FACULTAD DE QUÍMICA DIVISIÓN DE ESTUDIOS SUPERIORES ESTUDIO DE CARBOHÍDRATOS Y ENZIMAS RELACIONADAS DURANTE LA GERMINACIÓN _ , _ , D E L GRANO DE MAÍZ EJEMPLAR ÚNICO T E S I S DE MAESTRÍA EN CIENCIAS QUÍMICAS Léxico, V. UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. SITIO DONDE SE DESARROLLO EL TEMA: LABORATORIO DE BIOQUÍMICA, RAMA DE BOTÁNICA, COLEGIO DE POSTGRADUADOS, CHAPINGO, MÉXICO. LABORATORIO DE NUTRICIÓN, DEPARTAMENTO DE ZOOTECNIA, ESCUELA NACIONAL DE AGRICULTURA, CHAPINGO, MÉXICO. Nombre completo y firma del sustentante: Nombres completos de los asesores del tema: DR. ALEJANDRO BLANCO LABRA DRA. MA. LUISA ORTEGA D, A D Presidente ler. Vocal Secretario Suplente Suplente DR. ALEJANDRO BLANCO LABRA DRA. MARÍA LUISA ORTEGA DELGADO DR. ANTONIO PEÑA DÍAZ DRA. ESTELA SÁNCHEZ DE JIMÉNEZ DR. SERGIO SÁNCHEZ ESQÜIVEL A G R A D E C I M I E N T O S A la Doctora Ma. Luisa Ortega D, y al Doctor Ale- jandro Blanco L., por su colaboración para el de- sarrollo y la redacción del presente trabajo. Al Consejo Departamental de Zootecnia (E.tt.A.) y al ing. Arturo Pro Martínez, que me concedieron las facilidades requeridas para tomar los cursos en la UNAM y desarrollar la tesis en el Colegio - de Postgraduados (C.P.). A Luz María y a Cheíto, porque representaron para mí un estímulo para la conclusión de este trabajo. CONTENIDO I.- INTRODUCCIÓN a). - Generalidades. b ) . - Cambios de presión osmótica. c).- Síntesis y degradación de sacarosa. d). - Síntesis y degradación de almidón. e). - Producción de glucosa. f).- Producción de fitoglucógeno. II.- OBJETIVOS III.- MATERIALES Y MÉTODOS a ) . - Materiales. b ) . - Germinación. c ) . - Carbohidratos solubles. d ) . - Almidón. e). - Amilosa. f). - Enzimas. IV.- RESULTADOS a). - Carbohidratos solubles totales en el grano, b ) . - Identificación de los carbohidratos solubles, c).- Cuantificacifin de los carbohidratos solubles. d). - Carbohidratos solubles en otros tipos de maíz, e ) o - Componentes no identificados, f).- Carbohidratos solubles totales en embrión y endos- permo de maíz H28. g ) . - Cuantif¿cación de azúcares individuales en maíz H28. h). - Contenido de sacarosa en diversos tejidos embriona— rios. i).- Actividad de invertasa. j).- Determinación de almidón, amilosa y amilopectina. k). - Actividad de amilasas. V.- DISCUSIÓN a). - Niveles de carbohidratos solubles. b ) . - Síntesis y degradación de la sacarosa. c).- Transporte de carbohidratos solubles. d). - Síntesis y degradación de almidón. Localización em- brionaria de amilasas. e), - Producción rápida de carbohidratos solubles en el • embrión. f).- Posible hidrólisis enzimática de la maltosa. VI.- CONCLUSIONES VII.- PERSPECTIVAS VIII.- BIBLIOGRAFÍA I . - INTRODUCCIÓN i a) Generalidades. La germinación de las semillas es un proceso que consiste en un incremento de la actividad metabólica gene- ral y permite el crecimiento de la planta a partir del em- brión (Mayer, 1975). Durante la germinación del grano de maíz aumenta el contenido de azucares solubles en agua (In_ gle et al_., 1974), al mismo tiempo el contenido de almidón disminuye y aumenta la actividad de las amilasas (Golds tein y Jennings, 1975). Se sabe además que existe una re- lación metabólica muy estrecha entre el embrión y el endos_ permo y se ha postulado que durante la germinación hay li- beración de ácido giberélico en el embrión que al llegar - al endospermo induce la síntesis de amilasas (Paleg, 1960, Radley, 1967, Jeffers y Rubenthaler, 1974). La degradación de almidón libera maltosa, gluco- sa, oligosacáridos y dextrinas que luego deben contribuir directa o indirectamente a los procesos embrionarios que - se desarrollan durante la germinación y que traen como cori secuencia el crecimiento de la plümula y la radícula con - un considerable aumento del peso del embrión. b) Cambios de presión osmótica. Es de interés el estudio de los carbohidratos so_ lubles durante la germinación del grano de maíz ya que el aumento en la concentración de estos componentes debe pro- ducir un incremento en la presión osmótica del grano y se supone que este factor ejerce una acción reguladora sobre la síntesis de amilasa en la capa de aleurona de cebada, - (Jones y Armstrong, 1971) , sin embargo hay discrepancia respecto a la existencia de dicho mecanismo, {Gepstain, e lian, 1974). Estudios realizados con maíz muestran un in- cremento continuo en la producción de aminoácidos y núcleo tidos solubles que pueden ejercer también el aumento obse£ vado en la presión osmótica, (Ingle e_t al_., 1974). c) Síntesis y degradación de sacarosa. La sacarosa es un importante carbohidrato solu— ble y es considerada como el principal material de trans— porte en plantas superiores (Zimmerman, 1960). En semi lias de cereales el incremento inicial de la sacarosa ocu- rre en el escutelo (Edelman el: al_., 1959). Aparentemente la hidrólisis de la sacarosa puede ser un prerrequisito pa_ ra el movimiento de azucares hacia el endospermo durante - la formación del grano (Sakri y Shannon, 1975). Uno de - 3 - los mecanismos para la degradación de la sacarosa es por - medio de la invertasa, enzima que ha sido demostrada en va rias semillas germinadas (Eldan y Mayer, 1974). Por otra parte, se conoce también el mecanismo - por medio del cual se sintetiza la sacarosa. La enzima ne cesaria para convertir la glucosa en sacarosa vía ÜTP y UDP-glucosa se encuentra en el escutelo (Edelman et aj., - 1959 y Nomura y Akazawa, 1974). ' Estudios realizados con trigo condujeron al descubrimiento de una enzima capaz de sintetizar sacarosa en el embrión (Leloir y Cardini, 1953) . Ahora se sabe que existen varios caminos para la formación de sacarosa; una vía de formación de sacarosa es por medio de la enzima sacarosa sintetasa (UDP-glucosa + fructosa —>• sacarosa + UDP), otro camino es por medio de sacarosa fos- fato sintetasa y una hidrolasa (UDP-glucosa + fructosa-6P —> UDP + sacarosa-P —> sacarosa + P). La enzima que for ma UDP-glucosa se denomina UDP-glucosa pirofosforilasa (UTP + glucosa-lP —*• UDP-glucosa + PP.) (Turner y Turner, 1975). Algunos autores piensan que la función de la sa- carosa sintetasa es la degradación de sacarosa para formar UDP-glucosa (Delmer, 1972) y que la producción de ADP-glu- - 4 - cosa ¿n_ vivo por una reacción de ADP con sacarosa es impr£ bable. Sin embargo, se sabe que la síntesis de almidón procede a partir de ADP~glucosa, la cual se sintetiza por la enzima ADP-glucosa pirofosforilasa a partir de glucosa- 1P proveniente de la reacción reversible de UDP-glucosa pirofosforilasa (Preiss y Kosuse, 1970). El proceso de formación de almidón a partir de sacarosa ha sido ya demos_ 14 trado suministrando sacarosa C y observando la incorpora_ ción de radioactividad en amilosa y amilopectina (Porter, 1962). Con el fin de aclarar dicho mecanismo, se propuso el esquema siguiente para la transformación de sacarosa en almidón: UDP SACAROSA -*. UDP-glucosa ALMIDÓN FRUCTOSA ^ L > FRUCTOSA ATP ADP GLUCOSA *• GLUCOSA-6P <4 -6P •- GLUCOSA-1-P Conversifin de sacarosa en almidón.- 1.- Invertasa 2.- Sacarosa-UDP (ADP) glucosiltransferasa (sacarosa sinteta_ sa) 3.-Hexoquinasa 4.~Glucosa-P isomerasa 5.~Fosfoglucomii tasa 6.-UDP (ADP)-glucosa pirofosforilasa 7.~Nucleósido d¿ fosfoquinasa 8.-Fosforilasa 9.-ADP (UDP)-glucosa almidfin - sintetasa. (Pérez et al., 1975, Turner y Turner, 1975, De Fe kete y Cardini, 1964). - 5 - d) Síntesis y degradación de almidón. La síntesis de almidón procede a partir de ADP- glucosa, UDP-glucosa 6 almidón fosforilasa (Tsai y Nel son/ 1968) , también se sabe que su degradación es princi- palmente por acción de las amilasas. La formación enzima tica de alfa amilasa ocurre por síntesis de_ novo en la ca. pa de aleurona de cereales (Filner y Varner, 1967). Tam- bién se ha observado que el tratamiento con proteasas li- bera amilasas (Jacobsen y Varner, 1967). La enzima alfa amilasa se encuentra en forma de isozimas (Olered, 1975) y se piensa que estas diferentes formas enzimaticas se encuentran funcionando cooperativa- mente en la degradación completa del almidón (Tanaka et - £l_.,1970), sin embargo, algunos investigadores sostienen que existen regiones altamente ramificadas (macrodextri— ñas) que son resistentes a la degradación por alfa amila- sa (Brammer et al. ,1972). Además de las diferencias respecto a la degrada ción del almidón parece ser que la enzima alfa amilasa es_ tS unida a los granulos de almidón mientras que la enzima beta amilasa se encuentra libre y Cínicamente actúa sobre - 6 - dextrinas producidas por acci6n de alfa amilasa (Graham, 1974). e) Producción de glucosa. AdemSs de la sacarosa, también la glucosa es un carbohidrato soluble muy importante durante la germina ción. La reducción de la capacidad para germinar está - precedida por una disminución de la utilización de gluco- sa (Abdul-Baki, 1969). La producción de glucosa es un evento vital en las primeras etapas de la germinación (Mayer, 1974). f) Producción de fitoglucógeno. El polisacárido fitoglucógeno se acumula en el maíz dulce, aunque también se ha encontrado en otros geno tipos; ha sido demostrado que este polisacSrido se encuen tra en la fracción de polisacáridos solubles en agua y se asemeja bastante al glucógeno según su comportamiento de sedimentación, longitud de cadena y degradación por enzi- mas, se ha demostrado también que la molécula donadora de grupo glucosilo para la formación de fitogucógeno es ADP- glucosa (Creech, 1968). - 7 - II.- OBJETIVOS El estudio del metabolismo de carbohidratos en el grano de maíz es importante, ya que si se conocen los eventos bioquímicos de una semilla; se puede mejorar su - calidad. Por ejemplo, sabiendo que durante la germina ci6n del grano de maíz aumenta el contenido de lisina y - triptofano (Dalby y Tsai, 1975), se puede recomendar su - uso como semilla germinada para la nutrición. Sabiendo - también que el contenido de aminoácidos y carbohidratos - solubles aumentan durante la germinación (Ingle et_ a_l_., - 1974) , se podría esperar una mejor digestibilidad del gra_ no germinado en comparación con la semilla sin germinar, esta posibilidad sin embargo se puede ver afectada debido al incremento en la formación de paredes celulares uno de cuyos principales componentes es la celulosa que no es - utilizable por los animales monogástricos. La germinación de la semilla de maíz ha sido estudiada por muchos inves- tigadores, sin embargo, restan algunas interrogantes en - el proceso. Se discuten atín los mecanismos de acción del ácido giberélico, los sitios de síntesis de los azúcares solubles y su transporte a las diferentes partes del e m - brión, así como los mecanismos enzimáticos involucrados. Tampoco se conoce la relación entre las velocidades de síntesis y degradación de los carbohidratos y se han pues_ to de manifiesto diferencias metabólicas entre las rasas de maíz, (Creech, 1968). Por lo anteriormente expuesto y siendo el maíz un cultivo fundamental para nuestro país, se propuso este trabajo de investigación con los siguientes objetivos: 1) Conocer cuáles son los tejidos del grano de maíz en donde se ponen de manifiesto los incrementos en carbo- hidratos solubles. 2) Investigar la concentración e identidad de los carbohi^ dratos solubles que se producen durante la germinación. 3) Estudiar la concentración y degradación del almidón y sus componentes en el grano, buscando una relación con la producción de los carbohidratos solubles. 4) Investigar algunas enzimas relacionadas con la degrada, ción de los carbohidratos durante la germinación. 5) Buscar similitudes y diferencias bioquímicas entre di- versos tipos de maíz. III.- MATERIALES Y MÉTODOS a) Materiales. Se estudiaron el maíz híbrido H28 y las razas - Dulce de Jalisco y Cristalino de Chihuahua de las colee— ciones del Instituto Nacional de Investigaciones Agríco— las (INIA) a quienes se agradece su colaboración. El híbrido H28 es un maíz de color blanco con - endospermo de tipo cristalino y se desarrolla a una alti- tud de 2000 a 2600 metros sobre el nivel del mar, siendo recomendado por su resistencia a la sequía y su capacidad reproductiva bajo condiciones de temporal. Su ciclo es - de 120-135 días en Texcoco y sus alrededores y tiene la - siguiente genealogía: (Mich. 21-26X (Max. 39 comp. I X mich. 21-20-29 2) (Mich. 21-comp. 1-27-2 X Mich. 21- comp. 1-7-1) (Aguado et al., 1963). El maíz Dulce de Jalisco es de color amarillo y presenta una testa invaginada que le proporciona una carac terística especial para poder distinguirlo fácilmente de otras razas. Su nombre deriva del carácter dulce de los granos. Se ha encontrado principalmente en el estado de Jalisco entre 1000 y 1500 metros de altitud aunque cier— tas modificaciones de esta raza se encuentran en Sonora - y Nayarit a 100 metros sobre el nivel del mar. (Wellhau- sen e_t al.,1951). El maíz Cristalino de Chihuahua es de color blan_ co y posee un endospermo cristalino, se desarrolla en v a — ríos estados de la República, el maíz Cristalino de Apat— zingan es de tipo dentado y se desarrolla a 2300 metros de altitud (Nat. Acad. Sci., 1954). b) Germinación. Las semillas con pesos similares se esteriliza^— ron por inmersión en una solución de hipoclorito de sodio al 1.5% durante 15 minutos y se germinaron en la oscuridad a una temperatura de 30°C (Goldstein y Jennings, 1975). c) Carbohidratos solubles. La extracción de los carbohidratos solubles se - hizo con una solución de cloroformo-agua-metanol (4:3:13) (Shannon, 1968)o Los tejidos de un grano se homogenizaron - 11 en un mortero de vidrio con 10 mi de la solución de extra£ ci6n, agitándose vigorosamente en un tubo de centrifuga - durante 5 minutos, centrifugándose después 20 minutos a - 1500 r.p.m. en una centrifuga clínica. Del sobrenadante - se midieron alícuotas de 0,1 mi para hacer las determina-— ciones de carbohidratos totales y para desarrollar la cro- matografía de intercambio i(5nico. Los componentes solubles totales se determinaron por el método de fenol sulfúrico (Dubois et al.,1956). La cuantificación individual de los carbohidratos se realizó en un analizador automático Technicon (Kesler, 1967), en - el cual la separación se efectúa en una columna comercial de intercambio iónico tipo s marca Cromo-Beads a 54°C con un gradiente de ácido bórico-NaCl (tabla 4 y esquema 1), y los carbohidratos eluídos se hacen reaccionar con una solu ción de orcinol al 0.1% en ácido sulfúrico al 70% leyéndo- se posteriormente el color desarrollado a 420 nm. Las áreas obtenidas en el registrador y los tiempos de reten— ción se comparan con tipos conocidos. Algunos resultados se obtuvieron haciendo la separación de los carbohidratos por cromatografía descendente en papel Whatman número 1 - usando una solución de isopropanol-agua (4:1) como eluyen- - 12 - te. El reconocimiento de las sustancias problema se hace comparando con tipos conocidos y aspersión con reactivos - diferenciales. d) Almidón. A fin de buscar un método para la determinación de almidón que conjugara la prueba rápida de fenol-sulfúr¿ co y que pudiera efectuarse sobre muestras pequeñas, se d£ sarrolló una metodología para la extracción del almidón y su posterior hidrólisis para la determinación de glucosa - por el método de fenol-sulfúrico. El método consiste en - extraer el almidón total empleando ácido perclórico al 30% (Gaines, 1973) , posteriormente se hace una hidrólisis con ácido clorhídrico y la determinación de glucosa utilizando reactivo de fenol-sulfúrico. Con el empleo del método de fenol-sulfúrico se - ahorran muchos pasos de precipitación y centrifugaciones - requeridas para el aislamiento del almidón; basta una e x — tracción con cloroformo-agua-metanol para quitar los carb£ hidratos solubles en agua y una segunda extracción sobre - la misma muestra usando ácido perclórico al 30% de donde - finalmente se toma una alícuota que se trata con 6 mi de - - 13 - ácido clorhídrico concentrado diluido 1:1 para hidrolizar el almidón. Para ver si otros polímeros como celulosa se ex- traen con ácido perclórico se tomó celulosa pura y se some^ tió al mismo tratamiento, observándose que del total de la celulosa únicamente pasa el 1.24% a la solución perclórica. Es importante mencionar que para la extracción con ácido - perclórico algunos autores recomiendan llevar a cabo pre— viamente, la gelatinización del almidón. Para ver si era posible excluir este paso en donde por el calentamiento de la muestra se puede llevar a cabo la hidrólisis parcial de otros polímeros diferentes del almidón, se realizó la cro- matografía en papel de una muestra homogenizada con agua - y se observó que al eluir con ácido perclórico al 30%, el almidón corría muy cerca del frente del solvente. Este ex perimento nos demostró que no se requiere gelatinización - si no que el almidón puede pasar fácilmente a la solución perclórica, después de la homogenización. e) Amilosa. La determinación de amilosa se realizó por medi- ción de la coloración azul que se produce con el reactivo - 14 - de yodo (Williams et̂ al. ,1970), pero ya que se tiene el eit tracto perclórico del almidón, se hace la prueba directa - sobre una alícuota de dicha solución, el método es rápido, así que no dá lugar a la hidrólisis parcial del almidón, - la prueba de la amilosa debe hacerse antes de la medición del contenido de almidón. Después de hacer modificaciones por volumen, el método se puede describir en los términos siguientes: tomar 25 a 30 mg de muestra, homogenizar con - ácido perclórico al 30% hasta completar el volumen deseado (10 mi), tomar una alícuota de 0.1 mi y colocarla en un tu bo de ensayo que contiene 5 mi de HC1 0.1 H y 0.1 mi del - reactivo de yodo; leer el color desarrollado a 625 nm. Los resultados obtenidos al medir la cantidad de almidón en una muestra de maíz H28 fueron de 57.32-0.82%, el porcentaje de amilosa para la misma muestra fue de 24.88 - 1.12% y el contenido de amilopectina obtenido por diferencia fue de 32O44%. Los resultados anteriores están dados como por ciento en base húmeda. f) Enzimas. La actividad de invertasa se detectó por incuba- ción de un extracto embrionario crudo en buffer de aceta— - 15 - tos 0.1 M pH 4.6 según el método empleado para medir saca- rosa después de su inversión a hexosa (Bergmeyer y Klotz— sch, 1963). El método se modificó viendo la hidrólisis de sacarosa por la disminución de intensidad de la mancha ob- tenida para dicho carbohidrato y la aparición simultánea - de fructosa después de desarrollar la cromatografía en pa- pel y revelar con un reactivo de orcinol-HCl (1:100)» Las amilasas fueron extraídas con buffer de suc- cinato 40 mM pH 5.0 y su actividad se determinó por medi— ción de la disminución del color azul que el almidón produ ce en presencia de yodo a 625 nm (Bernfeld, 1955, Blanco E. 1978). Es un criterio generalmente aceptado que por ac ción de calor (70°C,15 min) se inactiva la enzima beta ami_ lasa mientras que la enzima alfa amilasa es estable bajo - las mismas condiciones (Goldstein y Jennings, 1974). I n - vestigaciones recientes muestran que ciertas formas molecu_ lares de alfa amilasa son sensibles al calor (Labanssat, - 1975) . Sin embargo, en este trabajo se hicieron experimeii_ tos para determinar amilasas antes y después del tratamieri to con calor„ 16 - IV.- RESULTADOS a) Carbohidratos solubles totales en el grano. Con el objeto de obtener una curva estándar para medir la concentración de carbohidratos solubles, se toma- ron diferentes cantidades de glucosa, las cuales se hicie- ron reaccionar con el reactivo de fenol-sulfúrico obtenién dose los resultados mostrados en la figura 1; estos valo— res nos sirvieron para obtener la ecuaci6n de regresión mostrada; así que los resultados obtenidos en las muestras estarán dados como microgramos equivalentes de glucosa. La figura 2, nos muestra los resultados obteni— dos al medir la producción de componentes extraíbles con - cloroformo-agua-metanol y polisacáridos solubles en agua, durante la germinación del grano de maíz H28. Se puede ob servar que los niveles de carbohidratos solubles disminu— yen inicialmente, experimentando un importante incremento después del sexto día de germinación. Empleando el método de Shannon, no se encontraron cambios detectables en el contenido de polisacáridos solubles en agua, así que se de_ cidió hacer las observaciones posteriores sobre el extrac- to obtenido con cloroformo-agua-metanol que contiene los - - 17 - carbohidratos solubles en agua0 Para saber cuáles son los tejidos del grano de - maíz que contribuyen principalmente al incremento en la producción de carbohidratos solubles, se estudió el endos- permo en comparación con los tejidos embrionarios a los 3 días de germinación. La tabla 1, nos muestra el contenido de carbohidratos solubles en los diferentes tejidos del gra no de maíz H28, obteniéndose valores máximos en los teji- dos embrionarios, mientras que los valores más bajos se ob_ servan en endospermo y cutícula. b) Identificación de los carbohidratos solubles. Con el objeto de conocer la naturaleza química - de los carbohidratos presentes en el embrión y el endosper mo de maíces no germinados, en comparación con maíces de 6 días de germinación se realizó la cromatografía en papel - que se muestra en la figura 3 encontrándose una alta con— centración de sacarosa en el embrión,de maíces no germina- dos y de seis días de germinación, así mismo se observa - una mancha de glucosa en el embrión y el endospermo al sest to día del proceso, mientras que en el endospermo sin ger- minar no se detecta sacarosa. - 18 - Estos resultados se corroboraron utilizando una columna de intercambio iónico, empleando para ello un ana- lizador automático de carbohidratos de la marca Technicon, según el procedimiento que se describe en materiales y mé- todos. Las figuras 4 y 5 nos muestran los resultados obt£ nidos; se observan picos de glucosa y sacarosa en el em brión, pero no fue posible detectar sacarosa en el endos— permo; es interesante observar que no se detecta maltosa - en el endospermo aún tratándose de maíces germinados; era de esperarse encontrar niveles elevados de maltosa ya que se sabe que las amilasas comienzan a actuar desde los pri- meros días de germinación (Blanco, E., 1978). Con el obje_ to de observar la producción de maltosa, se utilizaron gra_ nos de maíz de 3 días de germinación poniendo en la colum- na de cromatografía una cantidad mucho mayor de muestra y obteniéndose los resultados que se muestran en la figura 6 observándose picos de maltosa y sacarosa en el endospermo, sin embargo, existe una diferencia notable con el conteni- do de sacarosa en el embrión. Con el objeto de hacer esta comparación se desarrolló el cromatograma mostrado en la - figura 7 a partir del cual se puede concluir que el conte- nido de sacarosa en el embrión es 10 tantos mayor que en - el endospermo, comparándolos en base seca. - 19 - Al hacer la cromatografía de intercambio iónico, se observan picos de rápida movilidad que bandean junto a la sacarosa según se puede ver en algunos de los cromato- gramas presentados; se hicieron pruebas para ver la natura, leza de estos picos encontrándose que el metanol del s o l - vente bandea en dicha posición, posteriormente se encontró que también el alcohol etílico sale con el mismo tiempo de retención. c) Cuantificación de los carbohidratos solubles. La siguiente fase del trabajo consistió en medir cuantitativamente el contenido de sacarosa y demás azúca— res solubles que se producen durante la germinación. Se - hicieron pruebas para ver si el área resultante bajo la - curva obtenida en el registrador del equipo automático de cromatografía, era proporcional al contenido de carbohidra_ to puesto en la columna. La figura número 8, nos muestra uno de los resultados obtenidos al medir las áreas del pi- co de sacarosa. Previamente al desarrollo del cromatograma de la figura 8, se hicieron pruebas para observar si la salida - del pico de sacarosa se afectaba por la variación en la - - 20 - concentración de los otros carbohidratos solubles en la - muestra, se observó gue los tiempos de retención de sacar£ sa no se afectaban por la variación en la concentración de glucosa y fructosa, por lo tanto, se pueden poner muestras sucesivas para detectar Gnicamente los picos de sacarosa, los otros carbohidratos solubles se retienen en la columna. Con objeto de conocer la cantidad de muestra por centímetro cuadrado del área bajo la curva graficada en el registrador, se hicieron varias pruebas obteniéndose los - resultados gue se presentan en la tabla 2. Se observa que se necesitan valores elevados de maltosa y fructosa para - obtener un centímetro cuadrado de área, este resultado se debe probablemente a diferencias en los coeficientes de eit tinción de los productos de reacción obtenidos con el reac tivo de orcinol ó al rearreglo molecular de carbohidratos debido a las condiciones alcalinas del buffer de elución, (Walborg y Lantz, 1968), d) Carbohidratos solubles en otros tipos de maíz. Con el fin de comparar algunas variedades en el contenido de carbohidratos solubles durante la germinación se hicieron los experimentos mostrados en las figuras 9 y - 21 - 10, utilizando las razas Dulce de Jalisco y Cristalino de Chihuahua» En ambos casos se observa el patrón ya encon— trado-en maíz H28, respecto al contenido total de carbohi- dratos solubles en agua; hay una disminución inicial segui_ da de un importante incremento a partir del segundo día de germinación. El contenido de sacarosa aumenta ligeramente en el embrión de maíz Cristalino de Chihuahua pero dismi— nuye en el embrión de maíz Dulce de Jalisco. Los niveles de glucosa y fructosa aumentan en ambas razas siendo la sa_ carosa el carbohidrato soluble mas abundante. La figura 11, nos muestra la cromatografía de in tercambio iónico de una muestra de maíz Dulce de Jalisco; se observa en la región del pico de la glucosa la sobrepo- sición de un carbohidrato que por su posición podría ser - xilosa, se hizo la cromatografía del extracto en papel y - no se comprobó la presencia de xilosa, por otra parte, se observó que cuando la concetración de carbohidrato es ele- vada, los picos tienden a desplazarse hacia el inicio del cromatograma, es decir que se adelanta la salida de los componentes de las muestras, así que muy probablemente se adelantó el pico de glucosa hasta la posición de salida de xilosa en esta muestra, el área total mostrada en la figu- 22 - ra se tomó para calcular el porcentaje de glucosa. e) Componentes no identificados. Es interesante hacer notar que en todos los cro- matogramas desarrollados, tanto con muestras del embrión - como del endospermo, se observan picos de baja movilidad - que salen después de la glucosa; no se hicieron pruebas pa_ ra la identificación de estos componentes; sin embargo, se observó que la glucosa pura, no importa la marca (Merck, - Baker ó Monterrey), produce picos en la misma posición. Estas observaciones nos hicieron pensar que la glucosa se oxida en su paso por la columna de cromatografía y se for- ma probablemente algün producto de descomposición que se - retiene fuertemente por ser más polar que la glucosa. Se pensó que los correspondientes picos de las - muestras son probablemente producidos por la glucosa pre— senté en esos tejidos, sin embargo, también se observó que las muestras de embrión de cero días de germinación que no contienen glucosa, producen el mismo pico característico. Estas ideas no se demostraron por no ser el objetivo de es_ te trabajo, pero podemos afirmar que el tratamiento con - cloroformo-agua-metanol de las muestras del embrión, e x — - trae componentes de baja movilidad. Se pensó que esos pi- - 23 - eos fueran producidos por glicerina obtenida por hidróli— sis de triglicéridos, pero se vio gue este alcohol sale antes de la maltosa excluyéndose dicha posibilidad. Las - observaciones mencionadas en el párrafo anterior, se mues- tran en la figura 12. f) Carbohidratos solubles totales en embriGn y endospercno de maíz H28. Con el objeto de buscar la relación entre la pro_ ducci6n de carbohidratos solubles en el embrión y el endos_ permo durante la germinación, se realizaron las determina- ciones descritas previamente con el híbrido H28. La figu- ra 13, nos muestra los resultados obtenidos. Se observa - una disminución inicial en el embrión seguida de un incre- mento después del segundo día de germinación, y por obser- vación de las barras que indican desviación estándar, se - puede pensar que las diferencias encontradas son significa tivas, en el endospermo se detecta un continuo incremento desde el inicio de la germinación» En cualquier momento, el contenido de carbohidratos solubles es menor en el e n — dospermo que en el embrión, calculándolos como porciento - en base seca. - 24 - g) Cuantificaci6n de azúcares individuales en maíz H28. Con el objeto de medir la producción de los priri cipales carbohidratos solubles del embrión en maíz H28, se realizó el experimento mostrado en la figura 14; se puede observar un patrón similar al obtenido con maíz Cristalino de Chihuahua; hay una disminución inicial en el porciento de sacarosa seguida de un incremento a partir del segundo día de germinación. También se observan incrementos conti_ nuos de glucosa y fructosa desde el inicio de la germina- ción. Contrariamente a lo que acontece en el grano de arroz, (Palmiano y Juliano, 1972), el carbohidrato soluble más importante es la sacarosa. La disminución inicial en el porciento de sacarosa que se muestra en la figura 14, - podría ser consecuencia del incremento en el peso del e m - brión, así que se decidió observar si el contenido total - de sacarosa experimentaba una disminución. En la figura - 15, se muestran los resultados de la figura 14, expresan— dolos como miligramos de carbohidrato por embrión. Posteriormente se hicieron determinaciones de los niveles de carbohidratos solubles en el endospermo. Se había ya detectado la presencia de maltosa y sacarosa. La figura 16, nos muestra las concentraciones obtenidas, se - - 25 - puede ver una disminución inicial en el contenido de saca- rosa seguida por un incremento continuo a partir del según do día de germinación; los niveles de glucosa, aumentan - desde el inicio de la germinación mientras que los niveles de fructosa y maltosa aumentan a partir del segundo día - del proceso. La importancia de estos cambios/ en especial la producción de maltosa se discutirá más adelante. h) Contenido de sacarosa en diversos tejidos embrionarios. Para conocer el contenido de sacarosa en los di- versos tejidos del embrión del maíz H28, se determinó este carbohidrato por cromatografía de intercambio iónico. Los resultados pueden verse en la tabla 3, observándose los va lores más bajos en la plúmula. i) Actividad de invertasa. Por observación de los resultados de la tabla 3, donde se pueden ver bajas concentraciones de sacarosa en - la plúmula y pensando que las enzimas implicadas en la pro ducción de hexosas fueran responsables de hidrolizar la sa_ carosa para producir glucosa y fructosa, se hicieron expe- rimentos para detectar actividad de invertasa al inicio de la germinación. Utilizando el método de Bergmeyer no se - - 26 - detectó hidrólisis de sacarosa en la plúmula aún incubando el extracto a 50°C, sin embargo, en el centro del embrión se obtuvo el resultado mostrado en la figura 17. Se o b — servó una disminución en la intensidad de la mancha de sa- carosa a medida que aumenta el tiempo de incubación. Se- gún se mencionó en materiales y métodos, el revelador usa- do fue una solución de orcinol-HCl. Se observó que para— lelamente a la desaparición de la intensidad de la mancha de sacarosa, comienza a aparecer una mancha de fructosa a medida que aumenta el tiempo de incubación. Se hicieron - las mismas pruebas utilizando sacarosa pura, se observa - que la intensidad de la mancha de sacarosa es constante; - solamente hasta los 90 minutos de incubación aparece una - mancha de fructosa; este último experimento se realizó pa- ra excluir la posibilidad de que la fructosa que aparece - en el cromatograma de la muestra sea el resultado de una - hidrólisis no en2imática de la sacarosa debido a la tempe- ratura de 50°C y las condiciones acidas de la solución re- guladora de acetatos. j) Determinación de almidón, amilosa y amilopectina. Se hicieron pruebas para medir los componentes - del almidón en el embrión y en el endospermo durante la - - 27 - germinación del maíz H2 8. La figura 18 nos muestra los resultados obtenidos, se puede ver que los niveles de e s - tos polisacSridos en el embrión, no cambian notoriamente a pesar de que parece haber una disminución en el contenido de amilosa en el segundo día de la germinación; sin embar- go, el contenido de almidón no se modifica. En el endos— permo el contenido de amilosa permanece constante. Hay - sin embargo un ligero aumento en el contenido de almidón - hasta el cuarto día y después ae presenta una disminución. Estos cambios no se deben al error experimental ó a la va- riabilidad genética según se puede ver por observación de las barras que indican desviación estándar. A fin de observar los resultados expresados como miligramos de carbohidratos por endospermo y por embrión, se presenta la figura 19, en donde se puede ver una conti- nua degradación del almidón en el endospermo habiendo una disminución simultánea del contenido de amilosa y amilope£ tina. En el embrión por el contrario, se observa una dis- minución inicial seguida de un continuo incremento después del segundo día de germinación, es importante hacer notar que los niveles de amilosa en el embrión, permanecen cons- tantes hasta el sexto día de germinación. En el endosper- - 28 - mo se observa por el contrario una disminución gradual en el contenido de este polisacárido, lo cual era de esperar- se, puesto que ha sido demostrada la actividad de alfa-altú lasa en este tejido durante la germinación; pero ¿por qué los niveles de aroilosa son constantes en el embrión? ¿no existe actividad de amilasa y por lo tanto, éste polisacá- rido no se degrada? ¿Hay degradación y formación simultá- nea, de tal manera que su velocidad de formación es igual a su velocidad de degradación y así los niveles permanecen constantes durante la germinación? A fin de responder e£ tas preguntas se llevaron a cabo mediciones de actividad - de amilasas, teniendo como antecedente el reporte de que - la actividad amilolltica total se incrementa en grano ente_ ro a partir del primer día de germinación (Blanco, E., 1978). k) Actividad de amilasas. Con objeto de conocer si existe actividad de aini lasas en el embrión, se realizó el experimento mostrado en la figura 20, en donde se puede ver que la actividad de a- milasas del embrión es tan importante como en el endosper- mo durante los primeros días de germinación, a pesar de las diferencias en tamaño, pero después del cuarto día dis_ - 29 - . minuye la actividad en el embrión mientras que en el endos_ permo continúa incrementándose. La misma figura, nos mues_ tra una actividad de amílasas similar en el embrión y el - endospermo a los dos días de germinación. Para conocer cual es la actividad de amilasas en el primer día de germinación en ambos tejidos, y con el fin de diferenciar por el proceso de sensibilidad a la tem peratura, se desarrollaron los experimentos mostrados en - las figuras 21 y 22. Previamente se habla detectado que los extractos de endospermo obtenidos con buffer de succi- nato 40 mM de pH 5.0 contienen almidón, mientras que los extractos obtenidos del embrión no producen coloración azul con yodo, estas observaciones nos hicieron pensar que la actividad de amilasas es mayor en el embrión que en el endospermo en el primer día de germinación o que la presen cia de almidón en los extractos endospérmicos se debe a su elevada concentración en este tejido. La figura 21, nos - muestra los resultados obtenidos en el endospermo. Se ob- serva que no existe actividad de amilasas en el primer día de germinación. La actividad de amilasas estables al c a — lor se incrementa continuamente desde el primero al quinto día de germinación y después experimenta una disminución - - 30 - importante. Las amilasas sensibles al calor presentan va- riaciones durante la germinación observándose valores míni_ ,jé mos entre el cuarto y quinto día del proceso y después au- mentan su actividad. La figura 22, nos .muestra los resultados obteni- dos en embrión. Las actividades de amilasas estables y - sensibles al calor tienden a aumentar desde el inicio de - la germinación. Es importante observar que la actividad - total de amilasas es más alta en el embrión a los dos días de germinación pero a partir del segundo día del proceso - predomina la actividad de amilasas en el endospermo. En - ambos tejidos es mayor la actividad de amilasas estables - al calor. - 31 - V.- DISCUSIÓN • a) Niveles de carbohidratos solubles. .Las observaciones de la figura 2 y la tabla 1, - en donde se puede ver un importante incremento en el conte_ nido de carbohidratos solubles en agua, encontrándose las concentraciones más elevadas en los tejidos embrionarios, nos permiten pensar en la existencia de una gran actividad metabólica que se traduce en el crecimiento de una nueva - planta. Además podemos pensar en un efecto importante de presión osmótica en el grano de maíz durante la germinación, puede decirse que es el embrión en donde aparece principal^ mente este incremento de presión, la cual es generada por la producción de componentes solubles en agua siendo gluco sa y sacarosa los principales carbohidratos implicados en el proceso. Las concentraciones de carbohidratos solubles en agua del endospermo y cutícula son bastante bajos; pué£ to que estos tejidos del grano no están destinados a c r e - cer, si no que al contrario, su peso disminuye considera— blemente durante los primeros seis días de germinación, se puede sugerir que la elevada producción de carbohidratos - solubles que aparecen durante la germinación es propia de los tejidos en crecimiento. - 32 - Es interesante observar en la figura 3 la pre sencia de glucosa y sacarosa en embrión de maíz H28 de - seis días de germinaci6n/ pero también es importante men— cionar que no se detecta maltosa. Se esperaba encontrar - este ültitno disacSrido en el embrión debido a la actividad de las amilasas sensibles al calor. Estas enzimas se iden tificaban como beta amilasas cuyo producto de reacción es maltosa (Goldstein y Jennings, 1975, Mayer y Poljakoff, 1975), pero la ausencia de este disacárido en el embrión,- nos permite pensar en que un importante proceso de hidróli^ sis de maltosa se encuentra funcionando en el grano de maíz durante la germinación; que el proceso sea endospérmjL co 6 embrionario no se dilucidó en este trabajo; sin emba£ go se puede mencionar a partir de los resultados obtenidos en esta investigación, que la existencia de maltosa difie- re de la existencia de almidón y sacarosa en que el primer carbohidrato es endospérmico mientras que los dos últimos se detectan en el embrión y en el endospermo (figuras 15 y 16). Para dar un grado mayor de generalización a las observaciones hechas con anterioridad, se decidió estudiar la producción de carbohidratos solubles en diferentes r a — zas de maíz, por tal motivo, se desarrollaron los experi— - 33 - mentos mostrados en las figuras 9 y 10, empleando embrio— nes de las razas Dulce de Jalisco y Cristalino de Chihua- hua; encontrándose también que el principal carbohidrato - soluble del embrión es sacarosa, cuyos niveles se determi- naron durante la germinaci6n siendo del 15% aproximadamen- te al inicio del proceso. Se encontró también que el por- centaje de glucosa aumenta continuamente desde el inicio - de la germinación y teniendo en cuenta que durante la ger- minación las células embrionarias se van diferenciando cori tinuamente para dar lugar a la formación de nuevos tejidos podemos proponer con cierto grado de generalización que la aparición de glucosa en el grano de maíz puede ser un índ¿ ce apropiado de diferenciación celular. Además se puede - también decir que el principal carbohidrato soluble en el grano de maíz es sacarosa y su localización es embrionaria. b) síntesis y degradación de la sacarosa. En el híbrido H28 se realizaron los experimentos mostrados en la figura 13 a partir de los cuales se puede concluir que tanto en el endospermo como en el embrión hay un incremento continuo en el contenido total de carbohidra_ tos solubles en agua, pero siempre es mayor el contenido - de carbohidratos solubles en el embrión durante la germina - 34 - ción tal como se había visto ya en la tabla 1 discutida con anterioridad. Las figuras 3, 4 y 5 revelan que existe una importante diferencia en el contenido de sacarosa e n — tre el embrión y el endospermo de maíz H28. Puede afirma£ se que el contenido de sacarosa del embrión es mucho mayor que el del endospermo, pero además de sacarosa hay produc- ción de glucosa en ambos tejidos. Ahora bien, ¿de dónde - proviene la glucosa del embrión?. Sabemos que durante la - germinación del grano de maíz hay un incremento continuo - en los niveles de este carbohidrato, tal como se muestra - en la figura 14; esta glucosa puede provenir del endosper- mo o producirse en el embrión a partir de la sacarosa que se encuentra en grandes cantidades según ya hemos visto con anterioridad. En la figura 14, también se muestra que los niveles de sacarosa experimentan una disminución en los primeros días de germinación, lo cual sugiere la exis- tencia de un proceso de degradación de sacarosa. Esta su- gerencia puede hacerse también por observación de la figu- ra 15, en donde se presentan los resultados expresándolos como miligramos de carbohidrato soluble por embrión. Por lo tanto, se hicieron pruebas para detectar actividad de invertasa al inicio de la germinación. El ex - 35 - perimento mostrado en la figura 17, nos permite confirmar la existencia de esta actividad enzimática al menos en el primer día de germinación, pero además es importante obse£ var que después del segundo día del proceso, el contenido de sacarosa por embrión se incrementa en relación con los niveles iniciales (figuras 14 y 15); esta observación per- mite hacer la siguiente sugerencia: si la actividad de in- vertasa no cambia durante la germinación, en las etapas in_ termedias del proceso parece que hay un predominio de la - formación de sacarosa sobre su degradación. En otras pala, bras, a partir del segundo día de germinación parece que - existe un interesante fenómeno de producción de sacarosa - en el embrión del maíz H28, este fenómeno podría continuar hasta el cuarto día de germinación a partir del cual podría ser constante y entonces seria posible proponer que la ve- locidad de síntesis de sacarosa es igual a su velocidad de degradación en las etapas finales de la germinación. Como se detectó una importante actividad de inver-- tasa en el primer día de germinación (figura 17), pode- mos además hacer la siguiente sugerencia, la glucosa produ cida en el embrión puede provenir en parte de la sacarosa que está en ese mismo tejido y la importante disminución - 36 en. los niveles de sacarosa en las primeras etapas de germi nación se podría originar parcialmente debido a la activi- dad de invertasa en el embrión ¿cuál es la razón por la cual se produce glucosa desde los primeros días de la ger- minación?, probablemente los tejidos embrionarios en for— mación requieren un substrato más fácilmente utilizable, - la obtención del cual se puede generar rápidamente por ac- ción de la invertasa. Ahora bien, ¿de dónde proviene la sacarosa que - se forma en el embrión?. Sabemos que los niveles de este carbohidrato en el endospermo son bastante bajos y que la síntesis de sacarosa ha sido demostrada en el embrión de - varias semillas (Leloir, 1953, Edelman, 1959 y Delmer, 1972). También se sabe que la sacarosa puede provenir de los llpidos (Beevers, 1961). El aumento de sacarosa al cuarto día que se observa en la figura 14, corresponde con las observaciones de que la malato sintetasa y la isocitra_ tasa tienen un aumento de actividad al cuarto día de germi nación en el escutelo de maíz (Longo y Longo, 1970). Con base en estas ideas podríamos sugerir que el sitio princi- pal de síntesis de sacarosa en el grano de maíz es embrio- nario. . - 37 - c) Transporte de carbohidratos solubles. También es posible pensar en la existencia de un importante proceso de transporte de carbohidratos solubles del endospermo al embrión; este proceso se puede iniciar ~ en los primeros días de germinación y si bien es cierto r que este trabajo no demostró la existencia del fenómeno, - la observación de que los niveles de carbohidrato soluble son bajos en el endospermo, aún en los granos de maíz de - seis días de germinación, parece indicar que de alguna ma- nera los carbohidratos solubles en agua que se producen en el endospermo contribuyen al incremento en el peso del em- brión. En otros términos, la elevada actividad de amila— sas debe producir material que pasa del endospermo al em— brión, puesto que en todos los estadios de la germinación, se observan niveles bajos de carbohidratos solubles en el endospermo, (figura 16). Además, los datos de la figura - 20 indican que la actividad de amilasas es baja en los pr:L meros días de germinación y aumenta a partir del segundo - día del proceso y por observación de los granos germinados se sabe que al segundo día de germinación existe un consi- derable incremento en el peso del embrión tal como se ve - en las figuras 9 y 10. - 38 - Por otra parte, el transporte de polisacáridos - del endospermo es improbable, debido al peso molecular de dichos componentes y la mayor parte del crecimiento del em bri6n se tiene que realizar a expensas del endospermo; pues bien, si la producción de carbohidrato soluble es al- ta en este tejido, debido a la actividad de las amilasas - y los niveles de estos carbohidratos solubles son bajos se_ gún se puede ver en la figura 16 entonces lo más probable es que se movilicen rápidamente hacia el embrión para uti- lizarse en el crecimiento de la plántula. d) Síntesis y degradación dé almidón. Localización em brionaria de amilasas. El siguiente aspecto que se tocó en esta investjL gación, fue la relación existente entre los niveles de po- lisacáridos y la actividad de las enzimas que los degradan,, Las figuras 18 y 19 nos muestran los resultados obtenidos al medir los niveles de estos polisacSridos expresándolos como porciento en base seca y en miligramos de carbohidra- to por grano individual. Kn la figura 19 se observa una - disminución en la cantidad total de almidón en el endosper mo; no así en el embrión, en el que se presenta un fenóme- no interesante de disminución inicial, seguida por un im— - 39 - portante incremento después del segundo día de germinación; como se supone que el transporte de almidón desde el endos- permo hasta el embrión es improbable, debido a su alto peso molecular, se puede sugerir que sus niveles en el embrión - aumentan debido a formación por síntesis de_ novo. Otra observación interesante respecto a los nive- les de estos polisacSridos es que el contenido total de am¿ losa por embrión es constante durante la germinación; se ha demostrado que la enzima alfa amilasa se produce en el escu telo y su principal sitio de acción es en el endospermo, mientras que la enzima beta amilasa se encuentra preformada en este último tejido aún en semillas latentes (Dure, 1960). Se puede establecer ahora la siguiente pregunta: ¿hay d e - gradación de almidón en el embrión ó es este fenómeno exclu sivo del endospermo? La figura 20, nos muestra los resultados obteni- dos al medir actividades de amilasa en el embrión y en el - endospermo; se observa un importante incremento en esta ac- tividad enzimStica en ambos tejidos, pero la actividad de - amilasa en el embrión disminuye después del cuarto día de - germinación, sin embargo el contenido de almidón aumenta a - partir del segundo día del proceso (figura 19), aun cuando - 40 - existe actividad de amilasas, por lo tanto, podemos suge— rir que al mismo tiempo que el almidón se está" degradando en el embrión, también existe un proceso de formación de - almidón simultáneo, por el cual también los niveles tota— les de amilosa en el embrión podrían permanecer constantes (figura 19), en otros términos, parece que las velocidades de síntesis y degradación de amilosa en el embrión son si- milares durante la germinación. Una vez obtenidos los resultados que se muestran en la figura 20, se realizaron experimentos para conocer - cuales son los principales tejidos del embrión que contri- buyen a su elevada actividad de amilasas, para lo cual se tomaron granos de maíz de 6 días de germinación, observán- dose que las plúmulas no poseen esta actividad enzimática mientras que el escutelo presentó una actividad de 1.11 - 0.135 miligramos/min/escutelo; pudiendo decirse a - partir de esta información, que la actividad de amilasas - radica fundamentalmente en el centro del embrión (escutelo y eje embrionario) el cual es también el tejido en donde - se detectó actividad de invertasa tal como se muestra en - la figura 17. - 41 - Tal como acontece con la actividad amilolítica, se localizó el almidón en el centro del embrión y no se de_ tectaron cantidades apreciables en la plúmula; este era el resultado esperado ya que no parecería lógico que existie- ra actividad amilolítica en un tejido que no contiene almi_ don. El almidón y la sacarosa presentan un comportamiento similar porque sus niveles disminuyen en el embrión duran- te los primeros días de germinación, pero difieren porque el almidón se encuentra ausente de la plúmula mientras que la sacarosa se detecta en cantidades apreciables en este - tejido. Suponiendo que este comportamiento se debe a que la sacarosa o sus componentes se translocan desde el cen— tro del embrión hacia la plümula, mientras que la amilosa no se moviliza debido a su peso molecular elevado, podemos decir que el presente trabajo muestra la posible existen— cia de un proceso de síntesis de novo de almidón en el em- brión. La aparición de actividad de amilasas después del primer día de germinación en el endospermo se explica sabiendo que la producción de alfa amilasa es por medio de un mecanismo de síntesis de_ novo (Pilner y Varner, 1967) . Sabemos que este fenómeno es relativamente lento porque se - 42 - necesita el desarrollo de todo el sistema requerido para - la síntesis de proteínas. En el embrión, por el contrario la aparición de actividad de amilasas se inicia rápidamen- te; parece ser entonces que el mecanismo de liberación de amilasas en el embrión y en el endospermo es diferente y - que probablemente la actividad de amilasas en el embrión - no se realice por síntesis de_ novo, siendo probable que la imbibición permita la liberación de enzimas preformadas, - lo cual llenaría el requerimiento del embrión para la pro- ducción rápida de carbohidratos solubles utilizados en las primeras etapas de su crecimiento. e) Producción rápida de carbohidratos solubles en el e m — briÓn. Los datos de las figuras 21 y 22 implican que la velocidad inicial de producción de carbohidratos solubles en el endospermo es menor que en el embrión, y parecería - que al inicio de la germinación, este tejido hidroliza sus propios carbohidratos de reserva para que pueda crecer la nueva plántula. Al hacer la extracción de amilasas con so lución reguladora de succinato 40 mM se puede demostrar - una elevada concentración de almidón soluble en el endos— permo, mientras que los extractos embrionarios no contie— - 43 - nen almidón. Estos datos permiten pensar que la alta con- centración de almidón que se detecta en los extractos e n — dospermicos se debe a la elevada concentración de almidón almacenado en este tejido (figuras 18 y 19), o que la acti_ viciad de amilasas del embrión es mayor que la actividad - de amilasas del endospermo en los primeros días de germina ción, por tal motivo, el almidón del endospermo no se d e — gradaría rápidamente y sería posible detectar su presen cia en los extractos enzimáticos, mientras que en el em brión, el almidón se podría hidrolizar rápidamente. Las - figuras 21 y 22 nos muestran que en el primer día de germi_ nación no se detectó actividad de amilasas en el endosper- mo, mientras que la actividad de amilasas del embrión exis_ te en niveles apreciables, además se puede ver que en el - segundo día de germinación la actividad de amilasas en el embrión es mayor que en el endospermo, este comportamiento está en contraste con la mayor actividad de amilasas en el endospermo durante las etapas finales de la germinación. Parece ser que estos experimentos sugieren la existencia - de un mecanismo inicial de producción de carbohidratos so- lubles para que el embrión pueda crecer en las primeras etapas de germinación, este mecanismo sería embrionario y se establecería antes que el sistema amilolítico para la - - 44 - degradación del almidón en el endospermo alcance su máximo desarrollo. Podemos sugerir entonces que la producción de carbohidrato soluble en el endospermo es un evento tardío durante la germinación. f) Posible hidrólisis enzimática de la maltosa. Una observación respecto a las gráficas 21 y 22, es que después del quinto día de germinación hay una impor_ tante disminución en la actividad de amilasas estables al calor, mientras que la actividad de las amilasas sensibles al calor se incrementa después de dicho período. La p r e — sencia de estas enzimas es congruente con la existencia de maltosa en el endospermo, en otras palabras si suponemos - que una fracción de las amilasas sensibles al calor (beta amilasa) producen maltosa, entonces la existencia de malt£ sa en el endospermo a partir del segundo día de germina ciÓn se explica por la presencia de amilasas sensibles al calor. Sin embargo en el embrión a pesar de que existe un incremento en la actividad de estas enzimas no se detectó maltosa, por lo tanto es posible suponer la existencia de un importante proceso de hidrólisis de maltosa en el em brión. La actividad de maltasa se ha demostrado en el en- dospermo (Mayer, 1975), lo cual es congruente con - 45 - los niveles bajos de maltosa en este tejido y existe así— mismo una importante producción de glucosa (figura 16). Entonces, si bien es cierto que el presente trabajo no de- mostró la existencia de maltasa en el grano de maíz permi- te suponer sin embargo la existencia de esta actividad en- zimática en el embrión. En resumen, los resultados anteriores parecen in_ dicar que existen eventos propiamente embrionarios íntima- mente relacionados con la producción de substrato disponi- ble para que el embrión se pueda desarrollar en los prime- ros días de germinación; es decir, la disminución en el - contenido de almid6n y sacarosa en los primeros días de - germinación en el embrión, podría tener el fin de propor— cionar carbohidrato soluble para que el embrión se pueda - desarrollar antes que la actividad de amilasas del endps— permo se desarrolle completamente, en esta forma el creci- miento del embrión se podría llevar a cabo desde los pri— meros días de germinación y así el proceso ya iniciado no se detendría porque si el endospermo no estuviera prepara- do para proporcionar substrato utilizable en los primeros días de germinación, el embrión proporcionarla los mate-— 46 - riales requeridos para su propio crecimiento. - 47 - VI.- CONCLUSIONES a) Durante la germinación/ el grano de maíz experimenta - un importante incremento en la concentración de carb£ hidratos solubles. b) La mayor concentración de carbohidratos solubles se l£ caliza en los tejidos embrionarios y parece que es pr£ pia de las partes en crecimiento. c) El principal carbohidrato soluble al tercer día de ger_ minación es la sacarosa, siendo su concentración 10 ve_ ees mayor en el embrión que en el endospermo. También se detectó fructosa en el embrión y el endospermo, pe- ro el disacSrido maltosa tánicamente se encontró en el endospermo. d) Los niveles de glucosa en el embrión se incrementan - constantemente desde el inicio de la germinación y pa- recen proporcionar un índice apropiado de diferencia— ción celular. e) Existe una importante actividad de invertasa en el em- brión al inicio de la germinación, así que, la glucosa detectada en ese periodo podría provenir parcialmente de la degradación de sacarosa. f) Se propone la existencia de un fenómeno de síntesis y - 48 - degradación de sacarosa en el embrión. Parece que e — xisten 3 estadios en la germinación del grano de maíz: en el primero de ellos (hasta el segundo día de germi- nación) parece que hay.un predominio de la degradación de sacarosa; en el estadio intermedio (del segundo al cuarto día de germinación) parece que predomina la sin tesis sobre la degradación y en las etapas finales del proceso es posible que la velocidad de síntesis sea - igual a la velocidad de degradación de sacarosa. g) De los datos experimentales se deduce que existe trans porte de carbohidratos solubles desde el endospermo al embrión. h) Existe una importante actividad de amilasas tanto en - el embrión como en el endospermo durante la germina ción i) Los niveles de amilosa en el embrión son constantes du_ rante la germinación, mientras que el almidón disminu- ye inicialmente y luego se incrementa a partir del se- gundo día del proceso. Si a pesar de la gran activi— dad de las amilasas, los niveles de almidón se incre- mentan en el embrión, se puede deducir que existe un - mecanismo de síntesis de almidón en ese tejido, j) Un corolario de la anterior afirmación es que la velo- - 49 - cidad de síntesis de amilosa en el embrión podría ser igual a su velocidad de degradación, por lo tanto, el incremento en los niveles de. almidón se podría deber - a la formación de amílopectina. k) En determinadas etapas de la germinación, entre los te_ jidos embrionarios, el centro del embrión contiene la máxima concentración de almidón, la máxima actividad - de amilasas y la máxima actividad de invertasa. 1) En el embrión parece que existe un mecanismo inicial - para la producción de carbohidratos solubles, los cua- les pueden formarse a partir de almidón y sacarosa. Por otra parte, no se detectó maltosa en el embrión a pesar de -la existencia de enzimas sensibles al calor; estas observaciones parecen indicar que la glucosa pro veniente de la sacarosa y del almidón embrionarios pro porciona la energía requerida para crecer en las prime ras etapas de la germinación, probablemente hasta que el mecanismo endospérmico para la degradación del almi don se encuentre proporcionando los carbohidratos solía bles requeridos para el crecimiento del embrión. A continuación se presentan algunas de las prin* cipales sugerencias obtenidas, a fin de intentar localizar_ 50 - FALLA DE ORIGEN las esquemáticamente en los diferentes tejidos del grano - de maíz. Hipótesis de la movilización de carbohidratos que podría - estar ocurriendo durante la germinación del grano de maíz. La presencia de los componentes químicos representados ha sido demostrada. Hay algunas interrogantes sin embargo, - respecto a las flechas que indican formación y transporte de enzimas y carbohidratos. El presente trabajo sugiere - que los eventos embrionarios de formación de glucosa apare cen primero en embrión que en el endospermo aunque la pro- ducción de carbohidratos solubles posteriormente es mayor en este último tejido. - 51 - V I I . - PERSPECTIVAS •EN El trabajo realizado proporciona muchas sugeren- cias en relación con fenómenos que no se conocen detallad^ mente en el desarrollo de la germinación, los cuales se p£ drlan confirmar utilizando diversas metodologías. Una de las investigaciones más importantes serla la demostración del proceso de síntesis de almidón en el embrión, utilizari do isótopos radioactivos; el experimento podría realizarse 14 incubando el embrión de maíz en presencia de sacarosa- C y observando la incorporación de radioactividad en el alirnL don embrionario, este planteamiento supone la utilización de sacarosa. Si la formación embrionaria de almidón re quiere monosac&ridos ó maltosa, el experimento se podría - 14 realizar germinando el embrión en presencia de glucosa- C 14 14 fructosa- C ó maltosa C. Los resultados obtenidos en este trabajo con sa- carosa y almidón respecto a su degradación embrionaria en las primeras etapas de la germinación, podrían ampliarse - a otros carbohidratos; sería conveniente por ejemplo, estia diar la velocidad de hidrólisis de maltosa en el embrión. - 52 - Tal como acontece con la actividad de las amilasas, se es- peraría encontrar una importante actividad de maltasa en - los primeros días de la germinación. Si se encuentran re- sultados similares, se confirmarían las ideas expresadas - previamente en relación con el metabolismo de los carbohi- dratos y de acuerdo con las cuales el embrión es esencial- mente catabólico en los primeros días de germinación. En lugar de medir niveles de carbohidratos y actividades enz¿ máticas, tal como se realizó en la presente investigación, otro enfogue de utilidad podría ser la obtención de extra£ tos enzimáticos e incubación en presencia de maltosa, saca_ rosa y almidón para ver la velocidad de producción de glu- cosa. Otro de los resultados obtenidos es la presencia de actividad amilolítica en el embrión; esta actividad en- zimática es tan importante como en el endospermo durante - los cuatro primeros días de germinación. La actividad de amilasas ha sido ampliamente estudiada en el endospermo, - pero en el embrión requiere más investigación. Este traba jo plantea la necesidad de investigar si el mecanismo de - liberación de amilasas en el embrión es diferente que en - el endospermo y si la aparición de esta actividad enzimSti - 53 - ca requiere la síntesis de proteínas. Los experimentos eii caminados a la solución de este problema podrían realizar- se utilizando alfa-amanitina 6 actinomicina-D que inhiben la transcripción y si el incremento de actividad se origi- na a un nivel post-transcripcional, podrían emplearse inhl. bidores como cordicepina o cicloheximida. VIII.- BIBLIOGRAFÍA Abdul-Baki, A.A. Relationship of glucose metabolism to germinability and vigor in barley and wheat seeds. Crop. Sci. (1969) 9_, 732-738. Aguado, A.T., Palacios de la Rosa, G. y Muñoz, A.O. H28 - Nuevo híbrido temporalero para valles altos. Agri- cultura Técnica en México. (1963) II (4), 146-147. Beevers, H. Metabolic production of sucrose from fat. Na- ture. (1961) 191, 433-436. Bergmeyer, H.ü. and Klotzsch, H. Sucrose. . Methods of Enzy_ matic Analysis. Acad. Press. N.Y. (1963), 99-102. Bernfeld, P. Amylases alfa and beta. Methods Enzymol. Acad. Press. N.Y. (1955) 1, 149-158. Blanco, L.E. Niveles de Enzimas Amilolíticas en la Germi- naciCn del Maíz. 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Entre paréntesis se indica el tiempo de germinación en días. 5w e H G r4 r4 \4 oí •0 DI 01 o•H IB S G 0 M m a 5 0 VI • (V n N « E 4) •d R V) •rC M B • 3 c 0) n) m 0 u3 •a ai •P tí i 3 H 0) H W • C •O •H U 10 G •rt E a) a> -d ui fB •H -d i i w0) U o u n) -d -H fl 0) -P J í O ro o-H mVB M Oí •" Í E a e ( 1 D E E 06 0) oe | pa] O ES Esz CSYD upruaas 3p o d e or 5 0 5 7 v i d w s o r o o g A P r e tuu o z Y pra 4 AUN A i i; 0 * - R V?N j > -o ? -~3> " i CU U 0 « 0 *3 •H O 3 -O O ua> 19 10 o uUS onj w cu •a EO 0 u•H a w0 H o' •o tí •H u id M (0 e0 u i f * 10 u3 tn •H Eu 1 0) +1 tí M cu 4J el tú • a•H 0) en tí •H tn co M N VI 10 6 CU •a g p0) 0. en 0 •a a cu H 0) > i a V) •H ,0 m i tu 10 u •H en VH M cu+J u mU 10 ü en TO * m u0) cutn m C 0) 0 •P c cu•H o n0 Q. rH CU ni s cu to 0) u a, cu10 en•H en i 0 id Üi-H g. 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