UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA. DETECCIÓN MEDIANTE PCR MÚLTIPLE DE PPV, PCV2Y Mycoplasma hyopneumoniae EN PULMONES DE CERDOS CON LESIONES NEUMÓNICAS TESIS QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE MÉDICO VETERINARIO ZOOTECNSTA PRESENTA OSCAR MONTIEL VELÁZQUEZ Asesor Alfredo Sahagún Ruiz MÉXICO, D.F. 2008 I UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. DEDI CATORI A Esta es una de las partes que m ás m e gusta leer de cada libro, de cada disco, de cada obra... ahora es m i turno de escribir la, y com o saben, no soy de m uchas palabras. Pero ya que es de bien nacidos ser agradecidos... y es ext rem adam ente difícil decidir a quién dedicar algo; puedes intentar agradecérselo a m uchas personas, con lo que corres el r iesgo de olvidar a ese am igo rencoroso que se molestará y te lo recordará el resto de tu vida. Pero yo soy arr iesgado y tengo una página por delante para rellenar. A mis padres; ya que les debo la vida y unas cuantas cosas más y sabiendo que no existiría una forma de agradecer todos los sacrificios y esfuerzos que hicieron para mí; quiero que sientan que el objetivo logrado también es suyo y que la fuerza que me ayudara a conseguirlo fue su apoyo. A m i Mamá Toña, todo lo que soy se lo debo a ella. At r ibuyo todos m is éxitos en esta vida a la enseñanza moral, intelectual y algunas veces física ( jeje) que recibí de ella. A mi Papá quien al principio de mi vida era un ser que a veces se aparecía para aplaudir m is últ imos logros. Cuando me iba haciendo mayor, era una figura que me enseñaba la diferencia entre el mal y el bien. Durante mi adolescencia era la autoridad que ponía lím ites a mis deseos. Ahora que soy adulto, es el mejor consejero y amigo que tengo. A m i Mam á Vicky, por ser siem pre m i gran apoyo y m í ot ra m am á. Por aguantarm e y com prender todos y cada uno de m is caprichos. Gracias Mam á. A mis Hermanos, aunque yo no estoy, se que ellos van a estar ahí siempre, (a veces peleando pero... es que somos hermanos); por ser ustedes el pilar en el cual me apoyo cuando estoy a punto de fracasar. A Jazmín por estar cerca de m i, compart iendo las experiencias m as im portantes de m i carrera y porque gracias a su apoyo he llegado a realizar una de m is grandes metas. Especialmente para Alejandro, porque eres de esa clase de persona que todo lo com prende. Porque sabes escuchar y br indar ayuda cuando es necesario… porque te has ganado el cariño, adm iración y respeto de todo el que te conoce; aunque lo m as importante es….simplemente decirte: GRACI AS POR SER MI HERMANO… TE QUI ERO MUCHO (aunque no se note tanto) . A Mónica, por perm it irme conocer e integrarme a tu gran familia. Gracias por apoyarme y confiar en mí. No sé si ya te dije lo feliz que me hace nuestra unión, la seguridad que me das al estar a m i lado, día t ras día, y el saber que estaremos juntos año t ras año. A m is am igos Raúl, David, Mario, Olao, Sonia, Lorena, porque m e conocen tal com o soy, m e acom pañan en m is logros y fracasos, celebran las alegrías, comparten el dolor y jam ás m e juzgan por m is errores. De verdad m uchas gracias! ! ! ! A m is t ías Flor, Albina, y la maest ra Glor ia I rma, porque siem pre están al tanto de m i fam ilia y de m í. Y por últ imo, pero principalm ente, a m is Abuelos, quienes aun siento ent re nosot ros, por contagiarm e su amor y respeto por vida, la naturaleza y los animales. Gracias a todos! ! ! ! II AGRADECI MI ENTOS Saber no es suficiente; tenemos que aplicarlo. Tener voluntad no es suficiente: tenemos que implementarla. (Goethe) . Al Dr. Humberto Ramírez, solo usted sabe lo valiosísim a que fue su ayuda para la realización de este t rabajo, y por br indarme su am istad. Al Dr. Marco A. Herradora Lozano del DPAC-FMVZ, por su colaboración en el t rabajo estadíst ico de este t rabajo. A la MVZ Lorena Reyes Guerra, por su colaboración en el t rabajo de bacteriología. A m is am igos de la Facultad y principalm ente a los del grupo 09, por perm it irm e conocerlos y ser parte de su vida. Por ayudarme y estar conm igo a lo largo de la carrera… y aun después. Al departam ento de Microbiología: Andira, Chucho, Ceci, Caro, Rosalba, Rebeca, Lupita, Rosalba, Alejandro de la Peña, y a todos y cada uno de los que form an parte de el. A los m iembros del Jurado A la Universidad III Este t rabajo fue realizado en el laboratorio de I nmunología Molecular del Departamento de Microbiología e I nmunología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional Autónoma de México. Financiado por PAPI I T UNAM: → I N 213302 y → I N 219006 I nvest igador Responsable: Alfredo Sahagún Ruiz. IV CONTENI DO Página RESUMEN 01 ABSTRACT 02 I NTRODUCCI ÓN 03 ∼ Parvovirus Porcino 04 ∼ Circovirus Porcino 05 ∼ Mycoplasma hyopneumoniae 06 JUSTIFI CACI ÓN 08 HI PÓTESI S 09 OBJETI VO 10 MATERI AL Y MÉTODOS 11 ∼ Ext racción de ADN 11 ∼ I niciadores 11 ∼ Reacción de la PCR 13 RESULTADOS 14 DI SCUSIÓN 23 CONCLUSI ONES 25 LI TERATURA CITADA 27 APÉNDI CE 36 ∼ Método de CTAB- fenol-cloroform o 36 ∼ Soluciones ut ilizadas 37 V 1 RESUMEN OSCAR MONTI EL VELÁZQUEZ. Detección m ediante PCR m últ iple de PPV, PCV2 y Mycoplasm a hyopneum oniae en pulm ones de cerdos con lesiones neumónicas. (Bajo la dirección del MVZ, PhD Alfredo Sahagún Ruiz) Las enfermedades respiratorias son uno de los problemas más importantes de la industria porcina mundial. El Complejo Respiratorio Porcino (CRP) se presenta en las etapas de desarrollo y finalización. Las pruebas diagnósticas para detección de patógenos individuales son costosas, no siempre son rápidas y eficientes; y en el caso del CRP no son suficientes debido a que hay más de un agente involucrado. El objetivo de este estudio fue diseñar una PCR múltiple para detectar ADN de Parvovirus porcino (PPV), Circovirus Porcino tipo I I (PCV2) y Mycoplasma hyopneumoniae (Mhp); y determinar las asociaciones de patógenos más frecuentes en el CRP a partir de muestras de pulmones neumónicos. Se realizó el muestreo, en el rastro Tipo Inspección Federal “Abastos Cuautitlán”, Cuautit lán Izcalli, Estado de México, de 102 pulmones de cerdo con lesiones sugerentes a neumonía. El ADN se extrajo a partir de 5g tej ido por el método de CTAB-fenol-cloroformo. El patógeno detectado más frecuentemente fue PPV (65.7% ), seguido de PCV2 (22.5% ) y Mhp (21.6% ). Mientras que por bacteriología Pasteurella multocida se encontró en 28.43% y Arcanobacterium pyogenes en 5.88% . PPV fue el patógeno que se encontró con mayor frecuencia como agente único en 20/102 muestras, y como asociado en 47/102; en contraste Mhp nunca se encontró como agente único y ocupo el segundo lugar como asociado en 22/ 102; PCV2 se encontró como agente único en solo 2/ 102, pero como asociado en 21/ 102. Las asociaciones entre patógenos fueron detectadas en 49 muestras, mientras que infecciones por un solo agente fueron detectadas en 35 muestras; lo cual indica que en los problemas neumónicos del cerdo es más frecuente que estén involucrados más de un patógeno. La PCR múltiple fue tan efectiva como la PCR simple para la detección de PPV, PCV2 y Mhp; considerando el tiempo y costos la PCR múltiple es más económica y rápida que la PCR simple. 2 ABSTRACT OSCAR MONTI EL VELÁZQUEZ. Mult iplex PCR for detect ion of PPV, PCV2 and Mycoplasm a hyopneum oniae in swine lungs with pneumonic lessions. (Directed by MVZ, PhD Alfredo Sahagún Ruiz) . Respiratory diseases are one of the most important problems for the swine industry worldwide. The Porcine Respiratory Complex (PRC) occurs at development and finishing. The diagnostic tests for detection of individual pathogens are expensive, not always rapid and efficient, and in the case of PRC, are not sufficient because there is more than one agent involved. The objective of this study was to design a multiplex PCR to detect DNA of Porcine Parvovirus (PPV), Porcine Circovirus type I I (PCV2) and Mycoplasma hyopneumoniae (Mhp) from pig pneumonic lung samples and to determinate the most often pathogen associations involved in PRC. One hundred two lungs samples with pneumonic lessions were obtained from the slaughter house Federal Inspect ion Type “Abastos Cuaut it lán” , Cuaut it lán Izcalli, Estado de Mexico. DNA was extracted from 5 g of t issue by CTAB-fenol-cloroformo. The pathogen most often detected was PPV (65.7% ), follow by PCV2 (22.5% ), and Mhp (21.6% ) ; while by bacteriology Pasteurella multocida was found in 28.43% , and Arcanobacterium pyogenes in 5.88% . PPV was the more often pathogen found as a single agent in 20/ 102 samples, and as associated agent in 47/102. In contrast Mhp never was found as single agent, and as associated agent was found in 22/102; PCV2 was found as a single agent in only 2/102 samples, but as associated in 21/ 102 samples. The associat ions between pathogens were found in 49 samples while single infect ions were only found in 35 samples. This indicates that in swine pneumonic disease is most often involved more than one pathogen. Mult iplex PCR was as effect ive as single PCR for detect ion of PPV, PCV2 and Mhp; considering t ime and cost mult iplex PCR is more econom ic and rapid than single PCR. 3 I NTRODUCCI ÓN La producción porcina ha cambiado drást icamente en los últ imos 30 años. Las condiciones de producción intensiva, el m ejoram iento genét ico y la nut r ición han perm it ido que los cerdos se envíen al m ercado a los cinco meses de edad. Es por esto que la frecuencia de las enfermedades respirator ias del cerdo ha aumentado considerablem ente, inclusive se ha propiciado la presentación de enfermedades emergentes y re-emergentes, que repercuten de manera sustancial en la salud y la producción porcina. Tal es el caso del Complejo Respiratorio Porcino (CRP) , que es considerado como uno de los principales problem as de salud que afectan a las Unidades de Producción porcina (UP) en el mundo. Su impacto económ ico es elevado pues compromete la rentabilidad de la carne de cerdo, por lo tanto, este complejo se ha convert ido en uno de los blancos de invest igación en la ciencia porcina. En condiciones de campo no es fácil entender la epidem iología del CRP y de sus componentes, por lo que es necesaria más información experimental y epidem iológica acerca de las interacciones de los agentes prim arios y secundarios (1, 2, 3, 4) . El CRP involucra d iversos fact ores com o son agent es in fecciosos, m edio am bient e y el m anej o de la producción. Ent re los agent es v irales involucrados, se encuent ran el v irus del Síndrom e Reproduct ivo y Respirat or io del cerdo ( PRRS) , el v irus de la I n f luenza porcina ( SI V) , el v ir us de la enferm edad de Au j eszky o Pseudorabia ( PRV) , r ecien t em ent e el Cir cov irus porcino t ipo I I ( PCV2) , Parvov irus porcino en algunos casos ( PPV) y adem ás en Méx ico el v ir us del Oj o Azu l o Rubu lav irus Porcino ( EOA) ( 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 ) . Los agentes bacterianos primarios involucrados son Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica y Salmonella enterica subespecie enterica serotipo Choleraesuis. Los agentes bacterianos secundarios son Pasteurella multocida, Arcanobacterium pyogenes, Haemophilus parasuis, Streptococcus suis y Actinobacillus suis. 4 Cada vez es más frecuente la asociación del PCV2 y PPV con problemas respiratorios (10, 11, 12, 13) . En el año 2000, PRRS, PCV2, Mhp, SI V y PPV estuvieron presentes en el 42% , 22% , 22% , 19% y 5% , respect ivam ente, de los casos de CRP rem it idos al Laboratorio de Diagnóst ico de la I owa State University ( I SU-VDL) (13) . Las interacciones ent re patógenos respirator ios primarios y secundarios hacen difícil la resolución del problem a clínico en forma eficiente y duradera. Por tanto, el cont rol de enfermedades depende de la ident ificación de los patógenos involucrados, siendo necesario un m étodo de diagnóst ico rápido, sensible y específico. Sin em bargo, no siempre se dispone de las pruebas específicas para el diagnóst ico, sobre todo para la detección de la enferm edad en los estados subclínicos o en animales portadores (2, 14, 15, 16, 17, 18, 19) . Parvovirus Porcino La parvovirosis porcina es una enfermedad viral de dist r ibución m undial com únm ente asociada a problem as reproduct ivos; es causada por un virus de la fam ilia Parvovir idae, m ide 18-26 nm , cont iene una sola cadena de ADN, es de sim et ría icosaédrica y no presenta envoltura. Ent re sus característ icas ant igénicas presenta t res proteínas est ructurales denom inadas VP1, VP2 y VP3; la VP2 t iene propiedades hem oaglut inantes, pr incipalmente de glóbulos rojos de cobayo, rata, pollo, gato y del grupo "O" hum ano. Es m uy resistente al éter, cloroform o, sustancias ácidas, calor y puede permanecer act ivo en el ambiente hasta por 14 semanas. Se inact iva con formol, betapropiolactona, hidroxilam ina, agentes oxidantes y radiaciones UV (5, 20, 21, 22) . Los problemas reproduct ivos se caracterizan por la presencia de abortos, cam adas pequeñas, m ort inatos y lechones débiles. La infección del PVP ocurre de forma horizontal y vert ical, las hembras suscept ibles lo adquieren principalmente por vía 5 oronasal, venérea, t ransplacentaria e int rauterina. Las cerdas no gestantes no presentan signos clínicos evidentes (23, 24) . En México PPV es ubicuo en la m ayoría de las granjas porcinas. La enfermedad de presenta cuando los ant icuerpos m aternos a PPV dism inuyen en los cerdos destetados. En las hem bras los signos clínicos se presentan más en las de primero y segundo parto (25, 26) . La coinfección por PCV2 y PPV ha sido dem ost rada en un núm ero significat ivo de casos de síndrom e de adelgazam iento pos-destete en Corea y Canadá. La coinfección ent re PCV2 y PPV induce lesiones y signos clínicos más severos, am bos virus han sido detectados a part ir de pulm ones de anim ales con CRP (9, 27) . Circovirus Porcino El circovirus porcino (PCV) se encuent ra ampliam ente difundido a nivel m undial. Se han caracterizado dos t ipos dist intos: el Circovirus Porcino t ipo I (PCV1) descrito com o un contam inante de la línea celular de r iñón porcino y el cual es apatógeno para el cerdo; y Circovirus Porcino t ipo I I (PCV2) , reportado en Canadá, los Estados Unidos, muchos países de Europa y algunos países de Asia. PCV2 está asociado a cuadros patológicos como el síndrome de adelgazam iento post destete (PMWS), t remores congénitos, lesiones en fetos abortados, lechones nacidos muertos y lechones débiles. La asociación de PCV2 al CRP induce una enfermedad clínica respiratoria prolongada e inusualmente grave, neum onía interst icial granulom atosa con bronquiolit is y fibrosis bronquiolar (27) . El PMWS y el CRP asociados a PCV2 causan grandes pérdidas económ icas en la indust r ia porcina mundial. La mayoría de las UP son serológicamente posit ivas al PCV2 con infección subclínica (28, 29, 30, 31) . Experim entalm ente, la doble infección de cerdos con PCV2 y PPV agrava los signos clínicos y lesiones de PMWS, (32) m ient ras que la inoculación solo con PCV2 produce leves lesiones 6 histológicas (10, 33, 34, 35) . La primera descripción en México fue hecha en 2001 y en 2006 se tuvo el pr imer aislam iento (36, 37, 38, 39) . Los circovirus porcinos deben su nom bre al hecho de que su genom a es circular y está unido de forma covalente en sus ext remos. Pertenecen a la fam ilia Circovir idae, género Circovirus. Es un virus sin envoltura, esférico, de sim et ría icosaédrica, y de tamaño pequeño, 17 nm, lo que los convierte en los virus de vertebrados m ás pequeños que se conocen. Posee una molécula de ADN circular simple de 1.7 kb. Es estable al medio am biente y puede ser t ransportado de forma mecánica; es muy resistente a la inact ivación por detergentes y desinfectantes usuales. En algunos casos, la enferm edad se puede presentar en UP con buenas medidas de bioseguridad. El virus ha sido aislado o detectado en tonsilas, t im o, bazo, hígado, r iñón, nódulos linfát icos, mucosa nasal, pulmón, intest ino delgado, médula ósea, encéfalo y test ículo (5, 29, 40- 44) . El diagnóstico de laboratorio de PMWS y la neum onía asociada a PCV2 es difícil, se lleva a cabo principalmente por el aislamiento viral en células susceptibles, técnicas de detección de antígenos (inmunohistoquímica e inmunoperoxidasa) o ácidos nucleicos virales (Hibridación in situ y PCR) y por la detección de anticuerpos específicos (ELISA) (20, 43-46). Mycoplasm a hyopneum oniae La Neumonía Enzoót ica (NE) , causada por Mycoplasm a hyopneum oniae (Mhp) , es una enfermedad crónica con alta morbilidad y baja mortalidad; afecta a los cerdos en etapa de crecim iento y engorda; y presenta alta prevalencia a nivel mundial. Este m icroorganismo pertenece a la clase Mollicutes; carece de pared celular, es pleomórfico, m ide 0.2 µm de diámetro y está rodeado por una m em brana citoplasm át ica de 10 nm de grosor (4, 5) . 7 Es un microorganismo de difícil aislamiento, su cultivo se realiza en medios complejos (medio de Friis) a los que se recomienda la adición de un antisuero contra Mycoplasma hyorhinis ya que frecuentemente se encuentra en el tracto respiratorio del cerdo y debido a que es de desarrollo rápido compite con Mhp (47, 48). Las colonias, en medio sólido, se hacen visibles hacia los 2 días de incubación y alcanzan un tamaño de 0.5-1 mm de diámetro entre los 4 y 7 días. Estas colonias son difíciles de observar a simple vista y están desprovistas de protuberancia central (4, 5). El Mhp resiste la liofilización y tem peraturas de -180° C. Puede sobrevivir durante mucho t iempo en medio líquido de Friis. No sobrevive a la desecación más allá de una semana. Sobrevive bien en el agua de lluvia (47, 49–52) . Los primeros signos de la NE en infecciones agudas son anorexia e hiperterm ia. En algunos casos la tos es el único signo apreciable en las primeras fases de la enfermedad. La intensidad de estos signos se exacerba por condiciones de est rés o por infecciones secundarias que pueden conducir a la muerte de los animales afectados. El diagnóst ico clínico es muy importante para detectar la NE, este se realiza en base a sintomatología de los cerdos en grupo, o bien por la observación de lesiones a la necropsia (12, 13, 53- 67) . Recientemente Krakowka et al., 2007 (68) han reportado que Mhp es un factor importante en la infección por PCV2 en el CRP y en el PMWS. La NE puede complicarse por la presencia de ot ros agentes como P. multocida, B. bronchisept ica, H. parasuis y virus como PRRS, PRV, PCV2 y PPV. Por lo que es necesario ut ilizar técnicas de laboratorio especializadas para el diagnóst ico que perm itan la detección de estos agentes (12, 53, 56, 57) . 8 JUSTI FI CACI ÓN Los agentes virales y bacterianos que afectan el sistema respirator io del cerdo son de los principales factores que impactan en la indust r ia porcina, pues bajo las condiciones de producción intensiva de los cerdos, es com ún que estos sean infectados simultáneamente con dos o más patógenos. Un diagnóst ico definit ivo de infecciones múlt iples es a menudo difícil, ya que los signos clínicos pueden ser variables. Las pruebas diagnóst icas específicas de virus individuales son costosas y no siempre nos dan los resultados de una forma rápida. Un nuevo método, la PCR múlt iple, se ha ut ilizado para ident ificar y dist inguir simultáneamente múlt iples patógenos en una sola muestra (69-71). En éste estudio se propone el diseño y estandarización de una PCR múlt iple para la detección de ADN de PPV, PCV2 y Mhp a part ir de muest ras de pulmón de cerdos sacrificados en rast ro; así como valorar las posibles asociaciones de agentes en CRP. 9 HI PÓTESI S Las infecciones respiratorias múlt iples del cerdo serán m ás frecuentes que las causadas por un solo patógeno La PCR múlt iple será tan eficiente en la detección de ADN de los patógenos pulmonares del cerdo como la PCR simple 10 OBJETI VOS Diseñar una PCR múlt iple para la detección de PPV, PCV2 y Mhp Estandarizar la técnica de ext racción de ADN de tej ido pulm onar de cerdo Detectar por la PCR ADN de PPV, PCV2 y Mhp a part ir de pulm ones de cerdo con lesiones neum ónicas Detectar las asociaciones m ás frecuentes de patógenos en pulm ones de cerdo con lesiones neum ónicas 11 MATERI AL Y MÉTODOS Se seleccionaron y colectaron 102 muestras de pulmones de cerdos con lesiones sugerentes a enfermedad respiratoria sacrificados en el rastro Tipo Inspección Federal (TIF) “Abastos Cuautit lán” ubicado en el municipio de Cuautit lán Izcalli, Estado de México; provenientes de los estado de Jalisco y Veracruz. Las muestras fueron tomadas de los lóbulos craneal y medio, de pulmones con lesiones neumónicas; se identificaron en orden progresivo y se transportaron en refrigeración al Departamento de Microbiología e Inmunología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional Autónoma de México, donde se les procesó para extracción de ADN por el método de CTAB-fenol-cloroformo (72). En un estudio paralelo las mismas muestras fueron trabajadas por bacteriología1 . Extracción de ADN Se maceraron 5g de la muestra de pulmón, el macerado se congeló y descongeló tres veces en nitrógeno líquido, se centrifugó a 2630 xg durante 10 min (70). Se recuperó el sobrenadante y se filtró a través de una membrana2 de 0.45 µm, posteriormente se realizó la ext racción de ADN por el método de CTAB/ fenol/ cloroform o (72) (Ver Apéndice) . I niciadores Se diseñaron de novo 3 juegos de iniciadores, uno por cada agente (PPV AY390557.1, PCV2 AF027217.1 y Mhp AY957500.1) , a part ir de secuencias de genes com pletos reportados en GenBank ; estos iniciadores fueron elegidos tomando en cuenta el tamaño de los productos de la PCR, un valor de G/C de 41 al 48% , excepto en el PPV (PPVNS1-R (71% )); 1Comunicación Personal MVZ Lorena Reyes Guerra (tesis de Maestría) 2007. 2 Millipore® 12 una TM de 62 °C para todos los iniciadores, una longitud entre 18 a 23 pares de bases (pb), que la base inicial y final fuera G/C (excepto en el PPV (PPV.NS1-F)): Parvovirus Porcino: iniciadores a part ir de la proteína no est ructural NS1 que am plifican un producto de la PCR de 221 pb. ∼ PPV.NS1 - F 5 ’ TACCAAGCAACAATGGCTAGC 3 ’ TM= 62° C ∼ PPV.NS1 - R 5 ’GTTGGCTCGCTCCACGGC 3 ’ TM= 62° C Circovirus Porcino t ipo I I : iniciadores a part ir del gen de la replicasa que am plifican un producto de la PCR de 427 pb. ∼ CVP- F 5 ’ CTGATTACCAGCAATCAGACC 3 ’ TM= 62° C ∼ CVP- R 5 ’ CCACTATTGATTACTTCCAACC 3 ’ TM= 62°C Mycoplasm a hyopneum oniae: iniciadores a part ir del gen parálogo de la adhesina p97 que am plifican un producto de la PCR de 760 pb ∼ Mhp- F 5 ’ GTCTAACTGTCGGACTTAGCA 3 ’ TM= 62° C ∼ Mhp- R 5 ’ GCCTGTGATTTGCGAAGACTA 3 ’ TM= 62° C Adicionalmente, se utilizaron iniciadores diseñados de novo para PRV (PRVgE, AY170318.1) los cuales amplifican un producto de la PCR de 515 pb. ∼ PRVgE-F 5’ GCGGTGCCTGCTGTACTAC 3’ TM= 62°C ∼ PRVgE-R 5’ CGACGACGCACGTCATCAC 3’ TM= 62°C Igualmente fueron utilizados los iniciadores para Act inobacillus pleuropneum oniae (APP) y Haem ophilus parasuis (HPS) descritos previamente, los cuales amplifican un producto de la PCR de 422 pb y 821 pb respectivamente (73, 74). ∼ APPL-F 5´ TGGCACTGACGGTGATGA 3´ TM= 56°C ∼ APPL-R 5´ GGCCATCGACTCAACCAT 3´ TM= 56°C ∼ HPS-F 5´ GTGATGAGGAAGGGTGGTGT 3´ TM= 62°C ∼ HPS-R 5´ GGCTTCGTCACCCTCTGT 3´ TM= 58°C 13 Reacción de la PCR La reacción de amplificación se llevó a cabo en un volumen de 20 µl de una mezcla de 75 mM Tris-HCl pH 8.8, 20 mM (NH4)2 SO4, 0.01% Tween 20, 1.5 mM MgCl2, 50 mM de KCl, 200 µM de una mezcla de dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 7.5% de dimetil sulfóxido (DMSO) 0.25 unidades de Taq polimerasa3 , 5 pmol de cada par de iniciadores, y 100 ng/µl de ADN de muestra sospechosa para cada reacción simple. La reacción de PCR múlt iple fue llevada a cabo mezclando los t res pares de iniciadores para PPV, PCV2 y Mhp j unto con las soluciones m encionadas en la PCR sim ple, ajustando el volum en final con H2O MilliQ para obtener 20 µl por reacción (69). Todas las reacciones de PCR de los experimentos de este trabajo incluyeron un testigo negativo conteniendo todos los elementos de la reacción excepto ADN, así como un testigo positivo4 , el cual contenía los mismos elementos de la reacción además de 1 µL (100 ng/µl) de ADN del patógeno a detectar (69, 70, 71). Las condiciones de la PCR simple y múltiple consistieron en un ciclo de desnaturalización inicial a 95º C por 4 min; seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 94º C por 1 min, alineación a 57º C por 1 min y extensión a 72º C por 1 min 30 seg; y por últ imo un ciclo de extensión final a 72º C por 10 min. La reacción de amplificación se desarrollo en un termociclador5 . Los productos de la PCR fueron separados por electroforesis a 100 voltios en un gel de agarosa6 al 1% , teñidos con una solución de bromuro de etidio al 0.1% 7 y posteriormente evaluados en un transiluminador8 de luz ultravioleta y digitalizados en un fotodocumentador9 . Análisis estadíst ico Las frecuencias de detección de agentes fueron analizadas por las pruebas de Wilcoxon, Spearman y Chi cuadrada. 3 Roche® 4 PPV y PCV2, proporcionados por el Dr. Humberto Ram irez; Mhp cepa J, Canada. 5 Mastercycler Gradient Eppendorf® . 6 ONBIO # Cat. AG-100 7 Research Organics # Cat . 3016E 8 Ult ra-Violet Products, inc ® 9 Kodak ® , Gel logic 200 I maging System 14 RESULTADOS Se estandarizó la PCR simple para la detección de ADN de PPV, PCV2 y Mhp; cuyas bandas corresponden, en orden ascendente, a 221 pb para PPV, a 427 pb para PCV2, y finalm ente a 760 pb para Mhp (Figura 1) . Figura 1. Am plificación por la PCR sim ple de PPV, PCV2 y Mhp Carr il: M= 1 kb ladder, 1= PPV, 2= PCV2, 3= Mhp, 4= C(–) 221 pb 427 pb 760 pb M 1 2 3 4 15 Se realizó la estandarización de la PCR múlt iple para detección de ADN de PPV, PCV2 y Mhp (Figura 2) . Carril: 1= PCR m últ iple de PPV 221 pb, P pb, 2= C (–) , M= 1 Kb Ladder Figura 2. Am plificación por la PCR m últ iple de PPV, PCV2 y Mhp CV2 427 pb y Mhp 760 760 pb 427 pb 221 b 1 2 M p 16 Los r esu l t ados obt en idos por la PCR sim ple y por bact er io logía1 nos m uest r an el núm er o de pu lm ones que fuer on posit iv os a PPV, PCV2 y Mhp , P. m u lt ocida y A. pyogenes. El agen t e det ect ado m ás f r ecuen t em ent e por la PCR sim ple fue PPV con 67 / 102 m uest r as ( P< 0 .0001) , segu ido de PCV2 con 23 / 102 , Mhp con 22 / 102 y por ú l t im o PRV, APP y HPS, cada uno con 0 / 102 ; m ien t r as que por bact er io log ía el m ás f r ecuen t e fue P. m u lt ocida con 29 / 102 y el m enos f r ecuen t e A. pyogenes con 6 / 102 ( p< 0 .0001) ( Cuadr o 1 , 2 y Figu r a 3 ) . Cuadro 1 n= 1 0 2 Patógenos pulm onares detectados por PCR PPV* PCV2 Mhp PRV APP HPS Muestras posit ivas % + 67 65.68 + 23 22.54 + 22 21.56 + 0 0 + 0 0 + 0 0 * p< 0.0001 Cuadro 2 n= 1 0 2 Patógenos pulm onares detectados previam ente por bacteriología1 P. m ultocida A. pyogenes* Muestras posit ivas % + 29 65.68 + 6 28.43 * p< 0.0001 1Comunicación Personal MVZ Lorena Reyes Guerra (tesis de Maestría) 2007. 17 Figura 3 : Total de patogenos detectados por PCR y Bacter iologia 45% 16% 15% 0% 4% 20% 0% 0% PPV (67) ( p< 0,0001) PCV2 (23) Mhp (22) HPS (0) PRV (0) APP (0) P. m ultocida (29) A. pyogenes (6) (p< 0,0001) De los agentes que fueron detectados produciendo infección única, el PPV fue el pr incipal con 20 m uest ras posit ivas, seguido de P. m ultocida con 11 m uest ras, PCV2 y A. pyogenes con 2 m uest ras, m ient ras que Mhp no se encont ró com o agente único (Cuadro 3 y Figura 4) . Cuadro 3 n= 1 0 2 Patógenos pulm onares detectados com o agentes únicos PPV* PCV2 * Mhp* P. m ultocida * * A. pyogenes* * Muestras posit ivas % + 20 19.60 + 11 10.78 + 2 1.96 + 2 1.96 + 0 0 * PCR, * * Bacteriología1 ________________________ 1Comunicación Personal MVZ Lorena Reyes Guerra (tesis de Maestría) 2007. 18 Figura 4 : Patógenos pulmonares detectados como agentes únicos 19.61% 10.78% 1.96% 0.00% 1.96% PPV (20) P. m ultocida (11) PCV2 (2) A. pyogenes (2) Mhp (0) En cont raste, se encont raron varias asociaciones ent re patógenos, es decir cuando dos o m ás agentes fueron detectados en una sola muest ra; PPV fue el patógeno que con mayor frecuencia se encont ró asociado a ot ros agentes en 47 m uest ras (p< 0.0001) . El segundo patógeno que se encont ró más frecuentemente asociado fue Mhp en 22 m uest ras; seguido de PCV2 en 21 m uest ras; P. m ultocida en 18 y finalmente A. pyogenes en 4 m uest ras (p< 0.0001) . La asociación más frecuente fue ent re PPV y PCV2 en 20 muest ras, en 2 de estas se detectó además P. m ultocida, m ient ras que en 6 de las 20 además se detectó Mhp (estas últ imas se ut ilizaron para la PCR múlt iple) , y en 1 de estas 6 se detectó además P. m ultocida (Cuadro 4, y Figura 5) . Se encont ró una correlación posit iva por la prueba de Spearman para las asociaciones ent re PPV con Mhp de 0.2786 (p< 0.0046) , seguido de PPV con PCV2 0.2417 (p< 0.0144) , PCV2 con Mhp 0.1163 y Mhp con P. m ultocida 0.0394; m ient ras que el resto de las asociaciones m ost raron una correlación negat iva (Cuadro 5) . 19 Cuadro 4 n= 1 0 2 Patógenos pulm onares detectados en infección m ixta PPV* PCV2 * Mhp* P. m ultocida * * A. pyogenes* * Muestras posit ivas % + + 12 11.76 + + 9 8.82 + + 9 8.82 + + + 5* * * 4.90 + + + 5 4.90 + + 4 3.92 + + + 2 1.96 + + + + 1* * * 0.98 + + 1 0.98 + + 1 0.98 * PCR, * * Bacteriología1, * * * ut ilizadas para la PCR m últ iple Figura 5 : Patógenos pulm onares detectados en infección m ixta 1 2 9 9 5 5 4 2 1 1 1 0 2 4 6 8 10 12 14 P P V P C V 2 ( 1 1 ,7 6 % ) P P V P . m u lt o c id a ( 8 ,8 2 % ) P P V M h p ( 8 ,8 2 % ) P P V P C V 2 M h p ( 4 ,9 0 % ) P P V M h p P . m u lt o c id a ( 4 ,9 0 % ) P P V A . p y o g e n e s ( 3 ,9 2 % ) P P V P C V 2 P . m u lt o c id a ( 1 ,9 6 % ) P P V P C V 2 M h p P . m u lt o c id a ( 0 ,9 8 % ) P C V 2 M h p ( 0 ,9 8 % ) M h p P . m u lt o c id a ( 0 ,9 8 % ) # m u e s tr a s PPV, PCV2 (11,76% ) PPV, PCV2, P. multocida (1,96% ) PPV, A. pyogenes (3,92% ) PPV, Mhp, P. multocida (4,90% ) PPV, PCV2, Mhp (4,90% ) PPV, Mhp (8,82% ) PPV, P. multocida (8,82% ) PCV2, Mhp (0,98% ) PPV, PCV2, Mhp P. multocida (0,98% ) Mhp, P. multocida (0,98% ) 1Comunicación Personal MVZ Lorena Reyes Guerra (tesis de Maestría) 2007. 20 Las 6 muest ras donde fueron detectados PPV, PCV2 y Mhp de forma conjunta por la PCR simple fueron ut ilizadas para la PCR múlt iple (Figura 6) . Figura 6: Amplif icación por la PCR múlt iple de PPV, PCV2 y Mhp Carr il M = 1 kb ladder, 1= PPV, 2= PCV2, 3= Mhp, 4 y 11= C ( - ) , 5-10= muest ras posit ivas a PPV PCV2 y Mhp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M Cuadro 5 n= 7 9 Asociaciones de Patógenos Pulm onares Agentes Muestras % PPV/ Mhp ¤ 20 26.6 PPV/ PCV2 ¤¤ 20 25.3 PPV/ P. m ultocida 17 21.5 PCV2/ Mhp 7 8.8 Mhp/ P. m ultocida 7 8.8 PPV/ A. pyogenes 4 5.1 PCV2/ P. m ultocida 3 3.8 PCV2/ A. pyogenes 0 0 Mhp/ A. pyogenes 0 0 P. m ultocida/ A. pyogenes 0 0 ¤ ( p< 0 .0 0 4 6 ) , ¤ ¤ ( p< 0 .0 1 4 4 ) 21 Cuadro 6 Com paración entre PCR sim ple y PCR m últ iple para 3 agentes PCR sim ple PCR m últ iple Tiem po 9 h 3 h Costo prom edio $600.00 $200.00 Considerando el número de agentes detectados por muestra, encontramos que fue mas común detectar 2 agentes involucrados en la infección pulmonar en 36 muestras, seguido de un solo agente en 35 muestras, 3 agentes se encontraron en 12 muestras y finalmente el número máximo de agentes detectados por muestra fue de 4 una de ellas. Dieciocho muestras resultaron negativas (Cuadro 7 y Figura 7). Cuadro 7 n= 1 0 2 Núm ero patógenos detectados por m uestra Patógenos Muestra % 0 18 17.65 1 35 34.31 2 36 35.29 3 12 11.77 4 1 0.98 Total 102 100 22 Figur a 7 : Núm e r o de pa tóge nos de te cta dos por m ue str a 34,31% 35,29% 11,96%0,98%7,65% 4 patogenos (1) 3 Patogenos (12) 2 Patogenos (36) 1 Patogeno (35) Negat ivos (18) Asociaciones El CRP es provocado por diferentes agentes bacterianos y virales; en este estudio, las asociaciones entre patógenos se encontraron en 49 muestras; mientras que el número de casos donde se encontró un solo agente fue de 35 muestras (Figura 8), lo que confirma que en los problemas neumónicos del cerdo regularmente están relacionados dos o mas patógenos. Las interacciones observadas en este estudio, han sido reportadas en el CRP (18, 45, 46, 69, 70). Grá fica 8 : Pa tógenos asociados VS únicos 48% 34% 18% Asociaciones (49) Únicos (35) Negat ivos (18) 23 DI SCUSI ÓN En este estudio, el ensayo de la PCR simple y múlt iple demost ró ser capaz de detectar y diferenciar de forma rápida los t res agentes patógenos aquí considerados (PPV, PCV2 y Mhp) , a part ir de muest ras de tej ido pulm onar. Al considerar la m ism a TM en el diseño de los iniciadores facilitó que estos pudieran ser ut ilizados en una m ism a reacción de amplif icación por la PCR múlt iple. Esto últ imo coincide con Huang et al. , 2004 (69) , quien señala que el diseño de cada par de iniciadores es crucial para tener éxito en la amplificación por la PCR simple, pero aun más en la PCR múlt iple. Recientemente, Allan et al. (9, 34) , Kim et al. (27) y Kennedy et al. (33) dem ost raron que la interacción ent re PCV2 y ot ros patógenos respirator ios y reproduct ivos com o el PPV puede ser im portante para la presentación del CRP y del PMWS. Lo que coincide con nuest ros resultados, en donde PPV se encont ró asociado con ot ros agentes en 46.6% de pulm ones con lesiones neum ónicas. Sorden et al., 2002 (10) , reportaron un incremento en la cant idad de ácidos nucleicos o ant ígenos de PCV2 en pulmones de cerdos coinfectados experim entalm ente con PRRS y PCV2 comparando con la infección con PCV2 sólo; de manera sim ilar a observaciones de ot ros invest igadores (75-83) . Sorden et al. , 2002 (10) , reporta que la asociación m ás frecuente es PCV2 con PPV seguida de PCV2 con Mhp. Mient ras que en nuest ro estudio, encont ram os que PPV con Mhp (21 muest ras) fue la asociación más frecuente; seguida de PCV2 con PPV (20 m uest ras) ; PPV con P. m ultocida (17 m uest ras) ; PCV2 con Mhp (7 muest ras) , Mhp con P. m ultocida (7 m uest ras) ; PPV con A. pyogenes (4 m uest ras) y PCV2 con P. m ultocida (3 m uest ras) . Bolin et al., 2001, señala que Mhp actúa como patógeno primario de la NE (81) ; sin em bargo en nuest ro t rabajo se detectaron 21.6% de pulm ones posit ivos a Mhp m ediante PCR, pero en ninguna de las m uest ras se encont ró a Mhp com o agente único, siem pre se le encont ró relacionado con ot ro u ot ros agentes. 24 Se sabe que PPV es endém ico en las UP y se puede encont rar en cerdos de destete sin causar enferm edad, aunque tam bién ha sido asociado al PMWS (25, 27) , sin em bargo en nuest ro estudio además de encont rarlo asociado a ot ros agentes respirator ios com o PCV2, en 20 casos se le encont ró com o agente único (negat ivo por la PCR a PCV2, PRV, HPS, APP y Mhp, y a la bacteriología) , en pulmones con lesiones neumónicas. La dem ost ración hecha por Ellis et al., (84) , de las lesiones pulm onares asociadas con PPV y PCV2, sugiere que PPV t iene un papel importante en el CRP, y aunque PPV es un agente patógeno ubicuo dent ro de las UP aun no esta claro si actúa de manera sinérgica, secundaria, o simplemente como patógeno oportunista. En nuest ros resultados PPV fue aislado como agente único lo cual sugiere que es un patógeno primario en enfermedad respiratoria y además se le encuent ra asociado en las afecciones por CRP; estos hallazgos evidencian la necesidad de esclarecer la part icipación de PPV en el CRP; con el fin de considerarlo en el diagnóst ico e implementar medidas de cont rol del CRP. Las evidencias obtenidas en este estudio, junto con los invest igaciones citadas; apoyan fuertemente la hipótesis de la importancia del papel de PPV y PCV2 en el CRP. Por lo que es recomendable que en el diagnóst ico de casos de CRP se incluyan pruebas diagnóst icas de PCV2 y PPV. 25 CONCLUSI ONES La PCR múlt iple fue tan efect iva com o la PCR sim ple para la detección de los patógenos estudiados; pero la PCR múlt iple podría dism inuir hasta en un tercio el t iempo y los costos de la PCR simple. PPV El PPV es el agente que se presenta con mayor frecuencia, ya que se detectó en el 65.7% de las muest ras. Debido a que las m uest ras fueron obtenidas del rast ro concluimos que existe circulación de PPV en animales en finalización, esto quiere decir que el virus no esta cont rolado y podría ser el causante, no solo de problemas reproduct ivos, si no también de problemas respiratorios, ya que no solo se le detecto asociado con ot ros agentes, si no también com o agente único en lesiones neumónicas. PCV2 Se detectaron 22.5% de reacciones posit ivas a PCV2 por PCR. Hasta el momento de escribir este t rabajo se encont raron 62 archivos con el genoma completo de PCV2 de diferentes países reportados en el GenBank; lo que evidencia a PCV2 como un virus de dist r ibución mundial ya que se presenta en Canadá, los Estados Unidos, m uchos países de Europa y algunos países de Asia. Mhp Se detectaron 21.6% de pulm ones posit ivos a Mhp mediante PCR, y en ninguna de las muest ras se encont ró a Mhp como agente único, siempre se le encont ró relacionado con ot ro u ot ros agentes. Lo cual refleja su papel como agente predisponente a la colonización secundaria del t racto respirator io por ot ros agentes. 26 La dificultad para el aislam iento de Mhp, t iempo y costo, hace a la PCR ideal para su diagnóst ico Asociaciones En los problemas neumónicos del cerdo regularmente están relacionados dos o más patógenos y no todos estos patógenos están clasificados com o del t ipo respirator io. Los resultados de este estudio confirman la asociación constante ent re PPV, PCV2, Mhp, P. m ultocida y A. pyogenes como factor importante en el desarrollo del CRP. Las asociaciones de PPV con Mhp y de PPV con PCV2 fueron más significat ivas. 27 LI TERATURA CI TADA 1. Plonait H, Bickhardt R. Manual de las enfermedades del cerdo. Zaragoza, España: Editor ial Acr ibia, 2001. 2. Fuentes M. Enferm edades respirator ias del ganado porcino ( I I ) . Síntesis Porcina 1990; 1: 56-58. 3. López JR. Enfermedades respirator ias del ganado porcino. Síntesis Porcina 1987; 8: 52-57. 4. Sánchez-Vizcaíno J.M. Curso de I nt roducción a la I nm unología Porcina. Segunda edición. Available from : URL: ht tp: / / www.sanidadanimal. info/ curso/ index.htm 5. Straw BE, Disease of swine. 8th Edit ion. Ames, I owa EUA: I owa State University, 1993. 6. Ramírez NR. Enfermedades de los cerdos. 2da reimpresión, México: Editor ial Diana, 1982. 7. García RO, Lobo MG. 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Coinfect ion by porcine circoviruses and porcine parvovirus in pigs with naturally acquired postweaning mult isystem ic wast ing syndrom e. J Vet Diagn I nvest 2000; 12: 21–27. 36 APÉNDI CE Extracción de ADN por el método de CTAB-fenol-cloroformo (57) 1. Tomar 567µl de sobrenadante de cult ivo celular, colocar en un tubo de 1.5m l y adicionar 30µl de solución SDS al 10% y 1.5µl de Proteinasa K10 (40m g/ m l) , mezclar la solución suavemente en un hom egenizador e incubar a 37° C./ 1 hora, 2. Adicionar 100µl de NaCl 5M y 80µl de solución CTAB/ NaCl (calentar antes de usar) , mezclar e incubar a 65° C/ 10 m in. en un baño maría. Esto es para remover los polisacáridos y ot ras m acromoléculas contam inantes. 3. Adicionar un volum en igual de Cloroform o- Alcohol I soam ílico ( 778.5µl) , m ezclar y cent r ifugar a 13000rpm / 5m in. Recuperar el sobrenadante y t ransfer ir a un t ubo nuevo. 4. Agregar al sobrenadante recuperado una cant idad igual de Fenol-Cloroformo- Alcohol I soamílico, mezclar y cent r ifugar a 13000rpm/ 5m in, recuperar el sobrenadante y t ransferir a un tubo nuevo. 5. Adicionar al sobrenadante recuperado 600µl de I sopropanol11 , m ezclar y para precipitar cent r ifugar a 13000 rpm / 5m in. Se formará un botón de color blanquecino, t irar el sobrenadante cuidando de no desprender el botón. 6. Lavar el precipitado (botón) , agregar 1m l de etanol al 70% 12 y cent r ifugar a 13000 rpm/ 5m in. Tirar el sobrenadante y dejar secar el botón a T° ambiente por una noche, o en una secadora al vacío por 10 m in. 7. Finalmente resuspender el botón en 50 m l de solución TE. Conservar en congelación a -20° C. 10 Sigma-Aldrich # Cat . P-2308 11 Sigma-Aldrich Cat # 154970-2L (Alcohol I sopropílico) 12 Sigma-Aldrich # Cat . E-7023-4X4L 37 Soluciones ut ilizadas SDS 1 0 % pH 7 .2 (Sulfato Dodecil de Sodio13 ) . Disolver 100g de SDS en 900 m l de H2O14 . NaCl 5 M . Para preparar 500m l; disolver 146.1g de NaCl15 (PM= 58.44) en 500 m l de H2O14 CTAB16 / NaCl (Bromuro de Cet ilt r imet ilamonio/ Cloruro de Sodio) . Para preparar 100m l: disolver 10g de CTAB en una solución de NaCl15 al 0.7M (PM= 58.44) , aforar hasta tener los 100m l. Cloroform o 17 - Alcohol I soam ílico 18 . Mezclar 24 partes de Cloroform o y 1 de Alcohol I soamílico. Fenol 19 - Clorform o17- Alcohol I soam ílico18. Mezclar 25 partes de Fenol, 24 de Cloroformo y 1 de Alcohol I soamílico. TE. Para preparar 1000µl, agregar 10µl de solución TRI S20 1M pH de 8 y 2µl de EDTA21 0.5M pH de 8.5; aforar a 1000µl (998µl) con H2O14 TRI S 1 M . Para preparar 200m l tomar 24.23 g de TRI S20, disolver en 200m l de H2O14 y ajustar el pH a 8 con un Potenciómet ro. EDTA 0 .5 M. Para 200m l, disolver 37.22g de EDTA21, en 200m l de H2O14 y ajustar el pH con un Potencióm etro. TAE 5 0 X (TRI S-Acetato-EDTA) . 242g de TRI S20, 51.1 m l de ácido Acét ico Glacial22 , 100 m l de EDTA21 0.5 M pH 8. 13 Sigma-Aldrich # Cat . L-4509 14 Milli Q® Millipore 15 J. T. Backer # Cat . 3624-01 16 Sigma-Aldrich # Cat . H-5882 17 Sigma-Aldrich # Cat . 366919 18 Sigma-Aldrich # Cat . 320021 19 Sigma-Aldrich # Cat . P-1037 20 Ult ra-Pure® , I nvit rogen # Cat . 15504-020 21 J.T. Backer # Cat . 8993-01 22 Merk # Cat . K-25686663