1 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO PROGRAMA DE MAESTRIA Y DOCTORADO EN PSICOLOGIA NEUROCIENCIAS DE LA CONDUCTA REORGANIZACIÓN DEL CIRCUITO DEL ÁREA MOTORA SUPLEMENTARIA - GANGLIOS BASALES DESPUÉS DEL APRENDIZAJE DE UNA TAREA RÍTMICA DE MOVIMIENTOS EN EL PRIMATE. TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: DOCTOR EN PSICOLOGIA PRESENTA: PAMELA GARCÍA SALDIVAR TUTOR PRINCIPAL: DR. HUGO MERCHANT NANCY INSTITUTO DE NEUROBIOLOGIA MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR: DR. LUIS CONCHA LOYOLA INSTITUTO DE NEUROBIOLOGÍA DR. FRANCISCO SOTRES BAYÓN INSTITUTO DE FISIOLOGÍA CELULAR Santiago de Querétaro, Querétaro, agosto 2024 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. 2 El trabajo de esta tesis fue realizado en el Instituto de Neurobiología de la Universidad Nacional Autónoma de México, campus Juriquilla, en el laboratorio B-15 Neurofisiología de Sistemas a cargo del Dr. Hugo Merchant Nancy y C-13 laboratorio de Conectividad Cerebral a cargo del Dr. Luis Concha Loyola. El desarrollo de esta tesis doctoral contó con el apoyo de una beca del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología con número de becario 414029. 3 Dedicatoria A mi familia, por su apoyo, amor y compañía. Sin ustedes, nada tendría sentido. A mi padre, mi héroe, la vida no me alcanzará para agradecer tu ejemplo: curioso, trabajador, creativo y perseverante. Gracias por la fortaleza con la que me construiste, te amo. Te debo todo. A mi madre, el amor de vida, gracias por ser ejemplo de: valentía, fortaleza y resiliencia. Toda mi admiración y amor para ti. Hiciste de mí, lo que una vez de joven soñaste: una mujer fuerte e independiente. Gracias mami A mi hermana, la princesa más inteligente y sonriente. La vida tiene sentido si tu estas a mi lado. Te amo profundamente. Gracias por tu amor y ternura, pero sobre todo por la alegría de verte sonreír. A Juan Christopher, contigo la vida me dio un hermano, te amo profundamente, todo mi agradecimiento por contenerme y estar. A mi Josesito, la vida contigo es mucho más bonita. Gracias por estar conmigo: animando, escuchando, sosteniendo y apoyando. Gracias por tu infinito cariño y hacerme saber que con tu compañía nunca me pensaré sola. Te amo A mis colegas y amigos, Tommy y Gil. 4 Agradecimientos Institucionales A la Universidad Nacional Autónoma de México, al Instituto de Neurobiología y a la Unidad de Resonancia Magnética. Al Dr. Merchant, le agradezco enormemente su apoyo en cada una de las ideas propuestas, así como por el ejemplo del trabajo arduo en la ciencia, por la guía y retroalimentación constante. Por la actitud positiva que siempre mostró ante el proyecto. Por confiar en que podría desarrollar un proyecto tan grande que nos llevó por varias ramas para finalmente enseñarme lo que es la ciencia. Al Dr. Luis Concha, una de las mejores personas que he conocido. Gracias por confiar en mi desde la primera entrevista. Gracias por guiarme en el mundo de la ciencia. Gracias por compartir su conocimiento pacientemente y siempre estar abierto a nuevos proyectos. Gracias por apoyarme durante este camino a través de su excelente y humana tutoría, pero sobre todo gracias por escucharme cada vez que más que un tutor requería de un amigo. Toda mi admiración para usted. A los miembros del comité tutoral Francisco Sotres Bayón. A los integrantes del jurado: Dra. Selene Cansino y Dr. Fernando Barrios. A la Dra. Gina Quirarte, representante del programa del posgrado en psicología en el INB por su paciencia y ayuda. A la Dra. María Corsi, por su acompañamiento y presencia en las evaluaciones de postulación y candidatura. A la Dra. Nuri Aranda, por todo su apoyo en el proceso de titulación. Al Dr. Erick Pasaye y al personal de la Unidad de Resonancia Magnética. Al técnico académico del laboratorio B-15 Luis Prado. Gracias por todo el trabajo de apoyo en la programación de tareas y la logística del lab. Al técnico del laboratorio B-15 Raúl Paulin, gracias por enseñarme como acercarme y manejar a los sujetos que participaron en este proyecto. Al personal de vigilancia de la Unidad de Resonancia Magnética del INB, porque durante todas las madrugadas que realizaba adquisiciones estaban al pendiente y me hacían sentir segura. 5 Agradecimientos Personales A mis amigos: Mayra y Felipe. Gracias por la estructura y por ser una familia para mí. Mayra, gracias por ser una persona tan linda que cuido de mí, cuando yo no sabía ni cómo hacerlo. Fel, gracias por enseñarme miles de cosas cada vez que platicábamos, por tu opinión sincera, por tus aportes cuando estaba atorada con mis análisis y ayudarme a salir de ellos, por mostrarme el amor por Python y la teoría de grafos, y por que al final terminamos colaborando y siendo grandes amigos. Dennise e Ian. Amiga mía, gracias por tu alegría, las porras, las risas, la complicidad, sin ti la vida no sería igual, te quiero inmensamente, ¡una tesis más! Mi Carlitos hermoso, eres una de las personas más lindas, tiernas y nobles que conozco, gracias por escucharme, gracias por estar, gracias por todas las risas, por ser un caballero y por ser el amigo que todas las personas necesitan. Itza y Ricardo. ¡Amigos lo logramos! Itza, gracias por ser un amigo tan sincero, gracias por ese último empujón, gracias por estar para escucharme o leerme, en ti siempre encontré empatía, risas, chistes y memes, te adoro. Ricardo, gracias por esas cenas terapéuticas, gracias por los ánimos y gracias por hacerme sentir paz cada vez que hablamos. Juan Pi, gracias por tu apoyo incondicional durante las madrugadas en la adquisición de las imágenes y por cada una de las charlas random que teníamos. Odette, Gael, Juan y Elvira. Gracias por el apoyo de los cuatro, durante todos estos años, gracias por las porras, gracias por hacerme ver que hay más familia que la nuclear, los quiero. 6 Índice Lista de abreviaturas ...................................................................................................................... 8 Índice de Figuras ............................................................................................................................ 9 Resumen ...................................................................................................................................... 11 Introducción ................................................................................................................................ 13 Antecedentes ............................................................................................................................... 17 Estudios de psicofísica: un acercamiento al estudio de la cuantificación del tiempo. ................. 17 Bases neurales del procesamiento temporal en la escala de los milisegundos ........................... 19 Conectividad estructural en el circuito corteza- ganglios basales- tálamo- corteza motor .......... 22 Cambios neuronales estructurales asociados al entrenamiento ................................................ 24 Propiedades de la sustancia blanca y su asociación con la ejecución de tareas de sincronización sensoriomotora ........................................................................................................................ 26 Nomenclatura y análisis de las propiedades de la sustancia blanca ........................................... 26 Justificación del proyecto ............................................................................................................. 30 Planteamiento del problema 1 ................................................................................................. 30 Planteamiento del problema 2 ................................................................................................. 31 Plan de trabajo ............................................................................................................................. 34 Métodos ...................................................................................................................................... 37 Experimento 1 .......................................................................................................................... 37 Diseño experimental ............................................................................................................ 37 Animales de laboratorio ....................................................................................................... 37 Tarea Control de Tiempo de Reacción (TCTR) ........................................................................ 37 Tarea de Sincronización a un Metrónomo (TSM) ................................................................... 38 Aparatos............................................................................................................................... 39 Estímulos ............................................................................................................................. 40 Entrenamiento ..................................................................................................................... 40 Análisis de datos conductuales ............................................................................................. 41 Evaluación del efecto del nivel de hidratación ....................................................................... 41 Adquisición de Imágenes ...................................................................................................... 41 Experimento 2 .......................................................................................................................... 43 Análisis de Imágenes de Resonancia Magnética .................................................................... 43 Análisis de grosor cortical transversal. PREEMACS ................................................................ 43 Sujetos ................................................................................................................................. 43 Flujo de trabajo PREEMACS .................................................................................................. 44 PREEMACS parcelación basada en superficie ........................................................................ 50 PREEMACS longitudinal ........................................................................................................ 50 Experimento 3. ......................................................................................................................... 51 Conducta rítmica, sustancia blanca profunda y método para el análisis de sustancia blanca superficial ................................................................................................................................ 51 Sujetos ................................................................................................................................. 51 Tarea experimental ............................................................................................................... 52 Estímulos ............................................................................................................................. 53 Aparatos............................................................................................................................... 53 Análisis de datos conductuales ............................................................................................. 54 Protocolo de imagen ............................................................................................................ 54 Procesamiento de imágenes ................................................................................................. 55 7 Análisis de métricas de Imágenes Ponderadas a Difusión (IPD) ............................................. 58 Análisis de correlación canónica regularizada (rCCA) ............................................................ 59 Experimento 4 .......................................................................................................................... 60 PREEMACS. Análisis de grosor cortical a lo largo del entrenamiento ..................................... 60 PREEMACS. Evaluación Sustancia Blanca Superficial de PNH ................................................. 61 PREEMACS. Análisis de sustancia blanca yuxtacortical y superfical a lo largo del entrenamiento ............................................................................................................................................ 63 Resultados ................................................................................................................................... 65 Experimento 1.1. Conducta ...................................................................................................... 67 Experimento 1.2. Entrenamiento .............................................................................................. 72 Experimento 1.3. Protocolo para la adquisición de IRM de PNH ................................................ 73 Experimento 1.4. Evaluación del efecto del nivel de hidratación. Control de fluidos .................. 76 Experimento 2. PREEMACS ....................................................................................................... 77 Experimento 3. Conducta rítmica, sustancia blanca profunda y método para el análisis de sustancia blanca superficial ...................................................................................................... 89 Experimento 4. Evaluación del grosor cortical a lo largo del entrenamiento ............................ 106 Experimento 4. Análisis de Sustancia blanca ........................................................................... 110 Sustancia blanca superficial ................................................................................................ 110 Sustancia blanca profunda .................................................................................................. 113 Discusión ................................................................................................................................... 114 Desarrollo de protocolos de entrenamiento para tareas de sincronización sensoriomotora, estandarizados y reproducibles en primates no humanos ....................................................... 114 Estandarización de protocolos de adquisición y análisis de IRM en primates no humanos ...... 115 PREEMACS ............................................................................................................................. 115 Puntos fuertes de PREEMACS ................................................................................................. 115 Generalización de PREEMACS ................................................................................................. 117 Comparación con otros procedimientos para la reconstrucción de superficies de PNH ........... 118 Limitaciones de PREEMACS .................................................................................................... 119 Control de niveles de hidratación ........................................................................................... 119 Bases estructurales de la sustancia blanca para la precisión de fase, durante la sincronización del movimiento de tapping en humanos ...................................................................................... 120 Estudios longitudinales empleando IRM ................................................................................. 124 Conclusión ................................................................................................................................. 125 Referencias ................................................................................................................................ 127 ANEXOS ..................................................................................................................................... 133 ANEXO A ................................................................................................................................ 134 ANEXO B ................................................................................................................................ 142 ANEXO C ..................................................................................................................................154 ANEXO D ..................................................................................................................................175 8 Lista de abreviaturas AMS Área Motora Suplementaria BOLD Blood Oxygenation Level Depend CC Cuerpo Calloso CGBTC Circuito Corteza-Ganglios Basales-Tálamo-Corteza CSD Método de Deconvolución Esférica Restringida DAF Densidad Aparente de Fibras DAFpar Densidad Aparente de Fibra paralela DAFtan Densidad Aparente de Fibra tangencial DAFtotal Densidad Aparente de Fibra total DOF Grados de libertad DWI Diffusión Weighted Image FA Anisotropía Fraccional FBA Análisis Basado en Fixeles FOD Fiber Orientation Distribution fIRM Resonancia Magnética Funcional FOV Campo de vista HICPO High Intensity Control Point INU Inhomogenidad de campo ISC Intervalos Isócronos IPD Imágenes Ponderadas a Difusión IPNH Imágenes de Primates No Humanos IRM Imagen de Resonancia Magnética MCI Métricas de Calidad de Imagen IRMqc Image quality metrics PNH Primates No Humanos preAMS Area Motora Pre-Suplementaria PREEMACS Pipeline for Preprocessing and Extraction of the Macaque Brain Surface PRIME-DE Primate Data Exchange rCCA Análisis de Correlación Canónica regularizada RM Resonancia Magnética SB Sustancia Blanca SBP Sustancia blanca profunda SBS Sustancia blanca superficial SG Sustancia Gris SVM Support Vector Machine T1w Volumen ponderado en T1 T2w Volumen ponderado en T2 TCTR Tarea de Tiempo de Reacción TSC Tarea Sincronización-Continuación TSM Tarea de Sincronización a un Metronómo TSMa Tarea Sincronización a un Metronómo auditivo TSMv Tarea Sincronización a un Metronómo visual 9 Índice de Figuras Figura 1. Inyección de trazadores neuronales anterógrados en la corteza motora primaria de mono Rhesus. ........................................................................................................................................ 23 Figura 2. Representación esquemática de inyección de trazadores neuronales en la corteza motora suplementaria del mono Rhesus .................................................................................................. 24 Figura 3. Sustancia blanca superficial y sistema de fibras en U. ..................................................... 27 Figura 4. Análisis de las propiedades de la sustancia blanca, basado en fixeles. A. D ..................... 29 Figura 5. Plan de trabajo. ............................................................................................................. 36 Figura 6. Tareas de entrenamiento ............................................................................................... 39 Figura 7. Flujo para el preprocesamiento y extracción de superficies de imágenes de primates no humanos (PREEMACS). ................................................................................................................ 49 Figura 8. PREEMACS Longitudinal. ................................................................................................ 51 Figura 9. Tarea de Sincronización - Continuación .......................................................................... 53 Figura 10. Método para la evaluación de Sustancia Blanca Superficial y de fibras en U.................. 57 Figura 11. Evaluación de Grosor cortical. ...................................................................................... 60 Figura 12. Parcelación de áreas basadas en superficie en el hemisferio izquierdo ......................... 61 Figura 13. Generación de Superficies Yuxtacorticales (SYc)............................................................ 64 Figura 14. Publicaciones obtenidas como resultado del desarrollo del proyecto ........................... 66 Figura 15. Análisis conductual. Tarea Control de Tiempo de Reacción. .......................................... 68 Figura 16. Entrenamiento en la Tarea de Sincronización a un metrónomo visual y auditivo. .......... 70 Figura 17. Entrenamiento y condiciones de adquisición de IRM. ................................................... 71 Figura 18. Imágenes de Resonancia Magnética estructural de mono Rhesus ................................ 74 Figura 19. Procesamiento de imágenes ponderadas a difusión. .................................................... 75 Figura 20. Variabilidad de escaneo-rescaneo en el grosor cortical durante condiciones de agua libre y control de agua en un macaco Rhesus ....................................................................................... 77 Figura 21. Rendimiento de la herramienta de segmentación de cerebro PREEMACS. .................... 79 Figura 22. Evaluación de agrupamiento de las métricas de calidad de IRM ................................... 80 Figura 23. Atlas de segmentación de PREEMACS .......................................................................... 82 Figura 24. Patrón de curvatura y esfera promedio PREEMACS Rhesus. .......................................... 83 Figura 25. Superficie de SB promedio de PREEMACS Rhesus......................................................... 84 Figura 26. Superficie pial promedio de PREEMACS Rhesus que muestra el patrón de datos de curvatura. .................................................................................................................................... 85 Figura 27. Evaluación de errores en las superficies corticales obtenidas con PREEMACS ............... 86 Figura 28. Errores de segmentación “mínimos” más comunes ...................................................... 87 Figura 29. Ejemplos de estimaciones de superficie. ...................................................................... 88 Figura 30. Grosor Cortical. ............................................................................................................ 89 Figura 31. Análisis conductual durante la Tarea de Sincronización continuación (TSC). .................. 90 Figura 32. Matriz de correlación para las asincronías absolutas entre sujetos para cinco intervalos para las condiciones auditivas (izquierda) y visuales (derecha). .................................................... 92 Figura 33. Análisis de la sustancia blanca superficial. .................................................................... 95 Figura 34. Coeficiente de determinación entre asincronías auditivas y la densidad de fibra aparente tangencial .................................................................................................................................... 97 Figura 35. Asociaciones entre las asincronías y regiones de interés de DAFtan ............................... 98 Figura 36. Correlación canónica entre métricas de comportamiento y DAFtan. ............................. 101 Figura 38. Asociación entre la sustancia blanca profunda y la media de las asincronías de todos los intervalos objetivo. .................................................................................................................... 105 10 Figura 39. Parcelación de áreas basadas en superficie. ............................................................... 106 Figura 40. Grosor cortical para el M01 y M02 en 5 áreas de la corteza cerebral del hemisferio derecho ..................................................................................................................................... 108 Figura 41. Grosor cortical para el M01 y M02 en 5 áreas de la corteza cerebral del hemisferio izquierdo .................................................................................................................................... 108 Figura 42. Grosor cortical para el M01 en 5 áreas de la corteza cerebral (motora primaria, motoras secundarias -F2, AMS y pre SMA- y en el área visual), correspondientes a ambos hemisferios. ... 109 Figura 43. PREEMACS Superficie de Sustancia Blanca Yuxtacortical (SBY) mostrando los valores promedio del mapa de FA, de los sujeos M01 y M02, en la primera adquisición. ........................ 111 Figura 44. Resultados de la cuantificación de FA en la sustancia blanca yuxtacortical (SBY) para ambos sujetos en ambos hemisferios. ........................................................................................ 112 Figura 45. Disección virtual de la capsula externa ipsilateral. ...................................................... 113 11 Resumen El tiempo es una propiedad física que percibimos de forma constante. La estimación temporal en la escala de los milisegundos es de relevancia, debido a que en esta se ejecutan procesos tales como: la comprensión y producción del lenguaje, la apreciación y ejecución de la música y danza, así como la intercepción de blancos en movimiento o la evasión de un choque (Merchant et al., 2014). Con respecto a las bases neurobiológicas que sustentan a este proceso, evidencia previa sugiere que el área motora suplementaria (AMS), pre-suplementaria (pre-AMS) y el putamen dorsolateral, elementos del circuito cortico-ganglios basales-tálamo-corteza motor (CGBTCm), están involucrados en el procesamiento de intervalos ejecutados en las tareas de producción rítmica (Gamez et al., 2019). Sin embargo, no ha sido descrito cómo es que el entrenamiento intensivo en estas tareas, a lo largo del tiempo, modifican al circuito CGBTCm. Dos monos rhesus machos, sin previa exposición a alguna tarea cognitiva, fueron entrenados en una tarea de tiempo de reacción (TCTR) y en una tarea de sincronización a un metrónomo visual (TSMv) y auditivo (TSMa). Imágenes de Resonancia Magnética (IRM). T1w, T2 e imágenes ponderadas a difusión (DWI) fueron obtenidas antes, durante y después del entrenamiento en cinco condiciones: agua libre, restricción de agua, entrenamiento en una tarea control de tiempo de reacción, fase de descanso y entrenamiento en la TSM visual y auditivo. Los sujetos se lograron sincronizar a estos intervalos con asincronías cercanas a cero. El tiempo promedio de entrenamiento por sujeto, fue de 14 meses y tal como ha sido descrito previamente, los PNH muestran mayor habilidad de sincronización para tareas con metrónomos visuales. 16 grupos de imágenes por sujeto fueron colectadas a lo largo de 17 meses. Derivado de la novedosa aproximación metodológica empleada, haciendo uso de IRM de PNH, tres algoritmos de procesamiento y análisis de IRM fueron desarrollados PREEMACS–Cross, PREEMACS– long y PREEMACS evaluación Sustancia Blanca Superficial (SBS). PREEMACS, a través de 3 módulos estandarizó, el preprocesamiento de imágenes IRM ponderadas en T1 y T2, obteniendo una extracción y reconstrucción automática de la superficie del cerebro del mono Rhesus, que permitió evaluar con precisión el grosor cortical. Asimismo, con el objetivo de desarrollar y estandarizar PREEMACS SBS, así como probar su sensibilidad para describir la variabilidad neuroanatómica asociada al fenómeno conductual evaluado, se desarrolló esta método que permitió la caracterización de las propiedades de las fibras en U. Para lo anterior, 32 sujetos humanos posterior a la adquisición de IMR (T1w, T2 y DWI) realizaron una TSMa y TSMv, con estímulos isócronos en un rango de entre 550 a 950 ms, esta tarea fue homologa a la empleada en los PNH. El análisis mostró que las diferencias que los sujetos presentaron en la precisión del desempeño en la TSMa se asociaron con mayor densidad y mayor diámetro de las fibras en U por debajo de áreas que integran al circuito audio-motor derecho. Además, se encontró una asociación significativa entre las asincronías absolutas, la densidad y el diámetro del cuerpo calloso, formando un mapa selectivo de intervalos donde los intervalos cortos y largos se correlacionaron conductualmente con las porciones anterior y posterior del cuerpo calloso. Estos hallazgos sugieren que las propiedades estructurales de la SBS en el sistema audiomotor respaldan las capacidades de sincronización del tap de los sujetos, ya que la densidad de fibras en U está vinculada al ritmo del tap preferido y las propiedades del cuerpo calloso definen una topografía selectiva de intervalos. Con respecto a los cambios neuroanatómicos asociados al entrenamiento, derivado de un problema de poder estadístico, vinculado al tamaño de la muestra, no fue posible caracterizar dichos cambios. Por lo que, para poder darle respuesta a la hipótesis planteada en este trabajo, es necesario ampliar la muestra, así como implementar novedosos métodos de análisis multivariados para el análisis de IMR adquiridos de forma longitudinal. Palabras clave: sistema audiomotor, sincronización de sensoriomotora, sustancia blanca superficial. 12 Abstract Time is a physical property that we perceive constantly. Time estimation on the millisecond scale is relevant because it is where processes such as language comprehension and production, music and dance appreciation and execution, and the interception of moving targets or collision avoidance, are executed (Merchant et al., 2014). Regarding the neurobiological bases that support this process, previous evidence suggests that the supplementary motor area (SMA), pre-supplementary (pre-SMA) and the dorsolateral putamen, elements of the cortico-basal ganglia-thalamus-motor cortex (CGBTCm) circuit, are involved in the processing of intervals executed in rhythmic production tasks (Gamez et al., 2019). However, it has not been described how intensive training in these tasks, over time, modifies the CGBTCm circuit. Two male rhesus monkeys, naive to any cognitive task, were trained on a reaction time task (RTT) and a synchronization task to a visual (vSMT) and auditory (aSMT). Magnetic resonance imaging (MRI), T1w, T2, and diffusion-weighted images (DWI) were obtained before, during, and after training under five conditions: free water, water restriction, training on a reaction time control task, rest phase, and training on the visual and auditory SMT. Subjects were able to synchronize to these intervals with near-zero asynchronies. The average training time per subject was 14 months, and as previously described, NHPs show greater synchronization ability for tasks with visual metronomes. Sixteen sets of images per subject were collected over 17 months. Derived from the novel methodological approach employed, using PNH MRI, three MRI processing and analysis algorithms were developed: PREEMACS–Cross, PREEMACS–long, and PREEMACS Superficial White Matter (SBS) assessment. PREEMACS, through 3 modules, standardized the preprocessing of T1 and T2 weighted MRI images, obtaining an automatic extraction and reconstruction of the surface of the Rhesus monkey brain, which allows the assess cortical thickness accurately. To develop, standardize PREEMACS SBS and test the sensitivity of the proposed method to describe the neuroanatomical variability associated with the evaluated behavioral phenomenon, a method was developed to characterize the properties of the U-fibers. For this purpose, 32 human subjects, after the acquisition of MRI (T1w, T2 and DWI), performed a vSMT and aSMT, with isochronous stimuli in a range of 550 to 950 ms, homologous to that used in the PNH. The analysis showed that the differences that the subjects presented in the precision of the aSMT performance were associated with a higher fiber density and a larger diameter of the U-fibers below areas that integrate the right audio-motor circuit. In addition, a significant association was found between the absolute asynchronies, density, and diameter of the corpus callosum, forming a selective interval map where short and long intervals were behaviorally correlated with the anterior and posterior portions of the corpus callosum. These findings suggest that the structural properties of the SBS in the audiomotor system support the subjects' tap synchronization abilities since the density of U-fibers is linked to the preferred tap rhythm and the properties of the corpus callosum define an interval-selective topography. Regarding the neuroanatomical changes associated with training, due to a problem of statistical power, linked to the sample size, it was not possible to characterize these changes. Therefore, in order to answer the hypothesis raised in this work, it is necessary to enlarge the sample. Keywords: audiomotor system, sensorimotor synchronization, superficial white matter. 13 Introducción El tiempo es una propiedad física que percibimos de forma constante. Acompaña a la información que se recibe de cualquier tipo de estímulo al que se está expuesto y es una propiedad esencial para la ejecución coordinada de las acciones motoras que se llevan a cabo (Zarco, Merchant y Mendez, 2009). La estimación del tiempo es un proceso cognitivo que no está ligado exclusivamente a una modalidad sensorial y, de hecho, el ser humano tiene una capacidad extraordinaria para estimar el tiempo y realizar acciones motoras con una precisión temporal muy alta. A pesar de la importancia que tiene el tiempo en la conducta, poco se sabe acerca de las bases neurofisiológicas de la cuantificación temporal. Para la evaluación de la estimación temporal en la escala de milisegundos, el proceso de sincronización sensoriomotora (SMS) es fundamental para explorar cómo los individuos coordinan sus movimientos con los estímulos rítmicos externos. Esta coordinación es esencial no solo en contextos musicales, sino también en diversas interacciones sociales y tareas cognitivas. Por ejemplo, permite predecir eventos y coordinar acciones en interacciones sociales, permitiendo a los individuos alinear sus movimientos con los de los demás, lo que es crucial en actividades como la creación musical y la danza. La relevancia de la investigación sobre SMS abarca varios dominios, incluidos el envejecimiento, los trastornos neurocognitivos y la interacción de las modalidades auditivas y visuales en las tareas de sincronización. Con relación a las bases neurales de la percepción tiempo y la sincronización sensoriomotora estudios con neuroimagen funcional consistentemente han descrito la participación de estructuras cerebrales específicas en tareas tanto de percepción como de producción de intervalos temporales. Entre las estructuras que participan en estos paradigmas están: el núcleo caudado, el putamén, el área motora suplementaria (AMS) y el área motora pre-suplementaria (preAMS), la corteza prefrontal, y la corteza parietal (Coull et al., 2010; Grahn et al., 2009; Hoeschele et al., 2015; Merchant et al., 2014; Palomar- García et al., 2016; Zatorre et al., 2007). Todas estas estructuras interconectadas constituyen el circuito corteza-ganglios basales-tálamo-corteza motor (CGBTCm) (Ammirante et al., 2016; Goel et al., 2014; Honing et al., 2012; Meck, 1996, 2005; Mendoza 14 et al., 2014; Merchant et al., 2013; Merchant et al., 2013; Patel et al., 2014; Wiener et al., 2010; Zarco et al., 2009). Sin embargo, no ha sido descrito cómo es que el entrenamiento intensivo en estas tareas a lo largo del tiempo modifica al circuito CGBTCm. Por lo tanto, la pregunta de investigación a la que respondió el presente proyecto fue: ¿Cuál será el efecto del entrenamiento intensivo en la Tarea de Sincronización a un Metrónomo (TSM) sobre el grosor cortical del AMS y sobre la sustancia blanca yuxtacortical y profunda, que conecta al AMS y al putamén dorsolateral? Para responder la anterior pregunta, se empleó un estudio longitudinal, que consistió en entrenar a dos monos machos (Macaca Mulatta), sin previa exposición a alguna tarea cognitiva, en una tarea de tiempo de reacción y en una tarea de sincronización a un metrónomo visual y auditivo. Imágenes de Resonancia Magnética (IRM) fueron obtenidas antes, durante y después del entrenamiento en cinco condiciones: agua libre, restricción de agua, entrenamiento en una tarea control de tiempo de reacción, fase de descanso y entrenamiento en la TSM visual y auditivo. Con el objetivo de realizar una descripción de los cambios neuroanatómicos asociados al aprendizaje durante el entrenamiento de ambas tareas, cuatro experimentos fueron desarrollados. Experimento 1. Inició con la fase de pre-entrenamiento en la cual se desarrollaron y estandarizaron protocolos de adquisición de IRM estructural de alta resolución (T1w, T2, FLAIR y DWI) de PNH. Posteriormente el efecto de variabilidad en las IRM, generado por los niveles de hidratación y la posición de los sujetos dentro del resonador, fueron evaluados. En la segunda fase del experimento 1, se realizó el entrenamiento de los sujetos en dos tareas: una tarea control de tiempo de reacción con un estímulo visual, la cual carecía de estructura isócrona y en una TSM en dos modalidades sensoriales, visual y auditivo. Durante esta fase, de forma longitudinal, IRM antes, durante y post entrenamiento fueron adquiridas. Los pasos ejecutados en la fase de pre-entrenamiento y entrenamiento integran al experimento 1. Derivado de la novedad del proyecto en el campo de la IRM de PNH, varios métodos de procesamiento y análisis de imágenes fueron desarrollados, en un segundo y tercer y cuarto experimento. 15 En el experimento 2 (Figura 5. Panel C), se desarrolló e implemento “PREEMACS. Pipeline for Preprocessing and Extraction of the Macaque Brain Surface” (García-Saldivar, P., et al. 2021), flujo de trabajo que ejecuta de forma automatizada: el preprocesamiento de IRM de PNH, el análisis de calidad de las IRM, la generación de superficies corticales, así como la estimación de grosor cortical basado en superficie. Dado que el análisis de imágenes longitudinales en RM requiere realizar un análisis sin sesgo con respecto a cualquier punto temporal de las imágenes adquiridas de forma longitudinal, se desarrolló “PREEMACS Long” una adaptación para IRM de PNH del flujo de procesamiento PREEMACS y FreeSurfer longitudinal (Reuter et al., 2012) empleado para el análisis de IRM de sujetos humanos. Experimento 3. En un experimento paralelo al experimento principal de la presente tesis, se estudió si las habilidades de sincronización rítmica (evaluadas a través de una Tarea de tapping de Sincronización-Continuación) se asocian con diferencias individuales en la densidad de las fibras U (parte sustancia blanca superficial) en el sistema audiomotor, así como con propiedades de estructuras de la sustancia blanca profunda, en sujetos humanos. Este experimento tuvo que ser desarrollado por dos motivos: obtener mayor información que permitiera evaluar los posibles fascículos de la sustancia blanca profunda asociados a la habilidad de predicción rítmica, y con ello obtener información que guiará la búsqueda de posibles fascículos asociados a modificaciones estructurales durante el entrenamiento de la tarea de los sujetos (PNH), toda vez que, de encontrar cambios globales en las propiedades de la sustancia blanca asociadas al entrenamiento, no se podría diferenciar si alguno de ellos se asociaría directamente con la sincronización rítmica. El segundo motivo, se vinculó con el desarrollo de un método de procesamiento y análisis de DWI, que permitiera el estudio de las propiedades de la sustancia blanca superficial y la evaluación de la sensibilidad de este método para identificar diferencias en las propiedades de la SBS en humanos, asociadas a la sincronización sensoriomotora, y posteriormente implementar este método en las imágenes de DWI de los primates no humanos, teniendo evidencia de la validez del método. Para lo anterior, 32 sujetos humanos posterior a la adquisición de IMR (T1w, T2 y DWI) realizaron una TSMa y TSMv, con estímulos isócronos en un rango de entre 550 a 950 ms, esta tarea fue homologa a la empleada en los PNH. El análisis mostró que las diferencias que los sujetos presentaron en la precisión del desempeño TSMa se asociaron con mayor densidad de fibras y mayor diámetro de las fibras en U por debajo de áreas que integran al circuito audio-motor derecho. Además, se encontró una asociación significativa entre las asincronías absolutas, la densidad y el diámetro del cuerpo calloso, 16 formando un mapa selectivo de intervalos donde los intervalos cortos y largos se correlacionaron conductualmente con las porciones anterior y posterior del cuerpo calloso. Experimento 4. Finalmente, con las herramientas desarrolladas en los experimentos previos, se realizaron los análisis estadísticos de las IRM adquiridas antes, durante y después del entrenamiento. Se espera que el entrenamiento intensivo en la TSM tendrá un efecto sobre el aprendizaje, el cual a nivel neuroanatómico generará: cambios en el grosor cortical de diversas cortezas cerebrales, entre ellas la del AMS, así como cambios en las propiedades de la microestructura de la sustancia blanca profunda y yuxtacortical que conectan al CBGTCm. 17 Antecedentes Estudios de psicofísica: un acercamiento al estudio de la cuantificación del tiempo. Tareas de sincronización sensoriomotora han sido diseñadas para poder evaluar la cuantificación del tiempo. La sincronización sensoriomotora es definida como la coordinación de movimientos rítmicos con un ritmo externo (Repp et al., 2013). Este complejo proceso puede observarse en diferentes modalidades sensoriales: auditiva (Janata et al., 2003; Provasi et al., 2014; Zarco et al., 2009; Zatorre et al., 2007), visual (Gan et al., 2015; Gygi, et al., 2015; Zarco et al., 2009) y táctil (Ammirante et al., 2016; Giordano et al., 2015). Para que la sincronización motora a estímulos sensoriales pueda llevase a cabo, la estimación y cuantificación precisa del tiempo es necesaria. Estas habilidades corresponden a un proceso cognitivo que permite ejecutar de forma coordinada procesos conductuales complejos en la escala de milisegundos, tales como: la comprensión y producción del lenguaje, la apreciación y ejecución de la música y danza, así como la intercepción de blancos en movimiento o la evasión de un choque (Merchant et al., 2014). Para comprender la regulación temporal en la ejecución rítmica de movimientos voluntarios, la tarea de sincronización a un metrónomo ha sido propuesta. Esta tarea consta de dos fases: durante la fase de sincronización se presentan estímulos visuales o auditivos al sujeto en intervalos regulares, mientras éste debe presionar un botón de manera intermitente siguiendo los estímulos presentados; en la fase de continuación el sujeto debe continuar presionando el botón de manera intermitente siguiendo el mismo intervalo de tiempo, pero sin la presencia de los estímulos sensoriales. La naturaleza cíclica de esta tarea implica que los sujetos deben realizar un seguimiento del tiempo transcurrido desde los eventos sensoriales y motores previos, hasta el tiempo que resta a los próximos eventos (Merchant et al., 2013; Zarco et al., 2009) Los datos obtenidos a partir de estos ensayos reflejan una característica intrínseca del procesamiento temporal: la propiedad escalar. Típicamente, las respuestas de un participante en una tarea de producción de intervalos siguen una distribución normal alrededor del intervalo a medir. Se le llama “propiedad escalar” al hecho de que la dispersión 18 de esta distribución es proporcional a la duración del intervalo estándar (Merchant et al., 2013; Buhusi et al., 2005). Otro parámetro importante que proporciona esta tarea son las asincronías que corresponden a la diferencia entre el tiempo del tap (contacto de mano o dedo con una superficie) y la presentación del estímulo (Repp et al., 2013). En humanos, las asincronías generalmente presentan valores negativos, (Blecher et al., 2016; Zarco et al., 2009) y estos son menos variables con estímulos auditivos que con estímulos visuales temporalmente equivalentes (por ejemplo, un metrónomo auditivo con tonos vs un estímulo visual que parpadea de forma isócrona) (Iversen et al., 2015), independientemente del entrenamiento musical de los participantes (Hove et al., 2013; Repp et al., 2013; Repp, 2005). Aunque el entrenamiento musical es más relevante para la sincronización sensoriomotora con estímulos auditivos, Krause y colaboradores (2010) encontraron que los bateristas y los pianistas profesionales eran significativamente menos variables que los no músicos al tocar con el estímulo visual. Sin embargo, recientemente se ha demostrado que la sincronización visomotora mejora sustancialmente con estímulos móviles, como por ejemplo con una pelota que rebota continuamente (Gan et al., 2015; Iversen et al., 2015). Estas y otras observaciones soportan la hipótesis de que en humanos, el sistema audiomotor está especialmente relacionado con el procesamiento temporal de la información, en tanto que el procesamiento visomotor con el procesamiento de las relaciones espaciales (Iversen et al., 2015; Mendoza et al., 2014). Con respecto a los modelos empleados para el estudio del procesamiento temporal en la escala de los milisegundos y la sincronización sesoriomotora, Zarco y colaboradores (2009) presentaron datos que sugieren que el mono Rhesus es un óptimo modelo animal para estudiar la producción de intervalos temporales. El trabajo de Zarco y colaboradores comparó la variabilidad en la ejecución de tareas de producción de intervalos múltiples y únicos definidos por estímulos visuales o auditivos, en sujetos humanos y macacos. Los resultados mostraron que en las dos especies la variabilidad en el procesamiento temporal incrementa en función de intervalo medido, siguiendo la propiedad escalar. Además, se observó que la variabilidad en el procesamiento temporal fue similar en ambas especies cuando los sujetos producen un intervalo único o varios intervalos sincronizados con un estímulo isócrono. Es importante resaltar que se ha descrito que los monos cuantifican la duración de las pausas entre movimientos y no la cinemática de los movimientos para oprimir el botón (Donnet et al., 2014). Esta observación sugiere que los monos, al igual que los sujetos humanos, midieron explícitamente el paso del tiempo. Sin embargo, dos diferencias importantes entre la ejecución de los seres humanos y de los monos fue 19 observada: por un lado, una marcada deficiencia para producir intervalos internamente temporalizados, en relación con los seres humanos (Zarco et al., 2009) y por otro, una incapacidad de los macacos para producir asincronías negativas: el movimiento rara vez precedió a la presentación del estímulo. De hecho, los movimientos ocurrieron ~250 ms después de cada presentación del estímulo (Mendoza et al., 2014; Zarco et al., 2009). Estudios posteriores mostraron que a través de diferentes estrategias de entrenamiento las asincronías pueden reducirse hasta ~100 ms (Merchant et al., 2014). Estos resultados sugieren que el mono es un óptimo modelo animal para estudiar procesamiento temporal complejo, pero también indican que los macacos no incluyen en su repertorio natural de conductas, la producción de movimientos repetitivos que deben ser estrictamente temporalizados utilizando un posible reloj interno (Merchant et al., 2014; Honing et al., 2014). Basados en estos hallazgos se ha propuesto una hipótesis gradual de evolución audiomotora (Mendoza et al., 2014; Merchant et al., 2014). Esta hipótesis sugiere que el entrenamiento rítmico se desarrolló gradualmente en primates, alcanzando su pico máximo en humanos; así, sólo rasgos limitados del entrenamiento rítmico están presentes en primates no humanos, mientras que el tiempo dividido en intervalos es compartido entre humanos y todos los primates no humanos (Mendoza et al., 2014). Por tanto, esta hipótesis responde al hecho de que la ejecución de los monos Rhesus es comparable con la de los humanos en tareas de un solo intervalo, tales como en las de reproducción de un intervalo pero difiere en el entrenamiento rítmico (Zarco et al., 2009) . Bases neurales del procesamiento temporal en la escala de los milisegundos Con relación a las bases neurales de la percepción del tiempo y la sincronización sensoriomotora, estudios con neuroimagen funcional consistentemente han descrito la participación de estructuras cerebrales específicas en tareas tanto de percepción como de producción de intervalos temporales en la escala de los milisegundos. Entre las estructuras que participan en estos paradigmas están: el núcleo caudado, el putamén, el área motora suplementaria (AMS) y el área motora pre-suplementaria (preAMS), la corteza prefrontal, y la corteza parietal (Coull et al., 2010; Grahn et al., 2009; Hoeschele et al., 2015; Merchant et al., 2014; Palomar-García et al., 2016; Zatorre et al., 2007). Todas estas estructuras 20 interconectadas constituyen el circuito corteza-ganglios basales-tálamo-corteza motor (CGBTC) (Ammirante et al., 2016; Goel et al., 2014; Honing et al., 2012; Meck et al., 1996, 2005; Mendoza et al., 2014; Merchant et al., 2013; Merchant et al., 2013; Patel et al., 2014; Wiener et al., 2010; Zarco et al., 2009). Estudios de resonancia magnética funcional (fIRM) han demostrado que el CGBTC está involucrado en la conducta rítmica (por ejemplo, en la danza o en la ejecución musical), donde el CGBTC tiene participación no sólo durante la producción musical y el entrenamiento rítmico, si no también durante la percepción rítmica (Coull et al., 2010; Grahn et al., 2009; Hoeschele et al., 2015). Por ejemplo, en un estudio de resonancia magnética funcional (fIRM) se le presentó a sujetos humanos un intervalo estándar (1200ms) delimitado por 2 marcadores auditivos seguido de una pausa de duración fija (1000ms), y después de la pausa, un segundo intervalo de comparación de duración distinta al estándar. Este diseño, así como la implementación de controles adecuados (discriminación del tono de los marcadores auditivos, por un lado y responder después de escuchar 4 marcadores auditivos sin otro requerimiento) permitió relacionar la señal de resonancia magnética a eventos particulares del procesamiento de información temporal; por un lado la instancia de codificación de la duración del intervalo, y por otro lado la etapa de comparación-decisión-implementación de la respuesta (Wiener et al., 2010; Rao et al., 2001). Los resultados de dicho trabajo indicaron una disociación de las etapas de procesamiento mencionadas. Para la etapa de codificación de la duración se encontró una mayor participación del putamén, la cabeza del núcleo caudado y los núcleos centro-medial y ventral-anterior del tálamo. A nivel cortical, se encontró una mayor participación del surco intraparietal, el área premotora dorsal, el área motora presuplementaria (AMS), la corteza premotora ventral y el giro temporal medio. En cambio, en la etapa de decisión se encontró una mayor señal BOLD (imagen de contraste dependiente del nivel de oxígeno en la sangre, en inglés Blood-oxygen-level dependent contrast imaging) en la corteza prefrontal dorsolateral derecha y el vermis posterior del cerebelo (Macar et al., 2002). Estas áreas, que establecen conexiones recíprocas entre sí, forman un circuito de cuantificación de información temporal que está compuesto principalmente por el circuito CGBTC. Estudios de neurofisiología en primates no humanos han puesto énfasis en el registro de la actividad neuronal del AMS y la preAMS. Por ejemplo, Merchant y colaboradores entrenaron a dos primates no-humanos (Macaca Mulatta) en un paradigma de producción de múltiples 21 intervalos de tiempo, denominado tarea de sincronización-continuación. En este paradigma los animales debían presionar un botón sincronizándose a estímulos separados por un intervalo específico (fase de sincronización), y al terminar la serie de estímulos, los monos debían seguir presionando el botón manteniendo la misma temporalidad sin el beneficio de la guía sensorial (fase de continuación). Adicionalmente, se utilizó como control una tarea de tiempo de reacción (TCTR) similar a la tarea previa, pero con estímulos separados por intervalos aleatorios, impidiendo así la temporalización del movimiento. Los resultados del registro de la actividad neuronal unitaria en el AMS y la preAMS durante la ejecución de la tarea temporal revelaron que diferentes poblaciones neuronales codifican diversos aspectos del paso del tiempo, sin que mostraran respuestas claras en la tarea control TCTR. Una población neuronal representó el tiempo desde el último movimiento (tiempo absoluto) y la otra el tiempo restante para el siguiente movimiento (tiempo relativo). Las neuronas de tiempo absoluto incrementaron su tasa de disparo instantánea con una pendiente constante para los diferentes intervalos blanco, mientras que las neuronas de tiempo relativo tuvieron una pendiente inversamente proporcional al intervalo blanco (Merchant et al., 2011). Por otro lado, otro estudio describió que alrededor del 30% de las neuronas de la AMS y el putamén están sintonizadas a la duración de los intervalos producidos, es decir, muestran un cambio en su tasa de disparo en función del intervalo con una respuesta máxima en el intervalo preferente (Bartolo et al., 2014; Merchant et al., 2013). Asimismo, estos estudios describieron que la mayoría de las neuronas sintonizadas a la duración, también mostraron preferencia por uno de los elementos secuenciales de la producción de múltiples intervalos. Además, de que las neuronas en las áreas motoras suplementarias (AMS) están sintonizadas con la duración del tempo del tapping (Merchant et al., 2014, 2013b), también se ha descrito que esta sintonización da lugar a circuitos de intervalos específicos que definen un mapa cronotópico en las áreas premotoras mediales, con intervalos preferidos cortos en la región anterior e intervalos preferidos largos en la porción posterior de dichas áreas (Protopapa et al., 2019; Merchant et al., 2024). Concluyendo, estudios neurofisiológicos y de neuroimagen permiten establecer una correlación entre diferentes estructuras y las etapas de procesamiento de información temporal. Se ha observado que algunas estructuras, entre las que destacan el AMS, preAMS y los ganglios basales, participan consistentemente en diferentes tareas de cuantificación de intervalos de tiempo aun cuando se utilizan diferentes tipos de estímulos para delimitar las duraciones. 22 Sin embargo, a pesar de la sólida evidencia de la participación del AMS y putamén durante la ejecución de tareas de estimación temporal y sincronización sensoriomotora, no se ha estudiado la conectividad estructural entre dichas áreas y su relación con la ejecución de estas tareas, ni cómo es que estas áreas se modifican durante el entrenamiento de tareas de producción rítmica, ni en humanos o en algún modelo experimental. Conectividad estructural en el circuito corteza- ganglios basales- tálamo- corteza motor Empleando la técnica de trazadores neuronales anterógrados Schmahmann y Pandya (2006), describieron las proyecciones axonales de grupos neuronales de diferentes áreas de la corteza cerebral en monos Rhesus, entre ellas las de las cortezas motoras primarias y secundarias. En este caso los autores emplearon la técnica de isótopos radiomarcados, en donde aminoácidos radiomarcados (leucina tritiada y prolina) se inyectan en una región específica del cerebro, estos aminoácidos forman proteínas dentro de las neuronas en el lugar de la inyección y posteriormente son transportadas anterógradamente (desde el cuerpo celular hasta las terminales de los axones) mediante transporte axonal (Saleeba et al., 2019; Lanciego, et al., 2011). Los axones marcados y sus proyecciones terminales se pueden visualizar mediante el procedimiento de autorradiografía, donde las secciones del cerebro se recubren con una emulsión fotográfica y se revelan para producir granos de plata negros que revelan las vías neuronales marcadas (Schmahmann et al., 2006) (Figura 1B). Esta técnica permite identificar los patrones de proyección de las neuronas que se originan en el lugar de la inyección, proporcionando información detallada sobre la conectividad anatómica de los circuitos neuronales (Lanciego, et al., 2011). Como puede observarse en la Figura 1C, las neuronas ubicadas en el área 4 (representación motora de la mano), proyectan al putamen dorsolateral a través de las fibras estriatales que se unen a la capsula externa y extrema (Schmahmann et al., 2006). 23 Figura 1. Inyección de trazadores neuronales anterógrados en la corteza motora primaria de mono Rhesus. A. Representación esquemática del sitio de inyección en el área 4 (área delimitada con color negro), localizada en el giro precentral posterior al surco arqueado. Esta área corresponde a la representación motora de la mano del sujeto. La línea marca el corte observado en B y C. B. Fotomicrografía en corte coronal que muestra el sitio de inyección, así como las proyecciones axonales de las neuronas del área 4. C. Representación esquemática de las trayectorias resultantes de las fibras de asociación cortical, comisurales y subcorticales (líneas discontinuas y puntos). Asimismo, se muestra la nomenclatura de la sustancia blanca, así como las terminaciones en áreas subcorticales. Modificado de Schmahmann et al., 2006. Se ha descrito que la capsula externa es un sistema de fibras estrictamente corticoestriatales, originada por neuronas ubicadas en las cortezas: prefrontales ventral y medial, premotora ventral, asi como en el giro precentral, entre otras. Estas fibras terminan de forma topografica, principalmente en el putamen, asi como en el núcleo caudado. Asimismo, existe evidencia de que las proyecciones de la cápsula externa provienen de la corteza motora primaria y se dirigen exclusivamente al putamen, mientras que aquellas del área motora suplementaria terminan en el núcleo caudado y en el putamen (Borra et al., 2021). Evidencia que tambien ha sido corroborada con la inyección de trazadores neuronales retrogrados (Borra et al., 2021). Con respecto a las proyecciones de los axones de las neuronas ubicadas en el AMS, los datos indican que las fibras que proyectan al putamen dorsal y lateral provenientes del AMS constituyen parte de la capsula externa (Schmahmann et al., 2006). Por lo anterior, las proyecciones de AMS y de M1 convergen en zonas especificas del putamen, formando parte de la capsula externa (Borra et al., 2021). A B C 24 Figura 2. Representación esquemática de inyección de trazadores neuronales en la corteza motora suplementaria del mono Rhesus. Modificado de Schmahmann et al., 2006. Con base en la información anterior, podemos hipotetizar que durante el entrenamiento en la TSM una de las estructuras de sustancia blanca que probablemente mayor modificación microestructural presentará, será la capsula externa ipsilateral, toda vez que esta estructura comunica a las estructuras que previamente estudios de registros neuronales (AMS, M1 y putamén dorsolateral) se han descrito, participan en la estimación temporal y seguimiento de ritmos (Merchant et al., 2013). Cambios neuronales estructurales asociados al entrenamiento El efecto del aprendizaje derivado del entrenamiento constante sobre las redes neuronales ha evidenciado que, como respuesta a la experiencia, el cerebro es capaz de modificarse a través de varios niveles que van desde la sinaptogénesis y la reconfiguración de redes neurales locales, hasta cambios morfológicos extensos (derivados probablemente de la arborización de los axones y dendritas, la cantidad de volumen de células gliales y la angiogénesis) que se ven reflejados a nivel macroscópico como cambios en el grosor cortical, los cuales pueden ser evaluados a través de técnicas de neuroimagen no invasivas (Herholz et al., 2012). Uno de los primeros estudios en utilizar estas técnicas en humanos A B C 25 demostró un aumento del volumen de la corteza visual (particularmente en MT y V5, regiones involucradas en el seguimiento de movimientos) en individuos que aprendieron a hacer malabares durante 3 meses (Draganski et al., 2004), aunque estos cambios son visibles con tan solo una semana de entrenamiento (Driemeyer et al., 2008). Otros estudios han proporcionado evidencia de que el entrenamiento en tareas cognitivas y motoras induce cambios sobre el grosor cortical (Calmels, 2020), una de las métricas empleadas para evaluar la anatomía macroscópica del encéfalo. El grosor cortical ha sido definido como la distancia entre el límite de la sustancia blanca y la superficie pial en milímetros (Kharabian et al., 2020; Fischl et al., 1999). Esta métrica puede ser evaluada a través de la reconstrucción de la superficie pial y la superficie de sustancia blanca, empleando imágenes de resonancia magnética estructural (Fischl, 2012). De igual forma, la sustancia blanca se ve modificada en respuesta a la experiencia y el aprendizaje. La microarquitectura de los fascículos de sustancia blanca que interconectan regiones remotas de la corteza cerebral puede ser estudiada mediante imágenes sensibles a la difusión del agua. Estas técnicas explotan el hecho de que en un intervalo de tiempo corto (~50 ms) las moléculas de agua que se difunden en el medio interaccionan varias veces con las membranas del tejido que habitan, lo que modula las trayectorias promedio que logran en dicho intervalo (Beaulieu, 2002). Así, es posible utilizar este fenómeno para estudiar un efecto microscópico a escalas macroscópicas (Concha, 2013), y además poder reconstruir las trayectorias tridimensionales de los tractos mediante tractografía (Mori et al., 2002). En un experimento similar con sujetos que aprendieron a realizar malabares, se demostró que la sustancia blanca subyacente a las regiones visuales antes reportadas aumenta su coherencia en respuesta al aprendizaje (Scholz et al., 2009), lo que puede corresponder a un aumento en la cantidad de mielina, el aumento del calibre de los axones o la densidad de estos (Concha et al., 2010). Este fenómeno se ha visto replicado mediante otros paradigmas de aprendizaje y memoria, y los cambios micro-arquitectónicos no están limitados a la sustancia blanca. En otro estudio (Sagi, et al., 2012) se demostró que la difusión promedio del hipocampo disminuye después del aprendizaje de tareas visuo- espaciales, tanto en humanos como en roedores y, al menos en el caso de la especie inferior, es debido a un aumento de vesículas sinápticas y procesos astrocíticos. Estos estudios demuestran el enorme potencial de la imagenología por resonancia magnética, particularmente de las imágenes sensibles a la difusión del agua, para identificar cambios microscópicos inducidos por aprendizaje. 26 Propiedades de la sustancia blanca y su asociación con la ejecución de tareas de sincronización sensoriomotora Con respecto a la participación de las propiedades de la sustancia blanca dentro del proceso de estimación temporal en la escala de ms, un estudio de análisis de imágenes de difusión por resonancia magnética indago la relación entre las conexiones fronto- temporales, callosas y la ejecución en una tarea de sincronización rítmica a un metrónomo auditivo en humanos, describiendo correlaciones significativas entre las asincronías de los sujetos y la anisotropía fraccional del fascículo arqueado izquierdo y del segmento temporal del cuerpo calloso, en donde mayor precisión temporal de los sujetos se correlacionó con mejores propiedades de la sustancia blanca, proponiendo que las habilidades de sincronización audiomotora están asociadas con vías anatómicas específicas que se asocian con otros procesos cognitivos que también requieren de la sincronización motora, tales como el lenguaje (Blecher, et al., 2016). Siendo este el único experimento reportado, hasta donde se conoce, en donde se ha evaluado el desempeño en tareas de sincronización sensoriomotora (SMS) y las características microestructurales de la sustancia blanca profunda. Nomenclatura y análisis de las propiedades de la sustancia blanca La integración funcional de las subunidades cerebrales está mediada en parte por la sustancia blanca (Neubert et al., 2010), ésta comprende una amplia red de conexiones entre poblaciones neuronales y se ha demostrado que muestra cambios en respuesta a procesos fisiológicos. Para ello, el estudio de la organización de las fibras de sustancia blanca se ha dividido en dos grandes grupos: sustancia blanca profunda y superficial. Se estima que la sustancia blanca profunda (SBP) corresponde al 40 % del volumen total de SB y ha tenido mayor interés de estudio a diferencia de la SBS que presenta dificultades técnicas para poder diseccionarla virtualmente (Schilling et al., 2023). La sustancia blanca superficial (SBS) se define como la capa de sustancia blanca inmediatamente debajo de la corteza cerebral y está compuesta de fibras de asociación cortas que pueden conectar áreas corticales adyacentes (SBS entre giros) o correr a lo largo de la cresta de un giro (SB intra-giro) (Yoshino et al., 2024). Así, la conectividad de corto alcance se logra a través de fibras que corren tangencialmente a la superficie cortical y conectan regiones corticales adyacentes y proximales. Estas fibras se denominan fibras 27 en U debido a su forma (Yoshino et al., 2024; Schüz & Braitenberg 2002, Schmahmann 2009, Shastin 2022) (Figura 3. A y B). Las fibras en U representan la mayoría de las conexiones del cerebro humano (Shastin 2022; Schüz & Braitenberg 2002), ocupan hasta el 60 % del volumen total de la sustancia blanca (Schüz & Braitenberg 2002) y se encuentran entre las últimas áreas del cerebro en mielinizarse (Ouyang et al., 2017). Asimismo, contienen una alta densidad de neuronas intersticiales en relación con otras sustancias blancas (Zhang et al., 2014) (Figura 3 C y D). La SBS desempeña un papel fundamental en la función, la plasticidad, el desarrollo y el envejecimiento del cerebro, y se ve especialmente afectada en diferentes patologías (Schilling et al., 2023; Hong et al., 2019). A pesar de su prevalencia e importancia, la sustancia blanca superficial ha sido poco estudiada, en comparación con la sustancia blanca de largo alcance, que incluyen a las fibras de proyección y a las fibras comisurales del cerebro, debido a la complejidad que presenta su modelado. Figura 3. Sustancia blanca superficial y sistema de fibras en U. A. Imagen de resonancia magnética estructural de humano que ejemplifica la ubicación del sistema de fibras U (en un corte coronal a inicio del surco central) con un grosor promedio de entre 1 a 3 mm dependiendo de la ubicación. B Imagen de resonancia magnética de mono Rhesus en la que se observan giros y la ubicación del sistema de fibras en U (en un corte coronal a inicio del surco intraparietal) con un grosor promedio de entre 0.5 a 1 mm. C y D. Imágenes de microscopía que muestran el resultado de inmunohistoquímica para la tinción de mielina en el surco suprasilviano de hurón. La región marcada por el corte, muestra como la sustancia blanca superficial puede dividirse de la sustancia blanca 28 profunda debido a diferentes propiedades, entre ellas mayor porcentaje de mielinización. (C y D, modificadas de Yoshino et al., 2024). En el caso de los primates no humanos, específicamente en la especie Macaca Mulata, las fibras en U también han sido descritas con técnicas de resonancia magnética y con estudios de trazadores neuronales (Yoshino et al., 2024; Borges et al., 2015) (Figura 3 B). Asimismo, se ha identificado que las fibras en U tienen una organización y topología similar a la observada en humanos (Tusa et al., 2015), aunque la densidad en el cerebro del macaco se ha descrito, es menor (Zhang et al., 2014). Las imágenes de resonancia magnética ponderadas en difusión (DWI, por sus siglas en ingles, Diffusion-Weigthted images), proporcionan información sobre el movimiento de las moléculas de agua dentro de los tejidos (Van Hecke et al., 2016). Derivado del análisis de estas imágenes diversas métricas para evaluar las propiedades de la sustancia blanca han sido descritas, entre las más conocidas destaca la métrica de anisotropía fraccional (FA). Esta métrica describe que tan variable es la difusión en diferentes direcciones (Smith et al, 2015), tomando valores entre 0 y 1, en donde 0 hace referencia a una difusión isotrópica, es decir; que las moléculas de agua no tienen restricción o están igualmente restringidas y un valor de 1 implicaría que la difusión ocurre a lo largo de un eje y se encuentra restringida en todas las direcciones. Con respecto a las propiedades biológicas que evalúa, la métrica de FA se ha descrito que se correlaciona con la densidad de fibras, el diámetro axonal y la mielinización de la sustancia blanca (Van Hecke et al., 2016). Sin embargo, el método de tensor de difusión presenta un enorme problema vinculado a una limitación para poder identificar más de dos poblaciones de fibras en un mismo vóxel, lo que corresponde al ~90% del total de la sustancia blanca cerebral. Uno de los métodos propuestos para resolver este problema, es el modelo de deconvolución esférica restringida (CSD, Constrained Spherical Deconvolution), esto lo realiza estimando la distribución de orientación de las fibras, en cada voxel, a través de una representación denominada FOD (Fiber Orientation Distribution) (Figura 4 A), la cual representa poblaciones de fibras a través de lóbulos, por ejemplo, en la figura 4 A podemos observar un voxel con dos grupos de fibras. Si más de una población de fibras coexiste en un vóxel dado, la FOD se segmenta y se asigna una métrica de densidad de fibras (FD: fiber density) a cada población, 29 denominada fixel (elemento de fibra), haciendo posible obtener diversas métricas que describen las propiedades de las poblaciones de fibras de sustancia blanca. En este caso el modelo de CSD permite obtener tres métricas: Densidad de fibra (FD), FC diámetro del grupo de axones y FDC una combinación de la densidad y diámetro de la población (Figura 4B). La FD se deriva de la integral de los lóbulos de distribución de la orientación de las fibras (FOD) y es proporcional al volumen intraaxonal total, reflejando así la densidad de una población de fibras dentro de un vóxel (Rojas-Vite et al., 2019). FC es una métrica macroscópica del diámetro del haz de fibras (Figura 4B). Al proceso de análisis para obtener las anteriores métricas, se le denomina análisis basado en fixel (Fixel Based Analysis. FBA) y ha sido empleado principalmente para describir las propiedades de la sustancia blanca profunda (Dhollander et al., 2021). Figura 4. Análisis de las propiedades de la sustancia blanca, basado en fixeles. A. Distribución de orientación de las fibras, en un voxel, a través de una representación denominada FOD (Fiber Orientation Distribution), la cual representa poblaciones de fibras a través de lóbulos. En este caso dos grupos de fibras son representados. Si más de una población de fibras coexiste en un vóxel dado, la FOD se segmenta y se asigna una métrica de densidad de fibras (FD: fiber density) a cada población, denominada fixel (elemento de fibra). B. Métricas obtenidas del análisis basado en fixeles. Densidad de fibra (FD), FC diámetro del grupo de axones y FDC una combinación de la densidad y diámetro de la población. La FD es proporcional al volumen intraaxonal total, reflejando así la densidad de una población de fibras dentro de un vóxel (Rojas-Vite et al., 2019). FC es una métrica macroscópica del diámetro del haz de fibras. 30 Justificación del proyecto Planteamiento del problema 1 Se desconocen a profundidad las redes neuronales que participan en la estimación del tiempo transcurrido en la escala de los milisegundos. Evidencia previa sugiere que el AMS y el putamén dorsolateral, ambos elementos del circuito CGBTCm, están involucrados en el procesamiento de intervalos ejecutados en las tareas de producción rítmica (Gamez et al., 2019). Sin embargo, no ha sido descrito cómo es que el entrenamiento intensivo en estas tareas a lo largo del tiempo modifica al circuito CGBTCm. Por lo tanto, la pregunta de investigación a la que respondió el presente proyecto fue: ¿Cuál será el efecto del entrenamiento intensivo en la TSM sobre el grosor cortical del AMS y sobre la sustancia blanca yuxtacortical y profunda, que conecta al AMS y al putamén dorsolateral? Hipótesis El entrenamiento intensivo en la TSM tendrá un efecto sobre el aprendizaje, el cual a nivel neuroanatómico generará: cambios en el grosor cortical de diversas cortezas cerebrales, entre ellas la del AMS, así como cambios en las propiedades de la microestructura de la sustancia blanca profunda y yuxtacortical que conectan al circuito CBGTCm. Objetivo General Describir el efecto del entrenamiento intensivo en la TSM (antes, durante y posterior a éste) sobre el grosor cortical, sustancia blanca profunda y yuxtacortical, mediante el uso de técnicas de resonancia magnética estructural de alta resolución, así como el desarrollo de métodos de análisis de IRM de primates no humanos, que provean indicios novedosos de posibles cambios neuroanatómicos asociados al aprendizaje de nuevas tareas. Objetivos Específicos 1. Entrenar a dos monos Rhesus en una tarea control y una tarea de sincronización a un metrónomo en dos modalidades sensoriales visual y auditiva. 31 2. Desarrollar un protocolo de adquisición de IRM de alta resolución. 3. Desarrollar herramientas metodológicas para el análisis de grosor cortical longitudinal en IRM de primates no humanos. 4. Desarrollar herramientas metodológicas para el análisis de sustancia blanca yuxtacortical, primero en IRM de primates humanos y posteriormente en no humanos. 5. Evaluar el grosor cortical antes, durante y después del entrenamiento en una TSM bajo dos modalidades sensoriales. 6. Analizar los cambios estructurales de los fascículos que conectan al circuito CGBTCm, durante el entrenamiento de los sujetos experimentales en las tareas antes descritas. Planteamiento del problema 2 Se ha descrito que existe una asociación entre las propiedades de la sustancia blanca profunda y el desempeño de los sujetos humanos en tareas de sincronización audiomotora, proponiendo que ésta habilidad está asociada con vías anatómicas específicas que se asocian con otros procesos cognitivos que también requieren de la sincronización motora, tales como el lenguaje (Blecher, et al., 2016). No obstante, estos datos no han sido replicados, ni ha sido evaluado si existen diferencias interindividuales en las propiedades de la sustancia blanca superficial y profunda, asociadas a la sincronización rítmica audiomotora y visual a diferentes intervalos, en sujetos humanos. Por lo tanto, la pregunta a la que respondió el presente proyecto fue: ¿Existirá una asociación entre las habilidades de sincronización rítmica de sujetos humanos y las propiedades macro y microestructurales de su materia blanca superficial (SWM) y profunda (DWM)? Este segundo experimento, paralelo al experimento principal de la presente tesis, tuvo que ser desarrollado por dos motivos: obtener mayor información que permitiera evaluar los posibles fascículos de la sustancia blanca profunda asociados a la habilidad de predicción rítmica, y con ello obtener información que guiará la búsqueda de posibles fascículos asociados a modificaciones estructurales durante el entrenamiento de la tarea de los sujetos (PNH), toda vez que, de encontrar cambios globales en las propiedades de la sustancia blanca asociadas al entrenamiento, no se podría diferenciar si alguno de ellos se asociaría directamente con la sincronización rítmica. El segundo motivo, se vinculó con 32 el desarrollo de un método de procesamiento y análisis de DWI, que permitiera el estudio de las propiedades de la sustancia blanca superficial y la evaluación de la sensibilidad de este método para identificar diferencias en las propiedades de la SBS en humanos, asociadas a la sincronización sensoriomotora, y posteriormente implementar este método en las imágenes de DWI de los primates no humanos, teniendo evidencia de la validez del método. Es importante mencionar que, en ambos problemas de investigación, se empleó la misma tarea de sincronización a un metrónomo auditivo y visual, con un rango de intervalos isócrono similar de entre 550 a 950 ms. Hipótesis Las habilidades de sincronización rítmica (evaluadas a través de una Tarea de tapping de Sincronización-Continuación) se asociarán con diferencias individuales en la densidad de las fibras U (parte sustancia blanca superficial) en el sistema audiomotor, así como con propiedades de estructuras de la sustancia blanca profunda. Objetivo General Caracterizar la asociación entre las habilidades de sincronización rítmica (evaluadas a través de una Tarea de tapping de Sincronización-Continuación) y las diferencias individuales en la densidad de las fibras U, así como con la densidad y diámetro de los fascículos de la sustancia blanca profunda. Objetivos Específicos 1. Desarrollar e implementar un método para la evaluación de las propiedades microestructurales de la sustancia blanca yuxtacortical, superficial y sistema de fibras en U. Derivado de la inexistencia de un método que permitiera, diferenciar a la sustancia blanca superficial (y sus divisiones) de la sustancia blanca profunda. 2. Evaluar la sensibilidad del método para describir la variabilidad de las propiedades estructurales de la sustancia blanca superficial y su posible asociación con las métricas que evalúan la producción rítmica periódica, obtenidas de la ejecución de 33 una tarea clásica de tapping de sincronización-continuación, en dos modalidades: auditiva y visual. 3. Evaluar los posibles fascículos de la sustancia blanca profunda asociados a la habilidad de predicción rítmica. Toda vez que la única evidencia previa existente (Blecher et al., 2016), describe sólo la asociación de un fascículo (arqueado izquierdo), en una tarea de sincronización a sólo un intervalo temporal (493 ms) con un metrónomo auditivo. 34 Plan de trabajo El plan de trabajo se encuentra organizado en la Figura 5, como puede observarse para dar respuesta a las preguntas de investigación, 4 experimentos fueron desarrollados. Experimento 1. Inició con la fase de pre-entrenamiento en la cual se desarrollaron y estandarizaron protocolos de adquisición de IRM estructural de alta resolución (T1w, T2, FLAIR y DWI) de PNH. Posteriormente el efecto de variabilidad en las IRM, generado por los niveles de hidratación y la posición de los sujetos dentro del resonador, fueron evaluados. En la segunda fase del experimento 1, se realizó el entrenamiento de los sujetos en dos tareas: una tarea control de tiempo de reacción con un estímulo visual, la cual carecía de estructura isócrona y en una TSM en dos modalidades sensoriales, visual y auditiva. Durante esta fase, de forma longitudinal, IRM antes, durante y post entrenamiento fueron adquiridas. Los pasos ejecutados en la fase de pre-entrenamiento y entrenamiento integran al experimento 1 (Figura 5. Panel B). Derivado de la novedad del proyecto en el campo de la IRM de PNH, varios métodos de procesamiento y análisis de imágenes fueron desarrollados, en un segundo, tercer y cuarto experimento. En el experimento 2 (Figura 5. Panel C), se desarrolló e implemento “PREEMACS. Pipeline for Preprocessing and Extraction of the Macaque Brain Surface” (García-Saldivar, P., et al. 2021), flujo de trabajo que ejecuta de forma automatizada: el preprocesamiento de IRM de PNH, el análisis de calidad de las IRM, la generación de superficies corticales, así como la estimación del grosor cortical basado en superficie. Dado que el análisis de imágenes longitudinales en RM requiere realizar un análisis sin sesgo con respecto a cualquier punto temporal de las imágenes adquiridas de forma longitudinal, se desarrolló “PREEMACS Long” una adaptación para IRM de PNH del flujo de procesamiento PREEMACS y FreeSurfer longitudinal (Reuter et al., 2012) empleado para el análisis de IRM de sujetos humanos. Experimento 3. Con respecto al análisis de las propiedades de la SBS, un experimento independiente en sujetos humanos fue desarrollado. En un experimento paralelo al experimento principal de la presente tesis, se estudió si las habilidades de 35 sincronización rítmica (evaluadas a través de una Tarea de tapping de Sincronización- Continuación) se asocian con diferencias individuales en la densidad de las fibras U (parte sustancia blanca superficial) en el sistema audiomotor, así como con propiedades de estructuras de la sustancia blanca profunda, en sujetos humanos. Este experimento tuvo que ser desarrollado por dos motivos: obtener mayor información que permitiera evaluar los posibles fascículos de la sustancia blanca profunda asociados a la habilidad de predicción rítmica, y con ello obtener información que guiará la búsqueda de posibles fascículos asociados a modificaciones estructurales durante el entrenamiento de la tarea de los sujetos (PNH), toda vez que, de encontrar cambios globales en las propiedades de la sustancia blanca asociadas al entrenamiento, no se podría diferenciar si alguno de ellos se asociaría directamente con la sincronización rítmica. El segundo motivo, se vinculó con el desarrollo de un método de procesamiento y análisis de DWI, que permitiera el estudio de las propiedades de la sustancia blanca superficial y la evaluación de la sensibilidad de este método para identificar diferencias en las propiedades de la SBS en humanos, asociadas a la sincronización sensoriomotora, y posteriormente implementar este método en las imágenes de DWI de los primates no humanos, teniendo evidencia de la validez del método. Para lo anterior, 32 sujetos humanos posterior a la adquisición de IMR (T1w, T2 y DWI) realizaron una TSMa y TSMv, con estímulos isócronos en un rango de entre 550 a 950 ms, esta tarea fue homologa a la empleada en los PNH. Experimento 4. Finalmente, con las herramientas desarrolladas en los experimentos previos, se realizaron los análisis estadísticos de las IRM adquiridas antes, durante y después del entrenamiento. PREEMACS PREEMACS LONG Sustancia blanca superficial en humanos Sustancia blanca superficial en PNH Desarrollo y estandarización de protocolos de adquisición de IRM estructural de PNH Adquisición pre-entrenamiento agua libre/restricción de agua Adquisición Entrenamiento Tarea Control. Tiempo de reacción sin estructura Adquisición Entrenamiento TSC. Metrónomo Visual Adquisición Entrenamiento TSC. Metrónomo Auditivo Entrenamiento y adquisición de Métodos de procesamiento y análisis de Pre - Entrenamiento A) B) C) Estímulo Respuesta Estímulo Respuesta Estímulo Respuesta T1w T2w FLAIR DWI Experimento 1 Experimento 2 Experimento 3 Experimento 4 36 Figura 5. Plan de trabajo. Experimento 1. A) Fase pre-entrenamiento. Consistió en el desarrollo de protocolos de adquisición de imágenes estructurales de alta resolución de PNH. Posteriormente, se evaluó la variabilidad asociada al efecto de hidratación en adquisiciones longitudinales. B) Fase de entrenamiento y adquisición de imágenes. Dos monos Rhesus (macaca mulata) fueron entrenados en dos tareas (tarea control y tarea de sincronización a estímulos visuales y auditivos). Durante este periodo fueron adquiridas imágenes pre- durante – post entrenamiento. C) Desarrollo de métodos de procesamiento y análisis de imágenes. Tres métodos para el análisis de IRM estructural de PNH fueron desarrollados e implementados (experimento 2). Experimento 3. Evaluación de la SBS en sujetos humanos, el método fue probado y desarrollado de forma inicial con IRM de humanos (experimento 3) para posteriormente implementarlo en IRM de PNH (experimento 4). 37 Métodos Experimento 1 Diseño experimental Longitudinal. Dos monos machos (Macaca Mulatta), sin previa exposición a alguna tarea cognitiva, fueron entrenados en una tarea de tiempo de reacción y en una tarea de sincronización a un metrónomo visual y auditivo (Figura 6B). Imágenes de Resonancia Magnética (IRM) fueron obtenidas antes, durante y después del entrenamiento en cinco condiciones: agua libre, restricción de agua, entrenamiento en una tarea control de tiempo de reacción (Figura 6A), fase de descanso y entrenamiento en la TSM visual y auditivo. Animales de laboratorio Dos monos Rhesus (Macaca Mulata), diestros, machos de 7 y 9 Kg de peso. Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados previamente por el comité de bioética (protocolo 0.90A INB) del Instituto de Neurobiología de la Universidad Nacional Autónoma de México y se encuentran en conformidad con la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio publicada por los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos de América (NIH,1985). Tarea Control de Tiempo de Reacción (TCTR) La TCTR consistió en la presentación de estímulos visuales sin una estructura rítmica. La tarea iniciaba cuando el sujeto colocaba su mano en una palanca, por al menos 300 ms y de manera simultánea tres intervalos no-isócronos eran presentados. Posterior a la presentación del estímulo, el sujeto debía responder pasando su mano por un sensor, reaccionando al estimulo, sin poder predecir su presentación (Figura 6A). En esta tarea el intervalo inter-estímulo entre cada par de estímulos fue aleatorio entre 450,550,650 y 850 ms, evitando la temporalización explicita del movimiento. Los animales recibían recompensa si el tiempo de respuesta posterior al estímulo se encontraba dentro de una ventana de 200 a 500 ms. En esta tarea la recompensa otorgada no dependía de los intervalos blancos presentados. 30 repeticiones correctas fueron colectadas para cada sujeto. 38 Tarea de Sincronización a un Metrónomo (TSM) La TSM consistió en dos fases: metrónomo y sincronización. En la fase de metrónomo, un estímulo fue presentado para definir intervalos inter-estímulos aleatorios de 450, 550, 650, 750 o 850 ms, para la modalidad visual, en tanto que para la modalidad auditiva se omitió el intervalo de 450 ms. Posteriormente en la fase de sincronización los estímulos continuaban siendo presentados y el sujeto tenía que ejecutar movimientos sincronizados (taps) a la presentación del estímulo (Figura 6B). El inicio de la tarea se ejecutaba cuando el sujeto colocaba su mano en una palanca, observando el estímulo con estructura isócrona, por al menos dos veces, después de esta observación los sujetos podían mover su mano, y ejecutar movimientos rítmicos que consistían en pasar su mano a través de un sensor, mientras los estímulos continuaban siendo presentados. Los ensayos fueron separados por un tiempo variable aleatorio de 1.2 a 2.5s. Primero se entrenó a los sujetos en la tarea de sincronización a un metrónomo visual y posteriormente a un metrónomo auditivo. El objetivo del entrenamiento en cada modalidad fue la ejecución de 7 movimientos del sujeto (taps), sincronizados al intervalo blanco. Cada ensayo era correcto, si se cumplían dos condiciones: a) el intervalo producido y el intervalo blanco, no debían tener una diferencia mayor a un umbral de 200 ms y b) si las asincronías de los 7 movimientos del sujeto eran menores o igual al 15% del valor del intervalo blanco. 30 repeticiones correctas para cada intervalo blanco fueron colectadas. El aprendizaje de la tarea en cada modalidad fue considerado cuando el performance de los sujetos durante cinco sesiones era mayor al 70%. El entrenamiento se realizó a través de condicionamiento operante. Los animales recibían recompensa (gotas de jugo) por cada ensayo correcto. 39 Figura 6. Tareas de entrenamiento. A) Tarea control de tiempo de reacción TCTR. El ensayo iniciaba cuando el sujeto colocaba su mano sobre la palanca por un tiempo variable y posterior a la presentación de un estímulo separado por un intervalo inter-estímulo aleatorio, el animal debía pasar su mano por un sensor de movimiento. La estructura de la tarea, no isócrona, impide que el sujeto pueda predecir el tiempo de presentación del siguiente intervalo. B). Tarea de Sincronización a un metrónomo. Al igual que en la TCTR, la tarea iniciaba con la colocación de la mano del animal sobre la palanca por un tiempo variable. Posteriormente un metrónomo visual fue presentado y el sujeto debía ejecutar movimientos sincronizados a la presentación del estímulo. Los ensayos correctos eran recompensados con jugo. Los intervalos instruidos fueron 450, 550,650,750 y 850 ms, para la modalidad visual, en tanto que para la modalidad auditiva el intervalo de 450 ms fue omitido. Aparatos. Los sujetos se posicionaron dentro un set-up, sentados en una silla de primates, en una habitación con sonido atenuado, frente a una pantalla de computadora. Los animales pasaban su mano por un sensor, mientras que su brazo opuesto estaba cómodamente sujeto. Las respuestas conductuales se adquirieron utilizando un procesador 40 en tiempo real (Tucker-Davis Technologies RZ2). La presentación del estímulo fue controlada por computadora mediante un programa realizado en Psychtoolbox. (MathWorks, Natick, MA, Versión 7.3.0.267). Los estímulos auditivos llegaron a través de altavoces frontales equidistantes. El monitor estaba a 57 cm de los ojos de los sujetos. Estímulos. El metrónomo visual consistió en un cuadrado amarillo con un tamaño de 4.5 cm por lado, presentado durante 33 ms. El metrónomo auditivo consistió en un tono de 550 Hz, presentado entre 80 y 85 dB durante 33 ms. Procedimiento. La secuencia de entrenamiento de los sujetos fue la siguiente: tarea control, TSM modalidad visual y TSM modalidad auditiva. Entrenamiento Los sujetos fueron entrenados en sesiones diarias de 3 horas cada una, de lunes a sábado, en un horario de 11am a 2 pm. El objetivo del entrenamiento para la tarea de TCTR fue disminuir al máximo el tiempo de reacción y para la TSM fue disminuir las asincronías de las ejecuciones de los sujetos. Durante el entrenamiento de cada tarea, la adquisición de las IRM se realizaba una vez que los sujetos cumplían dos objetivos: una ejecución del 70% de éxito y el mantenimiento de este performance durante 5 días consecutivos. Con el objetivo de evaluar los cambios estructurales durante el entrenamiento en ambas tareas, las adquisiciones de las IRM estuvieron asociadas a las siguientes fases del entrenamiento.  TCTR. Entrenamiento en 2 taps (700 ms y 1 ms), 2 taps (450 ms y 1 ms) y 3 taps (450 ms y 1 ms). Los taps debían ser ejecutados reaccionando a la duración aleatoria previamente citada en paréntesis. En las tres fases de entrenamiento los intervalos eran delimitados por estímulos visuales no-isócronos  TSM. Entrenamiento en 2, 5 y 7 taps para cada uno de los metrónomos (visual y auditivo) en cinco intervalos 450, 550, 650, 750 y 850 ms y cuatro para la tarea auditiva (no se incluyó el intervalo de 450 ms). 41 Análisis de datos conductuales. Una métrica para evaluar el desempeño de los sujetos durante TSM, fue calculada (Figura 6B) (Gámez et al., 2018; Merchant, et al., 2008). Durante la fase de sincronización, se estimaron las asincronías, definidas como la diferencia entre el inicio de la presentación del estímulo y el paso de la mano del sujeto a través del sensor. Se realizó una t de student para analizar la diferencia entre la ejecución del sujeto 1 y sujeto 2. Evaluación del efecto del nivel de hidratación Fase agua libre. Durante 14 días, empleando bebederos graduados se cuantifico la cantidad de agua consumida por los sujetos ad libitum. Dos IRM fueron adquiridas, cada 7 días. Fase deprivación. Durante 24 días, los sujetos consumieron el 70% del total de la cantidad de agua cuantificada en la fase ad libitum. El agua fue administrada en los bebederos graduados todos los días a las 9 am, teniendo acceso a ella de forma libre. Durante esta fase dos IRM fueron adquiridas, una a los 7 días y otra a los 11 días, posteriores a la primera adquisición, toda vez que, después de cada escaneo, como parte de la recuperación del efecto de anestesia, los sujetos tenían acceso a agua libre por un periodo de 48 horas y posteriormente se iniciaba de nuevo el protocolo de deprivación. Adquisición de Imágenes Las imágenes obtenidas a lo largo del experimento 1, empleadas en el experimento 2 y 4, se adquirieron posterior a 8 horas de la última ingesta de agua y alimento de los sujetos a las 2 pm, iniciando a las 10 pm con la administración de la dosis inicial de anestesia. Preparación de los sujetos. Entrenamiento Una vez alcanzado el objetivo conductual, al finalizar el quinto día de entrenamiento se aseguraba la ingesta de agua al 70% de lo que los sujetos consumían en la fase de agua libre. El protocolo específico para la adquisición de IRM de los sujetos, que incluye la limpieza del resonador, los pasos para el traslado de los sujetos, del laboratorio a la Unidad de Resonancia Magnética del INB y su cuidado posterior se encuentra descrito en el Anexo A. 42 Anestesia Los animales fueron anestesiados con una dosis inicial de ketamina 7 mg kg-1 I.M. y xilacina, 0.6 mg kg -1 I.M. El mantenimiento del efecto de anestesia se realizó con dosis de ketamina 2.5 mg kg-1 y xilacina, 0.2 mg kg -1 I.M. aplicadas cada 30 minutos. La frecuencia respiratoria fue monitoreada durante toda la sesión, con un cinturón colocado alrededor del abdomen compatible con IRM. Con el objetivo de disminuir los efectos secundarios de la ketamina, una dosis de atropina (0.05 mg kg-1) fue administrada posterior a la dosis inicial de ketamina/ xilacina. Protocolo de adquisición IRM estructural fueron adquiridas en un resonador de 3T (Philips Achieva TX), empleando una antena de cabeza de 32 canales para humanos, disponibles en el Instituto de Neurobiología. Los animales fueron colocados dentro del resonador en posición de esfinge invertida, minimizando la distancia entre la cabeza de los sujetos y la antena, lo que mejora la relación señal-ruido. Una capsula de vitamina E fue colocada sobre el lado derecho de la cabeza de los animales en cada una de las adquisiciones para identificar claramente los hemisferios derecho e izquierdo durante los pasos posteriores del procesamiento de imágenes. Para garantizar la misma posición de todos los animales dentro del resonador (Reuter et al., 2012), utilizamos un casco de plástico, según los modelos de https://docs.cneuromod.ca/en/2020-alpha2/IRM.html , diseñado específicamente para la bobina de cabeza de 32 canales con acolchado extraíble, diseñado a medida y adaptado al cráneo de cada mono. Estas precauciones minimizaron el movimiento y evitaron el contacto directo de la cabeza del mono con la bobina, toda vez que, si el cráneo del sujeto experimental toca específicamente algún canal de antena, genera un error de homogeneidad de intensidad en la imagen, lo que impacta en el análisis de las cortezas con mayor mielinización (Song X et al., 2021). Los volúmenes ponderados en T1w se adquirieron empleando una secuencia eco de gradiente usando codificación espacial tridimensional, con cortes recolectados en el plano sagital (codificación de frecuencia = anterior/posterior), utilizando los siguientes parámetros: TR/TE=3.1/5.24 ms, ángulo de inclinación = 8º, tamaño de matriz = 184 x143x183 y dimensiones de campo de vista (FOV) de 128x128x145 mm3. Seis imágenes T1w fueron adquiridas por animal. Cuatro volúmenes ponderados en T2 en el plano sagital (codificación 43 de frecuencia = anterior/posterior), fueron adquiridos utilizando una secuencia turbo espin eco, con codificación espacial tridimensional, resolución de vóxel isométrica de 0,5 mm, tamaño de matriz = 256 × 256 × 290 cortes, TR/TE=2500/338 ms, ángulo de giro = 90°, FOV=256 × 256 × 100 mm3.El filtro de intensidad de bobina de superficie, predeterminado por el fabricante se aplicó a todas las imágenes antes de continuar con el procesamiento. Imágenes de alta resolución angular, sensibles a difusión basada en imágenes eco- planares fueron adquiridas con una resolución de 1.3 x 1.3 x 1.5 mm3, en cortes axiales continuos, ajustados a todo el volumen cerebral. Cuatro valores de sensibilización fueron empleados: b= 0, 1000, 2000 y 3000 s/mm2 aplicados en 18, 64 y 128 direcciones únicas de difusión, respectivamente, adquiridas 3 veces. Asimismo, una imagen (b = 0 s/mm2) fue adquirida con reversa de fase, con el objetivo de corregir distorsiones geométricas. El tiempo total de adquisición por sesión fue de 4 horas. Experimento 2 Análisis de Imágenes de Resonancia Magnética Con el objetivo de evaluar el grosor cortical, así como las propiedades microestructurales de la SB a lo largo de las adquisiciones, tres métodos fueron desarrollados: PREEMACS. Pipeline for Preprocessing and Extraction of the Macaque Brain Surface. (García-Saldivar, 2021), PREEMACS Longitudinal y PREEMACS evaluación de sustancia blanca superficial. Análisis de grosor cortical transversal. PREEMACS El flujo para el preprocesamiento y extracción de superficies de imágenes de primates no humanos (PREEMACS. Pipeline for Preprocessing and Extraction of the Macaque Brain Surface, García-Saldivar, 2021), ejecuta los pasos necesarios para la reconstrucción de superficies piales y sustancia blanca, con el objetivo de estimar el grosor cortical, sin intervención manual. Sujetos Desarrollo PREEMACS. Ocho monos Rhesus (Macaca mulatta) (seis machos, de 4 a 10 años, con un peso de 5 a 12 kg) fueron escaneados empleando los protocolos de anestesia y adquisición previamente descritos. 44 Validación de PREEMACS. Para evaluar la generalización del método, se probó el flujo de trabajo PREEMACS con la base de datos PRIME-DE (Milham et al., 2018). PRIME-DE es una base de datos de código abierto con 217 sujetos PNH de veintisiete sitios diferentes. Esta base de datos contiene escaneos T1w, T2w, fIRM y DWI. Las imágenes fueron adquiridas con diferentes escáneres, bobinas, protocolos de resonancia magnética estructural y especies de macacos (Macaca mulatta y Macaca fascicularis). Por lo anterior, solo fueron seleccionadas imágenes que cumplieron con los siguientes criterios: resonancias magnéticas con secuencias T1w y T2w, disponibles para descargar en línea (sin requisitos especiales), sin recorte, sin máscaras de cerebro, y sólo un conjunto de imágenes por animal. Además, se eliminaron las imágenes de recuperación de inversión sensible a la fase, ya que FreeSurfer produce errores en el paso de clasificación del tejido. Flujo de trabajo PREEMACS PREEMACS tiene un diseño modular, con cada uno de estos funcionando de forma independiente. Estos módulos realizan el flujo de trabajo canónico para el preprocesamiento de IRM para humano (Glasser et al., 2013; Alfaro-Almagro et al., 2018; Esteban, et al., 2019), a excepción de los pasos que son específicos para los datos PNH utilizando diferentes funciones de diversos programas, tales como: FSL (Biblioteca de software de FIRMB - FSL, Oxford, Reino Unido) (Smith et al., 2004), ANTS (Avants et al., 2011), MRtrix (Tournier et al., 2019), IRMqc (Esteban et al., 2017) y FreeSurfer (Dale et al., 1999; Fischl et al., 1999b; Fischl, 2012). Los elementos de entrada para PREEMACS son uno (o más) volúmenes de T1w y uno (o más) volúmenes de T2w por animal (Figura. 6A). Modulo 1. Preparación de imágenes. Este módulo prepara las imágenes sin procesar (T1w y T2w), a través de los siguientes seis pasos (Figura. 7B): Orientación del volumen: dado que las imágenes de cerebro de PNH se pueden adquirir con los sujetos en diferentes posiciones dentro del escáner (por ejemplo, lateral, esfinge, supino), es necesario reorientar la imagen. Este paso genera un volumen de salida en el espacio RAS relativo a la posición de la esfinge (Derecha->izquierda; Anterior->posterior; Superior->inferior). Recorte de imagen. El FOV (campo de vista) de la adquisición de resonancia magnética PNH a menudo incluye anatomía más allá de la cabeza del animal. Esta información adicional puede aumentar la variación entre sujetos y dificultar la normalización espacial. 45 Por lo tanto, PREEMACS recorta el cerebro y partes del cráneo automáticamente en el espacio nativo. Este proceso se realiza mediante una máscara cuya geometría depende de las coordenadas de las comisuras anterior y posterior. Estas coordenadas se estiman alineando el volumen T1w con una imagen template NMT (Seidlitz et al., 2018) a través de un registro lineal con 6 grados de libertad (DOF) usando ANTS (Avants et al., 2011), para después estimarlas en el espacio nativo. Si el registro falla, PREEMACS le pide al usuario que proporcione las coordenadas de las comisuras anterior y posterior para recortar las imágenes. Corrección de falta de uniformidad de intensidad (INU): la mayoría de las imágenes PNH presentan falta de uniformidad de intensidad y esta varía espacialmente. Las fuentes comunes de falta de uniformidad incluyen el uso de antenas multicanal, la posición del animal con respecto a la antena y falta de homogeneidad de B1. Corregir la falta de uniformidad de intensidad de las imágenes impacta en la correcta segmentación de estas. La normalización de la intensidad de las IRM, generalmente se realiza con el algoritmo N4 (Tustison et al., 2010) en cada volumen, antes del promedio. En PREEMACS para mejorar el rendimiento del algoritmo N4, el parámetro de ajuste b-spline se ajustó empíricamente (- b [100 mm]). Promedio de imagen, remuestreo y conformación: los volúmenes T1w y T2w se promedian por separado. Esto se realiza mediante la herramienta IRM_motion_correct.fsl de FreeSurfer. Cada uno de los dos volúmenes resultantes se vuelve a muestrear para obtener una resolución isométrica de 0,5 mm y un tamaño final de 256 × 256 × 256 vóxeles. Segmentación de cerebro: la obtención de una máscara precisa del cerebro es un paso crucial para el procesamiento de imágenes. Si bien, existen muchas herramientas para la segmentación de cerebro en IRM de humanos (Kleesiek et al., 2016; Eskildsen et al., 2012; Iglesias et al., 2011; Smith, 2002), las herramientas disponibles para PNH (Beare et al., 2013; Cox, 1996; Balbastre et al., 2017; Seidlitz et al., 2018; Lohmeier et al., 2019) en la mayoría de los casos, muestra errores de estimación en la corteza prefrontal y los lóbulos temporales, así como errores en la separación de la duramadre y la sustancia gris. Para resolver este problema, ajustamos el módulo de Python DeepBrain (Itzcovich, 2017), que fue diseñado para la segmentación de cerebros de IRM de humanos utilizando una red neuronal convolucional implementada en Tensorflow. Para trabajar con datos de PNH entrenamos el modelo DeepBrain utilizando un conjunto de imágenes de monos T1w y las correspondientes máscaras cerebrales definidas manualmente. El preprocesamiento de las 46 imágenes para el entrenamiento de la red convolucional fue el siguiente: Primero, ejecutamos el primer módulo de PREEMACS empleando los pasos: “Promedio de imágenes, recorte de imágenes, remuestreo y conformación” utilizando un total de 126 imágenes: 88 imágenes de PRIME-DE (empleando imágenes de 17 sitios distintos), 17 de la UNAM-INB y 21 de la base de datos UNC-Wisconsin (Young et al., 2017). En segundo lugar, se realizó una máscara de cerebro para cada imagen de la siguiente manera: para las bases de datos PRIME-DE y UNAM-INB, se realizaron las máscaras cerebrales utilizando el flujo de trabajo atlasBREX (Lohmeier et al., 2019) y se realizó la corrección manual correspondiente. Las máscaras incluían toda la sustancia gris, la sustancia blanca, el cerebelo, y el tronco encefálico (puente, bulbo raquídeo). Se excluyeron de la máscara cráneo, piel, músculos, grasa, ojos, duramadre, hueso y quiasma óptico. En el caso del conjunto de datos de UNC-Wisconsin, la segmentación manual de las imágenes ya estaba disponible, por lo que solo excluimos el quiasma óptico de las máscaras originales. El grado de superposición entre la máscara calculada con la herramienta de PREEMACS y la máscara de referencia segmentada manualmente, se determinó utilizando tres métricas: coeficiente Dice (Dice, 1945), sensibilidad y especificidad (Klesiek et al., 2016). Estas medidas dependen de los siguientes cuatro parámetros: falsos negativos (FN), definidos como vóxeles que se eliminan mediante el método Deep Neural Network pero que están presentes en la máscara de referencia; falsos positivos (FP), definidos como vóxeles que se han predicho incorrectamente como tejido cerebral; verdaderos positivos (VP), que corresponden a los vóxeles que fueron identificados correctamente por la herramienta de segmentación de PREEMACS como tejido cerebral; y verdaderos negativos (VN), definidos como los vóxeles correctamente identificados como tejido no cerebral. El coeficiente Dice, es el más comúnmente empleado para comparar dos segmentaciones (Klesiek et al., 2016; Manjon et al., 2014; Wang et al., 2014) y se define como la diferencia del doble del tamaño de la intersección de las dos máscaras, en relación con la suma de sus tamaños, de la siguiente manera: Dice = 2VP 2VP+FP+FN Basado en Kleesiek et al. (2016), también calculamos las puntuaciones de sensibilidad (VP/(VP+FN)) y especificidad (VN/(VN+FP)). 47 Modulo 2. Control de calidad. Dado que las imágenes con artefactos de adquisición pueden inducir sesgos y errores de cálculo en la estimación del tejido cerebral, es de suma importancia un riguroso control de calidad de las imágenes para la identificación automática de las superficies corticales. Con el objetivo de evaluar si PREEMACS podría ejecutar la estimación de superficies sin o mínima intervención manual o si la superficie no podría ser estimada debido a problemas de adquisición de la IRM. En PREEMACS, se realizó una adaptación de una herramienta de control de calidad para imágenes de resonancia magnética estructural denominada MRIqc v0.15.2 (Esteban et al., 2017) para trabajar con IRM de PNH. MRIqc lleva a cabo la segmentación de diferentes tejidos y calcula métricas de calidad de imagen. Del total de 68 métricas calculadas por MRIqc, se usaron 58 para un análisis más detallado. PREEMACS utiliza las métricas de calidad de imagen (MCI), como predictores de la calidad de la superficie. A través del empleo de un clasificador “Support Vector Machine (SVM)”, las imágenes tenían tres posibilidades de clasificación: imagen con mínimos errores en la estimación de la superficie, imagen con errores medios en la estimación de la superficies y grandes errores en la estimación de la superficie (Figura 7C). Los detalles del funcionamiento del clasificador se encuentran en el Anexo B. Módulo 3. El objetivo de este módulo es cuantificar el grosor cortical, empleando superficies piales y de sustancia blanca (Figura 7D). Esto se realizó ejecutando el programa FreeSurfer v.6 (Dale et al., 1999a), el cual consiste en una suite de herramientas automatizadas para el análisis estructural del IRM de humanos, por lo que dicho programa fue optimizado para imágenes de PNH. Este módulo inicia realizando una segunda corrección de inhomogeneidades de campo. Posteriormente se ejecuta el flujo trabajo de procesamiento de FreeSurfer v.6, realizando una segmentación de sustancia blanca basada en diferencia de intensidades y rellenando los espacios de estructuras subcorticales empleando para ello un registro a un atlas de PNH denominado PREEMACS Freesurfer PNH. Los pasos de construcción se encuentran en el Anexo B. Posteriormente se ejecuta un paso para minimizar un error de segmentación común en las resonancias magnéticas de PNH. El error consiste en un sesgo de intensidad, caracterizado por altos valores en la corteza del giro precentral y en la corteza de las áreas occipitales, lo que genera que la sustancia gris de estas regiones sea clasificada incorrectamente como sustancia blanca. El problema se resolvió desarrollando una herramienta a la que se denominó HICPO (High Intensity Control Point). HICPO estima el promedio de los valores 48 de intensidad en la corteza del giro precentral y en la corteza de las áreas visuales, con lo que genera un umbral más alto (más estricto) para la segmentación de estas dos cortezas, que difiere del umbral de segmentación empleado para el resto de la corteza. Una vez obtenida la correcta segmentación de sustancia blanca y sustancia gris, una malla tridimensional constituida por vértices y aristas es generada y corregida en el espacio nativo para cada uno de los hemisferios. Posteriormente y con el objetivo de obtener correspondencia de vértices entre los sujetos, la superficie de sustancia blanca es registrada a un espacio estándar. Registro de atlas de superficie. Dado que el número de vértices no es el mismo entre los sujetos y depende del tamaño del cerebro de cada mono, la superficie sustancia blanca en el espacio nativo debe registrarse en un espacio común (Fischl et al., 1999a, 1999b). Este paso calcula la esfera de un sujeto a partir de la superficie inflada de la sustancia blanca, posteriormente deforma esta esfera en un archivo 2D que contiene el patrón de curvatura y convexidad del sujeto, para finalmente registrar el archivo 2D con un patrón de referencia llamado “PREEMACS. Template de parametrización neuroanatómica de mono Rhesus” (la cual también fue desarrollada y se describe en el Anexo B). Esto se ejecuta para garantizar que el patrón de convexidad y curvatura de cada sujeto, estén alineados con una plantilla genérica de referencia de mono Rhesus. Por lo tanto, estas métricas nos permiten establecer un sistema de coordenadas basado en la superficie (Fischl et al., 1999a) con correspondencia de vértices entre sujetos, de tal forma que las características anatómicas pueden compararse entre animales para el análisis grupal. Para la ejecución de este registro, se empleó la herramienta IRMs_register de la suite de FreeSurfer (Fischl et al., 1999). Estimación de la superficie pial y del grosor cortical. Finalmente, PREEMACS estima el grosor cortical para cada uno de los sujetos (los pasos pueden ser consultados en el ANEXO B). Posteriormente, estos datos pueden ser proyectados y mapeados en un espacio común (atlas de superficie) denominado “PREEMACS. Atlas de superficie cerebral de mono Rhesus“. Los pasos para la creación de este atlas se encuentran en el ANEXO B. 49 Figura 7. Flujo para el preprocesamiento y extracción de superficies de imágenes de primates no humanos (PREEMACS). A. Imágenes T1 y T2 de entrada sin preprocesamiento. B. Módulo 1. Ejecuta la orientación del volumen, corte de la imagen, corrección inhomogeneidades de campo, promedió de imágenes y mascara de cerebro. C. Módulo 2. Ejecuta control de calidad usando una adaptación de MRIqc, obteniendo métricas de control de calidad, las cuales son usadas para determinar la probabilidad de éxito de la extracción de superficie basado en un clasificador. D. Módulo 3. Estima las superficies pial y de sustancia blanca empleando una versión de FreeSurfer 6.0 adaptada para PNH. Este módulo inicia ejecutando una segunda corrección de inhomogeneidades de campo y una parcelación de estructuras cerebrales. Posteriormente, se realiza la segmentación y estimación de superficie de sustancia blanca, la cual es registrada a una superficie promedio (PREEMACS Rhesus parameterization template). Finalmente, la superficie pial es estimada, corregida a través de la imagen T2 y el grosor cortical es estimado en espacio nativo y un espacio geométrico promedio denominado PREEMACS Rhesus average surface. (García-Saldivar, 2021) 50 PREEMACS parcelación basada en superficie Para poder realizar la comparación de métricas a lo largo de todas las adquisiciones y entre sujetos por áreas, fue necesario realizar una parcelación de áreas basadas en superficie. Derivado de la creación de PREEMACS Rhesus average Surface (García-Saldivar et al., 2020), template generada del análisis de superficie de 33 monos Rhesus, obtuvimos un volumen T1 promedio, este fue empleado para realizar un registro lineal ANTs (Advanced Normalization Tools, http://stnava.hithub.io/ANTs) del atlas D99 (Salemm et al., 2021), el cual contiene la parcelación estructural de 120 área de mono Rhesus. Una vez realizado el registro, este fue corregido manualmente. Empleando MATLAB v.2018 las etiquetas correspondientes a diferentes áreas cerebrales fueron proyectadas a PREEMACS Rhesus average Surface y nuevamente, fueron corregidos manualmente. PREEMACS longitudinal Con el objetivo de realizar un análisis sin sesgo con respecto a cualquier punto temporal de las imágenes adquiridas de forma longitudinal, se realizó una adaptación del flujo de procesamiento FreeSurfer longitudinal (Reuter et al., 2012) para imágenes de PNH (Figura 8). Este esquema de procesamiento inicia ejecutando PREEMACS transversal (etapa 1. Figura 8A). Posteriormente, empleando los puntos temporales adquiridos por sujeto, una imagen promedio es generada, dicha imagen es procesada ejecutando los pasos del módulo 3 de PREEMACS transversal, las superficies piales y de sustancia blanca son generadas (etapa 2. Figura 8B). Finalmente, las superficies generadas en la etapa 2 son empleadas para inicializar el proceso de estimación de sustancia gris y blanca en cada punto temporal y así proporcionar la métrica de grosor cortical (etapa 3. Figura 8C). Se ha demostrado que el flujo de procesamiento de FreeSurfer longitudinal reduce la variabilidad aleatoria en el procedimiento de procesamiento y mejorar la robustez y sensibilidad del análisis longitudinal general (Reuter et al., 2012). 51 Figura 8. PREEMACS Longitudinal. Flujo para el preprocesamiento y extracción de superficies de imágenes de primates no humanos, adquiridos de forma longitudinal. A) El procesamiento inicia ejecutando todos los módulos de PREEMACS transversal (etapa 1). B) Posteriormente una imagen template es generada, con el objetivo de obtener una máscara de cerebro general para ser empleada en todos los puntos temporales, así como una imagen normalizada y superficies cerebrales que ayuden en la inicialización del proceso de análisis de superficies en cada punto de adquisición a lo largo del entrenamiento (etapa 2). C) Finalmente, se realiza una nueva estimación de superficies cerebrales, empleando las obtenidas en la etapa 2, para inicializar el proceso en cada punto temporal, generando de esta forma un análisis sin sesgo con respecto a cualquier punto de adquisición longitudinal. Experimento 3. Conducta rítmica, sustancia blanca profunda y método para el análisis de sustancia blanca superficial Sujetos Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de nuestra Institución (protocolo número 049H-RM). Treinta y dos sujetos humanos sanos (edad = 25,37 ± 3,21 años; 19 mujeres) se ofrecieron como voluntarios para participar y dieron su consentimiento informado por escrito de acuerdo con los lineamientos de la Declaración de Helssinki (Anexo C). 52 Criterios de inclusión, exclusión y eliminación Inclusión. Dominancia manual derecha, hablantes nativos de español, sin entrenamiento musical formal y sin condiciones neurológicas, psiquiátricas o cognitivas. Exclusión. Contraindicaciones para la adquisición de IRM. Eliminación. Hallazgos radiológicos en las IRM. (Anexo C) Tarea experimental La TSC del presente estudio fue similar a la TSC estándar descrita con anterioridad en Merchant, Zarco y Prado, 2008 y Merchant, Zarco, Bartolo, et al., 2008. La tarea iniciaba cuando se presentaban de forma simultánea tres círculos blancos vacíos sobre un fondo negro, formando un triángulo isósceles invertido (Figura 9). La ejecución de los ensayos iniciaba cuando los sujetos colocaban su dedo en el circulo central-inferior, en donde se les presentaba una secuencia de seis estímulos alternos derecho/izquierdo con un intervalo interestímulo constante (fase de percepción), posterior a la percepción del intervalo blanco, los sujetos debían dar un toque en el interior de los círculos blancos (tapping), en sincronía con el metrónomo durante seis intervalos (fase de sincronización) y continuar ejecutando el tapping en la pantalla táctil durante otros seis intervalos sin metrónomo (fase de continuación) (Figura 9). Como retroalimentación del éxito en la ejecución de la tarea, la media de asincronías era presentada en la pantalla al final de cada ensayo. Un ensayo se consideraba correcto cuando las asincronías se ejecutaban por debajo del 30% del intervalo blanco durante la fase de sincronización y por debajo del 40% durante la fase de continuación. La tarea se programó utilizando Psychtoolbox para Matlab (2018, The Mathworks). 53 Figura 9. Tarea de Sincronización - Continuación. Inicialmente, los sujetos colocaban su dedo en el circulo central-inferior de una pantalla táctil para comenzar la tarea, manteniendo el dedo en esta posición mientras atendían una secuencia de dos a seis estímulos visuales alternos (derecho/izquierdo) con un intervalo interestímulo constante (fase de percepción). Luego, una vez que los sujetos consideraban haber extraído el ritmo, tocaban la pantalla táctil en el circulo izquierdo o derecho de la parte superior de la tarea, en sincronía con el metrónomo visual alterno durante seis intervalos (fase de sincronización). Finalmente, los sujetos continuaban ejecutando el toque dentro de los círculos blancos derecho o izquierdo durante otros seis intervalos sin el metrónomo (fase de continuación). La media de las asincronías producidas y el intervalo objetivo se mostraban al final de cada ensayo como retroalimentación. Los sujetos también realizaron una versión de la TSC con un metrónomo auditivo. El metrónomo consistió en tonos de 500 Hz que se presentaron en el lado derecho o izquierdo de un auricular. Cinco intervalos blanco (550,650,750,850 o 950 ms) fueron presentados pseudoaleatoriamente. Las condiciones visuales y auditivas fueron intercaladas entre los sujetos. Estímulos. El metrónomo visual consistió en un círculo amarillo presentado durante 33 ms y se mostró de forma alternada dentro de los círculos blancos vacíos derecho o izquierdo (Figura 9). El metrónomo auditivo consistió en un tono de 550 Hz, presentado entre 80 y 85 dB durante 33 ms y al igual que el estímulo visual se mostró de forma alternada en el auricular derecho o izquierdo. Los intervalos isócronos blanco tuvieron una separación de 550, 650, 750, 850 y 950 ms, y fueron presentados pseudoaleatoriamente dentro de un ensayo. Cada sujeto realizó 10 ensayos correctos para cada intervalo objetivo. Aparatos. Los participantes se sentaron en un sillón frente a una pantalla táctil de alta definición de 23” (frecuencia de actualización: 60 Hz; ELO Touch solutions), ubicada a 50 cm de distancia, la cual debían tocar con el dedo índice derecho durante la tarea. Los estímulos auditivos se presentaron a través de auriculares con cancelación de ruido (Sony, MDR-NC50). 54 Procedimiento. Las resonancias magnéticas se obtuvieron en la primera sesión. En una segunda visita, fuera del resonador magnético, los sujetos realizaron de forma aleatoria las tareas auditivas y visuales. Análisis de datos conductuales Cuatro métricas para evaluar el desempeño de los sujetos durante TSC, fueron calculadas (Gámez et al., 2018; Merchant, et al., 2008c). Durante la fase de sincronización, se estimaron las asincronías absolutas y las autocorrelaciones de la serie temporal de intervalos entre ejecuciones. (Iversen et al., 2015; Wing, 2002). El error constante y la variabilidad temporal fueron calculados a partir de los intervalos producidos durante las fases de sincronización y continuación. Las asincronías absolutas fueron definidas como la diferencia, sin signo, entre el inicio del estímulo y el inicio del toque. El error constante se calculó como la diferencia entre el intervalo producido y el intervalo blanco, interpretada como una medida de precisión temporal. La variabilidad temporal se definió como la desviación estándar del total de intervalos producidos y corresponde a una métrica de precisión temporal. La autocorrelación de los seis intervalos inter-taps producidos durante un ensayo fue calculada. Por lo tanto, la autocorrelación de lag-1 es normalmente negativa para los metrónomos isócronos, lo que significa que un intervalo producido más largo tiende a ser seguido por un intervalo más corto y viceversa, reflejando un mecanismo de corrección de errores empleado, para mantener el ritmo del metrónomo durante la sincronización (Iversen et al., 2015). Se realizó un ANOVA de medidas repetidas con dos y tres factores para el análisis de asincronías, error constante y variabilidad temporal. (Iversen et al., 2015). Protocolo de imagen Las imágenes se adquirieron utilizando un escáner Philips Achieva TX de 3T con una antena de cabeza de 32 canales. Los volúmenes ponderados en T1 se obtuvieron utilizando una secuencia eco de gradiente codificada tridimensionalmente (TR/TE = 8,2/3,7 ms, ángulo de giro = 8º, campo de visión = 256x256x176 mm3, tamaño de matriz = 256x240x176 mm3 y una resolución de voxel = 1x1x1 mm3). Imágenes de difusión (DWI). Las imágenes de difusión (DWI) se adquirieron con imágenes ecoplanares (EPI), resolución de vóxel de 55 2x2x2 mm3, FOV = 256 × 256 mm3, 62 cortes axiales, TR/TE = 16500/72 ms. Las imágenes se sensibilizaron a la difusión con b=1000 s/mm² (64 direcciones únicas) y b=3000 s/mm² (96 direcciones). También se adquirieron cinco volúmenes sin ponderación de difusión (b = 0 s/mm2), junto con un volumen adicional de b = 0 s/mm2 obtenido con polaridad de codificación inversa de fase para la corrección de distorsiones geométricas. Procesamiento de imágenes a) Superficie cortical. Se utilizaron imágenes ponderadas en T1 para estimar las superficies corticales. Primero se eliminó el ruido de las imágenes (Coupe et al., 2008) y se corrigieron las fallas de homogeneidad de intensidad (Tustison et al., 2011). Las máscaras binarias del cerebro fueron obtenidas con volBRAIN v.2.0 (Manjón & Coupé, 2016). Las superficies corticales se obtuvieron mediante el pipeline FreeSurfer v.6.0 (Fischl, 2012). Las superficies individuales se registraron a una superficie template con 20,484 vértices (fsaverage5) (Fischl et al., 1999). b) Pre-procesamiento de imagénes de difusión. Primero se eliminó el ruido de los volúmenes ponderados por difusión (DWI) (Manjon et al., 2013) y se corrigió el sesgo de campo, artefacto no deseado en las IRM (Tustison et al., 2011). Posteriormente se corrigieron las distorsiones geométricas y el movimiento usando el algoritmo topup-eddy de FSL (Andersson & Sotiropoulos, 2016). c) Superficies de sustancia blanca yuxtacortical y superficial. Para evaluar las propiedades de SBS, utilizamos una representación sintética de axones basada en la topología cortical. Calculamos un campo de potencial laplaciano entre los ventrículos y el límite sustancia gris (SG)- sustancia blanca (SB) (Jones et al., 2000; Lerch et al., 2008; Liu et al., 2016) empleando la herramienta minclaplace (Lerch et al., 2008) (Figura 9A). A continuación, se iniciaron “streamlines” (modelación matemática que representa en 3D las posibles rutas de grupos axonales) (Smith, R. E., et al., 2022), en cada vértice de la superficie de SB, previamente calculada en el paso A antes descrito y los streamlines o trayectorias se propagaron hacia los ventrículos utilizando Matlab, 2020A. Así, se obtuvieron trayectorias laplacianas para cada vértice de la superficie SB (Figura 10. B-C). La distancia entre cada paso de la trayectoria laplaciana fue de 100 µm, y las trayectorias se truncaron a 5 mm. Esto resultó en representaciones de la SB, organizadas, sin superposición que respetaron 56 la topología del tejido de la sustancia blanca superficial (Figura 10C). Además, el primer segmento de estas trayectorias es perpendicular a la superficie SB-SG, y los segmentos subsiguientes toman una posición angulada gradualmente a medida que se alejan de la superficie de SBYuxtacortical (Figura 10C). Estos aspectos hacen que las trayectorias laplacianas se comporten de manera similar a lo que se espera de la anatomía de las fibras en U (Figura 10C). Finalmente, todas las superficies de SB y trayectorias sintéticas laplacianas se distorsionaron a su correspondiente espacio en su IPD específica del sujeto a través del registro no lineal entre modalidades utilizando las herramientas del programa ANTS (Avants et al., 2011). Los datos de un sujeto fueron descartados para el análisis de la sustancia blanca superficial debido a problemas en el preprocesamiento, específicamente el registro entre los mapas métricos DWI y la superficie de la sustancia blanca fue subóptimo. d) Análisis Basado en Fixel. Brevemente, el proceso de análisis de FBA consta de cinco pasos. Primero, las imágenes de cada sujeto se procesan para obtener un mapa FOD de sustancia blanca en el espacio nativo utilizando CSD. En segundo lugar, se construye una imagen promedio de: las FOD´s, así como una de máscara de fixeles. En tercer lugar, el mapa DAF y los fixels correspondientes para cada vóxel se calculan para cada sujeto en el espacio nativo. La métrica FD, se calcula para cada fixel a partir de la señal total de las IPD por vóxel. Cuarto, los fixels y el mapa de la DAF se reorientan a la template, calculada en el paso dos. Finalmente, se calculan las estadísticas por cada uno de los fixeles en el espacio de promedio, previamente calculado. Interfaz SG/SB Ventrículo Vértices superficie de St re am lin es Ve ct or es 0° 1000°A B DAF = DAF =tan par Vértices sustancia blanca yuxtacortical v1 v2 3v v5 v 4 v 4,0= v6 v7 v4,2 v4,4 v4,6 v4,8 v4,10 v4,12 Tr ay ec to ria s/ St re am lin es la pl ac ia no s SG SB v1 v2 3v v5 v 4 v6 v7 Mapa de difusión cuantitativo v1 v2 3v v5 v 4 v6 v7 DAF - DAF C D Mapa de difusión cuantitativo Mapa de difusión cuantitativo total total fixel Figura 10. Método para la evaluación de Sustancia Blanca Superficial y de fibras en U. A. Isolíneas Laplacianas que muestran el flujo de calor desde los ventrículos hacia la interfaz sustancia gris/sustancia blanca, generada con la herramienta minclaplace. Este mapa de isolineas permitió la creación de vectores en X, Y y Z (corte coronal a inicio del surco central). B. Trayectorias laplacianas con inicio en cada uno de los vértices de la superficie de sustancia blanca. C. Mapa de anisotropía fraccional que modela las propiedades de la sustancia blanca superficial (giro frontal medio, corte coronal). En la imagen inferior se representa esquemáticamente como se obtienen los valores de los mapas cuantitativos (ej. AF) a lo largo de cada uno de los vértices. D. Izquierda. Representación esquemática del método propuesto para la evaluación de SBS y fibras en U, empleando el mapa de densidad aparente de fibra (DAF). Derecha. Mapa de densidad aparente total, representado los valores de la SBS muestreados a través del método propuesto. Abajo, esquematización del método de fixeles que permite analizar las propiedades de dos paquetes de fibras dentro de un voxel. E. Derecha. Esquematización del método propuesto para analizar las propiedades del sistema de fibras en U, dividiéndolo de otras fibras que integran a la sustancia blanca superficial, a través de la resta de las fibras en paralelo creando un mapa de densidad aparente tangencial que permite dividir a la sustancia blanca superficial del sistema de fibras en U. 57 58 e) Procesamiento para obtener modelos de fibras en U. Empleando el programa mrtrix v3.0 utilizamos la información basada en fixel para evaluar de forma independiente los dos sistemas de fibras que coexisten en el SBS: las fibras U que proporcionan conectividad corticocortical de corto alcance y las fibras comisurales, de asociación y de proyección de largo alcance (Kirilina et al., 2020; Schüz & Braitenberg, 2002; Yoshino et al., 2020). Con la suposición de que las fibras en U se ubican tangencialmente a la superficie SG-SB, mientras que las fibras de largo alcance se ubican sobre la superficie de forma perpendicular, atribuimos los fixeles orientados en paralelo a los segmentos de las trayectorias laplacianas a las fibras de largo alcance, y los fijos restantes al sistema de fibra en U (Figura 10.D-E). Las métricas derivadas de DWI se muestrearon a lo largo de las trayectorias laplacianas a 0, 0.5, 1, 1.5 y 2 mm por debajo de la interfaz SG-SB. Las métricas muestreadas fueron Densidad Aparente de Fibra total (DAFtotal) (la integral de los FOD dentro de un vóxel dado, Figura 10D) y Densidad aparente de Fibra atribuido a fibras de largo alcance (DAFpar; la integral del FOD del fixel paralelo a la trayectoria laplaciana) o fibras en U (DAFtan; definido como DAFtotal- DAFpar) Figura 10E. Todas las métricas a lo largo de las trayectorias laplacianas se proyectaron en la superficie promedio de sustancia blanca (fsaverage5) para su visualización y análisis estadístico y se suavizaron utilizando un kernel bidimensional de 1.5 mm de ancho total. Análisis de métricas de Imágenes Ponderadas a Difusión (IPD) Análisis basado en superficie de SB. Los análisis se realizaron ajustando un modelo lineal general en cada vértice. Este análisis evaluó la relación entre el valor de las métricas de difusión en cada vértice (i) y las métricas de conducta de la TSC (asincronías absolutas, error constante, variabilidad temporal y de la autocorrelación lag-1 de la serie temporal, como: SB i = β0 + β1 * TSC metrica El análisis de vértices de superficie se corrigió para múltiples comparaciones utilizando la teoría de campos aleatorios con un umbral de error familiar de (PFWE < 0,001). Los grupos con PCluster < 0,001 se consideraron significativos. 59 Los grupos significativos se identificaron anatómicamente utilizando un Atlas Cerebral Basado en la Arquitectura Conexional (Brainnetome) (Fan et al., 2016). Todos los análisis se realizaron empleando las herramientas de Surfstat (Worsley et al., 2009) para Matlab (2018; The Mathworks). Análisis de correlación canónica regularizada (rCCA) Como verificación adicional de los resultados obtenidos mediante el análisis de la teoría de campos aleatorios, se realizó un análisis de correlación canónica entre los datos de comportamiento de la TSC y la información estructural de la SB. Este enfoque permitió evaluar de forma independiente la correlación de las mediciones de la DAF (Densidad Aparente de Fibras) de cada vértice con cada variable de la TSC. El objetivo principal de la CCA fue estimar las variables canónicas (U y V) que maximizan la correlación entre X - Y. Concretamente, el rCCA se calculó entre la matriz de métricas de comportamiento de la fase de sincronización de la TSC (es decir, asincronía absoluta, error constante, variabilidad temporal y autocorrelación de lag-1) para cada modalidad sensorial (auditiva y visual) y cada intervalo objetivo (550-950 ms) y la matriz DAF de todo el cerebro. Dada la ortogonalidad entre DAFtan y DAFpar, y su colinealidad con la DAFtotal, se construyeron modelos individuales para cada métrica de la DAF. Dado que el número de variables (particularmente el número de vértices) es mucho mayor que el tamaño de la muestra, incluimos dos parámetros de regularización para las matrices de covarianza en el modelo (rCCA) (Mihalik, A., et al., 2021). Estos parámetros fueron optimizados mediante un algoritmo de validación cruzada con búsqueda recursiva sobre una matriz que maximizó la correlación de las variantes canónicas. Los intervalos de confianza (al 99%) para las cargas canónicas de las variables después del ajuste del modelo se estimaron mediante la construcción de distribuciones nulas de las cargas canónicas basadas en permutaciones aleatorias (n = 10 000) de las métricas originales. Esto fue útil para identificar las variables de comportamiento más relevantes asociadas con los datos estructurales. 60 Experimento 4 PREEMACS. Análisis de grosor cortical a lo largo del entrenamiento Empleando PREEMACS longitudinal se obtuvieron superficies tridimensionales de la sustancia blanca y de la superficie pial (Figura 11. A-C), constituidas por vértices y aristas. La métrica de grosor cortical se definió como la distancia en milímetros, entre un vértice de la SB y su correspondiente en la superficie pial (SP) (Figura 11. D) Figura 11. Evaluación de Grosor cortical. A. Reconstrucción tridimensional de la superficie pial y blanca de mono Rhesus. B. Visualización de un segmento de SP y SB. C. Malla y visualización de vértices y aristas de SP y SB. D. Ejemplo de la evaluación de grosor cortical entre tres vértices. Basados en la parcelación de superficie, 5 áreas en ambos hemisferios fueron analizadas: motora primaria (M1), áreas motoras secundarias (F2), área motora suplementaria (AMS), área motora presuplementaria (preAMS) y el área visual (Figura 12). A) B) C) D) 61 Figura 12. Parcelación de áreas basadas en superficie en el hemisferio izquierdo. A. Vista lateral. B. Vista medial de PREEMACS Rhesus average Surface mostrando la parcelación de cinco áreas que fueron analizadas. Empleando la parcelación de superficie se seleccionaron los vértices sobre los cuales se realizó el análisis descriptivo correspondiente a grosor cortical (Figura 12). PREEMACS. Evaluación Sustancia Blanca Superficial de PNH El experimento 3 y sus resultados, proporcionaron información que permitió adaptar el método de evaluación para la sustancia blanca yuxtacortical y superficie blanca superficial, de imágenes de humanos a imágenes de PNH. Este flujo de análisis inició con la ejecución de PREEMACS transversal, después PREEMACS Longitudinal y por último la ejecución PREEMACS evaluación de la SBS y Yuxtacortical (Figura 13), los pasos que ejecuta este último flujo de procesamiento se explican a continuación: A) Preprocesamiento DWI 1. Eliminación de ruido. Aplicación de un filtro que reduce el ruido aleatorio de las imágenes de difusión a través de un análisis local de componentes principales (Manjon eta al., 2013). D D M1 preSMA SMA F2 M1 Visual A P P A V V Vista Lateral Vista Medial A) B) 62 2. Corrección de distorsiones geométricas. Este artefacto derivado de las corrientes de eddy, inducidas por los gradientes durante el cambio entre una dirección y otra, fue corregido empleando la codificación de fase inversa en dos volúmenes de b=0 s/mm2 para estimar y corregir las distorsiones geométricas, empleado el comando eddy_correct (parte de los comandos de FSL , v.5.0.9, FIRMB software library). 3. Corrección de movimiento. Los volúmenes de DWI se registraron a la b=0 s/mm2 para la corrección de movimiento a través de las herramientas del programa FSL (v.5.0.9, FIRMB software library). 4. Tensor de difusión. El modelo de tensor fue ajustado a los datos DWI corregidos y se proceso para obtener mapas de fracción de anisotropía (FA), este ajuste se realizó empleando las herramientas de la suite de MRtrix (Tournier et al., 2013). B) Generación de Superficies Yuxtacorticales de PNH Generación de campos vectoriales Laplacianos. Con el objetivo de obtener gradientes en las coordenadas x,y,z y con ello generar streamlines con origen en cada uno de los vértices que constituyen a la superficie de sustancia blanca, la ecuación de Laplace fue aplicada a través de la herramienta minclaplace (https://github.com/Mouse-Imaging- Centre/minclaplace;Jones et al., 2001; Learch et al., 2008). Para su empleo fue necesario obtener la segmentación de los ventrículos, sustancia gris y blanca, las cuales fueron obtenidas de las segmentaciones de la ejecución de PREEMACS (Figura 12 A). Posteriormente los gradientes obtenidos se dirigen de la sustancia blanca hacia los ventrículos (Figura 13B). Generación de trayectorias laplacianas. Una vez obtenidos los vectores, streamlines son generados con pasos de 100 μm, empleando como punto de inicio las coordenadas x,y,z de cada uno de los vértices que integran a la superficie de sustancia blanca, obtenida posterior a la ejecución de PREEMACS (Figura 13C), dichos streamlines son generados empleando la herramienta stream3 de MATLAB 2020. Registro de mapas FA a volúmenes T1. Con el objetivo de poder emplear las superficies generadas en el espacio del volumen T1, un registro de la imagen de FA fue realizado al volumen T1 para con ello obtener coincidencia espacial. Esto se realizó empleando la herramienta ANTs (Advanced Normalization Tools, http://stnava.hithub.io/ANTs). 63 Cuantificación de FA en superficies yuxtacorticales. Una vez que los streamlines sintéticos fueron generados y con base en el mapa de FA, cada uno de los puntos espaciales de x,y,z puede tomar un valor de FA. Esto se realiza empleando la herramienta tcksample de la suite de herramientas para el procesamiento de DWI, MRtrix (Figura 13 D- E). Correspondencia de vértices. Los valores de FA asociados ahora a cada uno de los vértices que constituyen a las superficies yuxtacorticales, deben obtener correspondencia de vértices a lo largo de las adquisiciones longitudinales, para ello el comando IRMs_preproc de la suite FreeSurfer fue empleado (Figura 13 D-E). Finalmente, los valores pueden ser proyectados en superficie por sujeto o en un espacio promedio (template). Como resultado de este proceso, los valores de FA pueden obtenerse cada 100 μm, por debajo del límite de la corteza cerebral y de la sustancia blanca (Figura 13F). PREEMACS. Análisis de sustancia blanca yuxtacortical y superfical a lo largo del entrenamiento El análisis de la SBY y SBS se realizó seleccionando los vértices de cinco áreas, en ambos hemisferios: motora primaria (M1), áreas motoras secundarias (F2), área motora suplementaria (SMA), área motora presuplementaria (preSMA) y el área visual. Sobre los vértices de cada área, estadística descriptiva fue empleada para evaluar la modificación de SBY y SBS a lo largo del entrenamiento. 64 Figura 13. Generación de Superficies Yuxtacorticales (SYc). Posterior a la ejecución de PREEMACS cross y PREEMACS longitudinal, se realiza el preprocesamiento de imágenes de DWI. La construcción de SYc inicia con la generación de vectores Laplacianos (A,B). Posteriormente, con base en estos vectores, streamlines sintéticos son generados, usando como punto de inicio las coordenadas de los vértices de la sustancia blanca, obtenida del resultado de la ejecución de PREEMACS Longitudinal (C). Las coordenadas de los streamlines sintéticos son empleadas para obtener los valores de FA (D,E). Finalmente, se obtiene correspondencia de vértices para con esto poder comparar cada uno de los valores a lo largo de las adquisiciones longitudinales, dichos valores se proyectan en una superficie promedio(F,G). 65 Resultados Dos monos Rhesus Macaca Mulata, fueron entrenados en la ejecución de una tarea control de tiempo de reacción (TCTR) sin una estructura isócrona y en una tarea de sincronización a un metrónomo (TSM) visual y auditivo con una estructura rítmica, ambas tareas presentaron estímulos en la escala de los milisegundos. Durante el proceso de entrenamiento, imágenes de resonancia magnética estructural de alta resolución fueron adquiridas antes, durante y después de este, con el objetivo de realizar una descripción de los cambios neuroanatómicos asociados al aprendizaje durante el entrenamiento de ambas tareas. Para este objetivo cuatro experimentos fueron desarrollados. Los resultados del proyecto derivaron en dos publicaciones de primera autoría y cinco publicaciones en colaboración con diversos laboratorios extranjeros. La Figura 14, proporciona un panorama general de los resultados y de las publicaciones obtenidas a lo largo del proyecto. PREEMACS PREEMACS LONG Human Superficial White Mater Non-human primate Superficial White Mater Garcia-Saldivar, P., Garimella, A., Garza-Villarreal, E. A., Mendez, F. A., Concha, L., & Merchant, H. (2021). PREEMACS: Pipeline for preprocessing and extraction of the macaque brain surface. NeuroImage, 227, 117671. Wang, X., Li, X. H., Cho, J. W., Russ, B. E., Rajamani, N., Omelchenko, A., ... & Xu, T. (2021). U-net model for brain extraction: Trained on humans for transfer to non-human primates. Neuroimage, 235, 118001. Messinger, A., Sirmpilatze, N., Heuer, K., Loh, K. K., Mars, R. B., Sein, J., ... & Klink, P. C. (2021). A collaborative resource platform for non-human primate neuroimaging. NeuroImage, 226, 117519. Milham, M., Petkov, C. I., Margulies, D. S., Schroeder, C. E., Basso, M. A., Belin, P., ... & Zarco, W. (2020). Accelerating the evolution of nonhuman primate neuroimaging. Neuron, 105(4), 600-603. Garcia-Saldivar, P., de Leon, C., Concha, L., & Merchant, H. (2024). White matter structural bases for predictive tapping synchronization. elife. Desarrollo y estandarización de protocolos de adquisición de IRM estructural de PNH Adquisición pre-entrenamiento agua libre/restricción de agua Adquisición Entrenamiento Tarea Control. Tiempo de reacción sin estructura isocróna Adquisición Entrenamiento TSC. Metrónomo Visual Adquisición Entrenamiento TSC. Metrónomo Auditivo Entrenamiento y adquisición de imágenes Métodos de procesamiento y análisis de imágenes Pre - Entrenamiento A) Estímulo Respuesta Estímulo Respuesta Estímulo Respuesta T1w T2w FLAIR DWI Song, X., García-Saldivar, P., Kindred, N., Wang, Y., Merchant, H., Meguerditchian, A.,& Poirier, C. (2021). Strengths and challenges of longitudinal non-human primate neuroimaging. NeuroImage, 236. Poirier, C., Hamed, S. B., Garcia-Saldivar, P., Kwok, S. C., Meguerditchian, A., Merchant, H., ... & Fox, A. S. (2021). Beyond MRI: on the scientific value of combining non-human primate neuroimaging with metadata. NeuroImage, 228. Experimento 1 Experimento 2 Experimento 3 B) C) D) E) F) G) Experimento 4 Figura 14. Publicaciones obtenidas como resultado del desarrollo del proyecto. Las publicaciones de primera autoría (C y G) estuvieron asociadas al experimento 2 y 3. Las publicaciones de segunda autoría (B) derivaron del experimento 1. Otras publicaciones (B,D,E y F) estuvieron asociadas al experimento 2. Las flechas en color verde indican las publicaciones asociadas a cada uno de los experimentos o de sus diferentes fases. 66 67 Experimento 1.1. Conducta Tarea control de tiempo de reacción. Durante la tarea de tiempo de reacción (TCTR) los sujetos debían pasar su mano sobre un sensor en respuesta a cinco estímulos visuales que se presentaron en una secuencia separados por un intervalo inter-estímulo aleatorio (seleccionado de forma aleatoria entre 450 y 1000 ms), impidiendo que los sujetos pudieran predecir la ocurrencia del siguiente estímulo. El objetivo del entrenamiento fue reducir al mínimo posible el tiempo de reacción ante la presentación de los estímulos, teniendo como referencia ~ 300 - 500 ms, según lo reportado por Takeya y colaboradores en 2017, teniendo un 75% de ensayos correctos. Tres IRM fueron adquiridas durante el entrenamiento de esta tarea. En la Figura 15, se puede observar la reducción del tiempo de reacción a lo largo del entrenamiento en tres puntos. El entrenamiento inició, con la respuesta a dos estímulos y finalizó con la ejecución de tres movimientos. El tiempo de reacción promedio M01, al inicio del entrenamiento fue de 662 ± 77.80 ms para el tap 1 y 486 ± 145 ms para el segundo tap (Figura 15.A), en tanto que el M02 alcanzó una media de 434.84 ± 71.85 ms para el tap 1 y 355 ± 73.59 ms para el segundo tap (Figura 15. A). Para la mitad del entrenamiento la reducción del tiempo de reacción fue de 94.37 ms y 61 ms para el M01 y 9.71 ms y 10 ms para el M02, para el tap 1 y 2 respectivamente, observando una reducción significativa en la desviación estándar para las ejecuciones de ambos sujetos. El entrenamiento finalizó con la ejecución de tres movimientos en respuesta al estímulo con una media de 530 ± 108 ms para el M01 y 473 ± 42 ms para el M02. Las ANOVAS realizadas para cada uno de los puntos, mostraron que el M02 obtuvo tiempos de reacción más cortos que el M01 (F(2,325)= 0.75, P < 0.00001). Con respecto a las diferencias entre el tiempo de reacción en la tarea control y las asincronías de la tarea de sincronización a un metrónomo en la modalidad visual, se observaron efectos significativos de la tarea (F(1,361)= 3.7, P < 0.00001) y la interacción tarea-intervalo blanco(F(5,209)= 11.5, P <0.00001). La prueba post hoc Tukey para múltiples comparaciones mostró diferencias significativas entre todas las combinaciones de las tareas y los intervalos objetivo. Lo anterior, indico que, aunque los sujetos no presentaran asincronías negativas en la TSM, sus respuestas en esta tarea presentaron duraciones más cortas en comparación con los tiempos de reacción de la TCTR, 68 respaldando la hipótesis de que los sujetos emplean un mecanismo para la predicción temporal al ejecutar la TSM, lo que previamente ya ha sido descrito por Zarco y colaboradores (2009). Figura 15. Análisis conductual. Tarea Control de Tiempo de Reacción. A. Comparación del tiempo de reacción de ambos sujetos ejecutando 2 movimientos en un rango temporal de 700 ms a 1 seg, El tiempo de reacción promedio M01, al inicio del entrenamiento fue de M01 fue de 662 ± 77.80 ms para el tap 1 y 486 ± 145 ms para el segundo tap , en tanto que el M02 alcanzó una media de 434.84 ± 71.85 ms para el tap 1 y 355 ± 73.59 ms para el segundo tap B. Comparación del tiempo de reacción de cada uno de los sujetos ejecutando 2 movimientos en un rango temporal más amplio (450 ms a 1 seg), se observó una reducción del tiempo de reacción: 94.37 ms y 61 ms para el M01 y 9.71 ms y 10 ms para el M02, para el tap 1 y 2 respectivamente, observando una reducción significativa en la desviación estándar para las ejecuciones de ambos sujetos. C. Comparación del tiempo de reacción ejecutando 3 movimientos rango temporal (450 ms a 1 seg). El entrenamiento finalizó con la ejecución de tres movimientos en respuesta al estímulo con una media 530 ± 108 ms para el M01 y 473 ± 42 ms para el M02. Las ANOVAS realizadas para cada uno de los puntos, mostraron que el M02 obtuvo tiempos de reacción más cortos que el M01 (F(2,325)= 0.75, P < 0.00001). Asimismo, la prueba post hoc Tukey para múltiples comparaciones mostró diferencias significativas entre todas las combinaciones de las tareas y los intervalos objetivo. 69 Tarea de Sincronización a un Metrónomo (TSM) La TSM consistió en dos fases: metrónomo y sincronización. El metrónomo visual consistió en un cuadrado amarillo, presentado durante 33 ms., para definir intervalos aleatorios de 450, 550, 650, 750 o 850 ms. Posteriormente en la fase de sincronización los estímulos continuaron siendo presentados y los sujetos tenían que ejecutar movimientos sincronizados a la presentación del estímulo. Derivado de la ejecución de la TSM, la métrica de asincronías fue calculada. Estas fueron definidas como la diferencia del tiempo entre la presentación del estímulo y la respuesta (ver Figura 6 panel B), permitiendo evaluar la diferencia de fase entre la temporalización interna y el metrónomo externo (Reep y Su, 2013). La Figura 16 panel C presenta los datos finales del entrenamiento para la TSM, en ambas modalidades, para ambos sujetos. En la TSM en la modalidad visual (TSMv), los sujetos se sincronizaron a 5 intervalos. El sujeto M01 pudo ejecutar asincronías cercanas a 0 para los intervalos de 550,650 y 750 ms (14.23 ± 32.08, 13.50 ± 28.56,10.50 ± 43.3 ms), en tanto que el M02 tuvo asincronías positivas más grandes alrededor de los 50 ms (53.58 ± 53.46, 61.28 ± 43.3, 56.48 ± 48.86), estas diferencias sólo fueron significativas para el intervalo de 550 (P< 0,0001). Con respecto a la TSM en la modalidad auditiva (TSMa), los sujetos se instruyeron para sincronizarse a 4 intervalos. Al igual que en la TSMv el sujeto 01, para los intervalos 550,650 y 750 ms, las asincronías estuvieron cercanas a 0 (15.99 ± 35.83, 10.65 ± 48.29, 6.85 ± 48.57) en comparación el sujeto M02 presentó asincronías mayores, cercanas a los 75 ms (101.8 ± 19.190, 73.45 ± 20.20, 58.77 ± 25.88), estas diferencias fueron significativas para los 4 intervalos (P< 0.0001). Se realizó un ANOVA de medidas repetidas sobre las asincronías de cada modalidad de metrónomo (auditiva y visual: 2 niveles) y duración del intervalo instruido (550, 650, 750, 850 ms: 4 niveles) como factores. El ANOVA mostró efectos principales significativos para la duración (F(3,167.81) P< 0,00001), modalidad (F(1,442) P< 0,0001) y entre sujetos (F(1, 17.68 P < 0,0001)), pero no una interacción significativa entre duración x modalidad. La corrección post-hoc de Tukey para múltiples comparaciones mostró asincronías significativamente mayores para la modalidad visual que auditiva en las tres duraciones (P <0.0001 para 550, 650 y 750). 70 Figura 16. Entrenamiento en la Tarea de Sincronización a un metrónomo visual y auditivo. A. Resultados conductuales en el primer punto de adquisición de IRM. El inicio del entrenamiento para cada una de las modalidades tuvo diferentes intervalos, 550 ms y 850 ms para la modalidad visual y 650 ms y 850 ms para la modalidad auditiva. Para ambos sujetos, en ambas modalidades, la sincronización para intervalos largos fue más sencilla, existiendo diferencias significativas sólo para la ejecución del M02 en la modalidad auditiva (P < 0.0001). B. La segunda adquisición correspondió a la sincronización de 5 intervalos para la TSMv y 4 para la TSMa, ejecutando 5 taps. Se puede observar una reducción de las asincronías para ambas modalidades en ambos sujetos, sin embargo, las asincronías para el M02 en la modalidad auditiva fueron mayores significativamente (P < 0.0001), en todos los intervalos, en comparación con las ejecutadas por el M01, acentuando las diferencias individuales. C. Asincronías al finalizar el entrenamiento, observando que los sujetos ejecutaron asincronías positivas cercanas a 0, no obstante, el sujeto M02 presentó asincronías cercanas a los A) B) C) 71 75 ms, estas diferencias fueron significativas para los 4 intervalos (P < 0.0001). Colores azules datos correspondientes al M01, colores amarillos datos M02. Todas las gráficas representan el promedio de datos adquiridos durante 5 días de entrenamiento. Figura 17. Entrenamiento y condiciones de adquisición de IRM. Las IRM fueron adquiridas en 6 condiciones del diseño experimental, en 16 puntos temporales. Días. Describe el tiempo acumulado entre puntos de adquisición. ∆t: Días transcurridos entre los diferentes tiempos de adquisición. Horas: tiempo de entrenamiento para cada punto de adquisición. Los puntos de adquisición en las fases de entrenamiento corresponden a los siguientes elementos conductuales: P1 – P4. Corresponde a puntos control para la evaluación del efecto de la deprivación de agua en los sujetos, sobre las IRM´s. P5. Tarea Control. Asociación palanca – pasar la mano a través de un sensor de movimiento. P6 , P7 y P8. Entrenamiento de 2 movimientos en reacción a estímulos visuales con un rango de presentación intervalos de entre 700 ms a 1 seg y 450 ms a 1 seg, respectivamente. P9 y P10. Periodo de descanso entre tareas. P11, P12 y P13. Corresponden al entrenamiento en 2 intervalos (550 y 850) generando 2 taps, 5 intervalos (450,550,650,750,850), 5 taps, 5 intervalos, 7 taps, respectivamente, en la modalidad visual. P14. 2 intervalos (550 y 850 ms) generando 2 taps, P15 y P16. Entrenamiento en la modalidad auditiva, con la misma estructura de entrenamiento que en la modalidad visual a excepción de los intervalos iniciales (650 y 850 ms) y el total de intervalos (550,650,750,850 ms). Las Figuras 14 y 15 muestran los resultados conductuales asociados a cada punto de adquisición. 72 Experimento 1.2. Entrenamiento El objetivo del entrenamiento consistió en la ejecución de un ritmo isócrono a intervalos de 450,550,650,750 y 850ms guiado por un metrónomo visual y auditivo, disminuyendo al mínimo posible las asincronías alrededor de los ±70 ms (Zarco et al., 2009; Gamez et al., 2018), con un sesgo a asincronías negativas. Denotando que los sujetos no contaban con algún entrenamiento previo. El entrenamiento se llevó a cabo en sesiones promedio de 3 horas cada una, de lunes a sábado, permitiéndoles a los sujetos experimentales descanso de un día con acceso a agua libre. El tiempo total de entrenamiento fue de 476 y 620 días, para el M01 y M02, respectivamente (Figura 16. P5-P8, TCTR; P11-P13, TSMv y P14-P16; TSMa). Equivalentes a 1410 hrs. para el sujeto 1 y 1860 hrs para el sujeto 2. La TSMa constituyo el 54% y 53 % (M01 y M02) del total del tiempo del entrenamiento para ambos sujetos. La Figura 17 describe el diseño de entrenamiento final del presente trabajo, constituido por 4 fases y 12 puntos de adquisición, definidos por los siguientes elementos conductuales: P5. Correspondió a la adaptación de los sujetos al set up, consistente en: sentarse tranquila y cómodamente en la silla de trabajo, inmovilización de la mano izquierda durante la ejecución de las tareas, asociación de: colocar su mano derecha en la palanca para iniciar la tarea y posteriormente pasar su mano por un sensor que detectaba el movimiento. El tiempo promedio para que los sujetos lograran la adaptación al set–up fue de aproximadamente un mes, equivalente a 102 y 90 horas para M01 y M02, respectivamente. P6 y P7. Correspondieron al entrenamiento de la ejecución de 2 movimientos en reacción a estímulos visuales, con un intervalo de presentación de entre 700 ms a 1 segundo y 450 ms a 1 seg, respectivamente para P6 y P7. El objetivo de ambos puntos fue la reducción del tiempo de reacción. El tiempo de entrenamiento para cada uno de estos puntos fue de 34 y 44 días para el M01 y M02. La correlación conductual puede observarse en la Figura 15 panel A y B. P8. El entrenamiento de la TCTR finalizó con la ejecución de tres movimientos en reacción a intervalos de entre 450 ms a 1 seg., sin estructura isócrona. El tiempo total del entrenamiento para esta tarea fue de 78 días para el M01 y de 89 para el M02. Es importante mencionar, que el tiempo de entrenamiento para ambos sujetos fue similar y en esta tarea 73 el sujeto M02 mostró menores tiempos de reacción en comparación con el sujeto M01 (Figura 15. Panel C). P11 a P13. La Tarea de Sincronización a un Metrónomo Visual (TSMv) inició con el entrenamiento a 2 intervalos (550 y 850 ms) definidos por un estímulo visual, el cuál presentaba un ritmo isócrono y los sujetos debían realizar dos movimientos en sincronía a estos (P11). El entrenamiento tuvo una duración de 46 y 60 días, para M01 y M02, respectivamente. P12 correspondió a la ejecución de 5 movimientos en alineación con 5 intervalos isócronos (450,550,650,750 y 850 ms), la duración del entrenamiento fue de 55 y 80 días, para M01 y M02, respectivamente. P13 correspondió al entrenamiento final de la TSMv sincronizando 7 movimientos isócronos a intervalos de 450,550,650,750 y 850 ms. En total la duración del entrenamiento para la TSMv fue de 136 días (4.5 meses, equivalentes a 408 hrs de entrenamiento) para M01 y 200 días (6.6 meses, equivalentes a 200 horas de entrenamiento) para M02. P14-P16. Para la sincronización a estímulos auditivos la TSMa, inició con el entrenamiento a 2 intervalos (650 y 850 ms), con 2 movimientos sincronizados. P15. correspondió a la ejecución de 5 movimientos en alineación con 4 intervalos isócronos (550,650,750 y 850 ms), la duración del entrenamiento fue de 97 y 124 días, para M01 y M02, respectivamente. P16. Correspondió al entrenamiento final, con una estructura de sincronización de 7 movimientos a 4 intervalos (550,650,750 y 850 ms). La duración del entrenamiento en esta tarea fue de aproximadamente el doble del requerido para la TSMv, 256 dias (8.5 meses, equivalentes a 768 hrs de entrenamiento) y 331 días (11.1 meses, equivalentes a 993 horas de entrenamiento). Es importante mencionar que el M02 requirió de mayor tiempo de entrenamiento, en comparación con el M01 y su performance no alcanzó lo observado para este sujeto, el cual tuvo mejor desempeño. Lo que podría asociarse con la teoría de que en los primates no humanos al igual que en los humanos existen amplias diferencias en la precisión, exactitud y en la predicción del movimiento de sincronización (Merchant et al., 2024). Experimento 1.3. Protocolo para la adquisición de IRM de PNH Este trabajo permitió: la creación de protocolos para la adquisición de imágenes por resonancia magnética (T1W, T2w, FLAIR y DWI) de alta resolución, una base de datos de alto valor para el campo de los estudios longitudinales y cambios neuroestructurales asociados al entrenamiento en PNH, así como el desarrollo, implementación y validación 74 de 4 pipelines (flujo de pasos) de ejecución automatizada y sin intervención manual para el procesamiento y análisis de IRM de PNH. Figura 18. Imágenes de Resonancia Magnética estructural de mono Rhesus N=1. A,B,C y E Corte axial al inicio del surco lateral. A. Imagen ponderadas en T1. B. Imagen ponderada en T2. C. Imagen secuencia FLAIR. Observe el contraste óptimo en T1 que permite diferenciar la sustancia gris de la sustancia blanca. D. Resultado del protocolo de imágenes ponderadas a difusión. La base de datos obtenida se integra por IRMs de dos primates no humanos (Macaca Mulata), constituida por: 96 IRM secuencia T1w, 64 secuencia T2w, 16 secuencia FLAIR, 256 imágenes B0 ponderadas a difusión, 96 DWI sensibilizadas a 1000 s/mm², 2000 s/mm² y 3000 s/mm², aplicados en 18, 64 y 128 direcciones únicas de difusión, respectivamente, adquiridas 3 veces. Colectadas de forma longitudinal a lo largo de aproximadamente 18 meses. Asimismo, la base de datos cuenta con metadatos (Poirier et al., 2021) que incluyen: control de fluidos (información sobre el nivel de hidratación de los sujetos antes de las IRM), pastilla de identificación del lado derecho de cada sujeto y datos de entrenamiento. La A) B) C) D) 75 Figura 18 presenta un ejemplo de la calidad de las imágenes obtenidas en cada punto de adquisición. La base datos, además de los objetivos iniciales, puede ser empleada para la aplicación de diversos modelos de procesamiento de imágenes de difusión, dadas las características de adquisición. Como ejemplo, la Figura 19 presenta los resultados de la aplicación del modelo de deconvolución esférica (CSD) a los datos obtenidos en un punto de adquisición. El modelo de CSD permite la estimación de propiedades de varias fibras en un mismo voxel (Tournier et al., 2007, 2013, 2019). Figura 19. Procesamiento de imágenes ponderadas a difusión. A. Procesamiento de DWI a través del método de deconvolución esférica (CSD). B. Corte coronal del mapa de distribución de la orientación de fibras (FOD´s). Asimismo, se observa la orientación de fibras que permiten estimar y cuantificar propiedades de varias poblaciones de fibras en un mismo voxel. C. Tractografia de cerebro completo a través del método de deconvolución esférica sobre el mapa de FOD´s. D. Tractografía tridimensional de cerebro completo obtenida a través del método de CSD. C) D) A) B) 76 Experimento 1.4. Evaluación del efecto del nivel de hidratación. Control de fluidos Durante el entrenamiento, los sujetos fueron deprivados de agua, consumiendo un 70% de lo que consumían en un estado ad libitum. Asimismo, se ha descrito que el nivel de hidratación puede influir en la estimación de grosor cortical (Meyers et al., 2016). Por lo anterior y con el objetivo de estimar como la deprivación de agua podía influir en el análisis de los cambios estructurales de forma longitudinal, un experimento como prueba de concepto fue desarrollado. Los resultados se muestran en la Figura 20. Se observó que el efecto de hidratación generó variabilidad (escaneo-rescaneo) en el grosor cortical durante condiciones de agua libre y control de agua. Los escaneos P1 y P2 se adquirieron cuando el sujeto tuvo acceso ilimitado al agua durante un mes y estuvieron separados por 13 días. P3 se adquirió al final de un período de control de fluidos de 24 días que comenzó inmediatamente después de P2. El protocolo de control de agua consistió en el acceso al 70% de la ingesta libre, 6 días a la semana. Las regiones de interés se eligieron al azar. GC. Grosor cortical. AMS. Área Motora Suplementaria. AMS-pre. Área motora pre- suplementaria. Una prueba t pareada, p < 0.0001, mostró diferencias significativas en todas las áreas evaluadas, observando una diferencia de pequeña amplitud. Por lo anterior, se decidió generar un protocolo de hidratación antes y después de cada uno de los puntos de adquisición. 77 Figura 20. Variabilidad de escaneo-rescaneo en el grosor cortical durante condiciones de agua libre y control de agua en un macaco Rhesus. Los escaneos P1 y P2 se adquirieron cuando el sujeto tuvo acceso ilimitado al agua durante un mes y estuvieron separados por 13 días. P3 se adquirió al final de un período de control de fluidos de 24 días que comenzó inmediatamente después de P2. El protocolo de control de agua consistió en el acceso al 70% de la ingesta libre, 6 días a la semana. Las regiones de interés se eligieron al azar. GC. Grosor cortical. AMS. Área Motora Suplementaria. AMS-pre. Área motora presuplementaria.*prueba t pareada, p < 0,0001. Observe que la diferencia es de pequeña amplitud, pero consistente en todas las regiones del cerebro. Experimento 2. PREEMACS Para evaluar la generalización del método, se probó el flujo de trabajo de PREEMACS con el conjunto de datos de la base PRIME-DE (Milham et al., 2018). Cincuenta y dos imágenes de PRIME-DE más cinco imágenes de nuestra base de datos UNAM-INB cumplieron con los requisitos de inclusión. Así, se empleó un total de cincuenta y siete imágenes de monos de once sitios de diferentes partes del mundo para evaluar todos los módulos de PREEMACS. La Tabla 1 presenta una descripción detallada de la cantidad de imágenes utilizadas en los diferentes módulos de PREEMACS. 78 Proceso Número de sujetos Nombre de base de datos Evaluación de la generalización del flujo de procesamiento PREEMACS 52 PRIME-DE PREEMACS. Superficie cerebral promedio de mono Rhesus 33 PRIME-DE y UNAM-INB PREEMACS herramienta de mascara de cerebro 126 PRIME-DE, UNAM-INB, UNC- WISCONSIN MRIqc modelo de clasificación 57 PRIME-DE, UNAM-INB Desarrollo de PREEMACS 5 UNAM-INB Tabla 1. Número de imágenes empleadas a través del desarrollo y validación de los diferentes módulos de PREEMACS. PREEMACS. Herramienta de segmentación de cerebro Un método para segmentación de tejido cerebral fue desarrollado, este método se basó en un algoritmo de Deeplearning que obtiene máscaras de cerebro precisas, resolviendo un problema fundamental en las estimaciones basadas en superficies. La Figura 20A muestra los valores de Sensibilidad, Especificidad y DICE para 126 máscaras obtenidas con la herramienta de máscara de tejido cerebral de PREEMACS. Estas métricas fueron diseñadas para evaluar la superposición entre la máscara calculada y la segmentación manualmente, con valores entre cero (sin superposición) y uno (superposición perfecta) (ver Métodos). Los resultados mostraron valores cercanos a uno para las tres métricas en todos los sitios con una media para DICE de 0.97 ± 0.009, Sensibilidad de 0.96 ± 0,01 y Especificidad de 0.99 ± 0.0006, lo que respalda la noción de que la implementación de Deep Neural Network, para la extracción del cráneo fue muy sólida en una amplia variedad de imágenes y sitios. Sin embargo, la sensibilidad mostró valores entre 1 y 0.9, lo que indica cierto grado de tasa de falsos negativos y, por tanto, que las máscaras predichas eran más pequeñas que las de referencia. Esto puede explicarse por la tendencia a sobreestimar una máscara dibujada manualmente. En cambio, los falsos positivos fueron muy escasos ya que la especificidad era muy cercana a uno. De hecho, la Figura 21B ilustra la clara segmentación de cinco máscaras cerebrales calculadas a partir de imágenes recopiladas de diferentes sitios. 79 Figura 21. Rendimiento de la herramienta de segmentación de cerebro PREEMACS. A. Gráficos de violín para las métricas: DICE, Sensibilidad y Especificidad calculadas en 18 sitios (codificados por colores, ver recuadro) para 126 imágenes de monos. B. Máscaras cerebrales (rojas) para cinco monos de diferente procedencia. Predicción de la calidad de la superficie basada en métricas Utilizando 58 métricas de calidad, se entrenó a SVM para clasificar imágenes estructurales volumétricas. Empleando PREEMACS se obtuvieron 57 superficies, que fueron clasificadas en 3 grupos: errores mínimos, medianos y grandes. Se inició con una puntuación visual (ver anexo B) de las propiedades de las imágenes estructurales volumétricas para predecir con SVM la calidad/confiabilidad de las superficies de salida. El rendimiento del clasificador mostró un 66 % ± 1.9 (media ± STD) de predicciones correctas, considerablemente más alto que el azar (33.3%, para 3 clases). Sin embargo, planteamos la hipótesis de que no todas las métricas contienen información útil para predecir la calidad de las superficies obtenidas. Por lo tanto, seleccionamos aquellas métricas que maximizaron la clasificación según el análisis de grafos (ver Anexo B). En particular, cinco métricas mostraron un gran poder de agrupación para distinguir entre categorías de superficie (Figura. 22B), formando un “clique” máximo con un alto grado de centralidad (Figura. 22C. D). Estas métricas de calidad fueron: resumen del percentil 5 de sustancia gris (SGmP05), relación señal-ruido de SG (SNR gm), mapeo probabilístico de tejido para SB y SG (TMP sb/sg) y fracción de 80 volumen de LCR (consulte la Tabla 2, ordenada por relevancia). El SVM empleó solo estas cinco métricas de calidad, mostrando un aumento en el rendimiento del 72.8 ± 1.6 %, lo que respalda la hipótesis de que las métricas de calidad importantes pueden predecir el resultado de PREEMACS. Este resultado también sugiere que las métricas de calidad restantes son características que no contienen información para predecir la calidad de las superficies obtenidas e incluso pueden agregar ruido al procedimiento de clasificación (Pavlidis et al., 2004). Figura 22. Evaluación de agrupamiento de las métricas de calidad de IRM. A. Cálculo del umbral de extracción de grafo, empleando la densidad de conexiones de los grafos calculada con la puntuación de Calinski-Harabasz. La línea roja corresponde al umbral que minimizó la densidad de las conexiones. B. Grado de centralidad de todas las métricas como nodos del grafo. Tenga en cuenta que sólo cinco métricas muestran una gran interrelación dentro del grafo, lo que indica su gran capacidad para disociar las superficies de resultados. C. Grafo extraído en el umbral. D. Máximo “clique”. Métrica Descripción Valor Resumen SG p05 Calcula el percentil 5 de la distribución de la intensidad de la sustancia gris. Los valores más cercanos al valor de la mediana indican una estimación precisa de la SG. (Esteban et al., 2017). 81 Relación señal-ruido (SNR SG) Calcula la relación señal-ruido en la sustancia gris. Los valores más altos son indicativos de un ruido más bajo. Por lo tanto, se prefieren valores más altos. (Dietrich et al., 2007). Mapeo probabilístico de tejidos Esta métrica calcula la superposición entre los mapas de probabilidad de tejidos estimados a partir de la IRM y los mapas de probabilidad calculados a partir de la una IRM promedio de PNH. Los valores más cercanos a 1 indican una alta similitud con la IRM promedio, aunque los valores que se desvían pueden indicar inconsistencias en la imagen o en las características de la imagen individual (Esteban et al.,2017). Fracción de volumen Estimación de la fracción de volumen de cada tejido (SB, SG) y de LCR, calculada sobre la segmentación realizada por el programa FSL denominada FAST. Los valores normativos caen alrededor del 50 %, 28 % y 12 % para SG/SB y LCR respectivamente (Seidlitz et al., 2018). Tabla 2. Métricas con interacciones de nodos significativos que forman un máximo “clique” con un alto grado de centralidad. Atlas de segmentación de PREEMACS Se construyó una segmentación para PNH con etiquetas de estructuras corticales y subcorticales para obtener una estimación precisa de superficie cerebral en el Módulo 3. La Figura 23 presenta la estimación de etiquetas volumétricas en el espacio NMT (Seidlitz et al., 2018). Se estimaron los volúmenes de estructuras subcorticales a partir de 57 imágenes de monos utilizando este atlas de segmentación, disponible para descargar en un repositorio de GitHub (https://github.com/pGarciaS/PREEMACS). 82 Figura 23. Atlas de segmentación de PREEMACS. A-D. Secciones axiales del cerebro en cuatro niveles ventrodorsales que se muestran en el recuadro de A. gb, ganglios basales; tc, tallo cerebral; cca, cuerpo calloso anterior; ccma, cuerpo calloso medio anterior; ccm, cuerpo calloso medio; ccc, cuerpo calloso central; ccmp, cuerpo calloso medio posterior; sgc, sustancia gris cerebelosa; cl, claustro; sbc, sustancia blanca cerebelosa; sg, sustancia gris; vl, ventrículo lateral; hmp, hipocampo; tl, tálamo; dcv, diencéfalo ventral; sb, sustancia blanca. Registro de la curvatura y convexidad: archivo de parametrización PREEMACS Rhesus Para obtener la correspondencia de vértices entre sujetos y comparar características anatómicas entre animales, es fundamental alinear cada superficie de mono con una superficie de referencia genérica de mono Rhesus. Se ejecutó un procedimiento iterativo en 33 imágenes de monos (20 con errores de superficie mínimos y 13 con errores de superficie medios, ver en la siguiente sección) para obtener un estándar de mono Rhesus para los patrones de curvatura y convexidad de la sustancia blanca, al que se nombró archivo de parametrización PREEMACS Rhesus (ver Anexo B). Este archivo incluye nueve parámetros que caracterizan completamente la geometría de los surcos corticales del mono. La Figura 24 A muestra la imagen promedio del patrón de datos de curvatura resultando en una imagen deformada en 2-D, que es uno de los nueve elementos del archivo de parametrización de PREEMACS Rhesus. Cualitativamente, cada surco esperado está asociado con una región cóncava en el promedio del patrón deformado (Figura 24). Todas las superficies de los sujetos se registraron en este espacio común, pudiendo expresarse en un sistema de coordenadas esféricas estándar (es decir, longitud y latitud) para indexar un punto en los pliegues de la superficie cortical para un sujeto determinado. La Figura 24 B-D muestra una vista lateral, sagital medial y posterior de la superficie promedio de SB como una esfera unitaria, que define la relación geométrica entre 83 todos los surcos de un cerebro promedio de mono Rhesus. La esfera promedio se emplea para registrar todos los sujetos al final del análisis de superficie. Figura 24. Patrón de curvatura y esfera promedio PREEMACS Rhesus. A. Patrón promedio de datos de curvatura deformada en 2-D. Este patrón de datos de curvatura es uno de los nueve elementos del archivo de parametrización PREEMACS Rhesus empleado como promedio para alinear las superficies y obtener correspondencia de vértices entre los sujetos. B, C y D. Superficie promedio de SB izquierda inflada como una esfera (vista lateral, sagital medial y posterior, respectivamente). Surcos etiquetados como referencia: surco arqueado; cas, surco calloso; cc, surco calcarino; cgs, surco cingulado; cs, surco central; ecal, surco calcarino externo; ias, surco arqueado inferior; iccs, surco calcarino inferior; ios, surco occipital inferior; ips, surco intraparietal; ls, surco lateral; lus, surco semilunar; ms, surco marginal; ots, surco occipitotemporal; pos, surco parietal-occipital; prs, surco principal; ros, surco rostral; sas, surco arqueado superior; sccs, surco calcarino superior; sbps, surco subparietal; pts, surco temporal superior; mw, pared medial; sH, espacio del hipocampo. Superficies promedio Las superficies promedio de SB y pial con 163.842 vértices por hemisferio se representan en las Figuras 25 y 26, respectivamente. Las vistas lateral, sagital medial y ventral de las superficie promedio muestran una alta fidelidad anatómica con un cerebro real de mono, sin artefactos aparentes en el patrón de curvatura en todos los surcos (Figura 25) y giros (Figura 26). Las superficies individuales de SB y pial se registran a esta superficie promedio para grosor cortical y análisis de girificación con una correspondencia de vértice uno a uno, lo que permite análisis de grupo en un espacio común de mono Rhesus. 84 Figura 25. Superficie de SB promedio de PREEMACS Rhesus muestra el patrón de datos de curvatura. A. Vista dorsal. B. Vista lateral. C. Vista ventral. D. Vista sagital medial. Surcos etiquetados como referencia: cas, surco calloso; cc, surco calcarino; cgs, surco cingulado; cs, surco central; ecal, surco calcarino externo; ias, surco arqueado inferior; iccs, surco calcarino inferior; ios, surco occipital inferior; ips, surco intraparietal; los, surco orbitario lateral; ls, surco lateral; lus, surco semilunar; ms, surco marginal; mos, surco orbitario medial; olfs, surco olfatorio; ots, surco occipitotemporal; pos, surco parietal-occipital; prs, surco principal; ros, surco rostral; sas, surco arqueado superior; sbps, surco subparietal; sccs, surco calcarino superior; spcd, surco precentral superior; pts, surco temporal superior. 85 Figura 26. Superficie pial promedio de PREEMACS Rhesus que muestra el patrón de datos de curvatura. A. Vista dorsal. B. Vista lateral. C. Vista ventral. D. Vista sagital media. Los surcos y circunvoluciones están etiquetados como referencia. Surcos: cas, surco calloso; cc, surco calcarino; cgs, surco cingulado; cs, surco central; ecal, surco calcarino externo; ias, surco arqueado inferior; iccs, surco calcarino inferior; ios, surco occipital inferior; ips, surco intraparietal; los, surco orbitario lateral; ls, surco lateral; lus, surco semilunar; ms, surco marginal; mos, surco orbitario medial; olfs, surco olfatorio; ots, surco occipitotemporal; pos, surco parietal- occipital; prs, surco principal; ros, surco rostral; rhs, surco rinal; sas, surco arqueado superior; sbps, surco subparietal; sccs, surco calcarino superior; spcd, surco precentral superior; pts, surco temporal superior. Circunvoluciones: SFG, circunvolución frontal superior; AG, circunvolución angular; ASPG: circunvolución parietal anterosuperior; CgG, giro cingulado; Cu, cuneus; GR, giro recto; ICgG, istmo de la circunvolución del cíngulo; IFG, circunvolución frontal inferior; ITG, giro temporal inferior; LOrg, circunvolución orbitaria lateral; MG: giro marginal; MFG, circunvolución frontal media; MOrg, circunvolución orbitaria medial; OG, giro occipital; PCG: circunvolución poscentral; PCu, precúneo; PhG, circunvolución parahipocámpica; PrCG, circunvolución precentral; STG, giro temporal superior. McGill MountSinai-P OHSU Princeton UCDAVIS A B C SitioSujetos Si tio Errores minímos Errores medianos Grandes errores Generalización de PREEMACS e identificación de errores superficiales. Cincuenta y siete conjuntos de imágenes de once sitios diferentes de la base de datos Primate Data Exchange (PRIME-DE) fueron procesadas con PREEMACS. Las superficies resultantes se evaluaron en busca de errores mediante una prueba de inspección visual que incluía criterios de suavidad de las superficies y segmentación (ver Anexo B). Dado que el sitio representó una gran fuente de variabilidad entre las imágenes, comparamos los errores de prueba de los once sitios (Figura 27 A). En particular, las superficies de 20 de 57 imágenes de monos, de 8 sitios mostraron errores mínimos que necesitaron una corrección manual insignificante o nula (Figura 27 A). En la Figura 27C se muestran las superficies piales y de sustancia blanca de sujetos representativos con errores de superficie mínimos para cinco sitios. Los errores de segmentación más comunes (Figura 27 B y Figura 29) se ubicaron en la sustancia blanca parahipocampal (Figura 28 A), el polo frontal (Figura 28B), la corteza occipital (Figura 28C) y la corteza cingulada anterior (Figura 28D). El tiempo promedio para corregir estas imágenes por parte de un experto utilizando las herramientas de corrección manual del software FreeSurfer fue de aproximadamente 10 minutos. 13 y 30 de las superficies de los sujetos mostraron errores medianos y grandes, respectivamente. Figura 27. Evaluación de errores en las superficies corticales obtenidas con PREEMACS en todos los sitios. A. Superficie pial (izquierda) y sustancia blanca (derecha) de monos representativos con errores de superficie mínimos para cinco sitios etiquetados en el eje x. B. Frecuencia de sujetos con errores mínimos, medianos y grandes en las superficies corticales obtenidas de la ejecución de PREEMACS en función del sitio (n = 11). C. Número de sujetos con errores mínimos en B que mostraron errores de segmentación en cinco áreas corticales, en siete sitios. El área sombreada en gris corresponde al número total de sujetos con errores mínimos para 86 87 cada sitio; cada sujeto puede tener una o más áreas con errores mínimos. PHwm, sustancia blanca parahipocampal; FPwm, sustancia blanca en polo frontal; TmpAC, corteza temporal anterior; Owm, sustancia blanca occipital; Acc, corteza cingulada anterior. Figura 28. Errores de segmentación “mínimos” más comunes. A. Sustancia blanca Parahipocampal (PHsb). B. Sustancia blanca del Polo frontal (FPsb) C. Sustancia blanca Occipital (Osb). D. Corteza cingulada anterior (Acc). Línea azul para pial y línea amarilla para superficie de sustancia blanca. Se muestra un individuo diferente en cada panel. Grosor cortical Se cálculo el grosor cortical de la superficie promedio de PREEMACS Rhesus restando la superficie de sustancia blanca de la superficie pial. Siendo evidente en la Figura 30 A que el grosor cortical del mono Rhesus no es homogénea, con una corteza más gruesa en el lóbulo frontal, especialmente en la corteza motora primaria, y una corteza más delgada en el lóbulo occipital, corroborando resultados previos (Naselaris et al., 2006); Calabrese et al., 2015; Seidlitz et al., 2018). Además, se comparó el grosor cortical de 662 vértices dentro del ROI en la corteza motora primaria izquierda (M1) representada en la Figura 30 B para las tres categorías de clasificación de las superficies (errores mínimos, medianos o grandes) definidas por la prueba de inspección visual (Figura 29). El promedio de grosor cortical para este ROI fue similar en las tres categorías de clasificación (cinco sujetos por categoría, Figura 30B). Sin embargo, la dispersión del grosor cortical fue considerablemente mayor para las superficies con grandes errores de segmentación (Figura 30 B, C). 88 Figura 29. Ejemplos de estimaciones de superficie. A) Errores mínimos en las estimaciones de superficie: Los errores de segmentación simples (flechas) se corrigen fácilmente utilizando las herramientas disponibles en FreeSurfer. B) Errores medios: además de los errores de segmentación corregibles (flechas), la superficie de la sustancia blanca es irregular en todo el cerebro, a menudo como resultado de la baja resolución de las imágenes de entrada. C) Grandes errores: la falta focal de contraste entre la sustancia gris y la blanca, genera superficies incorrectas que no se pueden corregir. Todas las superficies se muestran en el espacio nativo. Superficie SB Superficie Pial I D 89 Figura 30. Grosor Cortical. A. Vistas lateral, dorsal y medial del grosor cortical calculadas a partir de la superficie promedio de PREEMACS Rhesus restando la superficie de sustancia blanca de la superficie pial que se muestran en las Figuras 25 y 26. B. Media y desviación estándar del grosor cortical de cinco sujetos pertenecientes a cada una de las tres categorías de superficie de resultados (1 = mínimo, 2 = errores medianos o 3 = grandes) clasificados mediante la prueba de inspección visual. El recuadro muestra la ubicación del ROI de la corteza motora primaria utilizada para calcular el grosor cortical. C. Distribución del grosor cortical en todos los vértices del ROI M1 para un sujeto representativo de cada una de las tres categorías de superficie de resultados. Experimento 3. Conducta rítmica, sustancia blanca profunda y método para el análisis de sustancia blanca superficial Conducta rítmica Treinta y dos sujetos realizaron una versión modificada de la clásica Tarea de Sincronización Continuación TSC que incluyo tres épocas: percepción del beat, sincronización y continuación (Figura 31). Esta tarea comenzó con la percepción de un ritmo isócrono, definido por estímulos visuales alternos de izquierda a derecha, seguido de la sincronización del tap con los estímulos alternos y la continuación del tap generado internamente hacia los objetivos derecho o izquierdo sin el metrónomo (Pérez et al., 2023). Los sujetos también realizaron una versión auditiva de la TSC (Figura 31, ver Métodos). 90 Figura 31. Análisis conductual durante la Tarea de Sincronización continuación (TSC). A. Muestra gráficamente las métricas para la evaluación de la ejecución rítmica de TSC. Las asincronías corresponden a la diferencia de tiempo entre el estímulo presentado (IE) y el inicio del toque (IT) en los (n) intervalos de la época de sincronización. El error constante fue definido como la diferencia entre los intervalos producidos (IP) y el intervalo objetivo (IO), y la variabilidad temporal corresponde a la desviación estándar del 91 IP. Finalmente, se calculó la autocorrelación del IP durante la sincronización y la autocorrelación de lag-1. 1. Un valor negativo indica que el sujeto está utilizando un mecanismo de corrección de errores (ver el texto). B. Asincronías absolutas para cada intervalo instruido y modalidad de metrónomo (Auditivo: azul, Visual: rojo) durante la época de sincronización. C. Autocorrelación de lag-1 para cada intervalo y modalidad durante la época de sincronización. D. Error constante en función del intervalo objetivo para ambas modalidades de metrónomo y las épocas de sincronización (izquierda) y continuación (derecha) de la TSC. Las líneas en D en la época de continuación corresponden al ajuste lineal entre el error constante y el intervalo objetivo; el intervalo de indiferencia corresponde a 680 ms (flecha vertical azul) para la condición auditiva. E. Variabilidad temporal en función del intervalo objetivo para ambas modalidades de metrónomo y las dos épocas de la TSC. Las asincronías absolutas corresponden a la diferencia de tiempo entre cada par de estímulos y la respuesta, representado una medida de la precisión de fase entre los taps y estímulos (Figura 31A). Por lo tanto, este parámetro sólo se puede evaluar durante la época de sincronización de la TSC. Se realizó un ANOVA de medidas repetidas sobre asincronías absolutas con modalidad de metrónomo (auditiva y visual: 2 niveles) y duración del intervalo instruido (550, 650, 750, 850 y 950 ms: 5 niveles) como factores intra-sujeto. El ANOVA mostró efectos principales significativos para la duración (F(4,124) = 36.88 P < 0.0001) y la modalidad (F(1,31) = 20 P < 0.0001), así como una interacción significativa entre duración x modalidad (F(4,124) = 32.3 P < 0.0001). La corrección post-hoc de Tukey para múltiples comparaciones mostró asincronías significativamente mayores para la modalidad visual que auditiva en todas las duraciones (P <0.0001 para 550, 650, 750 y 850 ms; P = 0.006 para 950 ms; con efecto de interacción principalmente dirigido por la diferencia en los 950 ms entre modalidades). Estos resultados confirman la preponderancia de la modalidad auditiva sobre la visual para producir el alineamiento de los taps con el metrónomo (Comstock et al., 2018; Gámez et al., 2018; Merchant et al., 2015b). Además, se calculó la matriz de correlación entre sujetos sobre las asincronías absolutas en los intervalos instruidos y encontramos una correlación significativa entre 650 y 750 ms para las condiciones auditivas y visuales (r=0.67, p=0.000026; r=0.69, p=. 000011, respectivamente) 92 Figura 32. Matriz de correlación para las asincronías absolutas entre sujetos para cinco intervalos para las condiciones auditivas (izquierda) y visuales (derecha). Observe que sólo la correlación entre los intervalos de 650 y 750 ms fue significativa tanto para las condiciones auditivas como visuales. Este hallazgo sugiere la existencia de un mecanismo compartido para la alineación de la fase del metrónomo-tap en los intervalos que corresponden al tempo preferido indicado en estudios previos, corroborando así la noción de que el sistema audiomotor está sintonizado eficientemente a este tempo (Zalta et al., 2020 ). Con respecto a la métrica de autocorrelación de lag-1, un resultado negativo generado por los intervalos producidos, durante la época de sincronización, indica la participación de un mecanismo de corrección de errores que mantiene la sincronización del tap con el metrónomo, ya que un intervalo producido más largo tiende a ser seguido por un intervalo más corto, mientras que un intervalo más corto tiende a ser seguido por la producción de un intervalo con una duración más larga (Figura 31A; Iversen et al., 2015; Repp & Su, 2013). El ANOVA de medidas repetidas para la autocorrelación del intervalo inter-tap de la serie temporal (Figura 31C) no mostró diferencias significativas entre modalidades (F(1,31) = 1.6 P = 0.21), intervalos (F(4,124) = 2.05 P = 0.09) o su interacción (F(4,124) = 2.34 P = 0.06). Por lo tanto, la autocorrelación de lag-1 entre los ensayos fue negativa (~80% de los ensayos) y similar entre las modalidades y duraciones objetivo, lo que respalda la noción de un mecanismo de corrección de errores robusto y amodal durante el TSC. El error constante, definido como la diferencia entre los intervalos producidos y los objetivo, es una medida de la precisión del período durante las épocas de sincronización y continuación (Figura 31A). Un ANOVA de medidas repetidas sobre el error constante con modalidad, duración objetivo y época de la tarea como factores intrasujetos reveló efectos principales estadísticamente significativos para la modalidad (F (1,31) = 46.05, P <0.0001), 93 duración objetivo (F (4,124 ) = 29.15, P < 0.0001), y época (F(1,31) = 6.44, P = 0.01), así como interacciones significativas entre modalidad x intervalo (F(4,124) = 3.5, P = 0.008), época x intervalo (F (4,124) = 48.33, P <0.0001) y modalidad x época (F (1,31) = 23.35, P <0.0001). La prueba post hoc Tukey no mostró diferencias significativas para la duración objetivo, en el error constante durante la sincronización para ambas modalidades, con una sincronización precisa cercana a cero. Por el contrario, durante la continuación, la misma prueba post hoc reveló que las interacciones significativas entre factores se debían principalmente a las diferencias significativas entre intervalos distantes dentro de las modalidades auditiva y visual (Figura 31D). De hecho, para la época de continuación, el error constante siguió un efecto de sesgo, con sobreestimación para duraciones cortas y subestimación para duraciones largas, especialmente para la condición auditiva (Jazayeri et al., 2010; Pérez et al.,, 2018; Pérez et al., 2023). El intervalo indiferente, que corresponde al intervalo asociado con error constante cero, fue de 654 ms para la condición auditiva (Figura 31D, flecha azul) y de 420 ms para la condición visual. Este hallazgo sugiere que los sujetos tenían un intervalo preferido claro en la condición auditiva cercano a los 2 Hz informados en la literatura (Zamm et al., 2016). Finalmente, la variabilidad temporal se definió como la desviación estándar de los intervalos producidos y es una métrica de precisión del período de tiempo (Figura 31A). El mismo ANOVA de medidas repetidas sobre la variabilidad temporal mostró efectos principales significativos para la duración del objetivo (F(4,124) = 110, P <0.0001) y la modalidad (F(1,31) = 58.06, P <0.0001), pero ningún efecto principal significativo para la época de la tarea (F(1,31)=0.94, P =0.33). Además, se revelaron efectos significativos para las siguientes interacciones: época-intervalo (F(4,124) = 3.42, P = 0.01), época-modalidad (F(1,31) = 70.68, P <0.0001), intervalo-modalidad (F(4,124) = 11.34, P = 0.0001) e intervalo de modalidad de época (F(4,124) = 14.74, P = 0.0001). Las pruebas post hoc HSD mostraron una variabilidad temporal significativamente mayor en el metrónomo visual que en el metrónomo auditivo (para los intervalos 650, 750, 850 y 950 ms: P < 0.0001) durante la sincronización, pero no en la época de continuación, confirmando la alta precisión del período para metrónomos auditivos, especialmente durante la sincronización (Figura 31E; Gámez et al., 2018; Repp y Penel, 2004). 94 Análisis de la sustancia blanca Para cada sujeto, la interfaz de sustancia gris/blanca fue identificada, modelando esta interfaz a través de superficies 3D basada en vértices y aristas (métodos) (Fischl, 2012; Fischl et al., 2002). La métrica, densidad aparente de fibras (DAF) (Raffelt et al., 2012), evalúa de forma no invasiva la densidad axonal (Rojas-Vite, G, et al., 2019), y se deriva del análisis de IPD empleando el método de deconvolución esférica restringida (CSD) (Tournier et al. , 2004). Los vértices de las superficies 3D de la interfaz SG/SB se emplearon para muestrear los valores de DAF, por lo que a cada vértice se le asigno un valor de esta métrica con base en su representación espacial. Para evaluar las propiedades de la materia blanca a diferentes profundidades con respecto al manto cortical, se crearon trayectorias sintéticas que se extendían desde cada vértice en la interfaz de sustancia gris/blanca hacia los ventrículos y se muestrearon las de métricas de difusión a lo largo de estas trayectorias cada 0.5 mm (Figura 33 A). Aprovechando la capacidad de la CSD para identificar poblaciones de fibras cruzadas, la DAF (Figura 33 B) se evaluó por separado para aquellas fibras que entran o salen de la corteza y, por lo tanto, son paralelas a las trayectorias virtuales (DAFpar) y aquellas que se extienden tangencialmente a la corteza, perpendicular a las trayectorias virtuales (DAFtan). A lo largo de este trabajo, asumimos que DAFpar está relacionado con fibras de asociación, comisurales y de proyección que eventualmente entran o salen de la Sustancia Blanca Profunda (SBP), mientras que DAFtan proporciona informa de conexiones cortico-corticales de corto alcance a través de fibras U (Schüz & Braitenberg, 2002). 95 Figura 33. Análisis de la sustancia blanca superficial. A-D: Se tomaron muestras sistemáticamente de la densidad aparente de fibras (DAF) de la sustancia blanca superficial (guiones rojos en C) a lo largo de las trayectorias virtuales (líneas rojas en A y C) que se extienden desde cada vértice (círculos rojos) de la superficie de la interfaz de sustancia gris/blanca hacia los ventrículos siguiendo un campo laplaciano (A, C). La integral de todas las funciones de distribución de orientación de las fibras (FOD, D) corresponde a la densidad aparente total de las fibras (DAFtotal), separada además (B) en densidades de fibras correspondientes a las fibras que entran/salen de la corteza, paralelas a las líneas de flujo laplacianas (DAFpar) y fibras en U las que corren tangencialmente a la corteza (DAFtan). E. Existen correlaciones significativas entre las asincronías de los sujetos durante el TSC con un metrónomo auditivo y la DAFtotal, que se muestra en la Figura para el intervalo de 650 ms (E). F. Grandes áreas dentro de los lóbulos: frontal, parietal y occipital de ambos hemisferios mostraron correlaciones significativas entre las asincronías absolutas en la modalidad auditiva y DAFtan. 96 G. Sólo las regiones frontales y temporales restringidas al hemisferio izquierdo, mostraron correlación entre DAFpar y las asincronías absolutas en la modalidad auditiva. H. Coeficiente de determinación para los 32 sujetos entre las tres métricas de la DAF y asincronías para un vértice ejemplar (punto amarillo en E, F y G). Correlaciones entre comportamiento y materia blanca superficial. Posteriormente, se evaluó la asociación entre el desempeño conductual y las propiedades microestructurales de SB inferidas de las IPD. El análisis basado en superficie de SB (ver Métodos) se realizó para evaluar la posible asociación entre las diferentes métricas de rendimiento de sincronización rítmica y las métricas de SB muestreadas a cinco profundidades con respecto a la interfaz de sustancia gris/blanca (0, 0.5, 1, 1.5 y 2 mm). Este análisis mostró la existencia de correlaciones negativas entre las asincronías auditivas absolutas y los valores de los mapas DAF en las cinco profundidades muestreadas (Figura 33 E, F, G). Por lo que, los sujetos con asincronías auditivas más cercanas a cero y, por lo tanto, con mayores capacidades predictivas, tenían valores de DAF y DAFtan significativamente más altos que los sujetos con menor rendimiento predictivo. En particular, estas asociaciones significativas se observaron principalmente para las asincronías auditivas de los intervalos de 650 y 750 ms y los valores de DAFtotal y DAFtan (Figura 33). No se encontraron correlaciones significativas entre los tres mapas de DAF y el error constante, la variabilidad temporal y la autocorrelación de lag-1 para la condición auditiva. Además, no se observaron correlaciones entre las tres métricas del SB y todos los parámetros de comportamiento para la condición visual. No se encontraron correlaciones significativas entre los parámetros de rendimiento rítmico de la TSC y la DAFpar, excepto por algunos grupos con coeficientes de correlación bajos para las asincronías auditivas en los intervalos de 550, 650 y 750 ms (Figura 33 H). De hecho, el nivel de asociación entre la precisión de la fase en la TSC y los mapas de DAF, fue mayor para DAFtan que para DAFpar (Figura 33 H). Según Schüz y Braitenberg (2002), la profundidad promedio del sistema de fibras en U es de aproximadamente 1.5 mm. Por lo tanto, los siguientes análisis se realizaron a esta profundidad. La Figura 34 muestra el coeficiente de correlación de los valores de determinación entre las asincronías auditivas y DAFtan a 1.5 mm por debajo de la interfaz de la sustancia gris/blanca en todos los tempos probados. Después de la corrección para comparaciones múltiples (Pcft <0.001 y PCluster <0.001), sólo los intervalos de 650, 750 y 850 97 ms mostraron una asociación significativa entre los parámetros estructurales y de asincronías absolutas en la modalidad auditiva. De hecho, nueve (con 2232 vértices), doce (con 2827 vértices) y dos (con 374 vértices) grupos mostraron correlaciones significativas entre las asincronías auditivas y DAFtan para los intervalos de 650, 750 y 850 ms, respectivamente. Figura 34. Coeficiente de determinación entre asincronías auditivas y la densidad de fibra aparente tangencial para cada vértice en la sustancia blanca superficial (muestreada a 1.5 mm por debajo de la interfaz de sustacia gris/blanca) en todos los intervalos probados en la TSC para ambos hemisferios. Se localizaron correlaciones significativas en grandes grupos dentro de las áreas motora, auditiva y visual, particularmente para intervalos de 650 y 750 ms. Para identificar las regiones anatómicas con grupos significativos de vértices, parcelamos la SB según el Atlas Brainnetome (Fan et al., 2016). Las áreas con vértices significativos (después de la corrección de múltiples correcciones; Pcft < 0.001 y PCluster < 0.001) se 98 agruparon en 14 regiones: motora primaria, motora secundaria dorsolateral, motora medial (AMS y pre-AMS), corteza prefrontal dorsolateral (DLPC), área de lenguaje motora, somatosensorial primaria, corteza de asociación parietal, precuneus, áreas auditivas primarias y secundarias, corteza temporal inferior, áreas de reconocimiento de objetos y rostros, áreas visuales primarias y secundarias y áreas de asociación límbica (Figura 35 C). Figura 35. Asociaciones entre las asincronías y regiones de interés de DAFtan. A y B. Gráfico de correlación interregional de las asincronías auditivas y DAFtan en función del intervalo instruido y la profundidad del DAFtan. Los grupos significativos correspondieron a catorce regiones (eje y) según el Atlas Brainnetome que se muestra en C. El color y el tamaño del círculo para cada grupo corresponde al coeficiente de determinación (valor crítico r > 0.355 en p < 0.02, gl =29) y el porcentaje de vértices significativos en cada área, respectivamente. El hemisferio izquierdo (A) mostró más áreas con vértices significativos que el derecho (B; 17541 > 16641). Se observó una disminución sistemática en el tamaño del círculo en función de la profundidad en áreas de ambos hemisferios. A una profundidad de 1.5 mm, las regiones con un mayor porcentaje de vértices significativos para 99 el hemisferio derecho, asociados al intervalo de 750 ms fueron las áreas motoras medial (AMS y preAMS), auditiva y del lenguaje (B). Por el contrario, se observaron pocos vértices significativos en las regiones del hemisferio izquierdo (A). C. Atlas Brainnetome (Fan et al., 2016) que muestra los catorce ROIS analizados en A y B. D. Curvas que muestran intervalos selectivos para los coeficientes de determinación y el porcentaje de vértices significativos a diferentes profundidades (codificadas por colores) para preAMS. E. Igual que D pero para la corteza auditiva. Tenga en cuenta que el intervalo preferido en las dos áreas está entre 650 y 750 ms. Las Figuras 35 A y B muestran una disminución sistemática en el porcentaje de vértices significativos en función de la profundidad en áreas de ambos hemisferios. Sin embargo, el efecto más destacado es la selectividad del intervalo de los coeficientes de determinación y el porcentaje de vértices significativos, con un intervalo preferido entre 650 y 750 ms en muchas áreas y profundidades (Figura 35 A, B, D, E). Específicamente, a nuestra profundidad objetivo de 1.5 mm vinculada con el sistema de fibra U, las áreas con el mayor porcentaje de vértices significativos en el hemisferio derecho fueron pre-AMS (52.4%, 𝑟𝑟 2=.41, p< 0.001), auditiva (49.2%, 𝑟𝑟 2=.38, p< 0.001) y lenguaje motor (40.2%, 𝑟𝑟 2=.45, p< 0.001) para la correlación entre las asincronías auditivas de 750 ms. y DAFtan. De manera similar, a 650 ms, el mayor porcentaje de áreas con vértices significativos en el hemisferio derecho fueron las áreas motoras mediales (pre-AMS: 41.8%, 𝑟𝑟 2=.36, p< 0.001; AMS: 28.1%, 𝑟𝑟 2=.39, p< 0.001) y área motora del lenguaje (28.1%, 𝑟𝑟 2=.40, p< 0.001). Las Figuras 35 D y E muestran las curvas de selectividad de intervalo para los coeficientes de correlación y el porcentaje de vértices significativos en las profundidades de DAFtan (codificadas por colores) para la corteza auditiva y pre-AMS, lo que confirma la noción de preferencia de intervalo para las asociaciones estructurales y de comportamiento. En contraste, en el hemisferio izquierdo, el porcentaje de áreas con vértices significativos fue menor, con efectos significativos para las áreas visuales (31.8%, r2=0.45, p< 0.001), reconocimiento de objetos y rostros (29.9%, r2= 0.44, p< 0.001) y áreas motoras primarias (2.4%, r2=0.44, p< 0.001), para el intervalo de 650 ms; corteza asociación parietal (35.1%, r2=0.52, p< 0.001), áreas motoras primarias (28%, r2=0.40, p< 0.001) y áreas visuales (25%, r2=0.40, p < 0.001) para el intervalo de 750 ms. Estos resultados respaldan la idea de que el sistema audiomotor del hemisferio derecho muestra diferencias individuales en la densidad de las fibras U con un gradiente que se correlaciona con el grado de precisión de fase entre los sujetos en la fase de sincronización de la TSC. Fundamentalmente, esta correlación es específica para la modalidad, lo que sugiere que los cambios estructurales en el sistema audiomotor ocurren sólo para la modalidad que produce sincronización rítmica con mejor precisión de período y fase. 100 Además, la selectividad de intervalo de la correlación estructural y de comportamiento, indica que los circuitos de sincronización sintonizados a intervalos de 650 y 750 ms son susceptibles de presentar diferencias macro y microestructurales en las fibras U de la sustancia blanca, dentro de la población de sujetos examinados. Finalmente, las áreas visuales y la corteza motora contralateral (hemisferio izquierdo) a los movimientos del tap, también mostraron asociaciones significativas entre el ajuste de fase (phase locking) sensoriomotor y la densidad de las fibras en U. Correlación canónica entre mapas conductuales y DAF En la sección anterior correlacionamos diversas medidas de comportamiento con todos los vértices de los mapas de la DAF, donde se incrementa el riesgo de error tipo I. Para abordar esto, se realizó un análisis de correlación canónica (rCCA) entre los datos de comportamiento de la TSC y la información estructural de la SB (ver Métodos). Este enfoque permitió evaluar de forma independiente la correlación entre las mediciones de DAF de cada vértice y cada variable de la TSC. Específicamente, rCCA se calculó entre la matriz de parámetros de comportamiento de la fase de sincronización de la TSC (es decir, asincronía absoluta, error constante, variabilidad temporal y autocorrelación de lag-1) para cada modalidad sensorial (auditiva y visual), cada intervalo objetivo (550-950 ms) y las métricas de la DAF de todos los vértices de la superficie del cerebro. Se construyeron modelos separados para cada métrica de DAF (es decir, DAFtotal, DAFtan y DAFpar). En particular, todos los emparejamientos de datos de comportamiento y de DAF generaron variaciones canónicas altamente correlacionadas (Figura 36 A). De acuerdo con los resultados anteriores, la correlación más alta se encontró entre los datos de TSC y el DAFtan, seguido de cerca por el DAFtotal y luego el DAFpar (Figura 36 A). Las correlaciones entre cada parámetro de comportamiento y DAFtan y sus correspondientes variantes canónicas revelaron una estructura clara entre el comportamiento predictivo de los sujetos y las diferencias estructurales en las fibras U de la sustancia blanca en el sistema audiomotor. La Figura 36 A muestra las correlaciones entre cada parámetro de la TSC estandarizada y la variable canónica correspondiente (U), donde es evidente que las asincronías de la modalidad auditiva para los intervalos de 650-850 ms son los parámetros con una relación significativa con la variable canónica. Un resultado novedoso del rCCA es la asociación significativa entre la variabilidad temporal de la fase auditiva en los mismos intervalos (650- 850 ms). Además, el mapa DAFtan muestró una correlación significativa con las estructuras audiomotoras y la variante canónica. Nuevamente, la correlación entre todos los vértices y 101 sus variables canónicas fue negativa, corroborando la hipótesis de que los sujetos con mayores capacidades predictivas tenían una DAFtan mayor en el circuito audiomotor (Figura 36). Figura 36. Correlación canónica entre métricas de comportamiento y DAFtan. A. Cargas canónicas (correlaciones) de las variables de la TSC para el modelo DAFtan. Tenga en cuenta que las asincronías absolutas de la modalidad auditiva mostraron las correlaciones más altas con los datos estructurales, en los intervalos de 650-850 ms, en línea con resultados anteriores. Además, este enfoque identificó como significativa la variabilidad total en una misma modalidad sensorial e intervalos. B. Correlación de Pearson de variables canónicas (U = conductual; V = DAFtan entre vértices). C. Cargas canónicas del mapa DAFtan. Tenga en cuenta que el sistema audiomotor está altamente correlacionado con el comportamiento de la TSC. Sustancia blanca profunda y selectividad estructural al intervalo También se evaluó la asociación entre la precisión y exactitud del período y fase del tapping en la TSC y las propiedades de la Sustancia Blanca Profunda (SBP). Empleando el análisis basado en Fixel (FBA) (Dhollander et al., 2021; Raffelt et al., 2017) para estimar las diferencias micro y macroestructurales dentro de los vóxeles asociados a la SBP (Genc et al., 2018; Kelly et al., 2020; Mito et al., 2018; Rau et al., 2019). Este método, similar fue al análisis SBS, basado en el CSD de los datos de IPD. 102 FBA proporciona tres métricas asociadas a características específicas de las fibras (densidad de fibra, sección transversal de fibra y densidad y sección transversal de fibra; FD, FC y FDC, respectivamente) (Raffelt et al., 2017). La FD se deriva de la integral de los lóbulos de la distribución de orientación de las fibras (FOD) y es proporcional al volumen intraaxonal total, lo que refleja la densidad de una población de fibras dentro de un vóxel (Rojas-Vite et al., 2019). Es importante denotar que la FD es idéntica a la DAFtotal empleada en el análisis de superficie, con una nomenclatura para FBA siguiendo a Raffelt et al. (2017). Sí coexiste más de una población de fibras en un vóxel determinado, el FOD se segmenta y se asigna un FD a cada población, denominado fixel (elemento de fibra). FC es una métrica macroscópica del diámetro del haz de fibras y, finalmente, FDC es una combinación de FD y FC (ver Métodos). El FBA reveló correlaciones negativas significativas entre la métrica de FDC en el cuerpo calloso (CC) y las asincronías absolutas del metrónomo auditivo para intervalos de 650 ms, 750 ms, 850 ms y 950 ms (Figura 37). Por lo tanto, este análisis mostró una estrecha relación entre la densidad y el diámetro de los haces de fibras del CC y la sincronización a ritmos isócronos. Los sujetos que mostraron una gran precisión de fase con asincronías cercanas a cero también mostraron grandes valores de FDC, y los sujetos con poca precisión de fase y grandes asincronías tuvieron valores bajos de FDC. Como en el caso de las métricas de fibra U, los valores FBA no se correlacionaron con la exactitud o precisión del período, ni con la corrección de errores para las modalidades auditivas y visuales durante las épocas de sincronización y continuación. La asociación entre la sincronización de fase y las propiedades de la sustancia blanca definió un mapa selectivo de intervalos en el CC, con el FDC en diferentes niveles del CC mostrando correlaciones significativas con las asincronías absolutas en intervalos específicos (Figura 37). Este mapa mostró un gradiente anteroposterior, con asociaciones conductuales y estructurales para intervalos cortos y largos en las porciones anterior y posterior del CC, respectivamente. Los valores de los fixeles para la métrica de FDC de la parte media posterior del CC (interconexión de cortezas motora,premotora y M1) mostraron una correlación negativa significativa con asincronías auditivas absolutas para los intervalos de 650 y 750 ms (Figura 37 BC; corrección por múltiples comparaciones con el algoritmo “family-wise error” (FWE ) – valor P corregido < 0.05). 103 Para las asincronías del intervalo de 850 ms, se observó una correlación negativa con los valores de los fixeles de FDC ubicados en el istmo y el esplenio (Figura 37 C; interconexión de las cortezas motora primaria, temporal y visual). Finalmente, las asincronías del intervalo de 950 ms mostraron una correlación negativa significativa con los fixeles ubicados en los fórceps menor y mayor (Figura 37 A, D; interconectando a las cortezas prefrontal y visual, respectivamente). 104 Figura 37. Mapa de selectividad intervalar y su correlación con propiedades microestructurales de la sustancia blanca profunda. A-E. Haces de fibras que mostraron correlaciones significativas entre las asincronías en la condición auditiva del TSC y la sección transversal de densidad de fibras (FDC) del cuerpo calloso (CC). Los paneles A - C corresponden a las secciones coronales anteriores del mapa sagital representado en el centro de la Figura. Los paneles D y E corresponden a las secciones axiales posteriores del mismo mapa sagital central. Se representa un mapa selectivo de intervalos con un gradiente anteroposterior. 105 F. Sección coronal del CC que muestra los fixeles con un coeficiente de correlación significativo (valores r codificados por colores; sólo se muestran los fixeles con pcorr<0.05) entre asincronías en el intervalo de 750 ms en la condición auditiva y FDC. G. Distribución de los coeficientes de determinación (r2) de la FDC vs asincronías absolutas para los cuatro intervalos listados en el eje x. Los diagramas de caja intercuartiles se muestran a la derecha. En la Figura 37 A-E se observa que los segmentos de las trayectorias de los fixeles, que presentan correlaciones con la sincronización a ritmos isócronos, se ubicaron principalmente en la unión de los dos hemisferios a través del CC. Sin embargo, se encontró un efecto de lateralización para el hemisferio izquierdo, con fixeles asociados con asincronías auditivas de 750 y 950 ms en el istmo y el esplenio, respectivamente. Además del CC, el fórnix derecho mostró una asociación significativa con las asincronías del intervalo de 750 ms para la métrica FD. Por último, se llevó a cabo un análisis de correlación entre la media de las asincronías absolutas de los cinco intervalos y el FC (Figura 38), así como el FDC. En particular, para la condición auditiva, los tractos con fixeles significativos para la métrica FC fueron el fascículo arqueado izquierdo (Figura 38 A,E), CC, M1 (Figura 38 C,E), fórceps mayor (Figura 38 B,D), fascículo longitudinal superior 2 (Figura 38 F) y fornix derecho. Figura 38. Asociación entre la sustancia blanca profunda y la media de las asincronías de todos los intervalos objetivo. A. Corte sagital que muestra el valor p de los fixeles significativos. B. Ejemplo de la correlación significativa entre la métrica de la sección transversal de la fibra (FC) y la media de las asincronías absolutas en un único fixel ilustrativo (punto rojo en el panel D). C. Corte coronal D-F. Cortes axiales que muestran la correlación negativa (r2) entre FC y la media de las asincronías absolutas para fixeles significativos. CC M1 = 106 Cuerpo Calloso áreas motoras primarias (C), FMA= fórceps mayor (D), FA= fascículo arqueado (E), FLS 2= fascículo longitudinal superior 2 (F). Experimento 4. Evaluación del grosor cortical a lo largo del entrenamiento Uno de los retos del presente proyecto fue la creación de procedimientos para poder obtener las métricas de las imágenes de primates no-humanos, tales como: grosor cortical y FA de superficies yuxtacorticales, los cuáles no estuvieran sesgados por la intervención manual, así como por problemas inherentes al método, como, por ejemplo: diferentes parámetros de inicio para la generación de superficies cerebrales. Para dar solución a la problemática anterior, cuatro métodos fueron desarrollados: PREEMACS, PREEMACS Longitudinal (PREEMACS Long), PREEMACS evaluación de sustancia blanca yuxtacortical (PREEMACS SBY), PREEMACS parcelación basada en superficie (todos previamente descritos en el método). Posterior al desarrollo de las herramientas para el procesamiento de las imágenes. Se implemento PREEMACS Long a cada uno de los puntos de adquisición, a posteriori y basados en la parcelación de superficie, 5 áreas en ambos hemisferios fueron analizadas: motora primaria (M1), áreas motoras secundarias (F2), área motora suplementaria (AMS), área motora presuplementaria (preAMS) y el área visual (Figura 38). Ésta parcelación permitió seleccionar los vértices sobre los cuales se realizó el análisis descriptivo correspondiente a grosor cortical. Figura 39. Parcelación de áreas basadas en superficie. Vista lateral y medial de PREEMACS Rhesus average Surface mostrando la parcelación de cinco áreas que fueron analizadas. D D M1 preSMA SMA F2 M1 Visual A P P A V V Vista Lateral Vista Medial 107 Los resultados del M01 y del M02 son presentados en la Figura 40 para el hemisferio izquierdo y Figura 41 para el hemisferio derecho. El análisis descriptivo no mostró diferencias, en las áreas seleccionadas (M1, F2, AMS, preAMS y áreas visuales), en ninguno de los hemisferios, entre los diferentes puntos de adquisición, en ninguno de los dos sujetos. Este resultado preliminar puede deberse a falta de poder estadístico dado: a) el tamaño de la muestra (n=2) y b) el tamaño del efecto, entre otros elementos que son discutidos en la siguiente sección. La Figura 42 presenta el grosor cortical de las diferentes áreas del M01, con el objetivo de mostrar los datos descriptivos (media y desviación estándar) de cada área analizada 108 Figura 40. Grosor cortical para el M01 y M02 en 5 áreas de la corteza cerebral del hemisferio derecho (motora primaria, motoras secundarias -F2, AMS y pre AMS- y en el área visual). Figura 41. Grosor cortical para el M01 y M02 en 5 áreas de la corteza cerebral del hemisferio izquierdo (motora primaria, motoras secundarias -F2, AMS y pre AMS- y en el área visual). M01 Hemisferio derecho M02 Hemisferio derecho M01 Hemisferio izquierdo M02 Hemisferio izquierdo 109 Hemisferio Izquierdo Hemisferio derecho Figura 42. Grosor cortical para el M01 en 5 áreas de la corteza cerebral (motora primaria, motoras secundarias -F2, AMS y pre SMA- y en el área visual), correspondientes a ambos hemisferios. 110 De igual forma se realizó un análisis del grosor cortical global de cada uno de los sujetos a lo largo del entrenamiento, sin observar diferencias estadísticamente significativas. Experimento 4. Análisis de Sustancia blanca Sustancia blanca superficial Posterior a la aplicación de PREEMACS SBS y Yuxtacortical (SBY) a las DWI obtenidas en cada uno de los puntos de adquisición, se evaluaron los valores de FA por debajo de las áreas M1, F2, AMS, preAMS y visual, correspondiente a la SBY. La figura 43 presenta el promedio de los valores de FA de ambos sujetos, en la primera adquisición, proyectados en un espacio común (PREEMACS average) como puede observarse los valores de FA no son homogéneos en la SBY. Las áreas correspondientes a la SBY por debajo las cortezas somatosensoriales y motoras primarias contralaterales a la dominancia manual presentan mayores valores de FA (F1=0.42 ± 0.04, F2= 0.37 ± 0.06, F4= 0.36 ± 0.04, S1=0.39 ± 0.05) en comparación con la SBY de otras áreas como, por ejemplo, las visuales (FA= 0.28 ± 0.07). Asimismo, la SBY por debajo de las áreas motoras del cíngulo del hemisferio derecho (CMAd/M3=0.47 ± 0.08 CMAv/M4=0.49 ± 0.06) también presentaron altos valores de FA en comparación con el resto de la SBY. Este hallazgo es de relevancia, toda vez que es el primer estudio en describir las propiedades de la SBY en primates no-humanos a través de métodos no invasivos. Con respecto a los cambios en las propiedades de la sustancia blanca yuxtacortical asociados al entrenamiento en la TSM, los resultados pueden observarse en la figura 44. No se encontró alguna tendencia en las variaciones heterogéneas que se observan en los datos, de las áreas estudiadas. La variación promedio entre los puntos fue de 0.1 ± 0.24, a excepción del área preAMS del hemisferio derecho del sujeto M01, en donde la variación fue en promedio de 0.2 ± 0.32. Con relación a los cambios entre diferentes profundidades (hasta 1 mm por debajo de la corteza), se observó un incremento de los valores de FA. No obstante, las variaciones a lo largo de los puntos de adquisición se mantuvieron con respecto a los valores de la SBY. 111 Figura 43. PREEMACS Superficie de Sustancia Blanca Yuxtacortical (SBY) mostrando los valores promedio del mapa de FA, de los sujeos M01 y M02, en la primera adquisición. A.Vista lateral, hemisferio izquierdo. B. Vista dorsal. C. Vista lateral, hemisferio derecho. D. Vista cara medial, hemisferio izquierdo. E. Vista cara medial, hemisferio derecho. Las áreas correspondientes a la SBY por debajo las cortezas somatosensoriales y motoras primarias contralaterales a la dominancia manual presentan mayores valores de FA (F1=0.42 ± 0.04, F2= 0.37 ± 0.06, F4= 0.36 ± 0.04, S1=0.39 ± 0.05) en comparación con la SBY de otras áreas como, por ejemplo, las visuales (FA= 0.28). Asimismo, la SBY por debajo de las áreas motoras del cíngulo del hemisferio derecho (CMAd/M3=0.47 ± 0.08 CMAv/M4=0.49 ± 0.06) también presenta altos valores altos. 112 Figura 44. Resultados de la cuantificación de FA en la sustancia blanca yuxtacortical (SBY) para ambos sujetos en ambos hemisferios. No se encontró alguna tendencia en las pequeñas variaciones que se observan en los datos. La variación promedio entre los puntos fue de 0.1 ± 0.24, a excepción del área preAMS del hemisferio A. M01 Hemisferio derecho B. M02 Hemisferio derecho C. M01 Hemisferio izquierdo D. M02 Hemisferio izquierdo 113 derecho del sujeto M01, en donde la variación fue en promedio de 0.2 ± 0.32, estos cambios no fueron estadísticamente significativos. Sustancia blanca profunda La identificación de la capsula externa ipsilateral, fascículo que conecta al circuito CGBTCm, se muestra en la Figura 45. Esta identificación se realizó empleando una template de monos Rhesus postmortem de alta resolución (Calabrese et al., 2015) de libre acceso. Lo anterior como prueba de concepto para conocer, la porción de la capsula extrema que conecta al putamén dorsolateral y a la corteza motora suplementaria (AMS). Figura 45. Disección virtual de la capsula externa ipsilateral. A Vista lateral. Observe como el fascículo conecta exclusivamente al putamén dorsolateral y a la corteza motora suplementaria (AMS). B. Vista Coronal. Acercamiento que muestra como las fibras ingresan a la AMS. La aproximación metodológica empleada en la figura 44, fue implementada a los datos obtenidos de forma longitudinal, sin observar modificaciones en los valores de FA a lo largo de los 16 puntos, para ninguno de los 2 sujetos. A B 114 Discusión Un estudio longitudinal fue diseñado e implementado, con el objetivo de evaluar los cambios neuroanatómicos asociados al aprendizaje en tareas de sincronización a un metrónomo visual (TSMv) y auditivo (TSMa). Para lo anterior, dos monos Rhesus fueron entrenados en una tarea control de tiempo de reacción TCRT, así como en TSMa y TSMv. El rendimiento rítmico de la TSC en duraciones (Intervalos isócronos: 550, 650, 750, 850 o 950 ms) y modalidades (auditiva y visual), se caracterizó utilizando las asincronías como una métrica de precisión. Dada la novedad del proyecto, en el campo del procesamiento de IRM de primates no humanos (PNH), diversas aproximaciones metodológicas tuvieron que ser desarrolladas. Estas aproximaciones incluyeron: la creación de protocolos y herramientas para la adquisición de IRM de alta resolución (resolviendo problemas técnicos inherentes a la anatomía de la cabeza del mono, así como a las propiedades del tejido cerebral en áreas específicas), el desarrollo de procesos automatizados (o con mínima intervención manual) para el preproceso y análisis de IRM de PNH, desarrollo de herramientas que permitieran el análisis de propiedades de la sustancia blanca superficial, así como el estudio de la sensibilidad de algunas de estas herramientas para evaluar propiedades neuroanatómicas, asociadas al éxito en la TSM Desarrollo de protocolos de entrenamiento para tareas de sincronización sensoriomotora, estandarizados y reproducibles en primates no humanos Este trabajo documenta el proceso de entrenamiento para la ejecución de TSM en PNH. Como se observó, el entrenamiento logró que los sujetos se sincronizaran a estímulos visuales y auditivos con asincronías cercanas a cero. Si bien Zarco y colaboradores en 2009, describieron brevemente el proceso de entrenamiento, no existe, hasta este momento, un registro meticuloso del proceso, con el objetivo de generar lineamientos estandarizados que describan pasos, procedimientos de secuenciación, así como la estimación del tiempo en el que los sujetos desarrollan las habilidades de sincronización a diversos intervalos, en diferentes metrónomos. Por lo que, el presente trabajo aporta información sobre el proceso y la toma de decisiones sobre la secuenciación de pasos, basados en la información de como que es que los sujetos ejecutan los movimientos con mayor precisión. 115 Estandarización de protocolos de adquisición y análisis de IRM en primates no humanos Durante el desarrollo del presente trabajo, a través del primer Taller y Consorcio de Colaboración Global PRIMATE-Data Exchange (PRIME-DE) (Milham et al., 2020), se conoció que el problema de la estandarización de protocolos para la adquisición y análisis de IRM de PNH, era un problema emergente al cuál se le estaba dando solución. Por ejemplo, derivado de la experiencia que se obtuvo durante el desarrollo del presente trabajo, se aportó al taller y al campo de conocimiento, que la posición dentro del resonador en estudios longitudinales debe controlarse (Song et al., 2021), toda vez que esto puede afectar el control calidad de las IRM e impactar en el cambio de contraste, que a su vez tendría un efecto en la estimación de propiedades del tejido cerebral (Song et al., 2021). Asimismo, dentro de la estandarización de la posición de los sujetos dentro del resonador, se identificó que esta debía cumplir con una regla básica: la cabeza de los sujetos no puede estar en contacto directo con la antena, toda vez que derivado de las características anatómicas del cráneo de los monos Rhesus, cuando el cráneo toca la antena genera un problema de homogeneidad de campo, que impacta en la estimación de propiedades del tejido. Error que se observó en una amplia cantidad de imágenes de la base de datos de PRIME-DE (2018). Asimismo, no existía una superficie tridimensional promedio, a la cual pudieran referenciarse las superficies individuales, para poder tener un espacio común de medición. Con esta experiencia y dado que no existían en ese momento protocolos totalmente estandarizados (sin intervención manual) se desarrolló PREEMACS. PREEMACS Puntos fuertes de PREEMACS PREEMACS es un sistema robusto, automático y flexible que estandariza todos los pasos necesarios para el procesamiento de IPNH con el objetivo de extraer las superficies corticales del mono Rhesus. El programa tiene tres módulos: 1) preprocesamiento, 2) control de calidad y 3) estimación de la superficie cerebral que son fáciles de ejecutar individualmente o como un flujo de trabajo de procesamiento de imágenes completo. 116 En el Módulo 1 se ajustaron varios pasos clave en el preprocesamiento de IRM para disminuir la gravedad de los artefactos que se observan con frecuencia en las imágenes de PNH, como por ejemplo la falta de uniformidad de la intensidad (INU, debido al diseño y a la sensibilidad de las bobinas multicanal), la extracción del cráneo, (siendo la anatomía del PNH muy diferente a la de los humanos) y la identificación errónea de la duramadre como tejido cortical. Como característica particular, el método de extracción de cráneo desarrollado fue basado en un algoritmo de aprendizaje profundo, el cual obtiene máscaras cerebrales precisas con grandes valores de DICE, sensibilidad y especificidad, resolviendo uno de los problemas que no permitía la automatización del proceso de estimación de superficies corticales. La evaluación previa de la calidad de la imagen es fundamental para la implementación automática del presente pipeline y con base en los datos obtenidos se sugiere, sea un paso indispensable para el análisis y revisión de los resultados. Utilizando diferentes métricas de IRMqc, el Módulo 2 proporciona un método de clasificación SVM que predice la calidad de las superficies resultantes con un alto grado de precisión. Esta herramienta de predicción fue validada en 57 imágenes de once sitios. Fundamentalmente, el análisis grafos realizado indicó que cinco IQM son fundamentales para predecir el resultado de la superficie de PREEMACS. Se desarrollaron tres templates de mono Rhesus para la estimación de superficies en el Módulo 3. El atlas de segmentación PREEMACS FreeSurfer permite la parcelación estructural de estructuras corticales y subcorticales mejorando la segmentación SG/SB. La template de parametrización de PREEMACS Rhesus incluye toda la información sobre los patrones de curvatura y convexidad del mono en la SB. Esta template es crucial para obtener un registro de vértices entre sujetos. Finalmente, las superficies SB y pial individuales se registran en la superficie promedio PREEMACS Rhesus para que se puedan obtener las medidas de grosor cortical y girificación para el análisis grupal en un espacio común, referenciado a un atlas de mono Rhesus. También la normalización espacial, es necesaria para registrar conjuntamente cerebros individuales en atlas multimodales de interés, como citoarquitectónico, mieloarquitectónico, seguimiento de fibras, etc., que pueden enriquecer enormemente la potencialidad analítica de PREEMACS (Goubran et al., 2019). Por lo tanto, estas tres templates proporcionan una gran especificidad en la estimación de la superficie del macaco, con resultados sólidos en todos los sitios y protocolos de recopilación de imágenes. 117 Otro punto fuerte del flujo de trabajo actual es la identificación precisa de la superficie pial, que se logra gracias a la información combinada de los volúmenes T1w y T2w. Sin embargo, es importante enfatizar que PREEMACS ofrece la opción de ejecutar el flujo de trabajo sólo con la imagen T1w, aunque se recomienda utilizar ambas imágenes de entrada para obtener resultados óptimos. Una característica fundamental de PREEMACS es que todas las imágenes y las superficies resultantes se mantienen en el espacio nativo, lo que reduce una gran cantidad de posibilidades de sesgos debido a deformaciones locales en diferentes pasos de procesamiento de imágenes (Ashburner y Ridgway, 2013; Reuter et al., 2012). Generalización de PREEMACS PREEMACS resuelve prácticamente todos los problemas de preprocesamiento de imágenes descritos en 2019, por el Taller y Consorcio de Colaboración Global PRIMATE- Data Exchange (PRIME-DE) (Messinger et al., 2020). PREEMACS se generalizó a través de una variedad de imágenes de entrada realizando correctamente los siguientes pasos: Procesar imágenes con diferentes orientaciones de la cabeza, realizar un recorte automático, puede corregir el fuerte sesgo de intensidad atribuible a la gran variedad de bobinas utilizadas, lleva a cabo una extracción automática del cráneo y realiza una segmentación automática del tejido. Es importante destacar que todos estos pasos se generalizaron en un conjunto de datos de imágenes de once sitios. Se obtuvieron correctas reconstrucciones de superficie cuando las imágenes de entrada cumplieron con los criterios mínimos de la evaluación de control de calidad de IRM de PNH. Específicamente, las imágenes que tenían una resolución de vóxel de 0.5 mm³, una alta SNR (especialmente para GM) y un alto contraste entre SB/SG mostraron una segmentación óptima y una estimación de superficie pial con mínimos errores. Estos resultados se obtuvieron para 20 imágenes, en donde variables como el escáner de resonancia magnética, la bobina y la posición del mono, no sesgaron el resultado de PREEMACS. Es aconsejable que la resolución del vóxel sea pequeña e isotrópica (≤ 0.5 mm), ya que la estimación de la superficie mejora con la alta resolución de los vóxeles. Con respecto al grosor cortical resultante, este estuvo en el rango de valores informados previamente (Georgopoulos et al., 2007; Calabrese et al., 2015; Seidlitz et al., 2018). Por lo tanto, la validación proporciona 118 una prueba importante de la versatilidad y generalización de PREEMACS, descartando cualquier efecto de sitio. Comparación con otros procedimientos para la reconstrucción de superficies de PNH Hasta donde se sabe, existen cinco proyectos adicionales para la estimación de la superficie de PNH (Messinger et al., 2021). Estos son Human Connectome Proyect para PNH (Donahue et al., 2016; Donahue et al., 2018; Autio et al., 2020), CIVET-Macaque (Lepage et al., et al., este número), FreeSurfer-PNH , Precon_all y Macapype, todos ellos contenidos en la wiki de Primate Resources Exchange (PRIME-RE) (Messinger et al., 2021). Todas estas herramientas para la extracción automática del grosor cortical en PNH muestran diferentes niveles de complejidad, robustez y automatización. Debido a limitaciones de alcance, no se proporciona una comparación cuantitativa formal entre los algoritmos de procesamiento. Cualitativamente, el HCP-PNH ha sido validado en humanos, chimpancés, múltiples especies de monos y titíes (Glasser et al.,2013; Donahue et al., 2016; Donahue et al., 2018; Autio et al., 2020), e identifica y etiqueta automáticamente el tronco del encéfalo, el cerebelo y el claustro. Además, este entorno analítico incluye características posteriores adicionales, como herramientas de preprocesamiento de imágenes estructurales, funcionales y de difusión. PREEMACS no posee tales características. La descripción completa de CIVET-Macaque (Lepage et al., 2021) muestra similitudes con PREEMACS en su alcance y utilidad generales. Tanto CIVET-Macaque como PREEMACS proporcionan adaptaciones y extensiones cruciales de procesos de procesamiento previamente disponibles para la estimación de superficies corticales en humanos; el primero se basa en CIVET (Lepage et al.,2021) y el segundo se basa en FreeSurfer (Fisch et al., 2012). En particular, PREEMACS tiene un diseño modular, realiza una selección automática y robusta del cráneo a través de una red neuronal convolucional, lleva a cabo una evaluación de control de calidad de las imágenes de entrada, preserva todos los volúmenes de imágenes y las superficies resultantes en el espacio nativo, utiliza una imagen promedio de mono Rhesus dentro del proceso y (si el primer módulo considera que los datos de entrada son de calidad suficiente), puede ejecutarse de forma totalmente automática y proporcionar datos de grosor cortical óptimos para el análisis de grupos de vértices. En el espíritu de colaboración y ciencia abierta característico de PRIME-DE (Milham et al., 2020), visualizamos una estrecha asociación entre todos los grupos que trabajan en la estimación 119 de la superficie de PNH (Messinger et al., 2021) para, en última instancia, proporcionar un canal integrado que evolucione dinámicamente a medida que el campo crece. Limitaciones de PREEMACS Además de la posible falta de convergencia de modelos discutida anteriormente, PREEMACS no incluye un atlas GCA de mono Rhesus para parcelar en el entorno FreeSurfer, el cuerpo calloso, el cerebelo y la protuberancia. En su lugar, utilizamos el atlas de GCA humano que produjo algunos errores de segmentación en el cerebelo y partes de la corteza visual. Además, no existe una herramienta de parcelación para identificar áreas corticales y definir automáticamente ROI´s para el análisis entre grupos de animales. Control de niveles de hidratación Continuando con el análisis de los puntos que se sugiere se tomen en cuenta dentro de la estandarización de los protocolos de IRM de PNH, se encuentra el control de niveles de hidratación. Los datos obtenidos de la prueba de concepto permitieron aportar evidencia a la hipótesis (Meyers et al., 2016) de que el control del nivel de hidratación tiene efecto sobre la cuantificación del grosor cortical. Sin embargo, esta información no es concluyente, toda vez que este experimento fue empleando datos de un sujeto. Al realizar la prueba de concepto aplicando el protocolo de PREEMACS Long en ambos sujetos se observaron cambios asociados probablemente al nivel de hidratación, toda vez que un decremento menor a un milímetro fue observado. El mecanismo de los efectos de la hidratación sobre la estructura del cerebro puede explicarse por las siguientes razones. La deshidratación suele ir acompañada de hipovolemia, que puede provocar un aumento del volumen del sistema ventricular y una reducción del volumen cerebral (Streitbürger et al., 2012; Dickson et al., 2005). La osmolalidad sérica inducida por la deshidratación aguda podría producir un gradiente osmótico, lo que resultaría en una mayor difusión de las reservas de agua intracelular hacia el espacio extracelular. Los cambios provocan la contracción de las células, en particular de los astrocitos, que desempeñan un papel vital en el transporte de agua y, por tanto, conducen a la expansión del sistema ventricular (Streitbürger et al., 2012). 120 Bases estructurales de la sustancia blanca para la precisión de fase, durante la sincronización del movimiento de tapping en humanos Este trabajo identificó que las habilidades de sincronización rítmica (evaluadas a través de una Tarea de tapping de Sincronización-Continuación, Figura 30) se asocian a diferencias individuales en la densidad de las fibras U en el sistema audiomotor derecho, toda vez que estas propiedades se correlacionaron con el grado de precisión de fase entre los estímulos y los taps de los sujetos. Estas correlaciones fueron específicas de la época de sincronización con metrónomos auditivos y tempos de alrededor de 1.5 Hz. Además, se encontró una asociación significativa entre la precisión de la fase y la densidad con el diámetro de los fascículos del cuerpo calloso, formando un mapa selectivo de intervalos donde los intervalos cortos y largos se correlacionaban conductualmente con las porciones anterior y posterior del cuerpo calloso. Estos hallazgos sugieren que las propiedades estructurales de SBS y SBP en el sistema audiomotor respaldan las capacidades de sincronización del movimiento de tapping de los sujetos. Para probar lo anterior, se adquirieron DWI de 32 sujetos que posterior a la adquisición realizaron una TSC empleando estímulos visuales o auditivos como metrónomos en el rango de los cientos de milisegundos. El rendimiento rítmico de la TSC en duraciones (Intervalos isócronos: 550, 650, 750, 850 o 950 ms) y modalidades (auditiva y visual) se caracterizó utilizando las asincronías absolutas, la autocorrelación de la serie temporal de intervalos entre toques durante la época de sincronización, el error constante y la variabilidad temporal durante las épocas de sincronización y continuación. Estos parámetros evaluaron la precisión de fase, el error constante, la precisión del periodo y la precisión del período del tapping rítmico de los sujetos, respectivamente (Figura 30A). Se empleo un rango de intervalos isócronos (ISC) de 550-950 ms porque contienen el intervalo preferente y está dentro de la ventana óptima para la sincronización de tap (Repp, 2005). Por lo tanto, con este rango de intervalos isócronos (ISC), se lograron identificar correlatos estructurales tanto para el tempo preferido como para la selectividad del intervalo. Con estas hipótesis, se evaluaron las propiedades de los fascículos de la SBP utilizando un enfoque basado en fixeles (Dhollander et al., 2021) y se desarrollaron dos métricas para la evaluación de la sustancia blanca superficial (SBS): a) densidad de fibras correspondiente a las fibras que entran o salen de la corteza y b) las fibras en U que se han descrito se ubican tangencialmente a la corteza. 121 Los resultados de este experimento respaldan cinco conclusiones: Primero, la fase y el período de tapping durante la TSC mostraron precisión y exactitud, así como la corrección de errores sesgadas hacia los metrónomos auditivos en lugar de visuales, confirmando así observaciones previas. En segundo lugar, el sistema audiomotor derecho mostró diferencias individuales en la densidad de las fibras en U. Estas diferencias se correlacionaron con el grado de precisión de fase de la sincronización del tapping entre los sujetos. En particular, las correlaciones fueron selectivas para la época de sincronización de la condición auditiva y específicas para los intervalos de 650 y 750 ms. En tercer lugar, hubo una asociación significativa entre la fase de sincronización rítmica, la densidad y el diámetro de los fascículos del CC, formando un mapa selectivo de intervalo con una tendencia anteroposterior. Esto implica que las asociaciones conductuales y estructurales para intervalos cortos y largos tendieron a estar en las porciones anterior y posterior del CC, respectivamente. En cuarto lugar, el diámetro de las fibras del fascículo arqueado, CC, fórceps mayor y fascículo longitudinal superior mostraron una correlación significativa con la media de las asincronías en todos los tempos evaluados. Finalmente, no se encontraron asociaciones significativas entre las propiedades SBS y SBP y la variabilidad temporal, el error constante o la autocorrelación de lag-1 en las condiciones visuales y auditivas durante las épocas de sincronización y continuación de la TSC. Estos últimos hallazgos sugieren que la conectividad dentro del sistema audiomotor está estrechamente relacionada con la capacidad de sincronizarse en fase al tempo preferido de los metrónomos auditivos. Muchos estudios han demostrado que el tapping sincronizado con un metrónomo auditivo es más preciso y exacto que la sincronización con un metrónomo visual intermitente con las mismas características de sincronización (Chen et al., 2002; Hove et al., 2013; Merchant et al., 2008c ; Patel et al., 2005; Repp y Penel, 2004). Esta asimetría auditivo-visual puede anularse mediante metrónomos visuales en movimiento (Hove, et al., 2010; Perez, et al., 2023). Desde los primeros relevos de procesamiento, el sistema auditivo tiene una resolución temporal más alta en comparación con el sistema visual (Duysens J. & A., 1996; He et al., 1997; Sayegh et al., 2011) y juega un papel crítico en la percepción del tiempo y reproducción en muchas tareas, no solo en la extracción de TCS (Grondin et al., 2005; Merchant et al., 2008b; Merchant et al., 2014). Por ejemplo, la alteración de la corteza auditiva por estimulación magnética transcraneal (EMT) perjudicó la estimación del tiempo para los estímulos auditivos y visuales, mientras que la alteración en la corteza visual solo produjo alteraciones en el tiempo para los estímulos visuales (Kanai et al., 2011). En consecuencia, una hipótesis actual es que la corteza auditiva participa en el procesamiento 122 temporal multimodal, y la interacción entre los sistemas auditivo y motor en el lóbulo frontal permite no solo la codificación del tiempo sino también la predicción del tiempo (Merchant et al., 2014; Merchant et al., 2016; Patel et al., 2014). Los hallazgos reportados por la presente investigación apoyan esta noción de diferentes maneras. En primer lugar, el rendimiento rítmico de los sujetos estuvo sesgado hacia la condición auditiva en diferentes medidas de comportamiento. En segundo lugar, el sistema audiomotor derecho mostró correlaciones generalizadas y significativas entre la densidad de las fibras en U superficiales y el grado de precisión de la fase sensoriomotora en todos los sujetos. Estas asociaciones anatomo-conductuales son selectivas para los intervalos en el rango de 650- 750 ms. En tercer lugar, el diámetro de las fibras del fascículo arqueado izquierdo, un tracto clave que conecta el sistema auditivo parietotemporal con el lóbulo frontal, mostró una correlación significativa con la media de las asincronías en todos los tempos evaluados. Además, el claro agrupamiento de sujetos como buenos o malos sincronizadores en una tarea de acompasamiento isócrono silábico se correlacionó tanto con la diferencia en la magnitud de activación en las áreas frontales como con los cambios en las vías de la sustancia blanca (es decir, el fascículo arqueado izquierdo) que conectan el sistema auditivo con el sistema cortical premotor (Assaneo et al., 2019). Por lo tanto, los resultados acentúan la base estructural audiomotora para el acompasamiento rítmico (Honing et al., 2014; Miyata et al., 2022). La falta de asociaciones estructurales en la condición visual se debe probablemente a la mayor variabilidad en el movimiento de tap rítmico para esta modalidad, lo que dificulta inferir correlaciones estadísticas entre las métricas. Como se describió anteriormente, las asociaciones anátomo-conductuales nulas para la condición visual también podrían deberse a la lenta tasa de muestreo de la atención temporal periódica visual, con un intervalo de muestreo que es más largo que las duraciones probadas (Zalta et al., 2020). Las asociaciones observadas entre las propiedades SBS y SBP evaluadas y la precisión en la fase de sincronización fueron negativas. Este resultado indica que los valores de los parámetros de la sustancia blanca fueron mayores en sujetos con asincronías cercanas a cero. Estos resultados apoyan la teoría de que las diferencias entre sujetos en la fase de sincronización rítmica dependen de propiedades micro y macroestructurales de la sustancia blanca, que podrían tener un sustrato genético y/o aprendido. Desde una perspectiva genética, podríamos especular que la existencia de sincronizadores pobres y superiores (Blecher et al., 2016) puede depender de la densidad de las fibras en U superficiales, en el sistema audiomotor derecho, así como de la densidad de tractos profundos como el CC y 123 el fascículo arqueado. Desde una perspectiva de entrenamiento, estos fascículos de SBP y SBS pueden desarrollar una mayor densidad y mielinización a través de la práctica musical intensa, distinguiendo los tractos audiomotores entre músicos y no músicos (Palomar-García et al., 2020; Vaquero et al., 2018; Zatorre et otros, 2007). Estudios anteriores han demostrado correlaciones entre el desempeño de tareas de sincronización sensoriomotora (SMS) y las características microestructurales de SBP. Por ejemplo, Blecher et al. (2016) encontraron una asociación positiva entre la FA del fascículo arqueado izquierdo, CC y el rendimiento en una tarea de tap con los dedos con indicaciones auditivas. La SBS que se encuentra inmediatamente debajo de la corteza ha sido menos estudiada que los fascículos de la SBP, a pesar de que representa el 60% del volumen total de sustancia blanca y es fundamental para mantener la conectividad cortico-cortical (Schüz y Braitenberg, 2002; Schmahmann et al., 2006). No obstante, estudios recientes han descrito anomalías de la SBS en la epilepsia (Liu et al., 2016), el trastorno del espectro autista (Hong et al., 2019), la enfermedad de Alzheimer (Phillips et al., 2016), la esquizofrenia (Nazeri et al., 2013) y en accidentes cerebrovasculares (Stockert et al., 2021). La SBS contiene fibras de asociación de corto alcance que conectan giros adyacentes (fibras en U) y las porciones iniciales o finales de conexiones de largo alcance que atraviesan la SBP (Schüz y Braitenberg, 2002; Guevara et al., 2020; Kirilina et al. , 2020; Yoshino et al., 2020). La SBS es difícil de estudiar debido a su complicada geometría y abundancia de cruces de fibras (Guevara et al., 2020). Para caracterizar mejor la microestructura de SBS, se separaron los dos componentes del SBS y se realizó una evaluación de superficie y profundidad. De manera complementaria, se analizó la SBP utilizando FBA, que aborda muchas de las deficiencias del análisis de vóxeles de imágenes con tensor de difusión (Dhollander et al., 2021). Este enfoque doble permitió evaluar todo el volumen de sustancia blanca y mostrar la asociación entre sus características mesoscópicas (es decir, densidad de fibras) y la sincronización predictiva del movimiento de tapping. Una limitación potencial del estudio es el número relativamente pequeño de participantes, relacionado con la naturaleza de la evaluación del comportamiento y el largo tiempo de escaneo. Además, se realizaron diversas pruebas estadísticas, relacionando varias métricas de comportamiento con varias métricas de difusión a diferentes profundidades. Para minimizar la posibilidad de errores estadísticos, realizamos un rCCA para modelar conjuntamente las métricas de comportamiento y de imagen, teniendo así en cuenta las 124 numerosas pruebas estadísticas y reduciendo la posibilidad de informar resultados falsos positivos. Esto reforzó la importancia de la comunicación cortico-cortical superficial a través de las fibras en U y la TSC para intervalos alrededor del ritmo preferido. Si bien se intentó controlar los errores estadísticos, es posible que inevitablemente una muestra de 32 adultos jóvenes con criterios de inclusión y exclusión específicos no represente a la población. Se espera que estos hallazgos se repliquen y amplíen en estudios futuros. Estudios longitudinales empleando IRM El estudio longitudinal de los cambios morfológicos asociados al aprendizaje de nuevas tareas, empleando métodos no invasivos, tal como lo es la RM, requiere del control de diversas variables (Song et al., 2021; Porier et al., 2021), inherentes a factores fisiológicos, tales como, control de: nivel de hidratación y horarios de adquisición (Zaid et al, 2022). Asimismo, factores inherentes a la adquisición: posición dentro del resonador, emplear de forma consistente los parámetros de adquisición, así como realizar un control de calidad periódico monitoreando la intensidad de la señal (Wood ML., 2020). Por último, factores relacionados con el pre y post-procesamiento de IRM, tales como: métodos de procesamiento de imágenes libre de sesgo con respecto a alguno de los puntos, de adquisición y análisis estadístico que permita identificar los posibles cambios sin sesgos (Reuter et al.,2012). Lo anterior, ha descrito que mejorar la eficacia de la resonancia magnética longitudinal DWI en entornos clínicos (Zaid et al, 2022). Para el presente estudio, cada una de las anteriores variables fueron controladas con el objetivo de garantizar que los cambios observados a lo largo del entrenamiento se asociaran con los parámetros de conducta (disminuyendo así, la probabilidad estadística de cometer un error tipo I). Sin embargo, la gran mayoría de los estudios que proponen el control de las anteriores variables, son trabajos vinculados al estudio de grandes efectos clínicos en el tejido cerebral, tales como, progresión de enfermedades neurodegenerativas (perdida de volumen en patologías como Alzheimer, Parkinson, Corea de Huntington), cambios asociados al neurodesarrollo o efectos de intervenciones médicas. A pesar de que una característica distintiva de los datos recopilados longitudinalmente es que los resultados o las respuestas de cada sujeto se evalúan de forma repetida (permitiendo que cada sujeto sirva como su propio control), los estudios longitudinales clínicos en IRM requieren de por lo menos 20 sujetos (Zaid et al, 2022), para poder evaluar 125 un promedio de cambio global de menos del 5% (Olabi et al., 2011). Con esta evidencia, no se puede concluir que no existan cambios asociados al aprendizaje de nuevas tareas en nuestros sujetos, si no que muy probablemente, los resultados obtenidos con respecto a los cambios estructurales del tejido cerebral asociados al entrenamiento de tareas de sincronización sensoriomotoras, se deban a un problema de poder estadístico, vinculado al tamaño de la muestra. Por lo que, para poder darle respuesta a la hipótesis es necesario ampliar la muestra. No obstante, tomando en cuenta el tiempo de entrenamiento por sujeto (~1 año 6 meses), no fue viable ampliarla en este trabajo. Por otro lado, aún, no han sido desarrollados métodos multivariados que puedan describir cambios con un mayor número de puntos de adquisición, en lugar de mayor número de sujetos, limitación que puede estudiarse en estudios posteriores. Conclusión Se logró el entrenamiento de dos monos Rhesus, en la ejecución de la TSM a estímulos visuales y auditivos a intervalos de 450, 550, 650, 750 o 850 ms con estructura isócrona. Los sujetos se lograron sincronizar a estos intervalos con asincronías cercanas a cero. Con respecto a los cambios neuroanatómicos asociados al entrenamiento con el número de sujetos entrenados, empleando técnicas no invasivas, no fue posible caracterizar cambios morfológicos asociados al aprendizaje de la TSM. No obstante, derivado de la novedad de la aproximación metodológica empleada en PNH, se desarrollaron herramientas para el análisis de IRM, tales como: PREEMACS, un algoritmo de pre-procesamiento, flexible, versátil y robusto para la extracción de las superficies cerebrales corticales de mono Rhesus. El código completo está disponible gratuitamente en GitHub (https://github.com/PREEMACS/PREEMACS). La extracción de las superficies corticales de mono Rhesus se realizó con una intervención manual mínima o nula cuando la calidad de las imágenes de entrada alcanzó un cierto umbral, lo que muestra un gran éxito en la reconstrucción de superficies en los sitios probados en todo el mundo. Teniendo en cuenta los esfuerzos recientes para compartir datos en el campo de los primates no humanos (Milham et al., 2018), PREEMACS es un proceso validado y fácil de usar para la extracción automática de superficies corticales, que puede ser utilizado por la creciente comunidad de 126 neuroimagen de PNH, no sólo para la estimación del grosor cortical, sino también para realizar análisis de imágenes multimodales en el mismo espacio geométrico. Asimismo, desarrollando y probando nuevos métodos de análisis para la estimación de propiedades de la SBS, que proporcionaran métricas novedosas que pudieran describir la variabilidad del fenómeno conductual evaluado. Se desarrollo un método que caracterizó las propiedades de las fibras en U y se mostró que las diferencias que los sujetos presentaron en la precisión del desempeño de la TSC se asociaron con mayor densidad de fibras y mayor diámetro de las fibras en U por debajo de áreas que integran al circuito audio- motor derecho. Esto es consistente con la literatura que muestra que un mejor desempeño en diferentes variables conductuales se asocia con valores más altos de las métricas de FA. Por ejemplo, un mejor desempeño en una tarea de coordinación bimanual se asoció con valores más altos de densidad y diámetro de fibras en el CC (Adab et al., 2020). 127 Referencias Ammirante, P., Patel, A. D., y Russo, F. A. (2016). Synchronizing to auditory and tactile metronomes: a test of the auditory-motor enhancement hypothesis. Psychonomic Bulletin y Review, 0–34. Ashburner, J., Ridgway, G. R. (2013). Symmetric diffeomorphic modeling of longitudinal structural IRM. Frontiers in Neuroscience, 6, 1–19. 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Trapeau, L. Uhrig, J. Vezoli, Z. Wang, S. Wells, B. Williams, T. Xu, A.G. Xu, E. Yacoub, M. Zhan, L. Ai, C. Amiez, F. Balezeau, M.G. Baxter, E.L.A. Blezer, T. Brochier, A. Chen, P.L. Croxson, C.G. Damatac, S. Dehaene, S. Everling, L. Fleysher, W. Freiwald, T.D. Griffiths, C. Guedj, F. Hadj-Bouziane, N. Harel, B. Hiba, B. Jung, B. Koo, K.N. Laland, D.A. Leopold, P. Lindenfors, M. Meunier, K. Mok, J.H. Morrison, J. Nacef, J. Nagy, M. Pinsk, S.M. Reader, P.R. Roelfsema, D.A. Rudko, M.F.S. Rushworth, B.E. Russ, M.C. Schmid, E.L. Sullivan, A. Thiele, O.S. Todorov, D. Tsao, L. Ungerleider, C.R.E. Wilson, F.Q. Ye, W. Zarco, Y. Zhou (2020). Accelerating the evolution of nonhuman primate neuroimaging.Neuron,105(4), 600-603. 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Agenda de horario para uso de resonador II.II Resonador 3T Philips Achieva TX (Unidad de Resonancia Magnética) II.III. Sujetos experimentales II. Traslado. Laboratorio a Unidad de Resonancia Magnética III. Preparación del sujeto dentro del resonador IV. Adquisición de IRM V. Traslado. Unidad de Resonancia Magnética a Laboratorio VI. Cuidado del sujeto posterior a la adquisición de IRM VII. Limpieza de Resonador Anexo ANEXO A. Lista para verificar materiales 136 I. Preparación I.I. Agenda de horario para uso de resonador El reglamento de la Unidad de Resonancia Magnética ubicada (URM) en Blvd. Juriquilla 3001, Juriquilla, 76230 Santiago de Querétaro, Quéretaro, indica que para hacer uso del resonador 3T Philips Achieva TX es necesario agendar haciendo uso de la cuenta personal del estudiante y/o investigador a cargo del protocolo de investigación, dichas cuentas se otorgan al personal certificado por la URM. El horario destinado para adquisición de IRM de Primates no-Humanos (PnH) es de Lunes a Viernes de 22:00 a 06:00 hrs y fines de semana las 24 horas. I.II Preparación del resonador 3T Philips. Para ambas modalidades 50 minutos antes de la hora agendada, el estudiante o investigador a cargo del protocolo de investigación, previamente certificado para el uso del resonador, se encargará de: 1) Limpieza de resonador 3T Philips  Materiales: 1. Toallitas desinfectantes de la marca Kirkland. Empleadas como indican las instrucciones para desinfección. 2. Desinfectante en aerosol de la marca Lysol 3. Guantes estériles 4. Cinta micropore de la marca 3M 5. Palillos de madera de 10 cm de largo y 0.5 mm de circunferencia  Procedimiento. Con la ayuda de las toallitas desinfectantes (empleadas como indican las instrucciones para desinfección) y haciendo uso de guantes estériles: 1. Limpieza área y resonador 3T Philips 2. Limpieza de la plancha del resonador 3T Philips. 3. Limpieza del sillón que se encuentra dentro del cuarto del resonador. 4. Limpieza del sensor de respiración. 5. Limpieza de antenas (32 canales o superficie). Con ayuda de las toallitas desinfectantes se limpiará exhaustivamente y en su totalidad la superficie de la antena a emplear, esto incluirá el cable de conexión hacia el resonador. Para el caso de la antena de 32 canales con ayuda de los palillos de madera y las toallitas desinfectantes se limpiarán los espacios en donde ancla la tapa y las áreas laterales a las almohadillas. 6. Limpieza de colchoneta que cubre toda la superficie de la mesa de usuarios del resonador. Esta deberá sacarse del cuarto de resonancia y haciendo uso de desinfectante en aerosol (empleado como indican las instrucciones para desinfección) cubrir toda la superficie de la colchoneta. Posteriormente regresar al cuarto de resonancia y colocarlo sobre la mesa de usuarios. 2) Cobertura de los objetos a emplear dentro del resonador. 137  Materiales: 1. Campos quirúrgicos desechables 2. Campos quirúrgicos de algodón esterilizados en autoclave Procedimiento. Posterior a la limpieza, mediante campos quirúrgicos desechables y de algodón se cubrirán: la plancha, la superficie de la antena que toca al sujeto y cable del sensor de respiración. Asimismo, se colocará un pañal desechable para adulto sobre la plancha de resonador. 3) Verificación de funcionalidad del resonador. Una vez colocada la antena (32 canales o superficie) y protocolo a emplear, se correrá una secuencia de prueba empleando una botella con agua. Lo anterior se realizará, con el objetivo de corroborar la funcionalidad del equipo de resonancia. 4) Preparación del área de camillas. Como medida de seguridad, se colocarán campos quirúrgicos (previamente esterilizados con autoclave en el laboratorio B15) sobre una camilla compatible con IRM. Esto se realizará de manera preventiva, en caso de emergencia donde se requerirá sacar al sujeto del resonador y revisarlo. I.III. Preparación de sujetos experimentales 1) Privación estricta de alimento y agua. 8 hrs antes de la hora agendada en la URM los sujetos experimentales serán privados de agua y alimento. La última ingesta (8 horas antes) consistirá en: 400 ml de agua, 100 gr de croquetas y una fruta de 200 gr. 2) Anestesia.  Materiales. 1. Ketamina 1000 mg/10ml solución inyectable (uso veterinario) 2. Xylacina al 2% solución inyectable (uso veterinario) 3. Guantes estériles 4. Jeringas de 1 ml 5. Torundas de algodón 6. Alcohol Procedimiento. 30 minutos antes de la hora agendada, en el laboratorio B15 del INB, a los sujetos se les administrará una dosis inicial intramuscular de ketamina/xylacina (7/0.6 mg/kg). Deberá tomarse nota del tiempo exacto en el que fue administrada la dosis inicial, toda vez que la anestesia será mantenida durante todo el protocolo con dosis de ketamina/xylacina (IM 2.5/0.05 mg/kg) cada 30 minutos. La manipulación de los sujetos, siempre y en todo momento, deberá realizarse empleando guantes estériles, bata, cubrebocas y gorro quirúrgico. II. Traslado. Laboratorio B15 INB a URM  Materiales. 1. Campos quirúrgicos de algodón esterilizados en autoclave 2. Chamarra y calcetines para PnH 138 3. Monitor de frecuencia cardiaca y respiratoria 4. Caja de transporte Procedimiento. 1. Verificar que el sujeto no cuente con reflejos ni tomo muscular, esto se observa aproximadamente de 8 a 10 minutos posterior a la administración de anestesia. 2. Al sujeto deberá colocársele la chamarra, así como los calcetines en manos y patas. 3. Colocar al sujeto en la caja transportadora especial para monos Rhesus compatible con RM. La posición del sujeto dentro de la caja deberá ser decúbito lateral. 4. Colocación de sensor de frecuencia cardiaca y respiratoria. 5. Transportar al sujeto en un vehículo a la Unidad de Resonancia Magnética. El tiempo de traslado es de aproximadamente 10 min, tiempo durante el cuál los signos vitales son monitoreados mediante el sensor de frecuencia cardiaca y respiratoria. 6. Ingreso a la URM. Se realizará por la puerta de emergencia. III. Preparación del sujeto dentro del resonador  Materiales 1. Tapones auditivos de seguridad infantiles 2. Esponjas 3. Sensor de frecuencia respiratoria infantil compatible con RM 4. Sensor de frecuencia cardiaca infantil compatible con RM 5. Ketamina 1000 mg/10ml solución inyectable (uso veterinario) 6. Xylacina al 2% solución inyectable (uso veterinario) 7. Guantes estériles 8. Jeringas de 1 ml 9. Torundas de algodón  Procedimiento. 1. Antes de entrar al cuarto donde se encuentra el resonador se debe quitar el sensor de frecuencia cardiaca y respiratoria. 2. Colocación de sujeto sobre la mesa del resonador. La manipulación del sujeto siempre deberá realizarse sujetándolo de la zona axilar y del pecho. Asimismo, tome en cuenta que la cabeza siempre debe de permanecer hacia enfrente. 3. Colocación de sensor de frecuencia respiratoria infantil, este deberá fijarse al sujeto con la ayuda de los campos quirúrgicos desechables con los que también es recubierto. 4. Colocación de sensor de frecuencia cardiaca infantil compatible con RM 5. Aplicación de dosis para mantenimiento de anestesia (ketamina/xylacina IM 2.5/0.05 mg/kg), 30 minutos posterior a la aplicación de la dosis inicial. 6. Colocación tapones de oídos. 7. Colocación del sujeto sobre la antena de 32 canales o colocación de la antena de superficie. 8. Fijación de posición de la cabeza del sujeto empleando esponjas propias del laboratorio B15 (no se emplean las de la URM). 9. Revisar que los parpados del sujeto se encuentren cerrados. 10. Cubrir al sujeto con los campos quirúrgicos de algodón esterilizados. 139 IV. Adquisición de IRM Los protocolos de adquisición de IRM tendrán una duración mínima de 15 minutos y una duración máxima de 3 horas, periodo durante el cual la condición de anestesia será mantenida con la dosis de ketamina/xylacina IM 2.5/0.05 mg/kg cada 30 minutos. Asimismo, durante el tiempo adquisición la frecuencia cardiaca y respiratoria será monitoreada a través de los sensores observando los valores en la pantalla de operación del scanner. V. Traslado. Unidad de Resonancia Magnética a Laboratorio Al finalizar el protocolo de adquisición los siguientes pasos deberán realizarse antes de comenzar el traslado. 1. Verificar que el sujeto no cuente con reflejos ni tono muscular. Si el sujeto no cuenta con ellos puede ingresarse a la caja de traslado, en caso contrario una última dosis de mantenimiento deberá ser administrada 2. Retiro de los sensores de fr. cardiaca y respiratoria. 3. Retiro de tapones de auditivos de seguridad 4. Colocar al sujeto dentro la caja de transporte en posición decúbito lateral. 5. Colocación de sensor de frecuencia cardiaca y respiratoria. Este debe realizarse fuera del cuarto donde se encuentra el resonador. 6. Transporte inmediato del sujeto en un vehículo al laboratorio B15 del INB. El tiempo de traslado es de aproximadamente 10 min, tiempo durante el cual los signos vitales son monitoreados mediante el sensor de frecuencia cardiaca y respiratoria. VI. Cuidado del sujeto posterior a la adquisición de IRM  Materiales:  Campos quirúrgicos de algodón  Fruta  Procedimiento 1. Ubicar al sujeto dentro del cuarto de cirugía 2. Colocarlo en la silla para PNH, colocando campos quirúrgicos para sostener la cabeza y evitar asfixia. 3. Verificar el tono muscular. Durante todo el tiempo de atonía, el investigador y/o estudiante a cargo del protocolo de investigación se encontrará cuidando al sujeto, monitoreando la frecuencia cardiaca y respiratoria. 4. Esperar a que el sujeto se encuentre libre de sedación. Durante este periodo se comenzará a hidratar con 200 ml de agua. 5. Una vez libre de sedación el sujeto se regresará a su jaula, hidratándolo con 350 ml de agua y se le dará una porción de fruta de 200 gr. 6. Una hora posterior al efecto de sedación el sujeto tendrá acceso libre a agua y alimento. 140 VII. Limpieza de Resonador Una vez que el sujeto es trasladado al laboratorio B15, otro estudiante certificado por la URM se encargará de la limpieza del resonador, realizando los siguientes pasos:  Materiales:  Toallitas desinfectantes de la marca Kirkland. Empleadas como indican las instrucciones para desinfección.  Desinfectante en aerosol de la marca Lysol  Guantes estériles  Microdacyn en spray  Palillos de madera de 10 cm de largo y 0.5 mm de circunferencia  Procedimiento 1. Retiro del pañal para adulto. 2. Retiro de los campos quirúrgicos de sensor, antenas y plancha 3. Limpieza de exhaustiva se superficie de antenas con toallitas desinfectantes. Una vez seca, sobre las superficies a través de un aspersor se aplica una ligera capa de Microdacyn. 4. Limpieza de sensor de respiración. Ésta se realiza con toallitas desinfectantes fuera del cuarto de resonancia y sobre un campo quirúrgico de algodón limpio. 5. Limpieza de colchoneta. Se colocará sobre una silla, fuera del cuarto del resonador y se le rociará Lysol desinfectante. 6. Limpieza del sillón que se encuentra dentro del cuarto del resonador. Se realizará empleando toallitas desinfectantes. 141 Anexo A. Lista de verificación de materiales Material Verificación Toallitas desinfectantes de la marca Kirkland. Microdacyn en spray Desinfectante en aerosol de la marca Lysol Guantes estériles Palillos de madera de 10 cm de largo y 0.5 mm de circunferencia Campos quirúrgicos desechables Campos quirúrgicos de algodón esterilizados en autoclave Jeringas de 1 ml Torundas de algodón Alcohol Chamarra y calcetines para PnH Tapones auditivos de seguridad infantiles Monitor de frecuencia cardiaca y respiratoria Caja de transporte Esponjas Fruta Fármacos Ketamina 1000 mg/10ml solución inyectable (uso veterinario) Xylacina al 2% solución inyectable (uso veterinario) 142 ANEXO B Modulo 2. Control de calidad Específicamente, se realizaron las siguientes adaptaciones al programa MRIqc (Esteban et al., 2017), para imágenes de PNH: conformación, segmentación de cerebro, normalización espacial al espacio estándar de la imagen promedio de PNH (Seidlitz et al., 2018) con una imagen promedio de alta resolución (0.25 × 0.25 × 0.25 mm3), y reemplazo de todas las imágenes promedio empleadas para humanos (imagen promedio de cerebro, máscara de cerebro, máscara de cabeza y archivos de segmentación probabilística) con la imagen promedio denominada NMT. Como resultado de estas modificaciones, el proceso MRIqc es totalmente compatible con las imágenes PNH. MRIqc lleva a cabo la segmentación del cerebro y estima las máscaras cerebrales para finalmente calcular las métricas de calidad de imagen (MCI). Del total de 68 métricas calculadas por MRIqc utilizamos 58 para análisis adicionales. Las otras diez métricas se excluyeron porque estaban relacionadas con los tamaños de vóxel, campos de vista (FOV) y en las métricas de artefactos de fondo de partes de las imágenes que PREEMACS recorta o no se pueden calcular de manera confiable en todas las imágenes. Además, no se incluyeron seis conjuntos de datos estructurales porque su relación señal-ruido era muy baja y no permitía el cálculo de MCI. El SVM fue entrenado cien veces con una validación cruzada veinte veces para evaluar el desempeño del clasificador. El conjunto de datos de entrenamiento del SVM fueron 58 MCI de 57 imágenes T1 (52 IRM de PRIME-DE y 5 IRM de UNAM-INB), para los cuales se definió la clase objetivo (errores mínimos, medianos o grandes) a través de una prueba de inspección visual en las superficies PREEMACS SB/SG. Esta prueba utilizó una escala de calificación de entre 0 y 48 puntos dependiendo de la suavidad de las superficies y la presencia de errores de segmentación. La suavidad de la superficie es una métrica que visualmente permite evaluar el éxito del proceso en la reconstrucción de la superficie cerebral. La suavidad tomó valores entre 0 para superficies perfectamente lisas y 10 para superficies muy irregulares. La calificación de segmentación podía adquirir valores entre 0 para ausencia de errores y 38 para errores generalizados en la SG en todas las áreas corticales. Los valores de la prueba de inspección visual se clasificaron como errores mínimos de 0 a 9, medios de 10 a 15 y errores mayores de 16 a 48. Las superficies con grandes errores en la prueba de inspección visual requerirían una intervención manual importante. 143 Asimismo, se evaluó si algunas métricas proporcionaban más información para predecir la calidad de las superficies obtenidas. Con este fin, calculamos una matriz de disimilitud para todos los pares de métricas posibles utilizando el índice de Calinski-Harabasz como medida de distancia (Calinski y Harabasz, 1974). Este índice permite evaluar el poder de agrupación de métricas para separar a los tres grupos de superficies, que corresponde a la relación entre la dispersión intra y entre grupos con puntuaciones más altas para una mejor agrupación. Esta matriz se trató como la matriz de adyacencia para un grafo no dirigido ponderado. El umbral se encontró a través de un enfoque de minimización de la densidad de uniones, mediante el cual la densidad del grafo (K), definida como K = n / (N × (N−1)), donde n es el número de uniones en el grafo y N el número total de métricas se calculó iterativamente para un umbral creciente, comenzando en cero y alcanzando el índice máximo de Calinski-Harabasz en la matriz, eliminando progresivamente las uniones que no alcanzaron cada umbral y los nodos que perdieron todas sus uniones. Por lo tanto, el umbral para extraer el grafo final fue el índice que minimizó la densidad de uniones, porque en este punto el grafo proporciona la máxima información sobre su compleja topología (Royer et al., 2008). Como se muestra en la Figura 35, el umbral tenía un índice de Calinski-Harabasz de 14.7 y la densidad de uniones en el umbral fue de 0.08. PREEMACS utiliza estos IQM como predictores de la calidad de la superficie resultante utilizando la herramienta de Support Vector Machine (SVM), donde los tres resultados posibles del clasificador son superficies con errores mínimos, medianos o grandes (Figura. 28). Creación de templates. Para la correcta ejecución de PREEMACS, tres templates o plantillas fueron creadas. (1) Atlas de segmentación nombrado PREEMACS FreeSurfer, con segmentaciones corticales y subcorticales, (2) PREEMACS. Plantilla de parametrización neuroanatómica de mono Rhesus, que incluye las plantillas de patrones neuroanatómicos de curvatura y de surcos de monos Rhesus, empleada para el registro de superficies de sustancia blanca de PNH individuales, (3) PREEMACS. Atlas de superficie cerebral de mono Rhesus, empleada para la proyección y mapeo final de vértices y valores de todos los sujetos. Las dos últimas templates o plantillas, se construyeron usando 33 resonancias magnéticas de PNH de dos bases de datos (29 resonancias magnéticas) PRIME-DE y (4 resonancias magnéticas) UNAM-INB. 144 Atlas de segmentación de PREEMACS FreeSurfer PNH: Un atlas con etiquetas bajo el formato FreeSurfer, fue creado en el espacio estándar de la template NMT que a su vez emplea el espacio MNI. Este atlas se construyó usando la segmentación de la template D99, la cual fue registrada a la template NMT usando una transformación no rígida (difeomorfica) empleando la suite de herramientas de ANTS (Avants et al., 2012). La segmentación se corrigió manualmente y se agregaron manualmente las segmentaciones de: hipocampo, tálamo, claustro, diencéfalo ventral, tronco encefálico y cuerpo calloso. PREEMACS. Plantilla de parametrización neuroanatómica de mono Rhesus. Primero, cada imagen T1 se registró linealmente, empleando 6 grados de libertad, al espacio NMT. En segundo lugar, con estas imágenes registradas ejecutamos el flujo de trabajo de PREEMACS hasta el paso de creación de la esfera, donde se obtuvieron las superficies de la sustancia blanca de cada hemisferio, infladas hasta geométricamente crear una esfera. A continuación, se creó un archivo de parametrización en formato TIFF y 2D (archivo de parametrización neuroanatómica de mono Rhesus) siguiendo los pasos descritos en la wiki de FreeSurfer http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/fswiki/SurfaceRegAndTemplates, creando una plantilla de registro para todos los animales (Fischl et al., 1999b). Este archivo de parametrización contiene información sobre: 1) la media y la varianza (entre sujetos) del patrón de curvatura, 2) la media y la varianza del patrón de convexidad y 3) los grados de libertad (número de sujetos) utilizados para el cálculo estadístico de los tres patrones. La varianza se utiliza para reducir los pesos de las características de las grandes fluctuaciones entre sujetos, de tal forma que el registro dependa de las características estables, como los patrones de curvatura y convexidad de los surcos central/calcarino/silviano en la superficie inflada. El archivo de parametrización se construyó agregando sujetos de forma iterativa, inicializando el proceso con la información de la superficie de sustancia blanca del atlas NMT para evitar algún sesgo en la estimación. PREEMACS. Atlas de superficie cerebral de mono Rhesus: Para obtener un atlas para la representación geométrica de las superficies de sustancia blanca y pial, una superficie promedio fue creada, siguiendo los pasos descritos en la wiki de FreeSurfer http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/fswiki/SurfaceRegAndTemplates. La correspondencia de vértices entre los sujetos se calcula sólo para el análisis de grupo, por lo que sólo los datos de los sujetos (por ejemplo, el grosor cortical) se muestrean en el espacio estándar, por lo que la geometría de la superficie se mantiene en el espacio nativo. 145 Estimación de la superficie pial y del grosor cortical. La estimación final de la superficie pial se realiza empleando imágenes T2w. Para mejorar la estimación pial, llevamos a cabo tres modificaciones en el procesamiento FreeSurfer (Fischl et al., 1999a). La primera modificación corrige la intersección comúnmente observada en las superficies piales entre hemisferios. Inicialmente se estimó la diferencia entre la segmentación cortical de las imágenes T1w y T2w. Posteriormente, la corrección se lleva a cabo restando esta diferencia en la segmentación cortical de las imágenes T2w, enfocándose en un ROI que está formado por dos cortes sagitales de la pared intermedia. En segundo lugar, para evitar errores de segmentación del hipocampo y la amígdala, utilizamos nuestro atlas para identificar y eliminar estas estructuras de las imágenes finales. Finalmente, PREEMACS estima el grosor cortical modificando el parámetro de grosor cortical máximo (del valor predeterminado de 5 mm a 10 mm) para garantizar que el espacio falso de 1 mm (ver Tamaño de imagen Voxel) no establezca un límite bajo en el grosor cortical (Donahue et al, 2018). EVALUACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LOS CORRELATOS ANATOMO-FUNCIONALES DE LOS ASPECTOS TEMPORALES DE INTERVALOS RÍTMICOS Y DEL PROCESAMIENTO DE SONIDOS COMPLEJOS EN LA ESCALA DE MILISEGUNDOS EN HUMANOS Dr. Hugo Merchant Nancy, Dr. Luis Concha Loyola, Biol. Cynthia Ivette De León Andrez, Mtra. Pamela García Saldivar PROTOCOLO DE APLICACIÓN No. Sujeto:__________________________ SELECCIÓN  Datos Generales  MoCA (Montreal Cognitive Assessment)  Inventario de Depresión Beck  Inventario de Ansiedad de Beck  Cuestionario de actividades CONSENTIMIENTO INFORMADO  Consentimiento Informado investigación  Consentimiento Informado Resonancia Magnética ANEXO C 1 Consentimiento Informado Santiago de Querétaro, a ______ de ____________ de 2017  Título del estudio: Evaluación y caracterización de los correlatos anatomo-funcionales de los aspectos temporales de intervalos rítmicos y del procesamiento de sonidos complejos en la escala de milisegundos en humanos.  Investigador principal: Dr. Hugo Merchant Nancy.  Nombre de los aplicadores: M. en Psic. Pamela García Saldívar Biol. Cynthia Ivette De León Andrez I. Introducción Antes de aceptar su participación en este estudio de investigación, es importante que lea y le sean claros todos los aspectos del presente texto. Este escrito describe el objetivo, los beneficios y riesgos asociados al presente experimento. II. Objetivo Este estudio está diseñado para comprender las bases psicométricas y correlatos anatomo- funcionales de la percepción y producción de intervalos temporales en el rango de los cientos de milisegundos. III. Descripción del estudio El protocolo se encuentra constituido por cuatro secciones: ejecución de 4 tareas psicométricas perceptuales, evaluación cognitiva y neuropsicológica, toma de imágenes cerebrales a través de resonancia magnética y registro electroencefalográfico de potenciales auditivos evocados a sonidos complejos, las cuales se describen a continuación. 2 Toma de imágenes cerebrales por Resonancia Magnética Se realizará la toma de imágenes cerebrales a través de resonancia magnética, con una duración aproximada de 1 hora en la que el sujeto de estudio deberá permanecer recostado con el menor movimiento posible. Se anexa la hoja de CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA ESTUDIOS DE RESONANCIA MAGNETICA. Ejecución de tareas psicométricas Usted estará sentado frente a un monitor de computadora y se le pedirá que toque una pantalla táctil para realizar diferentes tareas asociadas a la cuantificación del tiempo. Las tareas se aplicarán en 2 sesiones con una duración aproximada de 80 minutos cada una, con un tiempo de descanso de 15 minutos entre cada tarea. Estas tareas se encuentran en la categoría de sincronización-continuación en las que se producirán movimientos rítmicos asociados a un estímulo visual o auditivo (FASE DE SINCRONIZACION) para posteriormente proseguir con este movimiento rítmico, pero ahora sin la presentación del estímulo (FASE DE CONTINUACION). Si durante el estudio usted siente cualquier incomodidad, el estudio será interrumpido inmediatamente. IV. Preparación para el estudio a) Descanso de entre 6- 8 horas continuas la noche anterior del estudio. b) No haber consumido bebidas alcohólicas 48 horas antes del estudio. c) No consumir ningún tipo de medicamento 12 horas antes del estudio. d) Presentarse sin maquillaje el día del estudio. e) En el caso de las mujeres no encontrarse en la fase de menstruación durante los días del estudio. V. Posibles riesgos a) El estudio no tiene riesgos físicos o psicológicos de ningún tipo. VI. Posibles beneficios a) Se obsequiarán las imágenes cerebrales (T1) obtenidas a través de la resonancia magnética en un CD. b) Se otorgará un estímulo económico de entre 100 y 250 pesos, dependiendo de su ejecución en las tareas de psicofísica. 3 Los estímulos serán otorgados al concluir las cuatro secciones del presente protocolo de investigación. En caso de no concluir alguna fase del estudio dichos estímulos no serán otorgados. VII. Confidencialidad Los datos de este estudio serán mantenidos en privado. Cualquier manuscrito publicado con relación a este estudio no incluirá la identidad de los sujetos participantes. VIII. Derechos de los sujetos en estudios de investigación. Yo, __________________________________________________________ he leído y comprendido todo lo anterior. El experimentador, M. en Psic. Pamela García Saldívar y/o Biol. Cynthia Ivette de León Andrez, me han explicado el estudio y ha contestado todas mis preguntas y dudas. Asimismo, me han descrito los posibles riesgos y beneficios del estudio y comprendo que puedo abstenerme de participar o retirarme del experimento cuando lo decida sin ninguna penalización. ______________________________________ Nombre y Firma de aceptación del participante 1 DATOS GENERALES NO. SUJETO_______________ FECHA EVALUACIÓN ________/ ________/ ________ FECHA NACIMIENTO ________/ ________/ ________ IDIOMAS __________________ EDAD _________________GÉNERO_______________ESCOLARIDAD______:__________ OCUPACIÓN______________________________________________ PESO____________kg DOMINANCIA MANUAL (Inventario de Edinburgh) (suma de los diez ítems) ................................................ [ ] Puntuación: 1. Derecha muy preferente 3. Mano indiferente 5. Izquierda muy preferente (especificar) 2. Derecha preferente 4. Izquierda preferente 1. Escribir 1 2 3 4 5 6. Tijeras 1 2 3 4 5 2. Dibujar 1 2 3 4 5 7. Cuchara 1 2 3 4 5 3. Lanzar un objeto 1 2 3 4 5 8. Escoba (mano más alta) 1 2 3 4 5 4. Cepillarse los dientes 1 2 3 4 5 9. Encender un cerillo 1 2 3 4 5 5. Cuchillo (sin tenedor) 1 2 3 4 5 10. Abrir una caja 1 2 3 4 5 OBSERVACIONES MÉDICAS Y NEUROLÓGICAS I.- Se encuentra tomando algún medicamento. Si____________ NO_________ II.- En caso de que la persona esté tomando algún medicamento, especifique cuál, la dosis y la duración del tratamiento: ____________________________________________________________________________ III.- Antecedentes médicos: Marque con una “X” en caso de que tenga o haya tenido alguna de las siguientes enfermedades: ( ) Hipertensión Arterial ( ) Traumatismos craneoencefálicos ( ) Enfermedades pulmonares ( ) Diabetes ( ) Tiroidismo ( ) Accidentes cerebrovasculares ( ) Disminución de agudeza visual o ( ) Otros _________________________ auditiva. IV. Consume bebidas alcohólicas. Si____________ NO_________ Con que frecuencia: a) Dos copas o su equivalente por mes b) Cuatro copas o su equivalente por mes c) Seis copas o su equivalente por mes d) Más de 8 copas o su equivalente por mes 2 V. Consume algún tipo de droga. SI ____ (Especificar) __________________ NO_________ Con que frecuencia: a) Una vez por mes b) Dos veces por mes c) Tres veces por mes d) Más de 4 veces por mes VI. Fuma. Si____________ NO_________ Con que frecuencia: a) Un cigarro por día b) Dos a tres cigarros por día c) Tres a cuatro por día d) Más de cinco por día VII. ¿Cuál es el promedio de horas que duerme por día? ___________________________ VIII. Fecha de término del último ciclo menstrual___________________________________ OBSERVACIONES TAREAS Describir las estrategias en las que el participante se apoya para resolver las tareas 1 CUESTIONARIO DE HABILIDADES Instrucciones. A continuación, se le harán una serie de preguntas, por favor lea con atención cada una de ellas, revise las opciones que se dan y elija la opción de su preferencia. I. Música 1. ¿Ha tenido algún tipo de entrenamiento musical? (Fuera de la educación musical básica que se imparte en primaria o secundaria). SI NO 2. ¿Cuánto tiempo duró el entrenamiento? a) 1-3 meses b) 6-12 meses c) 1-3 años d) 4-6 años 3. ¿Hace cuánto ocurrió este periodo? a) 1-7 días b) 1-3 meses c) 4-6 meses d) 1-3 años o más 4. ¿Continúa con la práctica? SI NO 4.1 ¿Cuántos días le dedica a la semana? a) 1-2 días b) 3-4 días c) 5-7 días 4.2 ¿Cuántas horas practica a la semana? ________________________________________________________________ 2. Deportes. 1. ¿Ha practicado alguna actividad física? SI NO 2. ¿Qué tipo de actividad ha practicado? a) Aeróbica o Cardio b) Anaeróbica (Pesas) c) Estiramientos 3. ¿Cuántas horas practicaba a la semana? a) 1-3 horas b) 4-7 horas c) 8-12 horas d) 13-17 horas 2 34 ¿Hace cuánto ocurrió este periodo? a) 1-7 días b) 1-3 meses c) 4-6 meses d) 1-3 años o más 5. ¿Continúa con la práctica? SI NO 5.1 ¿Cuántos días le dedica a la semana? a) 1-2 días b) 3-4 días c) 5-7 días 5.2 ¿Cuántas horas practica a la semana? ________________________________________________________________ 3. Videojuegos. 1. ¿Dedica tiempo a jugar videojuegos? SI NO 2. ¿Qué tipo de videojuegos juega/jugaba? a) Arcade b) Acción c) Deportivos d) Estrategia e) Simulación f) Juegos de mesa 3. ¿Hace cuánto ocurrió este periodo? a) 1-7 días b) 1-3 meses c) 4-6 meses d) 1-3 años o más 5. ¿Continúa con la práctica? SI NO 5.1 ¿Cuántos días le dedica a la semana? a) 1-2 días b) 3-4 días c) 5-7 días 5.2 ¿Cuántas horas practica a la semana? ________________________________________________________________ ESTE DOCUMENTO LE EXPLICARÁ BREVEMENTE EN QUÉ CONSISTE EL ESTUDIO DE RESONANCIA MAGNÉTICA AL QUE USTED SE SOMETERÁ. POR FAVOR LÉALO ATENTAMENTE, Y SI TIENE ALGUNA PREGUNTA CONSULTE AL PERSONAL DE LA UNIDAD. AL FINAL DEL DOCUMENTO SE ENCUENTRAN UNA SERIE DE CONDICIONES QUE USTED ACEPTA EN CASO DE QUE FIRME AL CALCE. PRIMERO.-¿Qué es una Imagen por Resonancia Magnética? La imagen por resonancia Magnética (IRM) es un estudio diagnóstico seguro que proporciona una visión muy clara del cuerpo humano. En la IRM (estructural y funcional) NO se expone al paciente a radiación ionizante (rayos X), por esta razón es considerada una de las técnicas más seguras y de menor carácter invasivo. Esta técnica consiste en posicionar al paciente en un campo magnético de alta intensidad, para recolectar señales de respuesta por ondas de radiofrecuencia con un sistema de antenas colocadas externamente al paciente. SEGUNDO.-¿Qué preparación se me solicita para el estudio? • Contar con una solicitud médica • Usar ropa cómoda (sin partes metálicas; botones, broches, cierres). • Dieta ligera (y en caso de estudios contrastados o sedación, ayuno total de 6 horas). • Durante el estudio no deberá portar: monedas, teléfonos celulares, tarjetas de crédito, prótesis dentales, joyas u objetos metálicos en general. • Confirmar su asistencia con 24 horas de anticipación. • Asistir 20 minutos antes de la cita. • No dejar de consumir los medicamentos indicados por su médico. • En caso de requerir sedación o monitorización anestésica, deberá seguir las indicaciones específicas del personal de la Unidad de Resonancia Magnética. • En algunos casos puede ocurrir que se le solicite usar bata clínica para mayor comodidad. • Si está usted embarazada, el estudio sí se puede realizar, siempre y cuando tenga más de 12 semanas de embarazo, el estudio haya sido solicitado por su médico y usted informe al personal de la Unidad de su estado. • Si su peso es mayor a 120 Kg no podrá realizarse el estudio. • Si en su estudio se necesita usar medio de contraste es necesario contar con un estudio de creatinina sérica de no más de 30 días. TERCERO.-¿En qué casos no es posible efectuar el estudio? En los casos en que la persona use algún dispositivo médico como: a) Marcapasos, b) Implantes metálicos, c) Prótesis quirúrgica, d) Neuroestimulador, e) Prótesis auditiva, f) Si la persona alberga alguna partícula de munición o fragmento metálico, g) Cualquier otro dispositivo metálico Por favor informe inmediatamente al personal de la unidad ya que en casos especiales se pueden realizar los exámenes bajo monitoreo clínico estrecho. CUARTO.-¿Cómo se lleva a cabo el estudio? El estudio será realizado por técnicos radiólogos y personal de enfermería, ambos expertos en estas técnicas, quienes podrán contestar cualquier pregunta adicional. Antes de realizar el estudio, el equipo médico le ayudará a colocarse sobre una camilla móvil que le conducirá hacia el campo magnético. El aparato empezará a funcionar y usted escuchará el "ronroneo" de la máquina, señal de que todo marcha bien. El estudio no causa dolor pero algunas personas pueden sentirse ansiosas durante el estudio sobre todo si sufren de claustrofobia (ansiedad al estar en espacios reducidos). El estudio tiene una duración aproximada de 50 minutos, según la región del cuerpo a evaluar. Al finalizar del estudio podrá inmediatamente regresar a sus actividades diarias. QUINTO.-¿Qué es un estudio contrastado? Algunos estudios de IRM requieren medio de contraste, medicamento que se inyecta en una vena del brazo, con la finalidad de conseguir mejores imágenes para el diagnóstico. En su caso usted deberá declarar a los médicos si es alérgico (a) a algún medicamento y especificar cuál es éste. Deberá presentarse en ayuno total de 6 horas y con creatinina sérica reciente de no más de 30 días. Los riesgos asociados a la administración de contraste son bajos, es decir de 0.07%; incluyen reacciones leves (náusea, mareo, vómito, comezón y exantema; las más comunes, presentes en 75% de las reacciones), moderadas (edema laríngeo, disnea, broncoespasmo, bradicardia, taquicardia e hipotensión; poco frecuentes y presentes en 19% de las reacciones), y más remotamente severas (insuficiencia respiratoria, arritmia, convulsiones, paro cardio-respiratorio y muerte; las menos frecuentes, y presentes en 7% de las reacciones). El beneficio directo del estudio es la obtención de un diagnóstico radiológico que permita a su médico establecer un mejor tratamiento. SEXTO.- ¿Qué pasará con las imágenes que se obtengan? Los resultados sólo serán entregados al paciente o familiares que cuenten con el recibo del estudio o en su caso al médico tratante. Su identidad y sus datos personales serán resguardados en caso de que las imágenes obtenidas se utilicen para efectos de docencia o investigación. SÉPTIMO.- ¿Habrá algún costo adicional al acordado? Todos los procedimientos realizados en el protocolo de imagen tendrán el costo monetario acordado antes del estudio, con las posibles excepciones de los casos en que se requiera sedación o monitorización anestesiológica, o en casos que se requiera medio de contraste o secuencias no requeridas en la solicitud médica para la caracterización de lesiones. OCTAVO.-¿Reprogramación de citas y dudas? En caso de no poder asistir a su examen se le solicita llamar para reprogramar con 24 horas de anticipación. De haber falla de alguno de nuestros equipos de IRM, usted podrá ser reprogramado. Manifiesto bajo protesta de decir verdad, que he leído y entendido la explicación sobre el estudio de IRM al que voluntariamente me voy a someter. Asimismo, acepto que mis datos clínicos e imagenológicos sean utilizados bajo confidencialidad, con fines de docencia e investigación. Entiendo que en caso de que así lo requiera el procedimiento, recibiré ya sea un sedante para que el estudio se lleva a cabo adecuadamente o un medio de contraste que se administrará por vía intravenosa. Habiendo leído este documento, acepto las condiciones del estudio y eximo al personal adscrito a la Unidad de Resonancia Magnética, y al Instituto de Neurobiología de LA UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO, de cualquier responsabilidad civil, penal, administrativa, laboral o de cualquier otra índole por la realización del estudio al que me someteré en la UNIDAD DE RESONANCIA MÁGNETICA ___________________________________________________________________ NOMBRE Y FIRMA DE ACEPTACIÓN DEL PACIENTE ___________________________________________________________________ NOMBRE Y FIRMA DE TESTIGO ___________________________________________________________________ NOMBRE Y FIRMA DE SEGUNDO TESTIGO FECHA (DIA/MES/AÑO) CONSENTIMIENTO INFORMADO EN ESTUDIOS DE RESONANCIA MAGNÉTICA (ADULTO) JAGC ADVERTENCIA: Ciertos implantes, dispositivos, u objetos pueden ser peligrosos y/o pueden interferir con el procedimiento de Resonancia Magnética. NO ENTRE a la sala del Resonador si tiene alguna pregunta o duda relacionada con un implante, dispositivo, u objeto. Consulte con el técnico o radiólogo antes de entrar. POR FAVOR INDIQUE SI TIENE ALGUNO DE LOS SIGUIENTES: Pinzas de aneurisma Marcapasos cardiaco Implante con desfibrilador para conversión cardiaca (ICD) Implante electrónico o dispositivo electrónico Implante o dispositivo activado magnéticamente Sistema de neuroestimulación Electrodos o alambres internos Implante coclear, otológico, u otro implante de oído Dispositivo implantado para infusión de medicamento Cualquier tipo de prótesis Prótesis de válvula cardiaca Muelle o alambre de párpado Malla metálica (stent), filtro o anillo metálico Válvula de derivación (espinal o intraventricular) Catéter y/u orificio de acceso vascular Semillas o implantes de radiación Catéter de Swan-Ganz o termodilución Parche de medicamentos (nicotina, nitroglicerina) Aumentador de tejidos (óseos, mamarios, etc.) Grapas quirúrgicas, clips o suturas metálicas Articulaciones artificiales (cadera, rodilla, etc.) Varilla de hueso/coyuntura, tornillo, clavo, alambre, etc. Dispositivo intrauterino (DIU), diafragma o pesario Dentaduras o placas parciales Tatuaje o maquillaje permanente Perforación (piercing) del cuerpo Munición o fragmento metálico alojado en el cuerpo Audífono (quíteselo antes de entrar a la sala) Otro implante _________________________________ Problema respiratorio o desorden del movimiento Claustrofobia (ansiedad al estar en espacios reducidos) si no si no si no si no si no si no si no si no si no si no si no si no si no si no si no si no si no si no si no si no si no si no si no si no si no si no si no si no si no si no si no Marque en la imagen la localización de cualquier implante o metal en su cuerpo ¡ AVISO IMPORTANTE ! Antes de entrar a la sala del Resonador deberá quitarse todo objeto metálico incluyendo: audífonos, dentaduras, placas parciales, llaves, celular, lentes, horquillas de pelo, pasadores, joyas, piercing, reloj, alfileres, clips, tarjetas de crédito, monedas, plumas, corta uñas, navajas, ropa con cierres o botones de metal. Manifiesto bajo protesta de decir verdad que la información anterior es correcta según mi mejor entender. Leí y entendí el contenido de este cuestionario y he tenido la oportunidad de hacer preguntas en relación a la información del cuestionario y en relación al estudio de Resonancia Magnética al que me someteré. NOMBRE FIRMA FIRMANOMBRE Reviso: JAGC FECHA NeuroImage 227 (2021) 117671 Contents lists available at ScienceDirect NeuroImage journal homepage: www.elsevier.com/locate/neuroimage PREEMACS: Pipeline for preprocessing and extraction of the macaque brain surface Pamela Garcia-Saldivar a , Arun Garimella a , b , Eduardo A. Garza-Villarreal a , Felipe A. Mendez a , Luis Concha a , ∗ , Hugo Merchant a , ∗ a Institute of Neurobiology, Universidad Nacional Autónoma de México, Campus Juriquilla. Blvd. Juriquilla, 3001 Querétaro, Querétaro, México b International Institute of Information Technology, Hyderabad, India a r t i c l e i n f o Keywords: MRI Structural imaging T1 Quality control Artifact a b s t r a c t Accurate extraction of the cortical brain surface is critical for cortical thickness estimation and a key element to perform multimodal imaging analysis, where different metrics are integrated and compared in a common space. While brain surface extraction has become widespread practice in human studies, several challenges unique to neuroimaging of non-human primates (NHP) have hindered its adoption for the study of macaques. Although, some of these difficulties can be addressed at the acquisition stage, several common artifacts can be minimized through image preprocessing. Likewise, there are several image analysis pipelines for human MRIs, but very few automated methods for extraction of cortical surfaces have been reported for NHPs and none have been tested on data from diverse sources. We present PREEMACS, a pipeline that standardizes the preprocessing of structural MRI images (T1- and T2-weighted) and carries out an automatic surface extraction of the macaque brain. Building upon and extending pre-existing tools, the first module performs volume orientation, image cropping, intensity non-uniformity correction, and volume averaging, before skull-stripping through a convolutional neural network. The second module performs quality control using an adaptation of MRIqc method to extract objective quality metrics that are then used to determine the likelihood of accurate brain surface estimation. The third and final module estimates the white matter (wm) and pial surfaces from the T1-weighted volume (T1w) using an NHP customized version of FreeSurfer aided by the T2-weighted volumes (T2w). To evaluate the generalizability of PREEMACS, we tested the pipeline using 57 T1w/T2w NHP volumes acquired at 11 different sites from the PRIME-DE public dataset. Results showed an accurate and robust automatic brain surface extraction from images that passed the quality control segment of our pipeline. This work offers a robust, efficient and generalizable pipeline for the automatic standardization of MRI surface analysis on NHP. I. Introduction Research about brain structure and function in non-human primates (NHPs) is fundamental to understand both the neural substrate of hu- man cognition and the sources of brain dysfunction in different neu- rological populations ( Mendoza and Merchant, 2014 ; Merchant et al., 2015 ; Buffalo et al., 2019 ). Important recent progress on multimodal and multi-scale neuroimaging technologies in NHPs have opened a win- dow to investigate many critical structural-functional properties of the brain ( Milham et al., 2020 ); these include the study of structural brain changes during development, aging, and models of neurological disor- ders ( Goldberg, 2019 ). With the objective of accelerating the research in NHP and promote collaboration, a recent worldwide initiative, the Primate Data Exchange or PRIME-DE, has been created for data sharing and the development ∗ Corresponding authors. E-mail addresses: lconcha@unam.mx (L. Concha), hugomerchant@unam.mx (H. Merchant). of open resources for NHP imaging ( Milham et al., 2018 , 2020 ). Never- theless, a major obstacle for the community is the lack of fully validated pipelines and automated methods for data preprocessing and surface ex- traction of macaque MRI structural data. Consequently, in this paper we describe PREEMACS, a pipeline that standardizes the preprocessing of raw structural MRI images (T1- and T2-weighted) for the extraction of cortical surfaces in macaque NHPs with minimal or no manual interven- tion. 1.1. Why study the cortical surface in NHP? For the last 20 years, the use of MRI surface-based methods has been a crucial tool to study the human cortical structure. These methods in- clude several cortical morphometric measures such as cortical thickness (CT), cortical surface area (SA), and gyrification ( Lerch et al. 2017 ). CT https://doi.org/10.1016/j.neuroimage.2020.117671 Received 1 July 2020; Received in revised form 4 December 2020; Accepted 16 December 2020 Available online 24 December 2020 1053-8119/© 2020 The Authors. Published by Elsevier Inc. This is an open access article under the CC BY-NC-ND license ( http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ ) ANEXO D P. Garcia-Saldivar, A. Garimella, E.A. Garza-Villarreal et al. NeuroImage 227 (2021) 117671 is a macroscopic parameter that provides relevant information about atrophy, as well as cortical plasticity ( Scholtens et al., 2015 ). The mor- phology of the brain surface is regarded as an important endopheno- type in neurological and psychiatric disorders ( Davatzikos et al., 2011 ; MRC AIMS Consortium et al., 2019 ; Whelan et al., 2018 ). Neurodevel- opmental studies have reported changes of CT and SA at different ages, which relate to age-specific neuronal pruning, myelin concentration, and cortical reorganization ( Zhou et al., 2013 ; Li et al., 2015 ; Shaw et al., 2008 ; Wierenga et al., 2014 ). In addition, measures like CT are sen- sitive to cortical changes in myelin and cytoarchitecture within days and weeks, enabling studies of task-related cortical plasticity ( Sampaio- Baptista and Johansen-Berg, 2017 ). Thus, the quantitative assessment of changes of cortical morphometry using MRI surface-based methods is a powerful non-invasive technique to investigate brain structure in many areas of neuroscience research. Notably, using MRI in NHPs as a model for brain plasticity, development and neurological diseases provides es- sential benefits over human MRI datasets ( Van Essen and Dierker, 2007 ). First, scanning NHPs under highly controlled anesthesia protocols per- mits acquisition of virtually motion-free images with high quality and resolution, with the added benefit of longer scan times than those fea- sible in human subjects ( Milham et al., 2020 ). Second, while recruiting and following a homogeneous group of subjects to track individual MRI changes over time remains a large problem in human studies, NHP stud- ies allow for great control in longitudinal studies and are better suited to isolate the effects of experimental interventions ( Scott et al., 2016 ; Song et al., this issue) and the reconfiguration of the cortical sheet af- ter intensive training in complex cognitive tasks ( Fortes et al., 2004 ; Crowe et al., 2014 ; Merchant and Averbeck, 2017 ). Finally, NHP struc- tural MRIs can be combined with invasive experimental conditions that are impossible to implement in human studies, such as pharmacological interventions ( Yc et al., 2019 ), histological studies ( Sultan et al., 2010 ; Naselaris et al., 2005 ; Georgopoulos et al., 2007 ; Caminiti et al., 2009 ), and high density electrophysiological recordings ( Schwartz et al., 2014 ; Mendoza et al., 2016 ), as well as the injection of viral vectors for optoge- netic manipulations ( Galvan et al., 2017 ) or Calcium imaging ( Li et al., 2017 ), which provides a unique way to understand the human brain and its pathologies. Therefore, the use of these combined methodologies can shed light on fundamental information about the molecular, structural and brain circuit mechanisms behind changes in cortical thickness as- sociated with development, learning, and neurological and psychiatric disorders ( Buffalo et al., 2019 ). Despite their aforementioned advantages, surface-based methods have been scantly used in NHPs and confront the following technical issues: 1) the inability of specialized software to natively support sub- millimetric resolution NHP brain volumes, 2) lack of precise brain ex- traction algorithms adapted specifically for macaques, 3) the hetero- geneity of MRI acquisition methods, and 4) a lack of consensus on image preprocessing ( Gronenschild et al., 2012 ). PREEMACS provides a unified analytical framework that solves these issues and generalizes across dif- ferent image acquisition schemes and research institutions around the world. 1.2. The value of accurate cortical surface estimations Determination of the pial (outer) and white matter (inner, i.e., the boundary between the cortex and underlying white matter) surfaces is central to accurate CT estimation. Errors in the estimations of these sur- faces produce artificially higher or lower CT that potentially affect the results ( Ducharme et al., 2016 ; Rosen et al., 2018 ). Partial volume ef- fects (PVE) due to MRI resolution is a common problem in MRI that can blur the boundaries of gyri and sulci difficulting their identifica- tion ( Rueda et al., 2010 ). For this reason, correct data acquisition, data preprocessing and quality control are of the highest priority. Proper seg- mentation of gray and white matter, as well as CSF, are critical for sur- faces reconstruction ( Eggert et al., 2012 ). Moreover, multiple algorithms exist that calculate and determine the outer- and inner-surface bound- aries, such as: “Marching Cubes ”, a bottom-up method using edge de- tection used in CIVET ( Kim et al., 2005 ), SureFit in Caret ( Zhong et al., 2010 ), volumetric-based method in ANTs ( Tustison et al., 2014 ), and Bayesian approaches ( Miller et al., 2000 ). All algorithms and methods are prone to errors and inaccuracies that need to be addressed and min- imized when conducting surface estimations ( Zhong et al., 2010 ). No- tably, these methods have mostly been optimized for human brain imag- ing and they application to NHPs has been proved challenging. Indeed, this situation has led to each research group developing site-specific adaptations of existing tools, with poor generalization, or developing new methods from the ground up ( Oguz et al., 2015 ). 1.3. The importance of quality control in NHP MRI Results from image processing pipeline can only be as good as the raw data will allow. Quality assurance is, therefore, an obligatory first step. Semi-automated quality control (QC) has gained traction due to the ever-increasing generation of large amounts of imaging data (big data) in MRI, with datasets prohibitively large to curate manually ( Alfaro- Almagro et al., 2018 ; Klapwijk et al., 2019 ). Recent efforts in QC for big data analysis demonstrate that curation is a necessity to reduce vari- ability and increase statistical power in morphological data ( MRC AIMS Consortium et al., 2019 ). Automated extraction of QC metrics and their intuitive visualization has been adopted by recent software such as MRIqc ( Esteban et al., 2017 ), which provides an easy to use HTML-based interface to quickly curate human neuroimaging data. The importance of QC is accentuated with NHP MRI data where there is increased vari- ability due to the type of image sequences used, as well as their orienta- tion, geometry, and other parameters ( Milham et al., 2018 ). The present pipeline relies on different MRIqc-based metrics to determine whether the input NHP images are of enough quality to produce adequate esti- mates of brain surfaces and CT measurements. Here, we aimed at developing a robust, automatic and versatile pre- processing pipeline for macaque cortical surface estimation. Our work- flow deals with many specific challenges of the NHP structural images and was validated on 57 images from 11 different sites from the PRIME- DE. Specifically, PREEMACS carries out automatic skull striping, per- forms a quality control assessment on input images that predicts the quality of the surface outcome, uses three custom made macaque tem- plates for surface segmentation and registration within the pipeline, keeps all images and the resulting surfaces in native space, and runs all the steps automatically within the workflow until the CT group data analysis. 2. Material and methods 2.1. UNAM-INB dataset 2.1.1. Subjects Eight rhesus monkeys ( Macaca mulatta , six males, 4–10 years old, weight 5–12 kg) were scanned under anesthesia. Animal care, hous- ing, and experimental procedures were approved by the National Au- tonomous University of Mexico Institutional Animal Care and Use Com- mittee (protocol 090.A INB) following the principles outlined in the Guide for Care and Use of Laboratory Animals (NIH, publication number 85–23, revised 1985). 2.1.2. Data acquisition Anesthesia Anesthesia was induced with an initial dose of ketamine/xylazine (IM 7/0.6 mg per Kg) and maintained with additional doses of ke- tamine/xylazine (IM 2.5/0.05 mg per Kg) every 30 min. Animals were monitored continuously with a pulse oximeter to track heart rate and peripheral capillary oxygen saturation. 2 P. Garcia-Saldivar, A. Garimella, E.A. Garza-Villarreal et al. NeuroImage 227 (2021) 117671 Imaging protocol Images were acquired using a 3 T Philips Achieva TX scanner with a 32-channel head coil for humans. Animals were placed inside the scanner in an inverted sphinx position, which minimizes the distance between the animal’s head and the coil and improves signal-to-noise ratio (SNR). A vitamin E capsule affixed to the right portion of the head to unequivocally ascertain left/right hemispheres throughout sub- sequent image processing steps. In order to ensure the same posi- tion of all animals in the scanner, based on https://caseforge.co mod- els, we used a custom-made plastic helmet specifically designed for the 32-channel head coil with removable tailor-made padding adapted to each monkey’s head. These precautions minimized motion and avoided direct contact of the monkey’s head with the coil. T1w vol- umes were acquired using a spoiled gradient echo sequence using three- dimensional spatial encoding, with slices collected in the sagittal plane (frequency encoding = anterior/posterior), with imaging parameters as follows: TR/TE = 3.1/5.24 ms, flip angle = 8°, SENSE, field of view (FOV) = 128 × 128 × 145 mm 3 , matrix size = 184 × 143 × 183 slices, yielding voxel resolution = 0.7 × 0.5 × 0.5 mm 3 . We obtained 6 T1w images per animal. Four T2w volumes in the sagittal plane (frequency encoding = anterior/posterior) were acquired using a turbo spin echo sequence with three-dimensional spatial encoding, with an isometric voxel resolution of 0.5 mm, matrix size = 256 × 256 × 290 slices, SENSE, TR/TE = 2500/338 ms, flip angle = 90°, FOV = 256 × 256 × 100 mm 3 . The manufacturer’s default surface coil intensity (SCIC) filter was applied to all images prior to further processing. 2.2. PREEMACS modules PREEMACS has a modular design, with each module running in- dependently. These modules perform the canonical workflow for pre- processing MRI ( Glasser et al., 2013 ; Alfaro-Almagro et al., 2018 ; Esteban, et al., 2019 ), except for the steps that are specific for NHP data using different previously-available functions from FSL (FM- RIB’s Software Library – FSL, Oxford, U.K) ( Smith et al., 2004 ), ANTs ( Avants et al., 2011 ), MRtrix ( Tournier et al., 2019 ), MRIqc ( Esteban et al., 2017 ) and FreeSurfer ( Dale et al., 1999 ; Fischl et al., 1999b ; Fischl, 2012 ). Inputs to the pipeline are one (or more) T1w vol- umes and one (or more) T2w volumes per animal ( Fig. 1 A). 2.2.1. Module 1: preprocessing This module prepares the raw images (T1w and T2w) for initial pro- cessing and is constituted by the following six steps ( Fig. 1 B): Volume orientation: Since brain images of the NHP can be acquired with the subjects in different positions (e.g. lateral, sphinx, supine) within the scanner, it is necessary to reorient the image. This step gen- erates an output volume in RAS space relative to the sphinx position (Right- > left; Anterior- > posterior; Superior- > inferior). Image crop. The FOV of NHP MRI acquisition often includes anatomy beyond the head of the animal. This extra information can increase between-subject variance and make spatial normalization difficult. Therefore, PREEMACS crops the brain and parts of the skull automat- ically in native space. This crop is performed using a mask whose ge- ometry depends on the coordinates of the anterior and posterior com- missures. These coordinates are estimated by aligning the T1w volume to the NMT template ( Seidlitz et al., 2018 ) through a linear registration with 6 degrees of freedom (DOF) using ANTs ( Avants et al., 2011 ), then back to native space. If registration fails, then PREEMACS asks the user to provide the coordinates of anterior and posterior commissures to crop the images. Intensity non-uniformity (INU) correction: Most NHP images contain spatially varying intensity non-uniformities. Common sources of non- uniformities include the use of multi-channel coils, the position of the animal with respect to the coil, and B1 inhomogeneities. Image segmen- tation, in turn, is likely to fail unless these non-uniformities are properly corrected. Intensity normalization is performed with the N4 algorithm ( Tustison et al., 2010 ) on every volume, prior to averaging. For improv- ing the performance of the N4 algorithm the b-spline fitting parameter was tuned empirically (-b [100 mm]). Image averaging, resampling and conform: The T1w and T2w volumes are averaged separately for each contrast. This is performed using the tool mri_motion_correct.fsl of FreeSurfer. Each of the two resulting vol- umes are resampled to obtain an isometric resolution of 0.5 mm and a final size of 256 × 256 × 256 voxels. Skull-stripping: Obtaining an accurate mask of the brain is a cru- cial step for image processing. While there are many tools for skull- stripping in human MRI ( Kleesiek et al., 2016 ; ( Eskildsen et al., 2012 ; Iglesias et al., 2011 ; Smith, 2002 ), we encounter far fewer tools for NHP, including: Marker based watershed scalper (MBWSS) ( Beare et al., 2013 ), 3dSkullStrip of AFNI ( Cox, 1996 ), Primatologist- Toolbox ( Balbastre et al., 2017 ), NMT_subject_align.sh ( Seidlitz et al., 2018 ), and automated template derived brain extraction in animal MRI (atlasBREX) ( Lohmeier et al., 2019 ). Nevertheless, the brain segmen- tation obtained using these tools, in most cases, shows estimation er- rors in the prefrontal cortex and the temporal lobes, as well as errors in the separation of the dura and gray matter. To solve this problem, we customized the Python module DeepBrain ( Itzcovich, 2017 ), which was designed for skull-stripping in human MRI using a convolutional neural network implemented on Tensorflow, to work with NHP data. We trained the DeepBrain model using a set of T1w monkey images and the corresponding manually-defined brain masks. Notably, the data aug- mentation strategy implemented in DeepBrain increases the variability of image orientation in order to obtain a richer input dataset. We refer to this skull striping method based on the convolutional neural network model as the PREEMACS brainmask tool. The preprocessing of the im- ages for training the convolutional neural network was the following: First, we executed the first module of PREEMACS through step “Image averaging, resampling and conform ” using a total of 126 images: 88 im- ages from PRIME-DE (sampling at least an image per PRIME-DE site from 17 sites), 17 from UNAM-INB, and 21 from UNC-Wisconsin dataset ( Young et al., 2017 ). Second, we built a brain mask for each image as follows. For the PRIME-DE and UNAM-INB datasets, we built the brain masks using the atlasBREX pipeline and performed the corresponding manual correction. The masks included all cerebral and cerebellar gray matter and white matter, as well as the brainstem (pons, medulla). Skull, skin, muscles, fat, eyes, dura mater, bone and the optic chiasm were ex- cluded from the mask. In the case of the UNC-Wisconsin dataset, manual segmentation of the images was already available, so we only excluded the optic chiasm from the original masks. The degree of overlap between the mask computed with the PRE- EMACS brainmask tool and the manually drawn reference mask was determined using three metrics: Dice coefficient ( Dice, 1945 ), Sensitiv- ity and Specificity ( Kleesiek et al., 2016 ). These measures depend on the following four parameters: false negatives (FNs) defined as voxels that are removed by the Deep Neural Network method but are present in the reference mask; false positives (FPs), defined as voxels which have been predicted incorrectly as brain tissue; true positives (TP), that cor- respond to the voxels that were correctly identified by the PREEMACS brainmask tool as brain tissue; and true negatives (TN), defined as the voxels correctly identified as non-brain tissue. Dice is the most com- monly used coefficient to compare two segmentations ( Kleesiek et al., 2016 ; Manjon et al., 2014 ; Wang et al., 2014 ) and is defined as the ratio of twice the size of the intersection of the two masks relative to the sum of their sizes, as follows: Dice = 2TP 2TP + FP + FN Based on Kleesiek et al. (2016) , we also computed the sensitivity (TP/(TP + FN)) and specificity (TN/(TN + FP)) scores. 2.2.2. Module 2: quality control Since images with acquisition artifacts could induce biases and seg- mentation miscalculations, a rigorous quality control of the input im- 3 P. Garcia-Saldivar, A. Garimella, E.A. Garza-Villarreal et al. NeuroImage 227 (2021) 117671 Fig. 1. Pipeline for PREprocessing and Extraction of the MACaque brain Surface (PREEMACS). A. Input raw images. B. Module 1 performs volume orientation, image cropping, INU correction, image average, and skull-stripping. C. Module 2 performs quality control using an adaptation of the MRIqc method and extracts quantitative quality metrics, which are used to determine the likelihood of a successful brain extraction based on a SVM classifier. D. Module 3 estimates the white matter (WM) and pial surfaces from T1w using an NHP customized version of FreeSurfer 6.0. After a second INU correction, a volumetric label estimation is carried out based on our PREEMACS FreeSurfer segmentation atlas. Then, WM segmentation is performed and the WM surface is registered to the PREEMACS Rhesus parameterization template. The pial surface is properly estimated with the help of the T2w image. Finally, CT is calculated and the resulting surfaces can be analyzed in the geometric space of PREEMACS Rhesus average surface. ages is of utmost importance for the automatic identification of cor- tical surfaces. Here, we adapted the structural MRI Quality Control tool MRIqc v0.15.2 ( Esteban et al., 2017 ) to work with NHPs. Specif- ically, we performed the following adaptations to MRIqc for monkey images: conform, skull-stripping, spatial normalization to the NMT mon- key template ( Seidlitz et al., 2018 ) space with a high-resolution template (0.25 × 0.25 × 0.25 mm 3 ), and replacement of all human template im- ages (brain template, brain mask, head mask and probabilistic segmen- tation files) with the NMT template. As a result of these modifications, the MRIqc pipeline is fully compatible with NHP images. MRIqc car- ries out the brain segmentation and estimates the brain masks to finally compute the image quality metrics (IQMs). From the total 68 metrics cal- culated by MRIqc, we used 58 for further analysis. The other ten metrics were excluded because they related to voxel and FOV sizes, which are constant across the resampled images, measure background artifacts of parts of the images that PREEMACS crops or could not be reliably com- puted across images. In addition, six structural datasets were not in- cluded since their signal-to-noise ratio was very low and did not allow for the computation of IQMs. PREEMACS uses these IQMs as predictors of the quality of the re- sulting surface using a Support Vector Machine (SVM), where the three possible outcomes of the classifier are surfaces with minimum, medium or large errors ( Fig. 1 C). The SVM was trained one hundred times with a twenty-fold cross-validation to evaluate the performance of the classi- fier. The training dataset of the SVM were the 58 IQMs of 57 T1 images (52 MRIs from PRIME-DE and 5 MRIs from UNAM-INB) and for which the target class (minimum, medium or large errors) was defined using a visual inspection test on the wm/gm PREEMACS surfaces. This test uses a rating scale between 0 and 48 points depending on the smoothness of the surfaces and presence of segmentation errors. The smoothness takes values between 0 for perfectly smooth and 10 for very irregular surfaces. The segmentation rating can acquire values between 0 for no errors and 38 for widespread errors in the wm across all cortical areas. The values of the visual inspection test were ranked as minimal for 0–9, medium for 10–15, and larger errors for 16–48. Surfaces with large errors on the visual inspection test would require major manual intervention. We investigated whether some metrics contained more information to predict the quality of the obtained surfaces. To this end, we computed a dissimilarity matrix for all possible metrics pairs using the Calinski– Harabasz index as a distance measure ( Calinski and Harabasz, 1974 ). This index measures the clustering power of a metric pair to separate the three outcome surfaces and corresponds to the ratio of the intra- to the inter-cluster dispersion with larger scores for better clustering. This matrix was treated as the adjacency matrix for a weighted undirected graph. The threshold was found through an edge density minimization approach, whereby the graph density ( K ), defined as K = n / ( N × ( N − 1)), where n is the number of edges in the graph and N the total number of metrics, was iteratively calculated for an increasing threshold, starting at zero and reaching the maximum Calinski–Harabasz index in the ma- trix, progressively eliminating edges that did not reach each threshold and nodes that lost all its edges. Therefore, the threshold to extract the final graph is the index that minimized the edge density, because at this point the graph conveys the maximal information about its complex topology ( Royer et al., 2008 ). As depicted in Fig. 3 A, the threshold had a Calinski–Harabasz index of 14.7 and the edge density at the threshold was 0.08. 2.2.3. Module 3: brain surface estimation The purpose of this module is to obtain the CT of the brain sur- face using a customized version of FreeSurfer v6 optimized for NHP images ( Fig. 1 D). This module uses the skull-stripped images obtained 4 P. Garcia-Saldivar, A. Garimella, E.A. Garza-Villarreal et al. NeuroImage 227 (2021) 117671 Table 1 Adaptations of FreeSurfer recon-all pipeline. FreeSurfer Flag Step Status autorecon1 Motion correction and conform FreeSurfer v.6 Non-uniform intensity normalization FreeSurfer v.6 Talairach transform conformation PREEMACS customized Intensity normalization I FreeSurfer v.6 Skull stripping replaced by PREEMACS brain mask tool autorecon2 Linear volumetric registration to Gaussian Classifier Atlas (GCA) FreeSurfer v.6 Intensity Normalization based on GCA model FreeSurfer v.6 Non-linear volumetric registration to GCA atlas FreeSurfer v.6 Remove neck Deleted Align volume with skull to GCA atlas FreeSurfer v.6 Volumetric labeling estimation PREEMACS customized Intensity normalization 2 PREEMACS customized WM segmentation PREEMACS customized Edit WM with volumetric labeling PREEMACS customized Fill FreeSurfer v.6 Tessellation FreeSurfer v.6 Smooth 1 FreeSurfer v.6 Inflate 1 FreeSurfer v.6 Qsphere FreeSurfer v.6 Automatic topology fixer FreeSurfer v.6 autorecon3 Final surfaces PREEMACS customized Smooth 2 FreeSurfer v.6 Inflate 2 FreeSurfer v.6 Spherical mapping PREEMACS customized Spherical registration PREEMACS customized Spherical registration, contralateral hemisphere PREEMACS customized Cortical ribbon mask FreeSurfer v.6 from Module 1. Output surfaces are provided in Freesurfer and GIFTI formats. Second INU correction: Certain averaged volumes can have per- sisting image intensity non-uniformities (INU). PREEMACS uses the BiasFieldCorrection_sqrtT1wXT1w.sh pipeline from HCP to address this issue ( Glasser et al., 2013 ) based on procedures described in Rilling et al. (2012) . Briefly, the T2w image is aligned to the T1w im- age with a 6 DOF rigid-body transformation using ANTs tool, then the bias field is estimated and corrected for based on the square root of T1w × T2w. Voxel image size: Most of Freesurfer’s tools expect images to be con- formed to an isometric resolution of 1 mm per side, and to have a specific FOV of 256 voxels per side. Given that NHP volumes typically have sub- millimeter resolution not accepted by most software, the image header is edited to fake isometric resolution of 1 mm (yet the image data is not resampled) ( Donahue et al., 2016 ). FreeSurfer processing: FreeSurfer is a suite of tools for the analysis of neuroimaging data using automated workflows to quantify structural properties of the human brain based on surface measures ( Fischl, 2012 ). Freesurfer’s main pipeline for human brain surface extraction is called recon-all, which is in turn divided into three parts denominated autore- con 1, 2, and 3. Specific adaptations of recon-all have been made in PREEMACS to work with NHP images, which are outlined in Table 1 . Modifications in Autorecon 1. For this part of the pipeline we devel- oped two adaptations. Firstly, multiple steps of the FreeSurfer work- flow required the use of talairach coordinates as seed points. To obtain these coordinates, FreeSurfer performs an affine registration ( Dale et al., 1999 ) to the MNI305 atlas, using 4dfp image registration tools dis- tributed as a part FreeSurfer, and keeps the transformation matrix as an .xfm file. Our pipeline uses a Rhesus template image in MNI space (namely the NMT template) instead of freesurfer’s default MNI305 tem- plate. The second adaptation is the use of our skull-stripping procedure based on a convolutional neural network, as described previously (Sec- tion “Skull-stripping ”). Modifications in Autorecon2 Volumetric label estimation. To improve the wm/gm segmentation, it is necessary to perform brain structural parcellation based on an atlas. For each subject, FreeSurfer obtains the cortical and subcortical struc- ture labels by non-linear registration using the Gaussian Classifier Atlas (GCA) ( Fischl et al., 2002 ). This human-based parcellation is used in dif- ferent steps throughout Freesurfer’s workflow such as wm segmentation, segmentation of the cerebellum and pons among others. We replaced the GCA with a custom NHP segmentation (PREEMACS FreeSurfer segmen- tation atlas, see below for details). Label estimation for each subject is obtained by registering the generic NMT atlas, a space where the PRE- EMACS FreeSurfer segmentation atlas was designed, to the correspond- ing T1w using a non-linear transformation (diffeomorphic) registration using ANTs ( Avants et al., 2012 ). White matter segmentation. Two adaptations were developed in PRE- EMACS to obtain a robust wm segmentation. First, the wm was seg- mented using a wm mask ( Dale et al., 1999 ). This wm mask includes empty spaces on subcortical gm in the human FreeSurfer workflow. These spaces are filled using a subcortical mask. To solve this issue in NHP, the subcortical structures are identified using our PREEMACS FreeSurfer segmentation atlas. Then, the identified areas are filled as wm in the mask. Second, we customized the FreeSurfer pipeline to minimize a com- mon segmentation error in NHP MRIs consisting of a strong intensity bias with high intensity values in the precentral gyrus and the visual cortex. The problem was solved using the High Intensity Control Point (HICPO) tool, developed and implemented in our workflow. The HICPO estimates the WM in the precentral gyrus (PCg) and in the visual cortex using a higher (stricter) volume segmentation threshold and a normal threshold over the rest of the cortex. We follow the standard FreeSurfer process for the wm segmentation using the mri_segment tool for both thresholds. Then, we created a mask on the high thresholded areas and used it to replace the precentral gyrus and the visual cortex on the brain volume with low threshold segmentation. Modifications in Autorecon3 Surface atlas registration. Since the number of vertices is not the same among the subjects and depends on the brain size of each monkey, the wm surface in native space needs to be registered to a common space ( Fischl et al., 1999a , 1999b ). This step computes a subject’s sphere from the wm inflated surface, warps the sphere into a 2-D file containing the curvature and convexity pattern of the subject, and then registers the 2D file with a reference pattern called PREEMACS Rhesus parameterization template (detailed below). This is executed to ensure that the monkey´s curvature and convexity pattern are aligned with a generic Rhesus NHP reference template. Thus, these metrics allow us to establish a surface- based coordinate system ( Fischl et al., 1999a ) with vertex correspon- dence between subjects, such that anatomical features can be compared between animals for group analysis. For registration, FreeSurfer uses mris_register, which represents deformation by a displacement field on the sphere. This algorithm minimizes areal distortions, so that the over- all change in area of triangular mesh faces during the transformation is minimized ( Fischl et al., 1999a ). After that, the pial surface is created by expanding the white matter surface so that it closely follows the gray- CSF intensity gradient, keeping the same topology (number of vertices, edges, faces). During inflation, indexed vertices in each surface space retain one-to-one correspondence, such that each index represents the same cortical location across white, pial, inflated and spherical surfaces. Due to the surfaces are not matched across hemispheres within individ- uals, the data associated with each vertex are sampled into the group space in order to obtain vertex correspondence across subjects. Pial surface and cortical thickness estimation. Final estimation of the pial surface is estimated using T2w images. In order to improve pial es- timation we carried out three modifications on the FreeSurfer pipeline 5 P. Garcia-Saldivar, A. Garimella, E.A. Garza-Villarreal et al. NeuroImage 227 (2021) 117671 (Supplementary Figs. 1 and 2) ( Fischl et al., 1999a ). The first modi- fication corrects the commonly observed intersection in pial surfaces between hemispheres. We initially estimate the difference between the cortical ribbon from T1w and T2w images. Then, the correction is car- ried out by subtracting this ribbon difference from the T2w images, fo- cusing on an ROI that is made of two sagittal slices of the intermediate wall. Second, to avoid segmentation errors from the hippocampus and amygdala, we used our atlas to identify and eliminate these structures from the final images. Finally, PREEMACS estimates the cortical thick- ness modifying the maximum cortical thickness parameter (from the default 5 mm to 10 mm) to ensure that the fake 1 mm space (see Voxel image size ) does not set a low cap on cortical thickness ( Donahue et al., 2018 ). Template building: Three NHPs templates were built within the FreeSurfer environment: (1) PREEMACS FreeSurfer segmentation atlas, with cortical and subcortical labels, (2) PREEMACS Rhesus parame- terization template, that includes the Rhesus curvature and sulcal pat- tern templates for individual monkey wm surface registration, (3) PRE- EMACS Rhesus average surface for final mapping of vertices across all animals. The last two templates were constructed using 33 monkey MRIs from the (29 MRIs) PRIME-DE and (4 MRIs) UNAM-INB datasets. PREEMACS FreeSurfer segmentation atlas: We created an atlas with FreeSurfer format labels in NMT space. This atlas was built using the D99 template segmentation and registered to the NMT space, using a non- rigid transformation (diffeomorphic) using ANTs ( Avants et al., 2012 ). The segmentation was corrected manually, and hippocampus, thalamus, claustrum, ventral diencephalon, brainstem, and corpus callosum were manually added. PREEMACS Rhesus parameterization template: First, each T1 im- age was linearly registered (6 dof) to the NMT space. Second, with these registered images we executed the PREEMACS workflow until the sphere creation step, where we obtained the wm sphere surface from both hemispheres. Next, we created a parameterization file (PRE- EMACS Rhesus parameterization file) following the steps described in the FreeSurfer wiki http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/fswiki/ SurfaceRegAndTemplates creating a registration template across all ani- mals ( Fischl et al., 1999b ). A FreeSurfer workflow was designed to build, for each hemisphere, a parameterization template file in 2D TIFF for- mat. This parameterization file contains nine elements with information about the mean and variance (across subjects) of the curvature pattern (estimated from both the smooth and inflated wm surface), the mean and variance of the convexity pattern (using the smooth wm surface), and the degrees of freedom (number of subjects) used for the statis- tic calculation of the three patterns. The variance is used to lower the weights of features with high fluctuations across subjects, so that the registration depends on the stable features like the curvature and con- vexity patterns of the central/calcarine/sylvian sulci in the inflated sur- face. The parameterization template file was built by adding subjects iteratively, initializing the process with the information of the NMT wm surface to avoid biasing the estimation. PREEMACS Rhesus average surface: In order to obtain a template for the geometric representation of the wm and pial surfaces, we created an average surfaces using the steps described in the FreeSurfer wiki http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/fswiki/SurfaceRegAndTemplates . The vertex correspondence across subjects is computed only for group analysis, so the subjects´ overlays (e.g. thickness) are sampled into the group space (not the surface geometries themselves). 3. Results To evaluate the generalizability of our method, we tested the PRE- EMACS workflow with the PRIME-DE ( Milham et al., 2018 ) data set. The PRIME-DE is an open source dataset with 217 NHP subjects from twenty- seven different sites. This database contains T1w, T2w, fMRI and DWI scans. These images were acquired with different scanners, coils, struc- tural MRI protocols and macaque species ( Macaca mulatta and Macaca Table 2 Number of images used across the different modules for the development and validation of PREEMACS. Process Number of subjects Database Assessment of the generalizability of PREEMACS pipeline 52 PRIME-DE PREEMACS Rhesus average surfaces 33 PRIME-DE and UNAM-INB PREEMACS brainmask tool 126 PRIME-DE, UNAM-INB, UNC- WISCONSIN MRIqc classifier model 57 PRIME-DE, UNAM-INB PREEMACS pipeline development 5 UNAM-INB fascicularis ). Consequently, we only selected images that met the follow- ing criteria: MRIs with both T1w and T2w sequences, available to down- load online (without special requirements), no cropping or masks, and only one set of images per animal. In addition, phase-sensitive inversion recovery (e.g. Real-IR) images were eliminated as FreeSurfer produces errors in the tissue classification step. Fifty-eight images from PRIME-DE plus five images from our UNAM-INB database met these requirements. Nevertheless, we excluded six subjects due to their low signal-to-noise ratio. Thus, a total of fifty-seven monkey images from eleven sites across the world were used to evaluate all modules of PREEMACS. See Table 2 for a detailed description of the number of images used across the dif- ferent modules of PREEMACS. 3.1. PREEMACS brainmask tool We developed a skull stripping method based on a deep learning algorithm that obtains accurate brain masks solving one of the most common bottlenecks in surface-based estimations. Fig. 2 A shows values of Dice, Sensitivity and Specificity for 126 masks obtained with PRE- EMACS brainmask tool. These metrics were designed to measure the overlap between the computed against the manually drawn mask, with values between zero (no overlap) and one (perfect overlap) (see Mate- rials and Methods). The results showed values close to one for the three metrics across sites with a mean ( ± SEM) for Dice of 0.97 ± 0.009, Sen- sitivity of 0.96 ± 0.01, and Specificity of 0.99 ± 0.0006, supporting the notion that our Deep Neural Network implementation for skull stripping was very robust across a wide variety of images and sites. Nevertheless, the sensitivity showed values between 1 and 0.9, indicating some degree of false negative rate, and hence, that the predicted masks were smaller than the reference. This can be explained by the tendency to overesti- mate a manually drawn mask. In contrast, the false positives were very scarce since the specificity was very close to one. Indeed, Fig. 2 B illus- trates the clear segmentation of five brain masks computed from images collected from different sites. 3.3. Surface quality prediction based on IQMs Using 58 IQMs we trained SVMs to classify volumetric structural im- ages that produced 57 PREEMACS surfaces into groups with minimum, medium, and large errors. We used visual scoring (see methods for de- tails) on the properties of the volumetric structural images in order to predict with SVMs the quality/reliability of the output surfaces. The classifier performance showed 66 ± 1.9 (mean ± STD) percent of cor- rect predictions, considerably higher than chance (33.3%, for 3 classes). However, we hypothesized that not all metrics contain useful informa- tion to predict the quality of the obtained surfaces. Therefore, we se- lected those metrics that maximized the classification based on graph analysis (see Section 2.2.2 ). Notably, five IQMs showed large cluster- ing power to distinguish between outcome surface categories ( Fig. 3 B), forming a maximum clique with a high degree of centrality ( Fig. 3 C,D). 6 P. Garcia-Saldivar, A. Garimella, E.A. Garza-Villarreal et al. NeuroImage 227 (2021) 117671 Fig. 2. Performance of the PREEMACS brainmask tool that uses a Deep Learning convolutional neural network model. A. The violin plots for the Dice, Sensitivity and Specificity metrics computed across 18 sites (color coded, see inset) for 126 monkey images. B. Brain masks (red) for five monkeys of different provenance. Fig. 3. Clustering evaluation . A. Calculation of the graph-extraction threshold using the edge density of graphs computed with the Calinski–Harabasz score. The red line corresponds to the threshold that minimized the edge density. B. Degree of centrality of all the IQMs as graph nodes. Note that only five IQMs show a large interrelation within the graph, indicating their large capability to dissociate the outcome-surfaces. C. Graph extracted at the threshold. D. Maximum clique. 7 P. Garcia-Saldivar, A. Garimella, E.A. Garza-Villarreal et al. NeuroImage 227 (2021) 117671 Table 3 Metrics with significant node interactions that form a maximum clique with a high degree centrality. Metric Description Value Summary GM p05 Calculates the 5th percentile of the distribution of grey matter intensity. Values closer to the median value indicate an accurate estimation of the gm ( Esteban et al., 2017 ). Signal to noise ratio (SNR GM) Calculates the signal to noise ratio in the grey matter tissue. Larger values are indicative of lower noise. Hence, higher values are preferred ( Dietrich et al., 2007 ). Tissue Probabilistic Mapping (TPM overlap WM and GM) This metric calculates the overlap between the tissue probability maps estimated from the image and the probability maps calculated from the NMT template. Values closer to 1 indicate a similarity to the template although deviating values may indicate inconsistencies in the image or individual image characteristics ( Esteban et al., 2017 ). Volume fraction (ICV CSF) Estimation of the volume fraction of each tissue calculated on the FSL FAST’s segmentation. Normative values fall around 50%, 28% and 12% to GM/WM and CSF respectively ( Seidlitz et al., 2018 ). Fig. 4. PREEMACS FreeSurfer segmentation atlas. A–D. Axial sections of the brain at four dorsoventral levels shown in the inset of A. bg, basal ganglia; btm, brainstem; cca, anterior corpus callosum; ccma, mid anterior corpus callosum; ccm, mid corpus callosum; ccc, central corpus callosum; ccmp, mid posterior corpus callosum; cgm, cerebellar grey matter; cl, claustrum; cwm, cerebellar white matter; gm, grey matter; lv, lateral ventricle; hmp, hippocampus; thl, thalamus; vdc, ventral diencephalon; wm, white matter. These IQMs were: Summary GM Percentile 5 (SgmP05), Signal to Noise Ratio of GM (SNR gm), Tissue Probabilistic Mapping to WM and GM (TMP wm/gm) and Volume Fraction of CSF (see Table 3 , sorted by rele- vance). The SVMs using only these five IQMs showed an increase in per- formance to 72.8 ± 1.6%, supporting our hypothesis that critical IQMs can predict the PREEMAC outcome. This result also suggests that the remaining IQMs are features that do not contain information to predict the quality of the obtained surfaces and may even add noise to the clas- sification procedure ( Pavlidis et al., 2004 ). 3.4. PREEMACS FreeSurfer segmentation atlas A custom monkey segmentation with macaque labels of cortical and subcortical structures was constructed to obtain an accurate surface es- timation in Module 3. Fig. 4 shows the volumetric label estimation in NMT space. We estimated the volumes of subcortical structures from 57 monkey images using this segmentation atlas, available for downloading in a GitHub repository ( https://github.com/pGarciaS/PREEMACS ). 3.5. Registering the curvature and convexity: PREEMACS Rhesus parameterization file To obtain the vertex correspondence between subjects and to com- pare anatomical features between animals, it is critical to align each monkey surface to a generic Rhesus reference template. We ran an it- erative procedure on 33 monkey images (20 with minimum and 13 with medium surface errors, see below) to obtain a Rhesus monkey standard for the white matter curvature and convexity patterns, called PREEMACS Rhesus parameterization file (see Materials and Methods). This file includes nine parameters that fully characterize the geometry of the monkey cortical sulci. Fig. 5 A shows the resulting mean curvature data pattern template warped in 2-D, which is one of the nine elements of the Rhesus parameterization file. Qualitatively, every expected sul- cus is associated with a concave region in the warped pattern template ( Fig. 5 ). All the subject surfaces were registered to this common space and can be expressed in a standard spherical coordinate system (i.e. longitude and latitude) to index a point on the folded cortical surface for a given subject. Supplementary Figs. 1 and 2 show the average iso- topic (size-change) and average anisotropic (shape-change) distortions ( Robinson et al., 2018 ) of twelve subjects (minimum errors in surface estimation from 6 PRIME-DE sites) when registered from native to a common space. Fig. 5 B–D shows lateral, mid-sagittal, and posterior views of the WM template surface as a unit sphere, defining the ge- ometrical relation between all the sulci of a standard monkey brain. The template sphere is used to register all subjects for final surface analysis. 3.6. Average surfaces The average wm and pial surfaces with 163,842 vertices per hemi- sphere are depicted in Figs. 6 and 7 , respectively. The lateral, mid- 8 P. Garcia-Saldivar, A. Garimella, E.A. Garza-Villarreal et al. NeuroImage 227 (2021) 117671 Fig. 5. PREEMACS Rhesus sphere and curvature pattern template. A. Mean curvature data pattern template warped in 2-D. This curvature data pattern is one of nine elements of the PREEMACS Rhesus parameterization file used as a template to align the surfaces and obtain vertex correspondence between the subjects. B, C and D. Left WM template surface inflated as a sphere (Lateral, Mid-sagittal, and Posterior view, respectively). Sulci labeled for reference: as, arcuate sulcus; cas, callosal sulcus; ccs, calcarine sulcus; cgs, cingulate sulcus; cs, central sulcus; ecal, external calcarine sulcus; ias, inferior arcuate sulcus; iccs, inferior calcarine sulcus; ios, inferior occipital sulcus; ips, intraparietal sulcus; ls, lateral sulcus; lus, lunate sulcus; ms, marginal sulcus; ots, occipitotemporal sulcus; pos, parietal-occipital sulcus; prs, principal sulcus; ros, rostral sulcus; sas, superior arcuate sulcus; sccs, superior calcarine sulcus; sbps, subparietal sulcus; sts, superior temporal sulcus; mw, medial wall; sH, space of hippocampus. sagittal and ventral views of the surface templates show a high anatom- ical fidelity with an actual monkey brain, with no apparent artifacts in the curvature pattern across all sulci ( Fig. 6 ) and gyri ( Fig. 7 ). The individual wm and pial surfaces are registered to these templates for CT and gyrification analysis with a one-to-one vertex correspondence, which allows for further group analysis in a common Rhesus monkey space. 3.7. PREEMACS generalization and identification of surface errors Fifty-seven sets of images from eleven different sites of the Primate Data Exchange (PRIME-DE) database were run with the PREEMACS pipeline. The resulting surfaces were evaluated for errors using a visual inspection test that included a criteria for smoothness of the surfaces and segmentation (see Section 2.2.2 ). Since the site accounts for a large source of variability between input images, we compared the test errors across the eleven sites ( Fig. 8A ). Notably, the surfaces of 20 (out of 57) monkey images from 8 sites showed minimal errors that needed negligi- ble or no manual correction ( Fig. 8A ). The pial and wm surfaces of repre- sentative animals with minimal surface errors for five sites are shown in Fig. 8 C. The most common segmentation errors ( Fig. 8 B) were located in the wm of Parahippocampal ( Fig. 9 A), Frontal Pole ( Fig. 9 B), Occipital Cortex ( Fig. 9 C) and Anterior cingulate cortex ( Fig. 9 D). The average time to correct these images by an expert using a manual correction toolbox from FreeSurfer was ~10 min. In addition, the surfaces of 13 and 30 subjects showed medium and large errors, respectively. Notably, these poor brain extractions were predicted from the IQMs classification analysis (Supplementary Fig. 3). 3.8. Cortical thickness We computed the CT of the PREEMACS Rhesus average surface of the pial minus wm. It is evident in Fig. 10 A that the monkey CT is not homogenous, with a thicker cortex in the frontal lobe, especially in the primary motor cortex, and a thinner cortex in the occipital lobe, corroborating previous results ( Naselaris et al., 2006 ; Calabrese et al., 2015 ; Seidlitz et al., 2018 ). In addition, we compared the CT for the 662 vertices within the ROI in the left primary motor cortex (M1) depicted in Fig. 10 B for the three outcome surface categories (mini- mum, medium or large errors) defined by the visual inspection test (see Section 2.2.2 “Quality control module ”). The mean CT for this ROI was similar across outcome surface categories (five subjects per category, Fig. 10 B). However, the dispersion of the CT was considerably larger for the surfaces with large segmentation errors ( Fig. 10 B,C). 4. Discussion 4.1. PREEMACS strengths PREEMACS is a robust, automatic, and flexible pipeline that stan- dardizes all the needed steps, starting from raw structural MRI images, for the extraction of cortical surfaces in the macaque. The program has three modules: 1) preprocessing, 2) quality control and 3) brain surface estimation that are simple to run individually or as a complete image processing workflow. Several key preprocessing steps have been fine-tuned in Module 1 to mitigate the severity of artifacts often seen in NHP imaging, such as 9 P. Garcia-Saldivar, A. Garimella, E.A. Garza-Villarreal et al. NeuroImage 227 (2021) 117671 Fig. 6. PREEMACS Rhesus average WM surface showing the curvature data pattern. A. Dorsal view. B. Lateral view. C. Ventral view. D. Mid-sagittal view. Sulci labeled for reference: cas, callosal sulcus; ccs, calcarine sulcus; cgs, cingulate sulcus; cs, central sulcus; ecal, external calcarine sulcus; ias, inferior arcuate sulcus; iccs, inferior calcarine sulcus; ios, inferior occipital sulcus; ips, intraparietal sulcus; los, lateral orbital sulcus; ls, lateral sulcus; lus, lunate sulcus; ms, marginal sulcus; mos, medial orbital sulcus; olfs, olfatory sulcus; ots, occipitotemporal sulcus; pos, parietal-occipital sulcus; prs, principal sulcus; ros, rostral sulcus; sas, superior arcuate sulcus; sbps, subparietal sulcus; sccs, superior calcarine sulcus; spcd, superior precentral dimple; sts, superior temporal sulcus. intensity non-uniformity (INU, due to coil sensitivity profiles and use of multi-channel array coils), skull stripping (with anatomy of NHP be- ing vastly different from that of humans), and erroneous identification of dura as cortical tissue. Notably, our skull stripping method, based on a deep learning algorithm, obtains accurate brain masks with large DIC, sensitivity and specificity values, solving one of the most common bottlenecks in surface-based estimations. The prior assessment of the image quality is fundamental for the automatic implementation of the present pipeline. Using different met- rics from MRIqc, Module 2 provides an SVM classification method that predicts the quality of the resulting surfaces with a high degree of ac- curacy. This prediction tool was validated on 57 images of eleven sites. Crucially, the performed graph analysis indicates five IQMs are critical to predict PREEMACS surface outcome. Three Rhesus monkey templates were developed for surface estima- tion in Module 3. The PREEMACS FreeSurfer segmentation atlas allows for the structural parcellation of cortical and subcortical structures im- proving the wm/gm segmentation. The PREEMACS Rhesus parameter- ization template includes all the information about the curvature and convexity patterns of the monkey wm. This template is crucial to obtain a vertex registration between subjects. Finally, the individual wm and pial surfaces are registered to the PREEMACS Rhesus average surface so that the CT and gyrification measures can be obtained for group anal- ysis in a common Rhesus monkey space. Normalization is also needed to co-register individual brains onto multimodal atlases of interest, such as cytoarchitectonic, myeloarchitectonic, fiber tracking, etc., which can highly enrich the analytical potentiality of PREEMACS ( Goubran et al., 2019 ). Therefore, these three templates provide a large specificity in the macaque surface estimation, with robust results across sites and image collection protocols. Another strength of the present workflow is the accurate identifica- tion of the pial surface, which is achieved due to the combined informa- tion of T1w and T2w volumes. Nevertheless, is important to emphasize that PREEMACS offers the option to run the workflow on T1w only, although is highly recommended to use both input images for optimal results. A fundamental characteristic of PREEMACS is that all images and the resulting surfaces are kept in native space, decreasing a large number of potential for biases due to local deformations at different image pro- cessing steps. Thus, PREEMACS can be also used for longitudinal data, obtaining surfaces automatically and easily producing subject-specific templates to preserve within-subject changes for final statistical analy- sis ( Ashburner and Ridgway, 2013 ; Reuter et al., 2012 ). 4.2. PREEMACS generalizability PREEMACS solves practically all the image preprocessing issues re- cently outlined by The PRIMatE-Data Exchange (PRIME-DE) Global Col- laboration Workshop and Consortium (reference). Our pipeline general- ized across a variety of input images performing properly the following steps: process images with different head orientations, performs an au- tomatic cropping, can correct the strong intensity bias attributable to the huge variety of coils used, carries out an automatic skull stripping and performs an automatic tissue segmentation. Importantly, all these steps generalized across a dataset of images from eleven sites. Good sur- face reconstructions were obtained when the input images met the min- imal IQMs criteria of our customized NHP quality control assessment. Specifically, images that had a voxel resolution of 0.5 mm 3 , adequate SNR (specially for GM), and a large contrast between WM-GM showed proper segmentation and a good surface PREEMACS estimation. These 10 P. Garcia-Saldivar, A. Garimella, E.A. Garza-Villarreal et al. NeuroImage 227 (2021) 117671 Fig. 7. PREEMACS Rhesus average pial surface showing the curvature data pattern. A. Dorsal view. B. Lateral view . C. Ventral view. D. Mid-sagittal view. Sulci and gyri are labeled for reference. Sulci: cas, callosal sulcus; ccs, calcarine sulcus; cgs, cingulate sulcus; cs, central sulcus; ecal, external calcarine sulcus; ias, inferior arcuate sulcus; iccs, inferior calcarine sulcus; ios, inferior occipital sulcus; ips, intraparietal sulcus; los, lateral orbital sulcus; ls, lateral sulcus; lus, lunate sulcus; ms, marginal sulcus; mos, medial orbital sulcus; olfs, olfactory sulcus; ots, occipitotemporal sulcus; pos, parietal-occipital sulcus; prs, principal sulcus; ros, rostral sulcus; rhs, rhinal sulcus; sas, superior arcuate sulcus; sbps, subparietal sulcus; sccs, superior calcarine sulcus; spcd, superior precentral dimple; sts, superior temporal sulcus. Gyri: SFG, superior frontal gyrus; AG, angular gyrus; ASPG, anterior superior parietal gyrus; CgG, cingulate gyrus; Cu, cuneus; GR, gyrus rectus; ICgG, isthmus of the cingulate gyrus; IFG, inferior frontal gyrus; ITG, inferior temporal gyrus; LOrg, lateral orbital gyrus; MG, marginal gyrus; MFG, middle frontal gyrus; MOrg, medial orbital gyrus; OG, occipital gyrus; PCG, postcentral gyrus; PCu, precuneus; PhG, parahippocampal gyrus; PrCG, precentral gyrus; STG, superior temporal gyrus. exceptionally good results were obtained from 20 images independently of the MR scanner, the coil, and the monkey position (Supplementary Table 1). It is advisable that voxel resolution be high and isotropic, as surface estimation can only be as good as the lowest resolution available in the input volumes. In addition, the resulting CT was in the range of previously reported values ( Georgopoulos et al., 2007 ; Calabrese et al., 2015 ; Seidlitz et al., 2018 ). Therefore, our validation provides an impor- tant piece of evidence for PREEMACS versatility and generalizability, ruling out any site effect in our tests. 4.3. Comparison with other pipelines for NHP surface reconstruction As far as we know, five additional pipelines for NHP surface estima- tion exist ( Messinger et al., 2021 ). These are HCP-style NHP Pipeline ( Donahue et al., 2016 ; Donahue et al., 2018 ; Autio et al., 2020 ), CIVET- Macaque (Lepage et al., this issue), NHP-FreeSurfer, Precon_all, and Macapype, all of them contained in the Primate Resources Exchange (PRIME-RE) wiki ( Messinger et al., 2021 ). All these tools for automatic extraction of cortical thickness in NHP show different levels of com- plexity, robustness, and automation. Due to scope constraints, we do not provide a formal quantitative comparison between pipelines. Quali- tatively, the HCP-style NHP Pipeline has been validated across humans, chimpanzees, multiple monkey species, and marmosets ( Glasser et al., 2013 ; Donahue et al., 2016 ; Donahue et al., 2018 ; Autio et al., 2020 ), and automatically identifies and labels the brain stem, cerebellum, and claustrum. Furthermore, this analytical environment includes additional downstream features, such as structural, functional and diffusion image preprocessing tools. PREEMACS does not possess such features. The full description of CIVET-Macaque is part of this special issue on monkey MRI and shows similarities PREEMACS in its overall scope and utility. Both CIVET-Macaque and PREEMACS provide crucial adaptations and extensions of previously available processing pipelines for the estima- tion of cortical surfaces in humans, with the former relying on CIVET (Lepage et al., this issue) and the latter building on FreeSurfer. Notably, PREEMACS has a modular design, performs automatic and robust skull- striping through a convolutional neural network, carries out quality con- trol assessment of input images, retains all image volumes and resulting surfaces in native space, uses custom made macaque templates within the pipeline, and (if input data is deemed of sufficient quality by the first module), is able to run fully automatically and provide cortical thick- ness data suitable for vertex-wise group analyses. In the spirit of col- laboration and open science characteristic of PRIME-DE ( Milham et al., 2020 ), we envision a close partnership between all groups working on NHP surface estimation ( Messinger et al., 2021 ) to ultimately provide an integrated pipeline that dynamically evolves as the field grows. 4.4. Continuous updating of deep learning neuronal networks and SVMs The PREEMACS brainmask tool was trained on 126 images from 18 PRIME-DE sites. The trained convolutional neural network model was quite robust, with predicted masks that showed close to perfect values for Dice, sensitivity and specificity. Nevertheless, an issue with 11 P. Garcia-Saldivar, A. Garimella, E.A. Garza-Villarreal et al. NeuroImage 227 (2021) 117671 Fig. 8. Evaluation of errors in the PREEMACS cortical surfaces across sites. A. Pial (left) and wm (right) surfaces of representative monkeys with minimal surface errors for five sites labeled in the x -axis. B. Frequency of subjects with minimal, medium, and large errors in the PREEMACS cortical surfaces as a function of site ( n = 11). C. Number of subjects with minimal errors in B that showed segmentation errors in five cortical areas across seven sites. The shaded grey area corresponds to the total number of subjects with minimal errors for each site; each subject can have one or more areas with minimal errors. PHwm, Parahippocampal wm; FPwm, Frontal Pole wm; TmpAC, Temporal anterior cortex; Owm, Occipital wm; Acc, Anterior cingulate cortex. Fig. 9. Most common “minimal ” segmentation errors. A. Parahippocampal wm (PHwm). B. Frontal Pole wm (FPwm) C. Occipital wm (Owm). D. Anterior cingulate cortex (Acc). Blue line for pial and yellow line for wm surface. Different individual shown in each panel. model building is the generalizability of prediction for images collected with conditions not included in the original multidimensional space ( Esteban et al., 2017 ). A similar problem is confronted on the SVM classi- fication of fifty-seven surfaces based on the image metrics of our quality control routine. It is probable that no convergence has been obtained yet in these models due to the limited amount of input images and their con- strained range of parameter values. Hence, these PREEMACS modules should be continuously updated and the models rebuilt until our skull- stripping and the quality control methods show robust performance for practically any image collection circumstance. 12 P. Garcia-Saldivar, A. Garimella, E.A. Garza-Villarreal et al. NeuroImage 227 (2021) 117671 Fig. 10. Cortical thickness. A. Lateral, dorsal and medial views of the CT computed from the PREEMACS Rhesus average surfaces of pial minus wm shown in Figs. 6 and 7 . B. Mean and standard deviation of the CT from five subjects pertaining to each of the three outcome surface categories (1 = minimum, 2 = medium or 3 = large errors) classified using the Visual Inspection Test. The inset shows the location of the ROI of the primary motor cortex used to compute the CT. C. Distribution of CT across all vertices in the M1 ROI for a representative subject from each of the three outcome surface categories. 4.5. PREEMACS limitations Besides the potential lack of model convergence discussed above, PREEMACS does not include a macaque GCA atlas to parcellate in the FreeSurfer environment the corpus callosum, cerebellum and pons. In- stead we use the human GCA atlas that produced some segmentation errors in the cerebellum and parts of visual cortex. In addition, there is no parcellation tool to identify cortical areas and automatically define ROIs for analysis between groups of animals. 5. Conclusion PREEMACS is a new, flexible, versatile and robust pipeline for extraction of the Rhesus monkey cortical brain surface. The entire code is freely available at GitHub ( https://github.com/PREEMACS/ PREEMACS ). The extraction of cortical surfaces in the macaque was per- formed with minimal or no manual intervention when the quality of the input images reached a certain threshold, showing a large success in surface reconstruction across the tested sites around the world. Consid- ering the recent efforts toward data sharing in the non-human primate field ( Milham et al., 2018 ), PREEMACS is a validated and user friendly pipeline for the automatic extraction of cortical surfaces, which can be used by the growing macaque neuroimaging community not only for cortical thickness estimation, but also to perform multimodal imaging analysis in the same geometrical space. Data available PREEMACS workflow code, manual brain masks, wm and pial sur- faces, cortical ribbon and wm segmentation are available on https: //github.com/pGarciaS/PREEMACS . Declaration of Competing Interest The authors declare no conflict of interest. Credit authorship contribution statement Pamela Garcia-Saldivar: Conceptualization, Methodology, Soft- ware, Validation, Formal analysis, Data curation, Visualization, Writing - original draft, Writing - review & editing. Arun Garimella: Method- ology, Software, Formal analysis, Visualization, Writing - original draft, Writing - review & editing. Eduardo A. Garza-Villarreal: Methodology, Writing - original draft, Writing - review & editing. Felipe A. Mendez: Methodology, Software, Formal analysis, Writing - original draft, Writ- ing - review & editing. Hugo Merchant: Conceptualization, Methodol- ogy, Formal analysis, Supervision, Project administration, Funding ac- quisition, Writing - original draft, Writing - review & editing. Acknowledgments We express our sincere gratitude to Dr. Matthew Glasser and one anonymous Reviewer for their insightful comments on the manuscript. We also thank Luis Aguilar, Alejandro De León, Carlos Flores and Jair García of the National Laboratory for Advanced Scientific Visualiza- tion, UNAM for their technical assistance, and Erick Pasaye, Leopoldo González-Santos, and Juan Ortiz for technical support in the National Laboratory for Magnetic Resonance Imaging. Supported by CONACYT: A1-S-8430 to H. Merchant. LC was partially funded by UNAM-DGAPA (IG200117, IN204720), and Conacyt (1782). Pamela Garcia-Saldivar is a doctoral student from Programa de Maestria y Doctorado en Psicología, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) and received a fel- 13 P. Garcia-Saldivar, A. Garimella, E.A. Garza-Villarreal et al. NeuroImage 227 (2021) 117671 lowship number 414029 from CONACYT through the scholarship holder number 280464. Supplementary materials Supplementary material associated with this article can be found, in the online version, at doi:10.1016/j.neuroimage.2020.117671 . References Alfaro-Almagro, F., Jenkinson, M., Bangerter, N.K., Andersson, J.L.R., Griffanti, L., Douaud, G., Sotiropoulos, S.N., Jbabdi, S., Hernandez-Fernandez, M., Vallee, E., Vi- daurre, D., Webster, M., McCarthy, P., Rorden, C., Daducci, A., Alexander, D.C., Zhang, H., Dragonu, I., Matthews, P.M., Miller, K.L., Smith, S.M., 2018. 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E-mail address: hugomerchant@unam.mx and lconcha@unam.mx. 2 Abstract We determined the intersubject association between the rhythmic entrainment abilities of human subjects in a synchronization-continuation tapping task (SCT) and the macro- and microstructural properties of their superficial (SWM) and deep (DWM) white matter. Diffusion-weighted images were obtained from 32 subjects who performed the SCT with auditory or visual metronomes and five tempos ranging from 550 to 950 ms. We developed a method to determine the density of short- range fibers that run underneath the cortical mantle, interconnecting nearby cortical regions (U- fibers). Notably, individual differences in the density of U-fibers in the right audiomotor system were correlated with the degree of phase accuracy between the stimuli and taps across subjects. These correlations were specific to the synchronization epoch with auditory metronomes and tempos around 1.5 Hz. In addition, a significant association was found between phase accuracy and the density and bundle diameter of the corpus callosum, forming an interval-selective map where short and long intervals were behaviorally correlated with the anterior and posterior portions of the corpus callosum. These findings suggest that the structural properties of the SWM and DWM in the audiomotor system support the tapping synchronization abilities of subjects, as cortical U-fiber density is linked to the preferred tapping tempo and the bundle properties of the corpus callosum define an interval-selective topography. Keywords: audiomotor system, tap synchronization, superficial white matter, corpus callosum 3 1. Introduction Moving in synchrony with regular musical events (i.e., beat) is a basic and generalized human ability that can reach sophisticated levels in professional percussionists (Honing et al., 2015; Merchant et al., 2015a). Indeed, humans are extremely sensitive to auditory regularities and can entrain to auditory beats across a wide range of tempos, as well as use timed movements of different body parts (such as finger or foot taps or body swaying) to keep the beat (Mendoza & Merchant, 2014; Repp & Su, 2013). A classical task used to study rhythmic entrainment is the synchronization- continuation task (SCT), where subjects first entrain their tapping to a set of isochronous stimuli, also known as a metronome, and then continue tapping without the periodic stimulus using an internal clock (Merchant et al., 2008a,b; Wing, 2002; Wing & Kristofferson, 1973). In this type of task, humans show negative asynchronies, namely they tap a few milliseconds before the metronome, supporting the notion that entrainment depends on a predictive internal beat that is phase-locked to the stimuli (Lenc et al., 2021; Repp & Su, 2013; Zarco et al., 2009). Neurophysiological and functional imaging studies have shown that the internal beat representation during an SCT rests in the motor system, including the basal ganglia and supplementary motor regions (Bartolo et al., 2014; Merchant et al., 2013a, 2015a; Merchant & Averbeck, 2017; Rao et al., 2001; Sánchez-Moncada et al., 2024). These areas produce a regenerating rhythmic signal (Crowe et al., 2014; Gámez et al., 2019; Merchant et al., 2015b) that dynamically interacts with the auditory areas, creating audiomotor loops where the motor prediction of the beat is flexibly compared and adjusted depending on changes in the input stream of rhythmic stimuli to phase-lock sensory and motor signals (Comstock et al., 2018; Merchant & Honing, 2014; Patel & Iversen, 2014). In addition, neurons in the supplementary motor areas (SMAs) are tuned to the tempo duration of tapping (Merchant et al., 2014, 2013b), giving rise to interval-specific circuits that define 4 a chronotopic map with short preferred intervals in the anterior portion and long preferred intervals in the posterior portion of the medial premotor areas (Protopapa et al., 2019; Merchant et al., 2024). The existence of neural circuits with preferred intervals comprising chronotopic maps is consistent with the human flexibility to tap in phase (with asynchronies close to zero) and high precision to isochronous stimuli over a wide range of interstimulus-onset intervals (ISIs), spanning from 400 to 1200 ms (Mates et al., 1994, Repp 2005). Within this window, subjects demonstrate a spontaneous rhythmic tempo, which corresponds to the interval produced naturally when asked to tap in without external cues (McAuley et al., 2006; Zamm et al., 2018). This spontaneous or preferred tempo is around 600 to 750 ms in human adults (Fraisse, 1963, 1978, but see Parncutt, 1994), but is faster in early childhood and slower in late adulthood (McAuley et al., 2006). A recent study demonstrated that the perception of rhythmic stimuli also has a preferred tempo, with an optimal sampling rate of ~1.4 Hz (ISI of 714 ms) in audition and ~0.7 Hz (ISI of 1428 ms) in vision. Furthermore, motor tapping helps to synchronize the temporal fluctuations of attention with maximal effects at ~1.7 Hz (ISI of 588 ms), but only for the auditory modality (Zalta et al., 2020). These findings support the notion that ongoing motor activity shapes attention and beat perception, as it imposes temporal constraints on the sampling of sensory information within a narrow frequency range (Morillon, et al., 2019). Hence, the audiomotor system is built to optimally work at a preferred tempo. Although rhythmic entrainment is prevalent across all human cultures and is a natural behavior for social interaction (Nettle, 2000; Jacoby et al., 2024), there are wide individual differences in the period (inter-tap interval) and phase (asynchronies) of movement synchronization. There are subjects who lack musical training, yet spontaneously synchronize to rhythmic stimuli ranging from strictly periodic metronomes to complex musical pieces, with performance comparable to that of trained musicians (Scheurich et al., 2018; Tranchant et al., 2016). Conversely, there are poor 5 synchronizers (around ten percent of the population) that show low period accuracy and large asynchronies to isochronous metronomes and musical excerpts (Phillips-Silver et al., 2011; Sowiński & Dalla Bella, 2013; Tranchant et al., 2016). Furthermore, non-musicians synchronize less flexibly and less precisely across tempos than musicians (Scheurich et al., 2018). Hence, both genetic and learning factors influence the beat-entrainment abilities of humans. A large-scale genome-wide association study (GWAS) recently demonstrated a highly polygenic architecture of the human capacity to synchronize to a musical beat. The GWAS phenotype for beat synchronization was related to performance in beat synchronization tasks and rhythm perception tasks (Niarchou et al., 2022). Nevertheless, genetic influences account for only a small portion of human variation in beat synchronization, while environmental influences are the primary drivers of rhythmic accuracy. In fact, functional imaging has revealed that individual differences in beat perception depend on activation differences in the SMA and the posterior auditory cortex (Grahn & McAuley, 2009). In addition, the putamen, SMA, and auditory cortex show greater functional connectivity during rhythm perception, with larger modulation for musicians than non-musicians (Grahn & Rowe, 2009, 2013). Consequently, the magnitude of the anatomofunctional association between the auditory and motor control areas of the cerebral cortex seems to covary with the individual difference in how humans perceive and entrain to simple regular beats. Such brain networks rely on the structural connectivity provided by white matter, which can be evaluated through diffusion-weighted imaging (DWI). Long-range anatomical connectivity is supported by deep white matter (DWM) bundles, while short-range connectivity is achieved through fibers that run tangentially to the cortical surface and connect adjacent and proximal cortical regions. These fibers are collectively termed U-fibers due to their shape (Schüz & Braitenberg 2002, Schmahmann 2009, Shastin 2022). In this work, we individually analyze the role of these two forms of connectivity 6 in rhythmic entrainment abilities. We hypothesize that if the cortical connectivity of the audiomotor system is defining rhythmic entrainment abilities, then individual differences in tapping synchronization should covary with the degree of anatomical connectivity (Assaneo et al., 2019; Steele et al., 2013). Previous evidence suggests that the audiomotor system is tuned at a limited interaction rate (Zalta et al., 2020; Morillon et al., 2019). Hence, we also hypothesize that the relationship between rhythmic tapping abilities and the structural connectivity of the audiomotor system should be more evident for intervals close to the preferred tempo. To test these hypotheses, we acquired DWIs from 32 subjects that had previously performed an SCT using flashing visual or auditory tones as metronomes in the range of hundreds of milliseconds. SCT rhythmic performance across durations (ISI: 550, 650, 750, 850 or 950 ms) and modalities (auditory and visual) was characterized using the absolute asynchronies, the autocorrelation of the inter-tap interval time series during the synchronization epoch, the constant error, and the temporal variability during both synchronization and continuation epochs. These parameters measure the phase accuracy, error correction, period accuracy, and period precision of the rhythmic tapping of the subjects, respectively (Figure 2A). We used an ISI range of 550-950 ms because it contains the preferred interval and is within the optimal window for tap synchronization (Repp, 2005). Hence, with this ISI range, we could potentially identify structural correlates for both the preferred tempo and interval selectivity. With this in mind, we evaluated DWM fascicles using a fixel-based approach (Dhollander et al., 2021) and developed two metrics for superficial white matter (SWM): fiber density corresponding to fibers entering or exiting the cortex and U-fibers running tangentially to the cortex. Widespread correlations in the right audiomotor circuit were found between the tangential U-fiber density and the phase accuracy of subjects during the synchronization epoch of the auditory condition for the 650 and 750 ms intervals. The interval specificity in these associations suggests 7 that the preferred tempo for rhythmic entrainment has its origins in the structural properties of the U-fibers running superficially across the audiomotor circuit. In addition, there was a significant association between asynchronies in the auditory condition and the density and bundle diameter of the corpus callosum (CC), forming an interval-selective map with an anterior-posterior gradient, similar to the topography of interval-tuned clusters observed with functional imaging. Crucially, the anatomo-behavioral associations were negative, indicating that subjects with good predictive abilities and small asynchronies exhibited large superficial and deep apparent fiber densities (AFDs), while subjects with large asynchronies showed low fiber densities. 2. Results 2.1. Rhythmic behavior Thirty-two subjects performed a modified version of the classical SCT that included the following three epochs: beat perception, synchronization, and continuation (Figure 1). This task starts with the active perception of the isochronous beat defined by alternating left-right visual stimuli, followed by tapping synchronization to the alternating stimuli, and the internally driven tapping continuation to the right or left targets without the metronome (Perez et al., 2023). The subjects also performed an auditory version of the SCT (Figure 1, see Methods). 8 Figure 1. Synchronization-Continuation Task (SCT). Initially, the subjects placed their finger at the central- bottom target of a touchscreen to start the trial and maintained the finger in this position while observing a sequence of right-left alternating visual stimuli with a constant interstimulus interval (target duration, perception epoch). The subjects were instructed to start tapping once they got the beat from the metronome; they had two to six stimuli to start tapping. Thus, when they considered they had extracted the beat, subjects tapped the touchscreen on the left or right target in synchrony with the alternating visual metronome for six intervals (synchronization epoch). Finally, they continued tapping on the right or left targets for another six intervals without the metronome (continuation epoch). The mean produced and the target interval were displayed at the end of each trial as feedback. Subjects also performed an auditory metronome version of the SCT, where the metronome consisted of 500 Hz tones that were presented on the right or left side of a headphone. Five target 9 durations (550, 650, 750, 850 or 950 ms) were presented pseudorandomly, with the visual and auditory conditions interleaved between subjects. Absolute asynchronies correspond to the time difference between each stimulus and response pair and are a measure of the phase accuracy between taps and stimuli (Figure 2A). Hence, this parameter can only be measured during the synchronization epoch of the SCT. We performed a repeated-measures ANOVA on absolute asynchronies with metronome modality (auditory and visual: 2 levels) and instructed interval duration (550, 650, 750, 850, and 950 ms: 5 levels) as within-subject factors. The ANOVA showed significant main effects for duration (F(4,124) = 36.88 P < 0.0001) and modality (F(1,31) = 20 P < 0.0001), as well as a significant duration x modality interaction (F(4,124) = 32.3 P < 0.0001). Tukey’s honest significant difference (HSD) post hoc test showed significantly larger asynchronies for the visual than auditory modality across all durations (P < 0.0001 for 550, 650, 750 and 850 ms; P = 0.006 for 950 ms; with the interaction effect mainly driven by the difference in the 950 ms across modalities). These results confirm the preponderance of the auditory modality over the visual modality to produce phase alignment of the taps with the metronome (Comstock et al., 2018; Gámez et al., 2018; Merchant et al., 2015b). In addition, we computed the intersubject correlation matrix on the absolute asynchronies across instructed intervals and found a significant correlation between 650 and 750 ms for both the auditory and visual conditions (r=0.67, p=.000026; r=0.69, p=.000011, respectively) (Figure 2–Supplement 1). This finding suggests the existence of a shared mechanism for metronome- tap phase alignment in the intervals that correspond to the preferred tempo indicated in previous studies, thereby corroborating the notion that the audiomotor system is efficiently tuned to this tempo (Zalta et al., 2020). A Isochronus intervals (ms) 550 650 750 850 950 Ab so lu te As yn c (m s) 120 80 40 0 Co ns ta nt Er ro r (m s) Te mp or al Va ri ab il it y (m s) Stimuli (n) Response Taps (n) Asynchronies = SO,- TO,, Constant cd pa Temporal = Standard Deviation of total Pl's variability E 05 Ps = 380 Autocorrelation 3 05 1 2 3 Lag (taps) Start Beat Synchronization Continuation perception O Synchronization 05 $S 3 2 E 8 00 9 3 0.355 at p < 0.02, df=29) and the percent of significant vertices in each 20 area, respectively. The left hemisphere (A) showed more areas with significant vertices than the right (B; 17541 > 16641). A systematic decrease in circle size as a function of depth was observed across areas of both hemispheres. At a depth of 1.5 mm, the regions with a larger percent of significant vertices for the right hemisphere at 750 ms were the medial premotor (SMA and preSMA), auditory, and language motor areas (B). In contrast, few significant vertices were observed across the regions of the left hemisphere (A). C. Brainnetome Atlas (Fan et al., 2016) showing the fourteen ROIS analyzed in A and B. D. Interval selectivity curves for the correlation coefficients and percent of significant vertices across tanAFD depths (color coded) for preSMA. E. Same as D but for the auditory cortex. Note that the preferred interval in the two areas is between 650 and 750 ms. Figures 5A and B show a systematic decrease in the percent of significant vertices as a function of depth across areas of both hemispheres. Nevertheless, the most prominent effect is the interval selectivity of the correlation coefficients and percent of significant vertices, with a preferred interval between 650 and 750 ms across many areas and depths (Figure 5A,B,D,E). Specifically, at our target depth of 1.5 mm linked with the U-fiber system, the areas with the highest percent of significant vertices on the right hemisphere were pre-SMA (52.4%, 𝑟𝑟 2=.41, p< 0.001), auditory (49.2%, 𝑟𝑟 2=.38, p< 0.001) and language motor (40.2%, 𝑟𝑟 2=.45, p< 0.001) areas for the correlation between the 750 ms auditory asynchronies and tanAFD. Similarly, at 650 ms the highest percent areas with significant vertices on the right hemisphere were the medial motor areas (pre-SMA: 41.8%, 𝑟𝑟 2=.36, p< 0.001; SMA: 28.1%, 𝑟𝑟 2=.39, p< 0.001) and language motor area (28.1%, 𝑟𝑟 2=.40, p< 0.001). Figures 5D and E show the interval selectivity curves for the correlation coefficients and percent of significant vertices across tanAFD depths (color coded) for auditory cortex and pre-SMA, confirming the notion of interval preference for the behavioral and structural associations. In contrast, in the left hemisphere, the percent areas with significant vertices were smaller, with significant effects for visual areas (31.8%, 𝑟𝑟2=0.45, p< 0.001), object and face recognition (29.9%, 𝑟𝑟2=0.44, p< 0.001), and primary motor areas (28.4%, 𝑟𝑟2=0.44, p< 21 0.001) for the 650 ms interval; and parietal association (35.1%, 𝑟𝑟2=0.52, p< 0.001), primary motor areas (28%, 𝑟𝑟2=0.40, p< 0.001), and visual areas (25%, 𝑟𝑟2=0.40, p< 0.001) for the 750 ms interval. These results support the notion that the audiomotor system of the right hemisphere shows individual differences in the density of U-fibers with a gradient that correlates with the degree of phase accuracy across subjects in the synchronization phase of the SCT. Crucially, this correlation is modality- specific, suggesting that structural changes in the audiomotor system occur only for the modality that produces rhythmic timing with better period and phase precision (see Figure 3–Supplement 1). Furthermore, the interval selectivity of the behavioral and structural correlation indicates that the timing circuits tuned at intervals of 650 and 750 ms are susceptible to presenting macro- and microstructural differences in white matter U-fibers within the tested population of subjects. Finally, the visual areas and the motor cortex, contralateral (left hemisphere) to the tapping movements, also showed significant associations between sensorimotor phase locking and the U-fiber density. 2.4 Canonical correlation between behavioral and AFD maps In the previous section we correlated many behavioral measures with all vertices of the AFD maps, risking inflation of type I error. To address this, we performed a canonical correlation analysis (rCCA) between the behavioral data of the SCT and the structural information of the SWM (see Methods). This approach allowed us to independently assess the correlation between our AFD measurements of every vertex and every variable of the SCT. Specifically, rCCA was calculated between the matrix of behavioral parameters from the synchronization phase of the SCT (i.e., absolute asynchrony, constant error, temporal variability, and lag 1 autocorrelation) for each sensory modality (auditory and visual), every target interval (550-950 ms) and the AFD metrics from all vertices across the brain surface. Separate models were built for each AFD metric (i.e., totalAFD, tanAFD, and parAFD). Notably, all pairings of behavioral and AFD data rendered 22 highly correlated canonical variates (Figure 6A). In line with the previous results, the highest correlation was found between the SCT data and the tanAFD, closely followed by totalAFD, and then parAFD (Figure 6A). The correlations between each behavioral parameter and tanAFD and their corresponding canonical variates revealed a clear structure between the predictive behavior of subjects and the structural differences in U-fibers of the white matter in the audiomotor system. Figure 6B depicts the correlations between each standardized SCT parameter and the corresponding canonical variate (U), where it is evident that the asynchronies of the auditory modality for the 650-850 ms intervals are the parameters with a significant relation to the canonical variate. A novel result from the rCCA is the significant association between the temporal variability of the auditory phase in the same intervals (650-850 ms). In addition, the tanAFD map shows a significant correlation between the tanAFD in audiomotor structures and the canonical variate. Again, the correlation between all vertices and their canonical variates was negative, corroborating the hypothesis that subjects with greater predictive abilities had a larger tanAFD in the audiomotor circuit (Figure 6C). 2.5. Deep white matter and structural selectivity to the interval We also evaluated the association between the precision and accuracy of the SCT tapping period and phase and the DWM properties. Fixel-based analysis (FBA) (Dhollander et al., 2021; Raffelt et al., 2017) was used to estimate micro- and macrostructural differences within DWM voxels (Genc et al., 2018; Kelly et al., 2020; Mito et al., 2018; Rau et al., 2019). This method, similar to that of our SWM analysis, is based on the CSD of DWI data. 23 Figure 6. Canonical correlation between behavioral metrics and tanAFD. A. Loadings (correlations) of the SCT variables for the tanAFD model. Note the absolute asynchronies of the auditory modality showed the highest correlations with the structural data, at the 650-850 ms intervals, in line with previous results. In addition, this approach identified the total variability in the same sensory modality and intervals as significant, although with a lower correlation coefficient and of the opposite sign. B. Pearson’s correlation of canonical variates (U=behavioral; V=tanAFD across vertices). C. Loadings of the tanAFD map. Note that the audiomotor system is highly correlated with the SCT behavior. FBA provides three fiber-specific indices (fiber density, fiber cross-section, and fiber density and cross- section; FD, FC, and FDC, respectively) (Raffelt et al., 2017). FD is derived from the integral of the fiber orientation distribution (FOD) lobes and is proportional to the total intra-axonal volume, thus reflecting the density of a population of fibers within a voxel (Rojas-Vite et al., 2019). Note that FD is identical to 24 totalAFD used in our surface-based analyses, with nomenclature for FBA following Raffelt et al. (2017). If more than one fiber population coexists in a given voxel, the FOD is segmented, and an FD is assigned to each population, referred to as a fixel (fiber element). FC is a macroscopic metric of the fiber bundle diameter and, finally, FDC is a combination of FD and FC (see Methods). Briefly, the FBA analysis pipeline consists of five steps. First, the images of each subject are processed to obtain a white matter FOD map in native space using CSD. Second, a FOD template and a fixel mask are built. Third, the AFD map and the corresponding fixels for each voxel are computed for each subject in native space. The FD metric is obtained for each fixel computed from the total DWI signal per voxel. Fourth, the fixels and AFD map are reoriented to the template. Finally, fixel-wise statistics are performed at each spatial location in template space. The FBA revealed significant negative correlations between the FDC in the CC and the absolute asynchronies to the auditory metronome for 650 ms, 750 ms, 850 ms and 950 ms intervals (Figure 7). Therefore, this analysis showed a tight relationship between the density and bundle diameter of CC fibers and beat entrainment. Subjects exhibiting large phase accuracy with asynchronies close to zero also showed large FDC values, and subjects with poor phase accuracy and large asynchronies had low FDC values (Figure 7–supplement 1). As in the case of the U-fiber metrics, the FBA values were not correlated with period accuracy or precision, nor with the error correction for the auditory and visual conditions during the synchronization and continuation epochs. The association between entrainment phase and white matter properties defined an interval- selective map in the CC, with the FDC at different levels of the CC showing significant correlations with the absolute asynchronies at specific intervals (Figure 7). This map showed an anterior-posterior gradient, with behavioral and structural associations for short and long intervals in the anterior and 25 posterior portions of the CC, respectively. Thus, the FDC fixel values of the posterior midbody of the CC (interconnecting motor and pre-motor cortices and M1) showed a significant negative correlation with absolute auditory asynchronies for the 650 and 750 ms intervals (Figure 7BC; family-wise error(FWE)- corrected P-value < 0.05). For the asynchronies at the intermediate interval of 850 ms, a negative correlation was observed with FDC fixel values located in the isthmus and the splenium (Figure 7C; interconnecting primary motor, temporal, and visual cortices). Finally, the asynchronies of the 950 ms interval showed a significant negative correlation with fixels located in forceps minor and major (Figure 7A,D; interconnecting prefrontal and visual cortices, respectively). B Ss A R gq PL ( Coronal view o 17 650 ms Coronal view A 750 ms Z s 2 A S A 850 ms > [ L que O 950 ms l D Temporal CC A 7 : / ) 3 E z A Z R R R A A A dE» Cor ¿Dpe L L Es Axial view G 0.6 0.4 e : : di : 0 ———cKQ—— 1 650 750 850 950 Intervals (ms) 26 27 Figure 7. Interval-selective map of the correlations in the deep white matter. A-E. Fiber bundles that showed significant correlations between the asynchronies in the SCT auditory condition and the fiber density cross-section (FDC) of the corpus callosum (CC). Panels A to C correspond to the anterior coronal sections of the sagittal map depicted in the center of the figure. Panels D and E correspond to the posterior axial sections of the same central sagittal map. An interval-selective map with an anterior posterior gradient is depicted. F. Coronal section of the CC showing the fixels with a significant correlation coefficient (color-coded r values; only fixels with pcorr<0.05 are shown) between asynchronies at the 750 ms interval in the auditory condition and FDC. G. Distribution of the coefficients of determination (r2) of the FDC vs absolute asynchronies for the four intervals listed on the x-axis. The interquartile box plots are depicted on the right. It is evident in Figure 7A-E that the streamline segments of the fixels with entrainment correlations were located mainly at the joint of the two hemispheres across the CC. Nevertheless, a lateralization effect was found for the left hemisphere, with fixels associated with auditory asynchronies of 750 and 950 ms in the isthmus and splenium, respectively. In addition to the CC, the right fornix showed a significant association with the asynchronies of the 750 ms interval for the FD metric (see Figure 7–Supplement 1). Lastly, we carried out a correlation analysis between the mean absolute asynchronies across the five intervals and the FC (Figure 8) and FDC (see Figure 8–Supplement 1). Notably, for the auditory condition, the tracts with significant FC fixels were the left arcuate fasciculus (Figure 8A,E), CC M1 (Figure 8C,E), forceps major (Figure 8B,D), superior longitudinal fasciculus 2 (Figure 8F), and right fornix (see Figure 8–Supplement 1). 28 Figure 8. Association between deep white matter and mean absolute asynchronies across all target intervals. A. Sagittal brain section showing the p-value of significant fixels. B. Example of the significant correlation between the fiber cross-section (FC) metric and the mean absolute asynchronies in a single illustrative fixel (red dot in panel D). C-F. Axial sections showing the negative correlation (r) between FC and mean absolute asynchronies for significant fixels. CC= corpus callosum (C), FMA= forceps major (D), AF= arcuate fasciculus (E), SLF 2= superior longitudinal fasciculus 2 (F). 3. Discussion The present research determined the intersubject association between the structural properties of the SWM and DWM and different measures of rhythmic timing during a synchronization-continuation tapping 29 task. Our study supports five conclusions: First, the tapping phase and period during the SCT showed precision and accuracy, as well as error corrections that were biased towards auditory rather than visual metronomes, thereby confirming previous observations. Second, the right audiomotor system exhibited individual differences in SWM and U-fiber density. These differences were correlated with the degree of phase accuracy of the tapping synchronization across subjects. Notably, the correlations were selective for the synchronization epoch of the auditory condition and were specific to the 650 and 750 ms intervals. Third, there was a significant association between the rhythmic entrainment phase and the density and bundle diameter of the CC, forming an interval-selective map with an anterior-posterior trend. This implies that the behavioral and structural associations for short and long intervals tended to be in the anterior and posterior portions of the CC, respectively. Fourth, the fiber bundle diameter of the arcuate fasciculus, CC, forceps major, and superior longitudinal fasciculus showed a significant correlation with the mean asynchronies across all tested tempos. Finally, we found no significant associations between SWM and DWM properties and temporal variability, constant error, or lag 1 autocorrelation under the visual and auditory conditions during the synchronization and continuation epochs of the SCT. These last findings suggest that connectivity within the audiomotor system is tightly linked with the ability to synchronize in phase at the preferred tempo for auditory metronomes. We speculate that the structural white matter is associated with tapping-phase control, not with period representation, as the latter depends on neural population dynamics within the timing network (Gamez et al., 2019; Betancourt et al., 2023) and the former depends on a prior ability to detect changes in phase at the preferred tempo, whose intrinsic nature is defined in the audiomotor connectivity. Many studies have shown that performance tapping synchronized to an auditory metronome is more precise and accurate than synchronization to a flashing visual metronome with the same timing characteristics (Chen et al., 2002; Hove et al., 2013; Merchant et al., 2008c; Patel et al., 2005; Repp & 30 Penel, 2004; Zarco et al., 2009). This auditory–visual asymmetry can be cancelled out by visual moving metronomes (Hove, et al., 2010; Perez, et al., 2023). Since the first processing relays, the auditory system has higher temporal resolution compared to the visual system (Duysens J. & A., 1996; He et al., 1997; Sayegh et al., 2011) and plays a critical role in time perception and reproduction across many tasks, not only in tapping SCTs (Grondin et al., 2005; Merchant et al., 2008b; Merchant & de Lafuente, 2014). For example, when audiovisual stimuli are used in an oddball paradigm, the perceived duration is dominated by the auditory modality (Chen & Yeh, 2009). In addition, Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) disruption of the auditory cortex impaired time estimation for auditory and visual stimuli, while disruption in the visual cortex only produced timing impairments for visual stimuli (Kanai et al., 2011). Consequently, a current hypothesis is that the auditory cortex is engaged in multimodal temporal processing, and the interaction between the auditory and motor systems in the frontal lobe allows not only time encoding but also time prediction (Merchant & Honing, 2014; Merchant & Yarrow, 2016; Patel & Iversen, 2014; Schwartze et al., 2012). Our present findings support this notion in different ways. First, the rhythmic timing performance of our subjects was biased towards the auditory condition across different behavioral measures. Second, the right audiomotor system showed widespread and significant correlations between the density of superficial U-fibers and the degree of sensorimotor phase accuracy across subjects. These anatomo-behavioral associations are selective to the intervals in the 650-750 ms range. Third, the fiber bundle diameter of the left arcuate fasciculus, a key tract connecting the parietotemporal auditory system with the frontal lobe, showed a significant correlation with the mean asynchronies across all tested tempos. Furthermore, the clear clustering of subjects as either good or bad synchronizers in a syllabic isochronous entrainment task correlates with both the difference in the activation magnitude in frontal areas and the changes in white matter pathways (i.e., left arcuate fasciculus) that connect the auditory system with the premotor cortical system (Assaneo et al., 2019). Hence, our results accentuate the 31 audiomotor structural foundation for rhythmic entrainment (Honing & Merchant, 2014; Miyata et al., 2022). The lack of structural associations in the visual condition is probably due to the larger variability in rhythmic tapping for this modality, making it difficult to infer statistical correlations between our metrics. As described above, the null anatomo-behavioral associations for the visual condition could also be due to the slow sampling rate of visual periodic temporal attention, with a sampling interval that is longer than our tested durations (Zalta et al., 2020). The observed associations between the measured SWM and DWM properties and the accuracy in the synchronization phase were negative. This result indicates that the white matter parameter values were greater in subjects with asynchronies close to zero and an accurate tapping phase with the metronome than in subjects with large gaps in time between the stimuli and taps. These results support the theory that intersubject differences in rhythmic entrainment phase depend on micro- and macrostructural white matter properties, which could have a genetic and/or learned substrate. From a genetics perspective, we could speculate that the existence of poor and superior synchronizers (Blecher et al., 2016) may depend on the FD of superficial U-fibers in the right audiomotor system, as well as on the density of deep tracts such as the CC and arcuate fasciculus. From a training perspective, these SWM and DWM bundles may develop larger density and myelination during intense musical practice, distinguishing the audiomotor tracts between musicians and non-musicians (Palomar-García et al., 2020; Vaquero et al., 2018; Zatorre et al., 2007). The correlations between the density of tangential U-fibers in the right audiomotor circuit and the asynchronies for the auditory condition were interval-selective for the intermediate tested tempos. The observed interval specificity corroborates the existence of an spontaneous rhythmic tempo, already observed in many studies of rhythmic entrainment, and with values between 600 and 750 ms, (Drake et al., 2000a,b; McAuley et al., 2006: Dalla Bella, et al., 2017). The biological intrinsic periodicity may 32 depend on a biased distribution of preferred tempos towards 1.5 Hz in the interval-tuned neurons of the motor system (Bartolo et al., 2014; Bartolo & Merchant, 2009; Perez et al., 2023; Perez and Merchant, 2018). Interestingly, Zalta et al. (2020) showed that humans were best at following auditory rhythms at a rate of ~1.4 Hz and that overt motor activity optimizes auditory periodic temporal attention at a similar rate. This rate is close to the intervals with structural associations in the present study. Consequently, we suggest that cortico-cortical connectivity within the audiomotor system is especially designed to support the internal representation of an auditory beat at the preferred tempo, providing larger phase-locking abilities with the metronome for spontaneous motor tempos (Balasubramaniam et al., 2021). On the other hand, Zalta and colleagues (2020) also demonstrated that the best rate for visual rhythms was far slower, at ~0.7 Hz (Zalta et al., 2020). Therefore, it is possible that we did not get effects in the visual condition because our target interval of 950 ms was not slow enough for this modality. Ultra-high-field (7T) functional imaging revealed that the medial premotor areas (SMA and pre- SMA) of the human brain possess neural circuits that are tuned to different durations, forming a topographical arrangement during a visual discrimination task. These chronomaps show units with enhanced responses for the preferred interval and suppressed activity for the non-preferred duration, and define a topographical gradient with short preferred intervals in the anterior portion and long preferred intervals in the posterior portion of the medial premotor areas (Protopapa et al., 2019; 2020; Schwartze et al., 2012). Protopapa et al., (2019) also showed chronomaps in the SMA during an interval reproduction task using auditory cues, which is similar to the task used in this study. Notably, chronomaps also showed an anterior-posterior gradient, but they represent relative rather than absolute time, and they presented some flexibility in the location of the preferred interval depending on the task context (Bueti, et al., 2021). In addition, a recent imaging study described the existence of large chronomaps covering the cortical mantle from the dorsal and ventral premotor areas to the occipital pole (Harvey et al., 2020; Hendrikx et 33 al., 2022). Our measurements of the FDA also revealed a topographical arrangement in the correlations between FD in the DWM and CC and the sensorimotor phase accuracy of subjects. We also found significant anatomo-behavioral associations in the anterior part of the CC for short intervals and in the posterior CC for long tapping tempos (Schwartze et al., 2012). Nevertheless, our interval-selective map is defined by the correlation between asynchronies and FDA, with no topographic model of the distribution of preferred intervals as shown in fMRI studies. These studies have not explored individual differences. Moreover, we found a frontal CC cluster of fixels with longer interval selectivity, producing a discontinuity in the anterior-posterior gradient of preferred intervals. These findings suggest that the map for duration selectivity starts anteriorly in the CC, which is linked to the premotor system, and ends in the CC of the visual areas of the occipital lobe. The anterior selectivity for the 650 and 750 ms ISI supports the notion that the motor system functions at 1.7 Hz during beat perception and entrainment and strongly influences the auditory system but not the visual system at this tempo (Zalta et al., 2020). The latter could explain why we did not find interval selectivity in the CC for the visual condition. Consequently, timing maps define a cortical processing framework for efficient timing integration that has both functional and anatomical bases, especially for the auditory modality (Merchant and de Lafuente, 2024). Previous studies have shown correlations between Sensorimotor Synchonization (SMS) task performance and the microstructural characteristics of DWM. For instance, Blecher et al. (2016) found a positive association between the fractional anisotropy of the left arcuate fasciculus and CC and performance in an auditory-cued finger-tapping task. The SWM immediately below the cortex has received has been less studied than DWM fasciculi, even though it accounts for 60% of the total white matter volume and is pivotal in maintaining cortico-cortical connectivity (Schüz & Braitenberg, 2002; Schmahmann et al., 2006). Nonetheless, recent studies have implicated SWM abnormalities in epilepsy (Liu et al., 2016), autism spectrum disorder (Hong et al., 2019), Alzheimer’s disease (Phillips et al., 2016), 34 schizophrenia (Nazeri et al., 2013), and stroke (Stockert et al., 2021). The SWM contains short-range association fibers that connect adjacent gyri (U-fibers) and the initial or final portions of long-range connections that traverse the DWM (Schüz & Braitenberg, 2002; Guevara et al., 2020; Kirilina et al., 2020; Yoshino et al., 2020). The SWM is difficult to study because of its complicated geometry and abundance of fiber crossings (Guevara et al., 2020). To better characterize the SWM microstructure, we separated the two components of the SWM and performed a surface- and depth-wise evaluation. Complementarily, we analyzed the DWM using FBA, which addresses many of the shortcomings of voxel-wise analysis of diffusion tensor imaging (Dhollander et al., 2021). This two-pronged approach allowed us to evaluate the entire white matter volume and show the association between its mesoscopic characteristics (i.e., AFD) and predictive tapping synchronization. A potential limitation of our study is the relatively small number of participants, related to the time- consuming nature of the behavioral evaluation and the long scanning time. Moreover, many statistical tests were performed, relating several behavioral metrics to various diffusion metrics across the brain at different depths. To minimize the possibility of statistical errors, we performed an rCCA to jointly model the behavioral and imaging metrics, thus accounting for the numerous statistical tests and reducing the possibility of reporting false positive findings. This reinforced the importance of superficial cortico-cortical communication through U-fibers and the SCT for intervals around the preferred tempo. While we have attempted to control for statistical errors as much as possible, a sample of 32 young adults with specific inclusion and exclusion criteria may inevitably not represent the population. We expect our current findings to be replicated and extended in future studies. In conclusion, our results showed that the subjects’ accuracy in SCT performance was associated with higher FC, FDC, or FD values. This is consistent with the literature that shows that better performance in different tasks is associated with higher values of FBA metrics. For example, better 35 performance in a bimanual coordination task was associated with higher FBA values in the CC (Adab et al., 2020). Funding This work was supported by Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) Grant CONAHCYT: A1-S-8430, UNAM-DGAPA-PAPIIT IG200424, and SECITI 2342 to H. Merchant. L. Concha is partially funded by CONAHCYT (C1782, FC-218-2023) and UNAM-DGAPA-PAPIIT (AG200117, IN204720, IN213423). Pamela Garcia-Saldivar is a doctoral student from Programa de Maestria y Doctorado en Psicología, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) and received fellowship number 414029 from CONAHCYT through the scholarship holder number 280464. The National Laboratory for MRI is supported by CONAHCYT and UNAM. Acknowledgments: We thank Sonja Kotz and Florencia Assaneo for their valuable comments on the manuscript and to Jessica Gonzalez Norris for proofreading the manuscript. We also thank Luis Prado, Erick Pasaye, Juan Ortiz, Leopoldo González for their technical assistance. 36 Methods This study was approved by the Ethics Committee of our Institution (049H-RM). Participants. Thirty-two healthy human subjects (age= 25.37 ± 3.21 years; 19 females) without musical training volunteered to participate and gave informed consent, which complied with the Declaration of Helsinki and was approved by our Institutional Review Board. All participants were right-handed and native Spanish speakers. They did not have MRI contraindications or neurological, psychiatric, or cognitive conditions. Apparatus. Participants were seated comfortably in a quiet experimental room, facing a high-definition 23” touch screen (refresh rate: 60 Hz; ELO Touch solutions) located 50 cm away, which they were instructed to tap using the right index finger. Auditory stimuli were presented through noise-canceling headphones (Sony, MDR-NC50). Experimental Task. The SCT of the present study is similar to the standard SCT described elsewhere (Merchant, Zarco, & Prado, 2008; Merchant, Zarco, Bartolo, et al., 2008). However, instead of tapping a button, the subject tapped on the right or left halves of the touch screen. The task started when three empty white circles (radius 1 degree of visual angle) on a black background were presented simultaneously, forming an inverted isosceles triangle (2 degrees of visual angle on each side). Subjects were trained to place their finger at the central-bottom target to start the trial and attend to a sequence of two to six right/left alternating stimuli with a constant interstimulus interval (perception epoch). They were instructed to tap the touchscreen on the corresponding target in synchrony with a metronome for six intervals (synchronization epoch) and continue tapping on the screen for another six intervals without the metronome (continuation epoch) (Figure 1). During the perception epoch, the subjects were instructed to 37 start tapping once they got the beat from the metronome, and they had two to six stimuli to start tapping. The mean produced interval was presented at the end of the trial as feedback. A trial was considered correct if, for every interval, the absolute difference between the produced interval and the target interval was below 30% of the target interval during the synchronization and below 40% during the continuation epoch. The task was programmed using Psychtoolbox for Matlab (2018, Mathworks). Stimuli. The visual metronome (33 ms, yellow circle, 0.5 degrees of visual angle) was alternatively displayed inside the right or left empty circles. The auditory metronome (33 ms, 550 Hz, 80–85 dB SPL) was also presented alternatively in the right or left headphone. The isochronous target intervals were 550, 650, 750, 850, and 950 ms, which were pseudorandomly presented within a block. Each subject performed 10 correct trials for each target interval. Procedure. The MRIs were collected in the first session. In a second visit, the auditory and visual tasks were performed randomly across subjects outside of the MRI scanner. Analysis of behavioral data. Four metrics were calculated to assess the subjects’ performance during SCT (Figure 2A) (Gámez et al., 2018; Merchant et al., 2008c). During the synchronization epoch, we estimated the absolute asynchronies and autocorrelations of the inter-tap interval time series (Iversen et al., 2015; Wing, 2002). The constant error and temporal variability were calculated from the produced intervals during both the synchronization and continuation epochs. Absolute asynchronies were defined as the unsigned difference between stimulus onset and tap onset. Constant error was calculated as the difference between the produced interval and the target interval and is a measure of timing accuracy. Temporal variability was defined as the standard deviation of the total produced intervals and is a metric 38 of timing precision. The autocorrelation of the six inter-tap intervals during a trial was calculated and averaged across trials. Thus, lag 1 autocorrelation is normally negative for isochronous metronomes, meaning that a longer produced interval tends to be followed by a shorter interval and vice versa, reflecting an error correction mechanism used to maintain the beat of the metronome during synchronization (Iversen et al., 2015). A repeated-measures ANOVA with two and three factors was carried out for the analysis of asynchronies, constant error, and temporal variability. Imaging protocol. Images were acquired using a 3 T Philips Achieva TX scanner with a 32-channel head coil. T1-weighted volumes were obtained using a three-dimensionally encoded spoiled gradient echo sequence (TR/TE=8.2/3.7 ms, flip angle = 8º, field of view = 256×256×176 mm3, matrix size = 256× 240×176 mm3 yielding voxel resolution = 1×1×1 mm3). DWIs were acquired with echo-planar imaging (EPI), 2×2×2 mm3 voxel resolution, FOV = 256 × 256 mm3, 62 axial slices, TR/TE=16500/72 ms. Images were sensitized to diffusion with b=1000 s/mm² (64 unique directions) and b=3000 s/mm² (96 directions). Five volumes without diffusion weighting (b = 0 s/mm2) were also acquired, along with an additional b = 0 s/mm2 volume obtained with reversed-phase encoding polarity for correction of geometric distortions. Image processing a) Cortical surface. T1-weighted images were used to estimate cortical surfaces. Images were first denoised (Coupe et al., 2008) and corrected for intensity inhomogeneities (Tustison et al., 2011). Binary masks of the brain were obtained with volBRAIN v.2.0 (Manjón & Coupé, 2016). Cortical surfaces were obtained through the FreeSurfer pipeline v.6.0 (Fischl, 2012). Individual surfaces were registered to the surface template with 20,484 vertices (fsaverage5). 39 b) DWIs were first denoised (Manjon et al., 2013) and bias field corrected (Tustison et al., 2011), then corrected for geometric distortions and motion using FSL’s topup-eddy algorithm (Andersson & Sotiropoulos, 2016). Fixel-based analysis. We analyzed individual fiber-specific properties in the presence of crossing fiber populations (‘fixels’) (Raffelt et al., 2015) following the steps described in (Raffelt et al., 2017) and using the tools available in MRtrix3 (Tournier et al., 2019). A white matter mask was computed for each subject, followed by global signal intensity normalization of the DWI, which was performed across subjects by dividing all volumes by the median b = 0 s/mm2 intensity. Images were upsampled to 1 mm3 isometric resolution (Dyrby et al., 2014). White matter FODs were estimated using the multi- shell, multi-tissue CSD (MSMT-CSD) algorithm (Jeurissen et al., 2014). Tissue-specific response functions were calculated for each subject, from which we derived group-averaged response functions that were used to estimate FODs (lmax=8) for each subject. A FOD template was constructed through iterative nonlinear registration using the FODs of all 32 subjects followed by the calculation of the intersection of masks of all subjects. Fixels were derived at each voxel by FOD segmentation and reoriented to the study template. Finally, FBA metrics (FD, FC, and FDC) were calculated for each fixel. Statistical analysis. A whole-brain probabilistic tractogram was calculated based on the FOD population template, seeded from a whole-brain white matter mask to produce a tractogram of 20 million streamlines. Next, the SIFT algorithm (R. E. Smith et al., 2013) was used to select a subset of streamlines (n=2 million) that best fit the diffusion signal and therefore reduce tractography biases. The structural connectivity metric between fixels was obtained according to probabilistic tractography using the connectivity-based fixel enhancement tool (Raffelt, et al., 2015). 40 The FD, FC, and FDC measures were correlated with SCT for both conditions (visual and auditory) using a General Linear Model. Non-parametric permutation tests and connectivity- based fixel enhancement (Raffelt et al., 2015) were carried out for correction of multiple comparisons (Nichols & Holmes, 2001). After the statistical analysis, tracts with significant fixels in the group space were identified using the tract-selection regions from the XTRACT tool (Warrington et al., 2020) included in FSL software (FMRIB's Software Library – FSL, Oxford, UK) (Smith et al., 2004), which were warped into our population template. Tracts with significant fixels were reconstructed using MRTrix (Tournier et al., 2019). Superficial white matter surfaces. To assess SWM properties, we used a synthetic representation of axons based on cortical topology. We computed a Laplacian potential field between the ventricles and the gray/white matter boundary (Jones et al., 2000; Lerch et al., 2008; Liu et al., 2016) using minclaplace (Lerch et al., 2008). Next, Laplacian streamlines were seeded at each vertex of the white matter surface and propagated towards the ventricles using Matlab, 2020A. Thus, one Laplacian streamline was obtained for every white matter surface vertex (Figure 3A). The distance between each step of the Laplacian-streamline was 100 µm, and streamlines were truncated at 5 mm. This resulted in smooth and non-overlapping pathways that respect topology and traverse the superficial white matter. Furthermore, the first segment of these streamlines is perpendicular to the GM-WM surface, with subsequent segments gradually bending as they extend away from it. These aspects make the Laplacian streamlines behave similarly to what is expected from the anatomy of the SWM. Finally, all the white matter surfaces and synthetic streamlines were warped to their corresponding subject-specific DWI space via between-modality non-linear registration using ANTS (Avants et al., 41 2011). Data for one subject was discarded for SWM analysis (figures 3, 4, and 5) due to suboptimal registration between DWI metric maps and white matter surface. We used the fixel-based information to independently evaluate the two fiber systems that coexist in the SWM: U-fibers subserving short-range cortico-cortical connectivity and long-range projection, association and commissural fibers (Kirilina et al., 2020; Schüz & Braitenberg , 2002; Yoshino et al., 2020). With the assumption that U-fibers run tangentially to the gray/white matter surface and long- range fibers impinge on the surface in a perpendicular fashion, we attributed the fixels oriented parallel to the segments of the Laplacian streamlines to long-range fibers, and the remaining fixels to the U-fiber system. DWI-derived metrics were sampled along each Laplacian streamline at 0, 0.5, 1, 1.5, and 2 mm under the gray/white matter interface. The metrics sampled were totalAFD (the integral of all FODs within a given voxel) and AFD attributed to either long-range fibers (parAFD; the integral of the FOD of the fixel parallel to the Laplacian streamline) or U-fibers (tanAFD; defined as totalAFD - parAFD). All metrics along the Laplacian streamlines were projected onto the gray/white matter surface of the fsaverage5 template for visualization and statistical analyses and smoothed using a two-dimensional kernel of 15 mm of full width at half maximum. Surface-based analysis of superficial white matter. Analyses were performed by fitting a general linear model at each vertex using SurfStat (https://www.math.mcgill.ca/keith/surfstat). This analysis assessed the relation between the value of diffusion metrics in each vertex (i) and the behavioral metrics from the SCT (absolute asynchronies, constant error, temporal variability, and lag 1 of the autocorrelation of the inter-tap-interval time series), as: 42 SWM i = β0 + β1 * STC metric Surface vertex-wise analysis was corrected for multiple comparisons using random-field theory with a cluster-forming threshold Pcft < 0.001 (Eklund et al., 2016). Clusters with PCluster < 0.001 were deemed significant (https://www.math.mcgill.ca/keith/surfstat). Significant clusters were anatomically identified using the Brain Atlas Based on Connectional Architecture (Brainnetome) (Fan et al., 2016). All the analyses were carried out in Surfstat (Worsley et al., 2009) for Matlab (2018; Mathworks). Regularized Canonical Correlation Analysis. As an additional verification of the results obtained via random field theory analysis, we performed a canonical correlation analysis between the behavioral data of the SCT and the structural information of the SWM. This approach allowed us to independently assess the correlation of the AFD measurements of every vertex with every variable of the SCT. Concretely, rCCA was calculated between the matrix of behavioral metrics from the synchronization phase of the SCT (i.e., absolute asynchrony, constant error, temporal variability, and lag 1 autocorrelation) for each sensory modality (auditory and visual), and every target interval (550-950 ms) and the AFD matrix of the whole brain. Given the orthogonality between tanAFD and parAFD, and their collinearity with totalAFD individual models were built for every AFD metric. Since the number of variables (particularly the number of vertices) is much larger than the sample size, we included two regularizing parameters for the covariance matrices in the model (rCCA) (Mihalik, A., et al., 2021). These parameters were optimized by a grid search algorithm that maximized the correlation of the canonical variates (Figure 6A). Confidence intervals (at 99%) for the loadings of the variables after model fitting were estimated by building null distributions of loadings based on random 43 permutations (n=10,000) of the original metrics. This was useful to identify the most relevant behavioral variables (Figure 6) associated with the structural data. 44 References Adab, H., Chalavi, S., Monteiro, T. S., Gooijers, J., Dhollander, T., Mantini, D., & Swinnen, S. P. (2020). Fiber-specific variations in anterior transcallosal white matter structure contribute to age-related differences in motor performance. NeuroImage, 209, 116530. 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The surface- based analysis (SBA) was used to assess the association between the performance metrics of the SCT and the 3 metrics to characterize the SWM sampled in five depths with respect to the gray/white matter interface. The number of significant vertices (both hemispheres) after SBA are shown for the three DWI metric maps, through five depths sampled, and the four behavioral metrics in five intervals, two epochs, and two modalities. The number of vertices for the three AFD metrics showed association only with the absolute asynchronies of the different intervals of the auditory modality. The largest significant clusters were observed between the absolute asynchronies for the 650 and 750 ms intervals through the five depths sampled in the three AFD metrics. The SBA results were corrected to multiple comparisons, using as thresholds Pcft < 0.001 and PCluster< 0.001. AFD: Apparent fiber density; tanAFD Tangential apparent fiber density; parAFD: Parallel apparent fiber density; Async: Absolute asynchronies; Lag 1: Lag 1 of the autocorrelation for each instructed interval; CE: Constant error; TV: Temporal variability; Sync: Synchronization; Cont: Continuation. Figure 3–Supplement 2. Video. Figure 3–Supplement 2. Spatial correlations between the SWM apparent fiber density and interval-specific absolute asynchronies of the auditory modality. Coefficient of determination of the significant cluster vertices after surface-based analysis through the depths sampled (pF W E < 0.001 and pcluster < 0.001). Figure 3–Supplement 3. Video. Figure 3–Supplement 3. Spatial correlations between the tangential SWM apparent fiber density and interval- specific absolute asynchronies of the auditory modality. Coefficient of determination of the significant cluster vertices after surface-based analysis through the depths sampled (pF W E < 0.001 and pcluster < 0.001). Figure 3–Supplement 4. Video. Figure 3–Supplement 4. Spatial correlations between the parallel SWM apparent fiber density and interval- specific absolute asynchronies of the auditory modality. Coefficient of determination of the significant cluster vertices after surface-based analysis through the depths sampled (pF W E < 0.001 and pcluster < 0.001). 4 Figure 4–Supplement 1. Association between asynchronies (650 ms intervals) and tangential superficial white matter apparent fiber density (tanAFD) at various depths from the gray/white matter interface. tanAFD sampled at 0 mm shows significant correlations distributed throughout most of the brain, but specific regions (e.g., motor, auditory, and visual areas) consistently show significant correlations as depth increases. 5 Figure 5–Supplement 1. A and B. Interregional correlation plot of the auditory asynchronies and parAFD as a function of the instructed interval and the depth of the parAFD calculation. 6 Figure 6–Supplement 1. Percent of significant fixels (five intervals) in the deep white matter in projection tracts in the (A) Left hemisphere, (B) Right hemisphere, and (C) Commissural tracts (C). AF = Arcuate fasciculus; ATR = Anterior thalamic radiation; CB = Cingulum bundle; CST = Corticospinal tract; FX = Fornix; IFO= Inferior Fronto- Occipital fasciculus; MdLF = Middle longitudinal fasciculus; SLF2 = Superior longitudinal fasciculus 2; STR=Superior Thalamic Radiation; AC= Anterior commissure; CC = Corpus callosum; FMI = Forceps minor; FMA = Forceps major; FD = Fiber density; FC = Fiber cross-section; FDC= Fiber density and cross-section; MAs = Mean asynchronies. 7 Figure 7–Supplement 1. Percent of significant fixels (mean asynchronies) in the deep white matter in projection tracts in the (A) Left hemisphere, (B) Right hemisphere, and (C) Commissural tracts (C). AF = Arcuate fasciculus; ATR = Anterior thalamic radiation; CB = Cingulum bundle; CST = Corticospinal tract; FX = Fornix; ; IFO= Inferior Fronto-Occipital fasciculus; MdLF = Middle longitudinal fasciculus; SLF2 = Superior longitudinal fasciculus 2; STR=Superior Thalamic Radiation; AC= Anterior commissure; CC = Corpus callosum; FMI = Forceps minor; FMA = Forceps major; FD = Fiber density; FC = Fiber cross-section; FDC= Fiber density and cross-section; MAs = Mean asynchronies.