UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO Facultad de Estudios Superiores Iztacala PARTICIPACIÓN DE lncRNAs EN EL DESARROLLO DE COMPLICACIONES DIABÉTICAS: REVISIÓN SISTEMÁTICA Y META-ANÁLISIS T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: B I Ó L O G O P R E S E N T A : LEONARDO ELÍAS CABRERA NÁJERA DIRECTOR DE TESIS Biol. GLADYS CHIRINO GALINDO Los Reyes Iztacala, Edo. De México, 2023 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. 1 AGRADECIMIENTOS Gracias a los que intentaron entenderme 2 ÍNDICE 1 RESUMEN ...................................................................................................... 6 2 INTRODUCCIÓN ............................................................................................ 8 2.1 Diabetes mellitus ......................................................................................... 8 2.1.1 Generalidades ....................................................................................... 8 2.1.2 Clasificación ........................................................................................ 10 2.1.3 Identificación ....................................................................................... 16 2.1.4 Complicaciones Patológicas ............................................................... 17 2.2 RNAs ......................................................................................................... 20 2.2.1 Generalidades ..................................................................................... 20 2.2.2 Clasificación ........................................................................................ 21 2.2.3 lncRNAs .............................................................................................. 22 2.2.3.1 Generalidades ................................................................................. 22 2.2.3.2 Importancia de los lncRNAs ............................................................ 27 2.2.3.3 Regulación de los lncRNAs ............................................................. 29 2.2.4 Enfermedades asociadas a lncRNAs .................................................. 45 2.2.4.1 lncRNAs y Diabetes......................................................................... 48 2.3 Medicina Basada en Evidencias ................................................................ 49 2.3.1 Generalidades ..................................................................................... 49 2.3.2 Evidencia y Artículos de revisión ........................................................ 50 2.3.3 Revisión Sistemática ........................................................................... 52 2.3.4 Meta-análisis ....................................................................................... 52 3 ANTECEDENTES ......................................................................................... 53 4 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ........................................................... 56 5 PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN ............................................................... 57 6 HIPÓTESIS ................................................................................................... 57 3 7 OBJETIVOS .................................................................................................. 57 7.1 Objetivo general ........................................................................................ 57 7.2 Objetivos particulares ................................................................................ 57 8 MÉTODOS .................................................................................................... 58 8.1 Estrategias Metodológicas ......................................................................... 58 8.2 Validaciones .............................................................................................. 58 8.3 Criterios de consideración sobre unidades de estudio .............................. 59 8.3.1 Tipos de estudios ................................................................................ 59 8.3.2 Tipos de participantes ......................................................................... 59 8.3.3 Tipos de intervenciones ...................................................................... 59 8.3.4 Tipos de medidas de resultado ........................................................... 59 8.4 Sistematización de las unidades de estudio .............................................. 60 8.4.1 Búsquedas electrónicas ...................................................................... 60 8.4.2 Búsquedas por otros recursos ............................................................ 60 8.5 Colección de datos y análisis .................................................................... 60 8.5.1 Selección de estudios ......................................................................... 60 8.5.2 Extracción de datos y manejo ............................................................. 60 8.5.3 Evaluación del riesgo de sesgo .......................................................... 61 8.5.4 Medidas del efecto del tratamiento ..................................................... 61 8.5.5 Problemas de unidades de estudio ..................................................... 62 8.5.6 Manejo de datos faltantes ................................................................... 62 8.5.7 Evaluación de heterogeneidad ............................................................ 63 8.5.8 Evaluación de sensibilidad .................................................................. 63 9 RESULTADOS.............................................................................................. 64 9.1 Descripción de estudios............................................................................. 64 9.2 Resultados de la búsqueda ....................................................................... 64 9.3 Estudios incluidos ...................................................................................... 66 4 9.3.1 Diseño de estudios.............................................................................. 66 9.3.2 Participantes ....................................................................................... 67 9.3.3 Intervenciones ..................................................................................... 70 9.3.3.1 Duración .......................................................................................... 70 9.3.3.2 Frecuencia e intensidad .................................................................. 72 9.3.3.3 Resultados ...................................................................................... 75 9.4 Estudios excluidos ..................................................................................... 83 9.5 Efectos de la intervención .......................................................................... 83 9.5.1 Comparación de efectos ..................................................................... 83 9.5.1.1 Cardiopatía diabética....................................................................... 83 9.5.1.2 Afecciones músculo-esqueléticas ................................................... 87 9.5.1.3 Nefropatía diabética ........................................................................ 90 9.5.1.4 Neuropatía diabética ..................................................................... 100 9.5.1.5 Retinopatía diabética ..................................................................... 106 9.5.1.6 Afecciones glandulares ................................................................. 111 9.5.1.7 Afecciones hepáticas..................................................................... 113 9.5.1.8 Afecciones pancreáticas ................................................................ 114 9.5.1.9 Muestras sanguíneas .................................................................... 116 9.5.1.10 Otros resultados ........................................................................... 116 9.5.2 Efectos representativos ..................................................................... 118 9.5.2.1 lncRNAs con mayor repeticiones entre estudios ........................... 118 9.5.2.1.1 Contraste entre la búsqueda exhaustiva y MALAT1 .......................... 118 9.5.2.1.2 Contraste entre la búsqueda exhaustiva y H19 ................................. 121 9.5.2.1.3 Contraste entre la búsqueda exhaustiva y NEAT1 ............................ 121 9.5.2.1.4 Contraste entre la búsqueda exhaustiva y TUG1 .............................. 122 9.5.3 lncRNAs con mayor tasa de cambio de expresión ............................ 123 9.6 Riesgo de sesgo de los estudios incluidos .............................................. 125 10 DISCUSIÓN ................................................................................................ 129 10.1 Interpretación general de los resultados .............................................. 129 5 10.2 Comportamiento de lncRNA MALAT1 .................................................. 131 10.3 Comportamiento de lncRNA H19 ......................................................... 133 10.4 Comportamiento de lncRNA NEAT1 .................................................... 135 10.5 Comportamiento de lncRNA TUG1 ...................................................... 136 10.6 Implicaciones para la práctica, la política y la investigación futura ....... 137 11 CONCLUSIONES ....................................................................................... 138 12 LITERATURA CITADA ............................................................................... 139 13 LITERATURA COMPLEMENTARIA (ARTÍCULOS INCLUIDOS) ............... 187 13.1 Modelo de rata [R] ................................................................................ 187 13.2 Modelo de ratón [M] ............................................................................. 189 6 1 RESUMEN La diabetes mellitus (DM) es un conjunto de trastornos metabólicos, caracterizados por hiperglucemia crónica, que pueden causar daños macro y microvasculares. Debido a su prevalencia mundial, se ha convertido en un importante problema de salud pública, para la que se han buscado tratamientos efectivos. En los últimos años, se ha sugerido que los lncRNAs (ARN largos no codificantes) desempeñan un papel importante en el desarrollo de complicaciones diabéticas, debido a la afectación de diversas rutas de señalización por modificaciones moleculares. El objetivo de este estudio fue evaluar la participación de los lncRNAs en el desarrollo de patologías asociadas a la hiperglucemia crónica en diferentes modelos animal de rata y ratón, en diferentes tipos de diabetes (Diabetes mellitus tipo 1, 2 y gestacional [T1DM, T2DM y GDM]). Para ello, se llevó a cabo una búsqueda de manera sistemática y exhaustiva de estudios. Además, el meta-análisis cuantifico la tasa de cambio de expresión de lncRNAs, al ser expuestos a un ambiente diabético. Los resultados mostraron que, de las 11 complicaciones diabéticas identificadas, la retinopatía, la nefropatía, la neuropatía y las afecciones hepáticas son las más representativas. Además, se encontró que MALAT1, H19, NEAT1 y TUG1 son los lncRNAs más estudiados en relación con estas complicaciones en ratas y ratones. Por otro lado, los lncRNAs con mayor tasa de cambio fueron MSTRG.1662 y ENSRNOT00000093120_Aox3, NONRATG013497.2 en ratas y SIRT1 y TUG1, CYP4B1-PS1- 001, M-50.6, 1500026H17Rik y NEAT1 en ratones. A pesar de que el metaanálisis ha demostrado una asociación significativa entre la expresión anormal de lncRNAs y las principales complicaciones diabéticas, así como la identificación de nuevos blancos terapéuticos para la DM, se necesitan estudios más rigurosos para comprender completamente el papel de los lncRNAs en la progresión de las complicaciones diabéticas. 7 ABSTRACT Diabetes mellitus (DM) is a group of metabolic disorders characterized by chronic hyperglycemia that can cause macro and microvascular damage. Due to its worldwide prevalence, it has become an important public health problem and effective treatments have been sought. In recent years, it has been suggested that long non-coding RNAs (lncRNAs) play an important role in the development of diabetic complications due to their impact on various signaling pathways through molecular modifications. The aim of this study was to evaluate the involvement of lncRNAs in the development of pathologies associated with chronic hyperglycemia in different animal models, such as rats and mice, and in different types of diabetes (T1DM, T2DM, or GDM). To perform this, an exhaustive search was carried out in various databases. The results showed that, of the 11 identified diabetic complications, retinopathy, nephropathy, neuropathy, and liver damage are the most representative. Additionally, it was found that MALAT1, H19, NEAT1, and TUG1 are the most studied lncRNAs in relation to these complications in rats and mice. On the other hand, the lncRNAs with the highest rate of change were MSTRG.1662 and ENSRNOT00000093120_Aox3, NONRATG013497.2 in rats and SIRT1 and TUG1, CYP4B1-PS1-001, M-50.6, 1500026H17Rik, and NEAT1 in mice. Although the meta-analysis has shown a significant association between abnormal lncRNA expression and major diabetic complications, as well as the identification of new therapeutic targets for DM, more rigorous studies are needed to fully understand the role of lncRNAs in the progression of diabetic complications. 8 2 INTRODUCCIÓN 2.1 Diabetes mellitus 2.1.1 Generalidades La diabetes mellitus (DM) es una enfermedad que ha sido de gran importancia histórica. Desde tiempos remotos, se han descrito síntomas como la sed y la micción excesiva en los pacientes diabéticos, como se puede apreciar en el papiro de Ebers, datado en el año 1500 a.C. (Ebbel y Banov, 1937; MacCracken y Hoel, 1997; Willerson y Teaff, 1996;). Incluso el papiro de Kahun, del año 2000 a.C., contiene una receta para tratar la sed excesiva en mujeres (Ghalioungui, 1987; Karamanou et al., 2016). Posteriormente, en la India del siglo V a.C., los cirujanos Sushruta y Charaka identificaron la diabetes y la clasificaron en dos tipos, correspondientes en la actualidad a los tipos 1 y 2, en su obra Samhita (Frank, 1957; Lakhtakia, 2013; Tipton, 2008). También descubrieron que la orina de los pacientes diabéticos tenía un sabor dulce, textura pegajosa y capacidad de atraer hormigas, lo que llevó a llamarla "Madhumeha" u "orina de miel" (Algaonker, 1972; Tattersall, 2016). Además, se ha encontrado una relación entre la DM y factores como la herencia, la obesidad, la falta de actividad física y la dieta poco saludable (Ahmed, 2002). Es importante destacar que la enfermedad que ahora conocemos como DM no recibió su nombre hasta el siglo II d.C., cuando Aretaeus de Capadocia decidió llamarla "diabetes", que en griego significa "sifón" (Araetus, 1856; Dobson, 1776; Laios et al., 2012). El término "mellitus", que significa "dulce como miel" en latín, fue acuñado por el cirujano británico John Rollo en 1798 para distinguir la DM de la diabetes insípida (Schadewaldt, 1989; von Engelhardt, 1989). Aunque ambas enfermedades presentan síntomas como sed excesiva, aumento de la ingesta de líquidos y micción frecuente, en la DM prevalece un estado de hiperglucemia que provoca la eliminación de glucosa en exceso a través de la orina. En cambio, en la diabetes insípida los niveles de glucosa en la sangre son normales, pero los riñones no pueden concentrar la orina adecuadamente (National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases [NIDDK], 2021). Durante el período histórico posterior al acuñamiento del nombre de la enfermedad, se continuó identificando y describiendo la sintomatología que la caracterizaba (Tabla 1). Por ejemplo, en la antigua China, Chang Chung (ca. 160-ca. 219), conocido como el Hipócrates chino, identificó la poliuria, polidipsia y pérdida de peso como síntomas de una enfermedad específica (Karamanou et al., 2016; Peumery, 1987;). En el siglo VII, Chen Chuan retomó esta 9 información y describió la conjunción de síntomas que corresponden a sed intensa, grandes cantidades de orina con sabor dulce, para nombrar inicialmente a la enfermedad como “Hsiao kho ping”. Más tarde, en el siglo VIII, los médicos observaron la tendencia de los pacientes diabéticos a desarrollar infecciones cutáneas como furúnculos, úlceras de roedores y problemas de la vista. En el siglo XI d.C., el famoso médico arabo-islámico Avicena (980-1037) describió la diabetes en su libro de texto El Kanun (Canon de la Medicina) y mencionó la gangrena y la disfunción eréctil como complicaciones. Años después, el erudito medieval Moisés Maimónides (1138-1204) describió detalladamente la diabetes, incluidos los síntomas de la acidosis (Karamanou et al., 2016; Peumery, 1987). Tabla 1. Descubrimientos históricos sobre la DM, traducido y tomado de Tattersall (2016). Características clínicas de la diabetes Pairo de Ebers (Egipto, 1500 a.C.) Estado poliúrico Sushruta y Charaka (India, 5to siglo a.C.) Orina dulce: distinción entre pacientes Aretaeus (Cappadocia, 2do siglo d.C.) Estado poliúrico, lo llamo diabetes Chen Chuan (China, 7mo siglo) Orina dulce Avicenna (Arabia, 10mo siglo d.C.) Orina dulce; gangrena y complicaciones de impotencia Cetoacidosis diabética William Prout (Inglaterra, 18101820) Coma diabético Adolf Kussmaul (Alemania, 1874) Respiración acidótica Hiperlipidemia Albert Heyl (Filadelfia, 1880) Lipidemia retiniana Retinopatía Eduard von Jaeger (Alemania, 1855) Características generales Stephen Mackenzie y Edward Nettleship (Inglaterra, 1879) Microaneurismas Edward Nettleship (Inglaterra, 1888) Vasos nuevos, abalorios de venas retinianas Julius Hirschberg (Alemania, 1890) Clasificación de lesiones; específicas de diabetes Neuropatía y Pie diabético John Rollo (Inglaterra, 1797) Síntomas neuropáticos Marchal de Calvi (Francia, 1864) Neuropatía como complicación diabética William Ogle (Inglaterra, 1866 Parálisis del nervio ocular en diabetes Frederick Pavy (Inglaterra, 1885) Neuropatía periférica Julius Althaus (Alemania, 1890) Mononeuropatía Thomas Davies Pryce (Inglaterra, 1887) Úlceras perforantes del pie Nefropatía Wilhelm Griesinger (Alemania, 1859) Enfermedad renal en personas con diabetes Paul Kimmelstiel y Clifford Wilson (USA, 1936) Glomeruloesclerosis asociada con poliuria intensa 10 Después de revisar la historia y las investigaciones más recientes, se puede afirmar que la DM es un término general que se refiere a una familia heterogénea de trastornos metabólicos no transmisibles (Kerner y Bückel, 2014; Unnikrishnan et al., 2016; Winter y Signorino, 2003;), caracterizados por hiperglucemia crónica (Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales [NIDDK], 2016; Scobie, 2016). Estos trastornos metabólicos son crónicos y degenerativos en su naturaleza (Cole y Florez, 2020; Morla, 2004), y se manifiestan en la degradación del glucógeno, la oxidación de ácidos grasos, la producción de cetonas y la formación de urea, entre otros procesos (Stables y Rankin, 2010). La hiperglucemia es causada por una disfunción en el sistema endocrino (Cho et al., 2018), particularmente en el páncreas, que puede resultar en una disminución de la secreción de insulina, una alteración en la acción de la insulina o ambos (Islas y Revilla, 2004; Organización Mundial de la Salud [WHO], 2021). 2.1.2 Clasificación La DM puede presentar variaciones en términos de su fisiopatología, etiología e incluso epidemiología (Sathish, 2012). Como resultado, se ha clasificado en cuatro grupos (ver Fig. 1): DM Tipo 1 o insulinodependiente (IDDM), DM Tipo 2 o no insulinodependiente (NIDDM), DM Gestacional (GDM) y Otros tipos específicos de DM (National Diabetes Data Group [NDDG], 1979; The Expert Committee on The Diagnosis and Classification of DM, 2003). Figura 1. Clasificación de Diabetes, tomado de NIDDK (2018). 11 La DM Tipo 1 (T1DM) o insulinodependiente (IDDM) es una enfermedad crónico- degenerativa que se origina en una falta de secreción de insulina endógena, principalmente por las células β pancreáticas (Norris et al., 2020; Tébar y Escobar, 2014). Además, se considera una enfermedad inmunomediada debido a la destrucción autoinmune de las células β por las células CD4+, CD8+ y macrófagos que se infiltran en el páncreas (Foulis et al., 1991; Gillespie, 2006). Aunque se sabe que los procesos autoinmunitarios conducen a la disfunción de las células β, la etiología precisa y los mecanismos del desarrollo patológico aún no están muy claros (Ilonen et al., 2019). Existen varias suposiciones, aunque dos han tomado mucha fuerza a lo largo de los años. La primera sugiere que la formación de autoanticuerpos se induce tras la exposición a un presunto factor ambiental que desencadena una pérdida de la regulación inmunitaria en un paciente con inmunodeficiencias (Atkinson et al., 2014), como se ve en la figura 2. La segunda hipótesis sugiere que el deterioro autoinmunitario se produce únicamente por riesgo genético (Eisenbarth, 1986). Sin embargo, también hay otras hipótesis (Gale, 2006; Wilkin, 2001). Figura 2. Factores de riesgo para el desarrollo de T1DM, tomado de Gillespie (2006). La epidemiología de la T1DM muestra una menor prevalencia en comparación con la T2DM, y suele diagnosticarse en niños menores de 15 años, afecta a más de 500,000 niños y se presentan cerca de 900,000 nuevos diagnósticos cada año (Thunander et al., 2008). Sin embargo, también puede ser diagnosticada después de los 50 años (Thomas et al., 2018). Cerca del 90% de los pacientes con T1DM presentan síntomas como polidipsia, polifagia, poliuria y pérdida de peso, que son causados por la hiperglucemia (Dariya et al., 2019). 12 La DM Tipo 2 o no insulinodependiente (NIDDM) es una DM que surge por un defecto en la retroalimentación entre la acción de la insulina y la secreción de esta (Landgraf et al., 2019; National Institute for Health and Care Excellence [NICE], 2020; Valero y León, 2010). En el caso del uso de la insulina, generalmente se asocia a una resistencia a la insulina, debido a que algunos tejidos presentan una disminución en su sensibilidad a la hormona, lo que puede provocar una mayor generación de glucosa hepática y una disminución en la captación de glucosa en miocitos y adipocitos (Maassen et al., 2004; Stumvoll et al., 2005; Weyer et al., 1999; Zheng et al., 2018). Mientras que, a nivel de secreción de insulina, se produce una disfunción en los islotes pancreáticos, específicamente en las células β, lo que da como resultado una reducción en la liberación de insulina, que es insuficiente para mantener los niveles normales de azúcar en sangre (Barazzoni et al., 2018; Reaven, 1988; Stump et al., 2003; Wilcox, 2005). Algunos de los factores de riesgo para el desarrollo de T2DM (Fig. 3) son: Historial familiar: se ha encontrado que el riesgo de un hijo con un solo padre con DM es 3.5 veces mayor, mientras que, para hijos con ambos padres diabéticos, esta tasa se incrementa hasta 6 veces (Meigs et al., 2000). Además, la hipótesis de que la T2DM es una enfermedad hereditaria se sostiene gracias a observaciones en gemelos, la agregación familiar y las altas tasas observadas en poblaciones étnicas y raciales (Fletcher et al., 2002). La T2DM es conocida por desarrollarse en la edad adulta temprana o madura, pero su prevalencia aumenta con la edad (Lean et al., 2019). Sin embargo, en los últimos años se ha observado que los adultos de 45 a 64 años (~706,000 personas) son más propensos a desarrollar T2DM, seguidos de los adultos de 18 a 44 años (~452,000 personas), y finalmente, los mayores de 65 años (~326,000 personas) (Centers for Disease Control and Prevention [CDC], 2020; da Rocha et al., 2020; Harris et al., 1998). La raza y etnicidad también son características cruciales en la incidencia de T2DM, ya que se ha demostrado que en USA, grupos como los afroamericanos no hispánicos son los más susceptibles a desarrollar la enfermedad, seguidos de los hispanos, isleños del Pacífico asiático y blancos (Centers for Disease Control and Prevention, 2020; Divers et al., 2020). Esto se debe a varios factores, como que el HbA1c sanguíneo puede tener niveles más altos en estos grupos (Smalls, 2020). Además, tienen una mayor probabilidad de desarrollar síndrome metabólico (Adjei et al., 2020). En general, las minorías étnicas tienen una mayor predisposición, aunque la razón aún es desconocida (van der Linden et al., 2019). 13 Figura 3. Factores de riesgo para el desarrollo de T2DM, tomado de Fletcher et al. (2002). La obesidad y la inactividad física están estrechamente relacionadas con la perturbación del metabolismo de la glucosa y la resistencia a la insulina, lo que puede resultar en el desarrollo de T2DM (Chan et al., 1994; Eaton y Eaton, 2017; Helmrich et al., 1991; Koh-Banerjee et al., 2004; Ruegsegger y Booth, 2017). Se ha observado que las personas que tienen un índice de masa corporal (BMI) ≥30 kg/m2 y realizan niveles bajos de actividad física presentan una regulación de la glucosa alterada y tienen 30 veces más posibilidades de desarrollar la enfermedad (Diabetes Prevention Program Research Group, 2002; Venables y Jeukendrup, 2009; Weisman et al., 2018). Los receptores de insulina compiten entre adipocitos y miocitos (Eaton et al., 2002; Eaton y Eaton, 2017; Virtanen et al., 2002), lo que genera un conjunto de respuestas reguladoras epigenéticas a niveles elevados de insulina que conducen a una resistencia generalizada a la insulina intrínseca (Boden et al., 2001; Carbone et al., 2019; DeFronzo y Tripathy, 2009; Kahn y Flier, 2000). 14 Es importante destacar que tanto la T1DM como la T2DM son enfermedades con causas heterogéneas, lo que significa que presentan una amplia variedad de síntomas y formas de progresión. En algunos casos, puede resultar difícil realizar un diagnóstico preciso, ya que hay personas que no se ajustan claramente a una clasificación específica. Esto puede ser problemático, ya que la clasificación es esencial para determinar el tratamiento adecuado (según la American Diabetes Association [ADA], 2021). La DM Gestacional (GDM) es un trastorno metabólico que se produce durante el embarazo y se define como la intolerancia a la glucosa. Su diagnóstico se realiza durante el embarazo, independientemente del nivel de hiperglucemia, siempre y cuando no exista un diagnóstico previo de DM (Zhang et al., 2010). Generalmente, se diagnostica en el segundo o tercer trimestre, especialmente entre las 24 y las 28 semanas de gestación, ya que durante este período se producen cambios metabólicos significativos (Arribas y Vallina, 2007; Wu et al., 2020). El embarazo en sí mismo es un estado que implica cambios fisiológicos que afectan el metabolismo, y cuando se presenta junto con la DM, las complicaciones gestacionales son más frecuentes y graves, y están directamente relacionadas con el control de la glucemia (Cabrero, 2010; Rangel, 2010). Algunos de los riesgos asociados con la GDM incluyen un mayor riesgo de parto por cesárea (30%) y de hipertensión durante el embarazo (50%) (Deputy et al., 2018), un mayor riesgo de adiposidad fetal, posibles efectos negativos en el desarrollo neurológico y resistencia a la insulina tanto en la madre (Lowe et al., 2018; Scholtens et al., 2019) como en el feto (Dabelea, 2007; Simmons, 2008). Además, la madre puede desarrollar DM tipo 2 debido a una disfunción de las células beta pancreáticas (Buchanan et al., 2007). Por otra parte, el feto tiene un 70% de probabilidades de nacer prematuramente y un 30% de desarrollar macrosomía (O'Sullivan et al., 2011). La prevalencia estimada de GDM es del 4.7 al 13.7% en todo el mundo, y se estima que alrededor de 21 millones de nacimientos ocurren anualmente en mujeres con diabetes materna (Cho et al., 2018; Di Biase et al., 2018). 15 Finalmente, existen varios tipos de diabetes específicos que se adquieren por otras causas o de manera secundaria. Estos tipos de diabetes se clasifican en defectos genéticos de la función de las células beta, defectos genéticos en la acción de la insulina, enfermedades del páncreas exocrino, endocrinopatías, diabetes inducida por fármacos o químicos, infecciones, formas poco comunes de diabetes inmunomediada y otros síndromes genéticos a veces asociados con la diabetes (Figura 4) (Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales, 2018). Figura 4. Otros tipos de Diabetes, tomado NIDDK (2018). 16 2.1.3 Identificación El criterio para realizar un diagnóstico de DM (Figura 5) es un valor de glucosa plasmática ocasional de ≥ 200 mg/dL (≥ 11.1 mmol/L), glucosa plasmática en ayunas de ≥ 126 mg/dL (7.0 mmol/L) (en ayunas de 8-12 horas) y/o HbA1c ≥ 6.5% (≥ 48 mmol/mol Hb) (Khan et al., 2019; Russell y Zilliox, 2014; Petersmann et al., 2019; WHO, 2019). En cuanto al diagnóstico de GDM, se consideran dos posibles estrategias: la primera consiste en la prueba de tolerancia a la glucosa oral (OGTT) de 75 g, con valores similares o superiores en ayunas de 92 mg/dL (5.1 mmol/L), 1 hora: 180 mg/dL (10.0 mmol/L), y 2 horas: 153 mg/dL (8.5 mmol/L); la segunda es la prueba de carga de glucosa (GLT), en la que si el nivel de glucosa plasmática medido 1 hora después de la carga es 130, 135 o 140 mg/dL (7.2, 7.5 o 7.8 mmol/L, respectivamente) (American Diabetes Association [ADA], 2021; Russell y Zilliox, 2014; WHO, 2019). Figura 5. Diagrama de flujo del diagnóstico de DM, tomado de Kerner y Bückel (2014). 17 2.1.4 Complicaciones Patológicas La DM es una enfermedad que puede ocasionar múltiples daños al organismo. Por lo tanto, es fundamental mantenerla controlada, ya que, de no ser así, puede provocar el desarrollo de patologías a diversos niveles (American Diabetes Association, 2010). La hiperglucemia actúa como desestabilizador en el equilibrio y control de diversos procesos moleculares, especialmente en el desequilibrio de los agentes oxidantes y antioxidantes (estrés oxidativo), y provoca la formación de productos finales de glicación avanzada (AGEs) y Metilglioxal (MGO) (Jang et al., 2017; LaRocca et al., 2016;). Dichos productos causan apoptosis, autofagia, necroptosis y producción de citocinas proinflamatorias (Berchtold et al., 2016; Volpe et al., 2018), y juegan un papel fundamental en la progresión de diversas complicaciones diabéticas al dañar varios tejidos del cuerpo, como el corazón, los ojos, los riñones y el sistema nervioso (Di Rosa et al., 2016; Liang et al., 2017). Las complicaciones diabéticas suelen agruparse en dos categorías principales. La primera es la enfermedad macrovascular (CVD), caracterizada por el daño arterial y considerada una de las principales causas de muerte en el mundo (Abi Khalil et al., 2012; Harding et al., 2019). En este caso, se ha observado una tendencia al desarrollo acelerado de aterosclerosis, infarto de miocardio, disfunción cardíaca y enfermedad cerebrovascular, como accidente cerebrovascular (Filla y Edwards, 2016; Forbes y Cooper, 2013; Peters et al., 2016). Es importante destacar que las CVD pueden estar presentes tanto en pacientes con diabetes como en aquellos sin la enfermedad, pero la presencia de diabetes aumenta en tres veces el riesgo de padecer un infarto de miocardio (Canoy et al., 2021; Haffner et al., 1998; Laing et al., 2003; Schramm et al., 2008;). Además, las CVD suelen estar acompañadas por deterioro renal y, en el caso de la T2DM, suele haber un aumento en las dislipidemias, un control glucémico deficiente y elevaciones de la presión arterial (Drury et al., 2011; Forbes y Cooper, 2013; Forsblom et al., 2011; Prince et al., 2007), especialmente si el paciente presenta obesidad. La aterosclerosis se considera un trastorno inflamatorio crónico generalizado caracterizado por la acumulación de lípidos y la inflamación crónica en la pared arterial (Falk, 2006; Poznyak et al., 2020; Rajbhandari et al., 2021). La inflamación en las células endoteliales provoca la unión de macrófagos y células epiteliales a la pared de los vasos sanguíneos (Owusu y Barret, 2021), lo que facilita la absorción de lipoproteínas de baja densidad (LDL) que se encuentran en el torrente sanguíneo en el endotelio, resultando en la oxidación de estas LDL y su absorción en los macrófagos, convirtiéndose en células espumosas (O’Brien et al., 1996). Las células espumosas y monocitos combinados con células musculares lisas calcificadas forman 18 las placas ateroscleróticas (Boyle et al., 2017; Cheng et al., 2013; Sedding et al., 2018). Es importante destacar que las células espumosas son susceptibles a su fraccionamiento y liberan diversas moléculas que pueden obstruir el flujo sanguíneo, lo que aumenta el riesgo de infartos o accidentes cerebrovasculares (Federici y Lauro, 2005; Filla y Edwards, 2016). Las enfermedades microvasculares son otro grupo de complicaciones diabéticas que se caracterizan por causar daño a los vasos sanguíneos de menor tamaño. Aunque estas complicaciones no suelen ser significativas en términos de mortalidad, incluyen la nefropatía, retinopatía, neuropatía y anomalías vasculares en extremidades inferiores (Cheema et al., 2018; Gilbert, 2013; Lachin et al., 2017). Debido a que las células endoteliales de la microvasculatura son independientes a la insulina (Kaiser et al., 1993; Ogiso et al., 2022; Sabaratnam y Svenningsen; 2021), estos tejidos reciben constantemente entrada de glucosa no regulada, lo que aumenta la prevalencia de estas complicaciones. Los pacientes pueden desarrollar discapacidad visual, insuficiencia renal, accidentes cerebrovasculares, miocardiopatía diabética y disfunción de las extremidades inferiores (Shi y Vanhoutte, 2017). La nefropatía diabética (DKD) es una complicación microvascular importante que se caracteriza por una disminución progresiva en la tasa de filtración glomerular, albuminuria y una elevada presión arterial (Arroyo et al., 2008; Reichelt-Wurm et al., 2019; Thomas et al., 2015). A nivel histológico, se suele presentar expansión mesangial, glomeruloesclerosis, hipercelularidad extracapilar, fibrosis e inflamación (Afkarian et al., 2013; Clotet et al., 2016; Mottl et al., 2018; Reichelt-Wurm et al., 2019). La DN tiene un gran tiempo de progreso que, de no ser tratada, se desarrolla en una uremia fatal (Li et al., 2013a; Mogensen et al., 1983; Oshima et al., 2021; Wu et al., 2018). Es considerada la principal causa de enfermedad renal terminal y presenta un riesgo de 8 a 10 veces más alto de desarrollar complicaciones macrovasculares como ataques cardíacos y accidentes cerebrovasculares (Chronic Kidney Disease Prognosis Consortium, 2010; Couser et al., 2011). La retinopatía diabética (RD) es una de las principales causas de ceguera evitable en adultos de 20 a 74 años (Antonetti et al., 2006; Frank, 2004; Hirai et al., 2011). Se caracteriza por un conjunto de lesiones en la microvasculatura retiniana y durante su desarrollo es notable observar neurodegeneración retiniana, apoptosis neuronal y activación de la gliosis (Kern y Barber, 2008; Simó y Hernández, 2009; Simó et al., 2018). Cabe destacar que, aunque la activación de la gliosis de manera normal tiende a presentar características neuroprotectoras, si se encuentra en un estado persistente, conduce a la pérdida de la función de las células de Müller 19 y, por consiguiente, a la pérdida de neuronas retinianas (Goldman, 2014; Liu et al., 2016a; Wang y Lo, 2018). Es importante señalar que las alteraciones celulares y bioquímicas del progreso de la enfermedad son totalmente diferentes. En el caso de la RD temprana o retinopatía no proliferativa, se presenta el debilitamiento de la barrera hematorretiniana, el engrosamiento de la membrana basal vascular y la muerte de los pericitos (Cheung et al., 2010; Nguyen et al., 2008; Lois et al., 2014). Debido a estas alteraciones, puede haber condiciones hipóxicas prolongadas, lo que puede evolucionar hacia la retinopatía proliferativa. Esta última se caracteriza por cambios en la permeabilidad vascular, microaneurismas capilares, degeneración capilar y neovascularización (Gao et al., 2007; Lechner et al., 2017; Watanabe et al., 2005). Cabe resaltar que la causa de la ceguera recae en la neovascularización fibrosa y la tumefacción macular provocada por la acumulación de líquido. Adicionalmente, en algunos casos, también se puede desarrollar un desprendimiento de retina (Stitt et al., 2016). La neuropatía diabética (NeD) es un síndrome que se caracteriza por el daño de las fibras nerviosas, lo que puede afectar tanto la división somática como la autónoma del sistema nervioso periférico (Kim et al., 2012; Tesfaye et al., 2010; Zakin et al., 2019). Además, se ha observado daño en la médula espinal (Selvarajah et al., 2006) y en el sistema nervioso central superior (Wessels et al., 2006). Los síntomas de la NeD incluyen entumecimiento, deterioro de la visión, pérdida del equilibrio, atrofia, cicatrización deficiente, disfunción eréctil, enfermedades y disfunciones cardíacas (Edwards et al., 2008; Iqbal et al., 2018; Kaku et al., 2015). Además, se han observado otros síntomas como parestesia, alodinia, hiperpatía, hiperalgesia, disestesia, dolor central, dolor paroxístico lancinante y dolor urente continuo o quemante (Calcutt, 2002; Gibbons y Goebel- Fabbri, 2017; Vinik, 2004, 2010). La amputación de las extremidades inferiores es una preocupación importante en la NeD, ya que las personas con esta afección son propensas a desarrollar úlceras y lesiones en los pies (Boulton et al., 2005; Jeffcoate, 2015; Nongmaithem et al., 2016). Además, el entumecimiento y la pérdida de reflejos y tacto generalmente se presentan primero en las manos y los pies debido a que estas zonas presentan fibras nerviosas de mayor longitud, lo que conduce a una pérdida temprana de la velocidad de conducción (Quattrini et al., 2007; Umapathi et al., 2007). Es importante destacar que la NeD se puede diagnosticar mediante la identificación de anormalidades vasculares, como el engrosamiento de la membrana basal de los capilares y la 20 hiperplasia endotelial con la subsiguiente disminución de la tensión de oxígeno e hipoxia (Thrainsdottir et al., 2003; Kim et al., 2011, 2015; Feldman et al., 2019). Sin embargo, en estados avanzados, el deterioro de las fibras nerviosas puede provocar alteraciones en la sensibilidad a las vibraciones y en los umbrales térmicos, que progresan hasta la pérdida de la percepción sensorial (Rosenberger et al., 2020; Selvarajah et al., 2014; Woolf, 2011). 2.2 RNAs 2.2.1 Generalidades Cuando la biología molecular experimentó un importante avance, se empezaron a desarrollar los primeros proyectos para secuenciar genomas. Sin embargo, en lugar de proporcionar respuestas acerca del funcionamiento genómico, esto llevó a la formulación de hipótesis sobre el número de genes que codifican proteínas, que es relativamente bajo (alrededor de 21,000), en comparación con la cantidad de proteínas que existen (superior a un millón) (International Human Genome Sequencing Consortium, 2001). No fue hasta el descubrimiento y la profundización de la molécula del RNA cuando se planteó la hipótesis del "mundo del RNA". Este concepto se ve respaldado por diversas investigaciones, que van desde el descubrimiento de la naturaleza y función del RNA mensajero hasta el silenciamiento de genes, entre otros (ver Tabla 2) (Elliot y Ladomery, 2016). El mundo del RNA se sitúa en una idea conceptual que se remonta a hace unos 4,000 millones de años, cuando el RNA o una molécula químicamente similar (Higgs y Lehman, 2015; Sankaran, 2016) desempeñaba el procesamiento de la información y las transformaciones metabólicas necesarias para que surgiera la biología a partir de la química (Orgel, 1968; Ponnamperuma y Gabel, 1968). Otro importante aporte en biología molecular es el "dogma central", que destaca la relevancia del DNA y el RNA. El DNA almacena y replica la información genética, mientras que el RNA cumple un papel crucial en el transporte y la maduración de la información genética. Además, se ha observado que el RNA también puede tener actividad catalítica en reacciones bioquímicas (ribozimas) y capacidad de sintetizar DNA (transcripción reversa) (Woski y Schmit, 2004). Por otra parte, el RNA se considera un polinucleótido similar al DNA, pero difiere en su estructura porque presenta una ribosa en lugar de desoxirribosa y una base nitrogenada 21 diferente, el uracilo en lugar de la timina. Además, los enlaces fosfodiéster 3 '5’ son menos estables, lo que da como resultado una diferencia estructural significativa (Brown, 2008). Tabla 2. Principales aportaciones al conocimiento del RNA, Traducido de Elliot y Ladomery (2016). Ganador del premio Nobel Descubrimiento François Hollande, André Lwoff, Jacques Monod (1965) Naturaleza y función del RNA mensajero Robert Holley, Har Gobind Khorana, Marshall Nirenberg (1968) Primera secuenciación del tRNA Sidney Altman y Thomas Cech (1989) Ribozimas Richard Roberts y Phillip Sharp (1993) Splicing Andrew Fire y Craig Mello (2006) Silenciamiento genético por RNA de doble cadena Roger Kornberg (2006) Base molecular de la transcripción eucariótica Venkatraman Ramakrishnan, Thomas Steitz Yonath (2009) Estructura y función del ribosoma 2.2.2 Clasificación El RNA se presenta principalmente como una cadena sencilla, pero debido a su composición química, que le confiere cierta flexibilidad, puede adoptar una variedad de formas y tamaños. Existen tres tipos principales de RNA involucrados en la síntesis de proteínas (Tabla 3): el RNA mensajero (mRNA), el RNA de transferencia (tRNA) y el RNA ribosomal (rRNA) (Wang y Farhana, 2021). Como dicta el dogma central de la biología molecular, el mRNA se transcribe a partir del DNA y contiene el modelo genético para producir proteínas (Jacob y Monod, 1961; Koonin, 2012; Jafari et al., 2017). Por otra parte, los tRNA son moléculas de RNA que traducen el mRNA en proteínas; la función principal de un tRNA es transportar aminoácidos en su sitio aceptor 3' a un complejo de ribosomas con la ayuda de la aminoacil-tRNA sintetasa. El rRNA forma ribosomas, que son esenciales en la síntesis de proteínas. Los ribosomas contienen un sitio de salida (E), peptidilo (P) y aceptor (A) para unir aminoacil-tRNA y unir aminoácidos para crear polipéptidos (Raina y Ibba, 2014; Wang y Farhana, 2021). Adicionalmente, el consorcio ENCODE identificó diversos datos de secuencias largas de RNA no codificante (ncRNA), a través vías análogas a las de los genes codificadores de proteínas (Eddy, 2001; Derrien et al., 2012; Harrow et al., 2012; Zhang et al., 2019a). Estos hallazgos fueron de ayuda para identificar la diversidad de ncRNAs. Por parte de los ncRNAs 22 reguladores, se pueden identificar tres clases en base a la longitud de nucleótidos, siendo los RNAs pequeños, medianos y largos (Alvarez-Dominguez y Lodish, 2017; Ponting et al., 2009;). Los ncRNAs cortos presentan un tamaño entre 20 y 50 nucleótidos y lo integran los miRNA (micro RNA), siRNA (small interfering RNA), piRNA (Piwi-interacting RNA), crasiRNA (Centromere repeat associated short interacting RNAs) y telsRNA (telomere specific small RNAs), mientras que los snoRNA (Small nucleolar RNA), PROMPTS (yielding promoter upstream transcripts), tiRNA (tRNAderived stressinduced RNAs), snRNA (Small nuclear RNA), entre otros, fueron asignados a los ncRNAs medianos que van desde los 31 a 200 nucleótidos (Wang et al., 2017; Dahariya et al., 2019) y finalmente los ncRNAs largos que presentan potencia regulada máxima, y que constan de más de 200 nucleótidos, se clasifican como RNA largo no codificante (lncRNA) (Brown, 2008; Deveson et al., 2017) (Fig. 6). Tabla 3. Tipos y características de RNAs, elaboración propia. Tipo de RNA Función Características RNA mensajero (mRNA) Transporta información genética del DNA al ribosoma para la síntesis de proteínas. Largo, monocatenario, se transcribe a partir del DNA. RNA de transferencia (tRNA) Transporta aminoácidos al ribosoma para la síntesis de proteínas. Pequeño, estructura de hoja de trébol, contiene un sitio de unión para el aminoácido y un anticodón complementario al codón del mRNA. RNA ribosomal (rRNA) Componente estructural del ribosoma y sitio de síntesis de proteínas. Largo, forma estructuras complejas junto con proteínas para formar el ribosoma. RNA pequeño nuclear (snRNA) Procesamiento del RNA pre- mensajero. Pequeño, se encuentra en el núcleo, ayuda en el corte y empalme del RNA pre-mensajero. RNA pequeño nucleolar (snoRNA) Procesamiento del ARN ribosomal. Pequeño, se encuentra en el núcleo, ayuda a la maduración del RNAr. RNA interferente pequeño (siRNA) Regulación post-transcripcional de la expresión génica y defensa contra virus. Pequeño, se une a mRNA y lo degrada, ayudando en la defensa contra virus. 2.2.3 lncRNAs 2.2.3.1 Generalidades Los lncRNAs son transcriptos de RNA que constituyen la mayor proporción de transcriptomas no codificantes en mamíferos (Guttman et al., 2009; Mercer et al., 2009; Yao et al., 2019), aunque, se informa la presencia de lncRNA en muchos organismos como el pez cebra 23 (Pauli et al., 2011), los tetrápodos (Necsulea et al., 2014), los protozoos, los helmintos (Silveira et al., 2022), entre otros. Hay que destacar que los lncRNA poseen patrones distintivos conservados evolutivamente, con un mayor grado de especificidad tisular (Vance y Ponting, 2014). Principalmente se forman por acción de la RNA pol II (similares al mRNA) y RNA pol III en varios loci del genoma (The FANTOM Consortium et al., 2005), aunque se ha logrado observar que pueden surgir a partir de sus propios promotores, o de promotores compartidos con genes codificantes o no codificantes transcritos de manera divergente, incluso también de secuencias potenciadoras (Al-Tobasei et al., 2016; Hu et al., 2012). Generalmente estos RNAs se suelen encontrar en el núcleo y citoplasma (The ENCODE Project Consortium, 2007). Estudios previos revelaron un catálogo a gran escala de lncRNA como transcripciones putativas dentro del genoma humano que no codifican proteínas, pero muchas de ellas muestran cola poli-A+ y 5′- cap (Derrien et al., 2012), además de identificar una multitud de paradigmas regulatorios controlados por varios lncRNA que afectan la amplia gama de actividades celulares y se asocian funcionalmente con el desarrollo normal y la fisiopatología de bastantes enfermedades (Cipolla et al., 2018; Giroud y Scheideler, 2017; Melissari y Grote, 2016). No existe una definición de lncRNA que se base en argumentos biológicos y sea ampliamente aceptada en la comunidad. La definición más utilizada se basa en el umbral de 200 nucleótidos (nt) hasta 100 kilobases (kb) de la longitud del RNA y que tienen poca o nula actividad sobre la codificación de proteínas (Spizzo et al., 2012; Zhu et al., 2013; Trovero y Geisinger, 2019). Sin duda, la definición de lncRNA basada simplemente en la longitud es arbitraria. Actualmente, los lncRNA se definen como aquellos ncRNA que funcionan como transcritos primarios o empalmados, independientemente de las clases existentes conocidas de pequeños ncRNA (Amaral et al., 2011). En la figura 6 se esquematizan los principales tipos de ncRNA. 24 Figura 6. Diversidad y clasificación de los RNAs (tomado de Dahariya et al., 2019). En un inicio, debido a la ausencia de características particulares y su gran diversidad, los lncRNAs no tenían clasificación, ya que era algo irrelevante (García, 2019), pero tras el descubrimiento de su importancia a nivel transcripcional, junto con su procesamiento alternativo, que origina una cantidad considerable de isoformas (Mercer et al., 2009), es posible identificar los distintos lncRNAs de acuerdo con su posición genómica, que puede ser: intergénica, intrónica, potenciador, promotor, bidireccional, sentido o antisentido lncRNAs (Fig. 7) (Chekanova, 2015; Ma et al, 2013). Aunque también, pueden utilizarse clasificaciones de acuerdo con su estructura y su efecto sobre el genoma (Fig. 7). Debido a que los lncRNAs presentan distintas ubicaciones y transcripciones diversas, aquellos transcritos de regiones intergénicas se denominan lncRNAs intergénico (Liu et al., 2020), mientras que los transcritos que se originan a partir de intrones de genes que codifican proteínas, se denominan lncRNAs intrónicos (Ma et al., 2013). Se cree que los lncRNAs intergénicos e intrónicos están regulados a través de diversos mecanismos de transcripción (Prensner et al., 2011), además, de presentar diferencias en la poli(A) y una divergencia en las actividades, de acuerdo con la ubicación celular (Cheng et al., 2005), cabe destacar que existen unos tipos de RNAs intergénicos llamados “RNA no codificantes intergénicos largos” (lincRNA), que funcionan a través de distintos tipos de mecanismos regulación transcripcional cis o trans 25 control traduccional, regulación de splicing, regulación postranscripcional, entre otros (Ma et al., 2013). Los lncRNAs sentido, se transcriben a partir de una hebra de los genes que codifican a proteínas, que contienen exones de genes codificantes, además de poder superponerse con parte de los genes codificantes o cubrir la secuencia completa de estos tipos de genes (Devaux et al., 2015; Nociti y Santoro, 2021). Por otra parte, los lncRNAs antisentido se transcriben a través de hebras antisentido de genes codificantes (Devaux et al., 2015), cabe destacar que estos suelen aparecer cuando las transcripciones de la hebra antisentido de los genes codificadores de proteínas se superponen a un exón de un gen sentido a través de los exones de los lncRNA, las transcripciones del intrón de un gen sentido no tienen superposición exón- exón con este gen sentido y las transcripciones cubren la secuencia completa de un gen sentido a través de un intrón (Cui et al., 2021; Ma et al., 2013). Los RNAs potenciadores (eRNAs) son elementos reguladores cortos de DNA accesible que ayudan a establecer el programa transcripcional de las células aumentando la transcripción de los genes diana (Arnold et al., 2020). El proceso de producción de eRNA procede a través de los siguientes pasos: (1) reclutamiento de factores de transcripción y coactivadores necesarios para la formación de potenciadores y la activación de genes, (2) modificaciones de histonas en los loci potenciadores activos y (3) transcripción, elongación y procesamiento de eRNA. Las regiones potenciadoras y promotoras de los genes que codifican proteínas comparten propiedades y reglas similares para el inicio de la transcripción (Kaikkonen et al., 2013; Sartonelli y Laubeth, 2020). Los ncRNA bidireccionales denominados eRNA se transcriben en potenciadores, estos eRNA inducidos, como transcritos funcionales (Hah et al., 2011; Kim et al., 2010; Wang et al., 2011b), parecen ejercer funciones importantes para la inducción observada dependiente de ligandos de genes codificantes diana, lo que provoca un aumento de la fuerza del bucle potenciador: promotor específico iniciado por la unión (Li et al., 2013b). 26 Figura 7. Clasificación de los lncRNAs con base a la posición genómica (Ma et al., 2013) 27 2.2.3.2 Importancia de los lncRNAs En los últimos años, se ha puesto bastante atención a los lncRNAs, ya que se les vincula con procesos de diferenciación, apoptosis, respuesta inmune, desarrollo tisular, proliferación y migración celular (Atkinson et al., 2012; Rinn y Chang, 2012), además de estar asociados a procesos moleculares como regulación de la expresión de genes a nivel transcripcional o post- transcripcional, en el control de actividad de proteínas, modificaciones en la cromatina, organización de dominios nucleares, controlar la síntesis de proteínas y la maduración y el transporte del RNA (Carrieri et al., 2012; Li et al., 2017a; Nagano et al., 2008; Trovero y Geisinger, 2019; Wang y Chang, 2011) (Fig. 8). Cabe destacar, que el patrón de expresión es bastante peculiar, ya que distintos lncRNAs aparecen en tipos celulares determinados o en momentos específicos del desarrollo, con una especificidad mucho mayor de tejido/tipo celular/etapa del desarrollo, que los RNAs codificantes (Cabili et al., 2011; Luk et al. 2014). 28 Figura 8. Diversidad de lncRNAs y clasificaciones basadas en sus patrones de localización subcelular, su relación con genes codificadores de proteínas adyacentes o de homología, su interacción con otras macromoléculas y sus funciones biológicas de Guo et al. (2019). 29 2.2.3.3 Regulación de los lncRNAs Regulación de cromatina La detección de la asociación RNA-cromatina en todo el genoma (Bell et al., 2018; Bonetti et al., 2020; Chu et al., 2011; Li et al., 2017c), combinada con técnicas de captura de la conformación de la cromatina, ha revelado una regulación compleja en la arquitectura de la cromatina y la expresión génica mediante lncRNA (Isoda et al., 2017; Mumbach et al., 2019). Aunque estos mecanismos reguladores mediados por lncRNA deben explorarse individualmente, el RNA tiene un potencial regulador inherente, debido a que la carga negativa del RNA puede neutralizar las colas de histonas cargadas positivamente, lo que lleva a la descompactación de la cromatina (Dueva et al., 2019), por lo que la apertura y cierre de la cromatina mediada por el RNA podría funcionar como un cambio rápido de la expresión génica. Mecánicamente, tanto los lncRNA nucleares que actúan en cis como los que actúan en trans establecen interacciones con el DNA para alterar el entorno de la cromatina, a veces indirectamente en virtud de su afinidad por proteínas que pueden asociarse tanto con el RNA como con el DNA, y en otros casos mediante la unión del DNA en una secuencia específica (Statello et al., 2021). Interacciones directas entre lncRNAs y DNA. Una característica esencial de los lncRNA es su potencial para generar estructuras híbridas con DNA para influir en la accesibilidad de la cromatina, tales interacciones pueden tomar la forma de hélices triples o bucles en R. La prevalencia real de ambos tipos de estructuras aún se desconoce debido a la dificultad de detectarlas in vivo (Statello et al., 2021). Sin embargo, la formación de hélices triples y bucles en R probablemente esté muy extendida y sea esencial para la actividad reguladora de muchos lncRNA. Las hélices triples de RNA-DNA-DNA se han propuesto como un ejemplo de interacción de RNA-DNA no codificante en la mediación del silenciamiento génico (Martianov et al., 2007; O’Leary et al., 2015; Schmitz et al., 2010) o la activación (Grote et al, 2013; Mondal et al., 2015; O’Leary et al., 2015). El potencial para formar hélices triples se basa principalmente en la secuencia de RNA (Blank-Giwojna et al., 2019; Kuo et al, 2019; Li et al., 2016a). Localización y función de proteína-lncRNA en la cromatina. Los RNA largos no codificantes se unen a los reguladores de cromatina y se dirigen a ellos. La conexión íntima entre el RNA y la cromatina, el complejo DNA-proteína donde residen todos los genes eucariotas, se reconoció hace más de 40 años (Britten y Davidson, 1969). Paul y Duerksen (1975) hicieron el sorprendente hallazgo de que la cromatina purificada bioquímicamente contenía el doble de RNA 30 que, de DNA, lo que planteó la idea de que el RNA puede influir en la estructura de la cromatina y la regulación génica. A través de los años, se ha demostrado que el RNA es necesario para la estructura adecuada de la cromatina y el reclutamiento de los complejos modificadores de la cromatina en el DNA (Bernstein y Allis, 2005). Sin embargo, los tipos de RNA específicos asociadas, seguían siendo esquivas. Los estudios genéticos en las décadas siguientes revelaron algunos lncRNA que estaban asociados con la formación e impronta de heterocromatina [es decir, Xist (Brown et al., 1991), Air (Barlow et al., 1991), H19 (Bartolomei et al, 1991)]. Los avances en los últimos años han revelado numerosos ejemplos de lncRNA para controlar el acceso o la eliminación de proteínas reguladoras de la cromatina. Varios estudios han demostrado que los lncRNA pueden dirigirse a varios complejos de modificación de la cromatina implicados en el silenciamiento génico. Además, los lncRNA pueden dirigirse a diversos reguladores de la cromatina. Muchos complejos reguladores de la cromatina funcionan como proteínas de unión al RNA; la capacidad de unirse a los lncRNA les otorga reconocimiento específico de condición o alelo de la cromatina del gen diana (Bernstein et al., 2006; Jeon y Lee, 2011; Khalil et al, 2009; Kino et al., 2010; Martianov et al., 2007; Schmitz et al., 2010; Tripathi et al., 2010; Yao et al., 2010; Zhao et al., 2010). Numerosos lncRNA se localizan en la cromatina, donde pueden interactuar con proteínas, lo que facilita o inhibe su unión y actividad en regiones de ADN objetivo (Jain et al., 2016; Rosa et al., 2016; Yap et al., 2010). Además, las interacciones de cromatina de largo alcance asistidas por proteínas, como las interacciones de cromatina mediadas por el factor de unión CCCTC (CTCF), también pueden actuar como facilitadores de los efectos transcripcionales directos de lncRNA en los genes diana (Saldaña-Meyer et al., 2019; Xiang et al., 2014; Yang et al, 2015). Aunque la unión de lncRNA a factores de cromatina ha suscitado un interés considerable, se recomienda precaución al evaluar tales interacciones y se deben aplicar metodologías rigurosas en estos estudios. Además, los niveles de expresión de un lncRNA dado en relación con los factores con los que interactúa pueden definir el alcance de los efectos que ejercen los lncRNA en la cromatina objetivo (Schertzer et al, 2019). Interferencia transcripcional actuando por reposicionamiento del nucleosoma promotor. El DNA en el núcleo está organizado en cromatina con un andamiaje organizacional que consta de nucleosomas, cada uno con dos copias de histonas H3, H4, H2A y H2B (Kornberg y Lorch, 1999). Los nucleosomas pueden estar densamente empaquetados, interfiriendo con las interacciones proteína-DNA, o relajados, facilitando estas interacciones (Li et al., 2007). El proceso de transcripción, que genera DNA monocatenario a medida que RNAPII avanza a lo 31 largo de un locus génico, puede afectar directamente el posicionamiento del nucleosoma (Hughes et al., 2012; Valouev et al., 2011; Weiner et al., 2010). Por lo tanto, la transcripción de lncRNA podría causar interferencia transcripcional (TI) al depositar nucleosomas de una manera desfavorable para la unión de factores de transcripción en promotores o potenciadores. Transcripción de lncRNA creando un entorno de cromatina permisivo. Los potenciadores son elementos genéticos que se unen a los factores de transcripción y facilitan el ensamblaje de la maquinaria de transcripción en los promotores cercanos (Ong y Corces, 2012; Visel et al., 2009). Las transcripciones de RNAPII de hasta 2 kb de longitud se transcriben bidireccionalmente desde algunos potenciadores neuronales (denominados potenciadores o eRNA) (Kim et al., 2010; Ong y Corces, 2012). La transcripción de eRNA se correlacionó positivamente con la expresión de mRNA cercanos y se propuso un modelo, pero aún no probado experimentalmente, en el que su transcripción establece un paisaje de cromatina que respalda la función potenciadora. La transcripción de lncRNA, ya sea abriendo la cromatina o inhibiendo la unión de la proteína represora, podría resultar de manera similar en la activación del gen o del locus. Un ejemplo de esto es el proceso de recombinación V(D)J, que une elementos de la familia multigénica V, D y J mediante reordenamientos cromosómicos para crear inmunoglobulinas de células B funcionales y receptores de células T (Schatz y Swanson, 2010). Interferencia transcripcional actuando por modificaciones de histonas promotoras. Los nucleosomas asociados al promotor llevan modificaciones postraduccionales del extremo terminal de la histona, que reflejan el estado de actividad del promotor y también influyen en la accesibilidad de los factores de unión al DNA implicados en la transcripción (Bannister y Kouzarides, 2011). Se ha demostrado que algunas enzimas modificadoras de histonas se unen y viajan con RNAPII alargado (Brookes y Pombo, 2009; Ehrensberger y Svejstrup, 2012), por lo que es posible que la transcripción de lncRNA pueda inducir TI al afectar las modificaciones de histonas en el promotor de un gen diana superpuesto. Aunque no se han descrito estudios similares para el genoma de los mamíferos, H3K36me3 marca el cuerpo de los genes transcritos en los mamíferos, lo que plantea la posibilidad de que tales mecanismos de TI puedan conservarse (Brookes y Pombo, 2009; Ehrensberger y Svejstrup, 2012). Regulación transcripcional por reclutamiento de modificadores de cromatina. Los lncRNA median cambios epigenéticos mediante la metilación del DNA, la modificación de histonas y el reclutamiento de complejos de remodelación de cromatina en loci genómicos específicos, principalmente en las regiones promotoras, y provoca la represión o activación de los genes diana. Se encontró que el lncRNA podría cumplir dos funciones. (i) Los lncRNA actúan 32 como un andamio puente y se unen a una proteína o complejo proteico para facilitar los cambios conformacionales de la cromatina (Carrozza et al., 2005). (ii) Los lncRNA actúan como un andamio anclado que dirige las enzimas modificadoras de la cromatina a motivos [secuencias cortas de nucleótidos que se presume que desempeña una función biológica concreta] de DNA específicos. Por ejemplo, el lncRNA HOTAIR (RNA antisentido de la transcripción de Hox) actúa como un andamio de proteína epigenética y posee múltiples dominios de unión para distintas proteínas (Gummalla et al., 2012; Kim y Buratowski, 2009). Interferencia transcripcional actuando por metilación del DNA promotor. En los genomas de mamíferos, la metilación del DNA generalmente se asocia con promotores silenciosos de islas CpG, pero la mayoría de los promotores de islas CpG permanecen libres de metilación independientemente de su estado de expresión (Deaton y Bird, 2011; Jones, 2012; Ooi et al., 2009). El proceso de metilación de novo depende de las metiltransferasas DNMT3A/3B y del homólogo DNMT3L catalíticamente inactivo y requiere histonas que carecen de H3K4me3, lo que garantiza que los promotores activos permanezcan libres de metilación (Ooi et al., 2007). Sin embargo, los datos hasta ahora muestran que es un mecanismo que actúa en cis, ya que solo el alelo que lleva la deleción silencia el gen codificante de proteínas superpuesto. Además, aunque no se excluyó un papel para el producto de RNA aberrante, parece poco probable que la transcripción inducida por mutación de dos regiones cromosómicas intergénicas independientes en las enfermedades descritas produzca productos de RNAlnc con funciones represivas similares. Curiosamente, el silenciamiento de los genes pc impresos por los lncRNA también se correlaciona a menudo con la ganancia de metilación del DNA en el promotor silencioso del gen pc (Santoro y Barlow, 2011). En el caso del gen Igf2r, esta marca de metilación del DNA no es necesaria para iniciar o mantener el estado silencioso, pero parece desempeñar un papel en el refuerzo del estado silencioso (Latos et al., 2012; Santoro et al., 2013). Regulación de transcripción Se considera que la transcripción se regula por una interacción de factores de transcripción (TF) y factores modificadores de la cromatina en los promotores de genes. Los LncRNA modulan la expresión génica al asociarse específicamente con otras moléculas; DNA, RNA y proteínas, ya sea en los promotores o en los potenciadores de sus genes diana (Kornienko et al., 2013). Con un número creciente de lncRNAs implicados en la regulación de genes transcripcionales, esta visión puede necesitar refinamiento para incluir redes de lncRNAs específicos de tejidos y etapas de desarrollo que complementen los reguladores conocidos para 33 controlar estrechamente la expresión génica y, por lo tanto, la complejidad del organismo (Mattick, 2009; Mattick et al., 2010). La regulación transcripcional por lncRNAs podría funcionar tanto en cis como en trans, y podría controlar negativa o positivamente la expresión del gen. La posición relativa entre un lncRNA y sus genes vecinos es un determinante clave de su relación reguladora. Dado que se descubrió que la transcripción bidireccional y antisentido generalizada de lncRNA estaba conservada evolutivamente (Seila et al., 2008), la distribución genómica no aleatoria de los lncRNA podría representar una adaptación evolutiva de los genes para regular su propia expresión de una manera específica del contexto. Por ejemplo, la disposición genómica de los lncRNA divergentes es clave para la regulación génica en cis (Luo et al., 2016a). Esta regulación puede estar mediada por dos mecanismos principales que no se excluyen mutuamente: el transcrito de lncRNA puede regular loci vecinos y/o el acto de transcripción o empalme del lncRNA puede generar un estado de cromatina o un impedimento estérico que influya en la expresión de genes cercanos. Por lo tanto, se requiere la interpretación de varios experimentos ortogonales de pérdida de función y ganancia de función para discernir estos posibles modos de funcionalidad lncRNA (Gil y Ulitsky, 2020). Interferencia transcripcional en ausencia de cambios de cromatina en el promotor silenciado. La RNAPII actúa como portador de enzimas modificadoras de cromatina, otros modelos de TI predicen que RNAPII de un promotor que atraviesa otro promotor puede interferir con su actividad sin introducir cambios en la cromatina (Palmer et al., 2011; Pauler et al., 2007, 2012). Una indicación de que tal mecanismo puede ser utilizado por lncRNAs en mamíferos proviene de un estudio que utilizó un enfoque genético para diseccionar la función silenciadora del Airn lncRNA en ratones marcados (Barlow, 2011; Koerner et al., 2009). La demostración de que la transcripción de Airn se requiere continuamente para el silenciamiento de Igf2r y que su eficiencia de silenciamiento disminuye cuando el promotor de Igf2r se expresa fuertemente brinda soporte para un modelo en el que RNAPII iniciado desde un promotor 'interferente' interfiere con el inicio de la transcripción de un promotor 'sensible'. En apoyo de un modelo basado en la transcripción, se demostró que Kcnq1ot1 silencia al menos un gen al regular la flexibilidad de la cromatina y el acceso a los potenciadores (Korostowski et al., 2012). Esto es consistente con un modelo de dos pasos en el que la transcripción de lncRNA inicia el silenciamiento de genes no superpuestos mediante la interferencia del potenciador, luego las enzimas modificadoras de histonas represivas mantienen ese silenciamiento. Transcripción de lncRNA y activación de locus. Otros ejemplos indican que la transcripción de lncRNA activa la expresión génica al bloquear el acceso de los complejos 34 represores a la cromatina. Más tarde, se sugirió que este modo de acción era un mecanismo general, en el que el acto de transcripción sirve como un interruptor epigenético que alivia el silenciamiento génico mediado por PCG mediante el reclutamiento de modificadores epigenéticos para inducir la expresión génica y generar cromatina activa estable y hereditaria (Beisel y Paro, 2011). Un análisis de la transcripción de lncRNA en el grupo HOXA humano reveló una correlación positiva entre la transcripción de lncRNA y la pérdida de interacciones PCG/cromatina que precede a la activación del gen HOXA (Sessa et al., 2007). Sin embargo, la asociación de la transcripción de lncRNA con la activación de genes debe considerarse dentro del marco de que la mayoría de los promotores de genes que codifican proteínas en levaduras y células de mamíferos dan lugar a una transcripción bidireccional de lncRNA antisentido (Neil et al., 2009; Seila et al., 2008). Hasta la fecha, no está claro si los lncRNA bidireccionales asociados con el promotor representan una transcripción espuria en el contexto de la cromatina abierta (Brosius, 2005; Kowalczyk et al., 2012) o si se requiere para mantener la cromatina abierta. En el último caso, la unión mejorada de TF asegura una cromatina accesible que permite una expresión del gen pc más constante dentro de una población celular (Wang et al., 2011a). Silenciamiento de genes por lncRNAs. Los mecanismos más conocidos de represión génica mediada por lncRNA están relacionados con la compensación de dosis génica. El principal representante de esta funcionalidad es el lncRNA XIST, responsable de la inactivación del cromosoma X en células de hembras de mamífero, ya que, durante el desarrollo embrionario, las moléculas XIST se esparcen sobre uno de los dos cromosomas X y provocan el silenciamiento de gran parte de sus genes (Wutz, 2011). Los lncRNA pueden suprimir la expresión génica al interferir con la maquinaria de transcripción, lo que conduce a la alteración del reclutamiento de factores de transcripción o Pol II en el promotor inhibido (Latos et al., 2012), alteración de las modificaciones de histonas (Stojic et al., 2016) y reducción de la accesibilidad a la cromatina (Rom et al., 2019; Thebault et al., 2011). Otro mecanismo por el cual un lncRNA puede regular la TI generalizada está representado por el RNA regulador supresor adyacente (Chaserr) (Rom et al., 2019) lncRNA CHD2 conservado, que se encuentra río arriba del gen Chd2 del remodelador de cromatina, causando aumento de la accesibilidad en el promotor de Chd2, entre otros. Mecanismos por los cuales la transcripción de lncRNA silencia la expresión génica. El silenciamiento mediado por la transcripción, también conocido como (TI), se define aquí como un caso en el que el acto de transcripción de un gen puede reprimir en cis la transcripción funcional de otro gen (Palmer et al., 2011; Shearwin et al., 2005). Se ha informado de TI en 35 organismos unicelulares y multicelulares (Palmer et al., 2011). Los detalles del mecanismo aún no están claros en gran medida, pero TI podría actuar teóricamente en varias etapas de la transcripción: influyendo en la actividad del potenciador o promotor o bloqueando la elongación, el empalme o la poliadenilación de RNAPII. Todo lo que se requeriría es que la RNA polimerasa (RNAPII) iniciada a partir de un promotor 'interferente' atraviese una secuencia reguladora de ADN 'sensible'. TI se ha informado principalmente en promotores superpuestos (Bird et al., 2006; Bumgarner et al., 2009; Gummalla et al., 2012; Latos et al., 2012; Petruk et al., 2006), pero también hay ejemplos en los que TI actúa aguas abajo del promotor. Impronta genómica e inactivación del cromosoma X. La impronta genómica es el fenómeno del silenciamiento epigenético de un alelo heredado de cualquiera de los padres (Wood y Oakey, 2006). Las regiones de control de impresión (ICR) son tramos cortos de ADN que desempeñan un papel fundamental en la impresión de múltiples genes (Bartolomei, 2009). Curiosamente, se ha observado que las regiones impresas muestran una asociación significativa con los ncRNA, que median el silenciamiento por diversos mecanismos como la remodelación de la cromatina y la competencia potenciadora (Wan y Bartolomei, 2008). La inactivación del cromosoma X es un proceso mediado por el ncRNA-Xist largo, en el que se inactiva una copia del cromosoma X en las mujeres (Tsai et al., 2010), mientras que PRC2 se forma a partir del cromosoma X activo restante por la transcripción antisentido Tsix. Sin embargo, otro estudio describe un mecanismo alternativo en el que Xist y Tsix se hibridan para formar un dúplex de RNA que Dicer procesa para generar pequeños RNA de interferencia (siRNA) que son necesarios para las modificaciones represivas de la cromatina en el cromosoma X inactivo (Mercer et al., 2009). lncRNAs transcritos en potenciadores. Los potenciadores activos se pueden transcribir en dos tipos principales de RNA no codificantes: eRNA y lncRNA asociados a potenciadores (elncRNA). La distinción principal entre los dos grupos de transcritos se basa en sus características: los eRNA son transcritos con tapa bidireccional relativamente cortos, que generalmente no están empalmados, no poliadenilados y son inestables (Anderson et al., 2014; De Santa et al., 2010; Hon et al., 2017; Kim et al., 2010). Por el contrario, los elncRNA son en su mayoría unidireccionales, poliadenilados y empalmados. Aunque la correlación entre la actividad potenciadora y la expresión del eRNA está bien establecida, todavía se debate si las transcripciones del eRNA per se son funcionales (Statello et al., 2021). Cabe destacar que los (eRNA) son una categoría de lncRNA derivados de regiones potenciadoras de genes, que interactúan con el DNA para regular al alza la transcripción de genes a través de dos posibles 36 mecanismos, como el bucle potenciador-promotor y el seguimiento de la maquinaria transcripcional (Li et al., 2016b). Mientras estudiaban los potenciadores activados por la señalización de calcio en neuronas de ratón, Kim et al. (2010) por primera vez, identificaron un eRNA de aproximadamente 2 kb transcrito bidireccionalmente a partir de potenciadores activos. La expresión de este eRNA se correlacionó con la actividad de la región potenciadora (Andersson et al., 2014; Kim et al., 2010), lo que sugiere que los eRNA contribuyen a la función potenciadora e influyen en la transcripción de genes. Además de funcionar a través de conformaciones de cromatina preexistentes, algunos eRNA pueden facilitar o impulsar directamente el bucle de cromatina al interactuar con proteínas de andamiaje como el Mediador o el mantenimiento estructural de la cohesina del complejo cromosómico (Gil y Ulitsky, 2018; Tan et al., 2020). Estas interacciones generan contactos regulatorios entre potenciadores y promotores que pueden estar separados por varias megabases (Jiao et al., 2018; Kim et al., 2018; Li et al., 2013b). La activación de genes por elncRNA a menudo da como resultado fenotipos complejos relacionados con enfermedades humanas (Fanucchi y Mhlanga, 2017; Tan et al., 2017; van Steensel y Furlong, 2019). Un ejemplo de esto es el lncRNA SWINGN (está ubicado en el límite de un dominio de asociación topológica que incluye su gen objetivo GAS6) promueve la interacción entre los complejos de remodelación de cromatina SWI/SNF y el sitio de inicio de la transcripción de GAS6, pero también con loci distantes adicionales involucrados en fenotipos malignos, lo que explica su función prooncogénica (Grossi et al., 2020). Regulación en cis. La evidencia actual sugiere la existencia de lncRNAs que tienen la capacidad de regular genes de manera cis (en genes vecinos), ya que, a diferencia de los mRNA que de primera mano necesitan traducirse en el citoplasma para producir proteínas funcionales (Hoernes et al., 2016; Taniguchi et al., 2010), los lncRNA pueden existir en su conformación funcional inmediatamente después de su transcripción y, por lo tanto, teóricamente pueden ejercer su función en cualquier compartimento celular, incluido su sitio de transcripción (Kopp y Mendell, 2018; Latos et al., 2012) (Fig. 9). Por lo tanto, varios estudios han revelado que los lncRNAs ejercen la regulación en cis de elementos reguladores cercanos, como promotores y potenciadores (Engreitz et al., 2016; Groff et al., 2016; Paralkar et al., 2016). Estos lncRNAs que tienen la posibilidad de actuar en cis pueden hacerlo de dos maneras. El primero depende de un producto de lncRNA, como puede ser en el caso de la inducción de la inactivación de X por Xist en mamíferos hembra, ya que, Xist se expresa a partir de de uno de los dos cromosomas X e induce el silenciamiento de todo el cromosoma (Wutz, 2011). Dicho mecanismo en donde el transcrito se une y entrega modificadores epigenéticos a sus genes 37 diana mientras que aún están unidos al RNAPII en elongación generalmente se denomina 'anclaje' y se usa a menudo para explicar la regulación en cis por los lncRNA. Por el contrario, el segundo método de regulación en cis implica el proceso de transcripción en sí mismo que a priori actúa en cis (Kornienko et al., 2013). Varias líneas de evidencia sugieren que el mero proceso de transcripción de lncRNA puede afectar la expresión génica si RNAPII atraviesa un elemento regulador o cambia la organización general de la cromatina del locus (Heo y Sung, 2011; Magistri et al., 2012; Wang et al., 2011a). Figura 9. Elementos reguladores del RNA, mecanismos de función de núcleo y citoplasma, tomado de Elcheva y Spiegelman (2020). Actualmente, se desconoce el número exacto de lncRNAs reguladores en cis, aunque experimentos en fraccionamiento celular han denotado que una gran parte de lncRNAs se enriquecen en el núcleo y pueden unirse estrechamente a la cromatina (Engreitz et al., 2016; 38 Werner et al., 2017). Se ha demostrado que la expresión de los RNA enriquecidos en cromatina exhibe una mayor correlación con sus genes vecinos que con otros lncRNA, lo que sugiere que muchos de ellos podrían ser reguladores en cis (Werner et al., 2017). Redes reguladoras que involucran lncRNA que actúan en cis. Cada vez es más claro que la regulación en cis por lncRNAs no solo está determinada por los efectos uno a uno de un lncRNA en un gen vecino (Dimitrova et al., 2014). Los lncRNA son parte de unidades reguladoras complejas, en las que la expresión de un gen que codifica una proteína puede estar regulada por la actividad coordinada de dos o más lncRNA y de mecanismos dependientes e independientes de la transcripción (Statello et al., 2021). Varias de estas unidades actúan sobre genes esenciales del desarrollo o sobre loci con funciones importantes para mantener el equilibrio entre los procesos normales e hiperproliferativos (Bao et al., 2015; Groff et al., 2016; Huarte et al., 2010). El gen de los derivados del corazón y de la cresta neural expresados (Hand2) codifica un factor de transcripción esencial para el desarrollo del corazón, en el que el desequilibrio de la dosis puede causar graves malformaciones (Laurent et al., 2017). La eliminación en ratones de cualquiera de estos genes lncRNA conduce a la letalidad embrionaria. Uno de estos lncRNA, Upperhand, se transcribe a partir de un promotor bidireccional, de forma divergente al promotor Hand2 (Anderson et al., 2016; Han et al., 2019). En conclusión, varios factores interdependientes emergen como reguladores cruciales de la función de lncRNA: la posición relativa del lncRNA y el gen objetivo, la formación de interacciones co-transcripcionales de RNA-DNA y RNA-proteína, y si el efecto regulador está mediado por la transcripción de lncRNA o por su transcripción (Statello et al., 2021). La coocurrencia específica de células de estos factores determina el potencial regulador de los lncRNA individuales. Regulación en trans. Además de la regulación transcripcional de lncRNAs en cis, también existe el trans (en genes distantes), que de igual manera puede estar implicada en la organización de dominios nucleares y la regulación de proteínas o moléculas de RNA (Matsumoto et al., 2017; Ulitsky y Bartel, 2013). Sin embargo, además de probar la función trans potencial, las eliminaciones genéticas también pueden perturbar los mecanismos reguladores de cis (p. ej., mediante la eliminación de potenciadores de la transcripción). La inserción de señales de poliadenilación (poli-A) en los lncRNA puede interrumpir el alargamiento de la transcripción y revelar fenotipos in vivo (Anderson et al., 2016, Bond et al., 2009), pero dado que la actividad transcripcional local al comienzo de la transcripción del lncRNA sitio (TSS) a menudo puede regular genes cercanos, la inserción de poli-A puede no inactivar todas las funciones potenciales de lncRNA. Por otro lado, los métodos que se dirigen directamente a las transcripciones de 39 lncRNA para la degradación, como el uso de shRNA y oligonucleótidos antisentido (ASO), no distinguen claramente entre los mecanismos que actúan en cis y trans, particularmente para los lncRNA que se localizan en el núcleo (Kopp y Mendell, 2018, Wagschal et al., 2012). Algunos ejemplos significativos de lncRNA que actúan en trans son aquellos que pueden influir en la producción transcripcional general de una célula al afectar directamente la actividad RNAPII. Un ejemplo es el lncRNA 7SK de 331 nucleótidos, que reprime el alargamiento de la transcripción al evitar que el factor de transcripción PTEFβ fosforila el dominio carboxi-terminal (CTD) RNAPII (Peterlin et al., 2012). Otro ejemplo es el lncRNA B2 de 178 nucleótidos, un represor general de la actividad RNAPII tras el choque térmico (Espinoza et al., 2004). El lncRNA B2 actúa al unirse a RNAPII e inhibir la fosforilación de su CTD por TFIIH, alterando así la capacidad de RNAPII para unirse al ADN (Espinoza et al., 2007; Yakovchuk et al., 2011). La regulación en trans también puede actuar en un lugar específico. Si bien la capacidad de los lncRNA para actuar de forma específica en el locus para regular un conjunto de genes se demostró por primera vez en genes impresos en los que se demostró que la expresión de lncRNA silencia de uno a diez genes flanqueantes en cis (Mancini-Dinardo et al., 2006; Sleutels et al., 2002; Williamson et al., 2011), los lncRNA que se encuentran fuera de los grupos de genes impresos, como el lncRNA HOTAIR, también se descubrió que tenían una acción locus específica. HOTAIR interactúa con el complejo represivo 2 de Polycomb (PRC2) y es necesario para la trimetilación represiva de la histona H3 lisina-27 (H3K27me3) del grupo HOXD. La orientación de los modificadores epigenéticos (EM) por parte de los lncRNA proporcionó un modelo muy buscado para explicar cómo los EM obtienen especificidad de locus, y desde entonces se ha sugerido como un mecanismo general para los lncRNA de acción trans (Guttman y Rinn, 2012; Ng et al., 2012). Temas mecanicistas emergentes: señuelos, andamios y guías Como ya se ha mencionado antes, los lncRNAs tienen una capacidad intrínseca para unirse a proteínas, provocando diversas capacidades reguladoras (Derrien et al., 2012); sin embargo, a pesar del amplio conocimiento que se tiene en el área, solamente se conocen un par de ejemplos caracterizados, por lo cual han surgido varios temas mecánicos de las funciones de los lncRNAs (Wang et al., 2011d). A pesar de todo, se han descrito tres principales temas mecanicistas: ● Señuelos: en primer lugar, y al nivel más simple, los lncRNA pueden servir como señuelos que impiden el acceso de las proteínas reguladoras al DNA (Wang et al., 2011c). Por ejemplo, el lncRNA Gas5 se induce tras la inanición del factor de crecimiento; Gas5 40 contiene un motivo de secuencia de horquilla que se parece al sitio de unión al DNA del receptor de glucocorticoides en inanición sirve como señuelo para liberar el receptor del DNA para evitar la transcripción de genes metabólicos (Kino et al., 2010). Se identificó un ejemplo de señuelo de lncRNA más reciente, denominado PANDA, que se asocia con el factor de transcripción NF-YA para prevenir la apoptosis mediada por p53 (Hung et al., 2011). ● Andamio: los lncRNA pueden servir como adaptadores para llevar dos o más proteínas a complejos discretos (Spitale et al., 2011; Zappulla y Cech, 2006); Un ejemplo de andamios lncRNA es HOTAIR, que puede unirse simultáneamente tanto al complejo PRC2 como al LSD1-CoREST a través de dominios específicos de la estructura del RNA (Tsai et al., 2010). Esta combinación garantiza el silenciamiento génico. Ejemplos adicionales incluyen ANRIL, que combina el PRC2 y el PRC1 (Kotake et al., 2010; Yap et al., 2010); y Kcnq1ot1, que interactúa tanto con PRC2 como con G9a para promover H3K27me3 y H3K9me3, dos tipos de histonas silenciadoras diferentes (Pandey et al., 2008). Es probable que ambas combinaciones refuercen el estado transcripcionalmente silencioso (Guttman et al., 2011; Khalil et al., 2009). ● Guías: como se describió anteriormente, muchos lncRNA se requieren individualmente para la localización adecuada de complejos proteicos específicos. Los lncRNA involucrados en la compensación de dosis y la impresión (Xist, Kcnq1ot1, Air) sirven como guías para orientar la actividad de silenciamiento de genes en una forma específica de alelo. HOTAIR también sirve como guía para localizar el PRC2 en la expresión génica relacionada con el desarrollo y el cáncer (Gupta et al., 2010; Rinn et al., 2007). Los lncRNA de guía combinan dos funciones moleculares básicas: la unión de una proteína asociada más un mecanismo para interactuar con regiones selectivas del genoma. El concepto de guía lncRNA se ha analizado previamente según si la guía ocurre en cis (en genes vecinos) o en trans (en genes ubicados a distancia). Se ha asumido que los actores cis ocurren de manera cotranscripcional, lo que lleva a la analogía de los lncRNA como ataduras (Lee, 2009), al igual de tener capacidad de obrar en trans (Jeon y Lee, 2011; Martianov et al., 2007; Schmitz et al., 2010). Las acciones cis tampoco se correlacionan simplemente con la distancia desde el sitio de síntesis de lncRNA (Nagano et al., 2008; Wang et al., 2011d), lo que quizás refleja el importante papel del bucle cromosómico en los llamados efectos cis. Curiosamente, todos los ncRNA clásicos largos y pequeños que se han caracterizado bien también funcionan en trans a través de 41 interacciones con proteínas (es decir, rRNA, tRNA, snoRNA, RNase P, TERC) (Chu et al., 2011; Delebecque et al., 2011; Simon et al., 2011). Estos tres modos de acción abarcan muchos de los temas mecánicos de los lncRNAs descubiertos recientemente, aunque es probable que haya muchos otros mecanismos por descubrir. Está claro a partir de los ejemplos anteriores que, a medida que se descubren socios de proteínas adicionales y mecanismos de orientación (no sólo al DNA sino quizás también a otras estructuras celulares), es posible construir scripts reguladores complejos a partir de lncRNAs (Delebecque et al., 2011). Será esencial para comprender el significado de dichos guiones tener una comprensión sistemática de las partes individuales de lncRNA y sus interacciones relevantes, probablemente similar a lo que fue en su momento descifrar los codones de los RNA mensajeros. Regulación postranscripcional Además de sus funciones en la regulación de la transcripción y la organización nuclear, los lncRNA controlan otros aspectos de la expresión génica, y algunos lncRNA incluso se traducen en péptidos funcionales (Hartford y Lal, 2020). De acuerdo con lo ya mencionado, las diversas funciones de lncRNAs recaen sobre las regulaciones postranscripcionales, traduccionales y postraduccionales. A nivel postranscripcional, los lncRNA regulan actuando como RNA endógenos competitivos que regulan los niveles de microRNA que, a su vez, modulan los niveles de mRNA al alterar la estabilidad del mRNA, el decaimiento del mRNA y la traducción (Dykes y Emanueli, 2017). Modos de interacciones directas lncRNA-proteína. Los lncRNA están involucrados en la regulación postranscripcional mediante el secuestro de proteínas a través de su unión a motivos o estructuras de secuencia de RNA, para formar complejos específicos de lncRNA- proteína (lncRNP), lo que da como resultado una alteración en el empalme y el recambio del mRNA y, en ciertos contextos biológicos, en la modulación de vías de señalización (Wang et al., 2002; Yap et al., 2018). Abundantes lncRNA, como los lncRNA y SPA (Mattick et al., 2023; Wu et al., 2016) relacionados con el RNA pequeño nuclear en la región PWS y PNCTR (Yap et al., 2018), contienen grupos de motivos que secuestran diferentes factores de empalme, incluidos los motivos UGCAU y GCAUG, que están unidos por RBFOX2, secuencias ricas en UG unidas por TDP43 y motivos YUCUYY y YYUCUY unidos por PTBP1142, lo que suprime el empalme de los pre-RNAm que contienen los mismos motivos (Wu et al., 2016; Yap et al., 2018; Yin et al., 2012). Otros mecanismos de regulación de empalme mediada por lncRNA implican modificaciones postraduccionales moduladoras de lncRNA de factores de empalme, represión 42 de empalme a través de la formación de híbridos de RNA-RNA con pre-RNAm objetivo y ajuste fino del empalme del gen objetivo a través de la remodelación de la cromatina (Romero-Barrios et al., 2018). Además de unirse a motivos de secuencia, los lncRNA pueden plegarse en estructuras que interactúan con proteínas involucradas en vías de señalización clave. Por ejemplo, FAST se transcribe a partir de la hebra antisentido del gen6 FOXD3, se expresa en gran medida en hESC y se requiere para el mantenimiento de la pluripotencia de hESC (Guo et al., 2020). Queda por explorar la base molecular de cómo estas proteínas RBP no canónicas interactúan con los lncRNA. No obstante, la relación estequiométrica entre este grupo de lncRNA y sus proteínas que interactúan debe evaluarse cuidadosamente. Emparejamiento con otros RNA para reclutar complejos de proteínas. Algunos lncRNA pueden emparejarse directamente con otros RNAs y, posteriormente, reclutar proteínas involucradas en la degradación del RNAm. Por ejemplo, la descomposición del RNAm mediada por Staufen se lleva a cabo mediante la proteína de unión a RNA bicatenario Staufen homólogo 1 (STAU1), que se une a las regiones 3' no traducidas de los RNAm que se están traduciendo (Gong y Maquat, 2011; Kretz et al., 2013; Wang et al., 2013). Los lncRNA que contienen retroelementos Alu en humanos u otros elementos intercalados cortos (SINE) en ratones (Wang et al., 2013) pueden promover la descomposición del RNAm mediada por Staufen de los RNAm que tienen una complementariedad parcial o total con estas repeticiones mediante el reclutamiento de STAU1 (Gong y Maquat, 2011). El antisentido de la ubiquitina carboxi-terminal hidrolasa L1 (AS-Uchl1) es un lncRNA nuclear que contiene una repetición SINEB2, que está implicada en la función cerebral y las enfermedades neurodegenerativas en ratones (Carrieri et al., 2012). Cabe destacar, que los lncRNA que actúan en trans están emergiendo como importantes reguladores postranscripcionales Esponjas moleculares de microRNAs. Algunos lncRNA abundantes que contienen sitios complementarios de microRNA (miRNA) pueden regular la expresión génica como RNA endógenos competitivos o "esponjas" de miRNA, lo que reduce la disponibilidad de miRNA para apuntar a los mRNA. La relación estequiométrica entre un RNAlnc endógeno competitivo potencial y los miRNA es importante para lograr un efecto medible en la expresión del RNAm diana (Bosson et al., 2014; Denzler et al., 2014). Funciones reguladoras de los orgánulos. Curiosamente, numerosos lncRNA se localizan en orgánulos específicos, como exosomas y mitocondrias (Carlevaro-Fita et al., 2016; Mercer et al., 2011; Noh et al., 2016; Rackham et al., 2011). Debido a que los exosomas se liberan regularmente en el entorno extracelular, los lncRNA localizados en exosomas pueden 43 secretarse y terminar en las células receptoras, donde se encuentra que dichos lncRNA están involucrados en la regulación epigenética, la reprogramación del tipo celular y la inestabilidad genómica (Gudenas y Wang, 2018; Li et al., 2018; Statello et al., 2018). Los lncRNA localizados en mitocondrias pueden ser codificados tanto por el DNA nuclear como por el mitocondrial, y a menudo, se asocian con el metabolismo mitocondrial, la apoptosis y la diafonía de las mitocondrias con los núcleos (Zhao et al., 2018). El RNA no codificante oncogénico específico del melanoma mitocondrial asociado a la supervivencia del lncRNA codificado nuclearmente (SAMMSON) controla la homeostasis mitocondrial (Leuci et al., 2016), la maduración del RNA ribosomal 16S mitocondrial y la expresión de polipéptidos codificados por mitocondrias (Vendramin et al., 2018). El descubrimiento de otros lncRNA específicos de orgánulos probablemente proporcionará una visión mecánica adicional de la conexión entre la regulación de lncRNA y la homeostasis de los orgánulos (Statello et al., 2021). lncRNA como fuente de miRNA. La mayoría de los pri-miRNA generalmente tienen más de 1 kb de longitud (Kim et al., 2009); y por lo tanto puede considerarse como una forma de lncRNA. Hay dos fuentes principales de pri-miRNA en el genoma: (i) pri-miRNA que están incrustados dentro de otro gen y cuya expresión generalmente, pero no siempre, está vinculada a la expresión de la transcripción original, y (ii) pri-miRNA que se transcriben independientemente de los genes de miRNA que contienen promotores que regulan su transcripción principalmente por la RNA polimerasa II (RNA PolII) de manera similar al RNAm (Dykes y Emanueli, 2017). Aproximadamente el 50 % de los miRNA se producen a partir de transcritos no codificantes (Saini et al., 2007); sin embargo, con los miRNA incrustados en los genes codificantes, muchos miRNA también se encuentran dentro de los intrones de los genes no codificantes (Dykes y Emanueli, 2017). Tal organización genómica sugiere que el lncRNA huésped no actúa simplemente como un pri-miRNA, sino que puede tener otras funciones adicionales codificadas por los exones. Por ejemplo, DLEU2 es el gen huésped del miRNA supresor de tumores, grupo miR-15a/16.1 ubicado dentro de su tercer intrón (Srijyothi et al., 2018). lncRNA como regulador negativo de miRNAs. Se sabe que los miRNAs actúan como reguladores negativos de la expresión génica. Las transcripciones se dirigen a través de la unión de una secuencia semilla corta de 6 a 8 nt dentro del miRNA a un elemento de respuesta de miRNA (MRE) en las regiones 3 'UTR de los objetivos (Srijyothi et al., 2018). Las predicciones computacionales basadas en secuencias de semillas de miRNA encontraron que muchos lncRNA contienen sitios de unión a miRNA (Zhang et al., 2019 c, d). Esto plantea una posibilidad interesante de que muchos lncRNA funcionen para regular la expresión génica mediante el 44 secuestro de miRNA, lo que limita su concentración dentro de la célula y, por lo tanto, reduce la reserva de miRNA disponible en la célula (López-Camarillo et al., 2021). De esta forma, el lncRNA actúa como un regulador negativo de la función de miRNA y, por tanto, como un regulador positivo de la expresión génica. Esto se conoce como la hipótesis del RNA endógeno competitivo (RNAce) (Salmena et al., 2011; Thomas et al., 2010). Por ejemplo, el lincRNA-ROR intergénico, que inhibe miR-145 en células madre embrionarias pluripotentes (Dykes y Emanueli, 2017). Los RNA endógenos competitivos (ceRNA) son lncRNA que secuestran miRNA e inhiben las funciones de miRNA; tienen dos formas estructuralmente distintas, como lineal y circular. Los lncRNA no circulares o lineales son moléculas monocatenarias que se unen a los miRNA y regulan la expresión génica al promover su degradación (Dempsey y Cui, 2016). Los RNA circulares (circRNA) son un tipo de lncRNA formador de anillo que se forma uniendo los extremos 3 'y 5' con un enlace covalente de empalme posterior (Ashwal-Fluss et al., 2014). Además, los lncRNA pueden facilitar la inhibición de la traducción o descomposición del RNAm mediante el apareamiento parcial de bases con las secuencias 3'UTR a través de sus elementos Alu en forma mediada por Staufen (Gong y Maquat, 2011). Es probable que una transcripción no codificante que comparte un alto grado de homología con un gen codificante comparta muchos de sus MRE y, por lo tanto, los pseudogenes se consideran buenos candidatos para actuar como RNAce (An et al., 2017; Milligan y Lipovich, 2015; Poliseno et al., 2010). Degradación de mRNA mediada por lncRNA e independiente de miRNA. Además de regular la expresión génica a través de la interacción con los miRNA, algunos lncRNA se dirigen directamente al mRNA para su degradación (Srijyothi et al., 2018). Por ejemplo, Staufen 1 (STAU1) es una proteína que reconoce un motivo específico en el 3 'UTR de los ARNm y media su degradación por descomposición mediada por mRNA sin sentido (NMD) (Park y Maquat, 2013). STAU1 se une a un motivo de ARN de doble cadena dentro de la UTR 3 'del ARNm que codifica el factor 1 de ribosilación de ADP (ARF1), donde forma una estructura de bucle de tallo. Sin embargo, algunos ARNm dirigidos por la descomposición mediada por Staufen carecen de la estructura de bucle de tallo y contienen solo un sitio de unión monocatenario dentro de la 3 'UTR, por ejemplo, el miembro 1 del clado E del inhibidor de serpina peptidasa (SERPINE1). Curiosamente, tales ARNm son el objetivo de un lncRNA que lleva un sitio de unión monocatenario complementario y la unión imperfecta de lncRNA al mRNA crea un motivo de unión de ARN bicatenario para STAU1. Esta clase de lncRNA se denomina ARN con sitio de unión medio STAU1 (Gong y Maquat, 2011). 45 Activación de ncRNA. Éstos son una clase de lncRNA que se transcriben a partir de loci independientes, pero no a partir de potenciadores, y tienen una función de activación transcripcional (Ørom et al., 2010; Yang et al., 2016). La activación de los ncRNA activa específicamente la transcripción de los genes codificantes vecinos de una manera dependiente del ARN y requiere la actividad del promotor del gen codificante (Yang et al., 2016). Estos ncRNA activadores son funcionalmente similares a los eRNA. Sin embargo, a diferencia de los eRNA, los ncRNA activadores son transcritos estables poliadenilados y empalmados. La activación de genes mediada por los ncRNA activadores requiere un cambio en la conformación cromosómica para acercar el locus de los ncRNA activadores al promotor de su gen diana (Lai et al., 2013). Se ha demostrado que varios ncRNA activadores están asociados con el complejo mediador que está implicado en la unión de promotores con potenciadores; y el agotamiento de este complejo inhibe el bucle entre el locus de activación de ncRNAs y su gen diana. Por lo tanto, el eRNA y los ncRNA activadores funcionan interactuando con el mismo conjunto de moléculas, formando un andamio para un complejo proteico que une el elemento similar al potenciador y el promotor de un gen codificante (Malik y Roeder, 2010). 2.2.4 Enfermedades asociadas a lncRNAs Los lncRNAs son un grupo de transcritos muy estudiados para entender el papel que desempeñan en los organismos (Mercer et al., 2009). Actualmente, toman relevancia en diversas áreas de investigación, debido a las múltiples características que presentan, como por ejemplo tener regiones genómicas conservadas, lo que indica una relación funcional a lo largo de la historia evolutiva (Johnsson et al., 2014). Pero la más relevante, es el papel que desempeñan en funciones moleculares, ya sea por su capacidad de actuar a niveles epigenéticos (Chang y Han et al., 2016), modificación de la cromatina (Fan et al., 2015) e inclusive su capacidad reguladora (Chen et al., 2018). Dichas características moleculares han sido fundamentales para el estudio y profundización sobre la etiología y desarrollo de enfermedades (Beermann et al., 2016). Algunas de las enfermedades con las que se relacionan los lncRNAs, consisten en manera principal con afecciones directas al metabolismo, aunque también son observables enfermedades complejas (Goyal et al., 2018) e inclusive gran parte de los diversos cánceres que existen, tienen relación con estos transcritos, debido a que están implicados con su aparición, desarrollo y complicación (Bhan et al., 2017). 46 En el caso de las enfermedades que afectan al metabolismo, se han identificado afecciones de lncRNAs a nivel de órganos, como pueden ser el hígado, páncreas, músculos, cerebro y órgano adiposo (Giroud y Scheideler, 2017). Las problemáticas que implican al hígado están asociadas con la homeostasis energética y el metabolismo hepático (Rui, 2014), en donde algunos lncRNAs que se han identificado son lncLSTR, lncRNA SRA, MALAT1, Srebp1C, entre otros (Yan et al., 2016). En el páncreas se han identificado una gran cantidad de lncRNAs que actúan a diversos niveles del órgano (Benner et al., 2014; Ku et al., 2012; Morán et al., 2012), algunos de los lncRNAs más estudiados son lncRNA TUG1 (Yi et al., 2015), lncRNA HILNC25 (Losko et al., 2016), y lncRNA PLUTO (López–Noriega y Rutter, 2021), lncRNA MEG3 (Chen y Song, 2021). Por otra parte, el músculo esquelético es considerado un tejido metabólico de una alta actividad energética, ya que sus principales funciones recaen en el almacenamiento y suministro de nutrientes, además de su capacidad de reacción ante estímulos hormonales (Fritzen et al., 2020; Hargreaves y Spriet, 2020). En el caso del lncRNA MD1, se ha observado una actividad en la diferenciación muscular, por lo cual, su desregulación puede afectar la activación de factores de transcripción, dando origen a diversos estragos en la expresión génica de genes específicos musculares (Cesana et al., 2011; Li et al., 2021a), otro lncRNA relevante es el Dum, el cual representa una importancia en la regulación de la miogénesis y la regeneración muscular inducida por daños, a través del reclutamiento de Dnmts (DNA metiltransferasa) (Li et al., 2018; Wang et al., 2015). En el caso del músculo cardiaco, presenta diversas exposiciones de señales a nivel tejido extrínseco y tejido intrínseco (Hernandez et al., 2001; McMullen y Drew, 2016; Liapi et al., 2020), por lo cual es común encontrar enfermedades que afectan al metabolismo y función del corazón, adicionalmente pueden provocar un conjunto disfunciones, hipertrofias e inclusive enfermedades cardiacas de distinto nivel (Hall et al., 2015; Mandavia et al., 2013). Algunos de los lncRNAs que están asociados con remodelamiento cardiaco son lncRNA P21, lncRNA APF, lncRNA CARL, lncRNA Chaer, lncRNA CHRF, lncRNA H19, lncRNA Mhrt, lncRNA MIAT, lncRNA NRF, y lncRNA ROR (Shen et al., 2017). El cerebro es un órgano indispensable en la detección de fluctuaciones metabólicas de hormonas y nutrientes, también actúa de manera clave en la homeostasis energética, debido a su capacidad de regulación energética a través de la de ingesta de alimentos y el gasto de energía (Giroud y Scheideler, 2017; Luna et al., 2021; Nimgampalle et al., 2021; Roh et al., 2016). 47 Existen una amplia gama de lncRNAs, que tienen participación en el cerebro, ya sea en sus rutas metabólicas, en enfermedades neurodegenerativas, entre otros. Algunos de los lncRNAs que se han identificado son lncRNA MIAT (Aprea et al., 2013), lncRNA MALAT1, lncRNA NEAT1 (Bernard et al., 2015; Fox y Lamond, 2010; Sunwoo et al., 2017), lncRNA BACE1antisense (Faghihi et al., 2008). La principal función del tejido adiposo es el equilibrio homeostático del organismo, ya que de acuerdo con la situación en la que se encuentre, tendrá diversas actividades, en el caso de una ausencia o disminución considerable de nutrientes, serán liberados ácidos grasos, por el contrario, si existe un estado de exceso de nutrientes, se desarrollara un almacenamiento energético a través de los adipocitos. La principal relación que existe del tejido adiposo con algunas complicaciones o posibles enfermedades que se desarrollen a causa de los lncRNAs, es a través de la adipogénesis y metabolismo de adipocitos (Liang et al., 2021; Wei et al., 2016), ya que los lncRNAs, fungen como reguladores de estas funciones, ejemplos de esto son lncRNA PU.1 AS (Wei et al., 2015), lncRNA NEAT1 (Cooper et al., 2014), lncRNA ADINR (Xiao et al., 2015), lncRNA ADNCR y lncRNA H19 (Li et al., 2016c). Por otra parte, una de las principales enfermedades en donde la investigación de los lncRNAs ha tomado mayor importancia es el cáncer, debido a que son asociados con distintos tipos de esta fisiolpatología (Bartonicek et al., 2016; Vitiello et al., 2015), con la premisa de que el cáncer consiste de procesos neoplásicos del tejido hematopoyético con manifestaciones diferentes, existen tejidos y cuerpos celulares que involucran innumerables agentes carcinógenos endógenos o exógenos y varios mecanismos etiológicos (Coleman y Tsongalis, 2016), además, de estar implicados un conjunto de inestabilidades genéticas y genómicas (Hanahan y Weinberg, 2000, 2011). En todos los tipos de cáncer, se encontrarán relaciones con expresión aberrante y mutaciones que, a su vez, estarán asociadas a la tumorigenesis, metástasis y estadios tumorales (Peng et al., 2017; Taniue y Akimitsu, 2021). En el cáncer de próstata, existen diversos lncRNAs afectados, pero uno de ellos corresponde a PCA3 (Prostate Cancer Antigen 3), el cual se encuentra sobreexpresado en un 95% de casos de cáncer de próstata (Warrick et al., 2014), además de ser fácilmente identificado en la orina de pacientes de este tipo de cáncer benigno o maligno (Qin et al., 2020), este lncRNA puede interactuar con otras moléculas o receptores, algunos de estos son: Receptor Hedgehog PTCH (Albino et al., 2014; Dijkstra et al., 2014), Prune2, entre otros (Salameh et al., 2015). Por otra parte, en el cáncer colorrectal, los lncRNAs que se han podido identificar son variados, pero los más peculiares son H19, KCNQ1OT1, HOTAIR, MALAT1, ZFAS1, CCAT1, CCAT2, OCC1, 48 CCAT1L, CRNDE, TUCR y otros (Xie et al., 2016; Xu et al., 2014). Del mismo modo, en el cáncer de vejiga, interactúan otro conjunto de lncRNAs: TUG1, UCA1, MALAT1, MEG3, H19, lincUBC1 y más (Huang et al., 2016). De manera particular, existe el carcinoma hepatocelular en donde se tienen registrados una sobre expresión de los lncRNAs MALAT1, HULC, HEIH y HOTAIR (He et al., 2014), aunque de manera general, en el cáncer de hígado también se pueden encontrar otros, del tipo lncTCF7, CCAT1, MEG3, CUDR, LALR1 (Parasramka et al., 2016). Uno de los cánceres en donde se han identificado una mayor actividad molecular de estos transcritos, es en el cáncer de pulmón, ya que, los principales que se ven afectados son MALAT1, CCAT2, HOTAIR, AK126698, MEG3, SOX2OT, HNF1AAS1, ANRIL, H19, CARLo5, MVIH, PVT1, EVADR, SPRY4IT1, PANDAR, GAS5, BANCR, TUG1 (Peng et al., 2016; Wu et al., 2016). Mientras que, en el cáncer de mama están implicados los lncRNAs HOTAIR, ANRIL, ZFAS1, HOTAIRM1, PVT1, MALAT1, LNP1, entre otros (Li et al., 2016d; Su et al., 2014). Por último, la leucemia al ser tan compleja no está muy lejos de los otros cánceres, en este caso tan particular se le atribuyen los siguientes lncRNAs DLEU1, DLEU2, LUNAR1, HOTAIRM1, MALAT1, CCAT1, CCDC26, BGL3, NEAT1, NALT, UCA1, entre otros (Hu y Shan, 2016). Finalmente, entre las enfermedades complejas, se pueden encontrar enfermedades degenerativas, como son el Alzheimer y la DM. En el caso del Alzheimer se ha observado a través de la tecnología de microarreglos una desregulación de un total de 205 lncRNAs en un modelo de ratón (Lee et al., 2015), mientras que en tejido post mortem de humano, se han identificado alrededor de 108 lncRNAs que se expresaban de manera diferencial (Yang et al., 2017). 2.2.4.1 lncRNAs y Diabetes Relación entre afecciones genéticas y fisiológicas El estudio de los lncRNAs ha ganado terreno en el estudio de diversas enfermedades como lo es la DM, ya que presentan una interacción tanto positiva como negativa; un ejemplo de esto es que los lncRNAs se utilizan en terapias de RNA junto a los miRNAs para tratar la patogénesis de la diabetes y sus complicaciones (Leung y Natarajan, 2018; Regazzi, 2018), como puede ser el lncRNA Chast, que se relaciona con hipertrofia cardiaca (Viereck et al., 2016). También están involucrados en el desarrollo, diferenciación y maduración de miocitos cardiacos (He et al., 2016; Li et al., 2017b) como lo son lncRNA Myheart (Chang y Han, 2016), lncRNA Braveheart (Xue et al., 2016) y lncRNA Upperhad (Anderson et al., 2016). Por otra parte, existen lncRNA como el lncRNA NONRATT021972, del cual se ha reportado que su incremento está 49 asociado con el incremento de glucosa en sangre y la T2DM, se ha encontrado que sirve como biomarcador de T2DM y al desarrollo de dolor neuropático (Yu et al., 2017). 2.3 Medicina Basada en Evidencias 2.3.1 Generalidades Debido a la necesidad constante de actualización del conocimiento médico, así como a las dificultades para leer artículos científicos debido a la sobrecarga de información científica y al fenómeno del "sillón" (Masic et al., 2008), se desarrolló la medicina basada en evidencias (EBM). Esta consiste en integrar la experiencia clínica individual con las mejores evidencias científicas de la investigación clínica y los valores del paciente, utilizando la mejor información de investigación disponible (Haynes et al., 2000; Swanson et al., 2010). En los últimos años, se ha dado un enfoque más sistemático para obtener los mismos resultados (Wieten, 2008). Aunque la EBM surgió en 1904 (Pearson, 1904), no tuvo un papel significativo en el cuidado de la salud hasta 1990. Se identificaron estudios en las áreas sociales que podían adoptar la misma estructura para crear evidencia (Fischer, 1973), pero no fue hasta 2002 que Oackley describió que “el todo basado en evidencia” (EBE, evidence based everything) realmente se originó en las ciencias sociales, principalmente en educación y política social (Oakley, 2002), pero se han visto opacadas por la EBM. La Cochrane Collaboration ha hecho que los profesionales y legisladores de otras disciplinas piensen mucho sobre los paralelos y las diferencias entre la atención médica y otras formas de intervención profesional en la vida de las personas. Adrian Smith, presidente de la Sociedad Real de Estadística en 1996, mencionó su susceptibilidad ante controversias y debates en cuestiones de política pública debido a la falta de base de evidencia, lo que generó un conjunto de críticas sobre la naturaleza no científica, no acumulativa, no colaborativa e inaccesible de gran parte de la investigación educativa. Como resultado de estas críticas, surgieron diversas opiniones, como si el objetivo de basar la política y la práctica en la evidencia es simplemente un complot del gobierno, si es un intento de restringir la libertad académica al imponer criterios estándar para la calidad de la investigación o si es un movimiento tremendamente erróneo imponer el "positivismo" del modelo médico en un mundo social del que no se puede esperar que cumpla los mismos requisitos (Atkinson, 2000; Elliott, 2001; Hammersley, 2001). Por lo tanto, se puede asumir que durante al menos dos décadas se ha buscado aplicar la evidencia basada en diversas áreas de investigación, además de la médica. En la actualidad, se ha visto que esto ha dado resultados y no es raro ver legislación basada en evidencia (EBL), práctica basada en 50 evidencias (EBP) (que considera diversos campos de práctica profesional) (Trinder, 2006) y práctica psicológica basada en evidencia (American Psychological Association [APA], 2008), entre otras. 2.3.2 Evidencia y Artículos de revisión Por otra parte, el término "evidencia" generalmente se refiere a los hallazgos de investigación (Karlsson y Takahashi, 2017). A su vez, estas evidencias suelen obtenerse a través de una revisión de la literatura, la cual debe integrar las siguientes características: brindar un sólido respaldo a un tema de investigación que debe ser importante en el campo, utilizar datos de calidad bien definidos para la síntesis y el análisis, seleccionar una metodología de investigación adecuada, contribuir al desarrollo de un nuevo ámbito de práctica y destacar la necesidad de investigar más en áreas de interés previamente no reveladas (Samnani et al., 2017). Sin embargo, la cantidad de información académica ha aumentado de manera exponencial, especialmente con la digitalización y la eliminación de la prohibición del uso comercial de Internet, así como con el surgimiento de navegadores y motores de búsqueda (Leiner et al., 1997). Por lo tanto, recuperar información clave sobre un tema de interés se ha vuelto complicado y puede llevar varios meses leer cada artículo en detalle (Erren et al., 2009). Por lo que se comenzó a elaborar síntesis de literatura, pero estas carecían de formalidad y metodología, además de presentar incertidumbre en los hallazgos reportados (Mulrow, 1987). No fue hasta que la preocupación de Archie Cochrane sobre la ignorancia sobre los resultados de las prácticas sanitarias dio impulso a la fundación de la Cochrane Collaboration, lo que proporcionó una variedad de recursos a la industria del cuidado de la salud, este acontecimiento dio origen a la edad moderna de los artículos de revisión (Grant y Booth, 2009; Hart, 1998). Estos artículos no solo tienen como finalidad resumir el conocimiento, sino también destacar la necesidad de seguir investigando sobre las lagunas identificadas al realizar y escribir una revisión (Knopf, 2006). Existen diversos tipos de síntesis de literatura, que presentan diversas características y difieren en su aplicabilidad, presentan una gran variedad de fortalezas y debilidades. Dependiendo de la fuente, puede variar la cantidad de tipos de síntesis existentes. En este caso, se mencionan cuatro tipos de síntesis o resúmenes de la información disponible (ver Figura 10). 51 Figura 10. Clasificación de artículos de revisión. Elaboración propia. 52 2.3.3 Revisión Sistemática Esta consiste en un escrito que tiene como finalidad reunir datos empíricos que cumplan con ciertos criterios de elegibilidad, a razón de responder una pregunta de investigación (Centro Cochrane Iberoamericano, 2011). Además, de intentar reducir las debilidades de otras publicaciones, a través de la complementariedad bibliográfica, ya que se deberá recopilar toda la evidencia y literatura disponible (Scheidt et al. 2019), con el uso de criterios para mantener la caracterización metodológica, transparencia, comprensible y replicable (Siddaway et al., 2019; Wright et al., 2007). 2.3.4 Meta-análisis El Meta-análisis (MA) es un procedimiento matemático que combina y resume los resultados para un resultado específico (Andrade, 2020), ya que conjunta los valores de diversos estudios para generar nuevas estimaciones que fueron agrupadas por efecto de algún tratamiento o en su caso por una exposición a un resultado (Cordero y Dans, 2021). El Meta-análisis trata de responder cuatro preguntas: ¿Son similares los resultados de los diferentes estudios? ¿Cuál es la mejor estimación general? ¿Qué tan precisa y robusta es esta estimación? ¿Se pueden explicar las diferencias? (Lau et al., 1997). 53 3 ANTECEDENTES Debido a la relativa poca antigüedad de los ncRNAs en general, no existen muchos antecedentes sobre la realización de revisiones sistemáticas (RS) o MA sobre la participación de estas moléculas en las complicaciones diabéticas. Uno de los pocos estudios disponibles realizados es el de Zhang et al. (2019b) quienes realizaron un Metaanálisis sobre la función de biomarcadores de T2DM a través del cambio de expresión de lncRNAs, y donde reportaron un total de 11 lncRNAs con potencial para ser biomarcadores o como blancos terapéuticos de T2DM. Boon et al. (2016) realizaron una revisión sobre los lncRNAs y su correlación desde la genética clínica hasta los blancos terapéuticos, en donde se recaba la regulación, patología, función de biomarcadores y retos de los lncRNAs en las CVDs. Por otra parte, Pullen y Rutter (2013) señalan evidencia sobre la función epigenética y mecanismo de acción de los lncRNAs que contribuyen con el riesgo, progresión de T2DM y la disminución de la masa de células β de los islotes y su función, ya que reportaron más de 1000 lncRNAs en islotes que han sido funcionalmente caracterizados, en los que principalmente varios polimorfismos de un sólo nucleótido (SNPs) están asociados con un mayor riesgo de localizar a un lncRNA expresado desde el locus INK4, llamado ANRIL, el cual tiene un efecto directo en la capacidad proliferativa de las células β, por lo cual se genera cierta susceptibilidad a la diabetes al limitar la capacidad de aumentos compensatorios en la masa de células β. Adicionalmente, Krishnan et al. (2019) realizaron un perfilado de las diversas clases de RNA asociados a exosomas codificantes y no codificantes de proteínas en exosomas derivados de islotes cadavéricos humanos tratados con IL1 e IFN, un modelo de exposición ex vivo destinado a imitar el entorno proinflamatorio de la T1DM. Se encontraron aproximadamente 37 millones y 34 millones de lecturas de muestras de control y tratadas con citoquinas, respectivamente, pero únicamente el 21% fueron lncRNAS, de los cuales sólo 5,711 tenían potencial como biomarcadores de T1DM, pero nada más en 31 lncRNAs se encontró una tasa de expresión diferenciada con un fold change ≥ 1.3. El término fold change podría traducirse como “veces de cambio”, o “cambio de dobleces”, pero la traducción literal es inútil, y no refleja el concepto biológico que se desea. Una traducción más correcta sería algo así como “número de veces que el valor se duplica o incrementa”, que es muy largo. Por dichas razones, se conservará el término en inglés. Por otro lado, se pueden identificar estudios dirigidos hacia otro tipo de complicaciones y tejidos biológicos, un ejemplo de esto es el trabajo de Cao et al. (2019) 54 quienes describen las funciones reguladoras de los lncRNA exosómicos en el envejecimiento y las enfermedades relacionadas con la edad, e identificaron al lncRNAp3134, que juega un papel en el antagonismo del desarrollo de T2DM, ya que promueve factores reguladores clave en las células β como son: Pdx1, MafA, GLUT2 y TCF7l2. Además, se encontraron 3 lncRNAs (GAS5, MALAT1 y RNCR3) que tenían correlación con la aterosclerosis. También se ubica dentro de este espectro a Zhang et al. (2018a) ya que identificaron el rol de los microRNAs y los lncRNAs en la disfunción endotelial en diabetes e hipertensión; además identificaron 21 miRNAs y 14 lncRNAs que presentaron alguna relación con la función y disfunción endotelial, además de mencionar la importancia clínica que tienen los miRNAs y lncRNAs debido a su utilización como biomarcadores y como blancos terapéuticos, también se retoma la importancia entre la interacción miRNAs/lncRNAs. Cabe destacar, que se han hecho diversos estudios sobre la identificación y función sobre algunos lncRNAs. Leung y Natarajan (2018) revisaron la relación de lncRNAs con la DM y sus complicaciones, debido a que estos transcritos son reguladores importantes de la regulación génica y la función celular y están implicados como actores importantes en la diabetes y sus complicaciones. Se encontraron un total de 13 lncRNAs en tejidos metabólicos (HI‐LNC25, β linc1 [páncreas], STR, SRA [hígado], MEG2, MEG3, linc‐YY1 l, Linc‐RAM y Dum [músculo], lnc‐BATE1, Blnc1, SRA [adipocitos]) y otros 13 asociados a complicaciones diabéticas (Malat1, Meg3, linc‐MIAT, ANRIL [retinopatía], PVT1, Lnc‐MGC, Tug1, LincRNA‐GM4419 [nefropatía], E330013P06, Lnc‐Ang362, SENCR, SMILR, PUNISHER [CVDs]. Además, mencionaron que los lncRNAs se desregulan durante la diferenciación de las células β pancreáticas, así como por la hiperglucemia y los factores de crecimiento relacionados, mientras que en las complicaciones se pueden presentar cambios en la inflamación, fibrosis, estrés del RE, estrés oxidativo y disfunción mitocondrial. Ignarsky et al. (2019) realizaron una descripción concisa del conocimiento actual sobre los lncRNA en la enfermedad renal glomerular y tubulointersticial, encontraron un total de 18 lncRNAs en enfermedades glomerulares (EB), otros 18 en enfermedades tubulointersticial (lesión renal aguda) y dos en biomarcadores renales sistémicos. Adicionalmente, mencionan la importancia de los estudios fisiopatológicos y la búsqueda de nuevas estrategias terapéuticas en la enfermedad renal, pero la mayoría de los estudios se han mantenido principalmente descriptivos. 55 Leung et al. (2018) vincularon las complicaciones vasculares diabéticas con los lncRNAs, ya que pretendían realizar una descripción general de los lncRNA que funcionan en las células vasculares y aquellos que se han relacionado con complicaciones diabéticas. Debido a que, se ha demostrado que las células vasculares, incluidas las células endoteliales, las células del músculo liso vascular y los pericitos, expresan lncRNA vinculados a enfermedades vasculares, por lo cual, se reconocieron un total de 7 lncRNAs (LOC100129973, Linc00152, PUNISHER, SENCR, LncAng362, SMILR, HypERlnc). Por otra parte, sobre los lncRNAs en complicaciones vasculares diabéticas, existen datos que indican que los lncRNA están involucrados en varias complicaciones, incluida la nefropatía asociada a la diabetes, la retinopatía, la hipertensión y la aterosclerosis, por lo cual, se encontraron un total de 10 lncRNAs (ANRIL, MIAT, MALAT1, MEG3, LncArg362, E330013P06, Lethe, Pvt1, LncMGC y Tug1). Zhang et al. (2019a) estudiaron la participación de los ncRNAs en la patogénesis de la miocardiopatía diabética, y describieron que la disfunción mitocondrial, el estrés oxidativo, la respuesta inflamatoria, la autofagia, la apoptosis, la microangiopatía diabética y la fibrosis miocárdica están implicadas en dicha patogénesis, como resultado identificaron a los lncRNAs que tienen una participación en fibrosis miocárdica, apoptosis y autofagia de cardiomiocitos e Inflamación,que son los siguientes: AK081284, ANRIL, H19, Meg3, GAS5, PFL), 3 (MIAT, MALAT1, H19) y 4 (MALAT1, MIAT, H19, LIPCAR, SENCR. 56 4 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA En la última década, la DM se ha convertido en un problema de salud pública debido a su elevada prevalencia a nivel global, junto a su etiología y su tasa de mortalidad. A partir de 1980, la DM ha incrementado cuatro veces su incidencia, por lo cual, en la actualidad existe un aproximado de 537 millones de personas que padecen algún tipo de DM (International Diabetes Federation [IDF], 2021; Wild et al., 2004). Este incremento tan abrupto de pacientes diabéticos ha fomentado grandes estragos en el sector salud, sobre todo en países subdesarrollados, ya que no cuentan con la infraestructura para mantener un tratamiento ideal para demasiados individuos (Organización Panamericana de la Salud [OPS], 2011; Hernández-Ávila et al., 2013). En el caso particular de México, se puede observar que se halla en la sexta posición de mayor número de casos de DM a nivel mundial (~14.1 millones) de acuerdo con datos de la IDF, (2021). Cabe destacar que, a partir del año 2000, este padecimiento es considerado una de las principales causas de muerte en México (Secretaría de Salud, 2014; Encuesta Nacional de Salud y Nutrición [ENSANUT], 2020). De acuerdo con el Instituto Nacional de Estadística y Geografía [INEGI] (2020), en el año 2020 hubo 99,733 (14%) defunciones a causa de la DM (52,136 hombres y 47,429 mujeres); una de las razones primordiales de las muertes por DM, es la gran inversión presupuestal que conlleva su tratamiento, ya que de manera anual se invierten cerca de 27 mil 108 pesos mexicanos, cuando el salario mínimo promedio general, de acuerdo con la Comisión Nacional de los Salarios Mínimos [CONASAMI] (2021), es de 58,158 pesos anuales y además de que el 48.8% de la población se encuentra con un ingreso inferior a la línea de pobreza (Consejo Nacional de Evaluación de la Política de Desarrollo Social [CONEVAL], 2018), lo que hace que el tratamiento sea bastante complicado de adquirir. Además, investigaciones recientes sugieren que los lncRNA juegan un papel importante en el desarrollo de complicaciones diabéticas (Leung y Natarajan, 2018). Por tanto, es necesaria una revisión actualizada que presente la información existente sobre la relación entre DM y lncRNAs y que facilite la planificación de futuras investigaciones en esta área. 57 5 PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN ¿Cuál es la participación de los lncRNAs como reguladores genéticos en el desarrollo de complicaciones diabéticas macro y microvasculares provocadas por hiperglucemia crónica en ratas y ratones? 6 HIPÓTESIS Las complicaciones patológicas causadas por la DM se deben a un conjunto de modificaciones metabólicas y genéticas. La glucosa, al ser precursora del desequilibrio en los agentes oxidantes y antioxidantes, genera un estado de estrés oxidativo que produce moléculas altamente reactivas capaces de interactuar con el DNA y el RNA. Esto puede causar daños en diversos procesos moleculares, sobre todo, en aquellos que están relacionados con la desregulación de diversos lncRNAs fomentando el desarrollo de complicaciones diabéticas. 7 OBJETIVOS 7.1 Objetivo general Evaluar mediante una RS/MA la participación de los lncRNAs en el desarrollo de patologías asociadas a una hiperglucemia crónica, ya sea T1DM, T2DM o GDM, en los dos modelos o especies más utilizadas en biomedicina, como son ratas y ratones. 7.2 Objetivos particulares ● Distinguir el papel que desempeñan los lncRNAs en el desarrollo de complicaciones patológicas desencadenadas por la presencia de T1DM, T2DM y GDM en ratas y ratones. ● Revisar las principales afecciones patológicas en las que estén relacionadas los lncRNAs y la T1DM, T2DM y gestacional en ratas y ratones. ● Comparar los posibles cambios en los niveles de expresión en los lncRNAs presentes en una complicación diabética, con respecto a un estado control. ● Identificar los principales lncRNAs que se ven afectados al estar expuestos a un ambiente diabético en ratas y ratones. 58 8 MÉTODOS 8.1 Estrategias Metodológicas Para lograr una búsqueda de información homogénea y coherente con los objetivos y los interrogantes de la investigación, se emplearon diversos métodos de búsqueda. El primero de ellos fue la búsqueda por palabras clave, utilizando términos como "diabetes", "DM", "T1DM", "T2DM", "GDM", "DMT1", "DMT2", "DMG", "embarazo", "pregnancy", "DM pregestacional", "pregestacional DM", "DM materna", "maternal DM", "gestational diabetes", "lncRNAs", "ncRNAs" y "long non coding RNAs". Además, se empleó un motor de búsqueda booleano, que utilizó los operadores "AND", "OR", "NOT", "SAME" y "WITH", en combinación con las palabras clave previamente mencionadas. Por último, se utilizó una búsqueda de tipo PECO (Population, Exposition, Comparison y Outcome), en la que se consideraron como población los modelos biológicos de ratas y ratones, así como estudios en humanos. La exposición fue la presencia de cualquier tipo de diabetes, mientras que nuestros resultados se centraron en la medición cuantitativa de la expresión de lncRNAs. Es importante destacar que no se aplicó ninguna restricción de idioma ni fecha de publicación en las búsquedas realizadas en las bases de datos bibliográficas, que se remontan desde su inicio hasta 2022. 8.2 Validaciones Debido a que es fundamental validar los estudios para evitar resultados y conclusiones engañosas o una estimación incorrecta, se llevó a cabo una evaluación de la validez de los estudios desde la formulación de la pregunta de investigación, el análisis, la interpretación y la generación de resultados y conclusiones. La validez externa se refiere al alcance, generalización o aplicación de los hallazgos del estudio. Por lo tanto, la aplicabilidad del presente trabajo se centra en recopilar información existente sobre la relación entre la DM y los lncRNAs para facilitar el diseño de investigaciones relacionadas con este tema. Asimismo, este estudio puede ayudar a evitar gastos innecesarios en la realización de investigaciones en las que ya existe una hipótesis bien fundamentada. 59 Por otro lado, la validez interna está relacionada con la pregunta de investigación. Para este estudio, se ha planteado una pregunta de investigación de tipo etiológica que explique la causalidad de las complicaciones diabéticas. La pregunta de investigación es de naturaleza amplia, por lo que se encontraron datos muy dispersos. Para evitar la inclusión de sesgos, se llevó a cabo un análisis exhaustivo. 8.3 Criterios de consideración sobre unidades de estudio 8.3.1 Tipos de estudios Para mantener la homogeneidad en todo el proceso de búsqueda, se utilizó como fuente principal aquellos estudios que cumplieran exclusivamente con los criterios de diseño de estudio a nivel de exposición. Cabe destacar que se incluyeron todos los estudios que cumplían con los criterios de inclusión y exclusión que se describen más adelante. Además, se exploró la literatura científica en relación con la posible asociación entre los distintos tipos de DM y la expresión de lncRNAs relacionados con enfermedades o complicaciones diabéticas. 8.3.2 Tipos de participantes La selección de los participantes del estudio se centró en modelos animales de rata y ratón, en los que el estudio haya incluido presentación de alguna complicación diabética, o modelos de estudio con cepas o razas que propiciarán el desarrollo de patologías relacionadas con la diabetes. 8.3.3 Tipos de intervenciones Los participantes debían presentar alguna complicación patológica asociada a la DM, por lo cual se consideró a aquellos sujetos de estudio que padecían o se haya inducido T1DM, T2DM y GDM. Además, se dio prioridad a aquellos trabajos de intervención que incluyeran un diseño de estudio que permitiera el análisis comparativo entre sujetos de tratamiento y controles. 8.3.4 Tipos de medidas de resultado Se consideraron las medidas expresadas en gráficos y tablas que mostraban el valor medio y su desviación estándar en forma de Fold change, expresión relativa o absoluta, niveles o cuantificación. 60 8.4 Sistematización de las unidades de estudio 8.4.1 Búsquedas electrónicas La investigación de estudios se realizó en múltiples bases de datos, como Dialnet, Scielo, HINARI, Springer, ClinicalKey, OTseeker y PubMed. Con la finalidad de no excluir la literatura gris, que tiene gran importancia debido a sus grandes aportes a la ciencia, a pesar de no estar formalmente publicados, se realizó una búsqueda de pre-prints en bases como BIORXIV, MEDXIV y SIGLE. 8.4.2 Búsquedas por otros recursos Además, se profundizó en la literatura gris, incluyendo aquellos documentos que no necesariamente se encuentran en línea, tales como resúmenes de conferencias, correcciones y cartas, registros de ensayos y protocolos, revisiones regulatorias e informes de estudios clínicos, siempre y cuando presentaran un valor muestral estadísticamente significativo. 8.5 Colección de datos y análisis 8.5.1 Selección de estudios Criterios de inclusión y exclusión: Se incluyeron los estudios que cumplían con los siguientes criterios: 1) ser artículos originales y experimentales, 2) tener como objetivo principal el estudio de la DM, 3) analizar la desregulación de lncRNAs, 4) proporcionar información sobre al menos un objetivo, 5) utilizar modelos biológicos en ratas o ratones, 6) ser únicamente modelos in vivo, 7) mencionar el tejido en el cual se cuantificó la expresión de lncRNAs, 8) presentar las mediciones en Fold change , expresión relativa o absoluta, niveles o cuantificación. Los criterios de exclusión fueron: 1) ser artículos de revisión, 2) no tener la DM como estudio principal, 3) no medir lncRNAs, 4) exclusión de sujetos con mayores afecciones, 5) tener participantes humanos, 6) no cuantificar la expresión de lncRNAs mediante algún tipo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), 7) no utilizar controles, 8) tener una metodología poco clara. 8.5.2 Extracción de datos y manejo Tras la selección y filtrado de los estudios, éstos se clasificaron de acuerdo con el tipo de DM presente y a los modelos de estudio utilizados. Posteriormente, se registraron los valores de media y desviación estándar utilizando el software AutoCAD 24.2., Autodesk 61 Inc©, publicado en 2023. Los resultados obtenidos fueron procesados mediante el software RevMan 5.4.1, The Cochrane Collaboration©, publicado en 2023. 8.5.3 Evaluación del riesgo de sesgo Para evitar el sesgo de selección, se implementaron diversos métodos, ya que la selección de estudios, en algunos casos, puede caer en la subjetividad. Por lo tanto, se utilizó el criterio propio, basado en los criterios de inclusión y exclusión ya mencionados, para evitar sesgos. También se revisaron los estudios por la asesora de tesis (Biol. Gladys Chirino Galindo) y el jefe del grupo de investigación (Dr. Martín Palomar Morales) para garantizar una revisión de terceros impares, lo que permitiría resolver conflictos sobre la admisión o el rechazo de algún estudio. Además, se utilizó la revisión de estudios y análisis de sesgos que proporciona el manual Cochrane (https://bit.ly/3KonA4c) y los diseños de estudio CAMARADES, SYRCLE y QUADAS-2 para la revisión y el análisis de sesgo de los estudios. Para evitar los sesgos de desempeño, deserción y notificación, se realizó una extensa y amplia revisión de la metodología de cada uno de los estudios que se deseaba incluir en el Meta-análisis. También se realizó una revisión por pares para obtener un mayor índice de confiabilidad. Sin embargo, existe la posibilidad de que estos tipos de sesgos estén presentes, especialmente si los resultados no se reportaron o se ocultaron en los estudios revisados. Para regular el sesgo de detección, se utilizó una metodología exclusivamente a través de RT-PCR para medir los lncRNAs. Además, las medidas de los lncRNAs debieron expresarse obligatoriamente mediante un Fold change o expresión/nivel/cuantificación Relativa/absoluta en comparación con una media estadísticamente válida. 8.5.4 Medidas del efecto del tratamiento Debido a que se utilizaron los valores de expresión en Fold change, expresión relativa o absoluta, niveles o cuantificación, los datos fueron del tipo continuo, ya que los lncRNAs son datos cuantitativos. Por lo tanto, las medidas de efecto fueron dadas en diferencia de medias, al comparar los valores medios entre dos grupos con el fin de encontrar la diferencia, lo que puede servir como posible indicador de la relación entre lncRNA y el desarrollo patológico. Además, es importante considerar las estimaciones de efectos directos en un contexto biológico, y se debe tomar en cuenta una relación de control-experimental y 62 aleatorización de los sujetos de estudio. Para ello, se utilizó un análisis de agrupación o emparejamiento de los sujetos de estudio, en el que se tuvo en cuenta el efecto de los análisis realizados por los autores. En los casos en que no se dispuso de datos resumidos para cada grupo o simplemente no puedan ser extraídos, se utilizó la varianza inversa, que se obtiene directamente del procesamiento de los datos. 8.5.5 Problemas de unidades de estudio Uno de los principales problemas que podrían surgir es la vinculación de múltiples informes sobre el mismo estudio, ya que en algunos casos se pueden reportar varios lncRNAs en un mismo estudio. Para evitar cualquier posible sesgo, se mantendrá una delimitación clara del lncRNA específico de interés. Otro problema para considerar es la intervención en diferentes partes del cuerpo, ya que pueden utilizarse muestras distintas para tratar distintas patologías. Para evitar errores de ajuste por falta de independencia, se realizará un análisis de resultado separado para cada tipo de muestra. Es importante también considerar estudios de larga duración, aunque en nuestro caso el rango promedio de tiempo es de una semana. Debido a esto, no se podrán combinar los resultados debido al error de unidad de análisis. En su lugar, se obtendrán los datos de cada participante de manera individual y se realizará un análisis que considere todo el seguimiento temporal para obtener una medida de efecto que abarque todas las unidades de estudio. 8.5.6 Manejo de datos faltantes Es importante destacar que existen diferentes técnicas para abordar el problema de los datos faltantes, sin embargo, es fundamental tener en cuenta que ninguna técnica es perfecta y todas presentan limitaciones. Por esta razón, es recomendable realizar un análisis cuidadoso y detallado de los datos disponibles y de las diferentes técnicas de imputación que se pueden utilizar antes de tomar una decisión. Sin embargo, en algunos casos, la imputación de datos faltantes puede aumentar la precisión y la potencia de los análisis, sin embargo, también puede llevar a una sobrestimación de los efectos o a una disminución de la varianza, lo que puede generar resultados incorrectos o engañosos. 63 8.5.7 Evaluación de heterogeneidad Es importante tener en cuenta que existe una alta tasa de heterogeneidad en las publicaciones, lo cual es una premisa que siempre estará presente en la realidad. Para abordar esta situación, se decidió utilizar análisis a nivel de efectos aleatorios. En caso de que se presente un alto índice de heterogeneidad, se llevará a cabo un análisis de subgrupos mediante el software RevMan 5.4.1 para explicar esta variabilidad. 8.5.8 Evaluación de sensibilidad Debido a que las revisiones sistemáticas y los Meta-análisis requieren una toma de decisiones rigurosa y objetiva para excluir la existencia de selecciones arbitrarias o poco claras, es fundamental realizar un análisis de sensibilidad que incluya diversas estrategias. La estrategia principal consiste en filtrar objetivamente los criterios de elegibilidad de los estudios para estandarizar los rangos, características del resultado, diseño de estudio y características de los participantes. Otro método consiste en analizar los datos necesarios y los métodos de análisis, justificando su uso y manteniendo la homogeneidad de los datos para evitar sesgos. Por último, se realizaron revisiones para evaluar la elegibilidad de los estudios en el Meta-análisis, en caso de que esta sea dudosa debido a la falta de detalles completos. En este caso, el análisis de sensibilidad puede implicar realizar el Meta-análisis dos veces: primero, incluyendo todos los estudios y segundo, incluyendo solo aquellos que sean definitivamente conocidos. 64 9 RESULTADOS 9.1 Descripción de estudios Todos los estudios utilizaron modelos biológicos in vivo de ratas o ratones sin restricciones de género, edad y/o cepa. Estos estudios fueron del tipo experimental, originales, y se centraron en la DM como objetivo principal. Además, se cuantificó el cambio de expresión de los lncRNAs. Los diversos lncRNAs fueron extraídos de tejidos de áreas específicas, de acuerdo con el área patológica de interés, y los resultados se expresaron en términos de Fold change, expresión relativa o absoluta, niveles o cuantificación. Para determinar el nivel de expresión, se utilizó principalmente la técnica RT-PCR, que puede ser cuantitativa o no. 9.2 Resultados de la búsqueda Los resultados de la búsqueda en once bases de datos bibliográficas arrojaron 48,480 publicaciones, incluyendo 2,938 de Dialnet, 642 de Scielo, 3,595 de HINARI, 9,068 de Springer, 10,476 de Clinicalkey, 308 de OTSeeker, 3,676 de PubMed, 13,663 de BIORXIV, 3,778 de MEDXIV y 336 de SIGLE. De este total, se identificaron 980 tesis, 23,886 artículos originales, 1,921 ensayos clínicos, 3,672 recopilaciones de publicaciones en libro y 18,021 elementos de literatura gris (244 de conferencias y 17,777 artículos no publicados) (fig. 11). Tres personas (Dr. Palomar, Biol. Chirino y P. Biol. Cabrera) revisaron los títulos y resúmenes de manera independiente. En aquellos estudios que no se podían excluir con seguridad, se realizó una lectura superficial. Los revisores evaluaron de forma independiente la inclusión de 350 artículos para la elegibilidad a través de texto completo. Si existía algún desacuerdo sobre la elegibilidad de algún artículo, se decidía a través del voto de los tres revisores, además de tomar en consideración los criterios de inclusión y exclusión previamente descritos. Noventa y cinco estudios diferentes cumplieron con los criterios de inclusión y fueron seleccionados para la revisión (fig.11) (Revisar materiales suplementarios sección A y B). 65 Figura 11. Diagrama de flujo sobre la búsqueda y filtrado de artículos. Identificación de estudios a través de bases de datos y registros. Registros identificados de: Base de datos (n = 48,480) Dialnet (n = 2,938) Scielo (n = 642) HINARI (n = 3,595) Springer (n = 9,068) Clinical-Key (n = 10,476) OTSeeker (n = 308) PubMed (n = 3,676) bioRxiv (n = 13,663) medRxiv (n = 3,778) SIGLE (n = 336) Registros eliminados antes de la revisión Registros duplicados eliminados (n = 912) Registros examinados (n = 964) Registros excluidos (n = 640) Revisiones (n = 262) Meta-análisis (n = 2) Opinión/Preliminar (n = 27) Literatura gris (n = 13) Criterios de elegibilidad (n = 333) Retractados (n = 3) Informes buscados para recuperar (n = 324) Informes no recuperados (n = 4) Informes evaluados para elegibilidad (n = 320) Estudios excluidos (n = 225) Estudios humanos (n = 51) Modelo in vitro (n = 51) Modelo humano e in vitro (n = 49) Información invalida (n = 35) Metodología inadecuada (n = 32) Estudios no primarios (n = 4) Retractados (n = 3) Estudios incluidos en la revisión (n = 95) Reportes incluidos en la revisión (n = 251) Id en ti fi ca ci ó n R ev is ió n In cl u id o s 66 9.3 Estudios incluidos 9.3.1 Diseño de estudios De los 95 artículos obtenidos, 48 corresponden a un modelo de T1DM y 46 a T2DM, con 32 en rata y 14 en ratón para T2DM y uno en ratón para GDM. Además, se identificaron las principales complicaciones patológicas asociadas con la DM, incluyendo DCM, DKD, NeD, RD, afecciones hepáticas, musculoesqueléticas y pancreáticas, entre otras. Los resultados muestran 14 casos de cardiopatía (DCM), 27 de nefropatía (DKD), 15 de neuropatía (NeD), 13 de retinopatía (RD), 6 de afecciones hepáticas (Ah), 6 de afecciones pancreáticas (Ap), 5 de afecciones musculoesqueléticas (Me) y 9 de otra índole, que incluyen 2 modificaciones en sangre/suero (As), 4 modificaciones en estómago (GpD), 2 afecciones glandulares (Ag) y 1 caso de macrófagos (Mf) (tabla 4). Tabla 4. Artículos asociados a un modelo DM y complicaciones patológicas en ratas. ID NOMBRE PATOLOGÍA DM R-01 Feng et al., 2019 DCM T1DM R-02 Fu et al., 2021 RD T1DM R-03 Gong et al., 2018 GpD T1DM R-04 Guo et al., 2019 NeD T1DM R-05 Han et al., 2018 Mf T2DM R-06 Hao et al., 2019 NeD T2DM R-07 Hao et al., 2021 NeD T1DM R-08 He et al., 2021 RD T1DM R-09 Huang et al., 2019 DKD T1DM R-10 Huang et al., 2020 Ap T2DM R-11 Huang et al., 2022 DKD T2DM R-12 Huo et al., 2019 Me T1DM R-13 Lei et al., 2018 DKD T1DM R-14 Ling et al., 2018 DKD T1DM R-15 Liu et al., 2016 NeD T2DM R-16 Liu et al., 2017 NeD T2DM R-17 Luo et al., 2022 RD T1DM R-18 Meng et al., 2022 DCM T1DM R-19 Peng et al., 2017 NeD T2DM R-20 Ren et al., 2021 NeD T2DM R-21 Song et al., 2017 Ah T2DM R-22 Sultan et al., 2021 DKD T1DM R-23 Tian et al., 2022 RD T1DM 67 (Continúa) R-24 Wang et al., 2016 NeD T2DM R-25 Wang et al., 2019 DKD T1DM R-26 Wang et al., 2020 NeD T1DM R-27 Wu et al., 2016 NeD T2DM R-28 Wu et al., 2018 DKD T2DM R-29 Yu et al., 2022 DKD T2DM R-30 Zhan et al., 2020 DKD T1DM R-31 Zhang W. et al., 2020 Me T2DM R-32 Zhang M. et al., 2016a DCM T1DM R-33 Zhang M. et al., 2016b DCM T1DM R-34 Zhang Y. et al., 2020 RD T1DM R-35 Zhao et al., 2017 NeD T1DM R-36 Zhao et al., 2019 RD T1DM R-37 Zhou et al., 2017 DCM T1DM R-38 Zhuo et al., 2017 DCM T1DM 9.3.2 Participantes La búsqueda identificó 99 estudios, de los cuales 38 se realizaron en ratas y 61 en ratones. Se utilizaron un total de 782 ratas en los estudios (429 experimentales y 353 controles), como se muestra en la Tabla 4, y 1,149 ratones (597 experimentales y 552 controles), como se detalla en la Tabla 5. La mayoría de los estudios incluidos consisten en muestras pequeñas de no más de 25 individuos (34 para ratas, lo que representa el 89% del total, y 57 para ratones, lo que representa el 92% del total). En algunos casos, se encontraron estudios con más de 30 individuos experimentales, pero los controles no superan los 25, como se observó en 3 estudios de ratas y 2 de ratones. Finalmente, solo se identificó un único estudio grande en ratas, que incluía 40 individuos tanto experimentales como de control, y 3 estudios en ratones, que variaba de 30 a 60 individuos (30, 30, 40 y 60, respectivamente). 68 Tabla 5. Artículos asociados a un modelo DM y complicaciones patológicas en ratón. ID NOMBRE PATOLOGÍA DM M-01 Cao et al., 2022 Ah GDM M-02 Chen et al., 2021 RD T1DM M-03 Chen et al., 2022 DKD T2DM M-04 Cui et al., 2018 Ah T2DM M-05 Du et al., 2019 NeD T1DM M-06 Duan et al., 2021 DKD T2DM M-07 Feng et al., 2018 DKD T2DM M-08 Gao et al., 2019 DCM T1DM M-09 Gui et al., 2020 Me T2DM M-10 Guo et al., 2018 As T1DM M-11 Guo et al., 2020 DKD T1DM M-12 Hu et al., 2017 DKD T1DM M-13 Huang et al., 2021 Ag T2DM M-14 Jiang et al., 2020 DKD T2DM M-15 Kazeminasab et al., 2021 Ah T2DM M-16 Li et al., 2017 RD T1DM M-17 Li et al., 2018 DKD T2DM M-18 Li et al., 2020 Ah T2DM M-19 Li et al., 2022a Ap T2DM M-20 Li et al., 2022b Ap T2DM M-21 Liu et al., 2014 RD T1DM M-22 Liu et al., 2019 DKD T2DM M-23 Liu et al., 2020 DCM T1DM M-24 Long et al., 2016 DKD T2DM M-25 Meng et al., 2022 DKD T1DM M-26 Motterle et al., 2017 Ap T2DM M-27 Ni et al., 2021 DCM T2DM M-28 Qin et al., 2021 As T1DM M-29 Qiu et al., 2016 RD T1DM M-30 Radhakrishnan y Kowluru, 2021 RD T1DM M-31 Shan et al., 2020 GpD T1DM M-32 Shao et al., 2020 RD T2DM M-33 Shi et al., 2022 Ag T2DM M-34 Su et al., 2022 DKD T2DM M-35 Sun et al., 2019 NeD T1DM M-36 Wang et al., 2018 DKD T2DM M-37 Wang et al., 2021a Me T1DM 69 (Continúa) M-38 Wang et al., 2021b NeD T2DM M-39 Wang et al., 2021c GpD T1DM M-40 Wen et al., 2019 DKD T2DM M-41 Xie et al., 2020 NeD T1DM M-42 Xiong et al., 2020 Ap T2DM M-43 Yan et al., 2018 Ah T2DM M-44 Yang et al., 2018 DCM T1DM M-45 Yang et al., 2019 DKD T1DM M-46 Yang et al., 2020 DKD T2DM M-47 Yang et al., 2021 RD T1DM M-48 You et al., 2016 Ap T2DM M-49 Yu et al., 2018 DCM T2DM M-50 Zhang et al., 2018a DKD T2DM M-51 Zhang et al., 2018b Me T2DM M-52 Zhang et al., 2019 DCM T2DM M-53 Zhang et al., 2020 GpD T2DM M-54 Zhou et al., 2018 DKD T1DM M-55 Zhou et al., 2021 DKD T2DM M-56 Zhu et al., 2021 DCM T1DM M-57 Zhuo et al., 2021 DCM T1DM 70 9.3.3 Intervenciones 9.3.3.1 Duración La duración de las intervenciones varió. Las intervenciones más breves dejaron actuar el fármaco durante 3 a 5 días. Las duraciones más largas fueron las siguientes: una semana (5 [2 en rata y 3 en ratón]), dos semanas (5 en rata), veinte días (2 en rata), cuatro semanas (3 [2 en rata y 1 en ratón]), seis semanas (4 [3 en rata y 1 en ratón]), siete semanas (1 en rata), ocho semanas (14 [9 en rata y 5 en ratón]), diez semanas (1 en ratón), once semanas (1 en ratón), doce semanas (13 [6 en rata y 7 en ratón]), quince semanas (1 en ratón), dieciséis semanas (2 [1 en rata y 1 en ratón]), diecisiete semanas (1 en ratón), veinte semanas (2 en ratón), veinticuatro semanas (1 en ratón), veinticinco semanas (1 en rata), y tres meses (2 [1 en rata y 1 en ratón]). En algunos casos, las intervenciones se dieron en diferentes momentos en un estudio, como en uno que se dieron a las 6, 10, 14, 18 y 22 semanas (1 en rata) y otro en el que se dieron a 3, 7, 14 y 28 semanas. Cabe destacar que, debido a la estructura metodológica de algunas intervenciones, no se mencionó cuánto tiempo se dejó actuar el fármaco para el desarrollo de alguna complicación diabética. En estos casos, resultaron en tres intervenciones de ratas en las que se omitió el dato y en treinta y dos en el caso de ratones. Tabla 6. Distribución de la duración de las intervenciones Duración Especificación ID Tres días Explicación clara R-30 Cinco días M-35 Seis días M-01 Una semana R-19, R-27 M-05, M-07, M-23, M-32a Dos semanas R-09, R-18, R-24 Tres semanas M-06 Cuatro semanas M-31, M-41, M-50 Cinco semanas M-18, M.37 Seis semanas R-14, R-16, R-20, R-28 71 (Continúa) Siete semanas Explicación clara R-15 M-26b Ocho semanas R-04, R-06, R-07, R-08, R-10, R-22, R-26, R-29, R-34 M-38, M-39, M-44, M-52 Diez semanas M-11c, M-42, M-54 Doce semanas R-01, R-05, R-11, R-13, R-32, R-33, R-37 M-12, M-15, M-20, M-28, M-46, M-47 Quince semanas M-45 Dieciséis semanas R-03 M-02, M-03, M-08 Diecisiete semanas M-19 Veinte semanas M-25 Veinticinco semanas R-02 Tres meses R-38 M-09 Seis meses M-30 Variado (Diferencia de edades) 12-14 semanas M-55 4-8 días M-04 Sin datos Sin mención R-12, R-23, R-25, R-35, R-36 M-16, M-53 Poco claro M-10, M-21, M-22, M-27 M-34, M-49, M-56, M-57 R-17, R-21 Uso de cepas R-31 M-13, M-14, M-17, M-24, M-29, M-33, M-36, M-40, M-43 M-48, M-51 Nota. a1 semana y 3 días, b7.5 semanas, c72 días. 72 9.3.3.2 Frecuencia e intensidad Los patrones de uso de las intervenciones, en cuanto a su frecuencia e intensidad, variaron ampliamente entre los diferentes estudios. Las intervenciones menos comunes fueron aquellas en las que se usaron cepas que tendían al desarrollo de algún tipo de DM (27 casos: 2 en rata y 25 en ratón). Otro tipo de intervenciones fueron las breves, que consistieron en una sola intervención y una prueba post-intervención para asegurar la presencia de la enfermedad (68 casos: 36 en rata y 32 en ratón) (Tabla 7). Tabla 7. Distribución de la frecuencia de las intervenciones. Frecuencias Especificación ID Cepas Zucker diabetic fatty (ZDF) R-15 Goto Kakizaki (GK) R-31 BKS.Cg-Dock7m+/+LeprdbJ (db/db) M-04, M-06, M-07, M-09, M-13, M-14, M-17, M-20, M-21, M-22, M-24, M-26, M-27, M-32, M-33, M-34, M-36, M-40, M-42, M-48, M-49, M-50, M-51, M-55 B6.Cg-Lepob/J (ob/ob) M-43 Intervenciones breves STZ R-01, R-02, R-03, R-04, R-07, R-08, R-09, R-10, R-11, R-12, R-13, R-14, R-16, R-17, R-18, R-19, R-20, R-21, R-22, R-24, R-25, R-26, R-27, R-28, R-29, R-30, R-32, R-33, R-35, R-36, R-37, R-38 M-01, M-03, M-05, M-10, M-11, M-15, M-16, M-29, M-35, M-37, M-38, M-39, M-41, M-46, M-47, M-53, M-56 Intervenciones largas STZ R-05, R-06, R-23, R-34 M-02, M-08, M-12, M-18, M-19, M-23, M-25, M-28, M-30, M-31, M-44, M-45, M-52, M-54, M-57 73 En los estudios que emplearon cepas específicas para el desarrollo de algún tipo de DM, se utilizaron diferentes cepas en ratones y ratas. En el caso de los ratones, se emplearon dos tipos de cepas: Zucker diabetic fatty (ZDF) [fa/fa] y Goto Kakizaki (GK), ambos modelos para el desarrollo de T2DM y cada uno se utilizó en un único estudio. Por otro lado, en los estudios con ratones se empleó la cepa BKS.Cg-Dock7m+/+LeprdbJ (db/db) en 24 estudios, la cual es ideal para investigaciones sobre T2DM en fases I, II y III, así como para investigaciones sobre obesidad y cicatrización de heridas. Además, un estudio empleó una variante de la cepa db/db con Smad- /- y otro estudio empleó la cepa B6.Cg-Lepob/J (ob/ob), la cual presenta características de T2DM en fases I y II y es utilizada para investigaciones sobre obesidad y cicatrización de heridas. En cuanto a las duraciones más largas, se registraron las siguientes: dos veces por semana durante tres semanas (R-05); dos días consecutivos (R-34); tres días consecutivos (M- 23, M-45); cuatro días consecutivos (M-30); cinco días consecutivos (R-23, 13 en ratón [M-02, M- 08, M-12, M-18, M-19, M-23, M-25, M-28, M-31, M-44, M-52, M-54, M-57]); y seis días consecutivos (R-06). Todos los estudios que utilizaron una única intervención y una prueba posterior a la intervención emplearon el mismo fármaco, la estreptozotocina (STZ), que fue administrada de manera intraperitoneal. La dosis de la intervención fue de 20 mg/kg para un estudio de ratón, seis estudios en rata utilizaron una dosis de 30 mg/kg, tres estudios en rata utilizaron una dosis de 35 mg/kg, cuatro estudios utilizaron una dosis de 40 mg/kg (dos en ratas y dos en ratones), diecisiete estudios fueron tratados con 50 mg/kg (cuatro en ratas y trece en ratones). Es importante destacar que todas las intervenciones mencionadas anteriormente se consideran intervenciones de baja dosis (un total de 31 intervenciones). En comparación, se obtuvieron 37 intervenciones de alta dosis (con el mismo método de aplicación y fármaco): cinco estudios se administraron a una dosis de 55 mg/kg (cuatro en ratas y uno en ratón), otros seis estudios se administraron a una dosis de 60 mg/kg (cinco en ratas y uno en ratón), trece estudios se sometieron a una dosis de 65 mg/kg (once en ratas y dos en ratones), cinco estudios se administraron a una dosis de 70 mg/kg (uno en rata y cuatro en ratones, en los siguientes estudios, solamente se usó modelo de ratón: dos estudios en se administraron a una dosis de 100 mg/kg, uno a una dosis de 120 mg/kg, uno se sometió a una dosis de 130 mg/kg, uno con una dosis de 140 mg/kg, uno con una dosis de 150 mg/kg, y dos se administraron a una dosis de 200 mg/kg (Tabla 8). 74 Tabla 8. Distribución de la intensidad de las intervenciones. Intensidad Dosis (mg/kg) ID Dosis baja 20 M-38 30 R-16, R-19, R-21, R-27, R-29 35 R-10, R-20, R-28 40 R-22, R-34 M-01, M-18 50 R-09, R-11, R-14, R-25 M-02, M-08, M-12, M-19, M-23, M-25, M-28, M-35, M-44, M-47, M-52, M-53, M-54 Dosis variadas 5, 10, 50 y 100 R-05 Dosis alta 55 R-06, R-07, R-30, R-36 M-30 60 R-03, R-08, R-12, R-17, R-38 M-39 65 R-01, R-02, R-04, R-13, R-18, R-23, R-24, R-26, R-32, R-33, R-37 M-56, M-57 70 R-35 M-10, M-16, M-29, M-31 100 M-37, M-45 120 M-46 130 M-11 140 M-15 150 M-41 200 M-03, M-05 75 9.3.3.3 Resultados Treinta estudios en ratas especificaron los resultados primarios, tanto en el texto completo como en el resumen, mientras que ocho estudios solo los mencionan en el texto completo de la publicación, pero no en el resumen (R04, R07, R26, R32-34, R36-37). Los resultados secundarios se mencionaron explícitamente en treinta y ocho estudios (del R01 al R09 y del R11 al R38, excluyendo al R10). Solo hubo un estudio en el que no se mencionaron los resultados secundarios en el resumen (R10) (ver Tabla 9). Tabla 9. Representación de resultados en los artículos incluidos de rata en la RS Patología Número Resultados primarios Resultados secundarios No resumen Ambos Si No Cardiopatía R-01 ✓ ✓ R-38 ✓ ✓ R-32 ✓ ✓ R-37 ✓ ✓ R-18 ✓ ✓ R-33 ✓ ✓ Nefropatía R-25 ✓ ✓ R-09 ✓ ✓ R-13 ✓ ✓ R-14 ✓ ✓ R-11 ✓ ✓ R-28 ✓ ✓ R-29 ✓ ✓ R-30 ✓ ✓ R-22 ✓ ✓ Neuropatía R-04 ✓ ✓ R-06 ✓ ✓ R-19 ✓ ✓ R-16 ✓ ✓ R-15 ✓ ✓ R-35 ✓ ✓ R-26 ✓ ✓ R-24 ✓ ✓ R-20 ✓ ✓ R-07 ✓ ✓ R-27 ✓ ✓ 76 (Continúa) Retinopatía R-36 ✓ ✓ R-34 ✓ ✓ R-23 ✓ ✓ R-08 ✓ ✓ R-17 ✓ ✓ R-02 ✓ ✓ Extras R-03 ✓ ✓ R-31 ✓ ✓ R-12 ✓ ✓ R-05 ✓ ✓ R-10 ✓ ✓ R-21 ✓ ✓ En treinta estudios en ratones, se especificaron los resultados primarios tanto en el texto completo como en el resumen. En nueve estudios, solo se mencionaron los resultados primarios en el texto completo de la publicación, pero no en el resumen (M-5, M-12, M-19, M-27, M-30, M- 36, M-44, M-49, M-55). Los resultados secundarios se mencionaron explícitamente en treinta y ocho (del M-01 al M-58, excluyendo el M-02). Solo hubo un estudio en el que no se mencionaron los resultados secundarios en el resumen (M-02). Estos detalles se encuentran en la Tabla 10. 77 Tabla 10. Representación de resultados en los artículos incluidos de ratón en la RS. Patología Número Resultados primarios Resultados secundarios No resumen Ambos Si No Cardiopatía M-23 ✓ ✓ M-49 ✓ ✓ M-52 ✓ ✓ M-27 ✓ ✓ M-08 ✓ ✓ M-44 ✓ ✓ M-57 ✓ ✓ M-56 ✓ ✓ Hígado M-01 ✓ ✓ M-18 ✓ ✓ M-04 ✓ ✓ M-43 ✓ ✓ M-15 ✓ ✓ M-E M -51 ✓ ✓ M-58 ✓ ✓ M-37 ✓ ✓ M-09 ✓ ✓ Nefropatía M-07 ✓ ✓ M-24 ✓ ✓ M-17 ✓ ✓ M-46 ✓ ✓ M-50 ✓ ✓ M-12 ✓ ✓ M-40 ✓ ✓ M-11 ✓ ✓ M-03 ✓ ✓ M-14 ✓ ✓ M-25 ✓ ✓ M-34 ✓ ✓ M-45 ✓ ✓ M-22 ✓ ✓ M-36 ✓ ✓ M-54 ✓ ✓ M-55 ✓ ✓ M-06 ✓ ✓ 78 (Continúa) Neuropatía M-35 ✓ ✓ M-38 ✓ ✓ M-05 ✓ ✓ M-41 ✓ ✓ Páncreas M-42 ✓ ✓ M-19 ✓ ✓ M-26 ✓ ✓ M-48 ✓ ✓ M-20 ✓ ✓ Retinopatía M-21 ✓ ✓ M-47 ✓ ✓ M-32 ✓ ✓ M-29 ✓ ✓ M-02 ✓ ✓ M-30 ✓ ✓ M-16 ✓ ✓ Sangre M-28 ✓ ✓ M-10 ✓ ✓ Extras M-13 ✓ ✓ M-33 ✓ ✓ M-53 ✓ ✓ M-31 ✓ ✓ M-39 ✓ ✓ Todos los ensayos incluidos informaron al menos uno de los resultados primarios relevantes para esta revisión. En trece estudios, el objetivo principal se centraba únicamente en la expresión de uno o varios lncRNAs (R-01, R-02, R-03, R-09, R-14, R-18, R-20, R-23, R-25, R- 33, R-34, R-37, R-38). Quince estudios evaluaron los niveles de expresión de lncRNAs asociados con algún factor que representa una afectación relevante en el desarrollo de alguna complicación diabética. Tres estudios presentaron niveles de expresión de diversos lncRNAs asociados a alguna modificación molecular que causa la complicación diabética (R-12, R-28, R-29). Por otra parte, en siete estudios, a pesar de cuantificar los niveles de expresión de lncRNAs, este no era el objetivo principal del estudio (R-4, R-5, R-6, R-7, R-10, R-13, R-26) (Tabla 9). En todos los estudios que utilizaron un modelo de rata, se midió la expresión de 85 lncRNAs, de los cuales se encontró que 19 lncRNAs de distintos tipos se repitieron en varios estudios. Nueve lncRNAs se repitieron dos veces (KCNQ1OT1, LOC102549320, LOC102551779, 79 LOC102554280, LOC103693580, MEG3, MIAT, TUG1, uc.48+). Tres lncRNAs se repitieron tres veces (H19, NEAT1, NONRATT021972). Un solo lncRNA se repitió cinco veces (MALAT1), siendo el que más se repitió. La mayoría de los lncRNAs repetidos presentaron un cambio en la expresión similar, con excepción de H19 (dos aumentaron y uno disminuyó) y MEG3 (uno aumentó y otro disminuyó) (Tabla 11). Tabla 11. Afecciones en la expresión de lncRNAs tras la exposición de distintos tipos de DM en modelo de rata. lncRNAs Regulación (Continúa) AABR07045350.1 Positiva LOC102548331 Positiva AABR07049695.2 Negativa LOC102549320 Positiva AABR07051308.1 Negativa LOC102551779 Negativa AABR07053710.2 Negativa LOC102554280 Negativa AABR07061448.2 Negativa LOC103690121 Positiva Artf3 Negativa LOC103693103 Negativa BC168687 Positiva LOC103693580 Positiva DCRF Positiva LOC103694303 Negativa ENSRNOG00000011753 Positiva LOC498759 Positiva ENSRNOG00000031644 Positiva MALAT1 Positiva ENSRNOG00000037522 Positiva MEG3 Mixto2 (1P/1N) ENSRNOG00000039080 Positiva Mfn2 Negativa ENSRNOG00000048366 Positiva MIAT Mixto2 (1P/1N) ENSRNOG00000050935 Positiva mordey.aSep08-unspliced Positiva ENSRNOT00000093120_Aox3 Positiva NEAT1 Positiva ENSRNOT00000093574_Lepr Negativa NONRATT004911.2 Positiva Ephx2 Negativa NONRATT015614.2 Positiva FLG-AS1 Negativa NONRATT018630.2 Positiva H19 Mixto1 (2P/1N) NONRATT021972 Positiva HCG18 Positiva NONRATT024782.2 Negativa HEPH Positiva NONRATT026027.2 Positiva Itgb8.aSep08-unspliced Negativa NONRATT029906.2 Negativa KCNQ1OT1 Positiva OGRU Positiva klygu.aSep08-unspliced Negativa Pdk4 Positiva LOC100910415 Negativa pydor.aSep08-unspliced Positiva LOC102548078 Positiva rawja.aSep08 Positiva 80 (Continúa) seebla.aSep08-unspliced Negativa uc.48+ Positiva Slc40a1 Negativa UCA1 Negativa speegaw.aSep08-unspliced Negativa verly.aSep08-unspliced Negativa Stc2 Negativa veyly.aSep08-unspliced Negativa Sultla1 Positiva V-set.69.aSep08 Positiva TINCR Positiva vyzaw.aSep08-unspliced Positiva TUG1 Positiva wogler.aSep08-unspliced Negativa Nota. 1 Está presente en tres reportes, en dos su regulación es positiva y en otro negativa. 2 Se encuentra en dos reportes, en uno se expresa de forma positiva y en otro negativa. Todos los estudios incluidos reportaron al menos uno de los resultados primarios relevantes para esta revisión. En treinta y cuatro estudios, el objetivo principal fue evaluar la expresión de uno o varios lncRNAs (M-04, M-06, M-07, M-08, M-09, M-11, M-13, M-14, M-16, M- 17, M-20, M-21, M-22, M-24, M-26, M-29, M-32, M-33, M-37, M-38, M-39, M-41, M-42, M-43, M- 44, M-45, M-46, M-49, M-50, M-52, M-53, M-54, M-56, M-57). Dieciocho estudios evaluaron los niveles de expresión de lncRNAs, pero estaban asociados con algún factor que representa una afectación relevante en el desarrollo de alguna complicación diabética (M-01, M-02, M-03, M-05, M-10, M-12, M-18, M-19, M-25, M-27, M-28, M-30, M-34, M-35, M-36, M-47, M-48, M-51). Cinco estudios presentaron niveles de expresión de diversos lncRNAs, pero estaban asociados a alguna modificación molecular que causa la complicación diabética (M-15, M-23, M-31, M-40, M-55) (Tabla 10). En todos los estudios que utilizaron un modelo de ratón, se midió la expresión de 166 lncRNAs, de los cuales se encontraron 23 lncRNAs de distintos tipos que se repitieron en distintos estudios. Ocho lncRNAs se repitieron dos veces (1500026H17Rik, GAS5, Gm15441, Gomafu, H19, KCNQ1OT1, PVT1, Srebf1). Tres lncRNAs se repitieron tres veces (MEG3, NEAT1, TUG1). Un solo lncRNA se repitió diez veces (MALAT1), siendo el que más veces se repite. La mayoría de los lncRNAs repetidos presentaron un mismo cambio en su expresión, excepto por Gm15441 (uno aumentó y uno se expresó igual al control), H19 (uno aumentó y uno disminuyó), KCNQ1OT1 (uno aumentó y uno disminuyó) y MALAT1 (nueve aumentaron y uno disminuyó) (Tabla 12). 81 Tabla 12. Afecciones en la expresión de lncRNAs tras la exposición de distintos tipos de DM en modelo de rata. lncRNAs Regulación (Continúa) 1500017E21Rik Positiva Eif4a2 Positiva 1500026H17Rik Positiva ENSMUST00000010224 Negativa 1700007L15Rik Negativa ENSMUST00000069768 Negativa 1700020I14Rik Negativa ENSMUST00000099676 Positiva 1700047G03Rik Positiva ENSMUST00000120706 Negativa 1700101I11Rik Positiva ENSMUST00000123574 Positiva 2310043L19Rik Negativa ENSMUST00000128831 Negativa 2610203C20Rik Negativa ENSMUST00000133488 Negativa 2810001G20Rik Positiva ENSMUST-00000134111 Positiva 3110045C21Rik Negativa ENSMUST00000137025 Positiva 4833411C07Rik Positiva ENSMUST00000139005 Negativa 4930412C18Rik Negativa ENSMUST00000139794 Positiva 4931408D14Rik Sin cambio ENSMUST00000140392 Negativa A330074K22Rik Positiva ENSMUST00000140814 Negativa A730036I17Rik Positiva ENSMUST00000141103 Positiva AA388235 Negativa ENSMUST00000142612 Negativa Aasdh Positiva ENSMUST00000144705 Positiva Adrm1 Negativa ENSMUST00000146010 Positiva AK008372 Positiva ENSMUST00000146884 Positiva AK021108 Positiva ENSMUST00000147774 Positiva AK028326 Positiva ENSMUST00000150947 Negativa AK047066 Negativa ENSMUST-00000150952 Negativa AK139328 Positiva ENSMUST00000156336 Positiva AK155805 Negativa ENSMUST00000160089 Positiva Ankfy1 Negativa ENSMUST00000162370 Positiva ANRIL Positiva ENSMUST00000163495 Positiva B930059L03Rik Positiva ENSMUST00000175668 Positiva Blinc2 Positiva ENSMUST00000177010 Negativa Blinc3 Negativa ENSMUST00000189055 Positiva Cpt1b Negativa ENSMUST00000189909 Positiva Ctcflos Positiva ENSMUST00000197415 Positiva CYP4B1-PS1-001 Positiva ENSMUST00000203799 Positiva D630024K03Rik Negativa ENSMUST00000208069 Negativa D630029K05Rik Negativa ENSMUST00000210596 Negativa Dab Negativa ENSMUST00000227433 Positiva Defb42 Positiva ENSMUST00000228460 Negativa Dlx6os1 Positiva ENSMUST00000233842 Positiva Duox2 Negativa Fam120aos Negativa 82 (Continúa) Fendrr Positiva NR-040589 Negativa Foxo6os Negativa Pdia6 Negativa GAS5 Positiva Pkp4 Positiva Gm10638 Positiva Plet1os Sin cambio Gm10768 Positiva Psenen Positiva Gm10804 Positiva PVT1 Positiva Gm13490 Negativa Rai1 Positiva Gm15441 Mixto (P y Sc) Risa Positiva Gm15645 Negativa Rnu1b6 Negativa Gm21093 Negativa RP23-341H6.1 Negativa Gm36691 Positiva Rpl14-ps1 Positiva Gm38501 Positiva Slco6d1 Positiva Gm44502 Negativa SNHG15 Negativa Gm5524 Positiva SNHG16 Positiva Gm6300 Negativa SNHG17 Positiva Gm6457 Positiva Snhg18 Negativa Gomafu Positiva Snora73a Positiva H19 Mixto (P y N) Snora74a Negativa HOTAIR Negativa SOX2OT Negativa HOTTIP Negativa Srebf1 Positiva Igsf5 Negativa TCONS_00002412 Positiva Kcnq1ot1 Mixto (P y N) TCONS_00008179 Positiva Linc-md1 Positiva TUG1 Negativa lincRNA p21 Negativa uc.273- Positiva Lnc-G3bp2 Negativa uc008anr.1 Sin cambio lnc-ISG20 Positiva Usp15 Positiva Lnc-NUS1 Negativa Vps13d Positiva Lnc-Ptpn1 Positiva XIST Positiva Lnc-Sestd1 Positiva ZFAS1 Positiva Lnc-Trabd2b Negativa OIP5-AS1 Negativa MALAT1 Mixto (10P y 1N) Pck1 Positiva MEG3 Negativa Nota. Algunos lncRNAs estuvieron presentes en distintos reportes, por lo cual, en algunos casos tuvieron diferentes expresiones. Expresión positiva (P), y negativa (N). Mmp2 Negativa NCL Positiva NEAT1 Positiva NR-003513 Negativa NR-045306 Positiva 83 9.4 Estudios excluidos Durante la revisión de los estudios, se excluyeron varios debido a cuestiones metodológicas, principalmente por la alta variación de los criterios de diagnóstico, lo que dificulta una posible síntesis de datos sin la inclusión de heterogeneidad. También se excluyeron estudios que utilizaron modelos in vitro o incluyeron pacientes hospitalizados en su diseño de estudio (revisar los materiales suplementarios sección D y E). 9.5 Efectos de la intervención 9.5.1 Comparación de efectos 9.5.1.1 Cardiopatía diabética Resultados en ratas En el caso de la cardiopatía diabética en ratas, se identificaron un total de cinco lncRNAs. De ellos, DCRF, TINCR, MALAT1 y MIAT mostraron un aumento en su expresión al estar expuestos a un ambiente diabético, mientras que el lncRNA H19 disminuyó en la misma situación (Fig. 12). Cabe destacar que, debido a las características de los estudios, se puede observar que el nivel de heterogeneidad es elevado (I2 = 99). Por lo tanto, se intentó explicar la heterogeneidad mediante la creación de subgrupos. Figura 12. Forest plot de lncRNAs en DCM en un modelo de rata. En el primer caso, se intentó explicar a través del tejido utilizado para cuantificar el nivel de expresión de los lncRNAs. En este estudio se utilizaron dos tipos diferentes de tejido: tejido cardiaco y tejido de miocardio. En el caso del tejido cardíaco, se utilizó para cuantificar la expresión del lncRNA MIAT, TINCR y MALAT1 (este último se repite) (I2 =92), mientras que el 84 tejido de miocardio contemplaba a los lncRNAs DCRF y H19 (I2 =100). A pesar de tener niveles elevados de heterogeneidad por cada subgrupo, se puede observar que la prueba de diferencias entre los subgrupos arroja una I2 = 39.7%, lo que representa una heterogeneidad que puede que no sea relevante (Fig. 13). Cabe destacar que no se realizó un análisis de subgrupos según el tipo de DM, ya que todos los modelos utilizados en el estudio representaban un modelo de T1DM. Figura 13. Forest plot sobre la explicación de heterogeneidad en DCM en un modelo de rata. Resultados en ratones En los estudios de ratones en los que se indujo DM para el desarrollo de cardiopatía, se identificaron un total de quince lncRNAs. La mayoría de ellos presentaron un incremento significativo en comparación con la línea de no efecto, excepto el lncRNA HOTAIR, que mostró una disminución en sus niveles de expresión. En cuanto a la heterogeneidad, esta se encontró elevada debido a las diferencias intrínsecas de los estudios incluidos, lo que arrojó un valor de I2 = 99% (Fig. 14). 85 Figura 14. Forest plot de lncRNAs en DCM en un modelo de ratón. Para explicar la heterogeneidad, se crearon diversos grupos basados en dos características: el tipo de DM utilizado en el modelo y el tejido de interés en el que se realizó la PCR para medir el nivel de expresión de los lncRNAs. En la Fig. 15, se dividieron los estudios y sus respectivos lncRNAs según el tipo de DM utilizado, en este caso, solo se utilizaron modelos de T1DM y T2DM. En el modelo de T1DM, hubo un total de cinco lncRNAs, la mayoría de los cuales presentaron un aumento en la expresión, excepto el lncRNA HOTAIR, que disminuyó. En el modelo de T2DM, se identificaron un total de diez lncRNAs, todos los cuales tuvieron un aumento en su nivel de expresión. A pesar de que cada modelo de DM mostró una heterogeneidad elevada en el análisis de subgrupos con un valor de I2 = 99%, el análisis de las diferencias entre grupos arrojó un valor total de I2 = 0%, lo que implica una nula heterogeneidad o una homogeneidad de estudios. 86 Figura 15. Forest plot sobre la explicación de heterogeneidad de acuerdo con el tipo de DM en DCM en modelos de ratón. Sin embargo, en cuanto al tipo de tejido cardíaco, se observó que solamente el lncRNA HOTAIR presentó una disminución en su expresión, mientras que, GAS5 mostró un aumento en su expresión. En cardiomiocitos, solamente se identificó a GAS, con un incremento de su expresión. Por otra parte, en grupo de tejido de miocardio se encontraron tres estudios (M-23, M- 49 y M-52), siendo que en el estudio M-49 se midieron ocho lncRNAs, y todos ellos presentaron un aumento significativo en su expresión con respecto al control. Finalmente, en los tejidos de ventrículo izquierdo, se encontraron dos lncRNAs: ZFAS1 y KCNQ1OT1, ambos con un incremento en su expresión (Fig. 16). 87 Figura 16. Forest plot sobre la explicación de heterogeneidad de acuerdo con el tipo de muestra en DCM en modelos de ratón. Algo importante a destacar es que tanto la resolución de la heterogeneidad a través del tipo de DM como la del tipo de tejido extraído proporcionan una buena explicación sobre el comportamiento de los lncRNAs. En un análisis individual, los niveles de I2 sobrepasan el 90%, lo que indica una heterogeneidad considerable. Sin embargo, la división de subgrupos según el tipo de tejido extraído proporciona una mejor comprensión de las características de la heterogeneidad de los estudios incluidos. 9.5.1.2 Afecciones músculo-esqueléticas Resultados en ratas En el caso de las afecciones musculoesqueléticas en ratas, se identificaron dos estudios en los que se midieron un total de cuatro lncRNAs. De estos, dos presentaron un aumento significativo en su expresión: el linc-MIAT y MSTRG.1662, mientras que los otros dos disminuyeron su expresión después de la exposición a un ambiente diabético, siendo los lncRNAs NONRATG011882.2 y NONRATG013497.2 (Fig. 17). La representación de los estudios muestra 88 una alta tasa de heterogeneidad, con un valor de I2 = 99%, por lo que se realizó un análisis de subgrupos. Figura 17. Forest plot de lncRNAs en afecciones musculo-esqueléticas en un modelo de rata. La estructura de los estudios sobre afecciones músculo-esqueléticas sólo permitió la creación de subgrupos basados en el tipo de tejido utilizado para la PCR, estos tejidos incluyen células musculares lisas vasculares y músculo gastrocnemio. El resultado de la prueba de diferencias entre los subgrupos es I2 = 0% (Fig. 18). Figura 18. Forest plot sobre la explicación de heterogeneidad de acuerdo con la muestra empleada en afecciones musculo-esqueléticas en un modelo de rata. Resultados en ratones La heterogeneidad en los resultados de los ratones es notable debido a la gran variabilidad en los hallazgos. Esto se debe a que un único estudio analizó quince de los diecisiete lncRNAs identificados, lo que impone una limitación metodológica al análisis. De los lncRNAs evaluados, catorce no mostraron cambios significativos en su expresión, mientras que dos presentaron una disminución y uno tuvo un aumento en su expresión (Fig. 19). 89 Figura 19. Forest plot de lncRNAs en afecciones musculo-esqueléticas en un modelo de ratón. Una de las primeras formas de intentar explicar la heterogeneidad, es a través del modelo de DM utilizado en los estudios. Se puede observar que de los tres estudios que incluyen la sección de afecciones músculo-esqueléticas, dos corresponden a T2DM con un total de dieciséis lncRNAs, mientras que T1DM solamente presenta el lncRNA PVT1. De esta manera, no es posible reducir el nivel de heterogeneidad (Fig. 21). Figura 20. Forest plot sobre la explicación de heterogeneidad de acuerdo con el tipo de DM en afecciones musculo-esqueléticas, en modelos de ratón. 90 La manera que funciona de mejor manera para disminuir los niveles de heterogeneidad es a través del tejido el cual se dio uso la cuantificación de los lncRNAs, lo cual se deja notar que el estudio M-51 presenta una gran cantidad de diversidad metodológica, el cual hay que tener en consideración al momento de hacer análisis de sensibilidad (Fig. 21). Figura 21. Forest plot sobre la explicación de heterogeneidad de acuerdo con la muestra empleada en afecciones musculo-esqueléticas, en modelos de ratón. 9.5.1.3 Nefropatía diabética Resultados en ratas En términos de la nefropatía diabética, se identificaron dieciséis lncRNAs, que presentaron diversos comportamientos, el principal recae en una sobreexpresión de los lncRNAs al estar en presencia de un ambiente diabético con un total de once lncRNAs, dos tuvieron un decremento en su expresión (Mfn2 y UCA1) y tres se ubican en el área de no cambio (NEAT1, H19 y ENSR0G00000039080). Cabe destacar, que, de esta manera general, el índice de heterogeneidad corresponde a un 98%, lo cual refleja un nivel importante en la variación entre y/o intra-estudios (Fig. 22). 91 Figura 22. Forest plot de lncRNAs en DKD en un modelo de rata. Tras la división de subgrupos por medio del tipo de DM, se obtuvo una leve disminución en los niveles de heterogeneidad, en el caso de la T1DM se puede observar el efecto general tiende a la sobreexpresión, debido a que solamente dos lncRNAs presentan una disminución, siendo TUG1 y H19, mientras que el lncRNA con mayor expresión es NEAT1 del estudio número 25 (Fig. 23). Mientras que en la T2DM, el efecto general tiende a la sobreexpresión pero debido a la heterogeneidad de los estudios, se puede observar que el lncRNA UCA1 es el único que disminuye su expresión de manera significa, hecho que afecta a resultado general, pero debido a que los lncRNAs KCNQ10T1 y MALAT1, tienen un buen margen con respecto a la línea de no cambio (se sobreexpresan), siendo que el primero tiene una mayor expresión pero sus intervalos de confianza son más amplios con respecto a MALAT1 (Fig. 23). 92 Figura 23. Forest plot sobre la explicación de heterogeneidad de acuerdo con el tipo de DM en DKD en un modelo de rata. En el caso de la realización de subgrupos por medio del tejido empleado para la realización de las PCR, únicamente se dieron uso de dos tipos de tejidos, siendo tejido renal (n= 15 [basado en estudios incluidos] y tejido epitelial tubular renal (n= 1), los niveles de heterogeneidad disminuyen, pero no lo suficiente para considerar una heterogeneidad moderada, ya que sigue elevada, pero se puede observar que en el caso del grupo de tejido renal, existen algunos estudios que a través de pruebas de sensibilidad, afectan la I2, siendo los lncRNAs Mfn2 (estudio 22.2) y TUG1 (estudio 13), los que afectan a este índice, dejando está considerando de lado, se puede observar que el efecto general del subgrupo tiende a la sobreexpresión ya que la mayoría de los lncRNAs se sobreexpresan, además de que sus intervalos de confianza no tocan lo línea de no cambio (Fig. 24). Sin embargo, los lncRNAs NEAT1 (R-9 y R-30) y ENSRN0G00000048366, presentan una tendencia a la sobreexpresión, pero sus intervalos se encuentran ubicados en la línea de no efecto, mientras que, el lncRNA UCA1 es el único presente en el grupo de tejidos tubulares renales, por lo cual, no es aplicable algún índice de heterogeneidad, pero su nivel de 93 expresión tiende a la disminución de expresión de manera significativa, además de presentar intervalos de confianza estrechos (Fig. 24). Figura 24. Forest plot sobre la explicación de heterogeneidad de acuerdo con la muestra empleada en DKD en modelos de rata. Finalmente, se hizo un análisis de subgrupos por medio de la unidad que se usó para medir la expresión de los lncRNAS, teniendo cuatro tipos de mediciones, siendo estas: Fold change, Expresión relativa, Nivel y Cuantificación relativos. En este caso en particular, los resultados arrojaron resultados satisfactorios, ya que con una prueba de sensibilidad, se pueden disminuir de manera significativa los niveles de heterogeneidad, ya que estos subgrupos en particular, mantienen un constante en su concordancia de expresión, con excepción de algunos lncRNAs, como lo puede ser en el subgrupo de expresión relativa, donde el lncRNA UCA1, presenta una discordancia ,ya que es el único que presenta una disminución significativa en sus niveles de expresión, además de que este lncRNA presenta un gran peso, lo que hace que se mueva de manera drástica el efecto general del subgrupo (Fig. 25). En el caso del grupo de Fold change, la I2, está en un nivel de heterogeneidad elevada, debido a las diferentes escalas de expresión, ya que el lncRNA NEAT1 presenta casi el doble de expresión que MALAT1. En el caso del nivel relativo, únicamente se puede destacar su tendencia de disminución de expresión, ya que los intervalos de confianza se posan sobre la línea de no cambio, mientras que el último 94 subgrupo (cuantificación relativa), presenta un lncRNA que no presenta cambio (H19) y otro que tiene una disminución significativa de sus niveles de expresión (Mfn2), siendo que la presencia del primero provoque que incremente los niveles de heterogeneidad y mueva el resultado general (Fig. 25). Figura 25. Forest plot sobre la explicación de heterogeneidad de acuerdo con tipo de medición aplicada en DKD en un modelo de rata. 95 Resultados en ratones En el caso de los estudios identificados en donde la patología fuera nefropatía diabética y el modelo biológico fuese ratón, se pudo identificar que con diferencia este es el grupo de análisis más grande con respecto a cualquier otro, por lo cual, debido a las características estructurales del forest plot, será complicado tratar de resolver los diversos niveles de heterogeneidad presentes, incluso con la realización de subgrupos. En la Fig. 26 se puede observar un análisis general de todos los lncRNAs encontrados a lo largo de los estudios incluidos para el metaanálisis, se logra identificar un índice de heterogeneidad elevado, lo que deja ver que tenemos resultados dicotómicos, ya que algunos lncRNAs tienden a la sobreexpresión, mientras que otros disminuyen su expresión en presencia de un ambiente diabético, siendo los lncRNAs con menor expresión GM6300 y 4930412C18Rik, mientras que el lncRNA con mayor expresión y con diferencia es CYP4B1-PS1-001. Cabe destacar, que los niveles de heterogeneidad son elevados ya que el índice I2 = 89%, lo que indica diversidad entre los estudios incluidos en el forest plot. 96 Figura 26. Forest plot de lncRNAs en DKD en un modelo de ratón. 97 Para intentar disminuir la gran diversidad de los datos se manejaron diversos subgrupos, el primero fue basado en el tipo de DM que se indujo (Fig. 27), en este se puede observar que únicamente se trabajó con T1DM y T2DM, en el primer caso aún existe un alto grado de heterogeneidad, principalmente por el lncRNA TUG1 el cual presenta la discordancia de bajar sus niveles de expresión con respecto a los otros lncRNAs, por lo cual, si se realizara un análisis de sensibilidad se podría quitar el R-12, con la finalidad de que la I2 disminuyera. Por otra parte, en el caso de T2DM, se puede decir los niveles de heterogeneidad con solo ver el gráfico del subgrupo, ya que se encuentran diversos lncRNAs con comportamiento variado, además, las tasas de cambio de expresión de uno con respecto al otro son altas, por lo cual, no es de esperar este índice tan grande. Adicionalmente, se puede decir que dentro de todos los lncRNAs, el que tiene una mayor expresión es el CYP4B1-PS1-001, a diferencia de Gm6300 que es el que presenta la menor expresión. Otra forma de analizar los diversos estudios, fue a través del tejido el cual se usó para cuantificar la expresión de los lncRNAS, en el caso del tejido de corteza renal, su disposición es totalmente heterogénea, ya que se presenta lncRNAs con comportamiento de aumento y decremento de expresión, incluso se puede apreciar que SNGH16 es un lncRNA el cual tiene una leve tendencia al aumento pero su IC se encuentra en la línea de no cambio, cabe destacar que el resultado general tiende al decremento debido a que existe una mayor cantidad de lncRNAs que tienden a la baja y con mayor proporción que sus contrarios, a pesar de tener al lncRNA CYP4B1-PS1-001 (Fig. 28). Diahetes Control Mean Difference Mean Difference Study or Subgroup Mean SD Total Mean SD Total Weight IV,Random, 95% CI Iv, Random, 95% Cl 211 TD M-11 [SNHG17] 2.4345 0.3308 7 1 10 7 25% 1.43 (0.65, 2.21] = 1-12 [MALATI] 3:1403 0.9694 10 1 0392 10 25% 2.14 (1.49, 2.79] =- m-25 [TUG1] 0.0052 02318 5 1 07184 5 26% — -039/0.65,-0:14) 7 m-45 DIST] 2.5748 02715 8 1 00861 8 20% 1.57 (1.39, 1.77] - 1-54 [MALATI] 2.5445 0.9935 10 1 02671 10 25% 1:54 [0.91, 218] - Subtotal (95% Cl) 41 41 12.6% 1.24 [0.16, 2.33] e Heterogeneity: Tau*= 1.46; Ohi*= 183.91, df= 4 (P < 0.00001); 1== 98% Test for overall elect Z= 2.24 (P= 0.03) 2.1.2 12D M-03 [Dixbos1] 1.1441 0,5507 3 m-06 [Inc-15G20] 2.4384 0.4266 30 m-07.1 [6m5524] 3.9449 1.333 6 M-07.2 [6m15645] 0.2141 0.0093 6 M-14 [SNHG1 6] a 1.3567 3 M-17.1 [D630029K05RiK] 0.0234 0.0069 5 M-17.2 [170002011 4RiK] 0.3155 0,2742 5 M-17.3 [1500026H17RiW 3.5278 4.6225 5 M-17,4 [Fara 20208] 0.5327 0.1067 5 M-17.5 [D630024K03Rik 0.1451 0.0912 5 M-17.6 [RP23-341H6.1] 0.0081 0.0036 5 M-17.7 [ENHG18] 0.0835 0.0374 5 M-22 [MALAT1]] 2 0.2119 3 M-24 [TUG1] 0.3183 0.1274 5 M-34 [Risa] 7.1938 2.9645 20 M-36 [CYP4B1-P51-001] — 13.6229 0.729 6 m-40.1 [Rnutb6] -8.3552 0.9817 5 M-40.2 [4930412018RIK] — -8.8747 1.1006 5 m-40.3 [6m6300] -13.3653 2.4463 5 M-40.4 [Gm21093] -3.6233 0.3767 5 M-40.5 [AA388235] -2.7494 0.5249 5 m-40.6 [Sm6457] 3.5549 0.4451 5 M-40.7 [Rp 4-ps1] 4.7852 0.8944 5 M-46 [NEATI] 2.1845 0.0802 5 m-50.1 [Dab] -2.376 0.2393 3 M-50.2 [1700007L15RiKH — -2.0922 0.1813 3 M-50.3 [Snora74a] 1.4815 0,341 3 M-50.4 [2610203020RiJ— -2.6554 0.1893 3 M-50.5 [Defb42] 1.4305 0.364 3 M-50.6 [1500026H17RiW 4.3447 0.2051 3 M-50.7 [Snora73a] 1.2054 0.1605 3 m-55.1 [Inc-Ptpn1] 10.8322 1.7783 6 M-55.2 [Inc-Trabd2b] 0.7443 0,3453 6 M-55.3 [Inc-NUS1] 0.6844 0,5425 6 M-55.4 [Inc-Sestd1] 1.4534 0,2508 6 M-55.5 [Inc-G3bp2] 0.6559 0.1606 6 Subtotal (95% Cl) Heterogeneity: Tau= 3.45; Chi" Test for overall elect Z= 0.70 (P= 0.49) Total (95% CH) 249 Heterogeneity: Tau*= 3.17; Chi*= 5013.76, df= 40 (P < 0.0001), 1 Test for overall elect Z= 1.23 (P= 0.22) Testfor subaroup differences: Chi*= 2,55, df=1(P=0.11, F 4749.61, df= 35 (P <0.00001), 0.6976 0.38 3 2.5% 1.1933 0.7143 30 2.6% 1 0.0472 Bo 24% 1 0.1107 5 2.6% 1.5352 0.6495 3 21% 1 1 5 24% 1 1 5 24% 1 1 5 11% 1 1 5 24% 1 1 5 24% 1 1 5 24% 1 1 5 24% 1.0855 0.0675 3 2.6% 1 0.2271 5 2.6% 1 1 20 2.2% 0.9826 0.2152 Bo 2.5% 1.0892 0.2026 5 24% 1.0928 0.2937 5 24% 1.0974 0.3388 5 1.9% 1.0622 0.136 5 2.6% 1.1063 0.137 5 2.5% 0.9592 0.071 5 2.6% 0.9574 0.2428 5 2.5% 1 0.0912 5 2.6% 1.0322 0.2681 3 2.6% 1 0.2419 3 2.6% 1.0431 0,2436 3 2.5% 1.0269 0.2436 3 2.6% 1.002 0.1502 3 2.5% 1.0131 0.1819 3 2.6% 1.0234 0.1391 3 2.6% 1.0268 0.5917 Bo 2.2% 0.9859 0.3946 5 2.6% 1.0287 0.2958 Bo 2.5% 1 0.1494 5 2.6% 1 0.3681 5 2.6% 208 87.4% 99% 249 100.0% 99% 0.7% 0.45 £0.31,1.20] 1.25 [1.07,1.42] 2.94 1.88, 4.01] -0.78 L0.87,-0.70] 2.46 [0.76,4.:17] -1.00 F1.87,-0-12] -0.68 1.59, 0,22] 2.53 1.62, 6.67] -0.47 1.35, 0.41] -0.85 1.73, 0.03] -0.99 -1.87,-0:12] -0.92 1 .79,-0.04] 0.93 [0.69,1.18] -0.68 0.91, -0.45] 6.19 [4.82, 7.56] 12.65 (12.05,13.27] -7.27 L8:14, -7.78 8.78, -12.27 (414.43, - -2.56 2.91 -1.64 E2:12, 2.60 [2.20, 2.99] 3.83 [3.02, 4.64] 1.18 [1.08, 1.34 61.74, 1.09 1.43, -0.44 0.91 -1.63 1.98, 0.43 0.02,0.87] 3.33 [3.02,3.64] 0.18 £0.06, 0.42] 9.81 (8.31, 11.30] -0.24 0.65, 0.18] -0.34 0.84, 0.18] 0.45 [0.22, 0.69] -0.34 L0.65, -0.02] 0.22 [-0.40, 0.85] 0.35 [-0.21, 0.91] H p 5 gulated Ta 98 Figura 27. Forest plot sobre la explicación de heterogeneidad de acuerdo con tipo de DM en DKD en un modelo de ratón. Diabetes Control Mean Difference Mean Difference “Study or Subgroup Mean SD Total Mean SD Total Weight IV.Random, 95% Cl IV, Random, 95% Cl 3.1.1 Cortezas Renales M-14 [ENHO18] 4 1.3567 3 15352 08495 3 21% 2.46 (0.76, 4.17] — M-36 [CYP4B1-PS1-001] — 136229 0.729 6 0.9626 02182 8 25% 1266/1205,13.27] M-401 (Rnuth8] -8.3652 0.9817 5 -10892 0.2026 5 24% -7.27[8:14,-6.29 = M-40.2 (493041 2C18RI— -8.8747 1.1006 5 -1.0928 02937 5 24% -778[878,-6.78 = M-40.3 [(9m8300] -13.3853 2.4463 5 -1.0974 0.3388. 5 19% -1227P19,43,-1040] *— M-40.4 [Sm21093] -3.6233 0.3767 5 -10622 0136 5 28% -2566201,-221] - M-40.5 [RA388239] -2.7494 0.5249 5 14063 0.137 5 25% 1646212147] - M-40.5 [(9mB457] 25549 0.4451 5 0.9692 0071 5 26% 2.60 [2.20, 2.99] - M-40.7 [Rpl1 4-p51] 4.7852 0.8944 5 0.9574 024285 25% 3.83[3.02, 4.54] = Subtotal (95% Cl) 44 44 21.4% — -1.071-4.95,2.80] — A Heterogeneity: Tau= 34.89; ChP= 2779.84, af=8 (P < 0.0001); F= 100% Testfor overall efect: Z= 0.64 (P = 0.59) 3.1.2 Glómerulos M-11 [SNHO17] 2.4345 0.3300 7 1 107 25% 430.65, 2.21] z Subtotal (95% Cl) 7 7 25% 1.43 [0.65, 2.21] hd Heterogeneity: Not applicable Testfor overall effect: = 3,60 (P = 0.0003) 3.1.3 Podocitos M-24 [TUG1] 0.3183 0.1274 5 1 02271 5 26% — -068£091,-048] 7 Subtotal (95% CI) 5 5 26% -0.68[-0.91,-0.45] ' Heterogeneity: Not applicable Testfor overall effect: Z= 5.85 (P < 0.0001) 3.1.4 Tejidos Nefridiales M-03 (Dios!) 11441 0.5507 3 0.6976 038 3 25% 0.45 10.31, 1.20] va Subtotal (95% Cl) 3 3 25% 0.45 -0.31, 1.20] » Heterogeneity: Not applicable Testfor overall effect: Z=1.16 (P= 0.25) 3.1.5 Tejidos Renales M-06 Inc-15620] 2.4384 0.4266 30 1.1933 0.2143 30 28% 1.25 [1.07,1.42] - M-07 1 [9m8524] 39449 1.333 6 1 0.0472 6 24% 2.94 (1.88, 4.01] —- M-07.2 [Gmi 5645] 0.2141 0.0093 6 1 0107. 6 26% -0.79£087,-0.70] : M-12 (MALATI] 3:1403 0.9694 10 1 0392 10 25% 2:14 [1.49, 2.79] = M-17.1 (D630029K05RIg 0.0234 0.0069 5 1 1005 24% -1001187,-012) A M-17.2 [170002011 4 0.3155 0.2742 5 1 1. 05 24% -0681159,022 A M-17.3 [1500026H17RIM 35278 4.6225 5 1 105 14% 2:53 1-1.62, 0.67] A M-17.4 [Fam 20808] 0.5327 0.1067 5 1 1.05 24% -047(11.38,041) 5 M-17.5 (DB30024K03RIg 0.1481 0.0912 5 1 11. 05 24% -085/173,0.03) Y M-17.6 [RP23-341H6.1] 0.0081 0.0036 5 1 1.005 24% -099(187,-012) A M-17.7 [SNHG18] 0.0835 0.0374 5 1 1.05 24% -0.92(179,-0.04) = M-22 IMALATI]) 2 0.2119 3 1.0655 D.0575 3 26% 0.93 (0.69, 1.18] - M-34 [Risa 7:1938 2.9645 20 1 1 20 22% 6:19[4.82, 7.56] — M-45 PAST] 25745 0.2715 8 1 0.0881 8 286% 1:57 [1.38,1.27] > M-46 [NEATA] 2:1845 0.0802 5 1 00912 5 28% 1:18(1.08, 1.29] : M-50.1 [Dab] -2.376 0.2393 3 -1.0322 02681 3 28% -1.3411.74,-0.99) - M-50.2 [17D0007L1SRIK) 200922 0.1813 3 1 02449 3 26% — -109/1.43,-0.75 - M-50.3 [Snora74a] 14818 0.341 3 -1.0431 02438 3 25% -044£0.91,0.04] z M-50.4 (2810203020RIM— -288554 0.1893 3 -1.0269 02436 3 26% -163-198,-1.28 - M-50.5 [Defla42] 1.4305 0.364 3 1.002 01502 3 25% 0.43 10.02, 0.87] E M-50.6 [1500026H17RIK > 4.3447 0.2051 3 1.0131 01819 3 26% 3.33 [3.02, 3.54] - M-50.? [Snora73a] 1.2054 0.1605 3 1.0234 01391 3 26% 0:18 (0.06, 0.42] M-54 [MALATI] 25445 0.9935 10 1 02671 10 25% 1:54 (0.91, 2.18] =- M-55.1 Inc-Ptpn] 108322 1.7753 6 1.0268 0597 6 22% 981[831,11.30) — M-55.2 Inc-Trabd20] 0.7443 0.3453 6 0.9859 030486 8 26% -0241066,018 5 M-55.3 [Inc-NUS1] 0.6844 0.5425 6 1.0267 02988 8 25% -0341084,015 A M-55.4 [Inc-Sestd1] 1.4534 0.2508 6 1 01494 6 286% 0.45 [0.22, 0.69] - M-55.5 [nc-O3bp2] 0.6569 0.1606 6 1 03681 6 26% — -034£066,-0.02] 7] Subtotal (95% CI) 184 184 68,5% 0.68 [0.19, 1.17] ¡e Heterogeneity: Tau”= 1.63; Ch?= 2129.09, df= 27 (P < 0.0001); P= 99% Testfor overall efect: Z= 2.70 (P = 0.007) 3.1.6 Túbulos Renales M-25 [TUO1] 0.6052 0.2316 6 1 02184 6 26% — -039£065,-0:4] 7 Subtotal (95% CI) 6 6 26% -0.391-0,65,-0.14] ' Heterogeneity: Not applicable Testfor overall effect: Z= 3.04 (P = 0.002) Total (95% Cl) 249 249 100.0% — 0.351-0.21,0.91] Heterogeneity: Tau"= 3.17, Ch?= 5013.76, df=40 (P < 0.0001); P= 99% + 35 y + 7 Testfor overall effect: Z= 1.23 (P=0.22) Testforsubaroup differences: Chi" 49.19, df= 5 (P