UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS INSTITUTO DE ECOLOGÍA BIOLOGÍA EVOLUTIVA Variación fenotípica y predicción genómica en Abies religiosa (Pinaceae) TESIS PARA OPTAR POR EL GRADO DE: DOCTOR EN CIENCIAS BIOLÓGICAS PRESENTA: M. Sc. SEBASTIÁN ARENAS JIMÉNEZ TUTOR PRINCIPAL: DR. JUAN PABLO JARAMILLO CORREA INSTITUTO DE ECOLOGÍA, UNAM COMITÉ TUTOR: DR. VÍCTOR LUIS BARRADAS MIRANDA INSTITUTO DE ECOLOGÍA, UNAM COMITÉ TUTOR: DR. JORGE NIETO SOTELO JARDÍN BOTÁNICO, UNAM CIUDAD DE MÉXICO, ABRIL, 2021 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). 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JORGE NIETO SOTELO JARDÍN BOTÁNICO, UNAM CIUDAD DE MÉXICO, ABRIL, 2021 COORDINACIÓN DEL POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS ENTIDAD INSTITUTO DE ECOLOGÍA OFICIO CPCB/354/2021 ASUNTO: Oficio de Jurado M. en C. Ivonne Ramírez Wence Directora General de Administración Escolar, UNAM P r e s e n t e Me permito informar a usted que en la Sesión ordinaria del Comité Académico del Posgrado en Ciencias Biológicas, celebrada el día 08 de marzo de 2021, aprobó el siguiente jurado para la presentación de examen para obtener el grado de DOCTOR EN CIENCIAS, del estudiante ARENAS JIMÉNEZ SEBASTIÁN con número de cuenta: 513453108, con la tesis titulada: “Variación Fenotípica y Predicción Genómica en Abies religiosa (Pinaceae)”, bajo la dirección del DR. JUAN PABLO JARAMILLO CORREA, quedando integrado de la siguiente manera: Presidente: DR. JUAN SERVANDO NÚÑEZ FARFÁN Vocal: DR. ANTONIO GONZÁLEZ RODRÍGUEZ Vocal: DRA. ELLA GLORIA VÁZQUEZ DOMÍNGUEZ Vocal: DRA. ANGELINA MARTÍNEZ YRIZAR Secretario: DR. JORGE NIETO SOTELO Sin otro particular, me es grato enviarle un cordial saludo. A T E N T A M E N T E “POR MI RAZA HABLARÁ EL ESPÍRITU” Cd. Universitaria, Cd. Mx., a 27 de abril de 2021 COORDINADOR DEL PROGRAMA AGRADECIMIENTOS Inicialmente, quisiera agradecer a la Universidad Nacional Autónoma de México y al programa de Doctorado en Ciencias Biológicas, por la formación académica y personal que diariamente me ha dado, y por haberme dado un espacio durante el tiempo del doctorado. Especialmente a su personal administrativo, académico y técnico por las facilidades otorgadas durante mis estudios. El mismo agradecimiento le ofrezco al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT), ya que fue el sustento financiero de tesis con diferentes proyectos (CB-2016- 284457, 278987, CB0153305) y de mi persona (480152). De igual manera, estoy muy agradecido con el programa de financiamiento PAEP que me permitió asistir a un congreso internacional (en Carolina del Norte, Estados Unidos). A la Dirección General de Asuntos del Personal Académico de la UNAM, DGAPA; PAPIIT proyecto IN208416 asignado al Dr. Juan Pablo Jaramillo Correa. De forma especial agradezco los comentarios, sugerencias recomendaciones y consejos de mi tutor, Dr. Juan Pablo Jaramillo Correa. En el mismo sentido, estoy muy agradecido con los miembros de mi comité tutoral (Drs. Juan Pablo Jaramillo Correa, Víctor Barradas Miranda y Jorge Nieto Sotelo) por todas las discusiones que tuve con ellos para enfocar y desarrollar mejor mi proyecto y por todo el apoyo que siempre he recibido de su parte. AGRADECIMIENTOS PERSONALES Inicialmente agradezco también al Instituto de Ecología de la Universidad Nacional Autónoma de México que ha sido mi casa durante 6 años de mi vida, siempre he sido y seguiré siendo un puma. Ofrezco mi gratitud individual e infinita al Dr. Juan Pablo Jaramillo, porque desde antes de entrar al programa de Doctorado, siempre estuvo dispuesto a hablar conmigo sobre mis ideas y fomentó gran parte de mi curiosidad, creatividad y hambre de conocimiento, gracias por aceptarme en el proyecto y por el gran apoyo durante todo el Doctorado. ¡Espero sin duda que continuemos colaborando! Agradezco de forma infinita a los honorables miembros del jurado Drs. Juan Núñez Farfán, Ella Gloria Vázquez Domínguez, Antonio González Rodríguez, Jorge Nieto Sotelo y Angelina Martínez Yrizar por haber leído y haber aportado ideas claves para mejorar esta tesis. Estoy eternamente agradecido con el Consejo Civil Mexicano para la Silvicultura Sostenible (CCMSS) por su apoyo incondicional, particularmente a la Dra. Lucía Madrid y al ingeniero Andrés Juárez, junto con los señores ejidatarios de Amanalco de Becerra (Estado de México) que me abrieron las puertas de sus rodales forestales para permitirme así, llevar a cabo la investigación. De igual Igualmente, estoy muy agradecido con el Dr. Andrés Cortés y la Dra. Alicia Mastretta por el apoyo, amistad y enseñanzas que me dieron, y por las discusiones y colaboraciones que hemos mantenido. Sin duda, parte de mi madurez científica se debe a todo lo que me han enseñado y por su exigencia de que todo quede lo más claro posible. Agradezco enormemente a Brian Boyle y su equipo, por haberme secuenciado con la tecnología GBS nuestras muestras de oyamel. Igualmente conservo gran gratitud con mi jurado de Candidatura al título de Doctor en Ciencias (Drs. Ana Weiger, Luis David Alcaraz, Antonio González, Jorge Nieto y Rocío Cruz) por todos sus aportes para mejorar el desarrollo y la logística de esta tesis. Agradezco a la Dra. Tania Garrido, así como a Anabel por todo el apoyo técnico que me dieron en el laboratorio. También Agradezco a los Drs. Daniel Piñero, Ella Vázquez y María del Carmen Madujano por haberme aceptado en su laboratorio hace ya cuatro años. Este trabajo no habría sido posible sin la ayuda de Ernesto Campos Murillo por permitirme el acceso al cluster de la CONABIO para el proceso bioinformático de datos, de Gustavo Giles por su apoyo en el ensamble de los datos, de Leopoldo Vázquez por su apoyo en los análisis. De igual forma agradezco a mis compañeros de proyecto, Verónica Reyes, Jorge Cruz y nuevamente a Gustavo Giles; al igual que a Armando Sunny y Karen Carrasco por ayudarme con las colectas en campo, las extracciones y por las discusiones. ¡arriba el equipo oyamel! Agradezco a todos los miembros actuales y pasados del Laboratorio de Genética y Ecología. Me siento muy satisfecho y contento de haber pasado este tiempo con todos ustedes y solo tengo una sensación de gratitud y cariño. Gracias a todos por apoyarme en el crecimiento profesional e intelectual, nunca olvidaré el Mal del Puerco, las posadas de fin de año, las rutinas del gimnasio con Madison y Alejandro, las discusiones de coníferas o las 4 paredes del cubículo que me acompañaron durante 4 años. No me alcanzan las palabras para agradecerle a mis padres, Silvia Patricia y Ariel Eduardo para decirles lo afortunado que me siento de que sean parte de mi vida ¡Los quiero y los extraño entrañablemente¡ Con mucho cariño, agradezco a toda mi familia por todo su apoyo, fortaleza y tolerancia. Me siento muy afortunado tres hermosos hermanos, Juan Guillermo, Carlos Fernando y María Juliana, por mis dos muy queridos abuelos, Doña Silvia y Don Jaime (Requiéscat in pace) por su infinito apoyo y amor y por mis tíos incondicionales. Agradezco también a Lina Bolívar, por siempre sacar lo mejor de mí, acompañarme en cada decisión, y ayudarme a ser una mejor persona. Finalmente, agradezco a mis amigos, Daniel, Christian, Víctor, Mariela, Gaby, Karol, Yury, Angie, Juanse, Sebas, David, Paola, Ana, Laura, Juliette, Susana, Wilson, Tati Colmenares, Tati Villamizar, Karla, Andrés, en fin, a todos mis amigos de la vida por todo lo que hemos convivido, reído, discutido, aprendido. Son una parte importante de mi vida ¡Los llevo en el alma! Esta tesis es dedicada en primer lugar a mi abuelo quién me enseñó a amar la ciencia sin si quiera tener una carrera; abuelito, mi corazón te extraña, mi mente te recuerda y mi alma te echa de menos (RIP, 09/01/21). En segundo lugar, a todos los fallecidos por el COVID a causa de la falta de conciencia y tolerancia social en especial a Don Rafael Bolívar, me quedé con las ganas de estrechar su mano. Y en último lugar a mi pequeña y peluda compañía que me acompañó desde el día que decidí inscribirme en la licenciatura. PREFACIO La presente investigación es un trabajo original e independiente del autor, S. Arenas. Desarrollé las preguntas y objetivos de investigación a través de múltiples consultas con mi comité tutoral. Colaboré con colegas en las etapas de obtención de datos. Realicé el análisis de los mismos, la interpretación de los resultados y preparé los manuscritos. Diferentes secciones de esta tesis fueron o serán enviadas para publicación tal como se enumera a continuación: CAPÍTULO II • Arenas, S, Campo, J, Mastretta-Yanes, A, Jaramillo-Correa JP, 2021. Within-population genotype – soil interactions drive phenotypic variation in a recovering fir forest from central Mexico. Artículo aceptado en Forest Ecology and Management. CAPÍTULO III • Arenas, S., Jaramillo-Correa, J.P., 2020. ¿Es posible utilizar modelos de selección genómica (SG) en poblaciones naturales de plantas con largos tiempos generacionales y plantear perspectivas de manejo/conservación? Artículo en revisión en Annals of Forest Science CAPÍTULO IV • Arenas, S., Cortés, A.J., Mastretta-Yanes, A., Jaramillo-Correa, J.P. 2021. Evaluating the accuracy of genomic prediction for the management and conservation of relictual natural tree populations. Tree Genetics & Genomes 17, 12. https://doi.org/10.1007/s11295-020-01489-1 TABLA DE CONTENIDO RESUMEN .................................................................................................................................... 1 ABSTRACT ................................................................................................................................... 3 CAPÍTULO I ................................................................................................................................. 5 INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................ 5 1.1 Variación genética en árboles .......................................................................................... 6 1.2 Genética cuantitativa ....................................................................................................... 7 1.3 Variación fenotípica y heterogeneidad ambiental ........................................................... 8 1.4 El suelo como factor selectivo microgeográfico ............................................................. 9 1.5 Desafíos para estudiar las especies forestales y los marcadores moleculares ............... 10 1.6 Estrategias clásicas de mejora de árboles ...................................................................... 12 1.7 Utilización de la PG en las poblaciones naturales forestales ......................................... 14 1.8 Sitio de estudio .............................................................................................................. 14 1.9 Especie de estudio - Abies religiosa .............................................................................. 17 1.10 Referencias .................................................................................................................. 18 OBJETIVOS DE INVESTIGACIÓN ........................................................................................ 25 CAPÍTULO II ............................................................................................................................. 26 Las interacciones genotipo-suelo dentro de la población impulsan la variación fenotípica en un bosque de oyamel en recuperación del centro de México ........................................ 26 CAPÍTULO III ............................................................................................................................ 78 ¿Es posible utilizar modelos de selección genómica (SG) en poblaciones naturales de plantas con largos tiempos generacionales y aplicarlas en manejo y conservación? ...... 78 CAPÍTULO IV .......................................................................................................................... 109 Evaluación de la precisión de la predicción genómica para el manejo y conservación de poblaciones aisladas de árboles naturales ......................................................................... 109 CAPÍTULO V ............................................................................................................................ 141 DISCUSIÓN Y PERSPECTIVAS ............................................................................................ 141 5.1. Discusión general ........................................................................................................ 142 5.2. Perspectivas ................................................................................................................ 151 5.3 Referencias .................................................................................................................. 153 1 RESUMEN Comprender cómo responden los componentes de la variación fenotípica a la heterogeneidad del ambiente proporciona información importante para conservar y manejar las poblaciones naturales. La variación fenotípica es fundamental porque las diferencias entre individuos sirven como marcadores para estudiar los factores genéticos y ambientales responsables de ciertos rasgos específicos. Los árboles forestales, como el oyamel, Abies religiosa (Kunth) Schltdl. et Cham., dependen de sus niveles de variación genética para adaptarse a la heterogeneidad del ambiente. Por lo tanto, su cantidad y distribución en el espacio de la variación genética son importantes para la supervivencia y la adaptabilidad a largo plazo de las poblaciones. Las variaciones del ambiente afectan el fenotipo de los árboles a diferentes escalas geográficas y temporales. La variación del fenotipo está generalmente codificada por muchos genes que responden al ambiente, resultando en una interacción genotipo y ambiente (G × E). Esta interacción indica que los factores locales, como por ejemplo la variación edáfica dentro de una población, influye en el fenotipo de manera diferencial dependiendo del genotipo del individuo, lo que resulta en fenotipos contrastantes. Estudiar esta interacción e integrarla en modelos predictivos puede ayudar a mejorar programas de reforestación, manejo y conservación de especies, incluidos los Abies. Los árboles forestales presentan múltiples desafíos para el estudio de su capacidad de adaptación al ambiente, como su madurez sexual tardía o el retraso en la expresión de fenotipos importantes relacionados con la productividad, lo que provoca ciclos de selección largos y recurrentes. La Predicción Genómica (PG) se está aplicando como una herramienta para abordar tales deficiencias mediante la predicción temprana de fenotipos, utilizando simultáneamente los rasgos comerciales y un extenso conjunto de marcadores moleculares distribuidos a lo largo del genoma, por lo general polimorfismos de nucleótido único (SNP). Aunque algunos de los estudios ya se han desarrollado en plantaciones comerciales, aún no se ha probado hasta qué punto esta herramienta podría ser útil para hacer predicciones en poblaciones forestales naturales. Esto permitiría manejar la diversidad genética e impulsar los estudios de adaptación al ambiente. Para abordar estos desafíos, estructuré esta tesis en tres análisis que utilizan varias metodologías, basándose en fenotipos de crecimiento y fisiología, y técnicas de genotipado de alto rendimiento en dos grupos de árboles de A. religiosa con orígenes diferentes (regeneración natural y 2 reforestación). El primer estudio explora modelos poligénicos microgeográficos para caracterizar la diferenciación genética, las presiones de la heterogeneidad del suelo y la interacción G × E sobre la variación cuantitativa. El segundo se centra en revisar las posibilidades teóricas para la implementación de herramientas de PG en poblaciones naturales, sugiriendo con ello, la preselección de individuos para reforestar y recuperar ecosistemas degradados. El tercer estudio investiga el uso de PG para estimar la precisión en las estimaciones de parámetros genéticos en poblaciones naturales de árboles. Los resultados de estos tres estudios demostraron que: i) una parte de la diferenciación fenotípica podría explicarse por la interacción de factores genéticos, y edáficos dentro del sitio del ensayo (G × E), ii) existen genes potencialmente adaptativos que podrían estar respondiendo a escalas pequeñas dentro de un mismo rodal forestal, iii) la PG es una herramienta eficaz para orientar programas de manejo y conservación en poblaciones naturales para predecir fenotipos individuales y iv) los modelos de PG más eficientes fueron los construidos con árboles naturales y usados para predecir el desempeño de individuos reforestados en el mismo ambiente. Finalmente, se resaltan los factores que dificultan la transferencia de los modelos a las poblaciones naturales, como por ejemplo el tamaño de muestra para el fenotipado y genotipado y la variación en los rasgos entre individuos jóvenes y adultos. Además, se analizan algunas perspectivas para explorar estas metodologías en poblaciones naturales, a medida que las tecnologías de secuenciación de ADN continúan mejorando, y aumenta la calidad y cantidad de recursos genómicos disponibles para organismos con genomas complejos. 3 ABSTRACT Understanding how the components of phenotypic variation respond to environmental heterogeneity provides fundamental information for conserving and managing natural populations. Phenotypic variation is fundamental because differences among individuals serve as markers to study the genetic and environmental factors responsible for specific traits. Forest trees, such as Abies religiosa (Kunth) Schltdl. et Cham, depend on their levels of genetic variation to adapt to environmental heterogeneity. Therefore, their number and distribution in space are important for the survival and long-term adaptability of populations. Environmental variations affect tree phenotypes at different geographic and temporal scales. Phenotype variation is generally encoded by many environment-responsive genes, resulting in a genotype-environment interaction (G × E). This interaction indicates that local factors, such as edaphic variation within a population, differentially influence depending on the genotype of the individual, resulting in contrasting phenotypes. Studying this interaction and integrating it into predictive models can help to improve reforestation, management and conservation programs for species, including Abies. Forest trees present multiple challenges to study adaptive capacity to the environment, such as late sexual maturity or delayed expression of important phenotypes related to productivity, resulting in long and recurrent selection cycles. Genomic Prediction (GP) is being applied as a tool to address such deficiencies by early prediction of phenotypes using simultaneously commercial traits and a dense set of molecular markers distributed across the genome, usually single nucleotide polymorphisms (SNP). Although some of the studies have already been developed in commercial plantations, the extent to which this tool could be useful for making predictions in natural forest populations remains to be tested. This would allow us to manage genetic diversity and drive studies of adaptation to the environment. To address these challenges, I structured this thesis into three analyses using various methodologies, based on growth and physiology phenotypes and high-throughput genotyping techniques in two groups of A. religiosa trees with different origins (natural regeneration and reforestation). The first study explores microgeographic polygenic models to characterize genetic differentiation, the pressures of soil heterogeneity and G × E interaction on quantitative variation. The second focuses on reviewing the theoretical possibilities for the implementation of GP tools in natural populations, thereby 4 suggesting the pre-selection of individuals for reforestation and recovery of degraded ecosystems. The third study investigates the use of GP to estimate the precision of genetic parameter estimates in natural tree populations. The results of these three studies showed that: (i) part of the phenotypic differentiation could be explained by the interaction of genetic, and edaphic factors within the trial site (G × E), (ii) there are potentially adaptive genes that could be responding at small scales within the same forest stand, (iii) GP is an effective tool to guide management and conservation programs in natural populations to predict individual phenotypes, and (iv) the most efficient GP models were those built with natural trees and used to predict the performance of reforested individuals in the same environment. Finally, factors that make it difficult to transfer the models to natural populations, such as sample size for phenotyping and genotyping and variation in traits between young and adult individuals, are highlighted. In addition, some prospects for exploring these methodologies in natural populations are discussed, as DNA sequencing technologies continue to improve, and the quality and quantity of genomic resources available for organisms with complex genomes increases. 5 CAPÍTULO I INTRODUCCIÓN 6 Los árboles forestales constituyen aproximadamente el 80% de la biomasa de la tierra, almacenando una gran cantidad de carbono (Ellison et al., 2017). Cumplen funciones ecosistémicas integrales en el mantenimiento de la biodiversidad, la protección de los recursos hídricos y edáficos, y el secuestro de carbono; además, son un componente importante a nivel cultural y económico para las poblaciones humanas (Daniels, 1984; FAO, 2014; Le et al., 2012; Schwartz et al., 2012). Sin embargo, durante las últimas décadas los impactos antropogénicos (p. ej. la deforestación y la fragmentación del paisaje) han devastado bosques por todo el planeta (Isabel et al., 2020; Lobell y Gourdji, 2012). Además, se predice que el actual calentamiento climático (CC) acelerará el ritmo de los cambios ambientales, así como el aumento en la frecuencia de eventos de sequía e inundaciones, las infestaciones de plagas y las variaciones en la temperatura, entre otras comprometiendo la resiliencia de las poblaciones y el funcionamiento de los ecosistemas (Breshears et al., 2013; Hooper et al., 2012; Nadeau et al., 2016; Raffa et al., 2008). El éxito en la respuesta de los árboles a estos cambios dependerá de la capacidad de migrar a ambientes más favorables y de la variación genética disponible entre y dentro de las poblaciones/especies para hacerle frente a las condiciones locales cambiantes y adaptarse o responder plásticamente al ambiente (Aitken et al., 2008; Alberto et al., 2013; Hansen et al., 2012; Koskela et al., 2014; Plomion et al., 2016) 1.1 Variación genética en árboles El estudio de la variación dentro y entre poblaciones/especies es un tema de constante análisis para los genetistas. En general, la variación genética es la base para el cambio evolutivo potencial, y se le considera el nivel básico de diversidad biológica (Fox y Wolf 2006; George et al., 2017; Tamaki et al., 2008). Esta diversidad es crucial para la aptitud y supervivencia de los individuos y la capacidad de adaptación a los cambios ambientales (Melosik et al., 2016; Holliday et al., 2017; Hamabata et al., 2019). La presencia de suficiente variación genética en los árboles (y en casi cualquier otra especie) es crucial para la persistencia de las poblaciones. La pérdida de variación genética afectará la capacidad de respuesta por parte de las poblaciones a la variación ambiental, la pérdida del hábitat y la presencia de nuevos patógenos (Aitken et al., 2008; Isabel et al., 2020; Oddou-Muratorio et al., 2020). Por ejemplo, el estrés hídrico es una presión selectiva importante, y la variación genotípica en la resistencia a la deshidratación en árboles (Muthoo, 2002; Soltys-Kalina et al., 2016) resulta en la supervivencia diferencial de algunos de ellos 7 después de un evento de sequía (Moran et al., 2017; Sallam et al., 2019). Estudios recientes han analizado los patrones geográficos de la variación genética en especies forestales y cómo éstos afectan su capacidad para sobrellevar el CC (p. ej. Carvalho et al., 2020; Collevatti et al., 2019). Estos estudios, mediante evaluaciones de correlación entre la variación genética y variables ambientales, documentan que las poblaciones están adaptadas a las condiciones locales. Por lo tanto, las diferencias regionales con respecto al impacto del CC y la evolución del nicho ecológico conducirán a eventos maladaptativos para las poblaciones, y algunas de éstas se enfrentarán a una mayor probabilidad de extinción que otras (Koskela et al., 2014; Schneider et al., 2011). Muchas especies forestales presentan altos niveles de diversidad genética, lo que en principio les brinda la capacidad de abarcar grandes áreas de distribución y adaptarse a entornos fluctuantes (Balvanera y Aguirre, 2006; Kremer et al., 2014; Savolainen et al., 2007; Sork, 2018). Si se desea poder predecir con precisión el impacto de las variaciones del ambiente, es necesario comprender cómo se distribuye la variación genética dentro y entre especies/poblaciones, incluso a escalas geográficas finas (i.e. pequeñas áreas geográficas; Kubota et al., 2015; Rae, 2013). Por tanto, es fundamental evaluar la diversidad genética existente y la variación fenotípica vinculada a ésta, para explicar cómo las especies sobreviven y se adaptan a las presiones selectivas locales (Blanquart et al., 2013; Lascoux et al., 2016; Sork, 2018). Sin embargo, predecir la arquitectura genética de la adaptación en poblaciones naturales es difícil; al menos sin tener un enfoque generalizado para evaluar la sensibilidad a ambientes heterogéneos (Housset et al., 2018; Merilä y Hendry, 2014). 1.2 Genética cuantitativa La variación fenotípica es fundamental para entender los procesos evolutivos, ya que no solo es sobre los fenotipos que actúa la selección natural, sino que además las diferencias entre individuos sirven como marcadores para estudiar los factores genéticos y ambientales responsables de rasgos específicos (p. ej. anatómicos, morfológicos o funcionales; Fox y Wolf 2006). Hay dos tipos de variación basada en estos rasgos, la cualitativa y la cuantitativa. El rasgo cualitativo es aquel en el que hay un número de fenotipos de tipo discreto o categórico. Generalmente, un número reducido de genes participan en el control de tales rasgos, por eso, se ven en menor medida afectados por el medio ambiente (Kahlke y Hon, 2014). Los ejemplos de rasgos cualitativos incluyen: la presencia o ausencia de enfermedades hereditarias o congénitas, 8 la forma del fruto, el color de las estructuras florales, la ruta fotosintética, entre otros (Li et al., 2017). El rasgo cuantitativo es aquel para el que existen fenotipos que no pueden clasificarse fácilmente en categorías discretas (Grattapaglia et al., 2018; Ikram y Chardon, 2010). En estos últimos, un gran número de genes o loci con un efecto pequeño y aditivo influyen en la variación del rasgo (poligénicos); por ello, son útiles para comprender la mecánica y las bases genéticas que orientan los procesos de adaptación local (Alberto et al., 2013; Housset et al., 2018). Tradicionalmente, la adaptación local se ha descrito en experimentos de jardín común con germoplasma de diferentes procedencias plantado en las mismas condiciones ambientales; en ellos se evalúan rasgos relacionados al fitness como el crecimiento, la morfología y la supervivencia (Blanquart et al., 2013; Lascoux et al., 2016; Valladares et al., 2014). 1.3 Variación fenotípica y heterogeneidad ambiental Las variaciones del ambiente influyen en la expresión del fenotipo de los árboles a nivel intraespecífico y a diferentes escalas geográficas. A gran escala (macroambiente), los fenotipos responden a clinas ambientales de elevación, temperatura y/o precipitación, así como a la variación en la composición de suelo (De Mita et al., 2013; de Villemereuil et al., 2016; Zhang et al., 2019). A escala fina (microambiente), la variación fenotípica entre árboles cercanos dentro un mismo rodal es causada principalmente por variaciones edáficas y lumínicas, e interacciones bióticas, como la presencia de plantas nodrizas, comunidades de microorganismos y/o la exposición a plagas (Cappai et al., 2017; Carbajal-Navarro et al., 2019; Guerrero et al., 2018). Así, las variables del macro y microambiente pueden interactuar con la cantidad de variación genética (y el genotipo mismo) de los individuos, afectando directamente su arquitectura (Finkeldey y Hattemer 2007; Des Marais et al. 2013). Sin embargo, en la mayoría de los estudios realizados en especies forestales solo se ha evaluado la variación fenotípica a nivel de población en respuesta al componente genético y ambiental a escala geográfica grande (estimando heredabilidades y correlaciones genéticas) (de los Campos et al., 2015; Hodge y Dvorak, 2015), dejando rezagada la variación a nivel microgeográfico. Aún hace falta evaluar si esta variación microambiental es relevante en los rasgos relacionados con el fitness o adecuación biológica de la población. 9 1.4 El suelo como factor selectivo microgeográfico El suelo es el principal almacén de carbono (C) y nitrógeno (N) en formas disponibles para mantener las funciones de los organismos asociados (p. ej., plantas y micorrizas); por lo que actúa como una presión selectiva sobre ellos. La dinámica del C en el suelo es el resultado del balance entre la fotosíntesis (fijación de C) y la respiración (mineralización del C; Lafleur et al., 2015). El CO2 atmosférico es incorporado a los ecosistemas por medio de la fotosíntesis de los organismos autótrofos, como las plantas con clorofila, y los microorganismos quimioautótrofos, que convierten el CO2 a carbohidratos para integrarlos a su biomasa. Con la muerte, la biomasa se deposita en el suelo en forma de residuos orgánicos, donde la fauna y los microorganismos del suelo descomponen los residuos vegetales, que pasan a formar parte de la materia orgánica (MO). En el suelo, la MO formada por partículas con diferentes niveles de descomposición, así como por compuestos macro y micromoleculares, representan una fuente de energía accesible al microbioma (Silfver et al., 2015). Así como el C, el N forma parte importante del ciclo biogeoquímico del ecosistema, ya que es un elemento esencial para la vida, formando parte del ADN y las proteínas (Chen et al., 2019; Elliot et al., 2019). El N atmosférico (N2) se fija mediante procesos biológicos, por medio de bacterias (como Rhizobium y Bradyrhizobium) que cuentan con las enzimas necesarias para reducir el N2 a formas reactivas como el amonio (NH4 +), un compuesto biológicamente asimilable (Pugnaire et al., 2019; Sauer et al., 2012). Dentro de la solución del suelo, los microorganismos y plantas compiten por el NH4 +, ya que esta es la forma de N preferida para el metabolismo y para la síntesis de proteínas (Nacry et al., 2013; Potter and Snyder, 1915; Sauer et al., 2012). Cuando las plantas adquieren el NH4 +, incorporan principalmente el N para el crecimiento. Por lo tanto, la varianza en el crecimiento de las plantas de alguna manera refleja la disponibilidad edáfica de C, MO, N2 y NH4 + (Madritch et al., 2009; Raven and Andrews, 2010). Los procesos ecosistémicos orientados por la variabilidad de rasgos poligénicos de los árboles, como el crecimiento y la tasa fotosintética a escala fina, pueden ser regulados por la interacción entre el genotipo de la planta, la fertilidad del suelo y la estructura de las comunidades asociadas a ésta varianza fenotípica (Guerrero et al., 2018; Schweitzer et al., 2011). Por lo tanto, la variación del fenotipo es impactada por muchos genes que responden a la disponibilidad microambiental de nutrientes (Chen et al., 2019; Kubota et al., 2015), resultando en una interacción genotipo y ambiente (G × E), que implica algo más que la simple aditividad de ambos 10 componentes (Charmantier, 2014; Finkeldey y Hattemer 2007). Las interacciones G × E indican que los factores abióticos locales, como la variación espacial nutricional dentro del sitio (Cappai et al., 2017; Liu et al., 2019), la adición de fertilizantes (Bruelheide et al., 2018; Le et al., 2012), y la variación genética (Bailey et al., 2009; Madritch et al., 2006; Pregitzer et al., 2013), pueden influir potencialmente en la expresión de fenotipos adaptativos y, a su vez, tener impacto en la comunidad y en los procesos del ecosistema. Diversas metodologías se han utilizado para analizar la interacción G × E y describir la distribución de sus componentes en combinación con análisis de genética cuantitativa. Con ellos se desarrollan modelos predictivos utilizando información poligénica; como los análisis de correspondencia canónica (CCA), de componentes principales (PCA), de redundancia (RDA) o los modelos lineales (Forester et al., 2018; Rellstab et al., 2015; Scotti et al., 2016). Estos estudios demuestran que cuando se incluye la información de cientos a miles de genes se pueden obtener buenos estimados de la varianza de los rasgos y su correlación con los factores ambientales, además de diseccionar los patrones de G × E. En el capítulo II de esta tesis se utilizan métodos de análisis de la adaptación poligénica para describir los componentes de la variación fenotípica en respuesta a la heterogeneidad en las propiedades físicas y químicas del suelo a escala fina dentro de un rodal forestal. Cabe anotar que simultáneamente se han desarrollado métodos más complejos y estadísticamente más sólidos (p. ej., predicciones bayesianas) para efectuar predicciones más precisas y confiables de la varianza fenotípica (Scotti et al. 2016) y algunos se exploran dentro de este trabajo. 1.5 Desafíos para estudiar las especies forestales y los marcadores moleculares La capacidad de las poblaciones para adaptarse a la heterogeneidad ambiental va a depender de la cantidad de variación genética presente en los genes adaptativos (Aitken et al., 2008; Holliday et al., 2017; Sork, 2018). No obstante, los árboles forestales presentan múltiples desafíos para estudiar dicha variación, como se ha observado en el diseño de programas reproductivos y en ciertos experimentos (p. ej. al buscar loci asociados a rasgos cuantitativos (QTL), efectuar mapas de ligamiento y secuenciar genomas completos), debido a sus largos tiempos generacionales. Recientemente, con la llegada de las técnicas de marcadores moleculares basados en PCR (p. ej. microsatélites), bibliotecas de cADN y los avances en la secuenciación masiva o de nueva generación (p. ej., para generar miles de polimorfismos de un único nucleótido o SNPs), 11 han facilitado las investigaciones en organismos no modelo (Neale y Kremer, 2011; Savolainen et al., 2013). Recientemente, el uso de SNPs se ha hecho cada vez más frecuente; representan sustituciones de una sola base en una ubicación particular a lo largo del genoma; se encuentran con frecuencia en genes codificantes y, a menudo, son bialélicos, lo que los hace útiles para efectuar perfiles de variación genética dentro y entre poblaciones (Black et al., 2001; Yousefi et al., 2018). 1.5.1 Mapeo de loci de rasgos cuantitativos y estudios de asociación genética El desarrollo de tecnologías rentables para obtener marcadores moleculares ha facilitado el estudio y la descripción de la arquitectura genética de la adaptación local, vinculando la información fenotípica con los genes o alelos subyacentes (neutrales o adaptativos). Así, el mapeo de QTL y los estudios de asociación genética (GWAS) se han desarrollado para incrementar la comprensión de la base genética de los rasgos cuantitativos (White et al. 2007). El mapeo de QTL tiene como objetivo identificar regiones génicas específicas que tengan una fuerte influencia en el rasgo de estudio, y pueden ayudar a hacer predicciones fenotípicas sobre dicho rasgo. Por otro lado, los análisis de asociación de todo el genoma (GWAS) se utilizan para medir y analizar las variantes genéticas y asociarlas directamente con un fenotipo y estimar su efecto en el mismo, todo independientemente de la complejidad genética y de las interacciones que regulen su variación (Alimi, 2016; Korte y Farlow, 2013). Los GWAS utilizan un gran número de SNPs obtenidos con técnicas de secuenciación masiva, como GBS y DArTSeq (Soto-Cerda y Cloutier, 2010; Varshney et al., 2015) para aplicar una serie de pruebas estadísticas en las que los SNPs son tratados como eventos independientes; estos luego se correlacionan al fenotipo mediante modelos lineales generalizados (GLM, General Linear Model) (Bush and Moore, 2012; Corvin et al., 2010). Generalmente, los rasgos complejos están regulados por muchos genes con efecto diferencial (Francia et al., 2005), por lo que actualmente se han implementado modelos que retienen el efecto de miles de genes (incluso aquellos con uno muy pequeño) para explicar la arquitectura genética de estos rasgos en ramas de la ciencia como la medicina o el mejoramiento de plantas y animales. 12 1.6 Estrategias clásicas de mejora de árboles Los programas de mejoramiento en árboles con selección recurrente comenzaron aproximadamente en la década de los 50’s, para especies forestales con importancia económica (Badenes et al., 2016; Isik, 2014; Iwata et al., 2016). Desde entonces se han desarrollado rápidamente, en parte siguiendo los avances de los sistemas de mejoramiento en cultivos y animales de granja. El objetivo de los programas de mejora en árboles es evaluar la arquitectura de los rasgos de interés y aumentar la frecuencia de los alelos benéficos (Sniezko y Koch, 2017; White et al. 2007), todo a partir de diseños familiares con cruzas controladas, en experimentos aleatorios y replicados. Los progenitores seleccionados son aquellos que tienen y permiten obtener y “mejorar” el fenotipo deseado. 1.6.1 Selección asistida por marcadores y predicción genómica En el pasado, la selección asistida por marcadores (SAM) era considerada una estrategia para tomar decisiones de mejoramiento genético en árboles (Grattapaglia, 2014; Neale y Williams, 1991), que hacía uso del desequilibrio de ligamiento (LD) entre diferentes loci asociados a rasgos cuantitativos (QTL) y los marcadores genéticos utilizados (White et al., 2007). La estrategia SAM es un método para disminuir los largos ciclos reproductivos en árboles (Isik, 2014) y comprender mejor los rasgos complejos de sus fenotipos (Grattapaglia y Resende, 2011; Iwata et al., 2016). Esta estrategia supone que pocos marcadores con un gran efecto proporcionan información suficiente para predecir los fenotipos. Sin embargo, en árboles forestales, el SAM no presentó los resultados esperados, a causa de limitaciones como la naturaleza extremadamente poligénica de los rasgos de importancia económica, así como al hecho de que no se pueden aplicar en poblaciones diferentes a las estudiadas, a la presencia de interacciones G × E en la expresión de los QTLs y a un reducido desequilibrio de ligamiento (LD) entre marcadores y QTLs (Nakaya y Isobe, 2012; Poland y Rutkoski, 2016). Estas limitaciones se están superando parcialmente con el desarrollo de las metodología de selección y predicción genómica (Badenes et al., 2016). La predicción genómica (PG) utiliza simultáneamente los fenotipos y de miles a cientos de miles de marcadores, que se analizan sin información a priori de su efecto en el fenotipo (Hayes et al., 2009; Meuwissen et al., 2001). La PG es capaz de capturar gran cantidad de variación fenotípica de rasgos cuantitativos, ya que presupone que al menos algunos de los muchos marcadores se encontrarán en LD con los QTLs del rasgo (Resende et al., 2012a). El enfoque PG 13 combina información fenotípica y genotípica en un conjunto de entrenamiento (TRN), para desarrollar modelos que predigan valores reproductivos genómicos (GEBV) en un grupo de candidatos a ser seleccionados o de validación (TST), para los que solo se requiere su información genotípica (Goddard y Hayes, 2009; Lin et al., 2014; Van Eenennaam et al., 2014). Por otro lado, la selección genómica (SG) implica que los modelos de PG sean validados en la siguiente generación, pero esto solo ha sido probado en plantaciones de especies modelo (p. ej. Eucaliptus globulus, Populus trichocarpa, Pinus taeda, Picea glauca) luego de 1-2 ciclos de selección (Grattapaglia et al., 2018; Isik, 2014). El método de SG evita la necesidad de realizar las largas fases de prueba que los árboles requieren para obtener datos fenotípicos precisos, lo que resulta en una mayor ganancia genética por unidad de tiempo (Grattapaglia y Resende 2011; Grattapaglia, 2014). Esto ya se ha validado en la cría selectiva de animales y plantas de cultivos (Crossa et al., 2017; Meuwissen et al., 2016). Además, la implementación de una matriz de relaciones genéticas (G; VanRaden 2008) dentro de los modelos de PG facilita su montaje, ya que no se necesitan cruzas controladas; además, ofrece estimaciones más precisas, al considerar toda la varianza genética del conjunto TRN (Heffner et al. 2009). Queda por probar hasta qué punto esta herramienta podría ser útil para manejar la diversidad genética en poblaciones forestales naturales, donde puede haber un amplio espectro de relaciones familiares (presencia de hermanos completos y medios, relaciones históricas, etc.) (Charmantier et al., 2014). 1.6.2 Predicción y selección genómica en árboles forestales El potencial de la PG y la SG ha sido explorado con datos empíricos en pocas especies de árboles forestales, todas establecidas en plantaciones y con diseños familiares conocidos. Algunas de las especies estudiadas son: Eucalyptus spp. (Ballesta et al., 2018, 2020; Müller et al., 2017 Suontama et al., 2019; Tan et al., 2017), Pinus taeda L. (Resende et al., 2012a; Zapata-Valenzuela et al., 2013), Picea glauca (Beaulieu et al., 2014a, 2014b), Picea mariana (Lenz et al., 2017), Pinus pinaster (Bartholomé et al., 2016; Isik et al., 2016), Pseudotsuga menziesii (Ratcliffe et al., 2019; Thistlethwaite et al., 2017, 2019, 2020), Picea abies (Chen et al., 2018; Lenz et al., 2020) y Shorea platyclados (Sawitri et al., 2020). En el capítulo III, se presenta información relevante sobre varias de estas investigaciones previas. Esta tesis comprende uno de los primeros intentos para evaluar la factibilidad y precisión de la PG en rodales naturales de Abies religiosa (capítulo IV). 14 1.7 Utilización de la PG en las poblaciones naturales forestales La importancia y justificación de las investigaciones forestales en diferentes campos, incluida la PG, tendrán mayor prioridad hacia el futuro (Isik, 2014), dada la enorme variedad de bienes y servicios que proporcionan los bosques. Conservar los recursos genéticos forestales es por lo tanto vital, ya que los bosques son fundamentales para el crecimiento económico sostenible y la adaptación ambiental hacia el futuro (FAO, 2014). Las especies forestales pueden sobrevivir en una amplia gama de condiciones ecológicas, ya que han evolucionado durante períodos de grandes cambios climáticos; por esta razón, estudiar su variación genética en poblaciones silvestres es necesario para abordar el desafío de mitigar o adaptarse a futuros cambios ambientales (Aitken et al., 2008; Aitken y Bemmels, 2016). Históricamente, la forma más común de evaluar los recursos genéticos son los ensayos de procedencias bajo diferentes condiciones ambientales (Koskela et al. 2014). El objetivo principal de estas investigaciones es identificar poblaciones de árboles con buen desempeño fenotípico y que estén suficientemente adaptadas para ser fuente de semillas para la reforestación o la transferencia de germoplasma (Aitken y Whitlock 2013; Lin et al., 2018; Ledig y Kitzmiller 1992). Dado que los ensayos son costosos de establecer y mantener, y al largo período que toma pasar de su establecimiento a las recomendaciones para el manejo, el desarrollo de nuevos enfoques como los análisis moleculares y herramientas como la PG se han comenzado a ver como una aproximación valiosa para reducir los ciclos generacionales y hacer predicciones en entornos no estudiados (Ratcliffe et al., 2019; Thistlethwaite et al., 2019). De esta manera, se busca implementar planes de manejo y conservación que mitiguen los efectos del CC y ayuden a conservar la diversidad genética enfocándose en la resiliencia de los ecosistemas (Aitken et al., 2008; Aitken y Whitlock, 2013). Sin embargo, si bien son útiles y complementarios, los enfoques de PG para preseleccionar individuos para reforestar y recuperar los ecosistemas degradados no pueden sustituir los ensayos de procedencias, que aún son necesarios para estudiar las respuestas plásticas y adaptativas de los árboles al cambio climático (Hansen et al., 2012; Koskela et al., 2014; Pluess et al., 2016). 1.8 Sitio de estudio La presente tesis se llevó a cabo en el Área de Protección de Flora y Fauna Nevado de Toluca (APFFNT), que es una de las áreas de protección más importantes de México. Cuenta con una 15 gran riqueza natural y una estructura orográfica particular, siendo que allí se forma la cuenca hidrográfica del Lerma, una de las más importantes del país por su provisión de agua dulce para las comunidades humanas de la región. Además, presenta extensos bosques templados que contribuyen a la captura y almacén de carbono, así como al origen y protección de los recursos del suelo (Arzate-Fernández et al., 2015). El APFFNT está ubicada en el Estado de México (Fig. 1), al suroeste del valle de Toluca, dentro de la provincia fisiográfica Sistema Volcánico Transversal. Está localizada entre los 18°59’ y 19°13’ N y los 99°37’ y 99°58’ W. El volcán Nevado de Toluca representa la cuarta montaña más alta del país, alcanzando su altura máxima a los 4,660 m.s.n.m. Presenta un intervalo altitudinal que incluye al cono volcánico y otra serie de geoformas que se extienden hacia el noroeste (Candeau y Franco, 2007; Domínguez-Tejeda et al., 2010). El APFFNT abarca aproximadamente 50 mil hectáreas, incluyendo parte de los municipios de Toluca, Zinacantepec, Amanalco de Becerra, Almoloya de Juárez, Temascaltepec, Coatepec Harinas, Villa Guerrero, Calimaya y Tenango del Valle. Se caracteriza por un clima templado frío con una temperatura media anual de 13.1°C y una precipitación media anual de 1,219. mm. Los suelos son derivados de afloramientos andesíticos, producto del intemperismo de cenizas volcánicas con una edad aproximada de 1.6 a 1.2 millones de años (Arzate-Fernández et al., 2015). En las últimas décadas esta APFFNT se ha venido deteriorando por las actividades antrópicas (principalmente ganadería, agricultura, extracción selectiva de madera y tala ilegal) debido a su cercanía con áreas urbanizadas (CONANP, 2007; Granados-Ramírez et al., 2017). Dada su categoría de APFF, el Consejo Civil Mexicano para la Silvicultura Sostenible (CCMSS) ofrece a los habitantes locales opciones para cultivar y manejar el bosque; siendo uno de los objetivos principales el repoblar los sitios (o rodales forestales) mediante introducción de individuos por reforestación con especies nativas y brindar alternativas productivas viables para los pobladores. Esto también permite reducir el impacto humano y mitigación del CC promoviendo la conservación de los ecosistemas boscosos (CONANP, 2013). A pesar de las constantes presiones para el ecosistema, el paisaje manejado antropicamente nos permite realizar estudios genéticos y evolutivos, mismos que nos pueden proporcionar información valiosa para proponer planes de manejo y preservación de la diversidad genética (Candeau y Franco, 2007; Sáenz-Romero et al., 2003). 16 La diversidad de recursos naturales es, sin duda, una característica particular de esta región, los bosques templados son los que predominan en esta zona y estructuran las poblaciones primarias de este ecosistema, integradas por tres tipos de comunidades: el bosque de oyamel (Abies religiosa), el bosque de pino (conformado por tres especies, Pinus montezumae, Pinus hartwegii y Pinus pseudostrobus) y el bosque mixto (formado por pino, oyamel y encino (Quercus spp; Arzate-Fernández et al., 2015). Fig. 1 Mapa de la ubicación y área del Nevado de Toluca en el Estado de México, México. En escala de azules se presentan algunos de los rodales forestales trabajados por el CCMSS. Los puntos indican la ubicación de los dos rodales estudiados en esta tesis: Rincón de Guadalupe (rojo) y San Bartolo (naranja). 17 1.9 Especie de estudio - Abies religiosa Abies religiosa (Kunth) Schltdl. & Cham. (oyamel) es una conífera (Pinaceae) ampliamente distribuida en la zona ecológica templada subhúmeda del centro de México (entre 2800 y 3500 m.s.n.m), principalmente en el estrato superior del Sistema Volcánico Transversal (Rzedowski y Fryxell, 2006), a lo largo de un gradiente longitudinal que va de -96° a -104°. La especie puede crecer y desarrollarse principalmente en suelos jóvenes y profundos derivados de ceniza volcánica, con abundante MO y C y con alta humedad (Méndez-González et al., 2017). Los bosques de oyamel forman poblaciones densas y generalmente monoespecíficas, distribuidas en parches relictuales y dispersos entre sí (Rzendowski, 1978). Estos provocan un ambiente de sombra y humedad que permite la proliferación de hongos, musgos, helechos y hepáticas (CONANP, 2013). Sus poblaciones se han diferenciado históricamente en respuesta a la variación ambiental (Cruz-Nicolás et al., 2020), aparentemente siguiendo las características climáticas locales (p. ej. precipitación anual) y respondiendo a un gradiente de elevación que se traduce en variación fenotípica en diferentes rasgos (tamaño del cono y longitud de las acículas; Ortiz-Bibian et al., 2017). Se ha sugerido que esta diferenciación tiene una base genética adaptativa en respuesta al ambiente (Sáenz-Romero et al., 2016; Ortiz-Bibian et al., 2017). Es posible, además, que la heterogeneidad en la composición edáfica y las propiedades físicas del suelo (p. ej., la cantidad de materia orgánica) también hayan conllevado a una adaptación microambiental (Méndez-González et al., 2017), lo que hace suponer una interacción G × E. De esta forma, la cantidad de variación genética reportada podría considerarse como una estrategia adaptativa para colonizar suelos heterogéneos (o simplemente otros efectos como plasticidad fenotípica). Con los aumentos de calor y sequía predichos para las próximas décadas, asociados al CC, se espera que el nicho adecuado de A. religiosa en el centro de México se reduzca entre el 69 y 97% de aquí al año 2090; lo que hará susceptibles a las poblaciones al estrés por desecación y a la incidencia de plagas, como los insectos descortezadores y las plantas parásitas (Sáenz-Romero et al., 2012). Por lo tanto, esta variación ambiental obliga a los investigadores y mejoradores genéticos a tomar medidas preventivas en el manejo de estos bosques que permitan implementar enfoques de adaptación al cambio climático(Ortiz-Bibian et al., 2017). Se ha propuesto que la reforestación con individuos de oyamel en un ambiente propicio para su crecimiento, desarrollo y reproducción, puede representar una oportunidad para mitigar los efectos adversos del CC y conservar su ecosistema natural (Sáenz-Romero et al., 2016). Esta 18 estrategia de manejo consiste en transferir germoplasma dentro de poblaciones intervenidas para reactivar con mayor eficiencia los servicios ecosistémicos, como la recuperación de suelos degradados y conservar la biodiversidad (Carbajal-Navarro et al., 2019; Cruzado-Vargas et al., 2019). Abies religiosa es el centro de estudio de esta tesis debido a que exhibe características importantes para evaluar modelos poligénicos y cuantificar su variación fenotípica y los procesos adaptativos subyacentes. En particular, se espera que el origen de los árboles para reforestación sea un factor importante para detectar los efectos de las diferencias genéticas sobre la variación fenotípica. A diferencia de las especies con ciclos de vida corto, y teniendo en cuenta que las reforestaciones son de regiones cercanas (com. pers. Andrés Juárez), se espera que las plantas locales y las utilizadas en reforestación tengan una diversidad genética semejante, ya que el manejo forestal en el Nevado de Toluca es reciente. En comparación con las plantas de regeneración natural, se espera que las plantas reforestadas tengan un crecimiento más lento (al menos en los primeros años) (Ledig y Kitzmiller, 1992; Koskela et al., 2014), sugiriendo que en las primeras etapas de crecimiento, los procesos adaptativos pueden operar de diferente forma entre grupos. Esto permitirá evaluar la estructura genética y su asociación con la variación fenotípica, posterior a la reforestación. Sin embargo, también es importante considerar los efectos de las presiones selectivas de la heterogeneidad del suelo y la respuesta de interacción G × E. Al ser una especie forestal amenazada por la degradación de sus ecosistemas y el CC, se puede suponer que los efectos de la variación genética y la heterogenidad del suelo influenciarán en la variación del fenotipo. Estos efectos abren las puertas a la exploración e implementación de modelos poligénicos en poblaciones naturales. Ya que los bosques de oyamel se caracterizan por presentar suelos heterogéneos en lugares con condiciones ambientales similares (Méndez- González et al., 2017), se espera detectar cambios en los rasgos cuantitativos y en la respuesta adaptativa entre plantas locales e introducidas. Además, se espera poder modelar y predecir la relación entre la diversidad genética existente y la variación fenotípica vinculada a ésta, todo a partir de modelos estadísticos de PG para promover perspectivas de manejo y conservación. 1.10 Referencias Aitken, S. N., and Bemmels, J. B. (2016). Time to get moving: Assisted gene flow of forest trees. Evolutionary Applications 9, 271–290. doi:10.1111/eva.12293. Aitken, S. N., and Whitlock, M. C. (2013). Assisted Gene Flow to Facilitate Local Adaptation to Climate Change. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics 44, 367–388. doi:10.1146/annurev-ecolsys-110512- 19 135747. Aitken, S. N., Yeaman, S., Holliday, J. A., Wang, T., and Curtis-McLane, S. 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Such variation can be viewed as the sum of genetic factors and their interaction with environmental variation (e.g., soil characteristics), which lead similar genotypes to produce contrasting phenotypes in different environments, and introduced individuals to perform differently from local trees in plantations and test trials. Predicting this variation is of great interest to foresters working with commercially important species. Such is the case of sacred fir (Abies religiosa), a species that is an important source of wood and resin for communities living above 2,500 m asl in central Mexico. We determined the contribution of both genetic and soil factors for predicting phenotypic performance of local naturally regenerated (NR) and introduced by reforestation (RF) seedlings in a sacred fir trial test performed by local communities in the Nevado de Toluca National Park. In spite of a low genetic differentiation between plant sources, NR seedlings outperformed RF plants in terms of height, diameter and water use. According to our models, a large part of these differences could be explained by the interaction of genetic, management and edaphic factors within the trial site, with local genotypes using more efficiently the available soil nitrogen than the introduced ones; thus indicating that planting could be changing plant microenvironment and have a measurable phenotypic effect. Association studies between genetic and edaphic variation further suggested that local adaptation might also be occurring at small within-population scales. All such traits, when correctly integrated, may result in fair genome-based phenotypic predictions for small secluded natural populations, which could be at the base of better reforestation practices, and conservation and assisted migration programs. Key words: Abies; phenotypic variation; reforestation; local adaptation; forest regeneration; genotype – environment interaction (G × E); plant-soil interactions. 28 2.1 INTRODUCTION Reforestation is essential for the restoration of natural ecosystems and ecosystem services; some of its goals include the reinstatement of deforested areas, recovering soil fertility and conserving biodiversity (Firn et al., 2007; Le et al., 2012; Loo et al., 2014). Traditional reforestation programs usually rely on seedlings from top-mother-trees or noteworthy provenances (Tolkamp et al., 1999; Wills et al., 2017). This often leads to transferring germplasm from one place to another; a practice that could also lead to introducing maladapted individuals in the target population (Lawson and Michler, 2014; Sebastian-Azcona et al., 2020). Understanding the effects of transferring germplasm can help forestry practices, and also aid forecasting species’ responses to environmental changes (Sáenz-Romero et al., 2012; Aitken and Whitlock, 2013). Reforestation involves multiple life-history stages, from nursery seed germination, to seedling transplantation and survival in natural conditions (Koskela et al., 2014). Among the ecological factors that can affect seedling establishment in a new site, the soil-plant- atmosphere interactions seem the most relevant (Pregitzer et al., 2013; Carrasco-Carballido et al., 2019). It is noteworthy though that genetic-based adaptability is often overlooked in reforestation programs and modelling studies (Gray and Hamann, 2011; Lin et al., 2018; Isabel et al., 2020). However, the capacity of plants to adapt to a new environment, where they will face novel biotic and abiotic pressures, is crucial, because it directly translates into individual’s performance and survival (Aitken et al., 2008; Vizcaíno-Palomar et al., 2014; Zhang et al., 2019). The action of natural selection on introduced plants can result in rapid evolutionary change and local adaptation (Mitchell-Olds et al., 2007; Blanquart et al., 2013; Sork, 2018). Several studies have reported local adaptation at various geographic scales in forest trees (e.g., Savolainen et al., 2013; Sork et al., 2013), generally following environmental gradients (e.g. Savolainen et al., 2007; De Mita et al., 2013; Mahony et al., 2019). Thus, detecting candidate genes involved in local adaptation has been at the base of population genomics studies for several years, particularly for predicting the fate of individuals/species undergoing environmental changes (i.e. Aitken and Whitlock, 2013; Jaramillo-Correa et al., 2015; Lotterhos and Whitlock, 2015). However, most of the methods currently used only evaluate local associations between individual genes and environmental variables (Forester et al., 2016; Isabel et al., 2020), and overlook gene-gene (i.e. polygenic adaptation) or gene-environment interactions (i.e. G × E; Rellstab et al., 2015; Pluess et al., 2016; Forester et al., 2018), including conditonal neutrality. Traditionally, for accurately 29 exploring these factors, reciprocal transplants are necessary, which could be difficult to establish for some long-lived species, including forest trees (Lu et al., 2016). Common garden experiments are a powerful tool for studying local adaptation, where geo-referenced genetic materials (provenances) are set in a common environment to evaluate fitness-surrogate traits, like survival or growth (Blanquart et al., 2013; Lascoux et al., 2016; Wachowiak et al., 2018). However, unless experiments are replicated in different environments (i.e. multi-testing common gardens), detecting genotype-environment association is complicated. Environmental heterogeneity can be substantial in tropical and mountain ecosystems (Muthoo, 2002; Dufour et al., 2006), even at fine-geographic scales (i.e. within the same forest patch; Sauer et al., 2012; Cappai et al., 2017; Méndez-González et al., 2017). Edaphic variation is probably one of the most heterogeneous factors that may affect plant performance and survival in these environments (due to differences in pH, organic horizon depth and associated soil biota), particularly in the tropics, where soils often have different ages and composition and may be heavily lixiviated from heavy rainfall (Cruz-Ruiz et al., 2012; Li et al., 2012; Augusto et al., 2017). Empirical studies in both natural populations and common gardens have indeed shown that growth and physiological traits may depend on soil nutrient processes (e.g., nitrogen mineralization), and soil microbial community composition (John et al., 2007; Raven and Andrews, 2010; Schweitzer et al., 2011). Other factors, like aboveground productivity, leaf litter decomposition, nutrient cycling and carbon (C) sequestration seem further correlated to intraspecific genetic diversity (Bailey et al., 2009; Ren et al., 2016), which could affect individual survival. This implies that plant and ecosystem functional traits may be ultimately affected by both genotypic traits and soil fertility, suggesting that G × E at small within-population scales should be a potential driver of local adaptation, and a main component of individuals’ fitness in forest trees (Eckert et al., 2012; Talbot et al., 2017; Mahony et al., 2019; Brousseau et al., 2020). Among the soil factors that may be playing key selective roles at various spatial scales in forest ecosystems, nitrogen (N), and phosphorus (P) availability for plant demand seem particularly noteworthy (Kubota et al., 2015; Liu et al., 2019; Du et al., 2020). Understanding the interaction of these components with genetic factors and how they affect tree phenotype and mortality rate (Pregitzer et al., 2013; Silfver et al., 2015; Bennett and Klironomos, 2019) is still a pending task; as this information is used to predict the adaptive potential of reforested individuals 30 into natural populations for conservation, restoration or management purposes (Baer 2016; Sork, 2018; Isabel et al., 2020; Carvalho et al., 2021). Forest restoration seeks to improve ecosystem productivity and reduce degradation (Le et al., 2012; Koskela et al., 2014; Enache et al., 2016). However, some operations during reforestation (especially when scraping and extracting the topsoil) can cause severe disturbance and significantly change the physical (Cambi et al., 2017) and hydraulic properties of the soil (Abdi et al., 2017). The extent and severity of such disturbances depend on several factors, like the type of digging equipment (Lee et al., 2020), the use of machinery, the frequency of its use, and the texture and structure of the soil (Abdi et al., 2017). For instance, careless practicing can compact both the soil surface and the subsoil (Lee et al., 2020), diminishing the infiltration rate, the hydraulic conductivity and the aerial porosity, and increasing soil bulk density (Lee et al., 2020; Poltorak et al., 2018) with consequences to plant growth.. Abies religiosa (Kunth) Schltdl. and Cham. (sacred fir) is a major component of the highland tropical forests from central Mexico, along the Trans-Mexican Volcanic Belt (TMVB). It grows at elevations between 2800-3500 m where it forms large, and mostly monospecific stands (Méndez-González et al., 2017). Populations are found on relatively young soils, mainly andosolic, derived from volcanic ash, and rich in organic matter (Rzedowski, 2006). Abies religiosa is distributed in isolated patches on individual mountains, displaying a strong genetic differentiation at the landscape scale (i.e. GST= 0.20–0.51; for SSR markers, Cruz-Nicolás et al., 2020). At the phenotypic level, populations further exhibit heritable differentiation at growth traits (seedling height and dry biomass) along environmental gradients (Sáenz-Romero et al., 2012; Ortíz-Bibian et al., 2017). Although there is intrapopulation genetic structure, likely driven by soil differences (Méndez-González et al., 2017), little is known about putative within- population G × E interactions, and how they affect individuals’ phenotype, especially at such fine-geographic scales. In this study, we looked for within-population G × E interactions in a pilot study conducted in natural conditions within an A. religiosa stand with naturally regenerated and introduced individuals by reforestation. We compared newly generated genomic and microenvironmental soil data with phenotypic traits addressing the following questions: (i) does within-population phenotypic variation have a genetic component? (ii) Can phenotypic differences be at least partially explained by the soil characteristics? (iii) Does integrating G x E (genotype × soil 31 microenvironment) interaction increase the explained phenotypic variance in predictive models? And if so, (iv) does this soil-genotype interaction account for the phenotypic differences observed between local and introduced individuals? We expect that the G × E models here generated will improve future forest management practices and even help guiding assisted migration programs, along with results from previous studies (e.g., Ortiz-Bibian et al., 2017; Carbajal-Navarro et al., 2019; Cruzado-Vargas et al., 2019). 2.2 MATERIALS AND METHODS 2.2.1 Experimental design and site The study was conducted in a managed forest area in the municipality of Amanalco de Becerra (Mexico), within the buffer zone of the Nevado de Toluca Flora and Fauna Protection Area (NTFFPA), central Mexico. This protected area is located about 80 km west of Mexico City, in the Trans-Mexican Volcanic Belt (TMVB); and encompasses the stratovolcano Nevado de Toluca (4,690 m asl). It harbors several forested areas dominated by pines, firs and oaks. Management focuses in the sustainable use of timber from different ‘ejidos’ (communally owned and managed lands) with the assistance of Consejo Civil Mexicano para la Silvicultura Sostenible (CCMSS). Our sampling focused on the “Rincón de Guadalupe” forest stands (19º 15' 19,33'' to 19º 15' 29,84'' N and -99º 57' 19,33'' to -99º 57' 27,83" W). This site extends over 1.8 ha at elevations between 2,820 – 2,954 m. According to the World Reference Base for Soil classification, soils are andosols derived from ash and other volcanic ejections, and sedimentary rocks; characterized by the accumulation of stable organo-mineral complexes such as allophane (Krasilnikov et al., 2013; INEGI, 2015). This site encompasses highland tropical forests dominated by sacred fir (Abies religiosa). The climate is humid (Lang aridity index = 69; Lang, 1920), with a mean annual temperature of 15.5ºC and mean annual precipitation of 1,077 mm (CONAGUA, 2019). Measurements carried out in this study with a Digital Lux Meter Model LX-101; Taiwan, indicate the site has a low light intensity at noon, ranging from 292 to 487 μmol m−2 s−1. 32 Fig. 1. Map of the study site showing. A. Location of the Mexican state where the investigation was performed (State of Mexico). B. location of the ejido ‘Rincón de Guadalupe’ within this state. C. Spatial distribution of sampled individuals. Each color represents an genetic origin class. RF, reforested introduced individuals; NR, naturally regenerated plants. Selective wood extraction within the site has generated forest clearings that have been re- populated by natural regeneration (NR) from soil seed banks and introduced individuals through reforestation (RF). These individuals were planted in holes of approximately 26 cm in diameter and 30 cm deep. Soil was scraped, and the surface layer removed, along with most of the accumulated litter and organic matter. These plants are thus characterized by the absence of a 33 thick layer of organic matter around the stem. The planting hole was dug large enough to allow the plant to break through the soil and produce new roots. During reforestation, holes were slightly sunk as a supplementary water source for the planted trees. Although not exactly from the same site, reforested individuals originated from regional germplasm, as revealed in a previous population genomic study (Arenas et al. In press; see also below). Sampling was performed in a 13 years-old stand, to ensure plants were about the same age (10.3 ± 0.48 years and 8.5 ± 0.15 years, mean ± SE for NR and RF, respectively, ) and minimizing planting effects (but see below). The ages were obtained by counting the number of nodes per plant. We collected adult needles and soil, and measured phenotypic traits for 128 young trees between 1.2 and 2 m in height from both origins (51 NR- and 77 RF- trees) (Table S1); they grow intermixed along an east-to-west natural slope, under the same light and humidity conditions. All trees were devoid of apparent biotic damage and were at least 3 m apart from each other. 2.2.2. Analysis of phenotypic traits 2.2.2.1 Growth traits We measured 12 morphological traits in the field, including total height (TH, cm), stem diameter at both the base (BD, cm) and 20 cm from the ground (SD, cm), crown radius (CR, cm) and length (CL, cm), average needle length (Lleaf, mm; estimated from 50 needles taken at random in 5 main branches at half of TH per individual; 250 in total), growth for the two previous years to the study (G16 and G17, cm), and average growth for the previous four seasons (AG, cm). We inferred the age of each individual from bud-scar counts as in Hankin et al. (2018) and Urza and Sibold (2013). We then used general allometric equations to estimate the above-ground biomass in firs (AGB, kg) (1) (Chojnacky et al., 2014) and above-ground volume (AGV) (2) (Zianis et al., 2005). ln (AGB) = β0 + β1ln (SD) (1) where β0 = -2.3123 and β1 =2.3482; and !"# = & ∗ () ∗ (*+ 3 + & ∗ .) ∗ .*+ (2) where CH is the crown height, CR the crown radius, SH is the height from the ground to where the branches start (or first branch) and SR the stem radius. Although likely distorted because of a high proportion of compression wood during sampling (a distortion that should be uniform for all individuals sampled), specific wood density (WD, 34 g/cm3) was determined for each plant by averaging measures from two pieces of wood collected from main branches. Wood density estimates from destructive sampling of main stems was not authorized by park authorities. We first measured water displacement within a graduated test tube to determine fresh volume of wood sample. We determined dry mass with an electronic balance (precision of 0.001g) after drying pieces in an oven at 75 ºC for 24 hours. WD was then estimated following Williamson and Wiemann (2010) as (3): 23 (g/cm8) = 9:; <=>> (g) ?:@>ℎ BCDE<@ (cm8) (3) 2.2.2.2 Physiological traits Plants’ performance (and phenotype), we further measured Four physiological variables were measured to assess plant performance (and phenotype). Vegetative tissue samples were taken between 9 am and 3 pm in the upper half of the crown of each individual, immediately placed on ice, and stored at -10 °C until further processing in the laboratory. Plant water status at the time of the study, water potential (Ψ, MPa) was first determined using the Schölander’s pressure chamber technique (Boyer, 1967) and then, following Soltys-Kalina et al. (2016), we measured the leaf relative water content (RWC, %) as in (eq. 4). To do so, we used 20 randomly selected needles per plant, which were weighed by duplicate in an electronic balance (4). *2( = ?:@>ℎ <=>> (g) − 9:; <=>> (g) GE:HI9 <=>> (g) − 9:; <=>> (g) × 100 (4) Specific leaf area (SLA, cm2 g-1) as a proxy of photosynthesis. SLA was defined in single- side as leaf area dry mass⁄ (Poorter, 2002; Liu et al., 2017), and was estimated from the same needles above using images obtained with a scanner (HP Scanjet G3110). Leaf area of the images of each group of needles was calculated using ImageJ v.1.8 (Abràmoff et al., 2005). Finally, we estimated the relative growth rate (RGR, g g−1d−1) as (5): *"* = DW (!"X+YZ[) − DW (!"X+YZ\) G+YZ[ − G+YZ\ (5) Where !"X+YZ\ and !"X+YZ[ are the plant dry above-ground biomass for the two previous years to the study, and G+YZ[ − G+YZ\ is the time spanned (in number of days) between the end of the previous growing season and the sampling date (Hoffmann and Poorter, 2002). 35 2.2.3 DNA sequencing, de novo assembly and genotyping Total genomic DNA was extracted from young needles for a subset of 65 randomly selected plants (34 NR-individuals and 31 RF- individuals; Fig. 1), following Telfer et al., (2013), and using a DNAeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Germany). After DNA restriction with PstI, library preparation was carried out according to Poland et al. (2012). Single-end sequence reads were obtained from an Illumina HiSeq 2500 sequencer at the Institute of Integrative Biology and Systems at Université Laval (http://www.ibis.ulaval.ca/en/services-2/genomic-analysis- platform/). Demultiplexing and quality filtering, de novo assembly, read alignment and SNP calling were performed with an Ipyrad v0.7.23 (Eaton, 2014) pipeline. Assembling parameters included a clustering threshold of 0.9, a mindepth of 8, and a maximum barcode mismatch of 0 defining 80 bp reads after cutting them by quality. Both types of individuals (NR and RF) had to be represented at least once for a SNP to be called. Subsequently, monomorphic reads, variants with missing call rates above 25%, and samples with minimum allelic frequencies (MAF) below 5% and in Hardy-Weinberg disequilibrium (P < 1x10-6) (Minamikawa et al., 2018) were eliminated with Plink v1.07 (Purcell, 2010). 2.2.3 Soil sampling and analyses After removing the surface litter down to the mineral soil?, four topsoil (0-15 cm in depth) samples separated by 90° were collected around the 65 plants genotyped above (two ‘population subsets’) at the end of the dry season (between April and May of 2018). For each individual plant, we collected a soil sample proximal to the root (at a lineal distance between 0 and 7 cm) for chemical analysis. The four soil samples from each plant were combined in a composite sample in the field. Composite soil samples were air dried (between 25 and 30 ºC) for 48 hours, to prevent certain components from being lost at higher temperatures, such as those from ovens (Ren et al., 2016; Zhou et al., 2016). Soils were then sieved through a 2-mm mesh to eliminate large rocks and roots, and analyzed in the laboratory. This helped to visually determine physical differences associated with the intervened soil and the nursery substrate for reforested plants and the soil around naturally regenerated individuals. We determined soil pH of the composite aliquot after suspending samples in deionized water (1:2.5 w/v) and shaking them for 10 min (Ren et al., 2016; Chen et al., 2019). We determined the organic carbon (C, mg C/g), total nitrogen (TN, mg N/g) and total phosphorus (TP, mg P/g) 36 concentrations by automatized methods (Anderson and Ingram, 1993; Roa-Fuentes et al., 2015). We additionally assessed the concentration of mineral N in form of ammonium (NH4 +, µg/g) and nitrate (NO3 -, µg/g) after extraction with KCl (Robertson et al., 1999). We used 0.1 g of dried green needles from a composite sample to quantify N (Nleaf) and P (Pleaf) concentrations, using Kjeldahl’s method (Anderson and Ingram, 1993; Sáez-Plaza et al., 2013). Finally, we calculated soil C:TN, TN:TP, and NO3 -:NH4 + ratios, and Nleaf: Pleaf ratio. 2.2.4 Statistical analysis 2.2.5.1 Phenotypic traits Differences between groups of individuals (i.e., NR and RF) were determined for each phenotypic and soil trait through t-tests at 5 % probability levels. Correlations between pairs of phenotypic or soil traits were then performed with the corrplot package (Wickham, 2019) in R v.3.4.4 (R Core Team, 2017) to exclude highly correlated variables (Pearson’s ½r½ ≥ 0.75; Fig. S1). According to Gienapp et al. (2019) and Mahony et al. (2019), we fitted the following model for each i individual, by taking into account its age, and location within the stand (spatial effect) to eliminate experimental effects, and ‘precorrect’ phenotypes (6): ;^_ = ` + =H@^,_ + DCb^ + e^ (6) where ;^_is the phenotype of individual i from in origin j (NR or RF), μ is the experimental mean, =H@^ the fixed age effect (as a factor), DCb^ is the random and non‐genetic location effect (“environment effect”) and e^ is the residual error. We report phenotypes as z-standardized residuals of a linear mixed effects model, as implemented in ASReml package (Butler et al. 2007). We performed a PCA on ‘precorrected’ phenotypes using uncorrelated traits with the factoextra package (Kassambara and Mundt, 2020) to identify differences between groups of individuals and illustrate patterns of phenotypic differentiation. Then, a permutational multivariate analysis of variance (PERMANOVA) was used to test the null hypotheses of no phenotypic differences between groups (Anderson, 2017). The PERMANOVA was based on Bray-Curtis distances (Anderson and Santana-Garcon, 2015) and performed in vegan version 2.3‐ 5 (Oksanen et al., 2019). 2.2.5.2 Population genetic structure and individual relationship 37 The retained panel of 1,749 SNPs that was successfully genotyped for all 65 samples was used to estimate observed heterozygosity and genomic inbreeding coefficients (fi = F) in Plink v1.04 (Purcell, 2010). Population structure was inferred with a principal components analysis (PCA) with the AGHmatrix package (Amadeu et al., 2016), and the Bayesian method available in Admixture (Alexander and Lange, 2015). First, all SNPs were used to calculate a genomic relationship matrix (GRM) between individuals, which is equivalent to the formula described by VanRaden (2008). To test for population structure, the GRM matrix was spectrally decomposed with the eigen() function in R. Spectral decomposition of this matrix made it possible to estimate the variation captured by genomic relationship eigenvectors (GREs), which helped determining the extent of population structure between groups (Stanton-geddes et al., 2013). The first three eigenvalues, which together explained 10.33% of the genetic variance among individuals and groups of trees, were conserved and used to control for population structure in further partial canonical correspondence analysis analyses (pCCA, see below). FST (Weir and Cockerham, 1984) between NR and RF were calculated using the “genet.dist()” function in hierfstat (Goudet and Jombart, 2015). Admixture was used to probabilistically assign individuals to a pre-defined number of clusters (K-value) (Skotte et al., 2013). Ten independent runs were performed for K- values ranging from one to five. Cross-validation was used to identify the most likely K-value (Alexander et al., 2009; Fatokun et al., 2018). Individual PC-loads (GRE1) were then correlated and compared with Q-values and phenotypic PC-loads (PC1). 2.2.5.3 Quantitative genomic analyses We determined the relative contribution of genetic variables (i.e., GREs) on three phenotypic datasets (i.e., growth (ModelG1), physiological (ModelG2), and all traits (ModelG3), each one composed by multiple variables (Talbot et al., 2017), with three independent Redundancy analyses (RDA) performed with the rda function in vegan, v. 2.3‐5 (Oksanen et al., 2019). RDA accounts for multiple response variables allowing to determine the effect of the total genotypic variation on each individual phenotypic trait, and in all traits as a whole. We performed RDAs in two-steps, so that genomic and phenotypic databases were analyzed using multivariate linear regressions to produce multiple matrices of fitted values (Nadeau et al., 2016; Talbot et al., 2017). Then, we used the PCA of fitted values to produce canonical/constrained axes, which are linear combinations of predictors (Legendre and Legendre, 2012; Forester et al., 2018). We retained 38 individual loads for significant eigenvalues (P-value< 0.05) and used them in subsequent analyzes. Significance for all RDA’s models was evaluated using 1000 runs of Monte Carlo permutations. The best model was identified through forward selection of explanatory variables, with 999 permutations and a P-values of 0.05, on an adjusted coefficient of determination (R2; Peres-Neto et al., 2006). 2.2.5.4 Genotypic - environment interaction (G × E) Using the three models above, we conducted a pCCA (Ter Braak and Verdonschot, 1995) to estimate the relative contribution of genetic structure (i.e. individual loads of genomic relationship eigenvalues; GRE1, GRE2 and GRE3) and soil variables (pH, TN, TP, NO3 -, NH4 +, NO3 -:NH4 +, C, C:TN and TN:TP) to phenotypic differences between groups of individuals. We used a forward selection of variables (genomic and edaphic) with 999 Monte-Carlo permutations and P-values of 0.05 to identify the best model (Ter Braak and Verdonschot, 1995); we tested for statistical significance of individual loads using an ANOVA on pCCAs eigevalue (Delgado de la Flor et al., 2017). It must be noted that planting may have substantially modified the soil around reforested plants, and indirectly bias the performance and fit of the model above. To evaluate this, we built a new series of models for predicting the first three vectors of the RDA above (which summarize the relationship between the genomic and phenotypic variances) with the top soil variables retained in the pCCA using three strategies. First, we trained the model with the NR plants and used it to predict RDA vectors for RF individuals (‘across-groups’). A good model fit would indicate that soil is equivalent in both groups and that planting may have no effect on the results above. Second, we randomly selected 50% and 75% of individuals (regardless of their group, NR or RF) to train the model and used the rest of the sample to perform predictions (‘Resampling’). A better fit of this model would indicate that soil is not equivalent in both groups and that planting might be affecting results, therefore influencing the variation of the phenotype. If that were the case, we built a third model (“Compound”), which was trained with all NR plants and 50% of the RF individuals, and used to predict RDA vectors for the remaining RF plants. If planting was affecting our results, this model should also perform better than the first one. All models were validated with10-fold cross-validation (CV), after splitting data using function createFolds in R package caret. Sizes of individuals in each training and validation dataset are presented in Table 39 S2. Following to Ma et al. (2019) the model performance was evaluated by comparing the coefficient of determination of the calibration dataset (R2 Cal) with the mean R2 of cross-validations (R2 CV), and by estimating normalized mean square errors (nRMSECV; RMSE divided by the sample mean). 2.2.6. Genome scans for detecting candidate genes Genotype-environment associations were tested using the latent factor mixed model available in lfmm package, version 1.2 (Frichot et al., 2013) for R v.3.4.4 (R Core Team, 2017) to predict adaptive genotypes (Carvalho et al., 2021). Such model allows testing for linear relationships between individual genotypes and environmental (i.e. edaphic) traits, while accounting for neutral population structure as latent factors (Capblancq et al., 2018; Rellstab et al., 2017). Following previous clustering analyses (and preliminary lfmm runs), we set the number of factors (K) to 2, and performed 10 runs of the algorithm. We only considered the previously selected soil characteristics (from the pCCA models) as those that should be contributing the most to local adaptation. The z-values obtained across runs were combined using the Stouffer’s method (Stouffer et al., 1949). Then, a genomic inflation factor (GIF, a scale factor used to correct for deviations of P-values that do not follow a uniform distribution, Storey and Tibshirani, 2003) was computed and used to correct P-values. The distribution of P-values was further transformed into q-values using Benjamini and Hochberg approach’ (1995) for False Discovery Rate (FDR; François et al., 2016). Significant associations were inferred above thresholds of 0.05 and 0.01; q-values were graphed in Manhattan plots using R’s package qqman to ease visualization (Turner, 2018). Finally, the flanking ≈80 bp on each side of the identified candidates were blasted for nucleotide similarity against the TodoFirGene database (http://plantomics.mind.meiji.ac.jp/todomatsu/), which contains an annotated gene catalog for Abies sachalinensis (Ueno et al., 2018). We considered that homology was significant when the maximum ‘bit score’ was above 100, the percentage of identity higher than 90% and the E-value below 1E-10. The most significant hits were further scored for biochemical function, based on putative orthologous similarity against the InterproScan database (https://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search) (Urrestarazu et al., 2017). 40 2.3 RESULTS 2.3.1. Phenotypic and edaphic differences between groups of individuals Naturally regenerated (NR) and introduced (RF) individuals showed significant differences at ten out of twelve growth traits (TH, FH, SD, BD, AGB, CR, G16, WD, AG, and AGV; P-value < 0.05), and at three out of seven physiological traits (Ψ, RWC and PLeaf ; Table S2; P-value < 0.05). For growth traits, RF plants had lower means than NR saplings. For physiological traits, RF plants appeared more drought-stressed at the time of the study (lower means for Ψ and RWC; -0.47 ± 0.02 MPa and 65.7 ± 1.4 %, respectively) and had higher leaf-P concentration (Pleaf = 1.81 ± 0.09 mg P/ g leaf) than NR individuals (Ψ = -0.32 ± 0.015 MPa; RWC = 74.6 ± 1.9 %; Pleaf = 1.28 ± 0.1 mg P/ g leaf). There were, however, significant correlations between various growth and physiological traits (Fig. S1), and only ten variables were retained for subsequent analyses (six growth and four physiological traits), namely: TH, SD, CR, G16, Lleaf, WD, RWC SLA, Ψ and Pleaf, (Fig S1, P-value < 0.05). A joint PCA for the traits above (phenotypic variation per se), through a PCA, showed that both groups of individuals could be visually separated with relative ease (Fig. S2; Table S3). A PERMANOVA based on Bray-Curtis distances showed that these groups are statistically different (P-value < 0.05, Table S4). The first two axes of the PCA explained 54.36% of the total variation and were respectively loaded by positive correlations with TH, SD, CR, Ψ and G16 (PC1) and SLA (PC2). PC2 was also loaded by negative correlations with RWC and WD (Table S3). NR individuals had a higher phenotypic breadth than RF plants, which tended to be more phenotypically homogeneous (Fig. S2) and to have a similar age. Soil around NR and RF plants showed significant differences at four out of nine edaphic characteristics (pH, C, TN, and NH4 +; Table 1, P-value < 0.05). Soils under RF had lower organic C and TN concentrations, but greater pH and NH4 + concentration than those under NR. Significant co-variation was observed between some of these soil characteristics (Fig. S3, P-value < 0.05), which resulted in the elimination of organic C, and NO3 - metrics from further analyses. 2.3.2 Correlation between Genetic Structure and Phenotypic Variation Sequencing provided an average of 2,803,267 raw reads per individual. After filtering, 31,462 consensus reads were retained, which were de novo-assembled for identifying 373,267 41 SNPs with an average depth of 8X. After the final quality-filtering, the final data set included 1,749 SNPs genotyped for all 65 individuals (34 NR and 31 RF). Five-fold cross-validation of non-partitioned genomic data in Admixture revealed an optimal number of two genetic groups (K-value = 2; Fig. 2A; Table S6). However, a substantial degree of admixture was observed for NR individuals and, to a lower extent, for RF plants; indicating only partial genetic differentiation. An unsupervised demographic clustering (PCA) showed similar results, with spectral decomposition of the first two genomic eigenvalues (‘GRE axes’ from now on) explaining less than 8% of the genomic variance (4.21 and 3.25% for GRE1 and GRE2, respectively; Fig. S4A). Both groups had similar values (P-value > 0.05) of observed heterozygosity (0.235 ± 0.007 and 0.219 ± 0.005 for NR and RF, respectively) (Fig. S4B), a similar spectrum of genetic relationships (Fig. S5), and of genomic inbreeding coefficients (0.021 ± 0.027 and 0.026 ± 0.025 for NR and RF, respectively). FST between origins was low (0.012; P- value = 0.62). There was a significant correlation between individual loads for phenotypic and genetic PCs (R2 adj = 0.22; P-value < 0.001; Fig. 2B). However, redundancy analysis (RDA), performed on different partitions of phenotypic traits (models), showed that only modest parts of the phenotypic (constrained) variance (TVE) between groups of individuals could be accounted for by genomic data (Table 2). The best model (ModelG3) included all phenotypic traits and explained ~17% of the phenotypic variance. For the two other models (growth traits only, and physiological traits only), genomic data explained 10.91 and 6.86% of the phenotypic variance, respectively (Table 2). For the best model, the first three eigenvalues contributed approximately 40% of the TVE (RDA1 = 16.88%, RDA2 = 12.07%, RDA3 = 11.35%; Fig. S6). They were mostly loaded by G16, Ψ, TH and CR (RDA1), SD, WD and Lleaf for RDA2, variables and RWC, SLA and Pleaf, for (RDA3), respectively. These three axes were retained for analyses below. 42 Fig 2. A Genomic differentiation (barplot) among Sacred fir individuals sampled in a trial site in Central Mexico. An Admixture clustering was performed with 1,749 SNPs and assuming K-value = 2 (lowest cross-validation error). B Correlation between the phenotypic (PC1, x axis) and genetic (GRE1, y axis) principal components grouped by individual class (management). The diagonal line represents the best fit regression line (R2 adj = 0.22; P-value = 4.2 E-5). Blue and red colors represent naturally regenerated (NR) and introduced reforested (RF) individuals, respectively. 3.3.3 Including soil characteristics for partitioning phenotypic variation with genomic data To specifically display the effect of within-population genotype × environment (G × E) on phenotypic variation, we performed pCCA ordinations with an interactive forward selection of explanatory variables. In all cases, the best models comprised four soil biogeochemical metrics 43 (TP, TN and NH4 + concentrations, and NO3 -:NH4 + ratio) and the two genomic eigenvalues obtained above (GRE1 and GRE2). Integrating genome-soil interactions had a significant impact on TVE for all three groups of phenotypic traits (5.63, 3.79 and 6.88%, for ModelG×E1, ModelG×E2 and ModelG×E3, respectively), when compared to models exclusively using genomic or soil data alone (Table 3; Table S7). These models were also better (lower P-value) and had higher TVE values than the previous RDAs. As for previous analyses, the model including all phenotypic traits (ModelG×E3) had the highest TVE (21.58%). The first two eigenvalues for this model explained up to 94% of the TVE (Fig. 3; Table S8), and were mostly loaded by soil TP, TN and NH4 +, and GRE1 (pCCA1), and by soil NO3 -:NH4 + ratio and GRE2 (pCCA2; Table S9 and S10), respectively. The relationship between RDA1, and soil TN and NH4 + concentrations (P-value < 0.01) shown in Fig. 4 illustrates how integrating soil variation can account for a higher proportion of the phenotypic differentiation between plant groups than using genomic data alone. As a proxy for determining whether soil differences between groups were affecting results, we built a series of models for predicting RDA vectors with the top soil traits loading the pCCA axes above. The model built ‘across-groups’ (NR → RF) only explained a small percentage of the variance of the calibration dataset for all RDA vectors (Table 4). Model performance improved when including RF plants into the training set (‘Compound’ in Table 4) and when using a random set of individuals from both groups (‘Resampling’) to calibrate the model. The best fit was achieved when the ‘Resampling’ was randomly sampled 75% as training set (Table 4). Thus indicating that soil differences between groups have a measurable effect on phenotype and that planting might be affecting individual performance. 44 Fig. 3. A. Biplot derived from the partial canonical correspondence analysis for ModelGxE3 (all phenotypic traits included) according to edaphic characteristics in a Sacred fir trial site in Central Mexico. TN, total soil nitrogen; TP, total soil phosphorous; NH4 +, mineral soil nitrogen in form of ammonium; NO3 -:NH4 + ratio of mineral soil nitrogen in form of nitrate and ammonium; GRE1 and GRE2, genomic relatedness eigenvalues among individuals. B. Percentage of the total phenotypic variance between groups of individuals (NR vs. RF) explained by each database in the partial canonical correspondence analysis (pCCA; see Table 3). 45 Fig. 4. Biplot of the most significant component of a redundancy analysis for ModelG×E3 between phenotypic and genotypic data for two groups of individuals (NR and RF) of Sacred fir sampled in a trial site in Central Mexico. A. Total soil nitrogen (TN, mg N/g DW) and B. mineral soil nitrogen in form of ammonium (NH4 +, µg/g). NR, naturally regenerated individuals; RF, introduced reforested plants. There were significant differences between the ‘populations’ centroids for both edaphic characteristics according to a PERMANOVA (P-value < 0.01). 2.3.4. Genotype-environment associations (GEA) Testing for associations between SNPs and soil characteristics (by including population structure as a latent factor, K = 2, and using strict GIF and FDR corrections; Fig. 5) revealed fourteen candidate loci (0.48% of the total; Table S11). Half of them (7) were associated with the concentration of TN in the soil, five were correlated to the ratio of both inorganic soil N forms (i.e., NO3 -:NH4 +ratio), and the remaining two were associated with the concentration of NH4 +. Blasting contig sequences that contained these outliers against the transcriptome of A. sachalinensis allowed annotating two regions, both with SNPs associated to soil TN (Table S11). The first one was similar to a member of the pentatricopeptide repeat protein (PPR) superfamily (and thus related to protein amino acid binding; Barkan and Small, 2014), and the second one to a glycosyl hydrolase 9B13 gene (GH9B13; related to catalytic activities in carbohydrate metabolism; Opassiri et al., 2006). Genotype-environment associations suggested a dominance model for these two loci (Fig. S7). 46 Fig 5 Manhattan plots derived from latent factors mixed models testing for genotype-edaphic associations in a Sacred fir trial site in Central Mexico. Plots represent the −log10 significance values (Q-value) obtained for 1,749 SNPs. A, mineral soil nitrogen in form of ammonium (NH4 +): 2 SNPs; B, total soil nitrogen (TN): 7 SNPs; C, ratio of mineral soil nitrogen in form of nitrate and ammonium (NO3 -:NH4 +): 5 SNPs. Red and blue lines indicate FDR values of 0.05 and 0.01, respectively. The largest red dots show the most significant associations between genetic and microenvironmental variables. 2.4. DISCUSSION The present study provides a quantitative overview of the interaction between genotype and soil heterogeneity and its effects on plant phenotype at the local scale. It also shows that taking soil-plant interactions, and planting conditions (soil disturbance), into account can enhance phenotypic predictability in reforestation and restoration plans. It further reports two novel candidate genes associated with soil N availability, which deserve additional investigation under controlled conditions and in an evolutionary context. 47 2.4.1. Correlation between phenotypic and genetic variation in natural test-trial Understanding species’ phenotypic variability requires the identification of evolutionary, demographic and ecological processes operating at the population level (Mitchell-Olds et al., 2007; Villellas et al., 2014). In small and secluded natural populations or plantations, phenotypic performance and sapling survival can be compromised because of reduced genetic diversity, such as suspected herein from the differences between groups of individuals (lower growth and more stressed plants for the RF than for the NR group; Table S3). However, given that edaphic, phenotypic and genomic variability allow to subtly differentiate both types of trees, it seems necessary to invoke other forces affecting phenotypic performance. Genetic differentiation was weak between NR and RF individuals (FST =0.012 and P-value =0.62), especially when compared to the range-wide population levels (GST =0.20-0.51; Cruz- Nicolás et al., 2020), which, together with Admixture and PCA results, suggests a regional origin for the reforested individuals (see also Arenas et al., 2021). This indicates that even when privileging local seed-sources for reforestation, to avoid introducing maladapted individuals, phenotypic differences can still occur between reforested and regenerated plants, even ~9 years after plantation. A possible explanation for this could be translocation-related effects, like those derived from soil layer mixing and compaction during plantation (Lawson and Michler, 2014; Sebastian-Azcona et al., 2020). However, for adequately evaluating planting effects in forest restoration, requires a different experimental approach, as for example, including several repetitions at various locations with contrasting soil and topographic conditions. Other than translocation effects, our results also hint that phenotypic variation might be accounted for, at least in part, by genetic factors. An initial indication is the correlation between phenotypic traits (i.e. those associated to PC1: TH, SD, CR, Ψ, and G16) and the first axis of genetic differentiation (GRE1; R2 adj = 0.22). However, such a low coefficient is likely influenced by environmental variation (Forester et al., 2018) and probably includes plastic and epigenetic effects (Wang et al., 2020). While some studies have previously observed a similar correspondence between genetic and phenotypic differentiation in forest plants (e.g., Eckert et al., 2013; Gömöry et al., 2013; Harter et al., 2015), molecular markers are generally considered poor predictors of adaptive genetic variability (Kozak et al., 2011), unless they are massively surveyed and integrated into sophisticated genome-prediction models (Chen et al., 2018; Lenz et al., 2020). Herein, simple RDA models accounted for a modest ~17% of the phenotypic difference between 48 groups when including all retained traits (Table 2); thus suggesting that models with both more markers (especially from coding genes; Lebedev et al., 2020) and individuals could explain larger parts of the phenotypic variance, especially if they incorporate factors like G × E or soil variability. 2.4.2 Significant soil edaphic variation at small spatial scales Before being integrated into predictive models, environmental variability had to be described. Significant soil variation was detected along the small spatial gradient surveyed in the study site, with differences observed for soil nutrient concentrations and ratios (e.g., TN concentration and NO3 -:NH4 + ratio), which were particularly important for explaining differences between plant groups. Putative explanations for such soil variability include the above-mentioned planting- effects (see also Sauer et al., 2012; Larkin et al., 2016; Chen et al., 2019), together with other plant-soil feedbacks. These may influence nutrient availability via nutrient deposition and mineralization, which modify soil nutrient content at short spatial scales (Wardle et al., 2004; Silva and Lambers, 2020). Other anthropic factors derived from forest management, like machinery use during wood extraction, could also have changed the soil physical properties and might also be at stake (Cambi et al., 2015; Elliot et al., 2019). Reforestation usually includes removing the upper organic layer, and planting seedlings along with nursery soil altering the upper soil layers, and consequently the soil biogeochemical properties and nutrient cycles at reforested points (Le et al., 2012). Altogether, this requires translocated individuals to rapidly adapt to novel soil selective pressures during the acclimation time, which may diminish growth and nutrient assimilation, particularly N (Lu et al., 2012; Liu et al., 2019). In our trial site, increased soil NH4 + concentrations were estimated for reforested plants, perhaps from an exogenous source (i.e. nursery soil was enriched with N fertilizers; Andrés Juárez pers. comm.), while higher soil TN and organic carbon concentrations were determined around NR plants (Table 1 and Fig. S3). Such differences suggest higher organic matter inputs for the natural seedlings (Lafleur et al., 2015), which could increase soil water retention and have measurable effects in plant phenotypic performance. A better understanding of microspatial variability of soil fertility seem thus important to predict plant functional traits (Li et al., 2018), adequate reforestation practices and improve their success (Koskela et al., 2014; Larkin et al., 2016). 49 2.3.3. Partitioning phenotypic variation due to genotype by microenvironmental factors and their interaction Our results highlight the potential that models combining growth and physiological data may have for describing individuals’ fitness in natural forest tree populations. It has been well established that plant growth, and other factors such as photosynthetic activity and leaf nutrients (Čepl et al., 2016), have a genetic basis that can be influenced by the environment, including soil conditions (e.g., Lojewski et al., 2009; Madritch and Lindroth, 2011). Thus, identifying the effects of these conditions and their interaction with individual’s genotypes should help increasing phenotypic predictability, such as shown herein (Tables 4 and S7). Indeed, models including only genotypic data accounted for less than 17% of the phenotypic variance, while models exclusively taking soil data into account only explained ~12%. In contrast, models including both factors and their interaction accounted for up to about 22% in TVE,suggesting a local phenotypic response that depends on soil nutrient content and within-population G × E (which includes planting conditions). Our results are consistent with those from common gardens in other conifers, which report a significant positive correlation between plant growth and soil N concentrations (Deng et al., 2019; Ren et al., 2016), and support the view that terrestrial vegetation growth is generally N- limited (Augusto et al. 2017; Du et al., 2020). This indicates that local polygenic adaptation, quick response to a new environment, and phenotypic plasticity could be a driving force for seedling establishment in managed forest populations. Testing for local adaptation requires, however, estimating fitness in common garden or reciprocal transplant experiments (Blanquart et al., 2013; Savolainen et al., 2013; Lascoux et al., 2016), including the comparison with traits under strong genetic control, such as bud set timing (Mckown et al., 2014; Abbot et al., 2015), and evaluating survival over time (Cruzado-Vargas et al., 2019). Our use of individuals from two origins exposed to similar environmental pressures for over nine years is a first step for addressing microgeographic adaptation. Heritability estimates for some of the studied traits (h2 between 0.12 - 0.29; Arenas et al., 2021) indicate that there is a considerable amount of additive variation in these traits upon which natural selection could act (Ramírez-Valiente et al., 2014; Tiffin and Ross-Ibarra, 2014), and our predictive models suggested differential phenotypic response between origins (Tables 3 and 4). Altogether, these results indicate an interaction between plant genotype and microenvironment that can be measured even after nine years of planting. 50 Spatially variable selection has been reported in other tropical trees (Brousseau et al., 2020; Carvalho et al., 2021). Still, the small number of trees tested, the limited microenvironmental information (soil studied in a single “snap-shot” in time and the edaphic range was rather limited), and the lack of evidence for phenotypic plasticity hamper us, from extrapolating our results to larger spatial or temporal scales. To detect local adaptation, such scales have to be taken into account, as the intensity and direction of selection is likely to vary over space and time (Brachi et al., 2013; de Villemereuil et al., 2018). In forest trees, different life stages may have different fitness optima, given than environmental conditions change within and among years (Scotti et al., 2016). As with previous studies in controlled and natural conditions (Talbot et al., 2017; Budde et al., 2013; Riordan et al., 2016), a large portion of the phenotypic variance remained unaccounted for in our study. Usual explanations for this include polygenic adaptation, epigenetic factors, planting effects, and unmeasured (or inaccuracy in measured) environmental traits that could be playing important roles in phenotypic performance (Arnold et al., 2019; Des Marais et al., 2013; Talbot et al., 2017). Biotic interactions such as those with mycorrhiza, soil bacterial communities, herbivores or nurse plants have all been shown to be important for plant development and survival in shade-tolerant plants like sacred fir (Bennett and Klironomos, 2019; Carbajal-Navarro et al., 2019; Liu et al., 2019); taking these factors into account might help increasing TVE. Here, we made sure of including only individuals without visible herbivore damage and all growing under similar light conditions, leaving the effect of planting, including modified soil microbiome composition (i.e., bacteria and mycorrhizae), as the most likely unaccounted factor. For instance, the apparently higher P uptake that had the RF plants, evidenced by their increased Pleaf when compared to NR plants, could be a consequence of either the soil or its microbiome composition; more specifically of the mycorrhizae inoculated during the nursery phase (Andrés Juárez pers. comm.). While this is still a hypothesis to test, multiple studies suggest that the presence of bacterial and mycorrhizal communities can alter the phenotypic performance in a wide range of plant traits (Partida-Martínez and Heil, 2011), even at the biochemical and anatomical levels, by favoring root N and P absorption. Therefore, the correlation between the measured phenotypic traits and soil NH4 + and TN concentrations could be a consequence of reforestation, even more than nine years after planting. This is certainly a worth exploring avenue that may require testing in multiple sites with controlled soil NH4 + and TN concentrations, and using incubation 51 techniques. 2.4.4. Soil microenvironment: a potential selective factor for Sacred fir Our results also highlight the importance of studying soil fine-scale variation and its potential effects on phenotype in more detail. Indeed, in spite of using a (very) reduced representation of an extremely large genome (~18 Gb; Mosca et al., 2019), we detected 14 candidate loci potentially related to soil variation, and were able to annotate two of them (Table S11). One of these genes is a member of the PPR gene superfamily, which have been related to drought stress responses, and molecular mechanisms like protein binding (Barkan and Small, 2014). A member of this superfamily was previously related to adaptation to soil conditions and drought in Medicago truncatula (Guerrero et al., 2018). The other annotated gene, GH9B13, has been related to cellulose biosynthesis (Opassiri et al., 2006), and has been shown to recurrently over-express in trees under severe drought (Spokevicius et al 2017). Interestingly, this gene is also induced upon endophytic bacterial colonization in Arabidopsis (Sheoran et al. 2016); thus, endorsing its potentially adaptive role to soil composition. Future works under controlled conditions (e.g. incubation experiments) that include a better representation of the annual microenvironmental variation, and using a larger sample size are thus needed to confirm the putatively adaptive roles of these genes. Finding potential candidate genes to soil adaptation is not new in tree species, including Sacred fir. For instance, Méndez-González et al. (2017) found several genes related to soil fertility, which accounted for a significant portion of the within-population structure in a Sacred fir stand located some kilometers south from our trial site. Our results further reinforce previous findings (but a smaller scale) that suggested soil adaptation in Pinus contorta (Eckert et al., 2012), where a series of candidate genes (e.g., ABC‐Transporters) associated with gradients of soil aluminum and phosphate concentrations, (i.e., soil toxicity and nutrient supply) were detected. Such predictive models could be helpful for supporting future forest management and assisted migration plans (Sáenz-Romero et al., 2016; Aitken and Bemmels, 2016; George et al., 2017). 2.4.5. Tree genotypes and interactions with soil properties and management implications 52 Seedlings are exposed to a range of biotic and abiotic pressures, for instance competition, herbivory, drought and disturbance. Theoretical models suggest that polygenic adaptation may account for a large portion of phenotypic diversity between populations, which should be maintained by a combination of natural selection and gene flow (Le Corre and Kremer, 2012), and perhaps reinforced by demographic or neutral processes. Our pilot study points that genotype, planting conditions and soil variation may interact and impact tree phenotypic performance at small geographic scales (i.e. tens of meters). Bonifying these models with novel phenotyping capabilities and genomic resources will allow for a finer selection of genomic variants, and help identifying additional links between genetic divergence and environment. Expanding these studies to other populations along the species’ natural range should be of particular interest, since selection is likely to target multilocus combinations, rather than particular polymorphisms (Scotti et al., 2016), which may change among populations and environmental conditions. The link between plant genotype and soil conditions are poorly understood, both in controlled and natural conditions (Beals et al., 2020). Individual tree genotypes and genotype diversity play crucial roles in shaping community structure, and their interaction in a changing environment may modify ecosystem function (Arnold et al., 2019), and composition (Purahong et al., 2016). The interaction between particular genotypes and mutualistic communities may improve tree survival, growth and physiological performance, which is crucial to predict, given the forecasted threats associated to future climate change (Gehring et al., 2017). Although potentially difficult to address, including within-population G × E and polygenic adaptation should thus be critical for guiding reforestation strategies (Aitken and Whitlock, 2013). For instance, for optimizing planting conditions and avoiding maladapted individuals to particular conditions (Isabel et al., 2020). 2.5. REFERENCES Abdi, E., Moghadamirad, M., Hayati, E., Jaeger, D., 2017. Soil hydrophysical degradation associated with forest operations. Forest Science and Technology 13, 152–157. https://doi:10.1080/21580103.2017.1387611. Abbott, A.G., Zhebentyayeva, T., Barakat, A., Liu, Z., 2015. The genetic control of bud-break in trees. Adv. Bot. 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Soil characteristic Natural regeneration Reforestation t-test P-value Mean SE Mean SE pH (H2O) 5.8 ± 0.1 6.3 ± 0.04 -5.14 *** Organic carbon (C, mg/g) 187.6 ± 7.8 159.2 ± 6.1 3.76 *** Total Nitrogen (TN, mg N /g) 18.5 ± 1.1 14.3 ± 0.5 3.60 *** Organic carbon/Total nitrogen ratio (C:TN) 10.6 ± 0.3 11.1 ± 0.4 -0.10 Ns Nitrate (NO3 -, µg/g) 8.29 ± 1.27 9.97 ± 0.70 -1.28 Ns Ammonium (NH4 + , µg/g) 27.9 ± 2.2 40.9 ± 2.1 -4.29 *** Nitrate/Ammonium ratio (NO3 -:NH4 +) 0.28 ± 0.02 0.27 ± 0.03 -0.07 Ns Total Phosphorus (TP, mg P/g) 2.65 ± 0.17 2.59 ± 0.18 0.20 Ns Total Nitrogen /Total Phosphorus ratio (TN:TP) 7.43 ± 0.38 6.44 ± 0.43 1.96 Ns Ns, non-significant; *, P-value < 0.05; **, P-value < 0.01; ***, P-value < 0.001 62 Table 2. Results (variance constrained and unconstrained) of Redundancy Analyses (RDA) for accounting for the variation at three sets of quantitative traits (models) with 1,749 SNPs. ModelG1, growth traits only; ModelG2, physiological traits only; ModelG3, all traits. Fisher’s F, number of degrees of freedom (Df), P- value and adjusted coefficient of determination R2 (R2 adj) are shown also for each model at the bottom of the table. ModelG1 ModelG2 ModelG3 Variance-Constrained (%) 10.91 6.86 16.97 Variance-Unconstrained (%) 88.09 93.14 83.03 F-test 1.07 1.10 1.05 Df 6 4 10 P 0.08Ns 0.06 Ns 0.12Ns R2 adj 0.0059 0.0065 0.0051 Ns, non-significant; *, P-value < 0.05 Table 3. Results (% variance explained) for partial canonical correlation analyses (pCCA) between genomic and edaphic variation and three sets of phenotypic traits (models) in a trial Sacred fir site of in Central Mexico. ModelG×E1, growth traits; ModelG×E2, physiological traits; ModelG×E3, all traits. Source of Explained Variance Contribution to total variance (%) ModelG×E1 ModelG×E2 ModelG×E3 Effect genetical 10.02 8.28 9.8 Effect environmental 3.8 3.91 4.9 Effect genotype × environment 5.63 3.79 6.88 Total explained 19.45 15.98 21.58 Residual 80.55 84.02 78.42 63 Table 4. Results of the cross-validation of the model to predict the genomic and phenotypic variance calculated using predictive soil traits. The statistical measures are: To quantify the performance of the model obtained from the calibration data set, we used the calculated coefficient of determination (R2 Cal), while from the validation data sets we obtained the determination coefficient (R2 CV); and normalized mean square error (nRMSECV, RMSE divided by the sample mean), and in both cases it is indicated by the CV subscript. Method Model Statistical measures RDA1 RDA2 RDA3 Across-groups NR → RF R2 Cal 0.382 0.391 0.335 R2 CV 0.085 0.137 0.069 nRMSECV 2.32 13.34 4.38 Resampling 50 %’s sample R2 Cal 0.453 0.362 0.406 R2 CV 0.121 0.078 0.076 nRMSECV 16.3 28.01 18.58 75%’s sample R2 Cal 0.383 0.297 0.371 R2 CV 0.224 0.085 0.114 nRMSECV 20.94 24.51 23.68 Compound NR + (0.5*RFTRN) → R2 Cal 0.371 0.351 0.321 0.5*RFTST R2 CV 0.128 0.163 0.122 nRMSECV 12.63 20.608 9.729 64 SUPPLEMENTARY MATERIAL Table S1. Geographical coordinates for the 128 Sacred fir (Abies religiosa) individuals surveyed in this study. Origin of Individual Origin Population No. of Individual Latitude Longitude Genetic and soil samples Reforestation RF 51 19.2577 -99.9569 ✓ Reforestation RF 52 19.257 -99.9566 ✗ Reforestation RF 53 19.2572 -99.9565 ✗ Reforestation RF 54 19.257 -99.9566 ✓ Reforestation RF 55 19.257 -99.9565 ✗ Reforestation RF 56 19.2569 -99.9565 ✗ Reforestation RF 57 19.2567 -99.9566 ✓ Reforestation RF 58 19.2568 -99.9564 ✗ Reforestation RF 59 19.2568 -99.9566 ✓ Reforestation RF 60 19.2567 -99.9565 ✗ Reforestation RF 61 19.2566 -99.9566 ✓ Reforestation RF 62 19.2565 -99.9564 ✗ Reforestation RF 63 19.2564 -99.9564 ✗ Reforestation RF 64 19.2563 -99.9563 ✓ Reforestation RF 65 19.2562 -99.956 ✗ Reforestation RF 66 19.2563 -99.9561 ✓ Reforestation RF 67 19.2563 -99.956 ✗ Reforestation RF 68 19.2563 -99.9554 ✗ Reforestation RF 69 19.2563 -99.9561 ✗ Reforestation RF 70 19.2565 -99.9561 ✗ Reforestation RF 71 19.2566 -99.9562 ✗ Reforestation RF 72 19.2571 -99.9563 ✓ Reforestation RF 73 19.2575 -99.9568 ✗ Reforestation RF 74 19.2579 -99.957 ✓ Reforestation RF 75 19.2581 -99.9573 ✗ Reforestation RF 76 19.2576 -99.9566 ✗ Reforestation RF 77 19.2577 -99.9565 ✓ Reforestation RF 78 19.2577 -99.9566 ✗ Reforestation RF 79 19.258 -99.9566 ✗ Reforestation RF 80 19.2576 -99.9567 ✓ Reforestation RF 81 19.2576 -99.9566 ✓ Reforestation RF 82 19.2575 -99.9564 ✗ Reforestation RF 83 19.2576 -99.9564 ✓ Reforestation RF 84 19.2575 -99.9566 ✗ Reforestation RF 85 19.2574 -99.9565 ✗ Reforestation RF 86 19.2574 -99.9567 ✓ Reforestation RF 87 19.2571 -99.9566 ✗ Reforestation RF 88 19.2573 -99.9566 ✗ Reforestation RF 89 19.2568 -99.9563 ✓ 65 Reforestation RF 90 19.256 -99.9561 ✗ Reforestation RF 91 19.2567 -99.9565 ✓ Reforestation RF 92 19.2567 -99.9563 ✗ Reforestation RF 93 19.2568 -99.9567 ✓ Reforestation RF 94 19.2567 -99.9563 ✓ Reforestation RF 95 19.2567 -99.9563 ✗ Reforestation RF 96 19.2568 -99.9564 ✓ Reforestation RF 97 19.2568 -99.9565 ✗ Reforestation RF 98 19.2569 -99.9565 ✗ Reforestation RF 99 19.2569 -99.9566 ✗ Reforestation RF 100 19.2574 -99.957 ✓ Reforestation RF 101 19.2581 -99.9572 ✗ Reforestation RF 102 19.2583 -99.9577 ✓ Reforestation RF 103 19.2583 -99.9575 ✓ Reforestation RF 104 19.2583 -99.9575 ✓ Reforestation RF 105 19.2583 -99.9576 ✓ Reforestation RF 106 19.2582 -99.9575 ✗ Reforestation RF 107 - - ✗ Reforestation RF 108 19.2575 -99.9564 ✓ Reforestation RF 109 19.2563 -99.9565 ✗ Reforestation RF 110 19.2566 -99.9562 ✗ Reforestation RF 111 19.2568 -99.9559 ✓ Reforestation RF 112 19.2567 -99.9558 ✗ Reforestation RF 113 19.2567 -99.9559 ✗ Reforestation RF 114 19.2561 -99.9564 ✗ Reforestation RF 115 19.2564 -99.9564 ✗ Reforestation RF 116 19.257 -99.9567 ✓ Reforestation RF 117 19.257 -99.9567 ✗ Reforestation RF 118 19.2572 -99.9556 ✗ Reforestation RF 119 19.2576 -99.9566 ✗ Reforestation RF 120 19.2578 -99.9565 ✗ Reforestation RF 121 19.2571 -99.9563 ✓ Reforestation RF 122 19.258 -99.9566 ✓ Reforestation RF 123 19.2581 -99.9565 ✓ Reforestation RF 124 19.2578 -99.9562 ✓ Reforestation RF 125 - - ✗ Reforestation RF 126 19.2572 -99.9565 ✓ Reforestation RF 127 - - ✗ Natural regeneration NR 1 19.2576 -99.9567 ✓ Natural regeneration NR 2 19.2572 -99.9564 ✗ Natural regeneration NR 3 19.2571 -99.9564 ✓ Natural regeneration NR 4 19.2571 -99.9568 ✓ Natural regeneration NR 5 19.2574 -99.9569 ✓ Natural regeneration NR 6 19.2573 -99.9568 ✓ Natural regeneration NR 7 19.2577 -99.9571 ✗ 66 Natural regeneration NR 8 19.2579 -99.9573 ✓ Natural regeneration NR 9 19.2574 -99.9567 ✓ Natural regeneration NR 10 19.2565 -99.9563 ✗ Natural regeneration NR 11 19.2566 -99.9564 ✓ Natural regeneration NR 12 19.2566 -99.9563 ✓ Natural regeneration NR 13 19.2561 -99.9558 ✓ Natural regeneration NR 14 19.2575 -99.9564 ✗ Natural regeneration NR 15 19.258 -99.9571 ✓ Natural regeneration NR 16 19.2561 -99.9558 ✓ Natural regeneration NR 17 19.2567 -99.9564 ✓ Natural regeneration NR 18 - - ✗ Natural regeneration NR 19 19.2563 -99.9559 ✓ Natural regeneration NR 20 19.2575 -99.957 ✓ Natural regeneration NR 21 - - ✗ Natural regeneration NR 22 19.2573 -99.9567 ✓ Natural regeneration NR 23 19.2564 -99.9562 ✓ Natural regeneration NR 24 19.2581 -99.957 ✓ Natural regeneration NR 25 19.2575 -99.957 ✓ Natural regeneration NR 26 19.2577 -99.9571 ✓ Natural regeneration NR 27 19.2577 -99.9571 ✗ Natural regeneration NR 28 - - ✗ Natural regeneration NR 29 19.2574 -99.9569 ✗ Natural regeneration NR 30 19.2567 -99.9559 ✓ Natural regeneration NR 31 19.2564 -99.9558 ✓ Natural regeneration NR 32 19.2574 -99.9566 ✓ Natural regeneration NR 33 19.2573 -99.9567 ✓ Natural regeneration NR 34 19.2575 -99.9566 ✓ Natural regeneration NR 35 - - ✗ Natural regeneration NR 36 - - ✗ Natural regeneration NR 37 19.2574 -99.9564 ✓ Natural regeneration NR 38 19.2580 -99.9563 ✓ Natural regeneration NR 39 - - ✗ Natural regeneration NR 40 19.2554 -99.9555 ✓ Natural regeneration NR 41 - - ✗ Natural regeneration NR 42 - - ✗ Natural regeneration NR 43 - - ✗ Natural regeneration NR 44 - - ✗ Natural regeneration NR 45 19.2560 -99.9576 ✓ Natural regeneration NR 46 - - ✗ Natural regeneration NR 47 19.2557 -99.9554 ✓ Natural regeneration NR 48 19.2571 -99.9563 ✓ Natural regeneration NR 49 19.2566 -99.9559 ✓ Natural regeneration NR 50 19.2558 -99.9574 ✓ Natural regeneration NR 51 19.2575 -99.9574 ✓ 67 Table S2. Ten-fold cross-validation (CV) schemes on the three pre-established statistical models to the predictive power of the top soil variables on the RDA vectors in Abies religiosa. Predictive models were developed between a training and a validation dataset, which have different TRN/TST sizes. Method Model TRN/TST Across-groups NR → RF 34/31 Resampling 50 %’s sample 33/32 75%’s sample 48/17 Compound NR + (0.5*RFTRN) → 0.5*RFTST 49/16 68 Table S3. Mean and standard error (SE) for the 21 phenotypic traits surveyed in a Sacred fir (Abies religiosa) trial site in central Mexico, followed by t-student results for the response of morphological and physiological phenotypes performed between two groups of individuals; natural regeneration (NR), and introduced saplings (RF). Phenotypic trait Natural regeneration (NR) Reforestation (RF) t-test P-value Mean SE Mean SE Growth traits Total height (cm) 140.6 ± 6.5 93.5 ± 3.21 -6.46 *** Frond height (cm) 96.7 ± 5.85 68.9 ± 3.15 -4.19 *** Steam diameter (cm) 1.6 ± 0.09 0.97 ± 0.03 -6.76 *** Base diameter (cm) 1.95 ± 0.1 1.3 ± 0.04 -6.14 *** Above-ground biomass (kg) 582 ± 65 198 ± 16 -5.71 *** Crown radio (cm) 53.0 ± 2.8 32.9 ± 1.0 -7.46 *** Growth in 2017 (cm) 24.2 ± 2.0 23.3 ± 1.6 -0.36 Ns Growth in 2016 (cm) 26.38 ± 2.06 10.4 ± 1.18 -6.73 *** Average anual growth (cm) 21.23 ± 1.31 17.68 ± 0.81 -2.29 * Needle length (mm) 19.4 ± 0.23 19.1 ± 0.2 -0.76 Ns Above-ground volumen (m3) 0.38 0.05 0.085 0.007 -6.18 *** Wood density (g/cm3) 0.54 ± 0.02 0.41 ± 0.01 -6.12 *** Physiological Traits Water potential (MPa) -0.32 ± 0.015 -0.47 ± 0.02 -6.23 *** Relative water content (%) 74.6 ± 1.9 65.7 ± 1.4 -4.01 *** Specific leaf area (cm2/g) 0.038 ± 0.001 0.039 ± 0.001 0.21 Ns Relative growth rate (g g−1d−1) 1.32 ± 0.15 1.54 ± 0.15 1.16 Ns 69 Leaf N (mg N/g leaf) 19.3 ± 2.6 22.9 ± 2.05 -1.51 Ns Leaf P (mg P/ g leaf) 1.28 ± 0.1 1.81 ± 0.09 -4.11 *** Leaf N:P ratio 15.4 ± 2.9 12.5 ± 0.9 1.34 Ns *, P-value < 0.05; **, P-value < 0.01; ***, P -value < 0.001 Table S4. Eigenvalues, cumulative percent variation, and eigenvectors of the first six principal components (PCs) for ten plant traits surveyed in a sacred fir (Abies religiosa) trial site in central Mexico. Eigenvalues Components PC1 PC2 PC3 PC4 PC5 PC6 Eigenvalue 2.97 1.91 0.97 0.79 0.7 0.56 Variance cumulative 33.09 54.36 69.16 80.01 86.25 90.93 Trait PC1 PC2 PC3 PC4 PC5 PC6 Total height 0.71 0.49 0.03 -0.11 -0.21 -0.04 Steam diameter 0.59 0.53 0.14 -0.06 -0.16 -0.14 Crown radio 0.65 0.44 -0.07 -0.08 -0.05 -0.15 Growth in 2016 0.64 -0.24 -0.03 -0.46 0.6 0.42 Needle length 0.15 -0.31 0.91 -0.02 -0.19 0.02 Wood density 0.51 -0.55 0.09 0.41 -0.05 0.36 Water potential 0.6 -0.44 0.25 0.35 -0.31 -0.03 Relative water content 0.35 -0.64 -0.03 0.11 0.23 -0.41 Specific leaf area -0.25 0.57 0.23 0.66 0.29 0.13 Leaf P -0.42 0.45 0.3 0.56 -0.36 -0.1 70 Table S5. Results for a permutational multivariate analysis of variance (PERMANOVA) between the phenotypes of reforested and naturally regenerated individuals of sacred fir (Abies religiosa) surveyed in a trial site from central Mexico. Df Sum of Sqs R2 F P-value Origin 1 100,650 0.952 2522 < 0.001 Residual 126 5,028 0.048 Total 127 105,677 1.000 Table S6. Cross-validation results for Admixture analyses of reforested and naturally regenerated individuals of sacred fir (Abies religiosa) surveyed in a trial site from central Mexico. K-values from 2 to 5 were assumed. K- value CV-error K =1 0.509 K =2 0.498 K=3 0.521 K=4 0.550 K=5 0.596 Table S7. Results of a partial canonical correspondence analysis (pCCA) for testing for within-population genotype × environment interaction on three models of phenotypic traits evaluated in sacred fir (Abies religiosa) individuals from a trial site in central Mexico. F, Fisher’s F; Df, degrees of freedom; P-value; R2 adj, adjusted coefficient of determination. Table S8. Eigenvalues and cumulative variance for each axis of a variance partition analysis (pCCA) of phenotypic, genomic and edaphic traits evaluated in sacred fir (Abies religiosa) individuals from a trial site in central Mexico. Components pCCA1 pCCA2 pCCA3 pCCA4 pCCA5 Eigenvalue 0.0042 0.0007 0.0002 0.0001 4.00E-05 Variance cumulative 79.6 94.0 97.2 99.1 99.9 ModelG×E1 ModelG×E2 ModelG×E3 Variance-Constrained 19.45 15.98 21.56 Variance-Unconstrained 80.55 84.02 78.44 F 2.35 1.98 2.69 Df 6 6 6 P-value 0.02 0.08 0.002 R2 adj 0.115 0.0840 0.1400 71 Table S9. Results for an analysis of variance partition analysis on the first five pCCA axes for accounting for the phenotypic variation of sacred fir (Abies religiosa) individuals from a trial site in central Mexico. Components Df X2 F P-value pCCA1 1 0.0050 13.90 < 0.001 pCCA2 1 0.0004 1.20 Ns pCCA3 1 0.0001 0.30 Ns pCCA4 1 0.0001 0.21 Ns pCCA5 1 0.0000 0.07 Ns Residual 59 0.0206 Ns: P > 0.05 Table S10. Results for a phenotypic variation model and statistical contribution of each variable (edaphic and genomic relationship eigenvalues) as estimated with Monte Carlo simulations for sacred fir (Abies religiosa) individuals from a trial site in central Mexico, based on a variance partition analysis (pCCA) followed by Fisher’s F and significance level. Predictors Df X2 F P-value NH4 1 0.0014 3.57 * TN 1 0.0009 2.30 . TP 1 0.0007 1.97 Ns NO3:NH4 ratio 1 0.0004 1.31 Ns GRE1 1 0.0010 2.68 * GRE2 1 0.0012 3.48 * Residual 58 0.0208 ., P-value < 0.1; *, P-value < 0.05; ** 72 Table S11. L ist and putative annotation of contigs containing single nucleotide polymorphisms (SNPs) associated with soil properties in a sacred fir (Abies religiosa) trial site in central Mexico. Soil properties Associated SNPs q-value Gene Name Funtion Ammonium (NH4) locus_634977 1.30-2 NA NA locus_422812 1.99-2 NA NA Total N (TN) locus_288495 8.90-3 - NA locus_635539 8.95-3 Pentatricopeptide repeat (PPR) superfamily protein Protein amino acid binding locus_636923 8.95-3 - NA locus_176834 2.68-2 Glycosyl hydrolase 9B13 Carbohydrate metabolic process locus_496243 2.70-2 NA NA locus_635920 3.87-2 NA NA locus_87407 3.91-2 NA NA NO3:NH4 ratio locus_231253 3.37-3 NA NA locus_628906 1.45-2 NA NA locus_291346 3.16-2 NA NA locus_542357 3.16-2 NA NA locus_567195 3.37-2 NA NA 73 SUPPLEMENTARY FIGURES Fig. S1. Corplot showing statistically significant relationships between selected phenotypic traits in sacred fir (Abies religiosa). Numbers within boxes are Pearson's correlation coefficients. Red indicates a significantly positive correlation, blue a significantly negative correlation. Fig. S2. PCA biplot for the phenotypic variation (growth and physiological traits) of 128 Sacred fir (Abies religiosa) individuals sampled in a trial test in Central Mexico. Individuals had two origins, natural regeneration (NR, blue dots) and an introduced plants from reforestation with foreign germplasm (RF, orange dots). The percentage of the phenotypic variation explained by each component is indicated at each axis. 74 Fig S3: Corplot showing a statistically significant relationship between selected edaphic characteristics in a trial site of sacred fir (Abies religiosa) in central Mexico. Numbers within boxes are Pearson's correlation coefficients. Red indicates a significantly positive correlation, blue a significantly negative correlation. Fig S4 Genetic structure and diversity of studied sacred fir individuals based on 1749 SNPs. A. A principal component analysis (PCA) shows a weak genetic structure in a diversity panel of 65 individuals. The percentage of the variation explained by each component is indicated at each axis. B. Observed heterozygosity for each group of individuals. Red, introduced plants from reforestation (RF); blue, natural regeneration (NR). 75 Fig. S5 Genetic relationship between the 65 sacred fir (Abies religiosa) individuals sampled in a trial site from central Mexico. The density plot of the genomic relationship matrix shows the absence of differentiated groups between samples. 76 Fig. S6 Redundancy analysis (RDA) performed on genomic data from sacred fir (Abies religiosa) individuals sampled in a trial site in central Mexico. RDA performed with 1,749 filtered SNPs in ModelGxP3. Black arrows represent phenotypic traits: Total height (TH), stem diameter (SD), crown radius (CR), growth in 2016 year (G16), WD (wood density), water potential (Ψ), relative water content (RWC), specific leaf area (SLA) and P concentration (PLeaf). Dot color represents individual origin: blue, natural regeneration; red, introduced plants from reforestation with foreign germplasm. A. Components RDA1 and RDA2; B. components RDA1 and RDA3. P-value = 0.12. 77 Fig. S7 Significant genotype – environment association for two annotated contigs containing candidate SNPs (Locus_176834 (left) and Locus_635539 (right)) in a sacred fir (Abies religiosa) trial site in central Mexico. Statistical significance according to LFMM results (Krustal-Wallis one-way; P-value <0.05). 78 CAPÍTULO III ¿Es posible utilizar modelos de selección genómica (SG) en poblaciones naturales de plantas con largos tiempos generacionales y aplicarlas en manejo y conservación? 79 ¿Es posible utilizar modelos de selección genómica (SG) en poblaciones naturales de plantas con largos tiempos generacionales y aplicarlas en manejo y conservación? Arenas S, Jaramillo-Correa JP Resumen Los estudios de mejoramiento genético se realizan solo desde hace pocas décadas en árboles, revelándose como una tarea lenta, complicada y costosa. Sin embargo, los avances en genómica y biología molecular han revolucionado las técnicas de genética cuantitativa tradicional aplicadas a datos familiares para cuantificar la heredabilidad de rasgos fenotipicos. Con ellas, es ahora posible estimar la proporción de la varianza fenotípica explicada por marcadores moleculares sin depender de un pedigrí estructurado. La selección de genotipos basada en estas técnicas busca sobre todo reducir los ciclos reproductivos en plantaciones comerciales, y queda la duda sobre su efectividad en poblaciones silvestres. La selección genómica (SG) estima los efectos de loci potencialmente ligados a rasgos cuantitativos (QTL) evaluados para cientos de individuos con cientos a miles de variantes alélicas distribuidas a lo largo de su genoma, permitiendo evaluar su valor reproductivo genómico (GEBV). La SG permite predecir rasgos complejos, como el crecimiento, el rendimiento y varias propiedades de la madera. Recientemente también se está validando su uso para predecir adaptabilidad de los individuos al ambiente (por ej. sequía) y a las plagas. Aplicado a poblaciones naturales, este enfoque podría orientar programas de manejo y conservación al predecir fenotipos pre- adaptados a un ambiente futuro. Revisamos el estado del arte actual de la SG en el mejoramiento de árboles y discutimos cómo se podrían aplicar estos modelos predictivos en poblaciones naturales. Destacamos particularmente los desafíos para su implementación, como el manejo de la incertidumbre sobre el parentesco de los individuos y la manera de integrar las interacciones genotipo-ambiente (G × E). Finalmente, discutimos las perspectivas para aplicar este método en programas de migración asistida y adaptación al ambiente, junto a posibles perspectivas tecnológicas como la utilización de métodos de fenotipado de alto rendimiento y de Machine Learning, o la utilización de variantes epigenéticas para mejorar los modelos predictivos. Esta revisión es entonces un llamado a futuros estudios empíricos para ampliar estas técnicas en el manejo y conservación de especies silvestres en su ambiente natural. 80 3.1 Introducción El cambio climático (CC) es una amenaza que pone en riesgo la salud y la adaptación de todas las especies, particularmente las de larga vida como los árboles, afectando su crecimiento y supervivencia1–3. El manejo de la diversidad genética de los árboles es un paso fundamental para garantizar y preservar los servicios agroecosistémicos4,5, utilizando metodologías amigables con el ambiente, como la transferencia de germoplasma6. También, se ha planteado utilizar herramientas genómicas para apoyar el mejoramiento y la adaptación al cambio climático, a través de la selección de materiales élite y la identificación de genes potencialmente adaptativos7. Los árboles son un recurso económico fundamental para la obtención de materias primas (alimento, fibra, resinas, biocombustible y madera), y mejorar la ganancia genética por unidad de tiempo para caracteres asociados a la producción de estas materias primas es el objetivo final de su cría selectiva6. Esta se desarrolla por medio de una serie de pasos que buscan aumentar la frecuencia de alelos ventajosos en rasgos poligénicos como el crecimiento, la calidad de la madera, la producción de frutos y la resistencia a plagas8– 10; lo que a su vez tiene el riesgo de dejar en segundo plano otros rasgos claves para mantener la dinámica de los ecosistemas, como la eficiencia en el uso del agua y la supervivencia11,12. Entre los desafíos para la cría selectiva en árboles se encuentran los largos tiempos generacionales de muchas especies, la baja correlación que existe entre los fenotipos de árboles juveniles y maduros, la variación en las respuestas a cambios temporales del ambiente y las presiones emergentes debido al CC7. Esto conlleva a un interés creciente por conocer los componentes genéticos detrás de sus respuestas a condiciones desfavorables13,14. El progreso en el conocimiento de la base genética de estas respuestas, acompañado de la necesidad de reducir las pérdidas económicas, han promovido la implementación de técnicas para seleccionar árboles con mayor potencial adaptativo o de mejora7. Por esto, el desarrollo metodológico de la selección genómica ha cambiado desde su origen aplicado en animales domésticos y se ha adecuado al estudio de las especies con ciclos de vida largos y con potencial para la conservación en ambientes naturales. Aquí, nos centraremos en cubrir el estado actual de la optimización y aceleración del mejoramiento genético en árboles, explorando la posibilidad de extender estas técnicas al manejo y conservación de poblaciones naturales (PN). La idea central para esta exploración es apoyarse en datos genómicos (p. ej., SNPs; polimorfismos de un solo nucleótido) para orientar 81 los planes de reforestación, conservación, manejo de la diversidad y transferencia de germoplasma, con el objetivo de aumentar la supervivencia de las plántulas y reducir las pérdidas económicas10. Evaluamos si las estimaciones de la proporción de la variación fenotípica debido a factores genéticos (i.e. la heredabilidad) son un parámetro efectivo para hacer un puente exploratorio entre las investigaciones de genética cuantitativa tradicional y los métodos que incluyen marcadores moleculares. Para ello verificamos si existe correlación entre las estimaciones hechas con estas dos aproximaciones conceptuales. La razón detrás de esta hipótesis son los estudios que sugieren que los cálculos de heredabilidad efectuados a partir de caracteres fenotípicos y marcadores moleculares son a menudo similares, incluso entre poblaciones y ambientes diferentes15. Esto nos permitiría visualizar lo que podría suceder si se hace un uso generalizado de predicciones genómicas en poblaciones/individuos silvestres, como ya se ha hecho con plantaciones comerciales7. En segundo lugar, realizamos una breve revisión histórica sobre cómo y con qué fin se integran la genética cuantitativa tradicional y los estudios con marcadores para predecir fenotipos en árboles. Luego, describimos los desafíos para aplicar estos métodos en poblaciones naturales a la luz de algunos resultados prometedores16–18. Finalmente, intentamos echar un vistazo al futuro donde los avances progresivos de la selección o predicción genómica (SG y PG) proporcionarían una plataforma poderosa para realizar estudios adaptativos y predictivos ante el cambio climático. 3.2 El cambio climático y la importancia de los árboles El cambio climático está provocando variaciones en el sistema climático de la Tierra debido a la acumulación de gases de efecto invernadero19. Se prevé que los regímenes climáticos para los próximos 100 años estén caracterizados por un aumento de la temperatura, la concentración de CO2 en la atmósfera y la frecuencia de eventos extremos (p. ej., sequías prolongadas, huracanes)14,20. Todo esto debería impactar en el rendimiento y productividad de los ecosistemas, poniendo en riesgo la capacidad adaptativa de las especies, especialmente las de larga vida, como los árboles1,21. Los árboles juegan un rol importante en el complejo equilibrio biológico del planeta, ya que aportan servicios agro-ecosistémicos que facilitan la recarga de acuíferos y el secuestro de carbono. También reducen la degradación del suelo y ayudan a mitigar la inseguridad alimentaria en diversas poblaciones humanas19,21. De esta forma, y dada la lenta migración y adaptación genética de los bosques a largo plazo, se anticipa 82 que estos no puedan mantener el ritmo de un cambio ambiental tan acelerado3,11. Para intentar predecir cómo responderán los árboles a este cambio, se necesita conocer las restricciones que afectan su crecimiento y los mecanismos genéticos y funcionales claves involucrados en la respuesta a estas restricciones22. Estas brechas de conocimiento dificultan el pronóstico de las respuestas de los bosques a la amenaza del CC, y llaman a implementar enfoques integrados de gestión del paisaje23 y prácticas de manejo y conservación, como la migración asistida de individuos pre-adaptados que garanticen la estabilidad ecológica24,25. La adaptación local en especies arbóreas se ha documentado a través de una larga historia de experimentos de jardín común, compuestos por individuos de diferentes procedencias; en ellos se evalúan rasgos cuantitativos que reflejan su fitness, como el crecimiento y la supervivencia26,27. La rapidez del CC exige, sin embargo evaluaciones de este tipo en poblaciones naturales para investigar su sensibilidad a las presiones ambientales (eg.28–30). Dado que los jardines comunes son costosos de establecer y mantener, y debido al largo período que toma pasar de su establecimiento a las recomendaciones para el manejo, el desarrollo de análisis moleculares se ve como una aproximación para reducir los ciclos generacionales y hacer predicciones fenotípicas más rápidas para la cría selectiva13,31,32. La utilización de herramientas genómicas ha ayudado a desentrañar la arquitectura de la adaptación local e identificar regiones génicas involucradas en las respuestas adaptativas, mismas que buscan ser integradas en el manejo y conservación de poblaciones naturales1,28,33 Un ejemplo son las especies forestales que usualmente se distribuyen a lo largo de clinas climáticas, para las que se han observado modificaciones adaptativas a lo largo de estos gradientes, como el rebrote en respuesta a la altitud34 o la presencia de cutículas foliares gruesas, que les permiten retener humedad y las protegen de la luz ultravioleta35. 3.3 La heredabilidad: un parámetro ideal en las perspectivas de la selección genómica (SG) en poblaciones naturales (PN) Para descifrar la arquitectura genética de un rasgo complejo, es decir, cuántos y cuáles loci influyen en este, y cómo están distribuidos sus efectos en el fenotipo (size effects), es importante comprender y predecir la evolución de dicho rasgo16. En este sentido, la evolución se entiende como el cambio de las frecuencias alélicas de dichos loci por efecto de la selección natural36,37. Evaluar el efecto de las fuerzas selectivas es necesario para predecir las 83 consecuencias de los cambios ambientales en la adaptación local, la conservación de la diversidad y la idoneidad del germoplasma a ser transferido (ej.25,38). Antes de que la información de marcadores moleculares estuviera disponible, los estudios de genética cuantitativa se basaron principalmente en modelos lineales de efectos mixtos (MLM), aplicados a datos fenotípicos familiares15,39. Estos estudios suponían que los rasgos estaban afectados por un número infinito de genes o loci asociados a rasgos cuantitativos (QTL) con efectos pequeños; estos permitían modelar las (co)variaciones genéticas de los rasgos y su cambio evolutivo, para luego hacer predicciones de los valores genéticos de los individuos a partir de la información de su pedigrí40,41. Con esta suposición, se desarrollaron estudios que cuantificaban el potencial adaptativo a partir de estimaciones de heredabilidad del fenotipo37,42,43. La heredabilidad (h2) es un parámetro clave e intrínseco de las poblaciones44, que mide la importancia relativa de la variación genética aditiva (sg 2) con respecto a la ambiental (se 2), para explicar la variación fenotípica (sp 2) de un caracter15,45. Sin embargo, h2 difiere entre los rasgos y poblaciones evaluados, lo que se traduce a una menor precisión para aquellos que están más afectados por el ambiente que por factores genéticos16,43. Recientemente, con el desarrollo de las técnicas moleculares avanzadas (como la secuenciación de nueva generación), evaluar el potencial adaptativo en organismos no modelo se ha vuelto cada vez más factible. En estos estudios, se identifican cientos a miles de variantes alélicas relacionadas con un rasgo de interés o ‘modelo instrumental’. El modelo instrumental (p. ej. modelo de aprendizaje virtual ‘GBLUP’46) estima la proporción de la sp 2 explicada por una regresión lineal en un panel de (cientos a miles de) marcadores; a esta varianza se le conoce como heredabilidad genómica (hg 2)15,45. Estas técnicas también permiten el uso de métodos sofisticados, como la regresión de todo el genoma (WGR)47, que está basada en el modelo instrumental y tiene un poder estadístico superior al MLM. La WGR se está usando cada vez más para predecir rasgos cuantitativos o categóricos en diversas especies48, brindando la oportunidad de hacer predicciones precisas de la hg 2 sin depender de un pedigrí estructurado. Esto se hace a partir de un gradiente de parentesco de relaciones genómicas aditivas entre los individuos analizados (matriz G), lo que disminuye los intervalos generacionales15,45,46. Sin embargo, debido a las diferencias entre los métodos de genética cuantitativa tradicional y la WGR, es esencial verificar si existe un vínculo entre ambos, para así entender en qué medida el genotipo y el ambiente pueden explicar una gran proporción de la varianza fenotípica (sp 2) 84 entre y dentro de las poblaciones de interés. Sin embargo, el número de reportes en plantas longevas utilizando enfoques cuantitativos clásico supera con creces a los de marcadores, y ambas aproximaciones están sesgadas hacía ciertas familias vegetales como Pinaceae, Myrtaceae y Rosaceae (Tabla 1). 3.4 Revisión bibliográfica de valores de heredabilidad en árboles Realizamos una extensa revisión de la literatura para localizar publicaciones con ecuaciones predictivas que estiman la heredabilidad en sentido estricto (i.e. varianza aditiva) en plantas con ciclos de vida largos. Buscamos artículos científicos en motores de búsqueda como Science Direct, Google Academic, Redalyc y Scopus. Adicionalmente, hicimos una búsqueda de “literatura gris”, como tesis de grado o reportes internos no publicados; en ambos casos, usando palabras clave con operadores lógicos para seleccionar la literatura relevante: “narrow-sense heritability, growth performance, linear mixed model, genomic selection, genomic prediction, additive genetic variance, heritability and SNP, variance components, forest tree, frutal tree y tropical tree”. Una vez localizado un documento que contenía una estimación de h2, extrajimos la información para incorporarla en una base de datos con diversos campos: especie, familia, rasgo, enfoque de estudio; para la hg 2, registramos el tipo y número de marcadores utilizados. Para los estudios que presentaron más de un valor por rasgo y por especie, promediamos los datos disponibles, descartando los valores extremos (cuando los hubo). Los datos recopilados se analizaron con los paquetes devtools, ggpmisc y ggplot2 versión 3.2.249 dentro del programa R50. Se registraron valores pareados para las especies de las que se obtuvieron valores de h2 y hg 2. Con ellos se elaboró una regresión lineal y se calculó la proporción de la heredabilidad perdida, definida como la diferencia entre hg 2 y h2 y estimada con la fórmula (h2 - hg 2) / h2, para los rasgos más documentados en la literatura con el objetivo de identificar si los resultados entre las dos aproximaciones difieren en la proporción de sp 2 retenida. Para las especies con más de un estudio reportando alguna de las heredabilidades, se seleccionó aleatoriamente uno de los valores, mientras que para aquellas en las que hubo más de dos reportes de ambas aproximaciones, se seleccionaron dos estudios de cada tipo, también de forma aleatoria; esto con el objetivo de aumentar el tamaño de muestra del análisis. 85 Inicialmente, las regresiones lineales revelaron una correlación entre h2 y hg 2 para explicar la sp 2 reportada (R2 = 0.22, 0.31, 0.12 y 0.17 y P-values = 0.004, 0.001, 0.2 y 0.18; Fig. 1) para los caracteres más estudiados en árboles: altura, diámetro, densidad de la madera y rendimiento. Dentro de la base de datos revisada, se concluye que los dos rasgos más analizados en las mismas especies de plantas por las dos aproximaciones (genética cuantitativa tradicional y modelo instrumental) fueron la altura total y el diámetro del tallo. Fig. 1 Correlación entre los promedios de h2 vs. hg 2para la altura, el diámetro, la densidad de la madera y el rendimiento promedio estimado en las mismas especies. Las líneas representan la ecuación que ajusta una regresión lineal y el valor de R2 corresponde al coeficiente de correlación de Pearson. Conceptualmente la inconsistencia debida a la ‘heredabilidad perdida’ se atribuye a factores como un número insuficiente de variantes (moleculares) causales dentro del modelo, una alta variación en el desequilibrio del ligamiento (DL) entre los marcadores evaluados y el/los locus(loci) causal (QTL)51 o una elevada interacción genotipo-ambiente (G × E), entre 86 otros52. En la Fig. 2, presentamos el cálculo de ‘heredabilidad perdida’ para los estimados de las dos heredabilidades medias (h2 y hg 2) obtenidas para los rasgos más estudiados en árboles (altura total y diámetro). Esta fue positiva para muchos de los estudios revisados, lo que indica que la heredabilidad obtenida con un enfoque convencional fue mayor a la estimada con métodos basados marcadores moleculares (i.e. izquierda de la línea o hg 2 < h2). Hubo sin embargo algunas excepciones para las cuales el cálculo fue negativo (p. ej. Picea mariana), sugiriendo que el método de marcadores reportó valores mayores al tradicional (i.e. derecha de la línea o hg 2 > h2). No obstante estas diferencias, los cálculos de h2 y hg 2 fueron relativamente similares (aunque en poblaciones diferentes) y confirman que ambos enfoques son probablemente complementarios y contribuyen cada uno a su manera a desenmarañar la arquitectura genética del fenotipo y a entender la evolución del mismo45. Fig 2. Estimaciones de heredabilidad perdida ((h2 - hg 2) / h2) a partir de estudios para una misma especie de árbol. La línea roja representa la ausencia de la misma (h2 = hg 2). 3.5 El camino hacia la SG en poblaciones naturales (PN) Los avances en las técnicas de biología molecular condujeron al desarrollo de los métodos de predicción utilizando aproximaciones WGR, los cuales ayudan a incrementar la eficiencia 87 de los programas de mejora en plantas53. Hasta hace poco, la selección asistida por marcadores (SAM) era la más utilizada en árboles54,55. Con ella se buscaba ubicar y estimar el efecto de QTLs individuales, la mayoría de ellos con grandes efectos fenotípicos41,55 para rasgos simples o binarios y en diferentes poblaciones/ambientes56. Aunque, el SAM daba información valiosa sobre la respuesta adaptativa, esta se limitaba a especies con genomas grandes, tiempos generaciones largos, recursos genómicos limitados y rasgos extremadamente poligénicos o con expresión tardía, como la fenología de las yemas foliares, la calidad de la madera y la altura57,58. Dadas las deficiencias arriba descritas, se comenzaron a realizar mapeos de asociación en genomas “completos” (GWAS) en varias especies59,60, para fortalecer las técnicas de mejoramiento genético. Estos hacían estimaciones de la asociación ‘marcador-rasgo’ entre individuos59,61, proveyendo una mayor información sobre la arquitectura de los rasgos. Estos estudios resultaron en largas listas de genes candidatos potencialmente adaptativos e influenciados por el ambiente (ej. temperatura, sequía y patógenos)23,62,63. Un caso bien documentado es el de las proteínas de choque térmico (Hsps), que podrían estar involucradas en la resistencia al estrés por temperatura y sequía64. Sin embargo, al igual que con el SAM, los GWAS retuvieron pocas variantes de baja frecuencia y con efectos fenotípicos modestos. También generaron una gran cantidad de falsos positivos, es decir genes neutrales que fueron identificados como candidatos65. La falta de poder predictivo de los GWAS para varios rasgos provocó un cambio de paradigma y enfoque técnico. Se sugirió entonces que la selección y predicción genómica (SG y PG) podría ser una buena herramienta para asociar las técnicas de genética cuantitativa clásica y la estimación de asociaciones discretas, ya que permite explorar miles de marcadores distribuidos a lo largo del genoma y estimar valores genómicos de reproducción (GEBV) de una manera más precisa47. Esto a su vez aceleraría las mejoras fenotípicas de rasgos complejos7,8,31,66. La SG fue diseñada para explorar modelos poligénicos en rasgos complejos, incluso para aquellos con baja hg 2, como los caracteres de historia de vida, la fisiología y la interacción genotipo - ambiente (G × E)17,67,68. Las investigaciones en SG solo fueron posibles después del desarrollo de tecnologías de secuenciación masiva, que permitieron incluir un gran número de variantes (p. ej. SNP) que capturen proporciones sustanciales de hg 2 9,69, en lugar de unos pocos marcadores potencialmente causales70. Por ejemplo, diversos estudios utilizaron 88 material genético georreferenciado (diferentes procedencias) plantado en entornos comunes, para estimar la efectividad de la predicción del fenotipo, especialmente del crecimiento, la calidad de madera y la resistencia a enfermedades (ej. 17,71,72). Esto resultaría en un mayor potencial para pronosticar el rendimiento de los individuos y preseleccionar los más adecuados para un plan de manejo específico, lo que aumentaría la ganancia genética y disminuiría los ciclos de selección7,73. Esta práctica se ha concentrado, hasta el momento, en plantaciones de algunas especies “modelo” de climas templados (p. ej. Pinus taeda y Picea abies) y para caracteres comerciales. Falta entonces explorar su potencial en especies menos estudias, particularmente tropicales, en entornos naturales y para caracteres ecológicamente importantes, como la tasa fotosintética, el potencial hídrico, la adaptación al suelo, la ganancia de carbono, la supervivencia, etc74,75. El hecho de que la heredabilidad genómica refleje las relaciones entre individuos15,45, que haya estimaciones similares de hg 2 en el campo y el laboratorio para una misma especie15, y que haya ajuste entre los valores de hg 2 y h2 (ver sección anterior), nos llevan a pensar que la SG podría ayudar a predecir fenotipos individuales en poblaciones naturales, al menos en algunos casos muy específicos (p. ej. poblaciones históricamente pequeñas y aisladas, especies clonales etc.). Esto se argumenta de la siguiente manera: i) la poblaciones naturales podrían ‘imitar’ a las poblaciones parentales de un programa de mejoramiento, en el caso en que estas estén sobre todo compuestas principalmente por parientes que comparten alelos67 (como en poblaciones aisladas de alta montaña). Esto se basa en el hecho de que la SG explota al máximo las relaciones de parentesco entre individuos, omitiendo el pedigrí, incluso en especies de polinización abierta76,77. ii) Las poblaciones naturales históricamente pequeñas y aisladas pueden tener un alto DL entre SNPs y QTLs, dado que sus tamaños efectivos históricos se presumen bajos, lo que resulta en una alta consanguinidad (parientes cercanos) y en niveles reducidos de recombinación78. Esto a su vez facilitaría la implementación de la SG en estas poblaciones. iii) Existen numerosos reportes con exactitudes de predicción aceptables usando una baja densidad de marcadores (~10K SNPs; Tabla 2), lo que haría posible integrar estos métodos en especies poco estudiadas y con información genética escasa, como los árboles tropicales o aquellos amenazados de extinción. iv) Estos métodos además pueden integrar de manera relativamente sencilla la interacción G × E en entornos múltiples17,68, lo que facilitaría la aplicación de la SG a lo largo del rango de distribución de la especie de interés. Finalmente, 89 v) existen resultados de GWAS validados en ambientes naturales para muchas especies60,79; lo que indica que también se pueden hacer predicciones en estas condiciones y que los marcadores candidatos pueden ser incluidos en los modelos predictivos. De hecho, un estudio piloto en Abies religiosa argumenta la posibilidad de hacer predicciones en rasgos morfológicos y fisiológicos en poblaciones de ambientes naturales a partir de un amplio espectro de relaciones de parentesco genético67. Dado los resultados prometedores de este estudio piloto, describimos en la Fig. 3, las dos fases propuestas para implementar la SG en individuos/poblaciones naturales de árboles a largo plazo. En la primera fase se elaborarían y pondrían a prueba los modelos de predicción genómica (PG). Esta comienza con la determinación de un conjunto inicial de árboles de ‘entrenamiento’ (TRN), que son fenotipados y genotipados con un gran número de marcadores. A partir de estos datos, se desarrollan varios modelos predictivos que son posteriormente validados con un segundo conjunto de árboles, o de prueba (TST), que idealmente deberían estar (o se espera que estén) emparentados con los del TRN. Los modelos validados se utilizarán en la segunda etapa, que es donde la SG se pone realmente en práctica. En poblaciones naturales, el TRN estaría compuesto idealmente por cientos o miles de individuos (sin cruces controlados) con edades relativamente similares y muestreados en el mismo año y condiciones; estos son los que van a ‘imitar’ la población parental en un programa de mejoramiento. Lo esperado es que mientras más grande sea el número de estos individuos, mejor será la estimación de los efectos de cada marcador y más robusto será el modelo predictivo. En la segunda fase, los modelos de predicción se aplican en los individuos ‘candidatos a selección’; por ejemplo, aquellos con los que se pretende reforestar o conservar un área determinada. A ellos se le determinarán los genotipos y con ellos se predecirán sus GEBV7,66. Finalmente, los individuos mejor clasificados con respecto su GEBV serían los individuos a integrar en los planes de reforestación, manejo o conservación; estos serían plantados y entrecruzados para producir la siguiente generación e iniciar un nuevo ciclo de SG. 90 Figura 3. Esquema para integrar la selección genómica (SG) en poblaciones silvestres de árboles. Se inicia con el desarrollo de un modelo predictivo para los rasgos de interés (panel superior), éstos se utilizan para los ciclos de selección (panel inferior) y se retroalimentan con los datos generados. La SG utilizaría marcadores distribuidos a lo largo del genoma para estimar conjuntamente sus efectos en el fenotipo a partir de una “población de entrenamiento” (TRN) [Modificado de 10]. Ver texto para una descripción detallada 91 3.6 SG: avances y grandes desafíos en poblaciones naturales de árboles En la tabla 2 se muestra una lista de estudios empíricos en especies de árboles forestales y frutales que han calculado fenotipos a partir de modelos predictivos construidos con marcadores moleculares, la gran mayoría utilizando datos de genotipado de alto rendimiento. En ella se aprecia que hay más estudios para árboles forestales que frutales, y que la exactitud predictiva (r) para la mayoría de los rasgos está entre aceptable (estimaciones entre 0.2 y 0.4) y buena (estimaciones mayores a 0.4). Interesantemente, algunos de ellos son similares o mayores a los obtenidos en estudios genético-cuantitativos tradicionales, basados en pedigrí80,81. En las especies frutales se han evaluado principalmente rasgos relacionados con el rendimiento y la producción del fruto, y en las forestales los relacionados con el crecimiento y las propiedades de la madera. Aunque, se observa que muchos estudios tienen como objetivo el mejoramiento genético de una única población (whole-sample) con una estructura familiar conocida (principalmente medios hermanos66), recientemente se está empezando a trabajar sobre poblaciones con relaciones genéticas bajas o nulas, en individuos derivados de padres silvestres estudiados en ensayos de procedencia (p. ej.18,82) y en estudios en varias localidades, lo que permite medir los efectos de la interacción G × E. Por ejemplo, en la primera generación de árboles plus de Cryptomeria japonica, caracterizadas por relaciones genéticas muy bajas, se observó una exactitud de predicción mayor en los modelos whole-sample que para los de poblaciones individuales. Para los primeros se obtuvieron valores entre 0.193 para la densidad de madera y 0.634 para la fecundidad masculina18. Del mismo modo, en modelos diseñados para plantas de 19 procedencias, y sin ciclos de mejoramiento, se reportaron valores entre 0.05 para la lignina total y 0.30 para el volumen de la madera82. A partir de estos estudios y de algunas investigaciones que han realizado predicciones prometedoras para rasgos fisiológicos y de resistencia a plagas y enfermedades (p. ej.,72,74) incluso en especies clave con plagas naturales83, faltaría confirmar qué tan bien se pueden transferir estos modelos a poblaciones naturales. Uno de los grandes desafíos de la SG es tener en cuenta y explorar los factores que dificultarían su transferencia a poblaciones naturales, como el tamaño de muestra para el fenotipado y genotipado del conjunto TRN y la estructura genética subyacente, o la forma en que varían los rasgos entre individuos jóvenes y adultos84,85, la presencia de interacciones G × E a diferentes escalas espaciales86, el tipo de métodos para desarrollar y probar el modelo87, la cantidad de marcadores que se incluyen en este88 y la manera de evaluar su desempeño a largo plazo89. Algunos de estos desafíos ya se están investigando 92 en poblaciones de mejora genética con cruzas controladas85,87,90,91; explorarlos en poblaciones naturales sería entonces una de las prioridades para poder expandir satisfactoriamente la SG. A continuación, analizamos algunas ideas para explorar los tres primeros factores en poblaciones naturales a la luz de resultados experimentales en plantaciones. 3.6.1 Tamaño poblacional de la población de entrenamiento (TRN) y estructura genética La aplicación de modelos de SG en árboles se basa en la estructura y diversidad genética de las poblaciones reproductoras; esta se usa para explicar las relaciones genéticas de parentesco entre el TRN y los individuos candidatos a selección. Así, un tamaño grande de entrenamiento garantizará una mayor confianza en las estimaciones, ya que tendría una representatividad más adecuada de las relaciones de parentesco (i.e. Ne 40) y por ende de las relaciones genotipo-fenotipo. Esto produciría resultados con una probabilidad menor de estar sesgados. En general, los estudios de PG en árboles se han realizado entrenando los modelos con cientos a miles de individuos muestreados en diseños familiares, mostrando niveles de predicción aceptables para la mayoría de rasgos90,92–94. En poblaciones naturales y dependiendo de la especie, sería complicado tener conjuntos de entrenamiento grandes (por tanto una baja representatividad del Ne de la población), principalmente a causa de los desafíos metodológicos para fenotipificar tantos individuos. Tradicionalmente, los rasgos fenotípicos se determinan mediante mediciones manuales, a menudo destructivas, que requieren mucho tiempo y mano de obra. Muchas medidas son además propensas al sesgo durante su recopilación66; por ejemplo, para rasgos fisiológicos o aquellos relacionados la actividad metabólica, que pueden variar a lo largo del año o incluso durante un mismo día (p. ej., la conductancia estomática y el intercambio gaseoso95). Igualmente, algunos rasgos son complicados de medir para gran número de individuos en campo, como el potencial hídrico luego de un evento de estrés puntual, o la presencia de organismos simbiontes específicos (i.e. a nivel de especie) como micorrizas u hongos endófitos37. En algunos de estos casos, el fenotipo se ha logrado abordar utilizando métodos indirectos (proxies), por ejemplo el área foliar específica (SLA) y la tasa neta de asimilación (NAR) se han utilizado como medida indirecta de la ganancia de CO2 en plantas96,97. El desarrollo de métodos de fenotipado de alto rendimiento (HTP), que son parte integral de la fenómica vegetal y se basan en imágenes de diversas regiones espectrales para su posterior procesamiento informático98, han ayudado a solucionar, al menos 93 parcialmente, varios de los problemas arriba discutidos. Por ejemplo, han permitido deducir cambios fenotípicos después de algún evento ambiental. Estos métodos permiten un fenotipado preciso y no invasivo de numerosas plantas, y por largos períodos de tiempo, que se pueden efectuar para toda la planta (holísticos) o para órganos específicos99. A la par, también se pueden usar para medir rasgos de difícil fenotipificación, como la tolerancia a factores bióticos y abióticos. Por ejemplo, se ha simulado la infección artificial de plagas y calculado la eficiencia en el uso del agua (WUE)74 usando espectroscopía de infrarrojo cercano (NIRS) de isótopos de carbono estable (δ13C) en híbridos de Eucalyptus urophylla × E. grandis. También se han implementado proxies para medir la resistencia a plagas, como la concentración de piceol y el pungenol, que confieren resistencia a la polilla Choristoneura fumiferana en abetos (Picea)72. A parte de la obtención de fenotipos, en poblaciones naturales es difícil conocer el parentesco entre los individuos, por lo que es necesario realizar análisis genético- poblacionales previos para estimarlo, por ejemplo a partir de matrices G100. Dado que los modelos de PG no funcionan muy bien entre individuos poco relacionados o entre poblaciones diferenciadas genéticamente, es indispensable tener de antemano una idea de este factor antes de iniciar la modelización. En la Fig. 4 presentamos un análisis de componentes principales (PCA) extraído de101. Se observa que la diferenciación genética es débil entre poblaciones, es decir que no se observa separación de estas, lo cual es importante para generar buenos modelos de predicción fenotípica. Dicho de otra manera, es más fácil predecir individuos genéticamente similares. Por ejemplo, se reportaron valores predictivos de entre 0.02 y 0.46 para un modelo de dos poblaciones conjuntas de Eucalyptus nitens con diferentes patrones de selección y una diferenciación genética parcial, cuando se realizaron modelos cruzados (i.e. entre poblaciones) estos valores decayeron a -0.07 y 0.08102. Por lo tanto, sería importante asegurarse de trabajar en poblaciones con bajos coeficientes de endogamia y reducida estructura genético- poblacional para tener modelos más precisos y realizar predicciones entre entornos. Al igual que con el parentesco, también se debe determinar el desequilibrio de ligamiento (DL) promedio entre marcadores, y calcular la diversidad genética para tener una idea de la factibilidad de los modelos en la población de interés. El valor de DL va a garantizar que se esté trabajando con el tamaño de muestra óptimo (Ne), asegurando confiabilidad en los cálculos. En caso de querer trabajar con más de una población, también es recomendable contar con información a priori de la especie, a través de estudios de filogeografía y genética cuantitativa, ya que los modelos de PG no funcionan 94 adecuadamente en poblaciones con historias filogeográficas distintas. Un estudio de filogeografía garantizará que se estén utilizando poblaciones genéticamente similares y con historias demográficas equivalentes, que puedan reflejar la presencia de alelos compartidos entre poblaciones67. Generalmente, en el caso de encontrar que las poblaciones están muy diferenciadas entre sí, lo que se acostumbra hacer en cría selectiva es realizar modelos predictivos del total de individuos (p. ej.90), para luego hacer cruzas y transferencias recíprocas en caso de que se obtengan resultados importantes (p. ej. una alta hg 2). Teniendo en cuenta los resultados que se muestran en la Fig. 1, contar con información a priori de la h2 a partir de enfoques tradicionales servirá para darse una idea de cuáles rasgos vale la pena predecir y cuales no (además de que ya se tendría un experimento montado). Fig 4. Análisis de componentes principales (PCA) que representa un caso ideal para el desarrollo de modelos de predicción genómica (La figura fue modificada del estudio de 104), donde la diferenciación genética es débil entre cuatro poblaciones de una especie (ver paleta de colores). 3.6.2 Variación de los rasgos con la edad A diferencia de las plantas anuales, como la mayoría de cultivos agrícolas, la edad en la que se realiza la fenotipificación es importante para hacer buenas predicciones genómicas en árboles. Dado que la correlación entre lo observado en árboles jóvenes y maduros puede cambiar significativamente según el rasgo, la especie y el entorno7. De acuerdo con algunos datos publicados, las predicciones son más efectivas cuando los individuos del conjunto TRN y TST tienen aproximadamente la misma edad. Por ejemplo, al evaluar la altura de híbridos de Picea glauca × P. engelmannii de 3, 6, 10, 15, 30 y 40 años de edad, se observó que la predicción de los modelos fue mucho menor para los individuos más jóvenes (entre los 10 y los 15 años), que para los árboles de 30 y 40 años (cuyas predicciones fueron equivalentes)85. En contraste, se han reportado predicciones similares para las propiedades de la madera para Picea abies de entre 6 y 19 años84. En Populus deltoides se reporta un caso similar, al observarse una correlación aceptable (0.39– 95 0.42) entre la altura de plantas en invernadero (13-15 semanas de edad) con las medidas en campo a los 3- 5 años32. Estas comparaciones indican que puede haber rasgos más ‘estables’, y que no cambian con la edad, y que son ellos los que se deben privilegiar para desarrollar modelos predictivos, probablemente incluyendo algún componente ambiental como co-variable. En la naturaleza, lamentablemente se desconoce el nivel de correlación entre plantas jóvenes y maduras para la mayoría de rasgos; aunque algunas soluciones serían: estandarizar los rasgos de interés corrigiendo por la edad de las plantas (ver p. ej. 103), construir modelos para diferentes rangos de altura o diámetro67 o simplemente utilizar el crecimiento anual relativo de los individuos. Es importante resaltar que los datos obtenidos para especies perennes en diferentes edades se han recopilado principalmente en plantas cultivadas y en condiciones controladas; por lo tanto no pueden ser extrapolados totalmente a lo que se observaría en la naturaleza, dado que allí las presiones ambientales son cambiantes66. Cabe anotar también, que en regiones tropicales puede ser difícil determinar la edad de los árboles, ya que allí, al no haber estaciones, los anillos de crecimiento no están correlacionados con los ciclos anuales, como para los árboles templados. Para ello se podrían utilizar métodos más sofisticados, como los isótopos estables, la estimación de la descomposición de la madera, o simplemente trabajar con la regeneración en claros con una edad conocida104,105. 2.6.3 Interacción genotipo × entorno Los experimentos en diversas condiciones ambientales son esenciales para evaluar la influencia del entorno en los rasgos fenotípicos, y comprender las interacciones entre el genotipo y el ambiente (G × E). Las interacciones G × E han sido bastante estudiadas en árboles y se utilizan para determinar la estabilidad de los genotipos en diferentes condiciones (micro)ambientales86,92. Desde los primeros estudios experimentales90,92,102, se determinaron diferencias para un mismo rasgo entre individuos de diferentes entornos. Esto vendría a implicar que las predicciones genómicas son más efectivas cuando las TRN y TST están en un mismo sitio que cuando se elaboran entre sitios, pues se controla mejor el efecto G×E en el potencial predictivo del modelo. Así, se espera que las estimaciones de un modelo disminuyan cuando se usen entornos cruzados, es decir cuando entrenamos un modelo en una población (TRN) y lo intentamos validar en individuos muestreados en otro sitio (TST). Sin embargo, incluir la interacción G×E en los modelos PG haría más realista 96 la predicción de los fenotipos e incluso podría permitir hacer predicciones entre ambientes o para ambientes no muestreados. En los árboles, la interacción G × E se ha estudiado en sitios con ambientes contrastantes68. Por ejemplo, para individuos de Pinus taeda evaluados en cuatro sitios, se encontró que el modelo dentro de un mismo sitio proporcionó mayor precisión de predicción (0.64–0.74) que el elaborado entre sitios (0.18–0.66)106. Esto también se observó en Picea glauca (predicciones dentro un sitio 0.53–0.83; entre sitios 0.23–0.72)77. Sin embargo, hay que tener en cuenta que el efecto G × E también puede depender de la naturaleza del rasgo. Por ejemplo, esta interacción parece más acentuada sobre el crecimiento que sobre las propiedades de la madera87. En poblaciones naturales únicamente se podría utilizar un modelo elaborado para un sitio (TRN) para intentar predecir los GEBVs en otro lugar (TST) si los entornos cruzados son muy similares y estables en el tiempo, de manera que los rasgos sensibles al ambiente (p. ej. los bioquímicos y la fisiológicos) puedan ser predecibles con mejor exactitud7,74. Es obvio que desarrollar modelos predictivos en ambientes silvestres representa un gran desafío y que sería complicado controlar todas las variables (bióticas y abióticas) que determinan los procesos G × E para asegurar que el entorno de validación sea similar al de entrenamiento. Sin embargo, también se podría intentar predecir el desempeño funcional en múltiples sitios y crear con ellos el modelo predictivo1,24,25. De hacerse correctamente, los modelos podrían integrarse para hacer manejo y mitigación ecológica, e impulsar la recuperación de bosques intervenidos17,75,107. 3.7 SG: ¿una herramienta para la conservación en un futuro cercano? Dada la cantidad creciente de herramientas genómicas disponibles para árboles, de los genes candidatos retenidos a través de estudios GWAS, de los valores aceptables o elevados de h2 reportados en estudios tradicionales, y de los resultados prometedores en los estudios iniciales de PG (Tabla 2), se prevé una adopción más generalizada de estas herramientas para cumplir los objetivos originales del SAM en el mejoramiento y conservación de plantas7,108. Sin embargo, además de los desafíos arriba discutidos, implementar la SG en programas de conservación/manejo adaptativo de poblaciones naturales va a requerir mejorar el valor predictivo de los modelos y exigirá incluir co- variables ambientales (p. ej. utilizando bases de datos como ClimateBC109 y NASA POWER110), como ya se ha hecho en cultivos111. La integración de estas co-variables es fundamental para describir de forma más precisa el desempeño de las poblaciones en 97 diferentes ambientes naturales. Esta integración será un primer paso para la evaluación de las poblaciones naturales en múltiples entornos, incluso en aquellos que no fueron medidos, e identificar sitios adecuados para introducir germoplasma55,112. Un área que habrá que explorar mejor es la elaboración de modelos PG para especies distribuidas en ecosistemas heterogéneos y megadiversos, como los bosques tropicales. En estos ambientes las especies enfrentan presiones selectivas bióticas y abióticas extremadamente variadas33,113 y su variación fenotípica parece estar muy asociada al ambiente29,114. Esto las hace, a su vez, vulnerables a los cambios súbitos, como las olas de sequía1,2; lo que sugeriría que la SG sería una herramienta poderosa para la reproducción selectiva y manejo adaptativo de estos árboles, a través de programas más dinámicos. Por ejemplo, para predecir respuestas conjuntas a los regímenes de lluvias115, la irradiación116, la composición del suelo117 y las interacciones bióticas118. Esto llevaría a proponer medidas de gestión forestal sostenible, manejo de la biodiversidad y transferencia de germoplasma de individuos seleccionados38,119. El caso contrario es el de los ecosistemas urbanos, que han presentado múltiples eventos de fragmentación del paisaje, reducciones en la diversidad, introducción de especies exóticas, aumento de la contaminación y cambios en la temperatura del aire120. Una aproximación utilizado SG podría aumentar la ganancia en patrones y procesos ecológicos; por ejemplo, seleccionando individuos más tolerantes a las condiciones urbanas para hacer forestación121,122, utilizando criterios como el uso del suelo, la estructura de la vegetación, el porcentaje de cobertura del dosel y el uso de especies nativas. El enfoque de manejo de árboles pre-adaptados a estas condiciones podría ayudar a recuperar suelos degradados y mantener la estructura de las comunidades ecológicas urbanas123. Dado que hay especies para las cuales ya se ha determinado su importancia en el ecosistema, y se tienen estudios genético-poblacionales, se pueden desarrollar modelos PG para seleccionar individuos pre-adaptados para forestar y reforestar ecosistemas intervenidos74. Por ejemplo, buscando germoplasma resistente al estrés hídrico o nutricional, para recuperar y preservar las propiedades físicas del suelo, evitar la desertificación o el azolvamiento de los mantos acuíferos. Esto modelos también ayudarían a identificar rasgos con potencial de mejora. Algunos ejemplos de estas especies son la jacaranda (Jacaranda copaia124), el arrayán (Luma apiculata125), el mango (Manguifera indica126) o la guayaba (Psidium guajava127) y diferentes especies tropicales y templadas de sauce (Salix spp.128,129) y álamo (Populus spp.130). 98 Cabe anotar que para varias de las especies mencionadas anteriormente ya existe una gran cantidad información genómica, incluidos algunos genomas de referencia. Estos permitirían identificar e integrar otros tipo de variación en los modelos PG, como la epigenética (ej., la metilación y el control regulador de ARNs no codificante) y el número de copias de genes (CNV)131,132. El papel de los cambios epigenéticos en la variación del fenotipo es cada vez más estudiado y se ha evaluado en un contexto de cría selectiva de árboles133. Estos cambios parecen ser importantes en la adaptación, ya que ocurren mucho más rápidamente que los genéticos134. Dos ejemplos de ello son un estudio que revela la asociación entre la metilación del ADN y las condiciones climáticas de poblaciones naturales de Quercus lobata135 y otro mostró una correlación entre los niveles de metilación del ADN y la producción de biomasa en híbridos de Populus sometidos a diferentes condiciones de irrigación136. Por su parte, algunos estudios en los CNV indican que otros tipos de variación como las translocaciones y duplicaciones cromosómicas están involucradas en efectos fenotípicos que no pueden ser capturados totalmente por los SNPs, y por tanto se incrementa así la heredabilidad perdida131. Aunque la mayoría de ejemplos vienen de animales, como el efecto del gen KIT en el pelaje del ganado137 y la correlación entre el color y las condiciones ambientales138. Por otro lado, se espera que las técnicas de Machine Learning (ML) ayuden a hacer mejores predicciones de PG para ambientes y rasgos múltiples y sobre todo, para desenredar la varianza genética aditiva de los rasgos y los dominados por G × E139. Los desarrollos recientes de ML permitirán construir predicciones más precisas mediante la implementación de variables ambientales fusionadas, la diversidad de microhábitats dentro de una misma población y la divergencia genética entre poblaciones75. Estas técnicas permitirán desarrollar todo lo anterior en un contexto de adaptación de los bosques al cambio climático140, y aprovechar la variación fenotípica de rasgos adaptativos de los árboles. Finalmente, dado que las investigaciones iniciales de SG en árboles comenzaron con estudios de simulación54 y dichos estudios aún se realizan ocasionalmente66, cabe esperar un uso cotidiano de estas para predecir la factibilidad de la PG en poblaciones naturales. Esto será particularmente importante, pues la implementación de modelos predictivos en poblaciones naturales es costosa y prolongada, por los tiempos generacionales largos que tienen la mayoría de los árboles. Esto permitiría desarrollar estrategias óptimas en cada especie, rasgo y variación ambiental específica. 99 Tabla 1. Número de estudios revisados de genética cuantitativa tradicional y basados en marcadores moleculares que reportan valores de heredabilidad para rasgos fenotípicos en árboles entre (1981) y (2020). Tipo de estudio Familia Cantidad de estudios Porcentaje Métodos de genética Pinaceae 74 38.7 cuantitativa tradicional Myrtaceae 37 19.4 Rosaceae 13 6.8 Euphorbiaceae 7 3.7 Fagaceae 11 5.6 Salicaceae 7 3.7 Verbenaceae 5 2.6 Lauraceae 5 2.6 Otras 32 16.9 Total 191 Métodos de regresión de todo Pinaceae 33 29.7 el genoma con marcadores moleculares Myrtaceae 25 22.5 Rosaceae 11 9.9 Euphorbiaceae 8 7.2 Fagaceae 4 3.6 Salicaceae 9 8.1 Malvaceae 4 3.6 Otras 17 15.4 Total 111 Tabla 2. Estudios de selección genómica (SG) para varios rasgos fenotípicos en diferentes especies con tiempos generacionales largos utilizando diferentes modelos estadísticos y plataformas de genotipado de marcadores moleculares de NGS. Especies Tamaño poblacional Plataforma NGS Numero de marcadores Rasgos fenotípicos Modelo de SG Habilidad de predicción Referencia Importancia alimenticia Malus x domestica 1120 SNP array 7.692 Seis (PF) rrBLUP, BL 0.68 a 0.89 [141] Malus 142 Pyrus pyrifolia Nakai 765 SNP array 1.536 18 (C, PF y R) BRR, BL, BA, BB, BCπ, GBLUP y RF 0.2-0.8 [143] Citrus sinensi, C. reticulata, C. limon, C. aurantifolia, C. paradisi y C. máxima 676 SNP array 1.841 Diez y siete (C y PF) RR, GAUSS, RF, BL, EN, BRR, BL, BA, BB y BC 0.05-0.94 [144] 100 Citrus sinensis x C. reticulata 180 DArT array 5.287 Diez (C y PF) rrBLUP 0.53-0.64 [145] Malus 278 SNP array 8,294 Doce (PF) BLUP -0.5 - 0.81 146 Coffea canephora 3570 GBS 38,106 Tres (C, P y R) rrBLUP, BBR, BA, BB, BR, BVS, BCπ, BL, RF y fixedMLR 0 - 0,52 [147] Theobroma cacao 1,345 SNP array 9640 Cinco (R) GBLUP 0.07-0.48 [148] 148 SNP array 3,733 Once (P y R) GBLUP 0.37-0.67 [149] Manihot 358 SNP array 390 Cinco (P y CM) rrBLUP 0.09-0.34 [150] 899 GBS 78,212 Cinco (P y CM) GBLUP, RKHS, BL, RF, BA y BB -0.02-0.6 [151] 429 GBS 63,016 Venti ocho (R) GBLUP, RKHS, BA, BBBC, BA, BL y RF 0,27-0,45 [152] Musa spp 307 GBS 10,807 Quince (P, PF y R) BRR, BL, BA, BB, BC, RKHS 0.39-0.73 [153] Importancia industrial Elaeis guineensis Jacq 112 SSRs y SNPs 135 y 46,933 Seis (P y CM) rrBLUP, BA, BB, BCπ, BL, BRR, SVM y RF 0.19-0.30 [154] 1,218 SNPs 20.000 Seis (P y CM) rrBLUP, BA, B C, BRR y BL 0.43-0.75 [155] Hevea brasilensis 435 SNP array 30,546 C ABLUP, GBLUP y RHKS 0.2-0.8 [156] Hevea brasilensis 330 SSR 332 Uno (Rendimiento) BLR, RKHS, RR- BLUP 0.33-0.6 [157] Fraxinus excelsior 1250 TruSeq (genoma completo) 100-50,000 Uno (R) RR-BLUP 0.46 – 0.63 [83] Jatropha curcas 78 DArT array 1,248 Dos (P) rrBLUP, GBLUP, BBR, BA, BB, BCπ, BL y RKHS 0.46-0.66 [158] Castanea dentata 1230 GBS 71,507 Cinco(R) HBLUP, Bayes C 0.60 – 0.95 [159] Criptomeria japónica 476 SNP array 32,036 Cinco (C, M. Reproductive) GBLUP, RF, Bayes B -0.1 – 0.63 [18] Criptomeria japónica 578 SNP 3,034 Qince (C y M) GBLUP, RF 0.18-0.56 [160] Eucalyptus benthamii 505 SNP array 7,563 Tres (C) ABLUP, GBLUP, BRR, BA, BB, BCπ y BL 0-0.17 [93] Eucalyptus pellita 732 SNP array 12,483 0-0.44 [93] Eucalyptus polybractea 468 SNP array 10,000, - 502,000 Siete (C, terpenos y contenido aceite) ABLUP, GBLUP, Bayes B 0.08-0.79 [161] Eucalyptus cladochalix 480 SNP array 3,879 (Siete (C, M y F) FLORES Bayes A, Bayes B, BAyes C, BRR Calcular como yo [162] Eucalyptus nitens 691 SNP array 9,627 Seis (C y Prop MAd) BLUP, GBLUP 0.18-0.78 [163] Eucalyptus nitens 691 SNP array 12,236 Doce (C y M) rrBLUP, GBLUP -0.06-0.46 [102] Eucalyptus globulus 726 SNP array 3,914 Siete (C, M y R) rrBLUP, BL, BA y BB 0.38 a 0.60 [164] E. globulus 582 SNP array 60000 Cinco (C) BA, BB, BL, rrBLUP y PCR 0,43-0,54 [165] E. robusta 415 DartT array 2,919 Tres (C y M) ENet, GBLUP, RKHS 0.02-0.30 [82] E. grandis 1,575 SNP array 15,040 Siete (C y M) GBLUP 0.76-0.92 [166] (E. grandis, E. urophylla, E. globulus y sus híbridos) 820 y 920 DArT array 3,564 y 3,129 Cuatro (C y M) rrBLUP 0.55 a 0.88 [92] 101 E. urophylla x E. grandis 768 SNP array 24,806 Tres (C y M) GBLUP 0.41-0.75 [71] E. urophylla x E. grandis 949 SNP array 41,304 Ocho (C y M) GBLUP, rrBLUP, BL y RKHS 0.12-0.47 [80] E. urophylla x E. grandis 949 SNP array 41,304 Seis (C y M) rrBLUP 0.19-0.5 [167] E. urophylla x E. grandis 1130 SNP array 3,303 Cuatro (C y F) BLUP 0.63-0.9 [74] Populus trichocarpa 369 SNP array ~1,7 millones Cinco (C y F) rrBLUP 0.09-0.25 [168] Populus deltoides 453 SNP array 68,885 Altura GBLUP 0.25-0.47 [32] Pinus contorta 1,569 SNP array 19,584 Seis (C y M) GBLUP, BB, BC 0.34-0.8 [169] Pinus taeda 790–840 SNP array 4,852 Dos (C) rrBLUP 0.63–0.75 [106] 951 SNP array 4,853 17 (C, R y M) rrBLUP, BA, B Cπ, y BL 0.17 a 0.51 [170] 149 SNP array 3,406 Cuatro (C y CM) rrBLUP 0.30 a 0.83 [171] 165 SNP array 3,461 C rrBLUP y GBLUP 0.37–0.74 [172] 951 SNP array 4,825 Ocho (C) GBLUP 0.66–0.86 [173] 758 GBS 2729-3531 Tres (C y M) rrBLUP 0.09-0.23 [168] Pinus pinaster 661 SNP array 2500 Tres (C) GBLUP, BRR y BL 0.38–0.55 [174] 817 SNP array 4332 Tres (C y M) GBLUP y BL 0.24–0.94 [175] Pinus radiata 523 GBS 58,636 Cinco (C y M) BLUP y GBLUP 0.39-0.65 [163] Pinus radiata 981 SNP array 67,108 Cuatro (C y F) GBLUP, rrBLUP y BL 0.47–0.70 [176] Pinus sylvestris 744 GBS 8719 Siete (C y M) 177] Picea glauca 1694 SNP array 6,385 Doce (C y M) rrBLUP, BRR y BL 0.33 a 0.44 [77] 1748 SNP array 6,932 Cuatro (C y M) rrBLUP y BL 0.52 a 0.79 [100] P. glauca x P. engelmannii 1126 GBS 8,868– 62,198 Siete (C y M) rrBLUP y GRR 0.47–0.77 [81] P. glauca x P. engelmannii 769 GBS 34,570– 50,803 C rrBLUP, GRR y BCπ 0.31–0.47 [85] Picea abies 1370 exome capture 77,116 Cuatro (C y M) GBLUP, RKHS,BRR y BL 0.39-0.81 [178] 714 SNP array 3,914 Siete (C, M y R) GBLUP, ABLUP,BRR,B C y TGBLUP 0.1-0.55 [17] Picea glauca 578 - 1,310 SNP array 5,308 Siete (C y R) GBLUP y ABLUP, BCπ 0.38-0.67 [72] Picea abies 484 SNP array 130,269 Seis (C y M) GBLUP, ABLUP 0.35-0.46 [84] Picea abies Confirmar especie 856 SNP array 4,092 Cinco (C y M) Metiendo ablup es menos GBLUP 0.61-0.74 [179] Picea mariana 734 SNP array 4,993 Cuatro (C y M) rrBLUP 0.74-0.86 [90] Picea sitchensis [180] Pseudotsuga menziesii 1372 Captura de exoma 69,551 Seis (C y M) rrBLUP y GRR 0.78-0.92 [181] 1372 Captura de exoma 69,551 C rrBLUP, GRR y BB -0.15-0.92 [112] 11,759 Captura de exoma 66,969 C ssGBLUP, PBLUP 0.44-0.63 [89] Shorte platyclados 356 DDRadSeq 5,900 Siete (C y M) BL, BRR, BA, BB y BC -0.08-0.26 [182] Abies religiosa 201 GBS 2286 Diez (C, M y F) BRR y RKHS 0.11 – 0.54 [67] NOTA: rasgos de crecimiento C, características de calidad de madera M, características químicas de madera CQ, resistencia a enfermedades R; GBLUP, BLUP genómico; rrBLUP, regresión aleatoria BLUP; BL, Bayesian LASSO; BC, BayesC; BA, BayesA; GRR, regresión ridge generalizada; BRR, regresión ridge bayesiana. 102 3.9 Referencias 1. 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Geographical coordinates for the 213 individuals of Abies religiosa used for GP- modelling. Individuals Origin Experimental site Group No. of Individual Age Latitude Longitude Reforestation Rincón de Guadalupe RF 1 Nine 19.2577 -99.9569 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 2 Seven 19.2570 -99.9566 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 3 Nine 19.2572 -99.9565 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 4 Nine 19.2570 -99.9566 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 5 Eight 19.2570 -99.9565 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 6 Eight 19.2569 -99.9565 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 7 Eight 19.2567 -99.9566 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 8 Eight 19.2568 -99.9564 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 9 Eight 19.2568 -99.9566 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 10 Eight 19.2567 -99.9565 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 11 Eight 19.2566 -99.9566 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 12 Eight 19.2565 -99.9564 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 13 Eight 19.2564 -99.9564 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 14 Eight 19.2563 -99.9563 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 15 Eight 19.2562 -99.9560 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 16 Eight 19.2563 -99.9561 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 17 Eight 19.2563 -99.9560 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 18 Eight 19.2563 -99.9554 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 19 Eight 19.2563 -99.9561 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 20 Eight 19.2565 -99.9561 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 21 Seven 19.2566 -99.9562 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 22 Seven 19.2571 -99.9563 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 23 Seven 19.2575 -99.9568 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 24 Seven 19.2579 -99.9570 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 25 Seven 19.2581 -99.9573 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 26 Seven 19.2576 -99.9566 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 27 Seven 19.2577 -99.9565 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 28 Seven 19.2577 -99.9566 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 29 Seven 19.2580 -99.9566 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 30 Seven 19.2576 -99.9567 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 31 Seven 19.2576 -99.9566 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 32 Seven 19.2575 -99.9564 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 33 Seven 19.2576 -99.9564 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 34 Eight 19.2575 -99.9566 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 35 Seven 19.2574 -99.9565 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 36 Seven 19.2574 -99.9567 130 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 37 Seven 19.2571 -99.9566 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 38 Seven 19.2573 -99.9566 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 39 Seven 19.2568 -99.9563 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 40 Eight 19.2560 -99.9561 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 41 Seven 19.2567 -99.9565 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 42 Eight 19.2567 -99.9563 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 43 Eight 19.2568 -99.9567 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 44 Eight 19.2567 -99.9563 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 45 Eight 19.2567 -99.9563 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 46 Eight 19.2568 -99.9564 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 47 Eight 19.2568 -99.9565 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 48 Eight 19.2569 -99.9565 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 49 Eight 19.2569 -99.9566 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 50 Seven 19.2574 -99.9570 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 51 Seven 19.2581 -99.9572 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 52 Seven 19.2583 -99.9577 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 53 Seven 19.2583 -99.9575 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 54 Seven 19.2583 -99.9575 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 55 Seven 19.2583 -99.9576 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 56 Seven 19.2582 -99.9575 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 57 Seven - - Reforestation Rincón de Guadalupe RF 58 Seven 19.2575 -99.9564 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 59 Eight 19.2563 -99.9565 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 60 Seven 19.2566 -99.9562 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 61 Seven 19.2568 -99.9559 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 62 Seven 19.2567 -99.9558 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 63 Eight 19.2567 -99.9559 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 64 Seven 19.2561 -99.9564 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 65 Eight 19.2564 -99.9564 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 66 Eight 19.2570 -99.9567 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 67 Seven 19.2570 -99.9567 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 68 Seven 19.2572 -99.9556 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 69 Seven 19.2576 -99.9566 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 70 Seven 19.2578 -99.9565 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 71 Seven 19.2571 -99.9563 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 72 Nine 19.2580 -99.9566 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 73 Nine 19.2581 -99.9565 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 74 Nine 19.2578 -99.9562 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 75 Seven - - Reforestation Rincón de Guadalupe RF 76 Nine 19.2572 -99.9565 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 77 Seven - - Reforestation Rincón de Guadalupe RF 78 Seven 19.2560 -99.9567 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 79 Seven - - Reforestation Rincón de Guadalupe RF 80 Nine 19.2578 -99.9560 131 Reforestation Rincón de Guadalupe RF 81 Nine 19.2563 -99.9560 Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 1 Eight 19.2576 -99.9567 Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 2 Eleven 19.2572 -99.9564 Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 3 Twelve 19.2571 -99.9564 Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 4 Nine 19.2571 -99.9568 Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 5 Nine 19.2574 -99.9569 Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 6 Ten 19.2573 -99.9568 Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 7 Eight 19.2577 -99.9571 Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 8 Seven 19.2579 -99.9573 Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 9 Eleven 19.2574 -99.9567 Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 10 Ten 19.2565 -99.9563 Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 11 Twelve 19.2566 -99.9564 Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 12 Nine 19.2566 -99.9563 Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 13 Eight 19.2561 -99.9558 Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 14 Seven 19.2575 -99.9564 Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 15 Nine 19.2580 -99.9571 Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 16 Nine 19.2561 -99.9558 Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 17 Eight 19.2567 -99.9564 Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 18 Eight - - Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 19 Eight 19.2563 -99.9559 Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 20 Ten 19.2575 -99.9570 Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 21 Nine - - Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 22 Nine 19.2573 -99.9567 Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 23 Seven 19.2564 -99.9562 Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 24 Ten 19.2581 -99.9570 Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 25 Ten 19.2575 -99.9570 Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 26 Seven 19.2577 -99.9571 Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 27 Seven 19.2577 -99.9571 Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 28 Nine - - Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 29 Nine 19.2574 -99.9569 Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 30 Seven 19.2567 -99.9559 Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 31 Eight 19.2564 -99.9558 Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 32 Eight 19.2574 -99.9566 Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 33 Seven 19.2573 -99.9567 Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 34 Nine 19.2575 -99.9566 Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 35 Nine - - Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 36 Nine - - Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 37 Nine 19.2574 -99.9564 Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 38 Eight - - Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 39 Ten - - Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 40 Nine 19.2554 -99.9555 Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 41 Nine - - Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 42 Nine - - Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 43 Nine - - 132 Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 44 Seven - - Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 45 Ten - - Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 46 Ten - - Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 47 Eight 19.2557 -99.9554 Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 48 Eight 19.2571 -99.9563 Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 49 Eight 19.2566 -99.9559 Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 50 Eight 19.2558 -99.9574 Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 51 Eight 19.2575 -99.9574 Natural regeneration Rincón de Guadalupe NR 52 Seven - - Natural regeneration San Bartolo SB 1 Eleven 19.2352 -99.9210 Natural regeneration San Bartolo SB 2 Ten 19.2353 -99.9210 Natural regeneration San Bartolo SB 3 Nine 19.2355 -99.9211 Natural regeneration San Bartolo SB 4 Nine 19.2349 -99.9214 Natural regeneration San Bartolo SB 5 Nine 19.2349 -99.9213 Natural regeneration San Bartolo SB 6 Nine 19.2348 -99.9214 Natural regeneration San Bartolo SB 7 Eight 19.2348 -99.9215 Natural regeneration San Bartolo SB 8 Eight 19.2347 -99.9216 Natural regeneration San Bartolo SB 9 Ten 19.2346 -99.9214 Natural regeneration San Bartolo SB 10 Nine 19.2347 -99.9216 Natural regeneration San Bartolo SB 11 Ten 19.2340 -99.9229 Natural regeneration San Bartolo SB 12 Eleven 19.2345 99.9212 Natural regeneration San Bartolo SB 13 Twelve - - Natural regeneration San Bartolo SB 14 Ten 19.2338 99.9212 Natural regeneration San Bartolo SB 15 Ten 19.2336 99.9216 Natural regeneration San Bartolo SB 16 Ten 19.2334 99.9212 Natural regeneration San Bartolo SB 17 Eleven 19.2333 99.9211 Natural regeneration San Bartolo SB 18 Twelve - - Natural regeneration San Bartolo SB 19 Nine - - Natural regeneration San Bartolo SB 20 Twelve 19.2342 99.9212 Natural regeneration San Bartolo SB 21 Seven 19.2347 -99.9217 Natural regeneration San Bartolo SB 22 Nine 19.2346 -99.9221 Natural regeneration San Bartolo SB 23 Eleven 19.2345 -99.9223 Natural regeneration San Bartolo SB 24 Nine 19.2342 -99.9225 Natural regeneration San Bartolo SB 25 Twelve 19.2337 -99.9228 Natural regeneration San Bartolo SB 26 Seven 19.2332 -99.9231 Natural regeneration San Bartolo SB 27 Seven 19.2331 -99.9242 Natural regeneration San Bartolo SB 28 Nine 19.2328 -99.9241 Natural regeneration San Bartolo SB 29 Eight 19.2321 -99.9242 Natural regeneration San Bartolo SB 30 Ten 19.2315 -99.9243 Natural regeneration San Bartolo SB 31 Eleven 19.2324 99.9239 Natural regeneration San Bartolo SB 32 Seven 19.2347 -99.9221 Natural regeneration San Bartolo SB 33 Twelve 19.2347 -99.9217 Natural regeneration San Bartolo SB 34 Six - - Natural regeneration San Bartolo SB 35 Nine - - 133 Natural regeneration San Bartolo SB 36 Ten - - Natural regeneration San Bartolo SB 37 Seven 19.2347 -99.9221 Natural regeneration San Bartolo SB 38 Seven 19.2316 -99.9241 Natural regeneration San Bartolo SB 39 Ten - - Natural regeneration San Bartolo SB 40 Twelve - - Natural regeneration San Bartolo SB 41 Nine - - Natural regeneration San Bartolo SB 42 Nine - - Natural regeneration San Bartolo SB 43 Nine - - Natural regeneration San Bartolo SB 44 Six 19.2268 -99.9219 Natural regeneration San Bartolo SB 45 Seven 19.2268 -99.9219 Natural regeneration San Bartolo SB 46 Seven 19.2269 -99.9217 Natural regeneration San Bartolo SB 47 Seven 19.2270 -99.9214 Natural regeneration San Bartolo SB 48 Ten 19.2273 -99.9215 Natural regeneration San Bartolo SB 49 Seven 19.2274 -99.9215 Natural regeneration San Bartolo SB 50 Seven 19.2273 -99.9215 Natural regeneration San Bartolo SB 51 Eight 19.2274 -99.9215 Natural regeneration San Bartolo SB 52 Seven 19.2276 -99.9217 Natural regeneration San Bartolo SB 53 Six 19.2275 -99.9218 Natural regeneration San Bartolo SB 54 Nine 19.2277 -99.9221 Natural regeneration San Bartolo SB 55 Nine 19.2277 -99.9222 Natural regeneration San Bartolo SB 56 Nine 19.2280 -99.9221 Natural regeneration San Bartolo SB 57 Nine 19.2281 -99.9219 Natural regeneration San Bartolo SB 58 Nine 19.2280 -99.9218 Natural regeneration San Bartolo SB 59 Eight 19.2278 -99.9219 Natural regeneration San Bartolo SB 60 Nine 19.2277 -99.9220 Natural regeneration San Bartolo SB 61 Nine 19.2276 -99.9219 Natural regeneration San Bartolo SB 62 Eight 19.2277 -99.9219 Natural regeneration San Bartolo SB 63 Eight 19.2277 -99.9217 Natural regeneration San Bartolo SB 64 Seven 19.2275 -99.9215 Natural regeneration San Bartolo SB 65 Seven 19.2276 -99.9229 Natural regeneration San Bartolo SB 66 Six 19.2210 -99.9278 Natural regeneration San Bartolo SB 67 Seven 19.2290 -99.9217 Natural regeneration San Bartolo SB 68 Six 19.2220 -99.9213 Natural regeneration San Bartolo SB 69 Six 19.2324 -99.9239 Natural regeneration San Bartolo SB 70 Seven 19.2282 -99.9215 Natural regeneration San Bartolo SB 71 Seven 19.2282 -99.9216 Natural regeneration San Bartolo SB 72 Seven 19.2282 -99.9216 Natural regeneration San Bartolo SB 73 Seven 19.2282 -99.9219 Natural regeneration San Bartolo SB 74 Seven 19.2282 -99.9219 Natural regeneration San Bartolo SB 75 Seven 19.2281 -99.9219 Natural regeneration San Bartolo SB 76 Seven 19.2281 -99.9218 Natural regeneration San Bartolo SB 77 Six 19.2280 -99.9222 Natural regeneration San Bartolo SB 78 Seven 19.2276 -99.9222 Natural regeneration San Bartolo SB 79 Seven - - 134 Natural regeneration San Bartolo SB 80 Seven - - Table S2. Five cross-validation schemes in the four pre-established ‘across-groups’ statistical models to test for GP-predictability in Abies religiosa. Predictive models were developed between a training group (GTRN) and validated in a testing group (GTST). Note that the size and composition of training/testing sets ratio varies for each model. Model (GTRN → GTST) Training set size TRN = 0% TRN = 10% TRN = 20% TRN = 30% TRN = 40% NR → RF 51/77 59/69 66/62 74/54 82/46 SB → RF 73/77 81/69 88/62 96/54 104/46 NR → SB 51/73 58/66 66/58 73/51 80/44 SB → NR 73/51 78/46 83/41 88/36 93/31 Table S3. Pairwise-FST (Weir and Cockerham, 1984) between groups of individuals of Abies religiosa in two test trials from central Mexico. FST-pairwise SB NR RF SB 0.0000 0.0108 0.0103 NR 0.0108 0.0000 0.0114 RF 0.0103 0.0114 0.0000 Table S4. Pairwise-FST (Weir and Cockerham, 1984) between age classes of individuals of Abies religiosa in two test trials from central Mexico. FST-pairwise Six Seven Eight Nine Ten Eleven Twelve Six 0.0000 0.0047 0.0090 0.0026 0.0090 0.0101 0.0145 Seven 0.0047 0.0000 0.0008 0.0023 0.0036 0.0077 0.0076 Eight 0.0090 0.0008 0.0000 0.0025 0.0036 0.0043 0.0071 Nine 0.0026 0.0023 0.0025 0.0000 0.0011 0.0020 0.0052 Ten 0.0090 0.0036 0.0036 0.0011 0.0000 0.0026 0.0056 Eleven 0.0101 0.0077 0.0043 0.0020 0.0026 0.0000 0.0101 Twelve 0.0145 0.0076 0.0071 0.0052 0.0056 0.0101 0.0000 135 Table S5. Mean and standard error of predictive ability with two predictive methods for ten traits in Abies religiosa. The model with the lowest mean observed standard error is indicated in bold. Phenotypic Trait BRR RKHS ry ry Growth traits Total height (TH) 0.402 (0.02)a1,2 0.426 (0.04)a Stem diameter (SD) 0.490 (0.02)a 0.524 (0.03)b Above-ground biomass (AGB) 0.443 (0.03)a 0.452 (0.03)a Crown ratio (CR) 0.383 (0.03)a 0.358 (0.05)a 2016’s Growth (G2016) 0.541 (0.02)a 0.570 (0.02)b Wood density (WD) 0.322 (0.01)a 0.309 (0.01)a Physiological traits Water potential (Ψ) 0.434 (0.03)a 0.412 (0.03)a Relative water content (RWC) 0.229 (0.03)a 0.248 (0.03)a Specific leaf area (SLA) 0.286 (0.03)a 0.259 (0.03)a Relative growth rate (RGR) 0.090 (0.04)a 0.132 (0.03)b Average 0.362 (0.01)a 0.369 (0.02)a 1 Mean and standard for error of predictive ability of each method were calculated taking a model trained with 90% of individuals and tested with 10% of individuals for whole sample (combined model); 2 Different alphabetic letters indicate significant differences (p<0.05) according to Tukey’s HSD, between the methods for each trait after one-way ANOVA. Table S6. Mean and standard error for heritability values and estimated predictive ability for the two types of traits estimated in 201 Abies religiosa individuals. Growth traits Physiological traits h2 0.287 (0.01)a1 0.196 (0.01)b ry 0.423 (0.03)a 0.269 (0.01)b 1Different letters denote significant differences (p < 0.05) after a one-way ANOVA. 136 Table S7. Mean and standard errors for predictive abilities of ten phenotypic traits in three groups of Abies religiosa individuals. Phenotypic Trait SB NR RF ry ry ry Growth traits Total height (TH) 0.46 (0.02)a1,2 0.35 (0.02)b 0.29 (0.03)c Stem diameter (SD) 0.42 (0.03)a 0.45 (0.02)a 0.38 (0.02)b Above-ground biomass (AGB) 0.35 (0.03)a 0.42 (0.03)b 0.37 (0.02)a Crown ratio (CR) 0.51 (0.03)a 0.25 (0.03)b 0.19 (0.02)b 2016’s Growth (G2016) 0.45 (0.03)a 0.58 (0.04)b 0.44 (0.05)a Wood density (WD) 0.3 (0.04)a 0.23 (0.03)a 0.11 (0.05)b Physiological traits Water potential (Ψ) 0.39 (0.04)a 0.41 (0.03)a 0.37 (0.03)a Relative water content (RWC) 0.21 (0.05)a 0.14 (0.05)b 0.04 (0.05)c Specific leaf area (SLA) 0.28 (0.05)a 0.15 0.03)b 0.22 (0.03)a Relative growth rate (RGR) -0.1 (0.08)a 0.15 (0.06)a 0.02 (0.08)a Average 0.327 (0.01)a 0.313 (0.02)a 0.243 (0.02)b 1Predictive ability calculated with models trained with 90% of individuals and tested with 10% of trees using the BRR method; Different letters indicate significant differences between groups (p < 0.05) according to Tukey’s HSD after a one-way ANOVA. 137 Table S8. Mean and standard errors for predictive abilities estimated for four ‘across-groups’ models with five training/testing dataset (TRN/TST) ratios, expressed in percentage and numbers of individuals, and calculated with the BRR method. Model TRN/TST TH SD AGB CR G2016 WD Ψ RWC SLA RGR NR → RF 0% (51/77) 0.124 (0.03) 0.039 (0.04) 0.032 (0.04) 0.113 (0.04) 0.082 (0.03) 0.152 (0.02) 0.137 (0.03) 0.131 (0.03) -0.081 (0.03) 0.120 (0.03) NR → RF 10% (59/69) 0.239 (0.05) 0.155 (0.05) 0.201 (0.03) 0.232 (0.03) 0.299 (0.03) 0.227 (0.05) 0.291 (0.04) 0.110 (0.02) 0.071 (0.02) 0.094 (0.03) NR → RF 20% (66/62) 0.084 (0.03) 0.268 (0.04) 0.265 (0.04) 0.300 (0.02) 0.368 (0.05) 0.276 (0.04) 0.346 (0.02) 0.168 (0.04) 0.069 (0.03) 0.118 (0.04) NR → RF 30% (74/54) 0.330 (0.04) 0.309 (0.03) 0.307 (0.03) 0.262 (0.03) 0.418 (0.05) 0.258 (0.03) 0.397 (0.03) 0.163 (0.04) 0.192 (0.04) 0.106 (0.04) NR → RF 40% (82/46) 0.260 (0.06) 0.358 (0.03) 0.340 (0.02) 0.309 (0.04) 0.438 (0.03) 0.225 (0.01) 0.404 (0.02) 0.240 (0.04) 0.182 (0.05) 0.129 (0.03) SB → RF 0% (73/77) 0.134 (0.03) 0.183 (0.01) 0.105 (0.02) 0.043 (0.01) -0.12 (0.05) 0.143 (0.01) -0.006 (0.04) 0.018 (0.04) 0.188 (0.03) 0.093 (0.04) SB → RF 10% (81/69) 0.102 (0.03) 0.154 (0.02) 0.124 (0.4) -0.005 (0.02) 0.02 (0.04) 0.132 (0.01) -0.054 (0.05) -0.01 (0.03) 0.167 (0.04) 0.082 (0.03) SB → RF 20% (88/62) 0.181 (0.02) 0.173 (0.03) 0.129 (0.03) 0.125 (0.02) 0.136 (0.02) 0.189 (0.04) 0.106 (0.02) 0.068 (0.03) 0.180 (0.02) 0.075 (0.03) SB → RF 30% (96/54) 0.155 (0.05) 0.234 (0.03) 0.186 (0.04) 0.076 (0.02) 0.226 (0.03) 0.232 (0.03) 0.183 (0.05) 0.123 (0.03) 0.246 (0.03) 0.069 (0.05) SB → RF 40% (104/46) 0.136 (0.02) 0.228 (0.02) 0.143 (0.03) 0.081 (0.01) 0.253 (0.03) 0.226 (0.02) 0.176 (0.03) 0.134 (0.04) 0.219(0.03) 0.104 (0.02) NR → SB 0% (51/73) 0.063 (0.02) -0.047 (0.07) -0.025 (0.02) 0.137 (0.03) 0.064 (0.01) 0.073 (0.02) 0.234 (0.01) 0.12 (0.02) 0.158 (0.02) 0.03 (0.02) NR → SB 10% (58/66) 0.195 (0.05) 0.052 (0.09) 0.02 (0.03) 0.179 (0.02) 0.175 (0.04) 0.118 (0.02) 0.253 (0.01) 0.153 (0.01) 0.116 (0.02) 0.037 (0.04) NR → SB 20% (66/58) 0.203 (0.02) 0.193 (0.07) 0.116 (0.04) 0.272 (0.01) 0.182 (0.03) 0.147 (0.01) 0.279 (0.03) 0.161 (0.01) 0.171 (0.04) 0.101 (0.05) NR → SB 30% (73/51) 0.112 (0.08) 0.289 (0.08) 0.207 (0.06) 0.344 (0.04) 0.316 (0.02) 0.181 (0.03) 0.311 (0.02) 0.229 (0.04) 0.303 (0.03) 0.101 (0.03) NR → SB 40% (80/44) 0.212 (0.03) 0.30 (0.07) 0.202 (0.05) 0.338 (0.03) 0.332 (0.04) 0.105 (0.02) 0.332 (0.03) 0.243 (0.04) 0.26 (0.04) 0.138 (0.05) SB → NR 0% (73/51) 0.030 (0.03) -0.062 (0.03) -0.210 (0.01) 0.058 (0.03) 0.173 (0.02) 0.094 (0.03) 0.113 (0.03) 0.065 (0.03) 0.252 (0.02) 0.068 (0.02) SB → NR 10% (78/46) -0.01 (0.03) -0.083 (0.04) -0.155 (0.02) 0.103 (0.04) 0.187 (0.01) -0.049 (0.04) 0.289 (0.05) 0.00 (0.05) 0.232 (0.04) -0.024 (0.04) SB → NR 20% (83/41) 0.090 (0.02) -0.075 (0.05) -0.120 (0.03) 0.081 (0.03) 0.236 (0.05) 0.198 (0.03) 0.350 (0.04) 0.243 (0.03) 0.162 (0.04) -0.069 (0.05) SB → NR 30% (88/36) 0.003 (0.04) 0.088 (0.03) -0.053 (0.03) 0.127 (0.04) 0.296 (0.03) 0.211 (0.04) 0.297 (0.05) 0.273 (0.04) 0.258 (0.05) 0.097 (0.05) SB → NR 40% (93/31) 0.160 (0.03) 0.069 (0.06) 0.136 (0.04) 0.136 (0.05) 0.304 (0.04) 0.261 (0.05) 0.331 (0.04) 0.172 (0.03) 0.221 (0.07) 0.056 (0.06) 138 SUPPLEMENTARY FIGURES Fig S1. Corplot showing statistically significant relationship between phenotypic traits in A. religiosa. Numbers within boxes are correlation coefficients. Red indicates a significantly negative correlation, blue a significantly positive correlation and white non- statistical significance. 139 Fig. S2A. Boxplot of average minor allele frequency (MAF) for SNP markers and S2B percentage frequency distribution of MAF values in seven age classes. Fig S3. Heatmap of the pairwise genomic relationship matrix (G) of Sacred fir trees genotyped with 2286 SNP markers. Heatmap scales show a continuum of realized genetic relationships between individual pairs, from low relationships (red areas corresponding to values below zero), increasing to half-sib relationships (light blue shades, around 0.25), to full-sibs (blue areas, values around 0.5). 140 Fig S4. Scatterplot of pairwise linkage disequilibrium between SNPs (LD) (r2) for three group of Abies religiosa individuals. 141 CAPÍTULO V DISCUSIÓN Y PERSPECTIVAS 142 5.1. Discusión general Comprender cuáles son los componentes de la variación fenotípica que responden a la heterogeneidad ambiental proporciona información para conservar y manejar las poblaciones naturales y favorecer su adaptación y supervivencia en el largo plazo. Una pregunta fundamental en ecología evolutiva es cómo el fenotipo responde a estos componentes y cuáles son los mecanismos involucrados. Por lo tanto, estudiar el impacto ecológico y genético, así como las implicaciones evolutivas de la variación fenotípica, es de gran importancia para el manejo y la conservación de la diversidad biológica. Los estudios que integran la presente tesis permitieron abordar preguntas sobre la configuración de los patrones de variación fenotípica dentro de poblaciones naturales de oyamel (A. religiosa). Luego de una introducción general, se analizaron inicialmente algunos modelos poligénicos microgeográficos para caracterizar la diferenciación genética, las presiones de la heterogeneidad del suelo y la interacción G × E sobre la variación cuantitativa en dos grupos de árboles con orígenes diferentes (regeneración natural y reforestación; capítulo II). En el segundo estudio (capítulo III), se revisaron las posibilidades teóricas de utilizar las herramientas de selección y predicción genómica en poblaciones naturales de árboles, mismas que han sido validadas en plantaciones de especies semi-domesticadas como pinos (Zapata-Valenzuela et al., 2013; Isik et al., 2015, 2016) o abetos (Lenz et al., 2017; Chen et al., 2018). En el tercer estudio (capítulo IV), se utilizaron herramientas estadísticas de predicción genómica (PG) para predecir el desempeño fenotípico dentro de un estudio piloto en poblacionales naturales de oyamel. Desempeño de los modelos poligénicos y de predicción genómica (PG) en poblaciones naturales En el capítulo II se evaluaron modelos poligénicos para explicar/predecir la variación fenotípica de rasgos fisiológicos (7 rasgos) y de crecimiento (12 rasgos) en individuos jóvenes regenerados naturalmente (pool genético local) y reforestados (pool genético introducido) que coexisten entremezclados en un rodal forestal (“Rincón de Guadalupe”) en el centro de México. Se encontró, que a pesar de que no hay información confiable sobre el origen de las semillas de reforestación, los grupos tienen poca diferenciación (FST = 0.012) y niveles similares de variación genética (heterocigosidades observadas de 0.235 y 0.219 para NR y RF, respectivamente; p = 0.092). Estos niveles bajos son además similares a los reportados en otras especies forestales a partir de 143 marcadores obtenidos por secuenciación masiva (Hiraoka et al., 2018; Martins et al., 2018; Collevatti et al., 2019) e indican que los regímenes de manejo antrópico han tenido poco impacto sobre la diversidad genética neta de la población analizada. La evidente distribución restringida de los grupos poblacionales en el área de estudio puede explicar los valores de variación genética en las poblaciones analizadas (capítulos II y IV), aunado a la compleja interacción entre los distintos atributos de historia de vida de la especie estudiada, como su longevidad, la elevada mortalidad en estados juveniles y la reducida dispersión a larga distancia (Ángeles-Cervantes y López- Mata, 2009). También cabe destacar la influencia de factores ambientales e históricos que pueden haber variado en el tiempo y el espacio (Mastretta-Yanes et al., 2018). Siendo así, la actual distribución relictual del oyamel podría ser resultado de uno o múltiples cuellos de botella que tuvieron un impacto histórico en poblaciones que anteriormente poseían una distribución más amplia (Aguirre-Planter et al., 2000). La diferenciación genética débil (Fig. 2; capítulo IV), los valores bajos de endogamia, y un incremento en los niveles de consanguinidad (capítulos II y IV) indican que todos los individuos analizados provienen de un mismo pool genético ancestral. Siendo que la distancia entre San Bartolo y Rincón de Guadalupe es muy corta (7.4 km), es posible que su separación haya sido reciente. Es interesante que estos valores de reducida diferenciación genética son buenos indicadores de que se pueden desarrollar modelos predictivos partir de datos genómicos (capítulo III). Se encontró una amplia variación fenotípica en varios de los rasgos morfo- fisiológicos evaluados en los tres grupos de árboles de oyamel (NR, SB y RF). Esta gran variación es recurrente en coníferas mexicanas, incluso en aquellas con distribución restringida (Alfaro et al., 2014; Gernandt and Pérez-De La Rosa, 2014). Los individuos regenerados naturalmente (NR y SB) tuvieron mayor crecimiento y mejor desempeño fisiológico que los introducidos (RF), mientras que los individuos de los dos grupos naturales tuvieron un desempeño fisiológico similar (Tabla 1; capítulo IV). En el capítulo II se observó que algunos de estos fenotipos (p. ej., TH, SD de crecimiento y Ψ y Pleaf de fisiología), se correlacionan con el grado de diferenciación genética entre individuos (GRE1, Fig. 2B), tal como se ha reportado en estudios previos (Gömöry et al., 2013; Harter et al., 2015). Los rasgos de crecimiento fueron los que más aportaron a la diferenciación entre grupos (ModelG1 vs. ModelG2, Tabla 2 y S6), evidenciando que los rasgos fisiológicos pueden estar influenciados por una mayor cantidad de genes (Bouvet 144 et al., 2020) o estar sujetos a una mayor plasticidad (Mitchell-Odds et at., 2007) que los rasgos de crecimiento analizados (p. ej. altura total, diámetro del tallo y radio del docel). En concordancia con lo esperado en un modelo poligénico, los modelos de PG mostraron heredabilidades genómicas (hg 2) y habilidades de predicción (ry) menores para los rasgos fisiológicos (con la excepción del potencial hídrico), que para los caracteres de crecimiento (Tabla 3 y S6; capítulo IV); evidenciando que los primeros estarían más afectados por la variación ambiental y podrían presentar sesgos asociados al momento de la fenotipificación, dependiendo de las condiciones estacionales/climáticas en las que se midan (Plomion et al., 2016; Lenz et al., 2020). Esto a su vez podría disminuir aún más el poder predictivo de los modelos (capítulo III). Estos rasgos fisiológicos son el resultado de procesos complejos de expresión espacial y temporal, donde interactúan muchos genes (Sasaki, 2008). Aun así, son rasgos importantes para medir el efecto del ambiente sobre el genotipo, por lo que ya se están implementando métodos indirectos (proxies) para medir rasgos potencialmente variables y conjeturar de manera indirecta la respuesta fisiológica al ambiente. Por ejemplo, calculando la eficiencia en el uso de agua (WUE; Bouvet et al., 2020), la respuesta bioquímica a las plagas (Beaulieu et al., 2020) y la relación de biomasa foliar como medida de la ganancia de carbono (Poorter, 2002). Por consiguiente, es de suma importancia incluir métodos de fenotipificación que permitan estimar estas medidas, sobre todo después de algún evento ambiental extremo (p. ej., sequías o heladas severas) en gran cantidad de plantas y (en lo posible) de forma no invasiva, para ser incluidas en modelos predictivos (ver capítulo III). En esta tesis, los parámetros utilizados para cuantificar el estatus de las relaciones hídricas foliares (i.e., Ψ y RWC) reflejaron un mayor ingreso de agua en los grupos naturalmente regenerados (NR y SB) que en los reforestados (capítulos II y IV). Lo cual reflejaría una mayor capacidad de crecimiento a largo plazo (al menos en sus primeros años de vida). Dada la distribución geográfica restringida de A. religiosa, mantener un adecuado suministro hídrico foliar es importante en los ecosistemas de alta montaña, como el Nevado de Toluca, donde la estación seca es bien definida y la precipitación es variable a lo largo del año (i.e., entre junio y septiembre es más intensa; Figura 1). Se sugiere que sin la capacidad de mantener un buen suministro hídrico, la tasa de supervivencia de estas poblaciones podría ser mucho menor e incluso podría impulsar una mayor dormancia fisiológica. 145 Fig. 1 Climograma desde 1950 hasta el presente del APFFNT. Las barras grises muestran el promedio de la precipitación a lo largo de los años desde 1951 hasta el presente y las barras negras muestran el promedio en los dos años de muestreo (2016 y 2017). La raya representa la variación de temperatura a lo largo del año en cada mes. Se ha reportado que en las primeras etapas de vida, la sombra natural bajo el dosel es un factor que aumenta la supervivencia de las plántulas de especies arbóreas en bosque templado (incluidas las de Abies), ya que esta disminuye el estrés hídrico (Cruzado- Vargas et al., 2019) y facilita el crecimiento (Valladares y Niinemets 2008). En particular, la ausencia de diferenciación en rasgos como el SLA, el largo de la acícula y la RGR muestra que, en los grupos (NR y RF), la captura de luz necesaria para producir biomasa para el crecimiento y elongación de órganos aéreos (Poorter 2002) respondió de forma similar a los pulsos de luz (Kitao et al., 2018; Mathur et al., 2018). Similar a lo aquí observado para A. religiosa, otras especies típicas de bosques mexicanos (i.e., Pinus y Quercus) de alta montaña son tolerantes a la sombra, y poseen adaptaciones que maximizan la fijación de luz y controlan la pérdida de agua (Sáenz-Romero et al., 2016; Martins et al., 2018). La diferenciación fenotípica, probablemente ligada a la manipulación de los juveniles durante la plantación, abre la posibilidad de detectar el efecto de las presiones selectivas a nivel intrapoblacional (capítulo II). Al evaluar la influencia de los patrones genéticos y de la heterogeneidad del suelo en la arquitectura de los rasgos fenotípicos, se encontró que los primeros explicaron una mayor proporción de la varianza en todos los modelos (TVE de la Tabla S6). En el caso de la heterogeneidad del suelo, fueron ciertas variables específicas de fertilidad las que tuvieron influencia en la variación cuantitativa entre grupos de árboles (la disponibilidad de NH4 +, TN, NO3 -:NH4 + y TP). Es interesante notar que estos resultados también indican que los factores adaptativos no están afectando 0 5 10 15 20 25 30 35 0 50 100 150 200 250 300 ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DIC T e m p e ra tu ra ( ◦C ) P re ci p it a ci ó n ( m m m e s- 1 ) PRECIPITACIÓN 1951-2010 PRECIPITACIÓN EN AÑOS DE ESTUDIO TEMPERATURA 1951-2010 146 de la misma forma a los grupos de individuos, a pesar de su escasa diferenciación genética (Fig. 1; capítulo IV). Aun así, dentro de los análisis, la mayor proporción de la variación fenotípica no pudo ser explicada (aproximadamente el 80% de la variación total). Por lo tanto, es probable que los rasgos medidos respondan a plasticidad fenotípica o a presiones selectivas que no se cuantificaron; dicho patrón ya se ha observado en otras especies forestales en condiciones naturales y controladas (Budde et al., 2014; Riordan et al., 2016; Talbot et al., 2017; de Villemereuil et al., 2018). Los resultados obtenidos con nuestros modelos determinaron que al incluir las dos particiones de rasgos (crecimiento y fisiología), la predicción mejoró en comparación con los modelos de particiones individuales (Tabla 3; capítulo II). También se encontró que los dos factores edáficos con influencia más fuertes en la diferenciación de los grupos fueron las heterogeneidades de NH4 + y TN. Estos hallazgos, junto a las catorce asociaciones genotipo-fenotipo (Fig 5, capítulo II) y los valores de hg 2 reportados (capítulo IV), sugieren que la selección natural estaría actuando sobre la evolución de la variación cuantitativa (sp 2) de los rasgos medidos; sobre todo teniendo en cuenta la anotación de dos de los genes candidatos, ambos asociados con la disponibilidad de nitrógeno microambiental (un gen de la super familia de las pentatricopeptide repeat proteins y el gen del glycosyl hydrolase 9B13; Opassiri et al., 2006; Spokevicius et al 2017). Algunos estudios previos han mostrado una considerable respuesta genética a la variación en la composición nutricional y al estrés hídrico del suelo en especies forestales (p. ej., Eckert et al., 2012; Guerrero et al., 2018). En el capítulo IV se observaron diferencias de pH, conductividad eléctrica y nitrógeno total entre los sustratos de los dos sitios evaluados, siendo San Bartolo el sitio con condiciones ligeramente más fértiles para el crecimiento y desarrollo de las plantas de oyamel. Cabe anotar que no se analizó la correlación entre la variación fenotípica y microambiental en este lugar, y que aún hace falta determinar si las diferencias en diámetro de las plantas (Tabla 1), hasta qué punto se pueden explicar por la heterogeneidad del suelo entre sitios, y si se pueden encontrar variantes alélicas asociadas. La variación microgeográfica dentro (‘Rincón de Guadalupe’) y entre sitios (‘Rincón de Guadalupe’ vs. ‘San Bartolo’) es además un llamado a investigar de forma más generalizada los procesos selectivos del suelo a pequeñas escalas, y a buscar genes o regiones genómicas afectadas por dichos procesos si es posible en experimentos controlados. 147 Nuestros resultados apuntan también que existe un efecto de interacción entre el genotipo y el microambiente edáfico (G × E), que actúa sobre sobre una serie de rasgos fenotípicos de los individuos. Esto se confirma con el bajo ajuste predictivo en la validación cruzada (capítulo II) a partir de las variables del suelo. Resultados similares se obtuvieron con las aproximaciones bayesianas de predicción genómica (ver abajo). En otros árboles, predicciones de determinados rasgos fenotípicos en diversas condiciones ambientales también fueron bastante imprecisos, sugiriendo G × E (Resende et al., 2012; Cappa et al., 2016; Suontama et al., 2019). Por lo tanto, incluir la interacción microespacial en estudios de este tipo será fundamental, dadas las enormes presiones selectivas que puede ejercer el suelo sobre la supervivencia de los árboles (Eckert et al., 2012; Pregitzer et al., 2013). Sin embargo, muchos de los estudios en especies forestales se han desarrollado hasta el momento a escalas geográficas grandes (De Mita et al., 2013; Sork, 2018; Zhang et al., 2019), y sin considerar las presiones selectivas del suelo. El proceso de reforestación de las plantas estudiadas ha aparentemente afectado de manera significativa el suelo del bosque, creando un mosaico de microambientes y presiones selectivas planta-suelo. Entre otras se sugiere una disponibilidad diferencial de TN y C (y en general de materia orgánica) entre los individuos NR y RF. Esto probablemente se explica por la alteración del suelo durante el trasplante (i.e., se retiró la capa superficial del mantillo y luego se mezclaron los horizontes superficiales del suelo) que pudo haber generado condiciones edáficas de crecimiento distintas en los individuos RF. Esto indica que las actividades humanas pueden afectar el balance químico natural del suelo, no solo antes del transplante (p. ej., mediante la inoculación de micorrizas y los tratamientos con fertilizantes; Le et al., 2012; Larkin et al., 2017; Bruelheide et al., 2018), sino también durante la plantación en campo. En estudios futuros, se sugiere cuantificar la estructura y función del microbioma asociada a la rizósfera, para investigar el efecto del mismo en el genotipo del individuo (G × E), así como la competencia entre grupos funcionales y otros factores. Apoyándonos en la correlación entre la diferenciación genética y la variación fenotípica presentada en el capítulo II, junto a las características genético-poblacionales descritas en el capítulo III (p. ej., incremento en la consanguinidad, bajo Ne y baja diferenciación genética dentro de la muestra), se validó el uso de modelos de PG en un estudio piloto para probar la factibilidad de implementar estos modelos en plantas jóvenes de poblaciones naturales (capítulo IV). La idea es predecir el desempeño fenotípico de A. religiosa sin depender de información funcional a priori del efecto de los marcadores en 148 el rasgo de interés. Es decir, sin tener que buscar genes causales a priori, ya que las características genético-poblacionales arriba mencionadas favorecen la presencia de alelos compartidos entre individuos, que son la base teórica de los modelos de predicción genómica (Müller et al., 2017; Calleja-Rodríguez et al., 2020). En otras palabras, los patrones de diferenciación y parentesco indicarían que las poblaciones relictuales (como el caso de A. religiosa) pueden “imitar” las poblaciones fundadoras de los programas de mejoramiento, lo que a su vez permite crear modelos predictivos. Algunos ejemplos que podrían ser comparables a lo presentado en esta tesis son los programas de mejoramiento en especies con relaciones genéticas bajas (Resende et al., 2017; Hiraoka et al., 2018) y las plantaciones forestales durante su primer ciclo de mejoramiento (Rambolarimanana et al., 2018). Nuestros resultados indican que dichos modelos predictivos podrían aplicarse a poblaciones de otras especies con distribución fragmentada, como Taxus baccata en las regiones templadas de Eurasia o la gran mayoría de especies de alta montaña en México; incluso en poblaciones aisladas de especies más cosmopolitas, como las localidades Pinus sylvestris en el sur de España (Calleja-Rodríguez et al., 2020) o las de Pseudotsuga menziesii en el centro de México (Cruz-Nicolás et al., 2011). Todas ellas han mostrado una alta consanguinidad después de periodos prolongados de aislamiento geográfico (González-Martínez at al., 2010; Linares 2020). Aunque aún falta mucha información biológica para la mayoría de las especies forestales, nuestros resultados confirman enfoques prometedores para explorar rasgos adaptativos y que posiblemente acelerarán los programas reproductivos de los árboles (Eckert et al., 2013; Heslot et al., 2015; Lascoux et al., 2016). En esta tesis también además se estudiaron modelos desarrollados para cada grupo de individuos, obteniéndose mayores heredabilidades y habilidades de predicción para los individuos regenerados naturalmente (NR y SB). En este sentido, es importante destacar que los modelos de PG se van a enfrentar a importantes desafíos que permitan la implementación en poblaciones naturales como son: el tamaño de muestra para el fenotipado y el genotipado del conjunto con el cual se entrena el modelo, así como la estructura genética subyacente (la cual debería ser similar entre TRN y TST, capítulo III; Isik et al., 2016; Grattapaglia et al., 2018), la edad de las población de entrenamiento (Ratcliffe et al., 2015), la presencia de los efectos de las interacciones G × E en respuesta a condiciones ambientales naturales en diferentes escalas espaciales (Resente et al., 2012; Ratcliffe et al., 2015), el tipo de métodos para desarrollar y probar el modelo (p. ej. GBLUP, RKHS, BRR, entre otros; Rodríguez-Pérez y de los Campos 2015), la cantidad 149 de marcadores que se incluyen en este (Thistletwaite et al., 2020) y la manera de evaluar su desempeño a largo plazo (Thistletwaite et al., 2019). Las condiciones ambientales naturales de cada sitio parecen influenciar el desempeño de los individuos y sus efectos parecen ser predecibles a nivel local. Esto se sustenta en el modelo construido a partir de individuos regenerados naturalmente y utilizado en plantas introducidas en el mismo lugar (NR → RF), que fue el más eficiente de los modelos cruzados. Éste capturó mejor los efectos para ciertos rasgos (p. ej. G2016, Ψ y SD; capítulo IV, Fig.3), indicando que los modelos de PG con diseño local deberían favorecerse en programas de translocación, para optimizar el rendimiento y supervivencia de los individuos a introducir. Por el contrario, los modelos construidos entre sitios fueron los menos eficientes (SB → NR y SB → RF; capítulo IV). Esto pudo deberse a que la interacción G × E afecta la precisión del modelo entre entornos, tal como ya se ha documentado en plantaciones forestales (p. ej. Resende et al. 2012, Lenz et al. 2017; Thistlewaite et al. 2019). Para ambientes tropicales de alta montaña, la interacción G × E microgeográfica estaría determinada por la variación en la cantidad de luz y los factores edáficos (ver capítulo II), que son dos recursos determinantes para el crecimiento, supervivencia y reproducción de las plantas (Pregitzer et al., 2013; Valladares et al., 2014; Li et al., 2018). Apoyando la problemática de integrar los modelos de PG en las poblaciones naturales descrita en el capítulo III, se observa en nuestros resultados empíricos que incluir la interacción G × E es un desafío que complica la transferibilidad de modelos. Este mismo fenómeno también se ha reportado en otros estudios con especies de mejoramiento forestal (p. ej., Lenz et al., 2017; Ratcliffe et al., 2019). En nuestro caso, la habilidad de predicción de los modelos cruzados solamente mejoró cuando se incluyó germoplasma del entorno objetivo en el conjunto de entrenamiento (capítulo IV). Sin embargo, es necesario considerar que la diferenciación entre plantas solo se evidenció en individuos jóvenes, lo cual no implica que haya patrones de divergencia fenotípica a largo plazo. Lo anterior se podría solucionar, al menos parcialmente, con el diseño de experimentos de jardín común con diferentes procedencias y utilizando réplicas en distintas condiciones (Tiffin y Ross-Ibarra, 2014; Housset et al., 2018; Isabel et al., 2020). Esta aproximación podrá sin duda proporcionar una mejor comprensión de cómo la predictivilidad del fenotipo responde a la interacción G × E (Sork, 2018). Los procesos adaptativos identificados en esta investigación pueden ser resultado de que las poblaciones naturales evaluadas aún mantienen las variantes alélicas 150 adaptativas necesarias para responder a las presiones selectivas ejercidas por el suelo (y probablemente de otros factores). Estas presiones son principalmente la composición nutricional y la asociación con comunidades del suelo. Una de las dificultades de medir adaptación local en coníferas tropicales como A. religiosa es cuantificar el fitness (adecuación biológica) a lo largo de su vida (Ortíz-Bibian et al., 2018). Para poder evaluarlo se necesitan estudios de largo plazo e incluir rasgos demográficos (Peterson et al., 2016). Una medida directa del fitness es la tasa de crecimiento poblacional, que integra la supervivencia, la reproducción, la capacidad para generar bancos de semillas y el crecimiento variable entre las etapas de la historia de vida (Mitchell -Olds et al., 2007; Blanquart et al., 2013; Valladares et al., 2014). En la presente tesis sólo se presentaron datos de crecimiento en plantas juveniles, por lo que aún haría falta incluir en las predicciones, rasgos de diferentes rangos de edades, particularmente de los adultos reproductivos, (Lascoux et al., 2016; Housset et al., 2018; Wachowiak et al., 2018). Esto representa un gran desafío para la mayoría de las investigaciones en genética forestal, que generalmente incluyen una sola generación (i.e., rango de edad). Para comprender mejor la respuesta adaptativa de A. religiosa es necesario diseñar experimentos que permitan poner a prueba la hipótesis de adaptación local en rasgos directamente relacionados al fitness, e incluir diversas poblaciones junto a la variabilidad edáfica. La variabilidad del suelo detectada en dos localidades del Nevado de Toluca (Rincón de Guadalupe y San Bartolo) sugiere que los hábitats de A. religiosa son heterogéneos, por lo que habría que considerar un mayor número de variables que puedan contribuir en procesos adaptativos importantes, incluyendo el microclima, la composición de la vegetación, la competencia, y las interacciones bióticas, como las micorrizas del suelo (Schweitzer et al., 2011; Pregitzer et al., 2013; Li et al., 2018). Teniendo en cuenta tanto la ecología de los bosques de los Abies de México como la de los ecosistemas relictuales alpinos, algunas de las variables más valiosas podrían ser, por ejemplo, la exposición al viento y la cantidad de radiación solar incidente sobre la planta (i.e., efecto de ladera), ambas variables dependen de la ubicación microgeográfica dentro del bosque y se relacionan directamente con la cantidad de transpiración, y por lo tanto con el microclima. Finalmente, sugerimos que el potencial predictivo de los modelos podría mejorar al utilizar estadística frecuentista y modelos de aprendizaje virtual (p. ej. GBLUP), y controlar el efecto G × E a escala microgeográfica (Kubota et al., 2015). Esto resalta la necesidad de cuantificar y caracterizar la variación ambiental a niveles microespaciales 151 en el momento de hacer reforestaciones y demás planes de manejo forestal, ya que los procesos ecológicos y/o evolutivos importantes para el buen desempeño de las plantas podrían estar ocurriendo a esta escala. 5.2. Perspectivas A medida que las tecnologías de secuenciación de ADN continúen mejorando y evolucionando, aumentará la disponibilidad y la calidad de los recursos genómicos para organismos con genomas grandes y complejos, como las coníferas. Estas tecnologías permitirán explorar otros tipos de variación que afecten el fenotipo de las plantas, como la varianza epigenética y la variación en el número de copias de genes, que también podrían ser incluidas en modelos predictivos. Sin embargo, esto requerirá un estudio detallado de su heredabilidad (su naturaleza aditiva o no aditiva), ya que muchas de estas son únicamente fenotipos. Por ejemplo, la varianza epigenética puede usarse para mejorar rasgos valiosos y heredablemente estables, principalmente la tolerancia/resistencia al estrés (p. ej., hídrico o pestes). Se ha visto que cambios en la metilación de elementos transponibles pueden ser responsables de la variabilidad de algunos de estos rasgos (Sow et al., 2018; Wickler et al., 2018), que son especialmente importantes para especies que deberán enfrentar cambios ambientales futuros. La adopción de técnicas combinadas de modelos poligénicos y de PG, será de vital importancia para evaluar los mecanismos y las bases genéticas de la adaptación a las condiciones del ambiente e identificar respuestas específicas ante eventos de estrés (capítulo III). Se prevé que la duración y la intensidad de factores estresantes va a ir aumentando durante los próximos años (p. ej. el calor y la sequía; Dawson et al., 2014), y a muchas poblaciones silvestres de árboles se les dificultará responder a tiempo a desafíos tan súbitos (Mitchell-Olds et al., 2007; Oddou-Muratorio et al., 2020; Santos y Gaiotto, 2020), lo que afectará su capacidad adaptativa (Lascoux et al., 2016; Sork, 2018). Usar estas técnicas sería facilitado por la expansión de herramientas genómicas en árboles forestales y por el número creciente de especies estudiadas; se espera que este número continúe aumentando en el futuro. Entre las especies boreales, algunos buenos candidatos a estudiar son especies de los géneros Betula, y de las tropicales en general. Las metodologías mencionadas pueden capturar relaciones entre rasgos y medio ambiente de múltiples escalas (Bruelheide et al., 2018) en especies arbóreas no modelo (Mayol et al., 152 2020). Dada la complejidad y heterogeneidad de las fuentes de datos transdisciplinarias, Machine Learning (ML) y la conectividad entre estudios de asociación genómica con transcriptómica ofrecen enfoques predictivos y sintetizadores oportunos capaces de fusionar los aspectos más destacados de las técnicas ya nombradas (Depardiu et al., 2021). De esta manera, los modelos generados algorítmicamente ofrecerán nuevas formas de entender sistemas naturales muy complejos (p. ej. G x E; Myburg et al., 2019). De la misma manera en que ya se está utilizando en genómica funcional (Libbrecht y Noble, 2015) y modelado de nichos ecológicos (Phillips et al., 2017). Para poder implementar modelos poligénicos y de predicción genómica para el manejo y conservación de poblaciones naturales de árboles, se necesitará un trabajo intensivo de fenotipado, que este es aún un proceso limitante. Se espera que en los siguientes años se amplíen las bases de datos de rasgos fisiológicos y de crecimiento en especies de árboles clave, como A. religiosa. La utilización de herramientas como la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), de estudios de isótopos estables de carbono δ13C y el intercambio de gases en el infrarrojo ayudarán a desarrollar modelos que incluyan rasgos sensibles al ambiente, como la resistencia a la sequía y otras presiones abióticas (Isabel et al., 2020; Lenz et al., 2020). Sin embargo, evaluar estos rasgos utilizando enfoques tradicionales es complicado y demorado, por lo que será necesario integrar tecnologías de fenotipificación masiva (p. ej. geomática y modelado basado en imágenes o fenotipificación de alto rendimiento; Fiorani and Schurr, 2013), que permitan una evaluación rápida, precisa y eficiente; por ejemplo, mediante la captura de imágenes en varias regiones espectrales (Lebedev et al., 2020). Las tecnologías de detección remota de alta resolución, son un ejemplo de ello; estas permiten obtener y procesar datos fenotípicos y ambientales a gran escala (Fiorani and Schurr, 2013), permitiendo monitorear fenotipos a través del tiempo. Anticipamos que las técnicas de modelado con ML, CNV, transcriptómica y variación epigenética reforzarán las estimaciones de GP y de modelos poligénicos para varios rasgos en estudios multiambiente que tienen como objetivo desenredar la varianza genética aditiva y los componentes genotipo × entorno para entender la arquitectura genómica de la adaptación a las presiones del ambiente. Para esto, podemos esperar un uso más extenso de las simulaciones a nivel de implementación de modelos poligénicos y de PG. De esta manera, los nuevos desarrollos permitirán además construir predicciones más precisas mediante la fusión de variables ambientales, diversidad de microhábitats y 153 divergencia en todo el genoma, todo dentro de un contexto de adaptación al cambio climático en bosques naturales. 5.3 Referencias Aguirre-Planter, E., Furnier, G. R., and Eguiarte, L. E. (2000). Low levels of genetic variation within and high levels of genetic differentiation among populations of species of Abies from southern Mexico and Guatemala. Am. J. Bot. 87, 362–371. doi:10.2307/2656632. Aitken, S. N., and Bemmels, J. B. (2016). Time to get moving: Assisted gene flow of forest trees. Evol. Appl. 9, 271–290. doi:10.1111/eva.12293. Aitken, S. N., and Whitlock, M. C. (2013). Assisted Gene Flow to Facilitate Local Adaptation to Climate Change. Annu. Rev. Ecol. Evol. Syst. 44, 367–388. doi:10.1146/annurev-ecolsys-110512-135747. Aitken, S. N., Yeaman, S., Holliday, J. A., Wang, T., and Curtis-McLane, S. (2008). 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