FACULTAD DE QUÍMICA PROGRAMA DE MAESTRÍA Y DOCTORADO _ EN CIENCIAS BIOQUÍMICAS RELACIÓN ENTRE EL ENVEJECIMIENTO DE COTILEDONES Y LA DISMINUCIÓN DE LA TERMOSOLUBILIDAD DE PECTINAS DURANTE EL ALMACENAMIENTO Y REMOJO DE LA SEMILLA DE FRIJOL T E S I S QUE PARA OBTENER EL GRADO DE: MAESTRA EN CIENCIAS BIOQUÍMICAS P RR E SE N T. A: MARTHA YOLANDA QUEZADA VIAY Tutora: DRA. IRMA BERNAL LUGO MÉXICO, D. F. 2005 m3JO282 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. Autoo s 2 ju: +9 Bbilolecas de la UNE a iónico e impreso el contenido os mi trabajo cono! NomBRe: Hertha Holanda, rpezada Voy ECHA: ma, Somo E PROGRAMA DE MAESTRÍA Y DOCTORADO EN CIENCIAS BIOQUÍMICAS ENTIDAD ACADÉMICA FACULTAD DE QUÍMICA E INSTITUTO DE FISIOLOGÍA CELULAR Of. No. PMDCB/745/2004 BIÓL. MARTHA YOLANDA QUEZADA VIAY Alumna de la Maestría en Ciencias Bioquímicas Presente Los miembros del Subcomité Académico en reunión del día 23 de agosto del presente año, conocieron su solicitud de asignación de JURADO DE EXAMEN para optar por el grado de MAESTRA EN CIENCIAS (BIOQUIMICA), con la tesis titulada “Relación entre el envejecimiento de cotiledones y la disminución de la termosolubilidad de pectinas durante el almacenamiento y remojo de la semilla de frijol”, dirigida por la Dra. Irma Bernal Lugo. De su análisis se acordó nombrar el siguiente jurado: PRESIDENTE Dr. Ernesto Moreno Martínez VOCAL Dra. María Amanda Gálvez Mariscal SECRETARIO Dra. Martha Patricia Coello Coutiño SUPLENTE Dra. Sobeida Sánchez Nieto SUPLENTE Dr. Arturo Navarro Ocaña Sin otro particular por el momento, aprovecho la ocasión para enviarle un cordial saludo. Atentamente “POR MI RAZA HABLARÁ EL ESPÍRITU” Cd. Universitaria, D. F., a 25 de agosto de 2004. EL COORDINADOR DE LA ENTIDAD ACADÉMICA DR. ROGELIO RODRÍGUEZ SOTRES C.c.p. Archivo VNIVER4DAD NACIONAL AVENSMA DE MEXICO A LOS MIEMBROS DE + JURADO DE EXAMEN Por medio del presente manifiesto que he revisado el texto que será sometido a su consideración del (a) alumno (a) de Maestría en Ciencias Bloquímicas BIOL. MARTHA YOLANDA QUEZADA VIAY titulado: “Relación entre el envejecimiento de cotiledones y la disminución de la termosolubilidad de pectinas durante el almacenamiento y remojo de la semilla de frijol” ATENTAMENTE ÉL JP DRA. ¡MAbE LUG PROGRAMA DE MAESTRÍA Y DOCTORADO EN CIENCIAS BIOQUÍMICAS 23 de novembre de 2004 Ing. Leopoldo Silva Gutiérrez * Director General de Administración Escolar UNAM : PRESENTE Me es grato comunicarle que después de revisar cuidadosamente y de discutir mis sugerencias y correcciones al documento de tesis titulado ” “Relación entre el envejecimiento de cotiledones y la disminución de la termosolubilidad de pectinas durante el almacenamiento y remojo de la semilla de frijol” que para obtener el grado presenta el (la) alumno(a) Martha Yolanda Quezada Viay con número de cuenta 9981306-2 y número de expediente 100991021, inscrito(a) en la Maestria (X ) el Doctorado (_ ) en Ciencias Bioquímicas , considero que la Tesis reúne los requisitos establecidos y por ello emito mi VOTO APROBATORIO para que realice la réplica oral. Agradezco de antemano la atención que se sirva prestar a la presente. Aten Dr. Ernesto Moreno Martínez PROGRAMA DE MAESTRÍA Y DOCTORADO EN CIENCIAS BIOQUÍMICAS 23 de novitmbre 2004 Ing. Leopoldo Silva Gutiérrez Director General de Administración Escolar UNAM PRESENTE Me es grato comunicarle que después de revisar cuidadosamente y de discutir mis sugerencias y correcciones al documento de tesis titulado “Relación entre el envejecimiento de cotiledones y la disminución de la termosolubilidad de pectinas durante el almacenamiento y remojo de la semilla de frijol” que para obtener el grado presenta el (la) alumno(a) Martha Yolanda Quezada Viay con número de cuenta 9981306-2 y número de expediente 100991021, inscrito(a) en la Maestría (X) el Doctorado ( ) en Ciencias Bioquímicas , considero que la Tesis reúme los requisitos establecidos y por ello emito mi VOTO - APROBATORIO para que realice la réplica oral, Agradezco de antemano la atención que se sirva prestar a la presente. Atentamente, qua | PROGRAMA DE MAESTRÍA Y DOCTORADO EN CIENCIAS BIOQUÍMICAS 0 de _noyembe de 2004 Ing. Leopoldo Silva Gutiérrez Director General de Administración Escolar UNAM PRESENTE Me es grato comunicarle que después de revisar cuidadosamente y de discutir mis sugerencias y correcciones al documento de tesis titulado “Relación entre el envejecimiento de cotiledones y la disminución de la termosolubilidad de pectinas durante el almacenamiento y remojo de la semilla de frijol” que para obtener el grado presenta el (la) alumno(a) Mariña Yolanda Quezada Viay con número de cuenta 9981306-2 y número de expediente 100991021, inscrito(a) en la Maestría (X ) el Doctorado (_ ) en Ciencias Bioquímicas , considero que la Tesis reúne los requisitos establecidos y .por ello emito mi VOTO APROBATORIO para que realice la réplica oral. Agradezco de antemano la atención que se sirva prestar a la presente. Atentamente, . Dra. Martha Patricia Coello Coutiño PROGRAMA DE MAESTRÍA Y DOCTORADO EN CIENCIAS BIOQUÍMICAS 5_de noviembre de 2004 Ing. Leopoldo Silva Gutiérrez Director General de Administración Escolar UNAM PRESENTE Me es grato comunicarle que después de revisar cuidadosamente y de discutir mis sugerencias y correcciones al documento de tesis titulado “Relación entre el envejecimiento de cotiledones y la disminución de la termosolubilidad de pectinas durante el almacenamiento y remojo de la semilla de frijol” que para obtener el grado presenta el (la) alumno(a) Martha Yolanda Quezada Viay con número de cuenta 9981306-2 y número de expediente 100991021, inscrito(a) en la Maestría (X) el Doctorado (. ) en Ciencias Bioquímicas , considero que la Tesis reúne los requisitos establecidos y por ello emito mi VOTO APROBATORIO para que realice la réplica oral. Agradezco de antemano la atención que se sirva prestar a la presente. Atentamente, : insta, de iria. Foeóolah PROGRAMA DE MAESTRÍA Y DOCTORADO EN CIENCIAS BIOQUÍMICAS _3 de_noñembre de 2004 Ing. Leopoldo Silva Gutiérrez Director General de Administración Escolar . UNAM PRESENTE Me es grato comunicarle que después de revisar cuidadosamente y de discutir mis sugerencias y correcciones al documento de tesis titulado “Relación entre el envejecimiento de cotiledones y la disminución de la termosolubilidad de pectinas durante el almacenamiento y remojo de la semilla de frijoP” que para obtener el grado presenta el (Ja) alumno(a) Martha Yolanda Quezada Viay con número de cuenta 9981306-2 y número de expediente 100991021, inscrito(a) en la Maestría (X) el Doctorado ( ) en Ciencias Bioquímicas , considero que la Tesis reúne los requisitos establecidos y por ello emito mi VOTO APROBATORIO para que realice la réplica oral: Agradezco de antemano la atención que se sirva prestar a la presente. Atentamente, £ “Dr. Arturo Navarro Ocaña RECONOCIMIENTOS (£3 RECONOCIMIENTOS Esta tesis se realizó bajo la dirección de la Dra. Irma Ofelia Bernal Lugo en el laboratotio 104 del Departamento de Bioquímica de la Facultad de Química de la Universidad Nacional Autónoma de México. El Comité Tutoral que asesoró el desarrollo de esta tesis estuvo formado por: Dra. Irma Ofelia Bernal Lugo Facultad de Química, UNAM Dr. Ernesto Moreno Martínez Facultad de Estudios Superiores-Cuautitlin-UNAM Dr. Edmundo Brito De la Fuente Facultad de Química, UNAM Se reconoce la colaboración del Dr. Ernesto Moreno Martínez, Jefe de la Unidad de Investigación de Granos y Semillas de la Facultad de Estudios Superiores de Cuautitlán- UNAM, en cuyo laboratorio se llevó a cabo el almacenamiento del material biológico y las pruebas de la calidad biológica, pruebas físicas y de sanidad de los lotes de semillas utilizados en este trabajo. Se reconoce la colaboración del Dr. Arturo Navarro Ocaña, del Departamento de Química de Alimentos de la Facultad de Química, en cuyo laboratorio se llevaron a cabo los experimentos de identificación de compuestos fenólicos por Cromatografía en Capa Fina, Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución, así como el análisis e interpretación de los cromatogramas y los espectros obtenidos en los ensayos de Espectroscopia Infrarroja con Transformada de Fourier y Espectrometría de Masas. Se reconoce la colaboración del Dr. René Miranda de la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán-UNAM por su asesoría en el análisis e interpretación de los espectros obtenidos en los ensayos de Espectrometría de Masas con Impacto Electrónico y Espectrometría de Masas acoplada a Cromatografía de Gases. Se reconoce la colaboración del Dr. Manuel Jiménez Estrada del Instituto de Química por su ayuda en la obtención de los espectros durante el análisis con Espectroscopia Infrarroja con Transformada de Fourier. Se reconoce la colaboración del Dr. José Manuel Méndez Estivalet del Departamento de Química Orgánica de la Facultad de Química, en cuyo laboratorio se llevó a cabo la extracción y cuantificación de ligninas. RECONOCIMIENTOS SS Se reconoce la asesoría técnica de la M. en C. Carmen Patra González en el adiestramiento para el uso de los equipos y materiales del laboratorio y en los experimentos de la Sección de Estrés Oxidativo. Se reconoce la asesoría técnica de Margarita Romero Avila en la extracción y cuantificación de ligntnas. Se reconoce el apoyo técnico brindado por la M. en C. Laurel Fabila Ibarra durante la realización del trabajo de tesis. Se reconoce el apoyo de la M. en C. Magdalena Reyes Téllez de PRONASE por proveer el material biológico utilizado en este trabajo. Se reconoce especialmente a la Dra. Graciela Meza del Instituto de Fisiología Celular-UNAM, a la Dra. Rachel Mata del Departamento de Farmacia de la Fac. de Química-UNAM y a la Dra. Gloria Benitez King del Instituto Nacional de Psiquiatría por las facilidades otorgadas para el uso de sus instalaciones e infraestructura, Se reconoce el apoyo de Leticia García como Secretaria del Posgrado en Ciencias Bioquímicas en la logística académica durante la realización de esta tesis. El proyecto fue apoyado por la DGAPA-UNAM (208998). Durante los estudios de Maestría percibí una beca otorgada por CONACYT y Licencia con goce de sueldo otorgada por la FES- Cuautitlán-UNAM. “Esta tesis fue defendida en examen presentado el día El Jurado de Examen estuvo constituido por: Presidente Dr. Emesto Moreno Martínez FES-Cuautitlán, UNAM Vocal Dra. María Amanda Gálvez Mariscal Facultad de Química, UNAM Secretario Dra. Martha Patricia Coello Coutiño Facultad de Química, UNAM Suplente Dra. Sobeida Sánchez Nieto Facultad de Química, UNAM Suplente Dr. Arturo Navarro Ocaña Facultad de Química, UNAM INDICE GENERAL (Ly — O Índice General Índice General coin rare 1 dice de Tablas cc eee 4 Índice de Figuras es 6 RESUMEN ci een 8 ABREVIATURAS L INTRODUCCIÓN ones 11 ll. ANTECEDENTES cmcicciniini nenes 12 1. Importancia del grano de frijol ....ooncacancnnconinneennnnennr anno errereenrceannarrne reco rrrnerernerees 12 2. Estructura de la semilla de frijol ...ooooccncnnnonannnennono roororne ne recerca corrers rene nr 12 3. Pared Celulal .ocninnnnonnn erre 14 4. Entrecruzamientos entre los componentes de la pared celular ...ooonionnononcnenneresmesmessss» 21 5. Especies reactivas de oxígeno (ERO) ccracoccnnonnninnnnnncnnnnnannenrnncnn cerraron aereos 25 6. Efectos ambientales sobre las características culinarias y nutricionales del grano de frijol A ess 28 7. Efectos de las condiciones de almacenamiento sobre la calidad de las semillas ............... 29 8. Endurecimiento de frijol.......o.oococomm... JUSTIFICACIÓN enciccnanononnnnnnnnecconnonorceorenrrnasmecnes IL. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS ccnccccnnnnanooooons HipótOSiS .ccaocononncnnoronon creo ren cenrrenenrnrrnnernrr ne recono Objetivo General. ..coccocnnoncennerrennencernnenannreerosss Objetivos Particular seee IV. MATERIALES Y MÉTODOS cn es 37 1. Material DIOlÓBICO rc erro 2. Evaluación del contenido de humedad de la semilla 3. Determinación del tiempo de cocción del frijol .......... 4. Almacenamiento de la semilla.......oooococinininnnnnorenncecoronnernninennon nono ce rare ceneracaran one re ne cerrara 5. Capacidad de hidratación e hinchamiento de la semilla .........onoonocnonnoneninnonacnonicnorremrerrrcereso 39 INDICE GENERAL (£3 A O A 6. Aislamiento y purificación de la pared celulat ....coononciinnonnnnnonenncanenceenaren re e ro 40 7. Extracción de pectinaS mmm rn ner noneoe amenas 40 8. Determinación del contenido de ácido galacturónico en las pectiMaS moocccnnicannnoniononarensess 40 9. Determinación de azúcares totales .....ocmnonannmacamnmenaern rre rr nera acr nna o 41 10. Extracción de compuestos fenólicos unidos covalentemente a la pared celular de cotiledones de frijol.....onninionininicnnnnm erre 41 11. Extracción de compuestos fenólicos totales a partir de harina de frijol ..........aa.arrmmr.».. 42 12. Determinación de la concentración de compuestos femólicosS ...crocacccononconicoonnenonenanreases» 42 13. Identificación de ácido ferúlico y ácido diferúlico con la técnica de cromatografía en Cap a cc reee 43 14. Identificación de ácido ferúlico con la técnica de cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLO) coin 43 15. Identificación de ácido ferúlico con la técnica de espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier (FT-TR) coccion e 44 16. Identificación de ácido ferúlico y ácido diferúlico con las técnicas de espectrometría de masas con impacto electrónico (MS-ED), masas-masas (MS-MS), y espectrometría de masas acoplada a cromatografía de gases (GU-MSaccamamononnnnornoorennnnnneeeerennnrn careers 44 17. Determinación del contenido de lignina en las paredes celulares .ococonconnnneennneninnmerss. 44 18. Extracción de proteínas de pared Celada oo. ronenernrnenrn enn 45 19. Cuantificación de ProteÍDAS mmm ener eee 46 20. Electroforesis en geles de acrilamida: SDS-PAGE mccanncnonncnnononenrnerenncarereerennerenerreenness 46 21. Determinación del contenido de carbomiloS ......o.oronomoneonsarnnencnnernrrrnes recorren cenas 48 22. Determinación del contenido de malonil-dialdehído (MDA) ccccanconnonnnnnonionnnocarmmnnenens- 49 23. Determinación de la concentración de peróxido de hidrógeno (H203)..a.accemacornrrorniros: 50 24. Obtención de los extractos enziMáticOS .ooomonmenconncnnnnnnernne rene rnrone ereneamrrnnnrnerenareenreenans 50 25. Determinación de la actividad de la peroxidasa (POB oiccciononiconenenecanonorenrcnrmecrenoess 50 26. Determinación de la actividad de la catalasa (CAD)cononcinninnnnoncanonenennenenencnnncenennencaninnsss 51 27. Determinación de la actividad de la superóxido dismutasa (SOD) .oucccannannnrroornoernceses 51 28. Diseño experimental y análisis estadísticO .uacocommncnromennnn comerse reee 52 INDICE GENERAL ((3 Y. RESULTADOS cnica ceros 53 1. Cuantificación y caracterización química de las pectinas de ftijOl...oo.onnoninnmmmm 53 2. Identificación del tipo de pectina modificado por almacenamiento inadecuado.............. 54 3. Entrecruzamiento de proteínas de pared celular con posible formación de una red que atrapa físicamente a las PectinAS ...cocciocnncnnonnonnnnnnnrnnrnnoron concretan nano none 56 4. Posibles mecanismos involucrados en la disminución de la solubilidad de la pectina.....59 VI DISCUSIÓN cccccccnacanannnonnroonoornnnnnn errores VII. CONCLUSIONES VII. PERSPECTIVAS IX. BIBLIOGRAFIA X. APÉNDICE 1. Selección del material biológico 2. Características de cocción e hidratación de lotes de frijol almacenados en condiciones A 102 3. Purificación de la pared celular: optimización del MÉtOdO ..ocoononcnnnicononiancnnonennnne rociero 109 INDICE DE TABLAS (Cy A A Índice de Tablas Tabla 2.1. Reacciones involucradas en la generación de radicales de OXÍBenoO ..ccoriccononnrncnoorinnanerros 26 Tabla 4.1. Soluciones para la preparación de geles de acrilamida al 10V...oocmonannononemeoss 47 Tabla 4.2. Soluciones para la preparación de amortiguadores de corrida y de MUuesttAS.............-. 47 Tabla 4.3. Preparación de soluciones utilizadas en la tinción y fijación de geles de acrilamida....48 Tabla 5.1. Pectina aislada de pared celular de cotiledones de frijol.........aoomenenmeinnneensciareos 53 Tabla 5.2. Peso del extracto de los fenoles unidos covalentemente a la pared celular y su concentración de proteína y ácido galacturónico enn 61 Tabla 5.3. Contenido de fenoles totales en harina de cotiledón de dos variedades de frijol. ....... 69 Tabla 5.4. Niveles de fenoles unidos de forma no covalente a la pared celular purificada de cotiledones de la variedad de frijol FM. cooconcncononacanorioonononrnrrenenanins trees 70 Tabla 5.5. Niveles de ligninas encontradas en la pared celular de cotiledones de semillas remojadas de dos variedades de frijOl.......icoonnancononnnenconconncnnnorerenneenneerrenennerenererereeeeseess 70 Tabla 5.6. Contenido de proteínas oxidadas en los granos secos y remojados de la variedad de frijol flor de mayo almacenados en condiciones de 75% HR y BO Canncaconnnnnaninnconcannarennnnooos 71 Tabla 5.7. Nivel de lipoperoxidación membranal en granos secos y remojados de la variedad de frijol FM almacenados en condiciones de 75% HR y 30% Conmoocacainnncoonnonnonnnnmannonienenereerereoos 72 Tabla 5.8. Concentración de peróxido de hidrógeno en frijol almacenado en condiciones de DER y rc erre 72 Tabla 5.9. Actividad del sistema enzimático de defensa contra especies reactivas de oxígeno de cotiledones secos de dos variedades de frijol almacenados en condiciones de 75% HR y Tabla A.1. Tiempos de cocción de diversos lotes de dos variedades de frijol provenientes de la zona del Bajío cosechados en diferente AO .occonnarnoennnenoremnnrernennnnrnrne rec n e e o 101 Tabla A.2. Efecto del período de 165 días de almacenamiento a 75% HR/30? C sobre el número de granos cocidos en cinco horas de ebullición en las muestras de dos variedades INDICE DE TABLAS (£y O Tabla A.3. Rendimiento de pared celular obtenido con diferentes métodos de homogeneización de las muestras de harina de cotiledón en el ensayo de purificación de la pared celular....110 Tabla A.4. Rendimiento de pared celular obtenido con diferentes tipos de amilasa en el ensayo de purificación enzimática de pared celular. ..onocncanannonoconononnonnennncarrennrenennnnrreereernerctianeoeeo 110 Tabla A.5. Rendimiento de pared celular (mg/g harina de cotiledón) obtenido con diferentes condiciones de incubación de las muestras de cotiledones con la enzima amilasa en el ensayo de purificación de la pared celular. cooconnicnconononnnnnnarnnenccennnronermeneneor censo creer 111 Tabla A.6. Rendimiento de pared celular obtenido con diferentes concentraciones enzimáticas en el método de purificación de pared celular. ...... A 112 INDICE DE FIGURAS (Ly Índice de Figuras Figura 2.1. Anatomía de la semilla de ErijOl ccciconicncinncnrnononnerencennnennes r er rre nero ae 13 Figura 2.2. Micrografía mostrando la estructura de las células de cotiledón.....oooooniocicnionnnrcnorarroros 14 Figura 2.3. Principales componentes de la pared celular de angiospermas y algunos enlaces entre ÉSMOS con RR RARA RR Rana 16 Figura 2.4. Estructura de la pectna mccicinonnnnnnnnnncnn eee rene 18 Figura 2.6. Estructura de los precursores de ligniMa ....ccoconnnicnnnnenencnnonenorncrnonnrnnennnrernnnrrarorieero neos 20 Figura 2.7. Estructura de entrecruzamientos covalentes entre polisacáridos y proteínas en paredes nO lignificA AS cc ross 23 Figura 2.8. Estructura de los posibles entrecruzamientos covalentes entre polisacáridos y ligninas en la pared celular de pastOS .cicnciconnconncnnnnnncnonnnr narrar 25 Figura 4.1. Determinación del TC 50 coocionianannonnnenn consciencia 38 Figura 5.1. Caracterización química de la pectina extraída en paredes celulares de cotiledones de e 55 Figura 5.2. Niveles de proteína total en la pectina extraída de la pared celular de frijol ............... 56 Figura 5.3. Contenido de proteína en las fracciones de pectina de paredes celulares de cotiledones de frijol......conciciinininnm erre 57 Figura 5.4. Electroforesis (SDS-PAGE) de proteínas obtenidas con el MÉtOdO cocinas 58 de Hernández-Unzón (1988) cmo nenes 58 Figura 5.5. pH del agua de remojo de las semillas de frijol almacenadas en condiciones de endurecimiento moderado (75% HR /30% Cl) encrinciocanonncinnonconnenrncenrerennerarnerr ne es nero 60 Figura 5.6. Cromatografía en capa fina de los fenoles unidos covalentemente a la pared celular de cotiledones de frijol. ...occonninnonornmmarr nero rnrereretermnernees 62 Figura 5.7. Espectro de FT-IR de los fenoles de la pared celular de frijol flor de mayo control63 Figura 5.8. Espectros de FT-IR de los fenoles de la pared celular de la variedad FJ] control y EAQULeCidO inci een 64 Figura 5.9. Espectros de FT-IR de los fenoles de pared celular de la variedad FM control y endurecido nee 65 INDICE DE FIGURAS (£) PP O Figura 5.10. Espectro MS/MS para la huella m/z= 194 en frijoles de la variedad flor de mayo Figura 5.11. Espectro MS/MS para la huella m/z= 194 en frijol flor de mayo endurecido ........67 Figura 5.12. Propuesta de fragmentación del ácido ferúliCO vanccnocamnmonnnor coronas 68 Figura 5.13. Peróxido de hidrógeno en frijol almacenado en condiciones de 85% HR y 40” C.73 Figura 5.14. Efecto de la concentración del peróxido de hidrógeno en el agua de remojo sobre el TCso de granos de frijol de la variedad flor de mayo fresCO mnccmacconorrennoornoriernanernrirerare 74 Figura 5.15. Efecto de la concentración del peróxido de hidrógeno en el agua de remojo sobre el TCso de granos de frijol de la variedad flor de Mayo .ouonaomnamermesrenrososo. nenes 75 Figura 5.16. Actividad del sistema enzimático de defensa contra especies reactivas de oxígeno.77 Figura 6.1. Dominios de ramnogalacturonano y homogalacturonano de pectiMAS .ccaccconononannnooo 79 Figura 6.2. Modelo de la pared celular de cotiledones de frijol ÍLSCO...araccaconoorooniinannennennernrrrcrees 83 Figura 6.3. Modificación propuesta de la pared celular de cotiledones de frijol en condiciones de almacenamiento adecuado cinc rt 83 Figura A.1. Tiempo de cocción de las semillas de frijol almacenadas CM emmonnnonarnnionoreonons 103 condiciones de endurecimiento moderado (30% C /75 % HR) oooocicnncccononnononcnnconnnonenennes r tar 103 Figura A.2. Tiempos de cocción de los granos de frijol almacenados en condiciones de endurecimiento moderado (75% HR/30% Cjecccacainnnannnonoronninneneenncnrnennrnnerennnr ar nas 105 Figura A.3. Velocidad de endurecimiento de frijol almacenado a 75% HR y 30% Co ooccccccnicnacs 106 Figura A.4. Efecto del tiempo de almacenamiento sobre la capacidad de hidratación de los granos de ic eee 107 Figura A.5. Efecto del tiempo de almacenamiento sobre la capacidad de hinchamiento de los granos de dos variedades de frijol...........cuonormmnsrrnemrrrnnenceneeeeeeeetss 108 Figura A.6. Fracción enriquecida en pared celular vista al microscopio compuesto (40X)........113 Figura A.7. Rendimiento en peso seco de la pared celular de ErijO .occonniccnninnennncioninnnecrcereeos 114 RESUMEN (3 RESUMEN Las semillas de frijol almacenadas en condiciones inadecuadas de humedad y temperatura son susceptibles de deterioro bioquímico. La pared celular es susceptible a presentar ciertas modificaciones que disminuyen las propiedades mecánicas de extensibilidad y permeabilidad afectando su textura. Si el almacenamiento inadecuado es prolongado, se promueve el proceso de endurecimiento de las semillas. En este trabajo se estudiaron diversos factores que pudieran estar involucrados en este proceso. La composición química de pectinas aisladas de pared celular de cotiledones de dos cultivares de frijol (flor de mayo RMC y flor de junio Marcela) almacenados en dos condiciones de T y HR (30? C / 75% HR ó 40? C/ 85% HR) fue diferente. El ácido galacturónico fue más abundante en las primeras que en las segundas. El almacenamiento inadecuado de la semilla de frijol resultó en una disminución de la velocidad de termosolubilidad de las pectinas y promovió la lignificación. El entrecruzamiento ¿a muro entre estos dos componentes —pectinas y ligninas- de pared celular fue el factor determinante en la disminución de la capacidad de termosolubilidad de las pectinas en ambas variedades de frijol. Se encontraron evidencias indirectas de la participación del ácido ferúlico durante el entrecruzamiento de pectinas. No se encontraron indicios de la participación de las proteínas de pared celular en la insolubilidad de pectinas. Las condiciones de almacenamiento que promueven un endurecimiento moderado (30* C/ 75% HR) no se asociaron con un estrés oxidativo significativo. ABREVIATURAS (Xy ABREVIATURAS AN azúcares neutros AN/AU proporción de azúcares neutros con respecto a los ácidos urónicos AOAC Association of Official Analytical Chemists ATP adenosín trifosfato AU ácido urónico BSA albúmina de suero bovino CaCl cloruro de calcio CAT catalasa Cu? cobre DFA ácido diferúlico DNA ácido desoxirribonucleico DPPH radical 2,2-difenil-1-picrilhidracilo ERO especies reactivas de oxígeno EtoAc acetato de etilo FA ácido ferúlico Fe2* hierro EJ frijol de la variedad flor de junio FJC flor de junio fresco FJE flor de junio endurecido EM frijol de la variedad flor de mayo EMC flor de mayo fresco FME flor de mayo endurecido FT-IR espectroscopia infrarroja con transformada de Foutier GC guanidina 6M-cloruro de calcio CaCl 0.1 M GCD guanidina 6M-CaCt> 0.1 M- ditiotritol 5 mM GC-MS espectrometría de masas acoplada a cromatografía de gases H20 agua HO» peróxido de hidrógeno H2SO, ácido sulfúrico HCI ácido clorhídrico HCIO»s ácido perclórico HEPES 4-(2-Hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic acid HO radical hidroperoxilo HOAc ácido acético HPLC cromatografía de líquidos de alta resolución HR humedad relativa HRGP glicoproteínas ricas en hidroxiprolina ISTA International Seed Technology Association KBr bromuto de potasio ABREVIATURAS (€> O O KCI cloruro de potasio kDa kiloDalton KOH hidróxido de potasio m/z relación masa-carga eléctrica MDA malonil di aldehído ml mililitro MS-El espectrometría de masas con impacto electrónico MS-MS masas-masas NaCl cloruro de sodio NaCIOs hipoclorito de sodio NaOH hidróxido de sodio nd no determinado nm nanómetro Or anión superóxido O» oxígeno molecular OH alcohol PC pared celular PMSEF phenylmethanesulfony] fluoride POX peroxidasa PRONASE Promotora Nacional de Semillas RMC resistente al mosaico común RNA ácido ribonucleico SAGARPA Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación SDS Sodium Dodecyl Sulfate SDS-PAGE Electroforesis en geles de acrilamida SOD superóxido dismutasa T tempetatura TBA ácido tiobarbitúrico TCso tiempo en minutos al cual ya se ha cocido el 50% de la muestra de frijol 'TCA ácido tricloroacético TEMED N,N,N?N, -tetrametilenodiamina TEFA ácido trifluoroacético TLC cromatografía en capa fina UV luz ultravioleta V Volt £ coeficiente de extinción molar 1 longitud de onda * C grados centígrados 10 INTRODUCCIÓN (y 1. INTRODUCCIÓN Para su consumo, el frijol (Phaseolus vulgaris L.) al igual que otras leguminosas, debe ser cocido. El proceso consiste en un período de remojo en agua seguido por un tratamiento térmico, manteniendo el grano en agua en ebullición, hasta que adquiere una textura y un sabor adecuados (Quast y Dasilva, 1997). La suavización del grano durante la cocción se debe a la separación de las células del cotiledón, la cual se efectúa como consecuencia de la termosolubilidad de la pectina (Bernal es al, 1997; Waldron ez al, 1997), localizada en la lamela media de la pared celular (Rao y Luna, 1986; Carpita y Gibeaut, 1993). Por lo tanto, cualquier factor que modifique los componentes de la lamela media afectará en forma importante el tiempo de cocción de la semilla. Cuando los frijoles frescos se almacenan bajo condiciones adversas de alta temperatura (> 10% C) y humedad relativa (> 50 %), su tiempo de cocción aumenta y se dice que la sernilla ha envejecido. Esta característica se conoce como endurecimiento de frijol. Los frijoles con este defecto tienen menor valor nutritivo, disminuyen su digestibilidad, requieren largos tiempos de cocción y son menos aceptables por el consumidor. Está bien establecido que la pectina de frijol endurecido presenta una menor termosolubilidad que la del respectivo control (Whitmore, 1976; Srisuma el al, 1991; Esquivel, es a), 1992; Medina et al, 1993; Brownleader et al, 1995; Brady ef a/.,1996). Diversos mecanismos se han propuesto para explicar esta resistencia térmica de la pectina (Muller 1967; Molina ef al. 1976; Whttmetre 1978; Varriano-Marston y Jackson 1981; Hincks y Stanley 1986; Srisuma el al, 1989; Moura 1998) y en todos ellos se han reportado evidencias en contra y a favor. Los resultados contradictorios en la literatura sobre la participación de diversos factores en el endurecimiento, posiblemente pueden atribuirse a las características propias de cada variedad de frijol utilizada en los diversos trabajos y a condiciones muy específicas de almacenamiento inadecuado y manejo de las muestras previo a la cocción. Con la finalidad de establecer el mecanismo por medio del cual las pectinas disminuyen su termosolubilidad, en este trabajo se estudiaron diversos mecanismos que pudieran estar involucrados en esta modificación. 11 ANTECEDENTES S 1. ANTECEDENTES 1. Importancia del grano de frijol En los países en desartollo hay una deficiencia crónica de proteínas en la dieta. Las leguminosas son buenas candidatas para mejorar esta condición por su bajo costo y por ser de dos a tres veces más ricas en proteínas que los granos de cereales (Salunkhe, 1985). Las semillas maduras de las leguminosas también son fuente de minerales y vitaminas. Por otro lado, contienen una variedad de constituyentes tóxicos, como flavonoides, alcaloides y algunas proteínas poco comunes. Afortunadamente, muchas de las toxinas se eliminan durante el procesamiento, en el temojo en agua y en la cocción. Entre las leguminosas cultivadas se encuentran diversas vatiedades de importancia económica, por ejemplo, soya, frijol, haba, lenteja, garbanzo, chícharo, etc., que son producidas en todos los continentes del mundo. En México, el cultivo de frijol ocupa el tercer lugar en superficie cosechada, después del maíz y del sorgo (SAGARPA, 2002). El patrón de consumo depende de la disponibilidad del producto en cada región y en Sudamérica, tanto como en Centroamérica y en México, el frijol común Phaseolus vulgaris es el más consumido en una amplia variedad de formas. 2. Estructura de la semilla de frijo! La semilla madura de Phaseolus vulgaris consta del embrión y la cubierta de la semilla o testa. En la figura 2.1 se muestra la anatomía de la semilla de frijol (Tovar, 1997). En la testa se localiza el hilio, que es una cicatriz ovalada que aparece en el lugar donde la semilla estaba unida al funículo. A un lado del hilio se localiza una abertura, el micrópilo y al otro lado se localiza un borde llamado rafe. El embrión consiste de un eje embrionario con dos cotiledones. El eje embrionario está compuesto por el hipocotilo al cual están unidos los cotiledones, la radícula y la plúmula (el ápice del brote con las primeras hojas). Los cotiledones son abultados y constituyen el 90% de la masa de la semilla (Liu, 1995). 12 ANTECEDENTES y Figura 2.1. Anatomía de la semilla de frijol Fuente. Tovar, 1997. En la figura 2.2. se presenta la estructura de las células del cotiledón (Tovar, 1997). Las células del cotiledón son elípticas y están empaquetadas muy unidas entre sí. Por la desecación que sufre la semilla al madurar, los organelos se reducen y en las células solamente se observan gránulos de almidón diseminados entre los cuerpos proteicos. Los gránulos de almidón -sonr oblongos o esféricos con dimensiones de 20 a 35 pm. Los cuerpos proteicos son mucho más pequeños y más uniformes, varían de 1.0 a 1.5 um de diámetro. El núcleo de estas células es una masa viscosa, amorfa, con el material de DNA rodeado por la envoltura nuclear (Tovar, 1997). Cada pared celular está bien definida y en la unión de tres células se encuentra un espacio intercelular. Estos espacios se forman durante el desarrollo y permiten el flujo de gases a través del tejido (Goodwin y Mercer, 1972). Las esquinas de los espacios intercelulares son la unión de dos lamelas medias, las cuales están constituidas principalmente por pectina (Carpita y Gibeaut, 1993). 13 ANTECEDENTES Á y Figura 2.2. Micrografía mostrando la estructura de las células de cotiledón. pm, membrana plasmática; pc, pated celular; la, lamela media; ei, espacio intercelular; ga, gránulo de almidón; cp, cuerpos proteicos. Fuente:Tovar, 1997. 3. Pared celular 3.1. Organización de la pared celular La pared celular de plantas supetiores típicamente está constituida por tres capas denominadas: lamela media, pared primaria y pared secundaria. Sin embargo, las células juveniles en crecimiento, algunas células de almacenamiento maduras, las células fotosintetizadoras de las hojas y todas las células del parénquima, vistas con el microscopio electrónico, generalmente muestran sólo dos regiones en la estructura que las rodea; se trata de la pared primaria y de la lamela media. Esta última es el componente que mantiene unidas entre sí a dos células adyacentes (Carpita, 1990; Goodwin y Mercer, 1990; Anderson y Beardall, 1991). 3.2. Composición y organización química de la pared celular Las paredes celulares están constituidas por diversas moléculas como catbohidratos, proteínas, lignina, agua, algunos iones y moléculas inorgánicas y en algunos casos están presentes otras moléculas orgánicas como cutina y suberina (Carpita y Gibeaut, 1993; García y Peña-Valdivia, 1995; Cosgrove, 1997; Rodionova y Bezborodov, 1997; Bennet y Rose, 1999). La complejidad química de la pared celular se incrementa si se considera que la proporción, composición y 14 ANTECEDENTES y organización de la mayoría de estos constituyentes es variable entre especies, tipos de células y aún entre células vecinas y que se modifica durante el desarrollo y la exposición de la planta a diversos factores ambientales (McNeil es a/, 1984, Selvendran, 1985; Showalter, 1993). De manera general se han estimado las proporciones de los constituyentes de la pared celular como sigue: 10% proteína y 90% carbohidratos que incluye 9-25% de celulosa (Darvill ez 22, 1985; Selvendran y Ryden, 1990). Debido a la organización espacial de los componentes químicos, en la pared celular se distinguen dos fases: la microfibrilar y la amorfa (Aspinall, 1980; Darvill es al, 1980). La fase mictofibrilar está constituida por celulosa y la fase amorfa o no cristalina está formada por dos clases de polisacáridos: las sustancias pécticas y las hemicelulosas; ésta también contiene proteínas estructurales y catalíticas, compuestos fenólicos, agua y minerales (Northcote, 1972; Preston, 1979). En la figura 2.3. se muestra un diagrama de la interacción entre los diversos componentes de la pared celular. 15 ANTECEDENTES y Celulosa Jill / ¡ E-5-5- 7-66 EY 0-06 oO + » . ., CA AAA AAA A AAA Ec-e-6-6-6-6-6- 46 $ 90/00-04-50:00-09-96666943 + +. + >. $) +...» XXX 6 - Xlloglucana 8 9 ul OY RGI > ——E EX arabinogalactanas So -A-A-A-A=9:9=L-L-L-R Arabinoxllanas- - - Te Extensina DE- D A T - D C AD C - O - - G E G F RGI Figura 2.3. Principales componentes de la pared celular de angiospermas y algunos enlaces entre éstos El diagrama incluye (+) puentes de hidrógeno entre: (1) celulosa-celulosa, (2) xilogtucana-celulosa y (3) xilana-celulosa; (0) uniones de calcio entre (4) homogalacturonana-homogalcturonana; (+) otros enlaces iónicos entre: (5) extensina-pectina; (:) acoplamiento de fenoles entre (6) extensina-extensina, (7) pectina-pectina y (8) arabinoxilana-arabinoxilana; (=) enlace éster entre: (9) pectina-celulosa; y (-) enlace glucosidico entre (10) arabinogalactana-ramnogalacturonana y (11) pectina-extensina. Los azúcares representados son G, glucosa; X, xilosa; U, ácido galacturónico; A, arabinosa, R, ramnosa, L, galactosa; a, aminoácido; y, tirosina o isoditirosina; 9D, ácido ferúlico; D:9, ácido diferúlico. Fuente: Brett y Waldron, 1990. 16 3.3. Polisacáridos 3.3.1. Celulosas Las fibras de celulosa forman el componente más resistente de la pared celular, tanto a la hidrólisis química como a la enzimática. Están compuestas de cadenas no tamificadas de f-(1- 4)-D-glucano. La función de este polímero es la de formar el esqueleto y proveer de forma y fuerza a la pared celular. 3.3.2. Hemicelulosas Las hemicelulosas se pueden extraer con NaOH o KOH, las cuales rompen los enlaces ésteres pero no por agentes quelantes en frío y pueden unirse mediante puentes de hidrógeno a la celulosa. Incluyen a los xilanos que representan el 5% de la pared celular primaria en dicotiledóneas, el 20% de las paredes celulares primarias de pastos y 20% de la pared celular secundaria en pastos y dicotiledóneas. También los xiloglicanos están en este grupo, forman el 20% de las paredes celulares primarias de dicotiledóneas y de 1-5% en pastos. La calosa es otro polímero del tipo de las hemicelulosas, la cual se forma como una capa delgada entre la membrana plasmática y la pared, presente por ejemplo en las células del floema (Fry, 1988). 3.3.3. Pectinas Las pectinas son polisacáridos de moléculas de ácido D-galacturónico (figura 2.4.) que están unidos por enlaces a (1-4), algunos de cuyos grupos carboxílicos están esterificados ya sea con metanol (metoxilados) ó con ácido acético (acetilados). Las pectinas pueden presentar cadenas laterales de azúcares neutros como tamnosa, galactosa, arabinosa, xilosa, entre otros (Blancas, 2001). La pectina cuenta con tres dominios característicos: homogalacturonanos, formados de cadenas no ramificadas de residuos de ácido galacturónico y algunos bloques intercalados de ramnosa, galactosa y arabinosa (García y Peña-Valdivia, 1995); un segundo dominio formado por los ramnogalacturonanos tipo 1, que representan el grupo más abundante en dicotiledóneas y están constituidos por una estructura formada por la repetición del disacárido galacturonil- ramnosil, del cual alrededor del 50% de la ramnosa presenta ramificaciones de azúcares entre los que predominan galactosa y arabinosa formando galactanos, arabinanos o arabinogalactanos (Pacheco, 2003) y un tercer dominio constituido por los ramnogalacturonanos tipo II. Este 17 ANTECEDENTES «S FF A dominio es altamente conservado y está formado por un eje tico de ácido galacturónico con cadenas laterales que contienen once diferentes azúcates (Willats, 2001). De acuerdo a su solubilidad en agua, las pectinas se clasifican en tres tipos de sustancias pécticas: las propectinas, polímeros de alto peso molecular insolubles en agua (Robertson, 1979); los ácidos pectínicos o pectinas altamente metiladas, solubles en agua (Mcfeeters y Armstrong, 1984) y los ácidos pécticos o pectinas poco metiladas (pectatos), que pueden interaccionar con jones y cuya solubilidad depende de la cantidad de cationes a ellos asociados (Hudson y Buesscher, 1986). Comercialmente, han adquirido gran importancia por su capacidad de formar geles, la cual depende de la longitud de las cadenas de ácido utónico y del grado de metilación. De acuerdo a esta última característica, se clasifican en pectinas de alto metoxilo (55 a 80% de sus grupos catboxilo de manera estetificada) y las de bajo metoxilo (18 a 45% de esterificación); si se tuviera una pectina con 100% de metoxilación sería más bien una propectina y si tuviera 0% metoxilación, sería un ácido péctico (Badui, 1999). Para la extracción de cada una de ellas, se. utilizan diversos agentes quelantes como el CDTA, EDTA, hexametafosfato, entre otros (Stolle-Smits es 21, 1999). ÉSTER METÍLICO ÁCIDO GALACTURÓNICO Figura 2.4. Estructura de la pectina 18 3.4. Sustancias aromáticas 3.4.1. Ácidos hidroxicinámicos Los ácidos hidroxicinámicos de pared celular son derivados de la vía fenilpropanoide; esta vía produce un amplio rango de metabolitos secundarios aromáticos, cuya síntesis, al menos de muchos de ellos, es inducida o estimulada por heridas, ataque por patógenos u otros tipos de estrés. El ácido ferúlico (figura 2.5) es el principal ácido hidroxicinámico en las paredes celulares. En monocotiledóneas está esterificado a arabinoxilanos y en dicotiledóneas a residuos de arabinosa y galactosa de pectinas. Se considera que están presentes como ésteres de carbohidratos-fenoles porque se liberan con solventes alcalinos (Whitmore, 1974). Fig. 2.5. Ácido ferúlico 3.4.2. Lignina " Algunas células vegetales pueden contener lignina, un polímero fenólico cuyos precursores son los alcoholes aromáticos: cumarol, coniferol y sinapol (figura 2.6). Las ligninas consolidan la fuerza de la celulosa cristalina y les permite a las plantas-erecer a mayores alturas; su carácter hidrofóbico provee el medio por el cual los tejidos del xilema pueden conducir agua a grandes distancias sin pérdida significativa por absorción o por evaporación, y finalmente, la deposición de ligninas confiere a las paredes celulares más resistencia a la degradación y así crea una barrera contra patógenos oportunistas y depredadores y actúa como un material protector contra la luz ultravioleta (Vance ef a/,1980). Las paredes secundarias contienen una gran cantidad de polímeros fenólicos de lignina (Northcote, 1972). La pared celular primaria contiene sólo una pequeña cantidad de lignina, pero una cantidad importante de monofenoles (Whitmore, 1974). 19 ANTECEDENTES S (0) cH- £H30H ALCOHOL P-COUMAROL (0) cH=CH- CH,0H CH 0 ALCOHOL CONIFEROL CHO (Ojo CH,0H CH¿0 ALCOHOL SINAPOL Figura 2.6. Estructura de los precursores de lignina 3.5. Proteínas Las proteínas de pared celular pueden ser de naturaleza estructural o catalítica (Hatfield el al, 1999). Las proteínas estructurales de la pared celular han sido divididas en cinco clases (Showalter, 1993), de las cuales, tres son las principales: proteínas ricas en prolina, proteínas ricas en glicina y glicoproteínas ricas en hidroxiprolina (Bradley ef al, 1992). Estas últimas incluyen a las extensinas, que es la familia más estudiada. Las extensinas se caracterizan porque tienen un alto pl y una estructura en forma de bastón que presenta la secuencia Ser-Hyp-Hyp- 20 ANTECEDENTES y Hyp-Hyp, la cual aparece en repetidas ocasiones a lo largo de la proteína. El bloque de tetrahidroxiprolina, en el cual cada hidroxiprolina está pegada a un bloque de tetra-arabinosa la estabiliza y le da rigidez a la proteína. Hay otros bloques repetidos comunes en la cadena que posiblemente actúan como sitios de reconocimiento para enzimas glicosilantes o para áreas de interacción iónica con otras proteínas y polisacáridos (Brady ef al, 1996). Estas proteínas rápidamente se producen en el citoplasma en condiciones de estrés biótico y abiótico y en horas llegan a estar covalenternente unidas a la pared celular, de la cual ya es difícil extraerlas. Una probable causa de la insolubilización de la extensina es la formación de la isoditirosina, un dímero de tirosina acoplado oxidativamente por la acción de la peroxidasa (Fry, 1988). Por ejemplo, estas proteínas ricas en hidroxiprolina y las proteínas ricas en prolina son abundantes en las células de las esclereidas de la testa de las semillas de soya, donde se asocian estrechamente al patrón de deposición de lignina en la formación de pared secundaria (Bradley et al, 1992). 4. Entrecruzamientos entre los componentes de la pared celular En los modelos actuales de la organización de polímeros en paredes celulares primarias, se propone que las microfibrillas celulósicas están embebidas en una matriz de proteínas y polisacáridos no celulósicos entretejidos (Talbott y Ray, 1992; Carpita y Gibeaut, 1993), como xilloglucanos y posiblemente arabinoxilanos y glucomananos. Se ha previsto que una proporción de estos polisacáridos está unida por puentes de hidrógeno a las superficies de las microfibrillas de celulosa y por virtud de su longitud, son capaces de interactuar con la superficie de más de una microfíbrilla y así actúan como un pegamento entre ellas. Dentro de la matriz hay varias posibilidades de formación de puentes de hidrógeno entre polisacáridos y varias opciones de interacciones iónicas y salinas entre polisacáridos y proteínas (Iyama ef al, 1994). Todas estas fuerzas no covalentes entre polímeros de pared son necesarias para alcanzar una estabilidad. Las paredes celulares no sólo resisten la presión de turgencia, también deben permitir la expansión celular durante el crecimiento. Cosgrove (1993) ha discutido un mecanismo por el cual la relajación de las paredes puede conducir a la entrada de agua hacia la célula y permitir la expansión celular que acompaña al crecimiento celular, y una vez que se completa, las propiedades mecánicas de la pared celular cambian y ya no son capaces de más expansión. Estos 21 ANTECEDENTES y A o A cambios involucran la formación de asociaciones permanentes entre los polímeros de la pared por formación de entrecruzamientos covalentes (Iyama es al, 1994), 4.1. Sustituciones covalentes en paredes primarias no lignificadas o en paredes secundarias Enlaces glicosídicos entre cadenas de oligo- y polisacáridos son posibles a través del hidroxilo hemiacetal al extremo final reductor de una cadena y un grupo hidroxilo de otra cadena. Los homopolímeros son construidos en esta forma. Estas “asociaciones se llaman sustituciones covalentes o ¿nterlinks y no entrecruzamientos covalentes (Talbott y Ray, 1992). Se ha propuesto la formación de enlaces ésteres directos entre grupos carboxilo de residuos del ácido urónico en un polisacárido, por ejemplo glucuronoxilanos o ramnogalacturonanos, y el hidroxilo de una cadena de polisacárido vecina. Ha sido bien establecida la presencia de ácidos hidroxicinámicos como ácido ferúlico y ácido p-cumárico en enlaces éster con los arabinoxilanos en pastos, con pectinas en espinacas y con xiloglucanos en bambú (Ishii y Hirol, 1990). La posibilidad de asociaciones covalentes entre ácido ferúlico esterificado en polisacáridos fue presentada por Geissman y Neukom (1971) quienes obtuvieron geles a partit de extractos acuosos de harina de trigo en presencia de peróxido de hidrógeno y peroxidasa y demostraron que hay un acoplamiento deshidrogenativo entre dos ácidos ferúlicos esterificados en arabinoxilanos para formar ácido dihidroferúlico. Existen otras posibilidades para la dimerización de ácidos fenólicos en polisacáridos. Hay formación de una serie de homo- y heterociclodímeros del tipo ciclobutano por asociaciones cabeza-tallo, cabeza-cabeza, ácido p-cumárico y ácido ferúlico unidos por enlaces éster. 4.2. Biosíntesis de ésteres de ácido hidroxicinámico y su dimerización Fry y Miller (1989) siguieron la cinética de ferulación de los polisacáridos de pared en cultivos celulares de espinaca administrando (H) arabinosa y midiendo su incorporación a unidades de ácido ferúlico-(arabinosa)z. Los resultados indicaron que la arabinosilación y ferulación ocurren intracelularmente. 22 ANTECEDENTES «y 4.3, Papel de las proteínas en el entrecruzamiento covalente en paredes no lignificadas Las proteínas de pared llegan a ser insolubles como resultado del entrecruzamiento. Se ha establecido bien la formación de isoditirosina intramolecularmente en proteínas ricas en hidroxiprolina. Muchas proteínas ricas en tirosina, podrían formar entrecruzamientos de isoditirosina (figura 2.7.). Por ejemplo, proteínas ricas en prolina que además son ricas en tirosina son rápidamente insolubilizadas en las paredes celulares de soya en respuesta a un estrés o a un tratamiento con elicitores (Bradley ef al, 1992) y esto parece estar mediado por entrecruzamiento oxidativo a través de la enzima peroxidasa, PALYSACCHARIDE tm to) Figura 2.7. Estructura de entrecruzamientos covalentes entre polisacáridos y proteínas en paredes no lignificadas Fuente: Iiyama et al, 1994. 23 ANTECEDENTES Y O A a 4.4. Entrecruzamientos covalentes en paredes lignificadas En los tejidos vegetales involucrados en el soporte mecánico y conducción de agua, tales como esclerénquima, elementos traqueares, etc., las células carecen de protoplastos y la pared celular es la única estructura presente. Estas paredes celulares presentan una capa rica en celulosa y algunas están lignificadas. La lignina se forma por polimerización de monolignol después de que los polisacáridos de pared secundaria han sido colocados. La deposición de lignina se inicia en las esquinas celulares, después de la lamela media y a través de la pared primaria hacia la pared secundaria. En el proceso de lignificación, la lignina reemplaza al agua en la pared, uniéndose a polisacáridos celulósicos y no celulósicos y proteínas, resultando en paredes engrosadas de alta fuerza tensil e impermeables. Las superficies hidrófobas de los depósitos de lignina están íntimamente asociadas con las superficies de polisacáridos y proteínas. En este punto hay oportunidad para el entrecruzamiento (Iyama el al, 1994). 4.5. Entrecruzamientos covalentes directos en paredes lignificadas Se han propuesto tres tipos de entrecruzamientos entre ligninas y polisacáridos. Dos son enlaces covalentes directos. El primero, es un enlace éster directo entre el ácido urónico de glucuronoxilanos o ramnogalacturonanos y grupos hidroxilo en las superficies de ligninas para formar ésteres en las cadenas de monolignol. El segundo tipo propuesto es el enlace éter directo entre polisacáridos y ligninas (Fig. 2.8.). 4.6. Puentes éter-éster de ácido hidroxicinámico entre polisacáridos y lignina Los ésteres de hidroxicinámico de los polisacáridos se han encontiado en paredes lignificadas del internodo y células de las hojas de pastos. Los ácidos hidroxicinámicos están directamente esterificados o eterificados a las superficies de ligninas. (Bacic ef al, 1988; Lam et al, 1990). 4.7. Asociaciones covalentes proteína-lignina Hay evidencia de que las glicoproteínas ticas en hidroxiprolina y las proteínas ricas en glicina están asociadas con lignina y posiblemente actúan como punto para la polimerización de ligninas (Bacic ef al., 1988). 24, ANTECEDENTES «y ácido-eter > A” Tldroxicinámico (e) e interacción del ácido ferúlico L, oz o 5 a H - C, O interacción Roo, - ácido diéster-crer he S rodif o dihid: o) 4 2 ácido dehidrodiferúlico interacción diéster O: p-Coumaroil O :Feruion O-O : Dehidrodiferoloil Figura 2.8. Estructura de los posibles entrecruzamientos covalentes entre polisacáridos y ligninas en la pared celular de pastos a, enlace éster directo; b, enlace éter directo; c, ácido hidroxicinámico esterificado a polisacáridos; d, ácido hidroxicinámico esterificado a lignina; e, ácido hidroxicinámico eterificado a lignina; f, puente éter-éster de ferúlico; g, puente diéster de ácido dehidrodiferúlico; h, puente éter-diéster de ácido dehidrodiferúlico. Fuente: Iyama et al., 1994. Muchos de estos entrecruzamientos entre componentes de pared celular se realizan mediante reacciones acopladas por peroxidasas de pared celular, las cuales involucran al peróxido de hidrógeno, formado a partit de las especies reactivas de oxígeno presentes en las células. 5. Especies reactivas de oxígeno (ERO) Los estreses ambientales, a los que están sometidos las plantas, tales como la sequía, anoxia, bajas y altas temperaturas, oscutidad o luz muy intensa, contaminantes industriales, herbicidas, deficiencias minerales nutricionales, ataque por patógenos, etc., implican la existencia de un mecanismo letal común que actúa a nivel molecular: el oxígeno activado (Hendry, 1993). 25 ANTECEDENTES Y El oxígeno como una molécula no reactiva en el estado basal triplete (0) tiene que ser activado para poder reaccionar con los átomos o moléculas en el estado basal singulete. Heisser et al. (1998), señalan que algunas de las reacciones más importantes concernientes a esto son las reacciones luminosas, la activación reductora y la inducción de peroxidación lipídica y clorosis por especies reactivas de oxígeno. 5.1, Radicales de oxígeno activos en las células En la respiración mitocondrial, la citocromo oxidasa transfiere dos electrones al oxígeno molecular (O»), el cual, con la adición de dos protones, forma dos moléculas de agua; la energía liberada en esta reacción se usa en la formación de ATP. Sin embargo, cuando la transferencia de electrones al oxígeno es incompleta, es decir, sólo un electrón es transferido, se genera entonces el anión superóxido (Oz). Espontáneamente el superóxido puede reaccionar para formar el radical hidroperoxilo (HO») y peróxido de hidrógeno (H20>). El peróxido de hidrógeno acepta electrones aún más fácilmente que el oxígeno, llevando a la formación del radical hidroxilo altamente reactivo (Tabla 2.1). Tabla 2.1. Reacciones involucradas en la generación de radicales de oxígeno O,+te >0, O, +H'>HO),; HO,'+ HO, > H,O, + O, Fe” 6 Cu* . H,0,+ Oy ———P 0,+ OH + "OH 5.2. Daño celular por ERO Casi cada componente de una célula es sensible al daño por las ERO. Las proteínas pueden ser inactivadas por entrecruzamiento o ruptura (Davies, 1987) o por la oxidación de los grupos tiol (Sies, 1986). El DNA puede ser dañado por mutaciones puntuales (Michiels ef al, 1994) y puede resultar en la muerte celular (Tibble ef al, 1987). Las reacciones de radicales hidroxilo con ácidos grasos poliinsaturados de las membranas celulares disparan reacciones en cadena de 26 ANTECEDENTES y peroxidación de lípidos. La peroxidación lipídica es uno de los efectos más tóxicos de los radicales libres (Esterbauer ef a, 1986) conduciendo a la disfunción membranal por cambios estructurales que afectan su fluidez, porosidad, permeabilidad, inactivación de proteínas de transporte y receptores (Richter, 1987). Además los tadicales hidroxilo causan la inactivación de enzimas, incluso aquellas involucradas directamente con el procesamiento de ERO (Hendry, 1993). 5.3. Defensa contra ERO y reparación celular La protección contra el daño oxidativo debe tener un origen ancestral y podría explicar los diferentes mecanismos de defensa comunes entre eucariotes, conservados por largos períodos en el tiempo geológico (Hendry, 1993). Las plantas, en contraste con los vertebrados superiores, sintetizan un conjunto de moléculas antioxidantes. El cloroplasto es la fuente más rica de antioxidantes incluyendo los tocoferoles (vitamina E), el ácido ascórbico (vitamina C) y los catotenos (provitamina A) (Hendry, 1993). También cuentan con un sistema enzimático antioxidante, formado por las superóxido dismutasas (SOD), las peroxidasas (POX) y las catalasas (CAT). Las SOD catalizan la conversión del superóxido en peróxido de hidrógeno y oxígeno molecular. Cuando están disponibles las CAT 6 POX en niveles adecuados, el peróxido de hidrógeno producido por las SOD es convertido en H20 y el ciclo de radicales libres es evitado. Sin embargo, un exceso de peróxido de hidrógeno en las células es tal vez más peligroso que el superóxido por sí mismo; el peróxido de hidrógeno fácilmente acepta electrones del Cu* o Fe?* para generar el radical hidroxilo altamente tóxico vía la reacción de Fenton, llevada a cabo en los organelos celulares con acceso a estos elementos (Cu* o Fe?*) como la mitocondria y la membrana plasmática. Por otro lado, los radicales libres pueden inactivar a las enzimas responsables de eliminarlos. La SOD es inactivada por el peróxido de hidrógeno (Bray ef al, 1974). La glutatión peroxidasa es inactivada por los aniones superóxido (Blum y Fridovich, 1982). También el nivel de estrés oxidativo, al cual una célula está expuesta, influye en el nivel en que las enzimas antioxidantes se expresan en la célula. Si la aparición de algún tipo de estrés oxidativo tal como el aumento en la concentración de O», es gradual, las células pueden adaptarse, aumentando la expresión de los 27 ANTECEDENTES y genes de SOD y POX; sin embargo, cuando este mismo estrés aparece abruptamente, las células no se acondicionan y mueren probablemente al encender la apoptosis (Sullivan ef a/, 1992). 6. Efectos ambientales sobre las características culinarias y nutricionales del grano de frijol Existe una gran variabilidad en la poza génica de Phaseolus, esto se refleja en el contenido de compuestos antinutricionales (inhibidores de tripsina, quimotripsina y de a-amilasa), así como en las características de duteza y de tiempo de cocción de las semillas de diversos cultivares. Todos estos atributos son fuertemente afectados por la localización geográfica y las condiciones edáficas y climáticas del sitio de cultivo (Kigel, 1999). La aplicación de nitrógeno (Bengtsson, 1991) y azufre (Hojjati, 1976; Sharma ef al, 1993), especialmente cuando estos elementos son factores limitantes en el suelo, incrementan el contenido proteico de las semillas e incrementan los niveles de aminoácidos que contienen azufre (cisteína y metionina). Sin embargo se requiere de grandes cantidades de azufre para incrementar el contenido de aminoácidos que lo contienen y esto implica altos costos de producción. El contenido de aminoácidos no es afectado por la sequía, durante el desarrollo de la semilla, aunque este tipo de estrés reduce el contenido de almidón e incrementa el contenido de azúcares solubles en las semillas y esto no es deseable (Pasin ef al, 1991). En contraste hay poca información con relación al efecto ambiental sobre los niveles de los compuestos antinutricionales en la semilla. El ácido fítico es un agente quelante y está considerado como un factor antinutricional porque puede disminuir la disponibilidad de elementos esenciales tales como calcio, hierro, magnesio y zinc. En suelos con niveles más altos de fósforo, aparentemente se incrementan los niveles de fitato (Lott ef al, 1995). Por otro lado, un déficit de irrigación incrementa la cantidad de los inhibidores de tripsina, otro agente antinutricional en las semillas de frijol (Nemeskeri, 1997). En cuanto a la dureza y tiempo de cocción de la semilla se ha reportado que la capacidad de absorción de agua de las semillas es afectada por factores ambientales e interacciones del ambiente con el genotipo. Paredes-López ef al., (1989) reportaron que el tiempo de cocción y la dureza de la semilla se incrementaron en frijoles cultivados en localidades con suelos ricos en calcio y magnesio y temperatura anual promedio más alta (15-24? C), comparado a una localidad 28 ANTECEDENTES ÁS — a a con temperaturas inferiores (11-18? C) y suelos pobres en magnesio y fósforo. Stoyanova ef al, (1992) encontraron que semillas producidas sobre un suelo chernozem cálcico en Bulgaria tuvieron un tiempo de cocción mayor comparado al de semillas producidas en suelos con niveles menores de calcio. La aplicación de zinc a los suelos pobres en Bulgaria, redujo el tiempo de cocción. La lluvia también ha sido asociada a las características de adelgazamiento de testa y acortamiento de los tiempos de cocción (Stamboliev ef al, 1995). Las condiciones ambientales durante el desarrollo de la semilla podrían cambiar los niveles o actividad de las enzimas o los sustratos involucrados en las reacciones que participan en el endurecimiento de las semillas, participando así, indirectamente, en este fenómeno. 7. Efectos de las condiciones de almacenamiento sobre la calidad de tas semillas Diversos factores físicos, químicos y biológicos, tales como la humedad, temperatura y composición de gases de la atmósfera de almacenamiento, roedores, aves, insectos, bacterias y hongos microscópicos, afectan la vida media de los productos almacenados (Christensen y Kaufmann, 1965). Los efectos de la temperatura y humedad relativa en el almacén son considerados como factores cruciales para la conservación de los granos y semillas, ya que altos niveles en estos dos parámetros conducen al deterioro acelerado de granos y semillas. Muchos cambios bioquímicos ocurren en las semillas en deterioro, como mutaciones cromosómicas y daño al DNA, cambios en la síntesis de RNA y proteínas, cambios en las enzimas y reservas nutritivas, diferencias en la actividad respiratoria y producción de ATP, alteraciones membranales (Smith y Berjak, 1995) y en el caso de las leguminosas se ha reportado que también la pared celular sufre ciertas modificaciones que disminuyen sus propiedades mecánicas de extensibilidad y permeabilidad, volviéndose más rígidas (Downie ef al, 1997; Mullin y Xu, 2001). Esto afecta al principal atributo de calidad que contribuye a la aceptación del grano por parte del consumidor: la textura. El procesamiento de los granos de frijol va acompañado por la suavización de los tejidos. Este termoablandamiento se ha atribuido principalmente a cambios en la integridad estructural de la pared celular y la lamela media (Jackman y Stanley, 1995). Varios estudios han revelado que la principal reacción que lleva a la 29 ANTECEDENTES y PP A suavización de los vegetales es la fB-eliminación despolimerizante de pectinas metil-esterificadas (Sajjaanantakul et al, 1989). Un almacenamiento prolongado, especialmente bajo condiciones de alta temperatura y humedad relativa, promueve el defecto de endurecimiento de las semillas. Por otro lado, un sobrecocimiento para lograr el ablandamiento de los granos puede terminar en la pérdida de nutrientes esenciales (Kigel, 1999). 8. Endurecimiento de frijol Las condiciones en el campo y posteriormente, en el almacén pueden propiciar el endurecimiento de los granos de frijol que se manifiesta de dos formas: - Testa dura (Hardshe/): cuando las semillas no absorben agua suficiente durante la cocción y por lo tanto no se suavizan cuando se cuecen. Esto puede deberse a la baja permeabilidad de la testa al agua (Hinks, 1986). Agbo ef al., (1987) mostraron diferencias en el tamaño de los micrópilos y otras diferencias estructurales que estuvieron relacionadas a la permeabilidad de las semillas y la absorción de agua por la semilla. - Endurecimiento (Hard-to-cook): cuando las semillas absorben suficiente agua pero no logran suavizarse durante el remojo y la cocción. Cuando los frijoles son cocinados, la propectina en la lamela media forma una pectina soluble que se despolimeriza rápidamente durante el calentamiento y permite la entrada rápida de agua y su desplazamiento por las células cotiledonarias (Stanley y Aguilera, 1985). Un estado de alta hidratación celular y calentamiento permite de este modo que las células se suavicen y se separen. El defecto de endurecimiento es el resultado de cambios físicos y químicos que ocurren en los cotiledones a nivel intercelular durante el almacenamiento, dando por resultado una estabilidad incrementada de la lamela media. Algunos autores han demostrado que el deterioro en la cocción del frijol va acompañado de una disminución en la solubilidad de la pectina (Chang, 1977; Kon y Sanshuck, 1981; Jones y Boulter, 1983; Moscoso ef al, 1984; Bernal-Lugo et al, 1997; Garcia ef al., 1998; Shiga ef al, 2004). Se han propuesto varios procesos para explicar el incremento en la estabilidad de la lamela media durante el fenómeno de endurecimiento de frijol: 30 ANTECEDENTES QS 8.1. Insolubilidad de la sustancia péctica Debido a la degradación del fitato por fitasas, durante el almacenamiento en condiciones de temperaturas y humedades relativas altas (Ockenden es al, 1997), los cationes que la acompañan se liberan y eventualmente incrementan la fuerza de interacción entre moléculas de pectina por formación de pectatos de calcio y magnesio, que resultan en células más resistentes a la penetración del agua y al hinchamiento y en una falla en la separación de las células adyacentes (Kilmer el al, 1994). Se ha demostrado que durante el desarrollo de las plantas, las características de solubilidad de las pectinas varían con la variación de la velocidad de crecimiento del órgano o tejido en estudio (Redywell et al, 1992; Hadfield ef al, 1998). El incremento en solubilidad se da a través de disminuir el peso molecular de las pectinas (Ranwala ef al, 1992; Rose ef al, 1998). En este mecanismo participan las hidrolasas de pared celular, glucosidasas y pectinasas que requieren de un pH ácido para su acción (McFeeters ef al, 1980; Ebbelaar ef al, 1996). En contraste, la disminución en la solubilidad de estos polímeros se produce ya sea por entrecruzamiento O por lignificación (Varriano-Marston y Jackson, 1981; Hincks y Stanley, 1987; Iyama el al, 1994, Moura, 1998). El entrecruzamiento puede deberse a la formación de enlaces difenólicos intermoleculares o con proteínas estructurales de la pared celular (Geissman y Neukom, 1971; Hohlberg y Stanley, 1987). 8.2. Lignificación de la lamela media La lignificación de la lamela media ha sido estudiada en frijoles endurecidos (Varriano--Marston y Jackson, 1981; Hincks y Stanley, 1987, Moura, 1998). Muller (1967) sugirió que la lignina en las paredes celulares de los cotiledones podría afectar la calidad de cocción de los granos. Molina ez al, (1976) encontraron que el contenido de proteína lignificada de los cotiledones de frijol incrementaba con el tiempo de almacenamiento a 25? C y 70% HR y reportaron una correlación significativa entre la textura de frijol cocido y el contenido de proteína lignificada (1 = 0.91). De acuerdo a Hohlberg y Stanley (1987), las proteínas son degradadas durante el almacenamiento, especialmente bajo condiciones de altas temperaturas y humedades relativas, liberando pequeños polipéptidos y aminoácidos aromáticos libres que migran a la lamela media donde ocurren las reacciones de polimerización/lignificación (síntesis de polifenoles), catalizadas por 31 ANTECEDENTES y peroxidasas presentes en las semillas. La acumulación de lignina u otros polímeros insolubles en la lamela media contribuyen a la falta de separación entre células adyacentes durante la cocción. La coexistencia de pequeños polipéptidos y aminoácidos aromáticos junto con el desarrollo del endurecimiento durante el almacenamiento sugiete que existe una relación con este fenómeno. Rodríguez y Mendoza (1990) propusieron un alto contenido de lignina y sílice en la cubierta de la semilla. 8.3. La oxidación de polifenoles Esteves ef al, (2002) mencionan que la pérdida de calidad de las semillas de frijol se manifiesta por alteraciones en el sabor y oscurecimiento del tegumento debida a la actividad de oxidasas o polifenoloxidasas. 8.4. Interacciones entre proteínas y polifenoles Una contribución de los polifenoles en el endurecimiento de frijol puede también estar asociada con la formación de complejos proteína-lignina (Rozo, 1982; Esteves ef al, 2002). 8.5. Polimerización de compuestos fenólicos de pared celular Semillas de frijol (Phaseolus vulgaris, var. Seafarer) almacenadas nueve meses bajo tres condiciones (52 C/40% HR, 20% C/ 73% HR y 35% C/80% HR) produjeron diferentes grados de endurecimiento. Los resultados indicaron una correlación entre los niveles de ácidos hidroxicinámicos libres, principalmente ácido ferúlico y el grado de endurecimiento, aunque no se detectaron cambios significativos en los niveles de ligninas de testa y cotiledones (Srisuma, 1989). Garcia ef al, (1998) observaron una menor concentración de ácidos hidroxicinámicos en cotiledones duros de frijoles Carioca comparada a la de muestras control. Sin embargo, los frijoles duros tenían tres veces más fenoles asociados con la fracción de pectina soluble y un alto contenido de pectatos. Hincks y Stanley (1986) y Aguilera y Ballivian (1987) han sugerido una combinación de los mecanismos anteriores. Varias características fisicoquímicas de las semillas han sido correlacionadas con el tiempo de cocción. 32 ANTECEDENTES SS 8.6. Disminución en la capacidad de hidratación de la semilla Frijoles que requieren mayores tiempos de cocción absorben menos agua que aquellos que se cuecen más rápido. Pero Shellie y Hosfield (1991) reportaron que la correlación fenotípica entre el tiempo de cocción y el agua absorbida fue relativamente baja (r = -0.37) para justificar el uso de esta característica como un método de selección indirecto para el tiempo de cocción. 8.7. Tamaño de la semilla El tiempo de cocción mostró una correlación positiva con el tamaño de la semilla en 27 accesiones de frijoles cultivadas en Tanzania, sugiriendo que tamaños de semilla medianos y pequeños podrían indicar tiempos de cocción menores (Mwandemele y Nchimbi, 1992). 8.8. Composición química de la semilla El defecto de endurecimiento causado por un almacenamiento prolongado (5 años) a altas temperaturas (30-40%C) y >74%HR, estuvo asociado con un decremento general de las fracciones de nitrógeno soluble, particularmente proteínas, inhibidores de «-amilasa, un incremento en lectinas, pero no asociado a cambios en el contenido de inhibidores de tripsina y quimiotripsina (Martin-Cabrejas ef al, 1995). 33 JUSTIFICACIÓN (y, JUSTIFICACIÓN El frijol común (Phaseolus vulgaris L.) es una fuente importante de nutrientes para las poblaciones de los países en desarrollo (Bressani, 1993). La mayoría de estos países están localizados en áreas tropicales donde los cultivos están sujetos a condiciones inadecuadas de almacenamiento por la falta de recursos e infraestructura. En estos países los frijoles, al igual que otras semillas se almacenan en condiciones inadecuadas (de temperatura y humedad relativa) ocasionando la pérdida gradual de la calidad culinaria y nutricional. Las semillas almacenadas en condiciones inapropiadas se caracterizan por requerir largos tiempos de cocción para alcanzar la suavidad y palatabilidad exigida por el consumidor, fenómeno conocido como endurecimiento. Además, el valor nutricional también disminuye, pues durante este almacenamiento inadecuado, las proteínas y el almidón se modifican en tal forma que disminuye su digestibilidad (Hincks y Stanley, 1986; Liu, 1995; Shiga ef al, 2003). Las semillas endurecidas conducen a un incremento en el consumo de energía al momento de su procesamiento. Por esto, las pérdidas económicas debidas al fenómeno de endurecimiento son enormes. Por ejemplo, en Chile se registró una pérdida económica total anual debido al endurecimiento de frijol (Phaseolus vulgaris L.), de cuatro millones de dólares (Hohlbetg ef al, 1991). En México este problema también es importante, aunque no existen datos estadísticos precisos. Sin embargo, Moreno (2002) reportó que existen pérdidas anuales en granos almacenados fluctuando entre un 5 y 25%, de acuerdo a la zona del país de que se trate; estas cifras incluyen las pérdidas de frijol por endurecimiento. Para resolver esta problemática se han sugerido dos enfoques. Uno de ellos es el seguido por algunos países centroamericanos donde se han realizado importantes esfuerzos para desarrollar procesos tecnológicos a fin de transformar frijoles endutecidos en productos utilizables, destinados al consumo animal e incluso al consumo humano (De León y Elías, 1987). Sin embargo, la aceptabilidad de estos productos es escasa. El segundo enfoque consiste en elucidar los mecanismos involucrados en el fenómeno de endurecimiento y ha sido el foco de múltiples estudios científicos. Investigaciones en Inglaterra, Egipto, Australia, China, India, Estados Unidos, Centroamérica, Brasil, Chile, México, etc. han contribuido a la comprensión del fenómeno de endurecimiento (Hard-to-cook). Estos trabajos versan sobre los mecanismos 34 JUSTIFICACIÓN (y, O bioquímicos y los cambios estructurales de la semilla endurecida; alteración de las propiedades fisicoquímicas y texturales en los materiales dañados y su evaluación nutricional. Sin embargo, aun no se ha definido el mecanismo en su totalidad. El conocimiento de los mecanismos responsables del endurecimiento de frijol permitirán seleccionar y/o desarrollar cultivares que posean características de resistencia al endurecimiento durante el almacenamiento y más aún, una vez que se entienda a fondo en qué está basada la resistencia al endurecimiento del frijol durante el almacenamiento se podrán plantear estrategias reales pata disminuir las pérdidas poscosecha. 35 HIPÓTESIS Y OBJETIVOS y 11. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS Hipótesis La menor termosolubilidad de las pectinas de la lamela media del frijol endurecido se debe a que durante el almacenamiento de la semilla se induce un entrecruzamiento covalente entre las fibras de pectinas. Objetivo General Determinar las posibles causas de la disminución de la termosolubilidad que presentan las pectinas en semillas endurecidas de dos variedades de frijol. Objetivos Particulares 1. Obtener lotes de frijol de las variedades flor de mayo y flor de junio en los cuales la termosolubilidad de la pectina haya disminuido. 2. Evaluar el efecto del remojo sobre la facilitación de solubilidad de las pectinas en frijoles frescos y duros. 3. Conocer la participación de proteínas de pared celular en la disminución de la capacidad de solubilidad de pectinas. 4. Evaluar el efecto del almacenamiento en el contenido de lignina. 5. Evaluar si la lignificación del cotiledón se asocia con un estrés de tipo oxidativo. 36 MATERIALES Y METODOS O IV. MATERIALES Y MÉTODOS 1. Material biológico Los experimentos se llevaron a cabo con dos cultivates de frijol (Phaseolus vulgaris L.), flor de mayo RMC (FM) y flor de junio Marcela (FJ). Los lotes de ambos cultivares fueron donados por PRONASE, provenientes de Cortazar, Gto. Méx., en óptimas condiciones de poder germinativo (el lote FJ presentó un 98% de semillas viables y FM el 99%) y libres de hongos de almacén. Los lotes se seleccionaron por la homogeneidad de los granos en relación a sus tiempos de cocción y fueron refrigerados hasta ser sometidos a los diferentes tratamientos. 2. Evaluación del contenido de humedad de la semilla La evaluación del contenido de humedad del grano se llevó a cabo por el método de secado en estufa de acuerdo a las reglas de la ISTA (1976). Se pesaron 5 gramos de grano entero de cada muestra y luego fueron colocados en cajas de aluminio con'tapa, previamente pesadas. Las cajas con el grano se taparon e inmediatamente se pesaron. Las cajas destapadas se introdujeron en una estufa de circulación forzada BLUE M, a una temperatura de 130? C durante 1 hora. Después del período de secado se taparon las cajas y se colocaron en un desecador con sílica gel. Una vez frías se pesaron las cajas sin destaparlas. El contenido de humedad de la semilla se calculó mediante la siguiente fórmula: P2-P3_X 100 = % de humedad (con base en peso húmedo) P2-—P1 en donde: P1 = peso en gramos de la caja y su tapa P2 = peso en gramos de la caja, su tapa y la semilla P3 = peso en gramos de la caja, su tapa y la semilla después del secado en la estufa 37 MATERIALES Y MÉTODOS o 3. Determinación del tiempo de cocción del frijol Muestras de 25 semillas de frijol fueron colocadas en matraces con 20 ml de agua desionizada por 15 horas a 30” C. La prueba de cocción se llevó a cabo en cocinadores tipo Mattson (Varriano-Marston y Jackson, 1981), el cual consistió de un soporte de tres discos, los dos superiores hechos de latón con 25 perforaciones cada uno, que coincidieron en posición con los 25 pozos del disco inferior hecho de acero. Los frijoles remojados se acomodaron uno por uno en cada pozo y se sujetaron con agujas que atravesaban los dos discos superiores y quedaron apoyadas por su punta afilada en cada semilla. Los soportes con las semillas fueron introducidos en ollas de aluminio con agua en ebullición. Se colocaron entonces pesas de hierro de 200 gramos sobre el extremo superior de cada aguja, de modo que al reblandecerse la semilla, la pesa hacía que la aguja atravesara la semilla y ésta se consideraba cocida. Se registró el tiempo en que cada frijol de la muestra se coció como un porcentaje del total. Con estos datos se construyeron gráficas de porcentaje de frijoles cocidos contra tiempo de cocción y de la gráfica se obtuvo el TCso, que es el tiempo que tarda el 50% de la muestra de 25 semillas en cocerse (Fig. 4.1,). 100 1 70 60 7 7 TC_=57.468 min 50 7 s0 40 a 30 7 204 po rc en ta je de se mi ll as co ci da s (f re cu en ci a ac um ul ad a) 10 - 10 — 7 —— on EOS r - 7 - 1 0 20 40 60 80 100 20 tiempo de cocción (min) Figura 4.1. Determinación del TC so 38 MATERIALES Y METODOS 4. Almacenamiento de la semilla Las semillas de frijol de cada variedad fueron divididas en tres lotes. Los lotes consistieron en unidades experimentales de 50 gramos de frijol contenidos en frascos de vidrio con tapa de malla. 4.1. Almacenamiento en condiciones de endurecimiento moderado (30%C/ 75% HR) Un primer lote de unidades experimentales se almacenó en condiciones inadecuadas moderadas, dentro de cajas de plástico tapadas. Cada caja contenía dos litros de una solución sobresaturada de cloruro de sodio para mantener una humedad relativa de 75% dentro del recipiente cerrado y un contenido de humedad de la semilla de 15.5%. Las cajas de plástico se mantuvieron en una incubadora a 30C durante uno, dos, tres y cinco meses y medio. Este procedimiento se siguió para obtener un endurecimiento moderado en las muestras de frijol. 4.2. Almacenamiento en condiciones de endurecimiento acelerado (40% C/ 85 % HR) El segundo lote de unidades experimentales se almacenó en condiciones de endurecimiento acelerado. Las semillas se incubaron durante 30 días a 40% C en cajas de plástico cerradas que contenían una solución sobresaturada de cloruto de potasio para mantener una humedad relativa de 85%. 4.3. Almacenamiento en condiciones óptimas El tercer lote de semilla se mantuvo en refrigeración a 8% C hasta el momento de ser utilizado como conttol. 5. Capacidad de hidratación e hinchamiento de la semilla Muestras de 25 semillas se colocaron en un matraz con 30 ml de agua desionizada y se incubaron 15 horas a 40? C. Posteriormente se midió el volumen de agua que no fue absorbida por las semillas y con este dato se calculó el volumen de agua absorbida por la muestra (capacidad de hidratación). Para determinar la capacidad de hinchamiento se colocó la muestra de 25 semillas secas en una probeta de 50 ml conteniendo 30 ml de agua desionizada, se anotó el volumen de agua que desplazan las semillas y posteriormente al período de imbibición, se repitió el mismo procedimiento con las semillas remojadas. 39 MATERIALES Y MÉT A o 6. Aislamiento y purificación de la pared celular La pared celular se purificó de acuerdo al método de Garcia ef al, (1998). Se retiraron con una navaja, la testa y el eje embrionario de las semillas de frijol. Los cotiledones se maceraron con nitrógeno líquido, se liofilizaron y se conservaron a -70* C como harina seca hasta su uso. Para obtener las paredes celulares se tomó una muestra de 10 g de harina y se incubó con 100 uL de a-amilasa termoestable/ g de harina (Sigma) en solución amortiguadora de fosfatos pH 7.0 a 95% C por 30 minutos. La muestra se centrifugó a 4300g para obtener y reservar el sobrenadante de amilasa para cuantificar la pectina que se solubiliza en este paso. Después, la muestra se incubó a 60 *C con 2.5 mg de proteasa/ g de harina (Sigma) en una solución amortiguadora de fosfato de sodio 10 mM pH 7.5. La muestra se lavó con agua desionizada agitando vigorosamente y centrifugando a 4300g para retirar la proteasa en el sobrenadante. La muestra se incubó por 60 minutos a 60? C con 176 U de amiloglucosidasa/g de harina (Sigma) en solución amortiguadora de fosfatos pH 3.0. La muestra se lavó con agua desionizada, acetona y metanol-cloroformo (1:1 v/v), consecutivamente, para obtener una fracción seca, enriquecida en paredes celulares. 7. Extracción de pectinas Las pectinas fueron extraídas de la pared celular según el método descrito por Talbot y Ray (1992). Las paredes celulares purificadas se incubaron una hora con solución amortiguadora de oxalato de amonio-ácido oxálico 20 mM pH 4.0 a 70*C. Después de la incubación, la muestra se centrifugó a 4 300 g por 5 minutos y al sobrenadante se le agregaron 4 volúmenes iguales de etanol al 95% para precipitar las pectinas. Este tratamiento con solución amortiguadora de oxalato de amonio-ácido oxálico con la respectiva precipitación de pectinas con etanol, se repitió cuatro veces y al final se reunieron las pectinas extraídas. 8. Determinación del contenido de ácido galacturónico en las pectinas La cuantificación de ácido galacturónico se tealizó por el método colorimétrico de Blumenkrantz y Asboe-Hansen (1973), basado en la reacción de carbohidratos con un grupo carboxilo (ácidos urónicos, por ejemplo) con o-hidroxifenilo en un medio oxidante agresivo (ácido sulfúrico calentado) con un oxidante agresivo de tetraborato para formar un compuesto colorido cíclico. A una alícuota de la muestra de pectina solubilizada en agua se le adicionó agua 40 MATERIALES Y METODOS S desionizada suficiente para obtener un volumen igual a 0.4 ml. Posteriormente se agregaron 2 ml de una solución de tetraborato de sodio 0.0125 M en ácido sulfúrico, esta mezcla agua-ácido se enfrió en hielo y posteriormente se colocó en un baño María en ebullición por cinco minutos, después de los cuales se enfriaron nuevamente en hielo. Para el desarrollo del color se adicionó 0.1 mil de o-hidroxidifenilo. Los tubos de ensayo se agitaron e incubaron por 20 minutos y se midió la absorbencia a 520 nm. Para cada muestra se preparó un blanco, con la muestra y 0.1 ml de hidróxido de sodio al 0.5% en lugar de 0.1 ml de la solución de o-hidroxidifenilo y se siguió el mismo procedimiento que para los tubos problema. La curva patrón se preparó utilizando ácido galacturónico como referencia, en un tango de 10 a 70 g/ ml. Dentro de estos límites la absorbencia fue lineal. 9. Determinación de azúcares totales Para cuantificar los azúcares totales en las muestras se empleó el método de fenol-sulfúrico de Dubois ef al, (1956) que se basa en la reacción específica de carbohidratos reductores más fenol en un medio fuertemente ácido (ácido sulfúrico) para formar un compuesto colorido (amarillo- naranja) derivado del furfural. La pectina se disolvió en agua y de aquí se tomó una alícuota, a la cual se agregó agua desionizada suficiente para obtener un volumen final de 1 ml, se le adicionaton 0.6 ml de fenol al 80% y 3.6 ml de ácido sulfútico concentrado, se agitó en vórtex y se permitió que los tubos se enfriaran a temperatura ambiente. La absorbencia de las muestras ya frías se determinó a una A= 485 nm, contra un blanco de reactivos. La curva patrón se realizó con glucosa como referencia en un rango de 5 a 50 pg/ ml. Dentro de este rango la absorbencia fue lineal. 10. Extracción de compuestos fenólicos unidos covalentemente a la pared celular de cotiledones de frijol Se obtuvo la pared celular a partir de 10 gramos de harina de cotiledón. La pared celular se resuspendió en 20 ml de acetato de etilo para extraer los compuestos fenólicos solubles adheridos a la pared celular. Se incubaron por 12 h a temperatura ambiente, en 20 ml de NaOH 4M, en oscuridad bajo una atmósfera de nitrógeno para romper los puentes de hidrógeno. Se acidificó la solución de la muestra hasta pH 2.0 con HCL, para romper enlaces glucosídicos y desmetilar las pectinas, dejándolas como cadenas de aproximadamente veinte residuos de ácido 41 MATERIALES Y METODOS S galacturónico. Los fenoles de pared celular liberados de ésteres de carbohidratos- fenoles se extrajeron con acetato de etilo. El solvente se evaporó en un rotavapor y se conservó la muestra de fenoles en la oscutidad. 11. Extracción de compuestos fenólicos totales a partir de harina de frijol Se empleó la técnica de Pedrosa er a/., (2000) para extraer los fenoles de una muestra de harina de cotiledón. Se tomaron 5 g de harina y se homogeneizaron en licuadora durante 1 min. con 75 ml de etanol al 80%, se agitaron durante 30 min a 25” C. La mezcla anterior se filtró, se reservó el filtrado y el residuo se extrajo dos veces más. Se reunieron los tres volúmenes de las soluciones de etanol y se concentraron en un rotavapor a 65” C hasta un volumen aproximado de 30 ml. Este concentrado se extrajo en un embudo de separación con 100 ml de éter de petróleo para retirar pigmentos y aceites. La fase acuosa inferior se extrajo con 200 ml de acetato de etilo. La fase de acetato de etilo se recuperó del embudo de separación y se evaporó el solvente en su totalidad en un rotavapor a 65? C. El extracto obtenido fue un sólido de color café-amarillento, el cual se conservó a temperatura ambiente protegido de la luz. 12. Determinación de la concentración de compuestos fenólicos Se empleó el método oficial de análisis de la AOAC (1970), el cual es un método colorimétrico para la determinación de fenoles basado en la cuantificación del color azul formado por la reducción del ácido fosfotungstomolíbdico por compuestos del tipo de los fenoles en solución alcalina. Se preparó una curva patrón de ácido tánico con 0, 20, 40, 60, 80 y 100 ug/ml. Se llevaron los volúmenes a 8.5 ml con agua desionizada. Se adicionaron 0.5 ml del reactivo de Folin-Dennis y 1 ml de una solución sobresaturada de carbonato de sodio. Para la muestra, se resuspendieron los fenoles en agua. Se colocó esta mezcla en un baño María en ebullición durante 15 min. y se filtró la solución. Se tomó una alícuota de 1 ml del filtrado anterior y se procedió igual que para la curva patrón de ácido tánico. Se esperó el desarrollo de la reacción durante 30 min. Enseguida se tomó lectura de la absorbencia a una 1 = 760 nm en un espectrofotómetro ULTRASPEC 11 (Pharmacia). 42 MATERIALES Y MÉTODOS O 13. Identificación de ácido ferúlico y ácido diferúlico con la técnica de cromatografía en capa fina (TLC) Se empleó la técnica de TLC descrita por Sharma ef al, (1998) utilizando cromatoplacas de sílica gel en aluminio de 0.2 mm de grosor. Se usaron como estándares soluciones de ácido ferúlico de SIGMA y ácido diferúlico donado por el Dr. Arturo Navatro. Se probaron tres sistemas de solventes como fase móvil, tolueno: ácido acético en una proporción 9 :1 respectivamente; acetato de etilo: hexano, en proporciones 7:3 y 9:1, respectivamente; metanol: acetato de etilo en proporción 1:1, repectivamente. La fluorescencia de las manchas se observó bajo luz ultravioleta. Como teveladotes se utilizaron el' sulfato cérico, el radical 2,2-difenil-1- picrilhidracilo (DPPH), el reactivo de fenol Folin-Ciocalteu, vapor de hidróxido de amonio, cloruro férrico y vainillina- ácido sulfúrico (H2504). 14. Identificación de ácido ferúlico con la técnica de cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) El análisis de las muestras en HPLC se realizó a través de un cromatógrafo de líquidos serie 250 con bomba isocrática LC250 y un /oop de 20 pl Perkin Elmer, utilizando una columna C-18 Prodigy 50DS 250 x 4.60 mm y 5 micrones. Un detector programable UV Waters, 436 operando en la región UV a 279 nm, un integrador personal modelo 10205. La fase móvil o eluyente utilizada fue agua: metanol grado HPLC, en proporción 70:30 respectivamente. El agua utilizada fue acidificada con 1% de ácido acético glacial para después ajustarla a un pH= 4.0 con NaOH al 10% y ser filtrada a través de un sistema de filtración Millipore con membrana de 0.45um de acetato de celulosa. La fase móvil se desgasificó en un sonicador Brasonic Ultrasonic Cleaners modelo 2210 durante 20 minutos. El flujo fue de 1.0 ml/min. El volumen de muestra inyectada fue de 20 pul. La columna C-18 se calentó con una mantilla eléctrica hasta alcanzar una temperatura igual a 34-38? C y una presión en el cromatógrafo entre 2600-2700 psi. Al final de las inyecciones, la columna se lavó con la fase móvil. Se realizó una curva de calibración para el ácido ferulico bajo las condiciones antes mencionadas. Se manejaron cinco concentraciones: 5,4, 3, 2 y 1 ug/ ml, inyectándose cada concentración por triplicado. La pteparación de la muestra consistió en disolver el extracto sólido obtenido en metanol grado HPLC y proceder a la inyección en el cromatógrafo. 43 15. Identificación de ácido ferúlico con la técnica de espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier (FT-IR) La espectroscopia de infrarrojo se llevó a cabo en un Espectrómetro FT-1R Nicolet Magna 750. Los espectros se realizaron en la técnica de película ó film con bromuro de potasio (KBs). 16. Identificación de ácido ferúlico y ácido diferúlico con las técnicas de espectrometría de masas con impacto electrónico (MS-El), masas-masas (M5- MS), y espectrometría de masas acoplada a cromatografía de gases (GC-MS5) La espectrometría de masas con impacto electrónico y los análisis de masas-masas se desarrollaron en un espectrómetro de masas ThermoQuest de Finnigan GC plus Q. Alícuotas de las muestras suspendidas en acetato de etilo y/o acetona se usaron para el análisis de MS. La temperatura inicial fue de 80*C, la velocidad de calentamiento fue de 15%C/ min a 300%C durante 10 minutos. La temperatura del inyector fue de 275%C y se usó un flujo de 1 ml/ min. Se utilizó una columna HP-5MS de 0.31 mm de diámetro. Para la ionización de las muestras se usó un impacto electrónico de 70 eV. El análisis de GC-MS se desatrolló en el equipo mencionado arriba acoplado a un cromatógrafo de gases ThermoQuest CE Instruments Trace GC Serie 2000. 17. Determinación del contenido de lignina en las paredes celulares El contenido de ligninas se determinó en las paredes celulares por el método modificado de Iyama y Wallis (1990). Las paredes celulares (50 mg) se resuspendieron en 2 ml de cloruro de acetilo al 25% (w/w) en ácido acético glacial y 80 pl de ácido perclórico HCIOs en un tube-de ensayo con tapa de rosca dentro de un tubo de hierro sellado a 70% C por 30 min. Los tubos se agitaron a intervalos de 10 min. Después de completar la digestión, la muestra se enfrió en hielo y se centrifugó a 1 000 g por 1 min. Se transfirió una alícuota de 500 ul a un tubo de ensayo y se adicionó 2 ml de ácido acético y 500 pl de NaOH 2M. El contenido de lignina se estimó midiendo la absorbencia de la muestra en un espectrofotómetro UV ULTRASPEC ll a una A = 280 nm contra un blanco, el cual se corrió junto con la muestra. El contenido de lignina en la pared celular se expresó de acuerdo a la siguiente ecuación: lignina = 5.12 x absorbencia / concentración de la muestra — 0.74 MATERIALES Y METODOS > 18. Extracción de proteínas de pared celular La extracción de proteínas de pared celular se llevó a cabo por dos métodos diferentes: 1) Se utilizó una modificación del método descrito por Hernández-Unzón (1988) que consiste en extraer toda la proteína citoplásmica soluble en cloruro de sodio, principalmente faseolinas y albúminas en el caso del frijol. La muestra de harina de frijol se incubó a 60? C con 2.5 mg de proteasa/ g de harina (Sigma) en una solución amortiguadora de fosfato de sodio 0,1M pH 7.8. La muestra se lavó con solución amortiguadora de fosfato de sodio varias veces agitando vigorosamente y centrifugando a 4 300 g para retirar la proteasa en el sobrenadante. La muestra se incubó con SDS 1% durante 15 minutos a 95”C y se lavó con agua destilada agitando vigorosamente y centrifugando a 4 300 g hasta obtener un sobrenadante claro. Después se extrajeron las proteínas solubles unidas a la pared celular por interacciones iónicas con NaCl 1M 5 horas a temperatura ambiente. Toda la solución salina se retiró lavando varias veces la muestra hasta obtener en el conductímetro una señal igual a la del agua desionizada. Por último, se extrajeron las proteínas unidas covalentemente a la pared celular con hipoclorito de sodio- ácido acético (NaCIOs - HOACc 0.3%), incubando la muestra de frijol a 60*C toda la noche en un baño María. 2) Otra extracción de proteínas de pared celular se llevó a cabo de acuerdo al método de Marshall es al, (1999). Se homogeneizó la muestra, extrayendo las proteínas citoplásmicas con guanidina 6M-cloruro de calcio CaCl2 0.1 M (GC) durante 18 horas a temperatura ambiente y centrifugando a 4 300 g para retirar el sobrenadante. Se lavó la pastilla con agua desionizada agitando vigorosamente y centrifugando a 4 300 g para retirar el sobrenadante. Después se extrajeron las proteínas unidas débilmente a pared celular con SDS 1% a 95%C durante 15 minutos. Posteriormente, la muestra se incubó con guanidina ÓM-CaCl 0,1 M- ditiotritol 5 mM (GCD) durante 24 horas a 25"C y se lavó de nuevo con agua desionizada. Las proteínas unidas covalentemente a la pared celular se extrajeron incubando toda la noche con NaCiOs - HOAc 0.3%, a 60C. 45 MATERIALES Y METODOSCON 19. Cuantificación de proteínas Las proteínas se cuantificaron por el método de Lowty ef al. (1951). Se preparó una curva estándar con 5, 10, 15, 20, 40, 60, 80 y 100 ug/ ml de BSA y se agregó agua desionizada suficiente para obtener un volumen final igual a 150 Ll. Después se agregaron a cada tubo 50 pul de NaOH 0.4% y 1 ml de reactivo de cobre. Los tubos de ensayo se incubaron 15 minutos a temperatura ambiente y se adicionaron 100 pul de reactivo de Folin-Ciocalteu diluido en agua en una proporción 1:1. Los tubos se incubaton a temperatura ambiente por 30 minutos y se leyó la absorbencia a una 1= 700 nm en un espectrofotómetro ULTRASPEC II. 20. Electroforesis en geles de acrilamida: SDS-PAGE La electroforesis en gel discontinuo desnaturalizante (SDS-PAGE) se llevó a cabo por el método de Laemmii (1970). Se utilizó gel separador de acrilamida al 10% y gel concentrador de acrilamida al 4%, de acuerdo a las especificaciones de la tabla 4.1. El sistema de soluciones amortiguadoras de corrida y de muestra se prepararon de acuerdo a Laemmii (1970) tal y como se indica en la tabla 4.2. Los marcadores moleculares utilizados fueron adquiridos en SIGMA. Como marcadores de alto peso molecular se usó miosina (199 kDa), B- galactosidasa (120 kDa), BSA (87 kDa) y ovalbúmina (48.9 kDa). La fosforilasa B (112 kDa), BSA (87 kDa), ovalbúmina (53.2 kDa). anhidrasa carbónica (34.9 kDa), inhibidor de tripsina de soya (28.7 kDa) y lisozima (20.5 kDa) fueron utilizados como marcadores de bajo peso molecular. Para el desarrollo de la electroforesis se utilizó un sistema Miniprotean de BioRad. El sándwich con las placas de vidrio se ensambló utilizando dos espaciadores y se sujetó en el soporte. Se preparó la solución del gel separador en un matraz kitazato y se desgasificó conectando el matraz a la llave de vacío. Se añadió persulfato de amonio y TEMED (N,N,N',N>, -tetrametilenodiamina) a la solución desgasificada y se mezcló suavemente. La solución se aplicó en el sándwich y después se aplicó una pequeña cantidad de alcohol para evitar la evaporación de la solución. Se permitió la polimerización del gel a temperatura ambiente. Enseguida se prepató la solución del gel concentrador. Se retiró el alcohol y se aplicó la solución del gel concentrador al sándwich. Se insertó el peine en la parte superior y se permitió la polimerización del gel a temperatura ambiente. Para la solubilización de las proteínas se añadieron 4ul de B-Mercaptoetanol a 9641 del amortiguador de la muestra, para reducirlas a sus subunidades por reducción de las uniones 46 MATERIALES Y METODOS O bisulfuro. La solubilización de las proteínas consistió en colocar en un tubo eppendorf 8.75 pl de amortiguador de muestra con B-Mercaptoetanol, 26.25 1 de muestra equivalentes a 20ug de proteína y someterlas a ebullición 5 min. Después, las proteínas se aplicaron en los pozos del gel. Se ensambló la cámara de electroforesis y se llenó con solución amortiguadora de corrida. Se conectó la fuente de poder y se permitió la concentración a 50 V y luego la separación a 90- 100 V, de las proteínas aplicadas en el gel. Tabla 4.1. Soluciones para la preparación de geles de acrilamida al 10% Solución Gel separador Gel concentrador Acrilamida 30%-Bisacrilamida 0.8% 2.5 ml 500 yl Tris-HC1 3M pH 8.8 19m o e Áá Tris-HC11MpH 6.8 950 pl SDS 10 % 75 yl 37.5 pl Persulfato de amonio 50 pl 37.5 pl TEMED 5 pl 2.5 pl Tabla 4.2. Soluciones para la preparación de amortiguadores de corrida y de muestras Solución Amortiguador de Amortiguador de muestra corrida 10X' 4x Trizma base ME rr Glicina 14 g o SDS 108 0.2 y Tris-HC11MpH 6.8. 1.25 ml Azul de Coomasie —— 1 mg Glicerol....... o RÁ 3.45 ml Agua desionizada ——— 0.3 mi 1 Aforar a un litro con agua desionizada. 2Se obtiene un volumen final igual a 5.3 ml. Para visualizar las bandas de proteína migrantes en el gel se aplicó azul de Coomasie. Las soluciones teñidora, desteñidora y fijadora del gel se prepararon de acuerdo a las instrucciones en la tabla 4.3. Se colocó el gel en un recipiente y se cubrió con la solución teñidora, se mantuvo en agitación durante 30 min. Se lavó el exceso de solución teñidora con agua destilada hasta que las bandas azules de proteína fueron distinguibles sobre un fondo transparente. Enseguida se mantuvo en agitación con la solución fijadora durante una hora. El gel con las proteínas fijadas se mantuvo en refrigeración sumergido en agua desionizada hasta el momento de secarlo. 47 MATERIALES Y MÉTODOS CS Tabla 4,3. Preparación de soluciones utilizadas en la tinción y fijación de geles de acrilamida Reactivo Solución teñidora Solución desteñidora Solución fijadora Metanol 1.51 —-- eo Etanol 151 o Ácido acético 300 mil 300 ml 200 mi Azul de Coomasie BB e Agua desionizada 1.51 151 1.81 La detección de glicoproteínas se llevó a cabo separando las proteínas por SDS-PAGE de acuerdo a Laemmli (1970). Se hizo una transferencia de proteínas a membrana de nitrocelulosa y se siguió el protocolo indicado en el paquete de Sigma para detección de glicoproteínas, basado en el método de Zacharius ef a/., (1969) y Jay ef al., (1990). 21. Determinación del contenido de carbonilos Se determinó el contenido de carbonilos por el método de Levine ef al, (1990). Primero se procedió a la extracción de las proteínas solubles; se homogeneizaron 50 mg de harina de cotiledón con 600. ul de solución amortiguadora de fosfato de potasio 5 mM pH 7.5, PMSF 1 mM. Se agregaron 200 ul de solución amortiguadora de fosfato de potasio 5 mM pH 7.5, al homogeneizado anterior. Los ácidos nucleicos se precipitaron con estreptomicina a una concentración final de 2 % (200 pl de sulfato de estreptomicina al 10% preparada en HEPES 50 mM pH 7.2). Se-agitó la mezcla en vórtex y se centrifugó a 16 000 g por 15 minutos en frio; se | recuperó el sobrenadante y en éste se repitió la precipitación de ácidos nucleicos con 200 ul de estreptomicina. Se utilizó este segundo sobrenadante para determinar los carbonilos, se agregó un volumen igual de dinitrofenilhidracina 10 mM (preparada en HCl 2 M) y se preparó un control con la muestra que en lugar de hidracina llevaba HCl 2 M; se incubó una hora a temperatura ambiente. Para precipitar las proteínas, la muestra se ajustó a una concentración final de TCA de 10% y posteriormente se centrifugó a 16 000 g por 5 minutos. El precipitado se lavó tres veces con 800 pl de etanol: acetato de etilo (1:1 v/v) y se centrifugó a 16 000 g por 5 minutos. La proteína precipitada se resuspendió en 1.5 ml de guanidina 6 M pH 2.5, preparada en fosfato de potasio 20 mM y a la cual se le ajustó el pH con ácido trifluoroacético (TFA 30%). Se tomó una alícuota y se cuantificaron las proteínas resuspendidas: se preparó una curva patrón de albúmina de suero bovino (BSA) en tubos de ensayo con 0, 10, 20, 30, 40, 50 y 60 ug/ml de 48 MATERIALES Y MÉTODOS > BSA, a los cuales se les agregó agua desionizada suficiente para obtener un volumen final igual a 1 ml. Los tubos con la muestra de proteínas solubles se prepararon con 20 pl de muestra y 980 ul de agua desionizada. Se registró la absorbencia a una 1= 276 nm. Se conservan las muestras a 5%C durante toda la noche. Enseguida se determinó el contenido de carbonilos de acuerdo a la metodología de Levine ef al, (1990) y por el método de Sun y Leopold (1995), basados en la reactividad de los grupos carbonilos presentes en las proteínas oxidadas, con 24 dinitrofenilhidracina. La cuantificación se realizó leyendo a 366 nm cada muestra contra su control sin hidracina (e= 22 000 MA cm”) en un espectrofotómetro ULTRASPEC Il. 22. Determinación del contenido de malonil-dialdehído (MDA) En la prueba para medir peroxidación lipídica, la muestra es calentada con ácido tiobarbitúrico (IBA) a pH bajo y la formación de un cromógeno es medido por absorbencia a 532 nm. La mayoría de los aldehídos que reaccionan con T'BA son derivados de peróxidos y ácidos grasos insaturados. Durante el ensayo se determinó el contenido de MDA en microsomas obtenidos a partir de tejido cotiledonario de frijol. Los microsomas se obtuvieron de acuerdo al método de Sung y Chiu (1995). Se pesó 0.1 g de harina de cotiledón de frijol y se homogeneizó con 4 ml de solución amortiguadora de sacarosa 250 mM, Tris 70 mM/ HCl pH 8.0, KCl 10 mM, MgCL 1 mM, PMSF 1 mM. El homogeneizado se centrifugó a 24 000 g por 10 minutos. El sobrenadante se recuperó y se centrifugó a 77 000 g por una hora en una ultracentrifuga SORVALL RC5B. La muestra de microsomas se homogeneizó en mortero a 4 *C con 5 ml de ácido tricloroacético (ICA) al 5% v/v. El homogeneizado se centrifugó a 14-000 g por 20 minutos y se midió el MDA en este sobrenadante. La cuantificación de MDA se llevó a cabo según el método de Heath y Packer (1968). Se tomó una muestra del sobrenadante equivalente a 350 Hg de proteína, se adicionaron 4 ml de TBA al 0.5% en TCA al 20% y se colocó en un baño María en ebullición durante 30 min a 95 *C. Posteriormente se enfriaron las muestras en hielo y se centrifugaron a 10 000 g durante 10 minutos. La cuantificación de MDA se llevó a cabo determinando la diferencia de absorbencia a 532 nm menos la inespecífica a 600 nm de los productos generados después de dejar reaccionar el TBA con las membranas microsomales durante 30 minutos (e = 155 mM -1 cm *) en un espectrofotómetro BECKMAN DU-6. 49 MATERIALES Y METODOS 23. Determinación de la concentración de peróxido de hidrógeno (H20») Se siguió el método de Hildebrandt ef al, (1985) que está basado en el decremento de fluorescencia de la escopoletina en presencia de peróxido de hidrógeno y peroxidasa. Se obtuvo una curva patrón preparando tubos con 0, 5, 10, 20, 40, 60, 80 y 100 ul de H20» 125 mM, a los cuales se les agregó solución amortiguadora de fosfatos 50 mM pH 7.0 suficiente para obtener un volumen igual a 250 pl, luego se adicionó a cada tubo 250 pl de escopoletina 25 M más 10 unidades de peroxidasa de rábano (Sigma). Se agitaron los tubos de ensayo durante 5 minutos a temperatura ambiente y enseguida se detuvo la reacción con tetraborato de sodio 0.15 M pH 10. Ya que las estructuras celulares son permeables al peróxido de hidrógeno, se consideró que la concentración del peróxido en al agua en que se remojaron los granos es indicativo de la concentración del mismo dentro de los tejidos del cotiledón. Se tomaron 250 yl del agua de remojo de los granos de frijol y se procedió a la cuantificación de peróxido en esta muestra. La fluorescencia se determinó en un fluorómetro SHIMADZU a4 EXC 350 nm y A EM 460 nm. 24. Obtención de los extractos enzimáticos Los extractos enzimáticos se obtuvieron a partir de harina de cotiledones. Se tomaron 0.3g de harina y se trituraron con nitrógeno líquido en un mortero. Se homogeneizó la muestra con solución amortiguadora de fosfato de potasio 5 mM pH 7.5. El homogeneizado se filtró y se centrifugó a 14 000 rpm en una microfuga Eppendorf 5415C por 10 minutos en cuarto frío. Se tecuperó el sobrenadante y se alicuotó en tubos eppendotrf. Los extractos se conservaron a - 70%C por un máximo de 5 días. 25. Determinación de la actividad de la peroxidasa (POX) La actividad de la enzima se determinó por el método de Chance y Mahely (1955). La actividad de la peroxidasa se evaluó mediante la oxidación del guayacol (€ guayacol = 26.6 mM - cm” ). La mezcla de reacción consistió en 500 kl de solución amortiguadora de fosfatos 50 mM pH 6.7, 200 ul de guayacol 50mM, 200 pl de peróxido de hidrógeno 10 mM y 100 ul del extracto de prueba, lo que correspondió a un volumen final de reacción de 1 ml. Se preparó un blanco con 100 ul de agua desionizada en lugar de extracto. Se registraron los cambios de absorbencia 50 MATERIALES Y METODOS a una 1= 470 nm durante 5 minutos, a intervalos de 5 segundos en un espectrofotómetro BECKMAN DU 640. 26. Determinación de la actividad de la catalasa (CAT) La determinación de la actividad de la CAT se llevó a cabo por el método de Chance y Mahely (1955). La actividad se midió como desaparición de H20» (e = 40.0 mM -1 cor). El medio de reacción estuvo compuesto por 700 ul de buffer de fosfatos 50 mM pH 7.0, 200 ¡11 de H20» 50 mM y 100 pl del extracto de prueba. Se preparó un blanco de agua desionizada y un control de peróxido de hidrógeno que contenía 700 ul de buffer de fosfatos 50 mM pH 7.0, 200 yl de H202 50 mM y 100 pl de agua desionizada. La reacción se registró por el cambio de absorbencia a una A= 240 nm en celda de cuatzo durante 3 minutos, a intervalos de 20 segundos y en celdas de cuarzo en un espectrofotómetro BECKMAN DU 640. 27. Determinación de la actividad de la superóxido dismutasa (SOD) Se determinó la actividad de la SOD de acuerdo al método de Misra y Fridovich (1972). La actividad de la enzima se determinó registrando la auto-oxidación de la epinefrina a adrenocromo (E = 4.0 mM -1 cm). El medio de reacción consistió de 650 ul de solución amottiguadora de carbonatos 50 mM pH 10.2, 200 yl de EDTA 0.5mM, 100 ul de extracto de prueba y 50 p] de epinefrina 10 mg/ ml (disuelta en HC] 10 mM pH 2.0) para iniciar la reacción. Se preparó un blanco con 650 pl de solución amortiguadora de carbonatos 50 mM pH 10.2, 200 pl de EDTA 0.5 mM, 50 pl HCl 10 mM y 100 pl de agua desionizada. Se utilizó un. control de epinefrina, el cual contenía 650 ul de solución amortiguadora de carbonatos 50 mM pH 10.2, 200 pl de EDTA 0.5 mM, 100 yl de agua desionizada y 50 pl de epinefrina 10 mg/ ml (disuelta en HC] 10 mM pH 2.0). La actividad de la enzima se siguió por las variaciones de absorbencia a una A= 480 nm durante 3 minutos a intervalos de 10 segundos, en un espectrofotómetro BECKMAN DU 640, tomando en cuenta únicamente las lecturas posteriores a la fase ¿ag y anteriores a la pérdida de color del adrenocromo. 51 28. Diseño experimental y análisis estadístico Los resultados obtenidos fueron analizados conforme un diseño completamente aleatorio. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) y la comparación de medias se realizó con la prueba de Tukey, utilizando el paquete Instat de GraphPad versión 3.00. Las diferencias significativas se estimaron considerando un P< 0.05. Los resultados son presentados como el promedio y desviación estándar de repeticiones de experimentos independientes variables en cada caso. 52 RESULTADOS As V. RESULTADOS 1. Cuantificación y caracterización química de las pectinas de frijol Con la finalidad de demostrar si en el sistema utilizado, el almacenamiento inadecuado de los granos disminuía la extractibilidad de la pectina, se evaluó la capacidad de recuperación de este polímero en paredes celulares de cotiledones frescos y endutecidos (tabla 5,1.). En el caso de FM se compararon los tratamientos de almacenamiento de 30 d y 165 d porque los granos almacenados por 30 d, en condiciones moderadas de envejecimiento, presentaron el mismo TCso que los granos almacenados a 4? C, utilizados como control (ver apéndice, figura A.2.). El almacenamiento inadecuado del grano de frijol resultó en una disminución de la cantidad de pectina extraída. La magnitud de esta disminución vatió dependiendo del cultivar y de si el grano fue o no remojado previamente. En los granos secos, el almacenamiento inadecuado fue más efectivo en disminuir la termosolubilidad de la pectina del cultivar FM (62 %) comparado con el del cultivar FJ] (28 %). Lo contrario fue observado cuando se utilizó grano remojado (tabla 5.1.). Tabla 5.1. Pectina aislada de pared celular de cotiledones de frijol flor de junio flor de mayo Lote de frijol Seco Remojado Seco Remojado 4*C 349.84 370.32 n.d. n.d. 30 días 75% HR 30%C n.d. n.d. 406.9 0003291. 165 días 75% HR 30%C n.d. n.d. 155.2 269.0 30 días 85% HR 40%C 251.1b 198.4b n.d. n.d. n.d. no determinado . Nota: la pectina reportada es la suma de la soluble en el sobrenadante de amilasa y la extraída con oxalato de amonio, ambas precipitadas con etanol. * (mg/g PC) 53 RESULTADOS (> AAA AAA AAA 2. Identificación del tipo de pectina modificado por almacenamiento inadecuado Debido a que el método de purificación de pared celular incluyó la ebullición de la muestra con amilasa, la fracción de pectina termosoluble se solubilizó en el amortiguador, por lo que el total de pectina extraída fue la suma de esta fracción termosoluble y la fracción extraída por un agente quelante, el oxalato de amonio. Es por esto que en esta sección se analizó la composición química de estas fracciones y el efecto del endurecimiento del grano en cada una de ellas. En la figura 5.1. se observa que en el grano control, la cantidad de pectina termosoluble fue similar para ambos cultivares, aunque la composición química fue totalmente diferente. En el cultivar FJ, esta pectina fue rica en ácido galacturónico (Fig. 5.1.B.), mientras que en el cultivar FM, lo fue en azúcares neutros (Fig. 5.1.D). En cambio, para ambos cultivares, la pectina extraída con ácido oxálico, fue más rica en azúcares neutros que en ácido galacturónico (Fig. 5.1. A, B, D y E) y la cantidad extraída fue mayor en FM que en FJ). En el cultivar FJ, el almacenamiento inadecuado disminuyó la pectina termosoluble. En cambio, en el cultivar FM, los mayores cambios se detectaron en la fracción extraída con oxalato de amonio. La composición química de ambas fracciones fue similar a la que presentaron los cultivares control. En ambos casos, para FM y FJ, el almacenamiento inadecuado insolubiliza el polímero de ácido galaturónico. Dado que la abundancia de azúcares neutros en una y otra fracción fue diferente (figura 5.1.), el mecanismo de insolubilidad deberá ser diferente. 54 RESULT. ADOS) FRESCO 3ECOb FRESCO REMOJADO DURO 5ECO DURO REMOJADO > 50 100 150 - AZÚCARES NEUTROS (AN) AZÚCARES NEUTROS (AN) m 9 8 Mi a (my y psredcelular) EE% pectina contenida en el sobrenadante de amilasa EXE pectna contenida en el sobrenadante de amilasa E . EA pectina extraida con oxalato de amonio EZZA pectina extralda con oxalato de amonio E FRESCO SECO "RSC SER RR RAAAARw%w * FRESCO REMOJADO o so 100 150 200 ÁCIDOS URÓNICOS (AU) ÁCIDOS URÓNICOS (AU) (mg! y pared celular) (mg/ y pared celular) ES pecíina contenida en el sobrenadante de amilasa E pectinas en el sobrenadante de amilasa o . . EZZA pectinas extraídas con oxalato de amonio E224 pectina extraida con oxalato de amonio FRESCO SECO FRESCO REMOJADO DURO SECO DURO REMOJADO 10 29 30 de AN/AU ES pedina contenida en el sobrenadante de amilasa E pecina contenida en el sobrenadante de amilasa pectina extralda con oxalato de amonio pectina extralda con oxalato de amonio Figura 5.1. Caracterización química de la pectina extraida en paredes celulares de cotiledones de frijol. Nota : las gráficas A, B y C corresponden a la variedad flor de junio y las gráficas D, E y F a la variedad flor de mayo. 55 RESULTADOS (y, 3. Entrecruzamiento de proteínas de pared celular con posible formación de una red que atrapa fisicamente a las pectinas Se determinó la cantidad de proteína presente en el extracto enriquecido en pectinas; los resultados se muestran en la Fig. 5.2. En la vatiedad FJ] se extrajo una mayor cantidad de proteína en granos remojados que en secos, sólo para las muestras control. El remojo no mejotó la capacidad de extracción de proteína en muestras de frijol endurecido. Con respecto a la variedad FM no se presentaron diferencias significativas en el contenido de proteína de muestras secas y temojadas de frijoles con 30 días de endurecimiento moderado. En frijoles con 165 días de almacenamiento a 75% HR/30? C, el remojo disminuyó el contenido de proteína extraíble junto con la fracción de pectina. En la variedad FM se encontró que las muestras endurecidas 165 días presentaron un mayor contenido de proteína en comparación a las muestras de 30 días de endurecimiento moderado (Fig. 5.2.). b HER grano seco MM grano remojado PR OT EÍ NA (m g/ g pa re d ce lu la r) $ A > $ > Figura 5.2. Niveles de proteína total en la pectina extraída de la pared celular de frijol 56 RESULTADOS $ El contenido de proteína en las fracciones de pectina se presenta en la figura 5.3. El remojo incrementó la cantidad de proteína soluble en oxalato de amonio en los frijoles FJ frescos (figura 5.3.A). En los granos de frijol FM (Fig. 5.3. B) endurecidos se obtuvieron mayores concentraciones de proteína en las fracciones de pectina soluble en el sobrenadante de amilasa de frijoles secos y remojados comparadas con las concentraciones de proteína en la fracción de pectina extraída con oxalato de amonio; no se encontraron diferencias en el contenido de proteína de la pectina unida a calcio, entre frijol control seco y remojado. En los granos dutos y secos se determinó mayor abundancia de proteína que en el grano duro y remojado. 0 5 1 15 » 25 30 o 5 40 sa 20 PROTEÍNA PROTEÍNA (mg/ y pared celular) (mí y pared celular) 353 pectina contenida en el sobraaadante de amilasa 259 peoctina contenida en el sobrenadante de amilasa Y77/1 pectina extraida con oxalato de aruomio pectina extraída con oxalato de amonio A B Figura 5.3. Contenido de proteina en las fracciones de pectina de paredes celulares de cotiledones de frijol. Nota: la gráfica A corresponde a la variedad flor de junio y la gráfica B, a la variedad flor de mayo. CS, frijol fresco seco; CR, frijol fresco remojado; ES, frijol endurecido seco; ER, frijol endurecido remojado. 3.1. Patrones electroforéticos de las proteínas de pared celular En la figura 5.4. se presenta la fotografía del gel con las proteínas obtenidas con el método de extracción de Hernández-Unzón (1988). En el extracto crudo de frijol fresco sin remojar se encontraron más de diez bandas de proteína distribuidas a todo lo largo del carril, siendo las más abundantes dos bandas correspondientes a 53.4 y 48.9 kDa. Se decantó el sobrenadante del extracto crudo y la pastilla se lavó tres veces con solución amortiguadora de fosfatos pH 7.8. En 57 RESULTADOS((y, a el sobre- nadante del último lavado se encontraron nuevamente las bandas correspondientes a 53.4 y 48.9 kDa, sin embargo ya no se presentaron el resto de las bandas de mayor y menor peso molecular, o aparecen muy tenues. Á partir del tercer carril del gel se pueden observar las bandas de las proteínas obtenidas en las siguientes fases del método de extracción. Se comparó la composición de proteína en muestras de frijol Fj no remojado control y endurecido. No se observaron diferencias en los patrones electroforéticos entre frijol control y duro. En todos los carriles estuvieron presentes las proteínas de 53.4 y 48.9 kDa. Tanto en el extracto crudo de frijol, así como en las soluciones de proteínas extraídas con SDS 1% y NaCl 1M, estuvo presente una proteína de 60 kDa, que no apareció en la muestra extraída con NaCIO4-HOAc de frijol control y duro, correspondientes a las proteínas unidas covalentemente a la pared celular. Sólo en el extracto crudo se observaron proteínas de alto peso molecular. Buffer SDS 1% NaCl 1M NaCiO4-HOAc PO4 pH7.8 3 3 3 Marcadores o o e 8 “% E e $ É a Bo DSsxzsosS 3 3 3 o 3385535356343 w ús 8 me. o . do 41199. kDa ed sallá 460.7 kDa j e a ai a349 kDa aii 24.3 KDa lo Figura 5.4. Electroforesis (SDS-PAGE) de proteínas obtenidas con el método de Hernández-Unzón (1988) 58 RESULTADOS (y A En cuanto a la extracción de proteínas por el método de Marshall ez al., (1999), las principales bandas en los carriles correspondientes a muestras de proteínas citoplásmicas totales extraídas con guanidina 6M CaCl 0.1 M (GC) fueron iguales a las encontradas con el método de Hernández-Unzón (1988). Las proteínas unidas a pared celular extraídas con NaCIOr - HOAC 0.3% no fueron detectables en los geles de acrilamida al 10% ni tampoco al intentar identificarlas como glicoproteínas, con el método de Zacharius ef al., (1969) y Jay et al, (1990), que utiliza ácido periódico para teñir de rojo la fracción de carbohidrato de las glicoproteínas. De acuerdo a Cleland (1968), las glicoproteínas ricas en hidroxiprolina (HRGP) extraíbles con sales son solubles en TCA 5%. Ya que las proteínas de pared celular de frijol incluyen proteínas del tipo de las HRGP, intentamos solubilizar las proteínas en TCA 5%, sin conseguirlo. 4. Posibles mecanismos involucrados en la disminución de la solubilidad de la pectina Como se demostró, el endurecimiento de la semilla por almacenamiento inadecuado, disminuyó la solubilidad de la pectina (figura 5.1.). Por lo que es lógico hipotetizar que la sernilla endurecida ha perdido su capacidad para disminuir el peso molecular de las pectinas o bien se han activado los mecanismos de entrecruzamiento que incrementan el peso molecular de estos polímeros o la lignificación o una combinación de mecanismos. En esta sección analizamos las posibilidades anteriores. 4,1. Acidificación celular Dado que la actividad de hidrolasas de pared celular, glucosidasas y pectinasas depende de un pH ácido, se comparó la capacidad de acidificación de pared celular de semillas control y endurecidas. Considerando que la solución acuosa de la pared celular está en equilibrio con la del medio de remojo, esta capacidad se evaluó a través de determinar el pH de la solución de remojo. Durante los primeros 60 días de almacenamiento el pH del agua de remojo fue menor en FJ que en FM (Fig. 5.5.). Durante este mismo período, no se ha modificado el TC, en ambos cultivares, el valor del pH fue menor que el de su respectivo control (Fig. 5.5.). A partir del tiempo de almacenamiento en que se incrementó el TC (ver figura A.2. en apéndice), 90 días de almacenamiento, el valor de pH se incrementó en FJ, mientras que en FM permaneció similar al alcanzado por su control (Fig. 5.5.). 59 RESULTADOS (y 8.0 MN e ME Fu 754 z 9 o dá A u a <« 3 ll mn a xx ea 50 - da a o 30 80 90 165 PERÍODO DE ALMACENAMIENTO (DÍAS) Figura 5.5. pH del agua de remojo de las semillas de frijol almacenadas en condiciones de endurecimiento moderado (75% HR /30* C) FJ, flor de junio; FM, for de mayo 4,2, Entrecruzamiento de pectinas 4.2.1. Identificación de enlace diferúlico: entrecruzamiento de pectinas a través del ácido ferúlico Con la finalidad de establecer si durante el almacenamiento inadecuado de la semilla de frijol se formaban enlaces diferúlicos entre cadenas de pectina vecinas, los fenoles unidos covalentemente a la pared celular fueron obtenidos de acuerdo al método descrito en la sección correspondiente. Sorpresivamente, en los dos cultivares, la cantidad de fenoles unidos en forma covalente a las fracciones de pectina y hemicelulosa fue menor en la semilla endurecida que en la control (tabla 5.2.). La fracción fenólica presentó un contenido de proteínas y ácido urónico que representó del 10 al 13 % del total del peso del extracto fenólico en los frijoles control y fue mayor para el caso de los frijoles endurecidos (tabla 5.2.). 60 RESULTADOS (y, o Tabla 5.2. Peso del extracto de los fenoles unidos covalentemente a la pared celular y su concentración de proteína y ácido galacturónico Peso del extracto fenólico? Proteínas AGU (u8.8' harina) (8.8 harina) (18.8 harina) Variedad Conttol' Duro? Control! Duro? Control! Duro? Flor de 960 340 104.8 54.7 22.3 4.05 Junto Flor de 880 420 68.9 115.6 29.5 34.0 Mayo l almacenados a 4%C desde su cosecha y remojados 15h a 30%C 2 almacenados a 40%C y 85% HR durante 30 días y remojados 15 h a 30%C 3'Peso de la fracción soluble en EtoAc extraída después de acidificar las paredes celulares hidrolizadas con NaOH 4M 15 horas a temperatura ambiente. Garcia ef al, (1998) reportaron la presencia de ácidos hidroxicinámicos en cotiledones de una. variedad de frijol Carioca de Phaseolus vmlgaris L. Srisuma et al. (1989) encontraron principalmente ácido ferúlico en mayor cantidad en frijol endurecido comparado con el frijol fresco en navy beans” Phaseolus vulgaris var. Seafarer. Aparentemente el ácido ferúlico fue el más abundante. Para determinar si las pectinas de frijol de las variedades FM y FJ] tienen unidas a sus cadenas algunas moléculas de ácido ferúlico (FA) y si está presente el ácido diferúlico (DFA), se procedió a la identificación de los fenoles unidos covalentemente a la pared celular. En esta tarea se presentaron algunas dificultades como la cantidad y la falta de pureza de la rmuestra para hacer los análisis y la falta también de pureza de los estándares de ácido diferúlico. Este dímero no se encuentra disponible en el mercado. Por lo que se utilizó como estándar un ácido diferúlico aislado de zanahoria (donación del Dr. Arturo Navarro Ocaña) y otro sintetizado ¿a vitro pot el Dr. Navarro a partir de FA en presencia de POX (Sigma Chemicals). 4.2.1.1. Identificación de ácido ferúlico con la técnica de cromatografía en capa fina (TLC) La técnica de cromatografía de capa fina nos permitió detectar manchas en las placas correspondientes a las muestras de frijol control de las variedades FM y FJ con igual valor de R£ que el estándar de FA (Fig.5.6.). También fue posible distinguir manchas correspondientes a muestras endurecidas de FJ y FM, con igual valor de Rf que las del estándar de DFA de zanahoria. Sin embargo la evidencia no fue clara. Las manchas fueron muy tenues por la gran cantidad de residuos en las muestras. 61 RESULTADOS (y A FLOR DE MAYO FLOR DE JUNIO FA> Figura 5.6. Cromatografía en capa fina de los fenoles unidos covalentemente a la pared celular de cotiledones de frijol. FJC, flor de junio fresco; FJE, flor de junio endurecido; FMC, flor de mayo fresco; FME, flor de mayo endurecido; FA, estándar de ácido ferúlico; DFA, estándar de ácido diferútico. La posición de los ferúlicos se determinó por la fluorescencia de la mancha localizada bajo luz UV (onda corta y onda larga). Esta figura muestra las placas reveladas con el radical DPPH. 4.2.1.2. Identificación de ácido ferúlico con la técnica de cromatografía de líquidos de alta resolución (HPL.C) Alícuotas de los extractos fenólicos se inyectaron a un equipo de HPLC con detector de UV. No fue posible detectar algún compuesto con un tiempo de retención igual al del estándar de FA. 4.2.13. Identificación de ácido ferúlico y ácido diferúlico con la técnica de espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier (FT-IR) Para evaluar la presencia del ácido ferúlico en la pared celular de muestras de frijol fresco y endurecido de dos variedades se recurrió a la técnica de espectroscopia infrarroja. El espectro de la figura 5.7., correspondiente a la muestra de frijol FM control, que abarca la región de 1000 a 4000 crn!, muestra algunas señales características de los ácidos carborxílicos, particularmente los picos 3600 y 1725cm”. En el espectro aparece una señal correspondiente a 62 RESULTADOS (y, pu _ — 2 z=2+ 2 > _ _ E ____ _____>>AA044 A los 3600 cm”, característico de los alcoholes O-H; las señales 2927 y 2856 cm” corresponden al grupo O-CHs de un éster y la señal 1275 cm! corresponde al grupo C-O. Estas tres señales podrían corresponder al grupo oxidrilo, grupo etoxi y grupo catbonilo del ácido ferúlico. Los espectros para las muestras FMC, FME, FJC y FJE fueron muy similares. La técnica de FTIR detecta grupos funcionales presentes en las moléculas, pero tiene ciertas limitaciones. Los grupos funcionales señalados anteriormente también pueden corresponder al ácido diferúlico, sin que podamos discriminar entre este dímero y los monómeros de ácido ferúlico que lo componen en los espectros que corresponden a las muestras de frijol control y endutecido con esta técnica. Tampoco puede utilizarse como una técnica cuantitativa, ya que el porcentaje de transmitancia depende de la cantidad de muestra que se aplicó al equipo y de la cantidad de KBr utilizada. Se obtuvieron también las huellas dactilares correspondientes a las mismas muestras, y en todos los casos los espectros de infrarrojo son similares. En las figuras 5.8. y 5.9. se muestran los espectros correspondientes a las huellas dactilares para las variedades FJ y FM, respectivamente. instítuto de Química, UNAM Laboratorio de infrarrojo E e po A IS “7 yo A EN AA ; ¡ o] INSTITUTO DEQUIMICA | | J — DrMAmenaz MJELOA-FME ! i Jo rus oli 454 17-08-01 4 RPM ¡ ! | 2114 A Me 6 j il j 1 4 2827.70 : 3080 2060 008 A A A o A RA AA a —l Figura 5.7. Espectro de FT-IR de los fenoles de la pared celular de frijol flor de mayo control 63 RESULTADOS», Ele de Química, UNAM Laboratorio de —= _ NENA AO JA | / nf | . | E Lo o pe | “ | | . y ¡ po (A. de Química, UNAM _ Laboratono de tnfranvio a AN Ca OA ANA ql 0 | | y | o | m | po AL | E | INSTITUTO DE QUIMICA ! Me w | EN . o 7 ii ! cl | pa ' ps = = = > | Figura 5.8. Espectros de FT-IR de los fenoles de la pared celular de la variedad F] control y endurecido 64 RESULTADOS (y, (Aa. de Química, UNAM Laboratorio de Inirsrrojo O 0 T SIN Pelicula 18-06-01 RPM | | | | A | | YT 3 L 63 INSTITUTO DE QUIMICA 3 DrM.limenez— MJERO-1-FME 3 A Pelicula 17-05-01 3 1778,43 RPM E | m3 V jnazs 15,54 Figura 5.9. Espectros de FT-IR de los fenoles de pared celular de la variedad FM control y endurecido 65 RESULTADC ISA) aa AÓAá-Ó AAA 4.2.1.4. Identificación de ácido ferúlico con la técnica de cromatografía de gases acoplada a espectrometria de masas- masas (GC-MS/MS) En este estudio se utilizó GC-MS/MS para evaluar la composición cualitativa de los compuestos fenólicos en las muestras de frijol por estar presentes los compuestos de interés en cantidades ínfimas. Primero se inyectaron alícuotas de los extractos fenólicos a un equipo de GC-MS y se analizaron los picos en el termograma haciendo escáneres totales de las muestras (full scan mode). Se sensibilizó al aparato para detectar los picos correspondientes a una relación m/z = 194.0 y 386.0, que corresponden al FA y DEA, respectivamente. Entonces fue posible detectar huellas de m/z= 194.0 en las muestras de frijol control y endurecido de la variedad FM. Únicamente fue posible detectar huellas de m/z = 386.0 en las muestras de frijol endurecido, aparentemente en las muestras de frijol control no estuvo presente. Posteriormente se hizo un análisis MS/MS para la relación m/z de 194 en las muestras de frijol, controles y endurecidos (Fig.5.10. y 5.11., respectivamente) para comparar los patrones de fragmentación de esta molécula. Con el análisis de los datos obtenidos, se presenta la propuesta de fragmentación MS-MS para el FA en las muestras de frijol (Fig. 5.12.). La relación m/z=194.0 corresponde a la huella del ión molecular M* (la molécula perdió un electrón en alguna posición); la huella 193.3 corresponde a la molécula desprotonada; la relación m/z= 179 indica la pérdida del grupo metilo. La relación m/z= 178 puede resultar de una transposición de átomos con la pérdida de una molécula de oxígeno. La relación m/z= 166 pudo resultar de la pérdida de una molécula de carbono y el grupo OH y además perder un protón más dando lugar a la m/z =165. La relación m/z =123 resulta de la pérdida del grupo unido al C1 (m/z= 71). 66 RESULTADOS (>, controkt84)_ 030603012926 06/0303 0129-28 control(194)_0306030129264122 RT:0.80 AV. 1 NL: 3.3254 T: + SRMms2 194.008)1.00 | 35.00-194.00] 4 : 1783 al el el Ti Tr 194.3 E 5 Ps 105.4 ds Es Ea 179.3 19.3 3 2 2 se. 180.4 1 1523 164,3)|| 187.4 1 1393 ap 1385 151,4) 159.4 app 1eS 39.1 $20 573621 722 85t 091 969 1034 1127], A al ho al 1s8s, 1 54011, salio A RN EDEN ARTERIA 40 50 80 7O 80 80 100 110 120 430 140 150 160 170 180 190 miz Figura 5.10. Espectro MS/MS para la huella m/z= 194 en frijoles de la variedad flor de mayo fresco DDR, RENSñacido ferulicosiduro(194) 08/03/03 02:07:52 duro(1944125-128 RT:0.81-0.83 AW4 NL: 124E4 7: + c SRMms2 194.009)1.00 [ 35.00-194.00] +00 1784 1943 105.3 191.4 179.4 2 185.4 1 164. 187.4 1153 1094 153 mall 172 151 ( ] , 309 443 588 641 587.3 772 624 019 081 1054 alas qm3 a ¿ua ll A AA ERA A AAA PUR AD AN 4 hi, Li ll ] ll , 40 59 60 70 B0 20 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 -miz Figura 5.11. Espectro MS/MS para la huella m/z= 194 en frijol flor de mayo endurecido 67 RESULTADOS (3 + . o HO o 1 HO O ¿O -15 70eY A + 0) 0H oh, HO HO HO miz 194 Mm” -16 0 O o om, HO miz 123 HO miz 178 miz 165 Figura 5.12. Propuesta de fragmentación del ácido ferúlico 68 RESULTADOS (y A ====5á 4.3. Lignificación de la pared celular La lignificación de la pared celular se debe a la polimerización de fenoles. Por esta razón se estudió el efecto que el almacenamiento inadecuado ejerce sobre el contenido y distribución de los fenoles en la semilla y en el grado de lignificación de la pared celular. 4.3.1, Fenoles totales Durante el endurecimiento se incrementó el contenido fenólico en los cotiledones (Tabla 5.3.). No hubo diferencias significativas (P<0.05) entre variedades en ningún caso. Con el remojo se presentó un incremento en el contenido de fenoles libres tanto en muestras control como en las endurecidas para la variedad FJ, aunque este efecto es mayor en las muestras frescas. En la variedad FM también se presentó un aumento significativo en el contenido de fenoles libres con el remojo de las muestras control, pero no fue así en las muestras endurecidas, las cuales mantuvieron los mismos niveles antes y después del remojo. Tabla 5.3. Contenido de fenoles totales en harina de cotiledón de dos variedades de frijol. Fenoles (ug eq. ATg' harina) Variedad Control! Endurecido” Sin remojo Con remojo Sin remojo Con remojo Flor de Junto 0.3910.02a 1.41+0.45b 1.5510.53b 2.30+0.15cdef Flor de Mayo 0.18+0.03a 2.04+0.07bcd 1.63+0.67bc 1.76%0.27bcdef Y almacenados a 4%C desde su cosecha 2 almacenados a 409C y 85% HR durante 30 días Las letras diferentes indican diferencias significativas (P<0.05) entre los valores. 4.3.2. Fenoles asociados a la pared celular De acuerdo con Hohlberg y Stanley (1987), las proteínas son degradadas durante el almacenamiento en condiciones de alta humedad y temperatura, liberando pequeños polipéptidos y aminoácidos aromáticos libres, que participan en la vía fenilpropanoide, y migran a la lamela media y pared celular donde la lignificación puede ocutrit. Para determinar la presencia de fenoles unidos de forma no covalente a la pared celular purificada, se lavó la fracción enriquecida en pared celular con acetato de etilo. El contenido de fenoles encontrado en las muestras se reporta en la tabla 5.4. Como se observa, el contenido 69 RESULTADC SAN fenólico no se vio afectado por el remojo, las muestras no presentaron diferencias significativas (P<0.05) antes y después de ser sometidas a imbibición. Los datos indican que durante el endurecimiento de frijol, la cantidad de fenoles asociados a la pared celular es mayor. Tabla 5.4. Niveles de fenoles unidos de forma no covalente a la pared celular purificada de cotiledones de la variedad de frijol FM. Fenoles Á cido Ferúlico.e”* hari Control' Endurecido? Semillas sin remojar 0.59+0.006* 0.98+0.07* Semillas remojadas 0.59+0.011* 1.03+0.01> U almacenados a 30%C y 75% HR durante 30 días 2 almacenados a 30%C y 75% HR durante 165 días Las letras diferentes indican diferencias significativas (P<0.05) entre los valores. 4.3.3. Lignificación En la tabla 5.5. se muestran los niveles de lignificación de las paredes celulares aisladas de semillas control y almacenadas. Se encontraron diferencias significativas en los niveles de lignina de cotiledones endurecidos compatados con los frescos, para las dos variedades. Al parecer hay una asociación positiva entre la acumulación de lignina en la pared celular y el grado de endurecimiento de las semillas. Tabla 5.5. Niveles de ligninas encontradas en la pared celular de cotiledones de semillas remojadas de dos variedades de frijol Flor de Junio Flor de Mayo. Conttol' 2.6750.23a 0.6610.05c Endurecido? 7.5710,17b 6.82+0.23d % lignina = 5,12 x absorbencia/concentración de la muestra - 0.74 (liyama, 1990). 1 almacenados a 4%C desde su cosecha (remojados por 15 h a 30? C) 2 almacenados a 40%C y 85% HR durante 30 días(remojados por 15 h a 30? C) Las letras diferentes indican diferencias significativas (P<0.05) entre los valores. 4.4. Estrés oxidativo En la sección anterior se demostró que el almacenamiento inadecuado indujo la lignificación de paredes celulares. En ambos tipos de reacciones se requiere la acción de peróxido de hidrógeno y de peroxidasas. Dado que el peróxido de hidrógeno celular se produce como consecuencia de 70 RESULTADOS (y, estrés oxidativo, en esta sección se estudió si el almacenatniento inadecuado ocasionó un estrés de tipo oxidativo en las semillas. 4.4,1. Determinación de la oxidación de lípidos y proteínas Cuando una célula está sometida a estrés oxidativo se acumulan tres tipos de moléculas: lípidos membranales peroxidados, proteínas oxidadas y peróxido de hidrógeno. El primer tipo se cuantificó como el contenido de sustancias reactivas a tiobarbitúrico (SRT) y la oxidación de proteínas fue medida como el contenido de carbonilos en la fracción proteica. Las determinaciones de los productos de oxidación se llevaron a cabo en granos de frijol FM almacenados en 75% HR/30% C durante 30, 60, 90 y 165 días (tablas 5.6. y 5.7.). Los resultados obtenidos indican que no se presentó alguna variación significativa en el contenido de proteírras oxidadas a lo largo del período de almacenamiento, tanto en cotiledones secos como en aquellos embebidos 15 h/30? C en agua (tabla 5.6.). En los cotiledones secos, el contenido de SRT disminuyó significativamente a los treinta días y posteriormente, a los 60 días recuperó el nivel inicial, pero aparentemente las SRT continuaron acumulándose y a los 90 días se presentó un incremento significativo. En los cotiledones remojados se registró un incremento significativo de las SRT que se mantuvo constante después de los treinta días, sin embargo el remojo no parece haber permitido una elevación significativa en la cantidad de las SRT (tabla 5.7.). Tabla 5.6. Contenido de proteínas oxidadas en los granos secos y remojados de la variedad de frijol flor de mayo almacenados en condiciones de 75% HR y 30” € PROTEINAS OXIDADAS (nmoles carbonilos. mg proteína”) Tiempo de almacenamiento (días) 0 30 60 90 165 SECOS 0.46+0.06a 0.44+0.002 0.43+0.03a 0.450.052 nd REMOJADOS nd? 0.40+0.03a 0.40+0.042 0.42+0.052 0.46+0.07a 1 Las letras diferentes indican diferencias significativas (P<0.05) entre valores de una misma línea 2nd: no determinada 71 RESULTADOS), O A Tabla 5.7. Nivel de lipoperoxidación membrana! en granos secos y remojados de la variedad de frijol FM almacenados en condiciones de 75% HR y 30* C LIPOPEROXIDACION MEMBRANAL. (umoles MDA. mg proteína”) Tiempo de almacenamiento (días) 0 30 60 90 165 SECOS 0.85+0.09% — 0.69+0.02* 0.75t0.05” 1.0%0.00' nd REMOJADOS nd 0.570,03” 0.98:0.01% 0.98+0.14” 0.90+0.10” MDA: Malonil di-aldehído Los números diferentes indican diferencias significativas (P<0.05) entre valores de una misma columna Las letras diferentes indican diferencias significativas (P<0.05) entre valores de una misma línea nd: no determinada 4.4.2. Participación del peróxido de hidrógeno Se determinó el contenido de peróxido de hidrógeno en el agua de remojo de los granos de las dos variedades para estimar, basados en las propiedades de difusión de esta molécula, el nivel de agua oxigenada presente en los cotiledones para obtener un panorama más claro sobre si en los cotiledones se inducía un estrés oxidativo durante el período de almacenamiento. En la tabla 5.8. se presenta la concentración encontrada en las dos variedades de frijol. Las semillas de la variedad FJ acumularon una cantidad significativamente mayor de agua oxigenada que las semillas de la variedad FM y esta acumulación permaneció invariable a lo largo del experimento. Tabla 5.8. Concentración de peróxido de hidrógeno en frijol almacenado en condiciones de 75% HR y30*C PERÓXIDO DE HIDRÓGENO (nmoLm!”) Tiempo de almacenamiento (días) VARIEDAD 0 30 60 90 FJ 11.6140.69* 11.7140.30” 12.22+0.261a 11.83+0.13” FM 5.880.47% 4.7410.222b 6.49+0.282a 6.34+0.277 Los números diferentes indican diferencias significativas (P<0.05) entre valores de una misma columna Las letras diferentes indican diferencias significativas (P<0.05) entre valores de una misma línea 72 RESULTADOS (y O a Debido a estos resultados, se sometieron muestras de ambas variedades a un almacenamiento en condiciones de endurecimiento acelerado, con 85% HR/40* C. A los 30 días bajo estas condiciones el 67% de la muestra de la variedad FM no se coció en 5 horas. Los niveles de agua oxigenada fueron significativamente menores en los granos endurecidos comparados con los frescos para las dos variedades (Fig. 5.13,. 16 -. MI rior De Junio MIN rior ova maro L sd P E R Ó X I D O DE H I D R Ó G E N O ( n m o l e s / m i PERÍODO DE ALMACENAMIENTO (DÍAS) Figura 5.13. Peróxido de hidrógeno en frijol almacenado en condiciones de 85% HR y 40” C. Las letras iguales indican que no existen diferencias significativas entre los diferentes tiempos de almacenamiento (P<0.05) 4.4.2.1. Efecto del peróxido de hidrógeno exógeno en el agua de remojo de frijoles frescos, y endurecidos Debido a que en otros sistemas se ha demostrado que los efectos mediados por estrés oxidativo pueden ser mimetizados por la adición exógena de péroxido de hidrógeno (Geissman y Neukom, 1971; Ralph ef al, 1994; Grabber ef al, 1995; Oosterveld et al, 1997; Grabber el al, 2002), en este trabajo exploramos la posibilidad de que la semilla de frijol incrementara su TC al ser remojada en péroxido de hidrógeno. Los datos obtenidos señalan que la presencia por sí misma del peróxido en el agua de remojo, en una concentración de 60 nmol/ ml, no es suficiente para endurecer al frijol (Fig. 5.14.). Al incrementar la concentración en el agua de remojo hasta 600 nmol/ml se observó un tiempo de 73 RESULTADOS (y cocción superior al control, sin embargo, continuando con el incremento de H20» hasta 10 mmol/ml, el tiempo de cocción, contradictoriamente a lo esperado, fue estadísticamente igual al control (P<0.05). 70 50 4 40 4 T I E M P O DE C O C C I Ó N (M IN ) 8 A 60 6800 PERÓXIDO DE HIDRÓGENO (nmoles/ mi) Figura 5.14. Efecto de la concentración del peróxido de hidrógeno en el agua de remojo sobre el TCso de granos de frijol de la variedad flor de mayo fresco Las letras iguales indican que no existen diferencias significativas entre los diferentes tiempos de almacenamiento (P<0.05) Usando la concentración que sí tuvo un efecto sobre el tiempo de cocción de los granos (600 nmol/ml), se remojó al frijol endurecido con un tiempo de cocción inicial igual a 207.0 410.97 minutos, los resultados se presentan en la Fig. 5.15. En frijoles control, el peróxido en el agua de remojo incrementó el tiempo de cocción 1.5 veces, en frijoles duros, el incremento fue de 1.4 veces. 74 RESULTADOS (L, FMC o (M IN ) 150 - 00 + so ON . Z 0 600 PERÓXIDO DE HIDRÓGENO (nmoles/ mi) T I E M P O DE C O C C I Ó N Figura 5.15, Efecto de la concentración del peróxido de hidrógeno en el agua de remojo sobre el TCso de granos de frijol de la variedad flor de mayo Las letras iguales indican que no existen diferencias significativas entre los diferentes tiempos de almacenamiento (P<0.05). FEMC, flor de mayo fresco (almacenado a 4%C); FME, flor de mayo endurecido (165 días a 30? C/ 75% HR) 4.4.3. Participación de las enzimas de defensa anti-especies reactivas de oxígeno Se determinó la actividad enzimática del sistema anti-especies reactivas de oxígeno (ERO). La peroxidasa (POX) disminuyó su actividad a los treinta días en ambas variedades, después el nivel de actividad inicial se recuperó paulatinamente en la variedad FJ a diferencia del frijol FM. Ambas variedades presentaron niveles similares de actividad de superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT) durante el período de almacenamiento, las dos presentaron una pérdida significativa de actividad de las dos enzimas y ninguna de las dos variedades recuperó los niveles iniciales (tabla 5.9.). Con el objetivo de conocer el comportamiento de la actividad enzimática en el sistema remojado se evaluaron muestras de frijol FM sometidas a 15 h de remojo en agua destilada a 30 C por ser el material más sensible al endurecimiento, los resultados se presentan en la Fig. 5.16. La SOD incrementó de manera significativa su actividad después de la fase de remojo y la mantuvo constante a lo largo del experimento; la actividad de la POX también aumentó significativamente, pero igual que en el sistema seco, la actividad se perdió y no se 75 RESULTADOS (, A O A íá-— recupetó; la CAT en cambio disminuyó significativamente su actividad con el remojo y siguió disminuyendo a través del tiempo de almacenamiento. Tabla 5.9, Actividad del sistema enzimático de defensa contra especies reactivas de oxígeno de cotiledones secos de dos variedades de frijol almacenados en condiciones de 75% HR y 30” C Tiempo de almacenamiento ENZIMA (días) 0 30 60 90 165 POX FJ 45.20+3.864 30.48+4.84b 27.38+4.47b 29.56+1.64bc 42.69+8.39ac (jmol H,0,.min'.g*) FM 18.37%0.382 9.82+290b 8.78+194b 11.00+0.38b 8.65+0.19b CAT FJ 0.19+0.0064 0.12+0.046b 0.11:0.006b 0.14:0.011ab nd (umol H¿0,.min"'.g) FM 0.24+0.0781 0.10*0.015b 0.11+0.005b 0.15:0.015ab 0.13+0.04ab FJ 29.16+6.82a 22.01+0.47a 21.38+0.70a 23.370.174 13.01+0.80b SsoD (umoladrenocromo.min” FM 28.58+2.752 23.90+0.64b 23.30+1.084b 22.05+0.58b 16.25+0.48c g) nd: no determinada Las letras diferentes indican diferencias significativas (P<0.05) entre valores de una misma línea FJ, flor de junio; FM, flor de mayo 76 RESULTADOS (y 30 FP Je 2oL AA t0F S U P E R O X I D O D I S M U T A S A (u mo l ad re no cr om o. mi n- 1. g- 1) —I— SECO —A— remojado 15t P E R O X I D A S A (u mo l H , O , . m i n t . g ” 1 ) 0.39 0.30 F 0.25 FP 0.20 + 0.15 | C A T A L A S A (u mo le s H ¿0 ,M in 1. g1 ) 0.10 P 0.05 F 0.00 PERÍODO DE ALMACENAMIENTO (días) Figura 5.16. Actividad del sistema enzimático de defensa contra especies reactivas de oxígeno La actividad enzimática se evaluó durante el periodo de almacenamiento de la semilla de frijol flor de mayo en 75%HR/30"C 77 DISCUSIÓN (y, A VI. DISCUSIÓN El tiempo de cocción del frijol constituye una de las características más importantes que determinan la aceptación de la semilla por el consumidor. Sin embargo, el tiempo de cocción que presenta un lote de frijol depende de factores muy diversos. Algunos de ellos son las condiciones de cultivo y de cosecha, manejo poscosecha de la semilla, cultivar de que se trate, condiciones de cocción, condiciones y tiempo de almacenamiento, solo por nombrar algunos (Liu, 1995; Kigel, 1999; Acosta y Pérez, 2000; Berbert es al., 2002; Pérez ef al, 2002). Es por esto que en la ciencia de los alimentos y la bioquímica hay toda un área dedicada a definir las bases moleculares de la cocción del frijol. En estos estudios se ha demostrado que la velocidad de desestabilización térmica de las pectinas (ruptura intermolecular de puentes de hidrógeno y en algunos casos de los enlaces glucosídicos) contribuye de manera muy importante en la magnitud del tiempo de cocción que presenta la semilla (Singh y Rao, 1995; Martínez, 2003). A su vez, la velocidad de termo-desestabilización, está influida por la composición química, la fuerza de interacción intermolecular y el peso molecular de la pectina (Blancas, 2001; Méndez, 2003). De lo anterior se puede concluir que las propiedades fisicoquímicas de las pectinas contribuyen a las características de cocción del frijol (Stanley ez al, 1978). En frijol, al igual que en otras dicotiledóneas, las pectinas están constituidas por una cadena lineal formada por segmentos de homogalacturonano y de ramnogalacturonano (García y Peña- Valdivia, 1995). En el dominio de ramnogalacturonano, la posición 4 de la ramnosa se encuentra sustituida por cadenas laterales de arabinosa, xilosa, glucosa y galactosa (Stevens y Selvendran, 1984; Bonnie ef al, 2002), formando estructuras laxas debido a la presencia de cadenas laterales de azúcares (Fig. 6.1). El dominio de homogalacturonano forma estructuras regulares a través de iones calcio, también llamadas zóna de unión [Johanson el al, 2002) (Fig. 6.1). En ambos casos tales interacciones están estabilizadas por puentes de hidrógeno intercatenarios; entre mayor sea el tamaño y el número de las zonas de unión, mayor será la rigidez del gel formado por las pectinas (García y Peña-Valdivia, 1995). Por lo tanto, las diferencias en composición química de la fracción termosoluble de pectina entre cultivares (Fig. 5.1.) sugieren que en FJ este polisacárido se encuentra formando zonas de unión, mientras que 78 DISCUSIÓN (y, A ____X— en el cultivar EM, se encontraba interaccionando de manera laxa. En FJ, la pectina termosoluble estaba formada principalmente por homogalacturonano; ya que químicamente se detectó mayoritariamente ácido urónico (Fig. 5.1.). Mientras que en FM esta fracción fue principalmente ramnogalacturonano; ya que en su composición se detectó una gran cantidad de azúcares y poco ácido urónico (Fig. 5.1.). De donde se puede concluir que la estabilidad térmica de la pectina en el cultivar FJ fue mayor que en el cultivar FM. Ésta es una de las causas por la cual el tiempo de cocción del frijol fresco FJ fue mayor que el de FM (Tabla A.1.). CADENA LATERAL , DE ARABINANA, GALACTANA ÁCIDO O ARABINOGALACTANA GALACTURÓNICO ÁCIDO RAMNOGALACTURONANA GALACTURÓNICO ALTAMENTE ESTERIFICADA Y ESTERIFICADO LIGERAMENTE (EN LÁMINA MEDIA) Ó ALTAMENTE (EN 2+ mt2 PARED CELULAR PRIMARIA) Ca X XxX RAMIFICADA > LY N CADENAS LATERALES MUY -2)-0 -Luramnosa-1(1- CORTAS CON UNO O ALGUNOS RESIDUOS Figura 6.1. Dominios de ramnogalacturonano y homogalacturonano de pectinas Fuente: García y Peña-VWaldivia, 1995 Dos tratamientos que modifican el tiempo de cocción del frijol son el remojo de la semilla, previo al tratamiento térmico y su almacenamiento en condiciones inadecuadas (HR >50 % y T > 15 ”C). El primero disminuye el tiempo de cocción (Martínez, 2003) y el segundo lo incrementa (Méndez, 2003). Ambos resultados sugieren que las propiedades fisicoquímicas de las pectinas se modifican durante el tratamiento. En el primer tratamiento, la modificación incrementa la velocidad de termo-desestabilización de la pectina y en el segundo la disminuye, respecto a la presentada en el frijol fresco, sin tratamiento alguno (Martínez, 2003; Ríos, 2003). 79 DISCUSIÓN Qs, A OOO OO A nivel molecular, el aumento en la velocidad de termo-desestabilización de este polisacárido durante el remojo de la semilla, se debe a que el peso molecular y la abundancia de ácido urónico en las pectinas disminuye por acción de diversas pectinasas como la poligalacturonasa (Martínez, 2003), la pectinmetil-esterasa (Ríos, 2003) y diversas glucosidasas (Hincks, 1985; Stolle-Smits ef al, 1999; Pacheco, 2003). Estas disminuciones no se observaron en frijol almacenado o endurecido (Méndez, 2003) debido probablemente, a que la actividad de pectinasas no fue detectada en frijoles almacenados (Martínez, 2003; Pacheco, 2003; Ríos, 2003). Si el mecanismo anterior fuese el único que participa en modificar la velocidad de termosolubilización de la pectina y este se inactiva por efecto del almacenamiento inadecuado de la semilla (Ríos, 2003), entonces, el tiempo de cocción del frijol almacenado sería similar al del frijol fresco sin tratamiento. Sin embargo el tiempo de cocción del frijol almacenado en condiciones inadecuadas es siempre mayor que el del frijol fresco sin tratamiento. Esto sugiere la participación de un mecanismo adicional. Las paredes celulares, contienen además de los polisacáridos, jones, compuestos fenólicos, proteínas estructurales y enzimas del tipo de las peroxidasas y polifenoloxidasas (Carpita y Gibeaut, 1993; García y Peña-Valdivia, 1995, Mc Dougall et al, 1996). La presencia de estas moléculas sugiere que un mecanismo para disminuir la velocidad de termosolubilidad de la pectina, durante el almacenamiento inadecuado de la semilla, sería la formación ¿n muro de enlaces covalentes entre los polisacáridos y los diversos componentes de la pared celular. En las condiciones de almacenamiento (85% HR y T = 40? C) utilizadas en este trabajo, estas oxidasas son activas (Hincks, 1985). Entre los enlaces covalentes formados en estas condiciones se encuentran la formación de enlaces diferúlico (Fry, 1979; Iyama ez al, 1994), la interacción covalente entre polisacáridos y diversos grupos químicos en la superficie de las ligninas (Ralph ez al, 1995); así como la interacción entre grupos ferúlicos de los polisacáridos y los grupos superficiales de la lignina (Whitmore, 1978; Brett er al, 1999). Estos enlaces disminuyen la termo-desestabilización de las pectinas (Towo er al, 2003). En este trabajo se exploró la posibilidad de que durante el almacenamiento inadecuado de la semilla se formaran este tipo de enlaces, lo cual disminuiría la solubilidad de las pectinas e inclusive las insolubilizaría. Como 80 DISCUSIÓN (y, O sistema experimental se utilizaron dos cultivares de frijol almacenado en condiciones inadecuadas (85 Y% de HR y 40%C). La disminución en la cantidad de pectina termosoluble de los frijoles almacenados respecto a la de los frescos (Fig. 5.1.), sugiete que durante el almacenamiento inadecuado de la semilla, esta fracción se insolubilizó. Siendo esta una de las razones por la que los frijoles no se cocieron en 5 horas de tratamiento térmico (tabla A.2.). La insolubilidad de estos polisacáridos (Fig. 5.1.), no se debió a limitaciones en la hidratación ya que la cantidad de agua absorbida y el volumen de hidratación en frijoles almacenados fueron similares al de los frijoles frescos (Fig. A.4. y A.5.). Otra posibilidad que puede explicar la insolubilización de las pectinas inducida durante el almacenamiento lo constituye la formación de uniones éster entre el carboxilo de los residuos de ácidos urónicos y los grupos hidroxilo de los monolignoles presentes en la superficie de la lignina. Este tipo de unión se cataliza por peroxidasas (Iyama ef al, 1994). En frijoles almacenados en condiciones inadecuadas, la formación de estos ésteres se favorecería por el incremento de la lignina detectada en paredes celulares de frijoles almacenados (Tabla 5.5.). Sin embargo la presencia de estos enlaces éster no fue detectada de manera contundente debido a que su extracción de la pared celular se realizó con NaOH y este enlace éster es lábil en medio alcalino Brunzel er al, 2000; Grabber ef al, 2002). Otro tipo de enlace que probablemente participó en la insolubilizacion de la pectina es el de tipo ciclobutano por la asociación cabeza-cola del ácido cinámico o del ácido ferúlico esterificados a las cadenas de la pectina (Oosterveld ef al, 1997). El ácido ferúlico fue detectado entre los fenoles unidos covalentemente a los polisacáridos de la pared celular (Fig. 5.10. y 5.11.). Por otra parte, la lignificación es producto de la polimerización de alcoholes aromáticos (P- coumarílico, coniferílico y sinapílico) cuyo mecanismo de reacción no es claro. Se propone que las peroxidasas y las polifenoloxidasas podrían estar participando (Markwalder y Neukom, 1976; Fry, 1979; Brett es al, 1999). Esta reacción se realiza en forma extracelular y se favorece con el incremento de estos alcoholes en la pared celular. La presencia de estos alcoholes no se determinó de manera específica; aunque los espectros de FT-IR sugieren su presencia en los fenoles aislados de paredes celulares (Fig. 5.7-5.9) y muy probablemente su contenido haya 81 DISCUSIÓN (y, “aumentado durante el almacenamiento ya que los niveles de fenoles se incrementaron (Tablas 5.3 y 5.4). A su vez el incremento en fenoles (Tabla 5.3 y 5.4) detectado en frijoles almacenados respecto del de los frescos, sugiere que las condiciones de almacenamiento (Ay 85 % y T de 40*C) activaron el metabolismo celular; ya que estos compuestos se sintetizan en retículo endoplásmico y aparato de Golgi a partir de fenilalanina, y se transportan en vesículas hacia la membrana plasmática, donde son secretados hacia la matriz extracelular (Brett y Waldron, 1996; Brett ef al, 1999). Aunque también podrían provenir de las células del parénquima de la testa. Estas células poseen inclusiones de fenoles y están en contacto con los cotiledones (Tovar, 1997). Sin embargo, la velocidad de síntesis o de transferencia de fenoles de la testa hacia los cotiledones fue mayor en FM que en FJ, ya que el incremento en la cantidad de fenoles asociados a la pared celular y de ligninas dutante el almacenamiento fue mayor en FM que en EJ, aún cuando las condiciones de almacenamiento fueron similares en ambos casos. Esta mayor capacidad de modificar ín muro los componentes de pared celular podría estar relacionada con la sensibilidad al endurecimiento que presentan los diferentes cultivares. FM es más sensible a endurecerse que FJ (Fig. A.3.). También presenta la mayor capacidad de modificación ¿n muro de sus componentes, como aparentemente lo indica el mayor contenido de lignina (Tabla 5.5.), menor solubilidad de las pectinas (Fig. 5.1.) y mayor contenido de fenoles (Tablas 5.3. y 5.4.). Dado que las condiciones de almacenamiento utilizadas en este trabajo permiten que estas reacciones se realicen, la disminución de pectina termosoluble de paredes celulares aisladas de frijol almacenado, respecto del fresco, podría deberse a este tipo de entrecruzamiento. En la figura 6.2 se presenta un modelo de la pared celular de frijol no endurecido y una propuesta de las modificaciones ocurridas en las paredes celulares de cotiledones de frijol durante el almacenamiento inadecuado (Fig. 6.3.). 82 Figura 6.2. Modelo de la pared celular de cotiledones de frijol fresco % ácido golaciurónico ramnosa Oglucosa 8 arabinosa Papicea 8 galactosa Mucosa tameola media pared celular membrana plaemática 0 —MONÓMEROS DE LIGNINA ÁCIDO FERÚLICO ESTERIFICADO . Y A UN RESIDUO DE ARABÍNOSA unión a calcio arabinosa oe ÁCIDO DIFERÚLICO Figura 6.3. Modificación propuesta de la pared celular de cotiledones de frijol en condiciones de almacenamiento inadecuado DISCUSIÓN Ls, Además de los alcoholes fenilpropanoides, la formación de las ligninas requiere de la presencia de peróxido de hidrógeno en la pared celular; ya que constituye uno de los sustratos de la peroxidasa y de la polifenoloxidasa, enzimas responsables de realizar esta oxidación. Una de las fuentes de peróxido de hidrógeno es el citoplasma de células sometidas a un estrés oxidativo. Este estrés se establece cuando el equilibrio entre la formación y la desintoxicación de las especies reactivas de oxígeno se pierde (Hendty, 1993). Esto se detecta a través de la peroxidación de lípidos membranales y de la oxidación de proteínas citoplasmáticas. El efecto del almacenamiento en los niveles de acumulación del peróxido de hidrógeno depende de las condiciones de HR y T. El almacenamiento a 75 % HR y 30%C no modificó la acumulación del peróxido de hidrógeno (Tabla 5.8.), aunque se presentó una ligera lipoperoxidación (Tabla 5.7) sugiriendo que las células de semillas almacenadas en estas condiciones presentaban un ligero estrés oxidativo. Este estado de estrés se debió probablemente a que las enzimas citoplásmicas de desintoxicación (CAT y POX) de agua oxigenada disminuyeron, con excepción de SOD, formadora de peróxido de hidrógeno y se perdió el balance entre producción y desintoxicación de H20»- sobre todo en FM, el cultivar con mayor sensibilidad al endurecimiento (Tabla 5.9). El hecho de que frijoles frescos incubados en peróxido de hidrógeno no modificaron su tiempo de cocción de manera significativa (Fig. 5.15) sugiere que estas enzimas juegan un papel importante en evitar el endurecimiento del frijol, en contraste a lo que sucede con los frijoles deteriorados en los que la actividad del sistema enzimático anti-estrés oxidativo ha disminuido (Figura 5.16). 34 ONIS y VII. CONCLUSIONES 1. El almacenamiento inadecuado de la semilla de frijol resultó en una disminución de la facilidad de termo-desestabilización de la pectina. La magnitud de esta disminución fue dependiente del cultivar, del contenido de humedad de la semilla (remojada o seca) y de las condiciones de almacenamiento (temperatura, humedad relativa y tiempo). 2. El almacenamiento inadecuado de las semillas incrementó el contenido de ligninas en la pared celular de cotiledones. 3. El entrecruzamiento de ligninas y pectinas in muro aparentemente fue un factor influyente en la disminución de la capacidad de termo-desestabilización de las mismas, en ambas variedades de frijol. 4. Se encontraron evidencias indirectas de la participación de fenoles, específicamente ácido ferúlico durante el entrecruzamiento de las pectinas. 5. No se encontró evidencia que sugiriera la participación de las proteínas de pared celular durante la insolubilización de pectinas. 6. La superóxido dismutasa resultó ser la única enzima anti-ERO activa después del almacenamiento en condiciones inadecuadas, el cual provocó un decremento en las actividades de peroxidasa citoplásmica y catalasa. El hecho de no haber encontrado un incremento significativo en los niveles de oxidación molecular de lípidos y proteínas sugiere la participación de agentes antioxidantes no enzimáticos en colaboración con la SOD. 85 PERSPECTIVAS VIIl. PERSPECTIVAS En las condiciones de almacenamiento a 40% C y 85% HR utilizadas en este trabajo, algunos procesos metabólicos se activan y pueden formarse entrecruzamientos entre los componentes de pared celular. Los probables enlaces covalentes formados incluyen al enlace diferúlico entre cadenas de pectina y las uniones éster entre el carboxilo de los residuos de ácidos urónicos de las pectinas y los grupos hidroxilo de los monolignoles presentes en la superficie de la lignina. Sin embargo, la presencia de estos ésteres no fue detectada claramente en este trabajo, debido a que en su extracción de la pared celular se utilizó NaOH 4M y este enlace éster es lábil en medio alcalinopor lo cualse sugiere utilizar en su detección enzimas de pared celularde modo que los enlaces no se destruyan y sean detectados con las técnicas de espectroscopia infrarroja. La testa de la semilla de frijol contiene altas concentraciones de compuestos fenólicos como taninos y sus precursores. En algunos experimentos fue necesario remojar las semillas de frijol durante 15 horas a 30% C, No se evaluó si en el transcurso de esta incubación los fenoles solubles en el agua de remojo se difundieron desde la testa hacia los cotiledones. Para confirmar la procedencia de los compuestos fenólicos determinados en los cotiledones se sugiere utilizar semillas a las cuales se haya despojado previamente de la testa. Para evaluar la posibilidad de lignificación en el sistema, se almacenó semilla de frijol en condiciones de endurecimiento acelerado (30 d /40% C/ 85% HR). Efectivamente, se determinaron mayores concentraciones de lignina en las semillas endurecidas comparadas con las semillas frescas. Las semillas de ambas variedades de frijol incrementaron sus TCso después de los 90 días de almacenamiento en condiciones de 30% C y 75% HR. Resulta interesante conocer si el estado de lignificación que presentan las paredes celulares a los 90 días es igual al de las semillas frescas y mayor a los 165 días en que el tiempo de cocción incrementa significativamente. 86 BIBLIOGRAFÍA Qs, 1X. BIBLIOGRAFIA Acosta-Gallegos, J., Pérez-Hertera, P. 2003. Situación del cultivo de frijol común en México. Producción e investigación. — http://www.copafembrapa.br/negocios/ser doc anais / palestras /mesala.pdf Agbo, G., Hosfield G.L.Uebersax, M.A., Klomparens, K. 1987. Seed microestructure and its relationship to water uptake in isogenic lines in a cultivar of dry beans (Phaseolus vulgaris L.) Food Microestruct. 6, p. 91-102. Aguilera, J. M., Ballivian, A. 1987. A kinetic interpretation of textural changes in black beans during prolonged storage. J. Food Sci. 52, 691-695. Anderson, J.W., Beardall J., 1991. Molecular activities of plant cells. Blackwell Scientific. Publication. London, Great Britain. 384 págs. 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Selección del material biológico Con la finalidad de trabajar con lotes de grano homogéneos en cuanto al tiempo de cocción y de ser posible incluir dos variedades contrastantes en cuanto al valor de este parámetro, se estimaron los tiempos de cocción (TC 50) iniciales de cuatro lotes de grano de frijol común (Phaseolus vulgaris L.) de la variedad flor de mayo (FM) y un lote de la vatiedad flor de junio (FJ). Los TCso para los granos cosechados en los años 1997, 1999 y 2000, de la variedad FM, fueron similares entre ellos y mayores que el presentado por el lote del año1998 (tabla A.1.). El valor similar del TCso entre casi todos los lotes de FM podría deberse a que todas las muestras provienen de la misma zona geográfica y por lo tanto fueron cultivadas en condiciones climáticas y edafolópgicas muy similares. Tabla A.l. Tiempos de cocción de diversos lotes de dos variedades de frijol provenientes de la zona del Bajío cosechados en diferente año Variedad Año de cosecha TCso ! C.v.- flor de junio 1997 54.01 3.6% 6.7 flor de mayo 1997 57.34 2.7 4.8 flor de mayo 1998 38.5+ 2.1? 5.4 flor de mayo 1999 60.2423.4% 38.9 flor de mayo 2000 58.8% 5.0* 8.4 'Tiempo en el cual se cuece el cincuenta por ciento de la muestra * Diferentes letras indican diferencia significativa (Tukey P<0.05) * Coeficiente de variación *previo al tratamiento de cocción la semilla fue remojada por 15 h Sin embargo, llama la atención el bajo TCso que presentó el lote de FM cosecha 1998. Ácosta- Gallegos y Pérez-Herrera (2003) señalan que en la región Norte-Centro de México, se han tenido tres años desastrosos a causa de la sequía, 1992, 1997 y 1999, lo cual podría explicar el hecho de que en estos años los granos de frijol presentaran un tiempo de cocción mayor. Con excepción del lote FM cosecha 1999, los lotes de frijol de las dos variedades fueron homogéneos en cuanto a su TCso, ya que el coeficiente de variabilidad de este parámetro fue de menos del 10 %. 101 APÉNDICE Q O Debido a que el lote de la variedad FJ y el de FM cosecha 1998, presentaron “T'Cso contrastantes y población homogénea respecto a la variable TCso, estos materiales fueron seleccionados para realizar los experimentos durante el desarrollo de la tesis. 2. Características de cocción e hidratación de lotes de frijol almacenados en condiciones inadecuadas Cuando las muestras de frijoles frescos (muestras de frijol control, almacenados a 4? C) fueron almacenadas en condiciones de endurecimiento moderado, es decir, a 30% C / 75 % HR, la amplitud de la cinética de cocción, esto es el tiempo entre el inicio y término de la cocción de la población de frijoles, se incrementó. Este comportamiento se muestra en la figura 27 para FM y FJ. En esta figura se observa que cuando los frijoles se almacenaron por períodos mayores de 90 días se formaron sub-poblaciones: la de los granos que se mantuvieron suaves, la de los granos semi-endurecidos y la de los granos endutecidos, que requirieron más de cinco horas para su cocción. Así en la tabla A.2. se puede observar que después de 165 días de almacenamiento, en cinco horas de tratamiento térmico, se coció menos del 70 % de los frijoles de la población de ambas variedades. 102 GR AN OS CO CI DO S G R A N O S CO CI DO S (%) APÉNDICE (y 100 — AA AS z ¿ A Y .” 80 es L n e” q A QT e E e.” e ús —+ se $ QA 507 Je e .. 4 , FM “4 + .- 4 / L > —"— 0d NI «30 20 - : . 2 A —4— 60d 17 ES ¿ +- 90d 7 -—+— 165d o ATAN T T T r_——T 0 50 100 150 200 250 300 350 400 460 TIEMPO DE COCCIÓN (MIN) 100 4 e 1 AA y » «Ah e? £h $ 80 - i + * > e $ . % + sd s- sb z FJ +4 . +? —— 0d 40 7 » + as ; 1 > 300 A ¿ —4-— 60d 204 r . + 90d mel. —e — 165 o- da T Y v T v v v v T v T v T v 0 50 100 150 200 250 300 350 400 80 TIEMPO DE COCCIÓN (MIN) Figura A.!. Tiempo de cocción de las semillas de frijol almacenadas en condiciones de endurecimiento moderado ( 30? C /75 % HR) FM, flor de mayo; FJ, flor de junio 103 APÉNDICE (y, A A Tabla A.2. Efecto del período de 165 días de almacenamiento a 75% HR/30” C sobre el número de granos cocidos en cinco horas de ebullición en las muestras de dos variedades de frijol Granos Cocidos Variedad (9%) FJ 68+ 8.0” FM 60+10.6* “Diferentes letras indican diferencia significativa (P<0.05) Para poder determinar la cinética de endurecimiento del cien por ciento de los granos de las dos variedades almacenadas durante 165 días a 75 % HR / 30” C, fue necesario prolongar la duración de la prueba hasta siete horas. La duración de la prueba de cocción oficial es diferente en cada país y en cada época. De acuerdo al método oficial utilizado por CONASUPO durante su vigencia, debía permitirse un margen de cinco horas en ebullición para denominar como no cocido al grano de frijol. Actualmente, en México, la Norma de Importación para consumo (2003), publicada en el Diario Oficial, menciona que todas las importaciones de frijol provenientes de Argentina, Canadá, Chile, Estados Unidos de América y Nicaragua, deberán anexar un Certificado Fitosanitario Internacional donde se especifique un contenido de humedad de 9 a 18% y un tiempo de cocción en un intervalo de 55 a 70 minutos. En tanto la Norma Oficial para frijol en grano (1989), decretada por el gobierno de Guatemala, clasificó como aceptable para consumo humano aquel cuyo tiempo de cocción máximo era igual a 90 minutos como tolerancia máxima en grano de primera calidad, 120 minutos en grano de segunda calidad y 150 minutos en grano de tercera calidad, con un contenido de humedad que no excediera al 13%. Para conocer la sensibilidad al endurecimiento de las dos variedades de frijol seleccionadas, se determinó el TC,, de los granos almacenados en condiciones de endurecimiento moderado (75 % HR / 30? C). La figura A.2. muestra los resultados de las pruebas de cocción después de someter a los granos a un almacenamiento en 75 Y% HR/30*C. El TC;, se mantuvo constante en las dos variedades a lo largo del período de almacenamiento hasta los 90 días; el efecto del almacenamiento sobre el endurecimiento se evidenció hasta los 165 días, cuando el TC;, de las dos variedades se incrementó significativamente. La variedad FM mantuvo su TC ;, siempre por debajo del de FJ, hasta los 165 días en que su TC; fue mayor que el de EJ. 104 APÉNDICE (y, T I E M P O DE C O C C I Ó N TC (M IN ) PERÍODO DE ALMACENAMIENTO (DIAS) Figura A.2. Tiempos de cocción de los granos de frijol almacenados en condiciones de endurecimiento moderado (75% HR/30* C) Las muestras de frijol flor de mayo (EM) y flor de junio (FJ) fueron remojadas 15 horas a 30 2C previo a la cocción. Las letras iguales indican que no existen diferencias significativas entre los diferentes tiempos de almacenamiento (P<0.05). Con los datos de los TCso de la figura A.2. se calcularon los índices de endurecimiento obteniendo los cocientes TCx/TCo (tiempo de cocción en minutos al período de almacenamiento en cada muestreo dividido entre el tiempo de cocción en minutos que presentó - la muestra antes del almacenamiento). Estos valores se graficaron en función del período de almacenamiento (figura A.3.). Hasta los 90 días de almacenamiento, la velocidad de endurecimiento, dado por la pendiente de la gráfica en este período, fue similar entre variedades. A los 165 días de almacenamiento se observó una diferencia en el comportamiento de las dos variedades con relación a la velocidad de endurecimiento del grano, representada por la pendiente de la gráfica en este período. Estos datos indican mayor sensibilidad al endurecimiento en estas condiciones en la variedad FM, no obstante haber sido ésta, la que presentó el menor TCso inicial. Esto concuerda con lo reportado por Tovar (1997), quien encontró mayor sensibilidad a endurecimiento en frijol FM en comparación con FJ. 105 APÉNDICE (y, 6 ] y=0.027x + 1 , ¿AP R=0.99 Y | —“— FM o Y 4 J A gs Y E 3- / : 7 Y 3 21 L E ] _ A Mo yrO013x+0.924 1 j|L— R=0.99 0 Y T y T Y T 7 0 50 100 150 200 PERÍODO DE ALMACENAMIENTO (DÍAS) Figura A.3. Velocidad de endurecimiento de frijol almacenado a 75% HR y 30” C. FJ, flor de junio; FM, flor de mayo El fenómeno que se estudió en este trabajo de tesis fue el de resistencia a la cocción O endurecimiento del cotiledón y no el de testa dura. En algunas condiciones de almacenamiento inadecuado, estos fenómenos se pueden inducir simultáneamente (Hohlberg y Stanley, 1987; Downie ef al., 1997). Para distinguir entre ellos se evalúa experimentalmente la capacidad de hidratación y de hinchamiento de los granos, ya que en el endurecimiento por testa dura, esta capacidad disminuye, mientras que en el de resistencia a la cocción no. Por lo anterior, en los lotes almacenados de ambos cultivares se cuantificaron la hidratación e hinchamiento de los granos. La capacidad de hidratación del grano se determinó como la cantidad de agua que pudo absorber la muestra en 15 horas de remojo o imbibición a 30? C. El efecto del almacenamiento sobre la capacidad de hidratación de los granos disminuyó, transitoriamente. A los 30 días de almacenamiento (Fig. A.4.), la cantidad de agua absorbida fue menor significativamente, tal vez debido a un leve endurecimiento de la testa, pero prácticamente los granos recuperaron la permeabilidad de esta cubierta y a partir de los 60 días de almacenamiento no se presentaron diferencias significativas entre la cantidad de agua absorbida a partir de este tiempo de almacenamiento y la absorbida inicialmente. Estos resultados concuerdan con Hohlberg y 106 APÉNDICE (3, O O Stanley (1987) pero no coinciden con el reporte de Ántunes y Sgarbieri (1979) quienes detectaron el fenómeno de testa dura. AG UA AB SO RB ID A (mi ) PERÍODO DE ALMACENAMIENTO (DÍAS) Figura A.4, Efecto del tiempo de almacenamiento sobre la capacidad de hidratación de los granos de frijol FJ, flor de junio; FM, flor de mayo. Las letras iguales indican que no existen diferencias significativas entre los diferentes tiempos de almacenamiento (P<0.05) El agua penetra a través de la testa no endurecida y puede ser absorbida por los cotiledones frescos o quedar atrapada entre la testa y los cotiledones endurecidos; en nuestro sistema no se verificó ninguna de estas dos posibilidades. La testa se mantuvo permeable al agua a través del período de almacenamiento en ambas variedades (Fig. A.4.) y esto nos lleva a suponer la participación de mecanismos de reparación o auxilio en la reposición de esta capacidad de absorber agua. Una posibilidad es que debido a las condiciones de almacenamiento ocurra primero una fase de testa dura y posteriormente una fase de endurecimiento del cotiledón. Evidencia que apoya esta propuesta la constituye el hecho de que a los 165 días de almacenamiento, la testa no impidió el paso del agua hacia los cotiledones y sin embargo se detectó un mayor TCso en ambas variedades. Otro parámetro que distingue entre testa dura y endurecimiento del cotiledón es el volumen de los granos medido después de la fase de remojo y que se conoce como capacidad de 107 APÉNDICE (5 A se hinchamiento (Clemente ef a/., 1998). En la figura A.5. se graficó el volumen de los granos de las dos variedades, antes y después de la fase de remojo. 1.0 —a— FS —e— FMR osLb —A-- FIS mn : —Y— FJR 2 r A > É os| A D h 2 ww L a > 0.4 zZ ul - e o e MR z A AAA 2 02 + 3 > 0.0 J A L L L a J 2 L 0 30 60 90 165 TIEMPO DE ALMACENAMIENTO (DÍAS) Figura A.5, Efecto del tiempo de almacenamiento sobre la capacidad de hinchamiento de los granos de dos variedades de frijol. FMS, flor de mayo sin remojar; FMR, flor de mayo remojado; FJS, flor de junio sin remojar; FJR, flor de junio remojado Los granos de ambas variedades presentaron el mismo tamaño promedio y similar capacidad de hinchamiento. Consecuentemente con los datos presentados antes sobre los niveles de agua absorbidos durante el período de almacenamiento (Fig. A.4.), se-observó que a los 30 días la capacidad de hinchamiento fue menor comparada a la inicial, pero alcanzó los niveles iniciales a los 60 días en ambas variedades. De acuerdo a los T'Cso encontrados en las muestras, se esperaba encontrar granos remojados de menor volumen a los 165 días, en que los TCso de EJ y EM se incrementaron de manera significativa, sin embargo no fue así y a los 30 días en que el TC no fue diferente al de las muestras control (frijol fresco, almacenado a 4? C), se observó un decremento en la capacidad de hinchamiento de los granos. Los resultados anteriores sugieren que en las condiciones de almacenamiento utilizadas en este trabajo, el fenómeno de endurecimiento que se presentó fue el de resistencia a la cocción. 108 APÉNDICE (y ———_ o_o A _ Ka —— Con la finalidad de obtener muestras totalmente deterioradas en su calidad de cocción, donde los cambios involucrados en el fenómeno de endurecimiento estuvieran presentes en todos los granos, se almacenaron frijoles de la variedad FM por 30 días en condiciones de endurecimiento acelerado, a 40? C/85% HR. Se determinó el TCso de estas muestras y se encontró que el 100% de los granos no se cuece en 5 horas, es decir que el total de los granos pertenecen a la sub- población “dura”. Este lote fue utilizado para determinar el efecto del almacenamiento en la lignificación. 3. Purificación de la pared celular: optimización del método Para la obtención de las pectinas fue necesario hacer previamente la purificación de las paredes celulares a partir de muestras de harina de los cotiledones. Una vez que se purificaron estas estructuras celulares, se secaron y se obtuvo su peso. El método de purificación de pared celular involucró algunas variables como la técnica de homogeneización de las muestras, el tipo de amilasa, el pH de la solución amortiguadora de amilasa y las concentraciones de las enzimas utilizadas, que fueron determinantes en los resultados obtenidos. Los datos encontrados sobre el rendimiento de pared celular con cada modificación en el método se muestran en las tablas A3aA.5. Aparentemente el uso de mortero y pistilo en la homogeneización de la harina con el amortiguador de fosfatos fue mejor que la licuadora (tabla A.3.). En el 60% de los experimentos no hubo diferencias estadísticamente significativas (P<0.05), sin embargo, en frijol FM endurecido seco y EJ control remojado, utilizando la licuadora, el rendimiento en peso de la fracción enriquecida en pared celular fue mucho mayor debido a la contaminación con almidón, como se comprobó durante la evaluación de la siguiente variable. 109 APÉNDICE (y, A A A AAA AKXA— Tabla A.3. Rendimiento de pared celular obtenido con diferentes métodos de homogeneización de las muestras de harina de cotiledón en el ensayo de purificación de la pared celular Forma de homogeneización de la muestra Cultivar Tratamiento (pared celular mg/g harina) Seco Remojado Mortero Licuadora FM control” + - 133.5+21,4% 120 - + 137.7418.5* 129.5+41.0* FM endurecido? + - 144.8+16.2* 469 — - + 155.2415.3* 210.4489.6* FJ contro + - 59.2+18.4> n.d. - + 71.0:15.0* 93.2415,3* FJ endurecido? + - 106.6£12.6* n.d. - + 99,8+9.5" 125.9+33.2* Vletras diferentes en la tabla indican diferencias significativas (P< 0.05) 2 frijol almacenado a 4%C 3 frijol almacenado a 165 d a 30% y 75/HR n.d. no determinado En cuanto al tipo de amilasa utilizado, se obtuvieron mejores resultados con la amilasa termoestable (tabla A.4.), ya que con la termolábil quedaron gránulos de almidón en la muestra, tal y como se observó en el microscopio y esto se reflejó como un mayor peso de la fracción enriquecida en pared celular. Es importante considerar que al hervir la muestra, las pectinas termosolubles se perdieron en el sobrenadante de amilasa y contribuyeron a la pérdida de peso de la muestra. Tabla A.4. Rendimiento de pared celular obtenido con diferentes tipos de amilasa en el ensayo de purificación enzimática de pared celular. Amilasa Cultivar Tratamiento (pared celular, mg/g harina) Seco Remojado Termoestable Termolábil FM control" + - 133.5£21.4” 120.0 - + 123.13421.7* 205.0 FM endurecido” + - 144.8:16.2* 469.0 - + 170.8+35.9% 377.0 FJ control? + - 59.2+18.4" n.d. - + 79.9417.8% n.d. FJ endurecido* + - 106.6£12.6% n.d. - + 110.3422.9% n.d. 1 letras diferentes en la tabla indican diferencias significativas (P< 0.05) 2 frijol almacenado a 4%C 3 frijol almacenado a 165 d a 30%C y 75%HR. n.d. no determinado 110 APÉNDICE (y, A É É En la tabla A.5. se presenta el peso de la fracción enriquecida en pared celular, utilizando diferente acidez en el amortiguador de incubación de amilasa. Siguiendo con la base de que un mayor peso implica mayor contaminación por almidón, entonces la incubación de la amilasa en solución amortiguadora con pH 7.0 fue la mejor. Tabla A.5. Rendimiento de pared celular (mg/g harina de cotiledón) obtenido con diferentes condiciones de incubación de las muestras de cotiledones con la enzima amilasa en. el ensayo de purificación de la pared celular. pH de la solución amortiguadora de amilasa Cultivar Tratamiento (mg/g harina) Seco Remojado pH 6.0 pH 6.7 pH 7.0 pH 7.8* FM control” + - n.d. 133.5421.4* n.d. 120.0 - + 114.4:19.99! — 137.7+18.5* n.d. 205.0 FMendurecido? + - n.d. 144.8+16.2* n.d. 469.0 - + 177,1441.3% — 155.2415.3* n.d. 377.0 EJ control' + - n.d. n.d. 59.2+18.4* n.d. - + 93.2+15.3* n.d. 71.015,.0* n.d. FJ endurecido? + - n.d. nd. 106.6+12.6* n.d. - + 125.9+33.2* n.d. 99.8+9.5% n.d. 1 Letras diferentes en la tabla indican diferencias significativas (P< 0.05) 2 frijol almacenado a 4%C 3 frijol almacenado a 165 d a 30%C y 75%HR * los resultados en esta columna se obtuvieron utilizando amilasa termolábil, las columnas restantes corresponden a datos obtenidos con amilasa termoestable. n.d. no determinado De acuerdo a los resultados presentados en la tabla A.6., se infiere que la concentración de amilasa no jugó un papel importante en la purificación de la pared celular porque concentraciones de 100 ul/ g harina ó 200 pl/ g harina no presentaron un efecto diferente que fuera significativo (P<0.05) y una concentración de 70u1/ g harina no fue suficiente para eliminar el almidón en la muestra. 111 APÉNDICE CS, A Tabla A.6. Rendimiento de pared celular obtenido con diferentes concentraciones enzimáticas en el método de purificación de pared celular. . Concentraciones enzimáticas Cultivar (mg pared celular! y harina) Tratamiento A?100pL/ g harina A 70pE/gharinaa A 200 HL! g harina B 0U/g harina B 176 U/ g harina B 529 U/ g harina Seco Remojado C 2.5 mg/ g harina C 5 mg/ g harina C 10 mg/ g harina FM control" + - 133.5:21.4* n.d. n.d. - + 137.7418.5* 131.2 110.2+20.3% FM endurecido? + - 144.8+16.2* nd. n.d. - + 155.2415,3* 150.6 183.8144.5% FJ control + - 59.2418.4* nd. n.d. . + 71.0:15.0* 104.0 82.3 FJ endurecido” + - 106.6:12.6% n.d. n.d. - + 99.8+9.5* 149.4 102.5 1 Letras diferentes en la tabla indican diferencias significativas (P< 0.05) 2 la cantidad de amilasa utilizada se reporta como pL porque no vienen especificadas las unidades enzimáticas en el envase. Se utilizó a-amilasa de SIGMA clave A3306 3 frijol almacenado a 4%C 4 frijol almacenado a 165 d a 30%C y 75% HR n.d. no determinado A amilasa termoestable B amiloglucosidasa C proteasa De los experimentos anteriores se establecieron las condiciones siguientes de purificación de la pared celular para los ensayos posteriores: uso de mortero y pistilo en la homogeneización de la harina con el amortiguador de fosfatos, aplicación de amilasa de tipo termoestable en una solución amortiguadora con pH 7.0 y tratamientos de la muestra con 100 uL de a-amilasa termoestable/ g harina, 2.5 mg de proteasa/ g harina y 176 U de amiloglucosidasa / g harina. En la figura A.6. se muestra la apariencia microscópica de una preparación obtenida en condiciones optimizadas (Fig.A.6.B) y una obtenida en condiciones de baja actividad de amilasa (Fig. A.6.A). El contenido de almidón de la preparación disminuyó de manera importante al adicionar una alta actividad de amilasa. 112 APÉNDICE (y, — A A ooo B Figura A.6. Fracción enriquecida en pared celular vista al microscopio compuesto (40%). El cuadro Á presenta una muestra con abundantes gránulos de almidón. El cuadro B presenta una muestra de pared celular libre de almidones después de que la harina fue sometida a tratamientos enzimáticos. La muestra de pared celular fue purificada a partir de harina de cotiledón y fue teñida con lugol. En la figura A.7. se presenta el rendimiento obtenido en pared celular purificada de granos de la variedad FJ] y FM almacenados a 75% HR/30? C por 30 días y 165 días, como materiales control y endurecido, respectivamente, ya que el TCso a los O días comparado con el TCso a los 30 días de almacenamiento en estas condiciones no son significativamente diferentes y TCso a los 30 días comparado con el 'TCso a los 165 días sí son diferentes estadísticamente (P<0.05). En la figura A.7. se observa que el rendimiento de pared celular fue igual (P<0.05) entre tratamientos de cada variedad de frijol, sin embargo el rendimiento de pared celular de la variedad F] fue menor para todos los tratamientos, comparado con el rendimiento obtenido en la variedad FM. Aparentemente el remojo no tuvo efecto alguno sobre el rendimiento de la pared celular en frijoles frescos y duros en estas variedades de frijol. 113 APÉNDICE (y o 200 180 MN Fu 160 — 140 4 38 L o l 80 - ( m g / g ha ri na ) 80 4 407 R E N D I M I E N T O DE P A R E D C E L U L A R 204 Cs CR ES ER Figura A.7. Rendimiento en peso seco de la pared celular de frijol La pared celular fue purificada a partir de harina de cotiledones de frijol de las variedades flor de junio (EJ y flor de mayo (FM), control (C) 30 días en 75% HR/30"C y endurecido (E) 165 días en 75% HR/30%C antes (S) y después (R) de la fase de remojo de los granos. Las letras iguales indican que no existen diferencias significativas entre los diferentes tiempos de almacenamiento (P<0.05). 114