UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO PROGRAMA DE MAESTRÍA Y DOCTORADO EN INGENIERÍA INGENIERÍA AMBIENTAL – AGUA VÍAS DE REMOCIÓN Y ACTIVIDAD ESTROGÉNICA INVOLUCRADAS EN UN SISTEMA BASADO EN MICROALGAS PARA TRATAR AGUA RESIDUAL CONTAMINADA CON BISFENOL-A Y TRICLOSÁN TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: DOCTORA EN INGENIERÍA PRESENTA: M. en I. ATENGUEÑO REYES KARINA TUTOR PRINCIPAL DRA. MARÍA TERESA ORTA LEDESMA, INSTITUTO DE INGENIERÍA COMITÉ TUTOR DRA. ALMA CONCEPCIÓN CHÁVEZ MEJÍA, INSTITUTO DE INGENIERÍA DRA. PETIA MIJAYLOVA NACHEVA, IMTA CIUDAD UNIVERSITARIA, CIUDAD DE MÉXICO, MARZO, 2024 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. JURADO ASIGNADO: Presidente: Dra. Mijaylova Nacheva Petia Secretario: Dra. Chávez Mejía Alma Concepción 1 er. Vocal: Dra. Váldez Vázquez Idania 2 do. Vocal: Dr. González Sánchez Armando 3 er. Vocal: Dra. Orta Ledesma María Teresa Lugar o lugares donde se realizó la tesis: Instituto de Ingeniería, UNAM, Ciudad Universitaria Laboratorio de Ingeniería Ambiental, LIA TUTOR DE TESIS: Dra. Orta Ledesma María Teresa -------------------------------------------------- FIRMA (Seg u n d a ho j a ) iii El trabajo experimental fue realizado en el Laboratorio de Ingeniería Ambiental del Instituto de Ingeniería de la UNAM que cuenta con certificado de conformidad otorgado por el organismo acreditado Certificación Mexicana, S.C., por haber implementado y mantener un Sistema de Gestión de la Calidad de conformidad con los requisitos de la norma internacional ISO 9001:2015 No. de Certificado CMX C SGC 285 2023, válido en el período del 12 de octubre de 2023 al 11 de octubre de 2026 iv Agradecimientos Al CONAHCyT por el apoyo brindado durante la elaboración de este trabajo. CVU: 779848 Al posgrado de Maestría y Doctorado en Ingeniería Ambiental por la aceptación al programa y por la orientación recibida a lo largo de mi estancia. Al proyecto “Intensificación de los procesos para la obtención de biocompuestos a partir de agua residual” perteneciente a los Grupos Interdisciplinarios de Investigación (GII) del Instituto de Ingeniería de la UNAM (II UNAM). Al Laboratorio de Ingeniería Ambiental (LIA) del Instituto de Ingeniería de la UNAM por las facilidades brindadas para la realización de la experimentación correspondiente. Al personal del LIA por la asesoría y apoyo brindado durante la experimentación correspondiente. A la Mtra. Isaura Yáñez por la capacitación y asesoría recibida en el uso del cromatógrafo de gases y la técnica BLYES. A la Dra. Rosario Iturbe y la maestra Adriana Ramírez por todo su apoyo y disposición para el uso del cromatógrafo de gases. Al Dr. Ignacio Monje Ramírez, por su apoyo y contribuciones a la mejora del presente trabajo. A la Dra. Sharon Velásquez Orta por sus contribuciones y asesoría recibida durante el presente trabajo. Al Dr. Armando González Sánchez por toda la ayuda recibida, así como los comentarios emitidos para la mejora de este trabajo. A la Dra. Idania Váldez Vázquez por sus contribuciones y tiempo dedicado a la revisión de este trabajo. A las doctoras Petia Mijaylova Nacheva y Alma Chávez Mejía por su asesoría a lo largo de estos ocho semestres, así como su tiempo y paciencia. Muchas gracias doctoras por su acompañamiento a lo largo de todo este tiempo. v A la Dra. María Teresa Orta por aceptarme como su alumna, por su asesoría, apoyo y paciencia. Gracias por toda su ayuda doctora. A los compañeros del cubículo 410 del edificio 5 del Iingen, por su ayuda, especialmente a Isael y Eduardo Tecuapa por su apoyo en la técnica BLYES. A Andrea† y Dani Montaño por todo el conocimiento que compartieron conmigo. A Isaac por ser siempre tan amable. A Víctor y Eduardo por ser grandes compañeros. A Sandra y Adrián por todo su apoyo. Y a Erick Corona por toda su ayuda al validar la técnica de cromatografía, sin ti no lo hubiera logrado. A mis amigos de generación de IQ36, Ale, Kevin, Carlos, Myrna, Fidel, Julio, Diana, Chío, por seguir siendo parte de mi vida aún después de la carrera. A mis amigas Jocelyn y Johana por siempre estar ahí cuando las necesito. A Isaac por ser tan buen amigo y aguantar todas las tonterías que digo. A Cheems por llegar a mí de mil maneras y hacerme sonreír. A Paquito, por ser tan gran amigo y siempre molestarme. A mi familia, por siempre apoyarme y estar conmigo cuando más los necesito. Gracias por ser mi apoyo siempre. A mis dos gatas, Mako y Lince por sus maullidos y ronroneos que siempre me daban ánimo de seguir adelante. Ellas han sido toda mi alegría, las adoro. Y, sobre todo, a la UNAM, por ser parte de mi vida desde el CCH, le debo mucho a esta hermosa universidad. La ciencia, muchacho, está hecha de errores, pero de errores útiles de cometer, pues poco a poco, conducen a la verdad Julio Verne vi ÍNDICE Índice de Tablas ................................................................................................................................. viii Índice de Figuras ................................................................................................................................. ix Índice de Gráficos ................................................................................................................................. x RESUMEN ............................................................................................................................................ 1 ABSTRACT .......................................................................................................................................... 2 1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................ 3 2. ANTECEDENTES ........................................................................................................................ 5 3. MARCO TEÓRICO ................................................................................................................... 12 3.1 Contaminantes emergentes .........................................................................................................12 3.1.1 Efectos de los contaminantes emergentes .....................................................................14 3.1.2 Efectos en el medio ambiente ........................................................................................18 3.1.2 Bisfenol-A .....................................................................................................................19 3.1.3 Triclosán ........................................................................................................................21 3.1.4 Disruptores endocrinos ..................................................................................................28 3.1.5 Determinación analítica de contaminantes emergentes .................................................29 3.2 Actividad estrogénica ............................................................................................................33 3.2.1 Medición de la actividad estrogénica ............................................................................33 3.2.2 BioLuminiscence Yeast Estrogen Screen (BLYES) .....................................................34 3.3 Remoción de contaminantes emergentes ..............................................................................36 3.3.1 Adsorción ......................................................................................................................36 3.3.2 Membranas ....................................................................................................................36 3.3.3 Procesos de oxidación avanzada ...................................................................................36 3.3.4 Tratamientos biológicos ................................................................................................37 3.4 Remoción de contaminantes emergentes usando microalgas................................................37 3.4.1 Cultivo y cosecha de microalgas ...................................................................................37 3.4.2 Vías de remoción de contaminantes emergentes ...........................................................39 3.4.3 Reúso de la biomasa ......................................................................................................41 3.5 Legislación y normatividad ...................................................................................................42 3.5.1 México ...........................................................................................................................42 3.5.2 América Latina ..............................................................................................................43 3.5.3 Estados Unidos ..............................................................................................................43 3.5.4 Europa............................................................................................................................43 4. HIPÓTESIS, OBJETIVOS Y ALCANCES ............................................................................. 44 4.1 Hipótesis .....................................................................................................................................44 4.2 Objetivos .....................................................................................................................................44 Objetivo general............................................................................................................................44 Objetivos específicos ....................................................................................................................44 4.3 Alcances......................................................................................................................................44 5. METODOLOGÍA ....................................................................................................................... 45 5.1. Parámetros fisicoquímicos de agua residual sintética y curvas de calibración .....................45 5.1.1. Parámetros fisicoquímicos de agua residual sintética ...................................................45 5.1.2. Curva de calibración de crecimiento de microalgas ......................................................46 5.2. Efecto toxicológico ...............................................................................................................47 5.3. Validación BLYES/GC-MS ..................................................................................................47 vii 5.3.1. Curva de calibración de contaminantes emergentes ......................................................48 5.3.2. Preparación del cultivo de la levadura Saccharomyces cerevisiae ................................49 5.3.3. Dilución de muestras .....................................................................................................50 5.3.4. Preparación de curva estándar 17 -estradiol ...............................................................51 5.3.5. Análisis de actividad estrogénica ..................................................................................52 5.4. Determinación de las vías de remoción de contaminantes emergentes.................................52 5.4.1 Factores bióticos ..................................................................................................................54 5.4.2 Factores abióticos, fotodegradación indirecta .....................................................................54 5.4.3 Factores abióticos, fotodegradación directa.........................................................................54 5.4.4 Blanco ..................................................................................................................................55 5.4.5 Análisis de las muestras .......................................................................................................55 5.4.6 Balance de masa ..................................................................................................................58 5.4.7 Diseño experimental ............................................................................................................59 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................................................ 61 6.1 Efecto toxicológico, determinación EC50 ...................................................................................61 6.1.1 Experimentos control (blanco).............................................................................................61 6.1.2 Bisfenol-A............................................................................................................................62 6.1.3 Triclosán ..............................................................................................................................66 6.2 Efecto de los contaminantes emergentes sobre el consorcio microalgal ....................................69 6.2.1 Bisfenol-A............................................................................................................................69 6.2.2 Triclosán ..............................................................................................................................74 6.3 Remoción de contaminantes emergentes ....................................................................................79 6.3.1 Vías de remoción de BPA y TCS ........................................................................................79 6.3.2 Subproductos de degradación ..............................................................................................88 6.4 Actividad estrogénica .................................................................................................................92 7 CONCLUSIONES .................................................................................................................... 100 8 RECOMENDACIONES .......................................................................................................... 101 9 REFERENCIAS ........................................................................................................................ 102 10 PRODUCTOS DERIVADOS DEL PROYECTO ................................................................. 114 11 ANEXOS .................................................................................................................................... 122 A. Curva de calibración de DQO. ............................................................................................122 B. Medios de cultivo ................................................................................................................123 B1 Medio de cultivo OECD .......................................................................................................123 B2. Yeast Minimal complementado (YMM leu-, ura- comp) ....................................................124 B3. Preparación del stock de S. cerevisiae .................................................................................125 B4. Medio BG-11 .......................................................................................................................125 C. Preparación de soluciones ...................................................................................................125 D. Curvas de calibración para crecimiento de microalgas .......................................................126 E. Validación GC/MS-BLYES ................................................................................................128 Cromatografía de gases ...............................................................................................................128 Actividad estrogénica .................................................................................................................130 viii Índice de Tablas Tabla 1. Remoción de contaminantes emergentes usando microalgas....................................................... 6 Tabla 2. Mecanismos de remoción de contaminantes emergentes usando microalgas ............................... 8 Tabla 3 Trabajos realizados en los que reportan la presencia de triclosán y bisfenol-A en agua residual en la Ciudad de México y la Zona Metropolitana ........................................................................................ 11 Tabla 4 Listado de contaminantes emergentes prioritarios para México, Muñoz (2012) ......................... 13 Tabla 5. Contaminantes emergentes y sus efectos a la salud y el ambiente ............................................. 15 Tabla 6 Efectos de los contaminantes emergentes en fauna (adaptado de Reed, 2016) ............................ 18 Tabla 7 Propiedades fisicoquímicas del bisfenol-A ................................................................................ 20 Tabla 8 Propiedades fisicoquímicas del triclosán ................................................................................... 22 Tabla 9 Presencia de contaminantes emergentes en diversas muestras (ambientales, alimentarias y en humanos) ............................................................................................................................................... 23 Tabla 10 Clasificación de los biosensores (Rodriguez-Mozaz, et al, 2003) ............................................. 34 Tabla 11. Tipos de reactores para cultivo de microalgas ........................................................................ 38 Tabla 12. Métodos para la caracterización de agua residual ................................................................... 45 Tabla 13. Composición del agua residual sintética (ARS) ...................................................................... 46 Tabla 14. Condiciones experimentales para la determinación de vías de remoción y efecto de BPA y TCS .............................................................................................................................................................. 55 Tabla 15. Parámetros a determinar por cada experimento de determinación de vías de remoción ........... 56 Tabla 16 Diseño de bloques para determinación de mecanismos de remoción ........................................ 60 Tabla 17. Porcentajes de inhibición y crecimiento en la determinación de la EC50 para BPA .................. 63 Tabla 18. Concentraciones usadas de BPA en experimentos con microalgas .......................................... 64 Tabla 19. Porcentajes de inhibición y crecimiento en la determinación de la EC50 para TCS .................. 66 Tabla 20. Concentraciones usadas de TCS en experimentos con microalgas .......................................... 68 Tabla 21. Porcentajes cuantificados con respecto a los controles. Experimentos con BPA ..................... 70 Tabla 22 Porcentajes cuantificados con respecto a los controles. Experimentos con TCS ...................... 75 Tabla 23. Remoción de bisfenol-A ........................................................................................................ 80 Tabla 24. Cambio en el pH para experimentos en presencia de BPA ..................................................... 82 Tabla 25. Remoción de triclosán ........................................................................................................... 83 Tabla 26. Cambio de pH en experimentos en presencia de triclosán ...................................................... 85 Tabla 27. Subproductos de degradación de BPA .................................................................................... 89 Tabla 28. Subproductos de degradación de TCS .................................................................................... 91 Tabla 29. Remoción de contaminantes emergentes y actividad estrogénica por tratamientos de microalgas, fotodegradación y oxidación .................................................................................................................. 96 ix Índice de Figuras Figura 1. Rutas de entrada de contaminantes emergentes en el ambiente y en el agua residual. Adaptado de Cortes y Calderón (2011) ................................................................................................................ 13 Figura 2 Ingesta y transporte de contaminantes y nutrientes, sistema planta – suelo (adaptado de Adeel et al, 2017) ............................................................................................................................................ 19 Figura 3. Glándulas endocrinas en el cuerpo humano (Romano, 2012) ............................................. 28 Figura 4 Diagrama de bloques de un espectrómetro de masas (Smith y Thakur, 2017) ..................... 32 Figura 5 Configuración de S. cerevisiae para BLYES (adaptado de Sanseverino et al, 2005) ........... 35 Figura 6 Procesos involucrados en la remoción de contaminantes emergentes usando microalgas como tratamiento (adaptado de Wang et al, 2017) ......................................................................................... 41 Figura 7. Diagrama de flujo general de la metodología a usar ............................................................ 45 Figura 8. Diagrama general de flujo para la validación de la técnica GC/MS-BLYES ...................... 48 Figura 9 Diagrama de la preparación del medio de cultivo y el cultivo de la levadura S. cerevisiae . 50 Figura 10 Dilución de muestras........................................................................................................... 51 Figura 11 Preparación de curva estándar 17 -estradiol; (A) Soluciones stock de 17 -estradiol, (B) Diluciones seriadas de 17 -estradiol .................................................................................................. 51 Figura 12 Esquema para el llenado de las placas serológicas ............................................................. 52 Figura 13 Arreglo experimental para la determinación de las vías de remoción de contaminantes emergentes ............................................................................................................................................ 53 Figura 14. Determinación de EC50 para BPA 17 mg/L, (1a) 0 horas, (1b, 1c) 72 horas. TCS 325 g/L, (2a) 0 horas, (2b, 2c) 72 horas. Vista al microscopio Carl Zeiss Microscopie Axo Lab.A1 aumento 100X ..................................................................................................................................................... 69 Figura 15. Cromatogramas de la remoción de BPA, para ambas concentraciones de SST iniciales y fotodegradación directa e indirecta. Se muestra la remoción a los días 0, 7 y 15. ............................... 82 Figura 16. Constantes de disociación de BPA (Rovani et al., 2020).................................................. 83 Figura 17. Cromatogramas de la remoción de TCS, para ambas concentraciones de SST iniciales y fotodegradación directa e indirecta. Se muestra la remoción a los días 0, 7 y 15. ............................... 85 Figura 18. Disociación de triclosán (Dhillon et al., 2015) ................................................................. 85 x Índice de Gráficos Gráfico 1. Controles (en presencia y ausencia de metanol) en el crecimiento de Desmodesmus sp. y S. obliquus. Experimentos control realizados para BPA ......................................................................... 61 Gráfico 2. Controles (en presencia y ausencia de metanol) en el crecimiento de Desmodesmus sp. y S. obliquus ................................................................................................................................................ 62 Gráfico 3 Crecimiento del consorcio microalgal al ser expuesto a BPA ........................................... 63 Gráfico 4. Porcentaje de inhibición de crecimiento Desmodesmus sp. y S. obliquus en presencia de bisfenol-A ............................................................................................................................................. 65 Gráfico 5. Porcentaje de inhibición de crecimiento de Desmodesmus sp. y S. obliquus en presencia de triclosán ................................................................................................................................................ 67 Gráfico 6 Cambio con respecto al control. Consorcio microalgal expuesto a dos concentraciones distintas de BPA y dos concentraciones distintas de biomasa microalgal. (*P<0.05). ........................ 71 Gráfico 7 Porcentaje de remoción de nutrientes en agua residual sintética en presencia de BPA. (*P<0.05). Nitrógeno amoniacal en presencia de BPA= 17 mg/L mostró tener una remoción ≈100%, por lo que las barras de ambas concentraciones de inóculo no se graficaron. ..................................... 74 Gráfico 8 Porcentaje de incremento con respecto al control. Consorcio microalgal expuesto a dos concentraciones distintas de TCS y dos concentraciones distintas de biomasa microalgal. (*P<0.05) 77 Gráfico 9 Porcentaje de remoción de nutrientes en agua residual sintética en presencia de TCS. (*P<0.05) .............................................................................................................................................. 78 Gráfico 10. Vías de remoción para BPA ............................................................................................. 81 Gráfico 11. Vías de remoción para TCS.............................................................................................. 84 Gráfico 12. Remoción de BPA y TCS y actividad estrogénica en el medio acuoso ........................... 92 Gráfico 13. Actividad estrogénica y sorción de BPA y TCS .............................................................. 93 Gráfico 14. Remoción de BPA y TCS por acción de la fotodegradación y disminución en la actividad estrogénica ............................................................................................................................................ 94 1 RESUMEN En este estudio, se inició con la determinación de la concentración efectiva media (EC50) de bisfenol- A (BPA) y triclosán (TCS), individualmente, para el consorcio microalgal con predominancia de Scenedesmus obliquus y Desmodesmus sp, resultando en 17 mg/L para BPA y 325 g/L para TCS. Los valores de EC50 obtenidos, se usaron para evaluar el efecto que ambos contaminantes emergentes tienen en la remoción de nutrientes, el contenido de biomoléculas y el crecimiento de las microalgas. La concentración de contaminantes emergentes, se cuantificaron por cromatografía de gases y la actividad estrogénica fue determinada con la técnica BioLuminiscent Yeast Estrogen Screen (BLYES) la cual fue validada en el laboratorio. Los experimentos con el consorcio de microalgas, se realizaron con dos distintas concentraciones de microalgas vivas, reportadas como sólidos suspendidos totales (SST) de ≈300 mg/L y ≈500 mg/L, estos experimentos se llevaron a cabo en agua residual sintética. También se realizaron experimentos en los que se evalúo la fotodegradación (lámparas luz blanca fría ≈100 mol/s m2) de los contaminantes emergentes en ausencia de microalgas. Se observó un incremento significativo (P<0.05) en el crecimiento de microalgas, medido como SST, clorofila “a” (Chl-a), lípidos y proteínas en presencia de BPA y TCS. Este incremento intensifica el contenido de biomoléculas (carbohidratos, lípidos y proteínas) de interés comercial, así mismo, la medición y monitoreo de las biomoléculas es un indicador de la exposición de las microalgas a estrés por compuestos emergentes. Del mismo modo, la remoción de nutrientes como nitratos, nitrógeno amoniacal, ortofosfatos y alcalinidad tuvieron una remoción mayor con respecto al control en presencia de BPA y TCS. La eliminación de BPA fue mayor al 95% para ambos SST iniciales, la biodegradación contribuye con un porcentaje superior al 40% de remoción para ambas concentraciones de SST. Para TCS la remoción fue de 61.1% y 86.26% para SST ≈300 mg/L y ≈500 mg/L, respectivamente. Siendo fotodegradación y biodegradación las vías que más contribuyen a la remoción de TCS. En este estudio, se confirmó que la biodegradación y la fotodegradación son las vías de remoción que degradan en mayor cantidad el BPA y TCS, respectivamente. El tratamiento con microalgas presentó una mayor disminución de la actividad estrogénica de TCS a SST ≈500 mg/L de microalgas, con una remoción del 33.35%. este porcentaje corresponde a la combinación de las vías de remoción biodegradación, sorción y fotodegradación. Individualmente, la fotodegradación indirecta disminuye la actividad estrogénica asociada a TCS de 17.99%. Para el caso de BPA en los experimentos en presencia de microalgas y fotodegradación, se observaron incrementos en la actividad estrogénica con respecto al día cero. 2 ABSTRACT This study began with the determination of the median effective concentration (EC50) of bisphenol-A (BPA) and triclosan (TCS) individually for the microalgal consortium dominated by Scenedesmus obliquus and Desmodesmus sp. This resulted in 17 mg/L for BPA and 325 g/L for TCS. The EC50 values obtained were used to evaluate the effect of both emerging contaminants on nutrient removal, biomolecule content and microalgal growth. The concentration of the emerging contaminants was quantified by gas chromatography and estrogenic activity was determined using the laboratory validated BioLuminiscent Yeast Estrogen Screen (BLYES) technique. The experiments with the microalgae consortium were conducted with two different concentrations of live microalgae, reported as total suspended solids (TSS) of ≈300 mg/L and ≈500 mg/L, these experiments were conducted in synthetic wastewater. Experiments were also conducted to evaluate the photodegradation (cold white light lamps ≈100 mol/s m2) of emerging contaminants in the absence of microalgae. A significant increase (P<0.05) in microalgal growth, measured as TSS, chlorophyll "a" (Chl-a), lipids and proteins, was observed in the presence of BPA and TCS. This increase intensifies the content of biomolecules (carbohydrates, lipids and proteins) of commercial interest; likewise, the measurement and monitoring of biomolecules is an indicator of the exposure of microalgae to stress by emerging compounds. Similarly, the removal of nutrients such as nitrates, ammonia nitrogen, orthophosphates and alkalinity had a higher removal compared to the control in the presence of BPA and TCS. BPA removal was greater than 95% for both initial TSS, with biodegradation contributing more than 40% removal for both TSS concentrations. For TCS, removal was 61.1% and 86.26% for TSS ≈300 mg/L and ≈500 mg/L, respectively. Photodegradation and biodegradation were the pathways that contributed most to the removal of TSS. This study confirmed that biodegradation and photodegradation are the removal pathways that contribute most to the removal of BPA and TCS, respectively. Treatment with microalgae showed a greater decrease in the estrogenic activity of TCS at TSS ≈500 mg/L of microalgae, with a removal of 33.35%, which corresponds to the combination of the removal pathways of biodegradation, sorption and photodegradation. Individually, indirect photodegradation reduces the estrogenic activity associated with TCS by 17.99%. In the case of BPA, in the experiments in the presence of microalgae and photodegradation, increases in estrogenic activity were observed with respect to day zero. 3 1. INTRODUCCIÓN Los contaminantes emergentes son compuestos (de origen antropogénico) producidos en la última década hasta hoy, estos se encuentran presentes en el agua en órdenes de g/L o ng/L y presentan efectos adversos a la salud y al ambiente. Su principal característica es que no se pueden remover por procesos convencionales de tratamiento de agua (Barceló y López, 2007; Stuart, et al., 2012 Pal et al., 2010). Estos contaminantes provienen de sustancias de uso común en la vida cotidiana y de uso industrial, como lo son fármacos, productos de cuidado personal, hormonas y esteroides (naturales y sintéticos), pesticidas, herbicidas, plaguicidas, detergentes, plastificantes, medicamentos veterinarios, aditivos alimentarios, retardadores de llama, entre otros (Barceló y López, 2007; Herrero et al, 2012). Entre los efectos adversos que causan al ambiente y la salud es el hecho de que son disruptores del sistema endocrino, es decir imitan las hormonas interfiriendo con los procesos naturales endocrinos, tanto en humanos como en animales (Liu et al., 2009). En el caso de este tipo de contaminantes al afectar el sistema endocrino la respuesta a las dosis de exposición no es lineal, por lo que se ha optado por ensayo tanto in vivo (uso de huevos de peces), como in vitro (uso de levaduras) para determinar la estrogenicidad (Romano, 2012). Debido a que la presencia ambiental de los contaminantes emergentes es del orden de g/L o ng/L, las técnicas de análisis han ido mejorando para poder detectar las bajas concentraciones en las que se presentan en el ambiente. Las principales técnicas utilizadas son la cromatografía, ya sea de gases o líquidos, acoplada a espectrometría de masas, esta combinación no solo permite la cuantificación, también la identificación de los contaminantes presentes, haciendo uso de muestras con poco volumen (McNair y Miller, 2009; Agüera et al., 2012; Nikolaou, 2013). Como ya se mencionó, estos contaminantes no se remueven en procesos convencionales de tratamiento de agua, por lo que se ha hecho uso de procesos terciarios como: la adsorción/absorción, filtración con membranas de ósmosis inversa y nanofiltración; procesos de oxidación avanzada, procesos biológicos aerobios y anaerobios como lodos activados, acoplados a un tratamiento terciario (Rivera-Utrilla et al, 2013; García-Rodriguez et al, 2014; Boshir et al, 2017; Shammas, 2007; Bolong et al, 2009; Rodriguez- Narvaez et al, 2017) y más recientemente el uso de microalgas. Los tratamientos biológicos basados en el uso de microalgas han usado sistemas de estanques de algas de alta tasa (High rates algal ponds, HRAP), foto reactores (tanques agitados, paneles, reactores tubulares). Los géneros de microalgas utilizadas tanto a nivel laboratorio como escala piloto son Scenedesmus, Chlamydomonas, Selenastrum, Chlorella, Nannochloris; mezclas de Chlorella, diatomeas y Stigeoclonium; Chlorella, diatomeas, Chlorella y Scenedesmus o el uso de consorcio alga – bacteria (Matamoros et al, 2015; Matamoros et al, 2016; Xiong et al., 2016). El uso de microalgas o consorcio alga – bacteria para la remoción de contaminantes emergentes involucra mecanismos como adsorción y absorción (biosorción), proceso en el cual los contaminantes 4 emergentes (CE) pasan de la fase líquida a la matriz orgánica de la célula. En la biodegradación existe la ruptura de los CE debido a la catálisis por enzimas producidas por microrganismos. La fotodegradación es llevada a cabo por la acción de la luz solar pudiendo ser la fotodegradación directa (el compuesto es fragmentado por la absorción directa de la luz) o indirecta (la fragmentación del compuesto ocurre por exposición a radicales libres). La volatilización se debe a la remoción de contaminantes emergentes con altos valores de la constante de Henry, dependiendo del flujo de aire al que es expuesto el reactor (Gadd, 2009; Norvil et al, 2016; Wang et al, 2017). 5 2. ANTECEDENTES En México se ha comprobado la presencia de contaminantes emergentes en diversas matrices ambientales como agua residual, agua subterránea, reutilización de agua residual en agricultura dando lugar a su transporte en la recarga de acuíferos, agua superficial, agua de pozo, agua de manantial (Gibson et al., 2007; Chávez et al., 2011; Felix-Cañedo et al., 2013). Como ya se mencionó anteriormente, los contaminantes emergentes se caracterizan por su persistencia en las matrices que los contienen, siendo difíciles de remover en sistemas convencionales. Sin embargo, el uso de microalgas para su remoción es una opción de tratamiento. En la Tabla 1, se resumen algunos trabajos realizados para la remoción de estos contaminantes, se enlistan los contaminantes emergentes removidos, las especies de microalgas usadas, el porcentaje de remoción, la matriz en la que se realizaron los experimentos, el tipo de análisis instrumental efectuado, condiciones experimentales y si se llevó a cabo la determinación de la actividad estrogénica. Existen mecanismos involucrados en la remoción de contaminantes emergentes usando microalgas, en la Tabla 2 se recopilan trabajos publicados para la determinación del mecanismo de remoción, se enlistan los contaminantes emergentes utilizados, especie de microalgas, porcentaje de remoción, mecanismos determinados, técnica de análisis instrumental, y condiciones experimentales. Estas tablas recopilan trabajos reportados tomados como antecedentes, referentes a la remoción de contaminantes emergentes. Como se puede observar, solo hay un trabajo (Tabla 1) en el que se tomó en cuenta la actividad estrogénica del agua residual tratada, y en la Tabla 2 se muestra que los mecanismos de remoción predominantes son la biodegradación y la sorción. 6 Tabla 1. Remoción de contaminantes emergentes usando microalgas Especie de microalga Condiciones experimentales Contaminantes emergentes Matriz Porcentaje de remoción Actividad estrogénica Análisis Notas Referencia Stigeoclonium sp., diatomeas, Chlorella sp., Monoraphidium sp. Reactor: HRAP TRH: 10 días Volumen: 0.47 m3 Escala: Piloto Cafeína, acetaminofén, ibuprofeno, metil dihidrojasmonato, ácido hidrocinámico, Oxibenzona, ketoprofeno, 5-metil benzotriazol, naproxeno, galaxolida, tonalida, tributil fosfato, triclosán, bisfenol-A, octilfenol, diclofenaco, benzotriazol, OH- benzotiazol, trifenil fosfato, cashmeran, diazona, benzotiazol, celestolida, 2,4-D, atrazina, carbamazepina, metil parabeno, tris (2- cloroetil) fosfato Agua residual urbana (>90%) Cafeína, acetaminofén, ibuprofeno, metil dihidrojasmonato, ácido hidrocinámico (60 a 90%) Oxybenzona, ketoprofeno, 5-metil benzotriazol, naproxeno, galaxolida, tonalida, tributil fosfato, triclosán, bisfenol- A, octilfenol (40 a 60 %) diclofenaco, benzotriazol, OH- benzotiazol, trifenil fosfato, cashmeran, diazona, benzotiazol, celestolida, 2,4- D, atrazina (<40%) carbamazepina, metil parabeno, tris (2- cloroetil) fosfato ND GC/MS Experimentación hecha en la estación fría y cálida Medición de remoción de nutrientes Los CE fueron determinados en el agua residual Matamoros et al, 2015 C. mexicana, C. pitschmanni, C. vulgaris, Ourococus multisporus Operación: lote Reactor: Matraz TRH: 11 días Volumen: 150 mL Escala: laboratorio Ciprofloxacino (2 mg/L) Medio basal de Bold C. mexicana, 13% C. pitschmanni, 1.6% C. vulgaris, no observado O. multisporus, 2 % ND HPLC El ciprofloxacino fue adicionado Xiong et al, 2017 Chlorella sp., Scenedesmus sp., Vorticellides sp., Uronema minutum Operación: lote Reactor: PBR TRH: 8 a 12 días Escala: Piloto 17-estradiol (2 mg/L) Agua residual urbana 55 a 100 % ND HPLC Las especies de microorganismos fueron determinadas por PCR, en esta tabla solo se enlistan algunas El 17-estradiol fue adicionado Parladé et al, 2018 Operación: lote Reactor: matraz TRH: 24 horas Escala: laboratorio 17-estradiol (2 mg/L) Agua residual urbana 71 a 100% ND HPLC 7 Especie de microalga Condiciones experimentales Contaminantes emergentes Matriz Porcentaje de remoción Actividad estrogénica Análisis Notas Referencia C. reinhardtii, S. obliquus, C. pyrenoidosa y C. vulgaris Operación: lote Reactor: matraz TRH: 7 días Volumen: 500 mL Escala: laboratorio 50 compuestos orgánicos Agua residual municipal Alrededor de 32 compuestos se removieron con una eficiencia mayor al 50% YES RRLC- MS/MS Los compuestos orgánicos presentes en el agua residual se determinaron por cromatografía Zhou et al, 2014 M. braunii Operación: lote Reactor: matraz TRH: 4 días Volumen: 50 mL Escala: laboratorio Bisfenol-A (2, 4 y 10 mg/L) Medio FW04 81 a 90 % ND HPLC El BPA fue adicionado Gattullo et al, 2012 C. vulgaris Operación: lote Reactor: HRAP TRH: 73 días Volumen: 14 L Escala: piloto Tetraciclina (2 mg/L) Agua residual sintética 60% al día 61 y 69 % en el día 76 ND HPLC La tetraciclina fue adicionada De Godos et al, 2012 Chlorella sp. y Scenedesmus sp. Operación: lote Reactor: matraz TRH: 10 días Volumen: 500 mL Escala: laboratorio 11 contaminantes, concentración inicial de 10 g/L Agua de drenaje agrícola Mecoprop (nr), Atrazina (5), Simazina (6), Diazinón (21), Alacor (74), Clorfenvinfos (22), Lindano (72), Malation (97), Pentaclorobenceno (55), clorpirifos (50), endosulfan (99) ND GC/MS ------ Matamoros y Rodríguez, 2016 Operación: continuo Reactor: reactores de vidrio TRH: 2, 4 y 8 días Volumen: 5 litros Escala: NE Mecoprop (nr), Atrazina (2), Simazina (2), Diazinón (14), Alacor (14), Clorfenvinfos (16), Lindano (21), Malation (88), Pentaclorobenceno (99), clorpirifos (15), endosulfan (91) ND GC/MS TRH: tiempo de retención hidráulica; nr: no removido; NE: no especificado, ND: no determinado; YES: Yeast Estrogen Screen; RRLC: cromatografía de líquidos de rápida resolución; GC: cromatografía de gases; MS: espectrometría de masas; HRAP: estanque algal de alta tasa, PBR: fotobiorreactor de algas; PCR: reacción en cadena de la polimerasa; BPA: bisfenol-A 8 Tabla 2. Mecanismos de remoción de contaminantes emergentes usando microalgas Contaminante Especie de microalga Tipo de agua Condiciones experimentales Mecanismo de remoción Porcentaje de remoción Análisis Notas Referencia Diazinón (0.5, 5, 20, 40 y 100 mg/L) C. vulgaris, 1% de suspensión OD680 Medio basal de Bold Operación: batch Reactor: matraz TRH: 12 días Volumen: 100 mL Escala: laboratorio Bioadsorción, biodegradación y bioacumulación 94 HPLC Se propone la ruta metabólica del diazinón por biodegradación Kurade et al, 2016 Tetraciclina C. vulgaris Agua residual sintética Operación: batch Reactor: matraz TRH: 45 horas Volumen: 70 mL Escala: laboratorio Biosorción, biodegradación y fotodegradación >50% HPLC ------ De Godos et al, 2012 Carbamazepina (1, 10 y 25 mg/L) C. mexicana y S. obliquus Medio basal de Bold Operación: batch Reactor: matraz TRH: 10 días Volumen: 150 mL Escala: laboratorio Biodegradación y bioacumulación C. mexicana: 21 al 35 % biodegradación, 09 al 1.36 % Bioacumulación S. obliquus: 13 al 27.93 % biodegradación, 1.49 al 3.29 % bioacumulación UPLC- MS ------ Xiong et al, 2016 Diclofenaco Scenedesmus sp., Synechocystis sp. Biomasa muerta Agua destilada Operación: batch Reactor: matraz TRH: NE Volumen: 50 mL Escala: laboratorio Biosorción ----- HPLC La biomasa muerta fue liofilizada. Se realizaron experimentos para construir las isotermas de Freundlich y Langmuir Coimbra et al, 2018 Nonilfenol (NP) S. quadriauda, C. vulgaris, Ankistrodesmus acicularis y Chroococcus minutus Medio BG-11 Operación: batch Reactor: matraz TRH: 120 horas Volumen: 40 mL Escala: laboratorio Bioadsorción y bioabsorción Bioadsorción (13 a 26%), bioabsorción (74 al 87%) HPLC Se determinó el NP extracelular e intracelular He et al, 2016 Nonilfenol (1 mg/L) C. vulgaris, C. miniata, Chlorela sp. Medio Bristol Operación: batch Reactor: matraz TRH: 12, 24, 96 y 168 horas Volumen: 100 mL Escala: laboratorio Biodegradación 70 a 80 % removido entre las 12 y 24 horas GC/MS ------ Gao et al, 2011 9 Contaminante Especie de microalga Tipo de agua Condiciones experimentales Mecanismo de remoción Porcentaje de remoción Análisis Notas Referencia Nonilfenol 4-t-octilfenol (OP) 0, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0 mg/L S. obliquus Medio BG-11 Operación: batch Reactor: matraz TRH: 5 días Volumen: 150 mL Escala: laboratorio Biodegradación y bioacumulación En el día uno el NP fue removido un 70.9 a 90.4 y el OP de 37.8 a 82.2 % HPLC ------ Zhou et al, 2013 Nonilfenol (0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 mg/L) Phaeocystis globosa, Nannochloropsis oculata, Dunaliella salina y Platymonas subcordiformis Agua de mar artificial enriquecida con medio F/2 Operación: batch Reactor: matraz TRH: 5 días Volumen: 150 mL Escala: laboratorio Biodegradación y biosorción P. globosa (74.18), N. oculata (72.63), D. salina (79.02) y P. subcordiformis (92.12) HPLC Se determinó el NP extracelular e intracelular Wang et al, 2019 -estradiol, 17- estinilestradiol (5 mg/L) S. capricornutum y C. reinhardtii Agua residual Operación: batch Reactor: matraz TRH: 10 días Volumen: NE Escala: laboratorio Biodegradación 88 al 100 % de remoción, de este porcentaje del 42 al 54 % es debido a la biodegradación para el - estradiol Para el 17-estinilestradiol se obtuvieron remociones del 60 y 90 %, siendo el porcentaje atribuido ala biodegradación del 20 al 54 % HPLC ------ Hom-Díaz et al, 2015 Bisfenol-A (10, 20, 50 mg/L) C. sorokiniana Medio de sales minerales Operación: batch Reactor: matraz TRH: 168 horas Volumen: 100 mL Escala: laboratorio Biodegradación y bioadsorción Remoción aproximada de 38.5 % GC/MS Se identificaron los intermediarios de la biodegradación, no hay ruta metabólica propuesta Eio et al, 2015 Cafeína, ibuprofeno, galaxolida, tributil fosfato, 4-octilfenol, tris(2-cloroetil) Consorcio microalgal, predominan Chlorella sp. y Scenedesmus sp. Agua residual y agua residual sintética Operación: batch Reactor: matraz TRH: 10 días Volumen: 2 L Escala: laboratorio Volatilización (4- octilfenol, galaxolida y tributil fosfato) Biodegradación (ibuprofeno y cafeína) Volatilización (99) Biodegradación (59 para cafeína y 95 para ibuprofeno) GC/MS La fotodegradación y volatilización no son significantes para la remoción de los 7 contaminantes estudiados. Matamoros et al, 2016 10 Contaminante Especie de microalga Tipo de agua Condiciones experimentales Mecanismo de remoción Porcentaje de remoción Análisis Notas Referencia fosfato y carbamazepina Compuestos recalcitrantes (carbamazepina, y tris(2-cloroetil) fosfato) Bisfenol-A C. mexicana y C. vulgaris Medio basal de Bold Operación: batch Reactor: matraz TRH: 10 días Volumen: 500 mL Escala: laboratorio Bioacumulación y biodegradación C. mexicana (39) y C. vulgaris (28) UPLC -------- Ji et al, 2014 Ibuprofeno Phaeodactylum tricornutum Agua de mar estéril Operación: batch Reactor: tubos TRH: 10 días Volumen: 500 mL Escala: laboratorio Biosorción Remoción del 99.99%, para biomasa viva y muerta HPLC Se usó biomasa viva y muerta Se determinaron las cinéticas de sorción y las isotermas Santaeufemi a et al, 2018 Levofloxacin S. obliquus Agua residual salina sintética Operación: batch Reactor: matraz TRH: 11 días Volumen: 150 mL Escala: laboratorio Bioacumulación seguida de una biodegradación intracelular 4.53% a una concentración de NaCl de 0 mM (solo presencia de S. obliquus) En presencia de 171 mM de NaCl, la remoción fue de 93.4 % HPLC Se determinaron los metabolitos de la degradación de levofloxacin y se propuso una ruta metabólica Xiong et al, 2017 17-estradiol (E2) 17- etinilestradiol (EE2) 3mg/L C. vulgaris; S. quadricauda; S. capricornutum 3x107 cel/mL Medio BG-11 Operación: batch Reactor: matraz TRH: 7 días Volumen: 50 mL Escala: laboratorio Fotodegradación (F) Biodegradación (B) Sorción (S) E2 no significante, EE2 10% (F) C. vulgaris: E2: 89% (B) y 5% (S) EE2: 55% (B) y 1% (S) S. quadricauda: E2: 73% (B) y 4% (B) EE2: 57% (B) y 5% (S) S. capricornutum: E2: 91% (B) y 1% (B) EE2: 83% (B) y 3% (S) HPLC Se hace una predicción de actividad estrogénica calculada a partir de la concentración de E2 y EE2, adicional se hace un ensayo Yeast Estrogen Screen Wu et al., 2020 NE: no especificado; TRH: tiempo de retención hidráulica: UPLC: cromatografía de líquidos de ultra- alta resolución: HPLC: cromatografía de líquidos de alta resolución; GC: cromatografía de gases, MS: Espectrometría de masas 11 Dentro del grupo de investigación se ha trabajado con contaminantes emergentes, los cuales incluyen bisfenol-A, triclosán, 4-nonilfenol y estrona. Rocha, (2017); realizó oxidación con ozono para el influente de la PTAR cerro del agua ubicada en Ciudad Universitaria, los contaminantes que removió por ozonización fueron nonilfenol y bisfenol-A. Tecuapa (2017); realizó ozonización de agua de pozo fortificada, removiendo y detectando la actividad estrogénica de los contaminantes nonilfenol, 4- nonilfenol, triclosán, bisfenol-A y estrona. Mientras Orta et al, (2019), reportó la evaluación de la estrogenicidad posterior a la cloración y ozonización de agua de pozo fortificada con triclosán, bisfenol- A y 4-nonilfenol. En la Tabla 3 se enlistan trabajos en los que se reporta la presencia de contaminantes emergentes en la Ciudad de México y la Zona metropolitana del Valle de México (ZMVM) de la presencia de estos contaminantes en agua residual. Se observa que el orden de magnitud de las concentraciones de BPA y TCS están en el orden de µg/L, de acuerdo a las concentraciones reportadas en agua residual en otras partes del mundo (Tabla 9) las cuantificadas en el agua residual en la ZMVM están dentro del rango de concentraciones reportadas. Sin embargo, las concentraciones de BPA y TCS en México son más altas que las reportadas en otros países. Esto habla de la poca regulación nacional que existe para estos dos contaminantes emergentes. Tabla 3 Trabajos realizados en los que reportan la presencia de triclosán y bisfenol-A en agua residual en la Ciudad de México y la Zona Metropolitana Referencia Lugar Concentración (g/L) TCS BPA Gibson et al. 2007 Emisor Central 0.66 – 2.04 0.77 – 0.77 Chávez et al, 2011 Valle de Tula 0.32 – 1.821 0.432 – 3.177 Melo-Guimarães et al, (2013) Ciudad de México 0.801 0.965 Durán-Álvarez et al., 2015 Valle de Tula 1.401 ----- Peña-Álvarez y Castillo- Alanís (2017) PTAR Cerro de la Estrella 0.08 – 10.09 0.03 – 2.46 PTAR Coyoacán 0.32 – 9.34 0.02 – 4.27 PTAR Ciudad Universitaria 0.91 – 1.59 0.29 – 0.81 Estrada-Arriaga et al., 2016 Estado de México 0.531 (RS) 0.383 (DS) ----- Lesser et al, (2018) Valle de Mezquital 78.4 x 10-3 – 1.33 9.34 Ronderos-Lara et al., 2018 Hidalgo 2.5 --- Calderón et al., 2019 PTAR Cerro de la Estrella ----- 4.05 Hospital de especialidades 4.11 9.87 Chávez-Mejía et al., 2019 Valle de Tula 0.748 1.586 PTAR: Planta de tratamiento de agua residual: RS: estación lluviosa; DS: estación seca 12 3. MARCO TEÓRICO 3.1 Contaminantes emergentes El término contaminantes emergentes (CE) se refiere a compuestos xenobióticos producidos en la última década hasta hoy en día y que se encuentran presentes en el ambiente acuático, su presencia en el ambiente no se considera significativa en términos de concentración (detectados en el orden de partes por trillón, ppt) pero tienen un impacto ecológico y efectos adversos en la salud (Barceló y López, 2007; Stuart, et al., 2012). El origen de los contaminantes emergentes es antropogénico, ya sea sintetizados o producidos por actividades humanas (Tejada et al, 2014). Entre las sustancias químicas que son fuentes de contaminantes emergentes se encuentran los productos de cuidado personal, hormonas y esteroides, pesticidas y plaguicidas, subproductos de desinfección, detergentes y agentes tensoactivos, plastificantes, productos veterinarios, aditivos alimentarios, retardadores de llama, aditivos de gasolina (Barceló y López, 2007; Herrero et al., 2012). La forma en que estos contaminantes se incorporan al ambiente es por medio de vías como el agua residual de tipo doméstico e industrial (Fent et al., 2006), residuos de plantas de tratamiento (Kolpin, et al., 2002), aguas residuales de hospitales (Kümmerer, 2001), y de las actividades agrícolas y ganaderas (Watanabe, et al., 2010). Estos no se pueden remover por procesos convencionales de tratamiento de agua (Barceló y López, 2007; Stuart, et al., 2012 Pal et al., 2010) por lo que persisten en los efluentes de los tratamientos de agua residual ya que los procesos no están diseñados y optimizados para remover este tipo de contaminantes. Su remoción es difícil debido a su alta estabilidad, baja biodegradabilidad, bajo coeficiente de absorción (Gupta, et. al., 2015). En la Figura 1, se muestran las rutas de entrada de los contaminantes emergentes en el ambiente y en el agua potable. 13 Figura 1. Rutas de entrada de contaminantes emergentes en el ambiente y en el agua residual. Adaptado de Cortes y Calderón (2011) Los CE son sustancias tóxicas bioacumulables capaces de llegar a reservorios de aguas de consumo humano a través de aguas residuales y corrientes subterráneas (Reinoso et al, 2017). En el ambiente, estos contaminantes están sujetos a procesos como la biodegradación, la degradación química y la degradación fotoquímica, debido a estas altas tasas de transformación y/o remoción compensan su introducción al ambiente. Algunos de los subproductos derivados de las transformaciones que sufren los contaminantes emergentes son más persistentes que los compuestos originales exhibiendo mayor toxicidad (Tejada et al, 2014). A pesar de los efectos adversos y de la persistencia de los CE y sus subproductos no existe un listado prioritario para regulación. Hasta junio de 2004 se reportan 88.3 millones de sustancias químicas orgánicas e inorgánicas, pero de esta cantidad solo el 0.03% está regulada por alguna agencia internacional (Ramírez-Sánchez et al, 2015). Muñoz (2012), propuso un listado de 49 contaminantes de importancia en México tomando en cuenta los volúmenes de uso, la relevancia en salud pública, y el interés en su toxicidad los cuales se presentan ; en la Tabla 4. Tabla 4 Listado de contaminantes emergentes prioritarios para México, Muñoz (2012) Grupo Compuesto Esteroides y hormonas Estradiol Testosterona Estrona -etinilestradiol -etinilestradiol Productos para el cuidado personal Galaxolida Tonalida y otros productos de cuidado personal Triclosán (enjuague bucal) 14 Oxibenzona N,N-dietiltoluamida (DEET, repelente de insectos) Industriales Pentaclorofenol Nonilfenoles Bisfenol-A (BPA) Compuestos organiestánicos (organotinas) Butilbencilftalato (BuBeP) Fármacos Ácido mefenámico Sulfasalazina Ibuprofeno Diclofenaco Nimesulida Ketoprofeno Metil de ácido salicílico Gemfibrozil Ácido clofíbrico y metabolitos Benzafibrate Carbamacepina Salvasartan Metilprednisolona Tadalafilo Dexametasona Closfenamina Astemisol Amlodipino Diltiazem Pentoxifilina Avilamicina Metoprol Citrato de sildenafilo Antibióticos Sulfametozaxol Trimetropina Ciprofloxacino Roxitromicina Norfloxacino Sulfadiazina Cloranfenicol Conazol Imidazoles y triazoles Sulfacloropiridazina 3.1.1 Efectos de los contaminantes emergentes Algunos de los efectos que tienen los CE es la alteración del sistema endocrino, aunque se encuentren en bajas concentraciones, afectan la salud de seres humanos y de especies animales (Liu et al., 2009), siendo pesticidas, fármacos y fitoquímicos los que presentan alteración endocrina (Becerril, 2009). La Agencia de Protección al Medio Ambiente de Estados Unidos define a los disruptores endocrinos (Endocrine Disruptors Chemicals, EDC) como agentes exógenos que interfieren en la síntesis, secreción, transporte, acción o eliminación natural de hormonas en el cuerpo (EPA, 1997). En la Tabla 5, se enlistan las clases, productos que los contienen, y efectos a la salud y al ambiente. 15 Tabla 5. Contaminantes emergentes y sus efectos a la salud y el ambiente Clase de contaminante Usos / Origen Ejemplos Efectos a la salud y el ambiente Referencias Fármacos Medicamentos, antibióticos Ibuprofeno Diclofenaco Ácido salicílico Carbamazepina Propanolol Diazepam Riesgos estrogénicos en el humano y en la fauna. Generación de microorganismos resistentes. Liu et al., 2015 Hernando et al., 2011 Pereira et al, 2015 Productos de cuidado personal Ingredientes activos o preservativos en cosméticos, fragancias, shampoo, pasta dental, desodorantes Triclosán Almizcle (tonalida y galaxolido) Bioacumulación en organismos acuáticos, pueden dañar el sistema nervioso, efectos (anti)estrogénicos y (anti)androgénicos o ambos Covaci et al, 2012 Hormonas y esteroides (naturales y sintéticos) Antropogénico, uso en el tratamiento de desórdenes hormonales y anticonceptivos Estriol; Estrona Metabolitos del estradiol Etinil estradiol sintético 17-estradiol Causa feminización en peces, son disruptores del sistema endocrino Vulliet y Cren-Olivé, 2011 González et al, 2012 Pereira et al, 2015 Pesticidas y plaguicidas Agricultura Aldrin; DDT Diazinon; Carbamatos Triazinas Disruptores en la cadena alimenticia primaria en los ecosistemas acuáticos. Son de efecto acumulativo, inducen el cáncer de tiroides, modificación de la hormona tiroides Richardson y Ternes, 2017 Pereira et al, 2015 Subproductos de la desinfección Resultado de la oxidación de un desinfectante que reacciona con materia orgánica natural y contaminantes antropogénicos Halonitrometanos Nitrosanimas Haloamidas Halonitrilos Halofuranonas Haloaldehídos Halopirroles Haloquinonas; Trihalometanos Carcinógeno Ligados a efectos respiratorios como asma, aumentan el riesgo de infertilidad, pérdida fetal, larga duración gestacional y crecimiento fetal deficiente, anomalías fetales Hebert et al., 2010 Richardson y Postigo, 2012 Bisfenol-A Monómero usado en la producción de policarbonato y resinas epóxicas Otros nombres: BPA; 2,2- bis(4-hidroxifenil)propano Migración del BPA en el ambiente o la comida. Alteración en el desarrollo de las vías reproductivas, organización de circuitos sexualmente dimórficos en el hipotálamo, inicio del celo y pubertad precoz, alteración del peso, alteración de la organización de las glándulas mamarias, cáncer de mama y próstata Covaci et al, 2012. Perclorato Usado en sales de amonio, sodio y potasio como oxidante en propulsores sólidos para cohetes, misiles, bengalas y fuegos artificiales. Aditivos en reactores nucleares, Sales del ácido perclórico Bloquean la ingesta de yodo en la glándula tiroides produciendo alteraciones en los niveles de la hormona tiroides, como hipertiroidismo, es bioacumulable en lechuga, trigo y alfalfa Covaci et al, 2012 16 Clase de contaminante Usos / Origen Ejemplos Efectos a la salud y el ambiente Referencias infladores en bolsa de aire, tubos electrónicos, aceites lubricantes, procesos de curtido de piel, pinturas y esmaltes, galvanoplastia y refinado de aluminio. Puede formarse en la atmósfera Siloxanos cíclicos Geles de baño, shampoo, productos para el cabello, desodorantes, loción para bebé, antitranspirantes, chupones El más simple de estos compuestos es el hexametilciclotrisiloxan o (compuesto por tres unidades de — Si(CH3)2—O— ) Débil efecto estrogénico, efectos adversos en la salud reproductiva de los humanos, reducción en la fertilidad, reducción de los niveles de prolactina, son bioacumulables en el tejido adiposo Covaci et al, 2012 Compuestos perfluorinados Equipo contra incendio, espumas, lubricantes, detergentes, tintas, barniz, recubrimientos (paredes, muebles, empaques de alimentos), ceras, repelentes de agua y aceite para papel, textiles y cuero Ácido perfluorooctano (PFOA) Perfluorooctanosulfonato (PFOS) Bioacumulación ligada a las proteínas, biomagnificación de la cadena alimenticia con respecto a los efectos toxicológicos, infertilidad, disminución de la calidad del semen Pérez et al, 2012 Lei et al, 2015 Surfactantes Tensoactivos aniónicos y no aniónicos usados en detergentes, emulsificantes, pinturas, antiespumantes Alquilfenoles como el nonilfenoxi dicarboxilato, nonilfenol Sulfofenilcarboxilatos Dodecil sulfato de sodio Lauril sulfato de sodio Imitan hormonas naturales causando la disminución en el conteo de esperma y efectos cancerígenos, se pueden ligar a los fosfolípidos de la membrana celular y proteínas incrementando la permeabilidad, reduciendo la selectividad culminando en la muerte celular González et al, 2012 Pereira et al, 2015 Retardantes de llama bromados Encontrados en ropa, muebles, productos electrónicos Hexabromociclodecanos Tetrabromobisfenol-A Son compuestos persistentes y que se encuentran biodisponibles, causando neurotoxicidad, disrupción endocrina, cáncer, daños mitocondriales, interferencia en la homeostasis del calcio Covaci et al, 2012 Pereira et al, 2015 Ésteres organofosforados Retardantes de flama, plastificantes, acabado de pisos, revestimiento de paredes Trietil fosfato tri-n-butil fosfato tri-iso-butil fosfato tris(2-etilhexil) fosfato tris(2-butoxietil) fosfato Cloroalquil fosfatos Aril fosfatos Efectos en animales: asociados con síntomas colinérgico (salivación, diarrea, poli erección, temblor, ataxia y depresión de la respiración). Incremento de la masa del hígado y riñón, y bajo incremento de masa corporal Efectos en humanos: neuropatía tardía, dermatitis, propiedades diruptoras endocrinas (correlación negativa de la calidad del semen y los niveles de la hormona tiroides). Afectaciones de las mucosas (irritación de ojos, nariz y garganta) Covaci et al, 2012 17 Clase de contaminante Usos / Origen Ejemplos Efectos a la salud y el ambiente Referencias Hidrocarburos aromáticos policíclicos Combustión de combustibles fósiles, combustión natural de bosques Pireno; Fluoranteno Fenanteno Mutagénico, carcinógeno, teratogénico González et al, 2012 Endulzantes artificiales Industria alimentaria Sacarina Ciclamato Aspartame Sucralosa Alitame; Neotame Dihidrocalcona neohesperidina Potenciales efectos carcinógenos, posible causante potencial de la enfermedad intestinal inflamatoria que interfiere con las bacterias buenas y las enzimas, alteración de la micro biota y sus funciones metabólicas, puede inducir intolerancia a la glucosa y disbiosis. En el ambiente, afecta la producción de huevos, tasa de incubación y mortalidad en peces Kokotou et al, 2012 Luo et al, 2019 Nanomateriales Cosméticos, bloqueadores solares, ropa, pinturas, neumáticos, raquetas de tenis, electrónicos, jabones, shampoo, detergentes, remediación de suelos Fulerenos; Nanotubos Puntos cuánticos Oxanos metálicos Partículas de TiO2 Nano plata; Nano oro Nanopartículas de hierro cero valentes Genotóxicos, daño en el ADN, daño celular (alteración de la permeabilidad y la fluidez) Richardson 2012 EPA, 2010 Aditivos de gasolinas Mejoramiento del rendimiento de las gasolinas Benceno; 1,3-butadieno Metil tret-butil éter Carcinógeno, psicosis, dolor de cabeza Lei et al, 2015 Productos farmacéuticos veterinarios Salud animal Antimicrobianos Antihelmínticos Esteroideos y no esteroideos Antinflamatorios Antiparasitarios Astringentes Sincronización del celo Suplementos nutricionales Promotores del crecimiento Antibióticos usados en comida para animales Están presentes en formas bioactivas causando afectaciones a los suelos, agua, microorganismos, plantas, animales y a las personas mediante la cadena alimenticia Lei et al, 2015 Filtros UV Uso de cuidado personal, fijadores para el cabello, maquillaje, plásticos, muebles 3-(4- metilbencilideno)canfor Benzofenona-3 2-etilhexil 4- metoxicinnamato 3-benzilideno canfor Homosalato Ácido 4-aminobenzoico Son disruptores endocrinos, causando interrupción del eje hipotalámico hipófisistiroideo y la función reproductiva y de desarrollo Lei et al, 2015 18 3.1.2 Efectos en el medio ambiente Efectos en la fauna Los contaminantes emergentes amenazan la vida salvaje debido a la capacidad que tienen de afectar la reproducción, función cerebral y el sistema inmune (Lyons, 2006). Los ambientes acuáticos son considerados el último sumidero debido a la continua liberación humana de contaminantes emergentes en los cuerpos de agua y la habilidad que tienen para migrar a través del agua (Wang y Zhou, 2013), en la Tabla 6 se enlistan los efectos de los contaminantes en especies animales. Tabla 6 Efectos de los contaminantes emergentes en fauna (adaptado de Reed, 2016) Especie Efectos Peces Los peces toman los EDC como PCB y PAH a través de sus branquias y piel. Los EDC comprometen la fisiología y el comportamiento sexual de los peces, incluyendo impactos sobre la diferenciación sexual y deteriora la fertilidad. Anfibios Declive en las poblaciones, los EDC impactan individualmente a los anfibios especialmente en las capacidades reproductivos. Reptiles Efectos fisiológicos debidos a PBDE, alteración de los niveles de esteroides y de la actividad tiroidea, hermafroditismo o efectos de feminización, desmasculinización. Aves Adelgazamiento de los cascarones de huevo, cambios en la tiroides, retinol y homeostasis del glutatión, bajo éxito reproductivo, baja función inmune. Mamíferos Alteración de los niveles de esteroides, tiroideos, retinol y cortisol, masculinización, impacto reproductivo, esterilidad, incremento en la susceptibilidad a enfermarse, desordenes no reproductivos incluyendo tumores y deformidades óseas. Invertebrados Masculinización, efectos de feminización, esterilidad, baja fecundidad, deterioro reproductivo, anormalidades de desarrollo y reproductivas. Especies árticas Anormalidades congénitas, interferencia con el proceso regeneracional, disfunción tiroidea, anormalidades metabólicas, feminización o desmasculinización, disminución en el éxito reproductivo, anomalías congénitas graves, alteración del desarrollo cerebral y del comportamiento, alteración de las funciones inmunes. PCB: Bifenilos policlorados; PAH: Hidrocarburos aromáticos policíclicos; PBDE; Bromodifeniléteres Efectos en la flora Los efectos en plantas son principalmente la acumulación en vegetales con muchas hojas siendo relevante en riesgos para la salud humana. Los mecanismos que tienen las plantas para incorporar a su sistema diversos contaminantes presentes en agua y suelos, es por medio de las raíces. Para compuestos no ionizables existe un equilibrio entre los nutrientes y la sustancia contaminante en fase acuosa, seguida de una absorción química en los cuerpos lipofílicos. Los contaminantes no iónicos tienen el potencial de pasar las membranas celulares fácilmente debido al alto potencial para ser tomados por las raíces. Son transportados por el flujo de agua y se acumulan al máximo en las hojas (Adeel et al, 2017; Wu et al, 2015). En cuanto a los contaminantes hidrofóbicos, características como el coeficiente de partición octanol / agua (KOW) es un factor importante para la absorción y la difusión de los contaminantes orgánicos con log Kw de 1 – 3.5 (con un valor de log Kw óptimo de 1.8), tiene un alto potencial de absorción debido a un balance de solubilidad lipídica y acuosa. La ionización molecular también muestra una influencia en la acumulación de pesticidas en las plantas, las moléculas cargadas reducen el potencial para la 19 absorción en plantas debido a que la ionización reduce la capacidad de permear las membranas celulares (Dodgen et al, 2013). En la Figura 2, se muestra el proceso de ingesta y transporte de contaminantes y nutrientes que existe en un sistema planta – suelo. Figura 2 Ingesta y transporte de contaminantes y nutrientes, sistema planta – suelo (adaptado de Adeel et al, 2017) 3.1.2 Bisfenol-A El bisfenol-A (BPA) es un disruptor endocrino, es generalmente usado como monómero en la industria de los polímeros en la producción de resinas epóxicas, policarbonatos, resinas fenólicas, poli acrilatos y poliésteres (Wirasnita et al., 2014). El BPA se encuentra en equipo de salud, compuestos dentales, lentes de contacto, juguetes, láminas de ventanas, además de que se usa en la manufactura de plásticos que están en contacto directo con alimentos (Konieczna et al, 2015). El BPA es sintetizado por la condensación de fenol con acetona en presencia de un catalizador que es una resina de intercambio iónico fuertemente ácida (Corrales et al, 2015). El BPA tiene una baja presión de vapor y no tiende a tener una volatilidad significante, siendo la sorción en suelo significante (coeficiente de partición carbono/agua), es moderadamente bioacumulable lo que no ocurre a altas dosis, además de ser altamente hidrofóbico esto debido a su coeficiente de partición octanol/agua (Kow) (Careghini et al, 2015). 20 El BPA presenta actividad disruptora endocrina en varias especies de invertebrados provocando alteraciones en la reproducción y el desarrollo en los sistemas inmune y nervioso, también afecta órganos y sistemas fisiológicos, en el sistema endocrino imita o bloquea funciones de organismos vivos. Otros efectos adversos a la salud incluyen problemas en la reproducción y desarrollo, enfermedades metabólicas, afectación a la función hormonal de la tiroides, estrés oxidativo, efectos en la expresión genética y epigenética (Martínez de Paz, 2014; Muhamad et al, 2016). La ingesta de comida y agua contaminada con BPA es la mayor vía de exposición, mientras la inhalación y el contacto dérmico son vías de exposición comunes para trabajadores involucrados en la manufactura de BPA (Careghini et al, 2015). Las concentraciones reportadas como adversas son de 2.5 nmol/mg proteína causando desacoplamiento mitocondrial (hígado de rata); además de que se han realizado 61 estudios en seres vivos, no humanos; 0.0483 g/L a 2280 g/L a estas concentraciones ocasiona mortalidad, problemas en la reproducción, desarrollo y crecimiento (Wright-Walters et al., 2011). Concentraciones letales medias (EC50) reportadas para especies de microalgas son: 19.6 mg/L a las 72 horas para Desmodesmus subspicatus con una concentración inicial de 104 células/mL (Tisler et al, 2016). S. quadricauda a 96 horas, 13.233 mg/L con una concentración inicial de 2.13 x 106 células/L (Xiang et al., 2018). En la Tabla 7, se muestran las propiedades fisicoquímicas del BPA. Tabla 7 Propiedades fisicoquímicas del bisfenol-A Nombre 2,2-bis(4-hidroxifenil)propanoa Fórmula C15H16O2 b Fórmula desarrollada OH-C6H4-C(CH3)2-C6H4-OHc Peso molecular 228.29 g/molb Constante de Henry 2.5x105 mol/m3Pad pKa 9.6 y 11.3a Punto de fusión 158 – 159 °Cb Punto de ebullición 220 °C a 4 mmHgb Número CAS 80-05-7d Densidad 14 – 1.195 g/mL a 20 – 25 °Ce Solubilidad 120 – 130 mg/L a 25 °Ce Presión de vapor 4 x10-8 mm Hg a 25 °Ce Tiempo de vida media (días) 38 (agua); 75 (suelo), 340 (sedimentos), 0.2 (aire)e Coeficiente de partición octanol/agua, log Kow 3.64 ± 0.32e Estructura química OH OH b a Shareef et al, 2006; b Wirasnita et al, 2014; c Li et al, 2015; d Sander, 2015, e Corrales et al., 2015 21 3.1.3 Triclosán El triclosán (TCS) es un fenol halogenado, no iónico, es categorizado como un hidrocarburo halogenado aromático que tiene estructuras fenólicas, difenil éter y un bifenil policlorado, estas estructuras son similares al BPA, dioxinas, o a las hormonas tiroideas que son moléculas con dos anillos aromáticos (Dhillon et al., 2015; Dann y Hontela, 2010). Este constituyente es un agente antibacterial y anti fungicida presente en pastas dentales, jabones antibacteriales, desodorantes, shampoo, detergentes y cosméticos, muebles, juguetes, en aplicaciones industriales como detergentes, líquidos lavaplatos. Las concentraciones reguladas son del 0.3% (Directiva sobre cosméticos de la Comunidad Europea) y 0.1% (por la Food and Drug Administration, FDA) (Lee et al., 2019; Dhillon et al., 2015; Pirard et al, 2012; Dann y Hontela, 2010). Al ser un antibacterial y anti fungicida tiene una amplia gama de actividad siendo eficaz frente a bacterias Gram positivas y Gram negativas no esporulantes, bacterias, algunos hongos como Plasmodium falciparum y Toxoplasma gondii, pero algunas bacterias son resistentes como P. aeruginosa, pero no tiene actividad sobre endoesporas bacterianas (Zuñiga-Carrasco y Lozano, 2017). Las vías de absorción de triclosán son la dérmica, a través de las mucosas (boca, tracto intestinal y estomacal), mientras para trabajadores que están involucrados en la producción de esta sustancia química las vías de absorción son la dérmica e inhalación (Olaniyan et al, 2016; Allmyr et al, 2006). Los efectos adversos en la salud del TCS son el bloqueo la síntesis de ácidos grasos por la inhibición de la enzima enoyl reductasa, disfunción tiroidea, diabetes gestacional, aborto espontáneo, disminución de la fecundidad, menarquía temprana en personas con sobrepeso, disminución de la calidad del semen (Dhillon et al., 2015; Dix-Cooper y Kosatsky, 2019). En algas e invertebrados el TCS se acumula, en vertebrados como peces se ha encontrado la presencia de TCS en los organismos, músculos, plasma, bilis; también se bioacumula en mamíferos marinos como delfines (Dan y Hontela, 2010). También induce resistencia bacteriana en ambientes acuáticos y suelos, además de ser acumulable en plantas (Mathews et al, 2014; Olaniyan et al, 2016). El TCS es un ácido débil, lipofílico y no volátil, tiene afinidad por materia orgánica, moderadamente soluble en agua, es fotodegradable, al ser lipofílico tiende a la bioacumulación en tejido adiposo (Pannu et al, 2012; Mathews et al, 2014; Dhillon et al., 2015; Olaniyan et al, 2016). Las dosis de 0.8 – 2.8 nmol de TCS/mg de proteína dentro de las células/tejidos inducen efectos adversos, y estas concentraciones se encuentran dentro de los niveles de 0.4 – 64 nmol TCS/mg de proteína tisular que resultan de la exposición dérmica humana a productos que lo contienen (Weatherly y Goose, 2017). Las concentraciones letales medias para microalgas reportadas son de 187.5 g/L para S. obliquus y 325 g/L para S. quadricauda para 96 horas (Bi et al., 2018). S. subspicatus 0.7, 2.8 (método guía OECD 201) y 1.4 g/L (Roberts et al., 2014). En la Tabla 8, se muestran las propiedades fisicoquímicas del triclosán. 22 Tabla 8 Propiedades fisicoquímicas del triclosán Nombre 5-cloro-2-(2,4-diclorofenoxi)fenola Fórmula C12H7Cl3O2 b Peso molecular 289.54 g/mol a Constante de Henry 4.7x102 mol/m3 Pa b pKa 8.14 c Log Kow 4.76 d Presión de vapor a 20 °C 5.2x10-6 Pa c Punto de ebullición 280 – 290 °C a Punto de fusión 55 – 57 °C a Densidad 1.49 g/cm3 a Número CAS 3380-34-5 b Solubilidad en agua a 20 °C 0.012 g/L a Factor de bioconcentración 2.7-90 (organismos acuáticos) c Vida media, fotodegradación (min) 41 (solución acuosa) c Vida media, biodegradación (días) 18 (suelo aerobio) c Estructura química O OHCl Cl Cl a a Lee et al., 2019; b Sander, 2015; c Dhillon et al., 2015; d Dann y Hontela, 2010 Como se ha visto, los efectos a la salud y ambientales de los dos contaminantes emergentes a estudiar son adversos, por lo que en la Tabla 9, se enlistan trabajos en los que se ha reportado la presencia de estos dos contaminantes emergentes en diversas matrices, como lo son la ambiental (sedimentos, agua, suelo), alimentos (siendo la principal vía de absorción e ingesta) y en humanos (acumulación en tejidos y fluidos). 23 Tabla 9 Presencia de contaminantes emergentes en diversas muestras (ambientales, alimentarias y en humanos) Contaminante emergente Matriz Tipo de muestra País / Ciudad Concentración Notas Referencia Bisfenol-A Ambiental Suelo Valle de Tula, México  −  g/kg+ Campos agrícolas irrigados con agua residual Gibson et al., 2010 Norteamérica  g/kg+ Datos recolectados entre 1990 – 2006, suelo enriquecido con biosólidos Staples et al., 2010 Europa 0.24 g/kg+ Sedimentos Río Ebro, España <0.24 – 100 ng/kg+ Bahía del río Ebro en 2010 Gorga et al., 2014 Alemania 10 – 380 g/kg+ Río Elba Careghini et al., 2015 Taiwán 0.37 – 492 g/kg+ 16 ríos principales del país Nueva Zelanda <50 – 145 g/kg+ Sedimentos de estuario en Auckland Stewart et al., 2014 China 0.96 – 14.44 g/kg+ Río Hangpu y sus afluentes, invierno y verano Wu et al., 2013 España <0.24 – 117 g/kg+ Ríos Ebro, Llobregat, Júcar y Guadalquivir) Gorga et al., 2015 Aguas subterráneas Osaka, Japón 740 mg/m3 Aguas contaminadas con lixiviados Careghini et al., 2015 Inglaterra Hasta 20 mg/m3 -------- Europa <0.001 – 2.299 mg/m3 Estudio sobre aguas subterráneas europeas Loos et al., 2010 Ciudad de México, México <0.0005 – 0.010 mg/m3 Muestreo en la estación lluviosa y seca Félix-Cañedo et al., 2013 Agua superficial Portugal 0.029 – 0.098 mg/m3 Ríos de Portugal Careghini et al., 2015 Alemania 4 – 92 mg/m3 Río Elba Taiwán 0.01 – 45 mg/m3 16 ríos principales del país China 0.0071 – 0.1115 mg/m3 Río Hangpu y sus afluentes, invierno y verano Wu et al., 2013 Europa 0.00011 – 0.649 mg/m3 Ríos Ebro, Llobregat, Júcar y Guadalquivir) Gorga et al., 2015 Ciudad de México, México <0.0005 – 0.0007 mg/m3 Presas, muestreo en la estación lluviosa y seca Félix-Cañedo et al., 2013 Corea del Sur 0.0069 – 0.059 mg/m3 Río Han Yoon et al., 2010 0.011 – 0.120 mg/m3 Arroyos dominados por los efluentes que desembocan en el río Han España 0.006 – 0.126 mg/m3 Ríos Manzaneres y Jarama Esteban et al., 2014 Brasil <0.46 mg/m3 Ríos que cruzan la isla San Luis Melo y Brito, 2014 Hong Kong, China 0.011 – 0.41 mg/m3 Reserva Marina del Cabo D'Aguilar, RS Xu et al., 2014 0.025 – 0.24 mg/m3 Reserva Marina del Cabo D'Aguilar, DS 24 Contaminante emergente Matriz Tipo de muestra País / Ciudad Concentración Notas Referencia China oriental 0.024 – 1.175 mg/m3 Cuenca del lago Tai Norte Zhang et al., 2014 Xochimilco, México 2.08 – 107.14 ng/L (DS) 2.08 – 141.42 ng/L (RD) Dos muestreos, uno en la estación lluviosa (agosto 2008) y estación seca (febrero 2009) Díaz-Torres et al., 2013 Agua de manantial ZMCM 0.4 – 0.41 ng/L Manantial Cerro Colorado Gibson et al., 2007 Agua residual Ciudad de México 4.05 g/L PTAR Cerro de la Estrella Calderón et al., 2019 9.87 g/L Agua residual proveniente de un hospital de especialidades ZMCM 0.66 – 2.5 g/L Emisor Central Gibson et al., 2007 Valle de Tula, México 432 – 3177 ng/L Zona de irrigación Chávez et al., 2011 Ciudad de México 965 ng/L ----- Melo-Guimaraes et al., 2013 Ciudad de México Influente: 0.21 – 2.46 ng/mL Efluente: 0.03 – 0.41 ng/mL PTAR Cerro de la Estrella Peña-Álvarez y Castillo-Alanis, 2017 Influente: 0.81 – 4.27 ng/mL Efluente: 0.02 – 0.07 ng/mL PTAR Coyoacán Influente: 0.29 – 0.81 ng/mL PTAR Ciudad Universitaria Valle del Mezquital, Méx 9340 ng/L Muestreo en canales de irrigación Lesser et al., 2018 Alimentos Comida enlatada Washington y Maryland, EUA <2 – 790 g/kg* 78 comidas enlatadas y 2 comidas congeladas, BPA no detectado en comida congelada Noonan et al., 2011 Agua potable Ciudad de México 3.91 g/L ---- Calderón et al., 2019 Frutas, vegetales y carne Suecia <2 – 29 g/kg * Pescado (2.5 – 29 g/kg), carne (6.9 – 13 g/kg), papas (2.2 g/kg) Gyllenhammar et al., 2012 Hojas, tallos de lechuga y coles EUA 0.22 – 3.05 g/kg* Cultivo hidropónico Dodgen et al., 2013 Raíces de lechuga y coles 199.6 – 441.7 g/kg* Refrescos comerciales Qufu, China <0.02 – 0.86 mg/m3 Ocho refrescos (enlatados y embotellados) Li et al, 2013c Frutas y vegetales Florida, EUA Frutas 0.2 – 4.3 g/kg* Vegetales 2 – 9 g/kg* Comida fresca Lu et al., 2013 Agua potable Italia <0.00073 – 0.102 mg/m3 Muestra de fuentes públicas de 35 ciudades Maggioni et al., 2013 Agua mineral embotellada Italia <0.00073 – 0.00113 mg/m3 Muestras comerciales en botellas de PET 25 Contaminante emergente Matriz Tipo de muestra País / Ciudad Concentración Notas Referencia Productos de carne Alrededor del mundo 0.49 – 56 g/kg* -------- Careghini et al., 2015 Pescado 7.1 – 103 g/kg* Frutas y vegetales 11 – 95 g/kg* Cereales 1.0 – 3.8 g/kg* Comida enlatada 0.1 – 267 g/kg* Atún y jalapeños enlatados México Atún: 0.6 – 83.4 g/kg Jalapeños: <0.25 – 4.3 g/kg Migración de BPA por efecto de procesamiento térmico y almacenamiento Munguía-López et al., 2001 Jalapeños enlatados 15.33 g/kg Migración de BPA por efecto de procesamiento térmico, almacenamiento y temperatura Munguía-López et al., 2002 Agua embotellada Nigeria 124.2 – 1000.8 ng/L BPA encontrado en cinco de 16 muestras Omoruyi et al., 2014 Humanos Tejidos (cerebro, hígado y tejido adiposo) Bélgica Cerebro (2.36 ng/g); Hígado (0.9 – 2.77 ng/g); Tejido adiposo (1.12 ng/g) Muestras colectadas en 2002 a once pacientes durante autopsias Geens et al., 2012 Tejido placentario Tennessee, EUA 44 – 273.9 ng/g Muestras colectadas de junio 2007 a julio 2010 Troisi et al., 2014 Orina Ciudad de México, México 0.4 – 6.7 g/L ≤37 semanas (1.84 g/L) > 37 semanas (0.97 g/L) Mujeres embarazadas que dieron a luz a la semana 37 de gestación o más Cantonwine et al., 2010 Orina Liege, Bélgica 2.54 g/g de creat – 27.44 g/g de creat 1031 participantes, hombres y mujeres de 1 a 75 años de edad Pirard et al., 2012 Triclosán Ambiental Sedimentos Valle de Tula, México 1.0 – 1.5 ng/g 5 tipos de sedimentos y agua recolectados en la época seca Díaz y Peña- Alvarez, 2017 Agua superficial 29.7 – 31.4 ng/L Xochimilco, México 5 – 20 ng/L (DS) 5 – 73.3 ng/L (RS) Dos muestreos, uno en la estación lluviosa (agosto 2008) y estación seca (febrero 2009) Díaz-Torres et al., 2013 Valle de Tula, México 1.8 ng/L Manantial cerca de la parcela de riego de aguas residuales Durán-Álvarez et al., 2015 Taiwán 0.015 – 0.036 nM Río Danshuel Shen et al., 2012 España 66 ng/L Canal de marea en el Río San Pedro Pintado-Herrera et al., 2014 72 ng/L Rio Guadalete Agua de manantial ZMCM 1.12 – 1.3 ng/L Manatial Cerro Colorado Gibson et al., 2007 Agua subterránea España 68 ng/L Acuífero aluvial del Guadalete Pintado-Herrera et al., 2014 26 Contaminante emergente Matriz Tipo de muestra País / Ciudad Concentración Notas Referencia EUA 6.9 x 10-5 – 1.0 x 10-4 nM 20 muestras, DS (sep 2013) y RS (enero 2014) Sorensen et al., 2015 Inglaterra 0.18 nM Texas Karnjanapiboonw ong et al., 2011 Agua residual ZMCM 0.66 – 2.4 g/L Emisor Central Gibson et al., 2007 Valle de Tula, México 320 – 1821 ng/L Zona de irrigación Chávez et al., 2011 Ciudad de México 801 ng/L --------- Melo-Guimaraes et al., 2013 Ciudad de México Influente: 0.87 – 10.09 ng/mL Efluente: 0.08 – 7.33 ng/mL PTAR Cerro de la Estrella Peña-Álvarez y Castillo-Alanis, 2017 Influente: 2.5 – 9.34 ng/mL Efluente: 0.32 – 2.63 ng/mL PTAR Coyoacán Influente: 0.91 – 1.59 ng/mL PTAR Ciudad Universitaria Valle del Mezquital, Méx 78.4 – 1330 ng/L Muestreo en canales de irrigación Lesser et al., 2018 Ciudad de México 4.11 g/L Agua residual proveniente de un hospital de especialidades Calderón et al., 2019 Valle de Tula, México 1401 ng/L Agua tomada de los canales de irrigación Durán-Álvarez et al., 2015 Guanajuato, México 543 ng/L (RS) 926 ng/L (DS) Planta de tratamiento de agua residual Estrada-Arriaga et al., 2016 Estado de México, México 531 ng/L (RS) 383 ng/L (DS) España 95 ng/L Efluente en una PTAR en Puerto Real Pintado-Herrera et al., 2014 Inglaterra 0.25 – 1.51 nM Agua residual tratada Chi et al., 2013 EUA 6.91 – 10.36 Influente Anumol y Snyder et al., 2014 0.044 – 0.097 nM Efluente final Alimentos Calabaza y calabacita (zuccini) EUA 55 mg/kg Raíces 13 mg/kg Suelos tratados con biosólidos Aryal y Reinhold, 2011 Calabaza y calabacita (zuccini) EUA 480 mg/kg Raíces: 9.3 mg/kg Condiciones hidropónicas Aryal y Reinhold, 2013 Once cultivos Michigan, EUA Pimiento (2.94); Pepino (0.44); Jitomate (0.53); Ocra Condiciones hidropónicas TCS añadido al cultivo Mathews et al., 2014 27 Contaminante emergente Matriz Tipo de muestra País / Ciudad Concentración Notas Referencia (0.45); Betabel (0.48); Cebolla (0.12); Col (0.9); Apio (0.79); Brócoli (0.1); Espárragos (0.02); Papa (0.3) (todos en: mg/kg+) Cultivo de cuatro semanas TCS medido en los brotes de los cultivos Pescado Alemania 11.7 ng/kg 16 puntos de muestreo en los ríos Elba y Rin Rüdel et al., 2013 Rábano EUA 31.8 mol/kg+ Suelo modificado con biosólidos Pannu et al., 2012 Agua de grifo Taiwán 0.17 nM Agua obtenida de dos edificios de un campus universitario al sur de Taiwán Yang et al., 2014 Agua de grifo EUA 0.21 nM Muestras de una planta potabilizadora Padhye et al., 2014 Agua de grifo China 0.021 nM Agua de seis casas en un área residencial Li et al., 2010 Humanos Orina Liege, Bélgica 2.70 g/L (2.68 g/g creat) 1031 participantes, hombres y mujeres de 1 a 75 años de edad Pirard et al., 2012 Orina Corea del sur Preescolares: 0.2 – 1.0 g/L Estudiantes: 0.1 – 0.8 g/L Adolescentes: 0.1 – 0.7 g/L Adultos: 0.1 – 0.5 g/L Niños (557 preescolares de 3 a 5 años; 839 estudiantes de 6 – 11 años), 807 adolescentes (12 – 17 años) y 3759 adultos (19 – 86 años) Lim, 2020 Leche materna y plasma sanguíneo Estocolmo, Suecia Plasma: 0.067 – 0.072 ng/g* Leche materna: <0.018 – 0.019 ng/g* 36 madres, 2 muestras tomadas a los 6 y 12 meses después de dar a luz, entre oct-2003 y mayo-2004 Allmyr et al., 2006 Orina Vancouver, Canadá 14.5 g/L 100 inmigrantes asiáticas (19 – 45 años), país de origen: India, China, Hong Kong, Taiwán Dix-Cooper y Kosatsky, 2019 Orina China 0.73 ng/mL 1006 mujeres embarazadas (28.75 ± 3.69 años) Huo et al, 2018 Suero España 4.1 – 41.4 nM Total 24 muestras de fluidos analizadas Azzouz et al., 2016 Orina 1.1 – 7.3 nM Leche materna 0.86 – 7.3 nM Orina India 0.56 ±1.8 nM Niños con obesidad o sobrepeso de 2 a 14 años Xue et al., 2015 Orina EUA 0.51 ± 0.53 nM Trabajadores de dos hospitales, uno de éstos usa jabón con TCS al 0.3% en áreas de cuidados de pacientes, el otro no Maclsaac et al., 2014 *base húmeda o peso fresco; + peso seco; ⁑ pg/mL; ND: No detectado; ▲ sólidos secos; ZMCM: Zona Metropolitana de la Ciudad de México; PM: punto de muestreo; E1 estrona; DS: estación seca; RS: estación lluviosa, creat: creatinina 28 3.1.4 Disruptores endocrinos Un disruptor endocrino (EDC, Endocrine Disruptor Chemical por sus siglas en inglés) es una sustancia química exógena con actividad hormonal, que cuando es absorbido en el cuerpo imita o bloquea hormonas e interrumpe las funciones normales del cuerpo, esto ocurre alterando los niveles hormonales, inhibiendo o simulando la producción y metabolismo de las hormonas, cambiando la ruta de las hormonas a través del cuerpo o afectando las funciones de control de las hormonas (Schug et al, 2011). Para alterar el sistema endocrino, los EDC tienen cinco modos de acción, que se explicarán más adelante. Sistema endocrino El sistema endocrino lleva a cabo la comunicación entre células mediante estímulos químicos. Las células que se encargan de secretar estos estímulos o sustancias químicas (hormonas) se denominan células endocrinas. Se encuentran en células endocrinas agrupadas formando órganos o glándulas endocrinas, células endocrinas formando pequeños grupos dentro de órganos especializados (páncreas, ovarios, testículos), células endocrinas dispersadas entre otras células de tejidos epiteliales (por ejemplo, sistema digestivo o respiratorio), interactúa con el sistema nervioso a través del hipotálamo, la hipófisis y los neurotransmisores, que a la vez interactúan con el sistema inmune, denominado como sistema neuroendocrino difuso. Las hormonas actúan como enzimas o uniéndose a un receptor especifico, las hormonas regulan funciones actuando como transmisores de información, controlar funciones metabólicas, regula el desarrollo embrionario. (Romano, 2012). En la Figura 3 se muestra la ubicación de las glándulas endocrinas en el cuerpo humano. Figura 3. Glándulas endocrinas en el cuerpo humano (Romano, 2012) 29 Modos de acción de los EDC Hay cinco modos de acción en los que los EDC alteran el sistema endocrino, los cuales son: • Señalización de receptores nucleares. Los EDC al ser similares a muchas hormonas, son apropiados para inactivar o antagonizar los receptores hormonales nucleares. Las hormonas o las imitaciones de hormonas se unen a los receptores de membrana, desplazándose al núcleo y adhiriéndose a los receptores de respuesta, donde regulan la transcripción genética y la producción de proteínas. (Romano, 2012). • Efectos a dosis bajas. Los EDC presentan respuestas bifásicas a las dosis, es decir no presentan un patrón lineal (mayor dosis mayor efecto negativo). Muchas sustancias presentan curvas dosis- respuesta en forma de “U” o de “U invertida”, indicando que provocan efectos tóxicos a dosis altas, ningún efecto a dosis intermedias y efectos adversos a dosis bajas o viceversa. El efecto adverso de los EDC puede ser derivado de la acción combinada de diversas sustancias que individualmente no presentan efectos negativos, pero combinados pueden desencadenar respuestas paradójicas, ya sea sinérgica, antagónica o aditiva (Schug et al, 2011; Romano, 2012). • Susceptibilidad de ventanas de desarrollo. Los efectos adversos de los EDC son más pronunciados en organismos en desarrollo y ocurren a concentraciones por debajo de lo considerado nocivo para un adulto. Algunas razones para que la sensibilidad aumente en organismos en desarrollo es que en los adultos los mecanismos de protección como la reparación de ADN, sistema inmune competente, enzimas desintoxicantes, metabolismo hepático, barrera sangre/cerebro aún no está completamente funcional, incrementando la toxicidad. La exposición a edad temprana a sustancias tóxicas está asociada con el incremento en la tasa de las enfermedades humanas más comunes que han incrementado en los últimos 20 años, como el asma, problemas de aprendizaje, pubertad temprana, infertilidad, cáncer de mama y próstata, enfermedad de Parkinson, obesidad, entre otras (Schug et al, 2011). • Programación epigenética. Se refiere a los factores que regulan la expresión genética sin una modificación en el ADN. La exposición a sustancias químicas que poseen actividad endocrina puede afectar estos factores reguladores (Schug et al, 2011; Romano, 2012). • Acciones transgeneracionales de los disruptores endocrinos. Los factores ambientales promueven la transmisión hereditable de un fenotipo de enfermedad a través de generaciones sucesivas, referido a la herencia transgeneracional epigenética. Muchas sustancias químicas han sido implicadas en que promueven la toxicidad por múltiples generaciones, como el BPA, hidrocarburos policíclicos, cocaína, pesticidas y fitoestrógenos (Schug et al, 2011). 3.1.5 Determinación analítica de contaminantes emergentes Debido a que los CE se encuentran presentes en agua por su fácil disolución, la identificación y cuantificación ha requerido metodologías analíticas altamente sofisticadas capaces de detectar las concentraciones de CE en el orden de pico y nanogramos por litro (ng/L). Las principales técnicas analíticas utilizadas son la cromatografía (de gases o líquidos) acoplada a espectrofotometría de masas. Otras técnicas son la electroforesis capilar técnicas inmunoanalíticas o ensayos biológicos (Agüera et al., 2012; Nikolaou, 2013). 30 Extracción de contaminantes emergentes La extracción se refiere a la transferencia de un soluto de un líquido a otra fase. Las extracciones se clasifican en batch (en lote), continuas o contracorriente. • Extracción batch (en lote). El soluto es extraído de un solvente por agitación con un segundo disolvente inmiscible. Después de agitar las fases están listas para ser separadas, y la que contiene el contaminante de interés es removida con un embudo de separación. • Extracción continua. Requiere de aparatos especiales (por ejemplo, el extractor Soxhlet) siendo más eficiente que la separación batch (en lotes). • Extracción a contracorriente. Separa dos o más solutos con diferentes coeficientes de partición, algunos ejemplos de separación a contracorriente son la cromatografía de partición líquido- líquido. (Ismail y Nielsen, 2017) La extracción generalmente se lleva a cabo por extracción en fase sólida (SPE, solid phase extraction) y por micro extracción en fase sólida (SPME, solid phase microextraction). Para SPE las fases estacionarias usadas son varias mezclas de polímeros (divinilbenceno-vinilpirrolidona), octadecilsílica (C18) o más materiales como inmunosorbentes, polímeros impresos molecularmente, y materiales de acceso restringido (RAM restringed access materials) (Gross et al, 2008). • Micro extracción en fase sólida. Es simple y efectiva, se basa en la adsorción/absorción, elimina la necesidad de usar solventes y muestras compuestas. Depende del analito y la matriz, en el caso de muestras de agua puede llevarse a cabo de diferentes formas: extracción por inmersión directa (para compuestos poco volátiles y muestras secas), extracción de espacio libre (para compuestos más volátiles y muestras con suciedad), SPME protegido por membrana (extracción de analitos de muestras muy contaminadas), tubos SPME y micro extracción de capa fina. Los analitos objetivos en muestras acuosas son extraídos directamente y concentrados por el recubrimiento de la columna capilar, y pueden ser directamente transferidos a columnas de cromatografía de gases o líquidos para su análisis (Gross et al, 2008). • Extracción en fase sólida. La muestra líquida pasa a través de una columna, los solutos o analitos con afinidad son retenidos en la fase, posteriormente se usa un eluyente fuerte para recuperar el analito de interés. La muestra se pasa a través de cartuchos o filtros que son de materiales como C18, aminas, y sílica gel; los cartuchos C18 tienen gran retención de compuestos no polares mientras que los copolímeros de estirendivinilbenceno (DVB) altamente reticulados pueden extraer una amplia gama de compuestos no polares y polares. La extracción en fase sólida tiene numerosas ventajas, se requiere menos solvente, es un método de extracción rápido, menor cristalería requerida, mejor precisión y exactitud, mínima evaporación de solvente, (Qian et al, 2017). Cromatografía Es una técnica de separación basada en la separación-distribución de una muestra (analito) entre una fase móvil y una fase fija o estacionaria. La fase móvil puede ser un gas (cromatografía de gas) o un líquido (cromatografía de líquidos) o un fluido supercrítico; mientras la fase estacionaria es un líquido o un sólido (Ismail y Nielsen, 2017). 31 Cromatografía de gases La fase móvil es un gas y la estacionaria es un líquido inmovilizado o sólido inerte empacado o en una columna tipo capilar, es usada para separar mezclas de componentes volátiles termoestables, como ácidos grasos, triglicéridos, colesterol y otros esteroles, gases, solventes, agua, alcohol, azúcares simples, pesticidas, herbicidas, aditivos alimentarios, antioxidantes, nitrosaminas, bifenilos policlorados, saborizantes, entre otros. La muestra es transportada a través de la columna por el flujo de un gas inerte (Ismail y Nielsen, 2017). Los tamaños de columna van de longitud de 15 – 30 m x diámetro interno de 0.25 – 0.32 mm y diámetro de la película de 0.1 a 1 m (Gross et al, 2008). Cromatografía de líquidos de alta resolución Usada para la separación de contaminantes orgánicos, los tamaños de columna son de longitud de 10 – 25 cm x diámetro interno de 2.1 – 4.6 mm y tamaño de partículas de 3 – 5 m; las fases móviles usadas generalmente son acetonitrilo, metanol o mezclas de ambos solventes (Gross et al, 2008). Detectores Los detectores perciben los efluentes de la columna, proporcionan un registro en forma de cromatograma, proporciona la cantidad de cada analito haciendo posible un análisis cuantitativo (McNair y Miller, 2009). Los detectores disponibles comercialmente son: • Detector de ionización de flama (FID) • Detector de conductividad termal (TCD) • Detector de captura de electrón (ECD) • Detector de nitrógeno/fósforo (NPD) • Detector de ionización de llama alcalina (AFID) • Detector termoiónico (TID) • Detector de fotoionización (PID) • Detector de ionización de descarga (DID) • Detector de ionización de helio (HID) • Detector de flama fotométrico (FPD) • Emisión de plasma atómica (PAE) • Quimiluminiscencia • Detector de densidad de gas (GADE) • Detector de radiactividad • Espectrómetro de masas (MS o MSD) • Infrarrojo con transformador de Fourier (FTIR) La característica más importante de un detector es la señal que produce, pero hay otras dos características como el ruido y el tiempo constante que son importantes. • Ruido. Es la señal producida por un detector en ausencia de muestra, también es llamado “fondo” y aparece en la línea base. • Tiempo constante. Es una medición de la velocidad de respuesta de un detector. Es el tiempo (en segundos o milisegundos) que a un detector le toma responder al 63.2% de un cambio repentino de señal. 32 • Señal. La magnitud de la señal (altura de pico o área de pico) es proporcional a la cantidad de analito y es la base para un análisis cuantitativo. La señal es definida por la sensibilidad, detectabilidad mínima, rango lineal y rango dinámico. o Sensibilidad. Es igual a la señal de salida por unidad de concentración o por unidad de masa de un analito en el gas de acarreo. o Detectabilidad mínima. También llamado cantidad mínima detectada o límite de detección (McNair y Miller, 2009). Espectrómetro de Masas (MS) Es indispensable para la identificación, caracterización, verificación y cuantificación de moléculas pequeñas a grandes moléculas complejas, ha sido acoplada a otras técnicas de separación como la cromatografía de gases o de líquidos; la combinación de estas técnicas ha disminuido los límites de detección e incrementa la confianza de las mediciones. La espectrometría de masas consiste en poner una carga sobre una molécula que lo transforma a un ion (ionización), los iones generados son separados de acuerdo a su radio masa/carga (m/z) y son sometidos a una combinación de campos de radiofrecuencia y electrostáticos en un analizador de masa y finalmente son identificados mediante detectores de alta sensibilidad. Las señales resultantes son digitalizadas y procesadas por un software que despliega la información como un espectro de masas, revelando la masa molecular, su composición estructural permitiendo la identificación del analito. El espectrómetro de masas lleva a cabo tres funciones: debe haber una manera de ionizar las moléculas lo que ocurre en la fuente de iones, las moléculas ionizadas cargadas y sus fragmentos son separados de acuerdo a su m/z esto ocurre en le analizador de masas, los iones separados son detectados, en la Figura 4 se muestra un diagrama de bloques de la conformación de un espectrómetro de masas (Smith y Thakur, 2017). Figura 4 Diagrama de bloques de un espectrómetro de masas (Smith y Thakur, 2017) Cromatografía de Gases – Espectrometría de Masa (GC/MS) La cromatografía de gases es un método rápido de análisis, de alta resolución, fácil operación, excelentes resultados cuantitativos y costos moderados; pero con esta técnica no se puede identificar la identidad o estructura de ningún pico cromatográfico. Sin embargo, la espectrometría de masa puede identificar el compuesto y estructura solo requiriendo microgramos de muestra (McNair y Miller, 2009). Acoplar MS con GC permite que los picos cromatográficos sean identificados usando una búsqueda asistida por computadora en una librería que contiene espectros de masas. También se puede determinar la pureza de cada pico, esto se hace ejecutando GC/MS tomando espectros de masas con incrementos de tiempo muy cortos (Smith y Thakur, 2017). 33 3.2 Actividad estrogénica Las sustancias químicas simulan al estrógeno natural 17-estradiol, por lo que pueden unirse a los receptores de estrógenos (ER) e iniciar la actividad estrogénica en animales (Xie et al, 2015). La habilidad de interactuar de estos compuestos con actividad estrogénica con los receptores estrogénicos, ha sido usada en variedad de ensayos para cuantificar el efecto estrogénico usando métodos biológicos (Roda et al, 2006; Lee et al, 2006). 3.2.1 Medición de la actividad estrogénica Los ensayos biológicos usados se dividen en dos tipos: in vivo, son ensayos efectivos que requieren mucho tiempo, más complejos y costosos; y los ensayos in vitro, son rápidos, baratos y con este tipo de ensayos se pueden identificar compuestos estrogénicos y anti estrogénicos en el ambiente (Céspedes et al, 2004; Petrovic et al, 2003). Ensayos in vitro e in vivo como E-Screen, Yeast Estrogen Screen (YES), ELISA, vitelogenina de pescado han sido usados para medir actividad estrogénica (Chen et al., 2018). Mecanismos involucrados en los ensayos biológicos para determinar actividad estrogénica de los EDC son la proliferación de células, unión de ligandos, inducción de luciferasa, inducción de vitelogenina o interacciones antigen-anticuerpo (Chang et al., 2009). Los ensayos in vivo usan microorganismos acuáticos como Artemia salina, Danio rerio u Oryzas latipes (Zdarta et al., 2022). Ensayos in vitro usan levaduras como YES que se basan en el cultivo de células de levadura modificadas que incluyen receptores de estrógenos humanos capaces de unirse a compuestos estrogénicos, Saccharomyces cerevisiae es la más usada debido a su rápido crecimiento (Zdarta et al., 2022). Sustancias químicas como los productos de higiene personal y EDC desencadenan acciones como imitar o antagonizar las acciones in vivo e in vitro de estrógenos naturales como el 17β-estradiol las cuales se definen como sustancias con actividad estrogénica. Estos compuestos xenobióticos que exhiben actividad estrogénica interactúan con receptores de estrógenos (ER) que producen efectos adversos a la salud (Bittner et al, 2014). A bajas dosis, interfieren en el sistema endocrino de humanos y fauna salvaje, inhibiendo o imitando el comportamiento de hormonas naturales como estrógeno, testosterona y/o tiroides, pudiendo tener efectos estrogénicos, androgénicos o tiroidales (Chang et al., 2009; Chen et al., 2018). El comportamiento en cuanto a actividad estrogénica no sigue un patrón lineal. Reportes han encontrado que no existe relación entre la intensidad de la respuesta de la actividad estrogénica y la concentración de los EDC (Orta et al., 2019). Biosensores Debido a que los ensayos in vivo e in vitro hacen uso de organismos biológicos, éstos reciben el nombre de biosensores. Las características que un biosensor son: pequeño capaz de proporcionar información analítica cuantitativa o semicuantitativa utilizando un elemento de reconocimiento biológico que se mantiene en contacto directo con un transductor que convierte el elemento biológico en una señal de salida, son capaces de proveer información sobre efectos biológicos como toxicidad o actividad estrogénica (Rodriguez-Mozaz et al, 2003). En la Tabla 10, se muestran los tipos de biosensor y la señal que emiten, siendo esta la principal característica de su clasificación. 34 Tabla 10 Clasificación de los biosensores (Rodriguez-Mozaz, et al, 2003) Transducción de señal Electroquímica Amperométrica Conductimétrica Impedimétrica Potenciométrica Óptica Absorción Fluorescencia / Fosforescencia Bio/quimioluminiscencia Reflectancia Dispersión de Raman Índice de reflexión Sensibilidad de masas Biosensores de ondas acústicas de superficie Biosensores de ménsula Termométricos ---- Reconocimiento de biomoléculas ---- Anticuerpos Monoclonal (Inmunosensores) Policlonal Receptores de proteínas Receptores metabotrópicos Receptores ionotrópicos Células completas Sensores microbianos Células de mamíferos Tejidos Ácidos nucleicos Hibridación Interacción compuesta de bajo peso Enzimas ---- La transducción electroquímica ofrece alta sensibilidad, bajo costo y requerimientos bajos de energía. Los biosensores ópticos son más comunes, éstos se basan en propiedades como la absorción de luz, fluorescencia / fosforescencia, bio/quimioluminiscencia, reflectancia, índice de relección; son rápidos, de alta sensibilidad y robustos. Los de sensibilidad de masas como el biosensor de ondas acústicas operan en la base un cristal oscilante cubierto con una capa que contiene el elemento de biorreconocimiento que interactúa con el analito de interés. Los termométricos se basan en la absorción de calor durante las reacciones biológicas (Rodriguez-Mozaz et al, 2003). 3.2.2 BioLuminiscence Yeast Estrogen Screen (BLYES) Dentro de los ensayos in vitro como los competitivos de unión a ligando, proliferación celular y de transcripción del receptor de estrógeno, los ensayos realizados con levaduras recombinantes son más efectivos. (Céspedes et al, 2004). Varios estudios han usado las levaduras recombinantes debido a que son capaces de identificar compuestos con la habilidad de interactuar con los receptores de estrógeno humanos conocidos como ensayos de estrógenos para levaduras recombinantes (rYES, por sus siglas en inglés recombinant yeast estrogen screen), este tipo de ensayos hacen uso de la levadura Saccharomyces cerevisiae genéticamente modificada. El uso de este ensayo basado en el uso de S. cerevisiae se debe a al rápido crecimiento de la cepa, fácil intercambio de plásmidos, costo de ensayo relativamente bajo, alta conservación de mecanismos reguladores entre mamíferos y las células de ese 35 sistema, sistema altamente sensible, bajo esfuerzo y que permite el ensayo de muchas muestras en poco tiempo (De Boever et al, 2001; Routledge y Sumpter, 1996). Los rYES se han modificado debido a que tardan hasta 3 días y hay posibles interferencias con una sustancia cromogénica que se usa (clorofenol rojo--D-galactopiranosida), las modificaciones que se han hecho tienen como característica acortar los tiempos de análisis, la modificación de Boever et al, (2001) y Wagner y Oehlmann (2009) acortaron el tiempo a 24 horas de incubación; mientras la modificación hecha por Sanseverino et al (2005) toma 12 horas, haciendo mediciones cada 60 minutos. La técnica BLYES se usa para evaluar la actividad estrogénica en muestras de agua, la cepa usada es capaz de responder a compuestos estrogénicos los cuales cruzan la pared celular de la levadura y se liga a los receptores de estrógenos humanos (hER-), formando un complejo que se une a los elementos de respuesta de estrógenos activando la transcripción de luxA y luxB, los cuales generan la enzima luciferasa, ésta actúa sobre los sustratos aldehído producidos de los genes luxCDE (genes provenientes de Photorhabdus luminiscens) produciendo una emisión de luz (Sanseverino et al, 2005). En la Figura 5, se muestra la representación esquemática de la configuración de S. cerevisiae para BLYES. Figura 5 Configuración de S. cerevisiae para BLYES (adaptado de Sanseverino et al, 2005) Los compuestos estrógenos cruzan la pared celular y se unen a los receptores de estrógenos, este complejo interactúa con el elemento de respuesta estrogénica (ERE) iniciando la transcripción de luxA y luxB. 36 3.3 Remoción de contaminantes emergentes Como ya se mencionó, lo contaminantes emergentes son difícilmente removidos en las plantas de tratamiento de agua, sin embargo, existen procesos que están enfocados en su eliminación. Los procesos fisicoquímicos de remoción de contaminantes emergentes más usados incluyen coagulación – floculación, sedimentación, filtración, y desinfección de agua; algunos trenes de tratamiento incluyen intercambio iónico y adsorción; sin embargo, estos procesos convencionales son insuficientes para reducir considerablemente algunos EDC (Shammas, 2007). Los tratamientos terciarios de remoción de contaminantes emergentes son: adsorción, filtración por membranas, procesos de oxidación avanzada (POA) y dependiendo de la concentración de los contaminantes puede requerir que se acoplen a tratamientos biológicos. 3.3.1 Adsorción El principio de este tratamiento es remover los contaminantes de una fase (agua) a otra (sólida). El carbón activado es el adsorbente más usado debido a su porosidad y área superficial, siendo capaz de remover los EDC debido al proceso físico y químico de la sorción, alcanzando remociones mayores a 90% (Rivera-Utrilla et al, 2013). Los EDC se acumulan en los poros siendo éstos ligeramente más grandes que los contaminantes, los parámetros de calidad de agua como pH, materia orgánica disuelta y temperatura pueden afectar la remoción (Shammas, 2007). Los tipos de carbón activado usados para estos procesos son el carbón activado (Baccar et al., 2012), biocarbón (Ji et al., 2011), arcillas minerales (Genc y Dogan., 2015), nanotubos de carbón (Zheng et al., 2013), y otros materiales como zeolita, materiales meso y microporosos, resinas, y óxidos metálicos (Hou et al., 2010; Ahmed et al., 2015). La principal ventaja del uso de carbón activado es que no genera productos tóxicos o farmacológicamente activos y también elimina compuestos no polares (Shammas, 2007; Bolong et al, 2009; Rivera-Utrilla et al, 2013; Rodriguez-Narvaez et al, 2017). 3.3.2 Membranas Las membranas son producidas de diversos materiales que les confieren características como tamaño de poro, carga superficial e hidrofobicidad, que determinan el tipo de contaminante a retener. Las membranas se clasifican en: ultrafiltración (UF), nanofiltración (NF), microfiltración (MF) y ósmosis inversa (OR). La MF al llevarse a cabo a presión atmosférica no es capaz de remover contaminantes con tamaño <1 m, la UF remueve contaminantes con tamaños menores a los de los poros de estas membranas (0.001 – 0.1 m), la NF es útil para remover EDC debido a su tamaño de poro que va desde 10 – 100 Å; la OR y la osmosis reversa usan membranas semipermeables. Cuando el tamaño de poro disminuye la eficiencia de remoción de contaminantes incrementa (Melo-Guimarães et al., 2013; Rodriguez-Narvaez et al, 2017). 3.3.3 Procesos de oxidación avanzada Este tipo de procesos son efectivos en la oxidación de numerosos compuestos orgánicos e inorgánicos. Se basan en la generación de radicales libres (HO., O2 -, HO2 -), siendo el radical HO. el más reactivo. Los sistemas basados en la oxidación avanzada utilizan ozono, cloración, radiación ultravioleta, radiación gamma, H2O2, proceso Fenton, sonoquímico, TiO2, o combinaciones de los ya mencionados, 37 alcanzando porcentajes de remoción mayores al 70% (Rivera-Utrilla et al, 2013; Rodriguez-Narvaez et al, 2017). 3.3.4 Tratamientos biológicos Varios procesos biológicos han sido usados, tanto aerobios como anaerobios, por medio de sistemas como: lodos activados (más usado), filtración de suelos, filtración biológica, filtro percolador, reactor de biopelícula y reactores de microalgas. Estos sistemas simulan la habilidad natural de los ecosistemas en atenuar la contaminación del agua constituyendo una alternativa sustentable de costo – beneficio. Los procesos involucrados en este tipo de sistemas facilitan la remoción, reciclaje, transformación o inmovilización de sedimentos, nutrientes y otros contaminantes. Los mecanismos de remoción involucrados pueden ser físicos (sorción, fotodegradación, volatilización y sedimentación), químicos (reacciones de degradación e hidrolisis) y biológicos (biodegradación y fitorremediación), siendo de estos procesos los más predominantes la biodegradación, fitorremediación, fotodegradación y sorción (García-Rodriguez et al, 2014; Rodriguez-Narvaez et al, 2017; Ahmed et al, 2017). 3.4 Remoción de contaminantes emergentes usando microalgas El agua residual contiene nutrientes como nitrógeno y fósforo, así como mezclas de contaminantes, por lo que el uso de microalgas no solo es eficiente para la remoción de nutrientes (usados como sustrato para el crecimiento), sino también para remover metales pesados y sustancias orgánicas. Varias especies de microalgas verdes como C. reinhardtii, S. obliquus, C. pyrenoidosa, C. vulgaris, se han empleado en el estudio de remoción de varios contaminantes orgánicos debido a sus altas eficiencias de remoción y a su recuperación como fertilizante, biocombustible y a la producción de efluentes de agua con alta calidad (Matamoros et al, 2015; Zhou et al, 2014). Los principales procesos que ocurren en los reactores que usan microalgas para el tratamiento de agua residual y que remueven los contaminantes emergentes son la biodegradación, fotodegradación, volatilización y sorción (Tolboom et al, 2019). 3.4.1 Cultivo y cosecha de microalgas El cultivo de microalgas requiere grandes cantidades de agua y nutrientes, el uso de agua residual es una opción que disminuye los costos de cultivo, además de ser una alternativa de tratamiento de agua; siendo los nutrientes contenidos en el agua residual benéficos para el crecimiento de microalgas. Las microalgas crecen autotróficamente (usan luz solar, CO2 como fuente de carbono inorgánico, nutrientes como nitrógeno y fósforo) para realizar la fotosíntesis, haciendo uso de agua residual como medio de cultivo, el metabolismo autótrofo es la ruta metabólica reportada para el aprovechamiento de contaminantes inorgánicos. El agua residual contiene grandes cantidades de nutrientes como el amoniaco, fosfatos y otros componentes esenciales para el crecimiento de las microalgas, éstas asimilan el fósforo en exceso que es almacenado en las células en forma de polifosfato, y el nitrógeno es aprovechado en la forma de NH3 y NO3 - mayormente, seguido de NO2 - y urea. Durante el crecimiento autótrofo los valores de pH entre 7 y 9 son favorables para el crecimiento algal y los cambios de temperatura debidos al cambio de estaciones son importantes ya que algunas especies de microalgas 38 son capaces de adaptarse a estos cambios de temperatura (Dang y Lee 2018; Cuellar-Bermudez et al, 2017). Los sistemas de tratamiento basados en microalgas son más eficientes al remover nutrientes, metales pesados y contaminantes emergentes de agua residual comparados con tratamientos químicos, además de ser tratamientos rentables y ecológicos (López-Serna et al., 2019; Maryjoseph y Ketheesan, 2020). Estos sistemas se basan en la conversión de la energía solar y la ingesta de nutrientes para generar biomasa y oxígeno esto a través de la fotosíntesis (López-Serna et al., 2019; Mohsenpour et al., 2021). Siendo la biomasa generada de interés como un recurso renovable para la producción de biocombustibles y otros bioproductos valorizables como bioplásticos debido al alto contenido de lípidos y a su rápida tasa de crecimiento (Dang y Lee 2018; González-Balderas et al., 2020; Rocha et al., 2020). En el cultivo de microalgas en agua residual, existen interacciones entre bacterias y microalgas, éstas son positivas para el crecimiento algal. Las bacterias consumen oxígeno que degrada la materia orgánica mientras el CO2 producido de esta degradación posteriormente es aprovechado por las microalgas; esta sinergia puede incrementar la producción de biomasa y reducir los requerimientos de aireación, además de incrementar la remoción de contaminantes (Cuellar-Bermudez et al, 2017). Las microalgas pueden aprovechar los metales pesados por medio del proceso de sorción y bioacumulación; así como contaminantes emergentes como fenoles, etinilestradiol, cetonas, fármacos, BPA pueden ser removidos o degradados a moléculas simples por especies como Scenedesmus sp., Chlorella sp., entre otras. Sin embargo, debido a que muchos contaminantes emergentes son moléculas altamente estables es de interés determinar el mecanismo de remoción involucrado (Cuellar-Bermudez et al, 2017). El cultivo de microalgas se lleva a cabo en reactores, por lo que existen distintas configuraciones y estrategias de cultivo que tienen como objetivo mejorar la producción de biomasa. Hay aspectos importantes para su diseño como la iluminación, consumo de agua, consumo de CO2, suministro de nutrientes, control de la temperatura, material de construcción y limpieza (Carvalho et al, 2014); en la tabla 11, se enlistan los tipos de reactores y sus características. Tabla 11. Tipos de reactores para cultivo de microalgas Tipo de reactor Geometría / Forma Características Desventajas Referencia Estanques abiertos Óvalo, llamado raceway (pista de carreras) Bajos costos de construcción y operación Profundidad de agua de 20 a 100 cm Agitación con propelas Existe relación simbiótica alga – bacteria Usado para producir grandes cantidades de biomasa El crecimiento depende de las condiciones climáticas No se puede tener un monocultivo debido a su exposición al ambiente La luz no penetra totalmente en la profundidad del agua en el reactor El CO2 no es usado eficientemente Se requieren grandes áreas para instalar Rawat et al, 2016 Carvalho et al, 2014 39 Tipo de reactor Geometría / Forma Características Desventajas Referencia Fotorreactor de columna vertical Tubular Reactor cerrado Escala laboratorio Compacto, bajo costo, fácil de operar Horizontal, vertical, inclinado, helicoidal o en serpentín Buena transferencia de masa y calor Limitado a volúmenes de 50 a 100 L Las algas pueden pegarse al tubo obstruyendo el paso de la luz Al escalar la transferencia de masa es un problema y no hay buena distribución de luz Carvalho et al, 2014 Fotorreactor de panel plano Paneles Hecho de dos hojas que se pegan entre sí Hechos de material transparente Barato, fácil de limpiar, para cultivos en el exterior Bajo consumo de energía eléctrica Su diseño no es robusto Limitación en la concentración de biomasa Escalamiento requiere muchos compartimientos y materiales de soporte Dificultades en el control de la temperatura Posible estrés hidrodinámico en las microalgas Carvalho et al, 2014 Fotorreactor de capa delgada Capa delgada Diseñado para operar por largos periodos Incrementa la productividad y reduce el costo de producción Construido de material transparente La capa delgada de cultivo (6 a 8 mm) se calienta por acción de la luz, por lo que necesita agua de refrigeración Carvalho et al, 2014 3.4.2 Vías de remoción de contaminantes emergentes Los mecanismos involucrados en la remoción de contaminantes emergentes durante el tratamiento de agua residual son complejos, estando en contacto con bacterias, algas, compuestos orgánicos, iones disueltos bajo condiciones variables de pH, luz y temperatura, por lo que es difícil caracterizar y revelar los mecanismos implicados (Larsen, 2018). Autores como Matamoros et al, (2015) sugieren que los procesos involucrados en los reactores de estanque abierto de alta tasa (High rate algal pond, HRAP, por sus siglas en inglés) son la biotransformación o biodegradación, fotodegradación, sorción, y volatilización por lo que a continuación se describen. Biotransformación o biodegradación Se refiere a la ruptura de sustancias orgánicas catalizadas por enzimas producidas por los microorganismos. Existen dos vías de degradación que son la metabólica y la co-metabólica. La degradación metabólica usa los contaminantes como fuente de carbono, mientras la degradación co- metabólica depende de enzimas no específicas que se encuentran en el ambiente siendo éstas las que degradan los contaminantes. Este mecanismo es considerado el más efectivo y se puede catalogar como biodegradación intracelular y extracelular; con un sistema complejo de enzimas las microalgas pueden tener diferentes tipos de reacciones enzimáticas (hidroxilación, carboxilación, oxidación, hidrogenación, demetilación y división de anillos). Por otro lado, las microalgas al ser capaces de excretar varias sustancias poliméricas (formando una biopelícula) pueden usar esta biopelícula como un sistema digestivo externo que transportan desde la fase acuosa a la matriz los contaminantes que posteriormente son acumulados y utilizados debido a la retención de enzimas extracelulares en la matriz (Nguyen et al., 2020; Gondi et al., 2022; Zhou et al., 2022). 40 Fotodegradación Puede ocurrir por fotólisis directa o foto oxidación indirecta, dependiendo de la estructura de los contaminantes presentes, la cantidad de luz que penetra en el reactor, y la presencia de iones en el agua (Norvill et al, 2016). La fotólisis directa ocurre cuando los fotones son absorbidos por el contaminante objetivo rompiendo los enlaces químicos de éste, se ve afectada por el pH, la temperatura y la interacción con iones orgánicos e inorgánicos presentes. Los compuestos con anillos aromáticos, sistemas conjugados , los heteroátomos son propensos a la fotólisis directa debido a que su alta absorción de la irradiación ultravioleta en el rango de la luz solar (Norvil et al, 2016; Wang et al, 2017). La fotólisis indirecta o foto oxidación ocurre con la generación de radicales libres como el hidroxilo (OH.), radical peróxido (ROO.) y oxígeno en estado excitado o singlet (1O2) producidos durante la irradiación con luz solar, estos radicales se forman en presencia de materia orgánica disuelta (ácidos húmicos y fúlvicos o materia orgánica disuelta), NO3 -, y algunos iones metálicos (Norvil et al, 2016; Wang et al, 2017). La materia orgánica disuelta y el nitrato son dos componentes del agua residual que absorben luz alcanzando un estado energético excitado y producen compuestos reactivos que reaccionan y transforman otras moléculas orgánicas, estos compuestos reactivos son llamados fotosensibilizadores (Koumaki et al., 2015; Wang et al, 2017). La fotodegradación depende de la estructura molecular de los contaminantes y las condiciones ambientales, además de que este tipo de mecanismo es más efectivo a profundidades menores a 10 cm, teniendo como desventajas una incompleta degradación de los contaminantes y la generación de subproductos que pueden ser más tóxicos que el contaminante inicial (Nguyen et al., 2020). Biosorción Se puede definir como la remoción de sustancias de la fase acuosa a un material biológico. Incluye mecanismos fisicoquímicos como la absorción (el contaminante entra dentro de la célula microalgal, intracelular), adsorción (el contaminante se queda en la superficie celular, extracelular), intercambio iónico, complejación y precipitación de superficie. Hace uso de biomasa viva y muerta (seca o liofilizada), siendo el metabolismo de los microorganismos vivos que afecta los mecanismos fisicoquímicos de biosorción. La biosorción se ve afectada por las características de los contaminantes, como la hidrofobicidad, grupos funcionales, pH, temperatura, tiempo de contacto (Gadd, 2009; Xiong et al, 2017; Bilal et al, 2018). Debido a la presencia de grupos funcionales dominantes como carboxil, fosforil y amida, la pared celular de las microalgas tiene una carga negativa, y como resultado de la interacción electrostática los contaminantes con grupos catiónicos se pegan a la superficie de la célula resultando en biosorción; además de que las microalgas excretan sustancias similares a la celulosa, pectina, quitina, alginato, glicano, lignina, entre otros, que proporcionan importantes sitios de sorción (Nguyen et al., 2020). 41 Volatilización Contribuye a la remoción de contaminantes emergentes con valores altos de la constante de ley de Henry (H), y de la aireación suministrada, este proceso es afectado por la intensidad y la temperatura de la extracción de aire en el sistema; transporta contaminantes de la fase líquida a la atmosfera en lugar de descomponerlos (Wang et al, 2017). Este tipo de mecanismo se ve afectado por la intensidad de la corriente de aire y la temperatura del sistema (Nguyen et al., 2020) En la Figura 6 se muestran los procesos que intervienen en la remoción de contaminantes emergentes usando microalgas como tratamiento. Figura 6 Procesos involucrados en la remoción de contaminantes emergentes usando microalgas como tratamiento (adaptado de Wang et al, 2017) 3.4.3 Reúso de la biomasa Los estudios realizados al reúso de la biomasa posterior a un tratamiento de agua residual están orientados a la generación de biocombustibles, la extracción de fósforo, lípidos, proteínas y carbohidratos (González-Balderas et al., 2020a, González-Balderas, et al., 2020b) para su posterior aprovechamiento en bioplásticos (Gonzáles-Balderas et al., 2020c; López-Rocha, et al., 2020). Sin embargo, existen pocas publicaciones en las que se estudia el reúso de la biomasa microalgal, posterior a un tratamiento de remoción de contaminantes emergentes presentes en agua residual. 42 Ávila et al., 2021, evaluó la producción de biogás en un sistema microalgal. El consorcio usado se compuso de una mezcla de Chlorella sp. y Scenedesmus sp., la remoción de pesticidas a nivel laboratorio fue del 97% de clorpirifós, 88 % de oxadiazona y 74 % de cipermetrina; posteriormente de la remoción de pesticidas se evaluó el potencial bioquímico de metano (BMP). Después de evaluar el BMP, se encontró que la remoción de los pesticidas no inhibe la producción de biogás. En el estudio realizado por Xie, et al., 2019, la remoción de bisfenol-A (BPA), tetraciclina (TCY) y sulfametoxazol (SMX) se hizo usando la microalga Chlamydomonas sp., se encontró que SMX es removido por biodegradación; y una combinación de fotólisis e hidrolisis para la remoción de BPA y TCY. Se observó que la cantidad de ácidos grasos C16 y C18 aumentó, no habiendo diferencia en otros ácidos grasos importantes. La cantidad de C18 aumentó en un 15.2% a una concentración de TCY de 10 g/L. La degradación de intermediarios puede inducir la acumulación de ácidos grasos monoinsaturados, lo cual aumenta la calidad del biodiesel. 3.5 Legislación y normatividad Debido a la importancia y énfasis que se ha hecho en secciones anteriores sobre los efectos a la salud y el ambiente que la presencia de los contaminantes emergentes causa, principalmente presentes en la descarga de aguas, es recomendable analizar la normatividad nacional e internacional que rige el uso, descarga y límites máximos permisibles de estas sustancias. 3.5.1 México En la regulación de contaminantes en agua residual, residual tratada y agua potable, las Normas Oficiales Mexicanas de la SEMARNAT en sus normas NOM-001-SEMARNAT-1996, NOM-002- SEMARNAT-1996, NOM-003-SEMARNAT-1997; indican los límites máximos de contaminantes para agua residual, siendo parámetros fisicoquímicos, parámetros biológicos (huevos de helminto y coliformes fecales), metales pesados. La NOM-014-CONAGUA-2003 indica los límites máximos permisibles para agua residual tratada para recarga en acuífero, teniendo como parámetros biológicos, demanda biológica de oxígeno (DBO5), carbono orgánico total (COT) y los contaminantes regulados por la NOM-127-SSA1-1994 (2000). La NOM-127-SSA1-1994 (2000) contempla entre sus parámetros a regular características físicas, organolépticas, biológicas, radiactivas y químicas; dentro de éstas últimas se consideran plaguicidas (aldrín y dieldrín, clordano, DDT, gamma-HCH, hexaclorobenceno, heptacloro y epóxido de heptano, metoxicloro, 2,4-D) y trihalometanos totales; siendo los únicos contaminantes emergentes regulados que se presentan en agua potable, para el resto de los contaminantes emergentes mencionados anteriormente (fármacos, hormonas, esteroides, entre otros) no se tiene una regulación nacional. 43 3.5.2 América Latina Para la regulación en países de América Latina, se tiene que en Chile la Norma Oficial Chilena NCh 409/1.Of2005 referente a agua potable regula sustancias químicas de importancia para la salud, entre las cuales se engloban compuestos orgánicos (tolueno, benceno), plaguicidas y subproductos de la desinfección (Henríquez, 2012). En Colombia las regulaciones 1164 de 2002 y 371 de 2009 establecen la gestión de residuos hospitalarios y la devolución de productos de post consumo de fármacos o medicamentos vencidos, respectivamente, esto para reducir la presencia de fármacos al ambiente. En cuanto a aguas, el decreto 1575 de 2009 se refiere a la protección y control de la calidad del agua para consumo humano que no incluye límites máximos para productos farmacéuticos o de higiene personal (Caviedes, et al., 2017). En Brasil hay 30 pesticidas contemplados en la Portaria MS 2914/2011 y en las resoluciones CONAMA 357/2005 y 396/2008 (Montagner, et al., 2017). 3.5.3 Estados Unidos En cuanto a regulación a nivel internacional la EPA ha desarrollado guías y métodos de prueba, tales como Clean Water Act (1997), Safe Drinking Water Act (1974), Pharmaceutical manufacturing guidelines (1998), Nanomateriales Facts-Sheet (2012) y Compuestos fluorados PFOS y PFOA (2013). 3.5.4 Europa Mientras en la Unión Europea existen las regulaciones Water framework directive (2000/60/EC), Prority substances directive (2008/105/EC), Groundwater directive (2006/118/EC), Drinking water directive (98/83/ED) y para Inglaterra y Gales se tiene la Groundwater (England and Wales) regulation de 2009. Las normativas europeas se centran en límites máximos permisibles de contaminantes que consideran fármacos y hormonas, sustancias que las normas para América Latina no contemplan. 44 4. HIPÓTESIS, OBJETIVOS Y ALCANCES 4.1 Hipótesis La presencia de BPA y TCS en agua residual sintética tiene un efecto promotor en el crecimiento y producción de biomoléculas en un consorcio microalgal expuesto a los contaminantes emergentes mencionados; simultáneamente, el consorcio será efectivo para disminuir la cantidad de nutrientes presentes en el agua residual sintética, la concentración de BPA, TCS, y la actividad estrogénica asociada a estos dos contaminantes emergentes. 4.2 Objetivos Objetivo general Determinar las vías de remoción y la actividad estrogénica involucradas en un sistema basado en microalgas para tratar agua residual sintética contaminada con bisfenol-A y triclosán. Objetivos específicos 1. Determinar la concentración letal media (EC50) de bisfenol-A y triclosán que provoca la muerte del 50% de una población inicial de microalgas para definir la tolerancia máxima del consorcio microalgal, de acuerdo a la guía OECD 201. 2. Medir la actividad estrogénica de bisfenol-A y triclosán, presentes en agua residual sintética, mediante la validación la técnica de BioLuminescent Yeast Estrogen Screen (BLYES) acoplada con CG/MS. 3. Evaluar el efecto que tiene la adición de bisfenol-A o triclosán en un consorcio microalgal con predominancia de Scenedesmus obliquus y Desmodesmus sp., cuantificando el crecimiento (sólidos suspendidos totales y clorofila a) y la producción de biomoléculas (carbohidratos, lípidos y proteínas). 4. Determinar a nivel laboratorio la capacidad de un sistema basado en microalgas para tratar agua residual sintética contaminada con bisfenol-A y triclosán; por medio de la medición en el cambio en los nutrientes, DQO soluble, los compuestos emergentes presentes y actividad estrogénica. 5. Establecer las vías de remoción involucradas en la eliminación de bisfenol-A y triclosán en un tratamiento de agua residual basado en microalgas, cuantificando para cada vía de remoción el porcentaje de eliminación de los dos contaminantes emergentes adicionados. 4.3 Alcances • Se determinarán las vías de remoción y la actividad estrogénica de bisfenol-A y triclosán en agua residual sintética a nivel laboratorio usando un consorcio microalgal, previamente adaptado en agua residual, con Predominancia de S. obliquus y Desmodesmus sp. • Se evaluará la respuesta al estrés del consorcio microalgal al ser expuesto a BPA o TCS, realizando experimentos a nivel laboratorio. 45 5. METODOLOGÍA La metodología a seguir se dividió en seis etapas: curvas de calibración y producción de biomasa; determinación de EC50, validación de la técnica BLYES/GC-MS, efectos de los contaminantes emergentes sobre el consorcio microalgal, determinación de vías de remoción a escala laboratorio y determinación de la actividad estrogénica. En la figura 7 se muestra un diagrama de flujo general de la metodología a empleada. Figura 7. Diagrama de flujo general de la metodología a usar 5.1. Parámetros fisicoquímicos de agua residual sintética y curvas de calibración 5.1.1. Parámetros fisicoquímicos de agua residual sintética La caracterización del agua residual se realizó con los parámetros y métodos enlistados en la tabla 12. Tabla 12. Métodos para la caracterización de agua residual Parámetro Método analítico Técnica Sólidos suspendidos totales Método 2540 D Gravimetría Ortofosfatos Método de cloruro de estaño, 4500P-D Colorimétrico, a longitud de onda de 690 nm Nitrógeno amoniacal Método 4500-NH3 C Destilación con NaOH y titulación con H2SO4 DQO Método 5220 D Colorimétrico, a longitud de onda de 600 nm 46 Parámetro Método analítico Técnica Nitratos Método 353.1, EPA Sulfato de brucina Colorimétrico, a longitud de onda de 410 nm Nitritos Método 353.2, EPA Ácido sulfanílico Colorimétrico, a longitud de onda de 543 nm Alcalinidad total como CaCO3 Método 2320B Titulométrico. Titulación con H2SO4 La composición del agua residual sintética se muestra en la tabla 13, la cual está basada en el medio BG-11 (el cuál no incluye contenido de materia orgánica) , esta agua residual sintética (ARS) corresponde a una composición típica de agua residual doméstica (Habibi et al., 2019). Tabla 13. Composición del agua residual sintética (ARS) Compuesto Concentración (mg/L) NaNO3 42 K2HPO4 48 MgSO4 7H2O 75 CaCl2 2H2O 36 Na2CO3 20 Ácido cítrico 6 EDTA 1 Solución de metales traza* 1 mL/L NH4Cl** 40 *Composición solución metales traza (mg/L): H3BO3, 2.86; MnCl2 .4H2O, 1.81; ZnSO4 .7H2O, 0.222; NaMoO4 .2H2O, 0.39; CuSO4 .5H2O, 0.079; Co(NO3)2 .6H2O, 0.049; glucosa, 0.09 **añadido para contenido de nitrógeno amoniacal 5.1.2. Curva de calibración de crecimiento de microalgas Se realizó una curva de calibración en la que se relaciona la absorbancia del cultivo a 680 nm que se midió en un espectrofotómetro Hach DR3900, contra los mg/L de biomasa (o sólidos suspendidos totales, SST) y el conteo celular. Se preparó la curva de calibración para el agua residual sintética, preparando 50 mL de cada punto de la curva de calibración, a densidades ópticas a 680 nm (OD680), aproximadas de 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 y 3.0 Sólidos suspendidos totales Para la medición de SST se tomaron 10 mL de muestra y se siguió la técnica gravimétrica del Método 2540 D. Se graficó el contenido de SST contra la densidad óptica a 680 nm y contra el conteo celular. Conteo celular La segunda curva de calibración que se realizó fue el número de células/mL, el conteo se realizó en una cámara de Neubauer, (Blaubrand, Alemania, Ref. 717810) de 0.0025 mm2 de área y 0.1 mm de profundidad, observando en un microscopio óptico Carl Zeiss Microscopie Axio Lab.A1 a un aumento de 40X. Se graficó el conteo celular contra la densidad óptica a 680 nm y en otro gráfico, el conteo celular se graficó contra los SST. 47 5.2. Efecto toxicológico Se observó el efecto que los contaminantes emergentes tienen sobre el crecimiento del consorcio microalgal, probando distintas concentraciones y se obtuvo una concentración de dosis letal media (EC50). Los experimentos se realizaron siguiendo la metodología de la guía OECD 201, para BPA se usaron, concentraciones de 5.0, 10.0, 15.0, 16.0, 17.0, 18.0, 19.0, 20.0 y 25.0 mg/L. Para triclosán 300, 325, 350, 375, 400, 425 y 450 g/L. Para cada contaminante se realizó un control sin contaminante emergente y un control con metanol. Las condiciones experimentales fueron fijadas en: • Volumen: 150 mL • Luz constante: 100 mmol/s m2 • Agitación: 150 rpm • Temperatura ambiente • Concentración inicial microalgas ≈104 cel/mL • Tiempo de ensayo: 96 horas El medio de cultivo utilizado fue el recomendado por OECD, cuya composición incluye por cada litro de medio: NaHCO3 50 mg, NH4Cl 15 mg, MgCl2.6(H2O) 12 mg, CaCl2.2(H2O) 18 mg, MgSO4 .7(H2O) 15 mg, KH2PO4 1.6 mg, FeCl3.6(H2O) 0.0640 mg, Na2EDTA.2(H2O) 0.1 mg, H3BO3 0.185 mg, MnCl2.4(H2O) 0.415 mg, ZnCl2 0.003 mg, CoCl2.6(H2O) 0.0015 mg, Na2MoO4 .2(H2O) 0.007 mg, CuCl2.2(H2O) 0.00001 mg, el medio tiene un pH de 8.1. Debido a las bajas cantidades de reactivo para la preparación del medio se realizaron soluciones estándar de acuerdo a la guía OEDC 201 las cuales se describen en el anexo B1. El conteo celular se realizó cada 24 horas en una cámara de Neubauer, observando en un microscopio óptico Carl Zeiss Microscopie Axio Lab.A1 a un aumento de 40X. Al inicio y final del experimento se observaron las microalgas en un microscopio óptico Carl Zeiss Microscopie Axio Lab.A1 a un aumento de 100X para observar cambios fisiológicos que pudieran ocurrir debido a la adición de los contaminantes emergentes. 5.3. Validación BLYES/GC-MS Para la validación de la técnica de cromatografía de gases / espectrometría de masa y BLYES (GC/MS- BLYES) se siguió lo planteado en el diagrama de flujo mostrado en la Figura 8. Esta metodología está planteada para que la muestra tratada sea usada para GC/MS y BLYES. 48 Figura 8. Diagrama general de flujo para la validación de la técnica GC/MS-BLYES 5.3.1. Curva de calibración de contaminantes emergentes Se realizaron curvas de calibración para cada contaminante emergente (BPA ≥99% Sigma Aldrich 239658-50G; TCS ≥99% Sigma Aldrich PHR-1338-1G) y el uso de metanol grado HPLC ≥99.9% (Sigma Aldrich 34860-1L). Preparación del material Para evitar interferencias en el análisis de las muestras, así como en la preparación de las curvas de calibración, el material de cristalería (no volumétrico) se lavó con detergente libre de fosfatos y abundante agua, después se remojó 24 horas en agua corriente, posteriormente se remojó en agua Milli- Q por 24 horas, se dejó secar por 24 horas y se desorbió en un horno a 180°C durante 2 horas. Curvas de calibración Para el análisis cromatográfico, se elaboraron curvas de calibración individualmente para triclosán y bisfenol-A. Se prepararon cinco curvas de calibración para cada analito. Las concentraciones usadas en la curva se establecieron en 0.5, 1.0, 5.0, 10.0, 15.0 y 20.0 mg/L para bisfenol-A y para triclosán de 50, 49 100, 200, 300 y 400 g/L; aforando con metanol (curvas directas) a un volumen de 25 mL. Las curvas preparadas con metanol se evaporaron en una parrilla de calentamiento a 55 °C, hasta obtener un volumen de 300 L. Para comprobar el porcentaje de recuperación por extracción en fase sólida (SPE), se realizó una curva de calibración aforada con agua Milli-Q a 25 mL, para cada analito y a las mismas concentraciones ya mencionadas. Éstas, se pasaron por extracción en fase sólida como se describe en el punto 5.3.1.3. Las curvas de calibración se prepararon a partir de una solución stock de 1 mg/mL. Extracción en fase sólida Para realizar la extracción en fase sólida se utilizaron cartuchos OASIS C-18 con 500 mg de fase sólida (Waters Oasis HLB 6cc, Part. No. 186000115). Se inició con el acondicionamiento del cartucho de extracción en fase sólida adicionando 6 mL de metanol, el cual permaneció durante 15 minutos en el cartucho. Se eluyó el metanol aplicando vacío. La muestra se filtró a través del cartucho OASIS C-18 a flujo lento (aprox. 10 mL/min) a velocidad constante aplicando vacío. Los analitos retenidos en la fase sólida se eluyeron con 6 mL de metanol a flujo lento y velocidad constante aplicando vacío. El extracto obtenido se evaporó en una parrilla con calentamiento a 55 °C hasta obtener un volumen de 300 µL (Factor de concentración 83.33x). Se inyectó 1 L de cada punto de la curva de calibración por triplicado en un cromatógrafo de gases (Agilent, modelo 7890A) acoplado a un espectrómetro de masas (Agilent, modelo 5975C). Las condiciones del cromatógrafo fueron: ✓ Temperatura de inyección: 250 °C ✓ Columna: DB5-MS (30 m x 0.25 mm i.d x 0.25 µm film) ✓ Gas acarreador: Helio ✓ Rampas de temperatura en el horno (Ma et al., 2017): o Inicia en 60°C manteniéndose por 1 min o Aumenta 20°C/min hasta llegar a 80°C manteniéndose 1 min o Aumenta 5°C/min hasta llegar a 110°C manteniéndose 1 min o Aumenta 5°C/min hasta llegar a 150°C manteniéndose 1 min o Aumenta 5°C/min hasta llegar a 230°C manteniéndose 1 min o Aumenta 20°C/min hasta llegar a 300°C manteniéndose 4 min. o Tiempo total: 37.5 minutos ✓ Detector: Espectrómetro de masas marca Agilent, modelo MS5975 ✓ Modo de operación del detector: modo SIM Modo: Splitless ✓ Iones específicos: o BPA, m/z: 65.0, 91.0, 119.0, 213.0, 228.0 o TCS, m/z: 51.0, 63.0, 79.0, 114.0, 146.0, 218.0, 290.0 5.3.2. Preparación del cultivo de la levadura Saccharomyces cerevisiae La cepa S. cerevisiae BLYES es cultivada en medio Yeast Minimal complementado (YMM leu-, ura- comp), la formulación del medio se enlista en el anexo B2. 50 La preparación del medio de cultivo y el cultivo de S. cerevisiae se ilustra en la Figura 9. Figura 9 Diagrama de la preparación del medio de cultivo y el cultivo de la levadura S. cerevisiae La levadura S. cerevisiae proviene de un stock que se mantiene en ultracongelación, la preparación de este stock se describe en el anexo B3. 5.3.3. Dilución de muestras De las inyecciones en cromatografía se determinaron las tres curvas de calibración que presentaron la menor desviación estándar, éstas fueron las utilizadas para el ensayo de BLYES. De las muestras concentradas se realizaron diluciones de acuerdo a lo mostrado en la Figura 10. Los volúmenes indicados son los que se usaron para el análisis de la actividad estrogénica, que se explicará más adelante en el punto 5.3.5. 51 Figura 10 Dilución de muestras 5.3.4. Preparación de curva estándar 17 -estradiol El estándar de la actividad estrogénica como control positivo es el 17 -estradiol, realizando diluciones seriadas como se indica en la Figura 11. Figura 11 Preparación de curva estándar 17 -estradiol; (A) Soluciones stock de 17 -estradiol, (B) Diluciones seriadas de 17 -estradiol 52 5.3.5. Análisis de actividad estrogénica Una vez realizadas las diluciones descritos en la sección 5.3.3 y el cultivo de la sección 5.3.2, se procedió a realizar el ensayo BLYES, utilizando una placa serológica de 96 pozos, el llenado de los pozos se realizó como sigue: Se adicionaron 40 L de cada una de las diluciones de la curva estándar de 17 -estradiol (dilución uno a la 18), se adicionaron 40 L de metanol (blanco metanol) y agua Milli-Q (control negativo agua). Se tomaron los volúmenes de las muestras indicados en la figura 11 y se colocaron en sus respectivos pozos (1 al 9). Se dejaron secar los volúmenes colocados en la placa, una vez evaporados se añaden a cada pozo 200 L del cultivo de la levadura S. cerevisiae OD600 de 1.0, una vez llena la placa se colocó una membrana de sello transpirable y posteriormente se introdujo en un luminómetro que determinó la actividad estrogénica. El llenado de la placa se ilustra en la Figura 12. Figura 12 Esquema para el llenado de las placas serológicas La lectura de la placa se llevó a cabo en un luminómetro BioTek FLX800, que registra los datos en escala logarítmica generando una curva sigmoidal de componentes hormonales activos. Para ello, el equipo cuenta con un software especializado (Gen5 Microplate Reader and Imager Sofware), el cual proporciona la lectura de luminiscencia que se refieren a la concentración en moles de 17 β – estradiol. El equipo hace la lectura de luminiscencia (una cuenta por segundo) versus la concentración de EDC en moles (M), tarda aproximadamente 2 minutos en emitir el resultado. Las lecturas se realizan cada 60 minutos durante 12 horas. 5.4. Determinación de las vías de remoción de contaminantes emergentes La determinación de las vías de remoción de contaminantes emergentes (fotodegradación, biodegradación y sorción) se realizó en agua residual sintética. En la Figura 13, se muestra el arreglo experimental a seguir para la determinación de las vías de remoción. 53 Figura 13 Arreglo experimental para la determinación de las vías de remoción de contaminantes emergentes 54 5.4.1 Factores bióticos Los factores bióticos son debidos a la presencia de organismos vivos, los factores que se evaluaron son biodegradación y biosorción (absorción y adsorción). Se realizó triplicado, el experimento A (Figura 13) tiene como medio de cultivo agua residual sintética. Condiciones experimentales: • Luz (12 h luz / 12 h oscuridad) 100 mmol/s m2; luz blanca fría • Agitación (150 rpm) • Temperatura ambiente • Volumen inicial: 600 mL • [CE]= EC50 y concentración reportada en agua residual 5.4.2 Factores abióticos, fotodegradación indirecta La fotodegradación indirecta necesita la presencia de NO3 - para la formación de radicales libres (como 1O2 y .OH, Matamoros et al, 2008) que son los que rompen los enlaces de los contaminantes. Al igual que el experimento de factores bióticos el medio en que se realizó el experimento fue agua residual sintética. Condiciones experimentales: • Luz (12 h luz / 12 h oscuridad) 100 mmol/s m2; luz blanca fría • Agitación (150 rpm) • Temperatura ambiente • Sin biomasa • Volumen inicial: 600 mL • [CE]= EC50 y concentración reportada en agua residual 5.4.3 Factores abióticos, fotodegradación directa La fotodegradación directa consiste en la ruptura de las moléculas por acción directa de la luz. Por lo que en este experimento solo se evaluó la acción directa de la luz sin otras interferencias, teniendo como matriz agua Milli Q. Condiciones experimentales • Agua Milli-Q • Luz (12 h luz / 12 h oscuridad) 100 mmol/s m2; luz blanca fría • Agitación (150 rpm) • Temperatura ambiente • Sin biomasa • Volumen inicial: 600 mL • [CE]= EC50 y concentración reportada en agua residual 55 5.4.4 Blanco El objetivo del blanco es tener una referencia de la concentración y estructura de los contaminantes a estudiar, se tuvieron dos blancos, uno de fotodegradación y otro de crecimiento de las microalgas. Condiciones experimentales: Blanco Fotodegradación • Agua Milli-Q • Oscuridad • Agitación (150 rpm) • Temperatura ambiente • Sin biomasa • Volumen inicial: 600 mL • [CE]= EC50 y concentración reportada en agua residual Blanco crecimiento microalgas • Agua residual sintética • Luz (12 h luz / 12 h oscuridad) 100 mmol/s m2; luz blanca fría • Agitación (150 rpm) • Temperatura ambiente • Volumen inicial: 600 mL • Sin adición de CE En la Tabla 14, se esquematizan las condiciones de concentración de biomasa y contaminantes emergentes a usar en cada experimento. Tabla 14. Condiciones experimentales para la determinación de vías de remoción y efecto de BPA y TCS Experimento Concentración biomasa mg/L [BPA]= mg/L [TCS])= g/L Factores bióticos A 300 17.0 9.87x10-3 325.0 10.09 B 500 17.0 9.87x10-3 325.0 10.09 Blanco microalgas C 300 0 0 0 0 D 500 0 0 0 0 Fotodegradación directa E 0 17.0 9.87x10-3 325.0 10.09 Fotodegradación indirecta F 0 17.0 9.87x10-3 325.0 10.09 Blanco fotodegradación G 0 17.0 9.87x10-3 325.0 10.09 5.4.5 Análisis de las muestras De cada réplica de los experimentos se tomaron 100 mL de muestra los días 0, 3, 7, 10, 13 y 15. En la Tabla 15, se enlistan los parámetros a determinar para cada experimento, de acuerdo a lo establecido en la Figura 13. 56 Tabla 15. Parámetros a determinar por cada experimento de determinación de vías de remoción Parámetro a determinar Experimento A B C D E F G 1 Temperatura 2 pH 3 DQO soluble 4 Nitratos 5 Nitritos 6 Nitrógeno amoniacal 7 Ortofosfatos 8 Alcalinidad como mg CaCO3/L 9 SST 10 Clorofila “a” 11 OD680 nm 12 Conteo celular 13 Tasa de crecimiento 14 Proteínas 15 Lípidos 16 Carbohidratos 17 Conc. CE en el medio 18 Conc. CE intracelular 19 Conc. CE extracelular 20 Actividad estrogénica GC: cromatografía de gases; CE: contaminante emergente (BPA y TCS) Los parámetros fisicoquímicos (1 al 8) se determinaron de acuerdo a los métodos enlistados en la Tabla 12. SST de acuerdo a la sección 5.1.3.1. Para la medición de clorofila se tomaron 2 mL de cultivo y se agregaron 10 mL de metanol al 90% (extracción del pigmento), la mezcla se sometió a sonicación (Branson 2510 DTH Ultrasonic) por 20 minutos, posteriormente se calentó a 60 °C en un digestor Hach (DBR200) por 15 minutos; seguida de una centrifugación (Hermle Labortechnick GmbH, modelo Z513K) a 5000 rpm por 20 minutos. El sobrenadante se recuperó y se midió la absorbancia a longitudes de onda de 650, 665 y 750 nm (Toledo- Cervantes et al., 2013) en un espectrofotómetro Hach DR 3900. Los resultados obtenidos a = 650 y 665 nm se le resta a cada uno el obtenido a = 750 nm. Para calcular el contenido de clorofila se emplearon las siguientes ecuaciones (Becker, 1994): 𝐶𝑙𝑜𝑟𝑜𝑓𝑖𝑙𝑎 𝑎 = 𝐶𝑎 = 16.5𝐴665 − 8.3 𝐴650 𝐶𝑙𝑜𝑟𝑜𝑓𝑖𝑙𝑎 𝑏 = 𝐶𝑏 = 33.8 𝐴650 − 12.5 𝐴665 𝐶𝑙𝑜𝑟𝑜𝑓𝑖𝑙𝑎 𝑎 + 𝑏 = 4.0𝐴665 + 25.5𝐴650 Estas ecuaciones se usan para una mezcla de microalgas usando metanol al 90% como disolvente, el contenido de clorofila está dado en g/mL. Donde: A665 Absorbancia medida a 665 nm 57 A650 Absorbancia medida a 650 nm El conteo celular se realizó a partir de la curva de calibración de conteo celular vs SST descrita en la sección 5.1.3.2. La tasa de crecimiento se hizo a partir de las mediciones de SST, usando la ecuación: 𝜇 = ln 𝐴1 − ln 𝐴0𝑡1 − 𝑡0 Donde:  es la tasa de crecimiento en días-1 A1 SST al tiempo en que se toma la muestra A0 SST inicial t1 tiempo en que se toma la muestra t0 tiempo inicial La determinación del contenido de biomoléculas (carbohidratos, lípidos y proteínas) se realizó como sigue: a) Carbohidratos: utilización del método colorimétrico fenol-ácido sulfúrico. A 1 mL de cultivo se agregó 1 mL de fenol al 5% (p/v) y 5 mL de H2SO4 concentrado. Se dejó reposar por 10 minutos y se introdujo en un baño de agua a temperatura ambiente; midiendo en el espectrofotómetro Hach a 490 nm. El H2SO4 hidroliza los enlaces glucosídicos y el fenol reacciona con los monosacáridos dando una coloración amarillo-marrón (Hernández-García et al., 2019). b) Lípidos: utilización del método colorimétrico de la sulfo-fosfovainillina. A 1 mL de cultivo se agregaron 2 mL H2SO4 de y se calentó a 100 °C por 15 minutos, transcurrido el tiempo las muestras se dejaron en un baño de hielo y se agregaron 5 mL de sulfo-fosfovainillina. Las muestras se mantuvieron a temperatura de 37°C por 15 minutos y se midieron en el espectrofotómetro Hach a 530 nm. En este método de determinación, el H2SO4 a altas temperaturas reacciona con los lípidos formando iones carbonio los cuáles reaccionan con el grupo crabonilo de la fosfovainillina formando un compuesto color rosado (Hernández-García et al., 2019). c) Proteínas: método alcalino y de Biuret. Se tomaron 5 mL de cultivo y se ajustó el pH a 11 con NaOH 2N, se dejó en un baño de agua a 40 °C por una hora agitando cada 10 minutos. Terminado el tiempo de una hora se dejó reposar por 30 minutos, al término del tiempo, el sobrenadante de la muestra se filtró con una membrana de 0.45 m de diámetro de poro. De la muestra filtrada se tomó 1 mL y se agregaron 4 mL de reactivo de Biuret, se agitó y se midió en el espectrofotómetro a 540 nm. Este método se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. El Cu2+ se acompleja con los grupos NH en una estequiometría 1:4 (Uzun et al., 2012). 58 La preparación de las soluciones usadas para la determinación de las biomoléculas se describe en el anexo C. Para determinar la concentración de CE (contaminante emergente, solo para los experimentos con EC50) en el medio se tomaron 20 mL del cultivo de microalgas y se centrifugó a 4000 rpm por 20 minutos, el sobrenadante se trató de acuerdo a lo descrito en la sección 5.1.2.3, para los experimentos sin microalgas se trató directamente la muestra para extracción en fase sólida. La determinación de la concentración de CE extracelular e intracelular se realizó de acuerdo a lo realizado por He et al, 2016. El pellet centrifugado se trató como sigue: se agregaron 6 mL de metanol agitando por 60 segundos, seguido de una centrifugación a 8000 rpm por 25 minutos, se repitió el lavado una segunda vez para asegurar la extracción del contaminante emergente; posteriormente se trató el sobrenadante para la extracción en fase sólida (concentración extracelular). Al pellet después de centrifugar se le agregaron 3 mL de una mezcla diclorometano / metanol (1:2 v/v) y se sometió a sonicación por 20 minutos. Se centrifugó a 8000 rpm por 25 minutos. Los lavados con la mezcla de diclorometano / metanol se realizaron tres veces para asegurar la extracción del CE. El sobrenadante se trató para extracción en fase sólida (concentración intracelular) previamente filtrado con ayuda de una jeringa y filtros PVDF de 0.22 m (Millex Filter Unit, Ref.: SLGV033NB). Las muestras para los experimentos de fotodegradación fueron de 20 mL, se filtraron a través de un filtro de 0.22 m y se pasaron a la SPE. La actividad estrogénica se determinó de acuerdo a la sección 5.3 y se realizó para los parámetros 17 al 19 (Tabla 15) para los experimentos A, B, E, F y G. 5.4.6 Balance de masa De la determinación de la concentración de los CE en el medio, intracelular y extracelular, y por acción de la fotodegradación, el balance de masa se representa por la siguiente expresión matemática: 𝑋𝑏 = 𝑋𝑖 − 𝑋𝑟 − 𝑋𝑒 − 𝑋𝑎 − 𝑋𝑓𝑎 − 𝑋𝑜𝑓 Donde Xb Concentración biodegradada Xi Concentración inicial Xr Concentración residual en la fase acuosa Xe Concentración extracelular o adsorbida Xa Concentración intracelular o absorbida Xfa Concentración degradada por factores abióticos Xof Concentración degradada por otros factores Donde la concentración degradada por factores abióticos está definida por: 𝑋𝑓𝑎 = 𝑋𝑓𝑑 + 𝑋𝑓𝑖 59 Donde: Xfd Concentración degradada por fotodegradación directa Xfi Concentración degradada por fotodegradación indirecta Por lo que el balance de masa queda: 𝑋𝑏 = 𝑋𝑖 − 𝑋𝑟 − 𝑋𝑒 − 𝑋𝑎 − 𝑋𝑓𝑑 − 𝑋𝑓𝑖 − 𝑋𝑜𝑓 5.4.7 Diseño experimental En el diseño planteado para la determinación de los mecanismos de remoción se observan varias condiciones experimentales que son: (1) concentración inicial del contaminante a estudiar, (2) concentración de biomasa, (3) luz (la cual se medirá con un Terrestrial Quantum Sensors” de LI-COR Biosciences que cuenta con un sensor de modelo LI-190R), (4) medio de cultivo, (5) agitación, (6) temperatura y (7) volumen. De las cuales la biomasa, luz, concentración del contaminante emergente y medio acuoso son los que influyen en el experimento, los demás se conservan fijos en todos los experimentos, por lo que se asumirá una influencia nula. Para simplificar el análisis estadístico se analizará como un diseño de bloques al azar. Los bloques serán los contaminantes emergentes, BPA, TCS por lo que se tendrán 2 bloques. Para cada bloque se tendrán 3 tratamientos diferentes y dos controles, los cuales consisten en las siguientes condiciones experimentales: • Tratamiento 1: Luz – Biomasa – Medio de cultivo (L-B-M) • Tratamiento 2: Luz – Sin biomasa – Medio de cultivo (L-NB-M) • Tratamiento 3: Luz – Sin biomasa– Agua Milli Q (L-NB-A) • Tratamiento 4: Oscuridad – Sin biomasa– Agua Milli Q (O-NB-A) • Tratamiento 5: Luz – Biomasa – Sin CE – Medio de cultivo (L-B-M) En donde el medio de cultivo es el BG-11 o agua residual sintética, según lo indicado en la Figura 13. De acuerdo a esta figura, los tratamientos corresponden a: • Tratamiento 1: Factores bióticos • Tratamiento 2: Fotodegradación indirecta • Tratamiento 3: Fotodegradación directa • Tratamiento 4: Blanco fotodegradación • Tratamiento 5: Blanco crecimiento microalgas De cada tratamiento se hará un triplicado, por lo que el diseño queda como un 3x5x3, que equivale a 45 observaciones. El diseño experimental se puede considerar como bloques al azar, como se muestra en la Tabla 16 60 Tabla 16 Diseño de bloques para determinación de mecanismos de remoción Contaminante (Bloque) Tratamientos Factores bióticos Fotodegradación indirecta Fotodegradación directa Blanco fotodegradación Blanco crecimiento microalgas BPA 3 rep 3 rep 3 rep 3 rep 3 rep TCS 3 rep 3 rep 3 rep 3 rep 3 rep El modelo estadístico para un diseño de bloques se representa por: 𝑦𝑖𝑗 = 𝜇 + 𝜏𝑖 + 𝛽𝑗 + 𝜀𝑖𝑗 𝑖 = 1, … , 3 Bloques 𝑗 = 1 , … , 5 Tratamientos 𝑘 = 1, 2, 3 Repeticiones Dónde: •  Media general • i Efecto del bloque “contaminante emergente” • j Efecto del tratamiento • ij Error experimental de la unidad experimental En este tipo de diseño no hay interacción entre bloque y tratamiento, por lo que los efectos de los tratamientos son aditivos. El análisis estadístico se realizará con el programa R Studio 61 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 6.1 Efecto toxicológico, determinación EC50 Se estudió el efecto toxicológico del bisfenol-A y el triclosán tomando como referencia la guía 201 para la prueba de sustancias químicas de la OECD, de la cual se tomaron en cuenta las siguientes recomendaciones: la biomasa empleada se inoculó durante la fase de crecimiento logarítmico, al final del experimento el crecimiento del blanco debe ser al menos 16 veces que la concentración inicial, el tiempo del experimento es de 72 o 96 horas, el medio de cultivo usado es el OECD (ver anexo B para formulación del medio), la biomasa inicial no debe exceder los 0.5 mg/L, probar por lo menos cinco concentraciones del contaminante emergente a estudiar, las condiciones de iluminación de luz blanca fría constante (medición realizada: 100 mol/m2 s). 6.1.1 Experimentos control (blanco) Los experimentos control (o blanco) se realizaron adicionando metanol al cultivo microalgal (100 L/L) y sin adición de metanol ni contaminante emergente. Los experimentos de efecto toxicológico de BPA y TCS, se llevaron a cabo en fechas distintas, por lo que cada experimento tiene sus respectivos controles. En el Gráfico 1 se muestra el crecimiento del consorcio microalgal en los controles para los experimentos de determinación de EC50 para BPA. El control de crecimiento de microalgas sin metanol indica que la concentración inicial de microalgas se multiplicó 41 veces a las 72 horas y 46 veces a las 96 horas. En cuanto al control con adición de metanol se muestra un crecimiento menor respecto al control sin BPA y metanol, multiplicando la concentración inicial de microalgas 26 veces a las 72 horas y 24 veces a las 96 horas. Para verificar si el metanol tiene efecto en la reducción del crecimiento de las microalgas, se realizó un análisis de varianza, ANOVA. Gráfico 1. Controles (en presencia y ausencia de metanol) en el crecimiento de Desmodesmus sp. y S. obliquus. Experimentos control realizados para BPA En el análisis de varianza se observa que los factores considerados son el tiempo de exposición (0, 24, 48, 72, 96 horas) y la concentración de metanol (0 y 100 L/L). El metanol (P≈1.0) tiene un efecto 0.0 E+0 1.0 E+5 2.0 E+5 3.0 E+5 4.0 E+5 5.0 E+5 6.0 E+5 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100D en si da d ce lu la r (c el /m L ) Horas Blanco Metanol 62 poco significativo sobre la variable de respuesta (cantidad de células viables), solo el tiempo (P≈0) influye en el crecimiento. Se realizó el mismo análisis para los controles en la determinación de la EC50 para el triclosán. En el Gráfico 2, se muestra el crecimiento de los controles. La concentración inicial de microalgas se multiplicó 93 veces a las 72 horas y 111 veces a las 96 horas para el experimento sin adición de metanol o TCS. Mientras el control con adición de metanol muestra un crecimiento de 112 veces con respecto a la concentración inicial de microalgas a las 72 horas y de 118 veces a las 96 horas. Gráfico 2. Controles (en presencia y ausencia de metanol) en el crecimiento de Desmodesmus sp. y S. obliquus Al igual que con el BPA, se realizó un ANOVA para determinar si el metanol tiene un efecto inhibitorio en el crecimiento del consorcio microalgal. Las concentraciones de metanol (P≈1.0) tienen influencia poco significativa en el crecimiento del consorcio microalgal, solo el tiempo de exposición (P≈0) tiene un efecto significativo en el crecimiento del consorcio microalgal. P. subcapitata tiene una EC50 al metanol de 2 570 mM (Cho et al., 2009), la cantidad de metanol usada en este experimento fue de 100 L/L que equivale a 2.47 mM siendo 1000 veces menor a la concentración reportada como letal media para P. subcapitata. Especies de microalgas como C. vulgaris y S. capricornutum mostraron inhibición del crecimiento a una concentración de metanol de 3.96 g/L; Raphidocelis subcapitata y C. pyrenoidosa a 4.68 g/L; D. tertiolecta, Isochrysis galbana y Heterosigma akashiwo registraron un decaimiento del crecimiento de 50% a 23 g/L, 21 g/L y 0.5 g/L, respectivamente (Miazek et al., 2017). 6.1.2 Bisfenol-A Las concentraciones de BPA de 5 y 10 mg/L no mostraron tener un efecto inhibitorio en el crecimiento del consorcio microalgal, se observó que permite al consorcio seguir creciendo. En el gráfico 3 se muestran las curvas de crecimiento en presencia de BPA. La concentración de 5 mg/L presenta un 0.0 E+0 2.0 E-1 4.0 E-1 6.0 E-1 8.0 E-1 1.0 E+0 1.2 E+0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 D en si da d ce lu la r (c el /m L ) Horas Blanco Metanol 63 crecimiento 16 veces mayor con respecto a la concentración inicial a las 96 horas de exposición. Mientras la concentración de 10 mg/L de BPA a las 96 horas de exposición mostró un incremento en la densidad celular de 2.62 veces con respecto a la inicial. Gráfico 3 Crecimiento del consorcio microalgal al ser expuesto a BPA De acuerdo al Gráfico 4, la EC50 para BPA se ubica a una concentración de 17 mg/L a las 72 horas, de acuerdo al ANOVA, la adición de metanol no tiene influencia significativa en la inhibición del crecimiento, por lo que se atribuye este efecto inhibitorio a la presencia de BPA. En la Tabla 17, se muestra el porcentaje de crecimiento e inhibición del crecimiento para las concentraciones usadas de BPA. En el Gráfico 4 se muestra solo el porcentaje de inhibición del consorcio microalgal. Tabla 17. Porcentajes de inhibición y crecimiento en la determinación de la EC50 para BPA Tiempo Horas Blanco Metanol 100 L/L Concentraciones BPA, mg/L 5 10 15 16 17 18 19 20 25 % de crecimiento % inhibición de crecimiento 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 24 415.85 280.39 166.67 187.5 92.09 91.11 81.99 78.57 45.16 20.39 25.83 48 1609.76 1098.04 733.33 200 67.44 77.78 77.96 68.57 40.65 20.29 25.83 72 4146.34 2666.67 1166.67 212.5 61.63 55.56 50.54 34.92 30.97 16.67 20 96 6341.46 2701.96 1600.00 262.5 56.98 46.30 30.65 30.16 29.03 15.59 15 La concentración de BPA reportada en agua residual es de [BPAAR]= 0.02 a 9.87 g/L (Peña-Álvarez y Castillo-Alanís, 2017, Calderón et al., 2019), a una concentración de microalgas de 1.54 x 104 cel/mL la inhibición de crecimiento se da a los 3 días (72 horas) por lo que el consorcio microalgal usado puede tratar agua residual contaminada con BPA. De acuerdo al análisis estadístico el tiempo de exposición (P≈0), concentración de BPA (P≈0) y la interacción de ambos factores (P≈0), afectan la inhibición del crecimiento del consorcio microalgal. Por lo que la determinación de la EC50 depende del tiempo de exposición y la concentración del BPA. 0.0E+0 5.0E+4 1.0E+5 1.5E+5 2.0E+5 2.5E+5 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 D en si da d ce lu la r, c el /m L Horas 5 mg/L 10 mg/L 64 En la Tabla 18 se enlistan varios estudios en los que se usaron concentraciones similares de BPA que las empleadas para determinar la EC50 en este estudio. Se observa que las concentraciones usadas de BPA y la concentración de microalgas empleadas son similares a lo empleado por otros estudios. Las concentraciones letales medias (EC50) reportadas para Scenedesmus y Desmodesmus son de 19.6 mg/L a las 72 horas para D. subspicatus con una concentración inicial de 104 células/mL (Tisler et al, 2016). S. quadricauda a 96 horas, 13.233 mg/L con una concentración inicial de 2.13 x 106 células/L (Xiang et al., 2018); sin embargo, las EC50 reportadas son para cultivos puros, mientras en este estudio se tiene un consorcio. Otros experimentos realizados en otras especies de microalgas distintas a las enlistadas en la Tabla 18, muestra que microalgas como Ditylum brightwellii, Skeletonema costarum, Prorocentrun mininum, S. capricornurum, y Navicula incerta, tuvieron como concentraciones letales media (EC50) 0.039, 1.0, 1.506, 2.73 y 3.37 mg/L, siendo microalgas altamente sensibles al estrés por BPA. Otras especies de microalgas que son muy tolerantes al estrés provocado por la presencia de BPA, son C. pyrenoidosa (44.9 – 89.39 mg/L), Cochlodinium polykrikoides (68.15 mg/L), C. mexicana (44.8 mg/L), C. vulgaris (39.8 mg/L). Y una especie altamente tolerante al estrés por BPA es Picocystis (75 mg/L) (Azizullah, et al., 2022). Al comparar los intervalos de EC50 reportadas para otras especies de microalgas, se observa que el consorcio en estudio compuesto por S. obliquus y Desmodesmus sp., tiene una EC50 determinada en 17 mg/L; lo que coloca al consorcio en un punto intermedio entre las especies con alta sensibilidad al estrés por BPA y las que toleran mejor la presencia de BPA. Tabla 18. Concentraciones usadas de BPA en experimentos con microalgas Conc. BPA mg/L Microalga Conc. microalgas Medio Notas, EC50 Referencia 0.01, 0.1, 3.0, 5.0. 7.0 y 9.0 Stephanodiscus hantzschii 1.3 x 104 cel/mL Agua de mar artificial EC50 @ 96 h, 8.65 ± 0.26 mg/L Li et al., 2009 2, 4 y 10 M. braunii 105 cel/mL FW04 Escala laboratorio, remoción 81 al 90 % Gatullo et al., 2012 7.0 C. mexicana, C. vulgaris OD680nm=1.0 Basal de Bold Bioacumulación y biodegradación Ji et al., 2014 10, 20, 50 C. sorokiniana 104, 105, 106 y 107 cel/mL Sales minerales ≈38.5% remoción BD y BA Eio et al., 2015 10 – 50 C. reinhardtii 2.5 x 105 cel/mL Medio tris fosfato mínimo EC50 @ 96 h, 30 mg/L Esperanza et al., 2020 7 – 42 D. subspicatus 104 cel/mL NE EC50 19.6 mg/L, 72 h Tisler et al, 2016 0.1 – 20 S. quadricauda 2.13 x 106 cel/mL Medio MA EC50 96 horas, 13.233 mg/L Xiang et al., 2018 5 – 25 Desmodesmus sp., S. obliquus 1.54 x 104 cel/mL OECD 201 EC50 17 mg/L; 72 h Este estudio BD: biodegradación; BA: bioadsorción; NE: no especificado 65 Gráfico 4. Porcentaje de inhibición de crecimiento Desmodesmus sp. y S. obliquus en presencia de bisfenol-A 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 P or ce nt aj e de in hi bi ci ón Horas 15 mg/L 16 mg/L 17 mg/L 18 mg/L 19 mg/L 20 mg/L 25 mg/L Concentración promedio inicial: 1.56 x 104 cel/mL EC50: 17 mg/L, 72 horas, 50.54 % células vivas 66 6.1.3 Triclosán En el caso de la determinación de la EC50 para TCS se usaron concentraciones de 300, 325, 350, 375, 400, 425 y 450 g/L (Gráfico 5). Las condiciones experimentales fueron iguales a las empleadas en la determinación de EC50 para BPA. Si se compara el crecimiento de las microalgas a las 72 horas con el Gráfico 4, se observa que el decaimiento en la población de microalgas en los experimentos con adición de TCS no es debido al efecto del metanol, sino a la presencia del TCS. Por lo que la EC50 para TCS se ubica a 325 g/L a las 72 horas. De acuerdo al análisis estadístico el tiempo de exposición (P≈0), concentración de BPA (P≈0) y la interacción de ambos factores (P≈0), afectan la inhibición del crecimiento del consorcio microalgal. Por lo que la determinación de la EC50 depende del tiempo de exposición y la concentración del BPA. En la Tabla 19, se muestra el porcentaje de crecimiento e inhibición del crecimiento para las concentraciones usadas de TCS. Tabla 19. Porcentajes de inhibición y crecimiento en la determinación de la EC50 para TCS Tiempo Horas Blanco Metanol Concentraciones TCS, g/L 300 325 350 375 400 425 450 % de crecimiento % inhibición de crecimiento 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 24 494.12 507.41 86.98 87.42 85.00 89.10 90.96 79.29 69.03 48 3779.41 2996.30 76.05 72.90 54.80 54.18 63.86 56.43 57.20 72 9367.65 11203.70 58.14 50.00 41.00 42.99 54.70 52.50 45.81 96 11117.65 11888.89 28.14 38.71 29.00 25.52 30.36 30.00 32.26 De acuerdo a las concentraciones de TCS en agua residual reportadas van de 78.4x10-3 a 10.09 g/L (Peña-Álvarez y castillo-Alanís, 2017, Lesser et al., 2018) por lo que las concentraciones usadas para determinar el efecto toxicológico son mayores, lo que indica que si el consorcio se usa para tratar agua residual que tenga TCS a las concentraciones reportadas no habría inhibición del crecimiento del consorcio. En la Tabla 20, se enlistan estudios en los que se usan concentraciones similares de TCS que las usadas en la determinación de EC50 de este estudio. Las concentraciones letales medias para microalgas reportadas son de 187.5 g/L para S. obliquus y 325 g/L para S. quadricauda a 96 horas (Bi et al., 2018). S. subspicatus 0.7, 2.8 (método guía OECD 201) y 1.4 g/L (Roberts et al., 2014). 67 Gráfico 5. Porcentaje de inhibición de crecimiento de Desmodesmus sp. y S. obliquus en presencia de triclosán 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Po rc en ta je d e in hi bi ci ón Tiempo (horas) 300 ug/L 325 ug/L 350 ug/L 375 ug/L 400 ug/L 425 ug/L 450 ug/L Concentración promedio inicial: 1.08 x 104 cél/mL EC50: 325 mg/L, 72 horas, 50.0 % células vivas 68 Tabla 20. Concentraciones usadas de TCS en experimentos con microalgas Conc. TCS Microalga Conc. microalgas Medio Notas, EC50 Referencia 10 g/L S. obliquus, C. vulgaris 1. 4 a 1.7 x 105 cel/mL Basal de Bold, agua de laguna y agua de laguna estéril 61% remoción Larsen et al., 2019 0.537 g/L C. vulgaris Pseudonabaena acicularis S. acutus NE Agua residual doméstica sintética 83% remoción López-Serna et al., 2019 1, 2.5, 5, 7.5, 10, 15, 25, 50 mg/L P. tricornutum 0.4 g/L Agua de mar ≈100% remoción Santaeufemia et al., 2019 0 - 2000 g/L S. quadricauda S. obliquus 5x104 cel/mL OECD 201 S. quadricauda: EC50 96 h, 325 g/L S. obliquus: EC50 96 h, 187.5 g/L Bi et al., 2018 0.6, 1.3, 2.5, 5 y 10 g/L S. subspicatus 104 cel/mL OECD 201 EC50 96 h; 2.8 g/L Orvos et al., 2002 300 - 450 g/L Desmodesmus sp. S. obliquus 1.09x104 cel/mL OECD 201 EC50 72 h, 325 g/L Este estudio NE: no especificado Al inicio y final de los experimentos de determinación de EC50 se observaron las microalgas al microscopio a un aumento de 100X, las imágenes obtenidas se muestran en la Figura 14. Las imágenes 1a, 1b y 1c corresponden a la exposición de microalgas a BPA, las imágenes 1b y 1c corresponden a las 72 horas a una concentración de 17 mg/L, se observa que el pigmento verde inicial de las microalgas se deterioró y en algunas microalgas se observa nulo contenido celular dentro de las microalgas. Lo mismo se observó al exponer al consorcio microalgal a TCS (imágenes 2b y 2c). Esto sugiere que la presencia de BPA y TCS afecta la producción de clorofila en las microalgas, sin embargo, debido a la baja concentración de microalgas no se pudo realizar cuantificación del contenido de clorofila. 69 Figura 14. Determinación de EC50 para BPA 17 mg/L, (1a) 0 horas, (1b, 1c) 72 horas. TCS 325 g/L, (2a) 0 horas, (2b, 2c) 72 horas. Vista al microscopio Carl Zeiss Microscopie Axo Lab.A1 aumento 100X 6.2 Efecto de los contaminantes emergentes sobre el consorcio microalgal Se observó el efecto que la presencia de BPA y TCS tuvieron obre el consorcio microalgal, para esto se cuantificaron el crecimiento de las microalgas (SST), clorofila “a” y biomoléculas (carbohidratos, lípidos y proteínas). También se evaluó si el BPA y TCS tiene efecto sobre la remoción de nutrientes presentes en agua residual sintética. 6.2.1 Bisfenol-A En la Tabla 21 se muestra los porcentajes de incremento para SST, clorofila “a”, carbohidratos, lípidos y proteínas con respecto al control y porcentaje de remoción con respecto al control para DQO, 𝑃 −𝑃𝑂43−, 𝑁 − 𝑁𝑂3−, 𝑁 − 𝑁𝐻3, alcalinidad total. En los Gráficos 6 y 7 se muestra gráficamente la información de la Tabla 21. El análisis de varianza de realizó comparando el experimento control contra 70 el experimento que contenía BPA, se comparó entre los experimentos con idénticos SST iniciales y solo se muestra si el BPA tiene una influencia significativa en el parámetro medido. Tabla 21. Porcentajes cuantificados con respecto a los controles. Experimentos con BPA Concentración BPA 17 mg/L 9.87 g/L Concentración microalgas 300 mg/L TSS 500 mg/L TSS 300 mg/L TSS 500 mg/L TSS % % % % Crecimiento y biomoléculas SST 116.10 ± 6.00 108.25 ± 1.87 101.72 ± 6.16 112.17 ± 0.87 Clorofila “a” 140.19 ± 16.93 94.67 ± 10.78 111.51 ± 14.38 66.70 ± 19.60 Carbohidratos 97.88 ± 7.79 95.42 ± 3.06 97.32 ± 11.81 104.22 ± 7.29 Lípidos 137.84 ± 2.94 125.33 ± 3.19 97.66 ± 9.60 97.92 ± 2.13 Proteínas 116.73 ± 2.18 113.24 ± 21.65 108.33 ± 14.19 68.52 ± 22.50 Nutrientes DQO 79.68 ± 8.71 38.68 ± 3.76 12.06 ± 16.80 139.95 ± 24.25 Nitratos 225.13 ± 23.56 134.72 ± 11.11 77.72 ± 18.97 184.34 ± 21.58 Nitrógeno amoniacal 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 107.06 ± 22.17 166.75 ± 36.57 Ortofosfatos 134.78 ± 1.30 102.36 ± 6.06 170.49 ± 31.74 67.18 ± 10.99 Alcalinidad 124.00 ± 0.00 100.00 ± 0.00 161.51 ± 18.81 94.16 ± 13.70 Valores mayores al 100% indican que superan lo medido en el control. En el caso de nitrógeno amoniacal, el valor de 0% indica que la muestra tuvo una remoción total Crecimiento y contenido de biomoléculas Los resultados obtenidos en los experimentos en presencia de BPA (Gráfico 6), se observa que en cuanto a crecimiento, clorofila y contenido de biomoléculas las condiciones experimentales probadas que mostraron un mejor incremento fueron ≈300 mg SST/L y concentración de BPA de 17 mg/L. En ambas condiciones de biomasa inicial y BPA se observa que el crecimiento medido como SST aumenta en presencia de BPA. Para concentraciones iniciales ≈300 mg SST/L (3.33x106 cel/mL) se obtuvo un aumento del 16.1% y de 1.72% para concentraciones de BPA de 17 mg/L y 9.87 g/L, respectivamente. Para concentraciones iniciales de ≈500 mg SST/L (6.21x106 cel/mL) el crecimiento tuvo un incremento del 8.25% y 12.17% a concentraciones de BPA de 17 mg/L y 9.87 g/L, respectivamente. Autores han observado el efecto de BPA en géneros similares a los utilizados en este estudio. Wang et al., 2017, reporta una baja inhibición del crecimiento en Desmodesmus sp. WR1 (8.3x105 cel/L) a concentraciones de BPA de 1, 3, 5.5 y 13.5 mg/L. Xiang et al., 2018 obtuvo inhibición del crecimiento de S. obliquus (2.13x106 cel/mL) a concentraciones de BPA de 1 a 10 mg/L. Ji et al., 2014 observó inhibición del crecimiento del 28.6 % a 7 mg/L de BPA para S. obliquus. Li et al., 2017 registró inhibición del crecimiento del 80 % para S. obliquus a una concentración de BPA de 50 mg/L. Diferencias entre los efectos reportados sobre el crecimiento de microalgas y lo observado en los experimentos realizados puede ser atribuido a la cantidad inicial de biomasa, agitación, intensidad de luz. Otras especies de microalgas, distintas a las usadas en este estudio, como S. hantzschii muestra inhibición del 8.41 – 89.23% a concentraciones de BPA de 3 – 15 mg/L (Li et al., 2009). Tetraselmis 71 suecica presentó inhibición en conteo celular a concentraciones mayores a 7.5 mg/L (Ebenezer y Ki, 2016). BPA a 7 mg/L causa inhibición del crecimiento de 4.1, 24.5 y 41.5 % para C. mexicana, C., vulgaris y Micractinium reisseri, respectivamente (Ji et al., 2014). C. pyrenoidosa muestra inhibición del crecimiento en un 7%, 14% y 21% al cuarto día de exposición a 5, 8 y 11 mg/L de BPA, respectivamente (Li et al., 2022). Gráfico 6 Cambio con respecto al control. Consorcio microalgal expuesto a dos concentraciones distintas de BPA y dos concentraciones distintas de biomasa microalgal. (*P<0.05). Valores menores al 100% indican que no alcanzaron lo registrado en el control correspondiente. La clorofila es un indicador primario de la actividad fotosintética en microalgas, además de ser un marcador de presencia de sustancias tóxicas (Kurade et al., 2016). El contenido de clorofila “a” (Chl- a) mostró tener un incremento para ambas concentraciones de BPA para la concentración inicial de 72 ≈300 mg SST/L de 40.19 y 11.51% para 17 mg/L y 9.87 g/L, respectivamente. Para la concentración inicial de ≈500 mg SST/L para ambas concentraciones de BPA se registró una disminución en el contenido de Chl-a (Gráfico 5, Tabla 21). Efectos similares al incremento en el contenido de Chl-a fueron observados en Desmodesmus sp. WR1, hubo incremento de la clorofila para las concentraciones de 1, 3, 5.5 mg/L de BPA (Wang et al., 2017). Sin embargo, el efecto contrario se observó en S. obliquus disminuyendo la concentración de Chl-a de 27.63 – 82.59% a BPA de 1 – 20 mg/L (Xiang, et al., 2018). Una explicación para que el contenido de Chl-a haya disminuido en S. obliquus en los experimentos de Xiang et al., 2018, podría radicar en la diferencia en la intensidad de luz usada la cual fue de 25 mol/m2s; mientras la usada en este trabajo fue de ≈100 mol/m2s. Otras especies distintas a Desmodesmus y Scenedesmus, presentaron un efecto promotor en la producción de Chl-a. Por ejemplo, C. reinhardtii a una concentración de BPA de 30 mg/L tuvo un incremento en la producción de clorofila (Miguez et al., 2021). El contenido de clorofila en S. hantzschii no se vio afectado a concentraciones de BPA de 3 – 15 mg/L (Li et al., 2009). Mediciones como la concentración de oxígeno se han usado para monitorear la actividad fotosintética. En experimentos realizados con Picocytis sp. se probaron concentraciones de BPA de 1, 10, 25, 50 y 75 mg/L, la disminución de la cantidad de oxígeno correspondió al 18 – 38% a concentraciones de 1 – 25 mg/L. A concentraciones de 50 mg/L la cantidad de oxígeno disminuyó más del 80% y a 75 mg/L fue cercana al 100% (Ben Ouda et al., 2018). Li et al., 2022; en experimentos realizados con C. pyrenoidosa se observó inhibición de la clorofila del 11 – 46% a un rango de concentraciones de 2 – 11 mg/L. En un rango de concentración de BPA de 10 – 40 mg/L se registraron porcentajes de inhibición de clorofila del 12 – 69%. El comportamiento de los carbohidratos en presencia de BPA mostró una reducción con respecto al control. Ambas concentraciones de inóculo con BPA=17 mg/L mostraron una reducción del 2.12% y 4.58%, para SST iniciales de ≈300 mg/L y ≈500 mg/L, respectivamente. Cuando se usó una concentración de BPA de 9.87 g/L se registró una disminución de 2.68% con SST iniciales de ≈300 mg/L; pero se observó un aumento de 4.22% con SST iniciales de ≈500 mg/L. Si se compara N. incerta contra microalgas de agua fresca como C. vulgaris y C. mexicana, el BPA causa un ligero incremento del 9.6 y 6.5 % en los carbohidratos; a 25 y 50 mg/L de BPA. El efecto del BPA en los carbohidratos refleja una influencia en las funciones estructurales y metabólicas, cada especie de microalgas responden de manera distinta al estrés por BPA con respecto al metabolismo y almacenamiento de energía (Azizullah, et al., 2022). Spirulina platensis expuesta a 10 mg/L de ácido acetilsalicílico (ASA) tuvo un incremento del 35% y para S. obliquus hubo un incremento del 10 al 17% a concentraciones de ASA de 50, 70 y 100 mg/L (Rempel et al., 2021). Oxibenzona causó decaimiento del contenido de carbohidratos del 54.3 – 67.6% en S. quadricauda y en Chlorella sp. aumentó del 4.1% - 6% (Teoh et al., 2020). Se observó que en los experimentos con BPA= 17 mg/L, el contenido de lípidos aumentó 37.84% y 25.33% para SST iniciales de ≈300 mg/L y ≈500 mg/L, respectivamente. En experimentos con BPA= 9.87 g/L, los lípidos disminuyeron 2.34% y 2.08% en experimentos con SST iniciales de ≈300 mg/L 73 y ≈500 mg/L, respectivamente. En otros estudios que reportan cuantificación en el contenido de lípidos, Miguez et al., 2021; encontró que hubo un incremento de 2.7 veces en la peroxidación de los lípidos (daño oxidante en las membranas celulares) de C. reinhardtii a BPA= 30 mg/L. En cuanto al contenido de lípidos, N. incerta mostró un incremento en los lípidos totales arriba mayor del 134% a 5 mg/L de BPA. C. vulgaris y C. mexicana revelaron una tendencia similar a la cianobacteria de un incremento del 9.3 y 8.9 %. El incremento de los ácidos grasos insaturados se puede deber al daño en la membrana causada por el estrés oxidativo a causa del BPA (Azizullah, et al., 2022). El cambio en el contenido de proteínas con respecto al control se observó en un aumento del 16.73% y 113.24% SST iniciales de ≈300 mg/L y ≈500 mg/L, respectivamente al ser expuesto a BPA= 17 mg/L. en presencia de BPA= 9.87 g/L, las proteínas aumentaron un 8.33% con inóculo inicial ≈300 mg/L, pero se observó una disminución del 31.47%. En la cianobacteria Navicula incerta hay una reducción en el contenido de proteínas a 3 mg/L de BPA. La misma cianobacteria expuesta a una concentración de BPA de 2 mg/L demostró tener una disminución significante en el contenido de polisacáridos (Azizullah, et al., 2022). La exposición de S. platensis a 1 mg/L de paracetamol y diazepam aumentó en un 44% el contenido de proteínas, mientras en S. obliquus el aumento en el contenido de proteínas fue del 66% en presencia de ASA y cafeína (Rempel et al., 2021). S. quadricauda presentó decaimiento del 54.3 – 67.7% y Chlorella sp. aumentó entre 56.1 – 75.2%, en presencia de oxibenzona (Teoh et al., 2020). Remoción de nutrientes La remoción de nutrientes para BPA a SST iniciales de ≈300 mg/L y ≈500 mg/L se muestran en el gráfico 7. Para BPA (17 mg/L) y ≈300 mg/L en combinación, los parámetros fisicoquímicos que mostraron una mayor y significativa eliminación fueron los nitratos (2.51 veces mayor eliminación con respecto al control), nitrógeno amoniacal (≈100%), ortofosfatos (34.78% mayor que el control) y alcalinidad (24% mayor que el control). Para BPA y ≈500 mg SST/L en combinación, se observaron eliminaciones de nitratos (34.72% de eliminación mayor que el control), nitrógeno amoniacal (≈100%, P<0.05), alcalinidad y ortofosfatos (igual que el control). Cuando se usó BPA= 9.87 g/L, los parámetros que mostraron un incremento mayor al control fueron nitrógeno amoniacal (7.06%), ortofosfatos (70.49%) y alcalinidad (61.51%) para SST ≈300 mg/L. Al usar inóculo inicial de ≈500 mg/L, DQO (39.95%), nitratos (84.34%) y nitrógeno amoniacal (66.75%) mostraron una mayor remoción con respecto al control. 74 Gráfico 7 Porcentaje de remoción de nutrientes en agua residual sintética en presencia de BPA. (*P<0.05). Nitrógeno amoniacal en presencia de BPA= 17 mg/L mostró tener una remoción ≈100%, por lo que las barras de ambas concentraciones de inóculo no se graficaron. Valores menores al 100% indican que no alcanzaron lo registrado en el control correspondiente Hay pocos estudios que reportan el efecto que tiene la presencia de BPA en agua residual como medio de cultivo de microalgas, no hay datos que indiquen cuál es el nivel de afectación que se tiene. Solo Azizullah et al., 2022, indica que el BPA interfiere en la ingesta de nutrientes resultando en un poco crecimiento celular debido a la disminución en la absorción de algunos nutrientes. Esto puede deberse a sensibilidad que presenta cada especie de microalgas al estrés en presencia de BPA. 6.2.2 Triclosán Se observó el efecto que tiene la cantidad de biomasa y la presencia de triclosán en un consorcio de microalgas. Las condiciones de biomasa a usar fueron las mismas empleadas para experimentos en presencia de BPA. Las concentraciones de triclosán probadas fueron [TCS] = 325 g/L y 10.09 g/L. 75 En la Tabla 22 se muestra los porcentajes de incremento para SST, clorofila “a”, carbohidratos, lípidos y proteínas con respecto al control y porcentaje de remoción con respecto al control para DQO, 𝑃 −𝑃𝑂43−, 𝑁 − 𝑁𝑂3−, 𝑁 − 𝑁𝐻3, alcalinidad total. En los Gráficos 8 y 9 se muestra gráficamente la información de la Tabla 22. Tabla 22 Porcentajes cuantificados con respecto a los controles. Experimentos con TCS Concentración BPA 325 g/L 10.09 g/L Concentración microalgas 300 mg/L TSS 500 mg/L TSS 300 mg/L TSS 500 mg/L TSS % % % % Crecimiento y biomoléculas SST 117.78 ± 2.41 109.92 ± 2.11 94.46 ± 3.93 101.25 ± 1.97 Clorofila “a” 173.84 ± 15.60 100.14 ± 8.73 146.17 ± 19.09 85.96 ± 24.70 Carbohidratos 82.09 ± 4.24 101.77 ± 3.48 108.33 ± 6.67 98.04 ± 9.00 Lípidos 109.09 ± 2.08 118.75 ± 4.21 105.71 ± 5.41 109.52 ± 4.35 Proteínas 206.16 ± 8.64 171.43 ± 10.78 130.90 ± 12.66 95.58 ± 28.99 Nutrientes DQO 78.00 ± 29.67 76.40 ± 8.80 131.67 ± 23.84 159.60 ± 19.29 Nitratos 76.69 ± 16.99 86.41 ± 9.49 100.71 ± 28.33 110.47 ± 16.99 Nitrógeno amoniacal 307.14 ± 21.43 112.61 ± 18.02 96.18 ± 23.37 111.72 ± 12.89 Ortofosfatos 94.83 ± 16.25 0.00 ± 0.00 105.28 ± 8.13 97.13 ± 10.44 Alcalinidad 116.67 ± 23.33 78.13 ± 14.06 159.09 ± 27.55 103.66 ± 12.77 Valores mayores al 100% indican que superan lo medido en el control. Crecimiento y contenido de biomoléculas La mejor combinación de condiciones que mostró tener un incremento en los SST, clorofila “a”, carbohidratos, lípidos y proteínas fue a una concentración de TCS de 325 g/L y 300 mg/L SST de biomasa (Gráfico 8). Este comportamiento también se observó con la combinación de TCS= 10.09 g/L y 300 mg/L SST. El crecimiento del consorcio microalgal fue afectado por el TCS. Para SST ≈300 mg/L el crecimiento a TCS= 325 g/L 17.78%, mientras para TCS= 10.09 g/L el crecimiento disminuyó en 5.54%. A SST ≈500 mg/L tuvo incremento del 9.92% y del 1.25% para concentraciones de TCS de 325 g/L y 10.09 g/L, respectivamente (Tabla 22, Gráfico 7). Experimentos en Desmodesmus sp. registraron inhibición del crecimiento del 47.7% y del 64.8% para C. pyrenoidosa (107 cel/mL, medio TAP), a concentración de 400 g/L de TCS (Wang et al., 2018). Pseudokirchnereilla subcapitata (5x104 cel/mL; medio OECD) tuvo una reducción del crecimiento del 59±3% y 88±1% a concentraciones de TCS de 27 y 37 g/L, respectivamente (Machado et al., 2021). Otros experimentos realizados en presencia de TCS, mostraron que C. reinhardtii se observó una disminución del crecimiento de 77%, 54% y 34% a concentraciones de TCS de 1, 2 y 4 mg/L respectivamente (Wang et al., 2020). Closterium ehrenbergii fue expuesta a concentraciones de TCS de 0.125, 0.187, 0.25, 0.5 y 1 mg/L. A 0.125 mg/L no se observó un efecto adverso; sin embargo, a 0.187 y 0.25 mg/L se observó que la viabilidad de la célula disminuyó en un 60% en 48 horas. A 0.5 – 1.0 mg/L, a dos horas de iniciado el experimento, tiene efectos en la morfología del cloroplasto, pero no en la viabilidad de las células. Después de 48 horas, solo el 10% de 76 las células seguían viables, pero mostraban un menor tamaño y un cloroplasto deforme (Ciniglia et al., 2005). C. vulgaris, expuesta a 0.05, 0.15, 0.45, 0.75 y 1.05 mg/L de TCS; el crecimiento de C. vulgaris a una concentración de 1.05 mg/L al día 10 tuvo una reducción de 0.062 ± 0.0203 g/L. A bajas concentraciones de TCS (<0.75 mg/L) se estimula el crecimiento de C. vulgaris, además de que hay poco efecto en la producción de clorofila. (Dai et al., 2021). El contenido de Chl-a para SST ≈300 mg/L a TCS= 325 g/L 73.84%, mientras para TCS= 10.09 g/L hubo un aumento del 0.14%. A SST ≈500 mg/L tuvo incremento del 46.17% y disminución del 14.04% para concentraciones de TCS de 325 g/L y 10.09 g/L, respectivamente (Tabla 22, Gráfico 7). Hubo una disminución significativa en el contenido de Chl-a en P. subcapitata del 25% y 74% a TCS= 27 g/L y 37 g/L, respectivamente (Machado et al., 2021). C. reinhardtii tuvo una reducción significativa del 26.8% a 4 mg/L y 72 horas de exposición (Wang et al., 2020). A 0.075 mg/L de TCS el contenido de clorofila a aumentó 20.18 ± 0.64 mg/L; el contenido de Chl-a a una concentración de 1.05 mg/L de TCS tiene una disminución de 4.44 ± 0.05 (Dai et al., 2021). El cambio en los carbohidratos para SST ≈300 mg/L registró una disminución del 17.91% a TCS= 325 g/L, mientras para TCS= 10.09 g/L hubo un aumento del 8.33%. A SST ≈500 mg/L tuvo incremento del 1.77% y disminución del 1.96% para concentraciones de TCS de 325 g/L y 10.09 g/L, respectivamente (Tabla 22, Gráfico 7). El cambio en el contenido de carbohidratos se ha registrado en otras especies de microalgas y con otros contaminantes emergentes como C. vulgaris, C. mexicana. (expuestas a BPA); S. plantesis y S. obliquus (expuestas a ASA); S. quadricauda y Chlorella sp. (expuestas a oxibenzona) (Teoh et al., 2020; Rempel et al., 2021; Azizullah, et al., 2022). El contenido de lípidos tuvo un aumento para ambas concentraciones de TCS usadas y para ambas concentraciones iniciales de inóculo. TCS= 325 g/L, 9.09% y 18.75 para SST ≈300 y ≈500 mg/L. TCS= 10.09 g/L 5.71% y 9.52% para SST ≈300 y ≈500 mg/L. se observa que, a mayor cantidad de inóculo inicial, la cantidad de lípidos es mayor. No hay estudios en los que se realice la cuantificación de lípidos en presencia de TCS. Solo experimentos en presencia de BPA realizados para C. reinhardtii, C. vulgaris, C. mexicana y la cianobacteria N. incerta (Miguez et al., 2021; Azizullah et al., 2022). El contenido de proteínas mostró un aumento a TCS= 325 g/L de 106.16% y 71.43% para SST ≈300 y ≈500 mg/L, respectivamente. Con la concentración de TCS= 10.09 g/L hubo incremento del contenido de proteínas 30.90% a SST≈ 300 mg/L y disminución del 4.42% para SST≈ 500 mg/L. Estudios sobre el efecto del TCS en las biomoléculas indican que solo hay trabajos que reportan el efecto en el contenido de proteínas; C. vulgaris mostró un ligero incremento a dosis bajas de TCS (<0.75 mg/L). A 0.05 mg/L de TCS hubo un incremento de 0.145 ± 0.041 mg/L, a 0.75 mg/L 0.427 ± 0.018 mg/L. A 1.05 mg/L TCS hubo una disminución de 0.046 ± 0.008 mg/L (Dai et al., 2021). 77 Gráfico 8 Porcentaje de incremento con respecto al control. Consorcio microalgal expuesto a dos concentraciones distintas de TCS y dos concentraciones distintas de biomasa microalgal. (*P<0.05) Valores menores al 100% indican que no alcanzaron lo registrado en el control correspondiente Remoción de nutrientes A una concentración de TCS de 325 g/L y ≈300 mg SST/L (Gráfico 9) de inóculo mostraron una mayor eliminación que el control para el nitrógeno amoniacal (3.07 veces mayor) y la alcalinidad (16.67% mayor). Mientras que TCS= 325 µg/L y ≈500 mg SST/L en combinación mostraron una mayor eliminación para nitrógeno amoniacal (12.61%) y se obtuvo una concentración final de ortofosfatos ≈ 0 mg/L. La combinación de TCS= 10.09 g/L y ≈300 mg SST/L mostró una remoción mayor al 100% respecto al control en los parámetros DQO (131.67%), nitratos (100.71%), ortofosfatos (105.28%) y alcalinidad (159.09%). Y la combinación de TCS = 10.09 g/L y ≈500 mg SST/L los parámetros con remoción mayor al control son DQO (59.6%), nitratos (10.47%), nitrógeno amoniacal (11.72%) y alcalinidad (3.66%). 78 La presencia de TCS mostró un efecto positivo sobre el nitrógeno amoniacal y los ortofosfatos en ambas concentraciones de inóculo ensayadas. La presencia de TCS produce efectos significativos en la ingesta de fósforo a altas temperaturas, y la absorción de nitrógeno puede verse afectada por TCS (Xin et al., 2018). Al igual que en el caso del BPA no hay trabajos reportados en los que se estudie el efecto de la presencia de TCS en agua residual y el nivel de afectación que pudiera tener en la absorción de nutrientes. Gráfico 9 Porcentaje de remoción de nutrientes en agua residual sintética en presencia de TCS. (*P<0.05) Valores menores al 100% indican que no alcanzaron lo registrado en el control correspondiente 79 6.3 Remoción de contaminantes emergentes Un objetivo de este trabajo, es determinar las vías de remoción por las cuales los contaminantes emergentes son removidos del agua residual sintética. Estas vías son la biodegradación, sorción (adsorción y absorción) y fotodegradación (directa e indirecta). 6.3.1 Vías de remoción de BPA y TCS La remoción de BPA y TCS, se realizó por acción de microalgas y fotodegradación. En los experimentos realizados con microalgas, se evaluó la degradación por acción de las microalgas y la remoción por efecto de sorción. De los mismos experimentos con microalgas, se tomaron muestras para determinar la remoción de los contaminantes emergentes por acción de la adsorción y absorción. Paralelamente, se realizaron experimentos de fotodegradación directa (en presencia de agua ultrapura) e indirecta (en presencia de ARS). Además, para evaluar si otros factores contribuyen a la remoción de los contaminantes emergentes, se realizó un blanco de fotodegradación. Se midieron las concentraciones de los contaminantes emergentes relacionadas a la concentración residual, concentración adsorbida, concentración absorbida, concentración degradada por fotodegradación directa, concentración degradada por fotodegradación indirecta, concentración degradada por otros factores. Mientras la concentración biodegradada se deduce de la resta de la concentración inicial menos las concentraciones calculadas. El balance de masa se realizó para ambas concentraciones de inóculo inicial, para cada contaminante emergente, solo para las concentraciones determinadas a la EC50. El balance de masa se representa en la siguiente ecuación: 𝑋𝑏 = 𝑋𝑖 − 𝑋𝑟 − 𝑋𝑒 − 𝑋𝑎 − 𝑋𝑓𝑑 − 𝑋𝑓𝑖 − 𝑋𝑜𝑓 Donde: Xb Concentración biodegradada Xi Concentración inicial Xr Concentración residual en la fase acuosa Xe Concentración extracelular o adsorbida Xa Concentración intracelular o absorbida Xfd Concentración degradada por fotodegradación directa Xfi Concentración degradada por fotodegradación indirecta Xof Concentración degradada por otros factores La remoción de BPA por cada vía de remoción se muestra en la Tabla 23, Gráfico 10 y en la Figura 15. La remoción total fue del 95.1% que equivale a 16.172±0.828 mg/L para el inóculo inicial de ≈300 mg/L. Mientras para el inóculo inicial de ≈500 mg/L la remoción total fue de 95.68%, equivalente a 16.271±0.703 mg/L. Se observa que a una cantidad mayor de inóculo la remoción general es mayor, así como la cantidad biodegradada de BPA. En cuanto a la sorción se observa una mayor adsorción en la concentración inicial de inóculo de ≈300 mg/L, mientras en la absorción se observó la misma cantidad de BPA absorbida para ambas concentraciones de inóculo inicial. La fotodegradación indirecta (26.23%, 4.461±0.263 mg/L) mostró una mayor remoción comparada con la directa (3.8%, 0.646±0.082 mg/L); mientras que, se determinó una remoción del 10.54% (1.793±0.495 mg/L) 80 presumiblemente debida a otros factores, los cuales podrían ser el manejo de las muestras, la retención en el cartucho de SPE, la degradación poco significativa por la acción de la luz que se pudo filtrar al matraz, una ligera volatilización y la incrustación de los contaminantes emergentes en las paredes del matraz. 𝑋𝑏 = 𝑋𝑖 − 𝑋𝑟 − 𝑋𝑒 − 𝑋𝑎 − 𝑋𝑓𝑑 − 𝑋𝑓𝑖 − 𝑋𝑜𝑓 𝑋𝑖 = 17.006 ± 0.476 𝑚𝑔 𝐿⁄ Tabla 23. Remoción de bisfenol-A Inóculo inicial, mg/L Xr Xe Xa Xfd Xfi Xof Xb Concentración (mg/L) ≈300 0.834±0.043 1.573±0.043 0.722±0.002 0.646±0.082 4.461±0.263 1.793±0.495 6.976±0.201 ≈500 0.735±0.008 0.698±0.001 0.72±0.01 0.646±0.082 4.461±0.263 1.793±0.495 7.951±0.151 Porcentaje (%) ≈300 4.9 9.25 4.24 3.8 26.23 10.54 41.02 ≈500 4.32 4.11 4.24 3.8 26.23 10.54 46.75 La remoción de BPA con respecto a la cantidad de inóculo inicial tuvo como factores el tiempo de exposición y la cantidad inicial de SST. Al realizar los ANOVA correspondientes para la remoción de BPA con respecto a los SST iniciales; se observó que los factores individualmente tienen significancia sobre la remoción de BPA (tiempo, P≈0.0 y SST, P<0.001). Cuando se realiza el ANOVA considerando la adición de los factores, se observa que la interacción del tiempo de exposición y los SST iniciales influyen significativamente en la remoción de BPA (P≈0.0). En los experimentos de fotodegradación, los factores que influyen en la remoción de BPA son tiempo de exposición, luz/oscuridad y el medio acuoso (agua ultrapura o ARS). Para los ANOVA el medio acuoso, estadísticamente, no tiene influencia significativa en la remoción del BPA. Individualmente, el tiempo de exposición (P≈0.0) y la presencia o ausencia de luz (P<0.01) y la interacción de ambos factores (P≈0.0). 81 Gráfico 10. Vías de remoción para BPA 82 Figura 15. Cromatogramas de la remoción de BPA, para ambas concentraciones de SST iniciales y fotodegradación directa e indirecta. Se muestra la remoción a los días 0, 7 y 15. En la tabla 24, se muestra el cambio en el pH para los experimentos en presencia de BPA. El pH promedio inicial de los experimentos con ARS es de 6.59, mientras que el pH promedio inicial para AMQ es de 5.77. El pKa del BPA es de 9.6, por lo que al inicio y al final del tratamiento, el BPA permanece sin disociar (Fig. 16). Tabla 24. Cambio en el pH para experimentos en presencia de BPA Experimentos A B C D E F G Condiciones experimentales Concentración inicial microalgas (mg/L) ≈300 ≈300 ≈500 ≈500 0 0 0 BPA concentración (mg/L) 17 0 17 0 17 17 17 Luz Sí Sí Sí Sí Sí Sí No Medio ARS ARS ARS ARS ARS AMQ AMQ Inicio pH 6.42 6.44 6.90 6.77 6.40 5.61 5.94 Final 5.29 4.15 5.3 4.69 5.15 5.38 6.18 ARS: agua residual sintética, AMQ: agua Milli-Q 83 Figura 16. Constantes de disociación de BPA (Rovani et al., 2020) La remoción de triclosán se observa en la Tabla 25, Gráfico 11 y Figura 17. La remoción total fue del 61.1% que equivale a 192.383±36.177 g/L para el inóculo inicial de ≈300 mg/L. Mientras para el inóculo inicial de ≈500 mg/L la remoción total fue de 86.25%, equivalente a 271.584±39.925 mg/L. Se observa que a una cantidad mayor de inóculo la remoción general es mayor, así como la cantidad biodegradada de TCS. En cuanto a la sorción se observa una mayor adsorción en la concentración inicial de inóculo de ≈500 mg/L, lo mismo se observó en la absorción. La fotodegradación indirecta (14.074%, 44.313±17.151 mg/L) mostró una remoción casi igual a la fotodegradación directa (14.434%, 45.447±1.897 mg/L). En los experimentos en los que se estudiaron otros factores que contribuyen a la remoción de TCS, no se registró un cambio en la concentración inicial. 𝑋𝑏 = 𝑋𝑖 − 𝑋𝑟 − 𝑋𝑒 − 𝑋𝑎 − 𝑋𝑓𝑑 − 𝑋𝑓𝑖 − 𝑋𝑜𝑓 𝑋𝑖 ≈ 314.862 ± 56.46 𝜇𝑔 𝐿⁄ Tabla 25. Remoción de triclosán Inóculo inicial, mg/L Xr Xe Xa Xfd Xfi Xof Xb Concentración (g/L) ≈300 122.477±23.031 31.746±0.067 30.652±6.111 45.447±1.897 44.313±17.151 0 40.227±22.856 ≈500 43.277±6.362 59.258±15.35 57.181±14.069 45.447±1.897 44.313±17.151 0 65.386±22.856 Porcentaje (%) ≈300 38.889 10.082 9.735 14.434 14.074 0 12.776 ≈500 13.745 18.820 18.161 14.434 14.074 0 20.766 Los ANOVA para la remoción de TCS, fueron realizados de la misma manera que para el BPA y se consideraron los mismos factores que para BPA. Cuando se analizó la influencia de los SST iniciales, se encontró que individualmente el tiempo de exposición tiene una mayor significancia (P≈0.0) mientras los SST (P<0.1) no tuvo un efecto significativo en la remoción de TCS; sin embargo, la adición de los efectos de ambos factores mostró una alta significancia (P≈0.0), lo que indica que la remoción 84 de TCS se debe a un efecto conjunto entre los SST iniciales y el tiempo de exposición. Al igual que con el BPA, el medio acuoso no tiene influencia en la remoción de TCS. El tiempo de exposición (P<0.01) y la luz (P≈0.0) individualmente tienen un efecto significativo, mientras la combinación de ambos factores presenta un efecto aditivo significativo (P≈0.0). Gráfico 11. Vías de remoción para TCS 85 Figura 17. Cromatogramas de la remoción de TCS, para ambas concentraciones de SST iniciales y fotodegradación directa e indirecta. Se muestra la remoción a los días 0, 7 y 15. En la tabla 26, se muestra el cambio al inicio y final del pH. El pKa del TCS es de 8.14, por lo que de acuerdo a la figura 18, durante los 15 días del tratamiento el TCS estuvo sin disociar. Tabla 26. Cambio de pH en experimentos en presencia de triclosán Experimentos A B C D E F G Condiciones experimentales Concentración inicial microalgas (mg/L) ≈300 ≈300 ≈500 ≈500 0 0 0 TCS concentración (g/L) 325 0 325 0 325 325 325 Luz Sí Sí Sí Sí Sí Sí No Medio ARS ARS ARS ARS ARS AMQ AMQ Inicio pH 6.29 6.22 6.36 6.18 6.1 5.31 5.69 Final 5.69 5.19 5.57 4.59 6.51 5.88 5.81 Figura 18. Disociación de triclosán (Dhillon et al., 2015) 86 La remoción de contaminantes emergentes por acción de microalgas ha sido reportada para especies de microalgas similares a las usadas en este estudio y para consorcios con distintas especies de microalgas. Entre los consorcios usados está el reportado por Matamoros et al., 2015, en la que reportó aproximadamente 27 CE encontrados en agua residual urbana, entre ellos el BPA y TCS. El consorcio está compuesto de Stigeoclonium sp., diatomeas, Chlorella sp., Monoraphidium sp., la remoción se llevó a escala piloto con un TRH de 10 días, y volumen de 0.47m3; los porcentajes de remoción alcanzaron >90%. Palardé et al., 2018 removió 17β-estradiol en agua residual urbana, el consorcio compuesto principalmente de Chlorella sp., Scenedesmus sp., Vorticellides sp., Uronema minutum se probó a escala piloto y teniendo una remoción del 55 al 100%; mientras a escala laboratorio la remoción fue del 71 al 100%. Matamoros y Rodríguez, 2016; usaron un consorcio compuesto de Chlorella sp. y Scenedesmus sp. removieron 11 CE en agua de drenaje agrícola, la remoción se realizó a escala laboratorio y a un volumen de 5 litros, para ambos casos la remoción supero el 90%. Fu et al., 2023 usaron un consorcio conformado por C. pyrenoidosa, Acinebacter sp., Serratia marcencens, Pseudomonas sp. y bacterias, se removió BPA en un 20, 46.4, 42.9 y 43% de concentraciones iniciales de BPA de 2, 4, 6 y 8 mg/L. La remoción de BPA se ha realizado para otras especies de microalgas distintas a las usadas en este estudio. Hirooka et al., 2009 removió BPA con C. fusca, obtuvo porcentajes de remoción mayores a 95% en un intervalo de concentración de BPA de 10 a 80 M y un 70% a 160 mM. Gatullo et al., 2012 cuantificó la remoción de 81 a 90% con M. braunii. Zhou et al., 2014 removió 50 CE en agua residual municipal, de éstos alrededor de 32 tuvieron una remoción mayor al 50%. Entre estos CE se encontraron BPA y TCS, que fueron removidos por C. reinhardtii (14.25% BPA; 41.72% TCS), S. obliquus (11.2 % BPA; 68.58% TCS), C. pyrenoidosa (0.855% BPA; 57.55% TCS), y C. vulgaris (0.953% BPA; 47% TCS). La remoción de CE también se ha realizado para especies de microalgas individualmente. La remoción de triclosán (400 g/L) ha sido reportada para C. pyrenoidosa, Desmodesmus sp., Scenedesmus obliquus teniendo un porcentaje de remoción de 69.3, ≈100 y 99.7%, respectivamente (Wang et al., 2018). Otras especies de microalgas han sido reportadas para la remoción de CE distintos a los usados en este estudio. Por ejemplo, De Godos et al., 2012 empleó C. vulgaris para la remoción de tetraciclina (2 mg/L) obteniendo una remoción de 69%. Ding et al., 2017 removió naproxeno con S. quadricauda teniendo remoción de 58.8, 72.6 y 1.7% a concentraciones iniciales de 1, 10 y 100 mg/L. Xiong et al., 2017, usaron C. mexicana, C. pitschmanni, C. vulgaris, y Ourococus multisporus, removieron un 13, 1.6, no observado y 2% de ciprofloxacino con concentración inicial de 2 mg/L, respectivamente. Xiong et al., 2019, se removieron sulfametazina y sulfametoxazol con S. obliquus, obtenido porcentajes de remoción de 31 al 62% para sulfametazina y 28 a 47% para sulfametoxazol. Las vías de remoción reportadas en general para contaminantes emergentes son biodegradación, biosorción y fotodegradación. De acuerdo a lo obtenido en este estudio la vía que aporta la mayor remoción de BPA es la biodegradación y para TCS es la fotodegradación. Estudios realizados por otros autores revelan que las vías de remoción de BPA para otras especies de microalgas son la 87 biodegradación como vía predominante y la más reportada. Eio et al., 2015 con C. sorokiniana obtuvieron porcentajes de remoción de 0.15, 0.32, 0.36 y 0.6% a concentraciones de microalgas de 104, 105, 106 y 107 cel/ml, respectivamente. La acumulación tuvo un porcentaje de 0.05 y 0.11 % para las concentraciones de microalgas de 106 y 107 cel/ml, respectivamente; mientras que, para las concentraciones de 104, 105 cel/mL no se detectó BPA. Los porcentajes de remoción por biodegradación fueron de 38.5, 30.7 y 20.7 para las concentraciones de BPA de 10, 20 y 50 mg/L, respectivamente. Wang et al., 2017, reporta porcentajes de remoción de 57, 25, 18 y 26 para concentraciones de BPA de 1,3, 5.5 y 13.5%, respectivamente, las cuales atribuye a la bioactividad de Desmodesmus sp.WR1 y una leve remoción debida a fotodegradación. Ji et al., 2018 al remover BPA con C. mexicana y C. vulgaris, individualmente, las vías de remoción reportadas conjuntamente fueron bioacumulación y biodegradación. El porcentaje de BPA removido fue de 39 y 28% para C. mexicana y C. vulgaris, respectivamente. De acuerdo al Gráfico 14, las remociones de BPA en este estudio fueron de 41.02 y 46.75% para SST iniciales ≈300 y ≈500 mg/L. Los valores de biodegradación reportados contra los obtenidos tienen ligeras diferencias, por lo que coincide con lo reportado para el BPA y su alta predisposición a la biodegradación. La biodegradación de triclosán en este estudio se cuantificó en 12.78 y 20.76% para SST iniciales ≈300 y ≈500 mg/L, respectivamente. Pocos estudios sobre las vías de remoción han sido realizados para triclosán, por ejemplo, Wang et al., 2013 removió TCS (800 ng/L) con C. pyrenoidosa (3x107 cel/mL) teniendo una remoción de 72.3% a las 6 horas de exposición, los autores reportan que las vías de remoción involucradas fueron la adsorción y absorción. Wang et al., 2018 determinó que la cantidad de TCS (400 g/L) ingerido por microalgas, fue de 59.2 % en el primer día mientras en el séptimo día se cuantificó un 55% para C. pyrenoidosa. Para Desmodesmus sp., la ingesta de TCS fue de 39.9% el primer día, al cuarto día el porcentaje baja a 14.5, y para el séptimo día 2.8%. S. obliquus tuvo una ingesta de 2.1% el primer día de exposición y 1% al séptimo día. En cuanto a la fotodegradación, da Silva et al., 2014, reporta que la fotólisis aporta una remoción del 70% a una concentración inicial de BPA de 5 mg/L. Eio et al., 2015, obtuvieron porcentajes de remoción, por factores abióticos, de 11.3, 13.2 y 18.8% a concentraciones de BPA de 10, 20 y 50 mg/L, respectivamente. Koumaki et al., 2015 obtuvo para una concentración de BPA de 2 g/L remoción no mayor al 60% a 110 h de exposición (fotodegradación) y de 30% por 163 h de exposición (fotólisis), sin embargo, esta remoción incrementó a 90% en presencia de NO- 3 (10 mg/L). para el caso de TCS presentó la mayor fotodegradación sin la presencia del ion nitrato (93.55%) la adición del ion aumentó ligeramente la remoción a 98.06 y 96.77% a concentraciones de ion nitrato de 1 y 10 mg/L, respectivamente. Wang et al., 2017, no reporta un porcentaje, solo que el BPA es ligeramente removido por factores abióticos. Martínez-Zapata et al., 2013, encontraron una remoción de TCS (2 mg/L) de 72% a 19 h de exposición. Wang et al., 2017, estudiaron la fotodegradación directa (agua Milli Q) e indirecta (agua residual) para TCS a 150 g/L; a 4 h de exposición hubo una remoción del 97% (fotodegradación directa o fotolisis) y 62 % (fotodegradación directa). El autor argumenta que la vía primaria en la fotodegradación de TCS es la directa, es decir la acción de la luz para romper los enlaces 88 de la molécula. Wang et al., 2018 determinó que TCS a 400 g/L tuvo un ≈3.28% de remoción por fotodegradación. En este estudio se observó que la mayor remoción por efecto de la fotodegradación de BPA fue la indirecta, en donde las especies químicas presentes en el ARS intensificaron el porcentaje de remoción. Se obtuvo un 3.8 y 26.23% de remoción para fotodegradación directa e indirecta, respectivamente. Al igual que reporta Koumaki et al., 2015, la presencia de nitratos aumentó la degradación de BPA; la cantidad inicial promedio de nitrato fue de 5.1 mg/L. La interacción de la luz y el ion nitrato forma radical nitrito y radical .O-, éste último reacciona con el agua para formar el ion hidroxilo y el radical hidroxilo (Koumaki et al., 2015). Eso explica la mayor eficiencia de degradación en el agua residual sintética. La fotodegradación de TCS fue de 14.43 y 14.07% para fotodegradación directa e indirecta, respectivamente. La diferencia es mínima entre ambas vías de remoción atribuidas a la fotodegradación. 6.3.2 Subproductos de degradación Los subproductos de degradación fueron detectados en el modo SCAN, para los experimentos con microalgas fueron el p-isopropenilfenol, el cual ha sido identificado en la oxidación de BPA con ferrato de potasio (Li et al., 2008); y al ser expuesto a la luz en presencia de Fe2O3 (Ye et al., 2019). La formación de radicales •OH los cuales atacan el carbón tert-butil el cual es rico en electrones en los anillos aromáticos del BPA que da dos productos de degradación: fenol y p-isopropenilfenol (Ye et al., 2019). 2,6-dimetilbenzoquinona-4-oxima reportado en degradación por luz UV, la reacción principal consiste en la reacción del BPA con oxígeno en la que la reacción de oxidación se concentra en la posición para del fenol (Macko e Ishida, 2000). 4,6-di-tert-butil-m-cresol fue encontrado en las muestras de adsorción, este compuesto químico ha sido reportado en la degradación con catalizadores (Ma et al., 2018). Fenol 2,4-bis(1,1-dimetiletil)- ha sido reportado en la degradación de BPA por acción de microorganismos, Bacillus megaterium (Suyamud et al., 2018); Serratia sp. (Gupta et al., 2015); Escherichia coli (Zhang et al., 2019) y por catálisis con peroxidisulfato (Hu et al., 2022). 1- hexadecanol-2-metil se ha reportado en la degradación de BPA por Funali trogii (Erkut et al., 2015). Fenol que ha sido reportado en fotodegradación, y se debe a un ataque de radicales •OH (Katsumata et al., 2004). Las estructuras químicas de los subproductos de degradación identificados se muestran en la tabla 25. Compuestos químicos identificados pero que no han sido reportados son fenol 2,2’-metileno-bis[6-(1,1- dimetiletil)-4-etil]-, BPA diglídicil éter, hidroxitolueno butilado, los cuales por la estructura química podrían ser subproductos del BPA. Las estructuras de estos compuestos se muestran en la Tabla 25. En las muestras de adsorción y absorción se encontró la presencia de ácidos grasos, los cuales pertenecen a los presentes en microalgas. Subproductos de degradación en las muestras de microalgas (fase acuosa y sorción) no detectados podrían corresponder a compuestos químicos que se degradaron y no se detectaron en los cromatogramas, ya que los días de muestreo fueron cada 7 días. Para ambos experimentos de fotodegradación se encontró el compuesto benzofuran 2,3-dihidro-2-metil fue reportado en presencia de oxígeno (Kitajima et al., 2006). Otro compuesto identificado pero que no 89 ha sido reportado o asociado a la degradación de BPA es 2-(4’hidroxifenil)-2-(4’metoxifenil)-propano; por su estructura química (Tabla 27) podría asociarse al BPA. Tabla 27. Subproductos de degradación de BPA Nombre Estructura química p-isopropenilfenol 2,6-dimetilbenzoquinona-4-oxima 4,6-di-tert-butil-m-cresol Fenol 2,4-bis(1,1-dimetiletil)- 1-hexadecanol, 2-metil Fenol 90 Nombre Estructura química 2,2’-metileno-bis[6-(1,1- dimetiletil)-4-etil]- BPA diglídicil éter Hidroxitolueno butilado Benzofuran 2,3-dihidro-2-metil 2-(4’hidroxifenil)-2- (4’metoxifenil)-propano Los subproductos de degradación del triclosán que se identificaron fueron dibutil ftalato, hidroxitolueno butilado, dietil ftalato, fenol 2,6-bis(1,1-dimetiletil)-4-etil, fenol 2,6-bis(1,1-dimetiletil)-4-(1-metil-1- feniletil)-, estos compuestos químicos no están reportados en la literatura, sin embargo, por su estructura química podrían relacionarse al TCS. En las muestras derivadas de los experimentos con microalgas se detectaron ácidos grasos relacionados con microalgas. En los experimentos de fotodegradación los compuestos detectados fueron dibutil ftalato, y fenol 2,6-bis(1,1-dimetiletil)-; al igual que los experimentos con microalgas, los compuestos químicos detectados no están reportados para la degradación con TCS. La razón de que no se detectaron subproductos de degradación ya reportados para TCS, podría deberse a la estabilidad y tiempo de vida de los subproductos generados y que el tiempo de muestreo fue cada 7 días. En la Tabla 28 se muestran las estructuras químicas de los compuestos detectados. 91 Tabla 28. Subproductos de degradación de TCS Nombre Estructura química Dibutil ftalato Hidroxitolueno butilado Dietil ftalato Fenol 2,6-bis(1,1-dimetiletil)-4-etil Fenol 2,6-bis(1,1-dimetiletil)-4-(1- metil-1-feniletil)- 92 6.4 Actividad estrogénica Al igual que para la remoción de los contaminantes emergentes, la actividad estrogénica solo se determinó para BPA y TCS a la EC50 determinada. Los datos mostrados para BPA y TCS muestran el cambio en los equivalentes de 17β-estradiol para cada experimento, determinación en el medio, fotodegradación directa e indirecta y sorción. En el Gráfico 12, se muestra el cambio en la remoción de BPA y TCS y el cambio en la actividad estrogénica. Se observa que la actividad estrogénica aumenta conforme disminuye la cantidad de BPA y TCS en el medio acuoso. La concentración final de BPA fue de 0.834 y 0.735 mg/L, para SST iniciales ≈300 y ≈500 mg/L, respectivamente. La actividad estrogénica al día 15 de exposición aumentó siete veces y 1.13 veces para SST iniciales ≈300 y ≈500 mg/L, respectivamente. El TCS al día 15 de exposición se cuantificó en 12.477 y 43.277 g/L a SST ≈300 y ≈500 mg/L, correspondientemente. La actividad estrogénica para SST ≈300 y ≈500 mg/L aumentó 4.37 veces y disminuyó un 33.35%, respectivamente. Se observa que la actividad estrogénica no es directamente proporcional a la cantidad de CE presente. Gráfico 12. Remoción de BPA y TCS y actividad estrogénica en el medio acuoso AE: actividad estrogénica En la Tabla 27, se muestran estudios reportados en dónde la actividad estrogénica es removida por varios tratamientos, como microalgas, oxidación y fotodegradación. En los experimentos que involucran microalgas, se observa que los resultados obtenidos en este estudio alcanzan un porcentaje de remoción de los contaminantes emergentes mayor a 95% para el BPA, mientras para el TCS el porcentaje de remoción no superó el 90%. Los porcentajes de remoción obtenidos son similares a los reportados por Zhou et al., 2018, que obtuvo una remoción de 98.88% para BPA y 31.41 para TCS 93 para S. obliquus individualmente. En cuanto a la remoción de la actividad estrogénica, los estudios reportados muestran remociones que van desde 30 al 80% de remoción. En este estudio se encontró que a SST iniciales ≈300 mg/L, la actividad estrogénica se multiplicó con respecto al día cero; sin embargo, con SST iniciales ≈500 mg/L la actividad estrogénica se redujo en un 38.2% para BPA y de 80% para TCS. Lo que indica que a mayor concentración de microalgas iniciales la actividad estrogénica disminuye. Esto podría explicarse que a mayor cantidad de microalgas la biodegradación aumenta, siendo una vía de remoción en la que las moléculas al degradarse se rompen en subproductos de degradación que exhiben menor o ninguna toxicidad (Zhou et al., 2022). Se estudió la sorción de los contaminantes emergentes acumulados en las células de microalgas usadas en los experimentos de vías de remoción. En el Gráfico 13 se muestra la relación de la actividad estrogénica y la remoción de BPA y TCS al día 15 de exposición. El porcentaje de adsorción de BPA para SST ≈300 mg/L fue del 9.25% (1.573 mg/L) que equivale a 0.1907 EEQ ng/L 17β-estradiol. Mientras la absorción a esta misma concentración de 4.24% (0.698 mg/L), equivalente a 0.0978 EEQ ng/L 17β-estradiol. A SST ≈500 mg/L, la SST, fue adsorción fue de 4.11% (0.698 mg/L) con 0.3874 EEQ ng/L 17β-estradiol; y el porcentaje de absorción 4.24 (0.72 mg/L) con 0.1268 EEQ ng/L 17β- estradiol. El porcentaje de adsorción de TCS para la concentración de SST ≈300 mg/L fue de 10.082 (31.746 g/L) equivalente a 0.714 EEQ ng/L 17β-estradiol, mientras la absorción la misma concentración de SST fue de 9.735% (30.652 g/L) que equivale a 0.1829 EEQ ng/L 17β-estradiol. Para SST ≈500 mg/L, el porcentaje de TCS adsorbido fue de 18.82 (59.258 g/L) que en equivalentes 17β-estradiol es igual a 0.2082 ng/L; en el caso de la absorción la misma concentración de SST, el porcentaje de TCS removido fue de 18.161 (57.181 g/L) equivalente a 0.2468 EEQ ng/L 17β-estradiol. Gráfico 13. Actividad estrogénica y sorción de BPA y TCS AE: actividad estrogénica 94 En el gráfico 14 se muestra la relación entre la remoción de BPA y TCS por fotodegradación y la actividad estrogénica. En el caso de BPA se muestra la remoción de BPA y la actividad estrogénica para el control de fotodegradación, esto debido a que en el caso de TCS en el control de fotodegradación no se observó remoción del contaminante emergente. La actividad estrogénica removida en el control de fotodegradación (otros factores) tiene un ligero incremento del 6.19% con respecto al día cero. La actividad estrogénica removida por fotodegradación indirecta (26.23% remoción de BPA) mostró un incremento de 2.406 veces con respecto a lo determinado al día cero de exposición. La fotodegradación directa mostró tener una disminución en la remoción de la actividad estrogénica de 23.07%. La remoción de la actividad estrogénica de TCS, con respecto al día cero de exposición, mostró tener una disminución del 17.99%. En el caso de la remoción por fotodegradación directa (agua Milli Q como medio) tuvo un 3.8% y 14.43% para BPA y TCS, respectivamente. En cuanto a la actividad estrogénica hubo remoción para BPA y TCS en la fotodegradación indirecta y directa, respectivamente. Sin embargo, la actividad estrogénica en la fotodegradación directa aumentó 1.79 veces para BPA y se observó un aumento de 1.23 veces para TCS. Gráfico 14. Remoción de BPA y TCS por acción de la fotodegradación y disminución en la actividad estrogénica AE: actividad estrogénica, FI: fotodegradación indirecta, FD: fotodegradación directa 95 En la Tabla 27, el único trabajo que se enfoca en la fotodegradación, Mutou et al., 2006, probó la degradación de BPA en agua Milli Q, en la que no se detectó actividad estrogénica al final del experimento. En los estudios recopilados en la Tabla 27, se probó la combinación de fotodegradación en conjunto con TiO2, H2O2, cloración, hierro. En estos estudios las remociones de los contaminantes emergentes van del 7.3 al 99%, y la actividad estrogénica se cuantificó después de los tratamientos de 0 a ≈100% de remoción, sin embargo, las concentraciones iniciales de los contaminantes emergentes estuvieron entre los 100 ng/L a los 500 g/L. Otros estudios que involucran oxidación en los que se hace uso de agentes químicos que también son usados en la desinfección como cloro y ozono, reportan remociones de contaminantes emergentes de 79.3% al 99.72%, los cuales son más altos que los reportados en otros estudios. La cuantificación de la actividad estrogénica en tratamientos de cloración y ozonación se reporta de >4% hasta ≈100%. Las concentraciones de los contaminantes emergentes probados van desde los 1000 ng/L hasta los 4 mg/L. 96 Tabla 29. Remoción de contaminantes emergentes y actividad estrogénica por tratamientos de microalgas, fotodegradación y oxidación Contaminante emergente (CE) Concentración CE Matriz Condiciones experimentales Actividad estrogénica (AE) método Porcentaje remoción CE Porcentaje remoción AE Referencia Tratamiento: microalgas BPA 10 – 160 µM Medio Bristol C. fusca 0 – 36 W/m2 8:16 horas luz/oscuridad TRH1: 168 h YES 70% @ 160 >95% @ 10 – 80 ≈100 Hirooka et al., 2005 17-estradiol E1 E2 E3 5 g/L Agua residual S. dimorphus, 40 mg/L TRH: 8 días 12:12 horas luz/oscuridad Intensidad de luz: 100 μE/m2 s E-screen 10 – 20 30% @ 24 h Zhang et al., 2014 BPA TCS BPA: 20145.6 ng/L TCS: 41.7 ng/L * Agua residual C. reinhardtii, S. obliquus, C. pyrenoidosa, C. vulgaris Conc. Microalgas: 0.05 mg/L de Chl-a 12:12 horas luz/oscuridad Intensidad de luz: 60 μmol/m2 s TRH: 7 días YES C. reinhardtii BPA (98.57), TCS (58.27) S. obliquus BPA (98.88), TCS (31.41) C. pyrenoidosa BPA (99.14), TCS (42.44) C. vulgaris BPA (99.04), TCS (52.99) C. reinhardtii: 46.15 S. obliquus: 81.19 C. pyrenoidosa: 64.1 C. vulgaris: 56.41 Zhou et al., 2018 EE2 E2 3 mg/L BG-11 S. capricornutum, S. quadricauda, C. vulgaris 3x107 cel/mL 12:12 horas luz/oscuridad Intensidad de luz: 201.5 μmol/m2 s YES S. capricornutum, E2 (91), EE2 (83) S. quadricauda E2 (73), EE2 (57) C. vulgaris E2 (92), EE2 (55) S. capricornutum: 80 S. quadricauda: 64 C. vulgaris: 68 Wu et al., 2021 BPA TCS BPA: 17 mg/L Consorcio S. obliquus y Desmodesmus sp. BLYES BPA: 95.1 TCS: 61.1 BPA: 7.016 veces aumento Este estudio 97 Contaminante emergente (CE) Concentración CE Matriz Condiciones experimentales Actividad estrogénica (AE) método Porcentaje remoción CE Porcentaje remoción AE Referencia TCS≈ 325 g/L Agua residual sintética 12:12 horas luz/oscuridad Intensidad de luz: ≈100 μmol/m2 s TRH: 15 días SST≈ 300 mg/L TCS: 4.37 veces aumento Consorcio S. obliquus y Desmodesmus sp. 12:12 horas luz/oscuridad Intensidad de luz: ≈100 μmol/m2 s TRH: 15 días SST≈ 500 mg/L BPA: 95.68 TCS: 86.25 BPA: 1.13 veces aumento TCS: 33.35% Tratamiento: Fotodegradación + oxidación BPA 520 mol/L Agua ultra pura y agua residual Io= 4.25x10-6 E-1 750 mL volumen total 500 M H2O2 YES Sin H2O2: AUP: 7.3; AR: 8.8 Con H2O2: AUP: 35; AR: 28 50% @ 120 min Neamtu et al., 2006 BPA 100 M Agua Milli Q Radiación UVB 0 – 100 J/cm2 Y2H NR ND Mutou et al., 2006 E2 EE2 3 g/L Agua desionizada, agua tipo I, agua tipo II UV 0 – 12 000 mJ/cm2 500 g/L H2O2 YES EE2: 95% @ 5000 mJ/cm2 E2: 99% @ 4000 mJ/cm2 95% Rosenfeldt et al., 2007 BPA 100 ng/L Agua Milli Q Agua residual Irradiación: 0.7 W TiO2 0.8 g/L Y2H NR ≈100% @ TiO2 + 50 min+ 0.2 mM (𝑆𝑂42−, 𝐶𝑙−, 𝑁𝑂3−) ≈48.2% @ TiO2 + 50 min+ 𝑁𝐻4+ ≈39.5% @ TiO2 + 50 min+ 𝐻𝑃𝑂42− Zhang et al., 2012 98 Contaminante emergente (CE) Concentración CE Matriz Condiciones experimentales Actividad estrogénica (AE) método Porcentaje remoción CE Porcentaje remoción AE Referencia ≈78.3% @ TiO2 + 50 min+ 𝐻𝐶𝑂3− E2 500 g/L Agua desionizada Agua residual Irradiación 2.1 mW/cm2 Cloración 10 mg/L YES NR Agua desionizada 97.2 @ 5 min + UV + Cl 96.2 @ 5 min + Cl Agua residual 78.3 @ 5 min + UV+ Cl 49.1 @ 5 min + Cl Li et al., 2016 BPA 100 g/L Agua Milli Q Agua residual Cloración 0.2 – 2 mg/L Irradiación 6W YES AMQ: 18 y 70 para UVA y UVC respectivamente, @ 120 min AR: 66 @ 0.2 mg/L Cl, 3 min 99 @ 2 mg/L, 3 min 87 Lee et al., 2008 4-NP 4 mg/L Agua Milli Q Ozonación 1.5 mg/L YES NR ≈100 @ 10 min Sun et al., 2008 BPA 4-NP TCS 1000 ng/L Agua de pozo Ozono fase gas 1, 2 y 3 mg/L Tiempo: 1, 5, 10 min BLYES BPA: 98.7 4-NP: 79.3 TCS: 97 BPA:77 – 96 4-NP: 93 – 99 TCS: 94 – 96 Orta et al., 2019 Cloración 0.2, 1 y 1.5 mg/L Tiempo 10 minutos BPA: 86.2 4-NP: 94.3 TCS: 97.8 BPA: 81 – 94 4-NP: 95 – 97 TCS: 92 – 99 *Contaminantes emergentes encontrados y cuantificados en las muestras de agua residual utilizadas. Y2H: Yeast two-hybrid; AUP: agua ultra pura; NR: no reportado; ND: no detectado; LC: límite de cuantificación; AMQ: agua Milli Q; LD: límite de detección; E1: estrona; E2: 17β-estradiol; EE2: 17β- estinilestradiol; E3: estriol; ARS: agua residual sintética; 4-OP: 4-octilfenol; 4-NP: 4-nonilfenol 100 7 CONCLUSIONES 1. Las EC50 determinadas fueron de 17 mg/L para BPA y 325 g/L para TCS, con una concentración inicial promedio de microalgas aproximada de 104 células/mL, de un consorcio de microalgas con predominancia de Scenedesmus obliquus y Desmodemus sp. Las EC50 determinadas están en orden de magnitud a lo reportado por otros investigadores para otras especies individuales de microalgas. La diferencia entre la magnitud de concentraciones entre BPA y TCS, se determina que TCS es aproximadamente 52 veces más tóxico que BPA. 2. Se cuantificó la actividad estrogénica y la concentración de BPA y TCS, por medio de la técnica de BLYES-GC/MS. La relación entre la concentración del contaminante emergente y el área bajo la curva es directamente proporcional (cuantificación), sin embargo, esta tendencia no se observa en la actividad estrogénica, debido a que los contaminantes emergentes exhiben comportamientos fuera de la linealidad entre concentración y EEQ de ng/L 17β-estradiol. Ante ello, es necesario realizar la determinación de la actividad estrogénica de los contaminantes emergentes en los tratamientos, sin importar el porcentaje de remoción de los contaminantes emergentes que se alcance. 3. Se determinó que la presencia de BPA y TCS estimula (favorece) el crecimiento y producción de biomoléculas. A pesar de que el BPA y TCS son contaminantes disruptores endocrinos, el consorcio aumentó la producción de compuestos de interés comercial como carbohidratos, lípidos, proteínas y clorofila, así como la producción de biomasa microalgal. La mejor combinación de concentraciones iniciales fue a una cantidad de SST ≈300 mg/L y a concentraciones de BPA (17 mg/L) y TCS (325 g/L). 4. La remoción de los nutrientes no se vio afectada por la presencia de BPA y TCS, la disminución de algunos parámetros se vio favorecida, por lo que el uso de consorcio microalgal en estudio puede ser usado para la remoción de nutrientes en presencia de contaminantes emergentes. El efecto que tienen los contaminantes emergentes en la capacidad que tienen las microalgas de tomar nutrientes presentes en agua residual, no ha sido ampliamente estudiado por otros autores. Una posible explicación, podría ser que la producción de clorofila no se vio afectada por la presencia de BPA y TCS; lo que permitió al consorcio microalgal continuar con las funciones metabólicas necesarias para seguir consumiendo los nutrientes del agua residual sintética. 5. Se determinó la contribución de las vías de remoción en la degradación de BPA y TCS, la biodegradación es la vía más importante para remover BPA, la cual contribuye con un porcentaje mayor al 40%. Para el TCS se observó que la fotodegradación (suma de directa e indirecta) contribuye a la remoción del 28.5% del TCS. Debido a la vía de remoción que más favorece la degradación de los contaminantes emergentes, se observó que el BPA es un contaminante emergente biodegradable, mientras el TCS presenta una mayor toxicidad debido a su baja biodegradabilidad. Esto se observó anteriormente cuando se determinó la EC50 correspondiente. 101 8 RECOMENDACIONES Al cuantificar los contaminantes emergentes en las muestras de sorción, se observó que las microalgas tienen la capacidad de sorber tanto en el interior como en el exterior de la célula. Derivado de esto, se recomienda analizar el reúso seguro de la biomasa cultivada. La presencia de los contaminantes emergentes podría afectar el desempeño para su posterior uso como fertilizante. En el caso de las biomoléculas cuantificadas, se debe analizar si hay un efecto negativo en la estructura y cantidad de las biomoléculas. También se deben analizar los tratamientos necesarios para remover el contaminante emergente sorbido, para el mejor aprovechamiento de la biomasa. En cuanto a la actividad estrogénica, es necesario determinarla para asegurar que el efluente tratado es seguro para su vertido al ambiente, sin importar si la remoción de los contaminantes emergentes sea cercana a 100%. 102 9 REFERENCIAS 1. Adeel, M., Song, X., Francis, D., y Yang, Y., (2017). Environmental impact of estrogens on human, animal and plant life: a critical review. Environmental international, p. 1 – 15. http://dx.doi.org/10.1016/j.envint.2016.12.010 2. 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Velasquez-Orta D, Isaura Yáñez-Noguez”, Ignacio Monje-Ramirez *, Petia Mijaylova-Nacheva*, Alma Chávez-Mejía”, MaríaTeresa Orta Ledesma ” * Instituto de ía, Universidad Nacional A de México, Av. U d 3000, Alcaldía Coyoacán, CP 04510 Ciudad de México, Mexico > School of Chemical Engincering and Advanced Materials, Merz Court, Newcastle University, Newcastle upon Tyne NE1 7RU, UK * Instituto Mexicano de Tecnología del Agua, Paseo Cuauhnahuac 8532, Progreso, Jiutepec, Morelos 62550, Mexico ARTICLE INFO ABSTRACT Keywords: Amongst the many treatments available for the removal of emerging contaminants in wastewater, microalgal Pisphesial A: cultures have been shown to be effective. However, the effectiveness of exposure of a native microalgal con- Triclosan (TCS) sortium to emerging contaminants such as bisphenol-A (BPA) and triclosan (TCS) to determine the half- al maximum effective concentrations (ECs0) has not yet been determined. The effect on growth and nutrient Wistemater removal of such a treatment as well as on the production of biomolecules such as carbohydrates, lipids, and ECg0-96h proteins are, at present, unknown. In this study, the EC5y of BPA and TCS (96-hour experiments) was determined using a consortium of native microalgae (Scenedesmus obliquus and Desmodesmus sp.) to define the maximum tolerance to these contaminants. The effect of BPA and TCS in synthetic wastewater (SWW) was investigated in terms of microalgal growth, chlorophyll a (Chl-a), carbohydrate, lipid, and protein content, as well as nutrient removal. Assays were performed in heterotrophic conditions (12/12 light/dark cycles). ECso-96 h values of 17 mg/L and 325 yg/L for BPA and TGS, respectively, were found at 72 h. For an initial microalgal inoculum of = 300 mg TSS/L (total suspended solids per litre), growth increased by 16.1% when exposed to BPA and 17.78% for TCS. At = 500 mg TSS/L, growth increased by 8.25% with BPA and 9.92% with TCS, respectively. At the ECs0-96 h concentrations determined in the study, BPA and TCS did not limit the growth of microalgae in wastewater. Moreover, they were found to stimulate the content of Chl-a, carbohydrates, lipids, proteins, and enhance nutrient removal. Availability of data and material: Data sharing not applicable to this article as no datasets were generated or analysed during the present study. 1. Introduction Emerging contaminants can be persistent and difficult to remove in wastewater using conventional treatments. Wastewater treatment using photosynthetic microorganisms, such as microalgae, has grown in use due to the production of high-quality effluents and the potential re- covery of microalgae biomas for use as biofuels, fertilisers and protein- rich raw materials (Matamoros et al., 2015). The major advantage of microalgae-based treatment systems is that they reduce treatment costs through biomass valorisation, while providing effective wastewater remediation. However, their real-world application in the presence of emerging contaminants has been discussed very little (Maryjoseph and * Corresponding author. E-mail address: MOrtaLGiingen.unam.mx (M. Orta Ledesma). https: //doi.org/10.1016/j.ecoenv.2023.115117 Ketheesan, 2020). For effective treatment and biomass valorisation, the tolerance (or toxic effect) of microalgae to emerging contaminants such as bisphenol A (BPA) and triclosan (TCS) must be estimated. The maximum effective average concentration (ECsp) parameter is a statis- tical estimate of the concentration (or dose) of an environmental toxi- cant that produces a specific effect in 50% of the population under certain conditions (Rozman et al., 2010). ECso values for single cultures of different microalgae species have been found to range from 0.039 to more than 75 mg/L BPA and from 2.8 to 1637 1ig/L TCS (Orvos et al., 2002; Li et al., 2009; Ji et al., 2014; Ebenezer and Ki, 2016; Tisler et al., 2016; Li etal., 2017; Bi etal., 2018; Ding et al., 2018; Xiang et al., 2018; Esperanza et al., 2020; Wang et al., 2020; Machado and Soares et al., Received 9 March 2023; Received in revised form 2 June 2023; Accepted 5 June 2023 Available online 12 June 2023 0147-6513/0 2023 The Authors. Published by Elsevier Inc. This is an open access article under the CC BY license (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). 114 10 PRODUCTOS DERIVADOS DEL PROYECTO K. Atengueño-Reyes et al. 2021). An ECsp value of 19.6 mg/L has been reported for Demodesmus subspicatus exposed to BPA (Tisler et al., 2016), but no ECso data were found for TCS. For Scenedesmus quadricauda and Scenedesmus obliquus, ECsp values of 13.233 mg/L and 33.9 mg/L BPA were found (Li et al, 2017; Xiang et al, 2018). For the same species (S. quadricauda and S. obliquus) exposed to TCS, ECsp values of 325 1g/L and 187.5 1g/L were determined (Bi et al, 2018). But, specifically, for a consortium of indigenous microalgae (Scenedesmus obliquus and Desmodesmus sp.), which are the predominant species in wastewater, no information was found. The presence of BPA and TCS in microalgae-based treatment systems has therefore demonstrated contrasting results. Under certain culture conditions, BPA and TCS can limit or increase biomass, biomolecule or chlorophyll production and nutrient uptake from wastewater (Xin et al, 2018; Dai et al., 2021; Míguez et al., 2021; Azi- zullah et al, 2022; Li et al, 2022). Inhibition of growth caused by different emerging contaminants has been observed; both BPA and TCS affect growth by up to 80% in synthetic media of microalgae such as Desmodesmus sp., S. quadricauda, S. obliquus Chlamydomonas reinhardtii, Chlorella vulgaris (Li et al., 2017; Wang et al., 2017; Wang et al., 2018; Xiang et al., 2018; Wang et al., 2020; Machado and Soares, 2021; Dai et al, 2021). Chlorophyll is a primary indicator of photosynthetic ac- tivity in microalgae, and is a sensitive biomarker when microalgae are exposed to a toxic compound (Kurade et al., 2016). Both BPA and TCS have been reported to cause increased but also decreased chlorophyll content in microalgae including the following species: C. reinhardtii, Picocystis, Chlamydomonas mexicana, Pseudokirchnereilla subcapitata, Desmodesmus sp. and C. vulgaris (Wang et al., 2017; Ben Ouada et al, 2018; Wang et al., 2020; Dai et al, 2021; Míguez et al, 2021; Machado and Soares, 2021; Azizullah et al., 2022). Experiments using emerging contaminants other than BPA and TCS have shown that S. obliquus chlorophyll content may be reduced (Wan et al., 2022). Chlorophyll behaviour studies are needed for consortia of microalgae exposed to BPA and TCS. However, it has also been reported that different species of microalgae growing in wastewater contaminated with emerging con- taminants develop mechanisms to maintain their normal metabolism. These mechanisms include changes in the concentration of bio- molecules: carbohydrates, lipids and proteins. This could affect their ability to capture sunlight (Xiang et al., 2018; Teoh et al., 2020; Dai et al., 2021 Rempel et al., 2021; Azizullah et al., 2022; Ricky et al, 2022). However, the effect of BPA and TCS on the concentration of precursor biomolecules of beneficial products has not been described for consortia of microalgae. This study provides information on the toler- ance of a consortium of indigenous microalgae (S. obliquus and Desmo- desmus sp.) that are predominant in wastewater to BPA and TCS. The effect of both emerging contaminants on growth, chlorophyll a (ChLa), biomolecule content (carbohydrates, lipids and proteins) and nutrient removal in synthetic wastewater (SWW) was investigated, with the aim of applying this knowledge to wastewater treatment and the utilisation of biomass. 2. Materials and methods This research employed a microalgal consortium with a predomi- nance of Desmodesmus sp. and S. obliquus. To determine the tolerance of this microalgal consortium to BPA and TCS, the median effective con- centration (ECsog-96 h) was determined. Microalgae were grown in synthetic wastewater with the estimated dose of BPA and TCS that produced a negative effect on 50% of the population. Under these conditions, the effect on microalgal growth, Chl-a content, biomolecule content and nutrient removal was evaluated. 2.1. Reagents The reagents used for the assays were analytical grade BPA > 99% (Sigma Aldrich 239658-50 G), TCS analytical grade (Sigma Aldrich PHR-1338-1 G) and HPLC grade methanol > 99.9% (Sigma Aldrich Ecotoxicology and Environmental Safety 262 (2023) 115117 34860-1 L). The reagents used for the preparation of synthetic waste- water and determination of Chl-a, carbohydrate, lipid, proteins and nutrient removal were analytical grade. 2.2. Microalgae consortium and culture conditions The microalgal consortium was composed of S. obliquus and Desmo- desmus sp. as the predominant species, and included other microalgae such as: Desmodesmus intermedius, Desmodesmus magnus, Desmodesmus communis and Desmodemus opoliensis. This consortium was previously identified and reported by Hermnández-García et al. (2019). Experiments were carried out at laboratory scale, and microalgae were acclimatized to SWW. The composition of SWW was based on a modified BG-11 medium recipe used by Habibi et al. (2019), for dairy wastewater with the following composition (mg/L): NaNOz, 42; K2HPO4, 48; MgSO,7 H»0, 75; CaCl,H20, 36; NazCOz, 20; citric acid, 6; EDTA, 1. Trace 'metals: H¿BO», 2.86; MnCl,4 H20, 1.81; ZnSO47 H20, 0.222; NaMoO;2 HO, 0.39; CuSOy5 H20, 0.079; Co(NOs)26 H20, 0.049; glucose, 0.09, with the addition of 40 mg/L NH4Cl, for ammoniacal nitrogen content. 2.3. ECso-96 h, tolerance tests To investigate the mean effective concentration of BPA and TCS in the microalgal consortium, ECspy-96 h assays were performed following method 201 of the Organisation for Economic Co-operation and Devel- opment guidelines (OECD, 2006). Initially, the consortium of micro- algae was acclimatized for three days in OECD 201 medium. Once the cultures were acclimatized, they were exposed to BPA concentrations of 0,5,10,15,16,17, 18, 19, 20, 25 mg/L, and to concentrations of O, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450 1g/L of TCS. Control experiments (without the presence of BPA or TCS) were also carried out. Both BPA and TCS were prepared using methanol as the carrier solvent at a concentration of 0.01% (v/v) as recommended by the OECD 201 guideline. To verify the no observed effect concentration (NOEC) of methanol on the growth of the microalgal consortium, assays and analysis of variance were performed. In both NOEC and blank-EC5096 h experiments, it was observed that there was no significant inhibition of cell growth (P < 0.05, ANOVA). A volume of 150 mL of OCDE 201 culture medium was inoculated with an initial microalgal cell density of = 10* cells/mL. Cultures were subjected to a constant light intensity of 100 jmol/m?s (cool white light), with constant shaking at 150 rpm at room tempera- ture. The assay time was 96 h. Biomass growth measurements were performed daily by cell counting using a Neubauer chamber (BlauBrand, Germany. 0.0025 mm?, 0.001 mm depth) under a Carl Zeiss Microscopy Axio Lab.A1 optical microscope (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Ger- many) with 40x objective. 2.4. Effect of bisphenol-A (BPA) and triclosan (TCS) on biomolecules content and nutrient removal The ECso-96 h values (effective concentration that caused 50% growth inhibition) for Desmodesmus sp. and S. obliquus microalgae were 17 mg/Land 325 ug/L for BPA and TCS, respectively. These values were used to evaluate the effect of both emerging compounds on growth, Chl- a, biomolecule content and nutrient removal. For this purpose, experi- ments were established at two different initial concentrations of inoc- ulum. The tests used = 300 or = 500 mgTSS/L of initial inoculum to determine whether the concentration of the cultures had an influence on the effect of BPA and TCS. For each, a control experiment free of BPA or TCS was also carried out. The microalgal consortium was grown in 600 mL of SWW, under a light/dark cycle 12/12 h with light intensity of 100 jmol/m?s (cold white light), constant agitation of 150 rpm, at room temperature with an experimental duration of 15 days (hydraulic retention time, HRT). Control experiments were performed under the same conditions as described above, without the presence of BPA and TCS. Each experiment was performed in triplicate. INSTITUTO DE INGENIERÍA UNAM 115 K. Atengueño-Reyes et al. 2.5. Sampling for analysis Aliquots of 100 mL were taken from each experiment on days 0, 3, 7, 10, 13 and 15, and stored at 4 *C in the dark prior to analysis. Biomass was analysed for microalgal growth, Chla and biomolecule content, using unfiltered samples. To evaluate nutrient removal in the cultures, samples were filtered using a 1.6 jm pore size GF/A glass microfiber filter (Whatman, cat. 1820-055). 2.5.1. Biomass analysis Microalgal growth (biomass concentration) was determined in terms of the TSS parameter, which is expressed as mgTSS/L. In addition, the content of Chl-a, carbohydrates, lipids and proteins in the recovered biomass as well as cell density were evaluated. TSS was determined by method 2540 D (standard method) from biomass that was oven-dried at 103 *C. Cell density was calculated indirectly from TSS content and a standard curve was created by plotting TSS versus cell density (Eq. 1): cells/mL = 11667758 — 237452; R? = 0.984 (Mm Chl-a content was quantified by methanol 90% extraction in accor- dance with methodology described by Toledo-Cervantes et al. (2013). Absorbance was measured at 650, 665 and 750nm. A turbidity correction was made for the absorbances at 650 and 665 nm by sub- tracting the absorbances at 750 nm. Eq. 2 was used to calculate Chl-a content (Eq. 2) (Becker, 1994), where the units of concentration of chlorophyll are g/mL: Chlorophyll a = Chl— a = 16.5As6s — 8.3650 163) Where, Ases: absorbance measure at 665 nm; Agso: absorbance measure at 650 nm. Lipid content was quantified by the colorimetric sulfo-phospho- vanillin method, carbohydrates by the colorimetric phenol-sulphuric acid method (Hernández-García et al, 2019) and proteins by the Biuret method (Uzun etal., 2012). To quantify carbohydrates, lipids and proteins, calibration curves were constructed according to the linear equation (Eqs. 3-5): - Abs—0.2322 Caibohydrats (mg/L = 0000 2 = 09927) (3) pas _ Abs +0.0569 Lipids (ez = nr E = 09974) (4 z Abs —0.0692 > Proteins (me/z = 000005 E =s 09719) (5) Where, Abs= Absorbance. 2.5.2. Nutrient removal To evaluate nutrient removal, physicochemical parameters deter- mined in the SWW were: NO; (method 325.1 EPA, 1971), soluble COD (method 5220 D), , PO% (method 4500 P-D), N-NH5 (method 4500-NH3 C) and alkalinity (method 2320B) (American Public Health Association, 2023). Calibration curves were constructed according to the linear equation to measure the physicochemical parameters: Orthophosphates(mg PO” /L =0.9163Abs — 0.2824; R? = 0.9889) (6) Nitrates(mg NO; /L= 1.6929Abs + 0.8892; R? = 0.9943) (Mm COD(mg COD/L= 2464.8Abs — 3.0686: R? = 0.9985) (8) Where, Abs= Absorbance. Ecotoxicology and Environmental Safety 262 (2023) 115117 2.6. Statistical analysis Graphs were produced using Microsoft Excel Professional Plus 2016, and analysis of variance (ANOVA) and Tukey tests were carried out using R Studio 4.1.2 software. ANOVA test analyses were made for ECspo- 96 h determination, nutrient removal and biomolecule content. 3. Results and discussion 3.1. ECsg-96 h test A wide range of ECsp values (0.039 mg/L to >75 mg/L) for BPA and different genera of microalgae grown on synthetic media and individ- ually have been published (Table 1). The ECso-96 h values obtained in the present study, for the microalgal consortium grown in synthetic wastewater, are within the range previously reported. The indigenous microalgal consortium with a predominance of S. obliquus and Desmo- desmus sp. showed an ECso value of 17 mg/L of BPA at 72 h of exposure (Table 1, Fig. 1). These results agree with those published for the same genera of microalgae in single cultures. For example, ECso-96 h values of 33.9 mg/L BPA have been reported for S. obliquus; 13.23 mg/L for S. quadricauda; and 19.6 mg/L for D. subspicatus (Li et al., 2017; Xiang et al., 2018; Tisler et al., 2016). ECso-96 h values found for TCS are shown in Fig. 2. The growth inhibitory effect on the microalgal consortium for TCS was reached after 72h at a concentration of 325 g/L. Bi et al. (2018) report a lower ECso-96 h (187.5 g/L) for S. obliquus with a higher cell density and longer exposition time (5 x10* cells /mL at 96 h). A possible explana- tion for the difference of exposure time with respect to the present study, and therefore purity of culture, could be due to the cell density in each experiment (in the present study microalgal cell density was 1.08 x10* cells/mL). Perhaps at higher cell density the microalgae show more resistance to TCS stress, and therefore longer exposure time is required. Another type of microalgae, such as C. reinhardtii a unicellular alga, is reported to have a high tolerance to TCS, 1637 1g/L, 72h (Wang et al., 2020). 3.2. Effect BPA and TCS on biomass and biomolecules The effect of BPA and TCS on performance of the microalgal con- sortium was evaluated. Table 2 shows results of microalgal biomass growth (as TSS), Chl-a, carbohydrate, lipid and protein content, respectively, at 15 days of culture with respect to the control experiment (without BPA and TCS, respectively). The variations of the measured parameters can be seen in Fig. 3. 3.2.1. Microalgal growth With regard to the growth of the consortium of microalgae in syn- thetic wastewater in the presence of BPA (ECso-72 h; 17 mg/L), the re- sults show significant increases of 16.10% and 8.25% for inoculum of = 300 mg TSS/L(3.33 x10* cells/mL) and = 500 mg TSS/L(6.21 x10% cells/mL), respectively (Fig. 3). A similar effect was obtained in the case of TCS (ECso-72 h; 325 p1g/L), with increases of 17.78% and 9.92%, compared to the control. The results obtained with the consortium of microalgae formed by S. obliquus and Desmodesmus sp. contrast with those reported for microalgae of similar genera studied individually. Xiang et al. (2018) reported inhibition of the growth of the microalga S. quadricauda (2.13 x10% cells/mL) at high BPA concentrations be- tween 1 and 10 mg/L. Wang et al. (2018), reported that Desmodesmus sp. (1.0 x10” cells/mL) showed 47.7% growth inhibition with 400 1g/L TCS after the first day of exposure. Differences in culture conditions (light intensity and agitation) could be the reason for the contrast in the results obtained and reported. 3.2.2. Chlorophyll a content Chlorophyll is a primary indicator of photosynthetic activity in INSTITUTO DE INGENIERÍA UNAM 116 K. Atengueno-Reyes et al. Ecotoxicology and Environmental Safety 262 (2023) 115117 Table 1 EC+o-96 h reported for BPA and TCS with different microalgae species. Concentration Microalgae species Microalgae Media culture ECso value Ref. concentration BisphenolA 0.01 - 9 mg/L S. hanteschii 1.3 x 10* cells/mL Artificial sea water 8.65 mg/L,96h Lietal (2009) 10 - 50 mg/L C. reinhardtii 2.5 x 10* cells/mL Minimum tris phosphate 30 mg/L, 96 h Esperanza et al. (2020) 7-42 mg/L D. subspicatus 10* cells/mL NS 19.6mg/L,72h — Tisleretal. (2016) 0.1 - 20 mg/L S. quadricauda 2.13 x 10% cells/mL MA medium 13.233 mg/L, Xiang et al. (2018) 96 h 0.05-20mg/L — Ditylum brightwellii 3.25 x 105 cells/mL £/2 medium 0.039 mg/L, 72h Ebenezer and Ki (2016) 0.5-100 mg/L — Tetraselmis suecica 5.50 x 105 cells/mL 15.55 mg/L, 72h 1- 50 mg/L C. mexicana ODeso =1.0 Bold basal 44.8 mg/L,120h — Jietal.(2014) C. vulgaris 39.8 mg/L, 120 h 1-50 mg/L Chlorella pyrenoidosa NS Sterile OECD 201 44.9mg/L,96h Lietal (2017) S. obliquus 33.9 mg/L, 96 h 0.1-500 mg/L Cochlodinium polykrikoides 2.25 x 10* cells/mL £/2 medium 68.15mg/L72h Ebenezer and Ki (2012) 1-75 mg/L Graesiela sp. ODeoo = 0.07 Bold basal 19.5mg/L96h BenOudaetal, 2018 Picocystis sp. Zarrouk > 75 mg/L 96h 5-25 mg/L Desmodesmus spp and S. obliquus consortium — 1.54 x 10* cells/mL OECD 201 17 mg/L;72h This study Triclosan 0-2000 1g/L S. quadricauda 5 x 10* cells/mL OECD 201 325 |1g/L, 96 h Bi etal. (2018) S. obliquus 187.5 pg/L, 96 h 0.6 - 10 pg/L Scenedesmus subspicatus 10* cells/mL OECD 201 2.8 lig/L, 96 h; Orvos et al. (2002) 27, 37 yg/L Pseudokirchneriella subcapitata 10% cells/mL OECD 201 27 $g/L, 72 h Machado and Soares 37 hg/L, 72 h (2021) 0.5 -4mg/L C. reinhardti ODy50 = 0.6 Tris-acetate-phosphate 1637 g/L, 72h Wangetal. (2020) (TAP) 0 - 800 j1g/L Navicula sp. 1 mg/L Dl medium 145.64g/L,72h Dingetal. (2018) 300-450 g/L Desmodesmus spp and S. obliquus 1.08 x 10* cells/mL OECD 201 325 |1g/L, 72h This study consortium Ns: mot opecified 100 Initial cell density: 1.08 x 10*cellsámL | Gr ow th in hi bi ti on (% ) o 10 20.30 40 50 60 70 80 90 100 Hours -e-15m8/L —16mglL —17m8/L *18mg/L —19mgL ——20mpL 25 mg/L Fig. 1. Growth inhibition of the Desmodesmus spp. and $. obliquus microalga consortium in the presence of BPA, to allow determination of ECs0-96h for BPA. microalgae, and is a sensitive biomarker when microalgae are exposed to a toxic compound (Kurade et al, 2016). For experiments with initial consortium biomass of = 300 mgTSS/L, the Chla content had an in- crease of 40.19% and 73.84%, in the presence of BPA and TCS, respectively, compared to the control (Fig. 3). At the highest inoculum concentration (=500 mg/L), the increase was lower for TCS (0.14%) and a decrease was recorded for BPA (5.33%). In this regard, there are re- ports that BPA, at concentrations of 1-5 mg/L, increase the Chl-a con- tent of Desmodesmus sp. WR1 (Wang et al, 2017). There are reports indicating that BPA, at concentrations of 1-5 mg/L, increases the Chl-a content of Desmodesmus sp. WR1 (Wang et al., 2017). Likewise, the same effect of BPA has been reported for other genera of microalgae that were not evaluated in the present study, such as C. reinhardtii, (Míguez et al., 2021). The effect of TCS on Chl-a content has been reported for green ECsy 50.0% viable cells 3 Gr ow th in hi bi ti on (% ) e 0 10. 2030 40 SO 60 70 80 90 100 Hours —e-300 ug/L —+325ug/L —350u8/L —+-375ug/L -400ug/L -+-425ug/L —450ug/L Fig. 2. Growth inhibition of Desmodesmus spp. and S. obliquus microalgal consortium in the presence of TCS, to allow the determination of ECso-96 h for TCS. microalgae species other than the genera Desmodesmus sp. and S. obliquus. Studies found on C. vulgaris, showed a 20.18 + 0.64 mg/L increased in Chla when exposed to 750 g/L TCS (Dai et al., 2021). Molecular analysis has clarified that emerging contaminants have an effect on Chl-a metabolism in microalgae, which is reflected in the ef- ficiency of photosynthetic activity, as described by Ma et al. (2022). 3.2.3. Biomolecule content 3.2.3.1. Carbohydrates. Carbohydrates are structural components in cell walls, provide energy sources and play important roles in metabolic processes (Azizullah et al., 2022). Compared to the control, the micro- algal consortium (=300 and =500 mgTSS/L) grown in the presence of BPA showed a non-significant decrease in carbohydrate content, 2.12% and 4.58%, respectively (Fig. 3). In the presence of TCS, and with the INSTITUTO DE INGENIERÍA UNAM 117 U POSG K. Atengueno-Reyes et al. Ecotoxicology and Environmental Safety 262 (2023) 115117 Table 2 TSS and biomolecule content in the microalgal consortium with predominance of 5. obliquus and Desmodesmus spp. exposed to BPA and TCS. Experiment TSS Chlorophyll “a” Carbohydrates Lipids Proteins mgTSS/L Hg/mL mg/mgTSS Day 0 Day 15 Bisphenol-A BPA 307.50 + 10.92 447 + 26.83 0.88 + 0.15 0.23 + 0.018 0.10 + 0.003 0.32 + 0.007 17 mg/L Control 385 + 14.72 0.63 + 0.10 0.23 + 0.01 0.07 + 0.004 BPA 547.78 + 14.60 617 + 11.51 0.83 + 0.09 0.22 + 0.007 0.09 + 0.003 17 mg/L Control 570 + 5.77 0.88 + 0.22 0.24 + 0.01 0.07 + 0.002 0.20 + 0.03 Triclosan TCS 301.12 + 12.36 371 + 8.94 1.09 + 0.17 0.16 + 0.007 0.09 + 0.002 0.30 + 0.026 325 1g/L Control 315+7.0 0.62 + 0.053 0.20 + 0.007 0.08 + 0.002 0.146 + 0.026 TCS 457.12 + 12.19 518 + 10.95 0.71 +0.06 0.23 + 0.008 0.09 + 0.004 0.20 + 0.022 325 1g/L Control 471.2 +4.8 0.71 + 0.092 0.22 + 0.008 0.08 + 0.004 0.119 + 0.022 Initial characterization of microalgal consortium; Chla: 0.617 + 0.178 1g/mL; carbohydrates: 0.180 + 0.022 mg/mgTSS; lipids: 0.089 + 0.0074 mg/mgTSS; pro- teins: 0.155 + 0.029 mg/mgTSS. BPA = 17 mg/L 180 * TSS=300mgL 160 , =TSS=S00 mg/L. E 10 1 . 3 . ¿ , : 2 no ¡ É TT E E oo 78 5 bw 3 zos 2 TSS Chlorophyll a — Carbohydrates Lipids Protelns TCS = 325 pg/L 250 * TSS=300mg/L 2 TSS=500mg/L . 320 3 S E 150 l Z E g E 100 É 3 ¿Ss TSS Chlorophylla — Carbohydrates Lipids Proteins Fig. 3. Percentage increase with respect to control of TSS, Chl-a, carbohydrate, lipid and protein content in experiments in the presence ofBPA and TCS on the 15th day of exposure. Parameters with significant differences with respect to the control are indicated by an asterisk (*P < 0.05). lowest initial biomass concentration (=300 mgTSS/L) the carbohydrate content had a significant decrease of 17.91%. In contrast, an increase of 1.77% was observed with the highest initial biomass content (=500 mgTSS/L). To date, no information was found in the literature on the effect of BPA and TCS on carbohydrate content for the genera of microalgae evaluated at present study. Only one study was found referencing the effect of BPA on C. vulgaris and C. mexicana, where carbohydrate content showed slight increases of 9.6% (25 mg/L) and 6.5% (50 mg/L), respectively (Azizullah et al., 2022). 3.2.3.2. Lipids. Lipids are considered an indicator of stress due to the presence of toxic substances (Azizullah et al., 2022). The results of the lipid content in the biomass of the microalgal consortium cultured in the presence of BPA and TCS showed an increase with respect to the control experiments (Table 2, Fig. 3). In the case of BPA, the highest increase (37.84%) was obtained with an initial biomass concentration of = 300 mg SST/L, going from a lipid content of 7-10% (w/w) by dry biomass. In contrast, experiments in the presence of TCS showed a moderate increase (18.75%), with the highest initial biomass concen- tration (=500 mg TSS/L). In the latter case, the lipid content of the microalgal consortium increased from 8% to 9% (w/w) by dry biomass. Exposure of microalgae to emerging contaminants leads to an increase in lipids, this could be due to cell membrane damage caused by oxidative stress when microalgae are in contact with contaminants. The increase in unsaturated fatty acids may be due to cell membrane damage caused by this oxidative stress (Azizullah et al., 2022). 3.2.3.3. Proteins. Proteins are present in different parts of the micro- algal cell such as the cytoplasm, organelles, plastids, cell wall and nu- cleus (Amorim et al., 2021). In this study, both emerging compounds showed a positive effect on the protein content of microalgae biomass, highlighting the culture condition of lower initial biomass concentration (300 mg TSS/L) (Fig. 3). The presence of TCS doubled the protein content of the microalgae consortium with respect to the control; that is, it went from 15% (w/w) to 30% (w/w) by dry biomass (Table 2). In the case of BPA, the increase in protein content was less significant, as can be seen in Fig. 3. Little information is available on the effect of BPA and TCS on the protein content of the genera of microalgae evaluated in the present study. However, other types of emerging compounds are known to have the ability to increase the protein content of different micro- algae. For example, it has been reported that acetylsalicylic acid and caffeine influenced the protein content of the biomass, reaching values higher than 66% protein for S. obliquus (Rempel et al, 2021). 3.3. Effect of bisphenol-A (BPA) and triclosan (TCS) on nutrient removal BPA and TCS were observed to affect nutrient removal by the microalgal consortium. Related data in terms of physicochemical pa- rameters are shown in Table 3. Fig. 4 compares the nutrient removal for each emerging contaminant for each initial biomass concentration with respect to the controls. INSTITUTO DE INGENIERÍA UNAM 118 U POSG K. Atengueño-Reyes et al. Ecotoxicology and Environmental Safety 262 (2023) 115117 Table 3 Nutrient removal in SWW with S. obliquus and Desmodesmus spp. consortium exposed to BPA and TCS. Experiment COD N-NO; N-NH3 Orthophosphates Total alkalinity mg/L Day 0 Day 15 BPA 239.7 + 34.7 31.0+27 3.8+0.9 =0.0+0 9.2+0.1 10.00 17 mg/L Control 24.5 + 13.3 247 +46 8.6 +0.2 49+16 7.5+0.3 12.4 + 4.9 OS BPA 239.7 + 34.7 46.2+17 720.8 =0.0+0 127 +0.7 10.00 17 mg/L Control 24.5 + 13.3 17.9 + 4.2 9.7+0.4 5.60 13.0 +0.5 10.00 BPA-free Triclosan TOS 139.9 + 36.3 30.0 + 8.9 13.3 + 2.3 1403 14,5 +2.4 6.0.1.4 325 pg/L Control 24.5 + 13.3 23.4 + 1.2 10.2 + 2.6 430.8 13.8 + 0.7 701.2 TCS-free TOS 139.9 + 36.3 25.0 +2.2 11.7 +1.1 22:04 14.6 + 0.5 6.4 +0.9 325 yg/L Control 245 + 13.3 19.1+4.0 10.1 +5.5 25:09 =0.0+0 5.0+1.2 TCS-free BPA = 17 mg/L «TSS=300mg/L 2 TSS=500mg/L W% re mo va l wit h re sp ec to c ont rol cop Nitrates Orthophosphates Alkalimity TCS=325 ng/L 350 = TSS=300 mg/L. » TSS=S00mgL. 300 ¿ 3250 3 £200 É g 150 ó E 100 coD Mitrates Nu3 Orthophosphates — Alkalinity Fig. 4. Variations with respect to control for soluble COD, nitrates, ammoniacal nitrogen, orthophosphates and alkalinity in experiments in the presence of BPA and TCS at the 15th day of exposure. Parameters with significant differences with respect to control are indicated by an asterisk (*P < 0.05). Initial characterization of SWW (mg/L): Nitrates: 5.375 +1.11; ammoniacal nitrogen: 6.65 + 3.24; orthophosphates: 12.37 + 3.67; total alkalinity: 38.14 + 8.64. In Fig. 4 it may be observed that the BPA at = 300 mgTSS/L showed greatest nutrient removal, in terms of soluble COD, nitrates, ammoniacal nitrogen and orthophosphates. The five parameters measured showed significant removal with respect to controls. For BPA and = 300 mgTSS/ L in combination, the physicochemical parameters that exhibited major and significant removal were nitrates (2.51-fold greater removal with respect to control), ammoniacal nitrogen (=0 mg/L), orthophosphates (34.78% greater than control), and alkalinity (24% greater than con- trol). For BPA and = 500 mgTSS/L in combination, removals of nitrates (34.72% removal higher than control), ammoniacal nitrogen (=0 mg/ L), alkalinity and orthophosphates (same as control) were observed. TCS and = 300 mgTSS/L inoculum showed greater removal than control for ammoniacal nitrogen (3.07-fold higher) and alkalinity (16.67% higher). While TCS and =500 mgTSS/L in combination showed a greater removal than control for ammoniacal nitrogen (12.61%) and orthophosphates (= 0 mg/L). The results of the present study show the presence of BPA has a positive effect on nutrient removal in the lowest inoculum concentration tested. The presence of TCS exhibited a positive effect on ammoniacal nitrogen and orthophosphates in both inoculum concentrations tested. There are no available studies which extensively investigate the effect of BPA on nutrient intake. The presence of TCS results in significant effects on the intake of phosphorus at high temperatures, and nitrogen uptake may be affected by TCS (Xin et al., 2018). Matamoros et al. (2015), evaluated COD and N-NH3 removal in the presence of 26 emerging contaminants (which were found and quantified in wastewater), but this study does not include a control experiment to verify the effect on nutrient removal in the pres- ence of emerging contaminants. 4. Conclusions The ECso-96h values obtained for the microalgal consortium (S. obliquus and Desmodesmus sp.) indicate a medium tolerance to BPA (17 mg/L) and a low tolerance to TCS (325 g/L) compared to other genera and species of microalgae. In this study, it was found that under ECso-96 h conditions for BPA and TCS, both emerging contaminants increase microalgal consortium growth, Chl-a content, biomolecule content (lipids and proteins) as well as nutrient removal in synthetic wastewater. However, in terms of carbohydrate content, both emerging contaminants showed a negative effect. BPA had the greatest positive effect on lipid content at = 300 mgTSS/L. In the presence of TCS, Chl-a and protein content showed the greatest increase at = 300 mgTSS/L. For the removal of nutrients from wastewater, BPA showed the greatest removal efficiency for both inoculum concentrations tested. Finally, wastewater bioremediation and biomolecule production by the INSTITUTO DE INGENIERÍA UNAM 119 U POSG K. Atengueño-Reyes et al. microalgal consortium studied proved to be a highly efficient alterna- tive, even under conditions of stress, in the presence of emerging con- taminants such as BPA and TCS. Funding We would like to acknowledge Dirección General de Asuntos del Personal Académico, DGAPA (UNAM) for their support during this research, through the scholarship program PASPA. CRediT authorship contribution statement Karina Atengueño Reyes carried out the conception, methodology development; model creation and design analysis, data interpretation, curation of sources and contributed to the writing of the manuscript. MaríaTeresa Orta Ledesma performed research conceptualization, su- pervision, validation, research and Funding acquisition, formal analysis, contributed to the writing of the article and critical review. Sharon B. Velasquez-Orta was responsible for the supervision and leadership for the planning and execution of the research activity, including external mentoring to the core team, critical review, writing of the original draft, including substantive translation. Isaura Yáñez-Noguez contributed in providing study materials (reagents and materials), critical review, writing, revising and editing the paper at different stages, as well as attending to reviewers' comments. Ignacio Monje-Ramirez contributed to the critical review and supervision of the research. Petia Mijaylova- Nacheva contributed the critical review and methodological expertise, Alma Chávez-Mejía contributed the critical review and methodological expertise. Declaration of Competing Interest The authors declare the following financial interests/personal re- lationships which may be considered as potential competing interests: Maria Teresa Orta Ledesma reports financial support was provided by National Autonomous University of Mexico Directorate General of Ac- ademic Staff Affairs. Karina Atengueno Reyes reports financial support was provided by National Council on Science and Technology. Data availability Data will be made available on request. Acknowledgements We are grateful to the Dirección General de Asuntos del Personal Académico, of Universidad Nacional Autónoma de México (DGAPA, UNAM), for the support granted to María Teresa Orta Ledesma during this research, through the Programa de Apoyos para la Superación del Personal Académico (PASPA) scholarship program. Karina Atengueño- Reyes was supported by the Programa de Maestría y Doctorado en Ingeniería, UNAM, and Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT, Grant. No. 779848). References American Public Health Association, American Water Works Association, Water Environment Federation, 2023. Standard methods for examination of water and wastewater. https://www.standardmethods.org/. Amorim, M.L., Soares, J., Coimbra, J.S.D.R., Leite, M.O., Albino, L.F.T., Martins, M.A., 2021. Microalgae proteins: production, separation, isolation, quantification, and application in food and feed. Crit. Rev. Food Sci. 61, 1976-2002 https://doi.org/ 10.1080/10408398.2020.1768046. 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Agregar 167 mL de H2SO4 concentrado y 33.3 g de sulfato de mercurio. Aforar a 1 L con agua destilada. Caducidad: 6 meses. Reactivo ácido, pesar 10.12 g de sulfato de plata y adicionar a 1 L de H2SO4 concentrado. Caducidad: 12 meses. Solución patrón de DQO, pesar 0.425 g de hidrógenoftalato de potasio (secar a 120 °C por 1 hora), diluir en 1 L de agua destilada. Esta solución tiene una DQO teórica de 500 mg/L. Caducidad: 30 días. Para realizar la curva de calibración de DQO, se realizan diluciones de la solución patrón (Tabla A1). En un tubo de vidrio se añaden 2.5 mL de la muestra (patrón), 1.5 mL de solución de digestión y 3.5 mL de reactivo ácido. Se lleva a digestión a 150 °C por 2 horas, posteriormente se mide la absorbancia a 600 nm en un espectrofotómetro Hach. Tabla A1. Resultados de la curva de calibración de DQO Puntos mL de patrón, aforar a 50 mL DQO teórica Absorbancia Promedio Absorbancia Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3 1 0 0 0 0 0 0 2 2.50 25 0.016 0.012 0.006 0.011 3 5.00 50 0.016 0.021 0.032 0.023 4 7.50 75 0.044 0.034 0.029 0.036 5 10.00 100 0.042 0.045 0.044 0.044 6 12.50 125 0.051 0.046 0.046 0.048 7 15.00 150 0.06 0.06 0.06 0.060 8 17.50 175 0.068 0.075 0.081 0.075 9 20.00 200 0.084 0.08 0.09 0.085 10 25.00 250 0.097 0.106 0.1 0.101 11 30.00 300 0.123 0.117 0.116 0.119 12 35.00 350 0.14 0.141 0.143 0.141 13 40.00 400 0.164 0.161 0.168 0.164 14 45.00 450 0.182 0.192 0.185 0.186 15 50 500 0.201 0.205 0.207 0.204 123 Gráfico A1. Curva de calibración de DQO B. Medios de cultivo B1 Medio de cultivo OECD Solución 1. Macronutrientes Compuesto Cantidad (g/L) NH4Cl 1.5 MgCl2 6(H2O) 1.2 CaCl2 2(H2O) 1.8 MgSO4 7(H2O) 1.5 KH2PO4 0.16 Solución 2. Hierro 10.5 Cantidad (mg/L) FeCl3 6(H2O) 64 Na2EDTA 2(H2O) 100 Solución 3. Elementos traza Compuesto Cantidad (mg/L) H3BO3 185 MnCl2 .4(H2O) 415 ZnCl2 3 CCl2 .6(H2O) 1.5 R² = 0.9985 0.00 0.03 0.05 0.08 0.10 0.13 0.15 0.18 0.20 0.23 0.25 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 A bs or ba nc ia DQO (mg/L) 124 CuCl2 .2(H2O) 0.01 Na2MoO4 .2(H2O) 7 Solución 4. Bicarbonato Compuesto Cantidad (g/L) NaHCO3 50 Mezclar 10 mL de la solución 1, 1 mL de la solución 2, 1 mL de la solución 3, 1 mL de la solución 4 y aforar a 1 L. B2. Yeast Minimal complementado (YMM leu-, ura- comp) Reactivos para preparar 250 mL de medio base para cultivo de S. cerevisiae No Reactivo Concentración Cantidad 1 KH2PO4 - 3.403 g 2 (NH4)2SO4 - 0.495 g 3 KOH Pellets - 1.050 g 4 MgSO4 - 0.050 g 5 FeSO4 solución 40 mg/50 ml 0.25 mL 6 L-histidina 1 g/100 mL 1.25 mL 7 Adenina 1 g/100 mL 1.25 mL 8 L-arginina-HCl 1 g/100 mL 0.50 mL 9 L-metionina 1 g/100 mL 0.50 mL 10 L-tirosina 1 g/100 mL 0.75 mL 11 L-lisina-HCl 1 g/100 mL 0.75 mL 12 L-fenilalanina 1 g/100 mL 0.63 mL 13 L-ácido glutámico 10 g/100 mL 0.50 mL 14 L-valina 3 g/100 mL 1.25 mL 15 L-serina 3.75 g/100 mL 2.5 mL 16 L-isoleucina 1 g/100 mL 0.75 mL 17 Tiamina - 20 mg 18 Piridoxina - 20 mg 19 Ácido pantoténico - 20 mg 20 Inositol - 100 mg 21 Solución Biotina 2 mg/100ml 50 mL 22 Sol. D- (+)-Glucosa 20% m/v 10 mL 23 Sol. Ácido aspártico 4 mg/mL 6.25 mL 24 Solución de L-treonina 24 mg/mL 2 mL 25 Sol. de Sulfato de Cubre (II) 20 mM 0.625 mL Para preparar placas, agregar agar noble 13 g por cada litro de medio a la base del medio (reactivos 1 al 16), disolviendo con agitación en una parrilla y calentando hasta ebullición. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 120 °C y 1.4 kg/cm2 de presión. Dejar enfriar aproximadamente a 38 °C y agregar los reactivos 17 al 25 como se indica en la figura 15. Llenar las placas y someter a prueba de esterilidad a 125 30°C en una incubadora, comprobando que no hay contaminación se puede sembrar en las placas, el tiempo de incubación es de 3 días a 30 °C. B3. Preparación del stock de S. cerevisiae A partir del cultivo con OD600 de 1.0 (descrito en el punto 5.3.1) y se agrega glicerol estéril al 40 % en una proporción 1:1 v/v, se transfiere la mezcla a tubos de crio génesis y se almacena en ultracongelador a una temperatura de -70°C. B4. Medio BG-11 Compuesto Cantidad (g/L) NaNO3 1.5 NaHCO3 0.5 MgSO4 .7H2O 0.075 CaCl2 anhidro 0.027 Ácido cítrico 0.006 EDTA disódico 0.001 Citrato de hierro y amonio 0.006 K2PO4H.3H2O 0.04 Solución de metales traza 1 mL Solución de metales traza Compuesto Cantidad (g/L) H3BO3 2.86 MnCl2 .4H2O 1.81 ZnSO4 .7H2O 0.222 Na2MoO4 .2H2O 0.39 CuSO4 .5H2O 0.079 Co(NO3)2 .6H2O 0.0494 C. Preparación de soluciones • Fenol 5% Pesar 5 g de fenol y disolver en agua destilada aforando a 100 mL • Sulfofosfovainillina Pesar 0.075 g de vainillina y diluir en 1.25 mL de etanol absoluto. Añadir 1.125 mL de agua y agregar 50 mL de ácido fosfórico concentrado. • NaOH 2N Pesar 8 g de NaOH disolver en agua destilada y aforar a 100 mL. • Reactivo de Biuret 126 Agregar a 500 mL de una solución de NaOH 0.2 M, 9 gramos de tartrato de sodio y potasio y 3g de sulfato de cobre pentahidratado, una vez disueltos se agregan 5 g de yoduro de potasio. Aforar a 1L con la solución de NaOH 0.2M. 1L de NaOH 0.2 M (8.241 g de NaOH por litro de solución). D. Curvas de calibración para crecimiento de microalgas Primero se realizaron curvas de calibración con tres parámetros que indican el crecimiento de las microalgas, sólidos suspendidos totales, densidad óptica a 680 nm y células/mL; para agua residual sintética. Los Gráficos D1, D2 y D3, muestran las curvas de calibración del crecimiento de microalgas relacionando la densidad óptica a 680 nm, los SST y el conteo celular en agua residual sintética. Gráfico D1. Curva de calibración, SST vs OD680 y = 276.48x - 45.722 R² = 0.9759 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 S S T ( m g/ L ) Densidad óptica OD680 SST vs OD680 127 Gráfico D2. Curva de calibración, conteo celular vs densidad óptica Gráfico D3. Curva de calibración, OD680 vs SST y = 3E+06x - 810955 R² = 0.9771 0.0E+0 1.0E+6 2.0E+6 3.0E+6 4.0E+6 5.0E+6 6.0E+6 7.0E+6 8.0E+6 9.0E+6 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 C él ul as /m L Densidad óptica, OD680 Conteo celular vs Densidad óptica y = 11667x - 237452 R² = 0.984 0.0E+0 2.0E+6 4.0E+6 6.0E+6 8.0E+6 1.0E+7 0 100 200 300 400 500 600 700 800 D en si da d óp tic a, O D 68 0 SST, mg/L OD680 vs SST 128 E. Validación GC/MS-BLYES El objetivo de implementar conjuntamente la cuantificación de contaminantes emergentes y actividad estrogénica, es que a partir del mismo tratamiento de la muestra se pueda usar para ambas determinaciones. Cromatografía de gases El Gráfico E1 muestra la curva de calibración de TCS cuantificada en cromatografía de gases, y en el Gráfico E2 se muestra la curva de calibración de BPA. Mientras en la Tabla E1, se muestran los parámetros de validación calculados para ambas curvas de calibración de TCS y BPA. Gráfico E1. Curvas de calibración de triclosán, las barras de error representan la desviación estándar de 15 mediciones. y = 104326x + 329761 R² = 0.9849 0.0 E+0 5.0 E+6 1.0 E+7 1.5 E+7 2.0 E+7 2.5 E+7 3.0 E+7 3.5 E+7 4.0 E+7 4.5 E+7 5.0 E+7 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Á re a ba jo la c ur va Triclosán, g/L 129 Gráfico E2. Curva de calibración de bisfenol-A, las barras de error representan la desviación estándar de 15 mediciones. Tabla E1. Parámetros de la validación de cromatografía de gases Contaminante emergente Pendiente Desviación estándar r R2 Ecuación de la línea recta TCS 103481.98 1761996.62 0.989 0.9849 𝑦 = 104326𝑥 + 329761 BPA 170812279.9 64480236.6 0.99 0.9805 𝑦 = 2𝑥108𝑥 − 3𝑥108 Las ecuaciones de la línea recta se despejan en la variable x, para obtener la concentración a partir del área bajo la curva (y) obtenida por cromatografía. 𝑥 = 𝐶𝑜𝑛𝑐. (𝜇𝑔 𝐿⁄ ) = 𝑦 − 329761104326 Ecuación para TCS 𝑥 = 𝐶𝑜𝑛𝑐. (𝑚𝑔 𝐿⁄ ) = 𝑦 + 3𝑥1082𝑥108 Ecuación para BPA A partir de los parámetros obtenidos de la validación de cromatografía de gases, se calcularon el límite de detección, límite de cuantificación, porcentaje de recuperación, con las siguientes ecuaciones: 𝐿𝐷 = 3.3 𝜎𝑆 𝐿𝐶 = 10 𝜎𝑆 y = 2E+08x - 3E+08 R² = 0.9805 1.0 E+0 5.0 E+8 1.0 E+9 1.5 E+9 2.0 E+9 2.5 E+9 3.0 E+9 3.5 E+9 4.0 E+9 4.5 E+9 0 3 6 9 12 15 18 21 Á re a ba jo la c ur va BPA (mg/L) 130 %𝑅 = 𝑋𝑋𝑎 100 Dónde: LC: límite de cuantificación LD: límite de detección : desviación estándar S: pendiente de la curva de calibración %R: Porcentaje de recuperación X: Cantidad de analito hallada Xa: Cantidad de analito añadida En la Tabla E2, se muestra el cálculo de los límites de detección, cuantificación y porcentaje de recuperación para BPA y TCS para las curvas de calibración con y sin SPE. Tabla E2. Límites de detección y cuantificación para las curvas de calibración Contaminante emergente Con SPE LD LC %R promedio BPA 3.49 mg/L 10.57 mg/L 105.29 TCS 56.19 g/L 170.27 g/L 98.25 De las Tablas E1 y E2, se observa que las curvas de calibración para BPA y TCS, muestran una linealidad aceptable (≥0.98), un porcentaje de recuperación ≥98%; por lo que el método utilizado para la cuantificación de BPA y TCS por cromatografía de gases es adecuado para la identificación y cuantificación. Actividad estrogénica En los Gráficos E3 y E4, se muestra el comportamiento de la actividad estrogénica para BPA (5.0 – 20.0 mg/L) y TCS (50 – 400 g/L). 131 Gráfico E3. Actividad estrogénica para BPA, las barras de error representan la desviación estándar de 6 mediciones. GráficoE4. Actividad estrogénica para TCS, las barras de error representan la desviación estándar de 6 mediciones. Los efectos estrogénicos se pueden presentar a bajas dosis además de que los contaminantes emergentes no presentan un patrón lineal; algunas sustancias estrogénicas pueden presentar curvas dosis – respuesta en forma de “U”, “U” invertida, etc. (Romano, 2012). En los Gráficos E3 y E4, se observa que la mayor estrogenicidad la presenta la concentración más baja probada de cada contaminante emergente. Debido a la naturaleza que presentan los contaminantes emergentes con respecto a la estrogenicidad no se pueden determinar parámetros como linealidad, r, R2 o pendiente como en la determinación por cromatografía de gases. 0.000 0.003 0.006 0.009 0.012 0.015 0.018 0.021 0.024 0.027 0.030 0 3 6 9 12 15 18 21 E E Q 1 7β -e st ra di ol ( ng /L ) Concentración (mg/L) 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.035 0.040 0.045 0.050 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 E E Q 1 7β -e st ra di ol ( ng /L ) Concentración, g/L