0)088 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO INSTITUTO DE BIOTECNOLOGIA ANALISIS GENETICO DEL HIDROTROPISMO DE LA RAIZ EN Arabidopsis thaliana TESIS PROFESIONAL QUE PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTORA EN BIOTECNOLOGIA PRESENTA DELFEENA EAPEN ASESOR DRA.GLADYSICASSABLOPEZ Cuernavaca, More los Agosto , 2004 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. DE LA. BlB.LlOTECA To my parents and my family Seb, Andrew and Albert A11toó10 a la Dirección Gtner1ll dt Bibliotecas de la UNAM a difundir en fomato eleclfOftico e Impreso el contenido de m ~ ¡ r bajo rt C_.!P tlonal. NO M BR E : .J) V e ( t1 Q. ~ FECHA: F IRMA : Esta tesis se desarrolló en el Departamento de Biología Molecular de Plantas del Instituto de Biotecnología /UNAM bajo la asesoría de la Dra. Gladys 1 Cassab López. La realización de este trabajo de investigación fue posible gracias al apoyo de DGAPA (IN208999) , así como del proyecto de CONACYT (No. 36 071-N). AGRADECIMIENTOS Quiero expresar mi sincero agradecimiento a la Dra. Gladys Cassab por haberme permitido formar parte de su grupo durante todos estos años, por su valiosa asesoría y criticas para la realización de este trabajo. Expreso mi gratitud por ayudarme a traducir la mayor parte de este escrito al español. A los miembros de mi comité tutoral Dr. Jorge Nieto, Dra. lrma Bernal y Dra. Patricia León por sus valiosos comentarios y asesoría. A Dra. Georgina Ponce por su amistad, buenos consejos y críticas. Agradezco a Ma. Eugenia Campos por su amistad y valiosa asistencia para el mapeo y análisis genético de las mutantes. A Ma. Luisa Barroso por su valiosa participación y asistencia en la caracterización de la mutante. Quiero expresar mi reconocimiento a los miembros del jurado: Dr. Arturo Angel Guevara, Dra. Susana López, Dra. lrma Bernal, Dr. Miguel Lara, Dr. Ornar Pantoja y Dr. Baltazar Becerril por sus correcciones, comentarios y reflexiones que contribuyeron en la elaboración final de este escrito. Agradezco a los investigadores Joseph Dubrovsky, Svetlana Shishkova y Gabriel Corkidi por su asistencia y apoyo. A Dr. Stewart Gillmor y a la Dra. Lucero Gutiérrez por su valiosa asesoría en el mapeo de la mutante. A Yoloxochitl por su amistad y buena disposición en ayudarme en resolver mis problemas de la computadora, a Rosario Luján por su amistad y ánimos. A Manuel Sauceda por facilitar mi trabajo en todos estos años. A la Unidad de Síntesis de oligonucleótidos del Instituto de Biotecnología por los aligas sintetizados. Mis agradecimientos más especiales van dirigidos a todos aquellos que, durante todo este tiempo, me brindaron su apoyo, confianza, y los ánimos suficientes para la realización de este trabajo, mis amigos. INTRODUCCION JUSTIFICACION HIPOTESIS OBJETIVOS MATERIALES Y METODOS La raíz como una estructura en continuo crecimiento La raíz sintetiza reguladores del crecimiento Citocininas Acido abscísico (ABA) y etileno Giberelinas Auxinas Los sistemas principales de guía que controlan la dirección del crecimiento de un órgano vegetal Fototropismo Gravitropismo Tigmotropismo Otros tropismos Electrotropismo Oxitropismo Hidrotropismo Dos tipos de morfología de cofia Arabidopsis como planta modelo Análisis de mutantes como una herramienta poderosa de genética clásica Abanderamiento con T-DNA Mutagénesis química con EMS Objetivos particulares 3 4 6 7 7 9 10 10 11 12 12 13 13 14 14 16 19 19 20 22 23 24 24 24 25 Material vegetal y condiciones de crecimiento 25 Sistema de tamizado 25 Determinación del potencial de agua en el medio de tamizado 26 Mapeo genético de la mutación nhr1 26 RESULTADOS. PARTEI DISCUSION. PARTEI PERSPECTIVAS. PARTEI RESULTADOS. PARTE 11 Material de laboratorio Manipulación de ADN Rescate de plásmido Secuenciación de ADN y análisis de los datos Análisis por PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) Microsocopía 27 27 27 29 29 30 31 Diseño del sistema de escrutinio y su caracterización 31 Las raíces perciben un umbral de gradiente de potencial 34 hídrico Identificación de las mutantes con respuesta hidrotrópica 36 alterada Identificación de dos mutantes putativas, hyd3 y hyd6 generadas por inserción de T-DNA 37 La mutación hyd6 se localizó en el cromosoma 1 40 El gen hipotético At1g61190tiene similitud con el gen RPS2 41 Análisis genético y molecular de la mutante hyd6 por PCR 42 El porcentaje del fenotipo no hidrotrópico de la mutante hyd6 47 disminuyó en la generación F3 49 52 53 Identificación de la mutante nhr1 (no-hydrotropic root mutant 1) 53 La raíz de nhr1!+ en el sistema con gradiente de humedad en 55 el aire Las respuestas tigmotrópica y gravitrópica de la raíz se alteran en plántulas nhr1!+ 57 Crecimiento de la raíz de la mutante nhr1!+ en presencia de 58 hormonas exógenas DISCUSION. PARTE 11 CONCLUSION. PARTE 11 BIBLIOGRAFIA ARTICULO La morfología de la cofia de la mutante nhr1 La mutación nhr1 se localizó en el cromosoma 3 62 65 67 La mutante nhr1 es semi-dominante heterocigota 68 El transporte polar de auxina está alterado en la raíz de nhr1!+ 69 Las respuestas gravitrópica y tigmotrópica fueron 70 afectadas por la mutación nhr1 La percepción o transmisión de la señal está interrumpido en 71 nhr1 Intercomunicación en las vías de hormonas 71 73 75 RESUMEN En este trabajo, se analizó la capacidad de las raíces de plantas de percibir y dirigir su crecimiento en relación a gradientes de humedad, fenómeno conocido como hidrotropismo. La punta de la raíz o cofia percibe y procesa varias señales ambientales, incluyendo gradientes de humedad, gravedad, obstáculos, etc. Para estudiar los mecanismos moleculares involucrados en este tropismo, iniciamos un análisis genético que nos permitiera aislar mutantes de Arabidopsis con respuestas hidrotrópicas alteradas. Primero, se diseñó un sistema con un gradiente de potencial de agua que demostró la respuesta hidrotrópica en raíces de Arabidopsis. Segundo, se tamizaron dos colecciones de mutantes de Arabidopsis (inserción de T-DNA y tratadas con EMS) en el sistema diseñado. Se identificaron 23 mutantes putativas que no mostraban respuesta hidrotrópica, de las cuales tres fueron seleccionadas por su porcentaje de fenotipo mostrado en generaciones subsecuentes. Dos de estas mutantes provenían de la colección por inserción de T-DNA (hyd3 y hyd6), y la tercera de semillas tratadas con EMS (nhr1). El análisis genético de la mutante nhr1 (no-hydrotropic response) reveló que contenía una mutación localizada en el brazo superior del cromosoma 3. La caracterización fisiológica de las raíces de la mutante nhr1 indicó que el transporte polar de auxinas estaba afectado. También, estas raíces mostraron una disminución en la sensibilidad al ABA indicando que la señalización de esta hormona podría regular la respuesta hidrotrópica. Se diseñó un segundo ensayo para estudiar el hidrotropismo en Arabidopsis con gradientes de humedad en el aire, el cual comprobó la carencia de la respuesta hidrotrópica en raíces de la mutante nhr1 y que las raíces de Arabidopsis responden más a estímulos hidrotrópicos que a gravitrópicos. Tanto la morfología anormal de la cofia, como las respuestas gravitrópicas y tigmotrópicas alteradas en raíces de nhr1, sugirieron que la mutante podría presentar un desbalance en el control de la percepción y/o transducción del estímulo hidrotrópico. Los resultados demuestran que el hidrotropismo puede someterse a un análisis genético. SUMMARY The ability of plant roots to perceive moisture gradients and direct their growth towards higher moisture gradient was analyzed in the present work. lt has been showed that root cap perceives and processes many environmental signals such as gravity, obstacles and moisture gradients, etc. In this work, it was examined whether the hydrotropic response is under genetic control. To study the molecular mechanisms involved in root hydrotropism, a genetic approach was taken to isolate mutants, which are detective in this response. First, an artificial system with water potential gradient was designed to show hydrotropism in Arabidopsis roots. Second, screening for hydrotropic mutants was done in the above system using two different collections of mutagenized seeds of Arabidopsis (T-DNA insertion and EMS treated). Among the 23 putative hydrotropic mutants were identified, three mutants were selected for their percentage of phenotype in the subsequent generations. Two of them were T-DNA tagged mutants (hyd3 and hyd6), and were analyzed genetically. The third hydrotropic mutant was obtained from the EMS mutagenized (M2) collection. Genetic analysis of this no-hydrotropic response mutant 1 (nhr1) revealed that this was a novel mutation in Arabidopsis and it was localized in the upper arm of the chromosome 3. The physiological characterization of this mutant indicated that auxin efflux was affected in the roots. A decreased ABA sensitivity of nhr1 roots indicates that there exists a possible participation of ABA signaling in the phenomenon of root hydrotropism. With a second hydrotropic assay with moisture gradients in air, it was shown that Arabidopsis roots respond primarily to a hydrotropic than a gravitropic stimulus, and nhr1 is particularly affected in this tropic behavior. The abnormal root morphology, altered gravitropic and thigmotropic responses of the nhr1 suggested that might exist an imbalance in the control of perception and/or transduction of hydrotropic stimulus in this mutant. These results showed that hydrotropism is amenable to genetic analysis. 2 INTRODUCCION Los primeros organismos que vivieron y se reprodujeron en la tierra fueron las plantas. Al hacerlo, proveyeron de comida y refugio a los animales que invadieron la tierra. La estrategia más importante de las plantas es la plasticidad y adaptabilidad de sus programas de desarrollo. A diferencia de los animales, que pueden escapar de condiciones desfavorables por respuestas de comportamiento, las plantas compensan su estilo de vida sésil cambiando fácilmente su respuesta de desarrollo a estímulos externos. Mientras que los animales establecen la organización de su cuerpo entero durante la embriogénesis, la forma adulta de las plantas depende completamente de su desarrollo postembrionario. Los meristemos, sistemas de células troncales que se automantienen, se establecen en ambos extremos apical-basal del eje embrionario y son capaces de perpetuar a los órganos existentes así como de iniciar primordios de nuevos órganos (Steeves y Sussex, 1989). Algunos primordios se desarrollan en órganos determinados con un número finito de células, mientras que otros se desarrollan en tallos o raíces con meristemos secundarios. La diversidad morfológica de los órganos vegetales depende del origen de sus primordios: los meristemos del tallo generan hojas, meristemos florales que dan origen a órganos florales tales como, pistilos, óvulos, integumentos, las raíces dan lugar a las raíces laterales. La diferencia entre las hojas y los órganos florales, por ejemplo, puede ser atribuida a la expresión de genes homeóticos florales en los últimos, pero no en las primeras (Honma y Goto 2001 ). Una característica común de todos los primordios de órganos derivados del tallo, por el contrario a los derivados de raíces, es la expresión del factor de transcripción AINTEGUMENTA (Elliot et al., 1996). Otro ejemplo es la participación de la proteína homeótica WUSCHEL tanto en el desarrollo de la flor como del óvulo (Gross-Hardt et al., 2002). Además, los órganos subterráneos como las raíces laterales, son distintos de los órganos aéreos desde el punto de vista de su desarrollo en término de iniciación de primordios, desarrollo subsiguiente y regulación de la expresión génica (Malamay y Benfey, 1997). Estas observaciones 3 sugieren que al menos existen dos mecanismos de regulación diferentes que participan en la formación post-embrionaria de órganos en plantas. En la mayoría de las plantas terrestres la raíz es el órgano que absorbe agua y sales minerales en solución del suelo y al mismo tiempo ancla la planta a su sustrato. El sistema radicular varía ampliamente dentro y entre diferentes especies de plantas. En plantas monocotiledóneas, el desarrollo de la raíz comienza en el embrión con la emergencia de tres a seis ejes primarios (o seminales) y las raíces secundarias se forman post-embrionariamente en un contexto de desarrollo completamente distinto. Por el contrario, en plantas dicotiledóneas existe un sistema radicular con un solo eje, llamado raíz principal, del cual se desarrollan las raíces laterales que formaran un sistema ramificado extensivo (Fitter 1996). En algunas especies, las raíces desarrollan funciones especiales ya sea de almacenaje de agua y/o alimento (como en la zanahoria o camote), o proveen oxígeno a la planta, como los pneumatóforos de los manglares. En otros casos, pueden otorgar extra-anclaje, como las raíces adventicias que surgen del tallo en monocotiledóneas (ejemplo, maíz) y los manglares. La raíz como una estructura en continuo crecimiento Las raíces pueden crecer continuamente durante la vida de la planta y su proliferación depende de la disponibilidad de agua y sales minerales en el micro ambiente inmediato de la raíz. Su crecimiento está regido por la división y elongación celular coordinada en la zona más proximal de la raíz. Tanto en plantas dicotiledóneas como en monocotiledóneas, el desarrollo del sistema radicular depende de la actividad del meristemo apical de la raíz (RAM) (Steeves and Sussex 1989). Recientemente se ha estudiado con detenimiento el desarrollo de la raíz en varias especies tales como Arabidopsis thaliana, maíz y chícharo (Howell, 1998). La raíz se ha dividido en varias zonas de acuerdo a su actividad, ya sea de división celular (zona meristemática), elongación (zona de elongación proximal y distal) y diferenciación (zona de maduración) (Fig. 1 ). 4 En la zona meristemática las células se dividen en ambas direcciones, proximal y distal, y las células hijas se diferenciarán en tejidos funcionales de la raíz o de la cofia. Sin embargo, dentro del RAM existe un grupo de células con una tasa de división muy baja la cual se conoce como centro quiescente (CQ) (Taiz y Zeiger 1998). Estas células, que serían el equivalente de las células troncales de animales (stem ce/Is), juegan un papel muy importante manteniendo a las células meristemáticas dividiéndose en lugar de diferenciándose (Sabatini et al., 2003). Arriba de la zona meristemática, se localiza la zona de elongación, donde las células sólo se expanden longitudinalmente y realizan un ciclo final de división celular. Justo en esta zona, las células cambian dramáticamente sus patrones de expresión génica así como las características de su pared celular que finalmente le darán su tamaño y forma características. e ·O ~ T5 t1l t1l ... e ::J o -o N t1l E e :Q -o (.) t1l t1l e Cl o e N..Q ~ { ro E e o~ N l/l ·53 E cortex endodermis región de división 5 Figura 1. Diagrama del corte longitudinal de una raíz que muestra el región apical y la cofia. Las células meristemáticas generan la cofia y la parte de la raíz propia. Las células se diferencian en la zona de elongación para producir xilema, floema y cortex. Los pelos radiculares se forman de las células epidermales en la zona de maduración. Modificado de Taiz y Zeiger, 1998. En la zona de maduración las células son funcionales y por ejemplo las células de la endodermis engrosan sus paredes celulares y desarrollan una capa de suberina en las paredes radiales que impide la salida del agua absorbida por la raíz (Fig.1 ). En el haz vascular, las células cribosas del floema transportan carbohidratos del tallo a la raíz, y las traqueidas o elementos de vaso del xilema, agua de la raíz al tallo. El tejido del floema se desarrolla antes que el del xilema, ya que se requieren de grandes cantidades de carbohidratos para apoyar la división y elongación en la región de crecimiento de la raíz. La tasa tan baja de división celular en el ca podría deberse al insuficiente aporte de carbohidratos a esta zona (Taiz y Zeiger, 1998). Los pelos radiculares son extensiones microscópicas de las células epidérmicas que incrementan grandemente el área de superficie de la absorción de agua y minerales. Estos aparecen en la zona de maduración, donde el xilema adquiere la capacidad de translocar cantidades substanciales de agua de la raíz a la parte aérea. La raíz sintetiza reguladores del crecimiento Los reguladores del crecimiento u hormonas están implicados en la regulación de todas las actividades de la raíz, incluyendo su respuesta a estímulos del ambiente. Estos mensajeros químicos actúan en células blanco regulando su división, crecimiento, metabolismo y diversas funciones. Las raíces sintetizan casi a todas las hormonas vegetales (ltai y Birnbaum, 1996). Por lo que se ha propuesto que en cierto modo, las raíces regulan la disponibilidad de ciertas hormonas a la parte área. Las hormonas sintetizadas en raíces son las auxinas, citocininas, ácido abscisico (ABA) , etileno y giberelinas. 6 Citocininas Las citocininas son hormonas esenciales involucradas en la formación del meristemo apical del tallo, formación de hoja, división celular, biogénesis de cloroplastos y senescencia (Hwang y Sheen, 2001 ). La cinetina, una citocinina sintética, fue descubierta como un producto del rompimiento del ADN. (Skoog y Miller, 1957). Ellos identificaron la acción estimulatoria de esta molécula al aplicarla junto con auxinas y observar la proliferación de células de parénquima de tabaco en cultivo de tejidos. Años más tarde, demostraron que extractos de endospermo inmaduro de maíz contenían una sustancia que tenía el mismo efecto biológico de la cinetina, la cual fue llamada zeatina (revisado en ltai y Birnbaum, 1996). Ambas moléculas son derivadas de la adenina o aminopurina. Las actividades principales de las citocininas son: (1) inducción de la división celular en células en cultivo de tejidos en presencia de auxinas, (2) formación de brotes de hoja o raíz en células en cultivo de tejidos junto con el cociente apropiado de auxinas, (3) retraso de la senescencia de hojas, y (4) expansión de los cotiledones de dicotiledóneas (Hwang y Sheen, 2001 ). El RAM es el principal sitio de síntesis de citocininas libres en toda la planta. Se propone que las citocininas sintetizadas en la raíz se movilizan a través del xilema hacia el tallo donde participan en procesos de desarrollo y en la respuesta de la parte aérea a estímulos del ambiente (Murofushi, 1983). ABA y Etileno El ABA y el etileno controlan el crecimiento inhibiendo diversos procesos celulares bajo condiciones de estrés, como son la síntesis de proteínas, el transporte de iones, etc. El ABA es una hormona característica de plantas vasculares, habiendo sido detectada en musgos, pero no en hepáticas (plantas primitivas sin tejido vascular). (Taiz y Zeiger 1998) Esta fitohormona tiene un papel esencial en el proceso de latencia de semillas y en las respuestas adaptativas de las plantas al estrés. Bajo condiciones de estrés, tales como sequía, frío y salinidad, el nivel de ABA se incrementa en tejidos vegetativos, disparando 7 respuestas adaptativas específicas para cada estrés y permitiendo la sobrevivencia de la planta. El ABA provoca el cierre de estomas y su acumulación en hojas estresadas reduce la pérdida de agua por transpiración en condiciones de sequía. De hecho, el ABA induce la expresión de varios genes por estrés. El ABA se sintetiza en cualquier célula que contenga cloroplastos o amiloplastos. La estructura del ABA semeja la porción terminal de algunos carotenoides. Casi todas las moléculas de ABA se encuentran en la forma cis y cualquier cambio en ésta resulta en la pérdida de su actividad. La presencia de ABA en raíces y exudados de raíces fue demostrado en 1970 (Torrey, 1976). Estudios con cultivos de raíces asépticos de Phaseolus coccineus, que no habían estado en contacto con la parte aérea de la planta, producían niveles muy similares de ABA con respecto a raíces intactas (revisado en ltai y Birnbaum, 1996). El ABA está principalmente implicado en la señalización que se desencadena en las respuestas al estrés. La concentración de ABA en la raíz se incrementa durante el estrés hídrico y el funcionamiento del RAM se detiene. En raíces estresadas la expresión de un inhibidor de la ciclina COK se induce, sugiriendo que este inhibidor regula la actividad de COK bajo condiciones de estrés. Raíces primarias de maíz por ejemplo, continúan elongándose bajo condiciones de bajo potencial de agua (-1.6 MPa), cuando condiciones similares inhiben por completo el crecimiento del tallo (Sharp et al., 1998). Recientemente se ha propuesto que el papel más sobresaliente de la acumulación de ABA en tejidos vegetativos es el delimitar la producción de etileno (Spollen et al., 2000). Esto indica que diversas actividades de la planta requieren la participación de múltiples moléculas, ya sea hormonas o péptidos. En 1934, R. Gane identificó al etileno como un producto natural del metabolismo de plantas que por sus diversos efectos fue clasificado como hormona. Todos los tejidos vegetales son capaces de producir etileno (Salisbury y Ross, 1995). El etileno en condiciones fisiológicas es más ligero que el aire, por lo que se libera fácilmente de los tejidos y se difunde a través de los espacios intercelulares. Los niveles más altos de producción de etileno ocurren en tejidos en senescencia y durante la maduración de frutos. Se ha reportado la síntesis de 8 etileno en raíces de maíz (Mulky et al., 1983). Además, descubrieron que su síntesis puede inhibirse con aminoethoxivinilglicina (AVG) o con Co(N03) 2• Estudios recientes en los que se aplica exógenamente a Arabidopsis indican que la respuesta de las raíces a etileno varían considerablemente dependiendo de los suplementos nutritivos del medio de crecimiento (Bauer et al., 2003). El etileno es un mediador importante en la señalización de respuesta a patogénesis y varios estreses bióticos. Los niveles de etileno se elevan en tallos de plantas inundadas provocando epinastia, senescencia y la formación de raíces adventicias. Un precursor de la síntesis de etileno, el ácido 1-carboxílico-1-aminociclopropano (ACC) se acumula en exudados de raíces y su síntesis se aumenta bajo condiciones anaeróbicas (revisado en ltai y Birnbaum, 1996). Como la conversión de ACC a etileno solo ocurre en condiciones anaeróbicas, su aparición es la señal que se moviliza a la parte aérea (Bradford y Yang, 1980). Se considera al etileno como la hormona que induce la formación de aerénquima (tejido parenquimatoso con amplios espacios intercelulares) y como una molécula importante en la respuesta de las plantas a patógenos (Enyedi et al., 1992; Raz y Fluhr, 1993). Giberelinas Las giberelinas (GAs) son un grupo muy grande de compuestos definidos más por su estructura química, que por su actividad biológica. Existen más de 11 O moléculas con actividad de giberelinas. La mayoría de las giberelinas sintetizadas son precursores de giberelinas bioactivas. Las giberelinas son por lo general asociadas con inducir el crecimiento del tallo, ya que su adición a plantas intactas incrementa enormemente su altura. Los niveles más altos de GAs ocurren en las semillas. Investigaciones previas indican que las raíces podrían ser el sitio de interconversión de las GAs producidas en el vástago (revisado en ltai y Birnbaum, 1996). Condiciones adversas en el ambiente que rodea a la raíz han mostrado que afectan la cantidad de GA exportada por las raíces. 9 Auxinas Las auxinas son las fitohormonas más importantes en la regulación del crecimiento y desarrollo de la planta (Baluska et al., 2003), siendo además las primeras hormonas en ser descubierta. La auxina principal presente en plantas es el ácido indol-acético (AIA), aunque existen varias otras auxinas naturales y unas más sintéticas. Las concentraciones más altas de auxina libre en la planta se presentan en el meristemo apical del tallo y en las hojas jóvenes. Estudios con raíces de maíz indican que el AIA es sintetizada a partir de 14C-triptofano en raíces escindidas y en raíces cultivadas asépticamente (Feldman, 1980). Como ocurre con otras fitohormonas, los factores ambientales también influencian el nivel de AIA en la planta. Por ejemplo, raíces escindidas de maíz expuestas a manitol acumulan grandes cantidades de AIA (Ribaud y Pilet, 1994). Experimentos recientes en Arabidopsis indican que en tallos, el AIA es transportada de célula a célula unidireccionalmente del ápice a la base. Mientras que en raíces, el transporte de AIA es más complejo, ya que se mueve acropetalamente (hacia el ápice), a través del cilindro central, y basipetalmente (del ápice a la base), a través de las capas más externas de la raíz (Fig. 27) (Revisado en Muday y Delong, 2001 ). Los sistemas principales de guía que controlan la dirección del crecimiento de un órgano vegetal Las raíces utilizan un amplio rango de información interna y externa que controlan la dirección de su crecimiento. La dirección del crecimiento de la raíz en el suelo es alterada por diferentes estímulos físicos tales como la gravedad, obstáculos, gradientes de humedad, luz, campos eléctricos, gradientes en temperatura, etc. (Davies 1995). Si la tasa de crecimiento en un lado de la raíz no es igual al otro, entonces, la raíz se curva, y este cambio en la dirección del crecimiento se conoce como tropismo. Generalmente la percepción de los estímulos ocurre en la punta de la raíz y la curvatura se produce más arriba. 10 Los reguladores del crecimiento actúan en sitios blanco controlando la tasa de crecimiento de las células en los tejidos de la raíz o tallos o inflorescencias. Los mecanismos involucrados en las respuestas trópicas son la percepción del estímulo, la transducción de la señal y la curvatura como respuesta final. Considerando al desarrollo de plantas en general, es difícil discernir cual es el estímulo ambiental más poderoso que provoca un movimiento trópico. Las plantas dependen de mecanismos sofisticados que interpretan el constante bombardeo de señales para así poder ajustar su crecimiento. Las señales tales como la gravedad, la luz y los gradientes de humedad, influyen fuertemente en el desarrollo de las plantas. Aunque los mecanismos iniciales de percepción de gravedad y luz son muy diferentes, el resultado es similar (revisado por Corre! y Kiss, 2002). De ahí que no sea sorprendente que ambos tropismos compartan mecanismos de señalización similares. Fototropismo El fototropismo es la curvatura de un órgano en respuesta a la luz. Las plantas para recibir la luz adecuada orientan sus tallos o inflorescencias hacia la luz y lejos del vector de la gravedad, las raíces en el suelo por el contrario, crecen lejos de la luz y normalmente siguen al vector de la gravedad. Charles y Francis Darwin ( 1881) dieron a conocer la primera pista relacionada con el mecanismo de fototropismo, al demostrar que los sitios de percepción y de crecimiento diferencial hacia la luz están separados, la luz se percibe en la punta y la curvatura ocurre debajo de ésta. En años recientes se ha progresado en la elucidación de las vías implicadas en el fototropismo, en parte por el aislamiento de mutantes de Arabídopsís con respuesta fototrópica reducida. Los fotoreceptores primarios son los de luz azul (que está implicado en la percepción a las longitudes de onda UV-A y verde), que pertenecen a la familia de las fototropinas, PHOT1 y PHOT2 (Christie y Briggs 2001 ). Los fitocromos, los receptores de rojo y rojo lejano, también pueden absorber luz azul y participan en las respuestas fototrópicas, ya que los órganos vegetales pueden curvarse por inducción de luz roja. En 11 Arabidopsis se han aislado 5 genes de fitocromo (PHYA-E) (Christie y Briggs 2001 ). Gravitropismo La respuesta gravitrópica permite a los órganos vegetales dirigir su crecimiento a un ángulo específico del vector de la gravedad y promueve el crecimiento hacia arriba del vástago de la planta (gravitropismo negativo), o hacia abajo (gravitropismo positivo) en el caso de la raíz. La respuesta gravitrópica del vástago le permite a éste enderezarse en caso de haber sido expuesto a fuertes vientos o lluvia y esta respuesta le impide permanecer postrado y perderse la fotosíntesis. Es ampliamente aceptado que la gravedad se percibe en los amiloplastos que actúan como estatolitos al sedimentarse en el fondo de los estatocitos. En vástagos de dicotiledóneas y monocotiledóneas, los estatolitos se observan en células de la endodermis próximas a los haces vasculares. En raíces, estas células están restringidas a la región de la columela de la cofia. Cuando ocurre la graviestimulación, el movimiento de los amiloplastos ocurre en menos de un minuto y la curvatura casi 1 O minutos después (Davies, 1995). Tigmotropismo El tigmotropismo es el crecimiento en respuesta al tacto. El ejemplo más común de tigmotropismo se observa en el enrollamiento de los zarcillos de las plantas trepadoras. Las zarcillos y algunos tallos trepadores frecuentemente crecen siguiendo un patrón en espiral llamado circumnutación, el cual incrementa la oportunidad de que los zarcillos puedan trepar. La circumnutación es esencialmente un movimiento oscilatorio del vástago, de la inflorescencia y de la raíz que resulta de un proceso endógeno, rítmico e intrínseco al crecimiento. Las raíces generalmente encuentran obstáculos mientras crecen en el suelo y los evitan utilizando su respuesta tigmotrópica. Charles Darwin (1881) delineó conceptualmente el funcionamiento de los diversos movimientos de las plantas 12 tales como el tigmotropismo y la circumnutación. En su libro "El Poder de Movimiento en Plantas" menciona que: si las raíces encuentran un impedimento unilateral o se rozan en un solo lado, se curvarán en la dirección de la perturbación mecánica (Darwin, 1881 ). Estudios recientes en tigmotropismo confirman que obstáculos y gravedad, son dos de los muchos estímulos que las raíces deben integrar para responder apropiadamente al cambio en la dirección de crecimiento. Existe evidencia de que las respuestas a la gravedad y a obstáculos interactúan a nivel celular, ya que las raíces para poder responder a un obstáculo impiden la respuesta gravitrópica disminuyendo la sedimentación de amiloplastos, fenómeno crucial para disparar la respuesta gravitrópica (Massa y Gilroy, 2003). Otros tropismos Electrotropismo Se sabe que la dirección de crecimiento de ciertas células vegetales u órganos puede modificarse al aplicarles un campo eléctrico. Este fenómeno se conoce como electrotropismo y ha sido reportado en hongos, algas, tubos polínicos y raíces (lshikawa y Evans, 1990). Por su actividad de transporte de iones, las raíces generan campos eléctricos de larga duración en el apoplasto y la rizósfera. Estos campos eléctricos pueden polarizar a células y tejidos y generar una asimetría lateral de iones y hormonas en la zona de elongación que eventualmente afecta el crecimiento de la raíz. Stenz y Weisenseel (Stenz y Weisenseel, 1993) reportaron la respuesta electrotrópica de las raíces de maíz, sus estudios indican que el crecimiento hacia el cátodo (electrodo negativo), es el crecimiento verdadero de raíces intactas a campos eléctricos y que raíces sin cofia, siempre se dirigen hacia el ánodo (electrodo positivo). Además, ellos sugieren que la cantidad de los iones de hidrógeno (H+) y calcio (Ca2+) en el medio y en el apoplasto de la raíz, juegan un papel importante en el electrotropismo. Ya que las raíces intactas y sin cofia responden diferente, las señales de la cofia parecieran estar involucradas en la respuesta electrotrópica. 13 Oxitropismo Existen reportes de respuesta oxitrópica en la cual las raíces orientan su crecimiento hacia el oxígeno en un ambiente de microgravedad en el espacio. El comportamiento oxitrópico de las raíces fue estudiado en una variedad de chícharo (Pisum sativum) sensible a gravedad y en ageotropum, una mutante gravitropica en un ambiente controlado de un microrrizotrón (o micro-rizotrón) (Porterfield y Musgrave, 1998). En este estudio se muestra que la concentración absoluta de oxígeno no es tan importante como el gradiente· de oxígeno. El oxitropismo podría permitir a las raíces evitarse una a otra en el suelo, ya que percibirían y evitarían las zonas depletadas de oxígeno asociadas con la respiración de otras raíces. Esto evitaría competencia por agua, nutrientes y oxígeno. H idrotropismo Cuando las plantas evolucionaron del medio acuático al terrestre, tuvieron que adquirir diferentes estrategias que les permitieran evitar la sequía. Como el agua es el principal constituyente del cuerpo de la planta y es el medio en el cual se lleva a cabo la difusión de los solutos, las plantas terrestres adaptaron sus raíces para crecer en respuesta a la disponibilidad de agua. Las raíces responden a diferencias en el contenido de humedad en el suelo creciendo hacia las regiones con mayor potencial de agua, fenómeno conocido como hidrotropismo. Por lo general, el gradiente de humedad que se presenta en el suelo es vertical, es decir, la desecación ocurre en la parte más superficial del suelo porque la gravedad tiende a jalar el agua a los niveles más profundos. Por lo tanto, las raíces siguen al vector de la gravedad para localizar el mayor potencial de agua en el suelo. 14 g Figura 2. Experimento de Sachs de ·· 1a canasta colgante·· para mostrar hidrotropismo en las raíces de chícharo . Las semillas de chícharo se germinaron en una canasta de malla con un sustrato húmedo. Las raíces cuando salen del sustrato siguiendo la fuente de humedad (adaptado de Takahashi , 1997). Los primeros estudios de respuesta hidrotrópica fueron reportados por Sachs en 1872 (revisado en Takahashi 1997). Este autor describió un experimento simple (Fig. 2), en el cual plantó semillas de chícharo en una canasta colgante con vermiculita húmeda sostenida con una malla. En un principio, las raíces penetraron la vermiculita y crecieron hacia abajo siguiendo el vector de la gravedad, mostrando gravitropismo positivo. Sin embargo, cuando las raíces emergían de la vermiculita se curveaban hacia el substrato húmedo, sobrellevando entonces a la fuerza de la gravedad. Sachs llamó a este fenómeno como "crecimiento dirigido de las raíces a un gradiente de humedad". Darwin (1881) utilizando el método de Sachs, determinó si sólo la punta o toda la raíz eran responsables de la percepción a estos gradientes. Él cubrió la punta de la raíz con una mezcla de aceite de oliva y aceite para lámparas (mezcla hidrofóbica y visible) y así demostró que exclusivamente la punta de la raíz contiene la sensibilidad, no sólo a gradientes de humedad, sino también a obstáculos y gravedad. Molish (1883) y Hooker (1915) reportaron otros estudios clásicos sobre hidrotropismo (revisado en Loomis y Ewan, 1936). Todos los estudios que han 15 intentado demostrar la respuesta hidrotrópica, consideran que en particular ésta depende de un gradiente moderado de humedad en el aire. Sin embargo, por varios años se prestó poca atención al hidrotropismo, en parte porque varios investigadores no lo detectaron al no poder reproducir las condiciones apropiadas del gradiente de humedad que sobrellevara la fuerza de la gravedad (Takahashi, 1994). Recientemente la existencia del hidrotropismo fue confirmada y aceptada como un tropismo genuino. Takahashi y Scott (1993) controlaron estrictamente el gradiente de humedad del aire en una cámara cerrada y observaron que las raíces de chícharo y maíz crecieron hacía la región de mayor potencial de agua. En otros estudios, Takano et al. (1995) aplicaron un gradiente de potencial de agua a la cofia de una raíz mutante de chícharo llamada ageotropum utilizando dos bloques de agar que contenían diferentes concentraciones de sorbitol. Estos autores observaron que la raíz crecía hacia la región de mayor potencial de agua. Otra demostración sobresaliente fue que las raíces de ageotropum responden al estímulo hidrotrópico sin la interferencia de la respuesta gravitrópica, indicando que ambas respuestas trópicas tienen mecanismos de acción separados (Jaffe et al., 1985). Además, observaron que cuando se corta la cofia de las raíces de esta mutante, la elongación de la raíz no es afectada, pero si su respuesta hidrotrópica, confirmando así que el sitio de percepción a este estímulo reside en la cofia (Jaffe et al., 1985). Dos tipos de morfología de cofia La mayoría de las plantas poseen cofia, la cual es un grupo de células parenquimatosas que cubren la punta de la raíz. La cofia de las plantas terrestres presenta forma cónica que facilita la penetración de la raíz al sustrato. La cofia protege al meristemo apical de la raíz, percibe diversos estímulos ambientales y crea un micro ambiente químico que determina la arquitectura del sistema radicular (Tsugeki y Fedoroff, 1999). En la mayoría de las plantas dicotiledóneas con morfología de raíz tipo "abierta" no resulta fácil distinguir el límite entre la cofia y la propia raíz. Sin embargo, en raíces con el tipo de construcción "cerrada", como en las gramíneas, la cofia se distingue fácilmente de la propia raíz por la 16 aparición de una pared celular que forma una frontera entre las dos poblaciones celulares (Fig. 3). La razón detrás de la diferencia entre los ápices cerrados o abiertas, yace en la geometría y plano de división de los linajes celulares de las dos poblaciones (Barlow, 1975). Sin embargo, la función de la cofia es la misma independientemente de su morfología. Tipo cerrada Tipo abierta Figura 3. Dos tipos de morfología de la cofia. Generalmente, las raíces de especies monocotiledóneas, como el maíz, tienen cofia tipo cerrada y las dicotiledoneas tienen la cofia con construcción abierta. (Adaptado de Barlow, 2003) La estructura y función de la cofia ha sido estudiada extensivamente en especies tales como maíz, chícharo, Arabidopsis, etc. Por el contrario al resto de los tejidos vegetales, la cofia es una entidad estructural persistente, que consiste de células destinadas a abandonar la cofia y a morir eventualmente. En especies como maíz y Arabidopsis con construcción abierta (Fig. 4) se presenta un meristemo característico de la cofia conocido como las células iniciales de la cofia. Esta capa de células iniciales, son las células que se dividen más rápido en toda la planta y las menos diferenciadas de la cofia (Hawes et al., 2003). Al producirse nuevas células de la cofia por las células iniciales, estas células hijas se desplazan a través de la cofia, primero como estatocitos o células columna (las células localizadas en la parte central de la cofia) y posteriormente 17 son transformadas en células secretoras. Los estatocitos contienen partículas sedimentables, los estatolitos (plástidos llenos de almidón o amiloplastos), que son considerados como las células perceptoras de la gravedad. En ciertas especies como en las gramíneas, la capa más externa de la cofia secreta un mucílago muy hidrofílico. Las células que se desprenden de las últimas capas se conocen como células de la periferia (Hawes y Lin, 1990). Figura 4. Cofia de maíz y Arabidopsis. La cofia de Arabidopsis tiene teñidas los granulas de almidón con lugol. Las células son contables, por ejemplo las células de columela (C) se localizan en tres hileras y el centro quiescente (QC) solamente presenta cuatro células . C, columela; End, endodermis; Cor, cortex; Epi, epidermis; LRC, cofia lateral; Ste, estele. Modificado de Friml, 2003. La raíz crece a través de estas células y éstas se congregan en pequeños agregados a intervalos regulares a lo largo de la raíz (Hawes, 2003). Las células de la periferia están embebidas en la capa de mucílago secretado, el cual es 99.9% agua con potenciales hídricos mayores a -50kPa (Read et al., 1999). En condiciones de sequía, las células permanecen pegadas fuertemente a la periferia de la cofia (Guinnel y McCully, 1987). La cofia del maíz produce un mucílago con altas concentraciones de fucosa, la cual no se observa en otra parte de la planta. Diferentes especies de plantas secretan mucílagos con diversas composiciones y el mucílago junto con las células de la periferia, tienen múltiples funciones esenciales para el exitoso funcionamiento de la raíz en el acondicionamiento de la rizósfera (Guinnel y McCully, 1987). 18 La remoción de la cofia completa es posible en raíces con construcción cerrada y provee un sistema artificial para estudiar el desarrollo y diferenciación de células en la cofia (Barlow, 1974; Ponce et al., 2000). Utilizando técnicas avanzadas histológicas como ablación con rayo láser (Blancaflor et al., 1998) y estudios de ablación genética de células de cofia de Arabidopsis (Tsugeki y Fedoroff, 1999), se ha demostrado que la cofia contiene componentes esenciales del sistema de señalización que determina la arquitectura de la raíz. Arabidopsis como planta modelo Arabidopsis thaliana ha sido utilizada en laboratorios por más de medio siglo para estudios en diferentes áreas como fisiología, bioquímica y biología molecular vegetal. Es una planta pequeña de la familia, las Brassicaceae, que incluye a la mostaza. Arabidopsis ha sido utilizada con gran éxito en diferentes ensayos experimentales para análisis genético de varios aspectos de la biología vegetal. Desarrollos recientes en la secuenciación del genoma de Arabidopsis han ayudado a identificar secuencias polimórficas y nuevos marcadores moleculares, quefacilitan la identificación y el aislamiento de locus mutagenizados por clonación posicional o mapeo basado en clonación (http://www.Arabidopsis.org, Lukowitz et al, 2000). Para este estudio en particular, fue elegida por su tamaño pequeño, su ciclo de vida corto y características de auto-reproducción. Además, existen disponibles varios ecotipos y líneas mutantes en los centros de Arabidopsis (ABRC en la Universidad del Estado de Ohio, y el NASC en el Reino Unido). Análisis de mutantes como una herramienta poderosa de genética clásica La genética clásica se basa en la búsqueda de un fenotipo mutante, para la posterior identificación del genotipo responsable, es decir, la constitución genética. De esta manera, se puede estudiar la función de los genes. El análisis de mutantes es una herramienta poderosa que permite identificar genes que controlan el desarrollo o implicados en vías metabólicas. Para ello, primero se 19 mutageniza una población de plantas sobre la que y luego se busca al fenotipo deseado. Las poblaciones pueden mutagenizarse ya sea por medios químicos o físicos. Entre los métodos más utilizados están la mutagénesis química con el mutágeno etil metil sulfonato (EMS), la mutagénesis insercional (utilizando elementos transponibles o T-DNA) y la mutagénesis a través de la pérdida de segmentos de ADN, mediante el bombardeo rápido de neutrones (Bruggemann et al. 1996). Abanderamiento con T-DNA Los elementos de inserción, tales como el T-DNA o transposones, causan pérdida de función de los genes donde se insertan. El abanderamiento de genes se refiere a que un ADN introducido con una secuencia conocida, se inserta dentro de un gen deseado. La inserción de ADN extraño en un gen tanto lo muta, como sirve de vehículo para aislarlo (Feldman, 1991 ). Feldman y Marks (1987) desarrollaron un método de transformación en el cual el T-DNA (ADN de transferencia) de Agrobacterium tumefaciens es utilizado como mutágeno insercional. Más de 13,000 líneas transformantes han sido generadas tratando semillas germinadas con cultivos de A. tumefaciens (Feldmann y Marks, 1987; Feldman, 1991; Forsthoefel, 1992). La representación esquemática de la generación de líneas transformantes se muestra en la Figura 5. Utilizando este sistema, se puede clonar el gen y mapear la locación de la mutación utilizando diferentes estrategias de PCR (Liu et al., 1995). Varios genes han sido aislados y caracterizados a través de este método (Yanofsky et al., 1990). En este trabajo, fue utilizada la colección de mutantes de T-DNA preparada por Feldmann (Feldmann, 1991) para buscar mutantes con respuesta hidrotrópica afectada. 20 Semillas de plántulas silvestres (TO) Generación T1 Ca-cultivo con Agrobacterium Autofecundación Semillas T2 @+™~ Selección Kan A i Plántula T2 Plántulas T3 Autofecundación de heterocigoto KanR Kan 5 Figura 5. Representación esquemática de mutagénesis de semillas de Arabidopsis por infección con Agrobacterium . Adaptado de Feldman y Marks 1987. 21 Mutagénesis química con EMS Una mutación es un evento poco común y la estabilidad de los diferentes genes varía substancialmente (Redei et al., 1984). El etil metil sulfonato (EMS) es un compuesto ampliamente utilizado para mutagenizar semillas, porque es fácil de usar y mucho más efectivo que cualquier otro mutágeno. Ya que por lo general provoca cambios puntuales en las bases del ADN (preferentemente induce la transición de G a A), es más probable encontrar mutaciones ya sea dominantes, recesivas o alelos condicionales. El EMS se cree que causa mutaciones puntuales alcalinizando las posiciones N-7 o la 0-6 de la guanina. El destino de la guanina alcalinizada en la posición N-7 es incierto. Sin embargo, la metilación en la posición 0-6 parece provocar principalmente cambios de GC a AT (Legator y Flamm, 1973). Alelos mutantes de un locus en específico pueden encontrarse con una probabilidad de aproximadamente 1 en 2,000-5,000 plantas M2 (progenie de las semillas mutagenizadas). Las mutaciones puntuales inducidas por EMS pueden tener una gran variedad de efectos en la función del gen, incluyendo su pérdida total, una reducción parcial, una función alterada cualitativamente o una función constitutiva. Esto permite la detección de genes que con muy baja probabilidad serían identificadas con otros mutágenos. 22 J USTIFICACION Con el fin de entender la naturaleza del crecimiento de la raíz, así como sus respuestas trópicas, se necesitan elucidar los mecanismos moleculares que los controlan. Aunque el gravitropismo ha sido estudiado extensivamente en raíces, no se ha puesto mucha atención al hidrotropismo. El hidrotropismo es un fenómeno que al permtir a las plantas protegerse de la sequía, es muy importante para su sobrevivencia. Una de las razones por las cuales no hay interés en estudiar al hidrotropismo, podría ser la dificultad en diseñar un sistema experimental que contenga un gradiente de humedad constante que supere a la fuerza de gravedad. Ya que la gravedad es ubicua (al menos en la tierra), interfiere con otras respuestas trópicas. Sin embargo, estudios con la mutante de chícharo ageotropum indican la posibilidad de separar al hidrotropismo del gravitropismo. Arabidopsis, como planta modelo, no ha sido utilizada para estudiar la respuesta hidrotrópica de raíces. De tal manera, resultó interesante tanto desarrollar un sistema experimental que demostrara la presencia de hidrotropismo en Arabidopsis, como utilizarlo para aislar mutantes afectadas en dicho proceso. 23 HIPOTESIS El presente trabajo forma parte de un proyecto general cuyo principal objetivo es estudiar a los diversos procesos moleculares implicados en la respuesta hidrotrópica en raíces, fue planteado con la idea de que: "si la respuesta hidrotrópica se encuentra bajo un control genético complejo, es plausible encontrar diferentes mutantes afectadas en esta respuesta". OBJETIVOS El objetivo de este trabajo es estudiar los mecanismos genéticos y moleculares implicados en el fenómeno del hidrotropismo en raíces, mediante el aislamiento y caracterización de mutantes no hidrotrópicas. Objetivos particulares 1 . Diseñar y optimizar un sistema de escrutinio para analizar la respuesta hidrotrópica en plantas silvestres de Arabidopsis. 2. Aislar mutantes con fenotipos aberrantes a la respuesta hidrotrópica utilizando el método de escrutinio establecido. 3. Caracterizar genética y fisiológicamente las mutantes hidrotrópicas aisladas. 4. Identificar a los genes afectados en las mutantes descritas. 24 MATERIALES Y METODOS Material vegetal y condiciones de crecimiento Semillas de plantas silvestres de Arabidopsis thaliana (L.) de los ecotipos Columbia (Col-O)y Wassilewskija (Ws), así como las líneas mutantes con T-DNA preparadas por Feldman (Feldman, 1991) fueron obtenidas del ABRC de la Universidad Estatal de Ohio. La población mutagenizada con EMS fue preparada por la Dra. Gladys Cassab empleado 0.3% (v/v) de mutágeno, para embeber semillas por 16 horas. Las líneas mutantes wav2-1 y wav3-1 fueron provistas por el Dr. K. Okada de la Universidad de Kyoto, Japón. En los experimentos donde se requerían condiciones de esterilidad, las semillas fueron esterilizadas con hipoclorito de sodio al 1 .5%, (blanqueador comercial al 30% (v/v), y 1 µL/mL de 20% de Triton-X100 por 7-1 O minutos y enjuagadas con agua estéril de 3 a 4 veces. Las semillas fueron estratificadas a 4ºC en la oscuridad por 3 ó 4 días (para romper la latencia), antes de sembrarlas en cajas con medio de cultivo. Las cajas con el medio de escrutinio y las cajas control (con medio basal) para el ensayo gravitrópico/tigmotrópico, fueron colocadas verticalmente en un cuarto de cultivo con luz blanca fluorescente a un fotoperiodo de 16/8 hrs. luz-oscuridad y temperatura promedio de 24ºC. Las plantas adultas fueron crecidas en suelo tipo Metro-Mix 200 (Hummert lnternation de México S.A. de C. V) en cámara de crecimiento con el mismo régimen de luz y temperatura. Sistema de tamizado El sistema de tamizado consistió en el empleo de cajas de cultivo cuadradas mantenida verticalmente, conteniendo dos tipos de medio de cultivo. Un medio de cultivo normal (MN) en la parte superior de la caja, y un medio de estrés con bajo potencial hídrico (WSM) en la parte inferior. El MN consiste de las 25 sales básicas de Murashige-Skoog (Murashige y Skoog, 1962) suplementado con sacarosa 0.5% (w/v), pH de 5.7 y solidificado con 0.9% Saeto agar (Difco Laboratories, Detroit). El medio es añadido a las cajas empleando un pedazo de plástico (Electrophoresis Gel-bond, Sigma) colocado en la parte media, para evitar que el medio se extienda por toda la caja manteniéndolo en la parte superior. El WSM contiene los mismos componentes del MN, más glicerol al 2.5% (v/v), para disminuir el potencial de agua del medio, y ácido algínico 0.5% (v/v), para permitir su solidificación. El WSM es añadido a la segunda mitad de la caja una vez que el MN está solidificado. Determinación del potencial de agua en el medio de tamizado El potencial de agua del medio de tamizado fue medido con un microvoltímetro por punto de rocío (Wescor lnc., Logan, UTAH, USA). Para ello, pequeños pedazos de agar (de aproximadamente 1-2 mm diámetro), tomados de diferentes zonas de la caja del medio de tamizado fueron evaluados durante 8 días consecutivos. La determinación del potencial de agua se realizó de acuerdo a las instrucciones del microvoltímetro con un método psicométrico combinado. Mapeo genético de la mutación nhr1 El mapeo genético se realizó de acuerdo a Lukowitz (Lukowitz et al., 2000). Las poblaciones de mapeo fueron generadas mediante cruzas de la mutante nhr1 con plantas silvestres del ecotipo Ws. Las plantas de la generación F1 (Col/Ws) fueron sometidas a retro-cruza para generar la población F2 de mapeo. Plantas nhr1 homócigas fueron seleccionadas individualmente del medio de tamizado para obtener ADN de acuerdo a Lukowitz et al. (1996). La posición en un cromosoma fue determinada por mapeo grueso, evaluando en la población F2 la frecuencia de recombinación de marcadores específicos para cada uno de los 5 cromosomas de Arabidopsis. 26 Material de laboratorio La librería genómica clonada en lambda GEMll fue provista por la Dra. María de la Luz Gutiérrez (Instituto de Biotecnología, UNAM). Para el aislamiento de los plásmidos se utilizó el kit Qiagen Plasmid Mini kit (Qiagen lnc., Stanford, Ca). El resto de los reactivos de grado analítico fueron de casa comercial Sigma (St. Louis, Mo) o Baker (Phillipsburg, NJ). Las enzimas de restricción y de modificación fueron adquiridas de Amersham (Buckinghamshire, lnglatera) o de GIBCO BRL (Gaithersburg, MD). Manipulación de ADN Las técnicas de ADN recombinante para la transformación de bacterias y el aislamiento de plásmidos fueron hechos de acuerdo a los procedimientos estándares descritos en Sambrook et al. (Sambrook et al., 1989). Para rastrear el banco genómico de Arabídopsís, se transfirieron las placas del bacteriófago lambda GEMll a una membrana de nylon (Hybond-N de Amersham Life Sciences, Inglaterra) que se trató siguiendo el método convencional para desnaturalizar ADN e hibridar con la sonda marcado radioactivamente con 32P (Sambrook et al., 1989). El ADN de las placas positivas fue purificado de acuerdo al protocolo de Manfioletti y Schneider (Manfioletti y Schneider, 1988). Para el análisis tipo Southern, aproximadamente 4 µg de ADN total fue digerido con enzimas de restricción de acuerdo con las instrucciones de los distribuidores, el cual fue sometido a electroforesis en geles de agarosa y transferido a membranas Hybond-N (Amersham Lite Sciences, Inglaterra). Las membranas fueron hibridadas con sondas marcadas con el sistema multiprimer de marcaje de ADN (Amersham Lite Sciences, Inglaterra). Las membranas fueron prehibridadas, hibridadas y lavadas de acuerdo a Sambrook et al. (1989). Rescate de plásmido El ADN fue aislado de las mutantes hyd6, hyd3 y plantas silvestres crecidas 27 en Metro-mix. El ADN se aisló de la parte aérea de la planta de acuerdo al método de Ausbel et al. (Ausbel et al., 1995). El ADN de la planta que flanquea la inserción de T-DNA de la mutante hyd6 fue rescatado de acuerdo al protocolo descrito por Behringer y Medford (1992). Los diferentes pasos implicados en el rescate del plásmido de la región de T-DNA se resumen en el siguiente diagrama: ADN Total / Digestión completa con enzima San para rescatar el Borde Izquierdo (LB) del T-DNA Digestión completa con enzima EcoRI para rescatar el Borde Derecho (RB) del T-DNA Extracción y purificación de ADN digerido i Ligación con Ligasa T4 i Transformación de células ¡mpetentes Selección primaria de colonias Resistentes a ampicilina (100mg/L) • Selección secundaria de colonias resistentes a kanamicina (25mg/L) Análisis de los plásmidos rescatados Los plásmidos de las colonias aisladas en medio selectivo fueron digeridos con enzimas de restricción San y EcoRI, posteriormente el tamaño de los fragmentos fue analizado en gel de electroforesis (Sambrook et al.1989). Para la 28 secuenciación de ADN del plásmido rescatado se utilizaron los siguientes iniciadores: Iniciador Sal 1, 5' GCA TGA TAT AGA AGA CAG TCA TA 3' Iniciador 827-2, 5, CAG GAT CCA GAT GAA ACA GA 3, Iniciador pt-874, 5' AGA-CCC-TCT-CTT-TGT-ATC-AG 3' Secuenciación de ADN y análisis de los datos La secuenciación de ADN fue realizada en la Unidad de Síntesis del Instituto de Biotecnlogía (UNAM) utilizando el método de terminación con dideoxinucleótidos marcados fluorescentemente en un secuenciador automático. La secuencia de ADN fue analizada utilizando el programa GCG (Genetics Computer Group, Wisconsin) (http://GCG.ceingebi.unam.mx/gcg-bin/seqweb.cgi), y la posición en el mapa genético fue determinada por comparación tipo BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) contra el banco de datos de TAIR (http://www. Arabidopsis.org). Análisis por PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) La mutante hyd6 de inserción por T-DNA, fue cruzada con plántulas silvestres (wt x hyd6) y la población segregante F2 fue analizada individualmente. Mini preparaciones de ADN fueron obtenidas de acuerdo a Lukowitz et al. (1996). Los iniciadores para PCR fueron diseñados en base a la secuencia del plásmido S-27, rescatado de la mutante hyd6. Las reacciones de amplificación de ADN fueron realizadas en volúmenes de 40 µL con condiciones previamente optimizadas. Cada reacción contiene 0.2 mM de cada uno de los deoxiribunocleótidos, 1 O pico moles de cada iniciador, buffer 1 x (200 mM Tris-HCI pH 8.4, 500 mM Kcl,), polimerasa Taq DNA y 50-100 ng de ADN. Para estas reacciones la concentración óptima de MgCl2 fue de 1.5 mM. Las reacciones de PCR se realizaron en un termociclador automático empleando un programa de amplificación con un ciclo de 5 min a 96ºC, 36 ciclos de 94ºC por 1 min, 30 min a 59ºC, 1 min a 72ºC y finalmente un ciclo a 72ºC por 5 min. La enzima Taq 29 polimerasa se añadió 3 min después del inicio del primer ciclo de 96ºC. Los siguientes oligonucleótidos fueron utilizados como iniciadores: Iniciador# DE61-5'-GTACATCAGCCATAGGAAGC-3'y Iniciador # S27-4-5, -TGTCCCAAGTCAAACACACC-3,. Microsocopía Plántulas de Arabidopsis de 5-8 días de edad fueron utilizadas para análisis por microscopía confocal. Las plántulas fueron crecidas en medio del tamizado y en medio control (NM). Las raíces de plantas silvestres Col-O, heterócigas nhr1 y homócigas nhr1, fueron teñidas con ioduro de propidio (1 Oµg/mL) por 1 Omin y analizadas en el microscopio confocal (MRC-600, Bio-Rad Laboratories, Hercules, Ca) o por microscopía óptica utilizando un objetivo 63x C-Apocromático W Korr (AN 1.2 y difracción de agua de 0.25, Zeiss, Jena, Germany). 30 RESULTADOS.PARTEI Diseño del sistema de escrutinio y su caracterización Para el estudio de la respuesta hidrotrópica de las raíces primarias en maíz, trigo y chícharo, se han empleado diferentes sistemas experimentales diseñados por diversos autores (Jaffe et al., 1985; Takahashi y Scott, 1991; Takahashi et al., 1992; Oyanagi et al., 1995). Sin embargo, estos sistemas no son adecuados para la raíz pequeña y delgada de Arabidopsis. Para estudiar esta respuesta en raíces de Arabidopsis se tuvo que diseñar un sistema experimental que nos permitiera, primeramente monitorear su presencia y segundo, realizar escrutinios para el aislamiento de mutantes en esta respuesta. De ahí que el objetivo inicial de este proyecto fue el diseñar un sistema experimental aséptico donde las raíces de Arabidopsis mostraran claramente una respuesta hidrotrópica en respuesta a un gradiente de potencial de agua. El sistema de escrutinio fue diseñado de tal manera que las raíces crecieran gravitrópicamente en un medio de crecimiento basal (MN), que pudiese fácilmente ser contrastado con el crecimiento en un medio con gradiente de potencial de agua que estimulara una curvatura hidrotrópica. El gradiente de potencial de agua fue creado por la presencia de medio estresante (WSM) justo debajo del MN. Para desarrollar el medio estresante en el sistema de escrutinio, inicialmente se evaluó la utilización de diferentes solutos orgánicos de diversos pesos moleculares como sorbitol, manitol o polietilenglicol (PEG), conocidos por su habilidad de disminuir el potencial de agua de las soluciones donde se presentan. El MN al contener las sales MS y sacarosa promueve el crecimiento de las plántulas los primeros días después de su germinación, antes de confrontarse con el déficit hídrico creado en el WSM. Se hicieron varios ensayos de hidrotropismo con diferentes concentraciones de manitol y de sorbitol en el WSM. Como se muestra en la Figura 6 el uso de manitol (o de sorbitol) no pudo generar una respuesta hidrotrópica en la raíz primaria de Arabidopsis, ya que las raíces continuaron su crecimiento vertical dentro del WSM, llegando incluso al fondo de la caja. 31 Figura 6. El efecto del manitol en el sistema de escrutinio. Las raíces de Arabidopsis tha/iana, ecotipos Col-O y Ws, alcanzaron a crecer hasta el medio estresante con15% de manitol (o sorbitol) . En medio de escrutenio con bajas concentraciones de sorbitol/manitol (5 al10%) las raíces crecieron en respuesta al vector de gravedad. o 16 40 64 88 136 184 232 -0.5 ~.._____. -1 -1.5 -2 1 =:= ~~M con mannol 1 S~ -2.5 Figura 7. Cambio de potencial hídrico que occure en dos sitios del medio de escrutinio con 15% de manitol en la parte estresante . Los sitios fueron aproximadamente 15mm arriba y 15mm abajo del unión de de los dos medios. Por otro lado, cuando se utilizó PEG 5-10% (w/v) en el WSM, la germinación y el crecimiento posterior de las plántulas fueron retardados, pero no se presentó una respuesta hidrotrópica clara. Mientras que concentraciones de PEG más elevadas (15-20%) no permitieron que el medio solidificara. Estos datos sugieren que las plántulas de Arabidopsis son aparentemente tolerantes a las concentraciones de manitol y sorbitol ensayadas, los cuales son capaces de inducir estrés osmótico en otras especies vegetales (Turgeon R, 1989, Joshee et al. 1998). De ahí que se sugiere que plántulas de Arabidopsis pudieran metabolizar a estos osmolitos y utilizarlos como fuente de carbono. Debido a las propiedades iónicas e higroscópicas de solutos inorgánicos tales como NaCI, CaCl2 y K2C03 , ellos no fueron contemplados en este estudio 32 para generar déficit hídrico en el medio WSM. De tal manera, solamente solutos orgánicos inertes fueron utilizados en el WSM. El glicerol comúnmente se emplea en estudios farmacéuticos para retener el contenido de humedad, así se decidió probar las concentraciones de glicerol 2 a 10% (v/v) en el medio de escrutinio. Debido a que el WSM con glicerol no solidificó apropiadamente, se le añadió ácido algínico (0.5% w/v) para promover la gelificación del agar en presencia de glicerol. Como se muestra en la Figura 8, las raíces de Arabidopsis desarrollan una curvatura hidrotrópica clara después de 8 días en el medio de escrutinio con 2.5% de glicerol y ácido algínico. + g Figura 8. Effecto de glicerol al 2.5% (v/v) en el medio estresante. Las raíces de plántulas silvestres de Arabidopsis thaliana (Col-O) presentaron curvatura hidrotrópica en este medio. Las flechas indican las cuvaturas formadas en las raíces a los 7 días después de germinación. La flecha grande indica el vector de gravedad (g). En este sistema, las raíces mantienen su crecimiento en el MN y no dirigen su crecimiento en dirección del vector de la gravedad. Esto indica que el potencial de agua generado con el glicerol es un estímulo suficiente para disparar la respuesta hidrotrópica en raíces de Arabidopsis thaliana (Col-O). 33 Las raíces perciben un umbral de gradiente de potencial hídrico La respuesta no hidrotrópica de las raíces silvestres de Arabidopsis en el medio de escrutinio con glicerol fue evidente en comparación con el efecto de otros agentes estresantes. Sin embargo, aunque las raíces de Arabidopsis no presentaron una respuesta hidrotrópica en los ensayos con manito! y sorbitol a diferentes concentraciones, las plántulas sí mostraron algunos síntomas de estrés osmótico. Se ha reportado en estudios de hidrotropismo con la mutante de chícharo ageotropum, que la raíz de esta mutante responde hidrotrópicamente a un gradiente de potencial hídrico tan pequeño como de 0.5MPa (Takano et al., 1995). Por lo tanto, resultó interesante analizar el potencial hídrico del medio de tamizado con diferentes agentes estresantes. Con los fines de determinar el gradiente que provocó la respuesta trópica en raíces y el sitio de siembra de las semillas de Arabidopsis en el medio de escrutinio, se diseñó un experimento en el cual las semillas fueron sembradas en una manera diagonal, como se observa en la Figura 9A. La respuesta hidrotrópica se observó en las raíces de plántulas cuyas semillas fueron colocadas 1.3 cm arriba de la unión de los dos medios, MN y WSM. El gradiente se determinó por la variación de los valores del potencial hídrico en los medios de tamizado en días consecutivos después su preparación. La medición se realizó en trocitos de medio sólido tomado de diferentes sitios de la caja (Fig.9A. a,b,c,d y e). La medición se basa en el principio de densidad de vapor que se genera en una pequeña cámara con volumen de aire fijo , en la cual se coloca el trozo de agar que va a ser medido. El potencial hídrico del aire se equilibra con el potencial hídrico del trozo de agar, el cual se considera que no cambia significativamente en el proceso de medición (Salisburry y Ross 1992). El potencial hídrico del aire cerrado se determina entonces por medición de densidad del vapor (humedad) a la temperatura conocida. Este método fue diseñado por la compañía Wescor, lnc. Logan, UTAH, USA. 34 l-0.2 :¡ -0.4 -e: s &. -0.6 ... u ; .o.a s ~ -1.0 ! ~ e A o 2 " 6 Time (days) • • • b T e • d • • a R Figura 9. Determinación del gradiente de potencial hídrico generado en el medio de tamizado. En el diagrama (A) el sitio ··a .. , es el sitio donde los dos medios se unen ; ··b·· es el sitio en donde la raíz presenta la curvatura ; .. c .. es un sitio arriba de la siembra, .. d.·es el sitio abajo del union de los medios, y ··e·· es un sitio más abajo del medio estresante. En la gráfica (B) muestra el cambio de potencial hídrico en megapascales (Mpa) contra tiempo (en días) . Las mediciones se hicieron desde el primer día de preparación del medio. Los valores de potencial hídrico indican que la presencia del medio estresante provocó un gradiente de potencial hídrico en el MN del sistema de tamizado (Fig.98). Se considera que este gradiente fue generado por la difusión del glicerol hacia el MN. El MN tuvo un potencial hídrico de - 0.42 a -0.33 MPa. El potencial hídrico del WSM fue de -0.86 a -0.93 MPa. En la parte donde los dos medios esta en contacto (sitio 'a'), el potencial hídrico llegó al equilibrio en 48hrs. En el sitio 'b' (se considera la parte 7-14 mm arriba del sitio 'a') el cambio ocurre a los 3-4 días de la preparación del sistema de tamizado. En la parte arriba del sitio 'a' hacía el sitio 'b' las mediciones del potencial hídrico indicaron valores muy parecidos al sitio 'a', probablemente las diferencias en sus potencial hídricos son mínimas, que con el microvoltimetro no se logró a detectar. Sin embargo, es donde ocurre la curvatura hidrotrópica de las raíces de Arabidopsis. Para comparación, también se determinó el cambio de potencial hídrico que se generaba en el medio de escrutinio con 15% (w/v) de manitol. El potencial hídrico se midió en dos sitios de este medio (Fig.7) y se presentaron cambios de 35 potencial hídrico después del primer día de preparación. Aunque se generó un gradiente, éste no alcanzó a inducir una respuesta trópica en las raíces. Posiblemente el gradiente que se generó por la difusión de manito! en el medio fue más rápido que la velocidad de crecimiento de la raíz y impidiendo que la raíz lograrse percibirlo. Se ha demostrado también que la raíz de Arabidopsis puede crecer en bajas concentraciones de sorbitol y manito! (To et al 2002). Por el contrario, en el sistema de escrutinio con glicerol (que de aquí en adelante se llamara "medio de tamizado"), la raíz de Arabidopsis percibe el umbral del gradiente de potencial hídrico que provoca esta repuesta hidrotrópica. Identificación de las mutantes con respuesta hidrotrópica alterada Para entender los diferentes mecanismos involucrados en el hidrotropismo, desde el punto de vista molecular, se necesita aislar plántulas mutantes con fenotipos alterados en este proceso. Figura 1 O. Proceso de tamizado. Las plantulas mutantes perdieron la capacidad de responder al gradiente de potencial hídrico. Las raíces de dichas mutantes siguieron creciendo en el medio sin presentar curvatura hidrotrópica, como lo indica la flecha. Dado que la curvatura que presenta la raíz de Arabidopsis fue provocado por un gradiente de potencial hídrico y que ninguna raíz de plántulas silvestres probadas hasta la fecha alcanza a llegar la frontera del medio estresante, esta respuesta se consideró como una respuesta genuina de la planta de Arabidopsis thaliana(Col-0, Ws y Ler). Por lo tanto, se utilizó este sistema hidrotrópico como sistema de tamizado para identificar mutantes cuyas raíces no presentan curvatura trópica al gradiente de potencial hídrico, es decir, sigan creciendo 36 gravitropicamente en el medio de tamizado (Fig.1 O). Para el escrutinio, se decidió utilizar dos poblaciones diferentes de plantas mutagenizadas. Una de ellas generadas por el método de "T-DNA tagging" (o marcaje por T-DNA), el cual facilita el aislamiento del gen afectado en la mutante. La otra, por mutagénesis química con EMS, que es el método químico más utilizado para mutagenizar a Arabidopsis. El análisis de los dos tipos de poblaciones nos permitiría enriquecer la frecuencia de mutantes con pérdida de función , con la condición de utilizar una población M2 lo suficientemente grande. Identificación de dos mutantes putativas, hyd3 y hyd6, generadas por inserción de T-DNA Las líneas transformadas por la inserción de T-DNA en Arabidopsis (Feldmann, 1987 y 1991) fueron generadas en el ecotipo Ws. Por lo tanto, se determinó el sitio de siembra en el sistema de tamizado (MN) con las semillas de plántula silvestre Ws, sembrándolas en la manera diagonal (Fig. 11 ). Se observó que las plántulas sembradas 20 mm arriba del sito "a" (donde se unen los dos medios) presentaron la curvatura hidrotrópica. Bajo ese criterio, se realizó el tamizado simultáneo de 49 grupos de 100 líneas transformadas que se obtuvo del Centro de Distribución de Ohio (ABRC, Ohio). 37 Figura 11. Optimización del sistema de escrutenio para plántulas silvestres Ws . Las semillas se sembraron en una línea diagonal en la parte MN. La flecha indica la posición donde la raíz presentó la curvatura. La distancia entre la unión de los medios y sitio de siembra fue 20-21 mm. De las 13 mutantes que se aislaron en este tamizado, sólo dos líneas, denominadas hyd3 y hyd6 (por hydrotropism), mantuvieron el fenotipo no hidrotrópico en la siguiente generación (Fig.12 y Fig.13). Por el marcador de resistencia a kanamicina (NPTll) que lleva el T-DNA, ambas líneas presentaron resistencia a éste antibiótico. Para verificar la inserción, se realizó el análisis de hibridación tipo Southern blot con dos sondas del T-DNA, borde derecho (RB) y borde izquierdo (LB) , sobre ambas mutantes. Como se observa en la Figura 14, la mutante hyd6 dió una sola señal de hibridación en cada carril, indicando que existe una sola inserción del T-DNA, la cual podría estar causando el fenotipo mutante. Por lo tanto, se decidió clonar la secuencia genómica adyacente al T- ONA de la mutante hyd6 para su posterior caracterización. Por su parte, el análisis de hibridación con la sonda RB y LB en la mutante hyd3 dio más de una señal , sugiriendo que existe más de una inserción de T-DNA en esta mutante (Fig.14). 38 Figura 12. Fenotipo de la mutante hyd3 a los 10días en el medio de tamizado. Como comparación se muestra el crecimiento de plántulas silvestres. Figura 13. Fenotipo de la mutante hyd6 a los 10 días en el medio de tamizado. Para establecer la independencia alélica de las mutantes hyd3 y hyd6 se realizó un experimento de complementación por cruzas recíprocas entre ambas. De un total de 93 plántulas F1 analizadas en medio de selección, no se presentaron plántulas con fenotipo mutante, resultado que claramente indicó que las dos mutantes no son alélicas. 2 2 a a a S E E z Alíci nao nena zan las Figura 14. Análisis 2722723337 2333 tipo Southern blot de (o ph RE se E £ las mutantes hyd6 y A ,. | hya3. ELADN se >94 == Ledo Sd » mon P digirió con las — A o á 5% e e» enzimas Hindlll (H), 4.3 EcoRlI (E) y Sal (S). MS IAS lr als ADN sin digerir (SIN DIG) se utilizó como control. as ula aa 1 39 A!!:-' - ~ l f{~- --- .. ·- ... - .-· . ~, .·'• º.>'· • t -·------- - \ -~- -~-·~ -· ' -:: i ura 2. enotipo e l utante d3 l Odias l ed io e t izado. o o paración uestra l i iento e l t l s il stres. i ura 3. notipo e utante d6 O í s l edio e t i ado. ara t bl cer n ndencia l li utantes y d6 li eri ento plementación r as as tre bas. e tal l tul s ali as edio e l cción , ntaron l t l s n oti o utante, l o e ente i e s utantes n l li s. kb r.:i r.:i r.:i Q Q Q z z ~ :e i ra 4. nálisis (1) e;; :e ¡.¡ (1) e;; :e ¡.¡ (1) (1) ¡.¡ (1) .., .., "" "" "" "" .., "" .., .., .., "" "" i outhern blot ..., ..., ..., ..., ..., ..., ..., ..., ..., ..., ..., ..., >. >. >. >. >. >. ..., .::: .e -= >. >. >. >. >. >. >. utantes d6 -= -= kb kb yd3. l N - >9.4 i iri n - >9.4 6. 2 zi as ind ll ) , - >9.4 .3 coRI ) n ) . - 2.9 3.5 ... N i i erir I -3.0 I ) tili o ntrol. ..... ... La mutación hyd6 se localizó en el cromosoma 1 La secuencia genómica flanqueando el T-DNA en hyd6 fue aislada por el método de rescate de plásmido descrito por Behringer y Medford (Behringer y Medford, 1992), rescatándose un fragmento genómico de alrededor de 1.5kb adyacente al borde izquierdo del T-DNA. s 1 E s 1 1 pBR 322 Tn 5 pBR 322 RB 2.9 kb 3.7 kb 1.9 kb 1.6 kb 4.3 kb 2.2 kb Figura 15. Estructura del T-DNA que se insertó en las mutantes hyd6 y hyd3. Tiene dos cassettes de pBR322 flanqueado por borde izquierdo (LB) y borde derecho (RB). Los sitios de restricción están anotado como S (San) , E (EcoRI), H (Hinalll) . E En la Figura 15, se muestra un mapa del T-DNA con el que fueron transformadas las líneas mutantes hyd3 y hyd6. El mapa de la región genómica aislada de la mutante hyd6 se muestra en la Figura 19. Los resultados de comparación de la secuencia genómica aislada con la base de datos de Arabidopsis (TAIR}, indicaron que dicha secuencia se localiza en el cromosoma 1 correspondiendo a un gen hipotético implicado en resistencia a patógenos (At1 g61190) interrumpido por el borde izquierdo del T-DNA. Para clonar la secuencia genómica completa adyacente al T-DNA, se realizó el tamizado de una librería genómica de Arabidopsis clonada en fago Lambda GEM-11 , del que después de un tercer tamizado se obtuvieron cinco clonas positivas (Fig. 16). 40 Figura 16. Tamizado de biblioteca genómica de Arabidopsis thaliana. Finalmente se rescataron cinco clonas independiente que contienen la secuencia completa del gen idenificado en la mutante hyd6. El gen hipotético At1g61190 tiene similitud con el gen RPS2 AG1l (Arabidopsis Genome Initiative) es una colaboración internacional que secuenció el genoma completa de Arabidopsis thaliana (Col-0). La secuenciación empezó en 1996, con el propósito de secuenciar el genoma completo de Arabidopsis y anotar todos los posibles genes en ésta especie [The Arabidopsis Genome Initiative 2000 Nature, 408:796-815]. Se anotaron aproximadamente 26,620 genes con marco de lectura abierta a todo el largo de los 5 cromosomas de Arabidopsis. El análisis de la secuencia aislada de la mutante hyd6 mostró 99% de identidad con una secuencia depositada en el banco de datos de Arabidopsis (en el BAC F11P17). La inserción de T-DNA fue identificada en la región 3” de un supuesto gen con anotación: "similar a RPS2" (At1g61190). RPS2 es un gen de Arabidopsis implicado en resistencia contra la bacteria Psuedomonas syringae, la cual expresa el gen de virulencia avrApt2 (Bent et al., 1994; Caicedo et al., 1999). La secuencia de aminoácidos deducida del gen RPS2 consta de varios motivos funcionales representados en la figura 17. 41 • • ,t. . ... . .. . . . • ~ ' . 1. • . • f': ••• i ura 6. izado e i l ca ómica e r bidopsis li na . i l ente t ron i o l as n endiente e nti en cuencia pleta el n if o utante yd6. l n i otéti o t g6 190 e i ilit d n l n S2 GI i opsis enome l i t ) s a l oración ci nal e uenció l a pleta e r bidopsis l a ol-O). uenciación pezó 96, n l r pósito e cuenciar l a pleto e r bi opsis otar s sibl s nes sta pecie e r bidopsis enome l i t 00 ature, 8:796-815]. e otaron r amente , 20 nes n arco t ra i rta o l o s as r bidopsis. l álisis uencia i l a utante d6 ostró ti d n a uencia posit da l nco t s e r bi opsis l C 1P17). n r i n e A d ti c a i n ' uesto n n otación: i ilar PS2" t 190). S2 s n r bi opsis pli do i t cia ntra cteria onas ri ae, al presa l n i l cia rRpt2 ent t l. , 94; ai do t l., 9). uencia inoácidos ducida el n S2 nsta ri s oti os i ales nt dos g r 7. INBS I 11111111111111 LRR Figura 17. Motivos funcionales que se encuentra en la proteína predicha del gen RPS2 de Arabidopsis, LZ: cierre de Leucina, NBS: sitio de unión al nucleótido, HP: región hidrofóbica, LRR : repeticiones de región ricas en Leucina. Se considera que los motivos LZ y LAR median la interacción proteína-proteína y que la HP podría representar una región intermembranal. Adaptado de Caicedo et al., 1999. Análisis genético y molecular de la mutante hyd6 por PCR En la población de la generación T5 de hyd6, aproximadamente 60% de plántulas presentaron el fenotipo mutante. Sin embargo, todas estas plántulas fueron resistentes al antibiótico kanamicina, que como marcador de resistencia se considera un gen dominante. Por lo tanto, con el objetivo de verificar la inserción de T-DNA en las plántulas con el fenotipo mutante, se hizo un análisis profundo de ca-segregación del fenotipo hyd6 y la resistencia al antibiótico. Dicho análisis se realizó sobre la generación F2 en la que debe manifestarse la segregación de las características independientes. Para obtener la generación F2 se hizo una retrocruza (hyd6 X wt), cuya progenie (F1) se autofecundó para recuperar la progenie F2 experimental (Fig. 18). 42 1 T.B Análisis de Ce-segregación Mutante hvd6 X Silvestre Ws Generación F1 X F1 Plántulas F2 l F3 X F2 Análisis por PCR Siembra de semillas en medio de tamizado, transferencia a medio select ivo (kanamicina). Rescate de individuos para análisis y colecta de semillas Figura 18. Esquema del análisis de ca-segregación realizado sobre plántulas F2 con fenotipo hyd6 y resistentes al antibiótico. E 1 --. R 800 pb H !-1 ADN de la planta s 1 Figura 19. Mapa de restricción del plásmido pS-27 y posición de los olígos diseñados para emplearse como iniciadores en reacciones de PCR.La secuencia de cada uno de los iniciadores es: R: 5'-GTACATCAGCCATAGGAAGC-3' F: 5 '-TGTCCCAAGTCAAACACACC-3' 43 Para el análisis se diseñaron olígonucleótidos específicos para el gen interrumpido por el T-DNA de la mutante hyd6 (Fig. 19). En la mutante hyd6 se amplificó un fragmento de 805 pares de bases (pb), que como era esperarse, no se detecto en plántulas tipo silvestre. Este mismo juego de iniciadores se utilizó para analizar la progenie F2. Los porcentajes de segregación de 240 plántulas F2 analizadas con respecto de fenotipo mutante y la resistencia al antibiótico se presentan en la Tabla 1 . Tabla 1. Porcentajes de segregación hyd6 vs kanR 124 (51.6%) hyd6 KanR 25 (10.4%) hyd6 Kan5 10 (4%) wt Kan5 81 (33.7%) Curiosamente diez plántulas mutantes no fueron resistentes a kanamicina. Esta observación hizo sospechar la directa asociación del fenotipo hyd6 con la inserción de T-DNA. Por lo tanto, se decidió analizar por PCR la inserción de T- ONA en las cuatro clases de plántulas de la generación F2. 44 Figura 20. Análisis de co- segregación hyd6/kanR en la progenie F2. Fotografía negativa del gel de agarosa (1 %) con algunas de las muestras de productos generados por PCR. Los símbolos indican : M, Marcador de peso molecular ; hyd6, ADN de la mutante hyd6; Wt, ADN de Silvestre ; pS-27 , plásmido rescatado de la mutante hyd6. Los números representan el código de cada plántula F2. En el análisis de PCR se incluyeron 160 plántulas F2 (de los 240 mencionadas), un gel representativo de este análisis se muestra en la Figura 20. Los porcentajes de los fenotipos y amplificación del fragmento de 805pb de los 4 fenotipos analizados se muestran en la Tabla 2. 45 Tabla 2. Porcentajes de los fenotipos y análisis de ca-segregación por PCR de las plántulas F2 WT Fenotipo Kan R Plántulas analizadas 89 Porcentaje de fenótipo 56% WT Kan8 45 28% hyd6 KanR 21 13% hyd6 Kan8 5 3% -·-·-·············-·-······--···-··-······-·---·-···-···-······-········--···-····--··-·--··············- ............................................................ -········-------···-······-·--- porcentaje de amplificación del fragmento 87.6% 44.4% 100% 60% de 805pb por PCR Total de plántulas 160 100% 76.2% Como se observa en la Tabla 2, el porcentaje de amplificación del fragmento fue de 76.2%, lo que indica que la inserción de T-DNA fue única en este sitio. Sin embargo, dos plántulas con fenotipo mutante que fueron sensibles al antibiótico no amplificaron la secuencia de 805 pb. Esto podría haber ocurrido, también, por re-arreglos cromosomales. Para verificar la inserción de T-DNA en el gen At1g61190 de estas dos mutantes, se necesita hacer mayores estudios con iniciadores más internos del T-DNA. Excepto las 21 plántulas con fenotipo mutante y resistencia al antibiótico, los 3 grupos restantes no mostraron concordancia con los resultados de PCR. Por ejemplo, 20 plántulas con fenotipo silvestre y sensible al antibiótico amplificaron el fragmento de PCR. Dada esta ambigüedad de resultados, se decidió analizar el fenotipo de la progenie F3 para intentar confirmar el genotipo de la generación F2. 46 El porcentaje del fenotipo no hidrotrópico de la mutante hyd6 disminuyó en la generación F3 Con el objetivo de determinar el genotipo de plántulas F2 con fenotipo mutante, se analizó su progenie (F3) en medio selectivo. De un total de 39 plántulas de la generación F2 que produjeron semillas, se hizo el análisis de fenotipo en la generación F3. Los números de plántulas de cada grupo fenotípico que fueron analizadas en esta generación se muestran en la Tabla 3. Tabla 3. Análisis de fenotipo en la generación F3 Total de F3 analizadas hyd6/KanR hyd6/Kan8 wt/KanR 10 4 16 wt/Kan8 9 Lo esperado era que todas las plántulas F2 con fenotipo mutante diera su progenie (F3) mutantes. Contrariamente de lo esperado, las 14 plántulas hyd6 analizadas, solamente 9 presentaron fenotipo mutante en su generación F3. La amplificación de PCR en F2 y el porcentaje de fenotipo en su generación F3 se resumen en la Tabla 4. 47 Tabla 4. Amplificación de PCR y análisis de fenotipo en F3 ílR ,S WT. .R WT/Kan8 Planta PCR % de Planta PCR % de Planta PCR % de Planta PCR % de F2 fenotipo F2 fenotipo F2 fenotipo F2 fenotipo mutante mutante mutante mutante en F3 en F3 en F3 en F3 #70 + 9 #68 + 4 #60 - 8 #63 - 9 #72 + 2 #87 + 10 #61 - 11 #65 + 44 #88 + 3 #155 + 10 #62 - 18 #79 + 38 #89 + 2 #176 - o #74 + 9 #81 + 2 #90 + o #75 - 10 #82 - o #100 + o #76 + 21 #86 + 9 #102 + 4 #105 + o #122 - o #119 + o #110 - o #130 - o #174 + 2 #112 + o #131 - o #175 + o #113 + 13 #114 + 16 #115 + o #118 + o #124 + o #135 + 11 #193 + 21 Nota: El número indica el código de individuo F2. En la columna de PCR '"+·· indica que hubo amplificación del fragmento y .. _ .. indica no amplificación . Como se observa en la Tabla 4, los cuatro grupos fenotípicos identificados en la progenie F2 presentaron descendencia con fenotipo mutante en la F3. Los individuos que produjeron mayor porcentaje de progenie con fenotipo mutante en la F3 fueron #65 y #79, los cuales fueron sensibles al antibiótico en la generación F2. En general , el porcentaje de fenotipo mutante disminuyó en la F3 incluyendo la 48 línea mutante aparentemente "homócigotica··. En un análisis la progenie de hyd6 en la generación T6 generada por autofecundación, también mostró una disminución de hasta 54% del fenotipo mutante. Los resultados indican una reproducibilidad baja del fenotipo mutante en generaciones subsecuentes quizás debido a que el fenotipo no hydrotrópico no es estable en la mutante hyd6 y/o no está ligado con la inserción de T-DNA. Considerando que la característica de resistencia a kanamicina, no fue posible de asociar inequívocamente al fenotipo/genotipo mutante y la poca reproducibilidad en los experimentos de selección del fenotipo hyd6, se decidió redirigir el proyecto hacia el análisis de una línea mutante generada por EMS. La caracterización de esta mutante se describirá y discutirá en el siguiente apartado. DISCUSION. PARTE 1 Contrario de los transposones, la ventaja de usar T-DNA como ··mutágeno·· es que el T-DNA no se transpone después de integrarse al genoma y por lo tanto se considera que es estable a través de múltiples generaciones. Dado que generalmente una inserción de T-DNA ocurre en el orden de 5 a 25 kb de longitud, generalmente se asume que cada inserción produce interrupción del funcionamiento de un gen en Arabidopsis, cuyos genes tienen pequeños intrones y por la presencia de poco ADN intragénico. Las mutantes de T-DNA generadas por infección de semillas de Arabidopsis con Agrobacterium tumefaciens (Feldmann y Marks, 1987; Feldmann 1991 ), ha facilitado identificar genes que participan en el desarrollo y la fisiología de la planta (Koncz et al. 1990; Yanofsky et al. 1990; Finkelstein 1994; Simmons et al. 1995a, Ferrari et al. 2000). Con el propósito de aislar mutantes en la respuesta hidrotrópica, se realizó el tamizado de aproximadamente 30,000 semillas de la colección Feldmann- DuPont de Arabidopsis thaliana en fondo genético Ws (ABRC). De este escrutinio se seleccionaron dos mutantes, hyd6 y hyd3, las cuales no presentaron curvatura hidrotrópica en medio de tamizado y fueron resistentes a kanamicina. Es importante mencionar que estas mutantes mostraron penetrancia menor al 100% 49 de la mutación en la generación T5, aunque ambas fueron resistentes al antibiótico. Estas mutantes presentaron el fenotipo no-hidrotrópico aproximadamente en el 60 % de su población. Los datos sugirieron que la presencia del fenotipo mutante estaba asociada a la resistencia a kanamicina y que la inserción del T-DNA estaba afectado en un gen involucrado en la respuesta hidrotrópica. El análisis tipo Southern blot indicó que hyd6 podría tener una sola inserción de T-DNA y por lo tanto, se realizó el rescate de ADN adyacente al sitio de inserción. Por su parte hyd3 probablemente presenta más de una inserción de T-DNA y por esta razón no se continuó con su análisis. El análisis tipo Southern de la mutante hyd3 con sondas de los bordes del T-DNA indicó dos posibilidades: dos inserciones en tandem o dos inserciones en sitios diferentes, que por digestión generan fragmentos de tamaños muy similares. Posteriormente, la cruza que se realizó para verificar alelismo entre hyd6 y hyd3 demostró que ambas mutaciones son independientes. Este resultado sugiere que existen varios genes que controlan la vía de percepción y/o señalización del hidrotropismo. El rescate de la secuencia adyacente al sitio de inserción en la mutante hyd6 indicó que el T-DNA interrumpió el marco de lectura abierta del gen hipotético At1g61190, cuya proteína (predicha) tiene similitud con el gen RPS2 de Arabidopsis. Se han identificado 33 genes con características similares de resistencia a patógenos en el genoma de Arabidopsis (Staskawicz et al., 1995). Entre estos, 24 genes son idénticos con anotación de similar a RPS2 (TAIR). La proteína RPS2 tiene en su carboxilo terminal repeticiones ricas en leucina (LRR), y también contiene un sitio de unión a nucleótido (NBS). El LRR es un motivo en proteínas vegetales y animales que se ha involucrado en la interacción proteína- proteína. Se ha observado que éste motivo de 20 a 29 residuos de secuencias se presenta en proteínas de funciones diversas tales como interacción de hormona-receptor, inhibición de enzimas, adhesión de células y en tráfico celular (Caicedo et al., 1999). Dado que el gen At1g61190 está interrumpido en la mutante hyd6 cerca de su región 3 ' , la inserción podría resultar en un mensajero/proteína incompleto(a) e infuncional que estaría afectando en la respuesta hidrotrópica. 50 Recientemente existen reportes acerca de la participación de especies reactivas de oxígeno (ROS) en la respuesta gravitrópica (Joo et al. 2001 ), y ya que tanto la respuesta gravitrópica como hidrotrópica aparentemente utilizan vías de señalización tardías similares (Takahashi, 1997), suponemos que ROS también participan en el hidrotropismo. Consequentemente, el gen At1g61190 podría participar en la activación de ROS durante la respuesta hidrotrópica. Por otro lado, esto sugiere que la respuesta hidrotrópica podría ser regulada por genes con funciones redundantes. El resultado de amplificación de PCR de la generación F2 de la mutante hyd6, indicó que tres cuartas partes de la población (122/160) tuvieron el sitio de la inserción. De acuerdo a la proporción Mendeliana monogénica, este resultado sugiere que la inserción de T-DNA es única. Sin embargo, todas las plántulas hyd6/kanR F2 amplificaron al fragmento, indicando que el fenotipo aparentemente está ligado con la inserción de T-DNA La diferencia en la respuesta hidrotrópica entre dos ecotipos de Arabidopsis thaliana (Col-O y Ws) en el medio de tamizado, estimada por la distancia de siembra para inducirla, es notable. De ahí que otra posible razón de la baja reproducibilidad del fenotipo mutante en la generación T5 y en generaciones subsecuentes, puede ser por que la especificidad de detectar el gradiente de potencial hídrico de cada planta depende de otros factores ambientales y/o genéticos. 51 PERSPECTIVAS. PARTE 1 1) Verificar el sitio de inserción del T-DNA en la mutante hyd6 utilizando otro juego de iniciadores como podría ser algunos dirigidos al extremo derecho (RB) y verificar por PCR a los individuos que no amplificaron el fragmentp de 805 pb, pero si mostraron el fenotipo mutante. 2) Verificar el fenotipo de hyd6 con herramientas de genética reversa sobre el fondo genetico Col-O; o sobre mutantes de la colección SALK en el gen At1 g61190 de Arabidopsis thaliana. (http://www.Arabidopsis.orglabrcltdnaecke r. htm 1). 3) Limpiar la mutante hyd3 por retro-cruzas sucesivas, hasta generar una línea con una sola inserción de T-DNA asociada a la respuesta hidrotrópica. 52 RESULTADOS. PARTE 11 Identificación de la mutante nhr1 ( no-hydrotropic root mutant 1) Para aislar mutantes no hidrotrópicas se utilizó una colección de 8 lotes de semillas de generación M2, la cual fue generada en ecotipo Col-O por mutagénesis con EMS. Aproximadamente 26,400 plántulas M2 fueron analizadas en medio de selección en un primer tamizado. Se seleccionaron plántulas mutantes con fenotipo no hidrotrópico en las raíces, las cuales resistieron el gradiente de potencial hídrico y siguieron creciendo hacia abajo sin presentar la respuesta trópica. Diez candidatas fueron seleccionadas después del primer tamizado. El fenotipo de una línea mutante se confirmó en tres generaciones consecutivas. Esta mutante se denominó nhr1 (no !J.ydrotropic root). Debido a su baja tasa de germinación y baja reproducibilidad del fenotipo en las siguientes generaciones, no se analizaron los candidatos restantes. La caracterización genética de nhr1 reveló que el fenotipo mutante se segregó en la proporción 1: 2: 1 para plántulas silvestre: plántulas mutantes no-hidrotrópicas: plántulas con raíz chicas respectivamente (Fig. 21 ). Esta proporción monogénica indicó que las plántulas con fenotipo no-hidrotrópico son heterócigas (nhr11+) para la mutación nhr1 , mientras que las plántulas con raíz chica son homócigas (nhr1/nhr1). Las plántulas con raíz chica no forman una roseta normal, ni llegan al estado adulto, por lo tanto fueron letales (Fig. 22) 53 54 Figura 21. Fenotipo de la mutante nhr1 en medio de tamizado (A) y en el medio normal (B) a los 1 O días. En medio de tamizado, las raíces de nhr11+ pasaron la frontera entre medio normal (NM) y medio estresante (WSM). Mientras las raíces de plántulas silvestres detuvieron su crecimiento y algunas presentaron curvatura hidrotrópica. Las plántulas con asteriscos (*) representan nhr1 homocigotas. En B, plántulas de 7 días fueron seleccionadas del medio de tamizado y transferidas al MN. Barra= 5 mm. Figura 22. Fenotipo de la mutante nhr1 homocigótica de 8 semanas de edad . Algunas plántulas desarrollaron raíces adventicias y llegaron a formar hojas , sin embargo, ninguna produjo inflorescencia. Barra = 2 mm. La raíz de nhr11+ en el sistema con gradiente de humedad en el aire O hr 48 hrs B Figura 23. Sistema con gradiente de humedad en el aire. El sistema se diseño en una caja de cultivo con fuente de agua y solución de CaCl2 (A) . Las raíces de plántulas silvestre de Arabidopsis presentaron respuesta hidrotrópica (B) en este sistema. Para reconfirmar la respuesta no-hidrotrópica de la raíz de nhr1 !+ manifestado en el medio de selección, se diseñó otro sistema con gradiente de humedad generado en el aire. En este sistema, las raíces de plántulas silvestres mostraron la respuesta hidrotrópica (Fig. 238). El gradiente de humedad se generó colocando una fuente de agua (esponja vegetal húmeda, oasis) en la parte superior y una solución saturada de cloruro de calcio (CaCl2) en la parte inferior de una caja de cultivo cuadrada (Fig. 23A). Debido a la propiedad higroscópica del CaCl2, éste generó en su entorno un potencial hídrico mucho menor al presente en la cercanía del oasis. Las plántulas se colocaron sobre MN, horizontalmente con respecto al oasis y la solución de CaCl2, de tal manera que de 2 a 3 mm de la punta de la raíz crecen en el aire enfrentando el gradiente de humedad. En este sistema, las raíces de plántulas silvestres manifestaron la respuesta hidrotrópica positiva que supera la respuesta gravitrópica a las 6 horas después del inicio del experimento (Fig. 24). 55 gradiente WT 1 3 e rn] | , +/ nhri AA e WT sin gradiente +! nhrl * a las 24hrs Figura 24. Respuesta hidrotrópica de las raices de plántula silvestre y la mutante nhr1/+ en el sistema con gradiente de humedad en el aire. En este sistema, las raíces respondieron libremente a los estímulos de gravedad y humedad sin estar en contacto con el sustrato. Las plántulas fueron colocadas horizontalmente en un porta-objeto con MN. Las imágenes del lado izquierdo representan tiempo cero, las de la derecha 6 y 24 horas (*) después del inicio del experimento. Las raíces que estan en las primeras dos filas (1y 2) fueron sometidas al gradiente de humedad generado por la solución saturada de CaCl, (abajo) y agua (arriba), (Fig. 23A). Las imágenes que están en la tercera y cuarta filas son del experrimento control donde se utilizó agua en lugar de solución de CaCl,. Sin embargo, las raíces de plántulas mutantes nhr1/+ no reconocieron la dirección del mayor potencial hídrico y a las 24 horas se observó que la dirección del crecimiento de éstas desarrollaba ganchos o asas en la punta; ya que sus raíces perdieron la dirección de gravedad y humedad en este sistema (Fig. 24). A las 48 horas, la raíz de la mutante regresó al agar donde estaba colocada la plántula. Por otro lado, en el sistema control, donde se utilizó agua arriba y abajo, se observó un efecto aditivo en las respuestas hidro- y gravitrópicas en la raíz de plántulas silvestre (Fig. 24). Sin embargo, raíces mutantes nhr1/+ respondieron mucho más rápido al vector de gravedad y también regresaron al agar. Estos 56 Ohr 6 hr ~ ~ T r- . ¡ . -·- -...- .. -- . ,.c., ' ) rndkm• / rl 2 T 3 ) ''" '""'"'' l r l 4 l s hrs i ra 4. espuesta i r t pica í s l tula i stre utante r !+ n l i e a n r di nte e edad l ir . n ste i a, l s ndieron ibre nte t ulos e ad edad i star ntacto n l strato. s l t l s r n l das ri t l ente rt - bjeto n N. s im enes el l o iz i r o ntan ie o ro, l e l r cha ras ) spués el i i i el peri ento. s í s e t n l i eras s ila ( y ) r n etidas l r di nte e edad nerado or l l ci n t r da aCl2 ajo) ua rri a) , i . A) . s i enes e t n l ra arta il n el e ri ento ntrol nde tili ua l ar l ci n aCI?. i bargo, s l t l s utantes r1!+ ocieron i i n el ayor tencial í ri o ras servó e i ci n el i iento t s sa ro l ba chos as nta; e s í s r i r n l i ci n dad edad t i e a i . 4). ras, í utante r só l ar nde t ba l da l tula. or tr o, l e a ntrol , nde til ua rri ajo, servó f cto diti estas i ro- r vit i as í l t l s i stre i . 4). i bargo, í s utantes r1!+ ndieron ucho ás i o l ctor dad bién r n l ar. st s resultados confirman que la mutante nhr1 !+ es deficiente en su respuesta hidrotrópica, pero sí puede responder al vector de gravedad. Las respuestas tigmotrópica y gravitrópica de la raíz se alteran en plántulas nhr11+ En comparación con raíces de plántulas silvestres, las raíces de plántulas mutantes nhr11+ presentaron un patrón de ondulación diferente cuando crecía sobre una superficie sólida (agar). Por lo tanto, estas plántulas mutantes se examinaron en un ensayo tigmotrópico (Okada and Shimura, 1990). En este, las raíces mutantes nhr11+ mostraron un crecimiento ondulado más vigoroso que las raíces de plántulas silvestres (Fig . 25). Según los argumentos de Simmons et al. (1995) , este patrón de ondulación en la raíz de Arabidopsis sobre agar resulta principalmente de una combinación de la circumnutación y de la respuesta gravitrópica. Figura 25. Patrón de ondulación de nhr1/+ en medio tigmotrópico . En comparación se muestran plántulas tipo silvestre (wt). Barra=1 Omm . Circumnutación es el movimiento oscilatorio de órganos vegetales en crecimiento que se cree que resulta de procesos endógenos e intrínsicos del crecimiento; sin embargo, sus mecanismos moleculares se desconocen. Dado que el patrón de ondulación puede ser afectado por la respuesta gravitrópica, se decidió analizar la respuesta gravitrópica de la raíz en un ensayo de reorientación. El resultado de este análisis indicó que las raíces de la mutante nhr11+ responden 57 sustancialmente más rápido al vector de gravedad. (La gráfica se muestra en el artículo anexo). Crecimiento de la raíz de la mutante nhr11+ en presencia de hormonas exógenas Se ha documentado que el movimiento polar de auxinas juega un papel fundamental en la respuesta gravitrópica de la raíz (Chen et al., 2002b; Muday y DeLong, 2001 ). Sin embargo, no se sabe si este participa en la señalización del hidrotropismo. En la Figura 26 se ilustran el transporte acropétalo y basipétalo de auxinas en al raíz de Arabidopsis. Los estudios con inhibidores de transporte polar de auxina indican que el movimiento basipétalo controla la respuesta gravitrópica de la raíz en esta planta (Rashotte et al., 2000). También, se ha demostrado que la auxina se mueve de célula a célula por acarreadores de influjo y eflujo tanto en el transporte basipétalo como en el acropétalo. Además, se han reportado que algunas mutantes agravitrópicas tienen alteraciones en la sensibilidad a la aplicación de auxina exógena (Hobbie y Estelle 1995; Lusching et al., 1998; Hobbie et al., 2000; Chen et al., 1998). Por esta razón, se analizó el crecimiento relativo de la raíz en presencia de auxinas naturales y sintéticas, así como el efecto de un inhibidor del transporte polar de auxinas (NPA). El crecimiento relativo representa la elongación de la raíz en 5 días en el medio indicado con respecto a su control, que es la elongación en el MN sin hormona o inhibidor. Como se observa en la Figura 27, la respuesta de raíces de la mutante nhr11+ en presencia de la auxina natural, ácido indol acético (IAA) y la auxina sintética, ácido 2,4-Diclorofenoxiacético (2,4-D) fueron similares. Esto es, el crecimiento de la raíz es inhibido considerablemente al aumentar la concentración de auxinas. Sin embargo, las raíces de la mutante nhr11+ mostraron una resistencia significativa al ácido 1-naphthalenacético (NAA) 0.01 µM y 0.3 µM, en comparación con plántulas silvestres. Asimismo, raíces de la mutante nhr11+ mostraron una resistencia significativa a la presencia de 1 O µM de NPA. 58 QAIC • Af:C • TMP \ LP e NBP AM • e ¡ O AIC - acarreador de influjo de auxina ' AEC - acarreador de eflujo de auxina • TMP -transportador transmembranal • LP- proteina ligadora NBP- proteina que une NPA AM- movimiento de auxina Figura 26. Modelo de transporte polar de auxina en la raíz de Arabidopsis. A. Cada célula en tejidos que participa en transporte polar, posee transportadores transmembranales que median el influjo (AIC) y eflujo (AEC) de auxinas. El acarreador de eflujo está compuesto por 3 elementos; el transportador transmembranal (TMP), una proteína regulatoria que une a NPA y una supuesta proteína ligadora. B, La auxina que se sintetiza en el tallo se transporta a través de tejido vascular hacía a la punta de la raíz (transporte acropétalo) . De ahí , la auxina se distribuye a los tejidos laterales (transporte basipétalo) a través del sistema de transportadores que incluye la familia de genes como AGR1 (AGR-/ike). C, Cuando la raíz se estimula gravitrópicamente, la redistribución de auxina en los tejidos laterales de la raíz podría llegar a un nivel asimétrico. Esto forma un gradiente de auxina el cual puede ser el responsable de la curvatura gravitrópica. Modificado de Chen et al ., 2002 59 1111 1111 r:: 1 100 1 ··.. -nhr11+ r 1 .. 20 0 . 05 0.1 º·' o.os 0 .1 º·' A ...... .11 B ... _.. .... 120 1111 ''° 1111 , ... 1 100 t' ~ 1 ·· 100 .. •• t: 1 ·20 . 0.01 0.3 1 10 o e ....... .11 1 10 'º D ........ Figura 27. Efecto de las auxinas y NPA en la elongación de la raíz nhr1/+ y silvestre. Las plántulas germinadas en MN fueron transferidas al medio MN en presencia de IAA (A), 2,4-D (B), NAA (C), y NPA (O). La elongación de 5 días fue representada en crecimiento relativo (%) con respecto al crecimiento control (100%) y graficado contra la concentración de hormonas y el inhibidor. 120 100 ... o ~ 80 ! o 60 ¡ :§ 40 ~ o 20 A si lvestre nhr11+ B 0.01 0.1 10 Conc. de ABA en _M Figura 28. Efecto de ABA en la elongación de la raíz. La mutante nhr1 !+ muestra baja sensibilidad al ABA en comparación con la planta silvestre. A, El crecimiento relativo en porcentaje graficado contra la concentración de ABA en µM. B, Elongación de la raíz de nhr1!+ y de la planta silvestre en presencia de 1 OµM ABA. Plántulas de 5 días germinadas en MN fueron transferidas al medio que contiene 1 OµM de ABA. 60 El ABA es una hormona vegetal que juega un papel importante en las respuestas de la planta al estrés abiótico, tales como sequía, calor, frío y salinidad (lshitani et al. , 1997; Bonetta y McCourt, 1998). Ya que las raíces de la mutante nhr11+ pueden crecer en condiciones de bajo potencial hídrico por unos días (mueren si permanecen en el medio de ensayo por más de 15 días), se decidió examinar el crecimiento relativo en presencia de esta hormona. Como se observa en la Figura 28, las raíces de la mutante nhr11+ mostraron una baja sensibilidad al ABA a concentraciones de 0.01 , 0.1, 1.0, 1 O µM. Además, en el mismo ensayo se observó que raíces de la mutante nhr11+ siguieron respondiendo a la fuerza gravitrópica en 1 O µM de ABA, mientras que las raíces de plántulas silvestres se volvieron agravitrópicas en esta concentración. Los experimentos preliminares para verificar la sensibilidad de nhr11+ al ABA en la germinación, indicaron que la mutante es más sensible al ABA que plántulas silvestres. Esto sugiere que la acción de ABA en ambos procesos (germinación y respuesta trópica) es antagónica. 120 -r:: 1 60 40 20 o Efecto de ACC en la elongación de la Raíz o 0.01 0 .1 ------- [iWtl ~ 10 Figura 29. Efecto de ACC en la elongación de la raíz. El patrón de elongación de la mutante nhr1!+ es similar al silvestre excepto a la concentración de 0.01µM. Ya que algunas mutantes agravitrópicas y tigmotrópicas muestran insensibilidad al etileno (Chen et al. , 1998), se analizó el crecimiento relativo de raíces de la mutante nhr11+ en presencia del precursor de etileno, ACC (ácido 1- aminocicloprano). Como se observa en la Figura 29, las raíces de la mutante nhr11+ no mostraron ninguna alteración en su crecimiento relativo con respecto a 61 las raíces silvestres. Sin embargo, plántulas mutantes crecidas en oscuridad, para observar la triple respuesta de etileno, no formaron el gancho apical que se observa típicamente en plántulas silvestres (Fig. 30) . silvestre nhrlheterocigoto nhr1 heterocigoto nhr1 homocigoto La morfología de la cofia de la mutante nhr1 Figura 30. Plántulas de 5 días de edad crecidas en obscuridad. Las plántulas mutantes mostraron anomal ía en la formación del gancho apical. Las plántulas heterocigotas tienen los cotiledones medio abiertos y no presentan gancho apical. Se ha identificado a la cofia como el sitio de percepción a diversos estímulos tales como gravedad y gradientes de humedad (Jaffe et al. 1985), por lo tanto , se analizó la morfología de la cofia de la mutante nhr1 (Fig. 31 ). En este análisis, se utilizaron plántulas mutantes homocigotas y heterócigotas crecidas en MN y medio de tamizado de 5-8 días de edad. Las raíces fueron teñidas in vivo con ioduro de propidio (PI) 1 O µg/mL por 1 O minutos antes de observarlas en el microscopio confocal. El PI puede ser utilizado para teñir el apoplasto de las raíces en vivo (Scheres et al. , 1996) y de esta manera se puede identificar cada célula de la cofia en un corte en un microscopio confocal. Como se observa en la Figura 31 , las raíces de plántulas mutantes presentaron anomalías en la organización de la cofia. Las células del centro quiescente (QC) en ambos genotipos fueron más alargadas tanto en mutantes crecidas en medio MN, como en medio de tamizado, en comparación con las células de plántulas silvestres. La desorganización fue 62 menos severa en plántulas heterócigas donde se observan algunas células de la columela alargadas y divisiones atípicas en las células iniciales. En la cofia de las raíces de la mutante nhr1 homócigas, se observó una capa extra de células iniciales en la posición de la primera hilera de columela, donde normalmente no ocurren divisiones periclinales. Aunque las divisiones formativas (la división "T") que dan origen a la célula epidermal y a la célula de cofia lateral (Baum y Rost, 1996), no se vieron afectadas en las raíces de la mutante en ambos genotipos, las divisiones anticlinales que dan origen a la cofia lateral (las divisiones proliferativas), si lo estuvieron con respecto a raíces silvestres (Fig. 31 ). Los amiloplastos en la columela de la cofia de nhr1 (homocigota y heterocigota) fueron mucho más grandes que los observados en cofias de raíces silvestres, incluso parece haber un solo amiloplasto por columela. Por la baja resolución de las imágenes confocales de las raíces de nhr11+ crecidas en medio de selección, se analizaron cortes longitudinales de raíces embebidas en resina y teñidas con PAS (Ácido Periódico de Schiff) y Azul de Toluideno. De esta manera, se observó que el tipo de organización cerrada de la cofia estaba completamente ausente, así como la distribución de hileras de columela. Además, la organización del mismo meristemo apical de la raíz (RAM) se encontraba alterada. Sin embargo, se presentaron amiloplastos en supuestas células de columela y de cofia lateral. 63 silvestre 11 /tr l heterocigto 11/trl homocigoto Medio normal Medio normal . . . '' Medio de tamizado l) í) t 11 • Figura 31. Morfología de la cofia de nhr1 (homocigota y heterocigota) con respecto a la plántula silvestre. Los imágenes son de las raíces (5-7 días) teñidas con loduro de Propidio 10µg/ml por 10 minutos y analizados por microscopia confocal. La raíz de nhr11+ heterocigota crecidas en medio de tamizado fue analizado en corte longitudinal teñida con PAS y Azul de Toluideno. Las flechas blancas indican las divisiones anormales en la cofia de nhr1homocigota. Los círculos (amarillos) indican las divisionesT". El asterisco (*) indica célula de columela qrande. Barra = 25J.JM nlzrl (Col-O) heterocigota X silvestre (Ws) --- ~ - + Fl Muestra A Tamizado y selección de plántulas F2 Muestra B 1 2 3 Análisis de ligamiento de marcadores SSLP por PCR Figura 32. Esquema que muestra los pasos de análisis de ligamiento por PCR. l. Cruzas de la mutante con plántula silvestre de otro ecotipo para generar la F1. 11. Colectar ADN de la F1 (muestra A) y autofecundarla para generar F2. 111 . Tamizar la F2 y colectar ADN de las mutantes individualmente (muestra B) y analizarlas en grupos (50 a 100) por PCR con los marcadores SSLP. 64 La mutación nhr1 se localizó en el cromosoma 3 Con el propósito de determinar la posición cromosoma! de la mutación nhr1 en el genoma de Arabidopsis, se hizo el análisis de ligamiento con marcadores SSLP (Simple Sequence Length Polymorphism) de acuerdo a Lukowitz et al. (Lukowitz et al., 2000) . Los marcadores SSLP son nucleótidos repetidos de tamaños pequeños y específicos, generalmente polimórficos en diferentes ecotipos en los que generalmente varía el número de unidades repetidas. Con el objetivo de relacionar la mutación nhr1 con algunos de los marcadores moleculares SSLP que se encuentran a lo largo de los 5 cromosomas, se cruzó la mutante nhr11+ con una plántula silvestre de un ecotipo distinto al fondo genético donde se generó la mutación nhr1. La metodología general de este proceso se ilustra en la Figura 32. Este análisis se realizó por PCR en la población F2 generada de la cruza nhr11+ con el ecotipo Ws. El ADN de una plántula F1 es la muestra control (muestra A), la cual contiene una mitad de fondo genético Col-O y la otra de Ws. Esta plántula se autofecundó para generar la población F2 de la cual se aisló su DNA para amplificación por PCR con los marcadores SSLPs. El análisis de ligamiento se hizo sobre un grupo de 65 plántulas homócigas (bulk analysis) de la generación F2 (muestra B). Como se observa en la Figura 33A, los marcadores nga162 y nga172 segregaron en ligamiento con la mutación nhr1. El porcentaje de recombinación se determinó realizando PCR con muestras de ADN de cada uno de los 65 individuos por separado. La frecuencia de recombinación equivale al cociente del número de recombinantes entre el número de cromosomas analizados. El resultado de este análisis indicó que la frecuencia de recombinación de nhr1 con nga162 y nga172 fue 2.5% y 6% respectivamente (Fig. 338). 65 La mutación nhr1 se localizó en el Cromosoma 111 Col- Ws - N .... . "" e "' :! :. e N ~ '; " ·¡; ~ "" ·¡; e ~ e % de RF nga 172 6% ._ nhr1 nga 162 2.5% ciw 11 ciw 4 nga 6 A B Figura 33. Mapeo de la mutación nhr1 en el Cromosoma 3 de Arabidopsis. A. Fotografía negativa del gel en donde corrieron los marcadores SSLP amplificados en el control F1 (A) y en la mutante en grupo (B) (Fig.33). El ligamiento fue identificado con los marcadores nga172 y nga162. La intensidad de banda de Ws fue baja con ambos marcadores indicando que la mutación con fondo genético Col-O tiende a segregar entre los marcadores nga 172 y nga 162. B. Mapa del Cromosoma 3 con la ubicación de los marcadores y frecuencia de recombinación con la mutación nhr1 . 66 DISCUSION. PARTE 11 El fenómeno de hidrotropismo en raíces se reportó desde el siglo XIX (1811) por Knight (revisado por Takahashi 1997). En los estudios clásicos de hidrotropismo, las raíces fueron expuestas a un gradiente de humedad establecido entre un sustrato húmedo y un ambiente seco, aunque, el gradiente no fue determinado (Darwin 1881, Takahashi, 1997). El hidrotropismo ha sido poco estudiado por diferentes razones, como son la gran variabilidad de la respuesta en cada especie (Loomis y Ewan 1936), su estrecha interacción con el gravitropismo (Takahashi y Suge 1991; Takahashi y Scott 1991; Oyanagi et al. 1995) y/o la dificultad en establecer y mantener un gradiente constante (o estable) durante el largo tiempo requerido para retar el vector de gravedad. Algunos grupos de investigación han retomado recientemente el tema de hidrotropismo de la raíz (Jaffe et al. 1985, Takahashi y Suge 1991) utilizando la mutante de chícharo agravitrópica ageotropum. Ageotropum facilitó el estudio del hidrotropismo ya que la respuesta hidrotrópica de sus raíces ocurre sin la interferencia con el vector de la gravedad (Jaffe et al. 1985). Takano y colaboradores aplicaron trozos de agar asimétricamente con bajo potencial de agua para inducir la respuesta hidrotrópica en raíces de chícharo (Takano et al., 1995). Ellos observaron que un gradiente tan pequeño como de 0.5MPa en la cofia, puede inducir curvatura asociada con la respuesta hidrotrópica en la raíz de chícharo. Estas observaciones indican que la sensibilidad a gradientes de humedad en la cofia es muy alta. En este estudio, para demostrar el hidrotropismo de la raíz y aislar las mutantes de Arabidopsis afectadas en esta respuesta, fue necesario encontrar un sistema adecuado y práctico donde pueda visualizarse fácilmente este fenómeno. Las ventajas más importantes que tiene Arabidopsis en comparación con otras especies son: su tamaño pequeño, facilidad de mutagenizar, un bajo nivel en ADN repetido y con un número de cromosomas haploide de 5, lo cual es uno de los factores que facilita el proceso del mapeo de los genes. Además se ha secuenciado completamente su genoma y se han generado mutaciones en cada 67 uno de sus genes por diferentes métodos de mutagénesis como son la inserción de T-DNA y por exposición a EMS (http:l/www.Arabidopsis.org/abrc/tdnaecker.html; http://www.biotech .wisc.edu/Arabidopsis). La existencia de una colección grande de mutantes de Arabidopsis disponible a través de ABRC, facilita los estudios de complementación. En la primera parte de este trabajo, se diseñó un sistema de escrutinio con el que se demostró la respuesta hidrotrópica de la raíz de Arabidopsis. La optimización de siembra de dos ecotipos de Arabidopsis (Col-O y Ws) en el medio de tamizado, indicó que el gradiente de potencial de agua que percibe cada uno de éstos es diferente; esto sugirió que el umbral de potencial hídrico para cada ecotipo es diferente. La mutante nhr1 es semi-dominante heterocigota La mutante nhr1, con raíz no-hidrotrópica fue seleccionada a partir de una colección de semillas mutagenizadas con EMS. El análisis de retro-cruza reveló que el fenotipo no-hidrotrópico segregaba en proporción 1 :2:1 (silvestre: mutante no-hidrotrópico: raíz chica) en la siguiente generación. La mutante homocigota con fenotipo raíz chica, detuvo su crecimiento después de la germinación, indicando que el efecto de la mutación es letal para el desarrollo postembrionario. Mientras que el heterocigoto (nhr1 !+) está afectado en la capacidad de responder hidrotrópicamente, así como otros aspectos relacionados con la sensibilidad a hormonas del crecimiento. La segregación 1 :2:1 se ha observado en la mutante axr6 de Arabidopsis, que afecta la proteína CUL 1, que es una subunidad del complejo SCF implicado en la degradación del sustrato AXR2/IAA7 (Hellmann et al., 2003). Se ha mostrado que el gen AXR6 es requerido para la respuesta a auxina a lo largo en el crecimiento y desarrollo de la planta. Contrariamente de la nhr11+, axr6 tiene respuesta gravitrópica atrasada. Por el tipo de mutación que causa el EMS, nhr1 puede ser una mutación sin sentido (missense) que efectuando un cambio de codón provocó una ganancia de función. Consistente con esta interpretación, existen otras mutantes semi- 68 dominantes como axr3 y shy2 (Rouse et al. 1998, Tian y Reed 1999) que portan mutaciones sin sentido. La eventual clonación del gen NHR 1 y su análisis posterior ayudará a aclarar el carácter de la mutación con respecto a la función. El transporte polar de auxina está alterado en la raíz de nhr11+ Los diversos efectos de las auxinas sobre el crecimiento de la planta son principalmente sobre la elongación, división y diferenciación celular. Estos dependen tanto del control de biosíntesis y degradación, como de su transporte polar y su percepción en el sitio de acción. Se ha observado que la distribución de auxinas contribuye a la plasticidad en el crecimiento y por lo tanto, se ha propuesto a esta hormona como un morfógeno (revisado en Friml 2003). Un gran número de evidencias bioquímicas y fisiológicas se han integrado al modelo de transporte polar de auxinas. El modelo clásico explica que la auxina se mueve célula a célula a través de acción de acarreadores de entrada y salida (influjo y eflujo). Se propone que la localización (o posicionamiento) asimétrico de los acarreadores de salida, hacía a un lado particular de la célula, determina la dirección del flujo de auxinas. La identificación y caracterización de proteínas como AUX1 (acarreador de entrada) y PINs (acarreador de salida) refuerza este modelo (Bennett et al.1996, Galweiler et al. 1998, Müller et al. 1998, Friml et al. 2002). Estudios sobre los efectos de auxinas (natural y sintéticas) en la respuesta gravitrópica de la mutante aux1 indican que el efectividad relativa de 3 auxinas en alterar el gravitropismo es 2,4-D>IAA>NAA (Yamamoto y Yamamoto 1998). En el mismo estudio se especuló que el NAA puede entrar a la célula por difusión pasiva a través de la membrana plasmática. En cambio, el 2,4-D y el IAA necesitan el acarreador de influjo para entrar la célula. El crecimiento de la raíz de nhr1!+ en presencia de 2,4-D y IAA no fue afectado. Sin embargo, con NAA y NPA las raíces mostraron una disminución en su sensibilidad, indicando que el eflujo (salida) de auxinas en estas células podría estar alterado. De estas observaciones, se puede especular que el gen NHR1 codifica para una proteína de acarreador de auxina que aún no se identifica y/o corresponde a un gen regulador de algún acarreador 69 de auxina que actúa en sitios específicos de la raíz. Por ejemplo, se ha demostrado que la proteína PIN3 se expresa en células perceptoras de gravedad (estatocitos) y se re-localiza con respecto a la gravedad acumulándose principalmente en las superficies laterales de estas células (Friml et al. 2002). lnteresantemente, la mutante pin3 tiene defectos en la formación de gancho apical y respuesta gravitrópica, por lo que sería interesante analizar el fenotipo de la doble mutante pin3/nhr1 para verificar si existe un efecto aditivo del fenotipo no- hidrotrópico. Por oto lado, se podría verificar el efecto del NAA en la respuesta hidrotrópica utilizándola en el medio de tamizado. Sí la auxina regula la respuesta hidrotrópica, las plántulas silvestres podrían fenocopiar la mutante nhr11+ en alguna concentración específica de auxinas. Las respuestas gravitrópica y tigmotrópica fueron afectadas por la mutación nhr1 Para generar una respuesta de crecimiento apropiada las plantas tienen que integrar muchos estímulos a la vez. Gravedad y contacto son dos estímulos de naturaleza mecánica y por lo tanto, ambos podrían compartir elementos de señalización formando un sistema de percepción entre-cruzada (Fasano et al. 2002). Los estudios con la mutante rgr1 indican que el sistema de percepción y/o respuesta de gravi y tigmotropismo interactúan (Mullen et al. 1998). La mutante rgr1 tiene gravitropismo deficiente en la raíz y patrón de la ondulación diferente. Esta mutante es alélica a axr4 (resistente a auxina), lo cual indica que la señalización de auxina participa en ambas respuestas. Estudios de ablación de diferentes células en la cofia de Arabidopsis, indican que la percepción del estímulo de contacto y su señalización subsiguiente en las células de columela modulan la respuesta gravitrópica de la raíz (Massa y Gilroy 2003). Esto indica que la interacción de señalización de gravedad y contacto podría estar guiando el crecimiento para evadir obstáculos en el suelo, mientras se mantiene un crecimiento hacía abajo conforme al vector de gravedad. lnteresantemente, en la 70 mutante nhr 1 !+, la respuesta gravitrópica y tigmotrópica de la raíz fueron afectadas, sugiriendo que probablemente el producto del gen NHR1 podría estar actuando río arriba en la cascada de señalización de respuesta trópica donde interactúan estos dos tropismos. La percepción o transmisión de la señal está interrumpida en la mutante nhr1 Es ampliamente aceptado que la percepción de gravedad ocurre en los estatocitos de la cofia (Blancaflor et al. 1998, Boonsirichai et al. 2002). Sin embargo, no se conoce ni el lugar, ni el mecanismo de la percepción de otros estímulos trópicos. Dado que la estructura de la cofia está afectada en la mutante nhrt (Fig.32), se puede especular que la percepción o la transmisión de la señal haya sido afectado en la mutante. En otras palabras, puede ser que la percepción de gravedad haya aumentado cuando se perdió la transmisión de la señal al gradiente de humedad. Dado que en estado homocigoto nhrt tiene un fenotipo letal post-embrionario, no fue posible verificar su respuesta hidrotrópica o gravitrópica. Intercomunicación en las vías de hormonas La planta percibe y responde a señales ambientales y endógenas para asegurar su desarrollo y crecimiento óptimo. Para esto tiene que integrar los diferentes eventos de transducción a una red comprensiva de señalización y respuestas. Se ha observado la comunicación entrecruzada de auxinas con otras hormonas en la proliferación celular y desarrollo de la planta. Por ejemplo, uno de los primeros estudios en los que se aislaron mutantes resistentes a auxina, reportaron que auxt, axrt, axr2, y axr3 tienen respuestas alteradas por lo menos a otras dos hormonas (Hobbie y Estalle 1995). Los defectos pleitrópicos de señalización mostrados por varias mutantes de respuesta a auxina, destacaron el predominio de comunicación entrecruzada entre auxinas y otras vías de señalización por hormonas. Auxinas y etileno regulan la formación del gancho 71 apical, diferenciación y elongación de pelo radical, crecimiento de la raíz y fototropismo del hipocotilo en Arabidopsis (Revisado en Swarup et al. 2002). Además, se ha visto que las auxinas inducen biosíntesis de etileno aumentando la expresión de ACC sintasa en Arabidopsis (Abel et al. 1995). El ABA y las auxinas actúan antagonísticamente controlando la apertura de estomas, lo que requiere de una coordinación precisa de actividad de un canal iónico dentro de las células guardianas (Eckert y Kaldenhoff 2000). Otras evidencias genéticas de Arabidopsis indican que estas dos hormonas pueden interactuar para influir el crecimiento de la raíz y la germinación de las semillas. Mutaciones dominantes en el gen AXR2/IM7 de respuesta a auxina, confieren un fenotipo insensible al ABA en las raíces. Además, se ha visto que la mutante abi3, que originalmente fue identificada como insensibles al ABA, resulta insensible a NPA, lo cual afecta la formación de raíz lateral (Casimiro et al. 2001 ). También en recientes estudios se observó que el ABA inhibe el desarrollo de raíz lateral (Smet et al. 2003). Quizás existe alguna participación del ABA en la señalización de la respuesta hidrotrópica y gravitrópica que aún se desconoce, por lo tanto, parece importante analizar la señalización por ABA y su metabolismo en la mutante nhr11+. Junto con las evidencias discutidas y los resultados de este estudio en la mutante nhr11+, se puede especular que el efecto de la mutación en el gen NHR1 probablemente haya efectuado una perturbación en la homeostasis de hormonas, afectando la diferenciación y/o proliferación celular de la cofia. 72 CONCLUSION. PARTE 11 El crecimiento trópico y morfogénesis son ejemplos típicos de los fenómenos complejos que se presentan en el ciclo de la vida de las plantas. Aunque se han aislado y caracterizado diferentes clases de mutantes en respuesta a hormonas con escrutinios sencillos, aún no se han podido esclarecer los diferentes mecanismos moleculares del desarrollo y crecimiento diferencial en Arabidopsis. En este trabajo demostramos que la respuesta hidrotrópica puede ser disectada genéticamente en modelos como Arabidopsis cuyas raíces son fuertemente hidrotrópicas. Se aisló una mutante hidrotrópica a través de un escrutenio novedoso, en el cual las raíces se enfrentan a un gradiente de potencial de agua contra tiempo. La caracterización fisiológica de la mutante no-hidrotrópica (nhr11+) indicó que las respuestas gravitrópica y tigmotrópica están alteradas en la mutante. Esto sugiere que estas tres respuestas podrían estar interactuando entre sí (Fig. 35), aunque la respuesta hidrotrópica parece predominar sobrelas otras dos. Durante el proceso de evolución, el gravitropismo positivo pudo haber ayudado a las raíces a obtener agua y nutrimentos del suelo y a la vez, aumentar el anclaje de la planta, por lo tanto, no es sorprendente que existan elementos comúnes en las vías de señalización de estas tres respuestas. Sin embargo, puede decirse que la respuesta hidrotrópica es escencial para la sobrevivencia de la planta y que las raíces de Arabidopsis son principalmente hidrotrópicas. La interacción de estas tres respuestas trópicas puede describirse en el modelo presentado en la Figura 34. 73 ABA ?/ Amiloplastos 1 G ravitropismo NHR1 J_ Hidrotropismo ?f Ca 2+ Flujo de auxina Tigmotropismo Figura 34. Modelo que muestra la interacción de tres tropismos. Los diferentes elementos de la señalización como Ca2 + y flujo polar de auxina se han descubierto en gravi y tigmorespuestas. Los amiloplastos disparan la respuesta gravitrópica, pero inhiben el hidrotropismo. Es probable que exista una señalización negativa de ABA en la respuesta hidrotrópica contraria a la respuesta gravitropica. Puede ser que los componentes de señalización del hidrotropismo tengan redundancia genética, definiendo vías de señalización con entradas y salidas múltiples. Por lo tanto, es importante aislar y caracterizar más mutantes hidrotrópicas de otras colecciones de mutantes generadas por diferentes métodos como por ejemplo, irradiaciones con rayos gama y otros métodos de inserción o deleción, que ayuden a descifrar este fenómeno esencial para la sobrevivencia de la planta. 74 BIBLIOGRAFIA Abel S, Nguyen M D, Chow W, Theologis A (1995). ACS4, a primary indoleacetic acid- responsive gene encoding 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase in Arabidopsis thaliana. Structural characterization, expression in Escherichia coli, and expression characteristics in response to auxin. J. Biol. Chem. 270: 19093-19099 Ausbel F M, Brent R, Kingston R E, Moore D D, Seidmann J G Smith J A, Struhl K (1995). Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley New York. Vol.1: unit 2.3.3 Baluska F, Samaj J, and Menzel D (2003). Polar transport of auxin: carrier- mediated flux across the plasma membrane or neurotransmitter-like secretion? 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For most plants survival depends upon the capacity of root tips to sense and move towards water and other nutrients in the soil. Because land plants cannot escape environmental stress they use developmental solutions to remodel themselves in order to better adapt to the new conditions. The primary site for perception of underground signals is the root cap (RC). Plant roots have positive hydrotropic response and modify their growth direction in search of water. Using a screening system with a water potential gradient, we isolated a no hydrotropic response (nhr) semi-dominant rnutant of Arabidopsis that continued to grow downwardly into the medium with the lowest water potential contrary to the positive hydrotropic and negative gravitropic response seen in wild type-roots . The lack of hydrotropic response of nhrl roots was confirmed in a system with a gradient in air moisture. The root gravitropic response of nhrl seedlings was significantly faster in comparison with those of wild type . The frequency of the waving pattern in nhrl roots was increased compared to those of wild type. nhrl seedlings had abnormal root cap morphogenesis and reduced root growth sensitivity to abscisic acid (ABA) and the polar auxin transport inhibitor N-(1-naphtyl)phtalarnic acid (NPA) . These results showed that hydrotropism is amenable to genetic analysis and that an ABA signaling pathway participa tes in sensing water potential gradients through the root cap. Survival for most plants depends upon the capa- bilities of a dynamic, specialized organ at the root apex-the root cap (RC)-to sense water and nutri- ents and to respond by transmitting signals, which result in altered growth patterns. The root tip's re- sponse to environmental cues by directed growth plays a role in all aspects of plant development by virtue of its crucial role in establishing a stable un- derground architecture with access to nutrients and water (Hawes et al., 2000, 2002). The notion that plant roots penetrate the soil in search of water to sustain their growth may be one of those popular ideas that persist, simply because it is so easily thought of and seems so natural. This sort of behavior, rather than the action of gravity, was first offered as the expla- nation for the downward orientation of roots (sug- gested by Dodart around 1700; in Hart, 1990). How- ever, with greater awareness of the roles of other 1 This research was supported by the Mexican Council far Sci- ence and Technology (grant nos. CONACYT 25186N and 36071N), by the Universidad Nacional Autónoma de México (Dirección General de Asuntos del Personal Académico grant no. IN208999), by University of California (Mexus), and by DeGAPA IN204496 (scholarships to M.L.B. and D.E.). 2 These authors contributed equally to the paper. (wJ The online version of this article contains Web-only data. The supplemental material is available at www.plantphysiol.org. • Corresponding author: e-mail gladys@ibt.unam.mx; fax 52-77- 73-13 9988. Article, publication date, and citation information can be found at www.plantphysiol.org/ cgi/ doi / 10.l 104/ pp.011841. directional signals such as gravity and light on the general orientation of plant organs, interest in hydro- tropism has fluctuated over the years. In addition to roots, rhizoids and pollen tubes have been also re- ported to be positively hydrotropic (Molisch, 1883; Vochting, 1902; in Hart, 1990). By 1872, Sachs (in Hart, 1990) demonstrated that in pea (Pisum sativum) seedlings grown atan angle in a hanging sieve bas- ket, the emergent roots bent around and grew back toward the wet substratum, thus overcoming the force of gravity. Around that time, Sachs, Darwin, Pfeffer, and Weisner (who introduced the term hy- drotropism) demonstrated that moisture affected root orientation. Darwin (1881) discovered that the primary site for perception of underground signals is the root tip. He also proposed that the tip of the radicle transmit an influence to the upper part of the root so the root can bend after sensing an environ- mental stimulus. The phenomenon of root responsiveness to mois- ture gradients is known as hydrotropism. We still do not know how hydrotropism works and how the RC senses moisture gradients in the soil. Plant scientists have paid little attention to hydrotropism, whereas gravitropism, the ability of plant organs to use grav- ity as a guide for growth, has been studied exten- sively (Takahashi, 1997). Gravity is unique among environmental signals in that it is present continu- ously, it is unidirectional, and it maintains constant intensity. However, evidence shows that this intrin- sic growth of roots is sensitive to the microenviron- 536 P/ant Physiology, February 2003, Vol. 131, pp. 536-546, www.plantphysiol.org © 2003 American Society of Plant Biologists i ·0.4 e ti ¡ .0.6 .. ti ¡.o.a s t! -1.0 ~ ::J VI w ...... - .. . -· e ,. "' ... ,, • • o .. d • • o 2 4 6 8 Timo (days) D Figure 1. Screening system for the iso lati on of hydrotropic mutants, and phenotypes of wild-type and nhrl seedlings in this system and in NM. A, Ten-day-o ld nhrl and wild-type seedlings growing in the screening system. Wild-type roots arrested their growth at d 7 and developed a hydrotropic curvature. Roots of heterozygous nhrl plants continued to grow after crossing the boundary between NM and WSM showing a lack of hydrotropic response. Homozygous nhrl seedlings have short-root phenotype and are marked with as- terisks. Arrowheads indicate the boundary between NM and WSM. Bar = 50 mm. B, Phenotype of 1 0-d-o ld, heterozygous (Het) and homozygous (Hom) nhrl plants grown in NM. Seedlings of 7-d-old Plant Physiol. Vol. 131, 2003 Genetic Analysis of Hydrotropism in Arabidopsis ment at the root tip, and, thus, gravity is continually challenged by differences in moisture gradients, dis- tribution of nutrients, heat, light, and oxygen, among others. Studies of hydrotropism have always been difficult to achieve because the root response to grav- ity strongly interacts with its positive hydrotropic response (Takahashi and Suge, 1991; Takahashi et al., 1992a, 1992b, 1996). In addition, there are difficulties implicit in controlling and maintaining a continua! moisture gradient adequate for both inducing a root- positive hydrotropic response and for challenging its response to gravity. For instance, pea roots are in general hydrotropically nonsensitive but when the gravitropic response is nullified by clinorotation, they show positive hydrotropism (Takahashi et al., 1996). Therefore, the observation made by Jaffe et al. (1985) on roots of the pea mutant ageotropum, which are agravitropic, but respond to hydrotropism, is significant because it indicates that perception and response of these two tropisms are separable. To date, various screening procedures have been designed to isolate mutants affected in stimulus re- sponse for gravity, light, obstacle touching, or com- binations of these stimuli. To gain insight into the poorly understood phenomenon of hydrotropism, we have developed a screening system with a water potential gradient for the isolation of Arabidopsis mutants whose roots respond negatively to hydro- tropic stimulus. In this study, we report the isolation of the nhr1 mutant and its characterization under various physiological conditions. RESUL TS AND DISCUSSION Screening System with a Water Potential Gradient for the Isolation of No Hydrotropic Response Mutants So far, hydrotropism has not been studied in Ara- bidopsis roots. We first developed a system with a water potential gradient for demonstrating positive hydrotropic response of Arabidopsis wild-type Co- lumbia (Col) roots. This system comprised a square petri dish that was maintained in vertical position on one side and contained a normal nutrient medium heterozygous nhrl were selected from the screening system and then were transplanted to NM. Bar = 1 O mm. C, Diagram of the screening system showing where water potential was measured. To determine the thres ho ld level of the substrate water potential in the screening system, seeds were plated diagonally along the line drawn in the upper part of the dish and agar water potential was measured dail y. Position "a" is where the two media are in contact; position "b" is where the root stopped growing or where root curvature took place in NM; pos ition "e" is the middle position along the diagonal within NM; and position "d" is the upper limit of the WSM in the screening system. Position "e" is in the lower part of the dish containing the WSM. O, Changes in the substrate water potential over time within the screening system in the locations indi cated in C. Average data of four independent experiments are given. 537 Eapen et al. (NM; where Arabidopsis seeds were plated) in the upper part, and in the lower part, the same NM supplemented with glycerol and alginic acid (water stress medium [WSM]; Fig. lA). Wild-type plants grew downward and after 7 d stopped growing, or started to form a curvature responding positively to the hydrotropic stimulus by avoiding the substrate with lower water potential in the screening system; that is, roots never reached the area containing the WSM. The frequency of wild-type Arabidopsis roots that developed a hydrotropic curvature in the screen- ing system was 48% (n = 98). In the making of the screening medium for exam- ining positive hydrotropism in wild-type Arabidop- sis roots, we tested several osmolytes for the WSM such as sorbitol (5%, 8%, 10%, and 15% [v /v]), man- nitol (15% and 20% [v /v]), and polyethylenglycol 8000 (10%, 15%, and 20% [v /v]) besides glycerol (data not shown). Even though both sorbitol and mannitol produced a water potential gradient in the system, they were not adequate for inducing a posi- tive hydrotropic response in wild-type roots, particu- larly in long-term experiments. On the contrary, these roots continued to grow into the WSM (with either sorbitol or mannitol) for 13 to 15 d (see Fig. 1 in supplemental data available at www.plantphysiol. org). We assumed that Arabidopsis wild-type roots probably accumulated or metabolized both sorbitol and mannitol and, as a consequence, could grow in the presence of these osmolytes. Polyethylenglycol, on the other hand, did not diffuse in agar and, hence, no water potential gradient was formed in the screen- ing system. In contrast, glycerol was capable of in- ducing a positive hydrotropic response in wild-type roots. However, glycerol has to be combined with alginic acid for improving medium solidification. We also tested the effect of alginic acid (0.5%, 1 %, 1.5%, and 2.5% [w /v]) in the growth of wild-type roots by germinating seeds in plates with NM with different concentrations of alginic acid and by sowing seeds in a two-medium system having at the bottom of the plate NM plus alginic acid and at the top NM. Alg- inic acid did not influence the growth of Arabidopsis wild-type roots (data not shown). The screening system was then used for screening a population of 26,400 ethyl methane sulfonate (EMS)-mutagenized Arabidopsis M2 seedlings. Puta- tive mutants were selected based on their lack of hydrotropic response or their inability to sense the low water potential in the WSM, subsequently show- ing considerable root growth in contrast to wild-type roots (Figs. lA and 2B). The screening resulted in the isolation of 10 puta- tive negative hydrotropic mutants. After backcross- ing three times to wild-type plants, only two lines, nhrl and nhr2, had negative hydrotropism. nhr2 seeds germinated poorly; thus, our main attention was on the analysis of nhrl . In a backcross of nhrl seed to wild type, 50% of the F1 seedlings grown in 538 20 --WI M 16 --0--wt screerÍflg /I -a-- nhrr 16 system 'f . NM - -+--nhr 1w"""'1¡¡ o'6 -.tr-wi WS 14 oy.¡tem / ~· :[ 12 J. / í "' /..!' IS 2 ! 10 ~ o .K/ "' ~ 8 6 v ~~ 2 J • s 6 Timc(doys) 8 10 12 14 16 Timo(days) Figure 2. Dynamics of root growth of wi ld-type and heterozygous nhrl seed lings in NM, WSM, and screening system. A, Seeds were sown in NM or WSM plates and placed vertically. B, For measuring root growth in the screening system, seedlings initially were grown for 4 din NM and then were transferred to the screening system. Root elongation was measured on a subsequent day after germination by digita l image analysis. Each point represents the mean ± so (n = 20). Data are from three independent experiments. the screening system for 8 d showed no hydrotropic response phenotype and 50% showed positive hy- drotropic response. The segregation ratio of F1 seed- lings (44 wild type:31 no hydrotropic phenotype) indica tes that the nhrl mutation is partially dominant Cl = 2.26 < /-oos(Il = 3.84). When the backcrossed F1 plants were selfed, and the no hydrotropic genotype of the corresponding F2 plants was determined by examining F3 families, the segregation ratios (ho- mozygous wild type:heterozygous:homozygous mu- tant F2 seedlings) were consistent with thel:2:1 seg- regation ratio expected for mutations in a single locus. However, the homozygous mutant F2 seed- lings revealed a different phenotype because these seedlings were dwarfs with a very short root that never reached the reproductive stage (Fig. lB). The segregation ratio of selfed F2 heterozygous nhrl in- dividuals (113 wild type:286 no hydrotropic response phenotype:l36 short-root phenotype F3 seedlings) was consistent with the 1:2:1 segregation ratio ex- pected for a semidominant and single-locus mutation (/- = 4.5 < /-0 os(z) = 5. 99). These results are consis- tent with no hydrotropic response phenotype being heterozygous nhrl, and the short-root phenotype be- ing homozygous nhrl. The main difference between heterozygous and homozygous nhrl roots was that the homozygous nhrl plants never developed signif- icant growth of their roots and shoots under any condition tested. For example, the root lengths of 10-d-old homozygous nhrl seedlings grown in NM were on average 2.9 ± 0.04 mm, whereas those of heterozygous nhrl and wild-type seedlings were 37.9 ± 1.7 mm and 36.2 ± 1.8 mm (mean ± so, n = 10), respectively (Fig. lB). To characterize the water potential gradient in the screening system and plant responses in it, we mea- sured the changes in water potential over time in different parts of the system (Fig. lD). The water potential in the upper part of the dish gradually Plant Physiol. Vol. 131, 2003 decreased by glycerol diffusion during 8 d and be- came more negative in positions closer to the WSM (Fig. lC). Roots of wild type usually stopped grow- ing or started to curve away from WSM where water potential was -0.53 MPa after 6 to 7 d (position "b," Fig. lC). Roots of heterozygous nhrl continued to grow into the WSM along the gradient between -0.3 and -0.8 MPa. Notably, heterozygous nhrl seedlings became chlorotic when their roots were left more than 4 d in the WSM. To determine the threshold level of the substrate water potential, we planted wild-type seeds diagonally in the upper part of the plate (Fig. lC) . Roots stopped growing or developed a curvature in response to hydrotropic stimuli 1.3 cm above the boundary between the two media where the water potential was approximately -0.5 MPa. Mapping of the nhrl Mutation We determined the chromosomal position of the NHR gene by simple sequence length polymorphism (SSLP) linkage analysis (Lukowitz et al., 2000). We detected linkage of the recessive nhrl (short-root phe- notype) mutation, heterozygous nhrl (no hydrotropic response), and wild type by bulked segregant anal- ysis. The nhr mutation was induced in a Col back- ground and crossed to Wassilewskija (Ws) to gener- ate the following mapping population: F2 population derived from a Col/Ws F1 plant with the genotype nhr/NHR. The nga162 and nga172 molecular markers showed a clear bias toward the Col-specific band in the mutant pool. This indicated that the mutation maps to the upper arm of chromosome 111. The re- combination frequency across the nga162/nga172 in- terval obtained was 2.5% and 6%, respectively. Root Growth Responses of nhr1 Seedlings The growth of heterozygous nhrl roots in NM and WSM was indistinguishable from the wild type (Fig. 2A). When both wild-type and heterozygous nhrl seeds were sown in NM they showed similar growth rate (Fig. 2A). However, when both wild-type and heterozygous nhrl seeds were sown in WSM, their root growth was seriously impaired (Fig. 2A). This demonstrates that heterozygous nhrl roots were not resistant to the severe water deficit conditions of the WSM. Heterozygous nhrl seedlings were distin- guished from those of wild type in both NM and WSM by their wavy-like root growth (Fig. lB). This wavy-like root growth is absent in the wild-type Col ecotype and frequently cosegregated with no hydro- tropic response phenotype of heterozygous nhrl seedlings. In the screening system, however, het- erozygous nhrl roots showed a faster growth rate in comparison with wild-type roots (Fig. 28). Wild-type roots grew for only 4 d after transplanting to the screening system and no further growth was ob- served after d 8 (Fig. 28). However, heterozygous Plant Physiol. Vol. 131, 2003 Genetic Analysis of Hydrotropism in Arabidopsis nhrl roots continued to grow for 12 din the screening system (Fig. 28). Heterozygous nhrl had close to normal root growth in the screening system but could not grow from the onset in WSM. This most likely suggests that the heterozygous nhrl mutation does not confer water deficit resistance, but rather provides a short-term capacity for root growth in the presence of a substrate water potential gradient. On the other hand, this mutation might impair percep- tion of such a gradient. Hydrotropic and Gravitropic Responses of nhrl Roots in a System with Air Moisture Gradient To discern whether the phenotype shown by het- erozygous nhrl roots in the screening system oc- curred as a consequence of an alteration in glycerol metabolism, we developed a different system for studying root hydrotropism with a gradient in air moisture (Figs. 3 and 4A). In this system, a humidity gradient was formed in a square petri dish with a saturated solution of calcium chloride. Here, het- erozygous nhrl roots responded negatively to the moisture gradient stimulus (Fig. 3, E and F), in con- trast to wild-type roots that developed positive hy- drotropic response toward the water source (Fig. 3, B and C). Roots of both heterozygous nhrl and wild- type seedlings developed a curvature approximately 3 h after the exposure to a water potential gradient. The root curvature angles of all wild-type roots showed negative gravitropic values and roots grew toward the water source (Fig. 48). On the other hand, heterozygous nhrl roots showed either a right- or a left-handed twist in their growth direction in the same system (Fig. 3, E and F). However, without a moisture gradient, 6 (Fig. 3H) and 24 (Fig. 31) h after the beginning of the experiments, wild-type roots responded not only to the gravity vector but also to the water source. The direction of most wild-type roots was settled in the first of the 12 30° sectors and only 16% of roots were close to the expected 90° (Fig. 4C) . This indicates that the cumulative response in wild-type roots was developed to both gravitropic and hydrotropic stimuli. In contrast, the direction of approximately all heterozygous nhrl roots was closer to 90° (Fig. 3, K and L), thus confirming their faster positive gravitropic response (Fig. 5A) in contrast with those of wild type. Besides, sorne heterozygous nhrl roots showed a right- or a left-handed turn in their growth direction in the system without air moisture gradient. Hence, only wild-type roots re- sponded positively to the water source and were capable of abrogating the effect of gravity. 8oth wild- type and heterozygous nhrl roots showed no signif- icant differences in their rate of elongation after 6 h of growth under the two conditions tested. In a system with air water potential gradient, wild-type roots grew at 59 ± 35.5 µm h - 1 (n = 6), whereas heterozy- gous nhrl roots grew at 70 ± 37.1 µm h - 1 (n = 10). In 539 Eapen et al. r· -- -- wt H_ ' 1 .J ' . r(. . 1 , J±~~~-=- ~t ~ H. O ¡: ¡ -- -------- . , r:&'! --; ~ -J'- - l Figure 3. Hydrotrop ic response of heterozygous nhrl and wild-type roots in a system with a gradient in air moisture. In this system, an air moisture gradient was created around the roots between the oasis (water) and the cuvelte (sa turated solulion of CaCa l2 ) for lesting lheir positive hydrotrop ic response (A- F). The additive effect of grav itro- pism and hydrotropi sm was tested in a control system where both the oasis and the cuvette contained water (G- L). At time O (A, D, G, and J), roots were placed horizo ntally with a distance of 2 to 3 mm from the tips growing in the air to the water source. In the system with air moisture gradient, wild-type rools were hydrotropi ca lly stimulated and, as a consequence, showed negative gravitropic response 6 and 24 h after the beginning of the experiment (B and C). Heterozygous nhrl roots were not hydrotropi ca ll y stimulated 6 and 24 h after the beginning of the experiment (E and F). These roots showed either a right or a left-handed twist in their growth direction. Root growth direction of heterozygous nhrl ended behind the microscope slide in a loop-like structure 24 h after the beginning of the experiment (F). This root growth behavior hampered the measurements of root cur- vature angles. In the moisture air system, 6 (H) and 24 (1) h after the beginning of the experiment, root growth of wild-type seedlings was primarily directed toward the water source instead to the gravity vector. After 6 (K) and 24 (L) h, roots of heterozygous nhrl seedlings grew mostly in the direction of gravity. The figures are representative of five independent experiments (n = 24). the absence of a gradient, wild-type roots grew at 84 ::±:: 65.2 µ,m h - 1 (n = 11) and heterozygous nhrl roots at 114 ::±:: 34.7 µ,m h - 1 (n = 8; mean ::±:: so). The root responses to both absence and presence of an air mois- ture gradient were maintained up to 48 h, indicating its physiological nature. These analyses of growth and tropic responses in roots grown freely in air represent the first achieved in Arabidopsis, to our knowledge. This system has the advantage of allowing the study of directional root growth in three dimensions because previous studies ha ve been made on flat two-dimensional agar surface systems. Furthermore, in this system basic root movement, which is regulated by a combination 540 of right-handed and left-handed circumnutations, gravitropism, hydrotropism, obstacle avoidance, etc. (Darwin, 1881; Simmons et al., 1995 Migliaccio and Piconese, 2001) can be uncoupled from other re- sponses to agar surface-derived environmental stim- uli. In fact, when the heterozygous nhrl roots grew freely in the moisture air gradient their directional growth pattern was unusual (Fig. 3, E and F). Het- erozygous nhrl roots moved in various planes and formed a loop or a hairpin structure at the tip, in contrast to wild-type roots . Roots (like all plant or- gans) grow by making oscillatory movements around the growth vector rather than by growing linearly (Sachs, 1872; Migliaccio and Piconese, 2001). How- ever, the unusual directional growth pattem of het- erozygous nhrl roots in free air may indicate that forces other than positive gravitropism, lack of hydro- tropism, circumnutation, and thigmotropism could be involved in this process. For instance, the biomechani- cal properties of the root might also influence the directional root growth behavior of nhrl seedlings. In summary, heterozygous nhrl roots did not show positive hydrotropism in response to water potential gradients created either with glycerol or with a sat- urated solution of calcium chloride, thus confirming their lack of hydrotropic phenotype. Root Gravitropism and Waving Pattern Is Affected in the nhrl Mutant Heterozygous nhrl roots developed significantly faster gravitropic responses when grown on the sur- face of an agar medium (Fig. 5), and when embedded within the agar medium (not shown), indicating that heterozygous nhrl roots possess positive gravitropic but no hydrotropic competence (Figs. lA, 3, E and F, and 5). This implies that in heterozygous nhrl roots, A B e -g Figure 4. Diagram of the experimental system developed for the induct ion of positive root hydrotropism in Arabidopsis (A). Hydro- tropic and gravitropic responses of wild-type roots grown in a system with an air moisture grad ient generated with a saturated CaCl2 solution (B) or water (control; C). The frequency of root growth direct ions was analyzed by measuring curvature 6 h after the begin- ning of gravistimulation at 0° (0° angle corresponds to hori zontal position of the root tip). Each hydrostimulated and/or gravistimulated root was assigned to one of 12 30° sectors. The length of each bar represents the percentage of seedlings showing direction of root growth within that sector. Bar= 100%. g, Gravity vector; H 20, water source; CaCl 2 , reduced air moisture source. The gray sectors are indicators of where the CaCl 2 and water were placed in the plate. Data are from five independent experiments (n = 24). Plant Physiol. Vol. 131, 2003 120 100 A 60 n V 00 40 20 o o 6 8 10 Tttni:!'ihl Figure 5. Kinetics of root gravitropic be nding in wild-type and het- erozygous nhr1 seedlings. Seedlings on vertical plates we re turned 90º to a horizonta l positio n. Hete rozygous nhr7 seedlings were selected from the screening system and the n transfe rred to NM plates for the gravitropism analysis . Each point represents the mean ±: SD (n = 15). Stude nt's t test demonstrates statistical ly significan! differ- ences between nhr7 and wild-type seedlings at 2 (P = 0.01), 4 (P = 0.00015), 6 (P = 0.0014), and 8 (P = 0.023) h afte r gravistimulation. gravity can actívate a complex signal transduction pathway that results in the production of a grav- itropic root curvature at the elongation zone. Hence, in heterozygous nhrl roots, perception of the hydro- tropic stimulus is impaired but not the development of a tropic response. We also investigated the wavy growth pattern of heterozygous nhrl roots (Okada and Shimura, 1990). These roots showed increased wavy growth, with each curve encompassing a larger angle than curves in wild-type roots, similar to wav2-1 and shy2-22 (Okada and Shimura, 1990; Tian and Reed, 1999; Fig. 6). Because this waving phenom- enon is likely governed by circumnutation or spiral- ization patterns (Darwin, 1881; Simmons et al., 1995; Rutherford and Masson, 1996; Migliaccio and Pi- conese, 2001), the waviness of nhrl roots may be because of higher right-handed helical oscillations in the root growth direction. These oscillations could be amplified by tactile stimulation, gravity, or sorne other characteristics of the agar surface (i.e. nutrients or surface tension; Okada and Shimura, 1990; Ruth- erford and Masson, 1996; Mullen et al., 1998). How- ever, the enhanced gravitropic response and wavy growth pattern of heterozygous nhrl in agar (Figs. 5 and 6) and the unexpected growth of elongating heterozygous nhrl roots in air (Fig. 3, E and F) may indicate that NHRl is also involved in the control of directional root growth. Root Tip Morphology of nhrl Mutants Because moisture gradients are sensed in the RC (Jaffe et al., 1985), we analyzed the root tip morphol- ogy of nhrl mutants. By comparing root tips between wild-type and homozygous nhrl mutants, we ob- served several distinct aberrations in cell patterns of 5-d-old seedlings roots (Fig. 7, compare B with H). Abnormal root apical meristems (RAMs) and RCs were observed in 99% of the seedling progeny of homozygous nhrl mutants. In seedlings grown in either NM or screening system, the quiescent center Plant Physiol. Vol. 131, 2003 Genetic Analysis of Hydrotropism in Arabidopsis (QC) cells were expanded (Fig. 7, B and C) and the RC was highly disorganized (Fig. 6B) compared with wild-type roots (Fig. 7, H and I) . In the RC, cell divisions within the columella-initial cell layer were displaced to the first tier of the columella, where typically no periclinal divisions occur (Fig. 7C, ar- rows), and, as a consequence, lateral RC morphogen- esis in the mutant was anomalous. The formative periclinal T divisions (giving rise to epidermal and lateral RC cells) in the RAM (Baum and Rost, 1996) were not affected. However, anticlinal divisions, both in lateral-RC (proliferating divisions) and in cells giving rise to new RC/protoderm initials (formative divisions) were not observed (Fig. 7, B and C). The inhibited root growth probably resulted from the decreased activity of QC cells because they were unusually elongated and disorganized (Fig. 7, B and C). However, the processes of cell differentiation in the RC appeared to be normal because sorne amylo- plasts present in heterozygous nhrl mutants were larger than in wild-type plants (Fig. 7, A and G). We assume that the inhibition of root growth in homozy- gous nhrl is related to general inhibition of cell pro- liferation. Determínate root growth, small root size, and abnormally larger cells within the RAM indicate such a possibility. The described root phenotype of homozygous nhrl is unique and different from any described Arabi- dopsis mutants. Contrary to shr and ser, nhrl roots contain all cell layers (Scheres et al., 1995). Contrary to hbt (Willemsen et al., 1998), nhrl has all initial cells and a normal lateral RC is formed during embryo- genesis. In contrast to rml mutants (Vernoux et al. , 2000), postembryonic cell division in the RAM took place, though it was inhibited in homozygous nhrl plants. Continuous RC ablation in transgenic DT- Atsm plants (carrying the diphtheria toxin A chain under the control of the RC-specific RCPl promoter) produced highly abnormal short roots with reduced mitotic activity in the root tip similar to that observed in homozygous nhrl (Tsugeki and Federoff, 1999). However, these transgenic plants displayed no evi- dence of a gravitropic response in contrast to ho- Figure 6. Wavy root growth patte rn of wild-type and heterozygous nhr7 10-d-o ld seedlings. Wi ld-type (grown in NM) and he te rozygous nhrl (se lected from the scree ning system) 7-d-old seedlings were transfe rred to 1 .5% (w/v) agar plates and these were ti lted to 45° for 3d.Bar = lOmm . 541 Eapen et al. Figure 7. Roo! tip morphology in homozygous nhrl , heterozygous nhrl and wild-type seedl ings. Homozygous nhrl seedlings grow n on NM (A and B) or on screening system for 5 d (C). Homozygous nhrl roots show abnormal latera l RC formation because after formative T divi sions (marked by ye llow circ les), derivati ve cells in the epidermi s and latera l RC are not formed. Success ive T divisions are clase one to another (B; n = 13). In homozygous nhrl , cell s al the position of the wild-type quiescent center (QC) are di sorgani zed (arrowheads on B; n = 12) . Furthermore, two tiers of co lumella initials are found instead of a single columella tier in wild type (a rrow s; C; n = 6), and cell di ffe rentiation in the RC appears to be unaffected because amy- loplasts were present (A). Heterozygous nhrl 8-d-o ld seedlings grown on NM (D and E) or on screening system (F). lmages D and E were taken from the same root and the same foca l plane. In het- erozygous nhrl roots, irregular anatomy of columella initials and large columella cells (asteri sk) were present (n = 7; E). Amylop lasts were observed in columella cells of these roots as in wild type (G) but were larger and located al the bottom of the cell. Heterozygous nhrl roots grown in the screening system lack a typical QC and RC (n = 16; F). Arrow indicates apparent pos ition of a QC cell and the absence of the closed type of the Arabidopsis roo! apical meristem (RAM; F). Wild-type plants grown for 7 d on NM (G, H) or on screening system (1 ) showed normal RAM and RC structure. When grown on screening system, columella and QC cells were usuall y larger in size (1) compared with those roots grown in NM (G and H; n = 5) . A, D, and G, Bright-field images of the confocal sections (B, E, and H). 1, lmage contras! w as enhanced by using the " render different clouds" fi lter of Adobe Photoshop Elements 5.5 (Adobe Systems, Mounta in View, CA). Longitudinal thin section of a het- erozygous nhrl root stained w ith Period ic Ac id Schi ff and Toludine blue of roots (F). Ba r in 1 is the sa me for ali images except F. The fi gures are representat ive of three independent experiments (n = 60). Ba rs = 25 µm. mozygous nhrl roots (data not shown). These exper- iments indicate that the RC contributes to the regulation of overall root growth (Tsugeki and Fed- eroff, 1999). Physiological and genetic data suggest the involvement of auxin in pattern formation in plants. Essential components of the auxin redistribu- tion system reside in the RC. The use of the DRS:GUS auxin response reporter construct have shown that there is a maximum auxin response in the columella 542 initial cells (Sabatini et al., 1999). This asymmetric distribution is essential for distal patterning in the Arabidopsis RAM (Sabatini et al., 1999). PIN4, a pu- tative auxin efflux carrier, is presumably involved in the establishment and maintenance of endogenous auxin gradients in the Arabidopsis root tip (Friml et al., 2002a). pin4 mutants displayed various patterning defects in seedling roots (Friml et al., 2002a). Interest- ingly, root growth in heterozygous nhrl plants was less inhibited than in wild-type seedlings when the polar auxin transport inhibitor N-[1-naphthyl]phta- lamic acid (NP A; Fig. 8A) was added exogenously. This could reflect perturbation in auxin distribution and, in turn, might explain the abnormal patterning seen in the root tip of these mutants (Fig. 7, D-F). The root phenotype of heterozygous nhrl seedlings was significantly impaired in comparison with wild type when grown in NM (Fig. 7, D and E). In these roots, amyloplasts were larger than in those of the wild type (Fig. 7 A) and sorne columella cells were unusually large (Fig. 7E, asterisk) . However, when these mutants were grown in the screening system, their RC morphology was even more affected than in nhrl homozygous roots (Fig. 7, A-C). Atypical roots were observed in 99% of the seedling progeny of heterozygous nhr 1 mutants. Thin sections were made for heterozygous nhrl roots grown in the screening system because the confocal images of these roots were of very low resolution. Heterozy- gous nhrl roots lacked a typical QC and RC because the closed type of the Arabidopsis RAM was not present (Fig. 7F) . These RCs also showed abnormal columella and lateral RC cells and in both cells few amyloplasts were present. The root of this mutant was approximately 65% thicker than in those of wild type. This was because of greater cell thickness, and not because of an increase in the number of cell layers. Interestingly, these roots were capable of growth (Fig. 2B) and were not agravitropic (Fig. lA). Because RC of heterozygous nhrl roots had severe anomalies, we suggest that the activity of NHRl may control the pattern formation in the RC in addition to is role in the perception of water potential gradients as seen in Figures lA and 3, D through E. Heterozy- gous nhrl roots grown in NM showed an enhanced gravity response (Fig. SA). Amyloplasts constitute the susceptors for gravity perception (Boonsirichai et al., 2002) and beca use heterozygous nhrl roots grown in NM contained unusually large amyloplasts in the RC columella (Fig. 7D), their perception and proba- bly their response could be accelerated. nhrl Mutation Alters Root Growth Sensitivity to Abscisic Acid (ABA) and NPA Many agravitropic mutants exhibit altered sensitiv- ities to exogenously applied auxins, which are in- volved in the cellular growth processes accompany- ing organ bending and root growth (Boonsirichai et Plant Physiol. Vol. 131, 2003 al., 2002). Furthermore, polar auxin transport plays an important role in the control of root gravitropism because mutations in genes directly implicated in this transport also affect root gravitropism (Chen et al., 1998; Lusching et al., 1998; Müller et al., 1998; March- ant et al., 1999; Friml et al., 2002b). These mutations also increase root growth insensitivity to polar auxin transport inhibitors (Chen et al., 1998; Lusching et al., 1998; Müller et al., 1998; Marchant et al., 1999; Friml et al., 2002b ). The growth of the heterozygous nhrl roots was significantly less sensitive to 10 and 50 µ,m NP A than those of wild type (Fig. 8A). However, this was not correlated with an absence of gravitropic response as in eirl/agrl/wav6/pin2 mutants (Chen et al., 1998; Lusching et al., 1998; Müller et al., 1998; Fig. 5) but with a lack of response to hydrostimulation (Figs. lA and 3, E and F). Heterozygous nhrl and wild-type seedlings were then grown on media con- taining various concentrations of the auxins 2,4-D (Fig. 8B), indole acetic acid (IAA; data not shown), and NAA (Fig. 8C). Heterozygous nhrl roots re- sponded to 2,4-D (Fig. 8B) and IAA similar to the wild type, indicating that heterozygous nhrl roots A € 140 ~ 110 ~IDO~ f 80 j 'º 11. 40 * 10 € 140 ~ 110 ~ IQO f IO i 'º 11. 40 ¡f. 20 e 1 10 50 HPApM 0,01 1,3 HilpM 10 140 B t 110 !;. 100 ~ 10 i 'º 11. 40 * 10 ,¡; 140 i 110 f 100 e ªº i 'º 11. 40 ¡f. 20 D o;os 0, 1 o,s l,4-D pM 0,81 0, 1 10 AllApM Figure 8. Physio logical analysis of heterozygous nhrl mutant seed- lings. Effects of an inhibitor of polar auxin transport and hormones on wild-type and heterozygous nhrl seedlings root growth. Seedlings grew on NM for 4 d and were transferred to media containing various concentrati ons of NPA (A), 2,4-d ichlorophenoxyaceti c aci d (2,4-D; B), 1-naphtalene aceti c ac id (NAA; C), or ABA (D). Four days later, root growth was measured and pl otted as a perce ntage of root growth on NM. A, Roots of heterozygous nhr7 seedl ings were resistan! to the growth-inhibiting properties of NPA. The difference was significa nt at 1 O and 50 µ,M (Student's t test, P = 0.01 , P = 0.0055). B, The auxin 2,4-D equally inhibited root growth in both heterozygous nhrl and wild-type seedlings. C, The growth of heterozygous nhrl roots showed decreased sensitivity to NAA. The difference was significan! at 0.01 and 0.3 µ,M NAA (Student's t test, P = 0.001, P = 0.02). D, Roots of heterozygous nhrl seedlings were res istan! to the growth- inhibiting properti es of ABA. The difference w as significan! at 1 and 1 O µ,M ABA (Student's t tes t, P = 0.09, P = 4 X 1 o-5). Error bars represent the mean :!:: SD (n = 15). Absence of bar indicates that SD was less than the thi ckness of the symbol. The graphs are represen- tative of three independent experiments. Plant Physiol. Vol. 131, 2003 Genetic Analys is of H ydrotropism in Arabidopsis are not altered in response to these auxins. However, heterozygous nhr 1 mutant roots grew significantly faster than those of wild type in the presence of 0.01 and 0.3 µ,M NAA (Fig. 8C). The membrane-permeable NAA can evade the auxin influx carrier and enter directly to the cell in contrast to both IAA and 2,4-D (Katekar and Geisler, 1977). This lower sensitivity to NAA probably suggests that the nhrl mutation some- how affects certain aspect of auxin efflux regulation. Moreover, dark-grown nhrl seedlings failed to main- tain an apical hook, as do the auxin-response mutants axrl, tirl, bdl, and hbt (Blilou et al., 2002) . Because interactions between ABA and drought are well documented in Arabidopsis (Zhu et al., 1997), and heterozygous nhrl roots can grow under water deficit conditions (Fig. 2B), we also examined the effect of exogenous ABA on the growth of heterozy- gous nhrl roots. In wild-type plants, application of low concentrations of ABA accelerates root growth, whereas higher concentrations inhibit root develop- ment (Abeles et al., 1992). The growth of heterozy- gous nhrl roots was less inhibited by increasing con- centrations of ABA than those of wild type (Fig. 8D); however, seeds of this mutant were not insensitive to ABA on germination as the ABA-insensitive mutants abil, abi2, and abi3 (Koornneef et al. , 1984; data not shown). We also examined the hydrotropic response of the abil, abi2, abi3, and abal (Koornneef et al. , 1982) mutants in our screening system. These mutant roots showed positive hydrotropic response as those of wild type (Fig. 9 in supplemental data available at www.plantphysiol.org). Endogenous ABA concen- trations can rise and fall dramatically in response to environmental cues such as water deficit (Bonetta and McCourt, 1998). Thus, if heterozygous nhrl roots keep on growing under water deficit conditions, they might be impaired in sorne physiological pathway where ABA acts as a relay between the environment and the RC. Studies on how ABA is distributed, compartmentalized, and metabolized in the root tip upon gravistimulation are scarce. Moreover, sorne ABA mutants of Arabidopsis are agravitropic (E. Nambara, personal communication) but have not been characterized thoroughly. Our observations suggest that an ABA signaling pathway participates in the positive hydrotropic response of roots. We hypothesized that NHRl is the first element to inter- act with ABA sensitiveness, which in turn control and modify the regulation of auxin efflux carriers in response to environmental parameters. This interac- tion might allow the RC to sense water potential gradients and to cross talk with factors implicated in the polarity of auxin transport, which ultimately de- termine directional root growth. To assess whether nhrl affects NPA, NAA, and ABA responses specifically, we tested root growth responses to other hormones. Heterozygous nhrl mutant seedlings showed wild-type responses to the cytokinin kinetin and benzyl adenine, to the ethylene 543 Eapen et al. precursor 1-aminocyclopropane-1-carboxy lic a cid, and the GA GA3 (data not shown). These results indicated that apparently ABA responses and auxin efflux carrier regulation are predominantly altered by the nhrl mutation. We also tested whether the short roots of homozy- gous nhrl mutants might arise from altered hormone responses by growing them in the presence of vari- ous exogenous hormones (data nor shown). How- ever, the exogenous addition of different hormones could not stimulate growth of homozygous nhrl roots or shoots. The only effect seen was the induc- tion of organogenesis in the shoot after the addition of 0.1, 0.44, and 1 µM benzyl amino purine because several new leaves appeared and formed a miniature rosette. Further, both the hypocotyl and root of dark- grown homozygous nhrl seedlings elongated consid- erable more than seedlings grown in the light but this growth was also limited (data not shown). It remains to be determined how the shoot apical meristem is affected in the homozygous nhrl seedlings. The com- plete postembryonic growth arrest seen in homozy- gous nhrl seedlings suggests that the NHRl gene plays a role in cell proliferation. We are in the process of positional cloning the NHRl locus. The identifica- tion of this gene and its characterization will allow us to understand its role in cell proliferation. Interest- ingly, the nhrl mutation in the homozygous condi- tion results in a lethal phenotype (complete postem- bryonic growth arrest) but with one functional gene copy (semidominant heterozygous condition), seed- lings can grow and set seeds. Furthermore, the phe- notype of heterozygous nhrl seedlings suggests that the nhrl mutation play a role in controlling differen- tial root growth. Root motility is generated through the action of two discrete regions just above and separate from the RC, the RAM, and a region just above the meristem called the region of elongation (Baluska et al., 1996). When plants are supplied with basic needs, new cells are produced within the RAM more or less continuously, and these cells are the cells, which give rise to root growth. New cells de- rived from the RAM proceed through a transition phase before entering in to a period of rapid elonga- tion. The elongation zone is a srnall region of the root tip where cell expansion occurs. Cells in the elonga- tion zone are the first ones involved in root responses to several environmental stimuli and in the differen- tial growth that accompanies a gravitropic curvature (Boonsirichai et al., 2002). These two linked but in- dependent activities-cell division and cell elonga- tion-enable root movement. However, the primary site of signal perception leading to directional move- ment is the RC, not the two tissues (RAM and region of elongation) that actually generate growth (Darwin, 1880; Baluska et al., 1996). Therefore, in the heterozy- gous nhrl seedlings one wild-type NHRl gene copy enables cell proliferation but one nhrl gene copy resulted in impaired differential root growth (lack of 544 hydrotropism and enhanced gravitropism) and ab- normal patterning in the RC. This might suggest that cell proliferation and cell elongation leading to direc- tional movement in the root are coordinately regu- lated with perception in the RC. Our study dernonstrates that a complex phenorne- non such as hydrotropism can be genetically dis- sected. The isolated heterozygous nhrl mutants are unique in their defective response to positive hydro- tropism. RC morphogenesis in these mutants was disorganized, implying that NHRl is required for plant roots to sense water and to control pattern formation in the RC. It remains to be shown if the lack of organization of the RC is the cause of the failure in the hydrotropic response or vice versa. Cloning of NHRl loci and the isolation of new neg- ative hydrotropic mutants will unravel the molecular nature of the mutation and clarify the mechanisms involved in root-positive hydrotropism. MATERIALS AND METHODS Plant Growth and Manipulation Wild-type Arabidopsis seeds of the ecotypes Col and Ws were provided by the Arabidopsis Biological Resource Center (Ohio State University, Co- lurnbus). Seeds were surfaced sterilized and kept at 4ºC far 4 d . The screening system was prepared by pouring NM (1 x Murashige and Skoog salts supplemented with 0.5% [w / v] Suc) in one-half (upper part) of a square plate; an agarose-coated polyester gelBond film (FMC BioProducts, Rockland, ME) was introduced into the d ish to separa te it in two equal parts. After solidification of the NM, the same medium supplemented with 2.5% (v / v) glycerol and 0.5% (w /v) alginic acid (WSM) was poured into the other one-half (lower part) of the dish . Alginic acid was added to i.mprove medium solidification . Seeds were placed in the upper one-half of the plate, 1.3 cm above the division between both media, and subsequently the p iece of ge!Bond film was removed . Square plates were wrapped in Parafilm, p laced in vertical position at 23ºC, and subjected to 16-h-d /8-h-night cycles in a growth chamber far 8 to 10 d . Mutagenesis Arabidopsis Col ecotype seeds (10,000) were allowed to i.mbibe overnight in water at room temperature, and then were soaked in 0.3% (v / v) EMS solution far 16 h . Seeds were washed extensively with water and planted in eight independent populations in fla ts at 1,250 seeds flat - 1 . M2 seeds were harvested in bulk. Screening for Arabidopsis Mutants Affected in Positive Hydrotropic Response Approximately 3,300 Arabidopsis seeds from each of the independent EMS-mutagenized eight populations (a total of 26,400 seeds) were sterilized and plated in the screening medium described above far 8 to 10 d . Mutants without tip curvature up to the lOth d that continued to grow toward the WSM were selected. Seedlings that showed no hydrotropic response were transferred to soil and allowed to self-fertilize far faur generations. The nltrl mutant was characterized genetically and physiologically after backcrossing to wild type at least three times to remove unlinked mutations. Water Potential Analysis of the Screening System The wa ter potential of the screening system was measured a t time zero and every 24 h fa r 8 d in different sections of the plate by the dew point psychometric combined method . The HR-337 Dew Point Microvoltimeter (Wescor !ne., Logan, UT) was used . Plant Physiol. Vol. 131, 2003 Assay for Hydrotropism in Arabidopsis Roots with an Air Moisture Gradient For the hydrotropic assay, 7-d-old wild-type and heterozygous nhrl seedlings grown in NM were transferred to a microscope slide containin g a 2-mrn layer of NM. The slide was placed vertically in a square petri dish next to the water source (a piece of 2.5- X 1.4-cm oasis [Humrnert Interna- tional, St. Louis] saturated with 3 mL of water) and a saturated solution of calcium chloride (3 mL) in a plastic cuvette placed in the bottom of the dish. We used a saturated solution of calcium chloride for creating a grad ient in air moisture as reported by Takahashi and Scott (1991). The seedling was placed horizontally onto the microscope slide leaving 2 mm of the root tip in the air. The distance between the water source and the root tip was approximately 2.5 to 3.2 mm. The dish was sealed with Parafilm and maintained in a vertical position for 48 h. An air moisture gradient thus was created between the oasis and the cuvette. Ali manipulations were done in the presence of a room humjdifier. Root growth rate was measured with the public domain NIH Image program (developed at the United States Na- tional lnstitu tes of Health and available on the Internet at http:/ / rsb.info.nih.gov /nih-image). Photographs were taken at the indicated times. Analysis of Root Growth in the Presence or Absence of Hormones and Auxin Polar Transport Inhibitors Wild-type and heterozygous nhrl mutan! seedlings were grown on ver- tically oriented NM plates for 4 d in a growth chamber. After 4 d of growth, seedlings were carefully transferred (to avoid damage of the roots) onto vertically oriented NM plates supplemented wi th 2,4-D, NAA, ABA, and NPA cited in the figure at the indicated concentrations. Heterozygous nlzrl seedlings were selected from !hose of wild type because of their wavy-like root growth in NM. Auxins (2,4-D, IAA, and NAA) and an auxin polar transport inhibitor (NPA) were purchased from Sigma (St. Louis) and Chem Service (West Chester, PA), prepared as 10 mM stock solutions in diluted NaOH/ethanol, and added to the medium at the concentrations defined in the text. Plates were incubated in the growth chamber for 5 d, with pictures taken every 12 h. Root length data were standardized against lengths on unsupplemented medium. Root lengths were measured using digital image analysis and statistically analyzed. We used a Morpho Expert image ana- lyzer (Explora Nova, La Rochelle, France), with a monochrome CCD camera (COHU 4815, Jessop Canon UK Limited, Neasden, London) and a macrolens (FD 50 mm, 1:3.5, Canon, Tochigi, Japan) a ttached to a video wide-angle 0.SX high-resolution lens (Jessop, London). The plates were trans- illuminated in a macrostand (AMS, London). Root Gravitropism and Wavy Growth Pattern Examination in the nhrl Mutant For the gravitropic response experiments, plates were also kept in a vertical position. Wild-type seedlings were grown in NM at 90° either on the surface of 0.9% (w/v) agar NM or submerged within the medium for 5 d, and then manually rotated in a clockwise direction so that the roots were parallel to the surface of the Earth. Heterozygous nhrl seedlings were selected from the screening system after 5 d, then transferred to a NM plate and manually rotated as described above. The direction of new root growth was analyzed using digital image analysis every 2 h. Then, plates were reoriented to the vertical (initial) position and the recovery of root growth directions was recorded after 24 h. Root elongation was assayed at 4 d after germination. For the waving pattern, wild-type seedlings were grown on plates containing 0.SX Murashige and Skoog medium, plus 1% (w /v) Suc and 1.5% (w /v) agar, and placed in a vertical position for 7 d in a growth chamber (23ºC with 16 h of light). Heterozygous nhrl seedlings were selected from the screening system after 7 d and then transferred to plates containing the medium described above. Then, the plates were tilted to 45° and the seedlings were grown for 3 d and were photographed as described by Okada and Shimura (1990). Confocal Imaging of nhrl Mutant Root Tips For nUCroscopic examina tion, 5- to 8-d-old Arabidopsis seedlings were stained with propidium iodide (PI; 10 µg mL - 1 ) for 10 min and then were Plant Physiol. Vol. 131, 2003 Genetic Analysis of Hydrotropism in Arabidopsis observed with an MRC-600 laser scanning confocal microscope (Bio-Rad Labora tories, Hercules, CA) or bright-field microscopy using a 63 x C-Apochromat W Korr (1.2 numerical aperture and 0.25 water difraction) water immersion objective (Zeiss, Jena, Germany) . Seedlings grown in screening system when stained with PI had very low apoplast penetration and low contras! images were obtained. To improve image contras!, we used PI supplemented with 1 % to 2% (w /v) glycerol. This s taining still gave Jess contrasted images than seedlings grown in NM. Selection of heterozy- gous nhrl seedlings grown in NM was based upon their wavy-like root growth phenotype, and those grown in the screening system because of their lack of hydrotropic response. Determination of Genetic Map Position of the nhrl Mutation Genetic mapping was done according to Lukowitz et al. (2000). Mapping populations were generated by manually crossing heterozygous nhrl mu- tants (selected from the screening system) to the Ws ecotype. F1 plants were allowed to self-pollinate and set seed. Tissue from homozygous F2 plants was collected for DNA isolation. DNA pools were bulked and used to assign a rough position on the genetic map by identifying linked genetic markers (a set of SSLP markers spaced at regular intervals throughout the genome). For more fine-scale mapping, DNA was prepared from individual F2 plants (62 plants, 124 chromosomes) and recombination frequencies were obtained with flanking SSLP markers from the region. ACKNOWLEDGMENTS We warmly thank Lewis Feldman, Patrick Masson, Jorge Nieto-Sotelo, and two anonymous reviewers for critically reviewing the manuscript; Stewart Guillmor for valuable suggestions on the mapping of nhrl; Juan Manuel Hurtado for helpful computer support; Xóchitl Alvarado for mar- velous help with the confocal microscope; and Natasha Doktor, Yoloxóchitl Sánchez, and Manuel Saucedo for wonderful help with figures. Received July 26, 2002; returned for revision Sep tember 2, 2002; accepted November 12, 2002. LITERATURE CITED Abeles FB, Margan PW, Saltveit ME Jr (1992) Ethylene in Plant Biology. Academic Press, San Diego Baluska F, Volkmann D, Barlow PW (1996) Specialized zones of develop- ment in roots. View from the cellular leve!. Plan! Physiol 112: 3-4 Baum SF, Rost TL (1996) Root apical organization in Arabidopsis thaliana: l. Root cap and protoderm. 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