00381-- .'. . UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS , ' FACULTAD DE CIENCIAS EFECTO DE LA CARBAMAZEPINA SOBRE LA ORGANIZACiÓN DEL CICLO VIGILIA-SUEÑO, EN UN MODELO DE EPILEPSIA INDUCIDA POR EL ÁCIDO KAíNICO. T E S I S QUE PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE DOCTOR EN CIENCIAS (BIOLOGíA) PRESENTA M. en C. ALFONSO BENITO ALFARO RODRíGUEZ DIRECTOR DE TESIS: Dr. EN C. FRUCTUOSO AYALA GUERRERO MÉXICO, D. F. NOVIEMBRE, 2004 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. COMITÉ TUTORIAL DR. FRUCTUOSO A YALA GUERRERO DR. EMILIO ARCH TIRADO DR. LUIS CAMILO Ríos CASTAÑEDA t DR. AUGUSTO FERNÁNDEZ GUARDIOLA DEDICATORIA A lIián por su apoyo y por motivarme a seguir siempre adelante. A mis hijos: A Héctor, por refrescarme la memoria de mis días de infancia. A Blanca por su inocencia y por su dedicación al estudio. A Marianela por ser mi ángel guardián. y por último, a los Grandes Maestros de la humanidad, que me han conducido y guiado con su ejemplo a lo largo de toda mi vida. AGRADECIMIENTOS Al Dr. Fructuoso Ayala Guerrero por la dirección del trabajo, por el préstamo del equipo para realizar los registros electroencefalográficos y sobre todo por sus invaluables consejos, sin los cuales este trabajo no hubiera sido posible. Al Dr. Emilio Arch Tirado por su confianza y apoyo como investigador además de su contribución a la mejora del trabajo. Al Dr. Francisco Hemández Orozco por darme la libertad de desarrollarme como investigador. Al Dr. Miguel Ángel Collado Corona por brindarnos la oportunidad de desarrollamos académicamente. Al Instituto de la Comunicación Humana por su invaluable apoyo para el buen término de éste trabajo. A la O.F.B. Norma Labra Ruiz por su colaboración y asistencia en la realización de todo el trabajo. A la M. en C. Angélica González Maciel por el apoyo brindado en la realización de los estudios histo-morfológicos. A la M. en C. Beatriz Pérez Guillé y a la M.V.Z. Rosa Eugenia Rosales Soriano por las cirugías para la toma de muestras. A la M. en C. Miriam Carrasco Portugal por su apoyo en las mediciones corrnatográficas. Al Biól. Leonel Vargas por su colaboración durante los registros. Al Instituto Nacional de Pediatría por prestar sus instalaciones. A la O.F.B. llián Alfaro por la revisión y corrección del escrito. A mis sinodales: DR. FRUCTUOSO AYALA GUERRERO DR. EMILIO ARCH TIRADO DR. CAMILO RIOS CASTAÑEDA DRA. CLORINDA ARIAS ALVAREZ DRA. CAROLINA ESCOBAR BRIONES DR. JOAQUIN MANJARRÉZ MARMOLEJO DR. JOSÉ DE JESÚS MORALES MARTINEZ Por su trayectoria académica, por todos sus consejos, observaciones y correcciones hechas al presente trabajo. IN MEMORIAM Al DR. AUGUSTO FERNÁNDEZ GUARDIOlA 2 RESUMEN Dentro de los modelos biológicos más utilizados para la inducción de la epilepsia, se ha reportado la administración del ácido Kaínico, entre otros. Dicho modelo se ha propuesto por su potencia para inducir un síndrome caracterizado por un status epilépticus límbico agudo con el subsiguiente daño neuronal cerebral, similar al que se presenta en la epilepsia del lóbulo temporal en humanos. Por otro lado, se ha demostrado clínica y experimentalmente que la carbamazepina es un fármaco efectivo en el control de crisis psicomotoras y de gran mal. Debido a que dicho fármaco es uno de los medicamentos más utilizados como antiepiléptico, se consideró importante analizar su efecto ejercido sobre la actividad eléctrica cerebral y patrones de sueño, en un modelo de epilepsia desencadenada por la administración de ácido Kaínico. El objetivo de este estudio es evaluar el efecto de la administración de carbamazepina sobre los patrones de sueño en un modelo de epilepsia inducida por ácido kaínico, además de correlacionar la farmacocinética y farmacodinamia. El trabajo se llevó a cabo en el Instituto de la Comunicación Humana y en el Instituto Nacional de Pediatría. En el presente trabajo se utirlzaron 30 ratas macho de la cepa Wistar de 250 a 280 g a 10 de las cuales se les implantaron crónicamente, electrodos bipolares en la corteza motora para registrar la actividad cerebral (EEG) y en los músculos del cuello para obtener la actividad muscular (EMG), A este primer grupo se les tomo un registro eIectroencefalográfico desde el primer día, control, el segundo día se les administró ácido kaínico (10 mgJkg) para inducir las crisis epilépticas y se les registró hasta los 5 días. A un segundo grupo de 10 ratas también se les implantó crónicamente electrodos para el EEG y EMG, se les registró el primer día, control, y en el segundo día se les administró carbamazepina 30 mino antes de inyectares el AK, se registraron durante tres días, tiempo durante el cual se recuperaron. A un tercer grupo de 10 ratas se les implantó una cánula en la vena yugular, de donde se les tornó una muestra basal y enseguida se les administró carbamazepina (25 mgJkg), para iniciar la toma de muestras de sangre a los; 10, 20, 40 minutos y a las 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36 Y 48 horas después de la administración de carbamazepina, para el análisis farmacocinético. Para probar las diferencias entre los parámetros farmacodinámicos y farmacocinéticos obtenidos se utilizó una prueba de "t" de student, para datos no pareados con un nivel de significancia de *~0.05. Y para comparar las diferencias entre los grupos de los registros del EEG, los datos se analizaron mediante un análisis de varianza de una vía: p<0.01, * p<0.OO1 . Posteriormente se procesaron los cerebros para su análisis histológico, para observar el daño producido por ambos fármacos. los resultados mostraron una ausencia total de sueño el primer día experimental solo con AK, mientras que se encontró una recuperación parcial del sueño de Ondas lentas, durante el primer día experimental cuando se les administró la CBZ 30 mino antes del AK. El análisis histológico mostró daños similares a los presentados por la epilepsia del lóbulo temporal en humanos. El efecto de la carbamazepina fue favorable ya que por medio de la comparación de la cinética de la CBZ con las crisis, se mostró que éstas disminuyeron cuando se aplicó la CBZ por vía oral antes de la aplicación de AK por vía subcutánea. ConcIusión.- la CBZ actúa disminuyendo las crisis aunque solo existe una recuperación parcial del sueño, y es el sueño MOR el que se ve más afectado. 3 ABSTRACT Sleep pattems are disturbed by epileptie attaeks, due to the magnitude of the seizures in both humans and animals. Therefore the aim of this work is to analyze the etfect of carbamazepine on sleep pattems. The experimental protocols used 30 male Wistar Rats weighing between 280 and 320 g. Under general anaesthesia, animals were ehronically implanted with stainless steel electrodes plaeed in the right sensorimotor e~rtex for EEG recording, and in the neck museles to obtain the electromyogram (EMG). Three recordings for 10 continuous hours were made from 09:00 to 19:00 h under the following conditions: (1) Control; (11) after administration of kainie aeid (10 mglkg se) alone; and (111) with kainie aeid injected in earbamazepine-pretreated animals (25 mglkg). PoIy-graphie reeordings were analyzed visually and three different states of vigilance were identified: Wakefulness (W), Slow Wave Sleep (SWS) and Rapid Eye Movement (REM) sleep. Total time spend by animals in eaeh state ofvigilance was obtained under the aboye eonditions. Statistical analysis. The electrographie parameters of the different phases of the sleep were analyzed by a ANOVA TEST. Differences of .p s 0.01 and •• p SO.001 were considered to statistical significant. Our results showed that seizures induced a total inhibition of sleep, since both SWS and REM sleep were absent through out the first day after kainie acid administration. This effect was partially reversed by earbamazepine, since pretreated animals were able to show SWS. Our conelusion is that, besides decreasing seizure intensity, carbamazepine facilitates partial recovery of sleep. 4 INOICE RESUMEN ... ...... .. ....... ... ... ....... ........... ............ .......... ...... .. ............. .... .. 2 ABSTRACT .... .. .. .. ..... .. ..... ...... .. .... ................ ......... .. ........ ... ... .... ... ....... 3 INTRODUCCiÓN ... .. ..... .. ....... ... ....... ...... ... ... .... ..... ... ...... .. ... .. .. ...... .... .. ... 6 DEFINICiÓN Y CLASIFICACiÓN DE LAS EPILEPSIAS: A. Definición de crisis y epilepsia .... .... .... ........ .. ...... ...... ........... ....... .. .. 8 B. Clasificación de las epilepsias ..... .. ........ .......... ....... ................. .. .. ... 9 CONSIDERACIONES FISIOPATOLÓGICAS .. ........... ... ... .... .. ... .. ....... ........ ... 11 SUEJÍÍO y EPILEPSIA ..... ... .... ... .... ... ........ .. ...... ... ..... .. .... ... .. ....... ....... ... 12 CARACTERIZACiÓN DE LOS PATRONES DE SUEÑO .. ...... .... ... .... ... ..... ... 13 FASES DE SUEÑO ... .... ......... .... ........... .. .... ............ ...... ........ ....... ........ 14 FASES DE SUEÑO EN LA RATA .... .. ..... ...... .... ........ ... .. ... .. ... .. ...... ...... ... 18 SUEJÍÍO y EPiLEPSiA .... .. ....... ..... .......... ... ...... ........... ........ .... ........ ... ... . 20 EFECTO DEL SUEÑO SOBRE LA EPiLEPSiA ...... .... ..... ... .. ...... .. ..... .... ..... 22 Crisis generalizadas ... ...... ........ .. .. ...... ... .. ..... .......... .... .... ...... ..... .. ........... 23 Crisis parciales .......... .... .......... ....... ..... ...... ..... ... .... ...... ..... ..... ... ..... .. .... 24 EPILEPSIA DEL LÓBULO TEMPORAL. ...... ... ........ ..... ....... .... ... .... ........... . 25 MODELOS EXPERIMENTALES DE EPILEPSIA ...... ...... .... .......... ..... .. ....... 26 EL ACIDO KAINICO COMO MODELO CONVULSiONANTE .... .. .... ...... ... ...... 36 PAPEL DEL GLUTAMATO COMO NEUROTRANSMISOR EXCITADOR. ....... .... ................. ...... .... .......... ... .. . .41 RECEPTORES IONOTRÓPICOS DE GLUTAMATO ....... .. ........ .... .... ... .... .. .42 1.-Receptores de NMDA ... .. ...... ....... ... ......... .. .... .... ..... ..... .... .... ... ...... . ... . 42 2. -Receptores de AMPA ..................... .. .. ...... .... .... .. ... .......... .. ...... ......... 44 3.- Receptores de kainato .. ....... .. ... ..... ..... .... .... ........ .... ... ... .. .... . ......... .. . .45 Familia de subunidades de receptores de kainato: GLUR5-7, KA1 y KA2 ... ... ... .. ... ..... ...... . ... ...... ....... . .45 Diversidad estructural. ... .... ... .. ....... .. ... ............ ..... .... ........... ... ........ ....... 46 Distribución cerebral de las subunidades del receptor de kainato ......... .... ..... ....... .. ... ....... ... ...... .... ..... 49 5 FÁRMACOS ANTIEPILÉPTICOS (AEDS) ... .. ...... ....... ... ........ ... ... . ....... .... .. 50 Mecanismo de los fármacos antiepilépticos .. ... .......... .. ... ....... .. ..... .. .. .... ...... 51 CARBAMAZEPINA COMO ANTIEPILÉPTICO DE PRIMERA ELECCiÓN .............. ... .. ...... .. ... ... ...... ... ... .. ... ... . .... ....... ... .. 53 Mecanismo de acción .. .. ... .. ............ .... ... .. .. .... ...... ........ .... ........ ..... ... .. ... 53 Fannacocinética .. .. .... ......... ....... .. ...... ............ ............ ... , .. ... , ..... ........... 56 JUSTIFiCACiÓN .... .................................... ........ ...... ....... .. .. ........ .. .... .... 58 OBJETIVO GENERAL ..... ..... .... ....... ..... ........ .. .... ... ...... ........ ... ............... 59 Objetivos especlficos ............ ... .... ............ ..... ..... .. ... .. ... .......... ..... ...... ....... 59 HIPÓTESiS ......... ............. .. ... ...... .... ... .... . ............................ .... .. .. .. ....... 59 MATERIAl Y MÉTODOS ...... ..... .. ....... ......... ... .. .. .. , ............ ...... ... .. ...... ... 60 Procedimiento ..................... .......... ... ....... .. ... ......... .. ........ ...... ... ........... 60 Análisis de los datos del EEG .................. ... ..... ... ... ..... .. .. ...... ..... ..... ...... . 62 Técnica histológica .. ...... .... .. .. ..... ...... ...... .. ... ...... ...... ...... ....... ..... ....... ... ... 63 Evaluación de la farmacocinética de la CBZ .. ...... ........ ...... ........... ... ............. 63 Determinación de carbamazepina en plasma ............. .... ................ ..... .. ...... 65 RESULTADOS ... ' " ............ ...... ... ...... .. ........... .. ...... .. .... ....... ... ....... ... .. ... 67 Efecto del ácido kainico sobre los patrones de sueño ...... ...... .... ............. .. ................... .. ................. .. .. .... 67 Efecto de la carbamazepina + ác kaínico sobre los patrones de sueño .... .............. .. ... .... ..................... .... ..... ... .. ... .. 69 Hallazgos Neuroanatómicos ... .. .. .. ............ ...... ... .. .... .. .. .. ... ....... .. ....... ..... 77 ResuHados de la Farmacocinética de la CBZ Validación del método de medición de la CBZ ....... ... .. .. .. ...... .. ..... .... .. ...... ... 83 ctMVaS de calibración ... ........ .......... ... .......... ..... .. ..... ...... .. .... .. ..... .......... .. .. 83 Análisis de las concentraciones sanguíneas de cbz ...... ... ..... .... .. .. .. .... .. .. ..... 86 Evaluación de las crisis ...... ..... ...... ... .... ...... .. .... .... ........ ... ..... ..... .. .. ... ..... 87 DiSCUSiÓN ....... ...... .. .... ........ ..... .. .. ......... .... ... ...... .. .... ..... ............... .. 88 CONCLUSiÓN ..... ....... ...... ..... ..... ... .... ......... ....... ............ ..... ... .... ... ... 1 00 REFERENCIAS .... .... ..... ... .... .. ..... .. ..... .. ... .... .. ....... .. ....... ...... ..... .... .... 101 ANEXO ................ ............... ... ...... .. .. ..... .... .. ... ..... ..... .. ..... .. ...... ....... ... 127 ARTICULO PUBLICADO ... .. ... .. .... .. .. ........ ... ... ................................... 135 6 INTRODUCCiÓN La epilepsia es una enfermedad tan antigua como la humanidad. La palabra epilepsia se deriva de un verbo irregular E7tlAall~aVEtv (epilamvanein) "ser sobrecogido brutalmente". Esta terminología derivada del pasado, noción que representa todas las enfermedades con ataques causados por Dios o espíritus malignos, usualmente como castigo. Los ataques son el ejemplo más vivido de posesión por el demonio, la epilepsia fue considerada "la enfermedad sagrada", ya en el siglo V A.C. (Hipócrates). La epilepsia de origen, no es una enfermedad específica, o un síndrome simple, sino una amplia categoría de síntomas complejos producidos por numerosos desórdenes en las funciones del cerebro que pueden ser seguidos por una variedad de procesos patológicos. Los términos, trastornos convulsivos, trastornos de ataque y ataques cerebrales son sinónimos de epilepsia; todos se refieren a episodios proximales recurrentes de disfunción cerebral manifestada por alteraciones estereotipadas en el comportamiento (McNamara y Shin, 1994). Se considera como una enfermedad neurológica sin preferencia por edad, sexo, raza ó situación geográfica. Es uno de los trastornos neurológicos que requiere atención médica constante. La prevalencia de ésta enfermedad en el ámbito mundial va de 4 a 18 enfermos por cada 1 000 habitantes. En México su prevalencia reportada está en el orden de 18 por cada 1 000 habitantes (1.8%), (C.E.P.I.L.A.E., 1993, H.C.P.R., 1997, Rodríguez-Rivera, 1995, Hittencourt, 1995). Los factores de riesgo de ésta enfermedad han hecho que la edad más frecuente de su aparición sea la infancia y la adolescencia debido a los traumas obstétricos antes o durante el alumbramiento, a los traumas craneales, a las encefalitis o meningoencefalitis y en algunos casos al parasitismo cerebral como la cisticercosis (H.C.P.R., 1997, Rodríguez-Rivera, 1995). En muchos casos, las crisis epilépticas se complican con otras enfermedades neurológicas intercurrentes o con lesiones cerebrales (Penfield y Jasper, 1954); ocasionando una gran variedad de crisis. Para el tratamiento de cada tipo de crisis se utilizan distintos fármacos los cuales originan efectos 7 secundarios indeseables, además de su acción anticonvulsiva (McNamara, 1994), uno de los cuales es el trastorno del sueño. Actualmente un gran número de fenómenos clínicos son reconocidos como crisis epilépticas, como las crisis mioclónicas y atónicas las cuales son poco conocidas y pueden reflejar mecanismos neuronales que son diferentes a los procesos fisiopatológicos tradicionalmente considerados "epilépticos". Una variedad de condiciones o epilepsias han sido clasificadas y definidas no solamente por el tipo de crisis manifestada sino también por otras características clínicas asociadas. Los Síndromes epilépticos específicos han sido identificados por sus tipos de crisis características, patrones de crisis recurrentes, edad en la que se iniciaron los ataques, signos neurológicos asociados, registros electroencefalográficos (EEG), presencia o ausencia de ocurrencia familiar y pronósticos. Epilepsia y síndromes epilépticos son ampliamente divididos en desórdenes idíopáficos y sintomáticos. La epilepsia idiopática es generalmente benigna en el sentido que no es asociada con lesiones cerebrales, anormalidades neurológicas y daño mental y tiende a ser autolimitada o responde con facilidad a fármacos antiepilépticos. En la epilepsia sintomática las crisis son la consecuencia de una lesión identificable u otra etiología específica. Cuando la epilepsia es sintomática pero comúnmente de etiología específica desconocida, se determina criptogénica (Engel, 1991). Las crisis epilépticas en turno, representan las manifestaciones clínicas que resultan de excesivas, sincrónicas y anormales descargas de las neuronas que se localizan predominantemente en el córtex cerebral. Tal actividad paroximal anormal es usualmente intermitente y periódica. Las crisis epilépticas reflejan la hiperexcitabilidad de neuronas o circuitos neuronales en una región específica o difusa por todo el cerebro, principalmente para crisis generalizadas y parciales (Niedermeyer, 1987). 8 DEFINICiÓN Y CLASIFICACiÓN DE LAS EPILEPSIAS: A. Definición de crisis y epilepsia Una crisis epiléptica es la manifestación clínica que aparece en relación a una aHeración del funcionamiento neuronal autolimitada. Dependiendo del área cerebral afectada las crisis tienen manifestaciones diversas (motoras, sensitivas, psíquicas, etc.). Las crisis se originan por muy diversos mecanismos; como son la sobreexcitación neuronal o defectos en los mecanismos de inhibición neuronal. La epilepsia es una trastorno del sistema nervioso central caracterizada por la repetición de dos o más crisis epilépticas no provocadas por una causa inmediatamente identificable. La ocurrencia de una única crisis no permite el diagnóstico de epilepsia. Sin embargo, en ciertos casos se puede considerar el tratamiento prolongado tras una única crisis si el diagnóstico de sospecha es de muy probable repetición en un breve espacio de tiempo o si una nueva crisis pudiera representar un serio riesgo para el paciente. El diagnóstico de epilepsia se basa fundamentalmente en una anamnesis y exploración física detenidas que son complementadas con un electroencefalograma (EEG) y una prueba de imagen estructural. La resonancia magnética cerebral (RM) es la prueba de primera elección (Drislane y Schomer, 1994). La tomografía axial computarizada es parte de la rutina diagnóstica en urgencias pero no debe sustituir a la RM para la evaluación completa (Fountain y Lothman, 1995). En algunos casos de epilepsias benignas (ausencias infantiles, epilepsia mioclónica juvenil, epilepsia rolándica benigna) con presentación típica, no es necesario realizar pruebas de imagen. Una vez que se diagnostica la epilepsia, en la mayoría de los casos, se recomienda un tratamiento prolongado. Excepciones a esta regla son algunas epilepsias benignas de la infancia. El tratamiento se mantiene por lo general por un período de dos a cinco años. Alrededor de un 50% de los pacientes responden de forma completa al tratamiento inicial con un sólo fármaco antiepiléptico (Fujikawa y Itabashi, 1994, 9 Kaplan, 1994,) aunque la posibilidad de respuesta depende en gran medida del tipo de síndrome epiléptico y de la etiología. Al paciente que no presenta ninguna crisis durante este período de 2-5 años se le considera en remisión. En la mayor parte de las epilepsias se puede considerar, tras este periodo, reducir la medicación lentamente hasta su supresión total (Koepp y cols, 1998). De estos pacientes en remisión, aproximadamente un 30% recurrirán (Krumholz y cols, 1995). B. Clasificación de las epilepsias la epilepsia se clasifica por tipos de crisis y en síndromes epilépücos definidos que engloban por lo general varios tipos de crisis (lee, 1985, litt Y cols, 1994) 1. Clasificación de las crisis epilépticas las crisis epilépticas pueden ser parciales o generalizadas (Anexo A): las crisis parciales son aquellas que se originan en un lugar concreto del cerebro (tienen un foco) y son, por tanto, de origen temporal, frontal, occipital o parietal. Hay dos tipos de crisis parciales: simples, si no se asocian a pérdida de contacto con el medio externo, o complejas, si hay una alteración de la conciencia con pérdida de la capacidad de respuesta y memoria durante la crisis. las crisis parciales simples consisten en sensaciones o percepciones anormales de tipo visual, sensitivo, psíquico u olfativo, o en una actividad motora (movimientos clónicos, posturas tónicas). las crisis parciales complejas se caracterizan por mirada ausente y la realización de actos más o menos complejos y repetitivos (automatismos manuales desorganizados u organizados, movimientos de deglución o chupeteo, etc.) y amnesia de lo sucedido durante el período que dura la crisis y el inmediato período postcrítico. El 50% de los pacientes con crisis parciales presentan generalización secundaria y esta generalización ocurre de forma variable en función del control de su epilepsia. las crisis generalizadas pueden ser convulsivas (como son las crisis tónicoclónicas, mioclónicas o tónicas) o no convulsivas (ausencias o atónicas). la Comisión de Clasificación de la liga Internacional Contra la Epilepsia (C.E.P.I.L.A.E.1989) ha publicado una clasificación de las crisis y de los síndromes epilépticos (Lothman, 1990) y un glosario de términos (Lowenstein y Alldredge, 1998). Sin embargo, esta nueva clasificación es todavía una propuesta que, de 10 materializarse en los próximos años, sufrirá numerosos cambios. Por ello, no hemos considerado prudente su inclusión en este texto. 2. Clasificación sindrómica y etiológica las epilepsias se clasifican en síndromes que agrupan pacientes con una presentación y curso similar aunque con frecuencia de diversas etiologías (Anexo B). Globalmente se clasifican en epilepsias localizadas o focales y en epilepsias generalizadas. Además, las epilepsias se clasifican según su etiología del modo siguiente: 1 .. Idiopáticas: sin etiología conocida, en las que se postula un factor genético. 2 .. Sintomáticas: epilepsias en personas con historia de un daño neurológico previo que potencialmente aumenta el riesgo de epilepsia, tal y como son el traumatismo craneoencefálico, accidente cerebro-vascular, meningitis, encefalitis, una encefalopatía estática (de origen pre o perinatal manifestada con retraso mental o parálisis cerebral infantil) o una encefalopatía evolutiva (neurodegenerativa o metabólica). 3 .. Criptogénicas: son aquellas epilepsias en las que no se encuentra un factor de riesgo pero en las que se piensa puede haber una etiología. El ejemplo más típico es la epilepsia del lóbulo temporal asociada a esclerosis del hipocampo sin factor etiológico conocido. Asimismo, las crisis, pero no la epilepsia, pueden ser sintomáticas agudas si ocurren en cercanía temporal - una semana - y están asociadas con una afectación neurológica de cualquier índole, como, por ejemplo, una infección del sistema nervioso central, un traumatismo craneal , deprivación de alcohol, accidente cerebro-vascular, o una alteración metabólica o tóxica. Es importante distinguir entre crisis agudas sintomáticas y epilepsia sintomática. Las primeras son reactivas y no precisan tratamiento prolongado. Sin embargo, la epilepsia sintomática implica en su definición la ocurrencia de crisis espontáneas con un antecedente patológico previo, razón por la que precisa de tratamiento a largo plazo. 11 CONSIDERACIONES FISIOPATOLÓGICAS. Las crisis por si mismas son complejas, la observación de los diversos fenómenos en pacientes con epilepsia que son examinados se realiza con cierta facilidad. Las crisis sólo son el resultado de hiperexcitabilidad o pérdida de la inhibición neuronal (Fig. 1). EQUIUBRIO ENTRE LA EXCITACiÓN E INHIBICiÓN NEURONAL INHIBICIÓN Despolarización directa de la Desinhibición neuronal neurona(1) Inhibición de la neurona que ejerce la inhibición (2) Modulación de las neuronas excitadoras sobre las inhibidoras (3). ESTIMULO DESPOLARIZANTE 2 ,J.. 1. liberación de glutamato exdtaci6n /e Uberaclón de GABA t ESTIMULO A LA NEURONA INHIBIDORA 3 tt Fig. 1. La actividad neuronal se mantiene en un estado de equilibrio dinámico regulado por procesos inhibidores y excitadores. 12 Existen dos elementos fisiopatológicos esenciales, y cada uno representa el efecto final de muchos procesos complejos interaccionando: 1. Es una anormalidad de excitabilidad celular, la cual puede ser llamada "desregulación neuronal" originada por mecanismos que afectan la despolarización y polarización de la membrana. 2. Es un "defecto de red" el cual deriva de mecanismos básicos del desarrollo de integración neuronal aberrante, sincronización anormal de poblaciónes neuronales y propagación de las descargas epilépticas a lo largo de las redes neuronales interconectadas. Parte de la diversidad que caracteriza la expresión de las crisis se deriva del hecho que diferentes áreas del cerebro son responsables de diferentes aspectos de los fenómenos epilépticos (Dichter, 1994). Generalmente, estas regiones son espacialmente próximas, aunque son raramente congruentes. la lesión epileptogénica es el sustrato patológico de la epilepsia; hoy puede usualmente ser identificado por métodos como la resonancia magnética, tomografía computarizada entre otros, aunque el EEG es necesario para demostrar la epileptogénesis de la lesión. La zona sintomatogénica es la porción del cerebro responsable de producir el primer síntoma ictal clínico, mientras que la zona carente de funcionalidad es el área cortical o áreas de exhibición focal de disfunción no epilépticas. Finalmente la zona epileptogénica es el área total del cerebro que es necesaria para generar crisis y ésta zona puede ser eliminada para poder anular las crisis (Schwartzkroin, P. A., 1993). SUEÑO Y EPILEPSIA La importancia del estudio del sueño y su relación con muchas otras funciones del organismo radica en su actividad bioquímica y en la información que nos ofrece. En el humano, el sueño es una parte integral y básica del ciclo "actividad-reposo" presente además en todas las formas de vida. No es un proceso único, sigue un patrón determinado denominado hipnograma. En el humano está constituido por 4 fases de sueño lento o Sueño de Ondas Lentas 13 (SOL), más una fase de sueño paradójico o sueño de movimientos oculares rápidos (MOR), procesos naturales y fisiológicamente importantes e indispensables para la reparación de tipo físico y mental. Su estudio y cuantificación son llevados a cabo mediante técnicas electrofisiológicas, fisiológicas y de índices conductuales (Keenan, 1999). CARACTERIZACiÓN DE LOS PATRONES DE SUEÑO El electroencefalograma (EEG), es un testimonio de función o disfunción integrada de materia blanca y gris, y permanece como una medición importante de la integridad del sistema nervioso central (SNC), que ha permitido el establecimiento de diferentes estados electrofisiológicos y conductuales (Lesch y Spire, 1990). Algunos de los ritmos descritos para la vigilia y el sueño son los siguientes: Alfa El ritmo alfa está compuesto principalmente por actividad de frecuencia de 8 a 13 Hz, unos 25-50 mV de intensidad. Es un ritmo regular y bien sincronizado, que aparece con marcado predominio en las regiones parieto-occipital y temporal posterior (Prieto-Huesca, 1991). Beta Beta se define por una banda de frecuencia mayor de 13 Hz. El aumento de Beta es relativamente reducido a una amplitud de menos de 20-30mV. Se distribuye sistemáticamente sobre las áreas centrales y frontales y casi universalmente se presenta en sujetos normales en algún grado (Lesch y Spire, 1990). Theta Theta es definida en la banda de frecuencia de 4 a 7.9 Hz de 50 a 75 mv. Puede presentar un pequeño aumento en áreas centrales, temporales y parietales (Prieto-Huesca, 1991). 14 Delta Delta es una actividad de 0.5 a 4Hz. Es la frecuencia dominante de las etapas de sueño profundo y tiene amplitud mayor de 75 mV (Lesch y Spire, 1990). Complejo K Es una onda negativa de alto voltaje seguida de un componente positivo. Se ha pensado que son respuestas evocadas por estímulos internos del SNC. También se pueden provocar durante el sueño con estimulación externa (particularmente auditiva), (De Andrés y Corpas, 1990). Husos de sueño Son ondas, de apariencia episódica, en forma de huso con frecuencia de 12 a 14 Hz y duración de 0.5 a 1.5 segundos (De Andrés y Corpas, 1990). Ondas dientes de sierra Aparecen alrededor del vértex, poseen una frecuencia de 6 Hz y amplitud de 40 a 100 mV (Lesch y Spire, 1990). Ondas agudas del vértex Es un potencial agudo, negativo, que se presenta en el área del vértex, ocurre espontáneamente durante el sueño o en respuesta a estímulos sensoriales durante el sueño o la vigilia. Tiene diferentes amplitudes, pero rara vez excede los 250 mV. FASES DE SUEÑO Si existe alguna característica que define verdaderamente al sueño, es su falta de uniformidad. A lo largo de la noche, se suceden numerosos cambios cíclicos en la actividad eléctrica cerebral y en otros parámetros fisiológicos y de comportamiento, que han servido como criterio para dividir al proceso del sueño en diversas fases (Buela-Casal y Caballo, 1990). Cuando un sujeto se dispone a dormir, la actividad eléctrica de su cerebro cambia al pasar del estado de vigilia al de sueño. Dicho cambio no es constante 15 para toda la noche, sino que a lo largo de ella se modifica varias veces. Los cambios observados son tan claros que han permitido clasificar varias fases de sueño (Prieto-Huesca, 1991). El registro continuo y simultáneo de variables fisiológicas durante el sueño se denomina polisomnografía. El electroencefalograma (EEG), electromiograma (EMG) y electrooculograma (EOG) son los tres parámetros básicos de registro para determinar las fases de sueño. El electrocardiograma (EKG), el registro de flujo aéreo respiratorio y registro de movimientos de los miembros inferiores son otras variables, a menudo incluidas en el registro polisomnográfico (RPSG). Tradicionalmente, el ciclo sueño-vigilia en el adulto es determinado por 6 distintos patrones de EEG conocidos como "las fases de vigilia y sueño", las cuales correlacionan bien con alguna de las características fisiológicas, bioquímicas y conductuales observadas durante estos procesos. Esas fases son vigilia 0/}, sueño MOR y SOL, integrado por las fases 1, 2, 3 Y 4 (Lesch y Spire, 1990) (Fig. 2). YIGllIA ,',. J\t.rt. tf{t_ tiit'L ." ',' SUEÑO NO REM F_I '. ! F_2 ¡ rJovf,"'~~( ¡ fWJÁ ~ ~ I'~r~¡Iw~ : · I Compl.j o k ~" t r Fig. 2 Características de las ondas durante las fases del ciclo sueño-vigilia 16 Fase vigilia El ritmo beta es característico del estado de vigilia activa; se presenta cuando el sujeto realiza alguna operación mental, o se le aplica algún estímulo sensorial, cuando abre los ojos, o al dirigir su atención visual hacia algún objeto. La vigilia relajada se caracteriza por ritmo alfa de bajo voltaje con frecuencias mezcladas, que se presenta en regiones occipitales, con los ojos cerrados. El tono muscular es alto, con presencia de movimientos oculares (Buela-Casal y Caballo, 1990). El incremento en el tono muscular puede ayudar a identificar el estado de vigilia del sujeto (Lesch y Spire, 1990). Sueño Fase 1 A punto de dormir, la frecuencia y regularidad del ritmo alfa disminuyen. Las ondas alfa se presentan altemadas con ondas de frecuencia menor (3-7 HZ). Esta fase corresponde a la transición sueño-vigilia, aún cuando se mantiene cierto contacto con la realidad (Prieto Huesca, 1991). Después de la desaparición de alfa se puede apreciar lentitud en la actividad EEG en regiones fronto-centrales dentro el rango de theta y ocasionalmente delta. También empiezan a presentarse ondas agudas del vértex (Lesch Y Spire 1990). Se pueden presentar movimientos oculares lentos (Rechtschaffen y Kales, 1968). La fase 1 aparece fundamentalmente durante la transición de la vigilia al sueño, o después de movimientos corporales durante el sueño (Lesch y Spire, 1990). Durante el sueño normal, la fase 1 tiende a ser relativamente corta, dentro de un rango de 1 a 7 minutos (Rechtschaffen y Kales, 1968). La fase 1 de sueño normalmente ocupa de 4-5% del tiempo total de sueño (AS DA, 1990). Fase 2 Posterior a la fase 1, se acentúa la presencia de ondas theta, ocupando un mayor tiempo del registro; además aparecen husos de sueño. En esta etapa también aparecen, principalmente en el vértex los denominados complejos K. Así, esta fase se define por la presencia de husos del sueño o complejos K y por la ausencia de suficientes ondas lentas, de gran amplitud que define la presencia de fase 3 o 4 (Rechtschaffen y Kales, 1968). No se presentan 17 movimientos oculares rápidos (Suela-Casal y Caballo, 1990). Usualmente ocupa de 45-55% del tiempo total de sueño (AS DA, 1990). Fase 3 las fases 3 Y 4 en conjunto se han llamado sueño de ondas lentas (SOL). La fase 3 difiere cuantitativamente de la fase 4. La fase 3 se caracteriza primariamente por la actividad de fondo de la fase 2 con un incremento de amplitud en zonas anteriores. Se presenta la actividad delta, constituye del 20- 50% de la época en esta fase. El tono muscular permanece normal o ligeramente reducido (Lesch y Spire, 1990; Rechtschaffen y Kales, 1968; Prieto Huesca, 1991; Suela-Casal y Caballo, 1990). Fase 4 La fase 4 es similar a la fase 3 y ocurre cuando el 50% o más, de la época están compuesto de actividad delta de alto voltaje en todas las regiones de la cabeza, (Lesch y Spire, 1990; Rechtschaffen Y Kales, 1968). El tono muscular está disminuido en relación con las fases anteriores (Suela-Casal y Caballo, 1990; Prieto Huesca, en Ninomiya 1991). La fase 4 de sueño NMOR usualmente es llamada sueño de ondas lentas (SOL) y representa de 12-15% del tiempo total de sueño (ASDA, 1990). La actividad delta principalmente se presenta en la primera parte de la noche (cuando es mayor la necesidad de dormir), y junto con su amplitud disminuye a lo largo de la noche (Feinberg et al, 1974; 1980). Fase MOR El sueño MOR se caracteriza por frecuencias mezcladas de bajo voltaje (Lesch y Spire, 1990; Rechtschaffen y Kales, 1968), principalmente en el rango de actividad theta con ráfagas ocasionales de alfa lentas. Ondas dientes de sierra aparecen alrededor de la zona del vértex (Lesch y Spire, 1990). Hay movimientos oculares rápidos en ráfagas y pérdida del tono muscular, sin embargo comúnmente se aprecian episodios de temblor con duración de 0.25 segundos (Lesch y Spire, 1990; Rechtschaffen y Kales, 1968). El sueño MOR abarca del 20- 25% del tiempo total de sueño (AS DA, 1990). Aunque existen estructuras cerebrales cuya estimulación favorece más a uno u otro estado (sueno o vigilia), no existe propiamente un centro del sueño o la 18 vigilia, además, si corlsideramos la actividad de neuronas individuales encontramos que la mayoría se mantienen activas tanto al dormir como a! velar y lo que se altera ante todo es su pauta de actividad de descarga (Borbely, 1993). Durante el sueño se llevan a cabo cambios en el resto del organismo, además de los observados en la actividad eléctrica cerebral. En el caso del SOL se ha denominado a la fase 1 y 2 como sueño ligero; la 3 y 4 como sueño profundo y juntas abarcan del 75 al 80% del periodo total del sueño. De éstas, las fases de sueño profundo proporcionan una función reparadora a nivel físico debido a que, las funciones reguladas por el sistema nervioso periférico como las frecuencias respiratoria y cardiaca se tornan constantes y sincronizadas, es en este momento cuando se lleva a cabo la liberación de ciertas hormonas debido a la función antagónica de los sistemas simpático y parasimpático que se encuentran disminuidas existiendo por ende relajación, con pocos movimientos musculares además de ausencia de movimientos oculares. En el caso de sueño MOR o también denominado sueño paradójico, se da una activación de los procesos corporales. Al iniciarse un episodio de sueño MOR, la respiración se hace irregular, el pulso y la presión sanguínea exhiben fluctuaciones breves. En el sueño MOR, estudios en el hombre y en animales concuerdan con la existencia de un aumento significativo del flujo sanguíneo cerebral. Se presenta una desincronización en los ritmos cardiaco y respiratorio además de un incremento en la actividad endocrina. Se le atribuye una estimulación endógena sobre el cerebro con el fin de continuar con su desarrollo y programación genética principalmente en el feto y en el humano recién nacido etapas cuyo periodo de duración es el más prolongado. En la edad preescolar y escolar en los niños, al sueño MOR se le asocia con procesos de consolidación de la memoria, aprendizaje, madurez cerebral y de continuidad de la estimulación endógena (Mirmiran y Van Someten, 1993). FASES DEL SUEÑO EN LA RATA A fin de relacionar al sueño en mamíferos debemos examinar las corrientes eléctricas (EEG). Al igual que en el hombre, también es posible registrar el EEG de los animales mediante electrodos metálicos colocados sobre la superficie 19 cerebral o el cráneo. La figura 3 muestra los potenciales eléctricos musculares y cerebrales de la rata despierta y en los estadios de sueño que conocemos en humanos. Nos damos cuenta de que las curvas de la rata son perfectamente comparables con las nuestras. En estado de vigilia, las ondas son pequeñas y muestran un ritmo regular de unas siete oscilaciones por segundo (ritmo theta). La musculatura voluntaria está en tensión, lo cual provoca picos veloces y señalados en el electromiograma (EMG). Una vez conciliado el sueño, esta tensión muscular se pierde. Durante el SOL, las curvas de procedencia cerebral muestran ondas altas, anchas e irregulares en su aparición; en cambio, durante el sueño MOR las oscilaciones son pequeñas, rápidas y regulares. En el sueño MOR se dan, aparte de los veloces movimientos oculares, contracciones esporádicas de las patas y las vibrisas del hocico. Ambos tipos de sueño han podido observarse prácticamente en todos los mamíferos estudiados hasta ahora. Son excepciones el delfín y el equidna, monotrema en el cual no ha sido encontrado sueño MOR. De modo que los estadios del sueño y sus típicas alteraciones son característicos de la mayoría de los mamíferos. Volviendo a la rata y examinando su dormir un poco más de cerca. La rata es un animal activo de noche y duerme sobre todo durante el día. Registros de su sueño a lo largo de 24 horas mostraron que la rata duerme unas doce horas de cada 24. Diez de aquéllas corresponden al SOL y dos al MOR. Las horas diurnas, correspondientes a las nocturnas del hombre, no las pasa el animal sólo durmiendo, sino que está más de dos horas despierto. Al igual que en tantos otros animales, el sueño de la rata es polifásico, interrumpido una y otra vez por periodos de vigilia. Cada episodio aislado de sueño de la rata no suele durar arriba de unos minutos y es seguido por un episodio despierto, también corto por lo general. Lo mismo que en el hombre, también en los animales se inicia el episodio de SOL, y el sueño MOR aparece después. Cada ciclo de SOL y MOR dura en la rata sólo diez minutos, o sea que la duración de los estadios es mucho rnás breve que en el hombre. Potenciales cerebrales (F. .. c) ~~Q¡¡¡ .fItA...,'·~ • ni Poten~les musculares (EMe) _.tl.", all 11' .. VIGILIA SOL MOR Fig 3. Característiocas conductuales y electrográficas de los tres estados de vigilancia en la rata, modificado de Borbely (1981). SUEÑO Y EPILEPSIA 20 Los estudios sobre la relación del sueño y la epilepsia, comprenden dos aspectos fundamentales que son: el efecto de las crisis convulsivas focales o generalizadas, sobre la organización del sueño y la incidencia de las crisis según las fases de éste. Los resultados descritos señalan que ambos tipos de crisis presentan un efecto deletéreo sobre las fases del sueño, principalmente sobre el sueño MOR (Calvo, 1992). Aunque el fenómeno epiléptico puede ocasionar modificaciones en el sueño, el sueño también puede ocasionar una fuerte influencia en el desencadenamiento de las crisis y en las anormalidades interictales del registro EEG. Estos efectos han sido notorios en epilepsias idiopáticas y generalizadas, en epilepsia parcial con o sin crisis secundarias, incluso en modelos animales (Gian Luigi Gigli y cols, 1997). La relación entre las anormalidades epileptiformes y las fases de sueño ha sido tema de varios estudios. En 1971 Patry y colaboradores, describieron espigas continuas y actividad de vigilia durante la fase SOL a las que denominaron "estatus subclínico epiléptico inducido por el sueño en niños", además establecieron criterios estrictos para el diagnóstico de ésta condición (Pierangelo y cols. 1999). Posteriormente, Tassinari introdujo el término "estatus eléctrico durante el sueño' y definió las alteraciones clínicas que acompañan a ese patrón 21 del EEG como memoria a corto plazo y deterioro en el lenguaje, bajo IQ e hiperkinesia (Beghi, E. Y Perucca, 1995). Terzano y cols (1999), desarrollaron un análisis micro estructural de sueño basado en las alteraciones cíclicas consistente de dos fases: A (la primera mitad del tiempo total del sueño) y B (la segunda mitad del sueño total) de donde reportan que en particular, los EEG de las lesiones focales paroxísticas en las epilepsias temporales y fronto-temporales, muestran cierta activación durante la fase A, en tanto las descargas en las epilepsias idiopáticas generalizadas se activan más intensamente durante la fase B, e inician las espigas interictales. Mediante las técnicas de electroencefalografia (EEG) con monitoreo y video durante 24 horas en pacientes epilépticos, se ha llegado a considerar común el incremento entre la relación de crisis epilépticas y las alteraciones en las fases del sueño. La privación en alguna de las fases puede exacerbar las crisis e inclusive un periodo corto o la pobre calidad del sueño en estos pacientes puede llegar a ser un factor enmascarante, aunque parcialmente de tipo reversible mediante tratamiento farmacológico. Desafortunadamente la relación entre sueño y epilepsia también está afectada por el tratamiento farmacológico ya que los antiepilépticos controlan las crisis, pero modifican la estructura del sueño (Sammaritano y Sherwin, 2000) . • :. 1.- Epilepsias del sueño: Las crisis aparecen preferentemente durante el sueño. Este tipo de crisis son encontradas principalmente en epilepsias parcial y generalizada: • Epilepsias tónico- clónico generalizadas: cerca del 30% con crisis durante el sueño. • Epilepsia parcial idiopática en niños. • Síndrome epiléptico en niños, con espigas continuas y descargas de ondas lentas durante el sueño, llamado "Estatus epilépticus del sueño· (Síndrome ESE) .:. Activación del fenómeno epiléptico durante el sueño: (Degen, 1980, Halász, 1984) 22 a).- En las epilepsias idiopáticas generalizadas, la frecuencia de las crisis aumenta durante el Sol y disminuyen durante el sueño MOR. b).- En epilepsias generalizadas de sintomatología específica, la activación es durante las dos primeras fases del SOL y disminuye la actividad durante la tercera y cuarta fase. c) .- En epilepsias generalizadas de sintomatología no específica, tales como el Síndrome de West, el EEG muestra un patrón hipsarrítmico que desaparece durante el sueño MOR. En el Síndrome Lennox-Gastaut, existe un aumento en las espigas y la actividad del SOL durante las primeras dos fases del sueño y una disminución durante la tercera y cuarta fases del SOL. Las crisis tónicas usualmente aparecen durante el SOL. d).- En epilepsias parciales, especialmente de forma idiopática, el SOL se predispone a la generalización. En epilepsias asociadas con lesiones, la localización multifocal puede aparecer. El estudio del sueño ha sido muy útil para el diagnóstico de la epilepsia: 46% de las anormalidades aparecen en la primera media hora del registro, 57.3% después de las 2 horas, 73% durante las tres primeras horas (Decierck, 1982). El sueño y la epilepsia están íntimamente relacionados. La actividad epiléptica ictal e interictal interfieren en el sueño de animales y humanos. La privación del SOL facilita el fenómeno paroximal interictal e ictal (Samaritano y Gigli, 1991), la inestabilidad del sueño aumenta la frecuencia de fenómenos epilépticos. EFECTO DEL SUEÑO SOBRE LA EPILEPSIA El sueño causa modificaciones importantes del EEG de las epilepsias, como ya se mencionó antes. Estas modificaciones han sido notorias en epilepsias idiopáticas y generalizadas, en epilepsia parcial con o sin crisis secundarias e incluso en modelos animales (Broughton, 1984), en las cuales, durante el SOL se observa un aumento en la frecuencia de las descargas de espigas en el registro y la aparición de nuevos focus de descarga no presentes durante la vigilia . Por otra parte, la vigilia y el sueño MOR tienen un efecto contrario, reduciendo la frecuencia de espigas interictales en el EEG. La frecuencia de descarga y la topografía de la presentación de las espigas durante las etapas de sueño se han 23 investigado para determinar las áreas epileptogénicas primarias, ya que la estabilidad de la frecuencia de las descargas en los diferentes estados fisiológicos se considera un indicador del sitio epileptogénico primario. Existe un acuerdo general que durante el SOL existe una facilitación de la mayoría de las epilepsias con Crisis Convulsivas Primariamente Generalizadas (CCPG) y aquellas con crisis parciales. Estos hallazgos no tienen mucha consistencia, observan algunas variantes y sus manifestaciones durante el sueño MOR aún son controvertidas. Aunque existe una reducción en la propagación de las descargas desde el sitio de origen. Este fenómeno es de gran interés particularmente en vista de la organización del proceso epiléptico en relación con su tratamiento quirúrgico (Malow y cols. 1999). Los efectos del sueño sobre las epilepsias se han dividido en cuatro grupos, de acuerdo con el momento de presentación de las crisis durante el ciclo sueño-vigilia (Billard·S2). • Tipo A: pacientes con crisis del despertar, los que las presentan desde unos minutos hasta dos horas después del despertar. • Tipo B: pacientes con crisis antes del despertar o en la segunda mitad del sueño nocturno. • Tipo C: pacientes con crisis al iniciar el sueño o en la primera mitad del sueño nocturno. • Tipo o: pacientes con crisis en la tarde durante las horas de reposo, S a 12 horas después del despertar. Las crisis durante el ciclo sueño-vigilia se presentan principalmente al iniciar el sueño y poco antes del despertar (Daly, 1973). La relación que existe entre el ritmo del sueño, el estado de vigilia y las epilepsias se encuentra mejor expresada en las epilepsias con CCPG. Las epilepsias que se ven afectadas por los estados del sueño son principalmente: CRISIS GENERALIZADAS Crisis Tónicas Estas crisis consisten en una contracción tónica sostenida no vibratoria. El sueño tiene un efecto activador específico sobre este tipo de crisis. Aunque rara vez se 24 presenta durante la vigilia, son frecuentes durante el sueño. Son más comunes en la población infantil. Se presentan principalmente en las fases 11 y 111 del SOL, y no se han reportado durante el sueño MOR (Gastaut et al , 1963). Crisis Clónicas Aparecen principalmente durante episodios febriles y deben diferenciarse de los episodios mioclónicos, que suelen ser precipitados por el despertar. Estas crisis ocurren durante el SOL donde se observan descargas generalizadas bilaterales y sincrónicas de poliespiga, en ocasiones asociadas a mioclonías que evolucionan a crisis clónicas generalizadas. Estas crisis se presentan durante el SOL y desaparecen cuando aparece el sueño MOR (Gastaut, 1968). Crisis de Ausencia Estas crisis se caracterizan por un lapso de supresión de las funciones mentales, con pérdida de la conciencia, los reflejos y la memoria: tienen un inicio y fin súbitos, así como una duración variable entre 5 y 15 segundos pero pueden presentar duraciones extremas de un segundo o menos, hasta varios minutos. En la población adolescente las crisis son más frecuentes durante la vigilia que durante el sueño, mientras que en los adultos se facilitan durante el sueño. En relación con el ciclo sueño-vigilia, es durante el sueño MOR que se presentan dos tipos de crisis de ausencia una con descarga de espiga-onda breves y otra que no presenta descarga de espigas-onda. Epilepsia mioclónica del adolescente Este tipo de epilepsia se caracteriza por las descargas espigas-onda que se presentan al inicio del sueño y durante el SOL y desaparecen progresivamente durante el sueño MOR, aunque puede reaparecer al despertar. CRISIS PARCIALES Epilepsia parcial con sintomatología elemental Se presenta en los períodos de sueño y suele pasar inadvertida por los familiares, se detecta sólo mediante el registro poligráfico. Otro grupo presenta crisis aleatorias durante la vigilia y el sueño. Crisis parciales con sintomatología compleja 25 Se relaciona con las crisis generalizadas que pueden complicarse con crisis tónico clónicas durante la vigilia o el sueño Para fines del tratamiento farmacológico, lo más útil es clasificar a los pacientes de acuerdo con el tipo de crisis que experimentan, ya sea que se trate de cuadros con síndrome generalizado o bien con síndrome focales o parciales como vimos anteriormente en extenso (C.C.T.I.L.A.E., 1989 Anexo), de tal manera que los síndromes parciales están localizados en una región cerebral determinada. Las crisis generalizadas involucran a ambos hemisferios cerebrales tanto las de petít mal, como las crisis de ausencia, así como las de gran mal, como el status epiléptico, mioclónicas o tónico-clónicas. De acuerdo a su clasificación anatómica (C.C.T.I.L.A.E., 1989 Anexo), las epilepsias se clasifican en: 1. Epilepsia del lóbulo frontal 2. Epilepsia de la corteza motora 3. Epilepsia del lóbulo parietal 4. Epilepsia del lóbulo occipital 5. Epilepsia del lóbulo temporal Por las características que involucran a estructuras de la corteza temporal así como del sistema límbico, que tienen que ver con procesos de la memoria y el aprendizaje y por ende al sueño, el interés se centró en la Epilepsia del lóbulo temporal. EPILEPSIA DEL LÓBULO TEMPORAL En la población adulta la más común y devastadora de las epilepsias es la del lóbulo temporal (Nadler, 1981). Remite frecuentemente a una historia de convulsiones febriles o a una historia familiar de convulsiones. Debido a que las dosis terapéuticas, que en otros casos se consideran normales, aquí deben aumentarse gradualmente por lo que se termina por alcanzar grandes concentraciones que traen por consiguiente efectos no deseados (McNamara, 1994). Varias de las estructuras cerebrales que se alteran en la epilepsia del lóbulo temporal pertenecen al sistema límbico. Este tipo de epilepsia probablemente refleja en parte la epileptogenicidad extrema del sistema límbico en general, pero en forma más particular la del 26 hipocampo (Collins, 1983). Exámenes histológicos de tejido neuronal obtenidos por cirugía y por autopsias de pacientes con este tipo de epilepsia, revelan con frecuencia esclerosis del hipocampo y del Asta de Amón, la cual se refiere a pérdida neuronal y gliosis en el hilus del giro dentado, CA 1 Y CA3. Este tipo de lesión se presenta en un 66% de los pacientes con epilepsia y esta esclerosis se caracteriza por una marcada pérdida de neuronas principalmente del hipocampo además de gliosis (Sutula, 1994, McNamara, 1994). Se cree que estos cambios son consecuencia de una excesiva activación de receptores excitatorios a glutamato, lo cual provoca excitotoxicidad. Dentro de las diferentes hipótesis también se habla de la pérdida de neuronas GABAérgicas que conducen a un desequilibrio en la sinapsis y por lo tanto a un aumento desequilibrado de aminoácidos excitatorios (McNamara, 1994). MODELOS EXPERIMENTALES DE EPILEPSIA. El uso de modelos animales en el estudio de la Epilepsia ha permitido ampliar y profundizar los mecanismos cerebrales, ya sean celulares o sistémicos, válidos a la neurobiología en general y a la epilepsia en particular. Muchos son los trabajos que se realizan con la finalidad de desentrañar el fenómeno epiléptico. En general podemos decir que desde el punto de vista electrofisiológico se destacan dos grandes líneas: por un lado la de los modelos celulares (extra e intracelulares) y por otro, los modelos sistémicos. Razones éticas determinan que la epileptología experimental se estudie en modelos animales (Fisher, 1989). Algunos investigadores han utilizado tejido nervioso humano, de ablaciones quirúrgicas (Prince y Wong 1981), para obtener señales celulares paroxísticas. Los arduos e históricos trabajos clínicos- quirúrgicos de Penfield (Penfiedl y Jasper, 1954) en Montreal permitieron establecer caminos para el desarrollo de la epileptología clínica y experimental. Las respuestas experimentales siempre han dependido del modelo empleado (Purpura y cols, 1972), Y sus limitaciones están dadas cuando se los quiere homologar con la epilepsia humana. A continuación se describen algunas de las Cuadro 1. MODELOS EXPERIMENTALES DE EPILEPSIA MODELO AGUDO PARCIAL Típicos convulsivantes Penicilina Bicuculina Picrotoxina Estricnina Agentes colinérgicos Agentes anti-colinérgicos Estim. eléctrica aguda Rodajas de neocorteza MODELO CRÓNICO PARCIALES Implantes metálicos corticales Hidróxido de aluminio Cobalto Tungsteno Zinc Hierro Lesiones por congelación Otros (Robert S. Fisher (modiflCado),1989) MODELO TONICO- CLONICO Generalizado Genéticos Crisis audiógenas en ratones Fotosensibles en mandril Audiógenas Electroshock Convulsivantes químicos Pentilentetrazol Bemegride Picrotoxina Bicuculina Penicilina Otros Desórdenes metabólicos Hipoxia Hipoglucemia Oxígeno hiperbárico Hipercapnia Uremia H iperterrn ia Otros MODELO PARCIAL COMPLEJO Ácido kaínico Toxina tetánica Inyección en área temporal "Kindling" Rodaja de cerebro MODELO HlPOCÁMPICO Células aisladas Tejido humano Post-quirúrgico MODELO AUSENCIA GENERALIZADA Estimulación talámica Foco cortical bilateral Penicilina Opiaceos intraventriculares Otros MODELO STATUS EPILEPTlCUS Litio-pilocarpina Cobalto-homocisteína Estimulación recurrente Ácido kaínico 27 28 vertientes que canalizan algunos modelos experimentales en animales. En el Cuadro No. 1 se resumen algunos de los modelos experimentales más utilizados. Consideraremos a continuación, algunos de los muchos y renovados trabajos experimentales, especialmente clásicos. MODELO AGUDO DE EPILEPSIA PARCIAL SIMPLE Para la realización de este modelo se han empleado distintos fármacos como: Penicilina (Aya la y Vasconsetto, 1970; Gloor y cols, 1977), Bicuculina ( Campbell y Holmes, 1984), Picrotoxina (Usunoff y cols,1969), Estricnina (Knopman, 1975), sustancias colinérgicas (Turski y cols, 1983) o anticolinérgicas (Ayala y Vasconsetto, 1970), así como estímulos eléctricos (Ajmone-Marsan, 1972). Estos fármacos y estímulos se han administrado, directamente a los animales así como en rebanadas de corteza cerebral (Ayala y Vasconsetto, 1970). La aplicación de los fármacos mencionados se realizó por medio de aplicaciones tópicas. La penicilina focal, se aplica sobre corteza, embebiendo algodón con una solución de Penicilina al 1.7-3.4 mM., a los pocos minutos comienzan a registrarse espigas recurrentes (Matsumoto y Ajmone-Marsan, 1964) y semejantes a las obtenidas en el foco humano. La penicilina bloquea al ácido gamma-amino butírico (GABA), inhibiendo los potenciales post-sinápticos (Wong y Prince, 1979). La descripción de la despolarización paroxística obtenida en el modelo intracelular fue obtenida con penicilina (Ayala y Vasconsetto, 1970). Estudios previos describen los efectos del estímulo eléctrico repetido sobre la corteza cerebral, habiéndose descrito típico modelo de postdescarga (Purpura y cols, 1972). Aplicando trenes de ondas cuadradas de 0.5-10 mseg de duración, de 0.5- 5 mA, y a la frecuencia de 18-25 Hz., se obtiene una respuesta de la corteza ., animal semejante a la humana. La post-descarga ha sido útil para estudiar, en los modelos sistémicos, la propagación de las crisis (Penfiedl y Jasper, 1954). El empleo de las rebanadas de corteza cerebral (Burton y cols, 1987) de rata, conejo, etc, pueden tener semejanza a los modelos hipocámpicos que se describen más adelante (Andersen y cols, 1979). 29 Modelos crónicos de crisis parcial simple Para la obtención de este tipo de crisis experimental se han empleado metales como hierro (Lange y cols, 1980), zinc (Pei y cols, 1983), cobalto (Dow, 1962), tungsteno (Blum, 1960) y gel de hidróxido de aluminio (Kopeloff, 1955), en forma de implantes corticales. El modelo más estudiado y el que arrojó más beneficio fue el último de los mencionados. Se aplica sobre corteza de gato o monos hidróxido de aluminio al 4 %, después de un período latente de uno a dos meses, se producen ataques recurrentes similares a las crisis humanas, caracterizadas por sacudidas contra laterales a la lesión. La anatomía patológica muestra modificaciones importantes del árbol dendrítico y gliósis del foco (Westrum y cols, 1964). Lesiones criogénicas o por congelación (Hanna y Stalmaster, 1973), utilizando nitrógeno líquido también han sido utilizadas en este modelo. Las crisis aparecen después de algunas horas de latencia; durando o persistiendo varios días. MODELO DE CRISIS PARCIALES COMPLEJAS Las regiones utilizadas para estudiar este tipo de crisis son las comprendidas en las estructuras límbicas; hipocampo, amigdala y corteza temporal (Gloor y cols, 1977). Se emplearon para la obtención de los fenómenos parciales complejos: ácido kaínico (Nadler, 1981; Cavalheiro y cols, 1982, Sperk 1985), toxina tetánica (Mellanby y cols, 1984), fenómenos kindling (purpura y cols, 1972). El ácido kaínico produce lesiones en ¡as neuronas del hipocampo y la técnica consiste en la aplicación de la droga (0.8-2.0 ~g . ) o por vía intravenosa en dosis de 4mg/kg. Las crisis están caracterizadas por pérdida de la actividad, movimientos masticatorios seguidos de actividad motora compleja, pudiendo desarrollar posteriormente crisis generalizadas tónico-clónicas. La mayor actividad electroconvulsiva se da en la región límbica. La toxina tetánica es otra de las sustancias empleadas en la rata y el gato. Las crisis comprenden sacudidas mioclónicas del tren anterior y/o crisis generalizadas tónico-clónicas. El EEG, muestra un a actividad de punta o punta-onda a una frecuencia de 3-20 ciclos/seg. El estado convulsivo se desarrolla después de la aplicación de la toxina tetánica, que se inyecta en hipocampo. Cerca de la corteza prepiriforme, que al 30 ser sometida a microinyección de carbachol, ác. Kainico, bicuculina o N-Metil-D- Aspartato (NMDA), produce ataques clónicos bilaterales (Pinedda, 1985), provocando una muy rápida generalización de la descarga, semejante a la secundarización generalizada de las crisis parciales complejas de la clínica humana. El método Kindling, ampliamente descrito por Goddard (1967) y De la Delgado (1961), es un método que no contamina el modelo como ocurre con otros más invasivos, permitiéndo estudiar la naturaleza del foco y sus consecuencias de una manera más cercana a la realidad biológica, siendo quizás más justa esta apreciación cuando nos referimos al foco secundario. El fenómeno consiste en estimular eléctricamente la región a estudiar, en forma de trenes de estímulos durante 2 segundos, a 60 Hz. y 0.2-1 .0 mA. Después de algunos días de estímulo repetidos cada 24 hrs., menores estímulos son capaces de inducir una post- descarga con típicas manifestaciones clínicas convulsivas. Se cree que el fenómeno produce cambios en la excitabilidad de la neurona o disminución del umbral de descarga. En ocasiones las crisis son de aparición espontánea, lo que provoca la ocurrencia gradual y la cronicidad del evento. El kindling se presenta en todos los mamíferos adultos. Racine (1972), clasificó las respuestas conductuales del kindling (tanto en el gato como en la rata), en cinco etapas: ETAPA 1: clonus facial ETAPA 11: clonus facial y movimiento oscilatorio de cabeza (nodding) ETAPA 111: clonus facial, nodding más sacudidas clónicas del tren anterior. ETAPA IV: erección corporal y sostén del cuerpo con las patas posteriores. ETAPA V: caída al suelo, crisis generalizada con pérdida del control de la postura. La descripción realizada corresponde a la rata. El modelo kindling esta conceptualmente relacionado a la potenciación prolongada (Iong-terrn potentiation) y también a fenómenos ocurrentes en regiones de receptores NMOA. Wada (1982), ha estudiado la profilaxis del kindling con fenobarbital, ácido valproíco y diazepan, llegando a bloquear los ataques e impidiendo el desarrollo del proceso. Otro aporte está centrado en la constitución del foco secundario en espejo y que quizás responda a un fenómeno kindling, de allí la necesidad terapéutica de bloquear el foco primario e interrumpir el proceso. 31 A partir del método se relatan complejas modificaciones neuroquímicas tales como: aumento del recambio de dopamina y noradrenalina, disminución de la concentración de GABA, tiroxina hidroxilasa y aumento del GMP-cíclico. MODELO "CELULAR-BRAIN SLlCES" La necesidad de abordar el foco epiléptico en su expresión celular, sospechándose que en la actividad epiléptica se activa un pool de neuronas que encienden un grupo de potenciales de acción de alta frecuencia, indujo a desarrollar modelos intra y extracelulares (Andersen y cols, 1977). Con ellos se estudiaron con notable precisión la excitabilidad de la membrana y sus distintos componentes concurrentes propios del fenómeno epiléptico. Desde el punto de vista técnico los progresos en el registro tienen mucho que ver. La utilización de electrodos muy finos, metálicos o de vidrio (micro electrodos) de algunos micrones de diámetro de punta, permitió realizar en la neurona (registro extracelular), introducir en esta (registro intracelular) o poder "aspirar" un trozo de membrana neuronal, dentro de un micro electrodo, técnica del clampeo del voltaje y poder estudiar en forma controlada los potenciales de la membrana. El registro Electroencefalográfico fue complementado por una cadena electrónica de preamplificadores-osciloscopios-grabadores y conversores que a través de programas computarizados permiten registrar, grabar y cuantificar matemáticamente pequeñas señales extra e intracelulares del fenómeno epiléptico. Los trabajos se han realizado en animales con libre movimiento o en rebanadas de tejido nervioso de unos 250-350 micrones de espesor. En el primer caso el registro puede ser simultáneo, con macro y micro electrodos, lo que permite obtener registros simultáneos de EEG y de potenciales extra celulares. El tejido más empleado pertenece al hipocampo debido a su estructura y fácil visualización con bajo aumento permite guiar e introducir el micro electrodo en la . región celular elegida. El tipo de señal obtenida en el osciloscopio permitirá inferir que se trata del interior de la neurona o registrando actividad de campo extracelular. La aparente estructura elemental del hipocampo y las características funcionales de sus grupos celulares, han hecho del mismo la región más estudiada en este tipo de modelo experimental. El registro extracelular permitió 32 distinguir, según la frecuencia de aparición de los potenciales de acción, dos tipos de neuronas epilépticas (Wyler y Ward, 1980): el tipo 1, con intervalo interespiga menor de 5 mseg. Y el tipo 2 donde solo un 10 % aproximadamente descarga a esa frecuencia. Esa cuantificación de la actividad neuronal epiléptica se le denomina índice de descarga. Se ha demostrado que las neuronas de tipo 1, constituyen el foco propiamente dicho, mientras que el tipo 2 conforman la periferia del mismo. El primero funciona como un marcapaso del generador; el segundo permite, con su masa reclutada, que el evento se propague. El registro intracelular de células piramidales del foco, muestra un gran y prolongado potencial de membrana, sincrónico con las espigas interictales de la superficie, denominada despolarización paroxística (DPS) (Prince y Wong, 1981). MODELOS DE CRISIS GENERALIZADAS TÓNICO-CLÓNICAS. Diversos métodos experimentales han permitido el desarrollo de modelos de epilepsia generalizada de tipo clónico-clónica. Fisher (1989) en su revisión, aunque no encuentra un buen modelo animal para las formas primarias generalizadas de ataques recurrentes tónico-clónicos de tipo Gran Mal, propone la epilepsia fotosensible del mandrilo del Papio-papio y las crisis audiogénicas del ratón. Existen otros modelos hereditarios del ratón caracterizados por crisis tónicas generalizadas o ataques de ausencia (Trotterer mice) y una epilepsia genética de la rata denominada "Genetica"y Epilepsy-prone". La epilepsia fotosensible (Meldrum y Horton, 1971) del Papio-papio se obtiene por estimulación lumínica intermitente a la frecuencia de (Granilo y cols, 2001) flashes por segundo (Ki"am, 1967). Se caracteriza por crisis tónico-clónicas o espasmos tónicos de cara y cuerpo que persisten aún después de la estimulación. Las descargas muestran predominio topográfico frontal de punta o punta-onda bilaterales a 3 Hz. La actividad profunda puede ser obtenida en formación reticulada y núcleo centromediano del tálamo. La progresión del ataque produce brotes de poliespigas yen la etapa crónica ondas lentas. Al cesar las crisis existe depresión del voltaje. Las crisis audiogénicas, Purpura (1972) del ratón son provocadas por estímulos sonoros caracterizándose por un período pretónico, otro tónico y finalmente un período post-ténico. La raza de ratones pertenece a un fenotipo que ha sido 33 industrializado para fines experimentales y son denominados SJLlJ-DBAI2J61 de los laboratorios Jackson, Bar Harvor. La epilepsia genética "GEPR" (Genetically epilepsyprone rats) constituye un modelo genético. Las crisis son desencadenadas por el sonido, la hipertermia, estímulos químicos y/o eléctricos. Existen dos colonias epilépticas: la GEPR-9 y la GEPR-3; al estímulo sonoro ambas cepas corren descontrolada mente para luego presentar sacudidas clónicas. Las ratas GEPR-9 sufren además crisis tónicas extensoras. La etapa más propicia para producir este tipo de epilepsia refleja está comprendida entre la segunda y cuarta semana del nacimiento. Las crisis pudieron ser bloqueadas por la inyección de aminoácidos antagonistas en el colículo inferior. Efecto parecido se obtuvo cuando la inyección fue aplicada en la sustancia nigra y la formación reticulada del tronco cerebral. En estos animales se encontró déficit de noradrenalina en tronco cerebral, cerebelo y telencéfalo, como disminución de serotonina y aumento del contenido colinérgico en tálamo y estriado. Si bien la inyección de NMDA, en el colículo inferior desencadena una crisis, no hay concreta evidencia entre aminoácidos excitatorios y crisis audiogénica. El hallazgo de un aumento significativo de la glutámico-ácido decarboxilasa en neuronas del colículo inferior, sugiere que la desinhibición juega un rol importante en la susceptibilidad de las crisis. Existe una especie de rata que espontáneamente padece crisis tónicas y ausencias. Son ratas producto del cruzamiento entre ratas homocigotas "Tremor" y homocigotas "Zitter" . Se llaman ratas "SER" (ratas epilépticas espontáneas) y sus EEGs, muestran descargas de complejos de punta-onda a 5-7/s., en corteza e hipocampo (Serikawa y Yamada, 1986). Otros modelos son: el provocado por electroshock y por la aplicación sistémica de convulsivantes. El primero consiste en aplicar un estímulo eléctrico de intensividad suficiente como para desencadenar una crisis convulsiva. El estímulo se aplica sobre el cerebro. El estímulo que provoca la crisis gen~lizada se denomina estímulo umbral; mas allá de aquel es supraumbral o máximo. Con estímulo de trenes de onda cuadrada de 0.2 mseg., de duración y a una frecuencia de 60 a 100 pps., el animal, después de un breve período de inmovilidad presenta la fase tónica en flexión de los miembros. Luego le sigue la 34 fase clónica, caracterizada por extensión de las extremidades acompañada de movimientos de gran amplitud. Se cuantifican los tiempos de ambas fases como asi también los tiempos de recuperación (TR) del animal después de la estimulación. Muchos compuestos químicos pueden producir crisis generalizadas si se aplican e forma sistémica. La lista es amplia, pero mencionamos: penicilina, estricnina, homocisteina, NMDA (Czuczwar y cols, 1985) bemegride (Rodin y cols, 1958), pentilenetetrazol (PTZ) (Papy y Naquet, 1971). En el animal produce sacudidas mioclónicas y crisis generalizadas tónico-clónicas. La inyección intravenosa de una solución de PTZ al 1 % Y con 50mglKg, produce ataques clónicos, mientras que con 90 mglkg., crisis tónico-clónicas. Parecerla que estructuras como los cuerpos mamila res. los tractos mamilotalámicos y anterior talámico participan en las crisis generadas por el PTZ. El gamma-vinil GASA bloquea los ataques de PTZ., dentro de la formación reticular y el hipotálamo. Para algunos autores el PTZ bloquea la inhibición mediada por el GASA. El PTZ fue adoptado también como test para la evaluación de algunas drogas anticonvulsivas al igual que el electroshock. Por ejemplo: la fenitoína y la carbamacepina no tienen efecto sobre las crisis desencadenadas por la estimulación eléctrica. La penicilina suministrada por vía parentelal (Taylor-Curval y Gloor, 1984) puede producir crisis generalizadas en el gato y en la rata, aunque en el primero, es muy útil para estudiar variados tipos de crisis después de la administración de 300.000 unidadesJkg., vía intramuscular. Otros convulsivantes como mencionamos mas amba son empleados, por ej.: la estricnina que produce crisis generalizadas (Knopman, 1975). Su acción interactúa con los receptores GASA- benzodiacepinicos; aunque la acción más significativa seria contra la glicina que es un importante inhibidor. El bemegride (Rodin, 1958) ha sido empleado para producir ataques generalizados o activar focos. Fenómenos similares se obtienen con la picrotoxina (Usunoff y cols, 1969) y la bicuculina (Campbell y Holmes, 1984). No hay acuerdo sobre el modo de acción de estos fármacos que son antagonistas del GASA y bloquean los potenciales postsinápticos inhibitorios. Se sabe que la picrotoxina interactúa con el ionóforo de cloro del receptor GASA. La homocisteína (Hammond y cols, 1980) ha sido usada, en roedores para producir un modelo de crisis generalizadas. Cuando se la administra a razón de 1.000 35 mg/Kg., vía intraperitoneal aparecen crisis generalizadas clónicas o tónico- clónicas; si el estado persiste el animal puede entrar en status epilepticus y morir. Se han descripto receptores glutamatérgicos que se clasificaron según su sensibilidad al NMDA., al quiscualato y al kainato. Los últimos dos están comprometidos en la transmisión sináptica y los receptores NMDA en el fenómeno de potenciación de los procesos sinápticos (long term potentiation) que influyen en las crisis. La administración de NMDA intraperitoneal e intravenosa en el ratón produce crisis clónicas, mientras que la aplicación del N-metil aspartato conduce a la muerte en status epiléptico, en la totalidad de los animales tratados (Czuczwar y cols, 1985). MODELOS DE AUSENCIAS GENERALIZADAS Para este tipo de crisis fueron empleadas: la aplicación de penicilina sistémica, la creación de focos corticales bilaterales (Purpura y cols, 1972), la estimulación talámica (Morison y Damsey1970), la inyección intraventricular 66 de opiáceos o intraperitoneal de THIP-Tetra-hidroxiisoxazol0-4, 5 c-piridino 3-01-20. La aplicación de 300.00 un./kg., de penicilina G. , en el gato produce variedades de crisis; pérdida de la actividad, mioclonus, temblor facio-oral con progresión a generalización tónico-clónicas. El EEG., muestra descargas de punta-onda similar a las observadas en la ausencia clínica. A partir de este modelo electrográfico provocado por la penicilina se han desarrollado diversas líneas de estudio que abordan el origen celular o estructural de la punta-onda. El pequeño mal, tuvo como hipótesis de su origen, estructuras del tronco cerebral y la formación retículo-talámica (Jasper, 1964). En los animales esa teoría no fue reconocida, aún más, la puntaonda fue registrada en corteza antes que en el tálamo y la formación reticulada, por lo que se ha sugerido que el generador cortical es mantenido por un circuito recurrente tálamo-cortical. Altas dosis de sulfato de morfina vía parenteral, inducen crisis clónicas en roedores. La inyección intraperitoneal de THPI (5-10mg/Kg), en la rata producen ausencias de varias horas de duración y con descargas de punta-onda generalizada. Probablemente la THPI bloquea los efectos endógenos del GASA (Fariello, 1987). La estimulación talámica constituyó un modelo neurofisiológico epiléptico, definiendo el concepto 36 de fonnación retículo-talámica (Jasper 1964), ya que la estimulación de la línea media y el tálamo intralaminar produce ausencia y punta-onda en el EEG. Actualmente el papel que desempeña el talámico y la corteza en la generación de la ausencia es controvertido, de tal modo que se relatan observaciones de estimulación talámica con efecto anticonvulsivo. MODELO ANIMAL DE STATUS EPILEPTIUS. Variados modelos han sido propuestos como capaces de producir experimentalmente Status epilepticus. El efecto dellitio-pilocarpina (Butherbaugh, 1986) que produce en la rata, ataques generalizados clónicos o tónico-clónicos de varias horas de duración. En el EEG se observan características similares al status epiléptico humano. La dosis empleada en este modelo es de aproximadamente de 3mEq./Kg., intraperitoneal de litio; veinte horas mas tarde se agrega pilocarpina, por la misma vía, a razón de 25-30mg/Kg. La pilocarpina puede producir status motor. La asociación de cobalto focal con homocisteína sistémica puede producir status epiléptico tipo tónicoclónico, También nosotros obtuvimos status generalizado con el empleo del AK a altas dosis subcutáneas en la rata adulta o status eléctrico hipocampal con penicilina local o en núcleos profundos cerebelosos (Sperk, 1994; Granillo, 2001). En este sentido se considera al ácido kaínico (AK) como un potente estimulante del SNC y se postula que ejerce un mecanismo de acción como un agonista del glutamato. Se obtiene de una semilla dulce conocida como Digenea simplex. EL ÁCIDO KAíNICO COMO MODELO CONVULSIONANTE El ácido Kaínico (AK) es un ácido dicarboxílico, uno de los fármacos efectivos para inducir crisis epilépticas. La característica sobresaliente del AK para la investigación de la epilepsia es su potencia para inducir un síndrome caracterizado por un status epilépticus límbico agudo y con subsecuente daño neuronal cerebral, similar al que se presenta en la epilepsia del lóbulo temporal en humanos (Nadler: 1981, Pollard, 1993). La semejanza estructural del AK con el glutamato, el mayor neurotransmisor excitador en el cerebro, le confiere un efecto neuroexcitador y 37 neurolóxico en el SNC de los mamíferos (Sperk y cols, 1985 y 1994, Loscher y Schmidt, 1988, Shinozaki y Konishi, 1979). Se ha demostrado que la aplicación de AK a ratas ya sea vía intraperitoneal (i.p.) o subcutánea, a una dosis de 8-12 mgl kg; o bien en sitios especificos del cerebro a dosis de 0.4-1.5 g/ L de solución salina, es igualmente efectiva para inducir la aparición de descargas epilépticas continuas, espontáneas y recurrentes, asociadas con un patrón característico de daño cerebral semejante al descrito en humanos con epilepsia del lóbulo temporal (Ben-Ari y col., 1980; Sperk, 1994). En cuanto al mecanismo por el cual actúa el AK para reproducir los efectos de descargas epilépticas continuas y por lo tanto el daño cerebral, se propone que después de la inyección sistémica o local (Sperk, 1985) induce severas convulsiones provocando lesiones en axones y dendritas del hipocampo, corteza piriforme, amígdala y cerebelo entre otras. El AK llega a áreas vulnerables del cerebro e induce lesiones directas a las neuronas. Además puede ejercer una fuerte acción excitadora sobre ciertas vías neuronales (como por ejemplo sobre las fibras musgosas de las células granulares del giro dentado del hipocampo, las cuales transmiten su excitación hacia el circuito trisináptico del hipocampo el cual involucra a las neuronas piramidales de CA 1 Y CA3 causando hiperexcitabilidad), en su momento se producen crisis y finalmente daño a las neuronas (Sperk, 1994; Morin y col., 1999). Estos datos son muy ilustrativos de la potencia convulsionante del AK. Es importante señalar que la sustancia puede inducir un severo estatus epiléptico. ADMINISTRACiÓN SISTÉMICA La forma más conveniente de administrar el AK es por vía sistémica, porque produce cambios conductuales y neuropatológicos similares a los que se obtienen cuando se administra la neurotoxina en cualquier área cerebral (Sperk, 1994). Por esta vía de administración se evita el daño mecánico directo y la alta concentración local del AK que pudiera perjudicar a las neuronas por un efecto independiente de las convulsiones (Nadler, 1981) 38 CAMBIOS CONDUCTUALES La administración de una sola dosis sistémica-de AK en la rata produce cambios conductuales que se manifiestan más consistentemente como sacudidas de perro mojado seguidas por movimientos de roer, masticatorios, salivación excesiva, olfateo, movimientos de cabeza, parado en patas traseras, pérdida de la postura recta y episodios de hiperactividad (Nadier, 1981) . En la cumbre de las crisis ocurre la aparición de convulsiones tónico ciánicas. Eventualmente, los ataques limbicos pueden culminar en status epilépticus, posiblemente debidos a la apertura de la barrera hematoencefálica y la penetración del AK por la crisis provocada. La duración de estas manifestaciones en conjunto son de dos a tres horas (Sperk, 1994). CAMBIOS ELECTROENCEFALOGRÁFICOS El registro electroencefalográfico (EEG) en ratas administradas con ácido kaínico muestran que los cambios conductuales corresponden a las manifestaciones de la actividad epiléptica, que se inicia en las estructuras límbicas (Collins, 1983), principalmente en el hipocampo, la amigdala y la corteza piriforme. Inicialmente, se observan episodios recurrentes con espigas rítmicas, separadas por periodos interictales con lapsos de uno o varios minutos de duración (Nadier, 1981). Las convulsiones electroencefalográficas se prolongan rápidamente a través del circuito Iímbico. La actividad EEG de las ratas tratadas con AK se correlaciona estrechamente con los cambios conductuales observados en ellas. Estos cambios en la actividad EEG corresponden al desarrollo de las sacudidas de perro mojado (Sperk, 1994). La actividad convulsiva se propaga eventualmente a la neocorteza, situación que probablemente produce las manifestaciones motoras (Nadier, 1981) Cambios neuropatológicos Las neuronas piramidales del hipocampo son las más sensibles a la acción neurotóxica del AK, siendo la región CA3 la más vulnerable (Collins, 1983) seguida por la región CA4. Por el contrario, las regiones CAl y CA2 y los gránulos dentados son particularmente resistentes a esta toxina (Sen-Ari, 1980) 39 Histológicamente se ha descrito un engrosamiento glial y dendrítico de todo el cerebro anterior y un amplio daño neuronal. Las áreas más afectadas son el bulbo olfatorio, la corteza, el complejo amigdalar, el hipocampo y sus partes relacionadas con el tálamo y la neocorteza (Sperk, 1985) Se ha reportado que las ratas tratadas con AK experimentan denervación de células inhibitorias acompañada por arborización colateral de fibras musgosas conduciendo a la formación de sinapsis adicionales sobre otras células granulares dentadas, lo que constituye un nuevo circuito excitatorio recurrente (Dudek, 1994) Los cambios histopatológicos producidos por el AK involucran también pérdida masiva de células nerviosas, proliferación glial y necrosis de los tejidos límbicos (Sioviter, 1994). Tales cambios se reportan como permanentes. Estos eventos han sido clasificados como "daño cerebral relacionado con la crisis", y más correlacionados con la severidad de los cambios conductuales que con la dosis del AK administrado. Estos cambios no son inducidos por acción directa de la toxina sino por mecanismos secundarios que contribuyen a la patogénesis del daño cerebral epiléptico irreversible (Sperk, 1985) Adicionalmente, se ha encontrado daño cerebral similar después de la inyección local de AK, lo que ha sido denominado "lesión distante" (Zaczek et al, 1978). CAMBIOS NEUROQuíMICOS Estudios metabólicos han mostrado un aumento relevante en la utilización de glucosa de tres a seis veces en las estructuras límbicas después de la administración del AK (Wasterlain, 1993) Este aumento fue más notorio en hipocampo, amígdala, corteza piriforme, corteza entorrinal y subcortical (Collins, 1983) El sector CA3 del hipocampo es el área que responde más severamente al AK por acumulación de 2-desoxiglucosa. Un aumento progresivo en la dosis de AK produce una marcada acumulación de 2-desoxiglucosa (Sperk, 1985) Estudios del modelo animal también revelan cambios marcados en los parámetros neuroquímicos, los cuales ocurren en dos fases; la fase temprana se caracteriza por un aumento reversible en las monoaminas noradrenalina (NA), dopamina (DA) y serotonina (5-HD durante las convulsiones que ocurren de las 2 a las 24 horas 40 después de la inyección de AK. La fase tardía irreversible que se presenta entre los 3 y los 30 días después de la administración presenta una disminución de la actividad de la colina acetiltransferasa (ChAl) (Sperk, 1985; Sperk, 1994). En el cuadro NO.2 se presenta un resumen de cambios a nivel neuroquímico, de diferentes neurotransmisores y péptidos que se ven alterados por la administración de AK. TIEMPO DESPUÉS DE LA ADMINISTRACiÓN DE AK (3-24hr) (10-30 dlaa) Referencias (NA, 5:-HT) ! - 12,14,18 (S-HIAA, HVA) r - 12,14,18 niveles de Glutamato ! 4 GLU-Recaptura ! 12 Niveles peptidicos (somatostatina neuropeptldo Y) ! _Il 19 Glutamato decarboxylasa ! (hilus) _If 12,18 Colina acetiltransferasa ! T 18 Unión a-Bungarotoxina ! 11 Receptores KA ! 3, 16 Receptor a Benzodiazepina ! (hipp.) - 13 (central) ! 1 (SG) 20 Receptor a Benzodlazeplna 1 1,13 (periferica) .Proslaglandinas t - 2 Leukotrienos 1 - 17 2-desoxyglucose r (SG,CAI-CA3) _ 10 c-fos r (SG) - 7,15 Cuadro 2. CAMBIOS NEUROQUIMICOS INDUCIDOS POR EL AK EN LA RATA 1. Altar et al., 1990; 2. Baran et al., 1987a; 3. Berger et al. 1986; 4. Chapman et al., 1984; 7. Le Gal La Salle, 1988; 10. Lothman y Collina, 1981; 11. McCaughran et al., 1980; 12. Heggll et al., 1981; 13. Klsh et al, 1983; 14. Klelnrok y Turski, 1980; 15. Popovici et al, 1990; 16. Represa et al., 1987; 17. Slmet y Tippler, 1990; 18. Sperk et al., 1985; 19. Sperk et al., 1994; 20. Tanaka et al., 1992. Abreviaciones: ! decremento; r Incremento, - sin cambio; SG-stratum granulosum; hlpp.-hippocampus, tejido total. 41 PAPEL DEL GLUTAMATO COMO NEUROTRANSMISOR EXCITADOR En la actualidad, está bien establecido que el glutamato es el agente neurotransmisor usado en la mayoría de las sinapsis excitadoras del Sistema Nervioso Central de los mamíferos. Además de la función del glutamato como mediador de la transmisión sináptica, este aminoácido participa durante la formación del sistema nervioso en procesos de crecimiento y maduración neuronal, en la formación y eliminación de sinapsis, en determinadas áreas y de forma dependiente de actividad, en la formación de patrones precisos de conexión sináptica. Igualmente desencadena cambios duraderos en la eficacia sináptica, fenómenos conocidos como LTP (potenciación de larga duración, "long term potentiationj y L TO (depresión de larga duración, "Iong-term depression"), que se consideran el correlato celular de los procesos de aprendizaje y formación de la memoria. Además, alteraciones de la neurotrasmisión glutamatérgica están implicadas en el daño neuronal observado después de episodios de isquemia y de hipoglucemia, así como en la etiología de una serie de estados neuro-patológicos que incluyen la epilepsia y las enfermedades de Alzheimer, Parkinson, Corea de Huntington y Esclerosis Lateral Amiotrófica. El glutamato realiza sus funciones mediante la activación de varios receptores. Los receptores que el glutamato activa se han dividido en dos familias: receptores metabotrópicos y receptores ionotrópicos. Los receptores rnetabotrópicos (mGluRs) están acoplados a proteínas G (proteínas que unen GTP) y regulan la producción de mensajeros intracelulares (Pin y Ouvoisin, 1995). Esta superfamilia está formada por 8 genes diferentes (mGluR1-8), cada uno de los cuales da lugar a distintos mRNAs por mecanismos de empalme (splicing) alternativo. Según el nivel de conservación de su secuencia aminoacídica estos receptores se han subdividido en tres grupos (tipos 1, 11 Y 111) (Nakanishi, 1992), con dos posibles mecanismos de transducción (adenilato-ciclasa y fosfolipasa C). Estos tres grupos presentan también propiedades farmacológicas propias. Por el contrario, los receptores ionotrópicos de glutamato (iGluRs) forman un canal catiónico con diferente selectividad iónica según el tipo de receptor, 42 siendo permeables a sodio (Na+), potasio (K+) y, en ocasiones, a calcio (Ca2+) (Nakanishi, 1992; Hollmann y Heinemann, 1994). RECEPTORES IONOTRÓPICOS DE GLUTAMATO. Se estima que en el SNC de los mamíferos, el glutamato es el neurotransmisor empleado en el 90 % de las sinapsis excitadoras rápidas, donde actúa sobre receptores ionotrópicos (iGluR). En función del agonista que produce la activación de éstos con mayor afinidad o selectividad, los receptores ionotrópicos de glutamato se han clasifICado en tres tipos: receptores de NMDA (ácido N-metil-D-aspártico), receptores de AMPA (ácido a-amino-3-hidroxi-5-metil- 4-isoxazolepropiónico) y receptores de kainato. Desde el punto de vista molecular, los receptores ionotrópicos de glutamato son proteínas integrales de membrana formadas, probablemente, por cuatro subunidades que forman un tetrámero (Rosenmund et al., 1998). Estas subunidades son cadenas polipeptídicas de aproximadamente 900 aminoácidos (=100 KDa), las cuales están formadas por tres dominios transmembranales (M1, M3 Y M4) Y un dominio intramembranal (M2); con el extremo carboxiterminal intracelular y el aminoterminal situado en el lado extracelular. Se han identificado 28 subunidades distintas, codificadas por, al menos, 17 genes diferentes. Tal variedad se genera porque los RNAs pueden ser modificados mediante mecanismos de empalme alternativo. Además, se conocen variantes generadas por edición del RNA, lo que incrementa el número de isoformas. 1.-RECEPTORES DE NMDA. De los tres tipos de receptores ionotrópicos de glutamato, el mejor conocido es el receptor de NMDA, debido sobre todo, a la rápida disponibilidad de ligandos selectivos, como el agonista NMDA (N-metil-D-aspartato) y los antagonistas D- AP5, MK801 o ketamina. Los receptores de NMDA son canales catiónicos que permiten el paso de Ca2+. Funcionalmente, se caracterizan por poseer una alta permeabilidad a Ca2+ (Ascher y Nowak, 1988), presentar dependencia de voltaje debida al bloqueo del canal por concentraciones fisiológicas de magnesio (Mg2+)(Nowak et al., 1984; Mayer y Westbrook, 1987), un tiempo de apertura largo I j 43 (Nowak et al., 1984) y una cinética de activación y de deactivación relativamente lenta (Lester et al., 1990). Además de los sitios de unión para el agonista, el receptor de NMDA presenta diversos lugares de regulación alostérica, que son diana para compuestos tanto endógenos como exógenos. Estos sitios de unión incluyen: un sitio de alta afinidad para glicina (Johnson y Ascher, 1987; Klecner y Dingledine, 1998; Lerma et al., 1990); un sitio localizado en la luz del canal donde se unen el Mg2+ y moléculas como las fenciclidinas (PCP), el MK801, TCP o ketamina (Macdonald el al., 1991; Lerma el al., 1991); además de un sitio adicional en el que actúa Zn2+ inhibiendo las respuestas inducidas por el agonista de forma independiente de voltaje (Peters el al. , 1987; Westbrook y Mayer, 1987). Finalmente, es conocido que las poliaminas, espermina y espermidina potencian de forma alostérica el receptor de NMDA (Lerma, 1992). Igualmente, se ha descrito que los receptores de NMDA son sensibles a altas concentraciones extracelulares de H+ (p.e. son sensibles al pH) (Traynelis y Cull-Candi, 1990) y son susceptibles a los estados de oxidación-reducción (Aizenman et al., 1989) y fosforilación. A nivel estructural estos receptores están formados por, al menos, dos tipos de subunidades: NR1 (Moriyoshi el al., 1991) y NR2 (Monyer et al. , 1992; Meguro el al., 1992). Esta última consta de cuatro isoformas, NR2A, NR2B, NR2C y NR2D. La subunidad NR1 presenta 8 variantes generadas por empalme altemativo (Sugihara el al., 1992; Nakanishi el al., 1992), que tienen diferentes propiedades farmacológicas. Expresando en sistemas heterólogos la subunidad NR1 con cualquiera de las cuatro subunidades NR2, se obtienen receptores de NMDA con características funcionales similares a los nativos. La subunidad NR1 parece ser el constituyente común de los receptores de NMDA, puesto que ninguna de las cuatro subunidades NR2 es capaz de generar receptores funcionales por sí misma. Dependiendo de la sub unidad NR2 que se ensamble, los receptores heteroméricos NR1-NR2 tienen características propias. La subunidad NR1 se encuentra expresada en prácticamente todas las neuronas (Moriyoshi el al., 1991) mientras que las distintas subunidades NR2 44 muestran patrones de expresión espacio-temporales característicos en el cerebro y en la médula espinal, sufriendo alteraciones durante el desarrollo (Watanabe et al., 1992; Monyer et al., 1994). Los receptores de NMOA están involucrados en procesos fisiológicos complejos del SNC. Además de participar en la transmisión normal de la información, la activación de los receptores de NMDA se requiere para la generación de algunas formas de LTP (Nicoll et al., 1988). Igualmente, la alta penneabilidad a calcio de los receptores de NMDA hace que estos jueguen un importante papel en procesos de muerte celular por excitotoxicidad. 2. -RECEPTORES DE AMPA. La familia de los receptores de AMPA está formada por cuatro subunidades que presentan una homologla entre ellas del 68 al75 %. Se denominan GluR1-4 o GluRA-D, según el criterio seguido por el grupo que las clonó. Cada una de las cuatro subunidades presenta dos variantes generadas por procesamiento alternativo de los mRNAs, denominadas "flip" o "flap". Un determinante molecular importante para las propiedades de canal de los receptores de AMPA es el aminoácido situado en la posición 586 (sitio O/R). En tres de las cuatro subunidades del receptor de AMPA (GluR1 , 3 y 4) esta posición está ocupada por una glutamina (O). Los canales formados por cualquiera de estas subunidades presentan una marcada rectificación entrante: dejan pasar más corriente en sentido entrante (potenciales de membrana negativos) que en sentido saliente (potenciales de membrana positivos) y son significativamente permeables a calcio (HoIlman et al. , 1991; Verdoom et al., 1991; Bumashev et al., 1992). Por el contrario, la subunidad GluR2 presenta una arginina (R) en esta posición. Este cambio hace que estos receptores presenten rectificación saliente (dejan pasar más corriente a potenciales de membrana positivos que negativos) y no permeen calcio. La subunidad GluR2 es fenotípicamente dominante, determinando el comportamiento del canal. De forma contraria a los receptores de NMOA, que poseen varios sitios de modulación, los receptores de AMPA carecen, aparentemente, de esta compleja farmacología. En 1990 se describió que la sustancia Aniracetam potenciaba las respuestas de quisqualato a través de los receptores de AMPA (Ita et al. , 1990). 45 Investigaciones posteriores demostraron que una familia de compuestos, las benzotiodíacidas, eran capaces de reducir la desensibilización de los receptores de AMPA. En este sentido, los diazóxidos, clinicamente usados como antidepresivos, son un orden de magnitud más potente que el aniracetan. El compuesto más efectivo de esta familia es la ciclotiacida que reduce notablemente la desensibilización rápida de los receptores de AMPA, aumentando las corrientes postsinápticas (Yamada et al., 1993; Patneau et al., 1993; Trussell et al, 1993). Los receptores de AMPA se distribuyen por todo el cerebro, existiendo cambios de expresión según la etapa del desarrollo y el tipo de subunidad. De forma general, estos receptores se encuentran aHamente expresados en el hipocampo y en las capas superficiales de la corteza. Por el contrario, las capas profundas de la corteza y el caudadolputamen expresan niveles intermedios. Además de participar en la transmisión rápida de la información sináptica, estos receptores también han sido involucrados en algunas formas de plasticidad sináptica. Asimismo, una excesiva entrada de calcio en condiciones patológicas también contribuye a la muerte de las neuronas. 3.- RECEPTORES DE KAINATO. El receptor de kainato es el componente del sistema de señalización de glutamato que se ha mostrado más elusivo a los investigadores. La falta de herramientas farmacológicas especificas ha impedido la detección de este tipo de receptores en neuronas del Sistema Nervioso Central (SNC), así como la determinación de sus papeles fisiológicos. Hasta la clonación de las subunidades que fonnan los receptores de kainato, la evidencia de su existencia como receptores independientes era inexistente y sólo recientemente se han definido los procesos en los que estos receptores están involucrados (Lerma, 1997a). LA FAMIUA DE SUBUNIDADES DE RECEPTORES DE KAINATO: GLUR5-7, KA1 YKA2. La familia de subunidades que puede contribuir a la formación de receptores de kainato nativos se puede dividir en dos subfamilias. La primera incluye las subunidades GluR5, GluR6 y GluR7 y muestran entre sí un grado de homologia del 75-80%. Todas estas subunidades generan canales funcionales homoméricos, 46 conteniendo lugares de baja afinidad para la unión de kainato. La otra subfamilia la constituyen las sub unidades KA 1 Y KA2, las cuales, aunque no forman canales homoméricos por sí mismas, generan lugares de alta afinidad para la unión de kainato cuando se expresan en células de mamíferos. Mientras que las secuencias de aminoácidos de estas subunidades muestran un grado de homología entre si del 70%, sólo presentan un 45% de homología con las de la otra subfamilia. De forma similar a las subunidades de otros receptores de glutamato, las subunidades de los receptores de kainato se componen de aproximadamente 900 aminoácidos (=100 KDa) y tienen una topología de membrana similar a la descrita para las subunidades de los receptores de AMPA (ácido a-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropiónico) y de NMDA (ácido N-metil-D-aspartato) (Lerma, 1997.). DIVERSIDAD ESTRUCTURAL. Los receptores de kainato tienen la misma topologla transmembrana y la misma estequiometría que los receptores de AMPA y de NMDA. Es decir, son tetrámeros en los cuales cada monómero lleva su propio lugar de unión y contribuye con una secuencia de aminoácidos específica a la formación del lumen del canal, "amado segmento M2. Ese segmento está compuesto por residuos hidrofóbicos que entran en la membrana formando una estructura en forma de horquilla. Además de esta secuencia hidrofóbica, cada subunidad posee tres segmentos transmembrana (M1, M3 Y M4) distribuidos de tal forma que el dominio N-terminal de la protelna se sitúa extracelularmente y la región e-terminal está localizada intracelularmente (Ho"mann et al. , 1994; Rache et al., 1994; Taverna et al., 1994; Wo y Oswald, 1994; Bennet y Dingledine, 1995). Por analogía con los datos disponibles para los receptores de AMPA, se supone que el sitio de unión a glutamato en los receptores de kainato está formado por residuos distribuidos entre el dominio N-terminal y el lazo extracelular existente entre los segmentos M3 y M4 (Stem-Bach et al., 1994). Sin embargo, la estructura real del bolsillo de unión a kainato debe presentar diferencias significativas entre los distintos receptores de glutamato, que podrlan ayudar a explicar, entre otras cosas, porqué los receptores 47 de AMPA pueden unir kainato con alta afinidad mientras que algunos receptores de kainato no son capaces de unir AMPA. Algunas subunidades de los receptores de kainato se presentan como isoformas generadas por empalme alternativo de RNAm (Sommer y Seeburg, 1992). La subunidad GluR5 fue inicialmente descrita en dos formas moleculares que difieren en la presencia (GluR5-1) o ausencia (GluR5-2) de un fragmento de 15 aminoácidos en el extremo N-terminal (Bettler et al., 1990). Análisis adicionales revelaron la existencia de dos formas moleculares adicionales para GluR2 (Sommer y Seeburg, 1992), que difieren en regiones del extremo carboxiterminal, por lo que la subunidad GluR5-2 puede presentar 3 regiones o dominios C-terminal diferentes. Estas isoformas se denominaron GluR5-2a (la más corta), GluR-2b y GluR5-2c (la más larga). Se desconoce si estas isoformas presentan el mismo comportamiento farmacológico, puesto que es la subunidad GluR5-2a la que se ha estudiado más, debido a que es la más eficiente a la hora de expresarse cuando se transfecta en células de mamíferos (Sommer y Seeburg, 1992). La existencia de ajuste o procesamiento alternativo no se ha descrito para las subunidades GluR6, KA 1 Y KA2. Por el contrario, recientemente se ha descrito que la sub unidad GluR7 existe en dos variantes generadas por empalme alternativo del RNAm del extremo C- terminal, denominadas GluR7a y GluR7b (Schiffer et al., 1997). Aunque se ha demostrado que las variantes por empalme alternativo de otros receptores de glutamato son fundamentales para la función del receptor, las implicaciones funcionales de estas variaciones de los receptores de kainato todavía están por determinar. Se podría pensar que estas variantes con diferentes secuencias C-terminales podrían interaccionar con diferentes proteínas del citoesqueleto dotando al receptor de un mecanismo de interacción diferencial con distintos sistemas de señalización (Ehlers et al., 1996, Lerma et al, 1999). De forma similar a otros muchos receptores de neurotransmisores, las subunidades de los receptores de kainato contienen sitios consenso de fosforilación para diversas proteínas cinasas. Así, un residuo de serina en la posición 684 parece ser el principal sitio de fosforilación para la proteína cinasa A (PKA) (Lerma et al, 2(01). 48 Se dispone de algunas subunidades clonadas de pollo, sapo o peces que no forman canales funcionales ni receptores heteroméricos con otras subunidades cuando se expresan en sistemas recombinantes. Estas subunidades han sido designadas proteinas que unen kainato (KBP, kainate-binding proteins), (Lerma et al,1997b). La edición de los mRNA es una fuente de heterogeneidad molecular para determinadas proteinas (Cattaneo, 1991; Sornmer y Seeburg, 1992). Las subunidades GluR5 y GluR6, pueden sufrir edición postranscripcional del mRNA en un sitio localizado en la posición 590 (GluR6) o 591 (GluR5), conocido como sitio glutamina/arginina (Q/R). Es conocido que las propiedades de rectificación de los receptores de kainato están controladas exclusivamente por el sitio Q/R, de forma análoga a lo observado para los receptores de AMPA (Herb el al., 1992,; KOler el al., 1993). La versión no editada codifica para una glutamina (O) y muestra una clara rectificación entrante, mientras que la versión editada codifica para una arginina (R) en esta posición y no rectifica (Egebjerg y Heinemann, 1993). GluR6 puede sufrir también edición en dos sitios adicionales localizados en el primer dominio transmembrana, donde una isoleucina puede ser sustituida por una valina (sitio IN) y una tirosina puede ser sustituida por una cisteína (sitio Y/C). La edición del RNA en estas posiciones tiene consecuencias funcionales en los canales GluR6 homoméricos. Se ha visto que la permeabilidad a calcio de los canales GluR6 es modulada por el sitio O/R, cuando los sitios IN e Y/C del primer dominio transmembrana están editados (KhOler el al., 1993). El alcance de la edición es regulado durante el desarrollo. A diferencia de la subunidad GluR2 de los receptores de AMPA, una proporción significativa de subunidades de receptores de kainato no editadas está presentes tanto en el cerebro embrionario como en el adulto (Paschen el al., 1997; Bernard y Khrestchatisky, 1994). Igualmente, se ha observado la edición parcial de las subunidades GluR5 en el sitio O/R también en neuronas individuales de hipocampo de rata adulta (Mackler y Eberwine, 1993). Aproximadamente el 60% de los mRNAs de GluR5 se encuentran editados en tejido adulto, mientras que para GluR6 la proporción encontrada es del 80%. 49 DISTRIBUCiÓN CEREBRAL DE LAS SUBUNIDADES DEL RECEPTOR DE KAINATO. Estudios de hibridación in situ han revelado que los receptores de kainato se encuentran ampliamente distribuidos en el sistema nervioso. Sin embargo, los patrones de expresión de las distintas subunidades son bastante heterogéneos (Lerma et al, 2001). Así, el transcrito de GluR5 se encuentra presente sobre todo en neuronas de los ganglios de la raíz dorsal (DRG), el subiculum, el núcleo septal, el córtex piriforme y cingulado así como en las células de Purkinje del cerebelo (Bettler et al., 1990); GluR6 es abundante en las células granulares del cerebelo, en el giro dentado y en la región CA3 del hipocampo, al igual que en el estriado. La subunidad GluR7 está presente con bajos niveles en el cerebro, pero se expresa en particular en las capas profundas de la corteza cerebral, el estriado, y en las neuronas inhibidoras de la capa molecular del cerebelo. KA 1 se restringe de forma casi exclusiva a la región CA3 del hipocampo, aunque también se expresa en bajos niveles en el giro dentado, en la amígdala y en la corteza entorrinal (Wemer et al., 1991, Rodríguez-Moreno et al, 2000). Por el contrario, el mensajero de KA2 se encuentra prácticamente en todos los núcleos del sistema nervioso. Aunque las diferentes subunidades de los receptores de kainato están ya presentes a nivel embrionario, la expresión emerge durante el período postnatal. Así, la cantidad de mRNA de GluR5 alcanza un pico entre PO y P5, Y luego comienza a declinar hasta los valores adultos. Esto ocurre también con otras subunidades. Por otra parte podríamos señalar que el blanco del kainato para las alteraciones de los patrones del sueño, es principalmente la formación reticular ascendente la cual es provocada por el ácido kaínico por medio de éstimulaciones repetidas, las cuales causan daño neuronal principalmente en el hipocampo y la corteza cerebral. La relación de sueño y epilepsia es influenciada por el tratamiento farmacológico. Los antiepilépticos (AEDs) controlan las crisis y modifican la estructura hipnogénica en animales y humanos (Gigli y cols, 1997). Hay nuevos AEDs que presentan menos efectos secundarios comparados con los efectos secundarios de los fármacos tradicionales. 50 Se sabe muy poco de los efectos secundarios en la estructura del sueño tanto en los AEDs tradicionales y nuevos; por esta razón se realizan estudios con AEDs nuevos como Lamotrigina, Gabapentina, etc., comparándolos con Carbamazepina (Placidi y Diomedi, 2000). Para realizar estas comparaciones debemos saber cuales son los efectos secundarios que causan los antiepilépticos sobre la estructura del sueño. FÁRMACOS ANTIEPILÉPTICOS (AEDS) La selección de un fármaco varía con la experiencia, preferencia personal, el deseo de evitar efectos secundarios y el tipo de crisis (Tabla 1). CRISIS FARMACO Parcial simple y compleja con o sin Carbamazepina, Fenitoína, Ácido generalización secundaria. Valpróico, Divalproex de sodio Epilepsias tónico-clónico generalizada Ácido Valpróico, Carbamazepina primaria Fenitoína Ausencia Etosuximida, Ácido Valpróico Mioclónica Ácido Valproico, Benzodiazepinas Tabla 1. Muestra la seleccón de farmacos de acuerdo a las crisis epilépticas Los fármacos de segunda línea son útiles para una variedad de crisis epilépticas incluyendo los barbitúricos, fenobarbital, mefobarbital y primidona. Los productos de degradación de primidona son ácido feniletilmalónico y fenobarbital, cada uno con propiedades antiepilépticas. Las benzodiazepinas antiepilépticas incluyen a diazepan, clonazepan, clorazepato, lorazepan y midazolan. Recientemente se han desarrollado nuevos AEDs que son utilizados en la terapia para crisis parciales con generalización secundaria entre ellos Felbamato 51 puede tener un papel como un fármaco de segunda línea de los AEDs, pero se ha asociado con anemia aplástica y daño al hígado, además de somnolencia diurna. La Gabapentina y Lamotrigina son usados como fármacos de segunda línea para crisis parciales y generalización secundaria (Lai y Huang, 1993). MECANISMO DE LOS FÁRMACOS ANTIEPILÉPTICOS El conocimiento de mecanismos básicos de la epilepsia mediante modelos animales, ha servido para desarrollar fármacos antiepilépticos. Los antagonistas de canales de calcio, como flunarizina, (Morselli y Bosi, 1982) la inhibición de la degradación de GABA, como vigabatrina, (Sherwin, 1988) y otros agentes GABAérgicos, tales como progabida, han sido desarrollados por estos mecanismos. El aumento de la inhibición sináptica de farmacos GABAérgicos parece ser un importante mecanismo de acción de benzodiazepinas (Schliebs y cols, 1989) y barbituratos (Faigle and Feldman, 1982), fenitoína, carbamazepina, ácido valproico y fenobarbital pueden inhibir repetidas descargas de neuronas en un foco epiléptico (Morris y cols, 1987, Tsai y cols, 1992). Varios de estos fármacos también pueden inhibir corrientes de calcio en ciertos modelos, quizás relacionado a su acción antiepiléptica (Yukawa, 1996). El bloqueo de canales de sodio también parece inhibir el rompimiento celular epileptiforme (Willow y cols, 1984), Lamotrigina parece actuar en el voltaje-sensitivo de los canales de sodio para inhibir la liberación presináptica de glutamato. El agente antiausencia, etosuximida, parece inhibir una corriente particular de calcio en las neuronas talámicas involucradas en la actividad rítmica talámica (Richens, 1977). El ácido valpróico puede antagonizar el metabolismo de degradación de GABA, pero es probable que requiera concentraciones mayores a las terapéuticas. La gabapentina no tiene efecto en el GABA u otro sistema neurotransmisor conocido, pero puede actuar en un sitio de unión específico similar al sistema de transporte del ácido L-amino para modular la actividad de crisis. La mejor evidencia es vigabatrina como un inhibidor irreversible de la destrucción de GABA incrementando los niveles de GABA en el cerebro (Rowland y Tozer, 1989, González y cols 1999) 52 Son tres los mecanismos principales de los fármacos antiepiléptiocs, sin embargo tal vez cada fármaco actúa a varios niveles (Fig.4): A. Aumento de la inhibición sináptica mediada por el GABA. En presencia del GASA, el receptor GABAa, se abre y se produce un flujo de iones cloro que aumentan la polarización de la membrana. Existen fármacos que disminuyen el metabolismo del GABA (ácido valproico, vigabatrina) y otros actúan sobre el receptor GABAa (barbitúricos, benzodiacepinas, felbamato, topiramato). B. Inhibición de los canales de iones sodio (hidantoinas, carbamacepina, ácido valproico, lamotrigine, felbamato, topiramato, zonisamide) y del calcio (pentobarbital). Algunos también actúan sobre los receptores del glutamato. c. Reducción o inhibición del flujo de calcio a través de los canales de calcio tipo T (principal mecanismo de los fármacos que controlan las crisis de ausencia): ácido valproico, etoxusimida, trimethadiona, zonisamida. -- Neurona P ..... nipda ~ior l ltecepter *+ (ca2+) AIIPAlKatnto Fig. 4 Esquema de la sinapsis excitadora en el sistema nervioso central, donde se muestran las zonas de acción de fármacos antiepilépticos sobre la terminal presináptica glutamatérgica, sitio de acción de la CBZ. CARBAMAZEPINA COMO ANTIEPILÉPTICO DE PRIMERA ELECCiÓN N I o=c - NH1 Fig. 5 Fórmula estructural de la carbamazepina QUíMICA. 53 La Carbamazepina (CBl) es miembro de la familia de iminoestilbenceno con un grupo carbonilo, el cual es esencial para su efecto antiepiléptico. Tiene relación química con los antidepresivos tricíclicos (Fig 5); esta estructura tricíclica la hace insoluble en agua. El coeficiente de partición de la CBl es 58 en un sistema de octanollagua (Hershkowitz, 1978). Mecanismo de acción: Se ha descrito en animales así como en humanos que la CBl tiene acción sobre los canales de Na+ sensibles al voltaje, además de aumentar la frecuencia de las descargas de neuronas noradrenérgicas en el Locus Coeruleus de la rata. La CBZ también interacciona con los sitios de unión periféricos. El compartimiento sanguíneo (central) está unido o ligado, independientemente de algún otro compartimiento periférico, directamente al compartimiento efector, donde la CBl interactúa de manera reversible conduciendo a eventos fisiológicos y bioquímicos que reflejan el efecto farmacológico de la CBl. Este modelo sólo puede ser aplicado cuando existe un retraso en establecerse el equilibrio entre la concentración del compartimiento sangre y el compartimiento efector. En la figura 6 54 se representa esquemáticamente el modelo dinámico para la acción antiepiléptica delaCBZ. COIIPARnMIENTO COMPARTIMIENTO EFECTOR EFECTO ANTICONVULSIVO Fig. 6 Modelo farmacocinético-farmacodinámico con un compartimiento efector propuesto para la CBZ. Para este modelo en particular, el compartimiento sanguíneo llena al compartimiento efector, y la constante de transferencia de salida del fármaco del compartimiento efector (Keo) caracteriza el aspecto temporal del equilibrio entre la concentración sanguínea (Cs) y el sitio efector. Por lo tanto Keo es un parámetro del modelo que caracterizará el grado de histéresis (Fuseau y Sheiner, 1984). Este concepto fue propuesto por Dalstrom y cols (1978) para describir la respuesta analgésica de la morfina en ratas y luego desarrollado por Holford y Sheiner (1981) para describir la acción de la d-tubocurarina y a partir de ahí ha sido utilizado como un modelo mas general (Holford y Sheiner, 1981; Fuseau y Sheiner, 1984). Los estudios fannacológicos de Theobal y Kuntz en modelos animales revelaron una eficacia potente de la CBZ contra crisis inducidas por electroshock. ss Estudios realizados de cortes del hipocampo han demostrado una reducción de descargas en un ambiente libre de calcio, asociado a una membrana directa en lugar de la acción de un neurotransmisor mediador. la confirmación de esta membrana neuronal fue importante para los estudios de Mclean y McDonald, en los cuales indican un efecto en el canal de sodio en el "estado inactivo' (Okada y cols, 1997). Con estos estudios se dio a conocer ampliamente el mecanismo de acción de la CBZ: La CBZ estabiliza las membranas nerviosas hiperexcitadas, inhibiendo las descargas neuronales repetitivas y reduce la propagación sináptica de los impulsos excitatorios. Es posible que el bloqueo de los canales de sodio sensibles al voltaje sea uno o incluso el principal mecanismo de acción (Okada y cols, 1997». Se han dado a conocer dos formas generales en la que la CBZ puede atenuar una crisis epiléptica: • la reducción de la descarga excesiva de las neuronas patológicamente aHeradas. • Limitar la difusión de la excitación desde el foco e impedir la detonación e interrupción de la función de grupos normales de neuronas. Al parecer estos mecanismos de acción son debidos a la activación de los circuitos inhibidores GABAérgicos que se producen en muchas regiones del SNC, pero no se ha podido identificar cuáles neurotransmisores inhibitorios funcionan en el sistema. Se han postulado otros mecanismos de acción, aún en estudio: • Consiste en que la CBZ aumenta las descargas de neuronas norepinefrinicas en frecuencia y esto contribuiría a sus acciones antiepilépticas. • Otro mecanismo se refiere a la inhibición de la fijación de análogos de la adenosina en las membranas celulares del encéfalo en forma parcial por parte de la CBZ; la adenosina puede ejercer potentes efectos inhibitorios y postsinápticos sobre las neuronas; sin embargo no se ha podido deducir con exactitud el papel de la CBZ sobre los receptores de la adenosina en sus efectos antiepilépticos. 56 FARMACOCINÉTICA. La farmacocinética de la CBZ es compleja, está influenciada por su limitada solubilidad acuosa y su capacidad de inducir su propio metabolismo hepático. La CBZ se fija a las proteinas séricas principalmente albúmina en un 70- 80%. Una pequeña cantidad se fija a ácido a-glicoproteína. La fracción libre puede cambiar bajo condiciones medicas que presentan niveles bajos en suero de albúmina, tales como deficiencia hepática o renal, alterando las propiedades de unión al ácido a-glicoproteína. La concentración de la sustancia inalterada en el liquido cefalorraquideo y la saliva refleja la porción (20-30%) no fijada a las proteínas en el plasma (Morselli, 1982; Morris y cols, 1987) La CBZ es distribuida por el tejido presentando un volumen de distribución aparente de aproximadamente 1.5 mllkg (Glazko, A. J., 1995). La CBZ es metabolizada en el hígado en un rango aproximado del 98%, donde la vla epóxido de biotransformación es la más importante primero es oxidada por el sistema del citocromo P450 formando el metabolito activo CBZ 10,11-epóxido (cbz 10,11-epóxido), este metabolito es hidrolizado por la hodrolasa epóxido microsomal para transformarlo en transcarbamazepina-diol el cual es excretado por la orina en forma libre y conjugada (Fig. 7). Entre el 33-60% de una dosis oral es metabolizada vía epóxido. Otra vía importante de biotransformación de la cbz da lugar a diversos compuestos monohidroxilados y al N-glucurónido de cbz. (Bertilsson, 1986, Levy, 1995). La vida media de la CBZ es cerca de 24 - 36 horas después de una dosis oral única, pero la autoinducción durante la administración repetida utilizada como monoterapia lleva a una vida media de 12 - 15 horas (Gibaldi, 1991). En pacientes que reciben un tratamiento con fármacos que inducen enzimas hepáticas, induyendo fenitoína y fenobarbital; se han encontrado valores de vidas medias de 9-10 horas en promedio. 57 Fig. 7 Biotransformación de la carbamazepina La biotransformación puede ser inhibida por la coadministración de un número de fármacos, como macrolidos (eritromicina), cimetidina, bloqueadores de canales de calcio (verapamil), y varios imidazoles (Fuseau y Sheiner, 1984). La hidrolasa epóxido puede ser también inhibida, por valproato y antiepilépticos comunes usados junto con CBZ cuando la monoterapia no es suficiente (Holford y Sheiner, 1981). La autoinducción es un factor importante en la rápida intolerancia y reduce subsecuentemente ' la eficacia. Los pasos de epoxidación e hidratación del metabolismo de la CBZ son eficientes en cuanto a la duración de un tratamiento que va en aumento. (Harvey y Champe, 1992). Estas propiedades pueden causar reacciones adversas al inicio del tratamiento, particularmente si la dosis inicial no 58 se encuentra dentro de las concentraciones adecuadas. La autoinducción puede después causar una disminución de los niveles de CBZ en la sangre causando principalmente una disminución en la eficacia y quebrantar en las crisis. Esto ha defTlOStrado que la vida media en plasma de la CBZ se disminuye significativamente durante el aumento del tratamiento. (Touchon y cols, 1987). Se ha demostrado clínica y experimentalmente que la CBZ es efectiva en el control de crisis psicomotoras (Yukawa, 1996). En diversos artículos se ha mostrado que la CBZ es efectiva en el control de las crisis epilépticas pero desafortunadamente no puede reparar los trastornos producidos en el sueño por estas crisis. (Touchon y ools, 1987) Por otra parte, se ha mostrado que la actividad eléctrica cerebral (EEG) es una herramienta útil para monitorear la función y el metabolismo cerebral, siendo una de las variables fisiológicas más sensibles para detectar actividad epileptiforme (Jordan, 1993) y para la clasificación de los diferentes tipos de epilepsia (Niedermeyer, 1987). AsI mismo, numerosos estudios muestran una correlación entre la actividad eléctrica cerebral y la dosis administrada de fármacos clínicamente activos (Matejcek y Devos, 1976). En los estudios sobre la relación del sueño y la epilepsia enfocados al efecto de las crisis convulsivas, focales o generalizadas sobre la organización del sueño y la incidencia de las crisis según las diferentes fases de éste, los resultados descritos hasta el momento señalan que ambos tipos de crisis, presentan un efecto deletéreo sobre las fases del sueño, principalmente sobre la fase de sueño MOR (Calvo, 1992). JUSTIFICACiÓN Debido a que la CBZ es uno de los anticonvulsivantes de primera elección más utilizados en la clínica, se consideró importante analizar su efecto farmacológico sobre la actividad eléctrica cerebral, principalmente sobre los patrones del sueño. También es relevante evaluar las alteraciones neuroanatómicas producidas por el desencadenamiento del staus epilepticus inducido por la administración de ácido kaínico como modelo de epilepsia del lóbulo temporal más una dosis de caz. Este y otros modelos experimentales, han permitido el estudio de los diferentes efectos de fármacos con características potencialmente 59 anticonvulsivantes, además de que en este modelo, con AK, el desencadenamiento de las crisis así como sus características paroxísticas son muy similares a las desencadenadas por la epilepsia del lóbulo temporal en el humano, por lo que ésto nos da una idea de lo que puede ocurrir en el cerebro humano. OBJETIVO GENERAL Evaluar el efecto de la administración de carbamazepina sobre los patrones de sueño en un modelo de epilepsia inducida por ácido kaínico. OBJETIVOS ESPECIFICOS • Observar en este trabajo el daño cerebral provocado por las crisis convulsivas inducidas por la administración subcutanea del ácido kainico como se ha reportado. • Desarrollar un método de muestreo en la rata, para la determinación de los niveles sanguíneos de la carbamazepina. • Realizar la farmacocinética de la carbamazepina en la rata. • Correlacionar la farmacocinética y farmacodinamia (número de crisis presentadas) para evaluar la eficacia de la carbamazepina en este modelo. HIPÓTESIS La epilepsia desencadenada por la administración de AK en éste modelo animal, modifica los patrones del ciclo sueño-vigilia, como ya ha sido ampliamente documentado, entonces al administrar CBZ antes de inducir la epilepsia esperamos que haya una recuperación en cierto grado de los patrones de sueño. 60 MATERIAL Y METO DOS. Se utilizaron 30 ratas macho de la cepa Wistar de 250 a 280 g de peso, las cuales fueron mantenidas en cajas individuales y en condiciones óptimas de bioterio (Temperatura de 16-21°C, humedad relativa 45%) periodo de luz/oscuridad 12:12, iniciando el periodo de luz a las 8:00 a.m., comida yagu.a ad libitum. Después de un periodo de adaptación en una cámara sonoamortiguada, donde se llevaron a cabo los registros polisomnográficos, bajo anestesia general con pentobarbital sódico (50 mglKg de peso), a un grupo de 20 ratas se les colocaron crónicamente electrodos bipolares de acero inoxidable en la corteza motora y músculo del cuello para registrar la actividad cerebral (EEG) y muscular (EMG), tanto en condiciones control como experimental (Fig 8). PROCEDIMIENTO. Después de 7 días de recuperación de la intervención quirúrgica, a un primer grupo de 10 ratas se les realizó un registro poligráfico control durante 10 horas (día O), utilizando un polfgrafo de 10 canales (marca GRASS modo 70), de las 8:00 hrs. a.m. a las 18:00 hrs. p.m. Al siguiente día (experimental, día 1) se les administró 10 rngIkg de peso de ácido kaínico (AK) , según Sperk, 1994 y Leepik, 1998, vía subcutánea, desencadenando las crisis epilépticas 30 minutos después de la administración, y se les realizó un registro de 10 horas continuas para evaluar el efecto de la administración del ácido kaínico. A partir del día siguiente (de recuperación, día 2) hasta el quinto día se les realizaron registros poligráficos de 10 horas continuas (de las 8:00 hrs. a.m. a las 18:00 hrs. p.m.), con el fin de observar la recuperación de las diferentes fases del ciclo sueño-vigilia. A un segundo grupo de 10 ratas también implantadas de manera crónica, después de 7 días de recuperación de la intervención quirúrgica, se les realizó un registro poligráfico (EEG Y EMG) control durante 10 horas (día O). Al siguiente día se les administró a travéz de una sonda gástrica la CBZ (25 mg/kg de peso), disuelta en etanol y carboximetilcelulosa al 5%, 30 minutos antes de inducir la 61 epilepsia, con Ak (10 mg Ikg de peso) disuelto en solución salina. Enseguida se llevó a cabo un reg istro poligráfico continuo de 10 horas (de las 8:00 hrs. a.m. a las 18:00 hrs. p.m.), cuantificándose la intensidad y duración de las crisis convulsivas desencadenadas por el AK, solo que ahora con la administración del anticonvulsivante (CBZ), 30 minutos antes. FIG 8. Se muestra en la figura la cirugía del implante de los electrodos, utilizando un aparato esterotáxico. Al tercer día (día 2) y hasta el tercer día de la administración del anticonvulsivante y el AK se llevaron a cabo registros de 10 horas de registro continuo, para observar si persistía algún efecto de las crisis convulsivas. Se cuantificaron por el lapso de las 10 horas, las sacudidas de cabeza y cuerpo (sacudidas de perro mojado) después de la administración del AK. Se obtuvo el porcentaje de eficacia de la dosis de CBZ empleada tomando como referencia la intensidad y duración de las crisis convulsivas obtenidas con la administración única del ácido kaínico. 62 ANÁLISIS DE LOS DATOS DEL EEG los resultados poligráficos se analizaron visualmente y se clasificaron como: Vigilia. caracterizado por una desincronización en el EEG de baja amplitud y alta frecuencia y una acentuada presencia del tono muscular (EMG). Sueño de Ondas lentas (SOL), caracterizado por husos de sueño además de ondas de alto voltaje (75J.1V) , y baja frecuencia, seguido de una disminución del tono muscular. Sueño MOR, caracterizado por desincronización del EEG Y una ausencia de voltaje en el EMG (Fig 9). los registros de 10 horas c/u y se cuantificaron de acuerdo al número de épocas en que se presentó cada estado de vigilancia; la duración de cada época se estableció en 25 segundos y se siguió el criterio de considerar determinado estado de vigilancia solo si este abarcaba el 89% a juicio de dos calificadores independientes. Posteriormente se obtuvo el tiempo total empleado por los animales en cada estado de vigilancia y se calculó el porcentaje dentro del registro. los parámetros de sueño se expresaron como media +/- STO. los resultados obtenidos bajo condiciones control fueron comparados con los obtenidos después de la administración de KA y con los obtenidos con el tratamiento de CBZ más AK por un análisis de varianza (ANOVA). *P< 0.01, -p<0.001 fueron considerados significativos. _ .. -.... , ...... ~----------------.....,;. ._ .. _ .... '- '- ' _ ... - ._'_.,_ .. _. Vigilia SOL sueño MOR Ag. 9 Muestra las caracferisticas del EEG (corteza) y EMG (músculo del cuello), durante los tres estados de vigilancia en la rata. 63 TÉCNICA HISTOLóGICA Posterionnente, a los 2 grupos (1.- AK 10 mgJkg y 2.-CBZ 25 mglkg + AK 10 mglkg) se les procesó para realizar un análisis histológico, para detectar los daños provocados por los fármacos. Bajo anestesia general con Pentobarbital (50 mgJkg de peso), las ratas se perfundieron por vla intraventricular con solución salina y buffer-formalina (pH 7.2) al 10%. Se disecaron los cerebros y se realizaron cortes coronales (11IJm) para su procesamiento por medio de la técnica de Violeta de Cresilo y Klüver-Barrera. EVALUACIÓN DE LA FARMACOCINÉTlCA DE LA CBZ Con el fin de realizar una correlación entre las crisis epilépticas y la famacocinética de la CBZ, a un tercer grupo de 10 ratas, bajo anestesia general (Ketamina 35 mgJkg, Xilacina 3 mglkg), se les implantó una cánula de polietileno (PE-10) en la vena yugular para el muestreo sanguineo, y llevar a cabo la farmacocinética de la CBZ. Se tomó una muestra basal al terminar la cirugía (muestra O), posteriormente se administró por vía oral mediante sonda gástrica, CBZ a una dosis de 25 mgJkg, disuelta en etanol y carboximetilcelulosa al 5% (previamente preparada con solución salina) (Fig. 10), Y se procedió al muestreo a los 10, 20 Y 40 minutos y a la 1, 2, 4, 8, 12, 24 Y 48 horas después de administrada la CBZ, para llevar a cabo el análisis farmacocinético. A las ratas se les colocó en camáras metabólicas para facilitar el muestreo (Fig.11). La CBZ se administró 30 min antes de inducir las crisis convulsivas con 1Orng/Kg de ácido kaínico por vía subcutánea. Las sacudidas de cabeza y cuerpo (sacudidas de perro mojado) se comenzaron a cuantificar 15 minutos después de la administración del AK, y a lo largo de todo el registro (10 horas). 64 Fig.10 Administración de la CBZ por medio de una sonda gástrica A Fig. 11 En (A) se muestra la vista frontal, en la cual se aprecia la cánula heparinizada, en (B) se muestra a la rata dentro de una caja metabólica durante el tiempo de toma de muestras. (Fotos de la M en C Gabriela Femández-Saavedra). 65 DETERMINACiÓN DE CARBAMAZEPINA EN PLASMA La primera solución se preparó disolviendo CBZ y el estándar intemo (oxcarbacepina) en metanol obteniendo una concentración de 1 mg/ml de la cual se hicieron las diluciones en fase móvil. Método de Extracción. A cada muestra de plasma se le sometió a un proceso de extracción previo a su análisis cromatográfico. Este proceso consistió en adicionar a 500¡.t1 de plasma, 100 ¡.tI de CBZ con una de las concentraciones de la curva (0.5, 1, 2, 5, Y 10 ¡.tg/ml), 100 ¡.tI del estándar intemo (oxcarbacepina) de una concentración de 10 J.lg/ml, posteriormente se agregaron 4ml de diclorometano a cada tubo. Esta mezcla se agita en un Vórtex a la máxima velocidad por 2 minutos. Las muestras se centrifugan por 20 minutos a 3500 rpm. Se separa la fase orgánica y se evapora a sequedad en un baño Maria a 45°C bajo corriente de nitrógeno. El extracto seco se reconstituyó en 200 ¡.tI de una solución de acetonitrilo-agua en una proporción 40:60 (vlv) y se inyectaron 100 ¡.tI al sistema cromatográfico. Todas las determinaciones se realizaron a temperatura ambiente a una longitud de onda de 215 nm. Sistema Cromatográfico Se utilizó un cromatógrafo Waters, el cual consta de una bomba mod 510, un inyector U6-K, una columna de fase inversa; ¡.tBondapak C-18 de 30 centímetros de longitud, 3.9 mm de diámetro y 10 ¡.tm de tamaño de partícula, conectadas a un detector de luz ultravioleta con longitud de onda variable por la que se hizo pasar una fase móvil compuesta por una mezcla de acetonitrilo-agua en proporción 30:70 (vlv), con un flujo de 2 mi por min (Fig.12). A 'C ,~ '. ," l ' e 66 Fig. 12 Muestra tres cromatogramas típicos obtenidos al inyectar extractos sanguíneos al sistema cromatográfico. El cromatograma A) corresponde a una muestra sanguínea libre del fármaco, el B) corresponde a un extracto de sangre al que se le administraron cantidades conocidas del estándar interno (oxcarbacepina marcado con en No 1) más CBZ (2). El cromatograma C) es de una muestra de sangre, 30 minutos después de administrarle 25mglkg de CBZ al animal, adicionándole a la muestra el estándar interno antes de la extracción. Los tiempos de retención de estos compuestos fueron de 3.47 min para la oxcarbacepina (estándar interno) y de 4.96 min para la CBZ. 67 RESULTADOS. EFECTO DEL ÁCIDO KAiNICO SOBRE LOS PATRONES DE SUEÑO El primer grupo al cual se le administró solo ácido kaínico (10 mglkg de peso), presentó los siguientes resultados: Bajo condiciones control los animales mostraron los tres estados de vigilancia: Vigilia (V), Sueño de Ondas Lentas (SOL), y Sueño MOR. Durante la vigilia, las ratas presentaron diferentes tipos de conducta; exploratoria, alimenticia, de ingesta de agua o acicalamiento. La actividad cerebral se caracterizó por patrones de de ondas de alta frecuencia y bajo voltaje. El (EMG) mostró activida eléctrica originada por los músculos del cuello, los cuales mostraron aumento en el tono muscular producido por los movimientos del animal. Al iniciarse el sueño coincide con una conducta pasiva. Las ratas permanecieron sin actividad a lo largo del SOL, ojos cerrados pero con ausencia de movimientos oculares, la actividad cerebral mostró patrones de baja frecuencia y alto voltaje, el tono muscular disminuyó pero sin estar ausente EMG. El sueño MOR siguió al SOL. La actividad cerebral (EEG) fue similar a la observada durante la vigilia, aunque la actividad muscular permanecio ausente a excepción de esporádicas mioclonias causadas por sacudidas de las extremidades del animal (EMG). La cuantificación de los datos se realizó de la siguiente manera: Bajo las condiciones control las ratas pasaron durante la vigilia 182.72 ± 27.8 min., del tiempo total de registro (10 horas), durante el sueño de ondas lentas permanecieron 412.41 ± 29 min., y 70.5 ± 8.3 min., durante el sueño MOR. El tiempo total de sueño correspondió al 68% de un periodo de 10 horas de registro del cual el 9% correspondió al sueño MOR y 59% al SOL, la fase de sueño MOR ocurrió solo después de varios minutos de SOL, nunca se observó seguido de la fase de vigilia. Durante el día 1 (experimental) el registro electroencefalográfico obtenido después de la administración del AK (Fig. 13). 68 EEG ..... 'Wt+t .... ~..,.,.~ .. if'.~_c~tA~.~~ EMG A).- Rgistro control B).- 1 hora después de administrado el AK EMG , I ~ .... ,. • I '4 -'1 . " . C).- 4 horas después de administrar el AK ~so"v 1 S Fig.13 Muetra los registros del EEG y EMG de una rata a la cual se administró solamente AK, A) Registro control, B) Registro de 1 hora después de la administración s.c. de AK y C) Registro de 4 horas después de administrar el AK. 69 Se observó que este neuroexcitador inducía progresivamente alteraciones motoras como; inclinación de la cabeza, actividad de masticación, y sacudidas de cabeza y cuerpo (wet dog shakes -"Sacudidas de perro mojado"-), el cual fue seguido de crisis generalizadas, esta conducta fue acompañada por una intensa salivación, por varias horas los animales presentaron descargas recurrentes, hasta que éstas declinaron casi al final del tiempo total del registro, los animales terminaron exhaustos, permaneciendo en vigilia durante el tiempo total de registro (Fig. 14). Tanto el SOL como el sueño MOR permanecieron totalmente ausentes (Figs. 15-16). Al siguiente día, a lo largo del periodo de registro, se presentó una recuperación en el SOL, permaneciendo disminuido hasta el tercer día de registro, a partir del cuarto día el registro alcanzó sus valores normales, al mismo tiempo, la cantidad de vigilia fue disminuyendo progresivamente (Figs. 14-16). El sueño MOR permaneció casi ausente al segundo día de registro, presentando una recuperación al tercer día de registro aunque sin alcanzar sus valores normales hasta el 4 y 5 día de registro. Al 4 Y 5 día de registro los estados de vigilancia retornaron a sus valores control. Un hallazgo interesante es el hecho que el sueño MOR no presentó un incremento compensatorio, contrario a lo que se esperaría después de un largo periodo de inhibición. EFECTO DE LA CARBAMAZEPINA + ÁC KAíNICO SOBRE LOS PATRONES DE suEÑo Los resultados mostraron que las crisis epilépticas inducidas por la administración de AK afectaron la organización de los patrones de sueño. Por otro lado la CBZ (25 mg/Kg de peso) ejerció un efecto de recuperación sobre los patrones de sueño contra la administración del AK (10 mg/Kg de peso). El primer día de registro con la administración de CBZ se presentó durante el registro la aparición de SOL aunque con un decremento del 28% con respecto al control y un aumento de la vigilia del 28% con relación al control, Las crisis disminuyeron a partir de la 3 y 4 hora de registro, El EEG Y EMG mostraron cambios notables de acuerdo a las ratas aque solo recibieron AK (Fig 17). 70 EEG ..... ~ .. ,.f~.,.. .. ~~tJ\4I~~~ EMG A).- Registro control 1I • t B).- 1 hora después de administrar la CBZ + AK ••• q.- 4 horas después de la administración de CBZ+ AK ~so"v 1 S Figo 17 Muetra los registros del EEG y EMG de una rata a la cual se administró CBZ 30 minutos antes de aplicarle el AK vía soco, A) Control, B) 1 hora después de la administración soCo de AK Y C) 4 horas después de administrar el AKo 71 Al tercer día de registro ya se presentaron valores normales de vigilia y SOL, en cambio el sueí'lo MOR permaneció inhibido durante el primer día de registro experimental, apareciendo al segundo y tercer día de registro con valores similares a los del control (Fig. 18 Y 19). Cabe seí'lalar que tampoco se registró un efecto de rebote compensatorio en el sueño MOR después del día 1 experimental durante el cual estuvo ausente. EFECTO DE LAS CRISIS EPILÉPTICAS SOBRE LA VIGILIA T I E M P O T O T A L DE R E G I S T R O (m in ut os ) CONTROL DÍAS DE REGISTRO A Fig 14. Los animales tuvieron un periodo de 10 horas de registro control (día 0) a partir del día 1 se administró AK y se observó que los animales permanecieron en vigilia todo el registro (10 horas). La cantidad de vigilia disminiyó progresivamente a traves de los días subsecuentes de registro, (n=10, media + std, *p<0.01; **p<0.001). Ax | * 400 - | | 300 | | 2001. T | L | 100 4 | 1 2 3 4 5 72 G ~ - TO E S RISIS -I E TI AS- BRE I I I -----------l ,2600 ;:, e g 0 500 o:: lo- U) (;40 W o:: W 0300 ... t! ~200 O Q. ~ 0 W ¡::: TROL ** * Ol S OE I O I I I I I I .. __ J i 4. s i ales i r n ri o r s e istr ntrol í O) artir el í inistró K servó e i ales r anecieron n i ili o l istr ras). nti d e i ili i iniyó r i ente r s e í s secuentes istro, 10, edia ± t , O.01; O. 01). ,-------------------_. __ 500 111 ~450 e g400 O o::: 350 ~ ti) (; 300 W o::: 250 w e 200 ...J 20) ' U E ,9) I ¡:: 100 I oo ! [:J I O ' W W sws sws REM REM Figure 4. E/Tect of carbamazepine on sleep pallems disturbed by kai- nic acid administration: Control (white bars) and after kainic acid ad- ministration with carbamazepine-pretreated rats (black bars). Wake"ul- ness (W), slow wave sleep (SWS) and REM sleep (REM). Mean val- ues (n=8, mean ± SO) \Vere statistically compared using Student 's t- test 'p:'" 0.05. Our results showed that seizures induced a total inhibi- tion of sleep, since both SWS and REM sleep were absent through out the first day after kainic acid administration . This effeet was partially reversed by carbamazepine, since pretreated animals were able to show SWS. Our conclusion is that, besides deereasing se izure in- tensity, carbamazepine facil itates partial recovery of sleep. REFERENCES 1. Broughton RJ: Epilepsy, sleep and sleep deprivation. (eds) Amsterd.m: Elsevier. 1984: 317-356. 2. Baidy-Moulinier M: Sleep .nd Epilepsy, (eds) Academic Press. New York. 1982. 347-359. 3. Beran RG, Plunkett MJ & Holland GJ: Seizure 8: 97-102 (1999). the first day afier kainic acid administration, animals re- maining awake during the 10-h electrographic recording. The amount of wakefulness decreased progressively across the subsequent recording days (Fig. 1). There is a complete inhibition of SWS the first day of kainic acid administration. Sleep patterns recovered progressively, SWS reappearing the second recording day but not reach- ing the controllevels until the fifih recording day (Fig. 2). REM sleep was the most affected. There is a complete inhibition of REM sleep during the first day afier kainic acid administration. Then a progressive recovery is ob- served in subsequent days (Fig. 3). Carbamazepine exerted a protective effect against the sleep patterns aJterations induced by kainic acid. Although there was a reduction in the amount of sleep afier admini- stration of kainic acid in carbamazepine-pretreated ani- mals, sleep inhibition was not complete, as SWS was pre- sent from the first recording day. Only REM sleep was inhibited, wakefulness increasing 28% in relation to con- trol values while SWS showed a reduction of 19% (Fig. 4). :1 70 * * c8J §.!n CI 40 E :lO ¡:: 20 l~j CONTROl Recording days Figure 3. EfTect of seizures on REM sleep, Control (white bars) and after kainic acid administration (black bars). Mean values (n=8, mean ± SO) were statistically compared using Student's Hest *1'50.05. DISCUSSION: As described previously, the sleep and wakefulness nyctohemeral organization plays an impor- tant role in the incidence of the epileptic seizures [7,17,18]. Jt has been shown that sleep patterns respond differently to different types of seizures [19,20]. Sleep facilitates temporal lobe seizures. Epilepsy originating in this region, therefore, is considered a nocturnal sleep epi- lepsy [18,19,21]. On the other hand, despite the numerous studies that relate epileptic seizures to sleep, there are few rcports that describe the possible influence exercised by the epileptic seizures on the sleep organization. In the epilepsy model of the temporal lobe that we implemented, we observed a significant disorganization of the sleep-wakefulness cycle, involved both SWS and REM sleep phases. These find- ings agree partially with those obtained from sleep re- 63 cordings carried out in patients immediately after occur- rence of generalized seizures, where a transient decrease of REM sleep is observed [7,9]. A similar decrease has been described in experimental models of temporal lobe epilepsy, where epileptiform activity was triggered by electric shocks applied to the amygdala or hippocampus [13,22,23]. lt has been observed that the decrease in the amount of REM sleep persisted, but after electrical stimu- lation had ceased [24,25]. We observed similar effects in our experimental model, where the sleep inhibition per- sisted sorne time afier the behavior and electrographic symptoms of the epi leptic seizures had disappeared. This suggests that such inhibition and longtime insomnia is not only due to a physical effect of the electrical stimulation or an immediate pharmacological action, induced by kai- nic acid administration, but is probably also due to an ac- tion exercised on the neurophysiologic mechanisms that regulate the sleep-wakefulness cycle. It is also interesting from the pathophysiological viewpoint that the reduction of sleep induced by the epileptic seizures did not produce a compensatory increase as normally observed with sleep inhibition produced by other means [24) . : 1 * 3':0 1 ~ * 5'm j I g Z,H ~ GI 200 1 E 15) 1 ¡:: ,(O .1 U m! ~ I o ' w w sws SWS REM REM Figure 4. EfTect of carbamazepine on sleep panems disturbed by kai- nic acid administration: Control (\Vhite bars) and after kainic acid ad- ministration with carbamazepine-pretreated rats (black bars). Wakeful- ness (W), slow wave sleep (SWS) and REM sleep (REM). Mean val- ues (n=8, mean ± SO) \Vere statistically compared using Student's t- test *1'50.05. Our results showed that seizures induced a total inhibi- tion ofsleep, since both SWS and REM sleep were absent through out the first day afier kainic acid administration. This effect was partially reversed by carbamazepine, since pretreated animals were able to show SWS. Our conclusion is that, besides decreasing seizure in- tensity, carbamazepine facilitates partial recovery of sleep. REFERENCES 1. Broughton RJ : Epilepsy, sleep and sleep deprivation. (eds) Amsterdam: Elsevier, 1984: 317-356. 2. Baldy-Moulinier M: Sleep and Epilepsy, (eds) Academic Press. New York. 1982.347-359. 3. Beran RG, Plunken MJ & Holland GJ: Seizure 8: 97-102 (1999). 4. BaziICW: CurrOpinNeuroI341: 1607-10(2000). 5. Malow B, Selwa L, Ross O & Aldrich M: Epilepsia 40: 11 : 1592-97 (1999). 6. Halász P: Epilepsy, sleep and sleep deprivation (ed) Amsterdam: Ebevier, 1984, p.97. 7. 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