UNIVERSIDAD NACIONAL DEMEXICO ., . ----------------------------------------------.;_-- FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN EFECTO DE LA VITAMINA E, SOBRE LA FRECUENCIA DE LOS INTERCAMBIOS DE CROMATIOES HERMANAS EN EL CULTIVO DE LINFOCITOS HUMANOS. T E s QUE PARA OBTENER EL QUIMICA FARMACEUTICA P R E S E N SILVIA VAZQUEZ 1 s TITULO DE BIOLOGA T A OARDUAO No. DE CUENTA: 1352G7-t DIRECTOHES Df TESIS: M.C. SANDRA DIAZ BARRIGA ARCEO DR. EDUARDO MADRIGAL BUJAIDAR CUAUTITLAN IZCAUI, EDO. DE ME.XICO 1995 FALLA DE 01\IGEN UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis está protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN UNIDAD DE LA ADMIMISTRACION ESCOLAR DEPARTAMENTO DE EXAMENES PROFESTONALES INIILEALAL MAJONAL. . A/BNoca DE ASUNTO! if MEXIZS DR. JAIME KELLER TORRES DIRECTOR DE LA FES-CUAUTIFTLAN PRESENTE. AT'"N3 Ing. Fafael Rodriguez Ceballos Jefe del Departamento de Exámanes Profesionales de la F.E.S. - C, Con base en el art, 28 del Peglamento General ce Exámenes. nos permitimos Comunicar a usted que revisamos el trabajo 4 intercambios de Cromátides Hermanas en cultivo de - linfocitos humanos que presentá la pasantes _varia Silvia Vázquez Carduño, - con número de cuentas _ 8352427-9 para obtener el TITULO des Quláica Farmaréurica Eidlosz . Caonsideranto que dicho trabajo reúne los requisitos netesarios para ser discutido en el EXAMEN PROFESIONAL correspondiento, otorgamos nuestro VOTO APROBATORITO. ATENTAMENTE. “POR MI RAZA HABLARA EL ESPIFITU" Cuautitián lecalli, Edo. de Méx.. a 14 de Diciembre de 19794 PRESIDENTE MAMAT. Remiro Lápez Raños VOCAL Q-F.B, María Esther Revuelta Miranda : SECRETARIO M. en C. Sandra Diaz Barriga Arceo SAD ler. SUPLENTE 0Q-F.B. Virginta Oliva Arellano 2do. SUPLENTE Q.F.B. Rosalba Bonilla Sánchez “"LER-VAP-01 ¿>~i¡ ~t-~_jm ~~¿~~~ LTAD E DI S LIPER! RES AUTlTLAN I D OE t WJNISTRACION I R . CNTO CE EHES PRO~ESIONALES \l. No,.. ;~\l.,,c-.t. h11"1UU4:0 .\.\...,J:xAL l,'IJ>!lo9'>U [l( '\cm:: 1~tit W\ln>" ASUHT01 V~ 'J ATORIC::S R. I E ICE LER RES I TCR E - AUT I N ESENTE. . >".! ~º~· Ot~g1IO~~ol•lo'ort0'it' \•~""""'' T' s g. Ra:fael odri ;;: eballou Te el Oepar"tamento e >ct.man&s r 'fes1onale5 e . E. s. . on aae e l rt. 8 el egla ento eneral de :;.t.menes. os r 1t1 os c unicar t d e r- v1sa os l tr. aJo de trs•s• Efccro de Ja Vtr;om1.n5 E spbrg la frccyench de 192 a entá ....la_ sante: ''ndn 1lyio v~"'QllC"' G,;ir o n tl e,.o e anta: 6 524"2-9 ra t ner f!'l I LO e: o i r do Qua i o ra Jo üne s 1n1tos c sar10G r"a r i uti o n l EN FESl NAL r"r dt :it>:?. t r" os st "O TO ODATOFHO. TAMENTE, " R I ZA BLARA L P!l"ITU" u•ut1tlan z a l1. do. e M~x •• -1.!L...... e ~.,_.,"-'".ll!l"--- ESI OEHTE '.f y z Begi to t 6pez ªªººª CAL .F.B. ada sther evuelta iranda SECRETARIO . . andra iaz a riga rcco r. ENTE Q. . . \'i inia liva re lnno C'do. PLENTE .F.8. osalba onilla clnche:: e A G R A D E e I M I E N T o s A G R A D E C I M I E N T O S • A MIS PADRES Angel y Silvia. Por su apoyo, sacrificios y dedicación les doy gracias porque me dieron la -- vida y la mejor herencia que pude haber deseado, mi educación. Y porque gracias a ustedes realice uno de mis grandes sueños. Que Dios los bendiga. A MIS HERMANOS Angel, Arturo y Osear. Porque aunque no lo crean los quiero- mucho y espero que tambiCn ustedes, - logren lo que mas deseen, salgan ade- lante , se superen y eqto sea un pe-- queño ejemplo para su realización. A MIS ABUELITOS Eufcmio, Marina, y Julia. Por su gran amor que siempre me --- dicr!~ y pocque aunque dos de ellos ya no e~tcn siempr~ tuve una gran ternura atención y cari~o, no puedeo de1ar- de mencionarJoq, Ya que de ustedes- solo recibi bu~no~ consc)os y bund!ctones. D E D 1 C A T O R 1 A, A MI HERMANO CESAR. Este trab3jo se lo dedicó muy especialmente a mi hermano Jos~ C~sar al que amo y admiró aunque ya no esta con no- sotros. se que desde donde est~s te darA gusto que al -- fin d~ este paso en mi vida. Siempre vivirAs en mi cora- zón y cada meta que logré ser! en tu memoria. Porqu~ se que era algo que tu deseabas que realizar! y - por el gran amor que sembraste en esta vida y el ejemplo de amistad que nos diste a todos, NUNCA TE OLVIDARE. A MI DIRECTORA DE TESIS Sandra Diaz Barriga Arceo Por haberme esperado tanto tiempo, por ercer ttri m1, por su apreciable apoyo , le - doy las ,qracias por l'lU compresión • Y mas que una profesora con todo respeto espero me con!iJ.dere una amiga ya que usted es para mi una gran personR y ser humano. A MI CO-DIRECTOR, El Dr. Eduardo Madrigal Bujaidar. Por haberme abierto las puertas del labora- torio de Genética por, su valiosa ayuda , --- apoyo, y observaciones • MIL GRACIAS. A !.OS MAESTROS DEL H. H. LABORATORIO DE GENETICA DE l.A ENCB • Martha Ca!:sani J' Arturo Piña • Por haberme dedicBdo un poco de su tiempo y sabiduria asi como i=;u apoyo. GRACIAS. A MIS AMIGOS , Irene, Ernesto, David, Gaby , Bety y Angelice. Por haber sido y seguir siendo quienes me han apoyado y escuchado siempre , gracias por su sincera amistad, se que siempre puedo contar con ustedes. A MIS AMIGOS DE LA FESC Los Timhi.!"'. Por habher compartido una parte de mi "ida porque fueron unos a.nos inolvidables· V porque capero siga nuestra amist8d • A MIS AMIGOS Jaime, Jorge, lvo, Janeth, Carlo, Ada, y Diana. Por h .. l-)er estado en los morn~ntos que mas los neceai te.:, porque gracias a ustedes pude levantarme. y porque en cada uno de ustedes hay un pedazo del corazón de César. Cracias por su Apoyo • A todas aquellas personas , Compa~eros y Maestres • Que de alguna manera contribuyeron en mi formaci6n personal y/o académice GRACIAS • AL HONORABLE JURADO Por haberme dedicado una parte de su ti.empo , y por sus valiosos consejos , para el mejoramiento de este trabajo • A MI DIOS. Te doy gracias Señor por los padres que me diste, por haberme dejado llegar a cumplir uno de mis grandes anhelos , a ti debo cada uno de mis cHas , porque cuando todo parece oscuro siempre esta tu luz • También te doy las gracias porque siempre he tenido a mi lado gente buena y mas de los amigos que puedo contar con una mano y aunque no lo merezco te tengo a ti. RESUMEN RESUMEN IN acuerdo a los estudios realiuldos últimamente sobre vitamina E, se ha detennitUUkl una posible acd6n anlicancerosa , debida a sus propiedades antioxidantes, los cuales protegen la fase lipfdica de las cilulas del daño oxldalivo y a su funci6n como eliminador de radicales libres. El siguiente trabqjo comprende el estudio de /Tes dosis de vitamina E (alfa toco/ero/) de: JX Jfr, 2 X lfr, 3 X ltrM, sobre ünfocilos humanos expuestos al mutágeno milomicina C (MMC) que ha mostrado ser un potente inductor de JCH tanto in vivo como in vilro. El efecto fue evaluado mediante lo prueba de intercambio de cromálides hennanas, ya que es la prueba que mejor evalúa el daño genotóxico, y la más sensible según estudios realiuJdos. El análisis estadístico se //e1•ó a cabo mediante el análisis de mrianui de clasijicacwn doble con repeticiones y las diferencias entre las medias se resolvieron con la prueba de rango studenliz.ado de tukey ambas pruebas con o<=0.05. También se evalúa el efecto de dicha vitamina sobre lo proliferación celulor en linfocitos humanos y se anali;,6 mediante la prueba de chi cuadrada (X') con p > O. 05. Encontramos que la vi/amina E por sf misma no es genotóxica, ya que no aumenta la frecuencia de ICll>; además ejerr:ió un efecto anti /CH en un rango de dosis de / x Jtr a 2 x Jtr con un % de inhibición de 16.38 y 80.9% respectivamente, por otra parte no presentó efectos slnergfsticos con la MMC en lo frecuencia de /CH. En la proliferaci6n celular de los lirifocilos '1umm1os (in vilro), la vi/amina E modific6 tk mantra significaJiva la prolifrmció11 c~lultu·, pvr ella misma, y asociada a la MMC. ABREVIA TURAS ABREVIATURAS /CH lnltrcambio dt cromálidts he""'1111JS MMC Milomicina e DMSO Dúnetil Su(/6xido IR Jndiu de Replicación DNA AcU/o Desorirribonucleico BrdU Bromodtso:riuridúra %/Porcentaje de Inhibición INDICE INDICB I IN11lODUCCION 1.1 Aspectos de la antimuJaglntsis y anlicarcinoglnesls 1.2 Vílaminas, clasificadón y funciones 1.3 Lo Vílamina E 1.3.1 Dtfinici6n, camcttrWzdón y funci6n qubnica. 1.4 El inltrcambw th Cromálides Hennanas (/Cl/J 1.4.I /Hjinición y antecethntes dt los intercambios tú cromálidts hennanas. 1.4.2 lmpottancia y mitodM de estlUJJo. 1.4.3 Relación de la vitamina E con los /CH 1.4.4 Relación de la Milomkina C (MCC) con respecto a los /CH U OBJK17VO 11.1 Objetivo Gt!nmll 11.2 ObjttiW>s Patticularts l 4 s 6-12 13 13-14 15 19 20 21 21 rn HIPO TESIS 22 11' .tlATERIAL I" .VETOOOS ll'.J .lta1ui4l utili:¡u/q 23 ll'.1 Equipo l °tili:AdD 23 n·.3 .Va1eri.ol biológito :u ff.4 Sustanrias o Reaaivos :u ff.S ProudimknJo 15 n'.6 Análisis de 1Tsu/11u/(Js 19 ,. RESCLTAJ>OS JJ l'1 DISCCSJO.\' 38 I'// CO.\"CLCSIOSES 41 1'111 REFERE.\"CIAS 42 /NTRODUCC/ON /, INTRODUCCION 1.1 Aspectos tú la Á1IJÚnUlllKlntsis y Anticarcittogénesis Desde haee un dtctnlo se reconoce la gTWI Importancia tú los f01:tores ambientales en el cdncer humano. El ténnino '1actons ambientales" incluye todos los riesgos de origen a6geno, no sólo agentes físicos y qufmicos extrlnsecos, sino también factores del comportamiento como los baflos de sol, la dieta, el hábito de fumar y la bebida. El ritmo 01:elerado de nuestTrJ sociedad tecnológica presenta con frecuencia amenll4QS potenciales. (Somtn. E, 1981). Estamos en una época quúnica, en la cual la apücación de nuevos productos (eombustibles, fertiür.anles, adili1·os alimentarios, etc), se ha multiplicado en los últimos JO años. En particular el usi;, de qulmicos orgánicos se ha incrementado más de 300 veces. Según cálculos actuales se uJilizan en la vida diaria unos 60,000 productos químicos naturnles o sintéticos y coda año salen al mercado aproximadamente mil nuevos productos, los cuales, ya sea en sufonna original o residual pueden encontrarse en el aire, el agua, los alimentos o el suelo en forma de contaminantes emanados de los procesos de producción o consumo. lllaugh, 1978. Estas sustancias son potencialmente peligrosas para la salud del hombre, sin embargo los ensayos sobre carcinogenicidad sólo se han aplicado a unos 6, 000 compuestos. Estudios epidemiológicos indican que el cáncer figura como la segunda causa más importante de defunción para ambos sexos, asl como también la primera en cuanto a la pérdú/a potencial de años de vida en las mujeres. (Ca11ada. 1977). 1 Según el promedio de defunciones anuales y la /oraliZllcidn del alncer, la máxima mollalidad es causada e11tre /os hombres por los cclnceres de pulmdn, tú coldn, nrla y tsldmago. El hombre está expuesto a dosis naturo/es de mdiaciones ionimntes, ademtfs de las mdiario11es c6smicas especialmente para los q11e viven a gmn altilud. lA tecno/ogfa arJual l1a propiciado el uso de los rayos X, las emisiones de reactores nucleares y los radü11111rle6tidos en el agua son sil11acio11es que aumentan el riesgo a la salud. Por otra palle se >ahe que muchos mutágenos y carr:inóge11os causan daño oxidalivo a la cél11la y contribuym a las cornp/iracio11es en la patogénesis mullifactorial de otras enfennedades. (llfarx 1987). E11 el desarrollo t11moro/ la activación de oncogenes es 1111 proceso que puede ocurrir después del periodo de iniciarió11 e influir en las fases avanwdas de la malignidad, en asaciación con una exte11sa proliferorió11 de células adyacentes y al desarrollo de metástasis. Bishop, 1987. Afom111adamt11te nuestro organismo posee diversos recursos protectores, dirigidos a minimizar las collsecuencias por las frect1entes exposic011es a agentes nocivos. De lo antes expresado se concluye que UIÍll no se conoce por completo la estrategia para prevenir el cáncer, sin embargo se ha sugerido la impollancia de agentes capaces de inhibir las mutaciones. (De Flora, 1988). Algunos repolles en la lileNllura se refieren a la prevenci6n de cáncer, y nos dice11 que evilando la exposición a factores de riesgo se puede tener más seguridad en cuanto a no 2 contnurlo. Esta p".ención primaria estd dtfinida como iu¡uellas accionrs efectuadas en individuo• con buena salud, que 1vilen la e:cposic{ón a factores dt riesgo, o tstimukn los mecanismos de defensa del orranismo. la prevtnción secundaria (prevonción t11nprano), se rPjitrr a la p.uticiparión de medios de detección t intervtnción onlt.< dtl estabUcimienlo tú u114 condicidn patológica clúilcamtnlt opa"nte, la tercero prevención st propone mlnimi:Ar el efecto de la enfennedad evilando ti tktarrollo de complicat:iones o recaldos posterio"s a la terapia, (last, 1980). En este esqutma las sustancias lnhíbilorias de la mutagénesis y carcinoglntsis son dt particular interés porque también colaboran en la provención túl cáncer humano. El propó~'ilo tk buscar Inhibitorios de la muta¡;éntsis es descubrir tambiln agentes anlicarcinoglnicos. El esclarecimiento de los mecanismos de inhibición nos pennite Í11,ferir la posible actividad anticarcinogénica de los compuestos. Gaims, 1986. En la dieta se conocen algunas su·ticular en l1llllS y anemia en changos. Esw parece resu/Jar dt que las funciones de la vilamina E en ambos sistemas sea como un antioxidante y otra funci6n más especifica pero aún no conocüla. 9 La delintación del tocofnol se complica por la l"ariaci6n de la respuesta en diftrentts tspecies qut utili::Ait a la 1·ilami11a, y por la relaci6n lk la 1·ilamina E t'on otros factores de la dieta, algunos sintomas son pre1·midas por los computstos saturadas por a111ioxidan1ts no tspecifitos, tomo el selenio o por el sulfuro contenida en cierto amlnodcida. Es lmportantt stñalar qut la mayoría tk ws síntomas por dejicitncia Je •'ilamina E putden ser pre1·enidas por un antWxidante no espuijico. Encefalomalacia y diolesis trudativa m pollos son típicos ejempws de este fenómmo Ademds tk la pigmentación ceroúk , la colorocián amarilla cqfi del tejida adiposo, (.l\'ogichi d. al,1973). La 1'ilamlna E puetk adlllll' lkntro tk la membrana lipídica de le célula cuando están ntutrolfr;ufos los radicales libT"Ps, así pre1'ie11e una auto-oridación por T't!cucwn en la membrana tk la cadena lipídica. La anemia en changos parece ser el resul11uJo tk una tkficiencia de 1'ilamlna E, que provoca la tkstrucción de ci/ulas rojas por ptro:ridluión de la membrana (Filch, 1968) En niños con desnutrición raloricoproteica parece presentarse el mismo problema. (Majaj et. al: 1963). Algunas ei·idencias sugieren un tfeclo directo de 1'ilamina E en la bia.<>< --- - - - - - - - - - - _w: - --- - - ======r ==~= '-·~- .... ;;·:..-.... --.··....;· - ... ::... - - -:-Jllt: ... -:.·:...--- ..... ~::.; =-=-==--=------- ~ ~ --~ ... _____ ~---- ':--~e .. :--- --.:.-.... :...-...... -.·· ..:; .:_ ~" .... .. ~. ~~~ ~~ ,, SI ª' a MI 0 111 SI/ Mii , 111 'I "' s 111 ªI" Mii/ Rttimtemmte se han dtSanvllatlo mitcdos basados e11 la ti11cidn difenncial de las cromdlidts hennanas co11 antic11erpos anti-BrrJU que son úJiles incluso para incorporacio11es m11y bajas dt Bnll'. n'ogelel. al, 1986). Las pruebas indican que las lesiones tn el DNA san nsponsablts de la inducci6n: de las lCll, aunque no se sabe cual es el mecanismo involucrado. También se ha señalado que la mayor pane de los mutdgenos conocidos son capaces de aumentar notabkmente la fncutncia de ICll, (Morales P., 1983). J..a fonnación de los ICll se lleva a cabo en la etapa de sfntesis de DNA WoCU. 1974, y se ha prepuesto que omrre donde se bifurca la doble cadena del DNA durante el proceso de duplicación. Es factible q11e las lesiones que no se nparan antes de la sfntesis del DNA sean las causantes de los ICI/. (Kalo H., 1980) lt1dependienteme111e del inttris cie•1t(jico que susciJa el estudio del fenómtno de los JC/I como un indicador de la nspuesta celular al daño producido en el DNA, el andlisis de este fenómeno puede aprovecharse para la detección del potencial mutagénico de las sustancias a las que por diferentes ra:ones está expuesto el ser humano. (LaJt, 1976), 111 1.4.3 h/aci6n tk la Vilanlina B '''"' los ICH En algunos estudios se ha putsto dt' manifiesto la acción antirarrinogénica de la vitamina E, en un intento de entender como es que se reali::a este efecto protector. Evaluándose la capacidad antimutagénlca de la vitami11a E, a troves del ensayo del /C/l inducidos por un mulágeno de acción reronocida. En el caso de encontmrse una efectiva acción anti-ICll, por ptute de la vitamina E, se presumirla que tal vez su acción anticarcinogénlca involucro un evento antimutagénico y que no solamente se debe a la acción antioxidante sobre los componentes membronales. (Beckma11 C. et.al, 19111). Actualmente se conoce el daño que producen gmn número de agentes al DNA, también se ha obstr••ado que causun un sig11ificativo incremento en la frecuencia de ICll, comúnmente a dosis hqjas: lo cual e11 ocasiones se co"1!laciona co11 un apnciable incremento e11 las abelTtlciones cromosómicas. La validez del análisis del IC// como una prueba sensitiva y conveniente paro detectar mutdgenos y carci11ógenos se ha investigado i11 vüro, e in viJ.•o, usando diferentes tejidos y distintos animales i11tactos, (IAtt, 1979). Los IC/I son usados paro detectar /os efectos de los clastógenos y paro diferenciar la frugi/idad de los cromo•·omas en las enfennedades. 19 1.4.4 Lli MlloMleM C (MMC) mn nspedo • los ICll Can rr/ación a estt cllmpursto que Induce ¡;mn número IÍ• /Cll, en un experimento realiuu/o co11 seis carcinógtnos inductores de ICll, en lirifociJos humanos se observó que /a MMC es un potente clastógeno e inductor de ICll a las 24 hrs. de exposición. (Craig. 11. et. al. 1977). Los intercambios son mucho más frecue11tes que /as rupturas cromosómicas o de cromátides por ejemplo en estudios in vitro se observa un incrrmento significativo de la fnc11e11cia de /CH con tan solo 3 nglml de MllfC. En cambio /as aberraciones cromosómicas son menos frecuetites, 100 >'eces menorrs en comparación con los ICll. También se ha demostrado que la 111/lfC i11duce una clara rrlación dosis-rrspuesta. Úl MMC fue elegida para esta investigación por su marcado efecto sobrr el DNA ulular, además de que la molécula esta ampliamente caracterizada en sus aspectos qufmicos y biológicos. A partir de los /CH se puede obtener irifonnación importante sobre el daño a los cromosomas, ya que nos penniJe una sensitiva detección del daño al DNA. (Samuel LaJt 1974). 20 OBJETIVOS /l. OBJBTIVOS 11.1 06jtSiWJ gvurol Dettnninar ti e/teto dt la vitamina E, sobre los intercambios de cromálides htnnanas en u11 cultivo de linfocitos humanos. 11.2 06jdivos Pnkrdarrs 11.2.l Observar la variaci6n que sufren tos JCll por inducci6n de diferontes dosis de vitamina E, aplicados in vilro ante una dosis detenninoda del mutágeno lllMC. ll.2.2 AnaJiwr la posible modificación de la proliferación celular que puede surgir en un c11ftivo de linfocilos humanos expueslos a 111/lfC y a diferentes conce11truciones de vitamina E. 11.2.3 Detenninar si la vilamina E y la MMC poseen juntas un efeclo co-mutagénico, sobre la frecuencia de /CI/ i!!-1im1,_ 21 HIPO TESIS m. HIPOTESIS lA vitamina E tiene 1111 •fecto inhibidor de la producci6n de ICH ocasionados por la Milomicina C. 22 MATE:RIAL Y Mt:TODOS IV. MATERlAL Y METODOS /V.1 M'*rial UtiliZllda -Frascos de cultivo ce/11/ar estériles con lapa de hule. -l'ipelas pas1e11r (estériles) -Pipetas de J mi. gruduadas -Pipetas de 5 1111. graduadas -lWcropipelas y p11n/as paro micropipetas estériles -Jeri11ga de JO mi. (estériles) -Tubos para ce11trifuga -Perillas de goma -Eq11iptJ de filtro millipcre -lllatraz erlenmeyer de 250 mi. -Burt/a de 100 mi. -Pottaobjetos, cubnoójetos y pinzas IY.2 Equipo l/tilimdo -Autocla•e -Refrigerador -Campanu de flujo laminar -/lomo -Est¡ifa de 37'C. ·Cámara de luz negra 23 -Vótttx -T1rm61n11ro W .3 Mattriol Biol68ko St 1rabqj6 con sangre entera obtenida por venopunción de un donador sano, qut no fumó y no ingirió sustancias alcohóücas ni medicamentos con anterioridad de 3 mrses a la pn11ba. W.4 Sustandas o Re4diva:t W.4.1 Medio de c11l1ivo McCoy Sa. modificoáo. W.4.2 Filohemaglulinina estéril, agn!gar por cada frasco de culliva 0.3 mi. W.4.3 Colchicina (Solución al 0.04%). IV.4.4 S·Bromode.mxiuridina (Solución de 4 mglml.} W.4.5 Coloronte Iloescl1t 33258 (Solución a una co11 c. de 100 glml.) IV.4.6 Suspensión de vilamina E (Gelcaps al 98%>t-tocoferol). Ptrptuad4n d4 111 S11SP01sión de Vil. E A.0.1 mi. de la vitamina E liquida se le agrega con agilacián constan/e O.J mi. de dimetil sulfif:xülu (DMSO), y S• lleva a u11 aforó de 10 mi. con 11,0 deslilada, posleriorme11te se e•l•rilira por autoclave en condiciones normales. La sus¡Hnsión correspondt a 3.15.!f de 1·Uamlna E. lk esta susptnsi6n se toman las alil:uotas correspondientes para obtener los concentraciones de: I X/{)<, 2 X lf>', 3 X /(}', M IV.4.7 Mitomicina C (MMC). Solución a una concentración de 1.5 X lf>'M. lh esta soluc/6n se agregó a cada frosco un volumen conslanlt de 50 uf. IV.S Procedimiento Se procede a la siembro de 16 /rrucos de cullivo a las cuales se les agregó 8 mi. de Medio Me Coy Sa. modificado, 0.3 mi de FilohemDglutinina, y O.S mi. de sangre venenosa hepariniztula. Se homogenizó a ia mezcla y se incuba por 72 hrs., a 37"C. A las 24 hrs., se agregaron vitamina E, BrdU, y MMC según las dosis correspondientes para cada /rosco. Se distribuyeron de la siguiente fonna: 25 Sembrar 16 frascos con medio + fitohemaglutinina + sangre [ ----·- --- ---· ··- ----- - /ncuba;~-37~c"] 1 ~-------~--------~ A /ns 24 hrs R9.reg:u \lit. ~. BrdUr, MMC, st1gún corresponda Incubar a 37oC A las 70.5 hrs. agr.,gar O. 1 mi de co/chicina Incubar a 37oC hasta las 72 Hrs. Proceder a la cocecha ;¡; Centrifugar el contenido de los frascos)( 10 min. a 1500 rpm. Tratamiento hipot6nico do las células con KCI 0.075 M a 37oC Incubar x 20 min. a 37oC Centrifugar nuevamente a las mismas condiciones ¡ acer IJBCtones con me ano - ac. acético 3:1 por 15 min. a temperatura ambiente Realizar las proparaciones cromosórnicas Figura 4. Diagrama de Flujo de procedimiento • -~-;~;:-·-···· Br:~d~ 2 TVI 1 x 10-4M + " ¡· 2 TV22x 10-4M + 2 TV3 3 x 10-4M + 2T (+)··-···· MMC BrdU 1 2DV1 1 X 10-4 + • • 2DV2 2 x 10-4 + 2DV33 x 10-4 Teñir diferencia/mente las células según la técnica de /CH. [-Análisis de los resu/fado-;-J ~---------~~J Feo.tú ndti"' Vi1ami11a E (t:011t) So1Mci6nMMC Solución Bnl·U ll'sti¡:o (·) 110 tie11e l'ilamina E ningu11u 45 ul. lt'Sli}:O t/t t•it. E tn'J 1 x ur 11inguna 45 ul. testigo de vil. E(1V) 2 X J()' ninguna 45ul. testigo de vit. E (1VJ J x ur ninguna 45 ul. testigo(+) no tiene viJamina B 50 ul. 4S ul. dosis de •it. E (DVJ J X]()' SO ul. 4S ul. dosis de vil. E (DV) 2x J()' SO ul. 4S ul. dosis de vil. E (DV) Jxl()' SO ul. 4S ul. 27 Las dosis de vilamina E se escogit·ron de acuerdo al estudio nali:Ju/o por (~rlJluu1 y Wagner 1985). l:Hspués de agngar las soluciones anttriores nuevamente se deja con la incubacidn completar las 71 hrs., al ténnino de las cuales se agng6 0.1 mi. tk eolchiclna y se continu6 con la incuba<:i611 durante 1 hora más • Al ténnino de las 72 hrs., se procedi6 a nalimr la cosecha de litifocitos. Paro lo cual se vierte el contenido de los frascos a tubos de centrifuga, limpios y secos. Centrifugor por JO min. a 1500 rpm., posterionne11te eliminar el sobrante y nsusptnder el bot6n celular con 7ml de KCL. O. 075 M a 37ºC de temperruuro por cada tubo. Incubar por 20 min. a 37ºl; al ténnino, 1·olver a Ct!ntrifugar JO min. a 1500 rpm. y eliminar el sobrenadante, nS11spe11der el botón celular con meta110/ 3:1 dcido acético paro proceder a la fijación. lhjar reposar por 15 min., a temperaJura ambiente, repetir la operación otras dos vtces. Con esta suspe11sión celular se naliw.rrm las pnparociones cromosómicas correspondientes paro cada tubo. Del co11tenido de cada tubo se gotea parte de este en los porta-o~etQs limpios y ..ecos. Se dejan madurar las laminillas por 2 días y se prorede a teñir diferencia/mente las células de acuerdo a la técnica de Goto modificada que se IÜscrlbt a continuación. (Gota and Cols, 1975). 28 IV.6 11nición de Lambcillas I J Se sumergen las laminillas en una solución de bislmrzimida (Hoechsl 332S8) a una co11centroción d• 1()() uglml. en agua desd/ada durante 40 mln. 2) A condnuación se lavan las laminillas con agua destilada y se secan en el hamo de 60"C durante IS min. 3) Vna l'e:z secas, se montan en solución reguladora de fosfato citrolo, pH = 7, con un cubreobjetos, para así ser expuestas durante 40 min., a la luz negra (luz ultravioleta cercana J x 10' cm.), a una distancia de 2 cm. 4) Enseguida se enjuagaron con agua desd/ada y se secaron en el homo nuevamente a 6<1"C por IS min. SJ Posterionnente se incubaron en soluci6n salina-cilralo (2xSSC) a 60"C duran/e 20 min. 6) Finalmente se enjuagaron con agua desd/ada y se secaron en el hamo a 60"C durante l!i min., y se tifleron con colorante Giemsa al 2% en solución buffer de fosfatos con un pH = 6.4. 29 RESULTADOS IV. 7 Análisis dt los Rtsullados Post•rionntntt s• naliz6 ti muf/Jsis de res;,ll"®s, s• o/Jstn>aron los /CH por cada dosis y cada ttstigo. As{ conw la cinética rtlulor dt los mismos. Por cada dosis y ttstigo st nalivJ el análisis cromos6mico cornspondiente en el microscopio dt campo claro. Se analitJzron JO me/afoses de segunda división por dosis paro el conteo de /CH. Tnmbiln se obtuvo la cinltico celular a pa1tir de las primeras 100 melafasts de la., 2a. y Ja. divisüln por dDsis para calcular el lmüce de replicaci6n (l.R.), que pennile dettnninar ti grado dt proliferoci6n ctlular. /.R. = /MI + 2M2 + JMJ / 100 Dondt: MI, M2 y MJ representan los % de meta/ases de la., 2a. y Ja. división respectivamente. El análisis tstadfstico de los dalos se realiz6 por medio de un Arnilisls de varianza (ANDEVA), de c/asijicaci6n dDb/e con repeticiones y la prueba de rango sludentiz.ado de Tukey con un o< =O.OS. V. RESULTADOS St obtuvieron los siguientes resultados: El análisis dt varianza dt la /rtcuencia de /CH mostró que existen diferencias eitadislicamtntt significativas entre las dosis y los tratamientos empleados o<. =O.OS. Además comprobó que la inltracci6n entre la dosis de Vil E y la milomicina produjo diftrencla.r t.rtadfsticamtntt significutivas 0(=0.0S (Tabla/). JI Con la prueba dt Tulcey St pusieron de manifiesto las diferencias entn las medias que como puede observarse en Tabla 2, son las corrtspondientes a los tralados Dt Vtt E' + MMC y Vil E' + MMC con respecto al testigo poritiWJ (m11tógtno}. Como puede observarse este efecto depende de la dosis y ri modifica la acc/6n mulaginka . de MMC y pone de manifiesto que existe ln!eracción entre los 2 compuestos. Al comparar los ttstigos de vitamina E con valiJres de 9.1, 11.9 y 8.8 ICH!cllula y ti T (·) (10. 7 /CH/célula}, no se observaron diferencias estadísticamente sign/fu:advas con la Prueba th Tulcty o< =O.OS. Por lo tanto, la vilamina E se puedt considelPI' como no genot6xlca. Tabla l. Al comparar los promedios de /CH de los tralalllientos que fueron 18.13, 13.7, 22.6 /CH/célula con respecto al T (+) (21.6 ICH!ctlula), se observó que la vitamina E actúa disminuyendo los /CH con las dosis D, y D, donde existe una diferencia tstadlslicamtnte significativa, lo que no sucede en la dosis D. donde los /CH no disminuyeron. Se obtuvo un % de inhlbic/6n de 16.38% para la D, y un 80.9% para la D, la más efectiva. Tabla 2. En la Cinética Celular se observó: Que la vitamina E disminuyó de manera significativa la proUferación celular con respecto al 'l' (·), tanto en los testigos de vilamina E como en las dosis probadas, esto también se explica con el /.R. Por lo que se obrtrva que la vitamina E más la MMC no producen efecto sinergista en la prollferación celular comprobado con la proeba chi cuadrada p>0.05. 32 TABLA 1. Efectrt 11<> Is Vlt8mina E IJOlxB la frecuencia del Intercambio de ctorMl/des hermanas inducidos por la mitomlclna-C (MMCJ In vftro. TtlllanllelllO Dos/6de No.11- A#d/11 e.e lnhlb/d(JtJ V1r E1111 Ctllulas /CH ¡ T (-) Testigo 1 o 30 10.7 0.761 1 ÍTV7 (VE) 1X10-4 30 9.1 0.374 1 TV2 (VEJ 2 X 10-4 30 11.9 0.569 TV3 (VE) 3x 10-4 30 8.8 0.624 ! 1 \r(+J(MMC) 30 21.5 9.967 ! 1 ID1 (VE+MMC) 1X10-4 30 • 18.13 0.75 lo2 (VE+MMC) 2X 10-4 30 • 13.96 0.839 1 iD3 (VE+MMC) 3x 10-4 1 so 21.6 1.569 1 1 L •Diferencia es1ac6Slicamente significativa ANDEVA y prueba Tukeyo<..0.05 con respscto al valer de MMC % de lnhlbieión • 100- X ICH clebidos al lfalamien10 x 100 • X ICH debidos al mutágeno M-Molar e.e. - error eatandar " 16.38 80.9 o.o TABLA 2. AnA/ls/a d6 vafianZa efactuadl> •las Ft9CUf1flCias /CH producidas por la llfram/na E y i. mlromlcina e (Alfa. 0.05) ~de Gl-*"'119 Sumada Cultdrados .,,.. \1ll1llCIOO llborrJld Culldrade el mutáge110 por si solo. Por lo que concluimos que no eriste efecto sinergista de la vitamina E con la mitomicina C. 38 La tu:ri6n de la 'l'ilamina E como antimutdgeno se ha estudiado in vitro con/m otros agente&, como en el trabqjo de Gebhatt y Wagner en 1985, el cual utüiz/J como agentes clastoglniros B/comlclll.: (BMJ, ciclofoifamida (CPJ ytrenimon (TRJ, como anliclasl6genos utiliza las vitaminas C y E. En dicho trobqjo, ademd.< de evaluar los ICH. se estudia d daño cromos6mico y se concluye que las dos vitaminas inhiben lafunci6n clasloglnica de TR y CP ya que a la 8111 no la qfectan. El efecto de la disminuci6n de la frecuencia fue slgnificalivo en este experimento, a diferencia de el presente trabqjo donde si hubo aclivUlad anli-ICll aunque el efecto se encuentra en un Intervalo limitado. En cultivos celulares y Drosophila in vivo, tamblln se obseT1'6 efecto anlimutagénico th la vitamina E contra dimelil ben:;u&treno. Beclcman C., Royand R.111., Sproule A., 1982. En micro-organismos como Salmone/Ja thyphimurlum trotados con aflotoxina re observ6 un potente efeClo inl1ibitorio, Raymond J., Frances F., 1973. Estos dalos nos indican que la vitamina E puede tener un amplio espectro de acci6n antigenot6xica si cumple detenninadas condiciones experimenta/es, ya que actúa en un rango de concentraci6n limitado. Sobre la vitamina C y E existen estudios in vivo e in vitro realiwdos en el laboratorio de Genltica de la Escuela Nacional de Ciencias Bio/6gicas, con un enfoque similar al nuestro, al comparar los dalos primeramente con la vitamina E in vivo, se obseT1'6 que son muy similares a los obtenidos in vitro en el cual la vitamina por s( sola no es genot6xica, y el efeClo anti-ICII existe aunque fue muy leve in vivo. 39 Por el con/TrUio, en los trobajos dt 1itamlna Cu time una acci6n anligentl/6xica más allll que la que proporciona la vitamina E. La vilamina C presenta un a/lo efecto anti-ICH, por lo que se puede decir que tiene una buma funci6n de anJimutagenicidad. También la vilamina C produce modijícaci6n m el ciclo celular comparalivanunte con vitamina E, pero no se sabe si este efecto es por la citotocixidad del mut4geno, efectos sinlrgkos, o por la acci6n protectora de las 1'itaminas. Dt dicha comparación se desprende que ambas vitaminas son inocuas desde el punJo de vista genot6xico. Como la relación entre antimutagénesis y anticarcinogénesis es estrecho, cuando un agente es efecti1•0 en alguna acción es conveniente determinar su efecto en la otro. La vitamina E se ha demostrado que tiene un carácter anlioxiáallle que es una útil pro~dad para la acción inhibitoria de la mu/agénesis, también existen evidencias sobre su potencial para inhibir el cncimlento tumoral o bloquear la fomwci6n de carcinogénesis. (Süvio de Flora, 1988). Los datos Dlllerlores nos hactn suponer que la vitamina E padrfa usarse en el futuro, como un co..vlyu1•anle en la pnvención y control de problemas relacionados en la mu/agénesis- carcinogénesis, sin embargo todavfa es indispensable conocer una serie de elementos relacionados con su actiridad, como la interacción con otras sustancias, su especificidad antimuJagénica y el inte1'1'alo en que actúa, con lo que podria establecerse una terapeútica m4s concreta para su uso. CONCLUSIONES Vil CONCLUSIONES La l'ilamina E no prod11jo por sf sola, un incremento estadfsticamente significativo de los ICHs eon respecto al control negalivo, con ninguna de las dosis probadas. No obstante, si modX progl'fllll. Muta/ion Rtstart:h. 81: 11-62. -uhlllngtr A. L. Bloquúnka - Vilamlnas y CotnVinos. &l. Omtga Barctlona, gun4a tdicúJn. 341-343. 1982. -Unus PauliJrg, Jon C. Nlxon, Fnd Slilt. 1985. E/ltct o/ ditltJ!Y ascorbic acid •n tht incidtnct o/ sponlalltous manrmary tumors in R/11 mice. Proc Nat/ Sel. 82: 5185-518 • ·Marx, J. L. 1987. Scitnce. 235: 529-531. ·MtWgh T. H. 1978. Omcen: How many an thtre?. Scitnce 162-169. ·Me. CliJrJoclc. 1938. The production of homosygous dtjicient tissuts wilh mu carru:ltrlstics by m•ans of lht abemmJ miJolic bthavior o/ ring-shoped chromoso es. Gen1ücs. 23: JIS-316. ·Moraús Pedro. 1988. El daño a la úlformati6n genltica y las interr:ambios enln crom4JúUs hermanas. Ciencia y MsarroUo. 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