❯◆■❱❊❘❙■❉❆❉ ◆❆❈■❖◆❆▲ ❆❯❚✓❖◆❖▼❆ ❉❊ ▼✓❊❳■❈❖
PROGRAMA DE MAESTRÍA Y DOCTORADO EN INGENIERÍA
INGENIERÍA ELÉCTRICA - SISTEMAS ELECTRÓNICOS
DISEÑO, DESARROLLO E IMPLEMENTACIÓN DE UN
BIOSENSOR DE GLUCOSA MINIATURIZADO E INTEGRACIÓN
EN UNA PLATAFORMA DE MEDICIÓN DUAL PARA LA
DIABETES MELLITUS TIPO II
TESIS
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE:
DOCTOR EN INGENIERÍA
PRESENTA:
JEHÚ LÓPEZ APARICIO
TUTORES:
DR. PABLO ROBERTO PÉREZ ALCAZAR, FI-UNAM
DR. MATHIEU CHRISTIAN ANNE HAUTEFEUILLE, FC-UNAM
COMITÉ TUTOR:
DRA. MARGARITA NAVARRETE MONTESINOS, IINGEN-UNAM
DR. OLEKSANDR MARTYNYUK, FI-UNAM
Ciudad Universitaria, Cd. Mx., Enero 2018
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
  
DERECHOS RESERVADOS © 
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL 
  
Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal 
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). 
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea 
objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para 
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
  
 
ii
JURADO ASIGNADO:
Presidente: Dr. Pérez Alcázar Pablo Roberto.
Secretario: Dra. Carreón Castro Maŕıa del Pilar.
Vocal: Dr. Hautefeuille Mathieu Christian Anne.
1er Suplente: Dra. Stern Forgach Catalina Elizabeth.
2do Suplente: Dra. López Maŕın Luz Maŕıa.
Lugar donde se realizó la tesis: Laboratorio Nacional de Soluciones Biomiméticas para
Diagnóstico y Terapia (LaNSBioDyT) y en el Taller de Óptica Láser, Facultad de Ciencias,
UNAM.
TUTORES DE TESIS:
Dr. Mathieu Christian Anne Hautefeuille. Dr. Pablo Roberto Pérez Alcázar.
ii
iii
Examen profesional presentado el ante el Jurado:
Presidente: Dr. Pérez Alcázar Pablo Roberto.
Secretaria: Dra. Carreón Castro Maŕıa del Pilar.
Vocal: Dr. Hautefeuille Mathieu Christian Anne.
1er Suplente: Dra. Stern Forgach Catalina Elizabeth.
2do Suplente: Dra. López Maŕın Luz Maŕıa.
Tutores:
Dr. Mathieu Christian Anne Hautefeuille.
Dr. Pablo Roberto Pérez Alcázar.
iv
v
Este trabajo se desarrolló en el taller de óptica láser
de la Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional
Autónoma de México, bajo la tutoŕıa del Dr. Mathieu
Christian Anne Hautefeuille y del Dr. Pablo Roberto
Pérez Alcázar.
Las pruebas experimentales se realizaron en el taller de
óptica láser de la Facultad de Ciencias de la Universidad
Nacional Autónoma de México (FC-UNAM), bajo la
tutoŕıa del Dr. Mathieu Christian Anne Hautefeuille.
Este trabajo fue financiado por los proyectos CONACyT
246988 y 280317; y por el proyecto PAPIIT IT102017
(FC-UNAM).
vi
vii
El autor, sin perjuicio de legislación de Universidad
Nacional Autónoma de México, otorga el permiso para
el libre: uso, reproducción y distribución de esta obra;
siempre que sea sin fines de lucro, se den los créditos
correspondientes y no sea modificada, en especial ésta
nota.
D.R. ©Jehú López Aparicio, Ciudad de México; Enero
de 2018.
viii
ix
La redacción y edición de esta tesis se realizó utilizando:
LATEX, Inkscape y GIMP.
x
Dedicatoria
A mi Familia
∼ Jehú ∼
xi
xii Dedicatoria
Agradecimientos
El desarrollo del presente trabajo ha sido posible gracias a la contribución de muchas
personas, además, se ha mejorado gracias a las numerosas observaciones, comentarios y distintos
puntos de vista.
A mis tutores, Los Doctores Mathieu Christian Anne Hautefeuille y Pablo Roberto Pérez
Alcázar, por la confianza, la paciencia y el apoyo brindado durante el desarrollo del presente
trabajo.
Al Dr. Mathieu Christian Anne Hautefeuille por brindarme la confianza y apoyo desde el
primer momento y a lo largo de todo el trabajo, es decir, desde la propuesta, el desarrollo y la
conclusión de este trabajo. Por guiar mi formación profesional y asesorar en todo momento en
cada uno de los aspectos que he requerido. Por compartir en todo momento tus experiencias
y puntos de vista de manera imparcial. Por la paciencia y el profesionalismo mostrado en los
momentos más dif́ıciles.
A los Doctores: Maŕıa del Pilar Carreón Castro, Catalina Elizabeth Stern Forgach, Luz
Maŕıa López Maŕın, Pablo Roberto Pérez Alcázar y Mathieu Christian Anne Hautefeuille, por
las observaciones, correcciones y sugerencias hechas al presente trabajo.
A los miembros del comité tutor; Los Doctores Pablo Roberto Pérez Alcázar y Margarita
Navarrete Montesinos; por sus: observaciones, comentarios y sugerencias, para que este trabajo
se llevara a buen término.
Al equipo de trabajo de este proyecto: Los Doctores Catalina Elizabeth Stern Forgach, Dra.
Tatiana Fiordelisio Coll y Dr. Mathieu Christian Anne Hautefeuille, aśı como los M. en C.
Mariana Soledad Centeno Sierra y José Alfredo Jiménez Medina, por su dedicación y esfuerzo
invertido en el desarrollo del Biosensor Molecular, aśı como su interés en crear tecnoloǵıa que
pueda ayudar a la sociedad.
A la Dra. Laura Oropeza Ramos, por compartir su conocimiento y experiencia para el apoyo
de mi formación profesional.
M. en C. Alejandro Esparza Garćıa (CCADET), por su apoyo técnico en la obtención de los
primeros perfiles de las estructuras producidas con el grabado láser.
Al F́ıs. Diego Zamarrón Hérnandez, por su apoyo técnico en la obtención de los perfiles de
las distintas micro estructuras producidas para los micro moldes.
Al F́ıs. Aaron Cruz Ramı́rez, por su apoyo técnico en la fabricación de los micromoldes.
A la F́ıs. Sara Jacqueline Herrera Domı́nguez, por su apoyo en la caracterización de los micro
electrodos para medir glucosa.
A F́ıs. Adriana Razo de Léon, por su apoyo en la caracterización de electrodos aplicados a
un sensor de temperatura.
A Mariel Cano Jorge e Ixchetl Rojas Benito, por su apoyo en el desarrollo de electrodos para
conteo celular.
M.C.I.M. Daniel Pérez Calixto, por sus observaciones y asesoŕıas relacionadas con los
aspectos f́ısicos de esta tesis.
xiii
xiv Agradecimientos
M. en C. Lidia Escutia Guadarrama, por su asesoŕıa en la parte electro-qúımica del presente
trabajo.
A la F́ıs. Ana Lućıa Cabriales Torrijos, por su paciencia y tiempo en el entrenamiento para
le preparación y uso del PDMS.
Al Laboratorio Nacional de Soluciones Biomiméticas para Diagnóstico y Terapia
(LaNSBioDyT); por facilitar sus: instalaciones, equipo y material que fueron necesarios para
el desarrollo de este trabajo; especialmente al Dr. Mathieu Christian Anne Hautefeuille, por el
esfuerzo invertido para que dicho laboratorio tuviera lugar en la Facultad de Ciencias.
Al CONACyT por la beca de Doctorado y a los proyectos CONACyT 246988 y 280317; y
por el proyecto PAPIIT IT102017 (FC-UNAM).
Al Taller de Óptica Láser; a los Doctores: Vı́ctor Manuel Velázquez Aguilar, Mathieu
Christian Anne Hautefeuille y Enrique López Moreno; por facilitar las instalaciones y equipo
para que este proyecto se desarrollara. Especialmente, al Dr. Vı́ctor Manuel Velázquez Aguilar,
por su asesoŕıa, consejos, confianza y amistad. Esta relación de amistad y trabajo con la Dra.
Aurora Vargas Treviño y el Dr. Sergio Vergara, me han tráıdo a esta institución y doy gracias
por ello.
Al Laboratorio de Electrónica de la Facultad de Ciencias; Al Dr. Sergio Enrique Soĺıs
Nájera, por las facilidades que el laboratorio ha tenido en el desarrollo de este proyecto, y a los
laboratoristas Rosaĺıa Meléndez López y Oswaldo Nava Carbajal por su apoyo en el préstamo
de material o equipo.
Al equipo del Taller de Mecánica de la Facultad de Ciencias; Fabian Arreola Millán, Fernando
Pozos Pérez y Jonatan Mares Hurtado; por el apoyo brindado en el diseño del prototipo del
micromanipulador, corte de distintos sustratos y maquinado CNC. Asimismo, al equipo del
Taller de carpinteŕıa por el apoyo brindado en el corte de distintos sustratos.
Al personal del Departamento de F́ısica y personal administrativo del departamento de
bienes y suministros de la facultad de ciencias.
A las firmas Maxim Integrated y Texas Instruments Incorporated por las muestras de
circuitos integrados empleados en este proyecto.
A Google por el financiamiento a través del premio Google Research Awards for Latin
America.
En el transcurso de este trabajo, he tenido el gusto de conocer a distintas personas a
quienes quiero agradecer por su amistad y los gratos momentos que hemos compartido: Arturo
Abner Jiménez Aguilar, Ana Ximena Monroy Romero, Beatriz Dı́az Bello, Cindy Viridiana Peto
Gutiérrez, Daniela Margarito Segundo, Erika Araceli Gonzalez Villa, Edgar Adán Jimenez Dı́az,
Francisco Paez Larios, Genaro Vazquez Victorio, Maŕıa José González Vázquez, Mart́ın Reyes
Gallegos, Raúl Sánchez Olvera, Raúl Caudillo Viúrquez, Verenice Graciela Bautista Arce, Yasab
Ruiz Hernández y Erandi Elizabeth Madrigal Anguiano, y Adrian Aupart.
Finalmente, a mis amigos que han motivado mi camino y a quienes me han apoyado en los
momentos dif́ıciles: Alfonso Pantoja Vázquez, Raúl Fernández Rojas, Virgilio Ponce, Liz Pilar,
Felipe Ponce, Heriberto I. Hernández, Efrén Gaŕın, Paco Gaŕın, Celes Gaŕın, Moy Gaŕın, Ana
Laura Pérez y Oscar Mart́ınez.
A todos, Gracias.
∼ Jehú ∼
Índice general
Dedicatoria ①✐
Agradecimientos ①✐✐✐
Resumen ①①✈✐✐
Introducción ①①✐①
1. Biosensores 1
1.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.2. Clasificación de los biosensores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.2.1. Biosensores piezoeléctricos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.2.2. Biosensores electroqúımicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.2.2.1. Conductimétricos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.2.2.2. Potenciométricos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.2.2.3. Voltametŕıa ćıclica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.2.2.4. Amperométricos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.2.2.5. Espectroscopia de impedancia electroqúımica . . . . . . . . . . 14
1.2.3. Biosensores ópticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
1.2.3.1. Resonancia de plasmón superficial . . . . . . . . . . . . . . . . 17
1.2.3.2. Biosensores basados en interferometŕıa . . . . . . . . . . . . . . 19
1.2.3.3. Biosensores colorimétricos y fluorescentes . . . . . . . . . . . . 21
2. Miniaturizar con microtecnoloǵıa 25
2.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.2. Técnicas de microfabricación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.2.1. Fotolitograf́ıa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
2.2.2. MEMS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
2.2.3. Microfresado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
2.2.4. Litograf́ıa suave . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
2.2.5. Microfabricación láser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.3. Moldes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.3.1. Molde-Réplica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
2.3.1.1. Caracterización geométrica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
2.3.2. Microfresado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
2.3.2.1. Maquinado y caracterización geométrica . . . . . . . . . . . . . 34
2.3.3. Microfabricación Láser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
2.3.3.1. Grabado del sustrato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
xv
xvi ÍNDICE GENERAL
2.3.3.2. Caracterización geométrica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
2.4. Electrodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.4.1. Litograf́ıa suave . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
2.4.2. Microfresado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
2.4.3. Microfabricación Láser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
2.5. Caracterización eléctrica de electrodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
2.5.1. Configuración de la medición . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
2.5.2. Impedancia de los microelectrodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
2.5.2.1. Microelectrodos de carbón . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
2.5.2.2. Microelectrodos de plata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
2.5.2.3. Microelectrodos de oro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
2.5.3. Respuesta en condiciones de humedad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
2.6. Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
3. Aplicación - Glucosa 57
3.1. Transducción electroqúımica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
3.1.1. Inmovilización de enzima . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
3.1.1.1. Retención f́ısica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
3.1.1.2. Unión qúımica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
3.2. Obtención de señales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
3.2.1. Polarización de electrodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
3.2.2. Medición con un sensor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
3.2.3. Medición múltiple . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
3.3. Electrodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
3.3.1. Sensibilización de electrodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
3.3.2. Preparación de muestras de solución con glucosa . . . . . . . . . . . . . . 68
3.3.3. Ensamble de electrodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
3.3.3.1. Sustratos con un solo electrodo . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
3.3.3.2. Sustrato con dos electrodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
3.3.3.3. Sustratos con 4 electrodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
3.4. Pruebas funcionales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
3.4.1. Sustratos con un electrodo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
3.4.1.1. Molde réplica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
3.4.1.2. Microfabricación láser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
3.4.2. Medición múltiple . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
3.4.2.1. Microfresado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
3.5. Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
4. Aplicación Insulina 79
4.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
4.2. Sensor de biomoléculas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
4.2.1. Detección de una molécula . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
4.2.2. Detección de múltiples moléculas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
4.2.3. Desplazamiento de las part́ıculas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
4.3. Materiales y métodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
4.4. Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
4.4.1. Detección de una molécula . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
Índice general xvii
4.4.2. Detección de múltiples moléculas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
4.5. Integración sensor glucosa-insulina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
5. Conclusiones y trabajo futuro 93
A. Preparación de electrodos 97
A.1. Materiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
A.2. Equipo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
A.3. Preparación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
B. Uso del medidor de impedancias 99
B.1. Materiales y equipo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
B.2. Uso . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
C. Preparación de PDMS 103
C.1. Materiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
C.2. Equipo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
C.3. Preparación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
D. Preparación de muestras con glucosa 105
D.1. Materiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
D.2. Equipo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
D.3. Preparación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106
E. Funcionalización de part́ıculas magnéticas 107
E.1. Materiales utilizados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
E.2. Lavado de part́ıculas magnéticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
E.3. Funcionalización de part́ıculas magnéticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
F. Aplicaciones con microelectrodos 109
F.1. Sensor de temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
F.2. Microelectrodos para conteo celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110
G. Art́ıculo 111
H. Solicitud de patente 119
Bibliograf́ıa 121
xviii ÍNDICE GENERAL
Índice de figuras
1.1. Componentes de un biosensor [1]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.2. Curva de calibración de un biosensor. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.3. Señales de excitación en voltametŕıa: (a) barrido lineal, (b) Pulso diferencial, (c)
onda cuadrada y (d) triangular. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.4. Circuito electrónico simplificado para hacer voltametŕıa ćıclica. . . . . . . . . . . 9
1.5. Circuito electrónico de un potenciostato. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.6. Ejemplo de voltagrama. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.7. Proceso de reducción-oxidación [2]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.8. Tres formas de transporte de masa (a) difusión, (b) convección y (c) migración [3]. 12
1.9. Biosensor capacitivo (a) sección transversal y (b) electrodo interdigitado. . . . . 15
1.10. Biosensor óptico sin marcador. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
1.11. SPR utilizando acomplamiento con un (a) prisma y (b) gráfica del ángulo θ vs
reflectividad. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
1.12. Interferómetro de Mach-Zehnder. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
1.13. Pasos de ELISA directo: (a) inmovilización de ant́ıgeno, (b) anticuerpo marcado
y (c) adición de sustrato, detección se señal y cuantificación. . . . . . . . . . . . 21
1.14. Pasos empleado en el ELISA Indirecto: (a) inmovilización de ant́ıgeno, (b)
incubación de anticuerpo primario, (c) incubación de anticuerpo secundario y
(d) adición de sustrato, detección se señal y cuantificación. . . . . . . . . . . . . 22
1.15. Pasos de ELISA Sandwich: (a) anticuerpo de captura inmovilizado, (b)
inmovilización de ant́ıgeno, (c) anticuerpo secundario marcado y (d) adición de
sustrato, detección se señal y cuantificación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
1.16. Pasos de ELISA por competencia: (a) anticuerpo de captura inmovilizado, (b)
inmovilización de ant́ıgeno y ant́ıgeno marcado con enzima y (c) adición de
sustrato, detección se señal y cuantificación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.1. Método para fabricar electrodos; (a) técnicas de microfabricación, (b) el molde
en un sustrato, (c) depósito del material conductor y (d) el electrodo. . . . . . . 26
2.2. Proceso básico de la fotolitograf́ıa. (a) sustrato, (b) depósito de material
fotosensible, (c) exposición, (d) revelado y (e) grabado y (f) revelado. . . . . . . 28
2.3. Proceso básico para la fabricación MEMS donde: (a) es la preparación del
sustrato; (b) es el proceso de depósito, (c) es la transferencia del patrón, (d)
es el grabado y (e) es el producto terminado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
2.4. Proceso utilizado por el microfresado: (a) diseño en computadora, (b) equipo
CNC y (d) sustrato. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
2.5. Técnica molde replica: (a) molde maestro, (b) PDMS sobre el molde maestro, (c)
polimerización de PDMS y (d) molde-replica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
xix
xx ÍNDICE DE FIGURAS
2.6. Proceso de ablación láser; (a) sustrato, (b) sustrato tratado con material
absorbente y (c) sustrato grabado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.7. Procedimiento para preparar un molde réplica; (a) diseño, (b) diseño impreso en
termoplástico, (c) molde maestro y (d) molde-replica. . . . . . . . . . . . . . . . 33
2.8. Perfil de una ĺınea de un molde hecho en el termoplástico Shrinky Dinks (Figura
2.7c). (a) Diseño del molde maestro y (b) perfil de la ĺınea (a-1). . . . . . . . . . 33
2.9. Maquinado de: (a) una ĺınea, (b) un cuadro y, (c) dos cuadros adyacentes y (c)
dos cuadros opuestos por el vértice. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
2.10. Diseño para verificar las medidas del grabado en un sustrato de PMMA. (a) ancho
de una ĺınea, (b) dimensiones del grabado, (c) distancia entre pozos adyacentes
y (d) distancia entre dos pozos opuestos por el vértice. . . . . . . . . . . . . . . 35
2.11. (a) Maquinado de un pozo de ∼ 2x2mm, (b) perfil en 3D de dicho grabado y (c)
perfil del grabado en 3 ĺıneas distintas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
2.12. Diseño de ĺıneas (a) y cuadros (b), para observar la repetibilidad de un maquinado
CNC. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
2.13. Maquinado de ĺıneas (a) en un sustrato de PMMA, (b) profundidad y (c)
rugosidad del grabado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
2.14. Maquinado de cuadros (a) en un sustrato de PMMA, (b) profundidad y (c)
rugosidad del grabado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
2.15. Maquinado de cuatro pozos adyacentes para observar la repetibilidad en distintos
sustratos de PMMA. (a) Diseño, (b) pozos y (c) perfil 3D. . . . . . . . . . . . . 37
2.16. Preparación de micromoldes en un sustrato de PMMA con microfabricación láser.
(a) es el diseño, (b) el proceso de grabado y (c) el grabado. . . . . . . . . . . . . 38
2.17. Diseño de microelectrodos en un archivo de mapa de bits, para (a) caracterización
eléctrica, (b) aplicaciones de amperometŕıa y (c) impedancia. . . . . . . . . . . . 39
2.18. Proceso de grabado en acŕılico mediante la técnica de microfabricación láser. (a)
Sustrato de acŕılico, (b) tratamiento del sustrato, (c) grabado con láser y (d)
micromolde. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
2.19. Sustrato después del grabado (a) y después de limpiar (b). . . . . . . . . . . . . 40
2.20. (a) Diseño y (b) grabado y verificación de dimensiones. . . . . . . . . . . . . . . 41
2.21. Perfil del grabado pasando el haz láser solo una vez sobre el sustrato. (a)
Micromolde, (b) perfil de grabado en tres ĺıneas y (c) perfil de un pozo en 3D. . 41
2.22. Control de profundidad del grabado sobre el sustrato. (a) Sustrato grabado y (b)
perfil del grabado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.23. Procedimiento de depósito del material conductor. (a) Molde, (b) depósito de
material conductor y (c) microelectrodo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
2.24. Molde (a), microelectrodos de plata (b) y de carbón (c). . . . . . . . . . . . . . 44
2.25. Microelectrodos producidos con micromaquinado. (a) Sustrato micromaquinado,
(b) perforación al sustrato, (c) fijación de alambre, (d) depósito de material
conductor y (e) microelectrodo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
2.26. Procedimiento de depósito del material conductor en un micromolde preparado
con microfabricación láser. (a) Micromolde grabado, (b) micromolde limpio, (c)
depósito de material conductor y (d) microelectrodo. . . . . . . . . . . . . . . . 45
2.27. Procedimiento de depósito de pasta de carbón en un molde de PMMA. (a)
Micromolde, (b) depósito de pasta de carbón y (c) uso de varilla para limpiar
el exceso de carbón. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
Índice de figuras xxi
2.28. Microelectrodos de pasta de carbón. (a) Para caracterización eléctrica y (b) para
aplicación en impedancia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
2.29. Procedimiento de depósito de pasta de tinta de plata en un micromolde de PMMA
(b), utilizando una toalla de papel (a). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
2.30. Electrodos de plata. (a) y (c) ejemplos de electrodos interdigitados para aplicación
en impedancia y amperometŕıa; y (b) electrodo para aplicación en impedancia. . 47
2.31. (a) Configuración de 4 terminales y (b) configuración de 2 terminales. . . . . . . 49
2.32. Configuración para la medición de impedancia. (a) Configuración de 4 terminales,
(b) medidor de impedancias, (c) platina para posicionar las puntas sobre
microelectrodos y (d) puntas sobre microelectrodos. . . . . . . . . . . . . . . . . 50
2.33. Manipulador implementado (b) con platinas (X, Z) (a) y platinas XY con ajuste
fino (c). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
2.34. Impedancia (Z (a), θ(b)) de una estructura de carbón en función del voltaje
aplicado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
2.35. Geometŕıa de una estructura rectangular. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
2.36. Impedancia (Z (a), θ(b)) de distintas estructuras con la misma longitud y
diferente área de sección transversal. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
2.37. Impedancia (Z (a), θ(b)) de una estructura con la misma área de sección
transversal y distinta longitud. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
2.38. Impedancia (Z (a), θ(b)) de un microelectrodo de plata en función del voltaje
aplicado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
2.39. Modelo eléctrico para microelectrodos de carbón y plata. (Z (a), θ(b)) . . . . . . 53
2.40. Impedancia (Z (a), θ(b)) de un microelectrodo de oro en función del voltaje
aplicado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
2.41. (a) Impedancia del microelectrodo de carbón (Figura 2.39a-1) a través del tiempo
cuando una gota de agua se deposita sobre el microelectrodo y (b) Rw y Cw
normalizados. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
3.1. Esquema de la reacción oxidación-reducción. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
3.2. Circuito de transimpedancia (a) y amplificador operacional (b). . . . . . . . . . 60
3.3. Circuito de transimpedancia (a) montado en una tablilla de prueba (b) y conector
para una tira reactiva (c). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
3.4. Voltaje vs Glucosa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
3.5. Voltaje total vs Glucosa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
3.6. Diagrama a bloques del sistema electrónico para procesar las señales de un sensor
de glucosa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
3.7. Respuesta de un sensor comercial cuando se polariza el electrodo. (a) Corriente
de producida por una tira reactiva medida con equipo comercial SMU (b). . . . 63
3.8. Circuito utilizado para polarizar un electrodo de trabajo. (a) circuito de
transimpedancia y (b) polarización con una fuente de 700 V. . . . . . . . . . . . 64
3.9. Señal de salida para dos muestras de agua con glucosa de (a) 2.5mg/dL y (b)
300mg/dL. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
3.10. Circuito utilizado para procesar la señal de 4 sensores de glucosa de manera
simultánea. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
3.11. Aplicación para procesar la señal de cuatro sensores de glucosa de manera
simultánea. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
xxii ÍNDICE DE FIGURAS
3.12. Elaboración de pasta (d) hecha con (a) rodio en carbón, (b) aceite mineral y
sensibilizada con glucosa oxidasa (c). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
3.13. Ensamble de una tira reactiva FreeStyle InsuLinx (a) con electrodos de Ag/AgCl
- carbón (b) y dimensiones del área sensibilizada del electrodo de trabajo (c). . . 69
3.14. Procedimiento de ensamble de un electrodo de plata (a), con un electrodo de
carbón utilizando un adhesivo (b) para formar un canal de acceso para la muestra
(c-d). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
3.15. Microelectrodos de carbón preparados con la pasta de Lasercon. (a) Sustrato
de PMMA grabado, (b) Perforación de 550µm, (c) alambre de 110µm y (d)
microelectrodo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
3.16. Procedimiento para ensamblar electrodos. (a, b) Electrodos en sustrato de PDMS,
(d) electrodos en sustratos de PMMA, ensamble de electrodos en sustratos de
PDMS (c) y PMMA (d). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
3.17. Electrodos en una tarjeta de circuito impreso. (a) Ensamble de los electrodos y
(b) diseño con 2, 4 y 5 electrodos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
3.18. Sustrato con cuatro pozos (a) y cuatro electrodos de carbón para (b). . . . . . . 72
3.19. Diseño (a) y corte de separadores en vinilo (b) y cinta doble cara (c). . . . . . . 72
3.20. Respuesta del sensor en sustrato de acŕılico (a) para muestras de agua y agua
con glucosa (b). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
3.21. Respuesta del sensor de glucosa en sustratos de PDMS (a) y PMMA(b). . . . . 73
3.22. Medición de glucosa con electrodos de plata y pasta de carbón y niveles t́ıpicos
de glucosa en lágrimas, orina y sangre. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
3.23. (a) Diseño de cuatro electrodos en un arreglo lineal, (b) canal hecho en sustrato
de PMMA y (c) ensamble de electrodos y canal. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
3.24. Medición múltiple (a, b) con cuatro electrodos del diseño Figura 3.18. . . . . . . 75
3.25. Moldes para microelectrodos para medición múltiple. (a) diseño, (b) maquinado
en sustrato de PMMA y (c) cinta adhesiva de vinilo. . . . . . . . . . . . . . . . 76
3.26. Medición múltiple con electrodos cuatro electrodos (a, b) del diseño Figura 3.25. 76
4.1. Método de detección de una molécula. (a) Zona de entrada del ant́ıgeno, (b) zona
de reacción y (c) zona de detección óptica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
4.2. Método para la detección de múltiples moléculas. (a) Zona de entrada del
ant́ıgeno, (b) zona de reacción y (c) zona de detección óptica. . . . . . . . . . . . 82
4.3. Método de detección paso a paso. (a) Entrada del ant́ıgeno, (b) zona de reacción,
(c) el imán desplaza a las nanopart́ıculas a la zona de reacción y (d) el imán
desplaza a las nanopart́ıculas a la zona de detección óptica. . . . . . . . . . . . . 84
4.4. Plataforma mecánica para el control de movimiento del imán (a) y circuito
electrónico de control (b). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
4.5. Demostración de la manipulación de las part́ıculas magnéticas en microcanales
de poli-dimetilsiloxano (PDMS). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
4.6. Geometŕıa de la plataforma flúıdica utilizada para el MDU. . . . . . . . . . . . . 86
4.7. Medición de insulina utilizando el MDU. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
4.8. Resultados obtenidos con el MDU para insulina en muestra de sangre de humano. 89
4.9. Resultados obtenidos en el MDM descrito para la medición de GH e insulina. . . 90
4.10. Resultados obtenidos en el MDM descrito para la medición de GH (verde),
insulina (rojo) y PRL (azul) simultáneamente. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
Índice de figuras xxiii
4.11. Diseño del chip dual. (d) es la zona de entrada de la muestra, (a) es la zona
de entrada del ant́ıgeno, (b) la zona de reacción, (c) es la zona de detección de
biomoléculas y (e) zona de medición de glucosa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
F.1. Configuración del experimento para probar el sensor de temperatura (a) y
respuesta de sensores de NTC y PTC (b). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
F.2. Conteo de células mediante medición de impedancia ( Zn(a) y θn(b) ) con
microelectrodos de plata para diferentes concentraciones de suspensión Hep C9. 110
xxiv ÍNDICE DE FIGURAS
Lista de tablas
1.1. Ejemplos de ensayos comunes utilizados en la medicina. . . . . . . . . . . . . . . 24
2.1. Perfil en diferentes puntos (Figura 2.8a) de un molde maestro (Figura 2.7c). . . 34
2.2. Profundidad y ancho promedio de las estructuras maquinadas con microfresado
en dos sustratos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
2.3. Altura y ancho promedio de dos estructuras. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
2.4. Comportamiento eléctrico de los electrodos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
4.1. Longitudes de onda de excitación y emisión de los fluoróforos utilizados. . . . . . 87
xxv
xxvi LISTA DE TABLAS
Resumen
En este trabajo se presenta el diseño, desarrollo e implementación de una plataforma
miniaturizada, con capacidad de detección biológica para diagnóstico y monitoreo de la diabetes
mellitus tipo II. La plataforma presentada se ha construido con un proceso de bajo costo, basado
en técnicas de microfabricación.
El tamaño reducido del biosensor permite: (a) utilizar cantidades reducidas de agentes
biológicos, (b) detectar con precisión y especificidad las sustancias consideradas, (c) integración
fácil con los sistemas electrónicos que se desarrollaron para el procesamiento de datos y (d)
garantiza un bajo costo de fabricación.
Para implementar la zona de detección de glucosa, se diseñaron y desarrollaron
microelectrodos, los cuales se elaboraron utilizando las técnicas de molde-réplica, maquinado
CNC y microfabricación láser. Los electrodos se sensibilizaron con la enzima glucosa oxidasa,
para hacer espećıfico el sensor.
Se utilizó la amperometŕıa como método de detección de glucosa, tomando como base un
circuito electrónico (hardware) para el procesamiento de la señal del sensor de glucosa. El sensor
de glucosa puede medir concentraciones en el rango de 2.5mg/dL a 300mg/dL.
El hardware diseñado para el sensor de glucosa comunica los datos de dicho sensor a una
computadora y mediante un software, la computadora es capaz de leer, almacenar, y procesar
esta información.
Se diseñó y desarrolló un circuito electrónico para el control y manipulación de una
plataforma mecánica miniaturizada, acoplada a un cartucho microflúıdico que sirve como soporte
de un sensor de biomoléculas. El sensor de biomoléculas se desarrolló en el Laboratorio de
Neuroendocrinoloǵıa Comparada y ha demostrado ser útil para medir insulina. Dicho sensor
utiliza un cartucho microflúıdico, para manipular las micropart́ıculas magnéticas en los canales
flúıdicos, hecho con el poĺımero polidimetilsiloxano.
El método de detección de biomoléculas utiliza una técnica de ensayo por inmunoabsorción
ligado a enzimas por competencia, el cual emplea: (a) un equivalente al analito a medir, (b) un
anticuerpo marcado fluorescentemente y, (c) micropart́ıculas magnéticas, manipuladas con la
plataforma electrónica y mecánica, que permiten la detección.
Además, en el Laboratorio de Neuroendocrinoloǵıa Comparada, se desarrolló una aplicación
para el procesamiento de imágenes del sensor de biomoléculas. Las imágenes de dicho sensor
son obtenidas con un microscopio, por ello se propuso una plataforma mecánica miniaturizada,
para integrar una forma de detección óptica utilizando fotodiodos y/o lentes y un teléfono.
Finalmente, los sensores de glucosa e insulina se integran en una plataforma de medición
dual y en una misma plataforma electrónica y software.
xxvii
xxviii Resumen
Introducción
La diabetes mellitus ha crecido en rangos epidémicos, se estima que 422 millones de personas
viven con diabetes alrededor del mundo [4]. La diabetes mellitus tipo 2 (DMT2) es la responsable
de más del 90% de todos los casos de diabetes, y entre el 60 y 90% están relacionados con
obesidad [5]. En México, la DMT2 tiene una prevalencia del 14.4%, es decir, más de 16 millones
de personas están afectadas y es la principal causa de: ceguera, enfermedad renal terminal,
neuropat́ıas debilitantes, amputación de miembros, infarto del miocardio y embolias [6].
La DMT2 es una enfermedad cĺınica y genéticamente heterogénea, resultado de la interacción
entre factores genéticos y ambientales. Cĺınicamente la DMT2 se define como hiperglucemia en
ayuno o postprandial, por lo tanto monitorear los niveles sangúıneos de glucosa forma una parte
importante de la detección oportuna y de los objetivos de cualquier tratamiento. Sin embargo,
lograr niveles apropiados de monitoreo de glucosa en sangre en la población mexicana ha
demostrado ser una meta dif́ıcil de alcanzar. En México, de acuerdo a los resultados de la última
encuesta de nutrición (ENSANUT del año 2012), menos de 1.6 de los 6.4 millones de individuos
que se saben afectados con la enfermedad, cuentan con un control adecuado de los niveles de
glucosa sangúınea. Con todo, la definición cĺınica de DMT2 delimita un estado relativamente
tard́ıo en el proceso de la enfermedad ya que defectos significativos en la homeóstasis de la
glucosa y en el metabolismo energético son detectados mucho tiempo antes de que la diabetes
ocurra [7]. En la DMT2 se produce una deficiencia relativa de insulina, hormona clave en la
homeostasis de la glucosa, debida a la resistencia periférica y a un defecto secretor.
La insulina, un péptido de 51 aminoácidos secretado por las células beta del islote
pancreático, ejerce acciones en el metabolismo de carbohidratos, ĺıpidos, protéınas y electrolitos.
Sin embargo, la retroalimentación fisiológica dominante es en la glucosa, por lo que la secreción
de insulina esta acoplada a los niveles de glucosa a través de una relación dosis respuesta
muy estrecha que es necesaria para mantener la concentración de glucosa plasmática dentro de
un rango definido (∼ 4.5mmol/l). La insulina ejerce sus acciones metabólicas a través de sus
órganos “blanco”, impidiendo la liberación de glucosa por el h́ıgado y promoviendo la captura
de glucosa por el músculo y el tejido adiposo. Cuando las concentraciones fisiológicas de insulina
son incapaces de desarrollar esta respuesta se habla de resistencia a la insulina. La resistencia
a la insulina es el defecto metabólico común de las alteraciones que se agrupan en el śındrome
metabólico, tales como obesidad, intolerancia a la glucosa, hipertensión arterial, dislipidemia y
DMT2 [8]. Al desarrollarse existe un periodo de glucemia normal o cercana a lo normal, en la cual
las células beta pancreáticas compensan la resistencia mediante la hipersecreción de insulina.
Cuando eso ocurre, el páncreas fracasa en secretar suficiente insulina y se desarrolla diabetes.
Por lo tanto, es de gran importancia contar con herramientas para cuantificar la sensibilidad a
la insulina en humanos, que puedan ser usadas para investigar apropiadamente la epidemioloǵıa,
los mecanismos fisiopatológicos, el beneficio de las intervenciones terapéuticas y el curso cĺınico
de pacientes con resistencia a la insulina. Las formas más sencillas de valorar la sensibilidad a
la insulina requieren de la medición en paralelo de los niveles sangúıneos de glucosa e insulina.
xxix
xxx Introducción
Justificación
A la fecha, no existen plataformas de medición dual glucosa-insulina miniaturizada y de
bajo costo que permitan realizar un diagnóstico preciso, ni monitoreo en tiempo real de manera
generalizada, como es requerido por el sector médico, tanto en México como en el resto del
mundo. Debido al alto costo actual de medición de niveles sangúıneos de insulina (que se
encuentran t́ıpicamente en pmol/l), el procedimiento común consiste en medir niveles de glucosa
en la sangre exclusivamente, utilizando glucómetros comerciales de relativamente bajo costo. Por
lo tanto, para estudios cĺınicos de detección temprana y monitoreo en tiempo real, se requiere de
un dispositivo que pueda medir de manera dual esas dos concentraciones sin elevar demasiado
el costo total del estudio por paciente.
La tecnoloǵıa de los biosensores promete soluciones prácticas para responder a la necesidad
de medir glucosa e insulina de forma generalizada en pacientes. El objetivo del presente proyecto
es responder a las necesidades antes presentadas, ofreciendo nuevas alternativas de plataformas
de detección de la diabetes, gracias a una medición dual de niveles de glucosa y de insulina en
la sangre, en paralelo, con un microchip.
El diagnóstico común de la diabetes, con la única medición del nivel de glucosa sangúınea,
presenta limitantes, sobre todo cuando se presenta una resistencia a la insulina y en poblaciones
jóvenes o sin śıntomas evidentes. Además, una medición puntual de los niveles de glucosa es
necesaria pero no suficiente para revelar el estado de salud del paciente y se requiere también de
un seguimiento a corto, mediano o largo plazo según los casos [9]. Además, es conveniente que
el médico pueda realizar pruebas de medición de niveles de glucosa y de insulina en la sangre en
paralelo, en intervalos diferentes. Cuando se logra esta medición en paralelo, se puede describir
con mayor precisión la condición general del paciente en un momento dado. Esa necesidad
de medir la evolución temporal de los niveles de glucosa e insulina es cŕıtica también para
monitorear la evolución de la enfermedad y para analizar el impacto inmediato o a largo plazo
de los tratamientos, de la dieta o del ejercicio, aplicados al paciente [7].
Una plataforma basada en microestructuras ofrece ventajas que permite la microfabricación:
una resolución elevada gracias a una detección a micro escala; bajo costo, rapidez y facilidad de
producción.
Las plataformas microestructuradas son actualmente fáciles de conectar con el mundo
exterior con métodos de lectura remotos por computadora o dispositivos portátiles.
Adicionalmente, se puede incorporar una gran cantidad de funcionalidades para realizar
detección y diagnóstico acoplando estos sensores miniaturas al plasma sangúıneo, usando
métodos ópticos, eléctricos o qúımicos. De esa manera, usando biosensores microfabricados,
el médico cĺınico puede obtener datos relevantes en tiempo real y, mientras, se puede generar
simultáneamente una base de datos que pueda ser consultada posteriormente, usando mineŕıa
de datos (data-mining). Actualmente, muchos esfuerzos se concentran en el desarrollo de
biosensores de alta resolución, especificidad y sensibilidad, que puedan competir con métodos
convencionales más costosos.
Recientemente se han logrado avances en el desarrollo de plataformas miniaturizadas de
diagnóstico y biodetección de bajo costo, alta especificidad y alta eficiencia gracias a técnicas no
convencionales de microfabricación [10]. En algunos casos, la eficiencia de los dispositivos es tan
relevante que puede competir con métodos convencionales maduros . En adición a lo anterior, los
sistemas microfabricados pueden proporcionar otras ventajas como: su disponibilidad, facilidad
de uso, costo y requerimiento de bajos volúmenes de agentes biológicos y de sangre.
Por lo tanto, aqúı se propone utilizar algunas de estas técnicas de microfabricación no
xxxi
convencionales para desarrollar microbiosensores anaĺıticos que midan glucosa e insulina en
paralelo. Utilizando métodos de microfabricación láser se pueden producir una gran variedad
de geometŕıas y dispositivos según la aplicación, desarrollándose por ejemplo: microarreglos de
electrodos, canales o detectores ópticos de tamaños y formas modulares para realizar estudios
de sangre o tejidos biológicos in vitro utilizando volúmenes de sangre y de agente biológico o
bioqúımico muy reducido.
Objetivos
El objetivo principal del presente proyecto es diseñar, desarrollar e implementar un biosensor
de glucosa miniaturizado e integrarlo en una plataforma de medición dual, con capacidad de
detección biológica para diagnóstico y monitoreo rápido, sencillo, de bajo costo y con alta
sensibilidad de la DMT2. El biosensor deberá ser fiable y ofrecer la posibilidad de monitorear
glucosa e insulina de manera dual y en tiempo real con capacidad de reportar al paciente
y al médico. El “biosensor” se construirá con un proceso polivalente de bajo costo, basado en
técnicas de microfabricación modernas, combinando litograf́ıa suave y litograf́ıa láser; además, el
tamaño reducido del biosensor permitirá: (a) utilizar cantidades reducidas de agentes biológicos,
(b) detectar con precisión y especificidad las sustancias consideradas, (c) ofrecer fácil integración
con los sistemas electrónicos que se desarrollarán para el procesamiento de datos (recopilación,
almacenamiento y comunicación) y (d) garantizar un bajo costo de fabricación. Finalmente,
todas estas caracteŕısticas deberán hacer posible la realización de sensores tipo “Lab-on-Chip
(laboratorio en un chip o LoC) en los cuales están integradas todas las funcionalidades necesarias
a cualquier tipo de transducción (con detección óptica, eléctrica o qúımica) y de monitoreo (sea
remoto, con o sin fuentes de enerǵıa externas, etc.)
El trabajo de este proyecto gira entorno a la realización, implementación y caracterización
de tres etapas necesarias al desarrollo del biosensor:
1. Cartuchos microflúıdicos como soporte del sensor y veh́ıculo de las muestras a probar,
tanto para glucosa e insulina.
2. Microelectrodos de identificación por métodos bioqúımicos de detección.
3. Plataforma electrónica para procesamiento, almacenamiento y comunicación.
Este cartucho microflúıdico es común a los dos métodos de detección; sin embargo, para
la detección de insulina se empleó un método óptico, desarrollado en el Laboratorio de
Neuroendocrinoloǵıa Comparada.
Objetivos espećıficos
El diseño, desarrollo e implementación del biosensor se divide en las siguientes tareas:
Tarea 1 - Establecimiento de los procesos de microfabricación, el cual incluye:
T1.1. la revisión bibliográfica del estado del arte y de los antecedentes del grupo de trabajo
en microfabricación (litograf́ıa suave, fotolitograf́ıa, litograf́ıa láser).
T1.2. Identificación de los métodos implementables en nuestro laboratorio y de los
procesos/equipos a desarrollar.
T1.3. Diseño de los equipos y establecimiento de los protocolos: optimización del equipo
xxxii Introducción
láser existente, equipo láser con cabeza óptica de equipo comercial Blu-ray, técnica de
fotolitograf́ıa, técnica de litograf́ıa suave por réplica-molde.
Tarea 2: Desarrollo de la zona de detección por microelectrodos:
T2.1. Diseño de los microelectrodos para etapa de detección, considerando las limitaciones
de los métodos disponibles.
T2.2. Elección de los métodos implementables.
T2.3. Fabricación de los microelectrodos.
T2.4. Comparación de los resultados y decisión sobre el método a implementar.
T2.5. Caracterización eléctrica de los microelectrodos.
T2.6. Funcionalización de los microelectrodos con la enzima glucosa oxidasa.
T2.7. Fabricación de los microelectrodos finales y calibración.
Tarea 3: Desarrollo de la plataforma electrónica integrada:
T3.1. Desarrollar una plataforma electrónica basada en un microcontrolador con los
siguientes módulos: (a) adquisición de datos, (b) memoria para almacenamiento de datos
y, (c) comunicación cableada.
T3.2. Caracterización y validación de la plataforma con sensores comerciales.
T3.3. Automatización y control por interface gráfica (Software) para el sensor de glucosa.
T3.4. Desarrollo de una plataforma electrónica para el control de una plataforma mecánica
para el sensor de biomoléculas.
T3.5. Adaptación, verificación de compatibilidad y validación con el biosensor dual final.
Metas
De manera general existen 4 metas principales que deben alcanzarse al finalizar este proyecto:
1. Establecer un proceso de microfabricación adecuado.
2. Desarrollar el cartucho microflúıdico para análisis de muestras con un volúmen de ∼ µL.
3. Desarrollar y caracterizar la zona de detección por microelectrodos para el sensor de
glucosa.
4. Desarrollar una plataforma electrónica con capacidad de adquirir datos, almacenarlos,
comunicarse con una PC, base de datos, o un dispositivo inteligente.
A continuación se detalla la estructura del presente documento de tesis.
En el Caṕıtulo 1 se presenta el estado del arte de los biosensores, una clasificación, sus
componentes principales, su principio de funcionamiento y aplicaciones.
En el Caṕıtulo 2, de describen las técnicas utilizadas para desarrollar la zona de detección
del sensor de glucosa; espećıficamente se habla sobre el diseño, desarrollo y fabricación de
microelectrodos.
En el Caṕıtulo 3, se describe el funcionamiento del sensor de glucosa, los métodos de
sensibilización de electrodos, la electrónica requerida para procesar las señales del sensor, el
ensamble de dichos electrodos y las pruebas funcionales del sensor de glucosa.
xxxiii
En el Caṕıtulo 4, se describe el método utilizado para medir la insulina, además se describe
el funcionamiento de la plataforma propuesta y los resultados obtenidos.
Finalmente, se presentan las conclusiones y trabajo futuro.
xxxiv Introducción
1 — Biosensores
1.1. Introducción
Existen dos clases de sensores, clasificados según el tipo de información que sean capaces de
transformar [11]:
F́ısicos: Dispositivos que detectan cambios en parámetros f́ısicos (temperatura, presión,
flujo de masa, etc.).
Qúımicos: Detectan cambios de pH, concentración, composición, etc..
Un sensor qúımico es un dispositivo capaz de transformar una información qúımica de una
muestra en una señal anaĺıtica útil [11], Los sensores qúımicos constan de dos componentes
básicos: un sistema de reconocimiento o receptor y un transductor. El receptor reconoce
selectivamente la información qúımica presente en la muestra y la convierte de forma que pueda
ser reconocida por el transductor, el cual la convierte en una señal procesable, generalmente
eléctrica u óptica. Existen tres tipos de receptores:
F́ısicos: cuando no hay reacciones qúımicas involucradas en la detección.
Qúımicos: cuando la señal proviene de una reacción qúımica.
Biológicos: cuando el material receptor tiene una procedencia biológica, tales como:
enzimas, anticuerpos (Ab, Antibody), Ant́ıgeno (Ag, Antigen), células, etc.
Un biosensor es un dispositivo que integra un receptor biológico o bioqúımico y un
transductor fisicoqúımico [12]. El desarrollo de los biosensores ha crecido mucho en la última
década y representan actualmente una de las ramas más importantes de la qúımica anaĺıtica
y de la ingenieŕıa biotecnológica. Su principal ventaja proviene de la posibilidad de detección
rápida y espećıfica de una sustancia en un medio complejo. Difieren de los sistemas clásicos de
análisis como la espectroscopia de absorción atómica y las técnicas de cromatograf́ıa en fase
ĺıquida o gaseosa por su bajo costo de producción, su tamaño y por la posibilidad ser utilizados
para mediciones directas en el sitio de interés.
Un biosensor es un dispositivo anaĺıtico que consiste en tres partes individuales: un material
biológico sensible, inmovilizado, el cual involucra un elemento de reconocimiento (enzima,
anticuerpo, ant́ıgeno, orgánulos, DNA, células, tejidos, o moléculas inorgánicas) integrado dentro
de un transductor fisicoqúımico y una parte electrónica. El biosensor, convierte la información
biológica en una señal medible en forma óptica, acústica, eléctrica o magnética (ver Figura 1.1)
[1]. Los biosensores modernos han evolucionado a partir de la unión de distintas disciplinas
como: la f́ısica, la electrónica, la qúımica y la bioloǵıa.
1
2 Biosensores
Acoplamiento
Procesamiento
Analógico
a digital
Amplificación
Sistema ElectrónicoMuestra biológica
Muestra ambiental a) bioreceptores b) Interfaz eléctrica
Cultivo de células
Muestra Humana
Muestra de fruta
Ácido nucleico
Células
Anticuerpos
Enzimas
Dispositivos FET
Nanoalambres
Nanopartículas
Electrodos
Transductor
Elementos de un biosensor
Resultado
Figura 1.1: Componentes de un biosensor [1].
La tecnoloǵıa de sensores inició a mediados de los 50’s con Leland C. Clark Jr., quien
inventó un electrodo para medir el ox́ıgeno en la sangre de los pacientes bajo ciruǵıa [13]. Una
modificación de este sistema permitió la creación del primer dispositivo de monitoreo de glucosa.
El sensor de glucosa-oxidasa es aún el más ampliamente utilizado, aunque se han agregado
muchas mejoras desde 1960. Durante la década pasada, técnicas de manufactura, inicialmente
desarrollada por los circuitos integrados, han hecho posible la producción de electrodos, cientos
o miles de veces más pequeños, debajo de 100µm [1].
Los biosensores en el mercado representan un campo de expansión rápida, en un ritmo
estimado del 60% anual, impulsado principalmente por la industria de la salud [13], acompañada
de otras áreas, tales como calidad de la comida [14] y monitoreo del ambiente [15].
Los biosensores son empleados para estudiar las interacciones entre una molécula de interés
(analito) y una molécula de bioreconocimiento. La especificidad del biosensor depende del
reconocimiento de las moléculas mencionadas. La sensibilidad de un biosensor depende del
uso de las biomoléculas de reconocimiento, su inmovilización sobre la superficie del biosensor y
del sistema de detección. Por ello, para explotar la interacción a través del bioreconocimiento,
la arquitectura del biosensor también debe suprimir cualquier interacción no espećıfica.
El sistema electrónico se utiliza para adquirir la señal del transductor, acondicionarla para
procesarla, almacenarla, mostrar el resultado y comunicarla si es necesario.
1.2. Clasificación de los biosensores 3
Un biosensor exitoso debe cumplir con las siguientes caracteŕısticas [1]:
La capa de bioreconocimiento debe ser altamente espećıfica para el propósito del análisis.
La respuesta debe ser correcta, precisa y reproducible sobre un rango útil.
Ser libre de ruido eléctrico.
Si el biosensor será utilizado para monitoreo invasivo en situaciones cĺınicas, la prueba
debe ser pequeña y biocompatible.
La sensibilidad y ĺımite de detección (LoD, Limit of detection) de un biosensor determina
su desempeño. El LoD es la concentración más pequeña de analito detectable con una
precisión especificada o reproducible. Los biosensores tienen un curva de calibración, la cual
corresponde a la respuesta que tiene a determinada concentración de analitos en una muestra.
Una concentración puede ser determinada a través de una extrapolación en una gráfica de
concentración vs unidad de medición, tal como se muestra en la Figura 1.2. La sensibilidad del
biosensor es el cambio de concentración más pequeño que el biosensor es capaz de detectar,
la cual está dada por la pendiente de la curva de calibración. El rango en el cual el sensor es
sensible, se llama rango dinámico.
Curva de calibración
Rango dinámico
U
ni
da
d 
de
 m
ed
ic
ió
n
Concentración
Figura 1.2: Curva de calibración de un biosensor.
1.2. Clasificación de los biosensores
La clasificación de los biosensores se puede realizar atendiendo a diferentes criterios, tales
como: los receptores utilizados, la metodoloǵıa para la inmovilización de dichos receptores o el
tipo de transductor utilizado; este último criterio es el más utilizado [16]. Los transductores
pueden ser:
Piezoeléctricos: aquellos que transforman un cambio de masa que se da sobre el electrodo
modificado, en un cambio de frecuencia de resonancia.
Electroqúımicos; aquellos que transforman una interacción electroqúımica entre el analito
y el electrodo en una señal eléctrica.
Ópticos; aquellos que transforman la interacción de un analito con el receptor en una señal
óptica.
4 Biosensores
1.2.1. Biosensores piezoeléctricos
El cuarzo es un cristal que experimenta el efecto piezoeléctrico, el cual tiene aplicaciones
en osciladores, sensores, actuadores, etc. La relación entre el voltaje aplicado y la deformación
mecánica es conocida, lo cual permite probar resonancia acústica por medios eléctricos. El
fundamento teórico para el uso de la piezoelectricidad fue postulado por Raleigh en 1885, pero
los hermanos Curie fueron los primeros en describir dicho fenómeno[17]. Ellos observaron que se
generaba un potencial eléctrico entre dos superficies deformadas si se ejerćıa presión sobre las
placas de cuarzo en una dirección particular. Sin embargo, el uso de dispositivos piezoeléctricos
como sensores de qúımica anaĺıtica fue hasta que Sauerbrey describió la relación frecuencia-masa
[18].
Cuando un campo eléctrico oscilante se aplica a través del cristal, induce una onda acústica
que se propaga a través de él. En una microbalanza de cristal de cuarzo (QCM, Quartz Crystal
Microbalance), la onda acústica se propagará en dirección perpendicular a la superficie del
cristal; para hacer esto posible, el cristal debe ser cortado en una orientación espećıfica con
respecto a los ejes del cristal [19].
Cuando se deposita una peĺıcula delgada sobre la superficie del cristal cambia la frecuencia
de resonancia en proporción a la masa de la peĺıcula. Se alcanza una oscilación resonante cuando
se incluye el cristal en un circuito de oscilación, donde las oscilaciones eléctricas y mecánicas
son cercanas a la frecuencia fundamental del cristal, el cual depende del grosor de la oblea,
su estructura qúımica, su forma y su masa. El grosor del cristal determina la frecuencia de
resonancia; entre más delgado es el cristal, la frecuencia de resonancia es mayor y el sensor es
más sensible, sin embargo son más frágiles. Algunos factores que pueden influenciar la frecuencia
de oscilación, como el grosor, la densidad y el módulo de corte del cuarzo, que son constantes,
y las propiedades f́ısicas del medio adyacente (densidad o viscosidad del aire o ĺıquido), por lo
tanto, los cambios en la frecuencia de resonancia están relacionados con la cantidad de masa
acumulada sobre el cristal.
Por lo tanto, para la detección de analitos en el aire, el cambio de frecuencia esta relacionado
simplemente con el cambio en la masa (ecuación 1.1).
∆f α K∆m (1.1)
Donde ∆f es el cambio en la frecuencia fundamental de resonancia del cristal (f), K es una
constante que se refiere a la frecuencia base del cristal (−2.3x106f 2/A) y el área cubierta (A),
∆m es la masa del material depositado.
Cuando el cristal entra en contacto con un ĺıquido, la frecuencia de resonancia cambia debido
al acoplamiento de la superficie del cristal y el ĺıquido. La oscilación en la interfaz genera un flujo
laminar plano en el ĺıquido, el cual causa un decremento en la frecuencia proporcional a (ρη)1/2
donde: ρ y η son la densidad y la viscosidad del ĺıquido; ρq y ηq, la densidad y la viscosidad del
cuarzo. Por tanto, la ecuación 1.1 se puede reescribir como (ecuación 1.2):
∆f = f
3/2
0
(
ρη
πηqρq
)1/2
(1.2)
Hay dos tipos de sensores disponibles, los de onda acústica superficial (SAW, Surface Acustic
Wave) y cristales piezoeléctricos (PZ, Piezoelectric). Los dispositivos SAW pueden operar con el
1.2. Clasificación de los biosensores 5
principio de propagación de onda de Raleigh o como un dispositivo piezoeléctrico. El dispositivo
PZ en cambio sigue la ecuación 1.1. En su nivel más simple, los dispositivos PZ se utilizan para
determinar la cantidad de masa que se absorbe sobre una superficie activa. Los materiales que se
inmovilizan en la superficie del cristal mediante adsorción o inmovilización qúımica, determinan
la especificidad y selectividad del sensor.
Los cristales SAW oscilan a frecuencias mayores que los cristales PZ. Teóricamente los
dispositivos SAW deben ser más sensibles, sin embargo esto se ve disminuido por el requerimiento
de un peĺıcula muy delgada de depósito.
Una QCM mide los cambios en la masa absorbidas por unidad de superficie de un electrodo
mediante la medición del cambio en la frecuencia de un resonador de cristal de cuarzo. La QCM
se puede utilizar bajo vaćıo, en la fase gaseosa y, más recientemente, en ambientes ĺıquidos
[20, 21].
Debido a la posibilidad de medir frecuencias con alta precisión, algunos sistemas comerciales
son diseñados para medir cambios de masa hasta de 100µg, con una resolución de ng. Los ĺımites
de detección que se pueden alcanzar con estos cristales de cuarzo están alrededor de 10−9kg
[22]. Además de medir la frecuencia, se puede medir la disipación para ayudar al análisis. La
disipación es un parámetro de cuantificación de amortiguación del sistema y se relaciona con
las propiedades de visco-elasticidad de una muestra.
Los primeros biosensores piezoeléctricos, utilizados para la determinación de concentración
de los correspondiente anticuerpos, fueron cristales recubiertos de ant́ıgeno [23]. Desde entonces,
se ha convertido en un práctica común en biosensores el uso de anticuerpos [24, 25, 26, 27] y
enzimas [28] como un recubrimiento espećıfico para el análisis en fase ĺıquida, por el contrario,
este no ha sido el caso para el análisis en fase gaseosa.
En la fase gaseosa, algunas aplicaciones incluyen: análisis de drogas [28], sensor de olores
[29, 30] y detección de explosivos [31], entre otros.
El fundamento teórico y el principio de operación de los biosensores piezoeléctricos es
relativamente simple; sin embargo, es importante considerar que cuando se utiliza la forma
simple de la ecuación 1.1, puede existir una diferencia entre la frecuencia de corrimiento predicha
y la obtenida experimentalmente; debido a que dicha ecuación fue derivada para depósitos de
peĺıcula delgada monocapa. Además de los biosensores piezoeléctricos, se encuentran los sensores
electroqúımicos que se describen a continuación.
1.2.2. Biosensores electroqúımicos
Las técnicas electroanaĺıticas se ocupan de la interacción entre la electricidad y la qúımica,
es decir, las mediciones de las magnitudes eléctricas, como la corriente, el potencial o la carga y
su relación con los parámetros qúımicos [3]. El uso de tales mediciones para fines anaĺıticos tiene
una amplia gama de aplicaciones, incluyendo monitoreo ambiental, control de calidad industrial
y análisis biomédico.
Los biosensores electroqúımicos proveen una forma de analizar el contenido de una muestra
biológica debido a la conversión directa de un evento biológico a una señal electrónica. Con ello se
pueden cuantificar procesos biológicos o bioqúımicos, los cuales son importantes en aplicaciones
médicas y biotecnológicas. La sensibilidad del sensor depende de la geometŕıa de la superficie, el
mecanismo de transducción y las moléculas receptoras de reconocimiento. Debido a esto, se han
invertido esfuerzos en la reducción de las dimensiones de los sensores para aumentar la relación
señal-ruido.
El principio de funcionamiento de los biosensores electroqúımicos, se basa en la detección
6 Biosensores
electroqúımica de los immunoagentes o marcadores tales como enzimas, iones metálicos u otros
compuestos electroactivos [32].
A diferencia de muchas mediciones qúımicas, que involucran soluciones homogéneas
en bulto, los procesos electroqúımicos tienen lugar en la interfase electrodo-solución. Los
biosensores electroqúımicos emplean dos tipos principales de mediciones electroanaĺıticas que
son potenciométricos y potenciostáticos. Ambos tipos requieren al menos dos electrodos
(conductores) y una solución de muestra de contacto (electrolito), que constituyen la celda
electroqúımica. La superficie del electrodo es, por lo tanto, una unión entre un conductor
iónico y un conductor electrónico. Uno de los dos electrodos responde al analito objetivo
y se denomina el electrodo de trabajo. El segundo, denominado electrodo de referencia, es
de potencial constante, es decir, independiente de las propiedades de la solución. Las celdas
electroqúımicas pueden clasificarse como electroĺıticas (cuando consumen electricidad de una
fuente externa) o galvánicas (si se utilizan para producir enerǵıa eléctrica).
Las técnicas de potencial controlado (potenciostático) se ocupan del estudio de los procesos
de transferencia de carga en la interfaz electrodo-solución y se basan en situaciones dinámicas, es
decir, cuando existe un flujo de corriente. En estas técnicas, se utiliza el potencial del electrodo
para derivar una reacción de transferencia de electrones y se mide la corriente resultante. El papel
del potencial es forzar a las especies qúımicas a ganar o perder un electrón, es decir, a reducirse
u oxidarse, respectivamente. Por consiguiente, la corriente resultante refleja la velocidad a la que
los electrones se desplazan a través de la interfaz electrodo-solución. Por esta razón, las técnicas
potenciostáticas pueden medir cualquier especie qúımica que sea electroactiva, es decir, que se
pueda reducir u oxidar.
A pesar de que los biosensores electroqúımicos pueden utilizar una variedad de elementos
de reconocimiento, utilizan predominantemente enzimas, debido a sus capacidades de unión
espećıfica y a la actividad biocataĺıtica. Los inmunosensores, por su parte, utilizan anticuerpos
o ant́ıgenos para monitorear eventos de unión en reacciones electroqúımicas.
Los biosensores electroqúımicos son robustos, poseen un amplio rango de linealidad y tiempos
de respuesta cortos. Los sistemas de procesamiento de señales requeridos son relativamente
económicos, fáciles de manejar y de miniaturizar; y además son de uso común en la mayoŕıa de
laboratorios de análisis.
En electroqúımica, la reacción bajo estudio podŕıa generar: una corriente medible
(amperométrico), un potencial medible o una acumulación de carga (Potenciométrico) o
alterar las propiedades conductoras de un medio (conductimétrico) entre electrodos. Además,
existen otras técnicas de detección como impedimétricas, que miden impedancia (resistencia
y reactancia), y efecto de campo, los cuales utilizan la tecnoloǵıa usada por los transistores
para medir una corriente, que es el resultado de un efecto potenciométrico en la compuerta
del electrodo. Entonces, existen tres grupos de transductores utilizados en los biosensores
electroqúımicos, según la técnica utilizada para obtener la información de la muestra:
conductimétricos, potenciométricos y amperométricos.
1.2.2.1. Conductimétricos
Los biosensores conductimétricos, se basan en la medida del cambio de conductividad
provocado por el analito, ya sea en la solución de medida o en la membrana selectiva. En
este tipo de sensores la conductividad (Λ) es proporcional a la concentración de iones (C) según
la ecuación 1.3.
1.2. Clasificación de los biosensores 7
Λ =
k
C
(1.3)
donde: k, es la conductividad espećıfica [S/cm2] de la solución o de la membrana selectiva;
y C, la concentración de iones [mol/cm3]. En este tipo de sensores, se realiza la medición de la
resistividad con una señal de corriente directa (DC, Direct Current), sin embargo, para realizar
mediciones de impedancia se utiliza, una señal de corriente alterna (AC, Alternating Current)
[33]. La capacidad de medir impedancia posibilita el desarrollo de biosensores, en los cuales los
cambios en las propiedades dieléctricas en la superficie de un electrodo puede ser detectada. La
unión de analitos a elementos de afinidad inmovilizados se pueden detectar directamente sin la
necesidad de marcadores. Estos cambios se pueden determinar midiendo la impedancia eléctrica
[34]. Estos biosensores han sido utilizados para detectar ant́ıgenos - anticuerpos [35], protéınas
[33], iones metálicos [36] y fragmentos de DNA [37]; aśı como para caracterizar los componentes
de una muestra sangúınea humana [38] o glucosa en una muestra de sangre humana [39, 40].
1.2.2.2. Potenciométricos
Esta técnica consiste en la determinación de una diferencia de potencial eléctrico en
condiciones de circuito abierto entre un electrodo de trabajo y uno de referencia; la medida
de ésta diferencia se relaciona con la concentración del analito de acuerdo a la ecuación de
Nersnt 1.4
E = E0 +
RT
nF
ln
(
ai + Σi,jk
pot
i,j a
Zi/Zj
j
)
(1.4)
donde: ai, es la actividad del ion principal; aj, la actividad del ion interferente; Zi y Zj, son
las cargas de los iones principal e interferente, y kpot
i,j , es el coeficiente de selectividad.
Existen dos tipos de procesos que pueden conducir corrientes en una interfase electrodo-solución:
en el primero, hay una transferencia directa de electrones v́ıa una reacción de oxidación en un
electrodo y, en el segundo, una reacción de reducción. A los procesos de este tipo se les llama
procesos faradaicos, porque están gobernados por la ley de Faraday, la cual establece que la
extensión de una reacción qúımica que se efectúa en un electrodo es proporcional a la intensidad
de corriente, llamada corriente faradaica (La reacción de 1 mol de sustancia implica un cambio
de n × 96487C). La corriente faradaica es una medida directa de la velocidad de la reacción
redox.
Los inmunosensores potenciométricos se basan en un cambio en el potencial que se produce
entre un electrodo de trabajo y uno de referencia, como resultado de la interacción espećıfica
entre un anticuerpo y su ant́ıgeno. Este tipo de sensor utiliza el efecto de la concentración sobre
la relación intensidad-potencial. Esta relación depende de la velocidad a la que el analito es
llevado a la superficie del electrodo (transferencia de masa) y de la cinética de la reacción de
transferencia en la superficie del electrodo. Una de las principales desventajas de este tipo de
detección es el cambio, en el orden de decenas de milivoltios, en el potencial que surge de la
interacción entre un anticuerpo y su ant́ıgeno [32]. Por otra parte, las interferencias de la matriz
de muestras, pueden prevenir que esta pequeña señal se detecte correctamente. Por lo tanto,
estos sensores a menudo tienen una fiabilidad y sensibilidad comprometida.
8 Biosensores
1.2.2.3. Voltametŕıa ćıclica
La voltametŕıa es una técnica electroqúımica que se basa en la medición de la corriente
que se produce en una celda electroqúımica en condiciones de polarización de concentración, es
decir, cuando se aplica un potencial a la celda, para hacer que una reacción tenga lugar a una
velocidad apreciable. La voltametŕıa ćıclica (CV, Cyclic Voltammetry) es una técnica utilizada
en el estudio de los procesos de oxidación y reducción en diferentes medios, de los procesos
de adsorción sobre superficies y de los mecanismos de transferencia de electrones en electrodos
qúımicos modificados [2].
En voltametŕıa se aplica una señal de excitación de potencial variable a un electrodo de
trabajo (WE, Working Electrode) en una celda electroqúımica. Esta señal de excitación causa
como respuesta una corriente caracteŕıstica, que es la cantidad mensurable en este método. En
la Figura 1.3 se muestran las formas de cuatro de las señales de excitación más comunes en
voltametŕıa, aunque la clásica es el barrido lineal que se muestra en la Figura 1.3a, en la que
el voltaje que se aplica a la celda aumenta linealmente (usualmente de 2V a 3V ) en función
del tiempo. La corriente que se genera en la celda se registra en función del tiempo y el voltaje
aplicado.
(a) (b) (c) (d)
V
ol
ta
je
[v
ol
ti
os
]
Tiempo[s]
V
ol
ta
je
[v
ol
ti
os
]
V
ol
ta
je
[v
ol
ti
os
]
V
ol
ta
je
[v
ol
ti
os
]
Tiempo[s] Tiempo[s] Tiempo[s]
Figura 1.3: Señales de excitación en voltametŕıa: (a) barrido lineal, (b) Pulso diferencial, (c) onda cuadrada y
(d) triangular.
En la Figura 1.3(b,c) se muestran dos señales de excitación pulsados. En estos casos la
corriente se mide en el tiempo de vida de dichos pulsos y se registra en función del tiempo.
Con la forma de onda triangular que se muestra en la Figura 1.3d, el potencial vaŕıa en forma
ćıclica entre dos valores; primero aumenta hasta un máximo y después disminuye con la misma
pendiente hasta su valor original. Mientras este proceso se repite, la corriente se mide y registra
en función del tiempo.
En un experimento de voltametŕıa ćıclica, el potencial del electrodo de trabajo con respecto
al electrodo de referencia es barrido linealmente con respecto al tiempo, mediante una señal
triangular, tal como de muestra en la Figura 1.3d (Voltametŕıa ćıclica). Este proceso se conoce
como tasa de muestreo y se especifica en voltios por segundo (V/s).
En una medición electroqúımica t́ıpica, llevada a cabo en una celda electroqúımica, se aplica
un potencial de escaneo, mediante una fuente de voltaje (VS), entre el contraelectrodo (CE,
Counter Electrode) y el electrodo de trabajo (WE, Working Electrode); el potencial (E ) se mide
entre el WE y el electrodo de referencia (RE, Reference Electrode) con un volt́ımetro (VM) y el
voltaje total (VS) se ajusta para mantener el potencial deseado en el WE con respecto al RE ;
y la corriente se mide entre el WE y el CE con un ampeŕımetro (AM), tal como se muestra en
la Figura 1.4.
La Figura 1.5 muestra el diagrama electrónico de un potenciostato diseñado con
amplificadores operacionales (OpAmp).
La celda consta de tres electrodos sumergidos en una solución que contiene al analito y un
exceso de un electrolito no reactivo (electrolito soporte). Las dimensiones del WE son de tamaño
1.2. Clasificación de los biosensores 9
AM
VM
RE
CE
WE
VS Celda
electroquímica
i E
Figura 1.4: Circuito electrónico simplificado para hacer voltametŕıa ćıclica.
reducido con el objetivo de intensificar su tendencia a ser polarizado. El RE, por lo general, es
de calomel saturado o de plata-cloruro de plata. El CE es a menudo una espiral de alambre de
platino. La fuente de la señal es un generador de voltaje de barrido lineal (VS), Figura 1.4, que
alimenta a un circuito potenciostático similar al que se muestra en la Figura 1.5. La impedancia
de entrada del OpAmp que contiene al electrodo de referencia es tan grande que a través de
él no circula corriente. Por lo tanto la corriente de la fuente circula del CE al WE. Además,
el circuito de control ajusta la corriente, de manera que el potencial entre el RE y el WE es
idéntico al voltaje de salida del generador de señales. La corriente resultante se convierte en
voltaje a través de un circuito de transimpedancia. Finalmente, este voltaje se registra a través
del tiempo por el sistema de adquisición de datos y se grafica en un voltagrama, tal como se
muestra en la Figura 1.6.
Generador
de señales
+
-
+
-
+
-
Sistema de adquisición
de datos
A
B
C
CE
WERE
Circuito de
control
Circuito de
transimpedancia
Celda electroquímica
R
R R
Figura 1.5: Circuito electrónico de un potenciostato.
Para obtener las mediciones necesarias y construir un voltagrama como el que se muestra
en la Figura 1.6, se puede emplear el siguiente procedimiento:
Seleccionar el potencial E para RE con respecto a WE.
Ajustar el voltaje de la celda (CE a WE) para obtener el voltaje deseado E (Control en
lazo cerrado).
Medir la corriente (i).
Seleccionar un nuevo voltaje (E) y repetir el procedimiento hasta que el barrido se
complete. Cuando el procedimiento es un barrido simple entre dos potenciales, se conoce
como voltametŕıa de barrido lineal. Cuando el barrido se configura de tal modo que cuando
se alcanza un potencial y luego el barrido es invertido, se conoce como voltametŕıa ćıclica.
Graficar los resultados.
10 Biosensores
Epa
Epc
E3
E1,E4, E2
Voltaje[V]
C
o
rr
ie
n
te
 (
i)
 [
m
A
]
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1
0
0.2
0.4
0.6
0.8
-0.2
-0.4
-0.6
-0.8
Oxidación
Reducción
Figura 1.6: Ejemplo de voltagrama.
Una vez que el experimento se completa, se grafica la corriente i obtenida contra el voltaje,
obteniendo la gráfica que se conoce como voltagrama. El ejemplo de voltagrama que se muestra
en la Figura 1.6 tiene 4 vertices donde: E1 , es el potencial de inicio; E2 y E3, potenciales de
conmutación; y E4, potencial final. El pico de voltaje en la forma de onda son los potenciales
anódicos (Epa) y catódico (Epc), los cuales dependen del área de contacto de los electrodos
con el electrolito soporte y de la velocidad de barrido de voltaje. En este ejemplo, el escaneo
inicia en E1 y se hace cada vez más positivo causando que la corriente anódica se incremente
rápidamente hasta el pico de potencial anódico (Epa). En E2, el potencial de escaneo conmuta
a negativo para invertir el barrido. A medida que el electrodo se reduce, la corriente catódica se
hace más negativa. El pico de potencial catódico ocurre en Epc. En el tercer potencial, E3, la
dirección se invierte de nuevo y el voltaje se barre hasta alcanzar E4. A partir de este barrido,
se puede obtener y analizar información importante sobre el experimento.
Los microelectrodos se fabrican con diferentes materiales como: fibra de carbono, platino,
oro y plata. El material de dichos electrodos se elige de manera que permitan la reacción
electroqúımica, sin participar en el proceso, por lo que generalmente se eligen materiales inertes.
Además, si tienen forma de alambre o fibra, se les pueden incorporar otros materiales.
Una de las caracteŕısticas principales que debe presentar un electrodo de referencia, es que
sea no polarizable, es decir, que su potencial no se vea alterado como consecuencia de los cambios
en la interfase, debido al paso de una corriente apreciable.
Uno de los electrodos de referencia muy empleado es el electrodo de plata-cloruro de plata
(Ag/AgCl), el cual se puede preparar utilizando un alambre de plata puro, sobre el cual se
realiza un depósito electroĺıtico de AgCl, por un tiempo de 10 minutos, en una solución Cloruro
de potasio(KCl) o ácido clorh́ıdrico (HCl) 0.1 M. Otra forma de prepararlo es a través de la
reducción de óxido de plata (AgO) en un horno, a partir de una pasta húmeda de este óxido
que recubre un alambre de Platino(Pt), tal como se preparan los electrodos comerciales. este
procedimiento es considerado el más adecuado para la preparación de este tipo de electrodos.
Los electrodos de trabajo pueden ser de carbono v́ıtreo, pasta de carbono, oro, cobre, ńıquel,
platino u otro material.
De manera general, los electrodos se eligen según la aplicación en la que se requieran,
considerando la composición de la solución a la que son expuestos y el intervalo de potenciales
1.2. Clasificación de los biosensores 11
que se espera obtener de la reacción. Aśı, por ejemplo, para medir glucosa se pueden emplear
electrodos de oro, plata, plata-cloruro de plata, platino, carbón, u otro material que no participe
en la reacción electroqúımica, es decir un material inerte. La glucosa se oxida a un potencial de
0.7V y por lo tanto la celda (en este caso la muestra entre los electrodos) estará expuesta a un
potencial similar.
1.2.2.4. Amperométricos
Los biosensores amperométricos basan su funcionamiento en la medición de una corriente
eléctrica, producida por intercambios electrónicos entre el sistema biológico y un electrodo
mantenido a un potencial constante. La amperometŕıa es una técnica en la que se registra
una corriente en función de la concentración de un analito en una muestra.
Los biosensores amperométricos emplean electrodos con enzimas inmovilizadas en su
superficie, lo cual los hace selectivos. Sin embargo, su buen funcionamiento depende en gran
medida de la inmovilización de la enzima, por ello dicha inmovilización debe permitir un ı́ntimo
contacto entre la enzima y el transductor, manteniendo inalterable, en medida de lo posible,
la estabilidad de dicho sistema de reconocimiento biológico. Los métodos de inmovilización de
enzimas comprenden métodos f́ısicos, fundamentalmente por adsorción o por atrapamiento, y
métodos qúımicos, ya sea mediante una unión covalente o por entrecruzamiento (crosslinking)
[41].
Los biosensores amperométricos emplean generalmente un par de electrodos, uno de trabajo
y otro de referencia. En el electrodo de trabajo se produce una corriente eléctrica y la respuesta
del sistema es monitoreada a medida que el analito se deposita sobre este electrodo, debido a que
la señal de respuesta cambia. La corriente producida por la oxidación o reducción de especies de
analito electroactivos en una superficie del electrodo se monitorea en condiciones controladas.
La magnitud de la corriente es luego relacionada con la cantidad de analito presente [32].
Los biosensores amperométricos emplean un potencial controlado (señal de voltaje de
corriente directa) para obtener una respuesta de corriente que está relacionada con la
concentración del analito de interés. Este objetivo se logra mediante el monitoreo de la
transferencia de electrones durante el proceso Reducción-Oxidación (redox) del analito (Figura
1.7).
E
le
ct
ro
do Seno de la soluciónCapa superficial
Tranferencia
de electrones
Cambio de
estado físico
Reacción
química
Transferencia
de masa
Cambio de
estado físico
Reacción
química
Transferencia
de masa
OxOx' OxOx'
RedRed' Red' Red
ne-
Figura 1.7: Proceso de reducción-oxidación [2].
En la Figura 1.7 se representan tres regiones de una semicelda electroqúımica, las cuales
incluyen: el electrodo, una capa superficial de la solución adyacente al electrodo y el seno de
la solución o solución en bulto. Cualquiera de las etapas intermedias mostradas en esta figura
podŕıan limitar la velocidad de la reacción global y la magnitud de la corriente. La transferencia
de masa, involucra el movimiento de la forma oxidada (Ox) y reducida (Red) desde el seno de
12 Biosensores
la solución hacia la capa superficial y viceversa. Algunas reacciones de semicelda son precedidas
por una reacción qúımica intermedia en la cual se forman especies Ox’ o Red’, que participan
en el proceso de transferencia de electrones.
En una reacción redox, cuando una especie cede electrones se dice que se oxida; y cuando
gana electrones, se reduce, tal como se muestra en la ecuación 1.5.
O + ne− ⇋ R (1.5)
donde O y R, representan las formas oxidadas y reducidas de la pareja redox; ne−, una
cantidad (n) de electrones (e−). Tal reacción ocurrirá en una región de potencial que hace que la
transferencia de electrones sea termodinámicamente o cinéticamente favorable. Para los sistemas
controlados por las leyes de la termodinámica, el potencial del electrodo puede utilizarse para
establecer la concentración de las especies electroactivas en la superficie (CO(0, t) y CR(0, t))
según la ecuación de Nernst (1.6).
E = EO +
2.3RT
nF
log
CO(0, t)
CR(0, t)
(1.6)
Donde: EO, es el potencial estándar para la reacción redox; R = 8.314JK−1mol−1, la
constante de gas universal; T , la temperatura en grados Kelvin; n, el número de electrones
transferidos en la reacción y; F = 96487C, la constante de Faraday.
La concentración de analitos en la capa superficial del electrodo (concentración de equilibrio),
está determinada por el potencial del electrodo (ecuación 1.6). Sin embargo, tal concentración es
generalmente distinta de la del seno de la solución, lo cual se debe a que, aún cuando el equilibrio
en la superficie del electrodo se alcanza de manera instantánea, la consecución del equilibrio entre
el electrodo y la solución requiere de un tiempo mayor (generalmente de minutos).
En un proceso de reducción-oxidación tienen lugar algunas etapas como: el transporte de
masa de las especies electroactivas a la superficie del electrodo, la transferencia de electrones
a través de la interfase y el transporte del producto a la solución en bulto. La velocidad neta
de la reacción, y por lo tanto la corriente medida, puede ser limitada por el transporte de
masa del reactivo o por la velocidad de transferencia de electrones. El proceso más lento será
el determinante de la velocidad, además, la velocidad también puede depender del potencial
empleado en el experimento. Cuando la reacción global es controlada únicamente por la
velocidad a la que las especies electroactivas alcanzan la superficie, se dice que la corriente
está limitada por el transporte de masas.
El transporte de masas ocurre de tres formas distintas (Figura 1.8).
(a) (b) (c)
E
le
ct
ro
do
Se
no
 d
e 
la
 s
ol
uc
ió
n
E
le
ct
ro
do
Se
no
 d
e 
la
 s
ol
uc
ió
n _
_
_
E
le
ct
ro
do
+
+
+
+
_
_
_
_
_
_
_ Se
no
 d
e 
la
 s
ol
uc
ió
n
Figura 1.8: Tres formas de transporte de masa (a) difusión, (b) convección y (c) migración [3].
Difussión: Movimiento espontáneo bajo la influencia del gradiente de concentración, desde
regiones de concentración alta a regiones de concentración baja (Figura 1.8a).
1.2. Clasificación de los biosensores 13
Convección: Movimiento f́ısico asociado con la agitación, el flujo de la solución, la
rotación o vibración del electrodo. La convección también puede ocurrir naturalmente
como resultado de los gradientes de densidad (Figura 1.8b).
Migración: Movimiento de part́ıculas cargadas a lo largo de un campo eléctrico, es decir,
donde la carga es llevada a través de la solución por iones (Figura 1.8c).
El flujo (J), una medida de la velocidad del transporte de masa en un punto fijo, se define
como el número de moléculas que penetran en una unidad de área en un plano imagnario en una
unidad de tiempo y se expresa en unidades de [mol · cm2 · s−1]. El flujo al electrodo se describe
matemáticamente por una ecuación diferencial, conocida como la ecuación de Nernst-Planck
(1.7), dada aqúı para una dimensión.
J(x, t) = −D
∂C(x, t)
∂x
− zFDC
RT
∂φ(x, t)
∂x
+ C(x, t)V (x, t) (1.7)
Donde: D es el coeficiente de difusión (cm2/s); ∂C(x, t)/∂x, el gradiente de concentración
a una distancia x en un tiempo t; ∂φ(x, t)/∂x, el gradiente de potencial; z y C, la carga y la
concentración de las especies electroactivas; V (x, t), la velocidad hidrodinámica en la dirección
x; R, la constante de gas universal; T , la temperatura en grados Kelvin; y F , la constante de
Faraday. En un medio acuoso, D está en al rango de 10−5 y 10−6 [cm2/s]. La corriente i, es
directamente proporcional al flujo y al área superficial (A) del electrodo (ecuación 1.8).
i = −nFAJ (1.8)
Tal como se indica en la ecuación 1.7, la situación es compleja cuando los tres modos de
transporte ocurren de manera simultánea, por ello, es complicado relacionar la corriente a la
concentración de analito. Esto puede simplificarse suprimiendo la electromigración mediante la
adición de un exceso de sal inerte. Esta adición de una alta concentración del electrólito de
soporte (en comparación con la concentración de iones electroactivos) ayuda a reducir el campo
eléctrico aumentando la conductividad de la solución. Los efectos de convección se pueden
eliminar usando una solución quiescente. En ausencia de efectos de migración y convección, el
movimiento de las especies electroactivas está limitado por la difusión. La reacción que ocurre
en la superficie del electrodo genera un gradiente de concentración adyacente a la superficie,
que a su vez da lugar a un flujo de difusión. Las ecuaciones que rigen los procesos de difusión
son, por lo tanto, relevantes para muchos procedimientos electroanaĺıticos.
De acuerdo con la primera ley de Fick (1.9), la velocidad de difusión (el flujo) es directamente
proporcional a la pendiente del gradiente de concentración.
J(x, t) = −D
∂C(x, t)
∂x
(1.9)
Combinando las ecuaciones 1.8 y 1.9 se tiene una expresión general para la respuesta en
corriente (ecuación 1.10)
i = −nFAD
∂C(x, t)
∂x
(1.10)
Por lo tanto, la corriente es proporcional al gradiente de concentración de las especies
electroactivas. Como se indica por las ecuaciones anteriores, el flujo de difusión depende del
tiempo. Tal dependencia es descrita por la segunda ley de Fick (para la difusión lineal) (1.11):
14 Biosensores
∂C(x, t)
∂t
= D
∂2(C(x, t))
∂x2
(1.11)
Esta ecuación refleja la velocidad de cambio de la concentración con respecto al tiempo entre
planos paralelos en los puntos x y x+ dx, que es igual a la diferencia de flujo en los dos planos.
La segunda ley de Fick es válida para las condiciones asumidas, es decir, planos paralelos entre
śı y perpendiculares a la dirección de difusión, espećıficamente, condiciones de difusión lineal.
En general, las leyes de Fick describen el flujo y la concentración de las especies electroactivas
como funciones de posición y tiempo.
En el caso del presente trabajo, se utilizaron electrodos con una geometŕıa cuadrada y,
cuando estos se ensamblaron, se formaron dos electrodos paralelos, entre los cuales se formo un
canal para el transporte de la muestra; estos detalles se muestran en el caṕıtulo 3.
Debido a que en los sensores amperométricos se monitorea la corriente producida por el
proceso redox mencionado, estos se pueden interconectar mediante un amplificador operacional,
en una configuración conocida como transimpedancia. En el circuito empleado en el presente
trabajo, se aplica una diferencia de potencial al electrodo de trabajo (∼ 0.7V ), para ayudar a
transportar el reactivo a la superficie del electrodo, ya que la difusión, convección o migración
son insuficientes, además, favorece el proceso de oxidación-reducción. De esta manera las señales
de corriente se pueden transformar en una señal de voltaje y pueden ser léıdas y procesadas
mediante algún microcontrolador comercial.
Los biosensores amperométricos son robustos y fáciles de miniaturizar, por lo que se pueden
emplear volúmenes de muestra en el orden de los µL; además, pueden ser empleados en
biofluidos turbios con compuestos ópticamente absorbentes y fluorescentes, proporcionando aśı
una oportunidad para analizar mezclas con diversos componentes, tales como fluidos biológicos
para el diagnóstico de enfermedades o monitoreo del estado de pacientes. A pesar de estas
ventajas, los biosensores amperométricos tienen baja estabilidad, baja relación señal-ruido,
rango dinámico limitado, y no permiten la identificación única de respuesta con el evento
bioqúımico [1].
1.2.2.5. Espectroscopia de impedancia electroqúımica
Como se mencionó en las secciones anteriores, los biosensores voltamétricos y amperométricos
miden la corriente en un electrodo como función del potencial o voltaje aplicado al
electrodo-solución; estos métodos emplean una señal de voltaje de corriente directa. En
contraste, los biosensores de impedancia miden el cambio de la impedancia eléctrica en una
interfaz electrodo-solución empleando señales de corriente alterna [42].
La espectroscopia de impedancia electroqúımica (EIS, Electrochemical Impedance Spectroscopy)
se basa en la determinación de los cambios de impedancia mediante el empleo de una señal de
voltaje de AC a una frecuencia fija y la medición de la corriente resultante. Este proceso se
repite para distintas frecuencias. La relación voltaje-corriente proporciona la impedancia [43].
La señal de voltaje empleada, es una onda sinusoidal de AC con amplitudes que pueden estar
entre (5 mVpp a 2 Vpp) sobrepuesta en un potencial de DC. La señal de CA escanea el dominio
de la frecuencia, permitiendo la excitación individual de los diferentes procesos con diferentes
constantes de tiempo. Por lo tanto, los procesos lentos como reacciones qúımicas y procesos
rápidos como conducción iónica se pueden estudiar de forma independiente de esta manera.
El espectro de impedancias se analiza utilizando un modelo equivalente de circuito eléctrico
que incluye capacitores (C), inductores (L) y resistores (R). La impedancia es un término que
1.2. Clasificación de los biosensores 15
describe la resistencia eléctrica de un circuito en corriente alterna y se define por la razón entre
la magnitud de la señal de potencial eléctrico alterno y la magnitud de la señal de corriente
alterna, y el ángulo de fase, tal como se muestra en la ecuación 1.12.
Z = V/I (1.12)
donde: Z, es la impedancia [Ω]; V = ∆V sen(ωt), es valor instantáneo del potencial eléctrico
[V ]; I = ∆Isen(ωt + φ), es valor instantáneo de la corriente eléctrica [A]; ∆E y ∆I , son la
amplitud máxima y ω = 2πf , es la frecuencia angular.
La EIS es una técnica que permite detectar cambios, en un medio ĺıquido y/o en la superficie
del electrodo, que pueden estar relacionados con varios fenómenos, tales como: un cambio
en la concentración de la muestra, un reconocimiento selectivo u otros eventos que pueden
ser dif́ıciles de observar. Además, se puede utilizar para caracterizar propiedades eléctricas
intŕınsecas de cualquier material o solución y su interfaz [44]. El análisis de la impedancia
del sistema observado como una función de la frecuencia y la amplitud de la señal de excitación,
proporciona información cuantitativa acerca de la conductancia, la constante dieléctrica y las
propiedades estáticas de las interfaces de un sistema, y su cambio dinámico debido a fenómenos
de absorción o el cambio de transferencia.
Muchos sensores de afinidad utilizan un sonda de captura que se une a la molécula de
interés, es decir el analito, de manera selectiva. Por lo tanto, si en la interfaz electrodo-solución,
la impedancia cambia debido a dicha captura, se puede asociar dicho cambio de impedancia a
la concentración de analitos en dicha solución.
Algunos sensores miden el cambio de capacitancia en la interfaz electrodo solución, el cual
se debe al cambio del espesor y/o comportamiento dieléctrico debido a la unión entre el analito
y la capa de biorreconocimiento. Por lo tanto, la unión entre el analito y el elemento de
afinidad inmovilizado puede ser detectado sin marcador o mediante alguna reacción, realizando
mediciones de la capacitancia eléctrica o impedancia con un electrodo o un arreglo de electrodos,
tal como se muestra en la Figura 1.9.
Sustrato
Aislante
+ _
Conductor Conductor
+
_
(a) (b)
Elemento de
bioreconocimiento
Elemento de unión
bioespecífico
Solución
Figura 1.9: Biosensor capacitivo (a) sección transversal y (b) electrodo interdigitado.
En la terminoloǵıa electroqúımica, un proceso faradaico es aquel en el que la carga se
transfiere a través de una interfaz, sin embargo, las corrientes transitorias pueden fluir sin
transferencia de carga en procesos no farádicos (por ejemplo, cargando un condensador). En
EIS farádica, una especie redox se oxida y se reduce alternativamente mediante la transferencia
de un electrón hacia y desde el electrodo. Por lo tanto, la EIS farádica requiere la adición de una
especie redox activa y condiciones de polarización de DC. En contraste, no se requiere reactivo
adicional para la EIS no farádica. El término biosensor capacitivo se asigna habitualmente a un
sensor basado en un esquema no farádico [45].
16 Biosensores
En la medición de capacitancia se emplean dos configuraciones de electrodos. La primera
configuración consiste en electrodos interdigitados, en el cuál se realizan mediciones del cambio
en la capacitancia entre dos electrodos con un elemento de reconocimiento inmovilizado entre
ellos (Figura 1.9). La otra configuración, consiste en medir mediante el uso de un potenciostato,
es decir electrodos inmersos en un electrolito tal como se hace en voltametŕıa ćıclica (Subsección
1.2.2.3), con un elemento de reconocimiento inmovilizado en la superficie del electrodo de
trabajo [34]. La configuración que se muestra en la Figura 1.9 puede ser utilizada para medición
de impedancia. En dichos biosensores, la impedancia se ajusta a un modelo eléctrico de una
resistencia-capacitor (ver [42]).
Los biosensores de impedancia requieren un mı́nimo de dos electrodos. El electrodo de
trabajo es usualmente sensibilizado y el electrodo de referencia o contraelectrodo es usualmente
mantenido a un potencial fijo, pero se puede emplear dicho método para un arreglo de
microelectrodos [46].
La inmovilización de biomateriales tales como enzimas, ant́ıgeno/anticuerpo o DNA en la
superficie de los electrodos altera la capacidad de transferencia electrones. Esto permite el
análisis de espectroscopia de impedancia de dichos cambios en la superficie del electrodo debido
a bioreconocimiento. Basado en este principio se han desarrollado biosensores de impedancia
sensibilizados con enzimas para medir urea e inmunoglobulina G [47], glucosa utilizando glucosa
oxidasa [39]; detección de protéınas [48, 49], entre otros ejemplos.
La espectroscopia de impedancia electroqúımica permite la detección de analitos sin
marcadores, debido al cambio de las propiedades eléctricas en la superficie del electrodo; sin
embargo, el uso de marcadores hace espećıfico y selectivo a un sensor, por ello la mayoŕıa de los
sensores utilizan marcadores. La principal ventaja de los sensores sin marcador es el monitoreo
en tiempo real, lo que generalmente no es posible con sensores con marcador, debido a que las
mediciones de impedancia se llevan a cabo una vez que el equilibrio ha sido alcanzado [45].
Los sensores de impedancia se pueden interconectar mediante sistemas electrónicos tales
como amplificadores de instrumentación, circuitos integrados generadores de funciones y
microcontroladores comerciales, para el procesamiento de las señales. Esto permite diseñar
aplicaciones con un tamaño de instrumento pequeño y un costo relativamente bajo.
La principal limitación en la fabricación de biosensores electroqúımicos se debe a la
inmovilización de biomoléculas en la superficie del transductor. Idealmente, esta inmovilización
debe ser perfectamente irreversible y estable en el tiempo, sin desactivar la biomolécula y
preservando una excelente accesibilidad a ella, permitiéndole cierta movilidad conformacional
para permitirle su actividad biocataĺıtica.
1.2.3. Biosensores ópticos
Los biosensores ópticos son una herramienta de análisis con una variedad de aplicaciones
en la investigación biomédica, la salud, la industria farmaceútica y el monitoreo ambiental,
entre otras. Estos sensores son inmunes a la interferencia electromagnética y capaz de realizar
detección multiplexada en el mismo dispositivo. De manera general, existen dos métodos que se
emplean en estos sensores: el primero de ellos consiste en la detección basada en fluorescencia y
el segundo, en una detección sin marcadores.
En la detección basada en fluorescencia tanto el analito como la molécula de bioreconocimiento
están marcados con tintes o colorantes. La intensidad de la fluorescencia indica la presencia del
analito y la intensidad de la interacción entre el analito y las moléculas de bioreconocimiento.
Aunque la detección basada en fluorescencia es muy sensible, con un ĺımite de detección de
1.2. Clasificación de los biosensores 17
hasta de una sola molécula [50], el proceso de marcado es laborioso y puede interferir con la
función de la biomolécula. Además, el analisis cuantitativo presenta un reto debido a que no
pueden colocarse de manera controlada, el mismo número de fluoróforos en cada molécula [51].
En contraste, en la detección sin marcadores, los analitos no están marcados o alterados
y son detectados en su forma natural. Este tipo de detección es relativamente fácil y
económico de realizar y además permite una medición cuantitativa de la interacción molecular.
Adicionalmente, algunas mediciones sin marcadores miden el cambio de ı́ndice de refracción
(RI, refractive index ) inducido por las interacciones moleculares, el cual se relaciona con la
concentración de analitos. Los sensores ópticos sin marcadores incluyen métodos que miden el
ı́ndice de refracción, la absorción óptica y la espectroscoṕıa raman. Los sensores que se basan
en la medición del ı́ndice de refracción pueden detectar el ı́ndice de refracción de la solución
debido al cambio inducido por la unión entre moléculas.
En la Figura 1.10 se muestra un diagrama conceptual del biosensor óptico, en donde se emplea
una molécula de bioreconocimiento tal como un anticuerpo. Los analitos que se encuentran en
la solución buffer se unen a la molécula de bioreconocimiento de la capa superficial entre el
sustrato y la solución, lo cual cambia el ı́ndice de refracción en la superficie del sensor, que
puede ser detectado opticamente como una señal de transducción de sensado. En la mayoria
de los sensores ópticos, la luz de sensado se localiza en la superficie del sensor, con un campo
evanescente que decae en la solución.
Sustrato
Solución
Analito
Molécula de bioreconocimiento
Figura 1.10: Biosensor óptico sin marcador.
Existen distintos arreglos propuestos para los biosensores ópticos sin marcadores, los cuales
incluyen sensores basados en: (1) resonancia de plasmón superficial, (2) interferometŕıa, (3) gúıa
de onda óptica, (4) resonadores de anillo, (5) fibra óptica y (6) cristal fotónico.
1.2.3.1. Resonancia de plasmón superficial
Los biosensores de resonancia de plasmón superficial (SPR, Surface Plasmon Resonance )
fueron empleados primeramente en 1983 [52], desde entonces esta técnica se ha convertido en
una herramienta para el estudio de las interacciones entre moléculas de bioreconocimiento y
analitos. Algunos trabajos describen de manera más extensa este método.
Los metales, además de reflejar la luz, tienen una propiedad óptica menos conocida; bajo
ciertas condiciones la luz puede viajar sobre la superficies metálicas. Esta onda electromagnética
involucra a los electrones libres en los metales. Rufus Ritichie descubrió éstas ondas en los años
50 del siglo pasado [53].
Una SPR es una oscilación de densidad de carga que ocurre en la interfaz de dos medios
con constantes dieléctricas de signos opuestos, tal como un metal (oro o plata) y un dieléctrico
[54]. Los plasmones son explicados clásicamente usando el modelo de Drude de los metales. El
metal es tratado como un cristal tridimensional de iones positivos, junto a un gas de electrones
deslocalizado que se mueve en esta red de iones que forman un potencial periódico [55].
18 Biosensores
En un metal, la luz es reflejada cuando la frecuencia es inferior a la frecuencia de plasma,
debido a que los electrones en el metal apantallan el campo eléctrico incidente. La luz de
frecuencia superior a la frecuencia de plasma es transmitida, debido a que los electrones del
metal no pueden responder tan rápidamente para poder apantallar el campo. En la mayoŕıa de
los metales, la frecuencia de plasma está en el ultravioleta, haciéndolos reflectivos en el rango de
la luz visible. Algunos metales, como lo es el cobre o el oro, presentan transiciones electrónicas
de bandas en el rango visible, por lo cuál algunas longitudes de onda del visible son absorbidas,
emitiendo su color caracteŕıstico [55].
Existen algunos métodos para empleados en la SPR, tales como el acoplamiento con un
prisma (Figura 1.11), una gúıa de onda, una fibra óptica o con una rejilla.
Onda
de luz
Prisma
óptico
Capa
de
metal
Medio dieléctrico
SPR
θ
(a) (b)
Figura 1.11: SPR utilizando acomplamiento con un (a) prisma y (b) gráfica del ángulo θ vs reflectividad.
En la configuración de acoplamiento con prisma, la luz incidente es totalmente reflejada en la
interfaz prisma-metal y genera un campo evanescente que penetra en la capa de metal, con una
intensidad que decae exponencialmente a cero. La luz polarizada que se filtra sobre la superficie
de la peĺıcula de metal, excitará la oscilación de los electrones confinados en ella. La Resonancia
de plasmón superficial se produce en la interfaz recubierta de metal cuando el vector de onda
de la luz incidente coincide con la de los plasmones de superficie en la peĺıcula del metal, dando
como resultado que la intensidad del haz de la luz reflejada disminuya significativamente. El
ángulo incidente a partir de este momento se llama, ángulo de SPR. El ángulo de SPR, es sensible
a los cambios del ı́ndice de refracción; por lo tanto, las variaciones en el ı́ndice de refracción
en la superficie del sensor, inducida por la interacción entre la molécula analito objetivo y el
elemento de reconocimiento biomolecular inmovilizado sobre la superficie del sensor, se pueden
observar como cambios en el ángulo de resonancia [56], lo cual produce una gráfica similar a
la que se muestra en la Figura 1.11b. En este caso se realizó una medición experimental de un
ángulo de resonancia (45.1 grados) de un sistema de SPR [56]. En el ángulo de resonancia, la
constante de propagación del campo evanescente coincide con la onda de plasmón superficial,
tal como se describe en la ecuación 1.13, y como resultado el fotón se acoplará en la onda de
plasmón superficial.
2π
λ
npsinθ = βsp (1.13)
donde: λ, es la longitud de onda incidente; np el ı́ndice de refracción del prisma; θ, el ángulo
de incidencia y; βsp, la constante de propagación de la onda de plasmón superficial.
El acoplamiento con prisma se ha empleado en estudios de diagnóstico, en donde el fenómeno
que se presenta en la superficie de una peĺıcula metálica delgada se modifica al absorber
concentraciones bajas de bioagentes o pequeños cambios ambientales y permiten una detección
óptica relativamente sencilla [57]. Aśı estos sensores se han empleado para detección de aire y
gases del aliento de diferentes personas [56], y glucosa [58], entre otros.
1.2. Clasificación de los biosensores 19
El acoplamiento de gúıas de onda es una alternativa al acoplamiento de prismas. En una gúıa
de onda, la luz se propaga mediante la reflexión total interna y genera un campo evanescente
en la interfaz gúıa de onda-metal, lo cual excita a la onda de plasmón superficial de la misma
forma que la configuración del prisma. Las fibras ópticas se emplean de una forma similar, y en
este caso, se remueve una capa de la fibra y se recubre de una peĺıcula de metal [59]. Además,
las ondas de plasmón superficial pueden ser excitadas mediante acoplamiento de rejillas. En
este caso la luz incide en una rejilla metálica. Si el momento de la luz difractada paralelo a la
superficie de la rejilla, es el mismo que la constante de propagación del plasmón superficial, la
luz se acoplará a la onda de plasmón superficial de la manera como se muestra en la ecuación
1.14.
2π
λ
ndsinθ +
2π
Λ
= ±βsp (1.14)
donde: nd, es el ı́ndice de refracción del medio dieléctrico; m, un entero que representa
el orden de refracción y; Λ, es el periodo de la rejilla. Con el acoplamiento de rejilla, la luz
incide directamente en la superficie metálica, por lo que requiere que el fluido de muestra sea
ópticamente transparente.
Entonces, la detección de analitos con SPR, se lleva a cabo mediante el monitoreo del ángulo
de resonancia [60], gúıa de onda resonante [61] o cambio de intensidad resonante [62].
1.2.3.2. Biosensores basados en interferometŕıa
La interferometŕıa Mach-Zehnder (MZI, Mach Zehnder Interferometer), es una técnica en
la que se hace viajar un haz de luz polarizado, coherente y de una sola frecuencia de un láser a
través de una gúıa de onda, el cual se divide simétricamente en dos caminos en una Y. Uno de los
caminos tiene una ventana sobre ella, lo que permite que el campo evanescente interactúe con la
muestra (área del sensor) mientras que el otro camino sirve como referencia y está protegido de la
muestra con una capa de revestimiento, tal como se muestra en la Figura 1.12. Los dos caminos
se recombinan a la salida, lo que produce un patrón de interferencias con una variación sinusoidal
que depende de la diferencia de los ı́ndices de refracción de los brazos sensor y referencia, y de
la longitud de la interacción, esto se puede relacionar con la concentración del analito a medir.
Un fotodetector puede emplearse para medir la intensidad.
Área de
sensado
Sustrato
Entrada de luz Salida de luz
Brazo de
referencia
Revestimiento
Figura 1.12: Interferómetro de Mach-Zehnder.
Generalmente, la estructura de la gúıa de ondas debe ser de polarización única y modo único
de modo que la interferencia multimodal y de polarización cruzada no aparezcan en la salida.
Cuando se lleva a cabo una reacción bioqúımica en el área del sensor, el camino a través del cual
luz que viaja experimentará un cambio en su ı́ndice de refracción, lo que provoca un cambio de
fase óptico y un cambio en la intensidad luminosa; esto se puede medir con un fotodetector en
base a la ecuación 1.15.
20 Biosensores
I(∆neff ) α cos(∆neffκ0L) (1.15)
donde: ∆neff , es el cambio en el ı́ndice de refracción; κ0, la amplitud del vector de onda y;
L, la distancia entre un dispositivo de carga acoplada (CCD, Charge-Coupled Device) que se
emplea para hacer el sensado y el chip. Usualmente, incrementando la longitud entre el chip y
y el CCD, incrementa la señal de sensado. Sin embargo, debido a la función coseno, el cambio
de la señal en los ĺımites máximo y mı́nimo no es sencillo de resolver, debido a que no es una
relación lineal.
La plataforma del sensor interferométrico proporciona una referencia interna para la
compensación de las fluctuaciones del ı́ndice de refracción y la absorción inespećıfica. Los
sensores interferométricos tienen un rango dinámico más amplio que la mayoŕıa de los otros
tipos de sensores.
El ĺımite de detección es generalmente limitado por el ruido electrónico y mecánico,
inestabilidades de la fuente de luz y el ruido qúımico. El MZI ha sido empleado en aplicaciones
de biosensado, por ejemplo, para medir glucosa [63, 64], con un ĺımite de detección en el ı́ndice
de refracción de 10−5.
Otra técnica utilizada es el interferómetro de Young (YI, Young’s interferometer), que
funciona de manera similar al MZI. En un YI, la luz de polarización única de modo único
y coherente, se acopla a la gúıa de onda, luego se divide en un brazo de referencia y en otro de
detección, pero en lugar de recombinar los brazos como en el MZI, la salida óptica de los dos
brazos se combinan para formar franjas de interferencia en una pantalla de detector, tal como
un CCD. En este caso, la distribución de intensidad(I(χ)), a través de la pantalla (χ), está dado
por la ecuación 1.16
I(χ) = 1 + cos
(
2πnd
λ0f
χ− δ
)
(1.16)
donde: λ0 es la longitud de onda en el vaćıo; n, el ı́ndice de refracción; δ, el corrimiento de
fase debido al cambio en el ı́ndice de refracción; d, la distancia entre los brazos y; f , la distancia
entre la salida del YI y la pantalla. La ecuación muestra que un cambio de fase en el brazo de
referencia provoca un cambio en la posición de las franjas de interferencia.
El primer sensor que mostró la viabilidad de este tipo de sensores fue empleado para medir
el ı́ndice de refracción en ĺıquidos y gases [65], en un trabajo posterior se muestra un ĺımite de
detección de 10−7 unidades de ı́ndice de refracción [66].
Una tercera configuración de interferometŕıa muy similar, que se ha utilizado en biosensores,
es el interferómetro de Hartman (HI, Hartman interferometer). En esta configuración, las
moléculas de funcionalización están modeladas en tiras en la parte superior de una gúıa de
ondas planas, la luz se acopla dentro y fuera de la gúıa de ondas plana usando rejillas. La óptica
se coloca cerca de la salida del chip para crear interferencia entre pares de tiras funcionalizadas.
Este tipo de arreglo ha sido empleado para detectar influenza y salmonela [67].
Aunque los sensores mencionados previamente tienen diferencias en su diseño, su principio de
funcionamiento es similar, la onda guiada experimenta un cambio de fase a medida que su campo
evanescente interactúa con la muestra, por lo tanto tienen un desempeño similar. Existe otro
sensor más llamado de Interferometŕıa de retrodispersión (BI, Backscattering interferometry),
el cual emplea un área de monitoreo más pequeño. El primer sensor empleado, que demuestra
1.2. Clasificación de los biosensores 21
este concepto, utilizó un sensor con una superficie porosa de silicon, en donde tanto la superficie
superior como la parte inferior del sensor poroso sirve como superficie reflectora; por lo que,
cuando los analitos son capturados por las moléculas de bioreconocimiento inmovilizadas en los
poros, se observa un corrimiento en la señal de interferencia. Este sensor se utilizó para medir
concentraciones de DNA con un ĺımite de detección de 2pM [68].
Otro ejemplo de este sensor, es un inmunoensayo de disco biológico (BioCD). En este
trabajo se utilizó un disco reflectante grabado con moléculas de bioreconocimiento, tales como
anticuerpos. El disco se hace girar y entonces puede ser léıdo mientras un rayo láser enfocado
se refleja fuera de la superficie del disco y de las manchas de anticuerpos. Los bordes de las
manchas biomoleculares producen una señal de interferencia. El disco se incuba con la muestra.
Si los puntos de bioreconocimiento capturan a las protéınas, la señal de interferencia cambia
cuando el disco se lee nuevamente después del secado. En este trabajo se logró detectar protéına
con un ĺımite de detección de 100pg/mL [69, 70].
1.2.3.3. Biosensores colorimétricos y fluorescentes
Existe una técnica conocida como ELISA (ELISA, Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)
ó ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas, la cual es una técnica en la que un analito es
capturado por un anticuerpo espećıfico sobre un sustrato y posteriormente marcado con una
enzima.
Existen diferentes configuraciones empleadas en el ELISA tales como: directo, indirecto,
sandwich y competitivo.
El ELISA directo se lleva a cabo mediante los siguientes pasos:
Inmovilizar un ant́ıgeno (Ag, Antigen) por adsorción en una base y lavar para remover las
moléculas que no fueron unidas (Figura 1.13a);
Incubar con un anticuerpo (Ab, Antibody) marcado con una enzima (Figura 1.13b), si los
anticuerpos reaccionan con los ant́ıgenos, el complejo quedará solubilizado, luego de lavar
para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado; y
Agregar un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora y realizar la
lectura visual o colorimétrica del producto final (Figura 1.13c),
(c)(a) (b)
Sustrato
Producto
Enzima
Anticuerpo
Antígeno
Figura 1.13: Pasos de ELISA directo: (a) inmovilización de ant́ıgeno, (b) anticuerpo marcado y (c) adición de
sustrato, detección se señal y cuantificación.
En ELISA colorimétrico convencional, se genera una señal mediante la conversión del sustrato
enzimático en una molécula coloreada (Figura 1.13) y se cuantifica la intensidad del color de
la solución midiendo la absorbancia con un lector de placas. Aunque se puede distinguir entre
solución no coloreada y coloreada a simple vista, esto sólo puede lograrse a altas concentraciones
del analito, por lo tanto, hacer una inspección a simple vista es inadecuada para una detección
22 Biosensores
a bajas concentraciones. Entonces, dicho ensayo se puede incorporar como un transductor en
un biosensor y hacer una detección ópticamente.
El ELISA indirecto se lleva a cabo siguiendo los siguientes pasos:
Inmovilizar un ant́ıgeno por adsorción en una base y lavar para remover las moléculas que
no fueron unidas (Figura 1.14a);
Incubar con un anticuerpo primario (no marcado) y lavar para eliminar los anticuerpos
primarios que no se hayan unido al ant́ıgeno (Figura 1.14b);
Incubar con un anticuerpo secundario marcado con una enzima y lavar para eliminar los
anticuerpos marcados que no hayan reaccionado (Figura 1.14c); y
Agregar un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora y realizar la
lectura visual o colorimétrica del producto final (Figura 1.14d).
(d)(a) (c)(b)
Lavar
Lavar
Sustrato
Producto
Enzima
Anticuerpo primario
Antígeno
Anticuerpo secundario
Figura 1.14: Pasos empleado en el ELISA Indirecto: (a) inmovilización de ant́ıgeno, (b) incubación de
anticuerpo primario, (c) incubación de anticuerpo secundario y (d) adición de sustrato, detección
se señal y cuantificación.
Para realizar el ELISA Sandwich se requiere de dos anticuerpos compatibles que reconozcan
diferentes partes (eṕıtopos) del mismo ant́ıgeno. De manera general, este método consiste en:
Incubar el anticuerpo primario (anticuerpo de captura) en una base (Figura 1.15a);
Inmovilizar el ant́ıgeno durante la incubación, luego los ant́ıgenos libres son removidos a
través de un lavado (Figura 1.15b);
Incubar con un anticuerpo secundario (anticuerpo de detección), marcado con una enzima
y luego los anticuerpos libres son removidos con un lavado (Figura 1.15c); y
Agregar un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora y realizar la
lectura visual o colorimétrica del producto final (Figura 1.15d)
En los casos anteriores, cuanto mayor es la concentración de analitos, la intensidad de la
señal es mayor.
Finalmente, cada uno de los métodos descritos anteriormente se pueden modificar para medir
moléculas basándose en su capacidad para interferir con un ensayo pretitulado conocido. Dichos
ensayos se pueden usar para estudiar ant́ıgenos o anticuerpos y pueden ser competitivos o
inhibidores basándose en las condiciones espećıficas de cada ensayo. En ambos tipos de ensayos,
un sistema pretitulado es desafiado con la presencia de la muestra de ensayo cuya actividad
de unión se determina entonces a partir del grado de la interferencia resultante en el sistema
establecido.
En ELISA por competencia se emplean los siguientes pasos:
1.2. Clasificación de los biosensores 23
(d)(a) (c)(b)
Lavar
Lavar
Sustrato
Producto
Enzima
Anticuerpo primario
Antígeno
Anticuerpo secundario
Figura 1.15: Pasos de ELISA Sandwich: (a) anticuerpo de captura inmovilizado, (b) inmovilización de ant́ıgeno,
(c) anticuerpo secundario marcado y (d) adición de sustrato, detección se señal y cuantificación.
Inmovilizar el anticuerpo primario (anticuerpo de captura) en una base (Figura 1.16a);
Inmovilizar el ant́ıgeno marcado con enzima durante la incubación y luego los ant́ıgenos
libres son removidos a través de un lavado (Figura 1.16b); y
Agregar un sustrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora y realizar la
lectura visual o colorimétrica del producto final (Figura 1.16c).
(c)(a) (b)
Lavar
Sustrato
Producto
Enzima
Anticuerpo
Antígeno
Figura 1.16: Pasos de ELISA por competencia: (a) anticuerpo de captura inmovilizado, (b) inmovilización
de ant́ıgeno y ant́ıgeno marcado con enzima y (c) adición de sustrato, detección se señal y
cuantificación.
En el caso de ELISA por competencia, cuanto mayor es la concentración de analitos, la
intensidad de la señal es menor.
ELISA ha sido utilizada principalmente en inmunoloǵıa para detectar la presencia de
anticuerpos o ant́ıgenos en una muestra [71], para ver la generación de anticuerpos en un
organismo, e incluso para la determinación de la constante de disociación del equilibrio de
ant́ıgeno-anticuerpo en una solución [72].
Aunque existe una gran variedad de sensores y métodos empleados para la detección de un
analito en particular, en la medicina se emplean algunos métodos comunes, como los que se
muestran en la Tabla 1.1[73].
24 Biosensores
Tabla 1.1: Ejemplos de ensayos comunes utilizados en la medicina.
Analito Método de ensayo
Glucosa Biosensor amperométrico
Urea Biosensor potenciométrico
Lactato Biosensor amperométrico
Hepatitis B Inmunoensayo quimioluminiscente
Candida albicans Immunoensayo piezoeléctrico
Colesterol Biosensor amperométrico
Penicilina Biosensor potencométrico
Sodio Electrodo de vidrio selectivo de iones
potasio Electrodo selectivo de intercambio iónico
Calcio Electrodo Ionóforo selectivo de iones
Oxygen Sensor de enfriamiento fluorescente
Insulina ELISA
pH Electrodo de vidrio selectivo de iones
Hasta este punto se han presentado distintos métodos empleados por los biosensores para la
detección de un analito; estos sensores emplean una plataforma en la que se integra una zona de
detección, en la que se inmovilizan las moléculas de bioreconocimiento espećıfico y que se puede
miniaturizar empleando técnicas de fabricación convencionales que se describen en el siguiente
caṕıtulo.
2 — Miniaturizar con microtecnoloǵıa
2.1. Introducción
La miniaturización de dispositivos microestructurados permite incorporar diferentes estudios
en un espacio reducido utilizando volúmenes anaĺıticos muy bajos (∼ µL) [74]. También, el
panel de materiales compatibles con las técnicas a desarrollar es muy amplio, lo que facilita el
desarrollo de biosensores a la medida. El grupo de Whitesides en Harvard siempre ha insistido
en las ventajas de biosensores microflúıdicos y han podido incorporar varios estudios de glucosa
y protéınas en una sola hoja de papel pequeña [75]. En 2010 se publicó un art́ıculo resumiendo
todas las ventajas que los biosensores con microflúıdica pueden presentar para los páıses en
desarrollo (costo, eficiencia, facilidad de desarrollo y utilización, etc.) [76].
Con la miniaturización de biosensores se pueden desarrollar arreglos de electrodos, canales
o gúıas y detectores ópticos de tamaños y formas modulares para realizar estudios utilizando
cantidades reducidas de agente biológico o bioqúımico (∼ µL), además de mejorar la sensibilidad
de los sensores. La miniaturización permite el desarrollo de plataformas que pueden ser utilizadas
para mediciones directas en el sitio de interés.
El crecimiento de la tecnoloǵıa de la microelectrónica y de su miniaturización ha permitido
también el desarrollo de biosensores miniaturizados. Los objetivos principales son los biosensores
implantables o la asociación de varios biosensores con el fin de obtener datos de múltiples analitos
simultáneamente. En particular, es posible fabricar micro-biosensores con inmovilización de
biomoléculas en la superficie de un amplio rango de electrodos, como electrodos interdigitados
(IDT, Interdigitated microelectrodes) o transistores a efecto de campo (FET, Field-Effect
Transistor), gracias al uso de las técnicas de microfabricación.
Como se mencionó en el caṕıtulo anterior, uno de los principales componentes de un
biosensor, es el transductor (ver Figura 1.1), que consta de un bioreceptor y una interfaz
eléctrica, la cual es empleada para recuperar una señal eléctrica del sensor que es procesada
posteriormente. La interfaz eléctrica, electrodos, son necesarios en sensores [77, 78] y biosensores
[79, 80] para obtener señales de componentes no metálicos como analitos biológicos o actividad
celular. Los electrodos son utilizados t́ıpicamente en aplicaciones de voltamperometŕıa [81, 82],
amperometŕıa [78, 83, 84, 85, 86] e impedancia [87]. Para evitar algún tipo de bioactividad
en biosensores, los electrodos pueden estar hechos de materiales como: oro, acero inoxidable,
platino, plata o carbón; y se preparan mediante el empleo de alguna técnica de fabricación.
Los sensores de glucosa, usualmente emplean la técnica de amperometŕıa y al menos un par
de electrodos, que pueden ser de distintos materiales. Trabajos previos han demostrado que se
puede monitorear glucosa e insulina con una respuesta lineal y resoluciones respectivas de 3mM
y 100nM , empleando amperometŕıa y electrodos, gracias a un dispositivo de “sensor dual”[88].
En este caso, la medición no presentaba reactividad cruzada, lo que es normalmente un problema
para los dispositivos tipo “multisensor”. Sin embargo, las corrientes son del orden de pA. Por lo
tanto, en el presente trabajo se propone un sistema electrónico con capacidad para procesar la
25
26 Miniaturizar con microtecnoloǵıa
información de dichos sensores, además de tener la capacidad para medir glucosa en un rango
de 5mg/dL a 300mg/dL e insulina en un rango de 0.025µg/L a 1.5µg/L, de manera dual y en
tiempo real. El rango propuesto se debe a que dichas moléculas se pueden encontrar en fluidos
como: plasma sangúıneo, saliva y orina, en tal concentración. Para miniaturizar estos sensores
se emplearán algunas técnicas de microfabricación que se describen en la sección 2.2.
Como se ha descrito en el caṕıtulo previo, los electrodos utilizados en aplicaciones de
voltamperometŕıa, amperometŕıa e impedancia, pueden estar hechos de materiales distintos y
ser preparados empleando una técnica de microfabricación. Entonces, la metodoloǵıa propuesta
en el presente trabajo es elaborar electrodos de la siguiente manera (Figura 2.1):
Producir una microestructura en un sustrato mediante una técnica de microfabricación
(Figura 2.1a).
Usar la microestructura como un molde para contener un material conductor (Figura
2.1b).
Llenar el molde con un material conductor (Figura 2.1c), y finalmente
Obtener el microelectrodo (Figura 2.1d), tal como se muestra en la Figura 2.1.
(a) (b) (c) (d)
Técnicas de
microfabricación
Figura 2.1: Método para fabricar electrodos; (a) técnicas de microfabricación, (b) el molde en un sustrato, (c)
depósito del material conductor y (d) el electrodo.
2.2. Técnicas de microfabricación
En la actualidad existe una tendencia hacia el desarrollo de tecnoloǵıa que nos permita
explorar el mundo microscópico; aśı surgió en 1970, en Estados Unidos, lo que se denominó
Sistemas Microelectromecánicos (MEMS, Micro Electromechanical Systems), en Europa
Tecnoloǵıa de Micro Sistemas (MST, Micro Systems Technology) ó Micro Máquinas en Japón
(Micro Machines) [89].
Los MEMS surgieron como dispositivos integrados por elementos mecánicos y electrónicos,
los cuales funcionaban como sensores y actuadores de tamaño micrométrico, fabricados por
medio de técnicas usadas en semiconductores; p.e. en obleas de silicio. Estas técnicas se basan en
la fotolitograf́ıa. El concepto de MEMS se ha extendido a dispositivos miniaturizados tales como
sistemas: magnéticos, térmicos, flúıdicos y ópticos; con o sin partes móviles, y a la utilización
de otros materiales estructurales como titanio, nitruros, cerámicos, metales y poĺımeros [90].
La microfabricación se refiere a la tecnoloǵıa que se encarga de la fabricación plana y
tridimensional de estructuras y sistemas con dimensiones micrométricas [91]. La cantidad
2.2. Técnicas de microfabricación 27
y variedad de tecnoloǵıas disponibles para fabricar microproductos es enorme. Todas estas
tecnoloǵıas se pueden clasificar en tres grandes grupos: (a) los métodos de fabricación con
enfoque descendente (partiendo de una pieza inicial se obtienen piezas más pequeñas). (b) los
métodos de fabricación con enfoque ascendente (partiendo de part́ıculas pequeñas se construyen
estructuras funcionales más grandes) y, (c) las tecnoloǵıas nuevas o combinación de las
existentes. Sin embargo, se han publicado distintos criterios para clasificar a las tecnoloǵıas
de miniaturización; por ejemplo, Marc J. Madou citó las tecnoloǵıas de miniaturización más
relevantes y las organizó en técnicas convencionales (involucran litograf́ıa) y no convencionales
(las cuales pueden o no incluir métodos litográficos) [92].
Los procesos basados en tecnoloǵıas de microIngenieŕıa (MET, MicroEngineering
Technologies) incluyen métodos que se caracterizan por la producción de componentes, moldes y
superficies microestructuradas, los cuales son de gran utilidad en los biosensores, para el diseño
de canales para transporte de una muestra o para el desarrollo de electrodos.
Las tecnoloǵıas de MicroIngenieŕıa pueden ser procesos: (a) Mecánicos: micromaquinado
con diamante, microfresado, microtaladrado y microrrectificado; (b) MEMS; (c) Asistidos por
enerǵıa: como el maquinado por haz láser (LBM, Laser Beam Machining) o; (d) Métodos de
réplica. Estas tecnoloǵıas se describen a continuación.
2.2.1. Fotolitograf́ıa
La fotolitograf́ıa es una derivación de la técnica general conocida como litograf́ıa. La litograf́ıa
suave, complementa la etapa de transferencia del patrón dentro del proceso de fabricación de
microestructuras. En este proceso, un patrón se transfiere a una resina fotosensible mediante la
exposición a una fuente de luz UV a través de una máscara. La máscara, generalmente de cromo
u óxido de hierro, consiste de patrones opacos sobre un soporte transparente, que se utiliza para
definir las caracteŕısticas de diseño sobre el sustrato expuesto. El material fotosensible expuesto
a la luz se vuelve más soluble (resina positiva) o menos soluble (resina negativa) en una solución
qúımica [93]. La resolución del diseño en la resina depende de la resolución en el plano de la
máscara, de la potencia de exposición a la luz y de la longitud de onda utilizada.
El proceso básico de la fotolitograf́ıa consiste en (Figura 2.2) [92]:
(a) Preparar la superficie: limpiar el sustrato, deshidratarlo y eventualmente depositar un
qúımico que promueva la adhesión de la resina fotosensible.
(b) Depositar el material fotosensible: asegurando la homogeneidad de la capa y controlando el
espesor (se puede aplicar un horneado suave para mejorar la adhesión al sustrato).
(c) Alinear la máscara y exponer : Se alinea la máscara para transferir el patrón mediante
exposición del material fotosensible a la luz (potencia y el tiempo de exposición controlado).
(d) Revelar : Se disuelven las zonas solubles de acuerdo al tipo de resina. En esta misma etapa
se aplica un segundo horneado (hard bake) para endurecer la resina fotosensible restante.
(e) Grabar : La superficie expuesta del dióxido de silicio se graba según el patrón deseado.
(f) Revelar : la resina se disuelve para revelar el patrón transferido.
El patrón transferido puede ser modificado después repitiendo el proceso. La precisión de
la alineación de la máscara y el sustrato es cŕıtica en este caso. Existen otras derivaciones de
litograf́ıa, en los que se vaŕıa básicamente la fuente de luz para mejorar la resolución [92].
28 Miniaturizar con microtecnoloǵıa
(a) (b) (c)
(d)
Sustrato
(e) (f)
Dióxido de silicio Resina
Máscara
Resina negativa
Resina positiva
Luz
Figura 2.2: Proceso básico de la fotolitograf́ıa. (a) sustrato, (b) depósito de material fotosensible, (c) exposición,
(d) revelado y (e) grabado y (f) revelado.
Con esta técnica se puede producir una estructura tridimensional, es decir un molde maestro
(Figura 2.2d), que puede ser utilizada para producir réplicas mediante litograf́ıa suave, que se
describe en la subsección 2.2.4. Además, con esta técnica se pueden producir estructuras con un
material conductor, las cuales pueden ser usadas como electrodos, que son parte importante en
un transductor de los biosensores (ver Figura 1.1).
2.2.2. MEMS
La mayoŕıa de las técnicas de fabricación de MEMS tienen sus ráıces en los métodos de
fabricación estándar (litograf́ıa) desarrollados por la industria de semiconductores. Además,
los materiales de fabricación utilizados en MEMS son más variados, ya que se pueden usar
poĺımeros, cerámica, biomateriales, carbono, etc.[93]. En la Figura 2.3 se muestra el proceso
básico que se utiliza para la fabricación de MEMS.
Preparación
de sustrato
Depósito Transferencia
de patrón
Grabado
Producto
terminado
- CVD
- PVD
- Oxidación
- Electrodeposición
- Sputtering
- Spin Coating
- Fotolitografía
- Ablación Láser
-Grabado en  superficie
-Grabado en  volúmen
(seco / húmedo)
(a) (b) (c) (d) (e)
Figura 2.3: Proceso básico para la fabricación MEMS donde: (a) es la preparación del sustrato; (b) es el proceso
de depósito, (c) es la transferencia del patrón, (d) es el grabado y (e) es el producto terminado.
Las peĺıculas de distintos materiales se depositan con técnicas qúımicas o f́ısicas (Figura
2.3b); sus propiedades dependen de la técnica utilizada, las cuales pueden ser: deposición qúımica
por vapor (CVD, Chemical Vapor Deposition), deposición f́ısica por vapor (PVD, Physical Vapor
Deposition), oxidación, electro deposición, pulverización catódica de part́ıculas (sputtering) del
material deseado en alto vaćıo y técnica de recubrimiento por giro (spin coating) [94].
Posterior al depósito de la peĺıcula (Figura 2.3c), se realiza la transferencia del patrón
diseñado mediante una etapa de fotolitograf́ıa empleando una resina fotosensible. Otra técnica
utilizada para transferir el patrón en la resina o directamente sobre el material sin requerir a la
fotolitograf́ıa es el grabado directo por medio de la ablación láser. La transferencia de patrón
por fotolitograf́ıa es generalmente seguida por un paso de grabado, con productos qúımicos en
estado ĺıquido o gaseoso, con el fin de obtener una peĺıcula con el patrón diseñado mediante la
remoción selectiva de material sobre el sustrato. La ablación láser puede ser muy útil ya que,
2.2. Técnicas de microfabricación 29
si se realiza directamente sobre el sustrato, no requiere de una etapa posterior; esta técnica se
describe en los siguientes párrafos.
El grabado (Figura 2.3d) puede ser superficial (surface micromachining) o volumétrico (bulk
micromachining) y este último a su vez puede realizarse en seco o húmedo según el tipo de
productos utilizados (Dry/Wet etch) [95].
Por último, se realiza la unión de sustratos ya sea para integrar múltiples funcionalidades,
estructuras de mayor complejidad o para fines de empaquetado para llegar a un producto o
prototipo terminado con el cual se puedan realizar las pruebas de caracterización.
Dentro de este proceso, el depósito de material, la transferencia de patrón y el grabado son
tres etapas que pueden ser repetidas de acuerdo a las especificaciones del diseño y condiciones
de fabricación de la estructura micrométrica [95].
2.2.3. Microfresado
El sistema de fresado es un método de fabricación que utiliza cortadores rotativos para
remover material de un sustrato. Este método hace uso de software de control y programación
para controlar el movimiento de los cortadores en tres dimensiones y lograr una resolución
micrométrica. En la Figura 2.4 se muestra el proceso general empleado por este método que
consiste en [96]: (a) preparar un diseño asistido por computadora (CAD, Computer-aided
design); (b) utilizar una fresadora para transferir el diseño al sustrato mediante una herramienta
de corte; y (c) el diseño se ha transferido en el sustrato acorde con el diseño.
(a) (b) (c)
Sustra
to
Figura 2.4: Proceso utilizado por el microfresado: (a) diseño en computadora, (b) equipo CNC y (d) sustrato.
El sistema de fresado básico consiste en: (1) una mesa de trabajo para el posicionamiento
de la pieza de trabajo, en este caso el sustrato; (2) una herramienta de corte, usualmente una
fresa y; (3) un mandril para asegurar y girar la herramienta de corte.
Usualmente la mesa de trabajo lleva a cabo el movimiento en el eje X e Y y el eje Z es
controlado por la herramienta de corte.
La geometŕıa y dimensiones de las estructuras producidas por este método, dependen de la
geometŕıa y dimensiones del cortador empleado, y se pueden utilizar como: un molde maestro
por el proceso de litograf́ıa suave; un molde para preparar electrodos, mediante el depósito de
un material conductor en dichas estructuras; o un canal para transportar microflúıdos, desde
luego, para ello la estructura debe sellarse.
Además de las técnicas mencionadas existen otras técnicas, como la litograf́ıa suave y
microfabricación láser, que se describen a continuación.
30 Miniaturizar con microtecnoloǵıa
2.2.4. Litograf́ıa suave
La mayoŕıa de los procesos de microfabricación comunes basados en la microelectrónica
requieren de equipo especializado y preparación de máscaras de alta resolución, resultando en un
proceso relativamente costoso y que consume mucho tiempo; por ello es importante desarrollar
métodos que permitan realizar prototipos de manera rápida y a bajo costo [97].
Con la litograf́ıa suave se pueden producir estructuras tridimensionales con superficies bien
definidas y controlables, con distintos poĺımeros, además de permitir el uso de materiales
compatibles con aplicaciones biológicas. Esta técnica se puede utilizar para producir estructuras
que puedan ser utilizadas como moldes para depositar en ellas un material conductor y
producir de esta forma electrodos, los cuales son empleados por los biosensores piezoeléctricos
y electroqúımicos.
Existen diversas técnicas de litograf́ıa suave, por ejemplo: (a) Molde réplica (REM, REplica
Molding), la cual permite obtener una estructura a partir de un molde maestro; (b) Impresión de
microcontacto (µCP, Micro-Contact Printing), la cual se puede utilizar para estampar un diseño
sobre algún sustrato, tal como se haŕıa con un sello sobre una hoja de papel; (c) Estampado
(hot embossing), la cual es una técnica en la que se estampa un patrón sobre un poĺımero que
es calentado a una temperatura mayor a su temperatura de transición v́ıtrea (Tg) [98].
La técnica de REM requiere de: (a) un molde maestro, elaborado mediante alguna de las
técnicas de fabricación mencionadas; (b) emplear el molde maestro para verter, en él, el poĺımero
con el cual se desea preparar la réplica; y (c) poĺımerizar para obtener una réplica del molde
maestro.
En la Figura 2.5 se muestra el proceso de la técnica molde réplica propuesta y empleada
en el presente trabajo, en la cual se utiliza: (a) molde maestro, hecho en un sustrato de
polimetilmetacrilato (PMMA); (b) se vierte en él poĺımero polidimetilsiloxano (PDMS); (c) se
polimeriza el PDMS, mediante el uso de un horno y se desprende el poĺımero curado del molde
maestro obteniendo aśı; (d) la réplica del molde.
(a)
PDMS
PMMA
PMMA
PMMA
PDMS
(b) (c) (d)
Figura 2.5: Técnica molde replica: (a) molde maestro, (b) PDMS sobre el molde maestro, (c) polimerización
de PDMS y (d) molde-replica.
La principal ventaja de la litograf́ıa suave es su tiempo de desarrollo, ya que se realiza el
diseño deseado y obtiene la estructura resultante en menos de 24 horas. Es un método que
utiliza una gran variedad de poĺımeros y, por lo tanto, existen muchos materiales que se pueden
utilizar[98]. Además, es una técnica de fabricación de bajo costo. Se ha convertido en una
tecnoloǵıa útil para una serie de aplicaciones que incluyen la bioloǵıa celular, microflúıdica,
lab-on-a-chip y fotónica flexible [98].
Además de las técnicas mencionadas existen otros enfoques, como el de la microfabricación
láser, que se describe a continuación.
2.3. Moldes 31
2.2.5. Microfabricación láser
La aplicación de la tecnoloǵıa láser en la microfabricación tiene ventajas por ser un proceso
sin contacto mecánico y por facilitar la creación de prototipos sin bajar la calidad y la precisión
del corte en los materiales. También ofrece la posibilidad de utilizar al láser para microfabricación
local basada en la ablación (se remueve una parte del material) o bien en la sinterización (se
adhiere un material a un sustrato dado por calentamiento).
La tecnoloǵıa láser en la microfabricación puede ser aplicada como [91]: (a) herramienta
directa por medio de la ablación, corte y adición de material o; (b) herramienta indirecta para
la fabricación de máscaras para procesos litográficos y transferencia de patrones.
La microfabricación a partir de la tecnoloǵıa láser aprovecha: el calor producido por la luz
láser, el hecho de que el haz puede ser enfocado y la absorción de la luz por el material bajo
prueba [99]; por lo tanto, es importante conocer: la longitud de onda de la luz láser empleada; la
potencia eléctrica u óptica; diámetro del punto mı́nimo a la distancia focal (spot) y; comprender
que fenómeno f́ısico, óptico o qúımico ocurre durante la interacción del haz láser con el material
con el que entra en contacto. Con lo dicho previamente se puede hacer el diseño de algún patrón
que se desea transferir en un sustrato.
En la Figura 2.6, se muestra un diagrama de un proceso de ablación láser, en donde: (a) es
el sustrato, (b) el haz láser enfocado sobre el sustrato tratado con un material absorbente, y
(c) el sustrato grabado en las regiones expuestas al haz láser.
(a) (b) (c)Sustra
to
Sustra
to
Sustra
to
Figura 2.6: Proceso de ablación láser; (a) sustrato, (b) sustrato tratado con material absorbente y (c) sustrato
grabado.
Con la aplicación de la tecnoloǵıa láser en la microfabricación, se pueden obtener estructuras
sobre algún sustrato, que pueden ser utilizados como un molde maestro para hacer mediante
ellos réplicas o como un molde que pueda ser usado para preparar electrodos.
A continuación se presentan los métodos de microfresado, molde replica y microfabricación
láser, empleados para la obtención de moldes.
2.3. Moldes
Existen distintos métodos para producir estructuras tridimensionales, que pueden ser
utilizados como moldes, tales como: la fotolitograf́ıa, molde réplica y microfresado entre
otros. Además, los materiales sobre los cuales son elaboradas dichas estructuras son diversos,
dependiendo de la aplicación de interés. En el presente trabajo se elaboraron moldes en
sustratos de PMMA y PDMS, empleando los métodos de molde-réplica, maquinado CNC y
microfabricación láser.
Los materiales que se eligieron como sustratos para elaborar los micromoldes son los
poĺımeros PDMS (SYLGARD 184 [100]) y PMMA (Plastiglas de México S.A. de C.V.). El
PDMS es un poĺımero orgánico basado en silicio y se eligió debido a que es: biocompatible,
transparente, inerte, inocuo y no inflamable; además, si se deposita sobre una superficie, se
32 Miniaturizar con microtecnoloǵıa
extiende por toda la superficie y se amolda a todas las imperfecciones de esta, haciéndolo ideal
para replicar estructuras a micro y nano escala [98]. El PMMA, se obtiene de la polimerización
del metacrilato de metilo y se puede encontrar en el mercado en hojas de 244 x 122 cm. El
sustrato de PMMA utilizado en el presente trabajo se obtuvo, cortando una hoja de PMMA de
244 x 122 cm y 3mm de grosor en piezas del tamaño de un portaobjetos (1”x 3”) utilizando un
equipo CNC. Se eligió este material por ser: biocompatible, accesible, de bajo costo, un material
que se puede maquinar con CNC, y ofrecer la posibilidad de ensamblar con otra pieza de PMMA.
Además, el uso de PMMA y PDMS como sustratos, nos permite ensamblar las estructuras para
formar el canal de transporte de fluidos hacia la zona de detección, es decir, hacia los electrodos.
2.3.1. Molde-Réplica
Recordemos que el molde-réplica obtenido será llenado con un material conductor, por ello,
la estructura del molde maestro debe ser en relieve.
En la literatura existe un método reportado en el que se emplea un termoplástico, shrinky
dinks, para preparar estructuras tridimensionales con aplicaciones en microflúıdica [10, 101].
Este método permite preparar prototipos de manera rápida, fácil y de bajo costo. El método
mencionado consiste en el siguiente procedimiento:
Preparar el diseño del patrón que se desea transferir en el termoplástico mediante el uso de
un software de edición de imágenes, considerando que el termoplástico se encoge ∼ 60%
de su tamaño original.
Imprimir el diseño con una impresora láser sobre la hoja del termoplástico (de 6 a 8 veces).
Limpiar el exceso de tinta en el termoplástico con un hisopo humedecido con alcohol
isoproṕılico y acetona (10:1).
Recortar el diseño y colocarlo en un horno a 160◦C durante 5 minutos.
Retirar la pieza del horno y dejar enfriar.
Limpiar la pieza con alcohol isoproṕılico.
El proceso descrito previamente, permite crear una estructura en relieve, que puede ser usado
como molde maestro. La preparación del molde maestro se puede hacer con diferentes técnicas
de fabricación, sin embargo, por facilidad y por la reducción del tiempo empleado en dicho
proceso, se eligió hacer este molde empleando el termoplástico mencionado.
En la Figura 2.7 se ilustra el procedimiento empleado por la técnica de molde-replica, en
donde: (a) es el diseño hecho en un software de edición de imágenes, (b) es la impresión en la
hoja del termoplástico (shrinky dinks), (c) es el termoplástico después de ser horneado y que se
usa como molde maestro, (d) es la réplica en PDMS del molde maestro.
Para replicar el molde deseado se emplea el siguiente procedimiento:
El molde se coloca en un recipiente, que pueda tolerar temperaturas mayores a 80◦C.
Se vierte PDMS (proporción 10:1, prepoĺımero: agente curante, ver apéndice C) en el
recipiente con el molde maestro.
2.3. Moldes 33
Se coloca el recipiente en una parrilla a 80◦C durante 1 hora, para polimerizar. La
temperatura puede ser mayor a 80◦C, lo importante es que el molde tolere dicha
temperatura.
Se retira el recipiente de la parrilla, y se desprende la réplica del molde maestro.
(a)
8mm
(b)
8mm
(c)
2mm 2mm
(d)
Figura 2.7: Procedimiento para preparar un molde réplica; (a) diseño, (b) diseño impreso en termoplástico, (c)
molde maestro y (d) molde-replica.
Entonces, con este método se obtienen réplicas de estructuras que pueden ser utilizadas como
moldes para elaborar electrodos o como canales para el transporte de muestras. Sin embargo,
debido a que la geometŕıa de las réplicas dependen de la geometŕıa del molde maestro, es muy
importante conocer la topoloǵıa de dichas estructuras mediante su caracterización geométrica.
2.3.1.1. Caracterización geométrica
Para cada una de las estructuras usadas como molde maestro se obtuvo el perfil en diferentes
regiones con un perfilómetro (KLA Tencor D600). En este caso se presenta una serie de dichas
mediciones para una estructura en forma de cruz que se muestra en la Figura 2.8a. En la Figura
2.8b, se muestra el perfil de una de las ĺıneas (Figura 2.8a-1). Aunque este método ofrece obtener
estructuras en relieve que pueden ser utilizados como molde maestro, se puede observar que el
perfil del relieve es irregular y que además la altura de dichas estructuras difieren una de otra
(Tabla 2.1). Por ello, el uso de este termoplástico, no es recomendable para producir estructuras
en donde la repetibilidad es un factor importante. A pesar de esto, puede ser utilizado para
elaborar un prototipo rápido, tal como se muestra en la Figura 2.24.
1 2
3 4
5
6
7
(a) (b)
0
50
100
150
200
250
300
0 1000 40002000 50003000
Ancho[um]
A
lt
o[
um
]
Figura 2.8: Perfil de una ĺınea de un molde hecho en el termoplástico Shrinky Dinks (Figura 2.7c). (a) Diseño
del molde maestro y (b) perfil de la ĺınea (a-1).
34 Miniaturizar con microtecnoloǵıa
Tabla 2.1: Perfil en diferentes puntos (Figura 2.8a) de un molde maestro (Figura 2.7c).
# de ĺınea Altura promedio µm Ancho promedio µm
1 259 3411
2 237 3419
3 245 3493
4 225 3476
5 258 3440
6 231 3243
7 216 3305
Promedio 238 ± 21 3398 ± 91
Debido a las irregularidades observadas a partir de los perfiles obtenidos de las estructuras
del molde maestro, se eligió el método de microfresado para elaborar los moldes requeridos.
2.3.2. Microfresado
Con este método se pueden obtener estructuras tridimensionales con un solo paso, que pueden
ser utilizadas directamente como moldes para elaborar un electrodo o como un canal para
transportar algún fluido, desde luego para ello el canal debe sellarse.
En el taller de mecánica de la Facultad de Ciencias, existe un equipo de maquinado CNC
IS400 de Gravograph, que se utilizó para preparar moldes en sustratos de PMMA. Este equipo
permite el corte en las direcciones XY Z y para ello utiliza el software de control propietario.
2.3.2.1. Maquinado y caracterización geométrica
El equipo CNC utilizado permite pasos de 200µm en los ejes XY Z y el cortador utilizado
tiene un diámetro de 800µm. Para observar las dimensiones mı́nimas de las estructuras que se
pueden hacer en un sustrato de PMMA, se maquinaron las siguientes estructuras ( Figura 2.9):
Una ĺınea de 5mm de longitud (Figura 2.9a), que permite conocer el ancho mı́nimo del
canal que puede realizarse.
Un cuadro de 4x4mm (Figura 2.9b), para conocer la profundidad mı́nima que se puede
alcanzar, es decir el paso mı́nimo en el eje Z.
Dos cuadros adyacentes de 4x4mm (Figura 2.9c), lo cual nos permite conocer la separación
mı́nima, en el eje X o Y , entre grabados paralelos y,
Dos cuadros adyacentes opuestos por un vértice (Figura 2.9c), para conocer la separación
mı́nima, en los ejes X y Y entre dos grabados adyacentes.
El resultado de los grabados de la Figura 2.9 se muestra en la Figura 2.10. En la Figura 2.10a
se muestra el grabado de una ĺınea, en la cuál se observa que el ancho de la ĺınea corresponde
con el diámetro del cortador, es decir, el ancho mı́nimo que se puede lograr para un canal es
de 800µm usando este cortador. Las dimensiones (ancho x largo) del grabado (Figura 2.10b)
corresponden con 4x4mm, tal como se especificó en el diseño, y la separación mı́nima entre dos
cuadros adyacentes (Figura 2.10c y Figura 2.10d) es de 200µm.
2.3. Moldes 35
(a) (b) (c)
4x4mm
5
m
m
4x4mm
4x4mm
(1)
4x4mm 4x4mm
(1)
(d)
Figura 2.9: Maquinado de: (a) una ĺınea, (b) un cuadro y, (c) dos cuadros adyacentes y (c) dos cuadros opuestos
por el vértice.
(a) (b) (d)
200µm200µm
(c)
1mm200µm
Figura 2.10: Diseño para verificar las medidas del grabado en un sustrato de PMMA. (a) ancho de una ĺınea,
(b) dimensiones del grabado, (c) distancia entre pozos adyacentes y (d) distancia entre dos pozos
opuestos por el vértice.
Para observar la topoloǵıa del grabado, se maquinó el cuadro que se muestra en la Figura
2.11a, en un sustrato de PMMA. De este grabado se obtuvo un perfil en 3D y en tres ĺıneas
distintas (Figura 2.11b); el resultado muestra que el perfil es similar en dichas ĺıneas (Figura
2.11c) y que la profundidad es uniforme en todo el grabado (∼ 135µm). Un pozo como el que
se muestra en Figura 2.11b se puede utilizar para llenar de material conductor y elaborar un
microelectrodo. Además esta técnica se puede utilizar para maquinar estructuras con distinta
geometŕıa y que podŕıan ser utilizadas para elaborar canales para flúıdos.
(a) (b) (c)
-150
-100
-50
0
50
P
ro
fu
nd
id
ad
[µ
m
]
Largo[µm]
(1) (2) (3)
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
140
0
P
ro
fu
nd
id
ad
[µ
m
]
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
La
rg
o[µ
m
]
0
0.5
1.0
1.5Ancho[µm]
2.0
2.5
3.0
(1)
(2)
(3)
Figura 2.11: (a) Maquinado de un pozo de ∼ 2x2mm, (b) perfil en 3D de dicho grabado y (c) perfil del grabado
en 3 ĺıneas distintas.
36 Miniaturizar con microtecnoloǵıa
Debido a que estos moldes se llenaron con un material conductor, es deseable que la sección
transversal o longitud de los moldes sea el mismo entre uno y otro, para que las caracteŕısticas
eléctricas de los electrodos también sean similares entre ellos. Esto es debido a que la resistencia
de una estructura depende de la longitud y de su sección transversal. Uno de los parámetros
que puede cambiar en la sección transversal es la rugosidad. Para observar si este parámetro es
afectado por la veces que el cortador pasa sobre la misma región, se maquinaron dos diseños en
un sustrato de PMMA. (a) El primero consiste de ĺıneas de 5mm de longitud y; (b) el segundo,
en cuadros de 2 x 2mm. Para cada uno de los diseños anteriores el cortador pasó sobre la misma
región 1, 2, 4, 8 y 16 veces (Figura 2.12).
(a) (b)
5
m
m
2x2mm
1x 2x 4x 8x 16x 1x 2x 4x 8x 16x
Figura 2.12: Diseño de ĺıneas (a) y cuadros (b), para observar la repetibilidad de un maquinado CNC.
En la Figura 2.13a se muestra el grabado de la Figura 2.12a, en donde el cortador de la
máquina CNC pasó en cada una de las ĺıneas 1, 2, 4, 8 y 16 veces, respectivamente. Se observa
que la profundidad no es la misma en todos los grabados (Figura 2.13b). Estas diferencias
debidas a la inclinación, se deben principalmente a la dificultad de alinear el sustrato en la
plataforma de la máquina CNC. Además, la rugosidad no cambia significativamente con el paso
sucesivo del cortador (Figura 2.13c).
1x 2x 4x 16x8x
(a) (b) (c)
R
ug
os
id
ad
[u
m
]
1
2
3
0
-90
-80
-70
-60
-50
P
ro
fu
nd
id
ad
[u
m
]
0 1x 2x 4x 16x8x
-100
0 1x 2x 4x 16x8x
Figura 2.13: Maquinado de ĺıneas (a) en un sustrato de PMMA, (b) profundidad y (c) rugosidad del grabado.
De manera similar, en la Figura 2.14 se muestra el grabado de los cuadros de ∼ 2x2mm
(Figura 2.12b); de los perfiles de este grabado, también se puede observar que la profundidad
tampoco es la misma en cada pozo y la rugosidad tampoco disminuye conforme el número
de pasos. Por lo tanto, si se desea maquinar la misma estructura en diferentes regiones de un
sustrato, debe considerarse que la profundidad puede cambiar significativamente.
Por otro lado, para verificar si la profundidad de los pozos es similar en regiones adjuntas
y en distintos sustratos, se grabaron cuatro pozos en un sustrato (sustrato 1) (Figura 2.15) y
luego otros cuatro en un sustrato distinto (sustrato 2). Para cada uno de los pozos se obtuvo el
perfil en tres ĺıneas (Figura 2.15b) y se calculó la profundidad promedio de cada pozo. Esto se
realizó para dos sustratos distintos; los resultados se muestran en la Tabla 2.2.
De la Tabla 2.2, se observó que la profundidad entre pozos adyacentes vaŕıa ∼ 5% (Tabla
2.2), mientras que, la profundidad de los pozos hechos en distintos sustratos, puede cambiar en
2.3. Moldes 37
1x 2x 4x 16x8x
(a) (b) (c)
R
ug
os
id
ad
[u
m
]
-90
-80
-70
-60
-110
P
ro
fu
nd
id
ad
[u
m
]
0 1x 2x 4x 16x8x
-100
0 1x 2x 4x 16x8x
0.5
1
1.5
0
2
Figura 2.14: Maquinado de cuadros (a) en un sustrato de PMMA, (b) profundidad y (c) rugosidad del grabado.
2mm
Pozo1
Pozo2
Pozo4Pozo3
(a) (b) (c)
3 1 2 3 1 2
3 1 2
3 1 2
Pozo1
Pozo2
Pozo4Pozo3
Figura 2.15: Maquinado de cuatro pozos adyacentes para observar la repetibilidad en distintos sustratos de
PMMA. (a) Diseño, (b) pozos y (c) perfil 3D.
Tabla 2.2: Profundidad y ancho promedio de las estructuras maquinadas con microfresado en dos sustratos.
Pozo
Sustrato 1 Sustrato 2
Profundidad promedio µm Ancho promedio µm Profundidad promedio µm Ancho promedio µm
1 124 2069 344 2081
2 116 1970 344 2069
3 120 2055 329 1994
4 128 1947 371 2105
más de 100%. Por lo tanto, si se desea utilizar este método para preparar moldes, es necesario
hacer un grabado previamente para establecer la coordenada Z0 y entonces hacer el grabado
requerido por el diseño, como usualmente se hace con cualquier pieza que se maquina con equipo
CNC; sin embargo, debido a la rugosidad producida por la herramienta, no se eligió hacer dicho
maquinado previamente, pues este sustrato se debe ensamblar con otro para propósitos de
construir estructuras más elaboradas. Aún aśı, se utilizó dicha técnica para producir electrodos
que se probaron y de los cuales se muestran resultados en la sección 2.4.2.
38 Miniaturizar con microtecnoloǵıa
2.3.3. Microfabricación Láser
Este método se propone debido a que: (a) es un método de un solo paso, (b) no requiere de
una máscara para la transferencia del patrón, (c) no requiere pasos adicionales de revelado,
pre-horneado o post-horneado, (d) alcanza una resolución en el orden de los µm, (e) y la
geometŕıa es controlable. Este método, hace uso de la ablación láser para remover o extraer
material de manera local de la superficie de nuestro sustratos [99].
Nuestro método de microfabricación se basa en una plataforma láser con una unidad de
CD-DVD para producir microcanales sobre sustratos de PMMA, que son utilizados como
micromoldes para producir microelectrodos, con un método similar al que se describe en [102]. La
plataforma mencionada utiliza una unidad óptica (OPU, Optical Pick-up Unit) de un sistema
comercial de grabación/reproducción de CD/DVD, que contiene un par de diodos láser, uno
infrarrojo de 780nm correspondiente al CD y otro rojo de 650nm correspondiente al DVD. La
OPU está montada en una plataforma mecánica con control motorizado y movimiento en los ejes
X, Y y Z. El movimiento en el eje Z permite ajustar el enfoque del haz láser sobre la muestra que
se desea grabar con el apoyo de un objetivo de microscopio; los movimientos en los ejes X y Y,
permiten desplazar la muestra según el diseño que se desea grabar en el sustrato. Las plataformas
mecánicas (Platinas de Newport) que permiten el movimiento en X y Y son controladas por
motores a pasos (ZFS25B de Thorlabs) con una resolución de 1µm. El tiempo de encendido y la
potencia eléctrica suministrada al diodo láser, aśı como el encendido y apagado de los motores
a pasos, son controlados por un circuito electrónico conectado a una computadora a través
del puerto paralelo. El circuito electrónico permite controlar la operación del diodo láser en
modo continuo o pulsado a través de un circuito controlador de diodos láser (LDD, Laser Diode
Driver) para garantizar la corriente suministrada; los pulsos pueden ser monoestables con un
ancho de 3.2µs, 24µs, 8µs, 272µs, 900µs, 1.6ms a 5.8ms. El circuito electrónico recibe órdenes
a través de una computadora que env́ıa dichas instrucciones mediante un software de control.
El software de control, procesa la información del diseño que se requiere transferir al sustrato a
través de un archivo de mapa de bits, el cual contiene información del diseño en dos dimensiones
(2D). Además, el circuito previamente montado en una protoboard se ha implementó en una
tarjeta de circuito impreso (PCB, Printed Circuit Board), para mejorar su desempeño.
En la Figura 2.16 se muestra un diagrama general de los pasos de nuestro método para
preparar un micromolde en sustrato de acŕılico usando microfabricación láser: (a) es un diseño
2D hecho en inkscape; (b) el proceso de grabado en el equipo de microfabricación láser y; (c) el
micromolde en un sustrato de acŕılico.
(c)(a) (b)
haz láser
Sustrato
Figura 2.16: Preparación de micromoldes en un sustrato de PMMA con microfabricación láser. (a) es el diseño,
(b) el proceso de grabado y (c) el grabado.
El primer paso de nuestro método de fabricación es el diseño (Figura 2.16a), el cuál consiste
en proponer una geometŕıa que se desea transferir al sustrato de acŕılico. El diseño se elaboró
utilizando el software Inkscape, mediante el cual se obtuvo un archivo de mapa de bits, que se
utilizó por el equipo para transferir al sustrato de PMMA. En la Figura 2.17, se muestran
algunos ejemplos de diseños propuestos para: (a) caracterizar eléctricamente electrodos de
2.3. Moldes 39
carbón, (b) elaborar electrodos de plata y, (c) elaborar electrodos de carbón como sensor de
temperatura.
R1 R2 R3
R4 R5 R6
R7
R8
R9
a) b) c)
1000µm 1000µm 1000µm
Figura 2.17: Diseño de microelectrodos en un archivo de mapa de bits, para (a) caracterización eléctrica, (b)
aplicaciones de amperometŕıa y (c) impedancia.
2.3.3.1. Grabado del sustrato
Debido a que el PMMA es transparente a las longitudes de onda (650nm) del láser de la
plataforma utilizada, es necesario depositar una peĺıcula de nanopolvo de carbon (Sigma-Aldrich,
parte no. 633100) sobre dicho sustrato. Para ello es necesario distribuir dichas part́ıculas de
manera homogénea, garantizando un grabado uniforme. Para depositar el nanopolvo de carbón
en el sustrato de PMMA se siguen los siguientes pasos:
Limpiar la superficie del sustrato con un hisopo y alcohol isoproṕılico,
Depositar una gota de alcohol isoproṕılico sobre el sustrato de PMMA,
Depositar una pequeña cantidad de nanopolvo de carbón ( ∼ 5µg), y
Esparcir el nanopolvo de carbón sobre el sustrato de acŕılico.
Después de preparar la muestra se coloca en la plataforma del equipo de microfabricación.
Con la ayuda de las platinas XY Z, se puede ubicar con precisión la región del sustrato en donde
se quiere transferir el diseño, aśı como el enfoque del haz láser sobre la superficie del sustrato.
Debido a la longitud de onda del haz láser (650nm), el equipo de microfabricación cuenta con un
sistema de visualización para facilitar al usuario dichos ajustes. El software permite un control
numérico por computadora y la transferencia del diseño pixel por pixel. Para transferir el diseño
al sustrato, el usuario debe:
Establecer la plataforma XY , en su posición inicial.
Verificar que el haz enfoque la superficie en la que se va a transferir el diseño.
Configurar los parámetros de grabado: el tiempo de pulso, la potencia eléctrica del diodo
láser, el número de pasos en la misma región y la resolución (µm x pixel).
Especificar la ruta del archivo de diseño.
40 Miniaturizar con microtecnoloǵıa
Iniciar el proceso de grabado.
En la Figura 2.18 se muestran los pasos del proceso de grabado con nuestro método de
microfabricación láser, los cuales consisten en:
Limpiar el sustrato de PMMA.
Depositar una peĺıcula de nanopolvo de carbón.
Enfocar el haz láser sobre el sustrato.
Obtener el sustrato grabado.
(c)(a) (b)
Haz láser
Sustrato
Sustrato
Sustrato
+ CNP
(d)
Figura 2.18: Proceso de grabado en acŕılico mediante la técnica de microfabricación láser. (a) Sustrato de
acŕılico, (b) tratamiento del sustrato, (c) grabado con láser y (d) micromolde.
Después de transferir el diseño con el equipo de microfabricación láser, se limpia el sustrato
de la siguiente manera:
Se remueven las part́ıculas de nanopolvo de carbón mediante el uso de un hisopo
humedecido con alcohol isoproṕılico.
El sustrato se pone en un baño ultrasónico durante 10 minutos a 23◦C usando agua
destilada para remover las part́ıculas que no se removieron con el hisopo.
Se enjuaga el sustrato con agua destilada y,
Se pone el sustrato en una parrilla durante 1 minuto a 50◦C para secarlo.
En la Figura 2.19a se muestra un sustrato grabado antes de limpiar y en la Figura 2.19b
después de limpiar.
(a) (b)
500µm 500µm
Figura 2.19: Sustrato después del grabado (a) y después de limpiar (b).
2.3. Moldes 41
2.3.3.2. Caracterización geométrica
Una vez que el sustrato se ha limpiado, se observa el grabado con un microscopio óptico
(Nikon Eclipse Ci-L) para verificar que el diseño ha sido correctamente grabado y para corroborar
que las dimensiones del grabado corresponden con el diseño.
En la Figura 2.20a se muestra el diseño del grabado; en Figura 2.20b una fotograf́ıas
del grabado, en donde se puede observar que el diseño ha sido transferido correctamente y
que además sus dimensiones corresponden con las contempladas en el diseño. Se utilizó un
microscopio con un objetivo de 10 aumentos y un ocular graduado con una regla de 0 a 1000µm.
(a) (b)
200um 200um
200um 200um200um200um
Figura 2.20: (a) Diseño y (b) grabado y verificación de dimensiones.
Para verificar la profundidad de cada grabado, se utilizó un perfilómetro. En la Figura
2.21(b-c) se muestran los perfiles de un grabado con un diseño de dos PADs unidos por una
ĺınea (Figura 2.21a). En este caso, la rugosidad tiene mayor importancia, debido a la escala,
pues cambia de manera significativa el volúmen de material que puede contener el pozo grabado.
El volumen del material puede cambiar de manera significativa la impedancia de la estructura.
(a) (b) (c)
(3)
(2)
(1)
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
-30
-20
-10
0
10
P
ro
fu
nd
id
ad
[µ
m
]
Ancho[µm]
(1) (2) (3)
500 µm
0
32.7
Profundidad
[µm]
0
0.2
0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
Largo[
µm]
0
0.5
1.01.2
Ancho[µm
] 20µm
Figura 2.21: Perfil del grabado pasando el haz láser solo una vez sobre el sustrato. (a) Micromolde, (b) perfil
de grabado en tres ĺıneas y (c) perfil de un pozo en 3D.
Además, la profundidad del grabado se puede controlar grabando repetidamente sobre la
misma región tal como se muestra en la Figura 2.22; en dicha figura se puede observar que
pasando sobre la misma región se pueden alcanzar profundidades de 10µm, 20µm, 30µm y
40µm grabando una (1x), dos (2x), tres (3x) o cuatro veces (4x) sobre la misma región.
El control de la profundidad del grabado permite producir estructuras que pueden tener
aplicaciones en flúıdica, aunque debe considerarse que la alineación es un factor importante en
ese proceso, debido a que cada grabado requiere de un depósito de material absorbente. En
42 Miniaturizar con microtecnoloǵıa
P
ro
fu
nd
id
ad
[µ
m
]
Ancho[µm]
0 500 1000 1500 2000
-60
-40
-20
0
20
(b)
(1)
(a)
(1)
250µm 1x
2x
3x
4x
1x
2x
3x
4x
Figura 2.22: Control de profundidad del grabado sobre el sustrato. (a) Sustrato grabado y (b) perfil del grabado.
nuestro caso esto nos permitió cambiar la profundidad de los canales para el depósito de un
material conductor.
Hasta este punto se han presentado tres métodos empleados para producir moldes, que por
su escala podemos referirnos a ellos como micromoldes. En la siguiente sección se presenta la
elaboración de electrodos; debido a que dichas estructuras se pueden elaborar a una escala
alrededor de los micrómetros, nos referimos a ellas como microelectrodos.
2.4. Electrodos
La miniaturización de electrodos permite: (a) incorporar diferentes estudios en una misma
plataforma de medición, es decir dispositivos tipo ”lab on chip”(laboratorio en un chip) [10, 103];
(b) utilizar volúmenes anaĺıticos bajos (∼ µL) [74, 75]; (c) reducir el volumen de reactivos
requeridos para el desarrollo del sensor (d) reducir el costo total del desarrollo del sensor [104];
(e) modificar la sensibilidad, debido a la posibilidad de cambiar la geometŕıa del área del sensor;
(f) desarrollar dispositivos con aplicacion en telemedicina, empleados en puntos de atención
(point of care) para ensayos rápidos; y (g) desarrollar dispositivos portátiles [105, 10].
Existen muchos métodos para generar microelectrodos reportados en la literatura; sin
embargo, un método comunmente usado, es la fotolitograf́ıa convencional [92]. La fotolitograf́ıa,
no es simple debido a que requiere de varios pasos, usualmente llevados a cabo en un cuarto
limpio y con equipo especializado; requiere de mucho tiempo y para cada modificación en
el diseño se requiere una mascara diferente para la exposición de las resinas fotosensibles.
También se puede usar un láser de pulso ultracorto para crear arreglos de microelectrodos
sobre substratos, mediante la remoción de una capa de metal [106]; sin embargo, este método
requiere un paso de depósito por pulverización catódica (sputtering) y cualquier modificación en
el diseño requiere de la modificación en el software. Otro método para producir microelectrodos
es la creación de patrones directamente a través del curado selectivo de nanopart́ıculas de
una tinta organometálica [107], pero este método requiere varios pasos antes y después de la
transferencia del patrón deseado, tales como pre-horneado y post-horneado para asegurar un
buen comportamiento estructural.
Existen otras técnicas como la inyección de tinta, pero están limitados debido a la resolución
que pueden alcanzar, especialmente, si el sustrato tiene una superficie hidrofóbica. Por esta
razón, esta técnica se combina con la sinterización láser. Como alternativa, la técnica de ablación
con láser pulsado ultracorto ha sido empleada para producir microelectrodos sobre poĺımeros
y puede ser utilizado como un coloide de nanopart́ıculas Ag [108]. Otra técnica que ha sido
utilizada recientemente como método para prototipado de microelectrodos y para fabricar
2.4. Electrodos 43
estructuras microflúıdicas sobre poĺımeros [109], es el ploteo láser directo, pero éste método
está limitado por su alto costo y nivel de complejidad.
Existen algunos métodos para generar dichos electrodos reportados en la literatura [110], sin
embargo en el presente trabajo empleamos molde-réplica, maquinado CNC y microfabricación
por láser [111], debido a que estos métodos son compatibles con sustratos de PDMS, PMMA y
nos permiten depositar el material conductor con el mismo método.
El método utilizado para depositar el material conductor, en el molde, es la técnica “Doctor
Blade”, la cual consiste en depositar un material en el molde y remover el exceso de material
mediante el uso de una navaja [112]. Este método se eligió, debido a que: (a) no requiere de un
depósito por pulverización catódica, (b) pre-horneado, o (c) pasos adicionales de revelado.
El número de electrodos y la selección del material del cuál están hechos, depende de la
aplicación en la que se requieren utilizar. En aplicaciones de voltamperometŕıa ćıclica es común
utilizar una configuración de 3 electrodos: electrodo de trabajo, contralectrodo y referencia, los
cuales deben ser de distintos materiales; por ejemplo carbón, platino y plata.
Eligimos utilizar pasta de carbón y plata como materiales conductores, por ser dos materiales
comunmente utilizados en sensores de glucosa. La pasta de carbón (LaserCon) que utilizamos
está hecha a base de solventes de grupo cetónico (acetonas), solventes de grupo glicoéteres,
resina acŕılica y grafito; y la tinta conductora que utilizamos es de plata (ConductivePen).
Para cada uno de los moldes producidos, con los distintos métodos en el presente trabajo, el
depósito del material conductor se realizó mediante el procedimiento que se ilustra en la Figura
2.23, en la cual se muestra: (a) el molde, (b) el depósito mediante la técnica de doctor blade y
(c) el molde con la estructura del material conductor (electrodo).
(c)(a) (b)
Figura 2.23: Procedimiento de depósito del material conductor. (a) Molde, (b) depósito de material conductor
y (c) microelectrodo.
2.4.1. Litograf́ıa suave
El poĺımero PDMS es biocompatible e inocuo, lo cual permite elaborar estructuras con
aplicaciones biológicas. Debido a que el interés del presente trabajo es desarrollar un biosensor,
este material es un buen candidato para desarrollar las estructuras tanto para la zona de
detección como para el transporte del flúıdo. Entonces, como primer método, elaboramos
microelectrodos a partir de un molde-replica realizado en un sustrato de PDMS. Estos electrodos
se muestran en la Figura 2.24. Para elaborar dicho electrodo se tomó un molde réplica (Figura
2.24a) y se llenó con plata y pasta de carbón, para obtener electrodos de plata (Figura 2.24b)
y carbón (Figura 2.24c).
La ventaja que tienen las réplicas de PDMS es que la geometŕıa de dos pozos que vienen del
mismo molde maestro es la misma, por lo que al tener la misma sección transversal, la impedancia
de dichas estructuras es la misma. Aunque si se requieren estructuras más elaboradas, debe
considerarse el hecho de que la sección transversal puede cambiar. Por ejemplo, para cada uno
de los electrodos que se muestran en la (Figura 2.24b) y (Figura 2.24c), la sección transversal
no es la misma, como se mostró en la Tabla 2.1.
44 Miniaturizar con microtecnoloǵıa
(b)(a)
2mm 2mm2mm
(c)
Figura 2.24: Molde (a), microelectrodos de plata (b) y de carbón (c).
Aunque se pueden elaborar electrodos en un mismo sustrato de PDMS, debe considerarse
el hecho de que si los pozos no tienen la misma profundidad, es decir una sección transversal
distinta, la resistencia o impedancia de los electrodos podŕıa cambiar. Además si se requieren
ensamblar dos sustratos, debido al termoplástico utilizado como molde maestro, ensamblar las
réplicas producidas no es sencillo, debido a las irregularidades en su superficie, lo que no permite
un sellado hermético. Una desventaja de usar PDMS es que es un material hidrofóbico, esto
dificulta el sellado con otra estructura del mismo material, lo cual nos permitió explorar con
otro material como el PMMA, como se muestra a continuación.
2.4.2. Microfresado
Por otro lado, utilizando microfresado se obtienen estructuras regulares en regiones locales
o adyacentes, además la profundidad de dichas estructuras permiten el depósito de material
conductor para elaborar electrodos, tal como se muestra en la Figura 2.25. Para preparar
electrodos de pasta de carbón y de tinta de plata se utiliza el siguiente procedimiento, que
consiste en:
Preparar un molde en sustrato de PMMA (Figura 2.25a);
Perforar el micromolde con una broca de 550µm (Figura 2.25b), debido a la necesidad de
conectar el electrodo con el exterior, para recuperar las señales con dicha estructura;
Fijar un alambre de 120µm en la perforación (Figura 2.25c);
Depositar el material conductor (pasta de carbón o plata) mediante la técnica de doctor
blade (Figura 2.25d); y
Secar las estructuras en una parrilla a 50◦C durante 5 minutos, para obtener los
microelectrodos de plata o carbón (Figura 2.25e).
Aunque las estructuras hechas en sustratos de PMMA se pueden llenar fácilmente con
material conductor, debe considerarse el hecho de que cada pozo contiene un volumen diferente
de material, debido a las diferencias de profundidad entre los pozos tal como se mostró en la
Tabla 2.2. Una de las ventajas que tiene utilizar este material es que ensamblar un sustrato
con otro es relativamente más sencillo porque: es ŕıgido, es hidrof́ılico y su superficie no tiene
irregularidades. Debido a que el maquinado es un pozo y no un relieve, no se puede utilizar
directamente para hacer una réplica. Si se desea maquinar como molde maestro para hacer
réplicas, es necesario desbastar el material circundante a la estructura en relieve que se desea
replicar. Esto agrega como consecuencia, rugosidades en la superficie que se transfieren a la
2.4. Electrodos 45
(c)(a) (b) (d)
1 mm 200 µm100 µm 4 mm
(e)
Figura 2.25: Microelectrodos producidos con micromaquinado. (a) Sustrato micromaquinado, (b) perforación
al sustrato, (c) fijación de alambre, (d) depósito de material conductor y (e) microelectrodo.
réplica y que a su vez afectan el ensamble del sustrato. Desde luego es posible si se maquina un
sustrato de otro material como latón.
La caracterización eléctrica del material corresponde con la presentada en los párrafos 2.5.2.1
y 2.5.2.2.
2.4.3. Microfabricación Láser
Finalmente, nuestro método de fabricación láser nos permitió preparar moldes que se
utilizaron para llenar de material conductor y elaborar nuestros electrodos, referido en este
párrafo como microelectrodos.
En la Figura 2.26 se muestra el procedimiento general para el depósito de material conductor
en nuestro sustrato de PMMA utilizando el método de doctor blade; en (a) se muestra el sustrato
grabado; en (b), el sustrato después del procedimiento de limpieza, en (c), el procedimiento de
depósito y; en (d), el electrodo.
(d)(c)(a) (b)
Figura 2.26: Procedimiento de depósito del material conductor en un micromolde preparado con
microfabricación láser. (a) Micromolde grabado, (b) micromolde limpio, (c) depósito de material
conductor y (d) microelectrodo.
Para llenar nuestro moldes con pasta de carbón o plata se utilizaron procedimientos similares,
con algunas diferencias debido a la viscosidad de los distintos materiales.
La pasta de carbón utilizada contiene part́ıculas de grafito dispersas en un solvente que
seca rápidamente a temperatura ambiente. Esta pasta se ha utilizado para la fabricación de
electrodos de carbón [113] para aplicaciones de voltametŕıa; en el presente trabajo se aplican
para amperometŕıa.
Una vez que el molde en el sustrato de acŕılico está listo, se puede utilizar para elaborar
microelectrodos mediante los siguientes pasos:
Proteger la mesa de trabajo, de residuos de pasta de carbón, con una toalla de papel (∼
20 x 20 cm);
Colocar el sustrato sobre la toalla de papel (Figura 2.27a);
46 Miniaturizar con microtecnoloǵıa
Depositar pasta conductora sobre el molde de acŕılico (Figura 2.27b);
Realizar el barrido en el sentido que se muestra en la (Figura 2.27c) utilizando una varilla;
Remover el exceso de material conductor mediante la técnica de Doctor Blade; y
Poner el sustrato en la parrilla a 50◦ por 5 minutos, para secar la pasta de carbón.
(a) (c)(b)
Figura 2.27: Procedimiento de depósito de pasta de carbón en un molde de PMMA. (a) Micromolde, (b)
depósito de pasta de carbón y (c) uso de varilla para limpiar el exceso de carbón.
Mediante este proceso se puede obtener un microelectrodo de carbón de manera rápida y de
bajo costo, tal como se muestra en la Figura 2.28.
(a) (b)
200um
200um
Figura 2.28: Microelectrodos de pasta de carbón. (a) Para caracterización eléctrica y (b) para aplicación en
impedancia.
También se pueden preparar microelectrodos de plata con un procedimiento similar. El
material conductor que se utilizó es una tinta de plata (CW2200MTP) de Chemtronics [114].
Para depositar la tinta de plata sobre el sustrato de PMMA se siguen los siguientes pasos:
Proteger la mesa de trabajo, de residuos de tinta de plata, con una toalla de papel (∼ 20
x 20 cm);
Se cortan 4 o 5 piezas de papel de aproximadamente 7x7cm (Figura 2.29a);
Colocar el sustrato sobre la toalla de papel (Figura 2.29b);
Depositar una gota de la tinta de plata sobre el sustrato de acŕılico;
2.5. Caracterización eléctrica de electrodos 47
Remover el exceso de tinta mediante el uso de la toalla de papel; y
Dejar secar el material durante 5 minutos a temperatura ambiente.
El procedimiento para el depósito mencionado se muestra en la Figura 2.29.
(a) (b)
200um
Figura 2.29: Procedimiento de depósito de pasta de tinta de plata en un micromolde de PMMA (b), utilizando
una toalla de papel (a).
Después de hacer el depósito del material conductor, se obtienen microelectrodos de plata,
tal como se muestra en la Figura 2.30.
(c)(a)
500µm
(b)
500µm
500µm
Figura 2.30: Electrodos de plata. (a) y (c) ejemplos de electrodos interdigitados para aplicación en impedancia
y amperometŕıa; y (b) electrodo para aplicación en impedancia.
Las estructuras que se muestran en las Figuras 2.30a y 2.30d se utilizaron para caracterizar
la impedancia de los electrodos y la Figura 2.30c para una aplicación de conteo de células en
un medio de cultivo.
Cada una de los electrodos obtenidos mediante las técnicas mencionadas se caracterizaron
eléctricamente mediante medición de impedancia, la cuál se describe a continuación (2.5).
2.5. Caracterización eléctrica de electrodos
La amperometŕıa y voltametŕıa involucran mediciones de corriente en un electrodo como
función del voltaje aplicado a la solución-electrodo, estos métodos utilizan señales de DC; En
contraste, los biosensores de impedancia miden la impedancia de una interfaz eléctrica utilizando
una señal de AC, en estado estacionario, con condiciones de polarización de DC constante, por
ello es importante conocer la respuesta del electrodo, según la aplicación en la que se requieren
48 Miniaturizar con microtecnoloǵıa
utilizar. Por lo anterior, los electrodos producidos en el presente trabajo, se caracterizaron
eléctricamente mediante espectroscopia de impedancia (IS, Impedance Spectroscopy).
La espectroscopia de impedancia, es un término utilizado en la medición de señales pequeñas
que son la respuesta eléctrica de un material de interés. El análisis de dicha respuesta da
información sobre las propiedades fisicoqúımicas del sistema y se realiza normalmente en el
dominio de la frecuencia. Las mediciones de impedancia son necesarias para caracterizar la
respuesta del material [115].
El procedimiento experimental para medir impedancia consiste en aplicar una pequeña señal
de potencial eléctrico a un electrodo y medir su respuesta en corriente a diferentes frecuencias.
A la relación de impedancia y frecuencia se denomina “espectro de impedancias”, el cual se
analiza utilizando circuitos eléctricos equivalentes, compuestos por resistores (R), capacitores
(C) e inductores (L). Estos datos se pueden representar en una gráfica en el plano complejo,
ó Z y θ en el eje Y vs f en el eje X. De esta manera se pueden caracterizar los electrodos
producidos en el presente trabajo.
Los electrodos producidos fueron caracterizados eléctricamente mediante el uso de un
medidor de impedancias (Precision LCR Meter Agilent E4980A), usando señales desde 5mV a
2V en un rango de frecuencias de 20Hz a 2MHz a 25◦C.
La impedancia es un término que describe la resistencia eléctrica de un circuito en corriente
alterna y se define por la razón entre la magnitud de la señal de potencial eléctrico alterno y la
magnitud de la señal de corriente alterna, y el ángulo de fase (Ecuación 2.1).
Z =
E
I
, (2.1)
E = ∆Esen(ωt), (2.2)
I = ∆Isen(ωt+ φ), (2.3)
Donde Z, es la impedancia [Ω]; E e I, el valor instantáneo del potencial eléctrico [V ] y
corriente eléctrica [A]; ∆E y ∆I , son la amplitud máxima y ω = 2πf , es la frecuencia
angular. La corriente asociada a una señal de potencial sinusoidal, es también sinusoidal, de
la misma frecuencia, pero con una amplitud y fase diferente. Cuando en el circuito se involucra
un capacitor (C) o un inductor (L), la impedancia se puede representar como (ecuación 2.4).
Z = R + jX, (2.4)
Donde, X es la reactancia inductiva (XL = 2πfL) o capacitiva (XC = 1/(2πfC)).
Para medir la impedancia de los electrodos, se puede utilizar un medidor de impedancias
(Precision LCR Meter Agilent E4980A), tal como se describe a continuación.
2.5.1. Configuración de la medición
El medidor de impedancias Precision LCR Meter Agilent E4980A nos permite realizar
mediciones de: resistencia, capacitancia, inductancia, reactancia, impedancia y admitancia, en
un rango de frecuencias de 20Hz a 20MHz con una precisión de medición de 0.01% [116]. Los
parámetros Z y θ, se miden utilizando la ecuación 2.5
2.5. Caracterización eléctrica de electrodos 49
Z = R + jX = |Z|∠θ, (2.5)
|Z| =
√
R2 +X2,
θ = atan
(
X
R
)
,
Generalmente, cualquier inductancia mutua, interferencia entre las señales de prueba, o
factores no deseados debidos a la conexión tienen un efecto en la medición, especialmente a
altas frecuencias. Por esta razón, el medidor de impedancias E4980A emplea una configuración
de medición de cuatro terminales que permite una medición estable y precisa tanto para baja,
como para alta impedancia, tal como se muestra en la Figura 2.31a.
Lcur HpotLpot Hcur
(2)(1)
(3)
Configuración de
4 terminales
GND
DUT
(2) (2)
Lcur
Hpot
Lpot
Hcur
Configuración de
2 terminales
Placa de conexión
DUT
Terminal BNC
(a) (b)
Figura 2.31: (a) Configuración de 4 terminales y (b) configuración de 2 terminales.
Los puntos que se deben considerar son (ver Figura 2.31a): (1) La longitud del cable entre
las terminales del medidor y el dispositivo bajo prueba (DUT, Device Under Test) debe ser tan
corto como sea posible, (2) Las terminales de GND deben estar conectadas entre si, tan cerca
como sea posible y, (3) Las conexiones entre las terminales BNC y el dispositivo bajo prueba
deben ser tan cortas como sea posible.
Para evitar efectos inductivos y capacitivos debidos a la conexión de las terminales, cables
y puntas, se ha realizado una conexión con una configuración de 2 terminales, que se muestra
en la Figura 2.31b, tal como se especifica en el manual del equipo [116].
En la Figura 2.32a se muestra una configuración de 2 terminales para utilizar el medidor de
impedancias (Figura 2.32b) y mediante unas puntas (Figura 2.32c) caracterizar eléctricamente
los electrodos (Figura 2.32d).
Debido a las dimensiones de los microelectrodos, ha sido necesaria la implementación de
un micromanipulador (Figura 2.33b) para posicionar las puntas sobre los microelectrodos y
hacer la caracterización eléctrica de dichas estructuras con el medidor de impedancias. El
micromanipulador fue hecho utilizando: piezas de tubeŕıa de cobre, madera, cable coaxial,
tornillos, dos plataformas micrométricas para el movimiento XZ (Figura 2.33a), y una platina
para el movimientos XY (Figura 2.33c).
Para llevar a cabo las mediciones de Z y θ se requieren realizar algunos ajustes al medidor de
impedancias , tales como: configurar parámetros de medición (impedancia, voltaje y frecuencia),
realizar los ajustes en circuito abierto y en corto circuito y configurar el almacenamiento de los
datos (ver apéndice B).
50 Miniaturizar con microtecnoloǵıa
(a) (b) (c) (d)
Figura 2.32: Configuración para la medición de impedancia. (a) Configuración de 4 terminales, (b) medidor
de impedancias, (c) platina para posicionar las puntas sobre microelectrodos y (d) puntas sobre
microelectrodos.
(a) (b) (c)
Figura 2.33: Manipulador implementado (b) con platinas (X, Z) (a) y platinas XY con ajuste fino (c).
El Medidor de impedancia LCR Meter E4980A, se ha utilizado para realizar la
caracterización de los microelectrodos elaborados sobre un sustrato de PMMA, tal como se
muestra en la Figura 2.32d. Además, la impedancia de estos electrodos se ha caracterizado,
para aplicarlo en un sensor de glucosa, usando un método amperométrico.
2.5.2. Impedancia de los microelectrodos
2.5.2.1. Microelectrodos de carbón
Para caracterizar los electrodos de carbón, primero se diseñó una estructura como la que
se muestra en el recuadro (1) de la Figura 2.34. Para dicha estructura se aplicó una señal
sinusoidal con amplitudes de 500mV , 1V , 1.5V y 2V @ 20Hz a 2MHz. Los resultados para Z
y θ se muestran en la Figura 2.34. Se observa de dichos resultados que la impedancia cambia
en función del voltaje aplicado en aproximadamente ±1.26%. Lo anterior se debe a que Z es
directamente proporcional a E, mientras que θ depende de la reactancia (Ecuación 2.1), es decir
de la naturaleza capacitiva o inductiva del material.
Basado en lo anterior, se eligió una señal sinusoidal con amplitud de 1V para caracterizar
nuestros microelectrodos, para lo cual se diseñaron estructuras con: (a) la misma longitud y área
de sección transversal distinta y, (b) la misma área de sección transversal y longitud distinta. En
la Figura 2.35, se muestran las dimensiones de una estructura en forma de prisma rectangular
2.5. Caracterización eléctrica de electrodos 51
101 102 103 104 105 106 107
2.32
2.34
2.36
2.38
2.40
2.42
2.44
Frecuencia [Hz]
Z
[Ω
]
(a)
x104
500µm
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0
0.5
Frecuencia [Hz]
θ[
°]
(b)
101 102 103 104 105 106 107
0.5V
1.0V
1.5V
2.0V
0.5V
1.0V
1.5V
2.0V
500µm
(1)
Figura 2.34: Impedancia (Z (a), θ(b)) de una estructura de carbón en función del voltaje aplicado.
en donde: a, es el ancho de la estructura; h, la altura y; l, la longitud. La resistividad en un
estructura con la geometŕıa citada se puede expresar de la forma ρ = RS
l
; donde S = ah, es el
área de la sección transversal.
l
a
h
Figura 2.35: Geometŕıa de una estructura rectangular.
En la Tabla 2.3, se muestran las dimensiones para distintas estructuras, con distintas
longitudes y distintas áreas de sección transversal, que se utilizaron para caracterizar los
electrodos de carbón. Estas medidas se obtuvieron con un perfilómetro.
Tabla 2.3: Altura y ancho promedio de dos estructuras.
Estructura
Sección transversal distinta
Estructura
Longitud distinta
h [µm] l [µm] S [µm2] h [µm] l [µm] S [µm2]
R1 26 100 1933 R1 26 100 1933
R2 26 100 2666 R6 26 224 1933
R3 26 100 2979 R7 26 466 1933
R4 26 100 6105 R9 26 1940 1933
R5 26 100 7239 - - - -
Los resultados para Z y θ vs Frecuencia, para cinco estructuras con una longitud de
∼ 100µm y área transversal distinta se muestran en la gráfica de la Figura 2.36. De dicha Figura
se puede observar que la Z es inversamente proporcional al área de la sección transversal. Aunque
θ, solo se ve afectado para frecuencias mayores a 100kHz, el efecto capacitivo es directamente
proporcional al área de la sección transversal.
52 Miniaturizar con microtecnoloǵıa
101 102 103 104 105 106 1070.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Frecuencia [Hz]
Z
[Ω
]
(a)
x104
500µm
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0
0.5
Frecuencia [Hz]
θ[
°]
(b)
101 102 103 104 105 106 107
R1
R2
R3
R4
R5
R1
R2
R3
R4
R5
Figura 2.36: Impedancia (Z (a), θ(b)) de distintas estructuras con la misma longitud y diferente área de sección
transversal.
Los resultados para Z y θ vs Frecuencia, para estructuras con la misma área de sección
transversal y cambiando la longitud se muestran en la gráfica de la Figura 2.37. De ésta gráfica
se puede observar que Z es directamente proporcional a la longitud de la estructura. En este
caso, aunque θ, solo se ve afectado para frecuencias mayores a 100kHz, el efecto capacitivo es
inversamente proporcional a la longitud de la estructura.
101 102 103 104 105 106 107
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Frecuencia [Hz]
Z
[Ω
]
(a)
x105
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
Frecuencia [Hz]
θ[
°]
(b)
101 102 103 104 105 106 107
3.0
3.5
4.0
R1
R6
R7
R9
R1
R6
R7
R9
Figura 2.37: Impedancia (Z (a), θ(b)) de una estructura con la misma área de sección transversal y distinta
longitud.
Por lo tanto, para las estructuras de carbón, si se requiere cambiar la impedancia de la
estructura se puede modificar el ancho o bien el largo, según sea el caso deseado para la aplicación
requerida.
2.5.2.2. Microelectrodos de plata
Para caracterizar los microelectrodos de plata, se aplicó una señal sinusoidal de 0.5V a 2V
en un rango de 20Hz a 2MHz. Los resultados para Z y θ vs Frecuencia, para dicha prueba,
se muestran en la Figura 2.38. Se puede observar que Z es similar para las distintas amplitudes
de la señal aplicada. θ se ve afectado para frecuencias mayores a 100kHz, en este caso se puede
observar que θ es positivo por lo que el efecto es inductivo.
En la Figura 2.39 se muestra el comportamiento para Z y θ para microelectrodos de carbon
y plata respectivamente (Ver recuadros de la Figura 2.39a). Se observa que en el caso del
microelectrodo de carbón, el comportamiento se puede ajustar a un modelo eléctrico de un
circuito RC en paralelo; mientras que para los microelectrodos de plata, a un modelo R-L en
serie, tal como se muestra en la Figura 2.39b
La frecuencia de las señales que se aplican a los microelectrodos, afecta su impedancia, por
lo tanto esto debe considerarse según la aplicación para la cual se diseñan.
2.5. Caracterización eléctrica de electrodos 53
101 102 103 104 105 106 107
0.66
0.67
0.68
0.69
0.70
0.71
0.72
Frecuencia [Hz]
Z
[Ω
]
(a)
-1
-0
1
2
3
4
5
Frecuencia [Hz]
θ[
°]
(b)
101 102 103 104 105 106 107
0.5V
1.0V
1.5V
2.0V
0.5V
1.0V
1.5V
2.0V
Figura 2.38: Impedancia (Z (a), θ(b)) de un microelectrodo de plata en función del voltaje aplicado.
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0
0.5
Frecuencia [Hz]
θ C
ar
b
on
[°
]
(b)
101 102 103 104 105 106 107
-1
0
1
2
3
4
5Carbon
Plata
θ P
la
ta
[°
]
R L
C
R
 101 102 103 104 105 106 107
2.32
2.34
2.36
2.38
2.40
2.42
2.44
Frecuencia [Hz]
Z
C
ar
b
on
[Ω
]
(a)
x104
0.66
0.67
0.68
0.69
0.70
0.71
0.72
Z
P
la
ta
[Ω
]
Carbon
Plata
500µm
500µm
(1)
(2)
Figura 2.39: Modelo eléctrico para microelectrodos de carbón y plata. (Z (a), θ(b))
2.5.2.3. Microelectrodos de oro
En algunas tiras reactivas para medir glucosa emplean electrodos que están en distintos
sustratos y se unen con un cinta para mantener la distancia entre ellos; sin embargo, existen
diseños en los que dichos electrodos se integran en un mismo sustrato (ver Figura 3.17a). Debido
a las dimensiones del molde (en algunos casos < 500µm) y al método utilizado para depositar
el material conductor, el depósito de distintos materiales en el mismo sustrato es dif́ıcil.
Por lo anterior, se diseñaron electrodos de oro y se enviaron a fabricar utilizando un
proceso de fotolitograf́ıa, para ser empleados con un método amperométrico. La respuesta en
impedancia de estos electrodos, es similar a los de plata, tal como se observa en la Figura
2.40. El comportamiento de Z y θ es similar al comportamiento de los electrodos de plata, es
decir para frecuencias mayores a 100kHz muestran un efecto inductivo, debido a que ambos
materiales son buenos conductores, no aśı el caso del carbón, que es más resistivo. Además,
debido a su baja impedancia, estos electrodos son ideales para aplicaciones como amperometŕıa
y voltamperometŕıa.
101 102 103 104 105 106 107
0.0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
Frecuencia [Hz]
Z
[Ω
]
(a)
-20
-0
20
40
60
80
100
Frecuencia [Hz]
θ[
°]
(b)
101 102 103 104 105 106 107
0.05V
0.1V
0.5V
1.0V
2.0V
0.05V
0.1V
0.5V
1.0V
2.0V
Figura 2.40: Impedancia (Z (a), θ(b)) de un microelectrodo de oro en función del voltaje aplicado.
54 Miniaturizar con microtecnoloǵıa
Además, es importante conocer cual es el comportamiento de éstas estructuras en distintas
condiciones, como humedad y temperatura, entre otras cosas, debido a que muchas aplicaciones
requieren que estos microelectrodos se expongan a estas condiciones, por lo tanto se probaron
como se describe a continuación.
2.5.3. Respuesta en condiciones de humedad
Los microelectrodos de carbón son sensibles a la humedad, por lo que la impedancia total
del sistema se puede afectar a través del tiempo. Por esta razón, se hicieron una serie de
mediciones para observar la impedancia. Se depositó una gota de agua destilada de 1µL sobre el
electrodo de carbon (Figura 2.39a-1) y luego se realizó una serie de mediciones de impedancia. El
microelectrodo utilizado (Figura 2.39a-1), consiste en una ĺınea de 2mm de longitud y 100µm
de ancho, unido por dos puntos de contacto cuadrados de 1mm x 1mm. Se observó que la
mayor diferencia de ∆θ esta entre 80 y 300Hz, mientras que la mayor diferencia ∆Z es para
frecuencias mayores que 10kHz. Z se decrementa debido a la resistencia (Rw) y a la capacitancia
(Cw) causada por la gota de agua, y retorna a su valor inicial (Re) cuando la gota de agua se
evapora (Figura 2.41a).
t [min]
R
w
n
 y
 C
w
n
0 2 4 6 8 10
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
1.1
(b)
Re
Rw
Cw
Rwn=-0.034t+1.05
Cwn=-0.058t+0.43
Rwn
Cwn
 
θ[
°]
(a)
0 2 4 6 8 1410 1812 16
t [min]
-5
-4
-3
-2
-1
0
35
40
45
50
55
60
65
Z
[k
Ω
]
Z
θ
500µm
Figura 2.41: (a) Impedancia del microelectrodo de carbón (Figura 2.39a-1) a través del tiempo cuando una
gota de agua se deposita sobre el microelectrodo y (b) Rw y Cw normalizados.
En la Figura 2.41b se muestra en el modelo eléctrico cuando la gota se deposita sobre el
microelectrodo; Rw y Cw se calcularon de las mediciones (Figura 2.41a) y normalizaron como:
Rwn = Rw−R0
R0
and θwn = θw−θ0
θ0
. Se observa que en los primeros 9 minutos Cwn se incrementa
2.8% cada minuto, mientras que Rwn 1.7%. Por lo tanto, este comportamiento en la impedancia
debe considerarse en un proceso de medición que toma más de un minuto y menos de nueve.
En la Tabla 2.4, se resume el comportamiento eléctrico (Z, θ) de los electrodos de carbón,
plata y oro en función del voltaje o frecuencia de operación. Entonces, dicha tabla se puede usar
para elegir el material del electrodo según la aplicación para la cual se diseña.
Aplicaciones como amperometŕıa y voltamperometŕıa ćıclica realizan la medición de una
corriente en función del voltaje aplicado a una muestra, empleando una señal de voltaje
de corriente directa; por lo tanto, para estas aplicaciones, es importante considerar que la
impedancia es afectada por los niveles de voltaje aplicado a los electrodos, sobre todo si
se emplean electrodos de carbón. Para aplicaciones que emplean medición de impedancia es
importante considerar los niveles de la amplitud y el rango de frecuencias de las señales
empleadas en las mediciones. Haciendo las consideraciones previas se podŕıa elegir el material
del electrodo.
2.6. Discusión 55
Tabla 2.4: Comportamiento eléctrico de los electrodos.
Carbón Plata Oro
Z
V 1.26% @ 0.5V 0.4% @ 0.5V 0.5% @ 0.5V
20Hz a 100kHz Constante ∼ kΩ Constante ∼ mΩ Constante ∼ mΩ
100kHz a 2MHz Incrementa 1.8% Incrementa 5%(100mΩ) Incrementa 90%(100mΩ)
θ
V No afecta No afecta No afecta
20Hz a 100kHz Constante ∼ 0◦C Constante ∼ 0◦C Constante ∼ 0◦C
100kHz a 2MHz Incrementa hasta ∼ 2◦C Incrementa hasta ∼ 4◦C Incrementa hasta ∼ 80◦C
Permeable Si No No
Modelo eléctrico RC en Serie RL en Paralelo RL en Paralelo
En el apéndice F, se describen algunas aplicaciones adicionales utilizando electrodos de
carbón y plata producidos en el presente trabajo.
2.6. Discusión
En este caṕıtulo se han presentado tres métodos para producir electrodos en sustratos de
PMMA y PDMS.
El método de molde replica, no resultó conveniente, principalmente por el termoplástico
que nosotros usamos para hacer el molde maestro; además, depositar material conductor en
un molde de PDMS presenta dificultades por ser hidrofóbico. Llenar un canal en PDMS con
material conductor, usando la técnica de doctor blade, presenta dificultades y la limpieza de las
muestras también se dificulta; por lo que no es ideal para propósitos del presente trabajo.
El PDMS tiene la ventaja de replicar siempre de manera similar las estructuras del molde
maestro, pero debe elegirse apropiadamente el material del molde maestro; tal material puede ser
de latón, aluminio u otro material que no se deforme a temperaturas cercanas a 100◦C, debido
a que para polimerizar el PDMS se emplean temperaturas ∼ 70◦C. Además, debe cuidarse la
rugosidad de dicho molde, si se desean ensamblar posteriormente las estructuras hechas a partir
de él.
El método de microfresado sobre sustratos de PMMA resultó un método rápido pero no
repetible, debido a que evitamos hacer un maquinado inicial sobre toda la superficie para
establecer una coordenada inicial en Z (Z0); esto principalmente por la rugosidad que deja
el cortador y debido a la necesidad de tener un sustrato libre de rugosidad para ensamblar con
otro sustrato. Sin embargo resultó un método útil para producir un prototipo rápido.
El método para producir electrodos sobre un sustrato de PMMA, utilizando microfabricación
láser, ha resultado una técnica que nos permite producir estructuras con geometŕıa controlada;
sin embargo, para producir estructuras con éste método, se requiere tiempo de grabado, además
de que las estructuras en diferentes sustratos, no tienen el mismo perfil, haciendo que el volumen
del material depositado cambie y finalmente modifique la impedancia de la estructura.
Por otro lado, los electrodos producidos con fotolitograf́ıa en una tarjeta PCB, son una
buena alternativa, sin embargo están limitados para integrarlos con un canal para el transporte
56 Miniaturizar con microtecnoloǵıa
de fluidos, debido la rugosidad en la superficie, a la tinta que el fabricante utiliza como aislante
y al relieve mismo del conductor sobre el sustrato.
La elección del método que debe usarse para producir un molde depende de la aplicación
que se quiere implementar, del nivel de integración al que se requiere llevar la microestructura
producida, el costo, la velocidad a la cual se tiene el dispositivo terminado, material y equipo
disponible. Cuando se requiere crear una estructura tridimensional en un sustrato de PDMS,
de manera rápida y a bajo costo, elegir el método de molde réplica mediante un molde maestro
hecho con el termoplástico shrinky dinks, es una muy buena alternativa, sobre todo si la
repetibilidad es más importante que la exactitud de patrón transferido, en base al diseño.
Además, debido a la gran capacidad de replicar un molde maestro, el PDMS es una excelente
elección como material de sustrato. Por otro lado, si se prefiere el control de profundidad y una
resolución en el orden de los micrómetros, la microfabricación láser es una excelente alternativa;
sin embargo, esta técnica se realiza en sustratos de PMMA y el tiempo del proceso es mayor.
Finalmente, si se prefiere una estructura hecha en un molde de PMMA, latón, aluminio u otro
sustrato, el microfresado es la opción más conveniente.
Cuando se elige el material con el cual deberá estar hecho el electrodo, se debe considerar el
método de depósito de dicho material, el sustrato, el material y equipo disponible. Por ejemplo,
para depositar una pasta de carbón, es más fácil hacerlo en un molde de PMMA preparado
mediante microfresado y usando la técnica de doctor blade, debido a la viscosidad del material;
Para depositar tinta de plata, es mejor hacerlo en un molde preparado mediante microfabricación
láser, debido a la profundidad del pozo y a que los solventes de la tinta se evaporan, lo que
permite depositar una peĺıcula en pocos minutos.
Aunque la técnica doctor blade no requiere de una máscara para hacer el depósito del material
conductor, es un método accesible y rápido, existen otros métodos, como la pulverización
catódica; este método requiere del uso de una máscara para depositar de manera selectiva
una peĺıcula del material conductor sobre el sustrato de interés. Este método no es de bajo
costo, aunque es compatible con otros sustratos y el espesor de la peĺıcula que se deposita es
controlable; por lo tanto, los electrodos son repetibles.
En el caṕıtulo siguiente se presenta la aplicación de estas estructuras en el diseño y
construcción de un sensor de glucosa.
3 — Aplicación - Glucosa
3.1. Transducción electroqúımica
Los biosensores amperométricos funcionan debido a la producción de una corriente cuando
un potencial es aplicado entre los electrodos. Una de las aplicaciones de este tipo de biosensor es
la determinación de las concentraciones de glucosa, mediante el uso de una membrana de glucosa
oxidasa inmovilizada. La reacción resulta en una reducción de la concentración de ox́ıgeno (3.2)
mientras éste se difunde a través de la membrana biocataĺıtica al cátodo, siendo esto detectado
por una reducción de la corriente entre los electrodos.
Existen tres tipos de transductores que pueden ser empleados para medir glucosa: (a) los
sensores de oxigeno, miden la concentración de oxigeno y la convierten en una corriente.; (b)
los sensores de pH, miden la producción de ácido glucónico y convierten este cambio de pH en
una diferencia de potencial; y (c) sensores de peróxido, los cuales miden la concentración de
peróxido y la convierten en una corriente.
En el primer electrodo de enzimas de Clark, la enzima glucosa oxidasa, era mantenida
junto a un electrodo de platino entre membranas de teflón; la glucosa oxidasa se encarga de
catalizar la reacción (ecuación 3.1), lo que produce ácido glucónico y peróxido de hidrógeno
(H2O2); el peróxido de hidrógeno es oxidado a 700mV (versus a un electrodo de referencia
de calomel saturado) sobre la superficie del electrodo de platino, produciendo una corriente
eléctrica que es directamente proporcional a la cantidad de glucosa en la muestra. Muchos
sensores comerciales aún utilizan este principio. La membrana permite eliminar la interferencia
debida a otras sustancias electroactivas; el criterio que se debe mantener es que la membrana,
permita el paso del peróxido de hidrógeno, pero no de otras sustancias. Además, debe permitir
entrar al analito en la capa de enzima.
Glucosa+O2 glucosaoxidasa−−−−−−−−−−−→ ácido glucónico +H2O2 (3.1)
O2 + 4H+ + 4e− → 2H2O (3.2)
En 1973, Guilbault y Lubrano describieron un electrodo para medir glucosa en sangre basado
en un método amperométrico para medir el producto de peróxido de hidrogeno (ecuación 3.3)
en lugar del decaimiento de ox́ıgeno 3.2. Ellos pudieron con este sensor obtener buena precisión
y exactitud.
H2O2 → O2 + 2H+2e− (3.3)
Se han diseñado sensores de glucosa implantables que realizan una medición de manera
periódica. El problema que presentan estos sensores es la saturación de u obstrucción de la
membrana entre los electrodos; además, los niveles del oxigeno en los tejidos subcutáneos es
57
58 Aplicación - Glucosa
inestable y por ello se deben recalibrar. Aśı, los sensores de ox́ıgeno son utilizados para medir
la disminución de ox́ıgeno, en proporción a la oxidación de glucosa.
Se ha trabajado también con el objetivo de minimizar la dependencia del ox́ıgeno y el nivel
de ruido de los electrodos de enzimas, reemplazando el ox́ıgeno en la reacción con electrones
(aceptores / donadores), también conocidos como mediadores. Uno de los mediadores mas
utilizados es el ferroceno.
Los mediadores tienen un potencial de oxidación mas bajo que el peróxido de hidrógeno, por
lo que pueden ser operados a potenciales mas bajos ( 200mV - 500mV versus calomel saturado).
Por lo tanto, son menos susceptibles a componentes que producen interferencias electroacivas,
como el ácido úrico o el ácido ascórbico, que están presentes en los fluidos corporales.
En el caso del uso de mediadores, la reacción corresponde con la ecuación 3.4
Glucosa+ 2M o glucosaoxidasa−−−−−−−−−−−→ ácido glucónico + 2M r + 2H+ (3.4)
donde: M o, es la forma oxidada del mediador y M r es la forma reducida. En la Figura 3.1,
se muestra el esquema de la reacción oxidación-reducción.
Glucosa
Glucosa oxidasa
Ácido glucónico
Electrodo
b) mediador oxidado
(a) Oxígeno
o
(a) Peróxido de hidrógeno
(b) mediador reducido
o
Electrones
Figura 3.1: Esquema de la reacción oxidación-reducción.
Existen tres generaciones de sensores de glucosa que han sido utilizados a través de los años.
(a) En la primera generación, se utiliza al oxigeno como mediador entre el electrodo y la
Glucosa oxidasa. En esta generación se mide el consumo de oxigeno o el aumento del peróxido
de hidrogeno. La principal desventaja de esta estrategia es mantener constante la concentracion
de oxigeno es dif́ıcil.(b) En la segunda generación, se utilizan mediadores artificiales para
transportar electrones del centro redox de la enzima a la superficie del electrodo; dichos
mediadores son comunmente de hierro derivados de ferricianuro, ferroceno y quinonas.(c) En
la tercera generación, se elimina el uso de mediadores, debido a que la enzima se inmoviliza
directamente sobre los electrodos. Los métodos de inmovilización de la enzima sobre el electrodo
son muy importantes, debido a la distancia entre la capa de enzima y la superficie del electrodo.
3.1.1. Inmovilización de enzima
Como se mencionó, una de las partes más importantes en el diseño y construcción de un
sensor enzimático es la inmovilización de la enzima sobre el electrodo; para ello existen distintos
métodos. La inmovilización consiste en fijar la enzima sobre el sustrato de interés mediante
retención f́ısica o mediante una unión qúımica.
3.1. Transducción electroqúımica 59
3.1.1.1. Retención f́ısica
La enzima puede inmovilizarse mediante su retención f́ısica en cavidades de una matriz solida
porosa, dicha matriz puede ser un prepoĺımero, como: poliacrilamida, colágeno, alginato, entre
otros. Para inmovilizar la enzima, ésta se coloca en una solución de algún monómero, al cual
le sigue un proceso de polimerización mediante el uso de temperatura o debida a una reacción
qúımica.
También puede inmovilizarse por inclusión en membranas permeables que permiten el paso
de moléculas y producto, pero no de la enzima; o mediante atrapamiento en geles o en fibras.
Como sea, siempre debe observarse las condiciones en las cuales la enzima se atrapa, para no
degradarla.
La enzima también puede unirse a un sustrato mediante adsorción, que permite la
inmovilización a un soporte debido a interacciones iónicas, fuerzas de Van der Waals y puentes
de hidrógeno. Sin embargo, existen factores que influyen en este proceso como el pH del medio,
la fuerza iónica, el diámetro del poro en el que se fija, o la presencia de iones.
3.1.1.2. Unión qúımica
La unión qúımica consiste en unir la enzima a soportes inorgánicos u orgánicos, procurando
que la inmovilización incremente la afinidad por el sustrato, disminuya la inhibición, ampĺıe el
intervalo de pH y reduzca las posibles contaminaciones microbianas. Las enzimas pueden unirse
a estos soportes mediante adsorción iónica o mediante unión covalente.
La unión covalente se basa en la activación de grupos qúımicos del soporte para que
reaccionen con nucleófilos de las protéınas. Algunos de los aminoácidos, que se encuentran
en la estructura de las enzimas, más empleados para la formación de enlaces con el soporte
son, principalmente: la lisina, la cistéına, la tirosina y la histidina. Algunas ventajas que ofrece
este método son que: la carga de la enzima permanece constante después de la inmovilización
y existe mayor resistencia a la desactivación por efecto de la temperatura, disolventes orgánico
o del pH; sin embargo, se debe conocer la densidad de grupos activos por unidad de superficie,
pues esto condiciona el numero de uniones enzima-soporte; además, el proceso de inmovilización
puede alterar la estructura del centro activo. Por ello esta técnica no es aconsejable a enzimas
sensibles a cambios de pH o fuerza iónica.
También existe un método conocido como entrecruzamiento (cross-linking), que consiste en
el uso de reactivos bifuncionales que originan uniones intermoleculares entre las moléculas de
enzima. Los reactivos bifuncionales que se pueden emplear son: dialdeh́ıdos, diiminoésteres,
diisocianatos y sales de bisdiazonio, entre otros. El resultado de este método son enzimas
con enlaces intermoleculares irreversibles capaces de resistir condiciones extremas de pH y
temperatura. Esto se debe a que con este método se obtiene un entramado cristalino, donde las
moléculas de enzima están rodeadas exclusivamente por otras moléculas de protéına.
Para inmovilizar la enzima en nuestros electrodos, empleamos retención f́ısica, aprovechando
el hecho de que preparamos el material conductor para nuestros electrodos, el cual consiste en
una pasta hecha a base de grafito. También empleamos la inmovilización de la enzima glucosa
oxidasa mediante atrapamiento en gel.
Muchos métodos electroqúımicos han sido publicados para medir glucosa, con diferencias en
las técnicas para elaborar electrodos, en los materiales con los cuales se elaboran los electrodos,
y en los métodos para inmovilizar la enzima; sin embargo debido a la especificidad, dicha enzima
sigue siendo utilizada en la mayoŕıa de los casos.
60 Aplicación - Glucosa
Además, existen diferentes técnicas que pueden ser utilizadas para cuantificar la señal que
se obtiene de los electrodos utilizados para medir glucosa. Una de las técnicas más utilizadas
es la amperometŕıa, aunque la voltamperometŕıa también puede ser utilizada. El presentado en
este trabajo emplea la amperometŕıa; por ello, se presenta a continuación el circuito diseñado
para tal propósito.
3.2. Obtención de señales
Existen instrumentos comerciales que se pueden utilizar para medir o registrar una pequeña
señal de corriente eléctrica producida por un sensor electroqúımico, tal como una tira reactiva
de un glucómetro comercial. Los sensores amperométricos producen una señal de corriente
eléctrica pequeña, en el orden de los pA o µA. Estas corrientes pueden ser medidas con: (a) un
ampeŕımetro, (b) por una unidad de medición de (SMU, source measure unit) de Keithley, (c) o
por un circuito que sea capaz de convertir una señal de corriente a voltaje y luego utilizar un
volt́ımetro u osciloscopio. En el presente trabajo utilizamos una unidad SMU 2450 de Keithley
para medir y registrar dichas corrientes, además implementamos un circuito electrónico capaz
de convertir las señales de corriente de un sensor de glucosa a una señal de voltaje, que pudo
ser registrado con un osciloscopio. Además, se implementó un circuito para procesar estas
señales utilizando un microcontrolador y comunicado mediante una interfaz de bus serial a
la computadora, la cual procesó dicha información.
En electrónica existen distintos circuitos y configuraciones que pueden ser utilizados para
registrar la corriente producida por un sensor. Uno de los principales circuitos integrados
utilizados es el Amplificador Operacional (OpAmp). Los amplificadores operacionales pueden
ser operados en distintas configuraciones, según la aplicación deseada; por ejemplo, pueden ser
usados, entre otras funciones, para: sumar, restar, integrar o amplificar señales de voltaje. En
el caso de los sensores que entregan corriente, la configuración que se emplea es conocida como
transimpedancia, la cual se utiliza para convertir una señal de corriente a voltaje.
En la Figura 3.2 se muestra el diagrama electrónico de un circuito amplificador en una
configuración de transimpedancia, utilizada en el presente trabajo. El circuito integrado que se
utilizó es el AD8608; con 4 amplificadores operacionales internos.
(a) (b)
C
R
i
Vo+
-
Figura 3.2: Circuito de transimpedancia (a) y amplificador operacional (b).
Para hacer el análisis de circuitos con amplificadores operacionales, se hacen dos
consideraciones: (a) la impedancia de entrada de dicho circuito es muy alta y, (b) que el potencial
en las terminales inversora y no inversora es similar, por lo tanto, el único lazo por el cual circula
corriente es por la resistencia; entonces, el voltaje de salida se puede calcular como se muestra
en la ecuación 3.5.
3.2. Obtención de señales 61
Vo = Ri (3.5)
donde: Vo, es el voltaje de salida; R, es la resistencia de ganancia del circuito; C, un capacitor
para estabilidad del circuito e; i, la corriente proveniente del sensor.
La mayoŕıa de los glucómetros comerciales, por ejemplo FreeStyle InsuLinx, miden la
concentración de glucosa de una muestra sangúınea utilizando un sensor enzimático y empleando
un método amperométrico. Este tipo de sensores emplean un circuito similar al que se muestra
en la Figura 3.2.
Para mostrar la forma de estas señales, (a) se utilizó un circuito de transimpedancia con
ganancia de 82kΩ (Figura 3.3a); (b) se usó un OpAmp AD8608, montado en una tarjeta
de circuito impreso (PCB, Printed Circuit Board) (Figura 3.3b); (c) el circuito se conectó
a una tira reactiva comercial mediante un conector recuperado de un glucométro (Figura
3.3c) y, (d) mediante un osciloscopio se registró una serie de señales de voltaje para distintas
concentraciones de una muestra de agua con glucosa (60− 220mg/dL) (Figura 3.4).
(a) (c)
10pF
82kOhm
i
Vo+
-
AD8605
(b)
Figura 3.3: Circuito de transimpedancia (a) montado en una tablilla de prueba (b) y conector para una tira
reactiva (c).
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
1
2
3
4
5
V
ol
ta
je
 [
V
]
Tiempo [s]
60mg/dL
80mg/dL
100mg/dL
120mg/dL
140mg/dL
160mg/dL
180mg/dL
200mg/dL
220mg/dL
Figura 3.4: Voltaje vs Glucosa.
Las muestras de agua con glucosa se prepararon mediante el procedimiento que se muestra
en el apéndice D.
De la Figura 3.4 se observa que cada curva tiene un valor máximo diferente en función de
la concentración de glucosa. Para ver con mayor claridad dichos cambios se puede hacer un
cálculo del área bajo cada curva y comparar dichos valores. Cada curva consta de una serie de
valores tomados con el osciloscopio de manera regular, con una separación de 10ms entre cada
medición.
62 Aplicación - Glucosa
Para cada una de las curvas de la Figura 3.4, se realizó una suma de todos los valores
comprendidos entre 0 y 18 segundos mediante la Ecuación 3.6, para calcular un valor de voltaje
que corresponde con cada concentración de glucosa en la muestra utilizada.
Vtotal =
1800
∑
i=0
Vi (3.6)
donde: Vi, es el voltaje correspondiente a cada punto.
Debido a la ganancia del circuito, dada por la resistencia de retroalimentación, las
concentraciones altas producen una señal de salida que puede saturar el circuito y las
concentraciones muy bajas pueden producir señales con una amplitud en el orden de losmV ; por
lo tanto, en el diseño del circuito debe elegirse apropiadamente el OpAmp que debe utilizarse,
considerando la ganancia del circuito y los niveles de voltaje de alimentación del circuito.
Realizando la suma de todos los valores comprendidos entre los ĺımites definidos en la
ecuación 3.6 se obtiene la gráfica que se muestra en la Figura 3.5, a la cual se le puede ajustar una
curva que puede ser usada para interpolar un valor de voltaje para conocer una concentración
dada. A ésta curva de ajuste se le conoce como curva de calibración del sensor y de ella se
pueden conocer los ĺımites de detección del sensor.
0
V
ol
ta
je
[V
]
Glucosa [mg/dL]
60 80 100 120 140 160 180 200 220
3500
500
1000
1500
2000
3000
0
Figura 3.5: Voltaje total vs Glucosa.
El circuito presentado en la Figura 3.3 se puede utilizar con un osciloscopio, sin embargo
para no depender de dicho instrumento se requiere de un circuito que sea capaz de procesar
dicha señal. Si bien es cierto que la señal entregada por el circuito es medible, es una señal
analógica, por lo tanto hacen falta algunas etapas adicionales tales como:
Convertir la señal de voltaje a una señal digital mediante un convertidor analógico-digital
(ADC, Analog to digital converter);
Leer y procesar la señal digital mediante un microcontrolador;
Comunicar el dato a una computadora o dispositivo móvil de manera cableada o
inalámbrica y;
Procesar la información mediante un software, lo cual implica, leerla, procesarla,
almacenarla, desplegarla y comunicarla;
De esta manera, el sistema electrónico quedaŕıa representado como en el diagrama de la
Figura 3.6.
3.2. Obtención de señales 63
Circuito de
transimpedancia
Procesamiento con
microcontrolador 
Convertidor
ADC Interfaz USB
Procesamiento con
computadora
Almacenamiento
de información
Sensor
Despliegue de
información
Figura 3.6: Diagrama a bloques del sistema electrónico para procesar las señales de un sensor de glucosa.
3.2.1. Polarización de electrodos
Como se mencionó, la enzima glucosa oxidasa tiene un potencial de oxidación alrededor de
700mV . Para observar el comportamiento de la corriente de salida del sensor se conectó una
tira comercial al equipo SMU 2450 (Figura 3.7b). Con dicho equipo se pueden medir corrientes
en un rango de pA a A. Mientras este equipo mide la corriente resultante del sensor, puede
suministrar simultáneamente una señal de voltaje entre las terminales de los electrodos; además
permite hacer un registro de hasta 100,000 datos.
(a) (b)
220mg/dL
+
polarización
a 700mV
 
22
0m
g/
dL
si
n 
p
ol
ar
iz
ar
Agua
+
Polarización a
700 mV
Figura 3.7: Respuesta de un sensor comercial cuando se polariza el electrodo. (a) Corriente de producida por
una tira reactiva medida con equipo comercial SMU (b).
Conocer el efecto que tiene el voltaje de polarización sobre la magnitud de corriente que
entrega el sensor, nos permite calcular la ganancia requerida por el circuito electrónico de
transimpedancia (subsección 3.2.2), para convertir la señal de corriente a una señal de voltaje
de salida en un rango que pueda ser léıda y procesada por un microcontrolador. Para estudiar
el efecto de la polarización, se utilizó el equipo SMU para aplicar el voltaje de polarización al
sensor y medir corriente simultáneamente, tal como se muestra en la Figura 3.7. Para ello, se
realizaron las siguientes pruebas.
Se midió la corriente del sensor para una muestra de glucosa con 220mg/dL usando una
tira reactiva comercial y polarizando los electrodos a 700mV .
Se midió la corriente del sensor para la misma muestra, pero sin polarizar.
Finalmente, polarizando los electrodos se midió una muestra de agua.
64 Aplicación - Glucosa
En la gráfica de Figura 3.7a, se puede observar que el nivel de corriente producido por el
sensor se incrementa de manera considerable (4 veces más la magnitud que cuando no se polariza)
cuando se polariza; además, se puede observar que aún en presencia de dicho potencial en los
electrodos, cuando se mide una muestra sin glucosa, esta no tiene efecto sobre la señal de salida
del sensor.
3.2.2. Medición con un sensor
Como se mencionó previamente, la enzima glucosa oxidasa tiene un potencial de oxidación,
alrededor de 700mV , entonces este voltaje debe ser suministrado por el circuito; por tal motivo,
en el diagrama de Figura 3.8a se muestra una fuente de 700mv.
(a) (b)
10pF
82kOhm
i
Vo+
-
AD8605
+ -
700mV
Figura 3.8: Circuito utilizado para polarizar un electrodo de trabajo. (a) circuito de transimpedancia y (b)
polarización con una fuente de 700 V.
En la Figura 3.8b, se muestra un circuito en el que se observa un diodo conectado entre la
terminal inversora del OpAmp y el lazo de retroalimentación. El propósito de tal configuración
es utilizar dicho componente (1N4728A) como un regulador de voltaje de 700mv. La ventaja
que ofrece esta configuración es que el voltaje se mantiene fijo, aún si la bateŕıa se descarga
hasta un valor cercano al voltaje de polarización del diodo.
Uno de los efectos que tiene el voltaje de polarización mencionado, es que la magnitud de la
corriente es mayor; por lo tanto la magnitud de la corriente para concentraciones menores es más
fácil de leer. Lo anterior hace que la señal de salida del circuito se sature para concentraciones
altas. Para resolver este inconveniente, sobre todo si se quiere medir concentraciones en un
rango entre 5mg/dL y 300mg/dL (Figura 3.9), se debe aumentar el voltaje de alimentación
de los circuitos integrados. Sin embargo, esto también presenta otro inconveniente, y es que la
mayoŕıa de los microcontroladores que tienen un ADC interno, solo toleran voltajes hasta de
5V . Por lo tanto, es necesario el uso de ADCs que toleren señales de voltaje con amplitudes
hasta de 20V , tal como el AD574AJN, el cual es un ADC de 12 bits con un bus de interfaz
paralelo compatible con microcontroladores. Considerando lo anterior, en el presente trabajo
se ha implementado el uso de un circuito ADC acoplado con el circuito de transimpedancia
mencionado previamente.
De la Figura 3.9, se puede observar que la amplitud máxima para la muestra con 2.5mg/dL
es de ∼ 5V , mientras que para la de 300mg/dL, de ∼ 16V ; por lo que el circuito ADC usado
puede procesar dichas señales sin perder información.
3.2. Obtención de señales 65
(b)(a)
Figura 3.9: Señal de salida para dos muestras de agua con glucosa de (a) 2.5mg/dL y (b) 300mg/dL.
3.2.3. Medición múltiple
Por otro lado, planteamos reducir el error en las mediciones a través de la implementación
de 4 electrodos en un mismo sustrato, mediante una medición simultánea y obteniendo la media
aritmética (3.7) de las cuatro mediciones.
La media aritmética de una muestra de n valores, x1, x2, . . . , xn, se define como:
x =
1
n
n
∑
i=1
xi (3.7)
donde: n, es el número de valores; y xi, el i-esimo elemento. La media aritmética, es una
variable que depende de la muestra y tiene generalmente una varianza (3.8) menor que las
variables usadas para su cálculo. Cuanto mayor es la muestra, su valor se aproxima con precisión
al valor de la media poblacional.
La varianza, es una medida de dispersión que indica que tan alejada o cercana están los
valores de una variable con respecto a la media y se define como:
s2 =
1
n− 1
n
∑
i=1
(xi − x)2 (3.8)
donde: n, es el número de valores; xi, el i-esimo elemento; y x, es la media aritmética. De
la ecuación (3.8) se puede calcular otra medida de dispersión, la desviación estándar, que es
la ráız cuadrada positiva de la varianza y se denota por s. Es usual emplear estas medidas de
dispersión para conocer la desviación que tienen los datos con respecto a la tendencia central.
Aśı, si los datos son cercanos entre ellos, la desviación respecto a la media es menor y entre
mayor número de datos, la desviación es menor.
Lo anterior implica que el circuito emplee 4 configuraciones idénticas para procesar las señales
y enviarlas mediante una interfaz USB a una computadora, tal como se muestra en el diagrama
de la Figura 3.6.
Considerando que el ADC utilizado tiene una interfaz paralela de 12 bits de datos y 2 bits de
control, es necesario contemplar que se necesitan al menos 56 ĺıneas de conexión disponibles en
el microcontrolador. Para resolver el planteamiento anterior, en el presente trabajo se utilizaron
dos microcontroladores ATMEGA2560 (Arduino Mega), uno de los cuales funciona como un
nodo maestro y el otro como esclavo. La comunicación entre ambos se hizo con el protocolo de
66 Aplicación - Glucosa
comunicación serial I2C. El módulo maestro comunica los datos a una computadora portátil
mediante el puerto USB.
En la Figura 3.10, se muestra el circuito utilizado para procesar la señal de 4 sensores
de glucosa de manera simultánea y comunicar los datos a la computadora, la cual los procesa
mediante un software implementado con Python. La interfaz gráfica de usuario de esta aplicación
se muestra en la Figura 3.11.
Circuito de
transimpedancia
Procesamiento con
microcontrolador 
Convertidor
ADCInterfaz USB
Interfaz eléctrica
con el sensor
Alimentación del
circuito
Fuentes para
polarizar electrodos
Figura 3.10: Circuito utilizado para procesar la señal de 4 sensores de glucosa de manera simultánea.
Figura 3.11: Aplicación para procesar la señal de cuatro sensores de glucosa de manera simultánea.
En la Figura 3.11, se muestra una interfaz en la que los datos obtenidos a través del puerto
3.3. Electrodos 67
USB son graficados y procesados con la ecuación 3.6. Los datos además se pueden: almacenar
en un archivo con formato *.csv, leer de un archivo y graficar.
3.3. Electrodos
El método amperométrico utiliza un electrodo de trabajo y uno de referencia. En el presente
trabajo se prepararon electrodos de trabajo de pasta de carbón y electrodos de referencia de
plata. Para ello, se utilizaron tres métodos presentados en el Caṕıtulo 2. Para los electrodos de
carbón, se utilizó un procedimiento para sensibilizar la pasta de carbón antes de ser utilizada
para llenar los moldes respectivos.
3.3.1. Sensibilización de electrodos
Primero se preparó una pasta hecha a base de rodio en carbón (parte No. 266164), glucosa
oxidasa tipo VII (parte No. G2133) y aceite mineral (parte No. M5904), tal como se describe en
[88]. Se pesó rodio en carbón y aceite mineral en una proporción (40:60 w/w), tal como se indica
en [88], sin embargo, utilizando tales proporciones no es posible elaborar una pasta homogénea.
Entonces se pesó en una báscula anaĺıtica 40mg de rodio en carbón, 88mg de aceite mineral y
9.8mg de glucosa oxidasa. Todo se juntó en un vaso de precipitado y se mezcló utilizando una
varilla durante 20 minutos, hasta lograr una pasta uniforme, tal como se muestra en la Figura
3.12d.
(a) (b) (c) (d)
Figura 3.12: Elaboración de pasta (d) hecha con (a) rodio en carbón, (b) aceite mineral y sensibilizada con
glucosa oxidasa (c).
También se preparó un pasta hecha a base de la pasta conductora de LaserCon, utilizando
un procedimiento similar al mencionado previamente. Sin embargo, debido a que este material
está hecho a base de resina acŕılica y solventes, el tiempo para preparar la mezcla es menor
(∼ 5min).
También se sensibilizaron los electrodos mediante atrapamiento en gel siguiendo el
procedimiento que se describe a continuación:
Preparar una solución gelatinosa Agua- grenetina (10:1 w/w).
La temperatura de la solución se ajusta de 35◦C a 40◦C para evitar que la enzima se
desnaturalice.
10 mg de glucosa oxidasa en 100ml de la solución acuosa.
68 Aplicación - Glucosa
Poner una cantidad de la solución gelatinosa en un vaso de precipitado.
Sumergir el electrodo de carbón en la solución gelatinosa y dejar reposar por algunas horas
(toda la noche).
Retirar los electrodos y dejar secar.
Si los electrodos no se van a utilizar, se deben almacenar a 4◦C en el refrigerador.
Con el procedimiento mencionado previamente, se puede preparar de manera sencilla el
material sensibilizado para elaborar el electrodo de trabajo.
3.3.2. Preparación de muestras de solución con glucosa
Las muestras de glucosa se prepararon utilizando diferentes cantidades de glucosa liofilizada
(Glucosa-D) (mg/dL) en agua destilada, preparado previamente con buffer salino de fosfatos
(PBS, Phosphate buffered saline), hidróxido de sodio (NaOH) y ácido clorh́ıdrico para garantizar
un pH = 7.4, sabiendo que el pH biológico está entre 7.35 y 7.45.
Primero (a) se prepararon disoluciones de agua desionizada con PBS (10:1) (1000ml de agua
desionizada : 100ml de PBS); (b) se colocaron en una parrilla magnética y se mezclaron con un
agitador magnético a 500rpm @ 3min. (c) Se midió el pH de la disolución y se agregaron algunas
gotas de HCl a la solución para alcanzar un pH = 7.4 (el uso de NaOH, no fue necesario).
Luego de asegurar que la solución de agua desionizada + PBS tiene pH ∼ 7.4: (a) se pesaron
pequeñas cantidades de glucosa-D (2.5, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180,
200, 220, 240, 260, 280 y 300 mg), (b) cada porción se agregó a 100ml de la solución preparada
previamente, (c) se colocó en una parrilla magnética y se mezcló con un agitador magnético
a 500rpm @ 3min, (d) cada muestra se depositó en frascos ambar de 30ml y, (e) todas las
muestras se almacenaron en un refrigerador a 4◦C.
Finalmente, las muestras fueron medidas con un glucómetro comercial. Es interesante ver que
los glucómetros comerciales, tienen discrepancias de hasta 25% con las soluciones calibradas.
3.3.3. Ensamble de electrodos
Como se mencionó antes, los sensores de glucosa utilizan un par de electrodos, que pueden
estar integrados en el mismo o en diferentes sustratos. La dificultad en la preparación de los
electrodos depende en gran medida del material del que esta hecho el molde y de las dimensiones
de éste. Depositar la pasta de carbón en un molde hecho de PDMS resulta más complicado que
llenar un molde hecho en un sustrato de PMMA, debido a la hidrofobicidad del PDMS. Por lo
tanto, los moldes que se probaron en PDMS son de mayor dimensión (∼ 4mm), que los hechos
en moldes de PMMA(< 500µm).
Algunos electrodos comerciales integran dichos electrodos en distintos sustratos y los
ensamblan mediante una cinta plástica que se usa para unir y al mismo separar dichos electrodos,
para evitar contacto entre los conductores de plata y carbón. Además, dicho separador entre los
electrodos sirve para formar un canal flúıdico, en el cual se hace llegar la muestra por capilaridad.
En la Figura 3.13 se muestra un ejemplo del ensamble de un electrodo comercial de FreeStyle
InsuLinx.
Como se muestra en la Figura 3.13a, la muestra sangúınea llega por si misma sobre los
electrodos a través de un canal que se forma con el adhesivo. La separación entre ambos
3.3. Electrodos 69
(a) (b) (c)
Plástico
Electrodo Indicador
Electrodo de referencia
Adhesivo
Electrodo Indicador
Electrodo de trabajo de carbón
Glucosa oxidasa
1mm
Figura 3.13: Ensamble de una tira reactiva FreeStyle InsuLinx (a) con electrodos de Ag/AgCl - carbón (b) y
dimensiones del área sensibilizada del electrodo de trabajo (c).
electrodos es de ∼ 60µm y el ancho de canal en particular es de aproximadamente 1.7mm;
en este caso particular, los electrodos son ≥ 4mm2, sin embargo hay sensores que emplean
dimensiones menores en sus electrodos, además de integrarlos en un mismo sustrato. Como sea,
utilizan un principio similar para hacer llegar la muestra sangúınea al área de sensado.
Sabemos que la relación superficie - volumen de los cuerpos, al aumentar su tamaño,
disminuye; y del ejemplo previo se puede ver que, cuando las dimensiones de los canales se
reducen la relación área superficial - volumen, aumenta; esta relación hace que los efectos
superficiales dominen sobre los volumétricos, en un microflujo. En la mecánica de un microflujo
dominan otros fenómenos como el flujo laminar, la tensión superficial, la difusión y la capilaridad.
En este tipo de sensores se emplea la capilaridad para hacer entrar la muestra hasta el área de
monitoreo. La capilaridad le permite al ĺıquido deslizarse en estos microcanales por si mismo,
debido a la adhesión con la superficie del canal; por lo tanto, los materiales con los que se forma
el microcanal deben permitir tal fenómeno.
De la Figura 3.13 se puede ver que la unión del electrodo de Ag/AgCl y de carbón (Figura
3.13b), se hace de manera indirecta mediante el uso de un adhesivo (Figura 3.13); sin embargo,
esta unión podŕıa hacerse directamente entre sustrato y sustrato siempre y cuando: (a) se evite
el contacto entre los electrodos, pues esto ocasionaŕıa que la corriente que se mide sea debido a la
impedancia del material y al potencial de polarización aplicado entre los electrodos y; (b) exista
un canal que haga llegar la muestra hasta los electrodos.
3.3.3.1. Sustratos con un solo electrodo
En el presente trabajo se utilizó una separador adhesivo para unir los electrodos hechos en
sustratos de PDMS y PMMA, tal como se muestra en la Figura 3.14. Primero se preparan los
electrodos como se muestra en la Figura 2.25, luego el electrodo de plata (Figura 3.14a) se une
al electrodo de carbón mediante el uso de cintas adhesivas (Figura 3.14b) para formar un canal
de 100µm x ∼ 2mm (Figura 3.14d), el cual sirve como punto de acceso para la muestra. Se logró
hacer una separación de 100µ y 200µ entre los electrodos, utilizando una o dos cintas adhesivas
para separar los electrodos.
Además, se prepararon micromoldes con microfabricación láser, el cual fue utilizado para
preparar microelectrodos para medir glucosa, tal como se muestra en la Figura 3.15. Primero se
preparó el micromolde (Figura 3.15a), luego se le hizo una perforación de 550µm de diámetro
(Figura 3.15b), para insertar un alambre de 110µm (Figura 3.15c), y luego llenar de pasta
conductora para tener un microelectrodo con un alambre (Figura 3.15d).
En la Figura 3.16c, se muestran electrodos hechos en sustrato de PDMS, utilizando la pasta
70 Aplicación - Glucosa
(a) (b)
Alambre
Adhesivo
(c)
Entrada de la muestra
100µm x 2mm
Microelectrodo
de Plata
Microelectrodo
de carbon
(d)
100µm 100µm
Figura 3.14: Procedimiento de ensamble de un electrodo de plata (a), con un electrodo de carbón utilizando
un adhesivo (b) para formar un canal de acceso para la muestra (c-d).
(a) (d)(c)(b)
500µm 500µm 500µm 500µm
Figura 3.15: Microelectrodos de carbón preparados con la pasta de Lasercon. (a) Sustrato de PMMA grabado,
(b) Perforación de 550µm, (c) alambre de 110µm y (d) microelectrodo.
conductora hecha con rodio en carbón, aceite mineral y glucosa oxidasa, en este caso, el aceite
mineral por ser hidrofóbico no permite una buena adherencia con el sustrato, además no permite
la entrada de la muestra hecha a base de agua y glucosa. Por ello se utilizó un papel como
medio para hacer llegar la muestra hasta los electrodos Figura 3.16b. El papel se colocó sobre
el electrodo de carbón (Figura 3.16a) y luego sobre el papel se colocó el electrodo de plata. A
pesar de los inconvenientes que presenta el uso de esta pasta conductora se puede probar que
es posible elaborar electrodos en dicho sustrato.
(a) (c)(b) (d) (e)
Figura 3.16: Procedimiento para ensamblar electrodos. (a, b) Electrodos en sustrato de PDMS, (d) electrodos
en sustratos de PMMA, ensamble de electrodos en sustratos de PDMS (c) y PMMA (d).
Ensamblar electrodos en PMMA (Figura 3.16d) es mas sencillo por ser un sustrato ŕıgido y
porque no es hidrofobico como el PDMS. El resultado se puede ver en (Figura 3.16e). Además
los electrodos mostrados en la (Figura 3.16e) están hechos con la pasta conductora de Lasercon.
3.3.3.2. Sustrato con dos electrodos
Existen tiras reactivas que integran los electrodos en el mismo sustrato y utilizan un par de
cintas adhesivas para formar el canal flúıdico por donde entra la muestra, tal como se observa
en la Figura 3.17a; en este diseño la distancia entre electrodos no depende del grosor de la cinta,
3.3. Electrodos 71
sin embargo, debido al método utilizado para depositar el material conductor, es muy dif́ıcil
depositar distintos materiales en el mismo sustrato debido a las dimensiones del grabado con el
método de microfabricación láser (< 500µm).
Cinta adhesiva
Microelectrodos
Canal
(a) (b)
(1) (2) (3)
Figura 3.17: Electrodos en una tarjeta de circuito impreso. (a) Ensamble de los electrodos y (b) diseño con 2,
4 y 5 electrodos.
Existen técnicas no enzimáticas, que se pueden utilizar para determinar la concentración
de glucosa en muestras, tal como la voltametŕıa ćıclica [117], en la que se aplica un barrido
de potencial eléctrico entre los electrodos, mientras se mide la corriente resultante del sensor.
Esta técnica es muy utilizada para determinar el potencial de oxidación de moléculas, por lo
que también puede utilizarse para determinar la concentración de glucosa en una muestra sin
utilizar una enzima; sin embargo, esta técnica no es espećıfica, debido a que podŕıan haber otras
moléculas que puedan oxidarse a un potencial similar que la glucosa. Sin embargo, la ventaja
que tienen es que pueden utilizarse electrodos del mismo material, por ejemplo plata-plata,
como electrodos de trabajo y contraelectrodo. Por tal motivo, se prepararon algunos diseños
y se enviaron a fabricar en una tarjeta de circuito impreso (Figura 3.17b). En este caso los
electrodos son de oro-oro, tanto los de trabajo como los de referencia. En el diseño que se
muestra en la Figura 3.17b se muestra un configuración de dos, cuatro y cinco electrodos. El
propósito de integrar más de dos electrodos, es para realizar una medición múltiple.
3.3.3.3. Sustratos con 4 electrodos
En la Figura 2.24, se muestran electrodos hechos en sustrato de PDMS con el método
de molde-replica; en dicho sustrato se muestra un arreglo de 4 electrodos, y un canal que los
comunica, el cual es utilizado para llevar la muestra a los cuatro electrodos de manera simultánea.
El propósito de esta geometŕıa es el de realizar una medición múltiple con la idea de reducir el
error.
En la Figura 3.18 se muestra un arreglo de cuatro electrodos, hechos en sustratos de PMMA
para una medición múltiple, los cuales fueron maquinados con CNC. En este caso, debido a
la necesidad de llevar la muestra a los 4 electrodos, se diseñó y se cortó un separador con la
geometŕıa deseada para tal propósito y luego se unieron los electrodos. El diseño y corte del
material separador se muestra en la Figura 3.19.
Una vez que los electrodos están ensamblados, se midió la impedancia entre ambos electrodos
y se verificó que el medidor de impedancias indicara una impedancia de ∼ GΩ; además, con el
el medidor SMU de Fuentes SMU Keithley, se verificó que entre las terminales no se registrara
corriente.
72 Aplicación - Glucosa
(b)(a)
Figura 3.18: Sustrato con cuatro pozos (a) y cuatro electrodos de carbón para (b).
(b) (c)
2mm 2mm
2mm
800µm
(a)
Figura 3.19: Diseño (a) y corte de separadores en vinilo (b) y cinta doble cara (c).
3.4. Pruebas funcionales
Para cada prueba, se prepararon muestras de agua destilada con glucosa y PBS; el
procedimiento detallado puede consultarse en el apéndice D.
3.4.1. Sustratos con un electrodo
3.4.1.1. Molde réplica
En primer lugar se probó un electrodo en sustrato de acŕılico. En dicho electrodo se
depositaron tres muestras de agua sin glucosa y luego tres muestras de agua con glucosa con una
concentración de 120mg/dL. En la Figura 3.20a, se muestra la forma de la señal obtenida con el
instrumento de medición SMU. Se observa en la Figura 3.20b, que para las tres muestras de agua
sin glucosa, el sensor no produce una corriente, sin embargo, cuando tres muestras de glucosa se
depositan en el sensor, se puede observar una curva semejante a la que se muestra en la Figura
3.20a; por lo tanto, podemos validar de esta manera que el sensor trabaja adecuadamente.
Mediante el cálculo del área debajo de cada una de las curvas que se muestran en la
Figura 3.20b, se puede obtener un promedio del valor de la corriente que corresponde a una
concentración conocida. De esta manera se puede iterar para cada concentración conocida y
luego obtener la curva de calibración del sensor.
En la Figura 3.21a se muestra una curva de respuesta para un sensor de glucosa elaborado
en un sustrato de PDMS, mediante molde réplica; y en la Figura 3.21b, la de un sensor en un
sustrato de PMMA. En estos electrodos se utilizó como material conductor una pasta hecha a
base de rodio en carbón.
Debido a que la pasta conductora utilizada para los sensores de la gráfica en la Figura 3.21
es hidrofóbica, fue complicado realizar más mediciones con otras concentraciones. Aunque esta
3.4. Pruebas funcionales 73
(a) (b)
3 muestras
de Agua
3 muestras de 120mg/dL
Figura 3.20: Respuesta del sensor en sustrato de acŕılico (a) para muestras de agua y agua con glucosa (b).
(b)(a)
Figura 3.21: Respuesta del sensor de glucosa en sustratos de PDMS (a) y PMMA(b).
pasta conductora es fácil de preparar, presenta el inconveniente de ser hidrofóbica, por lo que
hacer llegar la muestra entre el electrodo de trabajo y de referencia también es complicado;
para resolver esto se utilizó un papel como medio para transportar la muestra, sin embargo este
método no garantiza el control de volumen sobre el sensor, a pesar de que el volumen para cada
medición fue de 4µl, dosificado con una micropipeta(LabNet).
Se observa entonces que elaborar electrodos de pasta conductora hecha a base de aceite
mineral no es ideal, por (a) el método que utilizamos para preparar el molde maestro no es
repetible, (b) la dificultad de depositar la pasta de carbón en el sustrato, (c) la pasta usada fue
hecha a base de aceite mineral.
3.4.1.2. Microfabricación láser
Debido al inconveniente mencionado previamente, se preparó una pasta conductora
sensibilizada con la pasta de LaserCon, la cual fue utilizada con un sustrato de PMMA, en
la cual se preparó un micromolde tal como se muestra en la Figura 3.15.
Los electrodos preparados, tanto el de pasta de carbón como el de plata, son cuadros de
2x2mm para implementar el sensor de glucosa, tal como se utiliza en uno comercial.
Después de preparar el micromolde, Figura 3.15a, se perforó (550µm)(Figura 3.15b), se
colocó un alambre en la perforación (Figura 3.15c) y se depositó el material conductor (Pasta
de carbón o plata). Luego, ambos electrodos se unieron con una cinta doble cara para formar
el canal para hacer entrar la muestra. Se eligieron microelectrodos cuadrados de 2mm x 2mm,
debido a que es el tamaño mı́nimo con el que se logró una medición mı́nima de 10mg/dL en
muestras de 1µL. La caracterización de este sensor se muestra en la gráfica de la Figura 3.22.
Para obtener la gráfica que se muestra en la Figura 3.22 se midió la corriente que es
74 Aplicación - Glucosa
 
0 50 100 150 200 250
Nivel de glucosa (g) [mg/dL]
0.0
100
200
300
400
500
600
700
800
I
[n
A
]
I=2.19g+135.87
R2=0.9951
Orina
Lágrima
Sangre
Figura 3.22: Medición de glucosa con electrodos de plata y pasta de carbón y niveles t́ıpicos de glucosa en
lágrimas, orina y sangre.
proporcional a la cantidad de glucosa en la muestra. El sensor se conectó a una unidad de
medición SMU Meter para suministrar 700mV a los electrodos (el microelectrodo de carbón se
conectó a Vcc y el electrodo de plata a GND) y medir al mismo tiempo la corriente producida
por el sensor.
Para esta prueba se utilizaron muestras de 1µL con diferentes concentraciones de glucosa.
Las muestras se prepararon como se indica en la subsección 3.3.2.
De la Figura 3.22, se puede observar que el electrodo elaborado por este método de fabricación
es capaz de medir concentraciones de glucosa en un rango de 10mg/dL a 240mg/dL. Además,
como se muestra en las gráficas de la Figura 3.9, el circuito electrónico diseñado es capaz de
medir tales concentraciones. Por lo tanto, éste método de fabricación de microelectrodos en
conjunto con el sistema electrónico, es viable para producir microelectrodos para aplicaciones
amperométricas.
3.4.2. Medición múltiple
3.4.2.1. Microfresado
Se prepararon tres diseños para integrar cuatro electrodos en un sustrato de PMMA. El
primero consiste en cuatro electrodos en un arreglo lineal, tal como se muestra en la Figura
3.23a. Debido a las dimensiones de éste arreglo de electrodos, se propuso integrar canales en
un sustrato de PMMA, tal como se muestra en la Figura 3.23b; la desventaja con este diseño
es que, no se pudo garantizar que la muestra llegara a todos los electrodos (Figura 3.23c) de
manera simultánea (Figura 3.23(b-1, b-2)), atribuimos esto a las irregularidades en los canales
debido al proceso de microfresado. Por ello, no se presentan las gráficas de la respuesta de dichos
sensores. Sin embargo, es importante considerar que a futuro la geometŕıa de dichos canales se
puede mejorar mediante otro método de fabricación.
Otra geometŕıa que se probó, es un arreglo de cuatro electrodos maquinados en un sustrato
de PMMA; para ello se maquinaron mediante microfresado, cuatro pozos en la geometŕıa que
se muestra en la Figura 3.18 y en la Figura 3.24a. Para los electrodos de la Figura 3.18, se
hicieron una serie de mediciones, sin embargo como se muestra en la Tabla 2.2, los pozos no
son repetibles entre diferentes sustratos, por ello no se logró obtener una curva de calibración.
Sin embargo, se realizaron algunas mediciones para los electrodos que se muestran en la Figura
3.18a. Los resultados se muestran en la Figura 3.24.
Como se observa en las gráficas del Figura 3.24, la muestra entra en un canal y al pasar por
los dos primeros electrodos (Figura 3.24a-1) produce dos señales indicadas con (1) en la Figura
3.4. Pruebas funcionales 75
(a)
Muestra
(b) (c)
(1)
(2)
Figura 3.23: (a) Diseño de cuatro electrodos en un arreglo lineal, (b) canal hecho en sustrato de PMMA y (c)
ensamble de electrodos y canal.
(a) (b)
Muestra
(1) (2)
(1)
(2)
(1)
(2)
Figura 3.24: Medición múltiple (a, b) con cuatro electrodos del diseño Figura 3.18.
3.24a-1; luego, la muestra avanza por el canal y produce un par de señales adicionales indicadas
con (2) en la Figura 3.24a-1; por lo tanto se puede observar que las señales no se generan de
manera simultánea; este comportamiento se puede corroborar en la Figura 3.24b-(1-2). Por lo
tanto el uso de esta geometŕıa no es ideal si se requiere hacer una medición múltiple de manera
simultánea.
Por otro lado, también se hicieron mediciones utilizando electrodos de trabajo de plata,
sensibilizados con glucosa oxidasa atrapada en gel, tal como se describe en la sección 3.3.1 y
electrodos de referencia de plata.
Se maquinaron pozos adyacentes (Figura 3.25a) con la geometŕıa que se muestra en la Figura
2.9d. Con ésta geometŕıa, la muestra entra en la parte superior, para lo cual se cortaron piezas
de cinta adhesiva de vinilo (Figura 3.25c) con el propósito de unir los sustratos y ensamblar los
electrodos. En esta geometŕıa, la muestra, al entrar en la parte central de los electrodos, tiene
un camino menor que recorrer hasta llegar a los electrodos, además, puede llegar de manera
simultánea.
La gráfica de la Figura 3.26 muestra dos mediciones múltiples realizada con electrodos con
la geometŕıa que se muestra en la Figura 3.25a. En esta gráfica se presentan mediciones para
muestras de 100mg/dL. Aunque las muestras son de la misma concentración, se puede observar
que las gráficas son distintas. Este comportamiento se debe a que los moldes maquinados en
distintos sustratos no son repetibles, tal como se muestra en la Tabla 2.2, por to tanto, los
electrodos en cada sustrato tampoco. Entonces, si se requieren electrodos similares, es necesario
encontrar un método que nos permita elaborar electrodos de una manera repetible.
76 Aplicación - Glucosa
(a)
Entrada de
la muestra
(b) (c)
Figura 3.25: Moldes para microelectrodos para medición múltiple. (a) diseño, (b) maquinado en sustrato de
PMMA y (c) cinta adhesiva de vinilo.
(a) (b)
Figura 3.26: Medición múltiple con electrodos cuatro electrodos (a, b) del diseño Figura 3.25.
Con el propósito de realizar mediciones múltiples se implementó el hardware que se muestra
en la Figura 3.10 y la interfaz gráfica del software que se muestra en la Figura 3.11. En la Figura
3.11, se muestra un conjunto de cuatro señales correspondientes a cuatro sensores. Debido a las
dificultades citadas en el párrafos previos, es primordial primero producir moldes repetibles,
antes que realizar las mediciones con el circuito y el software diseñado para tal propósito.
3.5. Discusión
En este caṕıtulo se ha presentado la aplicación de los microelectrodos, fabricados en el
caṕıtulo 2, al desarrollo de un sensor de glucosa.
Se utilizó un sensor de glucosa comercial para estudiar la señal que produce, mediante el
uso del equipo comercial SMU; con ello, se midió la corriente producida por el sensor, estudiar
el efecto que tiene la polarización de los electrodos y utilizar esta información para diseñar
un circuito electrónico que pueda entregar una señal de voltaje. Con éste equipo se observó
que el efecto que tiene la polarización de los electrodos, es el incremento de la magnitud de
corriente. La ventaja de este equipo es el rango de corriente que puede medir (pA a A), mientras
puede suministrar una señal de voltaje para polarizar el electrodo de manera simultánea. Las
desventajas son que solo puede medir la señal de un solo sensor y su costo elevado (miles de
pesos).
Se utilizó el circuito diseñado previamente para observar la señal del sensor mediante el uso
3.5. Discusión 77
de un osciloscopio. La ventaja de este equipo es el rango de voltaje que puede medir (mV a
∼ 100V ); sin embargo, las desventajas son: el número canales disponibles (usualmente 2 o 4) y
solo puede medir voltaje (depende de un circuito adicional para medir corriente).
Se utilizó el circuito diseñado y se proceso la señal mediante un microcontrolador. El rango
que puede medir está entre 5mV a 20V , el cual se ajustó en función al rango de concentración
de glucosa de interés (2.5mg/dL a 300mg/dL ). Las desventaja de hacer un diseño propio es
el tiempo requerido para el desarrollo, pruebas y validación. Este circuito tiene las siguientes
ventajas: puede medir y procesar la señal de un sensor de glucosa mediante un microcontrolador,
no depende de equipo comercial para funcionar (SMU o un osciloscopio), es su bajo costo y tiene
la capacidad de procesar múltiples sensores de manera simultánea.
Se elaboraron sensores mediante molde réplica, microfresado y microfabricación láser. La
principal desventaja de los métodos de molde réplica y microfresado es que el molde producido
no era repetible. Por ello, el sensor que se logró calibrar, en un rango de 10mg/dL a 240mg/dL,
fue aquel hecho con microfabricación láser. Para validar el circuito electrónico diseñado, se
empleo el equipo comercial SMU y el osciloscopio.
Existen técnicas que permiten el desarrollo de sensores no enzimáticos, las cuales utilizan
voltamperometŕıa ćıclica para lograr medir la concentración de glucosa, sin embargo, debido a
que existen distintas moléculas que podŕıan oxidarse al mismo potencial, este tipo de sensores
no son espećıficos; por ello la enzima glucosa oxidasa, ha sido empleada por los sensores de
glucosa comerciales para hacerlos espećıficos.
La elección del material del sustrato es importante debido a que afecta al sensor de la
siguiente manera. Si se elige un material hidrofóbico, como el PDMS, la muestra entra con
mayor dificultad debido a la tensión superficial de la muestra; si por el contrario se elige un
material hidrof́ılico, la muestra se transporta fácilmente a la zona de detección y esto favorece
al proceso de medición, sobre todo si se diseña una plataforma con más de una zona de detección,
tal como un sensor múltiple. Por ello el PMMA ha favorecido el diseño del sensor de glucosa.
Se hicieron diseños con arreglos geométricos distintos para un integrar cuatro sensores de
glucosa en una misma plataforma de medición. El primer diseño consiste en un arreglo lineal, a
través del cual se hacer llegar la muestra mediante un canal o mediante canales distintos; este
diseño no es ideal debido a que la muestra no llega de manera simultánea a los sensores, lo
cual se debe al tamaño de los canales (∼ 1cm de longitud) y a la limitación en el método de
fabricación del canal (microfresado).
Luego se diseño un arreglo de sensores, en forma de una matriz (2 columnas x 2 renglones);
este diseño tampoco es ideal, debido a que la muestra llega primero a dos electrodos y luego a
los otros dos, es decir, no de manera simultánea.
Finalmente, distribuir los sensores alrededor de un punto central a través del cual entra la
muestra, es la mejor opción. La distancia entre el punto de entrada y los sensores debe ser tan
pequeña como sea posible; en caso de tener sensores con un tamaño aproximado de 2x2mm
una distancia entre el sensor y el punto de entrada de ∼ 100µm es preferible. En caso de tener
sensores con tamaño aproximado de ∼ 200um, la distribución del arreglo puede cambiar; esto
se debe principalmente a que el tamaño del canal de transporte de la muestra es menor, lo cual
hace que el tiempo en que la muestra llega a todos los sensores es casi simultánea.
El objetivo del presente trabajo es integrar los electrodos para medir glucosa en una
plataforma de medición dual glucosa-insulina, por lo tanto, se ha buscado que los materiales
utilizados en los sustratos sean compatibles con el método de medición insulina, que se describe
en el siguiente caṕıtulo, por ello los sustratos utilizados hasta este punto han sido PDMS y
PMMA.
78 Aplicación - Glucosa
4 — Aplicación Insulina
4.1. Introducción
Actualmente múltiples afecciones fisiológicas requieren del monitoreo constante de analitos a
partir de muestras biológicas (sangre, biopsias, exudados, etc). Las pruebas para tal monitoreo se
realizan en laboratorios de análisis cĺınicos y, debido a la frecuencia con que debeŕıan realizarse,
no permiten un buen seguimiento y control de la condición de un paciente.
Algunas pruebas de análisis cĺınico incluyen: (a) el perfil hormonal (prolactina, gonadotropinas,
estradiol, progesterona, testosterona), que deben realizarse 80 millones de parejas que padecen
infertilidad y el 8% de las mujeres que padecen Ovario Poliqúıstico y cuya prognosis y mal
seguimiento propician el desarrollo de diabetes en un 30% de los casos; (b) la insulina; (c) TSH
(hormona reguladora de la tiroides), (d) glucosa; (e) hemoglobina glucosilada, que 10% de
hombres y mujeres con diabetes deben hacerse; y (f) hormonas tiroideas (T3 y T4); y
Una de las técnicas más utilizadas para estos análisis es la técnica de ELISA (ELISA,
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) ó ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas, la cual
es una técnica en la que un ant́ıgeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado
a una enzima capaz de generar un cambio detectable, como un cambio de color u otro tipo.
Usualmente, para reducir costos del ensayo, se utiliza un anticuerpo primario que reconoce al
ant́ıgeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima
anteriormente mencionada. La aparición de colorantes permite medir indirectamente, mediante
espectrofotometŕıa, el ant́ıgeno en la muestra.
Debido al interés de disponer de plataformas de medición portátiles interconectadas con
otros dispositivos y con capacidad de integrar plataformas minuaturizadas, hemos propuesto
integrar dos sensores, glucosa-e insulina en una plataforma tipo Lab on a chip. La plataforma
que se describe en el presente trabajo propone entregar una señal medible por un sistema
optoelectrónico, que puede enviarse a una computadora o dispositivo móvil y a través de ello,
mejorar el proceso de diagnóstico, seguimiento y terapia de una condición patofisiológica.
La plataforma tipo “Lab on a chip”, que se describe a continuación, permite el análisis de
uno o varios analitos, a partir de una muestra biológica. Esta plataforma o dispositivo emplea
tres elementos: (a) un equivalente al analito a medir, (b) un anticuerpo marcado fluorescente o
enzimáticamente y, (c) micropart́ıculas magnéticas que permitirán la detección.
En esta plataforma se emplea o aplica un campo magnético externo para manipular las
micropart́ıculas magnéticas en los canales flúıdicos. Las part́ıculas magnéticas permiten la
adhesión a su superficie de protéınas, ant́ıgenos, anticuerpos o cualquier agente que forme
un enlace covalente con ella; es decir, permiten ser funcionalizados o sensibilizados. La
inmovilización de biomoléculas en la superficie de la micropart́ıcula es tan estable, que permite
su transporte a una región espećıfica y su separación del resto de la muestra, mediante su
manipulación con un campo magnético.
El empleo de la microflúıdica, permite la elaboración a baja escala de varias zonas de reacción
79
80 Aplicación Insulina
y detección, por lo que posibilita que esta plataforma sea escalable a la detección de una o más
moléculas. La idea es hacer posible la medición de paquetes de analitos relacionados con una
misma afección o con padecimientos relacionados cuya correlación o interdependencia sea de
interés. Por ejemplo, proporcionar un diagnóstico apropiado, darle seguimiento y una terapia
apropiada a una persona diabética.
La plataforma que se describe en este trabajo permite la detección de una o varias
biomoléculas en muestras de sangre a partir de un método de ELISA de competencia con
part́ıculas magnéticas, las cuales son funcionalizadas con ant́ıgenos similares a los que se quiere
detectar.
El método de ELISA ha demostrado su potencial para la detección de analitos [120, 122]
y muchas variantes de esta técnica se han desarrollado en el sector privado y público.
Recientemente se han publicado y empleado ELISAs ultrasensibles para analitos como la
insulina (ELISAs comerciales como Mercodia) y hormonas como la de crecimiento (GH, Growth
Hormone) [118] y prolactina [119]. Sin embargo, en todos estos casos, la necesidad de múltiples
pasos y reactivos, el tamaño de las placas y los lectores ópticos no permiten su empleo de forma
fácil y económica. Otros métodos de detección múltiple empleados, especialmente en el área de
investigación, han sido desarrollados por Merck y Biorad. Sin embargo, estos métodos tienen los
mismos inconvenientes que los descritos para el ELISA convencional, con el agravante de que el
lector es un aparato de muy alto costo (se debe mencionar que en todo el páıs la compañ́ıa solo
ha podido vender uno).
A la fecha, no se ha reportado el uso de un ELISA de competencia (tal y como está descrito
más adelante en la exposición del método) para biomoléculas o cualquier analito, sin necesidad
de anticuerpo secundario, con pocos elementos de reacción, empleando poca muestra y en un
tamaño portátil.
Existen métodos de detección con part́ıculas magnéticas en un sólo paso que ya
están publicados [120]. Sin embargo, éstos usan un método de medición basado en una
propiedad magnética de las part́ıculas que se ve alterada por la unión con el bioanalito
(super-paramagnética o de magnetorresistencia). Su realización y medición requiere de
tecnoloǵıa avanzada y sensores de alto costo, muy diferente de lo que se propone aqúı.
Se ha reportando el uso de la técnica de ELISA para la detección de patógenos empleando
nanopart́ıculas de oro (AuNPs) y su separación usando esferas magnéticas (MBs). El método
descrito se reduce a la separación y concentración de bacterias o toxinas para su posterior
detección con un método de ELISA, lo que difiere de la técnica descrita en el presente trabajo
[121].
Las técnicas mencionadas son alternativas de métodos como el ELISA. Además, en todos
los casos, se emplean múltiples pasos, reactivos y reacciones que hacen poco factible su empleo
casero o a gran escala.
Espećıficamente, sobre el biosensor biomolecular de insulina/glucosa, podemos decir que
comercialmente existen varios inventos para la medición de glucosa que, al determinar el nivel de
este analito, posibilitan el control más preciso y adecuado de la inyección de insulina al paciente.
Algunas variantes de estos glucómetros, incluyen la comunicación remota o por computadora
(US 2012/0022497), pero tienen un error de medición que va del 25 al 30%.
Además, existe un antecedente de dispositivo de medición dual glucosa-insulina con
dos documentos del mismo solicitante en dos años consecutivos (US 2014/0377789 y US
2015/0031053) de tipo “point-of-care” y portátil (que el paciente se pueda medir sólo), que
aspira a calcular el estado de avance y progresión de la diabetes para adaptar el tratamiento de
forma individual. Este documento de patente concedida es el más cercano a esta variante del
4.2. Sensor de biomoléculas 81
biosensor biomolecular propuesto en el presente trabajo.
4.2. Sensor de biomoléculas
La plataforma descrita en el presente trabajo tiene la posibilidad de realizar dos tipos de
mediciones:
Detección de una molécula (MDU) Figura 4.1, cuyo propósito es realizar la detección y
medición de un solo tipo de biomolécula, y
Detección de múltiples moléculas (MDM) Figura 4.2, con el cual se podrán detectar y
medir dos o más biomoléculas en la misma plataforma, dependiendo de los marcadores
(fluoróforos convencionales, qdots, etc) que se utilicen para su detección.
4.2.1. Detección de una molécula
Dynabeads
Antígeno
BSA
(a)
Antícuerpo
Anticuerpo unido a la muestra y
anticuerpo libre unido a beads
Emisor
Fluoróforo
(c)
Receptor
(b)
Figura 4.1: Método de detección de una molécula. (a) Zona de entrada del ant́ıgeno, (b) zona de reacción y (c)
zona de detección óptica.
En la Figura 4.1 se observan los componentes de la plataforma del método de medición
unico.
La detección de las moléculas se lleva a cabo mediante el siguiente procedimiento:
La muestra (sangre o saliva), que contiene los ant́ıgenos que son las biomoléculas que se
desean medir, se deposita en la zona de entrada del ant́ıgeno (Figura 4.1a). que contiene
los ant́ıgenos que son las biomoléculas que se desean medir.
La muestra pasará a través de un microcanal a una zona de reacción (Figura 4.1b),
en la cual, la muestra se mezclará con el anticuerpo espećıfico de reconocimiento de la
biomolécula de interés, y que está marcado para su posible detección. En este caso se
ilustra el ejemplo de marcaje fluorescente, aunque podŕıan ser marcados con enzimas
que generen una reacción de color o con otros detectores qúımicos. Dependiendo de la
concentración de las biomoléculas de interés en la sangre o saliva, éstas se unirán a cierta
cantidad de anticuerpos, dejando libre el resto.
Las nanopart́ıculas magnéticas, previamente funcionalizadas (proceso en el cual la
nanopart́ıcula se cubre con la misma biomolécula que se quiere medir y se bloquean los
espacios libres con albúmina sérica bovina (BSA)) y ubicadas en la zona de detección
82 Aplicación Insulina
(Figura 4.1c), son movilizadas, empleando un imán que es movido mecánicamente por
una plataforma, a través de un canal de microflúıdica hacia la zona de reacción (Figura
4.1b).
En la zona de reacción (Figura 4.1b), los anticuerpos marcados libres (aquellos que no
reaccionaron, con las biomoléculas de la muestra), se unirán a las nanopart́ıculas.
Las nanopart́ıculas se desplazan con ayuda de un campo magnético aplicado con un imán,
de regreso, a la zona de detección óptica (Figura 4.1c). En la zona de detección óptica, se
utiliza una fuente de luz blanca o espećıfico para cierta longitud de onda (488nm, 510nm
ó 590nm, pero no exclusivamente) y un detector óptico.
En la zona de detección (Figura 4.1c), el emisor irradia la luz que excitará los fluoróforos
que se encuentran en los anticuerpos unidos a la part́ıcula y, en respuesta, éstos emitirán
una luz en otra longitud de onda, que es captada por el detector óptico. En este caso, se
ha utilizado un microscopio, sin embargo se esta buscando que el detector sea una cámara,
un teléfono celular con cámara, una cámara CCD, un fotodiodo o cualquier detector que
permita obtener luz y/o una imagen. Es decir, la luz detectada es proporcional a los
anticuerpos que quedaron en la nanopart́ıculas magnéticas, por tanto no reaccionaron con
la muestra. Mientras más intensa es la luz detectada, mayor es el número de anticuerpos
unidos a las nanopart́ıculas, y menor la cantidad de biomoléculas en la muestra.
4.2.2. Detección de múltiples moléculas
El método de detección de múltiple moléculas, emplea las mismas zonas que el método de
detección de una sola molécula, tal como se muestra en la Figura 4.2.
Dynabeads
Antígeno
BSA
Antícuerpo
Fluoróforo
(a)
Receptor
Emisor
(c)
Anticuerpo unido a la muestra y
anticuerpo libre unido a beads
(b)
Figura 4.2: Método para la detección de múltiples moléculas. (a) Zona de entrada del ant́ıgeno, (b) zona de
reacción y (c) zona de detección óptica.
El procedimiento para realizar la detección es similar al método de detección de una sola
molécula. Por ejemplo, para detectar tres biomoléculas, el procedimiento es el siguiente:
Las tres biomoléculas que se quieren detectar son tomadas de la misma muestra (sangre,
saliva o lágrimas), la cual se deposita en la zona de entrada (Figura 4.2a), luego esta
muestra pasa a la zona de reacción (Figura 4.2b).
4.2. Sensor de biomoléculas 83
En la zona de reacción, las biomoléculas se ponen en contacto con tres anticuerpos
espećıficos marcados previamente con tres fluoróforos espećıficos (Figura 4.2b), según los
marcadores que se quieran detectar. En este caso, las nanopart́ıculas magnéticas estaŕıan
previamente funcionalizadas con los 3 ant́ıgenos espećıficos.
El imán desplaza las nanopart́ıculas, de la zona de detección óptica (Figura 4.2c) a la zona
de reacción de anticuerpos ant́ıgenos (Figura 4.2b), para unir los anticuerpos libres que
no reaccionaron con las biomoléculas y que se pegarán solamente a las nanopart́ıculas que
les corresponden (con la biomolécula espećıfica que reconoce cada anticuerpo),
las nanopart́ıculas son trasladadas posteriormente, a la zona de detección óptica como se
explicó para el método de detección única (Figura 4.2c).
En el caso de la detección múltiple de moléculas, las longitudes de onda de los fluoróforos
o reacciones de color empleadas se encuentran con una separación tal que permiten detectar
tres, cuatro o cinco biomoléculas diferentes, dado que las propiedades de la luz permiten que
estos fluoróforos sean excitados en una longitud de onda espećıfica y emitan en otra longitud
de onda (corrimiento de Stokes), por lo que no hay un sobrelapamiento de la señal a detectar.
Como ejemplo, un fluoróforo que se excita en 488nm emite en 510nm; otro fluoróforo se excita
en 510nm emite en 560nm; y un tercero más se excita en 590nm emite en 640nm. Estas
caracteŕısticas de los fluoróforos permiten realizar una medición múltiple con el mismo método,
utilizando el mismo dispositivo, con los mismos emisores y detectores.
El chip utilizado es del tamaño de un portaobjetos (1” x 3”): En la Figura 4.3, se representa
el canal y las zonas de: (1) entrada del ant́ıgeno, (2) reacción y (3) detección.
En la Figura 4.3 se representa el método de detección de biomoléculas paso a paso.
La muestra que se deposita en la zona de entrada, (Figura 4.3a-1), pasa a través del canal
microflúıdico hacia la zona de reacción (Figura 4.3a-2).
Los anticuerpos marcados con el fluoróforo espećıfico que se desee medir reaccionan con
la biomolécula de la muestra (Figura 4.3b-2).
Las nanopart́ıculas magnéticas funcionalizadas, que se encuentran depositadas en la
zona de detección (Figura 4.3b-3) , se desplazadan mediante la aplicación de un campo
magnético con un imán hacia la zona de reacción (Figura 4.3c-2) a través de un canal
microflúıdico.
Después de que las nanopart́ıculas magnéticas funcionalizadas reaccionan con los
anticuerpos libres (Figura 4.3c-2) se regresan a la zona de detección (Figura 4.3d-3).
En la zona de detección (Figura 4.3d-3), las nanopart́ıculas magnéticas funcionalizadas
se excitan con las longitudes de onda requeridas para recuperar la señal luminosa de
fluorescencia, que es inversamente proporcional a la concentración del analito a cuantificar,
mediante un sensor de luz que convierte la intensidad de la luz en señal eléctrica.
84 Aplicación Insulina
AntígenoBSADynabeads Antícuerpo Fluoróforo
(d) 
(c) 
(a)
(b)
(3)(2)(1)
(3)(2)(1)
(3)(2)(1)
(3)(2)(1)
(4)
(5)
Figura 4.3: Método de detección paso a paso. (a) Entrada del ant́ıgeno, (b) zona de reacción, (c) el imán
desplaza a las nanopart́ıculas a la zona de reacción y (d) el imán desplaza a las nanopart́ıculas a
la zona de detección óptica.
4.2.3. Desplazamiento de las part́ıculas
En párrafos anteriores se ha indicado que las nanopart́ıculas magnéticas son movidas
mediante la aplicación de un campo magnético con un imán, de la zona de detección (Figura
4.3d-3) a la zona de reacción (Figura 4.3c-2) o viceversa, utilizando una plataforma mecánica
que permite un movimiento controlado. Para ello la plataforma mecánica debe cumplir con lo
siguiente:
4.2. Sensor de biomoléculas 85
Tener una dimensión de 85mm (largo) x 30mm (ancho) x 20 mm (alto).
Un dezplazamiento horizontal máximo de 3.5cm;
La plataforma debe tener un manera de acoplarse con un imán de 5mm de diámetro;
Permitir el paso de luz a través de él;
Tener un espacio para montar un portaobjetos, en donde se coloca la plataforma de
medición y;
Ser controlado por una computadora o de manera manual.
Con las especificaciones anteriores, se alaboró una plataforma con material de PMMA
(Figura 4.4a). En ésta estructura, se montó un motor a pasos con un tornillo sinfin (Figura
4.4a-1), el cual dezplaza (hasta 3.5cm) un soporte (Figura 4.4a-2) que lleva montado un imán
de 5mm de diámetro (Figura 4.4a-3).
El motor del tornillo sin fin, (Figura 4.4a-1), está conectado a una plataforma electrónica
que permite controlar el movimiento del imán de manera manual, mediante una perilla (Figura
4.4b-2). Además, se pueden enviar instrucciones a dicha plataforma con una computadora a
través de la interfaz USB (Figura 4.4b-2). La plataforma electrónica consiste en una tarjeta de
desarrollo arduino UNO conectada a un controlador de motor a pasos (Figura 4.4b-1).
La plataforma electrónica descrita en esta sección es independiente de la plataforma
electrónica para el procesamiento de señales de los sensores de glucosa, sin embargo, todo esto
se integrará en una tarjeta de circuito impreso para tener una plataforma de medición dual
glucosa-insulina.
(a) (b)
(3)(2)
(2)
(1)
(2)
(1)
Figura 4.4: Plataforma mecánica para el control de movimiento del imán (a) y circuito electrónico de control
(b).
En la Figura 4.5, se pueden observar imágenes consecutivas, que provienen de la toma de
una peĺıcula, en las cuales se muestra el desplazamiento de las nanopart́ıculas magnéticas de un
extremo a otro de un microcanal.
La misma cantidad de part́ıculas se deposita en cada chip, por lo que se sabe cuál es
la concentración final. Además, como caracteŕıstica adicional, debe referirse que todas las
part́ıculas pueden moverse en grupo a voluntad.
86 Aplicación Insulina
Figura 4.5: Demostración de la manipulación de las part́ıculas magnéticas en microcanales de
poli-dimetilsiloxano (PDMS).
4.3. Materiales y métodos
Como se mencionó previamente, la plataforma flúıdica, utilizada en el presente trabajo, tiene
las dimensiones de un portaobjetos. En la Figura 4.6 se muestra la geometŕıa y las dimensiones
de dicha plataforma. en este caso se muestra la zona de entrada del ant́ıgeno (Figura 4.6a), la
zona de reacción (Figura 4.6b) y la zona de detección (Figura 4.6c). Este diseño consta de tres
pozos de 5mm de diámetro, unidos por canales de 10mm de longitud. Los canales tienen 500µm
de ancho en la unión con los pozos y 100µm en la parte central, de esta manera se permite el
paso de las nanopart́ıculas, que son funcionalizadas con el procedimiento que se muestra en el
apéndice E.
5mm5mm
0.1mm 0.5mm
0.5mm
5m
m
10mm
(a) (b) (c)
Figura 4.6: Geometŕıa de la plataforma flúıdica utilizada para el MDU.
Se utilizaron tres fluoróforos distintos para que se unieran con los anticuerpos, con las
siguientes longitudes de onda de exitación y de emision (Tabla 4.1):
La plataforma mostrada en la Figura 4.6, está hecha de PDMS y unida a un sustrato de
vidrio. Esto permite tener acceso a a la plataforma flúıdica para obtener imágenes en la zona de
4.4. Resultados 87
Tabla 4.1: Longitudes de onda de excitación y emisión de los fluoróforos utilizados.
Fluoróforo Excitación [nm] Emisión [nm]
Alexa 488 488 519
Alexa 555 555 570
Cy5 647 670
detección. Las imágenes que se muestran en la sección 4.4 se procesan mediante un programa
hecho en python y el procedimiento general para obtener una medición de la concentración de
una muestra es:
Leer la fotograf́ıa monocromática de 8 bits, el cual contiene valores de 0 a 256.
Calcular la moda de la imagen; lo cual se hace con la finalidad de eliminar los valores mas
repetitivos, que en este caso es el fondo (valores cercanos a 0).
Calcular el promedio de los valores mayores a la moda.
Dicho promedio corresponde al valor de concentración de una medición en particular.
4.4. Resultados
Como se refirió anteriormente, con la plataforma de medición propuesta en el presente trabajo
se han detectado biomoléculas como insulina y prolactina.
4.4.1. Detección de una molécula
La insulina se midió con el método de detección que detallamos anteriormente. Para ello,
las nanopart́ıculas magnéticas fueron funcionalizadas con insulina y mezcladas con diferentes
concentraciones conocidas de la misma biomolécula (curva estándar), con las que se calculó un
ajuste numérico dado por la ecuación 4.1:
f(x) = 20.08x−0.1796 (4.1)
En la Figura 4.7, se pueden observar los resultados obtenidos con el método de medición
único para insulina, en donde:
En la Figura 4.7A se observa una imágen de luz transmitida, en donde lo negro son las
nanopart́ıcluas magnéticas empleadas.
En la Figura 4.7B se observa el control negativo de fluorescencia, en el cual no hay un
anticuerpo que detecte el ant́ıgeno y por tanto no hay señal de fluorescencia;
En la Figura 4.7C se muestra el control positivo, cuando todas las part́ıculas están
cubiertas por anticuerpo y la emisión de fluorescencia es la máxima.
En la Figura 4.7(D,E,F) se muestra como se observa la fluorescencia de las nanopart́ıculas
al reaccionar con diferentes concentraciones de la biomolécula a medir (PRL).
88 Aplicación Insulina
En la Figura 4.7D se observa que cuando la concentración de la biomolécula es muy baja,
y por lo tanto queda mucho anticuerpo marcado libre, un mayor número de ellos se pega
a las nanopart́ıculas. Esto produce una señal de fluorescencia elevada.
En la Figura 4.7E se muestra una imágen de la reacción a una concentración intermedia
de PRL; menos anticuerpos que en el caso anterior quedan libres y esos son los que
van a reaccionar con la nanopart́ıcula. Por lo tanto, la fluorescencia es menor que para
la concentración baja. Finalmente, a una concentración alta de PRL (Figura 4.7F), la
mayoŕıa de los anticuerpos quedan atrapados en la muestra, porque reaccionan con las
biomoléculas, y muy pocos se pegan a las nanopart́ıculas, por lo tanto la fluorescencia
medida es menor.
D. Concentración baja de antígeno en muestra
E. Concentración media de antígeno en muestra
F. Concentración alta de antígeno en muestra
B. Beads sin anticuerpo
C. Beads  con anticuerpo
A. Imágen de Beads en luz transmitida
Figura 4.7: Medición de insulina utilizando el MDU.
En la Figura 4.8, se muestra la cantidad de insulina en muestras de sangre de humano
en ayuno (ćırculos amarillos) y la medición de insulina en la muestra de saliva de estos
mismos individuos (rombos pequeños rojos), la medición de muestras de sangre en individuos
4.5. Integración sensor glucosa-insulina 89
postprandial (rombos azul claro) y de una muestra de sangre de una persona diabética en ayuno
(rombo azul oscuro). Como puede observarse en la comparación de sangre y saliva, la medición
de insulina se corresponde a como ha sido descrita en [122]. En los individuos en ayuno la insulina
es baja en comparación con aquellos que śı recibieron alimento (postprandial). Finalmente, en
esta figura se muestra la importancia que para un paciente diabético tiene el poder realizarse
una medición de insulina, dado que como se puede observar este individuo a pesar de estar en
ayuno, tiene niveles muy elevados de insulina, lo cual puede determinar su tipo de diabetes o
su tratamiento.
In
te
ns
id
ad
[a
.u
.]
Insulina [µg/mL]
0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.010
15
20
25
30
35
40
Muestras de sangre humana en ayuno
Muestras de sangre humana diabético
Muestras de saliva humana en ayuno
Muestras de sangre humana postprandial
Ajuste numérico
Curva control
Figura 4.8: Resultados obtenidos con el MDU para insulina en muestra de sangre de humano.
Hasta este punto se han mostrado imágenes y resultados que competen a la medición de una
sola biomolécula, en este caso, insulina. Sin embargo, es posible medir dos biomoléculas con la
misma plataforma.
4.4.2. Detección de múltiples moléculas
En la Figura 4.9, se puede observar en rojo las nanopart́ıculas que fueron marcadas para
la medición de insulina y en verde para la medición de GH. Ninguna de ellas reconoce
inespećıficamente a la otra biomolécula, por lo que no se observa una mezcla en la misma
part́ıcula de rojo y verde (amarillo), dado que como explicamos con anterioridad se utilizan
dos longitudes de onda diferentes para excitar y observar la reacción de cada una de las
nanopart́ıculas.
Finalmente, en la Figura 4.10, se puede observar una imagen de MDM para tres biomoléculas:
prolactina en azul, GH en verde e insulina en rojo.
Con esto se demuestra que con el dispositivo presentado en este documento se puede medir
dos o más moléculas en el mismo sistema sin que haya interferencia.
4.5. Integración sensor glucosa-insulina
Como se ha mencionado a lo largo del presente trabajo, la intención de este proyecto es
integrar dos sensores en una plataforma de medición. En este caso se han trabajado dos métodos
de manera separada y recientemente se ha iniciado el proceso de integración, empezando por
unificar las zonas de detección para ambos sensores. Para medir glucosa, se utiliza un método
eléctrico (amperometŕıa). Y para medir insulina, un método ELISA por competencia, a través
del cual se obtienen imágenes que son procesadas para obtener la concentración. El sustrato a
utilizar debe ser compatible con ambos métodos y mientras un sustrato de PDMS ha funcionado
90 Aplicación Insulina
Figura 4.9: Resultados obtenidos en el MDM descrito para la medición de GH e insulina.
Figura 4.10: Resultados obtenidos en el MDM descrito para la medición de GH (verde), insulina (rojo) y PRL
(azul) simultáneamente.
para la detección de insulina, no ha sido óptimo para integrar electrodos sensibilizados con la
enzima glucosa oxidasa; por lo tanto se busca integrar ambos métodos en otros sustratos como
4.5. Integración sensor glucosa-insulina 91
acŕılico, sin embargo, la desventaja principal en el caso del método de medición de una molécula,
es que la rugosidad es un factor que impacta en la movilidad de las microesferas magnéticas.
Por ello, el proceso de integración de ambos sensores en la misma plataforma es un trabajo que
esta en proceso.
Como sea, se ha preparado un diseño maquinado con microfabricación láser de una
plataforma con Blu-ray, que ha probado ser viable para producir estructuras en un sustrato
de acŕılico de las dimensiones de un portaobjetos. El diseño que se ha maquinado tiene las
especificaciones que se describen en la Figura 4.11.
5mm
(d)
(a) (b) (c)
(e)
Figura 4.11: Diseño del chip dual. (d) es la zona de entrada de la muestra, (a) es la zona de entrada del ant́ıgeno,
(b) la zona de reacción, (c) es la zona de detección de biomoléculas y (e) zona de medición de
glucosa.
Este diseño esta basado en el diseño de la plataforma de medición de una sola molécula, que
se ha probado y funcionado, el cual se muestra en la Figura 4.6.
92 Aplicación Insulina
5 — Conclusiones y trabajo futuro
Conclusiones
Existe una gran variedad de biosensores empleados en la industria de alimentos, inspección
sanitaria, aplicaciones veterinarias y agŕıcola, monitoreo ambiental y análisis cĺınico; siendo éste
último de interés en este trabajo. Los biosensores, empleados en el área de la salud, utilizan
distintas técnicas para la detección del analito de interés. En el caso del presente trabajo,
buscamos un método que nos permitiera la detección de glucosa e insulina y encontramos
que existen una gran variedad de métodos reportados en la literatura; algunos son libre de
marcadores, otros son espećıficos, unos mas fáciles de implementar que otros; sin embargo,
se debió encontrar un método que nos permitiera medir ambos parámetros o bien, facilitar
la intergración de ambos en una misma plataforma y que, además, nos permitiera realizar la
medición integrando una plataforma electrónica. Por ello se eligió la amperometŕıa como una
excelente alternativa para este propósito.
Usualmente la glucosa se mide empleando un método eléctrico, amperometŕıa, el cual es
capaz de entregar una señal que puede procesarse para registrar el nivel de glucosa en una
muestra. La amperometŕıa utiliza un electrodo de trabajo y otro de referencia. En la literatura,
se han reportado métodos amperométricos para medir insulina y glucosa-insulina de manera
dual. Por ello, se ha propuesto un método de fabricación de microelectrodos, para aplicarlos en
amperometŕıa.
En el presente trabajo, se emplearon tres técnicas distintas de fabricación de estructuras para
elaborar electrodos o microelectrodos, cada una de las cuales, presentó ventajas y/o desventajas
frente a otros métodos. Además, se trabajó en la búsqueda de un material conductor que nos
permitiera elaborar dichas estructuras con la ayuda de un molde. Se propuso en este trabajo un
método para producir electrodos de manera rápida y de bajo costo.
En la literatura se han reportado distintos métodos para producir electrodos o microlectrodos
con aplicaciones en amperometŕıa; muchos de los cuales requieren: un gran número de pasos,
de equipo especializado, uso de qúımicos tóxicos y equipos con costo elevado. Por ello, en el
presente trabajo se emplearon tres métrodos de fabricación, que permitieron crear estucturas
que pueden ser utilizadas como moldes. Luego se utilizó el método de doctor blading para
depositar material conductor en dichos moldes, de esta manera, se obtuvieron electrodos para
aplicarlos como sensores de glucosa.
En primer lugar, se empleo la técnica de molde-replica utilizando polidimetilsiloxano, para
preparar un molde en escala milimétrica. Debido a la gran capacidad de réplica de este poĺımero,
es posible obtener estructuras bien definidas a partir del molde maestro. Sin embargo, la principal
desventaja de este método es que, el molde debe ser lo mál fiel posible a la estructura que se
requiere reproducir. Debido a que el molde maestro en este trabajo se produjo, utilizando un
termoplástico, no se pudo controlar la geometŕıa ni las dimensiones, y por lo tanto la replica
tampoco lo hizo, de manera que los electrodos producidos con éste método no fueron repetibles.
93
94 Conclusiones y trabajo futuro
Aunque, la principal ventaja de este método es que se pueden producir estructuras de manera
fácil, rápida y a muy bajo costo.
El segundo método utilizado para la elaboración de moldes, en un sustrato de
polimetilmetacrilato, fue el método de maquinado CNC. Con éste método se pueden preparar
estructuras de manera rápida, sin embargo la desventaja de este método es la presencia de
rugosidad en la zona en donde se lleva a cabo el corte. Debido a que las dimensiones de
la estructura requerida son menores, en comparación con las dimensiones del cortador, es
dificil crear estructuras repetibles. Una de las formas de eliminar la rugosidad en un corte con
herramienta giratoria es incrementar la velocidad del cortador o pasar varias veces en la misma
region, sin embargo hay que considerar que el polimetilmetacrilato tiene una temperatura de
transición v́ıtrea baja, por lo que en lugar de cortar el material, se puede fundir, lo que hace
colapsar una estructura de tales dimensiones (< 1000µm). La ventaja de utilizar este método
es que permite, al igual que al anterior, preparar estructuras de manera rápida; aunque no ha
sido un método repetible, debido a que el equipo utilizado es viejo, el cortador utilizado es de
∼ 800µm de diámetro, y el corte inicial sobre el sustrato, para establecer la coordenada inicial
Z0, no se realizó para evitar la rugosidad ∼ 5µm.
Una mejora que se puede proponer en este punto es el uso de maquinado CNC para producir
moldes en un sustrato de material como latón y entonces utilizar molde-replica para producir
los moldes requeridos.
El tercer método utilizado, es el de microfabricación láser, el cual permitió crear estucturas
con escalas micrométricas que pudieron ser utilizadas como micromoldes. Los moldes producidos
con este método tampoco son repetibles, aunque debido a las dimensiones del spot del láser
(∼ 4µm), el error asociado a la geometŕıa de los moldes es menor.
Los electrodos fabricados con los tres métodos se caracterizaron eléctricamente con
espectroscopia de impedancia y de dicha caracterización, se observó que el material de pasta de
carbón utilizado es permeable. Por ello, el cambio de impedancia que los electrodos hechos de
este material presentan en condiciones de humedad, debe considerarse cuando son empleados
en aplicaciones biologicas.
Para probar la factibilidad de los electrodos en aplicaciones biológicas se prepararon sensores
de glucosa con cada método y tres sensores con el método de microfabricación láser; el primero
para medir temperatura; el segundo, para concentración celular en un medio de cultivo, y
finalmente, uno para medir glucosa.
Los sensores de glucosa emplean un electrodo de referencia de plata y otro de trabajo hecho
de pasta de carbón. La muestra debe llegar por capilaridad a la zona de detección mediante un
canal flúıdico hasta los electrodos, por ello el ensamble de los electrodos es muy importante en
el diseño de los sensores de glucosa. En el mejor caso, el sensor acá presentado, fue ensamblado
con un separador entre los electrodos para formar el canal requerido.
Los sensores de glucosa elaborados utilizando moldes hechos con el método molde-replica y
el método de CNC, no son repetibles. Con maquinado CNC se pudieron elaborar electrodos para
una medición múltiple, los resultados muestran que este método no es repetible; sin embargo fue
útil para determinar la geometŕıa optima para la integreación de un arreglo de cuatro sensores
para una medición múltiple.
En el caso del sensor de temperatura, se probaron distintos materiales conductores hechos
a base de pasta de carbón y se encontró que es posible producir termistores NTC y PTC, con
cambiar el material con el que se elaboran los electrodos. El parámetro que se midió en este
sensor, fue el cambio en la impedancia del electrodo. Se midió en un rango de 25 a 44◦C, la cuál
es útil para aplicaciones fisiológicas.
95
Para medir concentración celular se eligieron electrodos de plata, por sus propiedades
antibacterianas y se midieron cambios de impedancia para observar dichos cambios como función
de las distintas concentraciones de células en un medio de cultivo. Cada una de las muestras
empleadas fue de 7µL en suspensión celular C9.
El sensor de glucosa elaborado con microelectrodos de plata y de carbón modificado con
glucosa oxidasa, hechos con microfabricación láser probó ser factible; para probar este sensor
se emplearon muestras de agua destilada y deionizada con glucosa. El volúmen de las muestras
fue 1µL, dosificado con una micropipeta. Se midió en un rango de 10mg/dL to 240mg/dL.
Para el procesamiento de las señales del sensor de glucosa se diseñó, un Hardware, que
consiste en un circuito electrónico que es capaz de medir procesar la señal de un sensor para
muestras con una concentración mı́nima de 2.5mg/dL y máxima de 300mg/dL. Dicho hardware
envia estas señales a una computadora que ejecuta un software que puede procesar, almacenar,
leer y graficar lo datos de multiples una medición con múltiples senosres. De manera que con el
hardware y software diseñado hace posible prescindir de un equipo tan sofisticado con el SMU
u osciloscopio.
Por otro lado, el sensor de insulina presentado en este documento, consiste en una plataforma
integrada en el que se puede medir una biomolécula o más de dos de manera simultánea; por ello
en lugar de utilizar un método amperométrico para medir insulina, empleamos dicho método
con el cual fue posible medir insulina con una concentración mı́nima de ∼ 100ng/mL. Esté
método se ha implementado con un técnica de detección óptica similar al ELISA.
El trabajo que se presenta en éste documento es parte de un proyecto mayor, por lo que el
sensor de insulina se está caracterizando en el Laboratorio de Neuroendocrinoloǵıa Comparada.
Con el trabajo sobre microelectrodos presentado, se publicó un art́ıculo titulado “Use of
a CD laser pickup head to fabricate microelectrodes in polymethylmethacrylate substrates for
biosensing applications”.
Hemos sometido una solicitud de patente para un sensor de biomoléculas, con la cual se
presentan las posibilidades para medir glucosa-insulina y otras biomoléculas. El número de
solicitud de dicha patente es Mx/a/2016/008613.
Trabajo futuro
Aunque tanto el sensor de glucosa, como el de insulina se han probado y han mostrado
factibiliad, no se han integrado, por lo que hay tareas que pueden hacerse a futuro.
Producir microelectrodos mediante el método de fabricación láser, pero cambiando el
método de depósito del material conductor, en este caso se puede emplear pulverización
catódica.
Integrar ambos sensores en la misma plataforma de medición.
Integrar el software de procesamiento del sensor de glucosa con el software de
procesamiento de imágenes del sensor de insulina.
Fabricar la tarjeta de circuito impreso, para integrar el hardware de procesamiento de las
señales del sensor de glucosa y control de la plataforma mecánica del sensor de insulina.
96 Conclusiones y trabajo futuro
A — Preparación de electrodos
Objetivo: Elaborar microelectrodos de pasta de carbón y plata, en micromoldes elaborados
en sustratos de PMMA o PDMS, utilizando la técnica de doctor blade.
A.1. Materiales
Materiales conductores: pasta de conductora o tinta de plata.
Micromolde.
Toallas de papel.
Varilla de acero inoxidable.
Navaja.
A.2. Equipo
Bata.
Guantes.
Cubrebocas.
Medidor de impedancias.
A.3. Preparación
Por seguridad e higiene debe usarse guantes de nitrilo, cubrebocas, bata y gafas.
1. Cortar piezas de papel (10x10cm aproximadamente) para limpiar la superficie del sustrato.
2. Colocar el sustrato sobre la toalla de papel.
3. Depositar pasta conductora sobre el micromolde1.
4. Tomar la varilla de acero inoxidable y limpiar el exceso del material conductor mediante
un barrido sobre el sustrato.
1cuando se emplea un sustrato de PDMS, en lugar de la varilla, se puede emplear una navaja.
97
98 Preparación de electrodos
5. Poner el sustrato en la parrilla a 50°C por 10 minutos cuando se emplea pasta de carbón;
Cuando se emplea tinta de plata, 5 minutos son suficientes.
6. Verificar el el electrodo se haya depositado correctamente, mediante un microscopio óptico.
7. Caracterizar eléctricamente el electrodo mediante el medidor de impedancias (Ver apéndice
B).
B — Uso del medidor de impedancias
Objetivo: Emplear el medidor de impedancias para la caracterización eléctrica de electrodos.
B.1. Materiales y equipo
Sustrato con microelectrodo.
Medidor de impedancias RLC meter E4980A.
Lupa.
B.2. Uso
Por higiene debe usarse guantes de nitrilo, cubrebocas y bata.
Para desplazarse en el menú del medidor de impedancia se utilizan las flechas ⇐⇒⇑⇓ ,
para desplazarse a través de las opciones que se muestran en la pantalla.
El botón MEAS SETUP , se utiliza para cambiar la configuración del equipo y los
parámetros de medición.
1. Encender el medidor de impedancia.
2. Verificar que los cables estén conectados con el medidor de impedancias y el
micromanipulador, tal como se muestra en la Figura 2.32a.
3. Encender el medidor de impedancia.
4. Realizar el ajuste en circuito abierto.
MEAS SETUP → Correction
Verificar que la opción esté en OFF antes de iniciar el ajuste, además de verificar
que las puntas del medidor NO se estén en contacto entre si.
MEAS OPEN , esperar hasta que finalice el ajuste, y mientras esta corrección se
lleva a cabo EVITE TOCAR o MOVER el equipo.
MEAS OPEN → ON
5. Realizar el ajuste en circuito cerrado.
MEAS SETUP → Correction
Verificar que la opción esté en OFF antes de iniciar el ajuste y que las puntas estén
en contacto entre śı.
99
100 Uso del medidor de impedancias
MEAS SHORT , esperar hasta que finalice el ajuste, y mientras esta corrección se
lleva a cabo EVITE TOCAR o MOVER el equipo.
MEAS SHORT → ON
DISPLAY FORMAT , Cuando las correcciones se han realizado correctamente
deberá observar un valor de impedancia ∼ µΩ a mΩ.
6. Colocación de la muestra en la plataforma de medición, con ayuda de las platinas Figura
2.33(a,c).
Colocar la muestra en la platina que se muestra en la Figura 2.32c.
Con la platina de la Figura 2.33c, se puede ubicar la muestra a una zona cercana a
las puntas.
Utilizar las perillas de la platina que se muestra en la Figura 2.33a, para posicionar
las puntas del manipulador sobre los electrodos o estructuras deseadas.
Cuando se requiera posicionar sobre el electrodo, se debe utilizar la lupa para hacer
que la punta toque la superficie sin dañar la estructura, tal como se muestra en la
Figura 2.32d.
7. Configurar los parámetros deseados de medición.
Impedancia y frecuencia.
• MEAS SETUP → FUNC → MORE → (Z,θ)
• MEAS SETUP → FUNC → FREC , ajusta la frecuencias deseada mediante
las teclas numéricas.
Tablas.
• MEAS SETUP → LIST SETUP → FREC .
• Desplazarse sobre la ĺınea 1.
• Puede usar las teclas numéricas para ajustar el valor deseado o configurar tablas
logaŕıtmicas FILL LOG , lineales FILL LINEAR o definidas por el usuario.
Inicio de medición.
• MEAS SETUP → TRIG → MANUAL , para indicarle al equipo cuando
iniciar mediante el botón trigger.
• MEAS SETUP → TRIG → INT , para que el equipo inicie la medición
automaticamente.
• Se puede usar la función TRIG DELAY para que el equipo inicie la medición
con el retardo especificado, después de que el TRIGGER ha sido activado, ya
sea manual o interno
Guardar mediciones en archivo.
• Para configurar el almacenamiento en una memoria USB externa, SAVE/RECALL
→ SAVE DATA → MEDIA → EXT .
• Iniciar las mediciones SAVE/RECALL → SAVE DATA → START LOG ,
DISPLAY OPTION → LIST SWEEP → Trigger , con ello la medición se
inicia.
B.2. Uso 101
• Para almacenar los datos guardados en la tabla construida por el medidor
de impedancia SAVE/RECALL → SAVE DATA → SAVE AND STOP ,
el equipo muestra el nombre del archivo en la parte inferior del medidor de
impedancia.
• El nombre del archivo no se puede cambiar y por defecto el equipo lo
almacena con formato .csv. Los archivos pueden tener un nombre que vas desde
E498x000.csv hasta E498x999.csv ; cuando se almacena el archivo número 999,
el contador se reinicia a 000 ; por lo que debe considerar esto para evitar sobre
escribir algún archivo.
8. Retirar la muestra.
Utilizar la perilla ubicada en la parte superior de la platina que se muestra en la
Figura 2.33a (girar en el sentido horario), para retirar las puntas de la muestra y
evitar dañar la muestra.
9. Limpiar las platinas y las puntas del manipulador con un hisopo y alcohol.
102 Uso del medidor de impedancias
C — Preparación de PDMS
Objetivo: Preparar PDMS Sylgard 184.
C.1. Materiales
PDMS Sylgard 184.
Agente curante para PDMS Sylgard 184.
Varilla de acero inoxidable.
Vaso de precipitado.
C.2. Equipo
Balanza anaĺıtica.
Dremel o herramienta similar.
Desecador.
C.3. Preparación
Por seguridad e higiene debe usarse guantes de nitrilo, cubrebocas, bata y gafas.
1. Medir la cantidad requerida de PDMS, utilizando una báscula anaĺıtica y un vaso de
precipitados.
2. Añadir el agente curante en una proporción 10 a 1 en peso, es decir, agregar el 10% de la
masa de poĺımero en agente curante.
3. Mezclar durante 5 minutos a 1500 rpm utilizando el Dremel con la varilla de acero
inoxidable.
4. Desgasificar con un desecador durante el tiempo necesario para extraer las burbujas de
aire generadas durante el mezclado (aproximadamente10 minutos).
5. Emplear la mezcla para replicar estructuras y curar a la temperatura necesaria.
103
104 Preparación de PDMS
D — Preparación de muestras con glucosa
Objetivo: Preparar muestras con distintas concentraciones de glucosa con un pH de 7.4
D.1. Materiales
Glucosa-D.
PBS.
Buffer con pH de 4 y de 7.
Agua destilada.
Ácido clorh́ıdrico.
Probetas.
Vaso de precipitados graduados de 1000ml y 100ml.
Agitador magnético.
Guantes de nitrilo.
Bata.
Cubreboca.
Gafas.
D.2. Equipo
Parrilla con agitador (Heidolph).
Balanza anaĺıtica.
Medidor de pH (pH Meter 340 Corning).
105
106 Preparación de muestras con glucosa
D.3. Preparación
Por seguridad e higiene debe usarse guantes de nitrilo, cubrebocas, bata y gafas.
1. Limpiar el área de trabajo previamente.
2. Calibrar el medidor de pH mediante el empleo de los buffers de 4 y 7.
3. Dosificar 1l de agua destilada y 100ml de PBS, en un vaso de precipitados, mediante el
uso de una probeta y un vaso de precipitados.
4. Colocar la solución sobre la parrilla y agitar con ayuda de un agitador magnético a 400rmp
durante 3minutos.
5. Medir el pH de la disolución.
6. Agregar una gota de ácido clorh́ıdrico y repetir el paso 4, hasta lograr un pH de 7.4.
7. Tomar 100ml de la disolución obtenida en el paso 6 y verterla en un vaso de precipitados.
8. Pesar la cantidad de glucosa-D [mg] con el uso de una balanza.
9. Agregar la glucosa-D [mg] a 100ml de la disolución obtenida del paso 7.
10. Poner en la parrilla el vaso de agua con glucosa-D.
11. Agitar a 400rmp durante 3minutos.
12. Verter la cantidad deseada en un frasco esterilizado color ambar.
13. Repetir los pasos del 7 al 12, tantas veces como cantidad de muestras con distintas
concentraciones de glucosa se requiera.
14. Guardar la(s) muestra(s) en el refrigerador a 4◦C.
15. Limpiar y lavar los materiales utilizados.
16. Guardar los materiales y equipo utilizado.
17. Limpiar el lugar de trabajo.
E — Funcionalización de part́ıculas magnéticas
Protocolo de funcionalización de part́ıculas magnéticas (PM).
E.1. Materiales utilizados
Buffer 1. Fostato de sodio 0.1 M PH. 7.4
Buffer 2. PBS libre de Mg2+ y Ca2+ suplementado con 0.1 de BSA.
Buffer 3. 0.2 M Tris w/0.1 BSA PH 8.5
E.2. Lavado de part́ıculas magnéticas
Resuspender en contenido del vial vortexeándolo 30s, transferir 100µl a un tubo de 1.5ml
poner el imán y descartar el sobrenadante, agregar 1ml del buffer 1 y resuspender.
E.3. Funcionalización de part́ıculas magnéticas
Utilizar 200µg de ant́ıgeno por 1ml/4x108PM
1. Transferir 1ml de PM en el buffer 1 para resuspenderlas.
2. Colocar el tubo en un imán durate un minuto y quitar el sobrenadante.
3. Resuspender las PM en el Buffer 1 y añadir 200µg de ant́ıgeno para llegar a un volumen
total de acoplamiento de 1ml.
4. Incubar durante 24hr a 37◦C en constante agitación.
5. Colocar el tubo en un imán durate un minuto y quitar el sobrenadante.
6. Añadir 1ml del buffer 2, mezclar e incubar durante 5min a 2◦C.
7. Aplicar el imán durante 1min, eliminar el sobrenadante, y repetir los pasos 5 y 6 una vez.
8. Incubar 4hrs a 37◦C en 1ml del buffer 3 para desactivar el resto de grupos libres.
9. Aplicar el imán durante 1min, eliminar el sobrenadante.
10. Agregar 1ml del buffer 1.
11. Aplicar el imán durante 1min, eliminar el sobrenadante y repetir el paso 10.
107
108 Funcionalización de part́ıculas magnéticas
F — Aplicaciones con microelectrodos
F.1. Sensor de temperatura
Adicionalmente, se diseñaron microelectrodos para medir temperatura en regiones menores a
1cm2 para aplicaciones biomédicas, los cuales consisten en un electrodo de carbón es de 10.4mm
de largo y 50µm de ancho con un área de sensado de 1mm2. Se eligió una geometŕıa de espiral
para optimizar el área de sensado en regiones pequeñas.
(5)
500µm
(2)
(1)
(4)
(3)
 
Z
n(
P
T
C
)
24 26 28 30 32 3834 4236 40
T[°C]
0.90
0.70
0.80
1.00
44
zn(PTC)=0.017T+0.24
0.96
0.98
1.00
0.92
0.94
Z
n(
N
T
C
)
zn(NTC)=1.3005e-0.01T
Linear fit
NTC
PTC
Exp fit
(a) (b)
Figura F.1: Configuración del experimento para probar el sensor de temperatura (a) y respuesta de sensores
de NTC y PTC (b).
En la configuración del experimento que se muestra en ls Figura F.1, (1) es la fuente de calor,
(2) son las puntas de prueba, (3) el sensor de temperatura DTH11, (4) los microelectrodos de
pasta de carbon paste y (5) una cámara.
El microelectrodo de pasta de carbón (Figura F.1a-4) se conectó al medidor de impedancias
a través de las puntas de prueba (Figura F.1a-2); Una fuente de calor (Figura F.1a-1) se colocó
a 15mm del microelectrodo (Figura F.1a-4) y cuatro sensores DHT11 (Figura F.1a-3) fueron
utilizados a 1cm del microelectrodo (Figura F.1a-4) para propósito de calibración. Todos estos
componentes fueron encapsulados en una cámara (Figura F.1a-5) para evitar corrientes de
convección. La fuente de calor entonces se encendió mientras la temperatura en el interior
de la cámara era monitoreada con una computadora y una tarjeta Arduino UNO; entonces
la impedancia del microelectrodo fue registrada con un medidor de impedancias de manera
simultánea. Un rango de 25 a 44◦C fue cubierta, útil para aplicaciones de temperatura corporal
humana evitando de esta manera la fundición del PMMA. Este rango fue escogido debido a que
estos microelectrodos fueron utilizados para aplicaciones biológicas, como sensores de glucosa.
Se probaron dos materiales distintos sin modificar la geometŕıa del molde obteniendo aśı
sensores con coeficiente de temperatura positivo (PTC, positive temperature coefficient) y (NTC,
negative temperature coefficient). El primero de ellos, hecho de pasta de carbón (LaserCon),
presentó una respuesta lineal en un rango entre 25 y 40◦C (Figura F.1b); El segundo, hecho de
nuestra pasta de carbón, presentó una respuesta exponencial decreciente en el mismo rango de
109
110 Aplicaciones con microelectrodos
temperatura. Por lo tanto, es posible diseñar y producir termistores PTC o NTC eligiendo el
material depositado en nuestros micromoldes, y además es posible cambiar la sensibilidad del
sensor dependiendo de la aplicación requerida.
F.2. Microelectrodos para conteo celular
También se probó la viabilidad de los microelectrodos de plata para aplicaciones de conteo
celular en soluciones. Escogimos microelectrodos de plata para evitar algun tipo de bioactividad
y porque tiene propiedades antibacteriales [123]. Una forma útil y menos invasiva para el
conteo de células y proliferación celular puede ser obtenida en base a la técnica de medición
de impedancia [124]. Cuando las células son cultivados sobre un arreglo de electrodos vessel,
la impedancia medida debido a la interacción electrodo-células se incrementa con el número
de células. Éste método hace posible la medición del número aproximado de células que se
encuentran en una suspención o adheridas sobre el sustrato del electrodo. Aśı, se diseñó y
fabricó un arreglo de electrodos que se muestran en la Figura F.2b-1. Mediciones de impedancia
se hicieron para un medio de cultivo de celulas y cuatro concentraciones de suspensión celular
C9 (C1 (0.25x106), C2 (0.5x106), C3 (0.75x106), C4 (1x106) [celulas/mL]) cuantificados por un
hemocitómetro [125]. Para cada una de estas suspensiones, una gota de 7.5µL fue depositada
sobre el electrodo Figura F.2b-1. El diseño fue adapatado de [124]). La impedancia fue medida de
40kHz to 1MHz at 10mV ; los resultados se muestran en la Figura F.2, Z and θ se normalizaron
como Zn = Z−Z0
Z0
, θn = θ−θ0
θ0
, donde Z0 and θ0 son la magnitud y ángulo de fase de la impedancia
del medio de cultivo sin células.
Frecuencia [Hz]
θ n
C1
C2
C3
C4
1
1.5
2
2.5
3.5
4
104 105 106
3
Microlectrodo
500µm
(b)
Frecuencia [Hz]
Z
n
(a)
104 105 106
1
1.5
2
2.5
3.5
4
3
C1
C2
C3
C4
Figura F.2: Conteo de células mediante medición de impedancia ( Zn(a) y θn(b) ) con microelectrodos de plata
para diferentes concentraciones de suspensión Hep C9.
De la Figura F.2 se puede observar que la diferencia entre θ0 y θ se incrementa con
la concentración de células, de manera similar como se reporta en [124], entre mayor es la
concentración de células el sistema es mas capacitivo. Una curva de calibración para el conteo
de células puede ser obtenido graficando la impedancia como una funcion de la concentración
de células. Además, la capacitancia puede ser calculada de las mediciones de impedancia, dichos
cálculos muestran que estos valores están entre 6nF and 83nF . Con esto, se puede implementar
un circuito para medir estos cambios capacitivos, a través del uso de un temporizador analógico
que genere una frecuencia que sea inversamente proporcional a la capacitancia; entonces, se
puede utilizar un microcontrolador para calcular esta frecuencia a través del conteo de pulsos
dentro de un periodo de tiempo dado. Desde luego esto queda fuera de los propósitos del presente
trabajo, pero podŕıa hacerse como trabajo futuro.
G — Art́ıculo
Biomed Microdevices  (2017) 19:5 
DOI 10.1007/s10544-016-0145-0
Use of a CD laser pickup head to fabricate microelectrodes
in polymethylmethacrylate substrates for biosensing
applications
Jehú López-Aparicio1,2
· Mathieu Hautefeuille1,2
· Sara Herrera-Domı́nguez1,2
·
Adriana Razo-de-León1,2
· Mariel Cano-Jorge1,2
· Ixchetl Rojas-Benito1,2
·
Mariana Centeno-Sierra1,2
· Tatiana Fiordelisio-Coll1,2
·
Catalina Elizabeth Stern-Forgach1,2
© Springer Science+Business Media New York 2017
Abstract In this work, we report a simple fabrication
method for microelectrodes on a polymethylmethacrylate
substrate, using a low-cost laser platform based on a CD-
DVD unit for direct rapid-prototyping. We used this laser
microfabrication technique to etch any desired design on
polymethylmethacrylate substrates to produce microchan-
nels with controlled geometry, with a highly repeatable
micron-scale resolution. Those shallow microchannels were
then filled with a conductive paste of material of our choice
that was converted into microelectrodes of desired shapes
and geometries after drying. To validate our process, different
geometries, sizes and materials were used as electrodes,
and then tested for amperometry and impedance measure-
ments. Development of these microelectrodes is motivated
by their potential application in sensors and biosensors, such
as glucose and cell counting, as demonstrated in this paper.
Keywords Microelectrodes · Microfabrication ·
Biosensing
1 Introduction
Electrodes are required in many applications to carry signals
from one circuit element to another. In electronic devices for
! Jehú López-Aparicio
jehu@ciencias.unam.mx
1 Facultad de Ciencias, Universidad Nacional Autónoma de
México, Ciudad de México, México
2 Laboratorio Nacional de Soluciones Biomiméticas para
Diagnóstico y Terapia, Facultad de Ciencias, UNAM,
Ciudad de México, México
application like sensors (Moser and Gijs 2007; Huang et al.
2010) and biosensors (Radke and Alocilja 2005; Varshney
and Li 2009), microelectrodes are necessary to obtain and
record signals from non metallic elements like biological
analytes or cell activities. They are used typically in voltam-
metry (Millan et al. 1994; Goyal et al. 2010), amperometry
(Huang et al. 2010; Bandodkar et al. 2014; Hernández
et al. 2011; Arslan et al. 2011; Kaur and Verma 2012) and
impedance applications (Varshney et al. 2007). To avoid any
type of bioactivity in biosensors, microelectrodes can be
made of inert materials like gold, stainless steel, platinum,
silver or carbon paste.
To fabricate microelectrodes onto low glass transition
temperature (Tg) polymers is not simple due to melting.
One common method to fabricate microelectrodes is con-
ventional photolithography (Madou 2002). This technique
is not always ideal because it requires several steps usually
done in a clean room, and with specialized equipment, it
is time consuming, and a different mask used to expose
the photosensitive coating is necessary for any modifica-
tion in the design. When one-step techniques are preferred
or required, laser microfabrication techniques offer solu-
tions to produce high-resolution microstructures that do
not require a mask and the structure size can be con-
trolled. Ultrashort pulsed lasers are used to create directly
pattern of microelectrodes array on a glass substrate by
removing a metal layer for instance (Hayden and Dalton
2010); this method requires a sputter coating step and any
change in the design only requires modifying the design
by software. However this process is not fully compatible
with polymethylmethacrylate. Another method to produce
microelectrodes is laser direct patterning by selectively curing
nanoparticles from organometallic inks (Kang et al. 2011),
but this method requires several steps before and after
transferring the desired pattern, such as pre-baking and
111
112 Art́ıculo
 5 Page 2 of 7 Biomed Microdevices  (2017) 19:5 
post-baking to ensure good structural behaviour. But these
steps are not compatible with Tg polymers due to elevated
temperature.
Techniques like inkjet printing are limited by the reso-
lution that they can achieve, especially, if the substrate has
an hydrophobic surface. For that reason this technique is
combined with laser sintering. As an alternative, ultrashort
pulsed laser ablation has been used to produce microelec-
trodes on a polymer and can be performed using a colloid
of Ag nanoparticles (Lee et al. 2012). Furthermore, Direct
Laser Plotting has been used recently as a prototyping
method to patterning (Wang et al. 2012) microelectrodes
and to fabricate microfluidic structures on polymers, but it
is limited by its high cost and level of complexity.
In this work we present a mask-free and low-cost method
to produce microelectrodes on substrates of polymethyl-
methacrylate (PMMA). This method does not require sputter
coating, pre-baking or development steps. We used a laser
ablation technique, by employing an existing laser platform
based on a CD-DVD unit, to produce microchannels on
substrates of PMMA and use it as mold to produce micro-
electrodes, with a method similar to what is reported in
Hautefeuille et al. (2013).
2 Experimental
2.1 Materials and equipments
Graphite powder (Sigma-Aldrich), silver conductive ink
(Chemtronics), carbon paste (LaserCon), adhesive tape
Tuk 4020 (Industrias Tuk S.A. de C.V.), glucose oxidase
(aspergillus niger Type VII, Sigma-Aldrich), D-Glucose,
carbon nanoparticles (CNP) (Sigma-Aldrich, part no.
633100) and standard cell culture media (DMEM) (Gibco)
were all used as purchased, without modification. The
PMMA substrates were produced by cutting a comercial
acrylic slide of 1′′
× 3′′ from large acrylic sheets (Plasti-
glas de México S.A. de C.V.) and used as such without
further treatment. We used a homemade laser platform
(Hautefeuille et al. 2012) in the laser ablation technique; an
optical microscope (Nikon H550S) and profilometer (KLA
Tencor D600) for inspection and characterization of the
geometry; Precision LCR Meter (Agilent E4980A) for elec-
trical characterization of microelectrodes and impedance
measurements; temperature and humidity sensors (DHT11),
Arduino UNO and a computer to characterize our
temperature sensor and Interactive SourceMeter Instru-
ment (Keithley Model 2405) to characterize our glucose
sensor.
2.2 Mold preparation
The surface of the PMMA substrate was coated with CNP,
as described in Hautefeuille et al. (2013). This method was
indeed compatible with PMMA as presented in Section 3.1.
Full characterization of our process will be presented else-
where for PMMA as it is outside the scope of this paper.
2D patterns (Fig. 1a) were designed using Inkscape, open
access software, and converted to a binary file to be used
for the CNC program of our homemade platform. It was
employed to irradiate the PMMA substrate with a laser
beam to etch the desired design at the surface (Hautefeuille
et al. 2012). Focusing the beam on the slide surface pro-
duces a micron-scale local etching (Fig. 1c), depth and
width are controlled by laser conditions as in Hautefeuille
et al. (2012) and presented for PMMA in (Fig. 3a). The
etched substrate was cleaned with distilled water using an
ultrasonic bath at 23 ◦C @ 10 min and ethyl alcohol to
remove CNP excess. This process produces a micromold
(Fig. 1d) with controlled geometry.
2.3 Microelectrode preparation
We mixed by hand the carbon paste (LaserCon) with glu-
cose oxidase (10 : 1 w/w) during 5 minutes as described
in Wang and Zhang (2001), to prepare the glucose enzyme
electrode, which is used in Section 3.6. We also prepared our
own carbon paste by hand mixing graphite, cellulose and
distilled water (5 : 4 : 4 w/w/w) to use it in our tempera-
ture sensor (Section 3.4). A thin layer of conductive material
(carbon paste or silver ink) was then used to fill the etched
patterns by using doctor blading technique (Fig. 1e). The
substrate was baked at 50 ◦C @ 5 min to dry the solvents
and, as a result, the conductive material left inside the mold
was then converted into microelectrodes of desired shapes
and geometries (Fig. 1f). To validate our process, different
geometries, sizes, and materials were used as electrodes and
then tested in amperometry and impedance measurements.
An optical microscope was used to verify the patterning
before and after cleaning the substrate, as well as to corroborate
that the conductive material was well deposited. A pro-
filometer was employed to measure the mold profile before
and after filling it with conductive material. A scanning
electron microscope was employed to measure the elec-
trode width and inspect the surface after filling it with silver
conductive ink. Finally, electrical characterization was per-
formed by measuring the microelectrode impedance with a
precision LCR-meter (Fig. 2a), which uses a four-terminal
pair configuration to avoid any mutual inductance or inter-
ference of the test signal or due to the test tips, especially at
113
Biomed Microdevices  (2017) 19:5 Page 3 of 7 5 
(d)(c)
(a) (b)
(f)(e)
Fig. 1 Process to prepare microelectrodes using laser microfabrica-
tion technique on PMMA substrate. a is a 2D design transfered to a b
PMMA substrate treated with CNP and irradiated with a laser beam,
c after cleaning the CNP from PMMA substrate, d a custom etched
design is obtained and, e Micromolds filled with a conductive material
produces f microelectrodes
high frequencies. The impedance of the test tips used in this
configuration was measured to be less than 1mΩ , in a range
of 20 Hz to 2 MHz and 1 mV to 2 V.
(a) (b)
Fig. 2 Bench setup for electrical characterization of microelectrodes.
a LCR-meter and b test tips on microelectrodes
3 Results and discussion
3.1 Geometry characterization
By modifying the lasing conditions, it is possible to vary
the depth of the etching in acrylic slides (Fig. 3a). Height
and width of each channel can be made design-specific. A
resolution of 4 µm per etched pixel was used to guaran-
tee reproducibility. We have observed that roughness in the
bottom of the mold helps to retain the material when this
is filled. Furthermore, an optimal depth of 20 µm or more
(Fig. 3b ,c) in the etched mold is recommended to perform
an appropriate filling of conductive material (Fig. 3d), par-
ticularly for viscous carbon paste. After profilometry, the
resulting microelectrodes show a 2–3 microns lower thick-
ness that was considered in the impedance calculations and
an average roughness lower than 1 micron over the full
electrodes.
3.2 Electrical characterization
Each microelectrode was characterized electrically by
impedance measurements using signals from 5 mV to 2 V @
20 Hz to 2 MHz at 25 ◦C. In dry conditions the magnitude of
the impedance (Z) (Fig. 4a) of microelectrodes vary 1.5 %
in carbon paste structures (Fig. 4a-1) and 2.85 % in sil-
ver structures (Fig. 4a-2) when the voltage applied to those
(a) (b)
(d)(c)
Fig. 3 a Micromold on PMMA substrate, b etch profile for empty and
filled channel, c 3D profile of an entire PAD and d SEM micrograph
of a silver microelectrode detail
114 Art́ıculo
 5 Page 4 of 7 Biomed Microdevices  (2017) 19:5 
(a)
(b)
Fig. 4 (a-1) Impedance of carbon paste and (a-2) silver microelec-
trodes at 1 V from 20 Hz to 2 MHz
structures vary from 5 mV to 2 V. From the phase angle of
the impedance (θ ) (Fig. 4b) it is observed that the impedance
response of silver microelectrodes fits to a resistance -
inductance model in a series configuration. In the same
manner, for carbon paste microelectrodes, the impedance
fits to a resistance - capacitance model in a parallel con-
figuration. Furthermore, Z remains constant for frequencies
lower than 1 MHz, which is an advantage for applications
that use signals in that range of frequencies or applications
that use DC signal, like amperometric applications.
3.3 Water droplets measurements
Carbon microelectrodes are humidity sensitive and it can
affect the total impedance of the system over time. For
this reason, a drop of distilled water of 1 µL was placed
over the carbon microelectrode, as shown in (Fig. 5a),
then a series of impedance measurements was performed
with a LCR Meter. This carbon paste microelectrode
(Fig. 4a-1) was a straight line of 2 mm long and 100 µm
wide with a square contact pad of 1 mm × 1 mm at each
end. It was observed that the largest "θ is between 80
and 300 Hz, whereas the largest "Z is for frequencies
greater than 10 kHz. Z decreased due to resistance Rw
and capacitance Cw caused by the water drop, and returned
to its initial value (Re) when the water drop evaporated
(Fig. 5a).
(a)
(b)
Fig. 5 a Impedance of carbon paste microelectrode (Fig. 4a-1)
through the time when a drop of water is placed over the microelec-
trode and b normalized Rw and Cw
In Fig. 5b it is shown in the electrical model when the
water drop is placed over the microelectrode; Rw and Cw
were calculated from measurements (Fig. 5a) and normal-
ized as Rwn =
Rw−R0
R0
and θwn =
θw−θ0
θ0
. In the first nine
minutes Cwn is incremented 2.8 % each minute while Rwn
1.7 %. Thus, this behaviour in the impedance should be con-
sidered in a measurement process that takes more than one
minute and less than ten minutes.
3.4 Temperature measurements
To test and validate our carbon paste microelectrodes in
an application in dry conditions, we designed microelec-
trodes for sensing temperatures in regions less than 1 cm2
for biomedical applications. This carbon microelectrode
(Fig. 6d) was 10.4 mm long, 50 µm wide and 1 mm×1 mm
of sensing area. A spiral geometry was chosen in order to
optimize the sensed area in small regions (Fig. 6d).
The carbon paste microelectrode (Fig. 6d) was con-
nected to the LCR Meter through the test tips (Fig. 6b); a
heat source (Fig. 6a) was placed at 15 mm of the micro-
electrode (Fig. 6d) and four DHT11 sensors (Fig. 6c)
were used at 1 cm from the microelectrode (Fig. 6d) for
calibration purposes. All these components were enclosed
in a chamber (Fig. 6e) to avoid convection currents. The
heat source was then turned on while the temperature
inside the chamber was monitored with a computer and an
115
Biomed Microdevices  (2017) 19:5 Page 5 of 7 5 
(e)
(b)
(a)
(d)
(c)
Fig. 6 Experiment setup used to test our temperature sensor where:
a is the heat source, b test tips, c DTH11 sensor, d carbon paste
microelectrode and e chamber
Arduino UNO; then the impedance of the microelectrode
(Fig. 6d) was registered with the LCR meter simultaneously.
A range from 25 to 44 ◦C was covered, useful for human
or animal temperature applications, thus avoiding PMMA
Melting. This range was chosen because these microelec-
trodes will be used in biological applications, like glucose
sensors.
Two different materials were tested without modifying
the geometry of the mold: a positive temperature coeffi-
cient (PTC) and a negative temperature coefficient (NTC)
were then obtained. The first of them was made with car-
bon paste (LaserCon). It presented a linear response in a
range between 25 to 40 ◦C (Fig. 7). The second one made
with our own carbon paste, presented a decreasing exponen-
tial response in the same range of temperature. Thus, it is
possible to design and produce PTC or NTC thermistors by
choosing the material deposited in our micromolds, and it is
also possible to vary the sensibility of the sensor depending
on the application.
3.5 Biological cells counting electrodes
We also tested the viability of our silver microelectrodes
(inset of Fig. 8) for cell counting applications in liq-
uid conditions. We choose silver microelectrodes to avoid
Fig. 7 Temperature measurement using a microelectrode of carbon
paste (Fig. 6d)
(a)
(b)
Fig. 8 Impedance measurement (Zn a and θn b) using silver
microelectrodes for cell-counting for different concentration of Hep
C9-suspensions (C1 = 0.25 × 106, C2 = 0.5 × 106, C3 = 0.75 × 106
and C4 = 1 × 106) [cells/mL]
any type of bioactivity and because it has antibacterial
properties (Ravindran et al. 2013). A useful and less invasive
way for cell-counting and cell-culture proliferation evalua-
tion may be obtained based on an impedance measurement
technique (Huang et al. 2003). When cells are cultured over
an electrode array vessel, the impedance measured due to
the electrode-cells interaction increases with the number of
cells. This method makes possible the measurement of the
approximate number of cells found either in suspension or
adhered over the electrode substrate. Thus, we designed and
fabricated a microelectrode array system (inset of Fig. 8a).
Impedance measurements were made for cell culture media
and four concentrations of C9 liver cells suspensions (C1
(0.25 × 106), C2 (0.5 × 106), C3 (0.75 × 106), C4 (1 × 106)
[cells/mL]) quantified with an hemocytometer (Phelan and
May 2007). For each of these suspensions, a drop of 7.5 µL
was placed over the electrode (inset of Fig. 8), design
adapted from Huang et al. 2003) after homogenization and
then the impedance was measured from 40 kHz to 1 MHz at
10 mV; the result is shown in (Fig. 8) Z and θ normalized as
Zn =
Z−Z0
Z0
, θn =
θ−θ0
θ0
, where Z0 and θ0 are the magnitude
and phase angle of the impedance of the cell media without
cells.
The difference between θ0 and θ increases with cell con-
centration, providing similar results to those reported in
Huang et al. (2003), the greater the cell concentration the
116 Art́ıculo
 5 Page 6 of 7 Biomed Microdevices  (2017) 19:5 
more capacitive the system is. A calibration curve used for
cells counting can be obtained by plotting impedance as
function of cells concentration. Furthermore, the capaci-
tance, can be calculated from impedance measurements and
was found to be between 6 nF and 83 nF. An electronic cir-
cuit can then be implemented to measure capacitive sensors
by using an analog timer circuit which generates a fre-
quency that is inversely proportional to capacitance and then
a microcontroller can be used to calculate this frequency by
counting pulses within a given period of time. This will be
shown in future work as it falls outside the scope of this
paper, which is to prove the feasibility of using our silver
microelectrodes for cell counting.
3.6 Glucose measurement electrodes
As previously mentioned, carbon and silver microelectrodes
were designed for amperometric applications. A carbon
paste microelectrode was sensibilized with glucose oxidase
(Section 2.3), for glucose sensing. We used two electrodes
to measure a current that is proportional to the amount of
glucose in the sample due to the reaction taking place at
electrodes (Wang and Zhang 2001). For this reason, we pre-
pared a square microelectrode of 2 mm×2 mm made of
carbon paste mixed with glucose oxidase (Section 2.3) and
a silver square microelectrode of 2 mm×2 mm to implement a
glucose sensor, similar to a commercial one. After preparing the
microelectrodes design they were wired (Fig. 9a) and a dou-
ble faced adhesive (Fig. 9b) was used as separator to create a
microchannel for input of the liquid sample when the micro-
electrodes are assembled (our glucose sensor) (Fig. 9c).
Square microelectrodes of 2 mm×2 mm were chosen as it
was the minimum size required to sense a glucose concen-
tration of 10 mg/dL in 1 µL. Then our glucose sensor was
connected to a SourceMeter Unit to supply 700 mV to the
electrodes (Carbon microelectrode to V cc and silver micro-
electrode to GND) and measure at the same time the current
produced by the sensor.
Liquid samples of 1 µL with different glucose concen-
trations were measured. They were prepared by mixing
(a) (b) (c)
Fig. 9 Microelectrode assembly process. a Silver microelectrode on
PMMA substrate wired, b Carbon paste microelectrode on PMMA and
a double faced adhesive was used as separator over the substrate and c
assembly of both microelectrodes
Fig. 10 Glucose measurement by using silver and carbon paste micro-
electrodes (Fig. 8) and typical glucose levels in tears, urine and blood
(Sen and Sarin 1980)
different amounts of glucose (mg/dL) (D-Glucose) in dis-
tilled and deionized water, previously prepared with phos-
phate buffered saline (PBS) and sodium hydroxide (NaOH)
to guarantee a pH = 7.4. The samples were then mea-
sured with commercial glucometers. It is interesting to
observe that the glucometers could display discrepancias
of up to 25 % with our calibrated solutions. From the
results (Fig. 10) it can be seen that our microelectrode
enabled the measuring of glucose concentration in a range
from 10 mg/dL to 240 mg/dL. We also designed an elec-
tronic system to measure concentrations from 10 mg/dL to
240 mg/dL; this electronic system is able to sense current
between 100 nA and 1 µA; this current is converted to a
voltaje signal between 1 V to 18 V, then processed to deter-
mine a glucose concentration of a sample. With these results
it is possible to confirm the viability of our electrodes to be
used in amperometric sensors as well.
4 Conclusions
We report a low cost method to produce microelectrodes
on polymethylmethacrylate substrates with a controlled
geometry and size, with two different materials to use them
in biological applications. We used a laser microfabrication
technique to etch acrylic slides with a desired geometry to
produce micromolds, which were filled with a conductive
material and converted into microelectrodes after drying.
This process gave us an alternative to develop microelec-
trodes at low cost on polymethylmethacrylate substrates. To
prove the applicability of our method, we designed and pro-
duced microelectrodes to measure temperature; the results
showed that it is possible to design PTC or NTC ther-
mistors by changing the conductive material. Moreover,
we produced a silver microelectrode array system for
biological cell counting; the results showed that it is possible
to detect cell concentration in media culture by impedance
measurements. Finally, we designed an amperometric glu-
cose sensor in which we used a silver microelectrode
and a carbon paste microelectrode modified with glucose
117
Biomed Microdevices  (2017) 19:5 Page 7 of 7 5 
oxidase, to measure glucose from 10 mg/dL to 240 mg/dL,
using samples of 1 µL. Results show that it is possible to
use those structures to measure glucose levels. Furthermore,
our electronic system is able to process the signal produced
in our microelectrode, in this way it is not necessary to
use sophisticated equipment like an SMU meter. There-
fore, we report a low cost, quick and inexpensive method
to produce microelectrodes, which proves to be feasible to
produce microelectrodes on demand.
Acknowledgments The authors thank LaNSBioDyT, DGAPA-
PAPIIT grant #TA100315, CONACyT #271573 and #246988. JL
thanks Aaró n Cruz-Ramı́rez and Diego Zamarrón-Hernández for their
technical support.
References
F. Arslan, S. Ustabaş, H. Arslan. Sensors 11(8), 8152 (2011)
A.J. Bandodkar, W. Jia, C. Yardımcı, X. Wang, J. Ramirez, J. Wang.
Anal. Chem. 87(1), 394 (2014)
R.N. Goyal, V.K. Gupta, S. Chatterjee. Sens. Actuators B 149(1), 252
(2010)
M. Hautefeuille, L. Cabriales, R. Pimentel-Domı́nguez, V. Velázquez,
J. Hernández-Cordero, L. Oropeza-Ramos, M. Rivera, M.
Carreón-Castro, M. Grether, E. López-Moreno. Lab Chip 13(24),
4848 (2013)
M. Hautefeuille, A.K. Jimenez-Zenteno, P.R. Pérez-Alcázar, K.M.
Hess-Frieling, G. Fernandez-Sanchez, V. Velazquez, M. Grether-
Gonzalez, E. Lopez-Moreno. Appl. Opt. 51(8), 1171 (2012)
C. Hayden, C. Dalton. Appl. Surf. Sci. 256(12), 3761 (2010)
M. Hernández, C.A. Galán, G.A. Álvarez, M. Páez. Información
Tecnológica 22(6), 25 (2011)
X. Huang, D. Greve, D. Nguyen, M. Domach. in Sensors, 2003.
Proceedings of IEEE, Vol. 1 (IEEE, 2003), pp. 304–309
X.J. Huang, L. Aldous, A.M. O’Mahony, F.J. del Campo, R.G. Comp-
ton. Anal. Chem. 82(12), 5238 (2010)
B. Kang, S. Ko, J. Kim, M. Yang. Opt. Express 19(3), 2573 (2011)
A. Kaur, N. Verma. European Journal of Experimental Biology 2(2),
389 (2012)
S. Lee, D. Lee, C. Lee, Y. Lee, S.T. Wereley, J. Oh. Physica Status
Solidi (a) 209(11), 2142 (2012)
M.J. Madou, Fundamentals of Microfabrication: the Science of Minia-
turization (CRC Press, Boca Raton, 2002)
K.M. Millan, A. Saraullo, S.R. Mikkelsen. Anal. Chem. 66(18), 2943
(1994)
Y. Moser, M.A. Gijs. J. Microelectromech. Syst. 16(6), 1349 (2007)
K. Phelan, K.M. May. Curr. Protoc. Cell Biol., 1–1 (2007)
S.M. Radke, E.C. Alocilja. Biosens. Bioelectron. 20(8), 1662 (2005)
A. Ravindran, P. Chandran, S.S. Khan. Colloids Surf. B: Biointerfaces
105, 342 (2013)
D. Sen, G. Sarin. Br. J. Ophthalmol. 64(9), 693 (1980)
M. Varshney, Y. Li. Biosens. Bioelectron. 24(10), 2951 (2009)
M. Varshney, Y. Li, B. Srinivasan, S. Tung. Sens. Actuators B 128(1),
99 (2007)
J. Wang, X. Zhang. Anal. Chem. 73(4), 844 (2001)
L. Wang, R. Kodzius, X. Yi, S. Li, Y.S. Hui, W. Wen. Sens. Actuators
B 168, 214 (2012)
118 Art́ıculo
H — Solicitud de patente
119
ti! 
í~' j \ 
A JBOGAIDO G[JIIE~L -:.~ "-'0 
IDulR[(cJJ<Í'\I G[MmA~ HJ[ AtVft/J'l>' elJ'I~<Y PI )c."l .... ' 
-~~.- ~ : .. ', , - . .. , 
DIRECCiÓN DE PROPIEDAD INTELECTUAL 
OFICIO: OGAJ/OPI-jpitt-3753J2016 
ASUNTO: Se envía primer requerimiento de 
examen de forma . 
ORA. GLORIAsOBERÓN CHAVéz 
Directo-ra General de Vinculación de la 
Coordinación de Innovíción y Desarrollo 
~­Presente 
En relación con la solicitud de patente de la invención denominada "DISPOSITIVO BIOSENSOR 
PARA LA DETECCiÓN Y MEDICiÓN DE BIOMOlECULAS UTILIZANDO UNA MUESTRA DE 
FLUIDO CORPORAL" con número de expediente MXfa/2016/008613 , le comunico que el día 12 
de octubre del año en curso se recibió del Instituto Mexicano de la Propiedad Industrial, el ofiCIO 
con número de folio 60141 de fecha 2 de agosto de 2016, en el que se emite el primer 
requerimiento de examen de forma de la solicitud de patente de referencia, a efecto de que se 
realicen las modificaciones pertinentes tal y como se indica en el citado oficio, mismo Que se 
anexa al presente en copia fotostática para pronta referencia. 
Por lo anterior, se solicita env íe a esta Dirección General la documentación necesaria a efecto de 
cumplir con el requerimiento antes seña lado , así como el comprobante de pago por la cantidad de 
$377.89 (TRESCIENTOS SETENTA Y SIETE PESOS 89/100 M.N.) por concepto de respuesta al 
examen de forma, de conformidad con el articulo 29 de las Tarifas por los Servicios que presta el 
Institulo Mexicano de la Propiedad Industrial, publicadas en el Diario Oficial de la Federación el 30 
de noviembre de 2015. 
Cabe señalar, que en caso de que no exista interés en continuar con el presente trámite, es 
necesario se informe por escrito a esta Dependencia, ya que de no dar respuesta se considerará 
abandonada la ci tada solicitud de patente , de confOffilidad con lo dispuesto en los artlculos 50 y 
58 de la Ley de la Propiedad Industrial. sin ninguna responsabilidad para esta Dirección General 
de Asuntos Juridicos. 
Ha9° propicia la ocasión para enviarle un cordial saludo. 
Atentamente 
"POR MI RAZA HABLARÁ E EspíRITU" 
Ciudad Universitaria, Cd. M ., a 13 de octubre de 2016 
EL DIRECTOR DE P Pie AD INTELECTUAL 
LIC. DANI 
"'roe"". 
VC>I 1292011 6 
e e p. o{I,a. Rosaura Ru· Gutolrr9l. D"e<:tor~ di I ~ F ~ OJ tad de Cien""," Pre""nlR 
'3 ··'S·" \.,~ 
Lo: Mijul Arceniq "'(¡ufar T~m ~ yo. 0""0:0< General dA "'.un lo. Ju,id COI. Presente 
M~'1" '''' ,,","" E. M""" """. ,~, ; """,", ''''~'' ,,, .. ,,~'"'' "",._" '"M""', ""~ •• p,,~". 
'. 
/100 '7 
120 Solicitud de patente
Bibliograf́ıa
[1] Dorothee Grieshaber, Robert MacKenzie, Janos Voeroes, and Erik Reimhult.
Electrochemical biosensors-sensor principles and architectures. Sensors, 8(3):1400–1458,
2008.
[2] Douglas Arvid Skoog, F Holler, R Douglas A Stanley, Mauri Aucejo, AdelaLlobat Estellés,
Maŕıa Herrèz Hernández, RosaAdela Mauri Aucejo, Maŕıa Llobat Estellés, Rosa Herrèz
Hernández, Sierra Alonso, et al. Principios de análisis instrumental. Number 543.4/. 5.
Cengage Learning,, 2008.
[3] Joseph Wang. Analytical electrochemistry. John Wiley & Sons, 2006.
[4] Tony Scully. Diabetes in numbers. Nature, 485(7398):S2–S3, 2012.
[5] Steven E Kahn, Rebecca L Hull, and Kristina M Utzschneider. Mechanisms linking obesity
to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature, 444(7121):840–846, 2006.
[6] Salvador Villalpando, Vanessa De la Cruz, Rosalba Rojas, Teresa Shamah-Levy,
Marco Antonio Ávila, Berenice Gaona, Rosario Rebollar, and Lucia Hernández. Prevalence
and distribution of type 2 diabetes mellitus in mexican adult population: a probabilistic
survey. Salud pública de México, 52:S19–S26, 2010.
[7] Ralph A DeFronzo. From the triumvirate to the ominous octet: a new paradigm for the
treatment of type 2 diabetes mellitus. Diabetes, 58(4):773–795, 2009.
[8] Sangeeta R Kashyap and Ralph A Defronzo. The insulin resistance syndrome:
physiological considerations. Diabetes and Vascular Disease Research, 4(1):13–19, 2007.
[9] Joseph Wang. Electrochemical glucose biosensors. Chemical reviews, 108(2):814–825,
2008.
[10] Himanshu Sharma, Diep Nguyen, Aaron Chen, Valerie Lew, and Michelle Khine.
Unconventional low-cost fabrication and patterning techniques for point of care
diagnostics. Annals of biomedical engineering, 39(4):1313–1327, 2011.
[11] Anthony Turner, Isao Karube, and George S Wilson. Biosensors: fundamentals and
applications. Oxford University Press, 1987.
[12] Saraju P Mohanty and Elias Kougianos. Biosensors: a tutorial review. IEEE Potentials,
25(2):35–40, 2006.
[13] Leland C Clark and Champ Lyons. Electrode systems for continuous monitoring in
cardiovascular surgery. Annals of the New York Academy of sciences, 102(1):29–45, 1962.
121
122 BIBLIOGRAFÍA
[14] Da-Wen Sun. Handbook of food safety engineering. John Wiley & Sons, 2011.
[15] Alexander Sabelnikov, Vladimir Zhukov, and Ruth Kempf. Probability of real-time
detection versus probability of infection for aerosolized biowarfare agents: A model study.
Biosensors and Bioelectronics, 21(11):2070–2077, 2006.
[16] Sarmishtha Ghoshal, Debasis Mitra, Sudip Roy, and Dwijesh Dutta Majumder. Biosensors
and biochips for nanomedical applications: a review. Sensors & Transducers, 113(2):1,
2010.
[17] J Curie and P Curie. Development, par pression, de l’electicite polarise dans les crystaux
hemiedbes et fares inclines. Comp. Rend, 91:4, 1880.
[18] G Saubrey. The use of quartz crystal oscillators for weighing thin layers and for
microweighing applications. Z. Phys., 155:206–222, 1959.
[19] CK O’sullivan and GG Guilbault. Commercial quartz crystal microbalances–theory and
applications. Biosensors and bioelectronics, 14(8):663–670, 1999.
[20] M Minunni and M Mascini. A piezoelectric biosensor as a direct affinity sensor. In Optical
Sensors and Microsystems, pages 143–150. Springer, 2002.
[21] K Kanazawa and Nam-Joon Cho. Quartz crystal microbalance as a sensor to characterize
macromolecular assembly dynamics. Journal of Sensors, 2009, 2009.
[22] AW Warner and CD Stockbridge. Mass measurement with resonating crystalline quartz.
KH Behrndt (Plenum Press Inc., New York). Warner, AW, and Stockbridge, CD, J. Appl.
Phys, 34:437, 1963.
[23] Alan Shons, Frank Dorman, and John Najarian. An immunospecific microbalance. Journal
of biomedical materials research, 6(6):565–570, 1972.
[24] C Raman Suri, PK Jain, and GC Mishra. Development of piezoelectric crystal based
microgravimetric immunoassay for determination of insulin concentration. Journal of
biotechnology, 39(1):27–34, 1995.
[25] Declan A Healy, Conor J Hayes, Paul Leonard, Louise McKenna, and Richard O?Kennedy.
Biosensor developments: application to prostate-specific antigen detection. TRENDS in
Biotechnology, 25(3):125–131, 2007.
[26] Jeong Hoon Lee, Kyo Seon Hwang, Jaebum Park, Ki Hyun Yoon, Dae Sung Yoon, and
Tae Song Kim. Immunoassay of prostate-specific antigen (psa) using resonant frequency
shift of piezoelectric nanomechanical microcantilever. Biosensors and Bioelectronics,
20(10):2157–2162, 2005.
[27] Michael Plomer, George G Guilbault, and Bertold Hock. Development of a piezoelectric
immunosensor for the detection of enterobacteria. Enzyme and microbial technology,
14(3):230–235, 1992.
[28] George G Guilbault. Determination of formaldehyde with an enzyme-coated piezoelectric
crystal detector. Anal. Chem.;(United States), 55(11), 1983.
Bibliograf́ıa 123
[29] Tzong-Zeng Wu. A piezoelectric biosensor as an olfactory receptor for odour detection:
electronic nose. Biosensors and Bioelectronics, 14(1):9–18, 1999.
[30] S-M Chang, B Ebert, E Tamiya, and I Karube. Development of chemical vapour sensor
using saw resonator oscillator incorporating odorant receptive lb films. Biosensors and
Bioelectronics, 6(4):293–298, 1991.
[31] Gudrun Bunte, Jürgen Hürttlen, Heike Pontius, Kerstin Hartlieb, and Horst Krause. Gas
phase detection of explosives such as 2, 4, 6-trinitrotoluene by molecularly imprinted
polymers. Analytica chimica acta, 591(1):49–56, 2007.
[32] Xueji Zhang, Huangxian Ju, and Joseph Wang. Electrochemical sensors, biosensors and
their biomedical applications. Academic Press, 2011.
[33] J Des Wright and Keith Rawson. Electrochemical sensors based on impedance
measurement of enzymelcatalyzed polymer dissolution: theory and applications. Analytical
Chemistry, 67(27):3928–3935, 1995.
[34] Christine Berggren, Bjarni Bjarnason, and Gillis Johansson. Capacitive biosensors.
Electroanalysis, 13(3):173–180, 2001.
[35] Richard F Taylor, Ingrid G Marenchic, and Richard H Spencer. Antibody-and
receptor-based biosensors for detection and process control. Analytica chimica acta,
249(1):67–70, 1991.
[36] Ibolya Bontidean, Christine Berggren, Gillis Johansson, Elisabeth Csöregi, Bo Mattiasson,
Jonathan R Lloyd, Kenneth J Jakeman, and Nigel L Brown. Detection of heavy
metal ions at femtomolar levels using protein-based biosensors. Analytical Chemistry,
70(19):4162–4169, 1998.
[37] Hanbin Ma, Richard WR Wallbank, Reza Chaji, Jiahao Li, Yuji Suzuki, Chris Jiggins,
and Arokia Nathan. An impedance-based integrated biosensor for suspended dna
characterization. Scientific reports, 3:2730, 2013.
[38] Rangadhar Pradhan, Analava Mitra, and Soumen Das. Impedimetric characterization of
human blood using three-electrode based ecis devices. Journal of Electrical Bioimpedance,
3(1):12–19, 2012.
[39] Reza Karimi Shervedani, Abdolhamid Hatefi Mehrjardi, and Najmehsadat Zamiri. A
novel method for glucose determination based on electrochemical impedance spectroscopy
using glucose oxidase self-assembled biosensor. Bioelectrochemistry, 69(2):201–208, 2006.
[40] A Caduff, F Dewarrat, M Talary, G Stalder, L Heinemann, and Yu Feldman. Non-invasive
glucose monitoring in patients with diabetes: a novel system based on impedance
spectroscopy. Biosensors and Bioelectronics, 22(5):598–604, 2006.
[41] Jose M Guisan. Immobilization of enzymes and cells, volume 22. Springer, 2006.
[42] Jonathan S Daniels and Nader Pourmand. Label-free impedance biosensors: Opportunities
and challenges. Electroanalysis, 19(12):1239–1257, 2007.
124 BIBLIOGRAFÍA
[43] J Ross Macdonald. Impedance spectroscopy. Annals of biomedical engineering,
20(3):289–305, 1992.
[44] Reza Karimi Shervedani and Abdolhamid Hatefi-Mehrjardi. Electrochemical
characterization of directly immobilized glucose oxidase on gold mercaptosuccinic
anhydride self-assembled monolayer. Sensors and Actuators B: Chemical, 126(2):415–423,
2007.
[45] Petr Skládal. Advances in electrochemical immunosensors. Electroanalysis, 9(10):737–745,
1997.
[46] Chao Yang, Daniel Rairigh, and Andrew Mason. On-chip electrochemical impedance
spectroscopy for biosensor arrays. In Sensors, 2006. 5th IEEE Conference on, pages
93–96. IEEE, 2006.
[47] Calum J McNeil, Dale Athey, Mark Ball, Wah On Ho, Steffi Krause, Ron D Armstrong,
J Des Wright, and Keith Rawson. Electrochemical sensors based on impedance
measurement of enzyme-catalyzed polymer dissolution: theory and applications. Analytical
Chemistry, 67(21):3928–3935, 1995.
[48] Hong Cai, Thomas Ming-Hung Lee, and I-Ming Hsing. Label-free protein recognition using
an aptamer-based impedance measurement assay. Sensors and Actuators B: Chemical,
114(1):433–437, 2006.
[49] Jung A Lee, Seongpil Hwang, Juhyoun Kwak, Se Il Park, Seung S Lee, and Kwang-Cheol
Lee. An electrochemical impedance biosensor with aptamer-modified pyrolyzed carbon
electrode for label-free protein detection. Sensors and Actuators B: Chemical,
129(1):372–379, 2008.
[50] William E Moerner. New directions in single-molecule imaging and analysis. Proceedings
of the National Academy of Sciences, 104(31):12596–12602, 2007.
[51] W Gregory Cox and Victoria L Singer. Fluorescent dna hybridization probe preparation
using amine modification and reactive dye coupling. Biotechniques, 36(1):114–123, 2004.
[52] Bo Liedberg, Claes Nylander, and Ingemar Lunström. Surface plasmon resonance for gas
detection and biosensing. Sensors and actuators, 4:299–304, 1983.
[53] Francisco J. Garćıa Vidal y Luis Mart́ın Moreno. Plasmones superficiales. Universidad de
Dijon, 2008.
[54] Xudong Fan, Ian M White, Siyka I Shopova, Hongying Zhu, Jonathan D Suter, and Yuze
Sun. Sensitive optical biosensors for unlabeled targets: A review. analytica chimica acta,
620(1):8–26, 2008.
[55] Stefan Maier. Plasmonics: Fundamentals and Applications. Springer, 2007.
[56] Lulu Zhang, Xing Chen, Haoyuan Cai, Hui Li, Jianhai Sun, Dafu Cui, and Chaoya Peng.
P1. 3.15 a microfluidic-based pdms prism for spr imaging system. Tagungsband, pages
971–973, 2012.
Bibliograf́ıa 125
[57] Eliza Hutter and Janos H Fendler. Exploitation of localized surface plasmon resonance.
Advanced Materials, 16(19):1685–1706, 2004.
[58] Dachao Li, Jia Yang, Peng Wu, Di Yang, Bo Wang, Yuan Lin, and Kexin Xu. Glucose
measurement by surface plasmon resonance with borate polymer binding. In Proc. of
SPIE Vol, volume 8591, pages 85910P–1, 2013.
[59] RC Jorgenson and SS Yee. A fiber-optic chemical sensor based on surface plasmon
resonance. Sensors and Actuators B: Chemical, 12(3):213–220, 1993.
[60] M Manuel, B Vidal, Raul López, Salvador Alegret, Julian Alonso-Chamarro, Ignacio
Garces, and Javier Mateo. Determination of probable alcohol yield in musts by means of
an spr optical sensor. Sensors and Actuators B: Chemical, 11(1):455–459, 1993.
[61] Jakub Dostalek, J Čtyrokỳ, Jirı Homola, Eduard Brynda, M Skalskỳ, P Nekvindova,
J Špirková, J Škvor, and J Schröfel. Surface plasmon resonance biosensor based on
integrated optical waveguide. Sensors and actuators B: Chemical, 76(1):8–12, 2001.
[62] C Mouvet, RD Harris, C Maciag, BJ Luff, JS Wilkinson, J Piehler, A Brecht, G Gauglitz,
R Abuknesha, and G Ismail. Determination of simazine in water samples by waveguide
surface plasmon resonance. Analytica Chimica Acta, 338(1-2):109–117, 1997.
[63] F Prieto, B Sepulveda, A Calle, A Llobera, C Domınguez, and LM Lechuga. Integrated
mach–zehnder interferometer based on arrow structures for biosensor applications. Sensors
and actuators B: Chemical, 92(1):151–158, 2003.
[64] EF Schipper, AM Brugman, C Dominguez, LM Lechuga, RPH Kooyman, and J Greve.
The realization of an integrated mach-zehnder waveguide immunosensor in silicon
technology. Sensors and Actuators B: Chemical, 40(2):147–153, 1997.
[65] Albrecht Brandenburg and R Henninger. Integrated optical young interferometer. Applied
optics, 33(25):5941–5947, 1994.
[66] Albrecht Brandenburg. Differential refractometry by an integrated-optical young
interferometer. Sensors and Actuators B: Chemical, 39(1):266–271, 1997.
[67] Bernard H Schneider, John G Edwards, and Nile F Hartman. Hartman interferometer:
versatile integrated optic sensor for label-free, real-time quantification of nucleic acids,
proteins, and pathogens. Clinical chemistry, 43(9):1757–1763, 1997.
[68] Victor S-Y Lin, Kianoush Motesharei, Keiki-Pua S Dancil, Michael J Sailor, and
M Reza Ghadiri. A porous silicon-based optical interferometric biosensor. Science,
278(5339):840–843, 1997.
[69] Manoj M Varma, Halina D Inerowicz, Fred E Regnier, and David D Nolte. High-speed
label-free detection by spinning-disk micro-interferometry. Biosensors and Bioelectronics,
19(11):1371–1376, 2004.
[70] Ming Zhao, David Nolte, Wonryeon Cho, Fred Regnier, Manoj Varma, Greg Lawrence,
and John Pasqua. High-speed interferometric detection of label-free immunoassays on the
biological compact disc. Clinical chemistry, 52(11):2135–2140, 2006.
126 BIBLIOGRAFÍA
[71] Eva Engvall and Peter Perlmann. Enzyme-linked immunosorbent assay, elisa. The Journal
of Immunology, 109(1):129–135, 1972.
[72] Bertrand Friguet, Alain F Chaffotte, Lisa Djavadi-Ohaniance, and Michel E Goldberg.
Measurements of the true affinity constant in solution of antigen-antibody complexes by
enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of immunological methods, 77(2):305–319,
1985.
[73] Brian R Eggins. Chemical sensors and biosensors, volume 28. John Wiley & Sons, 2008.
[74] Aaron M Streets and Yanyi Huang. Chip in a lab: Microfluidics for next generation life
science research. Biomicrofluidics, 7(1):011302, 2013.
[75] George M Whitesides. The origins and the future of microfluidics. Nature,
442(7101):368–373, 2006.
[76] Andres W Martinez, Scott T Phillips, George M Whitesides, and Emanuel Carrilho.
Diagnostics for the developing world: microfluidic paper-based analytical devices.
Analytical chemistry, 82(1):3–10, 2009.
[77] Yves Moser and Martin AM Gijs. Miniaturized flexible temperature sensor. Journal of
Microelectromechanical Systems, 16(6):1349–1354, 2007.
[78] Xing-Jiu Huang, Leigh Aldous, Aoife M O’Mahony, F Javier del Campo, and Richard G
Compton. Toward membrane-free amperometric gas sensors: a microelectrode array
approach. Analytical chemistry, 82(12):5238–5245, 2010.
[79] Stephen M Radke and Evangelyn C Alocilja. A high density microelectrode array biosensor
for detection of e. coli o157: H7. Biosensors and Bioelectronics, 20(8):1662–1667, 2005.
[80] Madhukar Varshney and Yanbin Li. Interdigitated array microelectrodes based impedance
biosensors for detection of bacterial cells. Biosensors and Bioelectronics, 24(10):2951–2960,
2009.
[81] Kelly M Millan, Angela Saraullo, and Susan R Mikkelsen. Voltammetric dna biosensor
for cystic fibrosis based on a modified carbon paste electrode. Analytical chemistry,
66(18):2943–2948, 1994.
[82] Rajendra N Goyal, Vinod K Gupta, and Sanghamitra Chatterjee. Voltammetric biosensors
for the determination of paracetamol at carbon nanotube modified pyrolytic graphite
electrode. Sensors and Actuators B: Chemical, 149(1):252–258, 2010.
[83] Amay J Bandodkar, Wenzhao Jia, Ceren Yardımcı, Xuan Wang, Julian Ramirez, and
Joseph Wang. Tattoo-based noninvasive glucose monitoring: a proof-of-concept study.
Analytical chemistry, 87(1):394–398, 2014.
[84] Mónica Hernández, Carlos A Galán, Giaan A Álvarez, and ME Páez. Desarrollo de
un biosensor amperométrico en configuración plana para la cuantificación de colesterol.
Información tecnológica, 22(6):25–32, 2011.
Bibliograf́ıa 127
[85] Fatma Arslan, Selvin Ustabaş, and Halit Arslan. An amperometric biosensor
for glucose determination prepared from glucose oxidase immobilized in
polyaniline-polyvinylsulfonate film. Sensors, 11(8):8152–8163, 2011.
[86] Amandeep Kaur and Neelam Verma. Electrochemical biosensor for monitoring insulin
in normal individuals and diabetic mellitus patients. European Journal of Experimental
Biology, 2(2):389–395, 2012.
[87] Madhukar Varshney, Yanbin Li, Balaji Srinivasan, and Steve Tung. A label-free,
microfluidics and interdigitated array microelectrode-based impedance biosensor in
combination with nanoparticles immunoseparation for detection of escherichia coli o157:
H7 in food samples. Sensors and Actuators B: Chemical, 128(1):99–107, 2007.
[88] Joseph Wang and Xueji Zhang. Needle-type dual microsensor for the simultaneous
monitoring of glucose and insulin. Analytical Chemistry, 73(4):844–847, 2001.
[89] Stephen D Senturia. Microsystem design. Springer Science & Business Media, 2007.
[90] Geoffrey Kotzar, Mark Freas, Phillip Abel, Aaron Fleischman, Shuvo Roy, Christian
Zorman, James M Moran, and Jeff Melzak. Evaluation of mems materials of construction
for implantable medical devices. Biomaterials, 23(13):2737–2750, 2002.
[91] Alejandro Kayum. Fabricación de microsistemas y máscaras de alta resolución con
tecnoloǵıa láser. UNAM, México, 2012.
[92] Marc J Madou. Fundamentals of microfabrication: the science of miniaturization. CRC
press, 2002.
[93] Rabih Zaouk, Benjamin Y Park, and Marc J Madou. Introduction to microfabrication
techniques. Microfluidic Techniques: Reviews and Protocols, pages 5–15, 2006.
[94] MEMS and Nanotechnology Exchange. Mems and nanotechnology clearinghouse. http://
www.memsnet.org/about/processes/deposition.html, 2017. [Consultado Mayo-2017].
[95] Babak Ziaie, Antonio Baldi, Ming Lei, Yuandong Gu, and Ronald A Siegel. Hard and
soft micromachining for biomems: review of techniques and examples of applications in
microfluidics and drug delivery. Advanced drug delivery reviews, 56(2):145–172, 2004.
[96] David J Guckenberger, Theodorus E de Groot, Alwin MD Wan, David J Beebe, and
Edmond WK Young. Micromilling: a method for ultra-rapid prototyping of plastic
microfluidic devices. Lab on a Chip, 15(11):2364–2378, 2015.
[97] Kazuyoshi Itoga, Jun Kobayashi, Yukiko Tsuda, Masayuki Yamato, and Teruo Okano.
Second-generation maskless photolithography device for surface micropatterning and
microfluidic channel fabrication. Analytical chemistry, 80(4):1323–1327, 2008.
[98] Dong Qin, Younan Xia, and George M Whitesides. Soft lithography for micro-and
nanoscale patterning. Nature protocols, 5(3):491–502, 2010.
[99] S Osswald, K Behler, and Y Gogotsi. Laser-induced light emission from carbon
nanoparticles. Journal of Applied Physics, 104(7):074308, 2008.
128 BIBLIOGRAFÍA
[100] Dow Corning Corporation. SYLGARD® 184 SILICONE ELASTOMER KIT. 2000 -
2014.
[101] Himanshu Sharma, Michelle A Digman, Natasha Felsinger, Enrico Gratton, and Michelle
Khine. Enhanced emission of fluorophores on shrink-induced wrinkled composite
structures. Optical materials express, 4(4):753–763, 2014.
[102] M Hautefeuille, L Cabriales, R Pimentel-Domı́nguez, V Velázquez, J Hernández-Cordero,
L Oropeza-Ramos, M Rivera, MP Carreón-Castro, M Grether, and E López-Moreno.
New perspectives for direct pdms microfabrication using a cd-dvd laser. Lab on a Chip,
13(24):4848–4854, 2013.
[103] Florent Haiss, Sergejus Butovas, and Cornelius Schwarz. A miniaturized chronic
microelectrode drive for awake behaving head restrained mice and rats. Journal of
neuroscience methods, 187(1):67–72, 2010.
[104] Jessica E Koehne, Hua Chen, Alan M Cassell, Qi Ye, Jie Han, Meyya Meyyappan, and
Jun Li. Miniaturized multiplex label-free electronic chip for rapid nucleic acid analysis
based on carbon nanotube nanoelectrode arrays. Clinical chemistry, 50(10):1886–1893,
2004.
[105] Gang Chen, Luyan Zhang, and Joseph Wang. Miniaturized capillary electrophoresis
system with a carbon nanotube microelectrode for rapid separation and detection of thiols.
Talanta, 64(4):1018–1023, 2004.
[106] CJ Hayden and C Dalton. Direct patterning of microelectrode arrays using femtosecond
laser micromachining. Applied Surface Science, 256(12):3761–3766, 2010.
[107] Bongchul Kang, Seunghwan Ko, Jongsu Kim, and Minyang Yang. Microelectrode
fabrication by laser direct curing of tiny nanoparticle self-generated from organometallic
ink. Optics express, 19(3):2573–2579, 2011.
[108] SH Lee, DJ Lee, CK Lee, YH Lee, Steven T Wereley, and JH Oh. Direct fabrication of
microelectrodes on a polymer substrate using selective ultrashort pulsed laser ablation of
inkjet-printed ag lines. physica status solidi (a), 209(11):2142–2146, 2012.
[109] Limu Wang, Rimantas Kodzius, Xin Yi, Shunbo Li, Yu Sanna Hui, and Weijia Wen.
Prototyping chips in minutes: Direct laser plotting (dlp) of functional microfluidic
structures. Sensors and Actuators B: Chemical, 168:214–222, 2012.
[110] Rangadhar Pradhan, Analava Mitra, and Soumen Das. Quantitative evaluation of
blood glucose concentration using impedance sensing devices. Journal of Electrical
Bioimpedance, 4(1):73–77, 2013.
[111] Mathieu Hautefeuille, Alejandro K Jimenez-Zenteno, Pablo Roberto Pérez-Alcázar,
Kristopher M Hess-Frieling, Gerardo Fernandez-Sanchez, Victor Velazquez, Marcela
Grether-Gonzalez, and Enrique Lopez-Moreno. Utilization of a digital-versatile-disc
pickup head for benchtop laser microfabrication. Applied optics, 51(8):1171–1177, 2012.
[112] George Mann. Print: A Manual for Librarians and Students Describing in Detail the
History, Methods, and Applications of Printing and Paper Making. Grafton, 1952.
Bibliograf́ıa 129
[113] Sayed IM Zayed and Hassan AM Arida. Preparation of carbon paste electrodes and its
using in voltammetric determination of amiloride hydrochloride using in the treatment of
high blood pressure. Int. J. Electrochem. Sci, 8:1340–1348, 2013.
[114] CHEMTRONICS. https:www.chemtronics.com. 2014.
[115] J Ross Macdonald. Impedance spectroscopy. Annals of biomedical engineering,
20(3):289–305, 1992.
[116] Agilent Technologies. Agilent e4980a precision lcr meter user’s guide. http://www.
keysight.com, 2017. [Consultado Mayo-2017].
[117] Kathryn E Toghill and Richard G Compton. Electrochemical non-enzymatic glucose
sensors: a perspective and an evaluation. Int. J. Electrochem. Sci, 5(9):1246–1301, 2010.
[118] Qi Li, Nan Li, Paul Le Tissier, David R Grattan, and Kagan Kerman. Miniaturized
electrochemical immunosensor for label-free detection of growth hormone. Electroanalysis,
24(6):1272–1276, 2012.
[119] Anne Guillou, Nicola Romano, Frederik Steyn, Karine Abitbol, Paul Le Tissier, Xavier
Bonnefont, Chen Chen, Patrice Mollard, and Agnès O Martin. Assessment of lactotroph
axis functionality in mice: Longitudinal monitoring of prl secretion by ultrasensitive-elisa.
Endocrinology, 156(5):1924–1930, 2015.
[120] Bo Wei, Fang Li, Huicui Yang, Lei Yu, Kaihong Zhao, Rui Zhou, and Yonggang
Hu. Magnetic beads-based enzymatic spectrofluorometric assay for rapid and sensitive
detection of antibody against apxiva of actinobacillus pleuropneumoniae. Biosensors and
Bioelectronics, 35(1):390–393, 2012.
[121] Il-Hoon Cho and Joseph Irudayaraj. In-situ immuno-gold nanoparticle network
elisa biosensors for pathogen detection. International journal of food microbiology,
164(1):70–75, 2013.
[122] B Fabre, V Mesh, A Oneto, G Macalini, H Grosman, C Aranda, and G Berg. La saliva y
su utilidad en la evaluación de la función endocrinológica. Rev. SAEGRE, 16, 2009.
[123] Aswathy Ravindran, Preethy Chandran, and S Sudheer Khan. Biofunctionalized
silver nanoparticles: advances and prospects. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces,
105:342–352, 2013.
[124] Xiaoqiu Huang, DW Greve, DD Nguyen, and MM Domach. Impedance based biosensor
array for monitoring mammalian cell behavior. In Sensors, 2003. Proceedings of IEEE,
volume 1, pages 304–309. IEEE, 2003.
[125] Katy Phelan and Kristin M May. Basic techniques in mammalian cell tissue culture.
Current protocols in cell biology, pages 1–1, 2007.
130 BIBLIOGRAFÍA