UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO FACULTAD DE MEDICINA DIVISION DE ESTUDIOS DE POSGRADO REGULACION DE LAS CELULAS ENDOTELIALES POR HORMONAS ESTEROIDEAS, INDUCCION DE LA SECRECION DE FACTORES QUIMIOATRAYENTES PARA MACROFAGOS Y SU RELACION CON LA FORMACION DE PLACAS ATEROMATOSAS. TESIS QUE PARA OBTENER EL. GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS BIOMEDICAS C(C BIOQUIMICA > PRESENTA: M. en C. EMMA ¡RODRIGUEZ MALDONADO ASESOR: DR. LUIS FELIPE MONTAÑO ESTRADA Autorizo a la Dirección General ¡bli . Í 7 fa Di lictec» UNAM a difundir en formato electrónico e imp : Cconlenido de mi trabaja recepcio. Nombre: Ena der. " MEXICO, D. F. Pta ladra ds le 2003 OS FECHA: 28€ * A ESTS CO A FALLA DE ORIGEN | Et AA • 11:<8 / 3~ I RSIDAD CI NAL NOMA E EXICO ULTAD E EDICINA I I I N E UDIOS E RADO ULACION E S LULAS OTELIALES R MONAS TEROi DEAS. 1 CCION E LA RECION E T RES I I AYENTES RA ROFAGOS LACION N MACION E AS OMA TOSAS. SIS UE RA TENER L ADO E CTOR I CIAS EDICAS ( I UIMICA ) ESENTA: . . MA JRODR EZ L NADO ESOR: R. IS LI E NTAfilO ADA MEXICO, . . 2003 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. Esta tesis fue realizada en el Departamento de Biologfa Celular del Instituto Nacional de Cardiologfa ••Jgnacio Chávez", bajo la tutorfa del Dr. Luis Felipe Montafto Estrada y la cotutoría del Dr. Felipe Massó Rojas. Este trabajo file realizado con el apoyo económico parcial de PADEP, UNAM. TESIS CON FALLA DE ORIGEN A Viridiaoa y Mareos El principal motor de rni vida A Hugo Por su apoyo y esfuerzo A Editb. Eatber, Eli-. Franeiseo y Blanca Con mucho carii\o TESIS CON FALLA DE ORIGEN AGRADECIMIENTOS A los miembros de mi jurado por su cuidadosa revisión y valiosas criticas Dr. Vianney Ortiz Navarrete Dr. Alejwidro Zentella Dehesa Dr. Luis Felipe Montaño Estrada Dr. Edgar Arturo Zenteno Galindo Dr. Marco Antonio Juárez Oropeza Dr. Enrique Pedemera Astegiano Dra. Verónica Guarner Lans Al Dr. René Méndez y a la Dra. Georgina Álvarez. por sus atinados consejos y la revisión del escrito. A Felipe y Araceli, por su gran apoyo critico y resolutivo, por su amistad. A Edith Rodriguez y a Estrella Zapata, por la elaboración de las ilustraciones. TESIS CON FALLA DE ORIGEN A Luis Por todo. A Estre Por los éxitos. los fracasos, las lágrimas, las sonrisas, Por que crecer duele menos cuando se está acompaftado. A todos mis compañeros y antigos, cuya lista es interminable. por compartir corunigo alegrías, sinsabores o tan solo un breve espacio de nuestra vida. TESIS CON FALLA DE ORIGEN CONTENIDO l. Glosario 2. Resumen 3. Abstract 5. Introducción 5.1 Origen de la aterosclerosis 5.2 Endotelio y aterosclerosis 5.3 Adhesión de leucocitos 5.4 Moléculas quimioatrayentes 5.5 Estrógenos y pared vascular 6. Justificación 7. Objetivos 8. Hipótesis 9. Material y métodos 9.1 Obtención de células endoteliales 9.2 Caracterización de células endoteliales 9.3 Subcultivo de células endoteliales 9.4 Migración de leucocitos en geles de agarosa 9.5 Quimiotaxis de monocitos 9.6 Cuantificación de MCP-1 e IL-8 9.6 Expresión de MCP-1 e IL-8 9. 7 Expresión de RE-o. y RE-P 1 O. Resultados 11. Discusión 12. Conclusiones 13. Bibliografía 14. Anexo (copia del artículo publicado) TESIS CON FALLA DE ORIGEN Página 3 4 .s 6 6 8 9 12 20 21 21 22 22 23 24 24 25 26 27 28 30 46 52 53 61 2 GLOSARIO E.,. TNF: Tmx: HUVECs: LPS: MCF-7: MCP-1: IL-8: LDL: HDL: SFB: RE-a.: RE-j3: HRT 1 7j3-estradiol TNF-a.; factor de necrosis tumoral alfa Tamoxifen Células endoteliales de vena de cordón umbilical L i popo 1 isacárido Células tumorales derivadas de un cáncer de mama Proteína quimioatrayente para macrófagos -1 lnterleucina -8 Lipoproteína de baja densidad Lipoproteína de alta densidad Suero fetal de bovino Receptor de estrógenos alfa Receptor de estrógenos beta Terapia de Reemplazo Hormonal 1ESlS CON FALLA DE ORlGEN 3 RESUMEN La adhesión de los leucocitos al endotelio y su subsecuente transmigración al espacio subendoltelial son los eventos iniciales observados durante la aterogénesis, los cuales son mediados por las células endoteliales activadas. La activación de dichas células puede ser inducida por un aumento en las concentraciones circulantes de moléculas proinflamatorias como TNF-cx. (TNF) e IL-1 o bien, de colesterol asociado a lipoproteínas de baja densidad (LDL-colesterol). En mujeres postmenopaúsicas que se encuentran bajo terapia de reemplazo hormonal se ha observado menor incidencia de enfermedades cardiovasculares, lo cual se ha atribuido a los efectos que los estrógenos pueden tener sobre la activación del endotelio, ya qú7. algunos estudios han mostrado que el 17¡3-estradiol (E2) es capaz de disminuir las co11centraciones circulantes de LDL-colesterol y la expresión de moléculas de adhesión en Ja súperficie apical de las células endotcliales. Sin embargo, no se sabe exactamente cuál es el p~pel de los estrógenos durante la aterogénesis. El objetivo de este tr:abajo fue determinar si el É2·tiene un efecto regulatorio sobre la adhesión y quimioatracción de linfocitos al endotelio. Se realizaron ensayos de adhesión de células U-937 en células endoteliales de vena de cordón umbilical (HUVECs) estimuladas con TNF t:n presencia o ausencia de E2 y también se cuantificó la concentración de las quimiocinas IL-8 y MCP-1 en los sobrenadantes del cultivo. Se determinó la presencia de los receptores de estrógenos a- y 13 mediante las técnicas de "Western blot" y "RT-PCR", respectivamente; en tanto que la evaluación de la transcripción de ambas quimiocinas se realizó mediante "RT-PCR". Los resultados mostraron una disminución del 35o/o en la adhesión de monocitos U-937 a HUVECs estimuladas con TNF en presencia de dosis fisiológicas (0.3 y 1 ng/ml) de E2, así como una disminución del 54% y del 65% en la secreción de IL-8 y de MCP-1. El E2 no tuvo efecto inhibitorio sobre la transcripción de ambas quimiocinas en tanto que, el tamoxifen (modulador de la activación del receptor de estrógenos) revinió el efecto del E2. Por lo tanto, se puede concluir que en nuestro modelo, el E2 inhibió la adhesión de los leucocitos a las células endoteliales, al inhibir la secreción pero no la transcripción de las moléculas quimioatrayentes. TESIS CON FALLA DE ORIGEN 4 ABSTRACT Inflammation, and especially mononuclear cell adhesion to endothelium, is an important physiopathological component of atherosclerosis. Since coronary heart: disease in women of' reproductive age and/or 'l.vith estrogen replacement therapy is reduced, our aim was to determine if 17¡3-estradiol (E2) hada regulatory effect on the adhesion of lymphocytes to the endothelium. We perf'ormed U-937 cells adhesion assays in TNF-a-stimulated HUVECs, and we also quantitated IL-8 and MCP-1 in culture supernatants, in the presence or not of 1713- cstradiol. The presence of a- and p-estrogen rcceptors was determincd by Western blot and RT-PCR, respectively, whereas the transcription of both chemokines ~as evaluated by RT- PCR. The results showed a 35o/o decrease in the adhesion of U-937 monocyte cells to TNF-ot- stimulated HUVECs, and a 54% and 65% inhibition of TNF-ot-induced IL-8 and MCP-1 secretion by physiological and physiologically high doses of E2. The hormone did not affect the transcription of both chemokine genes. Tamoxifen reverted the inhibitory effect induced by E2. In conclusion, E2 modifies the adhesion of leukocytes to endothelial cells by inhibiting the secretion, but not the gene transcription, ofproinflammatory chemokines. TESIS CON FALLA DE ORIGEN s INTRODUCCION La aterosclerosis es la alteración más frecuente que conduce al desarrollo de enfermedades isquémicas como el infano al miocardio y enfermedad coronaria, las cuales son la causa mas frecuente -de muene en las sociedades occidentales- Esta alteración se caracteriza por la formación de una placa fibro-grasa topográficamente aislada, en la intima de las anerias de mediano y grueso calibre, la cual está determinada por múltiples factores, especialmente genéticos, hemodinámicos y metabólicos. En humanos, los sitios de mayor predisposición para la formación de la placa son las ramificaciones aónicas, los arcos aónicos, la aorta descendente, las coronadas, los primeros seis centímetros de las carótidas internas, el polígono de Willis y las arterias de las extremidades inferiores. Origen de 111 aterosclerosis Se ha propuesto que el inicio de la aterosclerosis es resultado de alguna forma de daño directo sobre el endotelio anerial (1). El daño puede conducir rápidamente al desarrollo de una respuesta inflamatoria crónica que se caracteriza por la acumulación de leucocitos en el espacio subendotelilal. Los factores que producen la lesión pueden ser mecánicos, como el aumento en la tensión intramural, el estrés por fricción ligera u oscilatoria y el flujo turbulento; o bien, por factores químicos o biológicos, como el aumento en las concentraciones plasmáticas de colesterol, la acumulación de toxinas o la agresión por agentes virales o bacterianos. La persistencia del daño sobre el endotelio conduce a la activación endotelial crónica que favorece la proliferación y activación de las células musculares vasculares y gradualmente conduce a la denudación endotelial. La pérdida del endotelio facilita la ruptura y erosión vasculares, las hemorragias, las ulceraciones y la formación de trombos que finalmente conducen a la isquemia. Sin embargo, se sabe que diferentes agentes pueden estar involucrados en la aparición de la aterosclerosis y se considera que está precedida y acompañada por la inflamación, aunque no se conocen con exactitud los mecanismos por los cuales se origina y progresa (2). TESIS CON FALLA DE ORIGEN 6 Un primer aspecto visible de la aterosclerosis es la formación de la estría grasa. la cual está constituida por agregados de células espumosas en el espacio subendotelial. Estas células derivan en su mayoría de los leucocitos tanto mononucleares como polimorfonucleares que han sido reclutados y, de células de músculo liso vascular. las cuales gradualmente almacenan colesterol en el citoplasma en vesículas lipídicas (3). Estas vesículas son el producto de la endocítosis de LDL oxidadas que interactúan de manera específica con los receptores .. scavenger" tipo 1 y tipo U expresados en macrófagos y en las células musculares; dichas vesículas están recubiertas por clatrina. participan en el transporte citosólico y se fusionan con lisosomas. Sin embargo. los receptores ··scavenger" no están sujetos a una regulación negativa. por lo que es probable que se generen mecanismos que interfieran con la degradación del colesterol, ya que no existe recirculación de receptores y por ende, regulación del metabolismo del colesterol (4. 5). La estría grasa puede aparecer en la primera década de la vida y permanecer por muchos años sin causar problemas de salud, lo cual depende de la predisposición genética y de la exposición a factores de riesgo. El desarrollo de la estría grasa es muy lento hasta los 30 años en promedio, época en la que si existe predisposición. el proceso se acelera rápidamente. especialmente en los varones; entonces se observan incrementos en la acumulación de lipidos, en la migración y proliferación de músculo liso y en el depósito de proteínas de matriz extracelular, lo que transforma a la lesión en una placa de ateroma (6). La lesión fundamental de la aterosclerosis es el ateroma o placa fibra-grasa. Esta es la lesión que causa el estrechamiento de la luz de la arteria. conduce a calcificaciones de la pared arterial. debilitamiento de la actividad muscular y predispone la formación de trombos. El ateroma se distingue como una estructura redondeada de color blanquecino cuya cubierta fibrosa limita a un tejido conectivo ligeramente denso, constituido por células derivadas en su mayoría de músculo liso. pocos linfocitos T y macrófagos inmersos en una matriz de proteínas como fibrina. colágeno y mucopolisacáridos. En la parte central del ateroma se localiza el centro "necrótico", constituido por desechos celulares, gotas de lípidos, cristales de colesterol, depósitos de calcio y algunas células espumosas. Frecuentemente se observan pequeños vasos sanguineos proliferando (neovascularización) alrededor de la placa ateromatosa y en dirección a la adventicia vascular, lo que se puede correlacionar con un crecimiento acelerado TESIS CON FALLA DE ORIGEN 7 del atcrorna (7). El origen y el crecimiento de la placa dependen en gran medida del estado funcional del endotelio, por lo que es importante conocer los mecanismos celulares de respuesta de este tejido ante los diversos f"actores que pueden alterarlo o dañarlo. Captura I Sujeción ~ Rodamiento ~ Transmigración e::::::~> c61ulas endoteliales L-selectina P-selectina E-selectina lnlegrina. 1 AM. VCAM jlCAM IPECAM Figura 1.- Pasos sccuencinJcs de la adhesión de los leucocitos a las células endoteliales. La sujeción o adhesión suave está mediada por L-. P-. y E-sclectina....; : la adhesión firme se realiza mediante las moléculas de adhesión ICAM -1, ICAM-2 y VCAM. Lu transmigración se realiza al establecerse un gradiente quimiotáctico y se ve facilitada con la expre$ión de PECAM ( CD31 ) entre las uniones intercelulares endoteliales. El endotelio y la aterosclerosis El endotelio está constituido por una capa de células unidas a una láJnina basal y, además de ser una barrera selectiva entre la sangre y los tejidos, es un tejido multifuncional que regula la fisiología vascular y constituye la interfase entre los elementos sanguíneos circulantes y el resto de los tejidos y los órganos del cuerpo. Su situación estratégica le permite hacer un nlonitorco sistémico y responder a estímulos locales para realizar cambios funcionales en fom1a adaptativa y mantener la homcostasia. Sin embargo. en respuesta a la presencia de algún estimulo patofisiológico, corno la hipercolesterolcmia o la presencia de agentes inmunológicos, se producen modificaciones en la estructura y función endotclialcs que conducen a alteraciones localizadas, agudas o crónicas, que af"ectan la relación del endotelio con los componentes moleculares y/o celulares de la circulación. Las alteraciones observadas TESIS CON FALLA DE ORIGEN 8 incluyen: aumento en la permeabilidad a lipoproteínas plasmáticas oxidadas. incremento en la adhesión y reclutamiento de leucocitos. producción desbalanceada de factores de crecimiento, pro- y anti-trombóticos, así como de factores reguladores del tono vascular (8). Estas son las manifestaciones de la disfunción endotelial, la cual juega un papel muy importante en la aparición, progreso y complicaciones de la aterosclerosis. Actualmente se sabe que las plaquetas podrían participar en las etapas iniciales de la aterosclerosis ya que la disfunción endotelial o la presencia de algún factor en la circulación pueden activar la secreción de PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas) que favorece la migración y proliferación de células musculares vasculares en la íntima (7). Adhesión de Leucocitos Desde el punto de vista celular, la aterosclerosis se inicia con la adhesión de monocitos y linfocitos circulantes sobre las células endoteliales y su subsecuente migración y reclutamiento en el espacio subendotelial (Figura 1). El proceso de captura de los leucocitos con el endotelio activado consta de tres fases bien definidas. La primera, conocida como "sujeción". se realiza a través de la interacción del CDl5 (antígeno de Lewis sialilado) de los leucocitos con la E- y P-selectinas expresadas en la superficie de las células endoteliales ( Figura 2). Las selectinas son moléculas de superficie que se caracterizan por tener una lectina dependiente de Ca++ en el dominio amino terminal, un dominio de unión al FCE (factor de crecimiento epidérmico), un dominio transmembranal y un dominio carboxi-terminal citosólico. La E-selectina es expresada constitutivamente por las células endotelialcs mientras que la P-selectina, localizada en vesículas cercanas a la membrana plasmática. es rápidamente exocitada cuando la célula endotelial se activa por el primer contacto de los leucocitos con la E-selectina (9). La unión de estas moléculas a su ligando es inicialmente de baja afinidad y conforme avanza el proceso de activación endotelial la afinidad de la unión aumenta considerablemente debido a cambios conformacionales de las integrinas cx..-13 1 y a 1-j32 en la superficie de los leucocitos. Los ligandos de estas selectinas son oligosacáridos sialilados o fucosilados, tales como el antígeno sialilado de Lewis-X. el cual es parte de una cadena oligosacarídica más larga, presente de manera abundante en las glicoproteínas y los glicolípidos de los leucocitos y de algunas células endoteliales (Figura 3). TESIS CON FALLA DE ORIGEN 9 Flujo sanguíneo MeMbr-ona Basal Figura 2.- Interacciones adhesivas leucocito-endotelio. Las selectinas inducidas sobre el endotelio interactúan con sus ligandos de carbohidratos (sialil-Lewis .. ) del leucocito perniitiendo un anclaje suave .. entonces el leucocito rueda sobre el endotelio a consecuencia de ta fuerza de roce del flujo sanguineo. JU = G111(3/416), G11INA(6), GlcNAc(416) o Acido siálico(ll/9) (Au-•te e• 2.6 Y 2, 7 compu- ••llidn.) Figura 3.- Eslruaura del 1111tfgcno de silllillldo de Lewis-X. Este lllllfgcno ~ c;onfiJnnado por cUMro aziicwes fucosa. N-acetilglucosmnina (GlcNAc), galactosa (Gal) y 6cido sWico. TESIS CON FALLA DE ORIGEN 10 En la segunda rase conocida como "disparo", los leucocitos son activados por moléculas quimioatrayentes que son secretadas por la célula endotelial activada como consecuencia de la "sujeción" (Figura 4). Finalmente, se inicia la tercera tase conocida como "retención", en la que el leucocito se une firmemente a la superficie de la célula endotelial a través de las adhesinas ICAM-1 (molécula de adhesión celular intercelular -1), ICAM-2, VCAM-1 (molécula de adhesión celular vascular -1) y MAdCAM-1 (molécula de adhesión celular de adrcsina <.k la mucosa) que se expresan en la superficie de lu célula cndotclial. ya """' de manera constitutiva o inducida (8,10). Tanto ICAM como VCAM son adhesinas relacionadas frecuentemente con el proceso aterogénico y se caracterizan por tener un dominio transmembranal, un dominio carboxi terminal citoplasmático y dos o más dominios homólogos extracelulares (5, 2 y 6 dominios para ICAM-1, ICAM-2 y VCAM-1, respectivamente) hacia el extremo amino terminal. Estas moléculas se expresan en la superficie de las células endoteliales activadas y sus ligandos específicos se localizan en los leucocitos. Las adhesinas JCAM-1 e ICAM-2 son reconocidas por la integrinas a 1j32 (CDI l/CDl8), mientras que la VCAM-1, lo es por la integrina a...-131 (11). Aunque ICAM-1 y VCAM-1 se relacionan estrechamente en estructura y tunción, estudios recientes muestran que VCAM-1 juega un papel dominante en el inicio de la aterosclerosis ( 12). Se han identificado varios factores capaces de inducir la expresión de moléculas de adhesión sobre el endotelio y, como consecuencia, el reclutamiento de leucocitos. Entre dichos tactores se consideran la interleucina-1 (IL-1 ), el factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-a), el interforón- gama (INF-y) y las lipoproteínas de baja densidad oxidadas (LDLox). Subsecuentemente a la adhesión firme se realiza la transmigración de los leucocitos al espacio subendotelial, que depende de la activación de PECAM (molécula de adhesión celular plaqueta-endotelio) y de la formación de un gradiente quimiotáctico. PECAM es otra adhesina que se encuentra entre las uniones intercelulares, se expresa tanto en células endoteliales como en leucocitos y panicipa en el proceso de transmigración de los leucocitos al espacio subendotelial (I 2). TESlS CON FALLA DE ORIGEN 1 1 | | Diapedesis _| Transmigración Pe TOS LFAA cam A > Célula encdlotelial MS DUMFIOCimna 1-8 Figura 4.- Fases del proceso de captura y trasmigración de los leucocitos. Un aumento en la secreción de 1L-8 establece un gradiente quimiotáctico para los leucocitos que tienen en Su superficie receptores CXC que reconocen a la HL-8, Las interacciones más fuertes ocurren como resultado de la inducción de ICAM sobre las células endoteliales y la activación de su receptor LFA-1 y Mac-1 en el leucocito. Moléculas quimioastrayentes El reclutamiento de células mononucleares en el subendotelio está regulado por moléculas quimioatrayentes o quimiocinas secretadas por las células endoteliales vasculares activadas (13). Las quimiocinas son proteínas quimioatrayentes de 70 a 130 aminoácidos, que participan en la activación y favorecen la migración unidireccional de poblaciones de leucocitos. Con base en el número de residuos de cisteina, se reconocen por lo menos cuatro familias, pero solo se han caracterizado extensamente: las familias a y f que contienen 4 cisteínas (tabla 1) (14). La familia a (CXC) incluye moléculas como la interleucina-8 (IL-8), el péptido activador de neutrófilos-2 (NAP-2) y el factor plaquetario-4 (PF-4), en las que un aminoácido separa a las dos primeras cisteínas y participan en las reacciones de inflamación aguda a través de la activación y atracción de neutrófilos, En cambio, los miembros de la familia PB (CC) intervienen en la inflamación crónica a través de la atracción de linfocitos y monocitos y se caracterizan por tener las dos primeras cisteínas adyacentes. Algunos de sus miembros son RANTES (“regulated on activation, normal T-cell expressed and secreted”), la proteina 12 l—TESISCON FALLA DE ORIGEN | -- T~ i ura .- ases el roceso e tura t s igración e l s l cocitos. n ento l eción e t .. 8 st lece n diente i iotáctico ara l s l cocitos ue ti en s s perficie eptores C ue ocen l J -8. as i cciones n1ás enes rren o lt do e l i ción e re l s l las doteliales l ti ción e r eptor A-1 ac-1 l l cocito. oléculas i ioatr entes l l t iento e lulas ononucleares l endotelio stá lado or oléculas i ioatrayentes inUocinas retadas or l s l las doteliales sculares ti das ( 3). as i iocinas n r teínas i ioatrayentes e 0 0 nUnoácidos. e rti i an l ti ción recen l igración i ireccional e blaciones e l cocitos. on ase l ero e i os e i t ína. ocen or l enos atro ilias. ero lo an r cteri ado t sa ente: l s tiunilias p e nti nen i t í as t la ) 4). a ilia C) i l ye oléculas o l i t l ci a-8 -8). l ptido ti dor e utrófilos-2 ( P-2) l f tor l uetario-4 ( F-4), l s e n inoácido ara a l s os ri eras i t í as rti i an l s r ci nes e i fla ación uda a tr és e l ti ción t ción e eutrófilos. n bio, l s ie bros e l f"amilia p C) i t r i en l i fla ación r nica a tr és e l tr ci n e linf"ocitos y onocitos r cterizan or t er lus os ri eras i t í as yacentes. lgunos e s ie bros n .ANTES c· ulated n ti ation. nnal -cell ressed d ~reted .. ), l r teína TESIS CON LA E I EN 2 inflamatoria de macrófagos-1 (MIP-1) a. y f3 y la proteína quimioatrayente de monocitos-1 (MCP-1). Las quimiocinas se expresan en muchos tipos celulares incluyendo leucocitos y células endoteliales. Sus ligandos son receptores citoplasmáticos (CCR o CXCR) acoplados a proteínas G (15) que se caracterizan por tener siete dominios transmembranales y se expresan principalmente en leucocitos. La unión entre las quimiocinas y sus receptores se incrementa por la presencia de glucosaminoglucanos en la superficie de los leucocitos, induciendo la polimerización de las moléculas quimioatrayentes y aumentando así su concentración local (16). El mecanismo de reclutamiento de leucocitos hacia el espacio subendotelial posee dos componentes esenciales: la diapédesis y la migración. En la diapédesis los leucocitos cruzan la pared endotelial. en este paso se requieren moléculas tales como LF A-1 (leukocyte functional antigen-1). Mac-1 (Receptor de complemento tipo 3) y PECAM (también conocida como CD3 l). La interacción de estas moléculas con los leucocitos en el espacio intercelular endotelial facilitan el acceso de los leucocitos a través de las células endoteliales hacia los tejidos subepiteliales, dicho acceso está mediado por la acción enzimas proteolíticas (i.e. metaloproteasas) secretadas por los leucocitos. sobre las estructuras de la membrana basal (17). En cuanto a la migración de los leucocitos a través de los tejidos. se sabe que depende en gran medida de la presencia de moléculas quimioatrayentes o quimiocinas (9). Los leucocitos son extremadamente sensibles a variaciones en la concentración de las quimiocinas, ya que concentraciones tan bajas como l 0-100 pg/ml son suficientes para activar su migración direccional (18-20). Un modelo propuesto de migración celular implica la formación de un gradiente de concentración de diversas moléculas quimioatrayentes. Este gradiente se genera en el sitio de infección en el que los macrófagos tisulares al activarse secretan de manera inicial TNF. que a su vez activa a los mismos macrófagos y a las células endoteliales para que posteriormente secreten IL-8, la cual se une a proteoglicanos de la matriz extracelular formando dicho gradiente, a lo largo del cual los leucocitos polimoñonucleares pueden migrar al foco de ínfocción. TESIS CON FALLA DE ORIGEN 13 ce MCP-3.MCP-4 MIP-la RANTES eotáxina-1 GJ~ MCP-1.2.3.4 • .5 e •.. 1 c-=c- ·····~e ~ \ :xc~ c 2 xc e g ulámico Leucina-arsinina MIP-la MIP-ljl RANTES TARC MIP-31) Fractalcina IP-IO.MIG.1- TAC PARC. DC-CKI Linfotactina SDF-1 IL-11. GCP-2 IL-11. GCP-2 ILll.GCP-2 GRO-a.p ENA-711. NAP-2 CCRI CCR3 CCR-2 CCR-.5 CCR-4 CCR-7 CX 3 CRI CXCR3 ? ? CXCR4 CXCR4 CCRI CXCR-2 CXX~T ~t-1------ c:~c~ Fractalcina CX2CRI TlpeCel•lar 11••..cret• I• ...... -... Eosinófilo Basó filo Monocito Linfocito T CélulasNK Monocitos Linfocitos T Linfocitos T Lintbcitos T Células Ten reposo CélulasNK Neutrófilos Linfocitos T CélulasNK Tabla 1.- Quimiocinas y sus r=epcores. Las quimiocinas son pn>tclnaa homólops de 8-1 O kd que se subdividen con b8se en la posición relativ• de los residuos de cistefna. Lu quimiocin8a a tienen los dos primeros residuos de cistelna separados por un mnino6cido (CXC). mienll'U que la quimioc:inas p tielMll sus dos primeras ciSICinas adyacentes (CC). Las quimiocU.. (C) linfblllctina tielW solo dos c~fna en .. proteln8 ~ y la quimiocina fi'ac1alcina (CXXXC) tiene u- amino6cidos ............... lu dos primeras ci.cm.s. Los recepkX'eS de las quimiocinas son procem.s de membrmw que essmt KOpbidu • proeefnu O que M expreun en la superficie de los linfocitos. En humanos se hml identificado cllMl'U recepcares CXC (CXCRI a R4). ocho ._.,...._ CC (CCRI a RB) y un solo receptor CXXXC (CX,CRI). TESIS CON FALLA DE ORIGEN 14 El papel que juega el TNF en la contención de los procesos infecciosos e inflamatorios es vital ya que su función primordial es la de activar a cuantos polimorfonucleares existan en la zona para dos propósitos fundamentales: liberar moléculas quimioatrayentes que permitan la destrucción del patógeno y además. formar una barrera de contención conocida como granuloma. Los efectos inductores del TNF también son reproducidos por los lipopolisacáridos (LPS) ya que se ha establecido que las células endoteliales pueden responder de manera directa a la presencia de la infección gracias a receptores como CDl3 y TR4 (21.22). Se sabe que las primeras células atraidas al sitio de inflamación son neutrófilos y que cerca de seis horas después de haberse iniciado la respuesta inflamatoria. se inicia la atracción de monocitos circulantes a través de la acción de MCP-1. La exposición a bajas concentraciones de moléculas quimioatrayentes induce la polarización del leucocito y la subsiguiente formación de seudópodos. A medida que la concentración de la quimiocina aumenta se favorece el movimiento direccional de la célula hasta que en concentraciones muy altas y uniformes del quimioatrayente. la célula pierde su migración direccional y entonces se mueve al azar. La unión del quimioatrayente con un receptor específico acoplado a proteína G induce la formación de campos eléctricos que conducen a la despolarización rápida de la membrana asociada con un incremento en la concentración de Ca++ intracelular y con la activación de la proteína cinasa-C (PKC). la fosfatidil inositol 3-cinasa (Pl-3K) y la proteína mitógeno-activada cinasa (MAPK). las cuales se han asociado con la polimerización de filamentos de actina y la remodelación de la membrana plasmática (23.24). Estrógenos y pared vascular La deficiencia de estrógenos en las mujeres se asocia con alteraciones en la función del endotelio. tales como aumento en la producción de radicales libres y en la vasoconstricción inducida por angiotensina 11 (25). También es bien sabido que tanto las células endoteliales como las células vasculares de músculo liso expresan receptores para estrógenos. por lo que algunas de sus funciones son reguladas por acción estrogénica (26.27). Así mismo se ha demostrado una fuene asociación entre las alteraciones del endotelio con la inflamación. Las respuestas celulares que los estrógenos pueden inducir, implican mecanismos relacionados tanto con la expresión genética (moleculares o genómicos) como bioquímicos (no genómicos); los primeros inducen la activación de genes específicos tales como los de MCP-1 o IL-8. TESIS CON FALLA DE ORIGEN 15 mientras que los segundos modulan la acción de enzimas específiaas. e.g. Erk 1 y Erk2 cinasas (28). MAP cinasas (29) o proteínas que interaetúan con los receptores de estrógenos, como la proteína de choque térmico de 90 kDa (HPS 90), que activa a la óxido nitrieo sintasa endotelial (eNOS) (30). Entre las acc::iones del E2 a través de mecanismos molec:ulares se encucnttan: 1) el aumento en la expresión del gen pera la eNOS. la cual plll'ticipa en la síntesis de óxido nítrico. el cual Cavorece la relajación de las células musculares vasculares (31 ); 2) la inhibición de la secreción de endotelina-1 y. 3) la activación de la prostaciclina sintetasa y la ciclooxigenasa (32) que f"avorecen la síntesis de oxido nítrico (Figura S). I I I I AA / ,/ ~xiacn Lipoxigenasa I EDHF I I I I I I / Prostaglandinas 1 fAMPc Célula endotelial ... Angiotcnsina _______ ______, Figura S.- Representación esquemática de la reguhlción de los esttógenos sobre los factores derivados del endotelio. NO. óxido nítrico; AA. ácido araquidónico; cGMP, guanosina monofosfato c(clico; cAMP. adenosina monofosf.ro ck:lico. La linea punteada indica que los estrógenos pueden tener efectos directos sohl'e la las células musculares favoreciendo la relaj-ión. El E2 regula las concentraciones circulantes de lipoproteínas asociadas a eolesterol. Su administración por vía oral disminuye la concentnción de colestcft>l asociado a lipopn>tefnas TESIS CON FALLA DE ORIGEN 16 (HDL) hasta en un 15%, además eleva los niveles de triglicéridos en 20-25% en mujeres posmenopáusicas (33). Dif'erentes estudios en modelos animales y humanos muestran que una disminución de la relación colesterol-LDL/colesterol-HDL, mejora la disponibilidad y el metabolismo del colesterol, como lo demuestra un trabajo en el que se examinaron 113 corazones de varones con enfermedad coronaria que murieron repentinamente, mostrando una correlación directa entre la ruptura de placas sensibles y una relación LDLIHDL elevada (34). Las LDL son susceptibles de sufrir oxidación y existe una asociación directa entre la formación de células espumosas en el espacio subendotelial y un aumento en la oxidación de LDL (LDLox); sin embargo. se ha observado también que los estrógenos pueden reducir el nivel de oxidación de este tipo de lipoproteínas (35). Además de ser un antioxidante de lípidos circulantes, el E2 reduce la formación intracelular de especies de oxigeno reactivas en las células musculares del sistema vascular (36). Efecto de los estrógenos sobre la innamación Las citocinas IL-1, IL-6. IL-8, MCP-1, las moléculas de adhesión y el f"actor de necrosis tumoral son algunas de las moléculas sintetizadas por el endotelio durante la inflamación. Los efectos de los estrógenos sobre la síntesis y expresión de dichas moléculas son contradictorios, pues se ha observado que tienen tanto acción inhibitoria, estimulatoria o nula, lo cual puede depender del modelo o del método utilizado para la determinación del ef"ecto. En modelos ateroscleróticos (conejo y rata hipercolesterolémicos) se ha observado que el E2 inhibe la expresión de lL- 1 y de IL-6, mientras que favorece un incremento en las concentraciones plasmáticas de estas citocinas en mujeres sanas (37). En cuanto al TNF, la mayoría de los repones indican que los estrógenos tienen un efecto inhibitorio, tanto en su expresión como en sus concentraciones plasmáticas (38,39). El TNF es producido por linf"ocitos T y B, mastocitos, células NK, osteoblastos, monocitos y macróf"agos y pertenece a una superf"amilia de citocinas relacionadas con la respuesta inmune innata y adaptativa. Estas citocinas tienen funciones de activación endotelial, apoptosis de linf"ocitos activados y células tumorales, inflamación local, activación y prolif"eración de linf"ocitos By linf"ocitos T, citotoxicidad dependiente de Ca++, estimulación de osteoclastos, y reabsorción de hueso, a través de numerosos y dif"erentes receptores específicos (9); sus TESIS CON FALLA DE ORIGEN 17 reabsorción de hueso, a través de numerosos y diferentes receptores específicos (9); sus efectos benéficos sobre la respuesta inmune pueden revertirse dependiendo de la concentración sérica. ya que también un exceso de TNF circulante puede generar choque séptico. Figura 6.- Estrógenos e inflamación. Las células endoteliales responden a muchos estímulos que inician la trascripción de genes que codifican proteínas mediadoras de inflamación. El estrógeno puede modular este proceso al inhibir la activación de factores de trascripción nuclear como el NFtc:B (40). Este factor inactivo esta conformado por tres subunidades proteicas, de las cuales. la subunidad h::B es reguladora. La disociación de hcB permite la activación del f'actor. el cual se despla?..n al núcleo e interactúa con secuencias regulatorias y de este modo, favorece la expresión de genes dependientes de él. La activación de NF-tcB puede ser inducida por moléculas proinflamatorias como IL-1. IL-6 y TNF. Aunque no se dispone de mucha TESIS CON FALLA DE ORIGEN 18 muestra que existe una relación directa entre la unión del E2 con su receptor y una disminución en la actividad de NF-icB (41) (Figura 6). En cuanto a los efectos que pueden tener los estrógenos sobre la expresión de moléculas de adhesión, existen hallazgos contradictorios, ya que en un estudio realizado por Caulin-Glaser y colaboradores (42), se observó que en las células endoteliales tratadas con E2 durante 48 h se inhibía la expresión de las moléculas de adhesión, en tanto que Cid y colaboradores (43), al tratar las células endoteliales simultáneamente con E2 y TNF, observaron un incremento en l:;i expresión de moléculas de adhesión que se correlacionó con un aumento en la adherencia de células mononucleares. Existe muy poca información acerca de cómo los estrógenos pueden regular la síntesis y expresión de quimiocinas. La citocina MCP-1 es una de las quimiocinas más estudiadas y se considera actualmente como un marcador serológico de intlamación, el cual puede ser modulada por E2. En las mujeres sanas bajo terapia de reemplazo hormonal se encontró que el tratamiento co1nbinado de progesterona con estrógenos equino-conjugados (CCE), durante dos meses, disminuyó los niveles sanguineos de MCP-1 hasta en un 35o/o (44). En estudios in vitro se ha encontrado que los estrógenos pueden modular de diferente manera la secreción y expresión de MCP-1 por tejidos específicos, pues en células MCF-7(45) y en macrófagos (46) se observa una regulación negativa. Sin embargo, en células endometriales humanas tratadas con dosis fisiológicas de E2 se registró un aumento significativo del mensajero de MCP-1 (47). Por otro lado, aunque existen pocos estudios sobre la regulación de los estrógenos en la síntesis y expresión de IL-8, se ha observado, que de manera semejante a lo ocurre con MCP- 1, la respuesta depende del tejido utilizado. Se ha observado una modulación negativa del E2 en células de melanoma metastásico humano (48) y en el plasma proveniente de varones con cirugía coronaria tratados con E2 dos días previos a la cirugía (49). Mientras que, en folículos preovulatorios humanos (50) y en células de endometrio ectópico humano (51) no se detectó efecto alguno. TESIS CON FALLA DE ORIGEN 19 JUSTIFICACION La mujer en la etapa reproductiva presenta menor incidencia de enfermedades cardiovasculares en relación con hombres de la misma edad (52), la cual puede ser hasta 50% menor (53); lo anterior se ha atribuido principalmente a la acción los estrógenos. Aunque diferentes estudios epidemiológicos muestran que las mujeres postmenopáusicas bajo terapia de reemplazo hormonal (HRT) tienen una mejor prevención contra la aparición y desarrollo de enfermedades cardiovasculares (33,54). En un estudio reciente de prevención secundaria (corazon y ·reemplazo de estrógeno/progestina, HERS) no se encontró evidencia de que la HRT i·eduzcii el riesgo en mujeres con enfermedad coronaria establecida (55-58), por lo que los mecanisr;.Jos de acción de los estrógenos durante la HRT aún están en debate. Sin embargo, actúalmeHte.ses';be que un factor de riesgo para la aparición y desarrollo de la aterosclerosis es una elevada ·concentración plasmática de lipoproteínas de baja densidad y que los estrógenos son capaces de disminuirla; además, favorecen la vasodilatación, lo cual está relacionado con un menor riesgo de enfermedad isquémica (32). Por otro lado, existen estudios morfológicos en humanos y en modelos animales que muestran que los estrógenos pueden reducir el desarrollo de ateromas (59,60). Aunado a ello, se sabe que el origen de la aterosclerosis está relacionado con un incremento en la síntesis de moléculas prointlamatorias, de adhesión y quimioatrayentes, que favorecen la adhesión y migración de leucocitos al espacio subendotelial. Sin embargo, existen discrepancias sobre cual es mecanismo exacto por el que los estrógenos pueden modular la síntesis y la expresión de dichas moléculas. Por lo tanto, resulta de interés estudiar el papel de los estrógenos sobre la secreción y expresión de quimiocinas, como IL-8 y MCP-1, involucradas en los procesos de infiltración y activación endotelial. TESIS CON FALLA DE ORIGEN 20 OBJETIVO GENERAL Determinar el papel del 1713-estradiol en Ja regulación de moléculas quimioatrayentes MCP-1 e IL-8 por parte de las células endoteliales. Objetivos Particulares l. Establecer cultivos primarios de células endoteliales a partir de cordón umbilical humano (HUVECs). dada su accesibilidad. 11. Determinar si la migración de leucocitos en geles de agarosa, en respuesta a medios condicionados (sobrenadantes) de HUVECs estimuladas con Lipopolisacárido (LPS) es moduladas por 1713-estradiol. lll. Evaluar la migración de monocitos (U937) mediante quimiotaxis, es respuesta a sobrenadantes de HUVECs estimuladas con TNF-a es reguladas por 1713-estradiol. IV. Determinar si la secreción y la expresión de IL-8 y MCP-1 por HUVECs estimuladas con TNF-a son moduladas por 1713-estradiol. V. Determinar la presencia de Jos receptores de estrógenos alfa (RE~a)y beta (RE:-13) en las HUVECs y su posible relación con la expresión ele , IL'-8 y d.e MCP..: l. HIPÓTESIS Si el 1713-estradiol reduce la formación de la placa aterosclerótica en los procesos iniciales, como son la adhesión y la migración de leucocitos al espacio subendotelial, entonces el 1 713- estradiol inhibirá la secreción y expresión de moléculas quimioatrayentes por las células endoteliales. TESIS CON FALLA DE ORIGEN 21 MATERIAL V METODOS Obtención de células endoteliales Las células endoteliales juegan un papel muy imponante en la fisiología y patofisiología vasculares. Una f"uente muy accesible de este tipo de células son las venas de los cordones umbilicales (HUVECs). cuya función es temporal y termina con el nacimiento. Entre las ventajas de utilizar HUVECs están: a) no muestran diferencias funcionales con las células endoteliales de adultos; b) son de los pocos tejidos humanos accesibles, cuya función termina con el nacimiento; c) no presentan procesos de aterosclerosis. lo cual permite contar con un modelo cercano a un estado fisiológico normal que puede ser manipulado para observar los efectos de una sola sustancia y d) pueden ser subcultivadas para obtener una cantidad relativamente alta células. provenientes de un solo individuo. Las células endoteliales se obtuvieron de venas de cordones umbilicales humanos de sujetos sanos mediante el método de Gimbrone. y colaboradores (61). Los cordones se colectaron en medio Ml99 (Gibco BRL) preparado para el transpone [10"./o CPSR-3 (Sigma). 5 U/mi de heparina, 1% de solución de antibiótico (Sigma), 10 mM HEPES (Gibco BRL) y 2mM glutamina (Sigma)] y se mantuvieron a 4° C hasta que fueron procesados. En la campana de flujo laminar, los cordones se limpiaron con etanol al 75% y gasas estériles y se canalizaron ambos extremos de la vena de cada cordón. La vena se lavó con 10 mi de solución salina de HEPES (HSS) [HEPES 1 M, O. 15 M de NaCI (Sigma), 4 mM de KCI (Sigma), 2.2 g/L de glucosa (INC biochemicals, pH 7.5)] para eliminar residuos de sangre. Para la disgregación de las células endoteliales, la vena se incubó con 1 O mi de HSS-0.2 % colagenasa tipo 11 (Gibco BRL), durante 15 mina 37º C. Las células disgregadas se recuperaron en tubos de centrífuga con 1 O mi de medio de transpone y se centrifugaron a 900 rpm durante S min. El botón celular se resuspendió con 3 mi de medio Ml99 suplementado [20 % SFB (Fetal Clon), 5 U/mi heparina, 1 o/o solución de antibióticos. 1 O mM HEPES, 2 mM glutamina y 40 µg/ml de factor de crecimiento de células endoteliales (Sigma)]. Las células endoteliales de cada cordón se sembraron en botellas de cultivo de 25 cm2 y se mantuvieron a 37º C, con humedad relativa del 95 % y una atmósfera de 7 % bióxido de carbono-93 % aire, hasta alcanzar la confluencia --~T.ESIS CON FALLA DE ORIGEN 22 y entonces fueron subcultivadas para obtener un número de células endoteliales suficiente para los ensayos. Caracterización de las células endoteliales Las células endoteliales fueron caracterizadas por su moñología típica, la cual asemeja un conjunto de adoquines cuando están en confluencia; y por su capacidad específica de producir el factor Von Willebrand, que actúa como acarreador del factor VIII de coagulación, el cual se detectó mediante inmunocitoquímica. Se sembraron 5 X 104 células en un cubreobjetos en presencia de medio de cultivo M 1 99, durante 24 h. Una vez adheridas al cubreobjetos, las células se fijaron con paraformaldehído (Sigma) al 4 % en solución amortiguadora de fosfatos (PBS) (Na2 HP04 , 0.015 M; NaH2 P04-H2 0, 0.015 M; NaCI, 0.15 M; pH 7.4). durante 10 min y enseguida se lavaron con 5 mi de PBS. Posteriormente se bloquearon estas preparaciones incubando con solución de albúmina sérica bovina (BSA) (Sigma-) al 0.1 % en PBS, durante 15 min a temperatura ambiente. El primer anticuerpo utilizado fue el anti- von Willebrand humano desarrollado en conejo, fracción lgG (Sigma) en dilución 1:100 en PBS-0. l % BSA., con el que se incubaron las preparaciones durante 45 min a temperatura ambiente. Posterior al lavado con PBS. se utilizó un anticuerpo secundario anti-conejo acoplado con rodamina (Sigma) en dilución l :200 en PBS-0. l % BSA., para revelar la presencia del anticuerpo primario. Las preparaciones se incubaron durante 45 min a temperatura ambiente. se lavaron y posteriormente fueron observadas en el microscopio de fluorescencia con filtro para rodamina (excitación: 552 nm. emisión: 570 nm); se realizaron 4 conteos de 100 células cada uno. Subcultivo de células endoteliales Para su propagación, las células en confluencia fueron despegadas con solución 1 % tripsina- 33 % EDTA(Sigma)-HSS, incubándolas durante 2-3 mina 37º C. Se recuperó la suspensión celular en un tubo de centrífuga y se adicionaron 10 mi del medio M199-IO % CPSR-3, para detener la reacción enzimática. Se centrifugaron a 800 rpm durante 5 min. y el botón celular se resembró en medio de cultivo en 1-2 botellas de 75 cm2 • Para los ensayos se utilizaron las células endoteliales subcultivadas del segundo al quinto pase. En todos los experimentos de estimulación con E2 se utilizó el medio MI 19 sin rojo de fenol (Gibco BRL) adicionado con TESIS CON FALLA DE ORIGEN 23 20 % de sustituto de suero CPSR-1 {deslipidizado, Sigma), 5 U/mi de heparina, 1 % de solución de antibiótico, 1 O mM Hepes, y 2 mM glutamina. Migración de leucocitos en geles de agarosa Se sembraron 2.5 X 1 os células por pozo en cajas de 24 pozos, después de 24 h se lavaron con solución HSS y se estimularon con E2 (O, 0.03, 0.3, 3 ng/ml) y/o LPS ( 1 O ng/ml), durante 1, 2, 3, 5 y 8 h y se colectaron los sobrenadantes, que se utilizaron en los ensayos de migración. Los leucocitos humanos se obtuvieron de sangre periférica de donadores sanos. Se tomaron 1 O mi de sangre con una jeringa heparinizada y se diluyeron con 10 mi de medio RPMI 1640, enseguida se colocó esta dilución en un tubo de centrífuga sobre 1 O mi de Histopaque-1077 (Sigma) con lo que se forma un gradiente; posteriormente se centrifugó a 1500 rpm durante 30 min. En este gradiente los eritrocitos se localizan en el fondo del tubo y los leucocitos en la interfase histopaque-medio. Los leucocitos se recuperaron por aspiración, se lavaron dos veces con medio RPMI 1640 y se resuspendieron en 10% SFB-RPMI 1640 para ser utilizados inmediatamente. Los geles se prepararon de acuerdo con el método de Al-Sumidaie y colaboradores (62): se colocaron 4 mi de PBS-agarosa al 0.8 % en cajas petri de 60 mm de diámetro, una vez que gelificó se agregaron 4 mi más de PBS-agarosa al 0.1 %. Se realizaron perforaciones en series de tres (ver esquema) con un horadador de 2.5 mm de diámetro. En el pozo central se colocaron 2 X 1 os leucocitos en 200 µI de medio 10% SFB-RPMl-1640, los pozos laterales contenían el medio de cultivo utilizado para células endoteliales como control y uno de los sobreanadantes de células endoteliales estimuladas. La distancia de migración se observó mediante microscopía óptica y para la medición se utilizó una lente con reglilla óptica de 10 µm, y se expresó como porcentaje, considerando como 100 % la distancia de migración no especifica (alrededor del pozo). TESIS CON FALLA DE ORIGEN 24 A o • • B o•• • • o e • • o D Esqucn1a que n1ucstra una distribución de los pozos en Jos geles de agarosa para la migración de leucocitos. El diámetro de cada pozo Cuc de 2.5 mn1. En el pozo central {negro) se colocnron los linf'ocitos en ~cdio RPMI 1640-1 O º/o SFB.; en el pozo httcrnl interno (punteado) se colocó el medio M J 99-20 % SFB como control ncga1ivo; en el pozo cxtcr-no (blnnco) se colocó el sobrcnndantc de célutns endotclinlcs (CE) incubadas ;i dilt:rentes tiempos con LPS ( 1 O ng71nl) y/o diferentes concentraciones de E2 .. Sobrenndantes: A.- CE sin cstinudar; B.- CE con LPS: C.- CE con E2; D.- CE con LPS y E:!. Quimiotaxis de n1onocitos El estudio de la migración de las células U-937 se realizó en cámaras de quimiotnxis de 24 pozos. utilizando membranas con poros de 0.5 µm. Las células U-937, una línea de ~onocitos humanos, que se reproduce y mantiene con facilidad, se marcaron ... con.- BCECF-AM (Molecular Pro bes, lnc.), de acuerdo a las indicaciones del prov:~edo!'.-. ~e·: i~~~baron 1x106 célulns U-937 con solución de BCECF-AM-DMSO anhidro (1 ..;,M)°;'-.e~ proporción I :500 con - ,.·.,;:_"•'·· ,- HSS, durante I h a 4° C y se utilizaron inmediatamente. Por otra .. pártc; las HUVECs aisladas de 4 diferentes cordones .se incubaron durante 24 h en presencia o ausencia de E2 (3 ng/ml), con la finalidad · de ·mantener las células endoteliales expuestas al E2 previamente a la estimulación ~on._TNF; -simulando un ambiente hormonal que podría presentarse en las células endoteliales denl'ujei-es'premenopá,usicas o bajo HRT previo a un evento inflamatorio agudo. Postcriorment.;;, tant~ las HUVECs pretratadas (expuestas previamente al E2) como las no TESIS CON FALLA DE ORIGEN 25 pretratadas, se lavaron con HSS y se estimularon por 2 h con TNF (O y 25 Ul/ml) y con E2 (O, 0.3 y l ng/ml). Al término de las incubaciones se colectaron los sobrenadantes y se colocaron 250 µI de cada uno de ellos en la parte inferior de los pozos de quimiotaxis, mientras que, en la parte superior se colocaron 5xl05 monocitos marcados U-937-BCECF resuspendidos en 250 µI de RPMI 1641-10% SFB. Las membranas de los pozos se removieron después de 90 min de incubación a 37° C, las células que migraron se cosecharon con pipeta y se lavaron con medio RPMJ-1640 libre de suero, y se adicionaron 1.5 mi de amortiguador de lisis (10% Tritón X-100 in 1 O mM Tris, pH 9.0) y se incubaron a temperatura ambiente por 20 min. Posteriormente se recuperó la suspensión de lisis y se leyó a 490 nm en un espectrofotómetro de luminiscencia LS 50B (Perkin-Elmer). Las células U-937 no marcadas se utilizaron como un control negativo. Todos los experimentos se realizaron por duplicado. La fluorescencia absoluta se determinó con 5x105 células U-937 marcadas. Cuantificación de MCP-1 e IL-8 La evaluación de la secreción de moléculas quimioatrayentes (MCP-1 e IL-8) se realizó mediante ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). La estimulación de las HUVECs se realizó con diferentes concentraciones de LPS (O, 10 y 100 ng/ml) y de TNF (O, 25 y 100 Ul/ml). Se sembraron 1.5 X 105 células por pozo en cajas de multipozos (24 pozos) durante 24 h, posteriormente las células se lavaron con HSS y se estimularon con LPS o TNF y diferentes concentraciones de E2 (O, 0.3, 3 y 10 ng/ml) durante dos horas a 37° C. En algunos experimentos, las células fueron estimuladas 24 h antes del ensayo con una dosis fisiológica alta (3 ng/ml) de E2 como anteriormente se mencionó. Se obtuvieron los sobrenadantes, se centrifugaron 3000 rpm por 5 min en una microfuga Eppendorf para eliminar las células flotantes y se ahnacenaron a -20º C hasta la cuantificación de las quimiocinas mediante ensayos de ELISA. Para la cuantificación de MCP-1 e IL-8 se utilizaron estuches comerciales (R & D Systems), siguiendo las instrucciones del fabricante. Al final de proceso las placas se leyeron a 450 nm con corrección a 570 nm en un lector de ELISA EL-3 1 1 (Bio-Tek lnstruments). Los resultados fueron expresados en ng/ml y analizados utilizando el programa KC-4 (software) de Bio-Tek. En los experimentos posteriores se usaron las concentraciones de TNF y E2 con las cuales se observó mayor electo. Las HUVECs pretratadas y no pretratadas TESIS CON FALLA DE ORIGEN 26 durante 24 h con 3 ng/ml de E2 fueron estimuladas con 25 UI/ml de TNF y dos diferentes concent..-aciones de E2 (0.3, 1 ng/ml) por 2 ha 37 ° C en una atmósf"era humidificada y 7 o/o de C02 . humidified atmosphere. Los sobrenadantes se colectaron y almacenaron en las condiciones antes mencionadas para la posterior cuantificación de las quimiocinas. Expresión de MCP-1 e IL-8 La expresión de MCP- 1 e IL-8 se realizó mediante la técnica de R T-PCR. Las células endoteliales de cada cordón se sembraron de cajas de petri de 100 mm de diámetl'"o (2 X 106 células/caja) en un volumen total de 6 mi de medio M199-20o/o CPSR-1 y se estimularon de manera semejante que en los experimentos de secreción y además. en algunos ensayos se utilizó tamoxifen ( 1 x 10- 9 M) solo o en combinación con el E2. para determinar si era capaz de revertir el ef"ecto del E2 sobre la expresión de IL-8. Para la extracción del RNA total. al ténnino de la incubación. las células endoteliales se lavaron con 5 mi de HSS y se incubaron con 500 µl de reactivo TRlzol (Gibco BRL) por 5 min a temperatu..-a ambiente para la extracción de RNA. El lisado celular fue raspado y colectado en tubos Eppendorf" de 1.5 mi y se mantuvo a 4° C para continuar el procedimiento de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El RNA total se resuspendió en 22 µI de agua ulua-pura y uatada con 0.02 o/o (peso/ volumen) de dietil pirocarbonato (DEPC) y se cuantificó determinando la absorbancia a 00260. la pureza se determinó mediante el cálculo del indice de absorbancia OD26o/OD2 so. que para todas las muestras tuvo un valor superior a 1.9. La calidad del RNA extraído fue probada mediante la detección de las bandas de RNA ribosomal en geles de agarosa al 2 o/o. La transcripción reversa y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realizaron mediante un procedimiento de un solo paso. utilizando el sistema .. Access RT-PCR" (Promega) y un termociclador (modelo .. Touchdown. Hybaid Thermal Cycler" de Perkin- Elmer). La mezcla de reacción contenía: 1 µg de la mezcla de RNA; 5 U de la transcriptasa reversa AMV; 5 U de polimerasa TflDNA; JO µI de amotiguador de reacción 5x AMV/ Tfl; MgS04 25 inM; 10 mM de cada uno de los cuatro desoxirubonucleótidos y agua-DEPC hasta completar el volumen final de 50 µl; La mezcla de reacción se incubó a 48º C por 45 min. seguida por un ciclo de desnaturalización a 94° C por 2 min. Posteriormente, se realizaron 40 TESIS CON FALLA DE ORIGEN 27 ciclos a 94° C por 30 s. 60º C por 1 min. 68º C por 2 min. y finalmente 68° C por 7 min. Se utilizaron 1 O µI de cada reacción y se analizaron los productos de PCR mediante electroforesis con geles de agarosa al 2 % en solución estándar de tris-boratos y EDT A (TBE) conteniendo bromuro de etidio; los geles fueron observados en un transiluminador y fotografiados. El análisis semicuantitativo de los productos de RT-PCR se realizó al determinar la densitometria de las bandas utilizando un densitómetro G5-670 de Bio-Rad y el programa "molecular analyst" versión 1. 1. Los oligonucleótidos utilizados como cebadores. para la detección de moléculas específicas a partir de cDNA fueron: IL-8.- 5'-ATTTCTGCAGCTCTGTGTGAAGGTGC-3' (sentido) 5'-TTGTGGATCCTGGCTAGCAGA-3' (contrasentido) (63) MCP.- 5'-CAAACTGAAGCTCGCACTCTCGCC-3' (sentido) 5'-ATTCTTGGGTTGTGGAGTGAGTGTTCA-3' (contrasentido) (64) P-actina.- 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCCA-3' (sentido) 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3' (contrasentido) (64). El gene que se expresa constitutivamente y que fue utilizado como control de reacción fue P- actina. El tamaño de los productos de PCR esperados fue: 749 bp para IL-8; 354 bp para MCP-1 y 548 bp para P-actina. Expresión de RE-a. y RE-13 La expresión de los receptores de estrógenos alfa y beta (RE-a. y RE-13) en las HUVECs se determinó mediante RT-PCR., siguiendo las condiciones previamente descritas. Los primers específicos fueron 5 · -AGGCTGCGCTTCGGC-3 · (sentido) y 5 · - ACGCATACTTCCCTTGTCAT-3' (contrasentido). para el RE-a.; y 5'- TTCCCAGCAA TGTCACT AACT-3. (sentido) y 5. -CTCTTTGAACCTGGACCAGT A-3. - (contrasentido) para el RE-13. El tamaño esperado de los productos de la amplificación fue de 410 bp y de 258 bp. respectivamente (65). Además. se obtuvo RNA de endometrio humano (HUE). perteneciente a una mujer que fue sometida a histerectomía por presentar miomatosis. Los productos de RT-PCR obtenidos a partir de dicho RNA fueron utilizados como controles positivos. TESIS CON FALLA DE ORIGEN 28 Detección del RE-a..- La presencia del ER-a. se determinó en células MCF-7 (línea celular de cáncer de mama que expresa los receptores ER-a. y RE-13) y en 1x106 HUVECs estimuladas durante 8 h con E2 (3 ng/ml), mediante el ensayo de inmunodetección tipo "'Western Blot", para lo cual se obtuvo la proteína total al lisar las células con un amortiguador de lisis compuesto por: 50 mM de Tris, 120 mM de NaCI, 0.5 % de NP-40, 100 µM de NaF, 200 mM de NaV, 3 µl/ml de aprotinina, 10 µg/ml de leupeptina, y 0.58 mM de tluoruro de fenil metanosulfonil. Se realizó la resolución de las proteínas mediante electroforesis (SDS-PAGE) al colocar 100 µg de cada extracto por pozo. en geles al 7.5% de poliacrilamida. Las proteínas resueltas fueron transferidas a membranas de nitrocelulosa y posteriormente, fueron bloqueadas con una suspensión al 5% de leche en polvo libre de grasa en 20 mM de Tris, 137 mM de NaCI, 3 mM de KCI y 0.1 o/o de Tween; pH 7.6. Después de 4 h de incubación con el anticuerpo anti-ER-a. (HC20, Santa Cruz Biotechnology) en dilución 1 :500, las membranas se lavaron tres veces con NaCl/Tris/Tween por 5 min, luego se incubaron con un anti-lgG biotinilado de conejo, desarrollado en cabra en dilución 1 :2000 por 30 min, enseguida, las membranas se lavaron nuevamente en las condiciones antes descritas y finalmente, se incubaron durante 30 min con el complejo estreptavidina-peroxidasa y se lavaron tres veces más con NaClrfris/T,veen. La peroxidasa unida a la membrana se rev.:ló mediante un sustrato quimioluminiscente ('"Supersignal West Pico Chemiluminiscent Substrate"). Análisis estadístico.- Los resultados fueron calculados como la media± la desviación estándar. La significancia de los cambios experimentales fue validada a través de la prueba estadística t de Student. Los ensayos de migración fueron analizados mediante las pruebas de ANOVA y de Tukey-HSD, utilizando el programa "'Statistica version 5". TESIS CON FALLA DE ORIGEN 29 RESULTADOS Caracterización de las células endoteliales El número promedio de células endoteliales obtenidas por cordón umbilical de 12-15 cm de longitud correspondió a aproximadamente 4 X 105 células. Para determinar la pureza de estas células, se marcaron con anticuerpo anti-f"actor von Willebrand. que se expresa de manera exclusiva en las células endoteliales, y los resultados mostraron que el 80 % de las células obtenidas fueron positivas. En evaluaciones posteriores efectuadas por otro grupo de nuestro laboratorio. utilizando el marcador CD 105 que es característico de las células endoteliales, se ha observado que existen subpoblaciones endoteliales que son antígeno de von Willebrand negativo y COJOS (endoglina) positivo (66), de tal manera que aproximadamente el 99% de las células en nuestros cultivos son CD 105 positivas. JVligración de leucocitos Los leucocitos sembrados en los pozos de agarosa migraron de forma inespecífica, haciendo una circunferencia alrededor del pozo. Sin embargo, los leucocitos sembrados en agarosa con medios condicionados o sobrenadantes de células endoteliales (HUVECs) colocados en un pozo adyacente. f"ormaron un .. pico" de migración específica. el cual se observa en la figura 7. La distancia de migración ínespecifica se considero como el 100% y fue el valor de referencia que se utilizó para calcular el porcentaje de migración especifica. En la gráfica de la figura 8 se muestra el porcentaje de migración de los leucocitos humanos en respuesta a los medios condicionados de células endoteliales obtenidas de 6 diferentes cordones umbilicales. Las células se estimularon con LPS (10 µg/ml) y dif"erentes concentraciones de E2 (O, 0.03, 0.3 y 3 ng/ml) durante diferentes periodos de tiempo (1, 2, 3, 5 y 8 h). El medio condicionado de células endoteliales sin ningún tratamiento indujo una migración muy semejante a la observada con el medio sin células. Al comparar la migración basal (sobrenadante de HUVECs sin ningún estímulo) con la migración producida en condiciones de estimulación con LPS se observó un incremento hasta del 120 % a las 8 h de cultivo;. sin embargo, no hubo diferencia significativa "'ntre los diferentes tiempos de cultivo. En la gráfica también se muestra una tendencia en la disminución de la migración de los leucocitos a medida que TESIS CON FALLA DE ORIGEN 30 aumenta la concentración de E2. Tmnpoco hubo diferencias significativas entre los medios condicionados ele HUVECs cultivndas con clistintns concentrnciones de E2. 1) 2) T='igura 7. J'\tigración de leucocitos hunrnnos t:n geles dc ag.¡uo~a en dirccci011 al p<..v.o 11.¡uc cunticn .... • sobn:nadantc de HUVECs .. 1) E~l.JUC1na dc.:J pozo central conteniendo los leucocitos. donde ~e representa el ·• pico·· de n1igración. A) representa la distancia de n1igración no dirigida (alrcdcdc"r dd pozo) y U) cs In di~tancia de n1igración dirigida hucia d J>Ozo que conti1.:nc el sobrandmnc de l IU'\.'ECs. 2) Fotografia (·10X) de uno.t porción del pozo que contiene los leucocitos .. rnostrando et .. pico de rnigraciónº. TESIS CON FALLA DE ORIGEN 31 300 e: 250 •o ·¡:; e 200 en ::!§ 150 ~ -¡¡¿. 100 50 --·------------ CJ 1 h Ei'!l2h •3h 05 h ·~Bh 0.3 3 Estradiol (nglml) _ _j Figur::1 X. l\.otigración de lcucocilos l1111nanos en geles de ag:1ros.1 en respuesta a los sobrcn.aclantes: de HUVECs cstintuladas con LPS C to ng/1111) y con diferentes couccnu-uc1oncs de 17J~-cstn1diol en diferentes ticrnpos. ,--------------------- !§ 200 = en :!!.. "' ·¡:; e: GJ u "' ~ o :::J ;:: GJ ..., ..., "' -e ·¡¡; e: .s E 150 100 50 o ----------.-! l•RPMl-1640 "] iaec ¡! !cec. e2- '. J !•ec+TNF '. ¡ '1 :aec +TNF +E2· i { JCIEC +TNF +E2 .. 1 Figura 'J. Migración de las células U-9::;7 en respuesta a los sobrcnad.,ntcs de HUVECs (EC). Los resultados rcprc~c:111~u1 la 111c~~~·;;::: '.,:>?: ~] o MCP-1 TNF (ng/ml) 25 100 2.48 ± 1 .2 2. 75 ± 1.3 2.54 ± 0.5 2.18 ± 0.4 '2.31 ± 0.3 •·.2;11± 0.4 2.34 ± 1.1 :2:20:±,;1'.4>'.2:06 :!:o.8 1 :9.{± o.8 «}:~~:c~¡1.~~é)·1·:s8 ± o.s ,_ < -~<-\ 1.99 :± o.7 1.s3 :!:o.5 1.29 ± 0.7 1.69 ± 0.6 1.47 ±0.5 1.28 ± 0.8 1.80 ± 1 .2 1.56 ± 0.4 TABLA 2. Secreción de Mc·p_)·;e·-¡r:;.tf-·p~~-.HU.VECs estimuladas durante 2 h con diferentes concentraciones de TNF-a (TNF) y J7f3-estnÍdiol (E2).,(A)''..;HUVECs sin pretratamicnto con E2. (B) HUVECs pretratadas con 3 ng/ml de E2 durante 24 h.· · " TESIS CON FALLA DE ORIGEN 36 [ -- ---- --- -A.- - ------- º 80 TNF (Ul/ml) 00 •25 ' • 100! 1 1 60 1 .:; 40 ! ; 2~ i -20 1 1 1 1 l ____ --- ·---- - --·----- ,- 1 80 o 1 :a 60 E 1 .. ca 40 -"1:11 1 ~ 20 ap 1 _, o 1 -20 1 1 o B 0.3 3 10 E2 (ng/ml) -------------------·--·----------------~ - ---- --------- ----------------1 E2 (ng/ml) TNF (Ul/ml) 1 5 00 Figura 11.- Sccrcciún de 11.-11 expresada como porcentaje de cambio con respecto al control. Las lllNECs fueron cstimul:ulas dur.mte 2 h con difcrt."ntC.'i concentr".tcion<."S de ·1N1-"-a (TNI') y dc l 7ji-estradiol (H2) (A) HUVECs sin prctratamicnto con E2. (B) IIUVECs prctratadas con J ng/ml de E2 durante 24 h. TESIS CON FALLA DE ORiGEN 37 -50 o 0.3 3 10 E2 (ng/ml) - ------ -------- --- 50 B 'O :a 30 TNF (Ul/ml) E .. ~~~1 u 10 --o ~ -10 --;'" a.. u -30 :E -50 o 0.3 3 10 E2 (ng/ml) ~~~~~--~~- Figuru 12.- Secreción de f\.tCP-lcxprcsada conu.> porcentaje de cambio con respecto al control. Las lllJVECs fueron cstim u ladas durante 2 h con di fcrc111L-s cotH.:cntrdcioncs de TNF-a. (O. 25. 100 Ul/nml) y de 171}-cstrJdiol (E2). (A:) llUVECs no prctratadas con E2; (0) lilJVECs prctr.uadas con 3 ng/ml de E2 durante 24 h. TESIS CON FALLA DE ORIGEN 38 Con el objeto de lograr un mejor análisis del efecto inhibitorio del E2. se seleccionaron las células de los 5 cordones más respondedores a la estimulación con TNF. los cuales se estimularon con la dosis de TNF-a. que había mostrado tener el máximo efecto estimulatorio (25 Ul/ml). Los resultados de dicho análisis se muestran en la tabla 3. La secreción basal de IL-8 (2.42 ng/ml) y de MCP-1 (2.18 ng/ml). aumentó bajo el estimulo con TNF de forma significativa (4.45 ng/ml para IL-8 y 2.83 ng/ml para MCP-1). En condiciones de pretratamiento (3 ng/ml de E2 ), el efecto inhibitorio del E2 fue menos importante, pues solo se observó una disminución del 25 º/o y 24 o/o (2.67 y 2.52 ng/ml vs. 3.54 ng/ml; p< 0.01 para ambos valores). Los resultados mostraron que en las HUVECs pretratadas hay una menor secreción (20 %) en la secreción de IL-8 comparada con las células no pretratadas (3.54 vs. 4.45 ~ng/ml). No se observaron dif"erencias significativas en la disminución de la secreción de IL-8 con concentraciones altas de E2 (3 ng/ml). Cuando las HUVECs no fueron pretratadas. el E2 erí concentraciones fisiológicas (0.3 y 1 ng/ml). disminuyó significativamente la secreción de IL-8 (54 y 51 %, respectivamente). El E2 también inhibió la secreción de MCP-1 en las HUVECS estimuladas con TNF. tanto pretratadas como no pretratadas con E2. En las células no pretratadas. se observó una disminución significativa del 25% (2.83 vs. 2. 1 ng/ml) con la dosis fisiológica (0.3 ng/ml de E2). El efecto inhibitorio se mantuvo en proporciones semejantes con las dosis mayores de E2 ( 19% con 1 ng/ml y 23% con 3 ng/ml). En condiciones de pretratamiento. la producción de MCP-1 disminuyó signifcativamente cuando las células endoteliales fueron expuestas a dosis fisiológicas de E2 (49% con 0.3 ng/ml y 42% con l ng/ml). Las HUVECs estimuladas con TNF pretratadas con E2, producjeron menos MCP-1 (30 %), en comparación cons las HUVECs estamiuladas con TNF no pretratadas con E2 (1.96 vs. 2.18 ng/ml). Expresión de MCP-1 e IL-8 Para determinar el posible mecanismó de la secreción de ambas quimiocinas se utilizó RT- PCR. En las HUVECs pretratadas con 3 ng/ml de E2 se detectaron los productos de ambas quimiocinas (figura 13). sin embargo. no se pudo observar el RNArn de MCP-1 en las células no pretratadas. Fue interesante observar que la expresión semicuantitativa del mensajero de TESIS CON FALLA DE ORIGEN 39 lL-8, resultó mas baja en condiciones de pretratamiento con relación a las células no pretratadas, y que además, tanto TNF como E2 son muy buenos inductores de los mensajeros de ambas quimiocinas, principalmente para IL-8 en las HUVECs pretradas con E2. TABLA 3.- Concentración de IL-8 y de MCP-1 *en sobrenadantes de células HUVEC en cultivo, pretratadas y no pretratasdas con 17¡3-estradiol. no pretratadas con E2 pretratadas con E2 IL-8 MCP-1 IL-8 MCP-1 Basal 2.42 ± 0.39 2.18 ± 0.36 2.4S ± 0.81 1.S6 ±0.42 + E2 (0.3 ng/ml) 2.16±0.18 1.90 ±0.25 2.SO ± 0.47 N.O. +TNF 4.45ª ± 0.6S 2.83° ±O.SS 3.S4ª± O.S2 1.96º±Ó.21 TNF ,-_,:.,,.·. + E2 (0.3 ng/ml) 2.05"±0.62 2.10• ± 0.26 2.67• :!: 0.60 -. . +E2(1 ng/ml) 2.18" ± 0.36 2.28.±0.S4 :i.S2~-± ~:~3 - ú4•±o'.Í9 + E2 (3 ng/ml) 2.45 ±0.81 2.16 ±0.40 2.S4±o.47 L27 ±0.23 •La concentración de las quimiocinas esta en ng/ml. El pretratamiento con 3 ng/ml de 17¡3-estradiol (E2) se ralizó durante 24 h. En los experimentos (n= 10), la incubación se realizó por 2 h con o sin 2S Ul/ml de TNF-Ot n:combinante (TNF) y diferentes concentraciones de E2. Los resultados están expresados como el promedio de la concentración en ng/ml ± la desviación es.tándar. N.O.= no determinado. a vs. b= p< 0.01, e vs. d= p< O.OS. -TESIS CON FALLA DE ORIGEN 40 IL-8 MCP-1 IL-B- J3-actina - MCP-1- 2 0.3 3 0.47 4 0.07 5 0.52 6 1.0 0.17 7 1.25 0.32 8 0.23 0.02 Figura 13.- RNAm de IL-8 y MCl'-1 de HUVECs cultivadas sin 17(3-esrndiol (E2) ni TNF-a. (TNF) (carriles 1 y 5): con 25 Ul/ml de TNF (llncus 2 y 6); con 0.3 ng/ml de E2 (lineas 3 y 7) y con E2 + TNF (líneas 4 y 8). ,_,s células uiiti;t" .... 'tdas para Ja obtención de RNAn1 de las de las línea..~ 5-8 fueron pretratadas durante 24 h con una dosis fisiológica ulta (3 nglrnl) de E2. n1icntras que de las líneas 1-4 no fueron pn:tratadas. Los núrncroscn el rccuudro cstan expresados co1no un indice de los valores scn1icuantitativos de las quiocinns en relación a 13- actina. TESIS CON FALLA DE ORIGEN 41 a) = IL-8 (a) IL-8 b ... E p.- ~ .... -- - ----~ e TNF 1.04 2.13 0.46 0.98 b) -IL-8- ------- -IS-act- ---~ ... _. Tmx 1.0 0.18 .36 0.55 0.38 nd• Figura 14.- RNAm de IL-8 obtenido de células endotcliales pretratadas durante 48 h con 3 ng/ml de 17!}- t:~lradiol. (a) 1 IU'-'ECs no prctratadas (el primer carril en la fotografia corresponde ni marcador de pesos moleculares) y (b) no pretrntadas. (C) corresponde a HUVECs no estimuladas; (TNF) HUVECs estimuladas con 25 Ul/ml de TNF-cx; E,) liUVECs estimuladas con 3 nglml de 17!}-estradiol Tmx). HUVECs estimuladas con 1x1 o·')rvt de tamoxi fcn. Los números en el recuadro representan los valores scmicuantitativos de IL-8 en relación con (l-actina ((l-act). • nd == no detectado. 'll!.::l1S CON FALLA DE ORIGEN 42 A -p-actina B -P-actina 12345 carril 2 3 4 5 0.13 0.69 0.42 Figura 15.- E:sprcsión dd receptor de cstrógenos rnediantc RT-PCR A) RNA1n obtenido de cndomctrio humano (HUE); rnarcndor de pesos 111ulecularcs VJ (carril t),. P-actin (curril ::?) ,. receptor de cstrógcnos alfn (ER-cx. cnrril J). receptor de estrógcnos beta (RE-13. carril 4) moleculares VI (linea 4). B). RT-PCR del mRNA obtenido de HUVECs (carriles 2 y 3) y HUE (carriles 4 y 5). Las células f"ucron estimuladas con 3ng de 17Jl-cstradiol (carriles 3 y 5). Loa nú1nc:ros en el recuadro representar el valor scmicuantitativo del ER-~ en relación a J3-actina. •nd~ no dctcctndo TESIS CON FALLA DE ORIGEN 43 N w • - ..... o z ..... ..... - ..... 1 1 ... e ..... '-... LL. LL. o N z N (.,) u (.) w .... w :& :& - ~-- ·- ._- 56 KDa- Figura 16.- Análisis por Western blot del receptor de estrógenos ex. (ER·a) en HUVECs no estimuladas (control) y cstin1uladas con 17'3-estradiol (E2• 3 ng/ml). con TNF-a (TNF. 25 Ul/ml) y con ambos. Se utilizaron como controles positivos las células de la línea MCF-7 no estimuladas y estimuladas con l 7J3-estradiol (E2 • 3 ng/ml). El 1narcador de 56 kDa es la prote(na piruvato-cinasa. TESIS CON FALLA DE ORIGEN 44 Con el propósito de analizar si el efecto del E2 está mediado a través de sus receptores, las HUVECs fueron estimuladas con tamoxifen, que es un antagonista de E2 a través del RE. Se determinó unicamente la expresión de IL-8, donde el efecto de E2 fue más importante sobre ella. Los resultados (figura 14) mostraron que en las células pretratadas con 3 ng/ml de E2, tanto el TNF como el E2 estimularon la expresión de la quimiocina y que el tamoxifen pudo revertir dicho efecto. Pero, en las células no pretradas, la estimulación con E2 no fue tan importante y se observó una mayor inducción debida al tamoxifen. Es, es interesante observar que al estimular al mismo tiempo con E2 y tamoxifen, se observó un efecto inhibitorio muy significativo, por lo que es probable que exista competencia por el receptor. Lo anterior permite suponer que el efecto inhibitorio del E2 puede ser a través del RE. Expresión de receptores de estrógtmos Para corroborar la presencia del receptor de estrógenos se analizó la expresión del RNAm de los receptores a y 13 de estrógenos (RE-a y RE-13). Se utilizó como control RNA total de cndometrio humano (HUE) en el cual se observó la expresión de ambos receptores (figura 15). Cuando las células endoteliales se estimularon con E2 se pudo detectar la presencia del RE-13. aunque de manera muy tenue en relación con el HUE, donde la expresión del RE-13 se incrementó en un 29 % con E2, respecto al HUE no estimulado. Dado que en nuestras condiciones experimentales no se pudo detectar el mensajero de RE-a mediante la técnica de "'RT-PCR", se realizó un análisis por "Western blot", para determinar si dicho receptor estaba realmente ausente en las HUVECs. Los resultados (figura 16) mostraron que la proteina del RE-a está presente en las células endoteliales de cordón umbilical y que su expresión puede inducirse con E2. Fue interesante observar que el TNF-a mostró un efecto inhibitorio sobre la síntesis del RE-a, aún en presencia de E2. TESIS CON FALLA DE ORIGEN 45 DISCUSIÓN Desde hace mucho tiempo se sabe que las mujeres en edad reproductiva tienen una menor incidencia de eventos cardiovasculares secundarios a procesos de aterosclerosis. También es bien sabido que al llegar la menopausia, la incidencia de procesos cardiovasculares alcanza cifras similares o idénticas a las de los hombres. Estas observaciones, apoyadas por estudios epidemiológicos de prevenc1on primaria y secundaria de enfermedades isquémicas cardiovasculares, hacen pensar que los estrógenos pueden ejercer un papel importante en la prevención de la aterosclerosis en las mujeres. Actualmente se piensa que la aterosclerosis está íntimamente relacionada con la disfunción del endotelio y que las hormonas f"emeninas pueden jugar un papel regulador sobre la función endotelial. Aunado a este hecho se sabe que los estrógenos tienen acción regulatoria sobre dif"erentes tipos de células vasculares a través de muy diversas vías que involucran mecanismos de activación génica (genómicos) y de regulación a nivel citoplasmático (no genómicos) (32). La migración de los leucocitos al espacio subendotelial, fenómeno mediado por el endotelio, es uno de los pasos iniciales en el proceso aterogénico, por lo que la intención de este trabajo fue determinar si el E2, uno de los tres estrógenos principales que se encuentran en la circulación y el biológicamente más activo, modula adhesión y la migración transendotelial, de células inflamatorias, procesos relacionados con el inicio de la placa ateromatosa. Debido a que el objetivo fue evaluar la acción del estradiol sobre el endotelio se decidió obtener células endoteliales a partir de una fuente relativamente accesible, confiable y ampliamente ultilizada, como los cordones umbilicales; además de que estas células nos daban una ventaja agregada, que es que derivan embriológicamente del producto y no de la madre (68). por lo que se tenia la seguridad de que cualquiera que fuese la respuesta obtenida en este u otro estudio seria que la célula no estuvo expuesta previamente a los numerosos factores de riesgo involucrados en el desarrollo del proceso ateroscleroso (69). En un intento de disminuir los factores hereditarios solamente se utilizaron cordones umbilicales de madres que no tuvieran historia de hiperlipidemia, tabaquismo o hipertensión arterial. Los resultados mostraron que el 99% de las células de los cultivos primarios obtenidos, tenían caracteristicas morfológicas y bioquímicas correspondientes a las .-eportadas para las células endoteliales. La TESIS CON FALLA DE ORIGEN 46 expresión del f"actor von Willebrand. se ha considerado como un marcador típico de la las células endoteliales. sin embargo. cerca del 10% de nuestras células endoteliales no fueron positivas para este f"actor. Estudios recientemente realizados en nuestro laboratorio, mediante citotluorometría. muestran que existe expresividad variable del f"actor von Willebrand e inclusive. se han localizado dif"erentes subpoblaciones celulares endoteliales que expresan de forma variable moléculas de adhesión celular (ICAM-1. VCAM-1, entre otras). A pesar de ello. más del 99% de las HUVECs fueron positivas para endoglina/CDIOS (66), que es una proteína integral de membrana de 180 kd. involucrada en el camino de sei\alamiento del factor-beta transf"ormante de crecimiento y que se expresa casi únicamente en células endoteliales (70). Una vez probada la pureza de las HUVECs. se decidió estimularlas tanto con LPS como con TNF. de tal manera que se contara con un modelo i11 vitro que asemejara las condiciones proinflamatorias. También se sabe que ambas moléculas son capaces de estimular la secreción de quimiocinas por las células endoteliales (71-73). Los experimentos iniciales se realizaron utilizando LPS; sin embargo. tanto en los ensayos de migración como de secreción no pudimos encontrar diferencias significativas en ninguno de los casos. Cuando las células se estimularon simultáneamente con LPS y E2. observamos una tendencia de disminución en la migración de leucocitos; sin embargo, con estradiol no se observó ningún efecto sobre las secreción de IL-8 y de MCP-1 por HUVECs estimuladas con LPS. Es posible que no encontrar diferencias se deba a la falta de sensibilidad del método y a las diferencias biológicas de cada cordón. pues las células endoteliales de algunos cordones umbilicales no respondieron a la estimulación con LPS. Además. tampoco se puede descartar el hecho de que la inducción de la quimiotaxis se debe al LPS per se. en vez de los productos de secreción de las HUVECs. Se ha reportado que el TNF es un mejor inductor de la secreción de quimiocinas (74. 75) que la lL-113 o el LPS. lo que se corrobora con nuestros resultados, pues el TNF fue capaz de incrementar la secreción basal de IL-8 hasta en un 80% en las HUVECs. Actualmente se sabe que la aterosclerosis es un proceso que involucra las respuestas inflamatoria y TESIS CON FALLA DE ORIGEN 47 fibroprolif'erativa, ante el daño endotelial (1,7,76), y que el TNF es una molécula que f'avorece la adherencia de monocitos y promueve su migración al espacio subendotelial, por lo que el uso del TNF permitió mantener un estado proinflamatorio in vitro. De acuerdo con los resultados obtenidos en los ensayos de migración, tanto en geles de agarosa como en los experimentos de quimiotaxis, las HUVECs no estimuladas en cultivo, f'ue1·on capaces de f'avorecer la migración. tanto de leucocitos sistémicos como de monocitos U-937 (línea de un mioloma humano). Además, se mostró que las HUVECs pueden ser activadas in vitro. ya que se observó un aumento en la migración basal cuando las células endoteliales se incubaron con TNF, lo que permite contar con un modelo proinflamatorio adecuado. De manera consistente se observó, tanto en condiciones basales como de estimulación. que el E2 tuvo un efecto inhibitorio sobre la migración inducida por las secreciones de las células endoteliales al medio. Estos resultados apoyan la evidencia de que la regulación de la migración de leucocitos al espacio subendotelial por el E2 requiere de la participación del endotelio, como ha sido reportado por Hofbauer et. al. (77) y Nathan et. al. (78). Desde hace varios años. se ha aceptado que los estrógenos tienen un papel ateroprotector. aunque los resultados de estudios recientes, hechos por Hully, y cols. (SS) y Simon y cols. (S6). han creado ciertas dudas sobre el verdadero ef'ecto preventivo de los estrógenos. cuando se utilizan como terapia de reemplazo hormonal en mujeres postmenopaúsicas. Sin embargo. es claro que los estrógenos tienen ef'ectos regulatorios sobre la tonicidad vascular (79,80). y la trascripción de genes endoteliales específicos (81). Por lo que decidimos determinar el ef'ecto del E2. en concentraciones equivalentes (fase f'olicular: 30-260 pg/ml; fase preovulatoria: 120- SOO pg/ml) o más altas (3 y 1 O ng/ml) que las detectadas en las mujeres premenopáusicas, así como en las mujeres que estaban bajo terapia de reemplazo hormonal (HRT) (82,83), sobre la secreción de moléculas quimioatrayentes. Nuestros resultados confirmaron que los sobrenadantes de las HUVECs estimuladas con TNF y con dosis fisiológicas de E2, disminuyeron la migración de las células U-937. Experimentos posteriores demostraron que el E2 en concentraciones fisiológicas y mayores disminuyeron la secreción de IL-8 y de MCP-1. TESIS CON FALLA DE OEIGEN 48 lo cual se correlaciona con los resultados de Yamanda et. al. (84) y de Caulin-Glaser et. al. (42).Una interesante observación fue que la adición de dosis fisiológicas de E2 en células endoteliales pretratadas. disminuyeron muy poco la secreción de IL-8. lo cual sugiere que el efecto inhibitorio del E2. sobre la secreción de quimiocinas, tiene un límite. Nuestros resultados indican claramente la capacidad regulatoria del E2 sobre IL-8 y MCP-1. moléculas relacionas con la transmigración de neutrófilos y monocitos en el proceso inflamatorio crónico (85). Un estudio reciente hecho por Koh et. al. (44) que apoya nuestros hallazgos. muestra que la terapia de reemplazo hormonal disminuye significativamente las concentraciones plasmáticas de MCP-1. lo que permite suponer que tendría como beneficio. una reducida transmigración endotelial de monocitos. si bien es cierto que las concentraciones plasmáticas no necesariamente reflejan lo que sucede en las zonas de migración. Otra observación interesante fue que las células endoteliales expuestas previamente al E2 mostraron una menor respuesta a efectores proinflamatorios. como el TNF. lo que indica que para obtener mejores efectos. los estrógenos deben estar presentes de manera crónica. esto es. de forma similar a lo que ocurre en las mujeres en edad reproductiva. De este modo se pueden excluir o minimizar los efectos benéficos de las terapias estrogénicas a cono plazo. En un inicio se pensó que la reducción en la secreción de IL-8 y MCP-1. como se ha observado para IL-6 (86). era consecuencia de un efecto inhibitorio sobre el proceso de transcripción de los genes de ambas quimiocinas, como se ha reponado para MCP-1 en macrófagos peritoneales murinos (46) y en moléculas de adhesión expresadas en HUVECs (87). Sin embargo. cuando se evaluó la expresión del RNAm de MCP-1 y de IL-8, se encontró que no hubo una disminución sino por el contrario. hubo un aumento debido al E2. lo que indica que probablemente el E2 inhibe la secreción de quimiocinas al regular los mecanismos traduccionales. postraduccionales o de exocitosis. En un trabajo realizado por EL Mezquini y colaboradores (88) se mostró que los estrógenos pueden modular la concentración del RNAm de la proteína PAM ("Peptidylglycine alpha-amidating monooxygenase") afectando la estabilidad del precursor. Sin embargo, la acumulación del mensajero de las quimiocinas, observada en el presente trabajo. permite suponer que los RNAm son estables y que la modulación del estrógenos pudiera ser posterior. Actualmente no existe mucha inf"ormación de si los estrógenos pueden tener efectos a nivel traduccional o postraduccional, pero sería 1 TESIS CON FALLA DE ORIGEN 49 interesante invertigar si el E2 puede modular la translocación de los mensajeros al citoplasma o pudiera tener alguna actividad inihibitoria sobre la maquinaria traduccional. Aunque aún no podemos saber cual es el mecanismo responsable de la disminución de IL-8 y de MCP-1 en las células endoteliales. existe evidencia que demuestra que la exocitosis. relacionada con proteínas V AMP-2 SNARE. puede ser inhibida por E2 (89). Otra alternativa puede ser que la regulación del E2 involucre mecanismos no genómicos. como la modificación de las condiciones de oxido-reducción íntracelular (90). Los mecanismos involucrados en los diversos ef"ectos de los estrógenos generalmente se relacionan con la presencia de un receptor específico. Los estrógenos f"orman un complejo al unirse con su receptor. el cual se dimeriza y se une a una región que contiene una secuencia reguladora consenso e induce o reprime la transcripción de genes seleccionados o blanco (40). o a través de su interacción con factores de transcripción inducibles. Todavía no es muy claro como se sintetizan y recambian los receptores de estrógenos en las células endoteliales de cordón umbilical. pues Jensen et. al. (91) reportaron que no detectaron receptores de estrógenos (RE) en dichas células. mientras que. en estudios previos han afirmado que sí (26, 92). Es probable que estos datos contradictorios se debieran a las variaciones propias de los ensayos o al método de detección. En nuestras condiciones. se pudo observar medí ante R T- PCR el RE-¡3 pero no el RE-ot. sin embargo. cuando utilizarnos un anticuerpo dirigido contra el RE-ot. si se pudo localizar la proteína mediante Western Blot. Es probable que el mensajero de la isoforma ot no sea muy estable o bien sea rápidamente utilizado para la síntesis proteica del receptor. Si bien es cierto que no se pudo afirmar cual fue el tipo de receptor más abundante. sí se observaron diferencias en su e)(presión. lo que permite suponer que estas variaciones están relacionadas con la función. En estudios previos se encontró que la isoforma ¡3 está vinculada con la regulación de la oxido nítrico sintasa (eNOS) a través de mecanismos no genómicos. en caveolas de células endoteliales (93). Por lo que es probable que el E2 pudiera favorecer su expresión en nuestras condiciones experimentales. Dado que las isoformas de los receptores pueden tener funciones tejido-específicas o bien respondan a señales diferentes es posible que en las HUVECs el RE-13 sea más abundante o permanezca más tiempo que la isoforma ot. o bien. no se degrade tan fácilmente. TESIS CON FALLA DE ORIGEN 50 Los experimentos con el tamoxifen no fueron suficientes para indicarnos los posibles mecanismos involucrados en el efecto inhibitorio del E2, pues el tamoxif"en puede competir por los receptores de estrógenos como un antagonista (94) como es el caso de la glándula mamaria o como un agonista (95), en el caso del tejido óseo. Además, el tamoxifen es una molécula anti-inflamatoria por si misma (96) e inhibe la expresión de algunos factores de transcripción (97). Recientemente se ha reportado que el tamoxifen puede tener efectos benéficos sobre el sistema cardiovascular, por ejemplo: el tamoxifen y el estradiol evitan la reduccióri del diámetro de la aorta de conejos hipercolesterolémicos (98), y aumentan la producción de oxido nítrico en ratas ovariectomizadas (99). Es posible que la acción del tamoxifen sea dependiente del tejido y de la concentración de estrógenos circulantes, ya que en las HUVECs no pretratradas con E2 se observó un efecto inhibitorio sinérgico sobre la expresión de IL-8, en tanto que en las HUVECs pretratadas, se observó efecto antagonista entre E2 y tamoxifen. En .conclusión, el 17j3-estradiol tiene efecto inhibitorio en la secreción pero no en la transcrip'?ió.n de IL-8 y MCP- J de células endoteliales de cordón umbilical. También se observó que las HUVECs previamente tratadas con E2 secretan menos quimiocinas inducidas por TNF-ot, que las células no previamente expuestas al E2, Jo que permite suponer que el E2 puede estar generando un bloqueo que se mantiene de forma prolongada y que es posible que involucre Ja regulación de moléculas relacionadas con el proceso de traducción o de factores de transcripción como el NFKB, manteniendo un estado de oxido-reducción de tal manera que se dificulte la disociación de la subunidad regulatoria hcB; o bien, que el E2 pudiera inhibir la actividad de moléculas relacionadas con la exocitosis, evitando la secreción. Por lo tanto, parece ser que en mujeres expuestas crónicamente a estrógenos pueden tener una menor activación endotelial que las expuestas de forma aguda. TESIS CON FALLA DE ORIGEN SI CONCLUSIONES 1. Se obtuvieron cultivos primarios de HUVECs con pureza mayor del 95%. 2. El 1 7J3-estradiol inhibió la migración de leucocitos en geles de agarosa, inducida por sobrenadantes de HUVECs estimuladas con LPS. 3. El 17¡3-estradiol inhibió la quimiotaxis de monocitos U-937 en respuesta sobranadantes de HUVECs estimuladas con TNF-a. 4. El 1 7J3-estradiol disminuyó la secreción de MCP-1 e IL-8 por HUVECs estimuladas con TNF-a. 5. El l 7J3-estradiol no tuvo efecto inhibitorio sobre la formación de los mensajeros de MCP- 1 e IL-8 en HÚVEC;¡·estimUladas con TNF-a. 6. Se dete'é:tó la expresión de RE-a y RE-J3 en la HUVECs en nuestras condiciones la cual fue estimul~da~~~h' ;~_:~~tradiol. 7. El tamoxiferí tuvo un efecto inhibitorio sinérgico con el 1 7J3-estradiol sobre la expresión de IL'-8 .en' HUVE.Cs pretratadas con estradiol y estimuladas con TNF-a. 8. El tarríoxifen mostró un efecto antagónico sobre la expresión de IL-8 en HUVECs no pretratadas con estradiol y estimuladas con TNF-a. TESIS CON 5:i . FALLA DE ORIGEN BIBLIOGRAFÍA 1. Ross R. 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Since coronary heart disease in women of reproductive age and/or with estrogen replac~rnent therapy is reduced. our aim '\vas to determine if 17¡3-estradiol hada regulatory effect on the adhesion of lymphocytes to thc endothclium. We pcrfonned U-937 cells adhesion assays in TNF-0<.-stimulated HUVECs, and '\V\! also quantitated IL-8 and MCP-1 in culture supernatants. in the presence or not of 1713-estradiol. The prcscnce of o.- and p-estrogen rcceptors v.·as determined by Western blot and RT-PCR, respectively, whereas the transcription of both chemokincs '\vas evaluatcd by RT-PCR. The results showed a 35% decrease in the adhesion of U-937 monocyte cells to TNF-o.-stimulated HUVECs, anda 54% and 65% inhibition ofTNF-cx-induced IL-8 and MCP-1 secrction by physiological and physiologically high doses of 17~-estradiol. The honnone did not affcct the transcription of both chemokine genes. Tamoxifcn reverted the inhibitory effect induced by l 7~estradiol. In conclusion, l 7~-estradiol modifics the adhesion of leukocytes to endothelial cells by inhibiting the secretion. but not thc gene transcription, of proinflanunatory chemokines. (O 2002 Elscvicr Science Inc. All rights reserved. Kcyi.vords: Atherosclcrosis; Esttogcn; Chcmokincs; Endothclial cells; Cytokincs - Correspondin3 nuthor. Tel.: +52-5-573-291Jx1337;. fllx! +52-5-573-0926. E-mail address: lñnontm..x@Yahoo.coln ~~F~ ~_9ntaño) .. 0024-3205/02/S - see front rnancr C> 2002 Elsevier Science Inc. All rights rcseivcd. Pll: 50024-3205(02)01999-9 TESIS CON F.ALLA DE ORIGEN E. Rodrigue:: et al./ Life Sciences 71 (2002) 2181-2193 Jntroduction The atherogenic process is the consequence of protective, although sometimes excessive, responses to insults to the endothelium and smooth muscle cells of the wall of the artery, preceded and accompanied by inflammation [1]. In this context, the recruitment and migration of important in1mune cells into the arterial intima are important in the pathogenesis of the disease. Women of rcproductive age are protected against coronary bean disease [2], the incidence being half of that observcd in age matched males [3]. Although the protective role of estrogen replacement thcrapy in thc prcvention of cardiovascular disease [4] in 'vomen with documented coronary heart disease is curr.:ntly under scrutiny [5], the mechanism is still under debate [6]. Estrogcns have gene and transcription regulatory cffects [7], modify lipid or carbohydrate metabolism [8]. modulate the thrombotic 111ilieu [9], and exert other direct effects on the vasculature, i.e, inhibition of LDL oxidation in thc subcndothelial space [1 O], ali of which may con tribute to a direct or indircct prevention of cardiovascular diseases. Thc rccruitment of mononuclear cells to the endothelium is regulated by chemoattracting n1olecules secreted by activated vascular endothelial cells [11]. Specific chemotactic cytokines have !:leen classified and subdivided into the CXC and the CC family; IL-8, a mediator of acute inflamn1atory reactions, is a key member of the forn1er, and MCP-1, a mediator in chronic inflammation, of the laner [12]. During monocyte:endothelial cell interaction therc is an increased production of IL-8 and MCP-1 (13], but very little infonnation exists on the possible role of estrogens in this cellular interaction. The aim of this work was to determine if physiological concentrations of estrogen inhibit the adhesion of mononuclear cells to TNF-0t-stin1ulated human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), and whethcr regulation of chemotactic molecules is involved. 1'1cthods Water soluble 1713-estradiol, :fetal calf serum, L-glutamine, N-[2-hydroxyethylpiperazine-N'-[etha- nesulfonic acid](HEPES), bovine gelatine, controlled proccss serum replacement-1 (CPSR-1), Triton X-1 00, Tris, streptavidin-peroxidase complex, diethyl pyrocarbonate, and porcine heparin were purchased from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). M-199 medium with or without phenol red, rype 11 collagenase, RPMI-1640, TRizol, liquid trypsin-EDTA (l x) •were from Gibco Laboratories (Grand Island, NY). Recombinant TNF-et and endothelial cell growth supplement were :from Boehringer-Mannheirn Bioquímica (Mexico, DF). Nitrocellulose rnernbranes were frorn Bio-Rad (Hercules, CA). Purified mouse anti-human Von Willebrand factor and rhodarnine-labelled goat anti- rnouse IgG were frorn Serotcc (Raleigh. NC). Biotin-labelled goat anti-rabbit Ig was from Dako (Carpinteria, CA ). Rabbit polyclonal anti-ERor. (HC20) antibody was from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). BCECF-AM was from Molecular Probes Inc. (Eugene, OR). Quantikine human IL-8 and MCP-1 irnrnunoassays were from R&D Systems (Minneapolis, MN); and agarose and Access RT- PCR systern from Promega (Madison, Wl). Transwell membranes (5 µm-pore size in 24 wells) were from Costar (Cambridge, MA). Supersignal West Pico Chemilumines-cent Substrate was :from Pierce (Rockford, IL). TESIS CON FALLA DE ORIGEN E. Rodrigue:: et al. I Life Sciences 71 (2002) 2181-2193 Human umbilical vein endothelial ce// (FfUVECJ. iso/ation and culture HUVECs isolated from umbilical veins (kindly donated by Dr. Valero, Hospital "Angeles.,, Mexico DF) were obtained with 0.2% type 11 collagenase and were serially passaged on gelatine-free flasks in phenol red-containing M-199 medium (Gibco Laboratories, Grand Island, NY) containing 20% heat- inactivated fetal calf serum and supplemented with HEPES (10 mM), penicillin (100 ug/ml), streptomycin (100 ug/ml), L-glutamine (2 mM), porcine heparin (5 JU/mi), and endothelial cell growth supplement (40 ug/ml). Trypsin-treated cells obtained from the flasks were extensively washed with 2% heat-inactivated fotal calf serum/HEPES saline solution (HSS)(l M HEPES, O. 15 M NaCI, 2.2 g/lt glucose, 4 mM KCJ, pH 7.5) and seeded at 2 x 105 cells/well in 500 µI of phenol red-free M-199 mcdium containing 20% of CPSR-1 and supplemented with HEPES and L-glutamine 48 h before cxperiments. The evaluation of IL-8 and MCP-1 expression and secretion was performed individually for each one of the umbilical cords. Unless otherwise indicated, the endothelial cells were pre-treated with 1 x 1 O - 8 M/ml of 1 7¡?.-estradiol for 24 h; pre-treatrnent in expression experiments !asted 48 h. lnhibition experiments were performed with tamoxifen (1 x 10 - 9 M). Cells were used within three passages and were identified as endothelial by their characteristic rnorphology and presence of von \Villebrand antigen. Endothelial cell viability was not affected by the 17¡?.-estradiol concentrations used in the experiments. Migration assays Cell 1nigraton was assessed in 24-well chemotaxis chambers fitted with 5.0 µm transwell mernbranes. 1-!UVECs obtained from four different umbilical cords were used. Supematants ofTNF-a-stimulated and non-stimulated as 'vell as 17¡?.-estradiol pre-treated and non-treated endothelial cells were added to the Jower wells and 5 x 105 BCECF-labelled monocytc U-937 cells in 250 µJ RPMl-1640 supplemented with 1 0% FCS were added to thc upper wells. The transwell rnembranes were removed after 90 min of incubation at 37 ºC, and the migrated cells were harvested by pipening, washed with sernm-free RPMl- 1640 twice before adding 1.5 ml oflysis buffer (lOo/o Triton X-100 in 10 mM Tris,·pH 9.0) for 20 min. The lysis buffer was recovered and was read at 490 nm in a LS 50B lurninescence spectrometer (Perkin- Elmer). Non-lnbelled U-937 cells served as negative control. Ali the experiments were performed in duplicate. Absolute fluorescence was deterrnined with 5 X 105 labelled U-937 cells. The U-937 cells were labelled with BCECF-AM according to manufacturer's instructions. Bricfly, 1 x 106 /rnl U-937 cclls were incubated for 20 min with 20 µl ofa 1 :500 dilution in PBS ofa 1 mM stock solution and they were suspended in 500 µI of PBS before being used. IL-8 and MCP-1 secretion T'venty-four hours 1 7¡?.-estradiol pre-treated and non-treated endothelial cells were extensively washed with HSS twice and then stimulated with 0.25 ng/ml ofTNF-at and two different concentrations of 17-¡?.-estradiol (1 x 10- 9 and 3.3 x 10 - 9 M) for 2 h at 37 ºC in a 7% C02 humidified atrnosphere. Afterwards the cell supernatant was collected, centrifuged at 3,000 tpm in an Eppendoñmicrofuge for 5 min, and kept al - 20 ºC until use. Extracellular immunoreactive IL-8 and MCP-1 was quantitated with a conunercially available kit, following manufacturer's instructions. At the end of the procedure, the plates were read at 450 nrn with a 570 nm correction in an EL-311 enzyme-linked imrnunosorbent assay m1·v "IS CO"' J.:.r2:l' h FALLA DE ORIGEN E. Rodrígi1ez et al. I Life Scierrces 71 (2002) 2181-2193 render (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT). Results expressed as ng/ml were analysed with Bio-Tek's KC-4 software .. RNA extraction 2 x 1 0 6 endothelial ce lis were incubated in 6 mi volume and 100 mm diameter glass Petri dishes coated with l % gelatine in HSS. Similarly to the other experiments, sorne piares were pre-treated with 1 x l O - 8 M l 7¡3-estradiol :for 48 hrs. Afterwards the plates were washed with HSS, and stimulated with 0.25 ng/ml o:f recornbinant TNF-o. and l x l O - 9 M/ml o:f 17¡3-estradiol :for 2 h at 37 ºC in a 7% humidified atmosphere be:fore obtaining the RNA. At the end o:f the incubation time, media were eliminated and thc cells "vere washed with HSS be:fore total RNA was extracted. TRizol (800 ~ti) were added to HSS-washed Petri dishes :for 5 min at room ternperature be:fore collecting the cells "vith a cell scraper. Cell lysate "vas collected into cold 1.5 nll Eppendor:f tubes and the rest o:f the procedure "vas done according to Gibco BRL instructions. RNA was resuspended in 22 ~ti of ultra-pure water containing 0.02º/o (w/vol) of diethyl pyrocarbonate. Total RNA was quantified using a spectrophotometcr at 00260 and the purity was assessed by detennining the 00260/00280 ratio. Ali sainples had ratios above 1.9. The quality of the extracted RNA was assessed by 2% agarose gel clectrophoresis. RT-PCR Reverse transcription and PCR reactions were per:formed by a single step procedurc using the Access RT-PCR system in a Touchdown, Hybaid Therrnal Cycler (Perkin-Elmer) thermocycler. The final volu111e of the reaction "vas SO µ! of a mixture containing: l µg of sample RNA; 5 U of AMV reverse transcriptase; 5 U of TflDNA polymerase; 1 O µ! of S x AMV /Tfl reaction buffer; 25 mM magnesium sulphate; l O mM of each of the four deoxynuc!eotides; and nuclease-free water. The reaction nlixture was incubated at 48 ºC :for 45 min followed by one denaturation cycle at 94 ºC for 2 min, cycling conditions (40 cycles) were 94 ºC for 30 s, 60 ºC for l min, 68 ºC :for 2 min, and finally 68 ºC for 7 nlin. Ten microliters of each PCR reaction sample were migrated on 2% TBE agarose gels containing ethidium bromide and photographed. Semiquantitative analysis ofthe RT-PCR products was perforrned by densitometric analysis of the gels using Bio-Rad's G5-670 densiton1eter and the molecular analyst version 1.1 sofuvare. The oligonucleotide primers used :for the detection o:f specific cDNA were: 5'- ATTTCTGCAGCTCTGTGTGAAGGTGC-3' upstream and 5'-TTGTGGATCCTGGCTAGCAGA-3' downstream, :for interleukin-8, and 5'-CAAACTGAAGCTCGCACTCTCGCC-3' upstrearn and 5'- ATTCTTGGGTTGTGGAGTGAGTGTTCA-3' downstream, :for MCP-1. The primers used :for the constitutively expressed 'housekeeping' gene ¡?.-actin were 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCCA-3' upstrcarn and 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3' downstrearn. For o.-estrogen receptor espe- cific primers were 5'-AGGCTGCGCTTCGGC-3' upstream and 5'-ACGCATACTTCCCTTGTCAT-3' downstream, and for 13-estrogen receptor (ER¡?.) especific prirners were 5'-TTCCCAGCAATGTCAC- TAACT-3' up-stream and 5'-CTCTTTGAACCTGGACCAGTA-3' downstrearn. The expected length of the PCR product was: IL-8, 749 bp; MCP-1,354 bp; ¡:\-actine, 548 bp; ERo., 410 bp and ERj3, 258 bp. In order to evaluare the RT-PCR conditions, human uterine endometrium obtained frorn a biopsy specimen from a woman undergoing total hysterectomy due to myomatosis, was used as positive control. TESIS CON FALLA DE ORiGEN E. Rodrigue= et al./ Life Sciences 71 (2002) 2181-2193 U'estern blot The presence of a-estrogen receptor was determined in the breast cancer MCF-7 cell line (known to express cxE;,R and p..E2 R) and in 1 x 106 HUVECs stimulated for 8 h with 17-r..-estradiol (1 x io- 8 M). Total protein was obtained from stimulated cells lysed with lysis buffer containing 50 mM Tris, 120 n1M NaCI, 0.5% NP-40, 100 µM NaF, 200 mM NaV, 3 µ1.ml - 1 aprotinin, 10 µg.mi- 1 leupeptin, and 0.58 mM phenyl methanesulfonyl fluoride; 100 µg protein were loaded per Jane and resolved by SDS- PAGE on 7.5% polyacrylamide gels. Proteins were transfered to nitrocellulose membranes and the mcmbrancs were blockcd with a suspension of 5% fat-free milk powder in 20 mM Tris, 137 mM NaCl, 3 1nM KCl and 0.1 o/o Tween, pH 7 .6. After 4 h incubation with HC20 antibody, the blots were washed thrice for 5 min each in NaCl/Tris/Tween. a biotinylated goat anti-rabbit Ig was added for 30 min, blots "'ere washed thricc with NaCl/Tris/Tween, followed by a 30 min incubation with a streptavidin- peroxidase cornplex and ~vashed thrice with NaCl/Tris/Tween. The peroxidase bound to the blot was dctccted using the Supersignal \Vest Pico Chemiluminiscent Substrate. S1atistica/ a11a(Fsis Results were calculated as the mean ± the standard deviation of the mean. Significance of experimental changes was assesed through Student's t-test. Migration assays were analyzed by ANOVA and the Tukey-HSD test using Statistica version 5 software. ncsults E;ffecr of Th'F-~ in endothelial cells The puriry of the cultures was confinned by unifonn positive staining' f;r.von:Willeqrru1d factor. The viabiliry of endothc!ial cells exposed to concentrations as high as 100 ng/m1-'ofrecombinant TNF-a was not altered, but we had previously established that there is·.a diminished [3HFthymidine incorporation, meaning diminished cell proliferation, as the TNF-o<,' .coné:entratfon increases in the endothelial cell cultures (14). Supernatants of endothe/ial ce/Is attracl monocyl~:: . Thc supernatant of the endothelial cells:· at·t;;ct'.e;~'.:more U-937 cells than the medium alone, m:vertheless. the stimulation of endothe!ial cells wiih" 0.25• ng/ml of TNF-a for 2 h induced migration of significantly m.ore cells than the supematant of non-stimulated endotbelial cells (Fig. 1). é.'jfect of 17/J-estradiol on monocyte atrraction by endothelial cells The migration of monocytes induced by the 24 h supernatant of the endothelial cells stimulated with 0.25 ng/ml ofTNF-a for 2 h diminished when physiological (1 x 10 - 9 M) or physiologically bigh (3.3 x 10 - 9 M) doses of 1 7r..-estradiol were added to the cell culture; pre-treatment ofHUVEC cultures with x 1 O - 8 M 1 7 r..-estradiol did not increase the airead y diminished monocyte rn.igration (Fig. 1 ). l TESIS CON .-FALLA DE ORIGEN 200 l 150 i 100 50 i l 1 oJ E. Rodrig11c= et al./ Lijt.• Scfo·nces 71 (2002) 2/,V/-2193 1·1g. 1. U-9.'\7 nlJ!.ff¡ltíon ;1s~ay n.: . ;uh..-. Thc n:::.ults n.:prl.." ... ~rH tht.• n~t.·.-i:~ • ... 1,lnd:1n...1 ~.h:viation of thc c:..;;pcriment,:.; pcrfronnt:d in durilli.-:-:i":..- with fuur diffcn.:nt 1.."Ildoth\..·li:ll cdl !'tlf'\."rnat~u11-. nun-~tu-11~d~t1.:d ¡mJ :--t11111dat.. .. ·d wnh 1 >. 10 '1 l\.t• ur 3.3 .•: 10 - ~ '\1- - 1 :i"'•·\."~tradic..1L •md O :!5 ng':nl of rc:..:c.11nbinant TNF-c... Using tht: po=:;t-:\NO\:'A 1nuhiplc cn1np~ui;.;on Tuk"'"~y-1 ISD tc:sl th~ ~litY1..·rcn1..·i:.,. arnot'!!;! 1h1: grnup:-. :->llll\Vcd ¡1 p -: n.noo:-. ;\Jthout_:h th~·ri..· \\a.-. n1..• !'olatis1u .. ·.al difti.·rcnct! hcnv1..·~n büth 17,'\-t:~tr¡iJiol •'1Hlt'\."f1tl·atl1>TJ:-O 1ht..•111~i.,itnu111 TL-X (4.45 n!:!h11l) ~cLrc.:tion induccd hy -rNF-n sho'-vcd a 54~0 and Sl~'ó diminution in tlic: pn.::-.t.:ll~'C uf 1 :-· 1 o .. l\·l ;;nd 3.3 ,., 1 o - " l\.·I dnscs or 1 71'.-t.:stradiol in the ccll cultures. To conlinn th.: inhibitory rok of 171">-t.:stradinl w.: 1·.:p.:::ncd tht.: cxperirnents with cndothclial cclls prc-trc:n.:d ,..,-ith 1 10 s :'1.1 17¡»-t.:stmcliol tor 24 h beforc stinn1lation "'ith TNF-«. Th1 tE:l !:':~cxp_,~sr:~t to E: Prcviously cxposed 10 E: IL-1< 1-ICP-t IL-S ;>.ICP-1 H.h~d :!.42 ± 0.3'l :!. IS -- 0.36 :!.45 :!: O.SI 1.56 ... 0.4:? 1 lll " 1-1 E: 2.1(1 :!. O.Is l.90 o.:s :!.50 ± 0.47 N.D. 1·~F-1·c 4 . ..::-·· =- l).6:' 2.SJ~· - 0.55 3.5.&·1 :!: 0.52 J.96~ = 0.21 l 10 .. :'1-1 E- 2.05"' 0.6~ 2.10J 0.26 2.67h :!: 0.60 1.ooJ 0.30 ' :; ICI - 1\1 E: :!.18t'> ... 0 . .36 .:?..~s~ 0.54 2.5:?~ :.!: 0.4~ 1.14'1 ... 0.19 - l 10 ' M E: 2.45 O.XI 2.16 = 0.40 2.54 = 0.47 1.27 = 0.23 Rt:sult' ar~ cxprcssc TNF-« (lanes 4 and 8). Cells used to obtain mANXA obrention in lanes | to were not pre-ircated with the high dose (1 < 107% M1) of 17f-estradiol, whercas those from danes 3 to $ were. The middle arrow tu the left margin of the photograph corresponds to f-actin, The numbers in the inset, expressed as an index, represent ie o serniguanttative value Ol the chemokine in relation to fA-actin: Pre-treated AA A AAA A A XK A e E, Tm x Lim e NN a E A A A -1L-8- -B-act- ce TNPF-c == Tmx Ez Tmx - ¡L-8 1.04 2.13 1 0.18 0.36 Fig. 3. MmRNA of IL-8 from 1 = 107% M 17f-estradiol for 48 h pre-tremed endothelial cells. The first lane on the photograph coresponds 10 molecular weight markers. € = non-stinulued HUWECSs; he cell cultures were stimulated witb TINF-a (0.25 ng! mb, Es (1 = 107% 21) Tmx (1 = 1071 tamosifem), Es += Tmx. The numbers in the inset, expressed as an index, represent TESIS CON FALLA DE ORIGEN CS the semiquantitative value of the chemokine in relation to fi-actin. E. Rndrlg11r= et"' / ¡_¡¡;._. ScU"llú'S 71 r..:002) .?lll~/-219.J MCP-1- 2 03 o .:1 0 º' 0.11' 7 , 25 . 2 e o 3 . 2 Fig. 2 ... rnR;'\: ... \. trnn.s~r-ipc!'- ofculturc:d hurn.u1 r.:11lh.l1h ... ·IJ.i1 ... -... ·II, \\:tfh,ut J7¡'•-l.."-"tr;ld1ol and T F-o:. (Janes 1 :ind S). 0.25 ng/ l f T~F-o Clam .. ·s 2 a J '1J. 1 ;..; 10 - "'~1 pg' J nf 17i'.-c-~trad1nl 1 bn.::-. 5 und 7) and 171~-cstradiol ..... F-u (Janes 4 nnd 8). clls u.-.cd In htmn n1RN.-'\ n tcntlon in h1ncs 1 ro -! "ere.: 11-..1 p:-~-tn ... ·~1k·d ,.,, nh t c high dosc: (1 :< t O - ~ i\1} f l f\-cstrndiol. \\'hcn:as 1ho:o0r.: fr lanc:.s 5 t S \\'ere. hc rni ülc arrn\\· 111 thi: kft arg.in f t c ot grnph c rrc.sponds t f'-:ictin. 1'ñc: tltnnbc..•rs in t c i sct . ..:xpn:!'o51.!°J a!" indl!.X. r\,·rn.•s1.:nt th;.: ~e:n1qtiantit;-itivc \.aluc or t c c c:mokinc i n:lati n to f3.-actin. rc-tr atcd ------------------ 111 -- I -8------. --- ~ ...... ·- 13-act-- - - -- -- e -a. x I -8 . 4 . 3 . 8 . 6 ig. 3-. n1 A f 11--8 fron1 1 x 1 O-~ :oc 1\.1 17J'.\-cstr;.uJiol t'Or 8 h pn:-trt:m..: induc..:d r-·ICl'-1 "'-''-'l"Ction o;hL>w..:d a 49'% t.li111inution in cultures cxpo . .;.:d i..·1 thc...· phy~iolugi~al do~c of l 7J-'.-L·:-.tradiol ( J ':-;, 1.96 ng·'1111) 1 but con1pared ,,_·ith thc not l 7i~­ c...·:-.tradiol prc-tn.:atcd cultun.~ th~ inhihititlll rc..:achc..:d a (15'!·;, valuc (.2.83 vs. 1 ng/inl)Crnblc J ). A 1 2 3 4 B 1 2 3 4 5 f·i:~ -! .·\.) RT-PCR ofn1R~A obtainC'1; lani.: ~. E.:...-sti1nuh1tcd 1 IUE~ (0.6"1); Jane 5. non E~-stitnulah:d 1 IUEs (0.42). TESIS CON FALLA DE ORiGEN E. Rodríguez et al./ Life Sciences 71 (2002) 2181-2193 Cltemo/..-ine n1RNA production by endothelia/ ce/Is _ In orcler to determine the possible mechanism of" chemokine secretion, the expression of" IL-8 and MCP-1 was assesed by RT-PCR; mRNA of" both chemokines was detected in 17¡?.-estradiol pre-treated HUVECs but it was interesting to observe that, in not pre-treated cells, MCP-1 mRNA could not be detccted and that the semiquantitative expression of IL-8 mRNA was Jower in relation to the pre-treated HUVECs. It was also interesting to observe that although 1 71?>-estradiol and TNF-0< were good inducers of both mRNAs thcre was a strong inhibition in the expression of both mRNAs, especially the IL-8 messenger, in 17¡:'>-estradiol pre-treated HUVECs (Fig. 2). E.ffect of tamoxifen on rite e:cpression of IL-8 mRNA Bccause our prcvious results (Fig. :?) had shown that there was an enhanced quantitative expression of 1 L-S in 1 7j?.-estradiol prc-treated/TNF-0< stimulated HUVECs, we decided to evaluate whether the effects induccd by 171?>-estradiol reverted with tan1oxifen. The results showed that similar to the observation nrnde with TNF-cx and 171?>-estradiol, tamoxifen + 171?>-estradiol inhibited the expression of" the IL-8 1nessenger (Fig. 3 ). Express ion of oi- or /1-estrogen receptor in HUVECs To evaluate ·whether the eff"ects induced by 171?>-estradiol were mediated by its receptors, we analyzed the expression of cxE2 R and j?.E2 R mRNA. Both n1RNAs were expressed in control human uterus (Fig. 4-A). nevertheless, under our experimental conditions, cxE2R mRNA was not observed in non-pretreated and pre-treated HUVECs (Fig. 4-B). On tite other side, it is worth while mentioning that although J?>- cstrogcn receptor ~vas weakly observed in l x 10 - 8 M 17¡?.-estradiol pre-treated HUVECs it was not present in non-pretreated cells (Fig. 4-B). N U.I -L&.. o z ,._ ,_ ... .- 1 1 -e L&.. " L&.. L&.. o N z N en U) (.) w .- w :E :E -- -- ·- ----56 KDa- Fig. 5. Western blot analysis of Q.-estrogcn receptor in HUVECs non-stimulated (control). E::-stimulated (3.3 x 1 O - 9 M). TNF-a stimulated (0.25 nglml). Positive control experiments werc perfonncd with the MCF-7 cell line non-stimulatcd and 3.3 x 1 O - 9 M c:strogcn-stimulatcd. The 56 kDa protein is pyruvate-kinase. TESIS CON F.ALLA DE ORIGEN 10 E. Rodrigue:: et al./ Lij'é Sciences 71 (2002) 2181-2191 To determine if a-estro gen receptor ·was really absent in stimulated HUVECs a .western blot analysis in TNF-0< stimulated cell cultures 'vas done. The results showed the presence ofthe a~reéeptor although in small quantities (Fig. 5). The qualitative analysis ofthe aE2 R protein iri HUVECs aiid control MCF-7 cells showed that E" alone or in cornbination with TNF-a, enhanéed the secretion of the protein in comparison to non-stimulated HUVECs (Fig. 5). Discussion Atherosclerosis is tightly relatcd to inflamnrntion and fibroproliferativé responses after insults to the endothcliun1 (1]. To induce a proinflHinmatory status we stiinulatcd HUVECs with TNF-0< because, it is a fast and b"ner inducer of chemokines sccretion as cumpared to interleukin-1 ¡?. or lipopolysaccharide ( 15]. Bcsides. it enhanccs adherenc<: of monocytes to thc endothelium and pro1notes migration of inf1ammatory c..:lls iuto th-esu-~diol. ut dos~s equivalt:nt or higher to those detected in non-menopausic and HRT-tn.:at.od woml.!n (20.21]. had a n:gulatory effect upan thc sccretion of both chemoanractant 1nulccules. Our rcsults confirmed that the supetnatant obtaincd from TNF-a: stimulnted HUVECs culturcd with physiological doses of cstradiol had n reduced migration activity for U-937 cells. Further cxperim.:nts dc1nonstratcd that estrogen, at physiological and physiologically high concen- trations, di1ninish.:d tho.: secrction of IL-8 and MCP-1, in accordance to thc results of Yamada et al. [22] and thos.: of Caulin-Glas.:r et al. [23]. An intcresting observation was that thc addition of physiological doses of estradiol to 17¡?.-estradiol pre-treated cultures did not din1inish fürthcr the secretion of IL-8, which suggests that the inhibitory effect of estradiol upon this chemokine has a linlit. Our rcsults indic,He that estradiol has an inhibitory activity upon IL-8 and MCP-1, especially IL-S. chemokin