UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO FACULTAD DE CIENCIAS EFECTO DE LOS CAURENOS AISLADOS DE Montanoa sp. SOBRE EL UTERO DE RATA in vitro T E s 1 s QUE PARA OBTENER EL TITULO DE B 1 o L o G o P R E S E N T A PATRICIA CAMPOS BEDOLLA FALLA m: OR!GEN México, D. F. Septiembre, 1991 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis está protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. CONTENIDO RESUMEN l. INTRODUCCION l. Aspectos botánicos a. Consideraciones botánicas b. Descripción botánica 2. Aspectos etnobotánicos 3. Estudios fitoquímicos 4. Naturaleza de los compuestos 5. Estudios farmacológicos 6. Mecanismo de excitación-contracción del músculo liso 7. Inervación uterina 8. Aspectos histoló~icos del aparato reproductor femenino de la rata . 9. Cambios morfológicos inducidos por la acción de los estrógenos en útero de la rata 10. Mecanismo de acción de los estrógenos en el útero de la rata . IL PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Ill. OBJETIVOS 11 13 15 22 24 39 44 46 49 52 54 56 IV.MATERIAL YMETODO l. Ensayos farmacológicos 2. Compuestos utilizados 3. Técnicas histológicas 4. Análisis estadístico V. RESULTADOS VI. DISCUSION VII. CONCLUSIONES VIII. BIBLIOGRAFIA 57 59 60 62 64 80 86 87 RESUMEN En este trabajo se estudió el efecto, in vitro, de los caurenos ácido caurad1enoico, caurenoico, grandiflórico, 16 alfa-OH caurenoico y su ester metílico aislados de Montanoa ssp. sobre el útero de rata tratada con estrógeno en contracciones inducidas por los agonistas acetilcolina, oxitocina y seroronina. Se observó que los caurenos estudiados inhiben indistintamente la respuesta contráctil inducida por estos agonistas en el útero de rata. Lo cual sugiere que estos compuestos podrían participar en el proceso de entrada de Ca2 + o en la inhibición de la hidrólisis de los fosfoinositidos, ya que la contracción uterina está intimamente relacionada con el ingreso de Ca2+ extracelular. El estudio histológico muestra el efecto del ácido cauradienoico (40.0 ug/ml) en el útero de rata tratada estrógeno. Se reporta que este caureno induce descamación epitelio de revestimiento y laxitud del tejido conjuntivo rodea a las glándulas. El objeto de esclarecimiento de caurenos en el músculo este trabajo es el de los posibles mecanismos liso uterino de rata. contribuir de acción en de con del que el los INTRODUCCION ASPECTOS BOT ANICOS CONSIDERACIONES BOTANICAS El cihuapahtli, un nombre náhuatl asignado a plantas dal género Montanoa que han sido utilizadas, desde épocas precolombinas, para el tratamiento de disfunciones en el aparato reproductor de la mujer. El género Montanoa , perteneciente a la familia Compositae, tribu Helianthae, está representado por 25 especies y 8 sub especies (Font, 1981). En 1790, Cervantes describe por primera vez el género Montanoa , dedicado al médico Luis Montaña y consideró una especie, M. tomentosa . Von Humboldt, Bonpland y Kunth (1820) habían descrito este género como Eriocoma , con una · sóla especie E. floribunda . En 1836, De Candolle modificó el nombre Montanoa por Montagnaea , para aproximar más la pronunciación hispánica del apellido Montaña, y describió 8 especies de este género. Posteriormente, Robinson y Greenman (1899) realizaron una revisión del género. En la obra de Standley Arboles y arbustos de México (1920- 1926), se asigna 31 especies diferentes al género Montanoa . En su tesis doctoral, Font (1981) describió la distribución del género Montanoa en México y Centroamérica, así como su ubicación taxonómica. Reporta en la República Mexicana 21 especies de las 25 descritas para este género (Cuadro 1). Se distribuye principalmente en zonas perturbadas, bosque de pino, bosque de pino-encino y selva baja caducifolia, desde 230- 2100 msnm. Existen reportes de las especies de Montanoa para el Distrito Federal y los estados de Estado de México, Guanajuato, Guerrero, Hidalgo, Morelos, Nuevo León, Oaxaca, Puebla, Querétaro, San Luis Potosí, Sinaloa, Sonora, Tlaxcala, Veracruz y Zacatecas (Font, 1981). 2 CUADRO ESPECIES DESCRITAS PARA EL GENERO Montanoa M. tomentosa (Cerv.) M. frurescens (Mairet ex D. C.) M. guatemalensis (Robins. ex Groenland) M. mollissima (Brongniart ex Groenland) M. andersonii (Me Vough) M. standleyi (V. A. Funk) M. liebannii (Sehultz Bip in Klatt, M. echinacea (S. F. Blake) M. revealli (H. Robinson) M. ovolifolia (Delessert ex D. C.) M. badi/loi (V. A. Funk) M. ungulata (Badillo) M. quadrangularis (Sehultz Bíp in c. M. josei (V. A. Funk) M. leucantha (Log., S. F. Blake) M. karwinskií (D. C.) S.F. Koch) Blake) M. atriplicifo/ia (Pers., Schultz Bip in Seemann) M. pteropoda (S. F. Blake) M. hibiscifo/ia (Benth in Oerst.) M. hexagona (Robins. y Greenrn,) M. laskowskii (Me Vaugh) M. grandiflora (A laman ex D. C.) M. speciosa (D. C.) M. imbricara (V. A. Funk) M. bipinnatifida (Kunt c. Koeh) 3 . 1 DESCRIPCION BOTANICA (Tomada de Font, 1981) Monranoa es un género arbustivo, muy ramificado, con una altura de 1.0-3.0 m. El tallo es café, cilfndrico, estriado y tomentoso. Las hojas son opuestas, con peciolos de 1.5-4.0 cm de largo y 2.0-8.0 cm de ancho; las inferiores de cardado a ovado- triangulares ápice es de irregularmente y las superiores ovado-oblongo-lanceoladas. agudo a acuminado, el márgen de aserrado dentado y sin lóbulos o hasta 3-5 lóbulos; El a el haz de moderado a densamente pubescente y el envés espaciado o densamente pubescente con pelos de 2 mm de largo (Fig. 1). Tiene cabezuelas pequeñas de 0.3-0.8 cm en flor y 0.5-1.2 cm de diámetro en fruto; en inflorescencias cimosas, dispuestas corimbos compuestos, ramificados en forma opuesta y alterna. Es un género monoico, con 0-6 rayos florales, sus corolas son de color crema a blanco, con lfgulas ovadas a obovadas, de 3.0-5.0 mm de largo y 2.0-4.0 mm de ancho y el ápice de truncado a redondeado. Los discos florales son de 8-9; las corolas de amarillo pálido a obscuro, espaciadamente pubescente, unido a su base, 5 lóbulos agudos pubescentes. Los estambres con filamentos de 1.2-3.5 mm de largo y 0.2 mm de ancho, con anteras no salientes de Ja corola; las tecas de color amarillo a café y Jos estilos amarillos de 5.5 mm de largo. Del total de aquenios por cabeza sólo madura uno, y es de colo café negrusco, con una longitud de 2.5-3.5 mm y 1-1.5 de diámetro. 4 en· ASPECTOS ETNOBOTANICOS DEL ZOAPATLE A lo largo de muchos siglos, los diferentes grupos étnicos de México han utilizado diversas especies vegetales, de una u otra forma como agentes reguladores de la fertilidad humana. Tal es el caso de las plantas del género Montanoa que han sido descritas en las diferentes fuentes históricas, desde hace más de 400 años, como plantas utilizadas para inducir la menstruación y el aborto o estimular las contracciones uterinas durante el parto (De la Cruz, 1552). Diversas denominaciones comunes se le han asignado a algunas especies cihoapatli de este género, como es el zihuatlpatl, zoapatl, y zoapatle. Conforme a la nomenclatura náhuatl, cihuapahtli (cihua (ti), mujer y pahtli, medicina), significa medicina de la mujer (Derbez, Pardo y Del Pozo 1945; Lozoya y Lozoya, utilizado 1982). Sin embargo, el término zoapatle es el más en la actualidad. La primera descripción la Cruz ( 1552) en su libro del uso del zoapatle la realiza De sobre plantas medicinales indígenas, traducido al latín por Juan Badiana en 1552, Medicinalibus lndorum Herbis. En el cual recomienda zoapatle " ... cuando una mujer tiene el parto". dificultad para feto o para facilitar Libellus el uso eliminar de del el En los libros La Historia general de las cosas de la Nueva Espaffa , escrito por Fray Bernardino de Sahagún en 1570, describe el uso empírico de la planta donde se establece que " ... son 6 útiles estas, sus hojas no se muelen, enteras se hierven (lo que) sale de sus hojas bien cocidas, le es útil a las mujercitas que ya sientes su vientre, que estan a punto de parir ... " y describe también " ... cuando ya la preñada sentía los dolores del parto, luego le daban un baño y después del baño dábanle a beber la raíz de una yerba molida que se llama cihuapactli, que tiene la virtud de impeler o empujar afuera la criatura ... ". (L6pez-Austin, 1971 ). En Hernández propiedades Historia natural de la Nueva Espaffa , escrito por (1576), describe plantas denominadas como cihuapatli con Ximénez "cihuapahtli ( 1576). medicinales en la mujer. (1615) describe la hemini6tico", descrito morfología anteriormente distribución del por Hernández Posteriormente, Cervantes (1880) realiza la descripción botánica del zoapatle, así como sus propiedades y modo de empleo, en Ensayo a la materia médica vegetal de México. 7 ESTUDIOS FITOQUIMICOS El interés por conocer y aislar los compuestos considerable secundarios del zoapatle ha motivido un número de investigaciones fitoqu{micas para el género Montanoa (Cuadro 2). Garcfa-Peña ( 1888), Río de la Loza (1893) y Quiróz (1894), que realizando los primeros análisis de los componentes de la planta, reportaron la presencia de un alcaloide no identificado. En un estudio efectuado por Altamirano ( 1895) se reportó la obtención de dos sustancias, una ácida de color negro y otra neutra de color amarilla, definiendo ésta última como un producto con probables efectos biológicos. En 1925 Fernández de Castro en su trabajo Contribución al estudio del cihuaphtli llevó a cabo un análisis de la planta del que obtuvo soluble en dos éter. alcaloides, uno soluble en agua y otro líquido No fue sino hasta 1970 que Caballero y Walls encontraron dos compuestos nuevos, el ácido monoginoico y una lacto na sesquiterpénica, a la que se le dio el nombre Asimismo, aislaron otros compuestos (Brieskorn descritos para de zoapatlina. otras plantas: el ácido monoginol al., 1966) también, cauradienoico and Pohlmann, (Kapadi y los en tiras and Dev, 1964), el ácido caurenoico ácidos palmftico y estereárico. de útero de rata in vitro, que obtenidos (etanólico, bencénico y hexánico), asi como monoginoico no mostraron actividad oxitócica. 8 1969), el (Cannon et Comprobaron los extractos el ácido Geissman y Griffin (1971) del extracto clorofórmico de las hojas y flores secas de la especie Montanoa tomentosa aislaron una lactona sesquiterpénica, a la que denominaron tomentosina. En 1972, se iniciaron diversos estudios en el Instituto Mexicano del Seguro Social con el propósito de identificar y aislar los compuestos activos del zoapatle. Así, se describió un nuevo método de extracción de compuestos de la planta, patentado y cedido posteriormente a Ja compañía farmacéutica, Ortho-Pharmaceutical. Este diterpenoides, zoapatanol posteriores compuestos grupo de investigadores biológicamente activos, obtuvo dos denominados y montano! (Mateos, 1976). Investigaciones han determinado la estructura molecular y procedimientos para Ja síntesis química de estos compuestos (Levine et al., 1979; Nicolau et al., 1980; Chen and Rowand, 1980; Kane and Doyle, 1981; Cotter, 1981; Kanojia et al., 1982). Levine et al. ( 1979) publicaron la fórmula estructural del zoapatanol y montano!. Al zoapatanol lo describieron como el causante de las respuestas biológicas. Sin embargo, se encontró que éste es un compuesto altamente inestable lo que sugiere que el zoapatanol no es el único compuesto responsable de las actividades biológicas (Marce lle et al., 1985). Werner compuestos et al. ( 1980) realizaron la extracción de tres germacradienólidos de la especie M. hibiscifolia , miembros de una clase trans, trans-germacra-1(10), 4-dien-cis-6, 12 olides. 9 Quijano et al. (1982) aislaron otros dos compuestos de M. tomentosa , a los que denominaron zoapatanólidos A y B, compuestos isómeros que se incluyen en el grupo de las lactonas sesquiterpénicas de tipo heliangólido. Otros hallazgos han sido los zoapatanólidos C y D, sesquiterpenos del tipo guaianólido (Quijano et al., 1984). Quijano et al. ( 1979) aislaron un nuevo compu.esto, una lactona sesquiterpénica obtenida de Montanoa frutescens, al que denominaron montafrusina. Asi como el ácido cauradienoico y su 15 alfa-isovalerato. En 1983, Wani et al. reportaron la síntesis y la evaluación biológica de análogos del zoapatanol. Utilizando el extracto acuoso y org:ínico de M. tomentosa . Continuando con la caracterización de los compuestos aislados de Montanoa tomentosa , Guzmán et al. ( 1984) aislaron, a partir de hojas y flores, un conjunto de tres sustancias, denominado "triada", constituida por zoapatanol, montano! y otra similar y relacionada con el montanol. De esta triada se obtuvo un nuevo compuesto definido como zoapatanólido E. De esta misma especie, Oshima et al. ( l 986a) aislaron dos flavonoides que denominaron nicotilorin e isoquercitrin. Enrfquez et al. (1983), determinaron la presencia del ácido grandiflorénico (o cauradienoico) por cromatografía de lfquidos de alta exactitud. Y farmacológicamente, destacan que este compuesto fue responsable, en parte, de la actividad biológica 10 observada en el extracto crudo. ( l 984a) obtienen un compuesto nombran como tomexantina Nuevamente, Quijano et diterpenoides que denominaron Posteriormente, semejante al al. (1985a) to mentol Se aman zoapatanol et al. y lo aislaron dos y tomenxantol Posteriormente, otro reporte del mismo grupo establecen los precusores de los derivados diterpenoides oxepano correspondientes, los denominados pre-tomentanol, pre-zoapatanol y pre-tomexantol ( Quijano et al. , l 985b ). En colectada un estudio en la región fitoquímico de de Soconusco, la especie Chiapas, M. hibiscifolia , se obtuvo ácido cauranoico y caurenoico. La composición química de esta especie especie colectada mostró diferencias al compararse con la misma en Costa Rica, C. A. (Magaña, 1986). Oshima et al. (1986b) describieron un nuevo compuesto aislado de Montanoa leucantha ssp. leucantha , una lactona sesquiterpénica denominada leucantanolido, la cual fue evaluada como un uteroevacuante en cobayos predados, a una dósis de 20 mg/kg administrada intraperitonealmente. Con el método de Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución cualitativo en fase inversa, se desarrolló un análisis y cuantitativo de los constituyentes dÍterpenoides, activos biológicamente, de extractos metanólicos y de agua caliente de algunas especies de Montanoa (Dong et al. 1989). En este trabajo, se propone la posibilidad de usar este método en investigaciones taxonómicas del género Montanoa . La 11 cromatografía zoapatanol, grandif16rico, manifiesta la presencia de compuestos como el ácido caurenoico, ácido monoginoico, ácido ester metílico del ácido caurenoico y tomenxantina ( Dong op cit., 1989). de los ca u renos aislados, como el Algunos cauradienoico aislado de M. tomentosa , han demostrado ácido tener actividad uterot6nicas en tira~ uterinas de cobayo, en experimentos de bioensayo in vitro (Lozoya et al., 1983; Enrfquez et al, 1984 ). Sin emburgo, otros compuestos y extractos acuosos de de otras especies no han sido evaluados aún en sistemas biológicos. 12 CUADRO 2 COMPUESTOS AISLADOS DE Montanoa ssp. COMPUESTO ESPECIE REFERENCIA Acido cauradienoico M. tomentosa Brieskorn 1969 Monoginol M. tom~ntosa Kapadi 1964 Acido caurenoico M. tomentosa Cannon 1966 Acido monoginoico M. tomentosa Caballero et al 1970 Zoapatlina M. tomentosa Caballero et al. 1970 Tomentosina M. tomentosa Geissman et al 1971 Zoapatanol M. tomentosa Levine et al. 1979 ·Montano) M. tomentosa Levine et al 1979 Montafrusina M. frutescens Quijano et al. 1979 15-alfa isovalerato M. frutescens Quijano et al. 1979 ácido caurenoico Zoapatanolido A M. tomentosa Quijano et al. 1982 Zoapatanolido B M. tomentosa Quijano et al. 1982 Zoapatanolido c M. tomentosa Quijano et al. 1984 Zoapatanolido D M. tomentosa Quijano et al 1984 Nicotiflorin M. tomentosa Oshima et al. 1986a lsoquercitrin M. tomentosa Oshima et al 1986b Leucantanólido M. leucantha Oshima et al. 1986b To mentol M. tomentosa Quijano et al 1985a Tomenxantol M. tomentosa Quijano et al. 1985a 13 ACIOO CAURADIENOICO ACIDO CAURENOICO ACIDO GRANDIFLORICO ACIDO 16 "·OH CAURENOICO ESTER METILICO DEL ACIDO 16 «·OH CAURENOICO FIG. 2. ESTRUCTURA DE LOS COMPUESTOS ESTUDIADOS Y AISLADOS DE Montanoa ssp. 14 NATURALEZA DE LOS COMPUESTOS En las plantas superiores existen productos naturales, que han sido clasificados como metabolitos primarios o secundarios. Los metabolitos primarios son compuestos químicos que están intimamente relacionados en el metabolismo celular y desarrollo fisiológico (aminoácidos, lfpidos, monosocáridos, etc.) (Balandrin et al., 1985; Gros et al., 1985). A los metabolitos secundarios no se les ha adjudicado una función aparente en los procesos metabólicos de la planta, tales como fotosíntesis, respiración, etc., (Dirzo, 1985). Sin embargo, a partir de metabolitos primarios algunas de estas sustancias son sintetizadas activamente por la planta. Se ha sugerido que son consecuencia de presiones ecológicas y fisiológicas que incluyen, por ejemplo, la protección contra radiaciones ultravioleta o la desecación, la de ser productos de detoxificación (Dirzo, 1985; West et al., 1979); así como, mediadores de las interacciones ecológicas con otros organismos, que en algunos casos actúan, inequivocamente, como mecanismos de defensa para reducir de alguna manera la herbivoría o la acción de los patógenos (Dirzo, 1985). Además de actuar como agentes protectores, también pueden funcionar como atrayentes, alelopáticos y, en menos casos, como hormonas vegetales (West et al., 1979; Rosenthal and Jansen, 1979) y no exclusivamente como mecanismo de defensa. De los diversos metabolitos secundarios terpenoides esenciales, comprenden algunas de pigmentos vegetales y productos 15 las de las plantas, los vitaminas, aceites de la degradación de la glucosa y ácidos grasos. En este grupo se incluyen a los diterpenoides tetracíclicos que caracterizan algunos de los productos naturales aislados del género Montanoa. Estos compuestos están constituidos de cuatro unidades de cinco átomos de carbono, denominándose cada una isopreno (2-metil-1,3- butadieno) o isopendieno. Los di terpenos están constituidos por los compuestos formados por la unión virtual de cuatro unidades isoprenoides, es decir esqueletos carbonados de 20 átomos de carbono. En los que se incluyen hidrocarburos, alcoholes, óxidos, cetonas, lactonas y ácidos carboxflicos, y se considera que derivan del pirofosfato geranilgeranil (Loomis and Croteau, 1980). La clasificación de los diterpenoides se basa en el número de ciclos que presenta el esqueleto alicíclicos, pentacíclicos, carbonado definiéndose las bicíclicos, macrocfclicos y tri cíclicos, misceláneos. siguientes clases: tetracfclicos, Estas clases se han subdividido de acuerdo con el tipo de esqueleto carbonado que presentan. principales En los tetracíclicos se subdividen en tres grupos que son: filocladeno-caureno, giberelinas y grayanotoxinas. De éstos, los del grupo filocladeno-caureno, son los más distribuidos y por lo tanto los más conocidos. 16 ESTUDIOS FARMACOLOGICOS Las primeras investigaciones sobre las propiedades farmacológicas del zoapatle son reportadas por Alfaro (1866) en la Gaceta Médica , donde describe su uso potencial para facilitar el parto e inducir la menstruación. En 1888 se fundó principal era el estudio aplicaciones industriales El Estudio (1889-1893) trabajos 1869, farmacológicos quien administró el Instituto Médico Nacional de la flora mexicana cuyo objetivo y sus posibles y medicinales. En sus publicaciones, y los Anales del Instituto, destacan los del zoapatle realizados por Rodríguez en extracto hidroalcohólico del zoapatle a sus pacientes, observando fuertes contracciones uterinas (Béjar, 1985). Cota en 1883 realizó un ensayo experimental con perras preñadas a las que les administró 1-2 g de la sustancia neutra obtenida por Alta miran o ( 1895) y describió al zoapatle como un oxitócico. En 1887 Reza describió del zoapatle los efectos tóxicos de la ingestión de las decocciones que ejercía una grávido, ya que acción directa en mujeres sobre el provocaba su tetanización. embarazadas. músculo Toussaint ( 1893) detectó el efecto del extracto zoapatle en la fibra cardíaca y estableció que inhibición en la contractilidad muscular. 17 Encontró liso uterino acuoso del inducía Mediante la recopilación de evidencias clínicas, Ramírez (1894) determinó que el zoapatle es una planta oxitócica y útil para el parto. No obstante, a principios del siglo se prohibió la venta del zoapatle en los mercados de México, debido a su uso indiscriminado (N oriega, 1902). Otro trabajo posterior que describe el efecto del zoapatle fue la tesis realizada por Rodríguez-Román (1929) con el Estudio fisiológico del cihuaparli . García-Colín (1929) realizó el estudio Contribución a la al farmacologla de los ocitócicos con especial referencia zoapatle , en biologicamente éste se reporta la presencia un ºelemento activo, Eriocomina A, especificando su actividad "ocitócica" en mujeres embarazadas. Del mismo modo, los trabajos de Terrés (1921) Estudio sobre la aplicación terapeútica de la Eriocomina en Ginecologla , el de Villafuerte ( 1929) Contribución al estudio de los oxitócicos y el de Valencia y Rodríguez-lbarra (1931), determinaron el efecto oxitócico y uteroconstrictor de la planta. De Lille y Ramírez (1933) efectuaron de la decocción de la especie Montanoa útero de cobayo in vitro, el cual indujo cobayos normales y grávidos. un análisis del efecto myriocephala sobre el motilidad uterina de Los resultados obtenidos hasta ese momento, en el estudio del zoapatle generaron un interés general que dio como resultado el surgimiento de diversos estudios fisiológicos posteriores. 18 Derbez, Pardo y Del Pozo (1945) estudiaron las acciones del zoapatle sobre la actividad motora del útero in situ en ratas grávidas e ingrávidas; así como, las respuestas uterinas a estímulos nerviosos y hormonales. Como resultado obtuvieron una respuesta inhibitoria en el útero ingrávido y excitatoria en el útero grávido. Se planteó que estas respuestas podrían deberse a la liberación de adrenalina de las glándulas suprarrenales. De acuerdo con sus observaciones sugirieron la acción directa del zoapatle sobre el músculo suprarrenales. uso El de trabajo realizado diferentes tipos por de uterino e indirecta en Hidalgo-Chávez (1947) destaca extractos y fracciones aislados las el del zoapatle, administrado por vía endovenosa, a conejas grávidas e ingrávidas y efectos sobre gatas la ingrávidas, contractilidad in y vivo. En actividad comparada con los diversos extractos ensayados. éste se rítmica observaron del útero, Concluye que la respuesta inducida por los extractos se debían probablemente a la liberación de adrenalina. Los trabajos de investigación, para evaluar los efectos de los diferentes extractos del zoapatle, han adolecido de imprecisiones metodológicas, lo que ha impedido conocer su efecto real sobre el músculo uterino. Dichas imprecisiones se deben a que no se ha considerado diversas condiciones tanto de la planta, como del sistema en que se está experimentando. Es importante considerar las características intrínsecas de la planta, como es la especie, su edad, el lugar y época 19 estacional de colecta; así como, la parte de la planta a partir de la cual se hizo la extracción; por ejemplo, flores, rafees, tallos u hojas. De acuerdo con esto, Damian (1990) reportó que la concentración de los compuestos aislados de Montanoa tomentosa no es constante en diferentes periódos estacionales. Otros factores que pueden influir son los factores abióticos (Estrada et al., 1983; Ponce-Monter et al., 1983), la presencia de electrolitos Na+, K +, Ca 2+ y Mg 2+ (Bolton, 1979), el pH del producto, la concentración y la variable de la dilución. Asimismo, debe tomarse en cuenta el estado hormonal en que se encuentran los animales utilizados en la experimentación. Esta condición se modificada en Jos mamíferos, de manera importante, en las diferentes fases del ciclo estral. El efecto uterotónico de Ja decocción del zoapatle fue comprobado por Sentí es y A mayo ( 1964) sobre útero humano grávido (32-42 semanas), con producto muerto. Durante esas investigaciones no se observaron cambios en la presión sanguínea, ni en la frecuencia respiratoria y cardiaca del paciente. Empero, no describieron la expulsión de Jos productos muertos. En 1976, Mateas et al. realizaron una descripción del efecto de los productos orgánicos semipurificados del zoapatle, en mujeres embarazadas con muerte fetal y en mujeres en diferentes días del ciclo menstrual. En 1977, Gallegos y Cortés-Gallegos obtuvieron una patente en la cual describieron los efectos del extracto acuoso del 20 zoapatle en mujeres con diferentes niveles hormonales. Inicialmente, administraron oralmente un concentrado de té con 15 y 30 g de hojas secas de Monranoa tomentosa , a mujeres de ciclo menstrual normal, en la fase lutea. En este trabajo se descrubrió una reducción rápida y transitoria en los niveles de progesterona circulante, como efecto luteolftico, y este cambio se relacionó con la temperatura corporal basal. Asimismo, determinaron una disminución en la duración del ciclo menstrual. Además se probó el efecto uterotónico del extracto acuoso en diferentes especies de animales in vitro. De la misma manera, los autores evaluaron el efecto tóxico del extracto sobre la función cardiovascular, gastrointestinal, renal y respiratoria, adicionalmente probaron en diferentes especies esta decocción no tuvo el de mono Rhesus . el efecto uterotónico del extracto acuoso de animales in vitro, y concluyeron que efecto sobre el útero de rata y ni sobre Calderón et al. (1977) realizaron un trabajo sobre el efecto de la decocción de M. tomentosa sobre la actividad uterina de conejas, in vitro. Concluyeron que la decocción del zoapatle, administrada en dósis de 0.5 mi, 1.0 mi y 1.5 ml, ejerce un efecto oxitócico menor al producido por la oxitocina. Sin embargo, en este trabajo no se menciona el origen de la planta, no se explica la forma de preparación del té, ni el volúmen de las cámaras de órganos aislados. Tampoco se consideró la presencia del ion potasio presente en la decocción. No obstante, realizaron la importante observación, hasta ese momento, de comparar su efecto con el de la oxitocina. 21 Von R. Neidlein y Stumpf estudios sobre la biotransformación grandiflorénico, obtenido de la (1977a) realizaron y farmacocinética planta del género algunos del ácido Espeletia . Describieron la formación de seis metabolitos obtenidos por incubación del ácido grandiflorénico (20 mg/kg) por la acción de la enzimas microsomales hepáticas de rata in vitro (Von R. Neidlein and Stumpf, 1977b) y su biodegradación por la flora intestinal y excresión renal (Von R. Neidlein and Stumpf, 1977c). Para corroborar los efectos anticonceptivos del zoapatle, la decocción Landgren et al. ( 1979) administraron oralmente equivalente a 124 g de hojas secas (l g/ml), a mujeres en embarazo temprano (6-7 semanas), con muerte fetal intrauterina. Estos autores concluyeron que la decocción del zoapatle tiene efecto uterotónico significativo con dilatación cervical, cólicos de tipo menstrual y sangrado en algunas pacientes. Indicaron también que las dósis administradas, 1.1 y 1.4 g/kg de hojas secas, fueron toleradas por las pacientes sin producir efectos gastrointestinales. De esta manera, ellos no detectaron propiedades Gallegos diferencias biológicas y luteolíticas, como Cortés-Gallegos lo había (1977). reportado anteriormente Sin embargo, estas podrían ser atribuidas y ecológicas de la planta o al estado reproductivo del animal Siguiendo farmacológicas la trayectoria y químicas sobre los a diferentes condiciones (Ponce-Monter et al., 1983), (Hahn et al., 1981). de las investigaciones han surgido basicamente dos grupos constituyentes de trabajo, del zoapatle, el de los 22 investigadores de Ortho Pharmaceutical y el de los investigadores mexicanos. Estos grupos de investigación han aportado elementos que han permitido ampliar la información sobre la planta. Destaca el trabajo publicado por Hahn et al. (1981), dentro de los investigadores del grupo de Ortho Pharmaceutical. Estos autores evaluaron diferentes productos aislados del zoapatle, extracto crudo, extracto semipurificado, montano! y zoapatanol, para observar los efectos de antifertilidad y antiimplantatorio en cobayo, rata, ratón y hamster. Sus resultados obtenidos demuestran sólo un efecto interceptivo en el cobayo en el día 22 de la preñez. La administración intraperitoneal y oral del extracto crudo, extracto semipurificado y el zoapatanol, a diferentes dósis, produjo la interrupción del embarazo y la disminución en el número de implantes. Reportan al montano! como un compuesto administrado a la menos misma activo, dósis. antiimplantatoria del montano!, por practica mente nula. resultaron ser más Los compuestos eficaces respecto comparado con el zoapatanol Mientras que, la actividad la vía intraperitoneal fue zoapatanol y montano! no que los extractos. En 1981, Smith et al. compararon la actividad del zoapata1.ol con el de las prostaglandinas, que existen en los efectos tomando como base las semejanzas antifértiles y en la estructura molecular química. En este experimento encontraron que el zoapatanol (100 nM) contraía el íleo de cobayo como la arteria coronaria del gato pero, en contraste, era incapaz de inducir un efecto sobre el útero de conejo y rata. Esto sugirió que el 23 efecto de interacción identificados. antifertilidad del zoapatanol podría deberse a aun su no con receptores del músculo liso vascular, Dentro de los trabajos realizados por el grupo de investigadores mexicanos, sobresalen los dirigidos por Gallegos así como, y Lozoya del Instituto Mexicano del Seguro Social; los investigadores del Instituto de Investigaciones la Secretaría de Agricultura y Recursos Hidráulicos investigadores del Instituto de Química, de la Nacional Autónoma de México. Agrícolas y de de los Universidad De diversos esta colaboración interdisciplinaria se el han producido trabajos de investigación sobre zoapatle, que analizaron farmacológicos, los aspectos históricos, botánicos, químicos, fisiológicos y toxicológicos. En estos trabajos, Estrada et al. ( 1983) evaluaron la actividad uterotónica de algunas especies del género Montanoa , recolectadas en diversas zonas de la República Mexicana. Comparándolas con especies cultivadas en un campo experimental de la Universidad Autónoma de Chapingo. Para ello, utilizaron el modelo in vitro en útero aislado de cobayo. Los resultados destacan la actividad de M. frutescens como la especie con mayor actividad uterotónica y a M. mollisima como la especie menos activa, mientras que M. tomentosa tuvo una potencia uterotónica intermedia. Ellos establecen que diversas variables pueden influir. en los resultados de este sistema in vitro, como es la edad de la planta y la parte estructural utilizada y las 24 condiciones climáticas o biológicas. Lozoya et al. (1983) comprobaron Ja acción uterotónica de Ja decocción, el extracto hexánico y el ácido cauradienoico sobre la contractilidad uterina de cobayo, perro y rata, in vitro, a dosis de 20 ug/ml 40 ug/ml y 20 ug/ml, respectivamente. Es importante destacar que estos compuestos incrementaron el tono y frecuencia de las contracciones; sin embargo, en úteros aislados de rata no se observaron efectos oxitócicos. Para disminuir el contenido de iones (K +, Ca 2 +, Mg 2 + ) del extracto acuso del zoapatle se administró el extracto dializado en tejidos uterinos de diversas especies de mamíferos (Ponce- Monter et al., (1983). Los pruebas toxicológicas aplicadas a rata y perro, demuestran que la decocción de hojas de zoapatle carece de toxicidad (Southam et al., 1983). Esto confirma los resultados obtenidos mujeres por Gallegos y Cortés-Gallegos et al. ( 1977), en y por Landgren et al., (1979), en rata y mono Rhesus. Diversos trabajos han surgido para destacar Ja actividad de los extractos acuosos de M. tomentosa y M. frutescens . Entre estos, el estudio de Estrada et al. (1983) y Ponce-Monter et al. (1983) quienes destacan a M. frutescens como la especie que induce mayor contractilidad uterina (Ponce-Monter et al., 1983). Otro trabajo es el realizado por Pedrón et al. (1985) quienes comprobaron la inhibición de los sitios de implantación en la rata, utilizando los extractos acuosos de M. frutescens 25 y M. tomentosa . Estos resultados destacan que el extracto acuosos de M. frutescens , a una concentración de 50 mg equivalentes de hojas secas, produce la inhibición total de los sitios de implantación, al cuarto dfa de preñez. Mientras que, al utilizar extracto presentan características acuoso de M. tomentosa morfológicas anormales. los implantes Lo que apoya los descrito por Levine et al. (1981) que demostraron que el extracto acuoso de M. tomentosa no tuvo efecto antiimplantatorio, al ser administrado oralmente del dfa al 6 de la gestación a dósis menores de 100 mg/kg. Para comprobar nuevamente la actividad de M. frutescens y M. tomentosa , González-Angulo et al. (1985) administraron intrauterinamente extracto acuoso (1 g de hojas secas/mi) a ratas. Estos resultados demostraron que el extracto acuoso de M. frutescens causa alteraciones en las estructuras morfológicas uterinas. No observándose este fenómeno con el extracto acuoso de M. tomentosa . Esto podría ser una base para explicar el efecto antiimplantatorio producido por el extracto acuoso de M. frutescens , en la rata. Esto también fue comprobado por Méndez (1989) quien compara el efecto de la decocción de M. tomantosa y M. frutescens sobre la implantación, organogénesis y período perinatal in vivo en rata. Wens et al. ( 1985) estudiaron el efecto de los extractos acuosos de M. tomentosa y M. frutescens (1 mg de hojas secas/mi) sobre espermatozoides de conejo y humano. Determinaron que el extracto acuoso de M. frutescens producía un efecto inhibitorio sobre la motilidad y viabilidad de espermatozoides humanos, lo 26 que no sucedió con el extracto acuoso de M. tomentosa . Del mismo modo, Valencia et al. (1986), encontraron que el ácido (ácido caurenoico y dos de sus derivados aislados de M. frutescens 15-hidroxi-dihidrocaurenoico y 15-ceto-dihidrocaurenoico), tienen efectos inmovilizantes y poca capacidad para disminuir el número en los espermatozoides humanos. Otro reporte que destaca extracto acuoso de M. tomentosa Monter et al. (1985). En éste, los efectos producidos por el fue el realizado por Ponce- se observa que la actividad espontánea de las tiras uterinas de rata son inhibidas en presencia del extracto acuoso, produciendo un efecto contrario en las tiras uterinas del cobayo. No obstante, Estrada et al. (1983) encontraron que el extracto acuoso de M. frutescens incrementa la contractilidad uterina en la rata. Ellos demostraron que los efectos producidos, no están mediados por los sistemas histaminérgicos presentes. Con el objeto de esclarecer los posibles mecanismo de acción de los extractos acuosos del zoapatle, Perusquía et al. (1985) estudiaron en tiras uterinas de rata el efecto de los extractos de M. tomentosa y M. frutescens (20 mg/ml). Los resultados de este trabajo demuestran que estos extractos son capaces de modificar la tensión muscular. En el útero de rata esta acción está mediada por la estimulación de receptores adrenérgicos y /o colinérgicos, producido, probablemente, por sustancias presentes en los extractos con propiedades adrenérgicas o colinérgicas. 27 Se han realizado cambios en los niveles los extractos acuosos Gallegos et al. (1977), diferentes trabajos para conocer los de progesterona circulante producido por del zoapatle. Según Gallegos y Cortés- se observa disminución en los niveles de progesterona plasmática al administrar el extracto acuoso a mujeres durante el ciclo menstrual. Y el mismo efecto cuando se administró a mujeres embarazadas (Landgren et al., 1979). Sin embargo, en el sistema seleccionado conejos preí'lados se les administró no se observaron modificaciones en por Pedrón et al. (1988), en estracto acuoso (5.0 mg/día) los niveles de progesterona plasmática. Con la continua inquietud de seguir explorando los mecanismos de acción de los compuestos aislados del zoapatle Béjar et al. (1984a) establecieron que el ácido cauradienoico, como compuesto más abundante en el extracto acuoso del zoapatle (0.19 mg/ml), tiene una actividad antagonista al calcio, lo que produce un efecto inhibitorio ·en la actividad contráctil del útero de rata. estudiaron en un modelo in vitro el Enríquez et al. (1984) efecto del ácido y de su del útero aislado de cobayo, ester metílico sobre la contractilidad rata y humano. Mostraron que el ácido cauradienoico produce inhibición en la actividad espontánea en los tres modelos empleados y que el ester metílico induce un aumento en la motilidad espontánea de los mismos tejidos ensayados. Este hallazgo confirmó la posible la función crítica que desempeí'la el grupo carboxilo sobre las propiedades farmacológicas de estos caurenos. Sin embargo, Ponce-Monter et 28 al. ( 1988) probaron que el ácido 16a-OH caurenoico y su ester metílico, aislado de M. hibiscifolia , sobre las tiras uterinas de rata y cobayo, manifiestan una inhibición en la actividad contráctil espontánea y la inducida por oxitocina y K +. Béjar et al. ( l 984b ), publicaron otro trabajo donde destacan el efecto del extracto acuoso de M. tomentosa (20 ul/ml) y el ácido grandiflorénico (12 ug/ml) en diferentes etapas del ciclo estral. Confirman que la motilidad uterina in vitro está determinada por los niveles de hormonas esteroides, como se comentó anteriormente. Las respuestas en las contracciones espontáneas inducidas por ambos compuestos son similares. Por lo que consideran al ácido grandiflorénico un componente importante del extracto acuoso. Dentro del grupo de investigadores de Ortho-Pbarmaceutical, Hahn et al. (1984), comprobaron el efecto antifertilidad y vasoconstrictor del músculo liso uterino de un compuesto sintético análogo del zoapatanol, el ORF 13811. Esto concuerda con lo reportado por Smitb et al. (1981), al demostrar el efecto vasoconstrictor del zoapatanol en arteria coronaria de gato. Asímismo, compuesto demostraron las propiedades u terotónicas de este Según los trabajos realizados por Yamamoto et al. ( 1983) se .ha comprobado que los caurenos di terpenos pueden inhibir la producción de glucosa en los tú bulos renales de la rata. Otros efectos producidos por los caurenos en la rata es la 29 fosforilación oxida ti va de (Bracht et al., 1985) y adrenales aisladas, inducidos 1986). la mitocondria aislada del efectos esteroidogénicos en por el caurenol (Moriwaid hígado células et al., Se ha propuesto que la polaridad de los compuestos influyan en la actividad uterotónica de los tejiidos ensayados. El primer tipo de actividad fue caracterizada por un incremento de las contracciones, en magnitud y frecuencia, el segundo tipo inhibe las contracciones espontáneas (Waller et al., 1987). Otros compuestos ensayados farmacologicamente han sido los ácidos angeloigrandiflórico, monoginoico y caurenoico. En bioensayos realizados en cobayo in vitro, se mostró que el ácido angeloigrandiflóric, a dosis mayores (100 mg/kg), induce contracción. Mientras que los ácido caurenoico y monoginoico (4.0 y 4.6 mg/ml), en fueron inactivos (Lu et al., 1987). Béjar (1988) reporta que el ácido grandiflorénico no tiene actividad estrogénica sobre el útero de rata ovarectomizadas, a diferentes dosis. En otro trabajo (Campos-Lara et al., 1990), se determinó el efecto antagónico de los derivados del ácido caurenoico en úteros de rata y cobayo estrogenizados. El ácido 15-ceto- hidrocaurenoico y el 15-hidroxi-hidrocaurenoico incrementaron la actividad espontánea uterina de cobayo a 10-60 uM y 15-100 uM, respectivamente, mientras 15-hidroxi-hidrocaurenoico espontánea y el ácido que, en el útero aislado de ( 15-100 uM) inhibe su 15-ceto-hidrocaurenoico (25-160 30 rata el actividad uM) la incrementa. Este incremento de la contractilidad uterina en ambos modelos no es modificado a través de los receptores muscarínicos y liberación de prostaglandinas. Otra propiedad reportada para el ácido caurenoico, obtenido de Mikania laevigata , es el de ser un compuesto antimicrobiano y fungicida, sobre Bacillus cereus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y S. epidermis y en hongos Gandida a/bicans. Cryptococcus neoformans. Rhodotorula rubra y Aspergil/us parasiticus , a una concentración de 250 ug/ml, (Davino et al., 1989). 31 MECANISMO DE EXCITACION-CONTRACCION En el mecanismo de excitación-contracción participación del calcio es indispensable del músculo liso, la para activar a las proteínas contráctiles de las fibras musculares (Somlyo and Somlyo, 1968; Bolton, 1979; Kanmura, 1988). Esta activación es producida por los cambios en la concentración de calcio intracelular del músculo liso (Kamm and Stull, 1989; · Kanmura, 1988). En la actualidad, se reconocen tres fuentes primarias para inducir el incremento intracelular de Ca 2 + , una es el calcio libre extracelular y otra es el calcio ligado a la membrana y, finalmente, el calcio almacenado intracelularmente (Mironneau, 1973; Hodgson and Daniel, 1973; Ruzycky et al., 1987). Se ha reportado que en el músculo liso uterino el retículo sarcoplásmico es un organelo fundamental en la regulación de calcio citoplásmico (Carsten, 1969; Somlyo, 1985), y que la mítocondria no contribuye significativamente en ello (Somlyo and Himpens, 1989). El ingreso de Ca 2 + al músculo liso es inducido por el acoplamiento electromecánico y farmacomecánico (Bolton, 1979). El primero está mediado por cambios en el potencial de membrana que ocasionan la entrada de Ca 2+ por los canales sensibles al voltaje, mediado mientras que por la entrada el acoplamiento farmacomecánico está de Ca 2+ a través de canales operados por el receptor y por la acción de segundos mensajeros, generados por la activación del receptor, los cuales inducen la liberación de calcio de almacenes intracelulares (Bolton, 1979; Ruzycky, 1987; 32 Somlyo and Somlyo, 1990). Un método para el manejo del acoplamiento farmacomecánico incluye el uso de agonistas colinérgicos, serotonérgico, oxitócicos, prostaglandínicos, entre otros; mientras que, un método para manipular el acoplamiento electromecánico consiste en la utilización de una solución despolarizante de K + (40 mM). Es importante mencionar que cuando se inducen contracciones del músculo liso uterino, independientemente del método utilizado, la actividad contráctil de este tejido depende de la concentración de Ca 2+ extracelular (Bolton, 1979). Bolton (1979) señaló que las contracciones del músculo liso, inducidas por agonistas, son consecuencia del incremento del calcio intracelular a través de las vías de entrada de calcio sensibles al receptor y que la contracción inducida por el método químico (K + 40 mM), es producto del incremento de calcio intracelular por las vías de entrada de calcio sensibles al voltaje. Al activarse el receptor por el agonista, la proteína G, que es un 'O!igómero formado de tres subunidades (alfa, beta y gama), se disocia y libera a su sub unidad catalítica (alfa), la cual activa a la fosfolipasa e, la cual inicia la hidrólisis de los fosfoinositidos (Berridge, 1987) (Fig. 3). Se ha propuesto que este mecanismo induzca la liberación de ca 2+ del retículo sarcoplásmico citoplásmico (Abdel-Latif, e incremente rapidamente la concentración de Ca 2+ y principia el acoplamiento farmacomecánico 1986; Hugbes and Putney, 1988; Van Breemen and 33 Saida, . 1989). Somlyo et al. (1985) aportan suficientes evidencias considerar que la vfa de fosfatidilinositol, específicamente para el inositol trifosfato (Ins 1,4,5 P3), actúa como un transmisor que induce la liberación de Ca 2+ del retículo sarcoplásmico del músculo liso. Observaciones similares reportan al Ins 1,4,5 P3 como un segundo mensajero que participa en la liberación de ca 2 + de fuentes no mitondriales (Carsten and Miller, 1985; Abdel- Latif, 1986; Berridge, 1987; Kan mura et al., 1988; Van Breemen and Saida, 1989) (Fig. 3). Este aumento Ca 2 +intracelular, por la vía de la hidrólisis de los fosfoinositidos, produce que la calmodulina se una a los iones de Ca 2+, formando el complejo Ca 2+ -calmodulina. Una molécula de miosin-cinasa de cadena ligera es activada por una molécula de Ca 2 + -calmodulina (Kamm and Stull, 1985). Al interactuar el compl.:jo Ca 2 + -calmodu!ina con la miosin-cinasa de cadena ligera, fosforita las dos cadenas ligeras de miosina. Una vez fosforilada la miosina forma puentes de entrecruzamiento con la actina y se produce el deslizamiento de los filamentos de la actina y la miosina. Cuando los niveles de calcio disminuyen, la calmodulina se disocia de la miosin-cinasa de cadena ligera, y se produce la relajación (Carsten, 1987; Somlyo, 1990). Cuando el músculo liso miometrial está en reposo la concentración de calcio es de 10-7 M. Mientras que en la contracción aumento en la concentración de calcio intracelular (Irvine, 1986; Carsten, 1987). 34 existe un a 10-5 M En esta dinámica de regulación de la concentración de Ca 2+ intracelular del músculo liso, intervienen dos sistemas de membranas, la membrana plasmática, la cual esta bajo el control del potencial de membrana y los agonistas, y el retículo sarcoplásmico, el cual está regulado por los segundos mensajeros (Van Breemen and Saida, 1989). La disminución de calcio intracelular través de la ·membrana plasmática puede realizarse por una ATPasa-Ca 2+ ,Mg 2+, por un intercambiador Na+ /Ca 2+ o a través de la toma de Ca 2+ por organelos intracelulares (Cauvin et al., 1983; Mironneau, 1984; Bolton, 1986; Nicholls, 1986; Carsten, 1987; Van Breemen and Saida, 1989). Se ha propuesto que el mecanismo del intercambiador Na 2+ /Ca 2+ en el músculo liso uterino es un mecanismo importante en el movimiento de Ca 2+ (Carsten, 1987). 35 A .. ¡r-..-. ................. ,_,,.,, ....... __ COR 1 ~ 1 lns r lns l,3,4,5Pl ATP + Jlnsl,3,5P ( LI ~ J t--lnsP-lns l,4P-lns l,4,5P___.Rs--..ca2 • ("" p,n h- AOP ATP V 2• ATP ca1m MLCK-P-.MLCKTCa. Calm J actomiosina-P ~ mioslna P miosina ADP '\ actina actina CONTRACCION RELAJACION FIG. 3 REPRESENTACION ESQUEMATICA DEL CICLO FOSFATIDIL INOSITOL. A:agonista. R:receptor, G:proteína G. PLC:fosfolipasa C, DG:diacilglicerol; ATP:adenosín trifosfato, PKC: Protefn- cinasa C, Pi:fosfato, Pl:fosfatidil inositol, PIP:fosfatidil inositol 4--fosfato, PIP 2 :fosfatidil inositol 4,5-bifosfato, lns 1,4,5,P:inositol 1,4,:> trifosfato, lns 1,3,4,SP:inositol . tetralásfosfato, lns 1,4,P: inositol 1,4 fosfato, InsP:inositol 1-fosfato, lns:inositol, RS:retículo sarcoplásmico, Calm:calmodulina, MLCK:miosina-cinasa cadena ligera, COR:canales operados por el receptor. INERVACION UTERINA Mediante técnicas histoquímicas y electrofisiológicas se ha determinado que el músculo liso uterino de rata presenta una inervación dual simpática y parasimpática. Asimismo, contiene plexos nerviosos en vasos sanguíneos y glándulas (Adham and Schenk, 1969). En el músculo liso del aparato reproductor de la hembra, la inervación simpática está constituida por fibras adrenérgicas que tienen como neurotransmisor a la noradrenalina, dicho neurotransmisor estimula receptores alfa y beta adrenérgicos que se encuentran en este tejido. Por su parte, la inervación parasimpática está conformada por fibras colinérgicas que tienen como neurotransmisor a la acetilcolina, la cual estimula a los recptores muscarínicos de este tejido (Campbell, 1970; Sato et al., 1989). La inervación dual del músculo liso uterino puede haber diferir considerablemente entre especies de animales (Moadwood, 1973). También se ha demostrado que las hormanas ováricas la cantidad de noradrenalina presente en las terminaciones regulan de los 1970). nervios adrenérgicos (Adham and Schenk, 1969; Marshall, El útero de rata presenta una inervación adrenérgica abundante, asociada con vasos sanguíneos y haces del músculo liso. La capa circular interna del músculo uterino está más inervada que la capa longitudinal externa; la intensidad de la inervación disminuye hacia la parte ovárica del cuerno uterino 37 (Adham and Schenk, 1969). De manera clásica, se ha propuesto que el nervio hipogástrico es la ruta parasimpática principal que se dirige hacia la zona pélvica; el nervio pélvico constituye la ruta parasimpática 1970). que va hacia las vías urogenitales (Campbell, Recientemente, Sato et al. (1989) confirmaron que el nervio hipogástrico y pélvico son las vías de inervación útero, cérvix y vejiga en la rata. adrenérgica y colinérgica del la uterino está influida en Además de actividad del forma directa motora del la inervación músculo liso por otros neurotransmisores, tales como la serotonina, la histamina, la oxitocina, la angiotensina y las prostaglandinas, sustancias que alcanzan la membrana celular a través de la vía sistémica. 38 ASPECTOS HISTOLOGICOS DEL APARATO REPRODUCTOR FEMENINO DE LA RATA En los mamíferos, el aparato reproductor femenino está constituido por los ovarios, oviductos, útero y vagina (Beck and Boots, 1974). El útero y oviducto derivan embriológicamente de los conductos de Muller. El oviducto se denomina algunas veces tubo uterino o trompa de Falopio (Snell, 1941; Bloom and Fawcett, 1987). En los oviductos se realiza la fertilización y el transporte 1941). de los gametos del macho y de la hembra (Snell, En el oviducto se distinguen varios segmentos, a los cuales se asignan diferentes términos descriptivos. La parte cercana al ovario llamada ámpula, comprende aproximadamente las 2 /3 partes de la longitud del oviducto. Su diámetro es amplio, forma prolongaciones largas y delgadas hacia la luz y anterior es semejante a un embudo abierto; el se su porción denomina infundfbulo. El ámpula continúa con el istmo (Snell, 1941), y comprende aproximadamente 1/3 de la longitud del oviducto en relación con el ámpula. Su luz es más estrecha, pero su pared es más gruesa. El istmo se continúa con el área de transición entre el oviducto y el útero llamada unión uterotubal. El útero tiene funciones importantes en la reproducción, ya que es el lugar donde se recibe al embrión procedente de la trompa, se produce la implantación y establece las relaciones vasculares para el mantenimiento del embrión a lo largo de su 39 desarrollo (Bloom and Fawcett, 1987; Dellmann and Brown, 1976). La porciones uterinas de los conductos de Muller pueden presentar varios grados de fusión, dependiendo de la especie (Snell, 1941; Dellmann and Brown, 1976). En la rata, estos conductos se fusionan solamente en sus extremos inferiores y se abren en un solo orificio al exterior, quedando su mayor superficie uterinos como dos tubos separados que forman los cuernos (Snell, 1941 ). Desde el punto de vista histológico la pared del útero está dividida en tres regiones: endometrio, miometrio y perimetrio (Dellmann and Brown, 1976; Banks, 1986; Vaquero, 1982). El endometrio participa en la implantación del embrión y la formación de la placenta (Bloom and Fawcett, 1987). El endometrio incluye el epitelio, las glándulas tubulares simples y el tejido conjuntivo subyacente (Vaquero, 1982; Banks, 1986). El epitelio es columnar simple y secretor (Bloom and Fawcett, 1987). Mientras que, las glándulas tubulares están revestidas por epitelio cúbico simple (Dellmann and Brown, 1976). Los productos de secreción del epitelio glandular incluyen lípidos, glucógeno y proteínas. El tejido conjuntivo laxo está muy vascularizado, con muchos fibroblastos. Se hallan presentes abundantes macrófagos, linfocitos sanguíneos. y células plasmáticas que penetran La siguiente región uterina, el miometrio, 40 desde los vasos está formado de - To . - . En la capa externa los haces están arreglados de manerá paralela al eje longitudinal del útero (Delimann and Brown, 1976; Banks, 1986). El tejido conjuntivo situado entre los haces musculares está formado por fibras colágenas, fibroblastos, células indiferenciadas del tejido conjuntivo, macrófagos y células cebadas (Bloom and Fawcett, 1987; Finn and Porter, 1975). El perimetrio o túnica serosa, se compone de tejido conjuntivo laxo, recubierto de mesotelio peritoneal. En esta capa se encuentran presentes numerosos vasos linfáticos y sanguíneos y fibras nerviosas (Dellman and Brown, 1976). El útero está vascularizado, principalmente, por las arterias uterinas y, de modo accesorio, por las arterias Ováricas , y por las arterias del ligamento redondo. Estas arterias penetran en la capa muscular y se resuelven en un plexo, del cual se emiten ramas externas para los estratos musculares más externos y para el perimetrio (Vaquero, 1982), La zona de transición es el cuello uterino O cérvix, que es de epitelio plano poliestratificado aglandular no queratinizado y sirve como válvula para cerrar el lumen uterino y separarlo de la vagina. El cuello uterino Se continúa com la vagina, la cual se abre hacia la vulva (Snell, 1941) y misma que se comunica al exterior. 41 una capa de músculo liso circular interna más gruesa están arreglados alrededor del eje longitudinal y los haces E~ l pa terna l s ces t n l os de anera: ralela l git dinal el t ro ell a n d r n, 76; anks, l je 86). l teji o juntivo fi ras it o tre l enas, l s ces usculares stá f r ado or lastos, l las i ifere ciadas el t ji o njuntivo, acrófagos l las adas ( l d awcett, 87; i n d orter, 75). l peri etrio ica se sa, pone e t ji o njuntivo l o, bierto e esotelio rit neal. n sta pa cuentran r sentes erosos sos li ti s uíneos i ras r iosas ell an d r n, 76). l t ro stá scularizado, i i l ente, rt rias t ri as y, e odo cesorio, or l s t rias or l s t rias el lig ento ndo. stas or l s ov i as rt rias netran l pa uscular el en l xo, el al iten as t rnas ara l s t tos usculares ás t r os ara l ri etrio ( aquero, 82). a na e t si i n l ello t ri o o rvix, e s e itelio l o polie t ti i o l dular o erati i ado i e o l ula ara rrar l l en t ri o ararlo e l gina. l ello t ri o s nti úa n l gina, l al re acia l lva nell, 41) is a e unica l terior. CAMBIOS MORFOLOGICOS INDUCIDOS POR LA ACCION DE LOS ESTROGENOS Existen diversos los mamíferos cambios morfológicos y fisiológicos a lo largo de su ciclo estral, éstos del útero de se encuentran regulados, estrógenos principalmente, por y la progesterona. las hormonas sexuales, los Se ha utilizado al útero de rata como modelo para describir los procesos celulares y bioquímicos relacionados con el mecanismo de acción de los estrógenos, estral o mediante su administración. inducidos durante el ciclo Los estrógenos en el útero de rata inducen una serie de procesos complejos que comprenden los incrementos en la permeabilidad vascular, en la imbibición de agua, de la de eosinófilos, de células cebadas, en el metabolismo glucosa, en la síntesis de proteínas, en Ja producción de actomiosina Katzenellenbogen, 1976; Campbell et al., (Lan y en and la estimulación de la síntesis de RNA (Wilson, 1980), 1963; Gorski and Nelson, 1965) y DNA Entre los trabajos histológicos, destaca el de Grunert et vía al. (1986) el cual establece que la administración endovenosa (0.01-1 000 ug/kg) en ratas ovarectomizadas, una reducción en la altura del epitelio celular 6 horas de la administración de esta hormona e induce por produce después también hipertrofia celular miometrial, después de 24 horas. Determinaron que el dietilestilbestrol es más débil que el 17- 42 beta estradiol para inducir edema uterino, incremento de eosinófilos y su redistribución en el miometrio, 6 h después de la administración. Esto concuerda con el trabajo de Hisaw (1959), quien compara la efectividad de seis estrógenos, administrados subcutáneamente, sobre el edema y crecimiento uterino de rata, a diferentes dósis. Sin embargo, Campbell et al. ( 1980) reportan que el dietiestilbestrol es más efectivo para promover el crecimiento del útero de rata ovarectomizada que el 17-beta estradiol con una dosis de 1 ug/ml y administrados por vía subcutánea. En el trabajo de Ross y Klebanoff (1967), realizado con microscopio concentración electrónico, determinaron cambios en la y distribución del retículo endoplásmico rugoso y el aparato de Golgi en las células del músculo liso y fibroblastos del útero de rata, seguido de una administración subcutánea de fases del ciclo están asociados 17-beta estradiol (0.06 a 60 estral. Estos autores proponen con Ja síntesis y secreción de ug), en diferentes que los cambios proteínas. Del mismo modo, Bo et al. ( 1968) describen un incremento gradual en el número de ribosomas en la lámina externa de la membrana nuclear y retículo endoplasmático rugoso, en células del músculo liso del útero de rata, entre 6 y 96 horas después de la administración subcutánea de dipropionato de estradiol (10 ug/100 ul). También informan de un incremento en el número de las mitocondrias (entre 24 y 48 h después de administración del estrógeno) y ribosomas (6-12 h después), establecieron que estos 43 cambios ocurren por un incremento en la actividad metabólica de la células del músculo liso. 44 MECANISMO DE ACCION DE LOS ESTROGENOS EN EL UTERO DE RATA Recientemente, se ha propuesto que las diferentes respuestas inducidas por los estrógenos sobre el útero de rata pueden agruparse en dos tipos de (Tchernitchin, 1979; Tchernitchin, mecanismos 1983). Así, independientes las respuestas que se manifiestan durante las cuatro primeras horas después de la administración de estrógenos, se han denominado tempranas e incluyen el incremento de eosinófilos, edema, incremento de permeabilidad vascular uterina, liberación de histamina y protección (Tchernitchin, antiinmune del blastocisto contra su rechazo 1974; Tchernitchin, 1979; Lan and Katzenellbogen, 1976), tal es sucesos se han caracterizado como efectos no ge nómicos respuestas, estrógenos, eosinófilos Ju minal contenido. situados de los estrógenos probablemente son localizados en la uterinos, los cuales uterino, donde sufren en Participan también la superficie de en el útero de rata. Estas mediadas membrana por receptores a de los leucocitos migran de la sangre al epitelio autolisis masiva y liberan su los los receptores a estrógenos vasos sanguíneos, dichos receptores, al ser activados por los estrógenos modifican la permeabilidad Lee, 1982). vascular (Tchernitchin, 1974; Tchernitchin, 1983: El otro tipo de mecanismo de acción de los estróg.enos sobre el útero de rata, es el que desencadena los procesos que tienen una latencia de más de 24 h y contemplan el aumento de la 45 síntesis de proteínas, de DNA y de RNA. A este se le ha denomina acción genómica de los estrógenos sobre el útero de rata y corresponde al mecanismo clásico de acción de los estrógenos que se inicia con la citosólico-n uclear activación del sistema receptor 1974). a estrógenos (Tchernitchin et al., Kirkland et al. (1977) y Gardner las respuestas no genómicas inducidas et al. (1978) sugieren que por los estrógenos en el de este tejido para las útero de rata representan la preparación respuestas genómicas que son el verdadero crecimiento del órgano. 46 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA El valor terapéutico de las plantas medicinales, manifiesto en la medicina tradicional mexicana, ha tenido un reconocimiento indiscutible por muchos siglos. En nuestro país, existe un gran número de plantas medicinales que cumplen una función importante en el manejo del primer nivel de atención a la salud. Sin embargo, muchas especies de plantas no han sido aun estudiadas desde el punto de vista fitoquímico y de su actividad biológica. Con base en los extensos estudios etnobotánicos, los estudios etnofarmacológicos tratan de evidenciar las propiedades biológicas de las decocciones y de los productos aislados de las plantas medicinales mediante la utilización de los métodos farmacológicos convencionales. A través de estos métodos se ha estudiado al zoapatle (Montanoa sp. ), planta ampliamente utilizada en los tratamientos relacionados con algunos procesos de la reproducción en la mujer. Se han realizado un gran número de estudios, utilizando preparaciones in vivo e in vitro, a fin de conocer el efecto de las decocciones y compuestos aislados del zoapatle sobre la actividad uterina de diferentes especies animales, tales como rata, cobayo e inclusive del útero humano. Sin embargo, estos estudios han mostrado resultados controversiales ya que los compuestos analizados presentan tanto efectos excitatorios como inhibitorios. Así, por ejemplo en estudios in vitro, en el útero de cobayo se ha observado que 47 generalmente incremento los compuestos aislados de Montanoa producen un en la actividad uterina; mientras que, frecuentemente, en el útero aislado de rata se ha observado un efecto inhibidor en la actividad uterina inducida por diferentes estímulos. histológicos compuestos Por que aislados otro lado, aún muestran el del zoapatle son efecto sobre muy escasos los estudios de las decocciones y el tejido uterino. Por tal motivo, en este trabajo se ensaya el efecto de los caurenos, aislados del género Montanoa , sobre la actividad contráctil del músculo liso uterino, aislado de rata tratada con inducida por los agonistas acetilcolin a, oxitocina y estrógeno, serotonina. Este ensayo se realiza con el objeto de conocer si los caurenos son Ca 2+ inducidas capaces por el de modificar acoplamiento tejido. el ácido Se pretende cauradienoico además, induce investigar, cambios aislado de rata tratada con estrógeno. 48 las vías de entrada de farmacomecánico en a nivel histológico, morfológicos en el este si útero Con este estudio, se pretende contribuir al conocimiento de algunos aspectos de la actividad biológicas de los caurenos, aislados de Montanoa frutescens , M. tomentosa y M. hibiscifolia , en útero aislado de rata estrogenizada al emplear técnicas farmacológicas e histólogicas. Específicamente, los objetivos de esta investigación son: l. Estudiar el efecto de los ácidos cauradienoico, grandiflórico, 16 alfa-OH caurenoico y el ester del ácido 16 alfa-OH caurenoico aislados de la planta caurenoico, metílico, Montanoa ssp. sobre el útero la contracción inducida por agonistas estrógeno 3 uterotónicos en de ratas tratadas con benzoato-17 beta estradiol in vitro. 2. Observar las características morfológicas del útero aislado de ratas tratadas con estrógeno (3BE 2) sometidos a diferentes tratamientos: solución Ringer Krebs bicarbonato, acetilcolina ( 1 O -4 M) y acetilcolina-ácido cauradienoico (40 ug/ml). 49 MATERIAL y METODO ENSAYOS FARMACOLOGICOS Los experimentos se realizaron en tiras de músculo uterino obtenidas de ratas vírgenes de la cepa Sprague-Dawley de 200-250 g de peso, aproximadamente. Los organismos estuvieron en condiciones controladas, agua y alimento ad libitum y un ciclo de luz-obscuridad de 12-12 horas. Con el objeto de estandarizar el estado hormonal de los individuos, a cada uno se le administró subcutaneamente una dosis de 20 ug/kg de 3-benzoato-17 beta estradiol (3 BE 2) de los laboratorios Sigma Chemical Co. (St. Lo u is, Mo.), en un volumen de 200 ul de aceite de maíz, 24 horas antes del sacrificio. Los animales se sacrificaron por desnucamiento e inmediatamente se extrajeron cuidadosamente los cuernos uterinos, quitándoles el tejido conjuntivo y grasa. Posteriormente, se colocaron en una caja de Petri que contenía solución Ringer- Krebs bicarbonato, con la siguiente composición (mM): NaHCO 3 20; NaCl 120; KCl 4.6; MgSO 4 1.2; KH 2PO 4 1.2; CaCl 2 2.0 y glucosa 11.5. Las sales utilizadas fueron grado reactivo (marca Merck). La solución se ajustó a un pH 7.4 con un burbujeo constante de una mezcla gaseosa de 5% de co 2 en 95% de o2. De la parte central de cada cuerno uterino se obtuvieron dos segmentos, de 1 cm de longitud aproximadamente. Los tejidos se colocaron en cámaras de órganos aislados, con un volúmen de 10 50 mi, las cuales contenían solución Ringer-Krebs bicarbonato, a una temperatura de 37 + 1- 1 ° C y burbujeo constante de 5 % de CO 2 en 95% de o2. La actividad uterina se registró isométricamente con un transductor de tensión (FT03 Grass) conectado a un polígrafo modelo Grass 7B. Los segmentos uterinos se ajustaron a 1 g de tensión (9.8 mN) y se estabilizaron durante una hora antes de exponerlos a las drogas, renovando la solución Ringer-Krebs bicarbonato cada 10 minutos. 51 COMPUESTOS UTILIZADOS Los agonistas utilizados en el presente estudio fueron cloruro de acetilcolina (AChCl), creatinin sulfato de serotonina (5HT) de los laboratorios Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.); así como, la oxitocina sintética (OT) de los laboratorios Sandoz (México). Estos compuestos uteroconstrictores se adicionaron directamente a la cámara de órganos aislados, en un volumen que no excedió los 20 u!. Las concentraciones utilizadas en cada agonista fueron acetilcolina 10-4 M y 10-5 M, oxitocina 5 mUI/ml, y serotonina 10-5 M. La respuesta inducida por acetilcolina c10-4 M) en todos los experimentos verificó la viabilidad del tejido. Los caurenos fueron aislados y purificados según lo reportado por Lozoya et al. (1983), Valencia et al. (1986) y Ponce-Monter et al. (1988), de diferentes especies de Montanoa . El ácido caurenoico se aisló de M. frutescens , el ácido granditlórico y ácido cauradienoico de M. tomentosa , mientras el ácido 16 alfa-OH-caurenoico y el ester metílico 16 alfa-OH- caurenoico se obtuvieron de M. hibiscifolia . Los caurenos utilizados se disolvieron en etanol puro (marca Merck) y se adicionaron directamente a las preparaciones estudiadas quedando una concentración final del disolvente de 0.1 %. Con el uso de bioensayos se comprobó que la concentración de etanol utilizada no modificó la respuesta del tejido. 52 TECNICAS HISTOLOGICAS Para las observaciones histológicas se utilizaron 3 ratas de la cepa Sprague-Dawley de 200-250 g de peso aproximadamente, las cuales estuvieron en las condiciones antes mencionadas. A este grupo de animales se le administró 20 ug /kg de 3-benzoato-17 beta Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.), aceite de maíz, 24 horas antes del subcutaneamente estradiol de los una dosis de laboratorios en un volúmen sacrificio. de 200 ul de Los animales se sacrificaron por desnucamiento e inmediatamente, se extrajeron los abdominal, quitándoles el tejido cuernos uterinos de la cavidad conjuntivo y grasa. De cada cuerno uterino se obtuvieron dos segmentos, de 1 cm de longitud por 0.3 cm de ancho, aproximadamente. Y de estos segmentos se obtuvieron los fragmentos de paltina (Estrada et al., 1982). Los fragmentos obtenidos fueron sometidos a los siguientes tratamientos: Tratamiento 1, considerado como control, fue extraído y fijado inmediatamente en formol al 10%. En los siguientes tratamientos el tejido uterino fue colocado en cámaras de órganos aislados, con un volúmen de 10 mi, los cuales contenían solución Ringer-Krebs bicarbonato, a una temperatura de 37 + /- 1°c, a un pH de 7.4 y burbujeo constante de 5% de co 2 en 95% de o2, durante un periodo de cinco horas. En el tratamiento 2, se mantuvo una porción uterina exclusivamente con solución Ringer Krebs bicarbonato, durante el 53 periodo estipulado. En el tratamiento 3, se indujo una contracción uterina con el agonista ACh 10-4 M, durante el mismo tiempo, Finalmente, en el tratamiento 4, el tejido uterino fue incubado con el ácido cauradienoico (40 ug/ml) durante 10 minutos y posteriormente (ACh 10-4 M). se indujo una contracción con acetilcolina Al finalizar cada uno de los tratamientos, el tejido uterino se procesó de la siguiente manera: se fijó cada porción en formol al 10 % por un tiempo de 48 h, después se lavó el fragmento de platina en agua corriente, por un periodo de 2 h, para eliminar el fijador. Posteriormente, se deshidrató en alcoholes graduales 50%, 60%, 70%, 80%, 96% y 100% durante 30 minutos en cada uno. Se aclaro en xilol, xilol-parafina y se procedió a incluir en parafina a 56 °c con tres cambios de 30 minutos cada uno. Los cortes se hicieron en un microtomo de parafina con un grosor de 6 um en dirección transversal. Las técnicas de tinción aplicadas fueron las de Hematoxilina-Eosina, Tricrómica de Gallego y azul de alciano. Al finalizar las técnicas de tinción se montaron, limpiaron y etiquetaron las preparaciJnes obtenidas. Se procedió a observar en un fotomicroscopio Zeiss lll, en un sistema de iluminación de campo claro. Se tomaron fotografías con una película Fuji 100 ASA. 54 ANALISIS EST ADISTICO El incremento en la actividad contráctil, inducida por los diferentes agonistas, se analizó cuantitativamente al obtener el área bajo la curva (cm 2) de los registros en un período de 6 minutos. La medicina del área bajo la curva se hizo con un planímetro digital con trazador ajustable, Tamaya modelo polar 2. La respuesta inducida por acetilcolina (lo-4 M) se consideró como el 100% en todos los experimentos y con ésta se comparó las respuestas inducidas por los agonistas (A Ch, OT y 5HT). Obteniendo un valor relativo porcentual. En el cuadro 3, se define el modelo experimental utilizado en este trabajo, cada valor observado representa el número de úteros utilizados en cada tratamiento. Para el análisis estadístico se consideró como dato los promedios de las fracciones utilizadas por útero en cada tratamiento. definido de esta manera para considerar la independencia Fue de las repeticiones. Asimismo, en este trabajo, no se identificaron fuentes de variación entre las unidades experimentales. Por tal al azar motivo, se utilizó un Diseño Experimental completamente sin covariable. Para el análisis de los datos se utilizó el paquete estadístico BMDP (Biomedical Package), especificamente el programa 7D. por presentar tratamiento. Este módulo de proceso estadístico se caracteriza histogramas y estadísticos básicos para cada Incluye también pruebas de comparación múltiple 55 (análisis de varianza de una vía y prueba de Tukey). El análisis de varianza de una vía contempla dos procedimientos de prueba. El primero supone que las varianzas son homogéneas y utiliza la prueba de Levene. El segundo, supone que no existe homogeneidad de varianzas, por lo que utiliza la prueba de Welch y lo Brown- Forsythe (Dixon et al., 1990). El nivel de significancia se fijó en valores de p < 0.05 unimarginal. Los datos en el texto y figuras constituyen los promedio de la fracciones media de los tratamientos. valores del útero 56 porcentuales + /- el error de inhibición estándar de la CUADRO 3 ACIDO CAURADIENOICO 20.0 ug/ml 17.0 ug/ml 8.0 ug/ml A Ch (JO -4 M) 6 9 OT (5 giUI/ml) 6 9 5HT (5- M) 3 3 3 A CID O CAURENOICO 20.0 ug/ml ~ 17.0 ug/ml 8.0 ug/ml ACh (JO -4 M) 3 2 OT (5 g1 UI/ml) 3 5HT (5- M) 2 3 ACIDO CAURENOICO 20.0 ug/ml 17.0 ug/ml 8.0 ug/ml ACh (JO -4 M) 3 * 2 OT (5 _rUilml) 3 * l! 5HT (5- M) 2 3 * ACIDO GRANDIFLORICO 20.0 ug/ml 41.66 ug/ml 53.75 ug/ml A Ch (JO -4 M) 3 * * OT (5 mUI/ml) 2 * * ACIDO 16 ALFA-OH CAURENOICO 20.0 ug/rnl 5.0 ug/ml A Ch (JO -4 M) * 2 5HT (I0-5M) 2 2 ESTER METILICO DEL ACIDO 16 ALFA-OH CAURENOICO 20.0 ug/ml 5.0 ug/ml A Ch (IO -4 M) * * 5HT (IO -5 M) 2 * Cada valor representa el número de úteros utilizados en· cada tratamiento. El * establece que no se pudo determinar el efecto. Y - no se realizaron experimentos con esos tratamientos. 57 RESULTADOS Los caurenos estudiados, cuya estructura química se muestra en la figura 2, inhibieron la actividad contráctil inducida por 10-5M de acetilcolina, 5 m UI /mi de oxitocina y 10-5 M de serotonina en el útero aislado de rata tratada con estrógeno. En la figura 4 se muestra un trazo típico del protocolo experimental utilizado en este trabajo. Se puede observar que la respuesta del tejido a 10-4M de acetilcolina es repetitiva y de semejante magnitud. En el trazo superior se define la acción de 5 mUI/ml de OT y posteriormente el efecto de este agonista en presencia de 20 ug/ml del ácido caurenoico. se observa el efecto del ácido cauradienoico En el trazo inferior (20 ug/ml) sobre la actividad contráctil uterina inducida por 10-5 M de acetilcolina. Nótese que en ambos casos, Ja respuesta a los agoni.stas empleados es reducida por la presencia de los ácidos antes mencionados. El cuadro 4 muestra el porcentaje de inhibición inducido por los ácidos cauradienoico y caurenoico (20 ug/ml) sobre la actividad uterina producida por 10-5 M acetilcolina, 5 m UI/ml de oxitocina y 10-5 M de serotonina sobre segmentos uterinos aislados in vitro de ratas tratadas con estrógeno. La contracción inducida por 10-5 M de acetilcolina fue inhibida por el ácido cauradienoico en un 52.81 % (+/- 14.18) y en un 79.75% ( + /- 6.16) por el ácido caurenoico. Así también, en la contracción inducida por 5 m UI /mi de oxitocina inhibieron en un 67.67% (+/- 5.26) y 72.21 % (+/- 15.41), respectivamente. Y en la contracción inducida por 10-5 M de serotonina inhibieron en un 58 68.63 3 ( + /- 31.37) y 100 3, comparativamente (Fig. 5 y 6). La comparación de Jos datos, obtenidos en estos tratamientos, a través del análisis de varianza de una vía y de acuerdo a Ja prueba de Leven e, muestran que no existen diferencias significativa. El ácido cauradienoico (17.0 ug/ml) inhibió las contracciones inducidas por 10-5 M de acetilcolina, 5 mUI/ml de oxitocina y 10-5 M de serotonina en un 27.373 (+/- 10.73), 36.563 (+/- 7.71) y 59. 73 3 ( + /- 40.27), respectivamente. A través de una prueba de análisis de varianza, de acuerdo a la prueba de Levene, no existen diferencias significativas entre tratamientos. A una concentración de 20 ug/ml el ácido grandiflórico inhibió la contracción inducida por 5 m UI /mi de oxitocina en un 13.94 3 ( + /- 0.855). Cuando se realizó el estudio comparativo entre el efecto del ácido grandiflórico, cauradienoico y caurenoico (20 ug/ml) sobre la contracción inducida por 5 mUI/ml de oxitocina se observó que existen diferencias altamente significativas (p < 0.01) entre estos tratamientos, de acuerdo con la prueba de Leven e (Fig. 7). La figura 8 muestra un trazo característico de los efectos del ester metílico y el ácido 16 alfa-OH caurenoico sobre la actividad uterina inducida por 10-5 M de serotonina sobre útero aislado de rata tratada con estrógeno. Se observa la notable diferencia en el efecto inhibitorio inducido por el ester metílico en contraste con el menor efecto del ácido 16 alfa-OH caurenoico. 59 ll AAN a Á | Á A k [0 mín ) ACh (10"%M) - ACHh(10"%M) OT (5 mUl/m!) OT (5 mÚUl/mi) ACIDO OT (5muUI/mi) o l - CAURENOICO 20 yg/mi ps Al lO min Ach 10m) acht10"%m) Acho" Sm) - ach(10"m) AcIDOo Achtio"óm) CAURADIENOICO 20 pgími Fig. 4 Efecto de los ácidos caurenoico y cauradienoico (20 ug/ml) en contracciones inducidas por la oxitocina (OT] y la acetilcolina (ACh) en útero de rata in vitro 1g I ~ l h uo-4 ) ~¡~ lu~ ~ >. >. 4 ACh (10-4 ) T Ul/ml) T 5 l/ l) ACh(ID- 4Ml l >. 5 ACh(IO- M) ~ A JO ln Á JOO T J/ml) ENOICO 0 ,11g/ml A -5M) ACh (10 CIDO RADIENOICO 0 ,11g/ml · .. d 5 caureno1c "das por la . o Y r di noico Fig. 4 Efecto ~f ~~s c~~'tr~cci~~ITgolrndau1Achl en útero (20 ug~m (OTJ Y la ac oxitocma ·n vitro e t t. -- CUADRO 4 PORCENTAJE DE INHIBICION INDUCIDO POR LOS ACIDOS CAURADIENOICO Y CAURENOICO (20 ug/ml) SOBRE LA ACTIVIDAD CONTRACTIL PRODUCIDA POR AGONISTAS EN UTERO DE RATA ESTROGENJZADA. A C 1 D O A C 1 D O CA URADIENOICO CAURENOICO A Ch (10-5M) 52.82 +/-14.18 (6) 79.75 +!- 6.16 (3) OT (5 mUl/ml) 67.67 +!- 5.26 (6) 72.21 + /- 15.42 (3) 5-HT (I0-5 M) 68.63 + /-31.37 (3) 100.00 +/- 00.00 (2) Los valores representan el valor promedio + !- el error estandar de la media. Entre paréntesis se muestra el número de úteros utilizados en cada experimento. 61 % D 100 80 E 60 1 N H 1 B ¿ 40 1 o N 20 ACETILCOLINA OXITOCINA SEROTONINA 10-5 M 5 mUl/mg 10-5 M FIG. 5. PORCENTAJE PROMEDIO DE INHIBICION INDUCIDO POR EL ACIDO CAURADIENOICO (20 ug/ml) EN CONTRACCIONES PRODUCIDAS POR AGONISTAS ACETILCOLINA, OXITOCINA Y SEROTONINA. Con valores de n =6, 6 y 3 respectivamente. 62 80 % D E 60 1 N H 1 B 1 40 e 1 o N 20 ACETILCOLINA OXITOCINA SEROTONINA 10-5 M 5 mUl/mg 10-5 M FIG. 6. PORCENTAJE PROMEDIO DE INHIBICION INDUCIDO POR EL ACIDO CAURENOICO (20 ug/ml) EN CONTRACCIONES PRODUCIDAS POR AGONISTAS ACETILCOLINA, OXITOCINA Y SEROTONINA. Con valores de n =3, 3 y 2 respectivamente. 63 100 80 o/o D E 60 1 N H 1 B 1 40 e 1 o N 20 * -r CAURADIENOICO CAURENOICO GRANDIFLORICO Fig. 7. Porcentaje de inhibición inducido por caurenos (20 ug/ml) en contracción uterina producida por oxitocina 5 mUl/ml * P