UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO ESCUELA NACIONAL DE ESTUDIOS SUPERIORES UNIDAD LEÓN TÍTULO: “Impresión 3D de andamios a base de ácido poliláctico (PLA) y sus efectos en cultivo con células madre dentales” FORMA DE TITULACIÓN; TESIS Y EXAMEN PROFESIONAL PARA OBTENER EL TÍTULO DE: LICENCIADO EN ODONTOLOGÍA P R E S E N T A CALLEJA LÓPEZ NATHALIA ESTEFANIA TUTOR: DR. GARCÍA CONTRERAS RENÉ León,Guanajuato,México 2022 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 2 Índice 1 Reconocimiento 4 2 Dedicatoria 5 3 Agradecimientos 6 4 Lista de abreviaturas 8 5 Resumen 10 6 Abstract 10 7 Introducción 11 Capítulo 1 14 8 Marco Teórico 15 9 Antecedentes 27 Capítulo 2 29 10 Planteamiento del Problema 30 11 Pregunta de investigación 31 12 Hipótesis 31 13 Justificación 32 14 Objetivo General 33 15 Objetivos Específicos 33 Capítulo 3 34 16 Marco metodológico 35 17 Variables de estudio 37 18 Materiales 38 19 Desarrollo de la Metodología 40 ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 3 Capítulo 4 51 20 Resultados 52 21 Discusión 59 22 Conclusiones 61 23 Bibliografía 62 Anexo 70 ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 4 1. Reconocimiento Esta Tesis no habría sido posible sin el apoyo de la Escuela Nacional de Estudios Superiores Unidad León de la UNAM, el inigualable apoyo de mis profesores, compañeros y personal que labora día a día en la universidad, por permitirnos trabajar en las instalaciones de la clínica del área de profundización de cirugía y patología oral, asi mismo el Laboratorio de Investigación Interdisciplinario (LII) área de Nanoestructuras y Biomateriales fundamentales. Reconocer la colaboración y apoyo de Dr. René García Contreras, Dra. Laura Susana Acosta Torres, Dra. Ma Concepción Arenas Arrocena, Dra. Rosa Elvira Nuñez Anita, LO. Ángel Paulino González, LO. Maria de Jesús Guerrero Gutiérrez. ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 5 2. Dedicatoria A todos los que confiaron en mí, en especial a mis papás y a mis hermanas que siempre están en cada uno de mis triunfos. A todas esas personas soñadoras, que nunca nos cansemos de soñar, porque cada logro comienza con un sueño. “El futuro pertenece a los que creen en la belleza de su sueño” Eleanor Roosevelt. ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 6 3. Agradecimientos A Dios, solo tu sabes lo mucho que me esforcé día a día para llegar a la meta,te agradezco el nunca dejarme sola, hasta en los momento que quería olvidarme de todo tu estabas ahí para demostrarme que sí podía, por darme la oportunidad en el momento adecuado de mi vida. A mis papas, por toda su paciencia, por su apoyo, por nunca dejarme caer, ciertamente sin ustedes absolutamente nada hubiera sido posible, por todo su amor incondicional y tiempo, por confiar en mí aun cuando ni siquiera yo podía hacerlo , en especial por nunca dejarme darme por vencida. A mis hermanas, mis niñas enfadosas, sin duda a ustedes les tocó lidiar con la parte más difícil de mi ser: Mi mal humor, pero aun asi sabian como hacerme sonreir cada día, gracias por su paciencia, su bromas, su amor y por siempre ser mis pacientes, gracias por siempre recordarme lo importante que es nunca dejar de ser niño. A mi familia, por sus buenos deseos, por sus consejos y su apoyo, por siempre hacer de mis fines de semana divertidos, por sus oraciones y bendiciones, que a pesar de estar lejos siempre se preocupaban por mi bienestar. A mis maestros, por su pasión por enseñar, por sus consejos, por siempre animarnos a ser mejores, son la base esencial de cada alumno, todos ustedes nos inspiran a ser mejores cada día, desde el primer año el sueño es llegar algún día a ser tan buenos como lo son ustedes. Quiero agradecer especialmente a los Drs. que hicieron que mi último año se volviera increíble, Dra. Tatiana, Dr. Federico y Dr. Abraham, Gracias por mostrarme la magia de la odontopediatría, por su amor y dedicación en su trabajo, por darme la oportunidad de aprender tanto de ustedes, por apoyarme y animarme cada día. A mi mentor, Dr. Rene, sin duda usted confió desde el día 1 en mi, nos ayudó a crecer de una manera increíble, nos enseñó la otra cara de la odontología, nos dio retos que pensábamos imposibles, pero usted confiaba en nuestra capacidad, gracias por todos esos momentos increíbles en el laboratorio, gracias por permitirme vivir momentos tan especiales a lo largo de mi licenciatura. A la Dra. Laura, quisiera agradecerle sus consejos y su confianza, por siempre escucharnos y cuidarme aun cuando estábamos a 1000 km de casa, siempre llevaré en mi corazòn sus palabras en ese viaje, por transmitirnos su pasión en todo lo que hace. A mis pacientes,por su tiempo, ciertamente son parte sumamente importante en mi Licenciatura, Gracias por permitirme atenderlos, por confiar en mí y mis maestros. A mi universidad, nunca imaginé ser parte de algo tan grande pero siempre soñé con ser parte de algo tan especial , gracias por permitirme representarte , por brindarme todas las herramientas y medios para crecer como alumno y como persona. ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 7 Al #TEAM STEM CELLS, Lupita, Dany, Ángel, gracias por ser parte de este equipo, por su esfuerzo, por las risas, las exposiciones fallidas y todas esas que fueron un éxito, en especial gracias a Ángel por toda su paciencia. A mis compañeros en esta gran aventura, a mis amigos, por permitirme vivir con ustedes este gran sueño, por todo su apoyo, por todas las risas y chocoaventuras y enseñanzas, por todo el llanto y el estrés, sin duda hubo mil veces más momentos buenos que malos pero siempre estaban, sin ustedes estos años no hubieran sido tan divertidos. No mencionó nombres especificos porque quisiera olvidar a nadie pero me gustaria agradecer a toda persona que confió en mi y me apoyo para cumplir mis metas. Quisiera agradecer especialmente a Hezu, vivimos tantos momentos juntas, ya sea en el laboratorio o en clínica o en Tepes o en mi casa, gracias por estar, por todo el ánimo, por el apoyo, porque siempre tenías algo que decir y hacías que cada nuevo reto fuera divertido. Gracias por alegrarte de mis triunfos y apoyarme incondicionalmente, no me arrepiento ni un poco de hacerte sentar a mi lado el primer día conmigo. Agradecer especialmente a el financiamiento recibido para investigación a la Dirección General de Asuntos de Personal Académico (DGAPA) por parte de los proyectos PAPIME: 201617, 208518, PAPIIT: IA205518 y a la Red de Farmoquímicos. ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 8 4. Lista de abreviaturas 3 3D:Impresión tridimensional A AFM: Microscopía de fuerza atómica α-MEM: Alpha Modification Minimum Essential medium B BMPs-4: Proteína morfogenética ósea tipo 4 BMSC: (Bone Marrow Stem Cells) Células madre mesenquimales de la médula ósea C CMM: Células madres mesenquimales adultas CM: Célula madre CFU-F: Unidades formadoras de colonias fibroblásticas D DAPI: Marcador fluorescente (4 ‘,6-diamino-2-fenilindol) D-MEM: Dulbecco ś modified Eagle ś medium DMSO: Dimetil sulfóxido DSCs:: (Dental Stem Cells) Células madre dentales E EDTA: Ácido etilendiaminotetraacetico ESC: (Embrionary Stem Cells) Células madre embrionarias G g: gramo GRASS:Sustancia generalmente conocida como seguro H hDPSC: (Human Dental Pulp Stem Cells) Células madre de la pulpa dental humana hESC: (Human Embrionary Stem Cells) Células madre embrionarias humanas HGF: Factor de crecimiento de hepatocitos I IDO: indolamina 2,3-dioxigenasa IFN-γ: Interferón gamma iPS: Células madre pluripotentes inducidas M MHC: Complejo mayor de histocompatibilidad μg: microgramo mL: Mililitro ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 9 μL: Microlitro μm: Micrométro N NaH2PO4: Dihidrógeno fosfato monosódico P PDL: (Population doubling level) Nivel doble de población pH: Potencial de hidrógeno PBS: Solución buffer de fosfatos PCL: Policaprolactona PEO: Óxido de polietileno PGA: Ácido poligicólico PHB: Ácido polihidroxibutírico PHBV: hidroxibutirato-co-hidroxivalerato PLA: Ácido poliláctico S SCAP: Células madre de la papila apical SFB: Suero fetal bovino T TGF-β: Factores de crecimiento transformantes-beta U UCSC: (Umbilical Cord Stem Cells) Células madre del cordon umbilical UV: Ultravioleta ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 10 5. Resumen Objetivos: Imprimir andamios basados en PLA y evaluar sus efectos en cultivo con hDPSC (Human Dental Pulp Stem Cells). Métodos: Los andamios fueron diseñados, impresos y caracterizados con microscopía de fuerza atómica (AFM) y estereomicroscopía. La degradación enzimática e hidrolítica del armazón se determinó mediante UV visible. Las hDPSC se aislaron, cultivaron y caracterizaron según las directrices internacionales. La citotoxicidad y la adhesión celular se determinaron mediante el ensayo MTT e inmunofluorescencia. Los experimentos se realizaron por triplicado de tres experimentos independientes (n=9 ) y los datos se analizaron con la normalidad de Shapiro-Wilk y las pruebas t-student, se utilizó una placa de cultivo convencional como grupo de control. Resultados: Los andamios tienen una rugosidad promedio de 10 μm y se observan porosidades de relleno del 95 %. La degradación enzimática e hidrolítica se redujo significativamente (p <0,05) a las 166 horas de agitación (6 %). La hDPSC mostró morfología fibroblastoide, adherencia a placa, diferenciación favorable a linaje condrogénico, adipogénico y osteogénico, marcadores positivos a CD105 + y negativos a CD14-. La citotoxicidad de los andamios reduce ligeramente el número de células viables (85 ± 8 %), mientras que la interacción célula-material aumenta significativamente (p <0,05) la proliferación celular (125 ± 5 %). Conclusiones: Los andamios de impresión 3D basados en PLA-convencional muestran efectos favorables en la interacción con hDPSC que pueden ser una excelente opción como biomaterial para odontología regenerativa. Palabras clave: Células madre, 3D, ingeniería de tejidos, odontología regenerativa, ácido poliláctico, biomaterial. ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 11 6. Abstract Objectives: To print scaffolds based on PLA and evaluate their effects in culture with hDPSC (Human Dental Pulp Stem Cells). Methods: The scaffolds were designed, printed, and characterized with atomic force microscopy (AFM) and stereomicroscopy. The enzymatic and hydrolytic degradation of the scaffold was determined by UV-visible. The hDPSC were isolated, cultivated and characterized under international guidelines. Cytotoxicity and cell adhesion was determined by the MTT assay and immunofluorescence. The experiments were performed in triplicate of three independent experiments (n = 9) and the data were analyzed with Shapiro-Wilk normality and t-student tests, a conventional culture dish was used as a control group. Results: The scaffolds have an average roughness of 10 μm and fill porosities of 95 % are observed. Enzymatic and hydrolytic degradation was significantly reduced (p<0.05) at 166 hours of agitation (6 %). The hDPSC showed fibroblastoid morphology, adherence to plate, favorable differentiation to chondrogenic, adipogenic and osteogenic lineage, positive markers to CD105 +and negatives to CD14-. The cytotoxicity of the scaffolds slightly reduces the number of viable cells (85±8 %), while the cell-scaffold interaction significantly increases (p<0.05) cell proliferation (125±5 %). Conclusions: The 3D print scaffolds based on PLA-conventional shows favorable effects in the interaction with hDPSC which can be an excellent option as a biomaterial for regenerative dentistry. Key words: Stem Cells, 3D, scaffolds, tissue engineering, regenerative dentistry, polylactic acid-based, biomaterial. ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 12 7. Introducción En los últimos años los investigadores se han centrado en buscar avances en diferentes ramas biomédicas, especialmente en la medicina regenerativa, esta rama se basa en investigar principalmente las células madre y su capacidad de diferenciarse en diferentes tejidos. (1) En la actualidad el uso de células madre como tratamiento regenerativo es tan innovador como en su tiempo fue la transfusión sanguínea o los trasplantes, los cuales hoy en día son procedimientos habituales. (1) Pero esta área de la medicina no trabaja sola, necesita de diferentes especialidades para realizar tales avances tecnológicos, como la ingeniería tisular. (1) La ingeniería tisular tiene como objetivo restaurar, sustituir o incrementar la función de algún tejido orgánico, en un proceso de investigación y desarrollo, se ha establecido como una opción viable para realizar tratamientos en la odontología y la medicina. (2) Dentro de esta área es indispensable el uso de: células madre y andamios, las células madre poseen la capacidad de dividirse de manera continua y tienen el potencial de crear células especializadas (2) , y un andamio, es una matriz polimérica en su mayoría, biodegradable y bioabsorbente, cuya función es ser un anclaje para la adhesión de las células. (3) Últimamente se ha generado el interés de aislar células madre de origen dental, donde se han identificadas MSCs en pulpa dental (DPSCs), dientes deciduos exfoliados (SHED), folículo dental, papila apical radicular (SCAP) y ligamento periodontal (PDLSCS). (4) Afortunadamente fue creado un manual para el aislamiento, cultivo y caracterización de células madre de la pulpa dental humana por el el Laboratorio de Investigación Interdisciplinario (LII) área de Nanoestructuras y Biomateriales fundamentales de la Enes UNAM, unidad León. (5) ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 13 El objetivo de la presente investigación fue imprimir andamios en 3D y conocer sus efectos en cultivo de células madre dentales por medio del contacto directo y adhesión de DPSCs determinando la viabilidad celular por medio de colorimetría rápida a través de ensayo de MTT, destacando sus perspectivas de uso y su potencial aplicación para regeneración tisular guiada de lesiones traumáticas y no traumáticas. ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 14 Capítulo 1 ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 15 8. Marco Teórico Ingeniería Tisular El interés y la necesidad mundial por crear nuevos tratamientos para enfermedades degenerativas han impulsado fuertemente el avance de la ingeniería tisular. (6) Sus principales objetivos se dirigen específicamente a la regeneración, reparación o reemplazo artificial de cualquier parte del cuerpo humano que haya sido dañado por alguna enfermedad o accidente. (7) Esta es un área multidisciplinar que combina los conocimientos de la ingeniería con las ciencias de la salud para desarrollar estructuras biológicas funcionales, para llegar a su objetivo se deben combinar materiales y componentes celulares para poder garantizar un mayor éxito en el tratamiento deseado. (6) Para que se lleve a cabo este proceso en esencial 3 factores: (1) Células madre troncales, (2) Andamios y (3) factores de crecimiento. (8) (Figura 1) Lo primordial de esta ciencia es conocer las propiedades de cada material y tejido a tratar así podremos manejarlo de la mejor manera, las investigaciones nos ayudarán a tener mejores tratamientos para los pacientes mejorando su calidad de vida. (9) ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 16 Células troncales Las células madre, son células indiferenciadas, inmaduras y autorenovables, que cuentan con 2 características esenciales: (10) • Capacidad de autorenovación, esta propiedad le permite tener una proliferación de manera ilimitada. ● Capacidad de diferenciación, le permite diferenciarse en diferentes tipos de células especializadas (óseas, sanguíneas, neuronas, epidérmicas, etc.) (11-13) En el organismo existen diferentes tipos de células madre que se clasifican de 2 diferentes maneras; por su origen o por su potencial de diferenciación. A su vez por Potencial de diferenciación se clasifican en: (Figura 2) ● Totipotentes: Proceden de las primeras etapas del desarrollo embrionario, tienen la capacidad de formar nuevos embriones o un organismo completo ya que pueden diferenciarse en varios tipos celulares. (14) ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 17 ● Pluripotentes: Se diferencian en cualquier tejido correspondiente a los 3 linajes germinales (Ectodermo, Endodermo y Mesodermo), las podemos encontrar en el polo embrionario del blastocisto. (15) ● Multipotentes: Se les conoce como células madre - órgano específico porque generan células de su propia capa embrionaria por lo que son células madre comprometidas (Ectodermo, Endodermo y Mesodermo), pueden generar un órgano en su totalidad. (16) ● Unipotentes: Son células destinadas a crear solo un tipo de célula específica y presentan menor potencialidad. (15-19) Y por origen se clasifican en: (Figura 3) ● Células Madre Embrionarias (CME): Se encuentran en la primera fase del proceso embrionario, es decir que son células Totipotentes. Se pueden obtener ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 18 por embriones por fertilización In-vitro, embriones creados de células somáticas y cultivos celulares de líneas de investigación ya existentes. Es muy difícil trabajar con este tipo de células ya que está prohibido en muchos países porque hay muchos conflictos éticos y legales. Muchos piensan que el estudiar este campo nos daría una gran promesa para el futuro de la medicina. (20) ● Células Madre Adultas (CMA): Se encuentran en tejidos adultos y en el cordón umbilical , estas células son ideales para la medicina regenerativa , la ingeniería tisular y la terapia de sustitución celular. Dan lugar a células del tejido en el que se encuentran, es decir, que es su responsabilidad conservar y restaurar el tejido. (21) Células Madre Mesenquimales Son células pluripotentes que se originan en el estroma de la médula ósea, poseen gran capacidad proliferativa y de diferenciación, pueden llegar a diferenciarse en osteoblastos, condroblastos, adipoblastos y mioblastos. (23) Pueden ser aisladas de médula ósea, cordón umbilical ,tejido adiposo, páncreas, hígado, pulpa dental, tejido periodontal, entre otros. Algunas de sus características son: su adherencia al plástico, el aspecto de fibroblastos fusiformes en cultivos no estimulados, expresión de marcadores específicos como SH2, SH3 y SH4 con ausencia de marcadores hematopoyéticos como CD45, CD34, CD 11 y CD14. (24) La sociedad internacional de terapia celular con siglas en inglés ISCT (International Society Cellular Therapy) propuso 3 grandes criterios para diferenciar las células madre mesenquimales: (25) (Figura 4) ● Ser adherentes en cultivos ● Expresión específica en antígenos de superficie ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 19 ● Ser capaces de diferenciarse in vitro a Osteoblastos, Condroblastos y Adipoblastos. Células Troncales Dentales Humanas (hDSCs) A lo largo de los años se han buscado diferentes alternativas para conseguir CMM de una manera más accesible y después de varios estudios se encontró que en los órganos dentales se hallaban en una gran población de células multipotentes con alta capacidad proliferativa y de multi diferenciación. (27) Las hDSCs no solo se encuentran en la pulpa dental, también podemos encontrarlas en: el germen dental, dientes exfoliados (SHED), papila apical de la raíz (SCAP), hueso alveolar, células precursoras del folículo dentario (DFSCs), sitio de implante dental(DISC), células gingivales fibroblásticas (GFSCs) y ligamento periodontal (PDLSC). (28-31) (Figura 5) ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 20 Andamios En la actualidad la medicina ha dado un giro impresionante con sus estudios enfocados en la regeneración de tejidos y los investigadores han pasado por muchos retos para desarrollar biomateriales que ayuden a mejorar la calidad de vida de los pacientes, los andamios han sido un parteaguas en las investigaciones de estos. (33) Los andamios deben cumplir algunos requisitos importantes: Deben ser tridimensionales, porosos, biocompatibles y biodegradables. (34) Funcionan como soporte tridimensional y dan un sustrato adhesivo para un cultivo de células in vitro y también para la regeneración tisular in vitro. (35) ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 21 Los andamios en sí son estructuras tridimensionales temporales en los cuales las células pueden crecer y formar tejidos, es por eso que a la hora de fabricarlos y diseñarlos se debe tener mucha atención en pequeños aspectos como el material que se usará hasta la técnica al fabricarlos, para lograr la porosidad perfecta y con la finalidad de proveer que un mayor número de células migre a su interior. (36) La degradación es una característica muy importante ya que esta va a permitir que el tejido nuevo se vaya fijando de una manera correcta y que los residuos del mismo no tengan carácter tóxico, sino que al pasar el tiempo siga siendo biocompatible. (37) Polímeros biodegradables Un polímero puede definirse como una macromolécula que se forma por la unión de moléculas más pequeñas, llamadas monómeros, a través de enlaces covalentes. (38) Un polímero biodegradable es aquel que se puede degradar completamente por el medio y una vez finalizada su vida útil, transforma su estructura molecular, así como sus propiedades físicas y químicas, al final el polímero se transforma en sustancias simples como agua o dióxido de carbono. (39) Por su origen, los polímeros biodegradables se pueden clasificar en 3 grandes categorías: (40) (1) Origen natural: Se extraen directamente de animales, vegetales e incluso bacterias, por ejemplo: la celulosa y el almidón. (2) Origen sintético: Pueden ser poliésteres, poliesteramidas y poliuretanos, son más biodegradables y gracias a sus grupos carbonilos absorben energía luminica lo que los hace fotodegradables. Algunos ejemplos de este tipo de polímeros son: PLA (Ácido poliláctico), PGA (Ácido poligicólico), PCL (Policaprolactona) y PEO ( Óxido de polietileno). (42) (3) Polímeros naturales obtenidos por procesos biotecnológicos: Estos son poliésteres biodegradables que se pueden producir quimicamente o ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 22 biológicamente. Son usados principalmente en el área industrial por tener buenas propiedades mecánicas. Algunos ejemplos son: PHB y PHBV. (38) Ácido poliláctico El ácido poliláctico es un homopolímero derivado del polímero natural L-PLA , se obtiene con la fermentación bacteriana de la dextrosa (Glucosa sin refinar) del maíz (40-45), Tiene excelente potencial para sustituir plásticos convencionales por sus propiedades mecánicas y físicas, si se mezcla con polímeros naturales permite desarrollar materiales con propiedades resistentes al agua.(41) Se puede formular para ser rígido o flexible, es biodegradable y se clasifica como GRAS (Sustancia generalmente conocida como segura) por la Food and Drug Administration de Estados Unidos. (42) Al ser compatible con el cuerpo humano ha sido muy usado en el área médica, ha sido aplicado en: cirugía, ortopedia, ortodoncia, oftalmologia, traumatologia, entre otras.(40) Tiene propiedades mecánicas iguales a polímeros petroquímicos, con una fuerza de tensión de 40-60 MPa, módulo de tensión de 3-4 GPa y una temperatura máxima de 50-60 °C. Se puede imprimir y no necesita un tratamiento específico antes de esta. (43) ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 23 Mecanismos de Degradación Actualmente se aceptan 5 mecanismos básicos de degradación para un polímero: ● Fotodegradación: Es el proceso de cambios físicos y químicos que sufre un polímero después de ser irradiado con luz con diversos intervalos del espectro electromagnético, por ejemplo: Luz ultravioleta, rayos X, luz visible, entre otras. (40) ● Mecánica: Esta tiene como consecuencia efectos macroscópicos como su deformación o fractura producido por el influjo de fuerza y cambios químicos por los esfuerzos mecánicos. (45) ● Térmica: Consiste en la descomposición de moléculas en fragmentos más pequeños, debido a que las uniones tienen resistencia limitada y el calor las vence. (44) ● Química: Son procesos que son inducidos, puede ser con sustancias muy agresivas como disolventes o con sustancias más simples como el agua, a esta degradación se le conoce como hidrolítica, se da cuando el material está en un medio acuoso, el agua produce hinchamiento de la matriz polimérica, ruptura de los puentes de hidrógeno, hidratación de las moléculas y finalmente hidrólisis de los enlaces inestables. ● Biodegradación: Los microorganismos como hongos y bacterias producen enzimas que reaccionan con los polímeros. (46) La degradación de polímeros comienza con la pérdida de peso molecular y termina con pérdida de masa molecular. ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 24 Degradación del ácido poliláctico Los microorganismos colonizan la superficie del polímero y segregan enzimas que llegan a romper la colonización, pero esto depende de más factores, como, la tensión superficial, porosidad y textura superficial. (47) La reacción enzimática ocurre en su mayoría en un medio acuoso y se necesitan diferentes condiciones para que ocurra el proceso de degradación:(48) (Figura 6) ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 25 ● Presencia de microorganismos ● Oxígeno ● Humedad ● Nutrientes ● Temperaturas entre 20-60 Grados ● pH 5-8 El ácido láctico se degrada por los lactatos - piruvatos, y seguidamente es eliminado en forma de CO2. (49) Aislamiento y cultivo de hDPSC Las CMM se aíslan generalmente como población de células adherentes al plástico utilizando procedimientos que implican explantes de tejido, digestión enzimática y crecimiento celular en una superficie de plástico.(50) (Figura 7) Varios investigadores recomiendan una técnica suave para recuperar la pulpa del órgano dental, podemos evitar el trauma con una irrigación continua, reducción de calor de fricción en la rotación de la fresa y reduciendo el tiempo de contacto.(51) Los cultivos celulares son esenciales para la investigación científica hoy en día, ya que nos permiten establecer modelos de estudio de los fenómenos biológicos, moleculares y comportamiento celular.(53) Para evitar la muerte celular por sobrepoblación es necesario realizar subcultivos. ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 26 ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 27 9. Antecedentes En 1987 se usó por primera vez el término ingeniería de tejidos, gracias a los doctores Dr. Joseph Vacantti y el Dr. Robert Langer, los cuales redactaron un artículo científico que describía nuevas tecnologías conocidas como el comienzo de una nueva disciplina biomédica.(54) En 1912 Alexis Carrel, un cirujano ganador del premio nobel, realizó algunos experimentos de trasplantes y reparación de órganos, permitiendo el avance en el campo de cultivos celulares.(13) Un evento que sin duda cambió la vida de la medicina fue el primer trasplante de corazón en 1967 por el cirujano africano Christian Barnard, esto nos daba abría un mundo de posibilidades para combatir enfermedades degenerativas. (54) En 1970 se generó cartílago usando una nueva técnica para aislar condrocitos combinados con andamios a base de hueso. (55) 1983, Owen y colaboradores describieron la capacidad de las células troncales de generar hueso, cartílago y tejido conjuntivo con una poca cantidad de células de la médula ósea inoculadas en una cámara de difusión en modelos in vivo.(56) Entre 1988 y 1990 se desarrollaron nuevos métodos de impresión 3D: la impresión por deposición de material fundido y la impresión por láser . En 2005 se desarrolla la primera máquina 3D autorreplicante: RepRap, con lo cual se da un paso gigante en el acceso y uso de las impresoras 3D.(57) En 2009 la empresa Organovo crea la impresora 3D MMX Bioprinter, la primera capaz de fabricar tejidos orgánicos . Los materiales que actualmente pueden utilizarse para ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 28 ”imprimir” son variados y lo cierto es que influyen bastante en el coste de la impresora. (58) En el 2008 se aplicó por primera vez un trasplante de células madre hematopoyéticas adultas autólogas esto para el tratamiento de defectos óseos periodontales con un historial de periodontitis agresiva. (59) En el 2020, el Dr. Rene García y colaboradores realizaron un manual en el que especificaba un protocolo para cultivar, caracterizar y criopreservar células madre de la pulpa dental humana de terceros molares, en el cual se concluyó que al ser criopreservadas poseen una mayor proliferación y supervivencia. (50) En 2021, Daniela Pérez Trujillo presenta un trabajo de tesis el cual consiste en imprimir andamios a base de PLA para identificar proteínas inflamatorias y diferenciación celular de hDPSC, así como la interacción bioquímica que existe.(60) ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 29 Capítulo 2 ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 30 10. Planteamiento del Problema Un gran reto en la odontología es la restauración de tejidos, ya sea tejido de soporte o mucosa oral, que se hayan perdido por alguna patología o lesión, como puede ser del tipo periodontal, endodóntico o caries. (62) El mayor motivo de consulta que se determina como urgente son traumatismos maxilofaciales, su compleja anatomía necesita de diferentes análisis de imagen para lograr un excelente diagnóstico y por consiguiente su tratamiento así como su rehabilitación. Existen algunas enfermedades congénitas que pueden llegar a dañar el macizo facial, como puede ser labio y paladar hendido, neoplasias o fisuras orofaciales. (63-64) Este proyecto propone analizar los efectos del ácido poliláctico en conjunto con células madre para así en un futuro usarlo como un biomaterial que nos ayude a restaurar los tejidos y devolver su función. ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 31 11. Pregunta de investigación ¿Cuáles son los efectos de las hDPSC en contacto con andamios impresos en 3D a base de ácido poliláctico? 12. Hipótesis Los andamios impresos en 3D a base de ácido poliláctico poseen una biocompatibilidad e interacción de las hDPSC aceptable y pueden ser utilizados como biomateriales para odontología regenerativa. ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 32 13. Justificación Desde hace varios años atrás ya se usa la impresión 3D para tratamientos quirúrgicos especialmente en traumatismos dentoalveolares, principalmente para planear meticulosamente los procedimientos, es importante enfocarnos en esta área ya que en México el 30 % de los pacientes que acuden a un hospital es por algun trauma facial.(65) En México el 47 % de las lesiones traumáticas dentales son tratadas, pero el 59% de los casos su tratamiento es inadecuado, mientras solo que el 4% es tratado por especialistas.(66) La enfermedad periodontal junto con la caries es una de los padecimientos más frecuentes en el mundo(67) que inducen pérdida de órganos y tejidos, así mismo existen otros factores como traumatismos, tratamientos inconclusos, fracturas dentales, etc. (68) Es por ello que esta investigación tiene la intención de ofrecer una solución a la regeneración con el uso de andamios en 3D para conocer sus efectos en la terapia post-quirúrgica y la no quirúrgica, la pronta regeneración de los tejidos en el área de la odontología, al mismo tiempo queremos dar a conocer los diferentes alternativas para favorecer los procedimientos odontológicos. (69-70) ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 33 14. Objetivo General Imprimir andamios en 3D a base de ácido poliláctico y conocer sus efectos en cultivo con hDPSC como biomaterial para odontología regenerativa. 15. Objetivos Específicos 1. Aislar, cultivar y caracterizar hDPSC mediante la diferenciación a diferentes linajes e inmunotipificación por citometría de flujo. 2. Diseñar e imprimir andamios en 3D a base de ácido poliláctico (PLA) mediante fusión térmica. 3. Caracterizar los andamios con estereomicroscopía y microscopía electrónica de barrido (SEM). 4. Identificar el tiempo necesario para la degradación del andamio y porcentajes de degradación del andamio en UV-visible. 5. Evaluar la adhesión inicial y la proliferación de los andamios en cultivo con células madre de la pulpa dental humana mediante pruebas de viabilidad celular con el método de MTT con base en la norma ISO 10993-5 2009- Biological Evaluation Of Medical Devices -Part 5: Tests For In Vitro Cytotoxicity . (77) ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 34 Capítulo 3 ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 35 16. Marco metodológico Tipo de estudio Estudio experimental in vitro, prospectivo, comparativo. Diseño de estudio Experimental puro. Universo de estudio Terceros molares extraídos en la clínica de la ENES Unidad León, UNAM. Andamios impresos en 3D a base de ácido poliláctico. Método de muestreo No probabilístico por cuotas. Tamaño de muestra Los experimentos se realizaron por duplicado de un total de 3 experimentos independientes (n=12) para obtener datos reproducibles Criterios de selección ● Células de línea celular primaria ○ Células con división celular menor a 15 ● Andamios: ○ Andamios con el 95 % de relleno ○ Andamios de 10x10x10 mm ○ Andamios de ácido poliláctico ○ Andamios con desinfección de Rayos UV por 20 minutos. ● Paciente: ○ Pacientes de 16-25 años de edad ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 36 ○ Pacientes con terceros molares permanente retenidos o erupcionados indicados para odontectomía ○ Pacientes libres de patología pulpar y periapical Criterios de exclusión ● Células: ○ Células contaminadas ○ Células con una división celular mayor a 15 ● Andamios: ○ Andamios de un tamaño mayor ○ Andamios con otro ácido ○ Andamios sin desinfectar Criterios de Eliminación ● Células ○ Células contaminadas en el subcultivo ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 37 17 Variables de estudio Variables Dependientes Variables Definición conceptual Definición operacional Escala de medición Tiempo de degradación Magnitud física que permite ordenar la secuencia de los sucesos(71) Se identicó el peso inicial y final posterior de los al almacenamiento en solución salina buffer de fosfato (PBS) incubación a 8, 24, 48, 72, 96, 144 y 168 h. De razón 0-168 h Viabilidad célular Mide la proporción de células vivas luego del procedimiento(72). Número de células adheridas vivas resultantes del cultivo celular junto con los andamios. Se determinaron por conteo con hematocitómetro. Cuantitativa De razón 0-n células/mL Inmunotipificación Proceso en el que se usan anticuerpos para identificar células según el tipo de antígenos o marcadores en su superficie. (75) Se utilizarán los anticuerpos positivos de CD 150 y CD 90. Mixta cualitativa : positivo/negativo a cada uno de los antígenos Cuantitativa: número de células positivas/negativas Diferenciación celular Capacidad que poseen las células madre de un tejido para producir tipos celulares diferenciados de otro tejido.(74) Capacidad de hDPSC de diferenciarse en los siguientes linajes celulares: Osteocitos: Son células planas en forma de almendra con núcleos densos, pequeño RER y AG, con prolongaciones citoplasmáticas con uniones comunicantes (gaps) que permiten el flujo de hormonas y de iones entre sí . Condrocitos: Son las células más abundantes del cartílago. Suelen mostrar varias formas. Las más jóvenes son elípticas u ovaladas; esféricas o poligonales. Adipocitos: forma esférica, pero se vuelven poliédricas cuando constituyen los lobulillos . La gran gota de grasa ocupa la mayor parte del volumen de la célula. Su presencia desplaza a todos los componentes del citoplasma hacia la periferia, incluido el núcleo Cualitativa Nominal 1- Positivo 2- Negativo ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 38 Variables Independientes Variables Independientes Definición conceptual Definición operacional Escala de medición Andamios en 3D de PLA Un andamio es una estructura microscópica 3D que favorecen y benefician la diferenciación celular. Andamios 3D a base de PLA con una tamaño de 10x10x10 mm con un 95% de relleno usados para verificar su tiempo de degradación y su viabilidad celular. Cualitativa ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 39 18 Materiales Impresión y Caracterización 3D de andamios Ácido Poliláctico (Filamento NinjaFlex 3mm Midnight. LOT: 3D3181290) Impresora comercial 3D MakerMex (Guanajuato, México) (Modelo: MM1) Método de Fabricación de Filamentos Fundidos. Aislamiento y caracterización de hDPSC Equipo Campana de flujo laminar horizontal (Lumistell MR LH-120, Celaya, Guanajuato, México), Microscopio de contraste de fases (Leica Axio Camp MRc, Wetzlar, Alemania), Centrifugadora (Beckman®, J2-MC, Indianápolis, EUA), Incubadora (Binder®, Tuttlingen, Alemania), Ultracongelador (Thermo Scientific®, Rochester, NY, EUA), Cámara de Neubauer (Bioeco®, Alemania), citómetro de flujo. Instrumental Micropipetas (Thermo Scientific®, Rochester, NY, EUA), cajas de cultivo de 10 cm y 6 cm (Thermo Scientific Rochester, NY, EUA), placas de cultivo de 96 μpocillos (Thermo Scientiic Rochester, NY, EUA), filtradores celulares Falcon® (40μm) (Corning, NY, USA), Pipetas serológicas, micromotor, Bomba de vacio, Tanque para Nitrógeno líquido, Tanque de 𝐶𝑂2, Baño María, Hoja de bisturí no. 20, Pinzas de disección, Portaobjetos de vidrio, Mango de bisturí, Disco de diamante, Espátula 7A o elevador recto, Pipetas volumétricas de 10 ml descartables estériles, Puntas para micropipeta, Tubos eppendorf de 1.5 ml de capacidad, Cajas Petri de 10-cm y 6-cm, tubos de prolipropileno. Reactivos Buffer de fosfato (PBS, pH 7.4), Suero fetal bovino (SFB) (Gibco® by Life Techonologies Corporation, Gran Island, NY,EUA) al 10%, Tripsina-EDTA al 0.05% (Gibco® by Life Techonologies Corporation, Gran Island, NY,EUA), Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM) (Gibco® by Life Techonologies Corporation, Gran Island, NY,EUA), αMEM, McCoy, Penicilina/Estreptomicina 10,000 UI/ml y 10,000μg/ml Antimicótico Anfotericina B (Gibco® by Life Techonologies Corporation, Gran Island, NY,EUA), Glutamax (Gibco® by Life Techonologies Corporation, Gran Island, NY,EUA), ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 40 Dexametasona, B- Glicerolfosfato, Ascorbato-2fosfato, isopropanol al 60%, Agua destilada, Rojo aceitoso O, Rojo de Alizarina, NaH2PO4 (Fosfato monosódico), Etanol 70% v/v, Anticuerpos positivos (CD105, CD90), Insulina, Agua bidestilada, Proteína morfognpetica ósea (BMP 4), Safranina O, solución de bloqueo (Albumina, bovina al 1% o SFB al 5% en PBS), Buffer de tinción. Degradación hidrolítica de los andamios Solución salina buffer de fosfato (PBS). Tripsina-EDTA al 0.05% (Gibco® by Life Technologies Corporation, Grand Island, NY, EUA). UV-vis (Thermo Fisher Scientific, Helsinki, Finlandia). Balanza analítica eléctrica (Denver Instrument SGC-LII) Viabilidad Celular de hDPSC en contacto con los andamios Placas de cultivo de 24 pocillos (Thermo Scientific Rochester, NY, EUA), Tubos Falcón® (50 mL) (Corning, NY, USA) Dimetil sulfóxido (Karal, GTO, México) Lector de microplaca a 570 nm (Thermo Fischer Scientific, Helsinki, Finlandia) ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 41 19. Metodología experimental 1 Obtención, aislamiento y cultivo de las hDPSC El protocolo para el aislamiento, cultivo y caracterización de células madre de la pulpa dental humana, fue evaluado por el comité de bioética de la ENES, Unidad León de la UNAM para su autorización. Se utilizaron terceros molares permanentes retenidos o erupcionados indicados para odontectomía en las clínicas de la ENES Unidad León de pacientes de 16-25 años de edad, libres de patología pulpar y periapical. ● Preparación del medio de transporte: Correspondió a una solución de PBS con pH 7.3 y se colocó en tubos falcon de 15 mL con 1 % de antibiótico y se almacenó a 4 °C hasta su uso. ● Obtención de terceros molares: 1. Bajo previo consentimiento del paciente y bajo anestesia local, se realizó odontectomía quirúrgica de los terceros molares, en casos necesarios se utilizó incisiones y osteotomías conservadoras para facilitar la extracción del diente. Se utilizó solución desinfectante en la zona de la extracción como puede ser: Clorhexidina al 0.06% y/o yodopovidona. El tercer molar recientemente extraído se colocó inmediatamente en la solución de transporte y se llevó al laboratorio (Figura 8) . ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 42 ● Obtención del tejido pulpar: El tejido pulpar fue aislado dentro de la campana de flujo laminar horizontal previamente desinfectada con luz UV. Inicialmente, se lavó el diente 3 veces con PBS removiendo los restos de tejido hematopoyético. 1. Se realizó un corte transversal a nivel de la corona anatómica con un disco de diamante a baja velocidad y con refrigeración para separar la corona de la raíz, el corte no alcanzó los límites de la cámara pulpar. 2. Se procedió a fracturar la corona de la raíz con una espátula 7A o un elevador recto. 3. Se retiró con mucho cuidado la pulpa cameral y radicular con pinzas de disección.(Figura 9) ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 43 ● Disgregación enzimática 1. Se colocó el tejido pulpar sobre un porta objetos de vidrio y se realizaron explantes de 1x1 mm con una hoja de bisturí. 2. Se depositaron los explantes en platos de cultivo de 10 cm, se inoculó en medio de cultivo α-MEM suplementado al 20% con suero fetal bovino (FBS), glutamina y antibiótico (Gibco) por 7 días. 3. Posteriormente se realizó la visualización de la migración de células adherentes a partir del explante a lo largo de la caja de Petri y reemplazamos el medio inicial por un volumen igual de medio fresco, prestando especial cuidado en no desalojar los explantes. 4. Tras la semana inicial y el primer cambio del medio de cultivo, se reemplazó dos veces por semana hasta que las células proliferaron alcanzando una confluencia de aproximadamente el 80% y morfología fibroblastoide (21 días aproximadamente) en la totalidad de la superficie de la placa, se consideró que ya estaba formada la monocapa de células y el cultivo primario se había establecido. (Figura 10) ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 44 ● Subcultivo y conteo celular: 1. Retirando el medio de cultivo con bomba de vacío, se lavó 2 veces con 4 mL de PBS, se añadieron 5 mL de Tripsina-EDTA. 2. Se incubó por un lapso de 5 minutos a 37 °C, 5 % de CO2 y 95 % de humedad. 3. Se observó el desprendimiento bajo el microscopio, donde se identificó la presencia redondeada y altamente refractante de los cuerpos celulares. 4. Se agregaron 3 mL de medio fresco para inactivar la Tripsina, se realizó un pipeteado con la finalidad de conseguir la resuspención completa de las células. 5. Posteriormente se tomaron 10 μL de la muestra de hDPSC y se pipeteó cuidadosamente en uno de los extremos del cubreobjetos. 6. Se observó en el microscopio. 7. Una vez enfocadas las células, se realizó el conteo celular con el hamatocitómetro de Neubauer de la cantidad de células a inocular,en cada uno de los cuadros que son en total: L1, L2, L3, y L4. 8. Ya obtenida la cantidad de células contabilizadas en los cuatro cuadros se utilizó la siguiente fórmula para determinar la concentración celular: C𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = 𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 / 𝑣𝑜𝑙ú𝑚𝑒𝑛 𝑒𝑛 mL 9. Posteriormente se añadieron 6-10 mL de medio de cultivo para completar el medio y se colocaron los platos en la incubadora bajo las mismas condiciones iniciales que los cultivos primarios. 2 Caracterización: Diferenciación a linajes celulares Los ensayos de diferenciación osteogénica, adipogénica, y condrogénica se realizaron con células con un pase celular de 4 o 5 divisiones y una confluencia del 80-100 %. Subcultivamos hDPSC en DMEM+10% FBS+antibiotico+L-glutamina a una densidad de 3x105 células/mL en platos de cultivo de placas de 6 pocillos e incubadas a 37 ºC con 5 % CO2 hasta observar una confluencia celular del 80-100%. DIFERENCIACIÓN OSTEOGÉNICA: 1. Se retiró el medio de cultivo. 2. Se lavó dos veces con PBS. 3. Se agregó medio de diferenciación osteogénica con α-MEM [SFB 10 %, penicilina y estreptomicina (1 %), dexametasona (0.1 mM), B-Glicerofosfato (10 mM), ascorbato- 2 fosfato (50 mg/mL)]. ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 45 4. Se reemplazó el medio cada segundo día durante 4 semanas hasta que se observaron cúmulos de minerales y cristales birrefringentes al microscopio. 5. Se interrunpió la diferenciación con una tinción de rojo de Alizarina (40 mM) en NaH2PO4 (0.1 M) y un pH de 4.3. 6. Se lavó las células dos veces con PBS. 7. Se fijaron las células con etanol al 70 % (v/v) por 30 minutos a temperatura ambiente. 8. Se lavó dos veces con PBS. 9. Se agregó 0.25 mL de rojo de Alizarina por 10 minutos a temperatura ambiente. 10. Se lavó dos veces con PBS. 11. Finalmente se lavó cinco veces con agua bidestilada. 12. Se observó en microscopio e identificamos estructuras mineralizantes de apariencia rojiza. DIFERENCIACIÓN ADIPOGÉNICA 1. Se retiró el medio de cultivo. 2. Se lavó 2 veces con PBS. 3. Se agregó medio de diferenciación adipogénica con α-MEM [SFB 10 %, penicilina y estreptomicina (1 %), dexametasona (0.1 mM), B-Glicerofosfato (10 mM), ascorbato- 2 fosfato (50 mg/mL)] adicionado con insulina y L-glutamina. 4. Se reemplazó el medio cada segundo día durante 4 semanas. 5. Se lavó dos veces con PBS. 6. Se agregó medio de cultivo con una solución saturada de rojo aceitoso (0.3 g) en isopropanol 60 % v/v (100 mL) por 1 hora a temperatura ambiente. 7. Se lavó 2 veces con PBS. 8. Se observó bajo microscopía de contraste de fases la presencia de depósitos de lípidos en coloración rojo o naranja. DIFERENCIACIÓN CONDROGÉNICA: 1. Se subcultivaron células en platos de cultivo de placas de 6 pocillos en forma de microgota o micromasa con medio de diferenciación con α-MEM [SFB 10 %, penicilina ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 46 y estreptomicina (1 %), dexametasona (0.1 mM), B-Glicerofosfato (10 mM), ascorbato- 2-fosfato (50 mg/mL), proteína morfogenética ósea (BMP-4) e incubamos. 2. Se reemplazó el medio cada segundo día durante 2 semanas. 3. Se lavó dos veces con PBS. 4. Se fijó con etanol al 70 % v/v por 10 minutos. 5. Se lavó una vez con PBS 6. Se agregó 0.15 mL de safranina O (0.1 %) por 5 minutos a temperatura ambiente. 7. Se lavó cinco veces con 0.15 mL de etanol al 100 %. 8. Se lavó cinco veces con agua bidestilada. 9. Se observó bajo el microscopio de contraste de fases e identificamos glucosaminoglicanos de apariencia azul. 3 Inmunotipificación por citometría de flujo 1. Subcultivamos hDPSC en DMEM+10 % FBS+antibioticos+L-glutamina a una densidad de 3x105 células/mL en platos de cultivo de placas de 6 pocillos e incubadas a 37 °C con 5 % CO2 hasta que observamos una confluencia celular del 80-100 %. 2. Se desprendió del plato con tripsina y suspendimos las células. 3. Se agregó Buffer FACS (PBS, 0.5–1 % BSA or 5–10 % FCS, 0.1 % NaN3). 4 Se agregó 100 μl de células en tubos de poliestireno de fondo redondeado. 5. Se agregó 100 μl de solución de bloqueo.(Albumina bovina al 1%) 6. Se incubó sobre hielo por 20 minutos. 7. Se centrifugó a 1,500 rpm por cinco minutos a 4 ºC. 8. Se removió el sobrenadante. 9. Se agregó 0.1 -- 10 μg/mL del anticuerpo primario e incubar por lo menos 30 minutos a 4 ºC en cuarto oscuro. 10. Se lavó tres veces con PBS. 11. Se centrifugó a 1,500 rpm por cinco minutos. 12. Se resuspendió con 200 μl de PBS frío. ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 47 13. Diluimos el anticuerpo secundario siguiendo las indicaciones del fabricante. 14. Se resuspendió las células con el anticuerpo. 15. Se incubó durante 30 min a 4°C en un cuarto oscuro. 16. Se lavó tres veces con PBS. 17. Se centrifugó a 1,500 rpm por 5 minutos. 18. Se resuspendió con 200 μL de PBS frío. 19. Se analizó la suspensión de células en citometría de flujo lo antes posible. ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 48 4 Impresión y caracterización de andamios Los andamios fueron impresos en 3D, con una impresora comercial (Makermex, Gto, México), fueron elaborados con ácido poliláctico convencional mediante el método de fabricación de filamentos fundidos, el material debe calentarse de 210 a 230 °C para su extrusión. (Figura 11) Previamente fue diseñado un andamio con un diámetro de 10 x 10 x .5 mm con relleno de la impresión del 95 % en el Software Blender (Figura 11) que es un programa informático especializado en el modelaje, diseño y creación de estructuras tridimensionales. La impresión de los andamios se realizó dentro de una campana de flujo laminar horizontal con previa desinfección de todos los componentes y bajo irradiación UV (Figura 12). Se imprimió en aproximadamente 20 minutos y se polimerizó por policondensación. La caracterización de la ultraestructura y topografía se realizó con estereomicroscopio y microscopía electrónica de barrido (SEM). Los andamios se lijaron con lija de agua del 1000 y suspensión de diamante MetaDi, los andamios se sumergieron en etanol al 100 % y se colocaron por 5 min en el ultrasonido, posteriormente fueron esterilizados durante 20 min. ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 49 Se realizó la microscopía la cual nos proporcionó información sobre la morfología del andamio, así como su espesor y distribución de capas. ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 50 5 Degradación del andamio La degradación del andamio correspondió a la reportada por Maet al. 2004 (76), donde se identificó el peso inicial y final con ayuda de una balanza analítica eléctrica (Denver Instrument) (Figura 13) después del almacenamiento en solución salina buffer de fosfato (PBS)/ trupsina al 0.25% e incubación a 8, 24, 48, 72, 96, 144 y 168 h. Además, el grado de degradación fue analizado en UV-vis a una DO de 390 nm (Thermo Fischer Scientic, Helsinki, Finlandia). 6 Viabilidad celular Antes de que los andamios entraran en contacto con las células, estos fueron puestos dentro de tubos Eppendorf de 10 mL con etanol al 100 % y se colocaron por 5 minutos en el ultrasonido, posteriormente fueron esterilizados durante 20 minutos. Las hDPSC fueron sub-cultivadas a 2x105 células/mL en platos de 24 pocillos junto con los andamios para conocer la proliferación celular que fue determinada a 1 hora para determinar la adhesión inicial y 96 hrs para determinar la proliferación. La viabilidad celular se determinó por el método de MTT (0.2 mg/mL) (Sigma-Aldrich). Se dejaron incubar durante 4 horas y el formazán fue disuelto con dimetil sulfóxido (Karal, GTO, México). Las muestras se analizaron en un lector de microplaca a 570 nm (Thermo ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 51 Fisher Scientific, Helsinki, Finlandia). Los ensayos se realizaron por triplicado de tres experimentos independientes. 7 Análisis e interpretación de los datos Los datos fueron descritos con porcentajes, desviación estándar y porcentajes y analizados con pruebas de normalidad de Shapiro-Wilk, pruebas t-student o U-Mann Whitney con el paquete estadístico SPSS (Statistical Package for Social Science, V15, Chicago, EUA). La significancia estadística fue fijada con un valor p<0.05 y un coeficiente de confiabilidad del 95%. La interpretación de los resultados se realizaron con gráficos de barra y tablas que muestran los porcentajes de viabilidad celular. ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 52 Capítulo 4 ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 53 20 Resultados Aislamiento y proliferación celular Se observó que la cantidad de células obtenidas del tejido pulpar de terceros molares aumenta con el tiempo de incubación. Bajo microscopía óptica se observó que las células emigraron desde la superficie de los explantes (Figura 14A). A los 7 días de cultivo se observaron las células dispersas adheridas al fondo del plato de cultivo y éstas muestran morfología fibroblastoide con contorno fusiforme con uno o dos núcleos ovalados o elípticos y proyecciones fibroblásticas en toda la superficie de la célula (Figura 14B). A los 15 días se observan conexiones a través de las prolongaciones fibroblásticas de la superficie celular (Figura 14C). A los 21 días se observa una alta confluencia celular y un cambio en la morfología de las células, adquiriendo una forma más redondeada y con disminución de proyecciones fibroblásticas, debido a la confluencia observada del 80-90% del plato (Figura 14D)..(72) ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 54 Diferenciación celular: Osteogénica, Adipogénica y Condrogénica Los explantes fueron expuestos a agentes adipogénicos, osteogénicos y condrogénicos específicos, respectivamente. En la diferenciación osteogénica las células expresaron fosfatasa alcalina en medio osteogénico y observamos bajo microscopía de contraste de fases la presencia de estructuras mineralizantes de apariencia rojiza, debido a la tinción de rojo de Alizarina. Para la diferenciación Adipogénica se detectaron gotas de lípidos gracias a la solución saturada de rojo aceitoso. Finalmente, en la diferenciación condrogénica los condrocitos fueron detectados por tinción con Safranina O, que tiñe la matriz secretada por estas células. (Figura 15) ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 55 Inmunotipificación por Inmunofluorescencia y citometría de flujo Las hDPSCs cultivadas procedentes de terceros molares en el linaje 3, expresaron: 58.1 % de células CD90+/CD105+ (doblemente positivas para estos anticuerpos), con 0.38% de células CD105+ que expresan la molécula CD90- (CD105+/CD90-) y hasta el 11.5% de células CD105-/CD90- (doblemente negativas para ambos anticuerpos) y 30.1% de células CD105-que expresan la molécla CD90+ (CD105-/ CD90+).(Figura 16) ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 56 Impresión y caracterización de andamios Los andamios tienen una rugosidad promedio de 10 µm,porosidades de 100 μm y se observan porosidades de relleno del 95% . (Figura 17) ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 57 Degradación del andamio La degradación enzimática e hidrolítica redujo significativamente (p<0.05) a las 166 horas de agitación en tripsina (6%) y en PBS (5%) (Tabla 1-2) (Gráfico 1) La degradación fue confirmada por la absorbancia de las soluciones. ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 58 Viabilidad celular En cuanto a porcentajes de adhesión y proliferación se observo podemos darnos mayor adhesión y proliferación en los andamios a 1 hora de adhesión inicial (p<0.05) y 96 hrs de proliferación (p<0.05) . (Figura 18). La significancia estadística fue fijada con un valor p<0.05, n=9 y un coeficiente de confiabilidad del 95%. ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 59 21 Discusión En un estudio de degradación in vitro que se llevó a cabo hasta por 8 semanas inicialmente demostrando que el PLA y los andamios PLA mantuvieron su integridad estructural sin perder totalmente la arquitectura original y la fuerza. Sin embargo, se observó un aumento de la rugosidad de la superficie para ambos tipos de muestras. (78) Se demostraron diferencias significativas entre ambos tipos de andamios. Los andamios de PLA exhibieron una mayor y progresiva pérdida de peso durante las primeras dos semanas de degradación in vitro. Sin embargo, entre las semanas 4 y 6 su tasa de degradación disminuyó significativamente. Finalmente, después de 8 semanas, el andamio compuesto demostró una pérdida de peso de alrededor del 4.5 %. (79) En nuestra investigación el proceso de degradación mostró una degradacion del 6% depués de 166 horas (7 días). Es conocido que un andamio ideal para la regeneración ósea debe transferir gradualmente la carga al hueso de la nueva forma durante la degradación. Por lo tanto, debe hacerse una elección adecuada del diseño de materiales y andamios para ajustar la velocidad de degradación y propiedades mecánicas. (80,82) En el 2017 se realizó una investigación con andamios neurofibrilares de PLA en el que tuvieron excelentes resultados en la adhesión de las células ya que las fibras pueden llegar a imitar las matrices extracelulares teniendo mejores resultados que su grupo control el cual fue una película delgada de PLA.(83) Nuestros andamios tuvieron excelentes resultados teniendo 7 % de adhesión celular y 13 % de proliferación celular a las 96 hrs comparado con el grupo control. La hipótesis planteada menciona que los andamios impresos en 3D a base de ácido poliláctico poseen una biocompatibilidad aceptable y buena interacción de las hDPSC, por lo que la hipótesis es aceptada. Dentro de las perspectivas a futuro se plantea el uso de células hDPSC en conjunto con los andamios impresos para determinar su adhesión focal, la diferenciación celular sobre los andamios, la calidad de su diferenciación y de esa forma proveer potenciales aplicaciones para las áreas como periodoncia, implantología, cirugía bucal o endodoncia. Dentro de las limitaciones de estudio, podemos destacar que el manejo de los programas para modelados de impresión es un reto para diseñar e imprimir. La inversión de los anticuerpos y el uso de equipos sofisticados siempre son un reto y es por ello que solo se logró la caracterización únicamente por los anticuerpos antes mencionados. Para obtener las hDPSC utilizadas en este trabajo, se siguió el protocolo para la obtención y aislamiento de éstas células propuesto por el Laboratorio de Investigación ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 60 Interdisciplinaria de la ENES, Unidad León, en el cuál se aislaron células madre de terceros molares con indicación de extracción, gracias a su localización anatómica, estas demostraron ser de fácil acceso y de bajo costo, a su vez, demostraron tener. ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 61 22 Conclusiones Los andamios impresos en 3D a base de PLA mostraron una buena interacción con las hDPSC, dando buenas posibilidades para que en un futuro se desarrolle como un biomaterial viable para la odontología regenerativa. Las hDPSC aisladas de terceros molares muestran características de células madre (troncales) bajo los estándares internacionales. En cuanto a la degradación fueron resultados considerables reduciendo aproximadamente 1 mm de su tamaño original, estos resultados fueron paulatinos en el lapso de 1 semana (-6%), nos dimos cuenta que el PLA puede degradarse de manera óptima. La adhesión celular se logró aumentar 7% y 13% de proliferación. ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 62 23 Bibliografía 1. Hernández Ramírez Porfirio. Medicina regenerativa II: Aplicaciones, realidad y perspectivas de la terapia celular. Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter [Internet]. 2006 Abr [citado 2022 Sep ];22( 1 ) Disponible en: http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S086402892006000100002&l ng=es. 2. Curbelo S, Meneses R, Pereira Prado V, Tapia G. Regeneración ósea como un ejemplo de ingeniería tisular en odontología, con énfasis en el desarrollo de los andamios. ode [Internet]. 2020 Dic [citado 2022 Sep];22(36):74-6. 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ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 78 Participante en IADR/AADR/CADR General Session & Exhibition en Vancouver, BC, Canada, 2019, presentando el trabajo: Effect of 3D-printing-scaffolds Based on PLA in Culture With hDPSC. ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 79 Consentimiento Informado ENES León UNAM Impresión de andamios 3D a base de PLA y sus efectos con células madre 80