> ..._hich are sho"'" in Fig:. S lfront \;jcw of the tO'l.ins ens (.midd\e) anden: tbouom1}. Both of thcm show. likc CnlO. a negati"e reg:ion at thc centra.\ pan of the P·shect but with \·artable size. In en: it is stron¡;er and T!-r-' is ulso a pan of it. The pasitivc equipotential 'iUrfa.:e ¡,. thererorc mu.:h smallcr b.:.:au~.: of the stron¡; ne¡;alt' e re, ion on the ris,ht of thc mole.;:u\e dueto OiutS and the influen~e of the C-tcnni- nal. In enS the ncg:athe re¡;ion at the center of the P-sh.::et is of less intcnsit): and does n"'t inciude T)r4. The po'iithe re!i'.ion stretchcs to thc rig:ht of th.: mole.:ule undi<.turbcd b~ G\) t~. Cn!' shO\\ s neutr:ll rcg:ion.; on thc \eft and bottom pan of thc mole- cule. Comparathe anol:-sls or to:oi..ins ""1th dlfferent speciOcitles. A .. outlined in the introdu.:tion. s.:orpicm to ... in .. o;.harc a 'e~ .,,imilar thr.:e-dtmen,;.ional fold ~o that their sp.:cics sp.:.:ifü:it~ ¡,proba- bly mcdiated b:o· rather subtk chan¡;e~ of amino ac1d rc,,idue.; in s.:lccted positions of th.: primar) s1ructure. The!ioe cru.:ia\ tC!>i- dues should belon¡; 10 the sid.: of the to,in that intcract~ \li.ith Follo\\in¡ the abo\e-outlined in.J.ic:i.tlons for the in,·oh·c- ment of thc front and top pan of the molc.:ule in thc bindin¡ to thc sodium channet. '"e consid.:rcd in our comparati\IC anal:-·sls :~:~~;";!¡'::!: t~:i'~;:st!~~~~-:t;~ ~i~h:~ e~~~~s~;-~f ~~ ~:,~: cule. 'b) ncar thc aromatic cluster tma~hnum dista.ncc bctwccn thc Ca atoms of a ¡:h·cn rcsidue nnd the nc·u arom:uic rcslduc bdng pan of the cluster w11s choscn lO be teu than 1.4 nml and Co:l d1spt;a:-· u surfa.:e :iccessibilit:-· nbo\c :!O~. As nn iltustradon. Fi¡. 7 shows thc front t,top modch and top (~ttom model) of the CnlO mode\ "ith th.: r.:.i;,iducs sunoundin}l the central cluster of arom:i.tic rcsidues hho\\n in ye1\ow) coloured 11cc;:ordinf to charge or h!-·drophobicity 1see le¡;.end1. ln.:ludin~ thcsc rcsidues in u comparison of the to,in .. li!>ted in Fi¡. 6. c1ear diffcrcn.:es be:t" een m:immal-spc.:i fic a.n.1 anhropod-spc.:ific to"ins can be staled for residue ... :6 tLeulA;.p or Asn). 35 n/Glul. ~O tHis/01!-·) und !'7 ('Val/Thf). Al- thou¡;h a markcd t.:nden.;!' .:,ists for r.:siducs 3: tOlnlL)·sl. 37 t Ala/S.:n and SS tTrp!T~ ri. their impi>nance se.:ms to b.: less b.:cause of one si¡¡mitic:i.nt c'ception in all thrc.: cases 1ered in t"o rei;:ions o.s demon- str;ited in Fi¡. 4. One rc¡ion i» siiu:ite.1 on top 1,,cc abo lowcr model in Fii;. 71 o( the mole.:ule compri"ioins a ccintinuous p11tch of residues :6 '!>itua1ed in thc n-h.:lh1. J7 01nd JS Oecand {J- strand1 :i.s '"el\ as 49 and ~O (th1rd tmiddle1 P·str:i.nd) nnd the two residue"io ).:! und 35 'iitu011ed :i.part at the tum betwcen a·helbc. an..t the seconJ P-strand. and thc athcr .:i.t 1he bonom of the front near thc e-terminal region crcsidue"' S7 and ~S). In conc\usion. "e a~sume th01t thc .. c two resions may determine if 11 todn from a ,;..:orpion of the ¡;enu:!o Cen~run:>id.:s a.:t~ specirtcally to\\ards mammal'> or arthropl'-.d ... Becau~e of th.: si¡;niticance of thc dif- icrencc ... e-.pc.:iall!' in po~ition .. .!b. )5-. ,:\8. ~9. 50 and 57. \\.e propu'ie that th.:,...: .;.¡, ri:~idu.: .. are th.: most promi.,.ins candi- d.ue,, fer future mutatinna\ e'perimcnts. To,\n.,. that act sp.:cifi.:all:- to\li.ards anhropod.i;, ~how diff.:r• enceo¡, in thcir fine "pccifi.:it:- to"ard~ in,:,cctc;. or cN!'>taceans. To idcntif:o· r.:sidue'i that mi~ht innuen.:e: thi"" spccifidty. "'e lookcd for 'añations \li.ithin th.: famil)· of anhropod-spccifi<: to)l.in" F'la.7. Frunl Uop mcodirll •nd lop •le"' 1bo11nm mudirlt of.11 i;pau·- nUC'd pA"Wnlalion of thir modd uf Cnlo. Soh cm·;i~·..-c~.,iNc rc .. 1duc .. lhill .111rir Jc.,., lh;in T . ..S nm (ruin lhC' nir;irc .. I rir- .. 1duc of lhC' ;iron1.1u,; .:/u,rcr ~·=ir-~: i~lu~~·;.:::•;:;, :.~.':~~C'r~c~~·~r~~"Jr ... ~~o~~ .. ~.:;c, ;'::~~- ~~~~::;~~;~ bic; purplir-. p.~/;ir un.;h;ir¡:cd1. All .. 11hcr rir-~iJuC'' ;irc in .. tme- ¡ti'l.'C'"n Jn Fi&. 6. Jn _genir-ral. the<.e 1Cl"\ÍR .. an: \C'"I") :-;imiloir 1:irnunJ SOc;:fJ. Rrl"iduc~ th.;ir di .. rlay •arioirion,. indudir- 1he re .. 1duei; IK .and 21. lhe u-helh re,.idue,. .!3 • .!6 ;;md .!7 :ind the lc>op hel\\C'en lhe lloC'"C"ond and third p ... 1r.md frt',.iduei;. 4.1 and 441. The .. e re. ~ions mi&hl dclermine 1he fine·lunin~ of 1he .. ~,·1li .. ·i1) o( 10,in\ aai,;e in anhropoJ ... In eon...iu ... ion. uur ;inal)"'es indicule lh:u 1he .. p.:.:ili.:il) uf a panicular lo"\in uf lhe JtC'nu' Cr111r111T•iúr-.f lo"anh mammal'!o or anhropod .. ¡ .. inOuenced hy 1he eh:ir.;ic1er of rei;idue,. ~6 •• 1.! •• l:"i. .37 • .38. 49. ~O. 57 omd :"18. Of 1he~"· residues .!6. ~:?. ~5. ~ 7 •• lK. 49 and !10 :ire ..,huolled "'-hhin a regiun of nepau•e elC'.:lr('"IOllic pci1en1ial. Con .. iderini;- lhe fac1 1h:i1 .. eurpio.m fCl\jn,. hind 10 ion ehannel' •fo rc_giton .. ••f pu .. i1i\e ... urf;;,ce p:i1cn1fol. rhe inJluC'nl."e ,,f 1he .. e re!>iduei;. mi¡:h1 he r.uher indih:'cl. In c-ontr.ai>t. n:siduei¡ !-7 .and S8 • .,iruated in a reJ;iun ...,, poi;.ilh·e ,urfaee po1en1ial. C<."ltild <.Jirc:-.:1ly t.:.iJ..e pan in lhe toinding of lhCrl•lfumhulJI Fc>und.illnn 1Ciern1.1nyl 10 B. S. and f>) sro1nl5 frnm thc H1• .. :1rd Hu&hir-to !\led1.;oal ln .. 111u1c 17.!1191·!';:710-I) 10 L. D. P •• rrom c ... ,,..J,. -'"'" umnl d .. Cir11,ia y Tc-c-11 .. 1,•s:li1·.tfc'.1kco clS~7.3-U iind o.-rrc-- ._.,.;., Grt1t'ro1/ dt' . ..\.c1111t'1.c dt'I Pe-r.•ot1uf Ac-adcl,.1ic-0ol.:1111 t'Nidod .\"oc-in.,.11 ·'"'"''""""ª Jt' .'1<61i.-o 11:...-.:!0~8931 10 B. B. \\"c .rre•nly apprr("f:ue 1he rc-.:hmo;-.:al as .. i .. 1;;inc-e ofTimo1ir-o Olamcndi. Femandt> Z:urludio 11nd Cipri• "'"º Bólldcr.:a~. \\"c "ish 10 1holnt. Ci01hrid !\f<>n"no-H01;sir-tsieb íor hi,. help "nh lhC' m:an.:>J¡Tenlir"nl of 1he comrmer fac-di1ieto In 1he labar.11ory of Or x .. , icr Sobirrón 10 "h•im "ir .. ,e $re:nl)' indcb1ed, and Or Edu:irdo Hor· 1;ilc .. f,ir cri11.:.1l u•Olding of 1hir- manu....:rir1. REFERE:"CES B.it>in. D. R .. \\".111. O. O .. Goo,.. S. M. &: .\flC'"jnel... R. "\~ f 197·0 Amino ""'d -.e<¡uirn.:-es of niruroro,ic pm1ein \01ri:rm1s from 1he \C'nom of c,,,,,.,,.,,,,¡ .. .c , .. .,,,.,.,,..;,,,1 E"ing. An·h. Bfr"Q.l-706 Bc.:irtT1I. B .• \';i1quirz. A .• O.:m:i;;i. C .. Cnron.111. ~t .• Boli\·ar. F. &: Pm.uni. L. 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